UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Caracterización molecular de pacientes con predisposición germinal a neoplasias hematológicas mediante la detección de variantes genómicas por técnicas de secuenciación masiva MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Cristina Andrés Zayas Directores Ismael Buño Borde Carolina Martínez Laperche Madrid © Cristina Andrés Zayas, 2023 Caracterización molecular de pacientes con predisposición germinal a neoplasias hematológicas mediante la detección de variantes genómicas por técnicas de secuenciación masiva Memoria para optar al grado de Doctora Presentada por: Cristina Andrés Zayas Directores: Ismael Buño Borde Carolina Martínez Laperche UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Facultad de Medicina Programa de Doctorado en Investigación Biomédica Madrid - 2023 Agradecimientos Agradecimientos En este cierre de etapa vital hay mucha gente a la que me gustaría agradecer haberme acompañado a lo largo de todo este proceso. Gracias a mis padres por ser un pilar en mi vida. Sin ellos nunca podría haber alcanzado ninguno de mis objetivos. Gracias por cuidarme como lo hacéis, por vuestra paciencia infinita, por encontrar siempre los mejores consejos y por haberme apoyado en todas y cada una de mis decisiones. Os quiero mucho. Gracias a mis Directores de Tesis, a Carolina y a Ismael, por haberme guiado a lo largo de todo este camino. Gracias por haber confiado en mí y por vuestro apoyo infinito. No sabéis cuánto he aprendido de vuestra experiencia, optimismo y entusiasmo. Hacéis que todo parezca muy fácil. Gracias a María Ángeles por haber sido mi Tutora de Tesis, por tus buenas palabras y tu siempre patente amabilidad cuando no tenía muy claro qué pasos dar. Gracias a mi casi Directora de Tesis, Julia, gracias de verdad por todos estos años de trabajo a tu lado. Eres una profesional increíble que haces fácil lo que para otros sería imposible. Tu dedicación y tu fortaleza como persona han hecho que Genómica sea mucho más que un laboratorio. Gracias a mis chicas de Genómica. Gracias Ainhoa por haber sido como una madre de laboratorio para mí, por tus consejos siempre acertados y por todas las andanzas que hemos vivido juntas. Gracias Marta por tus ganas de aprender desde el principio, por esos protocolos de sarcoma que ahora se han convertido en post clases de boxeo y por formar parte de esta aventura. Gracias Mari José por haberme enseñado todo lo que sé de Sanger (muchos ratitos dictándonos placas de fragmentos) y por haberme dado tanta seguridad desde el principio. Gracias María por ser un ejemplo de fuerza constante y de no desistir nunca. Muchas horas compartiendo anécdotas mientras sufríamos delante de equipos de vez en cuando. Gracias Lorena por tu buena energía y tu sonrisa continua. No la pierdas nunca, ni eso ni la asertividad!!! Chicas, hacéis que cada día de trabajo a vuestro lado merezca la pena. Gracias a todos los compañeros del laboratorio de Genética Hematológica (María, Asun, Merche, Loli, Alfonso, Susana, Jose y Diego) donde empecé a aprender y que siempre me han intentado ayudar. Gracias Paula por haber sido una compañera de viaje durante los años de tesis, sin tu apoyo en muchas ocasiones habría sido un camino menos bonito. Gracias a mis inmunólogos favoritos, Héctor, Elena y Balti, porque nunca pensé que el Gregorio Marañón me iba a aportar gente tan maravillosa en mi vida. Gracias a mis resis preferidas, Laura, Ali Ortiz, Cris Mon y Ali Mata, porque las aventuras a vuestro lado son maravillosas. Nos quedan muchas más etapas que cerrar en la vida y muchos avances que celebrar juntas. Laura, gracias por descubrirme que tengo un clon en la vida, con eso lo digo todo!! Gracias a todas las personas que me he ido cruzando a lo largo de este tiempo (técnicos, facultativos, personal de limpieza, celadores, administrativos, personal de almacén y del servicio de compras, mantenimiento, investigadores...) y que siempre me han dedicado una sonrisa, una historia de vida, que me han tratado de la mejor forma posible para intentar solucionar problemas que parecían irreparables. Hacéis que, pese a las dimensiones del Gregorio Marañón, todo parezca un poco menos grande. Me llevo grandes lecciones de vida de todos vosotros. Gracias a mis biosanis preferid@s, todo lo que hemos vivido juntos desde que la vida nos unió en un edificio prefabricado de la Universidad de Alcalá... Por seguir avanzando en la vida a vuestro lado porque el tiempo no se mide en horas, sino en momentos y con vosotros son de los mejores. Gracias, amig@s. Gracias a mis chicas del máster, por todos los momentos vividos y los que nos quedan por vivir. Gracias por vuestro apoyo y vuestros consejos siempre. Gracias Sara por haber sido mi acompañante incansable a lo largo del doctorado, te debo muchas cosas amiga. Gracias Andrea y Bea, mis compañeras de vida preferidas. Ramiro Molina ha unido algo muy bonito. Gracias por estar ahí en las cosas buenas y en las no tan buenas. Gracias a mis amigos del cole, los de toda la vida, Marta y Fer que si ya llevan tanto tiempo aguantándome no les queda otra que seguir. Gracias por todos estos años. Seguro que se me olvida gente, pero realmente no puedo estar más agradecida a todas las personas que han pasado por mi vida en estos años de Tesis Doctoral y de las que he aprendido y sigo aprendiendo a sacar la mejor versión de mí misma tanto a nivel profesional como personal. Abreviaturas Listado de abreviaturas ADN: ácido desoxirribonucleico MO: médula ósea NH: neoplasia hematológica NM: neoplasia mieloide LMA: leucemia mieloide aguda NMP: neoplasia mieloproliferativa SMD: síndrome mielodisplásico OMS: Organización Mundial de la Salud LMC: leucemia mieloide crónica PV: policitemia vera TE: trombocitemia esencial MFP: mielofibrosis primaria SP: sangre periférica TPH: trasplante de progenitores hematopoyéticos LH: linfoma tipo Hodgkin LLA: leucemia linfoblástica aguda LLC: leucemia linfocítica crónica MM: mieloma múltiple LNH: linfoma de tipo no-Hodgkin NGS: secuenciación masiva o next-generation sequencing VAF: frecuencia alélica de la variante o variant allele Frequency ELN: European LeukemiaNet alo-TPH: trasplante de progenitores hematopoyéticos alogénico WES: secuenciación del exoma completo o whole exome sequencing WGS: secuenciación del genoma completo o whole genome sequencing VSI: variante de significado incierto Índice Índice RESUMEN ............................................................................................................... 21 ABSTRACT .............................................................................................................. 27 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 32 1.1. Cáncer y predisposición hereditaria a cáncer ............................................. 32 1.2. Proceso de hematopoyesis ........................................................................ 36 1.3. Neoplasias mieloides ................................................................................ 37 1.3.1. Neoplasias mieloproliferativas ................................................................. 38 1.3.2. Síndromes mielodisplásicos ...................................................................... 39 1.3.3. Leucemia mieloide aguda ......................................................................... 39 1.3.4. Neoplasias mieloides con predisposición germinal ................................. 40 1.4. Neoplasias linfoides .................................................................................. 44 1.4.1. Leucemia linfoblástica aguda ................................................................... 44 1.4.2. Síndromes linfoproliferativos ................................................................... 45 1.4.3. Neoplasias linfoides con predisposición germinal ................................... 46 1.5. Secuenciación masiva e identificación de nuevos genes candidatos ........... 46 1.6. Manejo clínico de los pacientes y consejo genético ................................... 49 1.6.1. ¿En qué pacientes se debe realizar un estudio de cáncer hereditario? .. 49 1.6.2. Selección del tipo de muestra más adecuado .......................................... 51 1.6.3. Estudio de familiares ................................................................................ 51 1.6.4. Seguimiento clínico de pacientes y familiares ......................................... 52 2. HIPÓTESIS ........................................................................................................ 56 3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 58 4. RESULTADOS ................................................................................................... 62 4.1. Artículo 1: Utilidad clínica Utilidad clínica de un panel de genes de secuenciación masiva para el diagnóstico de neoplasias mieloides con predisposición germinal. ..................................................................................... 63 4.2. Artículo 2: Identificación de nuevos loci candidatos y variantes patogénicas en línea germinal implicadas en enfermedades hematológicas familiares a través del empleo de secuenciación de exoma completo. .............................................. 79 5. DISCUSIÓN INTEGRADORA ............................................................................... 94 6. CONCLUSIONES ............................................................................................. 105 7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 106 8. ANEXOS ......................................................................................................... 120 Anexo I. Índice de figuras .................................................................................. 120 Anexo II. Índice de tablas .................................................................................. 120 Anexo III. Listado de genes incluidos en el panel virtual de predisposición a cáncer… ............................................................................................................ 121 Resumen RESUMEN Resumen La importancia de las alteraciones en línea germinal dentro del campo de los tumores sólidos está bien establecida y se han realizado cambios en la práctica clínica a este respecto. Sin embargo, este campo en el mundo de la hematología aún está siendo explorado. En los últimos años, el crecimiento en el uso de las técnicas de secuenciación masiva ha llevado al reconocimiento de una nueva categoría dentro de la clasificación de la Organización Mundial de la Salud de 2016 de tumores hematopoyéticos conocida como neoplasias mieloides con predisposición germinal. Estas mutaciones germinales están presentes en aproximadamente el 1-2% de los pacientes mayores y el 4-13% en niños, adultos jóvenes y de mediana edad. En cualquier caso, aún queda trabajo por hacer para refinar el diagnóstico clínico de estas familias y proporcionar un asesoramiento genético adecuado. Desde que se identificó el primer gen (RUNX1) como responsable de la transmisión familiar de trastornos plaquetarios, la lista de genes involucrados ha aumentado exponencialmente. El rápido avance de las técnicas moleculares en el ámbito clínico ha permitido la detección de variantes en línea germinal en pacientes que previamente no habrían sido diagnosticados. Hasta la fecha, se han relacionado más de 20 genes con neoplasias hematológicas hereditarias, varios de los cuales también se encuentran alterados en casos esporádicos (CEBPα, TP53, ETV6), mientras que otros se limitan a trastornos específicas (ANKRD26, SRP72, SAMD9). Además, algunos genes de predisposición al cáncer no son exclusivos de los tumores sólidos, sino que también están involucrados en las formas hereditarias de las neoplasias hematológicas. En el ámbito clínico, la detección de casos familiares es crucial en el campo de la hematología debido a las implicaciones tanto para los propios pacientes como para sus familiares. Teniendo en cuenta que el trasplante de células madre hematopoyéticas es frecuentemente el único tratamiento curativo para estos pacientes, la presencia de una variante genómica predisponente en línea germinal es un problema significativo en este contexto. Esto es debido a que los familiares corren el riesgo de compartir la misma variante germinal. Elegir donantes que porten la alteración genómica podría llevar al fracaso del injerto, una recaída temprana o una leucemia de células del donante, entre RESUMEN otras complicaciones. Por eso, determinar la ausencia de la alteración es relevante durante el proceso de selección de donante. Además, los miembros de la familia deben participar en un programa de vigilancia y de asesoramiento genético. Estas entidades aún son difíciles de manejar para la mayoría de los clínicos, y existe una falta de estandarización en el campo en cuanto a qué pacientes y qué genes deben ser examinados. La utilidad de los paneles de genes dirigidos se ha evaluado en gran medida en la literatura y se considera un enfoque efectivo para detectar variantes en línea germinal en genes bien establecidos en el momento del diagnóstico. El objetivo principal del Artículo 1 fue analizar si el uso de paneles de genes de secuenciación masiva de permite la identificación de variantes germinales clínicamente relevantes en el momento del diagnóstico de neoplasia mieloide. Además, para aquellos pacientes en los que se identificaron mutaciones germinales, se realizó una revisión detallada de la historia familiar oncohematológica para caracterizar la enfermedad y los eventos moleculares subyacentes. Dentro de la cohorte 1 (n=88 pacientes no seleccionados), se detectaron un total de 329 variantes de las cuales el 62% se clasificaron como patogénicas o probablemente patogénicas, el 33% se clasificaron como variantes de significado incierto y el 5% se clasificaron como benignas o probablemente benignas. Teniendo en cuenta los 15 genes incluidos en el panel con relevancia germinal se detectaron 133 variantes, de las cuales el 45% se clasificaron como patogénicas o probablemente patogénicas, el 46% se clasificaron como variantes de significado incierto y el 9% se clasificaron como benignas o probablemente benignas. Se confirmó que cinco pacientes portaban variantes germinales patogénicas o probablemente patogénicas. En cuanto a la corte 2 (pacientes con fenotipo compatible con algún síndrome de predisposición a neoplasia mieloide conocido), se detectaron un total de 11 variantes, de las cuales el 64% se clasificaron como patogénicas o probablemente patogénicas y el 36% se clasificaron como variantes de significado incierto. Cuatro variantes se confirmaron como germinales en los genes de interés. RESUMEN En total, nueve pacientes presentaron diagnóstico de neoplasias mieloides con predisposición germinal. Este estudio destaca la importancia de la identificación de variantes germinales en este tipo de pacientes y la necesidad de una evaluación cuidadosa de la historia familiar para la selección de donantes en alo-trasplante y para un manejo clínico adecuado. Sin embargo, aún existe un subconjunto de pacientes con antecedentes familiares fuertes (dos o más familiares diagnosticados con enfermedades onco-hematológicas o antecedentes personales de múltiples tumores) en los que no se ha detectado ninguna alteración genómica. Para estas familias, expandir el análisis genético con tecnologías más extensas, como la secuenciación del exoma completo, ofrecería una oportunidad única para ampliar nuestro conocimiento y comprender su heterogeneidad clínica. Para abordar este problema, se incluyó una serie de 16 pacientes dentro del Artículo 2 que no habían sido previamente caracterizados molecularmente. Estos pacientes presentaban antecedentes onco-hematológicos familiares o personales relevantes. Se llevó a cabo la secuenciación del exoma completo para identificar la potencial variante subyacente de predisposición. Se realizó un estudio dúo en seis de los pacientes analizados. Se encontraron variantes en genes potencialmente involucrados en el desarrollo del cáncer en cuatro familias. También se identificaron variantes en otros genes relacionados con predisposición al cáncer en cuatro casos adicionales. Este estudio proporciona nuevas perspectivas sobre las mutaciones de predisposición as neoplasias hematológicas hereditarias y destaca la importancia de realizar pruebas genéticas en pacientes con antecedentes familiares o personales relevantes. En conclusión, la detección temprana de variantes de línea germinal puede tener implicaciones significativas en el manejo clínico, la selección de donantes y el asesoramiento genético. Se necesitan más investigaciones para comprender mejor la base genética de estas enfermedades y establecer pautas claras para el diagnóstico y el tratamiento. Abstract ABSTRACT Abstract The importance of germline alterations in the field of solid tumors is well established, and changes in clinical practice have been made in this regard. However, this field is still being explored in the realm of hematology. In recent years, the growing use of massively parallel sequencing techniques has led to the recognition of a new category within the 2016 World Health Organization classification of hematopoietic tumors, known as germline predisposition myeloid neoplasms. These germline mutations are present in approximately 1-2% of older patients and 4-13% of children, young adults, and middle- aged individuals. Nonetheless, there is still work to be done to refine the clinical diagnosis of these families and provide appropriate genetic counseling. Since the identification of the first gene (RUNX1) responsible for the familial transmission of platelet disorders, the list of involved genes has exponentially increased. The rapid advancement of molecular techniques in the clinical setting has enabled the detection of germline variants in patients who would not have been previously diagnosed. To date, more than 20 genes have been associated with hereditary hematological neoplasms, several of which are also altered in sporadic cases (CEBPα, TP53, ETV6), while others are limited to specific disorders (ANKRD26, SRP72, SAMD9). Additionally, some cancer predisposition genes are not exclusive to solid tumors but are also involved in hereditary forms of hematological neoplasms. In the clinical setting, the detection of familial cases is crucial in the field of hematology due to the implications for both the patients themselves and their relatives. Considering that hematopoietic stem cell transplantation is often the only curative treatment for these patients, the presence of a germline predisposing genomic variant is a significant issue in this context. This is because family members are at risk of sharing the same germline variant. Choosing donors who carry the genomic alteration could lead to graft failure, early relapse, or donor cell leukemia, among other complications. Therefore, determining the absence of the alteration is relevant during the donor selection process. Additionally, family members should participate in surveillance programs and genetic counseling. ABSTRACT These entities are still challenging to manage for most clinicians, and there is a lack of standardization in the field regarding which patients and genes should be examined. The utility of targeted gene panels has been extensively evaluated in the literature and is considered an effective approach to detect germline variants in well-established genes at the time of diagnosis. The main objective of Article 1 was to analyze whether the use of massively parallel sequencing gene panels allows for the identification of clinically relevant germline variants at the time of myeloid neoplasm diagnosis. Furthermore, for those patients in whom germline mutations were identified, a detailed review of the onco-hematological family history was performed to characterize the disease and underlying molecular events. Within Cohort 1 (n=88 unselected patients), a total of 329 variants were detected, of which 62% were classified as pathogenic or likely pathogenic, 33% were classified as variants of uncertain significance, and 5% were classified as benign or likely benign. Considering the 15 genes included in the panel with germline relevance, 133 variants were detected, of which 45% were classified as pathogenic or likely pathogenic, 46% were classified as variants of uncertain significance, and 9% were classified as benign or likely benign. It was confirmed that five patients carried pathogenic or likely pathogenic germline variants. Regarding Cohort 2 (patients with a phenotype compatible with a known myeloid neoplasm predisposition syndrome), a total of 11 variants were detected, of which 64% were classified as pathogenic or likely pathogenic, and 36% were classified as variants of uncertain significance. Four variants were confirmed as germline in the genes of interest. In total, nine patients were diagnosed with germline predisposition myeloid neoplasms. This study highlights the importance of identifying germline variants in this patient population and the need for careful evaluation of the family history for donor selection in allo-transplantation and appropriate clinical management. ABSTRACT However, there is still a subset of patients with strong family histories (two or more family members diagnosed with onco-hematological diseases or personal histories of multiple tumors) in whom no genomic alterations have been detected. For these families, expanding genetic analysis with more extensive technologies, such as whole exome sequencing, would offer a unique opportunity to broaden our knowledge and understand their clinical heterogeneity. To address this issue, a series of 16 patients who had not been previously molecularly characterized were included in Article 2. These patients had relevant onco- hematological family or personal histories. Whole exome sequencing was performed to identify the potential underlying predisposing variant. Duo studies were conducted in six of the analyzed patients. Variants in genes potentially involved in cancer development were found in four families. Additionally, variants in other cancer predisposition genes were identified in four additional cases. This study provides new insights into mutations predisposing to hereditary hematological neoplasms and highlights the importance of genetic testing in patients with relevant family or personal histories. In conclusion, early detection of germline variants can have significant implications in clinical management, donor selection, and genetic counseling. Further research is needed to better understand the genetic basis of these diseases and establish clear guidelines for diagnosis and treatment. 31 I. Introducción INTRODUCCIÓN 32 1. Introducción 1.1. Cáncer y predisposición hereditaria a cáncer Según los datos de la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer se estima que en el año 2020 se diagnosticaron aproximadamente 18,1 millones de casos nuevos de cáncer en el mundo. De acuerdo con la misma fuente, a nivel mundial se estima una prevalencia de cáncer a 5 años desde el diagnóstico de más de 44 millones de personas y la mortalidad estimada es superior a los 9 millones de muertes por lo que esta enfermedad sigue constituyendo una de las principales causas de mortalidad en el mundo (Figura 1) (1). Figura 1. Incidencia, prevalencia y mortalidad del cáncer a nivel mundial (Imagen adaptada de Las cifras del cáncer en España 2022, Sociedad Española de Oncología Médica) Las alteraciones genómicas en general se pueden dividir en dos tipos según su origen: germinales y somáticas (Figura 2). Se conoce como variante germinal a aquella alteración genética que ocurre en todas las células de un organismo y que, potencialmente, puede ser transmitida a su descendencia. Sin embargo, las alteraciones somáticas son aquellos eventos genéticos que ocurren a lo largo de la vida de los individuos y que tienen lugar en una célula dentro de un tejido concreto. De esta manera, los eventos que ocurren a nivel somático quedan confinados a una región concreta del organismo. INTRODUCCIÓN 33 Figura 2. Esquema explicativo de variantes genéticas de origen somático y germinal. Los tumores se originan de una célula única y evolucionan a través de procesos de expansión clonal. La adquisición de variantes genómicas somáticas otorga ventajas adaptativas a las células que conducen, por ejemplo, a una mayor proliferación. Estas alteraciones en el ADN pueden surgir de forma estocástica durante los procesos de replicación o debidos a la acción de mutágenos externos. Los genes implicados en cáncer pueden clasificarse en dos grupos principales: oncogenes y genes supresores de tumores. Los oncogenes codifican proteínas que controlan fundamentalmente rutas de proliferación y apoptosis y su activación se produce mediante variantes de ganancia de función mayoritariamente, lo que conduce a la activación constitutiva del gen. Por otro lado, los genes supresores de tumores adquieren más frecuentemente variantes de pérdida de función. El mecanismo más común por el que ambos alelos de las células quedan inactivados es la perdida de heterocigosidad por deleción cromosómica, disomía uniparental o recombinación mitótica. Paralelamente, algunos genes supresores de tumores pueden mostrar haploinsuficiencia, es decir, la pérdida de una copia del gen es suficiente para el desarrollo del tumor. Aproximadamente un 5-10% de los cánceres muestran un componente hereditario y aunque constituya un pequeño porcentaje sobre el total, los hallazgos genómicos en INTRODUCCIÓN 34 estos tipos de casos han cambiado el manejo de estos pacientes y de los familiares en riesgo a través del proceso de consejo genético. Estos hallazgos, además, han permitido el avance en el conocimiento de los tumores esporádicos ya que algunos de los genes implicados en los síndromes de predisposición solapan con genes recurrentemente alterados en los tumores esporádicos. La historia del cáncer hereditario comenzó con observaciones de agrupaciones familiares de pacientes en función de sus manifestaciones fenotípicas. Los primeros registros se remontan a 3.000 años AC donde aparece registrado el primer cáncer de mama en un papiro egipcio (2). La primera descripción significativa de un árbol genealógico con presencia de cáncer de mama fue publicada en 1866 por el cirujano francés Paul Broca (3). Este autor identificó las causas de fallecimientos de 38 miembros de la familia de su mujer a lo largo de 5 generaciones. Broca señaló su preocupación ante la posibilidad del cáncer hereditario en dicha familia. Este informe recoge, por tanto, el primer árbol genealógico de una familia con predisposición general al cáncer. En el año 1971, Knudson (4) propone la hipótesis conocida como “two-hit hypothesis” según la cual el inicio del proceso tumoral se origina por la adquisición de un primer evento en la línea germinal que la convierte en una célula con ventajas adaptativas frente al resto de células normales. A partir de este momento, la adquisición de alteraciones secundarias somáticas proporciona ventajas adicionales a las células que se convertirán en la subpoblación celular dominante. De esta forma, los individuos que portan, de base, una variante germinal, a menudo desarrollan una neoplasia a edades más tempranas ya que se requiere únicamente un segundo evento para el desarrollo del tumor. Esta hipótesis sigue siendo la base para comprender cómo las variantes genómicas conducen el desarrollo de los procesos de carcinogénesis (Figura 3). INTRODUCCIÓN 35 Figura 3. Esquema representativo de la hipótesis de dos-hits para el desarrollo del cáncer propuesta por Knudson (4). Actualmente sabemos que la presencia de alteraciones patogénicas en la línea germinal, especialmente en genes supresores de tumores, ocasionan síndromes de predisposición a diversos tipos de tumores. Dependiendo de las características de expresividad variable y penetrancia incompleta, los pacientes pueden tener diferentes manifestaciones de una misma patología. Se conoce como expresividad variable al rango de signos y síntomas que pueden ocurrir en diferentes personas que presenten la misma alteración genética. Por otro lado, se conoce como penetrancia incompleta cuando no todos los pacientes con la alteración genética desarrollan las características fenotípicas del trastorno en cuestión. Así mismo, el cáncer se clasifica en dos grandes grupos en función de su origen: los tumores sólidos y los tumores líquidos o hematológicos. Como se ha comentado anteriormente, ambos surgen debido a un crecimiento descontrolado de células en un tejido u órgano concreto que puede dar lugar a un cáncer o a un proceso tumoral benigno. Los tumores sólidos son masas de células tumorales que no contienen áreas líquidas (5). Sin embargo, los tumores líquidos se originan en la sangre, la médula ósea o los nódulos linfoides por lo que las células tumorales circulan por el organismo a través INTRODUCCIÓN 36 del torrente sanguíneo (6). A lo largo del presente trabajo de Tesis Doctoral nos centraremos en los tumores hematológicos. 1.2. Proceso de hematopoyesis La hematopoyesis es un proceso altamente complejo que conduce a la producción de hasta un trillón de células sanguíneas maduras diarias en un individuo sano. Las células sanguíneas se pueden dividir en tres grupos principales: eritrocitos, leucocitos y plaquetas (7). En los individuos adultos, la médula ósea (MO) es el órgano hematopoyético principal. Se localiza en la cavidad medular de todos los huesos inervados y vascularizados. Los tejidos hematopoyéticamente más activos en la edad adulta se localizan en la médula de hombros, pelvis, esternón, costillas, vértebras y cráneo inferior (8). Todas las células sanguíneas se originan a partir de células madre pluripotentes hematopoyéticas que tienen capacidad de auto-renovación, las cuales tras sucesivas divisiones celulares originarán células hijas idénticas y células progenitoras multipotentes. Estas células multipotentes se diferencian para dar lugar a los linajes mieloide o linfoide. El proceso de hematopoyesis se considera un proceso celular jerárquico (Figura 4) en el que las células van perdiendo su potencial para diferenciarse y acaban restringidas a un linaje único (9). La regulación génica en cada uno de los estadios de diferenciación está altamente controlada ya que se requiere de la expresión o inhibición de determinados genes para que el proceso sea exitoso. Además, el microambiente hematopoyético requiere de la presencia de distintos tipos celulares y moleculares (interleucinas, interferones, quimiocinas, hormonas y factores de transcripción) para el desarrollo normal de las células y la regulación de sus funciones. Todas estas interacciones contribuyen al equilibrio entre los diferentes procesos (10). INTRODUCCIÓN 37 Figura 4. Proceso de la hematopoyesis (Imagen modificada de Sistema hematopoyético de la médula ósea por OpenStax College, Anatomy and Physiology) La desregulación en algún punto de la hematopoyesis puede resultar en el desarrollo de una neoplasia hematológica (NH). Así, las NH son enfermedades hematopoyéticas clonales que resultan de la acumulación seriada de alteraciones genómicas en genes que regulan funciones celulares de proliferación, diferenciación, supervivencia y muerte celular, entre otras. Estos eventos moleculares conducen a una proliferación desmesurada, alteraciones en la capacidad de auto-renovación y fallos en los procesos de diferenciación de las células madre hematopoyéticas. En función del linaje afecto, las NH se pueden dividir en neoplasias mieloides o linfoides. 1.3. Neoplasias mieloides Como se ha comentado anteriormente, las células madre hematopoyéticas van acumulando alteraciones genómicas a lo largo de su vida. Muchas de estas alteraciones somáticas no contribuyen significativamente a la expansión clonal (mutaciones passengers). Sin embargo, variantes patogénicas en genes con funciones clave en vías de señalización celular, reguladores epigenéticos, factores de transcripción, componentes del spliceosoma o supresores tumorales proveerán a la célula de una ventaja adaptativa frente al resto (11–13). Así mismo, se han descrito también INTRODUCCIÓN 38 alteraciones en el microambiente de la médula ósea que participan en el desarrollo de las neoplasias mieloides (NM) (14). Dentro de las NM se encuentran la leucemia mieloide aguda (LMA), las neoplasias mieloproliferativas (NMP), los síndromes mielodisplásicos (SMD) y las neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas. El sistema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) utiliza criterios basados en datos clínicos, morfológicos, fenotípicos, inmunohistoquímicos, citogenéticos y resultados moleculares para el diagnóstico de estas entidades (15,16). 1.3.1. Neoplasias mieloproliferativas Las NMP son trastornos clonales y crónicos originados por una proliferación anormal de células hematopoyéticas y una tendencia aumentada a la transformación leucémica. Dentro de estas neoplasias se encuentran la leucemia mieloide crónica (LMC) que se caracteriza por la presencia de un evento molecular concreto conocido como fusión de los genes BCR-ABL o cromosoma Philadelphia, la policitemia vera (PV), la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP). La PV se asocia con un aumento en el número de eritrocitos, mientras que la TE se asocia con un aumento en el recuento plaquetario. Por otro lado, los pacientes con MFP presentan cifras altas de granulocitos y fibrosis medular lo que conduce a una hematopoyesis extramedular en el hígado y el bazo. El riesgo de desarrollar leucemia es variable en cada una de las entidades, siendo la MFP la que mayor incidencia presenta con cifras 10%-20% de transformaciones a leucemia aguda durante la primera década de la enfermedad. Adicionalmente, dentro de las NMP también se encuentran otras entidades menos frecuentes como la leucemia neutrofílica crónica, la leucemia eosinofílica crónica, la leucemia mielomonocítica juvenil y los trastornos mieloproliferativos sin especificar. INTRODUCCIÓN 39 1.3.2. Síndromes mielodisplásicos Los SMD son un grupo de enfermedades heterogéneas que se originan de la expansión de células madre hematopoyéticas alteradas. Se caracterizan por una hematopoyesis ineficaz con citopenias en sangre periférica (SP), MO displásica y un riesgo aumentado a desarrollar LMA. La mayor parte de los casos de SMD son esporádicos, con una mediana de al diagnóstico en torno a los 70 años. La supervivencia global es pobre y muchas veces la única estrategia terapéutica curativa es el trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH). 1.3.3. Leucemia mieloide aguda La LMA es una de las NH más agresivas y constituye un 31% de todos los casos de leucemia en adultos. La prevalencia de esta enfermedad aumenta con la edad, siendo la mediana de edad al diagnóstico de 68 años. Se caracteriza por una infiltración de la MO y la SP con células progenitoras hematopoyéticas clonales con una proliferación descontrolada (blastos), sin capacidad de diferenciación a células mieloides maduras y resistentes a los procesos de apoptosis. Los blastos compiten en el nicho de la MO con las células normales y acaban alterando la homeostasis del proceso. Las células normales, por tanto, acaban siendo reemplazadas por blastos leucémicos ocasionando citopenias, infecciones frecuentes, sangrados y fallo medular. Adicionalmente, las células leucémicas pueden infiltrar otros órganos tales como los pulmones o el sistema nervioso central. El diagnóstico de LMA se fundamenta en un recuento de al menos 20% de blastos inmaduros de origen mieloide en la MO o la SP, basándose en criterios morfológicos. Actualmente la OMS emplea criterios citogenéticos y moleculares para establecer un diagnóstico más preciso y una mejor estratificación del pronóstico de estos pacientes en función del riesgo (17,18). El aumento en el conocimiento biológico de la enfermedad ha contribuido al desarrollo de estrategias terapeúticas dirigidas frente a dianas moleculares concretas, mejorando así las tasas de respuestas (19). Sin embargo, esta patología sigue constituyendo un reto debido a su alta heterogeneidad clínica y INTRODUCCIÓN 40 genómica: únicamente entre un 30-40% de los pacientes más jóvenes de 60 años tienen una supervivencia por encima de 5 años. 1.3.4. Neoplasias mieloides con predisposición germinal La agregación familiar de las NH ha sido reportada durante décadas. Sin embargo, no es hasta 1999 cuando se identifica el primer gen asociado con NM de origen germinal (RUNX1) (20). A partir de ese momento y gracias al empleo de las nuevas técnicas de biología molecular han ido apareciendo múltiples genes asociados con predisposición a NM tales como ANKRD26, CEBPA, GATA2, ETV6, DDX41, SAMD9, SAMD9L y SRP72, entre otros. Tanto es así, que la OMS en su clasificación de 2016 ya incluyó un apartado para las neoplasias mieloides con predisposición germinal que ha sido actualizado en la última clasificación de la OMS de 2022 (Tabla 1) (15,16). Neoplasias mieloides con predisposición germinal sin un trastorno preexistente o disfunción orgánica LMA con variante germinal en CEBPA Neoplasias mieloides con variante germinal en DDX41* Síndrome de Li-Fraumeni (variante germinal en TP53)* Neoplasias mieloides con predisposición germinal y trastornos plaquetarios pre-existentes Neoplasias mieloides con variante germinal en RUNX1* Neoplasias mieloides con variante germinal en ANRD26* Neoplasias mieloides con variante germinal en ETV6* Neoplasias mieloides con predisposición germinal y otras disfunciones orgánicas Neoplasias mieloides con variante germinal en GATA2 Neoplasias mieloides asociadas con síndromes de fallo medular o Neutropenia severa congénita o Síndrome de Shwachman-Diamond o Anemia de Fanconi Neoplasias mieloides asociadas con trastornos de la biología de los telómeros RASopatías o Neurofibromatosis tipo 1 o Síndrome CBL o Síndrome de Noonan o trastornos tipo síndrome de Noonan* INTRODUCCIÓN 41 Síndrome de MIRAGE (variante germinal en SAMD9) Síndrome de ataxia pancitopenia (variante germinal en SAMD9L) Síndrome de Bloom (variante germinal bialélica en BLM) Neoplasias mieloides asociadas con síndrome de Down* *También están reportados casos de neoplasias linfoides. Tabla 1. Clasificación de las neoplasias mieloides con predisposición germinal. (Modificado de Khoury. et al. 2022 (16)) Estudios más ambiciosos de secuenciación de genoma completo apuntan a que las neoplasias mieloides con predisposición germinal suponen alrededor de un 4-10% de los niños y adolescentes con SMD o LMA (21,22), con porcentajes similares en los adultos con LMA (23). Neoplasias mieloides con mutación germinal en CEBPA Los casos de LMA con variantes en línea germinal en el gen CEBPA presentan un patrón de herencia autosómico dominante con penetrancia casi completa. En el momento en el que se realiza el diagnóstico de LMA, frecuentemente se observa la aparición de una segunda variante somática en el otro alelo del gen dando lugar a las variantes conocidas como CEBPA bialélicas (24). Se estima que un 10% de los pacientes con mutaciones bialélicas en CEBPA portan una variante en línea germinal en este gen. Con mayor frecuencia, las variantes germinales se localizan en el extremo 5’ del gen mientras que las somáticas se localizan en el extremo 3’ (25). La mediana de edad de presentación es inferior a los casos esporádicos siendo de 24,5 años. El progreso de los pacientes generalmente es favorable, aunque se observan episodios de recurrencia en clones leucémicos independientes (26). Neoplasias mieloides con mutación germinal en DDX41 Los casos de SMD/LMA asociados con variantes germinales en DDX41 suelen tener un inicio tardío con un rango de edad al diagnóstico que va desde los 44 a los 88 años, edades que solapan con la edad de inicio de los casos esporádicos. Presenta un patrón de herencia autosómico dominante y aproximadamente en un 50% de los pacientes se detectan variantes bialélicas en el gen, siendo el segundo evento de carácter somático. Se han descrito variantes en el gen DDX41 asociadas con patologías no mieloides como INTRODUCCIÓN 42 linfoma de tipo No-Hodgkin y mieloma múltiple, por lo que no se pueden asociar variantes genéticas determinadas con el desarrollo de un único tipo de neoplasia (27,28). Neoplasias mieloides con mutación germinal en RUNX1 Variantes germinales en el gen RUNX1 se asocian con un síndrome plaquetario familiar que predispone al desarrollo de SMD/LMA con un patrón de herencia autosómico dominante. Debido a que alteraciones en este gen disminuyen la cantidad de progenitores hematopoyéticos y bloquean la diferenciación de los megacariocitos, los pacientes presentan historias de trombocitopenias acompañadas de una tendencia al sangrado, aunque los rasgos clínicos pueden ser altamente variables. Es factible que existan otros factores implicados en la patogénesis de la enfermedad ya que miembros de la misma familia que presentan la misma variante tienen una evolución diferente. Neoplasias mieloides con mutación germinal en ANRD26 Se conoce como trombocitopenia relacionada con ANKRD26 al trastorno hereditario con un patrón de herencia autosómico dominante, ocasionado por variantes de ganancia de función en el gen ANKRD26 (29). La mayor parte de las variantes se localizan en la región promotora del gen. La edad de diagnóstico es variable y puede ir desde los 20 años hasta los 70 (30,31). Estos pacientes presentan una incidencia aumentada de NM, desarrollando un 5% LMA, un 2,2% SMD y un 1,3% LMC (32). Neoplasias mieloides con mutación germinal en ETV6 Alteraciones genómicas en el gen ETV6 se asocian con trombocitopenia familiar y desarrollo de NH. Se trata de un gen supresor de tumores que aparece frecuentemente alterado en leucemias infantiles en forma de la fusión génica ETV6-RUNX1. Sin embargo, los casos de predisposición se asocian con un amplio número de patologías entre las que se incluyen: leucemia linfoblástica aguda, SMD, leucemia mielomonocítica crónica, leucemia aguda con fenotipo mixto, mieloma múltiple y otros tipos de tumores sólidos como melanoma y cáncer de colon (33,34). INTRODUCCIÓN 43 Neoplasias mieloides con mutación germinal en GATA2 Las alteraciones genómicas en el gen GATA2 ya sean variantes puntuales de pérdida de función o deleciones se asocian con un espectro de síndromes entre los que se incluyen el síndrome de Emberger (linfedema primario y mielodisplasia), el síndrome MonoMAC (monocitopenia y desarrollo de infecciones micobacterianas) y la deficiencia de células dendríticas, monocitos B y células NK (35–38). Estas deficiencias predisponen a los pacientes a una gran variedad de infecciones atípicas tales como infecciones diseminadas por micobacterias, virus del papiloma humano, infecciones fúngicas o bacterianas. Estos pacientes, además, están a riesgo de sufrir complicaciones pulmonares (39). Es un síndrome de inmunodeficiencia primario y un síndrome de fallo medular que predispone a su vez al desarrollo de SMD y LMA. Por otro lado, los síndromes de fallos medulares son un grupo heterogéneo de enfermedades caracterizado por fallo medular que aparece en la infancia o adolescencia, anomalías congénitas y un riesgo aumentado de desarrollar otras enfermedades (40). Un amplio número de síndromes de fallos medulares predisponen al desarrollo de SMD y LMA. Entre ellos se encuentran la disqueratosis congénita (riesgo: 30%), anemia de Blackfan-Diamond (riesgo: 20%), anemia de Fanconi (riesgo: 40%), neutropenia severa congénita (riesgo: 20-40%), síndrome de Shwachman-Diamond (riesgo: 10-35%) o síndrome de Li-Fraumeni (riesgo: 5-7%). Predisposición germinal en neoplasias mieloproliferativas Adicionalmente, la agregación familiar en casos de NMP también está ampliamente reconocida, sobre un 7% de los casos tiene un componente genético subyacente. Los casos descritos se asocian con un patrón de herencia autosómico dominante y los diferentes miembros de la familia comparten factores de susceptibilidad a estas patologías. Ciertas alteraciones genómicas aumentan el riesgo de desarrollar una NMP a lo largo de la vida del paciente. Por ejemplo, se ha descrito la presencia de un haplotipo común en JAK2 (haplotipo 46/1 o GGCC, rs10974944) que aumenta hasta 2,8 veces el riesgo de presentar una NMP (41). Además del haplotipo 46/1 en el gen JAK2 mencionado anteriormente, varios autores sugieren la hipótesis de que la presencia de variantes germinales en el gen JAK2 INTRODUCCIÓN 44 preceden a la adquisición de la variante p.V617F en el mismo gen en pacientes con PV familiar. Por ejemplo, la presencia de una duplicación en línea germinal que implica 700 kilobases (genes localizados en 14q32: TCL1A, ATG2B, GSKIP, BDKRB1 y BDKRB2) se demostró que cooperaba con la adquisición de variantes somáticas en los genes JAK2, MPL y CALR induciendo la enfermedad y confiriendo una mayor ventaja adaptativa a las células que portaban esas mutaciones (42). Si bien es cierto que la mayor parte de alteraciones genómicas que confieren riesgo al desarrollo de estas patologías están descritas como polimorfismos en genes tales como MECOM, HBS1L-MYB, SH2B2, ATM y CHEK2 (43–46). 1.4. Neoplasias linfoides Como resultado del aumento en el conocimiento de las neoplasias linfoides, la última clasificación de la OMS en 2022 (47) ha refinado los criterios diagnósticos introduciendo categorías provisionales y reflejando la potencial existencia de entidades raras. Según la clasificación actual existen más de 80 entidades de neoplasias linfoides maduras, que se agrupan en 3 categorías principales: neoplasias de célula B, neoplasias de célula T, de célula NK y linfomas tipo Hodgkin (LH) (48,49). Vamos a proceder a explicar más en detalles las siguientes entidades por ser las más relevantes para el contenido de la presente Tesis Doctoral: 1.4.1. Leucemia linfoblástica aguda En primer lugar, las leucemias linfoblásticas agudas (LLA) afectan principalmente a niños, con un pico de incidencia a la edad de 2 a 5 años (50). La LLA de tipo B es la forma más común, reuniendo más de 20 entidades asociadas con patrones diferenciales de expresión génica y originadas por eventos genómicos determinados: aneuploidía cromosómica, reordenamientos comosómicos y mutaciones puntuales (51). INTRODUCCIÓN 45 1.4.2. Síndromes linfoproliferativos Dentro de los síndromes linfoproliferativos, cabe destacar por su relevancia los linfomas, la leucemia linfocítica crónica (LLC) y el mieloma múltiple (MM). Los linfomas representan un grupo heterogéneo de neoplasias linfoides con una amplía variabilidad en el curso clínico y en la respuesta a los tratamientos. El diagnóstico de estas entidades se basa principalmente en los rasgos morfológicos, inmunofenotípicos y las características genéticas. El pronóstico de éstos depende del grado histológico, las variables clínicas y las características moleculares. Las neoplasias de células B maduras suponen más de un 80% de los linfomas de tipo no- Hodgkin (LNH). Dentro de los 41 subtipos que se encuentran actualmente contemplados en la clasificación de la OMS de 2022, los más comunes son el linfoma folicular y el linfoma difuso de células B grandes (48). Por otra parte, las neoplasias de células T o NK maduras son entidades más raras que suponen un 10% del total de linfomas en países no asiáticos (52). Paralelamente, los LH difieren de otros tipos de linfomas por su composición celular con la presencia de células neoplásicas atípicas denominadas células de Hodgkin y Reed- Sternberg (52). La LLC es uno de los tipos de leucemia más comunes en los países desarrollados con una mediana de edad al diagnóstico de 72 años (53). Se produce por una acumulación de linfocitos B maduros en SP, MO y órganos linfoides secundarios. Las células leucémicas muestran un fenotipo característico que facilita el correcto diagnóstico de esta entidad, si bien la homogeneidad fenotípica no se ve reflejada en el curso clínico de los pacientes que es altamente variable (54). Si embargo, el avance en el conocimiento de la enfermedad ha posibilitado un avance en la introducción de nuevos fármacos dirigidos que han mejorado significativamente el curso clínico de los pacientes. El MM es una NH que se caracteriza por la presencia de células plasmáticas clonales aberrantes en la MO. Estas células tienen la capacidad de producir lesiones óseas, daño renal, anemia e hipercalemia por su crecimiento descontrolado (55). El pronóstico de INTRODUCCIÓN 46 los pacientes ha mejorado a lo largo de los últimos años por la introducción de nuevos agentes terapéuticos. De cualquier manera, se trata de una enfermedad compleja, y en muchos casos incurable, que evoluciona genómicamente desde estadios iniciales pre- malignos hasta estadios más avanzados (56). 1.4.3. Neoplasias linfoides con predisposición germinal Más allá de estos síndromes genómicamente bien definidos, pacientes con neoplasias linfoides también pueden albergar variantes genéticas de predisposición. De manera observacional y con estudios de casos-controles se demostró que familiares de primer grado de pacientes con LLC, LNH y LH tienen un riesgo incrementado 8.5, 1.7 y 3.1 veces, respectivamente, de desarrollar la misma neoplasia linfoide (57). Gracias a estas observaciones y al empleo de técnicas de genotipado masivo se consiguieron identificar loci de susceptibilidad a este tipo de cáncer, aunque finalmente el subgrupo de genes es muy seleccionado (58–63). Cabe destacar el gen PAX5 asociado con leucemia LLA tipo B familiar (64), el gen SH2B3 e IKZF asociados con LLA tipo B (65,66) o el gen POT1 asociado con LLC familiar (67). Por otro lado, síndromes de inmunodeficiencias tales como ataxia-telangiectasia, síndrome de Bloom, síndrome de Wiskott-Aldrich y agamaglobulinemia de Bruton también se asocian con un riesgo aumentado de desarrollar neoplasias linfoides (68). En el cáncer pediátrico hasta un 10% de los casos ocurren en el contexto de un síndrome de predisposición a cáncer. Entre estos síndromes, el caso del síndrome de Li-Fraumeni es relativamente común en niños (69–71). Variantes patogénicas heterocigotas en el gen TP53 predisponen al desarrollo de un amplio rango de neoplasias en estos pacientes. Entre ellas cabe destacar osteosarcoma, carcinoma adrenocortical, meduloblastoma y leucemia linfobástica aguda (frecuentemente hipodiploide) (72). 1.5. Secuenciación masiva e identificación de nuevos genes candidatos La caracterización genómica de los pacientes con NH es útil para el diagnóstico, pronóstico y abordaje terapéutico de los mismos (17,73). Por este motivo, las técnicas INTRODUCCIÓN 47 de secuenciación masiva o next-generation sequencing (NGS) se han ido introduciendo en la práctica asistencial puesto que son herramientas coste-efectivas capaces de analizar múltiples genes de manera simultánea. Adicionalmente, permite obtener profundidades de lectura lo suficientemente altas como para distinguir variantes genéticas en subclones minoritarios de la muestra de partida. Esta inferencia del porcentaje de células que presentan un determinado evento genómico es posible gracias a lo que se conoce como frecuencia alélica de variante, en inglés variant allele frequency (VAF). Este término hace referencia a la proporción de lecturas (de secuencias genómicas) que contienen el alelo mutado respecto al número de lecturas totales en una posición determinada. Los paneles de NGS en muestras tumorales son capaces de identificar alteraciones somáticas propias del propio tumor, pero también tienen la capacidad de detectar alteraciones en línea germinal que sean la causa subyacente del desarrollo de la neoplasia a estudio (74). El empleo de estas metodologías ha hecho crecer exponencialmente el número de genes relacionados con los síndromes de predisposición a NH. Tanto es así que muchos de estos genes se solapan con algunos ya conocidos en el campo de los tumores sólidos (75) (Figura 5). INTRODUCCIÓN 48 Figura 5. Representación de los genes conocidos asociados a síndromes de predisposición a tumores sólidos, hematológicos y genes comunes solapantes ya que aparecen descritos en ambos tipos de neoplasias (Imagen modificada de Tawana et al., 2018 (75)) Gracias al empleo de las técnicas de secuenciación de exoma completo se ha conseguido identificar la alteración genética responsable del síndrome de predisposición en familias no diagnosticadas anteriormente. En 2016, Narumi y colaboradores (76) identificaron 11 pacientes que presentaban variantes heterocigotas en el gen SAMD9 proponiendo la descripción de un nuevo síndrome caracterizado por mielodisplasia, desarrollo de infecciones, retraso en el crecimiento, hipoplasia adrenal, anomalías en los genitales y enteropatías (síndrome MIRAGE). De manera similar, ese mismo año, se describieron variantes missense en un gen parálogo, SAMD9L, asociado con el síndrome de ataxia- pancitopenia (77). En 2018, Sanders y colaboradores (78) asociaron variantes germinales en el gen MBD4 con el desarrollo temprano de LMA. Dicho gen presenta funciones para la reparación de INTRODUCCIÓN 49 daños inducidos por deaminaciones espontáneas a través de la ruta de escisión de pares de bases. Variantes en heterocigosis en genes helicasas de ADN, particularmente RECQL4, se asocian con desarrollo de LMA y es la causa genética de un síndrome (síndrome de Rothmund-Thomson) caracterizado por dermatosis, estatura baja, cataratas juveniles, anomalías esqueléticas, defectos en los huesos radiales, envejecimiento precoz y predisposición a diferentes enfermedades tales como osteosarcoma, linfoma y LMA (79). 1.6. Manejo clínico de los pacientes y consejo genético 1.6.1. ¿En qué pacientes se debe realizar un estudio de cáncer hereditario? Desde un punto de vista clínico, conocer cuándo se debe sospechar de un caso de síndrome de predisposición es crítico para un manejo óptimo del propio paciente, así como de sus familiares (80). La incorporación de preguntas acerca de la historia personal y familiar del paciente en las consultas es necesaria para la detección clínica de estos casos. Si bien es cierto, que publicaciones recientes apuntan a que hasta en un 50% de las familias con historia clínica sugestiva no se consigue identificar la variante genética causal del síndrome. Paralelamente, hasta un 40% de los individuos con un síndrome de predisposición pueden no ser detectados por los métodos tradicionales ya que carecen de historia familiar onco-hematológica (21). En un estudio elaborado por Keel y colaboradores (21), se identificaron variantes germinales patogénicas en 14 de 110 individuos estudiados menores de 45 años. La historia familiar y el examen físico sólo predijeron la presencia de este tipo de síndromes en 3 de estos pacientes. La Sociedad Americana de Oncología Clínica recomienda realizar un test genético de predisposición a cáncer en los siguientes supuestos: (1) el paciente presenta historia familiar o personal sugestiva de un síndrome de predisposición; (2) el test genético puede ser debidamente interpretado y (3) los resultados ayudan al diagnóstico o son útiles para el manejo médico del paciente o de sus familiares a riesgo (81). Como se comentaba anteriormente, en el caso de las NH la historia personal o familiar a menudo INTRODUCCIÓN 50 son ineficaces para sospechar de un síndrome de predisposición por lo que aún se requieren esfuerzos para elaborar guías clínicas que traten estos puntos. El grupo nórdico (82), liderado por Eva Hellström-Lindberg, redactó en el año 2019 unas recomendaciones para el diagnóstico genético, el manejo clínico y el seguimiento de los pacientes con neoplasias mieloides con predisposición germinal. En estas guías se recomienda sospechar de un síndrome de predisposición en los siguientes supuestos: (1) pacientes con una historia familiar positiva o presencia de signos/síntomas indicativos de una condición hereditaria; (2) pacientes con NM donde el diagnóstico genético rutinario ha detectado una alteración sospechosa de tener un origen germinal; (3) pacientes con un diagnóstico de SMD o LMA antes de los 50 años y con anomalías cromosómicas que impliquen el cromosoma 7 (82). Cabe destacar que el algoritmo diagnóstico propuesto por este grupo de trabajo se ajusta a cada uno de los supuestos mencionados anteriormente. Recientemente se han publicado las recomendaciones por parte de un panel de expertos dentro del grupo de trabajo de la European LeukemiaNet (ELN) (83). En este documento se recogen rasgos clínicos que deben hacer sospechar a los clínicos de la presencia de un síndrome de predisposición en el paciente. Rasgos clínicos Historia personal de  2 cánceres, siendo uno de ellos una NH Historia personal de NH sumado a: (1) otro familiar en 2 generaciones con una NH o (2) otro familiar en 2 generaciones diagnosticado de un tumor sólido a los 50 años o antes o (3) otro familiar en 2 generaciones con otras anomalías hematológicas Presencia de una VP/VPP potencialmente sugestiva de un origen germinal, especialmente si la variante está presente en muestras de RC Edad de diagnóstico de la NH en una edad más temprana a la media El origen germinal de la variante ha sido confirmado en muestras de ADN de tejidos tales como cultivo de fibroblastos o folículos pilosos La variante identificada se encuentra en al menos dos familiares con una frecuencia alélica compatible con un origen germinal (entre 30-65%) Tabla 2. Listado de rasgos clínicos que deben ser considerados para una evaluación clínica del paciente en relación con la identificación de síndromes de predisposición a neoplasias hematológicas. Abreviaturas: NH: neoplasias hematológicas; VP: variante patogénica; VPP: INTRODUCCIÓN 51 variante probablemente patogénica; RC: remisión completa. (Modificado de Döhner et al. 2022 (83)) Actualmente, más allá de estas iniciativas, no hay consenso sobre las recomendaciones de expertos a nivel internacional ni guías clínicas aprobadas como en el caso de otros tumores sólidos. 1.6.2. Selección del tipo de muestra más adecuado Otro aspecto importante que se debe tener en consideración es la selección del tejido más adecuado para realizar el análisis en línea germinal. Pueden detectarse falsos positivos si se emplean tejidos contaminados con células tumorales tales como SP, saliva o biopsias de piel sin cultivar. En la actualidad, se consideran los fibroblastos cultivados como el tejido gold-standard más recomendado por varias razones. En primer lugar, el cultivo permite aislar la población de fibroblastos y retirar potenciales contaminaciones con células sanguíneas. En segundo lugar, existen síndromes en los que la adquisición de eventos genéticos de reversión somática que hagan que la variante germinal sea indetectable si se estudian tejidos derivados de células sanguíneas (65,74,75). En tercer lugar, los eventos asociados a procesos de hematopoyesis clonal pueden persistir en la SP y la MO de los pacientes incluso aunque hayan alcanzado remisiones completas (76). 1.6.3. Estudio de familiares En cuanto a los familiares a riesgo, un proceso de consejo genético realizado por profesionales cualificados evita esfuerzos y costes adicionales, además de disminuir la ansiedad a la que pueden enfrentarse los pacientes hasta conocer si se han heredado la variante genómica. En cuanto a las neoplasias hematológicas, es importante resaltar que la única opción terapeútica curativa en gran parte de estos casos es el trasplante de progenitores hematopoyéticos alogénico (alo-TPH). Gracias a las mejoras en este campo, muchos de los pacientes que necesitan un alo-TPH tienen la posibilidad de realizarlo utilizando un donante haploidéntico, es decir, donantes que compartan un haplotipo HLA. Este será el caso de ambos padres biológicos y la mitad de los hermanos. Es importante destacar, que uno de los obstáculos para la realización de este tipo de trasplantes es la INTRODUCCIÓN 52 identificación de la variante germinal en alguno de los familiares candidatos (84). En estos casos, se recomienda evitar el uso de este donante ya que puede resultar en complicaciones como fallo del injerto o leucemia en células del donante (85,86). 1.6.4. Seguimiento clínico de pacientes y familiares Pese a que el objetivo último de la monitorización de estos pacientes es realizar una intervención precoz, antes de que se desarrolle la enfermedad de forma agresiva, existen pocas recomendaciones que reflejen la eficacia y los beneficios de un manejo estrecho de estos pacientes (73). Si bien es cierto que todos los pacientes, incluyendo portadores asintomáticos de una variante patogénica, deben ser remitidos a una consulta de hematología para poder valorar cada caso de forma aislada. Se recomienda que estos pacientes tengan una primera exploración física y conozcan los signos y síntomas del síndrome en cuestión. La monitorización de los pacientes es un aspecto que se encuentra actualmente en debate. Según las guías nórdicas (82) se recomienda la realización de una analítica de sangre completa, un aspirado de MO con análisis citogenético y la molecular por NGS de un panel mieloide para la posible identificación de alteraciones somáticas. Se recomienda repetir la analítica de sangre completa cada 6 meses, especialmente en pacientes de alto riesgo como aquellos con variantes en el gen GATA2 o RUNX1. Sin embargo, el aspirado de MO no se debería repetir si los valores de las analíticas se mantienen estables (82). En cuanto a los pacientes con un diagnóstico genético establecido, Babushok et al. (87) en sus recomendaciones indican que deberían ser remitidos a una consulta de consejo genético en el momento del diagnóstico, así como la realización de pruebas complementarias en caso de tener guías de actuación específicas de cada síndrome. Durante el seguimiento, se debería realizar en estos pacientes un hemograma con fórmula diferencial cada 3-6 meses y ser incluidos en programas de vigilancia específicos del síndrome, en caso de estar disponible. En caso de observar algún cambio en el recuento, realizar un aspirado de médula ósea. INTRODUCCIÓN 53 Debido a la reciente identificación de estas entidades la prevalencia real de individuos con NH hereditarias sigue estando infradiagnosticado y en un alto número de familias la causa genética sigue siendo desconocida. Sin embargo, como hemos comentado anteriormente la identificación de pacientes con estas patologías es relevante no sÓlo clínicamente para el manejo de su enfermedad y la toma de decisiones terapeúticas, sino también por las implicaciones familiares que supone. 54 55 II. Hipótesis HIPÓTESIS 56 2. Hipótesis Las NH con predisposición germinal son enfermedades poco estudiadas con una incidencia aún desconocida. Además, estas entidades son altamente heterogéneas ya que las características de expresividad y penetrancia en muchas de ellas aún se desconocen. El empleo de paneles de genes en la rutina asistencial para establecer el perfil genómico de los pacientes al diagnóstico es de gran utilidad en las NH, especialmente en las NM. Estos paneles incluyen genes que pueden albergar variantes en línea germinal por lo que se postulan como una herramienta útil para estudiar pacientes potencialmente portadores de este tipo de alteraciones genómicas. Sin embargo, las cohortes descritas apuntan a que un amplio número de familias se quedan sin diagnosticar una vez realizado este primer análisis genético. En este escenario, se plantean las siguientes hipótesis: 1. El diseño y empleo de un panel de genes para el diagnóstico de NM es una herramienta útil para detectar pacientes que porten variantes en línea germinal en genes de predisposición al desarrollo de estas enfermedades ampliamente descritos en la literatura. 2. La utilización de estrategias de secuenciación de exoma completo en casos de pacientes con una historia familiar y/o personal altamente sugestiva, permite detectar variantes en línea germinal en genes no descritos previamente. 57 III. Objetivos OBJETIVOS 58 3. Objetivos Los objetivos globales que se plantean en el presente trabajo son los siguientes: 1. Evaluar la frecuencia de aparición de NM con predisposición germinal en una cohorte de pacientes no seleccionados utilizando un panel de genes e identificar las características de estos mediante el estudio detallado tanto de la clínica del paciente como de su historia familiar. 2. Estudiar las alteraciones genómicas en familias con NH sin causa genética conocida mediante el estudio de exoma completo. Para alcanzar el primer objetivo global se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1.1. Emplear un panel de genes por secuenciación masiva para realizar el estudio genético sobre 88 pacientes con NM en el Hospital General Universitario Gregorio Marañón. 1.2. Identificar el total de variantes genómicas en cada una de las muestras analizadas mediante herramientas bioinformáticas. 1.3. Seleccionar aquellas variantes genéticas que muestren un potencial origen germinal y realizar una clasificación en base a su patogenicidad. 1.4. Establecer la relevancia clínica en función de las características clínicas de los pacientes. 1.5. Confirmar la presencia o ausencia de las variantes identificadas en muestras no tumorales de los pacientes. 1.6. Realizar la segregación familiar de la variante con el fin de elaborar árboles genealógicos. OBJETIVOS 59 Para abordar el segundo objetivo global se plantearon a su vez los siguientes objetivos específicos: 2.1. Emplear la secuenciación del exoma completo sobre muestras en remisión completa de 16 pacientes con criterios potenciales de presentar un síndrome de predisposición a NH. 2.2. Realizar una búsqueda bibliográfica de genes asociados con síndromes de predisposición a cáncer. Generar un panel virtual de genes con esta información para poder analizar las muestras en dúo o en casos índices aislados. 2.3. Ampliar el estudio a la totalidad de genes en las muestras con resultado genético no concluyente en el análisis primario. 2.4. Seleccionar aquellas variables genéticas que muestren un potencial origen germinal. Elaborar un análisis profundo de las funciones biológicas de los genes identificados y relacionar cada una de las variantes con la clínica asociada de los pacientes. OBJETIVOS 60 61 IV. Resultados RESULTADOS 62 4. Resultados Artículo 2. Andrés-Zayas C, Suárez-González J, Chicano-Lavilla M, Bastos Oreiro M, Rodríguez- Macías G, Font López P, Osorio Prendes S, Oarbeascoa Royuela G, García Ramírez P, Nieves Salgado R, Gómez-Centurión I, Carbonell Muñoz D, Muñiz P, Kwon M, Díez-Martín JL, Buño I, Martínez-Laperche C. Novel Candidate loci and Pathogenic Germline Variants Involved in Familial Hematological Malignancies Revealed by Whole- Exome Sequencing. Cancers. 2023; 15(3):944. https://doi.org/10.3390/cancers15030944 Artículo 1. Andrés-Zayas C, Suárez-González J, Rodríguez-Macías G, Dorado N, Osorio S, Font P, Carbonell D, Chicano M, Muñiz P, Bastos M, Kwon M, Díez-Martín JL, Buño I, Martínez-Laperche C. Clinical utility of targeted next-generation sequencing for the diagnosis of myeloid neoplasms with germline predisposition. Mol Oncol. 2021 Sep;15(9):2273-2284. doi: 10.1002/1878- 0261.12921. RESULTADOS 63 4.1. Artículo 1: Utilidad clínica Utilidad clínica de un panel de genes de secuenciación masiva para el diagnóstico de neoplasias mieloides con predisposición germinal. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 64 Clinical utility of targeted next-generation sequencing for the diagnosis of myeloid neoplasms with germline predisposition Cristina Andres-Zayas 1,2 , Julia Suarez-Gonz alez 1,2, Gabriela Rodrıguez-Macıas3, Nieves Dorado2,3, Santiago Osorio2,3, Patricia Font2,3, Diego Carbonell2,3, Marıa Chicano2,3, Paula Muniz~ 2,3, Mariana Bastos2,3, Mi Kwon2,3, Jose Luis D ıez-Martın2,3,4, Ismael Buno~ 1,2,3,5 and Carolina Martınez-Laperche2,3 1 Genomics Unit, Gregorio Maran~on General University Hospital, Gregorio Mara n~on Health Research Institute (IiSGM), Madrid, Spain 2 Gregorio Maran~on Health Research Institute (IiSGM), Madrid, Spain 3 Department of Hematology, Gregorio Maran~on General University Hospital, Madrid, Spain 4 Department of Medicine, School of Medicine, Complutense University of Madrid, Spain 5 Department of Cell Biology, School of Medicine, Complutense University of Madrid, Spain Keywords family history; genetic counseling; hereditary cancer; myeloid neoplasms with germline predisposition; next-generation sequencing Correspondence C. Martınez-Laperche, Hematological Genetics Laboratory, Department of Hematology, Gregorio Maran~on General University Hospital, Gregorio Maran~on Health Research Institute (IiSGM), C/ Doctor Esquerdo 46, 28007 Madrid, Spain Fax: +34 915868394 Tel: +34 915868775 E-mail: cmlaperchehgugm@gmail.com Cristina Andres-Zayas and Julia Suarez-Gonzalez contributed equally to this work. Ismael Buno and Carolina Mart~ ınezLaperche contributed equally to this work. (Received 18 October 2020, revised 30 December 2020, accepted 11 January 2021, available online 16 July 2021) Myeloid neoplasms (MN) with germline predisposition (MNGP) are likely to be more common than currently appreciated. Many of the genes involved in MNGP are also recurrently mutated in sporadic MN. Therefore, routine analysis of gene panels by next-generation sequencing provides an effective approach to detect germline variants with clinical significance in patients with hematological malignancies. Gene panel sequencing was performed in 88 consecutive and five nonconsecutive patients with MN diagnosis. Disease-causing germline mutations in CEBPa, ASXL1, TP53, MPL, GATA2, DDX41, and ETV6 genes were identified in nine patients. Six out of the nine patients with germline variants had a strong family history. These patients presented great heterogeneity in the age of diagnosis and phenotypic characteristics. In our study, there were families in which all the affected members presented the same subtype of disease, whereas members of other families presented various disease phenotypes. This intrafamiliar heterogeneity suggests that the acquisition of particular somatic variants may drive the evolution of the disease. This approach enabled high-throughput detection of MNGP in patients with MN diagnosis, which is of great relevance for both the patients themselves and the asymptomatic mutation carriers within the family. It is crucial to make a proper diagnosis of these patients to provide them with the most suitable treatment, followup, and genetic counseling. doi:10.1002/1878-0261.12921 Abbreviations Allo-HSCT, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; AML, acute myeloid leukemia; BM, bone marrow; COSMIC, Catalogue of Somatic Mutations in Cancer; ET, essential thrombocythemia; MDS, myelodysplastic syndrome; MN, myeloid neoplasms; MNGP, myeloid neoplasms with germline predisposition; NGS, next-generation sequencing; PB, peripheral blood; PMF, primary myelofibrosis; PV, polycythemia vera; VAF, variant allele frequency; VUS, variants of uncertain significance; WES, whole-exome sequencing; WGS, wholegenome sequencing; WHO, World Health Organization. Molecular Oncology 15 (2021) 2273–2284 ª 2021 The Authors. Published by FEBS Press and John Wiley & Sons Ltd. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 65 1. Introduction Chronic myeloproliferative neoplasms, myelodysplastic syndromes (MDS), and acute myeloid leukemia (AML) are genetically heterogeneous groups of clonal hematopoietic disorders characterized by morphological changes and ineffective hematopoiesis [1,2] together referred to as myeloid neoplasms (MN). While MN are mainly sporadic and primarily diseases of the elderly, germline mutations contributing to MN are not well defined. However, in recent years the increasing application of next-generation sequencing (NGS) has resulted in the recognition of multiple loci (GATA2, RUNX1, CEBPa, DDX41, ETV6, ANKRD26, SRP72, or SAMD9) [3–7] that the updated 2016 World Health Organization classification of hematopoietic tumors included as a new category named MN with germline predisposition (MNGP) [8]. It seems that they usually appear in 1–2% of elderly patients, and around 4–13% in children, young, and middle-age adults [9]. Furthermore, the growing interest of the scientific community regarding genetic predisposition of cancer will probably result in the recognition of a higher incidence in the future. The detection of individuals with these inherited disorders allows several opportunities for improvement in clinical care. Thus, it is important for clinicians to be familiar with the diagnosis, evaluation, and management of affected patients. A detailed family medical history, collected in all suspicious cases through the realization of a complete pedigree, should be mandatory. Once a germline mutation is confirmed in nonhematopoietic tissue, family members should be referred to genetic counseling. Moreover, the recognition of such patients is crucial for the identification of asymptomatic carrier family members [10–12] in the donor selection process for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). For these reasons, the inclusion of new genes involved in MNGP in NGS myeloid gene panels would improve the diagnosis and identification of these disorders [2,13]. In addition, many of these genes are also recurrently mutated in sporadic MDS/AML. Thus, our main objective was to analyze whether employing an NGS gene panel-based approach in MN diagnosed patients enables the identification of clinically relevant germline variants. In addition, for those patients in whom germline mutations were identified, a careful revision of the oncohematological family history was performed to characterize the disease and the underlying molecular events. 2. Patients and methods 2.1. Patient selection A myeloid gene panel was analyzed by NGS in 88 adults with a diagnosis of MN in the hematology department of Hospital General Universitario Gregorio Marañón from May 2017 to February 2019 (Cohort 1; Fig. 1 and Table 1. Patients diagnosed with AML and primary myelofibrosis (PMF) were all included. MDS, polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and MDS/myeloproliferative neoplasms (MPN) patients were only included if they were candidates to receive standard therapy or eligible to participate in a clinical trial. Patients diagnosed with bone marrow (BM) failure syndromes have not been included in the present study. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 66 Furthermore, five patients with a high suspicion of having MNGP diagnosed from 2010 to 2016 were also included (Cohort 2; Fig. 1 and Table 1. Patients were considered highly suspicious when they had (a) more than one first-degree relative affected from hematological malignancies or other solid tumors, (b) organ-system manifestations fitting known MNGP, and/or (c) personal history of multiple oncohematological tumors. The study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki, and ethical approval was obtained by the Ethical Committee of University Hospital Gregorio Maran~on. Personal and family his- tories, demographics, and patient characteristics were obtained from the electronic health records. 2.2. Analysis of molecular alterations through NGS Genomic DNA was purified from BM aspirates or peripheral blood (PB) samples at diagnosis following the manufacturer’s instructions (Maxwell 16 Blood DNA Purification Kit; Promega, Madison, WI, USA). NGS-based targeted gene capturepanel (MyeloidNeoplasm-GeneSGKit; Sistemas Genomicos, Valencia, Spain. Table S1) is routinely performed in our hospital to characterize MN patients [14]. Consistent with the current knowledge, the panel included 15 genes known to be involved in MNGP (ANKRD26, ASXL1, CBL, CEBPa, CSF3R, DDX41, ETV6, GATA2, IKZF1, JAK2, MPL, NF1, PTPN11, RUNX1, and TP53) [8,15–20]. Target enrichment experiments were performed according to standard manufacturer’s protocol for library preparation. Fig. 1. Workflow for the analysis of variants in the 93 patients studied (88 with MN diagnosis and five with suspected MNGP). BWA, Burrows-Wheeler Aligner; FB, fibroblasts; R-PB, remission PB; R-BM, remission bone marrow. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 67 Probes were designed to detect point mutations, indels < 30 base pairs, copy number variations, chromosomal rearrangements, and numerical alterations. Libraries were denatured and sequenced on an Illumina MiSeq platform with reagents v2 for paired-end sequencing (2*101 bp). FASTQ files were aligned to the human genome reference sequence (GRCh38/hg38) using BurrowsWheeler Aligner [21] and ‘in-house’ scripts. Variant calling was conducted using a combination of two different algorithms: VarScan [22] and GATK [23]. Identified variants were annotated using Ensembl database, population databases (the Exome Aggregation Consortium and 1000 Genomes), and specific variant databases (ClinVar, Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), Online Mendelian Inheritance in Man, and Human Gene Mutation Database). Variants were evaluated with Polyphen 2.0, SIFT, and Mutation Taster softwares to predict their functional effects. 2.3. Variant analysis After annotation, all frameshift and nonsynonymous variants located in coding or splicing regions of canonical isoforms, affecting all genes included in the panel and with minor allele frequency < 1%, were considered in subsequent analyses. Additionally, GATA2 synonymous variants were carefully analyzed, as recently reported [24,25]. The pathogenicity of variants was designated according to the recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology Fig. S1 [26]. Pathogenic or likely pathogenic variants were suspected to be of germline origin if they showed an allelic frequency [variant allele frequency (VAF)] > 0.4 for single nucleotide variations and > 0.3 for small insertions or deletions (indels). In such cases, variants may be either of heterozygous germline or of acquired origin. As the panel employed is capable to detect copy number alterations reliably, all cases were also carefully analyzed in order not to miss any potential germline variant with lower VAF than expected. Table 1. Clinical characteristics of the 93 patients (88 in cohort 1 and five in cohort 2) included in the study (Hb, hemoglobin). Cohort 1 (n = 88) Cohort 2 (n = 5) Sex, n (%) Female 28 (32) 3 (60) Male 60 (68) 2 (40) Age (years), median [range] 61 [14–82] 32 [15–45] MN subtypes, n (%) AML 30 (34) 2 (40) MDS 32 (36) 2 (40) MPN 22 (25) 1 (20) MDS/MPN 4 (5) 0 (0) Laboratory, median [range] Leukocytes (9 109/L) 5.6 [0.9–326.9] 3.3 [0.9–5.6] Neutrophils (9 109/L) 2.8 [0.1–109.3] 1.1 [0.2–3.1] Platelets (9 109/L) 112 [11–1049] 117 [11–200] Hb (gdL1) 10.5 [5.9–17.6] 10.5 [0–96] 9 [7.2–11.4] 0 [0–53] C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 68 BM blasts (%) PB blasts (%) 1 [0–98] 10 [0–36] LDH (UL1) Karyotype, n (%) 181 [74–428] 201.5 [123–280] Normal 34 (39) 0 (0) Altered 25 (28) 1 (20) Complex 9 (10) 1 (20) No karyotype 20 (23) 3 (60) Molecular alterations, patients (%) DNMT3A 10(11) 0 (0) RUNX1 9 (10) 1 (20) NPM1 8 (9) 0 (0) FLT3 5 (6) 0 (0) IDH1 2 (2.3) 0 (0) IDH2 2 (2.3) 0 (0) 2.4. Confirmation of germline origin As a first approach, PB/BM samples at complete remission (CR) or CD3+ T cells were employed to evaluate the origin of the mutation. Immunomagnetic separation method was carried out for the purification of T lymphocytes (TL) using anti-CD3 MicroBeads (Miltenyi Biotec 130-050-101, Bergisch Gladbach, Germany). Cell selection was performed on the auto-MACS PRO Separator (Miltenyi Biotech) using two paramagnetic columns, and positive selection was then retained. With the purpose of definitely confirming germline origin, a skin biopsy sample was requested to carry out skin fibroblast culture if possible. Skin fibroblast culture was conducted at 37 °C, in humidity conditions, 5% CO2, and in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) cell culture media (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) supplemented with glutamine, FBS, and 1% of penicillin and streptomycin during 4–6 weeks. After this time, cells were trypsinized and DNA was extracted using QiAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to manufacturer’s instructions. The confirmation was performed by optimizing specific PCR assays for each variant followed by Sanger sequencing with Big Dye Terminator v3.1 Chemistry (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) on ABI 3130xl or ABI 3730xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Visualization and localization of variants were assessed by using CHROMAS Software (Technelysium, South Brisbane, Australia) and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Bethesda, MD, USA). Once a germline variant was confirmed in the patient, a segregation study was offered to his relatives. In cases in which a rapid answer was needed from the laboratory (i.e., patient candidate to HSCT), the variant was analyzed in a nontumoral sample at the same time as potential family donors were being evaluated. In the rest of cases, we first screened the mutation in remission samples or TL and, if positive, a skin biopsy was requested when it was feasible. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 69 3. Results 3.1. Variant analysis Regarding cohort 1, a total of 329 variants were detected, of which 62% (205/329) were classified as pathogenic or likely pathogenic (P/LP), 33% (108/ 329) were classified as variants of uncertain significance (VUS), and 5% (16/329) were classified as benign or likely benign (B/LB). Taking into account only the 15 genes of potential germline relevance, 133 variants were detected. Among them, 45% (60/133) were classified as P/LP, 46% (61/133) were classified as VUS, and 9% (12/133) were classified as B/LB. Thus, 32 patients carried pathogenic or likely pathogenic variants with a VAF > 0.4 in these 15 genes. We could study the possible germline origin of 27 variants in 26 patients Table S2, and the remaining six patients could not be analyzed because nontumoral sample was not available. After confirmatory tests, five patients were confirmed of harboring germline variants. Thus, in cohort 1 a total 5.7% (5/88) of patients presented MNGP. The affected genes were MPL (p.Phe105Leu), GATA2 (p.Arg396Gln), DDX41 (p.Asp30_Asp32del; p.Ile592Phe), and ETV6 (p.Arg49Cys) Tables 2 and 3. Interestingly, in all cases suspected with germline variants in MPL, DDX41, and ETV6 genes, these were finally confirmed as of germline origin Tables 2 and 3. Regarding cohort 2, a total of 11 variants were detected, of which 64% (7/11) were classified as P/LP and 36% (4/11) were classified as VUS. Four variants were detected in the genes of interest with a VAF > 0.4 and were subsequently confirmed to be germline. In cohort 2, 80% (4/5) of Table 2. Relevant clinical characteristics of individuals affected from MNGP in the studied families. Dash indicates not chemotherapy received. Aza, azacitidine; Ch, chemotherapy; F, female; Fam, family; Ind, individual; lena, lenalidomide; M, male; MMS, Mono-Mac syndrome; NA, not available; NT, not treated; pred, prednisone. Fam Ind Cohort Sex Age (years) Gene Diagnosis BM blasts (%) Karyotype Ch Status HSCT Followup (months) A III.1 2 F 32 CEBPa AML 53 47,XX,+21 [18/20]; 46,XX [2/20] IA 3X7 CR No 132 A II.1 F 53 CEBPa AML NA 46,XX [10] IA 3X7 CR auto- HSCT 147 B IV.3 2 F 2 ASXL1 PMF NA 46,XX [20] Lena + pred CR No 220 B III.6 M 54 ASXL1 PMF NA NA Lena Progression No 88 C III.6 1 F 53 ETV6 MDS 6 46,XX [20] NT Progression No 100 C II.6 F 86 ETV6 MDS 2 46,XX [20] NT Exitus No 45 D II.1 1 M 41 TP53 AML 89 Complex IA 3X7 Exitus No 14 E II.2 1 M 53 MPL MPN 1 46,XY [20] NT Alive No 18 F II.1 2 M 35 GATA2 MDS/ MMS 0 Complex NT Complete chimerism allo- HSCT 20 G II.3 2 M 32 GATA2 MDS/ MMS 0 47,XY,+8 [5]; 46,XY [11] NT Exitus allo- HSCT 144 H III.1 1 M 70 DDX41 MDS 1 NA Aza Alive No 27 I PN- 09 1 F 58 DDX41 AML 21 Complex Clinical trial Progression No 9 C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 70 patients were identified as carriers of disease-causing germline variants in CEBPa (p.His24AlafsTer84), TP53 (p.Arg282Trp), ASXL1 (p.Gly704Arg), and GATA2 (p.Arg396Trp) genes Tables 2 and 3. In summary, nine patients presented MNGP Tables 2 and 3. Three patients had AML, two MDS/ Mono-MAC syndromes, two MPN, and two presented MDS. Mono-MAC syndrome represents a unique clinical entity characterized by monocytopenia, lymphedema, an increased risk of opportunistic infections, and hematological malignancies [27]. These patients presented great heterogeneity in the age at diagnosis (median age 47 years, range 2–73). The pedigrees of eight families are depicted in Fig. 2A–H. Family I is not shown since the patient denied any relevant family background, but did not give additional information about relatives to complete her pedigree. Considering the family history of hematopoietic neoplasms or solid tumors, we would like to highlight that six out of nine patients confirmed to harbor a germline variant presented a strong family history (three patients from cohort 1 and three patients from cohort 2). Only one patient with DDX41 germline mutation and the two cases of Mono-Mac syndrome (GATA2 variants) had no relevant family history (Families F, G, I; Tables 2 and 3. Moreover, it should be remarked that family history of all 93 patients included in the study was carefully evaluated and 10 patients did present a highly suggestive family history. Among them, with the panel employed, we have been able to detect a germline alteration in 60% of the patients (6/10). The remaining four did not show any germline variant in none of the genes studied despite of strong family background (three patients from cohort 1 and one from cohort 2). Molecular alterations detected in CEBPa, TP53, and GATA2 have already been identified as high-risk germline alleles with MN predisposition [27–32],meanwhile, ASXL1 variant p.Gly704Arg has only been found in patients diagnosed from sporadic MN and missense MPL variant p.Phe105Leu has been previously described in a case of chronic myelomonocytic leukemia and in a case of Sezary syndrome [33,34]. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 71 Other missense variants (p.Pro106Leu and p.Arg102Pro) have been described as germline mutations affecting the MPL/JAK2 signaling axis in hereditary thrombocytosis [35,36]. This new variant affects the extracellular domain of the gene, particularly a region involved in ligand binding [37]. The three in silico predictors classify this new variant as probably pathological. Therefore, we speculate that the nearby p.Phe105Leu mutation might have a similar disruptive capacity. Two patients harbored novel heterozygous germline variants in the DDX41 gene (p.Asp30_Asp32del and p.Arg339Cys), one of the most frequently mutated MN predisposition gene [38]. Additionally, we have detected a germline variant in the ETV6 gene (p.Arg49Cys) in both the index case and the mother of family J. The aforementioned alteration was found in COSMIC database as a pathogenic variant reported in a case of endometrioid carcinoma. Moreover, the prevalence of the alteration in the general population is 0.0017. Intrafamiliar heterogeneity could suggest that the acquisition of certain somatic variants may drive the evolution of the disease. The patient A.III.1 presented a somatic variant in GATA2 gene (p.Gly320Asp). Secondly, the subject B.III.6 acquired second-hit ASXL1 mutation (p.Gln976Ter). Lastly, the index case H.III.1 acquired a second-hit DDX41 somatic mutation (p.Ile592Phe). 4. Discussion Cancer predisposition has long been recognized to contribute to the development of many solid tumors. Recently, with the incorporation of NGS, new genes have been discovered correlating with MNGP and several family studies have been carried out to date [39]. Table 3. Germline variants identified in the current study. ALL, acute lymphoblastic leukemia. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 72 nt, not tested. Although the field of predisposition to hematological malignancies is evolving promptly, the penetrance, the phenotype, or the inheritance pattern of this subgroup of syndromes is still unknown. Etiology of MNGP is heterogeneous, and our data reinforce this idea. In fact, there are families with a homogeneous clinical phenotype, in which all affected members present the same subtype of disease,whereas other families have a mixed phenotype, with affected members suffering from different neoplasms. In this regard, the information obtained from family history seemed to indicate that MN in these families may be inherited in an autosomal dominant pattern with variable expression. Furthermore, the comparison of second-generation and first-generation patients showed a younger age of diagnosis in CEBPa and ASXL1 pedigrees. These families may be possible attached to a phenomenon of anticipation. When a genomic test is performed in patients with MN, it is crucial to confirm the germline origin of the variants found. According to our experience, cultured skin fibroblasts are the preferred source remaining as the gold standard sample for confirmation. Even though, other nontumor samples such as PB at CR, buccal swab, saliva, or isolated T cells can be used when a skin biopsy is not available or when a rapid clinical decision is needed (e.g., when there is a relative suitable as donor for allo-HSCT) [40]. However, these samples must be interpreted carefully as they may be contaminated with tumor tissue. In remission samples, Fig. 2. Pedigrees of patients with a confirmed MNGP. (A) AML (germline CEBPa p.His24Alafs). (B) MPN (germline ASXL1 p.Gly704Arg). (C) AML (germline ETV6 p.Arg49Cys). (D) AML (germline TP53 p.Arg282Trp). (E) MPN (germline MPL p.Phe105Leu). (F) MDS/Mono-Mac syndrome (germline GATA2 p.Arg396Gln). (G) MDS/Mono-Mac syndrome (germline GATA2 p.Arg396Trp). (H) MDS (germline DDX41 p.Arg339Cys). Arrowhead indicates index proband. Pedigree for Family I is not shown because no detailed family information was collected. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 73 it has already been described the presence of clonal hematopoiesis of indeterminate potential which is defined as the presence of recurrent somatic mutations in hematopoietic stem cells acquired throughout the life of the patients [41]. In saliva, the presence of a significant percentage of hematopoietic cells is conceivable, and, on the other side, the variant could have been acquired in a primary stem cell and be shared between myeloid and lymphoid lineages, so it could lead to a false positive if T cells are studied for validation [42]. On the other hand, those families in which there are several relatives affected from MN and the variant is found in more than one of them, cultured skin fibroblasts are not mandatory to confirm the germline origin. Moreover, in those cases in whom the variant is detected in a remission sample or in TL there would be enough evidence to report the high suspicion of the case and provide genetic counseling to the family. The implementation of a gene panel analysis by NGS for somatic mutations is increasingly used in the diagnosis, prognosis, and treatment selection for patients with MN [43,44]. In this sense, the fact that known genes related to predisposition to MN are also recurrently mutated genes in de novo neoplasms makes plausible the identification of suspicious germline variants in the routine analysis of tumor samples [13]. In cohort 1, 32 out of 88 patients (36.4%) were suspected of carrying a germline variant since they showed pathogenic or likely pathogenic variants in any of the 15 genes with potential germline relevance. Among these suspicious patients, 21 patients were studied and discarded, six patients could not be analyzed and five patients presented germline variants. Thus, we identified an incidence of 19.3% (5/26) in suspicious patients and a final incidence of confirmed MNGP of 6% (5/82). Our results are consistent with previous studies where it is estimated that around a 5% of all cancers present a hereditary component [13,45,46]. This percentage is increased when patients with highly suggestive family background (n = 10) are taken into account. In this situation, our panel was able to detect the causative mutation in 60% of the patients (n = 6). Furthermore, the panel employed was capable to reveal a germline variant in three cases from cohort 1 where family history was not known or suspected. Due to the fact that some relevant genes are missing from the panel, the number of patients identified may even be underestimated. That is why our gene panel will be updated with a new enhanced version which will include, inter alia, SAMD9, SAMD9L, or SRP72 genes. The inclusion of genes associated with hereditary myeloid malignancies into routine myeloid panels will reduce costs and optimize patient care. However, in this scenario, it is imperative to standardize which variants should be reported and pretest counseling. Additionally, genetic analysis may become even more challenging since some polymorphisms are yet known to be associated with an increased risk of developing cancer [47,48]. Nevertheless, it still needs to be established the role of common genetic variants in cancer predisposition syndromes. Those individuals with a highly suggestive family history but no variant found are interesting candidates to enlarge the genetic study with other available approaches such as a panel of cancer predisposition genes, whole-exome sequencing (WES) or whole-genome sequencing (WGS), in order to identify the causal alteration. In the case of WES/WGS, at least two affected members of the family must be analyzed to discover which are the genes involved. Thus, family history is so relevant that we consider it crucial to incorporate specific personal medical data of all patients diagnosed with MN in order to collect relevant family history for C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 74 clinical suspicion. However, variable expression and incomplete penetrance of these disorders add imperative challenges [49]. That is why it is important to carefully analyze the suspicious variants detected through NGS in order to provide the best clinical care, guide stem cell transplant decision, and identify other relatives in the family who may be at risk. The identification of variants which confer a predisposition to the development of hematological malignancies is challenging because as more pedigrees are described, surely one variant will be associated with a unique family [1,50]. We herein report a missense ASXL1 mutation (p.Gly704Arg) which, to our knowledge, has not been previously described as a germline variant. It has only been previously found in patients diagnosed with sporadic MN [29,51]. To date, few patients with MNGP have been reported to present germline ASXL1 mutations [16,52], however, the strong AML family history found within this family together with the fact that the variant was detected in a remission sample from the proband (B.IV.3), as well as in a diagnosis sample from her paternal uncle (B.III.6), supports the idea of its pathogenicity and germline origin Fig. 2. It must be highlighted that these data do not replace the need for further experimental validation, albeit it is reasonable to consider this variant as a predisposing risk allele in our family. We also report on a new missense germline variant in the MPL gene (p.Phe105Leu). It affects the extracellular domain of the gene, particularly a region involved in ligand binding [37] and a disruptive capacity was predicted. Further functional studies are required to determine the pathogenic potential of those non described variants and the significance of them in inherited related MN. Both germline variants in the DDX41 gene are located throughout the sequence of the gene, suggesting that different mutations can impact on different protein domains or motifs with pathologic consequences [38]. Despite small sample size, one out of 2 (50%) patients with germline DDX41 mutations in the present study harbored somatic point mutations in the other allele, as previously reported [53]. Finally, the precise function of the novel ETV6 mutation is unknown, although it is located in exon 2 and, in the protein level, near the SAM-PNT domain which mediates protein–protein interaction with Ets factors [54]. This p.Arg49Cys ETV6 variant has been previously described by Moriyama et al. [55] in a cohort of childhood acute lymphoblastic leukemia, revealing the complexity of hereditary cancer as specific mutations can confer different risks to different types of cancer [56]. When allo-HSCT is considered in a patient harboring a germline variant, donor selection among relatives must be carefully conducted. Potential-related donors should be evaluated for the mutation detected in the index case in order to avoid selecting an asymptomatic carrier as donor (42). In those cases in which the donor presents the alteration, alternative donors should be considered. In our cohort, patients D.II.1, F.II.1, and G.II.3 underwent allo-HSCT. For all of them, a screening of the mutation was performed in the candidate family members and donors were selected among those who did not carry the alteration. In the case of family D, despite the fact that the patient died before receiving the transplant, the alteration was detected in several siblings Table 3, Fig. 2. All of them are still at risk for suffering from hematological and solid tumors, since the alteration detected in TP53 gene (p.Arg282Trp) is diagnostic for the Li– Fraumeni syndrome [28,32]. Within this scenario, genetic counseling should be offered to family members. Healthy family members diagnosed with a hematological predisposition syndrome should be referred to cancer surveillance programs. The optimal clinical surveillance for asymptomatic individuals with germline alterations is unclear. Germline alterations are no fully penetrant, and many carriers C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 75 will not develop any malignancy. In accordance with other authors, analysis of complete PB counts every 6 months is highly recommended. If there is any change in the blood counts, the test must be repeated 1–2 weeks later, and if it persists, it will be necessary to perform a BM aspirate [57]. However, if the syndrome is associated with the onset of other tumors, this screening will be insufficient. Therefore, it is necessary to implement a surveillance specific program for each of the hematological hereditary syndromes and their follow-up should be performed by a multidisciplinary team in specialized centers. Research in this area is necessary to characterize in detail each of these syndromes, as well as the establishment of national and international registries. In the same way, it is crucial for clinicians to be familiar with these syndromes and they should keep in mind hematological malignancy predisposition syndromes on the differential diagnosis for every patient in order to identify properly families with predisposing conditions [10], [58]. 5. Conclusions In conclusion, we demonstrated that it is useful to include genes related to MNGP in gene panels designed principally for routine analysis of somatic mutations. They provide an effective approach to: (a) detect clinical significant variants of potential germline origin, and therefore (b) avoid using a related stem cell donor carrying the same mutation, and (c) offer genetic counseling to the families affected. In the future, the number of patients diagnosed with germline alteration will certainly increase as the full spectrum of genes involved in hematological malignancies syndromes is elucidated. This issue would be solved since WES, or even WGS, techniques will become a more cost-effective and timely approach in routine clinical care. Acknowledgements The authors are grateful to the patients and their families, as well as to the staffs at Gregorio Marañón Gen- eral University Hospital and Gregorio Marañón Health Research Institute. The present work was partially supported by the Ministry of Economy and Competitiveness ISCIII-FIS grants PI17/1880, cofinanced by ERDF (FEDER) Funds from the European Commission, ‘A way of making Europe’, as well as grants from the Asociacion Madrile na de Hematolog~ ıa y Hemoterapia (AMHH), Asociacion Espa nola Contra~ el Cancer (AECC), and Fundacion Mutua Madrile na~ (FMM). Conflict of interest The authors declare no conflict of interest. Author contributions CA-Z, JS-G, IB, CM-L, and JLD-M conceptualized the study; CA-Z, JS-G, DC, MC, and PM curated the data; GR-M, ND, SO, PF, MB, and MK recorded patient clinical characteristics; CA-Z, JS-G, DC, MC, PM, IB, and CM-L involved in formal analysis; JLDM, IB, and CM-L involved in funding acquisition; JSG, IB, and CM-L supervised the study; CA-Z, JS-G, IB, and CM-L wrote—original draft; CA-Z, JS-G, GR-M, ND, SO, PF, DC, MC, PM, MB, MK, JLD, IB, and CM-L wrote—review and editing. C. Andres-Zayas et al. Germline mutations in myeloid neoplasms by NGS 76 References 1 Churpek JE, Pyrtel K, Kanchi K-L, Shao J, Koboldt D, Miller CA, Shen D, Fulton R, O’Laughlin M, Fronick C et al. (2015) Genomic analysis of germ line and somatic variants in familial myelodysplasia/acute myeloid leukemia. Blood 126, 2484– 2490. 2 Guidugli L, Johnson AK, Alkorta-Aranburu G, Nelakuditi V, Arndt K, Churpek JE, Godley LA, Townsley D, Young NS, Fitzpatrick C et al. (2017) Clinical utility of gene panel-based testing for hereditary myelodysplastic syndrome/acute leukemia predisposition syndromes. Leukemia 31, 1226–1229. 3 Li R, Sobreira N, Witmer PD, Pratz KW & Braunstein EM (2016) Two novel germline DDX41 mutations in a family with inherited myelodysplasia/acute myeloid leukemia. Haematologica 101, e228–e231. 4 Pippucci T, Savoia A, Perrotta S, Pujol-Moix N, Noris P, Castegnaro G, Pecci A, Gnan C, Punzo F, Marconi C et al. 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Evidence framework and criteria for classifying pathogenic variants according to the recommendations of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Table S1. Genes and recurrent alterations included in the NGS gene panel employed. Table S2. Confirmatory analysis for suspicious variants in the genes of interest with a VAF > 0.4 in cohort 1. RESULTADOS 79 4.2. Artículo 2: Identificación de nuevos loci candidatos y variantes patogénicas en línea germinal implicadas en enfermedades hematológicas familiares a través del empleo de secuenciación de exoma completo. 80 cancers Article Novel Candidate loci and Pathogenic Germline Variants Involved in Familial Hematological Malignancies Revealed by Whole-Exome Sequencing Cristina Andrés-Zayas 1,2,†, Julia Suárez-González 1,2,†, María Chicano-Lavilla 2,3, Mariana Bastos Oreiro 2,3 , Gabriela Rodríguez-Macías 3 , Patricia Font López 3, Santiago Osorio Prendes 3, Gillen Oarbeascoa Royuela 2,3, Patricia García Ramírez 4 , Rocío Nieves Salgado 5, Ignacio Gómez-Centurión 2,3, Diego Carbonell Muñoz 2,3 , Paula Muñiz 2,3 , Mi Kwon 2,3 , José Luis Díez-Martín 2,3,6, Ismael Buño 1,2,3,7,‡ and Carolina Martínez-Laperche 2,3,*,‡ 1 Genomics Unit, Gregorio Marañón General University Hospital, Gregorio Marañón Health Research Institute (IiSGM), 28009 Madrid, Spain 2 Gregorio Marañón Health Research Institute (IiSGM), 28009 Madrid, Spain 3 Department of Hematology, Gregorio Marañón General University Hospital, 28007 Madrid, Spain 4 Department of Hematology, Hospital Universitario Príncipe de Asturias, 28802 Madrid, Spain 5 Department of Hematology, Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz, 28040 Madrid, Spain 6 Department of Medicine, School of Medicine, Complutense University of Madrid, 28040 Madrid, Spain 7 Department of Cell Biology, School of Medicine, Complutense University of Madrid, 28040 Madrid, Spain * Correspondence: cmlaperchehgugm@gmail.com † These authors contributed equally to this work. ‡ These authors contributed equally to this work. Citation: Andrés-Zayas, C.; Suárez-González, J.; Chicano-Lavilla, M.; Bastos Oreiro, M.; Rodríguez-Macías, G.; Font López, P.; Osorio Prendes, S.; Oarbeascoa Royuela, G.; García Ramírez, P.; Nieves Salgado, R.; et al. Novel Candidate loci and Pathogenic Germline Variants Involved in Familial Hematological Malignancies Revealed by Whole-Exome Sequencing. Cancers 2023, 15, 944. https:// doi.org/10.3390/cancers15030944 Academic Editor: Massimo Breccia Received: 5 January 2023 Revised: 27 January 2023 Accepted: 31 January 2023 Published: 2 February 2023 Copyright: © 2023 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (https:// creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/). 81 Simple Summary: Inherited predisposition to hematological malignancies is more common than previously perceived. The main objective of our study was to analyze the whole- exome sequencing data for the genomic characterization of sixteen patients with a strong family or personal onco- hematological history. When a duo analysis was performed, we detected pathogenic or likely pathogenic (P/LP) germline variants in four out of the six families studied. In the remaining four individuals, we detected three P/LP germline variants in genes with a potential role in cancer development. Next-generation sequencing strategies lead to the identification of novel candidate genes (NFATC2 and TC2N) potentially involved in the development of these germline syndromes. The recognition of predisposing variants is crucial for disease management and follow-up of affected patients and their relatives. Abstract: The familial occurrence of hematological malignancies has been underappreciated. Recent studies suggest that up to 15% of adults with myeloid neoplasms carry germline pathogenic variants in cancer- predisposing genes. This study aimed to identify the underlying germline predisposition variant in patients with a strong family or personal onco-hematological history using whole exome sequencing on sixteen uncharacterized individuals. It was carried out in two groups of patients, one with samples available from two affected relatives (Cohort A) and one with available samples from the index case (Cohort B). In Cohort A, six families were characterized. Two families shared variants in genes associated with DNA damage response and involved in cancer development (CHEK2 and RAD54L). Pathogenic or likely pathogenic germline variants were also found in novel candidate genes (NFATC2 and TC2N). In two families, any relevant pathogenic or likely pathogenic genomic variants were identified. In Cohort B, four additional index cases were analyzed. Three of them harbor clinically relevant variants in genes with a probable role in the development of inherited forms of hematological malignancies (GATA1, MSH4 and PRF1). Overall, whole exome sequencing is a useful approach to achieve a further characterization of these patients and their mutational spectra. Moreover, further investigations may help improve optimization for disease management of affected patients and their families. Cancers 2023, 15, 944. https://doi.org/10.3390/cancers15030944 https://www.mdpi.com/journal/cancers Cancers 2023, 15, 944 3 of 13 Keywords: predisposition syndromes; whole-exome sequencing; cancer susceptibility; hematological malignancies; germline mutation 1. Introduction The significance of germline mutations in the field of solid tumors is well established, and changes in the clinical practice to include the consideration of such mutations have been settled [1,2]. However, inherited forms of hematological malignancies (IFHM) have recently been recognized, which makes it difficult to establish the precise incidence and prevalence of these disorders. While it is true that the inclusion of the category “myeloid neoplasm with germline mutations” in the World Health Organization (WHO) 2016 classification constituted a breakthrough [3], further work remains to be completed to refine the clinical diagnosis of these families and provide appropriate genetic counseling. Since the first gene (RUNX1) was identified as being responsible for the familial transmission of platelet disorders [4,5], the list of genes involved in the inheritance of hematological neoplasms has exponentially increased [6,7]. The rapid advent of next- generation sequencing (NGS) in the clinical setting has enabled the detection of germline variants in patients not otherwise diagnosed. To date, more than 20 genes have been linked with heritable hematological malignancies, several of which are also mutated in sporadic cases (CEBPα, TP53, ETV6) while others are restricted to unique families (ANKRD26, SRP72, SAMD9) [8–10]. Additionally, some cancer predisposition genes are not exclusive from solid tumors but are also involved in IFHM. In the clinical setting, detecting familial cases is crucial in the field of hematology due to the implications for the patients themselves, their family members and genetic counseling. Taking into consideration that hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is frequently the only curative treatment for these patients, the presence of a germline predisposing genomic variant is a significant issue in the setting of HSCT [11]. Relatives are at risk of sharing the same germline variant as the patient. Choosing related donors who harbor pathogenic germline variants could lead to graft failure, early relapse or donor cell leukemia, among other complications [12]. That is the reason why determining the absence of the alteration is crucial during the selection process of the proper donor. Moreover, family members should be involved in a surveillance program. These entities are still difficult to manage for most clinicians, and there is a lack of standardization in the field regarding which patients and which genes should be tested. However, the new European LeukemiaNet recommendations give clinical features that prompt consideration of clinical testing for a germline predisposing alteration [13]. The usefulness of targeted gene panels has been largely evaluated in the literature [14–16], and they are considered an effective approach to detect germline variants in well-established genes at diagnosis [17]. As genomic studies provide highly sensitive information, it is crucial that all patients provide written informed consent according to the principles of the Declaration of Helsinki during a pre-test consultation. In a previous study from our group, 6% of unselected patients were confirmed to have a diagnosis of myeloid neoplasms with germline predisposition (MNGP) employing a gene panel-based approach. This percentage increased to 60% when patients with highly suggestive family histories were considered. Nevertheless, there is still a subset of patients with strong family backgrounds (two or more relatives diagnosed with onco-haematological diseases or personal background of multiple tumors) in which no mutation has been detected [12,17]. For these families, expanding the genetic analysis with more extensive technologies, such as whole exome sequencing (WES) or whole genome sequencing (WGS), would offer a unique opportunity to expand our knowledge and understand their clinical heterogeneity. Cancers 2023, 15, 944 3 of 13 ≤ To address this issue, the present study included a series of 16 uncharacterized patients with a strong family or personal onco-hematological history in which we performed WES with the objective to determine the underlying germline predisposition variant. For six of the patients, samples from two family members were also available for analysis. 2. Patients and Methods 2.1. Patient Selection A cohort of 16 human subjects was enrolled in this study, including 4 patients di- agnosed with hematological malignancies and 12 relatives from 6 families. They were all recruited from the department of hematology at Hospital General Universitario Gre- gorio Marañón, Hospital Universitario Príncipe de Asturias and Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz. Patients were only included if they presented strong family backgrounds (two or more first-degree relatives affected by any malignant neoplasm) or a personal history of multiple tumors throughout their lifetime. The term index case was referred to the first patient referred to a medical consultation at the department of hematology. Seven patients diagnosed with myeloid neoplasms were initially evaluated employing a gene panel implemented in the clinical setting, which included 15 genes known to be involved in MNGP: ANKRD26, ASXL1, CBL, CEBPα, CSF3R, DDX41, ETV6, GATA2, IKZF1, JAK2, MPL, NF1, PTPN11, RUNX1 and TP53. None of the patients presented a genomic alteration in the genes analyzed. Clinical data of the patients were obtained from their medical records. Genomic DNA was extracted from bone marrow (BM) or peripheral blood (PB) sam- ples according to the manufacturer’s instructions using a Maxwell® RSC Blood DNA Kit (Promega, Madison, WI, USA). Across our series of 16 individuals (Table 1), our study included samples from 2 affected individuals in 6 families (Cohort A; n = 12 samples). This strategy allowed us to perform genomic analysis on sharing variants. In the remaining 4 families (Cohort B), material was available from the index case only (4 samples). The research protocol was approved by the Ethical Committee of University Hospital Gre- gorio Marañón and was conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. 2.2. Genomic Profiling A total of 16 individuals from 10 different families (Table 1) were evaluated with WES. WES libraries were prepared from 210 ng of genomic DNA using the Twist Human Core Exome Kit (Twist Bioscience, San Francisco, CA, USA) coupled with Twist Human RefSeq Panel (Twist Bioscience, San Francisco, CA, USA), according to the manufacturer’s proto- col. Libraries were denatured and paired-end sequenced with a NextSeq 550 instrument (Illumina, San Diego, CA, USA) using the high output 300 cycles kit (2 × 149 bp). 2.3. Variant Analysis WES data were processed using the SOPHiA DDM® platform. In brief, read data were aligned to the human reference genome (GRCh37/hg19) and variants and indels were called according to the Genome Analysis Toolkit (GATK) [18]. Variants with a sequenc- ing depth of 25 were filtered out. Following quality control, variants were classified as pathogenic or likely pathogenic if they met the following criteria: (1) minor allele frequency in the general population (ExAC and gnomAD databases) < 1%; (2) variant allele frequency (VAF) > 30%; (3) non-synonymous variants located in coding or splicing regions of canon- ical isoforms; (4) not meeting any benign criteria following ACMG guidelines [19] and not rated as a benign or likely benign variant in ClinVar database; and (5) predicted to be pathogenic by, at least, three out of four tools employed to evaluate their functional effects: Polymorphism Phenotyping v2 (PolyPhen2), MutationTaster, Sorting Tolerant from Intolerant (SIFT) and Provean. Cancers 2023, 15, 944 3 of 13 For the analysis, two groups were established based on the availability of samples from the index case and one affected family member (Cohort A) or from the index case only (Cohort B). To search for a disease-causing variant in Cohort B, genes highly related to cancer predisposition syndromes were first analyzed (Supplementary Table S1). If the analysis remained negative, it was expanded to whole exome sequencing data. In Cohort A, samples from affected relatives were analyzed simultaneously to retain all the variants shared by both family members. The germline status of the variants detected was established using the VAF. When the VAF is 30–60%, the heterozygous status is very likely; meanwhile, when the VAF is >90%, the homozygous status is established. Copy number variants (CNV) were not included in the analysis since the bioinformatic pipeline used was not designed for this purpose. Cancers 2023, 15, 944 5 of 13 Cancers 2023, 15, 944 11 of 13 × 2.4. Variant Validation To eliminate possible artefactual and platform-specific variants, 7 selected variants identified with WES in 7 candidate genes were further validated with Sanger sequenc- ing. The confirmation was performed by optimizing custom PCR assays for each variant followed by Sanger sequencing with Big Dye Terminator v3.1 Chemistry using an ABI Prism 3730xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Visualization and localization of variants were assessed by using Chromas Software and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). To confirm the homozygous state of the variant found in CHEK2, the analysis of the samples was performed with the SALSA MLPA Probemix P190 CHEK2 kit (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands) which contains probes for all 15 exons of the gene (NM_007194.4). The samples were loaded onto a 3730xl Ge- netic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Results were visualized using Coffalyser.net software (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands). 2.5. SNP-Array As the panel employed did not capture structural abnormalities, an SNP array was performed on those families where the variant analysis remained negative. DNA samples were hybridized to the CytoSNP-12v2.1 array (Illumina, San Diego, CA, USA) according to the manufacturer’s protocol. Copy number analysis was performed using BlueFuse Multi software. 3. Results 3.1. Variant Analysis The average number of reads per sample was 57,576,203 (range: 48,642,142–74,957,334) and 88% of reads had a minimum depth coverage of 50 . Among the altered genes, seven variants in seven strong candidates with relevant oncogenic potential were classified as pathogenic or likely pathogenic (Figure 1). Cancers 2023, 15, 944 11 of 13 3.2. Cohort A: Families with Two Affected Members Studied Exomes from 12 samples (6 index cases and 6 affected family members) were se- quenced. Among the families studied, two of them (Family 2 and Family 6) did not show any relevant genomic variant in cancer-related genes. Both patients in Family 2 were diagnosed with myeloid neoplasms (MDS and AML). Additionally, their father had AML and their sister had breast cancer. On the other hand, the pedigree of Family 6 was not available. We only had the information regarding the index case (diagnosed with MDS) and his father (diagnosed with AML). The remaining four families shared variants between the affected members in genes potentially involved in cancer development: NFATC2 (c.1101-1G>A, p.(?)), TC2N (c.949C>T, p.Arg443*), CHEK2 (c.478A>G, p.Arg160Gly), and RAD54L (c.863del, p.Gly288Glufs*28) (Tables 1 and 2). Table 2. Genes mutated in six families from Cohort A. Family ID Gene Variant Consequence VAF (%) Transcript ExAC Frequency ACMG Status FH/PH 1 NFATC2 c.1101-1G>A; p.(?) splice acceptor 47.7 NM_001136021 No Pathogenic No 2 Not detected Yes 3 TC2N c.1327C>T; p.(Arg443*) frameshift 40 NM_001128595 0 Likely pathogenic No 4 CHEK2 c.478A>G; p.(Arg160Gly) missense 100 NM_001005735 0.00018 Pathogenic Yes 5 RAD54L c.863del; p.(Gly288Glufs*28) framsehift 42.4 NM_001142548 No Likely pathogenic Yes 6 Not detected No Abbreviations: VAF: variant allele frequency, FH/PH: family/personal history of hematological and/or solid malignancies. The heterozygous germline NFATC2 variant was present in the index case and her mother from Family 1, both diagnosed with Hodgkin’s lymphoma at 46 and 16 years old, re- spectively. The functional relevance of the intronic variant (c.1101-1G>A) remains uncertain, but it affects the natural donor-acceptor splice site and it is absent in population databases. In Family 3, the index case and her sister, who had all presented with chronic lympho- cytic leukemia (CLL), showed a novel truncating heterozygous variant in the TC2N gene. Both patients in Family 4 harbored a homozygous variant (c.478A>G) in the CHEK2 gene. The index case in this family was initially found to have acute myeloid leukemia (AML). Her older brother had lung cancer at 63 years of age. Her younger brother presented with AML at 60 years of age, and he received an allo-HSCT from her unaffected sister and died from donor cell leukemia. Donor cell leukemia is a rare, but severe, complication post-transplant. The development of these malignancies occurs in donor cells. Her father had gallbladder cancer and on the maternal side multiple family members presented with solid tumors. In Family 5, both affected individuals were diagnosed with myelodysplastic syndrome (MDS) at 75 years. The variant reported herein (c.863del) in the RAD54L gene leads to a stop codon, generating a smaller non-functional protein. Highly conserved amino acids are affected, and critical motifs are eliminated. Moreover, this family presented a strong family background of other solid tumors, a feature frequently associated with RAD54L variants. 3.3. Cohort B: Families with Only the Index Case Studied The additional four index cases harbor three variants in genes with a probable role in the development of IFHM (Tables 1 and 3). Patient B1 was diagnosed with AML at 57 years of age. Her family history included a mother with AML. The genetic analysis identified a likely germline variant in the PRF1 gene (c.272C>T). Perforin plays a central role in the pathophysiology of the immune system and is essential for eliminating cancerous cells. Cancers 2023, 15, 944 11 of 13 Cancers 2023, 15, 944 9 of 13 Patient B2 was also diagnosed with AML at 69 years of age. Her family background is strong including a brother diagnosed with biphenotypic acute leukemia, a grandfather diagnosed with “some sort of leukemia” and a niece diagnosed with polycythemia vera (PV). The WES analysis did not show any potentially pathogenic germline alterations. Patient B3 did not show any relevant family history, but he had presented acute lym- phoblastic leukemia (ALL) during childhood and several years later developed an AML. Among the altered genes, a likely germline variant in GATA1 (c.-19-679_221-48delinsTC) was retained as a strong candidate that conferred germline risk for hematological malig- nances or solid tumors. This mutation impaired the production of a full-length form of the protein. Patient B4 presented essential thrombocytemia (ET) at 45 years of age, and her medical records showed that both parents had suffered from myeloproliferative neoplasms (mother with ET and father with PV). The likely germline variant found in this case (MSH4:c.56C>A) generates a stop codon in a member of the DNA mismatch repair mutS gene family [20]. 3.4. SNP-Array Regarding the analysis of CNV, it did not reveal any germinal chromosomal alterations in the patients studied with SNP-array (both members of Family 2, Family 6, and patient B2). Somatic monosomy 7 (-7) was detected in one of the patients, as it had also been observed using conventional cytogenetics at diagnosis. The homozygous state of the variant detected in the CHEK2 gene suggested a possible deletion of the other allele. However, MLPA did not reveal any CNV alteration in this gene. To date, the functional role of a homozygous variant in CHEK2 remains uncertain. 4. Discussion The introduction of NGS platforms into the diagnostic setting has refined the diag- nosis, prognosis and treatment of sporadic hematological malignancies [16]. Moreover, these approaches have also revealed germline variants with clinical significance in these patients [21]. Unlike in solid tumors, the familial occurrence of hematological malignancies has been underappreciated. Recent studies suggest that up to 15% of adults with myeloid neoplasms carry germline pathogenic variants in cancer-predisposing genes [22]. In our study, possibly contributing mutations in NFATC2 and TC2N genes have been identified. On the one hand, NFATC2 is a member of the NFAT gene family and encodes for a protein involved in cell cycle arrest, apoptosis, and inhibition of the Stat5 pathway [23]. On the other hand, the protein encoded by TC2N has crucial roles in cellular metabolism, proliferation and cancer [24,25]. To our knowledge, variants in those genes have not been reported previously in the literature. Their biological functions are highly related to cancer development, highlighting their candidacy as novel cancer-predisposing genes. Both alterations occurred in families with diseases affecting lymphocyte proliferation (lymphoma and CLL). These diseases are less studied in the context of predisposing syndromes and germline variants than myeloid malignancies, but their pathogenesis has a strong association with immune evasion mechanisms. All the patients described herein and diagnosed with myeloid neoplasms are selected cases in which we had failed to detect variants in the genes commonly mutated in familial myeloid neoplasms (such as CEBPA, RUNX1, GATA2, DDX41, ANKRD26, etc.) [17]. CHEK2 is considered a tumor suppressor gene involved in the regulation of cell division and the response to DNA damage [26]. Inherited germline variants have been associated with multiple cancer predisposition syndromes: many types of solid tumors, Li-Fraumeni syndrome or lymphoid and myeloid malignancies [27–30]. MSH4 belongs to a member of the DNA mismatch repair (MMR) mutS family. It is involved in the process of DNA damage response and promotes genomic stability. Other members of the MMR gene family, such as MSH2, MLH1, MSH6 and PMS2, are linked to Lynch syndrome with an autosomal dominant inheritance pattern [31,32]. Even though MSH4 has not been identified in Lynch syndrome patients, its similar biological function Cancers 2023, 15, 944 10 of 13 makes it very likely to produce an effect on the genetic susceptibility to cancer. The RAD54L gene plays an important role in the DNA repair pathways [33]. Dysregu- lation of these mechanisms alters genomic stability and ultimately contributes to increasing the risk of developing multiple types of cancer [34]. Regarding the GATA1 gene, it has a crucial role in normal human hematopoiesis. Acquired and inherited mutations in GATA1 contribute to Diamond–Blackfan anemia, acute megakaryoblastic leukemia, transient myeloproliferative disorder and a group of related congenital dyserythropoietic anemias with thrombocytopenia [35,36]. The PRF1 gene has been historically associated with familial hemophagocytic lymphohystiocytosis 2 with an autosomal recessive inheritance pattern [37]. However, more recently, inherited PRF1 mutations were subsequently described in various types of lymphomas, suggesting an involvement in the immune surveillance mechanisms preventing tumor growth and/or development. Escape from immune surveillance is thought to be the main mechanism possibly explaining the role of PRF1 genetic mutations in the development of leukemia and lymphoma [38,39]. Regarding the variant found in Pt. B1 (p.Ala91Val), it has been previ- ously reported by other authors. This substitution in exon 2 was first described as a neutral polymorphism. Nonetheless, recent clinical evidence suggests a potential pathogenic role for the variant. Functional assays revealed low perforin expression levels, as well as im- paired NK cell-mediated cytotoxicity. It has been identified in patients with hematological malignancies, lymphoproliferative diseases and aplastic anemia [40–43]. Analogous to the cases reported, our findings also support the idea that this perforin mutation can contribute to hereditary cancer predisposition. However, another somatic event seems to be necessary to produce clinically significant effects and may act as a synergistic factor with other genetic mutations predisposing patients to a larger range of cancer types [44]. No genomic variants met our selection criteria in two families (Families 2 and 6) and one index case (Pt. B4). These examples highlight perfectly the challenges faced by researchers in identifying predisposing genomic lesions. It is conceivable that such families represent good candidates for WGS as the variant may reside outside the coding region. Recurrent gene alterations have not been detected in the patients analyzed, suggesting that most families are linked to a particular variant with its own characteristics regarding expressivity, penetrance and clinical heterogeneity. Efforts must be made to define the precise contribution of novel cancer-related genes and provide appropriate genetic counsel- ing to patients and at-risk family members. Identification of patients with hematological malignancies with germline predisposition is crucial in the allogeneic HSCT setting since it dictates the selection of donors since relatives with the mutation would not be considered. In our experience, when samples were available from two affected individuals, candi- date variants were detected in four out of the six families analyzed, which represent 66% of the cases. However, when samples were available from the index case, the percentage of patients with a candidate germline variant was 75%. These percentages are relatively similar, so according to our results, it is feasible to perform WES even in cases where a sample is available from the index case only. It is worth noting that this approach leads to the detection of a suggestive candidate variant. Nevertheless, in the absence of a proper Cancers 2023, 15, 944 11 of 13 segregation analysis, the possibility that the genomic finding does not have a causative role cannot be ruled out. Additionally, efforts must be made to create pre-test consultations in the health system which could provide an appropriate evaluation of patients. These units would be responsi- ble for taking into account some recommendations from expert panels [22,45]: (1) family history of AML or other hematological malignancies; (2) diagnosis of MDS at a young age (<40 years old) or a personal history of more than two hematological malignancies; (3) aber- rations in chromosome 7, overall when the age of diagnosis is <50 years old; (4) long-term cytopenia or bleeding; (5) other phenotypic features related to predisposition syndromes; (6) excessive toxicity to chemotherapy agents or poor mobilization; and (7) identification of a variant in a gene related to predisposition syndromes and a VAF suggestive of germline origin (>30%). Based on our experience, patients who meet one or more of these criteria should be suspected of having an underlying predisposition syndrome, and WES analysis should be offered. However, if not possible, a gene panel-based approach aimed at studying a set of genes associated with cancer predisposing syndromes should be recommended. Ideally, segregation analysis must be performed to rule out the involvement of the variant in the disease. Nevertheless, in retrospective studies, material from multiple affected individuals is not always available for several reasons such as post-decease evaluation, travel constraints or loss of follow-up. Furthermore, cultured skin fibroblasts offer the gold standard approach to discriminate germline from somatic changes [12]. This evaluation was not practical in our cases, so BM or PB samples obtained at complete remission were analyzed. Interpretation of the results proceeded under the recognition of this limitation, and the existence of confounding factors, including clonal hematopoiesis, cannot be ruled out. When the analysis is performed on samples from two affected individuals, the identification of a pathogenic/likely pathogenic variant is sufficient to establish the genetic basis of the disease in this specific family. In summary, our study leads to the identification of novel deleterious cancer predisposing mutations. These findings contribute to ongoing investigations and to the further charac terization of these patients and their mutational spectra. Expanding the analysis to WES in highly suspicious patients for a predisposing syndrome based on personal/family background is a useful strategy to detect germline variants with clinical significance and propose novel candidate genes. Moreover, it appeared promising to provide novel insights into the etiology of these complex and heterogeneous syndromes. In the clinical setting, the recognition of these predisposition syndromes is crucial for (1) the proper management of the patients, (2) choosing a suitable donor when an allo-HSCT is considered and (3) offering an appropriate genetic counseling of affected individuals and their relatives. 5. Conclusions Whole-exome sequencing is a useful approach to decipher the genomic complexity of germline predisposition syndromes to hematological malignancies. Further studies in this field would improve the clinical management of affected patients and their at-risk relatives. Supplementary Materials: The following supporting information can be downloaded at: https: //www.mdpi.com/article/10.3390/cancers15030944/s1, Table S1: Cancer related genes analyzed. Author Contributions: Conceptualization: C.A.-Z., J.S.-G., I.B., C.M.-L. and J.L.D.-M.; data curation: C.A.-Z., J.S.-G., P.M., D.C.M. and M.C.-L.; formal analysis: C.A.-Z., I.B. and C.M.-L.; funding acquisition: I.B., C.M.-L. and J.L.D.-M.; investigation: C.A.-Z. and J.S.-G.; methodology: C.A.-Z. and C.M.-L.; resources: M.B.O., G.R.-M., P.F.L., S.O.P., G.O.R., P.G.R., R.N.S., I.G.-C. and M.K.; supervision: I.B. and C.M.-L.; visualization: C.A.-Z. and J.S.-G.; writing—original draft: C.A.-Z., J.S.- G. and C.M.-L.; writing—review and editing: C.A.-Z., J.S.-G., M.C.-L., M.B.O., G.R.-M., P.F.L., S.O.P., G.O.R., P.G.R., R.N.S., I.G.-C., D.C.M., P.M., M.K., J.L.D.-M., I.B. and C.M.-L. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. Funding: The present work was partially supported by the Ministry of Economy and Competitiveness ISCIII-FIS grants PI17/1880 and PI20/00521 and co-financed by ERDF (FEDER) Funds from the European Commission, “A way of making Europe”. Institutional Review Board Statement: This study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki and approved by the Ethics Committee of Hospital General Universitario Gregorio Marañón (PI-HEM-GEN-IISGM- 2018-01, date of approval: 17 December 2018). Informed Consent Statement: Informed consent was obtained from all subjects involved in the study. Data Availability Statement: The data presented in this study are available in this article (and Supplementary Materials). Acknowledgments: The authors are grateful to the patients and their families, as well as to the staff at Gregorio Marañón General University Hospital and Gregorio Marañón Health Research Institute. Conflicts of Interest: The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest. References 1. Taeubner, J.; Wieczorek, D.; Yasin, L.; Brozou, T.; Borkhardt, A.; Kuhlen, M. 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En la nueva revisión de 2022 se ha mantenido esta categoría actualizando el listado de síndromes asociados conforme a los nuevos avances en este campo (47). Así mismo, el grupo de expertos que conforman el Consenso Internacional para la Clasificación de neoplasias mieloides y leucemias agudas reflejaron la entidad de “neoplasias hematológicas con predisposición germinal” dentro de su clasificación (88). La identificación de este tipo de síndromes de predisposición es crucial para un correcto diagnóstico de los pacientes, su manejo clínico y la realización de un buen proceso de consejo genético a los familiares en riesgo. Además, el alo-TPH es el tratamiento de elección y muchas veces el único curativo en pacientes con NH. Una buena selección de donante en pacientes con variantes de predisposición en línea germinal es un punto crítico ya que el uso de un donante emparentado “sano” que presente la misma alteración genómica puede resultar en el desarrollo de leucemia en células del donante o fallo del injerto, entre otras complicaciones (85,89–91). Pese a que el conocimiento ha avanzado enormemente, las neoplasias hematológicas con predisposición germinal siguen siendo entidades difíciles de identificar clínicamente. Por un lado, son entidades que no están restringidas a una aparición temprana, sino que hay variantes en genes como DDX41 o TERT que se asocian a una edad de inicio de la enfermedad similar a la de los casos esporádicos. Por otro lado, no siempre existe una fuerte historia familiar de neoplasias oncológicas que hagan sospechar al profesional y, además, la penetrancia y expresividad variable de muchas de estas entidades pueden enmascarar información al recoger la historia familiar de los pacientes (92). DISCUSIÓN INTEGRADORA 88 El aumento en el número de familias y de genes reportados en la literatura está directamente relacionado con el uso cada vez más extendido de las técnicas de NGS en la práctica clínica. Actualmente, son múltiples los laboratorios de genética hematológica que han incorporado en su rutina asistencial el uso de paneles de genes para un mejor diagnóstico y pronóstico de los pacientes con NH, sobre todo en relación con patología mieloide. En este contexto, estos paneles deberían incluir genes relacionados con síndromes de predisposición para ser útiles en el reconocimiento de variantes en los genes más ampliamente estudiados (93,94). Además, la bajada de precios para la realización de pruebas moleculares más complejas como WES (whole exome sequencing o secuenciación del exoma completo) o WGS (whole genome sequencing o secuenciación del genoma completo) han posibilitado la identificación de nuevos genes candidatos en familias que no habían sido diagnosticadas previamente (95). En este contexto, es necesario conocer la prevalencia de estos casos en nuestro entorno e identificar nuevos genes candidatos que permitan un mayor conocimiento de estas entidades ayudando a mejorar el diagnóstico y manejo de los pacientes y sus familias. Para ello, nuestro grupo desarrolló un panel dirigido al estudio de estas enfermedades en el que se incluyen genes ampliamente descritos en estas patologías y correlacionados con el desarrollo de NH con predisposición germinal. Por otro lado, se empleó la estrategia de búsqueda de nuevas alteraciones genómicas en aquellos casos con una alta sospecha en los que el panel inicial no fue capaz de detectar ninguna variante causal. A continuación, se muestran los resultados obtenidos en los dos trabajos realizados. Empleo de paneles de genes por secuenciación masiva para el diagnóstico de neoplasias mieloides con predisposición germinal. En el primer artículo integrado dentro de este trabajo de Tesis Doctoral (94) se secuenciaron un total de 93 pacientes con diagnóstico de NM “esporádicas” mediante un panel de genes empleado en la rutina asistencial que incluía 14 genes relacionados con síndromes de predisposición a NM (ANKRD26, CEBPα, DDX41, ETV6, GATA2, RUNX1, TP53, ASXL1, CBL, CSF3R, IKZF1, MPL, NF1, PTPN11). DISCUSIÓN INTEGRADORA 89 Los pacientes se dividieron en dos cohortes: cohorte 1 y cohorte 2. La cohorte 1 estaba conformada por un total de 88 pacientes con un diagnóstico de NM en los que se realizó el panel de NGS dentro de su proceso de diagnóstico clínico de forma prospectiva. En la cohorte 2 se incluyeron 5 pacientes de forma retrospectiva que presentaban una alta sospecha de padecer un síndrome de predisposición a NM en función de los siguientes criterios: (a) presentar más de un familiar de primer grado afectado de NH u otro tumor sólido, (b) manifestaciones orgánicas que encajaran con NM de origen germinal y/o (c) historia personal de múltiples tumores onco-hematológicos. En nuestro análisis de la cohorte 1, en concordancia con estudios previos (96–98), la incidencia de pacientes con un diagnóstico confirmado de neoplasia mieloide de origen germinal fue de un 5,7% (5/88). Los pacientes presentaron una alta heterogeneidad en la edad al diagnóstico (media: 47 años, rango 2-73). Por otro lado, al analizar la cohorte 2 la incidencia fue mucho mayor, de un 80% (4/5). Esto es debido a que los 5 casos habían sido seleccionados como pacientes altamente sospechosos de presentar un síndrome de predisposición. De acuerdo con lo publicado por otros grupos (99–103), de los 9 pacientes diagnosticados únicamente aquellos con variantes en línea germinal en el gen DDX41 y en el gen GATA2 carecían de historias familiares sugestivas. De esta manera, consideramos importante la recogida de la información familiar por parte de los profesionales clínicos ya que ayuda a sospechar de un síndrome de predisposición subyacente. Al tratarse de un panel de genes empleado en el momento del diagnóstico de la enfermedad, la sospecha del origen germinal de las variantes se realizó atendiendo a los genes alterados y a la VAF. De tal forma que aquellas variantes localizadas en los genes de interés y con una VAF en torno al 0,4 eran indicativas de poder tener un origen germinal. Se realizó la confirmación en 30 pacientes de los cuales se disponía de una muestra pareada (muestra de cultivo de fibroblastos, n=6; muestra de linfocitos T separados inmuno-magnéticamente, n=4; muestra de sangre periférica en remisión completa de la enfermedad, n=9; muestra de médula ósea en remisión completa de la enfermedad, n=11). DISCUSIÓN INTEGRADORA 90 En el presente estudio se reportaron las siguientes variantes en línea germinal: Cohorte 1: MPL (p.Phe105Leu), DDX41 (p.Asp30_Asp32del; p.Ile592Phe), ETV6 (p.Arg49Cys), TP53 (p.Arg282Trp); Cohorte 2: CEBPα (p.His24AlafsTer84), ASXL1 (p.Gly704Arg) y GATA2 (p.Arg396Gln; p.Arg396Trp). Las alteraciones genómicas en los genes CEBPα, TP53, DDX41 y GATA2 ya habían sido previamente reportadas por otros autores (104– 107). La variante detectada en el gen ASXL1 (p.Gly704Arg) no había sido descrita hasta la fecha como variante en línea germinal, pero sí había sido reportada en pacientes con NM esporádicas (106). Existen pocos casos reportados en la literatura con alteraciones en línea germinal en dicho gen (108), si bien la historia familiar sugestiva en nuestro paciente sumado a la identificación de la variante también en su tío paterno afecto apoya la patogenicidad de ésta, ayudando a expandir el conocimiento de estas entidades. Cabe destacar que sería necesaria la realización de ensayos funcionales adicionales para terminar de confirmar que se trate de un alelo que confiera un riesgo aumentado en la familia estudiada. La variante detectada en el gen MPL (p.Phe105Leu) afecta al dominio extracelular del gen, en particular una región implicada en la unión de ligando y había sido previamente descrita en un caso de LMC y en un caso de síndrome de Sézary (109,110). Además, en la literatura estaban reportadas otras dos variantes cercanas al aminoácido 105, con implicación en la vía de señalización MPL/JAK2 en trombocitosis hereditaria (111,112). Del mismo modo, la variante identificada en el gen ETV6 (p.Arg49Cys) ya había sido identificada en una cohorte de niños con LLA por Moriyama y colaboradores (113), aunque su función precisa no está bien establecida. Ambos casos son ejemplos de la complejidad del cáncer hereditario en términos de heterogeneidad clínica y manifestaciones fenotípicas diferentes incluso en presencia de una misma alteración genómica. Estas observaciones parecen indicar que existan alteraciones moleculares adicionales ya sean heredadas o adquiridas en los pacientes que dirijan el curso clínico de los mismos. El reconocimiento de estos pacientes resulta de vital importancia para la selección de donante en el contexto de la realización de un alo-TPH (114) y para la identificación de familiares en riesgo de portar la misma variante patogénica que el paciente a estudio. DISCUSIÓN INTEGRADORA 91 En este trabajo, 3 de los pacientes fueron sometidos a un alo-TPH y en todos ellos se realizó un screening de la variante detectada en aquellos familiares candidatos a donantes con el fin de seleccionar aquellos que no fueran portadores de la misma y evitar complicaciones post-TPH. El panel diseñado y empleado en el presente trabajo es capaz de identificar 9 casos de pacientes con neoplasias mieloides de origen germinal. Esta detección es relevante para el propio paciente y su tratamiento, como para sus familiares en riesgo por lo que se pone de manifiesto su utilidad clínica. Pese a que el rendimiento diagnóstico es mayor en la cohorte de pacientes seleccionados (Cohorte 2), cada vez es más plausible el hecho de que estos pacientes pueden presentarse en consulta sin ningún rasgo que haga sospechar clínicamente. De esta manera, la alta heterogeneidad en la edad al diagnóstico y en las características que presentan los pacientes hace que sea una cuestión relevante incluir, al menos, los genes más frecuentemente relacionados con estos síndromes en los paneles de diagnóstico empleados en la práctica clínica habitual. En nuestro estudio se realizó una recogida detallada de los antecedentes familiares de los pacientes incluidos. De los 10 que presentaban una historia familiar sugestiva, únicamente en 4 no se detectó ninguna variante causal. Este hallazgo nos hizo plantearnos el segundo objetivo de este trabajo que fue la realización de la técnica de WES en este tipo de pacientes para determinar si esta estrategia aumentaba el rendimiento diagnóstico. Empleo de la secuenciación de exoma completo para el diagnóstico de enfermedades hematológicas familiares. En el segundo artículo que conforma el presente trabajo de Tesis Doctoral (115), se realizó la técnica de WES en 16 pacientes seleccionados que presentaban una fuerte historia familiar y/o personal de neoplasias onco-hematológicas definiéndose como: a) dos o más familiares de primer grado con diagnóstico de neoplasia maligna; b) historia personal de múltiples tumores a lo largo de la vida del paciente. Para ello, se emplearon dos abordajes a la hora de realizar el análisis. Por un lado, contábamos con 12 familiares afectos pertenecientes a 6 familias (Cohorte A) y DISCUSIÓN INTEGRADORA 92 4 casos índices diagnosticados con algún tipo de NH de los que no disponíamos de muestras de otros familiares (Cohorte B). Cabe destacar que los pacientes pertenecientes a las familias 1 y 3 no fueron previamente evaluados con el panel cuyos resultados hemos comentado en el punto anterior. Estos pacientes presentaban un diagnóstico de patología linfoide (LH y LLC, respectivamente) en las cuales los genes asociados están mucho menos claros y pendientes de definir. Por este motivo, pasamos al empleo de un abordaje más ambicioso. La familia 4, pese a presentar diagnóstico de LMA, venía de otro centro por lo que tampoco habían sido valorados previamente por nuestro Servicio. Con los criterios de calidad y biológicos establecidos, se detectaron de media 764 variantes en los casos analizados en dúo y 1.350 variantes en los casos analizados de manera individual (n=21285 genes analizados). Al ser el número de variantes detectadas muy elevado, los casos de la cohorte B fueron analizado primeramente con un panel virtual de 535 genes asociados con síndromes de predisposición a cáncer (Anexo III). El número de variantes detectadas de media empleando esta estrategia fue de 76. En los casos en los que esta estrategia no fue capaz de detectar ninguna variante sugestiva se amplió el análisis a la totalidad de genes. Paralelamente, los pacientes que conformaban la cohorte A disponían de muestra de otro familiar afecto por lo que el análisis se realizó sobre la totalidad de los genes empleando la estrategia de análisis en dúo. Pese a que las herramientas para la clasificación y categorización de variantes han evolucionado enormemente a lo largo de los últimos años, este proceso sigue siendo un desafío para los genetistas sobre todo cuando se abordan estudios más ambiciosos de WES o WGS. El principal reto son las variantes de significado incierto (VSI) cuyo impacto clínico sobre el desarrollo y evolución de la enfermedad no está claro (116). Cuando el análisis se realiza de forma individual en el paciente, el número de VSI es muy alto y resulta difícil conseguir un diagnóstico molecular certero; sin embargo, cuando se emplean estrategias de dúo o de trío se reduce significativamente el tiempo de análisis y su complejidad. DISCUSIÓN INTEGRADORA 93 En la cohorte A, se detectaron 4 familias con variantes patogénicas o probablemente patogénicas en genes relacionados con el desarrollo de cáncer (NFATC2, TC2N, CHEK2 y RAD54L). En dos de estas familias no se detecta ninguna alteración patogénica o probablemente patogénica en genes relacionados con el desarrollo de procesos tumorales. Cabe destacar que las familias con variantes en los genes NFATC2 y TC2N presentaban un diagnóstico de neoplasia linfoproliferativa (LH y LLC, respectivamente), entidades que se encuentran mucho menos estudiadas en el contexto de predisposición en comparación con las NM. Pese a que el reporte de casos también se ha visto incrementado a lo largo de los últimos años (68), la mayor parte de los estudios observacionales estaban basados en análisis de asociación genómicos (GWAS) que identificaban loci de susceptibilidad para el desarrollo de neoplasias linfoides (58,62,117). Sin embargo, el número de genes asociados realmente con predisposición familiar es mucho más reducido. Entre ellos cabe destacar los genes PAX5, SH2B3, IKZF1 o POT1, entre otros (64–66,118). Hasta la fecha no existen guías clínicas que recomienden el estudio de genes concretos En el caso de los genes NFATC2 y TC2N, éstos no han sido previamente reportados en la literatura en casos afectos por este tipo de neoplasias. Si bien teniendo en cuenta las funciones biológicas de ambos, se postulan como genes candidatos relacionados con predisposición a cáncer. Por un lado, el gen NFATC2 es un miembro de la familia de genes NFAT y codifica una proteína implicada en el arresto del ciclo celular, apoptosis e inhibición de la vía Stat5 (119). Por otro lado, el gen TC2N codifica una proteína con funciones importantes en el metabolismo celular, proliferación y en el desarrollo de otros tipos de cáncer (120,121). La aparición de nuevos genes y variantes en familias únicas pone de manifiesto la alta heterogeneidad intrafamiliar de estos síndromes, siendo muchas veces la alteración detectada única de una familia concreta. Estos datos apuntan a que cada síndrome presentará unas características de expresividad, penetrancia y heterogeneidad clínica muy diversas. Los genes CHEK2 y RAD54L han sido reportados previamente por otros autores en relación con un aumento en el riesgo de desarrollar múltiples tipos de tumores. DISCUSIÓN INTEGRADORA 94 Alteraciones de origen germinal en el gen CHEK2 se han reportado en múltiples síndromes de predisposición a cáncer tales como síndrome de Li-Fraumeni, neoplasias mieloides y linfoides (122–125). Así mismo, recientemente Paperna et al. (126) describieron dos pacientes con diagnóstico de neoplasias malignas que presentaban una variante homocigótica en el gen CHEK2 (p.Gly167Arg) que contribuía a conferirles susceptibilidad al desarrollo de múltiples tumores primarios a lo largo de su vida. La familia identificada en el presente estudio presentaba un diagnóstico de LMA. De manera similar, alteraciones en el gen RAD54L alteran la estabilidad genómica y contribuyen al aumento del riesgo de desarrollar diversos tipos de tumores (127). En este caso, la familia estudiada en nuestro estudio presentaba un diagnóstico de SMD. En la cohorte B, de los 4 casos se detectaron 3 individuos con variantes patogénicas o probablemente patogénicas en los genes PRF1 (diagnóstico de LMA post-PV), GATA1 (diagnóstico de LMA) y MSH4 (diagnóstico de TE). No obstante, no se han podido realizar estudios de segregación ya que no se disponía de muestras de familiares afectos/sanos por lo que definiremos estas variantes como “potencialmente causales”. Históricamente, el gen PRF1 se ha asociado con linfocitosis hemofagocítica familiar con un patrón de herencia autosómico recesivo (128). Sin embargo, recientemente, se han descrito variantes germinales en este gen en linfomas, sugiriendo una implicación en los mecanismos de vigilancia inmunológica. De hecho, el escape del sistema de inmunovigilancia es uno de los mecanismos principales que parecen explicar el papel de las alteraciones en PRF1 en el desarrollo de leucemia o linfoma (129,130). En relación a la variante identificada en el presente trabajo (PRF1: p.Ala91Val), otros autores la han descrito como un polimorfismo (131). Sin embargo, de manera similar a lo detectado en este estudio, otros trabajos recientes sugieren una relación con la patogénesis de la enfermedad mediante el empleo de estudios funcionales. Nuestros resultados también apoyan la idea que esta alteración en el gen de la perforina puede estar contribuyendo a la predisposición a cáncer. Sin embargo, otros eventos somáticos parecen necesarios para una manifestación clínica abierta (132). Por otro lado, el gen MSH4 pertenece a la familia MutS de genes implicados en la reparación de errores en el ADN. Otros miembros de genes incluidos en esta familia DISCUSIÓN INTEGRADORA 95 (MSH2, MLH1 y PMS2) se han relacionado con síndrome de Lynch con un patrón de herencia autosómico dominante (133). Aunque el gen MSH4 no haya sido descrito nunca en este tipo de pacientes, su función biológica similar conduce a proponerlo como gen candidato de susceptibilidad a cáncer. Como se comentaba anteriormente, la lista de genes que solapan en tumores sólidos y hematológicos aumenta con el conocimiento de estas entidades. En relación con las alteraciones adquiridas y germinales en el gen GATA1 se han asociado previamente con un amplio grupo de patologías: anemia de Blackfan-Diamond, LMA, trastornos mieloproliferativos transitorios y un grupo de anemias diseritropoyéticas congénitas con trombocitopenia (134,135). La variante detectada (c.-19-679_221- 48delinsTC) impide la producción de la isoforma larga de la proteína GATA1. Del conjunto de resultados recogidos en los dos artículos que forman parte de esta Tesis Doctoral y en base a las recomendaciones realizadas por paneles de expertos (82,136) se procedió a la realización de un algoritmo diagnóstico para estos pacientes que se ha incorporado a la rutina asistencial de nuestro centro. Todos aquellos pacientes que reunieran 1 criterio de los mencionados a continuación, deben considerarse sospechosos de presentar un síndrome de predisposición subyacente: (a) historia familiar de LMA u otras enfermedades hematológicas; (b) diagnóstico de SMD a una edad temprana (<40 años de edad) o una historia personal de más de dos neoplasias hematológicas, (c) alteraciones en el cromosoma 7, sobre todo si la edad al diagnóstico es <50 años; (d) citopenias de larga duración o sangrados excesivos; (e) otros rasgos fenotípicos relacionados con síndromes de predisposición; (f) toxicidad excesiva a quimioterapia o pobre movilización; (g) identificación de una variante en genes relacionados con síndromes de predisposición que presente una VAF superior al 30% (sugestiva de origen germinal). Así mismo, queda patente que el abordaje con técnicas más ambiciosas de WES permite superar la principal limitación del empleo de paneles y es la necesidad de actualizar su contenido conforme va creciendo el conocimiento genético de estas enfermedades. Cuando las estrategias de WES sean accesibles y costo-efectivas en la práctica clínica de DISCUSIÓN INTEGRADORA 96 los hospitales, posiblemente acabarán convirtiéndose en la metodología de elección para el diagnóstico de NH ya que proveen información útil para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de los pacientes sin cometer un sesgo en cuanto a los genes seleccionados. En cualquier caso, resulta fundamental realizar una buena selección de los casos incluidos en este tipo de estudios porque el análisis genómico sigue siendo muy complejo y el número de VSI detectadas es alto. Esto puede generar el informe de alteraciones genómicas no relevantes en el contexto de la enfermedad que, sumado a la implicación familiar implícita en estos casos, hace necesaria una buena formación y experiencia previas de los genetistas en este campo para conseguir una buena transmisión de la información. Adicionalmente, debe tenerse en cuenta que nuestro estudio presenta alguna limitación. Por un lado, la secuenciación de exoma completo se ha llevado a cabo en pacientes seleccionados de manera retrospectiva en muestras almacenadas en el momento de remisión completa de la enfermedad. De esta manera, en alguno de ellos no se disponía de muestra ideal pareada proveniente de ADN de cultivo de fibroblastos. La realización de análisis funcionales que permitan estudiar el efecto real de las alteraciones genómicas identificadas y no descritas supondría un paso más allá en el conocimiento molecular de estos síndromes. En base a los resultados obtenidos a lo largo del desarrollo de los dos artículos que conforman la presente Tesis Doctoral, se pone de manifiesto que la elaboración de estudios genómicos que ayuden a entender mejor las neoplasias hematológicas de origen germinal y que incrementen la lista de genes asociados con predisposición al desarrollo de estas enfermedades permiten avanzar en el conocimiento de las mismas, así como proveer a los pacientes y a sus familias de un mejor manejo clínico que nos dirija hacia estrategias basadas en una oncología de precisión. 98 98 VI. Conclusiones CONCLUSIONES 99 6. Conclusiones 1.) El análisis por secuenciación masiva de paneles de genes que incluyan genes relacionados con síndromes de predisposición a NM en el momento del diagnóstico proporciona una herramienta eficaz para detectar variantes de posible origen germinal con importancia clínica. 2.) En los casos sin resolver tras el empleo de paneles de genes, las técnicas de secuenciación de exoma completo resultan una estrategia útil para la detección de alteraciones relevantes en familias con alta sospecha de presentar un síndrome de predisposición en base a sus antecedentes familiares y/o personales. 3.) La secuenciación de exoma completo permite ampliar el conocimiento de estas patologías y se muestra como una herramienta útil para la detección de nuevos genes candidatos con relevancia clínica. 4.) La identificación de pacientes con una susceptibilidad heredada es crucial para su manejo clínico y especialmente ante un posible alo-TPH ya que se puede realizar un screening a los potenciales donantes familiares para evitar el uso de aquellos que presenten la misma alteración en línea germinal. 5.) 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Esquema explicativo de mutaciones genéticas de origen somático y germinal. Figura 3. Esquema representativo de la hipótesis de dos-hits para el desarrollo del cáncer propuesta por Knudson. Figura 4. Proceso de la hematopoyesis. Figura 5. Representación de los genes conocidos asociados a síndromes de predisposición a tumores sólidos, hematológicos y genes comunes solapantes ya que aparecen descritos en ambos tipos de neoplasias. Anexo II. Índice de tablas Tabla 1. Clasificación de las neoplasias mieloides con predisposición germinal. Tabla 2. Listado de rasgos clínicos que deben ser considerados para una evaluación clínica del paciente en relación con la identificación de síndromes de predisposición a neoplasias hematológicas. ANEXOS Anexo III. Listado de genes incluidos en el panel virtual de predisposición a cáncer Gene Gene-ID Gene Gene-ID Gene Gene-ID ABCA4 NM_000350 BRCA2 NM_000059 CLTC NM_001288653 ABCD1 NM_000033 BRD3 NM_007371 CLTCL1 NM_001835 ABI1 NM_001012750 BRD4 NM_001330384 CNBP NM_001127192 ABL1 NM_007313 BRIP1 NM_032043 CNTRL NM_001330762 ABL2 NM_001136000 BTG1 NM_001731 COL1A1 NM_000088 ACKR3 NM_020311 BTK NM_000061 COLCA2 NM_001136105 ACSL3 NM_004457 BUB1B NM_001211 COX6C NM_004374 ACSL6 NM_001009185 CAMTA1 NM_001195563 CREB1 NM_001320793 AFF1 NM_001166693 CANT1 NM_001159772 CREB3L1 NM_052854 AFF3 NM_001025108 CARD11 NM_001324281 CREB3L2 NM_001253775 AFF4 NM_014423 CARS NM_001014437 CREBBP NM_001079846 AKAP9 NM_005751 CASP10 NM_001206524 CRLF2 NM_001012288 AKT1 NM_001014431 CASP8 NM_001080124 CRTC1 NM_001098482 AKT2 NM_001243028 CBFA2T3 NM_005187 CRTC3 NM_001042574 ALDH2 NM_001204889 CBFB NM_001755 CTNNB1 NM_001098209 ALK NM_004304 CBL NM_005188 CYLD NM_001042355 AMER1 NM_152424 CBLB NM_001321786 DAXX NM_001141969 APC NM_000038 CBLC NM_001130852 DDB2 NM_000107 ARHGAP26 NM_001135608 CCDC6 NM_005436 DDIT3 NM_001195053 ARHGEF12 NM_001198665 CCNB1IP1 NM_021178 DDX10 NM_004398 ARID1A NM_006015 CCND1 NM_053056 DDX5 NM_001320595 ARID2 NM_001347839 CCND2 NM_001759 DDX6 NM_001257191 ARID5B NM_001244638 CCND3 NM_001136017 DEK NM_001134709 ARNT NM_001197325 CCNE1 NM_001238 DICER1 NM_001195573 ASPSCR1 NM_001251888 CD274 NM_001267706 DIP2B NM_173602 ASXL1 NM_001164603 CD74 NM_001025158 DIS3L2 NM_001257281 ATIC NM_004044 CD79A NM_001783 DKC1 NM_001142463 ATM NM_000051 CD79B NM_000626 DNM2 NM_001005360 ATRX NM_000489 CDC25A NM_001789 DNMT3A NM_001320892 AXIN2 NM_004655 CDC73 NM_024529 DUSP10 NM_007207 BAP1 NM_004656 CDH1 NM_001317184 EBF1 NM_001290360 BARD1 NM_000465 CDH11 NM_001308392 ECT2L NM_001077706 BCL10 NM_001320715 CDK12 NM_015083 EGFR NM_001346897 BCL11A NM_018014 CDK4 NM_000075 EIF3H NM_003756 BCL11B NM_001282237 CDK6 NM_001145306 EIF4A2 NM_001967 BCL2 NM_000633 CDKN1A NM_000389 ELANE NM_001972 BCL3 NM_005178 CDKN1C NM_000076 ELF4 NM_001127197 BCL6 NM_001130845 CDKN2A NM_000077 ELL NM_006532 BCL7A NM_001024808 CDKN2C NM_001262 ELN NM_000501 BCL9 NM_004326 CDX2 NM_001265 EML4 NM_001145076 ANEXOS BCOR NM_001123383 CEBPA NM_001285829 EP300 NM_001429 BCR NM_004327 CHCHD7 NM_001011667 EPCAM NM_002354 BIRC3 NM_001165 CHEK2 NM_001005735 EPS15 NM_001159969 BLM NM_000057 CHIC2 NM_012110 ERBB2 NM_001005862 BMP4 NM_001202 CHN1 NM_001025201 ERCC1 NM_001166049 BMPR1A NM_004329 CIC NM_001304815 ERCC2 NM_000400 BRAF NM_004333 CIITA NM_000246 ERCC3 NM_000122 BRCA1 NM_007294 CLP1 NM_001142597 ERCC4 NM_005236 ERCC5 NM_000123 GATA1 NM_002049 KIF5B NM_004521 ERG NM_001136154 GATA2 NM_001145661 KIT NM_000222 ETV1 NM_001163147 GATA3 NM_001002295 KLF6 NM_001160124 ETV4 NM_001079675 GMPS NM_003875 KLK2 NM_001002231 ETV5 NM_004454 GNA11 NM_002067 KMT2A NM_001197104 ETV6 NM_001987 GNAQ NM_002072 KMT2C NM_170606 EWSR1 NM_001163285 GNAS NM_000516 KMT2D NM_003482 EXT1 NM_000127 GOLGA5 NM_005113 KRAS NM_004985 EXT2 NM_000401 GOPC NM_001017408 KTN1 NM_001079521 EZH2 NM_001203247 GPC3 NM_001164617 LAMA5 NM_005560 EZR NM_001111077 GPHN NM_001024218 LASP1 NM_001271608 FANCA NM_000135 GREM1 NM_001191322 LCK NM_001042771 FANCB NM_001018113 H3F3A NM_002107 LCP1 NM_002298 FANCC NM_000136 HAX1 NM_001018837 LIFR NM_001127671 FANCD2 NM_001018115 HERPUD1 NM_001010989 LMO1 NM_001270428 FANCE NM_021922 HEY1 NM_001040708 LMO2 NM_001142315 FANCF NM_022725 HMGA2 NM_001300918 LPP NM_001167671 FANCG NM_004629 HNRNPA2B1 NM_002137 LRIG3 NM_001136051 FANCI NM_001113378 HOOK3 NM_032410 LYL1 NM_005583 FANCL NM_001114636 HOXA11 NM_005523 MAF NM_001031804 FANCM NM_001308133 HOXA13 NM_000522 MAFB NM_005461 FAP NM_001291807 HOXA9 NM_152739 MALT1 NM_006785 FBXO11 NM_001190274 HOXB13 NM_006361 MAML2 NM_032427 FBXW7 NM_001013415 HOXC11 NM_014212 MAP2K1 NM_002755 FCGR2B NM_001002273 HOXC13 NM_017410 MAP2K2 NM_030662 FCRL4 NM_031282 HOXD11 NM_021192 MAP2K4 NM_001281435 FEV NM_017521 HOXD13 NM_000523 MAX NM_001271068 FGFR1 NM_001174063 HRAS NM_001130442 MDM2 NM_001145337 FGFR1OP NM_001278690 HSP90AA1 NM_001017963 MDM4 NM_001204171 FGFR2 NM_000141 HSP90AB1 NM_001271969 MECOM NM_001105077 FGFR3 NM_000142 IDH1 NM_001282386 MED12 NM_005120 FH NM_000143 IDH2 NM_001289910 MEN1 NM_000244 ANEXOS Gene Gene-ID Gene Gene-ID Gene Gene-ID FHIT NM_001166243 IGF2R NM_000876 MET NM_000245 FIP1L1 NM_001134937 IKZF1 NM_001220765 MFN2 NM_001127660 FLCN NM_144606 IL2 NM_000586 MITF NM_000248 FLI1 NM_001167681 IL21R NM_021798 MLF1 NM_001130156 FLNA NM_001110556 IL6ST NM_001190981 MLH1 NM_000249 FLT3 NM_004119 IL7R NM_002185 MLLT1 NM_005934 FNBP1 NM_015033 IRF4 NM_001195286 MLLT10 NM_001195626 FOXL2 NM_023067 ITK NM_005546 MLLT11 NM_006818 FOXO1 NM_002015 JAK1 NM_001320923 MLLT3 NM_001286691 FOXO3 NM_001455 JAK2 NM_001322194 MLLT6 NM_005937 FOXO4 NM_001170931 JAK3 NM_000215 MN1 NM_002430 FOXP1 NM_001012505 JAZF1 NM_175061 MNX1 NM_001165255 FRG1 NM_004477 JUN NM_002228 MPL NM_005373 FRG2 NM_001005217 KAT6A NM_001305878 MSH2 NM_000251 FRG2 NM_001286820 KAT6B NM_001256468 MSH6 NM_000179 FSTL3 NM_005860 KDM5A NM_001042603 MSI2 NM_001322250 FUBP1 NM_001303433 KDM5C NM_001146702 MSN NM_002444 FUS NM_001170634 KDM6A NM_001291415 MTCP1 NM_001018025 G6PC3 NM_001319945 KDR NM_002253 MUC1 NM_001018016 GAR1 NM_018983 KDSR NM_002035 MUTYH NM_001048171 GAS7 NM_001130831 KIAA1549 NM_001164665 MYB NM_001130172 MYC NM_002467 PDE4DIP NM_001002810 REL NM_001291746 MYCL NM_001033081 PDGFB NM_002608 RET NM_020630 MYCN NM_001293228 PDGFRA NM_001347827 RHBDF2 NM_001005498 MYD88 NM_001172566 PDGFRB NM_002609 RHOH NM_001278359 MYNN NM_001185118 PER1 NM_002616 RHPN2 NM_033103 NACA NM_001113201 PHF6 NM_001015877 RMI2 NM_152308 NBN NM_001024688 PHOX2B NM_003924 RNF213 NM_001256071 NCKIPSD NM_016453 PICALM NM_001008660 ROS1 NM_002944 NCOA1 NM_003743 PIK3CA NM_006218 RPL11 NM_000975 NCOA2 NM_001321703 PIK3R1 NM_001242466 RPL22 NM_000983 NCOA4 NM_001145260 PIM1 NM_001243186 RPL35A NM_000996 NDRG1 NM_001135242 PINK1 NM_032409 RPL5 NM_000969 NF1 NM_000267 PLAG1 NM_001114634 RPN1 NM_002950 NF2 NM_000268 PMEL NM_001200053 RPS19 NM_001022 NFE2L2 NM_001145412 PML NM_002675 RPS24 NM_001026 NFIB NM_001190737 PMS1 NM_000534 RPS7 NM_001011 NFKB2 NM_001077494 PMS2 NM_000535 RTEL1 NM_001283009 NHP2 NM_001034833 POLD1 NM_001256849 RUNX1 NM_001001890 NIN NM_016350 POLD3 NM_006591 SBDS NM_016038 NKX2-1 NM_001079668 POLE NM_006231 SCG5 NM_001144757 NONO NM_001145408 POT1 NM_001042594 SCN9A NM_002977 ANEXOS NOP10 NM_018648 POU2AF1 NM_006235 SDC4 NM_002999 NOTCH1 NM_017617 POU5F1 NM_001173531 SDHA NM_001294332 NOTCH2 NM_001200001 PPARG NM_001330615 SDHAF2 NM_017841 NPAT NM_001321307 PPM1D NM_003620 SDHB NM_003000 NPM1 NM_001037738 PPP2R1A NM_014225 SDHC NM_001035511 NR4A3 NM_006981 PRCC NM_005973 SDHD NM_001276503 NRAS NM_002524 PRDM1 NM_001198 SET NM_001122821 NSD1 NM_022455 PRDM16 NM_022114 SETD2 NM_014159 NTRK1 NM_001007792 PRF1 NM_001083116 SF3B1 NM_001005526 NTRK3 NM_001007156 PRKAR1A NM_001276289 SFPQ 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INTRODUCCIÓN II. HIPÓTESIS III. OBJETIVOS IV. RESULTADOS Clinical utility of targeted next-generation sequencing for thediagnosis of myeloid neoplasms with germline predisposition Novel Candidate loci and Pathogenic Germline VariantsInvolved in Familial Hematological Malignancies Revealed byWhole-Exome Sequencing Novel Candidate loci and Pathogenic Germline VariantsInvolved in Familial Hematological Malignancies Revealed byWhole-Exome Sequencing V. DISCUSIÓN INTEGRADORA VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA VIII. ANEXOS