Trabajo  Fin  de  Máster                           Evaluación  de  la  respuesta   inflamatoria  al  xenoinjerto   de  células  madre   mesenquimales  de  origen   de  pulpa  dental.  Estudio   piloto.         Máster  en  Ciencias  Odontológicas.     Facultad  de  Odontología.  UCM.       Autor:  Pablo  García  Cañas   Tutor:  Prof.  Dr.  Luis  Blanco  Jerez       2   Índice       Agradecimientos………………………..…………………………………………………………..…………………...3       Introducción…………………………………………………………………..……………………………………………4       Justificación…………………………………………………………………………………………………………………9       Hipótesis  de  trabajo…………………………………………………………………………………….…….………10       Objetivos………………………………………………………………………………………………………...…………11       Ética………..………………..……………………………………………………………………………………………….12       Material  y  método………….………………………………………………………………………………….………13       Resultados......................................................................................................................20       Discusión.........................................................................................................................26       Conclusiones...................................................................................................................28       Bibliografía…………………………………………………………………………………………………………..…….29                               3     Agradecimientos     Agradezco  a  la  Profª  María  del  Pilar  García  Rebollar,  Departamento  de   Producción  Animal  ETS  de  Ingenieros  Agrónomos,  su  constante  colaboración  y  apoyo   en  la  granja  experimental  como  experta  veterinaria.       Agradezco  al  Dr.  D.  José  Ramón  Ramírez,  Jefe  de  Servicio  de  Anatomía   Patológica  del  Hospital  del  Tajo  (Aranjuez),  su  colaboración  y  permanente   disponibilidad  como  experto  en  diagnóstico  histológico.                                                     4   Introducción     La  regeneración  ósea  se  ha  convertido  en  una  necesidad  para  multitud  de   terapias  médicas.  Los  últimos  avances  en  medicina  regenerativa,  ingeniería  tisular  y   cirugía  reconstructiva  han  demostrado  la  utilidad  de  células  madre  mesenquimales  en   aumentos  óseos.  La  literatura  describe  ampliamente  estas  células  como  importantes   herramientas  terapéuticas  para  curar  enfermedades  y  reemplazar  tejidos  perdidos,   incluyendo  el  hueso.     Según  la  Sociedad  Internacional  de  Terapia  Celular  (ISCT)  las  células  madre   mesenquimales  (CMM)  se  definen  sobre  la  base  de  tres  características  principales:  (1)   su  adhesión  a  plásticos,  (2)  la  expresión  de  un  conjunto  específico  de  epítopos  de   membrana  (por  ejemplo:  CD73  ,  CD90,  CD105),  junto  con  la  falta  de  expresión  de  los   marcadores  hematopoyéticos  (por  ejemplo:  CD14,  CD34,  y  CD45)  y  el  antígeno   leucocitario  humano  DR  (HLA-­‐DR),  y  (3)  su  capacidad  de  diferenciarse  en  linajes  de   células  mesenquimales:  osteoblastos,  condrocitos,  fibroblastos  y  adipocitos.  Otras   características  incluyen  autorrenovación,  hipoinmunogenicidad,  haciéndolos   hipotéticamente  aptos  para  el  trasplante  alogénico,  y  su  capacidad  de  producir   inmunosupresión  del  trasplante.  1       En  el  área  maxilofacial  es  frecuente  la  necesidad  de  reparación  de  defectos   óseos,  desde  pequeños  defectos,  hasta  abarcar  áreas  que  afectan  a  varios  huesos  del   macizo  maxilofacial,  a  causa  de  problemas  congénitos,  traumas,  procesos  infecciosos  o   lesiones  quísticas  y  tumorales.  La  reparación  de  defectos  óseos  sigue  siendo  un  reto  de     5   muchos  procedimientos  reconstructivos.  Las  células  madre  han  demostrado,  en   numerosos  estudios,  ser  útiles  en  estas  terapias  de  regeneración  de  tejidos  duros  en   deformidades  craneofaciales.  2,  3,  4,  5,  6,  7,  8    La  medicina  regenerativa  o  ingeniería  de   tejidos  se  presenta  como  una  de  las  grandes  promesas  para  la  regeneración  y   renovación  de  las  funciones  perdidas  por  tejidos  óseos  dañados,  bien  por   enfermedades  hereditarias  o  bien  por  lesiones  sufridas  a  lo  largo  de  la  vida  del   individuo.  La  herramienta  principal  de  la  medicina  regenerativa  es  la  terapia  celular.  9     El  modelo  animal  para  regeneración  ósea  es  ampliamente  utilizado  en  la   bibliografía.  Estudios  de  aumentos  o  regeneración  ósea  sobre  modelo  de  conejos  han   tenido  resultados  satisfactorios.  10,  11,  12,  13    Para  poder  realizar  estudios  de  regeneración   ósea  mediante  células  madre  mesenquimales  humanas  sobre  conejos,  deberemos   previamente  asegurarnos  de  que  la  inoculación  de  las  misma  sobre  estos  animales  no   produce  respuesta  inflamatoria.         Se  empieza  a  comprender  el  potencial  de  las  células  madre  mesenquimales  en   la  terapia  celular  para  regeneración  del  tejido  dañado  en  el  cuerpo.14  Capaces  de   diferenciarse  en  cualquiera  de  las  líneas  de  células  mesenquimales,  sin  embargo  estas   células  se  enfrentan  a  los  problemas  de  producción  tumoral  y  rechazo  inmunológico.15     En  la  actualidad,  el  uso  de  células  madre  autólogas  tiene  como  objetivo  evitar   el  hipotético  rechazo  inmunológico  de  células  madre  de  origen  alogénico  o  xenogénico.   A  pesar  de  los  primeros  resultados  prometedores,  la  recolección  autóloga  de  células   madre  sigue  planteando  problemas  logísticos,  económicos  y  limitaciones  de  tiempo.     6   Además,  la  mayoría  de  pacientes  que  se  benefician  de  terapias  con  células  madre  son   los  ancianos,  con  múltiples  comorbilidades  médicas.  Desafortunadamente,  una  serie   de  estudios  recientes  han  documentado  que  las  CMM  obtenidas  de  pacientes  de  edad   avanzada,  demuestran  una  capacidad  significativamente  reducida  para  la  proliferación,   diferenciación  y  neovascularización,  con  niveles  elevados  de  apoptosis  “in  vitro”  e  “in   vivo”.  Por  tanto,  tal  deterioro  podría  limitar  el  potencial  terapéutico  de  estas.16     El  uso  de  “células  donantes  universales”  de  pacientes  jóvenes  sanos  podría  ser   utilizado  como  alotrasplante  de  células  madre  sin  necesidad  de  terapias   inmunosupresoras  y  evitando  los  inconvenientes  de  las  primeras.  17       La  aplicación  potencial  de  estas  células  a  seres  humanos  deberá  resolver   previamente  el  hipotético  problema  del  rechazo  del  injerto  para  no  mantener   necesariamente  al  paciente  de  por  vida  sometido  a  una  inmunosupresión;  las  terapias   inmunosupresoras  reducen  la  capacidad  regeneradora  de  las  células  madre,  además   de  añadir  el  peligro  de  no  poder  hacer  frente  a  infecciones  o  combatir  posibles   tumores  en  una  situación  de  bajas  defensas  del  organismo.  Se  trabajan  diferentes  vías   para  manipular  las  células  antes  de  su  posible  transferencia,  como  eliminar  los   antígenos  Complejo  Histocompatibilidad  Mayor  (MHC)  extraños,  o  reemplazarlos.  18,19     Otro  de  los  problemas  que  existen  en  cuanto  a  células  madre  es  que  en  los   laboratorios  de  todo  el  mundo  no  existe  una  metodología  internacional  estandarizada   para  obtención  y  expansión  “in  vitro”  de  células  madre.14       7   Las  CMM  son  ampliamente  utilizadas  y  estudiadas  por  su  potencial  clínico,  fácil   obtención  y  propiedades  inmunosupresoras.20  Sin  embargo,  esta  última  propiedad   podría  mostrar  efectos  adversos  en  ciertas  circunstancias,  como  la  promoción  del   crecimiento  de  un  tumor.21  De  ellas,  las  de  origen  de  médula  ósea  son  las  más   utilizadas    por  su  capacidad  inmunomoduladora.22  Dicha  propiedad  se  le  atribuye  a  los   bajos  niveles  de  MHC-­‐I  y  ausencia  de  MHC-­‐II,  según  se  ha  demostrado.15     Las  células  madre  de  origen  de  pulpa  dental  son  una  alternativa  prometedora   para  la  ingenieria  tisular.  Las  células  madre  de  origen  pulpar  pueden  ser  estimuladas   para  diferenciarse,  en  condiciones  específicas,  hacia  diversos  tipos  de  células   (mioblastos,  neuronas,  condroblastos,  osteoblastos,  etc).  Su  amplia  gama  de   diferenciación  le  hace  una  prometedora  herramienta  para  la  regeneración  de  tejidos   perdidos  o  dañados.  Esta  característica  puede  estar  relacionada  por  el  origen  del  que   proceden,  la  cresta  neural.  Para  su  obtención  se  requieren  técnicas  poco  invasivas.   Esta  ventaja,  unida  a  su  gran  potencial  de  diferenciación,  hacen  de  las  células  madre   de  origen  de  pulpa  dental  una  buena  alternativa  de  uso  para  terapia  celular.23     Se  pueden  extraer  a  partir  de  pulpas  de  órganos  dentarios  exfoliados   (piezas  de  dentición  infantil)  o  de  piezas  dentarias  sanas  extraídas  con  fines   ortodónticos  y  terceros  molares.  La  pulpa  dental  está  conformada  de  componentes   ectodérmicos  y  mesenquimales,  contiene  células  de  la  cresta  neural  de  las  que  se  ha   demostrado  capacidad  multipotencial.24       8   Los  riesgos  de  formación  de  tumores  y  rechazo  inmune  después  del  trasplante   de  células  madre  son  siempre  una  preocupación.  Las  células  madre    mesenquimales  y   embrionarias  in  vitro  presentan  una  fuerte  inmunosupresión  sobre  linfocitos  e  incluso   las  segundas    en  estudios  anteriores  informan  de  que    tienen  potencial  para  generar   tumores.25                                         9   Justificación         El  avance  en  terapia  celular  supone  una  gran  ventaja  para  la  regeneración  del   tejido  óseo  maxilofacial.  Para  realizar  más  estudios  que  nos  permitan  observar  y   confirmar  esta  capacidad  regenerativa  ósea  de  las  células  madre  mesenquimales   humanas,  necesitamos  verificar  primero  la  ausencia  de  respuesta  inflamatoria  por   parte  del  modelo  animal  ante  el  trasplante  de  dichas  células.  Para  ello  proponemos  en   este  trabajo  el  uso  de  células  madre  de  origen  de  pulpa  dental  humana,  procedente  de   dientes  temporales  y  dientes  permanentes,  para  el  uso  de  terapia  celular  regenerativa   en  un  modelo  de  trasplante  xenogénico  (conejos).  Y  así  comprobar  la  capacidad  de   respuesta  de  los  tejidos  ante  la  introducción  de  este  tipo  de  células  madre,  viendo  si  se   produce  reacción  inmunológica  como  objetivo  principal.                                                 10   Hipótesis  de  trabajo       Considerando  a  las  células  madre  mesenquimales  como  células   hipoinmunogénicas,26    nuestra  hipótesis  de  trabajo  será:  el  trasplante  de  células  madre   mesenquimales  de  origen  humano  a  un  receptor  animal  xenogénico  (conejo)  no   produce  una  respuesta  inmunológica.                                       11   Objetivos       Las  evaluaciones  de  la  respuesta  inflamatoria  se  realizan  a  distintos  tiempos,   para  poder  observar  posibles  diferencias  de  la  reacción  del  organismo  al  trasplante,   desde  48  horas  posterior  a  la  inoculación  de  las  células  como  una  hipotética  respuesta   inmediata,  hasta  14  días  post  trasplante,  ya  que  se  realizan  en  tejido  celular   subcutáneo  y  no  esperamos  observar  signos  inflamatorios  más  allá  de  ese  tiempo   debido  a  su  alta  tasa  de  metabolismo  celular.     Por  lo  tanto,  los  objetivos  son:     • Evaluar  la  respuesta  inflamatoria  que  produce  el  trasplante  xenogénico  de   células  madre  humanas  de  origen  pulpar  de  diente  adulto  en  el  animal  de   experimentación.   • Evaluar  la  respuesta  inflamatoria  que  produce  el  trasplante  xenogénico  de   células  madre  humanas  de  origen  pulpar  de  diente  temporal  en  el  animal  de   experimentación.   • Evaluar  la  respuesta  inflamatoria  que  produce  el  trasplante  xenogénico  de   células  humanas  diferenciadas  (osteoblastos)  en  el  animal  de  experimentación.                 12   Ética     Proyecto  presentado  al  Comité  Ético  de  Investigación  de  la  Universidad   Politécnica  de  Madrid  que  tras  valoración  del  equipo  investigador,  la  metodología  y  los   fines,  no  hubo  inconveniente  en  informar  favorablemente  la  propuesta,   recomendando  el  efectivo  cumplimiento  de  los  compromisos  declarados.                                       13   Material  y  método       Para  realizar  este  estudio  piloto  experimental  animal  se  necesitó:     Animales  de  experimentación   4  Conejas    (Oryctolagus  cuniculus)  híbridas  (Neozelandés  blanco  x  Californiano)   nulíparas  de  3,5  meses  de  edad,  de  3,25  kg  de  media,  alojadas  en  la  granja   experimental  de  la  E.T.S.I.  Agrónomos  de  la  Universidad  Politécnica  de  Madrid  (UPM)  a   20-­‐25  oC,  16HL:8HO.  Se  cumplimentaron  estrictamente  las  normas  vigentes  respecto  al   alojamiento  y  a  los  cuidados  de  animales  destinados  a  la  experimentación   (86/609/CEE).     Por  no  encontrarse  publicaciones  científicas  previas  relacionadas  directamente   con  los  objetivos  del  presente  trabajo  se  realizó  un  estudio  piloto  con  un  tamaño   muestral  total  de  4  animales  por  cada  uno  los  cuales  se  inocularan  un  total  de  9   muestras.  En  función  de  los  resultados  obtenidos  en  este  estudio  preliminar,  según  la   magnitud  de  los  efectos  observados,  se  hará  un  calculo  del  tamaño  muestral  para   diseñar  un  estudio  definitivo.     En  cada  animal  se  ensayaron  2  líneas  celulares,  y  en  todos  ellos  el  control   negativo.      A  las  48  horas,  7  días  y  14  días  se  realizaron  los  estudios  pertinentes  para   evaluar  la  respuesta  inflamatoria.         14   Como  metodología  eutanásica  seguimos  los  estándares  dictados  por  las  normas   ISO  en  experimentación  animal;  la  eutanasia  se  realizó  con  pentobarbital  sódico  (iv)  1   g/20  kg.       Células  madre   Se  trasplantaron    dos  líneas  celulares  de  origen  pulpar  dental  deciduo,  y  una  de   pulpa  dental  adulta.      Se  obtienen  del  Laboratorio  de  Ingeniería  Tisular  de  la  Facultad  de  Odontología   de  la  Universidad  Complutense  de  Madrid,  a  partir  de  dientes  exodonciados  que   conserven  el  paquete  vasculonervioso  pulpar  intacto.  Se  extrae  la  pulpa  de  las  piezas   dentarias  y  se  realiza  una  digestión  mediante  colagenasa  y  centrifugación  de  la  misma.   Conseguimos  la  proliferación  celular  en  medio  de  cultivo  MEM  reconstituido  con  suero   fetal  bovino,  glutamina  y  antibióticos.  Los  cultivos  se  incuban  en  una  atmósfera   humidificada  que  contiene  5%  de  CO2  a  37oC.  Las  células  que  usaremos  se  encontraron   en  el  sexto  y  décimo  pase.       Control  positivo   Usamos  como  control  positivo,  buscando  una  reacción  inflamatoria  franca,   células  diferenciadas  provenientes  de  la  línea  celular  MG63,  que  está  formada  por   células  de  osteosarcoma  humano  de  tipo  osteoblástico,  las  cuales  son  ampliamente   utilizadas  en  los  estudios  biológicos.     15   Control  negativo   Como  control  negativo,  para  obtener  una  zona  con  ausencia  o  leve  respuesta   inmune  por  parte  del  huésped  a  la  que  comparar  al  trasplante  de  células  madre,   usaremos  una  solución  de  tampón  fosfato  salino  (PBS)  que  fue  el  vehículo  utilizado   para  la  inoculación  de  la  células.       METODOLOGIA     La  inmovilización  segura  de  los  conejos  se  consiguió  mediante  la  introducción   de  estos  en  "cepos  o  cajones  de  investigación"  que  deja  la  cabeza  fuera.     El  siguiente  paso  consistió  en  rasurado  del  dorso  de  los  conejos.   Posteriormente  se  dibujó  con  rotulador  indeleble  una  cuadrícula  de  tres  filas  por  tres   columnas,  generando  nueve  cuadrados  de  unos  9  cm2  (Figura  1).  Se  numeró  con   rotulador  indeleble  la  oreja  de  los  conejos  y  sus  jaulas,  para  evitar  confusiones.     16     Figura  1.  Cuadrícula  dibujada  e  inoculación  de  las  muestras.                                                                                                                                                 En  cada  conejo  se  hicieron,  como  hemos  comentado  antes,  nueve   inoculaciones  en  el  centro  de  cada  uno  de  los  cuadrados  dibujados  (Figura  1).  Dichas   inoculaciones  se  realizaron  en  tejido  celular  subcutáneo.  Los  conejos  1  y  3  recibieron,   además  del  control  negativo  (PBS),  el  trasplante  de  células  madre  provenientes  de  las   dos  líneas  de  pulpa  dental  decidua.  Los  conejos  2  y  4,  además  de  PBS,  se  inocularon   células  madre  de  origen  pulpar  adulto,  y  células  osteoblásticas  adultas  diferenciadas   MG  63  (Figura  2).  Las  células  (una  media  de  5  millones  por  inoculación)  se  inoculan   diluidas  en  1ml.  de  PBS.  Todas  las  inoculaciones  se  repiten  en  tres  lechos  distintos   (columnas),  que  coincidirán  con  los  tres  tiempos  de  extracción  (48  horas,  7  días,  y  14   días).       17     Figura  2.  Esquema  de  inoculaciones  realizadas  (PT1:  pulpa  temporal  1;  PT2:  pulpa   temporal  2;  PA:  pulpa  adulta)         Se  examinó  cada  lugar  de  implantación  mediante  lupa  de  bajo  aumento.  Se   registra  la  naturaleza  y  la  extensión  de  cualquier  reacción  tisular  observada  durante  el   período  de  estudio.       En  los  tiempos  de  extracción  referidos  se  procedió  a  la  anestesia  local  mediante   infiltración  de  articaína  4%  de  los  lechos  correspondientes.  Se  obtuvieron  con  hoja  de   bisturí  número  15,  muestras  para  biopsia  de  piel  y  tejido  celular  subcutáneo  de  las   áreas  infiltradas.  Para  permitir  la  evaluación  de  la  respuesta  biológica  local  se  efectúa   la  resección  del  trasplante  junto  con  suficiente  cantidad  de  tejido  circundante  no   afectado.  Se  sutura  la  herida  con  seda  3/0.         18   Las  muestras  se  mantuvieron  en  formaldehido  al  10%  refrigeradas  hasta  su   procesamiento,  que  consistió  en  deshidratación  en  proporciones  crecientes  de  etanol   y  a  continuación  inclusión  en  parafina.  Una  vez  confeccionados  los  bloques  se  cortaron   múltiples  secciones  de  3-­‐5  micras  de  grosor,  de  manera  que  representan  la  totalidad   del  tejido,  y  se  tiñeron  con  hematoxilina-­‐eosina  y  Masson  tricrómico.       Evaluación  histológica     Para  valorar  el  componente  inflamatorio  se  tomaron  los  siguientes  criterios:   • Presencia  de  edema.   • Leucocitos  polimorfonucleares  neutrófilos,  según  la  cantidad  respecto  a  toda  la   celularidad  inflamatoria.   • Linfocitos:  1)  linfocitos  aislados,  2)  grupos  de  linfocitos,  3)  formación  de   folículos  linfoides.   • Células  plasmáticas  según  la  cantidad  respecto  a  toda  la  celularidad   inflamatoria.   • Histiocitos  o  macrófagos:  1)  histiocitos  aislados,  2)  nódulos  histiocitarios,  3)   granulomas.       Todos  estos  criterios  se  valoraron  a  ciegas  sin  conocimiento  previo  de  la   situación  clínica  ni  de  los  procedimientos  realizados  en  cada  caso,  por  parte  de  un   médico  especialista  en  anatomía  patológica.       19     Para  graduar  la  intensidad  se  utilizan  métodos  subjetivos  y  semicuantitativos,   expresados  de  la  siguiente  forma:  (-­‐)  negativo;  (+)  leve;  (++)  moderada;  (+++)  intensa.       La  graduación  de  los  linfocitos  se  hace  dando  valor  negativo  (-­‐)  si  no  aparecen,   leve  (+)  cuando  aparezcan  aislados,  moderado  (++)  cuando  formen  nódulos  e  intenso   (+++)  si  constituyen  folículos  linfoides.       Para  los  histiocitos,  su  presencia  aislada  se  cuantifica  como  leve  (+),  la   presencia  formando  nódulos  se  considera  moderado  (++),  e  intensa  (+++)  si   constituyen  verdaderos  granulomas.       Todos  los  datos  se  reflejan  en  una  tabla.                             20   Resultados     En  ninguno  de  los  tiempos  se  observó  alteraciones  macroscópicas  de  las  zonas   de  infiltración.       Tras  el  estudio  al  microscopio  de  las  muestras  recogidas,  por  parte  del  patólogo,   se  recogieron  los  resultados  en  una  tabla  (Tabla  1).         Tabla  1.  Inflamación  registrada  (T1:  pulpa  temporal  1,  T2:  pulpa  temporal  2,  A:  pulpa   adulta)         Se  observó  la  ausencia  de  cualquier  tipo  de  reacción  inflamatoria  en  las   muestras  recogidas  a  las  48  horas,  independientemente  del  conejo  o  inoculación   realizada.       2  DÍAS   7  DÍAS   14  DÍAS   CONEJO  1   PBS   -­‐   +   -­‐   T1   -­‐   ++++   -­‐   T2   -­‐   +++   +   CONEJO  3   PBS   -­‐   -­‐   -­‐   T1   -­‐   -­‐   -­‐   T2   -­‐   -­‐   -­‐   CONEJO  2   PBS   -­‐   -­‐   -­‐   MG  63   -­‐   +++++++++   +++   A   -­‐   -­‐   -­‐   CONEJO  4   PBS   -­‐   -­‐   -­‐   MG  63   -­‐   ++++   +++   A   -­‐   -­‐   -­‐     21     A  los  7  días  es  cuando  aparecieron  los  signos  de  inflamación  de  forma  más   acentuada,  pero  solamente  en  las  muestras  que  tenían  el  control  positivo  (MG  63)  y  en   todas  la  inoculaciones  realizadas  al  conejo  1,  incluido  el  control  negativo  (PBS),  en   mayor  o  menor  medida.       A  los  14  días,  se  observó  una  inflamación  residual,  menos  florida  que  la  vista  a   los  7  días,  en  las  muestras  del  control  positivo  y  en  la  línea  de  células  madre  de  origen   de  pulpa  dental  temporal  "2"  del  conejo  1,  siendo  negativo  en  el  resto.         Para  conocer  la  naturaleza  inflamatoria  de  cada  muestra  que  mostró  reacción   inmunológica  por  parte  de  los  huéspedes,  se  realizó  una  tabla  con  los  criterios  que  se   tuvieron  en  cuenta  a  la  hora  de  valorar  la  inflamación  (Tabla  2).         Tabla  2.  Naturaleza  inflamatoria  (FIBR:  fibroblastos,  PMN:  polimorfonucleares,  LINF:   linfocitos,  C  PLASM:  células  plasmáticas,  HIST:  histiocitos)           VASOS   FIBR   PMN   LINF   C  PLASM   HIST   CONEJO  1   PBS  7d   -­‐   -­‐   +   -­‐   -­‐   -­‐   T1  7d   +   -­‐   +++   -­‐   -­‐   -­‐   T2  7d   -­‐   -­‐   ++   +     -­‐   T2  14d   -­‐   -­‐   +   -­‐   -­‐   -­‐                   CONEJO  2   MG63  7d   +     ++   +++   +   ++   MG63  14d   -­‐   -­‐   +   +   -­‐   +                   CONEJO  4   MG63  7d   -­‐   -­‐   ++   +   -­‐   +   MG63  14d   -­‐   -­‐   +   +   -­‐   +     22     Las  inoculaciones  de  las  células  diferenciadas  MG  63,  produjeron  una   inflamación  consistente  fundamentalmente  en  presencia  de  linfocitos,   polimorfonucleares  e  histiocitos,  con  la  aparición  leve  de  edema  y  células  plasmáticas   en  algún  caso  aislado  (Figura  3).       Figura  3.  Reacción  inflamatoria  ante  inoculación  de  células  MG63    a  los  7  días.         En  el  conejo  1,  el  cual  mostró  reacción  a  todas  sus  inoculaciones,  se  observaron   unas  reacciones  inflamatorias  basadas  fundamentalmente  en  polimorfonucleares   (Figura  4).     23     Figura  4.  Reacción  inflamatoria  ante  inoculación  de  células  madre  mesenquimales  de   origen  de  pulpa  dental  temporal  "1"  a  los  7  días.         Por  lo  tanto,  los  controles  negativos  y  positivos  se  comportaron  como   esperamos,  los  primeros  no  provocando  respuesta  inmune  y  los  segundos  dando  lugar   a  una  reacción  inflamatoria.  Las  células  madre  mesenquimales  de  origen  de  pulpa   dental  no  mostraron  inflamación  independientemente  de  su  origen,  salvo  en  el  conejo   1,  el  cual  mostró  inflamación  hasta  en  las  muestras  de  PBS.       Se  realizaron  gráficos  de  cada  animal,  donde  el  eje  de  ordenadas  corresponde  a   la  inflamación  según  la  puntuación  de  cruces  (+)  obtenida,  y  el  eje  de  abscisas  al   tiempo.  (Gráficos  1,2,3  y  4)     24   Gráfico  1:  Conejo  1  (eje  de  ordenadas:  grado  de  inflamación)       Gráfico  2:  Conejo  2         25   Gráfico  3:  Conejo  3       Gráfico  4:  Conejo  4         26   Discusión     Los  dos  grandes  problemas  de  la  terapia  con  células  madre  son  por  un  lado  el   hipotético  rechazo  inmune  y  por  el  otro  la  promoción  tumoral  descrita  en  algunos   casos.  15,  21,  25  La  ausencia  de  Antígenos  Leucocitario  Humanos  (HLA)  en  las  membranas   de  la  células  madre  mesenquimales,  hace  de  este  linaje  ser  potencialmente  apto  para   el  alotransplante  incluso  xenotransplante  debido  a  su  hipoinmunogenicidad.  Ante  la   controversia  en  la  literatura,  y  la  ausencia  de  experimentos  directamente  relacionados   con  el  tema  hemos  querido  comprobar  este  hipotético  rechazo  por  parte  del  sistema   inmunológico.  Es  también  importante  para  nosotros  conocer  la  seguridad  del   trasplante  de  células  madre  humanas  en  un  modelo  animal,  ya  que  usaremos  este   modelo  en  futuros  estudios  de  regeneración  ósea  mediante  terapia  celular.        Tras  la  inoculación  de  células  madre  mesenquimales  de  origen  de  pulpa  dental   humana  en  tejido  subcutáneo  de  conejo,  pudimos  observar  la  ausencia  de     reacción  inflamatoria  producida  por  parte  de  las  células  madre,  observando  al   microscopio  las  mismas  imágenes  que  producían  los  controles  negativos  (PBS)  en  los   cortes  histopatológicos.  Al  contrario  que  los  controles  positivos,  que  al  ser   osteoblastos  maduros  diferenciados,  con  sus  MHC  bien  determinados,  originaron  una   reacción  inflamatoria  de  cierta  entidad.  Sólo  hubo  una  excepción,  en  el  conejo  1,   donde  tanto  controles  negativos  como  células  madre  mostraron  cierto  grado  de   inflamación.       Queda  patente  pues  la  tendencia  de  las  células  madre  a  no  provocar  respuesta   inmunológica.  Llama  la  atención  en  los  resultados  la  falta  de  reacción  inflamatoria  en     27   todos  los  lechos  donde  se  implantaron  células  madre,  sin  importar  su  origen,  salvo  en   el  conejo  1.  Éste  conejo  respondió,  en  forma  de  reacción  inflamatoria,  ante  el   trasplante  de  las  células  madre  de  origen  de  pulpa  dental  temporal  que  se  le   inocularon,  pero  también  con  la  simple  inyección  de  PBS  mostró  leves   comportamientos  inflamatorios.     La  falta  de  respuesta  inmunológica  por  parte  de  otros  conejos  a  células  de  los  mismos   linajes,  unido  a  la  reacción  inflamatoria  ante  la  inoculación  del  PBS,  nos  hace  pensar   que  dicho  conejo  pudiera  padecer  algún  trastorno  que  manifestara  hiperreactividad   ante  estímulos  externos,  o  algún  tipo  de  exposición  previa  a  estos  estímulos.  Otra   explicación  pudiera  ser  la  existencia  de  poblaciones  de  células  maduras  diferenciadas   en  los  cultivos  de  células  madre,  ya  que  no  son  poblaciones  totalmente  purificadas.        De  cualquier  forma,  tras  este  estudio  piloto,  la  actitud  a  seguir  será  la  de   aumentar  la  muestra  en  futuros  estudios,  para  confirmar  este  hecho  como  excepcional,   o  por  el  contrario  descubrir  cierta  tendencia  a  la  reacción  inmunológica  ante  células   madre  en  determinados  especímenes.  Sólo  el  análisis  estadístico,  con  suficientes  datos   tras  un  estudio  definitivo,  podrá  determinar  conclusiones  rotundas.                     28   Conclusiones     Dentro  de  las  limitaciones  que  conlleva  un  estudio  piloto,  sin  análisis  estadístico,   podemos    afirmar  que  las  células  madre  mesenquimales  de  origen  de  pulpa  dental   humana  no  producen  una  reacción  inflamatoria  al  ser  inoculadas  en  conejos,  salvo  en   ciertas  condiciones  de  hiperreactividad  que  deberán  ser  estudiadas.                                               29   Bibliografía                                                                                                                   1  Razzouk  S,  Schoor  R.  Mesenchymal  stem  cells  and  their  challenges  for  bone   regeneration  and  osseointegration.  Journal  of  Periodontology.  2011.  Unedited.     2  Behnia  H,  Khojasteh  A,  Soleimani  M,  Tehranchi  A,  Khoshzaban  A,  Keshel  SH,  Atashi  R.   Secondary  repair  of  alveolar  clefts  using  human  mesenchymal  stem  cells.  Oral 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