UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
 

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
  
SECCIÓN DEPARTAMENTAL DE BIOQUÍMICA Y 

BIOLOGÍA MOLECULAR I
 

TESIS DOCTORAL
 

Funciones de la autofagia en el desarrollo de la 
retina: metabolismo, diferenciación y muerte 

celular 

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA
 

PRESENTADA POR
 

Lorena Esteban Martínez 

DIRECTORA 

Patricia Boya 

Madrid, 2017 

© Lorena Esteban Martínez, 2016 



 

 

 
 

 
 

 

 

 
 

 
Director: Patricia Boya 

 
 

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 

Facultad de Ciencias Biológicas 


Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I 


CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS 

Centro de Investigaciones Biológicas 


Funciones de la autofagia en el desarrollo de la retina: 
metabolismo, diferenciación y muerte celular 

Tesis Doctoral 

Lorena Esteban Martínez 



 



 

 

 
 

 
 

 
 
 
 

 
 

 

 
 

 
 
 
 
 
 

    
 

     
 
 
 
 
 
 
 
 

 

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 

Facultad de Ciencias Biológicas 


Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I 


CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS 

Centro de Investigaciones Biológicas 


Funciones de la autofagia en el desarrollo de la retina: 
metabolismo, diferenciación y muerte celular 

Memoria presentada por Lorena Esteban Martínez para optar al grado de Doctora en
 
Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Complutense de 


Madrid 


VºBº de la Directora de la Tesis VºBº del Tutor 

Patricia  Boya       Guillermo  Velasco  

Lorena Esteban Martínez 

2016 




 



 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 
 
 
 

“Todo cabe en lo breve. Pequeño es el niño y encierra al hombre; estrecho es el cerebro y 
cobija el pensamiento; no es el ojo más que un punto y abarca leguas”   

Alejandro Dumas 

A mis padres y hermanos. 
A Alberto. 



 

 



 

 
 

 

 

 

 

 

AGRADECIMIENTOS 

Es un honor comenzar esta Tesis Doctoral por la parte mas importante, el poder 

agradeceros a todos los que comenzáis a leer estas palabras que de alguna manera u otra 

habéis formado parte de esta aventura. En primer lugar, quiero expresar mi 

agradecimiento a la Dra. Patricia Boya, por confiar en mí desde el primer momento, aun 

cuando llegué al laboratorio como un pez que apenas sabe nadar. Gracias por 

permitirme formar parte de tu laboratorio durante todos estos años, por enseñarme a 

avanzar en el complicado mundo de la ciencia, por haber contado conmigo para ampliar 

mis conocimientos más allá de esta Tesis. Aun hoy sigo pensando que me queda un 

largo camino por aprender. Gracias por intentar que así sea. También quiero agradecer a 

los Doctores Flora de Pablo, Enrique de la Rosa, Teresa Suárez y Catalina Hernández 

todo su apoyo científico durante estos años. Cada día se puede aprender algo nuevo de 

vosotros. 

Antes de comenzar a agradecerles a todas las personas que he conocido a lo 

largo de estos años, tengo que hacer una especial mención a los ratones CD1, C57, 

GFP-LC3, Ambra1, Atg5 y a los ratones neoyorquinos Lamp2A y NIX. Por que sin 

vuestros embriones, ojos y retinas, jamás hubiera sido Doctora. Espero que este trabajo 

al menos sea valorado por vuestra valiosa presencia.  

Muchos han sido los años en los que he estado entregada a este trabajo y durante 

los cuales he conocido a gente que me ha aportado muchísimas cosas, más allá del 

ámbito académico. Y es que aunque en este laboratorio haya coincidido con personas en 

el pasado diferentes a las actuales, todos vosotros formáis  parte de esta historia. A los 

del pasado: Sergio, Marian, Natalia, Kike… nunca me olvidaré de vosotros. En primer 

lugar quiero agradecerle a Sergio su valiosa presencia en el laboratorio a mi llegada. No 

solo me enseñaste a sacrificar ratones sin que me diera un infarto antes, si no que me 

diste fuerzas y ánimos para no salir corriendo ante las adversidades. Eres un gran 

compañero de trabajo y sobre todo una gran persona y me siento afortunada de tenerte 

como amigo. A Marian, gracias por tu enorme paciencia, apoyo, ayuda y consejos al 

comienzo de mi tesis. En cierto modo fuiste una maestra para mí, asi que espero que 

estés orgullosa, porque al final no hay retina que se me resista. Natalia, eres todo un 

ejemplo a seguir. Admiro no solo tu inteligencia, sino también tu voluntad. Confío en 

que llegarás muy alto. Kike, aunque estuviste poco con nosotros, gracias por los 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

temibles genotipajes de los embriones Ambra y por darlo todo en el play back de la 

fiesta de la primavera del CIB del 2011!.  

Gracias al resto de personas de aquella época inicial: Jimena, Estíbaliz, Anne, 

Kikote, Esther, Ana Robles, Ana Arroba, Miguel Marchena, Isa, Sandra y todos los 

pollitos que han ido pasando por el 3D lab. Gracias por vuestras risas en las comidas 

que hacían el día más agradable. Gracias a José, por los genotipajes y por tus chistes. Y 

gracias a los que aun continuáis: Alberto, Tani, Noemí y Patri V. Sois unos veteranos 

imprescindibles en ese laboratorio. A Alberto y Tani, quiero agradeceros vuestra 

disposición en cada momento que he necesitado de vosotros, y por preguntarme qué tal 

va esta Tesis que como veis, ha llegado a su fin. A Noemí y Patri V quiero 

agradecéroslo todo. Sois un pilar fundamental no solo en vuestro laboratorio, si no para 

todas vuestras vecinas del 147. Para mi sois unas grandes científicas, y haya donde 

estéis, siempre lo seréis.  

Y qué decir de mis pollos del presente. Sois las mejores compañeras que se 

puede tener. No solo ayudáis a avanzar en los momentos de crisis, si no que hacéis de 

un día nublado un gran amanecer soleado. Nunca olvidaré nuestras conversaciones que 

escucha hasta “el apuntador” o “cualquier Ignacio”. Os voy a echar muchísimo de 

menos! Ya me queda un suspiro para abandonar el barco, asi que he ido cogiendo 

provisiones de pañuelos antillorera. Lucía muchas gracias por haber compartido 

conmigo grandes momentos durante la tesis. Por los congresos, por el mutuo apoyo, por 

las tardes de cerves arreglando el mundo, por enseñarme a contar en alemán… por 

mucho más que una compañera de Tesis. Ah!! y por aquel baile de pollitos que nos 

llevó a conseguir el jamón de la fiesta del CIB!!. Ana, muchas gracias por ser el “loro” 

del Boya lab. Gracias por tus conversaciones, consejos, risas y momentos surrealistas. 

Por las cerves, alguna noche llena de magia compartida con los pollitos y como no, de 

esas maravillosas canciones que te da por tararear en cualquier momento. Esther, nunca 

podremos estar lo suficientemente agradecidas por tu tremenda experiencia y por saber 

transmitirla. Gracias por formar parte de este trabajo y ayudar a que salga adelante. Allá 

donde estemos, espero verte en las fiestas del CIB, porque tengo una botella de Vodka 

que compartir. Elena, muchísimas gracias por todo. Eres una excelente científica y 

persona que merece mucho la pena tener cerca. Me alegro mucho de haber podido 

aprender de ti, esta tesis refleja esa parte de una gran compañera. Y gracias por tus 

puntazos inesperados que nos hacen reír en las comidas. Raquel, nuestro pollo grande. 

Gracias por tu apoyo en mi etapa final, tu ayuda en mi viaje al otro lado del charco y 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

sobre todo, por transmitir a este laboratorio algo de tranquilidad. Y Bea, la última 

adquisición. Siempre te estaremos agradecidas por esa tremenda sonrisa que te 

acompaña y por tu optimismo. Estoy convencida de que te irá genial porque te lo 

mereces. También estoy convencida de que terminarás bebiendo cerves… 

No me puedo olvidar de personas que han pasado un periodo breve en nuestro 

laboratorio, como Marta y Fengjuan. Me alegro mucho de haberos conocido. Ni del 

resto de vecinos del CIB con los que compartimos momentos en la campana de cultivos, 

reactivos, y por supuesto buenas conversaciones y risas: los Corbís (Víctor, Marta, 

Ignacio, Elena, Miriam, Emmanuel, Pilar…) y los Vidales (Mónica, Fabio y Kasia). 

Gracias por estar ahí.  

De igual modo, tengo que agradecer a científicos del CIB como el Dr. Ángel 

Luis Corbí, el Dr. Miguel Ángel Vega, el Dr. José Luis Rodríguez Fernández, el Dr. 

Eduardo Rial y el Dr. José María Sánchez Puelles, por vuestro valioso apoyo científico 

en algún momento de esta Tesis.  

Pero además de todas las personas con las que comparto el día a día, quiero 

agradecer a todo el personal científico y no científico del Centro de Investigaciones 

Biológicas, desde el servicio de esterilización, limpieza, fotografía, servicio técnico … 

conseguís que el centro se mantenga día a día y que podamos llevar a cabo nuestro 

trabajo.  Sois también protagonistas de esta historia porque con vuestra disposición y 

trabajo hacéis el camino mucho más fácil. En especial, agradecer a los servicios con los 

que he trabajado en mayor medida y a todo su personal por su experiencia: Maite, 

Gema, Lorena, Noemí y todas las personas que han pasado por el Confocal; a Bego y 

Fernando de microscopía electrónica; a Pedro de citometría y a todo el personal del 

animalario, en particular, a Dani, Esther, Carlos y Pablo. Gracias por cuidar de nuestros 

ratoncillos, por vuestra disposición en todo momento, por enseñarme y ayudarme a 

avanzar. Por vuestras risas. Y gracias por participar con los pollos en la fiesta del CIB. 

Aunque nuestro equipo perdió la gymkhana pasamos grandes momentos.  

Tengo que agradecer también el apoyo científico externo al CIB por parte del 

Dr. Marcos Malumbres y la Dra. María Salazar en el CNIO. Gracias por hacerme 

participe de vuestro trabajo enriquecedor. Y gracias por formar parte del mío. Y a 

Guillermo Mariño, muchas gracias por tu gran experiencia científica en nuestra 

colaboración, que espero pronto tenga sus frutos. 

Quería dedicar una parte de los agradecimientos a todas las personas con las que 

he coincidido en mi estancia en Nueva York. Fue una experiencia maravillosa, que me 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

aportó muchísimo a nivel laboral y sobre todo a nivel personal. Muchas gracias a la Dra. 

Ana María Cuervo, una científica digna de admirar. Ha sido un honor formar parte de tu 

laboratorio durante 3 meses y poder enriquecerme de todos vosotros. Espero que 

nuestros caminos se vuelvan a cruzar en algún momento.  

Pero esta historia comienza mucho antes de mi llegada al laboratorio. En 

realidad, a quien le tengo que estar verdaderamente agradecida es a mi cuñada Sonia. 

Ojalá hubieras podido estar hoy presente, se que te hubiera encantado. Gracias por 

haberme aconsejado que estudiara Biología y que realizara una Tesis; por confiar en que 

podría lograrlo. Seguro que desde ahí arriba te sientes orgullosa de mí. Y gracias a eso 

es como conocí a unas neuronitas maravillosas en la universidad. En primer lugar 

quiero darle las gracias al gran eritrocito de la historia de la biología, Félix. Por todos 

los buenos momentos vividos desde hace 12 años, por haber cogido tu a la raya en 

aquellas prácticas de zoología y por aquella maravillosa prótesis de rodilla. A Selene, 

muchas gracias por estar conmigo también desde el comienzo e incluso en nuestra 

aventura neoyorquina que nos enseñó a ser fuertes. Viva Breaking Bad y las ardillas del 

Central Park!. A Miguel, que te voy a decir a ti mi auténtica neuronita. Sabes que eres 

muy especial. Gracias por tus consejos en la facultad, por tu sonrisa siempre en la cara, 

y por tu esfuerzo que ha permitido que te veamos en tu sitio. Hay poca gente tan grande 

como tú. A Virginia, muchísimas gracias por ser como eres, por enseñarme que existe la 

versión “paperwoman”, igual de guapa en cuerpo y cerebro. Fue un honor compartir la 

taquilla con tus globos y dibujo de calavera. A Sari, gracias por los ánimos y por ser el 

esfuerzo personificado, por no rendirte nunca. Gracias por enseñarme que un gran 

científico no se mide por la suerte que tenga en la vida. Y gracias por compartir 

conmigo aquella boda y despedida de soltera, querida Miley. A Giaco y Sandra, muchas 

gracias por esta última etapa. Aunque os conozca un poco menos, me habéis aportado 

risas y apoyo en nuestra fase tesista. Sois geniales!.   

Tengo que agradecerle también su apoyo a una serie de personas que me 

conocen de cerca. A Iliana, por todo. Eres una amiga incondicional y gran parte de esta 

Tesis en cierto modo también es tuya. Gracias por estar siempre a mi lado y por los 

grandes momentos vividos, y los que quedan. Por acompañarme en mis aventuras de 

biólogos, por escucharme siempre, por alegrarte por mis logros y por estar orgullosa de 

mí desde el más sincero corazón. Gracias a Nuria, Félix y Dani, por considerarme como 

de la familia. Y gracias a Pablo, Felipa, Pablo, Mari Carmen, Pablito, Chispi, Jesús y 



 

 

 

 

 

 

 

Ana, por todo vuestro apoyo en todo momento. Soy muy feliz formando parte de 

vuestras vidas. 

Y en último lugar, quiero agradecerle a toda mi familia su mera existencia y su 

apoyo incondicional. A mis padres, por haber permitido con vuestro esfuerzo que 

tuviera unos estudios que me han llevado hasta aquí. Gracias por confiar en mí, por no 

haberme impuesto nunca lo que tenía que hacer con mi futuro y por enseñarme a ser 

como soy. Sin vosotros esta Tesis no hubiera tenido sentido. Me alegro mucho de que 

formarais parte también de mi estancia y de que hayáis podido conocer Nueva York. 

Espero que con esto no sigáis presumiendo de hijos xD. A mis hermanos, por ser tan 

distintos como sois, lo que hace que mi vida sea aun mejor. Gracias por bajar el 

volumen de la música en mis tiempos de estudio, por ello llegué hoy hasta donde estoy. 

Y gracias por escuchar lo que digo cuando hablo de mi trabajo aunque no entendáis ni 

una palabra. Preparaos para la próxima carrera de karts porque con la Tesis terminada 

ya podré con todo!. Gracias a mis sobrinos, Sandra y Roberto, por no pensar que soy 

una asesina de ratones y que lo que hago tiene algo de valor. Y gracias a mis primas 

Cira, Noemí, Mónica y Ana, vuestros ánimos siempre me han hecho sentir como si ya 

hubiera triunfado. 

El último párrafo de esta parte tan importante quiero dedicárselo a la persona 

gracias a la cual sin duda hoy puedo decir que soy Doctora: a Alberto. Eres la mejor 

persona que he conocido y me siento muy afortunada de tenerte a mi lado. Gracias por 

no permitirme que tire la toalla en esta última etapa tan difícil para mí, y por haber 

sobrevolado el Atlántico para estar conmigo. En cierto modo, Nueva York y 

Washington siempre formarán parte de nuestras vidas. Gracias por entenderme en cada 

decisión y cada paso que doy. Gracias por confiar en que todo mi esfuerzo tendrá su 

recompensa. Gracias por no frenarme en mi carrera científica en ningún momento y por 

no imponerme ningún futuro. Mi futuro es hoy y contigo, allá donde queramos. Gracias 

por permitirme ser una parte tan importante de tu vida.  



 

 

 



 

 
 

 

 

 

 

 

  

  

  

 

  

 

 

 

 

 

  

 

 

 

  

 

 

 

ÍNDICE 


RESUMEN__________________________________________________________ 17 

ABSTRACT _________________________________________________________ 18 

ABREVIATURAS ____________________________________________________ 19 

INTRODUCCIÓN ____________________________________________________ 25 

1. LA AUTOFAGIA ______________________________________________________ 25 

1.1 La macroautofagia ___________________________________________________________26
 

1.2 La autofagia mediada por chaperonas (CMA) ______________________________________29
 

1.3 Funciones fisiológicas de la autofagia ____________________________________________32
 

1.3.1 Control de la calidad celular mediante la autofagia ______________________________33
 

1.3.2 Papel metabólico de la autofagia ____________________________________________34
 

1.4 La autofagia y su relación con patología __________________________________________36
 

2. LA MITOFAGIA_______________________________________________________ 37 

2.1 La mitocondria______________________________________________________________37
 

2.1.1 Metabolismo mitocondrial _________________________________________________37
 

2.1.2 La homeostasia mitocondrial _______________________________________________39
 

2.2 La Mitofagia _______________________________________________________________40
 

2.2.1 Definición de la mitofagia _________________________________________________40
 

2.2.2 Funciones y reguladores moleculares de la mitofagia ____________________________41
 

2.2.2.1 Degradación de mitocondrias dañadas vía PINK1-Parkina ____________________42
 

2.2.2.2 Degradación de mitocondrias vía NIX/BNIP3 ______________________________44
 

2.2.2.3 Mecanismos de compensación entre los reguladores de mitofagia ______________47
 

3. DESARROLLO DE LA RETINA DE VERTEBRADOS ______________________ 49 

3.1 Estructura de la retina adulta ___________________________________________________49
 

3.2 Desarrollo de la retina de vertebrados ____________________________________________50
 



 

  

  

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

  

 

 

 

 

 

  

3.3 Desarrollo de las células ganglionares de la retina___________________________________53
 

3.4 Muerte celular durante el desarrollo de la retina ____________________________________54
 

3.5 Autofagia en retina y su relación con la muerte celular durante el desarrollo embrionario ____56
 

4. MITOFAGIA Y MUERTE CELULAR_____________________________________ 57 

5. REPROGRAMACIÓN METABÓLICA____________________________________ 59 

5.1 Efecto Warburg _____________________________________________________________59
 

5.2 Metabolismo de la retina de vertebrados __________________________________________60
 

5.3 Mitofagia y reprogramación metabólica __________________________________________61
 

5.4 Mitofagia en las neuronas _____________________________________________________63
 

OBJETIVOS ________________________________________________________ 69 

MATERIALES Y MÉTODOS___________________________________________ 73 

1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Y EXTRACCIÓN DE RETINAS_______ 73 

1.1 Ratones wildtype C57 y CD1___________________________________________________73
 

1.2 Ratones GFP-LC3 ___________________________________________________________73
 

1.3 Ratones deficientes de Atg5____________________________________________________74
 

1.4 Ratones deficientes de Ambra1 _________________________________________________74
 

1.5 Ratones deficientes de NIX (BNIP3L) ___________________________________________74
 

1.6 Ratones deficientes de LAMP-2A _______________________________________________74
 

2. GENOTIPAJE DE LOS RATONES KNOCK-OUT __________________________ 75 

2.1 Genotipaje de ratones adultos y embriones de la colonia Atg5 _________________________76
 

2.2 Genotipaje de ratones adultos y embriones de la colonia NIX _________________________76
 

2.3 Genotipaje de ratones adultos de la colonia Ambra1_________________________________77
 

2.4 Genotipaje de embriones deficientes de Ambra1____________________________________78
 

3. ESTUDIO DEL FLUJO DE AUTOFAGIA IN VIVO _________________________ 79 

4. CULTIVOS ORGANOTÍPICOS DE RETINAS _____________________________ 79 

5. MONTAJE EN PLANO DE RETINAS EMBRIONARIAS ____________________ 81 

6. INMUNOFLUORESCENCIA DE RETINAS EN PLANO _____________________ 81 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

  

   

7. DETECCIÓN DE LA MUERTE CELULAR ________________________________ 82
 

8. PREPARACIÓN DE SECCIONES DE OJO PARA INMUNOFLUORESCENCIA 83
 

9. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y CONFOCAL ____________________ 84
 

10. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA _______________________________________ 85
 

11. DISOCIACIÓN DE RETINAS Y CITOMETRÍA DE FLUJO_________________ 85
 

12. ESTUDIO TRANSCRIPTÓMICO Y DETECCIÓN DE RNA MENSAJERO ____ 87 

13. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT______________ 89
 

14. CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE ATP __________________________ 91
 

15. ANÁLISIS METABÓLICO _____________________________________________ 91
 

16. EXTRACCIÓN Y ESTIMULACIÓN DE MACRÓFAGOS PERITONEALES DE 


RATÓN_________________________________________________________________ 94
 

17. CULTIVO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS ______________________ 94
 

18. ANÁLISIS ESTADÍSTICO _____________________________________________ 95
 

RESULTADOS ______________________________________________________ 99
 

1. ESTUDIO DE LA AUTOFAGIA EN LA RETINA DE RATÓN ________________ 99
 

2. FENOTIPO DE MUERTE CELULAR TRAS EL BLOQUEO DE AUTOFAGIA 

DURANTE EL DESARROLLO DE LA RETINA DE RATÓN__________________ 104 

3. FENOTIPO DE MUERTE CELULAR TRAS LA INDUCCIÓN DE AUTOFAGIA 

DURANTE EL DESARROLLO DE LA RETINA DE RATÓN__________________ 122 

4. MITOFAGIA DURANTE EL DESARROLLO DE LA RETINA Y SU RELACIÓN 


CON EL METABOLISMO, LA DIFERENCIACIÓN Y LA MUERTE CELULAR_ 138
 

4.1 Mitofagia y metabolismo _____________________________________________________138 

4.2 Mitofagia y diferenciación de las células ganglionares de la retina de ratón ______________146 

4.3 Señal inductora y mecanismo molecular de mitofagia en retinas de E15.5 _______________162 



 

   

  

 

  

 

 

  

   

      

   

  

 

 

 

 

 

4.4 Mitofagia y muerte celular en E15.5 ____________________________________________171 

4.5 Mitofagia durante el desarrollo postnatal de la retina _______________________________174 

DISCUSIÓN _______________________________________________________ 179 

1. ESTUDIO DEL FLUJO DE AUTOFAGIA EN RETINA___________________ 179 

2. LA AUTOFAGIA ES ESENCIAL PARA LA ELIMINACIÓN DE LAS CÉLULAS 

APOPTÓTICAS DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE LA RETINA 

_______________________________________________________________________ 180 

3. LA MITOFAGIA ES ESENCIAL PARA EL DESARROLLO DE LA RETINA DE 

RATÓN________________________________________________________________ 185 

3.1. Un aumento de NIX regula la mitofagia en retinas a E15.5 __________________________185 

3.2. La mitofagia regula la muerte celular fisiológica de la retina en desarrollo ______________194 

3.3. La mitofagia induce un cambio metabólico durante  el desarrollo de la retina de ratón ____199 

3.4. La mitofagia regula la diferenciación de las células ganglionares de la retina ____________204 

3.5. Mitofagia durante el desarrollo postnatal de la retina _______________________________209 

4. EL CAMBIO METABÓLICO REGULA LA DIFERENCIACIÓN CELULAR __ 211 

CONCLUSIONES ___________________________________________________ 221 

BIBLIOGRAFÍA ____________________________________________________ 225 

ANEXOS __________________________________________________________ 255 



 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

RESUMEN 

En esta Tesis Doctoral hemos querido entender el papel de la autofagia y la 

mitofagia en el desarrollo de la retina de ratón. Nuestros datos muestran que la autofagia 

es un proceso activo durante el desarrollo de la retina de ratón, sobre todo en los 

estadios embrionarios iniciales, siendo las células ganglionares las que presentan un 

mayor flujo de autofagia. Este proceso presenta diversas funciones durante la fisiología 

de la retina embrionaria. En primer lugar, hemos demostrado que existen diferencias en 

los niveles de masa mitocondrial en las retinas de embriones en E13.5 debido a la 

degradación de mitocondrias por mitofagia únicamente en la región central de la retina 

en dicho estadio. Por otro lado hemos demostrado que la autofagia es necesaria para 

mantener unos niveles de ATP adecuados para la exposición de fosfatidil-serina en la 

superficie de las células apoptóticas, lo que permite su reconocimiento y degradación. 

Esta función no es universal, ya que la inhibición de autofagia no produce una 

acumulación de células apoptóticas en la región central, donde la masa mitocondrial es 

menor. Por otro lado, la mitofagia que se produce en la zona central de la retina 

contribuye a la muerte neural temprana localizada en dicha región.   

Además, esa degradación mitocondrial se produce de manera generalizada en 

toda la retina en un estadio del desarrollo mas avanzado, E15.5, debido a la activación 

del proceso de mitofagia regulado por hipoxia y NIX. En este caso, la mitofagia no solo 

contribuye a la muerte fisiológica de la retina, si no que también es responsable de un 

cambio metabólico hacia glicólisis necesario para la correcta diferenciación de las 

células ganglionares de la retina. Además, existe una estrecha relación entre el 

metabolismo, la masa mitocondrial y la diferenciación, ya que la modulación directa de 

la glicólisis produce cambios en los niveles de mitocondrias y altera la diferenciación de 

células ganglionares. Ese cambio metabólico mediado por mitofagia, también podría 

estar implicado en la polarización de macrófagos hacia tipo proinflamatorio M1 y en la 

diferenciación temprana de células stem. 

17
 



 

 

 
 

 

 

 

 

ABSTRACT 

In this PhD we wanted to understand the role of autophagy and mitophagy in the 

developing mouse retina. Our data show that autophagy is an active process during 

development of the mouse retina, especially in the early embryonic stages, being retinal 

ganglion cells which have a greater autophagy flux. This process has several functions 

during embryonic retina physiology. First, we have shown that there are differences in 

mitochondrial mass levels in the retinas of E13.5 embryos due to degradation of 

mitochondria by mitophagy only in the central region of the retina in that stage. 

Furthermore we have shown that autophagy is necessary to maintain ATP levels 

suitable for the exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic cells, 

allowing their recognition and degradation. This function is not universal, since 

inhibition of autophagy doesn´t lead to an accumulation of apoptotic cells in the central 

region where the mitochondrial mass is lower. Furthermore, the mitophagy that occurs 

in the central area of the retina contributes to early neural cell death located in that 

region. 

Moreover, the mitochondrial degradation occurs widely in the entire retina in a 

more advanced stage of development, E15.5 due to activation of mitophagy process 

regulated by hypoxia and NIX. In this case, mitophagy not only contributes to the 

physiological cell death of the retina, if not it is also responsible for a metabolic shift 

towards glycolysis required for proper differentiation of retinal ganglion cells. 

Furthermore, there is a close relationship between the metabolism, mitochondrial mass 

and differentiation, since direct modulation of glycolysis lead to changes in 

mitochondrial levels and disturb the differentiation of retinal ganglion cells. That 

metabolic change mediated by mitophagy also may be involved in macrophage 

polarization to proinflammatory type M1 and to early differentiation of stem cells. 

18
 



 

 

 

 
 

 
 

  
 

 

   
    
  
     

 
 

    

   
          

  

   
         

 
 

  
   

 

         

 
  

 
  

         
      

 
  
     

ABREVIATURAS 

3-MA 3-metil-Adenina 
ABC del inglés, ATP Binding Cassette 
Ad libitum sin límite 
AKT proteína kinasa B 
Ambra1  del ingles, Activating Molecule of Beclin-1 Regulated Autophagy 
AMPK proteína kinasa activada por AMP 
ANT adenín-nucleótido translocasa 
AO antimicina+oligomicina  
Atg del inglés, Autophagy Related Gene. Gen relacionado con la autofagia 
ATP adenosin trifosfato 
AZD AZD8055 
Bak del inglés, Bcl-2 homologous antagonist killer 
Bax del inglés, Bcl-2 associated x protein 
Blot del inglés, transferencia 
Becn1 gen de beclina1 
Boc Boc-D-FMK 
Brn3a Factor de transcripción Brain3a 
BSA del inglés, Bovine serum abumine. Albúmina sérica bovina 
Casp3a Caspasa-3 activa 
CCCP carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona 
cDNA DNA complementario 
CMA del inglés Chaperone mediated autophagy. 
COX citocromo oxidasa 
DABCO 1,4-diazabiciclo-(2, 2,2)-octano 
DAPI 1,4-diamino-2-fenilindol   
De novo del latín, de nuevo 
DHE del inglés, dihydroethidium 
DIOC del inglés, 3,3'-Dihexyloxacarbocyanine Iodide 
DMEM del inglés, Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium 
DNA del inglés, Deoxyribonucleic Acid 
DNasa enzima que digiere el DNA 
dNTP del ingles, deoxynucleotide-triphosphate 
DTT ditiotreitol 
E Día Embrionario 
EBSS del inglés, Earl´s Balanced Salt Solution 
ECAR del inglés, extracellular acidification rate. 
EDTA etilendiaminotetraacético 
ER retículo endoplasmico 
FBS del inglés, fetal bovin serum. Suero fetal bovino 
FCCP del inglés, fluoro-carbonyl cyanide phenylhydrazone. 
Feeder del inglés, sustento alimenticio 
FOXO3 factor de transcripción de la familia forkhead box O 
GAPDH del inglés, Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase 
GCL del inglés, Ganglion Cell Layer. Capa de células ganglionares 

19
 



 

 

 
 

         
  

            
    

        
 

 
 

  
 

 
   

    
 
 

    
  

  

 
 

 
 

 

  

  
  

  
 

 
 

 
 

 
 

gene trapping   técnica genética para la inactivación y detección génica por inserción         
de secuencias en el genoma 

GFP del inglés, green fluorescent protein. Proteína verde fluorescente 
HCQ hidroxicloroquina 
HK hexokinasa 
Hsc70  del inglés, heat shock cognate protein of 70kDa 
IF1 del inglés, inhibitor factor 1. Factor inhibitorio 1 
IFN-γ Interferon γ 
IL-13 Interleucina 13 
IL-4 Interleucina 4 
in vitro del latín, en el vidrio. De forma artificial. 
in vivo del latín, en vivo 
IP inyección intraperitoneal 
IPL capa plexiforme interna 
iPS del inglés, induced pluripotent stem (cells) 
JNK del inglés, c-jun N-terminal kinase 
KO del inglés, knock-out 
L2A LAMP-2A, glicoproteína de membrana asociada a lisosoma de tipo 2 
LAP Fagocitosis asociada a LC3 
LC3 del inglés, microtubule-associated protein 1 light chain 3 
LDH lactato deshidrogenasa 
Leu leupeptina 
LIF del inglés, Leukemia inhibitory factor. 
LKB kinasa B de hígado 
LPS lipopolisacárido 
LTR Lysotracker Red 
LY LY294002 
M  del inglés, mature. Zona más madura de la retina. 
M1 macrófagos de tipo proinflamatorio M1 
M2 macrófagos de tipo antiinflamatorio M2 
Merge del inglés, colocalización 
MP Metil-piruvato 
mRNA RNA mensajero 
mtDNA DNA mitocondrial 
MTDR Mitotracker deep red 
Mtf Mitofusina 
mTOR del inglés, Target of rapamycin 
MUL1 del inglés, mitochondrial E3 ubiquitin protein ligase 1 
NbL capa de neuroblastos 
Nfe2l1 del inglés, nuclear respiratory factor 2 
NGS del inglés, Normal Goat Serum. Suero normal de cabra 
NRF1 del inglés, nuclear respiratory factor 1, factor respiratorio nuclear 1 
OCR del inglés, oxygen consumption rate 
Optn gen de Optineurina 
OXPHOS fosforilación oxidativa 
P Postnatal 
Park2 gen de Parkina 
PBS del inglés, Phosphate Buffered Saline 
PCNA del inglés, proliferating cell nuclear antigen 
PCR  del inglés polymerase chain reaction 

20
 



 

 

 

 
 

 

 

   
 

 

  
  

 

  
 
  

 
 

PE fosfatidiletanolamina 
PFA paraformaldehído 
Pi fosfato inorgánico 
PI3K del inglés, Phospho-Inositide-3 kinase. Fosfatidil-inositol-3 kinasa. 
PINK1 proteína kinasa 1 inducida por PTEN 
PK piruvato kinasa 
PS del inglés, Phosphatidyl-Serine. Fosfatidil-serina. 
MPTP poro de transición de permeabilidad mitocondrial 
Rapa rapamicina 
RIN del inglés, RNA integrity number 
ROS del inglés, reactive oxygen species, especies reactivas de oxígeno 
ROT rotenona 
SDS dodecilsulfato de sodio 
Sirt1 sirtuína 1 
SMURF1 del inglés, SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1 
TCA ciclo de los ácidos tricarboxílicos 
TdT el inglés, Terminal Deoxinucleotidyl Transferase 
TE tris-EDTA 
TF del inglés, transcription factor. Factor de transcripción 
TFEB factor de transcripción EB 
TL del inglés, Tomato Lectin. Lectina de tomate 
TUNEL del ingles, TdT-mediated dUTP Nick End Labelling 
WM wortmanina 
Wt wildtype, genotipo salvaje 
X+/+ Genotipo homozigoto para el alelo salvaje 
Xgt/gt Genotipo homozigoto para el alelo inactivado por gene trapping 
Y  el inglés, young. Zona menos madura, de neuronas recién diferenciadas 
ΔΨm potencial de membrana mitocondrial 

21
 



 

 



 

 

 

 

 

 

INTRODUCCIÓN
 



 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

  

INTRODUCCIÓN 


1. LA AUTOFAGIA 

La homeostasis celular se mantiene con un equilibrio entre la síntesis y la 

degradación de los componentes celulares. Las células contienen dos sistemas 

proteolíticos: el sistema ubiquitina-proteasoma y el sistema lisosomal. La degradación 

de componentes intracelulares en el interior de los lisosomas se conoce como autofagia, 

que deriva de las palabras griegas “auto” (que significa a sí mismo) y “fagia” (que 

significa comer) (Boya et al, 2013).  

Se han identificado tres tipos de autofagia basados en cómo los componentes 

celulares alcanzan el lisosoma: la macroautofagia, la autofagia mediada por chaperonas 

o CMA, y la microautofagia (Figura 1). La macroautofagia es el más conocido y 

simplemente se suele denominar autofagia. Durante este proceso los componentes 

celulares que van a ser degradados se encierran en un orgánulo llamado autofagosoma 

que se fusionará con el lisosoma (Ktistakis & Tooze, 2016). La autofagia mediada por 

chaperonas sólo está presente en las células de mamífero y permite la degradación 

selectiva de proteínas que poseen una secuencia de aminoácidos determinada. Este 

motivo es reconocido por una chaperona y tras la unión con un receptor presente en la 

membrana lisosomal permite la translocación de la proteína al interior del lisosoma 

(Kaushik & Cuervo, 2012). Por último, la microautofagia es un proceso mucho menos 

conocido donde el material a ser degradado se transloca directamente al interior del 

lisosoma (Sahu et al, 2011). Los lisosomas contienen más de 60 hidrolasas ácidas que 

son capaces de romper y digerir la mayor parte del material biológico (Boya, 2012). La 

degradación mediante estas enzimas (nucleasas, proteasas, lipasas y glicosidasas), 

genera unos productos que son devueltos al citoplasma mediante transportadores y 

permeasas embebidas en la membrana lisosomal (Yang & Klionsky, 2010a). 

25
 



 

 

 

 
 

 

 
 

 

 

 

 

Figura 1. Esquema representativo de los subtipos de autofagia según la forma de captación del 
material a degradar por la vía lisosomal. 

1.1 La macroautofagia 

La macroautofagia fue el primer tipo de autofagia identificado por Christian De 

Duve (De Duve & Wattiaux, 1966) al observar que las células poseían orgánulos de 

doble membrana cuyo interior se asemejaba mucho al citoplasma. Posteriormente, se 

descubrieron en levadura los reguladores moleculares que se conocen como genes Atg, 

lo que ha permitido empezar a conocer este proceso y sus implicaciones en las células y 

los tejidos (Klionsky, 2007). De ahora en adelante voy a denominar a la macroautofagia 

como autofagia. Este proceso se activa no solo en respuesta a un estrés celular sino 

también de manera fisiológica, ya que el bloqueo genético de esta vía lleva a la 

acumulación de orgánulos dañados o proteínas alteradas sobre todo en células 

postmitóticas como las neuronas (Hara et al, 2006; Komatsu et al, 2006).  Por lo tanto, 

el mantenimiento de la homeostasis celular y el control de calidad de proteínas 

requieren de una macroautofagia constitutiva. 

26
 



 

 

 
 

 

 

 

 

 
    

 

 

 

Fases de la autofagia 

La formación del autofagosoma es la primera etapa de la regulación de la 

inducción de la autofagia y se inicia con la generación de una doble membrana conocida 

como fagóforo, o membrana limitante en mamíferos. Posteriormente esa membrana se 

elonga para englobar regiones citosólicas y se acaba cerrando para formar el 

autofagosoma completo (Ktistakis & Tooze, 2016) (Figura 2). El origen de esta 

membrana es controvertido y se ha observado que puede derivar de la membrana 

plasmática, de la membrana externa mitocondrial y del retículo (Lamb et al, 2013). 

Figura 2. Esquema representativo de las fases del proceso de autofagia y proteínas Atg implicadas 
en su regulación.  

La etapa inicial de la formación del autofagosoma está regulada por un complejo 

de nucleación constituido por la kinasa Vps34 y otras tres proteínas: Beclina1, Vps15 y 

Atg14. Las modificaciones lipídicas que se producen en estas proteínas como 

consecuencia de la actividad kinasa de Vps34, facilitan la formación de una estructura 

de andamiaje que se emplea para el posterior ensamblaje de otras proteínas y lípidos, 

facilitándose así el crecimiento de la membrana del autofagosoma (Ktistakis & Tooze, 

2016). 

Para la formación de esta membrana, se necesita la acción coordinada de dos 

sistemas: el sistema de conjugación covalente de Atg5 y Atg12, y la conjugación de 

27
 



 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

Atg8 (LC3 en mamíferos) a la molécula lipídica fosfatidiletanolamina. Ambos procesos 

se regulan enzimáticamente por la proteína Atg7, que trabaja con diferentes compañeros 

en cada vía de conjugación. El continuo ensamblaje de estos complejos proteína-

proteína y proteína-lípidos junto con la llegada de lípidos de otras membranas 

intracelulares a través de moléculas como Atg9, facilitan el crecimiento de la membrana 

del autofagosoma (Noda & Inagaki, 2015). Las proteínas Atg también participan en el 

tráfico dependiente de microtúbulos de los autofagosomas y la fusión de los mismos con 

los lisosomas (Mizushima et al, 2008; Yang & Klionsky, 2010b). La macroautofagia, al 

igual que en el resto de los tipos de autofagia, finaliza con la degradación y/o reciclado 

de los productos de la digestión liberados de nuevo al citosol (Boya et al, 2013). 

Regulación de la autofagia 

La autofagia es principalmente un proceso de respuesta a estrés y en particular al 

estrés nutricional o alteración en el balance energético celular, por lo que está regulada 

por la acción de mTOR y AMPK (Wong et al, 2013). Además, diferentes situaciones 

como la hipoxia, la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, el daño al DNA ó el 

estrés de retículo, también pueden activar este proceso a través de distintas vías de 

señalización (Kroemer et al, 2010). Así, inhibidores de PI3K-III, como 3-metiladenina 

(3-MA) y wortmanina (WM) bloquean autofagia. Por el contrario, la rapamicina (rapa) 

induce autofagia mediante inhibición de  mTORC1 (Noda & Ohsumi, 1998). 

Cuando existe un estrés prolongado, se activa un programa de regulación génica 

para mantener la activación de la autofagia (Pietrocola et al, 2013; Settembre et al, 

2011). El principal componente de este programa es el factor de transcripción EB 

(TFEB), que normalmente está retenido en el citosol por fosforilación mediada por 

ERK2 o mTOR. TFEB regula la expresión de genes Atg implicados en  los distintos 

pasos del proceso, así como de genes requeridos para la biogénesis lisosomal (Sardiello 

et al, 2009). Otro factor implicado en la regulación de la autofagia inducida por estrés y 

esencial para la supervivencia durante el envejecimiento y en respuesta a ayuno es 

FOXO3 (Factor de transcripción de la familia forkhead box O). Este factor de 

transcripción controla la expresión de genes clave de autofagia como Atg4b, Atg7, 

Beclina, Gabarap1, Map1lc3b y Bnip3 (Fullgrabe et al, 2014). 

28
 



 

 

 

 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 
 

 

 

   

Autofagia selectiva 

Durante mucho tiempo se ha pensado que la macroautofagia era un proceso de 

degradación aleatoria, pero recientemente se ha descrito que existen tipos de autofagia 

selectiva que degradan específicamente diferentes componentes celulares como las 

mitocondrias, el retículo, los ribosomas, los agregados de proteínas y los patógenos 

intracelulares (Figura 3). Todos los tipos de autofagia selectiva comparten la misma 

maquinaria que la macroautofagia general para la formación del autofagosoma, pero 

difieren en las moléculas de reconocimiento del material a degradar (Debnath, 2015). 

En esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de la mitofagia, que es la 

degradación selectiva de mitocondrias por la maquinaria de autofagia.  

Figura 3. Esquema representativo de los tipos de macroautofagia selectiva. 

1.2 La autofagia mediada por chaperonas (CMA) 

La autofagia mediada por chaperonas es utilizada por la célula para degradar 

selectivamente proteínas citosólicas que presentan un motivo específico para su 

reconocimiento: KFERQ. Más del 20% de las proteínas citosólicas poseen dicho motivo 

(Kaushik & Cuervo, 2012). 

29
 



 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 
  

 

 
 
 
 

 
 

 

 

 

Fases de la CMA 

El proceso de CMA comienza con el reconocimiento del motivo KFERQ de la 

proteína a degradar por la chaperona hsc70 (del inglés, heat shock cognate protein of 

70kDa), que se encarga de identificar y entregar proteínas individuales una a una a la 

superficie del lisosoma para su translocación y degradación (Cuervo, 2010; Orenstein & 

Cuervo, 2010; Susmita Kaushik, 2011).Tras llegar a los lisosomas, el complejo 

chaperona sustrato se acopla a la membrana lisosomal mediante interacción con la 

proteína de membrana lisosomal LAMP-2A (L2A) (Cuervo & Dice, 1996). La unión de 

los sustratos a la forma 

monomérica de L2A dirige su 

organización en un complejo de 

translocación multimérico 

(Bandyopadhyay et al, 2008), de 

manera que el sustrato desplegado 

es capaz de atravesar la membrana 

lisosomal para ser finalmente 

degradado por proteasas 

lisosomales (Figura 4).  

Figura 4. Esquema de las fases de la  
CMA (Susmita Kaushik, 2011) 

Regulación de la CMA 

Los niveles de L2A en la membrana lisosomal determinan directamente la 

actividad de la CMA, ya que la unión de sustratos a su región citosólica es el 

componente limitante de este proceso (Cuervo & Dice, 2000). La CMA se activa ante la 

deprivación prolongada de nutrientes, el estrés oxidativo y por acumulación de proteínas 

dañadas. 

30
 



 

 

 

 
 

 
 

  
 

  
 

 
 

 

 
 

 

 

 

 

 

La deprivación prolongada de nutrientes es el principal inductor de la CMA, 

pero a diferencia de la macroautofagia, que se activa rápidamente ante el ayuno, este 

proceso aumenta su actividad a las 8h de ayuno y alcanza la máxima inducción a las 

13h. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) aumentan la degradación de sustratos vía 

CMA mejorando la accesibilidad del motivo KFERQ a hsc70 e incrementando la 

eficiencia de internalización hacia el lumen lisosomal (Kiffin et al, 2004). Por último, 

cuando existe una acumulación de proteínas dañadas o mal plegadas, como ocurre en el 

caso de algunas proteínas patogénicas, la actividad de la CMA puede ser incrementada 

(Arias & Cuervo, 2011) (Figura 5). 

Figura 5. Esquema de las 
funciones fisiológicas de la 
CMA. La deprivación 
prolongada de nutrientes y el 
estrés oxidativo inducen la 
actividad de CMA (Susmita 
Kaushik, 2011) 

La mayoría de las células tienen niveles basales de actividad de CMA que 

funciona continuamente para degradar sustratos incluso en ausencia de estrés, y su 

bloqueo resulta en la acumulación de proteínas dañadas o agregados proteicos en 

diferentes tipos celulares (Orenstein et al, 2013). 

Sustratos de la CMA 

Se han validado diferentes proteínas que son sustrato de CMA y están 

implicadas en múltiples procesos celulares. Entre ellas se encuentran varias enzimas 

glicolíticas (Aniento et al, 1993; Cuervo et al, 1994; Lv et al, 2011; Tasset & Cuervo, 

2016), lo que tiene implicaciones fisiológicas, como un incremento en la actividad 

glicolítica cuando la CMA está alterada en un sistema  metabólicamente activo como 

los hepatocitos (Schneider et al, 2014; Tasset & Cuervo, 2016). Otro sustrato de CMA 

de interés en esta Tesis Doctoral es el factor de transcripción inducido por hipoxia 

(HIF1α) (Ferreira, 2015). 

31
 



 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 
 

1.3 Funciones fisiológicas de la autofagia 

La autofagia basal previene la acumulación de agregados proteicos intracelulares 

evitando así el estrés de retículo. Además, la degradación de orgánulos dañados, como 

las mitocondrias, evita su agregación y el incremento de ROS. Por otro lado, la 

inducción de autofagia permite proporcionar nutrientes utilizados por la célula para 

generar energía (Ktistakis & Tooze, 2016) (Figura 6).  

En la pasada década se han descrito un gran número de funciones celulares del 

proceso de autofagia como resultado de muchos estudios llevados a cabo utilizando 

modelos genéticos y tratamientos farmacológicos para bloquear o incrementar la 

autofagia. Modelos de ratón carentes de genes reguladores de autofagia no redundantes 

como Atg3, Atg5, Atg7, Atg9, Atg16, Ambra1, Rb1cc1/Fip200, y Beclina1, son letales 

embrionarios o perinatales (Mizushima & Levine, 2010). Estos modelos implican un 

papel de la autofagia durante el desarrollo embrionario, la supervivencia celular, la 

inmunidad y la longevidad (Figura 6). Además, se ha visto que la autofagia es necesaria 

para la diferenciación de numerosos tipos celulares como los eritrocitos, los adipositos, 

los linfocitos T y los osteoclastos (Baerga et al, 2009; Kundu et al, 2008; Sandoval et al, 

2008; Schweers et al, 2007; Singh et al, 2009; Zhang et al, 2009) (Lu et al, 2013; 

Stephenson et al, 2009; Zhao et al, 2012). Nuestro grupo ha demostrado que la autofagia 

es esencial para la diferenciación neuronal desempeñando un papel importante en la 

axonogénesis y neuritogénesis durante la diferenciación de células madre de bulbo 

olfativo (Vazquez et al, 2012). 

32
 



 

 

   

 

 

 

 

Figura 6. Síntesis de las funciones fisiológicas de la autofagia y su implicación en la patología.  

1.3.1 Control de la calidad celular mediante la autofagia 

Como sistema de degradación intracelular, la autofagia desempeña un papel en 

el control de calidad celular, evitando la acumulación de proteínas mal plegadas y de 

orgánulos dañados, así como mediante la eliminación de bacterias o patógenos 

intracelulares (Mizushima et al, 2008). Estudios con knock-out condicionales de los 

genes Atg5 o Atg7, muestran un compromiso severo de la función celular debido a la 

acumulación de agregados proteicos y disfunción de orgánulos celulares que 

incrementan la producción de ROS (Komatsu et al, 2006; Komatsu et al, 2005; Kuma et 

al, 2004). 

Aunque tanto la macroautofagia (Scherz-Shouval et al, 2007) como la CMA 

(Kiffin et al, 2004) se activan durante un estrés oxidativo, sus funciones protectoras no 

son redundantes. De hecho, la contribución de una vía u otra prevalece dependiendo de 

la diana del daño oxidativo. Así, cuando predomina un daño proteico destaca la 

selectividad de la CMA (Arias & Cuervo, 2011), mientras que un daño en orgánulos y 

acumulación de agregados proteicos dependen en mayor parte de la macroautofagia. La 

mayor parte de los efectos antioxidantes de la macroautofagia se han atribuido a su 

papel en la eliminación de mitocondrias dañadas mediante mitofagia.  

33
 



 

 

 

 

 

 

 

 
  

 
 
 

1.3.2 Papel metabólico de la autofagia 

A lo largo de los últimos años, varios estudios muestran la relación entre la 

autofagia y el metabolismo celular. En un trabajo llevado a cabo en levaduras se 

observa que el ayuno de nitrógeno promueve la degradación de mitocondrias vía 

autofagia inducida por ROS, manteniendo la masa mitocondrial al mínimo de acuerdo a 

los requerimientos energéticos y previniendo a su vez un exceso en la producción de 

ROS (Kurihara & 2012). En células de mamífero, el ayuno de aminoácidos induce 

muerte celular cuando la autofagia está inhibida (Boya et al, 2005). El uso de metil­

piruvato (MP), un sustrato del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) permeable a la 

mitocondria capaz de incrementar los niveles de ATP intracelular, revierte dicha 

muerte. Esto indica que los nutrientes obtenidos por la autofagia tienen un importante 

papel en la producción de ATP (Lum et al, 2005), ya que la degradación lisosomal 

genera componentes celulares como aminoácidos, ácidos grasos libres y carbohidratos 

que pueden ser reciclados para mantener las funciones energéticas y biosintéticas de la 

célula (Mizushima & Klionsky, 2007; Singh & Cuervo, 2011) (Figura 7). 

Figura 7. Esquema que muestra la inducción de autofagia por deprivación de nutrientes (Levine & 
Yuan, 2005). 

34
 



 

 

 

  

 

   

 

  

 

 

 

 

 

Existen dos principales vías de señalización que traducen la información sobre el 

estado energético de la célula y modulan la autofagia: la vía de mTOR y la señalización 

por AMPK (Wong et al, 2013). 

TOR es una serina-treonina kinasa altamente conservada que desempeña un 

papel importante durante el crecimiento celular, la autofagia y el metabolismo en 

respuesta a factores de crecimiento, nutrientes, hipoxia y estrés energético. En 

mamíferos, la kinasa está presente en dos complejos: el complejo 1 (mTORC1) y el 

complejo 2 (mTORC2). mTORC1 integra la señalización de factores de crecimiento con 

la disponibilidad de nutrientes y puede ser inhibido por rapamicina.  Este complejo está 

presente en la membrana de los lisosomas y está controlado por el flujo de aminoácidos 

y glucosa liberados desde este compartimento (Zoncu et al, 2011),  ejerciendo una 

regulación negativa de la autofagia (Hosokawa et al, 2009). Durante el ayuno, se 

suprime la actividad de mTORC1, lo que conduce al catabolismo proteico vía 

macroautofagia con el fin de reponer el conjunto de aminoácidos intracelulares y 

conservar la síntesis proteica (Mortimore et al, 1988). Por el contrario, mTORC2  es 

insensible a nutrientes y rapamicina y no  está directamente implicado en la autofagia 

(Bar-Peled & Sabatini, 2014; Zoncu et al, 2011). Además, una disminución en los 

niveles de ATP se asocia con un incremento en los niveles de AMP que lleva a la 

activación de AMPK. Una vez activada, AMPK estimula procesos catabólicos, como la 

entrada y el metabolismo de glucosa y ácidos grasos, e inhibe procesos anabólicos 

(Hardie, 2007; Mihaylova & Shaw, 2011). Si no se logra restaurar el balance energético, 

se generará un estrés metabólico que llevará a la inducción de autofagia mediante la 

interacción de AMPK con Ulk1 (Egan et al, 2011). 

Por otro lado, la autofagia contribuye al metabolismo general de la célula 

mediante la degradación selectiva de depósitos de glicógeno (glicofagia) (Debnath, 

2015) y mediante la activación de la CMA (Tasset & Cuervo, 2016). Tanto la 

generación de aminoácidos a partir de la degradación de proteínas como el papel de 

CMA en la degradación de enzimas glicolíticas  podrían estar detrás de los cambios 

energéticos celulares observados cuando la CMA está alterada (Kon et al, 2011; Lv et 

al, 2011), destacando así su papel en la regulación de la homeostasis metabólica.   

Todos estos mecanismos implicados en la homeostasis metabólica pueden estar 

a su vez condicionados por la disponibilidad de oxígeno. La hipoxia lleva a un cambio 

35
 



 

 

 
 

 

 
 

 

en la velocidad del metabolismo mediante regulación de la actividad de mTORC1, con 

el fin de disminuir el consumo de ATP y reducir así la demanda de oxígeno para 

mantener la homeostasis metabólica. Esto se apoya por estudios previos en los que se 

describe que la inhibición de mTORC1 por hipoxia induce autofagia (Solaini et al, 

2010). 

1.4 La autofagia y su relación con patología 

Considerando la autofagia como un proceso fisiológico,  se podría deducir que la 

alteración de dicho sistema puede desencadenar enfermedad. De hecho, diferentes 

estados patológicos como el cáncer, procesos infecciosos, la disfunción metabólica, la 

neurodegeneración, las cardiomiopatías, las miopatías y la enfermedad de Crohn, están 

asociados a un mal funcionamiento de los diferentes tipos de autofagia (Kroemer, 

2015) (Figura 8). 

Figura 8. Esquema de los estados patológicos con mal funcionamiento de la autofagia (Mizushima et 
al, 2008). 

36
 



 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

En enfermedades como el Huntington, se ha descrito una alteración de la 

autofagia debido a la inhabilidad de formar autofagosomas que reconozcan 

selectivamente a su carga citosólica (Arrasate & Finkbeiner, 2012; Martinez-Vicente et 

al, 2010). En la enfermedad de Alzheimer, existe una disfunción del tráfico vesicular  y 

fallo en la fusión lisosomal que puede contribuir a la patogenicidad de la enfermedad 

(Yang et al, 2011). En el caso de ciertas formas de enfermedad de Parkinson, hay un 

fallo en la eliminación de mitocondrias dañadas por mitofagia debido a mutaciones 

recesivas en los genes que codifican Parkina y PINK1 (proteína kinasa 1 inducida por 

PTEN) (Corti & Brice, 2013; Geisler et al, 2010). Además, se ha descrito que en esta 

enfermedad hay un fallo en la degradación mediante CMA de proteínas patogénicas 

como α-sinucleína, lo que contribuye a la progresión de la patogénesis (Schneider & 

Cuervo, 2013). 

Hay que destacar por tanto que la autofagia es un proceso muy importante a 

nivel basal especialmente en tejidos como el cerebro y el corazón, constituidos por 

células postmitóticas que no pueden disminuir el daño intracelular mediante división 

celular. 

2. LA MITOFAGIA 

2.1 La mitocondria 

Las mitocondrias son orgánulos abundantes en la mayoría de los tipos celulares 

y constituyen aproximadamente el 10-40% del volumen celular. Estos orgánulos se 

encargan de procesos celulares esenciales como la producción de ATP, la formación de 

constituyentes para la síntesis de proteínas y ácidos grasos, la regulación de la muerte 

celular y la producción de especies reactivas de oxígeno (Duchen, 2004; Viale et al, 

2014; Weinberg & Chandel, 2015). Además, las mitocondrias presentan su propio 

ADN, que codifica para 13 péptidos de la cadena de transporte electrónico (Lemasters, 

2005; Prigione & Adjaye, 2010). 

2.1.1 Metabolismo mitocondrial  

En presencia de nutrientes y oxígeno, la mitocondria es el principal componente 

celular encargado de generar ATP. El proceso metabólico mitocondrial que utiliza la 

37
 



 

 

 

 
 

 
  

  
 

   
     

 

energía liberada durante la oxidación de nutrientes para producir ATP se denomina 

fosforilación oxidativa (OXPHOS) (Mitchell & Moyle, 1967). Dependiendo del tipo 

celular, las mitocondrias utilizan carbohidratos, ácidos grasos o aminoácidos para 

generar energía a través del TCA (Ciclo de los ácidos tricarboxílicos). Cuando se utiliza 

la glucosa como principal fuente de energía, ésta se procesa vía glicólisis en pirúvico. 

Posteriormente, el ácido pirúvico se transloca a la matriz mitocondrial donde es 

convertido en acetil-CoA, cuya oxidación genera electrones que se transportan a lo 

largo de la cadena respiratoria mitocondrial en la membrana interna mitocondrial. Esto 

permite el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, 

generando un gradiente de pH y un potencial de membrana (ΔΨm) a lo largo de la 

membrana interna mitocondrial. La energía de los protones que fluyen por gradiente 

electroquímico es utilizada por la ATP sintasa para la síntesis de ATP. Durante este 

proceso, el oxígeno puede generar anión superóxido (O2
-), el precursor de la mayoría de 

los ROS a nivel del complejo I y III de la cadena de transporte electrónico (Hamacher-

Brady & Brady, 2016) (Figura 9). 

Figura 9. Esquema de la cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa mitocondrial. 
Cadena de transporte de electrones (Complejos I, II, III y IV) y fosforilación oxidativa (OXPHOS, 
complejo V) en la membrana interna mitocondrial.  Las flechas azules representan el movimiento de 
protones. El desvío de electrones fuera de la cadena de transporte electrónico puede generar anión 
superóxido (O2

-), una especie reactiva de oxígeno (ROS). TCA: ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Cyto 
c: citocromo c. Complex V: complejo V o ATPsintasa (Hamacher-Brady & Brady, 2016) 

La fosforilación oxidativa y la glicólisis funcionan de manera coordinada 

(Semenza, 2007). La glicólisis, aunque es menos eficiente generando ATP comparado a 

la respiración mitocondrial, puede producirlo más rápidamente (Prigione & Adjaye, 

2010). En condiciones de normoxia, el piruvato entra en la mitocondria y relaciona la 

glicólisis con la respiración aeróbica mediante entrada en el TCA. Sin embargo, bajo 

bajas concentraciones de oxígeno o en presencia de mitocondrias disfuncionales, el 

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piruvato puede convertirse en lactato mediante acción de la enzima lactato 

deshidrogenasa (Varum et al, 2011). 

2.1.2 La homeostasia mitocondrial 

El contenido y la integridad mitocondrial están regulados a diferentes niveles 

(transcripcional, traduccional, y postraduccional) mediante procesos de fusión y fisión, 

así como mediante su degradación (Chen & Chan, 2005; Hock & Kralli, 2009). Todos 

estos procesos están coordinados e interaccionan con el fin de mantener la población 

mitocondrial adecuada capaz de sostener el estado bioenergético y  la viabilidad celular, 

además de generar intermediarios metabólicos necesarios para el crecimiento celular 

(Michael, 2012; Scarpulla et al, 2012).  En el citoplasma, mTORC1 acopla las señales 

que promueven el crecimiento celular con procesos anabólicos, en los cuales la 

mitocondria desempeña un papel importante. Los procesos regulados por mTORC1 

afectan en general al flujo glicolítico y a la velocidad de degradación mitocondrial, e 

incluyen la regulación de factores de transcripción como HIF1α y YY1/PGC-1α  (MJ, 

2013) (Figura 10). Simultáneamente mTOR está sometido a varias señales como el 

ATP, ROS e intermediarios metabólicos. 

Figura 10.  Esquema de la regulación de  la actividad de mTOR y la función mitocondrial. Los 
factores de crecimiento y los aminoácidos estimulan la actividad de mTOR. Por el contrario, la hipoxia y 
el estrés energético la inhiben. mTOR regula la función mitocondrial mediante cuatro dianas (Glut1, 
PGC1α, ULK1 y VDAC1) y ésta influye en la actividad de mTOR mediante mecanismos de 
retroalimentación. Además, la función mitocondrial regula HIF1α, AMPK, BNIP3L y ROS, y todos ellos 
a su vez actúan sobre mTOR (MJ, 2013). 

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Varios factores de transcripción, como PGC-1α, Tfam y Nrf2 (también 

denominado Nfe2l1) regulan la biogénesis mitocondrial, en la que intervienen proteínas 

como OPA1 y mitofusinas 1 y 2 (Cunningham et al, 2007; Lin, 2005). 

2.2 La Mitofagia 

2.2.1 Definición de la mitofagia 

La mitofagia es el proceso mediante el cual las mitocondrias son englobadas 

selectivamente en autofagosomas con una muy limitada cantidad de cualquier otro 

material celular A lo largo de la evolución, las mitocondrias surgieron a partir de 

bacterias ancestrales que establecieron una relación endosimbionte con células 

eucariotas (Dyall et al, 2004). Por ello, cabría esperar que la mitofagia sea un proceso 

que ha evolucionado a partir de la fagocitosis y degradación de bacterias (Kim et al, 

2007; Youle & Narendra, 2011). Hay dos tipos de mitofagia: la mitofagia que se 

encarga de eliminar mitocondrias dañadas y la que degrada mitocondrias funcionales o 

mitofagia programada (Ashrafi & Schwarz, 2013). Ante un estrés moderado, la 

eliminación de mitocondrias dañadas en las que se produce permeabilización de la 

membrana mitocondrial (MPTP) y ROS mediante mitofagia constituye un mecanismo 

citoprotector (Lemasters, 2005). Uno de los principales determinantes moleculares de 

esta mitofagia identificados en mamíferos fue el par proteico formado por PINK1 y 

Parkina, de manera que Parkina es reclutada en mitocondrias disfuncionales con bajo 

potencial de membrana y posteriormente media su degradación en autofagosomas 

(Narendra et al, 2008; Vives-Bauza et al, 2010; Youle & Narendra, 2011). Por otro lado, 

la mitofagia programada se ha observado en algunos procesos fisiológicos como la 

diferenciación de los eritrocitos, la maduración de la lente del ojo y para la eliminación 

de las mitocondrias de origen paterno durante la fertilización del oocito (Ashrafi & 

Schwarz, 2013). 

40
 



 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.2.2 Funciones y reguladores moleculares de la mitofagia 

En mamíferos, la mitofagia  está regulada mediante diferentes mecanismos que 

probablemente coexisten en la misma célula (Kim et al, 2007; Youle & Narendra, 2011) 

(Figura 11). 

Figura 11.  Resumen 
de los mecanismos 
moleculares de 
mitofagia. 

Existen diferentes moléculas que funcionan como receptores y moléculas 

adaptadoras para degradar las mitocondrias por mitofagia, como NIX, BNIP3 y 

FUNDC1. Éste último es una proteína de membrana externa mitocondrial cuya 

expresión se incrementa ante un daño mitocondrial y cuya defosforilación bajo 

condiciones de hipoxia aumenta su interacción con LC3-II, lo que sugiere que puede ser 

un receptor de mitofagia inducida por hipoxia (Liu et al, 2012). Además de estos 

receptores, la ceramida, un esfingolípido bioactivo, y la cardiolipina, un fosfolípido de 

la membrana interna mitocondrial, también están implicados en mitofagia al 

interaccionar con LC3 (Chu et al, 2013; Sentelle et al, 2012). Así, la redistribución de 

cardiolipina de la membrana interna mitocondrial a la externa cuando hay un daño en la 

mitocondria es una señal para inducir mitofagia (Chu et al, 2013).  Se ha descrito que es 

necesaria una fragmentación mitocondrial previa mediada por la proteína de fisión 

DRP1 para una correcta mitofagia (Twig et al, 2008). Por otro lado, varias E3 ubiquitin 

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ligasas, como Parkina, SMURF1 y MUL1 están implicadas en la regulación de la 

mitofagia. SMURF1 regula la mitofagia mediante un mecanismo independiente de 

Parkina, en corazón, cerebro e hígado (Orvedahl et al, 2011), y MUL1, una proteína de 

membrana externa mitocondrial que promueve la fragmentación mediante estabilización 

de Drp1 (Braschi et al, 2009), despolarización y mitofagia durante la pérdida de 

músculo esquelético (Lokireddy et al, 2012; Orvedahl et al, 2011). 

Aunque Atg5 y Atg7 son generalmente considerados genes esenciales para 

autofagia, células que carecen de Atg5 ó Atg7 pueden aun inducir una forma de 

autofagia que no depende de la lipidación de LC3 pero requiere de ULK1, Beclina1 y 

RAB9A. Esta autofagia independiente de Atg5-Atg7 (o autofagia no canónica) está 

implicada en la eliminación de mitocondrias durante el desarrollo eritroide en ratones 

deficientes de Atg5 (Nishida et al, 2009), los cuales presentan una degradación normal 

de orgánulos y diferenciación eritroide (Matsui et al, 2006). 

Otras mecanismos reguladores de mitofagia implican la función de proteínas 

como el complejo estabilizador chaperona Hsp90-Cdc3 (Itakura et al, 2008; Lazarou et 

al, 2015) y ULK-1 (Joo et al, 2011). Además, también se ha descrito una mitofagia 

mediada por la enzima 15-lipoxigenasa (van Leyen et al, 1998). 

2.2.2.1 Degradación de mitocondrias dañadas vía PINK1-Parkina 

Generalmente la mitofagia de mitocondrias dañadas está mediada por la vía 

PINK1/Parkina (Figura 12). El daño mitocondrial se caracteriza por una acumulación de 

especies reactivas de oxígeno, como consecuencia del metabolismo de la mitocondria, o 

daños que generan mutaciones en el DNA mitocondrial, proteínas mal plegadas y una 

disminución en la producción ATP. Además, el daño mitocondrial puede inducir la 

permeabilidad mitocondrial causada por la apertura de poros de transición de 

permeabilidad (MPTP) en la membrana interna mitocondrial (Pickrell & Youle, 2015) 

(Figura 12). Estudios recientes sugieren la implicación del MPTP en la señal iniciadora 

de la mitofagia (Gunter & Pfeiffer, 1990; Hunter et al, 1976; Kissova et al, 2004; 

Lemasters, 2005), y su inhibición con algunos compuestos como la ciclosporina A 

(CsA), debido a su interacción con la ciclofilina D (CypD), inhiben el proceso de 

mitofagia (Forte & Bernardi, 2005; Mauro-Lizcano et al, 2015; Zoratti & Szabo, 1995). 

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Figura 12. Esquema representativo 
de la mitofagia inducida por 
Parkina. Mitocondrias dañadas 
(amarillas) acumulan PINK1 en la 
membrana externa mitocondrial, donde 
fosforila a Parkina. Parkina ubiquitiniza 
sustratos de la membrana externa 
mitocondrial para dos procesos: el 
reclutamiento de autofagosomas y la 
degradación por proteasoma de los 
sustratos mitocondriales 
ubiquitinizados. Fis1 es un receptor 
mitocondrial que se une a diferentes 
proteínas para favorecer la formación 
del autofagosoma alrededor de la 
mitocondria dañada. Finalmente se 
produce la degradación mitocondrial en 
los lisosomas (Pickrell & Youle, 
2015). 

No solo el estrés 

oxidativo y algunos procesos 

patológicos causan daño y 

disfunción mitocondrial, sino 

que incluso mitocondrias 

normales pueden acumular 

especies reactivas de oxígeno 

suficientes a lo largo del tiempo 

como para llegar a ser dañinas y 

posiblemente peligrosas para la célula. 

PINK1 es una kinasa presente en el espacio intermembrana mitocondrial que se 

recicla rápidamente cuando la mitocondria funciona normalmente para asegurar que sus 

niveles se mantienen relativamente bajos. Cuando se produce una despolarización de la 

mitocondria, los niveles de PINK1 se incrementan lo cual lleva al reclutamiento de 

Parkina, una ubiquitin ligasa citosólica, a la membrana mitocondrial (Lazarou et al, 

2012; Narendra et al, 2008; Narendra et al, 2010). Una vez allí, Parkina cataliza la 

conjugación de residuos de lysina 63 de ubiquitina a varias proteínas sustrato, lo que 

favorece el reconocimiento de mitocondrias despolarizadas por la maquinaria de 

autofagia (Geisler et al, 2010; Narendra et al, 2008; Vives-Bauza et al, 2010) (Figura 

12). El conocimiento de esta vía de mitofagia se ha consolidado mediante un estudio 

reciente en el que se han generado ratones knockout para cinco receptores de autofagia: 

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p62, NBR1, Optineurina (OPTN), NDP52 y TAX1BP1, de manera que PINK1 es 

suficiente para reclutar receptores de autofagia que presentan un dominio LIR en la 

mitocondria para inducir mitofagia (Lazarou et al, 2015).  

2.2.2.2 Degradación de mitocondrias vía NIX/BNIP3 

Otra de las vías reguladoras del proceso de mitofagia está mediada por BNIP3 Y 

NIX (también conocido como BNIP3L) (Mammucari et al, 2007; Schweers et al, 2007; 

Zhang & Ney, 2009). En este caso, la mitofagia se produce por la presencia de un 

motivo denominado región de interacción con LC3 (LIR) en la estructura de estos 

reguladores, que se une a los miembros de la familia Atg8, LC3B y GABARAPL2 

presentes en los autofagosomas, funcionando como receptores de mitofagia (Hanna et 

al, 2012; Novak et al, 2010). Las proteínas LC3 contienen una región hidrofóbica 

conservada que acopla mediante interacciones hidrofóbicas con el dominio LIR presente 

en los receptores de autofagia, que cuando se expresan 

se localizan constitutivamente en la membrana externa 

mitocondrial (OMM) a través de sus dominios 

transmembrana (Hamacher-Brady & Brady, 2016) 

(Figura 13). 

Figura 13. Síntesis de los receptores de mitofagia con dominio 
LIR localizados en la membrana externa mitocondrial. 

Utilizando la base de datos HUGO-biogps, hemos observado que NIX se 

expresa en una gran cantidad de tejidos como la retina y sistema nervioso central, 

siendo mayor su expresión en los eritrocitos, las células mieloides, los monocitos, el 

músculo liso, los cardiomiocitos, el hígado y el pulmón fetales, los adipocitos y la 

glándula pineal. Generalmente, la expresión de NIX es baja en condiciones basales en la 

mayoría de los tejidos, produciéndose su incremento transcripcional  bajo condiciones 

de estrés celular, crecimiento y diferenciación (Aerbajinai et al, 2003; Galvez et al, 

2006; Sowter et al, 2001; Yussman et al, 2002). 

Se ha descrito que uno de los reguladores mas importante de NIX es la hipoxia. 

En condiciones de hipoxia, los niveles de proteína de NIX se incrementan de manera 

HIF1α y p53 dependiente (Hamacher-Brady & Brady, 2016). Como consecuencia, se 

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rompe la unión entre Bcl-2 y Beclina1, induciéndose la autofagia (Bellot et al, 2009) 

(Figura 14). Además, durante la hipoxia BNIP3 y NIX pueden unirse a la proteína 

Rheb, reduciéndose así la actividad de mTOR e induciéndose autofagia (Li et al, 2007). 

Figura 14. Esquema de la 
regulación de autofagia por 
hipoxia. La hipoxia produce en 
la célula la activación de 
diferentes vías de señalización, 
pero principalmente induce la 
estabilización de HIF1α, el cual 
incrementa la expresión de 
BNIP3/NIX induciéndose así 
autofagia (He & Klionsky, 
2009).

 Existe una 

regulación coordinada de 

esta vía de mitofagia 

mediante varios factores de 

transcripción. Se ha 

descrito que SP1 aumenta 

la expresión de NIX en 

células cardiacas y FOXO3a induce la expresión de BNIP3 y NIX en músculo 

esquelético. Sin embargo, bajo condiciones de hipoxia, FOXO3a suprime la expresión 

de NIX mediada por HIF1-α mediante el cofactor CITED2, lo que constituye una 

regulación negativa compensatoria bajo condiciones de hipoxia. Otro factor de 

transcripción que incrementa la expresión de BNIP3 es E2F1 (Hamacher-Brady & 

Brady, 2016). Además, recientemente se ha descrito el papel de los microRNAs como 

moduladores negativos de mitofagia. Por ejemplo, miR-351, hsa-miR-125a-5p y miR­

137 suprimen la mitofagia mediada por NIX y la disminución de miR-137 asociada a 

hipoxia permite la expresión de de esta proteína (Hamacher-Brady & Brady, 2016) 

(Figura 15). Por otro lado, el factor de transcripción EB (TFEB), promueve la expresión 

de genes del autofagosoma y lisosomales (Settembre et al, 2011) e incrementa la 

mitofagia inducida por BNIP3 (Ma et al, 2012). 

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Figura 15. Esquema 
representativo de la regulación 
transcripcional de la mitofagia 
inducida por NIX. 

Se han descrito diferentes procesos fisiológicos como la homeostasis en hígado 

adulto de ratón para evitar defectos metabólicos y el papel citoprotector durante el daño 

por isquemia/repercusión en los miocitos cardiacos, en los cuales la degradación de 

mitocondrias por mitofagia desempeña un papel fundamental. Así, la mitofagia mediada 

por NIX es necesaria durante la diferenciación de eritrocitos para generar eritrocitos 

maduros sin mitocondrias, al menos en parte para promover la supervivencia y limitar la 

producción de ROS en el ambiente con alto contenido de oxígeno del pulmón (Kundu et 

al, 2008; Sandoval et al, 2008; Schweers et al, 2007). Además, las células NK realizan 

mitofagia mediada por NIX y BNIP3 para eliminar las mitocondrias dañadas con un 

incremento de ROS tras una infección viral, por lo que la mitofagia podría ser una 

característica de la formación de la memoria inmunológica (O’Sullivan, 2015). Por 

tanto, NIX parece estar implicado en la regulación de la mitofagia en condiciones 

fisiológicas (Hamacher-Brady & Brady, 2016). 

Por otro lado, la alteración del mantenimiento mitocondrial es una característica 

de muchas patologías humanas así como del envejecimiento. Se ha descrito que la 

mitofagia interactúa con la biogénesis mitocondrial para regular el contenido 

mitocondrial y la longevidad en Caenorhabditis elegans, de manera que hay una 

compensación que integra las señales metabólicas para coordinar la biogénesis 

mitocondrial y la mitofagia. La alteración de los dos procesos durante el envejecimiento 

contribuye a un incremento en la proliferación de mitocondrias dañadas y disminución 

de la función celular (Palikaras et al, 2015). 

Durante situaciones patológicas como la hipertrofia cardiaca (Galvez et al, 2006; 

Yussman et al, 2002), también se incrementa la expresión de NIX, siendo  necesario y 

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suficiente para causar la transición de hipertrofia a cardiomiopatía dilatada (Diwan et al, 

2008; Syed et al, 2004). 

Por último, hay que añadir que NIX y BNIP3 también desempeñan un papel en 

la muerte celular por apoptosis ya que son miembros proapoptóticos de la familia Bcl-2 

que contienen un dominio BH3. En la mitocondria, ambas proteínas suprimen la 

función de proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 (Zhang & Ney, 2009). 

2.2.2.3 Mecanismos de compensación entre los reguladores de mitofagia 

Hay que destacar que existen diferentes mecanismos de interacción entre las vías 

de mitofagia descritas hasta ahora. Además de promover el reclutamiento mediado por 

ubiquitina de diferentes proteínas, así como degradación de proteínas de membrana 

externa mitocondrial, PINK1 y Parkina interaccionan directamente con el complejo 

Beclina1-PI3K que promueve la nucleación del autofagosoma. Más específicamente, 

PINK1 interacciona directamente con el complejo Beclina1-PI3K para activar autofagia 

(Michiorri et al, 2010), y Parkina interacciona con Ambra1, un activador de Beclina1, 

facilitando su reclutamiento a la mitocondria despolarizada para activar el complejo 

PI3K de clase III (Van Humbeeck et al, 2011).  No se requiere de Ambra1 para la 

translocación de Parkina a la mitocondria despolarizada, pero contribuye críticamente a 

la mitofagia mediada por Parkina, mediante la estimulación de la actividad del complejo 

PI3K de clase III, que es esencial para la formación de autofagosomas (Tooze & 

Yoshimori, 2010). Además, Ambra1 presenta un dominio LIR siendo por tanto un 

receptor de mitofagia que permite la degradación de mitocondrias independiente de 

Parkina (Hamacher-Brady & Brady, 2016). 

Por otro lado, el mecanismo por el cual NIX y BNIP3 inducen mitofagia es 

controvertido, ya que también favorecen la despolarización mitocondrial y como 

consecuencia la inducción de mitofagia (Elmore et al, 2001; Twig et al, 2008). Así, 

varios estudios describen la degradación selectiva de mitocondrias despolarizadas por 

BNIP3 y NIX (Novak et al, 2010; Sandoval et al, 2008; Schweers et al, 2007) (Figura 

16). 

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Figura 16. Esquema de los mecanismos de mitofagia inducidos por NIX/BNIP3. NIX y BNIP3 
pueden son receptores de mitofagia que interaccionan con LC3. Además, en la membrana externa 
mitocondrial reclutan a Parkina en la mitocondria. Por otro lado, NIX y BNIP3 pueden inducir la 
despolarización de la membrana externa mitocondrial y con ello producir un incremento en los niveles de 
ROS, que ejercen una acción inhibitoria sobre mTORC1. La inhibición de mTORC1 también se produce 
por la inhibición de Rheb. MM: matriz mitocondrial; IMM: membrana mitocondrial interna; IMS: espacio 
intermembrana; OMM: membrana mitocondrial externa; ROS: especies reactivas de oxígeno (MJ, 2013). 

En el año 2010, Ding y colaboradores describieron que NIX prepara a la 

mitocondria para su degradación por mitofagia controlando la localización mitocondrial 

de Parkina bajo despolarización mitocondrial (Ding et al, 2010) (Figura 16). La 

despolarización mitocondrial con CCCP restaura la mitofagia incluso en reticulocitos 

deficientes de NIX, demostrando la presencia de mecanismos de compensación 

independientes de NIX para mediar mitofagia. Además, la ubiquitinización de NIX 

mediada por Parkina recluta al receptor de mitofagia NBR1 (Gao et al, 2015). 

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3. DESARROLLO DE LA RETINA DE VERTEBRADOS 

3.1 Estructura de la retina adulta 

La retina de vertebrados es un tejido sensible a la luz situado en la superficie 

interior del ojo encargado de procesar y transmitir la información visual La retina 

madura está constituida por 6 tipos neurales y uno glial que se  organizan en una 

estructura trilaminar que incluye la capa de células ganglionares (Formada por células 

ganglionares y amacrinas desplazadas), la capa nuclear interna (constituida por las 

neuronas bipolares, Müller, amacrinas y horizontales) y la capa nuclear externa (donde 

se encuentran los fotorreceptores) (Blackshaw, 2004 #12631). Las conexiones 

sinápticas se establecen entre estas tres capas y se organizan en capas adicionales 

denominadas capas plexiformes interna y externa (Figura 17). 

Figura 17. Organización esquemática de las neuronas en la retina de mamíferos. (Izquierda) 
Sección vertical de la retina de ratón mostrando diferentes tipos neuronales: conos (azul), células 
horizontales (rosa), células bipolares (rojo), células amadrinas (morado), y células ganglionares (blanco). 
ONL: capa nuclear externa, donde se agrupan los núcleos de fotorreceptores (conos y bastones); OPL: 
capa plexiforme externa, donde tiene lugar la sinapsis entre fotorreceptores y células bipolares; INL: capa 
nuclear interna, donde se agrupan los núcleos de las células horizontales, bipolares y amacrinas, así como 
de la glía de Müller; IPL: cala plexiforme interna, donde tienen lugar las sinapsis entre bipolares y RGCs; 
GCL: capa de células ganglionares. (Derecha) Representación esquemática de la retina. R: bastones, C: 
conos, HC: células horizontales, BC: células bipolares, AC: células amacrinas, RGC: células ganglionares 
(Hoon et al, 2014). 

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3.2 Desarrollo de la retina de vertebrados 

El desarrollo del ojo de vertebrados es un proceso complejo regulado por 

factores intrínsecos y extrínsecos que especifican un área del prosencéfalo como el 

campo ocular y posteriormente produce la retina neural. El desarrollo del ojo comienza 

en la última etapa de la gástrula cuando se organiza el campo ocular y se separa 

bilateralmente en la placa neural (Chow & Lang, 2001; Kim & Kim, 2012). En el día 

embrionario (E) 8.5, aparecen las vesículas ópticas y se evaginan lateralmente desde el 

prosencéfalo, creciendo hacia la superficie del ectodermo (Schoenwolf, 2009), el cual 

da lugar a la placoda del cristalino. Después, las vesículas ópticas y la placoda del 

cristalino se invaginan, formando la copa óptica y las lentes.  La copa óptica está 

constituida por dos capas: el epitelio pigmentario (RPE) y la neuroretina (NR), que se 

desarrolla hasta formar la retina madura trilaminada (Zagozewski et al, 2014). 

El desarrollo de la neuroretina comienza en el día embrionario 12.5 (E12.5) y la 

neurogénesis no finaliza hasta día postnatal 6.5 (P6.5). Durante las etapas tempranas del 

desarrollo de la retina, la capa de neuroblastos externa está constituida principalmente 

por células progenitoras mitóticas, mientras que las neuronas recién diferenciadas 

(principalmente células ganglionares y amacrinas)  residen en la capa neuroblástica 

interna. La posición de los progenitores mitóticos en la capa de neuroblastos externa 

varía dependiendo de su progreso en el ciclo celular, con células en fase S  situadas en 

la cara vitreal cerca del limite con la capa interna, y células en fase M localizadas en la 

cara escleral de la capa de neuroblastos externa, limitando con el epitelio pigmentario 

(Young, 1985). Los distintos tipos celulares de la retina madura se desarrollan a partir 

de un conjunto común de progenitores multipotentes (Zagozewski et al, 2014) mediante 

un proceso dinámico espacio-temporal en el siguiente orden: células ganglionares, 

células horizontales, conos, células amacrinas durante el desarrollo embrionario, y 

células bipolares, bastones y glía de Müller durante el desarrollo postnatal (Zagozewski 

et al, 2014). Los fotorreceptores, principalmente bastones, son el tipo celular más 

abundante de la retina y tienen un pico de diferenciación a p0 (Blackshaw et al, 2004). 

Finalmente a P6 la mayoría de las células de la retina ocupan sus destinos finales, 

disminuyendo la expresión de marcadores característicos de progenitores como 

cyclinD1 y cdk4 (Blackshaw et al, 2004) (Figura 18). 

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Figura 18. Esquema de la diferenciación temporal de los distintos tipos celulares de la retina de 
ratón. HC: células horizontales; Cone: conos; RGC: células ganglionares; AC: células amacrinas; Rod: 
bastones; BC: células bipolares; Glía: glía de Müller (Blackshaw et al, 2004). 

La diferenciación celular sigue un patrón centro-periférico y es probable que los 

progenitores localizados adyacentes a las neuronas diferenciadas en la región central 

estén expuestos a diferentes señales que aquellos progenitores localizados en la 

periferia, lejos del frente de diferenciación. Además, existen diferencias en la expresión 

génica entre estas dos regiones de la retina (Adler & Canto-Soler, 2007; Koso et al, 

2006; Koso et al, 2007). Así, diversos factores de transcripción están implicados en la 

organización y regionalización de la retina, como el factor de transcripción Pax6, que es 

el principal regulador del desarrollo del ojo (Zagozewski et al, 2014) y  es indispensable 

para el mantenimiento de la multipotencia (Marquardt, 2001). Además, Pax6 regula la 

expresión de genes proneurales de la familia bHLH específicos para cada subpoblación 

de progenitores que determinan un destino particular (Marquardt, 2001; Scardigli et al, 

2003) (Figura 19). 

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Figura 19. Esquema de los 
factores de transcripción que 
regulan el mantenimiento y 
diferenciación de los 
progenitores multipotentes 
de la retina (Marquardt, 
2001) 

Las células 

progenitoras de la retina 

tienen la habilidad de 

generar los diferentes 

tipos celulares de la 

retina (Jensen & Raff, 

1997; Turner & Cepko, 

1987). El destino celular 

posterior está determinado por propiedades intrínsecas y factores extrínsecos (Bassett & 

Wallace, 2012; Cayouette et al, 2006; Livesey & Cepko, 2001). Los factores 

extrínsecos, como los factores neurotróficos,  pueden activar vías de señalización que 

resultan en la expresión de unos factores de transcripción particulares que actúan en 

distintas combinaciones para definir cierta competencia/especificación de los 

progenitores o determinar los tipos celulares de la retina (Bejarano-Escobar et al, 2015). 

Así, factores de la familia bHLH como Math5, Mash1 y Ngn2 se activan en 

subpoblaciones de progenitores lo que hace que tengan un destino particular 

(Marquardt, 2001). De ese modo, a lo largo del desarrollo de la retina, varias familias de 

factores de transcripción mantienen la pluripotencia de los progenitores, especifican el 

destino de las células de la retina y promueven su diferenciación mediante un proceso 

dinámico espacio-temporal (Figura 20). 

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Figura 20. Resumen de los factores de transcripción implicados en la diferenciación de los 
diferentes tipos celulares de la retina (Graw, 2010). 

3.3 Desarrollo de las células ganglionares de la retina 

Se han descrito alteraciones del desarrollo en ratones que tienen anulados los 

genes de autofagia. Este proceso presenta un papel en la diferenciación de varios tipos 

celulares como los eritrocitos, los linfocitos y los adipocitos (Mizushima & Levine, 

2010). Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado como la autofagia está 

implicada en el proceso de neurogénesis del bulbo olfativo, durante la cual parece tener 

un papel metabólico ya que el suplemento con metilpiruvato, un análogo permeable del 

piruvato, restaura el fenotipo (Vazquez et al, 2012). Estos datos sugieren una conexión 

entre la autofagia y el metabolismo durante la diferenciación celular.  

En la presente Tesis Doctoral me he centrado en el proceso de diferenciación de 

las células ganglionares de la retina. Es importante destacar que la salida de ciclo celular 

durante la retinogénesis temprana se correlaciona con la expresión inicial de Atoh7, un 

factor de transcripción expresado en progenitores  necesario para el desarrollo del 

primer tipo celular diferenciado en la retina, las células ganglionares (Gao et al, 2014). 

La expresión de Atoh7 comienza en E11.5, es máxima en E12.5 y E13.5, y disminuye 

tras E14.5, aunque persistiendo hasta E18.5 (Gao et al, 2014; Mu et al, 2005), cuando 

comienza a disminuir gradualmente (Wu et al, 2015). Otros factores de transcripción, 

Ebf3 y Eya2, están enriquecidos en progenitores que expresan Atoh7. Además, Pou4f1 

(Brn3a), Pou4f2 (Brn3b), Isl1 y Myt1, son factores de transcripción asociados a los 

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progenitores que expresan Atoh7 y células ganglionares recién diferenciadas (Gan, 

1999; Gao et al, 2014; Mu et al, 2008; Wang et al, 2001). 

La figura 21 refleja el patrón de diferenciación centro-periférico de las células 

ganglionares en distintos estadios embrionarios.  

Figura 21. Representación del patrón centro-periférico de diferenciación de las células ganglionares 
de la retina.  

Por último, hay que destacar que las células ganglionares transmiten la 

información visual desde la retina a los núcleos del colículo superior y núcleo 

geniculado lateral a través de sus axones, que constituyen el nervio óptico. Para ello, es 

necesaria la expresión génica de moléculas  implicadas en guía axonal durante la 

diferenciación de las células ganglionares, como Netrin, Dcc, Unc5, L1Cam, 

componentes de la vía de señalización de Slit-Robo y semaforinas, como Sema4g, 

Sema6b y Sema7a, enriquecidas en células Atoh7+ (Gao et al, 2014). 

3.4 Muerte celular durante el desarrollo de la retina 

La muerte celular es necesaria para la homeostasis durante el desarrollo y el 

envejecimiento. Sin embargo, ante una alteración fisiológica o daño, como el glaucoma 

y la isquemia óptica, se produce la muerte de las células ganglionares y finalmente una 

pérdida de visión e incluso ceguera (Nickells, 2012; Nickells et al, 2012). 

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El tipo de muerte más abundante durante el desarrollo es la apoptosis, que se 

caracteriza por una disminución del tamaño de la célula, la condensación de la 

cromatina, la fagocitosis y posterior degradación de los cuerpos apoptóticos tras su 

reconocimiento por células vecinas (Fagocitos no profesionales) (Penfold & Provis, 

1986) o microglía (macrófagos del SNC) (Henson & Hume, 2006). Si las células 

apoptóticas no se eliminan, se puede producir la fragmentación de su membrana y 

desencadenar así procesos proinflamatorios, caracterizados por la ruptura de la 

membrana plasmática. Un aspecto importante de la apoptosis es que es una muerte 

celular activa dependiente de ATP e implica un gran conjunto de eventos para que 

progrese. Una de las primeras señales de la apoptosis es la exposición del fosfolípido 

fosfatidil-serina (PS) en la superficie de la membrana externa de la célula apoptótica 

(Fadok et al, 1992; Verhoven et al, 1999), un proceso altamente dependiente de ATP 

que permite el reconocimiento de las células muertas para su eliminación del tejido 

(Venegas & Zhou, 2007). 

Durante el desarrollo embrionario de la retina, se han caracterizado diferentes 

fases de muerte celular que afectan a distintos tipos celulares como células troncales 

neurales, los progenitores proliferativos, los neuroblastos indiferenciados y las neuronas 

y células de glía recién diferenciadas, y cuyo fin es contribuir a la correcta generación 

de la retina (Boya & de la Rosa, 2005; de la Rosa & de Pablo, 2000; Yeo & Gautier, 

2004). 

En función del estadio de desarrollo en el que tiene lugar, se distinguen tres fases 

de muerte en la retina: la muerte morfogenética, la muerte neural temprana y la muerte 

neurotrófica. La muerte morfogenética ocurre en estadios iniciales del desarrollo de la 

retina (E10.5-E14.5) y se produce en la fisura óptica, siendo necesaria para la 

reestructuración de la retina y para facilitar la salida de los axones de las RGCs 

(Cuadros & Rios, 1988; Morcillo et al, 2006; Ozeki et al, 2000). La muerte neural 

temprana afecta a neuroblastos proliferativos y a las células ganglionares recién 

diferenciadas (Boya & de la Rosa, 2005) y se localiza en la región central de retinas a 

E13.5-E16.5. En ratón, este tipo de muerte es difícil separar espacio-temporalmente de 

la muerte morfogenética (Pequignot et al, 2003). La muerte neural temprana es 

simultánea a la generación de RGCs pero no a la generación de otros subtipos 

neuronales más tardíos (Chavarria et al, 2007). Y por último, la muerte neurotrófica, 

que se produce en RGCs diferenciadas maduras por falta de factores tróficos durante el 

proceso de sinaptogénesis con sus células diana, por lo que tiene lugar en la segunda 

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mitad del desarrollo de la retina (E18.5-P12) (Pequignot et al, 2003). Posteriormente, se 

produce una muerte celular en la capa de fotorreceptores que coincide con la apertura 

del ojo en el neonato (Valenciano et al, 2008). Ambos procesos ocurren cuando la 

generación de las RGCs ha finalizado. 

3.5 Autofagia en retina y su relación con la muerte celular durante el desarrollo 
embrionario 

En relación a la muerte celular asociada al desarrollo de la retina, estudios 

previos de nuestro laboratorio han determinado que la autofagia es funcional en la retina 

de aves en etapas tempranas del desarrollo y que es necesaria para la correcta 

eliminación de las células apoptóticas durante la muerte celular del desarrollo (Mellén et 

al, 2008). La inhibición farmacológica de la autofagia con 3-MA redujo los niveles de 

ATP y bloqueó la exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática de células 

apoptóticas. En consecuencia, las células muertas no se eliminaron y se acumularon en 

el neuroepitelio (Figura 22). 

Figura 22. Representación 
esquemática del proceso 
de fagocitosis de las 
células apoptóticas en el 
neuroepitelio retiniano y 
el efecto de la inhibición 
de autofagia en el proceso. 
Modificado de (Boya et al, 
2008). 

Además, el suplemento con metilpiruvato, un análogo permeable del piruvato 

que sirve como un sustrato alternativo para la generación de ATP mitocondrial, restaura 

los niveles de ATP del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, la exposición de 

fosfatidilserina y la fagocitosis de las células apoptóticas (Boya et al, 2008; Mellén et al, 

2008). Estudios realizados a otras edades indicaron que este requerimiento de la 

autofagia para la eliminación de cuerpos celulares no parece ser universal (Mellén et al, 

2009). Hay que confirmar si este proceso afecta también al desarrollo de la retina de 

otras especies como el ratón, o es específico de aves.  

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En ratón, las células de la microglía están presentes en retinas de E11.5 

fundamentalmente en la región central. En E12.5 incrementan sustancialmente su 

número y llegan hasta la periferia de la retina. Estas células presentan un aspecto 

ameboide y, frecuentemente, cuerpos apoptóticos en su citoplasma. Evolucionan y se 

ramifican ya en E13.5 y, entre E13.5 y E15.5, se distribuyen por toda la retina. Tanto en 

ratón como en otras muchas especies de vertebrados, las células microgliales en el 

adulto se localizan en la capa de células ganglionares y en la INL, estando totalmente 

ausentes en la ONL (Alvaro et al, 2007) aunque ese patrón varía en caso de daño o 

patología retiniana (Harada et al, 2002; Humphrey & Moore, 1996; Roque et al, 1996). 

Por otro lado, y como he mencionado previamente, se ha descrito la autofagia 

como mecanismo de muerte o muerte celular de tipo II (Debnath et al, 2005; Zorov et 

al, 2006). Por lo que resulta interesante determinar si la autofagia podría contribuir 

también a la muerte fisiológica que se produce en las diferentes etapas del desarrollo de 

la retina así como su relación con la diferenciación de las células ganglionares.  

4. MITOFAGIA Y MUERTE CELULAR 

De manera general, existen diferentes vías de muerte celular evolutivamente 

conservadas, como la apoptosis dependiente de caspasas, mediada por los efectos 

coordinados de múltiples miembros de la familia Bcl-2 (Danial & Korsmeyer, 2004); la 

muerte por necrosis (Baines et al, 2005; Newmeyer & Ferguson-Miller, 2003) y la 

muerte por autofagia o muerte celular de tipo II (Debnath et al, 2005; Zorov et al, 2006). 

La apoptosis y la autofagia son vías que frecuentemente producen funciones 

contrarias en respuesta a un estrés celular (Marino et al, 2014). Mientras que la 

apoptosis ejecuta programas de muerte celular durante periodos de ayuno o estrés, la 

autofagia puede servir como un mecanismo de supervivencia celular mediante el 

mantenimiento de la homeostasis energética a través de su actividad catalítica (Levine et 

al, 2011; Marino et al, 2014). Por tanto, en general la autofagia es un mecanismo de 

supervivencia aunque en algunos casos se ha demostrado que puede participar 

activamente en los procesos de muerte celular (Levine & Yuan, 2005; Zorov et al, 

2006). De hecho, se sabe que el poro de transición de permeabilidad propociona una vía 

común que lleva a mitofagia, apoptosis y  necrosis (Figura 23). Ante una baja intensidad 

de agentes estresantes, el inicio de la permeabilidad mitocondrial podría solo 

incrementar la mitofagia para eliminar mitocondrias dañadas, que pueden inducir 

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muerte celular a través de la producción de ROS (Green et al, 2011; Levine et al, 2011; 

Marino et al, 2014). A medida que incrementa el estrés, la liberación de factores 

proapoptóticos de la mitocondria al sufrir MPTP desencadena la apoptosis. Cuando el 

sistema de autofagia está sobrecargado, puede liberar enzimas lisosomales y 

posiblemente otros factores que promueven la muerte celular, además de producir una 

degradación excesiva de los constituyentes celulares. Finalmente, un estrés extremo 

causa MPTP en todas las mitocondrias y una disminución de ATP de manera drástica. 

Debido a ese fallo energético, ni la autofagia ni la apoptosis pueden progresar, y solo se 

produce muerte celular por necrosis (Kim et al, 2007) (Figura 23). Por tanto la autofagia 

puede presentar un papel dual en la muerte celular que se inicia con una permeabilidad 

mitocondrial. 

Figura 23. Esquema de la progresión de 
mitofagia, apoptosis y necrosis.  Entre los 
inductores de MPTP se incluyen NAD(P)+, 
GSSG, ROS, Ca2+, y mutaciones de mtDNA 
(mtDNA) (Kim et al, 2007). 

Otro punto en común entre los tres procesos descritos en la figura 23 es NIX, 

que puede promover muerte celular con características tanto de apoptosis como de 

necrosis (Chinnadurai et al, 2008), e inducir mitofagia (Diwan, 2007; Sandoval et al, 

2008; Schweers et al, 2007; Zhang & Ney, 2009). La diversidad funcional de NIX en la 

muerte celular se relaciona con su localización en la mitocondria o en el retículo 

endoplasmico (Diwan et al, 2009) (Figura 24). La muerte celular necrótica mediada por 

NIX cuando se localiza en el retículo en contacto con la mitocondria es dependiente de 

ciclofilina D y no requiere de Bax y Bak, mientras que NIX localizado en la 

mitocondria induce solo apoptosis dependiente de caspasas sin afectar al MPTP (Chen 

et al, 2010). Una característica común a ambos tipos de muerte mediados por NIX es el 

marcaje TUNEL positivo (Chen et al, 2010). 

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Figura 24. Mecanismos de muerte inducida por NIX. NIX inducido transcripcionalmente se une a la 
mitocondria y a ER/SR y activa la muerte celular en las células vía muerte apoptótica clásica y lo que se 
piensa un nuevo tipo de muerte celular que implica a ER/SR. NIX en la mitocondria produce una 
permeabilización de la membrana mitocondrial, probablemente en coordinación con Bax/Bak, llevando a 
la liberación de citocromo c, formación del apoptosoma, activación de caspasas y apoptosis. NIX 
localizado en ER/SR contribuye a la sobrecarga de calcio en ER/SR y posterior liberación del mismo, que 
entra a través de un transportador uniporter en la mitocondria provocando una sobrecarga de calcio en la 
mitocondria. Como consecuencia, se produce MPTP con pérdida del potencial de membrana mitocondrial 
y liberación de proteínas mitocondriales esenciales. Como consecuencia no se produce ATP y el resultado 
es un fallo energético que lleva a muerte por necrosis (Diwan et al, 2009) 

5. REPROGRAMACIÓN METABÓLICA 

5.1 Efecto Warburg 

La reprogramación metabólica, también conocida como efecto Warburg, es un 

proceso mediante el cual las células cambian de un metabolismo oxidativo a glicólisis 

aerobia, convirtiendo la glucosa en lactato en presencia de oxígeno (Warburg, 1931). 

Este fenómeno fue inicialmente descrito en células tumorales y la retina (Warburg, 

1956) pero posteriormente se ha descrito en otros tipos celulares, como las células stem 

embrionarias, los linfocitos T humanos, los neutrófilos, las células dendríticas, los 

macrófagos y la retina adulta (Galvan-Pena & O'Neill, 2014; Jones & Thompson, 2007; 

Krawczyk et al, 2010; Ng et al, 2015; Palsson-McDermott, 2013).  

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Ese cambio metabólico promueve el flujo glicolítico y está acompañado de un 

incremento en la producción de lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y otros 

carbohidratos para mantener los requerimientos metabólicos de la célula. La hipoxia 

también produce un cambio de metabolismo hacia glicólisis, lo que se conoce como 

efecto Pasteur. Resulta interesante que NIX y BNIP3 regulan el proceso de mitofagia 

durante la hipoxia (Ney, 2015). Sin embargo, se desconoce el papel específico de la 

mitofagia durante la reprogramación metabólica  

5.2 Metabolismo de la retina de vertebrados 

La retina tiene grandes demandas energéticas para mantener el estado de 

excitación de las neuronas para la fototransducción y la neurotransmisión, además del 

mantenimiento normal de la función celular (Ames, 1992). La retina produce energía de 

la glicólisis incluso en presencia de oxígeno. Este hecho fue inicialmente observado por 

Warburg (Warburg, 1956) y  varias décadas después ha sido confirmado por otros 

investigadores (Ames, 1992; COHEN LH, 1960; Noell, 1959; Tornquist & Alm, 1979; 

Winkler, 1981; Winkler, 1995). 

Una posible explicación de que en retina adulta, a pesar de ser un tejido 

proliferativo, se observe el efecto Warburg, es que presenta similares requerimientos 

biosintéticos que los tejidos neoplásticos debido al reciclado de la opsina en las 

membranas discales de los segmentos externos de los fotorreceptores (Casson et al, 

2013). Consistente con esta teoría es la observación por Agathocleus et al. en el año 

2012 quienes describieron un metabolismo glicolítico aerobio en la retina en desarrollo 

de Xenopus laevis y Zebrafish para mantener sus requerimientos biosintéticos. En este 

caso, describen un cambio hacia un metabolismo dependiente de fosforilación oxidativa 

en la retina madura (Agathocleous et al, 2012). 

Una explicación alternativa para la alta actividad glicolítica de los 

fotorreceptores podría ser la compartimentalización celular, ya que las mitocondrias 

están localizadas en el segmento interno y ausentes en el segmento externo (Young, 

1971). La exclusión de las mitocondrias del segmento externo posiblemente lleva a la 

dependencia de la glicólisis en dicha región. 

Además de las necesidades energéticas de los fotorreceptores, las células de 

Müller también dependen de la glicólisis aerobia y producción de lactato (Winkler et al, 

2000), siendo células que constituyen los reservorios primarios de glicógeno en la retina 

(KUWABARA T, 1961). Sin embargo, la información sobre el perfil metabólico de 

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otros tipos celulares de la retina es limitado (Ames, 1992; COHEN LH, 1960; Noell, 

1959). Noell y colaboradores demostraron que las células ganglionares de la retina 

adulta son susceptibles a la hipoxia y son la parte más débil de la cadena visual cuando 

el oxígeno es escaso (Noell, 1959). Sin embargo, no está claro si las células 

ganglionares presentan un efecto Warburg. Además, no hay ningún estudio metabólico 

realizado durante la diferenciación de la retina.  

Varios factores de crecimiento, incluida la insulina/IGF1 promueven la 

proliferación de los progenitores de la retina (Agathocleous & Harris, 2009). Dado que 

mTOR está implicado en la regulación del ojo de Drosophila  (McNeill et al, 2008) y el 

tubo neural del pollo (Fishwick et al, 2010) y que la velocidad de crecimiento está 

limitada por la disponibilidad de nutrientes, es posible que mTOR y sus consecuencias 

en autofagia, puedan mediar para acoplar la disponibilidad de nutrientes con la 

proliferación y diferenciación de los progenitores de la retina. Así, la activación de 

mTOR produce una neurogénesis prematura en la retina central en desarrollo (Jo et al, 

2012), lo que sugiere que la vía PI3K/mTOR regula la diferenciación.  

5.3 Mitofagia y reprogramación metabólica 

Hasta la fecha, no había estudios sobre la relación entre mitofagia y 

reprogramación metabólica. En un estudio reciente en colaboración con Marcos 

Malumbres (CNIO) hemos demostrado que la mitofagia es un proceso modulador de un 

cambio metabólico hacia glicólisis durante un prolongado arresto mitótico. Esta 

estrategia terapéutica es empleada para alterar la proliferación de las células tumorales. 

Durante el arresto mitótico, la degradación de mitocondrias por mitofagia produce una 

disminución de los niveles de ATP y por tanto la activación de AMPK. Como 

consecuencia, la fosforilación oxidativa es reemplazada por la glicólisis mediante la 

fosforilación de PFKFB3 dependiente de AMPK. La inducción de autofagia, de AMPK 

o PFKFB3 resulta en un aumento de la muerte celular en mitosis y mejora la eficiencia 

antitumoral de las drogas utilizadas en el tratamiento contra el cáncer (Domenech et al, 

2015; Esteban-Martinez et al, 2015) (Figura 25). 

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Figura 25. Mitofagia durante el arresto mitótico. La inducción de autofagia en ausencia de biogénesis 
mitocondrial induce mitofagia (puntos verdes en panel superior) y la depleción de mitocondrias 
funcionales, provocando una disminución de ATP mitocondrial. Como consecuencia se produce la 
activación de AMPK, que posteriormente fosforila a PFKFB3, induciéndose la glicólisis. Con el fin de 
suplir las demandas energéticas de la célula en arresto mitótico (Esteban-Martinez et al, 2015). 

Por otro lado, se ha visto que la inducción de mitofagia mediada por MUL1 

juega un papel en la modulación del balance energético del músculo esquelético y del 

estado aerobio/anaerobio de las fibras musculares (Lokireddy et al, 2012). Además, la 

mitofagia inducida por PINK1-Mtf2-Parkina juega un papel en el cambio metabólico de 

carbohidratos a ácidos grasos en el corazón de ratón, siendo un prerrequisito para la 

introducción de mitocondrias cardiacas maduras óptimas para un metabolismo 

dependiente de ácidos grasos (Gong et al, 2015). Durante este proceso, la preferencia 

metabólica hacia glicólisis en corazones fetales recuerda al efecto Warburg observado 

en cáncer. Aunque los determinantes moleculares específicos del metabolismo 

glicolítico en los corazones fetales difieren de los que se encuentran en los tumores, en 

ambos casos, el incremento en la glicólisis es una adaptación al ambiente hipóxico y se 

optimiza para incrementar la biomasa, por ejemplo promoviendo el crecimiento celular 

(Vander Heiden et al, 2009). 

La mitofagia es por tanto un proceso que acompaña a diferentes situaciones que 

presentan un cambio metabólico caracterizado por una limitada actividad mitocondrial y 

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dependencia de la glicólisis para suplir las demandas energéticas, tanto en las células 

altamente proliferativas, como en las células madre hematopoiéticas (Joshi & Kundu, 

2013) así como en células ya diferenciadas, no proliferativas, como los eritrocitos 

(Sandoval et al, 2008; Schweers et al, 2007). 

Lo que aun no está del todo definido en la literatura es si la mitofagia es el 

proceso responsable del cambio metabólico o solo una adaptación celular a una 

necesidad de cambio metabólico según las demandas energéticas.  

5.4 Mitofagia en las neuronas 

El proceso de mitofagia se ha estudiado principalmente en líneas celulares no 

neuronales y apenas se ha estudiado en neuronas ya diferenciadas. Como en otros tipos 

celulares, las neuronas modulan continuamente el tamaño y número de las mitocondrias, 

dependiendo de las demandas energéticas y de los estados metabólicos a lo largo de su 

vida y/o diferentes compartimentos subcelulares (Chen & Chan, 2009; Santos et al, 

2010; Van Laar & Berman, 2013; Vives-Bauza et al, 2010). De ese modo, un gran 

número de mitocondrias reside muy lejos del soma, estando localizadas en el axón 

distal, en los procesos dendríticos (Hollenbeck, 2005; Perkins & Ellisman, 2011; 

Perkins et al, 2010), los nodos de Ranvier y los conos de crecimiento (Fabricius et al, 

1993; Morris & Hollenbeck, 1993), con el fin de proporcionar ATP localmente y la 

regulación de calcio necesaria para la actividad sináptica (Schon & Przedborski, 2011). 

Dado que los lisosomas están fundamentalmente localizados en el soma, se requiere de 

un transporte retrógrado de las mitocondrias hacia el soma para su degradación por 

mitofagia (Ashrafi & Schwarz, 2013). La eliminación de mitocondrias dañadas es así 

una función de demanda bioenergética. No obstante, la mitofagia es un proceso muy 

importante en neuronas, ya que permite proporcionar mitocondrias sanas en los 

procesos distales donde son imprescindibles para la transmisión sináptica (Amadoro et 

al, 2014). Por otro lado, también se ha observado una degradación local de mitocondrias 

despolarizadas antes de su transporte al soma (Wang et al, 2011) (Figura 26). 

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Figura 26. Compartimentalización y diferentes requerimientos energéticos en el soma, axón y 
compartimentos sinápticos de neuronas postmitóticas. (A) Las mitocondrias viajan largas distancias 
desde el soma hasta los terminales dendríticos y axónicos, donde se encargan de la producción de ATP y 
de la homeostasis del calcio. Los procesos dinámicos de biogénesis, fusión y fisión, regulan la función 
mitocondrial permitiendo adaptar los cambios espacio-temporales a los requerimientos energéticos. (B) 
Los autofagosomas formados se mueven a través de los microtúbulos en dos direcciones -como resultado 
de las actividades opuestas de proteínas motoras dineína y kinesina- y finalmente, se concentran en la 
región perinuclear donde se fusiona con los lisosomas (Amadoro et al, 2014). 

Además, las neuronas dependen críticamente de la autofagia para la 

diferenciación y la supervivencia (Komatsu et al, 2006) y son específicamente 

propensas al estrés oxidativo, por lo que la autofagia basal parece ser más eficiente que 

en otros tipos celulares proliferativos no neuronales (Boland et al, 2008) y está también 

probablemente regulada por diferentes vías (Ashrafi & Schwarz, 2013; Van Laar & 

Berman, 2013). Hay que destacar que puesto que las neuronas son células diferenciadas 

y que producen altos niveles de ROS (Cui et al, 2004; Fatokun et al, 2008), necesitan 

64
 



 

 

 

 

 

 

eliminar las mitocondrias antiguas para prevenir la acumulación de daño oxidativo 

(Kageyama et al, 2012).  

Por tanto, las mitocondrias desempeñan una función metabólica importante en la 

función neuronal y es necesario un control estricto de su homeostasis para mantener 

neuronas sanas que no acumulen ROS y evitar así su muerte celular. Estos datos, junto 

con las evidencias previas de que la autofagia es un proceso importante durante la 

diferenciación celular, nos han llevado a plantear la hipótesis de que la mitofagia podría 

ser un proceso esencial durante el desarrollo de la retina, modulando procesos como el 

metabolismo, la diferenciación y la muerte celular.  

65
 



 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

OBJETIVOS
 



 

 



 

 

 
 

 

 

  

 

 

 
 

OBJETIVOS 

El principal objetivo de esta Tesis Doctoral ha consistido en entender por qué la 

autofagia es esencial para el correcto desarrollo de la retina de ratón. En concreto, se 

han estudiado las funciones de la autofagia en relación al metabolismo, la diferenciación 

y la muerte celular. Los objetivos de este trabajo se detallan a continuación: 

1.	 Determinar el flujo de autofagia in vivo y ex vivo en la retina de ratón 

embrionaria y adulta. 

2.	 Determinación del fenotipo de muerte celular tras el bloqueo y la inducción de la 

autofagia en la retina embrionaria de ratón. 

3.	 Estudio del proceso de mitofagia a lo largo del desarrollo embrionario y 

postnatal de la retina. 

4.	 Determinación de la función metabólica de la mitofagia durante el desarrollo 

embrionario de la retina y la polarización de macrófagos. 

5.	 Estudio de la función de la mitofagia durante la diferenciación celular.  

69
 



 

 



 

 

 

 

 

MATERIALES Y 

MÉTODOS 



 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 
 

 

MATERIALES Y MÉTODOS 

1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Y EXTRACCIÓN 
DE RETINAS 

Todos los procedimientos experimentales realizados con animales en esta Tesis 

Doctoral han sido aprobados por los comités éticos locales de experimentación animal 

del CSIC y del Albert Einstein College of Medicine y se han llevado a cabo siguiendo la 

normativa vigente de la Unión Europea y Americana, y la declaración de ARVO para la 

utilización de animales en la investigación oftalmológica. Para el estudio de retinas 

postnatales se han empleado indistintamente machos y hembras.  Los animales fueron 

mantenidos en ciclos de 12:12 horas de luz y oscuridad, a una temperatura de 20 ºC, con 

comida y bebida ad libitum. Para la obtención de embriones, se cruzaron los animales y 

la mañana en la cual se detectó el tapón vaginal se consideró como el día embrionario 

(E) 0.5. Todos los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y los embriones 

fueron obtenidos por cesárea. Los embriones se decapitaron y se colocaron en una placa 

Petri con PBS 1x y, con unas pinzas finas bajo la lupa, se aislaron los ojos ó se 

diseccionaron las retinas separándolas del epitelio pigmentario, cristalino, vítreo, vasos 

y otros restos de tejido. El aislamiento de los ojos y las retinas de ratones adultos se 

realizó de igual modo.   

1.1 Ratones wildtype C57 y CD1 

Los ratones silvestres utilizados en este trabajo fueron de la estirpe  C57BL/6J y 

CD1 procedentes de Jackson Mice Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Estas cepas 

de ratón fueron mantenidas en el animalario del CIB (CSIC). 

1.2 Ratones GFP-LC3 

Los ratones transgénicos GFP-LC3 fueron proporcionados por el Dr. Noboru 

Mizushima (Departamento de Fisiología y Biología Celular en Tokyo Medical and 

Dental University, Tokyo, Japón) y han sido previamente descritos (Mizushima et al, 

2004). Se estableció una colonia en el animalario del CIB mediante transferencia 

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embrionaria. Para la obtención de embriones se cruzaron machos GFP-LC3 con 

hembras GFP-LC3, de manera que toda la descendencia expresa GFP. 

1.3 Ratones deficientes de Atg5 

Los ratones Atg5-/- de la estirpe C57 fueron proporcionados por el Dr. Noboru 

Mizushima (Departamento de Fisiología y Biología Celular en Tokyo Medical and 

Dental University, Tokyo, Japón). Se estableció una colonia en el animalario del CIB 

mediante transferencia embrionaria. Para la obtención de embriones se cruzaron machos 

Atg5+/- con hembras Atg5+/-. 

1.4 Ratones deficientes de Ambra1 

Los ratones mutantes Ambra1gt/gt de la estirpe CD1 fueron generados en el 

laboratorio del Prof. Francesco Cecconi (Università degli Studi di Roma Tor Vergara). 

Estos ratones se generaron por la técnica de gene-trapping, introduciendo una secuencia 

que cambió el marco de lectura del gen Ambra1 (Fimia et al, 2007). Se estableció una 

colonia en el animalario del CIB mediante transferencia embrionaria. Para la obtención 

de embriones se cruzaron machos Ambra1+/gt con hembras Ambra1+/gt. 

1.5 Ratones deficientes de NIX (BNIP3L) 

Los ratones deficientes de NIX (BNIP3L) de la estirpe C57 fueron 

proporcionados por el laboratorio del Dr. Alex Cvekl  (Albert Einstein College of 

Medicine). Para la obtención de embriones se cruzaron machos NIX+/- con hembras 

NIX+/­ . 

1.6 Ratones deficientes de LAMP-2A 

Los ratones deficientes de LAMP-2A de la estirpe C57 fueron proporcionados 

por el laboratorio de la Dra. Ana María Cuervo (Albert Einstein College of Medicine). 

La colonia de ratones LAMP-2A se mantuvo en homocigosis, ya que la deficiencia de 

LAMP-2A no es letal, por lo que para la obtención de embriones se cruzaron machos 

LAMP-2A-/- con hembras LAMP-2A-/-. Como controles se emplearon embriones C57 

de los estadios correspondientes.  

Las retinas y los ojos embrionarios obtenidos se procesaron mediante diferentes 

técnicas detalladas a continuación y resumidas en la figura 1: 

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Figura 1.  Procesamiento de ojos y retinas embrionarias empleados en esta Tesis Doctoral. IF: 
inmunofluorescencia. 

2. GENOTIPAJE DE LOS RATONES KNOCK-OUT 

El genotipaje de los ratones adultos de las colonias de Ambra1, Atg5 y NIX, y 

de los embriones deficientes de Atg5 y NIX,  se realizó a partir de DNA genómico 

obtenido de la punta de la cola del ratón o embrión según la técnica descrita por Miller y 

cols (Miller et al, 1988). El fragmento de cola se digirió en 0.5 mL de tampón de lisis 

(Tris-HCl 40 mM, pH 8.0; EDTA 20 mM; SDS 0.5 % (p/v)  y NaCl  200 mM) con 0.3 

mg de Proteinasa K (Sigma, 2308) durante toda la noche a 55 ºC. A continuación se 

añadieron 0.25 mL de una solución saturada de NaCl a 6M, se agitaron los tubos en el 

vortex y se dejaron 10 minutos en hielo. Posteriormente, se centrifugaron a 12.000 

r.p.m. durante 5 minutos a 4 ºC y se transfirieron los sobrenadantes, donde está 

contenido el DNA, a un nuevo tubo estéril. Al DNA de cada muestra se le añadió 1 mL 

de etanol al 96 % para su precipitación y se agitaron los tubos vivamente. Tras una 

centrifugación a 12.000 r.p.m, se lavó con etanol al 70 %  para eliminar las sales y tras 

una última centrifugación en las mismas condiciones, se dejó secar el DNA 

manteniendo el tubo abierto y tapado para evitar contaminaciones. Finalmente, los 

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DNAs se resuspendieron en agua milliQ estéril a la concentración indicada para cada 

genotipaje. 

Tras la PCR correspondiente, el resultado de las amplificaciones se analizó en 

geles de agarosa (Promadisa, 8014) al 2 % (p/v) conteniendo 1 µg/mL de bromuro de 

etidio (BioRad, 161-0433) y utilizando el marcador de pares de bases 1Kb (Invitrogen, 

10787-026) en todos los casos. La electroforesis se llevó a cabo a 115V durante 60 

minutos y el análisis de las bandas se realizó en GelDOC.  

2.1 Genotipaje de ratones adultos y embriones de la colonia Atg5 

Los DNAs genómicos procedentes de ratones adultos y embriones deficientes de 

Atg5 se resuspendieron en 50AL, se midió la concentración en NANODROP y se ajustó 

la concentración a 20 ng/µL. La detección del genotipo Atg5+/+, Atg5+/- y Atg5-/- se 

realizó utilizando los cebadores Check2, Exon3-1 y Short2. (Tabla 1).  

Cebador Secuencia 
Check2 5´-ACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGG-3´ 
Exon3-1 5´-GAATATGAAGGCACACCCCTGAAATG-3´ 
Short2 5´-GTACTGCATAATGGTTTAACTCTTGC-3´ 
Tabla 1. Secuencia de los cebadores empleados para el genotipaje de ratones adultos y 
embriones de la colonia Atg5. 

Con estas secuencias se obtiene un amplicón de 351 pb (pares de bases) en el 

Atg5+/+, y de 574 pb en el Atg5-/-. Las reacciones de amplificación se realizaron con 2.5 

µL de DNA genómico en un volumen final de 25 µL. La amplificación se llevó a cabo 

con el kit Master Mix©  (5 PRIME). Para la amplificación se utilizaron las siguientes 

condiciones: 1 ciclo a 95 ºC, 2 minutos; 33 ciclos de: 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos 

a 59 ºC y 30 segundos a 72 ºC; y finalmente 1 ciclo a 72 ºC, 10 minutos. 

2.2 Genotipaje de ratones adultos y embriones de la colonia NIX 

Los DNAs genómicos procedentes de ratones adultos y embriones deficientes de 

NIX se resuspendieron en 50 µL, se midió la concentración en NANODROP y se ajustó 

la concentración a 20 ng/µL. La detección del genotipo NIX+/+, NIX+/- y NIX-/- se 

realizó mediante dos PCRs utilizando las parejas de cebadores  NIX GT LOX-1-NIX 

GT LOX-3 y NIX GT LOX-2-NIX GT LOX-3. (Tabla 2).   

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Cebador Secuencia 
NIX GT LOX-1 5´- CACAGCATTGCCACCCCTGCAGAG-3´ 
NIX GT LOX-2 5´- GCTGCAGATGCCGGGCCTGAGCAA-3´ 
NIX GT LOX-3 5´- ACCTGCCCATGCTCCAGAGCAGGC-3´ 
Tabla 2. Secuencia de los cebadores empleados para el genotipaje de ratones adultos y 
embriones de la colonia NIX. 

Con estas secuencias se obtiene un amplicón de 375 pb (pares de bases) en el 

NIX+/+, y de  210 pb en el NIX-/-. Las reacciones de amplificación se realizaron con 2.5 

µL de DNA genómico en un volumen final de 25 µL. La amplificación se llevó a cabo 

con el kit Master Mix©  (5 PRIME). Para la amplificación se utilizaron las siguientes 

condiciones: 1 ciclo a 94 ºC, 2 minutos; 30 ciclos de: 1 minuto a 94 ºC, 30 segundos a 

60 ºC y 30 segundos a 72 ºC; y finalmente 1 ciclo a 72 ºC, 10 minutos.  

2.3 Genotipaje de ratones adultos de la colonia Ambra1 

La mutación introducida por gene-trapping para la generación de ratones 

deficientes de Ambra1 es letal embrionaria en homozigosis, por lo que la sola presencia 

del cassette introducido en tejido adulto indica que es heterocigoto para la mutación. 

Los DNAs genómicos procedentes de ratones adultos Ambra1 se resuspendieron en 50 

µL de agua milliQ, se midió la concentración en NANODROP y se ajustó la 

concentración a 80 ng/µL. La detección del genotipo Ambra1+/+ y Ambra1+/gt  se  

realizó utilizando los cebadores SAB y LacZb. (Tabla 3).  

Cebador Sentido Secuencia 
SAB F 5´-TCCCGAAAACCAAAGAAGAAGA-3´ 
LacZb R 5´- CCCAGTCACGACGTTGTAAAA-3´ 
Tabla 3. Secuencia de los cebadores empleados para el genotipaje de ratones adultos de la 
colonia Ambra1. 

Con estas secuencias se obtiene un amplicón de 145 pb (pares de bases) en el 

Ambra1+/gt. Las reacciones de amplificación se realizaron con 1 µL de DNA genómico 

en un volumen final de 25 µL. La amplificación se llevó a cabo con el kit Master Mix© 

(5 PRIME). Para la amplificación se utilizaron las siguientes condiciones: 1 ciclo a 95 

ºC, 5 minutos; 30 ciclos de: 2 minutos a 95 ºC, 45 segundos a 58 ºC y 45 segundos a 72 

ºC; y finalmente 1 ciclo a 72 ºC, 10 minutos.  

77
 



 

 

 
 

 

 

 

 

 

  
 

2.4 Genotipaje de embriones deficientes de Ambra1 

La detección de los genotipos Ambra1+/+, Ambra1+/gt y Ambra1gt/gt se realizó 

mediante una reacción de RT-PCR del RNA total de la cola del embrión. Para 

determinar los tres genotipos para el alelo mutado se estudió la presencia del mRNA 

aberrante y del silvestre. La extracción de RNA se realizó homogeneizándolo con un 

émbolo en un tubo eppendorf en presencia de 250 µL de Trizol© (Invitrogen). A 

continuación, se añadieron 50 µL de cloroformo, se agitó vigorosamente y se centrifugó 

a 12.000 r.p.m. durante 15 minutos a 4 ºC. Aproximadamente 125 µL del sobrenadante 

se mezclaron en un tubo nuevo con 125 µL de isopropanol y se centrifugaron a 12.000 

r.p.m. durante 10 minutos a 4 ºC. El precipitado obtenido se lavó con etanol al 70 % y 

se volvió a centrifugar a 7.500 r.p.m. durante 5 minutos a 4 ºC. Tras quitar el 

sobrenadante y dejar secar bien, el precipitado se resuspendió  en 40 µL de agua 

RNasaFree, se midió la concentración en NANODROP y se diluyeron las muestras a 

125 ng/µL. 

La reacción de retrotranscripción se realizó con Oligo (dT) (Invitrogen) y la 

enzima Superscript©  III (Invitrogen). Previamente, se trataron los RNAs con DNAsa, 

mediante una mezcla de RNA y H2O en un volumen total de 8 µL (teniendo el RNA una 

concentración de 1 µg), a la que se añadieron 1 µL de DNAsa, 1 µL de tampón de la 

enzima a 10x y 1 µL de EDTA. La reacción se llevó a cabo a 65 ºC durante 10 minutos. 

El anillamiento con Oligo (dT) se realizó a 65 ºC durante 5 minutos, utilizando una 

primera mezcla con un volumen final de 10 µL por cada 2 µL e RNA resuspendido, 

conteniendo 1 µL de dNTPs y 1 µL de Oligo (dT). Posteriormente se añadió una mezcla 

conteniendo 4 µL de tampón de la enzima, 1 µL de DTT (Ditiotreitol), 1 µL de RNAsa 

y 1 µL de Superscript©  III por cada muestra. La reacción se produjo en las siguientes 

condiciones: 25 ºC, 5 minutos; 50 ºC, 60 minutos, 70 ºC, 15 minutos.  

La detección del genotipo se realizó mediante dos PCRs utilizando las parejas de 

cebadores E-D y LacZb-E (Fimia et al, 2007). (Tabla 4).  

Cebador Sentido Secuencia 
E F 5´-AACGCATTTATACCCAGTCCA-3´ 
LacZb R 5´- CCCAGTCACGACGTTGTAAAA-3´ 
D R 5´- ACCATAACGTATCGGCCCATC-3´ 
Tabla 4. Secuencia de los cebadores empleados para el genotipaje de embriones de la 
colonia Ambra1. 

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Con estas secuencias se obtuvo un amplicón de aproximadamente 750 pb, siendo 

Ambra1+/gt positivo para las dos reacciones de PCR, Ambra1gt/gt positivo sólo para 

LacZb-E y Ambra1+/+ positivo solo para E-D. Las reacciones de amplificación se 

realizaron con 2 µL de cDNA en un volumen final de 25 µL. La amplificación se llevó a 

cabo con el kit Master Mix©  (5 PRIME). Para la amplificación se utilizaron las 

siguientes condiciones: 1 ciclo a 95 ºC, 5 minutos; 30 ciclos de: 1 minuto a 95 ºC, 45 

segundos a 60 ºC y 45 segundos a 72 ºC; y finalmente 1 ciclo a 72 ºC, 10 minutos. 

3. ESTUDIO DEL FLUJO DE AUTOFAGIA IN VIVO 

Para el análisis de la autofagia in vivo, se utilizaron los ratones transgénicos 

GFP-LC3 adultos a los que se les bloqueó la actividad lisosomal mediante la inyección 

intraperitoneal de leupeptina (L2884, Sigma) a una dosis de 40 mg/Kg de peso corporal 

en suero salino. Los animales control fueron inyectados intraperitonealmente con un 

volumen equivalente de solución salina. Para la inducción de autofagia, se mantuvieron 

un grupo de ratones en ayuno durante 24h, inyectando la leupeptina las 4 últimas horas. 

A continuación, se sacrificaron los animales y se aislaron los tejidos (retina y cerebelo), 

que se mantuvieron a -80 ºC hasta su procesamiento por western blot como se describe 

en el apartado 13. El cerebelo de ratones adultos se extrajo mediante la inserción de 

unas tijeras quirúrgicas pequeñas y un corte, primero lateralmente y luego en sentido 

anterior a través de cada oreja hacia la línea media. El cráneo fue cuidadosamente 

levantado hacia arriba y pelado para exponer el cerebro posterior. El cerebelo se extrajo 

utilizando unas tijeras curvas y la mitad del tejido se almacenó a -80 ºC para la 

extracción de la proteína y la otra mitad se fijó con PFA al 4%  para criosecciones. Los 

ojos se extrajeron como se describe en el apartado 1 y  para el análisis de fluorescencia 

se procesaron los ojos como se describe en el apartado 8. 

4. CULTIVOS ORGANOTÍPICOS DE RETINAS 

Las retinas embrionarias de ratón fueron cultivadas durante 6h en medio 

DMEM:HAM/F12 (Gibco, 42400) suplementado con bicarbonato sódico 10 mM 

(Sigma, S7561), piruvato 1.1 mg/L (Sigma, P2256), apotransferrina 100 mg/L (Sigma­

T2252), selenito sódico 0.0052 mg/mL (Sigma-S5261), putrescina 0.32 mg/L (Sigma­

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P5780), progesterona 0.2 mg/L (Sigma-P8783) y con gentamicina 0.05 g/L (Gibco, 

15710) y se ajustó hasta un pH de 7.14. En el momento del cultivo se suplementó el 

medio con glutamina a 2 mM (Gibco, 25030) e insulina humana recombinante (Sigma, 

I2643). Salvo que se indique, la concentración general de insulina utilizada fue de  10 

nM. En aquellos experimentos donde se indica, se utilizaron distintas concentraciones 

de insulina: insulina alta (160 nM), insulina baja (10 nM) o en ausencia de insulina.  

Los tratamientos utilizados en este estudio se presentan en la tabla 5. 

Tratamiento Casa 
comercial 

Referencia Concentración Función 

3-metil-adenina Sigma M9281 10 mM Inhibidor de autofagia 
Wortmanina Calbiochem 681675 10, 50 y 100 

nM 
Inhibidor de autofagia 

LY294002 Calbiochem 440202 100 µM Inhibidor de PI3K 
Hidroxicloroquina Laboratorios 

Rubió 
880872.4 30 µg/mL Inhibidor de la 

degradación lisosomal 
Metil-piruvato Sigma 371173 10 mM Suplemento 

metabólico 
EBSS Sigma E2888 Inductor de autofagia 
Rapamicina Euromedex R-5000 200 nM Inductor de autofagia 
AZD 8055 Axon 1561 1 µM Inductor de autofagia 
Ciclosporina A Sigma 30024 5 µM Inhibidor de mitofagia 
Antimicina A Sigma A8674 10 µM Inhibidor del complejo 

III mitocondrial 
Oligomicina Sigma O4876-25mg 1 µM Inhibidor del complejo 

I mitocondrial 
3-PO Millipore 525330 10 µM Inhibidor de PFKFB3 

(glicólisis) 
2-Deoxi-glucosa Sigma D8375 10 nM Inhibidor de 

Hexokinasa 
(glicólisis) 

Deferoxamina Sigma D9533-1G 1 mM Inductor de hipoxia 
FM19G11 Sigma F8807 1 µM Inhibidor de hipoxia 
Boc-D-FMK Calbiochem 218575 25 µM Inhibidor de caspasa3 
U0126 Calbiochem 662005 50 µM Inhibidor de 

Tabla 5. Lista de reactivos empleados en los cultivos organotípicos de retinas. 

Para el estudio de autofagia en embriones de ratones GFP-LC3 ex vivo, se 

cultivaron las retinas y ojos en EBSS durante 6h y para bloquear la degradación 

lisosomal, se añadió hidroxicloroquina durante las 3 últimas horas del cultivo. Para los 

western blot de flujo de autofagia de retinas en diferentes estadios, se realizaron cultivos 

durante 3h en presencia de hidroxicloroquina.  

80
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

 

La 3-metil-adenina se preparó fresca para cada cultivo a 10 mM en medio de 

cultivo y se mantuvo en un baño a 37 ºC hasta su completa disolución.  

En los cultivos con metil-piruvato, se suplementó el medio con 1.2 g/L de 

bicarbonato sódico para tamponar la disminución del pH generada por este compuesto.  

5. MONTAJE EN PLANO DE RETINAS EMBRIONARIAS 

Tras el cultivo, la retina neural se montó bajo la lupa sobre una membrana de 

0,44 μm de poro de nitrocelulosa (Sartorius). Las retinas se colocaron con la capa de 

células ganglionares hacia arriba, adhiriéndose a la nitrocelulosa con ayuda de unas 

pinzas finas de disección. Posteriormente se fijaron con PFA al 4% (p/v) en tampón 

fosfato 0,1 M, pH 7,4 durante al menos 12 horas a 4 ºC en placas de 24 pocillos. 

Finalmente se lavaron con PBS 1x y se mantuvieron en PBS 1x con azida sódica al 

0,001% a 4 ºC hasta el momento del procesamiento por inmunofluorescencia.  

6. INMUNOFLUORESCENCIA DE RETINAS EN PLANO 

Para la detección de epítopos nucleares como el factor de transcripción Brn3a, se 

trataron las retinas con tampón citrato a pH 6 durante 5 minutos en el microondas, tras 

lo que se lavó 3 veces con PBS 1x. A continuación se procedió a la permeabilización 

sobre las retinas montadas en plano, lavando 3 veces con una solución de BGT (BSA 3 

mg/mL, glicina al 10 mM y Tritón X-100 al 0,25% en PBS) y posteriormente con Tritón 

X-100 al 1% (p/v) en PBS 1x (3 veces, 30 minutos cada vez). Se eliminaron los restos 

de Tritón X-100 lavando bien con PBS y posteriormente se incubó con la solución de 

bloqueo (NGS 10% y Tritón X-100 al 1% en PBS 1x) durante 30 minutos en cámara 

húmeda. A continuación, se incubaron las retinas con  los anticuerpos primarios en 

cámara húmeda a 4 ºC toda la noche en la solución de bloqueo. Los anticuerpos 

primarios utilizados se presentan en la tabla 6.  

Anticuerpo 1º Casa comercial Referencia Especie Dilución 
TOMM20 Santa Cruz sc-11415 Conejo 1/100 
COX-IV Invitrogen 459600 Ratón 1/100 
Brn3a Millipore MAB1585 Ratón 1/50 
β-III-tubulina Covance MMS-435P Ratón 1/500 
Caspasa3a Cell Signaling 96615 Conejo 1/100 
Tabla 6.  Lista de anticuerpos empleados en inmunofluorescencia de retinas en plano. 

81 



 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La incubación con los correspondientes anticuerpos secundarios anti IgG de 

ratón, de conejo o estreptavidina conjugados con Alexa 568 o 647 (1/200, Invitrogen) se 

realizó durante 1 hora a temperatura ambiente, en cámara húmeda y oscuridad, también 

en solución de bloqueo (NGS). Tras los correspondientes lavados con PBS, las retinas 

se montaron con una mezcla de glicerol 70% en agua con 4% de 1,4-diazabiciclo-(2, 

2,2)-octano (DABCO, Sigma) conteniendo 1µg/mL de 1,4-diamino-2-fenilindol 

(DAPI), para marcar los núcleos. 

Además, se realizaron otra serie de marcajes, entre los que se incluyen el 

marcaje con LysoTracker  Red (LTR) (1 µM; Invitrogen) durante los 15 últimos 

minutos del cultivo a 37 ºC, para detectar fagosomas ácidos; y el marcaje con lectina de 

tomate (TL)- Biotina (1/100; Sigma) durante 2h a 37 ºC en NGS una vez fijadas con 

PFA 4%, para detectar la microglía.  

7. DETECCIÓN DE LA MUERTE CELULAR 

La muerte celular se moduló mediante la adición del inhibidor general de 

caspasas Caspase inhibitor III (BOC) (Calbiochem). La detección se llevó a cabo 

mediante diferentes procedimientos, como inmunofluorescencia de caspasa 3 activa 

(como se ha descrito en el apartado 5), reacción de TUNEL y detección de la 

translocación de fosfatidil-serina (PS) en la superficie de las células apoptóticas. 

Además, la tinción con DAPI permitió corroborar y diferenciar los núcleos condensados 

típicos del proceso apoptótico. 

En la técnica de  TUNEL (del inglés, TdT-mediated dUTP Nick End Labelling), 

la enzima transferasa terminal (TdT) añade nucleótidos (dUTP) marcados con 

fluoresceína a los extremos 3´OH libres del DNA, lo que permite detectar la 

fragmentación del DNA que se produce durante la muerte celular programada. El kit de 

TUNEL empleado fue DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (Promega, G3250). La 

reacción de TUNEL siempre se llevó a cabo en combinación con inmunofluorescencia 

para la detección de proteínas, por lo que el procesamiento de las retinas fue el mismo 

que en el apartado 5, aplicándose la reacción tras la incubación con los anticuerpos 

primarios una vez realizados  lavados con PBS 1x para eliminar los restos de 

anticuerpo. Previamente se realizó una incubación con la solución del kit durante 30 

minutos a temperatura ambiente. Se preparó la mezcla de reacción según las 

instrucciones del fabricante: 88 % de tampón de TUNEL, 9,8 % de dNTPs marcados 

82
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

con FITC y 1,9 % de TdT y se aplicó durante 1 hora a 37 ºC en oscuridad. 

Posteriormente, se paró la reacción con la solución SSC durante 10 minutos a 

temperatura ambiente, tras lo cual las retinas se lavaron con PBS 1x y se procedió con la 

incubación con los anticuerpos secundarios como se ha descrito en el apartado 5.  

Para la detección de la translocación del fosfolípido fosfatidil-serina (PS) a la 

superficie externa de la membrana  de células apoptóticas se utilizó Anexina-V 

biotinilada (Chemicon).  Se añadió Anexina-V al 5% en el medio de cultivo en 

presencia de 5 % de tampón con calcio y se incubó durante los últimos 30 minutos de 

cultivo a 37 ºC en las retinas montadas en plano. Posteriormente las retinas se fijaron en 

PFA al 4% (p/v) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 y 2,5 % de tampón de calcio durante 

al menos 3 horas a 4 ºC en placas de 24 pocillos. Tras ello, las retinas se lavaron en PBS 

1x y se mantuvieron a 4 ºC hasta su procesamiento. La detección posterior se realizó 

mediante el protocolo de inmunofluorescencia descrito en el apartado 5, utilizando 

como anticuerpo secundario una estreptavidina conjugada con el fluoróforo Alexa 568 

o 647 (Invitrogen) 1/200 en 10% de NGS y 1% de Tritón-X 100 en PBS 1x. Cuando el 

experimento requirió la combinación con la técnica de TUNEL, la reacción del TUNEL 

se llevó a cabo antes de la conjugación con estreptavidina-Alexa 568 o 647. Finalmente, 

las retinas se lavaron con PBS, se montaron sobre portas con una mezcla de glicerol 

70% en agua con 4% de DABCO conteniendo 1 µg/mL DAPI.  

8. PREPARACIÓN DE SECCIONES DE OJO PARA 
INMUNOFLUORESCENCIA 

Los ojos de ratones adultos o de embriones in vivo o tras cultivo de 6h se fijaron 

al menos durante 1 hora en PFA al 4% (p/v) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4, se 

lavaron 3 veces con PBS 1x y se incluyeron en una solución de sacarosa al 15 % en 

PBS 1x (w/v) durante al menos 12 horas. Posteriormente se pasaron a una solución de 

sacarosa al 30% en PBS 1x (p/v), donde se mantuvieron una semana para su correcta 

crioprotección y se preservaron a -80 ºC hasta su utilización. Tras ello, los ojos fueron 

embebidos en OCT (Tissue Tek, Sakura Finetek), en el interior de la tapa de un tubo 

eppendorf de 1,5 mL. Sobre estas muestras se realizaron cortes de 12  µm en un 

criostato Leica CM 1950 sobre portaobjetos tratados (Superfrost® Plus, Thermo 

Scientific). Los portaobjetos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 30 minutos 

y posteriormente a 60 ºC durante otros 30 minutos, para favorecer la adhesión de los 

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especimenes. A continuación, los cortes se refijaron durante 15 minutos con PFA 4% en 

PBS 1x. Tras ello se permeabilizaron tratándolos con BGT 3 veces  y se bloquearon con 

NGS durante 1 hora, antes de la incubación con los anticuerpos primarios y secundario 

tal y como se ha descrito en el apartado 5. Este procedimiento también se utilizó para al 

visualización de las secciones de ojos de ratones GFP-LC3 in vivo. Los anticuerpos 

utilizados en secciones de ojo se presentan en la tabla 7.  

Anticuerpo 1º Casa comercial Referencia Especie Dilución 
TOMM20 Santa Cruz sc-11415 Conejo 1/100 
β-III-tubulina Covance MMS-435P Ratón 1/500 
Tabla 7. Lista de anticuerpos utilizados en secciones de ojo. 

9. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y CONFOCAL 

Las inmunofluorescencias realizadas en retinas en plano y secciones de ojo, así 

como la detección de muerte celular se visualizaron con un microscopio Confocal Leica 

SP5 (Leica Microsystems GmbH). Las imágenes mostradas en esta Tesis Doctoral 

corresponden a la proyección máxima del grosor total de la retina o sección obtenida de 

secciones ópticas de 1 µm, en el caso de los cortes de ojo, y de 2 µm para las retinas 

montadas en plano. 

Las cuantificaciones de las células positivas para TUNEL, caspasa3a, LTR, 

Anexina-V y Brn3a se realizaron mediante el programa ImageJ 1.44 p. La 

cuantificación automática del área cubierta por masa mitocondrial (detectada mediante 

inmunofluorescencia de TOMM20) se determinó con el mismo programa, para lo que 

las proyecciones máximas se transformaron en imágenes de 16 bit y se estableció un 

umbral mínimo de detección común para todas las imágenes.  

En la figura 2 se muestra una imagen representativa para cada una de las 

tinciones realizadas en retinas montadas en plano: 

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Figura 2. Imágenes representativas de las tinciones realizadas y obtenidas mediante microscopía 
confocal. 

10. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA 

Para la microscopía electrónica, se utilizaron ojos aislados in vivo o tras un 

cultivo de 4h con HCQ de embriones CD1 a E15.5. La fijación se realizó durante 4h a 4 

ºC  en PFA al 4 % (w/v) con glutaraldehído al 2.5 % (v/v). Después, se lavaron y fueron 

fijados de nuevo en tetróxido de osmio al 5 % (w/v), ferricianida de potasio al 1 %, se 

deshidrataron con concentraciones crecientes de acetona y se trataron 3 veces de 10 

minutos con óxido de propileno. Posteriormente se embebieron en resina Epon (EMS). 

La resina se polimerizó en un horno a 50 °C. A continuación, se realizaron secciones 

ultrafinas (50nm) en un ultramicrotomo (Vitracut E, Reichert-Jung) y se tiñeron con 

acetato de uranilo y citrato de plomo. Este procesamiento se realizó en el servicio de 

microscopía electrónica del Centro de Investigaciones Biológicas. La microscopía 

electrónica se realizó en un microscopio de transmisión Zeiss EM 902, a 90 kV.  La 

cuantificación del número de mitocondrias se realizó mediante el programa ImageJ 1.44 

p, para lo que se cuantificaron 14 imágenes diferentes por región de retina (capa de 

neuroblastos y capa de células ganglionares) a una escala de 7000 nm.  

11. DISOCIACIÓN DE RETINAS Y CITOMETRÍA DE 
FLUJO 

Para el procesamiento por citometría de flujo, las retinas aisladas in vivo o tras 

un cultivo se incubaron con tripsina 0.5 mg/mL (Worthington, LS003703) en HBSS 

(Gibco, 14170-088) durante 5 minutos a 37 ºC, tras los cuales se disociaron mediante 

pipeteo. La digestión mediada por tripsina se bloqueó mediante la adición de suero fetal 

85
 



 

 

 

 

 

 
  

 
 
 
 

bovino al 10% (FBS) y las células fueron centrifugadas a 1.200 r.p.m. durante 5 

minutos. A continuación, se descartó el sobrenadante y se resuspendió en 300 µL de 

HBSS (Gibco, 14170-088) conteniendo la sonda correspondiente: MitoTracker Deep 

Red (MtdR) (M22426, Invitrogen) 10 nM, DHE (D1168, Invitrogen) 5 µM, Dioc (3,3'-

Dihexyloxacarbocyanine Iodide) (D273-100mg, Invitrogen) 40 nM. Todas las 

incubaciones se realizaron durante 10 minutos a 37 ºC, tras los cuales se procesaron las 

muestras en un citómetro FC500 (Beckman Coulter), adquiriéndose 10.000 células por 

muestra en los canales FL1 (Deval et al), FL3 (DHE) y FL4 (MtdR). El procesamiento 

de retinas GFP-LC3 se realizó de igual manera en el canal FL1. Para el análisis de los 

datos, se determinó la intensidad media de fluorescencia (Vivas et al) de la población 

viable (determinada en los canales FSC y SSC) y se normalizó frente al valor de las 

células no tratadas.  Este análisis así como los histogramas representativos de los 

valores se realizaron con el programa CXP Analysis. En la figura 3 se muestra un 

ejemplo de la adquisición de los valores de la citometría realizada a partir de retinas 

disociadas. 

Figura 3.  Esquema representativo de la población celular analizada (izquierda) e histograma 
resultante de la fluorescencia en dicha población (derecha). En verde está señalada la población de 
interés, así como el número de células adquiridas y el valor analizado. 

86
 



 

 

 

 

 

  
 

 

 

 

12. ESTUDIO TRANSCRIPTÓMICO Y DETECCIÓN DE 
RNA MENSAJERO 

El análisis de expresión génica a lo largo del desarrollo de la retina se realizó 

mediante un estudio transcriptómico y qRT-PCR. La extracción de RNA en ambos 

casos se llevó a cabo mediante el reactivo Trizol© (Fisher, 15596-018) como 

previamente se ha descrito para el genotipaje de embriones de Ambra1, pero ajustando 

los volúmenes como se muestra en la tabla 8.  

Reactivo V (µL) Embrión V (µL) Adulto 
Trizol 500 1000 
Cloroformo 100 200 
Isopropanol 250 500 
EtOH 70% 500 1000 
H2O RNAsa free 12 12-20 

Tabla 8. Volúmenes de los reactivos empleados para la extracción de RNA de retinas embrionarias 
y adultas. 

Para el estudio transcriptómico se utilizaron grupos de retinas (de media 24 

retinas/estadio) de todos los embriones de una ratona gestante para cada estadio: E12.5, 

E13.5, E14.5, E15.5 y E18.5; y grupos de 4 retinas para cada estadio postnatal: P0, P9, 

P15, P30 y P90. Las qRT-PCR se realizaron a partir de RNAs de grupos de 6 retinas por 

punto para los estadios E12.5, E13.5, E14.5, E15.5, E16.5, E18.5 y de 3 retinas por 

punto para los estadios P0, P9, P15, P30 y P90. Para las qRT-PCR de retinas deficientes 

de Atg5 o LAMP-2A, se realizaron grupos de 2 retinas por punto. En el caso de las 

qRT-PCR realizadas a partir de retinas tras cultivos organotípicos, se realizaron grupos 

de 2 retinas de E15.5 por punto. 

La homogeneización se realizó con una aguja de 0.8 mm x 25 mm acoplada a 

una jeringa de 1mL, seguida de una disgregación con aguja de 0.5 mm x 16 mm, unas 

5-10 veces. Además, antes de añadir el isopropanol, se añadió 1 µL en retinas adultas y 

0.5 µL en retinas embrionarias de glucógeno (Fisher, 10814010), para ayudar a 

precipitar el RNA.  

La reacción de transcripción reversa (RT) de mRNA se realizó a partir de 1 µg 

de RNA total mediante el kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit  (Applied 

Biosystems, Waltham, MA, USA) en un volumen total de 13.2 µL, según las 

instrucciones del fabricante. A cada reacción de RT se añadieron 6.8 µL de la mezcla de 

los siguientes reactivos del kit: 2 µL del buffer 10x, 2 µL  de Random Primers 10x, 0.8 

87
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 
 
 
 

  
  

 
 

 

 
 
 
 

  
 

 
 
 
 
 

 

µL de  25x dNTP Mix (100mM), 1 µL MultiScribe® Reverse Transcriptase (50 U/µL) 

y 1 µL de inhibidor de RNAsa (20 U/µL). Se pipeteó bien la mezcla y se llevó a cabo 

la reacción en termociclador con el siguiente programa: 25 ºC durante 10 minutos, 37 ºC 

durante 120 minutos, 85 ºC durante 5 minutos y 4 ºC como paso final.  

La reacción de PCR a tiempo real se llevó a cabo en el termociclador Light 

Cycler® 480 Instrument (Roche, Mannheim, Alemania) mediante la Taq polimerasa 

(Taqman Universal PCR Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)). La 

amplificación de L2A se ha empleado la biblioteca Universal Human Probe Roche 

library (Roche Diagnostics). Los ensayos se realizaron por duplicado y los resultados 

fueron normalizados a la expresión de los niveles de RNA de 18S. Los resultados 

fueron expresados utilizando el método de cuantificación ΔΔCT (cycle threshold). Los 

cebadores empleados para RT-PCR se muestran en la tabla 9. 

Gen Referencia Taqman 
Ulk1 Mm00437238_m1 
Ulk2 Mm00497023_m1 
Maplc3a Mm00458725_g1 
Maplc3b Mm00782868_sH 
Beclina1 Mm01265461_m1 
Ambra1 Mm00554370_m1 
Atg7 Mm00504340_m1 
Atg5 Mm00512209_m1 
Tfam Mm00447485_m1 
Ppargc1α Mm01208835_m1 
Pfkfb3 Mm00504650_m1 
Hk2 Mm00443385_m1 
Pkm Mm00834102_gH 
Gapdh Mm99999915_g1 
Slc2a1 Mm00441480_m1 
Pink1 Mm00550827_m1 
Parkina Mm00450187_m1 
Fundc1 Mm00511132_m1 
Optineurina Mm01333245_m1 
Rnf185 Mm00460976_m1 
Bnip3l Mm00786306_s1  
Smurf1 Mm00547102_m1 
Nrf1 Mm01135606_m1 
Sirt1 Mm00490758_m1 
Tfeb Mm00448968_m1 
Foxo3 Mm01185722_m1 
18S Hs99999901_s1 

Tabla 9. Lista de sondas y referencias empleadas para RT-PCR. 

88 



 

 

 

 

 
 

 

 

 

El estudio transcriptómico se llevó a cabo en el servicio de secuenciación y la 

unidad de bioinformática del CNIO (Osvaldo Graña). Se utilizó  1 µg de RNA total para 

cada estadio con un RIN (RNA integrity number) dentro del rango 8.6-9.9, determinado 

mediante el bioanalizador Agilent 2100 Bioanalyzer. Las fracciones de PolyA+ fueron 

procesadas mediante el kit TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit (Agilent). 

Las bibliotecas de cDNA resultantes se secuenciaron para 50 bases en un formato de 

lectura único (Illumina HiSeq 2000) y analizadas con Nextpresso, una fuente de cálculo 

computacional que lleva a cabo un análisis completo y automático. Se utilizó una tasa 

de valores falsos (False discovery rate (FDR)) de 0.05 como umbral de significancia de 

expresión diferencial. Las figuras de los heatmap fueron construidas mediante la 

plataforma GENE-E (http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE­

E/index.html). 

13. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN 
BLOT 

Tras la extracción y/o cultivo, las retinas se mantuvieron a -80 ºC hasta su 

procesamiento. La extracción de proteínas se realizó a partir de grupos de retinas para 

cada punto en el caso de los estadios embrionarios, y a partir de una retina en los 

estadios postnatales, en los volúmenes de tampón de lisis  indicados en la tabla 10. 

estadio Nº retinas/punto V de extracción (µL) 
E12.5 4 50 
E13.5 3 50 
E14.5 3 50 
E15.5 3 75 
E18.5 3 100 
P0 1 150 
P9 1 150 
P15 1 150 
P30 1 150 
P90 1 150 

Tabla 10.  Número de retinas y volumen de tampón utilizado para la extracción de proteínas de 
cada punto utilizado en western blot.  

El tampón de lisis empleado está compuesto por 50 mM Tris–HCl (pH 6.8), 10 

% glicerol (v/v), 2 % SDS (p/v), inhibidores de proteasas (Sigma, P8783) e inhibidores 

89
 

http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

de fosfatasas (1 mM ortovanadato sódico (S6508), 1 mM fluoruro sódico (201154), y 5 

mM fosfato sódico (221368); (todos de Sigma)). Las retinas se homogeneizaron 

mediante un émbolo en el caso de las retinas postnatales y mediante  pipeta en las 

retinas embrionarias. La extracción de proteínas de cerebelo se realizó en 500 µL de 

tampón de lisis mediante émbolo. Posteriormente, las muestras se calentaron durante 10 

minutos a 95 ºC para facilitar la desnaturalización de las proteínas y se guardaron a  -20 

°C. La cuantificación de proteínas se determinó mediante el kit Pierce BCA Protein 

Assay Kit (Pierce Thermo Fisher Scientific, 23227) realizando un patrón con BSA de 

concentración conocida y midiendo la longitud de onda a 540 nm. Se cargaron 15µg del 

extracto total junto con 10 mM de DTT y 0,005 % de azul de bromofenol en geles Any 

kD Criterion TGX Precast Gels (BioRad, 567–1124) y se transfirieron a membranas de 

PVDF (BioRad, 170–4157) durante 14 minutos a 25 V utilizando el sistema de 

transferencia Trans-Blot Turbo Transfer (BioRad). Tras la transferencia, las membranas 

fueron activadas con metanol al 100 % durante 2 minutos y bloqueadas con leche 

desnatada al 5 % en PBS-T (PBS 1X, 0.5 % Tween 20 (v/v)) durante 1h a temperatura 

ambiente. Tras lavar con PBS-T, las membranas se incubaron con los anticuerpos 

primarios en BSA 3 % en PBS-T durante al menos 12h a 4 ºC y en agitación. (Tabla 

11). 

Anticuerpo 1º Casa comercial Referencia Especie Dilución 
LC3 Sigma L7543 Conejo 1/1000 
Atg12-Atg5 MBL PM050 Conejo 1/1000 
pAkt (thr308) Cell Signaling 9275 Conejo 1/1000 
Akt Santa Cruz sc-1618 Cabra 1/1000 
pS6 Cell Signaling 4856 Conejo 1/1000 
S6 Cell Signaling 2317 Ratón 1/1000 
COX4/1 Invitrogen 459600 Ratón 1/1000 
TOMM40 Santa Cruz sc-11414 Conejo 1/1000 
TOMM20 Santa Cruz sc-17764 Ratón 1/1000 
TIMM23 BD Biosciences 611222 Ratón 1/1000 
PCNA Delta Biolabs DB051 Conejo 1/1000 
β-III-tubulina Covance MMS-435P Ratón 1/1000 
Recoverina Santa Cruz sc-28849 Conejo 1/1000 
GFAP Dako Z0334 Conejo 1/1000 
GAPDH Abcam ab8245 Ratón 1/1000 
Tubulina Santa Cruz sc-8035 Ratón 1/1000 
β -actina Sigma A5441 Ratón 1/2000 
Tabla 11. Lista de anticuerpos primarios empleados para la detección de proteínas mediante 
western blot. 

90 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tras sucesivos lavados con PBS-T, se incubaron las membranas durante 1h a 

temperatura ambiente con el correspondiente anticuerpo secundario conjugado con 

peroxidasa a una dilución 1/2000 (DAKO P0448 Conejo; Thermo Scientific 31430 

Ratón). Las membranas fueron reveladas con el sistema Pierce ECL Western Blotting 

Substrate (Thermo Scientific, 32106) y exponiéndolas a películas Curix RP2 Plus film 

(AGFA). 

14. CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE ATP 

La medición de los niveles de ATP se realizó utilizando el kit ATP 

Bioluminiscent Assay Kit HS II (Roche-11699709001) a partir de retinas embrionarias 

Atg5+/+ y Atg5-/- in vivo a E13.5, de retinas de embriones CD1 in vivo a E13.5 y E18.5 y 

de retinas de embriones CD1 a E13.5 cultivadas durante 6h con 3-MA y WM (ambas en 

ausencia y presencia de MP), en ausencia de insulina, con rapamicina y EBSS. Los 

cultivos se realizaron como previamente he descrito en el apartado 4, tras los cuales las 

retinas se congelaron a -80 ºC hasta su procesamiento. Las retinas se extrajeron en un 

volumen final de 50 μL de la mezcla del buffer de dilución y buffer de lisis del kit. Tras 

5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se centrifugaron a 10000g durante 1 

minuto a 4 ºC. Se reservaron 10 μL del extracto para la cuantificación de proteína total 

mediante BCA y se midió el ATP correspondiente a una concentración de proteína de 

100 ng en 50 μL. La medición de ATP se realizó mediante la reacción lumínica 

producto de la reacción de la luciferina en presencia de la enzima luciferasa con ATP y 

O2. Para ello se añadió 50 μL de una solución de luciferasa y luciferina del kit. La recta 

patrón se realizó con 50 μL de concentraciones de ATP conocidas, en presencia de 50 

μL de luciferasa y luciferina. Las mediciones se llevaron a cabo mediante un lector de 

placas Varioskan. 

15. ANÁLISIS METABÓLICO 

El análisis metabólico se realizó mediante espectometría de masas y Seahorse. 

Los estudios de metabolómica permiten la examinación e identificación de productos de 

reacciones bioquímicas endógenas, revelando información sobre las vías metabólicas 

que tienen lugar en las muestras procesadas. Para la espectometría de masas se 

utilizaron grupos de retinas (de media 24 retinas/estadio) de todos los embriones de una 

ratona gestante para cada estadio: E12.5, E13.5, E15.5, E18.5 y P0. Cada muestra se 

91
 



 

 

 

 

 

 

 

pesó antes del procesamiento para la normalización posterior de los datos. La técnica se 

llevó a cabo en el servicio de metabolómica Metabolomics and molecular cell biology 

platforms, Gustave Roussy, mediante una colaboración con el grupo de Guido Kroemer 

(Equipe 11 labellisée par la Ligue Nationale contre le cancer, INSERM U1138, Centre 

de Recherche des Cordeliers, 75006 Paris, France; Université Paris Descartes, 

Sorbonne Paris Cité). 

El fenotipo energético de las retinas se determinó mediante Seahorse XF-24 

(Seahorse Bioscience). Esta prueba mide la utilización de respiración mitocondrial y/o 

los niveles de lactato en condiciones basales y tras la inyección de diferentes 

compuestos para modular el metabolismo. El estudio se llevó a cabo a partir de retinas 

en distintos estadios simultáneamente en la misma placa: E13.5, E14.5, E15.5, P0 y 

adulto. Tras la disección, las retinas se montaron en plano en membranas de 

nitrocelulosa. Se utilizaron grupos de 4 retinas para las edades de E13.5 y E14.5, grupos 

de 2 retinas para E15.5 y 1 retina por punto para P0 y adulto. Una vez en la membrana, 

las retinas colocaron en placas de 24 pocillos específicas (Seahorse XF24 islet caputre 

microplate) con medio de cultivo para seahorse (DMEM no tamponado (Sigma, D0547) 

suplementado como en el apartado 3 pero sin bicarbonato sódico). A continuación, se 

realizó un perfil farmacológico clásico de BOFA, mediante la combinación de cuatro 

inhibidores mitocondriales (oligomicina, FCCP y rotenona+antimicina A) y el 

analizador seahorse como previamente ha sido descrito por Qian y Van Houten (Qian, 

2010). 

El OCR basal (medición de fosforilación oxidativa) es la cantidad de consumo 

de oxígeno que está ligada a la síntesis de ATP en la mitocondria. La oligomicina inhibe 

la ATP sintasa mitocondrial mediante su unión a la subunidad F0 de la ATP sintasa. Esa 

unión bloquea la conductancia de protones resultando en la pérdida de transferencia de 

electrones y consumo de oxígeno. El FCCP es un desacoplante mitocondrial que disipa 

el gradiente de protones, y por lo tanto desacopla la cadena de transporte de electrones y 

la respiración mitocondrial de la síntesis de ATP. El tratamiento con FCCP incrementa 

el consumo de oxígeno a su máximo nivel. La diferencia entre el valor de OCR para 

FCCP y basal es una buena medida de la capacidad respiratoria. La rotenona es un 

inhibidor mitocondrial que previene la transferencia de electrones desde el complejo I 

mitocondrial a la ubiquinona mediante el bloqueo del sitio de unión de la ubiquinona. 

La antimicina A inhibe el complejo III mitocondrial bloqueando así la respiración. En la 

figura 4 se muestra el perfil clásico de OCR tras la realización de un BOFA.  

92
 



 

 

 

 
 

  
  

 
 

 

 

 

 

 
 

 
   

 

 
 

 

 

Figura 4.  Perfil clásico de OCR tras 
un estudio de BOFA. (Modificado de 
Seahorse Bioscience). 

Las dosis empleadas de 

cada compuesto para el estudio de 

BOFA fueron las siguientes: 1 µM 

oligomicina, 0,6 µM fluoro­

carbonyl cyanide phenylhydrazone 

(FCCP), y 1 µM rotenona+1 µM 

antimicina A (Sigma- Aldrich).  

Para la medición de la acidificación del medio extracelular como consecuencia 

de la producción de lactato (ECAR) solo se consideraron los valores basales.  

El estudio de la función glicolítica en retinas deficientes de LAMP-2A se realizó 

mediante la medición de ECAR tras la adición de glucosa, para estimular la glicólisis, 

oligomicina, para bloquear la respiración y ver la respuesta compensatoria en glicólisis, 

y 2-DG para inhibir la respuesta glicolítica. En la figura 5 se muestra el perfil clásico 

para este estudio glicolítico: 

Figura 5. Perfil clásico de ECAR tras 
un estudio glicolítico. (Modificado de 
Seahorse Bioscience). 

Las dosis empleadas de 

cada compuesto para el estudio 

glicolítico fueron las siguientes: 

25 mM glucosa, 10 µM 

oligomicina, 100 mM 2-DG 

(Sigma- Aldrich).  

93
 



 

 

 
 

 

 

 

 
 

 

16. EXTRACCIÓN Y ESTIMULACIÓN DE 
MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATÓN 

Para la obtención de macrófagos peritoneales, se inyectaron intraperitonealmente 

ratones CD1 adultos con 1mL de tioglicolato al 4% (w/v). A los 4 días, se sacrificaron 

los animales por dislocación cervical y se inyectaron con 10mL de PBS estéril frío que 

posteriormente se aspiró para el lavado peritoneal. Una vez extraídos, los macrófagos se 

lavaron 2 veces con 10mL de PBS 1x frío para evitar la adhesión de los macrófagos, se 

contaron, y se resuspendieron 0.5x106 células/mL en medio RPMI 1640 (Gibco, 21875­

034) suplementado con FBS al 10% y penicilina/streptomicina al 1%. Para el análisis de 

citometría, se sembraron 0.5x106 células en placas de 24 pocillos durante 24h en 

presencia de LPS (100 µg/mL, E. coli 055:B5; Sigma-Aldrich) y mIFN-g (20 µg/mL, 

Immunotools, Germany) para la obtención de macrófagos M1, ó con mIL-4 e mIL-13 

(20 µg/mL, Immunotools, Germany) para la obtención de macrófagos M2. Tras las 24h, 

se aspiró el medio, se lavó 3 veces con PBS 1x y se cultivaron durante 6h con 3-metil­

adenina a 10 mM y ciclosporina A 5 µM durante 6h. Posteriormente se tomaron 

imágenes representativas de la morfología de los macrófagos mediante microscopía de 

fluorescencia. Para la preparación de las muestras para citometría tras el cultivo, se 

aspiró el medio, se levantaron los macrófagos con tripsina (Gibco, 25300-054), se paró 

la tripsina con medio conteniendo 10% de FBS y se centrifugaron las células durante 5 

minutos a 1.200 r.p.m. A continuación, se incubaron con Mitotracker Deep Red 

(M22426, Invitrogen) a 10nM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para el 

procesamiento se utilizó el citómetro FC500 (Beckman Coulter) y el análisis se realizó 

con el programa CXP Analysis. 

17. CULTIVO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS 

Las células madre embrionarias fueron proporcionadas por la Dra. María Salazar 

del grupo del Dr. Marcos Malumbres (CNIO). Las células madre se mantuvieron en 

placas de 6 pocillos en medio DMEM, con 10 % de FBS, 1 % de 

penicilina/streptomicina y 1 % de glutamina y se incubaron con  CO2 al 5 %. Se testaron 

los cultivos para asegurar la ausencia de contaminación por micoplasma. Las células se 

mantuvieron en estado proliferativo mediante la adición al medio de LIF (Leukemia 

inhibitory factor) y sobre feeders (Fibroblastos). Para la obtención de cuerpos 

94
 



 

 

 

 

 

 

 

 
 

embrioides, se eliminó el medio de la placa y se levantaron las células con tripsina 

(Gibco, 25300-054) durante 5 minutos a 37 ºC. Una vez levantadas, se contaron en una 

cámara de Neubauer y se sembraron 5.000 células por cada cuerpo embrioide. Los 

cuerpos embrioides se mantuvieron en la tapa de una placa Petri, con PBS 1x en la base 

para evitar que se secaran. Los experimentos de citometría se realizaron con  7.5 × 105 

células madre y 1 cuerpo embrioide por punto. Para el cultivo de las células en 

presencia de LIF con 3-metil-adenina y ciclosporina, se eliminó el medio de la placa, se 

lavó 3 veces con PBS 1x y se añadió el medio con los inhibidores durante 6h, tras las 

cuales se levantaron las células con tripsina, se centrifugaron 5 minutos a 1.200 r.p.m. y 

se incubaron con Mitotracker Deep Red durante 10 minutos a 37 ºC. Los cuerpos 

embrioides se pusieron en suspensión con las drogas durante 6h. A continuación, se 

disociaron con tripsina, se centrifugaron 5 minutos a 1.200 r.p.m. y se incubaron con 

Mitotracker Deep Red durante 10 minutos a 37 ºC. El procesamiento posterior se realizó 

en un citómetro FC500 (Beckman Coulter) del mismo modo que las retinas. 

18. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 

El análisis de datos presentado en el siguiente trabajo se realizó con el programa 

estadístico SPSS 17.0. El análisis utilizado para comparar diferentes tratamientos fue el 

análisis T-Student ó análisis de la varianza (ANOVA) cuando las poblaciones seguían 

una distribución normal, y test no paramétricos (Mann–Whitney U-test) en el resto de 

los casos. Los datos se presentan como la media de cada población ± error estándar de 

al menos tres experimentos independientes diseñados con triplicados. Se estableció 

como significativo un p<0.05.                                           

95
 



 

 



 

 

 

 

 

RESULTADOS
 



 

 



 

 

 

 
 

 

 
 

 

 

RESULTADOS 

1. ESTUDIO DE LA AUTOFAGIA EN LA RETINA DE 
RATÓN 

Para determinar si la autofagia está activada bajo determinadas circunstancias o 

estadios de la vida del ratón, es necesario evaluar el flujo de autofagia mediante 

inhibidores lisosomales, que permite determinar los niveles de formación de 

autofagosomas en una ventana de tiempo (Klionsky et al, 2012). El diseño experimental 

llevado a cabo para determinar la autofagia en retina está representado en la figura 1.  

Figura 1. Esquema del diseño experimental empleado para estudiar el proceso de autofagia en 
retina adulta in vivo y embrionaria ex vivo. 

99
 



 

 

 

 
 

   
    

 

 

 

 

El estudio de autofagia in vivo se llevó a cabo manteniendo a ratones 

transgénicos GFP-LC3 en ayuno (y con libre acceso a agua) durante 20h tras las cuales 

se realizó una inyección intraperitoneal con leupeptina, para bloquear la degradación 

lisosomal. Como se observa en la figura 2A, 4h de leupeptina es suficiente para 

incrementar los niveles de LC3-II en retinas tanto en condiciones basales como tras la 

inducción de autofagia por ayuno, por lo que este inhibidor es capaz de atravesar la 

barrera hematorretiniana e inducir un bloqueo en la actividad lisosomal, revelando la 

existencia de autofagia basal e inducida en la retina adulta.  

Figura 2. Determinación del flujo de autofagia mediante western blot. A. 4h de leupeptina inyectada 
intraperitonealmente bloquea el flujo basal y tras deprivación de nutrientes durante 24h. B. El flujo de 
autofagia no se bloquea en cerebelo por IP de leupeptina. Se ha empleado la tubulina como control de 
carga.  

Estudios previos utilizando ratones transgénicos GFP-LC3 revelan que el ayuno 

no es capaz de inducir autofagia en otras regiones del sistema nervioso central como el 

cerebro (Iwai-Kanai et al, 2008). En la figura 2B podemos observar como efectivamente 

en cerebelo de los animales de nuestro estudio no hay inducción de autofagia por ayuno 

ni bloqueo del flujo de autofagia con leupeptina.  

Para confirmar los resultados obtenidos por western blot, se determinaron los 

niveles de LC3 por microscopía de fluorescencia. Como se observa en la figura 3, la 

leupeptina incrementa los niveles de fluorescencia de GFP-LC3 en todas las capas de la 

retina, con un fuerte incremento en la capa nuclear externa (ONL) y segmento interno 

(IS) de los fotorreceptores (Figura 4A). Además, la capa nuclear interna (INL) así como 

la capa de células ganglionares (RGC layer) también presentan un incremento de la 

fluorescencia (Figura 3 y 4B, C). El ayuno incrementa la fluorescencia en todas las 

capas de la retina y el tratamiento combinado con leupeptina incrementa aun más los 

niveles de LC3. Por lo tanto, la autofagia puede estudiarse en retina in vivo en respuesta 

al ayuno, y más importante, se puede bloquear el flujo de autofagia con tan solo 4h de 

tratamiento con leupeptina. 

100
 



 

 

 

 

 
 

 
 

   

Figura 3. La deprivación de nutrientes induce flujo de autofagia en ojos de ratones adultos 
mediante análisis de fluorescencia de GFP-LC3. Ratones transgénicos GFP-LC3 fueron deprivados de 
comida durante 24h, inyectados intraperitonealmente con leupeptina para bloquear la degradación 
lisosomal in vivo, y sacrificados 4h después.  Las secciones de los ojos de los ratones GFP-LC3 se tiñeron 
los núcleos con DAPI  y se visualizaron mediante microscopía confocal. Barra de escala 50µm. RGCs: 
células ganglionares; IPL: capa plexiforme interna; INL: capa nuclear interna; OPL: capa plexiforme 
externa; ONL: capa nuclear externa; IS: segmento interno.; RPE: epitelio pigmentario. 

101
 



 

 

 
 

  

 

 
 

   

 
 
 
 

 
  

 
 

 

 

 

 

Figura 4. Análisis de 
fluorescencia de GFP-LC3 en 
las capas individuales de la 
retina de ratón adulto. 
Magnificación de las diferentes 
capas de la retina de las 
secciones descritas en la figura 
3: A. IS y ONL. B. INL. C. 
RGCs. Las flechas indican los 
puntos de LC3. Barra de escala 
15µm. RGCs: células 
ganglionares; IPL: capa 
plexiforme interna; INL: capa 
nuclear interna; OPL: capa 
plexiforme externa; ONL: capa 
nuclear externa; IS: segmento 
externo; RPE: epitelio 
pigmentario. 

Una vez 

confirmado el estudio de 

autofagia de retina adulta 

in vivo, determinamos si el 

flujo de autofagia se puede 

observar también en 

explantes de retina 

embrionaria ex vivo, para 

comenzar el estudio 

embrionario posterior 

llevado a cabo en esta 

Tesis Doctoral. Para ello 

se utilizaron retinas de 

embriones en estadio 

E13.5 cultivadas durante 

6h en medio control o 

EBSS para inducir autofagia, en presencia o ausencia de hidroxicloroquina (HCQ) 

durante las últimas 3h del cultivo para bloquear la degradación lisosomal. Como se 

observa en la figura 5A, la inhibición con HCQ incrementa los niveles de LC3-II y el 

ayuno mediante cultivo con EBSS induce un incremento en dichos niveles, que puede 

102
 



 

 

 

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     
 

    
 

  

 

 

 

 

ser también bloqueado al inhibir la degradación lisosomal (Figura 5A). Estos datos 

muestran que la autofagia basal e inducida puede ser determinada en explantes de retina 

mediante western blot. Estos resultados fueron confirmados mediante citometría de 

flujo, donde el descenso en la fluorescencia refleja la pérdida de la misma debido al pH 

ácido tras la fusión del autofagosoma con el lisosoma, como ha sido descrito por Shvets 

et al (Shvets et al, 2008).  El cultivo con EBSS disminuye la fluorescencia de GFP-LC3, 

que puede bloquearse con HCQ (Figura 5B y C). 

Figura 5. El ayuno de aminoácidos induce flujo de autofagia en explantes de retina embrionaria. A. 
Western blot de grupos de 3 retinas por tratamiento que muestra el bloqueo del flujo de autofagia 
mediante cultivo con HCQ en condiciones basales y tras la inducción de autofagia mediante ayuno de 
aminoácidos. Se ha empleado la tubulina como control de carga. B. Histograma representativo de la 
fluorescencia de GFP unido a LC3 de retinas disociadas cultivadas en las condiciones descritas. C. 
Cuantificación de la fluorescencia de GFP-LC3 mediante citometría de flujo. Los datos representan la 
media±error estándar de al menos 8 retinas de diferentes embriones. ***p<0,001; #p<0,05.  

Además, mediante inmunofluorescencia a partir de secciones de ojos GFP-LC3 

cultivados bajo las mismas condiciones que las retinas de la figura 5, podemos observar 

que incluso en ojo completo de un embrión de E13.5, la HCQ incrementa la señal de 

GFP-LC3 en el neuroepitelio, siendo la región de las células ganglionares  la que 

presenta un mayor incremento (Figura 6). El cultivo con EBSS y EBSS en combinación 

con HCQ incrementan la fluorescencia de GFP-LC3, lo que revela la presencia de 

autofagia tanto basal e inducida y confirma los resultados obtenidos in vivo. 

103
 



 

 

 
 

    

 

 

 

 

Figura 6. El ayuno de aminoácidos incrementa la fluorescencia de LC3 en ojos embrionarios 
cultivados ex vivo. Ojos a E13.5 de ratones GFP-LC3 cultivados en condiciones control y ayuno de 
aminoácidos durante 6h en ausencia/presencia de HCQ para bloquear la actividad lisosomal. Barra de 
escala 50µm. 

2. FENOTIPO DE MUERTE CELULAR TRAS EL 
BLOQUEO DE AUTOFAGIA DURANTE EL
DESARROLLO DE LA RETINA DE RATÓN 

Estudios previos de nuestro laboratorio han determinado que la autofagia es 

funcional en etapas tempranas del desarrollo en la retina de aves y que es necesaria para 

la correcta eliminación de las células apoptóticas durante la muerte celular del 

desarrollo (Boya et al, 2008; Mellén et al, 2008). Para determinar si la autofagia es un 

proceso activo no solo en retinas de aves, se realizó un western blot a partir de retinas de 

ratón a diferentes estadios embrionarios y postnatales. Observamos un incremento de 

proteínas reguladoras de autofagia como LC3 y el complejo Atg12-Atg5 a medida que 

progresa el desarrollo (Figura 7A). Además, se observan cambios en la fosforilación de 

S6, por lo que mTOR podría regular la autofagia durante el desarrollo de la retina. Estos 

cambios pueden tener relación con el estado proliferativo de la retina, que se mantiene 

hasta P0 como se observa mediante el anticuerpo PCNA, o bien con los requerimientos 

104
 



 

 

 

    
 

  
  

 
 

   
 

  

 

nutricionales, que son detectados por mTOR (Figura 7A). A nivel de mRNA también se 

observa un incremento en la expresión de diferentes reguladores de autofagia con el 

desarrollo (Figura 7B). No obstante, el flujo de autofagia es mayor en las etapas 

iniciales del desarrollo embrionario, disminuyendo a medida que progresa la 

diferenciación, detectada con el anticuerpo β-III-tubulina (Figura 7C).  

Figura 7.  La autofagia es un proceso activo durante el desarrollo de la retina. A. Western blot de 
retinas de ratón en diferentes estadios embrionarios y postnatales en el que se observa un incremento de 
proteínas de autofagia con el desarrollo. mTOR podría estar implicado en la regulación de la autofagia en 
la fisiología de la retina, ya que se observan cambios en la fosforilación de su diana S6. La proliferación 
se ha detectado mediante anticuerpo frente a PCNA y se ha utilizado β-actina como control de carga. B. 
Expresión relativa de diferentes genes reguladores de la autofagia en diferentes estadios embrionarios y 
postnatales. C. El flujo de autofagia, detectado mediante el bloqueo de la degradación lisosomal con 
HCQ, disminuye con el desarrollo embrionario. La diferenciación neuronal se ha detectado mediante el 
anticuerpo β-III-tubulina y se ha empleado β-actina como control de carga. 

En la presente tesis doctoral he estudiado si al igual que ocurre en retinas de 

aves, la autofagia también está implicada en la eliminación de células apoptóticas 

durante la muerte celular asociada al proceso de desarrollo de la retina de ratón. El flujo 

de autofagia puede ser inhibido en retinas embrionarias de ratón en estadios tempranos 

del desarrollo (E13.5) tras cultivo de 6h con 3-MA en ausencia/presencia de HCQ 

(Figura 8A). La inhibición de autofagia con 3-MA en tales condiciones produce un 

incremento de células TUNEL y caspasa3 activa positivas en una región muy concreta, 

105
 



 

 

 

 
 

     
  

   
  

 
 

                                                                                           

 

la periferia de la retina (Figura 8B-D). En esta región se localiza el frente de 

diferenciación, que es la zona en la cual se generan neuronas recién diferenciadas a 

partir de progenitores neurales. 

Figura 8. La inhibición de autofagia incrementa la muerte celular en la región periférica de la 
retina de E13.5. A. Flujo de autofagia determinado por cultivo de retinas en E13.5 durante 6h en 
presencia/ausencia de 3-MA y HCQ. Se ha empleado GAPDH como control de carga. B. Reacción de 
TUNEL para detectar muerte celular en retinas en plano cultivadas 6h con 3-MA.  Barra de escala 
100µm. El asterisco señala el nervio óptico. C. Inmunofluorescencia de caspasa 3 activa y reacción de 
TUNEL en la región periférica de la retina. Barra de escala 50µm.  Las dos imágenes inferiores 
corresponden al aumento de las áreas señaladas en el merge. D. Cuantificación del número de células 
TUNEL positivas/mm2 en la región periférica de la retina. ***p<0,001.  

Las retinas de ratón en estas etapas del desarrollo empiezan a tener infiltración 

de células microgliales, los cuales son responsables de la fagocitosis de cuerpos 

celulares apoptóticos (Santos et al, 2008). Estos fagocitos profesionales pueden ser 

detectados específicamente mediante tinción con lectina de tomate (TL)  conjugada con 

106
 



 

 

 

 
 

 

 
 
 
 
 

   

 
 
 
 
 
 
 

 
 

 

un fluoróforo (Santos et al, 2008). Como se observa en la figura 9, muchas de las 

células apoptóticas que aparecen en la retina tras cultivo en presencia de 3-MA no se 

encuentran en el interior de células microgliales.  

Figura 9.  La inhibición de autofagia 
provoca una acumulación de células 
apoptóticas en la periferia de la retina 
que no son fagocitadas por células 
microgliales. A. Inmunofluorescencia de 
TL para detectar microglía y reacción de 
TUNEL para detectar muerte celular. 
Barra de escala 50µm.  B. Aumento de las 
regiones señaladas en A. 

Tras la fagocitosis, los cuerpos apoptóticos son degradados en el interior de 

lisosomas, que pueden ser visualizados utilizando sondas lisosomotrópicas como el 

LysoTracker (LTR) (Boya et al, 2008; Mellén et al, 2008). La inhibición farmacológica 

de autofagia reduce la cantidad de células LTR positivas así como el porcentaje de 

fagocitosis (células TUNEL-LTR/TUNEL) (Figura 10). Estos datos parecen indicar que 

las células apoptóticas que aparecen en la retina de ratón tras el bloqueo de autofagia no 

están siendo correctamente fagocitadas y por lo tanto degradadas. 

107
 



 

 

 

   

  
 

 

 

 

Figura 10. Las células apoptóticas no son degradadas en el interior de lisosomas tras el bloqueo de 
autofagia. A. Imágenes de la región periférica de retinas en E13.5 marcadas con lysotracker (LTR) y 
reacción de TUNEL. Barra de escala 50µm.  Las dos imágenes inferiores corresponden al aumento de las 
áreas señaladas en el merge. B. Cuantificación del número de células TUNEL positivas/mm2 en la región 
periférica de la retina. ***p<0,001. C. Porcentaje de fagocitosis (células TUNEL-LTR/TUNEL) en la 
periferia de la retina. ***p<0,001. 

Durante la apoptosis, la fosfatidilserina (PS) se transloca a la cara externa de la 

membrana plasmática de las células que mueren, donde es reconocida por fagocitos 

profesionales o células vecinas. Estas células fagocitan los cuerpos apoptóticos y los 

degradan en el interior de los lisosomas (Elliott & Ravichandran, 2010). Para 

determinar si como ocurre en retinas embrionarias de ave, la autofagia es necesaria para 

mantener unos niveles de ATP intracelulares suficientes para que en las células 

apoptóticas se exponga la fosfatidilserina, se realizó una tinción con anexina-V en 

presencia y ausencia de metilpiruvato (MP). El MP es un análogo permeable del 

piruvato que sirve como un sustrato alternativo para la generación de ATP mitocondrial, 

108
 



 

 

 

 

 

  
 

 

 

 
 

 

Como se puede observar en la figura 11, el metilpiruvato restaura la tinción de anexina-

V y el porcentaje de exposición de fosfatidilserina (células TUNEL-Anexina-

V/TUNEL), lo que permite la fagocitosis de las células apoptóticas.  

Figura 11. Bloqueo del reconocimiento de las células apoptóticas de la retina de ratón en E13.5 por 
disminución de la externalización de PS al inhibir autofagia que se recupera al suplementar con 
MP. A. Reacción de TUNEL en retinas montadas en plano para la detección de muerte celular tras cultivo 
con 3-MA en ausencia/presencia de MP.  Barra de escala 50µm. B. Cuantificación del número de células 
TUNEL positivas/mm2 en la región periférica de la retina.  ***p<0,001. C. Detección de PS expuesta en 
la superficie de células apoptóticas mediante tinción con Anexina-V en retinas montadas en plano. Barra 
de escala 50µm. D. Cuantificación del número de células Anexina-V positivas/mm2 en la periferia de la 
retina. **p<0,01; ***p<0,001. E. Porcentaje de exposición de PS (células TUNEL-Anexina-V/TUNEL). 
**p<0,01; ***p<0,001. 

Además, se determinaron los niveles de ATP mediante el kit comercial ATP 

Bioluminiscent Assay Kit HS II. Según se observa en la figura 12, las retinas cultivadas 

en presencia de 3-MA presentan niveles reducidos de ATP, que se recuperan al 

suplementar con MP. Por tanto, se puede concluir que la autofagia es necesaria para 

mantener unos niveles de ATP intracelulares suficientes para que en las células 

apoptóticas se exponga la fosfatidilserina, lo que permite el reconocimiento, fagocitos y 

109
 



 

 

 

  

  
     

 
 
 
 
 

 
 

 

degradación de las células apoptóticas que se generan durante el desarrollo de la retina 

embrionaria de ratón.  

Figura 12. La inhibición de autofagia disminuye los niveles de 
ATP y éstos se recuperan en presencia de MP. Determinación de 
los niveles de ATP en retinas embrionarias de E13.5 tras bloqueo de 
autofagia y en ausencia/presencia de MP. *p<0,05. 

Estudios realizados con retinas de pollo a otras edades indicaron que este 

requerimiento de la autofagia para la eliminación de cuerpos celulares no parece ser 

universal (Mellén et al, 2009). Para determinar si en otros estadios del desarrollo 

embrionario de retinas de ratón la autofagia desempeña el mismo papel, se cultivaron 

retinas de embriones en E12.5 y E18.5 en presencia de 3-MA, y se realizó una tinción 

de TUNEL y LTR. Como se observa en la figura 13, la inhibición de autofagia con 3­

MA incrementa la muerte celular en E12.5  pero no en E18.5. De igual manera, la 

inhibición de autofagia en E18.5 no altera la tinción de LTR, pero si disminuye en 

E12.5. Estos datos demuestran que la función de la autofagia en la degradación de 

células apoptóticas solo se produce en etapas tempranas del desarrollo de la retina de 

ratón. 

110
 



 

 

 
   

  
 

  
  

 
    

 

 
 

 

 

 

 

 

Figura 13. La acumulación de células apoptóticas por inhibición de autofagia se produce en la 
muerte neural temprana (E12.5-E13.5), pero no en la muerte fisiológica de retinas en E18.5. A. 
Reacción de TUNEL y marcaje con LTR de retinas en E12.5 montadas en plano. Barra de escala 100µm. 
El asterisco señala el nervio óptico. B. Cuantificación del número de células TUNEL positivas/mm2 de la 
retina de E12.5.  ***p<0,001. C. Cuantificación del número de células LTR positivas/ mm2 de la retina 
de E12.5. ***p<0,001. D. Reacción de TUNEL y marcaje con LTR de retinas en E18.5 montadas en 
plano. Barra de escala 100µm. El asterisco señala el nervio óptico. E. Cuantificación del número de 
células TUNEL positivas/mm2 de la retina de E18.5. F. Cuantificación del número de células LTR 
positivas/ mm2 de la retina de E18.5. 

Para confirmar que lo observado es un efecto dependiente de autofagia y no a 

una alteración del proceso de apoptosis durante el desarrollo de la retina, se cultivaron 

retinas en presencia de wortmanina (WM), otro inhibidor de PI3K-III (Powis et al, 

1994) y por tanto de autofagia, así como en ausencia de insulina, condición en la cual se 

produce un incremento de muerte celular al ser la insulina un factor de supervivencia 

durante el desarrollo de la retina embrionaria (Diaz et al, 1999). Ambas condiciones 

incrementan la muerte dependiente de caspasas en retinas embrionarias en E13.5 

(Figura 14). 

111
 



 

 

 
  

  
  

 

 
 

 

 

Figura 14. La inhibición de autofagia mediante wortmanina y el cultivo en ausencia de insulina 
incrementan la muerte apoptótica dependiente de caspasas. A. Inmunofluorescencia de caspasa 3 
activa y reacción de TUNEL en la región periférica de la retina. Barra de escala 50µm.  Las dos imágenes 
inferiores corresponden al aumento de las áreas señaladas en el merge. B.C. Cuantificación del número de 
células TUNEL positivas/mm2 en la región periférica de  retinas tratada con wortmanina y en deprivación 
de insulina, respectivamente.  ***p<0,001.  

Sin embargo, solo la inhibición de autofagia, y no la deprivación de insulina, 

reduce el número de células LTR positivas y el porcentaje de fagocitosis (Figura 15). La 

ausencia de insulina incrementa el marcaje con LTR siendo correcta la fagocitosis de las 

células TUNEL positivas (Figura 15 C, E). 

112
 



 

 

 

 
  

 
 

   

 

 
 

 

 

 
 
 

Figura 15. La inhibición de autofagia con wortmanina impide la degradación de las células 
apoptóticas en el interior de lisosomas. Por el contrario, las células apoptóticas producidas por 
cultivo de retinas en deprivación de insulina son degradadas en el interior de los lisosomas.  A. 
Imágenes de la región periférica de retinas en E13.5 marcadas con lysotracker (LTR) y reacción de 
TUNEL. Barra de escala 50µm.  Las dos imágenes inferiores corresponden al aumento de las áreas 
señaladas en el merge. B. C.  Cuantificación del número de células LTR positivas/mm2 en la región  
periférica de la retina. ***p<0,001. D. E.  Porcentaje de fagocitosis (células TUNEL-LTR/TUNEL) en la 
periferia de la retina. ***p<0,001. 

Además, mediante tinción con anexina-V, hemos corroborado que la inhibición 

de autofagia con wortmanina disminuye el número de células anexina-V positivas así 

como el porcentaje de exposición de PS (Figura 16A, B, D). 

113
 



 

 

 

 

  

  
     

 

 
 

  

 

Figura 16.  Bloqueo del reconocimiento de las células apoptóticas de la retina de ratón en E13.5 por 
disminución de la externalización de PS tras a inhibición de autofagia con WM. A. Reacción de 
TUNEL en retinas montadas en plano para la detección de muerte celular tras cultivo con WM y en 
ausencia de insulina.  Barra de escala 50µm. B. C.  Cuantificación del número de células Anexina-V 
positivas/mm2 en la periferia de la retina. *p<0,05; ***p<0,001. D. E. Porcentaje de exposición de PS 
(células TUNEL-Anexina-V/TUNEL). ***p<0,001. 

Por el contrario, este proceso no se ve alterado en una muerte producida por 

ausencia de factores de crecimiento, inducida en las retinas mediante deprivación de 

insulina (Figura 16A, C, E). Las diferencias obtenidas entre ambas condiciones son 

debidas a una disminución de los niveles de ATP al inhibir autofagia, hecho que no 

sucede en retinas cultivadas en ausencia de insulina (Figura 17A, B).  

114
 



 

 

 
 

  

 
 

 
 
 

 
 

 

 

 

 

 

Figura 17.  La inhibición de autofagia con WM 
disminuye los niveles de ATP, pero éstos no se 
ven alterados en el cultivo de retinas de E13.5 
en ausencia de insulina.  **p<0,01. 

A continuación, se suplementaron las retinas con MP. El MP restaura el número 

de células anexina-V positivas en retinas con autofagia inhibida por wortmanina. Sin 

embargo, el porcentaje de exposición de fosfatidilserina solo se recupera parcialmente 

(Figura 18A-C). Esto se correlaciona con la recuperación parcial de los niveles de ATP 

al suplementar con MP retinas cultivadas con WM (Figura 18D). No obstante, hay que 

destacar que en estos experimentos el suplemento con MP tiende a disminuir los niveles 

de ATP basales y el porcentaje de PS expuesta, lo que podría explicar por qué no 

recupera completamente el ATP y la exposición de PS en retinas con autofagia inhibida 

por WM. Para confirmarlo, habría que incrementar el número de retinas para estas 

mediciones, ya que se trata de experimentos preliminares.  

115
 



 

 

 
 

  
  

 
 

      
 

  

 
 

 

 

Figura 18. Recuperación parcial de los niveles de ATP y de la externalización de PS al suplementar 
con MP retinas cultivadas con WM. A. Reacción de TUNEL e inmunofluorescencia de Anexina-V en 
retinas montadas en plano para la detección de muerte celular y exposición de PS tras cultivo con WM en 
ausencia/presencia de MP. Barra de escala 50µm. B. Cuantificación del número de células Anexina-V 
positivas/mm2 en la región periférica de la retina. **p<0,01; ***p<0,001. C. Porcentaje de exposición de 
PS (células TUNEL-Anexina-V/TUNEL). *p<0,05; ***p<0,001.  D. Niveles de ATP en retinas con 
autofagia inhibida por WM en ausencia/presencia de MP. *p<0,05; ***p<0,001.   

Además, las diferencias obtenidas entre 3-MA y WM pueden ser debidas a la 

menor especificidad de la wortmanina (Cross et al, 1995), ya que hemos observado que 

su efecto como inhibidor de autofagia depende de las condiciones nutricionales del 

cultivo. En retinas cultivadas con alta dosis de insulina (insulina 160nM), la autofagia 

basal no está muy activa, siendo el flujo de LC3 menor que a baja dosis de insulina 

(10nM), cultivo sin insulina o cultivo en ayuno de aminoácidos mediante EBSS (Figura 

19, LC3-I y LC3-II).  En estas cuatro condiciones, podemos observar como la 

inhibición del flujo de LC3 por inhibición de autofagia con WM, es mayor ante un 

estrés celular por deprivación de insulina o ayuno. De hecho, en el cultivo de retinas con 

alta insulina la WM induce autofagia en vez de inhibirla (Figura 19, LC3-I y LC3-II), 

como previamente se ha descrito en la inhibición con 3-MA a tiempos largos y en 

condiciones ricas en nutrientes (Wu et al, 2010). Por otro lado, la wortmanina  también 

116
 



 

 

 
 

 
     

 
     

 
  

 

inhibe PI3K de clase I, afectando directamente a la viabilidad celular 

independientemente del proceso de autofagia.  

Figura 19. El efecto de la WM como inhibidor de autofagia depende de las condiciones 
nutricionales del cultivo. La inhibición del flujo de autofagia con WM es mayor ante un estrés celular 
por deprivación de insulina o ayuno. La WM induce autofagia en el cultivo de retinas con alta dosis de 
insulina. Además, la vía de señalización de Akt  está inhibida por WM en todas las condiciones. 

Esas diferencias tienen sus consecuencias en la muerte celular, siendo ésta 

mayor cuando se utiliza wortmanina en condiciones limitantes de nutrientes, asociado a 

una disminución de la tinción con LTR (Figura 20).  

117
 



 

 

 

   
 

 

  
 

 
 

Figura 20. La muerte celular por cultivo con WM es mayor a medida que disminuye la dosis de 
insulina y en cultivo en ayuno de aminoácidos, y está asociada inversamente a la tinción de LTR. A. 
Reacción de TUNEL en retinas montadas en plano. Barra de escala 50µm. B. Cuantificación del número 
de células TUNEL positivas/mm2 en la región periférica de  retinas tratada con wortmanina en las 
condiciones mostradas. **p<0,01;  ***p<0,001. C. Marcaje de LTR en retinas montadas en plano. Barra 
de escala 50µm. D. Cuantificación del número de células LTR positivas/mm2 en la región periférica de 
retinas tratadas con wortmanina en las condiciones mostradas. ***p<0,001. 

Además, el incremento de muerte con WM es mayor al incrementar la dosis del 

inhibidor (Figura 21A, B), mientras que la disminución de la tinción con LTR solo 

ocurre a la dosis más elevada (Figura 21C, D). Por ello, es posible que la acumulación 

de células apoptóticas por inhibición de autofagia con WM que no se rescata al 

118
 



 

 

 

 

 
 

 
  

  
    

 
 

 
  

 

 

 

suplementar con MP, sea debido a un incremento de muerte celular por inhibición de 

vías de supervivencia como PI3K-I/Akt. 

Figura 21. Incremento de muerte celular dosis dependiente en retinas cultivadas con WM. La 
disminución de LTR solo ocurre a la mayor dosis probada. A. Reacción de TUNEL en retinas 
montadas en plano cultivadas con concentraciones crecientes de WM. Barra de escala 50µm. B. 
Cuantificación del número de células TUNEL positivas/mm2 en la región periférica de  retinas tratadas 
con diferentes concentraciones de wortmanina. *p<0,05;  ***p<0,001. C. Marcaje de LTR en retinas 
montadas en plano cultivadas con concentraciones crecientes de WM. Barra de escala 50µm. D. 
Cuantificación del número de células LTR positivas/mm2 en la región periférica de  retinas tratadas con 
diferentes concentraciones de wortmanina. **p<0,01. 

El incremento de muerte celular por inhibición de PI3K-I de comprobó mediante 

cultivo de retinas en presencia de LY294002 (Vlahos et al, 1994) (Figura 22A, B). En 

este caso, el porcentaje de exposición de PS no está alterado, por lo que las células 

TUNEL positivas son debidas a un incremento en muerte celular y no a un bloqueo de 

la fagocitosis (Figura 22C, D). 

Con estos datos podemos concluir que observamos tres situaciones diferentes en 

cuanto a muerte celular. En primera lugar, la inhibición de autofagia con 3-MA produce 

un bloqueo en la degradación de las células que mueren de manera fisiológica durante el 

desarrollo de la retina embrionaria de ratón específicamente en el frente de 

119
 



 

 

 

 

 
 

 
 

  
  

  

 
 

 

 

diferenciación. En segundo lugar, el cultivo de retinas en ausencia de factores de 

supervivencia, como la insulina, o en presencia de inhibidores de PI3K-I (LY), 

incrementa la muerte celular por toda la retina, sin estar afectada la fagocitosis de las 

células apoptóticas. Y por último, el cultivo de retinas con WM produce un incremento 

de muerte que refleja ambas situaciones: el incremento de muerte celular general por 

bloqueo de PI3K-I, así como un aumento de células apoptóticas en el frente de 

diferenciación por bloqueo de su reconocimiento y degradación lisosomal por autofagia.  

Figura 22. La muerte celular producida por inhibición de PI3K de clase I no se debe a una 
acumulación de células apoptóticas por alteración en la exposición de PS. A. Reacción de TUNEL en 
retinas de E13.5 montadas en plano. B. Cuantificación del número de células TUNEL positivas/mm2 en la 
región periférica de retinas tratadas con LY. *p<0,05. C. Inmunofluorescencia de Anexina-V en retinas 
montadas en plano para la detección de exposición de PS tras cultivo con LY.  Barra de escala 50µm. D. 
Porcentaje de exposición de PS (células TUNEL-Anexina-V/TUNEL) en retinas cultivadas con LY.  

A continuación se estudió el proceso de fagocitosis de células apoptóticas en 

retinas deficientes de dos reguladores de autofagia, Ambra1 y Atg5. El  fenotipo de 

Ambra1  se caracteriza a nivel celular por un incremento de la apoptosis en el tubo 

neural a partir de E9, en regiones en las que se produce la muerte asociada al desarrollo 

(Fimia et al, 2007). Por tanto Ambra1 parece tener un papel citoprotector durante el 

desarrollo del sistema nervioso. Retinas deficientes de Ambra1 presentan un incremento 

de muerte celular así como una disminución del porcentaje de exposición de PS in vitro 

(Figura 23A-D).  

120
 



 

 

 
 
 
 

 
 

  

  
 

     

 
  

 

 

Figura 23. Retinas 
deficientes de 
Ambra1 presentan 
un incremento de la 
muerte celular y 
reducción de la 
exposición de PS en 
cultivo. A. Reacción 
de TUNEL en 
retinas deficientes de 
Ambra1. B. 
Cuantificación del 
número de células 

TUNEL 
positivas/mm2 en la 
región periférica de 
retinas deficientes de 

Ambra1. ***p<0,001. C. Inmunofluorescencia de Anexina-V en retinas deficientes de Ambra1 montadas 
en plano PS tras cultivo.  Barra de escala 50µm. D. Porcentaje de exposición de PS (células TUNEL­
Anexina-V/TUNEL) en retinas deficientes de Ambra1 tras el cultivo.   

El incremento en muerte celular por inhibición genética de autofagia también  es 

una característica de retinas deficientes en Atg5 en E13.5, que presentan a su vez una 

disminución de los niveles de ATP (Figura 24A-C). Además, datos preliminares 

muestran que muchas de las células apoptóticas no se encuentran en el interior de 

células microgliales, pero el suplemento con MP en retinas Atg5-/- restaura parcialmente 

la muerte celular en el frente de diferenciación (Figura 24D). Todos estos datos 

obtenidos por inhibición genética de autofagia confirman los resultados de la inhibición 

farmacológica de autofagia. No obstante, es posible que además de estar afectado el 

reconocimiento de las células apoptóticas tras la inhibición genética de autofagia, otros 

procesos estén alterados, como la degradación lisosomal en el interior de las células 

microgliales. Se necesitan experimentos adicionales para corroborar esta hipótesis.   

121
 



 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

  
  

    
   

 

 
 

 

 

Figura 24. Retinas deficientes de Atg5 presentan un incremento de muerte celular y un déficit 
energético.  A. Reacción de TUNEL en retinas deficientes de Atg5 montadas en plano. Barra de escala 
50µm. B. Cuantificación del número de células TUNEL positivas/mm2 en la región periférica de  retinas 
deficientes de Atg5. *p<0,05. C. Niveles de ATP en retinas deficientes de Atg5. *p<0,05. D. Reacción de 
TUNEL e inmunofluorescencia de TL para el marcaje de microglía en retinas deficientes de Atg5 tras 
cultivo en ausencia/presencia de MP. Barra de escala 50µm. 

3. FENOTIPO DE MUERTE CELULAR TRAS LA 
INDUCCIÓN DE AUTOFAGIA DURANTE EL 
DESARROLLO DE LA RETINA DE RATÓN 

Una vez determinadas las consecuencias de la inhibición de autofagia en 

relación a la muerte celular, decidimos estudiar en detalle qué ocurre cuando se induce 

autofagia en retinas embrionarias de estadios tempranos, ya que como previamente 

hemos visto, el ayuno mediante cultivo en EBSS incrementa la muerte celular (ver 

figura 20). Como se observa en la figura 25A, la inducción de autofagia con EBSS 

incrementa la muerte celular siguiendo un patrón centro-periférico. Dicha muerte 

celular es dependiente de la activación de caspasas y se revierte con BOC, un inhibidor 

general de caspasas (Figura 25 B-D). 

122
 



 

 

 
 

 
 
 
 
 

 

  
  

  
 

 

 

  

  

 
 

 
 
 
 
 
 

 
 

 

 

 

 

 

Figura 25. El cultivo de 
retinas de E13.5 en ayuno 
de aminoácidos 
incrementa la muerte 
celular dependiente de 
caspasas. A. Imágenes de 
retina completa donde se 
muestra la reacción de 
TUNEL para la detección 
de muerte celular. Barra de 
escala 100µm. El asterisco 
señala el nervio óptico. B. 
Inmunofluorescencia de 
caspasa 3 activa y reacción 
de TUNEL en retinas 
montadas en plano tras 
cultivo en EBSS en 
ausencia/presencia de 
BOC. Barra de escala 
50µm. C. D. 
Cuantificación del número 
de células TUNEL 
positivas/mm2 y caspasa3a 
positivas/mm2 en B, 
respectivamente. *p<0,05; 
***p<0,001. 

Interesantemente, la muerte celular con EBSS también se revierte por inhibición 

aguda de autofagia con 3-MA (Figura 26 A-C). Sin embargo, la inhibición crónica de 

autofagia en retinas deficientes de Atg5 cultivadas en EBSS, produce un incremento 

mayor de la muerte celular, de acuerdo con el papel citoprotector de la autofagia durante 

el ayuno (Boya et al, 2005)  (Figura 26 D, E). 

123
 



 

 

 

 
    

  
 

     

 
 

 

 

 

Figura 26. El cultivo de retinas de E13.5 en ayuno de aminoácidos incrementa la muerte celular 
dependiente de autofagia. A. Flujo de autofagia determinado por cultivo de retinas en E13.5 durante 6h 
en presencia/ausencia de EBSS, 3-MA y HCQ. Se ha empleado GAPDH como control de carga. B. D. 
Reacción de TUNEL en retinas montadas en plano tras cultivo con EBSS en ausencia/presencia de 3-MA 
y en retinas deficientes de Atg5, respectivamente. Barra de escala 50µm. C. E. Cuantificación del 
número de células TUNEL positivas/mm2 en B y D, respectivamente. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. 

Para corroborar estos resultados, se estudió la inducción de autofagia mediante 

tratamiento con rapamicina. De nuevo se observa un incremento de muerte celular 

dependiente de caspasas que se revierte con BOC (Figura 27A-D) y 3-MA (Figura 28A­

C). Al contrario que en la muerte inducida por EBSS, retinas deficientes de Atg5 no 

presentan el incremento de muerte celular por tratamiento con rapamicina en retinas 

wildtype (Figura 28 D, E). 

124
 



 

 

 
 

 

 

 
 

 
 

 

 

 
 

 
 

 

 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Figura 27. El cultivo de 
retinas de E13.5 con 
rapamicina incrementa la 
muerte celular 
dependiente de caspasas. 
A. Imágenes de retina 
completa donde se muestra 
la reacción de TUNEL para 
la detección de muerte 
celular. Barra de escala 
100µm. El asterisco señala 
el nervio óptico. B. 
Inmunofluorescencia de 
caspasa 3 activa y reacción 
de TUNEL en retinas 
montadas en plano tras 
cultivo con rapamicina en 
ausencia/presencia de BOC. 
Barra de escala 50µm.  C. 
D. Cuantificación del 
número de células TUNEL 
positivas/mm2 y caspasa3a 
positivas/mm2 en B, 
respectivamente. *p<0,05; 
**p<0,01; ***p<0,001. 

125
 



 

 

 
 
 

  
  

  
     

 
 

  

 
 

Figura 28. El cultivo de retinas de E13.5 con rapamicina incrementa la muerte celular dependiente 
de autofagia. A. Flujo de autofagia determinado por cultivo de retinas en E13.5 durante 6h en 
presencia/ausencia de rapamicina, 3-MA y HCQ. Se ha empleado GAPDH como control de carga. B. D. 
Reacción de TUNEL en retinas montadas en plano tras cultivo con rapamicina en ausencia/presencia de 
3-MA y en retinas deficientes de Atg5, respectivamente. Barra de escala 50µm.  C. E. Cuantificación del 
número de células TUNEL positivas/mm2 en B y D, respectivamente. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. 

De igual manera, se observa un incremento de muerte celular dependiente de 

caspasas y autofagia al utilizar el inhibidor de mTOR AZD8055 (AZD) (Schenone et al, 

2011), que se bloquea al inhibir con BOC y 3-MA  (Figuras 29 A-D, 30 A, B).  

126
 



 

 

 
  

 
 
 
 
 

 
 

 
 
  
 

 
 

 

 

 
 
 
 
 
 

 

 

 
 

   

 

Figura 29. El cultivo de 
retinas de E13.5 con 
AZD incrementa la 
muerte celular 
dependiente de caspasas. 
A. Imágenes de retina 
completa donde se 
muestra la reacción de 
TUNEL para la detección 
de muerte celular. Barra 
de escala 100µm. El 
asterisco señala el nervio 
óptico. B. 
Inmunofluorescencia de 
caspasa 3 activa y 
reacción de TUNEL en 
retinas montadas en plano 
tras cultivo con AZD en 
ausencia/presencia de 
BOC. Barra de escala 
50µm. C. D. 
Cuantificación del 
número de células 
TUNEL positivas/mm2 y 
caspasa3a positivas/mm2 

en B, respectivamente. 
*p<0,05; ***p<0,001. 

Figura 30. El cultivo de retinas de E13.5 con AZD incrementa la muerte celular dependiente de 
autofagia. A. Reacción de TUNEL en retinas montadas en plano tras cultivo con AZD en 
ausencia/presencia de 3-MA. Barra de escala 50µm. B. Cuantificación del número de células TUNEL 
positivas/mm2 en A. *p<0,05; ***p<0,001. 

127
 



 

 

  

 
 

 

 
 
 
 

 
 

 

 
 

 
  

 
 
 
 

En estas tres condiciones de muerte inducida por activación de autofagia  no se 

han detectado diferencias en el porcentaje de muerte por apoptosis (% TUNEL­

Caspasa3a/TUNEL), lo que sugiere que la inducción de autofagia tiene una función 

proapoptótica (Figura 31). 

Figura 31. Porcentaje de muerte por apoptosis (células 
TUNEL-Caspasa3a/TUNEL) tras la inducción de autofagia 
con EBSS, rapamicina y AZD.  

Además, y al contrario de lo que cabría esperar, los niveles de ATP disminuyen 

drásticamente al inducir autofagia (Figura 32), pero en este caso el suplemento con MP 

no solo no revierte la muerte celular por inducción de autofagia, sino que la incrementa 

aun más (Figura 33 A-D). Estos datos sugieren que una disminución drástica de los 

niveles de ATP es consecuencia de un incremento de muerte celular, y que el MP puede 

no estar metabolizándose correctamente cuando se induce autofagia, lo que incrementa 

aun más la muerte celular.  

Figura 32. La inducción de autofagia con EBSS y rapamicina 
disminuye los niveles de ATP. ***p<0,001. 

128
 



 

 

 

 
 

  
  

 

 
 

 

Figura 33. El suplemento con MP incrementa la muerte producida por inducción de autofagia con 
EBSS y rapamicina. A. C. Reacción de TUNEL en retinas montadas en plano tras tratamiento con EBSS 
y rapamicina, respectivamente, en ausencia/presencia de MP. La imagen superior (barra de escala 100µm) 
corresponde a la retina completa y la inferior (barra de escala 50µm) a la región periférica en ambos 
casos. El asterisco señala el nervio óptico. B. D. Cuantificación del número de células TUNEL 
positivas/mm2 en la región periférica de retinas tratadas como se ha descrito en A y C.  *p<0,05; 
***p<0,001. 

Como he mencionado previamente, la deficiencia de autofagia produce una 

acumulación de células apoptóticas únicamente en la periferia de la retina (ver figura 

8B) como consecuencia de una disminución de ATP, lo que sugiere que la autofagia 

aporta metabolitos para la obtención de energía mediante TCA en dicha región. Por el 

contrario, la inducción de autofagia incrementa la muerte celular siguiendo un patrón 

centro-periférico (ver figuras 25, 27 y 29) y en este caso, el suplemento con MP no solo 

no es capaz de disminuir la muerte producida al inducir autofagia, si no que  la 

incrementa (ver figura 33 A-D). Estos datos nos llevaron a plantear si había una 

129
 



 

 

 

 

 
 

   

 
 

 

 

 

distribución diferencial de la masa mitocondrial, orgánulos donde el MP es incorporado, 

y si la inducción de autofagia en estos estadios estaba induciendo mitofagia y eso 

impedía que el MP fuera metabolizado.  

Para ello, determinamos la distribución de la masa mitocondrial mediante 

inmunofluorescencia utilizando anticuerpos frente a proteínas mitocondriales, 

TOMM20 y COX-IV. Podemos observar que hay una mayor masa mitocondrial en la 

región periférica de la retina de E13.5 (Figura 34 A, B).  

Figura 34. Distribución diferencial de la masa mitocondrial en retinas de E13.5. A. Imágenes de 
retina completa tras inmunotinción con anticuerpos frente a las proteínas mitocondriales TOMM20 y 
COX-IV. Barra de escala 100µm. El asterisco señala el nervio óptico.  B. Imágenes de la inmunotinción 
para TOMM20 y COX-IV de las áreas marcadas en A. Barra de escala 50µm. 

Además, la inhibición específica de mitofagia con CsA (Kim et al, 2007) 

(Carreira et al, 2010; Mauro-Lizcano et al, 2015) y de autofagia con 3-MA, incrementa 

ligeramente la masa mitocondrial en la región central de la retina (Figura 35A), pero no 

en la periferia (Figura 35B). Estos datos indican que la autofagia degrada mitocondrias 

en la región central de la retina de E13.5. En este estadio de desarrollo, se produce un 

proceso de muerte neural temprana, localizada fundamentalmente en la retina central 

(Boya & de la Rosa, 2005). Para determinar si la mitofagia contribuye a dicho proceso 

de muerte, se realizó una tinción de TUNEL en presencia de CsA y 3-MA. Como se 

observa en la figura 35, la inhibición de mitofagia y autofagia reduce la muerte en la 

región central de la retina (A, C), sugiriendo la implicación de la mitofagia en la muerte 

neural temprana.  

130
 



 

 

 
 
 
 

 
 

 

  
   

  

 
 

 

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 35.  Degradación 
mitocondrial por 
mitofagia y su 
implicación en la muerte 
neural temprana en la 
región central de retinas 
de E13.5. A. B. Imágenes 
de la inmunotinción para 
la detección de TOMM20 
y reacción de TUNEL en 
la región central y 

periférica 
(respectivamente) de la 
retina tras cultivo con 
CsA y 3-MA. Barra de 
escala 50µm. C. 
Cuantificación del 
número de células 
TUNEL positivas/mm2 en 
las regiones indicadas de 
retinas tratadas con CsA y 
3-MA.  *p<0,05; 
**p<0,01. 

No obstante, la inhibición de caspasas bloquea la muerte general de la retina sin 

alterar la masa mitocondrial (Figura 36). 

131
 



 

 

 

  
 

  
    

 
 

 

 
 

Figura 36. La inhibición de caspasas con BOC disminuye la muerte general de la retina sin alterar 
la masa mitocondrial. A. Imágenes de retina completa tras la reacción de TUNEL e inmunotinción de 
TOMM20 en retinas montadas en plano. Barra de escala 100µm. El asterisco señala el nervio óptico.   B. 
Cuantificación del número de células TUNEL positivas/mm2 en las regiones indicadas de  retinas tratadas 
con BOC. *p<0,05; ***p<0,001. 

Por otro lado, la inducción de autofagia con rapamicina y EBSS disminuye la 

tinción de TOMM20 en retinas de E13.5 montadas en plano. En este caso, tanto CsA 

como 3-MA incrementan la masa mitocondrial en toda la retina (Figuras 37A y 38A). 

Para corroborar si esa disminución de mitocondrias en la región central de la retina así 

como tras la inducción de autofagia es debida a mitofagia, se llevó acabo el estudio de 

mitofagia mediante citometría de flujo, utilizando la sonda mitotracker deep red  en 

combinación con inhibidores de autofagia y mitofagia según hemos descrito 

previamente en el laboratorio (Mauro-Lizcano et al, 2015). A pesar de las diferencias 

regionales observadas en retinas en plano, no se han detectado diferencias de masa 

mitocondrial a nivel basal en retina completa mediante citometría de flujo (Figuras 37 

B-E y 38 B-E). Sin embargo, los tratamientos con rapamicina, AZD y EBSS 

disminuyen la masa mitocondrial de toda la retina, siendo un proceso dependiente de 

inducción de autofagia ya que se revierte con 3-MA. Además, observamos un 

incremento de la masa mitocondrial mediante tratamiento con CsA tras la inducción de 

autofagia, lo que demuestra que la inducción de autofagia está induciendo mitofagia en 

retinas de E13.5 (Figuras 37 y 38).  

132
 



 

 

 

 
    

    
  

  
  

 

Figura 37. La inducción de autofagia con rapamicina y AZD disminuye la masa mitocondrial por 
inducción de mitofagia. A. Inmunotinción de TOMM20 en retinas montadas en plano tras cultivo con 
rapamicina, en ausencia y presencia de CsA y 3-MA. Barra de escala 50µm. B. D. Determinación del 
porcentaje de masa mitocondrial en las condiciones descritas mediante citometría de flujo utilizando la 
sonda Mitotracker Deep Red. C. E. Histogramas representativos de los datos de citometría en B y D, 
respectivamente. F. Disminución de la masa mitocondrial dependiente de mitofagia tras inducción de 
autofagia con AZD determinado mediante citometría de flujo. *p<0,05; **p<0,01. 

133
 



 

 

 

   
    

  
  

 
 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 

Figura 38. La inducción de autofagia con EBSS disminuye la masa mitocondrial por inducción de 
mitofagia. A. Inmunotinción de TOMM20 en retinas montadas en plano tras cultivo con EBSS, en 
ausencia y presencia de CsA y 3-MA. Barra de escala 50µm. B. D. Determinación del porcentaje de masa 
mitocondrial en las condiciones descritas mediante citometría de flujo utilizando la sonda Mitotracker 
Deep Red. C. E. Histogramas representativos de los datos de citometría en B y D, respectivamente. 
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. 

A continuación se determinó si la muerte producida por inducción de autofagia 

era consecuencia de la inducción de mitofagia. Como se observa en la figura 39, al igual 

que la inhibición de autofagia (ver figuras 26, 28 y 30), la inhibición de mitofagia con 

CsA disminuye la muerte producida por inducción de autofagia con rapamicina en toda 

la retina, lo que refleja de nuevo la contribución del proceso de mitofagia en la muerte 

celular. 

134
 



 

 

 

 
 

 

 

 

 

 
  

  

 
 

 
 
 

  
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 

 

 

 
 

Figura 39. La muerte 
celular por inducción de 
autofagia con rapamicina en 
E13.5 se bloquea al inhibir 
mitofagia con CsA. A. 
Imágenes de retina completa 
donde se muestra la reacción 
de TUNEL e inmunotinción 
de TOMM20 en retinas 
montadas en plano tras cultivo 
con rapamicina. Barra de 
escala 100µm. El asterisco 
señala el nervio óptico. B. 
Imágenes de las regiones 
central y periférica de retinas 
montadas en plano tras la 
reacción de TUNEL. Barra de 
escala 50µm.  C. 
Cuantificación del número de 
células TUNEL positivas/mm2 

en las regiones indicadas de 
retinas tratadas con rapa en 
ausencia/presencia de CsA. 
*p<0,05; ***p<0,001. 

En el caso de la muerte inducida por EBSS, solo se bloquea al inhibir mitofagia 

en la zona central de la retina, lo que refleja que el ayuno provoca muerte también por 

mecanismos independientes de mitofagia (Figura 40). 

135
 



 

 

 
 

 
 
 

 
 
 

  
   

 

 

  
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
  

 

 

 

 

 

Figura 40. La muerte celular 
por inducción de autofagia con 
EBSS en E13.5 se bloquea al 
inhibir mitofagia con CsA. A. 
Imágenes de las regiones central 
y periférica de retinas montadas 
en plano donde se muestra la 
reacción de TUNEL en retinas 
cultivadas con EBSS en 
ausencia/presencia de CsA. Barra 
de escala 50µm.  B. 
Cuantificación del número de 
células TUNEL positivas/mm2 en 
las regiones indicadas de  retinas 
tratadas con EBSS en 
ausencia/presencia de CsA. 
***p<0,001. 

Para corroborar la inducción de mitofagia en este estadio de la retina y su 

implicación en la muerte celular, se realizó el mismo abordaje anterior con un 

tratamiento inductor  específico de mitofagia, la combinación de antimicina y 

oligomicina (AO) (Ashrafi & Schwarz, 2013; Ding & Yin, 2012; Narendra et al, 2010; 

Youle & van der Bliek, 2012). De nuevo se observa una disminución de la tinción de 

TOMM20 tras cultivo con AO en retinas en plano de E13.5, así como de mitotracker 

por citometría de flujo, que se bloquea en presencia de CsA y 3-MA (Figura 41 A-C). 

Sin embargo, la inducción específica de mitofagia no incrementa la muerte celular, y de 

hecho, la disminuye en la región central (Figura 41 D, E). Esto podría ser debido a la 

inhibición de la señal inductora de muerte celular, ya que como he mencionado 

anteriormente, hay mitofagia basal que produce muerte celular en la región central de 

retinas en E13.5 (Ver figura 35).  

136
 



 

 

 

   
    

  
  

  
 

 

 
 
 
 
 

 

Figura 41. Inducción de mitofagia en retinas de E13.5 tras cultivo con Antimicina+Oligomicina 
(AO). A. Inmunotinción de TOMM20 en retinas montadas en plano tras cultivo con AO, en ausencia y 
presencia de CsA y 3-MA. Barra de escala 50µm. B. Determinación del porcentaje de masa mitocondrial 
en las condiciones descritas mediante citometría de flujo utilizando la sonda Mitotracker Deep Red. 
*p<0,05. C. Histograma representativo de los datos de citometría en B. D. Reacción de TUNEL en retinas 
montadas en plano tras cultivo con AO, en ausencia y presencia de CsA y 3-MA. Barra de escala 50µm. 
E. Cuantificación del número de células TUNEL positivas/mm2 en las regiones indicadas de  retinas 
tratadas como se ha descrito**p<0,01. 

137
 



 

 

 
 

 

 

  
 

    
 

  
  

4. MITOFAGIA DURANTE EL DESARROLLO DE LA 
RETINA Y SU RELACIÓN CON EL METABOLISMO,
LA DIFERENCIACIÓN Y LA MUERTE CELULAR 

4.1 Mitofagia y metabolismo 

Una vez confirmado que podemos modular la mitofagia a partir de cultivos 

organotípicos de retina embrionaria, decidimos estudiar este proceso a lo largo de todo 

el desarrollo de la retina. En primer lugar determinamos los niveles de masa 

mitocondrial en diferentes estadios embrionarios. En la figura 42 se observa tanto por 

inmunotinción de TOMM20 en retinas en plano (A, B) como por citometría de flujo (C, 

D), una disminución de la masa mitocondrial in vivo a medida que progresa el 

desarrollo de la retina. Este resultado se ha corroborado mediante western blot a 

distintas edades embrionarias para la detección de diferentes proteínas mitocondriales, 

observándose una disminución de la masa mitocondrial a partir de E15.5 (Figura 42 E). 

Además, retinas de E18.5 presentan menores niveles de ATP que retinas de E13.5 

(Figura 42 F).  

Figura 42. Disminución de la masa mitocondrial durante el desarrollo embrionario de la retina in 
vivo. A. Inmunofluorescencia de la proteína mitocondrial TOMM20 en retinas in vivo montadas en plano. 
Barra de escala 50µm. B. Área cubierta por la masa mitocondrial detectada en A. ***p<0,001. C. 
Determinación del porcentaje de masa mitocondrial en retinas de E13.5, E15.5 y E18.5 in vivo mediante 
citometría de flujo utilizando la sonda Mitotracker Deep Red. **p<0,01; ***p<0,001. D. Histograma 
representativo de los datos de citometría en C. E. Western blot de proteínas mitocondriales a partir de 
extractos de proteína de grupos de 3 retinas para cada una de las edades indicadas. F. Niveles de ATP en 
retinas de E13.5 y E18.5. *p<0,05. 

138
 



 

 

 
 

 

 

  
   

  
   

  
  

  

 
 
 

Ese descenso de masa mitocondrial es dependiente de autofagia, ya que retinas 

in vivo de embriones deficientes de Atg5 presentan mayor marcaje de TOMM20 (Figura 

43 A, B) y de masa mitocondrial determinada por citometría de flujo (Figura 43 C, D) 

en E15.5 y E18.5. La inhibición de autofagia con 3-MA también incrementa la masa 

mitocondrial en los mismos estadios que en el modelo genético. Sin embargo, la 

inhibición específica de mitofagia mediante CsA evita el descenso de masa mitocondrial 

a E15.5 pero no a E18.5, lo que sugiere que la degradación selectiva de mitocondrias 

únicamente tiene lugar en E15.5 (Figura 44).  

Figura 43. El descenso de masa mitocondrial durante el desarrollo embrionario de la retina está 
mediado por autofagia. A. Inmunofluorescencia de la proteína mitocondrial TOMM20 en retinas 
deficientes de Atg5 in vivo montadas en plano. Barra de escala 50µm. B. Área cubierta por la masa 
mitocondrial detectada en A. ***p<0,001. C. Determinación del porcentaje de masa mitocondrial en 
retinas Atg5+/+ y Atg5-/- de E13.5, E15.5 y E18.5 in vivo mediante citometría de flujo utilizando la sonda 
Mitotracker Deep Red. *p<0,05; **p<0,01. D. Histogramas representativos de los datos de citometría en 
C. 

139
 



 

 

 
  

    
 

 
 

 

 

 

 

 

Figura 44. El descenso de masa mitocondrial durante el desarrollo embrionario de la retina está 
mediado por mitofagia. A. Inmunofluorescencia de la proteína mitocondrial TOMM20 en retinas de 
E13.5, E15.5 y E18.5 montadas en plano tras cultivo con CsA y 3-MA. Barra de escala 50µm. B. Área 
cubierta por la masa mitocondrial detectada en A. ***p<0,001. C. Determinación del porcentaje de masa 
mitocondrial en retinas de E13.5, E15.5 y E18.5 montadas en plano tras cultivo con CsA y 3-MA 
mediante citometría de flujo utilizando la sonda Mitotracker Deep Red. *p<0,05; **p<0,01. D. 
Histogramas representativos de los datos de citometría en C. 

Esta observación ha sido confirmada en todas las edades del desarrollo 

embrionario de la retina desde E12.5 hasta E18.5 (Figura 45A), así como mediante 

western blot (Figura 45 B) e inmunotinción (Figura 45 C, D) de la proteína mitocondrial 

COX4/1 en retinas de E15.5. Además, el cultivo simultáneo con 3-MA y CsA no 

incrementa la masa mitocondrial más de lo que lo incrementan por sí solos cada uno de 

los inhibidores, reflejando que están en la misma vía (Figura 45 E), a pesar de que solo 

3-MA inhibe el flujo de autofagia (Figura 45 F). De igual modo, retinas deficientes de 

Atg5 cultivadas en presencia de 3-MA no presentan un incremento mayor de masa 

mitocondrial, por lo que la degradación selectiva de mitocondrias en E15.5 está mediada 

por una autofagia dependiente de Atg5 (Figura 45 G, H). 

140
 



 

 

 

 

 

 
 

  
  

     
 

  
 

 

 
 

Figura 45. La degradación selectiva de mitocondrias durante el desarrollo de la retina tiene lugar 
en E15.5 y está mediada por autofagia dependiente de Atg5.  A. Determinación del porcentaje de 
masa mitocondrial a lo largo de todo el desarrollo embrionario con retinas cultivadas con CsA y 3-MA 
mediante citometría de flujo utilizando la sonda Mitotracker Deep Red. *p<0,05; **p<0,01. B. Western 
blot de retinas en E15.5 tratadas con CsA y 3-MA de la proteína mitocondrial COX4/1. C. D. 
Inmunofluorescencia de la proteína mitocondrial COX-IV en retinas tratadas con CsA y 3-MA y en 
retinas deficientes de Atg5 in vivo montadas en plano, respectivamente. Barra de escala 50µm. E. 
Determinación del porcentaje de masa mitocondrial en retinas de E15.5 cultivadas con 3-MA, CsA y 
tratamiento combinado de 3-MA+CsA mediante citometría de flujo utilizando la sonda Mitotracker Deep 
Red. **p<0,01. F. Western blot para la detección del flujo de autofagia al bloquear la degradación 
lisosomal con HCQ en retinas cultivadas con 3-MA y CsA. G. Determinación del porcentaje de masa 
mitocondrial en retinas deficientes de Atg5 cultivadas en ausencia/presencia de 3-MA. H. Histograma 
representativo de los datos de citometría en G. 

La homeostasis mitocondrial se regula por una fina coordinación entre los 

procesos de fusión, fisión, biogénesis mitocondrial y mitofagia (Chen & Chan, 2005; 

Hock & Kralli, 2009; Palikaras et al, 2015). El estudio de la expresión génica mediante 

transcriptómica muestra que no hay cambios en la expresión Tfam y Nfe2l1, aunque sí 

una ligera disminución en la expresión de  Ppargc1α en E14.5, por lo que no hay 

cambios drásticos de la biogénesis mitocondrial durante el desarrollo embrionario de la 

retina (Figura 46A). Por otro lado,  si se observa una bajada de la expresión de 

141
 



 

 

 

 
  

  
 

 

 
 

 

 

 

Mitofusina 2  (Mtf2) en E15.5 (Figura 46B), que podría favorecer la pérdida de una 

estructura mitocondrial alargada y la mitofagia (Gomes et al, 2011). Estos datos han 

sido confirmados mediante RT-PCR de Ppargc1α y Tfam, lo que destaca el papel de la 

mitofagia como proceso implicado en la homeostasis mitocondrial en dichos estadios 

(Figura 46C).  

Figura 46. La disminución de masa mitocondrial durante el desarrollo de la retina no es debida a 
una disminución de la biogénesis mitocondrial. A. Expresión de mRNA de genes reguladores de 
biogénesis mitocondrial mediante transcriptómica a partir de RNAs de retinas en los estadios mostrados. 
B. Expresión de mRNA de Mitofusinas 1 y 2 mediante transcriptómica a partir de RNAs de retinas en los 
estadios mostrados. C. Expresión relativa de mRNA de los genes Ppargc1α y Tfam determinados 
mediante RT-PCR. 

En un estudio en colaboración con el grupo de Marcos Malumbres (CNIO), 

hemos demostrado que la mitofagia es necesaria para un cambio metabólico hacia 

glicólisis durante el arresto mitótico (Domenech et al, 2015; Esteban-Martinez et al, 

2015). Debido a que la mitofagia degrada mitocondrias durante el desarrollo de la 

retina, decidimos estudiar si este proceso tenía una relación con un cambio metabólico 

durante la fisiología de la retina, para lo que se realizó espectometría de masas de 

retinas en distintos estadios. En la figura 47A, se observa un incremento de metabolitos 

de la glicólisis posterior al pico de mitofagia descrito en E15.5. Además, se realizó un 

análisis de la actividad glicolítica mediante la determinación de la acidificación del 

medio extracelular (ECAR, de extracellular acidification rate) por incremento en la 

producción de lactato mediante seahorse. Durante el desarrollo de la retina, se produce 

142
 



 

 

 

 

 

 

un incremento de ECAR en retinas de E15.5 (Figura 47B) que se bloquea en presencia 

de CsA y 3-MA (Figura 47C), así como en retinas deficientes de Atg5 (Figura 47D), por 

lo que la mitofagia parece ser responsable del incremento en glicólisis. Para determinar 

si también se producen cambios a nivel de expresión génica, se realizó un estudio 

transcriptómico de retinas procedentes de embriones de ratón de distintos estadios. 

Como se observa en la figura 47E, F, hay un incremento en la expresión de enzimas 

glicolíticas a partir del pico de mitofagia de E15.5.  Además, la mitofagia está implicada 

en ese incremento de expresión génica, ya que la inhibición de mitofagia con CsA y de 

autofagia con 3-MA disminuye la expresión de varias enzimas reguladoras de glicólisis 

(Figura 47G). Estos datos muestran que la mitofagia es responsable de un cambio 

metabólico hacia glicólisis durante el desarrollo de la retina de ratón.  

143
 



 

 

 
 

   

 

 
 

  

Figura 47. Cambio metabólico hacia glicólisis dependiente de mitofagia durante el desarrollo de la 
retina de ratón.  A. Análisis de glicólisis mediante espectrometría de masas a partir grupos de retinas de 
las edades indicadas. B. Determinación de la acidificación del medio extracelular (ECAR) en retinas de 
E13.5, E15.5 y P0 in vivo mediante seahorse.  *p<0,05; **p<0,01. C. Determinación de la acidificación 
del medio extracelular (ECAR) en retinas de E15.5 tras cultivo con CsA y 3-MA mediante seahorse. 
*p<0,05. D. Determinación de la acidificación del medio extracelular (ECAR) en retinas deficientes de 
Atg5 in vivo de E15.5 mediante seahorse. *p<0,05. E. Heatmap de expresión relativa de genes 
reguladores de la glicólisis a partir de mRNA de retinas a las edades indicadas. F. Expresión de mRNA 
de enzimas glicolíticas mediante estudio transcriptómico. G. Expresión relativa de mRNA de genes 
glicolíticos mediante RT-PCR.  *p<0,05; **p<0,01. 

144
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Para determinar si esa modulación metabólica es un proceso fisiológico 

específico de retina o se produce también en otros contextos fisiológicos, decidimos 

estudiar si se producía mitofagia o no en macrófagos, debido a las diferencias 

metabólicas entre macrófagos M1 y macrófagos M2. En respuesta a patógenos o daño 

tisular, las células del sistema inmune deben adaptar rápidamente sus programas 

metabólicos para poder llevar a cabo sus funciones y los macrófagos polarizan en 

distintos subtipos funcionales en  respuesta a diferentes tipos de estímulo o citokinas. El 

programa de activación clásico en macrófagos (observado en macrófagos M1) se 

produce mediante combinación de componentes microbianos, como lipopolisacárido 

(LPS) e interferon-γ La activación de los macrófagos antiinflamatorios de tipo M2 se 

produce por citoquinas como IL-4 e IL-13 (O'Neill & Hardie, 2013). En macrófagos M1 

son necesarios los programas metabólicos de reconfiguración de fosforilación oxidativa 

a glicólisis aerobia y la ruta de las pentosas fosfato (PPP) para llevar a cabo su función 

proinflamatoria. Por el contrario, los macrófagos M2 utilizan principalmente la 

oxidación de ácidos grasos y un incremento en la biogénesis mitocondrial para producir 

ATP y poder reductor para sus necesidades metabólicas (O'Neill & Hardie, 2013). 

El protocolo experimental utilizado para estos experimentos está representado en 

la figura 48A. A partir de macrófagos extraídos de la cavidad peritoneal de ratón, 

determinamos mediante citometría de flujo que efectivamente los macrófagos M2 tenían 

más masa mitocondrial que los de tipo M1 (Figura 48B, C). Además, esa disminución 

de masa mitocondrial en M1 es debida a mitofagia, ya que se bloquea con CsA y 3-MA 

(Figura 48D, E); bloqueo que no se observa en los de tipo M2 (Figura 48F, G). Tras la 

activación con citoquinas de tipo proinflamatorio, los macrófagos adquieren una 

morfología redondeada característica de los M1, mientras que la activación con 

citoquinas antiinflamatorias conlleva la adquisición de una morfología alargada propia 

de macrófagos M2. En la figura 48H observamos como la inhibición de mitofagia en 

macrófagos M1 produce un cambio en la morfología, siendo más similares a 

macrófagos M2 con morfología alargada. Estos datos reflejan que la mitofagia es 

necesaria para adquirir el fenotipo de macrófagos M1, por lo que podría estar 

modulando la diferenciación hacia macrófagos proinflamatorios M1.  

145
 



 

 

 

  

 
     

 
  

 

  
 

 

 
 
 

 

  

Figura 48. Degradación de mitocondrias por mitofagia en macrófagos de tipo M1. A. Esquema del 
protocolo experimental seguido para la obtención de macrófagos de tipo M1 mediante estimulación con 
LPS e IFNγ y macrófagos de tipo M2 mediante estimulación con IL-4 e IL-13. B. Determinación del 
porcentaje de masa mitocondrial en macrófagos M1 y M2 mediante citometría de flujo utilizando la sonda 
Mitotracker Deep Red. *p<0,05. C. Histograma representativo de los datos en B. D. Determinación del 
porcentaje de masa mitocondrial en macrófagos M1 tras cultivo con CsA y 3-MA. *p<0,05. E. 
Histograma representativo en D. F. Determinación del porcentaje de masa mitocondrial en macrófagos 
M2 tras cultivo con CsA y 3-MA. G. Histograma representativo de F. H.  Imágenes representativas de 
microscopio de fluorescencia que muestran la morfología de los macrófagos en las condiciones 
empleadas.  

4.2 Mitofagia y diferenciación de las células ganglionares de la retina de ratón 

Nuestros datos demuestran que el proceso de mitofagia observado en retina se 

produce en un estadio embrionario muy concreto: E15.5. Los distintos tipos celulares de 

la retina madura se desarrollan a partir de un grupo común de progenitores 

multipotentes mediante un proceso dinámico espacio-temporal en el siguiente orden: 

células ganglionares, células horizontales, conos, células amacrinas durante el desarrollo 

embrionario, y células bipolares, bastones y glía de Müller durante el desarrollo 

postnatal (Zagozewski et al, 2014). Varias familias de factores de transcripción 

mantienen la pluripotencia de los progenitores, especifican el destino de las células de la 

retina y promueven su diferenciación (Zagozewski et al, 2014). 

146
 



 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A partir de los datos de transcriptómica  realizado con RNAs procedentes de 

retinas en diferentes estadios, se han elaborado varios heatmaps con los diferentes 

factores de transcripción que regulan el mantenimiento de los progenitores así como la 

generación de los distintos tipos celulares de la retina. Como se observa en la figura  

49A, la retina continua siendo proliferativa fundamentalmente hasta P0. La salida de 

ciclo celular durante la retinogénesis temprana se correlaciona con la expresión inicial 

de Atoh7, un factor de transcripción expresado en progenitores  necesario para el 

desarrollo del primer tipo celular diferenciado en la retina, las células ganglionares (Gao 

et al, 2014). Atoh7 y otros factores de transcripción específicos de progenitores de 

RGCs, como Pax6, Hes1 y Sox11, disminuyen su expresión a partir de E15.5, mientras 

que se mantiene la expresión de factores de transcripción específicos de progenitores de 

otros tipos celulares de la retina que se desarrollan más tardíamente.  

Además, en los heatmaps realizados para la expresión de genes específicos de 

cada tipo celular de la retina, observamos que a E15.5 se produce un incremento en la 

expresión de genes propios de RGCs diferenciadas como Pou4f1 (también denominado 

Brn3a), Sncg, L1CAM y diferentes Semaforinas (Gao et al, 2014), mientras que otros 

tipos celulares se diferencian más tardíamente (Figura 49B-G). Estos datos reflejan que 

el pico de mitofagia observado durante el desarrollo de la retina se produce durante los 

estadios de la diferenciación de las células ganglionares. 

147
 



 

 

 

  
 

  
  

Figura 49. Expresión de los genes reguladores del mantenimiento de progenitores y diferenciación 
de los distintos tipos celulares de la retina realizados a partir del estudio de transcriptómica con 
retinas a diferentes estadios embrionarios y postnatales. A. Heatmap de expresión de genes 
característicos de progenitores de la retina. B. Heatmap de genes expresados en linaje de RGCs. C-G. 
Heatmaps de genes expresados en el linaje de células horizontales, amacrinas, fotorreceptores, bipolares y 
glía de Müller. 

148 



 

 

 

 

 

 
 
 

 
 

 
 

   

 
 

 

A partir de retinas montadas en plano podemos estudiar el proceso de 

diferenciación de RGCs, que sigue un patrón centro-periférico, de manera que las 

células más maduras (M, de mature) se localizan en la retina central y las recién 

diferenciadas (Y, de young) en la retina periférica. Mediante inmunofluorescencia del 

factor de transcripción específico de células ganglionares diferenciadas Brn3a en retinas 

montadas en plano, hemos confirmado el incremento en diferenciación de RGCs a 

E15.5 (Figura 50 A-C). 

Figura 50. Esquema que muestra la el patrón de diferenciación centro-periférico de las RGCs de la 
retina. En E13.5, las RGCs recién diferenciadas se localizan en la región central de la retina. En 
E15.5 podemos distinguir RGCs más maduras en la región central y otras recién diferenciadas en la 
región periférica. En E18.5 prácticamente todas las RGCs han completado su maduración. A. 
Inmunotinción con el anticuerpo Brn3a para la detección de RGCs y TOMM20 para el marcaje 
mitocondrial. Barra de escala 100µm. El asterisco señala el nervio óptico. B. Cuantificación del número 
de RGCs en retinas in vivo a E13.5, E15.5 y E18.5. ***p<0,001. C. Imágenes de las áreas señaladas en A: 
región Y en E13.5; región Y en E15.5 y región M en E18.5. Barra de escala 50µm. 

Durante las etapas embrionarias del desarrollo de la retina de ratón, se pueden 

distinguir fundamentalmente dos capas: la capa de neuroblastos externa, constituida 

principalmente por células progenitoras mitóticas, y la capa neuroblástica interna, donde 

residen las neuronas recién diferenciadas (principalmente células ganglionares). 

Mediante inmunofluorescencia de TOMM20 en secciones de ojos de diferentes estadios 

149
 



 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

   

 
 

 

 
 
 
 

embrionarios, observamos una disminución de la masa mitocondrial a partir de E15.5 en 

toda la retina, siendo más acusada en la capa de RGCs (Figura 51).  

Figura 51. La disminución de la masa mitocondrial durante el desarrollo de la retina se produce en 
toda la retina, siendo más acusada en la capa de RGCs. A. Inmunotinción de TOMM20 en secciones 
de ojos embrionarios a E13.5, E15.5 y E18.5. NbL: capa de neuroblastos; RGCL: capa de células 
ganglionares. Barra de escala 75µm. B. Ampliación de las áreas señaladas en la capa de neuroblastos y de 
células ganglionares. 

Además, mediante microscopía electrónica se puede observar claramente que en 

la capa de RGCs las células presentan mitocondrias hinchadas, con acumulación de 

materiales electrón-densos y crestas mitocondriales desorganizadas, siendo menor el 

número de mitocondrias por célula en esta capa (Figura 52 A-D). Estas características 

son propias de mitocondrias dañadas. En relación con la mitofagia determinada en 

E15.5, el bloqueo de la degradación lisosomal con HCQ permite observar mitocondrias 

englobadas en autofagosomas en la capa de RGCs (Figura 52 E), confirmando mediante 

microscopía electrónica la activación de la mitofagia. Estos datos sugieren que la 

autofagia degrada mitocondrias durante el desarrollo de las RGCs.  

150
 



 

 

 

 

 
   

 
 

 
 

 

 
 

 

 

 

Figura 52. Determinación de mitofagia en retinas a E15.5 mediante microscopía electrónica. A. 
Imagen que muestra la capa de neuroblastos y la capa de RGCs en retinas de E15.5. B. Imagen 
representativa de un neuroblasto (NB), con gran cantidad de mitocondrias, y una RGC, con menor 
cantidad de mitocondrias. C. Cuantificación del número de mitocondrias por célula a partir de imágenes 
de microscopía electrónica. *p<0,05. D. Las mitocondrias en la capa de neuroblastos son alargadas y con 
crestas mitocondriales organizadas. Por el contrario, las mitocondrias de la capa de RGCs están 
hinchadas, con crestas mitocondriales desorganizadas y acúmulos de materiales electrón-densos. E. Etapa 
inicial de la formación del autofagosoma alrededor de una mitocondria (izquierda) y mitocondria en el 
interior de un autofagosoma (derecha) en la capa de RGCs. AP: autofagosoma; m: mitocondria. Las 
flechas indican la doble membrana del autofagosoma.  

A continuación se determinó el papel de la mitofagia en el proceso de 

diferenciación de las RGCs. Retinas deficientes de Atg5 presentan una disminución en 

el número de células Brn3a positivas en un estadio temprano de la diferenciación 

(E13.5), así como en toda la retina a E15.5 (Figura 53 A, B). En esas regiones se 

observa un incremento de masa mitocondrial (Figura 53 C, D) acorde al bloqueo de 

mitofagia previamente descrito. Además, mediante inmunotinción de RGCs con β-III­

tubulina en secciones de ojos en E13.5 y E15.5, se observa una disminución de RGCs 

en la capa interna de ojos deficientes de Atg5, presentando además una diferenciación 

ectópica (Figura 53 E). En retinas en plano se observa una distribución anómala de los 

axones de RGCs en toda la retina (Figura 53 F). Estos resultados muestran una 

151
 



 

 

 
 

 
 

    
 

  
 

 
   

    

 
 

alteración en la diferenciación y axonogénesis de las RGCs en embriones deficientes de 

Atg5. 

Figura 53. Retinas deficientes de Atg5 presentan alterada la diferenciación de RGCs. A. Imágenes 
de la región donde se inicia la diferenciación en retinas de E13.5 y de las regiones Y (de young, menos 
madura) y M (de mature) donde se muestra la inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en 
retinas en plano. Barra de escala 50µm. B. Cuantificación del número de RGCs en A. *p<0,05; 
**p<0,01. C. Inmunotinción de TOMM20 de las retinas mostradas en A. D. Área cubierta por la masa 
mitocondrial detectada en C. ***p<0,001. E. Inmunotinción de β-III-tubulina para la detección de RGCs 
en secciones de ojos Atg5+/+ y Atg5-/- de embriones en E13.5 y E15.5. Barra de escala 75µm. La línea 
discontinua separa las capas NbL y RGCL. Las flechas indican la diferenciación ectópica. F. 
Inmunotinción que muestra la distribución de los axones de las RGCs en retinas en plano de ratones 
deficientes de Atg5. Barra de escala 50µm. El asterisco señala el nervio óptico. 

A nivel farmacológico, a diferencia de la inhibición genética de autofagia, solo 

se observa una disminución de RGCs en la región periférica menos madura de retinas en 

E15.5 (Figura 54 A, B). Estas diferencias entre el modelo genético y el farmacológico 

152
 



 

 

 

 

 

 

 
   

 

  
 

  
   

 

 
 

 

pueden deberse al efecto más acusado de la inhibición crónica en retinas Atg5-/- o bien a 

otras posibles funciones de Atg5 independientes de autofagia (Codogno et al, 2011). No 

obstante, las diferencias observadas en RGCs entre retinas Atg5+/+ y Atg5-/- son mayores 

cuanto menos madura es la retina (Figura 54 C), por lo que la regulación de la 

generación de RGCs mediada por mitofagia se produce en el paso inicial de la 

diferenciación. La distribución anómala de los axones de RGCs observadas en retinas 

deficientes de Atg5 también se produce mediante el tratamiento farmacológico con CsA 

y 3-MA (Figura 54 D). 

Figura 54. Disminución de la diferenciación de RGCs en la región menos madura de retinas en 
E15.5 tras inhibición farmacológica de mitofagia con CsA y 3-MA. A. Imágenes de la región donde se 
inicia la diferenciación en retinas de E13.5 y de las regiones Y (de young, menos madura) y M (de 
mature) donde se muestra la inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en retinas  en plano. 
Barra de escala 50µm. B. Cuantificación del número de RGCs en A. *p<0,05. C. Representación del 
cociente del número de RGCs entre retinas Atg5-/- y Atg5+/+ que muestra mayores diferencias en el 
número de RGCs cuanto menos madura es la retina. *p<0,05; ***p<0,001. D. Inmunotinción que muestra 
la distribución de los axones de las RGCs en retinas en plano cultivadas con CsA y 3-MA. Barra de escala 
50µm. 

A continuación se determinó si la implicación de la mitofagia en la 

diferenciación tiene relación con el cambio metabólico hacia glicólisis previamente 

observado. Para ello, se moduló el metabolismo glicolítico directamente y se analizó la 

153
 



 

 

 

 
 

 

  
 

 

 

 

 

 

diferenciación de las RGCs. Como se observa en la figura 55 (A, B), la inhibición de la 

glicólisis mediante 3-PO y 2-DG disminuye el número de células Brn3a positivas 

únicamente en la región más madura de la retina a E15.5.  

Figura 55. Disminución de la diferenciación de RGCs en la región más madura de retinas en E15.5 
tras la inhibición farmacológica de la glicólisis con 3-PO y 2-DG. A. Imágenes de la región donde se 
inicia la diferenciación en retinas de E13.5 y de las regiones Y (de young, menos madura) y M (de 
mature) donde se muestra la inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en retinas  en plano. 
Barra de escala 50µm. B. Cuantificación del número de RGCs en A. *p<0,05. 

Además, se utilizaron retinas deficientes de L2A, que presentan un incremento 

de glicólisis en respuesta a glucosa e insensibilidad a 2-DG, en relación con la 

implicación de CMA en la degradación de enzimas glicolíticas (Aniento et al, 1993; 

Cuervo et al, 1994; Kon et al, 2011; Lv et al, 2011; Schneider et al, 2014; Tasset & 

Cuervo, 2016) (Figura 56 A). Retinas en plano de embriones deficientes en L2A 

presentan un incremento significativo en el número de RGCs solo en retinas de E15.5, 

siendo mayor la diferencia en la región madura de la retina (Figura 56 B-D). Al 

contrario que en retinas deficientes de Atg5, se observa un incremento de RGCs en 

secciones de ojos deficientes de L2A en E13.5 y E15.5. (Figura 56 E). Aunque no 

podemos descartar otras funciones mediadas por la CMA, es posible que su papel 

metabólico en cuanto a la degradación de enzimas glicolíticas regule la diferenciación 

de las RGCs. Esto se correlaciona con la disminución de la expresión de L2A en E15.5 

(Figura 56 F), estadio a partir del cual la retina comienza a depender del metabolismo 

glicolítico.  

154
 



 

 

 

 
 
 
 

  
 

    

 
  

 
 

  

 
 

 

 

Figura 56. Retinas deficientes de LAMP-2A muestran un incremento de la diferenciación de las 
RGCs. A. Análisis de la acidificación extracelular (ECAR) consecuencia de la actividad glicolítica 
mediante seahorse en condiciones basales y tras la adición de glucosa, oligomicina y 2-DG en retinas 
LAMP-2A+/+ y LAMP-2A-/-. *p<0,05. B. Imágenes de la región donde se inicia la diferenciación en 
retinas de E13.5 y de las regiones Y (de young, menos madura) y M (de mature) donde se muestra la 
inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en retinas  en plano. Barra de escala 50µm. C. 
Cuantificación del número de RGCs en B. *p<0,05. D. Representación del cociente  del número de RGCs 
entre retinas LAMP-2A-/- y LAMP-2A+/+ que muestra mayores diferencias en el número de RGCs cuanto 
más madura es la retina. *p<0,05; **p<0,01. E. Inmunotinción de β-III-tubulina para la detección de 
RGCs en secciones de ojos LAMP-2A+/+ y LAMP2A-/- de embriones en E13.5 y E15.5. Barra de escala 
75µm. La línea discontinua separa las capas NbL y RGCL. F. Expresión relativa de mRNA de LAMP-2A 
(L2a) durante el desarrollo embrionario de la retina determinado mediante RT-PCR. 

Estos resultados demuestran que el cambio metabólico mediado por mitofagia 

regula la diferenciación de las células ganglionares de la retina. El hecho de que la 

inhibición farmacológica de mitofagia  y de glicólisis en E13.5 no tenga efectos en 

diferenciación, puede ser debido a que en dicho estadio la mitofagia solo tiene un papel 

en la muerte celular temprana pero no en el metabolismo, que como he mencionado 

anteriormente, cambia a partir de E15.5. 

155
 



 

 

 

 

 

 

Hay que añadir que como consecuencia de la inhibición de la glicólisis en retinas 

cultivadas con 3-PO y 2-DG, se produce un incremento de la masa mitocondrial 

determinado por inmunotinción de TOMM20 en retinas en plano y por citometría de 

flujo con mitotracker deep red (Figura 57 A-C). Es posible que la inhibición del 

metabolismo glicolítico desencadene procesos de compensación para sostener el 

metabolismo celular. Por otro lado, retinas deficientes de LAMP-2A también presentan 

mayor masa mitocondrial, a pesar de ser más glicolíticas (Figura 57 D). Ese incremento 

podría deberse a la observación preliminar de la disminución de la expresión de algunos 

de los reguladores de la mitofagia en retinas deficientes de LAMP-2A (Figura 57 E). 

Estos datos demuestran que existe una relación recíproca entre el metabolismo y la 

masa mitocondrial, de manera que cualquier alteración en uno de los dos procesos, tiene 

consecuencias para el otro y viceversa. 

156
 



 

 

 
  

 
   

  
   

 
  

 

 
 

 

 

Figura 57.  Relación recíproca entre el metabolismo y la masa mitocondrial durante el desarrollo de 
la retina de ratón. A. Inmunotinción de TOMM20 de retinas de E15.5 tras cultivo con 3-PO y 2-DG. 
Barra de escala 50µm. El asterisco señala el nervio óptico. B. Área cubierta por la masa mitocondrial 
detectada en A. *p<0,05.C. Determinación del porcentaje de masa mitocondrial mediante citometría de 
flujo en retinas de E15.5 cultivadas con 3-PO y 2-DG. *p<0,05. D. Inmunotinción de TOMM20 en 
secciones de ojos  LAMP-2A+/+ y LAMP2A-/- de embriones en E13.5 y E15.5. Barra de escala 75µm. La 
línea discontinua separa las capas NbL y RGCL. E. Expresión relativa de mRNA de genes reguladores de 
mitofagia en retinas  de embriones LAMP-2A+/+ y LAMP2A-/- a las edades indicadas mediante RT-PCR.  

El siguiente paso fue determinar los efectos de mitofagia y metabolismo en la 

diferenciación de RGCs en estadios posteriores del desarrollo embrionario, cuando la 

retina ya es glicolítica. Como he mencionado previamente, solo la inhibición con 3-MA 

incrementa la masa mitocondrial en retinas de E18.5, pero ni CsA ni 3-MA alteran  el 

número de RGCs (Figura 58A, B). Sin embargo, la inhibición de la glicólisis con 3-PO 

y 2-DG si disminuye la diferenciación en retinas de E18.5 (Figura 58 C, D). Estos datos 

refuerzan la idea de que es la mitofagia específica que se produce en E15.5 la que regula 

el cambio metabólico necesario para la diferenciación y maduración de RGCs. Por otro 

lado, la inducción de mitofagia en retinas de E18.5 con rapamicina y EBSS (Figura 58E, 

157
 



 

 

 

F), disminuye el número de células Brn3a positivas (Figura 58G, H), por lo que una vez 

se ha producido el cambio metabólico, la inducción de mitofagia puede desencadenar 

mecanismos de retroalimentación negativa para evitar un exceso de diferenciación. Esa 

mitofagia solo se bloquea con 3-MA, pero no con CsA (Figura 58E, F), lo que refleja 

una degradación mitocondrial no selectiva debido a la inducción de autofagia. Estos 

datos sugieren que solo la mitofagia selectiva que se bloquea con CsA favorece la 

diferenciación de las células ganglionares. Además, el tratamiento con AO no induce 

mitofagia en E18.5, por lo que la inhibición de la cadena de transporte electrónico solo 

induce mitofagia antes o justo cuando comienza el cambio metabólico (Figura 58I).  

158
 



 

 

 
 

  

  
   

 
 

Figura 58. Efectos de la modulación de mitofagia y glicólisis en la diferenciación de RGCs en 
retinas a E18.5. A. C. Inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en retinas a E18.5 en plano 
tras el bloqueo de mitofagia y glicólisis, respectivamente. Barra de escala 50µm. B. D. Cuantificación del 
número de RGCs en A y C, respectivamente. *p<0,05. E. F. Determinación del porcentaje de masa 
mitocondrial tras la inducción de autofagia con rapamicina y EBSS en ausencia/presencia de CsA y 3-MA 
en retinas de E18.5 *p<0,05. G. Cuantificación del número de RGCs tras la inducción de autofagia con 
rapa y EBSS en retinas a E18.5. H. Inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en retinas a 
E18.5 en plano tras cultivo con rapamicina y EBSS. Barra de escala 50µm. I. Determinación del 
porcentaje de masa mitocondrial tras la inducción de mitofagia con AO  en retinas a E13.5, E15.5 y 
E18.5.  

159
 



 

 

 

 

 

  
   

   
   

 
 

 
 

A continuación determinamos si la inducción de autofagia/mitofagia en E13.5 

favorece la diferenciación en dicho estadio. La inducción de mitofagia en toda la retina 

mediante rapamicina aumenta la diferenciación de las RGCs en la región central, donde 

se inicia la diferenciación de retinas en E13.5 (Figura 59 A-D).  

Figura 59. La inducción de mitofagia con rapamicina en retinas de E13.5 incrementa la 
diferenciación de las células ganglionares. A. Inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en 
retinas de E13.5 en plano tras la inducción de mitofagia con rapamicina en ausencia/presencia de CsA y 
3-MA. Barra de escala 50µm. El asterisco señala el nervio óptico. B. Cuantificación del número de RGCs 
en A. *p<0,05; **p<0,01. C. Inmunotinción de TOMM20 de las retinas en A. Barra de escala 50µm. El 
asterisco señala el nervio óptico. D. Área cubierta por la masa mitocondrial detectada en A. *p<0,05; 
p<0,01. 

Sin embargo, la inducción de mitofagia mediante EBSS no cambia la 

diferenciación de RGCs (Figura 60 A, B). Además, cuando se induce mitofagia 

160
 



 

 

 

 
 

 
 

  
   

        

  
 

 
 
 
 
 
 

 

mediante AO, la diferenciación de RGCs disminuye en toda la retina, siendo este efecto 

independiente de mitofagia ya que no se revierte con CsA (Figura 60 C, D). Queda por 

determinar si estas diferencias entre los distintos estímulos inductores de mitofagia se 

deben a que sus efectos sean diferentes en el metabolismo celular. Además, como he 

mencionado previamente, la muerte por EBSS no solo se debe a mitofagia, ya que en la 

región periférica de la retina no se revierte con CsA, por lo que el ayuno tiene otros 

efectos independientes de mitofagia. 

Figura 60. La inducción de mitofagia con EBSS y AO en retinas de E13.5 no incrementa la 
diferenciación de las células ganglionares. A. Inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en 
retinas de E13.5 en plano tras la inducción de mitofagia con EBSS. Barra de escala 50µm. El asterisco 
señala el nervio óptico. B. Cuantificación del número de RGCs en A. C. Inmunotinción de Brn3a para la 
detección de RGCs en retinas de E13.5 en plano tras la inducción de mitofagia con AO en 
ausencia/presencia de CsA. Barra de escala 50µm. El asterisco señala el nervio óptico. D. Cuantificación 
del número de RGCs en C. *p<0,05. 

161
 



 

 

 
 

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

   
   

  
 

  
   

 

4.3 Señal inductora y mecanismo molecular de mitofagia en retinas de E15.5 

Una vez determinada la activación de mitofagia y sus efectos en metabolismo y 

diferenciación, quisimos conocer el estímulo inductor de mitofagia a nivel basal en 

retinas de E15.5. Uno de los principales estímulos para inducir mitofagia es el daño 

mitocondrial, que se caracteriza por un incremento en la producción de ROS y 

disminución del potencial de membrana mitocondrial (Lemasters, 2005). Durante el 

desarrollo de la retina hemos observado una disminución de los niveles de ROS 

medidos con la sonda DHE a partir del momento en el que se produce mitofagia (Figura 

61A, B). Sin embargo, esta disminución no es debida al proceso de mitofagia, ya que la 

deficiencia de Atg5 y la inhibición farmacológica de autofagia con 3-MA no alteran los 

niveles de ROS (Figuras 61 C-E). Por el contrario, la inhibición con CsA incrementa el 

estrés oxidativo, lo que sugiere que los niveles de ROS podrían modularse por cambios 

en la cadena de transporte electrónico mitocondrial (Figura 61 D, E). Además, esto 

parece ser específico del momento en el que se produce mitofagia selectiva, ya que 

retinas en E18.5 no presentan cambios en los niveles de ROS tras bloqueo de 

autofagia/mitofagia (Figura 61F).  

Figura 61. Disminución de los niveles de ROS durante el desarrollo de la retina de vertebrados 
independiente de mitofagia. A. Determinación del porcentaje de ROS en retinas in vivo en diferentes 
estadios mediante la sonda DHE por citometría de flujo. *p<0,05; ***p<0,001. B. Histograma 
representativo de los datos en A. C. Determinación de los niveles de ROS en retinas deficientes de Atg5 a 
E15.5. D. Determinación del porcentaje de ROS en retinas a E15.5 cultivadas en presencia de CsA y 3­
MA. **p<0,01. E. Histograma representativo de los datos de D. F. Determinación del porcentaje de DHE 
en retinas a E18.5 tras cultivo con CsA y 3-MA.  

162
 



 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

    
   

  

 
 

 

 

 

 

La cadena de transporte electrónico genera un gradiente de electrones a través de 

la membrana interna mitocondrial que se encarga de mantener el potencial de 

membrana. Para determinar el funcionamiento de la cadena de transporte electrónico se 

midió el potencial de membrana mitocondrial mediante citometría de flujo, utilizando la 

sonda DIOC. El potencial de membrana mitocondrial disminuye ya en E14.5, una edad 

anterior a la que se produce mitofagia (Figura 62A, B). La inhibición farmacológica de 

autofagia/mitofagia en E15.5 no alteró el potencial de membrana mitocondrial (Figura 

62 C). Sin embargo, retinas deficientes de Atg5 si presentan un incremento de DIOC 

(Figuras 62 D, E). Estos datos sugieren que una posible señal para la inducción de 

mitofagia es la disminución en el potencial de membrana mitocondrial, pudiendo 

resultar la deficiencia genética de mitofagia en mecanismos de compensación para 

incrementar los niveles de DIOC. 

Figura 62. Disminución del potencial de membrana mitocondrial previa a la mitofagia durante el 
desarrollo de la retina. A. Porcentaje de DIOC en retinas embrionarias in vivo a E13.5, E14.5 y E15.5. 
***p<0,001. B. Histograma representativo de los datos en A. C. Porcentaje de DIOC en retinas de E15.5 
tras cultivo con CsA y 3-MA. D. Porcentaje de DIOC en retinas deficientes de Atg5 a E15.5. *p<0,05. E. 
Histograma representativo de los datos en D. 

Además, se realizó un BOFA para estudiar el funcionamiento de la respiración 

mitocondrial en los diferentes estadios del desarrollo de la retina de ratón. Como se 

observa en la figura 63A, retinas de E13.5 presentan una respuesta normal a 

oligomicina, disminuyendo la respiración al inhibir la ATPsintasa. Además la respuesta 

163
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

a FCCP no incrementa el consumo de oxígeno, por lo que no hay diferencias entre la 

respiración basal y la respiración máxima que pueden alcanzar las células. Sin embargo, 

retinas de E14.5 se vuelven insensibles a oligomicina y FCCP, y a partir de E15.5, la 

ATPsintasa parece funcionar en reverso hidrolizando ATP (como ATPasa), ya que la 

adición de oligomicina incrementa el consumo de oxígeno. La respuesta a la inhibición 

de los complejos I y III con rotenona y antimicina A, respectivamente, disminuye en 

todos los estadios analizados (Figura 63 B-E). 

Las células presentan mecanismos para evitar la disminución de ATP ante una 

disfunción mitocondrial. Uno de ellos es incrementar la expresión del inhibidor 

fisiológico de la ATPsintasa IF1, para evitar que la bomba funcione en reverso y 

consuma ATP (Campanella et al, 2009; Formentini et al, 2014). A partir de los datos de 

transcriptómica, observamos como la expresión de IF1 incrementa progresivamente 

hasta E14.5 y disminuye drásticamente en E15.5, manteniéndose de ahí en adelante 

(Figura 63 F). Estos datos podrían indicar que ante la caída del potencial de membrana 

mitocondrial, retinas de E14.5 incrementan la expresión de IF1 para mantener la 

viabilidad, lo que tendría como consecuencia una insensibilidad de la mitocondria a 

oligomicina observada. Esto se relaciona con lo descrito previamente en neuronas de 

ratones transgénicos con la ATPsintasa inhibida (Formentini et al, 2014). Sin embargo, 

el hecho de que la expresión de IF1 disminuya en E15.5, pone de manifiesto el 

funcionamiento en reverso de la ATPsintasa como hemos observado en el BOFA. 

Además, la inhibición de la ATPasa con oligomicina en este estadio incrementa el 

potencial de membrana mitocondrial (Figura 63 G, H), lo que indica que los protones 

cedidos por NADH y FADH2 a nivel de los complejos I y II de la cadena de transporte 

electrónico no son transferidos a la matriz mitocondrial para la síntesis de ATP, sino 

que se acumulan en el espacio intermembrana,  lo que confirma la función reversa de la 

ATPsintasa en retinas de E15.5. 

Estudios previos han descrito este funcionamiento de la ATPasa en mitocondrias 

dañadas despolarizadas que son degradadas por mitofagia (Gunter & Pfeiffer, 1990; 

Hunter et al, 1976; Kissova et al, 2004; Lemasters, 2005), por lo que las alteraciones a 

nivel de la cadena de transporte electrónico observadas podrían constituir la señal 

inductora de mitofagia durante el desarrollo de la retina.  

164
 



 

 

 
 

  
   

    
    

 
 

 

 

 

 

 

 

Figura 63.  Alteración de la función respiratoria mitocondrial previa a la inducción de mitofagia. 
A-E. Determinación del consumo de oxígeno consecuencia de la respiración mitocondrial en condiciones 
basales y tras la adición de oligomicina, FCCP y Rotenona+Antimicina A en retinas de ratón de 
diferentes estadios: E13.5, E14.5, E15.5, P0 y adulto. *p<0,05; ***p<0,001. F. Expresión de mRNA de 
Atpif1 (inhibidor de la ATPsintasa mitocondrial). G. Porcentaje de DIOC en retinas a E15.5 tras la 
inhibición de la ATPsintasa con oligomicina. H. Histograma representativo de los datos en G. 

Como consecuencia de la alteración en la cadena de transporte electrónico, las 

retinas de E15.5 ponen en marcha un mecanismo que incrementa el consumo de 

oxígeno, por lo que se podría estar produciendo hipoxia en dicho estadio. Para ello, se 

realizó un heatmap con la expresión del factor inducible por hipoxia (HIF1α) y genes 

regulados por dicho factor (Figura 64A). Podemos observar un incremento en la 

expresión de genes regulados por HIF, como Adm, Egln, AldoA, Pgk1 y Slc2a1, por lo 

que retinas de E15.5 están sometidas a hipoxia.  

165
 



 

 

 
  

 
 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

Figura 64.  Expresión de genes regulados por HIF1α 
durante el desarrollo de la retina.  

En relación con la autofagia, HIF1α regula la expresión de diferentes genes de 

autofagia, destacando entre ellos los reguladores de mitofagia NIX y BNIP3 

(Hamacher-Brady & Brady, 2016). Se ha demostrado que NIX y BNIP3 están 

implicados en procesos fisiológicos como la maduración de eritrocitos o la generación 

de células NK de memoria mediante la degradación de mitocondrias (O’Sullivan, 2015; 

Schweers et al, 2007). A partir de un heatmap de reguladores de mitofagia generado 

con los datos procedentes de transcriptómica y utilizando la base de datos de gene 

ontology (GO0000422), podemos observar un grupo que se expresa fundamentalmente 

en estadios embrionarios de la retina, otro entre las edades E15.5-P0 y un tercer grupo 

en edades postnatales (Figura 65 A). Si nos fijamos en el que comprende nuestra edad 

de interés E15.5 (Figura 65B), podemos observar un incremento en la expresión de 

NIX. Para confirmar si durante la fisiología de la retina, NIX también es el responsable 

de la regulación de la mitofagia, realizamos RT-PCR de diferentes reguladores de 

mitofagia conocidos. En la figura 65C se observa un incremento de la mayoría de ellos a 

nivel postnatal, siendo NIX el que presenta un incremento en su expresión en E15.5, 

manteniéndose de ahí en adelante.  

166
 



 

 

 

   
 

 
  

Figura 65. Expresión de diferentes reguladores de mitofagia durante el desarrollo de la retina. A. 
Heatmap realizado a partir de la expresión de los reguladores de mitofagia obtenidos a partir de la base de 
datos gene ontology (GO0000422) a partir de mRNAs de retinas a diferentes estadios embrionarios y 
postnatales. B. Ampliación del área señalada en A. Entre los reguladores expresados en las edades de 
interés se encuentra NIX (BNIP3L). C. Confirmación mediante RT-PCR de la expresión de los 
reguladores de mitofagia más conocidos a partir de mRNAs de retinas de ratón en los estadios indicados. 

167 



 

 

 
 

 

 

 

 

 

 
 

  
 

 

 

Utilizando retinas de animales deficientes de NIX,  se ha confirmado el bloqueo 

de mitofagia mediante inmunotinción de TOMM20 en retinas en plano y en secciones 

de ojos, así como mediante mitotracker deep red por citometría de flujo (Figuras 66 A­

C). Estos datos sugieren que NIX regula el proceso de mitofagia descrito en retinas de 

E15.5 en respuesta a hipoxia. Los efectos de la mitofagia en diferenciación se han 

corroborado mediante inmunofluorescencia de β-III-tubulina en secciones de ojos 

deficientes de NIX (Figura 66D). Estos datos indican que NIX es el regulador del 

proceso de mitofagia implicado en la regulación de la diferenciación. Habría que 

determinar si retinas deficientes de NIX presentan una disminución en ECAR y en 

expresión de enzimas glicolíticas.  

Figura 66. Incremento de masa mitocondrial y disminución de RGCs en retinas deficientes de NIX 
a E15.5. A. Inmunofluorescencia de TOMM20 en retinas NIX+/+ y NIX-/- montadas en plano. Barra de 
escala 50µm. B. Inmunofluorescencia de TOMM20 en secciones de ojos de embriones a E15.5. La línea 
discontinua separa las capas NbL y RGCL. Barra de escala 75µm. C. Ampliación de las áreas señaladas 
en B. D. Inmunofluorescencia de DAPI y β-III-tubulina para la detección de RGCs en secciones de ojos 
de embriones NIX+/+ y NIX-/-. Barra de escala 75µm. 

168
 



 

 

 

 

  
   

 

 
 

 
 

Para confirmar la regulación de la diferenciación por mitofagia ante una 

situación de hipoxia, se cultivaron retinas de E13.5 y E15.5 con deferoxamina (DFO), 

un inductor clásico de hipoxia, en ausencia y presencia de CsA y 3-MA. Mediante 

inmunofluorescencia de Brn3a en retinas montadas en plano, podemos observar como la 

inducción química de hipoxia produce un incremento del número de RGCs en E13.5 y 

en la región menos madura de retinas de E15.5 (Figura 67A, B).  

Figura 67. La inducción de hipoxia incrementa la diferenciación de RGCs en retinas de E13.5 y en 
la región menos madura de retinas en E15.5. A. Imágenes de la región donde se inicia la diferenciación 
en retinas de E13.5 y de las regiones Y (de young, menos madura) y M (de mature) de retinas a E15.5 
donde se muestra la inmunotinción de Brn3a para la detección de RGCs en retinas  en plano. Barra de 
escala 50µm. B. Cuantificación del número de RGCs en A. *p<0,05. 

Estos efectos son debidos a inducción de mitofagia ya que disminuyen la tinción 

de TOMM20 en retinas en plano y se bloquean con CsA y 3-MA (Figura 67, 68A). 

Estos datos confirman que la hipoxia regula la diferenciación de células ganglionares de 

la retina mediante inducción de mitofagia. Habría que determinar si esa mitofagia 

mediada por hipoxia está produciendo un cambio metabólico hacia glicólisis durante el 

desarrollo de la retina.  

169
 



 

 

 
  

 
 

 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

  
   

Figura 68. La inducción de hipoxia disminuye 
la masa mitocondrial por mitofagia en retinas a 
E13.5 y E15.5.  A. Imágenes de la región central 
de retinas de E13.5 y de las regiones Y (de young, 
menos madura) y M (de mature) de retinas a E15.5 
donde se muestra la inmunotinción de TOMM20 
para la detección de mitocondrias en retinas  en 
plano. Barra de escala 50µm.

 Además de HIF1α, otros factores 

de transcripción como TFEB, E2F1, 

FOXO3a, CITED2, SP1 y Trp53, regulan 

la expresión de NIX. A partir del estudio 

transcriptómico realizado con retinas de 

ratón a diferentes estadios, podemos 

observar como algunos de ellos podrían 

también regular el proceso de mitofagia descrito durante el desarrollo de la retina 

(Figura 69). FOXO3a incrementa a partir de E14.5, y  E2F1 a partir de E15.5. Bajo 

condiciones de hipoxia, FOXO3a suprime la expresión de NIX mediada por HIF1-α 

mediante el cofactor CITED2, lo que constituye una regulación negativa compensatoria 

bajo condiciones de hipoxia (Hamacher-Brady & Brady, 2016). La expresión de 

CITED2 incrementa en E15.5, por lo que estos datos reflejan que podría haber una 

regulación coordinada y controlada de la expresión de NIX por diferentes factores de 

transcripción durante el desarrollo de la retina en edades en las que observamos la 

activación de mitofagia.  

Figura 69. Expresión de factores de transcripción reguladores de la expresión de NIX. A. Expresión 
determinada mediante el estudio transcriptómico a partir de mRNAs de retinas en distintos estadios. 

170
 



 

 

 

 
 

 

 

 
 

 
  

 
 

 
 

4.4 Mitofagia y muerte celular en E15.5 

Previamente he descrito que la mitofagia basal en la región central y la 

inducción de mitofagia en retinas de E13.5 inducen muerte celular. Por ello,  se 

determinó si la mitofagia basal observada en E15.5 también estaba implicada en la 

muerte fisiológica de la retina en dicho estadio. Tanto la inhibición de 

autofagia/mitofagia como de hipoxia con el inhibidor FM19G11 (Moreno-Manzano et 

al, 2010), disminuyen el marcaje de TUNEL en toda la retina (Figura 70 A, B). La 

inhibición de hipoxia en retinas de E13.5 también disminuye la muerte celular en la 

región central, lo que sugiere que ya en estadios tempranos hay cierto nivel de hipoxia 

en un área concreta de la retina que regula la muerte neural temprana (Figura 70 C, D).  

Figura 70. La mitofagia mediada por hipoxia contribuye a la muerte fisiológica durante el 
desarrollo de la retina. A. C. Imágenes de la región menos madura de retinas de E15.5 y de la región 
central de retinas a E13.5, respectivamente, donde se muestra la reacción de TUNEL para la detección de 
muerte celular en retinas  en plano. Barra de escala 50µm. B. D. Cuantificación del número de células 
TUNEL positivas/mm2 en las regiones indicadas de  retinas tratadas con CsA, 3-MA y FM19G11. 
***p<0,001. 

Sin embargo, retinas deficientes de Atg5 presentan un incremento de muerte 

celular a lo largo del desarrollo embrionario, siendo significativamente mayor a la 

muerte fisiológica de retinas Atg5+/+ en todas las edades estudiadas (Figura 71A, B), lo 

que puede reflejar otras funciones de la autofagia durante el desarrollo, como 

previamente hemos comprobado en E13.5.   

171
 



 

 

 

 
 
 
 

 
 

  
 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

 

 

  
  

 
 

 

Figura 71. Retinas deficientes de 
Atg5 presentan un incremento de 
muerte celular a lo largo del 
desarrollo embrionario. A. Reacción 
de TUNEL en retinas Atg5+/+ y Atg5-/­

a E13.5, E15.5 y E18.5 montadas en 
plano. Barra de escala 50µm. B. 
Cuantificación del número de células 
TUNEL positivas/mm2 en A. *p<0,05; 
***p<0,001. 

Por el contrario, retinas deficientes en mitofagia específicamente por delección 

de NIX, presentan una disminución en la muerte celular a E15.5, por lo que la mitofagia 

mediada por NIX desempeña un papel en la muerte celular (Figura 72 A, B). 

Figura 72. Disminución de la muerte fisiológica de retinas en E15.5 por deficiencia de NIX. A. 
Reacción de TUNEL en retinas NIX+/+ y NIX-/-. Barra de escala 50µm. B. Cuantificación del número de 
células TUNEL positivas/mm2 en A.  **p<0,01. 

No obstante, la muerte celular fisiológica  de retinas a E15.5, al igual que la 

muerte neural temprana de retinas a E13.5, también se bloquea al inhibir caspasas con 

BOC, por lo que de nuevo la mitofagia podría desempeñar un papel promuerte (Figura 

73). 

172
 



 

 

 

 

 
   

 
 

 

 

 

  

  

 
   

 
  

 

Figura 73. Disminución de la muerte fisiológica de retinas en E15.5 por inhibición de caspasas con 
BOC. A. Reacción de TUNEL en retinas tras  cultivo con BOC. Barra de escala 50µm. B. Cuantificación 
del número de células TUNEL positivas/mm2 en A.  *p<0,05. 

A diferencia de retinas en E13.5, ni rapamicina ni EBSS inducen mitofagia en 

retinas de E15.5, lo que se correlaciona con el hecho de no observar un incremento de 

muerte celular por inducción de autofagia en este estadio (Figura 74 A, B). Por otro 

lado, el tratamiento con AO si induce mitofagia en retinas de E15.5, pero disminuye la 

muerte celular, lo que confirma el papel promuerte de la mitofagia inducida por 

alteraciones en la cadena de transporte electrónico (Figura 74 C-E).  

Figura 74. El tratamiento con rapamicina y EBSS no induce mitofagia ni muerte celular en retinas 
de E15.5. A. Determinación del porcentaje de masa mitocondrial mediante citometría de flujo de retinas 
en E15.5 tras cultivo con rapamicina y EBSS. B. Reacción de TUNEL en retinas de E15.5 tras  cultivo 
con rapamicina y EBSS. Barra de escala 50µm. C. Determinación del porcentaje de masa mitocondrial 
mediante citometría de flujo en retinas de E15.5 tras cultivo con AO en ausencia/presencia de CsA y 3­
MA.  *p<0,05. D. Reacción de TUNEL en retinas de E15.5 tras  cultivo con AO. Barra de escala 50µm. 
E. Cuantificación del número de células TUNEL positivas/mm2 en D. *p<0,05. 

A continuación se determinó si las funciones de la mitofagia en la muerte celular 

y la diferenciación de RGCs están correlacionadas o, por el contrario, se trata de 

173
 



 

 

 

 
 

 

 

 
 
 

procesos independientes. La inhibición de caspasas con BOC no altera la diferenciación 

de RGCs en retinas de E15.5 a nivel basal ni en retinas de E13.5 con autofagia inducida 

por rapamicina, por lo que las funciones de la mitofagia en la muerte celular y en la 

diferenciación asociada a un cambio metabólico parecen ser independientes (Figura 75 

A-D). 

Figura 75.  Los efectos de la mitofagia en la diferenciación de las RGCs son independientes de la 
muerte celular. A. B. Inmunotinción y cuantificación de Brn3a para la detección de RGCs en retinas  en 
plano a E15.5 tras cultivo con BOC. Barra de escala 50µm. C. D. Inmunotinción y cuantificación de 
Brn3a para la detección de RGCs en retinas  en plano a E13.5 tras cultivo con rapa en ausencia/presencia 
de BOC. Barra de escala 50µm. *p<0,05. 

4.5 Mitofagia durante el desarrollo postnatal de la retina 

Una vez determinadas las consecuencias de la mitofagia observada durante el 

desarrollo embrionario de la retina, estudiamos qué ocurre durante el desarrollo 

postnatal. A partir del heatmap sobre la expresión de diferentes reguladores moleculares 

de mitofagia y las PCRs cuantitativas de retinas a diferentes edades, observamos un 

incremento en la expresión de otras vías implicadas en mitofagia, como PINK1, 

Parkina, Fundc1, Optineurina y Smurf1 a partir de P9. Mediante citometría de flujo 

podemos observar un bloqueo de mitofagia en retinas a P9 mediante CsA y 3-MA 

(Figura 76 A). En retinas a P15 el bloqueo solo se obtiene al inhibir autofagia y MAPK 

con U0126, que también están implicadas en mitofagia (Chu et al, 2007; Mao et al, 

2011) (Figura 76 B). El hecho de que a P9 se produzca un incremento drástico en la 

expresión de HIF1α que se mantiene de ahí en adelante (ver figura 64), nos lleva a 

pensar que quizá la hipoxia también este mediando esta segunda oleada de mitofagia 

durante el desarrollo de la retina.  

174
 



 

 

 

  

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

  
  

   
        

Además de la disminución del número de células ganglionares por inhibición de 

mitofagia durante el desarrollo embrionario, se observan alteraciones en la 

axonogénesis. Por ello, la mitofagia a nivel postnatal podría tener relación con la 

apertura del ojo y el establecimiento de las primeras conexiones sinápticas para 

transmitir la información visual. Para este proceso es importante la expresión de 

semaforinas, que como previamente hemos descrito en el heatmap elaborado para la 

expresión de genes reguladores del desarrollo de RGCs (ver figura 49, RGCs), 

incrementa en P9 y P15. No obstante, la mitofagia está detectándose en la retina 

completa, por lo que podría estar mediando también un cambio hacia el metabolismo 

glicolítico característico de los bastones y la glía de Müller. Estas células empiezan a 

diferenciarse en estos estadios postnatales, como podemos observar mediante western 

blot de las proteínas recoverina, para la detección de fotorreceptores,  y GFAP, para la 

detección de las células de Müller (Casson et al, 2013; Young, 1971). (Figura 76C) 

(Ver figura 49, fotorreceptores). 

Figura 76. Mitofagia durante el desarrollo postnatal de la retina. A. B. Determinación del porcentaje 
de masa mitocondrial mediante citometría de flujo de retinas a P9 y P15, respectivamente,  tras cultivo 
con CsA y 3-MA. *p<0,05. C. Western blot para la detección de proteínas de los fotorreceptores 
(recoverina) y de la glía de Müller (GFAP). 

175
 



 

 



 

 

 

 

 

DISCUSIÓN
 



 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DISCUSIÓN 

1. ESTUDIO DEL FLUJO DE AUTOFAGIA EN RETINA  

En esta Tesis Doctoral hemos descrito que en la retina el flujo de autofagia se 

puede determinar tanto in vivo como en ex vivo. La inyección intraperitoneal con 

leupeptina bloquea el flujo basal e inducido por ayuno en retina adulta, demostrando 

que este compuesto atraviesa la barrera hematorretiniana y que la autofagia es un 

proceso activo en la retina adulta (Figura 2 de resultados). El hecho de que podamos 

observar tanto la autofagia basal como la inducida en la retina contrasta con los datos en 

otras partes del sistema nervioso donde la privación de comida en los animales no 

induce autofagia. Esto podría deberse por un lado a que la retina presenta una autofagia 

basal muy elevada y/o a las características metabólicas tan especiales de la retina en 

comparación con el resto del sistema nervioso. Hay que destacar que las células de la 

retina con mayor flujo son las células ganglionares, cuyos axones envían la información 

al cerebro, y los fotorreceptores, las células encargadas de transformar la información 

visual en impulsos nerviosos (Figura 3 de resultados). Esto está de acuerdo con un 

reciente trabajo en el que ven que los fotorreceptores y en concreto los conos son las 

células que presentan mayor incremento de autofagia tras el ayuno (Zhou et al, 2015). 

Además, la retina es un buen modelo para estudiar sistema nervioso, ya que 

puede ser mantenida en cultivos organotípicos así como cultivando el ojo entero del 

embrión donde el flujo de autofagia es fácilmente modulable (Esteban-Martinez & 

Boya, 2015) (Figura 5 de resultados). De esa manera, hemos comprobado que en la 

retina embrionaria, las células ganglionares son las que presentan mayor flujo de 

autofagia (Figura 6 de resultados). Esto podría ser debido a que la autofagia desempeña 

un papel esencial en la diferenciación de este tipo celular mediante la eliminación de 

mitocondrias (Figuras 53, 54 y 66 de resultados), produciéndose la mitofagia 

fundamentalmente en la capa de células ganglionares (Figuras 51 y 52B, C, E de 

resultados). 

La autofagia basal en el sistema nervioso central es un proceso esencial para la 

homeostasis ya que ratones deficientes de autofagia en precursores neurales mueren de 

179
 



 

 

 

 
 

 

 

neurodegeneración en edad temprana (Hara et al, 2006; Komatsu et al, 2006). Por tanto, 

la determinación del flujo de autofagia es importante para estudiar la contribución de 

este proceso en la homeostasis en cada situación, estadio o tipo celular.  

2. 	LA AUTOFAGIA ES ESENCIAL PARA LA 
ELIMINACIÓN DE LAS CÉLULAS APOPTÓTICAS 
DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE LA 
RETINA 

Los procesos de muerte celular son necesarios para un correcto desarrollo de los 

tejidos y ocurren de manera prominente durante el desarrollo embrionario. Nuestros 

datos indican que durante el desarrollo embrionario de la retina de ratón, la autofagia es 

necesaria para mantener unos niveles de ATP intracelulares suficientes para la 

exposición de fosfatidilserina en la superficie de células apoptóticas, lo que permite su 

reconocimiento y degradación por la microglía (Ver figuras 11 y 12 de resultados). El 

metilpiruvato (MP) es un sustrato del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) 

permeable a la mitocondria, capaz de incrementar los niveles de ATP intracelular. El 

hecho de que retinas con autofagia inhibida por tratamiento con 3-MA o deficiencia de 

Atg5, presentan menores niveles de ATP y de que la presencia de MP  en el cultivo 

restaure los niveles de ATP y evite la acumulación de las células apoptóticas en la 

periferia de la retina, indica que los nutrientes obtenidos por la autofagia tienen un 

importante papel en la producción de ATP durante el desarrollo de la retina en dicha 

región. La distribución de la muerte celular fisiológica y tras la inhibición de autofagia 

en retinas de E13.5 está representada en la figura 1.  

180
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1. Fenotipo de la inhibición de autofagia en relación a la muerte celular fisiológica 
localizada en el frente de diferenciación en retinas de E13.5. 

Esta función de la autofagia como proceso productor de ATP se ha observado 

previamente cuando células de ratones Bax-/-/Bak-/- son sometidas a deprivación de 

factores de crecimiento, siendo la autofagia esencial para mantener tanto los niveles de 

ATP como la supervivencia celular en dichas condiciones (Lum et al, 2005). En el caso 

de las retinas, no hemos modulado la muerte por apoptosis directamente, lo que refleja 

la interrelación entre la apoptosis y la autofagia en un contexto fisiológico. El ATP es 

muy importante para la exposición del fosfolípido fosfatidil-serina  en la superficie de la 

membrana externa de las células apoptóticas (Fadok et al, 1992; Venegas & Zhou, 

2007; Verhoven et al, 1999) y los aminoácidos, ácidos grasos libres y carbohidratos 

generados de la degradación lisosomal por autofagia pueden incorporarse en el ciclo de 

Krebs y contribuir a la generación de ATP (Mizushima & Klionsky, 2007; Singh & 

Cuervo, 2011). Por tanto, hemos confirmado un papel metabólico de la autofagia para la 

181
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

eliminación de las células apoptóticas de la retina de ratón en estadios tempranos del 

desarrollo. Estos datos en la retina embrionaria de ratón son similares a los obtenidos en 

estudios previos de nuestro laboratorio en retinas de embriones de pollo (Boya et al, 

2008; Mellén et al, 2008), por lo que podría tratarse de un mecanismo asociado al 

proceso de  muerte fisiológica. Además, también se ha observado que la autofagia es 

necesaria para la exposición de fosfatidil-serina en el proceso de muerte que se produce 

durante la cavitación del embrión, desempeñando un papel en la producción de ATP. En 

todos estos casos mencionados, el tratamiento con metilpiruvato también es capaz de 

revertir el fenotipo (Boya et al, 2008; Mellén et al, 2008; Qu et al, 2007). Por otro lado, 

se ha descrito que el metabolismo es importante durante la diferenciación neuronal 

temprana de progenitores de bulbo olfativo, durante el cual la autofagia contribuye a la 

generación de ATP (Vazquez et al, 2012), por lo que los procesos fisiológicos afectados 

al inhibir autofagia en la retina podrían ser diversos.  

Nuestros datos indican que la inhibición de autofagia solo incrementa la muerte 

celular en el frente de diferenciación, localizado en la periferia de retinas de ratón a 

E13.5, sin afectar a los procesos de muerte celular que se producen en estadios 

posteriores del desarrollo de la retina (Figura 13 de resultados). De nuevo estos datos se 

corresponden con lo observado en la retina de ave (Mellén et al, 2009). Este hecho 

podría deberse a las diferencias en los niveles de masa mitocondrial observadas en 

distintas regiones de retinas a E13.5 (Figuras 34 de resultados y 1 de discusión) así 

como a la disminución de mitocondrias a partir de E15.5 (Figura 42 de resultados), lo 

que explicaría que en aquellas zonas o estadios de menor masa mitocondrial, los 

metabolitos generados por autofagia no se emplean para la generación de ATP mediante 

su incorporación en el TCA. Además, como hemos observado en estadios tardíos del 

desarrollo de la retina se produce un cambio metabólico hacia glicólisis a partir de 

E15.5 (Figura 47 de resultados), lo que resalta la idea de que los metabolitos generados 

por la autofagia no puedan ser incorporados en el TCA para la obtención de energía.   

Por otro lado, es posible que las altas demandas energéticas de las células en 

retinas de E12.5-E13.5 sean responsables del mayor flujo de autofagia que se observa 

en esas edades tempranas y no durante el desarrollo embrionario tardío (E18.5) (Figura 

7 C de resultados). Esto podría reflejar que la autofagia está más activada en 

condiciones en las que contribuye a la producción de ATP y que esta función está 

asociada a situaciones metabólicamente muy activas, no siendo un fenómeno universal. 

Así, la muerte celular fisiológica no se ve afectada por la inhibición de autofagia en 

182
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

otros estadios mas avanzados del desarrollo como las  retinas de E18.5 (Figura 13 de 

resultados). 

Además, hemos observado que la dosis de insulina modula la autofagia en 

retinas de E13.5, siendo mayor su activación cuanto menor es la dosis de insulina o tras 

ayuno de aminoácidos mediante cultivo de retinas en EBSS (Figura 19 de resultados). 

Esta adaptación al ayuno de la autofagia es esencial en el periodo neonatal, durante el 

cual es crítica la interrupción  de suministro de nutrientes a través de la placenta y hay 

una alta tasa metabólica. Así,  ratones deficientes de genes de autofagia, aunque llegan a 

nacer, mueren en los primeros días de vida debido a su inhabilidad de mantener 

suficientes concentraciones de aminoácidos para mantener los niveles de ATP y la 

síntesis de proteínas esenciales (Kuma et al, 2004). Esta hipótesis sobre la función de la 

autofagia como proceso productor de ATP en función de los requerimientos 

metabólicos, se relaciona con  el efecto diferencial de la wortmanina como inhibidor de 

autofagia en retinas embrionarias dependiendo de las condiciones nutricionales del 

cultivo, siendo mayor ante un estrés celular por deprivación de insulina o ayuno de 

aminoácidos (Figura 19 de resultados). El hecho de que en condiciones ricas en 

nutrientes la wortmanina a 6h induce autofagia, se relaciona con lo descrito previamente 

sobre la estimulación de autofagia por tratamiento con 3-MA en medio rico en 

nutrientes, pero en este caso, a tiempos mayores a 6h (Wu et al, 2010). Por ello, en 

nuestras condiciones experimentales de baja dosis de insulina (10nM) y durante 6h, 

hemos considerado la inhibición de autofagia con 3-MA más específica que la 

inhibición con wortmanina, ya que el flujo de LC3 está más inhibido con 3-MA (Figura 

8A de resultados) que con wortmanina en tales condiciones (Figura 19 de resultados). 

Por lo tanto en el caso de realizar cultivos es muy importante conocer las condiciones 

del cultivo y como las retinas responden a diferentes tipos de ayuno. 

En los dos modelos genéticos estudiados, retinas deficientes de Ambra1 y de 

Atg5, hay un incremento de la muerte celular a E13.5 (Figuras 23 y 24 de resultados). 

En retinas deficientes de Atg5, la muerte celular se acompaña de una disminución de los 

niveles de ATP y podría rescatarse en presencia de MP (Figura 24 de resultados), 

destacando el papel metabólico de la autofagia. Por otro lado, en las retinas deficientes 

de Ambra1 en cultivo, hemos observado una disminución de la exposición de fosfatidil­

serina y un incremento de los niveles de muerte celular (Figura 23 de resultados). En 

futuros experimentos, habría que determinar como son los niveles de ATP en retinas 

183
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

deficientes de Ambra1, y si el suplemento con MP rescata los niveles de muerte celular 

observados tras la inhibición genética de autofagia. 

Previamente se ha descrito el rescate del fenotipo de la diferenciación en el 

bulbo olfativo de embriones deficientes de Ambra1 y de Atg5 por tratamiento con  MP 

(Vazquez et al, 2012). No obstante, no descartamos que ese incremento de muerte 

celular se deba también a otros procesos independientemente del bloqueo de la 

fagocitosis y degradación de las células muertas. De hecho, retinas deficientes de Atg5 

presentan un incremento de muerte celular aun mayor en estadios tardíos (E18.5) 

(Figura 71 de resultados), en los que el bloqueo farmacológico de autofagia no afecta a 

la muerte celular (Figura 13 de resultados). En el caso de ratones deficientes para 

Ambra1 producidos por mutagénesis (Ambra1gt/gt), se ha descrito que muestran un 

incremento en la muerte celular en muchas áreas del cerebro en desarrollo (Cecconi & 

Levine, 2008), por lo que parece que además de poder presentar un bloqueo del 

reconocimiento de las células apoptóticas y su degradación lisosomal, la deficiencia de 

Ambra1 induce muerte celular. Estudios previos han demostrado que Parkina, una E3 

ubiquitin ligasa, podría proteger a las neuronas mediante la eliminación por mitofagia 

de mitocondrias dañadas, que son una fuente de estrés oxidativo. La interacción entre 

Parkina y Ambra1 es crucial para este proceso, luego es posible que otra de las 

funciones de Ambra1 en relación con la muerte celular también durante el desarrollo 

del sistema nervioso esté relacionada con la protección frente al estrés oxidativo (Van 

Humbeeck et al, 2011). 

Por otro lado, hay que destacar que la función de la autofagia en el proceso de 

fagocitosis de las células apoptóticas en retinas embrionarias de pollo (Mellén et al, 

2008) es más compleja en retinas de ratón. En retinas de pollo, la fagocitosis de las 

células apoptóticas la realizan las células vecinas, mientras que en ratón, la microglía, 

que ya está presente en la retina en estadios tempranos (Santos et al, 2008), y las células 

vecinas pueden fagocitar a las células apoptóticas. Es posible que en los modelos 

genéticos, las células de la microglía desarrollen estrategias para la fagocitosis de las 

células apoptóticas a pesar de la disminución de la exposición de la fosfatidil-serina. Se 

ha descrito que macrófagos de ratones deficientes de Atg7 específicamente en células 

mieloides presentan un incremento en su contenido bacteriano tras la infección, al 

incrementar la expresión de dos receptores de fagocitosis (Bonilla et al, 2013). Por lo 

que es posible que las células de la microglía de retinas deficientes de Atg5 y Ambra1 

incrementen la expresión de otros receptores de fagocitosis, lo que facilitaría la 

184
 



 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

incorporación de células apoptóticas a partir del reconocimiento de otras señales de 

fagocitosis. Además, en un futuro sería interesante determinar si retinas deficientes de 

Ambra1 y de Atg5 ponen en marcha la fagocitosis asociada a LC3 (LAP). LAP es un 

proceso en el cual los componentes a degradar son englobados en una estructura de una 

membrana mediante la actividad del complejo formado por Beclin1 y Vps34, y de los 

sistemas de conjugación de LC3, sin necesidad de la maduración del autofagosoma de 

doble membrana  (Deretic et al, 2013). Para ello, podríamos cultivar retinas deficientes 

de Atg5 o Ambra1 en presencia de 3-MA y determinar si existen diferencias en la 

muerte observada en estas retinas en ausencia de 3-MA. Además, recientemente se ha 

descrito la necesidad de la proteína Rubicon en el proceso de LAP pero no para 

autofagia (Martinez et al, 2015), por lo que sería interesante comparar el fenotipo de 

muerte celular en retinas deficientes de Rubicon con el fenotipo de retinas deficientes en 

Atg5 y Ambra1.  

En conclusión, la autofagia presenta un papel metabólico en los estadios 

tempranos del desarrollo necesario para llevar a cabo procesos dependientes de energía, 

como la fagocitosis de las células apoptóticas. No obstante, la inhibición crónica de la 

autofagia puede desencadenar mecanismos de compensación para intentar restaurar la 

fisiología celular. 

3. 	LA MITOFAGIA ES ESENCIAL PARA EL 
DESARROLLO DE LA RETINA DE RATÓN 

3.1. Un aumento de NIX regula la mitofagia en retinas a E15.5 

En esta Tesis Doctoral, hemos demostrado la activación del proceso de 

degradación selectiva de las mitocondrias por autofagia en estadios determinados del 

desarrollo. Así, observamos mitofagia fisiológica en la región central de la retina a 

E13.5 y en la retina completa a E15.5, ya que los niveles de masa mitocondrial 

aumentan al inhibir la autofagia con 3-MA, la mitofagia con CsA y en retinas 

deficientes de Atg5 (Figuras 35, 43, 44 y 45 de resultados; figura 2 A de discusión). 

Además nuestros datos indican que este proceso de mitofagia está regulado por hipoxia 

y NIX (Figuras 64-69 de resultados, figura 2 A, B de discusión). Además, durante el 

desarrollo embrionario no se produce un incremento en la expresión de genes 

185
 



 

 

 

 

 

 
 

 

   

 

 

 

implicados en biogénesis mitocondrial (Figura 46 de resultados), resaltando el papel de 

la mitofagia en la homeostasis mitocondrial de la retina. 

Figura 2.  Niveles de masa mitocondrial al bloquear e inducir los procesos de autofagia e hipoxia en 
retinas de ratón a E13.5 y E15.5. A. Situación control fisiológica. B. Inhibición de autofagia con 3-MA 
y en retinas deficientes de Atg5; inhibición de mitofagia con CsA y retinas deficientes de NIX; inhibición 
de hipoxia con FM19G11. C. Activación de autofagia/mitofagia mediante tratamiento con rapamicina y 
EBSS. D. Inducción de hipoxia con DFO. 

Generalmente, NIX está expresado en bajos niveles basales en la mayoría de los 

tejidos. Un incremento de sus niveles de expresión se ha visto asociado a una 

disminución de la masa mitocondrial en procesos fisiológicos como durante el 

desarrollo de la lente (Ashrafi & Schwarz, 2013), la diferenciación de los eritrocitos 

(Kundu et al, 2008; Sandoval et al, 2008; Schweers et al, 2007) y  la generación de 

células NK de memoria (O’Sullivan, 2015). Por tanto, la expresión de NIX está 

incrementada en  situaciones donde desempeña una función en la homeostasis celular 

(Aerbajinai et al, 2003; Galvez et al, 2006; Sowter et al, 2001; Yussman et al, 2002). 

Durante el desarrollo embrionario de la retina, el hecho de que la expresión de NIX 

presente un incremento entre E15.5-E18.5, mientras que otros reguladores conocidos de 

mitofagia lo hacen fundamentalmente a nivel postnatal (Figura 65 B de resultados), 

186
 



 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

sugiere que NIX podría tener un papel diferencial regulando la mitofagia observada 

durante el desarrollo embrionario de la retina de ratón.   

La autofagia puede inducirse por diferentes tipos de estrés celular o vías de 

señalización, como la deprivación de nutrientes, el estrés oxidativo y la hipoxia. Se han 

descrito diferentes factores de transcripción que regulan la expresión de NIX, como 

TFEB, SP1, FOXO3a, E2F1 y HIF1α, y la disminución de miR-137 asociada a hipoxia 

permite la expresión de NIX (Hamacher-Brady & Brady, 2016; Ma et al, 2012). Durante 

el desarrollo embrionario de la retina, hemos observado un  incremento de la expresión 

de genes regulados por el factor HIF1α, como Adm, Egln, AldoA, Pgk1 y Slc2a1 (Figura 

64 de resultados), lo que sugiere que se produce hipoxia durante el desarrollo de la 

retina. Además hemos observado un incremento en FOXO3a a partir de E14.5, y de 

E2F1 a partir de E15.5 (Figura 69 de resultados). Bajo condiciones de hipoxia, 

FOXO3a suprime la expresión de NIX mediada por HIF1-α mediante el cofactor 

CITED2, lo que constituye una regulación negativa compensatoria bajo condiciones de 

hipoxia (Hamacher-Brady & Brady, 2016). Estos datos reflejan que podría haber una 

regulación coordinada y controlada de la expresión de NIX por diferentes factores de 

transcripción, entre los que HIF1α, que se estabiliza bajo condiciones de hipoxia, parece 

ser fundamental en dicha regulación. Estos datos sugieren que un incremento de los 

niveles de hipoxia durante el desarrollo de la retina podría inducir la expresión de NIX 

para regular los niveles de mitocondrias.  

Se ha descrito que la inducción de niveles de HIF1α en células bajo condiciones 

de hipoxia es dependiente de mTORC1 y que se puede revertir mediante su inhibición 

con rapamicina (Brugarolas et al, 2003; Land & Tee, 2007). Nuestros datos indican que 

mTORC1 está activo en retinas a E15.5 (Figura 7 A de resultados) en las que hemos 

detectado la mitofagia, lo que podría reflejar que la inducción de HIF1α en retinas en 

dicho estadio es dependiente de mTORC1. Además, el tratamiento con rapamicina y el 

ayuno de aminoácidos por cultivo en EBSS a E15.5 no induce mitofagia (Figura 74 A 

de resultados; figura 2 C de discusión), lo que podría ser debido a la inhibición de 

mTORC1. Por el contrario, la disminución de la actividad de mTORC1 a E13.5 y E18.5 

observada por blot (Figura 7 A de resultados), podría generar un bucle negativo 

mediante la inducción de la degradación de HIF1α, resultando en la normalización de 

sus niveles con el fin de parar la respuesta aguda a hipoxia (DeYoung et al, 2008). Esto 

explicaría por qué hay un pico de expresión de NIX entre E15.5 y E18.5, siendo su 

expresión menor a E13.5 y posterior a E18.5 (Figura 65 B de resultados). De esa 

187
 



 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

  

manera, podría haber un control estricto de la degradación mitocondrial de las retinas a 

E13.5 para que se produzca únicamente en su región central (Figura 35 de resultados), 

estadio en el cual la masa mitocondrial ya está alterada cuando se modula la hipoxia 

(Figura 68 de resultados; figura 2 B, D de discusión). Por tanto, es posible que en 

estadios previos al pico de mitofagia haya limitaciones de oxígeno en la región madura 

de la retina, donde al igual que en retinas a E15.5, la mitofagia podría estar regulada por 

HIF1α. Teniendo en cuenta esta regulación de HIF1α dependiente de mTORC1, la 

inducción de mitofagia en toda la retina a E13.5 mediante tratamiento con rapamicina 

(Figura 37 de resultados; figura 2 C de discusión) podría indicar que otros mecanismos 

pueden estar implicados en la regulación de la mitofagia inducida por rapamicina. De 

hecho, se ha descrito que análogos de este compuesto activan a PINK1, el cual 

posteriormente recluta a OPTN y NDP52  en la mitocondria en ausencia de Parkina.  

No obstante, el mecanismo por el cual las células regulan la activación de HIF1α 

durante la hipoxia es controvertido. Se ha descrito que se requiere de los ROS 

generados en el complejo III de la cadena de transporte electrónico para la activación de 

HIF1α dependiente de hipoxia (Chandel et al, 2000; Klimova & Chandel, 2008). Bajo 

condiciones óptimas de funcionamiento mitocondrial, las demandas energéticas y la 

disponibilidad de sustratos metabólicos y oxígeno son los determinantes centrales de la 

respiración mitocondrial, de manera que un cambio en la disponibilidad de sustrato o 

una disminución de los niveles de oxígeno podría alterar la función mitocondrial e 

inducir mitofagia. Ante la ausencia de oxígeno, se activan una serie de mecanismos 

adaptativos esenciales para la supervivencia, como un incremento en la expresión de 

HIF1α que disminuye el número de mitocondrias y la generación de nueva vasculatura 

para incrementar la disponibilidad de oxígeno (Klimova & Chandel, 2008).  

El mecanismo que regula la activación de HIF1α y de la mitofagia mediada por 

NIX durante el desarrollo de la retina descrito en esta Tesis Doctoral está 

esquematizado en la figura 3 y se explica a continuación: 

188
 



 

 

 

   

 

  

 

Figura 3.  Señal inductora y mecanismo molecular de mitofagia durante el desarrollo de la retina 
embrionaria de ratón. 

Durante el desarrollo de la retina hemos observado que las retinas a E13.5 son 

metabólicamente muy activas, ya que la respuesta a FCCP no incrementa el consumo de 

oxígeno, lo que indica que las retinas ya están respirando al nivel máximo (Figura 63 de 

resultados; figura 3 (E13.5) de discusión). Esto se correlaciona con los elevados niveles 

de ROS y potencial de membrana mitocondrial en este estadio (Figuras 61A, B y 62 A, 

B de resultados; figura 3 (E13.5) de discusión). Además, hemos observado una 

disminución de ROS a partir de E15.5 que no es debida al proceso de mitofagia 

observado en dicha edad, ya que la deficiencia de Atg5 y la inhibición farmacológica de 

autofagia con 3-MA no alteran los niveles de ROS (Figura 61 C-E de resultados; figura 

3 (E15.5) de discusión). Por el contrario, la inhibición con CsA a E15.5 incrementa el 

189
 



 

 

 

 

 

 

 

 

estrés oxidativo, lo que sugiere que los niveles de ROS están modulándose por cambios 

en la cadena de transporte electrónico mitocondrial (Figura 61 D, E de resultados). 

Estos datos junto con la disminución del potencial de membrana mitocondrial en E14.5, 

previo al pico de mitofagia, indican que hay una alteración mitocondrial que precede a 

la activación de mitofagia (Figura 62 de resultados; figura 3 (E14.5) de discusión). 

Como he mencionado anteriormente, los ROS generados en la cadena de transporte 

electrónico son esenciales para la activación de HIF1α dependiente de hipoxia, por lo 

que esta alteración mitocondrial podría desencadenar la hipoxia observada en retinas a 

E15.5 (Chandel et al, 2000; Klimova & Chandel, 2008). 

La transferencia de electrones a través de los complejos de la cadena de 

transporte electrónico en la membrana interna mitocondrial es esencial para el 

mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial, por lo que la pérdida del 

mismo ya en retinas de E14.5 podría estar relacionada con una alteración de la actividad 

de la cadena de transporte electrónico. En el análisis de la función mitocondrial 

mediante Seahorse, hemos observado que retinas de E14.5 son insensibles a la adición 

de oligomicina y FCCP (Figura 63 B de resultados). Se ha descrito que durante la 

hipoxia/isquemia, la respiración mitocondrial está comprometida y se produce una 

disminución del potencial de membrana mitocondrial (Iijima, 2006). Esto puede 

promover la actividad reversa de la ATP sintasa, que pasa a funcionar como una 

ATPasa, consumiendo ATP y translocando protones desde la matriz mitocondrial hacia 

el espacio intermembrana en un intento de preservar el potencial de membrana. 

(Campanella et al, 2009; Faccenda & Campanella, 2012; Harman et al, 1990; Rouslin & 

Broge, 1993). Esa función reversa de la ATP sintasa puede bloquearse a nivel 

fisiológico mediante un incremento en la expresión del inhibidor IF1 (Campanella et al, 

2008). Durante el desarrollo de la retina, hemos observado un incremento progresivo 

hasta E14.5 en la expresión del inhibidor endógeno de la ATP sintasa IF1. Esto podría 

explicar por qué en dicho estadio las retinas son insensibles a oligomicina (Figura 63 B 

y F de resultados; figura 3 (E14.5) de discusión). El hecho de que la expresión de IF1 

disminuye a E15.5 (Figura 63 F de resultados; figura 3 (E15.5) de discusión) y de que el 

bloqueo con oligomicina incrementa el consumo de oxígeno (Figura 63 C de resultados) 

así como el potencial de membrana mitocondrial (Figura 63 G, H de resultados), sugiere 

que la ATPsintasa funciona en sentido reverso en dicha edad (Figura 3 (E15.5) de 

discusión). Estudios previos han descrito que la unión de IF1 a la ATPasa mitocondrial 

inhibe la hidrólisis de ATP y acelera la disipación del potencial de membrana 

190
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

mitocondrial, facilitando el reclutamiento de PARK2 para la degradación mitocondrial 

(Campanella et al, 2009; Matic et al, 2016).  En nuestro caso, hemos confirmado el 

papel de NIX en la mitofagia durante el desarrollo de la retina, por lo que IF1, hipoxia y 

expresión de NIX podrían funcionar de manera coordinada para inducir finalmente la 

degradación mitocondrial.  

Durante la respiración mitocondrial, el oxígeno puede generar anión superóxido 

(O2
-), el precursor de la mayoría de los ROS a nivel del complejo I y III de la cadena de 

transporte electrónico (Hamacher-Brady & Brady, 2016). La acumulación de ROS 

durante el metabolismo puede ser perjudicial y producir disfunción mitocondrial. Así, se 

ha observado una acumulación de mitocondrias disfuncionales que producen ROS en 

varios tipos de células deficientes de autofagia/mitofagia, como células NK deficientes 

de NIX (O’Sullivan, 2015), por lo que la autofagia es un proceso que juega un papel 

crítico en el mantenimiento de la homeostasis celular mediante la eliminación de 

mitocondrias disfuncionales (Lu et al, 2013). Además, se ha demostrado que el 

incremento de los niveles de ROS resulta en la pérdida del potencial de membrana 

mitocondrial y activación de mitofagia, proceso que se revierte en presencia de 

antioxidantes, por lo que los ROS constituyen una señal de activación de mitofagia 

(Wang et al, 2012). Por tanto, es posible que los altos niveles de ROS en retinas a E13.5 

y E14.5 también estén implicados en la activación de mitofagia a E15.5 (Figura 3 de 

discusión). Para ello, sería interesante modular el estado oxidativo mediante 

antioxidantes y determinar qué ocurre con la mitofagia observada durante el desarrollo 

de la retina.  

Ante una situación de hipoxia, puede no solo haber una limitación de oxígeno 

sino también de nutrientes, lo que podría determinar los niveles de masa mitocondrial 

con el fin de prevenir un malfuncionamiento de la mitocondria. Por ello, las respuestas 

de ayuno deberían llevar a una disminución de la masa mitocondrial (Youle & 

Narendra, 2011), pero la renovación completa de las mitocondrias podría ser perjudicial 

para la célula. En levaduras, el cambio de una fuente de carbono no fermentable a una 

fermentable y mutaciones en la ATP sintasa de la cadena de transporte electrónico, 

inducen mitofagia (Kanki & Klionsky, 2008; Nowikovsky et al, 2007; Priault et al, 

2005). Además, se ha descrito que RAS induce mitofagia como una estrategia de 

supervivencia mediante la activación de glicólisis para suplir el déficit energético 

resultado de la deficiencia de glucosa. En este caso, RAS induce la expresión de 

transportadores de glucosa como GLUT1 y promueve el cambio a metabolismo 

191
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

glicolítico mediante una reprogramación de la expresión génica. Una vez que se activa 

la glicólisis, no se necesita gran cantidad de masa mitocondrial para la producción de 

ATP (Guo et al, 2011). Por otro lado, la estimulación de autofagia en hepatocitos de rata 

por deprivación de suero y glucagón, incrementa la despolarización de las mitocondrias, 

que son englobadas en vacuolas ácidas. Este proceso está inhibido por CsA (He & 

Lemasters, 2005) y se correlaciona con el hecho de que el ayuno de aminoácidos por 

cultivo de retinas a E13.5 en EBSS induce mitofagia que se revierte con CsA (Figuras 

38 de resultados; figura 2 C de discusión). En las retinas a E18.5, el cultivo mediante 

EBSS también produce una disminución de la masa mitocondrial, sin embargo, en este 

caso no se inhibe por CsA (Figura 58 F de resultados), demostrando que el ayuno no 

siempre lleva a una degradación mitocondrial selectiva. Por tanto, la activación de 

autofagia no necesariamente significa que se vaya a inducir mitofagia. Así, el cultivo en 

EBSS no induce mitofagia en retinas a E15.5 (Figura 74 A de resultados), por lo que 

durante el desarrollo de la retina, la degradación mitocondrial basal a E15.5 parece ser 

específica de la limitación de oxígeno.  Además, como he mencionado previamente, la 

macroautofagia constitutiva es insensible a los efectos inhibitorios que mTOR, la 

señalización por insulina, y ciertos aminoácidos ejercen en la macroautofagia inducida 

por ayuno (Yamamoto et al, 2006), por lo que durante el desarrollo de la retina, el 

ayuno de aminoácidos no parece ser la señal inductora de mitofagia basal observada en 

E15.5. Queda por determinar si un ayuno de glucosa si induce esa mitofagia basal. No 

obstante, se ha descrito que las mitocondrias están protegidas durante la autofagia 

inducida por ayuno bajo determinadas circunstancias mediante fusión mitocondrial 

(Gomes et al, 2011). Nuestros datos indican que durante el desarrollo embrionario de la 

retina se produce una ligera disminución en la expresión de mitofusina 2 entre E14.5 y 

E15.5, lo que podría favorecer la mitofagia basal a E15.5 al disminuir la fusión 

mitocondrial. Para confirmarlo, sería interesante determinar los niveles de masa 

mitocondrial en retinas deficientes de mitofusina 2  in vivo y tras cultivo en diferentes 

condiciones de ayuno. 

Por tanto, la mitofagia que se observa durante el desarrollo de la retina está 

regulada NIX, y la señal inductora parece ser la limitación de oxígeno. No obstante, 

también hemos observado un incremento en la expresión de otros reguladores de 

mitofagia, como PINK1, Parkina, Optineurina, FUNDC1, Smurf1… (Figura 65 C)  en 

edades en las que se ha determinado la presencia de mitofagia, por lo que no hay que 

descartar la cooperación de otros mecanismos de regulación de la mitofagia. Existen 

192
 



 

 

 

 

 

 

 

diferentes mecanismos de interrelación entre las vías de mitofagia conocidas hasta le 

fecha. Se ha descrito que NIX prepara a la mitocondria para la degradación por 

mitofagia controlando la localización mitocondrial de Parkina bajo despolarización 

mitocondrial (Ding et al, 2010) y la despolarización mitocondrial con CCCP restaura la 

mitofagia incluso en reticulocitos deficientes de NIX, demostrando la presencia de 

mecanismos de compensación independientes de NIX para mediar mitofagia (Gao et al, 

2015). Por otro lado, el mecanismo por el cual NIX y BNIP3 inducen mitofagia es 

controvertido, ya que puede degradar mitocondrias mediante el dominio LIR y además 

puede promover la despolarización mitocondrial, lo que es suficiente para inducir 

mitofagia (Elmore et al, 2001; Twig et al, 2008). No obstante, la mayoría de los 

procesos de mitofagia en los que están implicados otros reguladores, como PINK1 y 

Parkina, se deben a la necesidad de eliminar mitocondrias ante un daño celular (Lazarou 

et al, 2012; Lemasters, 2005; Narendra et al, 2008; Narendra et al, 2010; Pickrell & 

Youle, 2015; Vives-Bauza et al, 2010; Youle & Narendra, 2011). Por el contrario, 

estudios previos han demostrado que NIX está implicado en procesos de mitofagia 

programada (Kundu et al, 2008; Sandoval et al, 2008; Schweers et al, 2007), por lo que 

NIX parece estar implicado en procesos de mitofagia durante la fisiología de distintos 

tipos celulares. 

Entre las funciones de la mitofagia durante el desarrollo destaca la degradación 

selectiva de las mitocondrias de origen paterno en los oocitos fertilizados, la 

maduración de eritrocitos, de tejido adiposo y de la lente (Ashrafi & Schwarz, 2013). En 

neuronas postmitóticas, el control de calidad de mitocondrias regula varias funciones 

metabólicas vitales como su adecuada distribución en los terminales sinápticos, el 

mantenimiento de la actividad de la cadena de transporte electrónico y la conectividad 

eléctrica (Bereiter-Hahn & Jendrach, 2010; Chen & Chan, 2006; Ferree & Shirihai, 

2012; Misko et al, 2012; Stowers et al, 2002; Verstreken et al, 2005), la protección de la 

integridad del ADN mitocondrial (Parone et al, 2008), apoptosis (Suen et al, 2008), así 

como formación y función de espinas dendríticas y sinapsis (Li et al, 2004).  

En esta Tesis Doctoral hemos comprobado que en retinas a E15.5 se produce 

una situación de hipoxia como consecuencia de una alteración mitocondrial previa, que 

desencadena el incremento de expresión de NIX y la mitofagia en dicho estadio. A 

continuación describo las consecuencias fisiológicas de la mitofagia durante el 

desarrollo de la retina.  

193
 



 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

  
   

 

 

 

3.2. La mitofagia regula la muerte celular fisiológica de la retina en desarrollo 

Nuestros datos indican que la inhibición de mitofagia disminuye la muerte 

fisiológica que se produce en la región central de retinas a E13.5 y en retinas a E15.5. 

Además, el tratamiento con CsA también reduce los niveles de la muerte celular 

generada por inducción de autofagia a E13.5 (Figuras 35, 39, 40, 70 y 72 de resultados; 

figura 4 A-C de discusión). Por otro lado, la muerte celular en todas las situaciones 

descritas más arriba también se bloquea al inhibir caspasas (Figuras 25, 27, 29, 36, 73 

de resultados; figura 4 A, E de discusión), por lo que la mitofagia podría presentar un 

papel promuerte durante el desarrollo de la retina. Sería necesario combinar la 

inhibición de caspasas con la inhibición de la mitofagia para esclarecer la relación entre 

ambos procesos.  

Figura 4. Patrón de distribución de la muerte celular en retinas embrionarias a E13.5 y E15.5 en 
condiciones basales y tras la modulación de la mitofagia y la apoptosis. A. Situación control 
fisiológica. B. Inhibición de autofagia con 3-MA; inhibición de mitofagia con CsA y retinas deficientes 
de NIX; inhibición de hipoxia con FM19G11. C. Activación de autofagia/mitofagia mediante tratamiento 
con rapamicina y EBSS. D. Inducción específica de mitofagia con AO (antimicina A+oligomicina). E. 
Inhibición de caspasas con BOC. 

La autofagia desempeña por lo general un papel citoprotector. La degradación 

mitocondrial puede evitar la acumulación de mitocondrias generadoras de ROS y la 

muerte celular. Sin embargo, un incremento de mitofagia puede degradar las 

mitocondrias funcionales, disminuyendo la capacidad de producir ATP y 

194
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

desencadenando la muerte celular (Shires & Gustafsson, 2015). Esto explicaría la 

disminución drástica de ATP (Figura 32 de resultados) y el incremento de muerte 

celular dependiente de mitofagia observado al inducir autofagia mediante tratamiento 

con rapamicina, AZD y ayuno de aminoácidos en retinas a E13.5 (Figuras 26, 28, 30, 39 

y 49 de resultados; figura 4 B de discusión), cuando el metabolismo depende de la 

respiración mitocondrial (Figura 63 A de resultados; figura 3 (E13.5) de discusión). 

Sería interesante determinar si la disminución de los niveles de ATP por inducción de 

mitofagia con rapamicina y EBSS no se recupera al inhibir caspasas con BOC, lo que 

reflejaría que la autofagia desempeña un papel promuerte mediante la degradación 

mitocondrial en retinas que dependen del metabolismo mitocondrial para la producción 

de ATP. 

Algunos estudios previos han descrito la relación entre la mitofagia y la muerte 

celular. En levaduras, la proteína Uth1p es necesaria para la mitofagia inducida por 

rapamicina y ayuno de nitrógeno, funcionando como un receptor para la degradación 

mitocondrial. Su deleción, así como la de Atg5, protege a las células de la degradación 

mitocondrial por inducción de autofagia (Kissova et al, 2004). Además, la deleción de 

Uth1p protege de un tipo de muerte de tipo apoptótico inducida tras la expresión de la 

proteína proapoptótica Bax, y su ausencia induce resistencia al tratamiento por 

rapamicina cuando las células crecen en condiciones respiratorias (Camougrand et al, 

2003). Por lo que Uth1p presenta una conexión entre apoptosis y mitofagia (Lemasters, 

2005). Estos datos son equiparables a la inducción de mitofagia y muerte celular por 

inducción de autofagia con rapamicina en retinas a E13.5, las cuales dependen de la 

respiración mitocondrial.  En este caso, hemos comprobado que la deficiencia de Atg5 y 

el tratamiento con 3-MA confieren resistencia al tratamiento con rapamicina (Figura 28 

B-E de resultados). Quedaría por determinar si la deficiencia de NIX, que es un receptor 

de mitofagia en mamíferos al igual que Uth1p lo es en levaduras, protege no solo de la 

mitofagia y muerte celular basal observada en retinas a E15.5 (Figuras 66 y 72 de 

resultados; figuras 2 B y 4 B de discusión), sino también de la muerte por inducción de 

autofagia. 

En otras situaciones, como durante la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, 

la deficiencia genética de PINK1 protege frente a la disfunción mitocondrial y la muerte 

celular en las células epiteliales del pulmón. Dicha muerte también se reduce en 

presencia de inhibidores de necrosis o necroptosis, lo que refleja la interrelación entre la 

mitofagia y los mecanismos de muerte celular (Mizumura et al, 2014). Durante este 

195
 



 

 

 

 

 

  

 

 

 

  

 

proceso, la señal inicial para la activación de mitofagia es la bajada del potencial de 

membrana mitocondrial como consecuencia de la disfunción mitocondrial. En el caso de 

la muerte fisiológica durante el desarrollo de la retina, hemos observado un rescate al 

inhibir caspasas con BOC, al inhibir autofagia y al inhibir el MPTP con CsA, por lo que 

la bajada del potencial de membrana mitocondrial parece constituir el mecanismo en 

común de muerte y mitofagia. Sería interesante determinar si la muerte fisiológica de la 

retina también se revierte con inhibidores de necrosis, como la necrostatina. Además, es 

necesario determinar el fenotipo de muerte celular tras la utilización simultánea de BOC 

y 3-MA ó BOC y CsA en retinas a E13.5 y a E15.5 para esclarecer el papel de la 

mitofagia en la muerte celular durante la fisiología de la retina.  

La relación entre la muerte celular y la mitofagia también se ha observado en 

neuronas de mamíferos tras la muerte inducida por MPP+ (Chu et al, 2007). En este 

caso, el tratamiento con la neurotoxina MPP+ induce mitofagia dependiente de MAPK 

y Atg5, Atg7 y Atg8 en células de neuroblastoma SH-SY5Y. Además, la inhibición de 

autofagia protege de la muerte inducida por MPP+. En este contexto, hay que destacar 

que al igual que ocurre en retinas a E15.5 en condiciones basales (Figura 62 de 

resultados; figura 3 (E15.5) de discusión), el tratamiento con MPP+ disminuye el 

potencial de membrana mitocondrial. Por tanto, el descenso del potencial de membrana 

mitocondrial podría constituir la señal en común que relaciona la muerte celular y la 

mitofagia durante el desarrollo de la retina y en otras situaciones donde se ha visto un 

efecto promuerte de la mitofagia. Por otro lado, también se ha descrito un mecanismo de 

promuerte por mitofagia inducida por ceramida independiente de las señales apoptóticas 

mitocondriales y de caspasas (Daido et al, 2004; Hamacher-Brady & Brady, 2016). Sin 

embargo, este no parece ser el caso del papel de la mitofagia en la muerte fisiológica de 

la retina, ya que como previamente he mencionado, también se previene al inhibir las 

caspasas. Por tanto, la mitofagia parece desempeñar un papel promuerte en diferentes 

situaciones, aunque el mecanismo final de muerte celular puede ser diverso.  

En el apartado anterior he explicado como la alteración de la función respiratoria 

mitocondrial, el descenso en el potencial de membrana mitocondrial y la función 

reversa de la ATP sintasa, podrían estar desencadenando la activación de la mitofagia 

mediada por hipoxia y NIX (Figura 3 de discusión). Además, la muerte celular 

fisiológica de retinas a E13.5 y E15.5 se bloquea al inhibir con 3-MA, CsA, FM19G11 

y AO (Figura 4 B y D de discusión). El poro de transición de permeabilidad 

196
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

mitocondrial (MPTP) propociona una vía común que lleva a mitofagia, apoptosis y 

necrosis (Kim et al, 2007). Además, muchos estudios corroboran la integración 

molecular y funcional de la ATPsintasa con la muerte celular (Alavian et al, 2011; 

Matsuyama et al, 1998; Santamaria et al, 2006; Shchepina et al, 2002), cuyo punto de 

no retorno es la permeabilización de la membrana interna mitocondrial mediante 

apertura del denominado poro de transición de permeabilidad (MPTP) (Di Lisa et al, 

2011; Galluzzi et al, 2009). Como mecanismo de supervivencia fisiológico, las células 

pueden incrementar la expresión IF1 para inhibir la ATPasa y evitar la muerte celular 

(Faccenda et al, 2013; Formentini et al, 2012), lo que mimetiza el efecto inhibitorio de 

la oligomicina en la apoptosis de retinas a E13.5 y E15.5 (Figura 41 y 74 D, E de 

resultados; figura 4 D de discusión) (Formentini et al, 2014; Matsuyama et al, 1998; 

Santamaria et al, 2006; Shchepina et al, 2002). Por ello se podría relacionar la 

disminución de la expresión de IF1 con el incremento de muerte celular en retinas de 

E15.5, así como el hecho de que el tratamiento con antimicina+oligomicina disminuye 

la muerte celular en la región central de retinas en E13.5 y en retina completa a E15.5 

(Figura 41 y 74 D, E de resultados). Además, la ciclofilina D, diana de CsA que regula 

la actividad del MPTP, también interacciona y regula la actividad de la ATP sintasa 

(Giorgio et al, 2009), por lo que es posible que la inhibición de la mitofagia  y la muerte 

celular en la región central de retinas de ratón a E13.5 y en retina completa a E15.5 con 

CsA, se deba a una doble función: por prevenir la disminución del potencial de 

membrana mitocondrial y por su unión a la ATPsintasa. No obstante, la inhibición con 

3-MA y FM19G11 también disminuyen el número de células TUNEL positivas (Figuras 

35 y 70 de resultados; figura 4 B de discusión), sugiriendo que la mitofagia inducida por 

la función ATPasa e hipoxia contribuye a la muerte celular. Aunque existe cierta 

controversia sobre el papel de la autofagia inducida por hipoxia en la muerte celular 

(Bellot et al, 2009; Mazure & Pouyssegur, 2010), si que se ha descrito en otros modelos 

(Azad et al, 2008; Song et al, 2012; Zhang, 2008). 

En relación a la muerte dependiente de mitofagia, hay que destacar que retinas 

deficientes de NIX, regulador molecular de la mitofagia en la fisiología de la retina, 

presentan una disminución en la muerte celular (Figura 72 de resultados; figura 4 A de 

discusión). Aunque NIX se describió inicialmente como una proteína proapoptótica 

esencial en la regulación de la muerte celular programada,  varias proteínas 

proapoptóticas incluidas BAX, BAK1, BCL2L1, BCL2L11/BIM o BBC3/PUMA no 

están implicadas en la mitofagia mediada por NIX, por lo que dicho proceso de 

197
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

mitofagia podría ser independiente de las vías proapoptóticas (Zhang & Ney, 2009). 

Existen varios mecanismos por los cuales NIX puede regular la muerte celular: en 

primer lugar,  puede promover la apertura del MPTP, pérdida del potencial de 

membrana mitocondrial, generación de ROS y muerte celular. En segundo lugar, NIX 

pueden unirse a proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 promoviendo la 

interacción entre BAX y BAK. Por último, existe un papel diferencial de NIX en la 

muerte celular en función de su localización. Así, la unión de NIX al ER incrementa la 

concentración de calcio en el ER y su entrada en la mitocondria, produciendo 

finalmente la apertura de MPTP y muerte celular (Zhang & Ney, 2009). Esta muerte 

celular mediada por NIX  localizado en el retículo en contacto con la mitocondria es 

dependiente de ciclofilina D y no requiere de Bax y Bak, mientras que NIX 

mitocondrial induce solo apoptosis dependiente de caspasas sin afectar al MPTP (Chen 

et al, 2010). Teniendo en cuenta estos mecanismos, sería interesante determinar el 

potencial de membrana mitocondrial en retinas deficientes de NIX, de manera que si 

fuera superior al de retinas NIX+/+, podríamos intuir que el mecanismo por el cual NIX 

induce muerte celular es por apertura de MPTP y pérdida del potencial de membrana 

mitocondrial. Además, esto constituiría una señal común a la inducción de mitofagia y 

de muerte celular, y explicaría en parte las diferencias observadas en cuanto a muerte 

celular entre las retinas deficientes de NIX y las deficientes de Atg5, las cuales 

presentan un incremento en el potencial de membrana mitocondrial y mayor muerte 

celular (Figuras 62 D, E y 71 de resultados). Por otro lado, sería también interesante 

determinar si un incremento en la interacción entre NIX y ER, o bien un incremento en 

los niveles de calcio a nivel de la mitocondria, disminuirían aun mas el potencial de 

membrana mitocondrial y la masa mitocondrial en retinas a E15.5, lo que iría en 

relación con el mecanismo descrito por Zhang y Ney (Zhang & Ney, 2009). No 

obstante, a pesar de sus funciones proapoptóticas, NIX y BNIP3 están altamente 

expresados en varios tejidos sin inducir muerte celular (Diwan et al, 2007). Por lo tanto, 

probablemente se requiere de señales adicionales para la inducción de muerte celular 

mediada por NIX y BNIP3 (Webster et al, 2005).  

Por tanto, BNIP3 y NIX presentan una función dual, ya que pueden activar 

muerte celular pero también participan en la inducción de autofagia (Zhang & Ney, 

2009). Como he mencionado previamente, la inducción de autofagia puede ser 

beneficiosa, pero en ciertas circunstancias está asociada con muerte por autofagia. En 

este sentido, no está claro si la muerte es debida a un exceso de autofagia/mitofagia o a 

198
 



 

 

 

 

 

 

 

  
 

 
 

 

una función proapoptótica de NIX (Zhang & Ney, 2009). Es posible que ambos 

procesos estén relacionados, ya que la función inductora de muerte de NIX, que está 

mediada por una despolarización mitocondrial, podría servir también como un evento 

que induce mitofagia. Esto corrobora la inhibición de mitofagia y muerte celular 

mediante tratamiento con CsA (Figuras 35 y 70 de resultados; figura 4 B de discusión). 

Sería interesante determinar los niveles de masa mitocondrial y muerte celular en retinas 

deficientes de NIX tras cultivo con 3-MA y CsA, para poder confirmar la relación entre 

la muerte celular y la mitofagia mediada por NIX en retinas a E15.5.  

Pero por otro lado, también es posible que ambos procesos sean independientes. 

De hecho, la muerte celular observada en la región central de retinas en E13.5 y en toda 

la retina en E15.5 no se bloquea en retinas deficientes de Atg5 (Figura 71 de 

resultados). No obstante, esto podría reflejar otras funciones del proceso de autofagia, 

no selectiva, o bien otras funciones de Atg5 independientes de autofagia (Codogno et al, 

2011), ambas necesarias para la supervivencia celular. Por otro lado, hemos confirmado 

que la mitofagia podría constituir un mecanismo de muerte durante el desarrollo de la 

retina, ya que la inducción de autofagia en estadios tempranos (E13.5) reduce la masa 

mitocondrial e induce muerte celular (Figuras 37-40 de resultados; figura 4 B de 

discusión), revirtiéndose ambos procesos mediante inhibición de autofagia y de 

mitofagia. En este estadio, el incremento de muerte observado en retinas tratadas con 

rapamicina, no se observó en retinas deficientes de Atg5 (Figura 28 D, E de resultados).  

Con todos estos datos podemos concluir que la mitofagia y la muerte celular son 

dos procesos activos durante el desarrollo de la retina, pero se necesitan experimentos 

adicionales para discernir si se trata de dos procesos independientes o interrelacionados. 

Además, queda por esclarecer la función exacta de NIX en la muerte celular.  

3.3. La mitofagia induce un cambio metabólico durante  	el desarrollo de la retina 
de ratón 

En un estudio reciente en colaboración con el grupo de Marcos Malumbres 

(CNIO), hemos demostrado que la mitofagia es necesaria para un cambio metabólico 

hacia glicólisis durante el arresto mitótico (Domenech et al, 2015; Esteban-Martinez et 

al, 2015). En esta Tesis Doctoral, hemos estudiado el papel metabólico de la mitofagia 

observada durante el desarrollo de la retina, ya que en el año 1931 Warburg ya describió 

que este tejido en ratones adultos presenta un perfil metabólico caracterizado por la 

generación de ATP mediante la conversión de piruvato a lactato (Warburg, 1931). Para 

199
 



 

 

 

  

 

 

 

ello hemos estudiado el metabolismo de la retina durante el desarrollo y hemos 

determinado los cambios metabólicos que se producen al modular la mitofagia que se 

produce en retinas a E15.5. 

Nuestros datos indican que a lo largo del desarrollo embrionario, se produce un 

cambio metabólico en la retina a partir de E15.5, en el cual se incrementan los 

metabolitos de la glicolisis y la producción de lactato, así como la expresión de enzimas 

glicolíticas (Figura 47 A, B, E, F de resultados). La mitofagia en retinas a E15.5 es 

responsable de esa reprogramación metabólica, ya que su inhibición disminuye la 

producción de lactato y la expresión de enzimas glicolíticas como Pfkfb3, Hk2, Gapdh y 

Pkm (Figura 47 C, D, G). Así, la degradación de mitocondrias puede acelerar la 

glicólisis, como se ha observado durante la transformación oncogénica y en células 

pluripotentes, ambas con elevada actividad glicolítica necesaria para el mantenimiento 

de su alta proliferación (Berridge et al, 2010; Jose, 2011; Liu et al, 2010; Lock et al, 

2011). Además, la inducción de mitofagia mediada por MUL1 juega un papel en la 

modulación del balance energético del músculo esquelético (Lokireddy et al, 2012).  Por 

tanto, son varias las evidencias que sugieren que la mitofagia puede regular el 

metabolismo, lo que podría tener consecuencias no solo en la función celular en las 

situaciones mencionadas, si no también durante el desarrollo de la retina. Esta hipótesis 

la voy a discutir a partir de la Figura 5 (de discusión). 

200
 



 

 

 

   
 

 
  

 

 

 

Figura 5.  Reprogramación metabólica mediada por mitofagia en retinas a E15.5 y sus posibles 
efectos sobre la proliferación y diferenciación celular. La mitofagia mediada por hipoxia y NIX 
produce un cambio metabólico hacia glicolisis, que podría tener consecuencias en el desarrollo de la 
retina. Las líneas discontinuas representan mecanismos adicionales que podrían incrementar la glicólisis.  

En primer lugar, hay que mencionar que es posible que se produzcan varios 

mecanismos simultáneos para activar la glicolisis durante el desarrollo de la retina. Al 

igual que en otros tipos celulares como los macrófagos (O'Neill & Hardie, 2013), 

HIF1α podría estar modulando directamente el metabolismo en retinas embrionarias 

además de la mitofagia. Sin embargo, el hecho de que la inhibición de mitofagia 

disminuye la expresión de enzimas glicolíticas a E15.5 (Figura 47 G de resultados), nos 

lleva a plantear que la mitofagia, activada como consecuencia de la hipoxia, es un 

proceso clave en el cambio metabólico a partir de E15.5 (Figura 5 de discusión). 

Además, esos cambios de expresión génica tras la inhibición de autofagia/mitofagia en 

retinas a E15.5, se ponen de manifiesto con una reducción en la acidificación por 

producción de lactato (ECAR) determinado mediante seahorse en retinas a dicha edad 

201
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

(Figura 47 C, D), demostrando la alteración de la función metabólica a nivel fisiológico 

por inhibición de mitofagia.  

Aunque el cambio metabólico hacia glicólisis lo observamos en retina completa 

a partir de E15.5 (Figura 47 A de resultados), tras el pico de mitofagia (Figuras 43 y 44 

de resultados), es posible que en retinas a E13.5 también se esté iniciando una 

preferencia por la glicólisis en la región central de la retina, donde la mitofagia también 

está activa. (Figura 35 de resultados; figura 2 A de discusión).  

Otro mecanismo que puede estar participando en el cambio metabólico que 

hemos descrito en la retina embrionaria es a través de la actividad de mTOR. Para 

mantener el crecimiento celular mTOR estimula la entrada de glucosa al incrementar la 

presencia y actividad del transportador de glucosa Glut1 (Slc2a1) en la membrana 

plasmática (Duvel et al, 2010; Edinger & Thompson, 2002; Wieman et al, 2007). En 

retinas a E15.5, S6 está fosforilado, reflejando la activación de mTOR (Figura 7 A de 

resultados). Además, mediante el estudio transcriptómico, podemos observar un 

incremento en la expresión del gen del transportador de glucosa (Slc2a1) a partir de 

E15.5 (Figura 47 E, F de resultados). Por otro lado, se ha descrito que mTORC1 

incrementa el flujo glicolítico vía transcripción de genes glicolíticos mediada por HIF1α 

(Duvel et al, 2010). Estos datos nos inducen a pensar que podrían estar activándose 

varias vías de señalización simultáneamente para favorecer el incremento de glicolisis 

observado en retinas a E15.5 (Figura 5 de discusión). Estos datos podrían resultar 

contradictorios, ya que mTOR inhibe autofagia. Sin embargo, este hecho es consistente 

con lo encontrado en numerosas líneas tumorales donde altos niveles de autofagia se 

encuentran en presencia de activación de mTOR (Guo et al, 2011). Además, la 

inhibición de mTORC1 no es un prerrequisito para mitofagia en todas las circunstancias 

(Melser et al, 2013), por lo que es posible que esa acción de mTOR dependa de las 

circunstancias metabólicas o no afecte en gran medida a la degradación selectiva de 

mitocondrias. Además, tanto la macroautofagia constitutiva como inducida comparten 

la misma maquinaria Atg pero diferente regulación (Yamamoto et al, 2006), de manera 

que la macroautofagia constitutiva es insensible a los efectos inhibitorios que mTOR. 

Hay que destacar también que BNIP3 y NIX previenen la activación de mTORC1 al 

unirse directamente e inactivar al activador de mTOR Rheb (Li et al, 2007), por lo que 

existe una interrelación entre los diferentes mecanismos que pueden regular el cambio 

metabólico hacia glicólisis. 

202
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

Un metabolismo preferentemente glicolítico presenta principalmente tres 

beneficios (Vander Heiden et al, 2009): 1. Capacidad de generar suficiente ATP en 

hipoxia. 2. Un metabolismo que facilita la incorporación de aminoácidos y ácidos 

grasos en estructuras celulares nuevas para el crecimiento celular y tisular, más que para 

ser metabolizados para la producción de energía. 3. Evitar la generación tóxica de ROS 

(Figura 5 de discusión). Todo esto podría ser importante para el mantenimiento de los 

progenitores proliferativos y la diferenciación de la retina, ya que el cambio metabólico 

lo hemos observado en estadios en los que confluyen procesos de proliferación (Figura 

7 A, PCNA y 49 A de resultados) y de diferenciación temprana (Figura 49 B-G de 

resultados). Para ello se requiere no solo de ATP, sino también de precursores 

biosintéticos derivados de la glicólisis y la ruta de las pentosas fosfato para generar 

poder reductor (NADPH). De ese modo, el incremento de glicólisis podría no solo 

favorecer la diferenciación temprana de la retina mediante la generación de neuronas 

protegidas frente al estrés oxidativo, sino también el mantenimiento de los precursores 

que van a dar lugar a los tipos celulares de la retina que se diferencian tardíamente. 

(Figura 5 de discusión). Esto podría explicar por qué a pesar de que la disminución de 

masa mitocondrial se produce fundamentalmente en la capa de células ganglionares, que 

son el primer tipo celular diferenciado en la retina (Figura 49 B-G de resultados) (Gao 

et al, 2014), observamos la activación de mitofagia en la retina completa. (Figura 51 de 

resultados). 

Por tanto, el cambio metabólico hacia glicolisis mediado por mitofagia durante 

el desarrollo de la retina podría tener consecuencias fisiológicas en células proliferativas 

y diferenciadas (Figura 5 de discusión). No obstante, no descartamos que en la retina se 

vuelva a producir posteriormente un metabolismo dependiente de la fosforilación 

oxidativa. En relación a esta hipótesis, se ha descrito que durante la maduración 

cardiaca perinatal en ratón, se produce una pérdida de sustratos de carbohidrato a través 

de la placenta, lo que promueve una transición hacia un metabolismo dependiente de 

ácidos grasos (Bartelds et al, 2000). Para que se produzca ese cambio en el 

metabolismo, es necesaria la eliminación de mitocondrias vía mitofagia y posterior 

incremento en la expresión de genes implicados en la biogénesis mitocondrial (Lehman 

et al, 2000). De manera similar, durante el desarrollo de la retina se produce un 

incremento en la expresión de Ppargc1α posterior al pico de mitofagia en E15.5 (Figura 

de 46 A, C de resultados), lo que podría reflejar un incremento de biogénesis 

mitocondrial para llevar a cabo un metabolismo dependiente de fosforilación oxidativa 

203
 



 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

en estadios tardíos del desarrollo. En este caso, sería interesante determinar la 

preferencia de la retina por diferentes sustratos (aminoácidos, carbohidratos, ácidos 

grasos…) antes y después del proceso de mitofagia. El hecho de que tanto  mitofagia 

como biogénesis mitocondrial ocurran simultáneamente en la célula, podrían parecer 

efectos contradictorios, pero por otro lado, podrían reflejar un papel en el control de 

calidad mitocondrial, porque la biogénesis mitocondrial acoplada a una mitofagia activa 

podría repoblar las mitocondrias funcionales, resultando en la restauración de una 

población sana de mitocondrias (Fu et al, 2008).  

3.4. La mitofagia regula la diferenciación de las células ganglionares de la retina 

Una vez descrita la activación de la mitofagia y su implicación en la 

reprogramación metabólica durante el desarrollo de la retina, hemos querido entender su 

función en relación con la diferenciación celular. Para ello, hemos modulado la 

mitofagia y la glicolisis y hemos determinado qué ocurre con la diferenciación de las 

células ganglionares de la retina, ya que el proceso de mitofagia y el cambio metabólico 

lo hemos observado en estadios en los que se diferencia este tipo celular (Figuras 43, 

44, 47 y 49 de resultados). Todo el estudio de diferenciación de células ganglionares 

(RGCs) se ha basado en inmunotinción utilizando el anticuerpo frente al factor de 

transcripción específico de ganglionares Brn3a, y frente a β-III-tubulina. Nuestros datos 

indican que el cambio metabólico asociado al proceso de mitofagia es esencial para la 

diferenciación de este tipo celular (Figura 6 de discusión).  

204
 



 

 

 

 

 
 

  

 

 

 

 

 

Figura 6.  Regulación de la diferenciación de RGCs mediante mitofagia y metabolismo. El esquema 
refleja la inmunotinción de Brn3a. La inhibición de autofagia/mitofagia disminuye la diferenciación de 
RGCs en la periferia de la retina de E15.5, región menos madura. Por otro lado, la inhibición de la 
glicólisis disminuye la el número de RGCs en la región central más madura de la retina de E15.5 así 
como en retinas de E18.5. 

La inhibición de autofagia/mitofagia produce  una disminución en la 

diferenciación de células Brn3a positivas en la región periférica de la retina a E15.5, 

donde se localizan las neuronas ganglionares recién diferenciadas (Figuras 53 A, B, E y 

54 A, B, C; figura 6 de discusión). Esto plantea la posibilidad de que la mitofagia sea un 

proceso asociado al proceso de diferenciación, pudiendo afectar a los progenitores en su 

última división mitótica o bien a la neurona recién generada. Esta hipótesis se 

correlaciona con el menor el número de mitocondrias por célula en la capa de RGCs 

observado mediante microscopía electrónica en ojos de embriones a E15.5 (Figura 52 

A-C de resultados). 

205
 



 

 

 

 

 

 

 

 

En cualquier caso, ese proceso de mitofagia es necesario para producir un 

cambio metabólico esencial para la diferenciación de las células ganglionares en la 

región más madura de la retina y en estadios embrionarios tardíos. Por ello, la 

inhibición de glicólisis disminuye el número de células Brn3a positivas 

fundamentalmente en la región central de la retina de E15.5 (Figura 55 de resultados; 

figura 6 de discusión), así como en retinas de E18.5 (Figura 58 C de resultados; figura 6 

de discusión), sin afectar a la diferenciación de retinas a E13.5 en las que aun no se ha 

producido un cambio metabólico (Figuras 47 y 54 de resultados; figura 6 de discusión). 

Puesto que ni la inhibición de mitofagia ni de glicólisis altera la diferenciación temprana 

de RGCs en retinas de E13.5 (Figuras 54 y 55 de resultados; figura 6 de discusión), 

deben existir mecanismos adicionales que inician la generación de RGCs en dicho 

estadio. No obstante, como he mencionado anteriormente, la mitofagia ya está activa en 

la región central de retinas a E13.5 (Figura 2 A, B de discusión), por lo que es posible 

que la activación de mitofagia no siempre implique un cambio metabólico hacia 

glicólisis. 

Estudios previos han demostrado que la mitofagia es necesaria para procesos de 

diferenciación celular, como durante la maduración de eritrocitos, la diferenciación del 

tejido adiposo blanco y de linfocitos T, así como durante la osteoclastogénesis. Ratones 

deficientes de NIX presentan eritrocitos con mitocondrias. Por otro lado, ratones 

deficientes de Atg5 y Atg7 no presentan la eliminación de mitocondrias ni completan el 

proceso de diferenciación del tejido adiposo (Baerga et al, 2009; Singh et al, 2009; 

Zhang et al, 2009). Además, tanto Atg5 como Atg7 son cruciales para la diferenciación 

de linfocitos T en ratones (Lu et al, 2013; Stephenson et al, 2009) y Bnip3 inducido por 

hipoxia es esencial para la osteoclastogénesis (Zhao et al, 2012). Todos estos estudios 

destacan la relevancia del proceso de mitofagia en la diferenciación celular.  

Durante la diferenciación de eritrocitos, la deleción de NIX no altera el número 

de progenitores hematopoiéticos lo que se correlaciona con el hecho de que esas células 

no diferenciadas no sufren apoptosis (Pecci et al, 2003; Testa et al, 1996). En el caso de 

la retina, la muerte celular temprana que en ratón tiene lugar alrededor de E13.5, es un 

proceso asociado a la diferenciación celular que afecta tanto a células progenitoras 

como a recién diferenciadas (Boya & de la Rosa, 2005; de la Rosa & de Pablo, 2000; 

Yeo & Gautier, 2004). En este trabajo hemos descrito la implicación del proceso de 

mitofagia en esa muerte neural temprana (Figura 35 de resultados; figura 4 A, B de 

discusión). Sin embargo, las funciones de la mitofagia en la muerte celular y la 

206
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

diferenciación de RGCs parecen ser independientes, ya que la inhibición de la mitofagia 

no altera la diferenciación de RGCs en retinas a E13.5 (Figura 54 de resultados; figura 6 

de discusión). En el caso de la muerte dependiente de mitofagia en retinas a E15.5 

(Figuras 70 A, B y 72 de resultados; figura 4 A, B de discusión), no hemos 

determinado a qué tipo celular está afectando, pero la proporción de células de doble 

tinción tunel-brn3a no cambia significativamente, por lo que la muerte podría estar 

produciéndose en células proliferativas o recién diferenciadas que aun no expresen 

Brn3a. 

Por tanto, es posible que la mitofagia observada en la retina tenga una doble 

función, cada una de ellas afectando a distintas poblaciones celulares: participar en el 

proceso de muerte fisiológico que tiene lugar en retinas a E13.5 (en la región central) y 

a E15.5, y regular un cambio metabólico necesario para la diferenciación de células 

ganglionares a partir de E15.5. Esta idea se refuerza por el hecho de que la inhibición de 

la apoptosis con BOC (Figuras 73 y 27 B-D de resultados; figura 4 E de discusión) no 

altera la diferenciación de RGCs en retinas de E15.5 a nivel basal ni en retinas de E13.5 

con mitofagia inducida por rapamicina (Figura 75 de resultados). No obstante, son 

necesarios experimentos adicionales para confirmar si la muerte por mitofagia y la 

diferenciación asociada a la degradación mitocondrial y cambio metabólico, son dos 

procesos relacionados o independientes durante el desarrollo de la retina.  

Por otro lado, hemos determinado qué ocurre con la diferenciación de células 

ganglionares cuando inducimos mitofagia de cuatro maneras diferentes. (Figura 7 de 

discusión). 

Figura 7.  Efectos en la diferenciación de RGCs al inducir mitofagia con diferentes estímulos en 
retinas de embriones a E13.5.  

La inducción de mitofagia por rapamicina incrementa la diferenciación de RGCs 

en E13.5 (Figura 59 de resultados; figura 7 de discusión). Este efecto es similar al 

207
 



 

 

 

 

 

 

 

  

incremento de la generación de células T-CD8 de memoria durante la fase de 

contracción tras la infección con LCMV por tratamiento con rapamicina (Araki et al, 

2009), fase durante la cual se produce mitofagia mediada por NIX en células NK 

(O’Sullivan, 2015). Estos datos muestran que el incremento de la degradación 

mitocondrial por inducción de autofagia puede favorecer o acelerar procesos 

fisiológicos dependientes de mitofagia. Además, la inducción de mitofagia mediada por 

hipoxia mediante DFO también incrementa la diferenciación de las RGCs en E13.5 y 

E15.5 (Figuras 67 y 68 de resultados; figura 7 de discusión). Es posible que esa 

activación de mitofagia al inducir hipoxia se deba a un incremento en la expresión de 

NIX/BNIP3, como se ha descrito en la inducción de hipoxia mediante CoCl2 en una 

línea de células ganglionares, RGC-5 (Yang et al, 2012), y mediante tratamiento con 

DFO en diferentes líneas celulares (Park et al, 2013). Por tanto, la inducción de una 

mitofagia mediada por NIX parece acelerar o favorecer procesos dependientes de esa 

mitofagia en condiciones basales. Para confirmarlo, habría que determinar el 

mecanismo molecular por el cual el tratamiento con rapamicina induce mitofagia en 

retinas a E13.5. 

Por otro lado, el cultivo de retinas a E13.5 en EBSS  no incrementa la 

diferenciación de células ganglionares (Figura 60 A, B de resultados; figura 7 de 

discusión), a pesar de inducir mitofagia en dicho estadio (Figura 38 de resultados; figura 

2 C de discusión). Es posible que este efecto se deba a que el ayuno de aminoácidos esté 

induciendo una mitofagia mediada por otro mecanismo molecular diferente a NIX. De 

hecho, se ha descrito que el tratamiento con EBSS tras someter a una condición de 

hipoxia disminuye los niveles de proteína de Bnip3 y NIX al inducir su degradación por 

macroautofagia (Park et al, 2013). Como he mencionado anteriormente, es posible que 

ya en retinas de E13.5 exista cierto grado de hipoxia en la región central, por lo que el 

ayuno de aminoácidos en dicho estadio podría estar favoreciendo la degradación de 

NIX, activándose otros mecanismos para inducir mitofagia. Además, se ha demostrado 

que esa degradación de Bnip3 y NIX por autofagia depende de la inhibición de 

mTORC1, aunque el efecto se ha observado fundamentalmente ante un ayuno de 

aminoácidos y no por tratamiento con rapamicina (Park et al, 2013). Estos datos podrían 

explicar las diferencias observadas en el efecto en diferenciación de RGCs en retinas a 

E13.5 al inducir mitofagia con EBSS y rapamicina.  

De igual manera, como se observa en el blot realizado con retinas en diferentes 

estadios embrionarios y postnatales (Figura 7 A de resultados), S6 está fosforilado en 

208
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 
 
 

retinas a E15.5, por lo que mTOR está activo y podría estar evitando la degradación de 

NIX por autofagia en este estadio en el que hemos observado mitofagia basal 

dependiente de NIX. 

En el caso de la mitofagia inducida por la combinación de antimicina y 

oligomicina (AO) en retinas a E13.5, se produce una disminución del número de RGCs 

en toda la retina, siendo este efecto independiente de mitofagia o de MPTP, ya que no se 

revierte con CsA (Figuras 41 A-C y 60 C, D; figura 7 de discusión). Se ha descrito que 

la mitofagia inducida por AO está mediada por PINK1-Parkina (Youle & Narendra, 

2011), por lo que de nuevo el hecho de que AO no aumente la diferenciación de RGCs 

puede deberse a que no sea una mitofagia mediada por NIX.  

Por tanto, un hecho importante a tener en cuenta es que el tipo estímulo 

empleado para inducir mitofagia puede tener diferentes consecuencias en la respuesta 

neuronal a mitofagia. Puede ser que las diferencias observadas en la diferenciación de 

RGCs al inducir mitofagia con distintos estímulos sean debidas a la activación de 

diferentes reguladores moleculares de mitofagia. Esto lleva a plantear la cuestión del 

hecho de si la mitofagia, sea cual sea el mecanismo por el cual se lleva a cabo o el 

estímulo que le induce, puede tener las mismas consecuencias fisiológicas o no. Para 

confirmar si el incremento en diferenciación de RGCs al inducir mitofagia solo se 

produce cuando esa mitofagia está mediada por NIX, habría que determinar el 

mecanismo molecular de la mitofagia inducida por rapamicina, EBSS y AO en retinas a 

E13.5. Esto estaría en relación con el papel de NIX, y no de otros reguladores 

moleculares, en la degradación mitocondrial durante diferentes procesos fisiológicos 

mencionados anteriormente, y entre los que podemos incluir la diferenciación de las 

células ganglionares de la retina. 

Por último, es posible que las diferencias entre los distintos estímulos inductores 

de mitofagia se deban a que sus efectos sean diferentes en el metabolismo celular. Para 

confirmarlo, habría que realizar un análisis metabólico mediante metabolómica y 

seahorse de retinas a E13.5 tras el cultivo con los estímulos empleados en la figura 7 de 

este apartado.  

3.5. Mitofagia durante el desarrollo postnatal de la retina 

En esta tesis doctoral solo nos hemos centrado en la diferenciación temprana de 

las células ganglionares de la retina, ya que el pico de mitofagia observado durante el 

desarrollo embrionario se produce en estadios en los que principalmente se diferencia 

209
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

este tipo celular (Figuras 43, 44 y 49 de resultados). Además, al estudiar el flujo de 

autofagia en retinas embrionarias mediante cultivo con HCQ para bloquear la 

degradación lisosomal, observamos que la autofagia está principalmente activada en la 

capa de células ganglionares (Figuras 5 y 6 de resultados) (Esteban-Martinez & Boya, 

2015). 

No obstante, mediante cultivo en presencia de CsA y 3-MA hemos determinado 

que la mitofagia se vuelve a activar en estadios postnatales, en concreto a P9 y P15 

(Figura 76 A, B de resultados). El estudio de autofagia in vivo mediante la inyección 

intraperitoneal de leupeptina en ratones adultos, muestra un incremento de los niveles 

de fluorescencia de GFP-LC3 también en la capa de células ganglionares (Figuras 2-4 

de resultados). Por ello, es posible que la mitofagia observada en retina postnatal 

contribuya a la maduración de las RGCs, proceso que culmina con el establecimiento de 

las conexiones sinápticas con núcleos superiores del cerebro (Gao et al, 2014). Para ello 

es importante la expresión de semaforinas (Gao et al, 2014), que como hemos descrito 

en el heatmap elaborado para la expresión de genes reguladores del desarrollo de RGCs 

(Figura 49 de resultados, RGCs), incrementa en P9 y P15. Un gran número de 

mitocondrias residen en las sinapsis terminales, ya que éstas dependen en gran medida 

de energía (Schon & Przedborski, 2011). Además, la mitofagia es un proceso muy 

importante en neuronas, ya que permite proporcionar mitocondrias sanas en los 

procesos distales donde generan energía suficiente y capacidad de reservorio de calcio 

necesario para la transmisión sináptica (Amadoro et al, 2014). Aunque la degradación 

mitocondrial se produce fundamentalmente en los somas (Ashrafi & Schwarz, 2013), 

también se ha observado una degradación local de mitocondrias despolarizadas en los 

axones antes de su transporte al soma (Wang et al, 2011), por lo que es posible que la 

mitofagia observada a P9 y P15 contribuya al establecimiento de las primeras sinapsis 

de las RGCs con el cerebro. Este hecho se relaciona con la alteración de la axonogénesis 

temprana en retinas embrionarias con la autofagia/mitofagia inhibida (Figuras 53 y 54 

de resultados). 

No obstante, nuestro método basado en citometría de flujo (Mauro-Lizcano et al, 

2015) solo permite la detección de mitofagia en la retina completa, por lo que podría 

estar afectando también a otros tipos celulares de la retina. A nivel postnatal, los picos 

de mitofagia observados se corresponden con la apertura del ojo en el ratón, por lo que 

la exposición a la luz, así como los ROS generados como consecuencia, podría inducir 

la expresión de otras vías de mitofagia, implicadas en la degradación de mitocondrias 

210
 



 

 

 

  

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

dañadas. Dado que los fotorreceptores son las células encargadas de detectar y convertir 

la luz en señales visuales, es posible que ese mitofagia postnatal afecte principalmente a 

este tipo celular. De hecho, mediante el estudio del flujo de autofagia in vivo de retinas 

adultas, hemos observado la activación de autofagia principalmente en la capa de 

fotorreceptores (Figura 3 de resultados). Este dato junto con el hecho de que en estadios 

postnatales se produce la diferenciación de fotorreceptores (Figura 49 E de resultados), 

nos hace pensar que la mitofagia podría estar modulando también el cambio hacia un 

metabolismo glicolítico, característico de los fotorreceptores (Casson et al, 2013; 

Warburg, 1956; Winkler, 1981). 

Los conos son las células encargadas de de la visión en color y la percepción 

visual en condiciones de luz. Este tipo de fotorreceptores deben generar mayores niveles 

de ATP en comparación con los bastones (Chertov et al, 2011; Nihira et al, 1995; 

Okawa et al, 2008; Perkins et al, 2004), para lo que la autofagia podría estar implicada 

mediante la generación de metabolitos que se incorporan en el ciclo de Krebs, como 

hemos descrito en retina embrionaria (Figura 12 de resultados). Además, conos 

deficientes de Atg5 presentan una acumulación de mitocondrias dañadas e incremento 

de ROS tanto en condiciones basales como ante un daño por luz, y finalmente muerte 

celular, sin afectar a la viabilidad y función de los bastones (Zhou et al, 2015). Estos 

datos confirman la importancia de la mitofagia para mantener unas mitocondrias sanas 

para mantener las altas demandas energéticas de los conos durante la función visual. 

4. 	EL CAMBIO METABÓLICO REGULA LA 
DIFERENCIACIÓN CELULAR 

La diferenciación de las células ganglionares sigue un patrón centro-periférico y 

es probable que los progenitores localizados adyacentes a las neuronas diferenciadas en 

la región central estén expuestos a diferentes señales que los progenitores localizados en 

la periferia, lejos del frente de diferenciación. En este sentido, se conoce que existen 

diferencias en la expresión génica entre estas dos regiones de la retina (Adler & Canto-

Soler, 2007; Koso et al, 2006; Koso et al, 2007). Por ello, no resulta sorprendente que la 

modulación de mitofagia afecte fundamentalmente a la diferenciación temprana (Figura 

54 A-C de resultados; figura 6 de discusión), mientras que la inhibición de la glicolisis 

con 2-DG y 3-PO afecta a neuronas maduras de la región central de retinas en E15.5 así 

como a RGCs de retinas en E18.5 (Figuras 55 y 58 C, D de resultados; figura 6 de 

211
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

   

 
 

 

 

discusión). Esto refuerza la hipótesis de que la mitofagia precede al cambio metabólico. 

En cualquier caso, hemos determinado que lo que resulta determinante en la regulación 

de la diferenciación de las células ganglionares es un cambio metabólico hacia 

glicolisis, ya que la inhibición de este proceso disminuye el número de células Brn3a 

positivas. Además, el hecho de que este efecto solo se observe en la región central de las 

retinas a E15.5 y en retinas a E18.5, sugiere que el metabolismo glicolítico es necesario 

para el mantenimiento de las RGCs más maduras. Esto explicaría el incremento de 

RGCs más acusado en la región madura de la retina observado en retinas deficientes de 

L2AKO (Figura 56 B-D de resultados; figura 8 de discusión), que presentan un mayor 

flujo glicolítico que retinas wildtype (Figura 56 A), en relación con lo que ocurre en el 

hígado de ratones deficientes de LAMP-2A (Tasset & Cuervo, 2016). En la figura 8 

están reflejadas las diferentes regiones de la retina de E15.5 en función de su 

metabolismo glicolítico y como está afectada la diferenciación de RGCs en retinas 

deficientes de L2A. 

Figura 8.  Representación esquemática de la distribución de las RGCs recién diferenciadas y 
maduras en función del estado glicolítico de la retina. 

Como he descrito previamente, en el mecanismo inductor de mitofagia durante 

el desarrollo de la retina interviene el incremento de la expresión de HIF1α (Figura 3 de 

discusión). Hay que destacar que este factor de transcripción, que se activa en respuesta 

a hipoxia, se degrada vía CMA (Ferreira, 2015). El hecho de que la expresión de 

LAMP-2A sea mayor en estadios tempranos del desarrollo (Figura 56 F de resultados), 

en los que la retina depende en gran medida del metabolismo oxidativo (Figura 63 A de 

212
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

resultados; figura 3 de discusión), y disminuya en el estadio en el que se induce 

mitofagia (E15.5) (Figura 56 F de resultados), podría constituir un mecanismo necesario 

para evitar la degradación de HIF1α vía CMA y permitir así la inducción de mitofagia, 

el cambio metabólico hacia glicólisis y la diferenciación de las células ganglionares. 

Según esta hipótesis, retinas deficientes de L2A no degradarían HIF1α e inducirían una 

mayor mitofagia. Sin embargo, hemos observado que retinas de embriones L2A-/­

presentan un incremento de masa mitocondrial y una disminución en la expresión de 

NIX (Figura 57 D, E de resultados), lo que podría reflejar la existencia de otros 

mecanismos de regulación de NIX independientes de hipoxia en retinas deficientes de 

LAMP-2A. Todos estos datos sugieren que la mitofagia debe estar estrictamente 

regulada durante el desarrollo de la retina y que existe una estrecha relación entre 

metabolismo y masa mitocondrial, de manera que cualquier alteración en uno de los dos 

procesos, tiene consecuencias para el otro y viceversa. Esta relación recíproca entre 

metabolismo y mitofagia también se ha observado al inhibir la glicólisis en retinas de 

E15.5 (Figura 57 A-C de resultados). 

En esta Tesis Doctoral hemos querido entender la relación entre la mitofagia y el 

metabolismo en distintos modelos que presentan efecto Warburg, como la retina y los 

macrófagos proinflamatorios de tipo M1.  Cuando se produce una disminución de 

oxígeno, las células reprograman su metabolismo para producir ATP mediante la 

conversión de piruvato a lactato. No obstante, este proceso se puede dar también en 

presencia de oxígeno, denominándose entonces glicólisis aerobia, y es característico de 

las células tumorales y otros tipos celulares como la retina y los macrófagos de tipo M1 

(El Kasmi & Stenmark, 2015; Galvan-Pena & O'Neill, 2014; Jones & Thompson, 2007; 

Krawczyk et al, 2010; Ng et al, 2014; Palsson-McDermott, 2013; Warburg, 1931). 

Nuestros datos indican que al igual que en retina,  la mitofagia es un proceso activo en 

macrófagos proinflamatorios M1, pero no en macrófagos antiinflamatorios M2 (Figura 

48 A-G). En el proceso de polarización hacia macrófagos proinflamatorios M1, HIF1α 

desempeña un importante papel modulando el cambio metabólico hacia glicólisis e 

incrementando la expresión de genes inflamatorios (El Kasmi & Stenmark, 2015). 

Habría que determinar si en este modelo, HIF1α también esté incrementando la 

expresión de NIX para inducir la mitofagia que hemos observado en macrófagos 

proinflamatorios M1, lo que podría facilitar el incremento de glicólisis.  

213
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Por tanto, la relevancia de la mitofagia dependiente de hipoxia y NIX  está en 

que podría constituir un mecanismo general para modular el metabolismo en diferentes 

tipos celulares que presentan efecto Warburg. En este sentido, las células inflamatorias 

del sistema inmune, como células dendríticas, linfocitos T y macrófagos M1 presentan 

un perfil metabólico dependiente de glicólisis cuando se activan (Palsson-McDermott, 

2013) y este cambio metabólico permite generar ATP más rápidamente así como 

intermediarios metabólicos para la biosíntesis de proteínas inflamatorias (Palsson-

McDermott, 2013). Además, se ha descrito que el tratamiento con rapamicina favorece 

la polarización hacia macrófagos de tipo M1 (Mercalli et al, 2013), lo que podría ser 

debido a la activación de la mitofagia. Estos datos junto con el bloqueo de mitofagia y 

cambio de fenotipo que hemos observado en macrófagos M1 tratados con CsA y 3-MA, 

resalta la importancia del proceso de mitofagia en la fisiología celular. Así, esta 

reprogramación metabólica en macrófagos, células dendríticas y células T podría tener 

una relevancia en la patogénesis de enfermedades inflamatorias y metabólicas, por lo 

que la modulación de la mitofagia podría constituir una estrategia terapéutica. De hecho, 

recientemente se ha descrito que la inflamación produce daño mitocondrial, lo que 

desencadena la activación de mitofagia mediada por Parkina y p62, evitando la muerte 

celular de macrófagos por producción excesiva de IL-1β. De esa manera, los 

macrófagos regulan su propia actividad inflamatoria para mantener la homeostasis y 

favorecer la reparación tisular (Zhong et al, 2016). 

Por otro lado, esta relación entre la mitofagia y el metabolismo podría ser 

también importante en el contexto de las células pluripotentes, ya que la función 

mitocondrial y su integridad son determinantes del destino de las células madre (Parker 

et al, 2009). Hasta la fecha se ha descrito que las células stem se localizan en un nicho 

en hipoxia, ideal para su mantenimiento porque estas células dependen 

fundamentalmente de la glicólisis y tienen baja actividad mitocondrial (Simsek et al, 

2010). Por tanto la reprogramación celular hacia un estado de pluripotencia implica un 

cambio metabólico hacia glicólisis (Folmes et al, 2011). Además, un estudio reciente 

muestra que en efecto la mitofagia interviene en la reprogramación de las células iPS 

favoreciendo la glicólisis (Ma et al, 2015), lo que destaca el papel de la mitofagia en el 

cambio metabólico en diversos contextos.  

Sin embargo, no se ha determinado si al igual que ocurre con la diferenciación 

de RGCs de la retina, la diferenciación de las células stem está también favorecida por 

214
 



 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

la activación de mitofagia. Se ha descrito que a medida que las células stem proliferan y 

se diferencian, las demandas energéticas aumentan, y el promedio de contenido 

mitocondrial de la célula necesita incrementarse para permitir esos cambios (Joshi & 

Kundu, 2013). No obstante, es posible que esto dependa del tipo celular, ya que como 

hemos descrito en esta Tesis Doctoral, durante la diferenciación de las RGCs de la 

retina se produce un incremento de glicólisis mediado por mitofagia. En este sentido, 

podría ser interesante estudiar el papel de la mitofagia en un sistema de diferenciación 

general como las células stem, en el que es posible que la mitofagia sea clave para la 

diferenciación de algunos tipos particulares de células y no de otras.  

En un estudio preliminar que hemos llevado a cabo a partir de cuerpos 

embrioides de células madre embrionarias, hemos observado un incremento de la masa 

mitocondrial al bloquear autofagia/mitofagia durante las primeras horas de la 

diferenciación (Figura 9 de discusión), por lo que no descartamos que la mitofagia, 

además de intervenir en la reprogramación somática por su implicación en el cambio 

metabólico hacia glicólisis, desempeñe un papel en la diferenciación celular de células 

madre.  

215
 



 

 

 

    
 

 
 

 
 

 

 

 

Figura 9.  Mitofagia durante la diferenciación temprana de células stem. A. Esquema representativo 
del cultivo de células stem embrionarias en presencia y ausencia de LIF, un factor que inhibe la 
diferenciación celular. B. Células stem embrionarias que se cultivan en presencia de LIF no presentan 
alteraciones en la masa mitocondrial al inhibir autofagia/mitofagia. C. Células de cuerpos embrioides al 
inicio de la diferenciación tienen un incremento de la masa mitocondrial al inhibir mitofagia.  

Por tanto, los datos mostrados en esta Tesis Doctoral nos permiten concluir que 

la mitofagia puede constituir un mecanismo fisiológico que puede no solo regular el 

contenido mitocondrial, si no también procesos tan relevantes como el metabolismo y la 

diferenciación celular. El estudio completo de la mitofagia, el metabolismo, la 

diferenciación y la muerte celular en retina, nos ha permitido avanzar en la comprensión 

otros modelos fisiológicos. En la figura 10 se muestra la distribución temporal de todos 

los procesos descritos en este trabajo durante el desarrollo de la retina.  

216
 



 

 

 
   

 
 

  
  

 

 
 

Figura 10.  Distribución temporal de los procesos en los que la autofagia desempeña una función 
para el correcto desarrollo embrionario de la retina de ratón. En los estadios iniciales del desarrollo 
(E12.5-E13.5), la autofagia contribuye a la generación de ATP para el mantenimiento de las funciones 
celulares. Por otro lado, hemos determinado la activación del proceso de mitofagia en la región central de 
retinas a E13.5 y en retina completa a E15.5, lo que contribuye a la muerte fisiológica de la retina en 
desarrollo. Además, esa mitofagia es necesaria para un cambio metabólico hacia glicolisis necesario para 
la diferenciación de RGCs. 

217
 



 

 



 

 

 

 

 

CONCLUSIONES
 



 

 



 

 

 

 
 

 
 

 
 

 

 

 
  

 

 

 
 

 

 
 

CONCLUSIONES 

1.	 La autofagia es un proceso activo en la retina de ratón, siendo mayor el flujo de 

autofagia en etapas embrionarias, y en concreto, en las células ganglionares de la 

retina. 

2.	 El bloqueo de autofagia en etapas tempranas del desarrollo de la retina de ratón 

disminuye los niveles de ATP necesarios para la exposición de PS en las células 

apoptóticas durante la muerte fisiológica asociada al desarrollo. Como 

consecuencia, se produce una acumulación de células apoptóticas en el frente de 

diferenciación de las RGCs.  

3.	 La inducción de autofagia incrementa la muerte celular dependiente de caspasas 

siguiendo un patrón centro-periferia. Este aumento de muerte se bloquea al 

inhibir mitofagia y caspasas.  

4.	 En estadios tempranos del desarrollo de la retina (E13.5), existe una distribución 

diferencial de la masa mitocondrial, siendo ésta mayor en el frente de 

diferenciación y menor en la región central más madura de la retina.  

5.	 A lo largo del desarrollo de la retina, se produce una disminución de la masa 

mitocondrial como consecuencia de la activación del proceso de mitofagia en un 

punto muy concreto del desarrollo, E15.5. Entre los reguladores moleculares de 

mitofagia, NIX está implicado en la degradación mitocondrial durante el 

desarrollo de la retina.  

6.	 La muerte celular fisiológica en la región central de retinas en E13.5 depende del 

proceso de la degradación mitocondrial, ya que la inhibición de mitofagia 

bloquea la muerte celular. De igual manera, el bloqueo de mitofagia rescata la 

muerte fisiológica de retinas de ratón en E15.5. 

7.	 La señal inductora de mitofagia necesaria para el incremento en la expresión de 

NIX es la hipoxia generada por las alteraciones a nivel de la cadena de 

221
 



 

 

 
 

 

 

 

 

 

 
 

 

 
 

 

 

transporte electrónico y fosforilación oxidativa previas a la mitofagia. Los ROS 

generados como consecuencia del metabolismo mitocondrial en estadios 

tempranos del desarrollo, podrían desencadenar las alteraciones en la cadena de 

transporte electrónico mitocondrial.  

8.	 La mitofagia que se produce en retinas de E15.5 está implicada en favorecer un 

cambio metabólico hacia glicólisis necesario para la apropiada diferenciación de 

las células ganglionares de la retina. Ese cambio metabólico mediado por 

mitofagia, también podría estar implicado en la polarización de macrófagos 

hacia tipo proinflamatorio M1 y en la diferenciación temprana de células stem. 

9.	 Retinas deficientes de CMA muestran un incremento en la diferenciación de las 

células ganglionares, posiblemente por su mayor actividad glicolítica. 

10. Durante el desarrollo embrionario de la retina, existe una interrelación entre 

metabolismo y autofagia, de manera que la inhibición de la glicólisis incrementa 

la masa mitocondrial. Además, retinas deficientes de CMA presentan un 

incremento de glicólisis así como de masa mitocondrial, debido a la disminución 

de la expresión de NIX. 

11. La mitofagia es necesaria para la muerte celular asociada al desarrollo de la 

retina así como para la diferenciación de las células ganglionares. A pesar de que 

la muerte por apoptosis es necesaria para una correcta diferenciación celular 

durante el desarrollo de la retina, las funciones de la mitofagia en muerte celular 

y diferenciación de células ganglionares parecen ser independientes. 

222
 



 

 

 

 

 

BIBLIOGRAFÍA
 



 

 



 

 

 

 
 

  

 

 
 

 
 

 
 

  
 

 
 

 
 

  

 

  

 

 
 

 

 

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Alegre-Abarrategui J, Aleo MF, Alirezaei M, Almasan A, Almonte-Becerril M, Amano 
A, Amaravadi R, Amarnath S, Amer AO, Andrieu-Abadie N, Anantharam V, Ann DK, 
Anoopkumar-Dukie S, Aoki H, Apostolova N, Arancia G, Aris JP, Asanuma K, Asare 
NY, Ashida H, Askanas V, Askew DS, Auberger P, Baba M, Backues SK, Baehrecke 
EH, Bahr BA, Bai XY, Bailly Y, Baiocchi R, Baldini G, Balduini W, Ballabio A, 
Bamber BA, Bampton ET, Banhegyi G, Bartholomew CR, Bassham DC, Bast RC, Jr., 
Batoko H, Bay BH, Beau I, Bechet DM, Begley TJ, Behl C, Behrends C, Bekri S, 
Bellaire B, Bendall LJ, Benetti L, Berliocchi L, Bernardi H, Bernassola F, Besteiro S, 
Bhatia-Kissova I, Bi X, Biard-Piechaczyk M, Blum JS, Boise LH, Bonaldo P, Boone 
DL, Bornhauser BC, Bortoluci KR, Bossis I, Bost F, Bourquin JP, Boya P, Boyer-
Guittaut M, Bozhkov PV, Brady NR, Brancolini C, Brech A, Brenman JE, Brennand A, 
Bresnick EH, Brest P, Bridges D, Bristol ML, Brookes PS, Brown EJ, Brumell JH, 
Brunetti-Pierri N, Brunk UT, Bulman DE, Bultman SJ, Bultynck G, Burbulla LF, 
Bursch W, Butchar JP, Buzgariu W, Bydlowski SP, Cadwell K, Cahova M, Cai D, Cai 
J, Cai Q, Calabretta B, Calvo-Garrido J, Camougrand N, Campanella M, Campos-
Salinas J, Candi E, Cao L, Caplan AB, Carding SR, Cardoso SM, Carew JS, Carlin CR, 
Carmignac V, Carneiro LA, Carra S, Caruso RA, Casari G, Casas C, Castino R, 
Cebollero E, Cecconi F, Celli J, Chaachouay H, Chae HJ, Chai CY, Chan DC, Chan 
EY, Chang RC, Che CM, Chen CC, Chen GC, Chen GQ, Chen M, Chen Q, Chen SS, 
Chen W, Chen X, Chen YG, Chen Y, Chen YJ, Chen Z, Cheng A, Cheng CH, Cheng Y, 
Cheong H, Cheong JH, Cherry S, Chess-Williams R, Cheung ZH, Chevet E, Chiang 
HL, Chiarelli R, Chiba T, Chin LS, Chiou SH, Chisari FV, Cho CH, Cho DH, Choi 
AM, Choi D, Choi KS, Choi ME, Chouaib S, Choubey D, Choubey V, Chu CT, Chuang 
TH, Chueh SH, Chun T, Chwae YJ, Chye ML, Ciarcia R, Ciriolo MR, Clague MJ, 
Clark RS, Clarke PG, Clarke R, Codogno P, Coller HA, Colombo MI, Comincini S, 

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Cronje MJ, Cuervo AM, Cullen JJ, Czaja MJ, D'Amelio M, Darfeuille-Michaud A, 
Davids LM, Davies FE, De Felici M, de Groot JF, de Haan CA, De Martino L, De 
Milito A, De Tata V, Debnath J, Degterev A, Dehay B, Delbridge LM, Demarchi F, 
Deng YZ, Dengjel J, Dent P, Denton D, Deretic V, Desai SD, Devenish RJ, Di 
Gioacchino M, Di Paolo G, Di Pietro C, Diaz-Araya G, Diaz-Laviada I, Diaz-Meco 
MT, Diaz-Nido J, Dikic I, Dinesh-Kumar SP, Ding WX, Distelhorst CW, Diwan A, 
Djavaheri-Mergny M, Dokudovskaya S, Dong Z, Dorsey FC, Dosenko V, Dowling JJ, 
Doxsey S, Dreux M, Drew ME, Duan Q, Duchosal MA, Duff K, Dugail I, Durbeej M, 
Duszenko M, Edelstein CL, Edinger AL, Egea G, Eichinger L, Eissa NT, Ekmekcioglu 
S, El-Deiry WS, Elazar Z, Elgendy M, Ellerby LM, Eng KE, Engelbrecht AM, 
Engelender S, Erenpreisa J, Escalante R, Esclatine A, Eskelinen EL, Espert L, Espina 
V, Fan H, Fan J, Fan QW, Fan Z, Fang S, Fang Y, Fanto M, Fanzani A, Farkas T, Farre 
JC, Faure M, Fechheimer M, Feng CG, Feng J, Feng Q, Feng Y, Fesus L, Feuer R, 
Figueiredo-Pereira ME, Fimia GM, Fingar DC, Finkbeiner S, Finkel T, Finley KD, 
Fiorito F, Fisher EA, Fisher PB, Flajolet M, Florez-McClure ML, Florio S, Fon EA, 
Fornai F, Fortunato F, Fotedar R, Fowler DH, Fox HS, Franco R, Frankel LB, Fransen 
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M, Gailly P, Gajewska M, Galliot B, Galy V, Ganesh S, Ganetzky B, Ganley IG, Gao 
FB, Gao GF, Gao J, Garcia L, Garcia-Manero G, Garcia-Marcos M, Garmyn M, Gartel 
AL, Gatti E, Gautel M, Gawriluk TR, Gegg ME, Geng J, Germain M, Gestwicki JE, 
Gewirtz DA, Ghavami S, Ghosh P, Giammarioli AM, Giatromanolaki AN, Gibson SB, 
Gilkerson RW, Ginger ML, Ginsberg HN, Golab J, Goligorsky MS, Golstein P, Gomez-
Manzano C, Goncu E, Gongora C, Gonzalez CD, Gonzalez R, Gonzalez-Estevez C, 
Gonzalez-Polo RA, Gonzalez-Rey E, Gorbunov NV, Gorski S, Goruppi S, Gottlieb RA, 
Gozuacik D, Granato GE, Grant GD, Green KN, Gregorc A, Gros F, Grose C, Grunt 
TW, Gual P, Guan JL, Guan KL, Guichard SM, Gukovskaya AS, Gukovsky I, Gunst J, 
Gustafsson AB, Halayko AJ, Hale AN, Halonen SK, Hamasaki M, Han F, Han T, 
Hancock MK, Hansen M, Harada H, Harada M, Hardt SE, Harper JW, Harris AL, 
Harris J, Harris SD, Hashimoto M, Haspel JA, Hayashi S, Hazelhurst LA, He C, He 
YW, Hebert MJ, Heidenreich KA, Helfrich MH, Helgason GV, Henske EP, Herman B, 
Herman PK, Hetz C, Hilfiker S, Hill JA, Hocking LJ, Hofman P, Hofmann TG, Hohfeld 
J, Holyoake TL, Hong MH, Hood DA, Hotamisligil GS, Houwerzijl EJ, Hoyer-Hansen 
M, Hu B, Hu CA, Hu HM, Hua Y, Huang C, Huang J, Huang S, Huang WP, Huber TB, 
Huh WK, Hung TH, Hupp TR, Hur GM, Hurley JB, Hussain SN, Hussey PJ, Hwang JJ, 
Hwang S, Ichihara A, Ilkhanizadeh S, Inoki K, Into T, Iovane V, Iovanna JL, Ip NY, 
Isaka Y, Ishida H, Isidoro C, Isobe K, Iwasaki A, Izquierdo M, Izumi Y, Jaakkola PM, 
Jaattela M, Jackson GR, Jackson WT, Janji B, Jendrach M, Jeon JH, Jeung EB, Jiang H, 
Jiang JX, Jiang M, Jiang Q, Jiang X, Jimenez A, Jin M, Jin S, Joe CO, Johansen T, 
Johnson DE, Johnson GV, Jones NL, Joseph B, Joseph SK, Joubert AM, Juhasz G, 
Juillerat-Jeanneret L, Jung CH, Jung YK, Kaarniranta K, Kaasik A, Kabuta T, 
Kadowaki M, Kagedal K, Kamada Y, Kaminskyy VO, Kampinga HH, Kanamori H, 
Kang C, Kang KB, Kang KI, Kang R, Kang YA, Kanki T, Kanneganti TD, Kanno H, 
Kanthasamy AG, Kanthasamy A, Karantza V, Kaushal GP, Kaushik S, Kawazoe Y, Ke 
PY, Kehrl JH, Kelekar A, Kerkhoff C, Kessel DH, Khalil H, Kiel JA, Kiger AA, Kihara 
A, Kim DR, Kim DH, Kim EK, Kim HR, Kim JS, Kim JH, Kim JC, Kim JK, Kim PK, 
Kim SW, Kim YS, Kim Y, Kimchi A, Kimmelman AC, King JS, Kinsella TJ, Kirkin V, 
Kirshenbaum LA, Kitamoto K, Kitazato K, Klein L, Klimecki WT, Klucken J, Knecht 
E, Ko BC, Koch JC, Koga H, Koh JY, Koh YH, Koike M, Komatsu M, Kominami E, 

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Kovacs AL, Kraft C, Krainc D, Kramer H, Kretz-Remy C, Krichevsky AM, Kroemer 
G, Kruger R, Krut O, Ktistakis NT, Kuan CY, Kucharczyk R, Kumar A, Kumar R, 
Kumar S, Kundu M, Kung HJ, Kurz T, Kwon HJ, La Spada AR, Lafont F, Lamark T, 
Landry J, Lane JD, Lapaquette P, Laporte JF, Laszlo L, Lavandero S, Lavoie JN, 
Layfield R, Lazo PA, Le W, Le Cam L, Ledbetter DJ, Lee AJ, Lee BW, Lee GM, Lee J, 
Lee JH, Lee M, Lee MS, Lee SH, Leeuwenburgh C, Legembre P, Legouis R, Lehmann 
M, Lei HY, Lei QY, Leib DA, Leiro J, Lemasters JJ, Lemoine A, Lesniak MS, Lev D, 
Levenson VV, Levine B, Levy E, Li F, Li JL, Li L, Li S, Li W, Li XJ, Li YB, Li YP, 
Liang C, Liang Q, Liao YF, Liberski PP, Lieberman A, Lim HJ, Lim KL, Lim K, Lin 
CF, Lin FC, Lin J, Lin JD, Lin K, Lin WW, Lin WC, Lin YL, Linden R, Lingor P, 
Lippincott-Schwartz J, Lisanti MP, Liton PB, Liu B, Liu CF, Liu K, Liu L, Liu QA, Liu 
W, Liu YC, Liu Y, Lockshin RA, Lok CN, Lonial S, Loos B, Lopez-Berestein G, 
Lopez-Otin C, Lossi L, Lotze MT, Low P, Lu B, Lu Z, Luciano F, Lukacs NW, Lund 
AH, Lynch-Day MA, Ma Y, Macian F, MacKeigan JP, Macleod KF, Madeo F, Maiuri 
L, Maiuri MC, Malagoli D, Malicdan MC, Malorni W, Man N, Mandelkow EM, Manon 
S, Manov I, Mao K, Mao X, Mao Z, Marambaud P, Marazziti D, Marcel YL, 
Marchbank K, Marchetti P, Marciniak SJ, Marcondes M, Mardi M, Marfe G, Marino G, 
Markaki M, Marten MR, Martin SJ, Martinand-Mari C, Martinet W, Martinez-Vicente 
M, Masini M, Matarrese P, Matsuo S, Matteoni R, Mayer A, Mazure NM, McConkey 
DJ, McConnell MJ, McDermott C, McDonald C, McInerney GM, McKenna SL, 
McLaughlin B, McLean PJ, McMaster CR, McQuibban GA, Meijer AJ, Meisler MH, 
Melendez A, Melia TJ, Melino G, Mena MA, Menendez JA, Menna-Barreto RF, 
Menon MB, Menzies FM, Mercer CA, Merighi A, Merry DE, Meschini S, Meyer CG, 
Meyer TF, Miao CY, Miao JY, Michels PA, Michiels C, Mijaljica D, Milojkovic A, 
Minucci S, Miracco C, Miranti CK, Mitroulis I, Miyazawa K, Mizushima N, Mograbi 
B, Mohseni S, Molero X, Mollereau B, Mollinedo F, Momoi T, Monastyrska I, Monick 
MM, Monteiro MJ, Moore MN, Mora R, Moreau K, Moreira PI, Moriyasu Y, Moscat J, 
Mostowy S, Mottram JC, Motyl T, Moussa CE, Muller S, Munger K, Munz C, Murphy 
LO, Murphy ME, Musaro A, Mysorekar I, Nagata E, Nagata K, Nahimana A, Nair U, 
Nakagawa T, Nakahira K, Nakano H, Nakatogawa H, Nanjundan M, Naqvi NI, 
Narendra DP, Narita M, Navarro M, Nawrocki ST, Nazarko TY, Nemchenko A, Netea 
MG, Neufeld TP, Ney PA, Nezis IP, Nguyen HP, Nie D, Nishino I, Nislow C, Nixon 
RA, Noda T, Noegel AA, Nogalska A, Noguchi S, Notterpek L, Novak I, Nozaki T, 
Nukina N, Nurnberger T, Nyfeler B, Obara K, Oberley TD, Oddo S, Ogawa M, Ohashi 
T, Okamoto K, Oleinick NL, Oliver FJ, Olsen LJ, Olsson S, Opota O, Osborne TF, 
Ostrander GK, Otsu K, Ou JH, Ouimet M, Overholtzer M, Ozpolat B, Paganetti P, 
Pagnini U, Pallet N, Palmer GE, Palumbo C, Pan T, Panaretakis T, Pandey UB, 
Papackova Z, Papassideri I, Paris I, Park J, Park OK, Parys JB, Parzych KR, Patschan S, 
Patterson C, Pattingre S, Pawelek JM, Peng J, Perlmutter DH, Perrotta I, Perry G, 
Pervaiz S, Peter M, Peters GJ, Petersen M, Petrovski G, Phang JM, Piacentini M, Pierre 
P, Pierrefite-Carle V, Pierron G, Pinkas-Kramarski R, Piras A, Piri N, Platanias LC, 
Poggeler S, Poirot M, Poletti A, Pous C, Pozuelo-Rubio M, Praetorius-Ibba M, Prasad 
A, Prescott M, Priault M, Produit-Zengaffinen N, Progulske-Fox A, Proikas-Cezanne T, 
Przedborski S, Przyklenk K, Puertollano R, Puyal J, Qian SB, Qin L, Qin ZH, Quaggin 
SE, Raben N, Rabinowich H, Rabkin SW, Rahman I, Rami A, Ramm G, Randall G, 
Randow F, Rao VA, Rathmell JC, Ravikumar B, Ray SK, Reed BH, Reed JC, Reggiori 
F, Regnier-Vigouroux A, Reichert AS, Reiners JJ, Jr., Reiter RJ, Ren J, Revuelta JL, 
Rhodes CJ, Ritis K, Rizzo E, Robbins J, Roberge M, Roca H, Roccheri MC, Rocchi S, 
Rodemann HP, Rodriguez de Cordoba S, Rohrer B, Roninson IB, Rosen K, Rost­

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Roszkowska MM, Rouis M, Rouschop KM, Rovetta F, Rubin BP, Rubinsztein DC, 
Ruckdeschel K, Rucker EB, 3rd, Rudich A, Rudolf E, Ruiz-Opazo N, Russo R, Rusten 
TE, Ryan KM, Ryter SW, Sabatini DM, Sadoshima J, Saha T, Saitoh T, Sakagami H, 
Sakai Y, Salekdeh GH, Salomoni P, Salvaterra PM, Salvesen G, Salvioli R, Sanchez 
AM, Sanchez-Alcazar JA, Sanchez-Prieto R, Sandri M, Sankar U, Sansanwal P, 
Santambrogio L, Saran S, Sarkar S, Sarwal M, Sasakawa C, Sasnauskiene A, Sass M, 
Sato K, Sato M, Schapira AH, Scharl M, Schatzl HM, Scheper W, Schiaffino S, 
Schneider C, Schneider ME, Schneider-Stock R, Schoenlein PV, Schorderet DF, 
Schuller C, Schwartz GK, Scorrano L, Sealy L, Seglen PO, Segura-Aguilar J, Seiliez I, 
Seleverstov O, Sell C, Seo JB, Separovic D, Setaluri V, Setoguchi T, Settembre C, 
Shacka JJ, Shanmugam M, Shapiro IM, Shaulian E, Shaw RJ, Shelhamer JH, Shen HM, 
Shen WC, Sheng ZH, Shi Y, Shibuya K, Shidoji Y, Shieh JJ, Shih CM, Shimada Y, 
Shimizu S, Shintani T, Shirihai OS, Shore GC, Sibirny AA, Sidhu SB, Sikorska B, 
Silva-Zacarin EC, Simmons A, Simon AK, Simon HU, Simone C, Simonsen A, Sinclair 
DA, Singh R, Sinha D, Sinicrope FA, Sirko A, Siu PM, Sivridis E, Skop V, Skulachev 
VP, Slack RS, Smaili SS, Smith DR, Soengas MS, Soldati T, Song X, Sood AK, Soong 
TW, Sotgia F, Spector SA, Spies CD, Springer W, Srinivasula SM, Stefanis L, Steffan 
JS, Stendel R, Stenmark H, Stephanou A, Stern ST, Sternberg C, Stork B, Stralfors P, 
Subauste CS, Sui X, Sulzer D, Sun J, Sun SY, Sun ZJ, Sung JJ, Suzuki K, Suzuki T, 
Swanson MS, Swanton C, Sweeney ST, Sy LK, Szabadkai G, Tabas I, Taegtmeyer H, 
Tafani M, Takacs-Vellai K, Takano Y, Takegawa K, Takemura G, Takeshita F, Talbot 
NJ, Tan KS, Tanaka K, Tang D, Tanida I, Tannous BA, Tavernarakis N, Taylor GS, 
Taylor GA, Taylor JP, Terada LS, Terman A, Tettamanti G, Thevissen K, Thompson 
CB, Thorburn A, Thumm M, Tian F, Tian Y, Tocchini-Valentini G, Tolkovsky AM, 
Tomino Y, Tonges L, Tooze SA, Tournier C, Tower J, Towns R, Trajkovic V, 
Travassos LH, Tsai TF, Tschan MP, Tsubata T, Tsung A, Turk B, Turner LS, Tyagi SC, 
Uchiyama Y, Ueno T, Umekawa M, Umemiya-Shirafuji R, Unni VK, Vaccaro MI, 
Valente EM, Van den Berghe G, van der Klei IJ, van Doorn W, van Dyk LF, van 
Egmond M, van Grunsven LA, Vandenabeele P, Vandenberghe WP, Vanhorebeek I, 
Vaquero EC, Velasco G, Vellai T, Vicencio JM, Vierstra RD, Vila M, Vindis C, Viola 
G, Viscomi MT, Voitsekhovskaja OV, von Haefen C, Votruba M, Wada K, Wade-
Martins R, Walker CL, Walsh CM, Walter J, Wan XB, Wang A, Wang C, Wang D, 
Wang F, Wang G, Wang H, Wang HG, Wang HD, Wang J, Wang K, Wang M, Wang 
RC, Wang X, Wang YJ, Wang Y, Wang Z, Wang ZC, Wansink DG, Ward DM, Watada 
H, Waters SL, Webster P, Wei L, Weihl CC, Weiss WA, Welford SM, Wen LP, 
Whitehouse CA, Whitton JL, Whitworth AJ, Wileman T, Wiley JW, Wilkinson S, 
Willbold D, Williams RL, Williamson PR, Wouters BG, Wu C, Wu DC, Wu WK, 
Wyttenbach A, Xavier RJ, Xi Z, Xia P, Xiao G, Xie Z, Xu DZ, Xu J, Xu L, Xu X, 
Yamamoto A, Yamashina S, Yamashita M, Yan X, Yanagida M, Yang DS, Yang E, 
Yang JM, Yang SY, Yang W, Yang WY, Yang Z, Yao MC, Yao TP, Yeganeh B, Yen 
WL, Yin JJ, Yin XM, Yoo OJ, Yoon G, Yoon SY, Yorimitsu T, Yoshikawa Y, 
Yoshimori T, Yoshimoto K, You HJ, Youle RJ, Younes A, Yu L, Yu SW, Yu WH, 
Yuan ZM, Yue Z, Yun CH, Yuzaki M, Zabirnyk O, Silva-Zacarin E, Zacks D, 
Zacksenhaus E, Zaffaroni N, Zakeri Z, Zeh HJ, 3rd, Zeitlin SO, Zhang H, Zhang HL, 
Zhang J, Zhang JP, Zhang L, Zhang MY, Zhang XD, Zhao M, Zhao YF, Zhao Y, Zhao 
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ANEXOS
 



 

 
 

MeLhods 75 (201 S) 79-86 

Contents lists available at ScienceDirect 

Methods 

ELSEVIER journal homepage: www.elsevier.com/locate/ymeth 

Autophagic flux determination in vivo and ex vivo CrossMark 

Lorena Esteban-Martinez, Patricia Boya * 

Department of Cellular and Molecular Biology, Centro de lnvest(gadones Biof6gicas. Ramiro de Maeztu 9. 28040 Madrid. Spain 

ARTICLE INFO ABSTRACT 

Anicle lliscory: Autophagy is a highly dyna mic process that mediaces the degradation of cellular constituencs inside 
Received 9 October 2014 lysosomes. It is characterized by the formation or autophagosomes. double membrane orga nel les that 
Received in revised form 19 January 2015 engulf cytosolic components and organelles and degrade thei r contents upon fusion with l ysosomes. 
Accepted 19 january 2015 

Upregulation of autophagy in response to specific stimuli can be determined by evaluating autophagic 
Available online 30 January 2015 

flux. This is achieved by comparing the number of autophagosomes in the absence and presence of 

lysosomal inhibitors. While the determination of autophagic flux in isolated cells is well-documented, 
Keywords: 

few studies have described its determination in tissues or in vivo. Here, we describe the evaluation of 
Autophagic flux 

autophagic flux both in vivo and ex vivo in several tissues, after treatment with lysosomal inhibitors 
Retina 

and exposure to classical autophagy-inducing stimuli. This method uses LC3 lipidation, as determined Cerebellum 

Liver by Western blot, fluorescence microscopy and flow cytometry. Our findings demonstrate that autophagic 

GFP-LC3 mice flux can be evaluated in vivo and ex vivo in several tissues. 

In vivo autophagy determination 

Ex vivo autophagy determination 

1. Introduction 

Autophagy is an intracellular recycling pathway that mediates 
the degradation of intracellular constituents inside lysosomes. This 
process constitutes an intracellular quality control mechanism as 
well as a response to a wide range of stimuli that endanger the cell 

[ 1 ]. Autophagy begins with the formation of an autophagosome, a 
double-membrane structure that engulfs entire organelles and 
parts of the cytosol, and subsequently fuses with a lysosome to 
trigger the degradation of the enclosed material. The degradation 
products. which include amino acids, lipids. and nucleotides. are 
released into the cytoplasm by permeases present in the lysosomal 
membrane and are then used for anabolic reactions to sustain 
cellular functions I 1 J. Autophagy is regulated by the Atg family 

Abbreviations: ATP. adenosinc tTiphosplmc; BBB. blood brain barrier: BRB. 
blood retinal barrier: BGT, BSA/glycinejTriton X-100: BSA, bovine serum albumin: 

CNS, central nervous system; DABCO, 1.4-diazabicyclol2.2.2]octane; DAPI, 4.6-
diamidino-2-phenylindole dihydrochloride: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's 
Medium; E, embryonic day: EBSS, Earl's balanced salt solution; GCL, gangl ion cell 
layer; GFAP, glial fibrillary acidic protein; GFP, green nuorescent 1>ro tein; HBSS, 

Hanks' balanced salt solution; HCQ. hydroxychloroquine; lNL, inner nuclear layer: 
IPL, inner plcxifom1 layer; IS, inner segmen t : LC3, microtubulc-associated protein 1 
light chain 3: Leu, leupe1>tin: Nbl., ne uroblast layer; ON, opLic nerve: ONL, outer 
nuclear l ayer; OPI, outer plexiform layer; PBS, phosphate buffered saline; PFA, 

parafom1aldellyde; Rapa, rapamycin: RGCs, retinal ganglion cells; RPE. retinal 
pigment epithelium. 

* Corresponding author. 

£-mail oddresses: lesteban@cib.csic.es (l. Esteban-Martinez). pboya®cib.csic.es 

(P. Boya). 

© 2015 Elsevier Inc. All rights reserved. 

of proteins. which participate in all stages of the autophagy pro­
cess; induction, autophagosome formation. lysosomal fusion and 
autophagolysosome formation. and finally, degradation [2]. 

A major hallmark of autophagy is the formation of autophago­

somes, and this can be directly determined by visualizacion of 
the autophagosomal binding protein MAP-LC3 (microtubule asso­

ciated protein LC3) 13]. During autophagosome formation LC3, 
the mammalian ortholog of Atg8, is lipidated by coval ent attach­
ment of phosphatidyl ethanolamine, a process mediated by the 
protein Atg7. This lipidation process can be detected by Western 
blot; the conjugated form of LC3 (LC3-ll) progresses through the 
gel more rapidly than the non-conjugated form. and is visualized 
as a lower molecular-weight band l4J, thus allowing determination 
of the free and autophagosome-bound forms of LC3. The associa­
tion of LC3 with autophagosomes can also be determined as an 
increase in LC3 puncta as visualized using specific antibodies or 

by measuring fluorescence in cells transduced with GFP-LC3 
expression vectors [3J. In tissues autophagy is often evaluated 
using GFP-LC3 transgenic mice, which express the GFP-LC3 repor­
ter in all cells of the body via a constitutive promoter [5]. Using 
these mice Mizushima and co-workers demonstrated the presence 
of autophagy in vivo and showed that nutrient starvation induced 
this process in most tissues including the liver, heart. pancreas, 
muscle and kidneys but not in the brain [5 j. 

While LC3 levels serve as a read-out of autophagosome number 
at specific time points, they do not provide useful information 
about autophagy per se, as autophagosome levels can also be 
increased by blocking autophagy in later stages of the process 

http://dx.doi.org/10.1016/j.ymeth.2015.01.008 

1046-2023/© 2015 Elsevier Inc. All rights reserved. 

http://dx.doi.org/10.1016/j.ymeth.2015.01.008
http://dx.doi.org/10.1016/j.ymeth.2015.01.008
http:pboya�cib.csic.es
mailto:lesteban@cib.csic.es


 

 

 

TOOLBOX 
Autophagy 11 :5, 833-843; May 2015; © 2015 Taylor & Francis Group, LLC 

New method to assess mitophagy flux by flow cytometry 

Marta Mauro-Lizcano,l,# Lorena Esteban-Martinez,l,# Esther Seco,1 Ana Serrano-Puebla,1 Lucia Garcia-Ledo,1 
Claudia Figueiredo-Pereira,2 Helena L A  Vieira,2·3 and Patricia Boya1·* 
1Deparramenc of Cellular and Molecular Biology; Centro de lnvescigaciones Biol6gicas; CSIC; Madrid, Spain; 2CEDOC; Faculdade de Ciencia Medicas; Universidade 

Nova de Lisboa; Lisboa, Portugal; 3lnstituto de Biologia Experimental e Tecnol6gica (!BET); Oeiras, Portugal 

'These authors contributed equally to this work. 

Keywords: astrocyte primary culture, 
autophagic flux, autophagy, flow cytome­
try, neurodegeneration, mitochondria, 
mitophagic flux, mitophagy, retina 

Abbreviations: ll'1', mitochondrial mem­
brane potential; 3MA, 3-methyladenine; 
Atg, autophagy-related; CCCP, carbonyl 
cyanide m-chlorophenyl hydrazone; Co, 
control; COX4Il, cytochrome c oxidase 
subunit IV isoform l; CsA, cyclosporin A; 
E, embryonic day; EBSS, Earle's balanced 
salt solution; FIS, fisetin; HCQ, hydroxy­
chloroquine; LC3, MAP1LC3/LC3; KO, 
knockout; MEFs, mouse embryonic fibro­
blasts; MTDR, MitoTracker Deep Red; 
MTOR, mechanistic target of rapamycin; 
NAM, nicotinamide; N +L, ammonium 
chloride + leupeptin; P, postnatal day; 
PARK2, Parkin RBR E3 ubiquitin protein 
ligase; PINKJ, PTEN-induced putative 
kinase l; PHEN, 1, 10-phenanthroline; 
Rapa, rapamycin; TIMM23, translocase 
of inner mitochondrial membrane 23 
homolog (yeast); TOMM20, translocase 
of outer mitochondrial membrane 20 
homolog (yeast); TOMM40, translocase 
of outer mitochondrial membrane 40 
homolog (yeast); WM, wortmannin; WT, 

wild type 
•correspondence to: Patricia Boya; Email: patricia. 

boya@csic.es 

Submitted: 04/22/2014 

Revised: 03/09/2015 

Accepted: 03/16/2015 

http:l/dx.doi.org/10.1080/15548627.2015.1 034403 

M
itochondrial autophagy, also 
known as mitophagy, is an auto­

phagosome-based mitochondrial degra­
dation process that eliminates unwanted 
or damaged mitochondria after cell stress. 
Most studies dealing with mitophagy rely 
on the analysis by fluorescence micros­
copy of mitochondrial-autophagosome 
colocalization. However, given the funda­
mental role of mitophagy in the physiol­
ogy and pathology of organisms, there is 
an urgent need for novel quantitative 
methods with which to study this pro­
cess. Here, we describe a flow cytometry­
based approach to determine mitophagy 
by using MitoTracker Deep Red, a 
widely used mitochondria-selective 
probe. Used in combination with selec­
tive inhibitors it may allow for the deter­
mination of mitophagy flux. Here, we 
test the validiry of the use of this method 
in cell lines and in primary cell and tissue 
cultures. 

Introduction 

Selective mitochondrial autophagy, or 
mitophagy, is a cell process that specifically 
targets mitochondria to autophagosomes 
for subsequent degradation in lysosomes.1 
Mitophagy is the only known pathway 
through which complete, damaged, and 
dysfunctional mitochondria are elimi­
nated.2 The presence of mitochondria 
inside autophagosomes was observed more 
than 50 y ago3 and has more recently been 
demonstrated using fluorescence in vivo 
microscopy by Elmore and coworkers, who 
coined the term mitophagy.45 Mitophagy 
is responsible for the specific elimination of 

mitochondria during the maturation of 
erythrocytes, the only mature cells that are 
completely devoid of these organelles.6 It 
had been proposed that mitophagy is 
responsible for the disappearance of pater­
nal mitochondria m the developing 
embryo,7'8 although this idea has been 
recently challenged.9 

Mitophagy is most commonly induced 
m vitro in mammalian cells using the 
uncoupler CCCP (carbonyl cyanide m­
chlorophenyl hydrazone), which reduces 
mitochondrial membrane potential 
(ll'1'm).10 Mitochondria are then targeted 
for lysosomal degradation, which requires 
the interaction of PARK2/PARKIN­
PINK1 proteins. Following mitochondrial 
depolarization PINK 1 is stabilized at the 
mitochondrial membrane where it recruits 
PARK2, which in turn ubiquitinates sev­
eral proteins that target the mitochondria 
for degradation.11 Mitophagy can also be 
triggered by the activation of specific mito­
chondrial receptors; these are proteins that 
harbor a MAP1LC3/LC3 (microtubule­
associated protein 1 light chain 3)-interact­
ing region/UR, which forms a bridge 
linking the mitochondria to the autopha­
gosome.12 The most commonly described 
receptors are BNIP3,13·14 BNIP3L/NIX,15 
yeast Atg3216 and FUNDCl.17 Other pro­
teins implicated in mitophagy include 
AMBRAl,18 AMFR19 SMURFl,20 
HKl,21 VDAC22 and the small GTPase 
RHEB.23 Lipids also participate in the for­
mation of bridges berween mitochondria 
and autophagosomes. Cardiolipin, a lipid 
of the inner mitochondrial membrane, is 

externalized to the outer membrane, where 
it acts as an "eat-me" signal, triggering 
mitophagy.24 Several drugs have been 

www.tandfonline.com Autophagy 833 

http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15548627.2015.1034403
http:www.tandfonline.com
http:mitophagy.24
http:FUNDCl.17
http:gosome.12
http:degradation.11
http:mitophagy.45
http:l/dx.doi.org/10.1080/15548627.2015.1
mailto:boya@csic.es


 

 

 

AUTOPHAGIC PUNCTUM 
Autophagy 11:12,2379-2380; December 2015; © 2015 Taylor & Francis Group, LLC 

Mitophagy in mitosis: More than a myth 

Lorena Esteban-Martinez, l,Z,# Elena Domenech, l,# Patricia Boya,2·* Marfa Salazar-Roa,1·* and Marcos Malumbres1 
1Cell Division and Cancer Group; Spanish National Cancer Research Centre (CNIO); Madrid, Spain; 2Department of Cellular and Molecular Biology; 


Centro de lnvesrigaciones Biol6gicas; Madrid, Spain 


'These two authors contributed equally to this work. 


Keywords: cancer therapy, cell cycle, gly­
colysis, microcubule poisons, mirophagy, 
mitosis 

•correspondence to: Patricia Boya; Email: 

pboya@cib.csic.es; Marfa Salazar-Roa; Email: 

msalazar@cnio.es 

Submitted: 10/02/2015 

Revised: 10/05/2015 

Accepted: 10/09/2015 

http//dx.doi.org/10.1080/15548627.2015.1108509 

Punctum to: Domenech E, Maestre C, Esteban­

Martfnez L, Partida D, Pascual R, Fernandez­
Miranda G, Seco E, Campos-Olivas R, Perez M, 

Megias D, Allen K, Lopez M, Saha AK, Velasco G, 
Rial E, Mendez R, Boya P, Salazar-Roa M, Malum­
bres M. (2015) AMPK and PFKFB3 mediate glycol­

ysis and survival in response to mitophagy 

during mitotic arrest. Nat Cell Biol 2015; 17: 
1304-1316; PMID: 26322680; doi:10.1 038/ 

ncb3231. 

A
n attractive strategy for cancer ther­
apy is to stop cell proliferation by 

means of agents chat directly arrest the 
cell cycle. Microcubule poisons such as 
taxanes block mitosis, eventually leading 
to cell death in a process frequently 
known as mitotic catastrophe. However, 
some cells are able to bypass chis mitotic 
arrest and survive, thus contributing to 
chemoresistance to chose therapies. We 
have recently observed chat mitotic arrest 
induces an early autophagic flux response 
chat results in autophagy-dependent 
mitochondrial degradation and a dra­
matic energetic deficit. The subsequent 
increase in the AMP/ATP ratio results in 
the activation of the metabolic sensor 
AMPK followed by phosphorylation and 
activation of PFKFB3, an enzyme 
required for glycolysis. Thus, mitophagy 
can be considered as a critical effector of 
the therapeutic effect of mitotic thera­
pies, while both AMPK and PFKFB3 are 
critical for survival. The manipulation of 
these molecular routes may therefore 
have therapeutic benefits in the presence 
of microtubule poisons. 

The special structural requirements 
that accompany chromosome segregation 
during mitosis make cells very sensitive to 
cell death during chis process. Multiple 
lines of evidence suggest that mitotic cell 
death is caspase-dependent alchough the 
presence of undefined caspase-indepen­
dent processes has also been suggested. 
Whether autophagy was or not present in 
mitosis has been a maner of debate in the 
past few years. Using a combination of 
genetic and chemical models, as well as 
time-lapse microscopy to monitor pro­
gression throughout the cell cycle, we 

recendy found that autophagy also plays 
critical roles in cell survival during pro­
longed mitotic arrest (Fig. 1). This pro­
cess is induced a few hours after mitotic 
arrest and has a strong impact on mitotic 
cell death. Knockdown of the autophagy 
regulators ULKl, PIK3C3/Vps34 and 
BECNl/Beclinl, as well as treatment with 
the class III Ptdins3K inhibitor 3-methyl­
adenine, blocks mitotic cell death to a 
similar extent as caspase inhibition. In 
fact, autophagy is likely upstream of 
apoptosis as caspase inhibitors do not pre­
vent autophagosome formation, whereas 
autophagy inhibitors delay caspase activa­
tion during mitotic cell death. Bax Bak 1 

double-knockout cells also die during pro­
longed mitotic arrest suggesting the pres­
ence of both caspase-dependent and 
-independent pathways in this process. 
Interestingly, induction of autophagy by 
knocking down RPTOR or treating cells 
with AKT-MTOR inhibitors increases 
cell death in mitotic arrested cells, indicat ­
ing a pro-death role in this particular set­
ting. Autophagy is mainly a prosurvival 
mechanism, and cell death is frequently 
prevented by a safery mechanism that 
leads to the activation of MTOR after 
prolonged stimuli, thus resulcing in 
autophagy attenuation. However, protein 
synthesis is limited during mitosis due to 
the lack of general transcription and trans­
lation so it could be speculated that the 
normal controls that limit the autophagy­
dependent degradation of intracellular 
components are absent during mitotic 
arrest. 

The productive autophagic flux 

observed as early as 3 h after mitotic arrest 
results in a marked decrease in mitochon­
drial numbers. Using a quantitative 

www.tandfonline.com Autophagy 2379 

http://dx.doi.org/10.1080/15548627.2015.1108509
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mailto:msalazar@cnio.es
mailto:pboya@cib.csic.es


 

 

 

M.S.-R. (e-mail 

ARTICLES 

nawre 

cell biology 

AMPK and PFKFB3 mediate glycolysis and survival 

in response to mitophagy during mitotic arrest 

Elena Domenech\ Carolina Maestre\ Lorena Esteban-Martinez2, David Partida\ Rosa Pascual3, 
Gonzalo Fernandez-Miranda3, Esther Seco2, Ramon Campos-Olivas4, Manuel Perez5, Diego Megias5, 
Katherine Allen6, Miguel L6pez7'8, Asish K. Saha6, Guillermo Velasco9, Eduardo Rial10, Raul Mendez3, 
Patricia Boya2, Maria Salazar-Roa1•11 and Marcos Malumbres1•11 

Blocking mitotic progression has been proposed as an attractive therapeutic strategy to impair proliferation of tumour cells. 

However, how cells survive during prolonged mitotic arrest is not well understood. We show here that survival during mitotic arrest 

is affected by the special energetic requirements of mitotic cells. Prolonged mitotic arrest results in mitophagy-dependent loss of 

mitochondria, accompanied by reduced ATP levels and the activation of AMPK. Oxidative respiration is replaced by glycolysis 

owing to AM PK-dependent phosphorylation of PFKFB3 and increased production of this protein as a consequence of 

mitotic-specific translational activation of its mRNA. Induction of autophagy or inhibition of AMPK or PFKFB3 results in 

enhanced cell death in mitosis and improves the anti-tumoral efficiency of microtubule poisons in breast cancer cells. Thus, 

survival of mitotic-arrested cells is limited by their metabolic requirements, a feature with potential implications in cancer 

therapies aimed to impair mitosis or metabolism in tumour cells. 

Chromosome segregation requires a marked reorganization of cellular 

structures including centrosome duplication and generation of the 

microtubule spindle, disassembly of the Golgi apparatus, breakdown 

of the nuclear envelope and chromosome condensation. At this stage, 

transcription is strongly suppressed, translation is limited to a subset of 

messenger RNAs, and the absence of the nuclear envelope temporally 

maintains on hold multiple regulatory mechanisms that are based 

on the separation of the nuclear and cytoplasmic compartments1. 

Progression through mitosis is monitored by the spindle assembly 

checkpoint (SAC), a regulatory pathway that delays mitotic exit until 

all chromosomes are bipolarly attached to the spindle2•3. The target 

of the SAC is the anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), 

an E3 ubiquitin ligase that, when activated by Cdc20, targets for 

degradation the separase inhibitor securin, and the Cdk! activatory 

subunit cyclin B. Stable bipolar attachment of chromosomes satisfies 

the SAC releasing APC/C-Cdc20 inhibition and resulting in Cdkl 

inhibition and activation of separase, thus leading to chromosome 

segregation and the reformation of two new nuclei4•5• 

Disruption of the mechanisms that regulate the proper attachment 

of chromosomes to the bipolar spindle results in mitotic arrest in a 

SAC-dependent manner. Thus, inhibition of mitotic kinases such as 

Aurora A or Plkl, or treatment of cells with microtubule poisons that 

disrupt the proper dynamics of the spindle, results in mitotic arrest, 

a feature that may be used to prevent tumour cell proliferation. Yet, 

the success of mitotic-targeted therapies is limited by the low mitotic 

index of human tumours, and mitotic slippage; that is, the ability of 

cells to exit from mitosis in the presence of mitotic blockers6•7• As 

mitotic slippage is APC/C-Cdc20-dependent8, targeting the mitotic 

exit machinery has been proposed as an efficient method to prevent 

resistance to anti-mitotic drugs8-11• 

Although death in mitosis is at least partially mediated by 

apoptosis, the molecular pathways that control survival or death in 

mitosis are not well understood 12•13• Here we show that death in mitosis 

is modulated by the energetic balance that counteracts the loss of 

mitochondrial mass during mitotic arrest. Using Cdc20-knockout cells 

or human cells treated with microtubule poisons, we describe here that 

1Cell Division and Cancer Group, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), Madrid 28029, Spain. 'Department of Cellular and Molecular Biology, Centro de 

lnvestigaciones Biol6gicas, CSIC, E-28040 Madrid, Spain. 31CREA and Institute for Researoh in Biomedicine ( IRB), Barcelona 08028, Spain. 'Spectroscopy and 

Nuclear Magnetic Resonance Unit, CNIO, Madrid 28029, Spain. 'Confocal Microscopy Unit, CNIO, Madrid 28029, Spain. 'Division of Endocrinology, 

Diabetes & Nutrition, Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts 02215, USA 'Department of Physiology, CIMUS, University of Santiago de 

Compostela-lnstituto de lnvestigaci6n Sanitaria, Santiago de Compostela 15782, Spain. "GIBER Fisiopatologia de la Obesrdad y Nutricr6n (CIBERobn), 15706, Spain. 

'Department of Biochemistry and Molecular Biology I, School of Biology, Complutense University, and lnstituto de lnvestigaciones Sanitarias San Carlos (Id I SSC), 

28040 Madrid, Spain. 10Department of Cellular and Molecular Medicine, Centro de lnvestigaciones Biol6gicas, CSIC, E-28040 Madrid, Spain. 

11Correspondence should be addressed to or M.M. m salazar®:nio.es or malumbres@cnio.es) 


Received 8 August 2014; accepted 24 July 2015; published online 31 August 2015; DOI: 10.1038/ncb3231 


1304 NATURE CELL BIOLOGY VOLUME 17 I NUMBER 10 I OCTOBER 2015 

© 2015 Macmillan Publishers Limited. All rights reserved 

http://dx.doi.org/10.1038/ncb3231
mailto:malumbres@cnio.es
http:msalazar�:nio.es


 

 

 

r,,Autophagy 

http://www_tandfonline_com/loilkaup20 

Autophagy 


9,,,,_,__- ISSN: 1554-8627 (Print) 1554-8635 (Online) journal homepage: 

Guidelines for the use and interpretation of assays 
for monitoring autophagy (3rd edition) 

Daniel J Klionsky, Kotb Abdelmohsen, Akihisa Abe, MdJoynal Abedin, 
Hagai Abeliovich, Abraham Acevedo Arozena, Hiroaki Adachi, Christopher 
M Adams, Peter D Adams, Khosrow Adeli, Peter J Adhihetty, Sharon G 
Adler, Galila Agam, Rajesh Agarwal, Manish K Aghi, Maria Agnello, Patrizia 
Agostinis, Patricia V Aguilar, Julio Aguirre-Ghiso, Edoardo M Airoldi, Slimane 
Ait-Si-Ali, Takahiko Akematsu, Emmanuel T Akporiaye, Mohamed Al-Rubeai, 
Guillermo M Albaiceta, Chris Albanese, Diego Albani, Matthew L Albert, 

Jesus Aldudo, Hana Algul, Mehrdad Alirezaei, lraide Alloza, Alexandru 
Almasan, Maylin Almonte-Beceril, Emad S Alnemri, Covadonga Alonso, 
Nihal Altan-Bonnet, Dario C Altieri, Silvia Alvarez, Lydia Alvarez-Erviti, 
Sandro Alves, Giuseppina Amadoro, Atsuo Amano, Consuelo Amantini, 
Santiago Ambrosio, Ivana Amelio, Amal 0 Amer, Mohamed Amessou, 
Angelika Amon, Zhenyi An, Frank A Anania, Stig U Andersen, Usha P Andley, 
Catherine K Andreadi, Nathalie Andrieu-Abadie, Alberto Anel, David K Ann, 
Shailendra Anoopkumar-Dukie, Manuela Antonioli, Hiroshi Aoki, Nadezda 
Apostolova, Saveria Aquila, Katia Aquilano, Koichi Araki, Eli Arama, Agustin 
Aranda, Jun Araya, Alexandre Arcaro, Esperanza Arias, Hirokazu Arimoto, 
Aileen R Ariosa, Jane L Armstrong, Thierry Arnould, lvica Arsov, Katsuhiko 
Asanuma, Valerie Askanas, Eric Asselin, Ryuichiro Atarashi, Sally S Atherton, 

Julie D Atkin, Laura D Attardi, Patrick Au berger, Georg Au burger, Laure 
Aurelian, Riccardo Autelli, Laura Avagliano, Maria Laura Avantaggiati, 
Limor Avrahami, Suresh Awale, Neelam Azad, Tiziana Sachetti, Jonathan 
M Backer, Dong-Hun Bae, Jae-sung Bae, Ok-Nam Bae, Soo Han Bae, Eric H 
Baehrecke, Seung-Hoon Baek, Stephen Baghdiguian, Agnieszka Bagniewska­
Zadworna, Hua Bai,Jie Bai, Xue-Yuan Bai, Yannick Bailly, Kithiganahalli 
Narayanaswamy Balaji, Walter Balduini, Andrea Ballabio, Rena Balzan, 
Rajkumar Banerjee, Gabor Banhegyi, Haijun Bao, Benoit Barbeau, Maria 
D Barrachina, Esther Barreiro, Bonnie Bartel, Alberto Bartolome, Diane C 
Bassham, Maria Teresa Bassi, Robert C Bast Jr, Alakananda Basu, Maria 
Teresa Batista, Henri Batoko, Maurizio Battino, Kyle Bauckman, Bradley L 
Baumgarner, K Ulrich Bayer, Rupert Beale, Jean-Fram;:ois Beaulieu, George 
R. BeckJr. Christoph Becker,J David Beckham, Pierre-Andre Bedard, Patrick 
J Bednarski, ThomasJ Begley, Christian Behl, Christian Behrends, Georg MN 
Behrens, Kevin E Behrns, Eloy Bejarano, Amine Belaid, Francesca Belleudi, 
Giovanni Benard, Guy Berchem, Daniele Bergamaschi, Matteo Bergami, Ben 
Berkhout, Laura Berliocchi, Amelie Bernard, Monique Bernard, Francesca 
Bernassola, Anne Bertolotti, Amanda S Bess, Sebastien Besteiro, Saverio 
Bettuzzi, Savita Bhalla, Shalmoli Bhattacharyya, Sujit K Bhutia, Caroline 
Biagosch, Michele Wolfe Bianchi, Martine Biard-Piechaczyk, Viktor Billes, 
Claudia Bincoletto, Baris Bingol, Sara W Bird, Marc Bitoun, Ivana Bjedov, 
Craig Blackstone, Lionel Blanc, Guillermo A Blanco, Heidi Kiil Blomhoff, 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

Funciones de la autofagia en el desarrollo de la retina: 
metabolismo, diferenciación y muerte celular 

En esta Tesis Doctoral hemos querido entender el papel de la autofagia y la mitofagia en el 

desarrollo de la retina de ratón. Nuestros datos muestran que la autofagia es un proceso activo 

durante el desarrollo de la retina de ratón, sobre todo en los estadios embrionarios iniciales, siendo las 

células ganglionares las que presentan un mayor flujo de autofagia. Este proceso presenta diversas 

funciones durante la fisiología de la retina embrionaria. En primer lugar, hemos demostrado que 

existen diferencias en los niveles de masa mitocondrial en las retinas de embriones en E13.5 debido a 

la degradación de mitocondrias por mitofagia únicamente en la región central de la retina en dicho 

estadio. Por otro lado hemos demostrado que la autofagia es necesaria para mantener unos niveles de 

ATP adecuados para la exposición de fosfatidil-serina en la superficie de las células apoptóticas, lo 

que permite su reconocimiento y degradación. Esta función no es universal, ya que la inhibición de 

autofagia no produce una acumulación de células apoptóticas en la región central, donde la masa 

mitocondrial es menor. Por otro lado, la mitofagia que se produce en la zona central de la retina 

contribuye a la muerte neural temprana localizada en dicha región. 

Además, esa degradación mitocondrial se produce de manera generalizada en toda la retina 

en un estadio del desarrollo mas avanzado, E15.5, debido a la activación del proceso de mitofagia 

regulado por hipoxia y NIX. En este caso, la mitofagia no solo contribuye a la muerte fisiológica de 

la retina, si no que también es responsable de un cambio metabólico hacia glicólisis necesario para la 

correcta diferenciación de las células ganglionares de la retina. Además, existe una estrecha relación 

entre el metabolismo, la masa mitocondrial y la diferenciación, ya que la modulación directa de la 

glicólisis produce cambios en los niveles de mitocondrias y altera la diferenciación de células 

ganglionares. Ese cambio metabólico mediado por mitofagia, también podría estar implicado en la 

polarización de macrófagos hacia tipo proinflamatorio M1 y en la diferenciación temprana de células 

stem. 


	Tesis Lorena Esteban Martínez
	AGRADECIMIENTOS
	ÍNDICE
	RESUMEN
	ABSTRACT
	ABREVIATURAS
	INTRODUCCIÓN
	1. LA AUTOFAGIA 
	2. LA MITOFAGIA 
	3. DESARROLLO DE LA RETINA DE VERTEBRADOS 
	4. MITOFAGIA Y MUERTE CELULAR 
	5. REPROGRAMACIÓN METABÓLICA 

	OBJETIVOS
	MATERIALES Y MÉTODOS
	1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Y EXTRACCIÓN DE RETINAS 
	2. GENOTIPAJE DE LOS RATONES KNOCK-OUT 
	3. ESTUDIO DEL FLUJO DE AUTOFAGIA IN VIVO 
	4. CULTIVOS ORGANOTÍPICOS DE RETINAS 
	5. MONTAJE EN PLANO DE RETINAS EMBRIONARIAS 
	6. INMUNOFLUORESCENCIA DE RETINAS EN PLANO 
	7. DETECCIÓN DE LA MUERTE CELULAR 
	8. PREPARACIÓN DE SECCIONES DE OJO PARA INMUNOFLUORESCENCIA 
	9. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y CONFOCAL
	10. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
	11. DISOCIACIÓN DE RETINAS Y CITOMETRÍA DE FLUJO
	12. ESTUDIO TRANSCRIPTÓMICO Y DETECCIÓN DE RNA MENSAJERO
	13. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT
	14. CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE ATP
	15. ANÁLISIS METABÓLICO
	16. EXTRACCIÓN Y ESTIMULACIÓN DE MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATÓN
	17. CULTIVO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
	18. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

	RESULTADOS
	1. ESTUDIO DE LA AUTOFAGIA EN LA RETINA DE RATÓN 
	2. FENOTIPO DE MUERTE CELULAR TRAS EL BLOQUEO DE AUTOFAGIA DURANTE ELDESARROLLO DE LA RETINA DE RATÓN 
	3. FENOTIPO DE MUERTE CELULAR TRAS LA INDUCCIÓN DE AUTOFAGIA DURANTE EL DESARROLLO DE LA RETINA DE RATÓN 
	4. MITOFAGIA DURANTE EL DESARROLLO DE LA RETINA Y SU RELACIÓN CON EL METABOLISMO,LA DIFERENCIACIÓN Y LA MUERTE CELULAR 

	DISCUSIÓN
	1. ESTUDIO DEL FLUJO DE AUTOFAGIA EN RETINA  
	2. .LA AUTOFAGIA ES ESENCIAL PARA LA ELIMINACIÓN DE LAS CÉLULAS APOPTÓTICAS DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE LA RETINA 
	3. .LA MITOFAGIA ES ESENCIAL PARA EL DESARROLLO DE LA RETINA DE RATÓN 
	4. .EL CAMBIO METABÓLICO REGULA LA DIFERENCIACIÓN CELULAR 

	CONCLUSIONES
	BIBLIOGRAFÍA
	ANEXOS
	Autophagic flux determination in vivo and ex vivo
	New method to assess mitophagy flux by flow cytometry
	Mitophagy in mitosis: More than a myth
	AMPK and PFKFB3 mediate glycolysis and survivalin response to mitophagy during mitotic arrest
	Guidelines for the use and interpretation of assaysfor monitoring autophagy (3rd edition)