UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Gabriel Conde Arias-Camisón DIRECTOR: Antonio Suárez Sanz Madrid, 2015 © Gabriel Conde Arias-Camisón, 1981 Mecanismos moleculares de shock endotóxico : efectos "in vivo" e "in vitro" de la endotoxina de escherichia coli sobre la estructura y la función de las mitocondrias Gabriel Conde .Arias-Camlsân t P IPJl ^ 2 4 llllllllllll ' 5 3 0 9 8 5 8 8 9 2 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE > - MECANISMOS M0ÎJECULARE3 DEL SHOCK ENDOTOXICQî EFECTOS ’•IN VIVO” E "IN VITRO" DE LA ENDOTOXIN A DE ESCHERICHIA COLI SOBRE LA ESTRUCTURA Y LA FUNCION DE LAS MITOCONDRIAS Departamento de Bioqulmlca Facultad de Ciencias Quimicas Universidad Complutense de Madrid 1982 DIBLIOTECf' Colecci6n Tesls Doctorales. N@ 129/82 @ Gabriel Conde Arias-Camis6n Edita e imprime la Editorial de la Universidad Complutense de Madrid. Servicio de Reprografla Noviciado, 3 Madrid-8 Madrid, 1981 Xerox 9200 XB 480 Deposito Legal: M-16193-1982 GABRIEL CONDE ARIAS-CAMISON MECANISMOS MOLECULARES DEL SHOCK ENDOTOXICO: EFECTOS "IN VIVO" E "IN VITRO" DE LA ENDOTOXINA DE ESCHERICHIA COLI SOBRE LA ESTRUCTURA Y LA FUNCION DE LAS MITOCONDRIAS DIRECTOR; ANTONIO SUAREZ 5ANZ DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS SEC. MEDICINA Y CIRUGIA EXPERIMENTAL CIÜDAD SANITARIA PROVINCIAL MADRID DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 1981 Esta tesls doctoral ha sido realizada en el Departamento de Bioquîmica de la Facultad de Ciencias Quimicas de la Univers^ dad Complutense de Madrid, bajo la direcciôn del Dr. D, Antonio Suarez Sanz y la supervisiôn del Prof. Dr. D. Angel Martin Muni- cio, catedrâtico y jefe del mencionado departamento, y del Prof. Dr. D. Pedro Garcia Barreno, Jefe del Servicio de Cirugia y Med^ cina Experimental de la Ciudad Sanitaria Provincial. Agradezco a ellos el interés y la ayuda que me han prpstado. Tambiln deseo expresar mi agradecimiento a mis companeros de laboratorio, en especial a 0?. M @ . del Carmen Mendez por su colaboraciôn, al Dr. D. Rafael Garcia del Departamento de Bioqu_i mica de la Clinica Puerta de Hierro y a la Firma C.R. Mares, que nos permitiô la utilizaciôn del espectrofotometro DU-2a. Esta tesis doctoral fuê leida en la Facultad de Ciencias Quimicas de la Universidad Complutense de Madrid el dfa 9 de octubre de 1981 ante un tribunal formado por los siguientes profesores de dicha Universidad ; Presidents Arsenio Fraile (Facultad de Ciencias Biolôgicas) Vocal Amador Schuler (Facultad de Medicina) Vocal Angel Martin (Facultad de Ciencias Quimicas) Vocal José L . Soto (Facultad de Ciencias Quimicas) Secretario Luis Franco (Facultad de Ciencias Quimicas) La calificaciôn obtenida fué de sobresaliente "cum laude" INDICE - I - INTRODUCCION Shock circulatorio 1 Métabolisme lipldico sn el shock 3 Composicion y estructura quimica de las endotoxinas 8 Comportamiento y propiedades fisicoqulmicas del LP5 en d'isolucion 13 Relaccion estructura-actividad biolôgica del LPS 14 Papal del LPS como componente de la pared externa de bacterias 14 Actividad tôxica 14 Interaccion con membranas 16 Accion del LPS a nival celular 20 Accion sobre las celulas del sistema inmunologico 20 Macrofagos 20 Leucocitos polimorfonuclearas * 22 Linfocitos 23 Accion sobre los eritrocitos 23 Accion sobre las plaquetas 24 Accion sobre las celulas retIculo-endoteliales 25 Accion sobre el higado 26 Caracteristicas estructurales y funcionales de las membranas mitocondriales 29 Membrane externa 29 Membrane interna 30 Control respiratorio 35 Mecanismos y regulacion del transporte de Ca^* mi- tocondrial 39 Actividad de la fosfolipasa A 2 mitocondrial 42 Accion del LPS sobre las mitocondrias 45 EFectos secondaries al shock circulatorio 46 Accion directa del LPS sobre los hepatocitos 47 - 11 - Prostaglandinas an el shock 49 Bioslntesis de prostaglandinas en el higado 51 MATERIALES Y METODOS Réactives y productos quimicos utilizados 54 Material biologico 55 Experimentacion "in vivo" 56 Shock endotâxico 56 Medida de presiôn arterial 56 Shock hemorfagico 57 Alslamiento de la fraccion mitocondrial de higado 59 Estudio de la Funcionalidad mitocondrial 61 Registre de consume de O2 : Electrode de oxigeno 61 Tecnicas espectrofotometricas 63 Oeterminacion de la actividad de la succinato- citocromo c reductasa * 63 Evaluacion de la concentracion de Ca^* 64 Aislamiento de la fraccion microsomal de higado 65 Estudio de la actividad de la prostaglandina sinte- tasa microsomal 65 Valoraciôn de grupos tiôlicos de la fracciôn micro­ somal 66 Experimentacion "in vitro" con fracciôn mitocondrial 67 Actividad de la fosfolipasa A 2 68 Incorporaciôn de âcidos grasos en los fosfoli- pidos mitocondriales 68 Analisis de lipidos 71 Extraccion 71 Cromatografia en capa fina 71 Cromatografia gas-liquido 72 Valoracion de fôsforo 75 Medida de radiactividad 75. - Ill - RESULTADOS Y DISCUSION Experimentaciôn "in vivo" 76 Shock endotôxico 76 Evoluciôa del shock 76 Niveles de las clases de lipidos en suero y homogeneizado total de higado 76 Composiciôn en âcidos grasos de las clases de lipidos neutros 01 Contenido en clases de lipidos de la fracciôn mitocondrial da higado 85 Composiciôn en âcidos grasos de las clases de lipidos 89 Funcionalidad mitocondrial 92 Respiracion 92 Actividad de la succinato-citocromo c re­ ductasa 94 Relacion composiciôn lipidica-funcionalidad mitocondrial 95 Relaciones entre las alteraciones mitocondriales y la fisiopatologia del shock endotôxico 95 Actividad de la prostaglandina sintetasa micro­ somal de higado 98 ShocK hemorrâgico ' 100 Contenido an clases de lipidos de la fraccion mitocondrial de higado 100 Funcionalidad mitocondrial; Respiracion 101 Experimentacion "in vitro" con fraccion mitocondrial 102 Actividad de la fosfolipasa A 2 103 Incorporaciôn de âcidos grasos en los fosfoli- pidos mitocondriales 107 Actividad respiratoria 107 - IV - Estudio de la capacidad de retenciôn de Ca^* 110 C0NCLU5I0NES 113 BIBLIOGRAFIA . 114 — \l - Nomenclatura da las clases de lipidos Nombre sistemâtico Nombre admitido Abreviatura x-fflonoacll-sn-glicerol l,2(2,3)-diacil-sn-glicerol 1,2,3-triacil-sn-glicerol 1 f 2-diacil-sn-glicerol-3-Fosf a to 1.2-diacil-sn-glicero-3- fosfocolina 1(2)-monoacil-3n-glicaro-3- f osFocolina 1.2-diacil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina l(2)-monoacll-sn-glicero-3— Fosfoetanolamina l*2-diacil-sn-glicaro-3- F osFoinositol 1.2-diacil-sn-glicoro-3- FosF oserina 1.3-bis(3-sn-FosFatidll)glicerol monoacilglicarol MG dlacilglicerol OG triacilglicerol TG ac. sn-FosFatldico 3-sn-FosFatidilcolina PC dlFosFatidllcolina LPC 3-sn-fosFatidiletanolamina PE lisoFosFatidiletanolamina LPE 3-sn-fosFatidilinositol PI 3-sn-fosfatidilserina PS dlfosFatidilglicerol OPG — V/1 — RELACION DE LAS A0REVIATURA UTILIZADAS Nombre Abreuiatura Adenosin 5- mono-, di- y triFosfato Coenzima A Acido etilendiaminotetracetico Dinucleotido de flavina y adenina Dinucleotido de nicotinamida y adenina y sus formas oxidada y reducida Fosfato del dinucleotide de nicotinamida y adenina y sus formas oxidada y reducida Fostato inorganico Tris(hidroximetil)aminometano 2,5-difeniloxazol L ,4-b is-{5-feniloxazolil-2)-benceno Heptosa Galactosa Glucose Glucosamine Acidbs grasos Acidos grasos libres Etanolamina Colina Ac. 2-ceto-3-desoxioctanôico Lipopdlisacârido Prostaglandina Tromboxanos Fosfolipidos Ac. 5,5-ditio-bis-2-nitrobenz6Ico Lipasa sensible a hormones Lipoproteina lipasa AMP, ADP, ATP Co A (o CoASH) EDTA FAD NAD, NAD+, NADH NADP, NADP+, NADPH Pi Tris PPO POPOP Hept Gal Glc Gic — NH2 AG AGL EtNH Col KDO LPS PG TX PL DTNB LSH LPL - VII - Nombre Abreuiatura Quilomicrones Lipoproteinas de baja densidad Lipoprotéines de muy baja densidad Ditiotreitol QM LDL VLOL DTT ■ INTRODUCCION — 1 — SHOCK CIRCULATORIO El shock ha sido reconocido como un slndrome clinico dura_n te casi dos mil anos, pero debido a su complejidad, en la actua- lidad, es todavia un Fenomeno controvertido. Esencialmente es una manifestaciôn patolôgica de amplitud sistémica, que aparece desde el momento en el que una lesiôn exceda en intensidad o/y duraciân el nivel para el que los sistemas homeostéticos estan adaptados. Ante tal lesiôn el organisme responds, intentando ré­ équilibrer sus Funciones vitales y sobrevivir, mediante una sé­ rié de cambios circulatorios y metabâlicos de acuerdo con una dinâmica, cuyas oscilaciones son inicialmente correctivas, pero pueden transformarse muy râpidamente en nocivas por si mismas, con lo que el shock puede llegar a ser irreversible en ausencia de un tratamiento adecuado. En realidad el shock no es un sxndrome unico desde el pun— to de vista etiolâgico, sino que bajo este termina se incluyen una serie de sindromes que aparecen en casos de hemorragia gra­ ve, traumatisme, quemaduras, infarto de miocardio, obstruccion cardlaca, embolia pulmonar generalizada e infeccion bacteriana masiva, por mencionar s6lo las causas mis importantes. Por ello se utilizan corrientemente en clinica para los distintos tipos de shock clasificaciones y nomenclaturas relacionadas con su atiologia, Cualquiera que sea el mecanismo iniciador, el aspecto co­ rnu n a todo proceso de shock es la apariciôn de un Fenômeno hemo- dinâmico patolôgico, que implica una inadecuada perfusiôn tisu- lar y se refleja en un métabolisme celular inadecuado. Este Fen& meno, en combinacion con otros factores, ocasiona lesiones celu- lares cuya magnitud determine la reversibilidad o irreversibili- dad del shock. - 2 - Para intenter esclarecer la patofisiologla del shock, se ha desarrollado en las ultimas decadas una amplia labor de in- vestigaciôn basada fundamentalmente en estudios de modelos ex­ périmentales de shock. Los dos modelos mis utilizados son: - Endotôxico.- Se basa en la administraciôn por via intraperito- neal o intravenosa de endotoxinas bacterianas. - Hemorrâgico.- Consiste en provocar una hemorragia controlada. Debido a la complejidad del shock, aunque existen numero- sos dates sobre aspectos parciales de los procesos implicados en su patofisiologla, no se conoce la relaciôn entre ellos y, por tanto, no existe una teorla global que permits explicar dicho Fenômeno. - 3 - METABOLISMO LIPIDICO EN EL SHOCK En la ultima década se ha dedicado un esFuerzo crecienta al estudio de las alteraciones metabolicas que acompanan al shock, pero la mayoria de las investigaciones han dirigido su a- tenciôn a los cambios en el métabolisme de hidratos de carbono, mientras que relativamente pocas se han centrado en el metaboli^ mo lipldico. Antes de pasar a comantar los resultados de estes estudios, repasaremos los organos implicados en el metabolismo de los dos lipidos que actuan como sustratos eâergétipos principa­ les, TG y AGL (figura 1). El tracto gastrointestinal y el tejido adipose estan representados como principales proueedores y el miocardio, el mûsculo esqueletico y otros tajidos perifericos, incluido el adipose, como principales consumidores y repos itéras de metabolites lipldicos. El higado ocupa una posicion interme­ dia, puesto que actua como proveedor y consumidor. TRACTO HIGADO MUSCULO ESQUEL. INTESTINAL MIOCARDID, ETC. an LIQUIDO EXTRACELULAR on AGL VLOL Cuerpos catânicos LDL GLICEROL AGL on AGL an Cuerpos + cetonicoa LDL LIQUIDO EXTRACELULAR AGL Glicerol + LDL AGL TEJIDO TEJIDO ADIPOSO ADIPOSO Figura 1.- Esquema del metabolismo de TG y AGL. - 4 - Tanto en el shock endotôxico como en el hemorrâgico tienen lugar cambios en los niveles sanguineos de TG y AGL. Se ha pues­ to de manifiesto en todos los tipos de shock estudiados una ele- vaciôn en los niveles de TG (revision de Spitzer, 1979), refleja- da también en los niveles de lipoproteinas de muy baja densidad (VLDL) responsables del transporte de TG (Sakaguchi y Sakaguchi, 1979). Sin embargo, con respecto a los niveles de AGL existen r£ sultados contradictories. En el shock hemorrâgico los resultados de los primeras es­ tudios mostraron una elevaciôn (Coran y cols., 1972), o bien la inexistencia de cambios en los niveles de AGL (Kovach y cols., 1970); pero en estudios posteriores se ha puesto de manifiesto una disminuciôn en los mismos (Farago y cols., 1971; Kashyap y cols., 1975; Oâniel y cols., 1970). El origan de estas discrepan^ cias estriba probablementa en que en los primeros estudios para provocar la hemorragia se administré a los animales heoarina, la cual ocasiona indirectamente la hidrôlisis de TG en aangre con la consiguiente apariciôn de AGL. Este efecto de la hepari- na se basa en que origine la liberaciôn a la sangre de la lipo­ proteina lipasa (LPL), que en condiciones normales no esta pre- sente en cantidades apreciables. En lo que se refiere al shock endotôxico» Groves y cols. (1970), Kovach y cols. (1970) y Spitzer y cols. (1974) no encon- traron cambio alguno en los nivelas de AGL, mientras que Hirsch y cols. (1964) observaron una elevaciôn inicial transitoria. En estudios mâs recientes Sakaguchi y Sakaguchi (1979) han observa- do el efecto de dos dosis distintas de LPS sobre los niveles de AGL en animales ayunados, encontrando con la dosis mâs baja un increments inicial y después un descenso hasta valores por deba- jo de los contrôles. Con la dosis mâs alta, los niveles de AGL se mantuvieron siempre mâs bajos que los contrôles. Estas dis- crepancias se basan en unas condiciones expérimentales distin­ - 5 - tas, incluyendo diferentes dosis y forma de administraciôn del LPS y fundamentalmente el que los animales hubieran sido some- tidos o no a un tiempo de ayuno previo a la reaiizaciôn del ex- perimento. Este aspecto es decisive, pues los niveles de AGL en suero de animales no tratados se elevan gradualmente, a medida que aumenta el tiempo de ayuno (Sakaguchi y Sakaguchi, 1979). La elevaciôn de los niveles plasmâticos de TG después de la administraciôn de LPS podria ser debida a un incremento en la producciôn o a una disminuciôn en la utilizaciôn. Con respecto a la primera posibilidad, la elevaciôn en los nivelas de AGL prov£ cada inicialmente por el LPS no es suficientemente grande, ni se mantiene un tiempo suficientemente largo, como para dar lugar a un incremento en la sfntesis de TG en el higado (Hirsch y cols., 1964; Sakaguchi y Sakaguchi, 1979). Sin embargo, la utilizaciôn de TG esté disminuida,. y a que se ha observa do an corazôn y teji­ do adipose un descenso en la LPL, responsable de la hidrôlisis de los TG plasmâticos para la incorporacion de sus âcidos grasos en dichos tejidos (Spitzer, 1979; Sakaguchi y Sakaguchi, 1979). No se conoce el mecanismo de la disminuciôn en la actividad de la LPL. Aparté de la influencia de la dieta, los niveles de AGL en sangre estân controlados por el balance entre su liberaciôn y su captura y utilizaciôn. La liberaciôn de AGL del tejido adiposo tiene lugar cuando prédomina la lipolisis sobre la reesterifica— ciôn. La velocidad con que se realiza la lipolisis depends fund£ mentalmente de la actividad de la lipasa sensible a hormonas (LSH) que esté regulada por las catecolaminas y la insulina pri£ cipalmenté. Después de la administraciôn de LPS, o de una hemo­ rragia aguda, tiene lugar un aumento en los niveles de catecol­ aminas en sangre, que conduce a una disminuciôn en la secreciôn de insulina. Taies cambios en los niveles de estas hormonas est£ mulan la lipolisis en el tejido adiposo, al igual que varias — 6 — prostaglandinas que se elevan en el shock endotôxico. Ademâs, se ha observado un incremento en la actividad lipolltica bajo la estimulaciôn con norepinefrina en adipocitos aislados de anima­ les tratados con LPS, efecto que se reproduce "in vitro" expo- niendo adipocitos aislados al LPS, lavéndolos e incubândolos de£ pues en presencia de norepinefrina (Spitzer, 1974). La explicaciôn de que, a pesar de astos hechos, los nive­ les de AGL presenten un descenso probablemente esta en los efec- tos de la disminuciôn del flujo de sangre a través del tejido adiposo, que tiene lugar como donsecuencia del shock tanto endo­ tôxico (Spitzer, 1979) como hemorrâgico (Kovach y cols., 1970; Nielson y Secher, 1970). En primer lugar, una inadecuada perfu­ sion tisular podria retarder la transferencia de AGL del tejido a la circulaciôn, como sugieren los resultados de Kashyap y col., (1975) que observaron una elevaciôn en la concentraciôn tisular de AGL en el shock hemorrâgico. En segundo lugar, debido a la h£ poxia la concentraciôn tisular de lactato se eleva y el pH des- cierde. La acumulaciôn de lactato y el pH bajo en el tejido adi= posa disminuyen el efecto lipolitico de la norepinefrina e incr£ mentan la reesterificaciôn (Nahas y Poyart, 1967; Fredholm, 1971; Hjemdahl, 1975). De hecho, los resultados de Sakaguchi y Sakagu­ chi (1979) indican que la actividad de la LSH solo se increments inicialmente después de la administraciôn de LPS, para disminuir luego a valores por debajo de los contrôles. Se ha puesto de manifiesto ademâs, que en el shock endotô­ xico la velocidad de apariciôn del glicerol se inbrementa consi- derablemente, mientras que la de AGL no cambia (Spitzer, 1979). La base de esta diferencia puede residir en que el incremento en la velocidad de reesterificaciôn afecta a los AGL pero no al gl^ cerol, que no participa en dicho proceso en el tejido adiposo. Por otra parte, Daniel y cols. (1978) utilizando âcidos grasos marcados radioisotôpicamente han observado en shock hemo- — 7 — rrâgico y endotôxico une disminuciôn en la velocidad de recambio de AGL en sangre, que indica tanto una menor movilizaciôn como una menor utilizaciôn. Ademâs, han detectado una menor produc­ ciôn de COg marcado que refleja una disminuciôn en la oxidaciôn de AGL. Paralelamente, Spitzer (1979) ha manifestado que después de la administraciôn de LPS la contribuciôn de los AGL a la ene£ g£a en miocardio esté notablemente disminuida y que este efecto SB da también "in vitro" utilizando miocitos aislados incubados en presencia de LPS, lo cual sugiere una posible acciôn directs del LPS sobre dichas células. COMPOSICION Y ESTRUCTURA QUIMICA DE LAS ENDOTOXINAS Las endotoxinas son lipopolisacâridos (LPS) que se encuen- tran en la pared celular de las bacterias gram negatives y se l£ beran al torrents circulatorio al ser fagocitadas estas. Cuando tiene lugar una invasiôn del organisme par este tipo de bacte- • rias, las endotoxinas pueden alcanzar niveles en sangre capaces de ejercer una amplia gama de ePectos biolôgicos sobre el orga­ nisme huésped (tabla 1) y de originar el shock, Por otra parte, introducidas en el torrente circulatorio de animales de experi- mentaciôn, son capaces, incluso en cantidades minimas, de indu- cir un shock circulatorio profundo. NO TOXICAS TOXICAS InfDunaldgicos Plrogenicidad Witogenicidad para linfocitos 8 Letalidad Acciôn adyuuanta Fenômeno de Schwartzman Activaciôn de células 8 policlonales Necrosis de médula ôsea Antlganicidad independiente del timo Lsucopenia Activaciôn de macrofagos Leucocitosis Incremento de la fagocitosis Hipotensiôn Incremento de la resistencia no especlfica Aborto a la infecciôn Necrosis tumoral Inducciôn de : slntesis de prostaglandinas, interferôn, actlvador del plasminôqeno. Factor estimulante de colonias. Activaciôn del complemento Activaciôn del factor Hageman Tabla 1; Actlvidadns biolâglcas de las endotoxinas. - 9 - La extracciôn selectiv/a de productos de bacterias, que po- seian actividad endotôxica, estableciô la base para avances cien^ tificos significatives en la comprension de su bioquimica (revi­ sion de Uilkinson, 1977). Los dos métodos de extracciôn mas ex- tendidos son los descritos por Boivin y Mesrobeanu (1935) y Ues^ phal y cols. (1952). El primero de ellos incluye una extracciôn con âcido tricloroacético 0.25M a y da lugar a preparaciones endatôxicas, que consistée fundamentalmen te en LPS, pero contie- nen ademas proteinas y lipides. El segundo procedimiento se basa en una extracciôn con fenol-agua (45:55, v/v) a GB^c, seguida de enfriamiento del extracto que sépara dos fases. La fase acuosa contiene LPS en forma de comptejo con âcidos nucléicos y su cen- trifugaciôn posterior a 105.000xg rinde preparaciones libres de proteinas y acides nucléicos. Ademas de estos procedimientos, otros investigadores han descrlto distintos métodos igualmente utiles (tabla 2). Tratamiento Referenda bibliogréfica Oiatilan glicol Morgan y Partridge (1942) Piridina-agua Goebel y cols. (1945) Olotil etor-agua Ribi y cols. (1959) Sulfôxido de dimetilo, 60®C Adams (1967) EDTA (pH 0.0-8.5), 37®C Leive y cols. (1969) renol-cloroformo-eter de petroleo Galanos y cols. (1967) NaCl IM y citrato sôdico 0.111 (pH 7.0), 0-4°C Raynaud y cols. (1973) Butanol-agua, 0-4°C Morrison y telve (1975) Tabla 2 , Otros métodos do extracciôn do LPS ■Las preparaciones obtenidas con los distintos métodos de extracciôn contienen cantidades variables de impurezas, le cual — 10 — podrla axplicar las discrapancias entra los resultados de algu- nos grupos de inuastigaciôn. En general, la molécula de LPS contiene una région de hete- ropolisacarido unida covalentemente a una lipidica denominada 1^ pido A (figura 2) . EtMH Ip l A6 — G1c (NH_) — KDO — KOO — hept — hept — çlc — gsl — glc flC — Clc(MH.) I I ' AG AC Lipido A KOO EtNH hept glcNAc Nùclso central ^gal — glc — glcNAcX ̂ col col /n Cadenas latérales II Llpldo A Ndclao central Cadenas latérales Figura 2.- I. Estructura qulmica del LPS de E. coli 0111:04. II. Modelo Bsquematico de la estructura basica de los lipopolisacâridos bacterianos. La porciôn de polisacérido contiens a su uez dos regiones: - Nucleo central.- Contiene âcido 2-ceto-3-desoxi-octanôico (KDO) heptosas, fosfoetanelamina y hexosas y suele ser identieo para cada grupo taxonômico de bacterias. Los grupos hidroxilo li­ bres de los azûcares generalmente estân fosforilados. - Cadenas latérales.- Son de dos a diez unidades repetidas de — 11 — oligosacârido, que contienen cada una très o cuatro unidaces diferentes de hexosa, entre las que se encuentran frecuente- mente 6-desoxi- y 3,6-didesoxi-hexosas. En ellas residen los déterminantes antigénicos y son especificas de especie. La estructura basica del lipido A (figura 3} aislado de un amplio conjunto de bacterias es muy similar y esta constituida por un asqueleto de glucosaminil-/3-r, 6-glucosamina sustituido en las posiciones 1 y 4 por grupos fosfato, que pueden former puentes pirofosfato con otro disacârido de glucosamina de otra unidad de lipido A. Los restantes grupos hidroxilo se encuentran generalmente esterificados por una amplia gama de âcidos grasos, entre los que predominant 12:0, 14:0, 16:0, 18:0 y 18:1. Los gru pos amino estân formando enlaces amida con ^-hidroxi-âcidos gra­ sos, preferentemente 0H-12:0 y OH-14:0, que son caracteristicos de cada grupo de bacterias. En algunos casos les grupos hidroxi­ lo de estos âcidos grasos estân esterificados por otros âcidos grasos. Finalmenta, es corriente la presencia de etanoiamina en el lipido A. HC-OH CM,I„-CM, a Figura 3.- Estructura del lipido A. — 12 - lîlîHHtîî; Pared externa LPS # Fosfollpido Proteina • Cation Peptidoglicano rig. 4.- Modelo de la pared celular -de bacterias Gram—negati­ ves. Las moléculas de LPS pueden estax dispersas en­ tre las moléculas de fosfolipidos y la repulsion else trostética entre las regiones de KDO-heptosa del nû- cleo de oligosacârido no existe debido a la presencia de moléculas de fosfolipidos que separan las de LPS. En otros casos los cationes bivalentes reducen esta r£ pulsion. Cuando los fosfolipidos presentan grupos car- gados negativamente la interacciôn requiers la partie^ paciôn de cationes. Las moléculas de proteinas también interaccionan con LPS y con los fosfolipidos quiza im- plicando a los cationes. - 13 - COMPORTAMIENTO Y PROPIEDAOES FI5IC0QUIMICA5 DEL LPS EN DI5Q- LUCION Las moléculas de LPS poseen caracter anfipatico, pues con­ tienen una region hidrofila (polisacérido) y otra hidrofoba (li­ pido a ). En solucion acuesa a pH 7 se encuentran en forma de po- lianidn, debido a la ionizaciân de los grupos fosfato, y tienden a formar agregados polidispersos con un tamano de particula de varios millones de Dalton. La microscopia electronica ha revel^ do la existencia de estructuras caracteristicas que recuerdan fragmentas de membrana y pueden presenter varias formas, en de- pendencia del organisme de origen y del procedimiento de extrac- cion: discos, lamelas, vesiculas (revision de Kabir y cols., 1978). A partir de estos estudios se han propuesto modelos mole_ culares, segun los cuales los agregados estan constituidos por bicepas de LPS semejantes a las membranes biolégicas (figura 5). Las fuerzas,. qua intarvienen en la autoagregacion de las moléculas de LPS, son similares probablemente a las implicadas en la union de estas macromoléculas a los otros componentas de la pared celular externa de las bacterias, como interacciones h^ drofébicas, fuerzas mediadas por cationes metalicos y puentes de hidrogeno (figura 4). As! los agregados pueden dispersarse me­ diants el tratamiento con detergentes, como dodecilsulfato sôdi­ co, Triton X-IDO y desoxicolato sôdico o con agentes quelantes, como EDTA (revisiôn de Wilkinson, 1977). Todos estos tratamien- tos dan lugar a cambios, tanto en las propiedades fisicoquimicas del LPS, como en su actividad biolôgica. Los estudios més recientes de Shands y Chun (1980) han in- dicado que la subunidad basica de LPS de S. tiphimurium es un d^ mero. — % 4 — RELACIOM ESTRUCTURA ACTIVIDAD BIOLOGICA A. PAPEL DEL LPS COMO COMPONENTS DE LA PARED EXTERNA DE BAC­ TERIAS. La pared externa de bacterias es muy rica en PE y bastante déficiente en glicerofosfolipidos âcidos en comparaciôn con ou­ tras membranas (Osborn y cols., 1972). Esto hace suponer que quiza la proporcion KOO-lipido A cargada negativamente posea un papel en el ensamblaje de dicha pared, similar al que desempenan los glicerofosfolipidos âcidos en otros tipos de membranas. Tambien parece claro que el LPS es necesario para el fun- cionamiento de la pared externa como barrera de permeabilidad y que contribuye a su rigidez (revision de Nikaido, 1973). 0. ACTIVIDAD TOXICA. El primer paso en la elucidaciôn del mecanismo primario de accion de las endotoxinas fus la caracterizaciôn de la porciôn activa de las moléculas de LPS. Les investigaciones en este cam- po avanzaron considerablemente con el descubrimiento de la exis­ tencia de ciertos mutantes rugosos de bacterias, que son défi­ cientes en determinadas glucosiltransferasas y por ello producen un LPS con la regiôn de polisacérido incomplets. Uno de estos mu tantes (Salmonella minnesota R595) es déficiente en heptosas y su LPS contiens unicamente lipido A y KDO. La demostraciôn de que las preparaciones de LPS obtenidas a partir de este mutante man^ festaban todas las propiedades tôxicas de las preparaciones obte nidas de bacterias lisas, estableciô firmemente que el lipido A desempena un papel dominante en la endotoxicidad (revisiôn de bir y cols., 1978). Por otra parte, se han utilizado algunos procedimientos f^ sicoqulmicos para modificar selectivamente determinadas porcio^ nés de la molécula de LPS, estudiando las variaciones en la act^ - 15 - - 16 - vidad tôxica que se produclan (tabla 3). Los resultados de estos estudios sugieren que la porciôn de polisacérido del LPS no es Fundamental para la toxicidad, pero sirue de transportador para la porciôn lipidica insoluble en agua. Ademâs, participa en las interacciones del LPS con ciertos tipos de celulas y de protei­ nas humorales que influyan sobre su distribuciôn en un animal y sobre las reacciones inmunes que provoca. Asi mismo, los écidos grasos aparecian como componentes funcionales fundamentales de la molécula de LPS, lo cual esté apoyado por estudios posterio- res, en los que se han encontrado ciertas actividades tôxicas propias de las endotoxinas en: varias N-acil derivados de glu­ cosamina (Behling. y cols-^ 1976) y complejos da âcido mirxstico con albumina y concanavalina A, dimetilmir1stamida con concana- valina A y esfingosina con albumina (Bradley, 1976; Bradley y cols., 1977). Nowotny y cols. (1975) han aislado una Fracciôn de polisa— carido que posee ciertas actividades biolégicas adscritas a las endotoxinas. No es extrano que varias fracciones de la molécula de LPS presenten actividad biolôgica, teniendo en cuenta que las endotoxinas ejercen sobre el huésped una coleciôn de efectos ( t̂ a bla 1). Por otra parte, es necesario indicar también que existen diferençias entre la actividad biolôgica de las preparaciones de LPS libres de proteinas y las obtenidas por extracciôn con TCA o butanol. Fundamental mente en lo que se refiere a la respuesta in̂ mune (revisiôn de Morrison y Ryan, 1980). C. INTERACCLÇN CON MEMBRANAS. La interacciôn de las endotoxinas con las membranas celul^ ras es de una importancia considerable, pues constituye el primer paso en el desarrollo de su acciôn tôxica a nivel celular. Se ha observado que los LPS presentan afinidad por las mem branas de numerosos tipos de células de mamiferos (revisiones de - 17 - Kabir y cols.,. 1970; Morrison y Ulevitch, 1978; Bradley, 1979). Los resultados de numerosos estudios de modificaciôn quimica del LPS han permitido concluir que su porciôn lipidica es esencial para la union a membranes (tabla 3). Esta idea esta apoyada ade­ mas por el hecho de que los fosfolipidos y el colesterol inhiben la union del L PS a la membrana de eritrocitos (Neter y cols., 1955) . Se han propuesto dos hipôtesis para explicar la base de la union del LPS a membranas : a/ interacciôn con un receptor especi_ fico de membrana y b/ incorporaciôn en la bicapa lipidica de la membrana. Con respecto a la existencia de receptores de membrana es- pecificos para el LPS existen pocos datos. Unicamente, Springer y ftdye (1977) han aislado y caractarizado una lipoglucoproteina de membrana de eritrocitos, que une LPS especifica y reversible- mente y sus resultados sugieren oue sôlo el components protéi- co de este receptor de LPS esta impiicado en la uniôn. Shands (1973) explicô la interacciôn del LPS con las mem— branas de los eritrocitos sobre la base de su modelo molecular de los agregados de LPS y de estudios de microscopia electronica, en los que demostrô que el LPS se unie a la membrana por los bor des de lasbicapas que forman sus moléculas (figura 5). Considéra ba este autor que este proceso implica interacciones hidrofôbi- cas entre grupos de las moléculas de LPS y gruoos o receptores de la membrana. Figura 5.- Modelo de la interacciôn del LPS con una bicapa lipidica de membrana. nniniinininniini A. Uniôn por loe bordes de la bica- ^___ __ pa de LPS en la que algunos âci- — wmm-^ * dos grasos de la regiôn de lipi- ■ do A podrian solubilizarse en la \y-mm ■ B. Apertura de la bicapa de LPS pa- ra permit!r la interacciôn de los âcidos grasos. B - 18 - El mecanismo planteado concuerda con los resultados de va-' rios estudios. En primer lugar, se observé que los LPS tratados con alcalis presentaban una mayor afinidad hacia los eritrocitos (Neter, 1956) y ademâs causaban su lisis (Ciznar y Shands, 1971) actividad que no poseian los LPS nativos. Shands (1971) explicô estas diferençias considerando que en los LPS nativos los âci­ dos grasos unidos por enlace ester y los unidos por enlace amida SB encuentran recluidos en el interior de la estructura en bica­ pa, mientras que en los LPS tratados, teducidoe a monocapa, po­ drian quedar expuestos hacia el exterior mâs grupos acilo. Paralelamente se puso de manifiesto que el calentamiento a 100°C de los LPS también incrementaba su afinidad hacia los eri­ trocitos (LUderitz y cols., 1958) y linfocitos (Kabir y Rosens- treich, 1977), si bien en menor magnitud que el tratamiento con alcali. La explicaciôn de este hecho no esta totalmente clara, pero es posible que se base en que debido al calentamiento los LPS sufran una desagregaciôn, o bien un cambio conformacional. En el casa de monocitos, poiimorfonucleares neutrôfilos, linfocitos 0 y T y plaquetas se ha concluido que la interacciôn de su membrana con el LPS reside en una fracciôn lipidica com- puesta fundamentalmente par glicerofosfolipidos (revisiôn de Mo­ rrison y Ulevitch, 1978). Gimber y Rafter (1969) propusieron que la interacciôn LPS-fosfolipidos puede implicar cationes bivalen­ tes, o bien basarse simplemente en interacciones hidrofôbicas en̂ tre grupos acilo. Por otra parte, se han realizado estudios con monocapas y bicapas fosfolipidicas y liposomas, los cuales han demostrado. que el L PS posee afinidad por dichos sistemas y es capaz de in- corporarse en ellos. Este hecho apoya la idea de que la uniôn del LPS con las membranas celulares implique una atracciôn entre la regiôn lipidica del mismo y los lipidos de membrana. - 19 - Schuster y cols. (1970) y Benedetto y cols. (1973) observa ron que el LPS ten£a un efecto desestabilizador sobre bicapas corn puestas por PC y colesterol. Taies resultados sugieren la posibi- lidad de que la interacciôn del LPS con las membranas celulares de mamiferos también de lugar a su desestabilizaciôn. Recientemente Onji y Liu (1979) han demostrado que el LPS provoca cambios en la carga superficial de liposomas fosfolipidi^ 2 + C O S , siendo necesaria la presencia de Ca en el casa de liposo­ mas con carga negatiua, pero no en el de liposomas con carga po­ sitiva o neutra. Estos resultados indican que el LPS interaccio- na con los liposomas tanto hidrofôbica como electrostaticamente. Ademas, sugieren la posibilidad de que la interacciôn del LPS con la membrana celular provoque cambios en la carga superficial de la bicapa fosfolipidica, alterando asi sus propiedades biolôgi- cas . - 20 - ACCION DEL LPS A NIVEL CELULAR Practicamente todos los drganos se ven afectados en la en- dotoxemia, pero au n no esta complétamente claro en cuales el eFe£ to se basa en una acciôn tôxica directa del LPS y en cuales se b£ sa mâs bien en la acciôn de otros efectores, cuya apariciôn es s£ cundaria a dicho fenômeno. Asimismo, tampoco se conoce bien la participaciôn de la lésion de los distintos ôrganos en el desarr£ llo del shock endotôxica. Debido a su importancia central en los mecanismos de reac- cion del organisme se ha centrado gran atenciôn sobre la acciôn tôxica del LPS sobre el hfgado, las celulas del endotelio vascu­ lar, las plaquetas y las células del sistema inmunolôgico (revi­ siones de Utili y cols., 1977; Morrison y Ulevitch, 1970; Bradley, 1979). ACCION SOBRE LAS CELULAS DEL SISTEMA INMUNOLOGICO Macrôfagos, leucocitoâ polimorfonucleares y linfocitos son sensibles al LPS. Macrôfâqos Los macrôfagos liberan selectivamente enzimas lisosomales después de la exposiciôn al LPS (Uelscher y Cruchaud, 1975). Ac- tivados "in vitro" por LPS, destruyen células tumorigénicas por un mecanismo nô fagocitico que requiers un contacte directe y en el cual se transfieren los lisosomas del macrôfago al citoplasma de la célula susceptible que subseeuentemente se lisa. Esta ac­ ciôn citotôxica es inhibida por hidrocortisona, agente estabili^ zador de membranas, que impide la fusiôn de las mismas requerida para la transferencia. Asimismo, es inhibida por el azul trypan, inhibidor de enzimas lisosomales. Por todo ello, Hibbs (1974) ha propuesto que dichàs enzimas son los efectores de los macrôfagos - 21 - actiuados. Bradley (1979) sugiere que tanto la citotoxicidad sobre c£ lulas humorales mediada por macrofagos, como la mitogenicidad, inducidas ambas por el LPS, implican la accion de los lisosomas en el ciclo celular. Si tal accion se centra en al nucleo de su propia célula (Figura 6 ), la consecuencia es mitogenicidad, pero si se centra en el nucleo de otro tioo de célula el resultado es la citotoxicidad. LPS (1) Endocitosls (2) Formacifin de lisosonss sscundarios (3 ) Liberaclôn de enzimas lisosomales (à) Interacciôn de lisosomas activa- dos con el nucleo, originando una respuesta mitcgénica (5) Aumento en la sintesis de mRMA, que conduce a un incremento en los nivales de enzimas lisosomales (5) AutoFagia, que da lugar a la des- trucciôn de las mitocondrias y o- tras particulas subcelulares Figura. 5 .— Consecuencias celulares de las interacciones entre el LPS y los lisosomas. Rosenstreich y cols. (1977) observaron que macrofagos de raton sintetizaban y liberaban grandes cantidades de prostaglan- dinas PGE^ V después de la exposiciôn "in vitro" al LPS, mientras que los de una estirpe résistante al LPS no presentaron esta respuesta. Kurland y Bockman (1970) también han descrito la produccion de PGE^ y PGE^ bajo la acciôn del LPS. Este fenômeno podria tener una gran importancia, considerando que, como se de- tallara mas adelanté, ekisten datos que sugieren .que las prosta- - 22 - glandinas participan en la patofisiologla del shock endotoxico y que durante el desarrollo del mismo se eleven los niveles sangul- neos de PGE 2 y PCF 2 *. Otros mediadores liberados por los macrôfagos en respuesta a la endotoxins son sustancias procoagulantes, pirogenos, colag£ nasa y el factor estimulanta de colonias, necesario para el cre- cimiento "in vitro" de colonias de monocitos y granulocitos. A la vista de estos datos y de otros experimentos "in vivo" (revisiôn de Morrison y Ulevitch, 1970) es tentador especular s£ bre un papel central de los macrofagos en la elaboraci6 n_de medi£ dores responsables de muchos de los efectos de las endotoxinas "in vivo". Leucocitos polimorfonucleares El LPS es capaz de inducir "in vitro" la liberaciôn de enz£ mas lisosomales en leucocitos polimorfonucleares (Uhite y Montgo­ mery, 1977). Este hecho tiene importancia,considerando que dichas celulas estan implicadas como mediadores de la lesion tisular en muchos procesos inflamatorios, incluyendo la reacciôn de Shuartz- man. La lesiôn tisular esta ocasionada en su mayor parte por los constituyentes lisosomales de leucocitos polimorfonucleares (Dean y Barret, 1976), sustancias que son capaces de digerir los compo­ nentes del tejido conectivo, incrementar la permeabilidad vascu­ lar y activar otros mediadores de la inflamaciôn como las quininas La participaciôn de este fenômeno en el desarrollo del shock esta apoyada por la observaciôn de que si se eliminan de la circulaciôn los leucocitos polimorfonucleares en algunas espe cies animales, se altéra profundamente su respuesta a la admini£ traciôn intravenosa de LPS. Sin embargo, esto no ocurre en prim£ tes (Pingleton y cols., 1975). Por otra parte se han descrito otros efectos "in vitro" del LPS sobre estas células, como la inhibiciôn de la actividad ATP- - 23 asa de la membrana plasmâtica y ciertos cambios en sus funciones y en determinadas actividades metabôlicas (revisiôn de Morrison y Ulevitch, 1978). Linfocitos Los linfocitos B sufren mitogénesis bajo la acciôn del LPS, que provoca una serie de cambios bioquimicos después de su uniôn. Estas cambios incluyen una alevaciôn de los niveles de c-GMP y un aumento en la captura de aminoacidos e iones, preferentemente Ca^ . Este ion parece jugar un papal importante, pues el ionôforo de ca­ tiones bivalentes A231B7 también induce la transformaciôn y ade- 2 + mâs, este efecto no tiene lugar cuando el Cà esté ausente en el medio (Luckasen y cols., 1974). A su vez, el c-GMP es mitogénico por si mismo, lo cual ha conducido a Uatson (1975) a sugerir que dicho compuesto actue como segundo mensajero de la acciôn de los LPS sobre los linfocitos B . Por otra parte, el LPS puede inducir la diferenciaciôn de los linfocitos B "in vitro", dando lugar a la apariciôn de célu­ las que sintetizan inmunoglobulinas G y M (Kearney y cols., 1976) También es capaz el LPS de infljir sobre la funciôn tanto de los linfocitos T cooperado res como de otros tipos be linfoci- t:o»,- ACCION SOBRE LOS ERITROCITOS Altas concentraciones de LPS sometido a hidrôlisis alcali­ ns suave causan la lisis de los eritrocitos (Ciznâr y Shands, 1971). Sin embargo, concentraciones mas bajas del mismo producto, provocan una alteraciôn en el contenido de K'*' y Na'*' de los eri­ trocitos, debido quizâ a un incremento en la permeabilidad de e£ tos iones a través de ciertas regiones de la membrana de los er£ trocitos, posiblemente combinado con un efecto indirecte sobre la actividad ATPasa dependiente de Na* y K* présenta en la mem­ brana. — 24 — ACCION SOBRE LAS PLAQUETAS A partir de los resultados de distintos tipos de experimen taciôn, tanto "in vivo" como "in vitro", se han propuesto (revi­ siones de Morrison y Ulevitch, 1978 y Ualker, 1979) très mecanis_ mos a través de los cuales las interacciones de las endotoxinas con las plaquetas pueden contribuir al sindrome del shock: a/ 1 beraciôn de sustancias vasoactivas taies como histamina y serot£ nina; b/ formacion de agregados plaquetarios intravasculares o- clusivos; c/ inducciôn de coagulaciôn intravascular disaminada por generaciân de la actividad del factor plaquetario 3. Existen diferençias fondamentales entre distintas especies animales en la importancia relative de esta respuesta, ya que los mecanismos de interacciôn endotoxina-plaqueta dependen criticameti te de la presencia de sitios de adhérencia inmunolôgica en la meim brana de las plaquetas, là cual no se da en todas las especies a- jiimales. La respuesta en las plaquetas que poseen dichos sitios, SB inicia con la uniôn de la endotoxina a la membrana plaquetaria a través de la regiôn de lipido A. Esta union permite la asocia— ciôn de los componentes de la ruta alternativa del complements sobre la porciôn de polisacérido de la endotoxina, que en el mi- croentorno de la membrana plaquetaria origina el ensamblamiento de Los componentes terminales del complemémto y la subsecuente lisis de las plaquetas. Ademâs de esta respuesta litica, Oades y Morrison (1978) han descrito una respuesta secretora "in vitro" independiente del complemento, que es dependiente de energia y parece basarse en un efecto ionôforo para el Ca2+ llevado a cabo por el LPS. Esta res- peesta sôlo se maniflesta con el LPS del mutante rugoso S. minne­ sota R595 deficients en polisacérido. La respuesta de las plaquetas carentes de sitios de adheren cia inmunôlôgica a las endotoxinas esta definida mucho menos cla- ramente y existen resultados conflictivos en la literature. Pare­ ce que la mayoria de las endotoxinas ejercen pocos o ningun efec- - 25 - to sobre este tipo de plaquetas, entre las que se incluyen las humanas (révision de Mbrrison y Ulevitch, 1978). ACCION SOBRE LAS CELULAS RETICULO-ENDOTELIALES Existen evidencias expérimentales que sugieren que los efe£ tos de la interacciôn de la endotoxina con las celulas reticulo- endoteliales pueden contribuir a la patogénesis del shock endoto- xémico. En primer lugar, los estudios de inmunofluorescencia indi­ rects han mostrado que el LPS se localiza en el endotelio de los capilares y ciertos vasos en varios tejidos, incluido el hlgado, t r anscur r ido cierto tiempo después de su inyecciôn. En segundo lu_ gar, se ha demostrado la lésion de las células reticulo-endotelia- les mediante estudios morfolôgicos y de recambio por administra- cion de timidina seguida de autorradiografia, ambos "in vivo". Ademâs esta lesiôn es independiente del complemento (revisiôn de Morrison y Ulevitch, 1978). Por otra parte, la perfusiôn"in situ"de un rinôn con endot£ xina, seguida de administraciôn sistémica de una segunda dosis de endotoxina, da lugar a la apariciôn de una reacciôn de Schwartz- man unilateral en el rinôn perfundido (Raiji y cols., 1977). Es­ tos autores sugieren que el fenômeno inicial en el desarrollo de la necrosis cortical del rinôn podrla ser un efecto local de la endotoxina sobre el endotelio vascular del mismo. MacIntyre y cols. (1978) han demostrado que las células re- ticulo-endoteliales son capaces de capturer y transformer la PGH^ de origen plaquetario en PCI potente agente antiagregante plaque­ tario e hipotensor. La lesiôn de las células reticulo-endotalia- les puede dar lugar a que la PGH^ se acumule en el medio y en la plaqueta siendo transformado en tromboxano TXA^, potente agente vasoconstrictor y agregante plaquetario, que es liberâdo al to­ rrents circulatorio. De hecho Cook y cols. (1980) han demostrado una marcada apariciôn en sangre de TXA^ después de la administra­ ciôn de endotoxina y sus resultados sugieren que este compuesto - 26 - es un factor primario en la patogénesis del shock. Alternativamente, la lesiôn de las células puede exponer la membrana basai vascular y aportar asf un lugar de activaciôn del factor Hageman de la coagulaciôn. Si esto ocurriese, no sôlo se iniciaria una coagulaciôn localizada, sino también la elabora- ciôn de potentes agentes vasoactivos,como la bradiquinina. Por tanto, la lesiôn original podrfa quedar amplificada enormemente a través de un conjunto de mediadores. ACCION SOBRE EL HIGADO En la endotoxemia se ven alternadas numerosas actividades metabôlicas del higado, habiéndose observado una desapariciôn de las réservas de hidratos de carbono, una inhibiciôn de la induc­ ciôn de ciertas enzimas y de la gluconeogénesis (revisiones de IJ tili y cols., 1977 y Goodrum y cols., 1978). El LPS induce ini— cialmente una hiperglucêmia .transltoria que résulta de una sali- da incrementada de glucosa hepética, debida a un aumento en la glucogenolisis. Pero seguidamente se desarrolla una hipoglucemia marcada,como consecuencia de una captura elevada de glucosa por los tejidos periféricos y de la imposibilidad del higado para compensarla con un aumento en la salida de glucosa (Uolfe y cols. 1977). Estos efectos sobre el metabolismo hepâtico han sido rel£ cionados por muchos autores con los cambios observados en la ac— tividad de enzimas implicadas en las rutas metabôlicas de los h£ dratos de carbono (revisiôn de Bradley, 1979). Se ha propuesto que el LPS actua indirectamente por media- ciôn de la liberaciôn de epinefrina, pero esta hipôtesis no ha sido corroborada por los resultados de varios estudios experimen taies (Zwadyk y Snyder, 1973). De cualquier forma, los estudios de Filkins y cols. (1975) y Tilkins y Cornell (1974) sugieren que la mayoria de los cambios en el metabolismo de hidratos de carbono son secundarios al shock. Estos autores observaron ini- cialmente que en el transcurso del shock traumâtico tenian lugar - 27 - cambios en la glucemia seme jantes a los observadosen el shock ejn dotôxico. Posteriormente, midiendo la conversion de alanina en glucosa "in vitro" en hepatocitos aislados e "in vivo", concluy£ ron que la gluconeogénesis esté disminuida en ambos tipos de shock. Un aspecto fundamental en la dilucidaciôn del papel del h^ gado en la patofis iologia del shock endotoxico es si las célu­ las parenquimatosas son afectadas directamente por el LPS o no. Existen datos de distintas lineas de investigaciôn que sugieren una respuesta afirmativa, como se comenta en détails a continua- ciôn. Estudios de distribuciôn de ^^Cr-LPS han demostrado que el higado juega un papel principal en la eliminaciôn de la endoto\i na circulants de la sangre y ademâs, parece ser el ôrgano mâs im portante en la inactivaciôn de la toxicidad del LPS (rev. de Ut£ 1i y cols., 1977). Asi, al higado de raton captura en una hora mâs del 80% del LPS inyectado por via intravenosa (Ualker y Sny­ der, 1978). Cerca del 45% del LPS se encuentra aaociado con la fracciôn nuclear, el 20% con la mitocondrial-lisosomal y el 30% con la soluble, si bien, no se ha establecido definitivamente que estos valores refiejen una verdadera distribuciôn intracelu- lar del LPS, pues puede tener lugar una redistribuciôn durante la preparaciôn y separaciôn de las fracciones subcelulares. De cualquier forma, mâs del 75% del LPS esté asociado con los hepa- tocitos (Zlydaszyk y Moon, 1976), lo cual prueba que el LPS tie­ ne acceso a dichas células e interacciona con ellas. La interacciôn del LPS con la membrana plasmâtica de los hepatocitos ha sido demostrada en estudios "in vitro" con hepa- tocitos aislades de conejo mediantes técnicas de inmunofluores­ cencia (Ramadori y cols., 1979) y también en estudios de uniôn 14de d-LP3 a hepatocitos aislados de rata realizados recienteme£ te en nuestro laboratorio (Portolés, 1980). A la vista de los r£ - 28 - sultados de estos ultimos estudios, puede concluirse que en el proceso de uniôn del LPS a hepatocitos aislados no parecen estar implicados receptores especlficos de membrana; por ello puede pensarse en un mecanismo de uniôn inespecifico en el que la por­ ciôn lipidica del LPS se pone en contacte con los grupos hidrop£ bicos présentas en la membrana celular. Teniendo en cuenta la ac tividad Fagocitaria de los hepatocitos, esta union podria estar relacionada con los procesos normales de endocitosls celular. Los estudios morfolôgicos por microscopia ôptica y electr^ nica han puesto de manifiesto la apariciôn de una serie de cam­ bios a nivel celular y subcelular después de la inyecciôn de do­ sis de LPS létales o prôximas a ellas en distintos animales de experimentaciôn (revisiôn de Utili y cols., 1977; Nordstoga y A_a sen, 1979). Las células se hinchan y lo mismo ocurre con estruc­ turas subcelulares como el reticulo endoplôsmico y las mitocon- drias. Estas ultimas llegan finalmente a presentar una ruptura de sus membranas y una compléta desapariciôn de la estructura i£ terna mitocondrial. En los lisosomas disminuye al numéro de par­ ticules dansas. La lesiôn de los hepatocitos puede llegar en las etapas finales a la liberaciôn de materiales citoplasmâticos y a la muerte celular. Se fia dedicado la méxima atenciôn a las alteraciones en las mitocondrias debido a su importancia capital para la célula. An­ tes de profundizar en este campo, se describirân las aspectos es tructurales y funcionales,de las mitocondrias, necesarios para su comprension. - 29 - CARACTERISTICAS [STRUCTURALES Y FUNCIONALES DE LAS MEMBRANAS MITOCONDRIALES La mitocondria posee una membrana externa, un espacio in- termembranoso, una membrana interna y una matriz. I) Membrana externa: Solamente una minorla de las enzimas mitocondriales se encuen­ tra localizada en la membrana externa (tabla 4 ) (revisiôn de De- Pierre y Ernster, 1977). Enzimas Membrana externa Membrana interna NAOH-citocromo b^ reductasa 5 Citocromo b^ Monoamino oxidasa Acil graso-CoA sintetasa Fosfolipasa A^ Glicero-P-acii transferasa Lisofosfatidato-acil transferasa Componentes de la cadena respiratoria Sistema de fosforilaciôn ligado a la cadena respiratoria (ATPasa F^) NMOH deshidrogenasa (sensible a antimicina) Succinato deshidrogenasa 0-hidroxibutirato deshidrogenasa Fosfolipasa A^ Carnitina-acil transferasa Tabla 4.- Localizaciân de los catalizadores en las membranas de las mitocondrias de higado de rata. Se acepta de forma general que la membrana externa es per­ meable a moléculas de pesos moleculares de varios miles, si bien - 30 - esta permeabilidad no refleja su compasiciôn, pues posee una re- lacion fosfolipidos/proteina doble que la correspond lente a la de la membrana interna. Ademâs contiene una cantidad significa- tiva de colesterol, components que disminuye la permeabilidad die membranas artificiales a sustancias no lipldicas (Ernster y Kuy- lenstierna, 1970) . Por ello, se ha planteado la posibilidad de que esta alta permeabilidad de la membrana externa sea un arte­ facts, debido quizâ a la distension de su estructura durante el aislamiento de la fracciôn mitocondrial (Tedeschi, 1971). Membrana interna : En la membrana interna mitocondrial residen la cadena re£ piratoria, sistema enzimâtico, que transfiere al oxlgeno los e- lectrones recogidos de una gran uariedad de sustratos metabôlicos (figura 9) y ademâs, otros procesos de transducciôn de energia relacionados con alla, como la sintesis de ATP (tabla 4). Debido a ello pesee una complicada organizaciôn estructural y es muy r£ ca en enzimas. La membrana mitocondrial interna es posiblemente la membra na mas rica en proteina, pues contiene aproximadamente un 75% de proteina y un 25% de lipidos. La proteina estructural représenta el 60-70% del total de proteina y probablemente constituye un e£ queleto para la colocaciôn especifica de los componentes de la cadena respiratoria en la membrana. Los lipidos de esta membrana son en un 90% fosfolipidos (tabla 5) y constituyen un raqueri- miento esencial para la funciôn de todas sus estructuras. Los fosfolipidos de la membrana interna difieren en su corn posiciôn de los de la externa, presentando la peculiaridad de un alto contenido en DPG (revisiôn de McMurray, 1973). Ademâs, di­ chos fosfolipidos poseen una distribuciôn àsimétrlca en las dos caras de la bicapa (Krebs y cols., 1979 ), de forma que el orden de abundancia en la cara externa o citoplasmâtica es: PC>PE>DPG - 31 - y en la interna o de la matriz es PE>DPG^PC (tabla 5) Mitoc. compléta Membrana interna Membrana externa Cara interna Cara externa Total PC 40.5 11.0 28.0 37.9 45.4 LPC 1.4 0.6 1.8 PE 34.7 21.0 13.0 38.3 30.4 PI 6.6 2.0 8.4 SM 2.4 0.8 4.4 OPG 14.8 18.0 6.0 20.4 9.5 Tabla S. Compos iciôn en fosfolipidos de las manbranas mitocondrlales de higado de rata. También en la composiciôn en acides grasos de los fosFolie pidos existen diferençias entre las dos membranas mitocondrlales pues los constituyentes de la interna son mâs ricos en acidos grasos insaturados (revision de McMurray, 1973) (tabla 6 ). En e£ té aspecto son interesantas ademas, las diferençias entre las distintas clases de fosfolipidos en cuanto al contenido en aci— dos grasos insaturados, ya que PC es muy rica en 10:2 y 20:4, PE la es mas en 20:4 y DPG solo es rica en 10:2, el cual es, por otra parte, su acido graso mayoritario. Con respecto a la distribuciôn posicional de los grupos acilo en 1 os f osf olipidos de las membranas mitocondrlales (tabla 7) cabe resaltar que, como ocurre en general en las demas membra nas, la posiciôn sn— 1 esté ocupada preferentemente por âcidos grasos saturados o monoinsaturados, mientras que ee la posiciôn sn-2 SB encuentran los de mayor numéro de insaturaciones. La ex- cepciôn esta en el DPG, que présenta 18:2 en las dos posiciones (Pfeiffer y cols., 1979). - 32 - Acidos grasos (como % del total de ac:. grasos en peso) 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:3 20:4 22:6 Mitoc . compléta 0.4 27.0 3.9 21.6 13.0 12.4 1.3 17.7 2.9 PC Memb. interna 0.3 27.1 3.6 18.0 16.2 15.8 1.0 18.5 3.8 Memb. externa 0.4 27.0 4.1 21.0 13.5 13.5 l.I 15.7 3.5 DPG Mitoc Memb. . compléta interna 0.2 0.7 7.0 7.0 7.6 6.5 3.6 4.3 19.9 19.7 58.8 58.6 1.2 1.8 2.4 1.5 Mitoc . compléta 0.3 26.6 3.2 27.3 12.0 5.4 22.0 3.2 PE Memb. interna 1.2 19.6 1.0 24.8 13.0 8.5 1.9 23.5 5.6 Memb. externa 0.6 25.3 2.5 25.5 10.0 4.7 0.1 22.0 8.0 PI Mitoc Memb. . compléta externa 2.0 26.3 20.7 5.8 4.9 38.4 33.0 14.0 16.2 4.2 6.6 7.6 7.2 3.2 4.5 Tabla 6. Composiciôn en âcidos grasos de las clases de fosfolipidos predo- minantes ien las membranas mitocondriales def higado de rata. Acidos grasos (nmoles/mg proteina iTiitocondrial) 14:0 16:0 15:1 18:0 18:1 18:2 20:3 20:4 20:5 22:5 22:6 PC Cl C, 0.6 37.8 0.2 3.7 3.5 1.5 27.7 1.9 7.3 5.6 3.5 17.9 0.1 2.4 0.3 31.6 0.1 3.5 2.6 0.1 11.5 PE Cl c. 0.2 31.4 0.1 1.1 1.1 0.4 24.2 0.6 6.2 1.8 0.8 6.4 0.1 0.0 27.7 3.0 4.5 19.7 DPG Cl c. 0.2 1.0 0.5 1.3 1.2 0.4 0.3 26.0 19.0 0.1 PI c. c. 0.2 2.5 0.4 0.2 5.8 0.8 0.2 0.1 0.3 0.1 0.2 0.5 7.4 0.2 ClTotal C, 1.2 72.7 0.3 5.7 6.1 3.1 57.7 3.3 13.9 15.9 30.4 43.6 0.4 3.4 0.8 66.7 0.1 6.5 7.1 0.1 31.4 Tabla 7.- Distribuciôn posicional de los grupos acilo de las clases princi­ pales de lipidos mitocondriales. - 33 - El papal de los fosfolipidos en la funciôn de la membrana interna mitocondrial parece residir a nivel de los sistemas enz^ mâticos organizados. Por ejemplo, la cadena respiratoria esta compuesta por cuatro complejos, cada uno formado por un mosâico de lipidos y proteinas. Los f os f ol ipifdos son esenciales para el funcionamiento de los complejos como un todo, ya que su organiz£ ciôn requiere un estado conformacional especial de las proteinas componentes, que se mantiene gracias a las interacciones con el entorno fosfolipidico. Al mismo tiempo, la organizaciôn de Los complejos represents una disposiciôn adecuada de las proteinas dentro del mosâico, que se basa en la presencia de las moléculas de los fosfolipidos intercalades entre ellas (revisiones de De- Pierre y Ernster, 1977 y Gemmel, 1978). La demostraciôn de la dependencia de los sistemas de tran£ porte electrônico de la presencia de los fosfolipidos de membra­ na, requiriô métodos de extracciôn bajo condiciones suficisnte- mente suaves para permitir la posterior reintroducciôn de los l_i pidos en el complejo. Se han utilizado dos métodos, el primero implica la extracciôn con una mezcla de acetona y agua (90:10; v/v) y élimina un 80% del total de fosfolipidos (Brieriey y col. 1962). El segundo método (Fleischer y cols., 1954) se basa en el tratamiento con fosfolipasa A bajo condiciones contraladas y da lugar a la degradaciôn de los fosfolipidos a lisofosfâtidos y âcidos grasos libres, productos que se eliminan mediante lavados con albumina, ya que pueden actuar como inhibidores. La recuper£ ciôn de las actividades se efectuô al adicionar suspensiones mi- celares de fosfolipidos mitocondriales y estaba acompanada por la uniôn de los fosfolipidos a las membranas empobrecidas en li­ pidos (revisiôn de McMurray, 1973). Asi mismo, la solubilizaciôn del sistema ATPasa responsa­ ble de la fosforilaciôn oxidativa da lugar a la pérdida de acti­ vidad y de su sensibilidad a la inhibiciôn por oligomicina y lo mismo ocurre cuando se tratan con fosfolipasa A 2 particules sub- - 34 - mltocondriales, derivadas de la membrana interna por sonicacion. Ambas propiedades se recuperan cuando se adicionan fosfolipidos a las dos tipos de preparaciones (revision de McMurray, 1973). Una de las caracteristicas de la membrana interna mitocon- drial es su muy baja permeabilidad, incluso a moleculas relative mente pequenas. Asi, compuestos no electrolitos insolubles en 1_£ pidos con un peso molecular superior a 100-150 son virtualmente incapacBS de cruzar esta membrana por difusiôn pasiua y en el c^ so de moleculas cargadas, incluso iones tan simples como H * , K"*”, Na* y Cl'*’ no pueden difundir libremente a travis de la membrana interna (Ernster y Kuylenstierna, 1970). Esta propiedad tiene gran importancia por su relacion con los procesos metabôlicos que tienen lugar en los medios a ambos lados de la membrana. Por .ello existen en ella varios transportadores, que controlan el flu jo de metabolites implicados en la transferencia da e qui vale ri tes de reducciôn y el transporte de ATP, AOP, fosfato inorg*ânico e iones entre los dos compartimientos (revisiôn de DePierre y Er­ nster, 1977). Por otra parte, la membrana interna mitocondrial se compo£ ta como un sistema de transducciôn de energla consistante en va­ rias unidades que pueden interconvertir reversiblemente la ener- gXa almacenada en forma de potencial redox, enlaces de alta anejf gla o gradientes de concentraciân (figura 7). Asi la cadena res- piratdria y el sistema ATPasa pueden servir como fuerzas motri­ ces para la transhidrogenasa de nucleotidos de nicotinamida e igualmente para los sistemas translocadores de iones (revisiôn de Ernster, 1977) . Las unidades transductoras de energia pueden generar de forma reversible un gradients de concentraciôn de protones o un potencial de membrane, que pueden sévir de base para la transfe­ rencia de energia entre distintas unidades, es decir, constituir el fondo comun de energia para las unidades de transducciôn de - 35 - NADH NAOH-Q QHg-c c reduc tasa 0 reductaia — oxidasa transhidrogenasa 1 NADPH gradients de [H*] o potencial de membrana P« +AOP sistema ATPasa ATP Translocadores de iones y metabolites Figura 7.- Unidades de transducciôn de energia de la membrana interna mitocondrial. energia. Esta es la base de la hipotesis quimiosmôtica que fué sostenida inicialmente por Mitchell (1976) y en la actualidad es la mâs extendida. De acuerdo con esta hipotesis, la membrana in­ terna constituye una parte integral del mécanisme de la transduc_ cion de energia y debe hallarse Intacta como barrera de permea- bilidad (reuisiones de Uikstrbm y Krab, 1980 y Fillingame, 1980). CONTROL RESPIRATGRIO Gracias a la existencia de las ticnicas polarogrâficas de medida del consumo de oxigeno an preparaciones de mitocondrias aisladas, los conocimientos sobre las propiedades de la respira- ciôn y el acoplamiento con la fosforilaciôn se han desarrollado considerablemente- La respiraciôn se efectua a una uelocidad maxima en las tocondrias aisladas, solamente cuando hay Pj. y ADP en el medio. Cuando Falta ADP, la velocidad de respiraciôn es muy baja y no se produce fosforilaciôn, debido a la inexistencia de aceptor de fosfato. Esta situaciôn se conoce como estado 2 de la respira­ ciôn, Al anadir posteriormente una cantidad conocida de ADP a este sistema, el consumo de oxigeno expérimenta un brusco incre- mento hasta un valor maxima y simuItôneamenta el ADP anadido se - 36 - fosforila. Este estado recibe e 1 nombre de estado 3. Cuando se ha fosForilado todo el ADP anadido, la velccidad de consumo de oxigeno desciendë bruscamente alcanzlndose el estado denominado 4 (figura 9). El control de la velocidad de respiraciôn por la concentra ciôn de AOP se denomina control respiratorio. La relacion o ind^ ce de control respiratorio (RCR) es el cociente de las velocida- des de respiraciôn mitocondrial er estado 3 y en estado 2 o 4. Esta relacion constituye un control util de la integridad de las mitocondrias aisladas, ya que cuando se hallan lesionadas o env£ jecidas, pierden su capacidad de fosforilaciôn del ADP y en su ausencia se produce transporte electrônico a una velocidad méxi- ma. En este caso RCR = 1; no obstante, en mitocondrias intactas la relacion es generalmente muy elevada, pudiendo alcanzar valo- rès de hasta 1 0 . Por otra parte, la oxidaciôn mitocondrial de los sustratos dependientes de NAD^ conduce a la f osf orilaciôn de hasta très mo_ leculas de ADP por atomo de oxigeno reducido (figura 0). Como consecuencia, la relaciôn P/O (n@ de moleculas de fosfato inor- gânico utilizadas para fosforilar ADP por atomo de oxigeno con— sumido) puede alcanzar un valor maximo de 3. Sin embargo, algu- nos metabolitos, como por ejemplo el succinato, son deshidroge- nados por las flavoproteinas y aportan sus electrones a la coen— zima Q, soslayando asi el centro I de fosforilaciôn (figura 8 ). Por ello dan como resultado la fosforilaciôn de solo dos molé­ cules de ADP par âtomo de oxigeno reducido, es decir, la rela­ ciôn P/O puede alcanzar un valor mâximo de 2. En estudios de respiraciôn con mitocondrias aisladas, la relaciôn ADP/O (nB de moles de ADP anadidos dividido por el nS de âtomos de oxigeno adicional consumidos) es igual a la rela­ ciôn P/O. La proximidad del valor calculado para dicha relaciôn al valor teôrico correspondiente al sustrato utilizado, refleja - 37 - el grado de acoplamiento de la fosforilaciôn oxidativ/s en la pre^ paraciôn mitocondrial. Glu tama to Malato HAD Succinato * FP, Rotenona 1i — F P i---- Coenzima 0 Contro I Aacorbato Antimlcina A Cianuro Cit b-i— Cit Ci »Cit c ►Cit 33 Centto II Centro III ADP-Pi ATP AOP-Pl ATP AOP-Pi ATP Fig. S'.- Oiagrama de la cadena respiratoria que muestra los très centres de fosForilaciôn oxidativ/a. Mediante el uso de inhibidores (fléchas discontinuas) dichos cnntros pueden estudiarse por separado. Cada centro es rasponsablo de la sintesis de una nolécula de ATP por â- tomo de oxigeno. La fosforilaciôn oxidativa résulta influida por agentes quimicos que pueden agruparse en très clases principales: a/ Agentes desacoplantes: Permiten la realizaciôn del transporte electrônico, pero impiden la fosforilaciôn del AOP. Ademâs, prou£ can un gran aumento en la actiuidad hidrolftica sobre el ATP, que en ausencia de estos agentes es muy débil. Estimulan la vel£ cidad de consumo de oxigeno de las mitocondrias en ausencia de ADP (f igura 9) . La mayor parte de los agentes desacoplantes conocidos son sustancias liposolubles que contienen un grupo âcido y su méca­ nisme de acciôn se basa probablemente en la eiiminaciôn de los gradientes de concentraciân de H"*" a través de la membrana inter­ na mitocondrial.. b/ Inhibidores de la formaciôn de ATP: Impiden,tanto la estimul£ - 38 - cion del consumo de oxigeno por el ADP, como la fosforilaciôn del ADP, ya que bloquean la transducciôn de energia entre la cadena respiratoria y la ATPasa. A consecuencia de ello, se alcanza un nivel energetico que hace imposibls la continuacion del trans­ porte electrônico. Sin embargo, la presencia de un agente desac£ plante anula la acciôn de los inhibidores sobre el consumo de o- xigeno, y a que provocan la desapariciôn del mencionado nivel ener_ getico (figura 9). AOP DNP Tieflipo Oligomicina I AOP DNP AOP T iempo Flg. 9 .- Acciôn de los agentes desacoplantes (DNP) y los inhibidores (Oli­ gomicina) . c/ l o n ô f o r o s E n su mayorîa forman complejos liposolubles con C£ tiones especificos, los cuales son transportados de este modo a traués de las membranas. Impiden la fosforilaciôn oxidativa, po£ que obligan a las mitocondrias a utilizar la energia de la resp^ raciôn para bombear cationes al interior de la matriz. Este pro- ceso se mantiene indefinidamente, ya que los cationes salem de la mitocondria a la misma velocidad con que son bombeados hacia su interior. - 39 - MECANISnOS Y REGULACIQN DEL TRANSPORTE DE Ca2+ MITOCONDRIAL Las mitocondrias da los tajidos animales pueden acumular Ca^* en contra de gradiente mediante un bombeo dependiente de e- nergia catalizado por una glucoproteina especifica de la membra­ na interna e inhibido por rojo de rutenio y lantlnidos. Se ha propuesto qua el Ca 2+ sg une a la superficie de la membrana mit£ condrial antes de alcanzar el sistema transportador, de forma que la interferencia de esta union afecta a la cinltica de captura de Ca2+ (revisiôn de Saris y Akerman, 1900). Después de la ex- tracciôn con acetona dô los fosfolipidos de la membrana mitocon­ drial, los sitios de uniôn desaparecen (Scarpa y Azzi, 1968; Ja­ cobus y Brierley, 1969); pero reaparecen con la adiciôn de fosf£ lipidbs, lo cual sugiere que la uniôn del Ca 2+ se realize princ£ palmente sobre las cabezas polares de las moleculas de fosfolipi dos de la membrana mitocondrial (revisiôn de Saris y Akerman, 1980). Por otra parte, existen datos (revisiôn de Saris y Akerman, 1980) que sugieren que la captura de Ca2+ se ve afectada signify cativamente por el estado fisico de la membrana, a traves de un efecto sobre la difusiôn dasde la superficie de la membrana has­ ta el transportador localizado en el interior de la membrana. De hecho, los cambios en la temperature y en la fluidez de los lipi. dos afectan notablemente a la difusiôn de iones a travês de lip£ somas (Blok y cols., 1975). Del mismo modo, cationes bivalentes como al Mg2+ (Papahadjopoulos, 1972) y otros agentes que modifi- can la fluidez a la densidad de carga de las membranas afectan a la permeabilidad de liposomas. Pero,ademas, las mitocondrias poseen un mecanismo independiente responsable de la liberaciôn del Ca 2+ acumulado, aûn cuando el potencial de membrana es sufi- cientemente alto como para impedir la salida de Ca^* por la in- versiôn de la acciôn del transportador mencionado anteriormente. La base molecular de esta via de salida de Ca^'*’ estâ todavlp. po- — 40 — CO Clara (revision de Fiskum y Lehninger, 1900). Unicamente Blojn din (1975) y Roman y cols. (1979) han presentado datas que indi- can que los acidos grasos insaturados y los saturados de longi- tud de cadena media pueden estar implicados en la liberaciôn de Ca^* de las mitocondrias, sugiriendo ademas, que los acidos gra­ sos insaturados liberados por la fosfolipasa A 2 mitocondrial po- drian ser esenciales en la regulaciôn de dicho proceso. Ex; 3te un acoplamiento entre los procesos de captura y li­ beraciôn de Ca 2 +, tal que ambos pueden funcionar al mismo tiempo bajo condiciones fisiolôgicas, dando lugar a un ciclo de Ca2+ que permits el establecimiento de un estado estacionario en las con­ centr aciones de Ca2+ intra y extramitocondriales. Parece que es­ te sistema junto con el reticula endoplismico participa en el control de la concentraciôn citoplâsmica de Ca2 + y, en consecuen­ cia,esta implicado en la regulaciôn de las actividades celulares sensibles al Ca2+ (Nichols, 1978; Becker y cols., 1980). La capacidad de retenciôn del Ca2+ acumulado en las mito- tocondrias aumenta an presencia de agentes que astabilizan la membrana interna mitocondrial, como el Mg2+ y la esparmina. Es­ tos agentes actûan probablemente previniendo los efectos nocivos del Ca 2+ para la mitocondria, taies como aumento de la permeabi­ lidad y conaecuente hinchamiento, asi como la activaciôn de la Fosfolipasa A 2 (revisiôn de Saris y Akerman, 1980). La elimina- ciôn del Mg^+ provoca un incremento en la permeabilidad de dicha membrana y la liberaciôn delCa2+ acumulado en las mitocondrias (revisiôn de Saris y Akerman, 1980). Estos efectos se basan qui- za en la formaciôn de complejos con los grupos aniônicos présen­ tes en la membrana, de forma que los Fosfolipidos cargados nega- tivamente y ciertas proteinas tenderian a quedar inmovilizadas (Binet y Volfin, 1975). Lo mismo podria ocurrir con los écidos grasos libres, que son capaces de actuar como ionôforos para ca­ tiones monovalentes (Uojtczak, 1974) y para Ca^* (Roman y cols.. — 41 — 1979) . La liberaciôn de Ca^* puede ser inducida "in vitro" en mi­ tocondrias aisladas por una serie de factures (tabla a) cuya pajr ticipaciôn en la célula Intacta bajo condiciones fisiolôgicas no se conoce. Agente Mecanismo de acciôn sugerido Rojo de rutenio Foafoenolpiruuato Relaciôn NAO(P)/NAO(P)H N-atil-maleimida y otros réactives con grupo -SH Oxalacetato Pi Paimi hoil-CoA Acidos grasos libres Prostaglandinas EDTA Desacoplantes Inhibe el transporte hacia el interior Libera el ATP mitocondrial Activa el flujo de salida Incramentan la permeabilidad Actuan como ionôforos Elimina el Mg^* de la membrana interna Oisminuyen el gradiente de pH o el po- tencial de membrana Tabla 8.- Factores que estimulan la liberaciôn del Câ '*' mitocondrial. Las perspectives son buenas para una regulaciôn de la concentra­ ciôn citoplasmica de Câ "*' por el estado de oxidaciôn de los nu­ cleotidos de piridina, puesto que este paramétra sufre considéra^ bles variaciones en funciôn del estado energetico celular. El Ca^* estimula ciertas enzimas, como la fosforilasa-quinasa,respon­ sable de la activaciôn de la glucogenolisis, promoviendo asi la movilizaciôn de las réservas de energia. Por ello, es posible ' que en las células con un bajo nivel energetico se produzca un cambio en la distribuciôn del Ca 2 +, que eleve la concentraciôn c£ - 42 - toplâsmica de Ca^*. Este cambio estaria promouido por el estado relativamente oxidado de los nucleotidos de piridina, que acomp» na a un nivel de energia bajo en el citoplasma. ACTIUIDAD DE LA FOSFOLIPASA A2 MITOCONDRIAL Considerando que la fosfolipasa A2 mitocondrial, al igual que las demâs fosfolipasa A 2 de membrana. es activada por Ca^'*‘ (Uhite y cols., 1969), que los fosfolipidos mitocondriales unen cationes bivalentes (Saris y cols., 1969) y que esta union repre_ sente la primera etapa para su transporte a traves de la membra­ na (Rossi y Lehninger, 1964) es interesante comentar las aspec- tos que se conocen sobre la relaciôn de la mencionada actividad con los movimientos del Ca^*. Parce y cols. (1978) han sugerido que en las mitocondrias, en las que la oxidaciôn y la fosforilaciôn estân acopladas, la actividad de la fosfolipasa A 2 no se maniflesta, porque es inna- ccesibla al Ca^* debido a la localizaciôn de la enzima en las membranas mltocondriales. También es posible que la mencionada actividad esté compensada normalmente por una reacilaciôn conc£ mitante de los lisoderivados résultantes (figura 1 0 ) y que, uni­ camente cuando hay un disbalance de los dos procesos, la activi­ dad de la fosfolipasa A 2 se haga patente. Èsto es lo que ocurre en el envejecimiento mitocondrial "in vitro", proceso en el que tienen lugar simultâneamente una pérdida de la capacidad de las mitocondrias para retenez al Ca^* acumulado en su interior y una elevaciôn en sus nivales de lisofosfolipidos (Siliprandi y cols., 1979), Se ha propuesto que un incremento en la actividad de la fosfolipasa A 2 esté implicado en la distorsiôn de la funcionali- dad que acompana a dicho proceso de enve jecimiento (Parce y cols.', 1978; Siliprandi y cols., 1979). Por otra parte, la adiciôn de Ca2+ al medio de una suspen­ sion de mitocondrias estimula la liberaciôn de écidos grasos por — 43 — Fosfolipasa A 2 Ca 2 + H 2 Ç-OOCR] R2COO-CH H 2 6 -OX CoASH Aciltransferasa CoASH R^iCOSCoA AMP+PPi HgÇ-OOCRi RgCOOH HO-ÇH H 2 C-OX 1 HgÇ-OH R^COQH HO-ÇH HgC-OX R^ = Cadena saturada o monoinsaturada R 2 = Cadena poliinsaturada X = Fosfoetanolamina (colina, etc.) Lisofosfolipasa Figura 10.- Metabolismo de fosfolipidos en las membranas mito­ condr iales . la acciôn de la fosfolipasa A 2 mitocondrial (Pfeiffer y cols., 1979) . Recientemente, Pfeiffer y cols. (1979) y Beatrice y cols. (1980) han puesto de manifles to el papel de la actiuidad de la fosfolipasa A 2 en el mecanismo subyacente a la acciôn de N-etil- maleimida, diamida, Pi y palmitoil-CoA. Estos agentes provocan la liberaciôn de Ca 2 + mitocondrial por un mecanismo comûn, que se basa en un incremento en la permeabilidad de la membrana in­ terna. La acciôn de dichos agentes requiers la presencia especi­ fica de Csi2 + exôgeno, cuyo lugar de actuaciôn debe estar locali­ zado en la cara interna o en el interior de la membrana interna, ya que la mencionada acciôn es impedida por el rojo de rutenio, - 44 - que inhibe la penetraciôn del Ca 2 + en la membrana y por tanto su transporte hacia el interior de las mitocondrias. Ademas, el cam bio en la permeabilidad no se manifiesta en presencia del anesté sico nupercaina, inhibidor de la actividad de la fosfolipasa A2 , y los mencionados autores han observado la apariciôn de acidos grasos poliinsaturados, que son el producto de dicha actiuidad, paralelamente al desarrollo del cambio en la permeabilidad. Sin embargo, la adiciôn de acidos grasos exôgenos, en cantidades comparables 0 sustancialmente mâs altas que las producidas por Ca2 + y los agentes mencionados, no provocô efectos nocivos so­ bre las mitocondrias (Beatrice y cols., 1900). Esto sugiere a . dichos autores que, quizâs, los responsables primaries del in­ cremento en la permeabilidad sean los lisofosfolipidos resultan tes de la actividad de la fosfolipasa A 2 » aunque no han sido de- terminados los cambios en los nivales de dichos compuestos. Es posible también, que los agentes mencionados den lugar a una inhibiciôn de la reacilaciôn de lisofos folipidos, que sea la responsable del ihcremento en los niveles de AGL. - 45 - ACCION DEL LP5 SOBRE'LAS MITOCONDRIAS Se ha demostrado que, paralelamente a los cambios morfolog.! C O S , LPS procédantes de distintas bacterias provocan una serie de perturbaciones en la funcionalidad mitocondrial, cuando se i£ yectan en animales de experimentacion y cuando se anaden a célu­ las en cultive o preparaciones de mitocondrias aisladas de higa- do de rata o humano. Ademas, estos efectos son llevados a cabo por cantidades biolôgicamente significativas de LPS en el curso de unas horas e "in vitro" bajo condiciones en las que la parti- cipaciôn de mediadores humorales u hormonas esta minimizada (ré­ vision de Utili y cols., 1977 y Bradley, 1979). Entre los efectos inducidos por el LPS sobre las mitocon­ drias hay que destacar la inhibiciôn del métabolisme oxidativo, con una disminucion en la velocidad respiratoria en estado 3 y en el RCR que indica un desacoplamiento de la oxidaciôn y la fo£ forilaciôn. Este efecto se ha observado también, tratando mito­ condrias aisladas con lipido A (revisiôn de Bradley, 1979), por lo que quiza la actividad desacoplante reside en la porciôn de acidos grasos del LPS. Ademas, se ha sugerido que el mencionado efecto se basa en aiteraciones de la membrana interna mitocon­ drial (Harris y cols., 1958; Nicholas y cols.,1974). Por otra parte, el LPS altera la captura de Ca2+ par las mitocondrias, independientemente de la inhibiciôn de la oxidaciôn de los sus­ tratos (Mêla y cols., 1970). Las aiteraciones en la funcionalidad mitocondrial de los hepatocitos podrian ser las responsables de los profondes cam­ bios metabôlicos del higado descritos anteriormente. La dismin£ ciôn de la actividad malato deshidrogenasa reduce el aparté de oxalacetato citoplasmico, que es el sustrato de-la f osf oenolpirij vato-carboxiquinasa durante la gluconeogénesis. A medida que la - 46 - relaciôn ATP/ADP desciende, se estimulan las actividades de la fosfofructoquinasa y la piruvatoquinasa de la ruta glucolitica. Tiene lugar una elevaciôn de los niveles de NADH en el citoplas­ ma que es responsable de un incremento en la reducciôn de piru- vato a lactato. Debido a su conexiôn con los niveles de NADH, los de NADPH citoplasmico se eleven, de forma que para estable- cer una relaciôn NA D (P)/NAD(P )H favorable se origina perôxido de hidrôgeno al actual la NADPH-oxidasa. Los mecanismos mediante los cuales el LPS provoca los efec tos descritos en las mitocondrias no estân claros y tampoco se conoce su situaciôn en el esquema global de la lesiôn celular, si es primario o secundario a otras aiteraciones patofisiolôgi­ cas del shock. Sin embargo, existen algunas hipotesis, que se co mentan a continuaciôn. I . Efectos secundarios al shock circulatorio a/ La inadecuada perfusiôn tisular que acompana al shock circula torio puede ser responsable de una hipoxia, la cual origina una déficiente producciôn de energia que indudablemente implica una incapacidad de las bombas de iones. El resultado es una entrada de iones extracelulares y entre ellos al Ca 2 + acompanada de una imposibilidad de bombeo hacia su interior por parte de las mito­ condrias y reticulo ondoplâsmico y consecuentemente una- eleva­ ciôn en los niveles citoplismicos de Ca^* (Chien y cols., 1977), capaz de activar la fosfolipasa Ag de membranas. Asi, se ha des- crito una pérdida de fosfolipidos, como consecuencia de la isque- mia, en homogeneizado total y sobrenadante postmitocondrial de h£ gado de rata (Chien y cols., 1978) y en mitocondrias de rindn de rata (Smith y cols., 1980), y de cerebro de cobaya (Majeuska y cols., 197?) .. También se pierde en la isquemia la funcionalidad mitocondrial (Mergner y cols., 1977 a y b). — 4 7 — b/ Algunos mediadores humorales, que aparecen como consecuencia de la endotoxemia,podrian ser responsables de las aiteraciones mitocondriales a través de una elevaciôn en la concentraciôn ci­ toplasmica de Ca2+. Asi,las catecolaminas, cuyos niveles sangui- neos SB elevan en la endotoxemia (Heiffer y cols., 1958; Esdahl, 1959), parece que son capaces de incrementar los niveles cito- plasmicos de Ca^'*’ (Rasmussen, 1970). También las prostaglandinas cuya sintesis y liberaciôn es inducida por el LPS y por las quin^ nas que aparecen en la endotoxemia, actuan como ionôforos de Ca^^ (Kirtland y Baum, 1972; Carsten, 1973) pudiendo alterar el con­ trol de la concentraciôn citoplasmica de este iôn. c/ Como se mencionô anteriormente, en el shock endotôxico se ha observado una elevaciôn inicial transitoria en les niveles san- guireos de AGL. James (1977) ha sugerido que estos écidos gra­ sos oodrian ser capturados por los hepatocitos y actuar como a- gentes desacoplantes (Sjdrntorp y cols., 1954) o favorecer la salida de Ca^* de las mitocondrias, II. Acciôn directa del LPS sobre los hepatocitos a/ La uniôn del LPS a la membrana plasmatica podria incrementar el flujo de Ca2 + a través de la misma, como sugieren 1 os resul- tados de Connors y cols. (1973). Este efecto podria incidir so­ bre los niveles citoplâsmicos de dicho iôn, con las consecuen- cias mencionadas. b/ Existen evidencias de que durante el shock inducido por LPS, las mitocondrias pierden el Mg 2 + unido a su membrana interna y que esta pérdida acompana a la modificaciôn en la estructura y funciôn de la misma (Mêla y cols.,1970 y 1971). Ademas Greer y cols. (1973) observaron que la presencia de Mg^* gn el medio préviens la pérdida del control respiratorio provocada "in vi­ tro" por el LPS en preparaciones de mitocondrias aisladas y han sugerido que el LPS actua secuestrando el Mg^* endôgeno de la membrana mitocondrial. Teniendo en .cuenta que, como se veia ante- - 48 - riormente, . el tiene una gran importancia para la Funciôn de dicha membrana y que parece que el LPS pénétra en los hepatoci­ tos, esta hipôtesis résulta en principio bsstante sôlida. Otra hipôtesis igualmente interesante es la propuesta por Bradley (1979) (figura 11), que sugiere que el LPS es introducido en las células por endocitosis, de forma que el fagosoma résul­ tante se une con un lisosoma primario. El LPS es transferido a la membrana mitocondrial y en la interacciôn con ella el lipido A altéra su estructura, desplazando a algun complejo de la cade­ na resoiratoria o a la ATPasa. c/ El LPS puede prouocar "in vivo" la liberaciôn de enzimas lis£_ somales en el higado (revisiones de Utili y cols., 1977 y Brad­ ley, 1979) y SB sugiriô que los cambios en el pH y las concentra^ clones citoplésmicas de cationes inducidas por el LPS podrian aiç tivar estas enzimas (Mêla y cols., 1972). Mêla y cols. (1973) comprobaron que la adiciôn de enzimas lisosomales a mitocondrias aisladas provoca la apariciôn de la mayoria de los efectos indu­ cidos por los LPS, por lo que han propuesto que son responsables parcialmente de la lesiôn mitocondrial. LPS, ADP M 15 (1) Endocitosis (2) Uniôn del LPS a la membrana interna mitocondrial (3) Alteraciôn de la Funcionalidad mito­ condrial . (4) AOP y se acumulan en el citoplas ma eatimulando la ruta glucolitica (5) El NADH acumulado se reoxida mediante la reducciôn del piruvato a lactato (6) Los radicales O2 y el H2O2 danan a los constituyentes celulares (7) Se estimula la autofagia y se liberan las enzimas lisosomales Figura 11.- Modelo para explicar los efectos del LPS (Bradley, 1979) - 49 - PROSTAGLANDINAS EN EL SHOCK Las prostaglandinas son agentes vasoactivos potentes que se forman en la mayoria de los tejidos de mamiferos a partir de écidos grasos pôlilnsâturadgs de veintë atomos de carbono, si- multaneamente a la apariciôn de los mismos. La acciôn de la fosfolipasa A 2 sobre los fosfolipidos de las membranas es de una importancia considerable, ya que una gran parte de los acidos grasos liberados corresponde al âcido araquidônico (McMurray, 1973) y su disponibilidad limita la ve- locidact de la biosintesis de prostaglandinas (Lands y Samuelsson 1968). Por ello, l a 'liberaciôn de este écido graso, en respuesta a una elevaciôn en los niveles de Ca^*, podria representar un punto de conexiôn entre el Câ '*' celular y el metabolismo de pros taglandinas. Esta hipôtesis esté apoyada por el hecho de que el Ca2+ estimula en cortes de médula renal simultâneamente la pro­ ducciôn de prostaglandinas y la liberaciôn de los acidos linolej^ co y araquidônico de los fosfolipidos tisulares ( E r m a n y cols,, 1979) ; estas écidos se encuentran predominantemente en la posi- ciôn sn— 2 de las moléculas de los fosfolipidos. En general, las prostaglandinas pueden actuar como mediad£ ras, pero entrando en la circulaciôn sistémica ejarcen también efectos en lùgares distantes de su origen. La degradaciôn de las prostaglandinas circulantes se realiza en gran parte por la ac­ ciôn de enzimas présentas en el higado, los pulmones y los rino- nes. Aunque su papel no esta claro todavia, se ha puesto de ma- nifiesto la participaciôn del sistema âcido araquidonIco-prosta­ glandinas en la patofisiologia del shock, tanto endotôxico y sé£ tico como hemorrâgico. Varios grupos de irvvestigaciôn han obser­ vado un incremento en los nivelas sanguineos de PGE y PGF en el shock experimental endotôxico y hemorrâgico, al igual que en ca- - 50 - SOS clinlcos da shock séptico (revision de Fletcher y Ramuell, 1980), Los resultados de Flynn y Lefer (1977) sugieren que la d£ gradacion de prostaglandinas no esta disminuida significativamen te en el higado, los pulmones y el rinon durante los dos tipos de shock experimental ya mencionados; por lo que el incremento an los niveles de prostaglandinas circulantes ha de ser conse— cuencia de un aumento en su sintesis y liberaciôn. Algunas hormonas y mediadores, coma la bradiquinina, y pro cesos, como la isquemia, que acompanan ai shock circulatorio, or_i ginan la liberaciôn de prostaglandinas en tejidos aislados per- fundidos (Block y cols., 1974; Isackson y cols., 1976 y 1977; Schwartzman y Raz, 1979). Teniendo en cuenta este hecho, cabe pensar en esos Factores como posibles responsables del menciona­ do incremento en los niveles de prostaglandinas; pero an el shock endotôxico no se puede descartar la posibilidad de la par­ ticipaciôn del LPS que, como se vio anteriormente, es capaz de inducir la sintesis y liberaciôn de prostaglandinas an los macr^ Fagos. La indometacina y otros fârmacos, que inhiben la sintesis de prostaglandinas, utilizados profilactica o terapéuticamente, incramentan la supervivencia y atenuan los fenômenos hemodinâmi- cos en los dos tipos de shock experimental, excepto cuando se utilizan dosis masivas de endotoxinas. Parece que la PGFg^ , potente agente vasoconstrictor, estâ relacionada con la hipertensiôn de la arteria pulmonar que tiene lugar en la endotoxemia experimental, pero no se conoce la rela­ ciôn de las prostaglandinas con la hipotensiôn arterial sistémi­ ca y tampoco si participan en la irreversibilidad del shock. - 51 — BIOSINTESIS DE PROSTAGLANDINAS EN EL HIGADO El complejo prostaglandina sintetasa microsomal de higado de rata genera PGE 2 V PGF2 * (Morita y Murota, 1970) sequn un me canismo ampliamente estudiado (Samuelsson y cols., 1975 y 1978) (figura 1 2 ). Araquidônico I Ci cl 00 xi gênas a COOH PGE2 PGF20, Figura 12.- Biosintesis de prostaglandinas. Durante la transformaciôn del âcido araquidônico en PGH2 » se adicionan al mismo dos moléculas de oxigeno, pero sôlo très âtomos de oxigeno quedan finalmente en la molécula de PGH 2 » Como consecuencia, se liberan équivalentes de oxidaciôn en forma de radicales reactivos que son los responsables de la autodesactiv£ ciôn irreversible de la ciclooxigenasa, que tiene lugar en el curso de la reacciôn "in vitro" (Egan y cols., 1976). Estos aut£ res han planteado a partir de sus resultados expérimentales un esquema para explicar el mecanismo de la autodesactivaciôn y el efecto protector dsl fenol y otros antioxidantes sobre la activ£ - 52 - dad de la ciclooxigenasa (Figura 13). La base de este esquema e£ ta en la existencia en la enzima de un puente disulfuro necesa- rio para la actividad catalitica; dicha existencia. sa-sugiriô por la observaciôn de que la inhibiciôn provocada por el ditiotrei- tol no se da en presencia de N-etil-maleimida. Este puente disul^ Furo podria actuar como aceptor del âtomo de hidrôgeno del âcido araquidônico, o bien ser necesario para el mantenimiento de la conformaciôn activa de la enzima. AA + E(SS) E(SH) t AA* + E(SH) 1 2 0 2 AAO4 * + E(SH) I AAO3 H + E(5S) + X(0) AAO4 H 4- E(3S) — I (PGG2 )| AAO3 H + E(SS) + Fenol* AAO3H 4- E(0) (PGH2 ) Figura 13.- Mecanismo propuesto para explicar la autodesactiva­ ciôn y el efecto protector del fenol sobre la activi dad de la ciclooxigenasa (Morita y Murota, 1970). La forma activa de la enzima E(SS) recoge el hidrôgeno del âcido araquidônico para generar la forma reducida inactive E(SH) y el radical AA*. La reducciôn reversible de la enzima con ditio treitol (DTT) genera la misma forma inactive. El radical AA * reacciona con el oxigeno dando lugar 'al radical AAO^* que se re­ duce subsecuentemente a AAO^H (PGG2 ), al mismo tiempo que la en­ zima se reoxida a la forma activa E(SS). La PGG2 puede ocasiona]^ mente oxidar irreversiblemente la enzima a E(0), al reducirse a PGH2 » lo cual da lugar a su desactivaciôn. Sin embargo, esto ocij - 53 - rre en muy pequena proporciôn (l de 5.000) lo cual hace suponer que otros componentes celulares X(R) se oxidan a X(0) en la re­ ducciôn de PCCg» este proceso "in vivo" puede ser la causa de una lesiôn celular, El fenol impide parcialmente la formaciôn de E(0) aportando équivalentes de reducciôn adicionales para gene­ rar PCH 2 y un radical fenol*, sin la producciôn concomitante de équivalentes de reducciôn. Ambos procesos horizontales mantienen a la enzima en su forma activa. Por otra parte, la actividad biosintética de prostaglandi­ nas de microsomae de higado de rata résulta inhibida por la adi­ ciôn de la fracciôn soluble a la mezcla de reacciôn, mientras que la incorporaciôn de acido araquidônico a fosfolipidos se in­ crements (Morita y Murota, 1978) . Todas las evidencias sugieren que el factor preseate en la fracciôn soluble de higado, respons£ ble de este efecto, es el ATP (Morita y Murota, 1980). Asimismo el pH influye de forma dacisiva en la actiuidad biosintética de prostaglandinas (figura 14), quiza debido a que a pH elevado el sistema enzimâtico responsable de la incorporaciôn del âcido ara_ quidônico a fosfolipidos résulta inhibido (Morita y Murota, 1978) FOSFOLIPIDOS microsomas 4- f, soluble | | homogenei zados, pH 7.6 A. ARAQUIDONICO microsomas ̂ j homogeneizados, pH 9.0 PGE2, PGFz* Figura 14.- Rutas prédominantes de utilizaciôn del âcido araqui­ dônico "in vitro" dependiendo del pH y de la prépara^ ciôn utilizada. MATERIALES Y METOOOS — 54 — REACTIVOS Y PRODUCTOS QUIMICOS UTILIZADOS Ferricitocromo c de corazôn de ternera, Sigma Chem. Co., USA. Kiesselgel-G, E. Merck, R.F.A. Acido pentadecanôico, E. Merck, R.F.A. Acido araquidônico, E. Merck, R.F.A. Patrones de esteras metilicos de écidos grasos, Applied Science Lab., USA. Rodamina 6 G, 8 .D.H. Chem. LTD., G.B. Trifluoruro de boro, Fluka, R.F.A. PPO, Sigma Chem. Co., USA. POPOP, Sigma Chem. Co., USA. Murexida, E . Merck, R.F.A. SaFranina, E. Merck, R.F.A. Cromosorb U/AU, Hewlett-Packard, USA. Succinato de dietilenglicol, Hewlett-Packard, USA. Productos marcados con radioisôtopos, Radiochemical Center, G.B Sacarosa, Sigma Chem. Co., USA. Manitol, Sigma Chem. Co., USA. lonôforo A 23187, cedido por D. Vazquez. Albûmina bovina, Sigma Chem. Co., USA.. Albumina bovina libre de acidos grasos. Sigma Chem. Co., USA. Lipopolisacarido \J de E. doli 0127:88, Difco Lab., USA. DTNB, Calbiochem. USA. Reactivo de Folin-Ciocalteau, E. Merck, R.F.A. Glutation, Sigma Chem. Co., USA. El resto de los productos no resenados en este apartado fueron de grado analitico. - 55 - MATERIAL BIOLOGICO Se han utilizado ratas macho de raza albina Uistar, de 200-300 g de peso, ayunadas durante la noche. Cuando se requerian muestras de sangre, los animales se descerebraron y a continuacion se realizô la toma de las mismas mediante punciôn cardiaca. En los demas casos los animales se sa- crificaron por decapitacion y después se sangraron exhaustiuamen- t e. - 56 - EXPERIMENTACION "IN VIVO" SHOCK ENDOTOXICO La induccion del estado de shock se realizô inyectando par via endovenosa (en vena de la cola) LPS disuelto en soluciôn sa­ line fisiolôgica a una concentraciôn de 20 mg/ml. Las dosis de LPS utilizadas fueron 1 y 2 mg/lOO g peso del animal, la segunda de las cuales corresponde a la dosis letal determinada en exper^ mentos previos. A los contrôles se inyectô un volumen igual de suero sali- no y después se mantuvieron todos los animales con agua "ad lib_i tum" y bajo observaciôn. Medida de la oresiôn arterial Con el fin de conocer la evoluciôn del shock se realizaron sucesivas medidas de presiôn arterial sistôlica desde la induc­ cion del mismo hasta la muerte de los animales. Se utilizo un sistema U+U Electronics que consta de un manguito que se aplica en la base de la cola de la rata y va unido a un dispositiuo ne£ matico que genera una presiôn que varia ciclicamente. Cuando la presiôn del manguito supera la presiôn sistôlica de la arteria caudal, esta se colapsa e interrumpe la transmisiôn de la pulsa- cion a la parte per iférica de la cola. Asimismo, cuando la pre­ siôn del manguito desciende la pulsaciôn retorna; esta pulsaciôn viene detectada por un transductor que se coloca también en la cola. La sehal eléctrica generada, una vez amplificada, sirve pa ra accionar un galvanomètre que esta conectado a una plumilla; el registre se efectua sobre un papel convenientemente calibrado en mm de mercurio (figura 15). La presiôn en el manguito esta generada por un pistôn alo- jado en el interior de un cilindro y accionado por un motor. Las dimensiones del cilindro son taies que la presiôn transmitida al - 57 - manguito varia de 0 a 290 mm Hg. Por otra parte, el cilindro es-’ ta también comunicado con la atmôsfera, de manera que al inicia^ se la traslaciôn del pistôn la presiôn del manguito es la atmos- férica, es decir, el cero esta igualado a la presiôn atmosférica. Figura 15.- Registre grafico de medida de presiôn arterial. Antes de realizarse las medidas, la rata se mantiene dura£ te unos 40 min a la temperatura de 35°C, para provocar una cier- ta vasodilataciôn. Durante la medida el animal se mantiene inmo- vilizado para evitar interFerencias en la senal. SHOCK HEMORRAGICO El modelo experimental de hemorragia controlada seguido fué el oropuesto por Uhigham y Ueil (1966). Las ratas se aneste- siaron con eter o mediante inyecciôn intraperitoneal.de tiobarb^ tal sôdico (60 mg/Kg peso animal) y se colocaron en la mesa de operaciones. Entonces se expusieron bilateralmente las arterias fémorales y se insertô en cada una un catéter de polietileno ll£ no con una disoluciôn de heparina (5 U/ml) en suero salino. Fina lizada la operaciôn se colocô una compresa de algodôn empapada en suero salino cubriendo cada herida y se introdujeron 300 U de — 5 8 — heparina/Kg peso per uno de 1 os cateteres. Por otra parte, el ca téter correspondiente a la arteria derecha se conecto a una je- ringa de -pllstico que contenia 1 ml de solucion salina con 5 U de heparina y siruio de reservorio de sangre. La velocidad de sangrado Fué de 0.25 ml/min y el v/olumen de sangre extraido fué 1-1.3 % del peso del animal. - 59 - AISLAMIENTO DE LA FRACCION MITOCONORIAL La fracciôn mitocondrial se aislo segùn el método de Schneider (1948) con ligeras modificaciones. Los medios utiliza- dos fueron siempre de reciente preparaciôn y su composicion Fué: - Medio de homogeneizaciôn: Sacarosa 75 mM Manitol 225 mM EDTA 0,1 mM - Medio de lauado: Igual al de homogeneizacion pero sin EDTA. Durante todo el proceso de aislamiento se trabajo a 0-4"C. Pr ocedimiento: Una vez sacriFicado el animal se extrajo el higado inmedi£ tamente, se troceo con una tijera en el medio de homogeneizacion y se lav/ô otra vez con el mismo medio para eliminar en 1 o posi- ' ble la sangre. Los trozos de tejido se suspendieron en unos 30 ml del medio y se homogeneizaron en un homogeneizador tipo Pot-- ter-Elvehjem (uidrio-teFlôn) de 0.2 mm de holgura mediante dos- ciclos de émbolo. El homogeneizado se repartiô en cuatro tubos de centriFuga donde se diluyô con unos 170 ml de medio de homogeneizacion. A continuacién se centriFugô a l.OOOxg durante 10 min en una cen­ triFuga Sorvall RC-5. El sobrenadante se Filtrô a través de gasa doble y se volviô a centriFugar a 6.500xg durante 10 min. El se- dimento obtenido (Fracciôn mitocondrial) se resuspendiô cuidado- samente,con un tubo de vidrio de Fonde redondo que contenia hie- lo picado en su interior, en 80 ml de medio de lavado y se cen­ triFugô a 7.000xg durante 10 min. La operaciôn se repitiô una vez mas y el sedimento obtenido se resuspendiô en 1.5-2 ml de mê dio de lavado, empleando un homogeneizador de vidrio tipo Bounce (Blaessig, USA) de 0,075 mm de holgura y se conservé en Frio ha^ - 60 - ta su utilizacion. Las preparaciones obtenidas por esta procedimiento contie- nen alrededor de 100 mg de proteina mitocondrial/higado y 25-50 mg proteina/ml suspension. La ualoraciôn de proteinas de las pre paraciones mitocondriales y de los homogeneizados de higado se realizaron segun el método de Loury y cols. (1951). - 61 - E5TUDI0 DE LA FUNCIONALIDAD MITOCONDRIAL I. REGISTRO DE CONSUMO DE Og: ELECTRODO DE OXIGENO Para estudiar la velocidad de consume de O 2 de las prépara clones mitocondriales se ha seguido el método descrito por Esta- brook (1964) con varias modificaciones y se ha empleado un sistis ma compuesto por: - Electrodo de oxlgeno tipo Clark (Yellou Springs Instruments Co USA) . - Cubeta de metacrilato de 3 ml de capacidad. - Agitador magnético de velocidad regulable. - Circuito de amplificacién de senal y de polarizaciôn del elec­ trodo. - Registrador de papel continue, con diferentes escalas para el voltaje, varias velocidades de recorrido del papel y respuesta .1 i neal. La cubeta posee un pequeno orificio que permits la intro- ducciôn de la preparaciôn, los sustratos y cofactores sin necesi^ dad de abrirla, aumentando la superficie de contacte del medio de ensayo con el aire, le cual modificarfa su contenido en oxfg£ no. La agitaciôn permits la mezcla continua del medio de reac- cion y facilita el establecimiento del equilibrio entre el oxfg£ no disuelto en el medio y el que difunde a través de la membrane del electrode. El sistema eléctrico permits variar la sensibilidad de la detecciôn de oxfgeno hasta valores maximes sin aumento del ruido de fonde y ademas carece de tiempo muerto apreciable. Los inhibidores, sustratos oxidables y cofactores se intr£ ducen en cantidades de 5-10 pl disueltos en agua destilada o et£ nol absolute. El medio de ensayo empleado para el registre del consumo ' de oxfgeno, fué siempre de preparaciôn reciente y contenfa: - 62 - Sacarosa 250 mM MgCl2 7 mM KCl 40 mM KHPO4 5 mM Tris-HCl 20 mM (pH 7.2-7.4) Por otra parte, dicho medio estaba saturado de O 2 , lo cual corresponde a una concen traciôn de 250 pM a la temperatura de eri sayo 25°C. El ensayo de consumo de oxfgeno de las preparaciones mito­ condriales consistiô en : - Registre del nivel de oxfgeno de 1 medio hasta estabilidad. - Adiciôn de una alfcuota de 25-100 pl de la suspension mitocon­ drial, correspondiente a una cantidad de proteina de 1.25-2.5 pg. Se registre el consumo de O 2 con sustrato endôgeno. - Adicion de sustrato, glutamato-malato o succinato, correspon- dientes a los centres I y II de fosforilaciôn respectivamente (concentraciôn en cubeta 0.33 m M ) . En los ensayos con succina­ to se adicionaba previamente rotenona para inhibit el centro I. Registre de consumo de O 2 en estado 2. - Adicion de ADP (166.6 pM en cubeta) y registre de consumo de O 2 en estado 3 hasta que se alcanza el estado 4, al consumirse el ADP, - Registro de consumo de O2 en estado 4. Para calibrar la escala del registro se déterminé el nivel cero de contenido en O2 del medio, dejando que una preparaciôn mitocondrial la consumiese todo, o bien, de forma mas râpida, adicionando unos microlitros de una solucion saturada de dition_i to sôdico. - 62 ■ o rias Glu Mal ixama ato to +oCslO c0) ADP o CD-P OU 1 min Tiempo Figura 16.- Registro de consumo de oxfgeno correspondiente a un ensayo de actividad respiratoria con glutamato + ma- lato como sustratos. - 63 - II, TECNICAS E5PECTRGF0T0METRICAS Determinacion de la actividad succinato-citocromo c reduc- tasa Se realizâ segùn el método descrito por Tisdale (1967). El medio de ensayo contenia: EDTA 0.2 wM NaN] 1.0 pM Albùmina 75.0 nM Succinato potasico 10.0 pM Fosfato potasico 10.0 pM (pH 7.4) (Concentraciones Finales en la mezcla de reacciôn). La reaccion es: Succinato + 2 citocromo c (Fe^^— ^Fumarato + 2 citocromo c (Fe2 + ) La reducciôn del citocromo se siguiô espectroFotométrica- mente a través del incremento en la absorbancia a 550 nm que 11^ va consigo y présenta una velocidad constante durante los prime-- ros minutes. En los ensayos realizados se utilizô un espectroFo- tometro de doble haz Uarian modelo Cary 118 con registro incorp£ r ado. Procedimiento: En la cubeta de medida, que contiens medio de ensayo, se adiciona una alicuota de suspension de mitocondrias preparada rê cientemente, obteniendo una concentraciôn de proteina en cubeta de alrededor de 0.07 mg/ml. A su vez, se adiciona en la cubeta de reFerencia el mismo volumen del medio en el que estaban sus- pendidas las mitocondrias. A continuaciôn, se adiciona en ambas cubetas Ferricitocromo c , alcanzando en la mezcla de reacciôn - . una concentraciôn de 4 mg/ml. El coeFiciente de extinciôn usado para el citocromo c (re- ducido-oxidado) es 18.5x10^ - 64 — Evaluacion de la concsntraciân de Se estudiaron las variaciones de la concentraciôn de Ca2+ en el medio de las suspensiones mitocondriales en presencia de murexida como indicador, monitorizando la formaciôn o desapari- ciôn del complejo Ca^^-murexida a través de los cambios en la ab sorbancia a 540 nm, segùn el método descrito por Mêla y Chance (1968). En las suspensiones de mitocondrias se producen variacio­ nes en la absorbancia, debidas a los cambios en la turbidez que tienen lugar como consecuencia de modificaciones en el volumen mitocondrial al capturar o liberar Ca2+. Para minimizar estas iji terferencias los ensayos se realizaron en un espectrofotômetro de doble haz y doble longitud de onda Aminco DU-2a, en el que pa san por la misma cubeta dos haces de longitudes de onda diferen­ tes. Se utilizaron 540 y 510 nm como longitudes de onda de medi­ da y de referenda respectivamente, ya que 510 nm corresponde al punto isosbéstico. El valor de la diferencia entre las absorban- cias a ambas longitudes de onda refleja ûnicamente la magnitud de la concentraciôn de complejo Ca2‘*’-murexida. El medio base de ensayo fue el mismo que el utilizado en las incubaciones, pero contenia murexida 30 pM. La concentraciôn de proteina mitocondrial en el medio de ensayo fue de 2 mg/ml. - 65 - AISLAMIENTO DE LA FRACCION MICROSOMAL Para la obtenciôn de la fracciôn microsomal se homogeneizo una porciôn de higado de cada rata, previamente troceado y lava­ do, en tampon fosfato potasico 100 mM (pH 7.5) utilizando un ho­ mogène izador Potter-Elvehjem (vidrio-teflôn). El homogeneizado se centrifugo a 2.000xg (centrifuge Sorvall RC5) y el sobrenadajn te obtenido se decanto a través de gasa doble para eliminar lip_i dos y luego se sometiô a centrifugaciôn a llS.OOOxg durante 2 h (ultracentrifuga Beckman L5-65B). Una vez eliminados los lipidos de la pared de los tubos de centrifuge, el sedimento (fracciôn micros ornai) se resuspendiô en el tampon fosfato, resultando una concentraciôn de alrededor de 40 mg proteina/ml. La concentra­ ciôn de proteina se determine por el método de Loury y cols. (1951) . ESTÜDIO DE ACTIVIDAD DE PROSTAGLANDINA SINTETASA MICROSOMAL El estudio de la actividad de prostaglandina sintetasa mi­ crosomal se llevô a cabo a través del consumo de oxigeno de las preparaciones microsomales, que se registro utilizando el mismo sistema que en el caso de las preparaciones mitocondriales. Los ensayos se realizaron,siguiendo el método descrito por Egan y cols. (1976), en tampon fosfato potasico 100 mM (pH 8.5) a 37°C. Para el mantenimiento de esta temperatura la cubeta de ensayo se introdujo en una camisa por la que circulaba agua termostatizada. Una vez adicionada una alicuota de preparaciôn microsomal, que daba lugar a una concentraciôn de proteina en cubeta de 0.25 mg/ml, se iniciô la reacciôn mediante la adiciôn de âcido araqu^ donico disuelto en sulfôxido de dimetilo a una concentraciôn de 55 m M . La velocidad de la reacciôn se déterminé a partir de la porciôn lineal de la curva obtenida al registrar el consumo de " 66 — oxigeno (Figura 17). Los reactivos, ensayados para obseruar su influencia sobre la actividad enzimatica, se adicionaron antes que el acido ara- quidônico. La sangre de los animales en ishock irreversible exhibia una acusada hemolisis y la hemoglobina liberada aparecia como contaminante de la fracciôn microsomal pudiendo actuar como co- factor de la reacciôn. Por ello, los ensayos se realizaron en presencia de un exceso de hemina (2uM) para evitar el error pro- vocado por la hemoglobina. o Misrosomas raquidôr icoo : o ! min T iempo Figura 17.- Registro de consumo de oxigeno correspondiente a un ensayo de actividad de la prostaglandina sintetasa. - 66 ^h-- VALORACION DE GRUP05 TIOLICOS DE LA FRACCION MICROSOMAL La valoracion de grupos tiôlicos de proteinas de la Frac­ ciôn microsomal se realizâ segun el método colorimétrico descri­ to por Ellman (1959) utilizando el siguiente medio de reacciôn: EDTA 1 mM Tris-HCl 0.1 M pH 7.5 El procedimiento seguido consistiô en la incubaciôn de al^ cuotas de las preparaciones microsomales, que contenian a 0 .2-» G.A mg de proteina, en 3 ml de medio de reacciôn en presencia de 0.1 ml de solucion del réactive DTNB a una concentraciôn de 0.4 mg/ml. Después de 15 minutos a temperatura ambiante se leyô la absorbancia a 412 nm Trente a un blanco sin reactivo. La curva patron se realizô con una solucion de glutation 5 mM. - 67 - EXPERIMENTACION "IN VITRO" CON FRACCION MITOCONDRIAL La experimantacion consistiô an la incubaciôn de prepara­ ciones de mitocondrias recien obtenidas, en un medio base cuya composiciôn dépendra del tipo de estudio a realizar. En los est^ dios de actividad fosfolipasa A 2 la composiciôn del medio fue: Sacarosa 65.7 mM Manitoi 197.3 mM Tris-HCl 20.0 mM (pH 7.4) En los estudios de actividad acil-transferasa el medio ba­ se contenia: Sacarosa 61.4 mM Manitol 184.0 mM N a d 8 . 6 mM Tris-HCl 20.0 mM (pH 7.4) La composicion de ambos medios se disenô para que tuviera una osmolaridad de 300, que es la calculada para la matriz mito­ condrial. El medio de incubaciôn tuvo en los dos tipos de estu­ dios un volumen total de 1 ml, consistante en 0.5 ml de medio b£ se y otros tantos de suspensiôn de mitocondrias en el mismo me­ dio. De esta forma, la concentraciôn de proteina mitocondrial fue de 20-40 mg/ml. Las incubaciones se llevaron a cabo en una incubadora de agua, previamente acondicionada a 18°C, con agitaciôn constante. Una vez transcurrido el tiempo de incubaciôn previsto, se adici£ naron a los tubos 5 ml de cloroformo-metanol (2:1, v/v) para pr£ ceder a la extracciôn de lipidos y con otra alicuota se realizô un ensayo de respiraciôn. Los distintos experimentos, realizados por duplicado, dif£ rian en la presencia o ausencia en el medio de incubaciôn de uno de los siguientes productos: - 58 - CaCl2 8 mM LPS 10 mg/ml ( 6 6 yg/mg proteina mitocondrial) A 23187 4 gM Tambien se ensayaron conjuntamente CaCl2 ~tPS y CaCl2“^23187. El ionoForo A-23187 se disoluio en dimetil sulfôxido a una concentraciôn de 25 mM y en esta forma se almacenô. A partir de esta solucion se realizaba, momentos antes de cada exper imento, una diluciôn en agua hasta una concentraciôn de 0.2 mM, con lo cual se euitaba la formaciôn de agregados del ionôforo debido a su baja solubilidad en agua. I. ACTIVIDAD DE LA FOSFOLIPASA A 2 Con el fin de evaluar la actividad fosfolipasa A 2 mitocon­ drial "in vitro", a través de los niveles de lis ode r i vad os de glicerofosfolipidos, se procediô a su marcaje "in vivo" con un radioisôtopo. El precursor elegido Fue etanolamina que se incor­ pora en PE y en menor extension en PC. Una hora antes del sacrificio se inyectaron a las ratas por via intravenosa 925 KBq de cloruro de [2-^'^C]-Etan-l-ol-2-a- mina (actividad especîFica 1849.9 MBq/mmol) disuelto en suero s£ lino a una concentraciôn de 462.5 KBq/ml. II. INCORPORACION DE ACIDOS GRASOS EN LOS FOSFOLIPIDOS MITOCONDRIALES. Se llevaron a cabo estudios de incorporaciôn de âcidos gr£ S O S marcados radiactivamente en los f osfolipidos mitocondriales. Se ensayaron por separado los siguientes âcidos grasos: Acido qraso Actividad especifica ( 1-^‘̂ C)-Araquidônico 2.14 HBq/mmol (U-^^C)-Palmitico 14.91 HBq/mmol - 69 - Cada âcido graso se introdujo en el medio de incubaciôn en forma de sal sôdica, la cual se préparé neutralizando con NaOH 1 N el âcido graso disuelto en etanol y calentando a SO^C des­ pués, mientras se llevaba a sequedad con corriente de nitrôgeno. Entonces se disolviô en una solucion de albumina en NaCl al 0.5% en la proporciôn de 1 mol de albumina por cada 5 moles de acido graso (Evans y Moeller, 1963). La actividad de cada âcido graso introducida en el medio de incubaciôn fué: Ac. Araquidônico 74.06 KBq Ac. Palmxtico 6.18 KBq — 70 — Esquema d e extracciôn para microsomas. mitocondrias v hornooenei- zado total: SUSPENSION (1 volumen = V) 19 V cloroformo-metanol (2:1, v/v) Homogeneizaciôn en Potter, agitaciôn Filtraciôn por Uhatman 1 Rosiduo 20 V cloroformo-metanol (2:1, v/u) Homogeneizaciôn an Potter y agitaciôn riltraclôn por Whatman I Res iduo (se desecha) 1 Extracto (l/') 1/5 V' MgCl,0.017% Ease superior (se desecha) Fase inferior Oos lavados 1/5 V ' medio de lavado* Fase superior (se desecha) Fase inferior concentrar a sequedad EXTRACTO DE LIPIDOS TOTALES Esquema de extracciôn para plasma: nUESTRA (1 volumen = V) 19 y cloroformo-metano1(2 :1, v/v) Agitaciôn 15 min. Filtraciôn por Whatman 1 Extracto (U') 0.2 V NaCl 0.56% Lavado Fase inferior Dos lavados 0.2 ' J ' medio de lavado* Fase superior (se desecha) Fase inferior concentrar n sequedad EXTRACTO DE LIPIDOS TOTALES Faso superior (se desecha) 'Medi o de lavado: cloroformo-metanol-':aC1 0.58% (3: 4 8 :ù ,, v/v) - 71 - ANALISIS DE LIPIDOS EXTRACCION La extracciôn de lipidos totales se llevô a cabo con clor£ formo-metanol (2 :1 , v/v), siguiendo el método de Folch y cols. (1957) con modificaciones adecuadas para cada tipo de material biolôgico (esquemas 1 y 2). Los estractos lipidicos obtenidos se llevaron a sequedad en evaporador rotatorio a presiôn reducida y a temperatura ambiante y se conservaron hasta su anâlisis bajo atmôsfera de nitrôgeno y a una temperatura de -20°C. CRÜMATOGRAFIA EN CAPA FINA El fraccionamiento de lipidos se realizô por cromatografIa en capa fina de silicagel G, monodimensional para la separaciôn de clases de lipidos neutros (Kelley, 1956) y bidimensional para la de clases de glicerofosfolipidos (Rouser y cols., 1970). Los sistemas de desarrollo utilizados fueron: Lipidos neutros: Hexano-éter-ac. acético (70:30:1, v/v/v) Glicerofosfollpidos: I Cloroformo-metanol-amoniaco conc. (65:25:5, v/v/v) II Clorof ormo-acetona-metanol-ac . acético-agua ( 3: 4:1:1: 0 . 5 , v/v) El tiempo comprendido entre los desarrollos en las dos di- mensiones y entre el final de las cromatograflas y el anâlisis posterior se redujo al miximo, secando las plaças con corriente de nitrôgeno. En la experimentaciôn "in vitro" las cantidades de extrac­ to lipidico que se obtenlan eran muy pequenas; por lo que para su total aprovechamiento se realizaron los fraccionamientos de lipidos neutros y polares en la misma plaça, segùn el siguiente esquema: - 72 - 1^ 2 _ □ f 3 . & ^ - 0 II1 ^ m : . - - - I — CLASES LIPIDOS NEUTROS / 4 CLASES LIPIDOS POLARES Desarrollo an el sistema de lipidos neutros. Se rascan las bandas correspondientes a clases de lipidos neij tros, uisualizadas reuelando, con rodamina 6 G la zona de la plaça en que se encuentran. Desarrollo bidimensional en los sistemas de lipidos polares. Se rascan las bandas correspondientes a clases de lipidos po­ lares. Para la visualizaciôn de las clases de lipidos en las pla­ ças de cromatografla sa revelaron estas con uapores de iodo (Ma£ gold y Malinc, 1961; Sims y Lerose, 1962) cuando el anâlisis pas terior fue contaje de centelleo liquide o ualoraciôn de fôsforo y con rodamina 6 G al 1% en metanol (Mangold y Malinc, 1951) siem pre que el anâlisis posterior requeria una cromatografia gas-ll- quido de ésteres metllicos de los âcidos grasos constituyentes. La identificaciôn de las manchas aparecidas en los cromat£ gramas se realizô mediante la utilizacion de patrones de las di£ tintas clases de lipidos. CROMATOGRAFIA GAS-LIQÜIDO La obtenciôn de les ésteres metllicos de los âcidos grasos componentes de los lipidos se lleuô a cabo segun el método de Metcalfe y cols. (1966). Para ello los extractos lipidicos secos o las porciones de silicagel correspondientes a las clases de l£ pidos, separadas por cromatografia en capa fina, se sometieron a tratamiento con BF 3 en metanol bajo atmôsfera de nitrôgeno (en - 73 - tubo cerrado con soplete) a 110°C durante 90 min. Seguidamente se extrajeron los esteras metilicos de la mezcla de reacciôn se- gun el siguiente esquema: riuestia da lipidos a sequedad 1 ml r^B al 10% an matanol 1 ml metanol, 0.9 ml benceno Metanolisis 6 ml hexano, 3 ml agua Extracciôn Fase inferior f--- Eases superiore: 6 ml hexano Extracciôn 6 ml agua Lavado Ease inferior (se desecha) Fase superior Ease inferior (se desecha) secar sobre Na2S0 ̂ filtrar concentrar a sequedad Extracto da esteras metilicos Para el anâlisis de ésteres metilicos el extracto seco se redisoluiô en un pequeno volumen de hexano y se inyectô en un cromatografo de gases Hewlett-Packard 5750, equipado con un de­ tector de ionizaciôn de llama y columnas de acero inoxidable de 2 m de longitud y 0.25 mm de diâmetro interno, rellenas con suc­ cinato de dietilenglicol al 15% sobre cromosorb U/AU (00-100 ma­ llas). Como fase môvil se utilizô helio con un flujo de 30 mi/min y las temperaturas de trabajo fueron IBQSC en el horno, 250°C en el detector y 300 en el inyector. Las areas de los picos résul­ tantes en el anâlisis se determinaron con un integrador Hewlett- - 74 — Packard 3370A acoplado al equipo y la identidad de los mismos se estableciô par comparaciôn con patrones de ésteres metilicos de los diferentes âcidos grasos. Para la determinaciôn cuantitativa de clases de lipidos se ha seguido el método de Christie y cols. (1970), que se basa en la adiciôn de un âcido graso conocido,como patron interno, en ca da muestra. Debido a que la respuesta de los detectores de ioni­ zaciôn de llama es proporcional a la masa de cada componente, la cantidad total de âcidos grasos de cada clase de lipidos puede calcularsB a partir de la suma de las âreas de sus picos, utili­ zando el factor de proporcionalidad ârea-masa obtenido para el patron, cuya masa se conoce. La masa de la muestra se obtiens multiplicando la de sus âcidos grasos por un factor, calculado dividiendo el peso molecular del lipido, considerado como si fu£ ra una especie molecular del âcido graso patron, por el producto del peso molecular del ester metilico del âcido graso patrôn par el numéro de restos de âcidos grasos que posea la molécula de 1_£ pido. En los anâlisis realizados se utilizô como patrôn interno âcido pentadecanoico, dado que no existe como componente de los lipidos de mamiferos. F actores: F. - o - - OC: F= 1.054 m g : F= 1.233 AGL: F= 0.945 PL: F= 1.370 LT: F= 1.078 Para el calcula del factor de glicerofosfolipidos se ha considerado la molécula de PC. El factor para lipidos totales se - 75 - ha obtenido teniendo en cuenta la contribue ion en tanto por cie£ to de cada una de las clases de lipidos. El patron se adiciono, como âcido graso libre disuelto en benceno, antes de la metanolisis adecuândose su cantida a la de los lipidos a valorar. VALORACION DE FOSFORO La valoracion del fôsforo presente en las distintas clases de fosfolipidos se realizô siguiendo el método colorimétrico de£ crito por Rouser y cols. (1966) con ligeras modificaciones. MEDIDA DE RADIACTIl/IDAD La medida de la radiactiuidad incorporada en las distintas clases de lipidos se llevô a cabo por contaje de centelleo liqu£ do en un espectrômetro Packard Tri-Carb 3255. Para ello se pasô el silicagel con los lipidos, separados por cromatografia en capa fina, a los viales con 10 ml de liqido de centelleo compuesto por : PPG 4 g PGPOP 100 mg Tolueno 1 1 Los viales se agitaron antes de las medidas para que el l£ quido de centelleo extrajera los lipidos del silicagel. RESULTAOOS Y DISCUSION - 76 - EXPERIMENTACION "IN VIVO" SHOCK ENDOTOXICO Evolucion del shock Transcurrido un tiempo después de la administracién del LPS, las ratas presentaron una serie de manifestaciones de la aparicién del shock, algunas de las cuales se acentuaban pro- gresiuamente. Entre elles cabe destacar fiebre, postracion, disnea e ingestién frecuente de agua. Las ratas que entraron en la fase de shock irreversible, ai llegar al colapso circu- latorio presentaron fuertes convulsiones que sollan précéder a la muerte, la cual ténia lugar entre las 3 y las 5 h después de la administracién del LPS. El estudio de la variaciôn de la presiôn arterial en se is de los animales permitiô concluir el establecimiento de un shock circulatorio profundo. Las osciiaciones ciclicas de presiôn que aparecen en algunos casos son caracteristicas del shock (figura 18). Por otra parte, hay que resaltar que la respuesta al LPS exhibe variaciones individuates de importancia. Por ello en los estudios realizados "in vivo", los resultados correspondientes a los animales tratados con LPS se han distribuido en dos gru­ pos distintos, segun los animales hubieran alcanzado o no la f£ SB irreversible del shock en el momento de sacrificarlos• Niveles de clases de lipidos en suero y homogeneizado total de higado Una de las hipôtesis propuestas (Oones, 1977), para expli- car la lesiôn de las mitocondrias que tiene lugar en el shock endotôxico, se basa en la existsncia de cambios en el metabolis- mo lipidico. Esta hipôtesis sugiere que los AGL, cuyos niveles - 77 - 170 150 130 en X 110EE 90 70 50 170170- 150150- 130-130- ^ 110 - 110- 90-90- 7070- 50- Tiempo (horas) Figura 18.~ 1 res ejemplos representatiuos de la variaciôn de pre- siôn arterial después de la administraciôn de LPS. Las fléchas indican el momento en que tuvo lugar la muerte y la linea discontinua el limite de sensibili­ dad de la técnica de medida. — 78 — presentan una elevaciôn en sangre durante el shock, podrian ser capturados por los hepatocitos alterando la Funcionalidad mito­ condrial. Sobre la base de dioha hipôtesis se planteô un estudio de los cambios en los niveles de las diferentes clases de lipidos en suero y homogeneizado total de higado, que tienen lugar en el shock endotôxico. Los resultados obtenidos se presentan en la figura 19. Los niveles sericos de LT, T G , PL y AGL se elevan como con­ secuencia del shock y la elevaciôn es mas acusada en los anima­ les que alcanzaron la fase irreversible (figura 19). Estos re­ sultados concuerdan con los existantes en la literatura, a ex- cepciôn de Id referente a los niveles de AGL, que segun Sakagu- chi y Sakaguchi (1979) presentan una elevaciôn inicial, para lue^ go descender a valores mâs bajos que los de los contrôles. La aparente discrepacia se basa en las diferencias del modelo de shock utilizado, y a que dichos autores admir. istran el LPS por via intraparitoneal, con lo cual el desarrollo del shock es mu- cho mâs lento. En nuestro modelo se alcanzan unos niveles eleva dos de LPS en sangre inmediatamente después de su administra-, ciôn y parece que el fenômeno prédominante es la liberàciôn de AGL del tejido adiposo, como consecuencia del efecto estimulan- te del LPS sobre la activaciôn de la LSH por las catecolaminas, descrito por Spitzer (1979). En homogeneizado total de higado (figura 20) los niveles de LT presentan durante el shock una ligera disminuciôn que se basa en su mayor parte en el descanso en los niveles de TG. T a ni bien existe una disminuciôn en los niveles de PL en los casos de shock irreversible, lo cual concuerda con la idea de que la extensiôn de esta disminuciôn es critica para la irreversibili- dad de la lésion celular, como sugirieron Chien y cols. (1978) en sus estudios sobre la isquemia hepética. Los niveles de AGL - 79 - LT PL 5 en E 1 50 ^ 3 0 O- o» OL 10 T T 1 AGL Figura 19.— Nivelas de lipidos totales y de las principales cla­ ses de lipidos en suero (Media « dèsviacién estandar). [ m Control (n=8 ) •JJ Shock reversible (n=10) Shock irreversible (n=5) — 80 — LT PL TG 40 o C L C7»E 20 0 » [b AGL Figura 20.- Nivales de lipides totales y de las principales cla- ses de Ixpidos en homogeneizado total de higado (Media ±desuiaci 6 n estandar). El significado de las barras y los valores de n son los mismos que en la figura 19. — 81 — muestran una eievaciôn que puede deberse a la lipolisis del te- jido, o a un incrementa en la captura de AGL originado par el ajj mento en sus niueles sangulneos. Composicifin en acidos qrasos de diferentes clases de Ifpidos neutres Con el fin de estudiar las relacienes entre les cambies eb- servados en les nivales de lipides en suere y hemegeneizado total de higado, se ha determinado la cempesiciôn en Acides grasos de las clases de lipides neturos més importantes. En el case de les AGL los resultados obtenidos se muestran en la figura 21, expre- sados corne cantidades abselutas de cada Acide graso per ml de suere y per mg de proteina de homegeneizado total, para analizar individualmente les cambios existantes. La figura 22 présenta las composiciones en Acidos grasos de los TG de suere y homoge- neizado total y la tabla 9 las de les DG y MG de homegeneizade total, expresadas corne % del total de Acidos grasos componentes. Solo se incluyen los Acidos grasos mAs importantes. Considerando los niveles de cada AGL individual existen di- ferencias entre los présentes en suero y homogeneizado total, aunque en ambas localizaciones les niveles de les Acidos grasos saturados aumentan. El Acide oléico disminuye en el suero y au- menta en homogeneizado total en la fase irreversible del shock y esto podria ser el resultado de una captura incrementada por parte del tejido, y a que aumenta ademas el contenido en este âcî do graso de los TG, DG y MG del tejido. Asimismo, en los cases de shock irreversible el acido linoléico disminuye en suero pero no en homogeneizado total, 1 o cual podria explicarse suponiendo que la captura de este Acido graso por el tejido sea superior a su salida del mismo. — 8 2 “ 80 60 4 0 20 1.4 1.2 2 1.0 a. I 0.8 * =^0.6 0.4 0.2 SUERO I HOMOGENEIZADO TOTAL 16:0 160 18:1 18:2 20:4 Figura 21.- Niveles de los principales acidos grasos libres en suero y en homogeneizado total de higado (media t desviacion estandar) . El significado de las berras y los valores de n son los mismos que en la figura 19. — 83 — lOOr SUERO 100 SO HOMOGENEIZADO TOTAL jfem. 160 16»1 180 18«1 18 >2 2 0 4 Figura 22.- Composicion en âcidoe de los triglicéridos de suero y homogeneizado total de higado (media* desviacion estandar). El significado de las barras y los valo­ res de n son los mismos que en la figura 19. — 0 4 “ evj en . m w W u u m en o CM tn r- r-4 (0 in o 3 ■H +( 44 44 44 44 o a _1 JC m en en aj u en ü •H ta o a CM o en CM U Lt 2 tn a CM 00 -4 en P o CD H +4 44 44 44 44 ta O r—* JC f-i a \ CM CM f-4 00 MT u p m en ne X] 'H CM en CD tn CD en o 6 E 4 S 2 PL o 4 o. o» 3 E o i2 =L TG AGL T T Figura 23.- Niveles de lipidos totales y de las principales cla­ ses de lipidos de la fraccion mitocondrial de higado (media± desviaciôn estandar). i m Control (n=8 ) Shock reversible (n=10) Shnrk irreversible (n=5) Shock hemorragico (n=7) — 87 — CL 0.1 Figura 24.- Niveles de las principales clases de fosfil!pidos de la fracciôn mitocondrial de higado (media ± des viaciôn estandar), El significado de las barras y los valores de n son Los mismos que en la figura 23. — 88 — no présenta variaciones significativas como consecuencia del shock. En lo que se refiere a las clases de lipidos no hay cam­ bios en los casos de shock reversible, pero en los de shock irr£ versible aparece un aumento en el contenido en AGL y una dismi­ nuciôn en el de fosfolipidos, que podria tener gran importancia considérando el papel fundamental de stos ultimos componentes para la funcionalidad mitocondrial. El aumento en los niveles de AGL podria también tener efectos nocivos para la funcionalidad mitocondrial, ya que se ha descrito su actuaciôn "in vitro" como desacoplantes (Bjorntorp y cols., 1964) y como ionoforos (Roman y cols., 1979), ELI anilisis de las distintas clases de fosfolipidos (figu­ ra 24) indica que la disminuciôn en los casos de shock irrever­ sible se centra principalmente en los componentes mayoritarios, PE y PC, en los que represents un 13.4 % y un 10 %, respectiva- mente; pero, ademés, se observa una disminuciôn de un 12.5 % en DPG. Teniendo en cuenta que el DPG es un componente especifico de la membrana interna, esta disminuciôn también puede ser cla­ ve para la funcionalidad mitocondrial. Por otra parte, hay que resaltar en los casos de shock irreversible la elevaciôn en el contenido en LPE y LPC, que ha de ser el resultado de la desapariciôn de las formas diaciladas por la acciôn de una fosfolipasa A. Esta elevaciôn también pua- de influir sobre la funcionalidad mitocondrial, suponiendo que se produzca en las zonas donde actua la fosfolipasa A 2 un aumen­ to local de la concentraciôn, que pueda modificar la fluidez de la membrane, provocando un aumento en su permeabilidad. - 89 - Composiciôn en Acidos qrasos de clases de lipidos de la frac­ ciôn mitocondrial Teniendo en cuenta, por una parte, la importancia de los âc_i dos grasos poliinsaturados componentes de los fosfolipidos de las membranas para la fluidez de las mismas y para la funcionalidad de las enzimas présentas en allas y, por otra parte, el interés por dilucidar el tipo de fosfolipasa responsable de la disminu­ ciôn observada en las principales clases de fosfolipidos de la fracciôn mitocondrial de higado, se procediô al anâlisis cuali- y cuantitativo de los acidos grasos présentes en dichas clases de fosfolipidos. Las figuras 25 y 26 muestran los resultados ob­ tenidos para los acidos grasos mayoritarios. También se realiza- ron las ualoraciones de los niveles de los AGL présentes en la fracciôn mitocondrial; los resultados de estas ualoraciones apa- recen en la figura 27. En los casos de shock irreversible aparece una notable dis­ minuciôn en el contenido en los acidos linoléico y araqudônico de la PE y la PC mitocondriales, mientras que los Acidos grascs saturados y monoinsaturados no presentan mAs que ligeras varia­ ciones. También en el DPG disminuye el contenido en Acido lino­ léico, que es su Acido graso mayoritario. Los resultados estAn expresados como cantidades absolutas de acidos grasos/peso de proteina mitocondrial, por lo que re- presentan las variaciones en el contenido de cada acido graso individual. As i pues, estos resultados, ai igual que los obte­ nidos mediante la valoraciôn de fôsfcro, indican un predominio de la hidrôlisis de P E , PC y DPG sobre la reacilaciôn de los liscde— rivados résultantes, que tiene lugar en condiciones normales en las mitocondrias. *: Teniendo en cuenta que los Acidos linoléico y araquidônico ocupan casi exclusivamente la posiciôn sn- 2 de las molécules de - 90 - 160 18*0 18*1 18*2 20*4 Figura 25.- Niveles de los principales Acidos grasos comptnen— tes de PE y PB de la Fracciôn mitocondrial ( midia ± desviaciôn estandar). El significado de las birras y los valores de n son los mismos que en la f.gura 19. - 91 - DPG 18:2 Figura 26.- Niveles de acido linoléico del DPG de la fraccion tocondrial (media ± desviacion estandar). El signifi­ cado de las barras y los valores de n son los mismos qua en la figura 19. AGL 16«0 1 8 0 18'1 18'2 20'4 Figura 27.- Niveles de los principales acidos grasos libres de la fracciôn mitocondrial (medial desviaciôn estandar) El significado de las barras y los valores de n es igual que en la figura 23. - 92 - PE y PC, su desapariciôn ha de basarse en la actuaciôn de la fosfolipasa A 2 mitocondrial. La fracciôn de AGL présenta en los casos de shock irreuers ble una elevaciôn de los niveles de todos los acidos grasos, cu- yo origen, a la vista de los resultados anteriores, no se puede Bxplicar de la misma forma para los acidos linoléico y araquidô­ nico y para los restantes âcidos grasos. La elevaciôn en los ni­ veles de los primeros ha de ser el resultado de su liberaciôn de las moléculas de fosfolipidos mitocondriales, mientras que la de los segundos podria basarse en un incremento en la captura por parte de las mitocondrias, debido al aumento en los niveles de dichos acidos grasos en suero y, consecuentemente, en el te­ jido. La hidrôlisis de los TG mitocondriales no podria dar cuen­ ta de la elevaciôn en los AGL, debido a que estân présentes en muy pequena cantidad. Es necesario indicar que la elevaciôn en los niveles de âc^ do araquidônico libre no es équivalente a su disminuciôn en los fosfolipidos, lo cual indica una pérdida del mismo en la frac­ ciôn mitocondrial. F uncionalidad mitocondrial Paralelamente a las determinaciones de composiciôn lipidica se realizaron con otras alicuotas de las preparaciones mitocon­ driales estudios de funcionalidad, a fin de analizar las ralaci£ nés entre los cambios producidos en ambos paramètres. Los asoec- tos de la funcionalidad estuoiados fueron: la respiraciôn y la actividad de la succinato-citocromo c reductasa. I. Respiraciôn En la figura 20 pueden observarse los valores de RCR y ADP/ 0 calculados a partir de los registres de consume de oxigeno rea lizados utilizando glutamato + malato y succinato como sustratos. - 93 - RCR (3/2) RCR (3/4) Giutamato + Malato AOP/0 3 2 1 Succinato Figura 28.- Valores de RCR y ADP/O utilizando glutamato + malato y succinato como sustratos (media ± desviacion estan­ dar). El significado de las barras y de los valores de n es el mismo que en la figura 23. - 94 - Como se deduce de los cambios en el RCR y en la relaciân ADP/O, la administraciôn de LPS provoca una notable disminu­ ciôn en el qrado de acoplamiento entre la respiraciôn y la fos- forilaciôn, que se hace mas patente en los casos de shock irre­ versible. Teniendo en cuenta que taies cambios se manifestabar utilizando sustratos correspondientes a los centros I y II de fosforilaciôn, cabe pensar que reflejen no una disfunciôn par- cial de uno de los centros de fosforilaciôn, sino una altera- ciôn de la membrane interna mitocondrial que afecta a los dos centros mencionados. Los resultados obtenidos concuerdan con los descritos por Mêla y cols. (1969). II. Actividad de la succinato-citrocromo c reductasa Los resultados de la valoraciôn de la actividad de la su­ ccinato-citocromo c reductasa de las preparaciones mitocondrie- les se presentan en la tabla 10. Como puede observarse la men- cionada actividad enzimâtica expérimenta también una disminuciôn notable en los casos de shock irreversible. Control Shock irreversible Actividad 45.8*1.9 2 2 .0 * 2 . 2 Tabla 10.- Actividad de la succinato-citocromo c reductasa expre sada en pmoles de citocromo c reducido/min mg de pro­ téine mitocondrial. - 95 - Relaciôn composiciôn llp£dica-funcionalidad mitocondrial Para estudiar la posible existencia de relaciones entre los cambios en la composiciôn lipidica y la funcionalidad mito- cbndrial, se han reali zado analisis de correlaciôn entre los va­ lores del RCR(3/2) con succinato como sustrato y los de varios paramétrés correspondientes a la composiciôn lipidica. Los re­ sultados mas interesantes se muestran en la figura 29. Puede apreciarse que los coeficientes de correlaciôn entre el conteni­ do en âcido araquidônico de PE y PC y el RCR son elevados, mien­ tras que los correspondientes entre el contenido en acido lino­ léico de ambos fosfolipidos y el RCR son natablemente mas bajos. A la vista de estos resultados cabe pensar que las espe- cies moleculares de PE y PC que poseen Icido araquidônico tienen una significaciôn fundamental para el acoplamiento de la fosfor^ laciôn con la oxidaciôn, quizâ debido a que su interacciôn con las enzimas implicadas es indispensable para su funciôn. Esta idea encaja dentro de la dependencia de la presercia de los fos­ folipidos de membrane que presentan tanto los sistemas de trans­ porte electrônico como la ATPasa, seçun se comentâ con detalle en la introducciôn. Relaciôn de las alteraciones mitocondriales con la fisiopa- toloqia del shock endotôxico Como ya se ha comentado,- 1 as alteraciones observadas en la composiciôn lipidica y en la funcionalidad de las mitocondrias son muy importantes en los animales que alcanzaron la fase irre­ versible del shock, en tanto que en los que se encontraban en shock reversible sôlo aparecen ligeros cambios en el grade de acoplamiento de la respiraciôn y fosforilaciôn (ver figuras 23, 24, 25, 26, 27 y 20. Ello se pone de manifiesto también en la f^ gura 30, donde se ha representado el contenido en Icido araquid^ — 96 — CM S g«r I (■)r = 0.404 . (4)r = 0.66 (x)r = 0.88 mi 3 2 14 168 1262 104 pg AG/mg prot. Figura 29.- Coeficientes de correlaciôn (r) entre RCR 3/2 usando succinato como sustrato y las cantidades de âcidos grasos para una serie de preparaciones de mitocon­ drias de higado de ratas control y en estado de shock. Acido linoléico (--- ) de PE (a ) y PC (■)• Acido araquidônico ( ) de PE (•) y PC (x). - 97 - «? « o CN CN00 mCN (O nn Q - t-H W (0 CL -H ■ f-tm 13 •o C (D O *-4 o ü J3 u a •H -H -p 0) C •H P V3 E (D ■D n •H C m □ N3 u c r •H u -ro U •H (4 (0 (0 U jse 0 - o o o T3 (0 JZ •H f—# mu NO Cm o 13 o TJ O OJ •H P C (0 O o > tu m o p '—f (D -Pm 0} u 13 m o X: c m en V3 13 H O OJ (0 (D • -P *—f C (Dm > r4 0) Om C P M 44o. 01 C (0 o O o : #-4 CJ or) (0w3 en ■»oJd 6ui/3(J 8p ÿ :o z Brf — 9 8 “ nico de PE Frente a los niveles de este fosFolIpido. Puede obse£ varse como, aunque los niveles de PE presentan variaciones, el contenido en dicho âcido graso de este fosfolipido no es nunca inferior a un cierto nivel en los animales control y en estado de shock reversible. Sin embargo, en los casos de shock irrever­ sible aparece una notable disminuciôn en el contenido en âcido araquidônico de P E. De lo expuesto anteriormente podria deducirse que la magni- tud de las alteraciones mitocondriales esta estrechamente rela- cionada con la gravedad del shock endotôxico y que la disfunciôn de las mitocondrias es clave en el desarrollo de los procesos que conducen a la muerte en la fase irreversible del shock. Actividad de la prostaqlandina sintetasa microsomal de hiqado La cantidad de Icido araquidônico que se libera de los fosf£ lipidos de la fracciôn mitocondrial es superior a ,1 a que se acu- mula en la misma y no hay una elevaciôn en los niveles de dicho acido graso libre en homogeneizado total (figuras 25 y “21 ) . Por ello hay que pensar que el acido araquidônico se metaboliza o bien se incorpora nuevamente a fosfolipidos en la fracciôn micr£ somal. Dado que una de las posibles rutas de transformaciôn del mencionado Icido graso es la biosi ntesis de prostaglandinas y considerando la importancia de estos compuestos en la patofisio- logia del shock endotôxico, se ha evaluado también la actividad de la prostaglandina sintetasa microsomal de higado, daterminln- dose sus parâmetros cinéticos Kjv| y U^ax' Los resultados obtenidos (tabla 11) indican que mientras la Vmax oo présenta variaciôn, la Kn aumenta ligeramente en 1 os an£ maies que alcanzaron la fase irreversible del shock. Teniendo en cuenta que estos estudios se realizaron "in vi­ tro" con la fracciôn microsomal aislada, no parece probable que - 99 - Control Shock irreversible Kjv, (PM) 0.15±0.04 0.25±0.06 ^max (nmol/min mg prot.) 176+21 177+23 Tabla 1 1 Constantes cinéticas de la prostaglandina sintetasa microsomal de higado. los cambios observados sean debidos a la presencia de algûn mod£ lador soluble originado como consecuencia del shock. Cabe pensar pues, que durante el transcurso del shock se produzcan cambios en el reticulo endoplasmico, capaces de modificar la afinidad de la prostaglandins sintetasa para el acido araquidônico. En esta linea una hipôtesis podria ser la oxidaciôn de los grupos tiôli- cos que, como se describiô en la introducciôn, parecen estar im- plicados en la funcionalidad del mencionado sistema enzimatico. Para estudiar esta posibilidad se valoraron los grupos tiôlicos libres présentes en la fracciôn microsomal y, como puede apre- ciarse en la tabla 1 2 , no existen diferencias significativas entre los valores de los contrôles y los correspondientes a ani­ males en shock irreversible. Control Shock irreversible Grupos tiôlicos 42+22 45 + 14 nmol/mg proteina Tabla 12.- Contenido en grupos tiôlicos libres de la fracciôn microsomal de higado. Por otra parte, el aumento en la observado en los anima­ les en shock irreversible no es suficientemente grande como para — 100 — que se pueda pensar que tenga lugar una disminuciôn notable en la actividad biosintetica de las prostaglandinas^ sobre todo te­ niendo en cuenta que en dicho estado la disponibilidad del sus­ trato, âcido araquidônico, es mayor. No obstante, es necesario indicar la importancia que puede tener en la desapariciôn del âcido araquidônico la peroxidaciôn, reacciôn que est! catalizada por la lipoxigenasa y requiers la presencia de H 2O 2 o radicales 02* Puesto que, como se comentô en la introducciôn, ambos pro- ductos se acumulan en el citoplasma, debido a los cambios en el metabolismo celular que tienen lugar en el shock, es muy proba­ ble que la actividad de la lipoxigenasa esté incrementada en el mencionado estado fisiolôgico. SHOCK HEMORRAGICO La comparaciôn de los efectos sobre las mitocondrias de dos tipos de shock de etiologia muy distinta, como son el hemorragi­ co y el endotôxico, reuestia un gran interés, ya que podria àpo£ tar informaciôn acerca de la contribuciôn de los cambios herrodi- nâmiccs y metabôlicos propios del shock circulatorio y de la que ejerce la actividad tôxica del LPS. Por ello, se realizaron estu dios de la composiciôn lipidica y la funcionalidad de las mito­ condrias de higado en animales sometidos a una hemorragia ccntr£ lada. Contenido en clases de lipidos de la fracciôn mitocordrial de hiqado El contenido en LT y en las clases de lipidos estudiades de la fracciôn mitocondrial de higado no presentô variaciôn signify cativa como consecuencia del shock hemorragico, segun puede ob­ servarse en las figuras 23, 24 y 27. Estos resultados indican que en este tipo de shock no tiene lugar el incremento en la ac- - igi - tiuidad de la fosfolipasa A 2 que ocurre en el shock endotôxico. Teniendo en cuenta que ambos tipos de shock tienen en comun los cambios hormonales y la inadecuada perfusiôn tisular, no parece logico pensar que estos fenômenos sean los responsables de dicha activaciôn, sino que la misma ha de basarse en algun efecto pro- pio del LPS, que quizâ podria ser su acciôn directa sobre los he patocitos o sobre las mitocondrias. Funcionalidad mitocondrial; Respiraciôn Las mitocondrias hepiticas de animales sometidos a shock hemorrâgico presentan una disminuciôn el RCR y en la relaciôn ADP/O con los dos tipos de sustratos, menor incluso que la ob­ servada en los casos de shock endotôxico reversible (figura 28 )• Por lo tanto, como consecuencia de la hemorragia aguda aparece también una lesiôn mitocondrial, pero de magnitud mucho menor que la que es capaz de provocar la administraciôn de LPS, lo cual, unido a la ausencia de cambios en la composicion lipidica, induce a pensar que la. lesiôn se produce por mecanismos dis- tintos en ambos casos. - 102 - EXPERIMENTACION "IN VITRO" CON FRACCION MITOCONDRIAL Con el fin de profundizar en el estudio de los posibles caniértios de la lesiôn mitocondrial y del incremento en la hidr^ lisis de fosfolipidos mitocondriales, observados en la experi­ mentaciôn "in vivo" como consecuencia de la administraciôn de LPS, se planteô una experimentaciôn "in vitro", consistante en la incubaciôn de preparaciones mitoco.ndriales en presencia de los factores que podrian ser responsables de dichos efectos. Estos factores son: el Ca^*^ activador de la fosfolipasa A2 mi­ tocondrial, y el propio LPS interaccionando directamente con la membrana interna mitocondrial, como ya se comentô con detalle en la introducciôn. También se ensayô el efecto del ionôforo de Ca2+ A-23187, ya que una de las posibles formas de actuaciôn del LPS podria basarse en su efecto ionôforo para dicho ion. Las concentraciones de LPS utilizadas fueron de 50-80 pg de LPS/mg de proteina mitocondrial, que corresponden, segun un célculo teôrico aproximado, a las que se obtendrian en el higado de los animales con el intervalo de dosis de LPS utilizado en . la experimentaciôn "in .vivo". Los aspectos estudiados en la experimentaciôn "in vitro" fueron: - Actividad de la fosfolipasa A2 - Incorporaciôn de écidos grasos en fosfolipidos - Actividad respiratoria - Capacidad de retenciôn de Ca^+ - 103 - Activldiad.-d_e la fosfolipasa Ag La actividad fosfolipasa A 2 da las preparaciones mitocon­ driales se évalué a través del aumento en el contenido en LPE, LPC y AGL. La eleccion del tiempo dé incubaciôn se realizô a partir de un estudio de variaciôn de los niveles de hidrôlisis con el tiempo (figura 31). 2 +Como puede apreciarse en la figura 32, en ausencia de Ca el ionôforo A-23187 no tiens efecto aiguno sobre la actividad fosfolipasa A 2 , pero el LPS la incrementa ligeramente; lo cual sugiere que la intéYacciôn del LPS con los fosfolipidos de las membranas mitocondriales favorece la acciôn de la enzima sobre ellos y que este efecto no se basa en una actuaciôn como ionô­ foro. En respuesta al Ca^+ solo o mas LPS o ionôforo aparece un gran incremento en los niveles de lisofosfolipidos. La presencia de otras particules subcelulares en las prepa raciones mitocondriales utilizadas no puede explicar los cambios observados, ya que los contaminantes fondamentales que pueden existir son lisosomas y la actividad fosfolipasa A 2 lisosomal r£ sulta mas inhibida que activada por Ca^* (Machbaur y cols., 1972). La acumulaciôn de AGL présenta un gran paralelismo con el incremento en lisofosfolipidos (figura 33). La gran elevaciôn en los âcidos grasos poliinsaturados, que acilan la posiciôn sn- 2 de la molécula fosfolipidica, indica la acumulaciôn de 1-acil-lisofosfolipidos y demuestra la especificidad de la hi­ drôlisis para la posiciôn citada. El hecho de que estos acidos grasos proceden de los fosfolipidos mitocondriales esta apoya- do ademâs por la inexistencia de otras actividades lipâsicas en las mitocondrias (Uignais y cols., 1976); ello élimina a los TG como posible fuente de AGL. Por otra parte, el contenido en acil-CoA es demasiado bajo para dar lugar a la apariciôn de las cantidades de AGL observadas. - i O à - o> (O n ro eseo IA oO) (O en .5 EV-* I w '— i +d. o _l c ♦cacNj >> -u to (D e_) u CL >- >._J (0 m c 1"O "4 1 0) O m U + '—( es (D m <0> •o u,4 C m oOT■D O H '—1 A SD (D U en -a •H A -Jc 03 o O •H 4_ ü (fl 1m O 1A %.N.-' d o m c TD O p f—1 -p