UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Farmacología y Toxicología CIPIOS ANTIINFLAMATORIOS DE T PRINCIPIOS ANTIINFLAMORIOS DE Inmunodepresión en situaciones de estrés experimental y morfinodependencia: su modulación farmacológica MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR José María Pórtoles Pérez Director Pedro Lorenzo Fernández Madrid 2004 ISBN: 978-84-8466-973-9 © José María Pórtoles Pérez, 1992 JOSE M~ PORTOLES PEREZ INMUNODEPRESION EN SITUACIONES DE ESTRES EXPERIMENTAL Y MORFINODEPENDENCIA: SU MODULACION FARMACOLOGICA Director: Prat Pedro Lorenzo Fernández DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGíA FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 1 992 INFORME DEL DII1E~OR DE LA TESIS PEDRO LORENZO FEENANDEZ CATEDRATICO DE FARMACOLOGíA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID TIENE A BIEN INFORMAR: Que el Proyecta de trabajo preentado por el Doctorando U. JOSE MARIA PORTOLES PEREZ, titulado: “Inmunodpresión en situaciones de estrés experimental y morfinodependencia: su modulación farmacológica”, reune las condiciones académicas y científicas necesarias para considerarlo como Tesis Doctoral. Madrid, 23 de Octubre de 1992 VP R~ EL TUTOR (2) El Directorde ¡a Tesis ¿rCULt4~ Prof. P. orenzoEdo.: _______________________ (fecha y firma) (fecha y firma> NIE.: 11.010.154 P INFORME DEL CONSEJO DE DEPARTAMENTO EL CONSEJO DEL DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGíA INFORMA: Favorablemente la presentación, exposición y defensa del Proyecto de trabajo presentado por U. JOSE MARIA PORTOLES PEREZ y dirigida por el Prof. Pedro Lorenzo Fernández, Catedrático de este Departamento, dado que reune las condiciones académicas y científicas requeridas para ser considerado como Tesis Doctoral. Madrid, 29 Octubre de 1992 Edo.: N.LF.: Fechareunión ConsejoDepartamento 27/10/92 El DirectordelDepartamento Edo.: Prof. P. Lorenzo (fecha y firma) 1. INTRODUCCION. 1.1.- ORGANIZACION ANATOMICA DEL ESTRES. i.a- SIGNIFICACION BIOLOGICA DEL ESTRES. i.ai.- Cuadros de entrés de origen sistémico. A) Estrás por shock térmico. 6) Estrás biológico por interacciones huésped-parásito. C) Estrás psiconeurógeno y mecanismos de adaptación. 1.3.- EFECTOS DEL ESTRES SOBRE LA INTERACCION NEUROINMUNE. ¡.3.1.- ModIficación de respuestas inmunitarlas en estados de ansiedad. 1.32- Sistemas monoaminérgicos, estés y respuesta Inmune. iZ&- Neuropéptidos aploldes y respuesta Inmune en situaciones de esté.. 1.4.- NEUROINMUNOMODULACION ENCUADROSDENPERSENSIBIUDADYANAFILAX¡A SU VARIACION EN SITUACIONES DE ESTRES. i.5.-MODIFICACIONES FARMACOLOGICAS DE LA INTERACCION NEUROINMUNE EN CUADROS DE ANAFILAXiA. ¡.6.- SOBRE LAS POSIBIUDADES DE MODELOS EXPERIMENTALES ADECUADOS. 1.6.1.- En relacción con cielos patones de condiclonamineto y aprendizaje. ¡.6.2.- En relaccián con los cuadros de analilada. II. OBJETIVOS DEL TRABAJO. III. MATERIALES Y METODOS. 111.1.- MATERIALES Y MEDIOS. 111.1.1.- Animaies. iii.i.2.- Cultivos celulares. Indice. 111.1.3.- Antígenos. 111.1.4.- Anticuerpos sensiblilzantes. 111.1.5.- AntIcuerpos para citofluorometrfa. 111.1.6.- MedIos de cultivo y solucionen. 111.1.7.- Mltógenos y reactivos celulares. III.i.8.- Fármacos. 111.2.- TEONICAS Y MODELOS EXPERIMENTALES. ¡¡¡.2.1.- Modelos experimentales de entrés. 111.2.2.- Obtención de sueros ardi-Brucella. ¡¡¡.23.- Determinaciones de Inmunoprecipitaclán cuantitativa. 111.2.4.- Determlnacton de proteínas. ¡¡1.25.- DetermInación de DL~ para moléculas endotóxicas. 111.2.6.- Anafilaxia sistémíca pasiva (PSA). y determInación de 1150. 111.27.- AnaIlíada cutánea pasiva (PSA). 111.28.- Ensayos de trasformación linfoblástica. 111.29.- Ensayas de proliferaclón celular en placa. í¡¡aio.- Determinaclon de lnterleuqulna-2 (IL-2). 111.2.11.- ActMdad citotóxica de células NK. 111.212.- Recuento plaquetarlo. lll.2.i&- Recuento de eoslnótlIos. 111.2. 1 4.- PreparacIón de células para su utilización en citolluarometría de flujo (FACS). 111.2.15.- Determinación de niveles de corticasterona en suero. 111.3.- ANAUSIS DE LOS RESULTADOS. Indice. u IV. RESULTADOS. IV.1 .- ESTUDIO DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES. IV.1 .1.- Modelos de estrás experimental. IV)l.2.- Modelos de analilaida experImental. IV.1 .2.1.- Anafilaxia sistémica Dasiva (PSA) . IV.I.2.2.- Anafilaxia cutánea ~asiva APRENDIDO Y’ ‘N~., Au¶sI~d~d Respuesta A } neuroendocrina o Fig. 1.-Representaciónesquemáticadel procesointegradode respuestadelsistemasepto- hipocampofrenteaunasimaciónambientalnueva. IntroducciÓn. 7 la que el individuo no sabe reaccionar y se origina entonces un fenómeno de inhibición del comportamiento, con lo que se encuentra en una situación de máximo estrés en la que mantiene todas las defensas preparadas, y con un nivel de ansiedad máximo acompañada de una sensación de desamparo, si es que puede admitirse este sentimiento en los mamíferos inferiores (GRAY, 1982). El sistema septo-hipocámpico es esencial en este tipo de reacciones. En la Fig. 1 se representa de un modo integrado todo el proceso hasta aquí descrito. Por otra parte, también consideramos oportuno resumir en la Fig. 2 las interacciones a nivel de SNC de un roedor, con indicación de los neurotransmisores implicados en determinadas vías. Este esquema nos permite representar mejor las dianas de los sistemas monoaminérgicos y la intervención de algunos fármacos. Ideación to NEOESTRIAD Motivación 000<’ lón STQP motuái -r IOIDES Fig. 1.-Esquemaque relaccionadiferenteszonas de la anatomíadel SNC murino con su funciónprincipal, indicandolos neurotrasmisoresimplicadosencadacaso. Memoria Atención BZD GASA DA T-DOR Agresión HPF HPT IntroducciÓn. 8 Por último, en cuanto a ¡avía eferente de este complicado sistema neuro-humoral, se articula sobre el eje hipotálamo-hipofiso-adrenal, y sobre respuestas mediadas directamente por el sistema nervioso autónomo. La regulación del control de ACTH se realiza por una doble vía endocrina y nerviosa (FORTIER, 1951) y, más recientemente, se admite una doble vía para el acceso de los estímulos productores de estrás a nivel neuronal en las células liberadoras del factor estimulador de corticotropinas, o células CRF- érgicas: la sistémica y la local. Estas células CRF-érgicas se distribuyen por todo el SNC, pero se concentran principalmente en la parte medial y rostral del núcleo paraventricular dei hipotálamo. Este grupo celular es el implicado en la regulación de la hipófisis. El factor estimulador de la liberación de corticotropinas . En el caso particular del shock térmico, la inducción de las proteínas coincide con la adquisición de tolerancia a temperaturas más extremas, aunque existe ¡acreencia de que en la termotolerancia podrían intervenir también otros mecanismos (LINDQUIST, 1986), puesto que hay casos y circunstancias en los que la inducción de termotolerancia no se correlaciona exactamente con la aparición de las PSTs. Estudios de este tipo se han realizado, bajo muy diferentes condiciones, con células de mamífero (LI, 1983; LI y LASZLO, 1985; LI y WERB, 1982) e incluso con ratones vivos (LI y col.,1983). Un sencillo experimento de letalidad termo-inducida demuestra la participación de las PSTs en la protección frente a temperaturas elevadas. Basta establecer dos lotes iguales de cultivos celulares u organismos sobre los que ensayar el fenómeno: uno de los grupos se somete a una temperatura extrema y se mide la cinética de la letalidad; en el otro grupo, se induce a síntesis de PSTs sometiéndolo a una moderada elevación de temperatura para, despues, someter a dicho grupo a las condiciones extremas del primero, con el fin de valorar -en análogas condiciones- la cinética de la termo-letalidad. De este modo se comprueba si existe o no un significativo incremento en la supervivencia de los animales. Esta cinética de inducción de termotolerancia coincide con la cinética de síntesis de PSTs y alcanza su máximo cuando se llega ala plataforma de acumulación de la PSI una integración de la información sensorial; b) un aprendizaje; c) una planificación del comportamiento; d) unas respuestas motoras; ye) un ajuste neuroendocrino. Todo ello nos ha de servir para mantener nuestro equilibrio en la continua lucha por la existencia. En el sistema limbico cabe distinguir dos partes, como se explicó anteriormente, según que la respuesta afecte a la parte media del cerebro (“limbic midbrain system’~ o a la parte anterior (“limbic forebrain system”). En el primer caso, a través del sistema activador reticular ascendente (SRAA), se desencadena una reacción del sistema de vigilancia o alerta general cuando se percibe un estímulo que puede ser significativo para la supervivencia. Dicho estímulo puede ser nocivo, amenazador o de recompensa, pero la atención o curiosidad y viveza para la acción de responder se incrementa cada vez que este se produce. En cada caso, los sistemas fisiológicos de acción subordinada que IntroducciÓn. 17 conllevan estas respuestas están activados, principalmente, a través del sistema nervioso autónomo. Si esquematizamossegún SMELIK <1987) los distintos acontecimientos involucrados en una respuesta de adaptación a un estímulo que surge del medio (Fig. 3), habremos de distinguir, en primer lugar, el efecto sobre el SRAA por lo que en terminología sajona se ha dado en llamar “reaction arousal” y que no es otra cosa que la respuesta primaria del estrés; ésta equivale a la reacción de alarma citada por SELVE (1 950) y es una respuesta Medioambiente: SI luselon eompr@m.tldt qn d.B•na.d•aa IIfi& ng.yt •eflsI Alerte activa Sist. reticular activador 1 Sistema de vigilancia ‘1 Respuesta neuroendocrina Sistema hm bloc 1 Sistema de valoraclon ACABADO AOECUA •0 11w. r.tti.rzm t•tsIs. Fig. 3.-Representaciónesquemáticade los diversas acontecimientosinvolucradosen respuestasde adaptaciónaestímulosmedioambientales. no condicionada, próxima a los reflejos orientativos de PAVLOV. Según esto, dichas reacciones de alarma forman parte del comportamiento diario y no constituyen una Expecta- tivas1 Inseguridad ansiedad IntroducciÓn. 18 reacción de emergencia sino una respuesta de reflejo adaptativo primario a señales biológicamente significativas. Cuando se percibe una de estas señales se hace preciso iniciar una respuesta; para ello, el animal evaluará la situación antes de decidir el comportamiento a seguir. Dicha evaluación tiene lugar en el sistema limbico anterior del cerebro, donde se compara la nueva situación con experiencias previas y se cuantifica la significación del estímulo examinando en paralelo la información previa almacenada y los nuevos datos (SOKOLOV, 1963). Entonces, el hipocampo recibe la información almacenada en el lóbulo temporal (“recuperación de memoria”) y suministra un mapa espacial que, orientado sobre el medioambiente actual, permite tomar decisiones o hacer predicciones acerca de la expectativa de acontecimientos. Cuando la sensación es de seguridad o tiene un sentido de provecho, la reacción de vigilancia o alarma se extingue y la respuesta de estrés desaparece; por el contrario, si la expectativa es incierta o inquietante, o incluso negativa porque un daño cierto existe, entonces la reacción de alarma se mantiene y avisaré de que deben tomarse acciones defensivas frente al nuevo acontecimiento. En esta planificación de la respuesta del comportamiento, el lóbulo frontal, que también puede ser considerado como del sistéma límbico puesto que existen importantes conexiones directas entre el córtex pre-frontal y las estructuras límbicas del cerebro medio, es capaz de integrar y controlar todo el proceso informativo, estableciendo una asociación entre el flujo de información sensorial y la carga emocional desde las breas del sistema límbico. Una vez juzgada la situación real, se toma una decisión sobre el comportamiento a seguir para eliminar el peligro o daño inminente. En esta disyuntiva de realizar o evitar un enfrentamiento, la amígdala juega un papel primordial. En las situaciones de enfrentarse a un nuevo acontecimiento inesperado, también puede suceder que no se encuentre una respuesta adecuada o que se bloquee la capacidad de respuesta <“sensación de desamparo’j. En tal caso, según GRAY (1982), se Introducción.19 produce una inhibición del comportamiento o congelamiento (“freezing” para los sajones) en la que como decisión preferente se adopta la de no hacer nada. Esta estrategia obedece a una actMdad del sistema septo-hipocámpico y se caracteriza por el mantenimiento de un alto nivel en la actividad del sistema de alarma o vigilancia, con una marcada sensación de alerta y anticipación de la ansiedad. Con ello, todos los mecanismos de defensa permanecen en situación de alarma, el estado emocional es tenso y ansioso, prevaleciendo la sensación de desamparo. En la actualidad esta situación es considerada como la de máximo estrás en un individuo. Según LEVINE y cola. (1978), es posible salir de esta grave situación mediante un comportamiento de adecuada serenidad que facilite la desaparición de la ansiedad; con ello se extinguirá la reacción de alarma y se atenuará el estado de activación neuroendocrina. Este comportamiento significaría que se ha producido una adaptación adecuada mediante un comportamiento competitivo. Eventualmente, esta capacidad de competición reduce las consecuencias patológicas de las situaciones de estrés; por el contrario, actitudes de conflicto, desamparo y frustración agravan profundamente los síntomas del estrés. Ante esta problemática, resumida en la Hg. 3, parece claro que el sistema límbico es esencial para controlar la adaptación al medioambiente, no sólo en cuanto a la participación de las estructuras cerebrales afectadas por los mecanismos específicos de la adaptación sino también en el sentido de que las respuestas emocional y de comportamiento son fundamentales para conseguir el éxito en la adaptación al medicambiente. En cuanto al ajuste neuroendocrino que permite completar esta adaptación al medioambiente, iniciada mediante la plasticidad del sistema neural, se realiza a través de una red de señales que ponen en marcha una serie de cambios químicos y morfológicos en determinadas poblaciones de neuronas y células gliales (Fig. 2) en las que se plasma la respuesta adaptativa del cerebro. El sistema endocrino está estrechamente regulado por Introducción. 20 el cerebro, a través del hipotálamo y la hipófisis; debido a esto, la interacción recíproca entre hormonas y cerebro proporciona una ruta por la que pensamiento y emociones pueden influir en la secrección hormonal. Es decir, que los sistemas nervioso y endocrino, a través de sus complejas interrelaciones, consiguen queel comportamiento, conocimiento y afecto puedan influir en la estructura y función del cerebro. Los ejemplos más significativos de la interacción neuro endocrina son concernientes con aquellos acontecimientos de la vida animal asociados con el ciclo actividad-sueño y con la acomodación del comportamiento a experiencias vitales de tensión. El eje cerebro- hipofisis-suprarrenales juega un importante papel coordinador de la actividad diaria en acontecimientos relacionados con el ritmo vigilia-sueño, y en aquellos que median en la capacidad del animal para soportar las situaciones de estrés. Mc EVEN y BRINTON <1987), al revisarlos fenómenos de activación, adaptación y atrofia dependientes de la acción de esteroides adrenales en el cerebro, resaltan la existencia de procesos fundamentales en el eje hipófiso-adrenal, como son las variaciones diurnas en cuanto a secrecciones y un efecto estimulo-dependiente que se produce durante actividades inducidas por situaciones de estrés. Cada patrón de comportamiento permanece asociado con diferentes efectos de la secrección adrenal sobre el cerebro y da lugar a resultantes de activación o de adaptación. Durante el ritmo diurno de secrección adrenocortical, los glucocorticoides ejercen efectos activadores que se sincronizan en el cerebro para mejorar algunos aspectos específicos de la función cerebral. De este modo, el ritmo glucocorticoide sincroniza los patrones de secrección del ORF y AOTH que, a su vez, controlan la producción de esteroides adrenales , desplazándose este máximo de actividad en unas 12 horas y apareciendo el óptimo de la función sináptica durante el periodo del sueño E ~H OU o “.~ 4 u) e 04 0) “.4 C E ‘o ~4 .,.4 ~ v n u ’o ..r4 It 4 O O ‘-4.0 u) it $44 •rl“.4 ‘‘III itU“-4‘44‘-4U0>04u)ci> e‘o O “.4 C itu ) H O OnO itt 4 -4 k it o a)te O> u C “-4‘a it U rd C a> ~ ‘o’d’d it it -.4 -.4 -.4 — 4 4 0 4 W “.4 $4“.4 C 6) t,6 )4 O $4 ‘‘L IIite-.4(u ¡ e ¡ 6)$4‘ait$4Oz u)o‘ait.0$44$46) 0 0 4 .,.4 u) 4 0 iteb’$4 C — 4 ‘d o a> ,~4 itE O — 4 4 u) it “.4 e II o0> “.4u)oLOdu)0>u)o-4E‘.44u)a> 6 ) 4 ‘H e itit Etit « 2 ~ ‘O $4 “-4 C ~ e 0 V -4 ‘0 O r4 ‘U —4 d o 0 W 4 4 it u) “.4 0 u)-n o ~ u) --4 it E “.4 $4 4 — 4 4 .C 6) it 6) --4 e > C O I~ H ’a III b it ite--4 ¡ eo4o‘-4 ¡ 0)u , it «a -4 $4 t1> o 4 3 4 e O it$ 4 E u it .r4 u e‘O -414-4 -.4 -4 4 e U d ita > itC $ 4 C 0 b ~ “.4 “.4 ‘ d C J ~ 6 ) O E 6)’d 0 0 > 4 U u) it .1 .4 it “.4 U 2’d H O it (U 6) cl> “.i . 0 k O C $4 <2> 6) d v ~ 4 4 .0 04”.4 44— 4 -4 it u $ 4 ’U .C u e w e e e w 0 4 H H H 4 III b it o.43ea>“.4Eit4$4o04Eou O“.444oItoU$4o4O 6) 4ea>“.4 C E V it -4 4 0 $ 4 it o > 0~“.4 E 4 0 0 a)4eitu.r4 44“.44.>it$4tiitE it a>> .4-’ --4 u )4 --4 0 m a>—.4 —46) o‘d d e 0 ) 0 V tl.r4 “.4 C~-4 O 6) “.4 C $ 4 0 6 ) 0 4 d 4 6 )1 1 ite--4Eit04o u-40)ECf)6)‘do‘U ¡ itu ¡ 44‘Uo.4’ Introducción.25 0)‘aO)ite-4$4uo‘Ueci)o$4a>eu)it4u)a)04u)a)$4u)it‘-4e6)u)ou-.4ti$4 ‘4)e“.4EitoeoEu)itE0)41)2 “.4(au)o— 4 6) 0 ) 4 ‘d e0) CU d it0 4 0 •A --4 u ’d - 4 6 ) $4it— 4 0 4 it‘O H uit -.4 0 4 ‘ c d itt E 4 it ooH1-4 u,H1)2o1-4 u(12 Hti)(12zoHti) 2 La intervención del sistema dopaminéraico en los fenómenos de adaptación, resulta algo más compleja, puesto que se puede considerar dividido en varios subsistemas. Entre ellos, las neuronas mesolímbicas y mesocorticales son las que más participan en los procesos de adaptación; las primeras, en los procesos de estimulo compensatorio o gratificante y también en todos aquellos comportamientos motivados hacia algo positivo cuando tiene lugar una administración de glucocorticoides exógenos (ROJO y col. 1984), dependiendo de: a) las características de la molécula para un huésped determinado; b) la dosis y el momento de administración del esteoride, que influirán en la magnitud y dirección de los efectos inmunofarmacológicos; y c) el parámetro inmunitario que se controla en cada órgano particular. Así se ha observado que la dexametasona puede producir en la formación de células sintetizadoras de anticuerpos, unos efectos supresores o estimulantes dosis- dependientes, según que se trate del bazo o de la médula osea y de glucocorticoides, puede originar efectos inmunosupresores, que van acompañados por la involución del timo, bazo y nódulos linfáticos, junto con una apreciable leucopenia 0> e‘0 0 .r4 u> o c Ita , $ 4 0 0)u> . 0 0 > -d ~ r-4 u> u> U > 0 0 0 C t’0 4 o > It$ 4 014-4 0) ‘ - 4 V ~ 4 -> $ 4 0 e 0 74 It It4 > 1 It zu>ItH‘-4‘o>o < d a la ) 0>4~>b1 ~ C ~ O ’tiV It 0>4-> It .r4 ..4 .74 fl U >, t E •~.4 t 0 e o E - It -4 $4 u> >~O o o> It 0 ‘~ -~ 4->74 .~4 O e ~ It C 4->4-> a ,O o> ’74It-74 4-4 $ 4 C $ 4 O C ‘do> 7 7 4 u> .7 -4 a) 7 -4 ‘ti $4 .~4 04 1~4C e u > e ‘o ‘C a ) < d V .r4 •-4 $ 4 4 -> -4 U 0 0 u > O u > It •74 t 0> -74 0— 4 ,C It ~,Q 4-)c -4 - 4 0 4 . 7 4 0 U .C ’d u > g 0> S-4 O> 0> C 44~74 H E $4H rz~ o ea,004 .74z1--E z u> oo 04->4-> 4-) .r4 -H c274 o o 30 ¼ , >,G> ItC u> .74 a, 0 .74 Ci) ‘U ~2 0> 04 u> .74g o > It C ’tir-4 H 6> o> > 1 fl u) o O u>4-) C .74 ~‘ a> ‘O O ‘d E -74 0 4-4 6> 0 4 . ) ’ o $4 Itw $ 4 C > $ 4 Ito C o> E < e H :2 E ‘--4o> ti) ‘U eP-. a ,I.~ a) ‘d e Itu > ‘O ’t O .74 It It 04 O ~d -4 $4 C It ~74$4 <1) ‘0 — 4 0 It ~ .74 ~ .r4 4-> 0 O C >~ 74-74 •74 It 0 04-> ,0 $ 4 4 -) O C -74 0 ’O 4-’ ~ j e C o> ~7474C > H ’ti U -4 ’U ea)o04 .74E-4 u> u > o u > 0 4 -) 0 4-> .7.44~> .740 0 0 0— 4 4-4e c u > -74 It It ~$4E 0 ¼ , Hrz~2 ‘O Id .74o ‘U ‘dIt 0 0 4-1•74>4 -o ‘ d O .7474 o ,0 $4 ~d>>1 I t ~ It.4->It u>0 > It 04u> u>a) $404ci) o> 0, ‘O.74 u> u> 0 ItO It~ 4 -> -4 a, .74 E o O .74 $4 4-4 4-> e <1) o> .74 u>oU.74e‘74$4Ituu> u>o4-> .74oo4-4e.74 u>od i It ‘4-4‘O$4oItE eo>o.4->eo>Eo>-404Eo0-4a) ‘tiu> .74<1>a) 4->e.74u>Itu >e a ,It 1eb u > .74 0 04-> It -.4 .74 0 0 0 u>Oo.74e‘744 -> . .74.74 2ouHuHH IntroducciÓ n.46 u.74U) .7.4u> -4a) ‘Ue‘O.74ue‘4-4It-4eo>u>o4.)uo>‘4-4rz~ U) t i ) 01-4 tz % u 2I—1 oU)1--E u)o2 LI>Ite.74EIt -4oua,4->ItuIte.74 -4ou-4.744)a,oIt$4o04It‘ticd.74‘Uo>Ee‘o.74oIt-4‘tioEo11-4 I-4 1--E las diversas citoquinas recombinantes obtenidas por ingenieria genética 1.3.3. Neuropéptidos oploldes y respuesta Inmune en sItuaciones de estrás Existe evidencia de que los péptidos opioides no son únicamente una clase distinta de neurotransmisores, como en principio se creía, sino que intervienen en otras muchas funciones fisiológicas cuyo mecanismo de acción no está aún perfectamente conocido. Las dificultades para su completo conocimiento radican en que algunos péptidos tienen una cinética de acción lenta o retardada en cuanto ala transmisión de su señal (IVERSON, 1984), que existe confusión o errores en las distintas localizaciones de un péptido y sus receptores específicos (HERKENHAM y Mc LEAN, 1986), y que muchos neuropéptidos coexisten con agentes neurotransmisores clásicos en neuronas individuales ; y dicho efecto particular será revisado con más detalle en el apanado que sigue, por sus implicaciones con la anafilaxia y el shock endotóxico. 1.4.- NEUROINMUNOMODULACION EN CUADROS DE HIPERSENSIBILIOAD Y ANAFILAXIA. SU VANiACION EN S[TUACIONE8 DE ESTRES. Las distintas respuestas de un organismo sensibilizado, frente a un antígeno sensibilizante, pueden ser agrupadas en cuatro tipos diferentes de reacción dependiendo de: a) el intervalo de tiempo entre el momento de sensibilización y la aparición de los síntomas; b) la naturaleza humoral o celular de la reacción inmunobiológica; y c) las dianas celulares o tisulares involucradas en el proceso reactivo. La diversidad en cuanto a mecanismo, diana biológica y tipo de reacción se resumen en la Tabla III, aunque sin descender a los detalles más íntimos de cada proceso, puesto que nuestro interés se centra fundamentalmente en el fenómeno anafiláctico y en la posible respuesta inflamatoria subsiguiente. Los mecanismos de interacción neuroinmune en dichas reacciones están aún poco aclarados, y particularmente aquellos en los que un mediador es capaz de estimular o IntroducciÓn.51 ‘4—E$4< 4 0 ti$ 4 .7.4 0 ‘-4 0 o ,4 titi (40<4 ‘4•00 H E O-44) u <4 0 $4 ‘0 .4 0 0 -e — ’ ‘0 0 :3 $4 0~..E O 4> ti $4 ti 4 > 0 $ 4 0 . d‘o • . ‘-E ~ U 1 4 1 -O S — .4 u 4> — -e e 4.4 4 > 0 E E •.-, O 4> W 0 ~ ~-4— 40 0. .-4 n E 4> O . u ~ 0 . 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O.7 .00O-Eoti(o .4u ) o D n ia p u flu ; o u a S — p u u t~ ~ ;sendsa~ j IntroducciÓ n.52 0 0 “ti O c ‘C O Ci ,.4 4> 0 . $ 4 0 ,e U .> 0 0 o u> 0 O ‘0 -4‘-4 4 -’ u > .4C o 2u ) c i, 04u ) 0 . 4 -. u ) <‘4 oci’o0 . -4C o <‘4 $40 ‘4.4 $4 0 0 era. 0 4 > -E V ¡ :3 ¡ $ 4 0 ¡ 0 0 S S o ~7. -4 :3 < 5 0 . -44 > 0 O c io ‘0 .4 0 0 .> 0 0 .4 E ti .C 0 0 0 0 4 0 ‘C $4 0U 0 .4 ‘4 0 w U 4 > ~ 0 .4 ’C 0 0 . ti> ‘0 — 4 0 ti 0 0 . tU ‘0 o,4> 0 0 .1 4 $4 (4 0 0 .0 4 4 $4 4> .74 4 > .4 $4 -E ‘44 0 ‘— Ci (oOU.4O‘.4-4U0 0 0 0 $ 4 U 0 .4 0 0 .. :3 0-E u .> u 9 U 0 T A 1 8 2 u T anb e o ¡ u s w a ~ inhibir la formación o actividad de otro, que también participa en la reacción inflamatoria o en el cuadro de shock por anafilaxia. Una reacción de hipersensibilidad es un proceso dinámico en el que el conjunto de células y factores que intervienen cambiacontinuamente. Como puede verse en la Tabla III, las reacciones de hipersensibilidad, tanto la inmediata como la retardada, pueden ser transferidas a un huésped no sensibilizado mediante el suero , estudiando distintas reacciones de hipersensibilidad de contacto, encuentran que un aumento en el nivel plasmático de corticosteroides, producido por distintos mecanismos de estrés como inmovilización, calor o frio, tiene distintas resultantes según que el fenómeno se mida como una hipersensibilidad retardada frente a hematies de carnero o como una respuesta de sensibilidad de contacto a dinitrofluorobenceno. IntroducciÓn. 53 En relación con los neuropéptidos parece que existen más antecedentes relativos a los efectos neurales directos e indirectos sobre la expresión de respuestas de hipersensibilidad inmediata. Se ha comprobado que las endotoxinas estimulan la liberación de ACTH y 13-endorfinas, y existen indicios de que la hipotensión, subsiguiente al cuadro de shock endotóxico, es parcialmente debida a la participación de endorfinas . La liberación de histamina, que también es producida por otros neuropéptidos procedentes del sistema nervioso periférico y del sistema nervioso central y el factor activador plaquetario (FAP), y por ello necesita altas concentraciones locales para producir efectos significativos “in vivo”. El metabolismo de la histamina es rápido y en él intervienen una metil-transferasa (existente en monocitos) y una monoaminoxidasa que la transforma en 3-metil-imidazol,5-acético; sobre la histamina restante actúa una diaminoxidasa (histaminasa, existente en neutrófilos y eosinófilos) que la convierte en imidazol-5-acético y después en ribosilimidazol-5-acético (PLAUT y LICHTENSTEIN, 1978): todos estos metabolitos son rápidamente excretados por via urinaria. La importancia de la histamina en fenómenos anafilácticos sistémicos y localizados varía extraordinariamente en función de la especie animal de que se trate. Así, por ejemplo, los ratones son bastante resistentes a la acción de la histamina, en tanto que los cobayos son muy sensibles. En humanos, la histamina juega un importante papel en las respuestas edematosas de la piel y en rinitis alérgicas, que responden perfectamente a los IntroducciÓn. 55 antagonistas H1, mientras que son inefectivos en asmáticos (PARKER, 1980). Esto hace pensar que, en este último caso, existen otros mediadores más importantes como sucede en cuadros de anafilaxia sistémica (SMITH y col.,1980), donde es posible que algunos efectos de la histamina estén asociados en parte al de otros mediadores, incrementándose la síntesis de POE2 y POE2, que son más activos como broncoconstrietores que la propia histamina. También en los fenómenos anafilácticos producidos por activación del Complemento, se produce liberación de histamina por efecto del los fragmentos C3a, 04a y C5a. Los diversos efectos de la histamina estan condicionados al tipo de receptor sobre el que actúa; así cabe distinguir la actividad sobre vasos sanguíneos y piel, durante las reacciones de hipersensibilidad inmediata, que son efectos de carácter pro-inflamatorio y dependen de receptores H, . En general, podemos afirmar que los opioides endógenos juegan importantes papeles en una gran variedad de parámetros fisiológicos entre los que se incluyen: regulación del dolor, apetencia alimenticia, balances hormonales y respuestas al shock o al estrés, Sin embargo, el empleo de agonistas o antagonistas no siempre facilita una información cierta por la complejidad de interacciones con otros sistemas (WILSON y col.,1980; VARBROUGH, 1983), puesto que la función opioide ha sido citada en otros muchos tejidos no neurales son muchos los signos y síntomas que pueden observarse en la fisiología normal del ratón morfino-dependiente, pero para sistematizar su intensidad, quizá sea lo más adecuado cuantificar la respuesta durante el periodo de hipermotilidad, particularmente en lo relativo al número y categoría de saltos en el síndrome de abstinencia, como la mejor medida cuantitativa de la adicción opiácea en la rata (BLASIG y col., 1973) y el ratón (HO y col., 1972), por existir una relación proporcional entre el número de saltos y el establecimiento del síndrome de abstinencia en función del grado de dependencia M cna ’ d r-E o — a, -41 W U 2 54-a U) o e --4 .7.4 ,C ti — .7 -4 U ” e a , m e “a~ o ca0 e e ‘o it r-4 “e O~ u d a , :1”e a’ e5-4 .74 it E 4 m a’ a,n. .74 54 Z a’ ‘a “a -~ o “e ‘— ~ -> .74 C — 4 0 W O r-I 4 E IJ ,Q 0 .r4 ni ~74 1 e.74<>2 .74 “eo1<>2o-4 -4o04 oeCidi ‘o4-’it04a)4ea,O’‘TIe‘:1dia,a’ 7-4ooa, -4 -4a) “ e ’ <“it “e s.’ .74 4 .74.74 .74a’ea)a’54a,04 .74“e o4uu e it a )a ,e ““‘o.74 e o ‘o -o -74 0 , uCi)it C n t O it -E J”e e5-E a, itm a’a,eo4it a)-4“-4a) -4o , S I H a )— .74ee ’ ti)a’a)eo.9-4 oua, ‘4-4e.74a,> 9 e.74u,.74 <0ea)di -4->it it0 4 4C e a, ‘~ a’O-4“-4o04 — Eoua ,— — 4 —4a, “ait“a.74 7.-E .74 .74a’ea,a’5-Ea,04 .74“ea) “a — .. ‘o.740 (3 1c12 e.74 - .74 0 0 — a’o5.4ti)e5-Ea)E-E a’ 5.4 C i, o o it -4 ”e .4-’ < ~ .74 e 0 t a,$.404 --~E a’ ~ d o W it -4 -lo e .74 0 u-’ S-~ 4 ura ‘TIe.7.4 4-’ eou a, a . 54 En • r- ú .6 ) o o o r~ Ú o, O O O’ 0 ,,r-~ O O ’ o a ~ ita o, QN C a < d r-, o r-- 540’ C a ’ Q N ~ ‘ Q N QN -H U)”74 ~ r.4 C i-4 W H ~ “e ~ j ~ r-4 .~ r-4 U ) 4 )~ 0 ~ ~ “e ’— O a’ ,4 -n —4 a’ e ‘ 4.) un ~ > it ~ o t» un :1 Ci .74 Ci O ~ “74 U) it 04 ‘~ e ’ h -a ita ’ a’ u a, it “e O O o’ o “a ti U ~t ~ e 1-E e 0”74 o ca 0 . ni “e o it U un >9 0 -H a’ ni - a’ ni 4-> - 6) .~ “k~ - ~ W U) C m d O 0> 0 . a’ 6) 54 04 C ”e a).74 4 U) e ‘4>It ~ J U) ~ C 5 4 -74 “e m a ) b’”e ~ e 74 0-74 a’ e O’ a’ O 4 < » -H 0> it O’4— E -H si m o unC <» 4 .7 4 <>2 It a )n i a’54 U) t ni ‘ - 4 4 -d 4 ‘4> a e ~ u, . 1 W 6) U) .~ 0 4 O ’ it U) 0 a ’ e 4 ‘o 4 0 0 ~ .7 4 4 <~>9 -74 ‘0-74 it >9 oC> >9~74 Ci 6 )5 4 0 0 4 5 4 •74C 1 U)”e 0) 0 0 :151 “e e E It P a ’’ 4 ) <>251 ~ .7 4 E ni ~ e e’i, 74 74H nia>4-d 6 )0 -7 4 0 -74 .74 C -7 4 0 -74-4-4 it E 54 0) “74 ‘5 4 0 4 54 5-< ~ 0 > ”e -4 E-74 E a’ 04— 4 E 5 4 0 4 0 04”e 04 <>2 ~ 04 C n5.4 a’ •74 W U ) C W 54 ~ C 74 ~W -74W -74 O 0 0 ~ U )04 ta 0 4 (12-74 (12 Q ~ -74U ) 0 0 4 ~ un~r74 U) — 4.. 54 i t ” ‘a a a’ LE, a’ ~ e a’ a’ a’ ita it 6) Ci U) U) a’ <2> <2> ~ o e ni e 05-E t e e e ~ ~ O O 0 0 0 0 ~ 54 4 4 4 ~ d it O 4 1.) 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Dichos mediadores afectan a la permeabilidad capilar, permitiendo el influjo de proteínas sanguíneas en tejidos adyacentes, con el consiguiente desequilibrio osmótico y edema tisular. En la piel, esto se manifiesta por la formación de un habón urticarial y eritema; además se producen contracciones en las fibras musculares lisas y secrección de glándulas endocrinas. En estos casos la reacción se produce en segundos y tiene una duración relativamente limitada. En otros casos, sobre todo en los de anafilaxia pasiva de tipo sistémico, pueden también originarse una serie de reacciones secundarias con participación de otros tipos celulares (eosinófilos, neutrófilos, plaquetas) que liberan factores quimiotácticos de eosináfilos (FQE-A), para atracción de neutrófilos (FQN), para activación de plaquetas . Existen diversos modelos de interacción anafiláctica en los que sepuede comprobar la respuesta total o evaluar el nivel de los distintos mediadores que intervienen (BROCKLEHURST, 1960). Según WEISER y col. (1941), los ratones son relativamente resistentes a sufrir un shock anafiláctico. Teniendo esto en cuenta, la anafilaxia cutánea pasiva (PCA) ha sido la más ampliamente utilizada para reconocer cuantitativamente anticuerpos homocitotrópicos (OVARY, 1958>, mientras que para reacciones cualitativas de este tipo de reacción se requieren procedimientos más especiales y algo más tarde el de ALEXANDER y col. (1925>, en el que también se acudía a producir el cuadro anafiláctico en cobayas sensibilizados mediante inhalación del antígeno específico, pero en ninguno de los casos se realizaban estudios cuantitativos ni se llegó a controlar la liberación de mediadores en la anafiláxis bronquial bajo estas condiciones experimentales. La naturaleza y actividad de dichos mediadores han sido estudiadas posteriormente y, en particular, para la histamina (BARTOSCH y colA 932) y distintos metabolitos del ácido araquidónico (BROCKLENHURST, 1960; PIPER y VANE, 1969; HAMBERO y col., 1976; ANDERSON y col.,1 983). Más recientemente se han IntroducciÓn, 69 propuesto diferentes modelos de hipersensibilización pulmonar, en ratones, que pueden dar lugar a una reacción anafiláctica por inhalación. Entre ellos, mencionaremos en primer lugar el de McKASKILL y col. (1982), en el que por vía nasal se produce una hipersensibilización con polen de gramíneasy después, por la misma ruta, se desencadena la reacción anafiláctica con el mismo alergeno. Sin embargo, como en estos casos se originan inflamaciones inmunológicamente inespecíficas, aunque localizadas en vías respiratorias altas, el modelo no es recomendable para estudios farmacológicos por la propia complejidad del material biológico. Estas dificultades han conducido a otros investigadores que tenian idéntico propósito de sensibilizar animales a nivel bronquial, a la utilización de aerosoles de ovoalbúmina como agente sensibilizante, en cuadros de hipersensibilización pulmonar experimental en cobayas, (HERXHEIMER, 1952) y en ratas y como fuente de anticuerpos homocitotrópicos, emplean líquido ascítico conteniendo anticuerpos anti-BSA procedente de ratones que han sido inmunizados por vía intraperitoneal con BSA más coadyuvante de Freund completo; para ello utilizan el método de TUNG y col. (1976), en el que se modifica un procedimiento de MUÑOZ (1957). En todos ¡os casos, el máximo de reacción se alcanzó a los 15 minutos de administrar el antígeno Y ÉSTRES Niveles séricos do C’ortlccsterona 4, 4, MO DU LACIO N FARMACOLOGIGA 7. Adaptógenos 8’ Antihistamínicos 2. Inmunomoduladores 4. Otros Fig. 9.-Representaciónesquemáticadel desarrollaexperimentalde estetrabajo,y de sus objetivas. ESTUDIO DE MODELOS AISLAMIENTO HACINAMIENTO INMOVILIZACION Objetivos.78 ¡u. MATEMAL Y METODO& 111.1.- MATERIALES Y MEDIOS. lll.1.1.-Arilmain La mayor parte de los experimentos se han realizado sobre ratones BALB/c (Interfauna Iberica SA.), de 8-12 semanas. En ocasiones, estudiamos comparativamente las respuestas entre animales de 8 y 36 semanas de edad respectivamente. En ensayos previos sobre variaciones de respuestas condicionadas por la estirpe murina empleamos otras razas de ratones consanguíneos, cuyas características genéticas también son perfectamente conocidas, como los C3H y C57B1/6 (Centro de Investigaciones Biológicas y Centro de Biología Molecular) , lecitina obtenida a partir de Cannavalina eusiformis por Calbiochem . 4/ Como moduladores de la respuesta inflamatoria se uilizaron: antiagregantes plaquetarios como Tictopldína , igual que para la determinación del tiempo medio de muerte (TL50>. M. y Métodos. 88 lll.2.7.-AnalilaxIs cutánea pasiva (PCA) Después de algunos ensayos previos en los que se tuvieron en cuenta los resultados de PROUVOST-DANON y col. <1967) se ensayaron dos métodos de sensibilización pasiva: a) procurando una sensibilización de piel entera mediante una inyección intravenosa de los anticuerpos sensibilizantes, es decir; lo que constituye la propia reacción PCA de OVARY (1958); y b) por sensibilización de areas localizadas de la piel inyectando intradérmicamente los anticuerpos para dar lugar alo que algunos autores prefieren llamar reacción cutánea pasiva reversa (PCR) o reacción revertida de anafilaxia pasiva, que más propiamente pudiera considerarse como un fenómeno de Arthus. También se provocó una sensibilización general mediante inyección intravenosa del anticuerpo (0.2 ml. de suero por vía retroorbital) para, 48 horas más tarde, inyectar el antígeno por vía intradérmica <0.5 pg de albúmina o 0.25 pg de endotoxina en 0,05m1. de PBS). De este modo se producen en el dorso de cada ratón unas lesiones intradérmicas en los lugares de administración del antígeno. Cinco minutos antes de administrar el antigeno, se inyectó 0,1 ml. de azul de Evans al 0,5% en PBS para hacer visibles los aumentos de permeabilidad. Aproximadamente una hora más tarde, tiempo suficiente para producir una reacción visible de anafilaxia cutánea, sacrificamos al animal para determinar el área de las lesiones en la cara interna de la piel. La intensidad de la reacción se cuantificó calculando la media geométrica de los diámetros de las distintas lesiones y determinando, después, las variaciones del % de respuesta para los casos de estrés, o por el efecto de los tratamientos farmacológicos, mediante la fórmula: = 100 - . Después se añadía el mitógeno correspondiente en volúmenes de 10 pl y las soluciones de fármacos a la concentración deseada en 20 Ml. En todos los casos se establecieron controles sin mitógenos. Los cultivos se mantuvieron 48 h en el incubador de CO2 a 37 0C, con atmósfera de 5% de CO 2 y humedad a saturación. Al cabo de este tiempo se añadió a cada pocillo un pulso de 3H-TdR <0.SpCvpocillo), y se vuelven a incubar las células otras 24 horas. Alternativamente se puede dar un pulso de 1 pCi durante las últimas 4 horas de esos tres días de cultivo. Pasado el tiempo total de incubación, las células se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio GF/A mediante cosechador automático para recogida de muestras múltiples. Los filtros con las células se transfieren a viales de vidrio para contador de centelleo líquido, se añaden 2 ml de líquido de centelleo, y se mide la radioactividad beta incorporada en un contador LKB. Las determinaciones se hicieron por triplicado, y los resultados se expresan en cada caso como c.pm. de 3H-TdR incorporada. Dicha medida da una idea exacta de la síntesis de ADN producida durante la proliferación celular. M. y Métodos. 90 lll.2.t-Enaayos de prollieraclán celular en placa. En ocasiones, particularmente en los experimentos de citometría de flujo (FACS), se determinaron las variaciones de respuesta linfoproliferativa sobre placas de microcultivo de 96 pocillos de fondo plano < 4 -’ e a, --4 a, 02 q~ O ti) Ci) 04 ~ a) 02 > 1 ‘0 Lo — a) a, o H o a> a) ‘0 ’0 02 ~ o It E ‘0 u -4 It ti 3.-’ u ~ C H ‘O It O a )a )a ) -4 C ~ 4 ~ 0 0 t’O ,e O ’ < ti-) .r4 a) 0 --lo U 2 4 a )U a ) a) 02•,-I “-4 H It$ 4 a,4-) d i-> IflH U dO It — ‘ 3.4 0 4 Itrlfl O U C a,5.4 .0o02IteItEa,02Itea,4 -). e 0 It‘0 < 0 2 ~ Itm -la , 4 4 -) ‘-a ) 02 ‘a > - P o 4 1 -) 0 2 ~ a ,a )“-fi ‘0 It4 023.1 a ,0 C o l “-4 0 O C ) It~ a) 4 -’’0 --40 2 0 2O 0 2 P d i-, 4 -)a ) C E --4 ‘It 4 -)P m d --4 0 4 ‘0 02 L o o d e a ,0 ’ O4 > , Cia,C q l ‘O rz~j0---4P ‘-4 4e It— rIO .0 0 2 d a ) E H 0 4 02 (‘4+ItU ) a,ti rlIteIta) It’d It ‘-4 ~r4’0 a, ‘0 u >.1~ ~-i ‘0 r-~ It “-4 , a )t ~ ‘0 e O -4 O W E U )a )0 2 a, 04-4 04 ‘0 a) $ -i’0 e d i ‘O 3-1 --4 o 0 1 0 o ‘e ‘-4 0 3-4 ..— o a) P H n H H e - C E 02 a, a) Ita ) + 3 02 ‘0c’~ a) It d o P 0 2 ’0 H 04 a) “-4 N P H a) 0 4 -4 P > 4 .0 , dos puntos con exceso de anticuerpo (relaciones AgIAc = 0,25/1 y 0,511) y otros dos más en la zona con exceso de antígeno a 60 a> c ‘4> 40 7 a> -c 20 o, E o 0,03 0.02 0045 0.09 r -— —r —r rozón L N del Ac ppdo Resultados.103 Realizamos curvas de precipitación en funcion de la dosis de antígeno para distintas toxinas (8. abortus, E.col¿ Y enterocolítica), como aparece en la Fig. 10 del apañado de métodos, seleccionanado la EDTX de Sabortus por presentar mayor precipitación de inmunocomplejos Vn vitro”. Hemos comprobadopreviamente las diferencIas detoxicidad de distintas moléculas endotóxicas sobre ratones BALB/c, C57B1¡6, y CSH; estos últimos, en principio, con una mayor resistencia a la acción endotóxica directa, tal como se resume en la Tabla VII. Los valores obtenidos en estos ensayos demuestran que, en efecto, el fenotipo C3H precisa dosis mucho mayores de endotoxina 16a0 >1600 >1600 1.-Las moléculas endotóxicas fueron obtenidas por el Dr. Ramón Diaz en la Universidad de Navarra. 2.-Valores referidas a ratón de 28 + 0.7 gr. e inyección i.v. de 0,1 ml. de endotoxina. Resultados. 104 mortalidad en los distintos grupos de animales pertenecientes a las tres razas de ratones seleccionadas en principio (Fig. 15). Así encontramos que la raza BALB/c resulta la más apropiada para este estudio, ya que las demás razas desarrollan TL~ excesivamente cortos para valorar variaciones posteriores (en algunas ocasiones inferiores a dos horas). Por otro lado, esta raza es la más sensible a las variaciones en la proporción Ag/Ac. Seguidamente, en el gráfico de la Fig. i6, se comparan los resultados de TL~ obtenidos en función de las distintas relaciones Ag/Ac, para dos grupos de edad (8 y 36 semanas) de ratones BALB/c, observandose diferencias significativas (p=0,05) entre las diferentes proporciones Ag/Ac para los ratones de 8 semanas. Los animales de 36 semanas presentaron una menoractividad inmune, con TL50 prolongado, mayor dispersión de resultados, y diferencias menos significativas para diversas proporciones de Ag/Ac. Estas variaciones pueden deberse a una disminución de la actividad inmune en los animales más viejos. A la vista de estos datos y dado que la , que constituye el otro modelo ensayado de inmunidad en animal vivo, se trata de producir anticuerpos dermo- sensibilizantes, y desencadenar después una reacción dérmica con el antígeno correspondiente. Empezamos por determinar el intervalo óptimo de inmunización con albúmina bovina (BSA), con objeto de obtener en suero, un nivel suficiente de anticuerpos reagínicos que permita desencadenar, posteriormente, la reacción de PCA. Para ello, se establecen diferentes intervalos entre la administración intraperitoneal de BSA, y la obtención del suero; estos sueros se emplean para desarrollar reacciones de PCA. La Hg. 18 muestra la relación entre los intervalos de inmunización, y las lesiones dérmicas obtenidas. De este modo, obtenemos un intervalo óptimo próximo a los 10-12 días, para las das razas de ratón ensayadas (BALB/c, C3H). Resultados. 107 % Mortalidad TLSO(horas) loo 80 60 40 20 o *2 15 12 9 e a o Fig. 17.-Estudiodereaccionesdeanafilaxia(PSA) producidasenratonesBALB/c paradossistemas antigénicos:homólogoBSA-antiBSAy heterólogoEDTX-antIEDTX. Se determinaTL50 y % de mortalidad. a, e •0 -~ .4 M ~6e e •~~10 a> o- 4— a o 2 4 6 8 10 12 Intradermorreaccián (mm) 14 03H ~BALB/c Fig. 18 .-Influenciadel intervalo deinmunizaciónutilizado para la obtencióndelantisuero(frente a BSA), en el posterior desarrollode reaccionesde PCA (piel completa).Se indican los diametrosdelesionesobtenidasparacadaantisueroen dosrazasde ratones. EDTXA ESA Resultados. 108 Después, determinamos el intervalo óptimo entre la administración intravenosa del antisuero y la intradérmica del antígeno (modelo PCA de piel completa), lo que señala la persistencia de los anticuerpos dermotropos ligados a los mastocitos de las capas epidérmicas lo lo 8 e 4 2 o lo Intervalo de sensibilización (dias) Fig. 19 -Variacionesen la reacciónde PCA en funcióndel intervalo entrela administracióndel antisuero(obtenidoen intervalo óptimo)y el antigeno;ensayadoendos razasderatones. M.DSÁwg/0.o2mm) Diámetro Lesión (mm) Minina Doala Sen. ~ Diámetro de lesión 12 - lo rB ‘-e -4u2 —-o Tipo de reacción y antFgeno Fig, 20 -Parámetrosde la reacciónanafiláctica(mínima dosis sensibilizantey tamaflo de lesión obtenida)paradosmodelosde PSA(piel completay reaccionrevertidalocal),condossistemas antigénicos(EDTX y BSA). 0 2 4 6 8 0,3 ó,25 - 0,2 0,15- 0,1 - 005 - o Pc EDTX Pc ESA Rr EDTX Rr ESA Resultados.110 0,1 ml de PBS o de 0,1 ml de suspensión de antígeno de Brucella produjeron leves variaciones sin significación estadística. La administración de antisuero frente a EDTX tampocoprodujo cambios estadísticamnetesignificativos. La disminución de corticosterona es menor aún, cuando se ensaya en un sistema homólogo sin intervención de endotoxina (resultados no mostrados). La estirpe C3H revela unos cambios similares. En su conjunto las diferencias no son importantes, y por tanto podemos descartar en principio desviaciones metodológicas significativas. Cuando esta determinación de corticosterona se efectúa en las reacciones PCA, también secomprueban ligeras variaciones, aunque de signo contrario atas anteriores. Por ejemplo, la inyección intradérmica de suero produce una discreta elevación en el nivel esteroide, que es algo más acentuada en presencia de suero de conejo heterólogo (Fig. 22); mientras que con la inyección intravenosa del antígeno se produce, en ambos casos, una disminución de la cantidad de corticosterona en suero. En situaciones en las que se produce la reacción PCA, se observa un aumento del nivel de corticosterona, que es transitorio, puesto que comprobamos su descenso a las 6 horas. En conjunto, podemos afirmar que para ambas reacciones, las variaciones en los niveles de corticosterona durante el desarrollo del modelo experimental son moderadas, y no muestran un patrón determinado. Aún siendo mas marcadas en el modelo EDTX- antiEDTX, carecen de significación; y por tanto no interferirán en las determinaciones a realizar posteriormente. Resultados.111 Corticosterona (pg/100 mi) 25 20 15 lo 5 o • p • n.a. entre 1a8 diferentes fases exoerimentales 20 - 15 lo 5 o Corticoaterona (wg/100 mí) Heteróloga (se/edt> Homóloga (sr/aib) Antigenos Fases experimentales n.a. entre las d¡ferentes fases ex erimentales Figs. 21 y 22 -Determinacionesde corticosteronasérica (COR) en cada una de las fases experimentalesde lasreaccionesdePSA (flg. 21, am%a)y PCA (flg. 22, abajo). Control PBS anti-EDTX EOTX PSA Fases experimentales Sueros Reacc.AF X Resultados. 112 IV.1.2.4. Perfil inmunolápico de la respuesta anafiláctica . Para comprender mejor las posibles modificaciones de respuesta anafiláctica durante las situaciones de estrés, determinamos las variaciones de diversos parámetros inmunofarmacológicos durante el proceso de reacción arialiláctica slstémica (PSA). Para ello, cuantificamos las respuestas blastogénicas mitógeno-inducidas, la síntesis de IL-2 y la actividad citotóxica de células NK Realizamos los ensayos en el modelo de reacción anfiláctica frente a inmunocomplejos anti-endotoxina de Brucella (aEBr) y Colibacilo (aECo) y frente a inmunocomplejos anti-albúmina (aBSA), en una proporción equivalente Ag/Ac. En estos tres grupos las determinaciones se efectuaron al cabo de 2 y 4 horas después de inyectar el agente desencadenante del posible shock anafiláctico. Los resultados obtenidos, en relación con la respuesta llnfoprolllsrativa, se resumen en las Figs. 23 a, b y c. Como puede verse, se produce una significativa estimulación de la mitogénesis intrínseca (PBS) en presencia de EDTX de Brucella (420% respecto a respuesta control, p=0.01). Este efecto queda enmascarado al estudiar la respuesta blastogénica en presenciade mitógenos (ConA= 11 O%y LPS= 132%; respuestas respecto al control p= n.s.) por la interacción de las sustancias activadoras de linfocitosTy 6 (ConA y LPS respectivamente). En el caso del sistema inespecífico de EDTX de Ecol~ frente a suero anti-Brucella, aparece un efecto mitogénico intrínseco menor (200%), presentando incluso una inhibición al interactuar con ConA (78%). En todos los casos de PSA, con utilización del sistema BSA-antiBsA, se observa una inhibición variable de la respuesta blastogénica, que solo es significativa en las determinaciones realizadas con mitógenos (ConA y LPS) a las 4 horas de desencadenar la reacción de PSA (Fig. 23). La actividad de células 1, valorada en función de su capacidad de producción de IL-2 en respuesta a mitógenos, se ve incrementada en ambos modelos endotóxicos (a abortusy Eco/O. Este efecto se aprecia a las 6horas de producirse el cuadro de PSA (con Resultados.113 3H-TÚR Inoorp. (cpm x 1000) 7 6 5 4: 3, 2. 1 o 250 200 150 loo so o Grunos experimentales SH-TdR inoorp. (epm x 1000) Grupos experimentales loo 80 60 40 20 o SH-TdR incorp. (cpm x 1000) Grupos experimentales Tiempos observación 2 horas 4 horas -pO,Ofi ••p~/lOO ml y EOS/pI 200 150 loo 50 o PO x 1O.000/pJ • p 005 frente al control Fig. 26 .-Deternilnactonesdecorticosterona(COR), cosinófilos(BOS) y plaquetas(PQT)enratones BALB/c smetidosa reaccionesde PSAfrenteados tipos deantígenos(EDTX y BSA). CTR sEEr asCo aBSA Grupos experimentales coR ~ Ecainófilos m Plaquetas - { * * 18 16 14 12 lo 8 6 4 2 o Control EDTX BSA Grupos experimentales Resultados. 116 íV.a RESPUESTA INMUNE EN SITUACIONES DE ESTRES EXPERIMENTAL células totales 1 bazo IV.2.1.-Perfll lnmunofarmacoláglco en situacIones de estrés. En este apartado estudiamos las modificaciones que el estrés produce en la respuesta inmune a nivel celular. Iniciamos el estudio obteniendo el bazo del ratón sometido a una situación de estrés mantenida durante una, dos, o tres semanas, para cuantificar el número de esplenocitos totales por animal. Los resultados se expresan en la Fig. 27, observándose en la primera semana una marcada disminución (estadísticamente significativa) para el modelo de inmovilización, mientras que el aislamiento no provoca apenas cambios en este tiempo. Los modelos de hacinamiento, y aislamiento requieren dos o tres semanas, respectivamente, para alcanzar una depresión similar a la de la primera semana de inmovilización, que tenga significación estadística (p=0,05>. 20 15 lo a o Inicio 7 dias 14 dias Tiempo transcurrido Núm. de células x 1O000.OOO 1 bazo Fig. 27 .-NúmerototaldeesplenocitosenratonesBALB/c sometidosasituacionesdeestrés por MS, I-IIAC y INM duranteuna,dos o tressemanas. 21 dias Grupos de animales Control -4-- Aislamiento * Hacinamiento —R— Inmovilización En los esplenocitos obtenidos, se determinan las respuestas blastogérilcas a los Resultados.117 30 minutos de finalizar las circunstancias que inducen el estrés; los datos se resumen en la Fig. 28, donde se comprueba que los modelos de hacinamiento y aislamiento - particularmente el último- no son tan efectivos para producir una situación de estrés que altere la respuesta inmunitaria. Los valores medios expresadosen % respecto a respuesta control fueron: HacInamIento ; AislamIento , LPS = 61% (Fig. 28>. 120 — 100e ~ 80o o , y Con-A (para linfocitos 7). Como puede verse en la Fig. 29, donde se comparan los cuatro modelos, se produce, para el modelo de lnmovtacl6n (lNh~, una disminución en la respuesta de mitogénesis intrínseca que alcanza su máximo a las 24 horas (21% de diferencia respecto al contro~ para recuperarse posteriormente a los Odias. Esta inhibición en la proliferación es más acusada Resultados.118 cuando se usa ConA, y se presenta desde los primeros 30 minutos (ConA: 50%; LPS: 78%) tendiendo progresivamente hacia (a normalización. El modelode morfinodependencla , y se ha estudiado la respuesta de las células CD3~ frente al antisuero monoespeciflco 2011 a las concentraciones de 0.5 y 1 1d/pocillo, respectivamente. Las situaciones de estrés se mantuvieron, en ambos modelos, durante una o dos semanas para estudiar las variaciones en función del tiempo de duración de dicho estrás. Al finalizar (os tratamientos estresantes, se determinaron los niveles de corticosterona, como índice de la reaccion de estrés del animal frente a la agresión y las respuestas blastogénicas, como índice de actividad del sistema inmune En el ensayo con antisuero monoespecífico 2011 (frente a 003+), se observa una depresión mayor durante la primera semana , se produce una depresión que aumenta al mantener el estrás durante dos semanas . En cuanto a los cuadros de estrás por morfino-dependencla, en el modelo de una semana (Rg. 31 a), se produce una depresión significativa de la proliferación celular, especialmente a nivel de linfocitos T (1 pg ConA: 53,8%, 2011: 78,3% de respuesta) y que desaparece al aumentar la dosis de mitógenos (3 pg ConA: 95,4%; 1 pl 2011: 93,6%; p~ n.s. frente al control). La respuesta a LPS se encuentra algo más deprimida que en el modelo de INM para el mismo tiempo (LES: 61,7% de respuesta respecto a control). En la segunda semana de adición (Fig. 31 b) se observa una depresión todavía mayor que sigue siendo más marcada para linfocitos T, y que solo se corrige parcialmente al elevar la dosis de mitógenos (1 pg ConA: 13%, p=001; 3pg ConA: 39%; 0,5 pl 2011: 19%; 1 pl 2011: 25% respuestas respecto al control). Para células LES sensibles, también Resultados. 123 se produce una inhibición más acusada . Sin embargo, los resultados presentan una cierta depresión con gran variabilidad indMdual, posiblemente esto se deba a la dificultad de normalizar el modelo en cuanto al tiempo final de inmovilización. En relación con las modificaciones a nivel de respuestas de citotoxicidad natural, se observa una disminución en la actMdad de células MC de origen espiénico procedentes de ratones sometidos a una situación de estrás por inmovilización; y también, en los casos de morfinodependencia con desarrollo o no de un síndrome de abstinencia. En la Fig. 35 se establece un examen comparativo de ambas situaciones en función de los tiempos de observación. Así se comprueba que el estrás por inmovilización tiene menos efecto sobre las respuestas decitotoxicidad natural (INM lasem.: 49% de lisis específica, 2asem.: 44% Resultados. 125 30 mm 24 horas 6 dias % Respuesta control cOFt (hg/lOO mí) 140 140 120 120 100 100 80 80 60 80 40 40 20 20 o o PES ConA LPS IL-2 COR Ensayos A las 24h. ~Alos6d.mi A los 30 mm. p = ns. respecto el control Fig. 34 .-Variacionesenrespuestaslinfoproilferativasy nivelesdeCOR inmovilizados,peroconposibilidadde autoliberación. enratonesBALB/e p=0,05 respecto al control> que en las situaciones de morfino dependencia (MFN 1~ sem.: 46% y 2~ sem: 49% de lisis específica; p=0,05 respecto al control). Esta inhibición se acrecienta aún más cuando se desencadena un síndrome de abstinencia por administración parenteral de naloxona 30 minutos antes de valorar la lisis específica frente a células YAC-1 (la sem¿ 31%; 2a sem.: 29% de lisis específica). En los otros casos de estrás menos efectivo, por aislamiento y hacinamiento, e incluso en casos de inmovilización con posibilidades de autoliberarse, no se observaron variaciones significativas a nivel de actividad citotóxica en las células NK esplénicas de origen murino . Los datos resumidos en la figura 36, recogen los recuentos de eoslnótlloe y plaquetas, en situaciones de estrés por inmovilización y morfino dependencia, sin que existan fenómenos de hipersensibilización. Reflejan disminución en el número de EOS (que es significativa para el caso de la MFN) y apenas se aprecia algún cambio significativo en el número de plaquetas, en relación con niveles de COR, elevados en ambos modelos. Resultados. 126 70 60 ‘1 o 50 a a40 e e U Q ~20 e 10 o Normales InmovIlIzados Morflnodopend 8.abstlnenola Grupos experimentales inicial ~ i’ semana EJ 2’ semana * p < 0,05 respectoal controLo p < 0,01 respectoal control. Fig. 35 .-Variacionesde actividaddecélulasMC obtenidasde ratonesBALB/c MFN durante1 ó 2 semanas,y expresadaen % delisis específica. 200 N o w o o 1-o 150 loo ea o «VR INM MFN Grupos experimentales — Cortlcostoronm ~ EcaInófílos E] 18 16 14 12 lo 8 8 4 2 o sometidosa ¡Mv! y o oo o o >4 a a- Plaquetas p <0,05 respectoalcontrol * * p c 0,01 respectoal control. Fig. 36 -Niveles de COR, númerode cosinófilos(EOS) y plaquetas(PLQ)enratonesBALB/c sometidosa estréspor INM y MFN. Resultados. 127 Ante la clara evidencia de una situación de inmunodepresión coincidente con los cuadros de estrás de MFN e INM, hemos querido profundizar en el conocimiento de la función linfocitaria. Para ello se han estudiado los cambios en la expresión funcIonal de las moléculas de superficie de las células inmunocompetentes, confirmando previamente por ensayos de proliferación celular en placa, según el método colorimétrico de Mossman, la inmunodepresión existente. El estudio se lleva a cabo en grupos de cinco a ocho ratones BALB/c de ocho semanas de edad, sometidos a situaciones de estrás por inmovilización, y por modino dependencia, del mismo modo que se realizó en los ensayos previos para determinar niveles de corticosterona, y respuestas linfoproliferativas. En todos los grupos experimentales se comprobó previamente, la situación de estrás por el nivel de COR sérica, y también el estado de depresión sobre la respuesta linfoproliferativa, tal como se observa en los ejemplos de respuesta condicionada por morfino dependencia que se resumen en las Figs. 37, 38 y 39 frente a ConA y suero anti- CD3 (para células 7) y frente a LPS (para células 6), respectivamente. La expresión de distintos marcadores de superficie en los linfocitos, nos permite estudiar la funcionalidad de las distintas subpoblaciones linfocitarias. El estudio se realizó formando un “pool’ a partir de suspensiones celulares obtenidas del bazo de cada ratón, determinando el número de células O (lg~), mediante anticuerpos anti-lg de rata FITO- marcado en presencia de 10% de suero normal de rata (para bloquear la unión inespecífica>. En el caso de los lInfocitos T, se utilizaron los marcadores CD4~ y CO8~, realizando una tinción -con anticuerpos de rata frente a las moléculas específicas- en dos fases, incubando primero las células en concentraciones apropiadas de los correspondientes anticuerpos monoclonales biotinilados y después con anticuerpos anti- biotina FITC-marcados, añadiendo el correspondiente 10% de suero de ratón. Resultados. 128 0,8 contRol- —O-— PLAceO —A’— MORFINA —6-— MORFINA+ NAtoxa’IA —4—— cONTROl. —O-— PLACERO —A— MORFINA ~6 MORFINA. NALOXONA o d 1! gui Figs. 37,38y39.-InmunodepresiónenratonesBALB/c sometidosa morflnodependenciaysíndrome deabstinencia(seincluye placeboy control). Determinacionescondistintas concentracionesde ComA (Fig. 36); de anti-C03 (Fig 37); 125(50 pg/ml) y PBS. Se determina la proliferación por método de 0.0. 540 nm. 0 1 2 3 Concanavalina A (pg/mI) 0.6 0,4 0,2 0,5 0.4 0.3 0.2 s d d E e o o> y células CD8~ (Fig. 43), comparándolas con los obtenidos frente a una tinción negativa. Para su mejor comparación, recurrimos a tabular los distintos porcentajes de células en cada caso y grupo experimental, indicando los anticuerpos utilizados en la tinción específica de cada grupo celular (Tabla VIII). Los datos antes reseñados no sufrieron apenas modificación al desencadenar un síndrome de abstinencia mediante la inyección de naloxona dos horas antes de extraer las células; lo que provoca una extraordinaria elevación de los niveles séricos de COR. En la Tabla IX se resumen los datos relativos a la expresión de marcadores funcionales de subpoblaciones linfocitarias del bazo, número total de esplenocitos, peso del hígado y peso corporal, para tener una idea de conjunto de las variaciones en la dinámica funcional de las células esplénicas de ratones BALBIc sometidos a estrás por morfinodependencia. Resultados. 130 zzrm LOti -41’- a-I•0Ir,tirlz (~•1 4ti- ‘o-4no, ciu -c _ a e -rcncio1-L I- (u ” >. e .- o 4 . c a ‘0 4>oo-0oo12 1-Eoo owci zIto2 x l w i ItLOQl 1 1’-2: ti2: Li R esultados.132 a1—u.cO t-z O c < Je t 0o -.-oEnir(-y1 — u. < u ” > O O > - 0 2 . c e -a wI -4’ ; A zEo ‘j.c tiE. 4ItEn4Cl-, rlEj2: ou - o - . - . c o rn Oo c ‘o o ; empleando para la primera un antígeno endotóxico (EDTX) frente a un suero heterólogo de conejo, y para la segunda un antígeno protéico (BSA) frente a un suero homólogo de ratón. Resultados.135 Ln C d — — Cd Cd r 1 ~ ’ — C o — o Cd Cd Cd ti> r r — o ~ ti, (‘2 .~ ~ (‘2 (‘2 C i ti> CO N e j e j e j — r — e j o> e j C i t t t t í- CO O > t t ‘1- — — — O , O CO U 2 t t t t e j -HII, cd -U .E ‘~3 ~ s z o.. o.. a,oO> (u<.3 ‘0oa>‘oo‘OocdOa. .0nCo(ucdo ’ (uaa, oCoa, .2 ~ g ‘0 ~ o C d a, e<1) - = 0 o c, (u ‘o Co 2 ’ O .0 4 -’ o ~ E a, c ~ .2> •n zuJ ‘Ua ~> ~ a> ‘oC o E ~ (u a, 0 ‘3 a, ~J O w ‘5 a ~ N D ci>(u a~~, ~ e a> ‘o 0 .2 cd ‘o .~ r a> >< ¿-3 O- O o - ‘d fl C i R esultados.136 .0O>O•0> O Oci= 9 <..34-OO= 9 <-3OOo<~32o>mo.0‘o(u ‘3‘O , ci o-JoOoa,(oa, ‘0ooC o cdn‘a ,oO> •0‘oOaO‘ocdo> .0‘5‘0Ocaa, — a 0 - .0 ‘- 0 0a.1.‘5a, .0oC o w ¡ C d e j 44oL O (N i O -c-5‘0o- ‘5aOCoO0(u ‘0oa,aa, -o6oCeOEa,oO , .2o.2’‘o‘oC d Co •¿3 c i, oo> C d a O0 ooa , Cl.. ¡ 1- Inicialmente, se realizaron estudios delfuncionamiento de ambos modelos en animal completo, utilizando como parámetros la determinación de la mortalidad, y del TL~ para PSA, y del tamaño de la lesión cutánea para PCA; posteriormente se determinaron los parámetros celulares para completar el estudio. IV.2.2.1 .- Reacción PSA anti-endotoxina . Se establecieron dos variantes experimentales: A,-En primer lugar sensibilizamos con un suero heterólogo distintos grupos de 12 ratones cada uno, y para ello utilizamos 0,15 ml/ratón de suero de conejo anti-endotoxina. A las 3 horas se inicia la situación de estrés correspondiente, por inmovilización o por morfino dependencia, durante una semana; al cabo de este tiempo se desencadena la reacción anafiláctica inyectando 0,1 5 mIde la soluciónantigénica de endotoxina de Brucella a la concentración que corresponda, de acuerdo con la relación Ag/Ac fijada previamente según datos de la curva de precipitación específica correspondiente (Fig. 14). En uno de los casos se inyectan 125 ~¿gde endotoxina en los 0,15 ml de PBS (Ag 3/Aa 2) para producir inmunocomplejos (IC) de pequeño tamaño, mientras que en otros casos se inyectaron 75 pg (Ag 0,25/Ac 1), en cuya proporción se forman IC de mayor tamaño. Para ambas proporciones de Ag/Ac, se observa una prolongación del TL~ en el modelo InmovIlIzacIón (Fig. 44 a y b). Llama la atención, que en el caso de inmunocompiejos de gran tamaño (Ag 0,25/Ac 1), existe una proongación muy importante del tiempo de muerte (que pasa de 3,7 a 7,6 horas; ps 0,05), con una disminución del % de mortalidad. Sin embargo, para la proporción Ag 3¡Ac 1, el alargamiento del TL~ es menor (el valor medio pasa de 16,5 a 19,2 horas; p= ns.>, mientras que disminuye drásticamente la mortalidad (en un 50%). Esta disminución en la agresividad del shock anafiláctico, refleja una menor actividad del sistema inmunitario en respuesta al estrés producido por la INM. Resultados.137 En el modelo de morfinodependencla, se produce una protección mayor para la proporción Ag 0,25/Ac 1, con TL5O de más del doble de los controles (valores medios 8,3 h. y 13,7 h. respectivamente; p=0,05), y una disminución del indice de mortalidad hasta un 58,3%. Cuando se provoca un síndrome de abstinencia, administrando naloxona, el efecto protector disminuye (TL~: 4,5 horas, p=0,05 respecto a MEN; y mortalidad: 83,3 Yo). Si existe exceso de Ag, el grado de protección es mucho menor, tal como se refleja en ambos parámetros: el TL~ pasa de 16,5 a 19,3 horas (valores medios), y la mortalidad baja al 73%. Al inyectar naloxona, aumenta el efecto protector, por una mayor depresión del sistema inmune, que para este caso es de un TL5¿ 18,5 horas, y una mortalidad 91,6% (Fig. 44 a,b). Los diferentes resultados para las dos proporciones Ag/Ac pueden ser explicados por diferencias fisiopatológicas en la lesión inmunitaria, en la que puede o no intervenir el sistema Complemento, como se discutirá posteriormente. 6.-En la otra secuencia temporal, se somete a los animales a las situaciones de estrés previamente indicadas durante el mismo tiempo. Después se procede a la sensibilización de los animales, y se desencadena la reacción anafiláctica con el antígeno endotóxico a las 6 h de la hipersensibilización. En este caso, se observó un perfil similar, aunque con algunas variaciones de tipo cuantitativo en los resultados. Así en la Fig. 45 a,b es posible comprobar que para el caso de inmovIlIzacIón en el modelo de exceso de anticuerpo, se produjo una inhibición algo menor que en el caso anterior (TL~, pasa de 4.1 a 7.2, p=0,05; y la mortalidad baja al 83,3%>. Sin embargo, cuando antigeno y anticuerpo están en la relación 3/2, las variaciones adquirieron mayor significación que en la anterior secuencia temporal para comprobar la sensibilidad de la reacción, observamos que el suero heterólogo precisaba de una mayor concentración para producir una intradermorreacción débil, posiblemente por la gran complejidad del antígeno inoculado o por diferencias en la capacidad de fijación dérmica de sus anticuerpos; y también, que en situaciones análogas, las reacciones frente a suero homólogo de raton presentan una mayor sensibilidad en la respuesta. Por este motivo, seleccionamos el modelo de PCA con suero homólogo para proseguir el estudio. En consecuencia, utilizamos los dos tipos de reacción indicados en el apartado de Métodos: a) sensibilización de toda la piel; y b) sensibilización sobre áreas localizadas. Los resultados, expresados en función de las dimensiones medias de las áreas de lesión y en % respecto del control, se resumen en las Fig. 46 a,b. Los datos obtenidos demuestran que las lesiones dérmicas, probablemente por la alteración de la permeabilidad, son de menor tamaño en la sensibilización generalizada de la piel. De acuerdo con nuestro protocolo experimental, ensayamos los dos tipos de reacciones PCA previamente descritas, para cada modelo de estrés, en grupos de 12 ratones BALB/c. En el caso de sensibilización sistémica, se administra el anticuerpo (Ac) vía iv., posteriormente se somete al animal a la situación de estrés correspondiente, y al finalizar esta (5 días después), se desencadena la reacción PCA. De este modo, en el espacio de Resultados. 140 12 10 i c ‘o o Cl,- E .4, o 180 160 140 120 100 c 80 u u 60 o o 40 ‘~‘ o 20 o SGnS.plOl cofliDí. Tipo de ensayo — CTR ~ NM W MPN — MP’NX * p< 0,05 ** pcO,Oi respectoal control Fig. 46 Variacionesproducidaspor el estés(INIM, MFN y SindronedeAbstinencia)en reaccionesPCAconsensibilizaciónlocal,o de piel completa.Se indicael diámetrode la lesióny el % respectoalcontrol. Sena.plel compl. Sena.área local. Tipo de ensayo sensiblilzante Sens.área local. sensibilizante Resultados.141 tiempo en el que se desarrolla el estrés, se produce la d’~tribución de suero sensibilizante, que queda fijado en las células dérmicas. En el caso de reacción local, se somete a los animales a la situación de estrés, durante el mismo tiempo, y al finalizar ésta, se administra el suero sc, en zonas localizadas de la dermis; 3 horas más tarde se induce la reacción local administrando el antígeno en la misma zona. Los resultados obtenidos, que se comparan en las (Figs. 46), demuestran que el método de sensIbIlIzación de pIel completa, por ser más generalizado en cuanto a la lesión, es más susceptible de presentar variaciones de respuesta condicionadas por las situaciones de estrés. Losdatos demuestran claramente que el animal reaccionade distinta manera según que haya estado sometido a inmovilización forzada o a morfino dependencia, mostrando una disminución del tamaño de la lesión en el primer caso, para ambos modelos experimentales. En el segundo caso, presenta similar comportamiento para la sensibilIzacIón local, con respuesta paradójica en el de piel completa; en el que se produce un aumento de la lesión local. Cuando se induce un síndrome de abstinencia, no se observa inhibición de la reacción intradérmica. IV.2.2.3.- Perfil inmunofarmaeolóciico en reacciones anafilácticas producidas en situaciones de estrés . Después de comprobar las variaciones de respuesta anafiláctica sistémica (PSA) en cuanto a su manifestación clínica (TL~ y mortalidad); es decir, atendiendo a las últimas consecuencias de un cuadro de shock generalizado, se intenta determinar las alteraciones producidas en diversos parámetros. Estos reflejan, tanto el nivel de estrés alcanzado (corticosterona) como aquellas variaciones en el número de células que específicamente responden a un cuadro de hipersensibilización (eosinófilos) o que intervienen en la agresión por lO (plaquetas). También se determinó el estado inmunitario del animal valorando la capacidad de proliferación linfocitariay las respuestas de citotoxicidad natural. Resultados.142 Para este estudio seleccionamos la relación Ag 0,25/Ac 1 , por ser la que previamente había mostrado un mayor sensibilidad al estímulo del estrás. Al comparar los datos resumidos en las Figs. 36 y 47, relativas a los niveles de cortlcosterona y número de eoslnálilos y plaquetas, en situaciones de estrás por inmovilización y morfino-dependencia, con o sin intervención de fenómenos anafilácticos, vemos que: en ambas situaciones de estrás y sin que existan fenómenos de hipersensibilización ; disminuye el número de ecainófilos circulantes (p=0,05); y apenas se aprecia algún cambio (no sign’rficatwo) en el número de plaquetas, ligeramente aumentadas en morfinodependencia (MFN). Por otra parte, en los cuadros de anafilaxis y con ausencia de situaciones de ansiedad, sea cual fuere el agente sensibilizante aparece una ligera disminución (variable según los casos) en los niveles de corticosterona, un acusado aumento en el número de eosinófilos y una disminución en el número de plaquetas circulantes. Cuando ambos cuadros patológicos se yuxtaponen; es decir, que en animales en situaciones de estrás (sistema nervioso afectado) se provoca un cuadro de anafilaxia (sistema inmune afectado), aparecen variaciones de distinto signo según la causa productora de la situación de ansiedad Fig. 48 .-Variacionesen los nivíes de COR y recuentode eosinófllosen situacionesde anafilaxia asociadaa estrés.Se incluyenlos valoresdereferenciaparaPSAsin estrése inmovilización, y paramorfinodependenciasin anafilaxia. Grupos experimentales CTA INM MFN PSA PSA+INM PSAtMFN Resultados.144 hipersensibilización produjeron un aumento en el número de eosinófilos (168 célIpQ, cuando no existían situaciones de estrés( Fig. 48). Esta interacción entre el estrés y la anafilaxia, produce una depresión a nivel de respuesta línfoproliferativa Intrínseca (en PBS). De hecho, se observa que el intenso efecto mitogénico propio de un lipopolisacárido (EDTX) (respuesta 350% respecto al control; p= 0,001), es drásticamente inhibido por el estrás, que lo situa en niveles casi normales (122% respecto al grupo control en el caso de INM), o incluso inferiores (83% en el caso de MFN; p=0,05) (Hg. 49). En la mitogénesis inducida por CoriA o LP8, el discreto efecto potenciador de la EDTX (ConA117%, LPS 1 34% respecto control) se ve anulado por los agentes estresantes, que lo sitúan en niveles infranormales (para INM: ConA 72%, p=0,05; LPS 97%, ns.; para MFN: ConA 67%, p=0,05; LPS 78%, p=0,05>. Las variaciones en la liberación y actividad de la IL-2 discurren paralelamente a las de la blastogénesis ConA inducida (para INM: actividad de IL-2 75%; y para MFN 69%; p=QOS) (Fig. 49>. Cuando se estudian las variaciones de citotoxicldad natural por células NI< de origen esplénico, valorada en % de lisis específica en relación frente al control, se ve que la inhibición provocada por la anafiláxia por EDTX-antiEDTX (actividad de células NK del 78% respecto control), aparece algo incrementada en situación de estrés, sobre todo en casos de morfinodependencia (INM 72%, MFN 68%> (Fig. 50). Resultados.145 % Respecto a ratones normales 400 350 300 250 200 150 loo 50 o PSA.INM Grupos experimentales p ‘ 0,05 frente a PSA (CTR) Fig. 49 .-Determinacióndeblastogénesis(intrínsecao mitógeno-inducida)y produccióndeIL-2 en ratonesquesufrenunareacciónde PSAtrassersometidosa situacionesdeestéspor INM y MFN. Valoresexpresadoen % respectoa controlnormal % LIsIs ocluías YAC1 % respecto si control 120 100 80 60 40 20 o CTA PSA (EDTX) PSA.iNM PSA+MFN Grupos experimentales p < 0,05 frente a control (ctp> Fig. 50 .-Variaciónenla actividaddecélulasNX obtenidasderatonessometidos a una reacciónde PSAtrassufrir estrésporINM y MFN. Se expresaen% delisis específicade célukasYAC.1. PBS Reap. conA ~ Resp. LP5 IL-2 * * PSA (eTA) PSA.MFN 120 loo 80 60 40 20 o Resultados.146 iva.- MODULACION FARMACOLOGICA DE LA INTERACCION NEURO- INMUNITARIA EN SITUACIONES DE ESTRES. Hemos evaluado las modificaciones que se producen en la respuesta inmunitaria en situaciones de estrás, midiendo esta respuesta tanto a nivel celular “ex vivd’, como en reacciones de anafilaxia “in vivd’. Se estudian las posibilidades de modificar esta interaccion por medio de distintos tratamientos. En este apartado hemos seleccionado los parámetros inmunologicos a controlar en cada grupa: así, para algunos grupos de fármacos, se estudia exclusivamente el modelo de PSA, puesto que de esta manera podemos controlar la respuesta inmune en su totalidad; mientras que en el resto, empleamos determinaciones de actividad linfoblástica y de otros parámetros celulares. Se ha intentado modular la inmunodepresión producida en situaciones de estrés a distintos niveles: a) fármacos adaptógenos que disminuyen el nivel de estrés: b) fármacos reguladores de la respuesta inmune a partir del sistema nervioso; c) fármacos reguladores de los sistemas serotonérgico e histaminérgico; y d) fármacos implicados en el brazo efector de la respuesta inmune propiamente dicha (antiinflamatorios y moduladores del Complemento>. En aquellos casos en los que se utilizó la reacción PSA, se desarrolló el protocolo experimental como se resume a continuación: a) Sensibilización pasiva por administración i.v. del anticuerpo específico anti-EDTX; b) establecimiento de un cuadro de estrás experimental por inmovilización o por morfino dependencia; c> instauración de las diferentes pautas de tratamiento farmacológico, que coinciden en parte con el periodo en que se desarrolla el cuadro de estrés; d) administración i.v. del antígeno (EDTX) para desencadenar la respuesta anafiláctica de carácter sistémico (PSA). Resultados.147 La valoración del cuadro se realiza através de los parámetros habituales (mortalidad, TL~, recuento de eosinófilos y plaquetas, así como niveles de COR>. IV.3.1.- TratamIento con eleuterósídos. Se comenzó por estudiar el posible efecto inmunoestimulante de eleuterosidos de naturaleza saponinica, existentes en algunos extractos vegetales, como en el Eleuterococcus senticosus. Se comprobó en primer lugar, silos extractos a utilizar tenian alguna actividad biológica sobre esplenocitos procedentes de ratones BALB/c, a los que se habla administrado 6 a 12 dosis diarias de 10 mg/Kg de dicho extracto. Como puede verse en la Fig. 51, los eleuterósidos administrados según nuestro protocolo, no tuvieron efecto por sí mismos sobre la blastogénesis, ya sea intrínseca o mitógeno inducida. Por otro lado, los niveles de corticosterona en el suero de dichos animales, experimentó un ligero descenso, que no parece correlacionarse con el tiempo de tratamiento. 25~> 0,8 20~ 0 0e ‘~ 0,6 15~ o a 90,4 10¡~ •0 c‘50,2 ‘u -ao*0 00 Tris Tr.2s INM 14.ls 5 Grupos experimentales Control PUS mini. Con A E] Blasí. LP8 Oart¡OoStOf’Ofl* Fig. 51 ,-Varlacionesenla respuestalinfoproliferativay nivelesdeCORderatonestratados con eleuterosidosduranteuna o dos semanas.El tratamientose aplica a ratones controly sometidosa inmovilización. CTR l4,2s Resultados.148 En cuanto a su efecto sobre ratones sometidos a situaciones de estrés por inmovilIzación (Fig. 51), se produjo una disminución signifcativa de los niveles de corticosterona, previamente elevados, descendiendo desde 23.2 pg/lOOml hasta 20 (p= ns.) y 15.8 pg/1 OCmI y se continuaba el tratamiento con extracto de eleuterococo durante otra semana; y en la tercera semana se hacía coincidir la situación de estrés (por inmovilización o por morfino dependencia>, con la hipersensibilización. Al concluir esta tercera semana de tratamiento, se inyectaba el antígeno correspondiente (EDTX),valorando los cambiossegún los parámetros descritos previamente; los resultados se resumen en las Fig. 52 a,b. Así, los niveles de corticosterona, aumentados en respuesta el estrés por inmovIlIzacIón, descendieron con el tratamiento en las dos proporciones de Ag/Ac (34 frente a 52 pg/1 00 ml del control, para el exceso de Ag, p=0,05; y 40,4 frente a 49 pg/i 00 ml con exceso de Ac). El tratamiento produjo un aumento en la actividad del cuadro de Resultados.149 140 o ‘o 120 o, o, ~ 100 o e o a Cl- o> o o o> o. ci, a, 80 60 40 20 o cOR (pg/lOOml> W Ecalnófilos LID Plaquetas ~ liso * p < 0,05. frente a grupo no tratado 140 o ‘~ 120 o, o, ‘~ 100 o e o 80 a 1~ o> o o a>o. 0 a, 60 40 20 o coR ~ Eceiná? líos Li Plaquetas TLBO • p < 0,05. El resto n. e. Fig. 52 ..Efectodel tratamientoconeleuterósídossobrelos parámetrosdeunareacciónde PSA, inducidaen ratonessometidosa estéspor inmovilización (arriba), o por morfinodependencia(abajo). 70 60 _ Eo 50 g o> 40 e” e ao Ea, o, 20 ~ o 10 ca o INM sin Con Eleu. INM sin Con Eleu. 210 180 o 150 ~ o> 120 a o, c 90 2 e> ‘a 60 ~ o 30 ~ o o MFN sin Con EIeu MFN sin Con EIeu Resultados.150 anafilaxia, con un acortamiento del TL50 (reflejo de una recuperación de la actividad inmunológica). Este efecto fue más acusado para este modelo, en el que el TL.~ disminuye un 25,8%, en el caso de exceso de Ag, y un 18,2% con exceso de Ac. El número de eoslnófilos aumentó con el tratamiento en proporciones variables (p= ns.) y no se produjo variación significativa en el número de plaquetas circulantes. En el grupo de ratones morfinodependientes, el efecto sobre la COR sérica, fue mucho menos intenso queen el grupo anterior, puesto que descendió de 167 a 160 pg/ml, y de 166 a 148 pg/ml, sin alcanzar significación estadística. El TL~ presentó una disminución escasa (entre un 8y un 11%; p= ns.), el recuento de ecaInállIos descendió, y no se detectó variación en el número de plaquetas.(Fig. 52 b). íV.aa- UtilIzación de dletIl-dlthk,carbaznato (OTO). De los distintos inmunomoduladores a nuestro alcance, la molécula de DTC es la más interesante desde el punto de vista de la modulación neuroinmune, dado su efecto especifico a nivel del neo-córtex. El modelo se desarrolla según el protocolo general descrito, con la administración subcutánea de sucesivas dosis de DTC durante la semana en que se somete a la situación estresante. En primer lugar se comprobó si la dosis media utilizada en otras ocasiones era la más indicada en estos casos, seleccionando la dosis de 25 mg/Kg de peso/día diluido en Olmí. En la Fig. 53 se resumen los resultados obtenidos en varias series experimentales de ratones BALB/c sometidos a diferentes ensayos de estrés y anafilaxia, con y sin tratamiento. Se comprueban así, las variaciones debidas al uso del fármaco en cada situación, indicando en la tercera barra de cada grupo de resultados, el cambio porcentual provocado por el DTC. Se definen los grupos control (CTR), endotoxina (EDTX), inmovilización (INM), y morfino dependencia (MFN>; estos dos últimos con y sin reacción de PSA añadida. Resultados.151 Se confirmó de nuevo que la hipersensibilización con EDTX, produce un leve aumento en la reactividad de las células T; de igual forma, comprobamos unadisminución de la respuesta linfoproliferavva debida al estrés, que fue más intensa en los cuadros de morfino-dependencia. En los casos en que a la situación de estrés se superponía un estado de sensibilización, se inhibió aún más la respuesta de las células T, especialmente en el caso de la morfinodependencia (primera columna de cada grupo en la Fig. 53). Si ahora observamos estos parámetros en los grupos que han sido tratados con DTC, según el protocolo descrlto (segundas barras de cada grupo, en Fig. 53), se puede ver como en el grupo control aparece un efecto inmunopotenciador intrínseco del fármaco, equivalente al 133% (comparando con el OIR, tercera barra). Este efectose mantiene en ratones inmunodeprimidos a consecuencia del estrés, con o sin situaciones de anafilaxia añadida, en diferente proporción para cada grupo. El máximo efecto restaurador aparece en aquellos grupos en los que existe una situación de estrás con intervención de morfino- dependencia, ya sea sola (128% respecto al grupo equivalente no tratado, p=0,05), o c.P.M. x 10.000 25 20 200 15 10 100 5 o o CTA PSA INM PSA.INM MEN PSA+MFN Grupos experimentales Sin Tratamiento ~ con DTO Li % frente no tratado Fig. 53 .-Variacionesen la mitogénesisConA inducida,producidaspor el tratamientocon DTC enratonessometidosa situacionesde estés,anafilaxia,o ambas. % Frente a no tratado Resultados.152 1 combinada con una sensibilización anti-EDTX (227% respecto al grupo sin DIC p=0,05). En cuanto a la intervención del DIC en la inducción del estrés, se controla mediante determinación del nivel de cortlcasterona en suero a tiempos variables (Fig. 54). Corticosterona Fig. 54 .-Variacionesenlos nivelesdeCOR a lo largo del tratamientoconDTC aplicado a ratonessometidosaestéspor INMy MFN. El efecto del tratamiento con DIC sobre las reacciones de anfilaxia en situaciones de estrás se resume en la Fig 55. En el grupo de InmovIlIzacIón se comprobó una restauración parcial de la actividad anafiláctica, con una disminución del TL~ del 36% en el caso de exceso de Ac , con escasas variaciones en los recuentos de eosinófilos <-17,7% y -19% para ambos grupos; p= n.sj, y con recuentos plaquetarios practicamente estables. En el grupo de morfinodependencla, se produjeron discretos aumentos de la OCR sérica, con incrementos (15%) del TL~ en el modelo Ag3/Ac2, y con incrementos en el recuento plaquetario W Eosinófilos Li Plaquetas ~ TLEO • p < 0,05 frente al grupo no tratado COR (¡jg/lOOml) ~ EoslOófIlos Li Plaquetas TLSO * p ‘ 0,05 frente al grupo no tratado Fig. 55 ..EfectodeltratamientoconDTC sobrelos parámetrosdeunareacciónde PSA, inducida en ratonessometidosaestéspor inmovilización (arriba),o morfinodependencia(abajo). 140 o ‘o 120 o, ca ~ loo o c o o. o> o o a> o. o, a, 80 60 40 20 o 70 60 — E o 50~ o> 40 ‘a c ao Ea> 0 20 0 o lo o e-) o INM s¡n Con OTC INM sin Con OTO 120 140 o ‘o o, ca ~ 100 o c oa n o> o o a, a o, a, 80 60 40 20 o 210 180 o 150 ~ a> 120 ca c 90 a> ‘o 80 o 1~ 308 o MFN sin Con OTO MFN sin Con OTO Resultados.154 IV.3.3,-UtlIIzacIón de antthlstamlnlcoa y antlserotonlnlooa. Se han utilizado cinco fármacos distintos: a> cromogilcato (CG), que tiene capacidad para inhibir la liberación de mediadores de mastocitos activados; b) ciproheptadina (CY), que actúa como anti-serotonérgico principalmente, aunque tambien tiene una débil acción como anti-colinérgico; y o> fármacos antihistamínicos como la clorfeníramína (CF) y la trípelenamína (‘1?), que tienen actividad bloqueante anti-H1, con más o menos efectos centrales, respectivamente: y la cimetldína . No hemos encontrado diferencias significativas debidas al tratamiento en tos parámetros (TL~, recuentos de eosinófilos y plaquetas). Los niveles de Cap, determinados en el grupo sometido a una reacción de PSA, no variaron significativamente (Fig. 57 ab>. Resultados.155 0,12 120 0,1 loo 0,08 80 0,06 60 0,04 40 0,02 20 0 0 1,2 120 1 loo 0,8 80 . Los resultados para la proporción AgO,25/Acl muestran diferencias de tipo cuantitativo, aunque son del mismo signo y proporción. 300 2 250 e o 200 u .5 150 ca a,~ loo a o, 4> 50 (r ~ 0 300 -~ 250 e o 200u .5 150 o, g ~oo o.: ir a’ O 1 A•I.8/T A.LI/CM A•l.t/CF A•l.t/CG A~l.t/TP MIt/CV Grupos experimentales corticosterona ~ EcaInóf líos Li plaquetas Mortalidad (TLGO) Fig. .-57 Efecto de los tratamientos con: cimetidina (CM), clorfeniramma (CF), cromoglicato(CO), y ciproheptadina(CY) sobre los parámetros de una reacción de PSA en ratones sometidos a estéspor inmovilización. Resultados.157 La clorfeníramina demostró un efecto inmunorrestaurador selectivo sobre la mitogénesis intrínseca, alcanzando los niveles del grupo control sin estrós (100%). No se apreciaron modificaciones en la mitogénesis ConA ni LPS-inducida. Sin embargo, en los ensayos “in vivo” con reacciones de anafilaxia sistémica se observó unamortalidad precoz de los animales, incluso antes de terminar el tiempo previsto para el ensayo, esto hace que los datos obtenidos sean de escasa significación, y de dificil interpretación (Figs. 56 y 57). La tripelenamínademostró una restauración de la mitogénesisConA-inducida hasta alcanzar los valores del control no estresado <100% tras tratamiento frente a 72% antes del tratamiento, p=0,05), las células LPS-sensibles también aumentaron su actividad (110% frente a 74% antes del tratamiento, p= n.s.). El TL~ de la reacción de PSA disminuyó, y aumentó el número de plaquetas, todo ello sin que se observaran variaciones en los niveles de COR.(Fig. 57 a, b). Para los ensayos correspondientes a la morfino-dependencla (MFN>, dejaron de utilizarse dosfármacos el cromoglicato, por la falta de resultados de interés en el modelo de INM; y la clorfeniramina, por las complicaciones letales detectadas en los ensayos previos. Del mismo modo, a la vista de la similitud de resultados encontrados en el modelo de INM para este grupo de fármacos, se suprimió el ensayo con Ag 0.25/Ac 1. Los resultados correspondientes a los restantes se resumen en las Figs. 58 y 59. La cíproheptadína presentó, en este caso, una leve disminución de la actividad mitogénica intrínseca (que bajó del 71% al 60%, respecto al control normal) con un claro descenso de la mitogénesis LPS-inducida (del 95%, en el grupo no tratado, baja al 65%), y sin cambios en las células ConA-sensibles. En el caso de reacción de PSA añadida, el TL~ aumentó, con una disminución del número de eosinófilos. Esto se desarrolla en el seno de unos niveles de COR que se elevan aún más que en el grupo no tratado. La trípelenamína presentó, al igual que en el modelo de inmovilización, una recuperación de actividad mitogénica en las células LPS y ConA-sensibles (Fig. 58), Resultados. 158 0. 0. a 690 nm. % Respuesta control 0,12 120 0,1 PBS 100 0,06 80 0,08 — 80 0,04 —— — — 40 0,02 — — — 20 o o CTA MFN MFN•CM MFN.TP MFN.CY 0. 0. a 690 nm. U Respuesta control 1,2 120 1 100 0,8 80 0,8 0,2 —-- — — 20 o o CTA MFN MFN.CM MFN.TP MFN.OY 0. 0. a 690 nn. % Respuesta control 0,2 120 loo 0,133 80 60 0,087 40 20 o o OTR MFN MFN~CM MPN~TP MFN~CY Grupos experimentales m Prollferaclón 1 Respuesta control • p < 0.08 frante a oontrol Figs. 58 a, b y c .-Efecto de los tratamientos con: cimetidina (CM>, tripelenamina (TP>, y ciproheptadina (CV) sobre la respuesta blastogénica de ratones sometidos a estrés por rnorfinodependencia. aunque en este modelo no llegó a alcanzar los valores control. En las reacciones de PSA se observó un nivel de COR que permanece elevado, y un acortamiento del TL~. Resultados.159 La cimetidina presenta resultados muy variables en los diferentes ensayos, y con gran dispersión de los resultados, habiendose constatado una disminución de la mitogénesis LPS inducida (p= n.sj, sin otras alteraciones. 300 250u ~ 200e~ 160 a• 100 e 00 e ~ o Ccrttostsrona ~ Piaquta Fig. 59 .-Efecto de los tratamientoscern cimetidina (CM), tripelenandan(TP), y ciproheptadina(CY) sobre los parámetrosde una reacciónde PSA en ratones sometidosa estréspor morfinodependencia. IV.3.4.-Uttaclán de antilnflamator¡os, agentes plaquetarlos e InhIbIdores del complemento. Se han seleccionado los siguientes fármacos antiinflamatorios como el ac. flufenámlco, y la lndomstadna inhibidores del complemento como la suraznlnay otros con efecto sobre las plaquetas como latlolopldína. Los hemos administrado durante la semana en la que se sometía a los ratones a situaciones de estrés, desarrollando a continuación las reacciones de anafilaxia pasiva (PSA) con diferentes proporciones de Ag/Ac, y comparando con los grupos no tratados. Las Tablas X y Xl muestran los resultados del ensayo en el grupo control y de estrés por INM, posteriormente se resaltan los cambios producidos por los tratamientos en cuanto a COR, TL~, y % de mortalidad en las Figuras 60 a, b ,yo. MM.WT MM.t/TP A4&UCM A.htt/OY Grupos experimentales ~ !ouIn6f te FS Modalidad (TLGO) Resultados.160 El tratamiento con suramína agudizó el cuadro de anafilaxia (PSA) con exceso de Ag, acortando el TL~ en este grupo LO(‘4oo,“4 “eit‘O—4 ~1 ~ rl C J 2 ~ ~ $ 4 ~ a>‘oOP o4 3 zOuzHo43E l zOue Ho4 3eouO43E-’ z1-4 cli H u‘-4“4ti)o)eo43itea)it“eitu . o it o -‘-4$1 ‘4 w C lio d io •0 o e 4 3 ‘o e -.4 U) o ~.4 ltd W 4 3 ‘-Ids.l d 4 3 rl e H C d ) O V O ano rl --4 d o 4 3 ~ —4 t4~4 d c z a > O ’o $4 .,-4 4 3 1 ) E N ‘it -.4rl it —4 rl .r4 “e a04 O U) 4 3 4 3 10(i) (‘4W -e—4 -4d o E -iU -4o$443eou(‘4u1’)O ’ ‘4 R e su lL a d o s.162 ‘-4 m 04 — — ir O 04 rl CM do O ~ o , (‘4 OP O — La 04 -4 0 C D - rl rl rl eHo, a , <‘4 <‘4 a ’ -4 O p 4~~CD 0 4 en La do - o — O — ~ O o , -4 r- rl r4 La o , LO OP — C V , c~ — (‘1 O Ú - LO ‘.0 0 4 a , 04 CD do < ‘4 La — O LO — •ct< rl LO rl -4 U ) o o u M O O LO 04 $4El >4a)‘OOP LO0 4 -4 -c i o , ‘4 o , CD O - o , C-.- -4rl « 1 (‘4rlLO eno , LOdo •~< rl 0 4 ‘.0 rl a. a. — rl o , La rla ’ fin C D a. La -4rl dO r- LOr— . CD ‘.0 en — O rl -~ - o d ~ rl rl rl CV, rlLO<‘4CV1 ‘-4ou La C D a. LO Orl CD OP — LO r— r- 04 o , a , CM — a. OO rl ir ti)oM >4 O O a> 04 $4 “U El OP -4CD $ 4 0 o c4-4 rl H 0‘4rl u .ci‘4 o , LO04 L O C o ) it H O 4 3 1 0 0 Ci -d ~ti ‘it < d c c ric O ) 0 i~ ’4 -4 > t1 )rl ~10o U) •rl C O w ~ O $ 4 ‘o ~ ~ it c ita ) --4 s.l rl 10 fl~ o e ffi C Ia) Cl U, ..~ “e ’4 U ) U ) 0 0 4 4 ’ 0 --4 0 ~ U uo, it £fl’4 ~C , ~ ~$4 U ) ~ O a ) ~ e4, e u C Ic OC i 4u 0 ”e 4 3 0 4 $4 --~ it o C irl ~ $4 43 it4 3 04 (1243 O $4 U ) ~ 0 rl o --4 ~ ,~ ‘O 43~C ) it 0 ”e e s.j u ‘O it a> a>t 04 “e 2 e ’4 1 0 ~ ~ a) e 4-404 -4 W a )0 C ~ s.l a>’O ~ -40 e ~ U) ea) o c io U) LO it W $ 4 N ~ El .-4 O e -~ 0 C i “-1 o -d ite s.I-4 ~ r4 0 ~ 4-410 ~ it > ~ it 43 U )C ) it-4 — s.j o it0 4 U) e E l ~ — W 1-4 >4z1-4 o43Elz4-4ti) fina)O-4x04 <‘4-4o’04La-4LOu)OrzLOouo‘OitN--4 rl--4 .0“-4U ) eU)u)oerlO$443eourla , “ecf)a>$4Orlitit43o2 o43 u z‘-4ti) (‘40‘4eno , ‘4 R esultados.163 grupo Ag 0,25/Ac 1). El efecto sobre plaquetas y eosinófilos se mantuvo (82 eosinófilos/pl sobre 43 del control, y 10,1 frente a 6,89 x 10~ plaquetas/pl en el caso de exceso de Ag> (F¡g. 60 a,b,c). Como puede verse las diferencias entre las dos proporciones de Ag/Ac son de escasa cuantía, lo que permite suponer que el efecto del fármaco no esté mediado por el complemento. Hemos constatado en el modelo de morfinadependencla (MFN>, una disminución de los niveles de COR, aunque pers~ten muy por encima de lo normal, Por otro lado, se mantiene el efecto propio del fármaco, con leves diferencias numéricas respecto al otro grupo de estrés, con disminución de eosinófilos, y aumento de las plaquetas (52 frente a 58 cél/pí, y 12,5 frente a 10,6 x 1 QS plaquetas/pi; en el modelo de exceso de Ac). El resto de los resultados pueden obtenerse de la Figura 60 c. La suma de estos dos efectos, dió como resultado un cuadro clínico más acelerado, pero con menor mortalidad (16,9 frente a 18,2 horas y 75% frente a 91,66% en el grupo Ag 3/Ac 2; 8,1 frente a 8,6 horas y 75% frente a 83,3% en el otro grupo>. El siguiente fármaco seleccionado es el Ac.Flufenémlco, otro antiinflamatorio con efecto sobre el sistema de complemento. El efecto de este fármaco difiere del anterior. En primer lugar hemos encontrado una reducción de los niveles de COR elevados en las situaciones de inmovilización (25,9 frente a 50,6 en los grupos de exceso de antígeno; y 45 frente a 51,3 en el otro grupo), y de morfinodependencia (42,5 frente a 173, y 62 frente a 171 en ambos modelos de PSA) 9. Sin embargo, en el modelo de Ag O,25/Ac 1 se reprodujo este efecto, aunque en menor cuantía. Esto parece deberse a la inhibición que dicho fármaco ejerce sobreel sistema de Complemento, que como hemos comentado previamente se ve implicado de una forma más directa en el modelo de PSA con exceso de Ag, y de hecho puede comprobarse un alargamiento similar de los TL~ en el grupo no Resultados.164 estresado (Fig. 60). Las variaciones en el número de plaquetas y eosinófilos son del mismo signo que en el caso del otro antinflamatorio ensayado, aunque con diferencias numéricas (Tabla X). En el ensayo con tlclopldlna se encontraron discretos incrementos de COR para todos los modelos ensayados (p= n.s.), con la consiguiente prolongación del TL~4,. Como era esperable, el recuento plaquetario disminuyó en todos los casos, aunque con diferente intensidad. Sin embargo, no pueden anotarse diferencias notables entre los dos tipos de reacciones PSA, producidas según la relación Ag/Ac, por lo que no parece mediar efecto alguno sobre el complemento (Fig 60 b y c). Resultados.165 30 20 10 ci -10 -20 -30 % Var. de COR loo * E 60 40¡ _ 20L-3 Dat 20 40 60 20 AF 3/2 u 1K 3/2 1K 0,25/1 AP 0,25/1 TO 3/2 TO 0,25/1 % var con, TLSO % de M Lo -2:KL[ Go 80 * MORFINODEP. * * 4. .J. .1. 1. 1K 3/2 1K 0,25/1 AP 3/2 AP 025/1 con &~TL50 EZJ%d.M * p 0,05 frente a grupo no tratado Fig. 60 .-Efecto de los tratamientoscon: ac. flufenámico (AP), indometacina(ID) y ticlopidina (TC), sobrelos parámetrosde unareacciónde PSA en ratonescontrol (arriba),y sometidosa estréspor inmovilizacióno morfinodependencia(abajo). lIC 3/1 lIC 0,25/1 AP 3/1 AP 0,25/1 % Ver, de TLSO, % de NI INMOVILIZACION 40 edl —20 .1- TO 3/2 TO 0,25/1 ResuJtados.166 it DISCUSION. Podemos considerar que las observaciones clínicas iniciales de que las situaciones de estrés podían asociarse a un aumento de la patología infecciosa y a una disminución de los sistemas de defensa del organismo, constituyen el punto de partida para el estudio de las interacciones neuro-inmunes. En nuestro trabajo, hemos pretendido obtener modelos experimentales que nospermitieran estudiar detalladamente aquellas alteraciones que las situaciones de estrás pueden producir en las respuestas inmunitarias; al mismo tiempo, hemos estudiado el efecto de distintos fármacos, en un doble intento de conocer mejor los mecanismos íntimos de comunicación neuro-inmune y su posible modulación farmacológica. De aquí, que los resultados obtenidos nos permitan establecer su discusión desde distintos puntos de vista, como son: a) los modelos experimentales utilizados; b> la resultante de la interacción entre la anafilaxia y el estrás; y c) las posibilidades de manipulación farmacológica. Vi.- DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES EMPLEADOS. Para comprender las alteraciones Inmunes, hemos realizado estudios celulares “ex vivci’, seleccionando parámetros inmunológicos capaces de reflejar la actuación de los diferentes grupos de células inmunocompetentes, mientras que los estudios “in vivd’, nos han permitido conocer el funcionamiento integrado de todo el sistema inmunitario, manteniendo intacto el eje neuro-inmune en el animal. Para ello, desarrollamos modelos normalizados de anafilaxiapasiva experimental, tanto a nivel sistémico (PSA) como cutáneo (PCA). La circulación y fijación de los inmunocomplejos en vasos y tejidos orgánicos no es consecuencia de un sencillo mecanismo de difusión, como se demuestra por la DiscusiÓn.168 imposibilidad de inducir cuadros patológicos mediante la simple administración pasiva de complejos Ag/Ac por vía endovenosa. Incluso cuando esto llega a ocurrir, el cuadro patológico es siempre muy benigno (COCHRANE y KOFFLER, 1973) y por tanto, no serviría para extrapolarlo a situaciones patológicas reales. Por tanto, hemos de producir dichos cuadros mediante la formación de inmunocomplejos ‘Vn vivd’; de aquí, el interes del modelo aplicado, en el que se ha estudiado la influencia de las proporciones Ag/Ac, puesto que es uno de los factores involucrados en el cuadro patogénico. Para el modelo de anafilAxia pasIva a nIvel altémlco (PSA) ensayamos dos tipos de antígenos, uno homólogo con albúmina bovina (BSA-antiBSA), y otro heterólogo con endotoxina de Bruceifa (EDTX) y suero de conejo antiEDTX, aprovechando la capacidad sensibilizante de esta molécula (en su fracción 5, según DIAZ y BOSSERAY, 1974). Como mencionamos en el capitulo de Resultados (Fig. 17), el cuadro producido por BSA-antiBSA precisó de dosis mayores de antígeno y desarrolló una presentación clínica más insidiosa, por lo que se seleccionó el modelo EDTX-antiEDTX. En este modelo PSA tuvimos en cuenta las variaciones de la respuesta en función de la estIrpe murína; estudios realizados previamente , que participan en la patogénia de enfermedades por inmunocomplejos (NEUWELT y CLARK, 1978). Es evidente que las proporciones obtenidas ‘Vn vftrd’, no se mantienen exactamente cuando se provoca este cuadro en el animal, pero hemos comprobado el desarrollo de un cuadro clínico diferente en cada una de las dos situaciones extremas. En la reacción PSA con exceso de anticuerpo (Ag O.25/Ac 1) se produce un cuadro clínico más agresivo, con un TL~ más corto y un índice de mortalidad mayor, esto es reflejo de una patogenia diferente, en la que posiblemente está implicada la no participación del Complemento. Los datos obtenidos en el tratamiento con Suramína, un ihibidor del Complemento, DiscusiÓn. 170 apoyan esta hipótesis. En efecto, el tratamiento no produjo apenas cambios en el caso de exceso de anticuerpo (Ag O,25/Ac 1), mientras que aumentó la agresividad del cuadro en el caso de exceso de antígeno (Ag 3/Ac 2), al bloquear el Complemento, reduciendo las diferencias entre las presentaciones clínicas de ambos cuadros (Tabla IX). Se ha estudiado esta reacción en diferentes razas de ratones y para diferentes edades (Fig. 18), seleccionando ratones BALB/c de 8 semanas, ya que los individuos de mayor edad han demostrado una disminución de actividad inmune que podría interferir en el estudio. Estos modelos, basados en la formación de inmunocomplejos, son fundamentales para estudiar mecanismos patogénicos de lesiones vasculares (DIXON y col.1961; KNIKER y COCHRANE, 1968) y permiten una mejor integración y control farmacológico clínico de distintas enfermedades (COCHRANE y KÓFFLER, 1973; WILLIAMS, 1980). No se conoce bien el mecanismo por el cual el sistema de histocompatibilidad H-2 esté relacionado con el nivel de Complemento, aunque sise sabe que el haplotipo H-2k tiene niveles de C4 y de C3 más elevados que los H-2d (FERREIRA y NUSSENZWEIG, 1975) y que existen diferencias entre el locus 55 deI H-2 que influyen en los niveles séricos de C4 (DEMANTy col.1973). Dentro de este modelo de anafilaxia se realizaron dos modalidades de ensayo: en una de ellas, se produce la reacción PSA en un individuo previamente estresado y en la otra se induce una situación de estrés en un individuo previamente sensibilizado, antes de desencadenar la reacción anafiláctica. Se ha trabajado, preferentemente, bajo la hipótesis de que la hipersensibilización precede al estrés, por considerarla de presentación más frecuente fuera del campo de la experimentación. Hemos pretendido, con estas dos versiones experimentales, encontrar diferencias atribuibles a la existencia de una comunIcación bkilrecclonal entre los sIstemas neuroendocríno e Inmune, taly como demostró TORRES-ALEMAN y col (1987) en ensayos “in vitrcY’ con esplenocitos estimulados por mitógenos. DiscusiÓn.171 En efecto, si recordamos lo referido en el capítulo de Introducción, existen evidencias experimentales de esta comunicación bidireccional, que siguiendo la revisión de WEIGENT y BLALOCK (1987) pueden resumirse en cuatro puntos: a) las celulas inmocompetentes pueden sintetizar hormonaspeptidicas neuroendocrinas biológicamente activas; b) poseen receptores específicos para péptidos opioldes y para otros peptidos; c) esos mediadores son capaces de modificar la respuesta inmune; y d) se han localizado receptores para linfoquinas en el SNC, y también marcadores de membrana, que son similares a los de determinadas células inmunológicas. En nuestro modelo, al igual que en el de KANETAy cols.Q 984), se ha observado que el máximo de respuesta dependía, en cierta medida, de la dosis del antígeno desencadenante del shock y del intervalo de sensibilización. Es posible que esto se deba al tipo de inmunocomplejo formado, y de aquí nuestro especial cuidado en seguir un protocolo experimental perfectamente normalizado. En cuanto al modelo de reaccIón anafiláctIca cutánea (PCA), se ensayaron igualmente ambos sistemas antigénicos, seleccionandose en este caso, la reacción homóloga BSA-antiaSA en la modalidad de sensibilización completa de la piel, tal y como propone OVARY (1958); de este modo obtuvimos lesiones cutáneas mas facilmente valorables, según queda reflejado en el capítulo de Resuitados (Fig. 20). También, en el estudio de este modelo, se valoraron diferentes parámetros de intervalo y secuencia del proceso experimental, seleccionando finalmente: inyección i.v. de suero antiBSA para, a los 4 días, inyectar el antígeno intradérmicamente y después hacer la lectura de la lesión dérmica a los 10 días, valorando la respuesta en función del diámetro de la lesión expresado en mm. Este modelo es semejante, en cuanto a posibilidades, al clásico modelo de PCA propuesto por MOTA y WONG (1969), utilizado también para estudios de modulación farmacológica de lg E por BAKER y cols (1981) (Figs. 18,19 y 20). En nuestro caso se estudiaron diferentes razasde ratones seleccionando, una vez DiscusiÓn. 172 más, la estirpe BALB/c, por presentar una lesión dérmica más facilmente valorable, para una dosis menor de Ag. En los ensayos posteriores, se utilizaron dos tipos de sensibilización: una sistémica, con inyección i.v. de BSA, y posterior administración subcutánea del anticuerpo; y otra local, con administración de ambas sustancias en un área dérmica concreta. De este modo intentamos buscar algunas diferencias fisio- patológicas que aportasen más datos sobre la interacción neuroinmune (Figs. 18,19 y 20). Para completar el estudio de los modelos seleccionados, con vistas a los ensayos posteriores, se estudiaron las varIaciones de los parámetros Inmunolágíco y de estés, en el desarrollo de ambas reacciones PSA y PCA. Ast hemos comprobado que las variaciones en los nIveles de corticosterona, un indicador bioquímico de estrés, son poco significativas a lo largo de ambos cuadros, aunque se ha detectado un aumento en las manipulaciones iniciales del modelo de PSA, que disminuye al originarse la reacción anafiláctica completa, reflejo posiblemente del inicio de una situación de fracaso orgánico (Fig. 21). En el caso de la anafilaxia cutánea (PCA), la inyección inicial del antígeno disminuye levemente los niveles séricos de corticosterona, con una elevación de los mismos al provocarse dicha reacción anafiláctica cutánea, como expresión de un cierto grado de estrés producido en el animal por los síntomas locales de dicha reacción , debido a una interacción competitiva entre estas, que se produce posiblemente a nivel de receptor. El efecto activador de la EDTX sobre las células ConA sensibles, se confirma al estudiar la producción de IL-2, aunque en este caso, la respuesta es más tardía, siendo patente a las 6 horas. El modelo BSA-antiBSA mostró para todos los casos una inhibición de intensidad variable. También hemos constatado una depresión ejercida inicialmente sobre células NI< (respuesta deI 78%), que va normalizandose progresivamente a lo largo del tiempo . En los estudios de actividad celular específica, hemos constatado una mayor afectación de lascélulas T, respecto de las 8. Sin embargo, si comparamos con el modelo de INM esta inmunodepresión es en conjunto mayor, correspondiendose con un nivel mayor de COR. Una vez más, la actividad de célulasT fue valorada por mitogénesis ConA- inducida. En cuanto a la producción de IL-.2, se observa una depresión hasta el 58% de actividad que se mantiene a las 24 horas (Fíg. 33). Este modelo presentó la depresión máxima en la respuesta a ConA, alcanzando hasta un 22% de la respuesta control, para mostrar posteriormente una tendencia hacia la normalización (Fig. 30). En este caso, la máxima inhibición se produjo a las 24 horas, a diferencia de lo ocurrido en la INM que mostraba el máximo a los 30 minutos. Esto parece ser debido a que la supresión del estrés en el modelo INM es inmediata, mientras que tras retirar el “pelle!’ de morfina, persisten niveles circulantes de esta sustancia, por lo que no se consigue unadesaparición inmediata del agente estresante. En la literatura se ha descrito un efecto dIrecto sobre los lInfocitos T, reflejado en la respuesta a ConA tras la administración de una dosis única de morfina, que parece ser dosis dependiente, y que coincide con el nivel máximo de biodisponibilidad de morfina (BAYER y FLORES 1991). Esto hablaría en favor de un efecto mediado por receptores opioides; sin embargo, este efecto no es revertido por Nx, y como hemos comprobado en DiscusiÓn.185 este trabajo> se mantiene también en administraciones crónicas de MFN, no coincidiendo necesariamente con un nivel sérico máximo de la droga (BRYANT y col. 1 988c), pareciendo correlacionarse con niveles más elevados de COR. Todo ello hablaría en favor de un efecto a nivel central . Este efecto seria explicable por los niveles elevados de COR . En nuestro estudio, la inducción de un síndrome de abstinencia con Nx, que aunque conlíeva un mayor estrés, implica simultaneamente un efecto antagonista de MFN a nivel receptores específicos, se asocia a una mayor depresión de estas células citotóxicas. No obstante, si valoramos los resultados tras dos semanas de estrés, esta correlación entre COR y depresión NK, no se mantiene claramente. En efecto, si consideramos los resultados de las figuras 32 y 35, no podemos establecer una correlación directa entre los niveles de corticosterona y la actividad NK Estos resultados, implicarían una regulación más compleja para este grupo celular, en la que participarían, tanto elementos receptoriales de las propias células, como factores de un nivel superior correspondiente a una regulación neuroinmune (IRWIN y col.1987; KATZ y col. 1985>. En cuanto a la repercusión sobre otros grupos celulares implicados en reacciones de anafiláxia, los eosínófilos sufren una inhibición máxima en las situaciones de morfinodependencia, presentando el recuento celular más bajo de todos los modelos; DiscusiÓn. 187 mientras que el número de plaquetas se eleva discretamente, aunque estas pequeñas variaciones podrían carecer de significación clínica. Existe alguna evidencia de que las plaquetas humanas podrían tener receptores opioides, pero estos datos no estan aún suficientemente contrastados (MEHAISHI y MILLS 1983). Cuando estudiamos el desarrollo de un síndrome de abstinencia mediante la administración de naloxona (Nx), encontramos una brusca elevación de los niveles de COR, reflejo del gran estrés que acompaña al cuadro clínico de este síndrome (Fig. 13). Por este motivo, esperabamos una potenciación de los efectos inmunosupresores observados en los animales monino dependientes, como se había constatado en la actividad NK (Fig. 35), con una disminución marcada de su actividad coincidente con aumentos en el nivel de COR; sin embargo, esta correspondencia no se mantiene al prolongar la situación durante dos semanas, según se ha comentado previamente. No pudo comprobarse una clara correlación en todos los parámetros analizados. Así, al considerar los resultados de la mitogénesIs intrínseca (en PBS), se observa una inmunorrestauración debida a la Nx; efecto que no aparece al añadir Nx al grupo control y que, por tanto, no puede considerarse dependiente de un efecto intrínseco del fármaco. Estos resultados apuntan a que este efecto de la MFN sobre los esplenocitos, podría deberse, al menos parcialmente, a un mecanismo de interacción directa receptor-ligando. En la literatura se encuentran resultados contradictorios sobre este punto, y mientras algunos autores afirman una reversibilidad parcial de este efecto inmunodepresor de la MFN, otros reportan la no reversibilidad con Nx (SHAVIT y col. 1986). En cualquier caso, es necesario continuar estos estudios para aclarar esta interacción. En la mitogénesis de células 8, se produce una recuperación de los niveles de respuesta, previamente deprimidos por la MFN, que también se muestra en los grupos control. La respuesta mitogénica de células T, valorada por ConA y 2011, presenta una inmunorrestauración variable, más patente en los ensayos con dosis bajas de mitógenos. DiscusiÓn.188 Tan sólo en el caso de ensayos con 1 pg de ConA y una semana de estrás, se pudo demostrar este efecto al administrar Nx a ratones no morfino dependientes, sin que aparezcan diferencias en el resto (Fig. 31); por tanto, no podemos concluir si este efecto es debido a la acción directa del fármaco, o implica otros sistemas de autorregulación. En los estudios realizados con dos semanas de estrás, quedó patente, una vez más, cómo la Nx disminuía el efecto inmunodepresor de la MFN, especialmente para las células 1, no pudiendo demostrarse ningún efecto sobre los grupos control. En cualquier caso, el sencillo modelo teórico: estrás, seguido de elevación de corticoides, y la consiguiente inmunodepresión, no parece ser la única explicación de nuestros resultados. Nos encontramos con que la Nx provoca un nivel de estrés mas acusado y un nivel más elevado de COR; pero que, en contra de lo esperado, se produce una corrección parcial de la inmunodepresión debida a la MFN. Esto hablaría en favor de un efecto directo de la morfina, mediado por receptores opioides, a nivel de células inmunocompetentes y, por tanto, potencialmente reversible por antagonistas específicos en un corto espacio de tiempo. Es lógico pensar que, en este modelo de estrés, se acumula el efecto de la MFN al del estrás neurologico, con un nivel de OCR elevado, tal como quedó demostrado en el modelo de INM; pudiendo existir, además, una acción directa sobre los receptores opioldes específicos, que sería antagonizada por Nx. El corto espacio de tiempo trascurrido entre la brusca elevación de COR y las determinaciones celulares, puede explicar la falta de efecto del factor corticoideo. Queda por dilucidar el posible efecto directo de la Nx , puesto que en determinados ensayos, también se han encontrado variaciones en los grupos control tratados. Los modelos utilizados para la valoración de la respuesta anafiláctica , resallan la importancia del neocórtex (punto de partida de la reacción de estrés neuropsiquico) en la respuesta inmune. Para este ensayo, se emplea un protocolo similar al del del fármaco anterior, con una dosis que se ajustó en 25 mg/Kg de peso. Los resultados obtenidos muestran un efecto estimulante intrínseco del fármaco sobre los llnfocltoeT (Fig. 53>. Este efecto no parece estar mediado por el eje hipotálamo- hipófiso-adrenal, puesto que se corresponde con niveles elevados de CON circulante a DiscusiÓn. 192 pesar del tratamiento (Fig. 54>. Así, el modelo de INM, que mostraba una buena correspondencia entre el nivel de estrás alcanzado y la inmunodepresión (especialmente de linfocitos T), presenta una corrección parcial de este efecto al emplear el DIC. Los ensayos ‘Vn vivo” muestran igualmente unamodificación del TL~, que disminuye al originarse una mayor actividad inmunológica, que se corresponde con unos niveles de COR elevados. Parece que el efecto del DIC. a través de neocórtex, es de mayor intensidad que el mediado por COR, pues consigue corregir las alteraciones inmunitarias en presencia de niveles elevados de corticosterona. El modelo de morfino-dependencla, que mostraba una complejidad mayor en los estudios de apartados anteriores, parece más sensible al efecto del DIC en nuestros ensayos “ex vivo» (Fig. 53); sin embargo, en la reacción PSA, no se producen modificaciones en cuanto a la duración del cuadro. Estas variaciones se desarrollan en presencia de niveles de COR elevados, lo que refuerza la hipótesis anteriormente explicada, así como la idea de que existe una mayor complejidad en la regulación de este modelo de estrás. Las diferencias debidas a las proporciones de Ag/Ac son de caracter cuantitativo, y poco significativas, como cabe esperar por los motivos expresados previamente para el primer grupo de farmacos. O) El siguiente grupo de fármacos está integrado por reguladores del sistema serotonérgico, histaminérgico, y por el cromoglicato, que se ha incluido en este apartado por su implicación en fas reacciones inmunológicas mediadas por hipersensibilidad. Considerando en primer lugar los fármacos antihistamínicos , vemos que la CIMETIDINA es un agente anti-H2 de primera generación, cuyo uso principal es la regulación de la secrección gástrica, no existiendo referencias claras sobre un efecto regulador primario del sistema inmune. Sin embargo los efectos centrales reportados, debidos a la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica, tanto a nivel neurológico (somnolencia), como endocrino (aumento en la producción de prolactina), hacían esperar DiscusiÓn. 193 algún efecto sobre la regulación neuroinmune. Así, encontramos en el modelo de INM un aumento de la mitogénesis inducida, que llegaba a superar los valores previos a la acción inmunosupresora del estrés (ConA 111%, LPS 100% respecto al control sin estrés). Esto concuerda con el aumento de inmunidad celular, especialmente en pacientes inmunodeprimidos en los que se usó este fármaco (PLAUT y cols. 1982). Este efecto no parece debido a la mediación adrenal, pues los niveles de COR no sufrieron variación. En el ensayo de anafilaxia (PSA>, no se observó potenciación o mejor funcionamiento del sistema inmune, comprobándose un TL~ más prolongado. Otros autores han descrito efectos de la histamina sobre celulas inmunitarias mediadas por receptores H2 y con una disminución de la producción de mediadores celulares e inmunoglobulinas, así como una menor actividad de neutrófilos (GANELLIN y col 1982). Estos resultados podrían explicarse también por la persistencia del estimulo del estrés. En el modelo de MFN se obtuvieron resultados con unacierta dispersión que no permiten una interpretación fiable. La TRIPELENAMINA, dentro del grupo de las etildiaminas, fue seleccionada por su especificidad y ausencia de efectos centrales, aunque algunos ensayos reportan somnolencia como efecto secundario. Nuestros resuitados muestran una estimulación de la mitogénesis ConA- y LPS-inducidas que, en el caso de la inmovilización, alcanza los valores previos a la situación de estrés, y en la morfinodependencia queda algo por debajo de los valores control, aunque se comprueba la tendencia hacia una inmunorrestauración (Figs. 56 y 57). Los niveles de COR permanecieron por encima de los valores normales, como era de esperar en un fármaco sin efectos neuroendocrinos. Las pruebas de anafilaxia demostraron una corrección de la actividad inmunológica (con valores de TL~ más cortos> en ambos modelos de estrés y coincidiendo estos resultados con los obtenidos en los ensayos ‘ex vivo”. La CLORFENIRAMINA se seleccionó por su potente acción y por la abundancia de DiscusiÓn.194 efectos centrales, reportados en los ensayos clínicos como efectos secundarios. Sin embargo, en contra de lo esperado, no hubo efecto detectable sobre el estrés, manteniendose sin cambios los niveles de COR. Hubo un leve incremento en la mitogénesis intrínseca, pero sin que se observaran variaciones en los ensayos mitógeno- inducidos. En los estudios de anafilaxia se detectó un aumento de la mortalidad, incluso previo al desencadenamiento de la reacción de PSA (tres animales de doce>; esto hace que el acortamiento del TL~ en los restantes grupos experimentales sea poco valorable. Estos problemas nos hicieron desistir de ensayarlo en el modelo de morfinodependencía. La CIPROHEPTADINA se seleccionó por su efecto antiserotoninérgico, asociado a un efecto anti-histamínico, y a una cierta acción dopaminérgica. Se ha descrito un aumento de la secrección de hormona del crecimiento (GH) para explicar alguno de sus efectos indeseables (HO y col. 1982) Nuestros resultados obligan a pensar en un doble efecto, ya que por un lado parece disminuir el nivel de estrás, con niveles de COR más bajos que los grupos no tratados; y por otro, presenta un efecto inmunodepresor a nivel celular. El primero puede explicarse por la inhibición del efecto serotonínico sobre la hipófisis, ya que algunos autores refieren un aumento en la producción de ACTH debido a serotonina, (KRIGE y col 1978). Los animales tratados con ciproheptadina presentaron unaclara disminución de la blastogénesis intrínseca, y de la mitogénesis en células sensibles. La mitogénesis ConA- inducida, que es la más afectada por el estrás en ensayos previos, continúa deprimida a pesar de la disminución de COR, en consonancia con los otros grupos celulares. Esta depresión no dependiente de los niveles de COR se corresponde con una prolongación del TL50 en los ensayos de PSA. D) El último grupo de fármacos, cuyos resultados se resumen en las Figs. 60 a, b, y c; y en la Tabla IX, incluye inhibidores del Complemento (Suramina), inhibidores de la DiscusiÓn.195 acción plaquetaria (Ticlopidina) y antiinflamatorios (Indometacina yAcido flufenámico). Este heterogéneo grupo reune fármacos cuya única característica común es el hecho de actuar sobre el brazo eferente del sistema inmune, y se seleccionaron buscando electos en el último eslabón de la interacción neuro-inmune, asi como variaciones en su mecanismo de acción al encontrarse el sujeto bajo una situación de estrás. El tratamiento con SURAMINA nos permitió confirmar la hipotesis de que la diferente manifestación clínica de los dos modelos de PSA era debida al sistema de Complemento, yaque con exceso de Ag (Ag 3/Ac2) se producen inmuno-complejos de pequeño tamaño, aclaramiento rápido y con activación del Complemento (a diferencia de lo que ocurría en la proporción Ag O,25/Ac 1). En el modelo de PSA correspondiente, se produce un cuadro con un TL~ más prolongado que en el otro grupo. Al aplicar el tratamiento con suramina en ambos modelos de PSA, se produce un acortamiento del TL~ en el grupo de exceso de Ag, que casi iguala al del modelo con exceso de Ac (que no se ve practicamente afectado por el tratamiento). De esta forma se comprueba que cuando se bloquea el Complemento, la presentación clínica en ambos modelos se asemeja bastante. Estos resultados confirman la hipótesis inicial, y refuerzan la existencia de dos modelos de PSA con diferente patogenia. Este efecto se observó también en el grupo de ratones inmovilizados sin que se produjeran cambios en la concentración sérica de OCR. Esta homogeneidad de resultados hizo que no se ensayara en el grupo de morfinodependencia. En los tratamientos con TiCLOPIDINA, no presentó resultados de interés, ya que en todos los grupos ensayados se constató una disminución del recuento plaquetario, sin cambios ni en los niveles de OCR, ni en los parámetros de PSA. Del mismo modo no pudo demostrarse diferencia en su acción debida al estrés. En el tratamiento con los dos agentes antiinflamatorios, obtuvimos diferentes resuitados para ambos. Así, el ACIDO FLUFENAMICO produjo una disminución en los DiscusiÓn. 196 niveles de COR, especialmente en los grupos de mayor estrás (Fig 60 a, b, y c). Sin embargo, en la literatura revisada no se han encontrado antecedentes que justifiquen este efecto, aunque algunas publicaciones refieren cambios en la secreción de hormonas hipotalámicas tras la ingesta de antiinflamatorios. Por otra parte, se comprobó el efecto inhibidor del fármaco sobre el sistema de Complemento, al presentar una acción similar a la de la suramina. Provocando una disminución del TL~ en uno de los grupos experimentales de anafilaxia en que se ensayé (Ag 3IAc2); tanto en el grupo con estrás por de inmovilización, como en el grupo sin estrés. Esta acción cualitativamente similar a la de la suramina, aunque menos intensa, había sido descrita previamente en nuestro Departamento (PORTaLES, 1989>. En el grupo de morfinodependencia se comprobaron niveles de COR disminuidos respecto al grupo no tratado; pero aún así, éstos siguen siendo muy superiores a los del grupo control. La INDOMETACINA, por su parte, produjo una elevación de COR en todos los grupos excepto en el de morfinoependencia que presenta resultados paradójicos. No hemos podido encontrar información sobre este efecto en la literatura revisada. Sin embargo cabe suponer, por la farmacocinética de esta sustancia, que este efecto sea más periférico que central, puesto que por su alta afinidad con las proteínas séricas, traspasa con dificultad la barrera hematoencefálica (GOODMAN, 1986). Se han descrito elevaciones de la concentración sérica de COR, con otros fármacos antiinflamatorios del tipo salicilato (GOODMAN, 1986 b), pero no con esta molécula. En cuanto a la presentación del cuadro clínico en la reacción de PSA, no se observan diferencias entre los grupos con exceso de Ag o Ac, ya que este fármaco no parece tener efecto selectivo sobre el Complemento. En el modelo de inmovilización se observa una prolongación del TL~ con disminución del índice de mortalidad, consecuencia de su efecto antinflamatorio directo, reforzado por el aumento de inmunosupresión DiscusiÓn. 197 secundaria a una situación de estrás (elevación de los niveles de COR>. El modelo de MFN tuvo de nuevo un comportamiento paradójico tras la utilización del fármaco, lo que revela una regulación más compleja del mismo. D¡scusiáo.198 VI. RESUMZN Y CONCLUSIONES. 1.- El modelo de inmovilización establecido, resulta incruento y normalizable, es capaz de producir un cuadro de estrás experimental repetible y cuantificable comportamental y bio- químicamente. En esta situación se origina una inmunodepresión de carácter generalizado que afecta básicamente, a la regulación de la respuesta inmune a nivel celular. 2.- También puede originarse una situación de estrás mediante la instauración de morfino- dependencia, que se agudiza al inducir un síndrome de abstinencia; y que, en cualquier caso> produce una inmunodepresión más intensa que la originada por inmovilización, y se relacciona con la dosis y pauta de administración de dicha droga. 3.- La inmunodepresión subsiguiente a las situaciones de estrás aquí descritas, son de intensidad variable y afectan, fundamentalmente, a los linfocitos T cooperadores CD4~ y a la actividad estimuladora de la IL-2. También resulta afectada la citotoxidad no mediada por anticuerpos; mientras que el efecto sobre los linfocitos B es consecuencia de las alteraciones en la cooperación celular T-B. 4.- Las respuestas de anafilaxia pasiva sistémica aquí estudiadas, presentan una diferente fisiopatología en función de la relación Ag/Ac, que hace posible la participación o no del Complemento. Sin embargo, las reacciones cutáneas salo permiten detectar alguans variaciones cuantitativas. 5.- La inmunodepresión originada en situaciones de estrás, condiciona una disminución en la agresividad de los cuadros anafilácticos, reflejo de una menor reactividad de los linfocitos T y de una disminución del número y función de eosinófilos. Conclusiones.200 6.- La interacción neuro-inmune en situaciones de estrás, cursa con una inmunodepresión de similares características sea cual fuere el origen del agente estresante. Sin embargo se observan algunas diferencias: as~ en el caso de morfinodependencia, parece existir una regulación multifactorial mas compleja que implica tanto al eje neuro-endocrino, como a interacciones receptor ligando en células inmunocompetentes. 7.- La modulación de estas interacciones puede conseguirse: a) mediante tratamientos con eleuterósidos, que parecen intervenir directamente en los mecanismos neuroendocrinos de estrés, a nivel de mensajeros secundarios; b) actuando con inmunomoduladores sobre el neo-córtex, consiguiendo una restauración de la respuesta inmune por mecanismos que parece no implicar el eje hipofiso-adrenal. a- En cuanto al resto de los fármacos ensayados: a) los tratamientos con anti-histamínicos y antiserotonérgicos, según nuestro protocolo, no parecen intervenir en la comunicación neuroinmune, aunque se observan efectos sobre el mecanismo inmunitario; b) los tratmientos con antiinfalamatorios, pese a su capacidad de intervenir en la activación del Complemento y en el brazo efector de la respuesta inmune, no parecen interferir con el mecanismo de inmunodepresión secundario al estrés. Conclusiones.201 vn. BIBLIOGRAnA. AKIL, H., WATSON, S.J., YOUNG, E., LEWIS, M.E., KHACHATURIAN, H. y WALKER, J.M.- Endogenous opioids: biology and function. Aun. Rey. Neurosci. 7, 223 (1964). ALLEN J.P., ALLEN, C. E., GREER, M.A. Y JACOBS, J.J. -Stress-induced secrection of ACTH. En: ‘Brain-pituitary-adrenal interrelactionships’ A.BRODISH (Ed.) Karger, Basel. 99- 127 (1973>. AMIR, 8., BROWN, Z.W. y AMIL, Z.-The role of endorphins in stress: evidence and speculations. Neurosci. Biobehav. Rey. 4, 77-81 (1980). AMIR 8. Anti-anaphylactic actión in the mouse of thyrotropin-releasing hormone 13 mediated through beta-l-adrenoceptive effectors. Neurosci. Leff. 46, 127-1 30 (1984). AMIR, 8. Beneficial effects of i.c.v. naloxone in anaphylactic shock is mediated through peripheral beta-adrenoceptive mechanisms. Brain. Res. 290,191-194 (1984 a>. AMIR, 5., Y REE, J. M. Beneficial effect of t-endorphin-typr peptides in anaphylactic shock. Brain Res. 329, 329-333 (1985). 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INTRODUCCIÓN ORGANIZACIÓN ANATÓMICA DEL ESTRÉS SIGNIFICACIÓN BIOLÓGICA DEL ESTRÉS EFECTOS DEL ESTRÉS SOBRE LA INTERACCIÓN NEUROINMUNE NEUROINMUNOMODULACIÓN EN CUADROS DE HIPERSENSIBILIDAD Y ANAFILAXIA. SU VARIACIÓN EN SITUACIONES DE ESTRÉS MODIFICACIONES FARMACOLÓGICAS DE LA INTERACCIÓN NEUROINMUNE EN CUADROS DE ANAFILAXIA SOBRE LAS POSIBIUDADES DE MODELOS EXPERIMENTALES ADECUADOS II. OBJETIVOS DELTRABAJO III. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MEDIOS TÉCNICAS Y MODELOS EXPERIMENTALES ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS IV. RESULTADOS ESTUDIO DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES RESPUESTA INMUNE EN SITUACIONES DE ESTRÉS MODULACIÓN FARMACOLÓGICA DE LA INTERACCIÓN NEUROINMUNITARIA EN SITUACIONES DE ESTRÉS V. DISCUSIÓN DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES EMPLEADOS ALTERACIONES INMUNOLÓGICAS PRODUCIDAS POR ESTRÉS EN EL MODELO DE INMOVILIZACIÓN VARIACIONES DE LA RESPUESTA INMUNE DE RATONES SOMETIDOS A SITUACIONES DE ESTRÉS POR MORFINODEPENDENCIA MODULACIÓN FARMACOLÓGICA VI. RESUMEN Y CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA