UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química en Ciencias Farmacéuticas TESIS DOCTORAL Sensores basados en nanopartículas de conversión ascedente para la detección de oligonucleótidos de ARN/ADN Sensors based on upconverting nanoparticles for the detection of RNA/DNA oligonucleotides MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Diego Méndez González Directores Jorge Rubio Retama Marco Laurenti Enrique López Cabarcos Madrid Ed. electrónica 2019 © Diego Méndez González, 2019 Sensores basados en nanopartículas de conversión ascendente para la detección de oligonucleótidos de ARN / ADN Sensors based on upconverting nanoparticles for the detection of RNA/DNA oligonucleotides UNIVERSIDAD COMPLUTENSE MADRID Directores Prof. Dr. Jorge Rubio Retama Prof. Dr. Marco Laurenti Prof. Dr. Enrique López Cabarcos Tesis Doctoral Mención doctorado internacional Diego Méndez González Facultad de Farmacia Dpto. de química en ciencias farmacéuticas UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA Departamento de química en ciencias farmacéuticas Sensores basados en nanopartículas de conversión ascendente para la detección de oligonucleótidos de ARN / ADN MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR CON MENCIÓN INTERNACIONAL Diego Méndez González Directores Prof. Dr. Jorge Rubio Retama Prof. Dr. Marco Laurenti Prof. Dr. Enrique López Cabarcos Madrid 2019 COMPLUTENSE UNIVERSITY OF MADRID FACULTY OF PHARMACY Department of chemistry in pharmaceutical sciences Sensors based on upconverting nanoparticles for the detection of RNA /DNA oligonucleotides MEMORANDUM TO REQUEST THE PHD DEGREE WITH INTERNACIONAL MENTION Diego Méndez González Supervisors Prof. Dr. Jorge Rubio Retama Prof. Dr. Marco Laurenti Prof. Dr. Enrique López Cabarcos Madrid 2019                                                                                                                                                                                                     Agradecimientos     "Lo  urgente  no  deja  tiempo  para  lo  importante".  Y  lo  importante,  sin  duda,  son  las   personas.   Cualquier   trabajador   apasionado   e   involucrado   en   un   proyecto   de   carácter   personal,   con   seguridad   puede   comprender   la   sensación   de   "deber   tiempo"   a   las   personas   que   ocupan   un   lugar   especial   en   sus   vidas:   tanto   por   la   ausencia   física   inherente   a   las   horas   consumidas   en   él,   como   a   la   ausencia   involuntaria,   aún   estando   de   cuerpo   presente,   fruto   de   estar   continuamente   inmerso  en  pensar  nuevas  ideas.           Investigar   es   probablemente   una   de   las   profesiones   más   estimulantes   y   apasionantes   que   pueda   haber,   aunque   el   sacrificio   que   exige   es   alto:   tiempo,   laborable   y   con   frecuencia   también   personal,   así   como   una   continua   demanda   física  y  mental.  Sin  embargo  en  investigación,  como  en  la  vida,  el  "tick-­‐tack"  dicta.     Por   eso,   esta   sección   de   mi   tesis   es   tan   importante   para   mí   como   el   trabajo   presentado  en  las  próximas  páginas.  A  continuación  me  gustaría  agradecer  a  todas   las  personas  que  de  una  manera  u  otra  han  tenido  un  impacto,  directo  o  indirecto,   en  el  desarrollo  de  esta  tesis:     Jorge,  te  debo  el  haber  podido  experimentar  la  vida  de  investigador  durante  varios   años  ya,  algo  con  lo  que  solía  soñar  de  estudiante  pero  que  creía  quimera.  Gracias   por  engancharme  a  este  mundillo  y  darme  la  oportunidad  de  investigar.  Quién  me   iba  a  decir  que  una  beca  de  colaboración  acabaría  llevándome  a  un  doctorado.  Has   favorecido   que   piense   por  mí  mismo   y   que   pueda   investigar   campos   en   los   que   creo   y   que   me   apasionan.   Esa   oportunidad   no   es   tan   común   en   ciencia   y   te   lo   agradezco  muchísimo.   Junto  con  Marco  hemos  vivido  años  duros,  pero  gracias  al   esfuerzo   de   todos   hemos   logrado   que   esto   despegue,   ¡Y   ahora   la   familia   crece!.   Estoy  muy  contento  con  lo  que  hemos  ido  logrando  todos  juntos.   Marco,  eres  un  compañero  de  lab  genial,  ojalá  me  encuentre  muchos  como  tú  en  el   futuro.   Tienes   cualidades   que   no   se   encuentran   fácilmente:   responsabilidad,   profesionalidad,   compañerismo,   saber   escuchar.   Gracias   por   las   risas   y   el   buen   rollo,   has   sido   mamá   pato   en   muchos   aspectos   y   espero   que   podamos   seguir   trabajando  juntos  muchos  años  más.  Te  deseo  la  mejor  de  las  suertes  y  que  sigas   creciendo  como  docente  e   investigador,  creo  que  puedes   llegar  a  hacer  muy  bien   ambas  funciones.     Enrique,  hay  pocas  cosas  que  me  impresionen  más  que  la  jovialidad  y  la  forma  de   ser  que  demuestras  en  el  día  a  día,  sobre  todo  después  de  tanto  tiempo  en  docencia   e   investigación.  Haces  que  acertadamente  parezca  que  nada  tenga   la   importancia   exagerada  que  le  solemos  dar,  sobre  todo  si  lo  relativizamos  al  conjunto  de  la  vida   en  sí  misma.  Espero  acabar  logrando  aplicar  plenamente  dicha  filosofía.  Al  mismo   tiempo   gracias   por   hacerme   reparar   en   cuánto   condiciona   nuestra   visión   del   mundo  la  rama  académica  que  conforma  la  base  de  nuestra  formación:  el  dejar  de   enfocar  un  problema  desde  un  punto  de  vista   tan  químico,  y  ver  cómo  éste  toma   otra  dimensión  al  enfocarlo  desde  uno  más  físico.   Sonia  y  Óscar,  Óscar  y  Sonia,  no  podría  hablar  del  uno  sin  el  otro.  Si  hubiera  podido   tener   más   directores   de   tesis,   sin   duda   también   lo   serían   ustedes.   Son   unas   personas  encantadoras  y  a   las  que   les  debo  mucho.  No  sólo   son  unos  profesores   magníficos,  sino  unos   investigadores  excelentes.  Son   la  prueba  viviente  de  que  el   conocimiento  y  el  saber  hacer  no  son  incompatibles  con  la  humildad,  la  paciencia,   el   respeto   a   quien   sabe  menos,   y   al   trabajar   codo   con   codo   enseñando   con   sus   amables   y   dedicadas   explicaciones.   He   aprendido   muchísimo   con   ustedes.   Ojalá   siga   conociendo   personas   con   la   calidad   humana   que   derrochan,   y   que   pueda   trabajar  con  ustedes  muchos  años  más.         Paulino,  no  podría   contar   la   cantidad  de  veces  que  me  has  hecho   reír  durante  el   doctorado.   Te   doy   las   gracias   por   esos   buenos   momentos   tanto   en   el   lab   como   fuera  (e.g.  esa  cara  de  perro  porque  nos  pille  lloviendo,  tengamos  que  aparcar  bajo   el   agua,   y   nos   intenten   timar   en   Jerusalén   jajaja).   Has   sido   un   poco   como   mi   hermano   mayor   en   los   inicios   de   la   tesis,   y   te   agradezco   muchísimo   tanto   los   consejos   como   las   largas   conversaciones.  Muchas  de   éstas   acabaron  haciéndome   meditar  muchas  cosas,  lo  que  considero  la  prueba  de  ser  conversaciones  valiosas.   Mucha  suerte  con  el  camino  que  has  tomado,  ¡Aunque  sé  que  no  la  necesitas!   Al  grupo  de  investigación,  en  especial  a  las  nuevas  y  prometedoras  investigadoras   Vivian  e  Irene,  y  a  las  incorporaciones  temporales  como  Pedro  y  Alicia.  Gracias  por   estos  meses,  en  los  que  habéis  creado  un  ambiente  tan  genial  y  habéis  llenado  de   vida  no  sólo  nuestra  sala  y  el  laboratorio,  sino  el  departamento  entero.  Para  mi  ha   sido   un   placer   enseñarles   y   ayudarles   en   todo   lo   que   ha   estado   en   mi   mano,   ejerciendo   esta   vez   yo   el   papel   de   mamá   pato.   Muchísima   suerte   con   sus   respectivas   tesis,   son   personas   muy   competentes   y   estoy   convencido   de   que   lo   harán   genial.   Y   no   se   desesperen   si   algo   no   les   sale   de   primeras,   que   cada   fallo   conduce  un  paso  más  cerca  del  acierto.     A   la   unidad   docente   de   química   física   y   física   aplicada   del   departamento   de   química  en  ciencias  farmacéuticas.  Estoy  muy  agradecido  por  la  ayuda  diaria  y  por   la   cálida   acogida   por   parte   de   todos.   En   especial   a   Visi,   Juani   y   a   Piedad,   por   cuidarnos   y   ayudarnos   tanto.   A   Marian   y   a   Begoña   por   la   ayuda   y   la   gran   amabilidad  a  la  hora  de  prestarme  parte  de  su  instrumental  de  laboratorio.  A  Paz,   Monte  y  Cristina  por  ser   siempre   tan  cariñosas  y  atentas  conmigo.  A  Concepción   Civera  y  a   Ignacio  por   la  ayuda  desinteresada  y  estar  siempre  al  pie  del  cañón.  A   Miguel   Ángel,   Pepe   y   Concepción   Arias   por   los   consejos   y   la   ayuda   prestada.   A   Niuris   e   Inma,   por   las   agradables   charlas   entre   prácticas   y   celebraciones   de   departamento.  A  Marco  Filice  por  las  conversaciones  y  las  risas,  y  a  su  grupo,  lleno   de  personas  encantadoras  y  siempre  dispuestas  a  ayudar:  Mario,  Karina  y  Marzia.               A  Tero  Soukka  por  acogerme  con  tanta  amabilidad  en  su   laboratorio,  por   toda   la   ayuda  durante  la  preparación  de  mi  estancia,  por  creer  en  mi  proyecto,  y  por  estar   abierto   en   todo  momento   a   la   discusión   científica.   A   todo   su   grupo,   por   el   buen   trato,  su  paciencia,  explicaciones  y  buen  hacer  durante  mi  estancia.       A   Edu   y   Elena,   por   las   explicaciones,   la   paciencia   y   su   fructífera   colaboración   investigadora.     A   mi   familia,   a   la   cual   dedico   especialmente   esta   tesis   y   todos   los   trabajos   no   incluidos   en   esta   disertación.   A   mi   hermano   Juan   Luis,   porque   es   el   principal   responsable  de  plantar  la  semilla  de  la  curiosidad  desde  mi  infancia,  con  nuestras   competiciones   de   construcción   de   barcos   o   trampas,   y   demás   proyectos   lúdico-­‐ científicos.  Espero  poder  lograr  devolverte  la  ayuda  que  me  has  prestado  siempre   y   el   fuerte   apoyo   que   me   has   brindado   en   todo   momento:   incluso   haciendo   realidad  alguna  de  las  ideas  que  tenía  en  mente,  como  la  construcción  del  prototipo   LED  presentado  en   la  publicación  5.  A  mi  hermana,  porque  siempre  has  sido  una   de  las  personas  más  adorables  y  cariñosas  que  conozco,  y  cuya  presencia  siempre   me  ha  dado  tranquilidad  y  seguridad.  Haces  que  me  sienta  en  casa  a  pesar  de  estar   a   2000   km.   Siempre  me   he   divertido  mucho   contigo,   y   ahora   ya   podemos   hasta   irnos   de   cañas   y   filosofar   un   poco   sobre   el  mundo,   ¡Qué   rápido   pasa   el   tiempo!.   Gracias  por  todo  tu  apoyo  durante  la  tesis.  A  mis  queridos  Padres,  Juan  Antonio  y   María  del  Carmen,  por  haber  logrado  todo:  Ser  unos  profesionales,  unas  personas  y   unos  padres   increíbles,   proveernos   de   una  buena   educación   (no   sólo   académica,   también  humana),  hacernos  percibir  el  valor  de  las  cosas  y  luchar  por  aquello  en  lo   que  creemos.  Sin  duda  son  actores  responsables  de  que  hoy  pueda  estar  cerca  de   terminar   un   doctorado.   También   fueron   mi   fundación   MCGL&JAMA   durante   los   complicados   inicios,   tal   como   recoge   el   trabajo   de   investigación   con   doi   "10.1016/j.eurpolymj.2016.01.013".   A   mi   tía   Montse   y   a   mi   abuela   Micaela.   Siempre  me  dan   la  mejor  bienvenida  que  se  pueda  tener.  Gracias  por  el   inmenso   apoyo   incondicional   que  me  muestran   siempre.   Abuela,   eres   una   de   las  mujeres   más  lúcidas  y  aventureras  que  conozco.  A  todos  mis  tíos  y  primos  por  el  cariño,  el   apoyo   y   el   interés   en   esta   aventura:   a   Felipe,   Loles,   Everto,   Isora,   Lito,   Petra   Magdalena,  Carmen  Rosa,  Yared  y  toda  la  familia.   A  mi   buena   y   querida   abuela   Serafina,   a  mi   tía   "Lala",   y   a  mi   inquieto   y   curioso   abuelo  Eduardo,  aunque  ya  no  estén  con  nosotros.  También  a  mi  tío  Eduardo,  cuya   curiosidad  innata  siempre  llegó  a  mis  oídos  y  despertó  admiración.     A  mis  amigos,  sin  los  que  la  vida  no  sería  tan  divertida.  A  David  y  Dani,  a   los  que   tengo  un  profundo  cariño,  con  los  que  siempre  he  podido  contar,  y  los  que  tiran  de   mi  para  exprimir  la  vida  siempre  un  poquito  más.  A  Miriam,  cuyo  carácter  singular,   interesantes  conversaciones,  y  coñas  continuas,  la  hacen  una  amiga  única.     A   Carlos   Vilas,   cuya   vitalidad   inagotable,   afectuoso   carácter,   y   amistad   incondicional,   lo  hacen  un  amigo   imprescindible.  A   Jonás,   que  después  de   tantos   años  de   amistad,   y   aún  desde   el   otro   lado  del   globo,   no  deja   de   demostrarme   el   poder  de  la  voluntad.  A  Carlos  y  a  Patricio,  por  el  apoyo  y  por  esos  divertidos  años   compartiendo  piso,  así  como  últimamente  nuestras  más  frecuentes  conversaciones   sobre   ciencia   y   el   futuro   en   general.   Mucha   suerte   con   vuestros   respectivos   doctorados.  A  Yago,  por  su  saber  escuchar,  por  tantas  conversaciones,  reflexiones,   y  buenas  vivencias  compartidas.  La  mejor  de   las  suertes  en  el  nuevo  camino  que   inicias.  A  Erik,  Emma,  Pino,  Pablo,  María  y  Alejandro,  por  tantas  conversaciones  y   vivencias,  por  hacerme  sentir  en  casa  cada  vez  que  nos  encontramos  de  nuevo.     A  la  increíble  Aida,  con  su  enorme  corazón  y  su  fortaleza  admirable.  Gracias  por  un   año  tan  genial  en  el  piso.  Espero  que  tengas  muchísima  suerte  en  todo  aquello  que   te  propongas,  ya  que  sé  que  fuerza  no  te  falta.  A  Lucía,  por  esas  conversaciones  tan   interesantes  en  las  que  siempre  acabo  aprendiendo  alguna  cosa  nueva.  A  Bea,  por   todo   su   cariño,   tantísimas   conversaciones,   sus   buenos   consejos   y   su   inestimable   amistad.   Eres   una   persona  muy   valiosa.   Gracias   por   acompañarme   durante   este   viaje   y   por   animarme   a   que   me   lanzara   a   investigar.   Siempre   tendrás   "familia"   tanto  en  Madrid  como  en  Canarias.   Con   especial   cariño   a   Sara,   con   quien   he   tenido   la   increíble   fortuna   de   poder   compartir   tantas   vivencias   bonitas.   Sin   ti   esta   tesis   no   habría   sido   la   misma.   Gracias  por  tu  ayuda,  apoyo  y  curiosidad,  por  tu  humor  magnífico  e   imaginación,   por  tu  enorme  cariño  e  infinita  paciencia.  Ah,  y  por  el  inve'nadero  y  cosas  afines.               Apoyo  técnico  y  financiero     Quería   agradecer   a   la   Bill   &   Melinda   Gates   Foundation   (grant   OPP1128411),   al   Ministerio   de   educación   y   competitividad   (proyectos   FIS2013-­‐41709,   SAF2014-­‐ 56763-­‐R,  MAT2014-­‐55065-­‐R  y  MAT2017-­‐83111-­‐R),  a  la  UCM-­‐Santander  (proyecto   PR26/16-­‐12B-­‐3),   y   a   la   comunidad  autónoma  de  Madrid   (proyecto  B2017/BMD-­‐ 3867  RENIM-­‐CM)  por   el   apoyo   financiero  durante   el   desarrollo  de   esta   tesis,   así   como   a   UCM-­‐Santander   por   el   contrato   predoctoral   (CT17/17-­‐CT18/17),   y   a   la   COST   Action   CM1403   "the   european   upconversion   network   from   the   design   of   photon-­‐upconverting  nanomaterials  to  (biomedical)  applications".     Quería  agradecer  también  al  centro  de  microscopía  nacional  (UCM,  Madrid)  y  a  sus   técnicos  por  los  consejos  y  los  servicios  prestados.   Finalmente   agradecer   a   Juan   Luis   Méndez   González   por   la   construcción   del   prototipo  LED  presentado  en  la  publicación  5,  y  a  Sara  López  París  por  la  ayuda  en   el  diseño  de  la  portada  y  algunas  de  las  figuras  presentadas  en  esta  tesis.                                                                                                                                                                                                                                                             "Magic  is  matching  an  effect  with  a  misleading  cause.      Science  is  a  kind  of  magic,  until  it  is  not"     "Magia  es  relacionar  un  efecto  con  una  causa  errónea.    La  ciencia  es  una  clase  de  magia,  hasta  que  deja  de  serlo"                                                                                                             Index  /  Índice   Abstract  /  Resumen  ..................................................................................  1  /  5   I) Introduction  ..................................................................................................  9 1) microRNA  ...............................................................................................................  13 1.1  Biosynthesis  and  mechanism  ........................................................................................................  13   1.2  Functions  and  biological  importance  ........................................................................................  17   1.3  Clinical  potential  and  challenges  .................................................................................................  20   1.4  References  .............................................................................................................................................  22   2) Reporters  in  bioassays  ......................................................................................  24 2.1  Fluorescence  and  organic  dyes  ....................................................................................................  24   2.2  Quantum  dots  .......................................................................................................................................  32   2.3  Photon  upconversion  and  upconverting  nanoparticles  ....................................................  36   2.4  References  .............................................................................................................................................  42   3) Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials    ..............  45 3.1  Introduction  ..........................................................................................................................................  45   3.2  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  (Publication  1)  ...........  47   II) Aims  of  the  work  /  Objetivos  del  trabajo  ...............................  71  /  75 III) Experimental  ...........................................................................................  79 1) Fundamental  study  of  UCNPs/Qs dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs    .........  81 1.1  Introduction  ..........................................................................................................................................  82   1.2  References  .............................................................................................................................................  91   1.3  Förster  resonance  energy  transfer  distance  dependence  from  upconverting   nanoparticles  to  quantum  dots  (Publication  2)  /  supporting  information    ........  93  /  103   1.4  Control  of  upconversion  luminescence  by  gold  nanoparticle  size:  from  quenching   to  enhancement  (Publication  3)  /  supporting  information    ....................................  109  /  122   1.5  Conclusions  ........................................................................................................................................  126   2) Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  upconverting labels    .........................................................................................................................  127   2.1  Introduction  .......................................................................................................................................  129   2.2  References  ..........................................................................................................................................  138   2.3  Oligonucleotide  sensor  based  on  selective  capture  of  upconversion  nanoparticles   triggered  by  target-­‐induced  DNA  interstrand  ligand  reaction  (Publication  4)  /   supporting  information  ...........................................................................................................  139  /  151   2.4  Photochemical  ligation  to  ultrasensitive  DNA  detection  with  upconverting   nanoparticles  (Publication  5)  /  supporting  information    .........................................  161  /  171   2.5  Conclusions  ........................................................................................................................................  187   IV) Discussion  /  Discusión  ..........................................................  189  /  197 1) References  ...........................................................................................................  205 V) Conclusions  /  Conclusiones  ...................................................  207  /  211 VI) Publications  and  patents  during  the  PhD  period  .....................  215 VII) Table  of  acronyms  .............................................................................  221                           Abstract  /  Resumen                                                   Abstract     1   Abstract       Since   the   discovery   of  miRNAs   in   the   early   90's,   their   study   during   the   last   two   decades  have  put  the  bases  for  the  understanding  of  the  biosynthesis,  mechanism   of   action,   and   importance   of   these   short   sequences   on   gene   regulation.   Highly   conserved  among  animals,  plants,  and  even  viruses,   their  role   in  gene  translation   repression  as  well  as  the  regulation  of  other  miRNA  sequences  has  revealed  as  an   upstream  way  to  control  and  correct  the  cell's  gene  expression.  Thus  regarded  as  a   possible   new   generation   of   drugs   for   the   treatment   of   diseases   due   to   their   biological   activity,   they   are   also   potential   diagnostic   biomarkers:   while   the   presence  of  foreign  miRNA  sequences  in  the  human  organism  can  be  used  for  the   early   diagnosis   of   infections,   the   alteration   of   the   normal   endogenous   miRNA   expression  profiles  is  revealing  as  a  promising  tool  for  the  diagnosis  and  prognosis   of  important  conditions  like  cancer  or  Alzheimer  disease.     Latest  advances  in  chemistry  and  nanotechnology  are  starting  to  offer  tools  for  the   direct   detection   of   miRNAs,   whose   low   detectability   is   mainly   due   to   their   low   serum  concentration  and  their  low  melting  temperatures  upon  hybridization  with   the   probes   designed   for   their   detection.   On   the   one   hand,   new   chemistries   are   starting  to  appear  on  the  biosensing  field,  such  as  "copper-­‐free"  click  chemistries   or  photo-­‐activated  chemical  reactions,  offering  new  possibilities  for  detection  and   quantification.   On   the   other   hand,   traditional   organic   dyes   are   starting   to   be   replaced  by  new  reporters  that  overcome,  by  far,  the  optical  properties  exhibited   by   them.   Some   examples   are   the   widely   known   quantum   dots,   or   the   new   and   promising  upconverting  nanoparticles  (UCNPs),  which  are  permitting  to  build  very   sensitive  sensors  and  assays.     UCNPs   exhibit   anti-­‐Stokes   emissions   that   are   far   away   from   their   excitation   wavelength,   located  at   the  near   infrared  region  (NIR).  They  perform  this  process   very  efficiently  by  using  continuous  wave  lasers  and  other  simple  instrumentation,   whereas  common  dyes  and  other  materials  usually  require  expensive  femtosecond   pulsed   lasers   to   produce   anti-­‐Stokes   emissions   by   two-­‐photon-­‐absorption   processes  that  are  orders  of  magnitude  less  efficient.         Abstract       2   The  photon  upconversion  anti-­‐Stokes  process  produced  by  UCNPs,   together  with   the  physical-­‐chemical  properties  of  these  nanoparticles,  permits  to  avoid  some  of   the   most   important   limitations   that   arise   when   using   common   luminescent   reporters  such  as  autofluorescence,  photobleaching,  or  fluorescence  intermittency.     For  these  reasons,   the  synthetic  control  of  UCNPs,  their  surface  functionalization,   and  conjugation  with  suitable  biomolecules  to  apply  them  as  reporters  may  permit   to  design  a  whole  new  generation  of  very  sensitive  detection  systems  based  on  the   direct   sensing   (i.e.   without   signal   amplification   methods)   of   targeted   analytes,   which   will   be   most   likely   accompanied   of   time   and   cost-­‐effective   assays   and   reduction  of  bias,  as  well  as  easier  point  of  care  diagnostics.         This   thesis   work   is   focused   on   the   synthesis   of   UCNPs,   their   functionalization,   fundamental   study,   and   bioconjugation   for   the   development   of   highly   sensitive   RNA/DNA   oligonucleotide   detection   systems,   using   UCNPs   as   labels.   Firstly,   an   introduction   is   presented,   explaining   the   miRNA   biosynthesis,   mechanism   and   clinical   potential   ("section   I.1").   Next,   the   mechanism,   optical   features,   and   advantages   of  UCNPs   are   compared  with   reporters   currently   used   in   bioimaging   and  detection  or  still  under  intense  research,  like  organic  dyes  and  quantum  dots   ("section  I.2").  A  wide  review  on  the  state  of  the  art  of  UCNPs  in  biodetection,  both   in   homogeneous   and   heterogeneous   assays,   is   presented   as   the   end   of   the   introduction   ("section   I.3").   In   this   section   the   properties   of   UCNPs,   their   application  to  different  platforms,  the  discussion  of  sensing  strategies  using  these   labels,   their   impact   in   the   performance   of   the   detection   systems,   and   future   prospects  are  discussed.         The  experimental  chapters  of  this  thesis  are  divided  in  two  different  sections:  The   first   one   focus   on   fundamental   studies   on   resonance   energy   transfer   processes   using   UCNPs   as   donors   and   CdTe   quantum   dots   (Q-­‐dots),   or   gold   nanoparticles   (AuNPs),   as   acceptors   ("section   III.1").  The   coating  of  UCNPs  with   silica   shells  of   different   thicknesses  permitted  to  study  the   influence  of   the  Q-­‐dots  proximity  on   the   upconversion   luminescence.   After   estimating   the   Förster   radius   for   this   system,  and  taking  into  account  the  multi-­‐emitter  nature  of  UCNPs,  we  were  able   to  explain  the  total  Förster  resonance  energy  transfer  (FRET)  efficiencies  obtained   experimentally   and   to   estimate   the   FRET   efficiency   for   the   different   individual   Erbium   ions   (Er3+  ions)  within   the  UCNP  as  a   function  of   their  distance   to   the  Q-­‐     Abstract     3   dots.  As   result,  we   established   some  general   guidelines  when  aiming   to   improve   total  FRET  efficiencies  and  to  apply  UCNPs/CdTe  Q-­‐dots  pairs  to  the  construction   of   FRET   sensors.   In   a   second   work,   the   effect   of   the   AuNPs   size   on   the   upconversion   luminescence   was   studied.   Smaller   AuNPs   proved   to   favor   luminescence   quenching   of   the   UCNPs,   while   the   bigger   AuNPs   exerted   an   increasing  effect  on  raising  the  radiative  decay  rate  of  Er3+  ions  due  to  the  Purcell   effect,   translating   in   a   progressive   luminescence   enhancement   as   AuNP   size   increased.  This  study  permitted  to  find  an  optimum  AuNP  size  for  the  quenching  of   UCNPs'   luminescence   (i.e.   ~14   nm),   while   establishing   an   AuNP   size   limit   from   which  an  effective  luminescence  enhancement  could  be  achieved  (i.e.  66  nm)  and   improved  with   larger   sizes.   These   results   should   be   considered  when   designing   sensors  based  on  upconversion  luminescence  quenching  or  enhancement.     The   second   experimental   section   is   mainly   focused   on   the   application   of   new   approaches  to  the  direct  detection  of  DNA/miRNA  in  heterogeneous  assays  using   UCNPs  as  labels  ("section  III.2").  In  the  first  work  presented  in  this  section,  silica-­‐ coated   UCNPs   were   bioconjugated   with   amino-­‐modified   single-­‐stranded   DNA   (ssDNA)  to  give  upconversion  probes  with  specific  biological  response  towards  the   targeted   oligonucleotide   in   the   assay.   The   grafted   ssDNA   also   had   an   azide   modification,  which  permitted  to  form  a  covalent  bond  by  Cu-­‐free  click  chemistry   with   a   DBCO   modification   contained   in   a   second   ssDNA   probe.   This   reaction   occurred  with  high  specificity,  when  both  azide  and  DBCO  modifications  were   in   close  proximity  upon  hybridization  of  the  probes  with  the  targeted  sequence.  This   strategy   allowed   the   use   of   repeated   or/and   harsh   washes   to   reduce   the   non-­‐ specific  binding  of  UCNPs  during  the  assay,  while  the  specific  signal  formed  due  to   the  presence  of  the  target  was  conserved  due  to  its  covalent  nature.  As  result,  the   assay  showed  a  very  good  sensitivity  (limit  of  detection,  LOD  =  100  fM).   The   second   work   was   based   on   a   photochemical   ligation   between   two   ssDNA   probes,   one   attached   to   the  UCNPs   and   the   other   one  being   free   in   solution   and   containing   a   photoactivatable   nucleotide.   This   photochemical   covalent   ligation   proceeded   only   in   the   presence   of   the   targeted   oligonucleotide   sequence   and   under  UV   irradiation  (365  nm).  This  reaction  proved  to  be  very  specific  and  also   allowed  the  use  of  repeated  or/and  harsh  washes  during  the  assay  developed  with   this  strategy,  which  translated  in  an  astonishing  sensitivity  (LOD  =  21  fM).     Abstract       4   The   photochemical   ligation   was   achieved   also   using   NIR   light   at   980   nm   as   external   excitation,   and   the   upconversion   emission   at   365   nm   of   Ytterbium   /   Thulium-­‐doped  UCNPs  as  local  source  of  UV  photons.  The  requirement  of  UV  light   for  the  ligation  to  proceed  allowed  the  control  of  the  place  where  the  reaction  took   place   in  a   solid   support,   as  well   as   the  exact   time  when   the   reaction  started  and   stopped,  which  could  be  used  to   form  patterns  specifically   in  the  presence  of   the   targeted  sequence.         Keywords:   Upconverting   nanoparticles,   silica,   quantum   dots,   gold   nanoparticles,   FRET,  quenching,   enhancement,  Purcell   effect,   sensor,  heterogeneous  assay,   click   chemistry,   photoligation,   miRNA,   oligonucleotide,   luminescence,   microwell,   pattern,  probe.                                           Resumen     5   Resumen       Desde  el  descubrimiento  de  los  miARNs,  a  principios  de  los  90s,  su  estudio  durante   las  últimas  dos  décadas  ha  sentado  las  bases  para  la  comprensión  de  la  biosíntesis,   mecanismo  de  acción,  e  importancia  de  estas  pequeñas  secuencias  en  la  regulación   de  los  genes.  Conservados  ampliamente  entre  animales,  plantas,  e  incluso  virus,  su   rol  en  la  represión  de  la  traducción  genética,  al  mismo  tiempo  que  en  la  regulación   de  otras  secuencias  de  miARN,  se  presenta  como  una  forma  de  controlar  y  corregir   la   expresión   génica   situada   al   inicio   de   la   cadena   de   procesos   celulares.   Así,   considerados  como  una  posible  nueva  generación  de  fármacos  para  el  tratamiento   de   enfermedades,   debido   a   su   actividad   biológica,   son   también   potenciales   biomarcadores   para   diagnóstico:  Mientras   la   presencia   de   secuencias   de  miARN   extraño   en   el   organismo  humano  puede   ser  usada  para   el   diagnóstico  precoz  de   infecciones,   la   alteración   de   los   perfiles   de   expresión   normales   de   miARN   endógeno   se   está   presentando   como   una   herramienta   prometedora   para   el   diagnóstico   y   el   pronóstico   de   importantes   enfermedades   como   el   cáncer   o   la   enfermedad  de  Alzheimer.   Los   últimos   avances   en   química   y   nanotecnología,   están   empezando   a   ofrecer   herramientas   para   la   detección   directa   de   miARNs,   cuya   baja   detectabilidad   se   debe   principalmente   a   su   baja   concentración   en   suero   y   su   baja   temperatura   de   fusión  (o  melting)  durante  la  hibridación  con  las  sondas  usadas  para  su  detección.   Por  un  lado,  nuevas  estrategias  químicas  están  empezando  a  aparecer  en  el  campo   de  la  biodetección,  tales  como  químicas  click  sin  cobre  o  reacciones  químicas  foto-­‐ activables,   ofreciendo   nuevas   posibilidades   para   la   detección   y   la   cuantificación.   Por  otro  lado,  los  fluoróforos  convencionales  están  empezando  a  ser  reemplazados   por   nuevas   etiquetas   que   superan   sustancialmente   las   propiedades   ópticas   exhibidas   por   éstos.   Algunos   ejemplos   son   los   conocidos   puntos   cuánticos,   o   las   nuevas   y   prometedoras   nanopartículas   de   conversión   ascendente   (UCNPs),   las   cuales  están  permitiendo  construir  sensores  y  ensayos  muy  sensibles.       Abstract       6   Las  UCNPs  exhiben  emisiones  de  tipo  anti-­‐Stokes  que  están  lejos  de  la  longitud  de   onda  de  excitación,  la  cual  se  localiza  en  la  región  infrarroja  (NIR).  Son  capaces  de   llevar   a   cabo   este   proceso   de   manera   muy   eficiente   usando   láseres   de   onda   continua  y  otra  instrumentación  sencilla,  mientras  que  los  fluoróforos  comunes  y   otros   materiales   normalmente   requieren   costosos   láseres   pulsados   de   femtosegundo   para   producir   emisiones   anti-­‐Stokes   por   medio   de   procesos   de   absorción  de  dos  fotones,  que  son  órdenes  de  magnitud  menos  eficientes.   El   proceso   anti-­‐Stokes   de   conversión   ascendente   de   fotones   producido   por   las   UCNPs,   junto   con   las   propiedades   físico-­‐químicas   de   estas   nanopartículas,   permiten  evitar  algunas  de  las  limitaciones  más  importantes  que  surgen  cuando  se   usan   las  etiquetas   luminiscentes  más  comunes,   como  son   la  autofluorescencia,   el   foto-­‐blanqueado  y  la  intermitencia  de  fluorescencia.       Por  estas  razones,  el  control  sintético  de  las  UCNPs,  su  funcionalización  superficial,   y  conjugación  con  biomoléculas  adecuadas  para  aplicar  las  UCNPs  como  etiquetas   podrían  permitir  el  diseño  de  una  nueva  generación  de  sistemas  de  detección  de   alta  sensibilidad  basados  en  la  detección  directa  (i.e.  sin  métodos  de  amplificación   de   señal)   de   analitos   de   interés,   lo   cual   probablemente   estaría   acompañado   de   ensayos  con  una  mejor  relación  tiempo  y  coste  /  beneficio  y  una  reducción  de  los   sesgos  y  la  irreproducibilidad,  así  como  un  diagnóstico  más  fácil  en  zonas  alejadas   de  laboratorios  especializados.   Este   trabajo   de   tesis   se   centra   en   la   síntesis   de   UCNPs,   su   funcionalización   superficial,   su   estudio   fundamental,   y   su   bioconjugación   para   el   desarrollo   de   sistemas   de   detección   con   alta   sensibilidad   de   oligonucleótidos   de   RNA/DNA,   usando   las  UCNPs  como  etiquetas.  En  primer   lugar  se  presenta  una   introducción   explicando  la  biosíntesis,  el  mecanismo,  y  el  potencial  clínico  del  miRNA  ("sección   I.1").   A   continuación   se   compara   el   mecanismo,   las   propiedades   ópticas   y   las   ventajas  de   las  UCNPs  con  etiquetas  usadas  en  bioimagen  y  detección,  o  que  aún   están   bajo   intensa   investigación,   como   fluoróforos   orgánicos   y   puntos   cuánticos   ("sección   I.2").   Al   final   de   la   introducción   se   presenta   una   amplia   revisión   del   estado  del  arte  de  las  UCNPs  en  biodetección,  tanto  en  ensayos  homogéneos  como   heterogéneos   ("sección   I.3").   En   esta   sección   se   discuten   las   propiedades   de   las   UCNPs,  su  aplicación  a  diferentes  plataformas,  las  estrategias  de  detección  usando       Resumen     7   estas   etiquetas,   su   impacto   en   el   rendimiento   de   los   sistemas   de   detección   y   las   perspectivas  futuras  del  campo.     Los  capítulos  experimentales  de  esta  tesis  se  dividen  en  dos  secciones  diferentes:   La  primera  se  centra  en  estudios   fundamentales  sobre  procesos  de   transferencia   de  energía  por  resonancia  usando  UCNPs  como  donadores  y  puntos  cuánticos  (Q-­‐ dots)  de  CdTe,  o  nanopartículas  de  oro  (AuNPs),  como  aceptores  ("sección  III.1").   El   revestimiento  de   las  UCNPs  con  recubrimientos  de  sílice  de  distintos  grosores   permitió  estudiar  la  influencia  de  la  proximidad  de  los  Q-­‐dots  en  la  luminiscencia   conversión  ascendente.  Después  de  estimar  el  radio  de  Förster  para  este  sistema,  y   tener   el   cuenta   la   naturaleza   multi-­‐emisora   de   las   UCNPs,   fuimos   capaces   de   explicar   las   eficiencias   totales   de   transferencia   energética   por   resonancia   de   Förster   (FRET)   halladas   experimentalmente   y   de   estimar   la   eficiencia   de   FRET   para  los  distintos  iones  individuales  de  Erbio  (iones  de  Er3+)  dentro  de  la  UCNP  en   función   de   su   distancia   a   los   Q-­‐dots.   Como   resultado,   establecimos   algunas   recomendaciones   para   mejorar   las   eficiencias   de   FRET   totales   y   aplicar   el   par   UCNPs/Q-­‐dots  de  CdTe  a  la  construcción  de  sensores  FRET.  En  un  segundo  trabajo,   se   estudió   el   efecto   del   tamaño   de   las   AuNPs   en   la   luminiscencia   de   conversión   ascendente.   Las   AuNPs  más   pequeñas   probaron   favorecer   la   desactivación   de   la   luminiscencia   de   las   UCNPs,   mientras   que   las   más   grandes   ejercieron   un   efecto   incremental  sobre  el  aumento  de  la  tasa  de  decaimiento  radiativo  de  los  iones  de   Er3+   debido   al   efecto   Purcell,   lo   que   se   tradujo   en   un   aumento   progresivo   de   la   luminiscencia  a  medida  que  el  tamaño  de  las  AuNPs  crecía.  Este  estudio  permitió   encontrar  un  tamaño  óptimo  de  AuNP  para  la  desactivación  de  la  luminiscencia  de   las  UCNPs   (i.e.   14-­‐21   nm),   al  mismo   tiempo   que   establecer   un   tamaño   límite   de   AuNP  a  partir  del  cual  se  pudo  obtener  un  aumento  efectivo  de  la  luminiscencia  y   mejorado  con  tamaños  mayores.  Estos  resultados  deberían  considerarse  a  la  hora   de   diseñar   sensores   basados   en   desactivación   o   aumento   de   la   luminiscencia   de   conversión  ascendente.                                                               La  segunda  sección  experimental  se  centra  en   la  aplicación  de  nuevas  estrategias   para  la  detección  directa  de  ADN/miARN  en  ensayos  heterogéneos  usando  UCNPs   como  etiquetas  ("sección  III.2").  En  el  primer  trabajo  presentado  en  esta  sección,   se   bioconjugaron   UCNPs   recubiertas   con   sílice   con   cadenas   sencillas   de   ADN   (ssDNA)  modificadas  con  grupos  amino  para  dar  sondas  de  conversión  ascendente   Abstract       8   con  una  respuesta  biológica  específica  en  el  ensayo  hacia  el  oligonucleótido  diana.   Las   ssDNA   fijadas   también   tenían   una   modificación   con   grupo   azida,   la   cual   permitió   formar  un  enlace   covalente  mediante  química   click   "sin   cobre"   con  una   modificación  con  DBCO  contenida  en  una  segunda  sonda  de  ssDNA.  Esta  reacción   ocurrió   con   alta   especificidad,   cuando   la   azida   y   el   DBCO   estaban   en   cercana   proximidad   debido   a   la   hibridación   de   las   sondas   con   la   secuencia   diana.   Esta   estrategia  permitió  el  uso  de   lavados  repetidos  o/y   fuertes  para  reducir   la  unión   no   específica   de   las   UCNPs   durante   el   ensayo,   mientras   que   la   señal   específica   formada   debido   a   la   presencia   de   la   diana   se   conservó   debido   a   su   naturaleza   covalente.  Como  resultado,   el   ensayo  mostró  una   sensibilidad  muy  buena   (límite   de  detección,  LOD  =  100  fM).   El  segundo  trabajo  se  basó  en  una  ligación  fotoquímica  entre  dos  sondas  de  ssDNA,   una   unida   a   las   UCNPs   y   la   otra   estando   libre   en   solución   y   conteniendo   un   nucleótido   foto-­‐activable.   Esta   ligación   fotoquímica   covalente   progresó   sólo   en   presencia  de   la  secuencia  del  oligonucleótido  diana  y  bajo   irradiación  con   luz  UV   (365   nm).   Esta   reacción   probó   ser  muy   específica   y   también   permitió   el   uso   de   lavados  repetidos  o/y   fuertes  durante  el  ensayo  desarrollado  con  esta  estrategia,   lo   cual   se   tradujo   en   una   sensibilidad   asombrosa   (LOD   =   21   fM).   La   ligación   fotoquímica  se  logró  también  usando  luz  NIR  a  980  nm  como  excitación  externa,  y   la   emisión   de   conversión   ascendente   a   365   nm   de   las   UCNPs   dopadas   con   Ytterbio/Tulio  como  fuente  local  de  fotones  de  UV.  El  requisito  de  luz  UV  para  que   la  ligación  progrese  permitió  controlar  el  lugar  en  el  que  la  reacción  tenía  lugar  en   un  soporte  sólido,  así  como  el  momento  exacto  en  el  que   la  reacción  empezaba  y   terminaba,   lo   que   pudo   ser   usado   para   formar   patrones   específicamente   en   presencia  de  la  secuencia  diana.         Palabras  clave:  Nanopartículas  de  conversión  ascendente,  sílice,  puntos  cuánticos,   nanopartículas   de   oro,   FRET,   desactivación,   aumento,   efecto   Purcell,   sensor,   ensayo   heterogéneo,   química   click,   fotoligación,   miARN,   oligonucleótido,   luminiscencia,  micropocillo,  patrón,  sonda.                                   I.  Introduction                                                                           I)  Introduction       11   I)  Introduction     Since   the  very  development  of  basic   tools  by  our  early  ancestors,   technology  has   turned   into   an   essential   matter   for   the   continuity   of   our   existence   and   our   adaptation   as   species.1–3   The   manipulation   of   matter,   either   by   joining   basic   materials   to  get  a  new  non-­‐phenotypically  provided  skill  or   tool,  by  carrying  out   chemical  reactions  to  reorganize  atoms  in  search  of  new  properties,  or  by  studying   and   modifying   biological   molecules   and   processes   to   exert   an   effect   in   living   organisms,  are  all  part  of  technology,  as  is  also  the  knowledge  required  to  make  all   of  this  possible.  Manipulation  of  matter  can  be  extended  to  different  scales,  being   technology   itself   the   one   allowing   to   push   the   field   to   new   limits,   such   as   the   nanoscale.   In  this  range,   the  properties  of  matter  can  experience  sudden  changes   compared  to  their  macroscopic  or  "bulk"  counterparts,  due  to  quantum  mechanics   related  effects  (e.g.  quantum  confinement  in  semiconductors),  the  high  surface  to   volume   ratios   exhibited   by   these   materials,   and   other   size-­‐related   phenomena.   Already  envisioned  by  the  physicist  Nobel  laureate  Richard  Feynman  in  his  speech   "There's  plenty  of  room  at  the  bottom",4  but  actually  starting  to  materialize  in  the   work  of  previous  (R.  A.  Zsigmondy)5  and  later  researchers  like  K.  Eric  Drexler,6  R.   Smalley,   R.   Curl   and   H.   Kroto,7   just   to   mention   a   few,   the   implications   of   manipulating  matter  at  the  atomic,  molecular  and  supramolecular  scales  have  led   to  the  dawn  of  a  new  field:  Nanotechnology.  This  includes  disciplines  as  diverse  as   microfabrication,   surface   and   colloids   science,   molecular   biology,   chemistry,   physics,   molecular   engineering,   or   physical   chemistry,   as   far   as   they   deal   with   materials  exhibiting,  at  least,  one  dimension  sized  from  1  to  100  nanometers.  This   implies   that   a   widely   multidisciplinary   knowledge   is   often   required   in   nanotechnological  research,  especially  when  it  comprises  from  the  synthesis  to  the   application   of   the   nanomaterial.   Although   not   exempt   of   concerns,   such   as   nanotoxicity   or   important   environmental   impacts   derived   from   their   massive   production,   the   potential   of   these   new  materials   offers   the   possible   solutions   to   face  some  of  our  contemporary  challenges:  energy  storage,  increased  efficiency  of   renewable  energy  production,   or  new  strategies   for  diagnosis,   drug  delivery  and   the   study   and   manipulation   of   biological   systems   (sometimes   referred   as   I)  Introduction     12   bionanotechnology),  to  mention  a  few.  In  this  regard,  the  increasing  availability  of   methods  to  synthesize  and  design  colloidal  nanoparticles  with  singular  properties   have   allowed   a   step   forward   to   the   fulfillment   of   greatly   desired   features   in   biodetection,   such   as   miniaturization,   multiplexing,   high   sensitivity,   and   direct   (non-­‐amplified)   detection.   Thus,   noble   metal   nanoparticles,   quantum   dots,   or   upconverting   nanoparticles   conform   just   some   examples   of   promising   reporters   that  are  substituting  traditional  organic  dyes  as  labels  for  biodetection,  due  to  their   enhanced  optical  and  physicochemical  properties.  The  minute  amounts  of  analytes   that   can   be   potentially   detected   by   these  means   open   the   possibility   of   directly   detecting   new   biomarkers,   such   as   miRNAs,   bypassing   some   bias   occurring   in   common  tasks  like  retro-­‐transcription  and  PCR  amplification  protocols.     This  thesis  focuses  on  the  synthesis,  surface  functionalization,  bioconjugation  and   application  of   upconverting  nanoparticles   in   the  development   of   systems   for   the   direct  detection  of  short  DNA/RNA  sequences,  specially  intending  to  exploit  to  the   greatest  extent  the  very  unique  optical  properties  of  these  labels  in  the  biosensing   field.               References     (1)     Parker,   S.   T.;   Gibson,   K.   R.   A   Developmental   Model   for   the   Evolution   of   Language   and   Intelligence  in  Early  Hominids.  Behav.  Brain  Sci.  1979,  2,  367.   (2)     Kuhn,   S.   L.  Mousterian   Lithic   Technology:   An   Ecological   Perspective;   Princeton   University   Press:  Princeton,  New  Jersey,  2014.   (3)     Toth,  N.  The  First  Technology.  Sci.  Am.  1987,  256,  112.   (4)     Feynman,  R.  P.  There’s  Plenty  of  Room  at  the  Bottom.  Eng.  Sci.  1960,  23,  22.   (5)     Zsigmondy,   R.   Ueber   Wässrige   Lösungen   Metallischen   Goldes.   Justus   Liebig’s   Ann.   der   Chemie  1898,  301,  29.   (6)     Drexler,   K.   E.   Molecular   Engineering:   An   Approach   to   the   Development   of   General   Capabilities  for  Molecular  Manipulation.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  1981,  78,  5275.   (7)     Curl,  Robert  F.;  Kroto,  Harold  W.;   Smalley,  R.  E.  The  Nobel  Prize   in  Chemistry  1996   -­‐  The   discovery   of   carbon   atoms   bound   in   the   form   of   a   ball   is   rewarded   https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1996/press-­‐release/.         I.1  microRNA       13   I.1  microRNA     Amongst   the   different   kinds   of   non-­‐coding   RNA   molecules   that   have   been   discovered   over   the   last   decades   (e.g.   microRNAs,   siRNAs,   piRNAs),   the   relative   abundance   and   the   influence   of   microRNAs   (miRNAs)   over   essential   cellular   processes  have  put  them  under  the  spotlight  of  research.  Although  lin-­‐4  represents   the   first  historic  example  of  miRNA  discovered   in  C.  elegans   in  1993   ,1   it  was  not   until   the   discovery   of   a   second  miRNA   sequence   (let-­‐7),2   seven   years   later,   that   researchers   started   to  wonder   about   the   presence   of   these   biomolecules   among   different  species,   including  human  beings.  Ever  since,   thousands  of  miRNAs  have   been  found  in  animals,  plants,  and  even  viruses,  proving  the  essential  role  of  these   21-­‐24  nucleotide  (nt)  long  RNA  sequences  for  the  well-­‐functioning  of  these  living   systems.3–5       I.1.1  miRNA  biosynthesis  and  mechanism     The  transcribed  miRNA  genes  are  only  biologically  active  after  being  processed  by   different   steps,   in   which   the   required   cellular   machinery   and   pathways   varies   between   different   evolutionarily   evolved   animals   and   plants.     In   the  case  of  animal  miRNAs,  most  sequences  are  codified   in   intergenic  regions,   and   around   half   of   all   discovered  miRNAs   are   clustered   and   expressed   as   poly-­‐ cistronic  transcrips  while,  less  commonly,  a  minority  possess  their  own  promoters.   RNA   polymerase   II   (Pol   II)   is   normally   in   charge   of   miRNA   gene   transcription,   whose   products   are   known   as   "primary  miRNAs"   (pri-­‐miRNAs)   that   are   several   kilobases   long   sequences   containing   local   stem   loop   structures.   Animal  miRNAs   are  firstly  processed  in  the  cell  nucleus,  being  cleaved  at  the  5'  and  3'  stem  of  the   loop   structure   and   releasing   a   60-­‐70   nt   hairpin   structure   named   "precursor   miRNA"   (pre-­‐miRNA).   This   step   is   carried   out   by   the   enzyme   "Drosha"   in   conjuction  with  the  protein  "DGCR8"  in  humans,  which  already  define  one  end  of   the  mature  miRNA,6,7  see  Figure  I.1.1.1.  These  pre-­‐miRNAs  are  then  transported  to   the  cytoplasm  by  the  nuclear  transport  receptor  "exportin-­‐5"  (EXP5).  Once  in  the   cytoplasm,   the   ribonuclease   "Dicer"   (in   association   with   other   proteins   like   I.1.1  microRNA  biosynthesis  and  mechanism     14   Argonaute  family  proteins  (Ago  1-­‐4),  "TRBP",  and  "PRKRA  or  PACT")  measure  22   nt   from  the  previously  defined  miRNA  matured   terminus  by  Drosha,  and  cleaves   the   miRNA   strand.   The   Dicer   associated   proteins   are   not   required   for   the   processing   of   pre-­‐miRNA,   but   for   the   formation   of   the   RNA-­‐induced   silencing   complex   (RISC).   Once   the   pre-­‐miRNA   has   been   proccessed,   one   strand   of   the   double  stranded  miRNA  product  is  degraded,  while  the  other  remains  bounded  to   Ago   as   the   mature   miRNA.   It   seems   that   the   selection   of   the   strand   which   will   remain   in   the   complex   to   perform   the   silencing   function   is   based   on   the   thermodynamic  stability  of   the   two  ends  of   the  miRNA  duplex.  The  one  with   the   less  stable  end  (miRNA*)  will  be  unwinded  by  a  RNA  Helicase  and  degraded  by  the   Ago  protein.  Once  the  single  stranded  mature  miRNA  is  obtained,  it  can  guide  the   RISC  to   its   target  mRNA  for  silencing   it  (see  Figure  I.1.1.1   for  whole  biosynthesis   process).8   The  maturation  of  miRNA  in  plants  is  different.  On  the  one  hand,  Dicer  like-­‐1  (DCL-­‐ 1)  is  the  only  protein  responsible  for  plant  miRNA  processing,  while  HASTY  (HST),   an  homologue  of  exportin-­‐5,  is  in  charge  of  transporting  the  miRNAs  from  the  cell   nucleus   to   the   cytoplasm.   Besides,   the   association   of   the   miRNAs   with   the   Ago   proteins  can  take  place  either  in  the  nucleus  or  in  the  cytoplasm.   Mature   miRNAs   can   silence   their   mRNA   targets   by   two   main   mechanisms:   translation   represion,   or   mRNA   degradation,   whose   selection   will   depend   on   different   factors.   Most   animal   miRNA   present   bulges   and   multiple   mismatches   upon   binding   to   their   target   sites   within   the   messenger   RNA   (mRNA),   usually   located   as  multiple   copies   in   their   3'   untranslated   region   (3'  UTR).  On   the   other   hand,  plant  miRNA  binding  sites  are  in  the  centre  of  their  complementary  regions,   and  posesses  a  high  degree  of  complementarity  with  their  target  mRNA.  The  level   of   miRNA-­‐mRNA   complementarity,   and   the   number,   position   and   kind   of   mismatches  determines  if  the  target  mRNA  will  suffer  degradation  or  translational   repression.  In  general,  central  mismatches  promote  translational  repression,  while   high   complementarity   favors   direct   mRNA   degradation.   Although   Ago   slicer   activity   represents   one   of   the   main   mechanisms   by   which   target   mRNA   can   be   degraded,  it  has  been  shown  that  other  mechanisms  like  deadenylation,  decapping,   and  exonucleolytic  digestion  of  mRNA  can  also  occur.9                                                                                                                                                              I.1.1  microRNA  biosynthesis  and  mechanism       15   Figure  I.1.1.1  animal  miRNA  biosynthesis  process.  Modified  with  permission  of  [8] I.1.1  microRNA  biosynthesis  and  mechanism     16   On  the  other  hand,  translational  repression  can  proceed  by  blocking  the  43S  PIC   (pre-­‐initiation  complex)  recruitment  or  the  ribosomal  scanning,  by  deadenylation   and  displacement  of  poly(A)  binding  protein  (PABP),  and  by  recruiting  protein   translational  repressors  (DDX6  or  4E-­‐T),10  see  Figure  I.1.1.2  for  further  details.         Figure   I.1.1.2  Animal  miRNA  translation  repression  mechanisms.  GW182  recruits   translational  repressors  (DDX6  or  4E-­‐T)  onto  the  target  mRNA,  although  the  exact   mechanism  by  which  the  repression  occurs  remains  unclear.  The  miRNA-­‐mediated   displacement   of   ATP-­‐dependent   helicase   elF4A   from   the   cap-­‐binding   complex   elF4F  also  repress  the  mRNA  translation,  by  blocking  the  43S  PIC  recruitment  or   ribosomal   scanning.   Deadenylation   and   displacement   of   poly(A)-­‐binding   protein   (PABP)  through  GW182  and  CCR4-­‐NOT  are  also  contributors  to  the  overall  mRNA   translational  repression.  Reproduced  with  permission  of  reference  [10]                       I.1.2  Functions  and  biological  importance       17   I.1.2  Functions  and  biological  importance     The  presence  of  miRNAs  and  some  of  their  cellular  machinery  goes  back  to  animal   phyla   existing   even   before   the   emergence   of   Bilateria   (animals   with   bilateral   symetry),  hundred  million  years  ago.  While  sponges  (Amphimedon  queenslandica)   and   starlet   sea   anemone   (Nematostella   vectensis)   are   some   species   proving   this   fact,  they  are  also  a  living  record  that  demonstrates  the  high  dynamic  evolution  of   these   regulatory   biomolecules   between   species,   as   represented   by   the   great   differences  in  miRNA  precursors  sizes  and  sequences.11     In   discovering   and   determining   the   function   of   miRNAs   within   the   different   species,   three   main   approaches   have   been   proved   specially   useful:   Genomic   experiments,   forward   genetics,   and   reverse   genetics.   The   first   approach   initially   makes   use   of   miRNAs   computational   predictions,   to   further   cloning   the   genes   containing  these  sequences.  This  will  permit  studying  if  they  are  processed  by  the   organisms  to  give  the  mature  miRNA  sequences  while  establishing  their  function.   On   the   other   hand,   the   use   of   forward   genetics   consists   in   isolating   the  mutant   genes  of   individual   organisms   that   shows  phenotypic  differences   compared  with   the   common   organism.   Finally,   reverse   genetics   is   based   on   either   the   overexpression   or   the   "knock   out"   of   specific   genes   as   a  mean   to   discover   their   function.12      The   prediction   by   bioinformatics   of   miRNA   sequences   in   plants,   and   thus   their   discovery,  is  considerable  easier  than  in  animals.  This  is  because  miRNA  sequences   in  plants   are  highly   complementary   to   their   target  mRNAs,   allowing  a  quick   and   confident   identification   of   the   possible   sequences   involved   in   their   regulation.   miRNAs  have  an  important  role  controlling  developmental  stages  in  plants,  either   by  cleavage  or  translational  repression  of  mRNA  targets.  In  fact,  this  is  their  main   function,   as   most   discovered   plant   miRNAs   target   transcription   factor   gene   families,   specially   those   related   to   cell   differentiation   and   developmental   regulatory   networks.   Even   among   the   few   sequences   whose   targets   are   not   transcription   factors,   some   of   them   seem   to   exert   a   negative   feedback   on   the   expression  of  the  above  mentioned  miRNAs.13  In  general,  plant  miRNA  regulatory   functions  can  be  splitted  into  three  categories  (see  Figure  I.1.2  ):  First,  defining  a   specific   spatial   expression   pattern   of   their   targets,   due   to   the   expression   of   I.1.2  Functions  and  biological  importance     18   miRNAs  and  their  targets  on  contiguous,  but  nonoverlapping,  plant  domains.  This   mechanism   can   be   responsible   for   creating   assymetry   in   the   plant,   for   example.   Second,   preventing   variations   in   pattern   and   expression   levels   of   targets,   by   sharing   expression   in   overlapping   plant   domains.   This   has   a   "buffering"   effect,   diluting   possible   target   expression   differences   in   nearby   plant   domains.   Third,   exerting   temporal   regulation   of   target   gene   accumulation,   thus   regulating   the   developmental  transitions.14                                                 Figure   I.1.2  Types  of  regulation  by  plant  miRNAs.  (A)  Spatial  restriction  of   target   accumulation.  The  target  of  the  miRNA  tends  to  accumulate  in  domain  A,  where  the   miRNA  is  not  present,  while  accumulation  of  the  miRNA  in  domain  B,  depletes  the   target.   Under  miRNA   regulation,   target   accumulation   is   restricted   to   the   adaxial   domain   (domain   A).   (B)   Buffering   of   target   expression.   Reduction   and   homogeneization   of   target   expression   levels   under   miRNA   regulation   in   the   meristem,"M".  In  the  wild  type  miRNA  accumulates  in  the  meristem  and  boundary   regions,   where   it   overlaps   with   the   target.   When   miRNA   is   not   present,   the   expression  of  the  target  is  increased  in  boundary  regions.  (C)  Temporal  regulation.   A   concentration   gradient   of   miRNA   expression   over   time   is   accompanied   of   an   opposite  gradient  of   target.  The  miRNA  is  expressed  at  early  stages,  avoiding  the   presence   of   target.   The   miRNA   is   absent   in   mature   leaves   "ml",   leading   to   the   accumulation  of  the  target  there.  When  lacking  miRNA  regulation,  the  expression   of   target   occurs   prematurely   in   "P0"   and   "P1"   (leaf   primordia   0   and   1,   respectively).  Adapted  with  permission  from  reference  [14].         I.1.2  Functions  and  biological  importance       19     As  highlighted  previously,   identification  of  miRNA   sequences   in   animals   is  much   more   challenging   than   in   plants.   The   reason   is   the   reduced   complementarity   between   the   sequences   and   their   target   mRNAs.   This   makes   the   bioinformatic   predictions   noisier   and   more   prone   to   false   positives,   while   needing   to   use   "evolutionary   conservation"   of   the   miRNA   sequences   between   species   as   a   criterion   for   their  discovery,  and  not  as  a  mean  to  validate   the  predicted   targets.   Another  characteristic  from  animal  miRNAs  is  that  they  are  often  clustered  in  the   genome  in  the  form  of  tandems.12,15    When  these  clustered  miRNAs  are  similar  in   sequence,  the  gene  products  may  act  additively  to  regulate  a  set  of  mRNAs.  On  the   other  hand,   the  presence  of  different  sequences  clustered  together  suggests  their   coordinated   expression   to   regulate   various   targets   simultaneously.   It   is   remarkable   that,   although   specific   miRNA   sequences   can   be   conserved   through  phylogenetically  distant  species  (like  vertebrates  and  insects),  the  targets   of   these   shared   miRNAs   sequences   highly   differ   (i.e.   the   genes   in   which   the   targeted   binding   sites   reside).12   This   suggests   the   plasticity   and   evolutionary   dynamics   of   the   miRNA   regulatory   systems   within   the   cells.     Similarly   to   plants,   some   animal  miRNAs   also   share   an   evolutionarily   conserved   role   in   transcriptional   regulation.  However,  only  a  minority  of  miRNA  sequences   are   involved   in   these   tasks   while,   in   contrast,   the   vast   majority   regulates   the   expression  of  genes  related  to  diverse  biological  processes.  In  fact,  to  which  extent   miRNAs  are  involved  in  these  processes  is  evident  when  some  reports  predict  that   over   one   third   of   human   genes   may   be   regulated   by   these   biomolecules.16   The   experimental   validation   of   the   diverse   functions   of   animal  miRNAs   is  wide:   The   influence   of   miR-­‐196   in   mouse   limb   development,17   the   muscle-­‐specific   miR-­‐1   controlling   the   balance   between   differentiation   and   proliferation   of   cardiomyocytes   during   cardiogenesis,18   the   expresion   of   miR-­‐375   in   pancreatic   islets   that   inhibits   the  glucose-­‐induced   insulin  secretion  by   targeting  Myotrophin   gene   (reducing   exocitosis),19   the   participation   of   miR-­‐32   in   antiviral   defense   mechanisms,20   or   the   role   of   miR-­‐15a   and   miR-­‐16-­‐1   as   tumor   supressors21,   to   mention  a  few.8  Interestingly,  the  relatively  recent  discovery  of  miRNA  sequences   being   exchanged   between   cells,   using   exosomes,   has   proved   that   they   also   can   function   as   hormones   or   intercellular   communication   mediators.22   This   fact   I.1.2  Functions  and  biological  importance     20   evidence  even  more  the  important  role  of  miRNAs  in   living  organisms,  as  well  as   their  increasing  clinical  relevance.       I.1.3  Clinical  potential  and  challenges     The  ubiquity  of  miRNAs,  and  the  fact  that  they  take  part  in  the  control  of  so  many   different   and   important   cell   processes,   poses   a   reasonable   question:   Can   their   misregulation   be   responsible,   at   least   in   part,   for   the   origin   of   certain   diseases?   Truth  is  that  there  is  an  increasing  number  of  diseases  that  are  starting  to  show  a   correlation   with   altered   levels   of   different   miRNAs.   Thus,   very   important   conditions   such   as   neurodegenerative   (e.g.   Alzheimer   disease)23   or   immune-­‐ related  diseases  (e.g.  Multiple  sclerosis),24  virus  infections  (e.g.  Hepatitis  C  virus),25   or  different  kinds  of  cancer  (e.g.  Lung  cancer),26  to  mention  a  few,  are  accompanied   of   aberrant   miRNA   expression   patterns.27   These   findings   are   of   high   clinical   importance:   On   the   one   hand,   as   miRNA   function   studies   have   shown,   their   expression  tend  to  be  tissue-­‐specific  and  mirrors  the  cell  physiological  nature  and   state28.   This   implies   that   the   deviation   of   cells   from   their   normal   states   can   be   reflected   in   the   form   of   specific   aberrant   miRNA   profiles.   Because   of   this,   the   potential   of   these   profiles,   in   order   to   quickly   identify   the   tissues   where   this   aberrant  miRNA  expression  is  taking  place,  stands  up  as  a  powerfull  tool   in  early   diagnosis  and  prognosis  of  human  diseases.  In  fact,  The  Cancer  Program  of  the  US   National   Cancer   Institute   sponsored   in   2006   the   workshop   entitled   "MicroRNA:   Potential  for  Cancer  detection,  diagnosis  and  prognosis",  bringing  together  leaders   in   the  miRNA   field   to   discuss   the   real   potential   of   these   biomolecules   as   cancer   diagnosis   biomarkers.29   Ever   since,   a   high   amount   of   works   characterizing   and   assessing   the  potential   in  diagnosis  of  miRNA  profiles,   specially   those   sequences   present   in   serum   or   other   body   fluids   that   could   be   easily   gathered,   has   been   reported.30–34   The   authors   often   try   to   select   the   lowest   possible   amount   of   miRNAs,   but   with   the   highest   significance,   to   simplify   the   diagnosis   of   specific   cancers  and  diseases  while  pursuing  high  sensitivity  and  specificity.     On   the   other   hand,   the   discovery   that   several   diseases   show   this   miRNA   misregulation,   together  with   the  upstream  position  of  miRNA   in  gene  regulation,   makes   them  both  potential   therapeutic   targets   and   therapeutics   themselves.  The       I.1.3  Clinical  potential  and  challenges       21   former,   because   the   correction   of   a   miRNA   overexpression,   by   targeting   and   inhibiting   those   specific  miRNAs,   can   restore   the   normal   levels   of   the   repressed   proteins,   thus   obtaining   the   therapeutic   effect.35   The   latter,   because   the   administration  of  synthetic  miRNA  or  miRNA  mimetics   into  diseased   tissues  as  a   "miRNA   replacement   therapy"  may   supress   a   harmful   gene   and   recover   normal   cell  functions  such  as  proliferation,  apoptosis,  etc.8   The   huge   importance   of   all   this   fundamental   research   can   be   reflected   by   the   increasing   interest   from   pharmaceutical   companies   in   the   field.   As   an   example,   Rosetta   genomics,   together   with   Columbia   University   Medical   Center,   has   developed   a   diagnostic   test   based   on   miRNA   detection   to   distinguish   between   squamous   and   nonsquamous   lung   cancer   patients.36   The   fact   that   miRNAs   are   naturally   ocurring   biomolecules   has   several   advantages   when   used   as   therapeutics.  For  instance,  they  will  have  a  higher  probability  to  be  safe  for  human   use,  giving  more  confidence  and  reducing  the  investment-­‐associated  economic  risk   during   their  development.   In   fact,   several  pharmaceutical   companies  are  starting   to   focus   on   exploiting  miRNAs   as   treatments   for   diseases:   In   2008,   Santaris  was   close   to   initiate   clinical   trials  with   SPC3649,   a   locked   nucleic   acid   (LNA)   against   miR-­‐122   for   the   treatment  of  hepatitis  C  virus  (HCV),  while  GlaxoSmithKline  and   Regulus   Therapeutics   allied   to   develop   novel   miRNA-­‐targeted   drugs   for   inflammatory   diseases.37   Thus,   miRNA   based   diagnostics   and   therapies   have   a   promising   future   forward,   although   some   challenges   need   to   be   adressed.   The   short   length,   existence   of   miRNA   isoforms   and   high   sequence   similarities,   are   features   that   turn   the   reliable   identification   and  quantification   of  miRNAs   into   a   very   difficult   task.   It   is   already   known   that   the   use   of   different   commercialized   miRNA  detection  platforms  shows  poor  consistency  between  each  other,38  and  that   base  composition,  structure  and  isoforms  (O-­‐methyl  modifications  being  especially   important),   are   partially   responsible   of   this   impact.   Other   parameters   such   as   sample   preparation   and   the   strategies   used   for   the   experimental   analyses   (e.g.   enzymatic   ligations,   reverse   transcriptions)   have   also   notorious   influence   by   introducing   variability.39   In   this   regard,   the   development   of   nanotechnology   is   playing  a  key  role  by  offering  new  and  direct  detection  methods   that  can  bypass   these   bias,39   as   well   as   contribuiting   to   solve   miRNA   issues   when   used   as   therapeutics  (such  as  tissue  targeting  and  developing  drug  delivery  platforms).40   I.1.3  Clinical  potential  and  challenges     22       References     (1)     Lee,   R.   C.;   Feinbaum,   R.   L.;   Ambros,   V.   The   C.   Elegans   Heterochronic   Gene   Lin-­‐4   Encodes   Small  RNAs  with  Antisense  Complementarity  to  Lin-­‐14.  Cell  1993,  75,  843.   (2)     Reinhart,  B.  J.;  Slack,  F.  J.;  Basson,  M.;  Pasquinelli,  E.;  Bettinger,  J.  C.;  Rougvie,  E.;  Horvitz,  H.   R.;   Ruvkun,   G.   The   21-­‐Nucleotide   Let-­‐7   RNA   Regulates   Developmental   Timing   in   Caenorhabditis  Elegans.  Nature  2000,  403,  901.   (3)     Muljo,   S.   A.;   Kanellopoulou,   C.;   Aravind,   L.   MicroRNA   Targeting   in   Mammalian   Genomes:   Genes  and  Mechanisms.  Wiley  Interdiscip.  Rev.  Syst.  Biol.  Med.  2010,  2,  148.   (4)     Zhang,  B.;  Pan,  X.;  Cobb,  G.  P.;  Anderson,  T.  A.  Plant  microRNA:  A  Small  Regulatory  Molecule   with  Big  Impact.  Dev.  Biol.  2006,  289,  3.   (5)     Grundhoff,  A.;  Sullivan,  C.  S.  Virus-­‐Encoded  microRNAs.  Virology  2011,  411,  325.   (6)     Lee,  Y.;  Ahn,  C.;  Han,  J.;  Choi,  H.;  Kim,  J.;  Yim,  J.;  Lee,  J.;  Provost,  P.;  Rådmark,  O.;  Kim,  S.;  et  al.   The  Nuclear  RNase  III  Drosha  Initiates  microRNA  Processing.  Nature  2003,  425,  415.   (7)     Han,   J.;   Lee,   Y.;   Yeom,   K.-­‐H.;   Kim,   Y.-­‐K.;   Jin,   H.;   Kim,   V.   N.   The   Drosha-­‐DGCR8   Complex   in   Primary  microRNA  Processing.  Genes  Dev.  2004,  18,  3016.   (8)     Wahid,  F.;  Shehzad,  A.;  Khan,  T.;  Kim,  Y.  Y.  MicroRNAs:  Synthesis,  Mechanism,  Function,  and   Recent  Clinical  Trials.  Biochim.  Biophys.  Acta  -­‐  Mol.  Cell  Res.  2010,  1803,  1231.   (9)     Behm-­‐Ansmant,   I.;   Rehwinkel,   J.;   Doerks,   T.;   Stark,   A.;   Bork,   P.;   Izaurralde,   E.   mRNA   Degradation  by  miRNAs  and  GW182  Requires  Both  CCR4:NOT  Deadenylase  and  DCP1:DCP2   Decapping  Complexes.  Genes  Dev.  2006,  20,  1885.   (10)     Iwakawa,  H.   oki;   Tomari,   Y.   The   Functions   of  MicroRNAs:  mRNA  Decay   and  Translational   Repression.  Trends  Cell  Biol.  2015,  25,  651.   (11)     Grimson,  A.;  Srivastava,  M.;  Fahey,  B.;  Woodcroft,  B.  J.;  Chiang,  H.  R.;  King,  N.;  Degnan,  B.  M.;   Rokhsar,  D.  S.;  Bartel,  D.  P.  Early  Origins  and  Evolution  of  microRNAs  and  Piwi-­‐Interacting   RNAs  in  Animals.  Nature  2008,  455,  1193.   (12)     Ambros,  V.  The  Functions  of  Animal  microRNAs.  Nature  2004,  431,  350.   (13)     Bartel,   D.   P.  MicroRNAs:   Genomics,   Biogenesis,  Mechanism,   and   Function.  Cell  2004,  116,   281.   (14)     GARCIA,  D.  A  miRacle  in  Plant  Development:  Role  of  microRNAs  in  Cell  Differentiation  and   Patterning.  Semin.  Cell  Dev.  Biol.  2008,  19,  586.   (15)     Lau,  N.   C.;   Lim,   L.   P.;  Weinstein,   E.   G.;   Bartel,   D.   P.   An  Abundant   Class   of   Tiny  RNAs  with   Probable  Regulatory  Roles  in  Caenorhabditis  Elegans.  Science.  2001,  294,  858.   (16)     Lewis,  B.  P.;  Burge,  C.  B.;  Bartel,  D.  P.  Conserved  Seed  Pairing,  Often  Flanked  by  Adenosines,   Indicates  That  Thousands  of  Human  Genes  Are  microRNA  Targets.  Cell  2005,  120,  15.   (17)     Hornstein,  E.;  Mansfield,  J.  H.;  Yekta,  S.;  Hu,  J.  K.-­‐H.;  Harfe,  B.  D.;  McManus,  M.  T.;  Baskerville,   S.;  Bartel,  D.  P.;  Tabin,  C.  J.  The  microRNA  miR-­‐196  Acts  Upstream  of  Hoxb8  and  Shh  in  Limb   Development.  Nature  2005,  438,  671.   (18)     Zhao,   Y.;   Samal,   E.;   Srivastava,   D.   Serum   Response   Factor   Regulates   a   Muscle-­‐Specific   microRNA  That  Targets  Hand2  during  Cardiogenesis.  Nature  2005,  436,  214.   (19)     Poy,   M.   N.;   Eliasson,   L.;   Krutzfeldt,   J.;   Kuwajima,   S.;   Ma,   X.;   MacDonald,   P.   E.;   Pfeffer,   S.;   Tuschl,  T.;  Rajewsky,  N.;  Rorsman,  P.;  et  al.  A  Pancreatic  Islet-­‐Specific  microRNA  Regulates   Insulin  Secretion.  Nature  2004,  432,  226.   (20)     Lecellier,  C.;  Dunoyer,  P.;  Arar,  K.;  Lehmann-­‐Che,  J.;  Eyquem,  S.;  Himber,  C.;  Saïb,  A.;  Voinnet,   O.  A  Cellular  MicroRNA  Mediates  Antiviral  Defense  in  Human  Cells.  Science.  2005,  308,  557.   (21)     Cimmino,   A.;   Calin,   G.   A.;   Fabbri,   M.;   Iorio,   M.   V;   Ferracin,   M.;   Shimizu,   M.;   Wojcik,   S.   E.;   Aqeilan,  R.   I.;   Zupo,  S.;  Dono,  M.;   et   al.  miR-­‐15  and  miR-­‐16   Induce  Apoptosis  by  Targeting   BCL2.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  2005,  102,  13944.   (22)     Yoshioka,  Y.;  Katsuda,  T.;  Ochiya,  T.  Circulating  microRNAs  in  Disease  Diagnostics  and  Their   Potential   Biological   Relevance;   Igaz,   P.,   Ed.;   Experientia   Supplementum;   Springer   Basel:   Basel,  2015;  Vol.  106.   (23)     Hu,   Y.-­‐B.;   Li,   C.-­‐B.;   Song,   N.;   Zou,   Y.;   Chen,   S.-­‐D.;   Ren,   R.-­‐J.;   Wang,   G.   Diagnostic   Value   of   microRNA   for   Alzheimer’s   Disease:   A   Systematic   Review   and  Meta-­‐Analysis.   Front.   Aging   Neurosci.  2016,  8,  1.   (24)     Keller,   A.;   Leidinger,   P.;   Lange,   J.;   Borries,   A.;   Schroers,   H.;   Scheffler,   M.;   Lenhof,   H.-­‐P.;   Ruprecht,   K.;   Meese,   E.   Multiple   Sclerosis:   MicroRNA   Expression   Profiles   Accurately       I.1.3  Clinical  potential  and  challenges       23   Differentiate   Patients   with   Relapsing-­‐Remitting   Disease   from   Healthy   Controls.   PLoS  One   2009,  4,  e7440.   (25)     Jopling,   C.   L.;   Yi,  M.;   Lancaster,   A.  M.;   Lemon,   S.  M.;   Sarnow,   P.  Modulation   of   Hepatitis   C   Virus  RNA  Abundance  by  a  Liver-­‐Specific  MicroRNA.  Science.  2005,  309,  1577.   (26)     Yanaihara,   N.;   Caplen,   N.;   Bowman,   E.;   Seike,   M.;   Kumamoto,   K.;   Yi,   M.;   Stephens,   R.   M.;   Okamoto,   A.;   Yokota,   J.;   Tanaka,   T.;   et   al.   Unique   microRNA   Molecular   Profiles   in   Lung   Cancer  Diagnosis  and  Prognosis.  Cancer  Cell  2006,  9,  189.   (27)     Li,   Y.;   Kowdley,   K.   V.   MicroRNAs   in   Common   Human   Diseases.   Genomics,   Proteomics   Bioinforma.  2012,  10,  295.   (28)     Lagos-­‐Quintana,  M.;  Rauhut,  R.;  Yalcin,  A.;  Meyer,  J.;  Lendeckel,  W.;  Tuschl,  T.  Identification   of  Tissue-­‐Specific  MicroRNAs  from  Mouse.  Curr.  Biol.  2002,  12,  735.   (29)     Tricoli,   J.   V.;   Jacobson,   J.   W.   MicroRNA:   Potential   for   Cancer   Detection,   Diagnosis,   and   Prognosis.  Cancer  Res.  2007,  67,  4553.   (30)     Roth,  C.;  Rack,  B.;  Müller,  V.;  Janni,  W.;  Pantel,  K.;  Schwarzenbach,  H.  Circulating  microRNAs   as   Blood-­‐Based   Markers   for   Patients   with   Primary   and   Metastatic   Breast   Cancer.   Breast   Cancer  Res.  2010,  12,  R90.   (31)     Bianchi,   F.;   Nicassio,   F.;   Marzi,   M.;   Belloni,   E.;   Dall’Olio,   V.;   Bernard,   L.;   Pelosi,   G.;   Maisonneuve,  P.;  Veronesi,  G.;  Di  Fiore,  P.  P.  A  Serum  Circulating  miRNA  Diagnostic  Test  to   Identify  Asymptomatic  High-­‐Risk  Individuals  with  Early  Stage  Lung  Cancer.  EMBO  Mol.  Med.   2011,  3,  495.   (32)     Hennessey,  P.  T.;  Sanford,  T.;  Choudhary,  A.;  Mydlarz,  W.  W.;  Brown,  D.;  Adai,  A.  T.;  Ochs,  M.   F.;   Ahrendt,   S.   A.;   Mambo,   E.;   Califano,   J.   A.   Serum  Microrna   Biomarkers   for   Detection   of   Non-­‐Small  Cell  Lung  Cancer.  PLoS  One  2012,  7,  e32307.   (33)     Chen,  X.;  Hu,  Z.;  Wang,  W.;  Ba,  Y.;  Ma,  L.;  Zhang,  C.;  Wang,  C.;  Ren,  Z.;  Zhao,  Y.;  Wu,  S.;  et  al.   Identification  of  Ten  Serum  microRNAs  from  a  Genome-­‐Wide  Serum  microRNA  Expression   Profile   as   Novel   Noninvasive   Biomarkers   for   Nonsmall   Cell   Lung   Cancer   Diagnosis.   Int.   J.   Cancer  2012,  130,  1620.   (34)     Manterola,  L.;  Guruceaga,  E.;  Pérez-­‐Larraya,  J.  G.;  González-­‐Huarriz,  M.;  Jauregui,  P.;  Tejada,   S.;   Diez-­‐Valle,   R.;   Segura,   V.;   Samprón,   N.;   Barrena,   C.;   et   al.   A   Small   Noncoding   RNA   Signature   Found   in   Exosomes   of   GBM   Patient   Serum   as   a   Diagnostic   Tool.  Neuro.   Oncol.   2014,  16,  520.   (35)     Mack,  G.  S.  MicroRNA  Gets  down  to  Business.  Nat.  Biotechnol.  2011,  29,  459.   (36)     H.   Ohad,   R.   G.   Mining   genes   from   junk   (Part   II)   https://seekingalpha.com/article/72184-­‐ rosetta-­‐genomics-­‐mining-­‐genes-­‐from-­‐junk-­‐part-­‐ii.   (37)     Regulus.   GlaxoSmithKline   and   Regulus   Therapeutics   Form   Strategic   Alliance   To   Develop   microRNA   Targeted   Therapeutics   to   Treat   Inflammatory   Diseases   http://ir.regulusrx.com/releasedetail.cfm?releaseid=712395.  Apr  17,  2008.   (38)     Leshkowitz,   D.;   Horn-­‐saban,   S.;   Parmet,   Y.;   Feldmesser,   E.   Differences   in   microRNA   Detection  Levels  Are  Technology  and  Sequence  Dependent.  RNA  2013,  19,  527.   (39)     Chugh,  P.;  Dittmer,  D.  P.  Potential  Pitfalls  in  microRNA  Profiling.  Wiley  Interdiscip.  Rev.  RNA   2012,  3,  601.   (40)     Chen,  Y.;  Gao,  D.-­‐Y.;  Huang,  L.   In  Vivo  Delivery  of  miRNAs   for  Cancer  Therapy:  Challenges   and  Strategies.  Adv.  Drug  Deliv.  Rev.  2015,  81,  128.                         I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes       24   I.2  Reporters  in  bioassays       Collecting   qualitative   and   quantitative   information   is   fundamental   to   start   comprehending  the  causal  relationships  taking  place  in  the  world  surrounding  us.   Nevertheless,  when  studying  microscopic  systems,  we  need  to  use  strategies  that   can   transduce   the   information   from   events   ocurring   at   this   scale   to  measurable   signals.  Only  after  this,  we  will  be  able  to  verify  and  get  evidences  of  what  happens   at  this  scale,  based  on  the  qualitative  and  quantitative  information  we  can  gather   by   these   means.   In   general,   a   reporter   is   a   (macro)molecular   transductor   that   permits  to  turn  the  microscopic  event  into  a  detectable  signal.  Thus,  the  generation   of   measurable   electrons   by   Glucose   Oxidase   in   the   presence   of   glucose,1   the   hybridization  of  a  dye-­‐marked  DNA  probe  with  a  targeted  DNA  sequence  as  a  mean   to   detect   its   presence   if   fluorescence   is   observed,2   or   detecting   the   specific   emission  of  a  photoluminescent  nanoparticle  coupled   to  an  antibody  as  a  way   to   reveal   the   existence   in   a   sample   of   the   targeted   antigen,3   are   representative   examples  of  how  different  reporters  are  used  in  bioassays.     In  this  section,  the  fundamentals  of  different  reporters  used  in  biodetection  will  be   explained,   their   features   compared,   and   the   reasons   for   choosing   upconverting   nanoparticles  for  the  development  of  the  systems  presented  in  this  thesis  exposed.       I.2.1  Fluorescence  and  organic  dyes       The  excellent  sensitivity  yielded  by  fluorescence-­‐based  detection  techniques  4  has   turned   dye-­‐labelling   of  molecular   probes   into   a   very   useful   reporter   strategy   in   molecular  biology  and  analytical  chemistry.  In  fact,  a  pletora  of  systems  based  on   this  property  have  been  developed  to  detect  and  quantify  analytes  of  interest  such   as  DNA,  RNA  and  proteins.   Some   important  and  currently  used   techniques  using   fluorescence   as   transduction   signal   are   the  widely   used   quantitative   polymerase   chain  reaction  (q-­‐PCR),  gel  electrophoresis  and  blotting  techniques,  microarrays  or   DNA  chips,  and  HPLC  (see  Figure  I.2.1.1).                                                                                                      I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes     25                 Figure  I.2.1.1  a)  The  image  depicts  the  electrophoretic  bands  from  a  western  blot,   revealed  by  fluorescence.  b)  In  this  picture  a  DNA  chip  is  shown.  The  magnification   depicts   the   DNA   array,   where   the   intensity   of   the   spots   belonging   to   different   sequences  is  revealed  by  fluorescence.       Fluorescence   is  a  phenomenon  typically  exhibited  by  aromatic  organic  molecules   and   some  minerals,   although   it   can   also   occur   in   some   individual   elements   like   those   from   the   group   of   lanthanides   (e.g.   europium   and   terbium   ions).5   The   process   of   fluorescence   starts   with   the   absorption   of   one   photon   of   a   certain   wavelength   by   an   orbital   electron   of   a   molecule   or   atom.   The   energy   of   this   absorbed  photon  permits  the  electron  to  reach  a  singlet  excited  state  that  is  paired   to  the  electron  in  the  ground  state  (i.e.  they  have  opposite  spin),  see  Figure  I.2.1.2a.   Because  of  this,  the  return  of  the  electron  to  the  ground  state  is  spin-­‐allowed,  and   happens  quickly  as  follows:  first  the  excited  electron  relaxes  vibrationally  through   non-­‐radiative   processes,   eventually   decaying   to   the   ground   state   by   emitting   a   photon  at  a  longer  wavelength  than  the  one  from  the  absorbed  one.  The  speed  of   this   process   implies   that   fluorescence   lifetimes   "τ"   are   normally   in   the   scale   of   nanoseconds  or  even  below.   In   contrast   to   the   singlet   formed   in   fluorescence,   a   triplet   excited   state   can   be   formed   upon   photon   absorption   as   part   of   a   phenomenon   called   intersystem   crossing,  which  can  be  promoted  by  the  presence  of  heavy  atoms  like  Br  or  I  due  to   spin-­‐orbit  coupling.   In  this  case,   the  excited  electron  is  no   longer  paired  with  the   electron   in   the   ground   state,   as   they   have   the   same   spin   (see   Figure   I.2.1.2b).   Consequently,  the  transition  to  the  ground  state  by  means  of  emitting  a  photon  will   be   slow,   as   it   is   forbidden   by   Pauli's   exclusion   principle,   and   it   leads   to  what   is   known  as  phosphorescence.  The  relativelly  slow  emission  rates  of  this  process  are   I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes       26   reflected   in   the   phosphorescence   lifetimes,   which   usually   are   in   the   order   of   milliseconds  to  seconds.6                       Figure   I.2.1.2   a)   Singlet   excited   state,   typical   from   fluorescence   processes.   b)   Triplet   excited   state,   normally   taking   place   in   phosphorescence   processes.   The   direction  of  the  arrows  represents  the  spin  of  the  electron.       The  different  steps   in   the   fluorescence  and  phosphorescence  mechanisms  can  be   otherwise   clearly   expressed   using   a   Jablonski   diagram   (Figure   I.2.1.3).   Upon   absorption  of   a  photon   (energy  =  h·νExc)   there   is   an   electron   transition   from   the   singlet   ground   state   (S0)   to   a   first   singlet   excited   electronic   state   (S1):             S0  +  h·νExc    →  S1   where  "h"  is  the  Planck's  constant  and  "νExc"  is  the  frequency  of  light  .   At   these   states,   the   electrons   can   be   in   a   number   of   different   vibrational   energy   levels  (depicted  as  0,  1  and  2  in  the  Jablonski  diagram).  Thus,  after  absorption  of   the   photon,   the   electron   can   internally   suffer   relaxation   processes   by   "non-­‐ radiative  transitions"  within  the  S1  state,  in  which  part  of  the  energy  is  dissipated   as   heat   (changing   its   vibrational   state   within   the   electronic   level,   see   Figure   I.2.1.3).                                                                                                              I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes     27                     Figure  I.2.1.3  Jablonski  diagram.  The  ground  state  is  depicted  as  S0.  S1  refers  to  the   first  singlet  excited  state,  while  T1  refers  to  the  first  triplet  excited  state.  0,  1  and  2   correspond  to  the  different  internal  vibrational  states  within  the  electronic  levels.   The  blue  arrow  symbolizes  the  excitation  of  the  electron  upon  photon  absorption.   Orange   arrows   represent   the   non-­‐radiative   relaxations   between   the   different   vibrational   states.   The   remaining   arrows   represent   the   return   of   the   electron   to   the   ground   state   by   the   emission   of   a   photon   through   fluorescence   mechanism   (green)  or  phosphorescence  mechanism  (red).       There   are   a   number   of   other   different   processes   through   which   relaxation   can   occur,   such   as   quenching,   energy   transfer,   or   solvent   interactions.   All   these   processes   are   actually   responsible   for   the   characteristic   "Stokes   shift"   presented   by   fluorescence   emissions   (i.e.   the   emission  of   a   less   energetic  photon,   of   longer   wavelength,  upon  the  transition  to  the  ground  state),  see  Figure  I.2.1.4.         Electrons  in  the  S1  state  can  also  suffer  a  spin  conversion  to  the  first  triplet  excited   state   (T1),   depicted   in   the   figure   as   "intersystem   crossing".   In   this   T1   state,   the   transition   of   the   electron   to   the   ground   state   conforms   the   process   previously   defined  as  phosphorescence,  whose  emitted  photon  upon   relaxation   is   shifted   to   even  longer  wavelengths  compared  to  fluorescence.  Molecules  that  contain  heavy   atoms   like   iodine   or   bromine   are   usually   phosphorescent,   as   they   favor   the   intersystem  crossing  and  increase  the  phosphorescence  quantum  yields.6             I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes       28                 Figure  I.2.1.4  Stokes  shift.  After  different  non-­‐radiative  relaxation  mechanisms  (e.g.   heat  dissipations),  the  fluorophores'  excited  electrons  lose  part  of  the  energy  taken   from   the   absorbed   photons.   As   consequence,   the   emitted   photons   during   fluorescence   are   less   energetic   (i.e.   of   longer   wavelengths)   than   the   absorbed   photons  (shorter  wavelengths).         Fluorescence  lifetime  and  quantum  yield  are  probably  the  most  important  features   of   photoluminescent   materials:   the   former   because   it   conditions   the   amount   of   time   that   the   fluorophore   spends   in   its   excited   state   interacting   with   the   environment.   The   latter   because   it   reflects   the   efficiency   of   the   fluorescence   process  of  a  particular  fluorophore  in  certain  defined  conditions.   The  fluorescence  lifetime  is  defined  as  the  average  time  the  fluorophore  spends  in   its  excited  state  before  returning  to  the  ground  state,  and   it  can  be  expressed  as:                          Ec.  I.2.1.1         where   "Γ"   is   the   emissive   rate   of   the   fluorophore,   and   "Knr"   is   the   non-­‐radiative   decay   to   the   ground   state   S0,   see   Figure   I.2.1.5.   All   possible   non-­‐radiative   relaxation  mechanisms   are   included   in   Knr   for   simplicity.   Fluorescence   lifetimes   are  usually  close   to  10  ns   in  organic  dyes,  but   it   is   important   to  highlight   that  as   fluorescence   emission   is   a   random  process,   and   this   feature   is   an   average   value,   only  a  few  molecules  emit  their  photons  precisely  when  t  =  τ.                                                                                                        I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes     29                 Figure   I.2.1.5   Simplified   Jablonski   diagram   in   which   emissive   rate   (Γ)   and   non-­‐ radiative   decay   (Knr)   are   depicted.   The   relaxation   step,   which   occurs   quickly   enough  (10-­‐12  s)  to  take  place  before  the  photon  emission,  is  the  responsible  of  the   Stokes  Shift  showed  by  fluorescence  emissions.       We   have  mentioned   that   another   important   feature   of   fluorophores   is   quantum   yield.   This   property   can   be   defined   as   the   number   of   photons   emitted   by   the   fluorophore  relative  to  the  number  of  photons  that  it  absorbed  (Ec.  I.2.2),  and  can   be  expressed  using  the  mathematical  terms  defined  previously  (Ec.  I.2.3):                                                                                Ec.  I.2.1.2                        Ec.  I.2.1.3             Thus,   the   closer   the   quantum   yield   approaches   to   unity   (Knr   <<   Γ),   the   more   efficient  the  fluorescence  process  will  be.  Some  examples  of  organic  dyes,  together   with  their  fluorescence  quantum  yields  (Q),  are  shown  in  Table  I.2.1.1.7       Table   I.2.1.1   Quantum   yield,   absorbance   and   emission   wavelength   of   different   organic   dyes:   Quinine   sulfate   dihydrate   (QS),   Coumarin   153   (C153),   Fluorescein   (Fl),  Rhodamine  6G  (R6G),  Rhodamine  101  (R101)  and  Oxazine  1  (OX1).  In  the  first   five   fluorophores   their   relative   quantum   yields   has   been   determined,   using   the   absolute  quantum  yield  from  R101.  Extracted  from  reference  [7].   Dye QS C153 Fl R6G R101 OX1 Solvent 0.105 M HClO Ethanol 0.1 M NaOH Ethanol Ethanol Ethanol Absorbance (nm) 270–400 350–500 400–550 425–575 475–620 500–710 Emission (nm) 385–700 465–750 490–690 505–750 540–750 615–950 Q 0.59 0.53 0.89 0.91 0.915 0.15 I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes       30   As   shown   in   the   table,   there   are   very   efficient   dyes   like   Rhodamine   101,  whose   quantum  yield  approaches   the  unity  and   thus  yield  strong  emissions.  Due   to   this   high  performance,  fluorophores  have  often  been  used  for  the  detection  and  study   of   a   wide   variety   of   biomolecules,   as   they   permit   to   obtain   good   sensitivities.     However,  there  are  three  main  limitations  regarding  the  use  of  these  molecules  as   reporters.   First,   organic   dyes   suffer   from   what   is   called   "photobleaching",   a   degradation  process  of  the  fluorophore  upon  excitation  by  which  it  stops  emitting   light,   due   to   the   rupture   of   structural   bonds   or   non-­‐specific   reactions   with   its   environment.   This   implies   a   depletion   of   fluorophore   over   time   and   a   fading   of   fluorescence  upon  excitation-­‐emission  cycles,8  so   long  exposures  and  high  power   densities  can  especially  affect  the  quality  of  the  signal,9  and  thus  the  reliability  and   sensitivity   of   the   detection   and   imaging   systems   based   on   these   molecules,   as   shown  in  Figure  I.2.1.6.10                             Figure   I.2.1.6  Photobleaching  of   fluorescein   and  Texas   red  organic  dyes,   staining   cytoskeleton  in  cells,  after  excitation  with  488  nm  or  594  nm  lasers  for  0  sec  (A),  5   sec  (B)  and  15  sec  (C).  From  ref.  [10].       Second,  a  phenomenon  known  as  "fluorescence  intermittency"  or  "blinking",  which   consists   in  the  random  switching  of  dye's  emission  between  "on"  and  "off"  states   due  to  the  competition  between  radiative  and  non-­‐radiative  relaxation  pathways.   As  this  phenomenon  occurs  randomly,  due  in  part  to  variations  in  the  local  media   surrounding   the   molecule,   the   quantification   of   small   amounts   of   dye-­‐marked   analytes   becomes   very   difficult.   It   is   important   to   remember   that   even   just   the                                                                                                    I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes     31   detection   of   the   fluorophore   in   these   conditions   can   be   challenging   due   to   photobleaching,  considering  that  the  excitation  power  densities  required  to  detect   the  fluorescence  signal  in  these  cases  are  very  high.   Last,  but  not  least,  "autofluorescence"  also  hampers  the  sensitivity  of  imaging  and   detection   systems   that   require   dyes.   This   is   because   fluorescence   is   not   an   uncommon  process  among  organic  molecules.   In   fact,   there  exist  many  biological   molecules   that  show  this  phenomenon  under   illumination  at  proper  wavelengths   (see  Table  I.2.1.2  for  some  examples).         Table  I.2.1.2  Absorbance  and  emission  wavelengths  of  different  biomolecules  that   contribute  to  autofluorescence.       This   causes   cellular   components   and   also   organelles   such   as   mitochondria   and   lysosomes   to   exhibit   a   basal   level   of   fluorescence   without   staining   them   with   synthetic  organic  dyes,  see  Figure  I.2.1.7.18  Consequently,  this  phenomenon  makes   difficult   to   distinguish   the   organic   dye   signal   from   the   autofluorescence   signal   when  the  dye  is  present  at  relatively  low  concentrations.   Biomolecule Absorbance (nm) Emission (nm) Organism Reference Chlorophyll a 320-460 550-690 660-760 Plants 11 Cholecalciferol 200-320 380-460 Animals 12 Collagen 270-370 305-450 Animals 13 Folic acid 217-346 450 All 12 Melanin 340-400 360-560 Animals 14 NAD(P)H 340 450 All 13 Retinol 250-400 500 Animals and Bacteria 12 Riboflavin 300-4904 500-700 All 15 Tryptophan 280 350 All 16 Tyrosine 270 305 All 17 I.2.1  Reporters  in  bioassays  -­‐  Fluorescence  and  organic  dyes       32                     Figure  I.2.1.7.  Autofluorescence  emission  from  a  section  of  corn  kernel  (Zea  mays),   Ex=450-­‐550   nm.   This   phenomenon   arises   in   plant   tissues   from   endogenous   biomolecules  such  as  lignins,  chlorophyll,  carotene  and  xantophyll.  From  ref.  [18].     When   comparing   the   absorbance   and   emission   wavelengths   between   synthetic   dyes   and   endogenous   biomolecules   (Table   I.2.1.1   and  Table   I.2.1.2,   respectively)   one   can   realize   that,   while   trying   to   excite   and   detect   minute   amounts   of   dye-­‐ marked  molecules,  biomolecules  are  also  going  to  be  excited  and  their  fluorescence   is  going  to  interfere  with  the  synthetic  dye  signal  detection.       As   fluorescence   is  a  relatively  simple,  versatile,  and  sensitive  technique,  different   approaches,   like   time-­‐resolved   fluorescence,   have   been   explored   to   overcome   some   of   their   limitations.   Nevertheless,   continuous   advances   in   nanotechnology   and  materials  science  have  permitted  to  design  and  synthesize  new  and  promising   photoluminiscent  materials   that  might   substitute   these  organic   reporters,   due   to   their   better   performances   and   reliability.   Two   of   these   promising   reporters   are   going   to   be   discussed   in   the   next   sections,   namely,   quantum   dots   (Q-­‐dots)   and   upconverting  nanoparticles  (UCNPs).           I.2.2  Quantum  dots     A  semiconductor  is  a  material  that  shows  an  electrical  conductivity  falling  between   that  of  a  conductor  (e.g.  gold)  and  an  insulator  (e.g.  glass).  The  electrical  resistance   of  semiconductors  can  decrease  under  certain  circumstances,  such  as,  temperature                                                                                                                                                                  I.2.2  Reporters  in  bioassays  -­‐  Quantum  dots     33   or   irradiation   with   light   of   certain   wavelengths,   showing   then   an   electrical   conductor-­‐like  behaviour.     The   excitation   with   light   of   bulk   semiconductors   results   in   the   formation   of   an   excited  electron  and  a  hole,  which  is  the  place  at  which  the  electron  was  within  the   valence  band  before  excitation  and  now  presents  a  positive  charge.  Both  electron   and  hole  are  known  as  exciton  or  charge  carriers.  These  are  separated  a  number  of   molecules  or  ions  away  within  the  material,  a  distance  that  is  referred  to  as  "Bohr   exciton  radius",  while  they  are  bound  by  weak  coulombic  attraction.  The  minimum   energy  required   to   form  these  charge  carriers   is  known  as   the  "band  gap"  of   the   semiconductor,  and  it  is  the  energy  difference  between  the  top  of  the  valence  band   and  the  bottom  of  the  conduction  band  (Figure  I.2.2.1).  After  the  formation  of  this   electron-­‐hole   pair,   it   is   transported   through   the   semiconductor   until   it   is   either   relaxed   by   emitting   a   photon   due   to   the   radiative   recombination   of   the   electron   and  the  hole,  trapped,  annihilated  if  it  collides  with  another  exciton  (e.g.  when  high   intensity  laser  excitation  is  used),  or  relaxed  by  matrix  phonons.19       Interestingly,  when  the  size  of  semiconductor  particles  is  smaller  than  their  Bohr   exciton  radius  a  spatial  confinement  of  the  charge  carriers  occurs,  so  the  valence   and  conduction  bands  split  into  discrete,  quantized,  electronic  levels.     The  fewer  number  of  atoms  resulting  from  the  nanometric  size  of  semiconductors   reduces  the  number  of  possible  energy  states  compared  to  bulk  materials,   explaining  the  quantization  of  the  energy  levels.                           Figure   I.2.2.1   Quantum   confinement   effect   on   quantization   of   valence   and   conduction   band   electronic   transitions,   and   on   band   gap   energy   increment.   I.2.2  Reporters  in  bioassays  -­‐  Quantum  dots       34     At  the  same  time,  the  quantum  confinement  caused  by  the  nanometric  dimensions   of   the   semiconductor   reduces   electron   mobility,   which   increases   the   energy   required  to  form  the  electron-­‐hole  pair  and  thus  the  energy  band  gap,  see  Figure   I.2.2.1.  The  latter  fact   implies  that  the  energy  of  the  absorbed  photon  required  to   bridge  this  gap  will  be  higher,  and  so  it  will  be  the  energy  of  the  photon  emitted.  As   a  consequence,  it  is  possible  to  tune  the  optical  absorption  and  emission  properties   of   the   nanometric   semiconductor   by   simply   varying   its   size   and   shape   Figure   I.2.2.2.20                       Figure  I.2.2.2.  CdSe  nanocrystals.  Size-­‐dependent  absorption  (A)  and  emission  (B).   Adapted  with  permission  of  ref.  [20].         Quantum  dots  (Q-­‐dots)  are  semiconductor  nanocrystals  normally  ranging  1-­‐10  nm   in   diameter.   They   receive   their   name   due   to   the   number   of   spatial   dimensions   through  which  electrons  and  holes   can  move   freely  without  experience  quantum   confinement  (i.e.  2D  structures:  quantum  wells;  1D  structures:  quantum  wires;  0D   structures:  quantum  dots).21     Their   versatility  mainly   arise   from   the   control   of   their   optical   properties,  which   can   be   achieved   by   varying   their   size,   shape,   semiconductor   material   and   core/shell  nanostructured  architectures,  see  Figure  I.2.2.3A  and  B.22  This  fact  turns   them  very  interesting  materials  for  biosensing,  especially  for  multiplexed  analyses,   as  they  can  emit  at  different  wavelengths  while  being  simultaneously  excited  in  the   UV  region  (Figure  I.2.2.2A  and  Figure  I.2.2.3A).       I.2.2  Reporters  in  bioassays  -­‐  Quantum  dots     35                         Figure   I.2.2.3.   A)   Size-­‐dependant   photoluminescence   of   CdSe/ZnS   quantum   dots   under   UV   excitation.   B)   Transmission   electron   microscopy   (TEM)   picture   of   a   CdSe/ZnS  (core/shell)  quantum  dot.  Adapted  with  permission  of  ref.  [22].       Besides  this  useful  tunability,  Q-­‐dots  also  show  a  remarkable  combination  of  large   Stokes   shifts   (>100   nm),   high   quantum   yields   (Q   =   0.1-­‐0.9)   and   large   molar   extinction  coefficients  (105-­‐107  M-­‐1·cm-­‐1),  being  comparable,  or  even  surpassing  in   certain   cases,   those   shown   by   organic   dyes.   Another   difference   with   traditional   fluorophores   are   their   longer   lifetimes,   normally   in   the   10-­‐100   ns   range.   Q-­‐dots   also  confers  some  advantages  over  traditional  dyes,  such  as  higher  photostability.   This  reduces  the  possibilities  of  photobleaching  when  using  these  nanocrystals  for   imaging  or  detection  purposes,  allowing  higher  reliability  and  sensitivity.   Nevertheless,  their  small  size  is  accompanied  by  several  disadvantages.  Their  high   surface-­‐to-­‐volume   ratio   (>10%   of   the   atoms   from   the   nanocrystal   are   on   the   surface)   makes   them   very   susceptible   to   the   environment,   which   manifests   by   quenching  effects,  oxidation,  and  other  phenomena.  As  a  consequence,  these  exert   changes   in   their  photoluminescent  properties,   in   reversible  or   irreversible  ways,   although   some   of   them,   like   the   high   surface-­‐to-­‐volume   ratio,   can   be   used   advantageously   in   sensing   applications   for   the   construction   of   efficient   FRET   systems.     Fluorescence  intermittency  (i.e.  blinking)  of  Q-­‐dots  is  also  a  limitation  when  using   these   reporters,   although   it   can   be   partially   addressed   by   using   core-­‐shell   I.2.2  Reporters  in  bioassays  -­‐  Quantum  dots       36   nanoarchitectures,  where  the  surface  of  the  quantum  dot  is  more  isolated  from  the   surrounding  media  (Figure  I.2.2.3B).     As   with   organic   dyes,   autofluorescence   remains   an   important   bottleneck   when   trying   to   detect   small   concentrations   of   Q-­‐dots,   which   still   limits   the   potential   sensitivity  of  the  detection  systems  relying  on  this  technology.     Further   comparative   studies   between   Q-­‐dots   and   organic   dyes   can   be   found   elsewhere.23         I.2.3  Photon  upconversion  and  upconverting  nanoparticles     Photon  upconversion  is  a  process  by  which  two  or  more   low  energy  photons  are   absorbed,  while  a  high-­‐energy  photon  is  emitted  in  exchange.  This  will   imply,   for   example,   the   absorption  of   several   photons   from   the  near   infrared   region   (NIR),   e.g.  at  980  nm,  and  the  emission  of  a  fewer  number  of  photons  in  the  visible  or  UV   regions   (e.g.   665   nm   or   365   nm).     This   upconversion   phenomenon   may   seem   confusing  at  first  glance,  especially  after  exposing  the  theory  behind  organic  dyes   and   Q-­‐dots,   characterized   by   Stokes-­‐shifted   emissions.   Nevertheless,   this   anti-­‐ Stokes   process,   although   not   very   common,   can   ocurr   in   certain   materials   containing   transition  metals,   actinides,   and   lanthanide   ions   due   to   their   singular   electronic   features.24   In   fact,   trivalent   Lanthanide   ions   (Ln3+)   have   very   unique   electronic  properties:   their  upconversion  emissions   result   from  4f-­‐4f   intraorbital   transitions   that   are   shielded   from   their   environment   by   the  more   external,   fully   occupied,  5s25p6  orbital  shells  (Figure  I.2.3.1).  This  translates  in  remarkably  stable   photoluminescent   emissions,   substantially   independent   of   particle   size   and   environmental   effects   (e.g.   lacking   spectral   shifts   of   their   emission   peaks   as   consequence  of  environmental  changes).25  These  intra-­‐4f  electronic  transitions  of   lanthanide  ions  form  electric  dipoles,  forbidden  by  quantum  mechanical  selection   rules,  which  are  eventually  relaxed  due  to  local  crystal  field-­‐induced  intermixing  of   the  f  states  with  higher  electronic  configurations.26  The  forbidden  nature  of  the  4f-­‐ 4f  transitions  results  in  very  long  lifetimes  (up  to  tens  of  milliseconds)  for  excited   electrons   in   the   energy   levels   of   lanthanide   ions.   In   fact,   these   long   lifetimes   are   one   of   the   key   features   allowing   photon   upconversion   processes   to   occur.          I.2.3  Reporters  in  bioassays  -­‐  Photon  upconversion  and  upconversion  nanoparticles     37                       Figure  I.2.3.1  Partial  energy  level  diagrams  of  Ln3+.  Upconverting-­‐emissive  excited   levels   are  marked   in   red.   Reproduced   from   Ref.   [25]   with   permission   from   The   Royal  Society  of  Chemistry.       To  date,  photon  upconversion  has  been  found  to  proceed  in  Ln3+  -­‐doped  materials   by   five   different   possible   mechanisms,   namely:   Excited-­‐state   absorption   (ESA),   Energy   transfer   upconversion   (ETU),   cooperative   sensitization   upconversion   (CSU),  photon  avalanche  (PA)  and  cross  relaxation  (CR),  although  the  last  process   is   more   a   mean   by   which   upconversion   color   output   can   be   tuned,   or   efficient   photon  avalanche  systems  can  be  built,  than  an  upconversion  mechanism  itself.26       Energy   transfer   upconversion   (ETU)   is   by   far   the   most   explored   and   applied   process,   due   to   its   superior   quantum   efficiency   (ca.   10-­‐3)   in   comparison   with   others   like   ESA   (ca.   10-­‐5)   and   CSU   (ca.   10-­‐6).25   In   fact,   most   of   the   currently   available   and   researched   upconverting   materials   are   based   on   this   process,   including   the   ones   discussed   in   this   thesis.   Thus,   we   are   going   to   focus   on   this   mechanism,   although   more   information   about   the   remaining   processes   can   be   found  elsewhere.24–26     ETU  typically  involves  two  different  Ln3+,  a  sensitizer  and  an  activator  (see  Figure   I.2.3.2),  and  its  mechanism  proceeds  as  follows:  The  sensitizer  harvest  low  energy   photons,   going   from   its   ground   state   to   its   metastable   level   (E1).   Then,   it   successively  transfers  the  harvested  energy  to  the  ground  state,  or  excited  state  E1,   of   the   second  Ln3+   ion,   the  activator.  While   each  energy   transfer   to   the  activator   from  the  surrounding  sensitizer  ions  excites  it  to  upper  emitting  states  (E1,  E2,  etc),   I.2.3  Reporters  in  bioassays  -­‐  Photon  upconversion  and  upconversion  nanoparticles       38   as  a  consequence  the  sensitizers  return  back  to  their  ground  state.  Eventually,  the   successively  excited  activator  ion  releases  all  the  transferred  energy  in  the  form  of   a  high-­‐energy  photon  (or  upconverted  photon).                     Figure   I.2.3.2   Energy   transfer   upconversion   (ETU)   mechanism.   The   sensitizer   excites   to   its   "E1"   energy   level   by   absorbing   a   photon   (1).   Then,   it   successively   transfers  its  energy  to  the  activator,  which  is  excited  to  its  E1  (2)  and  E2  (3)  energy   levels  before  relaxing  to  its  ground  state  "G"  by  emitting  a  high-­‐energy  photon  (4).       Two  examples  of  commonly  used  Ln3+  pairs  are  Yb3+/Er3+  and  Yb3+/Tm3+,  where   Yb3+  acts  as  the  sensitizer  (absorbing  980  nm  NIR  light),  and  Er3+  and  Tm3+  are  the   activators  (giving  green  and  blue  anti-­‐Stokes  emissions,  respectively).     The   different   energy   transfer   steps   responsible   for   the   upconverted   emissions   from  both  Ln3+  pairs  are  depicted  in  Figure  I.2.3.3.                     Figure  I.2.3.3.  Energy  transfer  steps  in  ETU  process  for  the  different  upconversion   emissions  of  Yb3+/Er3+   (a)   and  Yb3+/Tm3+   (b)  pairs.  Adapted   from  Ref.   [25]  with   permission  from  The  Royal  Society  of  Chemistry.            I.2.3  Reporters  in  bioassays  -­‐  Photon  upconversion  and  upconversion  nanoparticles     39   As  one  can  deduce  from  this  figure,  each  upconversion  emission  involves  a  certain   number  of  energy  transfer  steps  or,  in  other  words,  they  are  processes  that  require   two,   three,   four   or   more   low   energy   photons,   to   emit   one   single   high   energy   photon,  depending  on   the  region  of   the  spectra  where   the  emission   is   located  at.   For  example,   the  UV  (345  nm)  emission  obtained  with  the  Yb3+/Tm3+  pair  (1I6  →   3F4  transition  in  Tm3+)  is  a  five-­‐photon  process.  The  nature  of  these  ETU  processes   implies   that   the   upconverting   materials   are   going   to   show   a   non-­‐linear   optical   behaviour.  This  means   that   the  upconversion   emissions   are  not   going   to   show  a   linear   excitation   power-­‐dependance,   but   a   dependance   that   will   follow   an   "n"   power   law,   where   "n"   is   the   number   of   photons   involved   in   that   specific   upconversion   emission.   Thus,   in   contrast   to   the   reporters   exposed   in   previous   sections,   the   upconversion   photoluminescence   power-­‐dependence   of   these   materials  can  be  generally  expressed  as:                          Ec.  I.2.1.4     where   "IUCPL"   is   the   upconversion   photoluminescence   intensity   of   the   specific   emission   peak,   "K"   is   the   material-­‐related   coefficient,   "P"   is   the   laser   pump   excitation  power,  and  "n"  is  the  number  of  excitation  photons  required  to  produce   that  specific  upconversion  emission.     In  addition   to   the  use  of  proper  Ln3+  pairs,  whose  energy   levels  need   to   suitably   match   each   other   to   allow   the   ETU   process,   another   major   requisite   is   the   integration   of   these   trivalent   ions   at   the   right   concentrations   in   a   proper   host   matrix,  in  the  form  of  dopants.  It  is  important  to  mention  that  not  any  material  is   suitable   for   this   purpose.   In   fact,   the   host   matrices   need   to   be   as   resistant   to   photodamage  as  possible,  transparent  in  the  spectral  region  of  interest,  chemically   stable,  and  most   importantly,   to  posses  the  lowest  possible  phonon  cutoff  energy   value  and  a  local  crystal  field  that  favors  the  process.  The  low  phonon  cutoff  is  of   key   importance,  as  phonon-­‐induced  non-­‐radiative  processes  are   the  main  energy   loss   mechanism   of   upconversion.   This   can   be   explained   because   the   energy   difference  between  higher  and  lower  energy  levels  is  turned  into  lattice  phonons,   dissipating   the  excitation  energy  by  multiphonon-­‐assisted  relaxations.  The   larger   I.2.3  Reporters  in  bioassays  -­‐  Photon  upconversion  and  upconversion  nanoparticles       40   the   number   of   phonons   needed,   the   lower   the   efficiency   of   this   non-­‐radiative   process.   While  the  cutoff  phonon  energy  associated  to  the  host  lattice  is  a  good  indicator  of   the   number   of   phonons   that   are   needed   for   relaxation,   a   way   to   enhance   the   upconversion  efficiency  is  to  use  host  matrices  with  very   low  frequency  phonons   (low  cutoff  phonon  energy).  Thus,  a  higher  number  of  phonons  would  be  required   to  achieve  the  relaxed  state  by  the  non-­‐radiative  multiphonon-­‐assisted  relaxation   pathway.     The   local   crystal   field   also   has   an   important   influence   on   the   upconversion   efficiency,  as  the  local  crystal  geometry  surrounding  the  lanthanide  ions  conditions   the   intermixing   of   ion's   f   orbital   states.   In   fact,   less   symetric   crystal   phases   generally   increases   upconversion   efficiency   as   the   intermixing   of   Ln3+'s   f   states   with  higher  electronic  configurations  is  more  favored.26   Meeting  these  criteria,  the  hexagonal  or  "β"  phase  of  NaYF4  stands  out  as  one  of  the   most   efficient   host  matrices   to   date   for   green   (Yb3+/Er3+)   and  blue   (Yb3+/Tm3+)   upconversion  emissions.  Thus,  although  the  search   for  new  host   lattices   is  under   active   investigation,   most   of   the   upconverting   nanoparticles   (UCNPs)   used   in   research  consist  of  Ln3+-­‐doped  β-­‐NaYF4  crystals  (see  Figure  I.2.3.4).                       Figure   I.2.3.4.   A)   Transmission   electron   microscopy   (TEM)   of   β-­‐NaYF4   nanocrystals   doped   with   Yb3+   (20%   wt)   and   Er3+   (2%   wt)   synthesized   in   our   laboratory.   B)  Magnification   of   TEM   Image.   Scale   bars   are   500   nm   and   250   nm,   respectively.                I.2.3  Reporters  in  bioassays  -­‐  Photon  upconversion  and  upconversion  nanoparticles     41   Interestingly,   the   distinct   properties   showed   by   upconverting   nanoparticles   (UCNPs)   permit   to   meet   most   of   the   desirable   characteristics   that   are   pursued   when  using  photoluminescent  techniques  in  fields  such  as  imaging  or  biodetection.   In   fact,   these  materials   show  superior  performance,   compared  with  organic  dyes   or   Q-­‐dots,   in   most   of   the   previously   discussed   features   from   photoluminescent   reporters.   For   example,   they   show   remarkably   high   photostability   due   to   the   inorganic  nature  and  photoresistance  of  Ln3+   ions  and   the  dielectric  host  matrix,   with   some   authors   reporting   stable   emissions   even   under   1   hour   of   continuous   980   nm   irradiation   at   5·106   W/cm2.27   This   permits   to   partially   overcome   their   main   limitation,   the   low   quantum   yields   due   to   the   natural   inefficiency   of   the   multi-­‐photon  requirements  for  upconversion  processes.  Another  examples  are  the   stability   of   their   emission   intensity   through   time   (lacking   of   fluorescence   intermittency,   as   opposed   to  organic  dyes   and  Q-­‐dots),27   their   distinct   and   clean   emissions   due   to   their   huge   anti-­‐Stokes   shifts   (which   can   be   hundreds   of   nanometers   away   from   the   excitation  wavelength   at   980  nm,   see   Figure   I.2.3.5),   their  long  lifetimes  (up  to  tens  of  miliseconds),  the  lack  of  autofluorescence  when   using   these   reporters   (as   there   is   no  known  biomolecule   capable  of   harvest  980   nm  photons  and  turn  them  into  visible  light),  their  potential  in  multiplexed  assays   by   introducing   different   dopants   and   tuning   their   concentrations   to   achieve   different  emissions  and  different  lifetimes,28,29  and  more.30                     Figure  I.2.3.5  A)  Emission  of  β-­‐NaYF4:Yb3+(20%);Er3+(2%)  UCNPs  upon  excitation   with  a  980  nm  CW  laser.  The  laser  beam  wavelength  is  invisible  to  human  eye.  B)   Emission  spectrum  of  the  same  UCNPs.   I.2.3  Reporters  in  bioassays  -­‐  Photon  upconversion  and  upconversion  nanoparticles       42   Thus,  UCNPs  properties  have  the  potential  to  prompt  a  new  generation  of  systems   based  on  anti-­‐stokes  photoluminescence,  which  can  be  able  to  improve  resolution   and  sensitivity  in  fields  like  bioimaging,  but  especially  in  biodetection.             References       (1)     Rubio   Retama,   J.;   López   Cabarcos,   E.;   Mecerreyes,   D.;   López-­‐Ruiz,   B.   Design   of   an   Amperometric   Biosensor   Using   Polypyrrole-­‐Microgel   Composites   Containing   Glucose   Oxidase.  Biosens.  Bioelectron.  2004,  20,  1111.   (2)     Tyagi,  S.;  Kramer,  F.  R.  Molecular  Beacons:  Probes  That  Fluoresce  upon  Hybridization.  Nat.   Biotechnol.  1996,  14,  303.   (3)     Sirkka,   N.;   Lyytikäinen,   A.;   Savukoski,   T.;   Soukka,   T.   Upconverting   Nanophosphors   as   Reporters   in  a  Highly  Sensitive  Heterogeneous  Immunoassay   for  Cardiac  Troponin  I.  Anal.   Chim.  Acta  2016,  925,  82.   (4)     Rye,  H.  S.;  Dabora,  J.  M.;  Quesada,  M.  A.;  Mathies,  R.  A.;  Glazer,  A.  N.  Fluorometric  Assay  Using   Dimeric   Dyes   for   Double-­‐   and   Single-­‐Stranded   DNA   and   RNA   with   Picogram   Sensitivity.   Anal.  Biochem.  1993,  208,  144.   (5)     Melby,   L.   R.;   Rose,   N.   J.;   Abramson,   E.;   Caris,   J.   C.   Synthesis   and   Fluorescence   of   Some   Trivalent  Lanthanide  Complexes.  J.  Am.  Chem.  Soc.  1964,  86,  5117.   (6)     Lakowicz,   J.   R.   Principles   of   Fluorescence   Spectroscopy;   Lakowicz,   J.   R.,   Ed.;   Springer   US:   Boston,  MA,  2006.   (7)     Würth,   C.;   Grabolle,   M.;   Pauli,   J.;   Spieles,   M.;   Resch-­‐Genger,   U.   Relative   and   Absolute   Determination  of  Fluorescence  Quantum  Yields  of  Transparent  Samples.  Nat.  Protoc.  2013,   8,  1535.   (8)     Song,   L.;  Hennink,  E.   J.;   Young,   I.   T.;  Tanke,  H.   J.   Photobleaching  Kinetics  of   Fluorescein   in   Quantitative  Fluorescence  Microscopy.  Biophys.  J.  1995,  68,  2588.   (9)     Bernas,  T.;  Robinson,   J.   P.;  Asem,  E.  K.;  Rajwa,  B.   Loss   of   Image  Quality   in  Photobleaching   during   Microscopic   Imaging   of   Fluorescent   Probes   Bound   to   Chromatin.   J.   Biomed.   Opt.   2005,  10,  64015.   (10)     ThermoFisher  Scientific.  Photobleaching  Principles         I.2.4  Reporters  in  bioassays  -­‐  References     43     https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-­‐science/cell-­‐analysis/cell-­‐analysis-­‐ learning-­‐center/molecular-­‐probes-­‐school-­‐of-­‐fluorescence/fluorescence-­‐ basics/fluorescence-­‐fundamentals/photobleaching-­‐principles.html#.   (11)     Cerovic,  Z.  G.;  Ounis,  A.;  Cartelat,  A.;  Latouche,  G.;  Goulas,  Y.;  Meyer,  S.;  Moya,   I.  The  Use  of   Chlorophyll  Fluorescence  Excitation  Spectra  for  the  Non-­‐Destructive  in  Situ  Assessment  of   UV-­‐Absorbing  Compounds  in  Leaves.  Plant,  Cell  Environ.  2002,  25,  1663.   (12)     Zipfel,  W.  R.;  Williams,  R.  M.;  Christie,  R.;  Nikitin,  A.  Y.;  Hyman,  B.  T.;  Webb,  W.  W.  Live  Tissue   Intrinsic  Emission  Microscopy  Using  Multiphoton-­‐Excited  Native  Fluorescence  and  Second   Harmonic  Generation.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  2003,  100,  7075.   (13)     Georgakoudi,  I.;  Jacobson,  B.  C.;  Müller,  M.  G.;  Sheets,  E.  E.;  Badizadegan,  K.;  Carr-­‐Locke,  D.  L.;   Crum,  C.  P.;  Boone,  C.  W.;  Dasari,  R.  R.;  Van  Dam,  J.;  et  al.  NAD(P)H  and  Collagen  as  in  Vivo   Quantitative  Fluorescent  Biomarkers  of  Epithelial  Precancerous  Changes.  Cancer  Res.  2002,   62,  682  LP.   (14)     Gallas,   J.  M.;   Eisner,  M.   Fluorescence   of  Melanin-­‐Dependence   upon   Excitation  Wavelength   and  Concentration.  Photochem.  Photobiol.  1987,  45,  595.   (15)     Hill,   S.   C.;   Mayo,   M.   W.;   Chang,   R.   K.   Fluorescence   of   Bacteria   ,   Pollens   ,   and   Naturally   Occurring  Airborne  Particles :  Excitation  /  Emission  Spectra;  2009.   (16)     Absorption  and  emission  data  of  tryptophan      https://omlc.org/spectra/PhotochemCAD/html/091.html.   (17)     Menter,  J.  M.  Temperature  Dependence  of  Collagen  Fluorescence.  Photochem.  Photobiol.  Sci.   2006,  5,  403.   (18)     Nikon  microscopy.   Corn   Kernel   Autofluorescence   https://www.microscopyu.com/gallery-­‐ images/corn-­‐kernel-­‐autofluorescence-­‐1.   (19)     El-­‐Sayed,  M.  A.  Small   Is  Different:  Shape-­‐,  Size-­‐,  and  Composition-­‐Dependent  Properties  of   Some  Colloidal  Semiconductor  Nanocrystals.  Acc.  Chem.  Res.  2004,  37,  326.   (20)     Smith,   A.;   Nie,   S.   Semiconductor   Nanocrystals:   Structure,   Properties,   and   Band   Gap   Engineering.  Acc.  Chem.  Res.  2009,  43,  190.   (21)     Brichkin,   S.   B.;   Razumov,   V.   F.   Colloidal   Quantum   Dots:   Synthesis,   Properties   and   Applications.  Russ.  Chem.  Rev.  2016,  85,  1297.   (22)     Algar,   W.   R.;   Susumu,   K.;   Delehanty,   J.   B.;   Medintz,   I.   L.   Semiconductor   Quantum   Dots   in   Bioanalysis:  Crossing  the  Valley  of  Death.  Anal.  Chem.  2011,  83,  8826.   (23)     Resch-­‐Genger,   U.;   Grabolle,   M.;   Cavaliere-­‐Jaricot,   S.;   Nitschke,   R.;   Nann,   T.   Quantum   Dots   versus  Organic  Dyes  as  Fluorescent  Labels.  Nat.  Methods  2008,  5,  763.   (24)     Auzel,   F.  Upconversion   and  Anti-­‐Stokes  Processes  with   F   and  D   Ions   in   Solids.  Chem.  Rev.   2004,  104,  139.   (25)     Dong,   H.;   Sun,   L.-­‐D.;   Yan,   C.-­‐H.   Energy   Transfer   in   Lanthanide   Upconversion   Studies   for   Extended  Optical  Applications.  Chem.  Soc.  Rev.  2015,  44,  1608.   (26)     Chen,  G.;  Qiu,  H.;  Prasad,  P.  N.;  Chen,  X.  Upconversion  Nanoparticles:  Design,  Nanochemistry,   and  Applications  in  Theranostics.  Chem.  Rev.  2014,  114,  5161.   (27)     Wu,  S.;  Han,  G.;  Milliron,  D.  J.;  Aloni,  S.;  Altoe,  V.;  Talapin,  D.  V.;  Cohen,  B.  E.;  Schuck,  P.  J.  Non-­‐ I.2.4  Reporters  in  bioassays  -­‐  References       44   Blinking   and   Photostable   Upconverted   Luminescence   from   Single   Lanthanide-­‐Doped   Nanocrystals.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  2009,  106,  10917.   (28)     Zhang,   F.;   Shi,   Q.;   Zhang,   Y.;   Shi,   Y.;   Ding,   K.;   Zhao,   D.;   Stucky,   G.   D.   Fluorescence   Upconversion  Microbarcodes   for  Multiplexed  Biological  Detection:  Nucleic  Acid   Encoding.   Adv.  Mater.  2011,  23,  3773.   (29)     Lu,  Y.;  Zhao,  J.;  Zhang,  R.;  Liu,  Y.;  Liu,  D.;  Goldys,  E.  M.;  Yang,  X.;  Xi,  P.;  Sunna,  A.;  Lu,  J.;  et  al.   Tunable  Lifetime  Multiplexing  Using  Luminescent  Nanocrystals.  Nat.  Photonics  2013,  8,  32.   (30)     Mendez-­‐Gonzalez,   D.;   Lopez-­‐Cabarcos,   E.;   Rubio-­‐Retama,   J.;   Laurenti,   M.   Sensors   and   Bioassays  Powered  by  Upconverting  Materials.  Adv.  Colloid  Interface  Sci.  2017,  249,  66.                      I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials     45   I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting   materials     I.3.1  Introduction       A  general  classification  can  be  made  within  biosensing  platforms  attending  to  the   way  assays  are  carried  out:  Homogeneous  assays  are  those  that  proceed  by  simply   mixing   solutions   and   taking   measurements   to   read   the   result,   without   any   separation   or   washing   procedure.   This   kind   of   assays   is   often   based   on   energy   transfer  processes  between  donor  and  acceptor  pairs.  A  widely  known  example  of   homogeneous   assay   is   the   use   of   molecular   beacons,   where   a   DNA   hairpin   is   marked  with  a  fluorophore  (donor)  that  faces  a  quencher  molecule  (acceptor),  see   Figure  I.3.1.1.  In  this  situation,  when  the  organic  dye  is  excited  no  fluorescence  is   observed,  as  its  excitation  energy  is  transferred  to  the  quencher  by  a  non-­‐radiative   process.  On  the  other  hand,  when  a  complementary  (target)  sequence  is  present,  it   hybridizes  with  the  probe,  opening  the  hairpin.  This  moves  the  fluorophore  away   from  the  quencher,  now  being  able  to  fluoresce  and  thus  permitting  to  detect  the   presence  of  the  target  sequence.                               Figure   I.3.1.1   Example   of   homogeneous   assay:   Molecular   beacon.   When   the   fluorophore   (F)   faces   the   quencher   (Q),   it   is   no   able   to   fluoresce,   as   the   energy   from   its   excited   state   is   transferred   to   the   quencher,   non-­‐radiatively.  When   the   target   sequence   is   present,   the   hairpin   opens   upon   hybridization   with   it.   This   moves  the  organic  dye  away  from  the  quencher,  allowing  it  to  fluoresce.             I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials     46   As  contrast,  heterogeneous  assays  are  multi-­‐step  based  assays  in  which  separation,   analyte   capture,   and   washings   are   carried   out,   often   using   solid   supports.   This   usually  results  in  the  reduction  of  background  signals  and  other  advantages,  due  to   the   separation   and   washing   steps,   although   this   may   turn   the   assays   less   time-­‐ effective   in   comparison   with   other   strategies.   Sandwich   immunoassays   using   microwell  plates,  lateral  flow  assays,  or  DNA  chips  are  some  common  examples  of   heterogeneous  assays  (see  Figure  I.3.1.2).                                 Figure   I.3.1.2   Example   of   heterogeneous   assay   (inset)   using  microwells   as   solid   support  (real  image).  A  molecule  like  an  antibody,  which  can  capture  the  analyte  of   interest,   is   previously   fixed   to   the   solid   support.   When   adding   the   sample,   the   analyte  is  selectively  captured  from  the  solution  by  the  antibody.  Finally,  another   molecule  is  added  to  reveal  the  presence  of  the  analyte,  like  a  secondary  antibody   that  is  marked  with  a  label  and  showing  affinity  for  the  analyte.         The   use   of   UCNPs   as   reporters   is   starting   to   be   widely   applied   to   traditional   detection  platforms,  as  well  as   to  brand  new  conceptual  biosensing  systems.  The   advantages   derived   from   their   use   as   labels   are   being   exploited   in   both   homogeneous   and   heterogeneous   assays,   as   a   way   to   improve   sensitivities,   increase   the   reliability   and   the   reproducibility   under   reanalysis   of   results,   or   simply  to  build  and  investigate  new  concepts  for  biosensing.  A  review  on  the  state   of  the  art  in  this  field  is  presented  next.                           I.3.2     Sensors  and  bioassays   powered  by  upconverting   materials     (Publication  1)                    https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0001868617300842                                        I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     49                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     50                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     51                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     52                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     53                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     54                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     55                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     56                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     57                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     58                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     59                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     60                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     61                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     62                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     63                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     64                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     65                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     66                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     67                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     68                                                                                                              I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     69                                                                                                     I.3  Sensors  and  bioassays  powered  by  upconverting  materials  -­‐  Publication  1     70                                                                                                                                   II.  Aims  of  the  work                                                                                                                                                             II.  Aims  of  the  work       73   II)  Aims  of  the  work         1)   Synthesis   and   characterization   of   monodisperse   nanoparticles   based   on   β-­‐ NaYF4  doped  with  Yb3+/Er3+  and  Yb3+/Tm3+  pairs.     2)   Surface   functionalization   of   upconverting   nanoparticles   to  make   them  water-­‐ dispersible   and   with   desired   surface   characteristics   for   bioconjugations   and   subsequent  studies.     3)   Bioconjugation   of   water-­‐dispersible   upconverting   nanoparticles   with   DNA   probes   to   obtain   UC-­‐labels   that   show   a   specific   response   to   targeted   oligonucleotide  sequences.     4)   Fundamental   study   of   a   system   based   on   upconverting   nanoparticles   and   quantum  dots,  aiming  to  find  optimal  conditions  for  the  potential  development  of   oligonucleotide  sensors.           5)   Systematic   study   on   the   effect   of   gold   nanoparticles'   size   on   upconversion   luminescence,   searching   for   optimal   sizes   to   develop   oligonucleotide   sensors   based  on  luminescence  quenching  or  enhancement.     6)   Exploration   of   an   oligonucleotide   target-­‐induced   ligation   between   capture   probes,   based   on   click   chemistry,   for   the   development   of   a   highly   sensitive   heterogeneous  assay  using  upconverting  nanoparticles  as  labels.     7)   Design   of   a   highly   sensitive   oligonucleotide   detection   heterogeneous   assay   based  on  the  target-­‐induced  photochemical  ligation  between  capture  probes  using   UV  light  as  external  stimuli  and  upconverting  nanoparticles  as  labels.     8)  Temporal  and  spatial-­‐control  of  photochemical  ligation  using  Yb3+/Tm3+  doped   upconverting   nanoparticles   as   local   UV   source   and   near   infrared   (NIR)   light   as   external  excitation  source.                                                                                                                                                                 II.  Objetivos  del  trabajo                                                                                                                                                             II.  Objetivos  del  trabajo       77   II)  Objetivos  del  trabajo         1)  Síntesis  y  caracterización  de  nanopartículas  monodispersas  basadas  en  β-­‐NaYF4   dopado  con  pares  Yb3+/Er3+  and  Yb3+/Tm3+.     2)   Funcionalización   superficial   de   las   nanopartículas   de   conversión   ascendente   para   conseguir   que   se   dispersen   en   agua   y   posean   características   superficiales   deseadas  para  bioconjugaciones  y  estudios  subsiguientes.     3)  Bioconjugación  de  las  nanopartículas  de  conversión  ascendente  dispersables  en   agua  con  sondas  de  DNA  tradicionales  o  modificadas  para  obtener  UC-­‐labels  que   muestren  una  respuesta  específica  hacia  secuencias  de  oligonucleótidos  diana.       4)   Estudio   básico   de   un   sistema   basado   en   nanopartículas   de   conversión   ascendente  y  puntos  cuánticos,  con  el  objetivo  de  encontrar  condiciones  óptimas   para  el  potencial  desarrollo  de  sensores  de  oligonucleótidos.     5)  Estudio  sistemático  del  efecto  del  tamaño  de  las  nanopartículas  de  oro  sobre  la   luminiscencia   de   conversión   ascendente,   en   busca   de   tamaños   óptimos   para   el   desarrollo  de  sensores  de  oligonucleótidos  basados  en  desactivación  o  incremento   de  la  fluorescencia.     6)  Exploración  de  una  ligación  entre  sondas  de  captura,  basada  en  química  click    e   inducida  por  el  oligonucleótido  diana,  para  el  desarrollo  de  un  ensayo  heterogéneo   altamente   sensible   usando   nanopartículas   de   conversión   ascendente   como   etiquetas.     7)   Diseño   de   un   ensayo   heterogéneo   altamente   sensible   para   la   detección   de   oligonucleótidos   basado   en   la   ligación   fotoquímica   entre   sondas   de   captura   inducida   por   diana   y   usando   luz  UV   como   estímulo   externo   y   nanopartículas   de   conversión  ascendente  como  etiquetas.     8)  Control  del   tiempo  y   la   localización  espacial  de   la   ligación  fotoquímica  usando   nanopartículas   de   conversión   ascendente   dopadas   con   Yb3+/Tm3+   como   fuente   local  de  UV,  y  luz  de  la  región  del  infrarrojo  cercano  (NIR)  como  fuente  externa  de   excitación.                                                                                                                                                           III.  Experimental                                                                                                                               III.1       Fundamental  study  of   UCNPs/Q-­‐dots  and   UCNPs/AuNPs  pairs                                 III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       82   III.1.1)  Introduction     The  fact  that  homogeneous  assays  can  be  performed  in  the  absence  of  separation   and   washing   steps   makes   them   ideal   candidates   for   the   automatized,   real-­‐time,   and  quick  detection  and  quantification  of  analytes.  As   they  usually   require   just  a   simple  solution  "mixing"  step  to  carry  out   the  detection,   they  make   it  possible   to   bypass  the  necessity  of  well-­‐equipped  laboratories  and  facilities,  as  well  as  trained   operators,  making   them  suitable  alternatives  as  point-­‐of-­‐care   (POC)   tools   for   the   diagnosis  of  diseases  in  hardly  accessible  areas  or  countries  with  little  resources.   As  shown  in  the  previous  review,  UCNPs  are  receiving  a   lot  of  attention   for   their   potential   use   as   donors   in   this   kind   of   assays,   which   usually   rely   on   resonance   energy   transfer   (RET)   processes.   The   fundamental   study   of   specific   donor   /   acceptor   pairs   may   permit   a   better   comprehension   of   the   advantages   and   limitations  of  the  particular  systems,  as  well  as  finding  optimal  conditions  to  build   effective  assays  and  sensors.     With   this   in  mind,   investigations   were   carried   out   on   the   optimal   conditions   to   develop   homogeneous   assays   using   UCNPs   as   donors,   and   either   CdTe   Q-­‐dots   (Publication  2)  or  gold  nanoparticles  (Publication  3)  as  acceptors.  Both  studies  will   be   treated   in   this   section:   "Förster  resonance  energy  transfer  distance  dependence   from  upconverting  nanoparticles  to  quantum  dots"  (Publication  2),  and  "Control  of   upconversion   luminescence   by   gold   nanoparticle   size:   from   quenching   to   enhancement"  (Publication  3).     As   a   first   step   for   both   studies,  β-­‐NaYF4   nanoparticles   doped  with   Yb3+   (20%wt   relative  to  [Y3+  +  Yb3+  +  Er3+]  =  100%)  and  Er3+  (2%wt)  were  synthesized,  which   resulted   in   green/red-­‐emitting   UCNPs.   Among   the   different   methods   existing   to   synthesize   these   nanomaterials   (thermal   decomposition,   Ostwald-­‐ripening,   ionic   liquid-­‐based,  and  solvothermal  methods)  the  Ostwald  ripening  method  was  chosen   due   to   its   advantages:   relatively   mild   conditions,   non-­‐toxic   by-­‐products,   more   environmentally   friendly   chemicals,   relatively   simple   protocols,   and   highly   crystalline  hexagonal  (β)-­‐phase  nanoparticles  with  decreased  defects  as  products.1   This  synthetic  approach  is  based  on  the  in  situ  formation  of  small  sacrificial  cubic   (α)-­‐phase   NaYF4   nanoparticles,   by   the   reaction   of   rare   earth   (RE)   oleates   with              III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       83   sodium   fluoride   (NaF)   at   high   temperature.   Subsequently,   highly   crystalline   β-­‐ phase  UCNPs   are   grown   at   the   expense   of   the   initial   (α)-­‐phase   nanoparticles   by   heating   at   300ºC   for   1h   due   to   a   Ostwald-­‐ripening   process.2   This   ripening   phenomenon  is  based  on  the  fact  that  big  particles  are  thermodynamically  favored   in   comparison  with   smaller   ones,   due   to   a   lower   surface-­‐to-­‐volume   ratio   of   the   former   ones.   Thus,   the   high   temperatures   used   in   this   synthesis   favors   the   dissolution   of   small   α-­‐NaYF4   nanoparticles   (due   in   part   to   their   high   specific   surface   area)   and   their   crystallization   and   growth   at   the   surface   of   β-­‐UCNPs   (whose  crystalline  phase  is  less  soluble  and  more  stable  in  these  conditions).  Once   the   synthetic   process   has   finished,   all  α-­‐NaYF4   nanoparticles   are   consumed   and   highly   crystalline   oleate-­‐capped   β-­‐UCNPs   are   obtained.   Note   that   the   oleate   molecules   acting   as   capping   agent   make   the   resulting   UCNPs   hydrophobic.   A   general   scheme   of   the   synthetic   procedure   is   depicted   in   Figure   III.1.1.1.   Interestingly,   another   different   mechanism   for   β-­‐NaGdF4   formation   has   been   recently  proposed.3                             Figure  III.1.1.1.  Synthetic  steps  to  obtain  UCNPs  by  the  Ostwald  ripening  approach.   A)  Dissolution  of  YCl3,  YbCl3,  and  ErCl3  in  oleic  acid  and  1-­‐octadecene  at  160ºC.  B)   After  the  dissolution  of  the  salts,  the  mixture  is  cooled  down  to  room  temperature   (RT).  C)  Addition  of  methanolic  solution  containing  NaOH  and  NH4F.  Precipitation   of   NaF   after  methanol   removal.   D)   The   resulting   solution   is   heated   up   to   300ºC   under   N2   atmosphere   to   give   sacrificial  α-­‐phase  NaYF4   nanoparticles   during   the   process,  from  which  β-­‐phase  UCNPs  will  form  by  Ostwald  ripening.     III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       84   Once  the  UCNPs  were  obtained,  a  silica  (SiO2)  shell  was  grown  around  the  UCNPs   as  a  first  step  to  turn  them  hydrophillic  and  further  modify  their  surface.  This  was   achieved   by   a   reverse-­‐microemulsion   method,   using   tetraethyl   orthosilicate   (TEOS)   as   silica   precursor,   Igepal   CO-­‐520   as   surfactant,   hexane   as   continuous   phase,   and   ammonium  hydroxide   (NH4OH)   as   catalyst   and   dispersed   phase   (see   Figure   III.1.1.2)   .   In   this   method,   hydrolized   TEOS   molecules   exchange   at   the   surface   of   UCNPs   with   their   capping   agent   (Igepal   instead   of   oleic   acid,   at   this   point).4–6  During   this  process   the  nanoparticles   are   transferred   to   the   interior  of   the  aqueous  domains  (i.e.  water  droplets),  where  TEOS  molecules  condense  due  to   the   alkaline   media   provided   by   NH4OH.   The   condensation   of   TEOS   molecules   around   the  UCNPs  eventually   results   in   the   formation  of   a   concentric   silica   shell   around  the  UCNPs,  yielding  "UCNPs@SiO2"  nanoparticles.                 Figure  III.1.1.2.  Scheme  of  silica  shell  growth  onto  UCNPs'  surface  by  the  reverse-­‐ microemulsion  method.       To   study   the   distance-­‐dependence   of   Förster   resonance   energy   transfer   (FRET)   from   UCNPs   to   Q-­‐dots   (Publication   2),   different   SiO2   thicknesses   were   grown   around  the  UCNPs  to  act  as  a  "spacer"  between  the  two  nanomaterials.  The  reverse   microemulsion   method   allowed   a   tight   control   of   the   silica   coating:   By   using   different  amounts  of  TEOS,  controlled  thicknesses  at  the  nanometric  scale  could  be   obtained   (Figure   III.1.1.3).   Stopping   the   reaction   at   different   times   (i.e.   a   kinetic   control),  while  keeping  constant   the  amount  of  TEOS,   is  another  effective  way   to   control  the  shell  thickness.   In   the  case  of  publication  3,  UCNPs  coated  with  a   fixed  SiO2   thickness  were  used   instead.                III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       85               Figure  III.1.1.3.  The  addition  of  different  amounts  of  SiO2  precursor  (TEOS)  permits   to   effectively   control   the   shell   thickness,   making   it   an   ideal   spacer   to   study   the   FRET  distance-­‐dependence  between  UCNPs  and  Q-­‐dots.       As  a  final  step,  the  resulting  UCNPs@SiO2  (core@shell)  nanoparticles  were  further   modified   using   their   silanol   (-­‐SiOH)   surface   groups   as   anchoring   points   for   the   attachment   of   "(3-­‐aminopropyl)   triethoxysilane"   (APTES),   an   organosilane   molecule   that   yields   an   amine-­‐modified   surface,   see   Figure   III.1.1.4.   Amino-­‐ modified  UCNPs  are  able   to   interact  with  3-­‐mercaptopropionic  acid  capped  CdTe   Q-­‐dots   and   citrate-­‐stabilized   gold   nanoparticles   (AuNPs),   by   electrostatic   interactions   and   complexation,   as   amines   are   positively   charged   at   neutral   to   acidic  pHs  and  also  present  a  high  affinity  to  the  surface  of  gold  (Au)7.  This  allowed   to  study  how  the  proximity  of  Q-­‐dots/AuNPs   influence  the  photoluminescence  of   UCNPs,  permitting  to  establish  general  guidelines  to  follow  when  aiming  to  design   homogeneous   assays   based   on   UCNPs/Q-­‐dots   and   UCNPs/AuNPs   pairs   for   the   detection  of  small  biomolecules  such  as  oligonucleotides.                   Figure  III.1.1.4.  A)  UCNPs  with  oleic  acid  as  capping  agent.  B)  Silica  shell  growth  by   the  reverse  microemulsion  method,  yielding  silanol  (Si-­‐OH)  surface  groups.  C)  The   reaction   of   the   UCNPs@SiO2   with   APTES   allowed   the   functionalization   of   their   surface  with  primary  amines.       III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       86   As   discussed   previously   in   section   I.3   (publication   1),   FRET   is   a   non-­‐radiative   process  that  occurs  between  two  light-­‐sensitive  entities  (e.g.  fluorophores),  usually   named   as   "donor"   and   "acceptor",   under   specific   circumstances:   the   emission   spectrum   of   the   donor   must   overlap   the   absorption   spectrum   of   the   acceptor   (Figure   III.1.1.5),  while   the  donor  and   the  acceptor  needs   to  be   close  enough   for   this   phenomenon   to   happen   (within   1-­‐10   nm).8,   9   In   this   situation,   and   upon   absorption  of  light  by  the  donor,  the  energy  from  its  excited  state  is  transferred  to   the   acceptor,   which   is   commonly   named   "quencher"   as   it   deactivates   the   luminescence  from  the  donor  by  these  means.  The  received  energy  can  be  partially   dissipated  by   the  acceptor   in   the   form  of  emitted  photons  at  higher  wavelengths   (as   it  happens  with  Q-­‐dots),  or  entirely  as  heat,   in   the  case  of  a   "dark  quencher"   (e.g.  dyes  lacking  native  fluorescence).                       Figure   III.1.1.5.   FRET   requires   the   spectral   overlap   between   the   donor   emission   and  acceptor  absorption  spectra.       The  non-­‐radiative  nature  of  FRET  processes  is  explained  by  the  long-­‐range  dipole-­‐ dipole   interaction   between   the   donor   (whose   excited   electron   creates   a   momentary  dipole)  and  the  acceptor.  Thus,  the  energy  transfer  occurs  without  the   emission/re-­‐absorption   of   photons.   The   energy   transfer   rate   is   dependent   on   factors  such  as  relative  orientation  of  the  donor  to  the  acceptor  transition  dipoles,   degree   of   spectral   overlap   between   donor   emission   and   acceptor   absorbance,   quantum   yield   of   the   donor,   and   distance   between   donor   and   acceptor.   Once   understood  the  mechanism  of  this  phenomenon,  it  is  evident  that  bringing  in  close   proximity  the  quencher  to  the  donor  by  means  of  a  specific  biological   interaction              III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       87   (e.g.  antigen-­‐antibody,  hybridization  of  complementary  oligonucleotides,  etc)  will   cause  a  "switch  off"  behavior  on  donor's   luminescence,  which  will  make  possible   the  detection  of  the  targeted  analyte  behind  this  interaction  (e.g.  antigen,  antibody,   DNA  strand,  miRNA,  etc),  see  Figure  III.1.1.6.   When   designing   this   kind   of   sensors,   some   considerations   must   be   taken   into   account   to  maximize   their   detection   performance,   such   as   characteristics   of   the   donor   (e.g.   size,   specific   surface   area,   spectroscopic   features,   surface   bioconjugation,   etc),   characteristics   of   the   acceptor,   distance   between   donor   /   acceptor   when   interacting   with   the   targeted   analyte,   relative   donor   /   acceptor   orientation,  etc.  As  an  example,  FRET  only  occurs  with  high  efficiency  if  donor  and   acceptor  are   located  within  the  "Förster  radius",  which   is  defined  as  the  distance   where  half  the  excitation  energy  of  the  donor  is  transferred  to  the  acceptor.  Thus,   calculating   this   distance   as   well   as   other   parameters   for   a   specific   system   (e.g.   UCNPs/Q-­‐dots)  will  make   it   possible   to   improve   its   response   towards   a   desired   analyte,  which  is  the  motivation  behind  the  study  presented  in  publication  2.                       Figure   III.1.1.6.   Ideal  model   of   UCNP/Q-­‐dots   FRET   system   for   the   detection   of   a   specific   oligonucleotide:   The   targeted   sequence   brings   in   close   proximity,   upon   hybridization,   the   target-­‐complementary   DNA-­‐functionalized   UCNP   and   Q-­‐dots.   In  the  presence  of  the  targeted  sequence,  the  UCNP  luminescence  is  quenched  due   to  a  successful  FRET  process  to  the  nearby  Q-­‐dots  (acceptors).  As  result,  the  Q-­‐dots   luminescence   is   activated   when   exciting   the   system   at   UCNPs'   absorption   wavelength  (980  nm).       III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       88   A  similar  kind  of  system  based  on  upconversion  luminescence  quenching  by  non-­‐ radiative  energy  transfer  processes  can  be  built  using  UCNPs/AuNPs  pairs.  On  the   other   hand,   the   existence   of   numerous   works   reporting   either   quenching   or   enhancement  of  upconversion  luminescence  by  AuNPs  deserves  attention.10–15     Although   β-­‐NaYF4   doped   with   Ln3+   are   UCNPS   commonly   used   due   to   the   advantages   previously   discussed   in   this   thesis,   AuNPs   featuring   different   size,   shape,  surface  functionality,  and  spacing  for  the  reported  UCNPs/AuNPs  systems,   makes   it   difficult   to   qualitatively   and   quantitatively   compare   the   described   phenomena.  In  addition,  the  use  of  UCNPs  with  different  sizes,  which  affects  their   luminescence   and   quantum   yield   even   when   dopant   concentrations   and   host   matrix   are   kept   constant,   is   another   factor   to   take   into   account   in   the   design   of   these   systems,   as  we   and  other   groups  have   anticipated.16,17   Thus,   the  need  of   a   systematic  study  to  shed  light  on  the  interaction  between  UCNPs/AuNPs  aiming  to   better  design  sensors,  was  the  motivation  for  the  study  presented  in  publication  3.   In  this  work,  UCNPs  (20  nm  in  diameter)  coated  with  a  constant  SiO2  thickness  as   spacer  (i.e.  3.8  nm)  were  used  as  donor,  while  the  size-­‐effect  of  spherical  AuNPs  on   the  luminescence  of  UCNPs  was  studied.       Typically,  the  proximity  of  a  fluorophore  to  a  metallic  nanoparticle  (MNP)  can  be   accompanied  of  different  effects,  which  will  depend  on  factors  such  as  proximity  to   the  metallic   surface,   size   and   shape   of   the  metallic   nanostructure,   orientation   of   the   excited   fluorophore   (oscillating   dipole)   regarding   the   nanoparticle,   etc.   For   example,  the  high  proximity  to  a  metallic  surface  (e.g.  0-­‐20  nm)  usually  results  in           strong   fluorescence   quenching   by   non-­‐radiative   mechanisms   like   resonance   energy  transfer  (RET)  processes  and  other  phenomena.8,18,19   On  the  other  hand,   fluorescence  enhancement  can  also  occur  at  certain  distances   from  metallic  surfaces.  This  can  be  explained  by  the  increase  of  fluorophore's  rate   of   excitation   and/or   of   its   radiative   decay   rate,   which   can   occur   due   to   the   modification  of  the  local  electromagnetic  field  around  the  emitter  by  the  localized   surface  plasmon  resonance  from  a  nearby  MNP.8,19,20                   Emission   quenching   or   enhancement   effects   can   be   expressed   in   terms   of   the   modification  of  both  the  non-­‐radiative  decay  rate  (Knr)  and  the  radiative  decay  rate   (Γ)   of   the   fluorophore.   Thus,   for   example,   when   the   fluorophore   is   in   close   proximity  to  the  metallic  surface,  Knr  will  rise  substantially  by  the  increase  in  non-­‐            III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       89   radiative  relaxation  pathways  (e.g.  RET),  having  a  quenching  effect  on  the  overall   luminescence  quantum  yield  (Q)  and  a  reduction  of  lifetime  (τ):                 On  the  other  hand,  the  enhancement  of  fluorescence  emission  can  be  ascribed  to  a   higher  rate  of  excitation,  which  will  result  in  an  increased  brightness  but  without   any  change   in  quantum  yield  or   lifetime,  or   to  an   increase   in   the  radiative  decay   rate   by   what   is   called   Purcell   effect.   In   the   latter   case,   we   can   account   for   the   increment  of  the  radiative  decay  rate  due  to  the  MNP  as  the  decay  rate  due  to  the   metal  "Γm".    In  this  situation  the  quantum  yield  will  rise,  while  the  lifetime  will  be   reduced:                 The  proximity  to  the  metallic  surface  is  not  the  only  parameter  permitting  one  of   the   two  effects  (i.e.  quenching  or  enhancement)   to  become  dominant.   In   fact,   the   size  of  the  MNP  can  have  a  major  role  in  this  regard.  According  to  Mie  theory,  small   MNP,   up   to   ~40   nm   in   diameter,   are   expected   to   quench   fluorescence   as   absorption   is   dominant   over   scattering   phenomena.   Above   this   size,   scattering   starts   to   gain   importance   over   absorbance,   consequently   starting   to   exert   an   enhancement  effect  over  the  fluorophore  emission.19   Thus,   establishing   the   optimal   AuNP   size   that   yields   the   highest   quenching   of   UCNPs'   luminescence   is   important   for   the   proper   design   of   sensors   based   on   UCNPs/AuNPs   pairs.   Besides,   finding   AuNPs'   sizes   that   can   increase   the   luminescence   of   UCNPs   is   interesting   to   design   new   kinds   of   sensors   based   on   upconversion   luminescence   enhancement,   and   as   a   way   to   raise   upconversion   III.1.1  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Introduction       90   efficiency  by  the  use  of  plasmonic  nanostructures.  To  carry  out   these  studies,  we   synthesized   citrate-­‐stabilized   AuNPs   with   increasingly   bigger   diameters   by   a   seeded  mediated  growth  method  reported  by  Bastús  et  al.21   This  strategy  consists  in  the  formation  of  small  gold  nanoparticles  in  an  initial  step,   by  the  addition  of  chloroauric  acid  (HAuCl4)  to  a  boiling  solution  of  sodium  citrate.     From   this   point   on,   the   sequential   addition   of   chloroauric   acid   (HAuCl4)   and   sodium   citrate   permits   to   deposit   gold   atoms   onto   the   surface   of   the   previously   formed  nanoparticles   in  a  controlled  way  (i.e.  avoiding  secondary  nucleation  and   formation   of   new   small  AuNPs),  which   allows   the   growth   of   the   original   formed   AuNPs   used   as   seeds   (Figure   III.1.1.7).   The   completion   of   each   growth   step   is   accompanied  by  the  extraction  and  storage  of  55  mL  from  the  reaction  flask,  while   this  volume  is  substituted  by  53  mL  water  and  2  mL  sodium  citrate  (60  mM)  for   the  new  growth   step.   Thus,   this  method   is   ideal   to   obtain  AuNPs  of   increasingly   bigger  sizes  from  the  same  exact  synthesis,  which  is  very  desirable  for  the  kind  of   study  that  we  carried  out  in  publication  3.                               Figure  III.1.1.7  General  scheme  for  the  seed-­‐mediated  growth  method  used  for  the   synthesis  of  different  sized  AuNPs.  The  injection  of  HAuCl4  to  a  boiling  solution  of   sodium  citrate  generates  the  original  Au  seeds,  which  are  subsequently  grown  by   two  more  additions  at  90  ºC  of  HAuCl4  to  a  final  size  of  around  20  nm  (G0,  G0  +  1   mL   and   G0   +   2   mL,   respectively).   From   this   point,   55   mL   of   the   synthesis   are   extracted,  53  mL  of  water  and  2  mL  of  citrate  60  mM  are  added  to  regenerate  the   reducing  agent,  and  a  new  growth  step  is  started.                      III.1.2  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  References     91       References     (1)     Chen,  G.;  Qiu,  H.;  Prasad,  P.  N.;  Chen,  X.  Upconversion  Nanoparticles:  Design,  Nanochemistry,   and  Applications  in  Theranostics.  Chem.  Rev.  2014,  114,  5161.   (2)     Suter,  J.  D.;  Pekas,  N.  J.;  Berry,  M.  T.;  May,  P.  S.  Real-­‐Time-­‐Monitoring  of  the  Synthesis  of  β-­‐ NaYF   4 :17%   Yb,3%   Er   Nanocrystals   Using   NIR-­‐to-­‐Visible   Upconversion   Luminescence.   J.   Phys.  Chem.  C  2014,  118,  13238.   (3)     Hudry,  D.;  Abeykoon,  A.  M.  M.;  Dooryhee,  E.;  Nykypanchuk,  D.;  Dickerson,  J.  H.  Probing  the   Crystal   Structure   and   Formation   Mechanism   of   Lanthanide-­‐Doped   Upconverting   Nanocrystals.  Chem.  Mater.  2016,  28,  8752.   (4)     Ding,   H.   L.;   Zhang,   Y.   X.;   Wang,   S.;   Xu,   J.   M.;   Xu,   S.   C.;   Li,   G.   H.   Fe3O4@SiO2   Core/Shell   Nanoparticles:  The  Silica  Coating  Regulations  with  a  Single  Core  for  Different  Core  Sizes  and   Shell  Thicknesses.  Chem.  Mater.  2012,  24,  4572.   (5)     Darbandi,   M.;   Thomann,   R.;   Nann,   T.   Single   Quantum   Dots   in   Silica   Spheres   by   Microemulsion  Synthesis.  Chem.  Mater.  2005,  17,  5720.   (6)     Vogt,  C.;  Toprak,  M.   S.;  Muhammed,  M.;  Laurent,   S.;  Bridot,   J.-­‐L.;  Müller,  R.  N.  High  Quality   and  Tuneable  Silica  Shell–magnetic  Core  Nanoparticles.  J.  Nanoparticle  Res.  2010,  12,  1137.   (7)     Kumar,   A.;   Mandal,   S.;   Selvakannan,   P.   R.;   Pasricha,   R.;   Mandale,   A.   B.;   Sastry,   M.   Investigation   into   the   Interaction   between   Surface-­‐Bound   Alkylamines   and   Gold   Nanoparticles.  Langmuir  2003,  19,  6277.   (8)     Lakowicz,   J.   R.   Principles   of   Fluorescence   Spectroscopy;   Lakowicz,   J.   R.,   Ed.;   Springer   US:   Boston,  MA,  2006.   (9)     Piston,   D.   W.;   Kremers,   G.-­‐J.   Fluorescent   Protein   FRET:   The   Good,   the   Bad   and   the   Ugly.   Trends  Biochem.  Sci.  2007,  32,  407.   (10)     Li,  Z.;  Wang,  L.;  Wang,  Z.;  Liu,  X.;  Xiong,  Y.  Modification  of  NaYF4:Yb,Er@SiO2nanoparticles   with  Gold  Nanocrystals  for  Tunable  Green-­‐to-­‐Red  Upconversion  Emissions.  J.  Phys.  Chem.  C   2011,  115,  3291.   (11)     Qian,   L.   P.;   Zhou,   L.   H.;   Too,  H.   P.;   Chow,   G.  M.   Gold  Decorated  NaYF4:Yb,Er/NaYF4/silica   (Core/shell/shell)   Upconversion   Nanoparticles   for   Photothermal   Destruction   of   BE(2)-­‐C   Neuroblastoma  Cells.  J.  Nanoparticle  Res.  2011,  13,  499.   (12)     Liu,   S.;   Chen,   G.;   Ohulchanskyy,   T.   Y.;   Swihart,   M.   T.;   Prasad,   P.   N.   Facile   Synthesis   and   Potential   Bioimaging   Applications   of   Hybrid   Upconverting   and   Plasmonic   NaGdF4:   Yb3+,   Er3+/silica/gold  Nanoparticles.  Theranostics  2013,  3,  275.   (13)     Liu,   N.;   Qin,   W.;   Qin,   G.;   Jiang,   T.;   Zhao,   D.   Highly   Plasmon-­‐Enhanced   Upconversion   Emissions   from   Au@β-­‐NaYF   4:Yb,Tm   Hybrid   Nanostructures.   Chem.   Commun.   2011,   47,   7671.   (14)     Clarke,  C.;  Liu,  D.;  Wang,  F.;  Liu,  Y.;  Chen,  C.;  Ton-­‐That,  C.;  Xu,  X.;  Jin,  D.  Large-­‐Scale  Dewetting   Assembly   of   Gold   Nanoparticles   for   Plasmonic   Enhanced   Upconversion   Nanoparticles.   Nanoscale  2018,  10,  6270.   (15)     Deng,  W.;  Sudheendra,  L.;  Zhao,  J.;  Fu,  J.;  Jin,  D.;  Kennedy,  I.  M.;  Goldys,  E.  M.  Upconversion  in   NaYF4:Yb,  Er  Nanoparticles  Amplified  by  Metal  Nanostructures.  Nanotechnology  2011,  22.   (16)     Melle,   S.;   Calderón,   O.   G.;   Laurenti,   M.;   Mendez-­‐Gonzalez,   D.;   Egatz-­‐Gómez,   A.;   López-­‐ Cabarcos,   E.;   Cabrera-­‐Granado,   E.;   Díaz,   E.;   Rubio-­‐Retama,   J.   Förster   Resonance   Energy   Transfer  Distance  Dependence   from  Upconverting  Nanoparticles   to  Quantum  Dots.   J.  Phys.   Chem.  C  2018,  122,  18751.   (17)     Marin,  R.;  Labrador-­‐Paéz,  L.;  Skripka,  A.;  Haro-­‐González,  P.;  Benayas,  A.;  Canton,  P.;  Jaque,  D.;   Vetrone,  F.  Upconverting  Nanoparticle  to  Quantum  Dot  Förster  Resonance  Energy  Transfer:   Increasing  the  Efficiency  through  Donor  Design.  ACS  Photonics  2018,  5,  2261.   (18)     Barnes,  W.  L.  Fluorescence  near  Interfaces:  The  Role  of  Photonic  Mode  Density.  J.  Mod.  Opt.   1998,  45,  661.   (19)     Swierczewska,   M.;   Lee,   S.;   Chen,   X.   The   Design   and   Application   of   Fluorophore–gold   Nanoparticle  Activatable  Probes.  Phys.  Chem.  Chem.  Phys.  2011,  13,  9929.   (20)     Gersten,  J.;  Nitzan,  A.  Spectroscopic  Properties  of  Molecules  Interacting  with  Small  Dielectric   Particles.  J.  Chem.  Phys.  1981,  75,  1139.   (21)     Bastús,   N.   G.;   Comenge,   J.;   Puntes,   V.   Kinetically   Controlled   Seeded   Growth   Synthesis   of   Citrate-­‐Stabilized   Gold   Nanoparticles   of   up   to   200   Nm:   Size   Focusing   versus   Ostwald   Ripening.  Langmuir  2011,  27,  11098                                                                                                                                                 III.1.3       Förster  resonance  energy   transfer  distance  dependence   from  upconverting   nanoparticles  to  quantum  dots     (Publication  2)     https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpcc.8b04908                                                    III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2         95                                                                                                     III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2       96                                                                                                              III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2         97                                                                                                     III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2       98                                                                                                              III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2         99                                                                                                     III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2       100                                                                                                              III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2         101                                                                                                     III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2       102                                                                                                              III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2         103                                                                                                     III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2       104                                                                                                              III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2         105                                                                                                     III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2       106                                                                                                              III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2         107                                                                                                     III.1.3  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  2       108                                                                                                                           III.1.4       Control  of  upconversion   luminescence  by  gold   nanoparticle  size:  from   quenching  to  enhancement     (Publication  3)                                                      III.1.4  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Publication  3     111                                                                                                     https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2019/nr/c9nr02039j#!divAbstract III.1.5  Fundamental  study  of  UCNPs/Q-­‐dots  and  UCNPs/AuNPs  pairs  -­‐  Conclusions     126     III.1.5  Conclusions       -­‐   Yb/Er   doped   UCNPs   are   suitable   photoluminescent   probes   for   the   potential   construction   of   homogeneous   assays   based   on   energy   transfer   processes   using   CdTe  Q-­‐dots  or  AuNPs  as  acceptors,  as   the  green  emission  of   the   former  suitably   overlaps  the  absorption  spectra  of  the  latter.     -­‐  FRET  between  UCNPs  and  Q-­‐dots  has  been  demonstrated,  achieving  a  maximum   efficiency  value  of  10%  for  the  thinner  SiO2  shell  (3  nm)  whereas  a  negligible  value   was  obtained  for  distances  above  12  nm.     -­‐  We  obtained  a  Förster  radius  of  R0  =  5.5  nm,  which  is  large  if  compared  with  R0   from  organic  fluorophores  but  still  small  if  compared  with  our  UCNPs  diameter  (33   nm)  to  produce  an  effective  FRET  between  most  of  the  excited  Er3+  ions  and  the  Q-­‐ dots.     -­‐  Experimental  results  were  successfully  explained  theoretically  by  calculating  the   FRET  efficiency  of  each  single  Er3+/Q-­‐dot  pair  and  averaging  the  response  of  each   of  these  Er3+  ions  inside  the  UCNP.  We  found  out  that  only  Er3+  ions  within  a  5  nm   shell  from  the  UCNPs'  surface  were  able  to  experience  a  FRET  efficiency  >  10%.       -­‐  AuNPs  of  ~14  nm   in  diameter  are  optimum  to  efficiently  quench   luminescence   from  UCNPs  by  RET  (i.e.  ~40  %  luminescence  quenching).     -­‐  Increasingly  bigger  AuNPs  raises  the  radiative  decay  rate  from  UCNPs'  green  level   (4S3/2)   by   means   of   the   Purcell   effect,   which   translates   in   an   upconversion   luminescence   enhancement   of   ~30%   for   66   nm   AuNPs,   with   the   possibility   to   improve  this  effect  with  larger  AuNP  diameters.                             III.2     Innovative  strategies  for   heterogeneous  assays   with  upconverting  labels                                                                              III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction     129     III.2.1)  Introduction     The  use  of  heterogeneous  assays  is  generally  accompanied  by  several  advantages   over  homogeneous  assays:  as  they  are  usually  based  on  the  capture  of  analyte  and   reporter  by  a  solid  support,  it  is  possible  to  use  separation  and  washing  steps  that   often   translate   in   a   sensitivity   improvement.   The   fact   that   the   analyte   can   be   captured,   labeled,   and   ultimately   separated   from   the   liquid   sample   also   permits   more   reliable   measurements,   as   it   is   measured   in   a   "steady"   instead   of   in   a   "dynamic"   state,   as   it   occurs   with   homogeneous   assays.   This   also   permits,   especially   when   using   upconverting   nanoparticles   as   labels,   a   second   measurement  of  the  assay  even  months  after  the  assay  has  been  carried  out.1  Even   more,   the   use   of   a   2D   solid   support   allows   to   easily   developing   multiplexed   detection   assay   formats,   taking   advantage   of   the   spatial   localization   of   different   spots.       The  unusual   anti-­‐stokes  optical   properties   exhibited  by  UCNPs  makes   their   non-­‐ specific   binding   the   main   source   of   background   noise,   as   autofluorescence   is   directly   avoided   when   using   these   as   labels.   This   fact   is   in   contrast   to   the   vast   majority   of   reporters,   whose   main   sensitivity   limitation   comes   from   their   detectability   and  which   is   constrained,   for   example,  when   their   signal   is   hidden   within   the   autofluorescence   signal.   Thus,   the   reduction   of   the   amount   of   upconverting   labels   non-­‐specifically   bound   to   the   solid   support   may   potentially   improve  sensitivities  in  heterogeneous  assays.     The   use   of   stringent   or   even   harsh   washes   may   be   used   to   reduce   background   noise   by   disrupting   the   non-­‐specific   interactions   between   UCNPs   and   the   solid   support.   However,   this   will   also   lead   to   the   denaturation   between   the   capture   probes   and   the   target   sequence   aimed   to   be   detected   in   oligonucleotide   hybridization   assays.   As   consequence,   the   specific   signal   coming   from   hybridization   with   the   target   will   also   be   reduced,   eventually   avoiding   an   improvement  of   the   signal-­‐to-­‐background  ratio   (Sg/bg  ratio)  and  sensitivity   (see   Figure  III.2.1.1).         III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction       130                     Figure  III.2.1.1.  Harsh  washes  can  be  used  to  reduce  the  background  signal  coming   from  non-­‐specifically  bound   labels  (UCNPs)  to  the  solid  support.  However,   it  will   also  reduce  the  specific  signal  due  to  denaturation  of  the  duplexes  formed  between   the  capture  probes  and  the  miRNA  target  sequence.       Nevertheless,  if  the  presence  of  the  target  sequence  could  induce  the  formation  of   a   covalent  bond  between   the   capture  probes  used   for   its  detection,   the   situation   would   be   different:   The   use   of   harsh  washes  would   permit   the   reduction   of   the   background   signal   while   the   specific   signal   coming   from   the   target-­‐induced   covalent   ligation  of  capture  probes  would  be  conserved,  even  when  denaturation   took  place  upon   these  washes   (Figure   III.2.1.2).  This  would   translate   in   a  higher   Sg/Bg  ratio  and  an  improvement  of  the  assay  sensitivity.                             Figure   III.2.1.2   The   target-­‐induced   covalent   ligation   of   capture   probes   upon   hybridization  would  permit  to  use  harsh  washes  to  reduce  the  background  signal,   while  conserving  the  specific  signal  generated  by  the  target.                      III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction     131   Two   different   heterogeneous   assays   using   UCNPs   as   labels   and   different   target-­‐ induced   ligation   strategies   were   developed   and   are   presented   in   this   section:   "Oligonucleotide  Sensor  Based  on  Selective  Capture  of  Upconversion  Nanoparticles   Triggered   by   Target-­‐Induced   DNA   Interstrand   Ligand   Reaction"   (Publication   4),   and   "Photochemical   Ligation   to   Ultrasensitive  DNA  Detection  with  Upconverting   Nanoparticles"  (Publication  5).       In  publication  4,  the  synthesis  of  UCNPs  was  carried  out  using  the  same  strategy  as   the  one  described  for  publications  2  and  3.  In  brief,  UCNPs  were  synthesized  using   the   Ostwald   ripening   method,   covered   with   a   silica   shell   to   turn   them   water-­‐ dispersible,   and   further   modified   with   APTES.   Aiming   to   use   the   resulting   nanomaterials  as  upconverting  labels  (UC-­‐labels),  an  additional  synthetic  step  was   performed:   the   reaction   of   the   amino-­‐modified   UCNPs@SiO2   with   succinic   anhydride   to   yield   carboxylic   acid   surface-­‐modified   UCNPs.   At   this   point,   the   carboxylated  UCNPs  were  ready  for  their  bioconjugation  with  single  stranded  DNA   (ssDNA)  probes  by  Sulfo-­‐NHS/EDC  coupling.   In   this   reaction,   1-­‐ethyl-­‐3-­‐(3-­‐dimethylaminopropyl)carbodiimide   hydrochloride   (EDC·HCl)  was  used  to  form  an  o-­‐acylisourea  with  the  carboxylic  acid  groups  at  the   surface   of   UCNPs.   This   unstable   intermediate   allows   the   formation   of   an   amide   bond  at  room  temperature  between  the  activated  carboxylic  acids  and  the  amine   group  from  ssDNA  (Figure  III.2.1.3).  As  the  o-­‐acylisourea  intermediate  is  unstable   in  water,   it   is   common   to  use  N-­‐hydroxysulfosuccinimide   (Sulfo-­‐NHS)   to  prolong   the  EDC-­‐mediated  activation  of   the  carboxylic  acids,  and  thus   improve  the  whole   efficiency  of  the  coupling  process.   The   conjugation   of   UCNPs   with   ssDNA   was   the   last   step   on   the   synthesis   of   upconverting   labels   (UC-­‐labels)   for   their   use   in   the   heterogeneous   assays   presented  in  this  section.             III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction       132                             Figure   III.2.1.3.   Bioconjugation   of   carboxylic   acid   functionalized   UCNPs   with   ssDNA-­‐NH2  via  EDC·HCl/  Sulfo-­‐NHS  coupling  reaction.       In   contrast   to   the   previous   works,   β-­‐NaYF4   nanoparticles   with   Yb3+   (40%   wt   relative   to   [Y3+   +   Yb3+   +   Tm3+]   =   100%)   and   Tm3+   (0.5%   wt)   as   dopants,   were   synthesized  by  the  Ostwald  ripening  method  in  publication  5,  obtaining  UV/blue-­‐ emitting  upconverting  nanoparticles.   In  this  case,  a  second  different  strategy  was   used   to   make   the   resulting   UCNPs   water-­‐dispersible,   which   was   based   on   the   ligand  exchange  of   their  capping  agent  (i.e.  oleic  acid)  by  poly-­‐acrylic  acid  (PAA),   see   Figure   III.2.1.4.   This   ligand   exchange   was   carried   out   by   first   removing   the   oleate  from  the  UCNPs'  surface  with  HCl  0.1M.  In  this  step,  the  acidic  media  allows   the  removal  of  oleate  from  the  surface  due  to  the  formation  of  oleic  acid,  which  is   discarded   in   subsequent   washes.   After   this,   the   resulting   bare   UCNPs   are   functionalized  by   the   incorporation  of   a   thin   layer  of   PAA  at  pH=9.  The   fact   that   PAA  is  a  polydentate  ligand  implies  that  once  at  the  surface  of  the  UCNPs,  it  will  be   strongly  attached.  Thus,  the  coating  of  UCNPs  with  a  thin  PAA  layer  is  accompanied   by  certain  advantages:  A  strongly  bound  coating,  good  colloidal  stability  in  water,   and  the  presence  of  carboxylic  acid  groups  to  eventually  graft  the  ssDNA  capture   probes  by  Sulfo-­‐NHS/EDC  coupling.                  III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction     133                             Figure   III.2.1.4.   Coating   of   UCNPs   with   a   thin   PAA   layer.   First,   the   hybrophobic   UCNPs  (A)  are  treated  with  an  HCl  solution  to  remove  oleic  acid  from  their  surface.   Then,   the  resulting  bare  UCNPs  (B)  are  added   to  a  solution  of  PAA  (pH=9).  After   incubation,  the  PAA-­‐coated  UCNPs  are  obtained  (C).       Once   the   UC-­‐labels   were   obtained   by   Sulfo-­‐NHS/EDC   coupling,   two   different   heterogeneous  assays  were  developed  and  studied.   In   "publication   4",   a   target-­‐induced   ligation   strategy   based   on   a   Cu-­‐free   click   chemistry   reaction   was   explored.   This   reaction   takes   advantage   of   the   strain   contained   within   the   alkyne   moiety   of   a   dibenzocyclooctine   (DBCO)   group   to   increase   its   reactivity   towards   azide   groups   (N3),   without   requiring   catalyzers.   This  kind  of  reaction   is  known  as  a  "strain  promoted  alkyne-­‐azide  cycloaddition"   or  "SPAAC",  and  results  in  the  formation  of  a  covalent  bond  between  both  groups   by   yielding   a   triazole   ring   as   product   (see   Figure   III.2.1.5).   SPAAC   reactions   are   superior  to  other  kind  of  chemistries  due  to  their  interesting  advantages:  they  are   bioorthogonal  as  they  only  occur  by  the  reaction  of  DBCO  and  N3  while  being  inert   to   functional   groups   commonly   present   in   biological   systems   such   as   amines,   thiols,  carboxylic  acids,  etc.  They  are  considered  non-­‐toxic,  they  cannot  be  digested   by   common   cellular   enzymes,   do   not   require   catalyzers,   do   not   generate   by-­‐ products,   and   occur   at   room   temperature.2   When   these   functional   groups   are   incorporated  to  DNA  capture  probes,  a  complementary  sequence  can  be  used  as  a   "template"   to   hold   the   DNA   sequences,   forcing   the   DBCO   and   N3   groups   to   face   each   other   (see   Figure   III.2.1.5).   This   results   in   a   specific   ligation   of   the   probes   containing   these   reactive   groups,   as   the   reaction   rate   between   DBCO   and   N3   accelerates  by  several  orders  of  magnitude  under  these  conditions.3–5  Thus,  the  use   III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction       134   of   this   templated-­‐SPAAC   could   be   used   to   improve   even  more   the   sensitivity   of   bioassays   that   already   employ  UC-­‐labels:  Harsh  washes   could   be   used   to   reduce   the   background   signal   coming   from   non-­‐specifically   bound   UC-­‐labels,   while   the   specific  signal  formed  upon  ligation  would  be  conserved  due  to  the  presence  of  the   covalent  bond.                                           Figure   III.2.1.5.   Scheme   of   the   oligonucleotide   detction   assay   based   on   the   template-­‐promoted   SPAAC.   In   the   presence   of   the   target   sequence   the   SPAAC   occurs,   yielding  UCNPs   covalently   functionalized  with   biotin.  Upon   incubation   in   streptavidin-­‐coated  microwells,  the  resulting  biotinylated  UCNPs  are  captured  and   subsequently  washed  to  remove  the  non-­‐specific  bound  labels.       To   test   this   hypothesis,   a   novel   oligonucleotide   detection   assay   was   developed   using   the  DNA-­‐analogue  of   a   small  RNA  sequence  as   the   target,  which   is   specific   from  a   ribosomal   subunit   of   plasmodium   falciparum.  This   sequence   acted   as   the   template   that   allowed   the   specific   ligation   of   the   capture   probes   (see   Figure   III.2.1.5).  The  assay  was  revealed  by  using  streptavidin  (SA)  coated  microwells,  in   which  the  biotinylated  ligated-­‐products  could  be  trapped  and  washed  in  order  to   remove  the  non-­‐specifically  bound  labels  before  reading  the  bottom  of  the  wells.     A   similar   approach   was   used   in   "publication   5"   to   develop   a   highly   sensitive   detection  assay.  In  this  work,  the  specific  formation  of  a  covalent  bond  between  the              III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction     135   capture  probes  in  the  presence  of  a  target  sequence  was  also  pursued,  in  order  to   achieve   high   sensitivity   by   exploiting   the   aforementioned   strategy.   However,   instead  of  the  SPAAC,  a  photochemical  ligation  reaction  between  the  DNA  capture   probes   produced   by   365   nm   light   was   tested.6,7   The   presence   of   a   special   photoactivatable   nucleotide   in   one   of   the   capture   probes   is   required   for   this   photochemical   ligation   to   occur,   being   5'carboxyvinyl-­‐2'-­‐deoxyuridine   (cvU)   the   one  used  in  this  work.  This  nucleotide  has  a  chemical  modification  compared  with   the   natural   deoxyuridine   (Figure   III.2.1.6.),   which   allows   it   to   absorb   365   nm   photons   and   subsequently   react   with   a   close   cytidine   or   thymidine   via   a   2+2   cycloaddition,  see  Figure  III.2.1.7.                       Figure   III.2.1.6.   Nucleotide   structures.   A)   Synthetic   photoactivatable   nucleotide:   5'carboxyvinyl-­‐2'-­‐deoxyuridine   (cvU).   The   photoactivatable/reactive   group   is   marked  in  red.  B)  Naturally  occurring  nucleotide:  2'-­‐deoxiuridine.             This   photochemical   reaction   is   very   specific:   It   requires   a   DNA/RNA   sequence   acting   as   template   to   progress,   as   upon  hybridization   this   target   sequence   holds   the  cytidine  located  at  the  3'  end  of  the  UC-­‐label  in  a  way  that  faces  the  cvU  located   at  the  5'  end  of  a  second  probe.  Besides,  the  photoactivatable  group  also  requires  a   specific   spatial   configuration   towards   the   cytidine/thymidine   in   order   to   react,   which  is  favored  during  hybridization  and  makes  this  reaction  very  target-­‐specific.   In  addition,  as  photochemical  ligation  depends  on  the  irradiation  with  365  nm  light   it   can  be   started  and  stopped  at  will,  permitting  a   tighter   control  of   the   reaction   progress.     III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction       136                     Figure   III.2.1.7.  Photochemical   ligation.  The  photoactivatable  nucleotide   (cvU),  R2,   reacts  with  a  close  Cytidine  (or  Thymidine),  R1,  via  a  2+2  cycloaddition  upon  365   nm   UV   irradiation.   This   photochemical   ligation   results   in   the   formation   of   a   cyclobutane  (i.e.  covalent  bond)  between  R1  and  R2,  marked  in  red.       The   fact   that   the   photochemical   ligation   proceeds   under   365   nm   excitation,   and   that  UCNPs  doped  with  Yb3+  and  Tm3+  also  exhibit  an  upconverted  emission  peak   at  365  nm  when  excited  at  980  nm,   led  us   to  study   if   the  photochemical   ligation   could   be   locally   carried   out   at   the   surface   of   the   UCNPs   using   980   nm   as   the   external  excitation  source  (see  Figure  III.2.1.8).                                   Figure  III.2.1.8.  NIR  Photochemical  ligation  mechanism:  upon  980  nm  external   excitation  UC-­‐labels  act  as  the  local  source  of  365  nm  photons.                III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction     137   As  a  way  to  evaluate  the  feasibility  of  this  new  way  to  carry  out  the  photochemical   ligation  of   the  DNA  capture  probes   in   the  presence  of  a   target  sequence,   the  980   nm  laser  used  as  external  source  was  focused  on  the  bottom  of  streptavidin-­‐coated   microwells,   where   the   hybridized   complexes   formed   by   the   UC-­‐labels,   the   biotinylated  probe  and  the  target  had  been  previously  captured.     The  fact  that  the  laser  photons  can  be  concentrated  in  a  small  spot  at  the  bottom  of   the   microwells   is   of   interest,   as   it   opens   the   possibility   to   carry   out   the   photochemical  ligation  at  known  spatial  coordinates.  This  photoligated  spot  could   then  be  easily  revealed  by  performing  a  wash  using  denaturing  conditions,  which   would   led   to   the   removal   of   UCNPs   from   the   wells   except   for   those   from   the   photoligated  spot  (see  Figure  III.2.1.9).                         Figure   III.2.1.9.   Top   view   of   microwell   during   photochemical   ligation   using   UC-­‐ labels  as  local  365  nm  light  source.  The  complexes,  formed  by  hybridization  of  the   UC-­‐label  and  the  biotinylated  probe  with  the  target  sequence,  are  first  captured  at   the  bottom  of  the  SA-­‐coated  microwells.  Then,  a  980  nm  laser  beam  is  focused  at  a   region  of  the  microwell  bottom,  to  carry  out  the  photochemical  ligation  at  that  spot   using   the   upconverted   365   nm   emission   from   the   captured   UC-­‐labels.   After   a   denaturing  NaOH  wash,  the  non-­‐photochemically  ligated  complexes  are  removed,   while  the  photochemically  ligated  spot  is  revealed.       Interestingly,   this   strategy   would   make   it   possible   to   draw   patterns   of   photochemically  ligated  UC-­‐labels,  using  the  bottom  of  the  wells  as  canvas  (Figure   III.2.1.10).   The   fact   that   the   spatial   coordinates   where   the   laser   irradiation   has   taken   place   are   known   in   advance   implies   that   the   presence   of   an   "intensity   pattern"  may  serve  as  a  way  to  prove  the  presence  of  a  targeted  sequence.       III.2.1  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Introduction       138                     Figure  III.2.1.10.  Target-­‐dependent  formation  of  patterns  upon  NIR-­‐photoligation.   After   denaturing   the   non-­‐photoligated   complexes   and   reading   the   bottom  of   the   microwell,  the  intensity  pattern  appears.         As  a  final  remark,   it   is  worth  saying  that  this  strategy  permits  the  specific  spatial   functionalization  of  a  surface,   in  this  case  the  bottom  of  the  microwell,  which  can   be   exploited   for   different   applications   such   as   the   development   of   arrays   or   to   confer  different  spatial  functionalities  by  using  NIR  light  as  external  stimuli.           References       (1)     Päkkilä,   H.;   Ylihärsilä,  M.;   Lahtinen,   S.;   Hattara,   L.;   Salminen,  N.;   Arppe,   R.;   Lastusaari,  M.;   Saviranta,   P.;   Soukka,   T.   Quantitative   Multianalyte   Microarray   Immunoassay   Utilizing   Upconverting  Phosphor  Technology.  Anal.  Chem.  2012,  84,  8628.   (2)     Jewett,  J.  C.;  Bertozzi,  C.  R.  Cu-­‐Free  Click  Cycloaddition  Reactions  in  Chemical  Biology.  Chem.   Soc.  Rev.  2010,  39,  1272.   (3)     Shelbourne,  M.;  Chen,  X.;  Brown,  T.;  El-­‐Sagheer,  A.  H.  Fast  Copper-­‐Free  Click  DNA  Ligation   by   the   Ring-­‐Strain   Promoted  Alkyne-­‐Azide   Cycloaddition  Reaction.  Chem.  Commun.  2011,   47,  6257.   (4)     Heuer-­‐Jungemann,  A.;  Kirkwood,  R.;  El-­‐Sagheer,  A.  H.;  Brown,  T.;  Kanaras,  A.  G.  Copper-­‐Free   Click  Chemistry  as  an  Emerging  Tool   for   the  Programmed  Ligation  of  DNA-­‐Functionalised   Gold  Nanoparticles.  Nanoscale  2013,  5,  7209.   (5)     Heuer-­‐jungemann,  A.;  Kiessling,  L.;  Stratakis,  E.;  Kymakis,  E.;  El-­‐sagheer,  A.  H.;  Kanaras,  A.  G.   Programming  the  Assembly  of  Gold  Nanoparticles  on  Graphene  Oxide  Sheets  Using  DNA  †.  J.   Mater.  Chem.  C  2015,  3,  9379.   (6)     Nakamura,  S.;  Ogasawara,  S.;  Matuda,  S.;  Saito,  I.;  Fujimoto,  K.  Template  Directed  Reversible   Photochemical  Ligation  of  Oligodeoxynucleotides.  Molecules  2011,  17,  163.   (7)     Yoshimura,   Y.;   Noguchi,   Y.;   Sato,  H.;   Fujimoto,   K.   Template-­‐Directed  DNA  Photoligation   in   Rapid  and  Selective  Detection  of  RNA  Point  Mutations.  ChemBioChem  2006,  7,  598.                         III.2.3     Oligonucleotide  sensor  based   on  selective  capture  of   upconversion  nanoparticles   triggered  by  target-­‐induced   DNA  interstrand  ligand   reaction       (Publication  4)                    https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.7b00575                                            III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     141                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       142                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     143                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       144                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     145                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       146                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     147                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       148                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     149                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       150                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     151                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       152                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     153                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       154                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     155                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       156                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     157                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       158                                                                                                              III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4     159                                                                                                     III.2.3  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  4       160                                                                                                                           III.2.4     Photochemical  ligation  to   ultrasensitive  DNA  detection   with  upconverting   Nanoparticles     (Publication  5)                          https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b03106                                                                  III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5     163                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       164                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       165                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       166                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       167                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       168                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       169                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       170                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       171                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       172                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       173                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       174                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       175                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       176                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       177                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       178                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       179                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       180                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       181                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       182                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       183                                                                             III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       184                                                                                                              III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5     185                                                                                                     III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5       186                                                                                                            III.2.4  Innovative  strategies  for  heterogeneous  assays  with  UC-­‐labels  -­‐  Publication  5     187     III.2.5  Conclusions       -­‐   The   successful   target-­‐induced   ligation   between   the   capture   probes   has   been   demonstrated  by  using  both  SPAAC,   and   the  photochemical   ligation  mediated  by   cvU.     -­‐  Both  strategies  have  shown  specificity,  as  low  background  signals  were  obtained   in  the  absence  of  the  target  sequence.     -­‐  These   target-­‐induced   ligation   strategies  allowed   the   improvement  of   the  Sg/Bg   ratio   upon   harsh   or   repeated   washes,   leading   to   the   development   of   highly   sensitive  heterogeneous  assays.     -­‐   The   SPAAC   strategy   has   demonstrated   potential   for   quick   and   sensitive   assays   (LOD  ∼  100  fM),  which  could  be  ideally  applied  in  POC  detection  platforms.         -­‐  Although  not  so  straightforward  as  SPAAC,  the  use  of  the  photochemical  ligation   strategy  allowed  the  development  of  even  more  sensitive  assays  (21  fM),  as  well  as   controlling  the  moment  at  which  the  ligation  reaction  started  and  stopped.       -­‐   Local   photochemical   ligation   at   the   surface   of   the   UC-­‐labels   using   980   nm   photons  as  external  light  source  has  been  demonstrated.     -­‐   The   possibility   to   control   the   place,   as   well   as   the   amount   of   time   the   photochemical  ligation  takes  place  in  a  flat  surface  was  demonstrated  by  creating   patterns   at   the   bottom   of   microwells.   This   offers   new   possibilities   in   order   to   construct  arrays,  sensors,  and  perform  light-­‐controlled  surface  modifications.                                                                                     IV.  Discussion                                            IV.  Discussion         191   IV)  Discussion   The  synthesis  of  high-­‐quality  UCNPs  has  been  an  important  aim  in  this  thesis  work.   The  fact  that  it  conforms  the  first  step  in  the  nano-­‐construction  of  the  different  UC-­‐ labels  makes  it  essential  to  have  a  tight  synthetic  control  over  it,  as  this  will  further   condition  the  performance  of  the  resulting  reporters.  As  evidenced  in  the  different   publications,   monodisperse   UCNPs   were   obtained   using   the   Ostwald   ripening   method.   This   could   be   achieved   independently   of   the   dopant   nature   and   concentration,   in   spite   of   their   reported   influence   on   crystal   growth   rate   and   nucleation,1    whereas   the  use  of   the  different  activator  Ln3+   ions  (Er3+  and  Tm3+)   allowed  to  control  the  UCNPs  emission  color  (e.g.  green  or  blue).  The  importance   of  monodispersity  when  designing  UC-­‐labels  comes  in  part  from  the  fact  that  these   reporters   experience   a   size-­‐dependent   emission   intensity   and   ratio   between   emission  peaks.2–4  Thus,  when  detecting  minute  amounts  of  labeled  analytes,  and   consequently  of  UC-­‐labels,  differences  in  size  between  the  individual  UCNPs  should   be   avoided.   Apart   from   monodispersity,   the   structural   analyses   showed   that   UCNPs  were  formed  in  β-­‐phase,  which  is  quite  important  in  bioassays  as  it  yields   intense   upconversion   luminescence   and   permits   to   use   relatively   small   particle   sizes  while  keeping  a  good  detectability.    It   is   obvious   that   depending   on   the   detection   strategy   involved,   there   will   be   certain   characteristics   that   may   be   required   from   UC-­‐labels   in   order   to   achieve   good   detection   performances.   In   this   sense,   different   surface   functionalization   were  successfully  implemented  in  this  thesis'  work,  each  possessing  some  desired   characteristics:   controlled   silica   shell   thicknesses   that   acted  as   spacer,   thin   silica   coatings  to  yield  stable  shells  in  order  to  separate  the  UCNPs  from  the  media  and   give   a   solid   support   where   subsequent   covalent   surface   modifications   could   be   easily  performed,  further  functionalization  with  APTES  to  yield  positively  charged   surfaces   and   with   succinic   anhydride   to   give   carboxylic   groups,   or   the   ligand   exchange  of   oleic   acid  with  PAA,  which  directly   yielded   carboxylic   acid  modified   surfaces   as   well   as   moderately   robust   and   thin   coatings.   Besides   these   specific   features,   all   these   surface  modification   strategies   share   that   they   turned   UCNPs   water-­‐dispersible   and   made   possible   their   further   bioconjugation   with   ssDNA   capture  probes,  when  required.   IV.  Discussion         192   As   shown   in   the   section   III.1,   the   combination   of   proper   UC-­‐labels  with   specific   FRET  pairs  has   important   implications  on  the  mechanism  of   the  potential  sensor   and  its  overall  performance.  For  example,  the  use  of  Q-­‐dots  as  acceptors  permits  to   design  sensors  based  on  FRET,  in  which  UCNPs'  luminescence  is  quenched  in  close   proximity   to   Q-­‐dots   while   the   emission   of   the   latter   is   activated   through   this   mechanism   (publication   2).   This  would   allow   using   the   upconversion   quenching   and/or   the   Q-­‐dot   emission   as   transducer   of   the   presence   of   the   targeted   oligonucleotide  sequence.  However,  despite  the  complete  overlap  between  UCNPs'   emission  and  CdTe  Q-­‐dots  absorption,  a  maximum  FRET  efficiency  (E)  of  10%  was   obtained   for   the   thinnest   silica   shell   tested   (3   nm).   After   calculating   a   Förster   radius  of  R0  =  5.5  nm,   the   size  of   the  UCNPs  used   in   the  work   (33  nm)   together   with   their  multi-­‐emitter   nature   (i.e.   the   distribution   of   Er3+   ions  within   the   NP)   arise   as   the   main   limiting   parameters   behind   this   relatively   low   E.   In   fact,   the   theoretical  model  permitted  to  quantify  an  E  much  higher  than  10%  for  Er3+  ions   very   close   to   the  UCNPs'   surface   (i.e.   less   than  5  nm).  This   clearly   indicates   that   total  FRET  efficiencies  higher  than  10%  are  possible  for  systems  based  on  UCNPs  /   CdTe   Q-­‐dots   if   some   strategies,   when   if   not   a   combination   of   them,   are   implemented:   using   small   UCNPs   as   donors   (e.g.   20   nm   in   diameter   or   lower),   using  UCNPs   based   on   an   inert   core   (i.e.  with   no   Ln   doping)   and   an   active   shell   architecture  to  locate  the  majority  of  the  Er3+  close  to  the  surface,  using  a  very  thin   surface   functionalization   (e.g.   less   than  1  nm   if   possible)  when  designing  UCNPs   detection   labels.     On  the  other  hand,  AuNPs  can  not  only  be  used  as  acceptors  in  RET  systems,  but  as   plasmonic  nanostructures   to   increase  upconversion  emissions  due   to   the  Purcell   effect,  which  may  serve  as  a  new  alternative  sensing  mechanism  based  on  target-­‐ induced  luminescence  enhancement.  As  demonstrated  in  publication  3,  the  size  of   the  AuNP  conditions  the  effect  exerted  over  UCNPs'   luminescence  (i.e.  quenching   or  enhancement),  and  to  which  extent  the  luminescence  is  influenced  by  this  effect.     For  example,   small  AuNPs  are  better  quenchers,   finding  an  optimum  size  of  ~14   nm   in   diameter.   Contrary   to   what   occurs   with   UCNPs/Q-­‐dots   pairs,   the   energy   transferred   to   AuNPs   that   produce   quenching   of   upconversion   luminescence   is   dissipated  by  the  acceptor  in  a  non-­‐radiative  way,  and  not  partially  in  the  form  of  a   new  emission  as  it  is  the  case  in  Q-­‐dots.  When  the  AuNPs  size  continue  to  increase,                  IV.  Discussion         193   the   quenching   exerted   over  UCNPs   is   compensated   by   the   enhancement   of   their   emission,   which   results   in   a   decrease   of   effective   quenching   up   to   a   total   compensation  of  both  effects  (i.e.  neither  quenching  or  enhancement  of  emission  is   observed)   for   AuNPs   ranging   40-­‐50   nm   in   size.   Higher   diameters   exert   a   predominant  enhancement  effect  over  UCNPs'  emission  by  increasing  the  radiative   decay.   It   is   important   to   highlight   that   all   these   effects   have   been   found   using   a   constant   separation   between   UCNPs/AuNPs   of   ~4   nm,  which   correspond   to   the   UCNPs   SiO2   shell.   The   maximum   luminescence   quenching   achieved   in   these   conditions  was  around  40%,  thanks  to  the  use  of  AuNPs  of  ~14  nm.  As  pointed  out   in  publication  2,  the  use  of  smaller  UCNPs  may  allow  more  Er3+  ions  to  participate   in   the  RET  process  resulting   in  a  higher  RET  efficiency,  which  may  be  one  of   the   reasons   for   the   relatively   high   quenchings   observed   for   18   nm   UCNPs   in   publication   3.   As   also   suggested   in   publication   2,   the   use   of   thinner   shells   may   further  increase  the  efficiency  of  this  process,  which  should  be  considered  for  the   optimal  design  of  RET  sensors  based  on   the  quenching  of  UCNPs  with  AuNPs.   In   addition,  a   luminescence  enhancement  of  around  30%  was  achieved  with  66  nm   AuNPs.  Noteworthy,  although  not  being  the  optimum  size  for  the  development  of   potential  sensors  based  on  luminescence  enhancement,  it  establishes  a  lower  size   limit  from  which  an  effective  enhancement  can  be  obtained.   As   explained   in   the   work   of   this   thesis,   reducing   background   noise   while   conserving  the  same  levels  of  specific  signal  formed  by  the  presence  of  the  target   can  be  a  way  to   improve  the  Sg/Bg  ratio  and  sensitivity  of  heterogeneous  assays   using  UC-­‐labels.   This   approach  has   been  proposed   to   be  possible   using   a   target-­‐ induced  covalent   ligation  between  the   two  capture  probes  used   for   its  detection:   one   attached   to   the   UCNPs   (UC-­‐label),   and   the   other   containing   a   biotin   modification  in  order  to  subsequently  capture  the  resulting  hybridized  complexes   in  SA-­‐coated  microwells.         In   publication   4   we   studied   a   target-­‐induced   SPAAC   reaction   between   an   N3-­‐ modified  capture  probe,  which  was  attached  to  UCNPs,  and  another  capture  probe   containing  a  DBCO  group  and  a  biotin  modification.  The  formation  of  this  covalent   bond  in  the  presence  of  the  target  was  demonstrated,  by  comparison  with  a  non-­‐ ligated   capture   probe,   using   harsh   washes   (50   mM   NaCl   at   50ºC).   Under   these   conditions,   the   signal   from   the   target   was   conserved   when   using   the   modified   IV.  Discussion         194   probes   (i.e.   the   formation   of   the   covalent   bond   avoided   the   loss   of   signal   upon   harsh  washes),  while  the  signal  dropped  in  the  case  of  the  non-­‐ligated  probes.  On   the  other  hand,  when  no  target  was  present,  the  background  signal  of  the  modified   probes  was  comparable  to  the  background  signal  of  the  non-­‐ligated  ones,  proving   the  specificity  of  the  SPAAC  reaction.  This  strategy  allowed  a  LOD  of  100  fM,  and  it   proceeded   automatically   by   mixing   the   UC-­‐labels,   the   DBCO   containing   biotinylated  probes,  the  sample  containing  the  target,  and  letting  them  to  react  for   a   fixed  amount  of   time.  Due   to   its   simplicity,   it   could  be  easily   implemented   into   automatized   processes   or   other   detection   platforms   (e.g.   lateral-­‐flow   assays),   different   from  the  one  used  in  this  work  (i.e.  microwell  plates).  The  fact  that  this   reaction   is   also   bioorthogonal   implies   that   it   avoids   any   interference   from   molecules   and   functional   groups   normally   present   in   biological   samples.   This   is   very  important,  as  it  potentially  permits  to  detect  the  target  sequences  in  complex   samples  such  as  serum,  bypassing  miRNA  isolation  steps  and  other  sources  of  bias   from  current  well-­‐established  detection/quantification  methods.5   Another  strategy  for  the  target-­‐induced  ligation  of  capture  probes  was  studied  in   "publication  5".  In  this  work,  a  special  capture  probe,  containing  a  photoactivatable   nucleotide  (cvU)  at  the  5'  end  and  a  biotin  modification  at  the  3'  end,  and  another   probe,  attached  to  UCNPs  by  its  5'  end  and  containing  a  cytidine  at  its  3'  end,  were   required.  Upon  hybridization  with   the   target  sequence,   the   cvU   is  hold,   facing   the   cytidine  of  the  other  probe  in  a  specific  spatial  configuration.  In  this  situation,  the   irradiation  with  light  at  365  nm  produced  the  photochemical  ligation  of  the  probes   via   formation   of   a   cyclobutane   group.   In   this   publication,   the   assessment   of   the   photochemical   ligation   rate,   and   the   optimization   of   the   process   were   demonstrated  by   comparison  with   a   traditional   capture  probe.  The  use  of   a   365   nm  centered  LED  as  UV   source  made   it   possible   to   carry  out   this  photochemical   ligation   in   a   relatively   short   period   of   time   (20   min),   while   also   permitting   to   decide   the   moment   at   which   this   reaction   could   be   started/stopped.   This   translated  in  a  time-­‐effective  and  a  tightly  controlled  ligation  of  the  probes,  which   provided  a  LOD  of  21  fM  after  using  repeated  washings  to  reduce  the  background   signal.   In   this  work,  UCNPs  doped  with  Yb3+/Tm3+  were  used.  As   they  exhibit   an   emission   peak   at   365   nm   under   980   nm   excitation,   we   tested   the   feasibility   to   locally   carry  out   the  photochemical   ligation  at   the   surface  of   the  UC-­‐labels  using                  IV.  Discussion         195   this  emission  while  externally  illuminating  at  980  nm.  This  strategy  was  proved  to   be   possible,   allowing   a   new   photochemical   ligation   modality   that   could   be   employed   to   detect   specific   sequences   when   the   more   common   external   UV   sources  could  exert  a  negative  effect  on  the  sample.  Taking  advantage  of  the  use  of   a  980  nm  laser  in  this  modality,  the  beam  was  focused  at  the  bottom  of  SA-­‐coated   microwells   to   photochemically   ligate   the   hybridized   complexes   (previously   captured)   only   at   certain   regions   of   the   wells.   In   this   way,   the   bottom   of   the   microwells  was  used  as  a  canvas,  where  intensity  patterns  could  be  written  in  the   form   of   spots   by   this   photochemical   ligation   strategy   and   later   revealed   by   removing   the   non-­‐ligated   complexes   using   a   denaturalizing   solution   (NaOH).   Parameters   such  as  photochemical   ligation   rate,   irradiation   time,   intensity  of   the   photochemically  ligated  spots,  spatial  localization  of  the  intensity  spots,  spot  shape   and  pattern  formation  could  be  controlled  by  these  means.                                                                                                                         IV.  Discusión                             IV.  Discusión       199   IV)  Discusión     La  síntesis  de  nanopartículas  de  conversión  ascendente  (UCNPs)  de  alta  calidad  ha   sido  un  objetivo  importante  en  este  trabajo  de  tesis.  El  hecho  de  que  ésta  conforma   el  primer  paso  en   la  nano-­‐construcción  de   las  diferentes  etiquetas  de  conversión   ascendente  (UC-­‐labels)  hace  esencial  el  tener  un  estrecho  control  sintético  sobre  la   misma,  ya  que  condicionará  el   funcionamiento  de   las  etiquetas   resultantes.  Tal  y   como   se   ha   demostrado   en   las   diferentes   publicaciones,   se   han   logrado   obtener   UCNPs  monodispersas  mediante  el  método  de  maduración  de  Ostwald.  Esto  se  ha   logrado  con  independencia  de  la  naturaleza  y  la  concentración  del  dopante,  a  pesar   de   su   influencia   sobre   la   velocidad   de   crecimiento   del   cristal   y   su   nucleación,1   mientras  que  el  uso  de  diferentes  iones  Ln3+  activadores  (Er3+  y  Tm3+)  permitió  el   control  del  color  de  la  emisión  de  las  UCNPs  (e.g.  verde  o  azul).  La  importancia  de   la  monodispersidad  durante  el  diseño  de   las  UC-­‐labels  procede,   en  parte,  de  que   estas  etiquetas  experimentan  una  intensidad  de  emisión  y  un  ratio  entre  picos  que   depende   del   tamaño   de   partícula.2–4   Así,   al   detectar   cantidades   minúsculas   de   analitos   etiquetados,   y   por   tanto   de   UC-­‐labels,   diferencias   en   tamaño   entre   las   UCNPs   deberían   ser   evitadas.   Aparte   de   la   monodispersidad,   los   análisis   estructurales   mostraron   que   las   UCNPs   estaban   formadas   por   fase-­‐β,   lo   cual   es   bastante   importante   para   los   bioensayos,   ya   que   permite   usar   tamaños   de   partícula  relativamente  pequeños  mientras  se  mantiene  una  buena  detectabilidad.     Es  obvio  que,  dependiendo  de  la  estrategia  de  detección  involucrada,  habrá  ciertas   características   que   serán   requeridas   por   parte   de   las   UC-­‐labels   para   obtener   un   funcionamiento   óptimo  durante   la   detección.   En   este   sentido,   en   este   trabajo   de   tesis   se   implementaron   satisfactoriamente   diferentes   funcionalizaciones   superficiales,   cada   una   poseyendo   características   deseadas:   Recubrimientos   de   sílice   de   espesores   controlados   usados   como   espaciadores,   espesores   de   sílice   delgados   para   dar   recubrimientos   estables   con   el   objetivo   de   separar   las  UCNPs   del   medio   y   dar   lugar   a   un   soporte   sólido   donde   se   pudieran   llevar   a   cabo   subsiguientes  modificaciones   superficiales   covalentes,   posterior   funcionalización   con   APTES   para   dar   lugar   a   superficies   cargadas   positivamente   y   con   anhídrido   succínico  para  dar  grupos  carboxílicos,  o  el  intercambio  de  ligando  de  ácido  oleico   con  PAA,  el  cual  dio  directamente  superficies  modificadas  con  ácidos  carboxílicos   IV.  Discusión         200   así   como   recubrimientos   relativamente   finos   y   robustos.   Además   de   estas   características   específicas,   todas   estas   estrategias   de   modificación   superficial   comparten   que   permitieron   a   las   UCNPs   ser   dispersables   en   agua   e   hicieron   posible   su   posterior   bioconjugación   con   sondas   de   captura   de   ssDNA   (DNA   monocateario),  cuando  fue  requerido.     Tal   como   se   ha   mostrado   en   la   sección   III.1,   la   combinación   de   UC-­‐labels   apropiadas   con   parejas   FRET   específicas   tiene   importantes   implicaciones   en   el   mecanismo  del  potencial  sensor  y  su  óptimo  funcionamiento  global.  Por  ejemplo,   el   uso   de   puntos   quánticos   (Q-­‐dots)   como   aceptores   permite   diseñar   sensores   basados   en   FRET   en   los   que   la   luminiscencia   de   las   UCNPs   es   desactivada   en   cercana   proximidad   a   los   Q-­‐dots,   mientras   que   la   emisión   de   estos   últimos   es   activada   a   través   de   este   mecanismo   (publicación   2).   Esto   permitiría   usar   la   desactivación   de   la   conversión   ascendente   y/o   la   emisión   del   Q-­‐dot   como   transductor   de   la   presencia   de   la   secuencia   del   oligonucleótido   buscado.   Sin   embargo,   a   pesar   del   completo   solapamiento   entra   la   emisión  de   las  UCNPs   y   la   absorbancia  de  los  Q-­‐dots  de  CdTe,  se  obtuvo  una  eficiencia  de  FRET  (E)  máxima   del  10%  para  el  recubrimiento  de  sílice  más  delgado  que  fue  testado  (3  nm).  Tras   calcular  un  radio  de  Förster  de  R0  =  5.5  nm,  el  tamaño  de  las  UCNPs  usadas  en  este   trabajo   (33   nm),   junto   con   su   naturaleza   de  multi-­‐emisor   (i.e.   la   distribución   de   iones   de   Er3+   dentro   de   la   NP),   destaca   como   el   principal   parámetro   limitante   detrás   de   esta   E   relativamente   baja.   De   hecho,   el   modelo   teórico   permitió   cuantificar   una   E   mucha   mayor   al   10%   para   iones   de   Er3+   muy   cercanos   a   la   superficie   de   las   UCNPs   (i.e.   menos   de   5   nm).   Esto   indica   claramente   que   son   posibles  eficiencias   totales  de  FRET  superiores  al  10%  para  sistemas  basados  en   UCNPs/Q-­‐dots  de  CdTe  si  algunas  estrategias,  cuando  no  una  combinación  de  ellas,   son   implementadas:   usar   UCNPs   pequeñas   como   donadores   (e.g.   de   20   nm   de   diámetro  o  menos),  usar  UCNPs  con  una  arquitectura  basada  en  un  núcleo  inerte   (i.e.   sin   dopado   con   Ln)   y   un   recubrimiento   activo   para   situar   la  mayoría   de   los   iones   de   Er3+   cerca   de   la   superficie,   usar   una   funcionalización   superficial   muy   delgada   (e.g.   menos   de   1   nm   si   es   posible)   cuando   se   diseñen   las   UCNPs   como   etiquetas  para  detección.   Por  otro  lado,  las  AuNPs  pueden  no  solamente  usarse  como  aceptores  en  sistemas   RET   sino   como   nanoestructuras   plasmónicas   para   incrementar   las   emisiones   de       IV.  Discusión       201   conversión   ascendente   debido   al   efecto   Purcell,   lo   cual   puede   servir   como   un   mecanismo   nuevo   y   alternativo   de   detección   basado   en   el   aumento   de   luminiscencia   inducido   por   la   diana.   Como   se   demostró   en   la   publicación   3,   el   tamaño   de   la   AuNP   condiciona   el   efecto   ejercido   sobre   la   luminiscencia   de   las   UCNPs  (i.e.  desactivación  o  incremento),  y  hasta  que  punto  la  luminiscencia  se  ve   afectada   por   este   efecto.   Por   ejemplo,   AuNPs   pequeñas   son   mejores   desactivadores,   encontrando   un   tamaño   óptimo   de   ~14   nm   de   diámetro.   Al   contrario   de   lo   que   ocurre   con   pares   UCNPs/Q-­‐dots,   la   energía   transferida   a   las   AuNPs  que  produce  la  desactivación  de  la  luminiscencia  de  conversión  ascendente   es  disipada  por  el  aceptor  de  manera  no  radiativa,  y  no  parcialmente  en  forma  de   una  nueva  emisión  como  es  el  caso  de  los  Q-­‐dots.  Cuando  el  tamaño  de  las  AuNPs   continúa  incrementando,  la  desactivación  ejercida  sobre  las  UCNPs  es  compensada   por   el   incremento   de   su   emisión,   lo   que   resulta   en   una   reducción   efectiva   de   la   desactivación  hasta  una  compensación  total  de  ambos  efectos  (i.e.  no  se  observa  ni   desactivación  ni  incremento  de  la  emisión)  para  AuNPs  de  tamaños  en  el  rango  40-­‐ 50   nm.   Tamaños  mayores   ejercen   predominantemente   un   efecto   de   incremento   sobre   la   emisión   de   las   UCNPs   debido   al   aumento   del   decaimiento   radiativo.   Es   importante   destacar   que   todos   estos   efectos   se   han   encontrado   usando   una   separación   constante   entre   UCNPs/AuNPs   de   ~4   nm,   que   corresponde   con   el   grosor   del   recubrimiento   de   SiO2   de   las   UCNPs.   La   máxima   desactivación   de   la   luminiscencia  obtenida  en  estas  condiciones   fue  de  alrededor  del  40%,  gracias  al   uso  de  AuNPs  de  ~14  nm.  Tal  y  como  se  indicó  en  la  publicación  2,  el  uso  de  UCNPs   más   pequeñas   permitiría   a   un   mayor   número   de   iones   de   Er3+  participar   en   el   proceso  RET,  resultando  en  una  eficiencia  de  RET  mayor,  lo  cual  puede  ser  una  de   las   razones   por   las   que   se   observaron   desactivaciones   relativamente   altas   para   UCNPs  de  18  nm  en  la  publicación  3.  Como  también  se  sugirió  en  la  publicación  2,   el   uso   de   recubrimientos  más   delgados   podría   incrementar   la   eficiencia   de   este   proceso,   lo  cual  debería  ser   tenido  en  cuenta  para  un  diseño  óptimo  de  sensores   RET  basados  en  la  desactivación  de  UCNPs  con  AuNPs.  Adicionalmente,  se  obtuvo   un  incremento  de  la  luminiscencia  de  en  torno  a  un  30%  con  AuNPs  de  66  nm.  Es   de   destacar   que,   aunque   éste   no   es   el   tamaño   óptimo   para   el   desarrollo   de   potenciales   sensores   basados   en   incremento   de   la   luminiscencia,   establece   un   IV.  Discusión         202   límite   de   tamaño   inferior   a   partir   del   cual   se   puede   conseguir   un   incremento   efectivo.     Como   se   ha   explicado   en   esta   tesis,   reducir   el   ruido   de   fondo   a   la   vez   que   conservando  los  mismos  niveles  de  señal  específica  formados  por  la  presencia  de   la  secuencia  diana  puede  ser  una  forma  de  mejorar  la  relación  señal/ruido  (Sg/Bg   ratio)   y   la   sensibilidad   de   los   ensayos   heterogéneos   que   usan   UC-­‐labels.   Se   ha   propuesto   que   este   enfoque   podría   ser   posible   usando   una   ligación   covalente,   inducida   por   secuencia   diana,   entre   las   dos   sondas   de   captura   usadas   para   su   detección:   una   enganchada   a   las   UCNPs   (UC-­‐labels),   y   la   otra   conteniendo   una   biotina  como  modificación,  para  capturar  de  manera  subsiguiente   los  resultantes   complejos  hibridados  en  micropocillos  recubiertos  con  estreptavidina  (SA).  En   la   publicación   4   se   estudió   el   uso   de   una   reacción   SPAAC,   mediada   por   secuencia   diana,   entre   una   sonda   de   captura   modificada   con   N3   (la   cuál   fue   unida   a   las   UCNPs),  y  otra  sonda  de  captura  que  contenía  un  grupo  DBCO  y  una  modificación   de   biotina.   La   formación   de   este   enlace   covalente   en   presencia   de   la   secuencia   diana  se  demostró,  mediante  su  comparación  con  una  sonda  de  captura  no  ligada,   usando   lavados   fuertes   (50   mM   NaCl   a   50ºC).   En   estas   condiciones,   la   señal   proveniente   de   la   secuencia   diana   se   conservó   cuando   se   usaron   las   sondas   modificadas   (i.e.   la   formación   del   enlace   covalente   evitó   la   pérdida   de   señal   durante  los  lavados  fuertes),  mientras  que  la  señal  cayó  en  el  caso  de  las  sondas  no   ligadas.  Por  otro   lado,  cuando   la  secuencia  diana  no  estaba  presente,   la  señal  del   ruido  de  fondo  de  las  sondas  modificadas  fue  comparable  a  la  del  ruido  de  fondo  de   las  hebras  no  ligadas,  probando  la  especificidad  de  la  reacción  SPAAC.   Esta  estrategia  permitió  un  LOD  de  100  fM,  y  ocurre  automáticamente  mezclando   las  UC-­‐labels,  las  hebras  biotiniladas  que  contienen  DBCO,  la  muestra  conteniendo   la   secuencia   diana   y   dejándolas   reaccionar   durante   una   cantidad   de   tiempo   fija.   Debido   a   su   simplicidad,   ésta   podría   implementarse   fácilmente   en   procesos   automatizados  u  otras  plataformas  de  detección  (e.g.  Tiras  de  ensayo),  diferentes   de   la   usada   en   este   trabajo   (i.e.   placas   de   multipocillos).   El   hecho   de   que   esta   reacción  también  es  bioortogonal   implica  que  evita  cualquier   interferencia  de   las   moléculas  y  grupos  funcionales  que  están  normalmente  presentes  en  las  muestras   biológicas.   Esto   es   muy   importante,   ya   que   ello   permite   potencialmente   la   detección  de  secuencias  diana  en  muestras  como  el  suero,  sorteando  los  pasos  de       IV.  Discusión       203   aislamiento   de   miRNA   y   otras   fuentes   de   sesgo   típicos   de   métodos   de   detección/cuantificación  actuales  y  bien  establecidos.5     Otra  estrategia  para  la  ligación  inducida  por  secuencia  diana  de  sondas  de  captura   fue  estudiada  en   la   "publicación  5".  En  este   trabajo,   se   requirieron  una  sonda  de   captura  especial,  que  contenía  un  nucleótido  fotoactivable  (cvU)  en  el  extremo  5'  y   una   biotina   en   el   extremo   3',   así   como   otra   sonda,   unida   a   las   UCNPs   por   su   extremo   5'   y   conteniendo   una   citidina   en   su   extremo   3'.   Al   hibridar   con   la   secuencia  diana,  el  cvU  se  mantiene  encarado  a  la  citidina  de  la  otra  sonda  con  una   configuración  espacial  específica.  En  esta  situación,  la  irradiación  con  luz  a  365  nm   produjo  la   ligación  fotoquímica  de  las  sondas  mediante  la  formación  de  un  grupo   ciclobutano.   En   esta   publicación,   la   evaluación   de   la   tasa   de   fotoligación,   y   la   optimización   del   proceso   fueron   demostrados  mediante   la   comparación   con   una   sonda  de  captura  tradicional.  El  uso  de  un  LED  centrado  a  365  nm  como  fuente  de   excitación  hizo  posible   la   ligación   fotoquímica   en  un   tiempo   relativamente   corto   (20  min),  mientras  permitió  controlar  el  momento  al  cual  esta  reacción  podría  ser   empezada/terminada.   Esto   se   tradujo   en   una   ligación   rápida   y   altamente   controlada  de  las  sondas,  lo  cual  finalmente  permitió  obtener  un  LOD  de  21  fM  tras   usar   lavados   repetidos  para   reducir   la   señal   de   fondo.  En   este   trabajo   se  usaron   UCNPs  dopadas  con  Yb3+/Tm3+.  Debido  a  que  éstas  exhiben  un  pico  de  emisión  a   365  nm  cuando  se  excitan  a  980  nm,  se  investigó  también  la  viabilidad  de  llevar  a   cabo   la   ligación   fotoquímica   localmente   en   la   superficie   de   las   UC-­‐labels   usando   esta   emisión   mientras   se   iluminaba   externamente   a   980   nm.   Esta   estrategia   demostró   ser  posible,   permitiendo  una  nueva  modalidad  de   ligación   fotoquímica   que   podría   ser   usada   para   detectar   secuencias   específicas   cuando   las   fuentes   externas   de  UV,  más   comunes,   puedan   ejercer   un   efecto   negativo   en   la  muestra.   Aprovechando  el  uso  de  un  láser  a  980  nm  en  esta  modalidad,  se  focalizó  el  haz  en   el   fondo   de   micropocillos   recubiertos   con   SA   para   ligar   fotoquímicamente   los   complejos  hibridados  (capturados  previamente)  solamente  en  ciertas  regiones  de   los  pocillos.  De  esta  forma,  el  fondo  de  los  pocillos  se  usó  como  un  "lienzo",  donde   se   pudieron   grabar   patrones   de   intensidad   en   forma   de   puntos   mediante   esta   estrategia   de   fotoligación   fotoquímica,   y   revelarse   posteriormente   mediante   la   eliminación   de   los   complejos   no   ligados   usando   una   solución   desnaturalizante   (NaOH).  Parámetros  como  la  tasa  de  ligación  fotoquímica,  el  tiempo  de  irradiación,   IV.  Discusión         204   la   intensidad  de   los   puntos   ligados   fotoquímicamente,   la   localización   espacial   de   los   puntos   de   intensidad,   la   forma   de   los   puntos   y   la   formación   de   patrones   pudieron  ser  controlados  por  estos  medios.                                                                   IV.  Discusión       205       References       (1)     Kale,   V.;   Lastusaari,   M.;   Hölsä,   J.;   Soukka,   T.   Intense   UV   Upconversion   through   Highly   Sensitized  NaRF4:Tm  (R:Y,Yb)  Crystals.  RSC  Adv.  2015,  5,  35858.   (2)     Wang,  F.;  Wang,  J.;  Liu,  X.  Direct  Evidence  of  a  Surface  Quenching  Effect  on  Size-­‐Dependent   Luminescence  of  Upconversion  Nanoparticles.  Angew.  Chemie  Int.  Ed.  2010,  49,  7456.   (3)     Schietinger,  S.;  Menezes,  L.  de  S.;  Lauritzen,  B.;  Benson,  O.  Observation  of  Size  Dependence  in   Multicolor  Upconversion   in  Single  Yb  3+   ,  Er  3+  Codoped  NaYF  4  Nanocrystals.  Nano  Lett.   2009,  9,  2477.   (4)     Lim,  S.  F.;  Ryu,  W.  S.;  Austin,  R.  H.  Particle  Size  Dependence  of   the  Dynamic  Photophysical   Properties  of  NaYF_4:Yb,  Er  Nanocrystals.  Opt.  Express  2010,  18,  2309.   (5)     Chugh,  P.;  Dittmer,  D.  P.  Potential  Pitfalls  in  microRNA  Profiling.  Wiley  Interdiscip.  Rev.  RNA   2012,  3,  601.                                                                                                                                     V.  Conclusions                                                     V.  Conclusions     209   V)  Conclusions     -­‐  Monodisperse  β-­‐NaYF4  nanoparticles  doped  with  Yb3+/Er3+  and  Yb3+/Tm3+  pairs   for   red/green   and   blue/UV   emissions,   respectively,   have   been   synthesized   and   characterized.     -­‐   Successful   implementation   of   different   surface   functionalization   of   UCNPs  was   demonstrated:   growth   of   robust   silica   shells   with   controlled   thicknesses,   successive   surface   modifications   with   APTES   and   succinic   anhydride,   ligand   exchange  of  oleic  acid  with  PAA  to  yield  a  relatively  thin  and  robust  coating.  These   strategies  eventually  yielded  UCNPs  ready  for  bioconjugation.     -­‐   Water-­‐dispersible   UCNPs,   modified   by   either   of   the   aforementioned   methods,   were   successfully   bioconjugated   with   traditional   or   modified   ssDNA   probes,   yielding   UC-­‐labels   with   different   functionalities   depending   on   the   detection   strategy  involved.         -­‐   Fundamental   studies   of   UCNPs/CdTe  Q-­‐dots   FRET   pairs   permitted   to   calculate   the  Förster   radius   (R0  =  5.5  nm)  and   find  general  guidelines   to  develop  effective   sensors:   small   and   efficient   UCNPs,   inert   core/active   shell   UCNPs   architectures,   thin  surface  functionalization.       -­‐   Systematic   studies   on   the   effect   of   AuNP   size   on   UCNPs'   luminescence   have   revealed   that   an   optimum   quenching   can   be   obtained   for   ~14   nm   AuNPs,   compensation   between   quenching   and   enhancement   (i.e.   almost   no   effect   on   luminescence)   occurs   in   the   40-­‐50   nm   range,   and   luminescence   enhancement   is   predominant  for  ~66  nm  and  higher  diameters.     -­‐  The  target-­‐induced  ligation  of  capture  probes  was  successfully  achieved  using  a   SPAAC   reaction.   The   assay   developed   using   this   strategy   permitted   to   directly   detect  a  small  RNA  sequence  of  the  Plasmodium  falciparum  ribosomal  subunit  with   a  LOD  =  100  fM.   V.  Conclusions       210     -­‐   The   use   of   a   target-­‐induced   photochemical   ligation  was   used   to   build   a   highly   sensitive  sensor  for  the  direct  detection  of  a  DNA-­‐analogue  of  the  potential  breast   cancer   biomarker   miR-­‐195.   Its   LOD   was   21   fM,   which   is   already   within   the   concentration  range  of  low  to  moderately  abundant  miRNAs  in  serum.     -­‐  The  emission  at  365  nm   from  Yb3+/Tm3+  doped  UCNPs  under  980  nm  external   excitation  was  used  to  perform  local  photochemical  ligations  at  the  surface  of  the   UC-­‐labels.  The  potential  of  this  strategy  for  detection  and  patterning  purposes  was   demonstrated.                                                                                                   V.  Conclusiones                           V.  Conclusiones       213   V)  Conclusiones       -­‐   Se   han   sintetizado   y   caracterizado   nanopartículas   monodispersas   de   β-­‐NaYF4   dopadas   con   parejas   de   Yb3+/Er3+   e   Yb3+/Tm3+   para   emisiones   en   rojo/verde   y   azul/UV,  respectivamente.     -­‐   Se   ha   demostrado   la   implementación   exitosa   de   diferentes   estrategias   de   funcionalización  superficial  de  UCNPs:  El  crecimiento  de    revestimientos  robustos   de   sílice   de   grosores   controlados,   modificaciones   superficiales   sucesivas   con   APTES  y  anhídrido  succínico,  intercambio  de  ligando  de  ácido  oleico  con  PAA  para   producir   un   recubrimiento   relativamente   fino   y   robusto.   Estas   estrategias   produjeron  UCNPs  preparadas  finalmente  para  su  bioconjugación.     -­‐   Las   UCNPs   dispersables   en   agua,   modificadas   por   alguno   de   los   métodos   anteriores,   fueron   bioconjugadas   satisfactoriamente   con   sondas   de   ssDNA   tradicionales   o   modificadas,   dando   lugar   a   UC-­‐labels   con   diferentes   funcionalidades  dependiendo  de  las  estrategia  de  detección  involucrada.     -­‐  Estudios   fundamentales  de   los  pares  FRET  UCNPs/Q-­‐dots  de  CdTe  permitieron   calcular   su   radio   de   Förster   (R0   =   5.5   nm)   y   encontrar   guías   generales   para   desarrollar   sensores   efectivos:   UCNPs   pequeñas   y   eficientes,   arquitecturas   de   UCNPs   tipo   núcleo   inactivo/recubrimiento   activo,   funcionalización   superficial   delgada.     -­‐  Estudios  sistemáticos  sobre  el  efecto  del  tamaño  de  las  AuNPs  en  la  luminiscencia   de   las  UCNPs  han   revelado  que   se  puede  obtener  una  desactivación  máxima  con   AuNPs  de  ~14  nm,  una  compensación  entre  desactivación  e   incremento   (i.e.   casi   ningún  efecto  en  la  luminiscencia)  ocurre  en  el  rango  40-­‐50  nm,  y  un  incremento   de  la  luminiscencia  predomina  para  diámetros  de  66  nm  y  mayores.       -­‐  Se  logró  llevar  a  cabo  satisfactoriamente  la  ligación  inducida  por  secuencia  diana   de  sondas  de  captura  mediante  reacción  SPAAC.  El  ensayo  desarrollado  mediante   V.  Conclusiones         214   esta  estrategia  permitió  detectar  directamente  una  pequeña  secuencia  de  RNA  de   la  subunidad  ribosomal  de  Plasmodium  Falciparum  con  un  LOD  =  100  fM.     -­‐   El   uso   de   una   ligación   fotoquímica   inducida   por   secuencia   diana   se   usó   para   construir  un  sensor  de  elevada  sensibilidad  para  la  detección  directa  de  un  análogo   de  DNA  del  potencial  marcador  de  cáncer  de  mama  miR-­‐195.  Su  LOD  fue  21  fM,  el   cual   se   encuentra   ya   dentro   del   rango   de   concentraciones   de  miRNAs   de   baja   a   moderada  abundancia  en  suero.     -­‐   Se   usó   la   emisión   a   365   nm   de   UCNPs   dopadas   con   Yb3+/Tm3+   cuando   son   excitadas   externamente   a   980   nm   para   llevar   a   cabo   ligaciones   fotoquímicas   locales  en  la  superficie  de  las  UC-­‐labels.  Se  demostró  el  potencial  de  esta  estrategia   para  propósitos  de  detección  y  formación  de  patrones.                                                                     VI.  Publications  and  patents   during  the  PhD  period                                                                                                                                                        VI.  Publications  and  patents  during  the  PhD  period     217   Publications       1)  Rafael  Contreras-­‐Caceres,  Paulino  Alonso-­‐Cristobal,  Diego  Mendez-­‐ Gonzalez,  Marco  Laurenti,   Ana  Maldonado-­‐Valdivia,   Francisco  Garcia-­‐ Blanco,   Enrique   López   Cabarcos,  Antonio   Fernandez-­‐Barbero,   José   Manuel   Lopez-­‐Romero,   and   Jorge   Rubio-­‐Retama.   “Temperature   Controlled  Fluorescence  on  Au@Ag@PNIPAM-­‐PTEBS  Microgels:  Effect  of   the  Metal   Core   Size   on   the  MEF   Extension”.   Langmuir,   2014,   30   (51),   15560-­‐15567.       2)   Paulino   Alonso-­‐Cristobal,   Olalla   Oton-­‐Fernandez,   Diego   Mendez-­‐ Gonzalez,  J.  Fernando  Díaz,  Enrique  López-­‐Cabarcos,  Isabel  Barasoain,   and   Jorge   Rubio-­‐Retama.   “Synthesis,   Characterization   and   Application   in  HeLa  cells  of  NIR  Light  Responsive  Doxorubicin  Delivery  System  based   on  NaYF4:Yb,Tm@SiO2-­‐PEG  Nanoparticles”  ACS  Appl.  Mater.Interfaces,   2015,  7,  14992-­‐14999.     3)   Diego  Mendez-­‐Gonzalez,   Paulino   Alonso-­‐Cristobal,   Enrique   Lopez-­‐ Cabarcos,   Jorge   Rubio-­‐Retama.   "Multi-­‐responsive   hybrid   Janus   nanoparticles:  Surface  functionalization  through  solvent  physisorption",   European  Polymer  Journal,  2016,  75,  363–370.     4)  Marco  Laurenti,  Miguel  Paez-­‐Perez,  Manuel  Algarra,  Paulino  Alonso-­‐ Cristobal,  Enrique  Lopez-­‐Cabarcos,  Diego  Mendez-­‐Gonzalez,  and  Jorge   Rubio-­‐Retama.   "Enhancement  of   the  Upconversion  Emission  by  Visible-­‐ to-­‐Near-­‐Infrared   Fluorescent   Graphene   Quantum   Dots   for   miRNA   Detection".  ACS  Appl.  Mater.  Interfaces,  2016,  8  (20),  12644–12651.     5)   Diego   Mendez-­‐Gonzalez,   Marco   Laurenti,   Alfonso   Latorre,   Alvaro   Somoza,   Ana   Vazquez,   Ana   Isabel   Negredo,   Enrique   López-­‐Cabarcos,   Oscar   G.   Calderón,   Sonia   Melle  and   Jorge   Rubio-­‐Retama.   "Oligonucleotide   Sensor   Based   on   Selective   Capture   of   Upconversion   Nanoparticles   Triggered   by   Target-­‐Induced   DNA   Interstrand   Ligand   Reaction".  ACS  Appl.  Mater.  Interfaces,  2017,  9  (14),  12272-­‐12281.     VI.  Publications  and  patents  during  the  PhD  period         218   6)   Diego   Mendez-­‐Gonzalez,   Enrique   Lopez-­‐Cabarcos,   Jorge   Rubio-­‐ Retama,   Marco   Laurenti.   "Sensors   and   bioassays   powered   by   upconverting   materials".   Advances   in   Colloid   and   Interface   Science,   2017,  249,  66–87.     7)   Sonia   Melle,   Oscar   G.   Calderón,   Marco   Laurenti,   Diego   Mendez-­‐ Gonzalez,   Ana   Egatz-­‐Gómez,   Enrique   López-­‐Cabarcos,   E.   Cabrera-­‐ Granado,   Elena   Díaz,   and   Jorge   Rubio-­‐Retama.   "Förster   Resonance   Energy  Transfer  Distance  Dependence  from  Upconverting  Nanoparticles   to  Quantum  Dots".  J.  Phys.  Chem.  C,  2018,  122,  18751−18758.       This  publication  was  ACS  Editor's  choice  for  immediate,  free  open  access   by  ACS  due  to  its  potential  for  broad  public  interest.  This  honor  is  given   each   day   of   the   year   to   only   one   article   out   of   all   the   different   ACS   journals.         8)   Diego   Mendez-­‐Gonzalez,   Satu   Lahtinen,   Marco   Laurenti,   Enrique   López-­‐Cabarcos,   Jorge   Rubio-­‐Retama,   Tero   Soukka.   "Photochemical   Ligation   to   Ultrasensitive   DNA   Detection   with   Upconverting   Nanoparticles".  Anal.  Chem.,  2018,  90  (22),  pp  13385–13392.     This   work   was   awarded   the   3rd   poster   prize   at   2nd   conference   and   spring   school   on   properties,   design   and   applications   of   upconverting   nanomaterials  organized  by  The  European  Upconversion  Network  (COST   Action  CM1403).         9)   Diego   Mendez-­‐Gonzalez,   Sonia   Melle,   Oscar   G.   Calderón,   Marco   Laurenti,   E.   Cabrera-­‐Granado,   Ana   Egatz-­‐Gómez,   Enrique   López-­‐ Cabarcos,  Jorge  Rubio-­‐Retama  and  Elena  Díaz.  "Control  of  upconversion   luminescence   by   gold   nanoparticle   size:   from   quenching   to   enhancement".  Submitted                                                                                                                                            VI.  Publications  and  patents  during  the  PhD  period     219   Patents     1)   "Biosensor  for  the  detection  of  nucleic  acids,  method  of  manufacture   and   use   thereof"   /   "Biosensor   para   la   detección   de   ácidos   nucleicos,   método   de   elaboración   y   de   uso".   Application   (reference):   ES2580138A1       Grant  (reference):  ES2580138B2  ;  Oficina  Española  de  Patentes.   Inventors:   Enrique   José   López   Cabarcos,   Diego   Méndez   González,   Marco  Laurenti,  Paulino  Alonso  Cristóbal,  Jorge  Rubio  Retama.   Universidad  Complutense  de  Madrid.     2)"Super  fluorescent  Ag2S  nanoparticles  in  the  near  infrared  region  and   method  to  obtain   them/  Nanopartículas  de  Ag2S  súper   fluorescentes  en   la  región  del  infrarrojo  cercano  y  método  de  obtención".     Application  number:  P201900006   Inventors:   Jorge   Rubio   Retama,   Harrison   David   Assis   Santos,   Daniel   Jaque  García,  Diego  Méndez  González,  Marco  Laurenti.                                                                                                       VII)  Table  of  acronyms                                             VII.  Table  of  acronyms     223   VII.  Table  of  acronyms       43S  PIC                        pre-­‐initiation  complex   Ago                                        Argonaute  family  proteins     APTES                            (3-­‐aminopropyl)  triethoxysilane   Au      Gold   Au  NPs    Gold  nanoparticles   C153                                    Coumarin  153   CdTe      Cadmium  telluride   CR                                              Cross  relaxation   CSU                                        Cooperative  sensitization  upconversion   cvU                                            5'carboxyvinyl-­‐2'-­‐deoxyuridine     CW                              Continuous  wave   Cy3                                        Cyanine  3  dye   DBCO                                Dibenzocyclooctine     DCL-­‐1                                Dicer  like-­‐1   E      (FRET)  Efficiency     EDC·HCl                      1-­‐ethyl-­‐3-­‐(3-­‐dimethylaminopropyl)carbodiimide  hydrochloride   Er3+                                        Erbium  (III)  ion   ESA                                        Excited-­‐state  absorption     ETU                                      Energy  transfer  upconversion     EXP5                                  Exportin-­‐5   Fl                                                Fluorescein     fM                                              FemtoMolar  (10-­‐15  M)   FRET      Förster  resonance  energy  transfer     h                                                  Planck's  constant   HCl                                          Hydrochloric  acid   HCV                                      Hepatitis  C  virus   HEPES                              4-­‐(2-­‐hydroxyethyl)-­‐1-­‐piperazineethanesulfonic  acid   HPLC                                  High  performance  liquid  chromatography   HST                                        HASTY   Knr                                            Non-­‐radiative  decay  parameter     VII.  Table  of  acronyms       224   Ln3+                                        Trivalent  Lanthanide  ions   LNA                                        Locked  nucleic  acid   M                                                Molar   miRNA    Micro  RNA   MNP      Metallic  nanoparticle   mRNA      Messenger  RNA   N3                                              Azide   NaF      Sodium  fluoride   NaOH                                  Sodium  hydroxide       NH4F                                    Ammonium  fluoride   NH4OH                            Ammonium  hydroxide   NIR                                                      Near  infrared  region   nm                                            Nanometer   NP      Nanoparticle   nt      Nucleotide   OX1                                        Oxazine  1   PA                                            Photon  avalanche     PAA        Poly-­‐acrylic  acid   PABP                                  Poly(A)  binding  protein   POC                                        Point-­‐of-­‐care     Pol  II                                                RNA  polymerase  II   pre-­‐miRNA            Precursor  miRNA   pri-­‐miRNAs          Primary  miRNAs   Q                                                  Fluorescence  quantum  yield   Q-­‐dots                              Quantum  dots   QS                                              Quinine  sulfate  dihydrate     q-­‐PCR                                Quantitative  polymerase  chain  reaction     R101                                    Rhodamine  101       R6G                                        Rhodamine  6G   RE                                                            Rare  earths   RET                                                    Long  range  resonance  energy  transfer       RISC                                                  RNA-­‐induced  silencing  complex       VII.  Table  of  acronyms     225   RT                                                            Room  temperature     S0                                                Singlet  ground  state   S1                                                First  singlet  excited  electronic  state   SA                                              Streptavidin   Sg/bg  ratio              Signal-­‐to-­‐background  ratio   Si-­‐OH                                  Silanol  group   SPAAC                                        Strain  promoted  alkyne-­‐azide  cycloaddition   ssDNA                                Single  stranded  DNA   Sulfo-­‐NHS                  N-­‐hydroxysulfosuccinimide   T1                                                First  triplet  excited  state   TEM                                        Transmission  electron  microscopy   TEOS                                    Tetraethyl  orthosilicate     Tm3+                                      Thulium  (III)  ion     UC-­‐labels                    Upconverting  labels   UCNPs                              Upconverting  nanoparticles   UV-­‐Vis                              UV-­‐Visible  spectroscopy   XPS                                          X-­‐ray  photoelectron  spectroscopy     Yb3+                                        Ytterbium  (III)  ion     Γ                                                    Emissive  rate  (of  the  fluorophore)   νExc                                            Frequency  of  excitation  light     τ                                                      Fluorescence  lifetimes                                                                                                                                                                                                                                                                                       Tesis Diego Méndez González Portada Index Abstract I) Introduction I.1) microRNA I.2) Reporters in bioassays I.3) Sensors and bioassays powered by upconverting materials II)Aims of the work III)Experimental III.1) FundamentalstudyofUCNPs/Q-­‐dotsandUCNPs/AuNPspairs III.1.1) Introduction III.1.2 References III.1.3) Försterresonanceenergytransferdistancedependencefromupconvertingnanoparticlestoquantumdots III.1.4) Control of up conversion luminescence by goldnano particle size:from quenching to enhancement III.2) Innovative strategies for heterogeneous assays III.2.1) Introduction III.2.2) References III.2.3) Oligonucleotide sensor based on selective capture of upconversion nanoparticles triggered by target-induced DNA interstrand ligand reaction III.2.4) PhotochemicalligationtoultrasensitiveDNAdetectionwithupconvertingNanoparticles III.2.5 Conclusions IV) Discussion IV) Discusión V) Conclusions V) Conclusiones VI) Publications and patents during the PhD period VII) Table of acronyms