UniversidadComplutensede Madrid FacultaddeCienciasBiológicas Madrid 1996 iIIDIIInIflhflt53o96o7265~ UNIVERSIDAD CaMPLUTENSE Efectosdel estréscrónico y de la actividad glucocorticoidesobre el crecimiento: modificaciones en el esqueletocraneal de la rata Maria JoséGonzálezAbad ARCF9IVO MaríaJoséGonzález-Abad 7 Los Directores GonzaloJ.Trancho EstaTesisDoctoralha sidorealizadaen el Departamentode Biologia Animal II (Fisiología) de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutensede Madrid, bajo ladirecciónde los Dres.Adelina GamalloAmat y GonzaloJavierTranchoGayo,ProfesoresTitularesdeUniversidad. Siempre desee llegar a esta parte porque pensaba que supondría el final de un trabajo que ha resultado muy duro y, en ocasiones, desesperante. Ahora que escribo estas palabras la verdad es que los momentos dificiles ya no lo parecen tanto y hasta me atrevería a pensar que han sido ellos Los que me han ayudado a proseguir y los que han forjado el carácter de este trabajo. Nadie sabe tanto de esto como mi Directora, la Profesora Adelina GamalloAmat, la persona que ha estado en todo momento a mi lado. Ella ha sido la que me ha forjado a mi, la quecon cuidado,perofirmemente,meha ido dandoforma y la que ha sido tan inteligente como para hacerlo sin pretender cambiarme. Gracias, Chiky, por tu valía profesionaly personal, esta Tesiste la dedico especialmentea ti, a una mujer “de bandera”de la que me sientoorgullosade tener por MAESTRA. Mi sinceroagradecimientoa mi Director, el ProfesorGonzaloTrancho Gayo,quién meha aportadoreflexión y lucidezen los momentosde duda. Quién meha hecho recapacitarmásde una vezy ha calmadomis nervioscon su pacienciainfinita. Graciasportu experienciay portu asesoramientoen estetrabajo.Tambiénpor intercederentrela Informática y yo (espúblico queno nosllevamosnadabien). El másgrato de los recuerdospara mi compañero,el Dr. PedroMario, porque siempre he contadocon tu ayuda. Por el trabajo y los buenos ratos que hemos compartido,queno te imaginaslo muchoquehe echadode menos.Asimismo, quiero agradecer a mi compañeraElenaSánchezsu sonrisay buenhumor en todoslos momentosquepasamos juntas. A Inmaculada López le agradezco su ~~insistencia”conmigo a pesarde que a veces no soy demasiado sociable. Gracias por brindarme tu amistad, por tu interés y consuelo siempreque lo he necesitado. Mi agradecimiento a todos los integrantes del Departamento de Biología Animal TI (Fisiología), por su cariñosaacogida cuandoentré a formar parte de ellos y, posteriormente, por su compañerismo y trato afable. Particularmente, a las Profesoras Mercedes Alonso, Mónica de la Fuente y Rosa M~ Arahuetes, quienes como directoras del Departamento, desde mi incorporación, siempre me proporcionaron ayuda. Deseo agradecer a la Profesora M» Paz Nava sus desvelos por mí y su constante seguimiento de ¡a marcha de este trabajo. Yo también he podido observar de cerca tu dedicación y esflierzo. Gracias por tu ejemplo. A la Profesora MS Angeles Villanúa quiero agradecerla su interéspor mi trabajo y el cariño que siempre me ha demostrado y, especialmente, el que profesa a una persona muy cercana. A mis padres y a mi hermana, que todavía no se lo creen, les agradezco absolutamente TODO. No hay palabras y si un millón de besos. Bueno, Gonzalo,sólo quedastú. Te he dejado para el final porque a ti te debo los peores momentos de esta Tesis. Pero como ya dije al principio, esos son los mejores. Tú me entiendes. GRACIAS. ‘“-A -t. INDICE INDICE LISTA DE ABREVIATURAS 1. INTRODUCCION 1 1. Estréscrónicoy SíndromeGeneral de Adaptación 1 1.1. Activación del ejeHHA por el estrés 6 1.2. Característicasfuncionalesde los glucocorticoides 13 1.2.1.Efectosfisiológicos 16 1.2.2.Accionesfarmacológicas:dexametasona 20 ¡ .3. Efectosde la activación del eje 1-IHA sobrelos sistemasnervioso, endocrinoeinmune . 21 2. Crecimientoy desarrolloóseo . . 28 2.1. Componentesy estructuradel tejido óseo 28 2.2. Desarrollo,patronesde crecimientoy metabolismoóseo 32 2.3. Acción muscularsobreel metabolismoóseo 36 2.4. Regulaciónendocrinadel metabolismomineralen el hueso 38 2.4.1. Efectosdela paraihormonay de la vitaminaD 41 2.4.2. Regulaciónporcalcitonina 43 2.4.3. Participaciónde hormonasno directamenterelacionadas con el metabolismomineral 44 2.5. Efectos ambientalessobre el metabolismo del hueso: estrésy alteracionesóseas 47 II. ANTECEDENTES, 1-LIPOTESIS Y OBJETIVOS DEL TRABAJO: justificación del diseñoexperimental 58 1. Referenteal animal 58 2. Referentea los órganos . . 61 3. Referenteal esqueleto 63 III. METODOLOGíA .... . 68 ¡ Material biológico 68 2. Diseñoexperimental . . 69 2.1. Tratamientos . . 69 2.2. Procedimiento 70 2.3. Parámetrosa estudiar . . 70 3. Obtenciónde muestrasbiológicasde los animales 71 3. 1. Muestrasde sangrey plasma 71 3.2. Muestrasde órganosy craneos 72 4. Estudiodel desarrollode los órganos 72 5. Técnicacraneométrica 73 6. Técnicasanaliticas 79 6. 1. Valoraciónde corticosteronaplasmática 79 6.1.1. Reactivos específicos 79 6. 1.2. Extracción de corticosterona 80 6.1 3 Reacción antígeno-anticuerpo 81 614 Separación de las fracciones ligada y libre . . 82 6.1.5. Características del RIA 83 6.2. Valoración de ácidosnucleicos 83 6.2.1. Reactivos específicos 83 6.2.2. Extracciónde los ácidosnucleicos 84 6.2.3. Valoraciónde ADN .. 84 6.3. Valoraciónde proteínastotales 85 6.3.1. Reactivosespeciticos 85 6.3.2. Determinaciónde proteínas 86 6.4. Valoraciónde los constituyentes minerales del hueso 86 6.4. 1. Preparacióndelas muestras 87 6 4 2. Determinaciónde macroy microconstituyentes 87 6.4.2. 1. Patrones para la determinación de macro- constituyentes 88 6.4.2.2. Patrones para la determinación de micro- constituyentes . 89 6.4.2.3. Cálculo de concentracionesde las soluciones interferentes 89 7. Análisis estadístico 90 7.1. Estadísticadescriptiva 90 7.2. Test estadísticos 90 7.2.1. Análisis univariante 90 7.2.2. Análisis multivariante 91 ANEXO 1. Reactivosespecíficos,hormonasy anticuerpos 92 ANEXO 11. Aparatos 93 IV. RESULTADOS Y DISCUSION 94 1. Actividad adrenal 94 1. 1. Nivelesde corticosteronaplasmática . . 95 2. Crecimientoy desarrollode los animales 99 2. 1. Gananciade pesoacumuladay evolucióntemporaldela gananciade pesocorporal 99 2.2. Modificacionesen la distribuciónde lagrasasubcutánea 103 2.3. Posiblesefectosde la ingestade comida 107 2.4. Dimensionescorporales 113 3. Alteracionesdel desarrollo de los órganos 119 3.1. Alteracionesen el pesode los órganosy su incidencia en el peso corporal . .. 120 3.2. Alteracionesen el crecimientodelos órganos 129 4. Craneometría . . . 148 4.1. Variablescraneométricase indices:estudiounivariante 148 4.2. Estadísticamultivariantede lasvariablescraneométricas 186 4.2.1. Análisis factorial: análisisdecomponentesprincipales . . . . 187 4.2.2. Análisis discriminante 210 5. Alteracionesen el contenidodemacroy microconstituyentesdel hueso 217 S.l. Constituyentesminerales 217 5.2. Estadísticamultivariantede los constituyentesmineralesdel hueso . 237 5.2.1. Análisis factorial: análisisdecomponentesprincipales . . . . 238 V. DISCUSIONGLOBAL 249 VI. CONCLUSIONES 261 VII. BIBLIOGRAFíA 265 ABREVIATURAS ACTH: Hormonaadrenocorticotropa. ADN: Acido deoxinibonucleico. AMPc: 3’- 5’Adenosinmonofosfatocíclico. Acido ribonucleico. ARiNm: Acido ribonucleicomensajero. At: Tubosde actividadtotal del RIA. ATP: Adenosintrifosfato. Bo: Tuboscerodel RÍA. BSA: Albúmina séricabovina. CBG: Globulinatransportadorade corticosteroides. CRH: Hormonaliberadoradecorticotropina. dB: Decibelio. dimetilPOPOP: 1,4 di(2-(4-metil 5-fenil-oxazolil)benceno). dpm: Desintegracionesporminuto. ds: Desviación estándar. e: Errorestándar. EDTA: Acido etilendiaminotetraacético. FSH: Hormonaestimulantedel folículo. GABA: Acido gamma-aminobutírico. GC: Glucocorticoides. GH: Hormonade crecimiento. GnRI-t: Hormonaliberadorade gonatropinas. HHA: Hipotálamo-hipófisis-adrenal. HHG: Hipotálamo-hipófisis-gonadal. HHT: Hipotálamo-hipófisis-tiroideo. Hz: Herzio. íCP-AES Espectrometriade emisión porplasmade acoplamientoinductivo. KMO Kaiser-Meyer-Olkin. II Interleuquuia. LH: Hormona luteinizante. mmFlg: Milímetros de mercurio. MIF: Factorinhibidor de la liberaciónde MSH. Microcurio. MSH Hormonaestimulantedel melanocito. N Tubos residualesdel RíA. NADPH Nicotín-adenosín-difosfatoreducido. pc: Pesocorporal. PIF: Factorinhibidor de la liberaciónde prolactina. PPO: 2.5 difenil oxazol. PRF: Factorliberadorde prolactina. PRL: Prolactina. PTH: Parathormona. RIA: Radioinmunoanálisis. rpm: Revolucionesporminuto. sc: Inyección subcutánea. SGA: SíndromeGeneralde Adaptación. SNC: Sistemanerviosocentral. SNS: Sistemanerviososimpático. TSH: Hormonaestimulantedel tiroides. UI: Unidadesinternacionales. VIP. Péptidointestinal vasoactivo. vs: Venus Mediaaritmética. Watio u ¡ u u u E E u ¡ E u ¡ E ¡ E 1. INTRODUCCION E E u u u 3 1. INTRODUCCION 1. ESTRESCRONICOY SINDROMEGENERALDE ADAP’I’ACION Cuandoemprendemosel estudiode un servivo, no podemosdesligarlo del medio ambienteen el que se encuentrainmerso.Si algo caracterizaa éstees que fluctúa constantementey en consecuencialos individuos han de estarcapacitadospara respondera estasfluctuacionesrealizandoajustesinternosrápidos. Esta necesidadsehabríahecho más apremianteparalos vertebradosen su adaptacióna la vida terrestreya que las condicionesde estehabitatsonmásrigurosasy variables. Porotraparte, resultalógico pensarqueuna complejidadcrecientedebe ir acompañadapor un incrementoparalelo en la sensibilidadde los mecanismosinternosde control y de regulación.En estecontexto,el ambienteexternocomprendenumerososagentes potencialmenteperturbadoresfrentea los cualesno sólo son precisosmecanismosde ajuste rápido del medio interno sino que, además,sehacenimprescindiblesaquéllosque permitanla supervivenciadel individuo, condicionadatanto por la severidadde dichosagentescomo por las interaccionesque seestablezcanentreestosy la capacidaddel individuo paraadaptarsey mantenersu homeostasis.Por consiguiente,sehacenecesariala combinaciónde respuestas rápidascon mecanismosreguladoresa largopíazo,en funciónno sólo de la naturalezasino de la duraciónde la perturbaciónambiental. El conceptode honicostasisse debe al fisiólogo Claude Bernard (Lain Entralgo,1978). Sin embargo,Ibe WalterCannon(1914, 1935) quiénno sóloacuñóel término “homeostasis”,sino quién introdujo también la primera definición de estréscomo “todo agentecapazde inducir unarespuestaen el mecanismohomeostáticodel cuerpo”. Sus experienciaspusieronde manifiestola importanciadel sistemanerviososimpático(SNS) y de la liberación de las catecolaminasmeduloadrenalesen respuestaa diversos “agentes estresantes”,ya sean estostanto estímulosfisicos como sucesospsíquicoso emocionales. Estascatecolaminaseran puesesencialespara desarrollarlas estrategiasde luchao de huida —1— —— Iú’iré.’~ crónica actividadglucocoriicaftle y crecimiento —— ante las situacionesde emergencia.Cannon observóque el grado de respuestaobtenido guardabauna relaciónproporcionalcon la intensidaddel estímuloestresantehastaun punto por él denominado“nivel critico de estrés”,a partir del cual los mecanismoshomeostáticos eranincapaces de restaurarel funcionamientonormaldel organismo. Posteriormente,el endocrinólogo Hans Selye (1936) observó la existenciade una respuestafisiológica más amplia y de índole general frente a situaciones agresivasque abarcabantodos los campos,desdetraumatismosy situacionesambientales adversas,hastala estimulaciónsocial excesiva.Esta respuestacomprendíaun conjunto de manifestacionesconsistentespreferentementeen la apariciónde úlcerasgástricas,atrofiade los tejidos del sistemainmune, crecimiento de las glándulasadrenalesy disminución de las respuestasreproductivas. Selyc (1961) tomó prestadode la ingenieríaun término para describiresa respuesta:“las rataspadecíantensiones”.Se inicia de estaforma el campode la fisiología del estrésy sevincula la utilización de estetérmino al conceptoprevio definido por Cannon.TambiénSelyeestablecesu propia definición de “estrés”comouna “respuestano específicadel organismofrentea cualquierestímuloaplicadosobreél”; los estímuloscapaces de desarrollarestarespuestasonconsiderados,enestadefinición, como agentesestresantes. El conjuntototal de síntomas,consecuenciade la acciónde los diversos agentesestresantes,fue definidocomo SINDROMEGENERAL DE ADAPTACION (SGA) y su finalidad, como hemosvisto, esla de prepararal organismoparacontrarrestarlos efectos de dichos agentesen una primera fase, y la de desarrollarmecanismosadaptativosque conduzcana la supervivenciaen un segundonivel. Esteúltimo correspondea lasobservaciones de Selye relativas a una activación del eje hipófisoadrenal,desencadenándoseuna serie estereotipadade respuestasfrentea la liberación de las hormonascorticoadrenales(Sclye, 1946). Sin embargo, el SGA comprendeen total tres fases. La primera correspondea la REACCION DE ALARMA, ya descritapor Cannon,cuyacausaesuna estimulación simpática generalizaday mantenida a corto plazo por las catecolaminas meduloadrenales.Su objetivo esmovilizar los recursoscorporalesparala respuestainmediata del organismoante la posibilidad de una reacciónde huida o de lucha (Gray, 1971). Al dependerdel sistema nervioso simpático y de las catecolaminasmeduloadrenales,el -2- —— Introducción —— mantenimientoa largo plazo de estaprimera respuestasuponeun notablecosto energético. Por lo tanto, la reacciónestan rápidacomopasajeralo que la convierteen insuficientecuando los estímulosdesencadenantespersisten,sin embargoresultasuficientecuandola actuacióndel agenteestresanteestemporalo cuandosólo seprecisaunarespuestaagudade ajuste. Deestaforma, si la exposiciónal estímulocontinúa, seinicia la segunda fasedenominadaFASE DE ADAPTACION o DE RESISTENCIA. En estaetapa, Selye describeuna hipertrof¡aadrenalcuya causaresideen la activaciónde mecanismosendocrinos quepermitenuna regulacióna largoplazoejercidaatravésde la partecortical de estaglándula (Selye, 1937).La integracióndel agenteestresanteporel sistemanerviosocentralprovocala activacióndel eje hipotálamo-hipófiso-adrenal(HHA) lo queconducea un incrementode la secreciónde glucocorticoides(GC) por la cortezaadrenal (Armario y cok, 1981, 1984a; Morniéde y cok, 1984; Yeb, 1984; Alano y coL~., 1987a;GamaDay cds.,1988). Parauna mejorcomprensiónde lo quecontinúaesconvenienterecordar que el glucocorticoidemayoritario y activo secretadopor las adrenalesde casi todos los mamíferosesel cortisol, mientrasqueenlos roedoresessustituidopor lacorticosterona. La activación del eje HIHA debepermitir la resistenciaa la situación adversa,o bien desencadenarla puestaen marchade mecanismosadaptativosespecíficos;por ejemplo,las respuestastermogénicasde la grasapardafrente al frío en roedores.Cuandoésto no ocurre,la permanenciade las respuestasendocrinasmencionadasconducenal organismo a una tercera etapa o FASE DE AGOTAMIENTO, en la que los efectos nocivos sobre diferentessistemasasí como el agotamientode las reservasenergéticasy la inhibición de los mecanismosquepermitenhacerfrentea enfermedadese infeccionesterminanporconducira la muertedel animal (Selye,1971, 1978; Levi, 1973). La fasede agotamientopuederesultarinexplicableperotieneun sentido biológico que transciendeal individuo. El objetivo de este proceso está dirigido a la supervivenciade la especiea costade la supervivenciaindividual en situacionesextremaspor su intensidad,duracióno extensión. Cadaorganismode un mismo grupo espuestoa prueba,y la selección —— Exirés croníco, actividad glucocorticoide 0 c,-ecnn¡enk, —— natural permitirá la supervivenciade los más fuertes. Por otra parte, la réducción de la densidadde población(Edward-Wynne,1964) como consecuenciade la disminuciónde las respuestasreproductorasindividualesy del aumentode la mortalidad,proporcionaunamejora de las condicioneslimitantes(disponibilidadde alimentoo refugio, desgastesocial,etc.). De estaforma segarantizala supervivenciade un númeroreducidode individuos mejor dotadosque perpetúenla especie.Finalmente,en condicionesaltamente extremas,podríallegarseporestosmecanismosa la desapariciónde la especie. Hemosdesarrolladohastaahorala noción clásicasobreel conceptode estrésy el SGA. Sin embargo,actualmente,y sin contradecirlo expuesto,la evolución de ambosconceptossecentrafundamentalmenteen la ideade que la respuestafisiológicaal estrés no resultatan inespecíficay generalcomo Selyepropuso.Y así, porejemplo, respectoa la hipertrof¡a adrenal,existenreferenciasa favor de que determinadassituacionesestresantes, talescomoel choqueeléctricoo el hacinamiento,provocanen ratasmachoun mayordesarrollo de la glándulaadrenal(Gamalloy cois., 1986a,b;Restrepoy Armario, 1987; Alano, 1991) pero también son numerososlos trabajosque no describeneste aumento‘trófico tras la exposicióncontinuadaa otros agentesque provocanun similar aumentode la secreciónde corticosteronaque los citados (Armario y cois., 1984b; Mormédey cols4 1984). Por lo tanto, el hecho de que la estimulaciónadrenalprovocadapor el estrésdesemboqueo no en alteracionestróficas permanentesdel tejido adrenal, dependerádel grado de intensidad y duracióndel agenteutilizado, perotambiéndeotrosfactoresque ahorase nosescapan,y que vendríana incidir en el modeloespecificode agenteutilizado. Conformeseobtienennuevosresultados,aumentala controversiaen lo que se ha venido aceptandocomo norma general de respuestaendocrinaal estrés. Esto conjuntamentecon el hecho, cada vez más frecuente,de que distintos agentesestresantes pueden producir alteracionescualitativamentediferentesde una misma variable, nos hace pensarque probablementeel estrésno produceuna respuestaendocrinatan generalcomo se pretende. De hecho,sehan encontradoposiblesrelacionesentreU naturalezadel agenteestresantey las respuestasqueéstedesencadena(Corsony Corson, ¡983; Goldstein, -4- —— introduccion —— 1987). De estemodo se ha observadodiferenteincrementoen la secreciónde adrenalinay noradrenalinadependiendode la naturalezadel agenteestresante(Mason, l975a; Dinisdaley Moss, 1980).La acciónde ambascatecolaminasno puedelimitarse a una simple prolongación de los efectosdel estímulosimpático,y las diferenciasen sus propiedadeshande teneralgún significado fisiológico. Así, situacionescomo el miedo, dolor, ansiedady aquellasqueimplican actividadmental, aumentanprincipalmentelos nivelesde adrenalina,mientrasquela conducta agresivao las situacionesrelacionadascon el ejercicio fisico incrementanprincipalmentelos nivelesde noradrenalina.Nuestrogrupo de trabajo (Gamalloy cols., 1990)encontróligeras alteracionesde diferentescatecolaminassegúnel modelo de estréscrónico aplicado a ratas macho.Noradrenalinay dopaminaaumentabancon la exposiciónal mido y la dopaminalo haciaen respuestaal choqueeléctrico,mientrasquela adrenalinano estabaalteradaen ningún caso. Se cuestiona, por lo tanto, la inespecificidad de las reacciones producidaspor diversosagentesnocivos, tal y como propusoSelye.En estesentido,Masan (1975b) explica que esta inespecificidad se debe al hecho de que tras diferentesagentes estresantessubyacenreaccionespsicológicassemejantes.De esta forma, en ocasiones,la amenazade recibir un estímulonocivopuedesuponer,en términosde respuestahormonal,una situaciónestresantemayorquela exposiciónen sí (Masan,1968).Estehechoes,sin embargo, conocido desde muy antiguo y tiene su fundamento en los mecanismosdel reflejo condicionadodescritopor litan Paulov (1925), constituyendoel punto central’ de numerosas pruebasde aprendizajereforzadoen animales.Es de hechoun conceptoampliamenteutilizado en los trabajosclásicosde conductaanimal bajo el término de “conflicto emocional” (Gray, 1971; Skinncr, 1975; Alcock, 1978). Se pone en evidencia,de esta forma, que ademásde la naturaleza, intensidady duración del agenteestresante,existentoda una serie de factoresque pueden influir sobre las reaccionesfisiológicas del individuo, incluso con mayor intensidadque el propio estímulo (Conany Canon, 1983). Se describeasí la existenciade un componente psicológico del estrés, de entrecuyos factoresse puedendestacarla actitud y el estado emocionaldel individuo, la predectibilidady la capacidadde escapara la accióndel agente (Laudensíagery cols., 1983; Vugel, 1985; Muir y Pfíster, 1987). -5- -- Estrés croníco, actividad glucocortíconle ~vcrecun lento — Experimentalmente,un ejemplo clásico es el de ratas sometidasa descargaseléctricas:seobservaque aquéllascon capacidadparaponerfin al agenteestresante (estréseludible) o que recibíanuna señal de advertenciaantesde serexpuestasa un shock eléctrico (estréspredecible)presentabanuna respuestade estrés menos señaladay menos patológica(nivelesdecorticosteronay de catecolaminascirculantes,úlcerasgá~tricas,pérdida de peso,etc.) que las ratas que no tenían capacidadde control o que recibían la misma secuenciade choquessin previo aviso (We¡ss.1968; Lundbergy Frankenbauser,1978). Aunque la sutileza de las variablespsicológicasque en estosanimalesde experimentación puedenestudiarseseandecorto alcance,estosresultadostambiénpuedenhacer~eextensivosa la psicologíahumanay deestaforma, los estudiosen humanoshandemostrado~asimismoque una preparaciónpsicológicay la capacidadde desahogarseson beneficiososantesituaciones adversas(Sapolsky,1990). ¡.1. ACTIVACION DEL EJE TWA POR EL ESTRES Como ya hemos comentado,el agenteestresantedetectadopor el sistemasensorialo por ¡os interoceptoresdel sistema nerviosova a ser integradoa nivel central.El resultadode esta integracióndesencadenará,en un primer momentó,la respuesta nerviosasimpáticay meduloadrenérgica,pero es a nivel hipotalámicodonde, lugar el procesofinal de la integraciónque se encargade la activación del eje hipotálamo-hipófiso- adrenal,mediadorde la fasede RESISTENCIAa ADAPTACION, que en las situacionesde exposiciónaestréscrónico,comoen el casode estetrabajo,esla que centranue~tro interés. Vamosa comentarpues,con másdetenimiento,los principalesniveles de la activación del eje Hl-JA por el estrésque conducenal aumentode glúcocorticoides circulantes, Los mecanismosneuroendocrinosderivadosde la integraciondel agente estresantetienenlugaren el núcleoparaventriculardel hipotálamo,cuyasneúronasreciben el nombrede neuronasparvacelularesy proyectansus axoneshacia la capa~externade la Eminencia Media. Estas neuronassintetizan una neurohormona,la CRH u hormona -6- —- Introducción -— liberadora de corticotropina (revisionesen Antoni, 1986; Rivier y Plotski, 1986),que es almacenadaen el terminal axónicoy liberada por él a los vasosdel sistemaportal hipotalámico- hipofisarioa nivel de la propiaEminenciaMedia. La accióncomoneurohormonade la CRH se ha comprobadoporque la secciónde los vasos del sistemaportal hipotálarnico-hipofisario conducea unahipoflinción de la hipófisis anterior(Carpenter,1985). El núcleo paraventriculares un núcleo de integración que recibe aferenciasprocedentesde distintosnúcleosencefálicosentrelos cualessehallan núcleosde relevo de las vías sensoriales,aferencias viscerales, del sistema límbico (que integra informaciónafectivay emocional),del órganosubfornical,del núcleopreóptico así como de importanteszonashipotalámicasvecinas.Estasaferenciasmodifican la actividadnerviosade las neuronasproductorasde CRH a travésde diferentesneurotransmisorescomo acetilcolina, serotonina,catecolaminasy GABA (Barbanely cois., 1987). Los tres primeros frente al último ejercen una acción estimuladorade la secreciónde CRH. Este control nervioso representael mecanismode integracióndel estímulo estresantecon la posterior respuesta nerviosau hormonal. La CRJ-I esun péptido de 41 aminoácidoscuya actividadfundamental va a ser,por vía humoral,estimularmedianteunión a receptoresespecíficosla producciónde ACTH por las células corticotropasde la adenohipófisis.A pesarde que se sospechósu existenciaya en 1955 (Guillcndn y Rossenberg,1955; Saffran y cois., 1955; Saifran y Schally, 1955), su aislamientoy secuenciaciónno se consiguióhasta 1981 (Vale y cois., 1981). La secrecióny síntesisde CRH por las neuronasparvocelularesestá bajo doble control. Por un lado, las aferenciasnerviosasa las que nos hemosreferido,y que suponenel mecanismode integracióndel estrésfrente al resto de información sensorial y nerviosa. Por otra parte, los propios niveles circulantesde glucocorticoidesactúansobrelas neuronasparvocelularescontrolandola secrecióndeCRH a travésde receptoresespecíficos. La CRH seha catalogadocomo el principal responsablede la liberación de ACTH por la adenohipófisisduranteel estrés(Plotsky y Vale, 1984). Sin embargo,muy poco tiempo despuésde haberseaislado se tuvo claro que no era la única hormona -7- —— Psires crónica, actividad gh.¡cocorticoide y crecimiento — hipotalámica que estimulala secreciónde ACTH. Conjuntamentecon la liberaciónde CRH en la Eminencia Media, la neuronas parvocelulares liberan vasopresina, angiotensina, colecistoquinina,neurotensinay encefalinasen pequeñascantidades,compuestósa los quese les suponeuna posibleacciónneuromoduladora. Vasopresina,angiotensínay colecistoquininaactúansinérgicamentecon la CRH potenciandosu acción (Tilden y cols., 1985; Rittmaster y cok., 1987; Spinedi y cols., 1988) y parecentener una importancia fisiológica en la regulaciónde la secreciónde ACTH, caracterizándoseasíestaregulaciónporsermultifactorial. El segundonivel de activacióndel eje HHA ocurreen la adenohipófisis dondeseproducela estimulaciónde la liberaciónal sistemaportal hipofisariode la ACTH, u hormona adrenocorticotropa, péptido de 39 aminoácidossintetizado a partir de una proteínade mayor tamaño:la proopiomelanocortina(Guillemin y cok., 1977). A nivel hipofisario y durantelas situacionesde estréstiene lugar, además,un efecto paralelo a la elevaciónde la producciónde ACTH queconsisteen el aumentode la liberaciónde péptidos opioides.Esta liberaciónseproducejunto a la de ACTH, dadoque ambosderivandel mismo precursor.Estospéptidosson las beta-endorfinascon un potenteefectoanalgésjco(Howlett y Rcss, 1986)y las alfa y gamma-endorfinas,cuyosefectosen situacionesde est?ésno han sido aún determinadoscon claridad. Sin embargo,la activación de estesistemano está incluido directamentedentro del propio eje Fil-LA, siendo por lo tanto un mecanismocolateral. Los objetivosdeestetrabajosonajenosaestasacciones. La ACTH alcanzarapidamentela cortezaadrenalvía sanguíneay su accióndependeráde la unión a un receptorde membranaespecifico (Minino y cols., 1989; Sáez y cols., 1989) presente en las células que forman la zona fasciculada de la corteza adrenal. Unaevidenciaimportantea favordel efectotrófico de la ACTÍ-! sobrela cortezaadrenal es que la hipofisectomíaproduce, entre otros efectos, una atrofia de las glándulasadrenales,reduciéndoseconsiderablementela zona fasciculadaresponsablede la secreciónde los glucocorticoides(Jara-Albarrán,1988; Fernández-Tresgtíerres,1989). -8- —— Introducción —— La producciónadenohipofisariade ACTH es tambiéncontroladapor unaretroalimentaciónnegativaejercidaporlos nivelescirculantesde glucocortic¿ides. El último nivel de la activación del eje [-IHA consisteen estimularla producciónde glucocorticoidespor la cortezaadrenal. El efecto de la ACtH sobreesta producciónafectafundamentalmentea la síntesisde estashormonas,ya que la liberaciónes continua y no se producealmacenamientode las mismasen la cortezade íd glándula. La formacióndel complejoACTH-receptor,en las célulasfasciculadasde la corteza,activauna cascadaenzimáticadependientede AMPc, como segundomensajero(Baxúr y Tyrrcll, 1987), teniendo lugar respuestascelularesa dos niveles: se favorecela disponibilidad de colesterol,principal precursorde estashormonas,y se estimulanlas propiasrutas de síntesis a través bien de la activación de las enzimasclaves, o aumentandola concentraciónde cofactores(fiindamentalmenteNADPH). El efecto de la ACTH sobrela disjonibilidad de colesterol afectatanto al colesterol circulante como al almacenadoen las propias células corticoadrenales(Brown y Goldstein,1976; Raineyy cols., 1986). La importanciade los glucocorticoidesfrentea situacionesestresantes, seevidenciaen animalesadrenalectomizados,los cualestienenmuy disminuidalá capacidadde tolerar agentesestresantesde forma crónica(Reller y cols., 1983). Esta incapacidadpara resistir estímulos perjudiciales puede subsanarsemediante la administractonexógena de glucocorticoides.Por la importanciade estashormonasen nuestrotrabajo,los gl}icocorticoides seránobjetode un capítuloespecial. La actividadde estesistemade regulaciónencascada,conocidocomoeje hipotálamo-hipófiso-adrenal,seautocontrolaporun mecanismode retroalimentaciónnegativa cuandolos nivelesde glucocorticoidesen sangresonelevados.Nos referimos,por supuesto,a los ya mencionadosefectosinhibidores sobrela secreciónhipotalámicade CRH y sobrela secreciónhipofisariade ACTH. El principal lugarde actuaciónesa nivel centralJpuestoqueel hipotálamo esmássensibleque la hipófisis a las variacionesplasmáticasde gldcocorticoides. Se trata de una inhibición progresivay proporcional a la dosis y duracióndel excesode glucocorticoides(KeIIer-Woody Dallman, 1984; Won y cols., 1986; KelIer-Wood, 1989). Esta acción inhibidora también es provocadacuando esos niveles -9- —— Estrés crónico. actividad glucocortícoide y crecimiento — elevadosse mantienenmediantela administraciónexógenade distintos análogossintéticos, aunqueen estecaso la inhibición alcance,incluso, a reducir la producciónendógenade estas hormonasen la adrenal.Estetemaseráabordadomásafondo cuandohablemosde los efectos de la dexametasona. Pesea todo lo comentado,esdificil discernircon exactituda qué nivel ocurrela autorregulacióndel eje HHA, ya que seimbrican no sólo las ya descritasacciones directasde los glucocorticoidessobreel hipotálamoy sobrela hipófisis, sino que, además,a nivel hipofisario, se produce una desensibilizacióna la CRH, acción mediadapor una reducción de la población de receptorespara estahormona (Haugery cok., 1987) y, en consecuencia,seinhibe la liberaciónde ACTH estimuladaporCRH. Incluso sehapostuladola acción directa sobre las células adrenalesdada la existenciaen ellas de receptorespara glucocorticoides(Darbeiday Durand,1987). Asimismo podríanestar implicadasneuronas procedentesdel hipocampoy sistemalimbico, dondetambiénsehandetectadola existenciade receptorespara glucocorticoides(Sapolsky y cols., 1984; Sarricany coIs., 1986; Van Eekeleny cols., 1988). Aunqueseriade esperarque la acción inhibidorade los glucocorticoides sobreel eje HHA limitara su respuestafrentea una situaciónestresanteprolongada,éstono sucede. La Figura 1 puede ayudarnosa comprenderestaaparenteparadoja. Observamosque despuésde la integraciónnerviosa del estímulo externo, se produce la activacióndel eje y el consecuenteincrementode los nivelescirculantesde glu¿ocorticoideslo que, a su vez, desencadenael mecanismodeautorregulacióndel eje.En efecto,estoesasí, pero hemosde tener en cuenta, tal y como refleja la ausenciaen la figura de la correspondiente flecha, queno hay ningúnmecanismode regulaciónmediadopor el aumentode los nivelesde glucocorticoidesqueincida sobreel estímulosuprimiéndolo,y esesapermanehcialo quehace posibleuna activaciónpersistentedel eje aun cuandoel sistemade retroalimeniaciónnegativo esefectivo. Sólo cuandoel “motor” de esaactivación desaparezcael eje 1-IHA recuperarásu estadobasal. -10- u —— Evtrés crónica adhv¡dndglucocorticoide Y’ crecimu?nto — Otro aspectointeresanteesel referido a si elevadosnivelescirculantes de glucocorticoides,previos a la exposiciónal estímulo estresante,puedencondicionarla capacidaddel estimulo para desancadenarla respuestadel eje UHA. Pareceser que la contestaciónesafirmativa dependiendode la naturalezadel estímuloestresante,de modo que algunosestímuloscomo la hipoglucemia insulinica, la hipoxia o la anestesiacon éter son extremadamente“sensibles” a la acción inhibidora de los glucocorticoides,mientrasque la hemorragiao la laparotomíason relativamente“insensibles” a ese efecto. Todo lo expuesto señalala necesidadde unaexhaustivacaracterizaciónde un modelode estrésdesdeel punto de vista de su dinámica de respuestahipotálamo-hipóf¡so-adrenal.En nuestro caso la caracterizacióndel modelo de estréspor ruido que utilizamos ha sido realizadaa diversos niveles (Alano y cois., 1987a,b; Gamallo y cok., 1988; Gamallo y cols., 1992). La secreciónde todas las hormonasdel eje no esconstantesino que presentaun ritmo circadianorelacionadocon los períodosde sueño-vigilia.En la ratay otros roedores,animalesde hábitosnocturnos,es a primerashorasdel periodooscurocuandose producela mayor secrecióncoincidiendocon la mayor actividadde estasespecies.(Kaneko, 1980; Oxenkrug, 1984a). En el caso especifico de la secreción de glucocorticoides,el mecanismosincronizadordel reloj internode esteritmo no esdependienteexclusivamentede los ritmos circadianosde CRH y ACTH, sino que tiene un componenteneurógenomediado por la médulaespinalanivel 1-7. Sin embargo,duranteel estrésseproduceuna rápidaactivaciónde todo el eje, independientementede los valores plasmáticosprevios de glucocorticoidesy del momentodel díaen queseproduzca. Como puede entendersede lo que acabamos de describir, la consecuenciafinal de la activación del eje HJ-IA porel estrésconsisteen aumentarlos niveles circulantesde glucocorticoides.En la exposicióncrónica a un agenteestresante,estaactivación del eje HHA, no sólo dará una respuestapuntual o aguda, sino que se tenderáa un mantenimientocrónicode estosniveleselevados. - 12- —— Introducción —- 1.2. CARACTERISTICAS FUNCIONALES DE LOS GLUCOCORTICOIDES Como se ha comentado,la actividad secretorade las GLANDULAS ADRENALES va a ejerceruna acciónmediadorade las respuestasfisiológicasal estrés.De la primeradeestasrespuestaso “reacciónde alarma”seencargarála médulaalertadaporel SNS, y las respuestasal estréscrónicodependeránde la activacióncorticoadrenal.Dado que éstas últimas sonlas quecentrannuestroestudio,comentaremosbrevementealgunosaspectosde la anatomíafuncionalde la cortezaadrenal. La corteza de la glándula adrenal está constituida por tejido esteroidogénico,de origen mesodérmico.De las tres zonasen que, de acuerdocon Arnoid (1866), sesubdivideclasicamentela cortezaadrenal, la responsabilidadde la producciónde glucocorticoidesrecaeen la denominadazonafasciculada,y sucedeasíenvirtud de la presencia en sus célulasde las enzimasimplicadasen la biosintesisde estashormonas(Figura2). Existe, pues,una especificidadde localizaciónenzimática,demodoquela presenciaen dichazonade esas enzimas excluye aquéllas que catalizan la síntesis de otros productos~de secreción corticoadrenal(esteroidessexualesy aldosterona). Estamisma figura nos permiteexplicarporqué,en el casó de roedores, el glucocorticoideactivoes lacorticosteronay no el cortisol. El motivo resideen la ausenciade la enzima 17-oc-hidroxilasa, por lo que la ruta de síntesishacia el cortisol quedaen estos mamíferosbloqueada.Por el contrario, la progesteronase decantahacia la producciónde corticosteronapueslas enzimas21-hidroxilasay 1 1-13-hidroxilasasí estánpresentes.Por otra parte, al estar la zona fasciculadade la adrenal de todos los mamíferosenzimaticamente especializadaen producir glucocorticoides,se excluye la posibilidad de que la reacción continúehaciala producciónde aldosterona,de cuyasíntesisseencargaotrazonade la corteza denominadaglomerulosa. La estructurade las hormonasesteroidesesun núcleobásicoderivado del ciclopentano-perhidrofenantreno.La variabilidad de estas hormonas la confieren los diferentessustituyentesque se incorporana estenúcleo, los cualesdeterminanademássu gradode flincionalidad(Idíer, 1971). - 13 - — Estrés crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — Ii~~~oL — PREGNÉNOLONA --1 PS00EsTElla HA. 1 7-a—t,iéc~fiaa — — — — 21—Ndnshsa 1$ -tEO>2tORh1C0STU~OWL 1 7-OH-PROGÉSTEflONA 1——1I.-O-Mdroxtasa 2I~tndr’o,Jiasa - - - - - - ¡r.. 1S4~idroihS* 1-OEOXICOR11SOL 1 8~OH-C0flTIcosTeoNAj - - - -1 1 1-$-4iidfllflas& - — Figura2: Rutade síntesisde los corticosteroidesadrenales Si acudimosnuevamentea la Figura 2 observamosque el precursor común de la síntesis de corticosteroideses el colesterol.Una vez en el interior celular se transformaen pregnenolona,siendoestaconversiónla etapalimitantede la biosintesisde las hormonasesteroides.A continuación,diversashidroxilacionesen diferentesrutasde síntesis daránlugar, como hemosdicho, a los correspondientestipos de esteroidessegúnla diferente - 14- —— Introducción —— zonade la cortezaadrenal. Estasrutasde síntesisson las principales,pero ademásexisten rutas secundariaso alternativasen las que se altera el orden de actuaciónde las enzimas mencionadas. Los glucocorticoidessintetizadosseliberandirectamentea la sangre,en la que circulan bien de forma libre, bien formando compuestoscon proteínas séricas específicas. Estas proteínas son fundamentalmente la transcortina o CBG (“corticosteroid binding protein”) y la albúmina. Tanto el cortisol como la corticosterona circulan en plasmaprincipalmenteunidos a la transcortina(en un 70-80%) (Rlostermany cols., 1986; Whitworth, 1987). La albúminatiene menosafinidad por los esteroidesque la CBG, sin embargo,transportaaproximadamenteun 20% del cortisol circulante (Klostcrman y cols., 1986). Su papelcobrainteréscuandolos nivelesde esteroidessonmuy elevados,ya que su abundanciaen plasmahaceque puedatransportarel excesode hormonacuando la transcortinaestásaturada. Sin embargo,la hormonabiologicamenteactiva esla forma libre, ya que unidaa la proteínano puedeatravesarcon facilidadlas membranascelulares. Paraque las hormonascorticoadrenalesejerzansu acciónes necesano que interaccionencon receptoresespecíficosde las célulasdiana. Paraque esto sucedadeben atravesarla membranaplasmáticaya que estosreceptoresson intracelulares,sin embargola naturalezalipofilica de los esteroidesfacilita su pasolibre. Frentea la hipótesisformulada en 1968, de forma independiente,por .Jensen y cok. y Gorski o “hipótesis de los dos pasos”, y por la que el recéptorseria una proteína citoplásmica, otros investigadores (Gase y Baiílieu, 1986; Rossini, 1987) propusieronun nuevomodelode acción,mayoritariamenteaceptadoen la actualidad,en el cual el receptorde esteroidesselocalizaríaen el núcleocelular. -15- —— I&’ti~és crónico, actividad glucoc<’rticoide y crecimiento —— Los procesosde unión con el receptory su posteriorefecto sobreel ADN han sido propuestospor varios autores(DeNicola, 1985; T¡enrungroj y cok., ¡987; Dalman y cols., 1988). Resumidamente,la acción de los glucocorticoidesmodifica la expresióngénica, alterándosela producciónde ARNm específicos(Schíile y cols., 1988). También se ha postulado mecanismosposttransc¡ipcionales,en cuyo caso la acción del esteroideseejerceríaa nivel de la degradaciónde ARNm ya transcrito, lo que en definitiva conducidatambiéna alterarla síntesisproteica. Las hormonasesteroidessondegradadasrapidamenteen el organismoy excretadaspor la orina como conjugadosdel ácido glucurónico.Estecatabolismose efectúa, principalmente,en el hígado;si bienel riñón y otrostejidosposeenasimismoestacapacidad. 1.2.1. EFECTOSFISIOLOGICOS Al considerarel SGA descritopor Selye,ya seapuntabaquela finalidad de la activacióndel eje HHA, consistíaen permitir la “resistenciao adaptación”a la situación representadapor el agenteestresante.En relacióna esto,el papelque desempeñael aumento de la producciónde glucocorticoidespor la adrenalesconsecuencia,fundamentalmente,de las accionesde estashormonassobreel metabolismointermediario. En estas condiciones, los glucocorticoides,como comentaremosa continuación,potenciany extiendenla duraciónde la hiperglucemiaproducidaporel glucagón, la adrenalinay la hormonade crecimiento(GH), mientrasqueacentúala movilización proteica. evitando la calda de los niveles plasmáticosde glucosa,y permitiendoel suministrode este metabolito al sistema nervioso y a la musculaturahasta que el organismose adaptea la situaciónestresante. Efectivamente,la acción más específicade los glucocorticoides,en el animal adulto, va a ejercersesobreel metabolismohidrocarbonado.Experimentalmente,los efectossobre el metabolismo intermediario se manifiestande forma evidenteen animales adrenalectomizados(Foss y cok., 1987) y en pacientes con déficit de glucocorticoides -16- -- Introducción -- (enfermedadde Addison); en amboscasosy antecortassituacionesde ayuno seproduceuna marcadahipoglucemia,asícomo el agotamientocasiinmediatode las reservasde glucógeno.La administraciónde glucocorticoidesreestableceambasdeficiencias(Jara-Albarrán,1988). Los glucocorticoidesson pueshormonashiperglucemiantesy, por lo tanto, diabetogénicas.Susaccionesanabólicasseejercenftindamentalmentea nivel hepático, estimulandolos procesosde gluconeogénesisy glucogenogénesis,favoreciendola captaciónde aminoácidosy de ácidos grasos,así como la síntesis proteica (activación enzimática).La inducciónde la rutagluconeogénicaesel resultadode su acción incrementandola actividadde la piruvatocarboxilasay la síntesisde fosfoenolpiruvatocarboxilasa,fructosa1,6 difosfatasa y glucosa6 fosfatasa(Garland, 1986, 1988). Los elevadosniveles de glucosa hepática promuevenla glucogenogénesis,pero ademásesta ruta se favorecepor la conversiónde la glucógenosintetasab inactivaen su formaactiva,atravésde unareacciónquesimultaneamente inhibe la glucogenolisis. Sin embargo, a nivel periférico van a tener una acción totalmente contraria,promoviendoel catabolismoproteicoo lipídico, e induciendoregresióncelular. Los aminoácidos libres y ácidos grasos liberados en esta acción catabólica van a servir posteriormentecomo sustratopara la gluconeogénesishepática,dandocomo resultadoun aumentode la glucosaen sangreo del glucógenohepático. La principal fuente de proteínasparala movilización de aminoácidos son el plasmay la musculatura.Esta acción, en situacionesde excesode glucocorticoides, conducea una notable reducción de la masa muscularque tambiénobedecea un efecto inhibidor de los glucocorticoidessobre la síntesisde proteínasdel músculoal disminuir su capacidadribosomal(KeIly y cok., 1986). Estos aminoácidos son desaminadosen los propios tejidos periféricos, formándoseprincipalmentealaninay glutamina que son utilizadoscomo sustratoprincipal parala formaciónde glucosapor el hígadoy el riñón, repectivamente.Los aminoácidosliberados van también a influir como catalizadoressobre la actividad de las enzimasglucolíticasy gluconeogénicas. A diferenciadel músculoesquelético,el músculocardíacono muestra regresión frente al excesode glucocorticoides. El trabajo anteriormente mencionado (Kelly y -17- —— E’irés ciánico, actividad glucocorticoide y crecimiento —— cok., 1986) incluye también en su estudioal músculocardiaco,detectandoun incrementode su contenidode ARN y proteínasinducido por los glucocorticoidesadministrados.Por otra parte, la ausenciade estospuedeconducir a un empeoramientode la función miocárdica. Todos estosresultadosnos conducena pensaren una implicación de los glucocorticoides como potencialesreguladoresdel turnoverde las proteínascardiacas(Gagnony cols., 1987). En los tejidos periféricos los glucocorticoides inhiben, además, la captaciónde glucosapor las células, por lo que contribuyena aumentarla glucemia. No obstante,el corazóny el encéfalo no son afectadospor estaacción y la glucosaen exceso puedeserutilizadaporestosórganosvitales. Evidentemente,la fuente de ácidos grasosy glicerol será el tejido adiposo.Los glucocorticoidesno sólo ejercenunaacciónlipolítica sino que,además,favorecen las accionesde la adrenalinay la hormonade crecimiento. El resultadode la lipolisis se conduciráhaciael hígadocomo sustratosparala gluconeogénesis.Porotro parte,al inhibir la entradade glucosay de ácidosgrasosen estascélulas,dificultan la lipogénesis.El único tejido grasoque seve excluidodeestaacciónesla grasapardaen los roedores.Nuestropropiogrupo de trabajo, en colaboracióncon otros investigadoresespecializadosen grasa parda, tiene evidenciasde que la administraciónde glucocorticoidespuedeprovocar un aumento del contenidolipídico de estetejido (Gamalloy cols., 1987). Evidentementeestoes consecuencia de la especialfuncióntermogénicarealizadapor la grasaparda. A nivel de tejidos periféricos son relevantes,para este trabajo, las accionesde los glucocorticoidessobreel esqueleto,sobretodosu acciónsobreel metabolismo del calcio, las cualesserántratadascon profundidaden el apartadocorrespondiente. Otras accionesespecíficasde los glucocorticoidesvan a realizarse durantelas fasesembrionarias,regulandolos procesosde diferenciacióncelulary el desarrollo de distintosórganos,siendoestaacciónreguladoradiferentesegúnla fasetemporalen la quese encuentrela maduracióndel organismo.Son responsables,así, de la síntesisy liberacióndel surfactantepulmonar fetal y de los procesosde maduraciónpulmonar (Navarro y cUs., 1989). En el riñón, durantela embriogénesisde aves, seha observadoque ejercenun efecto tónico supresivo sobre la proliferación celular a través de la inducción de sus propios -18- -- Iniroduccion -- receptores(Bellabarba y cUs., 1983). Esta acción inhibidora tónica sobreciertosprocesos relacionadoscon el crecimientotambién la ejercen duranteel desarrolloy la maduración posnataldel cerebrocomo ha sido constatadoen rataspor Meyer (1987). Por otra parte, aparecenimplicados en la diferenciaciónembrionariadel tejido cromafin (Ebrl¡ch y cok., 1989) y poseenun importantepapelsobrela formaciónde las microvellosidadesintestinales, asícomootros muchosefectosque puedenserconsultadosen Herrera(1988). Sobreel sistemacardiovascular,una de las accionesconocida de los glucocorticoideses la que ejercensobreel mantenimientode los nivelesde presiónarterial,de forma que la exposición a situaciones estresantes así como la administración de glucocorticoideso ACTH generahipertensión (Alano y cok., 1987a;Gamallo y cols.,1988). Esta alteración esfrecuente también en pacientes con Síndrome de Cushing, provocado por una hipersecreciónde glucocorticoides(Whitworth, 1987), mientras que en Situacionesen los que los niveles de estas hormonas se reducen (enfermedadde Addison), se produce hipotensión (Jara-Albarrán,1988). Se apuntahacia una acción de los glucocorticoides potenciandoel efectopresorde las catecolaminasy la angiotensina(Armado y cols., 1981, Armario y Castellanos,1984; Dobrakovovay cok., 1984; Yeh, 1984) y, por lo tanto, puedehablarsede un efecto indirectovasoconstrictor.No sedescartatampocoque pudiera estarinvolucradasu capacidadde inhibir la síntesisde sustanciasvasodilatadorastalescomola histamina,prostaglandinas,bradicininay factoresepiteliales. Otros efectossobreel sistemacirculatorio son ejercido~ a nivel de la propia sangre.Ademásde los problemasde coagulación,consecuenciade la alteraciónen los niveles de sustanciascomo los tromboxanos,otros efectosse producen sobrelas células sanguíneas.Los glucocorticoidesejercenunaacciónreguladorade la densidadde poblaciónde los eritrocitosfavoreciendopor un lado la eritropoyesisy porotro los mecanismosfagocíticos queretirande la circulaciónlos eritrocitosenvejecidos. Los glucocorticoidesejercentambiénesaacción reguladorasobreotras poblaciones celulares, aumentando el número de leucocitos polimorfonucleares y disminuyendoel de linfocitos, eosinófilos, basófilos y monocitos circulantes.Posiblemente esteefecto guardetambién relacióncon procesosde redistribución.Dado que estascélulas sanguíneasparticipan en la respuestainmunitaria, y que la interacciónentre el estrésy el - 19- —— listrés crónico. actividad glucocorticoide y crecimiento — sistemainmune seráobjeto de un apartadodiferente,comentaremosentoncesotrosefectosde los glucocorticoidessobreestascélulas. A. nivel gástrico,los glucocorticoidespromuevenla secreciónde ácido clorhídrico, aumentanel flujo de sangreen la mucosapero disminuyen la proliferación del epitelio gástrico. Cuandola dosis administradaes sobrefisiológicaaumentala incidenciade úlcerapéptica (Wallace, 1987).La estimulaciónneurógenaincluidaen lasrespuestasal estrés reduceademásla motilidad gástricae intestinal(Williams y cUs.,1987). Más datosacercade los efectosfisiológicos de los glucocorticoidesse puedenencontraren Jara-Albarrán(1988),Bartolomé(1989)y López-Calderón(1992). 1.2.2. ACCIONESFARMACOLOGICAS: DEXAMETASONA La utilización de los g¡ucocorticoides,en la prácticamédica, se halla muy generalizadadebidoasu amplio espectrodeactuaciónen el organismo.El tratamientode numerosasafecciones(linfomas, anemias,edemascerebrales,procesosinflamatorios, asma, etc.) contemplael usodeglucocorticoides(Bartolomé,1989). La terapiacon glucocorticoidespuedeconducir a la presentaciónde reacciones adversas, principalmente cuando se emplean durante periodos de tiempo prolongados.Así, seproducenalteracionesen los mecanismosde regulaciónendocrinalo que conduce,a su vez, a cambiosen un gran númerode funcionesmetabólicasy a una serie de accionesno deseadas,entrelas que destaca:hipertensiónarterial,osteoporosis,trastornosde la función sexual, insuficiencia suprarrenal,miopatías, etc. Consecuenciatodas ellas de la exacerbaciónde sus propiosefectos. Actualmente existe un gran número de compueStos sintéticos comercializados,con diferente grado de actividad y de vida media, pero sin diferencias cualitativasde consideración.Entre los más utilizados (prednisolona,prednis¿na,cortisona, hidrocortisona) se encuentran los derivados fluorados como la betametasonay la dexametasona. - 20 - —— Introducción —— La dexametasona(9 alfa-flúor, 16 alfa-metil prednisolona) puede administrarseporvíaoral, intravenosao subcutánea(Handay cok., 1984);en todoslos casos, y aunquevarian los tiempos de absorción, se alcanzanniveles porcentualeselevadosde concentraciónen plasma siendo, por lo tanto, un glucocorticoide de vida media larga (Bartolomé, 1989). DifUnde bien en los tejidos, distribuyéndoseprincipalmenteen hígado, riñones,pulmón,suprarrenales,páncreas,médulaóseae hipófisis. Tambiénatraviesala barrera hematoencefálica,aunqueen el liquido cefalorraquideoapareceen muy bajaproporción. Se elimina fi.indamentalmenteen la orina sin sufrir ningunatransformación,aunqueun pequeño porcentajeseconjugacon los ácidosglucurónicoy sulfúrico. En el campoexperimental,la dexametasonaseutiliza frecuentementea causade su potenteefecto glucocorticoide.Es capazde inhibir la secreciónhipofisariade ACTH (Hashimoto y cok., 1981; Nokagauray cok., 1985), y en consecuenciala producciónendógenade glucocorticoides(Ramaley,1975, 1976; Kalin y Shelton, 1984; Stangl y cok., 1986; Mazzocehi y cois., 1988a,b).Este efecto lo consiguepor su alta afinidad por los receptoresde glucocorticoideshipotalámicose hipofisarios, ejerciendola acción de retroalimentaciónnegativaanteriormentecomentada.El nivel de actividad HHA puededeterminarsemedianteel denominadotest de supresiónde dexametasona,en el que se determinala producciónendógenade cortisol o corticosteronafrentea la administraciónde dexametasona(Ceulemansy cols., 1984; Oxenkrugy cois., 1984b;Llermusy cols., 1986; Stangl y cok., 1986). En estoscasosla medida de los niveles plasmáticosde cortisol o corticosteronaes indicativa de La potenciabloqueadorade la dexametasonaen términosde ACTH, y por consiguientees una forma indirectade medir el mantenimientocrónico de la actividad glucocorticoide generada por la dexametasonau otro compUesto sintético administrado. 1.3. EFECTOS DE LA ACTIVACION DEL EJE UllA SOBRE LOS SISTEMAS NERVIOSO,ENDOCRINO E INMUNE Ante las situacionesde exposicióncrónicaal estrés,el organismosufre no sólo el aumentode la secreciónde catecolaminasy glucocorticoidesadrenales,y sus -21 - —— Itlvtrés cronico. actividad glucocorticoide ~vcrecituiento — consecuenciasfisiológicas, sino tambiénel desajustede sus sistemasinformativos: nervioso, endocrinoe inmune En el casode los sistemasnerviosoe inmune, las alteracionesson en realidad partede las accionesejercidaspor los glucocorticoides,mediadasa través de la presenciade receptorespara estashormonasen neuronasa nivel central o en las células inmunitarias. Por otra parte, la actividad nerviosaglobal resultatambién alteradapor los propios mecanismosintegradoresdel estrésque se producen,con anterioridada la llegadade información al hipotálamo, en diversoscentrosnerviososde acuerdocon la naturalezadel estímulo y que, ademásde alertaral sistemaneuroendocrino,elaboransus propiasrespuestas independientes.Ello conducea variadasalteracionesde índole neurovegetativoo afectivo- emocional. Pero, dado que nuestrosobjetivos no se plantean en relación a respuestasnerviosaso inmunitarias, sólo haremosuna breve reseñade los efectos más relevantesproducidospor el estrésal final de este apartadopara centrarnosahoraen los desajustesque afectan al sistema endocrino. En este caso se puedegarantizarque estas alteracionesson provocadaspor la ruptura del equilibrio funcional global al activarse permanentementeel eje HL-JA. Por ello, muchasde las consecuenciasfueron ya descritaspor Selyecomo síntomasdel SGA. Efectivamente,el patrón de regulación neuroendocrinahipotálamo- adenohipófisisdesarrollaun conjunto de ejes paralelosque acaban,cadauno, en diferentes glándulasperiféricas(adrenales,tiroides, gónadas),así como controlan la producciónde una seriede hormonasadenohipofisariasde acción propiay directasobrelos tejidos: hormonade crecimiento(GH), prolactina(PRt). Una visión generalde la variadaproducciónhipotálamo- adenohipofisarianosla proporcionala Figura3. El equilibrio de este sistema funcional conjunto es muy fino y la alteraciónde un eje secretorconcretolo rompedesajustandonecesariamentelo~ restantes.Así cuando se activa el eje HHA, la actividad de la adenohipófisisse dirige principalmentea la producciónde ACTH, alterándosela síntesisde las demáshormonastróficasy provocando una reducciónfUncional de los ejes tiroideo (HHT) y gonadal(HHG). - 22 - -. Introducción -- Hipotálamo MW HRH, SS Hipófisis GnRH PRF(VIPXTRM, PIF Tiroxina Vmscpresln Thlodotírwdna Glucocortlca4dn Piel y SNC Pmges temna Y lecheEstrógenos Testosterona Figura 3: Secreciónhipotálamo-hipofisaria. Además,variosautoreshanobservadoque la activaciónpermanentedel eje HHA provocaun desajusteen los mecanismosde modulación de la secreciónen la adenohipófisis, de forma que ésta no responde ni a los ritmos circadianos ni a la - 23 - —— Eqrés crónico, adhv¡dadglucocorticotde y crecimiento — retroalimentación negativa por glucocorticoides (Przekop y cols., 1985; Fernñndez- Tresguerres,1989). En relaciónal ejetiroideo, la ideaclásica incorporadaen la descripción del SGA describeuna reducciónde la producciónhipofisariade la hormonaestimulantedel tiroides (TSR), queconduciríaa una reducciónde la fUnción tiroidea y su consecuenteefecto en el metabolismo intermediario. Sin embargo,los efectosdel estrés sobre la TSH son contradictoriosy así mientrasalgunosinvestigadoresseñalanuna reducciónde la actividad tiroideaporun posibleefectode los glucocorticoidessobreel hipotálamoy/o hipófisis (lzum¡ y Fukuyama,1984), otros por el contrarioencuentranun aumentode dichaactividadque resultadaen un incrementodel metabolismoen situacionesestresantes(Armario y cok., 1986). Por el contrario, las alteraciones sobre la síntesis de hormonas gonadotrópicasestánmásclaramenteaceptadas,de forma que el estrésprolongadoprovoca unahipoflinción del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal,lo queconducea unadisminuciónde los nivelesplasmáticosde estrógenos,andrógenosy progesterona.En consecuenciase producela supresiónde muchasfuncionesorgánicasrelacionadascon la actividadsexualy reproductiva (Armario y Castellanos,1984; Jurcovicovay cols., 1984; López-Calderóny cok., 1987; Ariznavarretay cols., 1989). Recordemosque una de las manifestacionesde la respuestaal estrés recogidaen el SGA eraprecisamentela disminuciónde la función reproductiva.Estaalteración esel resultadode lo anteriormentecomentadoen relaciónal eje HI-IG, pero también(López- Calderón y cols., 1984; Jurcovicovay cok., 1988) de las modificacionesde una de esas hormonasadenohipofisariasno ligadasdirectamentea un eje: la prolactina.López-Calderóny cok. (1989) describenuna reducciónde la liberación de PRL por la exposiciónprolongadaal agente estresante, siendo en tal situación dicho efecto inhibidor mediado por los glucocorticoides(López-Calderóny cok.,1984). En efecto, la PRL tiene un papel fundamentalen el desarrollode la glándulamamariay esimprescindibleen el inicio y mantenimientode la lactancia,de ahí que la - 24 - -- Introducción -- alteraciónde sus nivelescirculantesmodifique la fUnción reproductora,pero ademásde estas accionespropias, existe una fuerte interacción entre el eje Hi-IG y la PRL dado que ésta modula la secreciónde gonadotropinas,controlandopor ello de maneraindirecta la función gonadalen ambossexos.Tambiénsehan puestode manifiestoefectossobrela síntesisde las demáshormonashipofisarias,regulandoasí todoslos procesosqueéstascontrolan. Otra de esashormonasadenohipofisariasde acciónpropiacuya síntesis y liberación resultaafectadapor la activación permanentedel eje HHA es la hormonade crecimiento(Kanty cols., 1983; Armario y cok., 1986).Existen nuevamentecontradicciones en cuantoal signo de talesalteracionesde modo que, paraciertos autores,la administración prolongadade ACTH o de glucocorticoidesdisminuyela secreciónde GH (lzumi y cok., 1985; Nakagaway cok., 1987a,b),mediado al parecerpor un incrementodel tono de somatostatina(Giustina y cok., 1989,1990; Wehrenbergy cok., 1990a,b). Otros, sin embargo, describenun incremento en la producción de esta hormona eó determinadas situacionesde estrés(Brown y Heniger, 1976) o frente a la administraciónagudade bajas dosis de ACTH (Valentí y cok., 1986) o glucocorticoides(Thakorey Dinan, 1993), cuya función serelacionaríaconla movilizaciónde reservasmetabólicas. Estasaccionessobrela GH van a causaralteracionesen el crecimiento pero, además,hay que tener en cuenta que la hipersecrecióndc glucocorticoides,como consecuenciade la activacióncrónicadel eje 1-11-lA, va a ejercer,corno vimosanteriormente,un efecto lipolitico a nivel del tejido adiposo que se manifestaráen alteracionesen el peso corporal.Por otra parte,esteefecto lipolítico conducea una distribución caracteristicade la grasacorporal,como seevidenciaen los individuosafectadospor el Síndromede Cushing,los cualespresentanun acúmulode grasaen la zonaposteriordel cuello, en el áreasupraclavicular y en la cara,con una disminuciónde grasaen las extremidades.Se creeque estoscambiosde distribución son debidosa una especialsensibilidadde cienostejidos grasosa las acciones lipogénicasy antilipolíticas de la insulina, la cual se encuentraaumentadapor la acción diabetogénicade los glucocorticoides (Bartolomé, 1989). Ambos efectos,. reducción del crecimientomediadoporGH y pérdiday redistribuciónde la grasacorporal,puedenconverger como causade alteracionesen el pesocorporal. No sedescartan,además,efectospropios de los gLucocorticoidessobreel crecimientoy desarrollocelular. - 25 - bstréx crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento —— Hastaaquí hemosmencionadolos efectosque la activacióncrónicadel eje HHA tiene sobreel sistemaendocrino.Respectoa la incidencia sobreel sistemanervioso central,los glucocorticoidesmodifican la excitabilidadneuronala través,como comentamosal inicio de este apartado, de receptoresespecíficos muy abundantesen diferentes áreas cerebrales(Dubrovskyy cok., 1982; Avanzino y cols., 1987). Asociadosa elevadosniveles deglucocorticoideso asituacionesdeestréssehandescritoefectoscomola euforia, insomnio, inquietud y anorexia. Enfermos con síndrome de hipocortisolismo manifiestan también alteracionesde carácterafectivo-emocionalpero de signo contrario, como apatíay depresión (deCastro,1989; Velascoy cols., 1993>. Respectoal sistemainmune, las primerasobservacionesrealizadaspor Selye.ya destacabanunareducciónde la resistenciaa las infecciones,acompañadade la atrofia de órganosinmunocompetentestalescomo el timo. En efecto, los glucocorticoidesejercen importantesaccionessobre la inmunidad específica(Munck y cok., 1985; Sapolsky y Donelly, 1985),causandoentreotrosefectosunalinfopeniaaresultasdelacualórganoscomo el timo, bazoy ganglioslinfáticos involucionan,corroborandolas observacionesefectuadaspor Selyea esterespecto(Rebulka,1988>.Otra accióncaracterísticade los glucocorticoides,con unaclaraaplicaciónterapeútica,esla prevencióndelas reaccionesinflamatoriasen respuestaa sustanciasextrañaso lesionestisulares.Esta acciónes ejercidaa travésde la alteraciónde procesosimplicadosen la formaciónde edemas,asícomo a travésde la liberaciónde histamina e inhibición de la síntesis de toda una serie de sustanciasmediadorasde la respuesta inflamatoriay dela coagulaciónsanguínea(Tranchanty cols., 1989>. Los datosde los que se disponenactualmenteponende manifiestoque, a veces,los efectosde los glucocorticoidessobreel sistemainmune soncontradictorios.La interpretaciónactual más razonablede esosefectoscontrovertidos del estrés es que se producen cuandoseafectanlas respuestasinmunesespecíficas.Sin embargo,aunqueen ciertos casos(Batemany cols.,1989; Boumpasy cok., 1991)estimulenciertasaccionesel resultado conjuntoessupresivo.Otrasvecesson las diferenciasentre los distintosmodelosde agentey el momentoen que estosdejandeserestréslos responsablesde dichacontroversia. - 26 - Introdt,cción -- Todos los resultadosdescritosconfirman los efectosque la activación del ejeHHA tienefrenandolas actividadesencaminadashaciala reproducción,el crecimientoy la resistenciaa los procesosinfecciosos(Selye,¡971, 1978; Levi, 1973). A pesardeque estas accionestienen, a primeravista, un carácterclaramentenegativoparael individuo responden. sin embargo,al objetivo de conseguiruna adaptacióna la situaciónestresante.El organismono hace más que potenciaraquellos mecanismosde defensaque facilitan una enérgicaacción inmediata,supeditandoaellos aquellosprocesosqueno resultantan eficientesparalograr esa meta. Es en suma, una cuestiónde prioridadespero también la expresiónde la admirable capacidaddel organismo para reaccionarfrente al medio y mantenerconstantementesu homeostasis,permitiendoconello, ni másni menos,quela supervivenciadel individuo. Evidentemente,la fase de resistenciao adaptacióntiene un límite, de modoque si el estímulodesencadenanteadquiereun carácterpermanentees intnediatopensar en las consecuenciasperjudiciales en que revierte, no sólo las derivadasde procesos infecciosossino tambiénde la disminuciónde la resistenciaa otras enfermedadesno mediadas por el sistemainmune. Nos referimosal efectoque el mantenimientode elevadosniveles de glucocorticoidestiene sobrediferentestejidosy sistemas,que ya describimosen el apartado 1.2.2. relativo a los efectosfisiológicos de los glucocorticoides.Así, de forma resumida,la metabolizacióncontinuade la glucosa, sin respiropara almacenaría,conducea la atrofia y fatiga de los tejidos. En un plazode tiempo suficiente,los cambioscardiovascularesinducenla aparición de hipertensiónlo que, a su vez, puedeocasionarlesionesen el corazón,vasos sanguíneosy riñones. La reparaciónde los tejidos resultatambiénafectaday, tal y como sugeríanlos resultadosde Selye,seincrementala propensiónapadecerúlceraspépticas. No olvidemosque a todasestasalteracionessesumanlas relacionadas con las actividadesde crecimiento y reproducción,también característicasde la fase de agotamientoy que, a pesarde sus perjuicios,poseenun significado biológico importanteque incide de nuevo en el mantenimientode un equilibrio, estavez en un contexto másamplio dondela finalidad esla supervivenciade la especie. - 27 - —— Estrés ciánico, actividad glucocorticoide ~vcrecimiento — 2. CRECIMIENTO Y DESARROLLO OSEO El desarrollodel serhumanosecaracterizaporserun procesocontinuo y multifactorial al involucrar la actuación,en ocasionessecuencial,pero fundamentalmente conjunta y coordinada,de una seriede variablesgenéticas,endocrinasy nutricionales,cuyo resultadova a serla organizacióny mantenimientofuncionaldel organismo. Pero, además, el término desarrollo engloba el concepto de crecimiento,entendiendoéstecomola expresióndel incrementode cadauna de las partesdel organismoy de cadauno de sus diferentesórganos.Este incrementoesel resultadopuesde multiplicacionescelularesquemodificansu dimensión,volumeny peso. El crecimientosomáticoseva a producira expensas,fundamentalmente, del crecimientoóseodadoqueunade las funcionesdel esqueletoesla de erigirsecomo soporte estructuralsobreel que se modela la forma y el tamañode un ser vivo. En consecuencia, resultainteresanteconocerciertas característicasdel tejido que constituyecadauna de las unidadesdel esqueleto. 2.1. COMPONENTES Y ESTRUCTURA DEL TEJIDO OSEO El hueso es un tejido altamente vascularizado y en continua remodelaciónpuesa pesarde su rigidez, no es en modo alguno un tejido permanentee inmutable. Estáconstituidopor distintostipos de célulasy poruna matnzextracelular. La matrizextracelularposeeun componenteorgánicoy otro mineral. El componenteorgánicoestáformadapor fibrasde colágenode tipo 1 o tropocolágeno,ademásde por pequeñascantidadesde proteínas séricas como la albúmina y otras de origen no plasmáticoentrelas que seencuentranla actina, los proteoglicanosy la osteocalcina.Por su parte,el componentemineral está constituido basicamentepor calcio y fosfato (ésteúltimo esencialmenteen forma de hidroxiapatita), y en menor proporción por magnesio,sodio, manganesoy potasio.El cristal de hidroxiapatitasecaracterizaporsu capacidadparaadsorber - 28 - Introducción —— en su superficie no sólo proteínassino también ionesdel plasmasanguíneoque estaránen intercambio, más o menos rápido, con otros iones circulantes, existiendo ademásuna regulaciónmuyestrechadel gradode mineralizaciónde la matrizextracelular. Vamosa continuacióna describir resumidamentealgunosaspectosdel componentecelular, integrado basica y especificamentepor osteoblastos,osteocitos y osteoclastos. Los osteoblastosse presentanal microscopio en dos formas bien definidas: osteoblastosactivose inactivos. Esta diferenciaciónobedecea un criterio funcional, de modo que los osteoblastosactivos son los efectivosen la síntesisdel componenteorgánicode la matriz extracelular,tal y como histologicamentelo corroborala presenciade un retículoendoplásmico rugosomuy desarrollado,característicode las célulasque llevan a cabouna intensasíntesis proteica. Una vez que se ha sintetizadouna porción de componenteorgánico adecuadaparaun áreaóseadeterminada,es cuandoel osteoblastoactivo puedeseguir dos caminos:o derivarhaciaosteoblastoinactivo quedandocomo una célula de revestimientoy corno tal ejerciendoun control del flujo de ionesa su través,o ser englobadoen la matriz extracelular,dandolugara un osteocito,localizadoen una oquedado lagunaen cuya paredse abre un sistemaprofuso de canalesque lo comunicancon los osteoblastosinactivos de la superficieósea. En el caso de que el osteoblastoactivo pase a ser un osteocito, nuevamentesu gradode actividaddeterminarásu diferenciaciónen osteocitoactivo e inactivo. Mientrasque la forma inactivadel osteocitoesla expresiónúltima de su ciclo vital, el término ‘activo hacereferencia,al igual que sucedíacon los osteoblastosactivos,a su intervenciónen la produccióndel componenteorgánico de la matriz extracelular. Pero, además,se ha relacionadocon su posibleparticipaciónen la reabsorciónóseatal y como indica la presencia de vacuolasy abundantesmitocondriasen su citoplasma,de hechose ha podido comprobar queestasformasactivaspueden,tantomovilizar el componentemineralconservandola matriz - 29 - —— Iú’trés crónico, actividad glucocort ¡coide y crecimiento — extracelular,cornoreabsorberel componentemineralsimultaneamentecon la matriz. Como podemosobservar, las células expresanunas características histológicas al servicio de una actividad metabólica específica,cuyo grado de activación determinael uso de los términos“activo” e “inactivo”. Otro constituyentecelular son los osteoclastos,grandes células multinucleadascon un origen embrionariocontrovertidoa diferenciade los osteoblastosy los osteocitosdeclaroorigen mesenquimal.En cualquiercasoy desdeel punto de vista funcional, lo destacablees la presenciaen su citoplasma de numerosasmitocondrias, vacuolasy lisosomas;hechoquepareceapoyar,de entretodaslas hipótesis,su origen a partir de células madre hematopoyéticasresultantes de la fusión de fagocitos mononucleares.Esta ultraestructuranosavanzaya que son las principalescélulasencargadasde la reabsorcióndel hueso,a lo que contribuyesu gran movilidad a lo largo de la superficieósea. Sin embargo, persistenactualmenteciertos puntos oscuros acerca de la secuenciade las etapasde la reabsorciónóseaproducidaporestascélulas. En estepunto es importanteindicar que el conceptode osteoblasto como una célula sólo formadorade huesoy de osteoclastocomo una célula independiente encargadade su reabsorciónestáen constanterevisión, y actualmentetambiénse le atribuyeal osteoblastoun papelintermediarioen la reabsorcióndel hueso. Los tres tipos de células descritosson, como hemos comentado,los específicosdel tejido óseoperoexisteunaestrecharelaciónfuncional con célulasintegrantesde otros tipos de tejidos como los condroblastosy los fibroblastos.Estascélulascolaborancon los osteoblastosy los osteocitosen la producciónde la matriz extracelulardel huesopues sintetizan precursores matriciales orgánicos (proteínas y mucopolisacáridos). Esta cooperaciónentrecélulasóseasy otraspertenecientesa tejidos diferentesno debeextrañar.El origen embrionario de estostipos celulareses común, siendo las células mádre de origen mesenquimalprecursorasde osteoblastosy condroblastos,dependiendola diferenciaciónen uno u otro tipo celular de la integridadde la matriz circundante.Por otra parte, los tejidos óseo,conjuntivoy el cartílagosonfhncionalmentecomplementariosy su interrelacióndebeser estrechacomo veremosposteriormente. -30 - —— Introduccion —— A la vistade algunosde los aspectosmencionadosde cadacomponente del hueso:celular, orgánicoy mineral, resultaobvio que su organizaciónen un tejido requiere no sólo una relaciónanatómicade proximidad, sino tambiénuna vinculación funcional de los mismos. De esta forma, las células, aun cuando representanuna parte muy pequeñadel volumen óseo, son las responsablescomo hemos visto de la síntesis y secreción del componenteorgánicode la matriz extracelular.A travésde estafunción de síntesiscomparten con el componentemineral la importanciaa la hora de proporcionaral huesouna estructura adecuada,conunascaracterísticasno sólo de solidezy resistencia,sino tambiénde elasticidad quele permitahacerfrentea unasobrecargasin quebrarse.Por otra parte,la estrecharelación del componentecelular con la matriz extracelularno sólo es decisivapara la estructuradel hueso sino también para que otras funciones del tejido óseo,como el de constituirseen depósitoy fuentede minerales,seanefectivas.En estesentido, las célulasson clavesen el importantemantenimientode la calcemiaal regularla deposicióny reabsorciónde hueso. Desdeel punto de vista estructuralel huesoes un tejido conectivo mineralizado,y es posiblediferenciardos tipos de tejido óseode acuerdocon el modelo de estructurainterna que presente: reticular y laminar. A su vez puedendistinguirse dos variedadesde tejido óseolaminar:laminarcompactoy laminar esponjoso. El tejido óseo reticular corresponde,en el hombre, al tejido óseo embrionario,de ahí que recibatambiénel nombrede inmaduro.En el adulto estaestructuraen retículadesaparecey sólo persisteen la cápsuladel laberintoy en la proximidadde las suturas del cráneo. El tejido óseo laminar correspondeal tejido óseo más común e importanteen el adulto (tambiénse denominamaduro), cuya estructuramuestrauna clara estratificaciónen capasdenominadaslaminillas. En el caso del tejido laminar compacto, las laminillas se ordenan alrededorde los canalesvasculares.Un canal vascularjunto con las laminillas que lo rodean constituye una osteonao sistemade Havers. Los canales vascularesde las osteonasse comunicanentre sí a través de un sistemade canalesoblicuos llamadosde Volkmann. La -3’- -- Iist res crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento — estructuray el ordenamientode las osteonasdependede factoresmecánicoscomo sobrecargas y tensionesaqueestásometidoel hueso,pudiendoserremodeladascuandosemodificanestos factorescon el objetode adaptarsea las líneasde fuerza. En el tejido laminar esponjoso, las laminillas tienen la misma estructurahistológicaque las del laminar compactopero no se ordenanconcentricamente alrededorde canalesvasculares;por el contrario, formanunamalla tridimensionalde trabéculas y espículascon cavidadesintercaladasllenasde médulaóseay tejido adiposo. La nutrición del hueso proviene del periostio o capa de tejido conjuntivo que reviste al huesoen su totalidad excepto en aquellaspartesrecubiertaspor cartílago. Esta capaes rica en vasos sanguíneosy linfáticos, así como en terminaciones nerviosas. En su estrato interno u osteogénicose originan los osteoblastos,de ahí la importanciadel periostioen la consolidaciónde fracturas.Se ha observadoquela aplicaciónde un estímulo mecánico sobre el hueso desencadenauna respuestacelular adaptativa del periostioque conducea la formacióny reabsorciónde hueso.De estaforma, el periostio, a través de su componentefibroso, actúa como un elementotransmisorde las presionesy tensionesmecánicashacia la capaosteogénica,iniciándoseun procesode remodelaciónósea (Pollard y cok., 1984; Storeyy Feik, 1985, Fe¡ky cols., 1987). 2.2. DESARROLLO,PATRONESDE CRECIMIENTO Y METABOLISMO OSEO Las investigacionesmorfológicas sobre el desarrolloóseo durantela embriogénesishan puesto de manifiesto que el hueso puede formarse en dos secuencias diferentes:formaciónde huesoendocondraly formaciónde huesointramenibranoso.Esta nuevanomenclaturaen la denominacióndel huesoobedecesólo a un criterio distintivo del modoen que seforma. Cualquieraqueseael tipo de osificación,la estructuradel tejido óseoen formaciónes reticular, adquiriendo posteriormenteuna estructuralaminar, bien compactao esponjosasegúnel caso. En la formaciónde huesoendocondral,se producela sustituciónde un modelo cartilaginoso por hueso. Como consecuenciade la condrificación de células - 32- —— Introduccion —— mesenquimalesseforman condensacionescartilaginosasque, a modo de reducido modelo a escala, son el esbozodel futuro esqueleto.Un prerrequisito para la formación de hueso endocondrales la presenciade condroclastos,células conjuntivas diferenciadascapacesde horadar el cartílago, que posteriormenteserá reemplazadopor el huesoproducidopor los osteoblastos.El crecimientoy la sustitución del cartílago,y el depósitode huesoduranteel desarrolloestáncoordinadosde una forma tan ingeniosaque el huesoadulto, a pesarde la diferenciade tamaño,poseecasi la mismaformaqueel modelocartilaginosoinicial. En la formación de hueso intramembranoso,el tejido conjuntivo embrionario se transformadirectamenteen tejido óseo. Este tejido conjuntivo contiene abundantescélulas mesenquimalesque se transformanprimero en osteoblastosy luego en osteocitos.Simultaneamenteseformantambiénosteoclastosy aparecenfibras colágenasque cursanen distintasdireccionesadquiriendo,como hemosdicho,unaestructurareticular. Como vemos, tanto en uno como en otro modelo de fonación de hueso,apareceal principio un molde de tejido blandoquegradualmentese convierteen tejido óseopor el desarrollode la osteogénesis,frecuentementepor una aposicióncentral, hasta osificarsetodo el elementoesquelético.La apariciónde talescentrosde osificaciónocurreen un largo periodo de tiempo. La mayoríade los huesosseosifican a partir de varios centros distintos,uno de los cualesaparececercadel centrodel futuro huesohacia el final de la vida embrionariao al comienzode la fetal. En el casode los huesosde las extremidades,costillaso columna vertebral, con una formación de tipo endocondral,este centro se ocupa de la osificación progresivade la porción media o diáfisis hacia los extremos,los cualesson aún cartiLaginososen el momentodel nacimiento.Estasregionesterminaleso epífisissonosificadas por centrosdiferentes,a vecesmúltiples, llamadossecundarios,los cualesal ir creciendoy sustituyendoel cartílago circundante llegan a ocupar casi en su totalidad los extremos articularesdel hueso. Sobrela superficiede las epífisis y entreéstasy la diáfisis persisteuna zonade cartílagoespecializadodenominado“placa o cartílagode crecimiento”,graciasal cual el huesoconsigueaumentarsu Longitud hastaalcanzarsusdimensionescaracterísticas. El cartílagode crecimiento,histologicamente,es una zonade intensa - 33 - listrés cronico, actividad glucocorticoide y crecimiento — multiplicación de condrocitos,quebioquimicarnentesecaracterizaporuna elevadasíntesisde grandes moléculas del grupo de los proteoglicanos, responsablesentre otras de la estructuraciónde la tramaosea. Duranteel crecimientodel hueso,ambosprocesos:proliferacióncelular y síntesisde macromoléculas,seencuentranperfectamentecompensados,de formaque, pesea la constanteneoformación ósea, exista siempre una altura de cartílago que permita la continuacióndel proceso.El aumentode los nivelescirculantesdeesteroidessexuales,tras la pubertad,al bloquearla proliferacióndel cartílagoy producirsu desaparición,va aponerfin al crecimientolongitudinal del organismo.Conjuntamente,otro hechodeterminael término del crecimientoactivo del hueso: unión de epífisis y diáfisis, que representala fusión en un sólo elementoóseo de varias unidadesóseas,evolucionadaspor separadoen el mismo modelo cartilaginosoo mesenquimal,quecrecedurantetodo el proceso. Este procesode crecimiento extensivoa todas y cada una de las unidadesdel esqueletoconduce,efectivamente,aun aumentodel modelodel cuerpo(ya hemos mencionadoque el crecimientosomáticoseva a producir, fundamentalmente,a expensasdel crecimiento óseo), sin embargolas proporcionesde este modelo resultaríah radicalmente alteradassin un control genético. Es necesario,además,que el crecimiento del hueso se produzcade maneracoordinadacon el crecimientode los otrostejidos (junto con la evidente coordinaciónentreel crecimientode las diferentespiezasóseas). ¡ Hasta el momento,hemosconsideradoal huesocomoun tejido aislado del entornopero esevidenteque estospatronesde crecimientodel hueso,predefinidossin dudabajo un controlesencialmentegenético,puedensertambiénmatizadosporel ambienteno sólo interno (vascularización, tejidos adyacentes y fuerzas mecánicas originadas fundamentalmenteporel movimiento, hormonasy factoresde crecimiento),sino tambiénpor factoresambientalesexternos. En este sentido tampoco debemosolvidar que esta capacidaddel entornoparamodificarel huesoesefectivatantosobreel procesode modeladoóseoporel que los huesoscrecen,adquiereno mantienenuna determinadaforma durantela infanciay etapa juvenil del individuo, como sobreel procesode remodeladoóseoque se producedurantetoda - 34 - -- Introducción -- la vida del animal. La existencia de este proceso de remodelado óseo continuo y permanenteno es de extrañarya que anteriormentehemoscomentadoque, a pesarde su rigidez, el tejido óseono se desarrolla,crece y luego permaneceinmutable. Por el contrario, aunqueel crecimiento longitudinal del organismose detiene tras la pubertad,se requiere durantetoda la vida del individuo la renovacióncontinua de hueso“viejo” por “nuevo”, neutralizandoel desgastey fatiga de los constituyentesdel huesosometidosa continuas tensionesy, por lo tanto, permitiendo el mantenimientode una masa y morfología ósea determinadas.Esteesel objetivo quepersiguela remodelaciónósea,procesodependientede la acción concertadadeosteoclastosy osteoblastos(Farley y cok., 1987); y que participa ademásen la homeostasisdel calcio ya queconducea La liberaciónal plasmadeestemineral, así comoa la homeostasisde los constituyentesde la matriz ósea. Pero,ademásde que este procesode remodelaciónpermitaal huesoajustarsea los diferentesrequerimientosderivados de su propia función básicade tipo arquitectónico,también le posibilita adaptarsea los derivadosde otra función igualmentebásica,de tipo motor, al serviciode la actividadfisica del organismo,proporcionandoal tejido óseoun cierto gradode plasticidaden su respuesta.Esta plasticidaddebesergarantizadamediantemecanismosreguladores,que modifiqueno maticen la expresióndel controlgenéticomásrígido. Veremosmásadelantequeestaregulaciónincluye factoreslocalesde tipo mecánicoy factoreshormonales. Aunque la remodelaciónósea muestradiferenciassegún se trate de huesolaminar compactoo laminar esponjoso,se mantieneuna secuenciade actuaciónde amboselementoscelularesque constituyela basedel conceptode “acoplamiento’~,segúnel cual existeunacoordinacióntanto espacialcomo temporalentrela reabsorcióny la formación de hueso.Así una actividadde reabsorcióndemasiadointensaserelacionacon una pérdidade la actividadinductivadel huesotal y como observanWíodarskiy Kobus(1992). En resumen,el huesoesun tejido vivo cuyascélulasse nútren, respiran y desempeñanfunciones específicas;configurando todo ello su propio metabolismo. Un metabolismoque consiste,principalmente,en un procesocontinuo de reabsorcióny nueva formación. Durantela remodelaciónóseadel huesoya maduro, en el animal adulto, dichas funcionesmetabólicasde reabsorcióny nuevaformación son muy semejantesa aquellasque -35 - -— liscrés crónico, octivida~I gfucocorticoide y crecimiento — permitenel desarrolloy crecimientodel tejido durantelas correspondientesfasesde vida en el animal infantil y que hemoscomentadoanteriormente. Peroel huesono debeposeersólo las característicasmecánicasy fisicas necesariaspara constituirse en el soporte estructural del individuo, ni exclusivamente proporcionarlos puntosde apoyoparala inserciónde la musculaturacon la posibilidadde que su estructurapuedaser modificadaen función de la actividad fisica del sujeto. Como se discutirácon profundidadmásadelante,el huesointervienedirectamenteen el controlmineral del organismoconstituyéndoseen reservay fuente de minerales, supeditandosu propio metabolismoal metabolismo general. Una vez más, deben existir en este tejido procesos metabólicosquepermitanun adecuadorecambiodeciertosmineralescon el medio internoy de acuerdocon las diferentesdemandasorgánicas. Estos procesosmetabólicosdeben ser, en consecuencia,susceptiblesde regulaciónhormonal. Como acabamosde discutir crecimiento/reposición,actividadmuscular y metabolismo general son fUnciones que concurrenen el metabolismo óseo e implican distintostipos de regulación.Las funcionesóseasson de doble naturaleza,mecánico-motoras y metabólico-minerales,y el hechode que puedanmodificar el metabolismoóseoa travésde mecanismoshormonalesy locales hacea estetejido susceptiblede ser influido por factores ambientalesde cualquiernaturaleza. 2.3. ACCION MUSCULAR SOBREEL METABOLISMO OSEO La regulaciónlocal, a la que en ocasionesnos hemos referido como mecanismoparaadecuarla remodelaciónóseaa las distintasfuncionesmecánicas,corresponde a unaacciónespecíficaejercidadesdeel músculo.Se ha observadoquecuandoun huesosufre unalesión, la velocidadde remodelaciónen la zonaafectadaessuperiora la actividadordinaria (Mueller y cols., 1991), todo ello con la finalidad de potenciarla reacciónde defensapor partedel tejido no afectado.Estefenómenoresultainterferido por la inmovilización del hueso lesionado(Mueller y cols., 1992) poniéndosede manifiestosu dependenciade una acción mecánicay, por consiguiente,¡a importanciade la actividadmuscularsobreel turnover del hueso. - 36 - —— Introducción —— Por supuesto que la determinación de la forma primaria poseeun carácteresencialmentegenético,hechoque ha sido demostradoatravésdel cultivo de órganos y del trasplanteexperimentalde tejidos esqueléticosembrionarios (WiII¡ams y Warwick, 1985). Porconsiguiente,durantela primeraetapadel desarrollo,cuandoseestáestableciendo la forma primaria del hueso, las influencias mecánicasdebidasa la actividad de músculos asociadosapenaspuedenseroperativas,pero dadoque los músculossehacenactivosdurante lavidaprenatalesposibleque ejerzanesainfluenciaen el desarrollodel hueso,si bien esdificil estimarhastaquépunto. Despuésdel nacimientoy hastala adolescencia,antesde que todaslas epífisis sefusionen, el aumentodel uso de los músculospareceaumentarel desarrollode los huesos,tantoen longitud comoen circunferenciay así, recientemente,numerososestudioshan centradosuinterésen la posibleintervenciónde fuerzasmecánicasen el mantenimientode una velocidadnormalde remodelaciónósea,tantoen animalesadultoscomo en aquellosque están en períodode crecimiento(Kiliarid¡s y cols., 1992). En estosúltimos, la ausenciade estas fuerzasmecánicassobreel huesomedianteinmovilización, denervacióno tenotomía,conducea una pérdidatemporalde masaóseaen los miembrosafectados(Wronski y Morey, 1982; Globus y cok., 1984, 1985; Tuukanneny cok., 1991). Tambiénen niños la actividadfisica esun importantedeterminantedel desarrollode la masaóseay, así, cuandoson sujetosde determinadasenfermedadesque conllevan una disminución de la movilidad corporal (poliartritis crónica infantil) manifiestanuna pérdida significativa de hueso (Kotaniemi y cok., 1993).Otrosinteresantestrabajossecentrande formaespecíficaen la importanciade la función muscularsobrela morfología dentofacial (Bresín y cok., 1994) y el crecimiento craneofacial(Staley y cok., 1994), incluso en situacionesdonde previamenteexiste un desequilibriometabólico del hueso en la rata (Kiliaridis, 1989; Ejíjaridis y cok., 1992). Interesantesson también, en este contexto, estudiossobrela repercusiónen el huesode la ausenciade gravedaddurantelos vuelosespaciales(Jeey cols., 1983). Por consiguiente,las accionesmecánicasejercidaspor los músculos conducenen un gradoexcesivoo, por el contrario,insuficienteaunaalteracióndel crecimiento del huesoy a una marcadamodificación de la masa ósea(Bayers y Macmillan, 1970; Wronsk¡y Morey, 1982; Hallorany cols., 1988). -37 - —— lisirés crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — Sin embargo, aún permanecensin respuestanumerosascuestiones acercade la exactarelación entre la actividad fisica y su efecto sobreel huesotal y como mencionaChesnut(1993), entreellas el mecanismomolecularde la transducciónde estas fuerzas en acontecimientosbioquímicos, hoy por hoy desconocidoaun cuando se ha constatadola acciónde dichasfuerzasen una granvariedadde células(Harrelí y cols., 1977; De Witt y cok., 1984; Ngan y cols., 1988) provocando respuestasbiomecánicasy estructurales,tanto in i’¡tro como¡u VIVO. Bindermany cols. (1988)proponenun modelo en el cual las fuerzas mecánicasperturbaríanla membranade fosfolípidos con la consiguienteliberación de ácido araquidónicoy síntesisde prostaglandinas.Recientemente,se ha sugeridoademásla activación de la vía de los fosfoinositoles(Sandyy cois., 1989; Sandy y cok., 1993). No obstante, a la vista de todos estos resultados,parece obvio que la activación de los músculos,y por consiguientede su metabolismo,afecte al metabolismoóseodebiendoexistir algún tipo de comunicaciónquímica entre ambos tejidos. En estesentido, se ha propuestoque factores locales, aúnno identificados(posiblementecitoquinas.factoresde crecimientoy leucotrienos), conuna acciónautocrinao paracrina,puedanmediarel efectode estasfuerzasmecánicassobre la remodelaciónósea(Saito y cols., 1991). 2.4. REGULACION ENDOCRINA DEL METABOLISMO MINERAL EN EL HUESO En cuanto a la relación del metabolismo óseo con el metabolismo mineral,el esqueletono seerigesólo comoun meroarmazónmecánico.La adaptaciónal medio dulceacuicolay posteriormenteal medio terrestre,en los cualesla concentraciónde calcio es muy inferior a la necesariaparala actividadbiológica,condujoa los vertebradosa perfeccionar su reservoriode calcio, asi como de fósforo y magnesio,y a desarrollarsimultaneamente sistemascadavez másespecializadospararegularsus nivelesplasmáticos.De estaforma, el esqueleto se constituye en una reservadinámica y fuente de elementosquímicos que desempeñanfunciones esenciales.Así, en los mamíferos,más del 95% del calcio, 85% del tbsforoy másdel 50% del magnesiototal se localizaráen el esqueletoóseo. -38- -- Introducción -- Dada la importancia fisiológica de estos minerales, las hormonas reguladorasde sus concentracionesplasmáticasadquierenuna importanciavital y al ejercer dicha función se convierten,a su vez, en responsablesde la regulacióndel volumen óseo, manteniendoun balancecontinuoentrelas velocidadesdeformacióny reabsorcióndel hueso. Convienerecordar,someramente,la importanciade estostreselementos químicospara,asu vez, comprenderel valor de estafunción de regulaciónmineralejercidapor el tejido óseo. El calcio como mensajerointracelular ejerceráuna acción de eslabón clave en procesostan diversoscomo la contracciónmuscular,actividadesenzimáticasen el metabolismode los hidratosde carbono,transportede electrólitos, crecimiento celular y, además,en todos los procesosde exocitosisque comprenden:la neurosecreción,la liberación de productosexocrinosy las respuestashormonalesy paracrinas.Cambiosen su gradientea ambos lados de la membrana plasmática y, en especial, pequeñasvariaciones en su concentracióncitosólica,seránempleadoscomo mediadoresen el mecanismode acción de múltiples mensajerosextracelulares. En relacióncon el fósforo, esel principal tampón citoplasmáticoy un componentefundamentalen la estructuradel hueso,de las membranasy ácidosnucleicos.Los ésteresde fosfato sonesencialesen los procesosde almacenamientoy liberaciónde energía,y los iones fosfatoson necesariosen el metabolismode los tres principios inmediatos,al actuar comocofactoresde sistemasenzimáticos. Por su parte,el magnesiointervieneen la generacióny transmisióndel impulso nervioso, contracciónmuscular, liberación de parathormona,respuestade los receptoresóseosa esa hormona,y transportede ionesa travésde la membranaplasmática. Asimismo, actúacomo cofactorde diversossistemasenzimáticoscomo los involucradosen la hidrólisis y transferenciade grupos fosfato, reaccionesde síntesisde proteínas,grasasy carbohidratosy. reaccionesen las que intervieneel ATP. Ademásactúacomo reordenador espacialen la estructurade las membranascelularesy ribosomas. Por lo que respectaa los nivelesplasmáticosde fosfato y magnesio,no - 39 - —— Estrés crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento — parecendependeren gran medidade ningunaacción hormonaly sí del filtrado y del umbral para su excreción renal. Por otra parte, sus niveles circulantes no están reguladostan estrechamentecomo los del calcio, Por lo tanto, de entre los tres elementosquimicos, el control de los nivelesplasmáticosde calcio iónico dentrode ¡imites estrechossuponeel hechomásesencial. Estosnivelescirculantesse mantienena pesarde ampliasvariacionesen la dieta, crecimiento óseoy remodelación. El calcio plasmáticoy el de los fluidos tisularesse halla en constante equilibrio con las salescálcicasdel hueso,seha postuladoque aproximadamenteuna cuarta partedel calcio iónico plasmáticoseintercambiacadaminuto. Esteequilibrio resultaesencial no sólo desdeel punto de vista del mantenimientode los nivelesplasmáticosdel calcio, sino tambiénen relacióna la propiafisiología del huesocomoponede manifiestoel efecto inhibidor de bloqueantesde los canalesde sodio/calcio(nifedipina) sobreel turnover del hueso y la actividadde la placaepifisariade crecimiento(Duriez y cols.,1993). Los canales de Haversy sistemasde lagunasy canalículosóseos permitenqueampliasáreasde salesdel huesoseexpongana dichosintercambios.El contenido cálcicodel tejido óseomásrecientementeformadoesmáslábil queel de regionesmásantiguas, y el procesode sustitución de osteonasmaduraspor nuevas,que se producedurantetoda la vida, constituyeuna reservade ionesde calcio fácilmenteobtenibles.Se ha propuestoque la liberación de sales depende, en cierta manera, de la modificación activa de la matriz extracelular,a cargo de osteocitosvecinos(WiII¡ams y Warwick, 1985),pero se desconoce hastaque extremoestaosteolisiscelular activa contribuyeal recambiocontinuo y rápido del calcio. Este proceso por el cual se mantiene un intercambio de calcio permanentees, como vemos,multifactorial con la participación del componentemineral del huesoy de las célulasóseas,peroademáscon el controlejercidopor las hormonasparatiroidea (PTH) y calcitonina, así como por el efecto especialmenteimportantede la vitamina O. Tambiénintervienenotras hormonas,no directamenterelacionadascon la regulaciónmineral pero que, debido a su acción específicasobre el metabolismoy crecimiento global del - 40 - —— Introduccion —— organismo,afectanindirectamenteal metabolismoóseo. 2.4.1. EFECTOSDE LA PARATHORMONA Y DE LA VITAMINA D Cuando tiene lugar una disminución en el nivel de calcio iónico circulante se produce un aumentode la secreciónde hormonaparatiroidea,que a su vez ocasionaun aumentode la calcemiamediantevarios mecanismos,principalmentepor acción directa sobreel hueso,pero ademáspor un aumentode la reabsorciónde calcio en el túbulo renal,y finalmente,aunqueen menormedida,al aumentarla absorciónintestinal de esteión aunqueesteefecto,como veremos,esindirectomediadopor la vitamina D. Tanto esta hormona como la calcitonina, conjuntamentecon los metabolitosde la vitamina D, ejercensu acciónreguladorade las concentracionescirculantes del calcio actuandosobreesostres órganosdiana. Dos de ellos controlan la “entrada” y “salida” deesteión, nos referimosevidentementeal intestino y al riñón. Porsu parte,el hueso actúacomoel principal depósitoy fuentede calcio, y por la importanciaquetiene en nuestro trabajoseráel primeroen sercomentado. Sobreel tejido óseoestahormonapeptídica,producidapor las células principalesde las glándulasparatiroides,ejercedos accionesaparentementeantagónicas.Así, poruna parteestimulala reabsorciónóseay, por otra, favorecela formaciónde nuevohueso. Este efectoanabolizantese manifiestaa bajasdosisfisiológicas,Pi i’iIro e ¡u i’ivo, sobreel hueso tanto esponjosocomo compacto (Dempstery cok., 1993), muy probablemente mediadopor factoreslocalescomo el factorde crecimientoóseo(Canalisy cok., 1991).Esta acción constituye,posiblemente,una acción de mantenimientoen condicionesde secreción basalde la hormona. Sin embargo,cuandoestimuladaporunacaídade la calcemiala secreción de parathormonaesaumentada,seproducela acciónestimulantede la reabsorciónóseaque se lleva a caboen dos fases. En una de ella, la parathormonaincrementala movilización o salida de calcio desdeaquellaszonasdel huesoque mantienenun equilibrio dinámicocontinuocon el fluido extracelular. En otra fase, incrementael número de núcleos de los osteoclastosy -41 - —. ftstrés crónica, actividad glucocorticoide ~vcrecimiento — estimulaen estosla síntesisde AR.N y de enzimaslisosómicas,todo ello es indicativo de una actividad osteoclásticaaumentada,inhibiendo ademásla actividad de los osteoblastosy la producción de colágeno. A través de todas estasacciones la parathormonaestimula la reabsorciónóseay favorecela movilización de calcioóseo. Si bien sólo se ha podido demostrar receptores para hormona paratiroideaen los osteoblastosy los osteocitospero no en los osteoclastos,puedeafirmarse que la formación de AMPc por un lado y el incrementoen la concentraciónintracelularde calcio por otro, constituyensus mediadoresintracelulares(L5wik y cok., 1985). Por otra parte la presenciade receptorespara PTH en osteoblastosapoya la idea de estoscomo intermediariosde la reabsorción. Sobreel riñón, la parathormonaincrementala reabsorciónde calcio a través del sistema de la adenil ciclasa-AMPc, postulándoseademásla participación del citoesqueletoal serantagonizadala acciónde estahormona,tanto en riñón como en el hueso, porsustanciasinhibidorasde la polimerizaciónde la tubulina. Otra acción importantede la parathormonaen el riñón esfavorecerla síntesisde calcitriol (1 ,25-(OH)2-colecalciferol),el metabolitomásactivo biológicamentede la vitamina D. Estaacciónesejercidaal estimularla actividadde la enzima másimportanteen la formación de ese metabolito a partir de dicha vitamina, siendo de estaforma clave en su regulación.Esta estrecharelaciónentrePTH y calcitriol esel motivo por el que comentamos •1 en un mismoapartadociertosaspectosdel papelde estemetabolitode la vitamina D. En el hueso, in vitro e iii i’ivo, el calcitriol incrementala reabsorción óseaal parecerestimulandola formaciónde osteoclastosa partir de suscélulas progenitoras. En esteefectodicho metabolitoy la hormonaparatiroideasepotencianmutuamente,todavez que éstaúltima aumentala actividad de estascélulas. Resulta discordante,sin embargo,la incertidumbreacercade la existenciade receptoresparaestemetabolito en los osteoclastos, por lo que pareceprobableque induzcala liberaciónpor los osteoblastos.quesilos tienen,de un hipotético factorestimuladorde la actividadde los osteoclastos. Por otra parte, el calcitriol estimula indirectamenteuna correcta mineralización ósea, muy probablementepor la síntesis secundaria en estas células de - 42 - —— Introducción —— osteocalcina,siendoestaestimulacióndel turnoverdel hueso,la causade la pérdida - 45 - Itivtrés crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento —— aceleradade masaóseaobservadaen tales situaciones(Danielseny cok., 1993; Mosek¡lde y cok.,1993). Respectoa los andrógenos,la administraciónde testosteronaa ratas conducea una aceleraciónde la maduraciónde las células del cartílago, incrementode las reservasde glucógenoy ampliaciónde la zonacalcificadade los discosepifisarios(Fahmyy cok,, 1969). Además,se ha obtenidoen avestratadascon andrógenosun incrementoen la relacióncalcio/hidroxiprolinaen huesosfrontales,indicando unamásrápidamaduraciónde la matrizósea(Puchey Romano,1968). Esinteresante,porotra parte,destacarque mn vilro las respuestasde las células del hueso y del cartílago a los esteroidessexualespuedenser afectadasde forma selectivapor las interaccionesmutuasentreestosy las hormonascalcitotrópicasque hemos citado anteriormentea travésde diversosmecanismos,tal y como observanSflmjen y cok. (1990). También ¡ti vivo se pone de manifiesto que la presenciade factores locales o sistémicos son importantespara determinarcomo respondenlas células del huesoa los esteroidessexualesy asi lo muestra,en el estudiorealizadopor Turner y cok. (1990), la diferentey acusadarespuesta,trasla ovariectomia,de los osteoblastosa los estrógenossegún éstosse localicenen el periostio o en el endostiode la diáfisis tibial, inhibiéndosela formación de huesoen la superficieperiostialy no observándosetal efectoen la superficieendostial. La hormonade crecimientoejerceuna seriede efectosbiológicos que de forma integradaconducenal crecimientoo bien permiten,una vez que ésteha finalizado, atendera lasregulacionesmetabólicasnutricionalesdel organismo. En relacióncon el tejido óseo,estahormonaposeeun efectoespecífico sobresu crecimiento,actuandoen las células del cartílagode crecimiento.Es sobradamente conocido que en niños GR-deficientesse interrumpen los procesosde proliferación y transformacióncondrocíticos,estrechándoseeste cartílago. Procesos,todos ellos, que se restauranpor el tratamientoconGR exógena.Asimismo, estudiosen rataponende manifiesto que alteracionesen la longitud corporal y en el crecimientocraneal puedenser paliadas,al menos parcialmente,por la administraciónde GH (Bates y Holder, 1988; Oyhenart y Puccirelli, 1992). - 46 - -- Introducción-- Esta acción de la GR sobreel crecimiento óseo longitudinal queda subordinadaa la producciónperiférica, en tejidos tales como el hígado, de unos factores mediadores(somatomedinas)responsablesúltimos de dichaacción,estableciéndoseentonces una relación GH-somatomedinas-crecimiento(Prieto, 1992). Sin embargo,de los datos obtenidosen rata,parecedesprendersela existenciade un sistemamáscomplejoen el que la. propia hormonaseria responsablede una acción directa sobre el cartílagode crecimiento actuandosobregruposcelularesprecursoresde grantamaño(precondrocitos),mientrasquelas somatomedinasinducirían preferentementela proliferación de poblacionesde estadiomás avanzadode maduración.Ademásdeesteefectoproliferativo, la GH estimulariadirectamente a los condrocitosdiferenciadosa producir somatomedinas,las cualesdesencadenaríanla proliferaciónclonal y maduracióndenuevoscondrocitospormecanismosautoo paracrinos. Esta inducción del crecimiento lineal del huesopor ambosefectores (GR y somatomedinas)sedetieneunavez que se completa,tras la pubertad,la fusión de las epífisis,sin embargopersistesu efectosobreel crecimientodel huesoen diámetroa expensas de la capacidadosteogénicadel periostio. 2.5. EFECTOSAMBIENTALES SOBREEL METABOLISMO DEL HUESO: ESTRESY ALTERACIONESOSEAS Duranteel desarrolloy el crecimiento,las estructurascorporales,entre ellas los huesos, se hallan influidas por factoresgenéticos y por factores de carácter metabólico,responsables,comohemosmencionado,de un ciertogradode plasticidadala hora de que las funciones desempeñadaspor estas estructurasse ajustena las demandasdel organismoen el que seintegran. Sobreestainteracciónde factores,los agentesambientalesexternosson capacesde ejerceruna acción severasobreel desarrollo.En el casode las estructurasóseas, estaacciónambientalpodríaexpresarsea travésde la relaciónentremúsculoy huesoo bien a travésde la modificaciónde algunode los mecanismosde regulaciónhormonalque acabamos - 47 - —. E~trés crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento — de analizar. Respectoa la primeravía de incidencia, resultaobvio que la realizaciónde una actividad fisica específicaligada a las condicionesdel entornonatural o social del individuo alteraesa interacciónentreel músculo y el huesoy conducea modificacionesde los huesos específicos implicados en la ejecución de dicha actividad, potenciandQ su masa y característicasmecánicas.El estudiorealizadoporBayendory Martin (1989) puedeilustrar lo queacabamosde comentar.Estosinvestigadoresrealizaronun análisisde la división sexual de las laboresen una población prehistóricadenominadaAnasazi.En esteestudiose midieron la longitud, diámetroy circunferenciade los principaleshuesoslargos(fémur, tibia, clavículay húmero), calculándosela estaturay robustez de los individuos adultos. Los resultados obtenidossugierenque los Anasa.zi que ocuparonla región americanade Black Mesaeran significativamentedimórficos sólo en estatura,mientrasque todas las medidasde robustez fueron muy similares. Los autoresinterpretanestasimilitud como el resultadode que tanto hombrescomo mujeresparticipabanen la ejecuciónde labores, posiblementede diferente naturaleza,peroqueexigíansin embargounacantidadigual defuerzafisica. En muchasocasionestales modificacionesóseasse producen,no por unaincidenciadirectasobrela interacciónmúsculo/hueso,sino quesonconsecuenciade quela alteraciónambiental se conviertepor definición en estrésy los efectossobreel huesoson mediadosentoncesporel correspondienteaumentode los glucocorticoidescirculantesy/o las restantesalteracioneshormonalessujetasal SGA. No sólo las alteracionesambientales externaspuedenser calificadas como situacionesde estréspara el individuo, también una alteración de su medio interno (enfermedades,infecciones, estadoscarenciales) puede convertirse en una situación generadorade estrés. Más aún si ese desequilibrio de su homeostasisinterna es consecuenciade una alteración ambiental externa, con lo cual la intensidaddel estrésseacentúa(Martin y cok.,1991). Desdeestaperspectiva,no resultatan controvertidoel hecho de que tanto una actividad fisica no entrenadacomo una inactividad muscularpor inmovilización conduzcan,siendo ambassituacionesopuestas,a una pérdidade masaóseay cuando,además, seha asociadoal aumentode la acciónmuscularun efecto potenciadorde la masadel hueso. Estaconvergenciaen los efectossobreel huesoseexplicasi ambassituacionesseconviertenen estresantesal superarlos límitesde la normalidadsin queexistauna adaptacióndel organismo, en cuyo caso la implicación de los glucocorticoidesinhibiendo la formación ósea resulta - 48 - -. Ihíroducción -- evidente(Gallaghery cok., 1973; Dietrich y cok., 1979; Hahn y cok., 1979). A este respecto,tanto la inmovilización (Beaulien y cok., 1987; Gíralt y cok., 1987; Stepanovicy cols., 1988)como el ejercicio fisico intenso(Bargiel y cok., 1981; Smythey cok., 1983)son modelosde estrésclasicamenteutilizados. A la vistade todo lo comentadoy en relacióncon las estructurasóseas, la importanciacríticaque la interacciónde la informacióngenéticay del ambienteejercesobre el normal desarrollo de éstas es corroboradapor los numerososestudios efectuados, especialmente,sobre las piezas dentales. Tenezar y Bader (1966), en experimentos efectuadosen ratón,muestranque de un 21% a un 29% de la variaciónen la anchurade los segundosmolaresmandibularesesdebidoa factoresprenatalesno genéticos.Un valor similar esaportadopor Leamyy Bader(1968>. Factoresfisicos, químicos, nutricionalesu otros agentesambientales perturbadores,puedenprovocaralteracionesen las condicionesde los tejidos adyacentesal dienteque, a su vez, afectena la estabilidado expresiónde la informacióngenéticarelacionada con el adecuadodesarrollodental(Barden,1980). Por ejemplo,la insuficienciade vitaminaA (Paynter y Grainger, 1956), la restricción calórica (Shaw, 1970a,h) y la deficiencia de proteínas(DiOrio y cols., 1973) ejerceninfluenciaen el tamañode las piezasdentalesde ratas.De forma análoga,diversosestudios(Goosey Lee, 1973; Andersony cok., 1975; Bail¡t, 1975)subrayanel impactodel ambienteen la maduraciónde la denticiónhumana. Tanto los estudiosrealizadosen animalescomo en el hombreindicanun mayor efecto prenatal que postnatal de dichos factoresambientales,afectandode forma adversaal crecimiento de las piezasdentalesy a la simetría bilateral de la arcadadental (Payntery Grainger,1956; Riesenfeld,1970). Este último parámetrodental, y su modificación por el ambiente,ha sido objetode diversosestudios(Saundersy Mayhall, 1982).Todos los sistemasbiológicos que exhiben simetría bilateral se caracterizanpor poseerun cierto grado de “fluctuación asimétrica” en sus dimensiones.Este término, “fluctuación asimétrica”, hace referenciaa variacionesmétricasaleatorias,no direccionales(Van Valen, 1962), reflejo de alteracionesen -49- —— EsV ~ c,~omc<’, actividad g(ucocorticoidc’ y crecimiento — la sincronizacióndel crecimientode aquellasestructurasquela presentan. En el casode las piezasdentales,estacondición se incrementano sólo con el gradode consanguinidad(N¡swandery Chnng, 1965; Suarez,1974; DiBennardoy Bailit, 1978), sino también por la acción de factores ambientalesque interfieren en la morfogénesisdel diente: estadosde enfermedad(Ba¡lit y cok., 1970) o agentesestresantes (temperatura,ruido, alteraciónde la dietay ciertosagentesquímicos)queejercensu acción a travésdel ambienteintrauterino(Siegel y Smookler,1973; Siegel y Doyle, 1975a; Siegel y cok., 1977a; Brandt y Siegel, 1978; SciulIi y cok., 1979; Gesty cok, 1983). La exposicióna una señalsonoraintermitentey de elevadaintensidad, durantela gestacióny 21 díaspostparto,aumentala fluctuaciónasimétricade las dimensiones mediodistal y bucolingual del primer molar inferior en la rata (Siegel y Smookler, 1973). Similaresincrementosen esteparámetrofueronhalladostrasla exposiciónaestrésaudiogénico pre y postnatalpor Siegel y Doyle (1975a).No sólo el mido como agenteestresantesino tambiéntemperaturaselevadas(Siegel y cok., 1977b)ehipotermia(Siegel y Doyle, 1975b) han sido empleadascomo modelosdeestrésrevelándose,en la rata, como agentesinductores del incrementode la fluctuaciónasimétricaen la misma piezadental. Ademásde las piezasdentales,otrasestructurasóseashan sido objeto de estudioen relacióncon la incidenciadel estrés.Estasinvestigacioneshanabarcadono sólo el efecto del estréssobreel incrementode la fluctuación asimétricamostradapor los huesos largos de las extremidades(Siegel y cok., 1977b; Gest y cois., 1983) y por los huesos parietales(Mooncy y cok., 1985), sino tambiénsobreotrasvariablescomo el espesordel tejido óseo cortical del fémur (Brandt y Siegel, 1978). Este último estudio amplía el efectuadopor Riesenfeld (1976) quién observócomo el estréspor frío conducea una significativa reducción del espesorde dicho tejido óseo en el fémur de la rata, haciendo extensivoesteefectoa la acciónde elevadastemperaturas. Resulta interesanteobservarque estareduccióndel espesordel tejido óseocortical no se produceen los animalesestresadospormido. Estasdiferenciastambiénson halladasporSiegel y Doyle (1975a,b)al observarque las dimensionesdentalesafectadaspor - 50 - -- Introducción -- la exposición a mido y a bajastempeTaturaseran difeTentes. Estos datos sugieTendos conclusiones:que un mismo agenteestresanteno afectaa todaslas dimensionesóseasen el mismogradoy quedistintosagentesestresantespuedenproducirdiferentesalteracionesóseas. El estudiodel incrementode la fluctuación asimétricadental por el estrésha proporcionadonumerosasobservacionesacercade que no sólo la respuestaal estrés difiere segúnla dimensiónconsideradasino quetambiénestácondicionadapor la posiciónque el dienteocupaen laarcadaasí comoporsu pertenenciaa la maxilao a la mandíbula. Unaposibleexplicacióna estosresultadosseriaque las piezasdentales más distales son relativamentemenos establesque las más proximales (para una misma arcada),asícomo las situadasen la maxila lo son frentea los dientesde la mandíbula(Siegel y Doyle, 1975a; Kieser y cok., 1986; Harrisy Nweeia,1980),todo ello con independenciade la acciónde los agentesestresantes.Sobre estabase, Sofaer y amis. (1971) declaran que esta menor estabilidadse debe a que poseenun mayor componenteambiental en su variación fenotipica y como consecuenciapodrían ser más susceptiblesa modificaciones en su desarrollo. De esta forma, el diente distal (frente al proximal) y el maxilar (frente al mandibular) podrían evidenciar mayor fluctuación asimétrica, reflejando de forma más significativala acciónde los agentesestresantes. Hasta este punto, hemos expuesto una relación de diferentes alteracionesóseasinducidaspor factoresambientales,así como de ciertas peculiaridades asociadas,probablemente,a la naturalezadel agenteestresante,que una vezmáscuestionanel tanpretendidocaráctergeneraldela respuestaal estrés.Sin embargo,nadaseha comentadoen relacióncon los mediadoresde estaacciónambientalsobreel metabolismoóseo. El reiteradoempleo del término “factor ambiental” y su connotación negativaen estecontexto,nosconducede forma inmediataa pensaren la implicación de la elevaciónde los nivelesplasmáticosde glucocorticoides,inherentea todasituaciónestresante. Efectivamente, este hecho es considerado por Siegel y cois. (1977b). los cuales se fundamentanen la descripciónpor Seyle (1973> de un síndromegeneralde adaptaciónal estrés para proponer una hipótesis que explicase el incremento, debido a los agentes estresantes,en la fluctuaciónasimétricaobservadotanto en las piezasdentalescomo en los -51- —— Estrés cro/lico, actividad glucocorticoide y crecimiento — huesoslargos. Sin embargo,estosautoreshacenrecaerel papelmediadoren la elevaciónde los nivelesdehormonaparatiroideacomoparteintegrantede unarelaciónentreel ejehipotálamo- hipófiso-adrenaly la glándula paratiroides,y dado el efecto estimuladorde la actividad osteoclásticade estaúltima. La actuaciónde la parathormonaconduciría, finalmente,a una alteraciónde los nivelesplasmáticosde calcio. EstahipótesistambiénessugeridaporMooney y cols. (1985) quienesevaluaronlos efectosdel estrésprenatalen un tercermodelo óseoo huesomembranoso,tambiéndependientede los nivelescirculantesde calcio. Sin embargo, Brandt y Siegel (1978) opinan que no hay un único factor implicado en las alteracionesóseasinducidaspor el estrés,y sugieren,ademásde las modificacionesen los niveles plasmáticosde calcio, otros efectosdel estréstales como la disminuciónde la velocidad de mitosis y la reducción de la velocidadde síntesisproteica. Procesostales,que puedensuponerla implicación de otros factoresendocrinosrelacionados con el crecimiento(GH), o con el metabolismoen general,hormonatiroideay glucocorticoides. Lo expuestoanteriormentenos conducea pensarnuevamenteque la hipersecreciónde glucocorticoidesadrenales,asociadaal estrés,seatambién responsablede una acción mediadorade todosestosefectos;considerando,además,la interrelaciónentrela producción hipofisaria de ACTH y GH. Como hemos comentado, el exceso de glucocorticoidescausauna generalsupresióndel crecimientoy desarrollofisico (Navarroy cols., 1988; Navarro y cok., 1989; Avíalí, 1993). Estos efectosseextiendenal tejido óseo dondeinducenunareducciónde la formacióndehueso(Gallaghery cok., 1973; D¡etrichy amIs., 1979; Hahn y cols., 1979; Hughes-Fulfordy cok., 1992) como frecuentementese ponedemanifiestoen situacionesclínicascomoen el Síndromede Cushingo en,el tratamiento terapéuticode enfermedadesasmáticasy artríticas(Kotaniemi y cols., 1993; Olbricht y Benker, 1993). Otros trabajos inciden asimismo en la posible implicación de las elevadas concentracionesde glucocorticoides,queseproducenen respuestaa nivelestóxicosde drogas durantela gestación,en un crecimientodetenidoy en alteracionesesqueléticastalescomo la incidenciade paladarhendidoasí como de costillas con una morfologíaanómala(LaBorde y cois., 1992). También se apunta hacia los glucocorticoides en exceso como posibles mediadoresde los efectosteratogénicos(costillas supernumerarias)observadoscuando el estrésmaternalse produceduranteel periodocritico de la organogénesis(Beyery Chernoff, 1986). - 52 - -- futroducción -- Porotraparte,esde comúnaceptaciónquelos cambiosprovocadospor los glucocorticoidesen el huesoy en la homeostasisdel calcio son el resultadode un efecto directo sobrelos osteoblastos(Denipster,1989).Estaafirmaciónse basaen los bajosniveles plasmáticosde osteocalcina(indicadoraltamentesensiblede la inactivaciónde estascélulas) halladosincluso durantela administraciónde bajasdosisde glucocorticoides(Ekenstamy cok., 1988; Prummel y cok.,1991; Leechy cok., 1993).Sepostula que estadisminuciónde sus niveles en plasmasea debidaa una acción directade los corticosteroidessobreel gen promotorde la osteocalcina(Morrisony cok.,1989;íkeday cols., ¡992). Datoshistomorfométricospermiten apuntarque, además,duranteel tratamientocon corticosteroidesseincrementala reabsorciónósea(Bressoty cols., 1979).Sin descartaruna posible acción directa sobrela secreciónde PTH (Fuc¡k y cok., 1975),del calcitriol (Bilde y cok., 1993)o de la vitaminaD (Cbesneyy cols., 1978),generalmenteseha atribuido estehechoa un hiperparatiroidismosecundariocausadopor la reducidacalcemiaal disminuir la absorciónintestinal de calcio (Klein y cols., 1977; Hahn y cols., 1981) e incrementarsesu excreción urinaria (Suzuki y cols., 1983; Prummel y cols., 1991), aparentementeporefectode los glucocorticoides. Sin embargo,aunquela implicaciónde las hormonascalciotróficas,PTH y derivadosde la vitamina D, como mediadoresde las accionesde los glucocorticoidesen la homeostasismineral del huesoes ampliamenteaceptaday, si bien algunosinvestigadores encuentranefectivamenteelevadosnivelesplasmáticosde parathormona(Fuciky cols., 1975; Hahn y cols., 1979; Suzuki y cok., 1983),otrosestudiosno detectanmodificacionesen este parámetroduranteel tratamientocon glucocorticoides,antelo cual seha sugeridouna posible acción de estos estimulando la reabsorciónósea vía PTH sin elevar sus niveles sino potenciandosu acción en el hueso,tal y como sugierenestudiosefectuadosin vitro (Habn y Halstead., 1979). Otros autores no sólo no observan modificaciones en los niveles de parathormonasino que, además,se mantieneninalteradoslos marcadoresbioquímicosde reabsorciónde huesolo que, en consecuencia,sugiereque la osteopeniainducida por los glucocorticoidesesdebidaa una reducciónde la formaciónde hueso,no estandopotenciada una acciónde reabsorciónósea(Prummely cok., 1991). - 53 - —— Iiúnico. ncIí”í dad ghicocor¡ico¡~Ie y crecímienu, — Otro hechodestacable,hallado por Satierleey Roberts(1990)en la codorniz HS, es la drásticareducciónde la producciónde huevospor hembrasestresadas. Efectivamente,el estréscrónicoproduceunahipoflinción del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal y conduceala supresiónde muchasfuncionesorgánicasrelacionadascon la actividadsexualy reproductiva(Armario y Castellanos,1984; Jurcovicovay cok., 1984; López-Calderóny cols., 1987; Chatterton,1990). De hecho, la administraciónde corticosteroidesha sido empleadacon la finalidad de inhibir la puestade huevosen poííos de la estirpeWhite Leghorn (Ruszler y cois., 1984), de igual forma se ha observadoque aves seleccionadaspor su exageradarespuestaen los nivelesdecorticosteronafrente al estrésmuestranuna disminuida velocidadde producciónde huevos(Browny Nestor,1973). Asociadoa estaalteraciónde la función reproductoraen la codornizHS, Satterlee y Roberts (1990) encuentranun incremento de la cantidad de tejido óseo membranosoy una reducción del número de osteoclastosde este hueso, responsables primariosde la reabsorciónósea(Parfitt, 1983). Estos resultadosson relacionados,por los autores,con la menor necesidadde liberar calcio de la reservaque constituyeel tejido óseo membranoso,puesto que disminuyen las demandasde este mineral para la formación de cáscaras.En consecuencia,la asociaciónindirectaentrecorticosteronay metabolismodel calcio sobreestetipo de tejido óseoseestableceríaa travésde la capacidadde estecorticosteroide para deprimir la función reproductoraen las hembras.Sin embargoparece,cuantomenos, cuestionablela existencia,además,deun efectodirecto delacorticosteronasobreel tejido óseo membranoso,sobre todo a la luz de los numerosostrabajosque constatanla implicación directade los glucocorticoidesen el metabolismoóseo. Persisten,pues,las dudassuscitadasen relacióncon la identidadde los mecanismosimplicadosen las alteracionesóseasinducidaspor estrésy si bien son evidentes, no suponen, sin embargo, impedimento para utilizar las variaciones óseas detectadas, especialmenteen la magnitud de la fluctuación asimétricadental y de huesos largos y parietales,como indicadoresde estrésambientalen poblacioneshumanas(Perz¡gian,1977; Siegel y cois., 1977a; DiBennardoy Bailit, 1978; 1-larrís y Nweeia, ¡980; Saundery Nlayhall, 1982; Gesty cok., 1983). Sin embargo,esnecesarioteneren cuentaque¡os niveles de fluctuación asimétricaen los huesoslargos disminuyen con la edad, tanto en roedores - 56- —— Introduccum —. (Siegel y Doyle, 1975a), como en el hombre (Rufí’ y .Jones,1981). Hecho motivado, al parecer,por la remodelaciónfuncional que acontecepostnatalmente(Siegel y Doyle, 1975a). En estesentido,Gesty cols. (1983) han propuestoque cuandoseestablecencomparaciones entrepoblacioneshumanasde los nivelesde fluctuaciónasimétricade los huesoslargos,es necesariosiempreempleargruposde edadequivalente.Por otraparte, tambiénsugierenque este parámetropuedeser consideradosólo un indicador de estrésambiental(enfermedad, alimentación...)en los individuos jóvenes, ya que en los adultos los niveles de fluctuación asimétricapuedenaparecerdistorsionadospor la remodelaciónóseaasociadaa la fUnción muscular,siendoen estecaso,un buen indicadorde la actividado formadevida desarrollada por la población. No obstante,nosotros pensamosque esto es sólo aplicable a la comparaciónde poblacionesvivas. En el caso de las poblacionesantiguas,en los estudios paleoantropológicoscuandose hacendirectamentesobreel restoóseopreviamentedatado,las muestrasde la poblacióna comparardebenser de edadesequivalentes,pero en los restosde individuos madurosy seniles, las fluctuacionesasimétricasóseasconsideradaspodrán ser indicadores, por supuesto, de la actividad realizada por la población pero también representaríanal estrésambientalque hubieseafectadoa los individuos cuandoestosfueron jóvenes. A la vista de todos los datoshastaahoraexpuestos,y á pesarde los numerosos interrogantesque plantean, parece lógico pensar que los glucocorticoides constituyen punto de paso importante de esta relación estrés-alteracionesóseas. Probablementecon una implicación no sólo directa, sino también actuandosobre otros sistemasde regulaciónendocrinatalescomo el responsabledel control mineral, hechoque ya intuiamos dadala estrecharelación entremetabolismomineral y óseo,proponiendoestavía como unade las probablesformasen quelos factoresambientalesejerceríansuacciónsobreel hueso. Además, recordemoscomo los glucoeorticoidesson mediadoresde modificaciones óseas,causadaspor el estrés,al afectarotro sistemade regulación endocrina,en estecaso responsabledel controlde la funciónreproductoraen ax’es. 57 II. ANTECEDENTES, HIPOTESIS Y OBJETIVOS DEL TRABAJO: Justificación del diseño experimental II. ANTECEDENTES, HIPOTESIS Y OBJETIVOS DEL TR4BAJO: Justificación del diseño experimental Vamosaplanteartresobjetivosgeneralesqueserefierenal animal,a sus órganosy al esqueleto,respectivamente.En cualquiercaso,expondremosunaspremisasde partida, cuyo desarrolloy apoyo científico se encuentranen el capitulo de Introducción, propondremosuna hipótesis y plantearemossu correspondienteobjetivo, explicando a continuaciónel diseñoexperimentalparaconseguirlo.Cadauno de los tresobjetivosgenerales sedesglosanen varios objetivos parcialesmás concretos,los cualessecorrespondencon los parámetrosy técnicasanalíticasquesonexplicadascondetalleen el capítulodeMetodología, en el queseofrecentambiénlos detallesdel diseñoexperimentalaquíelaboradoo justificado. 1. REFERENTEAL ANIMAL El estréscrónicoprovocala alteración,de formarelativamentecontinua, de unaseriede factoresneuroendocrinos,entreellos, los nivelescirculantesdeglucocorticoides producidosen la corteza adrenal. En estesentido, nuestromodelo de estréscrónico por exposiciónal mido estásuficientementecaracterizadorespectoa la intensidady dinámicade su respuestacorticoadrenal(Alano y cok., 1987a,b;Gamallay cois., 1988). Los factoresneuroendocrinosreferidosy los propiosglucocorticoides tienen importantesefectosa nivel del metabolismo,crecimientoo maduraciónde los tejidos. Clasicamenteseatribuyena estosefectoslas pérdidasde pesoregistradaspor la exposición crónica al estrésque son expuestosen el SGA. Nosotroshemosregistradoalteracionesen el pesocorporaldemachosadultos(Alano y cok.,1987b)y hembrasgestantes(Velasco,1990) porla exposiciónal ruido. HIPOTESIS 1: Las alteracionesde pesoregistradasen animalesexpuestosal ruido puedenser efecto directo de la elevadaactividad glucocorticoideprovocadapor el ruido y el -58 - --Objetivos — grado de esasalteracionesdebe estar correlacionadocon la intensidad dé esa actividád glucocorticoide. OBJETIVO 1: Aunqueinicialmentesepartiráde las curvasde peso,nosproponemos valorar el estadodimensionaldel animal expuestoal ruido en relación con lá intensidadde actividad glucocorticoide mediada por el estímulo. Para ello, deberemoscomparar los resultadosde la exposiciónal ruido con tratamientosque representenmodeloscon mayor intensidad de dicha actividad, pero que vayan excluyendo sistematicamenteescalonesde activación del eje HHA, implícitos en el estrés,hastarepresentardirectay exclusivamentela actividaddebidaala presenciadealtosnivelescirculantesdelas hormonas. DISEÑO EXPERIMENTAL: La intensidadde la actividad adrenal d de la acción glucocorticoideseráevaluadaa travésde los nivelescirculantesde corticosteronaal final del tratamiento.Todos los parámetroscorporalesmedidosen los animalesexpuestosal mido se comparancon los de animalestratadosdirectamentecon ACTH o dexametasona: - Para la ACTI-1 se utiliza una dosis que intensifica la producción adrenal de corticosterona provocada por el estrés pero que excluye el componente neuroendocrino,aunqueno sus consecuencias:elevaciónde ACTH y corticosterona circulante. 2- La dexametasonaesaplicadaen una dosisque garantizauna actividadglucocorticoide mayor que la mediadapor el estrésy por la administraciónde ACTH, pero que excluye el componenteneuroendocrinoy la liberación endógenade ACTH y corticosterona,lacualessustituidaporla dexametasona.En estecasola evaluaciónde la actividad glucocorticoidede la dexametasonamediantela medida de los niveles plasmáticosdecorticosterona,semanifiestaen unareducciónde dichosniveles. Como referenciase utilizará el grupo control habitual y un grupo dondese compruebenefectosconjuntosde la dexametasonay la exposiciónal ruido. La utilización deesteúltimo tratamientoresultarámuy útil paradiscernirefectosexclusivamente debidosa los glucocorticoidesde aquélloscausadospor otros factoresde la exposiciónal estrés. - 59 - —— lis! rés crónico, actividad glucocorticoide y c,’ecimtenbo —— HIPOTESIS 2: ¿Las alteracionesde crecimientoencontradasen los animalesde los diferentestratamientossonreflejo de modificacionesen el desarrollovisceral?. OBJETIVO 2: Nos proponemosconocersi la actividadglucocorticoiderepresentada por los tratamientosprovocaalteracionesen el desarrollode órganosrelevantesy cómo contribuyenlas mismasal crecimientodel animal completo. DISEÑO EXPERIMENTAL: Hay tresórganosclaveen el funcionamientoorgánico: - Encéfalo:Centrode controlde todo el organismo,relacionadoademásdirectamentecon la integracióndel estrésy con la puestaen marchade los mecanismosneuroendocrinos vinculadosal mismo. - Corazón:Soportefuncionaldel repartode nutrientesenergéticos. - Riñón: Importanteparticipanteen el controldel medio interno. Vamos a considerarel valor del peso fresco absoluto de cerebro, corazóny riñón de los animalesde cadagrupoexperimental,y a compararlocon los restantes en funciónde su distinto nivel de actividadglucocorticoide.Paracomprobarsi las alteraciones encontradasse correlacionan con los cambios de crecimiento hallados en el animal, se compararátambiénel índicede cadaórganorelativoal pesodel animal. HiDótesis2ev Sucedeque el crecimientode cadaestructura,órgano,aparatoo sistema no es continuo ni constante,por lo que, en un momentodado, cadapartedel animal puede presentaruna diferentesensibilidada que su crecimientosea alteradopor cualquierfactor o por uno en particular. Conocersi existe esadiferenterespuestade unosórganosrespectoa otros, resultaconsecuentementeimportantepara caracterizarel patrón de crecimientoen el periodo de edad estudiado.¿En los animales de esta edad, alguno de los tres órganos estudiadossemuestramásresistentea factoresque retraseno alterensu crecimiento?. ()bieth’o 2a: Queremos comprobarsi hay una respuestaespecíficade cadauno de los - 62 - L..Qbjetivos -- tres órganosa los estímulosque alteransu desarrolloo crecimiento.Conocerqué órganoes más resistentey cuál más sensible. Delimitar la intensidad de actividad glucocorticoide requeridapara provocar efectossobre un órgano dado y el margen de saturaciónde la respuestade cadaórgano. Diseño experimental: Compararlas alteracionesde pesoabsolutoy relativo de cada órganorespectoa los otrosdosen cadanivel deactivaciónglucocorticoide. Hipótesis2b: Unaalteracióndepesoenun órganopuedeno serconsideradacomouna alteraciónen su crecimientoo desarrolloya quepuededeberseadiversosfactores. Objetivo 2b: Consisteen estudiarsi los efectossobreel pesode cerebro,corazóny riñon secorrespondenrealmenteconunaaplasia(menornúmerode células) de estosórganos, o conuna atrofia(menortamaño)de lascélulasqueintegranel órganoencuestión. Diseño experimental: Utilizaremosel contenidototal de ADN de cada’órganocomo una variable indicativa de la aplasiao hiperpiasiadel mismo. Existen modelosmatemáticos comentadosen la Metodología,quepermitenun cálculoaproximadodel númeróde célulasde un órganoen función del contenidototal de ADN. Tambiénse puedecalculai~ el índice del tamañocelularen el que interviene,ademásdel contenidode ADN, el contenidode proteínas totales. Parael cálculo de estosindicadoressevaloranel contenidode ADN y de proteínastotalesdel encéfalo,corazóny riñón por técnicasbioquímicasapropiadasque se describenen la Metodología. 3. REFERENTEAL ESQUELETO Entre los elementoso unidadesqueforman partedel total del animal,el esqueletoes un componentehabitualmenteolvidado desdeel punto de vista fisiológico. Sin embargo,concurrenen él varios factoresa considerar:contribuyecon el porcentajemásalto al - 63 - —— IW,trés crónico, actividad gIucocortia~i de y crecimiento —— peso total del organismojunto con la musculatura,su desarrolloy dimensionesson causa directade las dimensionesalcanzadaspor el animal, y esun tejido vivo, sedede importantes intercambiosmetabólicosobviamentecontroladoshormonalmente,control en el que los glucocorticoidesdesempeñanuna función. Desdeel punto de vista aplicado, el esqueleto resultaser el resto orgánicopostmortemmásestableal pasode los años.De ello que cienciascomo la Medicina Forense,la Antropología,la Paleontologíay la Arqueologíatratende leer” en ellos la ‘historía biológica” de los individuos, poblacioneso especiesque representan.Estos estudiosresultan ademásbastante“rentables” para las ciencias mencionadas,ya que, al ser uh tejido cuyo metabolismose ajustacontinuamentede acuerdoa las fluctuacionesdel medio internoy del habitat,éstasdejanhuellasindeleblesen el esqueleto. En estepunto y como consecuenciade lo expuesto,podemosplantear aquellos objetivos de esta Tesis que consideramosmás interesantespor ser los más novedosos,y los que realmenteprovocaronque nos planteásemosla realización de este trabajo. HIPOTESIS 3: ¿Las alteraciones del crecimiento animal debidas a la actividad glucocorticoidey a los factores ambientalesque la provocan, tales como el mido, son detectablesen el esqueleto?. OBJETIVO 3: Nos proponemosun estudiodimensionaly constitutivo,del esqueleto cranealde los animalessometidosa los diferentestratamientosdesdediferentesperspectivas que desglosaremosen las hipótesis3a, 3b, 3c y 3d. DISEÑO EXPERIMENTAL: Nos gustaría,sobretodo, justificar aquí la eleccióndel craneo como componentedel esqueletoa estudiar. Partiendo del hecho de la falta de experienciade nuestroequipo de fisiólogos en estetipo de estudios,el cráneonos resultó atractivopor ser una estructurarelativamentevoluminosa y compactadentro del esqueleto global. Al estarformadopor una diversidadde huesosdistintospero dificilmentedisgregables y que representanzonasbien diferenciadasmorfológica y funcionalmente(esplacnocráneo, neurocráneo,etc.), es capaz de generaruna gran variedad de información en un análisis - 64 - —Objetivos — conjunto. Es, además,fácil de limpiar y manejar,estárelaciondocon uno de los órganosestudiados(encéfalo) que presentauna notable importancia funcional y orgánica. Contieneelementos,como son las piezasdentales,que aun no habiéndoseestudiadoahora, puedensersusceptiblesde serevaluadosposteriormente.Esto último es de vital importancia considerandoque la poca información bibliográfica respectoa alteracionesdel esqueleto provocadas por estímulos ambientales o por agentes estresanteshace referencia frecuentementea estudiossobrela dentición. Por último, pensamosque el cráneoes la estructura ósea sujeta a cambiosdebidosal crecimientodurantemayor tiempo despuésde queel individuo alcanzala pubertad,por lo que puedeser objeto de cambios morfológicos causadospor estímulos ambientalesen el periodo de edadpor nosotrosestudiado.Sin embargo,su remodelaciónestá menossujetaa cambiosgeneralesde la actividad fisica locomotora,exploratQríao postural comosucedecon los huesosde las extremidades. Hipótesis 3a: ¿Podríala actividadglucocorticoide,y estímulos ambientalescomo el ruido, reducirel tamañodel cráneode los animalespúberes?. Objetivo 3a: Nos proponemoscomprobarlas alteracionesde las dimensionesdel cráneoprovocadaspor el excesode glucocorticoidescirculantesen función de su mayor o menorintensidad. Diseñoexperimental: Se defineny se asignanombrea 23 variablesdimensionalesdel cráneode la rataque aparecendescritasen el apartadocorrespondientede la Metodologíay que representanla totalidad del cráneopor zonasy dimensionesespaciales.Comparamosel valor quealcanzanestasvariablesen unostratamientosrespectoa otros. Hipótesis 3h: Las variables craneométricasdescritas pueden presentardistinta sensibilidadfrentea los factoresque alterensu crecimiento,de maneraque unasdimensiones espaciales,o unaszonasdel cráneo,seveanmásafectadasqueotras. ¿Podríaversealteradala - 65 - -- k=~réscrúnico, actividad glucocortico¡dc y crecnflien~o — morfología craneal?.¿Quézonasdel cráneoson más establesy cuál es la intensidad de la activación glucocorticoide que las modifica, así como su margen de tolerancia a la modificación?. Objetivo3h: Pretendemoscomprobarposiblescambiosmorfológicosen relacióncon la distinta intensidad de actividad glucocorticoide,de acuerdocon la alteracióndiferencial de variables craneométricasque representandiferentesdimensionesespacialesdel cráneo, o diferenteszonasdelesplacnoo neurocráneo, I)iseño experimental: En este caso se estudian y comparan entre los diferentes tratamientos,47 índicesquerelacionanlas variablescraneométricasentresí, y quesedescriben en la Metodología. El estudio de los índicesconfirmará o no los resultadossobreefectos diferencialesplanteadosen el estudioindividual de las variables. Hipótesis3c: Deacuerdocon los resultadosobtenidosen los anterioresóbjetivos cabe preguntarse¿cuálesel patrónde crecimientodel cráneoa estaedad?y ¿quévariablessonlas más representativasdel mismo a la hora de diseñarfuturos estudiosen animalesde estas características(estirpe,edad,sexo)?. Obietivo3c: Consisteen caracterizarel patrónde crecimientodel cráneoen la estirpe, edad y sexo de los animalesestudiados,señalandolas variables más representativasque permitan asignar los animales al grupo experimentalcorrecto de acuerdocon el efecto provocadosobre su crecimiento.Conseguireste objetivo es importanteporque reducirá el número de variables a utilizar en futuros estudios aplicados a animales de las mismas condiciones,ya queel manejode 23 variablesy 47 índicesresultaárduoy en ocasionesestéril. I)isd?o exnerimental Paraello, sehaceun estudiode las variablescraneométricaspor técnicas de análisis estadísticomultifactorial que permiten, por un lado, facilitar la interpretaciónde los resultadosde un amplio númerode variablessin que seproduzcauna pérdidaconsiderablede informacióny, porotro, analizarla contribuciónde unasvariablesen relación a otrasa la hora de clasificar, mediantefunciones matemáticas,cadaanimal en su grupoexperimentaly respectoa los demás,de acuerdocon la magnitudo dimensiónadquirida por la variable. Las técnicasreferidas,que sondescritascon detalleen la Metódologia,son el - 66 - --Ohje1ivu~ -- Análisis de ComponentesPrincipales(ACP) y el Análisis Discriminante. Hipótesis3d: Los glucocorticoides,y otrosmecanismosreguladorescuya alteraciónes concomitantecon la activación del eje ¡-¡HA, ejercenaccionesdiversassobreel metabolismo intermediario.El metabolismoóseoy la actividadfundamentalde las célulasóseasconsisteen controlarlos intercambioso el almacenamientode distintosminerales(mayoritariamentecalcio y fósforo). ¿Podríauna actividadglucocorticoideintensificadaalterarla composiciónmineral del hueso?. ¿Podría la alteración del contenido en un constituyentemineral específico representarel efecto de una actividadglucocorticoideintensa,o incluso relacionarsecon la exposicióna un factor ambientalespecíficocomo el mido?. Ello puedeserde interés, pues validaríaqueunaalteraciónespecíficaen el contenidomineral,puedaserconsideradacomoun marcadorindeleblede la exposiciónal estrésen los restosóseosde las poblacioneshumanaso animales. Objetivo 3d: Nos proponemoscomprobar la existencia de alteraciones de los constituyentesdel hueso, como consecuenciade la distinta intensidad de actividad glucocorticoiderepresentadapor los tratamientos.Tambiénpretendemosevaluarla existencia de algún constituyente,cuya alteraciónpuedaserconsideradacomo marcadordistintivo de la exposiciónal ruido. Diseño experimental: Paraello sevaloray cuantificael contenidode ocho elementos mineralesbásicos,incluyendo calcio y fósforo, en las mandíbulasde los animalesde los cinco gruposexperimentales.La técnicautilizada que se describeen la Metodología,o ICP-AES, presentauna alta sensibilidad para la detecciónde componentesmineralesen cantidades infinitesimales,en muestrasgeológicasy biológicas. Secompararánlas cantidadesde los ocho elementos,medidasporanálisisestadísticosconvencionales,paraconseguirunaaproximación a la existencia o no de alteraciones y, posteriormente,mediante análisis estadístico multifactorial se evaluarála contribuciónde la alteraciónde cadaconstituyentemineral a la caracterizacióndel efectode los tratamientos. - 67- III. METODOLOGIA III. METODOLOGIA Con el objeto de facilitar la adquisición de los productosy medios instrumentalesque sehan empleadoen las diferentestécnicasal serviciode nuestrodiseño experimental,hemosconfeccionadounaslistas donde se muestranlas caracteristicasy las empresasque comercializan el material más específico utilizado. Estas listas aparecen recopiladasal final deestecapítulobajo los epígrafesde: Anexo 1. Reactivosespecíficos,hormonasy anticuerpos. Anexo II. Aparatos. 1. MATERIAL BIOLOGICO En el presentetrabajo sehan utilizado ratas machode la estirpe Wistar, Ratius norvegicus,nacidasy criadasen el estabulariodel Departamentode Biología Animal II (Fisiología) a partir de reproductoreslila-Credo (Francia). Las condicionesde estabulación fueroncontroladasa 20-220C de temperatura,fotoperiodono invertido l2/12hluz/oscuridady 64% de humedad. Después del nacimiento, se seleccionaron los maéhos y se distribuyeron aleatoriamenteen camadasde cinco crías cadauna, empleándosejaulas de mantenimientode 50x25x15 cm (Panlab). A los veintidósdíasde edad, los animalesfueron destetadosy seformarongruposhomogéneosen peso,de cinco animalesporjañia. A partir de ese momento, fueron mantenidoscon aguay comida “ad libitum”; se utilizó una dieta especialpararata,tipo AO.4 de Panlab,con un contenidoenergéticode 299 Kcal/Kg. Con la finalidad de comprobarla homogeneidaden el peso de los diferentesgrupos, todos los animalessepesaronal nacimiento,destetey sesentadíasde edad. Todos los tratamientosse iniciaron cuando los animalescumplieron sesentadíasde edad. - 68 - -- Aletodo logia -- 2. DISEÑO EXPERIMENTAL 2.1. TRATAMIENTOS Cadatratamientotuvo una duraciónde treintadías(desdeel díasesenta al noventade vida), efectuándoseentrelas 8:30 y 9:30 h. Los tratamientosutilizadosfueronlos siguientes: a.- Estímulo sonoro(Gruno Str). Se aplicó una señal acústicacontinuade 2640 Hz, con unapotenciade 30 W y una intensidadde 102 dB, durante15 mm/día. Dicho tratamientoserealizó entrelas 9:15 y 9:30 h. b.- Administración de ACTH (Grupo Ac). Se admiistró diariamente una inyección subcutánea(sc) de ACTI-1, en dosis de 1.5 UI/IQO g de peso corporal. c.- Administración de dexametasona(Gruno Dx). Se inyectó diariamenteuna dosisde 100 pg/100g depesocorporal,vía sc. d.- Administración de dexametasonay aplicación del estímulo sonoro (Grupo DxStr). Seaplicarondiariamentelos tratamientos-c- y -a-, en esteorden,con un intervalode30 mm. e.- Animalescontrol (GrunoCo). Estosanimalesfueronmanipulados(transporte, pesaje,salino) de igual forma que los tratados,exceptuandolos estímulos estresantesy las administracioneshormonales. La señalsonorautilizadacomo estímulo estresanteseobtuvomediante un ordenadorpersonaly un ecualizador,con los que sedeterminóla frecuencia,la duracióny - 69 - —— Es!rés crónico, actividad gí uc<,cortíco¡cle y crecimiento — el tipo de señal.Dicho sonidosegrabóen unacinta magnetofónica. 2.2. PROCEDIMIENTO Entre las 8:35 y 8:45 h se inyectabaa los animalesde los gruposAc, Dx y DxStr. A continuación, sedejaban 30 mm de reposoy a las 9:15 h todos los animales eran transportados hasta las salasde estrés; en éstasse sometían al estimulo solamente los gruposStr y DxStr. A las 9:30 h todos los gruposerandevueltosal animalario,concluyendo así el tratamiento. Los animalesse tratarondiariamentey fueron sacrificadosel último día del citado periodo (30 dias), no antes de una hora de finalizada la última sesión o administración.Seutilizaron 10 animalesporgrupo. Lascantidadesde hormonaainyectaren cadacasose calcularona partir de los pesosindividuales,de forma que semodificó cuandofue necesario,paramantenerla dosis.La dilución de las mismasse realizó de maneraque el volumen inyectadofresede 0.25 ml porcada100 g de pesocorporal. 2.3. PARÁMETROSA ESTUDIAR Se valoraron los efectos de los distintos tratamientos sobre los siguientesparámetros: - Parámetros hormonales: - Se midieron los niveles plasmáticos de coriicoslerona mediantela técnicade radioinmunoanálisis,cuyo desarrollose describeen el apartadode técnicas analíticas. - Parámetros de crecimiento y desarrollo: - Evolución temporal de la ganancia de peso durante el tratamiento, evaluadaa travésde la construcciónde curvasde pesode Los animales.Estascurvas se 70 - -- AIctodología -- obtuvierona partir de las medidasde esteparámetrorealizadascadatresdías. Evolución de la ingesta de comida. Suevaluaciónseefectuómedianteel control dela ingestade comidacon igual periodicidadqueparala gananciade peso. - Distribucióndegrasasubcutáneaen ¡os plieguesescapular,centraldel lomo y dorsalde la patatrasera.Sevalorómedianteel empleodel calibrede grasa. - Dimensionescorporales. Estas dimensionesfueron la longitud: total y la envergadura,determinadaspormediciónmétrica. - Desarrollo y crecimiento del encefalo, corazón y riñón. Su eValuación se describeen el apartadodenominadoestudiodel desarrollode los órganos. Craneometría.La definición de las variablesy de los índicescraneométricos,y su obtención,sedescribenen el apartadocorrespondiente.La craneometríaflie objeto de análisis estadísticoconvencionaly multivariante, descrito en su correspondiente apartado. Contenidode maeroy microconstituyentesdel hueso.El contenidoen el huesode estosconstituyentesmineralessedeterininómediantela técnicade espect±ometriade emisión por plasma de acoplamientoinductivo (ICP-AES), cuyo procedimiento apareceen el apartadode técnicasanalíticas.También fue objeto de un tratamiento estadísticoespecial. 3. OBTENCLONDE MUESTRASBIOLOGICAS DELOS ANIMALES 3.1. MUESTRASDE SANGREY PLASMA Todos los animalesfueron sacrificadospor decapitación,en una sala ajenaal animalarioy a la salade exposiciónal estrés. -71 - -- lEs! rés cránico, ac!ii’¡dadglucocorticoide y crecimiento -- Las muestrasde sangre se recogieronen vasos de precipitado con EDTA, en frío (40C). Seguidamente,la sangrefue centrifugadaa 4500 rpm durante10 mm a 40C parala obtencióndel plasma. Cada muestra de plasma se repartió en varias alícuotas que se conservarona-200C hastael díade las correspondientesvaloracioneshormonales. 3.2. MUESTRASDEORGANOSY CRANEOS Tras la decapitaciónde los animalesseprocedióa su necropsiaparala obtenciónde los siguientesórganos. Se extrajeronlos riñones, corazóny encéfalo, siendo depositadosen recipientesadecuadospara su inmediato pesajeen fresco. Concluido éste, las muestrasse congelarona -200C hastael momentode lasrespectivasvaloraciones. En relacióncon el procesamientode los cráneosde los animalestras la decapitación,las cabezasfueron desprovistasde la piel y congeladashasta el inicio del estudio,momentoen el cual fueron sumergidasen aguaa temperaturaambientedurante24 h. Transcurridoesteperiodode tiempo se cocierondurante1 5 mm en unasoluciónde perborato de sosa(60 g/l) para, posteriormente,serdescarnadascon cuidadoy así obtenerlos cráneos quefueronfinalmenteblanqueadoscon aguaoxigenada. Respectoal mantenimientoespecíficode las mandíbulas,éstasfueron envueltasen papelde parafinay mantenidas,hastael momentodel análisis, a -200C con el fin de inhibir posiblesreaccionesde autolisisasícomo el desarrollode microorganismos. 4. ESTUDIO DEL DESARROLLO DE LOS ORGANOS Con la finalidad de conocer si los efectossobreel desarrollode los órganosse correspondencon una aplasiao con una atrofia, se determinaronel número y - 72 - —- Afetodologia —— tamañocelulardel encéfalo,corazóny riñón. Estas variables se determinaron aplicando las fórmulasdescritaspor Enescoy Leblond(1962). El númerodecélulasvienedadoporel númerodenúcleosqué secalcula considerandoel contenidoabsolutode ADN del órganoen relacióncon el contenidomedio de unacélulaeucariota(6.2pg). n0 de núcleos= ADN (mg) del órganox 103 /6.2 pg Se consideracomo índice del tamaño celular a la relación entre el contenidoen proteínastotalesy el númerodenúcleos(en millones). Indicetamañocelular= Proteínastotales(i’g) / n0 núcleos(106) Para la realizaciónde estoscálculos se precisaconocerel contenido total de ADN y proteínasde los órganosseleccionados,cuya valoraciónaparecedescritaen los apartados6.2. y 6.3., respectivamente. 5. TECNICA CRANEOMETRICA Las medidas de cada una de las variables que a continuación se describenfuerontomadascon un calibredigital, detal forma que seefectuaronparacadauna de ellas tres estimasque posteriormentefueron promediadascon el fin de reducir el error intraobservador.La estimaciónfue siemprerealizadapor la mismapersona. Han sido medidas un total de 21 variables craneométricas.Estas variables forman parte de las habitualmenteconsideradasen los estudios craneométricos efectuadostantoen animalescomo en humanos(Byrd, 1988; Nadaly cols., 1968)y aparecen definidasen los tresejesespacialesasícomoen las regionesdorsaly ventraldel cráneo,siendo representativastanto del esplacnocomo del neurocráneo.Los puntosanatómicosdel cráneo que definenestasvariablesy su descripciónaparecenrespectivamenteen la Figura 4 a, b y en la Tabla 1. - 73 - -- Estrés crónico, actividad glucocorticoidey crecimiento — KB E o D 9 7 Figura4 a: Variablescraneométricas. - 74 - u ¡ Metodología--u E u E u u E E ¡ E u E u Figura4 b: Variablescraneométricas. - 75 - -- ftVrés cróníco. activutad glncocorticoide y crecimiento — VARIABLES CRANEOM ETRICAS A-B longitud total o máxima dcl cráneo; distancia comprendida entre el punto más saliente del hueso Occipital y el Prostion (6>. 11-12 longitud palatina; distancia comprendida entre el Palalion (II) y el Oral (12). K-M/K’-M’ longitud del arco dental mínimo; distancia comprendida entre el punto más anterior del contacto incisointermaxilar (1<) y el punto anterior del primer molar (M). 1-2 altura exooccipitat distancia comprendida entre el punto superior del hueso Occipital en la línea sagital (1) y cl Opislion (2). 2-3 altura del ¡‘2oralnen magnum; distancia comprendida entre el Opistion (2) y el Basion <3). Tabla 1: Descripción de las variables craneométricas. - 76 - ¡ E u u E u u E u ¡ u ¡ 3 E ¡ ¡ E -— Alelodologia — Asimismo se establecieron 47 índices a partir de las variables craneométricasdescritas(Tabla 2). En ellos, cuandola variable denominadorrepresentauna anchura,la abreviaturadel índice comienzapor T y cuandorepresentauna longitud, lo hace por L, salvocuandoesalongitud esla total, en cuyo casoel índicecomienzapor 1. Previamentea la descripciónde los índicesconsiderados,es necesario definir dos nuevasvariablescraneométricasdada su implicación en varios de ellos. Estas variables,que no fi.ieron estimadasdirectamente,son:longitud del neurocráneo; distancia comprendida entre el punto más saliente del hueso Óccipital -J/A-13 md. yugonasal total l-yugonas = lOO * D-E lA-E md. basioccipital total I-hasiocc = lOO * 3-4/ A-E md. bicigomático total I-bicigom = lOO * 7-7/A-E md. cefálico total 1-cefalir = lOO * 8-8/A-E md. cigobregmático total 1-cigobre = 100 (2-E lA-U md. cigointermaxilar total l-cigoint = lOO * C-I ¡A-E md. esfenopalatino total I-esfenap = lOO * 4-5 /A-B md. exooccipital total 1-exoccip = 100 • 1-2 ¡A-E md. total del foramen 1-foramen = lOO * 2-3/ A-E md. jaterorbitario total 1-interor = LOO * 9~9/ A-E lnd. nasal total md. nasointermaxilar total ¡-nasoint = 100*11~1/A~li md. suprauccipital total l-supraoc = lOO * 0-1 ¡A-E lnd. longitudinal total 1-total lOO * neuro/A-E md. yugointermaxilar total l-yugoint = lOO * l)-J /A-B lnd. yugonasal total l-yugonas = 100 * 1)-E/A-E .1 Tabla 2 (continuación): Descripción de los índicescraneométricos - 78 - —— Aletodologia —. 6. TECNICAS ANA LITICAS 61. VALORACION DE CORTICOSTERONAPLASMÁTICA Se utilizó la técnicade radioinmunoanálisis(RIA) puestaa punto por Villanús y Gamallo (1985). Al ser la corticosteronauna hormonaesteroide se hace necesaria,a partir de cada muestra, una fase previa de extracción de la hormona. La corticosteronamarcadaes de uso comercial.Esta técnicaconsta,por consiguiente,de tres partes: - Procesode extracciónde lacorticosteronacon diclorometano.Finalizadala cual serealizaen el extractounaestimade la recuperaciónde corticosterona. - Reacciónantígeno-anticuerpo. - Separacióncon hidroxiapatitade las fraccionesligada y libre mediantevarias centrifugacionesseguidasde lavadoscon tampónfosfato. - Contajey cuantificación. 6.1.1. REACTIVOS ESPECIFICOS Tampónfosfato0.05 M, pH 7.4. Para1 1, en aguadestilada: 6.175g de fosfatodisódico. 0.8 18 g de fosfatomonosódico. 0.876g de clorurosódico. SolucióntampónTF-AG 0.005 M. pH 7.4. Se diluye tampón fosfato 0.05 M en aguadestiladaen la proporción 1/lO (y/y). - 79 - —— Estrés c,-ónico, actividad glucocorticoide •v crecimiento —- Porcada100 ml de estasoluciónseañaden: 60 ml de BSA. 20 mgde gammaglobulina. Tampón fosfato0.001 M, pH 7.4. Se diluye tampónfosfato 0.05 M en agua destilada en la proporción 1/50 (y/y). Suspensiónde hidroxiapatita,al 2.5% (p/v) en tampónfosfato 0.001 M. Solución de Aquasol (Dupont). Esta solución se utiliza para la medida de muestrasacuosas,tanto en los propios tubos de RIA como en los viales de centelleo. Soluciónmadrede corticosteronafría de 1 ~ig/mlde etanol. Soluciónde corticosteronamarcada,con unaactividadde 6800dpm por 100 ~tl de TF-AG. Soluciónde anticuerpo,auna dilución 1:10000 6.1.2. EXTRACCION DE CORTICOSTERONA Se descongelanlas muestrasde plasmay se agitanen vortex. En tubos de extracción,con bocaesmeriladay tapónde vidrio, sepreparanlos problemasy los blanco de acuerdocon el siguienteprotocolo: PROBLEMA BLANCO Muestra de í>lasma 50 ~tl Agua destilada 450 pl 500 pl Corticosterona-113 SO pl 50 pl AGITAR Y REPOSAR 20 MiNUTOS Diclorometano 5 ml 5 ml - 80 - —— Aietockdogia —— La adiciónde la corticosterona-H3serealizaparacontrolarlas pérdidas duranteel proceso,lo que sevaloraal final comoestimade la recuperaciónde corti¿osterona. A continuacióntodos los tubossecolocanen el agitadorrotatorio a 30 rpm durante30 mm. Transcurridoestetiempo, seaspira el sobrenadante(faseacuosa)con unabombade vacío.El residuosedecantaa tubosde vidrio limpios y seevaporaa sequedad bajocorrientede aireo mediantevacio, enbañoa370C. A los extractossecos(uno pormuestra)se les añade1 ml de tampón TF-AG 0.005 M pH 7.4. Se agitan 1 minuto y se dejan reposardurante30 mm. De cada extractoredisuelto se apartan 100 i.tl en un tubo para la realizacióndel RíA propiamente dicho. Antes de continuar con el proceso del RIA, vamos a realizar la estimaciónde la recuperaciónde corticosteronatras el procesode extracción.Paraello se pipeteanen viales para contaje (un vial por muestra)500 pl del correspondienteextracto redisueltoy en otrostresviales,paradeterminarla actividadtotal, 50 pl de corticosterona-1-13. Se les añade10 ml de soluciónde contajeAquasoly secuentandurante10 minutos en un espectrómetro13 decentelleoliquido. Los resultadosde recuperac’.ónde la extracciónaparecen registradosen el apartadode característicasdel RIA. 6.1.3. REACCION ANTIGENO-ANTICUERPO Se partede la soluciónmadrede corticosteronafría paraconstruir una curva patrón de corticosterona con nueve puntos que comprenden un rango de concentracionesde 3 a 8000pg/tuboen 2 ml de TF-AG. A continuación se procede a la valoración por duplicado de las muestrasy por triplicado de los puntos de la curva patrón, de acuerdocon el siguiente protocolo: -81- —— Lslrés crónico, ncti~’idnd gfucocorlicoide y crecimiento — PROBLEMA PATRON Extracto problema lOO pl loo III Anticuerpo 500 pl 50(1 pl AGITAR Y PREINCUBAR 30 MINUTOS Corticosterona-H3 100 pl 100 pl A los tubosde las muestrasy de la curva patrónhay que añadir: - Tres tubos de actividad total (At), conteniendo unicamente 100 pl de corticosterona-H3. - Tres tubos residuales(N), conteniendo600 pl de tampón y 100 pl de corticosterona-l-13. - Trestuboscero (RO), que no llevan patrónni problema,paradar el punto cero de la curva.Cadauno de elloscontiene100 pl de corticosterona-H3,500 pl de anticuerpoy 100 pl de tampón, - Ademásseincluye, entrelos tubos de un grupoexperimentaly el siguiente,la valoración de un suero comercial estándarde corticosteronaque permite la estimaciónde variacionesintra e interensayo,resultadosque aparecenen el apanadode característicasdel MA. Trasagitartodoslos tubosseincubana 2-40C durante12 a 18 h en reposo. &I.4. SEPARACIONDE LAS FRACCIONES LIGADA Y LIBRE Se añaden200 pl de la suspensiónde hidroxiapatitaa todos los tubos menosa los At, y a continuaciónserealizanlas siguientesoperaciones: Se agitay secentrifúgaa 1500g durante10 mm. Seconservael precipitado. - 82 - -- A fetodologia -- Seañade1 ml de tampónfosfato 0.001 M pH 7.4. Se agitay secentrifugaa 2000g durante10 mm. Seconservael pretiipitado. - Se añade 50 ~.l de tampón fosfato 0.05 M pH 7.4 para resuspenderel precipitado. Se agitantodos los tubos y se añadea cadauno 2 ml de ?soluciónde Aquasol. A continuaciónseintroducenen viales de vidrio y semide la radioacti’>idaden un espectrómetrode centelleofi durante4 mm. 6.1.5. CARACTERISTICASDEL lilA La recuperaciónde la cortieosterona-H3añadidaa las muestra~de plasma despuésdel procesode extracciónfue de 78 + 8.6 ng/ml. La sensibilidadde la curva patrón fue de 0.08 ng/ml. Los coeficientesde precisión intra e interensayoflierorí del 8% y 11.7%,respectivamente. 61. VALORACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS Se siguió la técnica descrita por Schneider (1957) basadaen la solubilidad de los ácidosnucleicosen ácidotricloroacéticocaliente.Constade dos partes:la extracciónen frío de los compuestossolubles en ácido y alcohol, y la detetminacióny cuantificaciónmediantecolorimetríade los ácidosnucleicos. 6.2.1. REACTIVOS ESPECíFICOS Suerosalino: clorurosódico0.12 M. Reactivode difenilamina: - 83 - -- (sstréx crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento — 1 g de difenilaminapurificada. lOO ml de ácidoacéticoglacial. 2.75 ml de ácidosulfúricoconcentrado. 6.2.2. EXTRACCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS Se procede a la homogeneizaciónde los órganos. El encéfalo se homogeneízaenterocon 3.4 ml de suerosalino y 6.6 ml de etanol al 96%. En el casodel corazóny los riñones,setomaunaalícuotadeaproximadamente0.4 g y sehomogeneizacon 2 ml de suerosalinoy 4 ml de etanolal 96%. A continuaciónsetoma 1 ml de homogeneizadoy seprocedea sucesivasextraccionesen frío (40C)y porduplicado: - Primero con ácido tricloroacético 0.15 N (2.5 mi) y separacióndel precipitadopor centrifugación(4500rpm, 10 mm). - Despuéscon etanol al 96% (5 mí) y separacióndel precipitadopor centrifugación(4500rpm, 10 mm). Posteriormente,para separarlas proteínasse realizan dos sucesivas incubacionesdel precipitadocon ácidotricloroacético0.075 N, en bañoa 750C(2.6 mí, 30 mm y 0.5 mí, 15 mm). En ambosprocesosseseparael sobrenadante,en el que seencuentranlos ácidosnucleicos,mediantecentrifugación(4500rpm, 10 mm). 6.2.3. VALORACION DE ADN De acuerdocon Schneider(t957), la difenilaminaal sercalentadaen soluciónácidareaccionacon la desoxirribosaproduciendounatonalidadazul. A partir de una solución madrede ADN de timo de terneradisuelto en agua destilada, se construyeron los patrones de la curva estándaren un rango de concentracionesde 5 a500 ig/mI. La ecuaciónresultantefue la siguiente: - 84 - —— Afetodología —— Concentraciónde ADN absorbanciax 528.459-1- 0.149 coeficientede correlaciónr = 0.999640594 A continuaciónseprocedea valorar los patronesy las muestraspor duplicadoconformecon el siguienteprotocolo: A 2 ml de muestrase añaden4 ml de reactivo de difenílamina y se incubadurante10 mm al bañoMaría. Seenfriaen bañoatemperaturaambientedurante5 mm. El blancosepreparócon ácido tricloroacético0.075 N. La lecturade absorbanciaserealizóa 600 nm. 6.3. VALORACION DEPROTEíNASTOTALES Las proteínas se determinaron siguiendo la técnica colorimétrica descritapor Lowry y c-ols. (1951). Consisteen la formación de compuestoshemiquinónicos coloreados(tonalidad azul) por la acción del ácido fosfomolibdotúngsticosobre el grupo fenólico de los residuosde tirosina presentesen las cadenaspolipeptídicas.Previamentelas proteínasse desnaturalizande forma que todos los restosde tirosina quedenexpuestosal medio acuoso, Esto se consigue utilizando sales de Cu2+ en medio básico (pH 10), formándosecomplejosestablesentredichocatióny los grupos-NH- del enlacepeptídico. 63.1.REACTIVOS ESPECIFICOS ReactivoA: carbonatosódico0.19M en hidróxidosódico0.1 N. Reactivo U: se mezclan en proporción 1:1 (y/y) las siguientes soluciones:sulfato de cobre11 0.04 M y tartrato sódicopotásico0.07 M. ReactivoCi 50 ml de reactivoA + 1 ml de reactivoB. - 85 - -- Estrás crónico, actividad glucocorticoide ~vcrecimiento — - Reactivo de Folin-Ciocalteu:diluido con aguadestiladaen proporción 1:2 (y/y). 6.3.2. DETERMINACION DE PROTEíNAS Para realizar la curva patrón se utilizó albúminabovina, fracción y, disuelta en suero salino en un rango de concentracionesde 5 a 300 pg/ml. La ecuación resultantefue la siguiente: Concentraciónde Proteínas= absorbanciax 1016.295- 24.337 coeficientede correlaciónr = 0.995069248 Las proteínassevaloraronpartiendodel homogeneizadorealizadopara la extracciónde los ácidosnucleicos.Cadamuestrase diluyó 200, 60 y 55 vecesdependiendo de la cantidadde proteínaesperada.Seprocediósegúnel protocolodescritopor Lowry y uds. (1951). El blanco se preparócon 0.8 ml de una soluciónde suerosalino. La lecturade absorbanciaserealizóa 500 nm. 6.4. VALORACION DE LOS CONSTITUYENTES MINERALES DEI HUESO Esta valoración se realizó empleando la técnica denominada espectrometríade emisión por plasmade acoplamientoinductivo (ICP-AES), metodología desarrolladaparael análisisde huesoporMartín en 1993. Estatécnicasebasaen la propiedadquetienen los átomos,en su estado fundamental,de absorberciertas cantidadesde energíapasandoa estadosexcitados.En su vuelta al estadode equilibrio, el átomo o lón excitadodevuelve la energiaabsorbidaen forma de radiacioneselectromagnéticasemitidasen longitudesde onda características,de tal modo - 86 - —— lvi etodologia —— que esaenergíacedidaesúnicaparacadaelementoy constituyesu espectroatómico. 6.4.1. PREPARACIONDE LAS MUESTRAS Estetécnicaanalíticarequiereunapreparaciónpreviade las mandíbulas a analizardadoque la formamásgeneralizadaparala introducciónde la muestraen un plasma esen solución. Estapreparaciónconsisteen las siguientesetapas: - Secado:las mandíbulassondesecadasa 1 100C en unaestufaduranteun periodo de 24 h. - Calcinación: cada pieza ósea se divide en dos partes y se pesa para a continuación introducirse en un horno de mufla previamente calentado a 1000C. Se establece una rampa de temperaturas hasta alcanzar 400 + 400C en 35 mm. Las muestrassemantienena dicha temperaturadurante4 h. Transcurridoese periodo de tiempo se dejan enfriar en un desecadorhasta temperatura ambiente. - Disolución: sepesan0.25 g de muestracalcinada,la cual se introduceen un hornode digestión por microondasy seañaden2 ml de HCI 2 N y 1 ml de HNO3. Seagitalevemente.La muestradisueltaseeluyehastaun volumenfinal de 50 ml. 6.4.2. DETERMINACION DE MACRO Y MICROCONSTITUYENTES Serealizanbarridosespectralesen el entornode la línea de emisión de cada constituyente mineral,de entre0.05 nm a0.1 nm, registrándoselos espectrosgráficosdel mismo así como del blancoy el de las solucionesinterferentes,Con la visualizaciónde dichos espectrosse evaluanlos efectosde solapamientostotal y parcialde las señalesde emisión,así comolas inherentesa las impurezasde los reactivos. -87- -- ffstrés crónico, actividad glucocorticoide ~vcrecimiento — Comparandoel espectro total de la muestra con los espectros individualesde cadaelemento,se identifican cualitativamentelos elementospresentesen la muestra.Paraconocerla cantidadde cadaelemento,semide la intensidadde luz producidaa la longitud de onda característicade cadaelementoy secomparacon la emitida por él a una concentraciónconocida. 6.42.1. PATRONES PARA LA DETERMINACION DE MACROCONSTITUYENTES Debido a las altas concentracionesde calcio y fósforo, principales constituyentesde la muestraósea,su análisis esmás idóneo en muestradiluida. La dilución óptima para todas las muestrases la 1:20. Se elaborancuatro patronesy el blanco de reactivos. A las soluciones patrón se les añadieron los siguientes componentes:. - Todos los macroconstituyentes que están presentes en la muestra en las concentracionesqueaparecenenel siguienteesquema: (pg/ml) BLANCO P-1 P-2 P-3 1¼ Ca 20.0 50.0 76.4 100.0 P 10.0 20.0 30.0 50.0 La 500 50.0 50.0 50.0 50.0 Los reactivos de ataquedel materiala analizar,diluidosen la mismaproporción queestosseencuentranen la muestra. 50 pg/ml de lantanocomopatróninterno. - 88 - —— Aletodologio —— 6.4.2.2. PATRONES PARA LA DETERMINACION DE MICROCONSTITUYENTES Para la curvade calibrado sepreparancuatropatronesy el blanco de reactivos, a los que se añade: Los reactivos de ataque (HCI 0.5% y/y y HNO3 0.5% y/y). Los elementos macroconstituyentes en la misma proporción que estos se presentan en solución, tal como recoge el esquemasiguiente BLANCO P-1 p-2 P-3 P-4 Ca 1800 1800 1800 ¡800 1800 P 900 900 900 900 900 Mg 20 50 80 lOO Za 0.50 1.00 2.00 5.00 Ca 0.02 0.04 0.10 0.40 Fe 0.10 0.25 0.50 1.00 Sr 0,10 0.25 0.50 1.00 Ba 0.02 0.04 0.10 0.40 6.4.2.3. CALCULO DE CONCENTRACIONES DE LAS SOLUCIONES INTERFERENTES Este cálculo se realiza considerandouna concentración global de muestrade 5000pg/ml, quecorrespondeal ataquede 0.25 g de muestracalcinadaaforadaaun volumen final de 50 mí, estimandola concentraciónmáximaprevisibleque dichoselementos puedenpresentaren el material. EstaconcentraciónWe de 1500 ¡.tg/ml para el calcio, 1000 pg/ml parael fósforo, 20 ¡ig/ml parael magnesioy 1 ¡ig/ml para el bario, hierro, estroncio, cobrey cinc. - 89 - -- (7sf rés cMnico, actividadglucocorticoide y crecimiento — 7. ANALISIS ESTADISTICO 7.1. ESTADíSTICA DESCRIPTIVA De los datos obtenidosparacadavariable,secalcularonen ¿adagrupo experimentallos siguientesparámetrosmuestrales:mediaaritmética(m), desviaciónestándar (ds) y error estándar(e). En las Tablasse representala media + desviaciónestándary en las Figurasserepresentala media+ error estándar. 7.2. TEST ESTADíSTICOS 7.2.1. ANALISIS UNIVARIANTE Análisis de varianzade una vía (ANOVA 1 vía): se utilizó para determinarlas diferenciasprovocadaspor los distintos tratamientossobre las variables analizadas (Sokal y Rohlf, 1979). Análisis de varianzade dosvías(ANO VA 2 vías): * Se aplicó a variablesvaloradasduranteel periodoexperimentaly sometidas por tanto al efecto de dos factores,el tratamientoal que se exponíanlos animalesy la variabletemporal(Milton y Tsokos,1987). * Seutilizó paraestudiarlas diferenciasocasionadasporel lado del cráneoen el que fueron definidasaquellasvariablescraneométricasque son simétricas.El empleodc estetestno condujoal encuentrode talesdiferencias. Test de Fisher y test de Seheife:se aplicaron“a posteriori” a variablesque mostraban diferenciasen el ANOVA con el Fm de determinarla existenciade diferenciasentre paresde grupos. - 90 - -- A’fetodoiogia -- 7.2.2. ANA LISIS MULTI VARIANTE Análisis factorial: análisis de componentesprincipales (ACP). Se utilizó para determinarun númerode factoreso componentesquerepresentasena las variablesde partidaconunapérdidamínimadeinformación. Análisis discriminante: nos permite encontrarÑnciones matemáticascon las que clasificarde forma inequívoca,en basea las variablesevaluadas,cadaindividuoen uno de los gruposexperimentalesconsiderados. La significaciónestadísticaseconsideróa partir de p S 0.05. Todos ¡os cálculosrelativos a las variablesconsideradasserealizaron medianteel paqueteNumber CruncherStatistical System, versión 5.05 (NCSS) (R¡ntze, 1987)y el paqueteStatisticalPackagefor dic Social SciencesPlus,versión 3.0 (SPSS,1989) en un ordenadorAT INVES 640 A turbo II Monitor VGA. -91 - -- túslrés cron¡co, achv¡dadghscoconwoide y cretimienio -- ANEXO 1. REACTIVOS ESPECIFICOS, HORMONAS Y ANTICUERPOS Acido desoxirribonucleicode timo de terneratipo 1 (Sigma). Acido etilendiaminotetraacético(EDTA), sal disódica(Sigma). Acido tricloroacético(TCA) (Merck). Albúmina séricabovina(BSA) fraccióny (Servay Sigma). Antisuero anticorticosterona-21-hemisuccinato-BSA(TecnovusInstitute for Cancer Research,G.B.). - Cloruro sádico(Panreac). - Corticosterona(Lab. Martín). - Corticosterona(1a,2a-(N)-H), actividadespecífica43 Ci/mmol (The Radiochemical Center,Amersham). - Corticotropina(ACTH) (NuvachtenDepot)(Ciba-Geigy). - Dexametasona(Fortecortin)(Merck). - Diclorometaro(Merck). - Fosfatosádicoy disódico(Merck). - Gammaglobulinaséricabovina, fracciónII (Serva). - Hidroxiapatita(Sigma). - Reactivode Folin-Ciocalteu(Merck) Los demásreactivosutilizados flieron de las casasMerck, Probuso Panreac,con un gradode purezaadecuadoparaanálisis. - 92 - —— Aletodología —— ANEXO II. APARATOS Agitadoresmagnéticos. Agitadoresvortex. Balanzasde precisión(August SauterKG. Ebingen, sensibilidad0. 1 mg y H-64 de Mettler, sensibilidad0.01 mg). -Balio termorregulado. -Calibre digital (Sylvac.Precisión0.01 mml.001 “). -Calibre de grasa (Hoistain. Precisión 0.1 mm con una presión constante de 1 0g/mm). Centrifliga de sobremesa (Biofbge B-Heraeus). Centrifliga refrigerada (Hermle ZK-365 de Kontron). Centrífuga refrigerada de sobremesa (TJ-6 de Beckman). Colector automático fISCO PYP). Congelador -20 0C (Liebherr). Digestor por microondas (RMS-150 de Floyd). Ecualizador (Mecasaund Ex-4973 de Metz). Espectrómetro ICP-AES (JY-70 PLUS). Espectrofotómetro (Spectronic 1201 de Milton Roy). Espectrómetro de centelleo líquido 13 (LKB de Wallac). Espectrómetro de centelleo líquido 5 (Multi-prias 1 de United Technologies Packard). Estufa de desecación y esterilización. Fotómetro (Uy-VIS DATA TEST ATOM 366). Homogeneizador (Potter-Elvehjen) acoplado a un rotor de 2900 rpm. Pipetas automáticas de puntas desechables (Eppendorf Fixed finn, Gilson y Oxford). Reproductor de cintas magnetofónicas (CFSI7 iS de Sony). - 93 - 1 u u E u u u u u u u u u u u IV. RESULTADOS Y DISCUSIONu u u u u u IV. RESULTADOS Y DISCUSION 1. ACTIVIDAD ADRENAL La causapor la que esteparámetrova a serdiscutido en primer lugar resideen que su cuantificaciónresultaesencialpor serun indicadorde la intensidadde la activacióndel eje Hl-LA o de la acciónglucocorticoideejercidapor nuestrostratamientos.El conocimientode la intensidadrepresentadapor los mismos,desdeestepunto de vista, es la plataformade partidaparala interpretacióndel restode los resultados. Una de las consecuenciasmásdirectase inmediatasde la estimulación adrenal por cualquier estímulo es la elevaciónde los niveles de corticosteronaen sangre mientras que, contraríanlente,la administración directa de hormonas glucocorticoides (dexametasona)inhibe la producción endógenade corticosteronaadrenal en una medida indicativadel gradode acciónejercidapor el glucocorticoideadministrado.Por estosmotivos, vamosa evaluarla actividadglucocorticoiderepresentadapornuestrostratamientosmidiendo dichosniveles. Evidentementenosotros ya hemos, en este sentido, caracterizado perfectamentenuestromodelo de estrés,fruto de nuestraya largatrayectoriaen estecampo (Alaria y cols., 1986; Alaria y cnt., 1987a,b;Gamallo y cols., 1988).Así, el estadotrófico de las adrenalesha sido evaluadoa través de un amplio númerode variables(Alaria y cnt., 19871» y junto con el grado de repercusiónglucocorticoidede los tratamiéntossobre el contenidohepáticode glucógeno(Velasco, 1990; Alaria, 1991) son, ademásdel que nos concierne,otros parámetrosque nos han permitidovalorar con anterioridadla intensidadde nuestromodelode estrésen términosde actividadadrenaly de acciónglucocorticoideasícomo en relación a los otros modelos comparativos utilizados (administración,de ACTH y dexametasona). A pesarde ello, el puntodepartidaobligadode estetrabajodebeser La reproducciónde esosdatospreviosen los animalesespecialmentetratadosparala ocasion. -94 - —— Resultados y discusion —— 1.1. NIVELES DE CORTICOSTERONAPLASMATICA Los valoresde corticosteronaplasmáticaal finalizar el tratamientose muestranen la Tabla3 y serepresentanen la Figura 5. CORTICOSTERONA (ng/mí) Grupo m ±d.s. Significación Co 197+39 bcde Str 517±54 acde Ac 943±55 abde Dx 2+0.5 abee DxStr 42±8 abcd GrupoexperimentalF (4,45)= 1025.4 pS0.001 Tabla 3: Nivelesde corticosteronaplasmática. Los códigosrepresentandiferenciassignificativasentrelos distintosgrupos experimentales:a = Co, b = Su,c = Ac, d Dx y e = DxStr. Los resultadosponen de manifiesto que el tratamientocon estímulo sonoro produceun aumentosignificativo de los niveles plasmáticosde corticosterona(p= 0.001). La administraciónde ACTH producea su vez un incrementode estahormona(p < 0.001),quefue significativamentesuperioral del grupoStr (p =0.001). En relación con la administración de dexametasona.ésta causó una reducciónsignificativa de los nivelesde corticosteronaen plasma(p=0.001). El tratamiento conjuntode la dexametasonay del estréstuvo por efectouna reducciónde la corticosterona frente al grupo control (p =0.001), aunquesignificativamentemenosacentuadaque la del grupoDx (p=000l) como consecuenciade la acciónestimulantedel estrés. -95 - - ¡ stre~ cromco actividad glucocortícoide y crecimiento — Corticosterona plasmática ng/ml 1000 800 600 400 200 o Figura 5: Nivelesdecorticosteronaen plasma Antes de iniciar el comentario de estos datos, y puesto que toda discusión se sustentasobre resultadosque son a su vez efecto de unos tratamientos determinados,pensamosque esimportante,parapoderdiscutir toda la informaciónque nos brindan, conocer previamente qué objetivos determinaron en su momento el diseño experimentaldenuestrostratamientos.Estediseñocorrespondeconcretamenteal objetivo 1 en el que desdeel puntode vistade la actividadadrenalperseguíamostres distintasintenciones con los tratamientos. Por un lado que causaranunaselevadasconcentracionescirculantesde glucocorticoides,endógenoso exógenos,con la finalidad de que reprodujeranparcialmentelo que sucedea nivel del eje HHA en ¡os animalesestresados.Además,pretendíamosque cada uno de los tratamientosrepresentaraun nivel diferentede estimulaciónde dicho eje de modo que los nivelesanterioresquedasenexcluidosy, por último, que seconsiguieraentreunosy otros una graduaciónen la intensidadde la acción glucocorticoideparapoderasí establecer -96 - -. Resultac¡<>s y discusion -- correlacionesentrela acciónde estashormonasy la intensidadde los efectosque deseamos evaluar sobre el crecimiento. Obviamente la mayor o menor intensidad de la acción glucocorticoide sobre los tejidos es consecuenciade la intensidad de la estimulación corticoadrenalque se traduce, como ya hemos mencionado,en mayoreso menoresniveles circulantesdel glucocorticoideendógeno(corticosterona),asícomotambiénesconsecuenciade ladosisy naturalezadel glucocorticoidecuandoen vezdeestimularsu producciónendógenaes administrado. Atendiendoa estastres intencioneslos resultadosmuestranque, en efecto, la estimulacióndirectacon mido y laprovocadacon la administraciónde ACTH causan un aumentode la producciónadrenalde corticosteronay en consecuenciaaumentanlos niveles en sangrede estahormona.Estos resultadosconfirman los datospublicadosanteriormente (Gamallo y cols., 1988). Nos preguntamosa continuacióncómoseexplican los bajosniveles circulantes de corticosteronaencontrados en los animalestratadoscon dexametasona.La respuestala hallamosen la dosificacióny tipo de administraciónde la dexametasonaempleada con lo que se consiguemanteneren sangreconcentracioneselevadasde esteglucocorticoide exógenoy, consecuentemente,activar un mecanismode regulaciónque inhibe la producción adrenaldecorticosteronaporunaacciónde retroalimentaciónnegativasobreel hipotálamoy la hipófisis. A estarazónhay queañadirla elecciónde la propiadexametasonaqueresultaserun esteroidesintéticocon unaelevadaactividadglucocorticoide,superiora la del cortisoly a la de la propiacorticosterona.Actividad que ha de manifestarseen sus accionessobrelos tejidos y que nosotros constatamospor su capacidadde inhibir la producciónde sus homólogos endógenos.Estos resultadosmanifiestan el logro de la primera de nuestraspretensiones comentadas,puescomo observamostodos los tratamientoscausanelevadasconcentraciones en sangrede glucocorticoides,ya seanestosendógenoso exógenos. Por otra parte,en los tratamientoscon estrésy ACTH se producela activación del eje HHA, más intensaen el caso de la administraciónde ACTH, como manifiesta el aumento de los niveles circulantes de corticosteronaencontradospero, evidentemente,existeuna diferenciaesencialentreambostratamientos.Estadiferenciaradica en el distinto nivel de activación hipotáiamo-hipófiso-adrenalque conducea dicho aumento siendo ésta, como mencionamos,otra de las intencionesperseguidas.De estemodo, en los animalesestresados,la activación del eje Hl-lA afecta, una vez producidala integración sensorialdel estimulo, a todos y cadauno de sus niveles: hipotálamo, hipófisis y glándulas -97 - -- ENtrés croníco. actividad glucocorticoide y crecimiento -- adrenales,mientrasqueen el casode la administraciónde ACTH, dadasu aplicációnexógena, tiene lugar una inhibición de los niveles hipotalámicoe hipofisario pero no de las adrenales cuya producción de corticosterona,como muestran los resultados,es por el contrario estimulada.Estos animalespresentanpuesaltos nivelescirculantesno sólo de corticosterona sino también de ACTH, a pesar de la inhibición hipofisaria, como resultado de su administraciónexógena.De igual forma el tratamientocon dexametasonainhibe los niveles hipotálamicoe hipofisario pero,a diferenciadel tratamientocon ACTH, seproduceademás unareducciónde la producciónde corticosterona.Consecuentementeestosanimalespresentan una actividad glucocorticoide elevada con una inhibición hipotálamo-hipófiso-adrenal importantey bajosniveles de ACTH circulante. De estemodo, con la elecciónde nuestros tratamientos,pretendemosconocerqué efectosson debidos a la estimulación adrenal, y consecuentementea las mayoresconcentracionesde glucocorticoidesqueconstatamoscuando los animalesson estresados,o si en los efectosparticipaademásalgunode los intermediarios en la activacióndel eje. En relacióncon la última de las pretensionescomentadas,la potente acción inhibidora de la dexametasonasobreel eje 1-IHA estáimplícita en los bajosnivelesde corticosteronacirculanteencontrados,ello conjuntamentecon la dosisempleadase convierte en un indicadorde su superiorintensidadde acción glucocorticoiderespectoa los restantes tratamientos.Dato que es apoyadoademáspor los resultadoshalladosen ttabajos previos relativos al efecto glucocorticoide sobre el contenido hepático de glucógeno en estos tratamientos(Velasco,1990; Alano, 1991). Los tratamientoscon estrésy ACTH siguen en menorintensidada los de dexametasona,reflejándoseahora sí en un aumento de los niveles circulantes del glucocorticoide endógeno. Además, los resultados muestran que la activación adrenal representadapornuestrotratamientocon ACTH esde mayorintensidadque laprovocadapor el estrés.Por su parte,el tratamientoconjunto de exposiciónal mido y administraciónde dexametasonamanifiestala oposiciónde dos efectosya mencionados:la activación del eje Hl-lA porel estrésy su inhibición por la dexametasona(Alano y cois., 1987a),de ahíque las concentracionesde corticosteronano alcancenvalorestan bajoscomo en el tratamientoúnico con dexametasona. Como consecuencia,estos resultadosrelacionadosc9n la actividad -98 - — Resuhados y discusión -- adrenalsatisfacenlas premisasplanteadasrespectoal diseñoy tratamientosexperimentales,y contenidasen partedel Objetivo 1. 2. CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE LOS ANIMALES De lo discutido hastael momentoquedaclaro que nuestrosdiferentes tratamientosexperimentalesrepresentanunadistinta intensidad de actividadglucocorticoide que, ciertamente,debe poseeruna repercusiónsistémicasobrediversosparámetros.Es de prever,además,que dicharepercusiónrefleje la graduaciónconseguidaen la intensidadde la acciónglucocorticoidea ellos asociada.Dadoque estaTesistiene como interésprimordial el estudiode las modificacionesde crecimientoy desarrollovinculadasa situacionesde acción glucocorticoideelevadacomo lo es la exposiciónal estrésinespecífico,vamosa centrarnosde entretodoslos factoressobrelos que la actividadglucocorticoidepodria estarincidiendo, en aquellos relativos al crecimiento de los animales lo cual suponeatendera los distintos objetivosparcialesen quehemossubdivididoel citado Objetivo 1, de los cualesel Objetivo la sereferíaa las relacionesentreel pesocorporal,las accioneslipolíticasde los glucocorticoides y la ingestade comida. 2.1. GANANCIA DE PESOACUMULADA Y EVOLUCION TEMPORAL DE LA GANANCIA DEPESOCORPORAL Hemosmedido la gananciade pesode los animalesdesdeel comienzo hasta el final del tratamiento(acumulada),así como su evolución temporal•por periodos semanales,datos que se muestranen la Tabla 4 y se representan,respectivamente,en las Figuras6 y 7. Respectoa la gananciade pesoacumulada,tantoen el grupoCo como en ¡os grupos experimentalesStr y Ac los animales presentanuna gananciaacumulada positiva. En el caso de los animalesexpuestosa estímulo sonoro no aparecendiferencias significativas frente a los controles.Por el contrario, en aquellos tratadoscon ACTH la gananciade pesoacumuladafue muy escasay significativamentemenor que la de los grupos Co y Str (p=0.001).Los gruposDx y DxStr muestranuna pérdidade peso,no apareciendo -99 - —— I~strés crónica, actividad glucocortícoide y crecimiento —— diferenciassignificativasentreellos. En relacióncon la evolucióntemporalde la gananciade pesolos grupos Co y Str muestranuna gananciadepesopositiva durantetodo el periodode tratamiento.Por su parte, los gruposDx y DxStr manifiestanuna pérdidade pesodurantetodo el periodo experimental,másacentuadaen la primerasemana.El comportamientode dichavariableno difiere entre ambos grupos. No ocurre así en el grupo Ac, que presentaen dicho comportamientodiferenciassignificativasfrente a los restantesgrupos (p < 0.001), de tal forma quela evolucióndedichavariablesecaracterizapor la alternanciade semanasen las que seproduceuna gananciadepesocon otrasen las que sepierdepeso.El balancefinal esuna pendientemoderadaen la evoluciónde estavariable. GANANCIA DE PESO (g) Grupo Signir. Acumulada Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Co cde 110.5±20.5 34.7 + 15.1 33.5±6.9 24.1 ±9.7 17.8±9.2 Str cde 109.3 ±24.2 35.8±13.2 27.7±8.1 22.3±53 23.5 + 8.9 Ac abde 5.2±21.7 6.9±14.6 -3.3+ 10.7 4.8±8.7 -4.0±7.9 Dx abc -58.5±23.9 -30.4±14.8 -13.5±9.0 -7.8±8.4 -7.0±7.2 DxStr abc -53.6±19.8 -29.8±13.6 -11.6±7.0 -6.2±7.5 -6.1±6.1 Gananciaacumulada Grupo experimentalF (4,245)= 714.20p =0.001 Evolucióntemporal (Anova2 vías) GrupoexperimentalE (4,980)= 862.48p =0.001 SemanadetratamientoF (3,980) 7.89 p =0.001 InteracciónF (12,980)= 44.62p =0.001 Tabla 4: Gananciade pesoacumuladay evoluciónde la gananciadepesoduranteel tratamiento. Los datosindican la inedia+ desviación estándar. Los códigosrepresentandiferenciassignificativascutrelos distintosgnipos experimentales:a = Co, b = Str, e = Ac, d = Dx y e = DxStr. -loo - —— Resizitados y discusion —— Ganancia de peso Oramos 150 1~Cc EJ Str ~Ac ~Dx ~DxSIr -100 Figura 6: Ganancia de peso acumulada Evolución ganancia de peso Gramos 40- .se Sfr -40- 0 1 2 3 4 Semana Figura 7: Evolución de la ganancia de peso durante el tratamiento -101 - —— lCslrés crónico, actividadglucocorucoide y crecimiento — En primer lugar tenemosque señalar que de nuestrosresultados (comportamientodel pesoen los controles)sededucequeduranteel periodode vida analizado estosanimalesestánaúnen fasede ganarpeso. Además, como esperábamos,los resultadosmuestranuna correlación entre la intensidadde la acción glucocorticoideasociadaa los tratamientosy el grado de alteración de la ganancia de peso de los animales. Es interesantedestacar, aunqueno sorprendente,que la activación corticoadrenalgeneradapor el estrésno logra modificar de forma significativa ni la gananciade peso de los animales ni su evolución temporal, consecuenciadel caráctermoderadode estetratamiento. Son numerosaslas discrepanciasen torno a la modificación o no de la ganaciade pesoporefectodel estrésy así, frentea situacionesestresantesde diferentestipos algunosautoresdescribenuna reducciónde estavariable(Mormédey cols, 1984; P¡tman y cols., 1988),mientrasqueotros no encuentranen ellaalteracionessignificativas(IBlsieh y cois., 1985; Restrepo y Armario, 1987). De cualquier manera los niveles de corticosterona circulantes mediadospor nuestromodelo de estimulaciónno parecenser suficientespara provocar diferencias significativas en la gananciade peso. Nuestros resultadospodrían hacernospensarque los nivelesde corticosteronacirculantesaumentadospor la exposicióna un estrésmoderadono están afectandoa los animales, lo cual dejaría sin’ contenido la continuaciónde estetrabajo. Sin embargo,veremosmásadelanteque bajo un parámetrotan generalcomo el pesocorporal de un amimal puedensubyacerefectosimportantesque por moderadosquedanenmascarados. La situaciónopuestala representanlos tratamientoscon dexametasona, en los que la intensidadde la acciónglucocorticoidea ellosasociadaes tal que la gananciade pesono sólo disminuyesino queadquierevaloresnegativos.La pérdidade pesoquemuestran los animalesasí tratados,aunquees más notoria en la primera semanadel trátamiento,se producedurantetodo el periodoexperimental,lo queincide en la superiorintensidadde acción glucocorticoidede estetratamientofrentea los restantes.Esto seconfirmacuandoobservamos quesi bien el tratamientocon ACTI-1 escapazde provocaruna pérdidade pesoen la segunda y cuartasemanasno essuficienteparaque el balancefinal sea efectivamenteuna pérdidade peso,sino que por el contrario,tal y como reflejan los datos,en estosanimalesse produceun ligero aumentode estavariable. En definitivaen los animalestratadoscon ACTH. cuyo grado -102- -— Resultados y discus,on —- de acciónglucocorticoidees intermediorespectoa los demástratamientos,la naturalganancia depesoduranteesteperiodoseestabilizapor la combinaciónde semanasen que la gananciade pesoesreducidacon otrasenlas que seproducepérdidadepeso. Como ya esconocido,las accionesmetabólicasde los glucocorticoides consistenen la movilizaciónde glucosahaciael hígadoy su almacenamiento,si conviene,en forma de glucógeno.Estasaccionessonrealizadasa costade la movilizaciónde aminoácidosy ácidosgrasosprocedentes,respectivamente,de las proteínasy triglicéridos tanto de la dieta comoconstitutivos(Jara-Albarrán,1988; Bartolomé,1989),lo cual puedealterarel peso corporalcon independenciade las accionesdirectassobreel crecimientoquepudieranejercer los glucocorticoides.Pensandoen estaacción lipolítica de los glucocorticoidessobreel tejido adiposoy en su posibleimplicación en las alteracionesde pesoque hemosdiscutido,hemos evaluadolas modificacionesde los depósitosde grasasubcutáneaen tres pliegues de los animales. 2.2. MODIFICACIONES EN LA DISTRIiBUCION DE LA GRASA S1JBCUTANEA Los valores correspondientesa la grasa subcutáneade los pliegues escapular,del lomo y de la patatraseraseexponenen la Tabla5 y se representanen la Figura 8. La exposicióna estréssonorono modifica, respectoal grupocontrol,el contenidoen grasasubcutáneaen ningunode los tresplieguesconsiderados.Los tratamientos Ac, Dx y DxStr provocanuna significativareducciónde los valoresde grasasubcutánea(p= 0.001 vs Co y Str). Los grupos de animales tratadoscon dexametasonano muestran diferenciassignificativasentresí cualquieraqueseael pliegueestudiadoy presentanvaloresde esteparámetromás bajosque los mostradospor el grupo Ac (p ~ 0.001),a excepcióndel pliegue de la pata traseradonde no aparecierondiferenciassignificativas entre estos tres tratamientosexperimentales. -103 - -- Estrés crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento -- GRASA SLJBCUTANEA (mm) Grupo Escápula Lomo Pata Co 3.82±0.37cdc 2.82 + 0.24 cdc 2.23 ±0.13cdc Str 3.62±0.20cdc 2.93±0.09cdc 2.22±0.11cdc Ac 2.72±O.29abde 2.04±0.13abde 1.34+0.21 ab Dx 2.02±0.18abc 1.74±0.13abc 1.24±0.16ab DxStr 1.96±0.21 abc 1.68±0.14abc 1.26±0.13 ab Grasa escapular Grupo experimentalF (4,45)= 114.05 p <0 001 Grasa lomo Grupo experimental F (4,45)= 147.37 p <0.001 Grasa pata Grupo experimental F (4,45)= 113.37 p <0 001 Tabla 5: Grasasubcutáneade los plieguesde la escápula,lomo y patatrasera. Los datosindicanla media±desviaciónestándar. Los códigosrepresentandiferenciassignificativasentre los distintosgrupos experimentales:a = Co, b = Str, c = Ac, d = Dx ye = DxStr. Nuestrosresultadosindican una movilización de estasreservastanto más intensacuanto mayor es la intensidadde la acción glucocorticoidecausadapor los tratamientos. Estamovilización de reservasescongruentecon el evidenteincremento de la actividad metabólicageneradopor la acción de los glucocorticoidesy que aparece confirmadoen estudiosprevios en los que evaluamosel contenidodeglucógenohepático,no sólo en condicionessimilaresen cualquieraspectoa las aquídescritassino tambiénen hembras tratadasdurantela gestación.En estosestudios(Velasco,1990; Alano, 1991) observamos que todos los gruposexperimentalesincluido el estrésmostrabanunosnivelesde glucógeno hepáticomarcadamenteelevados,pero que permitíandistinguir ademásla diferenteintensidad de la acciónglucocorticoiderepresentadapor los distintostratamientos.En cualquiercaso,con nuestrosresultadosactuales,dichaactivaciónmetabolicaencontradaen los animalesexpuestos al estrésno ha provocadouna movilización de su grasasubcutáneaque, sin embargo,se manifiestaclaramentea partir del tratamientocon ACTH. -¡04- —— l?esultados y discusion —— Figura 8: Grasasubcutáneade los plieguesde la escápula,lomoy patatrasera Los datosobtenidosmuestranasimismo que los plieguesescapulary del lomo resultanmásafectadospor la acciónde los tratamientosque el plieguede la pata, hastael punto de que en éste los tratamientosde mayor intensidadno muestrandiferencias entre si. La menor susceptibilidaddel depósitode grasa de la patapodríamosen parte explicarlaporsergeneralmentede todos ellos el que presentamenoracúmulode grasadadala implicaciónde la extremidaden la locomoción. En conjunto, tanto las alteracionesde la gananciade pesocomo de la distribución metabólicade grasasubcutánea,causadaspor nuestrosmodelosexperimentales, constituyenunosefectosconcordantesentresí y cuyaintensidadsecorrelacionacon la mayor o menor intensidad glucocorticoide desencadenadaen cada caso. De acuerdo con estos resultadosparececlaro que la utilización, como materia prima para la gradual activación metabólicaejercidapor los glucocorticoides,de la grasaalmacenadapodríaser,la causade los cambiosencontradosen la gananciade peso. Es estarelaciónentrelos parámetroshastaahoradiscutidosla que nos -105 - —— 1~54rés crónica, actividad glucoconicoide y crecimiento —— conduceavalorarqué estásucediendocon la ingestade nuestrosanimalesya que, esevidente, que la dieta representael aportede constituyentestanto para el metabolismocomopara el crecimientoy condicionala posibilidad de adelgazamientodel organismo.Por consiguiente,la elevadademandametabólicamediadapor los glucocorticoidesdebe ser compensadapor un aumentode la ingestión de alimento. Si tal equilibrio no se alcanza,escuandola activación metabólicaprovocadapodríallegar a afectara la distribuciónde la grasacorporalcon pérdida de peso.Además,una insuficienteingestade nutrientespuedeconducira una reduccióndel crecimiento. Porotraparte,y en relacióncon la ingesta,los efectosanoréxicosde los glucocorticoideshan sido ampliamenteconsideradosen las situacionesde estrés.Sin embargo, esconocidala existenciadeunanotablecontroversiaa esterespecto.Así hay casosenlos que ciertosmodelosde estrésestánasociadosa la aparición de efectosanoréxicos(Armado y cot., 1984b; Alado y cois., 1987b; García-Márquezy Armario, 1987), mientrasque en modeloscon intensidady secreciónde glucocorticoidessimilaresno acontecendichasacciones (Kurosh¡ma y ciAs., 1984; Gamallo y cois., 1986a; Adelí y cols., 1990). Estos resultados enfrentados son explicados como consecuenciade que diferentes modelos de agentes estresantesimplican distintos patronesde integraciónnerviosa, previos a la estimulación neuroendocrina,con independenciade su intensidad.Lo cual incidiría de forma específicaen la anorexialigada no a la acciónglucocorticoidesino a los sistemasde controlnerviosocentral. Por consiguientela ingestapuedeanalizarsedesdediferentesposibles comportamientos.Así puedeestimularseparacompensaruna demandametabólicaclarao bien no hacerlo, con los evidentesefectos sobre el animal que deberámantenerla activación metabólicaa costaexclusivamentede sus propios tejidos. Perotambiénpodríaincluso verse reducida si se produjese el mencionado efecto anoréxico descrito, en cuyo caso, las repercusionessobrela pérdidadegrasacorporaly/o crecimientoseríanmásdrásticas. Vemos, por tanto, lo importante que es conocer si nuestros tratamientosestánmodificandola ingestade los animalesy si estoa su vez está incidiendo finalmenteen su pesocorporal.Con estepropósitoevaluamosla ingestaabsolutay relativa. - 106 - -- Resultados> discusión -- 2.3. POSIBLES EFECTOS DE LA INGESTA DE COMIDA Los valoresde la ingestamediade comidaabsolutay relativaal pesode los animalesse muestranenla Tabla6 y en la Figura9. Los resultadosde la evolución de la ingestaabsolutay relativa se representanen las Figuras 10 y 11 respectivamente.La comparaciónestadisticade estos resultadosmedianterespectivosANOVAS de dosvías ofreció los siguientesresúltados:en la comparaciónentrelos gruposexperimentales,parala ingestaabsolutaseobtuvounaF (4,45) 91.1 (p =0.001)y parala relativa fUe de F (4,25) = 16.3 (pC 0.001); en la comparación entredías, parala ingestaabsolutafUe de F (10,55) = 13.9 (p=0.001)y en la relativade F (4,25)= 2.9 (p=0.05);los resultadosde la interacciónfueronrespectivamentede E (40,55)= (pS0.001)y F (6,25)= 7.36 (p =0.001). 3.0 INGESTA Grupo Absoluta (g/día) Relativa (mg/gx día) Co 18.2±2.4dc 65.2±6.8cde Str 18.1 ±1.6 de 64.6±3.7 ale Ac 17.8+1.4 dc 74.1±7.1áb Dx 14.0±1.5abce 73.5±7.8tb DxStr 14.6±1.5 abcd 74.3±9.5 Sb Ingestaabsoluta GrupoexperimentalF (4,45)= 38.32 p =0.001 Ingestarelativa GrupoexperimentalF (4,45)= 5.35 p =0.001 Tabla 6: ingesta media de comida absolutay relativa. Losdatosindican la media+ desviaciónestándar. Los códigosrepresentandiferenciassignificativasentrelos distintosgrupos experimentales:a= Co, b = Sir, e = Ac, d = Dx y e = DxStr. -107- —— Estrés crónico. actiyiclad glucocorucoide y crecimiento — Ingesta de comida EJ Absoluta ~ Rotativa ‘100 niglg di. 100 gldic 80 60 40 20 O Co Str Ac DX Dxstr Figura 9: Ingestamediadecomidaabsolutay relativa. Los resultadosde la ingestamediadecomidamuestranquelos animales expuestosa estréssonoroasí como aquellosa los que se les administróACTH no presentan diferenciassignificativasen la ingestaabsolutarespectoal grupocontrol. La evoluciónde este parámetroduranteel periodode tratamientotampocomuestradiferenciassignificativasentre estosgrupos. Sin embargo,la ingestarelativa al pesofue en el grupo Ac significativamente superiora la de los gruposCo y Str (p =0.001),así como tambiénlo fue la evoluciónde la ingestarelativa durantetodo el periodo (p =0.001). En los gruposDx y DxStr la ingesta absolutafue significativamenteinferior a la de los gruposCo, Str y Ac (p <0.001) siendoeste parámetrosuperioren el grupoDxStr queen el Dx (p =0.05).En el casode la ingestarelativa los resultadosmuestran que las diferencias entre ambos grupos desaparecensiendo significativamentesuperiora la de los gruposCo y Str (p S 0.001),pero similaresa la del grupoAc. La evolucióntemporalde la ingestaduranteel tratamientoindica que en los grupos Dx y DxStr la ingestaabsolutafue significativamenteinferior a la del control (p =0.001) mientrasquela relativaal pesode los animalesfue mayor (p =0.001).La comparaciónentresí de estosgruposmuestraque la evoluciónde la ingestade ambosfue similar, apréciándoseuna -108- —— Resul!s y discuswn -- Por otraparte,merecedestacarsela importanciaespecialqueel aumento significativo del pesorelativo adquiereen el casodel corazónde los animalesdel tratamiento conjunto(administraciónde dexametasonay estrés).En ellosobservamosque e! pesorelativo de esteórganoes significativamentemayor que el de los animalestratadosunicamentecon dexametasona.Esteresultadonosestá indicandoque la reduccióndel pesodel corazónestá siendode algunaforma parcialmentecontrarrestada,lo cual apoya la existenciade un posible efecto cardiotróficovinculado al propio estimulo sonoro. Volveremos a este punto más adelantecon nuevosresultadospero, en estemomento,cabeplantearseque esteefectodebe estarproduciéndosetambiénen los animalesexpuestossólo amido. Respectoaestasrelacionesentreefectosdel metabolismoen el pesodel animal, su crecimientoy el de sus órganos,aparecendos situacionesdiscordantes.Por una parte,podemosencontrarmodificacionessignificativasen el crecimientode los órganossin que seobserven,en estesentido,alteracionesen el animalo bien éstasseanmoderadas,tal y como hemosdiscutido en los animalesestresadoscon el encéfalo.Por otro lado, puedenaparecer modificacionesen el animal sin que se aprecienalteracionesen el crecimientode todos sus órganos,como observamosen los animalestratadoscon ACTH respectoal corazóny a sus riñones.Estassituacionesse explicansi tenemosen cuentaque no evaluamosla totalidadde los órganosdel individuo. Nuestrosresultadosmuestranque no todos ellos (tanto los no evaluadoscomo los aquí considerados)presentanla misma susceptibilidada los efectosque los tratamientosejercensobreel crecimiento,bienportratarsede una peculiaridadintrínsecaal órgano,bienporefectode la edaddel individuo y desuestadode desarrollo. De esta forma puede ocurrir que, aun cuando un Órgano de los estudiadospuedaver reducidosu crecimiento,la ausenciade tal modificación, en el resto de órganosmenossusceptibles(tantoevaluadoscomono) amortigueo enmascareel efectosobre el crecimientoglobal del individuo. Sin embargo,al aumentarla intensidaddel tratamiento (administraciónde ACTH) empiezana verse afectadoslos distintosórganosen orden a su diferentesensibilidad,en primerlugarel encéfalodel que ya hemosmencionado,quepareceser el mássensibley que essignificativamenteafectadoen mayor medidaen los animalestratados con ACTH queen los estresados.Posteriormentey de formamásmoderadael resto, tantode los estudiadoscomo posiblementede los no evaluados,haciendoque el efecto sumativode estasalteracionescomiencea apreciarseen el animal enterotratadocon ACTH. Al intensificar aún más los tratamientos,mayor númerode órganosresultanafectados,y aqúellosqueya lo -127- —— f2strés crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento —— estabanlo hacenahoraen superiormagnitud.Hechoque semanifiestaglobalmentetambiénen un mayorefectosobreel animal administradocon dexametasona. En resumen, cuanto mayor número de órganosempiezana verse afectadosmásse notael efectoen el animal enteroque en cadauno de susconstituyentespor separado.A esto hay que añadir que al utilizar el parámetro“peso” como representantedel animal enteroestamosconsiderandolos efectosque sobreel pesotienenlos depósitosgrasos queson ajenosa factoresde crecimientoy que,ya hemosvisto, estabanalteradosen todoslos gruposa excepciónde los animalesestresados. Estosresultados,enmarcadosen un contexto tisular, seunen a los ya discutidosen relación con las dimensionescorporalespara confirmar que una intensidad superior de acción glucocorticoide,aún asociadaa situacionesde estrésmóderado,puede efectivamentemediarefectossobreel crecimiento del animal. Esta conclusiónesa su vez punto de apoyoparaimplicara estosefectos,entreotros, como mediadoresen las alteraciones de pesode nuestrosanimales.Asimismo, los datosobtenidosnos indican que efectivamente, tal y como planteábamosen la Hipótesis2a, hay una diferenterespuestade unos órganos frentea otrosaque sucrecimientoresultealterado.Asi, en los animalesde estaedady con los datosdisponibles,podemosafirmar que el órgano mássensibleen ese sentidoresultaserel encéfalomientrasque el corazóny los riñones se muestranmás resistentesa factoresque retrasensu crecimiento. Sin embargo,siendoel encéfalomássensibleestambiénel órganoque alcanzaantesel umbralde respuesta(administraciónde ACTH) y, por lo tanto, su margende cambio es pequeño.Por el contrario, para los otros dos órganos no encontramosuna intensidadde acciónglucocorticoide,de entrelas asociadasa nuestrostratamientos,queactue comolimite o umbralde tal modo queno podemosconocercuál esexactamentéla amplitudde su márgendecambio. Por otra parte,cabecomentarqueen la discusiónde estosresultadosse ha otorgado una equivalenciaa los términos “peso” y “crecimiento” de los órganosen el sentido de que las alteracionesobservadasen el pesode los mismos son el resultado de alteracionesen su crecimiento.Esta suposicióndebeserevidentementeconfirmaday así lo haremosen función de los datoscorrespondientesal número y tamañocelular de los tres órganosconsiderados.Datos que ademásnos van a permitir proffindizar y enriquecerla discusiónhastaahoraderivadade los resultadosde sus pesosabsolutos.Con ello daremos -128 - —— Itesu Itactos ti discusmon —— respuestaal Objetivo 2b en quesubdividimosel Objetivo Generalreferentea los órganos. 3.2. ALTERACIONES EN EL CRECIMIENTODE LOS ORGAÑOS La atrofia de un órganoesun término que poseetanto un significado anatómicocomo funcional. Estaalteracióndel crecimientopuedeserel resultadbde un menor númerode célulasdebidoa queseafectela proliferacióncelularpero tambiéna quesepotencie la destrucciónde las células del órgano.Porotra parte, la atrofia puedeobedecera un menor tamañode sus células al impedirseque alcancensu maduraciónóptima. Los efectossobrela proliferacióny la maduracióncelular no sonexcluyentes,si bien resultalógico queestasetapas del desarrollomuestrenuna diferentesensibilidada ser afectadascomo consecuenciade su secuenciaciónen el tiempo. Obviamente,la faseproliferativa es muy intensaal comienzodel desarrollo de los órganossiendo relevada por una fase de crecimiento y diferenciación, alcanzadala cual, las célulasmantienen,si procede,una actividadde división encaminadaya sólo aasegurarsu propiarenovacion. La cuantificacióndel contenidoabsolutode ADN y su relacióncon el contenidoconstantede ADN deunacélulaeucariotanosva a permitir evaluarsi el númerode células es el parámetro afectado, mientras que la valoración del contenido absoluto de proteínasy su relacióncon el númerode celulasnos señalaráquésucedecon e~ tamañode las mismas.Deestaforma podemosver como semanifiestaanatómicamentela atrofia sufridapor el órgano.Además,el contenidoabsolutode proteínasnospermitediscutirdichaatrofia desde el punto de vista funcional. Vamospues, paraconocersi la atrofia de los órganoses vinculantea una alteracióndel crecimiento,a medirsu contenidoabsolutode ADN y proteír~as.A partir de esosdatoscalcularemos,aplicandolas fórmulascontempladasen el apartadode Metodología, los índicesrelativosal númeroy al tamañode las células, Previamentea la descripción de los resultados,vamos a definir los términoscon los que designaremoslas diferentesalteracionesdel crecimientode los órganos. Con el términoaplasiaharemosreferenciaa un menornúmerode células,mienb-asquecon el término atrofía celulardesignaremosun menortamañode las célulasdel órgano.A su vez, -129- —- ICstrés crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento —- convienerecordarque el término atrofia puedeasimismohacerreferenciaa un menortamaño del propio órgano. De sucederasí, mencionaremosindistintamenteatrofia del órgano y reducciónde su peso porseréstaunamanifestaciónde suatrofla. En último lugar, la atrofia de un órganopuedeser consecuenciade su aplasia, de la atrofia de sus células o de ambos factores. Los valores correspondientesal contenido absoluto de ADN y proteínasde los tres órganosestudiadossemuestranrespectivamenteen las Tablas9 y 10, expresadoscomo mediasy desviacionesestándar.Su representacióngráfica apareceen las Figuras 15 y 16. ADN (gg) Grupo ENCEFALO CORXZON RIÑONES Co 2669.41±87.72bcde 1441.97±149.14bede 8245.01 ±526.7Obcdc Str 2486.59±98.67ac 1287.08±91.O5acde 7122.47±312.36ade Ac 2245.76±21.42abdc 113O.84±57.27abd 6908.61 ±578.l5ade Dx 2429.22±89.67 ~c 869.73 + 72.57 abc~ 5611.70±339.40 abc DxStr 2494.73±71.37ac 1031.20±103.54aM 5923.07±419.76abc Grupo experimental F (4,20) = 18.63 p =0.001 Grupo experimental F (4.20) = 24.73 p =0.001 Grupo experimental F (4,20) = 27.34 p =0.001 Tabla 9: ContenidoabsolutodeADN del encéfalo,corazóny riñones. Los datosindican¡a media+ desviación estándar. Los códigosrepresentandiferenciassignificativasentre¡osdistintosgrupos experimentales:a = Co, b = Sir, e = Ac, d = Ox y e = DxStr. La exposición a estimulación sonora provoca en los tres órganos evaluadosuna reducciónsignificativadel contenidoabsolutode ADN (encéfalo:p =0.01 vs Co; corazón:p < 0.05 vsCo; riñones: p =0.001 Vs Co). Los animalestratadoscon ACTH presentantambiénunareducciónde esteparámetrofrenteal grupocontrol (p=0.0011 siendo másmarcadaquela de los animalesestresadossólo parael encéfalo(p=0.001)y el corazón(p C 0.05>, puesen el casode los riñonesno seencuentrandiferenciassignificativasentreambos -130- —— Resultados y discusmon —— gruposde tratamiento. Contenido de ADN pg (Miles> lo 8 ~R¡ñones 6 E] Encéfalo 4 E] corazón 2 a Co Str Aa Dx DxStr Figura 15: Contenido absoluto de ADN de los órganos. La administración de dexametasona reduce el contenido absoluto de ADN del encéfalo (p =0.005 vs Co), corazón y riñones (p =0.001 vs Co) apareciendo diferencias entre los grupos Dx y Ac que consisten en una reducción menos acentuada en el caso del encéfalo (p ~ 0.01) y más marcada en el corazón y riñones (p =0.001). También se observaun menor contenidoabsolutode ADN en el grupoDx que en el Str en relaciónal corazóny a los riñones(p=0.001).Por suparte, el tratamientoconjuntoreduceel contenido absolutode ADN de los tres órganosrespectoal grupo control(encéfalo:p =0.01; corazón y riñones:p =0,001). Cuandose comparanlos efectosque sobredichavariable ejercenlos tratamientoscon dexametasonaseobservaque éstosdifieren sólo en el corazón,de tal modo que la reducción presentada por el grupo Dx es significativamente mayor que la del grupo DxStr(p =0.05). -131 - —— ExtrA’ crónica, actividadglucocorticoide y crecimiento —— PROTEíNAS (mg) Grupo ENCEFALO CORAZON RIÑONES Co 316.79±12.40 bco 202.84±10.55 de 440.03±30.68dc Str 254.70+11.44actl 187.03+20.50dc 413.05±31.26dc Ac 200.12±22.20abde 185.71 + 18.89 dc 395;09±48.96de Dx 296.17+14.87bco 137.30±8.56 aIre 334.31+42.57 abc DxStr 256.22±15.21 aai 159.33±16.20 abed 321.66±31.30abc Sig. Grupo experimental F (4,20)= 40.89 p =0.001 Grupo experimental F (4,20)= 13.79 p =0.001 Grupo experimental F (4,20)= 9.15 p =0.001 Tabla 10: Contenidoabsolutode proteinasdel encéfalo,corazóny riñones. Los datos indican la media + desviación estándar. Los códigos representan diferencias significativasentre los distintos grupos experimentales: a = Co, b = Str, e = Ae, d = Dx y e = DxStr. Proteinas totales mg 500 400 ~Riñones 300 II Encéfalo 200 E corazón 1 00 o Co Str Ac Dx DXS*r Figura 16: Contenido absoluto de proteínas de los órganos. -132- E u 3 1 u E u u —— Resultados y discusion —— En relación con el contenido absoluto de proteínas, se observa que tanto en los animales estresadoscomo en los tratadoscon ACTH (p=0.001VS Co) dicho parámetro se reduce de forma significativa sólo en el encéfalo, existiendo diferenciasentre ambos tratamientos,de modo que la reduccióncausadapor la administraciónde ACTH es más acusada que la provocada por el estrés (p =0.001).El tratamientocon dexamáasona,porel contrario,reducesignificativamenteel contenidoabsolutode proteínasdel corazóny de los riñones (p=0.001 vs Co) mientrasque no altera el del encéfalo.Por su parte, el tratamiento conjunto causa una reducción de dicho contenido en los tres órganosestudiados(encéfalo, corazón y riñones: p =0.001 vs Co), siendo esta alteración sobre el corazón menos acentuada en el grupo DxStrqueen el Dx (p=0.05). A continuación analizaremos los datos concernientes a los parámetros número y tamaño de las células. Estos resultados aparecenreflejadosen las Tablas 11 y 12 respectivamente, y se representan en las Figuras 17, 18 y 19. N0 CELULAS (106) Grupo ENCEFALO CORAZON RIÑONES Co 430.55±14.15bede 232.58±24.05bede 1329.84±84.95bede Str 401.06±15.92 ~ . 207.59± 14.68 acde 1148.79±50.38ade Ac 362.22±3.46abde 182.39±9.24abd 1114.29+93.25 ade Dx 391.81±14.46ae 140.28±11.71 aIre 905.11±5474abc DxStr 402.38+11.51 ac 166.32±16.70 aid 955.34±67.70abc Síg. Grupo experimental F (4,20)= 18.63 p <0.001 Grupoexperimental F (4,20) 24.73 p =0.001 Grupéexperimental F (4,20)= 27.34 p =0.001 Tabla 11: Número de células del encéfalo,corazóny riñones. Los datos indican la media + desviaciónestándar. Los códigosrepresentandiferenciassignificativasentrelos distintosgrupos expenmentates:a = Co, b = Str, e = Ac, d = Dx y e = DxStr. -133 - —— listrés crónica, actividad glucocorlicoide y crecimiento —— TAMAÑO CELULAR (pg/106) Grupo ENCEFALO CORAZON RIÑONES Co 736.91±48,14bco 879.29±101.15 331.44±22.58 Str 636.45+ 49.41 aa¡ 907.51±144.93 359.94±29.07 Ac 552.16±57.l3abde 1020.56±117.93 356.29±50.19 Dx 756.53+ 43.13 bco 980.73±42.83 368.24±27.31 DxStr 636.80±33.63acd 965.37±135.01 336.85±24.69 Síg Grupo experimental F(4,20)= 15.82 p<0.O0I Grupoexperimental F(4,20)= 1.24 ns Grupoexperimental F(4,20) 1.18 ns Tabla 12: Tamañode las célulasdel encéfalo,corazóny riñones. Los datosindican la media+ desviación estándar. Los códigosrepresentandiferenciassignificativas entre los distintos grupos experimentales:a = Co, b = Sir, e = Ac, d = Dx y e = DxStr. Los resultadosrelativos al númerode célulasmuestranque el encéfalo, corazóny riñonesde los animalesexpuestosal estimulosonoropresentanuna reducciónde esteparámetrorespectoal grupocontrol (encéfalo:p =0.01; corazón:p =0.05; riñones: p < 0.001).Estemismo resultadoesel que seobservacuandoa los animalesse les administra ACTH (encéfaloy riñones:p =0.001;corazón:p =0.05),siendoestareduccióndel número de sus célulasmásacentuadaque la experimentadapor los animalesestresadosen el caso del encéfalo (p =0.001) y el corazón(p =0.05). En el caso de los riñones no se aprecian diferencias significativas entre ambos tratamientos. La administración de dexametasona ocasionaun menor númerode células de los tres órganosen estudio(p < 0.001 VS Co), resultandoseresteefecto sobreel corazóny los riñonesmás intensoque el observadoen los gruposde animalestratadoscon estrésy ACTI-1 (p=0.001).Porel contrario, la reduccióndel númerode célulasdel encéfalopor la administraciónde dexametasonaesmenosacentuadaque la ocasionadapor la administración de ACTH (p < 0.01), no mostrando diferencias significativas frente al tratamientoestresante.El tratamientoconjunto de dexametasonay estréspor ruido causafrenteal grupocontrolunareduccióndel númerode célulasdel encéfalo (p<0.01) corazóny riñones (p=0.001).Sólo sobreel corazónseconstatandiferenciaspara esteparámetroentrelos dostratamientoscon dexametasona,siendo el efectoreductorsobreel -134- -— Resultados ~vdiscusión —~ grupoDxStr significativamentemenorque el observadoen el grupotratado unicamentecon dexametasona(p<0.05>. Número y tamaño celular (Encéfalo) mlii. cJe células Mg proteina/m III. de células 500- -800 450- - -. 700 400- 600 nl350- 500Ibede ae ‘a nc ac300- -..d= ___ ~=. ___ ½ Co St’ Aa Dx DxStr EjNúmero ~Tamaño Figura 17: Númeroy tamañode lascélulasdel encéfalo. Respectoal tamaño de las células de los órganos estudiados, el tratamientocon ruido provocaunareducciónsignificativadedichavariableen el encéfalo(p= 0.01 vs Co) mientrasque ningún efectoseobservaen relación al corazóny los~ riñones.Los animalestratadoscon ACTI-I muestranasimismounareduccióndel tamañode la~ célulasde su encéfalo (p=0.001 vs Co), apreciándoseuna reducciónmásacentuadaen estosanimalesque en los expuestosal estimulosonoro(p =0.05). El tamañode las célulasdel corazóny de los riñones no se modificapor la administraciónde ACTH. El tratamientocon dexámetasonano modificafrenteal grupocontrolel tamañode las célulasde ningunode los órganós.En relación a los animalesdel tratamientoconjuntocon dexametasonay estrésse observauna reducción del tamaño de las células del encéfalo (p =0.01 vs Co) pero no se evidencianinguna modificaciónen el casodel corazóno de los riñones. -135 - —— Estre~ cranico att» ¡da mlii. do células pg protoina/mlil. do células 300 1200 250 1100 200 1000 150 900 100 800 Co Str Ac Dx DxStr Figura 18: Númeroy tamaño de las célulasdel corazón. Número y tamaño celular (Riñones) mili. dc células ~¿g protoina/niill. dc células 1400 EjNúmero ~Tam 1300 1 200 360 1 1 00 1 000 340 900 320 800 300 Co Su Ac Dx Dxstr Figura 19: Número y tamaño de las células de los riñones. -136- u u u u u E u u u u ¡ u u u u u u u ¡ u u —— I?esullados y discusion —— Del primer análisis global de estos resultadosse desprendendos conclusiones.Poruna parte,se demuestranreduccionesgeneralesde los parámetrospor todos los tratamientosy, en segundolugar, que hay un distinto comportamientode los órganos respectoatalesalteraciones. Vemosque el encéfalose diferenciaclaramentedel corazóny del riñon por ser el órgano cuyo crecimientoes más sensiblea los tratamientos,hecho que ya fue constatadoen la discusiónde los resultadosde peso de los órganos.Esta sensibilidad es debida,como indican los datos, a que la mayorpartede los tratamientos(a excepciónde la administraciónúnica de dexametasona)causanuna reducción del número de sus células (aplasia)y del tamañode las mismas(atrofia celular). La confluenciade alteracionesde estos dosparámetrosespueslo queconfiereal encéfaloesamayor sensibilidadrespectoal corazón y los riñones, confirmandola reduccióndel pesoo atrofia de esteórganoobservadaen los propiosanimalesestresados.Se explicaasí tambiénque la administraciónde dexametasona,al ejercerefectosolamentesobreel númerode células,no provoqueuna reduccióndel pesodel encéfaloen consonanciacon su actividadglucocorticoide.De esemodo, auncuandoel pesode este órgano se reduce, no se observan diferencias entre los tratamientoscon ACTH y dexametasona,de menory mayoractividadglucocorticoiderespectivamente. La menor sensibilidaddel corazóny del riñón obedecea que, por el contrario,únicamentemuestranaplasia. Es decir, a diferenciadel encéfalo,el tamañode sus célulasno sólo no essensiblea la dexametasonasino quetampocolo esa la corticosteronani a una posibleacciónpropia del mido. Esta menorsensibilidades coherentecon la ausenciade efecto sobreel pesode ambosórganosen el casode los tratamientoscon ruido y ACTH, y explica que sólo cuando esa aplasiacelular es suficientementeintensa(administración de dexametasona)se observeunareduccióndel pesodel corazóny de los riñones. Una vez que hemosseñaladola diferentesensibilidadde los órganosa los estímulos capacesde reducir su crecimiento a esta edad de los animales, vamos a continuacióna analizarel efectode cadatratamientosobredichosórganosrespectoal nivel de activación glucocorticoide que representan.Discutiremos,en primer lugar, los resultados concernientesal encéfaloy, seguidamente,los relativos al corazóny los riñones de forma conjuntaporsu comportamientosimilar en la mayoríade los casos. -137- —— Lvtréx crónica, actividadglucacorticoide y crecimiento — Comenzandopor el encéfalo de los animales expuestosal ruido, recordemosque nuestrosresultadosmuestranuna aplasiadel órgano acompañadade atrofla celular, por supuestode nivel moderadoen comparacióncon los tratamientosde mayor intensidadglucocorticoide. Las alteracionesencontradaspueden ser causadaspor la actividad glucocorticoideconsecuentea la hipersecreciónde corticosteronaprovocadapor el estrés, pero, en el casodel encéfalo,no sepodríadescartarque la integracióndel agenteestresante,al ser ésteun estímulo sensorial,provocaseestasalteracionesdirectamentesobrelas células nerviosas. Una discusión desde estas perspectivasserá abordadamás adelantecuando resultadosrelativos a otros tratamientosnos confirmen o no las causasde las alteraciones observadas. Además, estos resultadosnos conducenrapidamentea pensaren la naturalezade las estimescelularesafectadasy en las implicacionesneurológicasque pueden tenerdichasalteraciones. Efectivamente, en ningún otro órgano que en el encéfalo, podría sorprendemosencontrarefectosatróticossignificativospor todoslos tratamientos(incluido el ruido), consecuenciade la afectación tanto del número de células como de su tamaño o maduración. De inmediato surge la pregunta ¿los animales manifestabandisflinciones comportamentaleso motoras,consecuenciade un menornúmerode neuronas?. La respuestase basa en la observacióncotidiana por parte de los investigadores,ya que no se realizaronestudios de dicha naturalezaal no ser objetivo del presentetrabajo.Durantedichocontactodiario con los animalesno detectamosalteracionesde magnitudsuficienteparallamarnuestraatención,y el comportamientode los animalespuede considerarsedentro de la normalidad. Sin embargo,señalamosque podría ser interesante someterestos animalesa estudiospara comprobarsi capacidadesneurológicascomo las interacciones sociales y sexuales, el comportamientoexploratorio y la capacidad de aprendizajeo memoria,han sido alteradas. En cualquiercaso,la no existenciade problemasneurológicosgravesnos lleva a pensaren dos opciones. -138- —— J?esultados y discusion —— La primerade ella nosparecequetieneun sustentomenot,serefiere a la posibilidadde que las célulasafectadascorrespondana otrasestirpescelularesdistintasa las propiasneuronas.Si consideramosque, ademásde éstas,la población celular másnumerosa son las células gliales, podríamos pensar en esta opción. Sin embargo, las disflinciones nerviosaspor fallo de la glia son, hoy en día, ampliamente conocidas (Enfermedad de Alzheimer,etc.). La segundaopción sedapensarque los efectosse ejercen sobre la población neuronal accesoria, y que lo que se desencadenapor los tratamientos es un aceleramientode la mortalidady unainhibición del crecimientodedichasneuronas. Ciertamente,ha sido ampliamentedemostrado(Leví-Montalciní y Calissano,1979; Kuffler y Nicholls, 1982)que el nivel de maduración del sistemanervioso al nacimiento, y el nivel máximo conseguido durante la infancia, potencia siempre el crecimientode un númerosupletoriode neuronas,no sólo a nivel central sino incluso a nivel periférico (sistemaneuromuscular),de manera que se garanticeel establecimientode las conexionesbásicas.Con posterioridad,el excesoneurona]conlíevaunamortalidadcontinuada durantetoda la vida del sujeto, en principio de las célulasen excedente,posteriormentede aquellasque intervienen en circuitos no utilizados de acuerdocon la experienciaque va adquiriendoel animal y, por último, y dentrodel envejecimiento,se producela mortalidadde neuronasútiles. De acuerdocon esta información, nuestrosresultadospodrían indicar unaaceleraciónde estosprocesosdurantela exposicióna los tratamientosque, considerandoel periodo puberal del ciclo biológico de nuestrosanimales, estaría afectandoa población accesoriaquequizásnuncahubiesesido utilizada. Aunqueestahipótesisdeberlaser confirmadacon estudiosapropiados, no queremos dejar de exponer la implicación que tendría en individuos de mayor edad relacionarel envejecimientonerviosocon el mido ambiental. En cuantoal corazóny el riñón de los animalesestresados,vemosque unicamentepresentanuna moderadaaplasia.Los siguientestratamientosde mayor intensidad -139- -- Estrés crónica. actii’idndglucocoriicoide y crecimiento— nos confirmarán si esta alteración está causadapor los elevadosniveles circulantesde corticosterona.Sin embargo,y a diferenciadel encéfalo,esobvio que podemosdescartarya unaaccióndirectapor la integraciónnerviosadel estímulosensorial. Por otra parte,nosotrosno esperábamosencontrarque el crecimiento de estosórganosfueraafectadopor el tratamientocon mido, ya que los datosde pesono mostrabanningunaalteración significativa del mismo. Por lo tanto, estos resultadosnos conducena pensarque la reducción del crecimientodel corazóny del riñón, por implicar unicamenteal númerode células y ademásde una forma moderada,queda ‘diluida’ en el conjuntodel órgano. En relacióna la aplasiay atrofla celular quepresentael encéfalode los animales administradoscon ACTH, observamosque la superior intensidad~de la acción glucocorticoideasociadaa dicho tratamientointensificafrenteal estréstanto una comootra alteracióndel crecimiento.Estos resultadosnos permitenvincular estasalteracionesa los nivelescirculantesde corticosteronaya que, al compararlos resultadosde ambostratamientos, se guardauna correlaciónentre la intensidad del efecto y los niveles plasmáticosde la hormona.Porotraparte,en el tratamientocon ACTH no existeningunaintegraciónsensorial directa.Quedamosa laesperade los resultadosde los siguientestratamientos. En relación al corazóny a los riñones,vemosque el efecto aplásico ocasionadopor la administraciónde ACTH superael debidoa la exposiciónal ruido en el caso del corazón,perono en el casodel riñón. De estosresultadossededucequelamayoracciónglucocorticoidede la corticosteronaliberadapor la administraciónde ACTH respectoal tratamientocon mido, no suponediferenciassuficientesparaintensificarel efectosobreel riñón. Pero,por otraparte, estos datos podrían indicar una diferente respuestade ambos órganos a la actividad glucocorticoide.Sin embargo,estosresultadostambiénson coherentescon la sospechade un efectocardiotróficoen los animalesexpuestosal mido, consecuenciade la activaCiónneurógena por el estrés.Pensemosque si los tratamientoscon ruido y ACTH (con diferenteactividad glucocorticoide)no consiguenefectosdistintossobreel riñón, lo mismopodríaocurrir sobreel corazón.En esecaso,la atrofia del corazónen los animalesestresadoshubiesesido similar a la de los tratadoscon ACTH, pero nosotrosencontamosuna menor alteración al habersido -140- -- Res,,liados y discusion -- contrarrestadapor el referido efecto cardiotrófico. Discutiremos más ampliamenteesta hipótesiscuandotengamosreunidosmásdatosa su favor. En los animalestratadoscon dexametasonavimosque, adiferenciade lo quesucedíaen el restode los tratamientos,la aplasiaque presentael encéfalono seacompaña de atrofia celular. Estaausenciadeefectoporla administraciónde dexametasonanosconducea pensarque el crecimientode las célulasdel encéfaloessensiblea la corticostefonapero no a esteglucocorticoidesintético.Estaobservaciónno debeextrañarya que, en ottosparámetros evaluados,tambiénse observaránefectosdebidosa la actividadglucocorticoideque no son resproducidosexactamentepor la dexametasona. Porotraparte,el tratamientocondexametasonano intensificala aplasia del encéfalorespectoa la provocadapor la administraciónde ACTH, pero sí la del corazóny riñón. Todos estosresultadosnos llevan a considerarque el encéfaloposee una “protección” frentea la dexametasonade la que careceel corazóno el riñón y queno se haceextensivaa la presenciade elevadosnivelesdel glucocorticoideendógeno.Estaprotección setraduceen una ausenciatotal deefectosobreel tamañoo maduraciónde las célulasy en un efecto menor de lo esperadosobrela población total de las mismas. Por consiguiente,el encéfalo“distingue” entrecorticosteronay dexametasonalo cual dirige nuestra~Itenciónhacia la naturalezade los receptoresqueunencorticosteroidesen el SNC. En el encéfalode la rataseha detectadola presenciade dos tipos de receptoresparacorticosteroides,denominadostipo 1 y II (McEweny cols., 1969; deKloet y cols., 1975; Reul y de Kloet, 1985). Los receptorestipo II, localizadosfundamentalmenteen el septolateral. núcleodel tracto solitario e hipocampo,muestranbajaafinidad por la corticosterona(de Kloet y cols., 1975). Se ha observadoademásque el aumento de los niveles circulantes de corticosteronapor el estrésprovocala saturaciónde los mismos(Reul y cols., 1987). Ambos hechosseñalanque estereceptortiene comofunción mediar accionesde la corticosteronaen situacionessuprabasales.Estos datos implican a estos receptorescomo mediadoresde las numerosasaccionesque se desencadenanen las situacionesde estrés,como porejemploen la -141 - —— Iisirés crónico, acIit’kladglucocorticoide y crecimiento — autorregulacióndel ejeHl-LA por los glucocorticoides(Reuly cUs., 1987).A esterespecto,se ha observadoen rataquecambiosdegenerativosasociadosa la edad,especialmenteen la región del hipotálamo, podríanguardarrelacióncon una pérdidaprogresivade sensibilidaddel eje HHA a la regulaciónpor feedbacknegativo. Asimismopareceser quela pérdidade receptores que unenglucocorticoidesen el hipocampopodríaestarimplicadaen dicha desensibilización (Sapolskyy cots.,1986).Logicamente,las zonascerebralesdondeselocalizanesosreceptores poseen conexionescon áreas hipotalámicas. Se ha observado que la secciónde las vías aferentesdel hipotálamoatenúalos efectosinhibidoresque los glucocorticoidesejercensobre el eje(FeIdmany cois., 1973). Ya que estosreceptorestipo II, a diferenciade los denominadostipo 1, presentanademásafinidad por los glucocorticoidessintéticos (de Kloet y uds., 1975; Raynaudy cols., 1980) como la dexametasona,nosotrospensamosque la unión de este glucocorticoide a dichos receptoresdesencadena(a nivel suprahipotalámico)la potente supresiónqueejercesobreel ejeFil-LA, mimetizandoasíesaacciónde la corticosterona. Pero, por el mismo motivo, podemossugerir que la unión de la corticosteronaa estetipo de receptorno estámediandolos efectospor nosottosobservados sobreel encéfalode los animalesestresadoso tratadoscon ACTH ya que, si fueraasí, también la dexametasonadeberíahaberreproducidodichosefectos, El otro tipo de receptor(tipo 1) presenta,por el contrario, elevada afinidad por la corticosterona(McEwen y cols., 1969; de Kloet y cois., 1975; Rení y de Kloet, 1985), Estacaracterísticale permitesermáseficazque el tipo II a la hora decorregir pequeñasvariacionesde los niveles basalesde cortícosterona,producidasen respuestaa situacionescotidianas para el animal. Pero, obviamente, también mediará otras muchas accionesde la corticosterona.Nosotros sugerimos que los efectos observadossobre el crecimientodel encéfalopodríanserejercidospor la corticosteronavía estosreceptores.Esta suposiciónescoherentecon la resistenciaque muestrael encéfaloa que su crecimientoresulte afectadopor la administraciónde dexametasona,ya que como hemos mencionadoestos receptoresno muestranafinidadpor la misma. Sin embargonadaes estricto y asi encontramosun efecto, aunque menor, de la dexametasonasobreel númerode célulasdel encéfalo.Esteefectoseríaejercidoa -142- -- Resultados y discusion -- travésde su unión a estosmismosreceptorestipo 1. Decimosestoporquesi el receptortipo II estuviera implicado deberíamoshaberobservado,dadasu afinidad por la dexametasona,un efectomuchomásacentuadodel encontrado,que probablementellegaria a marcardiferencias significativasfrenteal tratamientocon ACTH. Por otra parte,con estosresultados,nadapodemosafirmar acercade cuál es el margen de toleranciadel encéfaloal efecto reductorsobre su crecimiento. Ello obedecea que, como hemos visto, la dexametasonano se comportasobreese parámetro exactamentecomo la corticosteronade modo que, paraaveriguardicho margende tolerancia, necesitaríamosdisponer de un tratamiento que ocasionaseunos niveles ¿irculantesde corticosteronasuperioresa los denuestrotratamientocon ACTH. Antes de pasar a discutir los resultados del siguiente grupo y aprovechandoel contextoen el que nos encontramos,no queremosdejarde mencionarcuál podríaserel motivo porel queno detectamosuna resistenciaa la acciónde la dexametasonaen el casodelriñón y del corazón.En estesentido,sehandescritoen el riñon deraíadostiposde receptoresque ligan glucocorticoides(Feldmany cok, 1973; Funder y cok., 1973a,b).Por un lado, los receptorestipo 11 conelevadaafinidad por estashormonasy, por otro, el tipo 111 queesespecíficoparacorticosterona.En realidad,de ésteúltimo no seconocecon exactitudsi esun verdaderoreceptoro sólo un sitio de unión intracelular.Tampocosu función fisiológica estábiendeterminada(Marver, 1984). Nosotrosproponemosquela uniónde la corticosteronaa los receptores tipo II del riñon podríaestarmediandolas alteracionesde crecimientoque observamos.Estos receptores,adiferenciade los tipo III, soncapacesde unir dexametasonalo cualexplicaríaque también encontremosuna acción de la dexametasonamimetizando esos efectos de la corticosterona. Por lo que respectaal corazón,pensamosque los efectosobservados podríanestarmediadosde una formasimilar, si bien carecemosde bibliográfiaquenospermita apoyartal suposición. Los resultados del tratamiento conjunto (administración de dexametasonay ruido) nos señalandos hechosen relación al encéfalo. Uno de ellos, que la -143 - —— Estrés crónica, actividad glucocorticoide .9 crecimiento —— aplasiadel mismo no seacentúani frenteal tratamientocon ACTH, ni frenteal tratamiento únicocon dexametasona. El otro hecho es que volvemos a encontraratrofia de las células del encéfalo.Anteriormentevimos queel tratamientoúnico con dexametasonano producíaefecto sobreel tamañode las célulasde esteórgano.Por consiguiente,descartadauna acciónpor el glucocorticoide sintético, sólo puedeatribuirse esta atrofia celular al otro factor que se adiciona:el mido. Obsérvesela similitud del nivel de aplasiaentrelos tratamientosconjuntoy de exposiciónal ruido. Esta accióndel mido en el tratamientoconjunto no es debidaa los niveles circulantesde corticosteronaque provocaya que, obviamente,la supresióndel eje HHA por la dexametasonamantieneunosnivelesdel glucocorticoideendógenopor debajode los valores basales, los cuales por si solos no ejercen ningún efecto significativo. En consecuenciala acción debeserprovocadadirectamentepor la integraciónnerviosadel mido comoestímulo sensorial. Deestemodo, la aplasiadel encéfaloesun efectodebidoexclusivamente a la actividad glucocorticoidede la corticosteronay de la dexametasona,mediadapor los mismos receptores que, sin embargo, muestran una afinidad distinta por ambos glucocorticoides. Este hecho se traduce en que la dexametasona.a diferencia de la corticosterona,ejerce un efecto cuya magnitud no se correspondecon su actividad glucocorticoide.Por su parte,la atrofia de las células del encéfaloes, a la vista de nuestros resultados,un efecto multifactorial. Por un lado estáinvolucradauna acción por los niveles circulantes de corticosterona,que se vincula a la mediación de los receptores de glucocorticoidesantesmencionadosperoque no es,en estecaso,reproducidadeningún modo por la dexametasona.Por otro lado, nos encontramoscon una acción que resulta de la integraciónsensorialdel estímuloy cuyo mecanismode acción no puedeserhipotetizado.En cualquiercaso,estosresultadosmanifiestanquelos procesosde proliferacióny maduraciónde las célulasde esteórganono sonreguladosexactamenteatravésde los mismosmecanismos. En el casode los riñones,el tratamientocon dexametasonay exposición al mido no incrementó la aplasia encontrada en los animales sólo inyectados con dexametasona.Luego,en estecaso,la actividadglucocorticoidede la dexametasonaprovocaun efectomáximosobreel númerototal de célulasde esteórgano,queno puedeserintensificado porla adición de lapequeñacantidadde corticosteronacirculanteproducidaporel estrés.Algo -144- —— Resultados•v discusion —— esperablesi tenemosen cuentaque una cantidadmayor de corticosterona,la liberadapor la administraciónde ACTH, no eracapazde acentuarla aplasiadebidaal tratamientoestresante. El corazónde los animalesexpuestosa dexametasonay ruido si mostró diferencias significativas comparadocon el de los sólo tratadoscon dexarnetasona.Sin embargo,estasdiferenciasno señalanun aumentode la aplasiasino que, por el contrario, el corazónde estosanimalestiene un mayornúmerototal de células. Estos resultados reproducen exactamente lo ocúrrido cuando comparamosel pesodel corazónde los animalesde estostratamientos,y confirmanque los efectos atróficos, por aplasia del corazón, debidos a la acción glucocorticoide de la dexametasona,son contrarrestadossignificativamentepor la exposición al ruido en el tratamientoconjunto.Por consiguiente,la hipótesisacercade la existencia de un cierto efecto cardiotrófico, consecuenciadel mido en los animales tratadoscon dexametasona,queda confirmadaa la luz de estosresultados. Desde una perspectiva fisiológica, esta hipótesis tenía altas probabilidadesde sercierta,ya queun efectocardiotróficopuedeser la conseduenciacrónica de la activaciónneurógenadesplegadaen la exposicióna cualquierestimuloestresante. Efectivamente, si recordamoslo expuesto en la Introducción, la respuestafisiológica al estrés desencadenainicialmente una respuestarápida: (Reacciónde Alarma) mediadaporterminalessimpáticosy médulaadrenal,y queprecedea la activacióndel ejeHHA. Precisamenteun blancoimportantede tal respuestaesel sistemacardiovascular, En las situacionesde estrésagudo estarespuesta,qué recuperalos nivelesbasalescon notablerapidez,no escapazde provocaralteracionesmorfométricasde un órgano. Sin embargo, en situacionescrónicas, por mantenimiento o repetición de las exposiciones,talesalteracionesentranen el terrenode la posibilidad a expensas y discusion —— El tratamientocon estréssonoro causó en los cráneosde los animales la modificación significativade unade las variablescraneométricasen estudiodefinidacomo 10- 12, la cual incrementasu valorfrente al grupocontrol (p=0.05). La administraciónde ACTH provocófrenteal grupoCo y Str una reducciónsignificativa(p S0.05) de dieciochovariables craneométricaslas cualesaparecenseñaladasen la Tabla 13 con el símbolo~‘. Las variablesB-E (p =0.05) y 9-9(p c 0.01) tambiénse redujeronsignificativamentefrenteal grupo Str. La variableG-I mostrófrenteal grupoCo un aumentosignificativo (p =0.05). El grupoDx presentauna reducciónsignificativade todaslas variables (p=0.05 vs Co y Str), exceptoG-I, 2-3 y 9-9’. Frenteal grupoAc. nuevede estasvariables experimentanuna reducciónmásacentuada(p s 0.05), son aquellasindicadasen la Tabla 13 con el símbolot. El tratamientoconjuntode exposicióna estréssonoroy de administraciónde dexametasonaafectó a todaslas variables, reduciendosu valor frenteal grupoCo (p ~ 0.05) exceptoG-t, 2-3 y 9-9’; y frente al grupo Str (p =0.051 excepto2-3. El valor de dicha reducciónfUe muchomayorque el causadopor la administraciónde Dx en sietevariablesque seseñalanen laTabla 13 con el simbolo A Los valoresde los índicescraneométricosdefinidos, expresadoscomo mediasaritméticas(m) y desviacionesestándar(ds), y el resultadode su evaluaciónestadística semuestranen las Tablas15 y 16, respectivamente. La estimulaciónsonoracausóla modificación significativadel indice Ir interor,cuyamagnitudaumentarespectoal grupocontrol (p< 0.05). La administración de ACTH alteró frente a los controles dieciseis indices(p=0.05),de los cualesdiezmuestranun aumentosignificativo y aparecenen la Tabla 15 con el símbolo A, mientrasque los seis restantes,indicadoscon el símbolo ~<, disminuyen. Deestosdieciseisíndices,nuevede ellos tambiéndifieren significativamentefrenteal grupoStr (p =0.05): T-palatin,T-maxilar, T-diasteni.T-prepala,L-palatin, L-maxilar, 1-basiocc, 1-cigobree I-bícigom. En los animalesadministradoscon dexametasonaseobservaque trece indices presentanunamodificaciónsignificativa respectoa los animalescontroles(p S 0.05). Ocho de ellos aumentansu magnitud y los cinco restantesmuestranuna modificación en -151 - —— tgMrés ciánico, actividad glucocorticois~vdiscusion —- INDICES CRANEOMETRICOS Grupos experimentales Indices Co Str Ac Di DxStr L-mnteror 22.64±0.70 23.82±0.36 23.39±0.58 24.30±O.58# 24.21±0.5tA L-maxilar 51.67±0.55 51.65 ±0.76 52.96±0.48A 52.01 ±0.70 51.93+ 0.65 L.-nasaí 56.17±2.87 57.99+ 1.74 58.14±1.40 56.60±1.36 55.48±1.31 L-naso¡nt 50.59±2.24 52.19+ 1.01 51.22±1.15 50.27±0.84 49.00±1.65 L-paíat¡n 57.65 ±0.87 57.83 ±0.73 58.71+ 0.32A 58.33 ±0.46 58.23±0.43 L-prepala 44.09±0.69 44.28+ 0.66 45.13 ±0.44 44.42±0.91 44.40±0.87 L-supraoc 22.71±1.21 24.21±0.88 25.16±1.24A 25.09±1.83# 23.99±1.41 L-yugoint 63.56±3.56 63.78±1.95 66.11±1.08 64.13+1.93 63.64+0.86 L-yugonas 65.66±1.80 66.02±1.11 66.17±0.71 65.79±0.98 65.97±0.80 T-basiocc 39.95±1.01 40.47±1.36 38.28±0.87 37.47±1.03” 38.14±1.38~ T-cigobas 61.97±0.77 61.06±0.89 60.10±0.99* 61.30±L43 61.99±1.31 T-cigobre 106.18±1.62 105 28±208 102.94±1.69* 10307±2.29”103.27±1.660 T-craneof 143.94±3.63 14265±187 138.69+271* 13894±2.93” 139.06±2.680 T-diastem 66.38±1.09 6616±109 69<43±118A 66 42±1.69 65.17±1.49 T-exoccip 34.66±1.74 34.68±1.40 34.26+ 1.81 34.28±1.83 33.84+ 1.00 T-foramen 34.14±0.65 33.50±0.52 34.39±1.26 36.20+1.95# 35.02±0.78 T-interor 40.61±1.65 42.00±1.06 41.59+ 1.18 42.68±060# 4210+0.84 T-maxilar 83.39+ 1.13 84.59±1.14 88.13±1.42¿S 84.90±278 83 81 ±2.21 Tabla 15 (Continuación):Indicescraneométricos. Losdatos indicanla media+ desviaciónestándar. -153- u u u u u ¡ u u u u u u u u —— iústrés croflico. actividad glucocorticoide y crecimiento — INDICES CRANEOMETRICOS Grupos experimentales Indices Co Str Ac Dx DxStr T-nasocig 69.93±2.07 71.69±2.53 74.55±1.704 71.62±2.62 69.41±1.56 T-palatin 93.04±1.05 94.71±1.21 97.71±1.824 95.20+2.67 93.99+2.33 T-prepala 71.16±0.98 72.52±1.09 75.10±0.934 72.50±2.23 71.66±2.32 T-supraoc 40.73 ±2.41 42.69±1.93 44.75±2.424 44.10+3.56 41.72+2.27 T-yugonas 117.73+3.09 116.43±3.62 117.66±1.75 115.59±1.76 114.77±2.51 I-basiocc 14.27±0.30 14.53 ±0.28 13.61±0.24* ¡3.62±0.39” 14.10±0.46 I-bicigom 51.41 ±0.84 51.22±0.98 49.32±0.72* 50.50±¡.45 51.42±0.99 I-cefalic 35.72+ 0.41 35.91 ±0.97 35,57±0.40 36.35 + 0.56 36.98 + 0.534 1-cigobre 37.93 + 0.70 37.80±0.50 36.61 + Q44* 37.46±0.97 38.19±0.57 1-cigoint 42.97+ 1.05 43.32 ±0.69 43.24±0.70 43.00±0.40 42.29±0.86 1-esfenop 32.11 + 0.39 32.22±0.63 31.42±0.56 32.17±0.76 32.02±0.52 I-exoccip 12.38±0.65 12.46±0.56 12.19 + 0.72 12.46+ 0.58 12.51 ±0.34 1-foramen 12.19±0.16 12.03±0.37 12.23±0.42 13.16±0.83# 12.95±0.334 1-interor 14.51 + 0.65 15.08±0.26 14.79±0.33 15.51 + 0.32# 15.57±0.314 1-nasal 35.95+1.19 36.70±0.69 36.76±0.56 36.14±0.56 35.68±0.55 1-nasoint 32.38±0.93 33.03 ±0.49 32.39+0.64 32.10+0.35 31.51+0.87 1-supraoc ¡4.55±0.93 15.32±0.53 15.91 ±0.774 16.02±l.15# 15.43±0.85 1-total 64.05±¡.19 63.30±0.69 63.24±0.56 63.86±0.56 64.32+0.55 I-yugoint 40.68+1.73 40.37±¡.24 41.81+0.72 40.95±1.18 40.93+0.80 1-yugonas 42.05±0.79 41.79±0.64 41.85+0.65 42.01 +0.64 42.44±0.77 Tabla 15 (Continuación):Indicescraneométricos Los datos indican la media + desviaciónestándar. -154- ANOVA Y COMPARACIONES EMPAREJADAS (Test de Seheife) Indices craneométricos Anova F(4,41) Signifi- cación Co Str Ac Dx DxStr L-basiocc 9.40 p=O.OOI ns cJe b b b L-bicigom 3.94 p=0.OI ns e b ns ns L-cefal¡c 3.94 p: Evaluación estadísticade los resultadosde los indices, -156 - u u u u u -- Resulta —— maxilar (5-6), longitud prepalatina(5-12)y longitud del arco dentalmínimo (K-M) tambiénse relacionan con el esplacnocráneo.En consecuencia, el superior grado de actividad glucocorticoideque la administraciónde dexametasonarepresentafrente a la de ACTH, intensifica el efecto reductorsobrevariablesque parecenconcentrarseen la región rostral, mientrasque no sucedeasí sobreotras regionesdel cráneoque estánsiendoalteradasen el mismo gradoque por el tratamientocon ACTH. Esto noshacesospecharquesi bien a bajas intensidades el esplacnocráneono responde y parece ser menos sensible al efecto glucocorticoide, luego se muestramás plástico que otras regionesy puede sufrir cambios mayoresproporcionalesa la intensidado gradode dicho efecto. Pero,como hemosdicho, no todaslas variablesde la zonaventral del cráneoquemuestranun efectomásintensoporel tratamientocondexametasonacorresponden al esplacnocráneo.Partede esasvariablespertenecenal neurocráneoy es interesanteseñalar que entre ellas se encuentrannuevamentealgunasde las implicadasen el reforzamiento occipital halladoen la exposiciónal ruido. Al igual queocurríacon la administraciónde ACTH, este dato corroborade nuevo que esteefecto es específico de ese tratamientoy no esta vinculadoa ningún otro mediadopor la actividad glucocorticoide,ya que dichaactividad no aumentala magnitudde esasvariablessino que, porel contrario, las reducey ademáslo hace en proporciónal gradode la actividadglucocorticoiderepresentadapor los tratamientos. Una vez que los resultados de los distintos tratamientos nos demuestranqueestaacciónesespecíficadel ruido, esconvenienteentraren unadiscusiónque habíamosvenido aplazando. Evidentementela remodelación de una zona de inserción muscular,como es la región occipital, esconsecuenciade un mayor desarrolloo actividadde los músculosqueen ella seinsertan,en estecasolos músculosqueforman el cuello del animal y que estánimplicadosen la sujecióny rotación de la cabeza.A su vez, estemayordesarrollo podríamosexplicarloo por un incrementodel pesocefálico o poruna mayor actividadfisica realizadapor el animal en respuestaa nuestromodelode estrés,y queimpliqueconcretamente a estosmúsculos. Referentea un mayor pesode la cabeza,ya conocemossin embargo que, precisamente,el pesodel cerebrose reducesignificativamenteen los animalesestresados (Tabla 8) porlo queprocedimosapesarel cráneode estosanimalesy compararlocon el de los controles,resultadosque aparecena continuaciónen la Tabla 18 y en la que obsérvamosque -170- —— Resultados y discusion —— tambiénel pesodel cráneoesreducidopor la elevaciónde corticosteronacirculantemediada porel estrés. De esta manera queda descartadala posibilidad de reforzamiento muscularparasoportarun pesomayor,ademásdeobtenerun nuevodato que nosinforma de una pérdidademasaóseaen estoscráneos. Pesodel cráneo 2.45±0.15b Anova GrupoexperimentalE (1,15) 7.71 pS0.05 Tabla 18: Pesocraneal(g). Los datosindican la media+ desviaciónestándar. Los superíndicesrepresentandiferenciassignificativasentrelos distintosgrupos experimentales:a Co y b Str. Estos datos, que inicialmente no estabaprevistoque se tomasen,son importantesporqueconstituyenun argumentomása favor de que el ruido estáreduciendoel desarrollocranealatravésde la actividadglucocorticoideque representa,si biende formamuy moderada lo que impide alcanzar matematicamentesignificación a muchas variables dimensionalessobretodocuandoéstassonmenossensiblesal efecto. Respectoal posible aumento de actividad general del animal por la exposiciónal mido deberíamosconsiderarsi hay unaimplicación de los músculoscervicalesy nucalesen las actividadeslocomotoray/o exploratoria,en cuyo casouna estimulaciónde estas conductaspodría explicar el reforzamientode los músculosmencionados,En principio la implicaciónde los músculosdel cuello en la actividadlocomotoraresultainciertacuando,por otra parte, no se observan alteracionessobre la musculaturade las extremidades,más relacionadaslogicamentecon estetipo de actividades.Sí esmásprobablesu implicación en la actividad exploratoria, por ejemplo en relación con la denominada“postura erguida”, una conductaestereotipadaasociadaen los roedorescon el comportamientoexploratorio. Sin -171 - -- Eviréscrónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — embargo,dadoque los animalesno son expuestosa un ambientenuevo durantela sesión de estrés,es dificil pensaren una estimulaciónde estaactividad. Por el contrarío,numerosos estudios(Nuble y Delini-Stula, 1976; Lanum y cUs., 1984; Lemoine y cols., 1990) y nosotrosmismos(Gainallo y cois., 1986b; Gamallo y cols., 1988)constatamoscomo las exposicionesaestrésinespecífico.conducena una reduccióndel comportamientoexploratorio durantelas pruebasde campoabiertoy otros tests. Nuestrasobservaciones,aunqueno han sido registradasen formade datosconcretos,nos permitenasegurarque durantela exposición al ruido no seha producidoun aumentodel númerode posturaserguidasde los animalesy que suactitudera, porel contrario,de quietudy alertasalvoesporádicassacudidasde la cabeza. Buscandounarelaciónentrela peculiarestimulaciónsensorialcontenida en el modelo de estrésutilizado y una aparentemayoractividadde los músculosdel cuello, nosotrossugerimosque, durantela exposicióncrónica al mido, los animales’podríanestar efectuandomovimientosrelacionadoscon el cuello y la cabezacon la probableintención de eliminar los efectosmolestosdel estímulosonoro. Otra actividad muscular asociadaa los músculos cervicalespodría consistirincluso,con una alta probabilidad,en contraccionesisométricasque mantendríanun “cierto tono” de esosmúsculosy una consecuenterigidez en estapartede la anatomíadel animal tan cercanaa los pabellonesauditivos. Esta idea parecerazonablepuestoque una respuestamotora refleja de “atención” o “alerta” de estos músculostiene un significado biológico obvio en relación con la entradasensorial auditiva ya que dichos músculosse encuentranimplicados en la orientaciónde la cabezay de los pabellonesauditivosfrente a la llegadadelestímulo. La idea que acabamosde discutir apuntaentoncesal mayor desarrollo muscularlocal como causadel reforzamientode la superficieóseasobrela que estosmúsculos se insertan.Estaes la únicaexplicación que nosotrosencontramosa estosresultadospero, evidentemente,seencuentradentrodel terrenode la hipótesisya quedeberíaserverificadacon otros datos de los que por ahorano disponemosni entran dentro de los objetivos de este trabajo. Cuandoseanalizanlos indicescraneométricosde los animalestratados con dexametasona,13 de ellos semodifican significativamentefrente al grupo’ control. Este -172- -- ¡<«su/fados y discusión -- menor número de índices significativos, trece, frente a los dieciseis hallados cuando analizábamoslos resultadosdel grupotratadocon ACTH esprecisamentelo primeroquenos llama la atención.El balancetotal entre ambosgruposes de tres indices de diferencia,sin embargoello esel resultadode la desaparición,en términosde significaciónestadística,de 11 de los índicesobservadosen el grupoAc y la incorporación,por lo tanto, de ocho nuevosque adquierenporel tratamientocon dexametasonasignificaciónfrenteal control. Nos restan cinco indices que mantienen los efectos vistos en el tratamiento con ACTH y que demuestranque el tratamiento con dexametasonano ha intensificadotalesefectos,ya que no existenparaestosíndicesdiferenciassignificativasentre ambos tratamientos.Por lo tanto, la mayor intensidad de la acción glucocorticoide del tratamientocondexametasonaaunque,comohemosvisto, hayaintensificadosusefectossobre las variablesindividualmente,no ha modificadolas relacionesentrelas incluidasen estoscinco índices. Sin embargo,como veremosa continuación,ha establecidonuevas relacionesentre otras variables, haciendoque ciertos índices significativos en el grupo Ac pierdan dicha significacióny otrosnuevosla adquieran. Convieneanalizar cuales son estos cinco indicesque se mantienen constantesrespectoal tratamiento con ACTH. Correspondena los índices craneofacial transversal(T-craneof)y cigobregmáticotransversal(T-cigobre)que relacionanvariablesde la región cigomática con la anchuramáxima del cráneo. Los índices supraoccipitaltotal (1- supraoc)y supraoccipitallongitudinal (L-supraoc)que suponenrelacionesentrela longitud supraoccipital(unade las variablesdescritascomoresistentesal efectode los tratamientos)y distintaslongitudes.Un quinto índice, basioccipitaltotal (I-basiocc),que relacionaentresí la longitud basioccipitaly la longitudtotal del cráneo, Siguiendolas ideasque sehan ido apuntandoal discutir los resultados de los otros tratamientos,los dosprimerosíndicesmencionadosen el párrafo anteriornos sugierenhacerun análisis de los efectossobre la región cigomática. Efectivamenteambos índices al reducirse significativamentenos señalanque variables representativasdel arco cigomático, anchurabicigomática(7-7’) y longitud cigobregmática(C-F), muestranrespectoa los animalescontrol una reducciónsignificativapor la administraciónde dexametasonamayor que la que seproducesobrela anchuramáxima. De nuevoestosindicesconfirmaríanque el efectoreductordel tratamientoesmayorsobreel crecimientode la regióncigomáticaque sobre -173- —— listrés ciánico, actividad glucocorticoide y crecimiento — el de otrasdimensiones,en este casola anchuradel cráneo,también a la intensidadde acción glucocorticoiderepresentadapor la administraciónde dexametasona.Esteefectoeraya intuido en los individuosexpuestosal ruido y posteriormenteconfirmadoen los tratadoscon ACTH. La mayor intensidaddel tratamientocon dexametasonano supone,sin embargo,que existan paraestos índicesdiferenciassignificativas frente al tratamientocon ACTH, lo cual indica que la relaciónqueseestableceentrelas variablessemantieneconstante bajo los efectostanto de la ACTH como de la dexametasona.Por lo tanto la reducciónde la zonacigomáticase haceen estemomentoindependientede la intensidaddel tratamiento.O lo que eslo mismo, aunsiendounazonamuy sensibleque muestrareducciónde su crecimientoa bajaintensidaddel tratamiento,“agota” pronto su toleranciaa serafectada.Tambiénpara la vanable anchura máxima del cráneo, la actividad glucocorticoide representadapor el tratamiento con ACTH constituye el umbral o límite superado el cual no se consigue intensificarel efectoreductorsobrela misma pero, a diferenciade las variablesrelacionadas con la región cigomática, la anchuramáxima del cráneo es menossensiblerequiriéndose intensidadesde acciónglucocorticoidesuperioresparaquesucrecimientosereduzcaeincluso cuandotodas estasvariables muestranel efecto reductor a una determinadaintensidad de tratamiento,siguensiendolas variablescigomáticaslas que se reducenen mayormedidaquela anchuramáximadel craneo. Sin embargo,seríaconvenientever como se comportan,en estecaso, otros indicesque impliquen variablesde la región cigomática.Precisamenteobservamosque, entrelos onceíndicesquehanperdidosignificaciónen los animalestratadoscon dexametasona 9 respectoal control, ocho de ellos implican variablesasociadascon estapartedel cráneo.El hecho de que la región cigomática haya alcanzadosu máxima respuestarespectoal efecto reductorde los tratamientosnos permiteexplicar la pérdidade significación de estosocho índices. Efectivamente,ya que lo ocurridoesqueel restode variablescontenidas en estos índices que eran inicialmente menos susceptiblesal efecto reductor de los tratamientos,sereducenen mayorgradopor la administraciónde dexametasonaque por la de ACTH. De estaforma, la mayor intensidaddel tratamientocon dexametasonano consigue acentuarla reducciónexperimentadapor las variablesasociadasa la zonacigomáticay causada por la ACTH, pero si logra que las otrasvariablescon las que serelacionana travésde los -174- —— Resultados t’ discusion —— índices se reduzcanen mayor medida. Como consecuencia,la reducción que muestranlas variablesde cualquierade los índicesdiscutidosesde igual magnitudy, por lo tanto, el índice pierdesignificaciónestadística.Ademásestosresultadosdemuestranqueel efectoreductordel tratamientocon dexametasonaes máscontundentesobreel conjunto del cráneoy ponende manifiesto como la intensidadcrecientede los tratamientosconducea una transición de variablesen cuantoasu margendetoleranciaparaserreducidas, La siguientecuestiónque suscitanuestrointerésy queguardarelación con lo queacabamosde exponeresel hechode quesólo siganalcanzandosignificaciónaquellos índicesque relacionanvariablesdel arco cigomáticoprecisamentecon la anchuramáximadel craneo(8-8’). Sin embargo,los indicesqueperdíansignificacióneranaquellosquerelacionaban la región cigomáticacon variablesque representanclaramentedimensionesde longitud, las cuales eran reducidasmás intensamentepor la dexametasona.Consecuentementeambos hechosnos permitensuponerque la anchuramáximaesuna variablepoco susceptibledeser modificadano sólo respectoa las variablesde la región cigomáticasino también respectoa aquellasrelacionadascon la longitud del cráneoy que las variablesde longitud, que a bajas intensidadesrespondíanmenosque la zonacigomática,mantienenmássu plasticidadfrentea intensidadesde acciónglucocorticoidealtas. Esta suposiciónpodría confirmarse observandoque sucedecon los índicesque relacionanla anchuramáxima con variablesde longitud. En el tratamientocon dexametasonaencontramosqueuno de los ocho índicesquese incorporancomo significativos es el denominadobasioccipitaltransversal(T-basiocc)que relacionala longitud basioccipital (3-4) con la anchuramáxima. Esteindice al disminuir su valor señalaqueel efectoreductordel crecimientoproducidoporel tratamientocon dexametasonaesmenorsobrela anchuramáxima que sobrela longitud basioccipital.Como veremosposteriormente,en el tratamientoconjunto con dexametasonay ruido, al intensificar la acción glucocorticoideestecomportamientose haceextensivoa índicesqueincluyenvariables(longitud del neurocráneoy longitud total) más representativasde la dimensiónlongitudinaldel cráneoquela contenidaen el índiceT-basiocc. Ademásno debemosolvidar que el índicebasioccipitaltotal (I-basiocc) sereducesignificativamentesiendouno de los cincoquemostrabanestecomportamientoya en el tratamientocon ACTH. Esteresultadoindica que la longitud basioccipitalestambiénmás sensibleal efectoreductorde los tratamientosquela longitud total del cráneoporquesiendo la -175- —— EsErés ciánico, actividad glucocorticoide y creciínieato —— reducción de la longitud total significativamentemás acentuadapor la administraciónde dexametasonaque por la de ACTH, no es suficiente para igualar en proporción a la que experimentala longitud basioccipitalaúncuandoéstano difiere entreambostratamientos. Esto no sólo pone en evidencia que las variables que representan longitudes totales son menossusceptiblesinicialmente que otras también longitudespero menos representativasde la totalidad del cráneo,sino también que la longitud basioccipital (una de las mássensiblesal efectoreductorde los tratamientosy con la queargumentábamos que, despuésde la regióncigomática,la siguientezonacranealmásvariableera la partebasal del neurocráneo)alcanzaa la intensidaddel tratamientocon ACTH su máxima respuestaa dicho efecto. No sucedeasí con las variables relacionadascon el esplaenocráneo,menos sensiblesque las del neurocráneopero másplásticasya que continúanreduciéndosede forma másacentuadaporel tratamientocon dexametasona.Estaconclusiónnos la confirmatanto el que seis de las nuevevariables que muestranuna reducciónsignificativamentemayor en el grupo Dx que en el Ac guardenrelación con el esplacnocráneo,como el hecho de que es precisamentea la intensidadrepresentadapor el tratamientocon dexametasonacuandodosde las cinco variables,que ya en la discusiónde los resultadosen los animalesestresadosvimos queparecíanofrecerciertaresistenciaa sermodificadas,sonreducidasde forma significativay ademásformanpartedela zonadel esplacnocráneo. En consecuencia,podemos decir que estos resultadosponen de manifiestouna transiciónentrela zonadel neurocráneoy del esplacnocráneoen relacióna su margende toleranciaal efecto reductorde los tratamientossobresu crecimiento.Es decir, a estaedadde los animales,el esplacnocráneomuestraunamayorplasticidadqueel neurocráneo a los cambios pues sus margenesde respuestason más amplios. Sin embargo,a bajas intensidadesesel neurocráneola regiónmássusceptiblea sermodificada,auncuandode forma moderada.Así, ¡oscambiosmásdrásticossevan a dejarsentiren el esplacnocráneoy no en el neurocráneoqueestámás“protegido”. Convienequizásen estemomentoinsistir en dosconceptosque hemos estadoutilizando y que aunqueson diferentesestánrelacionadospor lo que puedencrear confusión:uno esel de mayor o menorsensibilidadal efectoreductorde los tratamientos,de modoque decimosque una variablees muy sensiblecuandoa bajasintensidadesde la acción glucocorticoiderepresentadapor los tratamientosmuestraya unareducciónde sucrecimiento, -176- -- Resultados y díscusion -- mientrasque espoco susceptiblecuandoserequierenintensidadessuperioresparaque dicha variable manifieste ese efecto, pero también utilizamos este concepto cuando a una determinadaintensidadde acciónglucocorticoidea la quetodaslas variablesmuestranel efecto reductorunaslo hacenen mayor medidaque otras. El segundoconceptoesel de umbralde toleranciaa dichoefecto,quehacereferenciaa la intensidadde acciónglucocorticoideasociada a los tratamientosque actúa como techo o límite a partir del cual intensificar la acción glucocorticoideno intensíficael efecto.Deestaforma, las variableso las zonasdel cráneomás plásticasson aquéllasque cambianmáscon independenciade su sensibilidady esde pensar quesupatrónde crecimientoaestaedadestámenosestabilizado. Todo lo dicho hastaahoraindica quelas diferenciasde sensibilidadde las variablesmencionadasa los efectosreductoresde los tratamientosestablecénel ordenen quevanmostrandoalteracionessegúnaumentamosla intensidaddela acciónglucocorticoidede los mismos.Asi sealteraránantes(a menorintensidad)las variablesde longitud que las de anchuray de las variablesde longitud primero se modifican las parciales( neurocráneoy posteriormenteesplacnocráneo)y seguidamentelas longitudestotales.Estaes la explicación de que en el tratamientocondexametasonaencontremoscomo significativo el índiceT-basiocc queno lo eraa la intensidadrepresentadapor el tratamientocon ACTH, y queseanecesariala mayor intensidaddel tratamientocon dexametasonay ruido paraencontraralteracionesen los índicesquerelacionanlaanchuracon la longitudtotaldel cráneo. Como hemosvisto, la transición de variables respectoa su diferente sensibilidad frente a los tratamientos,puedededucirsetanto de los índices Óue adquieren significación,como deaquellosque la pierden,cuando sealcanzadeterminadaintensidaddel tratamiento. Recordemosque de los onceíndicesque pierdensignificación,ocho ya los hemostratadoen relaciónconel arcocigomático.Sin embargo,otrosdosde éstosíndicesse caracterizanpor relacionarentresí variablesde longitud. Igualmentehay un segundoíndicede los ocho que adquieren significación por el tratamiento con dexametasonaque también estableceunarelaciónentredos variablesde longitud. Por lo tanto, ya quela discusiónnosha llevadoa analizarestetipo de relacionesresultael momentoadecuadoparadiscutirías. Los dos índicesmencionadosen primer Lugar son el L-maxilar y el L- -177- —— itstrés crónico, actividadglucocorticoide y crecimiento — palatin, y relacionanlas longitudesmaxilar (5-6) y palatina(11-12)con la longitud basal(3- 12). Como consecuenciade la mayor intensidad del tratamiento con dexametasonalas longitudesmaxilar y palatinasereducenen mayor medidaque en el tratamientocon ACTH, mientrasque la reducción de la longitud basalno difiere entre ambostratamientos.Como resultadola reducciónque muestranestasvariablesen los dos indicesesde igual magnitudy por tanto éstospierdensignificación. Un tercer indice que adquieresignificaciónpor primera vez esel L-diastemque relacionala longitud del arco dentalmínimo (K-M) con la longitud palatina(11-12). Ambas variablesson reducidasen mayor medida por el tratamientocon dexametasonaqueporel de ACTH y esteíndiceal disminuir señalaquedicho efectoreductor esmayorsobrela primerade ellas. Estos resultados nos apoyan lo dicho respecto a la mayor susceptibilidadde las variablesque representanlongitudesparcialesque las que representan longitudestotalesy tambiénacercadel amplio margende toleranciaquemuestranlas variables relacionadascon el esplacnocráneo,ademásde indicamosqueentreéstasúltimases la longitud del arcodentalmínimola mássensibleal efectoreductorde los tratamientos. En términosgenerales,teniendoen cuentalo discutidoy que la anchura máxima (8-8’) es la variable que mejor nos representaestadimensióndel cráneo,podemos pensarque,despuésde las asociadasal arcocigomático,las siguientesvariablesen mostraruna mayor susceptibilidad al efecto reductor sobre su crecimiento correspondena las que representanla longitud del cráneo,siendoseguidasacontinuaciónpor laanchuradel mismo. Quedapor discutir aquellosíndicesen los que se hallan implicadas variablesrepresentativasde zonasóseascuyo crecimientono parecereducirsecualquieraque sea la intensidaddel tratamiento,permaneciendomás o menos constantes.Dos de estos índicesforman partedel grupode cinco que manteníanlos efectosvistosen el tratamientocon ACTH. Otros seisforman partede los ocho queporprimeravez adquieren,porel tratamiento condexametasona,significaciónrespectoal control. Los dos índices mencionadosen primer lugar implican a La longitud supraoccipital(G-1) relacionándolacon distintaslongitudes(A-B y neuro), mientrasque los seis últimos correspondena la relaciónde la anchurainterorbitaria(9-9’), o de la altura del foramenmagmtni (2-3) con esasmismaslongitudes (A-B y neuro), y ademáscon la anchura -178- -- Resultados y discusion -- máximadel cráneo. Todos estos índices aumentande forma significativa. El aumentode cadauno de ellos evidenciala constanciade estasregionesóseasa no ser afectadasen su crecimiento,mientrasquela anchuramáximay las longitudestotal y del neurocráneomuestran el efectoreductordebido al tratamientocon dexametasona.Un dato mása favot tanto de la resistenciade la longitud del hueso supraoccipitala su alteración, como también de que nuevamentela anchuramáxima muestrasu menor reducciónrespectoa otras dimensiones craneales,esla no significacióndel índicesupraoccipitaltransversal(T-supraoc);querelaciona dichas variables. Una vez más se confirma el comportamientode las partes del cráneo representadaspor estastres variables,intuido desdeel comienzode la discusióny afianzado en los sucesivostratamientos. A continuaciónvamosa discutir los resultadoshalladosen los animales del grupo DxStr. En estegrupo, al igual que en los tratadoscon dexametasona,se reducen significativamente20 de las 23 variablesen estudio.No sólo hay una igualdadnuméricaentre ambosgrupos,sino que tambiénsetrata de las mismasvariablesalteradaspor ‘el tratamiento único con dexametasona.Sin embargo,de estas20 variables, siete presentanuna mayor reducciónqueen el grupoDx. Estosresultadosindicanque, ademásde un generalizadoefecto reductorsobreel crecimientocraneal,ésteposeeunamagnitudsuperioral causadosólo por la administracióndedexametasona.En estesentido, los cráneossonmáscortosen longitud,tal y como ponende manifiestolas alteracionessobrelas variables:longitud total (Á-B), longitud cóndilo-basal(10-12)y longitud bulo-intermaxilar(K-R), mientrasque los cambiosdel arco cigomático se han estabilizado. Particularmente,pareceque esta reducció¡ en longitud respondea modificacionesen la región rostral como apunta la reducciónde las variables: longitud de los huesos nasales(B-E), longitud intermaxilonasalmáxima (E-1), longitud cigointermaxilar (C-I) y longitud del arco dental mínimo (K-M). Estosresultadosavalan el amplio margenque otorgábamostanto al esplacnocráneocomo a las dimensionesglobalesdel cráneo. El mayorefectoreductorquese ejercesobreestassietevariables,frente a los animalestratadoscon dexametasona,evidenciaademásun efecto debido al estréspor ruido que no alcanzasignificaciónestadísticacuandoesteagenteestresanteconstituye,por sí solo, el tratamientoexperimental. Incluso tres de estasvariablesfrieron analizadasen los -179- -- kstrés ciánico, actividadglucocorticoide y crecimiento — animalesestresadosentre aquellasque se reducíanpero no significativamente.Ello no hace sino corroborarque la ausenciade diferenciassignificativaspor el mido es debidaa que la intensidadmoderadade esteagentejunto con la edad de los animalesutilizados, impide modificacionessignificativasen el crecimientocranealcuandolos animalesson sólo afectados porel mido. Sin embargo,un efectosinérgicoentrela acciónglucocorticoidemuy intensade la dexametasonay la de la mayor secreciónde corticosterona(ver Tabla3 y Figura5) provocada por ¡a adición de la estimulación sonoracrónica a esosanimales, es capazde manifestar claramenteel efecto del mido. Vemos, además,que los resultadoscoincidenen resaltareste efecto aditivo del ruido sobrelas variablesde longitud las cualesya senos han manifestado mássensiblesqueotrasdimensionescraneales. Respectoa los índicescraneométricos,nuevede ellos semodifican de forma significativa frente al gmpo control. Siete de estos nueve indices también eran significativos por el tratamientocon dexametasona,aunqueno aparecendiferenciasentre ambos tratamientos. Los dos restantesadquieren por primera vez significación en el tratamientoconjunto de dexametasonay mido. Por otra parte,al aumentarla intensidaddel tratamientoseproducela pérdidade significaciónde seis delos índicesquehemosdiscutidoen el tratamientocondexametasona. Tratando de seguir el criterio por el que hemosido discutiendo los índices en otros tratamientos,observamosque dos de los siete indices que mantienenlos efectos debidos al tratamiento de dexametasona,craneofacial transversal (T-craneof) y cigobregmáticotransversal(T-cigobre), vuelven a confirmar la menor susceptibilidadde la anchuramáxima,en estecasorespectoa las variablesasociadasal arcocigomático.Los valores de ambos índices disminuyen de forma significativa, tal y como sucedíaen los animales tratadoscon ACTH y dexametasona,sin que existandiferenciassignificativasentreel efecto reductorde éstosy el debidoal tratamientoconjuntode dexametasonay mido. Comotampoco existendiferenciasentrelos tres tratamientosparacadauna de las variablesde estosíndices, estosresultadosconfirman que la región cigomáticaalcanzó su máxima respuestaal efecto reductorquecorrespondea la intensidaddel tratamientocon ACTH. El hecho de que estos dos índicessigan siendo significativos por el tratamientoconjuntode dexametasonay ruido noscorroboraquela anchuramáximadel cráneo es,en efecto, una variablepoco sensiblea reducirse.La mayor intensidadde estetratamiento -180- —— Resultados y discusgon —— no sólo respaldaestamenorsusceptibilidadfrentea las variablesde la regióncigomática,sino también frentea variablesque representanla dimensiónde longitud del cráneo.Recordemos queen el tratamientocon dexametasonahallábamosun indice significativo(T-basiocc)quenos permitíapensaren estaúltima cuestión.Puesbien, no sólo este indice sino dos más, que correspondena los queadquierensignificacióncuandosealcanzala intensidaddel tratamiento conjunto, confirman ese hecho. Así los indices [-cefaliey L-cefalic relacionanla anchura máximacon las longitudestotal y del neurocráneo,respectivamente,siendo aumentadossus valoresfrente al control. La importanciade estosdos últimos indices, I-cefalic y L-cefalic, radicaen queimplican variablesque son másrepresentativasde la dimensiónlongitudinal del cráneo que la variable longitud del hueso basioccipital, presenteen el índice T-basiocc, verificandola menor sensibilidad de la anchuradel cráneofrentea la dimensiónde longitud pero ademásindicando que las longitudes más representativasde la totalidad del cráneo presentanun márgende toleranciamuy amplio. Hemosanalizadohastaahoralas relacionesentrevariablesdeanchuray longitud, seria interesantesiguiendoel criterio establecidoconocerque sucedecon los índices querelacionanentresí variablesde longitud. Uno de estosindicesesel basioccipitaltotal (1-basiocc)queformaparte de los seis que pierdensignificación por el tratamientoconjunto de dexametasonay mido. Otro indiceesuno de los sietequemantienenlos efectosdebidosa la dexametasona:diastema longitudinal (L-diastem). Ambos nos muestrancuales de las variables que representan longitudessonmássensiblesal efectoreductorde los tratamientos.Puestoqueel primero nos indica quese necesitala mayor intensidaddel tratamientoconjuntoparaque la longitud total se reduzcaen igual medidaquela longitud del huesobasioccipitaly, dadoqueel segundonos señalaque la longitud del arco dental mínimo se reduceen mayor medida que la longitud palatina,confirmamosque de las variablesparcialesdel esplacnocráneola longitud del arco dentalmínimo esla mássensibley que se requierela acciónconjuntade dexametasonay mido paraafectaren mayormedidalas variablesquemejorrepresentanla longitud del cráneo. Quedanpor discutir tres indicesde los sieteque mantienenlos efectos debidos a la dexametasona:1-foramen, 1-interor y L-interor, que relacionanla altura del foramenmagnumy la anchurainterorbitariacon las longitudestotal y del neurocráneo.Todos ellos aumentansu valor señalandode nuevoque la altura del foramenmagnumy la anchura -181 - —— ltstrt’s cronico, actividadglucocorticoide y crecimiento — interorbitaria no se modifican mientrasque las dos longitudesse reducen.Una vezmásestos índicescorroboranla resistenciaa alterarsede la zonainterorbitariay del foramenmagnuma la vez quese produceunareduccióngeneralizadadel crecimientodel cráneoque afectaen mayor medidaa la longitud. Quedaclara la existenciade una correlaciónpositiva entreel gradode actividadglucocorticoiderepresentadopor los diferentestratamientosy la magnitud de las alteracionesobservadasen el crecimientocraneal,así como el hechode que estasalteraciones resultanen todos los casosmediadaspor la correspondienteacción glucocorticoidede la dexametasonaadministradao del excesode corticosteronacirculanteproducidopor el estréso por la administraciónde ACTH, quedandodescartadala implicaciónde cualquierotronivel de activacióndel eje Hl-LA vinculadoal estrés.Estehechoesconfirmado por los efectosaditivos entredosisfijas de dexametasonay unaadición de secreciónde corticosteronaendógenapor la estimulaciónsonoraen los animalesdel grupo DxStr. Cualquiersospechaacercade que los efectosfriesenmediadospor la ACTH (porejemplo,en los gruposStr y Ac) quedadescartada ya queen el tratamientocon dexametasonaestahormonamediadorade las accionesdel estrés estáfrertementeinhibida. Teniendoen cuentala correspondenciamencionadaentrela intensidad de la acción glucocorticoidede los tratamientosy la de las alteracionesobservadas,podemos resumiréstasde la siguientemanera: La intensidad de la acción glucocorticoidedebidaal tratamientocon estrésprovocauna reduccióndel crecimientocranealquesólo seponede manifiestosobrelas variablesmás sensiblesa dicho efecto. Sin embargo,pesea estamayor capacidadpara ser alteradas,la reducciónque experimentanno alcanzasignificación estadística,verificándoseel caráctermoderadode este tratamiento. Estas variables están relacionadascon la región cigomáticay con la longitud de diversaszonascraneales,especialmentedel neurocráneo.La estimulaciónauditiva repetitivapareceactivar la respuestade músculosnucalesy cervicales relacionadoscon la orientaciónde la cabeza,cuya mayor actividad remodelareforzandoel complejode inserciónoccipital de dichosmúsculos. -182- -- Resultados t’ discusion -- La intensidad de la acción glucocorticoidedebidaal tratamientocon ACTH provocauna reducciónsignificativadel crecimientocranealque seponede manifiesto no sólo sobrelas variablesqueya a la intensidadrepresentadaporel tratamientoestresantese mostrabancomomássensiblessino tambiénsobreaquellasquelo eranen menorgrado,tanto las que contribuíancon su aumentoal reforzamientode la región occipital por exposiciónal mido, como otrasque mostrabanasimismoun aumentosi bien debidoexclusivamenteal azar. Esteefectoreductorsobreel crecimientocranealadquierepuesunarepercusióngeneralizaday se caracterizapor ser más acentuadosobre la región cigomática que sobré las variables representativasde la dimensiónlongitudinaldel cráneo,siendoentreéstasúltimasaquéllasque serelacionancon la región basal del neurocráneolas que sereducenen mayor medida. Porel contrario, la anchuradel cráneopareceserla dimensióncon menoscapacidadparaserafectada en su crecimiento, aunqueefectivamenteresultaalterada.Se inician las alteracionesde las variablesdel esplacnocráneo. La intensidad de la acción glucocorticoidedebida al tratamientocon dexametasonaprovoca una reducción significativa del crecimiento craneal, igualmente de caráctergeneralizadopero estaintensidadya no escapazde reduciren mayor medida ni el crecimientode la región cigomáticani el de las variablesrelacionadascon la región basaldel neurocráneo,que eranlasmássusceptiblesaeseefecto;esdecir, a la intensidadde la actividad glucocorticoidecorrespondienteal tratamientocon ACTH, estaszonasóseashan“agotado” su capacidadpara ser alteradasasí como también la anchuradel cráneo,representadapor la variable anchuramáximadel mismo, que siendo menossensibleque las otraszonasmuestra también un agotamiento rápido de su plasticidad. Por el contrario, a la intensidad del tratamiento con dexametasona,las variables relacionadascon el esplaenocráneo,que eran menossensiblesinicialmente,siguenrespondiendoal efectoreductor. La intensidadde la acciónglucocorticoidedebidaal tratamientoconjunto con dexametasonay estrésprovocauna reducciónsignificativay generalizadadel crecimiento craneal,aunquesólo las variablescon un margende toleranciamásamplio muestranun efecto reductoracordecon la intensidaddel tratamiento,esdecir, aquéllasque no han “agotado” su tolerancia a ser reducidas. Estas variables son las relacionadascon longitudes del esplacnocráneoasí como con longitudes que representanla totalidad del cráneo,siendo las primerasmássensiblesqueéstasúltimas. -183- —— Estés crónico. actividad glucocorticoide y crecimiento — Por otra parte,y en relación con las variablescraneométricas,parece producirseuna transiciónde éstasatendiendoa su susceptibilidadfrente al nivél de intensidad de estostratamientos.En consecuencia,la forma que adquiereel cráneodifiere de uno a otro tratamiento de intensidad diferente. Podríamos habernos encontrado con réplicas más pequeñasde los cráneosen los tratamientoscon dexametasonaque en el casode la ACTH. Esteno pareceserel caso,y así un aumentoen la intensidaddel tratamientoconducetambiéna morfologíascranealesde diferentenaturaleza,no como consecuenciade que los tratamientos tengandistintosefectos,sino de la correlaciónque seestableceentrelas intensidadescrecientes de los mismos, y la distintaresistenciade las zonasóseasa modificarsu crecimiento. A esterespecto,convieneconcluir quea bajasintensidadeslas primeras alteracionesque se manifestaríancorrespondena las del arco cigomático, ~eguidasde las alteracionesdelas dimensionesde longitudy en último lugarde las de la anchurámáxima.Pero, además,el comportamientode las dimensionesde longitud difiere, mostrandomayor facilidad para ser alteradaslas longitudes parcialesque las totales; y siendo, entre las longitudes parciales, las relacionadascon el neurocráneomás sensiblesque las relacionadascon el esplacnocráneopero éstasúltimas másplásticasy variables.A intensidadessuperioreslo que sucedeesque ni la región cigomáticani el neurocráneoni la anchuracranealson capacesde mostraruna mayor reducciónde su crecimientode acuerdocon la superioriñtensidadde los tratamientosmientrasquesilo haceel esplacnocráneo,que erainicialmentemenossensible.Es decir la region cigomática,el neurocráneoy la anchuracranealse caracterizanpor poseerun margende toleranciamuy estrechomientrasque el de la región del esplacnocráneoresultaser másamplio. Respectoa que las longitudesparcialesseanmássusceptiblesque las totalesal efecto reductorde los tratamientoses obvio como consecuenciade que las primerasestán contenidasen las segundasde formaque, aelevadasintensidadesde acciónglucocorticoidees más fácil que la diferentesensibilidadque caracterizaa las variablesentresí se expreseen la variableque lascontieneya quela generalidadde las variablesen estudioresporáderianal efecto reductory ademáslo haríanen igual medida,no mostrándosedicha reduccióhde una forma especialsobredeterminadaszonascranealessino sobretodo el cráneoy, por lo tanto, serían las variablesmásrepresentativasde la totalidaddel cráneoquiénes“exteriorizarían”eseefecto. Una mayor facilidad paraalterartanto la zonacigomáticaen particular, como el esplacnocráneoen su conjunto, resultatambiénfacilmentecomprensible,teniendoen cuenta,que la edadde los animalesestaríacomprendidaen lo que podemosentendercomo -184- -- It\trés ciánico, actividadglucocorticoide y crecimiento — significativasen la morfometríay crecimientocraneal.Así desdeel punto de vista preventivo, la importanciade estosefectosno estribaen su intensidadsino precisamenteen el hechode su dificil manifestación,y dequepuedanversepotenciadosal coincidir con otrosfactores.Desde el punto de vistaantropológico,lo relevantederivade quela exposicióna un agenteambiental como el mido puedeestar “matizando” la morfologíacranealde una población o de partede sus individuos. Todasestasconclusionesconstituyenla respuestaalos Objetivos3a y 3b con los que pretendíamoscomprobaren el cráneode nuestrosanimalesposiblescambios, no sólo de carácterdimensionalsino tambiénmorfológicos,en relacióncon la distintaactividad glucocorticoidede los tratamientosempleados.Pero,además,la discusiónde estosresultados ha ido perfilandoun patrónde crecimientocranealcaracterísticode la estirpe,sexoy edadde nuestrosanimalesya queen la respuestadiferencialqueofrecenunasvariablesrespectoaotras a los tratamientos,subyacela existenciade diferenciasde sensibilidadde las diversaszonaso regionescraneales.Es nuestrosiguienteobjetivo, por lo tanto, caracterizarcon precisióneste patrón de crecimientocraneal a través del empleo de análisis estadísticosmultivariantesy comprobarsi secorroborano no lastendenciasobservadashastael momento. 4.2. ESTADíSTICAMULTIVARIANTE DE LAS VARIABLES CRANEOMETRICAS Nuestro estudio multivariante comprendedos técnicás de análisis estadístico:el análisisde componentesprincipalesy el análisis discriminante.Ambastécnicas auncuandopresentanun desarrollodiferente,comoacontinuacióncomprobaremos,nosvan a proporcionaruna gran diversidadde información permitiéndonosresponder,como ya seha comentado,a cuálesson las característicasdel patrón de crecimientocraneal de nuestros animales,pero tambiéna dosobjetivosqueno fueron inicialmentepropuestos. Así, por un lado, el discriminarquévariablescraneométricassonlas que caracterizana los diferentesgruposexperimentalesno sólo nos indica en funciónde quézonas del cráneosedefineesepatrón de crecimiento,sino que ademásde forma indirectanosestá -186- -- ¡, acnvidadglucocorticoide y crecimiento — MATRIZ DE CORRELACION Variables VII 12 V3_4 V4_5 VS_6 VIO_12 VG_1 VA_B VII_12 1.00000 V3 4 .78192 1.00000 V4 5 .8243 1 .74405 1.00000 VS 6 .95120 .71380 .70190 1.00000 Vio 12 .95587 .84603 .89411 .91864 1.00000 VG 1 .15348 .01932 .02622 .16644 .11995 1.00000 VA_B .93928 .79639 .86400 .90847 .96283 .15605 1.00000 VB E .84500 .70974 .71060 .83919 .85106 .27825 .90809 V3 12 .95114 .86128 .90691 .90582 .98938 .06161 .96157 VK M .89746 .71590 .80903 .86877 .88967 .07798 .92855 WC R .95930 .80525 .89557 .92207 .97879 .07875 .97253 VE 1 .87226 .69748 .69876 .86527 .85720 .18864 .86752 VC 1 .85628 .70818 .76524 .87389 .87768 .12835 .87905 VC E .77909 .78654 .82045 .67294 .83471 -.07431 .80332 VD_J .71873 .55678 .66437 .71100 .71118 .03983 .74996 VD E .86832 .74743 .83010 .81682 .87749 -.03474 .88440 Vi 2 .37363 .35225 .49126 .37065 .47428 -.17450 .46829 V2 3 .18658 .24318 .14682 .16472 .17496 -.32410 .15381 V7 7 .82579 .83389 .75411 .77349 .84788 -.12293 .80961 V8 8 .80356 .77224 .71322 .73733 .81041 .00692 .73164 V9_9 .48770 .55534 .46836 .43232 .56234 .40420 .46897 Tabla 19: Matriz de correlaciónentrelasvariablescraneométricasl -188- — Resultados y discusión -- MATRIZ DECORRELACION Variables VBE V312 VKM VKR VEI VCI VCF VB E 1.00000 V3 12 .83181 1.00000 VK_M .82372 .90460 1.00000 VK R .85024 .98180 .92527 1.00000 VE 1 .88966 .84200 .82029 .86050 1.00000 VC_1 .79551 .87779 .85276 .89785 .89499 1.00000 VC E .64529 .85218 .74592 .81944 .64104 .64158 1.00000 VB J .61348 .72455 .73903 .75533 .61489 .71997 .52350 VD E .67603 .89675 .83436 .90025 .68887 .80147 .78963 Vi 2 .25665 .48379 .441 12 .47612 .34669 .48149 .44656 V2_3 .00367 .18124 .19908 .16832 .05741 .07005 .34268 V7 7’ .63577 .87764 .76963 .85325 .73404 .76395 .86087 ¡ VS 8’ .60358 .80754 .70043 .77478 .62052 .63139 .77701 V9 9’ .40162 .51041 .33813 .44351 .38597 .37722 .50274 MATRIZ DE CORRELACION Variables VDJ VDE V12 V23 V77’ VSS’ V99’ VB J 1.00000 VD E .83084 1.00000 VI 2 .33665 .50562 1.00000 V2 3 .09552 .27047 .08965 1.00000 V7 7’ .57703 .81468 .49210 .32754 1.00000 VS 8’ .46613 .71295 .39846 .33145 .81636 1.00000 V9_9’ .20127 .43687 .23698 .19644 .48177 .56400 1.00000 Tabla 19 (Continuación):Matriz de correlaciónentrelas variablescraneométricas. -189- —— Estrés cránico, activiuladglucocorticoide y crecimiento — A partir de estamatrizde correlaciónseextraeotra, denominadamatriz factorial, que reproducela primerade forma mássencillae indica la relaciónentrelos factores y las variables. La matrizque se muestraen la Tabla 20 no esla matriz factorial sino unatransformaciónde éstallamadamatriz factorialrotada.La finalidaddeestatransformación efectuadamedianterotación varimax es favorecer, una vez más, su interpretación.Como podemosobservarcadauna de las columnases un factor mientrasque el númerode filas coincidecon el númerode variables.Los valoresnuméricosqueaparecenen la Tabla20 sonlos coeficientesde correlaciónque nosindican el pesoquecadavariableasignaa cadafactor, de modoqueaquéllascon coeficientesaltosen un factordeterminadosehallanasociadasa él. La asociaciónde una variablea un factor se decideporel coeficientede correlaciónmásalto quemuestredichavariable. Como observamos, sólo se han conservado tres factores que correspondena aquélloscuyosvalorespropios son superioresa la unidady en consecuencia, explican el mayor porcentaje de la variabilidad total. Estos tres factores explican conjuntamenteel 83%de la varianza. Se lograasíel objetivo del análisisal extraerun mínimo de factoresque expliquenel máximo de la variabilidadtotal, esdecir, al pasarde 2~ variablesa 3 factoressin queporello seproduzcaunapérdidaconsiderablede información. Analicemos ahora el significado de cadauno de los tres factores. El análisisde componentesprincipalessiempreva a extraercomo factor 1 aquellaasociaciónde variables que resumalo mejor posible la información contenidaen la matriz de datos de partida. En nuestrocasocumpleesapremisasuficientemente,puestoquevemosque a él se asocianuna gran mayoría de variables. Es decir, es el factor que más y mejor contribuyea explicar la variabilidad de la muestraen su conjunto (69%) y, por consiguiente,nos señalay agrupalas variablesy zonasque mejormuestranlos efectosde los tratamientos. -190- —— ¡ .945 .294 15 12 VE...! .333 -140 13 FC..) .921 .124 14 ‘¡eS .631 .587 15 Vb_J .825 ‘.026 16 Vb.> .351 .334 17 VI...2 .469 .176 18 V2_3 —.030 .659 19 V7_7 743 .531 20 VB.> .621 .642 21 ‘¡9_9 .253 .742 5 5 1-25- s L- lCD 1< 5 5 X 5 2’ S A X X C C O- DX O F T X AS O D S R XDX A A C A A 2 —1.25- A A AA O A —1.425 —.475 .475 1.425, —1.9 —.95 0 .95 FACTOR 1 0:00 S:SWR A:AC D:DX X:DXSTR Figura20 a: Representacióngráficade lacombinaciónde factores. -193- -. Estrés crónico, actividad glucocorticoide y ¿recimiento -. Borísontal Factor 1 Verticall Factor 3 Variable Coordenadas ti 2. VII._12 .904 S96 2 ¶3.3 .700 .021 3 ‘¡45 .81.7 —.049 4 VS.> .897 .111 s VIO_12 .905 ~073 21 6 VGl .089 .920 7 VA.> .939 ~O74 8 8 VB! .256 1281 124 9 7312 .915 .004 2 13 10 VKJI -914 —~O32 11 VKJ .945 —.001 20 311 12 VE.) .833 ¿175 141916 13 ¶0_1 .921 .050 14 VCF .681 —.140 17 15 VD3 .825 —~107 17 Vi_2 .469 —348 18 723 —.030 —~433 19 77_7 .743 —.119 20 ‘¡88 .621 —.020 21 119_9 .253 ~470 o A A A S O 5 SS 3 XX A E DX O A XD AA $ O O- D A 3 T A 500 O X XX 3 A n IX X e 3 —1.5- X CI —1.425 —.475 .475 1.425 ¡ —1.9 —.95 0 .95 FACTOR 1 C!CO S:STR A:AC D:DX XZDXSTR $t Ocurrencia múltiple Figura 20 b: Representacióngráfica de la combinaciónde factores.’ -194- -- Resultadosy discusion -- Horizontal Factor 2 Vertical Pactor 3 VarIable cj~aci~ 6 1 V1L12 .333 .096 2 ¶3_4 .538 .021 3 V4.fi .352 —.049 4 VS_6 .238 .111 5 V10.J2 .390 .073 21 6 7G1 —.020 .920 7 VA.> .276 .074 8 8 VB...! .131 .281 12 4 9 V32 .376 .004 137152 10 VKJ< .206 —S32 11 VILR .294 —-001 1011 20 12 VE_1 .1.40 .175 15 16 19 13 Ve! .124 .050 14 VCJ’ .587 —.140 2.~ 15 VD,J —.026 —.107 18 16 1/DE .334 —.160 17 VI...2 .176 —348 18 1/23 .659 —.433 19 V7_7 .531 —.179 20 1/88 .642 —.020 21 ~t9 .742 .470 1. 2’ A O T O R :3 —1. —1 —1.9 —.95 0 .95 FACTOR 2 0±00 S±STR A:AC D;DX X:DXSTR $: Ocurrencia nufltiple Figura 20 e: Representacióngráficade lacombinaciónde factores. -195 - —— iúgtrés cromcú, actividadglucocorticoide y crecimiento — Lo primeroque resultainteresantediscutir esel criterio porel cual las diferentesvariablesseasociana cadauno de los tres factoresdeterminadosporel análisisde componentesprincipales. Como ya se ha comentado, un número considerablede variables, diecisiete, asignanun pesomayor al factor 1. Dichas variables sepuedenclasificar en dos grupos. Las correspondientesa la zona cigomática y aquellas que representan la dimensión longitudinaldel cráneoque, logicamente,es la dimensióndefinidacon más frecuepcia. El que dichas variables estén asociadascon el factor que mejor representala variabilidadmuestralsignifica que los efectosde los tratamientossecentrande formaespecialen ellas y en las zonasquerepresentan. Por lo tanto, desdeel análisis multivariante, encontramosun apoyo sustanciala las tesisqueestablecíana la arcadacigomática(pertenecienteal esplacnocráneo)y al crecimientoen longitudcomola zonamásmodificabledel cráneoy comoel procesoquemas caracterizaal patrónde crecimientocranealde estosanimales,respectivamente.Por ello, arco cigomático, como región anatómica,y longitud, en cuanto a dimensióncraneal, reunenlas variables que muestran con mayor significación los efectos gradualesde una acción glucocorticoidecrecientea estaedady sexode los animales. Evidentementeello ocurreporque,en el periodode vida puberal-juvenil al que correspondela edadde las ratas utilizadas,el arco cigomático y la longitud del cráneo deben ser dos componentescuyo crecimiento no se ha estabilizadoy van a mostrarun desarrolloimportanteduranteesetiempo, permitiendoasíqueun agenteexternoles afecte. El siguiente factor que representala variabilidad muestral (factor 2) confiereun pesoconsiderablementemenora la mismay sólo tresvariablesseasociana él. Una de estastresvariablescorrespondea aquellaque representala anchurapor excelenciao anchura máxima del cráneo (8-8’). Ciertamente, de las ya pocas variables representativasde la dimensión “anchura”, ésta era la única que sufría algún cambio por efecto de la actividad glucocorticoide.Así, las alteracionesde esta variable en función de la intensidadde los tratamientosmostraron,con el análisis univariante,que seproducíana una cierta intensidad, eran de pequeñamagnitud y se estabilizabanrapidamente.Es decir, de acuerdo con la -196- —— Resultados y discusion nomenclaturautilizada pornosotros,eraunavariablepocosensiblea la acciónÉlucocorticoide en estaedady presentabaun margende saturacióndel efectoreductorpocoamplio. Esosresultadosdel análisisunivariantenosconducíana la tesisde una estabilizacióndel crecimiento en anchura del cráneode la rataen esteperiododeedad. Esta tesis queda ahora reforzada por la asociacióncon el factor 2 de la variable antes citada, junto con la anchura interorbitaria, permitiéndonospensar que la identidad del factor 2 consiste en representarla dimensión “anchura” del cráneo. Esta dimensión, al ser menossusceptiblede ser alterada,evidentementeexplica en términos de variabilidad,y porconsiguientede efectosde los tratamientos,muy pocasalteraciones. En un principio, la asociaciónen el factor2 de estasdos variablesy una tercera,alturadel foramenmagnum,nosprodujo confusión.Sobretodoteniendoen cuentaque la anchurainterorbitaria y la altura del foramen magnumse nos mostraban,en el análisis univariante,como variablestanresistentesa las accionesreductorasde los glucocorticoidesque habíansido incluidas, en nuestradiscusión, en una agrupaciónartificial cuyo denominador comúnerala incapacidadde alterarse. Ciertamente, si recordamos, la tercera de las llamadas variables “resistentes” era la longitud del huesosupraoccipitaly, como vemos,es la única variable asociadacon el factor3. Por lo tanto, de nuestrasideaspreestablecidasen el análisisunifactorial, hubiésemosesperadouna asociaciónen el factor3 de las tresvariablesno alteradas. Sin embargo,hemosmencionadoque la agrupaciónde estasvariables realizadapor nosotrosresultaartificial, ya que las mismasnadatienenen común desdeuna perspectivaanatómica,funcional o dimensional.En aquel momentoexpresamosuna posible explicaciónbiológicaparael hecho de que estasvariablestuvieran la necesidadde mostrarse muy establesen este períodoen que el desarrollodel animal ha alcanzadomadurez. Sin embargo,el análisisdecomponentesprincipalesnos permite,sin queello restevalideza tales explicaciones,ordenarmejorestasvariablesde acuerdocon la tendenciade la zonaanatómica -197- —— Extrés croflico, activádod glucoúoruicoide y crecimienu> —— del cráneo que representanfrente a la acción reductora de los glucocorticoides,y por consiguientefrentea la variabilidadmuestral. De estemodo quedaclaroqueel factor 2 representamayoritariamentela dimensión “anchura” del cráneoy asociaentresi variablesquerepresentandichadimensióny/o que muestran una afectación similar. Si aceptamosque el crecimiento en anchuraes muy estableen los animalesde estaedad, es razonableque los tratamientosprecisende un cierto grado de intensidadpara provocarefectos, y que estos sean de pequeñamagnitud sobre algunas variables de anchura e, incluso, que algunas de éstasni siquiera muestren alteraciones significativas(anchurainterorbitaria). Desde esta perspectiva nos planteamos una nueva posibilidad. La variablealtura del foramenmagnumparececompartiridentidadcon las variablesde anchura que como ella se asocianal factor 2. Nos preguntamossi, siendo una de las dos únicas variablesque representanla dimensión “altura” en el cráneo,no seráesteresultadoindicativo de un comportamientocomún de las dimensionesde “anchura” y “altura” ftente a los tratamientos.Evidentementeal serpocaslas variablesidentificadascon esadimensiónno hay suficiente información para asegurarlo. La otra variable representativa de la altura es la altura exooccipital (1-2), asociadaal factor 1 aunquecon el coeficiente más bajo de todas las variables. Volviendonuevamentea la identidadde los factores,observamosquela terceravariable “resistente” (longitud del huesosupraoccipital)es la única asociadacon el factor 3 que, porotra parte,esel que menosporcentajeexplica de la variabilidad muestral. Luego,ello demuestraque unade las característicasquedefinenlos efectosde los tratamientos esla incapacidadde alteraciónde estamedidadel huesosupraoccipitaly, en cualquiercaso,es la característicade menos peso. A continuaciónle sigue, con una relevanciaintermedia, la estabilizaciónde la dimensión de “anchura” (y quizás “altura”) del cráneo(factor 2). La “anchura” sufrirá alteraciones sólo si la intensidad de acción glucocorticoidees adecuada, dichasalteracionesseránde pequeñamagnitud y afectarána unasvariablesde anchura,sin -198 - -- Resultados y discusion -- apreciarselos efectosen otras. Porúltimo, la característicamásrelevante(factor 1) es la notableacción reductoradel crecimientodel cráneoen longitud así como de las variablesqueintegranel arco cigomático. De todo lo expuesto,podríamosdecir que el patrón de crecimiento cranealde la ratapúbersuponeuna estabilizacióndel crecimientoen anchuray posiblemente en altura, mientrasqueel crecimientolongitudinal esel procesoqueconfieremayorplasticidad al cráneodeestosanimales.El arcocigomáticosiguemostrándosecomo una regiónanatómica dondedichaplasticidadseresaltamás. Una vez conocido el significado de los factoresresultamás sencillo discutir la informaciónprocedentede su representacióngráfica (Figura20). En primerlugar centraremosnuestraatenciónen la posiciónrelativade los individuosde los diferentesgrupos,lo que permitirárelacionara los animalesde un mismo grupo,separándolesde los restantesen funciónde los factoresextraidosporel ACP. Es decir, al analizarla posiciónrelativaasumidapor los individuosfrentea los factores,podemosver si hay una agrupaciónde los mismosquenosposicionea cadagruposeparadode los demás,de acuerdocon el efectoo tendenciaquecadaanimal muestraparalas variablesrepresentadaspor los factores. Deestamanera,al eliminarel “ruido de fondo” producidoporel exceso de variablesagrupándolasen los factores,podremosdiferenciarmejor aquellosgruposcuyos resultadoseranpróximos,y averiguarsi los animalesasignadosa ellosforman partedegrupos diferenteso, porel contrario,seconfundenen un mismo grupo. Esta posibilidad resultaespecialmenteimportantepara nosotrosen el casodel grupode animalesexpuestosal mido, en los quemuchasveceslos efectosno llegan a manifestarseestadísticamente,pero seencuentranen el límite de la significacion. Iniciemos la discusiónde estapartepor la representacióngráfica que enfrentaal factor 1 con el factor 2. Si hacemosun bandeoo barrido de la imagen desdela -199- —— ltstrés crónica, actividadglucocorticoide y crecimiento — derechaa la izquierda, estamosanalizandola distribución espacialde los animalesde los respectivosgruposde acuerdocon el vectorquerepresentaal factor 1. Lo primeroqueobservamosesunadistribuciónacordecon la intensidad de acción glucocorticoide asociada a cada tratamiento, demostrando nuevamenteuna graduacióno polaridad de los efectosrepresentadospor el factor 1 frente a la misma. En consonanciacon esto último sepuedenestablecercinco bandasverticales quetienen cadauna su eje centralhorizontalen el factor 1. Dos de ellas, situadasmása la izquierda,señalaríanlos animales en los quelos efectossobre lo representadopor el factor 1 alcanzaun valor menor. Es decir, en los que los efectosreductores de la longitud del cráneoy del arco cigomático son mayores. Hay una banda central muy amplia que engloba a los animales que muestran unos efectos intermedios y dos bandasa la derechaque representaríanlos efectosmenoreso los animalesque al no serafectadospresentancráneosmáslargosy con un arco cigomáticomás desarrollado. A continuaciónanalizamospasoa pasola distribuciónde los individuos que aparecen en estasbandas.Los animalesque se sitúanmása la izquierdason los tratados con dexametasonay mido, seguidosde una bandabien delimitadaen la que se entremezclan animales de los grupos DxStr y Dx. Por lo tanto, los animalessometidosa una actividad glucocorticoide mayor se localizan muy próximos entre sí en las dos bandasque corresponden con los valores más bajos de las variablesasociadasal factor 1. Es decir, a mayorintensidadde la actividadglucocorticoidemayor efectoreductorsobreel crecimientoen longitud y mayor alteraciónaparentedel arcocigomático. Evidentementedebeexistir una bandade transiciónde menora mayor efecto reductor (segunda bandapor la izquierda),en la que los animalesde los dosgrupos tratadoscon dexametasonasedistribuyenmezclados,ya que, el nivel de acciónglucocorticoide querepresentanlo marcala propiadexametasona,y la diferenciaqueconfiere la hipersecreción de corticosteronaprovocadapor el estréses comparativamentemenor. Sin embargo,dicha diferencia,es suficientepara que aproximadamentemásdel 60% de los animalesDxStr se destaquende los tratados sólo con dexametasonapor mostrar efectos reductoresdel crecimiento craneal mayores (posición extrema a la izquierda). El resto(menosdel 40%) se comportandeunaformasimilar a los tratadosunicamentecondexametasona. -200 - —.. Resultadosy discus¡on —— A continuación,y justo en tornoal ejevertical central,nosencontramos la bandaintermediaa la que hemoshechoreferenciaanteriormente.Su simbolismo esclaroy no lo vamosa repetir,coincidiendocon el mismo,vemosqueestabandaestáocupadaporlos animales administradoscon ACTH, es decir por el grupo experimentalque presentauna actividad glucocorticoide intermedia entre los tratamientoscon dexametasonay los animales estresadoso controles.Por consiguiente,a unaactividadglucocorticoidemediale corresponde unosefectossobreel crecimientocranealmedios. Pasamosahoraal análisisde los animalesque sesitúanmásala derecha y que, por lo tanto, muestranlos valoresmás altos para los efectosasociadosal factor 1. Evidentementeesta posición coincide con los animalescuya actividad glucocorticoidees menor,y por ello, nos encontramosconanimalescontroles(actividadglucocorticoidebasal)y con animalesexpuestosal ruido (actividad glucocorticoidemoderada).Tambiéneraesperable encontrarnosa los animalesestresadosentremezcladoscon los controlesa razón de los resultadosunivariantesdiscutidos.Sin embargocabepreguntarse¿significaestehechoque los animales expuestosal ruido y los controles forman un mismo grupo indiferenciable?.El análisis multivariante nos va a permitir extraer información para la diferenciación en el comportamientodeambosgrupos. Lo primeroquedestacaal observaren la Figura20 la distribuciónde los animalesestresadoses su notabledispersión.Es cierto que dicho comportamientotambiénse evidenciaen los controlespero, en el casode los animalesdel grupoStr, la dispersiónesmás acusada,tanto en la dirección del factor 1 (horizontal), que estamosanalizando,como en la direcciónseñaladaporel factor2 (vertical). Hay dosaspectosdistintosa discutir en relacióna la dispersiónde los animalesestresados.Por un lado el motivo o causade la dispersión,pero tambiénpodemos analizarquela dispersióndistribuye a los animalesno azarosamente,sino formandosubgrupos entrelos cualesalguno esmayoritario y. por lo tanto, representativodel efecto debido a la exposiciónal mido. Vamosen primerlugara abordaresteúltimo aspecto,ya queva a serel que nospermitaestablecerlas diferenciasentrelos gruposcontrol y estrés.La dispersiónde los animalesexpuestosal ruido les hacedistribuirse en las tres bandasque se sucedende -201 - —— Lvtré.s crónica actividad glucocorticoide y crecimiento — derechaa izquierday que nos señalanla ausencia,moderacióny nivel medio de los efectos reductoresdel crecimiento craneal.Esto último representadopor la banda dispuestaen el centro, ya comentadaanteriormente,y ocupadapor el tratamientoconACTH. El análisisde la distribución de los animalesdel grupo estrésen estas tresbandasescomosigue. Un 22.2% de animalesestresadosaparecenen la primerabandade la derechacorrespondientea los cráneosmáslargosy/o con arcocigomáticomásdesarrollado, compartiendoestaposiciónconel 62.5% de los controles. Sin embargoel 66.7%,esdecir, la mayoríade los animalesexpuestosal ruido, estánen la segundabandade laderechaquedenotaya cráneosmáspróximosalos delos animalestratadoscon ACTH. La posiciónmayoritariade animalesestresadosen estabandase compartecon un 3 7.5%de los controlespero, asimismo,con algunode los animalesdel grupo Ac,aquélloscuyareducciónlongitudinaldel cráneoo del arcocigomáticoresultómenor. Por lo tanto estasegundabanda de la derechaparececorresponder nuevamentea una zonade transiciónentrela ausenciade efectosy el efectode la ACTH, Es decir, entrelabandamásala derechaocupadamayoritariamente(62.5%)por los controlesy aquellaquesituadaa la izquierda,en el centrode la representación,indica los efectosmediados por la ACTH. Desdeestaperspectivala ocupaciónmayoritaria(66.7%)de estabanda de transición precisamentepor los animalesestresadoses lógica, ya que presentanuna actividadglucocorticoidemediadaporuna moderadahipersecreciónde corticosteronay, por consiguiente,tambiénefectosmoderadossobreel cráneo.Razonablees asimismola presencia minoritariaen estabandade transiciónde animalesen los queel efectoreductordel tratamiento conACTH fue menor. En último lugarun it. 1% de los animalesexpuestosal ruido mostróun efectoreductordel cráneoquelo incluye en labandaocupadacasiexclusivamenteporel grueso de animalestratadoscon ACTH. En cuantoal motivo de la dispersiónde los animalesestresados,su análisisesindicativo tambiénde aspectosinteresantes. -202 - — Ressíltacfusy discusión -- Los fisiólogos estamosacostumbradosa que muchos parámetros evaluadospresentenmárgenesamplios de normalidad,por lo que, la propiaindividualidad de los sujetosde estudio haceque en un mismo grupo se produzca una dispersiónde los resultados.A pesarde la estabilidadgenéticade las estirpesutilizadasen la investigación,esta individualidaden el comportamientode muchosparámetros,y porconsiguientela dispersión de los valoresalcanzadospor los mismos, se manifiestahabitualmentesobretodo en los animalescontrol. Sin embargo,en los gruposexpuestosa un tratamiento,la dispersiónsuele ser contrarrestadapor el efecto común debido al mismo y desapareceen mayor o menor medidacuantomásintensoesel efecto. En nuestrocaso,al serlos efectosde la exposiciónal ruido moderados, podríamosencontrartodavíaunatendenciaa la dispersiónde los datos,similar a la queaparece en los animalescontrol, pero lo llamativo es que la dispersiónseaincluso muy superiora la manifestadapor los mismos. Unaexplicaciónparaun comportamientode estanaturalezaen animales sujetosa un tratamientoesque dicho tratamientocontengaestímulosqueprovoquensobrelas variables en estudioefectoscontrapuestos. Teniendo en cuentalas variablesque definen al factor, los animales estresadosparecen estar sujetos a moderadosefectos reductores de dichas variables ocasionadospor la moderadaacciónglucocorticoidede la corticosteronacirculanteestimulada porel estrés,pero tambiénpodríanestarsujetosa factoresque aumentasenla magnitudde las variablesconsideradas.En efecto, nosotrossabemospor los resultadossignificativos de la estadísticaunivariante,que los animalesdeestegrupomuestranun reforzamientode zonasde inserciónmuscularoccipital lo cual, obviamente,aumentalos valores de ciertas medidasde longitud contenidasen el factor 1. Ademássospechamosque en ellos tambiénse iniciaban,de unaformamoderada,los efectosreductoresdel crecimientocranealmediadospor el excesode glucocorticoides,señalandomediantereduccionesno significativasde las variablesy, sobre todo, por los cambiossignificativos de alguno de los índicesanalizados,precisamentea las longitudesdel cráneoy a la arcadacigomáticacomo laszonasvulnerablesdel mismo dondese iniciaban dichos efectos.Hay dos consecuenciasclaras de lo expuesto.En primer lugar, la dispersiónencontTadanosindicael mayor o menorgradoquecadaindividuo muestrade unou -203 - —— ¡2sfréscrónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — otro efecto. En segundotérmino, la ausenciade significación estadísticaen los animales estresadosno essólo consecuenciade lo moderadode los efectossino tambiénde que, sobre muchasvariables,los efectosreductoresdel crecimiento y los efectosde reforzamientodel complejooccipital secontrarrestan,no manifestándosesignificativamenteni unosni otros. Esta notable dispersión de las medidas cranealesen los animales estresadosseevidenciano sólo en relaciónal factor1, lo cual esindudablementemásrelevante porserel representativode los efectosmássignificativos de la actividadglucocorticoide.sino también frente al factor 2. Pudiendoen estecaso ser consecuenciaexclusivamentede la constanciade la anchurafrentea los tratamientos. Vamosa continuacióna analizarla distribución espacialde los animales de acuerdocon el vectorquerepresentael factor2. Consistiríaen hacerun barridode la misma representacióngráficaen sentidovertical. Estebanidosupone,teniendoen cuentalos efectos asociadosa dicho factor, que los animalescon cráneosmásanchossedistribuirán en la zona superiorde la representacióny los restantesse irán situandogradualmentede arriba hacia abajoen la medidaen quelos efectosreductoressobrela dimensión~~anchura”seintensifican. El primer resultadodeesteanálisis esque no existeuna ordenación,en relacióncon la intensidadde acciónglucocorticoide,tanclara comoen el casodel factor 1. Ciertamenteno encontramosuna distribuciónde los individuostratados tal quelos animalescon actividadglucocorticoidebasalo moderada(controlesy estresados)se sitúen en bandassuperioresy seguidamentese manifiesteuna polaridad. Por el contrario, observamosque la dispersiónesunanormageneralen todos los grupos.A excepciónsólo del tratamientocon ACTH, los animalesde los restantesgrupos experimentalesse localizan dentro de la bandaque les marca el factor 1 pero con una notable dispersiónen el sentido vertical. De estamaneray con independenciade que el efectoreductorsobrela longitud del cráneoo sobreel arco cigomáticoseamoderado(Str) o intenso(Dx y DxStr) nos encontramoscon animalesde cráneosanchosy estrechosen todoslos grupos.Tansólo en los animalestratadoscon ACTH se muestrauna clara agrupaciónindicativa de una tendencia homogéneaa la reduccióndel crecimientoen anchura. -204 - -- Resultados y discusion -- ¿Qué interpretación podemos hacer de estos resultados?. La información necesariala tenemosen el significado, ya discutido, de estefactor 2 y en el comportamientodelas variablesasociadasen él frentea la actividadde los glucocorticoides. En efecto,el factor 2 representalos efectossobrela anchuradel cráneo y éstamuestrauna notable estabilizaciónde su crecimiento en estosanimales,ya que los efectos reductoresde la actividad glucocorticoide se dejan sentir poco o nada sobrelas variablesimplicadas.Por lo tanto, los efectosreductoressobrela anchuracranealsonde orden secundadorespectoa los involucradosen el factor1, lo cualcoincideconla asociaciónde estas variablesde anchuraen el segundofactoren importanciadel ACP. La estabilidad de La anchuracraneal de estos animales no sólo se manifiestaporel hechode quetan sólo una de las variablesmuestrereduccionessignificativas en la estadísticaunivariante,tambiénsededucede que el efecto reductorsobreesavariable, que apareceprecisamenteen los animalestratadoscon ACTH, alcanzasu máximo exponente en ellosmismos.Es decir, la intensidadde tratamientonecesariaparaconseguirdichoefectoes la correspondientea la administraciónde ACTH, perotampocoeseefectoreductoraumentaa intensidadesmayoresde actividadglucocorticoide(tratamientoscondexametasona). Partiendode esta informaciónseexplica perfectamentela distribución de los animalestratadosqueestableceel vectorespacialdel factor2. Primero, la ausenciade polaridad de los valores adquiridos por la anchuradel cráneodesdeunamenora mayorintensidadde actividadglucocorticoide.Segundo, los animalespertenecientesa un mismo grupo manifiestansu individualidadfrentea variables que, al no estar supeditadasa un efecto común importante, no muestranuna tendencia homogénea.Como consecuenciade esto último todos los grupos presentanuna notable dispersióncon unadistribuciónazarosaentrecráneosanchosy estrechos. Porúltimo, tambiénse explica queel único tratamientoen el que todds los animalesseagrupancorrespondacon la administraciónde ACTH, indicandóque todoslos animalesdestacanpor mostraruna reducción de la anchuracraneal.ObviamenteestOesasí porque ese tratamientorepresentala actividadglucocorticoidesuficiente para próvocátun -205 - —— ltstrés cr4nico, actii’idadglucocorticoide y crecimiento — efecto reductorde la anchurapero éste queda ya saturadoen dichos animalesy no se intensificapor los tratamientoscon dexametasona,cuyosindividuos manifiestannuevamente una dispersiónen relacióna estadimensión. Estos resultadosdejanclaro de nuevo que lo más característicode los efectossobreel crecimientodel cráneoqueestamosestudiando,no son las alteracionesde la anchura y que, por lo tanto, no es una buena dimensión para caracterizare identificar tratamientosque alterenel crecimientocraneala estaedady sexode los animales.El factor2 no nos permite pues delimitar tratamientoscon mayor o menor efecto reductorsobre el cráneo. Respectoa la representacióngráficaque enfrentaa los factores1 y 3, observamosque los individuos se distribuyen en la dirección del factor 1 en cinco bandas atendiendoal mismocriterio queya hemosdiscutido.Recordemos,de izquierdaaderecha,una bandadondesesitúanmayoritariamentelos animalesdel grupoDxStr seguidade unabandade transición ocupadapor animalesde los grupos DxStr y Dx, aunquepredominandoestos últimos. A continuación,una amplia zonacorrespondientea los animalestratadoscon ACTH para pasar, de nuevo, a una zona de transición donde,en estecaso, los individuos que se entremezclanpertencena los gruposestrésy control. Porúltimo, la bandamása la derecha mayoritariamenteocupadapor los animalescontroles. Nadanovedosonosproporcionapuesel análisisdeestarepresentación respecto a lo ya dicho desde el punto de vista del factor 1, sin embargo sí resulta relevante la agudizaciónde la dispersiónde los animalescuandoobservamosla distribución de los mismos en la dirección que marca el factor 3. Es decir, cuando el bandeose realizadesdela zona superiorhaciala inferior dela gráfica. Haciéndoloasí vemosqueen todos los grupos,incluido el grupo Ac, nos encontramosanimalesque adquierentantovaloresaltos como bajosparala variable longitud del huesosupraoccipitalque es la únicaasociadaal factor 3. Estavariable representauna zonadel cráneocuyo crecimientoseencuentrafuertementeestabilizadoa esta edadde los animalesy, por consiguiente,la variabilidad de los valoresque paraella muestran los animalesdebeserconsideradacomounaexpresiónde supropiaindividualidady no como un efectode los tratamientos. En relacióna la representacióngráfica de los factores2 y 3, no tiene -206 - -- Resultados y chscuswn -- sentidorealizarun análisisprofundoya que enella seaunanlos factoresquemenorporcentaje de la variabilidadmuestralexplicany, porconsiguiente,representanlos efectosde menorpeso sobre el crecimientocraneal. En los casosanteriores,la asociaciónde estos factorescon el factor 1 permitía matizar la información procedentede la distribución de los animalesen función de los efectossobrela longitud cranealo sobreel arcocigomático.En el casoqueahora nos atañe,comopodemosver en la gráfica, no hay ningúncriterio queordenela disposiciónde los individuos y ademássu dispersiónesmanifiesta.Estaobservaciónes lógica ya que estos factoresasocian,por un lado, variables poco susceptiblesa los efectosreductoresde los tratamientosy, por otro, incluso muy resistentes,de modo que la posiciónde los animalesen esta gráfica no nos permite, como ya esperábamos, diferenciar ¡os grupos atendiendo al efecto de los tratamientos.Si estosfactores2 y 3 mostraban,en su combinacióncon el factor 1, una dispersiónde la respuestade los animales,esrazonableesperarmayordispersiónaúncuando secombinenentresí. En resumen,la informaciónque el análisisde componentesprincipales nos ofreceacercadel patrón de crecimiento de nuestrosanimalescontinna que la arcada cigomática,como zona craneal,y la longitud, como dimensión, son más susceptiblesa ser alteradosen su crecimiento,mientrasquelas zonasresistentesguardanrelacióncon la anchura (quizástambiénaltura)del cráneoy, de formamásacentuada,con el huesosupraoccipital. A la vista de estepatrón de crecimiento,el ACP nos proporcionala posibilidad de caracterizar y diferenciar entre silos distintos grupos de tratamiento en función de los efectosindicadosporel factor 1, que esel queagrupaesasvariablesrepresentativasde las zonas del cráneo más sensibles.Pero, además,nos está señalandola forma en que deberíamos diseñar futuros trabajos de esta naturaleza para que, sin que perdamos información relevante,ganemosen simplicidad. Esteobjetivo no erauno de los inícialmentepropuestos,sin embargo la aplicación del ACP nos permite de forma indirecta responder al mismo. Como podemosobservar,la contribucióndecadavariablea cadauno de los tres factoresdeterminadospor el análisis nosestá indicandoque dichos estudiosdeben “abordarse”por zonaso áreascraneales,no arbitrarias,sino caracterizadas,comoya hemos discutido, por su diferentesusceptibilidada los efectosreductoresque sobresu crecimiento causannuestrostratamientos. -207 - —— ltivtrés crónico, actividadglucocorticoi¿le y crecimiento — Dadoquelas diferenciasde sensibilidadde las diversaszonasdel cráneo esalgocaracterísticodel patrónde crecimientocraneal,y éstelo esa su vezde la estirpe,sexo y edad,estáclaro que estosresultadosnos permiten,como hemosdicho, diseñarcualquier estudiosobrealteracionesde crecimientoen animalesquereunanestascaracterísticas,seacual seael elementomodificadordel crecimientoque se estudiepero, con mayor seguridad,si el mecanismointermediario entre el elementoconsideradoy el crecimiento es la actividad glucocorticoide. Por lo tanto, a la hora de evaluaren animalescon esos requisitosel efectosobreel crecimientocranealde dichostratamientosdebemoscentrarnuestraatenciónen las variablescraneométricasrepresentativasde la dimensiónlongitud del cráneoasí como del arcocigomático,porseréstaslas zonascranealescuyo crecimientoa la edadde estosanimales aún no se ha estabilizadoy, por consiguiente,es más susceptiblede ser afectado por tratamientosde los quesesospecheaccionessobreel crecimiento. Obviamenteno seria práctico considerarlas variablesque definen la dimensión“anchura”, y probablementela dimensión“altura”, puesel análisisde componentes principales no las señalacomo significativasa la hora de diferenciarentresí los gruposde animalesatendiendoa los efectosreductoresde nuestrostratamientossobreel crecimiento craneal. Sin embargo,de interesarcomprobarefectossobre la anchurao la altura debería elegirseparafacilitar el trabajo, de entrelas variablespor nosotrosconsideradas,la anchura máximadel cráneo(8-8’) y la altura exooccipital(1-2) respectivamente,que sehan mostrado como lasvariablescon unaciertacapacidadde cambiorepresentativasde esasdimensiones. También resultarían descartadas de esos fUturos estudios las variables altamenteresistentesa que su crecimientoresultealterado(longitud del huesosupraoccipital) pues,precisamentepor esacaracterística,no permitirían que evaluaramosun efectoreductor sobreel crecimientodel cráneo. Vemos así que el diseño de futuros trabajosde este tipo resulta facilitado no sólo porqueresponderáa un criterio conocidode antemano,el de la diferente susceptibilidadque presentanlas distintas zonascraneales,sino porqueademásse produce una considerablereduccióndel númerode variablesa teneren cuenta.El ACP nos permiteasí cumplir otro de los objetivos que no fUeron planteadosen un principio pero que surgió en el -208 - —— Resultados y discusion —— transcursode la discusión del estudio univariante. Y lo hace al agruparnoslas variables craneométricasconsideradasen los tres factores que conjuntamenteexplican el mayor porcentajede la variabilidadmuestral. Nuestro estudio multivariante comprende otra técnicá de análisis estadístico:el análisis discriminante. Este análisis implica en su desarrollouna auténtica selecciónde variables entre todas las de partida. Esas variables van a ser las que mejor discriminenunosgruposde otros. En el casodel ACP, semantienentodas las variablesy lo quesucedeesquesedistribuyenen tresfactoresque“recogen” la informaciónquecadaunade ellas contiene. Las dos técnicas reducen asi el número de variables sin que se pierda informaciónrelevante. A partir de esa selección de variables, el análisis discriminante proporcionaecuacionesmatemáticas,algo que no hace el ACP, las cuales no sólo nos facilitarán conocer si realmente esas variables especificas permiten discriminar nuestros grupos, sino también si individuos con unasmismascacteristicasde estirpe, sexo,edady patrón de crecimientocraneal que los nuestros,y expuestosa tratamientosde los que se intuya efectossobreel crecimiento,puedeno no asignarsea uno de nuestroscinco gruposde tratamientoen funciónde la intensidadde acciónglucocorticoideporellos representada.Dicha clasificaciónrequiereúnicamenteconocerel valor quecadaanimalpresentaparacadauna de las variablesseleccionadasporel análisis. Obviamentela selección de variables previa a la obtención de las ecuacionescomentadasnos ofrece, desdeese mismo momento, información referentea la caracterizacióndel patrón de crecimientocranealde nuestrosanimalesfijánddnos si dichas variablesserelacionancon determinadaszonasdel cráneoquemuestrandiferentesensibilidada modificarsu crecimiento. Ambastécnicas,como vemos, difieren en determinadosaspectosde su desarrolloperonosofreceninformaciónconvergentea la horade responderal objetivo 3c. Vamos,porconsiguiente,a tratar a continuacióncon másdetenimiento el desarrollodel análisisdiscriminantey a discutir los resultadosobtenidos. -209 - —— Iiistrés crónico, actividad glucocorticoide y ¿recituienlo — 4.2.2.ANALJSIS DISCRIMINANTE Este análisis seleccionó cinco funciones matemáticascon las que clasificar de forma inequívocacadaindividuo tomado al azar en uno de los cinco grupos experimentalesconsiderados.Estas funcionesdiscriminantesson combinacioneslineales de trecede las veintiunavariablescraneométricasde partidaporserésaslas quemáscontribuyen a discriminarentre los gruposy, por lo tanto, son las característicascranealesdeterminadas por los efectos de estos tratamientos sobre tales variables las que condicionan esta clasificación. La seleccióndecadaunade estastrecevariablesserealizóatendiendoal criterio de la D2 de Mahalanobis,medianteel cual se seleccionaaquellaque maximiza la distancia de Mahalanobisentre los dos grupos más próximos. Siguiendo estecriterio, las variablesfueron seleccionadas“paso a paso”, de tal modo que entrasenen el análisis las variablesquecontribuyeranmása la discriminaciónentrelos grupos. Se especificóque dicha contribuciónfuesesignificativaal menosen un 5% así comoqueel valor detoleranciaadmitido Ibera de 0.001, de modo que si una variable fuese combinaciónde otrasn~ entraseen la función discriminante. Conocidas las combinacioneslineales de variables se estiman los coeficientes de cada una de las funciones de clasificación obtenidas. Estos coeficientes aparecenen la Tabla 21. La última columna correspondea los valores de la D2 de Mahalanobis,indicandoel ordende entradade cadavariableen el análisis. Una vez conocidosestoscoeficientes,esposible calcularunosvalores de clasificaciónque nos permitirándistinguir entrelos gruposexperimentalescuandoen las ecuacionesmatemáticasse sustituyendichoscoeficientesasí como los valoresque adquieren las 13 variablescraneométricasen cadaindividuo. De estemodo, un individuo pertenecea aquelgrupode tratamientoparacuya funcióno ecuaciónde clasificaciónha alcanzadoel valor declasificaciónmáselevado.Seobtieneasi unareglamatemáticaqueasignaalos individuosen uno delos cincogruposde tratamiento. -210- —— Resultados y discusion —— COEFICIENTES DE CLASIFICACION Variable craneo métrica Grupo 1 Grupo 2 Gn¡po 3 Grupo 4 Grupo 5 Distancia D2Co Str Ac Dx DxStr 10-12 -7.807552 46.06878 11.99279 27.42153 14.86687 0.71 3-12 -49.57920 -59.48621 -73.47484 -73.37417 -56.90607 2.63 A-B -28.58263 -62.09682 -21.25592 -21.94207 -28.45843 3.62 C-F -25.73193 -30.91523 -38.31358 -41.33243 -31.27322 4.92 K-M 250.3795 237.1140 244.3498 215.2883 214.0500 6.81 3-4 186.5514 196.7824 133.4063 109.9536 145.6194 9.90 2-3 130.6477 111.6683 156.5303 172.8208 146.0964 12.63 G-1 48.54650 58.38233 63.46573 72.82399 59.49281 17.55 5-6 142.0524 129.2118 132.0939 114.8989 124.9725 19.08 B-E 51.14529 57.62013 67.28055 67.90657 56.36824 21.36 1-2 316.4454 328.3361 304.2696 300.9342 297.5069 23.28 E-1 59.11360 80.96513 38.91967 41.38152 50.24405 23.37 C-I 3.934013 -8.243241 17.15699 15.52566 3.255827 29.40 Constante -4281.712 -4325.122 -4089.847 -3874.866 -3699.047 Tabla 21: Coeficientesde clasificaciónparacadagrupoexperimentaly valoresde la D2 de Mahalanobis. Los resultadosde estaclasificaciónsemuestranen la Tabla22 o matriz de confusión. Estamatriz presenta,paracadauno de los cincogrupos,el númerode -211 - —— histrés crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento —— casos en los que tomados aleatoriamentelos cráneos y aplicándoselas funciones discriminantesseha clasificadocon aciertoen el grupoexperimentalal que pertenecían.En la siguiente columna aparecedesignadocon un número cada uno de los grupos reales de pertenencia.A continuaciónaparecencincocolumnasen lasque seindicael grupopredicho.El porcentajede acierto fije del 100%, lo que indica que el análisisdiscriminanteestotalmente efectivo. MATRIZ DE CONFUSION Co Str Ac Dx DxStr n0decasos 8 9 10 9 10 %de coincidencia 100% 100% 100% 100% 100% Tabla 22: Matriz de confusión(clasificacionescorrectas). La discusión de los resultados proporcionados por el análisis discriminantevamosa iniciarla precisamentepor el porcentajede aciertoobtenidocuandoen las cinco ecuacionesmatemáticasse sustituyeel valor que presentacadauno de nuestros animales, escogidoal azar, para cada una de las trece variables seleccionadas.Al ser el porcentajede aciertodel 100%se confirma la valía de esasvariablesa la hora de diferenciar unosgruposdeotrosy, consecuentemente,que el procesode selecciónha sido eficiente. Por un lado, estosresultadosson importantesporque nosapoyanla identidadde los diferentesgruposde tratamientoy, por lo tanto, la del grupoestrésfrenteal control y al restode los grupos,algo que paranosotroses particularmenteinteresantepor lo ya comentadoen la discusiónde los datosdel ACP. De otra parte, su importanciaradicaen que, a la hora decaracterizarel patrón de crecimientocranealde nuestrosanimales,centrannuestraatenciónen las variables craneométricasseleccionadas.Decimosestoporqueya que la discriminaciónde los gruposgira en torno a unascaracterísticascraneométricas,la selecciónde estastrecevariables lo que manifiestaesla existenciade unadiferentesensibilidadde las zonascranealesa sermodificadas -2 1 2 - —— Resultados y discusion —— en su crecimiento por los tratamientosy, por consiguiente,la existenciade un patrón de crecimiento característicode nuestrosanimales. Este patrón de crecimiento ha sido ya establecidoen el apanadorelativo al estudiounivarianteasí como en relación al análisisde componentesprincipales,y escorroboradoporestosresultados. Nos interesa, por lo tanto, conocercuáles son esastrece variables seleccionadasporel análisisdiscriminantey con quézonasdel cráneoserelacionan. Observamosqueunade lasvariables(C-F o longitud cigobregmática)se relaciona con la región cigomática que, como vimos, se caracterizabapor su elevada sensibilidadaserafectadaen su crecimiento.Además,la seleccióndeestaúnicavariablepor el análisisdiscriminantela señala,de entrelas definidaspornosotrossobredicharegión,comola másrepresentativade la misma. Otras diez de las variables seleccionadasse puedenagruparpor ser variablesque se definenen mayor o menormedidasobrela longitud del cráneo(A-B, K-M, 10-12, 3-12, 3-4, G-1, 5-6, B-E, E-I y C-I), dimensiónque compartecon la zonacigomática esacapacidadde respuestaa los efectosreductoresde los tratamientos.Observamosademás que tres de estasvariables(10-12, 3-12 y 3-4) son algunasde aquellasrelacionadas,en su momento, con un efecto de reforzamiento de la región occipital observado exclusivamente en los animalestratadoscon ruido. Por lo tanto, su discriminaciónpor el análisisnosponede manifiestola importanciaquetambiénpresentan,ennuestroestudio,a la horade diferenciarde forma específicalos animalesdel grupoestrésde los restantes.En estecontextoescomodebe diseutirsela selecciónde la variableG-1 o longitud del huesosupraoccipital,que recordemos era una de las variables altamenteresistentesa ser reducida por los tratamientos. Por consiguientesu discriminaciónno permitidadiferenciarlos gruposen función de esosefectos reductorespero sí caracterizarel grupoestrésatendiendoal efecto de reforzamientooccipital ya comentado. El análisis discriminanteseleccionaotras dos variables (¡-2 o altura exooccipital y 2-3 o altura del foramen magimm) que representanen cieno grado a la dimensión ‘altura” del cráneo.En el ACP planteábamosla posibilidad de que estadimensión secomportasede unaformasimilar a la dimensión“anchura”, de tal modoquela estabilidadde su crecimientoexplicaríala necesidadde una cierta intensidadde acciónglucocorticoidepara -213 - —— ¡ entre el grupo de la columna considerada ~los diferentes grupos experimentales, teniendo en cuenta que a= Co, b= Str, c Ac, d= Dx y c~ DiSer. El tratamiento con estrés sonoro alteró el contenido de los constituyentes minerales de las mandíbulas, incrementando los niveles de bario, estroncio y cinc, y disminuyendo los de magnesio (p ~ 0.05 vs Co). La administración de ACTH también aumentó de forma significativa respecto al control el contenido de bario y estroncio, y disminuyó los niveles de magnesio (p= 0.05), pero no modificó el contenido de cinc. No aparecen diferencias significativas frente al tratamiento con ruido para dichos elementos. -218- —- Ites,,Itados y discusion —— La administración de dexametasona incrementó los niveles de bario y estroncio (p ~ 0.05 vs Co), pero no reprodujo la reducción del contenido de magnesio. No se aprecian diferencias estadisticas para estos constituyentes entre este tratamiento y los de estrés y administración de ACTH. El tratamiento conjunto de exposición a estrés sonoro y de administración de dexametasona provocó también un aumento del contenido de bario (p S 0.05 vs Co), aunque no el de estroncio, y una reducción significativa del contenido de magnesio (p s 0.05 vs Co). Sin embargo, en esta ocasión se produjo además un aumento significativo del contenido de calcio (p <0.05 vs Co). No hubo diferencias significativas entre estos resultados y los del tratamiento único de dexametasona, a excepción de los niveles de estroncio (p=0.05 vs Dx) los cuales eran elevados en dicho tratamiento pero no se alteran en el tratamiento conjunto. De un juicio general de nuestros resultados, se desprende, en un primer momento, dos hechos: la nula participación del cobre en la composición ósea de estos animales y que el calcio es, como era previsible, el elemento mayoritario. Por otra parte, observamos que el contenido de fósforo y de hierro no manifiesta una alteración significativa por ningún tratamiento. Este hecho puedé interpretarse como una carencia de acción reguladora, sobre el hueso, de la homeostasis de estos elementos mediada por los glucocorticoides. Sin embargo no se puede asegurar esta posibilidad, ya que desconocemos si el contenido óseo de estos elementos puede ser alterado por una actividad glucocorticoide de mayor intensidad que la utilizada por nosotros. En cualquier caso, estos resultados nos conducen a excluir posibles acciones especificas por parte de cualquiera de nuestros tratamientos y, por consiguiente, a estos oligoelementos como posibles marcadores de la activación glucocorticoide propia y mediadora de un estrés ambiental inespecífico y moderado. Sí encontramos, por el contrario, una alteración del contenido óseo de calcio, bario, estroncio, magnesio y cinc debida a nuestros tratamientos experimentales. Sin embargo, estas alteraciones no presentan un patrón común para todos los elementos evaluados -219- —— lÁistrés crónico, actividad glucocoríicoide ~vcrecimiento — ya que las alteraciones encontradas suponen incrementos o decrementos según el elemento considerado, y también, porque no siempre los tratamientos reproducen los mismos efectos de acuerdo con su correspondiente intensidad de actividad glucocorticoide. Por el contrario, hay efectos que parecen estar mediados por mecanismos activados en algunos de los tratamientos pero inhibidos en otros, y la dexametasona no actúa en todos los casos como análogo estricto de la corticosterona. Como consecuencia de ello, deberemos establecer la discusión de estos resultados considerando a los elementos independientemente o agrupándolos desde diferentes perspectivas. Observamos, en efecto, que el contenido en el hueso de bario, estroncio, magnesio y cinc se modifica en los animales estresados. Ante estos resultados, la pregunta que a continuación se nos plantea es si la modificación del contenido de estos elementos es un reflejo de la estimulación de la actividad corticoadrenal y, por lo tanto, un efecto del aumento de los niveles circulantes de glucocorticoides que acompaña a las situaciones de estrés. Para responder a esta pregunta, vamos a ir comparando los resultados referidos a los animales expuestos al mido con los datos relativos a los tratados con ACTH y dexametasona. De este modo, si la modificación del contenido de estos elementos en los animales estresados está mediada por los glucocorticoides, deberíamos encontrar que dicho contenido también se modifica en los otros tratamientos de comparación. En relación al cinc, vemos que el hecho de que su contenido sólo sea modificado en el hueso de los animales estresados, nos permite concluir que tal efecto no es mediado por el aumento de glucocorticoides circulantes que desencadena la exposición al estrés. Posteriormente comentaremos otros aspectos relativos al posible significado de este resultado. Sin embargo, resulta interesante discutir ahora el hecho de que los animales tratados con dexametasona y además expuestos al estimulo sonoro, no presenten ninguna modificación del contenido óseo de este elemento. Dado que los animales son estresados deberían mostrar un aumento del contenido de cinc, si bien se podría pensar que la dexametasona estuviera ejerciendo un efecto inhibidor sobre esa acción específica del estímulo. Respecto al bario y al estroncio, el aumento de su contenido óseo en los animales estresados también se observa en los individuos a los que se les administró hormonas, -220 - —— Resultados y discusion —— de modo que podemos atribuir esta modificación a la acción glucocorticoide. Además, los valores numéricos parecen indicarnos que existe una correlación entre la intensidad de la actividad glucocorticoide asociada a cada uno de esos tratamientos, y la intensidad del efecto producido sobre el contenido de estos dos elementos en el hueso. Sin embargo, esta posible correlación no puede ser aseverada ya que no hallamos diferencias significativas entre esos valores, quizás porque ya el exceso de corticosterona provocada por el estrés sea suficiente para alcanzar el “techo” en el depósito óseo de estos elementos. Hay que tener en cuenta que la propia palabra ‘oligoelemento” nos indica que su presencia en hueso es minoritaria. En consecuencia, al movemos en órdenes de magnitud mínimos, resulta fácil que una pequeña variación del estímulo provoque una saturación de estos niveles. Respecto al magnesio, observamos que su contenido se reduce significativamente en el hueso de los animales estresados y en los tratados con ACTH pero no en los administrados con dexametasona. Es obvio, por lo tanto, que esta reducción del contenido de magnesio en el hueso debe ser mediada por un factor común tanto al tratamiento estresante como al tratamiento con ACTH. Ambos tratamientos tienen en común niveles elevados de corticosterona pero, también, los elevados niveles circulantes de ACTH que resultan, en un caso, de la activación del eje Hl-LA producida en respuesta al estimulo estresante y, en el otro, de la propia dosis de ACTH administrada a los animales así tratados. De ser este factor el que modifica el contenido de magnesio, habría que considerar no sólo una acción directa de la ACTH, sino también el que dicha acción pudiera ser ejercercida a través de un elemento mediador. Sin embargo, no disponemos de ningún dato propio o bibliográfico que nos permita apoyar esta hipótesis en contra de otras opciones. La ausencia de un efecto significativo por la administración de dexametasona nos permite descartar una acción de este glucocorticoide sintético sobre dicho contenido, pero no excluye una acción propia de los elevados niveles circulantes del glucocorticoide endógeno: corticosterona, presentes tanto en los animales estresados como en los tratados con ACTH. De hecho, aun cuando en nuestro estudio se emplea la dexametasona como un análogo sintético de la corticosterona, a fin de evaluar los efectos de la acción glucocorticoide creciente de nuestros tratamientos, ambos glucocorticoides no tienen porque ejercer una acción estrictamente análoga. Por lo tanto podríamos encontrar un efecto -22! - —— Iú~trés crónico, actividad glucocorucoide y crecimiento — glucocorticoide sobre el magnesio mediado por la corticosterona (tratamientos con mido y ACTH) y no por la dexametasona. Un resultado similar ya fue encontrado al demostrar que la dexametasona, aunque sí reproduce los efectos de la corticosterona produciendo aplasia del encéfalo y de otros órganos, no se comporta de forma similar respecto a las alteraciones del tamaño celular del encéfalo. En aquel caso, para explicar estas diferencias, dispusimos de información bibliográfica en relación con la presencia en el encéfalo de distintos tipos de receptores de glucocorticoides. De lo discutido podemos entonces resumir que el efecto reductor observado sobre el contenido óseo de magnesio puede obedecer bien a una acción de la corticosterona, bien a una acción de la ACTH, lo cuai explicaría que encontremos dicho efecto en los animales estresados y en los tratados con ACTH. Este efecto, además, no es reproducido por la dexametasona, como pone de manifiesto la ausencia del mismo en los animales administrados con este glucocorticoide sintético. LLegado este punto, es el momento de acudir a los resultados referidos al contenido óseo de magnesio en los animales tratados con dexametasona y ruido, los cuales están constatando una reducción significativa de dicho contenido. Si nuestra hipótesis acerca de la identidad de los posibles mediadores del efecto reductor de este elemento en el hueso friese cierta, no deberíamos encontrar una alteración significativa de este parámetro por el tratamiento conjunto. La razón es lógica, ya que si bien los animales de este tratamiento son estresados y en consecuencia sus niveles de ACTH y corticosterona aumentan respecto al tratamiento único con dexametasona, sin embargo esa estimulación del eje Hl-lA se produce estando éste flincionalmente muy deprimido como consecuencia de la administración previa de la dexametasona, la cual no ejerce acción sobre el magnesio. Ello hace que los niveles de ACTH y corticosterona en los animales del tratamiento conjunto estén en realidad muy por debajo de los basales y, por lo tanto, no mediarían por sí solos ningún efecto significativo sobre el contenido óseo de magnesio. Efectivamente así sería a no ser que, al igual que hemos observado con el cinc, se estuviese ejerciendo un posible efecto propio de nuestro modelo de estrés y ajeno a la activación del eje FINA. Esta posibilidad estaría de acuerdo con los resultados hallados en los -222 -- Resultados y discuswn -- animales estresados y en los tratados con ACTH, ya que si la reducción del contenido de este elemento friese el resultado sólo de la activación hipófiso-adrenal, deberiamos haber encontrado un mayor efecto por el tratamiento con ACTH que por el estrés, dada la superior activación hipófiso-adrenal que ocasiona el tratamiento hormonal (mayores niveles de corticosterona y ACTH). Por el contrario no observamos una correlación positiva, lo cual refuerza la hipótesis planteada y asi, en los animales estresados, la actuación de ese posible efecto propio del mido, previo a la activación del eje 1-IRA, junto con el debido a dicha activación conseguiría que no se apreciasen diferencias significativas entre ambos grupos de tratamiento, tal y como muestran los resultados. Desde esta perspectiva podríamos pensar que la explicación de los efectos encontrados en cada uno de nuestros grupos experimentales friera la siguiente: En los animales estresados la reducción del contenido de magnesio seria un efecto debido por un lado a la moderada activación hipófiso-adrenal (corticosterona o ACTH) y por otro a una acción propia del mido, mediada o por otro eje endocrino o por otros factores desencadenados a nivel del SNC, punto de integración del estímulo. En los animales tratados con ACTH los mediadores de dicha reducción serían unicamente la activación hipófiso-adrenal vinculada a la ACTH o a la corticosterona ya que no hay activación del SNC. Dicha activación hipófiso-adrenal, al ser mayor en el caso de la ACTH que en el ruido, suple el efecto sumativo de ambos factores en los animales estresados igualando ¡os resultados. Por su parte, la administración de dexametasona no presenta activación del SNC, inhibe el eje 1-IHA y como glucocorticoide no reproduce el efecto de la corticosterona sobre el magnesio por lo cual no modificaría el contenido de este elemento. Mientras que si a los animales además de administrárseles dexametasona se les expone al mido seria el efecto propio de este estimulo el responsable único de la reducción significativa de magnesio que presentan. A este respecto cabe mencionar que el aumento del contenido de cinc en el hueso seria también el resultado de un efecto propio del ruido pero a diferencia del magnesio es un efecto al que no se suma el de la activación del eje HHA, motivo que explica que dicho -223 - -— Iúqrés crónica, actividad glucocorticoide ~ crecimiento — aumento sólo se observe en los animales estresados. En resumen, sólo el contenido óseo de uno de los cuatro elementos citados, el cinc, no parece verse afectado por la acción de los glucocorticoides pero si por algún factor desencadenado por la estimulación nerviosa del ruido. Para el bario, el estroncio y el magnesio podemos hablar de un efecto por la activación hipófiso-adrenal y para el cual, en el caso del magnesio, la dexametasona no se comporta como un análogo sintético de la corticosterona. Además, sobre el contenido de magnesio constatamos también la acción de un efecto propio de nuestro modelo estresante descrito ya para el cinc. Quizás sea éste el momento adecuado para aclarar conceptos acerca de cuando nos referimos a un efecto especifico del ruido, considerando a éste como un modelo de estrés ambiental, y cuándo el efecto puede ser interpretado como un marcador de estrés inespecífico. Es necesario hacer una aclaración de estos términos porque puede ocurrir que no sean utilizados con el mismo sentido desde la perspectiva de antropólogos fisicos y fisiólogos. Conviene recordar que el término estrés, y su definición, surge en el campo de la Fisiología y es acuñado por Cannon y Selye partiendo del concepto de homeostasia de Claude Bernard. El término estrés se refiere a cualquier cambio ambiental o del medio interno que desencadena una respuesta fisiológica neuroendocrina croncreta, espeelfica y bien conocida, cuyo resultado final y sus efectos crónicos son mediados por glucocorticoides (ver Introducción}. Por consiguiente, cualquier alteración que guarde relación dosis-efecto con los niveles circulantes de glucocorticoides (fundamentalmente endógenos) podrá ser considerado marcador de estrés inespecífico pues será reproducido por cualquier agente capaz de estimular la producción endógena de estas hormonas. Sin embargo, efectos como el demostrado para el cinc, que se encuentra en un modelo de estrés concreto (mido) pero que no parece ser mediado por la actividad del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal, pueden ser considerados marcadores específicos de ese agente estresante. De la relación de elementos minerales cuyo contenido es alterado por -224 - —— Resultados ~vdiscuston —— los tratamientos, el único que no ha sido aún considerado es el calcio. El contenido óseo de este mineral sólo resulta alterado significativamente en el tratamiento conjunto con dexametasona y estres. De estos resultados se desprende que dicha alteración no puede atribuirse a un efecto propio o exclusivo del mido, ni al nivel de activación del eje HHA encontrado en los animales estresados o administrados con ACTH. Tampoco la acción glucocorticoide de la dexametasona, por si sola, produce efecto pero éste si se manifiesta cuando a la dexametasona se adiciona algún factor contenido en el estrés. Una explicación a este último dato podría encontrarse en que el umbral de acción glucocorticoide necesario para modificar el contenido de calcio en el hueso sea muy alto y no se consiga un efecto significativo hasta que al nivel de dicha acción mediada por la dosis de dexametasona se le añada la pequeña pero significativa hipersecreción de corticosterona (Tabla 3). De hecho, los niveles de calcio son mayores también en los animales de los restantes tratamientos que en los controles, aunque estadisticamente no significativos. Esto nos lleva a planteamos los conceptos de distinta sensibilidad y tolerancia de los elementos minerales frente a la intensidad de la acción glucocorticoide, como hicimos con otros parámetros. Así observamos que el hueso presenta una modificación de su contenido en bario, estroncio y magnesio ya a la intensidad del tratamiento estresante, mientras que sólo cuando se alcanza la debida al tratamiento conjunto de exposición al mido y administración de dexametasona, encontramos una alteración significativa del contenido de calcio. Nosotros pensamos que este hecho podría atribuirse a que el calcio, a diferencia de los otros iones mencionados, es un elemento sobre el que recaen numerosos sistemas reguladores que posibilitan un control muy estrecho de sus niveles circulantes, lo que dificultarla encontrar una alteración significativa de sus concentraciones en hueso a bajas intensidades de acción glucocorticoide. Podríamos considerar que hay una protección fisiológica frente a la homeostasis del calcio. Respecto al margen de saturación de respuesta, si bien el bario y el estroncio son como vemos constituyentes del hueso muy sensibles, también son los que -225 - —— ít’strés crónica, acti~’idad glucocorticoide ~vcrecimiento — presentan un margen de saturación menor pues es a la intensidad del tratamiento estresante cuando estas dos variables muestran su máxima alteración. Diferente es el caso del magnesio, sobre cuyo contenido en el hueso la dexametasona no ejerce acción, en consecuencia deberla estudiarse la respuesta frente a una mayor intensidad del estrés o una mayor dosis de ACTH. Respecto al calcio, nada puede decirse acerca de si su margen de saturación es grande o no, ya que para ello necesitaríamos exponer a nuestros animales a tratamientos de superior intensidad glucocorticoide que la representada por el tratamiento conjunto de dexametasona y ruido Recordemos que era a la intensidad de la acción glucocorticoide asociada al tratamiento conjunto a la cual los animales mostraban una modificación significativa del contenido de calcio en el hueso. Observamos, por lo tanto, un diferente comportamiento de los elementos minerales evaluados ftente al grado de actividad hipófiso-adrenal de los tratamientos. El cinc no es sensible a esta activación mientras que el estroncio, bario y magnesio demuestran gran sensibilidad a la misma. El calcio sí es susceptible pero a partir de una intensidad de actividad glucocorticoide mayor (grupo DxSt). Respecto al grado de activación en el que se saturan los efectos, es muy bajo para el estroncio y el bario (que han alcanzado su efecto máximo ya en los animales estresados) y, por las circunstancias comentadas, no puede establecerse para el magnesio y el calcio precisándose niveles de activación adrenal o intensidad del estímulo superiores a los utilizados por nosotros. Hasta ahora hemos discutido nuestros resultados desde el punto de vista de los mecanismos que los provocan y que están presentes en los diferentes tratamientos, desde la activación hipófiso-adrenal y la actividad glucocorticoide hasta los efectos que podrían ser considerados específicos del estímulo (ruido). Pero, como hemos podido observar, no todos los constituyentes muestran variaciones de su contenido en el hueso en el mismo sentido. Independientemente de su mayor o menor sensibilidad a los tratamientos, nuestros resultados indican que mientras el contenido en el hueso de calcio, bario y estroncio aumenta, el de magnesio disminuye. Por lo tanto, ahora intentaremos justificar y dar sentido a esos cambios desde una perspectiva fisiológica. En conjunto podríamos sugerir que se está produciendo por el efecto de los tratamientos un proceso de mineralización ósea, ya que los cambios observados en el -226 - —— Resuhados y discuswii —— contenido mineral del hueso son mayoritariamente de aumento a excepción del magnesio. Esta mayor mineralización es acorde con el estudio de Leblondel y AHajo (1988a) al mostrar también un aumento del contenido de minerales específicos trás la administración de glucocorticoides. Vamos, en primer lugar, a tratar de discutir a qué obedece el aumento generalizado del contenido mineral del hueso mostrado por nuestros resultados. De los tres constituyentes minerales (calcio, estroncio y bario) cuyo contenido en el hueso aumenta, es evidentemente el calcio el que más contribuye a esa superior mineralización, por ser el elemento mayoritario en el hueso. Este hecho, y un conocimiento más amplio de los mecanismos que regulan su homeostasis, son los motivos por los que vamos a discutir con mayor profundidad los resultados a él referidos. El mantenimiento constante de los niveles de calcio circulante en sangre depende de un equilibrio muy fino, lo que implica una dependencia entre las acciones reguladoras que se ejercen en tres puntos: absorción a nivel intestinal, excreción a nivel renal y reserva a nivel del esqueleto, requiriéndose por lo tanto una estricta coordinación que las ligue. Varios autores han constatado que la administración de glucocorticoides ocasiona una disminución de la absorción intestinal de calcio (KIe¡n y cols., 1977; Hanh y cols., 1981) y un aumento de su excreción urinaria (Suzuki y cols., 1983; Prununel y cok., 1991). Se interpreta que es a través de estas acciones sobre la absorción intestinal y la excreción urinaria del calcio, como los glucocorticoides provocan una reducción de la calcemia (Reid, 1989). Nuestros resultados aportan a este respecto otro dato y es el aumento del contenido de calcio en el hueso por acción de estas hormonas. En este sentido, nuestros resultados están apoyados por los de Leblondel y Allain (1988a) los cuales constatan también un aumento del contenido de calcio en el hueso por la administración de glucocorticoides. Este aumento de los niveles de calcio que nosotros encontramos en el hueso podría estar mostrándonos quizás un efecto propio de estas hormonas sobre la homeostasis del calcio, que no ha sido señalado hasta ahora, de forma que la reducción de la calcemia observada trás la administración de glucocorticoides no sólo obedecería, como hemos mencionado, a una disminución de la absorción intestinal de calcio y a un incremento de su -227 - —— lis’trés crónico, actividadglucocorticoide y crecimiento — excreción urinaria, sino también a un posible efecto sobre el hueso provocando una calcificación del mismo. Sin embargo, ha sido clasicamente aceptado que la reducción de la calcemia provocada por los efectos de los glucocorticoides sobre la absorción intestinal y excreción renal debía estar compensándose por la salida de calcio desde el hueso, con la consiguiente desmineralización y/o reabsorción del mismo (Reid, 1989). bbviamente dicha salida compensatoria no era del todo eficaz ya que la hipocalcemia se detectaba. Nuestros resultados demuestran que, contrariamente a lo que se creía, esta acción descalcificadora es mediada por los glucocorticoides aunque puede estar siendo desencadenada por otros factores. Recordemos a este respecto las acciones de la hormona paratiroidea (PTH) y de los metabolitos de la vitamina D. De una forma resumida, veíamos que la secreción de la hormona paratiroidea se incrementaba en respuesta a una caida de la ca]cemia, estimulando entonces la actividad osteoclática y, por consiguiente, la reabsorción de hueso y la movilización de su contenido de calcio. Además, la hormona paratiroidea trata de corregir los efectos hipocalcémicos de cualquier factor (por ejemplo, los glucocorticoides) también a nivel intestinal y renal por sus demostrados efectos (ver Introducción> a estos niveles, tanto directos como mediados por el calcitriol (metabolito más activo biológicamente de la vitamina D). Por consiguiente, los resultados relativos al contenido óseo de calcio observados en nuestros animales, nos conducen a pensar que la acción de los glucocorticoides aumentando el contenido de este elemento en el hueso y la acción de reabsorción ósea desencadenada por otros factores endocrinos (entre ellos, la PTH y los derivados de la vitamina D) están estableciendo entre si una relación de competencia. Efectivamente, si el exceso de glucocorticoides circulantes es moderado, el aumento óseo de calcio mediado por los mismos es pequeño y puede ser contrarrestado por los restantes factores hormonales descritos, los cuales se han disparado frente a la hipocalcemia. En ese caso, el contenido de calcio en el hueso puede no ser alterado, ni en un sentido ni en otro, aunque la hipocalcemia debida a los efectos sobre el intestino y riñón se produzca. Ello explicada La ausencia de alteraciones en Los tratamientos con mido, ACTFI e incluso dexametasona. 228 - —— Resultado.s’v discusian —— Sin embargo, puede existir un límite superado el cual el exceso de glucocorticoides si provoque un aumento significativo de calcio en el hueso haciendo ineficaz la regulación por la PTH y la vitamina D. En nuestro caso, dicho limite lo representaría el tratamiento conjunto con dexametasona y ruido. Esta hipótesis tiene un sentido adaptativo claro para el animal por el cual, frente al exceso moderado de glucocorticoides en situaciones cotidianas de estrés inespecífico, habría una protección osea. En consecuencia, el calcio se encuentra bajo un control homeostático tan fino, que sólo va a poder actuar como marcador de estrés ambiental inespecífico en situaciones en las que él mismo adquiere unos niveles que superan lo predecible. Excepción a esto seria el caso en que el estrés consistiese en alguna de las diversas patologías que tienen reconocidos efectos descalcificadores. Pero en este caso no se puede hablar de estrés ambiental inespecifico y los mediadores de las acciones serían ajenos a los glucocorticoides. Por otra parte, nuestros animales presentan además uña pérdida de masa ósea tal y como se deduce de los resultados de peso de sus cráneos. Parte de estos datos, concretamente los referidos a los animales estresados, aparecieron en la Tabla 18, pero entonces el motivo por el que se pesaron los cráneos obedecía a otra finalidad diferente y concernía exclusivamente a dicho grupo de tratamiento. Sin embargo, ya que obtuvimos resultados significativos para el grupo de animales estresados procedimos en dicho momento a evaluar también ese parámetro en los restantes grupos experimentales aun cuando no se mostrasen en dicha tabla. Es ahora cuando, desde otra perspectiva, reflejamos esos resultados para todos los grupos de animales. Como podemos observar, nuestros animales presentan una disminución del peso del cráneo tras la exposición de los mismos a los diferentes tratamientos. Este efecto guarda además correlación con la intensidad de la actividad glucocorticoide de cada tratamiento. En relación a este resultado podríamos objetar que tal disminución fuese en realidad consecuencia de un menor tamaño de los huesos craneales. Esto podría ser cierto para los animales de los tratamientos en los que se manifiesta claramente una reducción generalizada del tamaño del cráneo. Sin embargo, la única interpretación del menor peso craneal de los animales expuestos al mido es la reducción de la masa del hueso, ya que la moderada intensidad del tratamiento con ruido causa, como vimos en su momento, una reducción poco significativa del -229 - —— Ji1¶trés crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento — crecimiento del cráneo. En los restantes tratamientos de superior intensidad glucocorticoide, la reducción del peso del cráneo responde obviamente a una reducción de su crecimiento, pero también a una reducción de la masa de hueso. Decimos esto último porque si así sucede ya a la moderada intensidad del estrés, es lógico pensar en ese mismo efecto a una actividad glucocorticoide más intensa. PESODEL CRANEO(g) Grupo mn + d.s. Significación Co 2.45+0.15 bede Str 2.26+0.13 ade Ac 2.17+0.16 ale Dx 2.00 + 0.07 abc DxStr 1.91+0.10 abc Grupo experimental F (4,37) = 23.38 pS 0.001 Tabla 25: Peso del cráneo. Los datos indicanla media+ desviaciónestándar. Los superíndicesrepresentandiferenciassignificativasentrelos distintos grupos experimentales: a= Co, h= Str, c= Ac, d= Dx y c= DxStr. En este sentido, estudios de otros autores relacionan los niveles suprabasales de glucocorticoides, tanto en situaciones fisiológicas como farmacológicas, con un balance negativo de calcemia y con la incidencia de pérdida de masa ósea (Lukert y Ra¡sz, 1990; Niewochner, 1993; Olbricht y Benker, 1993; Seenian, 1993). Sin embargo, esta pérdida de masa del hueso no se debe, a la vista de nuestros resultados, a una mayor desmineralización del mismo. Este hecho nos conduce a pensar que obedezca a una acción inhibidora de los glucocorticoides sobre la formación de hueso, tal y como exponen Hughes- Fulford y cok. (1992). Es decir, una acción reductora de los glucocorticoides del componente celular del tejido óseo, responsable de dicha formación (Deínpstcr, 1989), y no sobre la matriz mineral. -230- —— Resultados y discu,won —— Evidentemente estamos moviéndonos en el terreno de la especulación. Sin embargo, lo importante de esta suposición estriba para nosotros en que constituye una advertencia acerca de que una interpretación más cercana a la realidad de lo que está sucediendo en el hueso pasa por considerar, cuando se dispone de este tipo de resultados, no sólo acciones sobre el componente mineral sino también sobre el componente celular del tejido óseo. Por consiguiente nuestros resultados, al hacer partícipe al componente celular del hueso en las posibles alteraciones de la cantidad de masa ósea, están cuestionando el uso, ampliamente extendido, que se hace de los conceptos “masa ósea” y “mineralización”. Habitualmente se interpreta una disminución de la cantidad de mása ósea como resultado únicamente de una reducción de la mineralización del hueso. Se descarta así que una pérdida de hueso pueda obedecer a una reducción del componente órganico (celular), al mismo tiempo que el componente residual esté mineralizándose en exceso. Obviamente tal situación conlíeva una patología clara ya que la pérdida de masa ósea coincidiría con una menor elasticidad y una mayor dureza del hueso que lo harian más quebradizo o frágil. Desde este punto de vista se entiende que nuestros resultados y los de Leblondel y Allain (1988a) entren en contradicción con los de ciertos estudios (Gordon y cois., 1992; Kotan¡emi y cok., 1993; Lan y cok., 1993). En esos trabajds también se relaciona el aumento de los niveles circulantes de glucocorticoides con una reducción de la cantidad de masa ósea, pero dicha alteración es finalmente interpretada por los autores como una reducción del componente mineral del hueso o desmineralización. Esos resultados se obtienen a partir del estudio de parámetros tales como la densidad ósea o el peso de las cenizas, pero nunca a partir de la cuantificación de elementos minerales concretos cuyo contenido en el hueso pudiera resultar afectado. Vemos así que los autores aplican sin más ese concepto por el cual una reducción de la cantidad de masa ósea conlíeva de forma inequívoca una disminución del contenido mineral. Nuestros propios datos han constatado que no siempre este supuesto es cierto, hasta el punto de que lo observado es, por el contrario, un aumento de la mineralización asociada a pérdida de masa ósea. A esta divergencia de resultados contribuye también el que los autores, en base a esa asociación entre pérdida de masa ósea y desmineralización, hayan considerado que los mismos parámetros son válidos para medir ambas pérdidas. -231 - —— itstrés cronico, actividad glucocorticoide y crecimiento — Por el contrario, nuestros resultados han puesto de manifiesto que el empleo de parámetros indirectos puede no reflejar con exactitud lo que está sucediendo en tales situaciones con el componente mineral del hueso. De esto último se deriva, pues, otra advertencia importante y es el hecho de que siempre que se desee conocer si se ha producido una modificación del componente mineral, habremos de tener en cuenta además de los niveles de calcemia y parámetros relacionados con la masa ósea, el contenido real de constituyentes minerales específicos, esencialmente del calcio, tal y como nosotros y otros autores realizamos, sin olvidar el control de su incorporación y excreción del organismo. Es en este sentido, al medir las concentraciones en el hueso de ciertos constituyentes minerales en situaciones de elevados niveles circulantes de glucocorticoides, en el que nuestro estudio resulta novedoso. A este respecto queremos comentar la dificultad que hemos tenido para encontrar, durante la revisión bibliográfica, trabajos que persiguieran hallar explícitamente una relación entre elevados niveles circulantes de glucocorticoides y el contenido en el hueso de elementos minerales concretos. Más todavía aplicados a roedores o en animales de experimentación. La generalidad de los estudios con animales en los que sí se mide el contenido en el hueso de constituyentes minerales específicos se desarrollan mayoritariamente en un contexto nutricional, referido al consumo de dietas suplementadas con diferentes elementos minerales y su efecto sobre diversas variables, entre ellas el estado del hueso (Price y cok., 1986; OrwoII, 1992; Kirn y Firman, 1993; Lawson y cok., 1993). En estos trabajos, aun cuando se cuantifican elementos minerales concretos, no se establece una relación de su contenido en hueso con variaciones en los niveles de glucocorticoides u otros parámetros hormonales, ya que además en ellos las condiciones nutricionales a las que se exponen los individuos se desmarcan de un posible estrés nutricional. Obviamente con estos precedentes la interpretación de nuestros resultados resulta dificil por carecer de una base firme sobre la que apoyamos a la hora de su comparación. Sin embargo, esa misma carencia nos permite una visión muy amplia para sugenr sin prejuicios, aunque con la debida precaución, hipótesis que puedan dar respuesta a nuestros resultados. -232 - —— Resultados y discusma —— Así, consecuentemente con todo lo dicho hasta el momento, podemos decir que el aumento del contenido óseo de calcio que observamos no obedecería a una estimulación por los glucocorticoides de la formación de nuevo hueso y su posterior mineralización, sino que seria el resultado de una captación anormalmente excesiva de calcio por un tejido ya formado, o incluso en fase degenerativa por inhibición de su formación, como demuestra el menor peso de los cráneos. En consecuencia, la hipocalcemia subyacente al exceso de glucocorticoides circulantes es reflejo no sólo de sus acciones reduciendo la absorción intestinal y aumentando la excreción urinaria de calcio, sino también de una captación de este mineral por el hueso. Los mecanismos que tratarían de corregir la calcemia movilizando el calcio del hueso entrarian en competencia con esta última acción de los glucocorticoides, dependiendo el nivel de calcificación ósea del equilibrio en este proceso. En tal caso cabe preguntarse, en este momento, si el ión magnesio desempeñarla alguna función en relación a este mayor contenido de calcio en el hueso, Esta pregunta se nos plantea en vista de que, por el contrario, el contenido de magnesio es el único que disminuye y de que es sabido la estrecha asociación entre ambos iones• en numerosos procesos fisiológicos, desempeñando acciones antagónicas. Este antagonismo nos permite pensar en la posibilidad de que los iones calcio se incorporen al hueso al intercambiarse por iones magnesio de la matriz ósea ya formada. La discusión tratamiento a tratamiento de nuestros resultados no apoya rotundamente esta posibilidad. Resumidamente y dejando en un segundo término todas las suposiciones que han sido planteadas y para las cuales no tenemos una respuesta concluyente, lo que los resultados manifiestan sin lugar a duda es un aumento generalizado del contenido mineral del hueso por nuestros tratamientos experimentales. Nuestros resultados responden así al Objetivo 3d, de tal modo que podemos concluir que las alteraciones sobre el esqueleto debidas a una actividad glucocorticoide intensificada, bien por si sola o bien conjuntamente con otros f~ctores, no sólo son detectables en su fisonomía al afectar a su crecimiento, sino que trascienden a ésta para comprometer también al metabolismo óseo. Asimismo, desde una perspectiva antropológica, nuestros datos manifiestan la existencia de dos constituyentes minerales, cinc y magnesio, -233 - —— tlvtrés crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — cuya alteración de su contenido en hueso se relaciona con un efecto específico del ruido y, por consiguiente, se convierten en marcadores de la exposición a ese agente ambiental. Diferente es el caso del estroncio y del bario, los cuales sí pueden considerarse marcadores de estrés inespecífico desde el mismo momento en que la variación que experimentan sus niveles en hueso está mediada por la activación glucocorticoide, denominador común a cualquier estímulo estresante. También el calcio se conviene en un marcador de estrés inespecífico pero sólo a intensidades del estímulo que dificilmente se producen en la naturaleza por lo que, desde un punto de vista práctico, no resulta un indicador eficaz. En relación precisamente con el cinc, vamos a continuación a retomar los resultados a él concerniente para discutirlos desde otro punto de vista. Ya vimos que su concentración en el hueso se elevaba sólo en las ratas expuestas al ruido lo que nos conducía a pensar, como hemos dicho, en un efecto asociado a nuestro modelo de estrés y no relacionado con una posible acción glucocorticoide. Sin embargo, su significado biológico resultaba desconocido para nosotros. Desde una perspectiva antropológica, los elevados niveles de cinc en el hueso de estos animales pueden contribuir a matizar la interpretación que tradicionalmente se ha hecho de la presencia de este elemento en los restos óseos de poblaciones humanas. La investigación antropológica sobre la subsistencia de los grupos de población, se sustenta en el hecho de que ciertas categorías de alimentos difieren entre sí en aspectos específicos de su composición, que aparecen reflejados en la composición química de los huesos. Particularmente, un elevado contenido de cinc en los mismos se ha asociado al consumo de dietas ricas en proteínas (dietas cárnicas) (Bu¡kstra y cok., 1989). Encontrar una mayor cantidad de este elemento en el hueso de los animales estresados implicaría, según lo dicho, que habrían ingerido unas concentraciones de cinc superiores a las de ¡os animales de los otros tratamientos, y no fue ese el caso. Todas nuestras ratas consumieron el mismo tipo de dieta (carente de aditivos y con una composición equilibrada de todos ¡os nutrientes necesarios). Pero ¿podria suceder que, aun ingiriendo la misma cantidad de alimento, el ruido ejerciera una acción sobre la absorción intestinal y/o reabsorción renal de ese mineral especifico favoreciendo su incorporación/retención en el organismo?. En esta cuestión se halla la razón por la que esa interpretación que hacen los investigadores que trabajan sobre restos óseos puede no ajustarse a la realidad y es que ellos no tienen acceso a otros puntos de control de los niveles circulantes de nutrientes más que el propio resto óseo de su estudio. Por el contrario, los fisiólogos y otros investigadores -234 - —— Resultados y discus¡on —— podemos cuantificar no sólo la ingesta de alimento sino también su absorción intestinal y su excreción urinaria, además de la deposición de iones en el hueso, O bien conocer si hay una alteración de los parámetros reguladores de dichos procesos, ampliamente conocidos y de caracter endocrino. La implicación de los procesos de absorción intestinal y excrección renal, así como de su regulación endocrina, a la hora de discutir la presencia en el hueso de elementos minerales debe, por consiguiente, ser tenida en cuenta para explicar el resultado obtenido. Sin olvidar, además, las interacciones de carácter sinérgico o antagónico que se establecen entre elementos, no sólo durante la etapa de absorción intestinal sino también durante la fase de deposición en los tejidos. A este respecto, Larsen y Sandstrflm (1992a) observan en ratas que la absorción de cinc se reduce después de la adición de calcio a la dieta. Estos mismos autores (Larsen y Sandstr¿im, 1992b) constatan una correlación inversa entre la absorción intestinal de calcio, hierro y cobre, y los niveles de cinc en el fémur; mientras que por el contrario fue positiva entre este último elemento y el fósforo (Larsen, 1993). En nuestro caso, como ya hemos dicho, la relación que se establece entre la alteración del contenido de cinc en el hueso y la exposición a un factor ambiental como el mido, no resulta aparentemente mediada por la actividad glucocorticoide. Esto hace que dicha modificación sea un efecto muy específico de la exposición a este modelo de estrés, que podría estar ejerciéndose sobre esos puntos de control de las concentraciones de este ión. De forma que, aun ingiriendo la misma concentración de cinc que los animales de los otros tratamientos, de favorecerse su absorción intestinal y/o reducirse su excreción renal se produciría un aumento de sus niveles circulantes y ello conduciría, a su vez, a una mayor deposición en el hueso para tratar de mantener unos niveles basales de cinc en sangre pero no puede descartarse, con los datos disponibles, que la acción no sea exclusiva sobre el hueso reduciéndose sin más su concentración en sangre. Tampoco podemos aventurar qué mecanismo implicado en el mido, y ajeno a la activación hipófiso-adrenal y a la actividad glucocorticoide, produce este efecto. A este respecto, si bien nosotros no hemos evaluado en el presente trabajo la absorción o excreción de cinc, sabemos que los mecanismos reguladores de estos procesos son, como hemos dicho, de naturaleza endocrina y que, a su vez, se hallan regulados a nivel central hipotalamicamente. Su alteración por el mido obedecería pues a que la -235 - —— F.’trés crónic~,, actividad glucocorticoide y crecimiento — integración nerviosa del estímulo disparase la función hipotalámica como hace con el eje HHA. Pero, entonces, el desencadenamiento de cualquiera de esos mecanismos en el hipotálamo estaría normalmente relacionado con la actividad de ese eje y, sin embargo, los cambios observados en el contenido óseo de cinc no demuestran dicha relación. En cualquier caso, el hecho es que la exposición del sujeto a mido modifica especificamente el contenido óseo de cinc por el procedimiento que sea partiendo de una dieta estándar que es igual para todos los animales. Luego esto mismo podría ocurrir entre dos poblaciones humanas con el mismo consumo dietético. Por otra parte y con independencia del mecanismo mediador de esta modificación específica del contenido de cinc por la exposición a este factor ambiental, su importancia estriba, desde el punto de vista de la Antropología y ciencias afines, en que se convierte en un marcador indeleble de la exposición a este agente en los restos óseos de poblaciones humanas o animales y, por consiguiente, en una referencia para los investigadores que estudian estos restos, proporcionándoles una valiosa información adicional a la hora de caracterizar las poblaciones en estudio a las que pertenecen dichos restos. No es nuevo que la constitución química del hueso es un registro de señales acerca del ambiente en que un individuo se halla inmerso, habiéndose empleado en determinaciones cronológicas, en el estudio del proceso de fosilización o en el de ambientes y climas pasados (Prfre, 1989). Por lo tanto, el hueso al formar parte en un momento dado de un ser vivo, estuvo influido metabolica, hormonal, nutricional y bioquimicamente por un organismo que, a su vez, respondió a un ambiente ¡bito. Sin embargo puede haber otros estímulos ambientales, además de la dieta y el ruido, que reproduzcan este efecto. No queremos concluir aquí la discusión de estos resultados sin exponer otra posible interpretación de los mismos, aunque con un planteamiento alejado de nuestros objetivos. Son numerosos los estudios que han establecido la contribución de ciertos elementos, especialmente sodio, potasio, calcio y magnesio, a la etiología, prevención y tratamiento de la hipertensión arterial. Uno de estos estudios (Leblondel y Allain, 1988b) constata la existencia de modificaciones de las concentraciones tisulares de diversos elementos en ratas espontaneamente hipertensas (SHR). Otros investigadores inciden en esta misma idea a través de estudios que muestran como la deficiencia de calcio, magnesio o cobre en la dieta conduce a un aumento de la presión arterial en ratas (Altura y cok., ¡984; SehícUTer y cois., -236 - —— Resuilactos y discusion —— 1984; Medeiros, 1987) o bien destacan el efecto preventivo de la hipertensión que posee el consumo de dietas suplementadas con calcio o potasio (Sato y cok., 1991; Semafuko y Morris, 1991). A pesar de que todos estos datos convergen en la existencia de una relación entre el balance de ciertos elementos y la hipertensión arterial, se desconoce cuál o cuáles son los mecanismos por ¡os que esta relación se hace efectiva, aun cuando todo parece apuntar hacia una alteración de su metabolismo (Parrot-Garcia y McCarron, 1984; McCarron, 1989; Pernot y cols., 1991) y, por lo tanto, quedarían implicados en mayor o menor grado todos aquellos factores que convergen en él. Estos antecedentes, los resultados aquí expuestos relativos a una modificación de la homeostasis de algunos de los elementos analizados y el conocimiento por estudios previos de que nuestros tratamientos experimentales generan hipertensión arterial en las ratas, nos conducen a no descartar que los glucocorticoides, además de un probable efecto potenciador de las acciones de factores presores, fueran también responsables de los efectos hipertensivos observados en nuestros animales a través de la modificación del metabolismo de ciertos elementos con una función crítica en la fisiología cardiaca y vascular. Como vemos, este esbozo de discusión se aleja de los objetivos de esta Tesis, aunque por su relación con otra de nuestras áreas de investigación y por su interés en un futuro, no hemos podido resistir la siempre atractiva tentación de “recrearse” desde nuevas perspectivas en los resultados obtenidos. 5.2. ESTADISTICA MULTIVARLANTE DE LOS CONSTITUYENTES MINERALES DEL HUESO Nuevamente acudimos a la estadística multivariante como una “herramienta” eficaz con la que caracterizar y diferenciar nuestros grupos experimentales atendiendo, en este caso, al contenido mineral de sus huesos. Indirectamente va a facilitamos el manejo de los resultados obtenidos pues, como ya hemos mencionado, su propio desarrollo conlíeva una reducción del número de parámetros originales sin que se produzca una pérdida notable de información. Por otra parte, a estas alturas de la discusión, muchos de los conceptos -237 - —— ítlvlrés crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — asociados a esta prueba de análisis estadístico nos resultan ya familiares por lo que abordaremos la discusión de estos resultados concretos de forma más directa. 5.2.1. ANALISIS FACTORIAL: ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES Una vez cerciorados de que los constituyentes minerales en estudio se hallan altamente correlacionados, procedemos a llevar a cabo este análisis. MATRIZ DE CORRELACION Ca P Mg Zn Ba Sr Fe Ca 1.00000 P -0.63860 1.00000 Mg -0.68053 0.60669 1.09000 Zn 0.04108 0.05838 -0.25528 1.00000 Ba 0.27697 -0.23626 -0.46832 -0.05955 1 00000 Sr -0.15645 0.19149 -0.13535 0.20289 0.63935 1 00000 Fc -0.41522 0.15968 0.13550 -0.09571 -032752 -001191 1.00000 Tabla 26: Matriz de correlación entre los constituyentes minerales. En la Tabla 27 se muestra la matriz factorial rotada. Podemos observar que el análisis de componentes principales conserva tres factores que conjuntamente explican el 77% de la variabilidad de la muestra. Se consigue así reducir los ocho parámetros de partida a tres con una pérdida mínima de información. -238 - —— Resultados y discusion —— MATRIZ FACTORIAL ROTADA Factor 1 Factor 2 Factor 3 Calcio -0.90990 -0.03741 0.01924 Fósforo 0.84302 0.11288 0.10359 Magnesio 0.80503 -0.22787 -0.29208 Hierro 0.43618 -0.22397 0.02806 Estroncio 0.16902 0.91096 0.20170 Bario -0.37830 0.87405 -0.13656 Cinc -0.03920 0.04271 0.98071 Tabla27: Matriz factorial rotada. Además, la matriz factorial rotada nos proporcionú información adicional al indicarnos el peso que cada constituyente mineral asigna a cada factor, de modo que el calcio, el fósforo, el magnesio y el hierro se asocian al factor 1. El estroncio y el bario lo hacen al factor 2 y, por último, el cinc al factor 3. Recordemos que los constituyentes minerales con pesos elevados para el mismo factor aparecen agrupados, y son los efectos que los tratamientos ejercen sobre ellos los que hacen posible la caracterización y diferenciación entre los grupos de individuos. Antes de iniciar la discusión de estos resultados, vamos a comentar el significado de estas agrupaciones de elementos. Observamos que al factor 1 aparecen asociados cuatro constituyente minerales: calcio, fósforo, magnesio y hierro. Este factor es el que explica el mayor porcentaje de la variabilidad muestral (3 8%), lo cual indica que los efectos por él representados son los deteminantes en mayor grado de la caracterización y diferenciación de los grupos. La relación matemática que el ACP establece entre el calcio y el magnesio asociándolos en un mismo factor, puede entenderse desde el punto de vista de que la -239- —— Estrés crónica, actividadglucocorticoide y crecimiento — actividad glucocorticoide de los tratamientos es el elemento mediador común de las variaciones que experimenta su contenido en el hueso. Ya dijimos, en el estudio univariante, que el aumento del contenido óseo de calcio es mediado por la actividad glucocorticoide si bien se requieren elevadas intensidades para conseguir un efecto estadisticamente significativo. En lo que concierne al magnesio, comentamos que en su reducción estaría implicada la activación hipófiso-adrenal (corticosterona o ACTH), a la cual se le sumaría una acción propia del ruido. Por lo que respecta a la asociación del fósforo y del hierro al mismo factor que los otros dos constituyentes mencionados, no era lo esperado por nosotros a la luz de los resultados univariantes. Esos resultados nos indicaban que nuestros tratamientos no eran capaces de ejercer ningún efecto sobre su contenido. Por consiguiente, lo más lógico sería haber encontrado al fósforo y al hierro asociados juntos en un factor diferente. Pero, quizás, lo que nos quiera indicar esta asociación es que la actividad glucocorticoide de los tratamientos de forma general se distingue por sus acciones sobre el calcio y el magnesio, y por la ausencia de ningún efecto sobre el hierro y el fósforo. Por otra parte, cuando consideremos ¡os efectos representados por los restantes factores veremos que la asociación de estos constituyentes a cualquiera de ellos resulta más inadecuado. El segundo factor extraído por el ACP lleva asociados los constituyentes minerales estroncio y bario. La extracción de este factor en segundo lugar indica que los efectos que representa contribuyen en menor medida a la caracterización de los grupos y así explica el 23% de la variabilidad de la muestra. La asociación de estos dos constituyentes a un mismo factor resulta coherente con el comportamiento similar que exhiben. Recordemos que el contenido óseo de ambos aumenta mediado por la actividad glucocorticoide sin que detectemos una acción específica debida a posibles factores contenidos en el ruido, y que ambos alcanzan ya a la intensidad del tratamiento estresante su umbral de depósito óseo. El tercer factor es el que menor pocentaje de la variabilidad de la muestra explica (1 5%), comprende un único constituyente, el cinc, que queda de esta forma destacado del resto. Ya vimos que el comportamiento de este constituyente es completamente ajeno a la acción glucocorticoide. El aumento de su contenido en el hueso es un efecto específico del mido mediado, bien por un eje endocrino diferente del eje HHA pero asimismo desencadenado por el estrés, bien por factores de naturaleza neurógena activados durante el proceso de integración del estímulo sonoro y que no somos capaces de hipotetizar. -240 - -— Resultados y d¡scuswn —— Vamos a continuación a discutir la información que se desprende de las posiciones relativas que ocupan los individuos de los diferentes grupos experimentales, las cuales se muestran en la Figura 21 a, b y c. Comenzaremos con la representación gráfica que nos proporciona mayor información y que corresponde a las posiciones de los individuos en la combinación de factores 1 y 2. Analicemos en primer lugar la distribución de los animales atendiendo a los efectos de los tratamientos sobre el contenido óseo de calcio, magnesio, fósforo y hierro, asociados todos ellos al factor 1. En primer lugar resulta obvio que, por lo ya comentado en el estudio univariante, la posición de los individuos en relación a su menor o mayor contenido de fósforo y de hierro sólo puede interpretarse como una dispersión de los mismos en respuesta a la individualidad que los caracteriza. Por el contrario, si cabe hablar de una posición de los animales condicionada por el efecto de los tratamientos sobre el contenido óseo de calcio y magnesio. Para discutir dicha posición, es importante señalar que las coordenadas del calcio son negativas para el eje factorial 1, mientras que las del magnesio son positivas para ese mismo eje. Una vez dicho ésto, observamos que podemos definir tres bandas verticales en las que se agrupan los individuos. Cada una de ellas tiene su eje central horizontal en el factor 1. En la banda de la izquierda se localiza el 60% de los individuos del grupo DxStr. Son ellos, por tanto, los que presentan los mayores niveles de calcio. Compartiendo dicha posición, encontramos un 20% de animales del grupo Str así como el mismo porcentaje del grupo Dx. Esta presencia minoritaria tiene su explicación en la propia individualidad de los sujetos en estudio. La banda de la derecha comprende el 67% de los controles que muestran asi los valores mayores para el magnesio. Nuevamente hallamos la presencia minoritaria de un 14% de animales del grupo ACTH y un 20% del grupo estrés. Por su parte, la banda central recoge la mayor parte de los individuos, señalando con dicha posición que adquieren para el calcio y el magnesio valores intermedios a los referidos. -241 - -- Estrés ciánico, actividad glucocorticoide y crecimiento — Non lota! Factor 1. VertIcal Factor 2 Variable Coordenadas 5 4 1 1.25- E A e o It 0- 2 —1.25- 6 1 CA -.910 2 P .843 3 HG .305 4 SN —.039 5 RA -.378 6 ~t .2.69 7 FE .436 2 7 3 —1.8 —1.2 EACTOR 1 2:DXST 4:AC 5:DX 7:STR Figura 21 a: Representación gráfica de la combinación de factores. -.037 .113 .228 .043 374 -Sn —.224 5 4 4 5 5 4 4 54 5 74 7 77 4 2 7 2 2 :2.1 2 2 11 1 —2.4 .6 o 3. Co 1 —— .6 1.2 -242 - -- Resultadosy discusión — Horisoetal Factor 1. Vertical Factor 3 Variable Coordenadas 4 1 5 3- 1 CA -.910 2 1’ .843 3 MC .805 4 XII —.039 5 RA -.378 6 82 .169 7 lE .436 ¡ ¡ .6 1.2 FACTOR 1 1: Co 2:DXST 4:AC 5: DX Figura 21 b: Representación gráfica de la combinación de factores. .019 .104 -.292 -981 -.137 • 202 .028 6 .7 2 3 ~1 1.5- E A e T o R :3 o- 7 7 7 7 1 2 44 7 2 2 5 4 4 $1 2$451 55 1 -2.4 —1.8 —1. 2 .6 o 7: Sm -243- -- Estrás crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — 2 Horizontal Factor 2 Vertical Factor 7 1 3 :3- o.. —3. —1.9 .425 —.475 —.95 3 variable 1. CA —.037 2 1> .113 3 HG -.228 4 EM .043 5 31 .874 6 St .911 7 rg —.224 6 E o .475 FACTOR 2 2:DXST 4:AC 5: DX 7: STR Figura 21 c: Representación gráfica de la combinaciónde factores. coordenadas .019 .104 —.292 • 981 -.137 .202 .028 1 1.5- 1• A c T O R :3 7 7 7 1 7 2 47 4 4 :i. 2 4 4 12$ 2 5 45 5 15 5 1 2 Co 1.425 .95 -244 - -— I?cxultados y discuswn Por otra parte, la imposibilidad de diferenciar espacialmente los animales de la banda central en grupos definidos está corroborando también los resultados unwariantes. Dichos resultados señalaban que en el caso del calcio sólo se observaba un aumento significativo con el tratamiento conjunto de dexametasona y estrés, mientras que, por el contrario, en el caso del magnesio el tratamiento estresante conseguía ya la máxima variación de su contenido óseo. En consecuencia, como manifiesta su posición, los animales de los grupos Str, Ac y Dx no presentan, entre si, valores muy diferentes para ambos constituyentes. Vamos a continuación a analizar la distribución de lo~ animales en función de los efectos indicados por el factor 2. Para ello hacemos un barrido desde la zona superior a la inferior de la misma representación gráfica, definiendo tres bandas horizontales. La banda superior comprende animales de los grupos Ac y Dx (57% y 60%, repectivamente), cuya posición les asigna elevados niveles de estroncio y bario. En la banda inferior encontramos el 67% de los animales controles así como dos individuos del grupo DxStr (40%) que se comportan, por consiguiente, como si fueran animales no tratados. Por último, la banda central recoge todos los individuos del grupo Str, lo cual indica que presentan valores intermedios para el estroncio y el bario. Conjuntamente con ellos aparecen mezclados animales de todos los otros grupos, si bien en un porcentaje minoritario. Esta mezcla de individuos pertenecientes a todos los grupos en la banda central confirma los datos del estudio univariante cuando encontrabamos que el tratamiento con estrés conseguía la saturación del efecto sobre el contenido óseo de estos dos constituyentes. Por lo tanto, los valores de ambos elementos difieren poco de unos a otros grupos de animales. Sin embargo, este hecho no impide que apreciemos una cierta polaridad en la distribución de los mismos atendiendo a la creciente acción glucocorticoide de nuestros tratamientos. Precisamente es en esta representación donde podíamos pensar que se manifestase más facilmente tal gradación ya que el factor 2 asocia dos constituyentes, estroncio y bario, cuyas alteraciones si resultan mediadas más claramente por dicha acción glucocorticoide. Vamos seguidamente a analizar la distribución de los individuos en la representación que combina los factores 1 y 3. Nos centraremos en la discusión de la -245 - íú’frés crónico. actividad glucocorticoide y crecimiento — disposición de los animales atendiendo a los efectos asociados al factor 3. ya que respecto al factor 1 se reproduce la distribución analizada anteriormente. Observamos que los individuos estresados se dispersan hacia la zona superior de la gráfica en el sentido indicado por el eje factorial 3. Dicha posición asigna a estos animales un elevado contenido óseo de cinc que es el constituyente que aparece asociado a dicho factor. El resto de los animales tratados quedan relegados en tomo al eje horizontal, junto con los individuos controles, lo cual señala que todos estos animales se comportan como no afectados. No se observa, por otra parte, una polaridad en la posición de estos individuos de acuerdo con la actividad glucocorticoide representada por cada tratamiento. Estos resultados confirman los del estudio univariante al concluir que los animales estresados se diferencian e identifican de manera específica por presentar elevados niveles de cinc, y que la actividad glucocoticoide no es el elemento mediador de ese aumento. Observamos de esta forma que aunque el factor 3, y por consiguiente los efectos por él representados, es el que menos contribuye a explicar la variabilidad de la muestra total, sin embargo resulta determinante en lo que concierne a la caracterización del grupo estrés. Por último nos queda analizar las posiciones de los individuos en la representación gráfica de los factores 2 y 3. Si nos fijamos en las posiciones de los mismos atendiendo al factor 2, vemos que se reproduce la distribución ya comentada anteriormente. Lo único destacable es la dispersión que muestran los animales del grupo Str hacia la parte superior de la gráfica, o lo que es lo mismo, en el sentido del eje factorial 3. Por consiguiente, la posición espacial de esos animales refleja, una vez más, que muestran un elevado contenido de cinc. En conclusión, de toda la información proporcionada por el ACP vemos que sólo dos de los grupos de animales, los expuestos al ruido y los del tratamiento conjunto, pueden caracterizarse y diferenciarse claramente del resto. En realidad, este hecho está poniendo de manifiesto, al igual que el análisis univariante, la ausencia de un patrón común subyacente a los efectos observados sobre el contenido míneral del hueso. -246 - —— Resultadas y discusion Por otra parte, teniendo en cuenta esa observación, y considerando tanto la información proporcionada por el estudio univariante como por el ACP, podemos proponer ciertas pautas en relación a como deberíamos abordar en el futuro un trabajo de estas caracteristicas con independencia de la estirpe, sexo o edad de los animales utilizados. Decimos esto último porque, a diferencia de las variables craneométricas y de aquéllas que hacían referencia a los órganos, el comportamiento diferencial que muestran los elementos minerales estudiados no guarda relación con el crecimiento sino que debería relacionarse más con efectos específicos de la actividad glucocorticoide o de la propia exposición al ruido sobre el metabolismo y, por lo tanto, representa más al patrón de acción de los tratamientos que al patrón de crecimiento característico del tipo de animal. En el diseño de esos estudios, el conjunto de elementos a evaluar puede reducirse a aquellos que son imprescindibles cuantificar en cada grupo experimental por ser ellos los que lo caracterizan. Todo ello supone una facilitación del trabajo, algo siempre deseable. En primerlugar resulta obvio que la cuantificación del contenido óseo de hierro y fósforo no permite caracterizar los efectos de nuestros tratamientos, puesto que ninguno de estos constituyentes resulta alterado. Por lo tanto, los niveles que presentan los sujetos en estudio serán una manifestación de su propia individualidad. No deben por consiguiente ser considerados como marcadores de estrés ambiental ni especifico ni inespecífico. La evaluación del contenido de bario y estroncio tampoco permite diferenciar entre silos diferentes tratamientos. Ello no obedece, a diferencia de lo que sucede con el fósforo y el hierro, a la ausencia de efecto por nuestros tratamientos, sino a que ambos minerales alcanzan un techo de su depósito en hueso a una intensidad glucocorticoide tan moderada como la representada por la exposición al ruido. Sin embargo, esa mediación por la actividad glucocorticoide de la variación de sus niveles, los hace válidos como marcadores de la exposición de individuos o poblaciones a estrés ambiental inespecifico de carácter moderado. Por su parte, la cuantificación del contenido de calcio contribuye a caracterizar y diferenciar sólo tratamientos o situaciones cuya actividad glucocorticoide adquiere intensidades elevadas, ya que es en el tratamiento conjunto (DxStr) de actividad -247- lt\tré.~ ciánico, actividad glucocorticoide 1 crecnnient(> —— glucocorticoide mayor donde encontramos una alteración de su contenido. Además, se convierte en un marcador de estrés inespecífico como dijimos para el estroncio y el bario, si bien sólo en situaciones en las que sus niveles alcanzan una magnitud tan elevada que resultan altamente improbables en la vida cotidiana del sujeto. La medida de los niveles óseos de magnesio contribuye asimismo a caracterizar nuestros tratamientos. Sin embargo no podemos determinar, con nuestros datos, si dicha caracterización puede extenderse a situaciones o tratamientos de intensidad glucocorticoide mayor que la representada por la administración de ACTH, ya que intensidades superiores como la correspondiente a la administración de dexametasona no causo efecto alguno. En cualquier caso, el contenido de magnesio en el hueso se convierte en un marcador de estrés ambiental inespecífico al ser mediada su variación por la actividad hipófiso- adrenal. Además, al observarse un efecto propio del ruido sobre su contenido, también puede ser considerado como un marcador específico de la exposición de individuos o poblaciones a ese factor ambiental. Por otra parte, el contenido óseo de cinc se relaciona ampliamente con el consumo de dietas ricas en un aporte cárnico y, consecuentemente, se emplea como un indicador óseo de dicho consumo. A la vista de tal consideración no excluimos que tanto los niveles en hueso de cinc como de magnesio puedan ser considerados como marcadores específicos de otros factores que permanecen aún sin analizar y cuya incidencia deberá ser tenida en cuenta a la hora de explicar la variación de estos u otros constituyentes en el hueso. -248 - ¡ 1 ¡ E Y. DISCUSION GLOBAL E E E E y. DISCUSION GLOBAL La estimulación directa con mido produce un aumento de los niveles circulantes de corticosterona, lo cual pone de manifiesto una activación del eje Hl-lA que afecta, una vez producida la integración sensorial del estímulo, a todos y cada uno de sus niveles: hipotálamo, hipófisis y glándulas adrenales. Esta activación corticoadrenal generada por el estrés no consigue modificar significativamente una serie de parámetros de carácter general o global, tales como la ganancia de peso de los animales y su evolución temporal, los depósitos de grasa subcutánea, la ingesta absoluta y relativa, y las dimensiones corporales. Estos resultados no invalidan un efecto sistémico significativo de la mayor corticosterona circulante en este modelo de estrés, que nosotros mismos corroboramos en estudios previos al encontrar en los animales expuestos al ruido una reducción del contenido hepático de glucógeno (Velasco, 1990; Alano, 1991), sino que vienen a indicarnos que la activación corticoadrenal por el ruido no es suficiente para generar una repercusión significativa sobre el crecimiento global del animal, lo cual redunda en el carácter moderado de nuestro modelo de estrés. Efectivamente, la intensidad del modelo estresante utilizado es moderada, motivo por el cual no podemos hablar de acciones generalizadas pero, cuando profundizamos en nuestro estudio y nos circunscribimos al nivel de los compartimentos del animal, encontramos que la activación corticoadrenal generada por el estrés sí consigue una reducción del crecimiento de los órganos y del cráneo de los animales. Esta reducción, aun cuando moderada, confirma que efectivamente hay una repercusión y que si no se manifiesta en el animal es porque esos efectos quedan diluidos en la totalidad del individuo. Esa acción glucocorticoide sobre el crecimiento se traduce en el caso del encéfalo en aplasia y atrofia de sus células, con la consiguiente reducción de su peso. Además, encontramos que ese efecto atrófico sobre el encéfalo no sólo responde a la actividad -249 - -. lf«rés crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — glucocorticoide, como lo indica el que se reproduzca en los restantes tratamientos, sino también a una acción que resulta de la propia integración sensorial del ruido y que se manifiesta cuando a los animales se les estresa después de administrárseles dexametasona. El corazón y el riñón de los animales estresados muestran una reducción significativa de su crecimiento únicamente por efectos aplásicos. La ausencia de atrofia de las células de estos dos órganos es una manifestación más de la moderación de los efectos del modelo estresante utilizado, pero también es indicativo de unos órganos cuyo crecimiento ha alcanzado a esta edad de los animales un grado de estabilidad tal que resulta poco susceptible a ser reducido. Esas circunstancias explican que el peso del corazón y del riñón no se reduzca de una forma significativa. A ellas debe sumarse, en relación al corazón, un efecto hipertrófico que se detecta claramente en los animales expuestos al ruido tras la administración de dexametasona. Esta hipertrofia del corazón se debe a la activación neurógena crónica de la exposición al estrés y posee una finalidad bien definida, relacionada con la elaboración de una respuesta de “huida o lucha” del animal frente al estímulo estresante (Reacción de Alarma del SGA). Obviamente, el carácter crónico de la exposición al ruido de nuestros animales hace que el efecto carditrófico observado pierda ese carácter adaptativo. Puede entonces entenderse como un factor amortiguador, en situaciones estresantes moderadas, como en nuestro caso, de los efectos aplásicos sobre el corazón debidos a los glucocorticoides. El cráneo de nuestros animales estresados es otro exponente de la acción reductora de los glucocorticoides sobre el crecimiento, pero tampoco escapa a la moderación del agente utilizado que impide una reducción significativa de las variables craneométricas consideradas. Sin embargo, cuando estas variables se relacionan entre sí a través de índices se observan variaciones significativas que nos proporcionan una valiosa información que de otra forma quedaría enmascarada. El análisis de estos índices nos señala ya, a esta intensidad de acción glucocorticoide, las regiones anatómicas del cráneo con una mayor predisposición al efecto reductor de los glucocorticoides sobre el crecimiento, y que si no resultan reducidas de forma significativa se debe únicamente a la moderación del estrés ya que, como veremos, a intensidades superiores, representadas por los siguientes tratamientos, esas regiones anticipadas’’ muestran en efecto una reducción de su crecimiento. Así encontramos que, a la intensidad glucocorticoide del tratamiento -250 - -- Discusión global-~ estresante, las variables cuyo crecimiento resulta más sensible a reducirse se relacionan con la región cigomática y con la longitud del neurocráneo. La consideración de esta última dimensión merece una mención especial pues está apoyada por la variación significativa del índice que la contiene. Asimismo, en el análisis multivariante (ACP) encontramos un apoyo al crecimiento menos estabilizado de esas variables, ya que su asociación al factor que explica el mayor porcentaje de la variabilidad muestral indica que es en la zona cigomática y en la longitud del neurocráneo donde los efectos reductores del crecimiento del cráneo se centran de una forma especial. Ello ya es indicativo de cuál es el patrón de crecimiento craneal a la edad de los animales utilizados en el estudio (púberes). También el ACP nos permite confirmar de una forma gráfica que los animales expuestos al ruido constituyen un grupo diferenciable del control en cuanto a los efectos reductores de los glucocorticoides sobre el crecimiento del cráneo. El 66.7% de los animales estresados ocupan una posición precisa y representativa del efecto debido a la exposición al ruido. Este efecto se traduce en un cráneo más corto y/o con arcos cigomáticos menos desarrollados que los animales controles y siempre de acuerdo con una actividad glucocorticoide moderada. Es interesante, en relación con la estructura ósea de los animales estresados, comentar el reforzamiento de la región occipital (sustentado por el aumento significativo de la longitud cóndilo-basal y de la profUndidad y separación condilea) donde se insertan los músculos nucales y cervicales. Lógicamente, esta remodelación ósea local está potenciada por una superior actividad de esos músculos. Este efecto de reforzamiento no lo hemos encontrado en otros modelos de estrés de similar intensidad no incorporados al presente trabajo y sólo se detecta en este tratamiento, descartándose por lo tanto una implicación de los glucocorticoides, lo que dirige nuestra atención hacia una probable respuesta motora refleja (contracciones isométricas) del animal frente a la “entrada” de estímulos medioambientales, permitiéndole adquirir un estado de alerta o de atención a través de la orientación de la cabeza, y por consiguiente de los pabellones auditivos, en dirección a la fuente del estimulo sonoro que podría representar una amenaza. Por otra parte, este efecto de reforzamiento occipital ha de tenerse muy -251 - listrés crónica, actii’idadglucocorticoide y crecimiento —. en cuenta a la hora de interpretar los resultados craneométricos ya que puede estar impidiendo que aquellas variables, que en su definición comprenden a la totalidad o parte de la región occipital, lleguen a mostrar una reducción significativa. Dichas variables serían objeto de dos efectos contrapuestos, de un lado, la reducción de sus dimensiones mediada por los glucocorticoides y, de otro, un aumento de su valor a resultas del reforzamiento occipital mencionado. Como hemos dicho, el carácter moderado del mido determina una ambigíledad de los resultados en el sentido de que grán parte de ellos se muevep en el limite de la significación estadística. Así lo hemos visto en lo comentado hasta el momento. Era de esperar, por lo tanto, que una reducción tan moderada del crecimiento del cráneo no se expresase en el peso del mismo. Mas no fue así, el peso craneal de estos animales estresados se reduce indicando que están perdiendo masa ósea. Podríamos presuponer que dicha menor masa ósea fuese consecuencia de una desmineralización del hueso ya que, como hemos apuntado, no cabe responsabilizar de ese efecto a una menor crecimiento craneal si nos atenemos estrictamente a las dimensiones del cráneo. Sin embargo, en estos animales estresados no se detecta una pérdida de minerales sino que, por el contrario, se observa una mayor mineralización que afecta al contenido de estroncio, bario y cinc, y que discutiremos más adelante. En consecuencia, si la pérdida de masa ósea no se acompaña de nienores niveles de minerales, y por lo tanto, no influye sobre la matriz inorgánica del hueso, podemos pensar con más convencimiento en un efecto inhibidor sobre la fracción celular del mismo. Así, el hueso de estos animales seria un tejido de crecimiento estabilizado, o incluso en franco retroceso, y mineralizado en exceso. Esta deducción nos estaría a su vez argumentando la existencia de un efecto reductor del crecimiento óseo aun cuando no se manifiéste claramente en las dimensiones craneales o corporales debido al carácter moderado del tratamiento estresante. Como veremos en los tratamientos de mayor intensidad glucocorticoide, la reducción significativa no sólo del peso craneal, sino también del crecimiento del cráneo y de las dimensiones corporales de los animales nos apoyarán esa acción inhibidora sobre el componente celular del hueso, con independencia de las alteraciones que pueda sufrir el componente mineral del mismo. Retomamos a continuación la discusión referente al contenido mineral -252 - -. Discusión global -- del hueso de estos animales. La mayor mineralización que observamos se debe al aumento de los niveles de cinc, estroncio y bario, si bien distinguimos que la acción glucocbrticoide no es en todos los casos el mediador de ese aumento. El contenido de cinc aumenta exclusivamente en los animales estresados por lo que, descartada una acción glucocorticoide, este efecto debe ser atribuido a un efecto propio del ruido como tal estímulo sonoro. El aumento experimentado por el estroncio y el bario sí se reproduce en los restantes tratamientos pero, como veremos, no encontramos una correlación entre su intensidad glucocorticoide y sus efectos, probablemente porque el techo de depósito en hueso de estos dos constituyentes se alcanza ya a una intensidad de acción glucocorticoide tan leve como la representada por ~lestrés. El contenido óseo de magnesio merece un comentario aparte ya que, por el contrario, sus niveles en hueso son, de los tres constituyentes, los únicos que 4isminuyen en estos animales. La mediación de este efecto recae en ¡a moderada activación hipófiso-adrenal (corticosterona o ACTH) generada por el estrés, como lo pone de manifiesto que también detectemos una reducción de su contenido en los restantes tratamientos, a excepción de la administración única de dexametasona que cementaremos más tarde. Sin embargo. mencionamos ahora que la dexametasona al no reproducir el efecto de la corticosterona sobre el magnesio, no nos permite determinar si este mineral hubiera alcanzado su techode depósito a la intensidad del tratamiento con ese glucocorticoide sintético. Necesitariamos pues exponer los animales a mayores intensidades de estrés o mayores dosis de ACTH. Independientemente de la activación hipófiso-adrenal, observamos además un efecto propio del ruido que se manifiesta claramente en los animales expuestos al estímulo sonoro después de la administración de dexametasona. A pesar del análisis de estos resultados y de la comparación que se ha hecho entre los diferentes grupos de tratamiento, no hemos encontrado una explicación concluyente al decremento de los niveles de magnesio en el hueso. Destacamos por último, y a modo de inciso final, todos aquellos efectos que muestran los animales estresados pero que no responden a una aóción de los glucocorticoides oque además de obedecer a dicha acción también se deben a una efecto propio del mido. Corresponden al efecto hipertrófico sobre el corazón por la activación neurógena del estrés, al efecto atrófico del encéfalo por la integración sensorial del estimulo, al efecto de reforzamiento de la región occipital del cráneo por un mayor desarrollo muscular en relación -253 - -- Discusión global -. justifica por el adelgazamiento de los individuos, también su crecimiento se reduce. Las menores dimensiones corporales (longitud y envergadura) que observamos así nos lo señala. Obviamente, la dimensión de longitud que hemos evaluado no tiene el mismo significado que la altura en los estudios antropométricos, ya que no se consideran las extremidades posteriores. De modo que no podemos decir que nuestros animales tienen menor alzada pero si que son más cortos. Sin embargo, el efecto sobre la envergadura (la cual contempla los huesos largos de la extremidad anterior) nos permite pensar que también la talla o alzada del animal se debe estar alterando. Este efecto de los glucocorticoides sobre el crecimiento trasciende al animal contemplado en su totalidad, manifestándose también cuando nuestro estudio se centra en otros niveles. Eso es lo que sucede cuando encontramos que el encéfalo de estos animales tratados con ACTH reduce su peso por aplasia y atrotia de sus células, y además de forma más acentuada que en el caso de los animales estresados. Por el contrario, el peso del corazón y del riñón no se reduce significativamente a pesar de los efectos aplásicos significativos ocasionados por el tratamiento. Ya habíamos visto que los resultados concernientes a los animales estresados apuntaban a un crecimiento más estabilizado de estos dos órganos frente al encéfalo. Por consiguiente, los datos de los animales administrados con ACTH no hacen sino verificar esa apreciación e indicamos asimismo que esa estabilidad es mayor de lo que podríamos haber pensado en un primer momento, pues ni siquiera una intensidad de acción glucocorticoide superior a la del estrés consigue que el peso del corazón y del riñón manifieste de forma significativa la reducción del crecimiento de estos órganos. Este crecimiento más estable se hace más patente si cabe en el caso del corazón, ya que en estos animales administrados con ACTH no puede considerarse la existencia de un efecto cardiotrófico al que pudiera atribuirse una reducción del crecimiento del corazón menos acentuada de lo esperado. Más dúctil resulta ser el crecimiento del cráneo, reduciéndose en estos animales de una forma generalizada. Tal y como predecíamos a la vista de los resultados encontrados en los animales expuestos al ruido, las dimensiones relacionadas con los arcos cigomáticos y la longitud del neurocráneo no sólo se reducen de forma significativa sino que, como nos indican los indices, son ellas en efecto las más sensibles al efecto reductor de los glucocorticoides sobre el crecimiento, primando las dimensiones cigomáticas sobre la longitud -255 - -- Estrés crónico, actividad glucocorticoide~vcrecimiento — del neurocráneo. Les siguen en orden decreciente las variables que defin¿n el resto del esplaenocráneo que no es zona cigomática y, por último, la anchura craneal. La mayor estabilidad del crecimiento de cráneo en anchura es confirmada por el ACP y el análisis discriminante, y ambos sugieren además que el crecimiento en altura podría mostrar un comportamiento similar o ser su estabilidad ligeramente menos acentuada que la del crecimiento en anchura. Así pues, el carácter moderado del tratamiento con ruido es en efecto la causa de que no hayamos encontrado en los animales estresados reducciones significativas de las variables craneométricas consideradas, ni siquiera de aquellas más sensibles a reducirse Esta clara reducción del crecimiento del cráneo de estos animales determina una disminución del peso craneal como efectivamente observamos, que supera la mostrada por los animales estresados. Además, estos animales tratados con ACTH muestran, como hemos comentado, una reducción significativa del crecimiento de sós dimensiones corporales. Por consiguiente, con más claridad que en el caso del mido, podemos hablar de una pérdida de masa del hueso relacionada con un efecto de los glucocorticoides sobre el crecimiento, independientemente de su acción sobre el componente mineral del mismo. Respecto a este último aspecto, tampoco en estos animáles se produce una desmineralización del hueso que pudiera relacionarse con la pérdida de masa ósea al afectarse la matriz inorgánica. Por consiguiente, la menor masa del hueso es consecuencia de un efecto de los glucocorticoides sobre el crecimiento o división celular, que en estos animales ya se detecta claramente en las dimensiones craneales y corporales. Con independencia de esta hipótesis, vamos a discutir la mayor mineralización que por el contrario sí encontramos y que recae en los niveles de estroncio y bario. El contenido de estos dos constituyentes minerales aumenta en el hueso, pero, como ya adelantamos en su momento, este efecto no resulta más acentuado que e» los animales estresados. Nuevamente incidimos en que quizás el exceso de corticosterona provocada por el estrés sea suficiente para conseguir el techo de depósito en hueso de estos dos minerales. Respecto a los niveles de magnesio, vemos que disminuyen al igual que en los animales expuestos al ruido. Pero a diferencia de ellos, vinculamos esta disminución de -256 - -. Discusión global -. su contenido en hueso exclusivamente a la activación hipófiso-adrenal desencadenada por el tratamiento con ACTH. Excluimos, lógicamente, una posible acción propia del ruido ya que no hay activación del SNC. Por otra parte, aludimos nuevamente a la necesidad de exponer los animales a mayores dosis de ACTH si quisiéramos conocer a qué intensidad de acción glucocorticoide alcanza este elemento su máxima capacidad de depósito en el hueso ya que, como dijimos, la administración de dexametasona no ejerce efecto alguno sobre el mismo. La administración de dexametasona inhibe la producción endógena de corticosterona adrenal, Esta acción lleva implícita la presencia en sangre de elevadas concentraciones de este glucocorticoide por lo que, independientemente de que su procedencia sea exógena, se reproduce lo sucedido en el tratamiento con ruido respecto a un aumento de los niveles circulantes de glucocorticoides. Es obvio, por otra parte, que la dosis de dexametasona administrada y la potencia de su actividad glucocorticoide constituye una diferencia cuantitativa frente a la hormona endógena. Por consiguiente, la intensidad de sus acciones sobre los tejidos serán un reflejo de su elevada actividad como glucocorticoide que supera a la representada por los tratamientos con ruido y ACTH. Así lo manifiesta la pérdida de peso de los animales, que no sólo se detecta en ciertas semanas, como sucedía en los tratados con ACTH, sino durante todo el período experimental. A dicha pérdida de peso contribuye el marcado adelgazamiento de los animales, cuyos depósitos de grasa subcutánea se reducen en mayor medida que en los animales estresados y tratados con ACTH. Además, dicho adelgazamiento resulta agravado porque los animales sufren un efecto anoréxico que potencia la pérdida efectiva de peso que presentan. A todas estas acciones, que redundan en el peso de los animales, se suma además una acción glucocorticoide directa de la dexametasona sobre el crecimiento. Los animales administrados con este glucocorticoide sintético muestran dimensiones corporales más reducidas que los animales de los restantes tratamientos, esencialmente en relación a la longitud. No sólo estos animales son más cortos, también encontramos un efecto reductor del crecimiento sobre sus órganos acorde, además, con la intensidad glucocorticoide representada por la dexametasona. Una manifestación muy clara de lo dicho es la reducción -257 kiVrés crónico. actividad glucocorticaide y crecimiento — significativa del peso del corazón y del riñón por efectos aplásicos, a pesar de la resistencia que muestran a ser reducidos en su crecimiento como se ha discutido anteriormente. Por el contrario, los resultados obtenidos en los restantes tratamientos nos han mostrado que el crecimiento del encéfalo no se halla tan estabilizado en este periodo de edad y, por ello, seda de esperar que en los animales tratados con dexametasona observáramos una reducción del peso del encéfalo aún más marcada que en los tratamientos anteriores a resultas de una mayor aplasia y atrofla de sus células. Sin embargo, el peso del encéfalo de estos animales no difiere de los tratados con ACTH. La respuesta podemos encontrarla en una posible “protección “ del encéfalo frente a la acción de la dexametasona, como indica que no hallemos efecto alguno sobre el tamaño de sus células y, por otra parte, que la reducción de su número de células sea menor de lo esperado. Esta “protección” podría guardar relación con el hecho de la presencia en el encéfalo de receptores para glucocorticoides (tipo 1 y II) que median diferentes respuestas de estas hormonas y que presentan diferente afinidad por la dexametasona. Así, de todo lo comentado en relación a los órganos, puede resumirse finalmente que la atrofia de las células del encéfalo obedece a una acción de los glucocorticoides, que no es reproducida por la dexametasona, pero asimismo a una acción propia del ruido, tal y como comentamos en su momento. Por su parte, la aplasia de este órgano resulta ser un efecto exclusivamente relacionado con la actividad glucocorticoide de la corticosterona y que la dexametasona podría reproducir en menor nivel a través del mismo tipo de receptor (tipo 1). Este efecto sobre el crecimiento a nivel de los tejidos se evidencia también en un cráneo notablemente más “corto” que el de los animales tratados con ACTH, a lo que contribuye no sólo la menor longitud del neurocráneo sino, esencialmente, la reducción del crecimiento del resto del esplacnocráneo que no comprende la arcada cigomática. La exclusión de la región cigomática obedece a que, si bien se muestra muy sensible al efecto reductor sobre el crecimiento y pudiéramos pensar que siguiera reduciéndose en respuesta a una intensidad elevada como la del tratamiento con dexametasona, sin embargo encontramos que su reducción no es más acentuada que en los animales tratados con ACTH. Podemos decir en consecuencia que la región cigomática, a pesar de mostrar una gran capacidad de cambio, “agota” esa capacidad a intensidades moderadas de tratamiento. Esta afirmación también es válida para la longitud del neurocráneo y la anchura craneal, aunque en este último caso hay un matiz diferencial pues recordemos que la anchura del cráneo era además la dimensión menos -258 - -- Discusión global sensible a reducir su crecimiento, por lo que su amplitud de cambio resulta más restringida que para la región cigomática y la longitud del neurocráneo. Por consiguiente, todos estos datos nos indican que hay que tener cuidado a la hora de caracterizar la contribución del esplacnocráneo a la reducción del crecimiento craneal de los animales. De manera que sólo cuando el esplacnocráneo se considera en su totalidad (es decir, incluyendo la arcada cigomática) se muestra como la región con un mayor margen de cambio pues no sólo presenta una reducción de su crecimiento a intensidades de acción glucocorticoide bajas y moderadas (a resultas de la región cigomática) sino que, como hemos observado en estos animales tratados con dexametasona, su capacidad de respuesta persiste cuando esa intensidad aumenta (a resultas del resto del esplacnocráneo). Señal de esta amplitud de su respuesta es que el pequeño incremento de intensidad glucocorticoide que supone el tratamiento conjunto (DxStr) frente a la administración única de dexametasona consigue cráneos aún más cortos por reducción nuevamente de la zona no cigomática del esplacnocráneo. Este efecto reductor sobre el cráneo se manifiesta además en una disminución del peso craneal, y por consiguiente en una pérdida de masa ósea, más acentuada que en los tratamientos anteriores, a la que lógicamente contribuirá la marcada reducción del crecimiento del cráneo. Nuevamente dicha pérdida de hueso no se acompaña de una desmineralización ósea, lo cual plantea como en ocasiones anteriores un efecto inhibidor del crecimiento o división de las células del hueso. La superior mineralización que observamos en los animales tratados con dexametasona recae en un aumento del contenido de estroncio y de bario, que como ya hemos apuntado no difiere del que presentan los animales estresados o tratados con ACTH. No se observa ningún efecto sobre los niveles de magnesio de modo que, como ya adelantamos, la dexametasona no reproduce el efecto de la corticosterona o de la ACTH disminuyendo los niveles de magnesio. Lamentablemente no disponemos en este caso de bibliografla que nos permita justificar esa diferencia, como si sucedía en relación con la presencia en el encéfalo de diferentes tipos de receptores de glucocorticoides. El tratamiento conjunto de administración de dexametasona y exposición al mido reduce la concentración sanguínea de corticosterona, sin alcanzar valores -259 - —— lÓdrés crónica, actividad glucocorticoide y crecimiento — tan bajos como en el tratamiento único con el glucocorticoide sintético. La causa de dicho resultado es la acción estimulante del eje HHA ejercida por el estrés. La discusión de los efectos encontrados en los animales expuestos a este tratamiento se ha ido incorporando en los grupos anteriores, a excepción de un aumento significativo del contenido óseo de calcio que sólo se observa en estos animales. Encontrar dicho aumento en estos animales permite descartar, por una parte, un efecto propio del ruido y, por otra, la implicación del nivel de activación del eje 1-fHA que muestran los animales estresados o tratados con ACTH. Pero también la acción glucocorticoide de la dexametasona por sí sola y, por consiguiente, nos conduce a pensar que debe obedecer a la adición de algún otro factor contenido en el estrés. Evidentemente ese factor añadido es el mayor nivel de corticosterona circulante que une su efecto glucocorticoide al de la dexametasona, superando el umbral necesario para evidenciar respuesta. Por otra parte, la presencia de este efecto únicamente en estos animales impide que podamos conocer cuál es la intensidad de acción glucocorticoide que consigue que el aumento del contenido de calcio alcance su techo de depósito en hueso ya que, para ello, los animales deberían exponerse a una intensidad glucocorticoide superior a la representada por este tratamiento. Esta circunstancia restringe el empleo del contenido óseo de calcio como marcador inespecífico de estrés ambiental, ya que se requeriría una intensidad tal de acción glucocorticoide que sólo se asociaría a situaciones que lógicamente no son habituales para los organismos. -260 - E E u ¡ E E E E ¡ E E ¡ u E E VI. CONCLUSIONES E E u E E u VI. CONCLUSIONES Como consecuencia de la discusión anterior, queremos destacar una serie de conclusiones que responden a su vez a los objetivos planteados: - Respecto a los Objetivos la y ib, hemos encontrado que en situaciones de exposición a un estrés ambiental de intensidad moderada se producen alteraciones del crecimiento a nivel de órganos, esqueleto y contenido mineral del hueso que, siendo mediadas por la actividad glucocorticoide, pueden quedar enmascaradas por los parámetros o aspectos globales del animal. Tales alteraciones sí se manifiestan más claramente cuando dichas situaciones muestran una intensidad media como la representada por nuestra administración de ACTH. Las poblaciones biológicas humanas o animales pueden estar fácilmente expuestas en su vida cotidiana a tales niveles, moderado y de mediana intensidad, de los agentes estresantes. - Respecto a los Objetivos 2a y 2b, nuestros resultados muestran que el encéfalo es, de los órganos evaluados, el que presenta un crecimiento menos estabilizado a la edad de los animales empleados. La reducción de su crecimiento podría estar relacionada con una aceleración de la pérdida natural de población neuronal accesoria, implicada probablemente en el establecimiento de conexiones que no son funcionales en el animal porque no han sido requeridas durante los procesos de aprendizaje del individuo. La edad de estos animales nos permite descartar un envejecimiento prematuro a costa de la pérdida de neuronas no accesorias que, por lo demás, implicaría una alteración neurológica grave fácilmente detectable durante el contacto diario con los animales. Nosotros no observamos en ese sentido disfijnciones comportamentales o motoras, sin embargo resultaría interesante exponer estos animales a estudios que realmente lo confirmen (sobretodo en lo referente a su capacidad posterior de aprendizaje) y, asimismo, considerar la posible implicación que tendría en individuos de mayor edad relacionar el envejecimiento con el ruido ambiental. Respecto a los Objetivos 3a, 3b y 3c, podemos concluir varios aspectos: -261 - -- Estrés crónico, actividad glucocorticoide y crecimiento — ¡0 Que el patrón de crecimiento craneal a la edad y sexo de nuestros animales se caracteriza por presentar gran variabilidad en longitud y una pequeña capacidad de crecimiento en anchura y altura, lo que indica que el crecimiento en estas dos dimensiones se halla prácticamente estabilizado Esta estabilidad podría ser menos acentuada en altura que en anchura de acuerdo con los resultados del análisis discriminante. 20 Que respecto a un patrón de crecimiento por zonas, el conjunto del esplacnocráneo es el componente craneal más plástico y modificable, mientras que el neurocráneo se muestra más estable. Del esplacnocráneo podemos destacar la arcada cigomática como la más vulnerable a intensidades de actividad glucocorticoide moderada a media. El resto del esplacnocráneo (zona palato-nasal, etc.) sigue respondiendo a los efectos reductores de alta intensidad cuando otras zonas o dimensiones han agotado su capacidad de respuesta. 30 Que consecuentemente con lo dicho en los dos apartados anteriores, el crecimiento craneal en este período de vida del animal (púber) es heterogéneo, y responde de distinta forma a la actividad glucocorticoide mediadora de las respuestas al estrás, posibilitando una pérdida de la proporcionalidad entre las diferentes dimensiones o zonas evaluadas. Este cambio de la morfologia o de las proporciones se produce con más relevancia en las situaciones moderadas a medias por ser en ellas cuando los efectos se extienden a unas variables y no a otras. En la medida en que la situación ambiental representa una actividad glucocorticoide mayor, los efectos se generalizan y se tiende a paliar la situación manteniendo la proporcionalidad entre dimensiones y zonas craneales. 40 Que los efectos reductores de las hormonas que median las respuestas a estrés ambiental inespecífico provocan cráneos en general más cortos, con mayor acentuación de este efecto en la zona rostral y con arcadas cigomáticas menos pronunciadas o resaltadas. Respecto al Objetivo 3d, también se plantean varias conclusiones: 10 Que pueden darse efectos mediados por los glucocorticoides de pérdida de masa ósea y reducción del crecimiento del esqueleto por alteración de la reposición celular -262 - -- Conclusiones — adecuada, coincidentes sin embargo con una mineralización (a bajas intensidades) y con una mineralización que incluye calcificación a altas intensidades. Y Que los marcadores inespecíficos de estrés ambiental en el hueso a intensidades moderadas y medias (niveles cotidianos) son el magnesio, estroncio y bario, y a grandes intensidades (niveles “catastróficos”) el calcio. 30 Que de forma especial el estrés por ruido es capaz de provocar efectos propios que ya han sido enumerados. De ellos no se encuentra una adecuada explicación fisiológica al efecto que posee aumentando el contenido óseo de cinc y disminuyendo el de magnesio, aunque sí se pone de manifiesto que no hay mediación por la activación del eje HHA. Asimismo queremos señalar varios aspectos o aportaciones inter9santes de esta Tesis desde el punto de vista metodológico: 10 Que la dexametasona no siempre reproduce los efectos de los glucocorticoides endógenos, hecho en el que interviene la presencia, afinidad e implicación de diferentes receptores, 20 Que es necesario evaluar parámetros como el número y el tamaño celular, a través de la determinación del contenido de ADN y proteínas, para analizar con eficacia efectos de crecimiento sobre órganos, pudiendo ser insuficientes parámetros como el peso. 30 Que la utilización de índices resulta a veces muy indicativa para realzar efectos que pasan desapercibidos. 40 Que las técnicas estadísticas de ACP y análisis discriminante han resultado de gran utilidad no sólo por señalar y corroborar cuáles son las características del patrón de crecimiento craneal de nuestros animales, sino por facilitar la metodología de futuros trabajos de esta naturaleza. Esta simplificación del estudio se debe a que centra nuestra atención sólo en determinadas variables craneométricas, que son las significativas a la hora de diferenciar los grupos de animales entre si atendiendo a los efectos reductores de los tratamientos sobre el crecimiento craneal. Así, el ACP reúne las variables de partida en un menor número de factores -263 - —— LVrés crónica actividadglucocorticoide y crecimiento — de modo que representan a esas variables con una pérdida mínima de información, y el discriminante selecciona 13 de las 21 variables originales por ser las que más contribuyen a discriminar entre los grupos de tratamiento. El análisis discriminante nos brinda además la posibilidad de confirmar efectos reductores sobre el crecimiento craneal en animales de iguales características que los nuestros y, en caso afirmativo, conocer a qué intensidad de nuestros tratamientos es comparable dicho efecto. -264 - E E E u E ¡ u E E VII. 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Estrés crónico y Síndrome General de Adaptación 2. Crecimiento y desarrollo óseo II. ANTECEDENTES, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DEL TRABAJO: justificación del diseño experimental 1. Referente al animal 3. Referente al esqueleto III. METODOLOGÍA 1. Material biológico 2. Diseño experimental 3. Obtención de muestras biológicas de los animales 4. Estudio del desarrollo de los órganos 5. Técnica craneométrica 6. Técnicas analíticas 7. Análisis estadístico IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Actividad adrenal 2. Crecimiento y desarrollo de los animales 3. Alteraciones del desarrollo de los órganos 4. Craneometría 5. Alteraciones en el contenido de macro y microconstituyentes del hueso V. DISCUSIÓN GLOBAL VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA rgf: gh: ryhjn: