o SM UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUíMICAS DEPARTAMENTO DE QUíMICA ANALíTICA 111111tU it liii. 1 III III DM * 5309657207* UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DESARROLLO DE ELECTRODOS COMPOSITOS DE BASE GRAFiTO COMO ELECTRODOS VOLTAMiPEROMETRICOS Y DETECTORES ELECTROQUIMICOS EN HA Directores: Y IJiPLC JoséManuel Pingarrón Angel Julio ReviejoGarc CAROLINA FERNANDEZ MARTINEZ Carrazón la AROMI¶yo MADRID, 1996 Ciudad Universitaria 28040 Madrid (España) TeIéf. 3944331 Fax 3944329 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE FACULTAD DE CIENCIAS QUíMICAS DEPARTAMENTO DE QUíMICA ANALITICA LUIS MARIA RiO DIEZ, CAIFDRAIfl) Y DIREflflI DE IME DFPARfAMENIO aman Qie el presentetmb~jo, titulado “Desonvilo de electrodos compósito>sdebasegrqfitocomoelectrodosvoltaniperométricos y detectoreselectroquímicosen FM Y HPLC” ha sido realizadoen estedepartanrntopor Dfia. CarolinaFernérdez Martírrz, b~jo la dirección de los doctoresD. JoséManuel PingarrónCarrazón,CatedráticodeesteI>paxtanrntoy D. Angel Julio Reviejo Claxcía, Piofesor Titular de este I>partanrnto,constituye¡dola TesisDactoralde su autora. Madrid, Junio 1996 Luis Nl. PdoDíez A mi familia A Alfredo Lo prinrm quedebehacersecuantosepresentaurmlvknrria quecontiexevarios a~>sde trabajoesrecoxucerque entresuspáginasseescoixiela colaboracióndeanchas persomsamuy diferentesniveles. Estánlosqueteimitanel caninoaseguirytehacencompletar,avanzaro rectificar en tu investigación,esdecir los directores. Estánlos que te enseñana buscaren la bibliografía, aprepararun electrodo,a nrnrrjarun instrunento,unartilugio o unprogranmde ordenador. Estánlos que nmrjan los misnus equipos o dispositivosque tú, y por eso compartentuspmbleansy comprerrienperfectanrntetus nunentosdedesesperación. Estánlosqueteprestanunreactivo,unnntraz,untubodeteflónounsimpletomillo quete sacade apurosenun nrnrntodeterminado. Y estántodoslosden~s,losquete soportandia¡ianrnte,tantoenla Facultadconn encasa,yteaninnna seguiradelante. lbr eso,quieroexpresarmi inéssñremagradecimientoatodosellos,y enespecial: AJoseyaJulio,porsudirecciónysuamistad. A Asuny a Araceli, mis prinerascompafrrasdeLaboratorio,porsucolaboración paralo quehicierafalta, jirluso tonnrunascañassi eraircesano. A Inuidesy aMiguel Angel, tambiénliadosconsusTesisDactorales. A Anay aCésar,quetambiénsepelearonconlos electrodosdegrafito-teflón. A Palonn,aquiendebomisprinerospinitosenel RA enunatesinaqueelladirigió. A Rocíoy a Jesús,compainusde tardes,cochey cañas. A Javier,aCoirba,aMaría,a Wurs,atodoslos hacenahorasusTesiso Tesinas: Nuria, GemnnE,Teresa,Carlos, Luis, Mohamned,Toñi, A Jose Luis y a Federico,por su ayudaquimionÉtrica. A Pdopor su apoyo cxnog¡ífico. A los del laboratoriodeOrgánicade al lado, por susfrecuentes“prestaciomrs”,en especialaSanti. Muy especialnrntea Alfredo, que, aimquefueradel laboratorio,no ha tenidon* reniedioqueseguirmuydeceicatodala Tesis.Tantiéna mi ¡mdre,porcuidamrsiempre paraquerx nr Paltaradenadacuantollegabaacasa.Y ami padre,quefue el quesiempre quisoqueyo estudiaray nwranr lo dijo. GRACIAS, atodos. Porotro lado,tengoqueagradecera la C.I.C.Y.T. (Proyectode InvestigaciónAH 95-O4’~ la tinaxiaciónde los trabajosrecogidosenestalvkrruria. En memoriade mi padre INDICE Indice 1 U. INTRODUCCION 1.1.- OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO 3 1.2.- ELECTRODOSCOMPOSITOS .... 6 1.2.1.- Clasificacióny generalidades 6 1.2.2.- Electrodoscompósitosde pastade carbono 10 1.2.2.1.- Electrodosde pastade carbonomodificadoscon mediadoresredox 16 1.2.3.- Electrodoscompósitosde grafito-teflón . . . . 25 1.3.- ANTECEDENTESBIBLIOGRAFICOS SOBRELA DETERMINACION DE TIRAM Y DISULFIRAM 28 1.3.1.- Métodoscromatográficos 29 1.3.2.- Métodosespectrofotométricos 36 1.3.3.- Métodoselectroqunnicos 40 1.3.4.- Métodosvolumétricos 40 IL- PARTE EXPERIMENTAL . 43 11.1.- DETERMINACION DE TIRAM Y DISULFIRAM CON UN ELECTRODODE PASTA DE CARBONO MODIFICADO CON FTALOCIANINA DE COBALTO 45 11.1.1.- Instrumentacion 45 11.1.1.1.- Aparatos 45 11.1.1.2.- Electrodosy célulasde trabajo 46 11.1.2.- Reactivos 46 II. 1.3.- Procedimientosexperimentales 47 11.1.3.1.- Preparacióndel electrodomodificado 47 fi Indice II. 1.3.1.1.— II. 1.3.1.2.- 11.1.3.2.- II. 1.3.3.- 11.1.3.4.- 11.1.3.5.- Preparaciónde la pastade carbono modificadacon fialocianinasmetálicas Preparacióndel electrodoindicadorpara la medida Preparaciónde disoluciones Obtenciónde los voltamperogramasen discontinuo Determinaciónde tiram en fresascontaminadas Medidaspor inyecciónen flujo con detección amperométricade impulsos 11.2.- DESARROLLO DE ELECTRODOSCOMPOSITOSDE GRAFITO-TEFLON. DETERMINACION VOLTAMPEROMETRICA DE TIRAM Y DISULFIRAM 47 48 48 50 51 52 52 11.2.1.- Instrumentación 11.2.1.1.- Aparatos 11.2.1.2.- Electrodosy célulasde trabajo 11.2.2.- Reactivos 11.2.3.- Procedimientosexperimentales 11.2.3.1.- Preparacióndel electrodocompósitode grafito-teflón 11.2.3.1.1.- Preparacióndel materialcompósito 11.2.3.1.2.- Preparacióndel electrodoindicador 11.2.3.2.- Pretratamientodel electrodoindicador 11.2.3.3.- Preparaciónde disoluciones 11.2.3.4.- Obtenciónde los voltamperogramas 52 52 53 53 54 54 54 54 55 55 56 11.2.3.5.- Determinaciónde tiram en fresascontaminadas 11.3.- ELECTRODOSDE GRAFITO-TEFLONCOMO DETECTORES ELECTROQUíMICOSEN SISTEMAS EN FLUJO 11.3.1.- Instrumentación ... 56 57 57 Indice fi 11.3.1.1.- Aparatos 57 11.3.1.2.- Electrodos 59 11.3.2.- Reactivos 59 11.3.3.- Procedimientosexperimentales 59 11.3.3.1.- Preparacióndel electrodocompósitode grafito-teflón 59 11.3.3.2.- Pretratamientodel electrodocompósitode grafito-teflón 60 11.3.3.3.- Preparaciónde disoluciones 60 11.3.3.4.- Medidaspor inyecciónen flujo con detección amperométrica 61 11.3.3.5.- Determinaciónde tiram en aguascontaminadas 61 11.3.3.6.- Preconcentraciónpor adsorciónen continuo . . 61 11.3.3.7.- Separaciónen continuo de tiram y disulfiram . 62 11.4.- DETECCIONELECTROQUíMICA EN HPLC CON UN ELECTRODODE GRAFITO-TEFLON. DETERMINACION DE TIRAM Y DISULFIRAM 63 11.4.1.- Instrumentacion 63 11.4.1.1.- Aparatos 63 11.4.1.2- Electrodosy célulasde trabajo . 64 11.4.2.- Reactivos 65 11.4.3.- Procedimientosexperimentales 65 11.4.3.1.- Preparaciónde disoluciones . . . 65 11.4.3.2.- Obtenciónde los cromatogramas 66 11.4.3.3.- Determinaciónde tiram en muestrasde manzanas contaminadas 66 IV Indice fi.- RESULTADOS Y DISCUSION . 69 111.1.- DETERMINACION VOLTAMPEROMETRICA DE TIRAM Y DISULFIRAM CON UN ELECTRODO DE PASTA DE CARBONO MODIFICADO CON FTALOCIANINA DE COBALTO 71 III. 1.1.- Elecciónde la fialocianina metálicacomo mediador redox 72 111.1.2.- Comportamientovoltamperométricoy optimizaciónde las condicionesexperimentalesmediantevoltamperometría diferencialde impulsos 74 III. 1.2.1.- Influenciade la proporcióndel modificador 74 111.1.2.2.-Efectodel pH 82 111.1.3.- Característicasde los procesosde oxidación 87 111.1.4.- Adsorciónde los fungicidassobreel electrodode pastade carbonomodificado 93 111.1.4.1.-Comportamientovoltamperométricomediante diferencialde impulsos 97 111.1.4.1.1.- Efecto del tiempo de acumulación 98 111.1.4.1.2.- Influencia del pH 102 111.1.4.1.3.- Efecto del contenidoen metanolde la disoluciónanalítica 108 111.1.4.1.4.- Conclusionesparciales 108 111.1.4.2.-Efectode la velocidadde barridode potencial mediantevoltamperometríade barridolineal 112 111.1.5.- Curvasde calibradoy característicasanalíticas 117 111.1.6.- Estudiode interferencias 124 111.1.7.- Determinaciónde tiram en muestrasde fresas contaminadas 128 Indice V 111.2.- DETERMINACION DE TIRAM MEDIANTE INYECCION EN FLUJO CON DETECCION AMPEROMETRICA DE IMPULSOS SOBRE UN ELECTRODODE PASTA DE CARBONO MODIFICADO CON FTALOCIANINA DE COBALTO . 131 111.2.1.- Detecciónamperométricaconvencionalsobreel electrodo modificado 131 111.2.2.- Detecciónamperométricade impulsos 132 111.2.2.1.-Selecciónde los valoresdel potencialaplicadosen el programade impulsos 133 111.2.2.2.-Selecciónde los valoresde tiempo de aplicaciónde los potencialesanteriores 137 111.2.2.3.-Optimizaciónde las variableshidrodinámicas . . . . 138 111.2.2.4.-Curvasde calibrado 143 111.3.- EVALUACION CUANTITATIVA DE TIRAM Y DISULFIRAM MEDIANTE TECNICAS QUIMIOMETRICAS MULTIVARIANTES 148 111.3.1.- Regresiónmediantecomponentesprincipales(PCR) y mínimos cuadradosparciales(PLSR) 148 111.3.1.1.-Descripciónde los modelosmatemáticos empleados 150 111.3.2.- Redesneuronales 153 111.3.3.- Desarrollodel método 159 111.3.3.1.-Diseñoexperimental . . . . 160 111.3.3.2.-RegresiónmediantePCR y PLSR 162 111.3.3.3.-Aplicación de redesneuronalesmediantepropagación haciaatrás 167 111.3.3.3.1.- Especificacionesde las redesutilizadas . . . 168 111.3.3.3.2.- Resultados 169 VI Indice 111.4.- DESARROLLO DE ELECTRODOSCOMPOSITOSDE GRAFITO-POLI(TETRAFLUOROETILENO)- TEFLON-. DETERMINACION VOLTAMPEROMETRICA DE TIRAM Y DISULFIRAM 175 111.4.1.- Comportamientovoltamperométricomediantebarrido lineal 175 111.4.2.- Adsorciónde los fungicidassobreel electrodo compósito 177 111.4.2.1.-Optimizaciónde la composicióndel electrodo . . 179 111.4.2.2.-Regeneraciónelectroquímicade la superficie electródica 182 111.4.2.3.-Comportamientovoltamperométricomediante barrido lineal . . . 184 111.4.2.3.1.- Efecto del pH 186 111.4.2.3.2.- Influenciadel tiempo de acumulación . . . 189 111.4.2.3.3.- Efecto de la velocidadde barridode potencial 195 111.4.2.4.-Curvasde calibradoy característicasanalíticas . . 201 111.4.2.5.-Estudiode interferencias 205 111.4.2.6.-Determinaciónde tiram en muestrasde fresas contaminadas 211 111.5.- ELECTRODOSDE GRAFITO-TEFLON COMO DETECTORES ELECTROQUíMICOS EN SISTEMAS EN FLUJO 214 111.5.1.- Determinaciónde tiram y disulfiram medianteinyección en flujo con detecciónamperométrica 215 111.5.1.1.-Eleccióndel potencialaplicado 215 111.5.1.2.-Repetibilidadde las señalesobtenidas 216 111.5.1.3.-Optimizaciónde las variableshidrodinámicas . . . . 218 111.5.1.4.-Curvasde calibradoy característicasanalíticas . . . 226 Indice VII 111.5.1.5.-Estudiode interferencias 231 111.5.1.6.-Detenninaciónde tiram en aguade grifo y agua de pozo 235 111.5.1.7.-Preconcentraciónpor adsorciónen disoluciones en flujo de los fungicidas 237 111.5.1.7.1.- Repetibilidadde los voltamperogramas . . . 237 111.5.1.7.2.- Influenciadel caudal 239 111.5.1.7.3.- Influenciadel tiempo de pasode las disolucionesde los fungicidas 242 111.5.1.7.4.- Curvasde calibrado 244 111.5.1.7.5.- Estudiode interferencias 247 111.5.1.8.-Separaciónen continuo medianteinyecciónen flujo de tiram y disulfirain 249 111.5.1.8.1.- Elecciónde la fasemóvil y optimización de las variableshidrodinámicas 250 111.5.1.8.2.- Curvasde calibrado . 252 111.5.2.- Determinaciónde tiram y disulflram medianteHPLC con detecciónamperométrica . . 254 111.5.2.1.-Elecciónde la fase móvil 254 111.5.2.2.-Influencia del potencialaplicado 256 111.5.2.3.-Comparaciónde la respuestadel electrodo compósitode grafito-teflón con un electrodode carbonovitrificado 257 111.5.2.4.-Separaciónde tiram, disulflram, ziram y fenol . . . 259 111.5.2.5.-Curvasde calibrado.Comparaciónde las configuracioneswall-jet y thin-layer 265 111.5.2.6.-Determinaciónde tiram en manzanas contaminadas . 266 VIII Indice 1V.- CONCLUSIONES 271 y.- BIIBLIOGRAFIA 281 1.- INTRODUCCION Objetivoy Plan de Trabajo 3 Li.- OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO Unaparteesencialdecualquiersistemaanalíticodemedidaesel denominado transductor,un dispositivoqueconvierteel procesofisico/quimicodernterésenuna respuestaadecuadacon fines analíticosy que suele ser una señaleléctrica. En espectroscopiapuedeseruntubo fotomultiplicador(o un sistemadediodosenserie) que convienela intensidadde radiación en una corriente (o carga). En análisis térmicopuedeseruntermopar,quetransformaunadiferenciade temperaturaenuna diferenciade potencial.En electroanálisises el electrodo,másconcretamenteel electrodo indicador,el cual convierte los procesosacopladosde transferenciade cargainterfacialy de transferenciademasaenunacorrienteeléctricaenlas técnicas voltamperométricas.A diferenciade la mayoríade los transductores,puedeoperar en sentidoinverso; es decir, se puedeimponer un flujo de corrientea travésdel electrodode trabajoy emplearloparacontrolarprocesosde transferenciaelectrónica yio detransferenciademasa,comosucedeenculombimetría,siendoposibleademás, la medidadel potencialen la interfaseelectrodo-disoluciónduranteel proceso. Muchosde los avancesmássignificativosquesehanproducidoenQuímica Analíticaenlos últimos tiempos,hansidocomoconsecuenciadelperfeccionamiento de estostransductoresen términosde sensibilidad,selectividad(o porel contrario, carácteruniversal),operatividado economia.EnElectroanálisis,esteproblemapuede enfocarsehaciael desarrollode nuevoselectrodosindicadores. Hastahacepocosaños,el desarrollodel análisisvoltamperométricoestaba limitado por los materialeselectródicosdisponibles,dado que sólo era posible utilizar el electrodode gotasde mercurio,un metal o el electrodode carbono.El electrodo de pasta de carbono significa el comienzo de una nueva era en electroanálisis,y puedeconsiderarseel puntode partidaparala investigaciónen el áreadelos electrodosmodificados,nuevosmaterialescompósitosy microelectrodos. En algunos casos,estastres áreasde investigaciónresultan indistinguibles;por 4 Introducción ejemplo, ciertos materiales compósitos se comportan como un conjunto de microelectrodosmodificadossuperficialmente. Con la modificación de la superficie del electrodo se pretendeejercerun mayorcontrol sobresuscaracterísticase influir no sóloenel potencialaplicadosino tambiénen la reactividadsuperficial,pudiendopreseleccionaroanticiparlarespuesta del electrodomodificadohaciaciertasespeciesexternas. Conel desarrollodenuevosmaterialescompósitossepretendeprecisamente disponer de matrices electródicassusceptiblesde ser modificadas de fonna homogénea,perodemayorresistenciamecánicay químicaquela pastade carbono y de fácil regeneraciónde su superficieactivapor relleno o pulido. El objetivo fundamentalde estetrabajo, enmarcadodentrode una de las lineasde investigacióndel Grupo deQuímicaElectroanalíticadeesteDepartamento, es el de desarrollar distintos tipos de electrodosque puedan ser aplicados ventajosamenteal análisisde compuestosorgánicosde interésambiental,tanto en discontinuocomo en sistemasen flujo. Los analitosescogidosparaestosestudioshansidodosfungicidasderivados del ácido ditiocarbámico:tiram y disulfiram, de comportamientoelectroquímico similary quepresentanelevadossobrepotencialesparasuoxidaciónsobreelectrodos convencionales[1]. Por unaparte,se desarrollaráun electrodode pastade carbonomodificado con un mediadorredox, con objeto de facilitar la transferenciade cargaentre el electrodoy el analito en disolución.Esposibleasi, realizarla detenninaciónde los fungicidas a potencialesmucho menos positivos, aspectoéste particularmente interesantecuandose considerasu aplicabilidada la detecciónelectroquímicaen sistemasen flujo, ya quela reduccióndel sobrepotencialde activaciónpermiteuna Objetivoy Plan de Trabajo 5 mejorade la selectividadgraciasal empleodepotencialesde trabajomásbajos.Se empleará,por tanto, el electrodomodificado para la determinaciónde tiram y disulflram en discontinuoy se investigarála posibilidad de su utilización como detectoramperométricoen continuo. Por otro lado, se discutirá la aplicación de diversastécnicasquimiométricaspara la determinaciónconjunta de estos dos fungicidasde comportamientoelectroquímicotan similar. Por otra parte, se desarrollaráy caracterizaráun electrodo compósitode grafitoy teflón (poli-tetrafluoroetileno),conel fin deaprovecharlaspropiedadesque ofrecen este tipo de materiales compósitos con respecto a los electrodos convencionalesen términosderelaciónseñal-midoy con respectoa los electrodos depastade carbonoen términosderesistenciamecánicay química. Se estudiaráel comportamientodelelectrodocompósitodegrafito-teflóntantoendiscontinuocomo en continuo, empleandocomo analitostiram y disulfiram. La adsorciónde estos compuestossobre el electrodo constituye la base para su determinación en discontinuo y se aprovecharápara desarrollarun método de preconcentración selectivaen continuo.Porúltimo, sedemostrarála utilidad del electrodocompósito desarrollado como detector en sistemas en flujo, tanto FíA como HPLC, especialmenteen esteúltimo casodondeno son útiles los electrodosde pastade carbonopuestoqueel portadorpuedecontenerporcentajeselevadosde disolventes organicos.Así, sedeterminaránconjuntamentetiram y disulfiramtrassuseparación mediante cromatografia líquida de fase inversa, empleando como detector amperométricoel electrodode grafito y teflón. 6 Introducción L2.- ELECTRODOS COMPOS11?OS L2.1.- CLASIFICACION Y GENERALIDADES Un electrodocompósitopuededefinirse comoun materialque constade al menosunafaseconductoraenconjuncióncon al menosunafaseaislante,siendoel casomásusualun material que contieneunafaseconductoray unafaseaislante. Los electrodos compósitos ofrecen muchas ventajas potenciales en comparacióncon los electrodosmás tradicionales consistentesen una fase conductorasimple. Por ejemplo, los electrodoscompósitos puedena menudo fabricarse con gran flexibilidad en cuanto al tamaño y forma del material, permitiendounafácil adaptaciónaunagranvariedaddeconfiguracioneselectródicas. Los electrodoscompósitosde metalespreciososofrecenventajasen forma de un menorpesoy deun menorcosteencomparacióncon loscorrespondienteselectrodos conductorespuros. Una ventajapanicularen electroanálisises la mayorrelación señal/ruidoqueamenudoseobservacon los electrodoscompósitos(conrelaciónal correspondienteelectrodo conductorpuro), lo que generalmentese traduce en mejores(menores)límites de detección.Quizásel aspectomás interesantede los electrodoscompósitoses la versatilidadquepermitenparaincorporarespeciesque intensifiquenla selectividadyio la sensibilidadenel propiomaterialelectródico,bien mediantemodificaciónquímicadel conductoryio del aislanteantesde la fabricación del compósito,o medianteincorporaciónfisica dentro de la matriz del compósito. A diferencia de los electrodosmodificados superficialmente,estos electrodos compósitosmodificadospuedenser regeneradosen su superficie sin pérdidade modificador. Los electrodoscompósitossepuedenclasificarsegúnel modo en el queel conductory el aislanteestándistribuidosdentrodel materialcompósito.En la Figura 1 seilustra dicha clasificación. Electrodos compósitos 7 Figura 1 Clasificac¡ón de los electrodos compósitos Puestoque,por definición,un electrodocompósitoconsisteenal menosuna faseconductoray al menosuna faseaislanteentremezcladasde algunamanera,la superficie del electrodo compósito en contacto con la disolución consiste necesariamenteen regionesde conductorseparadaspor regionesde aislante.La primeraclasificaciónestábasadaen si la disposicióndel conductory del aislante estáaltamenteordenada(un array) o es aleatoria(un conjunto). 8 Introducción Los electrodosde arraypuedenclasificarseposterionnentedependiendode si el conductorestáconfinadoen la superficiede un aislador(o de un aislanteen la superficiedeunconductor)o el conductorordenadopenetraenel senodelmaterial. Lamayoríade los electrodosde arrayutilizadosen Electroanálisissonsuperficiales y puedenencontrarsealgunosejemplosen la revisión de Talíman y Petersen[2]. Estosarraystienengeometríasbien definidaspero, sin embargo,sussuperficiesa menudo no son planas y pueden ser también bastantedelicadas de pulir, requiriéndoseotra forma de regeneraciónsuperficial. Porlo queserefierea los electrodoscompósitosdeconjunto,estossepueden clasificar dependiendode la distribución del conductora través de la matriz del compósito.Los materialesen los quelas partículasde conductorestándistribuidas aleatoriamenteportodoel aislantesedenominancompósitosdispersos.Unapanícula deconductor(o un agregadodepartículas)tieneunaprobabilidadidénticadeocupar cualquier punto en la matriz. En contraste,los compósitosconsolidadosestán formadosde tal maneraque el conductorseextiendea travésdel compósitode un modoreticulado,aleatorio,con regionesde aislantepuro y de conductorpuro que no estanentremezcladas. Los compósitosdispersospuedenfabricarseenformadepastao biensólidos. Dentro del primer grupopuedenincluirselos electrodosde pastade carbono,que serán tratados en el Apanado 1.2.2. Los compósitosdispersossólidos pueden prepararsededosformas.El métodomáscomún(mezcladoconmonómeros)implica la dispersiónuniformede un conductorenun monómeroquees subsiguientemente polimerizado(2]. Alternativamente,el conductorpuededispersarseenun polímero o unacerafundidoso disueltos(mezcladocon polímeros)y permitirque lamezcla se endurezca. Los compósitosconsolidadosse puedenfabricar tambiénde dos maneras generales.Una implica la impregnaciónde, o bien un conductorporoso con un Electrodoscompósitos 9 aislante, o bien de un aislanteporoso con un conductor, denominándosetales materialescompósitosimpregnados.En este caso la consolidacióndel conductor dentrodelcompósito(y por tantoen la superficiedel electrodo)estápredeterminada por la estructuraporosadel conductoro del aislante. La segundamanerade formar electrodosconsolidadosimplica la mezclade un conductorenpolvo con un polímeroen polvo y el moldeadopor compresiónde la mezcla. Dentro de este grupose sitúan los electrodoscompósitosde grafito y teflón, que serán tratados con más detenimientoen el Apartado 1.2.3. Estos materialessellamancompósitossegregados.Loscompósitosconsolidadosengeneral y los compósitossegregadosen particularpresentanfrecuentementeventajasen comparacióncon los compósitosdispersosen Electroanálisis. Los electrodosde arrayy los electrodoscompósitosimpregnadosconducen a través de regiones bastantecontinuasde conductormayoritariamentepuro y homogéneo.Por otra parte, los electrodoscompósitossegregadosy los dispersos conducena través de regionesbastantesdiscontinuas,altamenteheterogéneasde conductory aislanteentremezclados,un procesodescritoamenudopor modelosde percolación [2]. Para tener una conductividad adecuadapara su uso en electroanálisis,un materialcompósitosegregadoo dispersodebetenerunafracción de volumende conductor,f, algo por encimade la composicióncríticao umbralde percolación,It Estacomposicióncríticaessignificativamentemenorparacompósitos segregadosqueparacompósitosdispersos.Paraambostiposdematerialesla mayor fracción de volumen utilizable de conductorestáa menudodetenninadapor la estabilidadmecánicarequeridaparael materialy variafuertementeconla naturaleza del aislantey del conductor. La superficiede un electrodocompósitopuedeasemejarsea un conjuntode microelectrodos.Es este aspectoel que da lugar a las mejoras en la relación 10 señal/ruidopara muchos electrodoscompósitoscuando se les comparacon sus correspondientesfasesconductoraspuras. Un electrodocompósitoescapazdeproducirunacorrientemayorporunidad de áreaactiva quela del correspondientemacroelectrodoconductorpuro, tanto en disolucionesquiescentescomobajocondicioneshidrodinámicas.Puestoqueel ruido y la corrientede fondo (por unidadde áreaactiva)debenser similaresparaambos tipos de electrodos,el electrodo compósitopresumiblementemuestrala mayor relación señal/mido. A medida que el recubrimientofraccional de la superficie geométricadel compósitopor el conductoraumenta,la relaciónseñal/midotiende a disminuir, aproximándoseen el límite a la del electrodoconductorpuro. Es por estarazónpor la quelos compósitosconsolidados,queposeenbuenaconductividad a un bajo valor de f, espresumibleque muestrenunarelaciónseñal/ruidosuperior a la de los compósitosdispersos. L2.2.- ELECTRODOSCOMPOSiTOSDE PASTA DE CARBONO En 1958,Adamspublicó un artículopreliminarenel queintroducíaun nuevo tipo de electrodosólido de carbonoparavoltamperometría,al que llamó electrodo de pastade carbono(CPE) [3]. El electrodobabiasido inventadoen un intento de prepararun electrodode carbonorenovable,gotero, que pudieseser utilizado en zonasde potencialespositivosdondelos electrodosde mercuriono son aplicables debido a la oxidacióndel material electródico.Se pensóque esta alternativaal electrodogoterode mercuriopodríaser llevadaa la prácticaempleandoun capilar conectadoa un depósitolleno de unasuspensiónde polvo de grafito en un liquido orgánicoapropiado[413.Sinembargo,tal montajeelectródicoresulténotenerutilidad práctica,debidoaparentementeaun contenidodemasiadograndedematriz líquida, queoriginabaunaaltaresistenciaeléctricay otros efectosno deseados.No obstante, unamezclaíntimadepolvo de carbonoo grafito conunacantidadapropiadade un Electrodosdepastade carbono 11 líquido orgánicono conductorresultóserun materialelectródicomuy útil, con una consistenciasemejantea la de la mantequilla[4]. Las siguientesinvestigaciones,la mayoríadesarrolladaspor el grupo de Adams, se encaminarona la caracterizacióndel electrodo a partir de estudios electroquímicosbásicosy, poco después,aparecieronlas primeras aplicaciones prácticasde CPEsparadeterminacionesanalíticas[5]. Durantela décadade los 60 y principios de los 70 se emplearonextensamenteCPEs para el estudio del comportamientoelectroquímicode numerososcompuestosorgánicos. En 1964,Kuwanaycolaboradoresdescribieronunanuevaformadeinvestigar el comportamientoelectroquímicode algunoscompuestosorgánicosdisolviéndolos en el componentelíquido de la propiapasta[6]. Así, los autoresdemostraronque la pastade carbonopodía contenerotro constituyente,que afectabade diferente forma al comportamientoglobal del material electródico. Este método puede consideradocomola primeracontribuciónal posteriordesarrollode los electrodos de pastade carbonomodificadosquímicamente(CMCPEs)en los años70. Como consecuencia,un nuevo avance que incrementó la popularidadde los CPEs, panicularmentecomo materialesmodificados, tuvo lugar con la sustitución del componentelíquido de la pastapor un aglutinanteelectrolítico. Tales materiales similaresa la pastaresultaronmuy adecuadospara el estudioelectroquímicode numerosassustancias,principalmentesólidos inorgánicosque se incorporaron directamentea la pasta[7]. Comocabíaesperarapartir deestasinvestigaciones,imnediatamentedespués de la primeramodificaciónde un electrodosólido en 1975 [8], la pastade carbono comenzóaatraerla atencióncomounmaterialquepuedesermodificadofácilmente. Así, un trabajo pionero es este campo fue realizado por Cheek y Nelson, que introdujeron grupos funcionalescomplejantesen la superficie del carbonopara preconcentrarplata [9]. Yao y Musha escogieronotro método de modificación, 12 Introducción consistenteen disolver un modificadoren el líquido aglutinantepara inmovilizar especieselectroactivas[10]. Perofue, sin lugar adudas,el trabajodeRavichandran y Baldwin en 1981, proponiendola mezcladirectade un modificadorcon la pasta, el activadorde la enormeexpansiónen las aplicacionesde los electrodosde pasta de carbonomodificadosquetuvo lugar en los añosposteriores[11]. El númerode publicaciones aumentó exponencialmentedesde entonces. Los CMCPEs se emplearontanto para determinacionesvoltamperométricasdirectas como para determinaciones amperométricas en sistemas continuos o discontinuos. Recientemente se han convertido en un soporte muy atractivo para las modificacionesconenzimas,debidoconcretamentea la facilidaddemodificaciónde las pastas de carbono sin necesidadde métodos químicos rigurosos. Este es probablementeuno de los camposde investigaciónmásexcitantesdesarrolladosen los últimos años. La primera revisióndedicadaexclusivamentea los CPEsfue escritapor el propio inventor y cubre las experienciascon CPEsen el período1958-1963 [12]. Desdeentoncesse han publicadovarias revisionessobre el empleo de CPEsen análisisvoltamperométricoo como detectoresen sistemasen flujo [13,14]. Cabe destacarla revisiónde Kalcher sobreCMCPEsquerecogelas investigacionesmás importantesrealizadashasta1989 [7]. Las experienciasmásmodernasy las últimas tendenciasen estecampotambiénhan sido recopiladas[15,16]. La pastade carbonoesun materialcompósitodisperso,constituidopor una mezclade polvo de grafito y un líquido aglutinante.El tamañode partícula del grafito oscila entre 5 y 20 g.¡m. Partículasmayoresoriginan una texturarugosay propiedadesmecánicasy electroquímicasdesfavorables,mientrasquelos polvosde grafito de menortamañode partículapuedenser adecuadosparala fabricaciónde microelectrodosde pasta de carbono. El grafito debe poseer una serie de propiedades,tales como una distribución uniforme de tamañode partícula, gran pureza química y baja capacidadde adsorción para el oxígeno e impurezas Electrodosde pastade carbono 13 electroactivas.Materiales demasiadoporosos como el carbono negro no son apropiadosparala preparaciónde pastasde carbono[4,12]. El segundocomponentede la pastadecarbonoesel liquido aglutinante.Debe ser químicamenteinertey no electroactivo,insoluble en la disolución a analizar, escasamentevolátil y estarlibre de impurezaselectroactivas. La pastade carbonosepreparamezclandoíntimamenteel polvo de grafito con el líquido aglutinante.La relaciónaglutinante/polvode grafito variaentre0.3 y 0.5 mL por gramo de grafito (pastas“secas”)y 0.5 y 0.9 mL por gramo de grafito (pastas“húmedas”). La estructurasuperficialde la pastade carbonoha sidoestudiadamediante métodoselectroquímicos,ópticosy microscópicos,y puededescribirsecomo un conglomeradode zonasconductoras(grafito) y aislantes(aglutinante).El tamañoy abundanciarelativade estaszonasdependede la relacióngrafito/aglutinante.Los CPEscon unacomposiciónnormal exhibenunasuperficiequeestáprácticamente recubiertapor unafinísima películadel líquido aglutinante.Ademásde la relación grafito/aglutinante,las propiedadesfisicas y químicas de amboscomponentes determinanel comportamientoelectroquímicoglobal de los CPEs. La complejanaturalezaheterogéneade los CPEsafectaa la transferenciade cargasuperficial.En general,la presenciadel aglutinanteenla superficiedisminuye la velocidadde la transferenciaelectrónica(cinéticasmás lentas),aumentandoel sobrepotencialcon respectoa los electrodoshomogéneos.Al aumentarla lipofilia del líquido aglutinanteseincrementael sobrepotencial(irreversibilidad)puestoque el carácterhidrofóbicodelaglutinantedificulta el accesode los analitoshidrofilicos ala superficiedelelectrodo.Esteefectoseproducetambiénal aumentarel contenido de aglutinanteen la pasta. 14 Los CPEs muestrancorrientesde fondo inferiores comparadascon los electrodosde grafito sólido o metalesnobles. La corrienteresidual disminuye al aumentarla cantidad de aglutinante en la pasta. Sin embargo,este efecto va acompañadode un descensode la sensibilidaddel electrodo. Los CPEspuedenser polarizadosen una ventanade potencialque abarca aproximadamentede -1.0 a+1.3 V vs. SCEen medioácido y de -1.5 a +1.0 V vs. SCEenmediosneutrosy alcalinos.Noobstante,en lasmedidasvoltamperométricas realizadasen la zonade potencialesnegativos,el oxigeno atrapadoen la pasta interfiere seriamente. Debidoala presenciadel aglutinante,la extracciónde especieslipofilicas es unapropiedadúnicade los CPEs.Lapreconcentraciónvíaextracciónesligeramente selectiva;sin embargo,la selectividadpuedeexaltarseajustandoel pH delmedio, ya quesolamentelasespeciesneutraso los paresiónicospuedenser extraídosen la pastaquecontieneunaglutinanteapolar.Los CPEstambiénpuedendiscriminarentre extraccióny adsorción,lo quepuedeserútil parael análisisdemezclasdesustancias que presentanun comportamientoelectroquímicomuy similar. La capacidadde adsorcióndealgunoscompuestos,enparticularmoléculaslipofilicas, sobrelos CPEs puedeser mayorquesobrelos electrodossólidosconvencionales,de nuevoa causa del aglutinante. La relacióngrafito/aglutinanteejerceun efecto importanteen el análisisde compuestosorgánicosque se adsorbensobre la superficie del electrodo.Cuanto mayoresel contenidodeaglutinante,mayoresla resistenciadel electrodo(eléctrica y difusional) y menorla cantidadde partículasdegrafito activas(no cubiertaspor el aglutinante)en la interfaseelectrodo-disolución.Variandola cantidadde grafito en relaciónal aglutinante,esposibledistinguirentrefenómenosde adsorciónsobre las partículasde grafito y aquellosque ocurrenesencialmentepor difusión a través de las capasde aglutinantehaciael grafito [17]. A pesarde queesdificil establecer Electrodos de pasto de carbono 15 un modelo[18], pareceserquecualquiercurvavoltamperométricaregistradasobre el CPEcorrespondea fenómenoscontroladostantoporadsorcióncomopor difusión delaespecieelectroactivaen la fasepastay en la fasedisolución(difusiónhacialas panículasde grafito en la interfaseelectródica). Graciasa la pequeñacorrienteresidualen un amplio intervalo de potencial, ha sido posible la determinaciónde cantidadesmuy pequeñasde compuestos orgánicos sobre CPEs empleando voltamperometríade barrido lineal (LSV), diferencialde impulsos(DPV) o de corrientealterna(ACV). Paraciertostipos de compuestosorgánicos (moléculas lipofilicas) y en determinadascondiciones experimentales(pH, fuerzaiónica, temperatura),lapastadecarbonoofreceunagran sensibilidady selectividadgraciasa la preconcentracióndel analitopor adsorción- extracción[19,20]. La acumulaciónselleva a cabocontrolandocon precisiónel transportede masa(agitaciónconstante,control de temperatura)bien a potencialcontrolado,o bien a circuito abierto.Estaúltima modalidadesla quesueleutilizarse(permiteel análisisdepequeñosvolúmenesdemuestra)apesardeseralgomenossensible[19]. La determinacióndetrazasdecompuestosorgánicosenmatricescomplejasrequiere bien separacióndel analito por extracción, o bien dilución y utilización de voltamperometríade adsorción-redisolución(cambio de medio) [18-20]. La heterogeneidadde la pastade carbonoes unadesventajaconrespectoa las aplicacionesde los CPEs en mediosno acuosospuestoque se desintegrael materialelectródico. La reproducibilidadde los CPEses algo peor que la de los electrodosde mercurio,metalesnoblesocarbonovitrificado. Los valoresde ladesviaciónestándar relativa obtenidosa partir de medidascon CPEsoscilan alrededordel 5%. Los 16 Introducción limites de detecciónpara la determinaciónde sustanciasorgánicase inorgánicas alcanzanvaloresbastantebajos [7]. LZ.2.1.- Electrodos de pasta de carbono modificados con mediadores redox La utilizacióndereaccioneselectrocatalíticascon finesanalíticoshacobrado graninterésespecialmenteenlosúltimosaños,debidoconcretamentea laexpansión quehatenidolugarenel campode la biosensorizacióndemoléculasbiológicamente importantesatravésde compuestoselectroquimicamenteactivos. En general,para la preparaciónde los electrodosde pasta de carbono modificadossuelenutilizarsediversosmétodos,algunosde ellos similaresa los empleadosparamodificar otro tipo de electrodossólidos. En primer lugar podría citarsela adsorcióndirectadelmodificadorsobrela superficiedel CPE, raramente utilizado con estefin puestoque esun sistemamásapropiadoparapreconcentrar especieselectroactivas.La formaciónde enlacescovalentesentreel modificadory el electrodotampocosueleemplearsepuestoquerequieretratamientoscomplicados como oxidacióno silanización.Por otro lado, la disolución del modificadoren el líquidoaglutinanteesaplicablesolamenteasustanciasconpropiedadesfuertemente lipofilicas. Sin duda alguna,el método utilizado máscomúnmenteparapreparar electrodosdepastadecarbonomodificadosesla mezcladirectadelmodificadorcon la pasta,sugerido en 1981 por Ravichandrany Baldwin [11]. La mezclapuede hacersecalentandoligeramentela pastao en presenciadeunapequeñacantidadde disolvente orgánico (cloroformo, tetracloruro de carbono) para solubilizar el modificador insoluble en aguay obteneruna pastade composiciónhomogénea. Despuésde la evaporacióndel disolventea temperaturaambiente,la pastaestá preparadaparasu uso. Los modificadoresutilizadosen mezcladirecta debenser insolublesen la disoluciónanalíticao, al menos,adsorbersefuertementesobrelos Mediadoresredox 17 componentesde la pastade maneraque seevite su disoluciónen la superficiedel electrododurantela medida. Es necesariorenovarla superficiedel electrodosi permanecencomponentes electroactívosadsorbidos sobre la superficie o si los grupos flincionales del modificadorquedanbloqueados.El método empleadopara la regeneraciónde la superficiedependede los mecanismosimplicadosen el procesoanalítico. Siempre es preferibleunaregeneraciónquímicao electroquímica,puestoqueasíse asegura que el número de grupos funcionales reactivos en la superficie del electrodo permanececonstanteen una serie de medidasrepetidas.No obstante,si se dan procesos de preconcentraciónquímica o extracción dentro del electrodo se recomiendala renovaciónmanualde la superficieparaevitar riesgosde efectosde memoria.La renovaciónmecánicarequiereuna gran homogeneidaddel material electródicoy un tratamientototalmenteanálogode la superficie del mismo para garantizarresultadosreproducibles. La electrocatálisisen la superficiedel electrodopuedetenerlugar de varias formas. Frecuentementese producecatálisisdirecta, como se esquematizaen la Figura2. En el casode la oxidación,el sustratoA(red) esoxidado a A(ox) por la forma oxidadadel modificador,M(ox), que pasaa su forma reducidaM(red). Este puede ser oxidado de nuevo electroquimicamente.La corriente neta observada correspondea la concentraciónde sustratoenel senode la disolución.Lareducción podríadescribirseconunmecanismoanálogo.El modificadoractúaclaramentecomo un mediadorredox, con objeto de reducir el sobrepotencialde la transformación electroquímica del sustrato. De forma similar puede explotarse la catálisis regenerativasi un analito electroactivose transformaelectroquimicamenteen un productoinerte,y éstereaccionacon el catalizadorparareconvertirseen la especie analítica. 18 Introducción Figura 2 Esquema de la acción directa del mediador redox utilizado como modificador en electwdos de pasta de carbono; M, modificador~ A, mnalito; red: fonna ¡tducida ox: fonna oxidada Entre los analitos inorgánicosdeterminadoscon mayor frecuenciasobre electrodosde pastade carbono modificados con mediadoresredox destacael peróxido de hidrógeno, que aparecefrecuentementecomo producto de ciertos procesosenzimáticos.Algunos ejemplos concretospuedenencontrarseen una modernarevisión de Kalchery colaboradores[16]. La actividad electrocatalíticade los electrodos de pasta de carbono modificadoscobraunaespecialimportanciacuandoseaplicaala determinaciónde analitosorgánicos,puestoque la mayoríade los compuestosorgánicosde interés presentanunsobrepotencialtangrandeparasuoxidacióno reducciónelectroquímica, que su determinaciónsobre electrodosconvencionalesse hacedificil o incluso imposible. Dactob Li.,’udhA A(a) Contacto Mediadores redox 19 Los compuestosorganometálicosinsolubles en agua, tales como las fialocianinas metálicas que se usaránen este trabajo, son modificadoresmuy apropiadosparala pastade carbono.Los electrodosresultantesofrecenpropiedades catalíticasquereducensustancialmenteel sobrepotencialde los procesosredoxde estetipo de analitosdébilmenteelectroactivossobreelectrodosno modificados. En la Tabla1 serecogenalgunasde las aplicacionesmásinteresantesde los electrodosde pastade carbonomodificadoscon tialocianinasmetálicas. El grupo de Baldwin fue uno de los primeros en utilizar electrodos modificados con fialocianina de cobalto con fines analíticos [21], habiéndose demostradosu utilidad tanto en discontinuocomo en sistemasen flujo [22-30]. Wang y col. también han utilizado la fialocianina de cobalto para catalizar la electrooxidaciónde hidracina [31] y peróxidos orgánicos (32] y el grupo de Kauffinann proflindiza en las aplicacionesconcretasde estafialocianina para la determinacióndecompuestosorgánicosquecontienenazufre[33,34].En estamisma línea, aunque tratándose de analitos inorgánicos, puede citarse un método recientementedesarrolladopara la determinaciónen continuo de tiocianato y selenocianatosobreun electrodode pastade carbonomodificadocon CoPC J35J. A pesarde que la mayorpartede las aplicacionesbasadasen ftalocianinas metálicas se centran en la tialocianina de cobalto, nuestro propio Grupo de Investigaciónha empleadola fialocianina de níquelcomo mediadorredoxpara la determinaciónde los antioxidantes BHT y BHA [36,37]. También hay que mencionarel empleode la fialocianinade hierrocomomodificadorde los CPEspara la reduccióncatalíticade peróxidosorgánicos[38]. 20 Introducción Tabla 1 Ejemplos de las aplicaciones de los electrodos de pasta de carbono modificados con flalocianinas metálicas. Modificador Analito Medio Potencial Método Ref. NaOH 0.2M Cisteina,glutation H2504 0.5 Nt! o fosfato0.5 M Acido oxálico,a- cetoácidos fosfato 0.5 M (pH 2) +0.75 . +090 y vs. Ag/AgCI fosfato0.1 M Hidratosde carbono NaOH 0.15 M Hidratosde carbono, NaOH 0.15 M polialcoholes +0.4 . +0.5 V vg. AgAgCl Alditoles, azúcares NaOH 0.15 M Ribonucícótidos NaOH 0.15 M +0.4 -4-0.5 V Vs. Ag/AgCI Fosfato 0.1 M Peróxidosorgánicos KNO, 0.05 M +0.7 V vs. Ag/AgCI CV, FíA 32 OoPC Cisteina,compuestos con azufre H2S040.5M, fosfato0.5 M +0.7 - +0.8 V vs. SCE CoPC Hidracina CoPC -0¡. y vs. Ag/AgCI CoPC Cv, LCED 21 -0.8 V VS. Ag/AgCI CoPC CV, LCED 22,23 Tiopurinas CoPC CV, LOED 24,25 +0.6 V ‘vs. Ag/AgCI CV, LCED CoPO 26 +0.4 V vs. Ag/AgCI CoPO CV, LOED (PAf» 27 CV, LOBO CoPC 28 +0.55 V vg. Ag/AgCI CoPO CV, LCED (PAD) 29 Hidracina CoPO CV, LCED 30 +0.3 V vs. Ag/AgC1 Cv 3’ LSV 33 CoPC Tiarnazol,tiourea 34 Mediadoresredox 21 Tabla 1 (Cont.) Ejemplos de las aplicaciones de los electrodos de pasta de carbono mod4ficados con ftalocianinas metálicas. Modificador Analito Medio Potencial Método Ref. CoPC SCN~, SeCN Hritton-Robinson +0.83,+0.60 V FIA 35 0.04 M vs. SCE (PAD) NiPO BHA lACIO4 0.1 M +0.50 V vs. SCE DPV 36 NiPC BlAl Fosfato0.05 M +0.80 V vs. SCE DPV 37 (pH 2) FePC Peróxidosorgánicos Fosfato (pH 2) +0.1 +0.2 V vs. CV, 38 (reducción) Ag/AgCI LCED CV, Voltamperometriacíclica; LCED, Cromatografíalíquida con detecciónelectroquímica;FIA, análisis por inyecciónen flujo; LSV, voltamperometríade barrido lineal; PAD, detecciónamperométricade impulsos Los óxidosde metalesde transiciónconstituyenotro grupode catalizadores bastanteempleadoscomo modificadoresde los CPEs [39-42]. Los electrodos resultantesse han utilizado preferentementecomo detectoreselectroquímicosen HPLC dada su gran estabilidad, efecto catalítico y densidadesde corriente extremadamenteelevadas[39]. En la TablaII se recogenalgunasde lasaplicaciones másimportantesde estetipo de electrodos.Puededestacarsela construcciónde un sensor“array” basadoenpastade carbonomodificadaconóxidosderutenio, cobre, níquely cobaltoparala determinaciónen continuo de carbohidratosy aminoácidos [42]. Se ha investigado asimismo la posibilidad de inmovilizar compuestos orgánicosconactividadcatalíticaen electrodosde pastade carbono[11,43-45].En la TablaIII secitan algunosde los modificadoresempleados,asícomola respuesta de los diversosanalitosensayados. 22 Introducción Tabla fi Aplicacionesde los electrodosdepasta de carbono mod4icadoscon óxidos de metalesde transidón como mediadoresredox Modificador Analito Medio Potencial Método Ref. Cu2O Hidratosde carbono, NaOH 0.1 M +0.55 V vs. FíA 39 aminoácidos,alcoholes, Ag/AgCI aminas RuO2 Alcoholes,hidratos de NaOH 1.0 M +0.4 V ‘.‘s. HA 40 carbono Ag/AgCI Oxido de 11202 NaOH 0.1 M +0.4 (ox) FíA 41 Co(II,II1) o -0.3 V (red) Vs. Ag/AgCI RuO2, Cu2O, Hidratosde carbono, KOH 0.5 M, +0.45 V vs. FíA 42 NiO y CoO aminoácidos NaOH 1.0 M Ag/AgCI HA, análisispor inyecciónen flujo El empleode electrodosde pastade carbonomodificadoscon mediadores redox, como sistemasde detección electroquímicaen cromatografia líquida, introducidoporel grupode Baldwin [21],ampliaenormementelas posibilidadesde detectar y determinar electroquimicamentenumerososanalitos que presentan cinéticasde transferenciaelectrónicalentas[14,46,47].Además,al trabajarcon un potencial aplicado más bajo, se consiguen límites de deteccióninferiores. La ifalocianinade cobalto es, sin duda,el modificadorque con más frecuenciase ha incorporadoa la pastade carbonocomomediadorredox.Algunasde lasaplicaciones delos electrodosresultantescomodetectoresen sistemasen flujo sehallanrecogidas en la Tabla1. Mediadoresredox 23 Tabla III Aplicacionesdelos electrodosdepastadecarbonomod4ficadoscon compuestósorgánicoscon actividadcatalítica Modificador Analito Medio Potencial Método Ref. Apomorfina (par redox) Acido ascórbico Regulador Mcllvaine (pH 6 o 7.4) +0.3 V vs. SCE CV 43 Quinonas Ferrocianuro,NAUR y ácido ascórbico Regulador Mcllvaine (pH 7) -0.1 V vs. SCE (NADH) CV 11 4,4-bipiridilo Citocromo,azurinay ferricianuro NaCIO4 0.1 M + fosfato0.1 M +0.236,+0.3 12 y +0.468 V vs. CV 44 (reducción) (pH 7) 5SCE (E0) N,N,N,N’- tetrametil-p- fenilendia- Acido ascórbicoy NADH Na2HPO~,0.15 M o ácido cítrico 0.15 lv! +0.1 y +0.4 V vs. SCE CV, CA 45 mina CV, Voltarnperometríacíclica; CA, Cronoamperometría Los electrodos de pasta de carbono comenzarona utilizarse como detectoresamperométricosen sistemasen flujo a principios de los 70 [48]. La preparaciónes sumamentesencilla,ya quebastacon rellenarcon la pastael hueco de unacélula wall-jet o thin-layer a la que sele ha quitado el electrodode disco paradisponerde un detectorrápidoy sensible.Las excelentescaracterísticasde los detectoresdepastade carbonoentérminosde relaciónseñal/ruidoseatribuyena la naturalezacompósitadesusuperficiey permitenla obtenciónde límitesdedetección doso tresórdenesdemagnitudmáspequeñosquelos obtenidoshabitualmentesobre undetectorde carbonovitrificado. Sinembargo,si seimponenpotencialesnegativos aun CPEparadetectarreducciones,la presenciadeoxígenoen la pastaoriginauna corrienteresidualmuy grandey, comoconsecuencia,no seobtienenbuenoslímites de detección. 24 Introducción Normalmente, los detectoresde pasta de carbono mantienen un buen fimcionamiento durante varios días sin necesidad de renovar la superficie, dependiendodel potencialaplicado,el tipo de muestrasinyectadasy la naturaleza del portadoro la fasemóvil. Sin embargo,en algunos.trabajos secomentala falta deestabilidadenvolumen(hinchamientopor hidratación)de los electrodosdepasta de carbonocuandoseempleanen sistemasen flujo [49,50] o la pérdidade grupos activos (CoPC)de la superficiecomo consecuenciade las violentascondiciones hidrodinámicas(“leaching”) [22,51].De cualquierforma, el principalproblemay en el quecoincidenla mayoríade los autoresquehantrabajadocon detectoresdepasta decarbono,essuincompatibilidadcondisolventesorgánicos,queoriginaunafuerte deriva de la línea base. Si se emplean fasesmóviles con más de un 20% de acetonitrilo o de un 30% de metanol, la pastase disuelveen un corto períodode tiempo [16]. Por estemotivo, continuamentese investigasobreel desarrollode nuevos materiales electródicossimilares a la pasta de carbono pero resistentesa los disolventes orgánicos y que puedan ser modificados de forma homogénea. Centrándonosen la fialocianinadecobalto,unmediadordetransferenciaelectrónica muy apreciadoque se habíainmovilizadobásicamentesobresoportesde pastade carbono, puedencitarse diversos trabajos en que la pasta tradicional ha sido sustituidapor otrasmatricesmásresistentesalos disolventesorgánicos.Porejemplo, sehanfabricadoelectrodoscompósitosconsistentesen grafito y CoPCdispersosen resmaepoxi, muy resistentesy fácilesdepulir y sehanaplicadoa la determinación de glutation [52], ácido ascórbico[53] y tioles [54]. Sin embargo,la principal desventajade la resmaepoxi es que no esposible la renovacióndel electrodopor relleno, comoocurríacon la pastade carbono. Huangy Kok proponenel empleode cementode grafito conductorcomo matriz electródica para la ifalocianina de cobalto [51]. Este nuevo electrodo compósitopresentauna buenaestabilidaden la respuestacuando se empleaen Mediadoresredox 25 sistemasen flujo, y permiteel rellenodelelectrodo.No obstante,su estabilidaden medioscon alto contenidoen disolventesorgánicosno ha sido demostrada. Otro materialmuy interesantesobreel queseha inmovilizadoCoPChasido un electrodocompósitode carbononegroy Kel-F (policlorotrifluoroetileno> [49], habiéndosedemostradola resistenciadel electrodoal hinchamientoen metanoly acetonitriloy aplicándosea la determinaciónde cisteinamedianteHPLC. L2.3.- ELECTRODOSCOMPOSI1’OSDE GRAFITO-TEFLON Los electrodosdegrafito-teflónpuedendefinirsecomomaterialescompósitos segregadosque se construyen mezclando cantidades conocidas de ambos componentesen polvo, para posteriormenteprensarmecánicamentela mezcla homogeneizadaen forma de pastillascon las dimensionesrequeridas. Normalmente,los polvos utilizados para fabricar un material compósito segregadoseescogendemaneraqueel diámetromediodelaspartículasconductoras seapequeñoenrelaciónconlas dimensionesde laspartículasdepolímero.Después del procesodemezclay dehomogeneizaciónde la misma,laspartículasconductoras ocupanlos intersticiosentrelas partículasde polímeromásgrandes. Una de las característicasmásatractivasde los electrodoscompósitosen general,queha fomentadola investigaciónen estecampo,esla excelenterelación corrientefaradaica¡ corrientedecargaque ofrecen,particulannentelos materiales compósitos segregados[2]. Las propiedadeselectroquímicasde este tipo de electrodosdependenengranpartede la naturalezadelmaterialcondwctor.Sin duda alguna,comoeslógico, los compósitosmásestudiadoshansido los quecontienen grafito o carbononegro,por su buenaestabilidadelectroquímica,disponibilidady bajo coste. 26 Introducción Las propiedadesfisico-quimicas del material dependen, sin embargo, fundamentalmentedel polímeroescogidocomofaseaislante,principalmentepor lo que se refiere a su resistenciamecánica,carácterhidrófobo y resistenciaal hinchamientoen disolventesno acuosos.Este último aspectoes especialmente interesantedesdeun punto de vista práctico, dado que la afinidad de la matriz poliméricapor los disolventesorgánicosesla causade la inestabilidaddimensional de algunoselectrodosen mediosno acuosos.El hinchamientode la fase aislante origina un crecimiento de la superficie del electrodoy, por tanto, una mayor corrientede carga.Los electrodoscompósitosbasadosen teflón, Kel-F, polietileno y polipropilenopresentanunabuenaresistenciaaalgunosdisolventesorgánicos[49]. Sin embargo,por otraparte, los materialescompósitosdegrafito-polietileno y grafito-polipropilenoposeenescasadureza,por lo queresultandificilesdemanejar y pulir. Por consiguiente,entrelos materialesaislantesmencionadosanteriormente, el teflón constituyeunadelasmatricespoliméricasmásatractivasparasuutilización enmediosno acuosos,puestoqueesprácticamenteinerteal hinchamientoy presenta buenaspropiedadesmecanícas. En 1975, Klatt y colaboradores [55] evaluaron el comportamiento voltamperométrico,mediantevoltamperometriacíclica, de electrodosde grafito y teflón dediferentecomposición,comparandola resistenciamecánicade laspastillas, la conductividaddel electrodoy la forma de los voltamperogramasobtenidoscon ferrocianuro. Estos autores examinaron,asimismo, la reproducibilidadde una superficie electródica dada y la reproducibilidad entre diferentes electrodos, concluyendoque presentanexcelentescaracterísticaspara su empleo en estudios electroquímicos.Además,demostraronsu estabilidadfisica en mediosorgánicos, hidroalcohólicosy fuertementeácidos. Por otra parte, Shahy Honigberg[56] evaluaronel comportamientode un electrodode grafito-teflón comodetectorenHPLC, demostrándosesuutilidad para Electrodosdegrajito.teflón 27 la detecciónelectroquímicade distintos compuestosfenólicos y discutiendoun aspectoprácticotanimportantecomoes la pasivaciónde la superficiedel electrodo por dichoscompuestos. Sin embargo,y un poco sorprendentemente,desde 1983 hasta nuestros estudios,sólo seha encontradoun trabajopublicadomáscon estetipo de matrices electródicascompósitas.En 1993, Wang y col. [57] emplearonestematerialcomo alternativapara la fabricación de electrodosenzimáticostridimensionales.Estos bioelectrodosde grafito-teflón se prepararondel modo usual, despuésde unir covalentementela enzimaal polvo de grafito. El senodel electrodosirve de este modo como “depósito’ tridimensional de la enzima, de manera similar a los correspondientesdispositivosfabricadoscon pastadecarbonoy grafito-epoxi. Los biosensoresresultantescombinanasílasventajasderapidezderespuesta,capacidad de renovación(por pulido), rigidez, facilidad de fabricacióny economía. Si bien comoya sehadicho,no sehanencontradomásreferenciasdondese utilicen electrodosdegrafito-teflónconfines analíticos,no puededejardecitarseun electrodocompósitosegregadosimilar como esel compuestopor Kel-F y grafito. Se conocecon el nombrede Kel-F al poli(clorotrifluoroetileno), un materialalgo másrígido queel teflón (poli(tetrafluoroetileno)).Esteelectrodosecaracterizópor primeravez en 1978 porel grupode Anderson[58], evaluándoseposteriormentesu empleocomodetectorensistemasenflujo [59] y aplicándoseala determinaciónen continuode carbamatos[60] y compuestosfenólicos [61]. 28 Introducción L3.- ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS SOBRE LA DETERMINACION DE TIRAM Y DISULFIIiAM a a a s CHS\ 1 ¡ /G~% CHS—CHI\ a 1 ~ CHs ~ N—C—8—S—C—N ~ CH. CH;~-CM. ~ N—c—S—S—c—N ~ CH.—CH, II Tiram (tetrametiltiuramdisulfiuro)(1) y disulflram (tetraetiltiuramdisulfiiro)(II) son dos derivadosdel ácido ditiocarbámicoquepresentanactividad fungicida. Los ditiocarbamatosseempleanfundamentalmentesobrefrutas,verdurasy cerealesparacontrolarciertasplagasdehongosque afectana estetipo de cultivos [62]. El Comité ConjuntoFAO!WHO Expertoen Residuosde Pesticidasestablece un límiteparael contenidomáximodeditiocarbamatosqueoscilaentre0.1 mgKg’ en patatasy 5 mg Kg’ en cereales[63]. En la CEE, las toleranciasestablecidas varíanentre2-7 mg Kg’ (expresadocomobisulfuro de carbono)[63]. Tantoel tiram comoel disulfiramseutilizan tambiéncomoaceleradorespara la vulcanizacióndel caucho.Además,el tiram tiene propiedadesantisépticasy el disulfiram es un agenteempleadoen el tratamientodel alcoholismo[64]. Parafacilitar la visión enconjuntode los métodosanalíticosexistentespara la detenninaciónde estosfungicidas, se han resumido,en forma de Tablas,los trabajosaparecidosen los quinceúltimos años,tomandocomobasela técnicaque permitela determinación.En cadaunade las Tablasseincluyentambién,cuandose conocen,las característicasanalíticasdel método,el tipo demuestraanalizadoy la forma de llevar a cabola determmacion. Antecedentesbibliograficos 29 L3.1.- METODOS CROMATOGRÁFICOS En la TablaIV seresumenlos trabajosencontradosen el períodode tiempo mencionadobasadosen técnicascromatográficas.Existen relativamentepocos métodosbasadosen el empleode la cromatograflade gases(GC), probablemente debido al carácterpolar de estetipo de compuestos.La mayoríade los métodos encontradosse basanen la hidrólisis ácida de los ditiocarbamatosy posterior inyeccióndel CS2 formado[63,69-71]. Sin embargo,estemétodosóloesespecífico para el grupo ditiocarbamatoy no permite la diferenciaciónde compuestoscon diferentesN-alquil sustituyentes. Muchomásinteresanteparecela derivatizacióna ésteresetílicos,con el fin dedisminuir la polaridade incrementarla volatilidad,quepermitela determinación conjuntade tiram y disulfiram empleandoun detectorde nitrógeno-fósforo[68]. La cromatografíalíquida de alta resolución (HPLC), particularmenteen la modalidadde fase inversa es, sin lugar a dudas, la técnicacromatográficamás utilizadaparala determinaciónde ditiocarbamatos,. Los límites de detecciónmás bajos se obtienen cuando se empleaextracción líquido-líquido o sólido-líquido [75,89,90,97,104-196],algunasveces“on-line” [81,108,109,112]. El detector más utilizado es el de absorción UV que no requiere derivatizaciónde los analitos. En algunoscasos,se empleaderivatizaciónpost- columnay la detecciónserealizapor absorciónen el visible [83,85,89] o seemplea detecciónfluorimétrica [76,86]. Tambiénla cromatografíaen capafina (TLC) seha utilizado bastantepara ladeteccióny determinaciónsemicuantitativadeditiocarbainatos,fundamentalmente sobre soportesde gel de sílice [113-ll5,118-120]. La detección colorimétrica requiere el revelado de las manchaspara la formación de especiescoloreadas 30 Introducción rí 13,115,117].Puededestacarseun curiososistemadedetecciónbiológica,basado en el tratamientode la placacon un hongosensiblea los ditiocarbamatos,Botiyfis cinerea, que se incubadurante48 horas[118]. Por último, se citan algunasaplicacionesde otras técnicascromatográficas para la determinaciónde tiram, como la cromatografía en papel [121] o la cromatografíam¡celar electrocinética[122]. Tabla IV Métodoscromalogrdflcospara la determinaciónde tirwn y disulflrant Cromatografíadegases (Gq. Muestra Analitos Tratamiento Nivel Detector Ref. Plasma Disulfiram ColumnaChromosorbW lO ng mL~’ - 65 empaquetadacon 3% OV-I Material Pesticidas - AFID/FID 66 biológico Lechuga Ditiocarbamatos Tratamientocon SnCI2 (1.5%) en 0.2 - 9.0 FPD 63 HCI 5 M paraformarC52 mgKg~’ Pesticidas Empleo de columnapersilanizada - MS 67 recubiertade fasede metilsilicona y He como gas podador Caucho Tiram, ExÉn. con CHCI3-Me2CO, 3.2, 4.6 AFrO 68 disulfiram derivatizacióna ésteresetílicos Aire Ditiocarbamatos Formaciónde CS2 69 Vegetales Ditiocarbamatos Transformaciónen CS2 por lO ng mL~’ . 70 calentamientoy dilución con HCI CS, (LO) Tiram Transformaciónen CS2por . . 71 calefacciónen medio ácido AFID:detectorde ionizaciónen llama alcalino;FILO: detectorde ionización en llama; MS: espectrometriade masas;FF0: detectorfotométricode llama. A ntecedentesbibliográficos 31 Tabla IV (Cont.) Métodoscromatográficospara la determinaciónde tireny disulfiram. CromatografíaLíquida deAlta Resolución(HPLC). Muestra Analitos Tratamiento Nivel Detector Ref. Píasma, Disulfiram y orina metabolitos Suero, plasma Agua, papel Oisulfiram Tiram Ditiocarbamatos Exta. con CHCI,, clean-upen gel de sílice. Elución conhexanoy CHCI3. Evap. a sequedad, redisoluciónen MeOlA 0.01 mg (LO) Compuestos orgánicoscon 5 R. de intercambiode ligando con Pd(II)-calceinay detección fluorescentede calceinalibre Ditiocarbamatos OcrivatizaciónconNi5O4 o Co(N03)2(paresiónicos) UV 77 Oisulfiram y metabolitos Ditiocarbamatos Etilación de susmetabolitosy separaciónen columnaalquilfenilo Derivatizacióncon soln. alcalina de BOTA y L-cisteina.Extn. Transformaciónen ésteres metílicoscon Mel Lechuga Fungicidas Oisulfiram y metabolitos Píasma Extn. con hexano:CHCI33:2 Purificacióny preconc.en precolumnaPerisorbRP-18. Separaciónen Li ChrosorbRltl8 0.5 - 2.0 mg U’ 3.4 . 3400 nniol U UV 80 LJV SI Extn. conCHCI3 y MeOlA. Separaciónen Separon50< o SeparonNIS. Elución con CHCI3:ciclohexano lO - 300 mg Kg~’ UV 82 Agua. manzanas 72 73 74 Uy 75 0.5-1.0ng FI 76 Píasma Vegetales 25 pg U’ 0.5 mg Kg” 78 79 Fresas, maíz Tiram 32 Introducción Tabla IV (Cont.) Métodoscromatogrtzflcosparala determinacióndetirwn y disulflrans. CromatografíaLíquida deA Ita Resolución(HPLC). Muestra Analitos Tratamiento Nivel Detector Ref. 13V/VISPreconc.en precolumna. Ocrivatizaciónpost-columnacon Cu metálico Sepn.en SeparonSGXC-18con MeCN:fosfatoo MeOH:NH4CI 13V 84 Preconc.en columnaC,8. Derivatizaciónpost-columnacon Cu metálico Derivatizaciónpost-columnacon reactivoOPA-MERC Extn. con hexano:EtOAc80:20, cleanup. Elución con MeCN:NH4C1 0.5 mg U’ (LO) UV 88 Ditiocarbamatos Edn. con CI-12C12. Preconc.en columnaC,8. Derivatizaciónpost- columnacon Cu metálico Extn. en cartuchosC,8. Elución com MeOH. Sepn.en C,8 con MeOH:acetato0.01 mol U’ (pH 5) 0.14 mg U’ (LD) 3.4 ng (LO) Inyeccióndirecta (300 jiL). Sepn. en columnaBiofine RPC-PO. Elución con MeCN:fosfato7 1:29 (pH 3.23) EC 90 PCO 91 13V 92 Manzanas Tiram Empleode doscolumnasde alta resolución 0.01 mg U’ 13V 93 Agua, orma Tiram, disulfiram Drogas Orina 83 Disulfiram y metaholitos Pesticidas Plasma Disulfiram UVIVIS FI3.8 ~g Melocoto- neros 85 86 87 Fungicidas 0.1-08 pmol L~’ Suelos, manzanas, lechugas 50 - 400 ~g U’ 13V/VIS Agua de río, formula- ciones Alfalfa Aguas 89 Tiram Tiram Pesticidas Antecedentesbibliográficos 33 Tabla IV (Cont.> Métodoscromatográficospara la determinacióndedramy diszdflram. CromatografíaLíquida deAlta Resolución(HPLC). Muestra Analitos Tratamiento Nivel Detector Ref. Verduras Pesticidas Aguas Aguas Aguas Pesticidas Pesticidas Pesticidas Extn., sepn.en LichrospherRP-18 u OctadecylSi-lOO polyol Extn. conCH2CI2. Sepn.en columnaWakosil-II SC,8 Preconcentraciónpor adsorciónen minicartuchode gel de poliestireno.Elución con MeCN y sepn.en columnaRSpakDE-613o NOVAPAR C,8 Extn. con CH2CI2. Sepn.en columnaTSK gel OOS.Elución con MeCN:H20:AcOH60:40:0.1 Elución con 40-45%MeCN (pH 4) UV 98 Extn. en cartuchosSep-Pak ENVtC,8. Sepn.en Nucleosil 120- SC,3. Elución con MeCN:MeOH 60:40 99 Extn. con columnaSep-PakPlus PS-l. Elución conMeCN. Sepn. en columnaWakosil-Il SC,rIOO con MeCN:H20 60:40 Uy 100 Extn. con cartuchosC,8 Extn. en cartuchosSepPak Plus 1’5-1 101 102 Agua de Pesticidas río polares Preconc.Sepn.en C,~ Elución con gradienteMeCN:agua 2-10 ~ U’ Uy 103 94 95 96 970.1 - 1.0 ~xgL~’ (LO) Aguas Aguas Pesticidas Pesticidas Aguas Aguas Aguas Pesticidas Pesticidas Pesticidas 34 Introducción Tabla IV (Cont.) Métodoscromatogr4ficospara la determinacióndetiram y disulflram. CromatografíaLíquida deAlta Resolución(HPLQ. Muestra Analitos Tratamiento Nivel Detector Ref. Cereales Tiram Aguas Aguas Aguas Aguas Agua potable Aguas Pesticidas Pesticidas Pesticidas Pesticidas Pesticidas Pesticidas Extn. con CH2CI2 o MeCN. Evap. a sequedad.Redisolucióncon MeOH:agua.Purif. en microcolumnaC,8 Preconc.en cartuchosSep-Pak Plus PS-l a pH 3.5. Elucióncon MeCN:H20 18:1 Extn. en columnasSep-PakPlus PS-l.Elución con MeCN. Sepn. en columna005 con MeOH:fosfato0.05 mol L~’ (pH 3.5) 1:1 0.05 mg Kg’ (LO) 25 ~¡gU’ 0.1 - 1.1 pg L’ (LD) Extn. con columnaSep-Pakplus PS-l a pH 3.5. Elucióncon MeCN. Sepn.en columnaWater Golf-Pakcon MeCN:fosfato0.05 ¡nol U’ (pH 3.5) Precone.en minicolumnaC,8. Elución e inyeccióndirecta Filtración. Preconc.on-line. Elución conMeCN:fosfato0.5 minol U’ 50:50 Extn. con cartuchosPS-2 a pH 3.5 5 ¡‘g 0.5 pg (LO) 5, 10 pg 0.3, 3 mg Extn. con cartuchosBond-Elut pH Preconc.on-line en precolumna 13V 104 UV 105 13V 106 13V 107 - 108 - 109 13V líO Agua de río Agua Pesticidas Pesticidas 0.2 - 0.8 ~g U’ (LO) III 11213V/FI EC: Detecciónelectroquímica;PCO: detectorde fotoconductividad A ntecedentesbibliogr4ficos 35 Tabla IV (Cont..) Métodoscromatográficosparala determinacióndetiramy disulfiram. Cromatografíaen Capa fina (TLC). Muestra Analitos Tratamiento Nivel Detección Ref. Extn. conhexano:CHCI,6:4.. Sepn.en gel de sílice con Et2O:hexano.Tto. con CuSO4 Sepn.en gel de sílice G en Me2CO. Elución con hexano:MeEtCO19:1 Extn. con CHCI3. Sepn.en gel de sílice. Tto. con CuSO4 Sepn.en Silufol con Me2CO:ciclohexanocomo eluyente Sepn.con hexano:Me2CO. Tratamientode las manchascon ferricianuro:clorurode hierro Sepn.en gel de sílice O en CHCI,. Desarrollocon CHCI3: Me2CO. Tratamientocon Botrytis cinereae incubacióna 250 durante48 h 2 mg (UD) Biológica 118 Oeriv. del ácido dimetil- y dietil- ditiocarbámico Sepn.en gel de sílice KSK con ciclohexano:dioxanoo hexano:EtOAc Tiram Vegetales Pesticidas Sepn.en gel de sílice VISMaterial biológico Tejidos Aguas Aguas Tiram, disulfiram Carbamatos Tiram Tiram Tiram 0.2 0.3 pig mU’ (UD) 0.5 pg (UD) 1-12 pg 113 114 115VIS Grano, hojas Fungicidas 116 117VIS Aguas Tapones de caucho 0.02 mg (UD) UV 119 120 94 UD: umbral de detección 36 Introducción Tabla IV (Cont..) Métodos cromatográficospara la determinación de tiram y disulfiram. Otras técnicas cromatogróficas. Muestra Analitos Tratamiento Técnica Detección Ref. - Pesticidas Elución conhexano: OPC VIS ¡21 Me2CO:MeOH.Tto. con esterasa de hígado de bovino. Visualizacióncon acetatode indoxilo - Pesticidas Sepn.con dodecil sulfato sódico MEKC - 122 como tensoactívo OPC: Cromatografíaen papel descendiente;MEKC: Cromatografíamicelarelectrocinética. L3.2- MIETODOS ESPECTROFOTOMETRICOS Existennumerososmétodosespectrofotométricosque sehanempleadopara la determinaciónde tiram, disulflram y ditiocarbamatosen general, aplicadosa muchas clases diferentes de muestras (Tabla y). Todos ellos implican la derivatizaciónde los analitos,bien por formación de complejos coloreadoscon metales de transición [127,132,136,140-142],o bien por digestiónácida de los ditiocarbamatos,atrapamientodel CS2 formado y derivatización a productos coloreados[123-125,148,149]. En ningúncasoesposibledistinguirentreditiocarbamatosconsustituyentes alquilicosdiferentes,puestoque la propiedadutilizadapararealizarla determinación escaracterísticadel grupo ditiocarbamato. Antecedentesbibliográficos 37 Tabla V Métodos espectrofotométricospara la determinaciónde tirwn y Muestra Analitos Tratamiento disuifiramn. Nivel X, nm Ref. Ditiocarbamatos Ditiocarbamatos Extn. con CHCI,. Calentamiento conHCI cc + SnCl~ Atrapamiento del CS2 conKOH enMeOH. Calentamientocon Zn(OAc)2 para formarZnS, acidificacióny reaccióndel H2S con amínodimetilaminay Fe» Calentamientocon SnCI2. Absorción del CS2 en disoln.de Cu(OAc)2 y dietanolaminaen EtOH Extn. con Me2CO. Calentamiento conH2504 cc, hidroquinonay CuSO4 Colorim. 125 Extn. con CH2CI,. Tto. con Cuí 126 • Polvo atmosférico Tiram Conc.por filtración del aire. Tto. con Cuí en CHCI, 25 ng nf 3 (LO) 425-430 127 Ditiocarbamatos Hidrólisis ácida y atrapamiento del CS 2 sobre reactivoformador de color 348,435 128 Tto. conCoCí2 en CHCI3 en presenciade Na2S2O, Ditiocarbamatos Tiram, etilenbis- ditiocarbamatos Tiram Oigestióncon 1~I3SO4. Absorción del CS2 en soln. de PhCH2SHen alcohol tert-butílico Formaciónde CS2 y reaccióncon Me2NH y Cu(OAc)2 para formar complejocoloreado Formaciónde un complejo coloreadocon CuCIO4.4MeCN en MeCN Frutas, verduras Frutas, verduras 662 435 123 12420 j.tg CS2 (LO) Patatas Tabletas Tiram Oisulfiram Aguas Caucho Tiram 323 Formula- ciones Frutas, verduras Cereales 129 430 0.1 mg Kg~’ 130 131 1320.4 mg U’ (LO) 420 38 Introducción Tabla V (Cont.) Métodos espectrofotométricospara la determinaciónde tiran, y Muestra Analitos Tratamiento disuiflram. Nivel A, nm Ref. Ditiocarbamatos Oescomposicióncon H2S046 M y AcOH. Absorcióndel CS,en soin. alcalina de 1 ,2,5-trihidroxibenceno y Et,N. Formaciónde complejo coloreadocon Ni 520 133 Formula- ciones,agua, cerealesy verduras Mezclas sintéticas, preparados comerciales Tiram, ziramy zineb Ditiocarbamatos Ditiocarbamatos Calentamientocon hematoxilina oxidadaen agua Hidrólisis ácida. Derivatización del CS2 a dibutilditiocarbamatode Cu(I) Derivatizacióna complejosde Se. Extn. en CHCIJ Reaccióncon acetatode cromoen medio HOAc/Ac~ (pH 2.5-3.0). Extn. del complejo en MIBK Derivatizacióncon Na2SeO3en acetona 1-8 mg U’ Tiram, tricloro- fenolato de Cu 420 138 390 139 Derivatizacióna complejode Mo(VI). Extn. con isobutilmetilcetona 1.2 mg U’ 420 140 Ditiocarbamatos Formaciónde complejosde Cr. Extn. en naftalenoy DMF 6-12 ~g 430 141 555 430 134 135 136 Tiram 5-lo Mg (LO) Tiram 420 Tejidos ¡37 Tiram Antecedentesbibliograficos 39 Tabla V (Cont.) Métodosespectrofotométricospara la determinaciónde tiram y disulfiramn. Muestra Analitos Tratamiento Nivel nm Ref. Formaciónde dimetilditiocarbamatode Cu(II) y Pd(II). Coprecipitaciónen naftalenomicrocristalino 395,430 142 Lechugas Tiram, zineb Disulfiram - Ditiocarbamatos Preparados Tiram, ziram, comerciales dibam y ferbam Formula- clones comerciales Agua Suelos, verduras Tiram, zineb, glutation Ditiocarbamatos Tiram,metam Adición de MCI 2.4 mol L~’ con SnCl, Formaciónde complejo coloreado con Cu Hidrólisis ácida.Absorciónsobre aminasenIvteOH Formaciónde complejosde Cr. Adsorciónen naftaleno microcristalino Inducciónde la reacción triyoduro-azidaen medio micelar Hidrólisis ácida.Absorcióndel CS2 sobreetilendiaminao piperidinaen MeOH Formaciónde CS~ Derivatizacion a complejoscoloreadosde Cu(II) Tiram 0.3 mg CS2 (LO) 143 144 145 146 147 148 149 5.4xJO~ 9 mol L~’ (LO) 500 1-10 mg U’ 40 Introducción 1.3.3.- METODOS ELECTROQUIMICOS Se han encontrado relativamente pocas aplicaciones de los métodos electroquímicospara la determinaciónde tiram y disulfiram (Tabla VI). En la mayoríade los casosse basanen la reduccióndel fungicida sobre electrodosde mercurio [l5O,152,153,154], aunquetambiénse ha aprovechadola oxidacióndel tiram sobreun electrodode Au [1]. Los métodosbasadosen lapreconcentracióndetiramporadsorciónsobrela superficiedelelectrodo[1,153]permitenalcanzarlímitesdedetecciónmásbajosque los obtenidosconotrastécnicas.No obstante,la selectividadesinsuficienteparasu aplicaciónal análisisde trazasen muestrasmedioambientales,por lo que se hace necesanorecurrir a la detecciónelectroquímicaen sistemascromatográficos[90]. L3.4.- METODOS VOLUMETRICOS En la bibliografia revisada aparecenvarios métodos volumétricos de determinacióndetiram y disulflram, cuyascaracterísticasprincipalesserecogenen la TablaVII. Debido a la escasasensibilidadde estetipo de métodosde análisis,se han aplicado fundamentalmentea la determinaciónde estosditiocarbamatosen medicamentos[160,165]y fonnulacionescomerciales[156,157,162,163].En la mayoría de los casos, el punto final se detecta potenciométrica o amperométricamente[157-162,165]. Antecedentesbibliogr4ficos 41 Tabla VI Métodoselectroquímicospara la determinaciónde tiram y disulfirant Muestra Analitos Tratamiento Nivel Técnica Detector Ref. Medica- Disulfiram, mentos fármacos - Tiram, compuestos orgánicoscon 5 Medio H20:EtOH con NaOAc 0.1-0.3 mol U’ Extn. en cartuchosC,8 (aguas)o con CHCI, (aceites).Evap. a sequedad.Redisoln. en MeOH Extn. con MeGE (preparados),Extn. con cartuchosC,8 (aguas). Elución con MeOH. Evap. a sequedad. Redisoln.con MeOH Empleo de soluciones de Bu4NI y H2S04 en OMF, EtOH o mezclas orgánico-acuosas 0.03 ~sg (LO) 0.3 pg U’ (LO) 0.3 mg AdSV AdSV P Hg 152 HMDE 153 Au rotatorio Hg 154 Manzanas Tiram Hidrólisis ácida. Absorcióndel OS2 sobre piperidinaen MeOH OPP,CV Disulfiram lx lO~ mcl U’ (LO) CSV 150 151Ag o películaHg Agua, suelos Preparados comercia- les, aguas Tiram Tiram Disulfiram 1.5-9.2 ~mol U’ OPP Hg 155 DPP:Polarografíadiferencialde impulsos;CV: voltamperometríacíclica;CSV: voltamperometríaderedisolución catódica;AdSV: voltamperometriade adsorción-redisolución;P: polarografía. 42 Introducción Tahía Vil Métodos volumétricospara la detenninaciónde tiram y disulflram. Muestra Analitos Tratamiento Nivel Detección Ref. ReducciónconNa2S y valoración ácido-basede la dietilamina formada Tiram Reduccióncon Na2SO,en Me,CO o EtOH:DMF. Valoracióncon CuSO40. 1 mol L~’ Potenciom. 157 Aceleradoresde vulcanización Valoracióncon Na2SO3 del ‘2 liberado por reaccióncon HL a 00 en MeOH acuoso Amperom. 158 Tiram, disulfiram Oisulfiram, metiltiouracil Valoración por reduccióncon K2CS,en OMF:H20 Derivatizacióncon Hg(OAc)2. Valoración como basesen HOAc y HCIO4 0. 1 mol U’ Xantatos, ditiocarbamatos, fungicidas Valoración con yoduro generado electroquímicamente >5 Mequiv. Amperom. 161 Valoración con tritiocarbonatoK en OMF:H20 Valoración con tritiocarbonatoK Potenciom. 162 Fotom. (%= 400 ¡un) 163 Valoracióncon tritiocarbonatoK Valoracióncon Cu 2~ 0.36-0.71 mg Potenciom. 165 Reacciónde azidasódicacon yoduro en presenciadel tiuram disulfuro (inductor).Valoración del excesode yoduro con arsenito sódico Formula- ciones comerciales Tiram Preparados comerciales 156 Tabletas Visual, potencíom. Potenciom. (pH) 159 160 Preparados comerciales Preparados comerciales Tiram Tiram Tiuram disulfuros Medica- mentos Oisulfiram Fotom. 164 Tiuram disulfuros (tiram, disulfiram) 0.5-14 pg Visual 166 II. — PARTE EXPERIMENTAL Parte Experimental 45 ff1.- DETERMINACION DE TIRAM Y DISULFIRAM CON UN ELECTRODO DE PASTA DE CARBONO MODIFICADO CON FTALOCIANINA DE COBALTO ff1 .1.- INSTRUMENTACION IIL1..1.1.- Aparatos Las medidasen discontinuose han realizadoutilizando un potenciostato EG&G PARC 273 equipadocon el softwarede Análisis ElectroquímicoMod. 270. La agitacióndurantela etapade preconcentraciónse ha llevado a cabo con un agitadormagnéticoP-Selecta. Paralos experimentosencontinuosehautilizadoun sistemadeinyecciónde flujo constituidopor una bomba peristáltica Wiz (ISCO) y una válvula Valco (Metrohm) con volumen de inyecciónvariable. Comodetectorse ha empleadoun detectorelectroquímicoEG&G PARCMod. 400acopladoa un registradorLinseis 6512 y equipadocon unacélulade flujo “thin-layer’ modeloMP-1305, en la cual se ha reemplazadoel electrodode carbonovitrificado por unapieza idénticaque presentaunacavidadde3 mm dediámetroen lugardeldiscodecarbonovitrificado. Dicha cavidadsereflenacon la pastade carbonomodificada. Paralas medidasdepH seha empleadoun pH-metrodeprecisiónMetrohm E 510. Otrosaparatosutilizadoshansido: bañodeultrasonidosP-SelectaUltrasons, centrifugadoraP-SelectaMeditronic y rotavaporHeidolphW 2000. 46 Parte Experimental II.1.1.2.- Electmdosy células de tmbajo Como electrodoindicadorse ha utilizado un electrodode pastade carbono modificadaconftalocianinasmetálicas,empleandocomosoporte paralos estudios en discontinuo,un electrodohuecoMetrobm6.0807.000(3.0 mm de diámetrode zonaactiva)y, paralos experimentosen continuo,el electrodohuecodescritoenel apañadoII. 1.1.1. acoplablea la célula de flujo “thin-layer’ modelo MP-1305. La preparaciónde los electrodosse describeen el apañado11.1.3.1. Paralasmedidasendiscontinuosehautilizado comoelectrodode referencia un electrodode calomelanossaturadoEG&G PARCMod. K0077y comoelectrodo auxiliar unapuntade platino. Como célula de trabajo se ha empleadouna célula electroquímicaMetrohm EA 875-20. Para los estudiosen flujo, la célula de trabajo ha sido, como ya se ha comentado,unacélulaelectroquímicapara cromatograflalíquidamodeloMP-1305. El electrodode referenciautilizado ha sido un electrodode Ag/AgCl modeloP/N 219054. 111.2.- REACTIVOS Parala preparaciónde los electrodosde pastade carbonose ha utilizado grafito en polvo (Ultra F, Dicoex) y aceitedeparafina(Fluka). La modificación se ha realizadocon diferentesflalocianinasmetálicas:de cobalto (Fluka), de niquel (Fluka) y de hierro (Kodak), que seusarontal comoserecibieron,sin purificación posterior. Losfungicidasanalizadosenesteestudiohansido: tetrametiltiuramdisulfliro (tiram),tetraetiltiuramdisultúro(disulfiram)y dimetilditiocarbamatodezinc (ziram), Parte Experimental 47 todosellos de la marcaAldrich. Otrosreactivosempleadoshansido: fenol (Sigma) y sulfato de zinc (Merck). Para la preparaciónde las disolucionesreguladorasse ha utilizado ácido bórico (Panreac),ácido acético(Carlo Erba), ácido fosfórico (Carlo Erba),NaOH (Panireac),NaH2PO4(Fluka) y Na2HPO4(Panreac).Como disolventesorgánicosse hanempleadometanoly cloroformo(Panreac).Todoslos productosutilizadoshan sido de calidadparaanálisis. Siempreseha trabajadocon aguaultrapuraobtenida medianteun sistemaMillipore Milli-Q. Las mueserasanalizadashansido fresasadquiridasen un mercadolocal. IL1.3.- PROCEDIM[ENTOS EXPERIMENTALES ff 1.3.1.- Preparación del electmdo modificado 11.1.3.1.1.- Preparación de la pasta de carbono mod¡ficadacon fta.locianinasmetálicas La pastade carbonomodificadasepreparapesandoexactamentela cantidad de grafito y ifalocianinanecesariasparaobtenerla proporciónmodificador/grafito deseada(expresadacomoporcentajede modificador). Se añaden0.4 mL de aceite deparafinay 5 mL decloroformopor cadagramodemezcla(grafito+ ftalocianina). Se agita la mezclaen un bañode ultrasonidosdurante3 minutosparaasegurarsu homogeneidad.A continuación se evapora el cloroformo haciendo pasar una comente de argón hastasequedadaparente.Por último, se deja secar la pasta resultanteal aire duranteunanochea temperaturaambiente. 48 Parte Experimental 11.1.3.1.2.- Preparacióndel electrodo indicadorpara la medida Con la pastapreparadacomo sedescribeen el apartadoanterior,serellena la cavidaddel electrododetrabajo,procurandoqueel empaquetamientosealo más compactoposible,y sepule la superficiedurante1 minutosobreunahoja de papel de ordenador.En los estudiosen discontinuose renuevala superficieelectródica despuésde cadaexperimento,retirandola pastausadadel exterior del electrodo (aproximadamente1 mm de profundidad)y sustituyéndolapor pastanueva. 11.1.3.2.- Preparación de disoluciones - Disolucionespatrón de tiram y d¡su’ 50 mi-’; v 10 mV st % CoPC i, (líA) E~ (V) 0 0.27 0.752 0.5 0.39 0.706 1 0.41 0.695 2 0.48 0.695 4 0.56 0.700 5 0.52 0.701 7 0.44 0.684 Tabia JX Influencia de la proporción de CoPC en la posta de carbono sobre la señal de oxidación de 1. Ox)ff’ molL’ de tirwn mediante vollwnperometrla djferencial de impulsos. Br¡tton-Robinson 0.1 mo! Lt pH 4.0, 2% metanoL 4E 50 mv; v~ it) mv st % CoPC i, (1.tA) E~ (V) 0 0.24 0.788 0.5 0.42 0.746 1 0.44 0.731 2 0.47 0.722 4 0.53 0.724 5 0.45 0.725 7 0.43 0.719 76 Resultadosy Discusión En las Figuras 6 y 7 se muestranalgunos de los voltamperogramas registradosa pH 7.0 sobre electrodosmodificadoscon diferentesproporcionesde CoPCenpresencia(Figura6) y enausencia(Figura7) de tiram. El pico queaparece aaproximadamente0.7 V enausenciadetiram seatribuyeala oxidacióndel Co(JI) a Co(III) en la fialocianina,puestoqueaumentaal aumentarla proporcióndeCoPC en la pastade carbonoy no aparecesobreel electrodosin modificar. Por otro lado, el aumentoexponencialde la corrienteque seobservaal final delbarrido sobrelos electrodosmodificados,y que no se producesobreel electrodosin modificar, se debea la existenciadeun pico a aproximadamente1.2 V quepuedeser asignadoa oxidacionesen el anillo de fialocianina(ventanade la Figura7). El pico de oxidacióndel tiram sobrelos electrodosmodificadosapareceen la mismazonade potencialqueel pico correspondientea la oxidaciónde Co(Il) a Co(III) en la fialocianina, como era de esperarpor tratarsede un procesode transferenciade cargaa travésde un mediadorredox. Teniendoen cuentaestacircunstancia,el valor de la intensidaddepico para la oxidacióndel tiram queapareceen las TablasVIII y IX seha medido restando al valor de la intensidadtotal al potencialdepico, el valor de la corrientede fondo a esemismopotencial. Comopuedeobservarseapartir de los datosde la TablaVIII y la Figura6, el pico de oxidacióndel tiram obtenido sobreun electrodode pastade carbono modificado,sedesplazaunos50 mV respectoal picoobtenidosobreel electrodosin modificar.Además,la intensidaddepico aumentacon el contenidode fialocianina en la pasta hasta una proporción del 4%, disminuyendo ligeramente para proporcionessuperiores,mientrasqueel potencialdepico semantieneprácticamente constante. Pastade carbono 77 0.6 0.8 i, ¡¿A 0.4 02 0.0 0.0 F¡gum 6 Influencia de la proponlón de CoPC en la pasta de carbono sobre la señal de oxidación de 1.0x10~ mol L’ de Unen, mediante voltamperometría diferencial de impulsos. Bñtton- Robinson 0.1 mol L4, pH 7.0; AE = 50 mV; v= 10 mV st 2% ¡netanol. ( — ) 0%, ( — ) 204(—)4V% <— )7%deCoPC. 0.8 06 1. MA 0.4 0.2 0.0 Figun 7 Voltamperogriunas, en DPV, de Bñtton-Robinson 0.1 mcl U’, pH 7.0, 2% nietanol, obtenidos con electmdos de pasta de carbono modificados con: ( — ) 0%, ( — ) 2<>/o, ( — ) 4~4 (— ) 7%de CoPC; AE= 50 mV; v= 10 mV. 0.3 0.8 0.9 1.2 E, V 0.0 0.3 0.6 0.9 12 EV Pastade carbono 79 Tabla X Influencia de ¡a proporción de CoFC en la posta de carbono sobre la señal de oxidación de 1. Oxl(r’ mo! 12 de disulflrwn mediante vo¡twnperometría d4ferenc¡al de impulsos. Brilton- Robinson 0.1 mo! JI’, pH 7.0, 2% metanoL Ab>’ SO mV; v 10 mV st %CoPC it, (1.¡A) it, «¡A) E,, (V) E~ (V) (Primerpico) (Segundopico) (Primerpico) (Segundopico) o 0.67 - 0.784 0.5 - 0.50 - 0.790 1 0.56 0.47 0.718 0.816 2 0.68 0.44 0.714 0.807 4 0.67 0.44 0.712 0.812 5 0.69 0.50 0.712 0.811 7 0.68 0.48 0.714 0.812 Tabla XI Influencia de la proporción de CoFC en la pasta de carbono sobre la señal de oxidación de 1.Oxl(T’ mo! 12 de disulflram mediante volttmsperometuía dÉferencial de impulsos. hilton Robinson 0.1 mo! U’, pH 4.0, 2% metanoL AP>’ 50 mV; v= 10 mV st % CoPC it, «¡A) E,, (V) 0 0.64 0.758 0.5 0.70 0.730 1 0.73 0.733 2 0.75 0.737 4 0.76 0.739 5 0.76 0.739 7 0.74 0.742 Pastade carbono 81 Puestoquela seffal de oxidacióndel disulfiram aparecetambiénen la zona depotencialesenqueseproducela oxidacióndeCo(II) aCo(III) en la flalocianina, la intensidadde pico seha medido respectoal fondo, al igual queen el casodel tiram. Se produce, por tanto, un desplazamientode la señal de oxidación del disulfiramhaciapotencialesmenospositivos.Sin embargo,el valorde la intensidad depico esprácticamenteigual sobreel electrodono modificadoy sobreel electrodo modificado con un 2% o másde CoPC. En medio Britton-Robinsonde pH 4.0 apareceun único pico de oxidación en todos los casos. El potencial de pico se desplazasólo ligeramentecon la modificacióndel electrodoy tampocoesmuy marcadoel aumentoen la intensidad de pico que tiene lugar al aumentarla proporción de CoPC en la pasta. Para proporcionesde CoPC superioresal 2% no se observavariación alguna en la intensidado el potencialde pico. o.’ CI ~ ¡iA 0.4 a Figum 11 Influencia de la proporción de flalocianina de cobalto en la posta de carbono sobre la intensidad de pico de los voltamperogramas, en DPI” de 1. Oxí tP mol U’ de: (e) dram a pH 7.0, (.) tirain a pH 4.0, (A) disuifiram a pH 7.0, (.) disulfiram a pH 4.0. Britton-Robinson 0.1 mo! U’, 2% metano!; AE= 50 mi’; v 10 mV 0. 0.2 0 2 4 CcPC, E 82 Resultadosy Discusión Finalmente,apH 10.0noseobservaningunadiferenciaentrela respuestacon el electrodomodificadoy sin modificar. Todos estos resultadosse han resumidoen la Figura 11, lo que nos ha conducidoaescogerun contenidode CoPCenla pastadecarbonodel 4%en el caso del tiram y del 2% en el caso del disulfirani, para llevar a cabo todas las experienciassubsiguientes. 111.1.2.2- Efecto del pH Se ha estudiadola influenciadel pH sobrelos valoresdel potencialde pico y de la intensidadde pico para disoluciones 1 .0x105 mol 12’ de tiram y de disulfirain enmedioBritton-Robinson0.1 mol L’ conun porcentajedemetanoldel 2%. Los valoresde pH que se dan a continuacióncorrespondena valoresreales medidos en la disolución de trabajo; los valores de intensidadde pico han sido medidosde basea base,y la anchurade pico se ha calculadoa la mitad de esta altura. En el casodel tiram, se obtienenunoo dospicos deoxidacióndependiendo del pH (Figura 12), aunqueparecelógico pensarque existendos picos en todo el intervalo estudiadoquesesuperponenparaalgunosvaloresdepH. Porestemotivo, la anchurade pico seha tenido tambiénen cuentaparaelegir el valor de pH más apropiado.Los resultadosobtenidosserecogenen la TablaXII y serepresentanen la Figura 13. El potencial de pico disminuyelinealmente(r= 0.998 y pendiente- 0.014 V) en todo el intervalo de pH estudiado.La intensidadde pico aumentaal disminuir la acidez del medio hastapH 6. Para valores de pH superiores,la intensidadpermanececonstantepero a pH 9 disminuye bruscamente,y el pico desapareceprácticamenteparavalores de pH mayores.Por otro lado, el valor máximoparala relacióni~/W 112, dondei, correspondeal pico menospositivobien Pastade carbono 83 desarrolladoy W,,2 es la anchurade estepico a mitad de su alturaen el caso de aparecerdospicos, seobtienea pH 8.0. Teniendoencuentaestosresultados,y con el fin deobtenerla mayorsensibilidady sencillez,seescogiócomomediodetrabajo para las experienciassubsiguientesuna disolución reguladoraconstituida por HBO2/BO; 0.1 mol 12 de pH 8.0. Figura 12 Volta¡npewgramas, en DPV, de 1.OxIO~ 5 mol L~1 de dram sobre un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4%de CoPC a diferentes valores de pH; Br¡tton-Robinson 0.1 mol 12’, 2% metanol, AE= 50 mV 0, v= 10 mV st I 0.5 pA 0.3 0.6 E, Y 0.9 1.2 0.8 I~. ¡¿A 0.6 - 0.4 0.2 0.6 E, y - 0.7 • • - 0.8 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 PH Figura 13 Influencia del pH sobre la i,, y el El,, en DPV, de 1.Ox1O~5 niol U’ de dram sobre un electmdo de pasta de carbono modificado con CoPC; Bñtton-Robinson 0.1 mol U’, 2% metanol; AE~ 50 mV; v= 10 mV st (U) E~, (@) ir Tabla XII Influencia del pH sobre la señal de oxidación, en DPV, de 1. Ox) O~ mo! U’ de tirwn sobre un electrodo de pasta de carbono modjlicado con un 4% de CoPC. Britton-Robinson 0.1 mo! U’, 2% metano!; AP>’ 50 mi’, v 10 mV st pH V y~A W 1,2, V AV~’ 1.6 0.750 0.42 0.179 2.33 2.2 0.742 0.44 0.175 2.51 3.1 0.730 0.55 0.226 2.43 4.1 0.716 0.59 0.167 3.53 5.1 0.702 0.64 0.142 4.51 6.2 0.688 0.66 0.133 4.96 7.1 0.670 0.67 0.122 5.49 8.1 0.660 0.67 0.113 5.93 9.0 0.652 0.42 0.233 1.80 84 Resultadosy Discusión • e • • •u • e • u u uu • u u u Pastade carbono 85 Por lo que respectaal disulfiram, los resultadosde esteestudiose recogen enlaTablaXIII y semuestranen lasFiguras14 y 15. En medioácido,el disulfiram presentaun único pico de oxidación,mientrasquea partir depH 6.0 aparecendos picos (Figura 14). Figura 14 Voltnmpemgmmas, en DPV, de iAxW5 mal U’ de disulfinun sobre un electmdo de pasta de carbono modificado con un 2% de CoPC a diferentes valores de pH; Buitton-Robinson 0.1 mol 12’, 2% metanol, AE= 50 mV st v 10 mV s~. ]jo.s pA 0.3 0.6 0.9 1.2 E, Y 86 Resultadosy Discusión El potencialdel primer pico de oxidación,quees tambiéne] más intenso hastapH 8.1, disminuyelineaihnente(rz0.998y pendiente-0.011 V) al aumentarel pH. La intensidadde pico aumentalinealmentedesdepH 2.3 hastapH 6.2 y disminuyebruscamenteal seguiraumentandoel pHdelmedio,al mismotiempoque creceel pico que se desarrollaa potencialesmáspositivos. De estamanera,a pH 10.1 seobservasolamenteestesegundopico; sin embargo,apH 11.0 no seobtiene yaningunaseñalde oxidaciónparael disulfiram. Tambiénen estecasosehatenido en cuentala anchurade pico en los mediosdondesólo se observaun pico de oxidación,esdecir, desdepH 1.6 hastapH 6.2. La relacióni,,/W,,2 esmáximaen el mediode pH 6.2. Con objetode conseguirla mayorsensibilidady simplicidad,se ha escogidouna disoluciónreguladoraconstituidapor H2PO41HPO4 2~0.1 mol L~’ parallevar a cabo los estudiossubsiguientes. 1.0 0.84 I~, ¡¡A ‘ E, V 0.B- - 0.78 0.8- 0.4 - — 0.72 0.2 - 0.0- . ,.,.i.i.,, -0.68 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 pH Figura 15 Influencia del pH sobre la i,, y el en DPV, de 1.0x105 mol L’ de disuifinm sobre un electmdo de pasta de carbono modificado con CoPC; Britton-Robinson 0.1 mol 12’, 2% metanol; AE= 50 mV; v 10 mV st (U) E,,,, (e) i~, 1, (O) E.~, (O) i.,~. a e e • e Ea o u• u u OS • a u u u Pastade carbono 87 Tabla XIII Influencia del pH sobre ¡a señal de oxidación, en DPV de 1.0x110 mo! U’ de disulflram sobre un electrodo de posta de carbono mod4ficado con un 2% de CoPC Brilton-Robinson 0.1 mo! U’, 2% metano!; AE= 50 mi’, v 10 mi’ s’. 111.1.3.- CARACTERISTICAS DE LOS PROCESOS DE OXIDACION Como sehavisto, tantoparael tiram comoparael disulfiram seproduceun aumentoconsiderablede la intensidaddepico y un desplazamientodelpotencialde pico hacia valores menospositivos cuando se empleael electrodo de pastade carbonomodificadocon CoPCencomparaciónconel electrododepastadecarbono sin modificar (Figuras4y 5). Además,el pico de oxidaciónqueapareceparaambos fimgicidas sobreel electrodomodificado con CoPC, se desarrollaen la zonade potencialesen que seproducela oxidación de Co(II) a Co(III) en la ftalocianina (Figuras6, 7 y 9). Estosresultadossugierenla existenciade un procesocatalítico de oxidaciónde tiram o disulfiram que puedeesquematizarsecomo sigue: 88 Resultadosy Discusión E Co(II) - ¿ . Co(III) C Co(III) + Z —> Co(II) + Z(ox) Así, el Co(IlI) formadocomoresultadode la oxidaciónelectroquímicadel Co(II) en la ftalocianina,producela oxidación químicadel fungicida (Z), en un procesoredox en el que a su vez se regenerala forma reducidadel catalizador (Co(II)). Este mecanismo ha sido propuesto para la oxidación de diversos compuestosorgánicos sobre electrodosmodificados con CoPC cuando dicha oxidaciónse produceen la zonade pasode Co(II) a Co(III) en la fialocíanína [46,47]. En otros casos,pareceser el par Co(II)/Co(I) el que estáimplicado en el procesocatalíticopuestoque la seflal de oxidación aparecea potencialesmucho menospositivos [167,168]. Conobjetode investigarmásprofundamentelos procesoselectródicos,seha llevado a caboun estudiosobreel efectode la velocidadde barrido de potencial sobrela respuestaelectroquímicade los fungicidasmediantevoltaniperometríade barrido lineal (LSV), con el electrodomodificado de pastade carbono. En el casodel tiram, los datosexperimentalesobtenidosconunadisolución 1 Ox 1 0~ mol L’ se recogenen la Tabla XIV. La representaciónde la función de corrienteijCv”2 ftenteal logaritmodey disminuyefuertementeal aumentary para velocidadesde barrido superioresa 150 mV 51 (Figura 16), lo que resulta característicode un procesocatalítico [169]. Además,el potencial de pico se desplazahaciavaloresmáspositivosal aumentarla velocidaddebarrido,hechoque coincide con lo esperadoparaun mecanismodel tipo EC [170]. En el caso del disulfiram, los resultadosexperimentalesse recogenen la TablaXV. Tambiénen estecaso,la función de corrientedisminuyeal aumentarla velocidadde barridoparavelocidadessuperioresa 80 mV s’ (Figura 17) , mientras Pastade carbono 89 queel potencialsedesplazahaciavaloresmáspositivos.Estosresultadosconcuerdan con el mecanismopropuestoparaambosfungicidas. Tabla X1V Influencia de ¡a velocidad de barrido de potencial, en LSV, sobre ¡a señal de oxidación de tirwn i.0x105 mol L’ sobre un electwdo de pasta de carbono modificado con un 4% de CoPC. RB0 2/BO; 0.1 inol U’, pH 8.0, 2% nietanol. m mVs 4 íogv i,,,gA login E,,, V A moL’ mL mV”2 5112 -0.59 -0.42 -0.24 -0.08 -0.03 0.11 0.17 0.27 0.30 0.34 0.47 0.58 0.708 0.714 0.729 0.740 0.751 0.746 0.746 0.767 0.762 0.770 0.772 0.788 5 10 20 40 60 80 100 150 200 250 500 1000 0.70 1.00 1.30 1.60 1.78 1.90 2.00 2.18 2.30 2.40 2.70 3.00 0.25 0.38 0.58 0.84 1.07 1.28 1.49 1.85 1.99 2.20 2.96 3.83 11.2 12.0 12.9 13.2 13.8 14.3 14.9 15.1 14.1 13.9 13.2 12.1 90 Resultadosy Discusión f±16 u U Y E -J E Y a E U ‘3 .2-10 0.0 0.6 12 1.8 2.4 3.0 Iag y Figura 16 Variación de la función de coMente, iICv’~, con iog y, mediante LSV, empleando un electmdo de pasta de carbono modificado con un 4% de ftalocianina de cobalto. 1.0x105 mol U’ de uiram; HBOJBO 2 0.1 mol U’, pH 8.0, 2% metanol. 12 - 10 - a a 0.0 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 Iog Y Figura 17 Variación de la función de coniente, i~/Cv’~, con log y, mediante ISV, empleando un electmdo de pasta de carbono modificado con un 2% de ftalocianina de cobalto. 1.OxItY 5 mal U’ de disulfimm; H 2PO¿/11P04 2 0.1 niol U’, pH 6.0, 2% metanol. 14 - 12 - .~ e 5 e 5 5 5 • 5 e u u U Y E -J E O E mc U ca a. Se. e e 5 e e e e Postade carbono 91 Tabla XV Influencia de la velocidad de barrido de potencial, en MV, sobre la señal de oxidación de disulfiram 1.Oxl(f’ mol U’ sobre un electrodo de posta de carbono mod4 ficado con un 2% de CoPC H>PO<¿/HP04 2 0.1 mo! U’ pH 6.0, 2% metanot mV ~ log y 1r jiA Iog i, E~, V A maL’ mLmV’~ s”~ 5 10 20 30 40 50 60 80 100 150 200 250 500 0.70 1.00 1.30 1.48 1.60 1.70 1.78 1.90 2.00 2.18 2.30 2.40 2.70 0.20 0.28 0.47 0.64 0.76 0.84 0.86 0.95 1.03 1.21 1.34 1.49 1.61 -0.70 -0.55 -0.33 -0.19 -0.12 -0.08 -0.06 -0.02 0.02 0.08 0.13 0.17 0.21 0.730 0.748 0.754 0.758 0.764 0.770 0.794 0.784 0.784 0.798 0.802 0.806 0.830 8.6 8.9 10.4 11.7 12.0 11.9 11.1 10.6 10.3 9.9 9.5 9.4 7.2 Por otra parte, la representacióndel logaritmo de la intensidadde pico ftente al logaritmo de la velocidaddebarrido es lineal entre5 y 100 mV s’ en el casodel tiram (Figura 18) y entre5 y 60 mV &‘ en el caso del disulfiram (Figura 19), siendolos valoresde laspendientes0.57y 0.66respectivamente,lo quesugiere que inicialmente los procesosestáncontroladospor difusión. Para velocidades 92 Resultadosy Discusión superioresa los valores indicados, se produce, más que una desviaciónde la linealidad,un cambio en las pendientes,que pasana ser 0.40en el casodel tiram y 0.36 parael disulfiram, que podría correspondera un control por otro tipo de difusión.De hecho,algunosautoressugierenquela superficiedelelectrododepasta de carbonoestárecubiertapor una fina pelicula de aglutinante[16] a travésde la cualel analito tienequedifimdir paraalcanzarla superficiedelelectrodo.Es decir, el analitodebedifundir a travésde dos capasde difusiónde diferentenaturalezay espesor[18], lo quecomplicarlael controlpor difusióndelacorrienteavelocidades de barridorelativamenteelevadas. 0.3 - ________________________________________ 0.8 ¡cg I~ 0.4 0.2 0.0 —0.2 —0.4 —0.8 —0.3- 0.0 0.8 1.2 1.8 ¡cg y Figura 18 Variación de log i~, con log y, mediante LSV, empleando un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4% de ftalocianina de cobalto. 1.0x105 mcl L-’ de tiram; HBO 2/BO; 0.1 mol U’, pH 8.0, 2% metanol. 2.4 LO Pastade carbono 93 0.4- log ¡~ 0.2 - 0.0 - —0.2 - —0.4 - —0.8 - —0.8 ¡cg y Figura 19 Variación de log i,, con log y, mediante LSV, empleando un electrodo de pasta de carbono modificado con un 2% de ftalocianina de cobalto. i.Oxi0~ mol U’ de disulfinm; H2P04 ¡JIPO4 0.1 mol U’, pH 6.0, 2% metanol. 1111.4.- ADSORCION DE LOS FUNGICIDAS SOBRE EL ELECTRODO DE PASTA DE CARBONO MODIFICADO Como se ha señaladoen el Apartado de Introducción, la presenciadel aglutinanteen la pastade carbonopuededar lugara la preconcentraciónde ciertos analitosacircuitoabiertosobrela superficiedelelectrodo,debidofundamentalmente a fenómenosde extracción [18,19], aunquetambién puedendarse procesosde adsorciónsobre las partículasde grafito [17]. Esteefectopuedeaprovecharsecon fines analíticos si se controla con precisión el proceso de transportede masa (temperaturay agitación constantes),por lo que se investigó la posibilidad de preconcentrartiramy disulfiramsobrela superficiedelelectrododepastadecarbono modificado,conobjetodemejorarlascaracterísticasanalíticasde la determinación. Para ello, se registraronen primer lugar los voltamperograniascíclicos de una disolución 1.0x10 5mol L~’ de tiram sin ningúntiempode acumulacióny aplicando e 0.0 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 94 Resultadosy Discusión un período de acumulacióna circuito abierto de 300 segundos,tanto sobre el electrodode pastade carbonomodificado con un 4% de CoPC (Figura 20) como sobreel electrodode pastade carbonosin modificar (Figura21). Sobreel electrodomodificado con fialocianina se observaclaramenteun aumentoenla intensidaddepico,asícomoun pequeñodesplazamientodelpotencial de pico hacia valoresmás positivos al aplicar el periodo de acumulación.Sin embargo,sobreel electrodode pastade carbonosin modificar el aumentoen la intensidadde pico es menosmarcado,aunquela señal sedesplazatambiénhacia potencialesmáspositivos. 4.0 ¡, ¡¡A 3.0 2.0 1.0 0.0 1.2 E. Y Figura 20 Voltainperogranias cíclicos de dram 1.0x105 mol L-’ sobre un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4% de CoPC; HBO 2/B02 0.1 mnol 12’, pH 8.0, 2% metanol. ( ) sin acumulación, (—) con un periodo de acumulación de 300 segundos; ( ) voltampengrmna del fondo con un periodo de acumulación, a ciftuito abierto, de 300 segundos; v 50 mV st 0.3 0.8 0.0 Pastade carbono 95 1.5 ¡. ¡¡A 1.0 0.5 0.0 0.8 1.2 Figura 21 Voltamperogranias cíclicos de dram 1.0x105 mol L’ sobre un electrodo de pasta de carbono sin mod¡fica~ HBO 2/B02 0.1 mol U’, pH LO, 2% metmnol. < ) sin acumulación, (—) con un periodo de acumulación de 300 segundos; ( ) voltamperograma del fondo con un periodo de acumulación, a circuito abierto, de 300 segundos; v 50 mV st En el casodel disulflram, seapreciamuchomásclaramentela existenciade fenómenosde adsorciónsobre la superficie del electrodo. En la Figura 22 se representanlosvoltamperogramascíclicosobtenidosparadisulfiram 1 .0x10 5mol L’ de sobreun electrododepastadecarbonomodificadoconun 2% de CoPC.Cuando se empleaun períodode acumulaciónde 300 segundos,la intensidadde pico aumentaconsiderablemente,desplazándoseel potencialde pico haciavaloresmás positivos. Este mismo efectopuede observarsecuandose empleael electrodode pastadecarbonosin modificar(Figura23), lo queponedemanifiestoqueel proceso de acumulaciónes muchomásacusadoen el casodel disulfiram. Esteefectopuedeexplicarseteniendoencuentaqueel disulfiramesbastante más apolar, más hidrofóbico, que el tiram. En general, las diferencias en la 0.6 0.6 E. Y 96 Resultadosy Discusión capacidadde acumulaciónde los compuestosorgánicossobre la superficiede los electrodos de pasta de carbonose atribuyen a las diferencias en el carácter hidrofóbicodedichoscompuestos,puestoqueenel procesodepreconcentraciónestá implicadala afinidad de los analitospor el aglutinantede la pastade carbono[17- 19]. Una vez verificadala posibilidaddepreconcentrarambosfungicidassobre el electrodomodificado,puedeaprovecharsecon fines analíticos.Combinandolos efectosde preconcentracióny electrocatálisisen un mismoelectrodoy empleando unarampade potencial quepermitaobtenerunaelevadasensibilidad,como es la voltamperometríadiferencialde impulsos,puedeesperarseunamejorasustancialde las característicasanalíticas, en términos de sensibilidad, de los métodos desarrolladospara la determinaciónde tiram y disulfiram. 10.0 ¡. ¡¿A 6.0 6.0 40 2.0 0.0 0.3 1.2 Figura 22 Voltamperogramas cíclicos de disulfiram 1.OxlO~ mol L’ sobre un electndo de pasta de carbono modificado con un 2% de CoPC; 112F0;/IWOQ- 0.1 mol Lt pI! 6.0, 2% metanol. ( ) sin acumulación, (—) con un periodo de acumulación de 300 segundos; ( ) voltamperograma del fondo con un período de acumulación, a circuito abierto, de 300 segundos; v 50 mV st E. Y 0.8 0.9 Pastade carbono 97 8.0 1, ¡¡A 6.0 4.0 2.0 0.0 0.3 E, Y Figura 23 Voltampen>gramas cíclicos de disulfimm i.o~i0~ mol L4 sobre un electmdo de pasta de carbono sin modificaq 11 2P0¿/HP04 2 0.1 mol 12’, pH 6.0, 2% metanol. ( ) sin acumulación, (—) con un período de acumulación de 300 segundos; ( ) voltamperograma del fondo con un período de acumulación, a circuito abierto, de 300 segundos; v~ 50 mV si. 111.1.4.1.- Comportamiento voltampemmétiico mediante diferencial de impulsos El estudiosistemáticode las distintasvariablesexperimentalesqueafectan a la respuestavoltamperométricase ha llevado a cabo empleando la técnica diferencial de impulsos, con objetode establecerlas condicionesóptimasparael trabajoanalítico. 0.6 0.9 1.2 98 Resultadosy Discusión HLL.4.1.1.- Efecto del tiempo de acumulación La dependenciade la corriente de pico con el peñadode acumulacióna circuito abierto se ha estudiado para ambos fungicidas a dos niveles de concentración,dado que para poder determinar concentracionesmás bajas es necesarioaumentarel tiempodepreconcentración,mientrasqueparaconcentraciones máselevadassealcanzaantesla saturacióndel electrodo. Los resultadosobtenidosparael tiram serecogenenlas TablasXVI y XVII y se representanen la Figura24. Paraunaconcentraciónde tiram de 1 .0x10’ mol L’, la corriente de pico aumentacon el tiempo de acumulaciónhastalos 60 segundos,manteniéndoseprácticamenteconstanteparatiemposmáslargos, lo que indica la saturacióndel electrodo.Parauna concentraciónde l.0x106 mal L’ de tiram, se observalinealidadhastalos 90 segundos,y la corriente de pico se hace prácticamenteconstantedespuésde 150 segundos. Por consiguiente,los períodosde acumulaciónque se han escogidopara estudiosposterioreshansido de90 y iSO segundos,parael nivel superiore inferior de concentraciónensayado,respectivamente. En el caso del disulfiram, la corrientede pico aumentacon el tiempo de acumulaciónhasta los 300 segundos,manteniéndoseconstante para tiempos superiores,paralos dos nivelesde concentraciónensayados(TablasXVIII, XIX y Figura25). Se ha escogido,por tanto,un tiempode acumulaciónde 300 segundos paraambosnivelesde concentracion. Postade carbono 99 Tabla XVI Influencia del tiempo de acumulación a circuito abie no sobre la intensidad del pico de oxidación de tiran, 1.0 xl(f5 nwl U’, en DPV, sobre un electrodo de pasta de cm-bono mod4ficado con un 4% de CoPC; ifilO/BO; 0.1 mo! U’,pH 8.0, 2% metano!; v= 10 mi’ s~’, 4E 50 mi’. t, segundos i~, ¡lA 0 0.66 30 1.10 60 0.95 90 1.45 120 1.45 150 1.14 300 1.08 Tabla XVII Influencia del tiempo de acumuiadón a circuito alileno sobre la intensidad del pico de oxidación de tiram 1.0 x11t6 mo! U’, en DPV, sobre un electrodo de posta de carbono mod4ficado con un 4% de CoPq lIBO/RO; 0.1 mo! U’, pH 8.0, 2% metano!; v= 10 mi’ s~, 4E 50 mV. t, segundos i~» jiA 0 0.10 30 0.14 60 0.17 90 0.22 120 0.23 150 0.24 180 0.25 210 0.25 100 Resultadosy Discusión 1.5 1.2- o>. 0.4~ 0J~ 0.0 O 80 lIC 180 240 tI.mpo de aaumiiIacIOn, e 300 Figura 24 Influencia del tiempo de acumulación sobre la ¡~, de tiram: (.) 1.0x105 ¡nol 12’ y de (u) 1.0x104 mol U’, en DPV, sobre un electrodo de pasta de carbono modificado con CoPC; HB0 21B02 0.1 mol U’, 2% metanol; AE= 50 mV; y 10 mV st 4.0 p. MA 8.0 2.0 1.0 0.0 Figura 25 Influencia del tiempo de acumulación sobre la i,, de disulfiram: (u) 1.0x10 5 mal U’ y de (u) 1.0110.6 mol 121, en DPV, sobre un electrodo de pasta de carbono modificado con CoPC; H 2PO$/H1P04 1 0.1 mal 12’, 2% metanol; Al» 50 mV; v= 10 mV s’. a— e 0 120 240 380 480 800 11cm». de •oumuJacIdn. e Pasta de carbono 101 Tabla XVIII Influencia del tiempo de acwmdacióna circuito objeto sobre la intensidad del pico de oxidaciónde disulflrwn 1.0 xl O~ mo! L’, enDPV, sobre un electrododeposta de carbono mod4ficadoconun 2% de CoPC;H2PO¿/RPOf0.1 molL’, pH6.0, 2%metanol;v 10mV st AE= 50 mV. t, segundos i,, ixA t, segundos i,, iiA 0 0.64 240 2.80 30 1.10 300 2.92 60 1.49 360 3.21 90 1.97 420 3.11 120 2.28 480 2.94 180 2.54 600 3.58 Tabla XIX Influencia del tiempo de acunudación a circuito abieno sobre la intensidaddel pico de oxidaciónde disulfiramn 1.0 xlCr 6 mo! L’, enDPV, sobreun electrododepostade carbono modificadoconun2% de CoPC;H 2PO/HPOt0.1 mo!L 4,pH 6.0, 2% metano!;v 10 mV 54~ LIE 50 mV. t, segundos i,, ¡iA 0 0.11 60 0.20 120 0.31 180 0.40 240 0.46 300 0.56 360 0.58 480 0.56 600 0.53 102 Resultadosy Discusión IIIL1.4.1.2.- Efecto del pH La influencia del pH sobre el potencialde pico y la intensidadde pico, cuandose empleapreconcentraciónde los fimgicidas, seha examinadoparauna concentraciónde tiram 1.0x105mol 121, utilizando un electrodomodificadoconun 4% de CoPC y un periodo de acumulaciónde 90 s a circuito abierto, en medio reguladorBritton-Robinson 0.1 mol L’ con un 2% de metanol, cubriendoel intervalo de pH desde1.5 hasta10.0. Figura26 Voltampewgranas,en DPV, de finim i.o~io~mol U’ sobft un electndode pastade carbono modificadoconun4%de CoPCadife¡tntesvalottsde PH; Britton-Rob¡nson0.1 ¡¡ml L’, 2% ¡¡¡etanol; tiempo de acunmlación:90 segundosa ci¡tu¡to abierto,AE= 50 mV st v= 10 mV —1 5. I 0.5 pA pH 9.1 ea o.¿ o.a ej te E• Y Pasta de carbono 103 Comopuedeobservarseen la Figura26, apareceun únicopico deoxidación en medioácido y neutro,queademásno muestraindicios de ser el resultadode la superposicióndedospicos,comoocurríacuandono seempleabaningúnperíodode acumulación(Figura 12). En medio ligeramentebásicosí seaprecialapresenciade dos picosde oxidaciónen amboscasos.Los resultadosobtenidosse recogenen la TablaXX y se hanrepresentadoen la Figura27. TablaXX InfluenciadelpH sobrela señalde oxidación,enDPV, de tirwn 1. OxítP mol L~’ sobre un electrododepastade carbonomod~flcadocon un 4%deCoPC Britton-Robinson0.1 mo!L~’, 2% metano!;tiempode acwnu¡ación90 segundosa circuito abierta AE= 50 mV, v= 10 mV —1 5. 104 Resultados y Discusión 1.0 0.5 01 I~. ¡¿A E. V 0.8 0.7 0.4 0.2 Figura 27 Influencia del pH sobrei~, y E~, en DPV, de linni 1.0x105mol L’ sobreun electwdode pasta de carbono modificado con CoPC; Britton-Robinson 0.1 ¡nol U’, 2% metanol; tiempo de acumulación: 90 segundosa cirruito abierto; AE~ 50 mV; v 10 mV &‘. (U) E~, (@) 1r El potencialde pico disminuyelinealmentedesdepH 2.1 hastapH 9.1 (r=z 0.994y pendiente-0.011 V). La intensidaddepico aumentay la anchuradisminuye desdepH 1.5 hastapH 8.1. Paravalores de pH superioresa 9.1, la intensidad disminuye,y por encimadepH 10.0 la señalde oxidacióndel tiram prácticamente desaparece.La mayor intensidaddepico y la mejor relacióni~IW1/2 seobtienende nuevo a pH 8.1, lo que confrnna la idoneidaddel medio de trabajo escogido anteriormenteconstituido por HBO 2/BO¿ 0.1 mol L’ de pH 8.0 para estudios subsiguientes.A pesar de tratarsede un medio ligeramentealcalino, no se ha observadodegradacióndel fungicida con el tiempo, paralos períodosusualesde trabajoen el laboratorio,puestoquela señalanalíticaobtenidaparaunadisolución de tiram en estemedio semantieneconstanteal cabo de unashorasde trabajo. 0.8 e.o te ~.o 6.0 8.0 10.0 pH Pasta de carbono 105 La influencia del pH sobre la señal de oxidación del disulf¡ram se ha estudiadopara una concentraciónde fungicida l.0x10~5 mol U’, utilizando un electrodomodificado con un 2% de CoPC y un período de acumulacióndc 300 segundosa circuito abierto,en medioBritton-Robinson0.1 mol U’ con un 2% de metanol. En la Figura28 semuestranlos voltainperogramasobtenidosen algunos de los mediosensayados. Figura 28 Voltiunpemgnunas, en DPV, de disulfimm t.OxtO~5 mal L4 sobre un electn>do de pasta de carbono modificado con un 2% de CoPC a diferentesvalores de pH; Britton-Robinson 0.1 mol U’, 2% metanol; tiempo de acumulación: 300 segundosa ci,tuito abierto, AE~ 50 mV s’, v 10 mV I 2 ¡¡A pH ti ea e~ e.u e.u te ia E. V 106 Resultadosy Discusión Se puedeobservarla presenciade dos picos de oxidaciónprácticamenteen todo el intervalo de pH estudiado.El que aparecea potencialesmáspositivosestá muy poco desarrolladoen medioácido, pero a medidaqueel mediosehacemás alcalino crece considerablemente,mientrasque el pico másinteresantedesdeel punto de vista analítico, ya que apareceen medio ácido a potencialesmenos positivos,va disminuyendoal aumentarla alcalinidaddelmedioy desapareceapH 10.0. Un efectosimilar seobservabasinemplearun períododeacumulación(Figura 14). Los datos sobre la influencia del pH sobre el potencial, la intensidady la anchurade pico se recogenen la TablaXXI y serepresentaen la Figura 29. Tabla XXI Influencia delpH sobrela señaldeoxidación, en DPV, de disulflrwn 1.OxItK5 mo! L’ sobre un electrododepastade carborzomod4ficadocon un 2%de CoPC Brilton-Robinson 0.1 mo! IV, 2% metano!; tiempo de acwnulación300s a circuito abierto. AE 50 mV, v= 10 mV ~‘. pH E~ 1,V 1Ñ, 1.¡A y ~p¡’~’I/2 gA V’ E y p 2, JtA 1.5 0.784 1.80 0.111 16.2 - - 2.1 0.774 2.32 0.100 22.4 - - 3.1 0.764 2.79 0.104 26.8 0.958 - 4.1 0.764 3.16 0.103 30.7 0.938 - 5.1 0.758 3.47 0.098 35.4 0.880 - 6.2 0.738 3.70 0.093 39.8 0.853 - 7.2 0.726 3.57 0.108 33.0 0.832 1.32 8.1 0.724 2.87 - - 0.834 2.04 9.0 0.708 1.96 - - 0.820 3.03 10.0 - - - - 0.828 3.55 11.1 - - - - 0.822 2.69 Posta de carbono 107 1.00 4.0 - 0.90 ¡.0 - E~ Y 2.0 - - ojo 1.0 - 0.70 0.0~ e.e a.e 4.0 6.0 8.0 ie.o 12.0 pH Figura 29 Influencia del pH sobre la i,, y el E,,, en DPV, de disulfiram 1.0x105 mol Ji’ sobre un electwdo de pasta de carbono modificado con CoPC; Britton-Robinson 0.1 mol L’, 2% metanol; tiempo de acumulación: 300 segundosa ciftuito abierto; AE= 50 mV; v= 10 mV s~’. (U) En,, (e) i,, 1, (El) E~2, (O) ‘pr El potencialde los dospicosde oxidacióndisminuyeentodo el intervalo de pH estudiado.La intensidaddel primer pico aumentay la anchuradisminuye al disminuir la acidez del medio hastapH 6.2, valor al que se obtiene la mayor intensidady la mejor relación¡1W,12. A partir deestevalordepH, la intensidaddel segundopico comienzaa crecerhastapH 10.0, paravolver a disminuir a partir de pH 11.1. En medio Britton-Robinsonde pH 11.9, no se observaningunaseffal de oxidación.Tambiénen el casodel disulfiram, el mediode trabajoconstituidopor reguladorfosfato 0.1 mol U’ depH 6.0 que sehabíaescogidoanteriormente,sigue siendoel másapropiadoparala determinaciónde disulfiram tras su acumulación sobrela superficiedel electrodo. o o e u e a o o a e OCo o a.a. • • • o u. u 108 Resultados y Discusión 111.1.4.1.3.-Efecto del contenido en metanol de la disolución analítica Debidoa la escasasolubilidadde los dosfungicidasestudiadosen agua,las disolucionespatrónse han preparadoen metanoly, por tanto, las disolucionesde trabajocontienenunapequeñacantidaddeestealcohol.La influenciadel porcentaje de metanol en el medio de trabajo sobre la respuestavoltamperométricaen diferencialde impulsosde disolucionesde 1.0x10~5mol U’ detiram y dedisulfiram conel electrododepastadecarbonomodificadoconCoPCseensayóvariandodicho porcentajeentreel 0.4 y el 40% (y/y). Los resultadosobtenidosestánrepresentados en las Figuras30 y 31. Puedeobservarseunafuertedisminuciónde la intensidadde pico al aumentarla proporciónde metanolhastaun 20% para ambosfungicidas. Cuandose empleó un porcentajedel 40% de metanol, se obtuvo una elevada corriente de fondo y ninguna señal asignablea la oxidación del tiram o del disulfiraxn. Aunque la mayor intensidadde pico seobtuvo en amboscasosparael mínimo porcentajedemetanol,conel fin de asegurarla solubilidaddel fungicidaen el mediodetrabajo, seha escogidounaproporcióndel 2% demetanolparaestudios posteriorestanto parael tiram comopara el disulfiram. 111.1.4.1.4.- Conclusionesparciales A modode conclusióny con fines comparativos,en las Figuras 32 y 33 se muestranlos voltamperogramasobtenidosparaunadisolución 1.0x10~5 mol 12’ de tiram, en diferencial de impulsos, sobre el electrodo de pastade carbono sin modificar y sobre el electrodo modificado con CoPC, a pH 8.0, sin realizar preconcentración(Figura 32) y empleandoun período de acumulaciónde 90 segundos(Figura 33). En las Figuras 34 y 35 se muestranlos voltamperogramas análogosobtenidosparaunadisolución1.0x10~’ mol L’ de disulfiramapH 6.0, sin emplearpreconcentración(Figura 34), y tras la aplicación de un período de acumulaciónde 300 segundos(Figura 35). Pastade carbono 109 10 1 MeOH Figura 30 Influencia de la proporción de metanol sobre la intensidad del pico de oxidación, en DPV, de dnm 1.0x10~ mol 12’ sobre un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4% de CoPC. RBO2/BO2~ 0.1 mol U’, pH 8.0; tiempo de acumulación: 90 segundos a circuito abierto; AE 50 mV; v= 10 mV st 10 E MeOH Figura 31 Influencia de la proporción de nietanol sobre la intensidad del pico de oxidación, en DPV, de d¡sulfirani i.OxiO~ ¡nol L’ sobreun elecindode pasta de carbono modificado con un 2% de CoPC. HyO;/P04 2 0.1 mnol 12’, pH 6.0; tiempo de acumulación: 300 segundosa circuito abierto; AE 50 mV; v 10 mV st 1.2 I~ ¡¿A 1.0 e e e e 0.8 - 0.8 - 0.4 - 0.2 - 0.0 o 20 a e e e e 4.0 - I~. ¡¿A 3.0 - 2.0 - 1.0 - 0.0 o 20 110 Resultados y Discusión 1.5 1, ¡¡A 1.2 - 0.8 - 0.8 - 0.3 - o Figura 32 Voltunpengramas, en DPV, de dram i.OxiW5 mol U’ sin aplicar período de acumulación sobre: (—) un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4% de CoPC, ( ) un electrodo de pasta de carbono sin modifica; HBO 2/802- 0.1 mcl U’, pH 8.0, 2% metano!; AESO mV, v= 10 mVs’. 1.5 1. ¡¿A 1.2 - 0.9 - 0.B - 0.3 - a Voltanipemgnmas, en DPV, de dram i.O~io-~ ¡nol U’ tras la aplicación de un período de acumulaciónde 90 segundossobre: <—) un eiectndo de pasta de carbonomodificadocon un 4% de CoPC, ( ) un electrodode pastade carbonosin modificar, ; IIBOJBOJ 0.1 ¡no! U’, pH 8.0,2% metano!; AE = 50 mV, v 10 mV s’. • • ¡ • 0.2 0.4 0.6 0.6 E. Y 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 E, Y Figura 33 Pastade carbono 111 1.2 1, ¡¿A 0.9 0.8 0.3 0.0 1.1 E. Y Figura 34 Voltampengnumas, en DPV, de disulfiram 1.OxlO5 mol U’ sin emplear ningún período de acumulación sobre: (—) un electrodo de pasta de carbono modificado con un 2% de CoPC, ( ) un electndode puta de carbono sin modifican H 2PO41HPO4 2~0.1 mol U’, pH 6.0, 2% metanol; AE=50 mV, v 10 mV s’. 5.0 1, ¡¿A 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 Voltamperogramas, en DPV, de disulfiram 1.0x105 mol U’ tras la aplicación de un período de acumulación de 300 segundossobre: (—) un electrodo de pasta de carbono modificado con un 2% de CoPC, ( ) un electrodo de pasta de carbono sin modifican H 2PO4/HPO4 2~ 0.1 mol U’, PH 6.0, 2% metanol; AE = 50 mV, v 10 mV s’. 0.3 0.5 0.7 0.9 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 E, Y Figura 35 112 Resultados y Discusión Se observaen todoslos casosun desplazamientodel potencialdepico hacia potencialesmenospositivosy un aumentodela intensidaddepico cuandosetrabaja con el electrodomodificado con CoPC (línea continua)respectoal electrodosin modificar (línea discontinua)lo que,comoya se ha dicho, evidenciala existencia de electrocatálisis.Cuandoseempleaun períododeacumulación(Figuras33 y 35) se observa un aumento considerablede la intensidadde pico (obsérveselas diferentesescalasde corrientede las figuras cony sin preconcentración),así como un estrechamientode los mismos,típico de los procesosdeadsorción,conrespecto a las señalesobtenidassin emplearpreconcentración(Figuras32 y 34). Por otra parte, el aumentode corrienteque se asociaal efectocatalítico debidoa la presenciade CoPCenel electrodoesmuchomásacusadoenel casodel tiram (Figuras32 y 33). Por el contrario,el incrementode la seffal que se produce en el procesode acumulación,es claramentemásgrandeen el casodel disulfiram (nóteseladiferenciaenla escalade intensidadesexistenteentrelasFiguras34 y 35). IIL1.4.2.- Efecto de la velocidad de barrido de potencial mediante voltampemnietríade barrido lineal Finalmente, se ha evaluado la influencia de la velocidad de barrido, empleandola técnicaLSV, sobre la corriente de pico y la función de corriente, tanto para el tiram comopara el disulfiram, tras su acumulaciónsobre el electrodode pastade carbonomodificado. En el casodel tiraxn, seha utilizadounaconcentración1.0x105mol L’ y un período de acumulaciónde 90 s, recogiéndoseen la Tabla XXII los resultados obtenidos.En el casodel disulfiram, se ha empleadola mismaconcentraciónde fungiciday un períodode acumulaciónde 300 5; los resultadosserecogenen la Tabla XXIII. Pastade carbono 113 Tabla XXII Influenciade la velocidadde herido depotencial,en LSV, sobre la señalde oxidaciónde tiram i.0x104mo! U’ sobreun electrodode posta de carbonomodificado con un 4% de CoPC Tiempode acunudaciów90s. HBO/BQ 0.1 mo!U’, pH 8.0, 2% metanot m mVs~’ ogv 1 1~, ~.t ~ E,,, V i,,/Cv’0 A mol’ mL mV’~ s”2 0.42 0.77 1.22 2.05 2.50 3.13 3.55 4.15 4.97 5.36 6.42 7.57 -0.38 -0.11 0.09 0.31 0.40 0.50 0.55 0.62 0.70 0.73 0.81 0.88 0.708 0.722 0.734 0.742 0.748 0.756 0.758 0.768 0.762 0.780 0.812 0.826 5 lo 20 40 60 80 100 150 200 ¡ 250 500 1000 0.70 1.00 1.30 1.60 1.78 1.90 2.00 2.18 2.30 2.40 2.70 3.00 18.7 24.4 27.3 32.4 32.3 35.0 35.5 33.9 35.1 33.9 28.7 23.9 1114 Resultados y Discusión Tabla XXIII Influencia de !a velocidadde barrido depotencial, en LSV, sobrela señal de oxidación de disulfiram 1.0x105mo! U’ sobreun electrododepostadecarbonomod4ficadocon un 2% de CoFC Tie~npo deacwnulació,r 300 s. H 2P04/HPOt 0.1 mo! U’, pH 6.0, 2% nwtanot m mV 4 log y i~, jiA log i~ E~, V A moF’ mL mV’ 12 ~¡í2 2.08 3.22 5.03 8.32 10.10 12.37 13.23 14.97 16.48 18.16 19.40 0.32 0.51 0.70 0.92 1.00 1.09 1.12 1.18 1.22 1.26 1.29 0.764 0.774 0.788 0.800 0.802 0.816 0.822 0.836 0.832 0.840 0.854 5 10 20 40 60 80 100 150 200 250 500 0.70 1.00 1.30 1.60 1.78 1.90 2.00 2.18 2.30 2.40 2.70 93 102 113 131 130 138 132 122 117 115 87 Pasta de corbono 115 20 - 0.0 0.8 1.2 1 1.6 2.4 3.0 Iog y Figura 36 Variación de la función de coniente, i,,/Cv’% con log y, mediante LSV, empleando un electndo de pasta de carbono modificado con un 4% de ftalocianina de cobalto. Tham i.OxiO~ mol U’; HBO2/BO; 0.1 mol U’, pH 8.0, 2% metanol. Tiempo de acumulación: 90 segundos. 0.0 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 ¡cg y Figura 37 Variación de la función de corriente, i,,/Cv’~, con log y, mediante LSV, empleandoun electrodo de pasta de carbono modificado con un 2% de ftaloc¡anina de cobalto. Disulfiram 1.OxiO 5 mol U’; H 2P041HP04 2 0.1 mol L’, pH 6.0, 2% metanol. Tiempo de acumulación: 300 segundos. 30 - f~ 40 U E -j E a E tu o .S-10 aB eeae. e e e e a tu u •~ 140 E .ai2O E a E100 « tu ~ 80- o a. e a.a a e Be e e e 116 Resultados y Discusión Iog I~ 1.0 - 0.8 - 0.6 - 0.4 - 0.2 - 0.0 - —0.2 - —0.4 - 1 1 ¡ 0.0 0.6 1.2 II 2.4 3.0 loa y Figura 38 Variación de log i,, con log y, mediante I.SV, empleando un electmdo de pasta de carbono modificado con un 4% de ftalocianina de cobalto. ‘Dram 1.0x10~5mol L’; HBOJBO 2 0.1 mol U’, pH 8.0, 2% metanol. Tiempo de acumulación: 90 segundos. 1.4 1.2 - ¡cg 1, 1.0 - 0.8 - 0.6 - 0.4 - 0.2 Iog y Figura39 Variación de log i,, con log y, mediante I.SV, empleando un electrodo de pasta de carbono modificado con un 2%de flalocianina de cobalto. Disulfiram i.OxiO~ mol U’; H2P04/HiPO4 2 0.1 mol U’, pH 6.0, 2% metano!. Tiempo de acumulación: 300 segundos. ¿e a oea a 0.0 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 Pasta de carbono 117 En amboscasos,la dependenciade la funciónde corrienteconla velocidad de barrido(Figuras36 y 37) esmuy parecidaa la observadacuandono se aplicaba un períododepreconcentración(Figuras16 y 17), disminuyendodichafunciónpara velocidadessuperioresa 200 mV s’ parael tiram y superioresa 80 mV SI parael disulfiram, lo que,comosehabíacomentado,resultacaracterísticode los procesos catalíticos. Sin embargo,la representaciónde log i ftente a log y, muestraun único tramo rectoentre5 y 100 mV st dependiente0.70 (r 0.998)enel casodel tiram (Figura38) y 0.63 (r= 0.9990)enel casodeldisulfiram(Figura39),y sedesvíapara velocidadessuperiores.Estosvaloresde la pendienteparecenindicar un controlpor difusiónde la corrienteabajasvelocidadesdebarrido,cuandodeberíanencontrarse indiciosde laexistenciadeadsorción.Esteefectopuedeexplicarsesi laacumulación del fungicidaseproduceenmayorgradopor extracciónenel aglutinantede lapasta de carbonoque por adsorciónsobre las partículasde grafito [18]. Así, el proceso de oxidaciónestaríacontroladoinicialmentepor la difusión del analitoa travésdel aglutinantehastala zona de reacción.Además,de estemodo sejustifica que la preconcentraciónseamuchomás acusadaenel casodeldisulfiramdadosucarácter másapolary, por tanto, su mayor afinidadpor el aceitede parafina. ILL1.5.- CURVAS DE CALIBRADO Y CARACTERISI1CAS ANAL~CAS Utilizando el períodode acumulaciónapropiadoparacadafungiciday para cada nivel de concentración, se han obtenido, empleandovoltamperometría diferencial de impulsos en la etapade redisolución, relacioneslinealesentre la intensidadde pico y la concentraciónde tiram y disulfiram en los intervalos que aparecenrecogidosen la TablaXXIV. Con fines comparativos,se hanrealizado también calibrados para ambos fungicidas sin emplear ningún período de 118 Resultadosy Discusión acumulación.Los parámetroscaracterísticosde todosestoscalibradosserecogenen la Tabla XXIV, encontrándoserepresentadosen las Figuras40 a 45. Comopuedeobservarse,cuandono seaplicapreconcentración,lascurvasde calibradosehanrealizadoapartir de 1.0x106mol L’, no siendoposibledeterminar concentracionesinferioresaéstaparaningunode los dos firngicidas.Por otraparte, las desviaciones de la linealidad para altas concentraciones,se producen aproximadamenteal mismonivel deconcentraciónrealizandoo nopreconcentración. Si se emplea un mismo periodo de acumulaciónpara diferentes intervalos de concentración,se observa una disminución en la pendiente al aumentar la concentracióndefungicida,característicade los procesosdeadsorción.De nuevose ponedemanifiestoquela adsorciónesmásfuerteenel casodeldisulfiram; así,para el intervalo 1.0x106-1.0x105mol 12’, la pendientedel calibradoescasi un ordende magnitudmayorcuandose empleaperíodode acumulación. Las característicasanalíticas de los métodos así desarrolladosse han calculadoa partir de los calibradosobtenidosutilizando preconcentracióny se encuentranrecogidasen la Tabla XXV. Los valores de la desviaciónestándar relativasehancalculadoapartir de lasmedidascorrespondientesa 10 disoluciones diferentes, utilizando 10 electrodos modificados distintos, a dos niveles de concentración,uno de los cuales se encuentrasituado en la parte inferior del calibradocorrespondiente.Puestoque sehanempleado10 superficieselectródicas diferentes,sehacalculadotambiénla desviaciónestándarrelativade los valoresdel potencialde pico, resultandoser menordel 1% en todoslos casos. Comocriterio paraestablecerel límite de determinación,seha utilizado el criterio sugeridopor la IUPAC [171], lOs, habiéndosetomadocomoestimadorde s, el valor de la desviaciónestándar,en unidadesde concentración,obtenidopara unaconcentraciónpróximaa lamásbajamedidaenel calibrado,siendoenestecaso de 4.Oxl& mol L’ parael tiram y de 1.0x107 mol U’ parael disulflram. Pasta de carbono 119 Tabla XX1V Cunasde calibradopara tirwn y dis¿dflram, medianteDPA dSV, empleandoun electrodode pastade carbonomodjficadocon CoPC 4E 50 mV; v= 10 mV <‘. Fungicida Tiempo de acumulación,s Intervalo lineal, mol 1<’ Coeficientede correlación Pendiente, isA L moF’ Ordenadaen el origen, ~A xlO’ l.0xl0’-6.0xl0~’ 0.996 0.65+0.02 0.19+0.09 o l.0x104-6.OxlO’ 0.998 0.85+0.05 -0.06+0.03 Tiram 90 l.0xl0~’-7.0xl0~’ 0.997 0.60+0.06 0.5+0.2 l.0xl0tl.0xl0~’ 0.9994 1.02+0.03 0.03+0.02 180 3.OxlO’-l.0x104 0.993 1.67+0.06 -0.011+0.005 o l.0x104-2.0x10’ 0.997 0.57+0.04 0.00+0.02 Disulfiram 1 Ox 10’-2.0xl05 0.9998 3.4+0.7 0.4+1.0 300 l.0xl0tl.0xl0~’ 0.9995 4.2+0.1 0.13+0.07 8.0x104-lOx io4 0.9995 4.8+0.1 0.061+0.006 Por lo que respectaal límite de detección,se ha calculadoa partir de la expresión3sjm [172], dondem esla pendientedel calibradoinferior considerado y comoestimadorde 5b seha tomadoel valor de la desviaciónestándarde la señal para 10 disolucionesde tiram 4.0x107mol 12’ y de disulfiram l.0x107 mol 12’. Como se pusode manifiestoen el apartadode antecedentesbibliográficos, la mayoría de los métodos electroquímicos que se han encontradopara la 120 Resultados y Discusión determinacióndetiram y disulfiramestánbasadosen la reducciónde los fungicidas sobreelectrodosde mercurioo de películade mercurio,oscilandolos límites de detecciónentrel.0x106 mo! 12’ [151] y 1.3x10’0 mo! U’ [153]. El único método encontradobasadoen la oxidacióndetiram tras suacumulaciónsobreun electrodo rotatorio deplatinoreportaun límite de detecciónde0.3 ng mU1 (1.3x109mol 12’), peropresentaclarasdesventajaspuestoqueel picode oxidaciónseencuentrasituado en la barreradeoxidación del medio(aproximadamentea 1.5 V) y esnecesarioun períodode acumulaciónde 10 minutos[1]. Puededecirse,por consiguiente,quelos métodosdesarrolladosutilizando el electrodode pastade carbonomodificadocon CoPCresultanventajososen términosdesensibilidad,potencialal queaparecenlas respuestas(mayor selectividad)y rapidezcon respectoa los métodosprecedentes. Tabla XXV Característicasanalíticos de los métodosdesarrolladospara la determinación de tiram y disulfiroan, medianteDP=4dSV,empleandoun electrododepastade carbono mod4ficado con flalocianina de cobalto. AE= 50 mV; v 10 mV st Tiempo de acwmdación: Tirain: 180 segundos,disulflram: 300 segundos. Fungicida RSD, % Límite de Límite de detenninación,mol L’ detección,mol 12’ Tiram 3.0 2.4x104 7.1x108 Disulfiram 7.3x108 2.2x108 7.2’ a) Nivel de concentración: l~) Nivel de concentración: c) Nivel de concentración: 5.Ox1O~6mol L~’ (n10) 4.Ox1O~’ mcl U’ (n10) l.Ox1O~’ mcl L~’ (n10) Pasta de carbono 121 6.0 - ¡~. ¡¿A 4.0 - 2.0 - 0.0 Figura 40 Influencia de la concentración de tiram sobre la intensidad de pico, i~, mediante DPAdSV, empleandoun electmdode pastade carbono modificado con un 4% de ftalocianina de cobalto. Intervalo de concentración: de 1.0x10~5 a 10.0x105mol U’ de dram; HBO 2/BO; 0.1 mcl U’, PH 8.0, 2% metanol. Tiempo de acumulación: 90 segundos. ¡ • 1 • 1 1 ¡ 0.0 2.0 4.0 8.0 8.0 10.0 0ÉIra.. maL ¡~i Figura 41 Influencia de la concentración de dram sobre la intensidad de pico, ii,, mediante DPAdSV, empleandoun electrodo de pastade carbono modificado con un 4% de ftalocianinade cobalto. Intervalo de concentración: de l.Ox10~5 a 10.Ox10~5mol L~’ de dram; HBO 2/BO2~ 0.1 mol U’, pH 8.0, 2% metanol. Sin período de acumulacion. -e — a a ¡ • ¡ • ¡ • ¡ • ¡ 0.0 2.0 4.0 8.0 9.0 10.0 Cuira.. maL V 1 x 10’ a o o 6.0 - 1,. ¡¿A 4.0 - 2.0 - 0.0 x 10’ 122 Resultados y Discusión • ¡ 0.0 2.0 4.0 0eíram. maL 171 x 10 Figura 42 Influencia de la concentración de dram sobre la intensidad de pico, ir,, mediante DPAdSV, empleando un electrodo de pastade carbono modificado con un 4%de ftalocianina de cobalto. Intervalo de concentración:de 1.OilO’ a 10.0x10’mol U’ de dram; HBOJBO; 0.1 mol U’, pH 8.0, 2% metano!. (@) empleando un período de acumulación de 180 segundos;(O) sin período de acumulación. 0.15 - l~, ¡¿A 0.10 - 0.05 - 0.00 Figura 43 Influencia de la concentraciónde tiram sobre la intensidad de pico, i,,, mediante DPAdSV, empleandoun electrodo de pastade carbono modificado con un 4%de ftalocianina de cobalto. Intervalo de concentración:de 3.O~10~ a 10.0x10~’ mo! U’ de dram; HBO 2/BO; 0.1 mo! 12, pH 8.0, 2% metanol. Tiempo de acumulación: 180 segundos. 1.0 - I~. ¡¿A 0.8 0.8 - 0.4 - 0.2 - 0.0 ¡ • ¡ • 8.0 8.0 10.0 ¡ • . ¡ 0.0 2.0 4.0 LO 8.0 10.0 0tI~iram. maL I2~1 x lo’ Pasta de carbono 123 5.0 I~. ¡¿A 4.0 - 3.0 - 2.0 - 1.0 - 0.0 ¡ 0.0 2.0 C 1.0 E. V 0.6 ¡jA 0.4 0.0 1.5 1, yA 1.0 0.5 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 E. Y d 0.0 0.2 0.4 0.5 0.8 1.0 . 1.2 E. V 128 Resultados y Discusión Tabla XXVI Efectode la presenciade otras sustanciassobrela señalvoltamperométricade 2.OxltT6 mol L’ de tiram o disulflram, medianteDPAdSV, sobre un electrodo de pasta de carbono mod4ficado conftalocianinade cobalto.Relacionesinterferente:analitoqueproducenun error relativo superior al 10% en la medidade i., Tiram: HBO/BO 0.1 mol 12, pH 8.0, 2% metanol,180segundosdeacumulacióna circuito abierto.Disulflram:H>PO 4/HPO4 2~0.1 mol L’, pH 6.0, 2%metanol,300 segundosdeacwmdacióna circuito abierta AE= 50 mV; v 10 mV5~. Interferente Relacióninterferente:analito Error relativo Tiram Disulfiram Tiram Disulfiram Tiram --- 1:1 --- 18% Disulfiram 0.1:1 --- 41% Ziranx 0.5:1 1:1 23% 13% Fenol 10:1 10:1 10% 28% Zn(IJ) 50:1 50:1 < 10% < 10% 111.1.7.- DETERMINACION DE TIIIAM EN MUESTRAS DE FRESAS CONTAMINADAS Comoseha comentado,unade lasprincipalesaplicacionesdel tiram sebasa en su actividadfungicida,empleándosefundamentalmentesobrecultivos de frutas, hortalizasy plantasornamentales[62]. Concretamente,el empleodetiramenfresas, manzanasy peraspresentaimportantesventajasconrespectoalautilizacióndeotros pesticidas[173]. En la CEEsetoleraun contenidode ditiocarbainatosentre2-7 mg Kg’ (expresadocomo CS 2) en frutasy verduras[63]. Pasta de carbono 129 Con objetode veríficar la aplicabilidaddel métodopropuestoutilizando el electrodo de pastade carbonomodificado con CoPC, se ha llevado a cabo la determinacióndetiram en muestrasde fresascontaminadascon 2 gg de tiram por gramo de fresa (lo que equivalea 1 mg Kg’ de CS2). El procedimientodescritoen la parteexperimentalseaplicóenprimerlugar aunamuestradefresassin contaminar.El voltamperogramadiferencialde impulsos obtenidosobreel electrodomodificadoparaesteblancosemuestraen la Figura49. Como puede observarse,apareceun pico a aproximadamente0.3 V que puede correspondera la oxidación de algún compuestoendógenopresenteen las fresas, puestoqueno se modifica con las adicionessucesivasde tiram y erareproducible independientementede la muestra, que no interfiere en la detenninacióndel fungicida. Tambiénpuedeobservarsea aproximadamente0.7 V el pico quese ha asignadoa la oxidaciónde Co(II) a Co(III) en la ifalocianina.La presenciade este pico en el fondohacenecesario,desdeun puntodevistaanalítico, restarestaseñal; queno aumentaconel procesode acumulación,de la respuestadelanalito.Paraello, se realizaronadicionesestándarsucesivasde 0.6 mg L~’ al blancode fresas(véase Figura 49) y el valor de la ordenadaen el origen obtenido para tres series de medidas,queresultóserO. 10+0.03 iiA, seconsiderócomoel valor decorrienteque debe restarsedel valor de la intensidad de pico medido en los estudios de recuperacióndel tiram. Los resultadosobtenidosparacinco muestrasde fresascontaminadasa un nivel de 2 gg de tiram por gramo de fresa,lo queimplica unaconcentraciónfinal de tiram en la disoluciónanalíticade 1.2 mg 19, aplicandoel métodode adiciones estándar,se recogenen la Tabla XXVII. La concentraciónexperimentalmedia obtenidafue de 1.12±0.09mg L’ de dram(1.9 + 0.1 ¡ig g 1), lo quesetraduceen unarecuperaciónmediadel 94 + 7 % para un nivel de significaciónde 0.05. Estos resultadosdemuestranla validezdel métododesarrolladoparala determinaciónde tiram en muestrasde estetipo. 130 Resultados y Discusión 1.2 !, ¡¿A 0.9 0.6 0.3 0.0 0.0 0.2 0.4 a.s os i.o E, V Figura 49 Voltampewgramas,en DPV, sobre un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4% de ftniocianina de cobalto, de la disolución analítica de una muestra de fresas sin contaminan (1) disolución blanco (en ausenciade dram), (2-6) adicionessucesivasde 0.6 mg L•’ de dram. HBO2/B02• 0.1 ¡nol u, pH 8.0, 2% metanol; AE= 50 mV; v= 10 mV s’. Tabla XXVII Recuperacióndedram enfresascontwninadas,medianteDPAdSV,con decarbonomod4ficado con CoPC Períodode acwrndación:180 s. un electrododepasta Muestra CteóúcaTiram,mgL 4 Cencont,.,~aTiram, mgL’ Recuperación,% 1 1.20 1.11 92.5 2 1.20 1.05 87.5 3 1.20 1.12 93.5 4 1.20 1.24 103.5 5 1.20 1.10 91.5 Pasta de carbono 131 11L2.- DETERMINACION DE TIRAM MEDIANTE INVECCION EN FLUJO CON DETECCION AMPEROME¶URICA SOBRE UN ELECTRODO DE PASTA DE CARBONO MODIFICADO CON ETALOCIANINA DE COBALTO Sehainvestigadola posibilidadde emplearel electrodode pastade carbono modificadoconCoPCcomodetectoramperométricoen sistemasen flujo. Paraello, se ha desarrolladoun método de inyección en flujo basadoen el procesode oxidacióndel tiram sobreel electrodomodificado.En el apanadoII. 1.1.1sedescribe el sistemaFíA utilizado. La célula de flujo empleadaha sido de tipo “thin-layer. I[L2.1.- DETECCION AMPEROMIETRICA CONVENCIONAL SOBRE EL ELECJRODO MODIFICADO Cuandoseaplicaal electrodoindicadorun potencialconstantede+ 1.0 V, se observaunadisminucióngradualde la corrientede pico tras realizarinyecciones sucesivasdetiram 1.0x105mol U’, empleandocomodisoluciónportadoraregulador HBO 2/BO; 0.1 mol L’ de pH 8.0 con un 2% demetanol(Figura50). Por ejemplo, i~disminuyeun 15% tras 17 inyecciones.Además,como puedeobservarseen la Figura50, el ruido dela líneabaseaumentaconsiderablementeconel tiempo.Estos efectos pueden atribuirse al ensuciamientode la superficie del electrodo, probablementecomo consecuenciade la adsorcióndel fungicida que, en los experimentosen discontinuo,hacenecesariala renovaciónde la superficie del electrododespuésdecadamedida.Esteimportanteproblemaprácticosehaintentado solventar medianteel empleo de la denominadadetecciónamperométricade impulsos(PAD). 132 Resultados y Discusión Figura 50 Fiagrama obtenido pan inyecciones consecutivas de dram 1.Oxl(V5 mol ~ en medio HBO 2/BO, 0.1 nl U’ de pH 8.0 - 2% metanol y/y empleando como electrodo indicador un electrodo de pastade carbono modificado con un 4% de CoPC. Vg 200 pL; caudal: 1.5 mL muí’; Ej +1.0 V. 111.2.2.- DETECCION AMPEROMETRICA DE IMPULSOS En laFigura51 serepresentael esquemadepotencialesaplicado,quealterna polarización anódicay catódicadel electrodo. Esta forma de llevar a cabo la detecciónha sido empleadapor el grupode Baldwin con buenosresultadoscuando seempleanelectrodosdepastade carbonomodificadoscon CoPCcomodetectores en cromatografialíquida [26,28]. 0.2 ~A 5 ruin Pasta de carbono 133 Figura 51 Esquemadel programa de potencialesutilizado para !a detecciónamperométilcade impulsos (PAD). 111.2.2.1.-Selecciónde los valores del potencial aplicados en el programa de impulsos El potencialanódico,E1, se ha escogidoparallevar a cabola detecciónde la oxidacióndel dram,mientrasque el potencialcatódico, E2, se ha elegidopara regenerarla superficie del electrodo. Con el fin de seleccionarel valor más apropiadode E1 se ha registradoel voltamperogramahidrodinámico del tiram, siguiendo el procedimientodescrito en el apartado11.1.3.5. Así, se inyectaron volúmenesfijos de unadisolución dedram 5.0x10’ mol L’ en medioHBO2/BO; 0.1 mol L’ de pH 8.0 y 2% y/y en metanolen el caudalde disoluciónportadora constituidapor el mismo electrólito fondo. ti E1 E2 t 134 Resultadosy Discusión En la Figura52 serepresentala variaciónde la intensidaddepico cuandose variaE1 entre+0.30y + 1.20 y, manteniendoE2= -0.3 V, valor depotencialcatódico recomendadopor el grupo de Baldwin para la reacfivaciónde la superficie del electrodo(26,28]. Comopuedeobservarse,se obtieneunamesetao “plateau’ bien definidaavaloresdeE1 comprendidosentre±0.90y ±1.10V. Lafuertedisminución de i~, apotencialessuperioresa+1.10V puedeatribuirsea la pasivaciónirreversible delmediadorredoxcuandoseaplicanpotencialesmuypositivos[28]. Dehecho,en las experienciasrealizadasen discontinuo(apartado111.1.2.1),podiaobservarseun pico de oxidacióna aproximadamente+1.2 V x’s. SCEasignablea la oxidacióndel anillo de fialocianina, cuando se registrabael voltamperogramadel fondo, constituidopor Britton-Robinson0.1 mol L•’ depH 7.0 (Figura7). Comopotencial para llevar a cabo la detecciónseha escogido,en consecuencia,un valor de ~= +0.95 V, situadoen la zonade la mesetade intensidadesde corriente(Figura 52). 1.2 1.0 0.8 • yA 0.8 0.4 0.2 Figura 52 Influencia del potencial anódico, E1, sobre la intensidad de pico, ii,, de dram 5.0x10~mol U’ en medio HBO,/BO; 0.1 mol L’ de pH 8.0 - 2% metanol y/y, mediante FIA-PAD empleando como electrodo indicador un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4% de CoPC. 200 >114 caudal: 1.5 mL mint Eg~ -0.3 V; tr 0.2 s; tr 0.2 s. 0.2 0.4 0A 0.8 1.0 1.2 1.4 E, Y Pasta de carbono 135 1.4- to - 1.5 1.2- I~. yA 1.0 1.0 0.5 0.8 ¡ • • ¡ • . 0.0 —0.8 —01 —0.4 —0.2 0.0 E,, Y Figura 53 Influencia del potencial catódico, E~, sobre !a intensidad de pico, i~ (e), y la relación señal/mido,i/i~. (El), de dram 5.OxlO’ mol 12’ en medio HBO2/BO; 0.1 mol L’ de pH 8.0-2% metanol y/y, mediante FIA-PAD empleando como electrodo indicador un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4% de CoPC. V1j 200 p14 caudal: 1.5 mL mun 4; E~ -0.3 V; t 1= 0.2 s; t~= 0.2 s. El valor de E2 seha escogidoestudiandosu influenciasobre la respuesta amperométricacuandosevaríaentre0.0 y -0.80 V. La alturade pico permanece prácticamenteconstanteentre0.0y -0.60 V, perola corrientede fondo aumentaal tomarE2valoresmásnegativos(Figura53). Lamayorrelaciónseñal/midoseobtuvo paraun valordeE2 0.0 V. Sin embargo,no seapreciaregeneracióndela superficie del electrodoparaestevalor depotencial.Así, en la Figura54 A seobservacómo laalturadepico disminuyetrasinyeccionessucesivasdetiram cuandoseutiliza E2= 0.0 V. Al cabode 20 inyecciones,la disminucióneni, es de un 20%. Comoseha mencionado,el grupodeBaldwin recomiendaun valor de-0.30 V (omásnegativo) parala regeneraciónde la superficiedel electrodo.Pareceser queestareactivación estárelacionadaconel procesodereduccióndeCo(II) a Co(I) en la fialocianina,que tiene lugar entre -0.3 y -0.5 V [26]. Efectivamente,no se observadisminución o o o o o aa a e o e a 136 Resultados y Discusión significativaenla intensidaddepico al cabode 20 inyeccionesconsecutivasdetiram cuandoseempleaE2= -0.3 V (Figura54 B), por lo quesehaescogidoestevalor de potencialparala regeneraciónde la superficieelectródica. Figura 54 Fiagramas obtenidos para 20 inyeccionesconsecutivasde tiram 5.0x10’ mol L~’ en medio HBO2/BO; 0.1 mcl U’ de pH 8.0 - 2% metanol y/y, mediante FIA-PAD empleando como electrodo indicador un electrodo de pasta de carbono modificado con un 4% de CoPC. 200 pL Programa de potenciales:(A): E1= +0.95 V; E2= 0.0 V; t1= 0.2 5; t2= 0.2 s. (B): E1 +0.95 V; Eg -0.3 V; t~ 0.2 5; t~ 0.2 s. 0.5 pA A 5min B Pasta de carbono 137 111.2.2.2.- Selecciónde los valoresdetiempodeaplicaciónde los potenciales anteriores Los períodosdetiempode aplicaciónde E1 y E2 (t1 y t.2, respectivamente)se hanoptimizadoteniendoen cuentasu influenciaen la respuestaamperométrica. Cuandot1 aumentaen el intervalo de 0.2 a 1.0 s,i,, disminuye(Figura 55). No obstante,tambiéndisminuyeel valor de la corrientede fondo,de tal modoque la relaciónseñal/ruidocreceal aumentart1. 1.4 1.2 - Ii,, MA 1.0 - 0.B 0.0 ti 0.4 ti, 0.80.6 u 2.0 •1.s - 1.0 • 0.5 0.0 1.0 Figura55 Influencia del tiempo de aplicación del potencial anódico, t~, sobre la intensidad de pico, 1,, (@),y !a relación señal/ruido, i,/i~ (O), de tiran 5.0x10~’ mol L’ en medio HBO2JBO; 0.1 mol 12’ de PH 8.0 - 2% metanol y/y, mediante FLA-PAD empleando como electrodo indicador un eiectwdo de pasta de carbono modificado con un 4% de CoPC. V1~j 200 ¡¡14 caudal: LS mL mm’; E,= +0.95 V; E, -0.3 V; t,= 0.2 s. o o • o• oo o. o e e a 138 Resultados y Discusión La influenciade t2 seha estudiadopara dos valoresde t~, 0.2 y 0.4 s. Los resultadosserepresentanen las Figuras 56 y 57. La intensidadde pico aumentaal aumentart~ cuandot1= 0.2 s y permaneceprácticamenteconstantecuandot2= 0.4 s. Sinembargo,lacorrientede fondoaumentatambiénconsiderablementeal aumentar en amboscasos,dandolugararelacionesseñal/ruidomáspequeñascuantomayor es t2. Por otro lado, cuantomayoresel tiempo transcurridoentredos medidasde intensidadde corriente(t1 + t2), peor definidaestá la señalamperométrica. Teniendoen cuentatodosestosresultados,sehaescogidoun valor de0.2 s tanto parat1 como parat2 paraestudiosposteriores. Empleando los parámetrosdel programa de potenciales que se han seleccionado,seobtuvounadesviaciónestándarrelativadel 2.1% en la medidade i,, para20 inyeccionessucesivasde tiram 5.0x10 6mol L’ (Figura 54 B), lo que confirma la utilidad de] esquemade detección amperométricade impulsos desarrolladopara la regeneraciónde la superficie del electrodomodificado con CoPC. 111.2.2.3.-Optimizaciónde las variableshidrodinámicas Se ha estudiadola influenciadel caudalde la disoluciónportadorasobrelos parámetrosque definen las señaleso fiagramas,estoes, la altura de pico, i,,, el tiempo de residencia,T, y la anchurade pico, ¿St. Los datosobtenidosseresumen en la TablaXXVIII y estánrepresentadosen las Figuras58, 59 y 60. Pasta de carbono 139 0.0 0.2 0.4 0.B 0.8 1.0 tas. Figura 56 Influencia del tiempo de aplicación de E2, t2, sobre la intensidad de pico, i~, (e),y la relación señal/mido, i,,/i1. , x xJ procedentede una serie de neuronas(ni) de la capa precedente.Lasn salidasOut U 1,...,n) de la capasongeneradassimultáneamente a través de la ecuación (7) o (8). En una estructuramonocapa,estassalidas constituyenla respuestafinal de la red. 158 Resultados y Discusión En una arquitecturamulticapa, las n salidasllegan a la siguiente capa, formadaporpneuronas.Estanuevacapatiene,evidentemente,nxppesosy produce p salidasque sepropagaránaposteriorescapas.La topologíade la red,númerode capasy deneuronasencadacapaviene condicionadaporla naturalezadelproblema y solo se puedeaveriguarmedianteun procesode pruebay error, quedecidiríala arquitecturaóptima de la redy que es válido paracualquiertipo de red neuronal. SALIDA Capadesalida Capasocultas Capade entrada ENTRADA Figura 66 Representaciónde una red neumnal de propagación hacia atnis poliestratificada El entrenamientode la red neuronal consiste en encontrar la correcta combinaciónde todos los factores de peso iva y de los parámetros~. y 4 que produzcalas respuestasapropiadaspara entradasconocidas(valoresde medida obtenidoscon patrones).Paraello, existendiversosprocedimientos[197], de los cuales,el másutilizado recibeel nombredepropagaciónhaciaatrás, quesebasaen la llamada“regla delta” parala correcciónde los pesosde cadacapan, 4v (iv qnuevo - w , duranteel aprendizajede la red: Técnicas Quimiométricas 159 = i~ 87 Oulj»’ (10) Esta regla estableceque el cambio de peso ¿1w~f’en la capan debe ser proporcionalal error 87 queproduceen la salidade la neurona]y ala señalOut7’ procedentede la neurona¡ de la capaanterior.El parámetrori seconocecomo taso de aprendizaje. En el algoritmo de propagaciónhaciaatrás, el cálculo de 4” se realiza medianteel llamadométododegradientedescendiente.Estemétodorequierequelas correccionesrealizadasvayansiempreencaminadasala minimizacióndel error E” en la capan[186]. En general, para conseguir una convergenciamás rápida con menos oscilaciones,y paraevitar quedaratrapadoen mínimoslocales,la ecuacióngeneral para la correcciónde los pesos(ecuación10) se complementacon un término adicional: = 8~” Oulj”’ + p. (11) donde~¡ se denominatérmino de momentoy ¿1w fl(P>~VÍO) es el cambiodel pesow del ciclo de aprendizajeprevio. 111.3.3.- DESARROLLODEL METODO El objetivo de este capítuloes realizar el análisis de mezclasde tiram y disulfiram en la región intermediadel calibradodinámicodemedidasmediantelos métodosquimiométricosreferidosanteriormente,conun doblefin: averiguarcuál o cuáles de los dos fungicidas estánpresentesen una disolución desconociday, lógicamente,procederasudetenninacióncuantitativaasociandounmargendeerror a estapredicción. 160 Resultados y Discusión El mediodetrabajoescogidofue reguladorHBO2/B02 0.1 mol L’ depH 8.0 con un 2% demetanol(y/y). El estudioserealizóenel intervalode concentraciones 1.0x10~’-9.0xl0 6mol Ji’ para cadafungicida, a partir de los datosprocedentesde los voltamperogramasobtenidosmediantela técnicadiferencialde impulsostrasla aplicacióndeun períododeacumulaciónde 180 segundosy utilizandounavelocidad de barrido de potencialde 10 mV s’ y unaamplitud del impulsode 50 mV. 111.3.3.1.- DISEÑO EXPERIMENTAL Cuandose investigala dependenciade un determinadoprocesode diversos factoresexperimentales,es necesarioobtenerun compromisoentreel tamañodel espacioparamétrico,definido por el númerode variablesindependientes,y el númerode experienciasque es factibley lógico realizarparala investigaciónde aquél. Estanecesidadse concretaen un diseñoexperimentalque, en Química Analítica, se ha reflejado en la admisión de los métodos quimiométricos multivariantescomo herramientahabitualde trabajoparael análisissimultáneode varioscomponentesen situacionesdebajaresolucióny derelaciónseñal-midopoco favorable. En estecaso, al tratarsesolamentede dos compuestosquímicos,e] diseño propuestoesmuy simple.Seescogieron22 combinacionesdetiram y disulfiram, 12 parala calibración(validacióninterna)y 10 depredicción(validación externa),con objeto de cubrir el máximo espaciomuestral. En la figura 67 se muestra la disposiciónfinal de las muestrasy en la Tabla XXIX las combinacionesde las concentraciones. Técnicas Quimiométricas 161 3 e e1- ‘-9 a 3 a a a ¡ a a ¡ 4 di-a aa a a 3 0 a a a ‘0a a í a a a-1 4- Di :0 • a • u — 2 4 6 c(Tlram)x10. mal -4 a la Figura 67 Representacióngráfica de las combinacionesde dram y disulfizam escogidas:(•) validación interna, (O) validación externa Tabla XXIX Combinaciones de dram y disu¡firwn utilizadas Validación interna 0Tú~,’ x 106, mol U’ ~ x 106, mol L~’ 0.0 0.0 0.0 2.0 2.0 5.0 5.0 5.0 8.0 8.0 9.0 9.0 0.0 5.0 9.0 2.0 8.0 0.0 5.0 9.0 2.0 8.0 0.0 9.0 Validación x lOe, mol U’ 1.0 1.0 1.0 4.0 4.0 5.0 5.0 6.0 6.0 8.5 lo a 6- 4- 2- -J a E o x u a a a a externa x 106,mol L.a 1.0 5.0 8.5 4,0 6.0 1.0 8.5 4.0 6,0 5.0 162 Resultadosy Discusión 111.3.3.2.-Regresión mediante PCR y PLSR Teóricamentelos resultadosobtenidosal aplicarPLSRdebensermejores,o al menossimilares,a los que se obtienenmediantePCR. Se ha procedidoa la aplicaciónde ambosmétodosy se han comparadomediantela función RMSEP (RootMean of SquaresPrediction).Dicha función se defmecomo: it RMSEP= 1~ , pH 7.4; E = O.OV;v’SOmVs’. t~, mm i,,, gA t~, mm í,,, gA 0 6 7.09 1 1.54 8 8.63 2 2.75 10 10.1 3 4.16 15 13.0 4 5.44 20 15.2 5 6.25 125 100 - .75 pA 50 25 O Figura 83 Influencia del tiempo de acumulación sobre la intensidad del pico de oxidación de disulfiram, en LSV, sobre un electrodo de gmfito-40% teflón. Disulfinm (@) 1.Ox10~5 mol U’, (U) 5.OxlO6 mo! U’; H 2PO4JHPO¿ 0.1 mo! L’, pH 7.4; Ej 0.0 V; v= 50 mV s’. O 5 10 15 20 t, mlii Grafito-teflón 195 18.0 12.0 - 1,. ¡¡A 8.0 - 4.0 - 0.0 O Figura 84 Influencia del tiempo de acumulaciónsobrela intensidad del pico de oxidación de disulfinun, en LSV, sobre un electrodo de grnfito-40% teflón. Disulfinm 5.Oxio7mol Ti’; H 2P041HP04 2 0.1 mol L’, pH 7.4; Ej 0.0 V; v= 50 mV s’. Comoun compromisoentresensibilidady tiempodeanálisissehaescogido, tanto parael tiram comoparael disulfiram a cualquiernivel de concentración,un períodode acumulaciónde 300 segundos. Por otra parte, el período de acumulaciónno afectabaa los valores del potencialde pico en ningún caso. 111.4.2.3.3.-Efectode la velocidadde barrido de potencial La influencia de la velocidad de barrido de potencial, sobre la respuesta electroquímicade los fungicidasaunnivel deconcentraciónde5.0x106mol L’, se ha estudiadomediantevoltamperometriade barrido lineal, entre5 y 1000 mV st traslaaplicacióndeun períododeacumulaciónde300segundosa0.0y. Sólamente 5 10 15 20 t, mlii 196 Resultados y Discusión se ha considerado su influencia sobre el primer pico que apareceen el voltamperogramapor ser el de interésanalítico. Los resultadosobtenidospara el tiram semuestranen la TablaIL y en las Figuras 85 y 86, mientrasque para el disulflram, los resultadosse recogenen la Tabla L y serepresentanen las Figuras87 y 88. Tabla It Influencia de la velocidad de barddo de potencial, en LSV, sobre la señal de oxidación de timm 5.0x106mol L~’ sobre un electrodo de gmfito-40% teflón. H 2PO;/1IPO4 2~ 0.1 mol L~’, pH 7.4; tj 300 s; E,= 0.0 V. m mV ~ log y ir,, ¡tA log i,, E~, V i ¡Cv”2 AL moL’ mV’~ ~1/2 5 0.70 2.33 0.37 0.660 0.21 10 1.00 4.40 0.64 0.680 0.28 20 1.30 8.50 0.93 0.700 0.38 40 1.60 15.91 1.20 0.725 0.50 60 1.78 19.14 1.28 0.735 0.54 80 1.90 27.37 1.44 0.745 0.61 100 2.00 36.31 1.56 0.750 0.73 150 2.18 53.02 1.72 0.765 0.87 200 2.30 60.04 1.78 0.773 0.85 250 2.40 74.03 1.87 0.780 0.94 500 2.70 117.6 2.07 0.831 1.05 1000 3.00 171.5 2.23 0.885 1.08 GraJlto-teflón 197 2.5 2.0 - 1.5 log 1, 1.0 0.5 0.0 Iog y Figura 85 Variación del log i,, con log y, mediante LSV, empleando un electrodo de gmfito-40% teflón. ‘flran, 5.0x106 mol 1;’; H 2P04/HP04 2 0.1 mol L~’, pH 7.4; t= 300 5; Ej 0.0 V. 1.2 •1 E o E -J sc 4; 1.0 0.8 0.8 0.4 0.2 0.0 10.00 y Figura 86 Variación de la función de contente, i~/Cv’~, con Iog y, mediante LSV, empleado un electrodo de grafito-40% teflón. ‘Dram 5.0x1O~’ mol L~’; H 2PO4YHiPO4 2 0.1 mol 12’, pH 7.4; tj 300 s; E¿ 0.0 V. 0.0 1.0 2.0 3.0 0.01 0.10 1.00 198 Resultados y Discusión Tabla L Influencia de la velocidad de batido de potencial, en LSV, sobre la señal de oxidación de disulflram 5.0x10~’ ¡nol L~’ sobre un electrodo de grafito-40% teflón. H2P04/HP04 2 0.1 mol 12’, pH 7.4; tj 300 s; Ej 0.0 V. 1 A 1 E V mVs’ ogv 1~ og 1P P’ ¡ A L moL’ mV”2 ~h¡2 5 0.70 3.57 0.55 0.645 0.32 10 1.00 7.44 0.87 0.655 0.47 20 1.30 15.08 1.18 0.674 0.68 40 1.60 29.22 1.46 0.694 0.92 60 1.78 42.25 1.63 0.714 1.09 80 1.90 52.95 1.72 0.724 1.19 lOO 2.00 65.95 1.82 0.734 1.32 150 2.18 92.86 1.97 0.754 1.52 200 2.30 117.3 2.07 0.754 1.66 250 2.40 138.9 2.14 0.764 1.76 500 2.70 223.1 2.35 0.803 2.00 1000 3.00 344.7 2.54 0.853 2.18 Grofito-teflón 199 3.0 2.5 - 2.0 - loa IP 1.5 - 1.0 - 0.5 — 0.0 0.0 ¡ , ¡ • ¡ 1.0 2.0 3.0 log y Figura 87 Variación del log i~ con log y, mediante 1.SV, empleando un electrodo de grafito-40% teflón. Disulfiram 5.OxlO’ mol 12’; H,P04V’HP04 2 0.1 mol 12’, pH 7.4; tj 300 s; E.~= 0.0 y. 2.4 ‘4 Cd E o E -i sc •4 o 2.0 - 1.6 - 1.2 - 0.8 - 0.4 - 0.0 0.01 0.10 1.00 10.00 y Figura 88 Variación de la función de contente, i,/Cv’~, con log y, mediante LSV, empleando un electrodo de gnfito-40% teflón. Disulflham 5.0x1O~6 mol 12’; H 2PO¿/1LP04 2 0.1 mol L~’, PH 7.4; tj 300 s; Ej 0.0 V. e e e ee e e e e e e e e 200 Resultadosy Discusión Las representacionesde log 1,, ftentea log y (Figuras 85 y 87) danlugar a líneas rectasde pendientepróxima a 1 para ambosfungicidas (0.89 paratiram y 0.93 paradisulfiram), comoes de esperarcuandoseproduceadsorcióndel analito sobrela superficiedel electrodo[198]. Además,el potencialdepico sedesplazaen amboscasoshaciavaloresmáspositivoscuandoaumentala velocidadde barrido (TablasIL y L), lo que sugiereuna fuerte adsorciónde los fungicidas sobre el electrodocompósito[199]. La variaciónde la funciónde corriente,ir/Cv 1/2 con la velocidaddebarrido, tambiénproporcionainformaciónsobrela naturalezade las señalesde oxidaciónde los fungicidas. Dicha función aumentarápidamenteal aumentarla velocidad de barrido de potencial para los dos compuestos(Figuras 86 y 88), siendo este comportamientotípico de los procesosen los que seproduceadsorcióndel analito sobre la superficiedel electrodo[170]. Todosestosdatosindicanquela fuerteadsorcióndetiram y disulfiramsobre la superficiedel electrodocompósitoesresponsablede las señalesde oxidacióntan intensasque se obtienenpara bajas concentracionesde los fungicidas mediante voltamperometríadebarridolineal. Laadsorciónsobreel electrododegrafito-teflón es muchomásacusadaquesobre los electrodosde pastade carbono,modificados o no, probablementecomo consecuenciade la existenciade cargaselectrostáticas superficialesen el electrododebidasa las partículasde teflón. La fuerteadsorciónde los fungicidasorigina tambiénun desplazamientode unos200 mV en el potencialde pico haciavaloresmenospositivos,respectoa las señalesde oxidaciónobtenidassobreun electrododepastade carbono(Figuras77 y 78), lo que contribuyea la mejorade la selectividadde las determinacionesde estoscompuestos. Grafito-teflón 201 111.4.2.4.-Curvas de calibrado y característicasanalíticas Empleandoun períodode preconcentraciónde 300 segundosa 0.0 V y utilizando la técnicaLSV con unavelocidadde barridode potencialde 50 mV s4, sehanobtenidorelacioneslinealesentrela intensidaddepico y la concentraciónde tiram y disulflram en los intervalosqueaparecenrecogidosen la TablaLI. En esta tablase recogentambiénlas característicasde los calibrados,cuyarepresentación gráfica se muestraen las Figuras 89-92. Tabla U Curvas de calibrado para tirana y disulfirana, medianteLSV, empleandoun electrodo de graflto-40%teflón. H~PO¿/HPO 4t0.1 molLt pH 7.4; tj 300 s;Ej 0.0 V; v 50mVst Fungicida Intervalo lineal. mol U’ Coeficientede correlación Pendiente, MA L mor’ Ordenadaen el origen, MA x10 8 l.Ox l0~-l .0x10~’ 0.9994 3.8+0.1 1.2+0.6 Tiram 2.Ox10’. 1 Ox ío~ 0.9990 4.7+0.2 -0.2+0.1 1.0x104-8.0x10’ 0.998 6.6+0.4 4+2 Oisulfiram 2.0x104-1.0x104 0.9997 10.1+0.2 0.1+0.1 202 Resultados y Discusión 0tlramní mcl 171 x 100 Figura 89 Influencia de la concentraciónde electrodo de grafito-40% teflón. H 2P041HP04 2 0.1 mol 121, pH 7 5.0 4.0 - 3.0 I~. pA 2.0 1.0 0.0 dram sobrela intensidad de pico, i~, en ISV, empleando un Intervalo de concentración: 1.0x10~ - 10.0x10~mol L~’; .4; tj 300 s; Ej 0.0 V; v 50 mV st Figura 90 Influencia de la concentraciónde tinmni sobrela intensidad de pico, i,, en ISV, empleando un electrodo de gmfito-40% teflón. Intervalo de concentración: 2.0x107 - 10.0x10~7 mol 12’; H 2PO4~/HPOft 0.1 mol ¡í, pH 7.4; tj 300 s; Ej 0.0 V; v= 50 mV s’. 1,. MA 40 30 - 20 - 10 - O 0 2 4 8 8 lO • 1 0 2 4 8 8 10 Ctjramí mal ~1 x Grafito-teflón 203 75 60 - 45 - I~ ¡¡A 30 - 15 - o CdjmuIflrmmí mal 171 xlO Figura 91 Influencia de la concentración de disulfinmm sobre la intensidad de pico, i~, en LSV, empleandoun electrodo de grafito-40%teflón. Intervalo de concentración:1.0x10~ - 1O.0x1O~ mol 12’; H2PO4JHPO4 2~ 0.1 mol 12’, pH 7.4; tj 300 s; Ej 0.0 y; v= 50 mV st 12.0 10.0 - 8.0 - ~ ¡¡A 8.0 4.0 - 2.0 - 0.0 Figura 92 Influencia de la concentración de dísulfiram sobre la intensidad de pico, i~, en 1.8V, empleandoun electrodo de grafito-40%teflón. Intervalo de concentración:2.0x107 - 1O.0x10’ mol 12’; H,PO 4~/KPO4 2 0.1 mol U, pH 7.4; tj 300 s; Ej 0.0 V; v 50 mV s~. e 0 2 4 6 8 10 0 2 10 CdIBUIflTA.. mal • ¡ • 4 8 8 ¡A x 204 Resultados y Discusión En amboscasos,la pendientede las curvasde calibrado es mayor en el intervalo deconcentracionesmáspequeñoconsiderado,comoesde esperarcuando tienen lugar procesosde adsorción dado que, a concentracionesmayores, se aproximael excesosuperficialde los fungicidasal estadode saturacion. La desviaciónde la linealidadque indica la saturaciónde la superficiedel electrodose produceparaconcentracionessuperioresa 1 .OxlO~’ mol L’ en el caso del tiram y a 8.0x106mol L~’ en el casodel disulfiram. Las característicasanalíticasde los métodosdesarrollados,empleandolas curvasde calibradode la TablaLI seresumenen la TablaLII. Los valoresde la desviaciónestándarrelativa obtenidospara 10 alícuotasde cadafungicida a dos niveles de concentración diferentes ponen de manifiesto que los métodos desarrolladosposeenunabuenaprecisión. TablaLII Caracteristicas analíticas de los métodos desanollados para la detemuinación de dram y disulfimm, mediante LSV y pwconcentmción,empleando un electrodo de gnfito-40% teflón. H 2PO¿/HPOft 0.1 mol L’, pH 7.4; tj 300 5; Ej 0.0 V; v 50 mV s’. Fungicida RSD, % Limite de determinación,mol L 4 Límite de detección,mol U’ Tiram 2.Oa 58b 1.8x10 7 5,4x10~8 Disulfiram 2. 7~ 6.5x108 2.OxlO.8 a) Nivel de concentración:5.0x106 mol U’ (n=10) 1,) Nivel de concentración:3.0x107mol 12’ (n10) Grofito-teflón 205 Los criteriosparaevaluarlos límitesde determinacióny dedetecciónde los métodosson los que se definieronen el Apartado111.1.5. Se ha tomado,en esta ocasión,comoestimadorde la desviaciónestándardelblanco,la calculadaparauna concentración3.0x107mol U’ de cadafungicida. Es de destacarque los límites de determinacióny de detecciónde los métodos desarrolladas, empleando voltamperometría de barrido lineal y preconcentración,son similaresen el casodel tiramy algomenoresenel casodel disulfiramquelos obtenidos,medianteDPV, conlos electrodosdepastadecarbono modificadoscon ftalocianinade cobaltodesarrolladosen el capítula111.1 de esta Memoria. Es necesariomencionarahoraquelas medidasllevadasa caboparaambos fungicidasempleandovoltamperometríadiferencialde impulsos(DPV) y de onda cuadrada(SWV) trasla etapade preconcentracióñ,no oftecieronningunaventaja respectoa la utilización de LSV, por lo que se escogió esta técnicapara la caracterizaciónde los electrodosy el desarrollode los métodosde análisis. 111.4.2.5.-Estudiode intedeitnciss En este apartadose ha estudiado,al igual que se hizo en el capítulo correspondientea la determinación de estos fungicidas con los electrodos modificadosdepastadecarbono,el efectoproducidopor la presenciade diferentes sustanciasquepuedenencontrarsejunto con estosfungicidasen diferentestipos de muestrascomo por ejemploaguas,sobrelas seflalesde oxidacióndel dramy del disulflram, aun nivel de concentraciónde 1 .0x10~mol L’, empleandoel electrodo compósitode gratito-40%teflón y utilizando un períodode acumulaciónde 300 segundosa 0.0 V. En el caso del de tiram, los compuestosensayadoscomo potencialesinterferenteshansidodisulfiram,ziram,fenoly Zn(II), mientrasquepor lo que se refiere al disulfiram, dichos interferentes fueron tiram, ziram, fenol y Zn(U). En las condiciones experimentales utilizadas, puede observarse un pico de oxidación a 0.698 V para el ziram en concentración 1 .OXIO.~ mol L”. Sin embargo, una concentración de este fungicida de 1.0x10-’ mol L-r no da lugar a una señal analítica apreciable. La señal de oxidación del fenol aparece a 0.560 V, aunque sólo se obtiene un pico bien definido para una concentración 5.0~10.~ mol L’ o superior (Figura 93). Obviamente, el Zn(H) no presenta ninguna señal de oxidación en el intervalo de potenciales barrido 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 E. V Figura 93 Voltampemgmmas, en KW, de: ( - ) fenol 5.0~10.~ mol L’, ( - ) dhdfitam 1.0~10~~ mol L’, ( - ) timm 1.0~10-~ mal L’, ( ) zimm 1.0 ~10~’ mol Z;‘, ( - ) zimm 1.0~10.~ mol Ll’, empleando un electrodo de grafito-40”hteflón; H,PO,~/HPO,’ 0.1 mol Ll’, pH 7.4; t= 300 s; Ex= 0.0 V; v= 50 mV s.‘. Grafito-teflón 207 Dadala proximidadde las señalesde oxidaciónque seobtienenparatiram, ziramy disulfiram, los voltamperogramasdemezclasbinariasde estosfungicidas presentaronun solopicoglobalde oxidación.Por el contrario,los voltamperogramas de las mezclasde tiram confenol y de disulflram con fenol mostrarondos señales separadas,como se observaen las Figuras94 y 95. Con objeto de establecerel grado de interferenciade cada compuesto ensayado,seregistraronlos voltamperograinasdedisolucionesdetirain o disulfiram I.OxIXY6 mol L’ y concentracionesvariables del compuesto interferente. Los resultadosseresumenen las TablasLIII y LIV. 25 20 15 1. ¡¿A 10 5 o Figura 94 Voltamperogramas, en LSV, de ( ) tinun t.0xt0~6 mal U’, ( ) fenol 5.0~10~nial 12’ (—) mezcla de dram 1.0x10~ mol U’ y fenol 5.0~10-~ mol 12’, sobm un electrodo de gmfito-40% teflón. H 2PO4JIIPO4 2~ 0.1 mal 12’, pH 7.4; tj 300 s; Ej 0.0 V; v 50 mV &‘. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 E, Y 208 Resultados y Discusión 45 30 1, ¡¡A 15 O 0.0 0.2 0.4 0.6 E, Y Figura 95 Voltaniperogramas, en 15V, de ( ) disulfimm 1.OxlO’ muí L’, (•••••-) fenol s.o~io~5mcl 1.’, <—) mezclade disulfinm 1.0x106mol U’ y fenol 5.OxlO5 mol Lt sobre un electrodo de gmafito-40% teflón. H 2PO4/HPO.¿0.1 mol 12’, pH 7.4; t~= 300 s; Ej 0.0 V; v 50 mV .15. Puestoquela corrientedeoxidacióndel disulfiramesbastantemayorquela del tiram (Figura93), la interferenciadeldisulfiram sobrela señaldeoxidacióndel tiram es másacusadaqueal contrario. Comopuedeverseen las TablasLIII y LIV, paraunarelacióndisulfiram:tiram0.2:1,el error relativoenlamedidade la corriente de pico parael tiram essuperioral 10%, superandodicho error el 100% cuandola relacióndeconcentracioneses 1:1. Sin embargo,paraunarelacióntiram:disulfiram 0.2:1, el error relativo de la medida de i~, para el disulfiram es menor del 10%, mientrasque con unarelación 1:1, dicho error es del 45%. Por lo que respectaal ziram, su señalde oxidación es considerablemente menorquela de tiram o disulflram al mismonivel de concentración(Figura93) y, por consiguiente,su presenciasólo afectasignificativamentea la medidade i, a partir de las relaciones ziram:tiram 1:1 y ziram:disulfiram 5:1 o superior, respectivamente. 0.6 1.0 Grajito-tejlón 209 Tabla LIII Influenciade lapresenciadediversassustanciassobrela intensidaddepicoobtenidamediante LSV, para tiram 1.Ox)P0¿/HP04 2 0.1 mo! IP, pH 7.4. Volumende inyecciórn250pL. E +1.0 1-’. Caudal, mL mm1 í,,, 1.uA 17, s At, s 0.23 0.29 52 83 0.43 0.47 31 48 0.64 0.60 21 33 0.87 0.69 17 23 1.11 0.77 13 19 1.32 0.91 11 16 1.50 1.01 9 15 1.71 1.08 7 14 1.92 1.10 6 11 2.14 1.17 6 10 220 Resultados y Discusión Tabla LVII Influencia delcaudal dela disoluciónportadorasobrela intensidad,4, eltiempoderesidencia, T, y la anchura, ¿It, de la señal obtenida mediante inyección en flujo con detección amperomdtr¡caempleandoun electrodocompósitodegrafito-40% teflón. Disulfiram 5.Cxl ¿16 mo! 12 en medioH2PO¿/HP04 2 0.1 mo! it, pH 7.4. Volumendeinyección:250pL. E= +1.0 y. Caudal,mL mm’ 1r 17, s At, s 0.38 0.40 30 45 0.58 0.55 23 28 0.78 0.60 17 23 1.00 0.70 14 19 1.22 0.72 12 15 1.45 0.78 10 13 1.64 0.86 8 11 1.89 0.84 7 8 2.00 0.86 7 8 2.20 0.83 6 8 Grafito-teflón 221 1.4 1.0 - 0.6 - 0.2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Caudal. mL m1n1 Figura99 Influencia del caudal de la disolución portadora sobre la intensidad de pico, i,,, de dram 5.0x10’ mol L-’ en medio HZPO¿/HPOt 0.1 mol U’ de pH 7.4, mediante análisis por inyección en flujo empleando como electwdo indicadorunelectindo compósito de grafito-40% teflón. V 1~ 250 ~iL;E= +1.0 V. 60 50 - 40 - T, a 30 - 20 - 10 - o ¡ ¡ ¡ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Caudal, mL mlrf t Figura 100 Influencia del caudal de la disolución portadora sobre el tiempo de residencia, T, de dram 5.OxlO’ mol 12’ en medio H 2PO¿/HP04 2 0.1 mol Ti’ de pH 7.4, mediante análisis por inyección en flujo empleando como electwdo indicador un electndo compósito de grafito-40% teflón. V 1~~ 250 pL; E= +1.0 y. I~, ¡iA e e. e e e e e e e 2.5 e e e e e e e e e 2.5 222 Resultados y Discusión 80 80 - 40 - 20 - ¡ ¡ ¡ ¡ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 CaudaI• ml m1n1 Figura 101 Influencia del caudal de la disolución portadora sobre la anchura de pico, ANt, de dram 5.0x10’ mol Ti’ en medio H 2PO4YHiPO4 2 0.1 mol U’ de pH 7.4, mediante análisis por inyección en flujo empleando como electrodo indicadorun electrodo conupósito de grafito-40%teflón. V 1j 250 pL E= +1.0 V. 1.0 0.8 - 1,, ¡¿A 0.6 - 0.4 - 0.2 1 ¡ ¡ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Caudal, mL m1n 1 Figura 102 Influencia del caudal de la disolución portadora sobre la intensidad de pico, ii,, de disulfiram 5.0110.6 mol U’ en medio H,PO¿/HPOft 0.1 mol L4 de pH 7.4, mediante análisis por inyección en flujo empleando como electrodo indicadorun electrodo compósito de grafito-40% teflón. V~,,= 250 pL E= +1.0 V. At, a e e e e e e.. e e o 2.5 e ~ e e e e e e Grafito-teflón 223 35 30 25 T, £ 20 15 - 10 - 5 ¡ 1 1 ¡ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Caudal, mL mu0 Figura 103 Influencia del caudal de la disolución portadora sobre el tiempo de residencia, T, de disulfiram 5.OxlO’ mol U’ en medio H,PO¿/HP0 4 2 0.1 mol U’ de pH 7.4, mediante análisis por inyección en flujo empleando como electrodo indicador un electrodo compósito de grafito-40% teflón. V 1,~,= 250 $14 E= +1.0 V. 50 40 - 30 - ¿ti a 20 - 10 - o ¡ ¡ ¡ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Caudal. mL mV 1 Figura 104 Influencia del caudal de la disolución portadora sobre la anchura de pico, At, de disulfiram 5.0110’ mol U’ en medio H,PW/HPO,2 0.1 mol U’ de pH 7.4, mediante análisis por inyección en flujo empleando como electrodo indicador un electrodo compósito de grafito-40% teflón. Vg 250 pL E= +1.0 y. e e e e e e e ~ e e e e e e e e ee e 224 Resultados y Discusión La influenciadelvolumen deinyecciónsehaensayadoutilizando buclesde 150,250, 350,650y 1150 pL. Los resultadosobtenidosse muestranen lasTablas LVIII y LIX. A modo de ejemplo, en la Figura 105 se han representadolos flagramasobtenidoscuando se inyectan volúmenesdiferentesde una disolución patrón de tiram 5.0x106mol ~ Al aumentarel volumen de muestrainyectado, aumentala intensidadde pico pero tambiénla anchuray el tiempo de residencia. Como compromiso entre una buena sensibilidad y una elevada capacidadde muestreo,se ha escogidoun volumen de inyecciónde 250 1.aL tanto parael dram comoparael disulfiram. En estascondicionesexperimentalesy utilizando un tubo de teflón de 90 cm x 0.3 mm de diámetrointerno, sepuedenanalizar15 muestras por hora realizandolas inyeccionespor triplicado. 2 1.5 i,pA 1— 0.5 - o Figura 105 Influencia del volumen de inyección sobre las señales obtenidas para dram 5.0x10~ mol U’ en medio 112P0.¿J1W04 1 0.1 mol U’ de pH 7.4, empleando como electrodo indicador un electrodo compésito de grafito-teflón. (1) 150 ¡‘14 (2) 250 gL <3) 350 ¡‘1.4 (4) 650 ¡‘14 <5) 1150 pL Caudal: 1.9 mL mi&; E= +1.0 V. 4 5 m o 120 240 380 t. $ Grafito-teflón 225 Tabla LVIII Influenciadel volumende inyecciónsobrela in.tensida44, el tiempode residencia,T, y la anchura,¿It, de la señalobtenidamedianteinyecciónenflujo con detecciónamnperométrica empleandoun electrodocompósitode grafito-40% teflón. Tiram 5.Oxl¿y6 mo! ¡A en medio H2PO¿/HP04 20.1 mo!L’, pH 74. Caudal: 1.9 mL miii’. E +1.0 V. y,,,,,, ~.¡L ¡~» ~.iA 17, s 150 0.77 8 7 250 1.00 10 10 350 1.09 13 12 650 1.29 18 20 1150 1.31 28 36 Tabla LIX Influenciadel volumende inyecciónsobrela intensidad,4, el tiempo de residencia,T, y la anchura, ~It,de la señalobtenidamedianteinyecciónenflujo condetecciónamperométrica empleandoun electrodocompósitode grafito-40% teflón. Disulfirant 5.0x1tT6mo! E’ en medioH 2PQ/HP04 2 0.1 mo! ¡A, pH 74. Caudal:1.9 mL miii’. E= +1.0 V. V,,,~,, ¡L ¡~, ~.tA T, s ¿Nt, s 150 0.70 9 7 250 0.79 11 10 350 0.80 15 13 650 0.95 21 23 1150 0.94 33 41 226 Resultadosy Discusión HLS.1.4.- Curvasde calibradoy característicasanalíticas En la Tabla LX se resumenlas característicasanalíticasde los calibrados obtenidosparatiraniy disulflram,los cualessehanrepresentadográficamenteenlas Figuras 106 a 111. A modode ejemplo, en las Figuras 112 y 113 semuestranlos flagramas obtenidos para los calibrados en el intervalo de concentraciones intermedio. Tabla LX Características analíticas de los calibrados obtenidospara la determinación de tiram y disulfirammedianteinyecciónenflujo condetecciónwnperométricaempleandoun electrodo compósitodegrafito-40%teflón. H2PO¿/HP04 2 0.1 mol L~’, pH 74; caudal:1.9 mL min-1; V&250~uL;E=+1.0V. Intervalo lineal, mol U’ Coeficiente de correlación Pendiente, ¡‘A L mo¡’ Ordenadaen el origen, ¡‘A L. detemdnación, mol L~’ L. detección, mol U’ RSD, % TIRAM 0.998 (1.9±0.1)x105 -0.001+0.006 0.9992 (1.64+O.05)xlO’ 0.08±0.03 1.4x10~7 4.3x104 2.V 77b 1.0x10 5-4.0x10~’ 0.99995 (l.24±O.04)x10’ 0.3+0.1 DISULFIRAM Intervalo lineal, mol L’ Coeficiente de correlación Pendiente, ¡‘A L mol’ Ordenada en el origen, ¡‘A L. detenninación, mol U’ 1.Ox 104-10.0x10’ 0.9995 (1.24+0.03)xIO’ 0.0016+0.002 L. detección, mol L’ RSD, % 1.Ox IOtIO.0x106 0.9994 (1.46±0.04)xlO’ 0.09+0.03 6.7x104 2.0x104 4.1’ 57b 1.0x10’-4.OxIW’ 0.9990 (I.3+0.2)x10 5 0.6+0.58 Nivel de cancentración5.0x10~ mal L’, b nivel de concentración1.0x10~’ mal U’ Grafito-teflón 227 La desviación de la linearidad se produce, en ambos casos, para concentracionesde fungicidamayoresde4.0x105mol L’, comoconsecuenciade la adsorciónsobre la superficie del electrodo.Los valores de desviaciónestándar relativa se han calculadoa partir de la medidade diez disolucionesdiferentesde cada fungicida a dos niveles de concentracióndistintos, realizando siempre inyeccionesportriplicado. Loslímitesdedetenninacióny dedetecciónqueaparecen en la Tabla LX se han calculadosegúnlos criterios lOs y 3s~,/m definidos en el Apartado111.1.5y utilizandola desviaciónestándarde lasseñalesparal.0x107mol L’ de cadauno de los fUngicidas como estimadorde la desviaciónestándardel blanco. Los valores de los límites de determinacióny de detecciónson muy parecidosa los obtenidosenlos experimentosendiscontinuoempleandoun periodo de preconcentraciónde 300 segundosa 0.0 V. 12- 9 8 3- o. 0 2 4 0ttram. Figura 106 Influencia de la concentración de dram sobre la intensidad de pico, i~, mediante inyección en flujo con detección amperométrica empleando un electrodo de grafito-40% teflón. Intervalo de concentración: i.0xiI0~5 a io.oxt<0 mol L’; H 2PO¡/1W04 2 0.1 mol 12’, pH 7.4; caudal: 1.9 mL min’; V 11= 250 ¡‘Ti, E= +1.0 V. ee e ¡ ¡ ¡ 6 8 lO mal [71 xlaa 228 Resultadosy Discusión 2.0 1.8 - 1.2 1,, ¡¿A 0.8 0.4 0.0 cu,... mal ¡71 x10~ Figura107 Influencia de la concentnción de dram sobre la intensidad de pico, i~, mediante inyección en flujo con detección ampenmétilca empleando un electiedo de grafito-40% teflón. Intervalo de concentración: 1.0x10~ a 10.0x10~’ mol U’; H2PO¿/HPO4 2~ 0.1 mol U’, pH 7.4; caudal: 1.9 mL ruin’; V 10~ 250 ¡‘L, E= +1.0 V. 0.20 - 0.15 — Ii,. ¡¿A 0.10 — 0.06 - 0.00 Figura 108 Influencia de la concentración de dram sobre la intensidad de pico, ii,, mediante inyección en flujo con detección ampemmétiica empleando un electftdo de grafito-40% teflón. Intervalo de concentración: i.o~io~~ a 10.0x10 4 mol U’; H,P0 41HP04 2 0.1 mol U’, pH 7.4; caudal: 1.9 mL muí’; V 1~= 250 pL, E= +1.0 V. ¡ • ¡ • ¡ • 1 ¡ 0 2 4 5 8 10 e ¡ ¡ ¡ ¡ 0 2 4 5 8 10 Ct¡ram, mal ¡71 xl a-’ Grafito-teflón 229 10.0 8.0 8.0 I~, ¡¿A 4.0 2.0 0.0 0 2 4 6 8 0dIiuIflram. mal [71 x10~ Figura109 Influencia de la concentración de disulfirmn sobre la intensidad de pico, ii,, mediante inyección en flujo con detección ampewmét¡íca empleando un electindo de grafito-40% teflón. Intervalo de concentración: 1.0x10~ a 10.0x105 mal U’; H 2P041HP04 2 0.1 mol L’, pH 7.4; caudal: 1.9 mL min’; V~»~= 250 pL, Fr +1.0 V. 1.8 - 1.2 - I~, ¡¿A 0.8 - 0.4 - 0.0 ¡ ¡ ¡ 0 2 4 8 8 10 CdIau¡f¡ram. mal L1 xlO Figura 110 Influencia de la concentración de disulfiram sobre la intensidad de pico, i~, mediante inyección en flujo con detección ampemmétrica empleando un electrodo de grafito-40 % teflón. Intervalo de concentración: 1.0x106 a 10.0x10’ mol U’; H,P0 41HP04 2 0.1 mal L-’, pH 7.4; caudal: 1.9 mL mm’; v 11,~,= 250 ¡‘L, Fr +1.0 V. 10 230 Resultadosy Discusión 0.15 0.10 I~ ¡¿A 0.05 0.00 0d¡aulflram’ mal [71 x107 Figura 111 Influencia de la concentración de disulfiram sobre la intensidad de pico, ii,, mediante inyección en flujo con detección ampenmétilca empleando un electrodo de gnfito-40% teflón. Intervalo de concentración: 1.0x104 a 10.0x107 mol U’; H,P0 4-/IH>04 2- 0.1 mol U’, pH 7.4; caudal: 1.9 mL mm-’; V 1~,3,= 250 ¡‘L, Fr +1.0 V. 1000 1500 2000 2500 t. £ Figura 112 Fiagrama obtenido por inyección de disoluciones <1) 1.0; (2) 2.0; (3) 3.0; (4) 4.0; (5) 5.0; (6) 6.0; (7) 7.0; (8) 8.0; (9) 9.0; (10) 10.0 x 10’ mol U’ de tirain en medio H2P04/HP04 2- 0.1 mol 12, pH 7.4, mediante inyección en flujo con detección amperométrica empleando un electrodo de grafito-40% teflón. Caudal: 1.9 mL mm’; V 1J 250 pL, Fr +1.0 V. 0 2 4 6 8 10 2.0 1 .6 1.2 i, ¡¿A 0.8 0.4 0.0 0 500 Grafito-teflón 231 0 1000 2000 3000 t¡ s 2.0 1.6 1.2 , pA 0.8 0.4 0.0 Figura 113 Fisgrama obtenido por inyección de disoluciones (1) 1.0; (2) 2.0; (3) 3.0; (4) 4.0; (5) 5.0; (6) 6.0; (7) 7.0; (8) LO; (9) 9.0; (10) 10.0 x 10’ mol U’ de disulfiram en medio H2P0471W04 2 0.1 mol ¡2, pH 7.4, mediante inyección en flujo con detección amperométrica empleando un electrodo de grafito-40% teflón. Caudal: 1.9 mL miii’; V 1.~= 250 pL, Fr +1.0 V. 111.5.1.1.- Estudio de interferencias La señalamperométricade tiran> o disulfiram puedeverseafectadapor la presenciade ciertassustanciasquecoexistancon el fungicidaen la muestra.Así, se ha estudiadoel gradode interferenciaproducidapor el disulfiram sobrela señalde oxidación del tiran> y viceversa, as¡ como la influencia de ziran> (N,N’- dimetilditiocarbamatode zinc), fenol y Zn(II) sobre las señalesde oxidación de ambosfungicidas. En las condicionesexperimentalesutilizadasparala detecciónde tirain y disulfiran>, tanto el ziram como el fenol dan lugar a señalesde oxidación bien definidasenFíA cuandoseinyectanaunnivel de concentraciónde 1.0x10 6mol U’ (Figura 114), siendola alturade pico parael ziram mayor quela del fenol. Porel contrario,comoerade esperar,el Zn(II) no mostróningunarespuestaal potencial aplicado. 232 Resultadosy Discusión 50 nAt~~ 1 2 100 s 4 Figura 114 Fiagramas obtenidos por inyección de 1.0x10’ mol U’ de: (1) tinun, (2) disulfinm, (3) ziram, (4) fenol y (5) Zn(ll), empleando como electrodo indicador un electrodo compósito de grafito- 40%teflón. R2P041H1204 20.1 niel U’, pH ‘7.4, caudal: 1.9 mL miii’; V 1~,,= 250 pL, Fr +1.0 V. En las TablasLXI y LXII se recogenlos valores de la intensidadde pico obtenidaa+1.0 V cuandosemezclantiram o disulfiram a un nivel de concentración de 1 .Oxl¡Y 6 mol L’ con concentracionesvariablesdel compuestointerferente.A excepcióndel Zn(II), que no interfiere inclusocuandola relaciónZn(IJ):fiingicida es 50:1, todaslas demássustanciasincrementanla señal de oxidación de tiran> o disulfiran> másde un 10%incluso cuandola relacióninterferenteanalitoesmenor de 1:1. El problemaoriginadopor los compuestosinterferentesen la determinación encontinuodetiram odisulflramponede manifiestola necesidaddeunaseparación cromatográficaprevia cuandose trabajacon una mezclade estoscompuestos.El hechode que las sustanciasensayadasinterfieranen las medidasde inyecciónen Grafito-teflón 233 flujo del tiran> o deldisulfiram, puedetransformarseenunaimportanteventajapara llevar a cabola detecciónamperométricade estosfungicidastras dicha separación cromatográficay así,comoseveráenel capítulo111.5.2,la respuestaamperométrica observadaparatodos los compuestosorgánicosensayadospermitirá su detección electroquímicasobrelos electrodoscompósitosde grafito-teflón. Tabla LXI Influencia de la presenciade diversassustanciassobre la intensidadde pico, 4, obtenida medianteinyecciónenflujo, de dram1.0x10’ mo! E’ enmedioH2PO47HPO/~0.1 mol L’, pH 74, empleandocomoelectrodoindicadorun electrodocompósitodegrafito-40% teflón. Caudal: 1.9 mL miii’; V,j 250 pL, E +1.0 7< Relación interferente:tiram ii,, ~iA Sustanciainterferente Disulfiram Ziram Fenol Zn(II) 0:1 0.2:1 0.4:1 0.6:1 0.8:1 1:1 2:1 10:1 50:1 0.32 0.34 0.34 0.37 (15) 0.41 (28) 0.46 (44) - - - 0.31 0.33 0.34 0.37 (15) 0.41 (28) 0.46 (44) - - - 0.30 0.30 0.30 0.29 0.30 0.33 (10) 0.37 (23) - - 0.30 - - - - 0.29 0.29 0.30 0.29 En estaTabla, los valoresentreparéntesisrepresentanel %, de la medidade la intensidadde pico de tiran>. error relativo, en 234 Resultadosy Discusión TablaLXII Influencia de la presenciade diversassustanciassobre la intensidadde pico, 4, obtenida medianteinyecciónenflujo, de disulfirana 1.OxlttmolE’ enmedioI-4P0¿/HPO./-0.1 mo! L’, pH 74, empleandocomo electrodo indicador un electrodocompósitode grafito-40% teflón. Caudal: 1.9 mL miii’; V& 250tuL, E= +1.0 V. Relación rnterferente:d¡sulfiram ¡,, jiA Sustanciainterferente ‘[¡ram Ziram Fenol Zn(II) 0:1 0.2:1 0.4:1 0.6:1 0.8:1 1:1 2:1 10:1 50:1 0.23 0.24 0.25 0.29 (26) 0.33 (43) 0.37 (61) - - - 0.23 0.27 (17) 0.29 (26) 0.30 (30) 0.37 (61) 0.41 (78) - - - 0.22 0.21 0.27(22) 0.28 (27) 0.30 (36) 0.32 (45) - - - 0.22 - - - - 0.21 0.23 0.23 0.21 En estaTabla, los valoresentreparéntesisrepresentanel error relativo, en %, de la medidade la intensidadde pico de tiram. Grafito-teflón 235 111.5.1.6.- Determinación de dram en aguade grifo y aguade pozo La metodologíadesarrolladase ha aplicadomedianteinyecciónen flujo a la determinaciónde tiram enaguasde grifo y depozocontaminadascon 40 ¡ig U’ defungicida.El procedimientoexperimentalutilizadosehadetalladoenel Apartado 11.3.3.5.Lapropiadisoluciónportadorasehaempleadopararedisolverel residuodel extractode fungicida llevadoa sequedad,por lo que,en estecaso,estáconstituida por reguladorfosfato 0.1 mol L’ depH 7.4 y un 2% (y/y) demetanolquepermite llevar a cabo dicha disolución. Siguiendo el procedimiento mencionado, la concentraciónfinal de tiran> en la disoluciónanalíticaes de 2.0 mg U’. A partir deadicionesde alícuotasde la disoluciónpatróndetiran> ablancos deambostipos deaguas,sometidosal mismotratamientodescritoparalasmuestras, sehanconstruidocurvasdecalibradoen el intervalo de 10 a 80 jxg L’. Parael agua degrifo, seobtuvoun coeficientede correlaciónde 0.9990,siendolos valoresde la pendientey de la ordenadaenel origende0.43±0.04gA L jxg1 (lo quecorresponde a (l.04±0.09)x105jiA L moV’) y -0.02±0.09 1.¿A, respectivamente.En el casodel aguade pozo,el coeficientede correlaciónfue 0.994y los valoresde lapendiente y la ordenadaen el origen fueron0.5+0.1kA L j.±g’[(1.3±0.2)xlO’ 1.¡A L mol 4] y -0. 1±0.3gA, respectivamente. La determinaciónde tiram en la muestracontaminadase ha llevadoa cabo por interpolaciónen el calibradomencionadoanteriormentecorrespondiente.Los resultadosobtenidosse recogen en la Tabla LXIII. Para cadamuestra se han realizadocincodeterminaciones,obteniéndoseunarecuperaciónmediade 103±6% (41±3j.tg L’ de tiran>) en el aguade grifo y de 97±7% (39+3 ~igL’ de tiran>) en el aguade pozo, estandolos intervalosde confianzacalculadospara un nivel de significaciónde 0.05. Estosvaloresderecuperaciónpróximosal 100%indicanque el métododesarrolladoesapropiadoparala determinaciónde tiran> en estetipo de aguas. 236 Resultados y Discusión Tabla LXIII Determinaciónde tiramn enmuestrede aguat contwninadavcon 40 pg L’ detirana mediante inyecciónenflujo con detecciónwnperom’rica, empleandocomo electrodo indicador un electrododegrafito-40%teflón. H>PO¿/11P04 2 0.1 molE’, pH 7.4, 2%metanoly/y; caudal: 1.9 mL ,nin’; Vg 250 uL, E +1.0 1’. Grafito-teflón 237 111.5.1.7.-Preconcentraciónpor adsorción en disoluciones en flujo de los fungicidas Sehainvestigadolaposibilidaddeaprovechar,encontinuo,lacapacidadque poseentanto el tiram como el disulfiram de adsorbersesobre la superficiede los electrodoscompósitosde grafito-teflón, la cual ha sido comentaday empleadacon fines cuantitativosendiscontinuo(capítulo111.4.2).Así, sehaintentadomejorarlas característicasanalíticas de la determinaciónen flujo de tiram y disulfiran>, principalmentepor lo queserefierea la selectividad,adaptandoaesteproblemala metodologíapropuestapor Wang y Freiha [200]. Estametodologíaconstade tres etapas:1) preconcentracióndel analitosobre la superficiedel electrodo,haciendo circularpor todo el sistemaFíA unadisolucióndel fungicida duranteun períodode tiempo determinado;2) cuantificación medianteun barrido anódico lineal de potencial;3) regeneraciónelectroquímicade la superficiedel electrodo,preparando el sistemaparael siguienteexperimento. Durantela etapade preconcentración,el electrodocompósitose mantuvoa un potencialde0.0 V, queesel potencialutilizado parallevar acabola acumulación en discontinuo(Apartado111.4.2). IH.5.l.7.1.- Repetibilidadde los voltamperogrwnas En laFigura115 (a) semuestrael voltamperogramaobtenidocuandosebarre linealmenteel potencialentre1-0.5 y + 1.2 V a 50 mV st despuésdehacerpasarpor la célula de flujo unadisoluciónde tiram S.0x106mol U’ en reguladorfosfato 0.1 mol U’ de pH 7.4 durante3 minutos. Despuésde cadamedida, la superficiedel electrodode grafito-teflón se limpió haciendocircular por la célula de flujo la disoluciónportadorade reguladorfosfatoy aplicandounpotencialde - 1.2 V durante 30 segundos(Apartado11.3.3.6).En la Figura 115, el voltamperograma(b) es el 238 Resultadosy Discusión correspondienteal fondo, obtenido cuando circula por el sistemala disolución reguladoradefosfatodespuésdelaregeneraciónelectroquímicade la superficiedel electrodoy el marcadocomo (c) es el voltamperogramaobtenidoparala misma disoluciónde tiran> queen (a) cuandoseharepetidoel procedimientodescritopor décima vez consecutiva.En la Figura 116 se muestranlos voltamperograinas obtenidospara 10 medidassucesivasde unadisolución de disulflram 5.0x106mol U’ empleandoun tiempo de preconcentraciónde 5 minutos. 20 16 12 1. yA a 4 a 0.4 Figura 115 Voltamperograznas de barrido lineal registrados tas hacer circular por la célula de flujo una disolución de dram 5.0x10’ mol U’ en medio H 2PO~¿/HPO4 2 0.1 mol U’, pH 7.4, durante 3 minutos: (a) primer barrido, (b) voltamperograna del fondo, (c) décimo barrido consecutivo. Caudal: 2.7 mL mint velocidad de banido: 50 mV s’; EM = 0.0 y. Las corrientesdepicosemidierontrazandola líneabasedevalle avalle. Los valoresde la desviaciónestándarrelativaobtenidosparalas medidasde i~, fueron 1.1% y 1.5%, paratiram y disulfiram, respectivamente,lo que demuestrala buena repetibilidaddel métododesarrolladoy, por tanto, la bondadde estametodología para ser aplicadaa la monitorización en continuo de estos fungicidas tras su preconcentraciónpor adsorción. 0.8 0.8 1.0 1.2 E. V Grafito-teflón 239 20 IB 12 1. yA 8 4 0 0.4 1.2 Figura 116 Voltampei~gramas de barrido lineal registrados tras hacer ciftular por la célula de flujo, 10 veces consecutivas, una disolución de disulflram 5.0x10’ mol U’ en medio H2PO.¿1HP04 2- 0.1 mol U’, pH 7.4, durante 5 minutos. Caudal: 2.7 mL mm’; velocidad de barrido: 50 mV s’; E~=0.0 y. ( ) Voltampemgrama del fondo. 111.5.1.7.2.- Influenciadelcaudal Sehaestudiadola influenciadelcaudalal quecirculala disoluciónanalítica sobre la intensidadde pico para disolucionesde fungicida 5.0x106 mol LI Los resultadosserecogenen lasTablasLXIV y LXV y sehanrepresentadoen la Figura 117. A modo de ejemplo, en la Figura 118 se muestranlos voltamperogramas obtenidosen el casodel disulfiram. Seobservacomo,enamboscasos,la corrientedepico aumentaconel caudal entre 0.6 y 2.7 mL mm’, permaneciendoprácticamenteconstanteparavalores superiores.En consecuencia,se escogió un caudal de 2.7 mL mm’ para los experimentossubsiguientes. 0.8 0.8 1.0 E, V 240 Resultadosy Discusión Tabla LXIV Influenciadelcaudal de la disoluciónanalíticasobrela intensidaddepicoobtenida,mediante LSV, tras la preconcentraciónpor adsorciónen continuodedram 5.Ox)0.6 mol E’ enmedio H2PO¿/HPO2-0.1 molL’, pH 74. Tiempodepasodela disoluciónanalíticaporel sistema.~ 5 minutos;Er 0.0 y; v 50 mVst Caudal,mL miiV’ ¡» ¡tA 0.6 3.26 1.0 4.15 1.5 4.75 1.9 5.06 2.2 5.32 2.7 5.54 3.0 5.37 Tabla LXV Influenciadel caudalde la disoluciónanalíticasobrela intensidaddepico obtenida,mediante LSV, tras la preconcentraciónpor adsorciónen continuo de disulfirana 5.Oxl0. 6mol L’ en medioH,PO¿/HPOf0.1 mol E’, pH 74. Tiempodepasode la disoluciónanalíticapor el sistema-5 minutos;E« 0.0 V; v 50 mVs& Grafito-te/hin 241 1 ¡ ¡ 0.5 1.0 1.5 Caudal, 2.0 2.5 mL mIn’ Figura 117 Influencia del caudal de la disolución analítica sobre la intensidad de pico obtenida, mediante LSV, tras la preconcentración por adso¡rión en continuo de 5.OxlO’ mol U’ (e) dram y (O) disulfiram, en medio H,P04/HP02 0.1 mol U’ de pH 7.4; Ej +1.0 y; tjS mio; v 50 mV .15. 0.50 0.70 0.90 E, y Figura 118 Influencia del caudal sobre los voltamperogranias obtenidos para disulfinni 5.OxlO’ mol L’, mediante LSV, tras la preconcentnción por adsorción en continuo del fungicida, en medio H2P04/HP04 2- 0.1 mol U’ de pH 1.4. Caudal: (1) 0.56, (2) 1.00, (3) 1.45, (4) 1.89, (5) 2.72 mL mm’; E~= +1.0 V, tj 5 mm; velocidad de banido: 50 mV st 8 6- I~, ¡¿A 4- 2 0.0 00 o o • eo e e o e e 3.0 3.5 20 le 12 • ¡¿A 8 4 o 1.10 1.30 242 Resultados y Discusión 111.5.1.7.3.-Influencia del tiempodepasode las disolucionesde los fungicidas La variación de la corrientede pico con el tiempo de preconcentración,es decir, con el tiempo de pasode la disoluciónde fungicidapor el sistemaFíA, se examinóparados nivelesde concentracióndiferentes:5.OxlW6 y 5.0x107mol U’. Los resultadosserecogenenlas TablasLXVI y LXVII y serepresentanenlaFigura 119. Paraunaconcentración5.0x106mol L’ defungicida seobservaun aumento de la intensidadde pico con el tiempo de acumulación,muy acusadopara los períodoscortos,pero pocosignificativoparatiempossuperioresa 5 minutos. Para el nivel deconcentraciónmásbajo, lacorrientepermaneceprácticamenteconstante paraperíodosde acumulaciónsuperioresa 3 y 4 minutos,paratiran> y disulfiran>, respectivamente. Tabla LXVI Efectodel tiempode acunudadónsobrela intensidaddepico obtenida,medianteLSV, tras la preconcentraciónpor adsorciónen continuode tirana enmedioH 2PO;/HP<)f 0.1 molE’, pH 74; E,~= 0.0 V; caudal:2.7mLmiii’; v 50 mVst Tlram 5.0x10 7 mol U’ tac, mm m,, ¡¡A 1 1 1 1 1 1 1 10 0 0.71 0.99 0.90 0.92 - - 1.07 5.0x1O~ mol L’ t mm ¡~, gA 1 1 1 1 1 1 1 10 1.69 3.07 3.93 4.40 5.02 5.29 5.62 6.20 Grafito-teflón 243 TablaLXVII Efecto del tiempode acwnsdaciónsobrela intensidaddepico obtenida,medianteLSV, tras la preconcentraciónpor adsorciónen continuodedisulfirana enmedioH>PO;/HP04 2 0.1 mol L~t pH 74; Ej 0.0 V; caudal:2.7 mL miii’; v 50 mVst Disulfiram 5.OxlO7 muí U’ mm i~, ¡mA 1 2 0.84 3 4 1.53 5 6 1.78 8 10 1.37 8.0 B.0 ¡ ¡¿A 4.0 2.0 0.0 Disultiram 5.Ox1U~ mol L’ t~, mm i~, ¡mA 1 3.44 2 5.27 3 5.84 4 6.57 5 7.00 6 7.06 8 7.40 10 7.58 0 2 4 8 6 10 t. mlii Figura 119 Influencia del tiempo de paso de la disolución analítica por el sistema (tiempo de acumulación) sobre la intensidad de pico obtenida, mediante ISV, tras la preconcentración por adsorción en continuo de (•) dram 5.0x106 mol U’, (O) disulfiram 5.0x1O~ mol 12, (U) tiram s.0~i0~ mol 12’, (0) disulfiram 5.0x107 mol U’. H 2P04111P04 2 0.1 mol U’, pH ‘7.4; Ej +1.0 V; caudal:2.7 mL mm4; v 50 mV s’. 244 Resultadosy Discusión 1111.5.1.7.4.-Curvasde calibrado En el casodel tiram, utilizandoun períodode acumulaciónde3 minutos, se obtuvieroncalibradoslinealesen los intervalosdeconcentración4.OxlOt l0.OxlW7 y l.OxlO6-5.0x106mol L’ (Tabla LXVIII y Figuras 120 y 121), observándose desviaciónde la linearidadparaconcentracionessuperioresa 5.0x106mol U’, como consecuenciade la saturaciónde la superficieelectródica.Empleandoperíodosde acumulaciónmayores,no seobtuvieronrelacionesintensidad-concentraciónlineales parael intervalo superiorde concentreaciones. Por lo que respectaal disulfiram, se obtuvieroncalibradoslinealesen el intervalo2.0xl0~l0.0x107mol L’ empleandoun tiempodepreconcentraciónde 4 minutos,y enel intervalo3.0xl0~-8.0xl04mol U’ con un períodode acumulación de 5 minutos(Tabla LXVIII y Figuras 122 y 123). Tabla LXVIII Curvasdecalibradoparatiranay disulfirana,obtenidasmedianteLSV,tras la preconcentración poradsorciónencontinuodelosfungicidasenmedioH,P0 4/11P04 20.1 molE’, pH 74;E,= +1.0 1”; caudal:2.7 mL miii’; v 50 mv1’. Fungicida Tiempo de acumulación, mm Intervalo lineal, mol L~’ Coeficientede correlación Pendiente, pA L moF’ xl 06 Ordenadaen el origen, MA 3 l.0,clOt5.OxlO” 0.999 1.13+0.09 0.6+0.3 Tiram 3 4.0x104-l0.OxlO’7 0.998 1.8+0.1 0.0+0.1 5 3.0x104-8.0x10~ 0.999 1,12+0.09 0.3±0.5 Disulfiram 4 2.0xl04-l0.0xl0~7 0.999 2.3+0.1 0.19+0.07 Grafito-teflón 245 10.0 8.0 - 8.0 1,. pA 4.0 2.0 0.0 Figura 120 Influencia de la concentración de tirani sobre la intensidad de pico, i,, mediante LSV, tras la preconcentración por adsorción en continuo del fungicida en medio H,PO¿/HP04 2 0.1 mol LI, pH 7.4; Intervalo de concentración: de 1.OxlO’ a 10.0x10~’ mol U’ de tiram; tiempo de acumulación: 3 minutos; Ej +1.0 V; caudal:2.7 mL min’; v= 50 mV s~. 2.5 2.0 - 1.5 I~. ¡¿A 1.0 0.5 0.0 Figura 121 Influencia de la concentración de tiram sobre la intensidad de pico, ii,, mediante LSV, tras la preconcentración por adsorción en continuo del fungicida en medio H 2P041HP04 2 0.1 mol U’, pH 7.4; Intervalo de concentración: de 4.0x107 a io.o~io-~ mol LI’ de tiran; tiempo de acumulación: 3 minutos; E~= +1.0 y; caudal:2.7 mL niin’; v 50 mV 0. e e ¡ ¡ ¡ 0 2 4 6 8 10 Curama mcl V1 x 10 0 2 4 6 8 10 Cur.m. mal 171 x io’ 246 Resultadosy Discusión 12.0 10.0 - 8.0 - I~. yA 6.0 4.0 - 2.0 - 0.0 o Figura 122 Influencia de la concentración de disulfiram sobre la intensidad de pico, ¡a,, mediante LSV, tras la preconcentración por adsorción en continuo del fungicida en medio H2P0411W04 2 0.1 mol U’, pH 7.4; Intervalo de concentración: de 1.0x10~’ a 10.01106 mol L’ de disulfinm; tiempo de acumulación: 5 minutos; Ej +1.0 V; caudal:2.7 mL mm’; v= 50 mV st 3.0 2.5 - 2.0 - l~, yA 1.5 - 1.0 - 0.5 - 0.0 0 2 4 8 8 10 4dIsuItlrum. mcl ~1 x lo’ Figura 123 Influencia de la concentración de disulfinm sobre la intensidad de pico, ii,, mediante LSV, tras la preconcentración por adsorción en continuo del fungicida en medio H,PO 4JHPO¿ 0.1 mol L~’, pH 7.4; Intervalo de concentración: de 2.0x10~’ a lo.oxio 7 mol U’ de disulfimm; tiempo de acumulación: 4 minutos; Ej +1.0 V; caudal: 2.7 mL min’; v= 50 mV st e e ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ 2 4 6 8 10 CeIsfIflram¡ mol 171 x lO~ Grafito-teflón 247 Comopuedeobservarseen la TablaLXVIII, la pendientede los calibrados esmayor,en amboscasos,paralos intervalosde concentracióninferiores,comoes deesperaren los procesosdeadsorcióndebidoaqueseacercael excesosuperficial de los fungicidasal excesosuperficiala saturación. Si se comparanlas característicasanalíticas con las obtenidasmediante análisispor inyecciónen flujo convencional(TablaLX), puedededucirseque el métodode preconcentraciónen continuoesmássensiblepuestoquelos valoresde las pendientesde los calibradosanálogosson mayoresen estecaso. Sin embargo, el intervalo de linealidadesahoramásestrechoy no sepuedenalcanzarlímitesde deteccióninferiores. 111.51.7.5.-Estudiode interferencias El aspectomásinteresantede la metodologíaempleandopreconcentraciónen continuo es la posibilidad de mejorar la selectividad de las determinaciones. Siguiendoel procedimientopropuesto,sólamentelas especieselectroactivasquese adsorbansobrela superficie del electrodooriginaránuna señalanalítica. En este contexto,seinvestigóla posibleinterferenciade los mismoscompuestosensayados en FíA convencional. En la Figura 124 semuestranlos voltamperogramasobtenidosal aplicar el procedimientodescritocuandosehacecircularpor la célula de flujo disoluciones 1 .OxlO6 mol L’ de tiran>, disulfiramy ziram,y unadisolución5.0x10’ mol U’ de fenol. Tanto el tiram (E~ 0.768y), como el disulfiran> (E~ 0.780 V) y el ziram (E~= 0.775 V) presentanseñalesde oxidación bien definidas a este nivel de concentración.Sin embargo,el fenol no mostróningunarespuestaenel intervalode potencialesbarrido, a un nivel de concentración50 veces superior al de los fUngicidas, lo queindicaqueno seadsorbesobreel electrodoen estascondiciones. 248 Resultados y Discusión Figura 124 Voltmnpeutgnmas, en LSV, fls la preconcentración por adsorción en continuo de: (1) disulfinm 1.Oxl0~ mol U’, (2) tiran l.OxlO’ mol U’, (3) ziram 1.0x10~ mol U’ y (4) fenol 5.0x10~ mol U’, en medio H2PO¿/.HP04 2 0.1 mol U’, pH 7.4; tiempo de acumulación: 3 minutos; Ej +1.0 V; caudal:2.7 mL mm’; velocidad de batido: 50 mV st En la TablaLXIX se recogenlos datosrelativosa la interferenciade estas especiesen la determinaciónde tiram y disulf¡ram, tras su preconcentraciónen continuo. Si secomparanestosresultadoscon los obtenidosmedianteanálisispor inyecciónen flujo (TablasLXI y LXII), puede destacarsela desapariciónde la interferenciaproducidapor el fenol, queno afectaa las medidasde los fungicidas inclusopararelacionesfenol:tiramo fenol:disulfiram50:1. Además,la interferencia producida por el ziram también se reduce considerablementeempleando preconcentraciónen continuo.Estehechopuedeatribuirsea la diferentecapacidad deadsorciónde los fUngicidas,en las condicionesexperimentalesempleadas,sobre la superficiedel electrodocompósitode grafito-teflón. I 0.4 0.6 0.1 E, V u Grafito-tejlón 249 Sin embargo,el problemade la interferenciamutuaentretiran> y disulfiram empeoraligeramenterespectoal método FíA convencional,puesto que ambos compuestosseadsorbenfuertementesobrela superficiedel electrodo. Tabla LXIX Efectode la presenciadediversassustanciassobrelas señalesde tiram y disulfiram 1. Oxl0.’ mol L’, enLSV, tras la preconcentraciónpor adsorciónen continuode los fungicidas en medioH2PQ/HP04 2 0.1 molE’, pH 74; tiempodeacwmdación:3 minutospara tiran, y 4 minutosparadisulfiram;Ej +1.0 1”; caudal: 2.7mL miii’; velocidadde barrido: 50mVst Interferente Relaciónanalito:interferente ¡,,, ¡tA (error relativo, %) Tiram Disulfiram Tiram Disulfirani 0:1 0:1 2.08 2.35 Tiram 1:1 - 4.20 (79%) Disultiram 1:1 - 3.21 (54%) - Ziram 1:1 1:1 2.76 (33%) 2.82 (20%) Fenol 50:1 50:1 1.95 (<10%) 2.46 (<10%) Zn(II) 50:1 50:1 2.00 (<10%) 2.37 (<10%) 111.5.1.8.- Separación en continuo mediante inyección en flujo de tiram y disulfiram El grave problemade interferenciaque origina la presenciade disulfiram sobre la señalamperométricade tiran>, y viceversa,en análisis por inyección en flujo, nos ha llevado a diseñarun esquemade separaciónen continuo de ambos fungicidascon el fin de poderconseguirsu determinaciónsimultánea.Paraello, se incorporóunapequeñacolumnaseparadoraal sistemaFíA. El dispositivo utilizado 250 Resultados y Discusión se describeen el Apanado11.3.1.1 (Figura 3). El sentidode flujo de la disolución portadoraa travésde la columnaseinvierteperiódicamenteparaevitarque la fase estacionariase compacteen un extremo de la columna y se produzca una disminuciónenel pasodefluido. Si no serealizaestainversión,el caudala la salida de la columna disminuye de 2 a 0.5 mL mm’ despuésde una hora de empleo continuado,dando lugar a un ensanchamientode las señalesy a resultadospoco reproducibles. 111.5.1.8.1.- Elección de la fase móvil y optimización de las variableshidrodinámicas La adiciónde metanolo de acetonitriloa la disoluciónportadora(regulador fosfato 0.1 mol L’ de pH 7.4) da lugar a una disminución considerablede las señalesamperométricasdeambosfungicidassobreel electrodocompósitodegrafito- teflón (TablaLXX). Tabla LXX Efectode la proporcióndemetanolo acetonitrilo en lafasemóvil (H2POpHPOJ0.1 moIL’, pH 74) sobrela corrientedefondo (i4 y la intensidaddepico (1,) de tiram 5.Oxl0.6 mol IP obtenidasmedianteinyecciónenflujo condetecciónamperométricaempleandocomoelectrodo indicadorun electrodocompósitodegrafito-40% teflón. Caudal:1.9 mL miii’; V4= 250pL; E= +1.0 y. Disolventeorgánico Proporciónen la fasemóvil, % i~, 1iA ir,, I.±A 0 0.15 1.20 Metanol 25 0.76 0.24 Metanol 50 1.53 0.06 Acetonitrilo 25 0.53 0.36 Acetonitrilo 50 0.95 0.07 Grafito-teflón 251 Comopuedeobservarseen la TablaLXX, la disminuciónen la intensidad depico fue másacusadacuandoseempleómetanol.Porestemotivo, sehadecidido emplear,comofasemóvil, unamezcladeacetonitriloy reguladorfosfatode pH 7.4 quepermitela separaciónde tiramy disulfiram enla columnaacopladaal sistema FíA. Empleandounaconcentraciónde cadafungicida de 5.0x106mol U’ y un volumen de inyecciónde 250 gL, se obtieneunabuenaresoluciónutilizando una proporciónacetonitrilo:fosfato25:75 y/y, comopuedeobservarseen la Figura 125 A. Si el porcentajede acetonitriloen la fasemóvil serebajaal 20%, seproduceun ensanchamientoy unadisminuciónsustancialdel pico del disulfiran>. 0.8 - i, pA 0.6 0.4 - 0.8 i. ¡aA 0.6 0.4 0 400 800 0 400 800 ti, s t, £ Figura 125 Señales obtenidas, mediante inyección en flujo con detección ampewmétxíca, para una mezcla de 5.0x10’ mol U’ de tiram (1) y disulfirani (2), tuis su separación en una columna empaquetada con fase estacionajia VYDAC SC-201 Rl>. Fase móvil: (A) 25:75, (B) 23:77 acetonitñlouegulador fosfato (pH 7.4). Caudal: 1.9 mL mint volumen de inyección: (A) 250 pL, (B) 650 gL E +1.0 V. 1 A 2 252 Resultados y Discusión En la Figura 126 se muestrael efectodel volumen de inyecciónsobre las señalesdetiran>y disulfiram. Comocompromisoentreunamayorsensibilidady una buena resolución de las señales,se ha escogido un volumen de 650 ¡iL. La separaciónhastala líneabasepuedeconseguirseenestascondicionessi serebajael porcentajedeacetonitriloenla fasemóvil al 23%,comosemuestraenla Figura125 B. 1.4 1.2 - 1.0 - Ii, pA 0.8 a.a - 0.4 - 0.2 Figura 126 Efecto del volumen de inyección sobre las señales de timm y disulfiuan obtenidas mediante inyección en flujo con detección amperométiica, tras su separación en una columna empaquetada con fase estacionaila VYDAC SC-201 RP. Fase móvil: 25:75 acetonitnlo:ftgIJlador fosfato (pH 7.4). Caudal: 1.9 mL min~’; volumen de inyección: (1) 150, (2) 250 , (3) 350, (4) 650, (5) 1150 pL; E= +1.0 V. 111.5.1.8.2.- Curvasde calibrado Empleandounafasemóvil constituidapor23:77 acetonitrilo:reguladorfosfato 0.1 mol L’ de pH 7.4, un caudalde 1.9mL mm1 y un volumendeinyecciónde650 ¡iL, sehanobtenidorelacioneslinealesentreel áreade pico y la concentraciónde 5 ¡ ¡ ¡ 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 ti s Grafito-teflón 253 tiran> y disulfiran> entre2.OxlW6 y 10.0x106mol U’ (TablaLXXI y Figura 127). Estosresultadosdemuestranla posibilidadde determinarsimultáneamentetiram y disulfiran> en muestrasen las que coexistanambosfUngicidas. Tabla LXXI Curvasdecalibradoparatirwn y disulfirwn, obtenidasmedianteanálisispor inyecciónenflujo tras la separaciónen continuode tiramy disulflram. Fasemóvil: 23:77acetonitrilo:regulador fosfato (pH 74). Caudal:1.9 mt miii’; volwnende inyección:650 pL; E +1.0 V. Fungicida Intervalo lineal, mol U~ Coeficientede correlación Pendiente, A s L moU’ Ordenadaen el origen, A s Tiram 2.Ox104-l0.0x104 09990 3.1±0.3 (-0.8+1.S)x106 DisuIt’iram 2.0x104-10.0x10~ 0.9991 3.2+0.2 (1.5±1.6)x10’ 4.0 7,3.0- N u 2.0 - a u e 0.0 o Figura 127 Influencia de la concentración de dram (O) y disulflram (O) sobre el dna de pico, mediante análisis por inyección en flujo tras la separación en continuo de los fungicidas. Fase móvil: 23:77 acetonitrilo:uiegulador fosfato (pH 7.4). Caudal: 1.9 mL mint volumen de inyección: 650 pL; E= +1.0 V. ¡ ¡ ¡ ¡ 2 4 6 8 10 c, mal 171 x 106 254 Resultadosy Discusión HLS.2.- DETERMINACION DE TIIiAM Y DISULFIRAM MEDIANTE Ill>LC CON DETECCION AMPEROMETRICA Comosehavisto enel apartadoanterior,la determinaciónconjuntadetiram y disulfiran> medianteanálisispor inyecciónen flujo con detecciónamperométrica estásujetaala interferenciamutuaentreambosfUngicidas,siendonecesariorecurnr a su separaciónprevia. Además,la presenciade otras sustancias,talescomoziram o fenol, tambiénorigina gravesinterferenciassobrelas señalesamperométricasde dramy disulflram. Porestemotivoy conobjetodeevaluarlos electrodoscompósitosdegrafito- teflón como detectoresamperométricosen HPLC, seha escogidola determinación conjuntade tiran> y disulfiram enpresenciade ziramcomoproblemaanalíticopara desarrollarun métodocromatográficoapropiado. Laoptimizaciónde lascondicionesexperimentales,talescomola eleccióndel disolventeorgánicoutilizado en la fasemóvil, así comosu porcentaje,el potencial aplicado al electrodo compósito y el tiempo transcurndoentre la mezcla de carbamatosy la inyecciónde dicha mezclase ha llevado a caboempleandouna configuraciónde célula de flujo de tipo wall-jet. La composicióndel electrodo indicador,esdecir, unamezclade grafitoy 40% deteflón, asi comoel componente acuosode la fase móvil (reguladorfosfato de pH 7.4) son los mismos que los utilizadosen capítulosprecedentes. 1515.2.1.- Elecciónde la fase móvil Antes de incorporar la columna cromatográficaal sistema,se realizaron experimentoscon el fin de evaluarla variación de la respuestaamperométricadel electrodocompósitode graflto-40% teflón cuandose rebajala polaridad de una Grafito-teflón 255 disoluciónde reguladorfosfato0.01 mol L’ de pH 7.4, empleadacomoportador, debidoa la adiciónde diferentesproporcionesde metanolo acetonitrilo.Paraello, se inyectaronen el sistemadesprovistode la columnacromatográfica,alícuotasde disolucionesde 60 ¡.±gU’ de tiram, preparadasenel mismomedio queel portador, empleandoun caudal de 2.0 mL miii’ y aplicando al electrodo indicador un potencialde +1.0 V. Al aumentarel contenidode disolventeorgánico se observó una fuerte disminuciónde la intensidadde pico y un aumentode la comentede fondo (ver Tabla LXX). Así, empleandoun 25% de metanol en la fase móvil, la señal amperométricadisminuíaun 80%. Si el porcentajede metanolse incrementahasta un 50%, la disminuciónen la intensidaddepico eradel 95%. Cuandoseutilizó una proporción de metanoldel 75%, el mido de la línea baseera mayorque la señal analíticaobtenida. 1.2- 1.0 - 1, pA 0.8 - 0.6 - 0.4~ 0 100 200 300 400 1, 8 Figura 128 Señalesobtenidascuandoseinyectan0.15~ugde tiram enel sistemadesprovistode columna separadorg,empleandocomofasemóvil H2PO¿/HP’i)f 0.1 mol L”, pH 7.4 mod4ficadacon un 25%de: (1) metanol,(2) acetonitrilo. Caudal: ZO mL miii’; I’%,,,= 10 pL; E= +1.0 Y. 1 2 256 Resultados y Discusión Cuandoseempleóacetonitrilocomomodificadororgánicode la fasemóvil, la disminución de la señal fue algo menor. Por ejemplo, cuandoel contenidode acetonitriloen la fasemóvil eradel 25%, la intensidadde pico eraun 70% menor quela obtenidaen medio reguladorfosfato0.01 mol U’. Sin embargo,el nivel de ruidoy la corrientede fondo sonconsiderablementemenoresquecuandoseempleó metanol (Figura 128). Para una proporción del 75% de acetonitrilo se observó precipitaciónde fosfato. Teniendo en cuentaestos resultados,se ha escogido acetonitrilo como modificadorde la fasemóvil. 111.5.2.2.-Influenciadel potencialaplicado En el apanado111.5.1.1seha discutidola eleccióndeun valor del potencial aplicado al electrodo indicador de + 1.0 V cuando se llevó a cabo detección amperométricade tiram y disulfiramenun sistemaFíA empleandounadisolución portadoraacuosa.Con objetode averiguarsi la presenciade acetonitrilo en la fase móvil puedealterar el valor de potencialmásapropiadopararealizarla detección amperométrica,seefectuaronmedidasde la corrientedepico paradistintosvalores de potencial,en el intervalo +0.50-+l.20V, cuandose inyectaron 10 ~L de una disoluciónde 180 ¡ig mU’ de tiram enuna fasemóvil constituidapor unamezcla de acetonitrilo:reguladorfosfato 0.01 mol U’ de pH 7.4 40:60y/y, en ausenciade columnaseparadora.Los datosobtenidosserepresentanen la Figura 129. La forma de la curva es muy parecida a la obtenida en ausenciade acetonitrilo en la disolución portadora(véasela Figura 97), con una mesetade intensidadesbien definidaentre+0.90 y + 1.1 V. Por consiguiente,se ha escogido paraestudiossubsiguientesel mismovalordepotencialde±1.0V paraser aplicado al electrodocompósitode grafito-teflón utilizado comoindicador. Grafito-teflón 257 0.6 0.4 - ii,, jiA 0.2 - 0.0 - 0.0 0.2 1.4 Figura 129 Influencia del potencial aplicado sobre la intensidad de pico de 180 pg 12’ de dram, sobre un electndo compósito de gnfito-40% teflón, empleando como portador acetonitrilo: regulador fosfato 0.1 mol L4 (pH 7.4) 40:60; caudal: 2.0 mL mint 111.5.2.3.- Comparación de la rtspuesta del electrodo compósito de grafito- teflón con un electrodo de carbono vitrificado Un aspectomuy importantepor lo que respectaa la aplicabilidady a la utilidad real como detectoramperométricoen sistemasen flujo del electrodode grafito-teflón,escomprobarsi estematerialmejoralasprestacionesde losmateriales electródicosnormalmenteempleadosen los detectoreselectroquímicos.Entreéstos, el electrodode carbonovitrificado puedeconsiderarsecomo el másan>pliamente utilizado,por lo queparececonvenientecompararla respuestade ambostipos de materialeselectródicosftentea los analitosestudiados.Paraello, secomparódicha respuestacuandoserealizaroninyeccionessucesivasde2.25 gg de disulfiran>en el sistemadesprovistode columnacromatográfica,por el que circula la fase móvil (40:60y/y acetonitrilo:reguladorfosfato 0.01 mol U’ de pH 7.4) aun caudalde 2.0 mL mm’. En la Figura 130 se muestranlas señalesobtenidas. ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 E. V 258 Resultados y Discusión 2.5 2.0’ 1.5 - I.uA 1.0 - Di’ 0.0 0 400 0.5 0.4 0.3 I.¡iA 0.2 0.1 0.0 Figura 130 Inyecciones sucesivas de 2.25 pg de disulflnrm en una disolución portadora constituida por 40:60 y/y acetonitrilo: regulador fosfato 0.1 mol U’ (pH 7.4) que circula a un caudal de 2.0 mL mm”, empleando como electmdo indicador (A) un elecindo compósito de grafito-40% teflón y (E) un electndo de carbono vitziticado. A LWW~L 800 1200 1600 ti a 2000 0 500 1000 1500 2000 2500 t. a Grafito-teflón 259 Como puedeobservarse,con el electrodode grafito-teflón se obtiene una respuestamuy reproducible,mientras que empleandoel electrodo de carbono vitrificado se produce un fuerte ensuciamientode la superficie electródicaque conducea unadrásticadisminuciónde la señalanalítica,la cual desaparecetras 6 inyeccionesconsecutivas. Además, puede apreciarsecomo la magnitud de la intensidadde pico obtenidaes mucho mayor sobre el electrodo de grafito-teflón. Otra importante diferenciaventajosadel empleodel electrodocompósitoesel menortiempo quese necesitaparaalcanzarunalíneabaseestable.Comopuedeverseen la Figura 130, al cabodeaproximadamente400 segundosseobtuvounacorrientede fondoestable conel electrododegrafito-teflón,mientrasquefue necesarioesperaral menos1500 segundospara estabilizarla línea basecuandose utilizó el electrodode carbono vitrificado. Todasestasimportantesventajasprácticasdemuestranla potencialidadde los electrodos compósitos de grafito-teflón para ser utilizados como detectores amperométricosen sistemasen flujo. 111.5.2.4.-Separaciónde tiram, disulfiram, ziram y fenol Con objeto de lograr las condicionesexperimentalesóptimaspara poder procedera la separaciónde las cuatroespeciesestudiadas,en primer lugar se ha estudiadoel efectode la proporciónde acetonitriloempleadoen la fasemóvil sobre las característicasde retenciónde tiram, disulflram, ziram y fenol. En la Tabla LXXII se muestranlos factores de capacidadobtenidospara estos compuestos cuandose inyectaron0.6 ¡ig de cadauno de ellos individualmenteen las fases móvilescondiferentesproporcionesdeacetonitrilo.Comopuedededucirse,el ziram no interaccionócon la faseestacionariautilizaday su tiempoderetencióncoincide 260 Resultadosy Discusión prácticamenteconel valor de t0 calculadoapartir de los datosde control decalidad delacolumna.No obstante,cuandoseinyectóacetonitrilopuroenel sistema,no se observóningunaperturbaciónde la líneabasea t0, por lo que la determinaciónde ziran> podría llevarsea cabo sin dificultad. Los valoresde k’ que aparecenen la Tabla LXXII sehan calculadotomandoel tiempode retenciónde zirain como t0. TablaLXXII Factores de capacidadobtenidospara tiram, disulfiranu, ¿irwn y fenol en fases móviles constituidasporproporcionesdiferentesdeacetonitrilo:reguladorfosfato0.01 molE’ (pH74). Cantidadinyectadw& 6 ~u¿gde cadasustanciaCaudal:2.0 mL miii’. Fungicida Fasemóvil Acetonitrilo:reguladorfosfato 0.01 mol U’ 40:60 45:55 50:50 60:40 Ziram 0 0 0 0 Fenol 2.0 1.3 1.1 0.9 Tiram 7.0 4.2 3.0 2.0 Disulf~ram 32.3 28.6 15.9 7.9 Cuandose utilizaronporcentajesde acetonitrilo en la fasemóvil igualeso menoresal 40%, el disulfiran>presentótiemposderetenciónmayoresde 30 minutos y, por consiguiente,su señal se ensanchabademasiadoy el tiempo de análisis aumentabaconsiderablemente. Por otraparte, comoerade esperar,al aumentarel contenidode acetonitrilo en la fasemóvil, el áreade pico disminuyóconsiderablemente,tanto para el tiran> comoparael clisulfiram, como consecuenciade la disminuciónen el coeficientede difusión al variar la fuerzaiónicay la viscosidaddel medio.La resoluciónhastala Grafito-teflón 261 0 400 800 1200 tu U líneabasede las señalesde ziram, tiram y disulflram se consiguióempleandoun contenidode acetonitrilo del 45% en la fasemóvil (Figura 131) 0.3 a.s 1, pA 0.4 0.2 0.0 Figura 131 Cromatogr’amas obtenidos para una mezcla de 45 pg mL’ de ziram (1), 80 pg mi) de dram (2) y 80 gg mL’ de disulfiram, empleando como fase móvil una mezcla 45:55 acetonitrilo:regulador fosfato 0.01 mol U’ (PH 7.4); caudal: 2.0 mL mm’; V10 10 pL; E= +1.0 y. Un aspectoanalíticoimportantedel problemaplanteadocon estaseparación esqueseobservóqueal inyectarunamezcladetiram y disulfiran> inmediatamente después de su preparación, aparecíanlos dos picos correspondientesen el cromatograma,pero que, si la inyección se realizabatranscurridosunos pocos minutos después de preparar la disolución, aparecía un tercer pico en el cromatogramacon un tiempo de retenciónintermedio (k’ 6.9 para un 50% de acetonitrilo).Estepico correspondeprobablementeal N,N-dietil-N’,N-dimetiltiuram disulfl¡ro, habiéndosedescrito esteefectopreviamentepor Smith y col. [77], que puedeatribuirsea la roturadelenlace-S-S-centraly posteriorrecombinaciónde los ftagmentosprocedentesde moléculasdiferentes. 262 Resultadosy Discusión En la Figura 132 se muestran los cromatogramascorrespondientesa inyeccionesde 10 ¡iL de unadisoluciónquecontiene60 ¡.tg mL’ de tiran> y 60 ¡ig mL’ dedisulfiran>,realizadasjustodespuésde la preparaciónde la mezclay al cabo de diferentestiempostranscurridosdesdedichapreparación. 2 1 a1 b c d o 156 10 Tiempo de retsnc¡Gn• mm Figura 132 Cmmatogramas obtenidos para una mezcla de 60 gg mL’ de dram (1) y 60 pg mU’ de disulfinm (2), cuando la inyección se realizó inmediatamente después de la mezcla (a), y al cabo de: (b) 15 minutos, (c) 90 minutos, (d) 180 minutos después de su preparación. (3) N,N- dietil-N’,W-dimetilduxam disulfuro. Fase móvil: 50:50 acetonitxilo:utgulador fosfato 0.01 mol U’ (pH 7.4); caudal: 2.0 mL mm’; V1~ 10 p14 E +1.0 V. 3 Grafito-teflón 263 A medidaque aumentael tiempo transcurridoentrela preparaciónde la disolucióny su inyección, disminuyeel áreade pico del tiran> y del disulfiram, mientrasqueaumentala señalcorrespondienteal compuestoderetenciónintermedia, hastaaproximadamente90 minutos.Paratiempossuperiores,no seobservóninguna variación apreciableen las señales,por lo que sededujoque,en estascondiciones, se alcanzabael estadode equilibrio. El compuestode retención intermedia mencionadono aparecíaen los cromatogramnascuandoseinyectaronmezclasde tiramy ziram,inclusoaunquedicha inyecciónserealizaradespuésde90 minutosdehaberpreparadola disoluciónde la mezclabinaria. Por el contrario, cuandose cromatografióuna mezclade ziram y disulfiran>transcurridosunospocosminutosdesdesupreparación,aparecieroncuatro picosen el cromatograma,con factoresde capacidadde 0, 3.0, 6.4 y 15.7cuando se empleó un 50% de acetonitrilo en la fase móvil (Figura 133). El tiempo de retencióndel segundoeluatocoincidecon el tiempo de retencióndel dramen estas mismascondiciones,de formaquepuedededucirsequeen la disolucióncoexistían ziram, tiran>, disulfiramy el mencionadoN,N-dietil-N’,N’-dimetiltiuran> disulfuro. La resoluciónhastala líneabasede los picoscorrespondientesaestoscuatro compuestos se consiguió utilizando una fase móvil constituida por acetonitrilo:reguladorfosfato 0.01 mol U’ de pH 7.4 45:55 y un caudalde 2.0 mL mm . Porconsiguiente,estascondicionesexperimentaleshansidolasescogidaspara la realización de los calibradosy la determinaciónde tiram en muestrasde manzanas. Sin embargo,si la disoluciónde trabajocontienefenol, su señalsolapacon el pico delziran>, aunqueno interfiereen la determinaciónde tiram y disulfiram.Si se quierellevar a cabounaseparacióncompletade todoslos compuestos,incluido el fenol, esnecesariorebajarel porcentajedeacetonitriloutilizadoen la fasemóvil, asícomomodificar el caudalduranteel desanollodel cromatogramacon el fin de 264 Resultadosy Discusión evitar una excesivaretencióndel disulflram. Dicho aumentodel caudalprovocó deriva en la líneabase,comoocurriría si el problemase resolvieraempleandoun gradientedefasemóvil. En la Figura134semuestrael cromatogramaobtenidopara unamezclade ziram, fenol, tiram y disulflram, empleandoun 38% de acetonitrilo en la fasemóvil y un caudalde 1.5 mL miii’ entrelos puntosmarcadoscon (a) y (b), y de 5 mL mlii’ a partir de (b). La inyección de una alícuotade 10 ¡1 se realizó inmediatamentedespuésde la preparaciónde la mezcla. 1.4 1.2 i,pA 1.0 15 t, mm Figura 133 Crumatograma obtenido pan una mezcla de 60 pg mL’ de zirznn (1) y 60 pg mL’ de disulfinmm (4), cuando la inyección se realizó después de 90 minutos de la preparación de la disolución. (2) dram y (3) N,N-diedl-N’,N’-dinietiltiuram disulfuro. Fase móvil: 50:50 acetonituilo:ngulador fosfato 0.01 mol U’ (pH 7.4); caudal: 2.0 mL mm’; v1~= 10 pL; i» +1.0 V. 0 5 10 Grafito-teflón 265 Figura 134 Cromatograma obtenido para una mezcla de 30 ~igmU’ de zimm (1), 30 pg mL’ de fenol (2), 30 pg mi]’ de dram (3) y 60 pg mi) de disulfiram (4), inyectada inmediatamente después de la preparación de la disolución. Fase móvil: 38:62 acetonitrilo:regulador fosfato 0.01 mol U’ (pH 7.4). Caudal: 1.5 mL mm” desde (a) hasta (b) y 5.0 mL mm” a partir de (b). V1~3,= 10 pL E~ +1.0 V. 111.5.2.5.- Curvas de calibrado. Comparación de las configuraciones wall-jet y thin-layer En esteapartadosehanrealizadocalibradostantoparatiram comodisulfiram en presenciade unaconcentraciónconstantede ziram (45 ¡.tg mU’ en el casodel intervalo deconcentracionessuperiorconsideradoy 4.5 ~¡gmU’ parael intervalode concentracionesinferior). Confines comparativos,sehanempleadodos configuracionesdiferentesde lacéluladeflujo paraobtenerdichascurvasdecalibrado,unala ya empleadadetipo 3 ]j O.lyA 4 12 20 ¡ ¡ o 5 10 15 t, mm 266 Resultadosy Discusión wall-jet y otra con la configuraciónthin-layer.En la TablaLXXIII se recogenlas característicasde los calibradosobtenidos.A modode ejemplo,en la Figura135 se muestranlos cromatogramasutilizadosparaconstruirel calibradocorrespondiente al intervalo superiordeconcentracionesensayadocuandoseutiliza la configuración thin-layer en la célula de flujo. Tabla LXXIII Calibrados obtenidospara dram y disulfiram, en presenciade ziram, medianteHPLC con detecciónwnperométrica sobre un electrodo compósito de grafito-40%teflón, empleando configuración walt-jet y thin-tayer; E~ +1.0 Y; Fase móvil: 45:55 acetonitrilo:regulador fosfato 0.01 molE’ (pH 74). Caudal: 2.0 mL miii’; V,,.p ¡0 pL Fungicida Configuración céluladc flujo Intervalo lineal, mg L’ Coeficientede correlación Pendiente, ¡iA s mg’ Ordenadaen el origen, jiA s Tiram walt-jet 2-10 10-100 0.998 0.9990 0.212+0.008 0.24±0.03 -0.039+0.05 -0.7+0.9 Thin-layer 1-10 10-100 0.9993 0.9998 0.20+0.02 0.1343+0.0002 0.01+0.06 0.4+0.2 Dusulfiram Walí-jet 6-10 10-100 0.99997 0.9992 0.19+0.02 0.16+0.01 0.0+0.1 0.3+0.6 Thin-layer 4-10 10-100 0.9990 0.9998 0.13+0.01 0.123+0.003 0.01+0.09 0.1+0.2 Como puede apreciarseen la Tabla LXXIII, la sensibilidades siempre ligeramentemayor cuandose empleala configuraciónwall-jet. Sin embargo,la corrientede fondoes considerablementemayorparaestaconfiguración,asícomoel mido enla líneabasey el tiemponecesarioparala estabilizacióndedichalíneabase antesdeefectuarla inyección.Dicho tiempodependedequeel electrodocompósito degrafito-teflónseacompletamentenuevoo hayasidoya utilizadoenexperimentos anteriores.Cuandoel electrodose empleapor primeravez, se requiereun mayor tiempodeacondicionamientohastaofrecerunalíneabaseestable(35-40minutosen Grafito-teflón 267 el casode la configuraciónwall-jet y 10-15 minutosen el casode la configuración thin-layer),mientrasquepararealizarel segundoo posteriorescromatogramaseste períododeestabilizaciónsereduceconsiderablemente(aproximadamente10minutos parala configuraciónwall-jet y menosde 5 minutospara la configuraciónthin- ¡ayer). Comoconsecuenciade que la magnitudy el ruido de la corrientede fondo sonmenoresempleandola configuraciónthin-layer,esposibledeterminarcantidades algo másbajasde ambosfungicidascon estaconfiguración. Figura 135 Cromatogrannis obtenidos cuando se inyectan disoluciones constituidas por mezclas de 45 p±g mi]’ de ziram con las siguientes cantidades de dram y disulfiram: (1) 10, (2) 20, (3) 40, (4) 60, (5) 80, (6) 100 pg mi]’, empleando configuración thin-layer. E~= +1.0 y; Fase móvil: 45:55 acetonitrilo:regulador fosfato 0.01 mol U’ (pH 7.4). Caudal: 2.0 mL min~’; V1~,= 10 pL 0.2 yA 15 mm a LI 1 2 3 4 5 6 268 Resultados y Discusión EnlaTablaLXX1V serecogenlascaracterísticasanalíticasobtenidasapartir de los calibradoscorrespondientes.Los valoresde la desviaciónestándarrelativase hancalculadoapartir de la medidadc 10 disolucionesdiferentesquecontenían2.0 ~‘gmU’ de tiran>, 6.0 gg mU1 de disulflram y 4.5 ~igmU1 de ziran> en el casode la configuraciónwall-jet y 1.0 ~ígmU1 de tiram,4.0 ¡ig mi” de disulf¡ramy 4.5 ¡ig mL~’ deziran>enel casodela configuraciónthin-layer.Loslímitesdedeterminación y de detecciónsehancalculadoempleandolos criterios 10 s y 3s~,/mdefinidos en del Apanado111.1.5. Tabla LXXIV Canwteñsdcas analiticas obtenidas pana Ja determinación de dram y disulfinun en pnsencia de zinm, mediante HPLC con detección amperométrica sobre un electrodo compósito de gnmfito-40% teflón, empleando configuración wall-jet y thin-laye~ E~= +1.0 y; Fase móvil: 45:55 acetonituilo:regulador fosfato 0.01 mol U’ (pH 7.4). Caudal: 2.0 ¡nL mm”; V,,,,= 10 pL. Fungicida Configuración célulade flujo RSD,% Límite de determinación,mg U’ Límite de detección,mg L” Tfram WaIl-jet 5.3 1.2 0.4 Thin-layer 3.4 0.49 0.14 Disulfirain WaIl-jet 6.4 3.4 1.0 Thin-layer 4.9 2.3 0.7 Como puedededucirsea partir de los datos de la Tabla LXXIV, se han obtenidolímites de determinacióny de deteccióninferiores, así como unamejor repetibilidad, tanto para tiran> como para disulfiran>, cuando se utilizó una configuraciónthin-layeren la célula de flujo. Grafito-teflón 269 111.5.2.6.- Detemiinación de tiram en manzanas contaminadas Como aplicacióndel método desarrolladomedianteHPLC con detección amperométricasobreel electrodocompósitode grafito-teflón, seha llevadoa cabo la detenninaciónde tiram en muestrasde manzanascontaminadascon 0.5 mg de tiram por Kg de manzana,siguiendoel procedimientodescrito en el Apartado 11.4.3.3.Comoya sepusode manifiestoen el apartadode Introducción,el tirani se utiliza ampliamentecomoun activo fungicida,habiéndoseencontradoen estetipo defruta. Lascantidadespermitidasenaplicacionesagrícolassonde0.03-0.01g Kg”. En primer lugar, el procedimientopropuestose aplicó a unamuestrade manzanas sin contaminar(muestrablanco). Figura 136 Cromatogranias obtenidos para un extracto de una muestra de manzanas sin contaminan (1) inyección del blanco, (2-6) adiciones sucesivas de 5 p±gmi) de dram a alicuotas de este extracto. Fase móvil: 45:55 acetonitilo:regulador fosfato 0.01 mol U’ (pH 7.4); caudal: 2.0 ¡nL mio”; V~= 10 pL; ~ +1.0 V. I 0.05 pA 1 2 3 4 5 o t. mm lo 6 20 30 270 Resultados y Discusión En la Figura 136 se muestranlas señalesobtenidascuandoseinyectó una alícuotadelextractode la muestrablanco(1), asícomolas señalescorrespondientes a las adicionessucesivasde 5 gig mL” de drama alícuotasde dicho extracto(2-6). Los valoresde la pendientey de la ordenadaen el origen de la curvade calibrado construidade este modo fueron 0.120±0.006¡A s L mg” y 0.1 + 0.1 ¡.tA s, respectivamente(r= 0.9995).Comopuedeobservarse,antesdelpico correspondiente al tiram, aparecióotra señalen el cromatograma,que puedecorrespondera algún compuestoendógenopresenteen el extractode lasmanzanas,peroqueno interfiere en absolutoen la cuantificacióndel tiran> en las condicionesde trabajo escogidas. El procedimientomencionadoseaplicó seguidamentea la determinación de tiran> en 3 muestrasde manzanascontaminadasa un nivel de concentraciónde 0.5 ¡.±gg’, lo queimplica unaconcentraciónfinal detiram enla disoluciónanalítica de 5.0 ~ig mU’. La concentraciónmedia encontradafue de 4.8+0.2 ¡g mL” (0.48+0.02j.¡g 4), lo quesuponeunarecuperaciónmediadel 97±3% paraun nivel de significación de 0.05. Esta recuperaciónes mejor que la obtenida por otros autoresparael mismo tipo de muestray el mismonivel deconcentracióndetiram, utilizando diferentes métodos basados en HPLC con detección ultravioleta [75,79,93], lo queindicaqueel métodopropuestopor nosotrosesapropiadoparala determinaciónde tiram en estetipo de muestras. IV.- CONCLUSIONES Conclusiones 273 1.- En este trabajo se han desarrolladodos tipos de electrodoscompósitos diferentesquecontienengrafitoenpolvo comofaseconductoramezcladoen cierta proporciónconun materialaislantequeofrececonsistenciaa la matriz electródica. Las característicasfisico-quimicasde cadafasey la proporciónen quese mezclan confieren a los materialesresultantesdiversaspropiedadesque hacen que su utilizacióncomoelectrodosindicadorespresentemúltiplesventajasfrenteal empleo de electrodosconvencionales. Electrodo depastade carbono mod«icadoconflalocianina de cobalto 2.- El primer electrododesarrolladoha sido un electrodode pastade carbono modificado con el mediadorredox ftalocianinade cobalto.La pastade carbonoes unamatriz electródicafácil de modificar por mezcladodirecto con los materiales modificadorespara conseguirel efecto deseado,lo que constituyeuna primera ventajafrente a otros materialeselectródicos. 3.- La utilización de la ftalocianinade cobaltocomomediadorredoxmezclada íntimamenteconla pastadecarbonodisminuyeel sobrepotencialnecesarioparaque se produzcala oxidación electroquímicade los fungicidastiran> y disulfiram sobre el electrodo.Paraambassustanciasseproduceun desplazamientodelpotencialde pico haciavalores menospositivos(alrededorde 100 mV) y un aumentode la intensidaddepico (+40% entérminosderelaciónseñal-ruido)cuandoseempleael electrodomodificado en comparacióncon el electrodode pastade carbonosin modificar. 4.- Ambos fungicidas se adsorbena circuito abierto sobre la superficie del electrododepastadecarbonomodificado.Esteprocesodeadsorciónpuedeutilizarse como etapade preconcentraciónefectiva antes de llevar a cabo las medidas cuantitativasde los fungicidas,lo que setraduceen un aumentoconsiderablede la 274 Conclusiones intensidadde los picos de oxidaciónobtenidos.La capacidadde preconcentración esmuchomásacusadaenel casodeldisulfiram,probablementedebidoa sucarácter máshidrofóbico y, por tanto, a su mayorafinidad por el aglutinanteapolarde la pastade carbono. 5.- A pesarde quela adsorciónirreversiblede los fungicidassobreel electrodo hacenecesariala renovaciónde la superficieelectródicadespuésde cadamedida,la reproducibilidadde las señalesanalíticaspuedeconsiderarseaceptableinclusoa los niveles de concentraciónmás bajos. Empleandovoltamperometríadiferencialde impulsosen la etapade redisoluciónseobtuvieronlímites de detecciónde7. 1x108 y 2.2xlO~8 mol L” paratiram y disulflram, respectivamente. 6.- Estosresultadospermitenconcluir que los electrodosde pastade carbono modificadoscont’talocianinade cobaltocombinandos aspectosfundamentalesque les confieren gran utilidad analíticapara la determinaciónvoltamperométricade fungicidas como el tiram y el disulfirain, como son preconcentracióny electrocatálisis.Como prueba de ello, el método desarrolladose aplicó a la determinaciónde tiram en muestrascontaminadasde fresas. 7.- Sin embargo, este.electrodomodificado no ofrece tan buenosresultados cuandosepretendióutilizarlocomodetectoramperométricoenanálisisporinyección enflujo. Porunaparte,cuandoseaplicaun potencialconstanteal electrododepasta decarbonomodificado,la intensidadde las señalesFíA va disminuyendoal realizar inyecciones sucesivas de fungicida, probablementecomo consecuenciadel ensucxan>ientoprogresivode la superficie electródicadada la capacidadde los compuestosestudiadosparaadsorbersesobrela superficiedel electrodomodificado. Esteproblemapudoresolversedeformasatisfactoriaaplicandoal electrodoindicador un progran>ade detecciónamperométricade impulsos que altemapolarización anódica(parala detección)y catódica(parala limpieza) del electrodo. Conclusiones 275 8.- Por otro lado, cuandosetrabajaen condicionesde elevadasensibilidad,se observaquela corrientedefondono esestable,sinoqueaumentaconsiderablemente con el tiempo,lo quedalugar a unafalta considerablede exactituden las medidas queimpide la determinaciónde los fungicidasa bajosnivelesde concentración(— io-7 mol L’). Este efecto se debeal hinchamientode la pastade carbonopor el contactoprolongadocon el caudalde la disoluciónportadora. Evaluación cuantitativa de tiram y disulfiram mediantetécnicasquimiométricas multivariantes 9.- La proximidadentrelos respectivospotencialesde las señalesde oxidación electroquímicade tiram y disulfirain mediantevoltamperometríadiferencial de impulsossobre el electrodode pastade carbonomodificado, da lugar a que se obtengaun único pico de oxidación cuando se analizan mezclas de estos dos fungicidas, lo que, obviamenteimpide su determinaciónconjuntaen una misma muestracon un análisisvoltamperométricodirecto. Una manerade resolvereste problemaesmediantela aplicaciónde técnicasquimiométricasmultivariantes,como regresiónpor componentesprincipales(PCR), regresiónpor mínimos cuadrados parciales(PLSR)e inclusoel empleoderedesneuronales.Los mejoresresultados, en términos de menor error en la prediccióncuantitativade mezclasde ambos fungicidas, se han obtenido mediante la aplicación de redes neuronales de propagaciónhacia atrás que introducenelementosde cálculo no linealesen el modelo,siendoposibleasíexplicarunaposiblepérdidade linealidaden las señales analíticasobtenidaspara las mezclasde los fungicidas. 276 Conclusiones Electrodo compósitodegrqfito-teflón 10.- El segundoelectrododesarrolladoha sidoun electrodocompósitodegrafito- poli(tetrafluoroetileno)-teflón-. El materialresultante,conun contenidoenteflón del 40%, presentaunaresistenciamecánicay químicamuy superiora la de la pastade carbono,lo queproporcionaal electrodoresultanteunaseriede cualidadesparasu empleo como electrodovoltamperométricoy como detectorelectroquímicoen sistemasen flujo. 11.- Mediantevoltamperometríade barridolineal seobservóquela adsorciónde tiramy disulfiran> sobrela superficiedel electrodocompósitoesmuchomásfuerte quesobreel electrodode pastade carbonomodificadocon fialocianinade cobalto. Esteefecto,quepuedeestarrelacionadocon la presenciade cargaselectrostáticas superficiales,confiereal electrodouna gran sensibilidaden la respuestaobtenida paralaoxidaciónvoltamperométricadelos fungicidas.Estafuerteadsorcióntambién es responsabledel desplazamientodel potencial de pico de los fungicidashacia valoresde potencialaproximadamente200 mV menospositivoscon respectoa la respuestaobtenidacon un electrodode pastade carbono. 12.- Despuésde cadamedidavoltamperométrica,la superficie del electrodose regeneraelectroquimican>enteaplicandoun potencialde - 1.2 V durante30 segundos, lo queconstituyeunagranventajaconrespectoal empleode los electrodosdepasta decarbonomodificados,querequierenunarenovaciónde la superficiedelelectrodo con pastanueva despuésde cadamedida. Además,graciasa la consistenciadel material electródico,es posible lijar la superficie del electrodopara obtenerun electrodonuevocuandoseanecesario. 13.- En sistemasen flujo, el empleodel electrodode grafito-teflón comodetector amperométricoofrece importantesventajas prácticas, en contraposicióna lo comentado con el electrodo de pasta de carbono modificado. Empleando la Conclusiones 277 metodologíacaracterísticadel análisispor inyecciónen flujo, no se ha observado ensuciamientode la superficiedelelectrodocuandoserealizaninyeccionessucesivas de tiran> y de disulfiran> a cualquiernivel de concentración,a pesarde la fuerte adsorciónde los fungicidassobreestematerialelectródicoobservadaendiscontinuo. Normalmente,la respuestadel electrodo se mantieneconstantedurantetoda la jornadade trabajo sin necesidadde efectuarningún procedimientode limpiezao pretratamientodel mismo. Además,el material electródicono se deteriora en contacto con la disolución portadora,incluso cuandoéstacontieneproporciones elevadasdeun disolventeorgánico.Los límitesde detecciónobtenidosson4.3x108 y 2.0x108mol U’ paratiran> y disulfiran>, respectivamente.La determinaciónde tiram en aguascontaminadasaun nivel de concentraciónde 40 j.tg U’ proporciona recuperacionesentreel 97 y el 103%. 14.- Los procesosde adsorciónquetienenlugar sobre la superficiedel electrodo se han aprovechadopara desarrollar un método de análisis basado en la preconcentraciónpor adsorciónen continuo de los fungicidas. Puestoque sólo originanunaseñalanalíticalasespeciescapacesdeadsorbersesobrela superficiedel electrodoen las condicionesde trabajo, la técnicaes potencialmentemuchomás selectivaqueel análisispor inyecciónen flujo convencional. 15.- Medianteel acoplamientode unapequeñacolumnade separaciónal sistema FíA esposible llevar a cabola separaciónon-line de tiram y disulfiram de forma sencillaen mezclasbinariasde ambosfungicidas. 16.- El electrodocompósitode grafito-teflónestambiénapropiadocomodetector amperométricoen HPLC. La integridadde la matriz electródicaen medios de elevado contenido en disolventes orgánicos, como los que se emplean en cromatografia,constituyeunagranventajaftenteaotrasmatriceselectródicascomo puedeser la pastade carbono. 278 Conclusiones 17.- Otra importanteventajaes, sin dudaalguna,el hechode que el electrodono seensuciatrasinyeccionessucesivasdecompuestosquepresentangranafinidadpor adsorbersesobresu superficie,comopuedensertiram y disulflram, al contrariode lo queocurrecon los materialeselectródicosnormalmenteempleadosen detección electroquímicaen HPLC, comoesel carbonovitrificado, cuyarespuestadisminuye drásticamente,e incluso desapareceal cabode 6 o 7 inyeccionessucesivasde fungicida. 18.- Mediantecromatograflalíquidadealtaresoluciónesposibledeterminartiram y disulfiram en presencia de ziran>. Estos tres fungicidas presentan un comportamientoelectroquímicomuy similar. Todos ellos se adsorbensobre la superficiedel electrodoy susseñalesvoltamperométricassesuperponen,de forma queinterfierenentresí, tanto en continuocomoen análisispor inyecciónen flujo, porlo queseharecurridoa suseparacióncromatográficapreviaa ladeterminación. 19.- La introducciónen el sistemacromatográficode mezclasde derivadosdel ácidoditiocarbámicoqueposeensustituyentesalquilicosdiferentes(metiloenel caso del tiram y ziram, y etilo en el casodel disulfiram), da lugar a cromatogramascon un númerode picos superioral númerode compuestosque se mezclan,lo que implica que,de algunamanera,las moléculasinteraccionanentresí e intercambian los grupos amino, dando lugar a la formación de compuestosque no estaban inicialmentepresentesen la mezcla. 20.- Con fines comparativos,sehan empleadodos configuracionesdiferentesde la célula de flujo: wall-jet y thin-layer. La configuraciónthin-layer resultamás apropiadapara la detecciónamperométricapuestoque se obtiene una mejor repetibilidaddelasseñales,unacorrientede fondomáspequeñay con menosruido y un límite de detecciónmásbajo tanto parael tiram comoparael disulfiran>. Conclusiones 279 21.- A modode aplicación,sellevó a cabola detenninaciónde tiram enmuestras de manzanascontaminadasa un nivel de 0.5 mg de tiran> por Kg de manzana, obteniéndoseunarecuperaciónmediadel97+3%.Estarecuperaciónesmejorquelas reportadasen la literatura, para el mismo tipo de muestray el mismo nivel de concentracióndel fungicida, empleandodistintas metodologíasde HPLC con detecciónultravioleta. y. - BIBLIOGRAFIA Bibliografla 283 1.- M. TeresaSevilla, J. Rodríguez Procopio, J.M. Pinilla y L. Hernández, Electroanalysis,2 , 475 (1990). 2.- DE. Talímany S.L. Petersen,Elec¡roanalysis,2, 499 (1990). 3.- R.N. Adams,Anal Chem.,30, 1576 (1958). 4.- R.N. Adams,Electrochemístryat SolidElectrodes,MarcelDekker,New York (1969). 5.- E.S. 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INTRODUCCIÓN I.1.- OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO I.2.- ELECTRODOS COMPÓSITOS I.3.- ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS SOBRE LA DETERMINACIÓN DE TIRAM Y DISULFIRAM II- PARTE EXPERIMENTAL II.1.- DETERMINACIÓN DE TIRAM Y DISULFIRAM CON UN ELECTRODO DE PASTA DE CARBONO MODIFICADO CON FTALOCIANINA DE COBALTO II.2.- DESARROLLO DE ELECTRODOS COMPÓSITOS DE GRAFITO-TEFLÓN. DETERMINACIÓN VOLTAMPEROMÉTRICA DE TIRAM Y DISULFIRAM II.3.- ELECTRODOS DE GRAFITO-TEFLÓN COMO DETECTORES ELECTROQUÍMICOS EN SISTEMAS EN FLUJO II.4.- DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA EN HPLC CON UN ELECTRODO DE GRAFITO-TEFLÓN. DETERMINACIÓN DE TIRAM Y DISULFIRAM III.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN III.1.- DETERMINACIÓN VOLTAMPEROMÉTRICA DE TIRAM Y DISULFIRAM CON UN ELECTRODO DE PASTA DE CARBONO MODIFICADO CON FTALOCIANIN III.2.- DETERMINACIÓN DE TIRAM MEDIANTE INYECCIÓN EN FLUJO CON DETECCIÓN AMPEROMÉTRICA DE IMPULSOS SOBRE UN ELECTRODO DE PAST III.3.- EVALUACIÓN CUANTITATIVA DE TIRAM Y DISULFIRAM MEDIANTE TÉCNICAS QUIMIOMÉTRICAS MULTIVARIANTES III.4.- DESARROLLO DE ELECTRODOS COMPÓSITOS DE GRAFITO-POLI(TETRAFLUOROETILENO) - TEFLÓN-. DETERMINACIÓN VOLTAMPEROMÉTRICA DE III.5.- ELECTRODOS DE GRAFITO-TEFLÓN COMO DETECTORES ELECTROQUÍMICOS EN SISTEMAS EN FLUJO IV.- CONCLUSIONES V.- BIBLIOGRAFÍA