UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ~53O9578392~ UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DESARROLLO POSTNATAL DE LA ASTROGLIA MEDULAR EN RATON BLANCO “APODEMUS APODEMUS” Tesis que para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas presenta D. Arsenio LAZAR9 GARCIA k CV.. ¡b.Lktú~cnp~o MADRID, JULIO D. Alfredo CARRATO IBAÑEZ, Profesor Emérito y Catedrático del Departamento de Biología Celular de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid y O. Benjamín FERNANDEZ RUIZ, Catedrático del Departamento de Biología Celular de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid. CERTIFICAN: que la Tesis Doctoral que lleva por titulo DESARROLLO POSTNATAL DE LA ASTROGLIA MEDULAR EN RATON BLANCO “APODEMUS APODEMUS”, de la que es autor O. Arsenio LAZARO GARCíA, ha sido realizada bajo nuestra dirección, en el DEPARTAMENTO DE BIOLOGíA CELULAR, de la Facultad de Ciencias de la Universidad Complutense de Madrid. Los directores ——y < 1 <‘1 ¡ / í Madrid, 30 (de Julio, 1091 Le dedico “ESTE LIBRo” a mi hija Gloria A Gloria. A mi padre y hermanos. AGRADECIMIENTOS Quiero dejar constancia de mi agradecimiento especialmente al Prof. Dr. O. Benjamín Fernández Ruiz, director de esta tesis doctoral. Maestro y a la vez amigo. A él le debo la realización de este trabajo. También deseo expresar mi agradecimiento especialmente al Prof. Dr. O. Alfredo Carrato Ibáñez, del que continuamente recibo inolvidables lecciones científicas y humanas; y cuya inestimable codirección, estimulo y ayuda ha hecho posible la consecución de este trabajo. A la Prof. Dra. D~ M~ Teresa Solas Alados, profesora titular del Departamento de Biología Celular, por su amistad y dedicación a que esta tesis sea una realidad. Al Prof. Dr. O. Agustin Zapata González, director del Departamento de Biología Celular, por las facilidades obtenidas en el Departamento para realizar este trabajo y su desinteresada ayuda humana. A la Prof. Dra. D~ Isabel Suárez Nájera, profesora titular del Departamento de Biología Celular y Genética de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Alcalá de Henares, a guien debo útiles sugerencias y correcciones en la realización de este trabajo. A la Prof. Dra. D~ Marimela Bullón, profesora titular del Departamento de Histología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valladolid, por su ensef~xanza y orientación sobre las técnicas inmunocitoquimicas de este trabajo. A O. Agustín Fernández Larios, Técnico del Centro de Microscopia Electrónica de la Universidad Complutense, por su amistad y continua ayuda en las técnicas histológicas y de Microscopia Electrónica. A todos mis compañeros y amigos del Departamento de Biología Celular, que siempre de una u otra manera me han prestado su ayuda, especialmente los Doctores, Lourdes Jimenez, Marta Torroba, Elvira Garrido, Marcelino Bañuelos y Amparo Landete. A mis antiguos compañeros de laboratorio D~ M~ Teresa López Herrero y José M~ Cuesta; y a Elisa León, Mercedes Hernández y Marga Nieto por su incondicional amistad. A Pepa de Cos García, por su ayuda y comprensión al mecanografiar este trabajo. A todos los becarios y personal auxiliar con los que he tenidos la gran suerte de convivir durante mi estancia en el Departamento. Al Vicerrectorado de Investigación cuya beca ha hecho menos gravosa la realización de esta tesis. Al Centro de Microscopia Electrónica de la Universidad Complutense de Madrid por su desinteresado ayuda en la realización de este trabajo. A Gloria, a ti te agradezco sobre todo, el haber soportado esta tesis. ABREVIATURAS a. = astrocito a.e. = astrocito periependimario a.g. = astrocito gemelo a.i. = astrocito interneuronal a.n. = astrocito perineuronal a.n.s. = astrocito perineuronal satélite a.v. = astrocito perivascular a.v.s. = astrocito perivascular satélite c. - cilio c.d. - cuerpo denso c.e. - célula endotelial c.g. - comisura gris C.P. = Cordón Posterior d. = desmosoma e. = ependimocitos E. = Epéndimo E.M.L. = Espacio Maginal de Lissauer f. = gliofibrillas F.M. = Fisura Media g. = glucógeno O. = Golgi h. = hematíe h.f. = haz de gliofibrillas L. - laminillas astrocitarias 1.g. - limitante glial 1. - leptomeninges m. — mitocondria m.b. - membrana basal m.p. - membrana plasmática m.t. - microtúbulo n. - neurona N.S.C. - Núcleo de Stilling-Clarke n.u. = núcleo N.W. = Núcleo de Waldeyer n.t. = neurotúbulo o. = oligodendrocito p. = pericito p.a. = prolongación astrocitaria p.ch. = pie chupador p.e. = prolongación ependimaria p.e.l. = prolongación ependimaria laminar p.e.t. = prolongación ependimaria triangular p.n. = poro nuclear r. - ribosoma r.e.r. - retículo endoplásmico rugoso s.a. - soma astrocitario S.B. - Sustancia Blanca S.G. - Sustancia Gris S.G.R. = Sustancia Gelatinosa de Rolando S.P. = Surco Paramedular S.M.D. = Surco Medio Dorsal T. = Tanicito y. = vaso sanguíneo INDICE Págs . INTRODUCCION I.Antecedentes históricos y caracteres estructurales de la neuroglia 1 II.Proteína Gliofibrillar ácida 15 III.Concepto y Estructura básica de la médula cervical 17 IV. Justificación del Trabajo 20 MATERIAL Y METODOS 21 I.Microscopía Optica 22 II. Inmunotinción para la G.F.A.P 23 III. Microscopia Electrónica 29 RESULTADOS OBTENIDOS I.En Microscopia óptica 31 A. Sustancia Gris 35 Astas ventrales 36 Núcleo medial 36 Núcleo ventral 38 Núcleo lateral 39 Astas laterales 41 Núcleo latero ventral 41 Núcleo lateral intermedio 42 Núcleo latero dorsal 42 Astas dorsales 43 Núcleo de Stilling-Clarke 43 Núcleo Propio 44 Sustancia gelatinosa de Rolando 44 Núcleo de Waldeyer 45 Zona marginal de Lissauer 45 E. Epéndimo y Areas periependimarias 45 C. Sustancia Blanca Zona Ventral Limitante Subpial. Fisura Media Ventral Zonas Laterales Zona lateral limitante (franja subpial externa) Zona lateral que contacta con sustancia gris Zona lateral media Zona Dorsal Zona limitante dorsal , como células en bastoncillo, encontradas en la parálisis general progresiva y que Río Hortega las interpretó como microglía patológica. 2Q) Oligodendroglía, Río Hortega (1921), es el tipo celular que difiere de las de astroglía, por presentar un núcleo denso, citoplasma escaso, ausencia de fibrillas y escasas prolongaciones. En la actualidad, las técnicas de impregnación metálica de Cajal y Río Hortega siguen siendo válidas para distinguir con detalle los diferentes tipos celulares ya reseñados y han hecho posible el desarrollo de la síntesis clasificatoria siguiente: NE1J~GLIA DE tP10E24 EXYI’ODF2~QW * fi el Bis-tau Nervioso Cextral Glia Aruiotrcpa: Astrccitcs Fibrcas Astr~itns Protrpláanicr,s - Gua Eperdinaria: - Olía Neurotxtpa: - Olía Espaiales: E~en3innzitras Tanici~ Glial radial (Untitanteexterna) Rakic, 1982 Oligzderdrtritcs interfa~ioilares Oligcx5enirccitosperineurcriales o satélites. Células Bergmann,en Iriquilla (cnrebelo) Celulas de FaI’~anás (C.eretelo) Células de Miller (~tina) Pituicitns, (Neuntip5fisis) —3- * Era el Sistsra Nervioso P~iféríw — Células satélites que ralean las renn~as garqlicnares - CélulasSc±Mann,(kntlcgasa los oligx5endrcciús del SistenaNervica, Cenfral> - Teloglía. Fn las tenniraiicres rerviosas periféricas. NWJÉGUA DE QW~24 ME~WE~?’Ja~ * Micrc.iglia Para nuestro trabajo nos vamos a centrar en el estudio de la astrología principalmente, si bien de manera colateral consideraremos otros componentes gliales. Son muchas las diversas clases de astrocitos que se han propuesto a lo largo de los años, pero no se ha podido determinar si representan realmente distintos tipos celulares, o son formas transicionales correspondientes a distintos estadios de maduración o diversas expresiones de una célula de gran plasticidad y capacidad de adaptación a los distintos territorios del Sistema Nervioso, Rakic (1982). Así por ejemplo, la llamada gua radial, por las relaciones que establece con la superficie subpial es hoy considerada como subcategoría de los astrocitos fibrosos, Schrneckel y Rakic (1973, 1979a, 1979b), Choi y Lapham (1978, 1980), Choi (1981). Con la técnica del oro-sublimado de Cajal (1913) se puso en evidencia que el soma de los astrocitos es asteriforme, con un núcleo esferoidal o ligeramente ovoide, claro y pobre en cromatina, con un diámetro que oscila entre cuatro y seis p. Las prolongaciones citoplasmáticas alcanzan entre las veinte y las cincuenta p. de longitud; que salen del cuerpo celular en disposición radial dando a la célula un aspecto aracniforme. -4- Este tipo celular es fácilmente alterable, y en un principio se pensó, con preparaciones pobremente fijadas, que su citoplasma era acuoso, hasta que con tejidos bien fijados de material normal, se comprobó que no es así, sino que sus mitocondrias estaban con un grado de turgencia hidrópica que las hacia desintegrarse por estallido. En material bien fijado las organelas están normalmente distribuidas por todo el citoplasma, como en células de otros tejidos, Mugnaini y Walberg (1964), Kruger y Maxwell (1967), Vaughn y Peters <1967, 1971), Palay y Chan-Palay (1974>. También se observó en las expansiones y estructuras somáticas en torno al núcleo de los astrocitos fibrosos unas gliofibrillas dispuestas longitudinalmente, dándoles el significado de estructuras esqueléticas citoplásmicas específicas de estas células, observables con microscopio óptico. Con M.E. se han observado también en el seno del citoplasma, gliofilamentos de 8 nni. de diámetro frecuentemente asociados a microtúbulos, granos de glucógeno, un número moderado de mitocondrias y de cisternas del retículo endoplásmico rugoso, un aparato de Golgi poco desarrollado, lisosomas primarios y secundarios, así como cuerpos residuales células adventiciales especiales, (células de Rouget o pericitos), aplicadas contra el capilar en un desdoblamiento de su membrana basal 2) monocitos de la sangre que atraviesan la pared capilar. En tanto quedan aclaradas todas estas hipótesis, la primitiva de Río Hortega permanece como la más sólida. Los microgliocitos, (células en bastoncito de Caj al), son células pequeñas, alargadas, con núcleo ovoide, igualmente alargado y rico en cromatina, estando recubierto por muy escaso citoplasma; de este último surgen abundantes y finas prolongaciones, preferentemente bipolares, no muy largas y con numerosas dicotomías, de contorno espinoso. El método de Río Hortega las impregna de un color negro intenso que refleja su silueta. Con métodos de coloración por anilinas se aprecia un núcleo denso en cromatina y un citoplasma finamente granujiento, que al M.E., muestra un retículo endoplásmico granular bien desarrollado y numerosos cuerpos densos de naturaleza lisosóniica. Su topografía es universal, en pleno tejido nervioso de los centros, tanto en la sustancia blanca como en la gris, aunque su proporción varíe de unos puntos a otros. Contactan lo mismo con neuronas que con otras células gliales y están desprovistas de pies vasculares - Lo verdaderamente notable en estas células microgliales es su coducta en condiciones anómalas, de injuria local en cualquier territorio de los centros nerviosos. La formación de un foco necrótico estimula a los microgliocitos en el triple sentido de: a) prescindir de sus prolongaciones por autoniutilación (clasmatodendrosis) b) agrandar su cuerpo y dividirse - 13 — c) actuar finalmente comomacrófagos, desplazándosehacia el foco necrótico y fagocitando partículas de regular tamaño que son objeto de una digestión lisosómica. La fagocitosis va acumulando residuos intracitoplasmáticos en los que predominan gotas lipoides, que distienden enormemente la célula y aplastan el núcleo . Los aminoácidos más abundantes fueron: ácido aspártico, glutamico, alanina, leucina y arginina; y los menos: histidina, prolina, y metionina, no existiendo prácticamente nada de cisteina. Estos valores concidían también con los obtenidos químicamente para células de neuroglía en años anteriores, por lo que se concluyó; fuera el mayor constituyente de las fibras de los astrocitos. — 15 — El alto contenido en: ácido aspartico y ácido glutámico, hacia que se tratara de una proteina ácida simple. Esta proteína no era similar a otras proteínas ácidas comparadas con ella. Filarina, aislada por Huneeus y Davison, (1970), proteína S-lO0, aislada por Cícero y cols., <1970); Tubulina, la subunidad de los microtúbulos aislada por Davison y Huneeus., (1970); si bien esta proteína presentaba algunas caracterícas en común, como la precipitación con Vinblastina e iones de Calcio. Posteriormente se observó que esta propiedad la presentaban todas las proteínas ácidas, Wilson. y cols. (1970). Tampoco observó ninguna semejanza con la alfa- queratina a pesar de que una de las conclusiones de los trabajos de Bairati, <1958), fuera que la proteína fibrillar astrocitaria debía ser clasificada, como una alfa-queratina. La G.F.A.P., fue también estudiada con la técnica de electroforesis, Eng. y cols. (1971), la fase soluble, se fraccionó por precipitación con sulfato amónico y Cl2Ca a pH~ 7,5, también se realizó una precipitación con vimblastina lnill. La fracción soluble resultante y la precipitada con sulfato amónico se volvieron a redisolver en tampón fosfato, 0,05 M. Bairati, <1957) y Eng., y cols. (1968), llevando la solución a un gel de poliacrilamida en el cual se examinaron los resultados del proceso electroforético. El residuo insoluble fue disuelto en mezcla de fenol-ácido fórmico-agua y examinados los discos de poliacrilamida con un pH=l. La electroforesis demostró, que una proteína ácida simple, migraba como una banda a pH=8,9 y en el otro proceso, como otra banda a pH=l. Esta proteína era por tanto el mayor componente de ambas fracciones, soluble e insoluble, de las proteínas extraídas de los tres tejidos patológicos. Posteriormente se utilizó dodecil-sulfato sódico, Eng. y cols., (1973-1979), para su extracción, y posterior análisis en los discos del proceso electroforético, pudiéndose observar que existían en realidad dos bandas, una mayor que correspondía a esta proteína ácida neuróglica con un Pm. entre 47.000 y 51.000, y otra que pertenecía a las proteínas de los neurofilamentos de células nerviosas, porque tenía un peso molecular mucho más elevado. — 16 — CONCEPTO Y ESTRUCTURA BASICA DE LA MEDULA CERVICAL La médula cervical está formada por los ocho primeros segmentos a partir del agujero occipital de la medula espinal; junto con la zona lumbar, es una de las zonas más anchas de diámetro de la médula. Funcionalmente es en origen una estructura segmentaría con imbricación de cada zona con sus dos inmediatas vecinas. Anatómicamente recibe información por las raíces dorsales y emite impulsos efectores por las raíces ventrales. Constituye una estructura continua, más o menos cilíndrica alargada y encerrada en las piezas óseas segmentarias, las vértebras. En corte transversal de tejido fresco, se aprecian dos tonos de color, por lo que se la dividió en sustancia gris la zona más interna y oscura y sustancia blanca la más externa, que envuelve por completo a la gris. La sustancia gris presenta forma de H o mariposa y aproximadamente en su centro se encuentra el canal ependimario. En ella se agrupan los somas neuronales formando agrupaciones más o menos compactas, los núcleos. Topográficamente se divide en tres zonas: la) Astas Motoras o Ventrales. 28) Sustancia Gris Intermedia. 38) Astas Sensitivas o Dorsales. En las Astas Ventrales se encuentran: los Núcleos medial anterior, medial posterior, núcleo ventral anterior, ventral posterior, lateral anterior y lateral posterior. En cada lado de la sustancia gris intermedia se encuentran los Núcleos laterales ventral y dorsal y ventromedial. En las Astas Dorsales, el núcleo funicular dorsal, el núcleo de Stilling- Clark, el núcleo propio, la Sustancia Gelatinosa, el núcleo de Waldeyer y el espacio Marginal de Lissauer. La Sustancia Blanca; está formada por las fibras nerviosas que se agrupan en haces y funículos. En el plano sagital se forman en los mamíferos dos surcos longitudinales; el surco ventral, muy profundo, y el posterior, muy superficial y continuado hacia dentro con el tabique dorsal medial de fibras neuróglicas astrocitarias. - 17 - En corte transversal la Sustancia Blanca, se divide en tres funículos o cordones: Ventral, Lateral y Dorsal. El Ventral o anterior lo delimitan las raíces anteriores y la fisura media anterior y en él encontramos los siguientes funículos: a) cortico-espinal directo espino-talámico anterior. El cordón lateral viene delimitado entre las raíces dorsales y ventrales y en el se encuentran los siguientes funículos: a) espino-talámico lateral b) espino—cerebeloso ventral (Haz de Gowers) c) espino—cerebeloso dorsal (Haz de Flechsig.) d) retículo-espinal lateral e) rubro espinal f) cortico-espinal cruzado como de las raíces dorsales y llegan al encéfalo alcanzando diferentes niveles y relevándose una o más veces en el trayecto de la vía nerviosa (fibras ascendentes). Las particularidades estructurales de la médula cervical radican en que por ser el territorio medular más próximo al encéfalo, es en donde mayor número de haces mielinicos se encuentran. En esta región la proporción de sustancia blanca con la de sustancia gris es muy favorable a la primera — 19 — JUSTIFICACION DEL TRABAJO La médula espinal representa la parte más primitiva del Sistema Nervioso Central de los vertebrados y básicamente conserva un patrón invariable en cuanto a su estructura propia, variando con la evolución la cada vez más compleja aportación de aferencias y eferencias respecto a los tejidos extraneurales y respecto al encéfalo. Funcionalmente tiene una autonomía segmentaria, en relación principalmente con los derivados de los somitas embrionarios. El gran acúxnulo de músculos y receptores que supone el desarrollo de las extremidades condiciona una hipertrofia de los segmentos correspondientes, cervico- torácicos y lumbares. Es pues de mayor rendimiento el estudio de la médula cervical con sus ocho segmentos definidos por los correspondientes ganglios sensitivos y raíces motoras. La distribución de los grupos neuronales y de los haces funiculares de la sustancia blanca presenta todavía muchos problemas por resolver, sobre todo en el orden comparativo de los vertebrados, pero en conjunto se ha llegado a un conocimiento bastante satisfactorio. Está menos avanzado sin embargo, lo concerniente a la distribución del componente glial y sus relaciones histológicas con las demás estructuras del tejido a este nivel. El estudio de esta parte del problema en la médula cervical del ratón blanco ha sido el móvil que ha justificado el desarrollo de la presente investigación, aplicando todas las técnicas clásicas de Cajal y de Río Hortega, a las que se añaden las de visualización de la proteína glial ácida y un complemento de observación o microscopia electrónica. En concreto pretendemos, al igual que se conoce el patrón de distribución de los haces en la sustancia blanca y de los núcleos en la sustancia gris, establecer la correspondiente distribución a lo largo del desarrollo postnatal de los componentes, astrocitarios. La médula cervical nos pareció por su particular estructura un modelo idóneo. - 20 - MATERIAL Y METODOS Hemos empleado 102 ratones blancos, divididos en 30 grupos, y cada uno de estos grupos se formé con 3 ejemplares sin distinción de sexos. Estos grupos se fueron sacrificando diariamente a partir del momento del nacimiento hasta el día treinta, estableciéndose así los 30 primeros grupos de ratón como R—1, ¡(-2, ¡(—3, etc. A partir del día 30 se sacrificaron cuatro lotes de tres animales adultos con edades de 60 y 120 días. De cada grupo de tres ejemplares, uno de ellos se destiné para fijación en formol al 10% formando la serie 1, otro para fijación en ES, formando la serie II, ambas series para examen con M.O. El tercero se destinó para fijación con Glutaraldehido-Milloning formando la serie III y posterior examen con M.E. Los dos últimos grupos de adultos además fueron procesados para impregnación de la neuroglía con una variante del método de Golgi. En los grupos comprendidos desde el día O a día 5, se sacrifican los ejemplares por decapitación y se extrajo la médula junto con las vértebras sin laminectomía. En el resto de los ejemplares se realizó la fijación con perfusión a través del bulbo aórtico y posteriormente fue extraída la médula con laminectomía. El segmento de médula elegido para nuestro estudio fue el cervical, comprendido entre el agujero occipital y la primera vértebra dorsal que, por su situación, es más asequible que el resto de la médula. La médula de cada uno de los ejemplares se dividió en tres partes iguales, destinándose dos de ellas para ser orientadas transversalmente, y una tercera longitudinalmente, pasando a la cofección de bloques tanto de parafina como de Araldita. - 21 - METODOS DE MICROSCOPIA OPTICA Los métodos empleados son técnicas histológicas sobre cortes de 10 >t en los bloques de parafina, l,5p. para los de Araldita semifinos y 50 p. en las piezas procesadascon el método de Golgi. Los ejemplares fueron anestesiados por inyección intraperitoneal con Uretano al 15% en agua destilada. Fijación: Se realizó previa perfusión en el bulbo aórtico de una solucIón salina. Fijación 1: Como fijador general para microscopia óptica se ha empleado formol al 10% a pH neutro en el grupo 1. Fijación II: Las médulas de cada uno de los animales sacrificados de la serie II, se fijaron en B-5 durante 4 horas a una temperatura de 40C y se realizó una postfijación de las piezas en alcohol de 700 donde pueden permanecer indefinidamente hasta el momento de la inclusión. DESHIDRATACION E INCLUSION EN PARAFINA DE LAS SERIES 1 Y II Etanol 70% 1 h. Etanol 96% 1 h. Etanol 100% 1 h. Etanol 100% 1 h. Xilol 1/2 h. Xilol 1/2 h. Parafina 12 h. ORIENTACION DE BLOQUES EN PARAFINA DE LAS SERIES 1 Y II Se orientaron fragmentos de médula tanto transversalmente como longitudinalmente para practicar luego los cortes en todos los animales a diferentes días. La obtención de los cortes fue mediante un microtomo tipo MINNOT de la casa REICHERT. OM.U3. Los cortes obtenidos fueron desecados en una estufa a 37W durante 24 h. antes de proceder al desparafinado y posterior inmunotinción. - 22 - TINCIONES REALIZADAS EN LAS SERIES 1 y u PARA N.a. 1Q Método de los anticuerpos no marcados. Peroxidasa antiperoxidasa. (Sternberger, 1970). Técnica para los cortes de parafína (Taylor, 1974, 1978>. 2Q Luxol - Fast-blue - PAS - Azul de toluidina. 3Q Médoto de Golgí. e> Aplicación de suero no inmune de cerdo, diluido 1:20 para disminuir la tinción inespecífica, durante 20 minutos. f) Incubación con suero anti-G.F.A.P. de conejo antí- humano a una dilución 1 : 500 en T.B.S. durante 30 minutos. g> Lavado con T.B.S. <2 lavados de 5 minutos). - 23 — It Incubación con IgG de cerdo antí-conejo, a la dilución 1:20 en T.B.S. durante 30 minutos. i) Lavado con T.B.S. (2 lavados de 5 minutos). j) Incubación con peroxidasa antí-peroxidasa (PAP) de conejo a la dilución 1 : 100 en T.B.S. durante 30 minutos. 1<) Lavado con T.B.S. (2 lavados de 5 minutos). 1> La actividad peroxidasa fue revelada con 3,3’ diaminobenzidina (D.A.B.) 0,05% y H202 al 0,0015% en tampón tris al 0,05 M. m) Lavado en agua corriente 2 o 3 minutos. n> Tinción de contraste con hematoxilina de Harris durante 1 minuto. ñ) Lavado en agua corriente. o) Deshidratación; en alcoholes sucesivos de concentración creciente. p) Aclarado en Xilol de 1/2 a 1 h. q) Montaje. En D.P.X. o bien en Bálsamo. 1.1 REACTIVOS: BUFFER - TRIS - SALINO (T.B.S.> Tris 0,605 gr. Cloruro sádico 8,0 gr. Acido clorhídrico lN 3,8 ml. Todo se disuelve en agua destilada hasta completar 1 1. y se ajusta el pH a 7,4 - 7,6. - 24 - SOLUCION DE (D.A.B.) Disolver 50 mg. de D.A.B. en 100 ml. de T.B.S. y añadir 0,15 cc. de agua oxigenada de 10 y. Esta solución ha de prepararse en el momento y manejarla con sumo cuidado debido al posible carácter cancerígeno de la D.A.B. HEMATOXILINA DE HARRIS tapando el frasco y dejar reposar 12 horas después de agitar. 30 Añadir 2 g. de carbón activado, agitar y filtrar inmediatamente. Se conserva durante varios meses en oscuridad y nevera. Reactivo de Itikansa y Oguru. Se sustituye el Azul de toluidina 0,1 g. Acido acético al 3% 1000 ml. Metabisulfito sódico al 5% Diluir 1 : 1 en Metabisulfito al 1,9 % en CLH al 12%. - 26 - METODO a. Desparafinar. b. Hidratar, hasta etanol de 950 c. Teñir con luxol a 560 - 600C toda la noche. c. Aclarar en etanol de 960 para eliminar el exceso de colorante. e. Diferenciar con carbonato de litio unos segundos, y luego con etanol de 70% también durante unos segundos, controlándolo bajo el microscopio. E. Sumergir en agua destilada para detener la diferenciación y aclarar en otro baño de agua destilada 5 minutos. g. Oxidar con ácido peryódico 10 minutos. h. Aclarar en dos baños sucesivos de agua destilada. 1. Tratar con el reactivo de Schiff diluido durante 10 minutos. j. Aclarar en tres baños de 2 minutos cada uno con metabisulfito. k. Lavar 15 minutos en agua. 1. Aclarar en agua destilada. m. Teñir con Azul de Toluidina de 20 a 30 segundos. También se puede contrastar con violeta de cresilo o hematoxilina. n. Diferenciar rápidamente con etanol de 7Q0, ñ. Deshidratar muy rápidamente en etanol de 7O~. o. Aclarar y montar en D.P.X. 3. METODO DE GOLOI (Nitrato de Plata) Según Bubenaite Hemos empleado dos series de ratones adultos de 60 y 120 días. Después de sacrificarlos por decapitación y extraer sus médulas cervicales por laminectomía. FIJACION: Sumergir las piezas durante un día y medio en un baño de: Hidrato de cloral 3 gr. Bicromato Potásico 3 gr. Formol al 10% 50 ml. - 27 - TINCION: a. Se pasan directamente las piezas a un baño de: Nitrato de plata en agua al 1% durante un día a una temperatura de 300C. b. Lavar rápidamente en agua destilada. o. Sumergir las piezas en: Etanol de 1000 durante 3 o 4 horas Tolueno unos 3 o 4 minutos. c. Se vierte sobre las piezas: Parafina de 6O~ para hacer los bloques y así quedan las piezas enclaustradas. e. Se realizan cortes de 30 o 40 p. f. Lavado rápido de los cortes en toluol. g. Pasar los cortes a etanol de 1000 donde pueden permanecer tiempo indefinido. h. Montar en D.P.X. o bien en Bálsamo - 28 - METODOS DE MICROSCOPIA ELECTRONICA ANESTESIA: Se procedió a la anestesia de todos los ejemplares. (SERIE III), excepto los de días O a 5, por inyección intraperitoneal de: Uretano 3 gr. en 20 ml. <15% en agua destilada/Kg. de peso). FIJACION: Se procedió a la fijación por perfusión a través del bulbo aórtico durante 1 minuto con solución lavadora y durante 15 minutos con la solución fijadora de glutaraldehido, Millonig FIJADOR: Un 20% de glutaraldehido al 25% y 80% de tampón. Después de la fijación durante 4 horas a 4W, se obtuvieron pequeñas piezas de las médulas. Se procedió a continuación al lavado con tampón más glucosa durante 40 minutos <4 cambios de 10 minutos) y postfijación con tetraóxido de osmio al 2% en tampón durante 2 horas. finalmente después de lavar con tampón toda la noche, se incluyó el tejido en Araldita. INCLUSION EN ARALDITA: Lavado en agua destilada de las piezas que provienen del tetraóxido de osmio. 1-3 de la casa Reichert. Los cortes semifinos se tiñeron con azul de Toluidina 0,5 gr., bórax 0,5 gr. y agua destilada 100 ml. a 60W y se estudiaron en un microscopio óptico. Los cortes ultrafinos se recogieron en rejillas con soporte de formvar. Se tiñeron durante 5 minutos con citrato de plomo y se observaron en un microscopio JEOL 100B del Departamento. - 30 - RESULTADO DE MICROSCOPIA OPTICA - 31 - GLIOARQUITECTURA DE LA MEDULA CERVICAL EN RATON ADULTO — 32 - MEDULA CERVICAL DE RATON ADULTO INDICE A) DISPOSICION DE LA ASTROGLIA EN MEDULA CERVICAL DE RATON ADULTO CON INMUNOTINCION PARA LA PROTEINA GLIAL- FIBRILLAR-ACIDA Núcleo de Waldever c) Sustancia gelatinosa de Rolando d) Núcleo propio e> Núcleo de Clarke 2Q EPENDIMO: a) Ependimocitos b) Capa externa c) Capa interna d) Zona periependimarias 3Q LIMITE ENTRE LA SUSTANCIA GRIS Y LA SUSTANCIA BLANCA 4Q En la SUSTANCIA BLANCA: 4.1 Zona Ventral 4.1.1 Limitante subpial 4.1.2 Fisura media ventral 1.1.1 1.1.2 1.1.3 - 33 - 4.2 Zona 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3 Zona 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 Laterales Zona lateral limitante (franja subpial externa) Zona lateral que contacta con sustancia gris Zona lateral media (con núcleos y haces nerviosos) Dorsal Zona limitante dorsal medulares - 20 Respecto a la variación morfológica de los astrocitos en las distintas áreas medulares. 1) SUSTANCIA GRIS Se ha observado G.F.A.p. positiva en los somas, prolongaciones somáticas de los astrocitos protoplásmáticos de forma idéntica en conjunto a la de los astrocitos fibrosos de la sustancia blanca, aunque vistos en detalle muestran prolongaciones espinosasy una relación topográfica especial con las fibras neuronales. Los astrocitos de la sustancia gris exhiben prolongaciones más cortas y abundantes que los de la sustancia blanca. En algunas ocasiones todas estas prolongaciones emergen de una región limitada del citoplasma, opuesta a la ocupada por el núcleo, que queda así en una situación excéntrica. La distribución medular de estos astrocitos protoplásmicos ha sido estudiada en relación con los distintos grupos neuronalesde las astas ventrales, laterales y dorsales, que forman esta sustancia gris, ya que en este caso, se visualizan bien las neuronas. También en este caso hemos preferido la distribución de núcleos, a la laminar (Rexed 1954) (Steiner 1972) Núcleo latero ventral b) Núcleo lateral intermedio c) Núcleo latero dorsal 1.1.3 Area Dorsal: BASE a) Núcleo de Stilling-Clarke CUELLO b> Núcleo propio CABEZA a) Sustancia gela- tinosa de Rolando b> Núcleo de Waldeyer c) Zona marginal de Lissauer Es difícil delimitar de forma nítida, en la sustancia gris, el contorno de núcleos contiguos, en realidad se trata de áreas, que es como las vamos a denominar. (Fig. 1> Esquema. 1.1.1 Area Ventral. Núcleo medial ventral: Es una agrupación de motoneuronas que sitúa sus limites ventral y lateral en la frontera con la sustancia blanca ventral más próxima a la fisura media. Su forma en conjunto es redondeada, (Fig. 2) y los somas neuronales que lo pueblan son de dos tipos: a) Células poligonales o triangulares, (Fig. 3) con expansiones filamentosas multipolares, . La trama de astrocitos protoplásmicos, en este área, continua a la zona del cordón anterior, es la más densa de la médula y no presenta distribución uniforme sino que los astrocitos se encuentran dispersos por toda el área, situándose sus somas en los espacios libres que dejan las neuronas, sin limite topográfico definido, (Fig. 8) Los somas de estos astrocitos protoplásmicos encontrados, emiten prolongaciones muy polimorfas, que se entrelazan con las fibras neuronales de formas muy variadas: a) Motoras triangulares multipolares. Algunos somas astrocitarios se disponen adosados a somas de estas neuronas. Queda a veces un pequeño espacio posiblemente artefacto de retracción entre ambos somas celulares. Se trata de astrocitos perineuronales, que envían una sola prolongación, que discurre paralela a una expansión neuronal. (Fig. 9) La yuxtaposición de los somas gliales se verifica en cualquiera de los dos lados lateral o medial de las neuronas. . b> Motoras bipolares. Van también acompañadas de astrocitos perineuronales, ocasionalmente son dos los astrocitos que emiten sus únicas prolongaciones en sentidos opuestos, uno de ellos con su soma adosado al de la neurona se aprecia también otro pie vascular de mayor tamaño, perteneciente a algún otro astrocito cuyo soma está en otro campo microscópico . También se han observado somas neuronales ovoideos dispuestos en fila entre algunas prolongaciones astrocitarias largas, de tal modo que una sola prolongación astrocitaria abarca varios somas neuronales y posteriormente se ramifica entre dos o tres neuronas (Fig. 28). En un área próxima, perteneciente ya al Núcleo Intermedio Dorsal, se encuentran mayoritariamente, astrocitos con somas muy polimorfos. (Fig. 29) Algunos de ellos emiten todas sus — 39 — prolongaciones en un solo sentido, a partir del soma (Fig. 30>. Rastreandoeste área, se han detectado astrocitos cuyo soma está colocado entre dos somas neuronales, se trata de astrocitos interneuronales, que emiten dos prolongaciones una más gruesa y larga en ambos sentidos, entre las neuronas; y otra más corta, originada por dictomia de la primera y ramificada hacia el soma de una de las neuronas. En algunos casos la cobertura astrocitaria para la neurona es solo parcial (Fig. 35). En esta zona, también se encuentran astrocitos con somas triangulares, similares a los del núcleo ventral pero de menor tamaño y con algunas prolongaciones sin espículas. (Fig. 36). Por último, mencionar que estas áreas ventrales o zona sensorial motora, tiene una distribución astrocitaria que no difiere básicamente de la descrita (dibujo esquemático de núcleos) para los núcleos que la pueblan, con una mayor densidad en los núcleos ventrales próximos a la Fisura Media Ventral y por tanto a la zona periependimaria ventral. Tampoco se encuentran diferencias significativas, en la relación que estos astrocitos mantienen con neuronas motoras triangulares multipolares, como con las bipolares ovoideas y vasos. - 40 - 1.1.2 Arcas laterales de la sustancía gris: En las últimas vertebras de la médula cervical, tiene lugar la formación de una protuberancia dorsal en la sustancia blanca que rodea parcialmente al Núcleo Intermedio Medial y al Núcleo Intermedio Lateral. Ambos núcleos forman el área que denominamos como Lateral y reciben la información visceral o interoceptiva. El núcleo intermedio lateral, está formando lo visceral sensitivo de estas astas laterales y está localizado a continuación de la zona somato-sensitiva que forman las astas dorsales. Sin embargo, el núcleo intermedio medial está formando lo visceral motor de estas astas laterales y se localiza a continuación de las astas ventrales que formaban la zona somato motora medular. En este caso también hemos considerado la localización de estos dos núcleos como una única área, en la que se aprecia con pocos aumentos como el número de astrocitos del núcleo intermedio medial es muy escaso en comparación con los del intermedio lateral, sobre todo en su zona dorsal . En este límite entre la sustancia gris y blanca es muy frecuente el hallazgo de astrocitos alineados, dentro de la sustancia gris, contactando sus prolongaciones con las de otros de la sustancia blanca . En este área del núcleo intermedio lateral se han observado algunas parejas de astrocitos que contactan mutuamente sus prolongaciones, para posteriormente deshilacharse a corta distancia del soma, posiblemente estas uniones de contacto entre prolongaciones tan finas, sean uniones estrechas o mácula adherens, dato que se confirmará con M.E. Al mismo tiempo uno de los astrocitos envía otras prolongaciones más gruesas hacia un vaso que se encuentra justo en el límite con la sustancia blanca. No se observa inniunotinción positiva en todo el contorno vascular, a excepción del lugar donde estas prolongaciones contactan con él . En el segundo caso se aprecian astrocitos que adosan no sólo los pies vasculares, sino también parte de su soma a la pared - 42 - vascular, son por tanto astrocitos satélites perivasculares . En el interior de este núcleo de Clarke, la densidad astrocitaria aparentemente asciende, encontrando astrocitos que envían sus prolongaciones en diferentes sentidos (Fig. 54). A veces se observan neuronas rodeadas, por astrocitos que disponen su soma y prolongaciones sobre un soma neuronal bipolar y una de las dos fibras nerviosas; la otra en dirección opuesta, a cargo de la prolongación de otro - 43 - astrocito, quedando por tanto la neurona prácticamente rodeada en todo su contorno por el componente astrocitario . Por encima del Núcleo de Stilling Clarke se encuentra el núcleo Propio, bastante bien delimitado, por su alta densidad en somas neuronales. Los axones de estas neuronas son decusantes hacia la sustancia blanca y en ella se mielinizan (Fig. 56). La densidad astrocitaria es aparentemente bastante mayor que en los casos anteriores, y los tipos astrocíticos encontrados son los siguientes: lQ Los típicos astrocitos de cuyo soma piriforme parten cuatro o cinco prolongaciones en sentido contrario al resto de dicho soma. (Fig. 57> 2Q En la zona próxima a la sustancia blanca se ha encontrado un astrocito que adosa su soma pequeño y una prolongación somática gruesa a una neurona, tratándose por tanto de un astrocito perineuronal satélite . que discurren entre las neuronas de niveles más profundos de las astas y contactan con las prolongaciones cortas de astrocitos fibrosos de la sustancia blanca (Fig. 65). Es difícil definir la relación entre astrocitos del espacio marginal de Lissauer y los de la sustancia blanca de esta zona, pero en ocasiones se observa que las prolongaciones astrocitarias largas ya citadas, de la sustancia gris, van también acompañadas de otras más cortas hacia la sustancia blanca para formar parte de la limitante externa (Fig. 6~>. Las prolongaciones largas, de estos grupos de astrocitos discurren especialmente, en los sitios próximos a la entrada de las raíces dorsales, y esta glioarquitectura se mantiene fundamentalmente en todos los cortes frontales (Fig. 6&4. En la zona próxima al límite con la sustancia blanca los somas astrocitarios envían sus prolongaciones finas hacia los haces de fibras gruesas para formar parte de ellos (Fig. 67). Con esta zona marginal de Lissauer, finalizamos, la descripción glioarquitectónica de las astas dorsales que sin duda, presentan aparentemente la densidad astrocitaria más baja, de toda la médula cervical, sobre todo comparándolas con las astas ventrales. 2.9 EPENDIMO Y AREAS PERIEPENDIMARIAS Se han considerado estas zonas en el ratón, como la lámina X de la organización laminar de , que abarca el epéndimo, - 45 - zonas periependimarias dorsal, ventral y laterales, también se incluyen las comisuras grises ventral y dorsal . - 46 - Esta zona periependimaria dorsal, abarca desde el mismo epéndimo hasta la comisura gris dorsal profunda; en ella se encuentran, además de las prolongaciones largas ependimarias descritas anteriormente, unos tipos astrocitarios, que sólo difieren del resto de la sustancia gris en su menor tamaño (Fig. 75). En la zona subependimaria o ventral ependimaria los propios ependimocitos y los somas astrocitarios son los que contribuyen a la formación de las dos limitantes, interna y externa, también van apareciendo algunos astrocitos con múltiples prolongaciones de mediano grosor. Estas prolongaciones se dicotomizan varias veces y cierto número de ellas atraviesan el plano sagital, hasta adelgazar y perderse en el lado opuesto. En una zona todavía más ventral, estas prolongaciones se hacen mucho más finas entrecruzándose entre ellas, formando todo un entramado astrocitario, todas son innunotinción positiva . En las zonas laterales periependimarias el número de astrocitos es también inferior al de la zona ventral, pero tienen el mismo tamaño que los de toda la zona periependimaria restante a excepción de los dorsales (Fig. 75>. Es muy frecuente encontrar en estas zonas, vasos de gran tamaño, con importantes relaciones astrocitarias protoplásmicas. En una zona lateral próxima al epéndimo . Sin embargo, a medida que nos acercamos a las zonas más laterales próximas a la sustancia blanca, se observan largas prolongaciones astrocitarias, que se entrecruzan con las de los astrocitos fibrosos, encontrando también un nuevo tipo de astrocitos intermedios entre protoplásmicos y fibrosos, astrocitos mixtos (Fig. 81). En general, corno capa interna del epéndimo, hemos observado, tanto prolongaciones astrocitarias con diferentes formas . Las prolongaciones finas de astrocitos fibrosos dorsales también participan en la formación de la comisura gris dorsal (Fig. 84). En la comisuragris dorsal, prolongaciones de astrocitos, contribuyen a formar una frontera discontinua en la que discurren haces de prolongaciones muy finas entre la sustancia gris y blanca. En muchas ocasiones es típico observar somas de unos astrocitos aislados del cordón dorsal enviando una prolongación entre estos hacecillos. La continuidad astrocitaria es observable en el surco medio dorsal, desde el epéndimo hasta la piamadre (Fig. 85). 4) StJSTANCIA BLANCA 4.1 Zona Ventral 4.1.1 Limitante subpial 4.1.2 Fisura media ventral 4.2 Zonas laterales 4.2.1 Zona lateral limitante (franja subpial externa) 4.2.2 Zona lateral que contacta con Sustancia Gris 4.2.3 Zona lateral media (con núcleos y haces nerviosos) 4.3 Zona Dorsal 4.3.1 Zona limitante dorsal (astas dorsales) 4.3.2 Surco medio dorsal 4.3.3 Surcos paramedulareso intermedios 4.3.4 Haz de Golí 4.3.5 Haz de Burdach - 49 — 4.1. Zona Ventral 4.1.1 Limitante subpial. El límite externo de la sustancia blanca viene delimitado por una franja subpial de naturaleza glial. En ella se encuentran somas astrocitarios y prolongaciones densamenteagrupadas;inniunotinción G.F.A.P. positiva. Debajo de la limitante subpial se observa en la periferia medular una condensación de fibras conjuntivas (Fig. 86). Varias capas de naturaleza astroglial se han observado en esta limitante subpial de ratón adulto. La localización de somas y prolongaciones es de dos formas en esta zona ventral: a. Astrocitos fibrosos con los somasen la propia franja subpial. Tres tipos, atendiendo a la forma somática. a.l. De soma triangular o poligonal, su tamaño es de lOp., y emiten unas prolongaciones finas a ambos lados del soma, en situación paralela al límite medular, también emiten otra prolongación muchomás larga y gruesa hacia la sustancia gris, que en ocasiones se subdivide en otras dos prolongaciones más finas. Uno de los lados de este soma de forma triangular contacta con la basal que la separa de la piamadre (Fig. 87). a.2. De soma redondeado, de unas 8p., de diámetro y emiten unas prolongaciones más finas, orientadas como los anteriores, a ambos polos del núcleo y en paralelo a la limitante leptomeníngica, y emitiendo otra mucho más ancha y larga hacia la sustancia gris que se subdivide como en dos ramas paralelas . b) Con soma redondeado de 8p., de diámetro. También emiten como los anteriores una sola prolongación dividida en dos sentidos, pero mucho más gruesa que la anterior (4)p. La prolongación que envían hacia la limitante subpial de la que participa subdividiéndose también dos ramas colaterales muy finas; 3p. de grosor y 6p., de largo, la que envían hacia la sustancia gris (en este caso no se subdivide>. Es típico observar próximos a ellos los astrocitos ya mencionados anteriormente, que contactan con su soma poligonal a la limitante subpial ., y también envían una sola — 51 — prolongación somática subdividida en dos sentidos hacia la limitante subpial; esta prolongación parece engrosarse al llegar a su extremo final y contrariamente hacia la sustancia gris se adelgaza y es mucho más corta (3»>., y además se estrecha paulatinamente. (Fig. 92). b.l.b.b. En este otro tipo celular la distancia a la limitante subpial es todavía mayor incluso que en los astrocitos anteriores, (12»>., y su tamaño somático es de <0,5), <0,7»>. Es característico también en este tipo astrocitario observar un engrosamiento de la prolongación somática hacia la sustancia gris justo en su base, en la zona inmediata al soma, dando la impresión de que las prolongaciones astrocitarias en este caso están en dos o más direcciones, siendo las ramas más numerosas y más cortas, que las anteriores (Fig. 93). b.2. Astrocitos que emiten varias prolongaciones somáticas. b.2.a. De soma redondeado: Disponen su soma celular a una distancia de <9) p., de la limitante subpial y su soma es de (0,4), <0,6»>. La prolongación somática que envían hacia la limitante se va engrosando paulatinamente hacia esta limitante, adquiriendo su mayor diámetro a (2»>. del límite. Este tipo astrocitario también envía cuatro prolongaciones más, que son cortas, y mucho más finas que la anterior en sentidos contrapuestos. (Fig. 94) También podemosobservar a una distancia de <6>p.., próximos a este tipo astrocitario el tipo perteneciente a los de una sola prolongación somática del tipo, b.l.a.a.. b.2.b. De somas poligonales o triangulares: El contorno de sus somas es de sección cuadrángular o bien triangular, pero en ambos casos distan (4,S)p., de la limitante subpial. Los que tienen el soma con aspecto cuadrángular envían una sola prolongación somática a la limitante subpial, más fina que las otras tres que envían hacia la sustancia gris. A una distancia de 1 y 3 p. del soma se subdividen en otras dos o tres ramas más finas, de (0,2»>. de grosor que progresan hacia la sustancia gris en recorridos muy polimorfos (Fig. 95). - 52 - Los que tienen su soma triangular presentan también una única prolongación somática hacia la limitante subpial, de (3,7»> de largo y en esta ocasión sólo envían dos prolongaciones somáticas mucho más gruesas que la anterior, hacia la sustancia gris formando un ángulo agudo entre ellas. Estas prolongaciones que van hacia la sustancia gris se subdividen en su recorrido en varias ramas mucho más finas que la de partida (Fig. 96). La relación de estos astrocitos fibrosos con elementos vasculares es distinta a la de A. protoplásmicos, y es menos importante que en la sustancia gris. 4.1.2. Fisura media ventral: Esta zona es por donde ramas de la arteria medular anterior suben para introducirse en la médula. Es el vaso de mayor calibre de la médula, y hace que en ella se produzca una gran riqueza astroglial. En esta zona medular, la franja subpial G.F.A.P. positiva, cubre todo el contorno de esta fisura media ventral según una capa de sección en “Y” de tal forma que la prolongación hacia el vértice inferior de al Y es de 140 p. de largo, llega casi hasta la comisura gris ventral de la médula en esta zona ventral. (Fig. 97). Entre los brazos superiores de la Y existe tejido conjuntivo laxo, restos de meninges y la arteria medular anterior que discurre de forma continua perpendicular a los cortes seriados, siendo todas estas estructuras G.F.A.P. negativas a excepción de la capa astroglial que recubre a la arteria. (Fig. 99) La disposición de los somas astrocitarios con sus prolongaciones es similar a la observada anteriormente en la zona ventral p. de largo y hacia la propia franja subpial glial. La zona intermedia o brazo inferior de la Y, es la zona más profunda de la fisura media ventral, en ella se localizan multitud de prolongaciones astrogliales G.F.A. positivas (Fig. 101). En ella se encuentran, ramas de la arteria medular anterior y células conjuntivas. De forma casual hemos encontrado un vaso de pequeño tamaño perteneciente a esta arteria en el que se observa un pie astrocitario vascular de forma triangular con multitud de finas fibras astrocitarias en su interior dispuesto sobre el endotelio capilar y un astrocito satélite perivascular. Nótese la positividad de la inmunoreacción en prácticamente todo el contorno vascular. . A esta zona llegan multitud de prolongaciones somáticas de astrocitos con su soma distante de ella, y también parten prolongaciones muy largas de astrocitos que disponen su soma en esta limitante. Este último tipo astrocitario que dispone su soma en la limitante, presenta dos subtipos, atendiendo a la forma somática: a) Astrocitos gemelos, emiten una sola prolongación somática hacia la sustancia gris (8> i. y en su recorrido se puede apreciar como esta contacta con la de otro astrocito contiguo que está enviando a su vez un pie astrocitario a un vaso próximo. En este mismo vaso también se visualiza otro pie vascular mayor en una zona superior izquierda. (Fig. 103). También se observa como emiten otras prolongaciones de menor grosor longitud que la anterior a ambos lados del soma que se encuentra en el límite de esta fisura media. b) De soma redondeado, no se observa que envíen prolongaciones contiguas a la fisura media, aunque sí una gran zona desnudadel soma se aplica a esta fisura media. En el lado opuesto se observa un engrosamiento somático En la zona próxima a la comisura gris ventral, las prolongaciones de los últimos astrocitos de la zona intermedia fisural que disponían su soma sobre esta fisura, son muy largas <30-40) p. y se encuentran con frecuencia ramificadas en multitud de prolongaciones más finas, presentando entrecruzamientos entre ellas (Fig. 105). Lo típico de esta zona es que los astrocitos tienen sus somas distantes de la propia fisura media y envien algunas prolongaciones finas hacia ella. Al ser una zona tan próxima a la comisura gris ventral se pueden observar tanto astrocitos fibrosos como protoplásmicos . Su contorno es inmunoreacción positiva (Fig. 108). Con mayores aumentos, se ha visualizado en su interior una célula sanguínea. 4.2. Zonas laterales medulares En ellas se encuentra el cordón lateral; su borde externo convenxo es G.F.A.P. positivo y forma la limitante glial externa que se encuentra menos marcada que en el cordón anterior y en el posterior (Fig. 109). La sustancia blanca ventral y lateral se encuentra fragmentada por tabiques y septos y los elementos gliales mantienen frecuente relación con estos septos, ellos son el producto de la entrada y salida de las prolongaciones neuronales de sustancia blanca a la gris y viceversa, así como la localización de vasos sanguíneos La disposición astrocitaria mencionadaanteriormente para la zona ventral medular se mantiene en lo fundamental también aquí, pero con algunos detalles distintos: a) Las prolongaciones de los astrocitos, discurren de forma casi paralela entre las fibras del cordón, tanto las de astrocitos que disponen sus somas en la propia franja subpial Los somas astrocitarios que se encuentran en la franja subpial están más próximos entre sí que los subpiales de las zonas ventral y dorsal medular. ja. enviando dos finas prolongaciones a ambos lados del soma, que participan en la formación de esta limitante subpial y otra mucho más gruesa que se dirige hacia la sustancia gris con un recorrido largísimo . de diámetro tienen una morfología somática muy parecida a los del cordón dorsal y son los que se encuentran con mayor frecuencia, en esta limitante. Sus prolongaciones se disponen de la misma forma que los anteriores . c) A una distancia de (3 a 6) ja. de la limitante subpial, se observa que las prolongaciones de los astrocitos que tienen sus somas en ella, se ramifican en multitud de prolongaciones más finas, en ocasiones aparecen como deshilachadas ocupando los lugares libres que dejan los axones neuronales de esta zona, contactando en multitud de ocasiones entre ellas . 4.2.3. Zona lateral que contacta con la sustancia gris. . Es muy frecuente que las prolongaciones más - 57 — finas se agrupen en haces o columnas más o menos definidos, formando los septos medulares; estos discurren casi paralelos entre la limitante externa y la sustancia gris. A su llegada a ella se expande a veces como deshilachándose (Fig. 126), pero habitualmente llegan mezclándose con las de unos astrocitos intermedios, cuyo soma se localiza justo en los vértices entre los tabiques medulares de la sustancia gris . Las diferencias morfológicas entre astrocitos fibrosos y protoplásmicos en esta zona es manifiesta, sobre todo en las prolongaciones más densas o más claras de ambos tipos; que en ocasiones contactan entre sí. (Fig. 130) Los astrocitos con somas cercanos a la sustancia gris presentan grupos opisitopolares de prolongaciones; no obstante las que llegan a la sustancia gris algunas son de corto trayecto, ramificándose en ocasiones estos haces en otras más finas en su recorrido inmediato antes de llegar a ella, y rodeando a axones de estas columnas medulares (Fig. 131). Finalmente decir que en la zonas más próximas a las raíces dorsales, disminuye el número de astrocitos con prolongaciones también más cortas que en el resto de las zonas laterales (Fig. 132). En su llegada a la sustancia gris se observa de nuevo la clara diferencia entre astrocitos protoplásmicos y fibrosos (Fig. 133). Un dato significativo de esta zona que destacamos es el reducido diámetro que adquieren en algunos tramos estas prolongaciones astrocitarias . — 58 — En las zonas laterales de sustancia blanca también hemos encontrado vasos sanguíneos, más abundantes en la zona límite con las raíces ventrales. Los dos tipos astrocitarios observados junto a estos vasos fueron los siguientes: En un primer tipo, observamos como la pared del vaso recibe varias prolongaciones finas, y una mucho más gruesa que forma un pie astrocitario con el endotelio vascular. . Profundizando más en esta relación entre el soma astrocitario y el endotelio vascular, hemos encontrado en algún corte transversal, un vaso con este tipo de astrocito, con prolongaciones que abrazan, la periferia del vaso, estableciendo contacto con el endotelio ja. del surco medio medular, y son los que ofrecen esta forma triangular al cordón dorsal , terminan como se aprecia en la foto unidos al surco medio medular, a modo de punta de lanza a una distancia de (130»>. de dicha limitante externa. En su interior contienen tejido conjuntivo laxo, similar al que rodea a toda la médula externamente, y también se observan terminaciones somáticas e incluso somas que se disponen en su contorno externo formando a modo de una nueva franja subpial. En esta imagen también se observan unos puntos gruesos, G.F.A.P. positivos que son las prolongaciones de astrocitos que se disponen orientadas perpendiculares a estos cortes transversales y por tanto sus prolongaciones están extendidas en el sentido longitudinal al epéndimo de la médula. (Fig. 146) Las zonas más importantes del cordón posterior son los fascículos ascendentes dorsales, es decir, los haces de Golí y de Eurdach, que llevan lo extereoceptivo epicritico (tacto fino), donde la distribución astrocitaria es como sigue: Tanto en el fascículo de Golí como en el de Burdach, los astrocitos observados son diferentes a los que forman el surco medio y los surcos paramedulares. Estos son de soma más pequeñoy prolongaciones somáticas muy finas que se elongan en una sola dirección una corta distancia p.,, desde el surco medio medular. A esta distancia del surco medio dorsal las astas dorsales de sus tancia gris contactan ya somáticamentecon la franja subpial. Es el lugar de aferencia neuronal, donde la zona marginal de Lissauer muestra las más largas prolongaciones astrocitarias de toda la médula. Los dos tipos astrocitarios que se observan en este espací en forma de cuña, son astrocitos con prolongaciones cortas y gruesas, formando un entramado de prolongaciones que se entrecruzan entre sí . Otro tipo, son los que disponen el soma en la propia limitante subpial y envían prolongaciones hacia la sustancia gris La limitante subpial de esta zona es continua y está formada, tanto por somas astrocitarios que emiten prolongaciones finas colaterales a ella y otras más gruesas hacia la sustancia gris, como por prolongaciones que llegan de astrocitos con somas distantes, pero que en este caso se visualizan con menor frecuencia que en otras zonasmedulares. Siendo muy frecuente encontrar multitud de ellas que parten de la franja subpial . En las zonas terminales de sustancia blanca, cercanas a la zona de contacto con las astas dorsales de sustancia gris, esta limitante subpial es más gruesa que en el resto medular, posiblemente por la multitud de prolongaciones finas que discurren hacia ella (Fig. 150). También se observa este mayor grosor de la limitante subpial en el espacio comprendido entre el surco medio medular y los surcos paramedulares. (Fig. 150>. Ocasionalmentehemos visualizado un soma astrocitario muy grande en sus proximidades (Fig. 150). — 61 — CRONOLOGíA DE LA APARICION DE LA G.F.A.P. EN LOS ESTADIOS POSTNATALES DEL RATON Se han analizado los detalles observados en la sustancia gris, ependimo y sustancia blanca, con especial énfasis en los hallazgos de: Densidad astrocitaria, con apreciación visual sin estudio estadístico alguno, de variaciones morfológicas de los astrocitos en las distintas áreas de la sustancia gris en los días correspondientes a la primera semana; así como la relación de elementos gliares con neuronas y vasos en las dos sustancias. Formación de la limitante glial subpial o barrera aislante en la periferia del S.N.C., surcos medio anterior y posterior; junto a las comisuras periependimarias de sustancia blanca. ESTADIO O (Animales recién nacidos) En este momento la astroglía es manifiestamente más patente que en los días 1 o 2 precedentesal parto sobre todo en las zonas periependimarias y en el límite externo de la sustancia blanca. Los elementos gliales, están mayormente representados, en la zona supraependimaria, desarrollando finas prolongaciones y estableciendo ya contacto con vasos y somas neuronales constituyendo una población que destaca especialmente en toda la sustancia gris. En esta población se han observado células inmaduras con pocas prolongaciones, que ofrecen ya una levísima tinción G.F.A.P. positiva, con poca tinción de fondo, en sus finas expansiones (Fig. 150). Estas células acaban transformándose en elementos de sección poligonal de gran tamaño, con muchas prolongaciones G.F.A.P. positivas, es decir una maduración completa morfológica y muy posiblemente funcional. Esta concentración periependimaria, permanecesólo en las primeras fases de la gliogénesis, unos dos días aproximadamente. En estadios posteriores, de 2-6 días proliferan la células astrogliales de la limitante subpial, de la sustancia — 62 — blanca. Este cambio de topografía; es debido muy probablemente a modificaciones de las tensiones de crecimiento locales. Después del nacimiento, la densidad astroglial es, según la observación al m.o., relativamente baja en conjunto, aunque el volumen absoluto astrocitario va en aumento. En resumen: en los dos días precedentesal nacimiento, mantiene aparentemente igual densidad astrocitaria que dos días postparto y aumenta relativamente durante el período postnatal; manteniendo siempre en aumento el volumen absoluto. El epéndimo, no se encuentra todavía totalmente diferenciado en el nacimiento; habiéndose observado en sus bordes ventral y dorsal, especialmente, ependimocitos muy inmaduros. No se han observado tanicitos, tan frecuentes en otras especies de vertebrados inferiores. El septo dorso- medial es abundante en expansiones gliales y ependimocitos, que alcanzan la zona pial, llevando prolongaciones y vasos . En el límite de la zona ventral, entre la sustancia gris y blanca, se han observado indicios de tinción G.F.A.P. en unas finisimas prolongaciones que discurren, desde somas situados en la misma limitante, haciéndose ligeros esbozos de los futuros tabiques medulares de las astas dorsales, las imágenes astrocitarias han sido muy escasas, prácticamente - 63 - nulas, a excepción de la ya mencionada zona periependimaria dorsal - El hecho más claro que se puede confirmar en los cortes de los animales neonatos es la positividad de la tinción G.F.A.P., aunque débil, en todas las fibras astrocitarias, también en esta imagen, se observa ya la aparición en la sustancia blanca de elementos gliales con tinción débil a la G.F.A.P. fundamentalmente en las prolongaciones de los astrocitos cuyo soma se sitúa en la capa subpial (Fig. 153 b). Sustancia blanca En este estadio, la sustancia blanca suele albergar, neuroglía de largas y escasasprolongaciones, muy abundantes en los cordones laterales y zonas marginales . En la limitante subpial, de la zona ventrolateral, se forman algunas capas astrogliales con tinción G.F.A.P. - 64 - positiva en las fibras pero todavía negativa en parte de los somas astrogliales (Fig. 156). En el cordón dorsal de la sustancia blanca se han observado también prolongaciones astrocíticas muy finas que se expanden en forma radial. Las más laterales alcanzan las astas dorsales de la sustancia gris. Las más frontales sin embargo, no forman limite preciso con la comisura gris dorsal. Muchas de ellas, como sucede en la zona ventral, parten de somas situados en la misma situación subpial, en otros casos se mezclan con esbozos de somas aislados entre las prolongaciones , en la zona ventrolateral subsiste la formación subpial así como la emigración por surcos medulares (Fig. 159). Parte de la astroglía permanece concentrada en la zona periependimaria dorsal y también se han observado finísimas prolongaciones astrocitarias que delimitan la comisura gris dorsal (Fig. 160>. Sustancia Gris: Considerada globalmente, se puede afirmar la existencia de un aparente aumento en volumen de la astroglía en las zonas sensitivas (dorsales) y la mayor densidad astrocitaria de toda la médula. Posteriormente en adulto; estos astrocitos serán los más pequeños de toda la médula; y estas zonas sensitivas las que presenten menor densidad astrocitaria (Fig. 161). Desde la zona marginal estos cuerpos astrogliales emigran por los septos neuróglicos, sobre todo del cordón ventrolateral hacia la vecindad de las neuronasy vasos en la sustancia blanca (Fig. 162). Más adelante aumentala densidad de estos elementos gliales tanto en las astas ventrales como en las dorsales (Fig. 163). — 65 — Sustancia Blanca Ventral: es aquí donde primero se han observado glioblastos aislados en la fisura medular ventral y comisura ventral. Tienen prolongaciones largas y algunas muy finas, con tinción claramente positiva a la G.F.A.P. En las proximidades de la fisura media ventral se observan esbozos de astrocitos, que sitúan sus somas justo en el límite subpial y envían largas prolongaciones teñidas débilmente hacia la sustancia gris. Esta limitante subpial es casi continua, con un solo estrato y abundantes gliocitos. La positividad de la ininunotinción en esta época, en sustancia blanca; se hace ya mucho más patente que la sustancia gris, posiblemente porque los astrocitos fibrosos, formen antes los haces de filamentos protéicos en sus somas, que los protoplásmicos (Fig. 164). El epéndimo: se observa todavía indiferenciado con ependimocitos migrando hacia la zona dorsal. El tubo neural se encuentra todavía sin cerrar por completo, aunque en teoría ya contiene liquido cefalorraquideo (Fig. 165>. En la zona dorsal ependimaria se ha observado, una todavía inmadura condición del epéndimo y los esbozos positivos de G.F.A.P. son siempre de astroblastos, difíciles de clasificar. (Fig. 166> Los ependimocitos no totalmente diferenciados se encuentran migrando desde la pía a su área definitiva en la zona dorsal en una etapa muy cercana a la presencia de tanicitos. En la Sustancia Gris Dorsal: tanto las neuronas como los astrogliocitos, se encuentran en fase muy temprana de diferenciación. La tinción de los últimos por la G.F.A.P., es débilmente positiva y uniforme, sus somas ya están completamente formados, mientras las prolongaciones son de gran variación en tamaño y grosor, muchas de ellas todavía cortas y muy finas (Fig. 167). En la Sustancia Gris Ventral: no hemos encontrado ningún rastro de inmunotinción positiva. En los cordones laterales, la astroglía con sus prolongaciones se orienta fundamentalmente paralela hacia el epéndimo (Fig. 168). Muchos de estos astrocitos disponen sus — 66 — somas en la misma limitante, enviando sus prolongaciones hacia la Sustancia Gris, con el resto de las prolongaciones, contribuyen a la formación de una limitante subpial casi continua . Epéndimo: básicamente se mantiene la condensación periependimaria dorsal (Fig. 177). La mayoría de estas células ependimarias emiten una única prolongación, hacia la comisura dorsal, sin llegar a la zona subpial. La zona inicial de las prolongaciones tiene un grosor considerable y van adelgazándose en otras más finas que discurren entre los somas neuronales. La densidad astrocitaria en esta zona es aparentemente tan grande que resulta difícil determinar el trayecto de todos estos procesos . La estructura astroglial de los surcos paramedulares, en esta zona dorsal se mantiene muy parecida a la del día 1. Es el surco medio dorsal, por donde emigran, los ependimocitos desde la pía hasta el epéndimo justo a su paso por el comienzo de la sustancia gris, se han observado un par de ellos (Fig. 182) (flechas>, aunque también es frecuente encontrarlos en la trayectoria desde la comisura gris hasta el epéndimo. La distribución astrocitaria radial, se mantiene en lo fundamental, a excepción de somas incipientes con prolongaciones más cortas que en las zonas anteriores descritas . Algunos astrocitos de estas astas dorsales, envían al menos tres o más prolongaciones tenues hacia el soma de neuronas diferentes, ramificándose desde el mismo soma (Fig. 187). Las prolongaciones cortadas transversalmente, aquí se traducen en puntuaciones de tinción positiva, aunque también aparezcan escasos somas astrocíticos (Fig. 188). Sustancia Gris Ventral; en la zona más próxima a la comisura gris ventral, se han observado somas astrocitarios redondeados, que emiten prolongaciones muy finas con tinción positiva (Fig. 189). Las neuronas motoras, con formas poligonales, todavía no se observan perfectamente diferenciadas. Entre las prolongaciones neuronales aparecen somas astrocitarios pequeños que emiten cortas prolongaciones . En un área próxima a la zona periependimaria ventral se observan astrocitos satélites perineuronales, así como finas prolongaciones astrocitarias con positividad muy débil (Fig. 192). - 70 - También se han observado algunas prolongaciones astrocitarias incipientes perineuronales que abarcan dos o tres somas neuronales y otras puntiformes entre los somas neuronales. (Fig. 193>. En general, en la zona ventral ya se han observado, por primera vez, somas astrocitarios aislados, con finas prolongaciones G.F.A.P. positivas. En la limitante de las zonas, ventrales y laterales de la sustancia blanca, pero no en la posterior se encuentran elementos astrogliales, en relación con los futuros septos (Fig. 194>. En la zona más profunda de la fisura media ventral se localizan multitud de finas prolongaciones astrogliales que todavía no se observan claramente formadas (Fig. 195). En general, los cordones ventral y laterales de la sustancia blanca medular, se encontraban fragmentados por tabique y septos, que son el producto de la entrada y salida de prolongaciones neuronales desde la sustancia gris a blanca y viceversa, acompañados por elementos gliales que mantienen frecuente relación con ellas. En zonas subpiales más próximas a la fisura media ventral, se han observado astrocitos que disponen sus somas a variables distancias de la pia, e incluso algunos en la misma franja subpial. Las prolongaciones son muy largas, y se van adelgazando a medida que discurren hacia la sustancia gris. Es muy frecuente, su bifurcación a poca distancia del soma; discurriendo entre las neuronas y oligodendrocitos, estos últimos con tinción negativa (Fig. 196). También se observan motoneuronas grandes en el límite con la sustancia blanca y una disposición astrocitaria subpial más madura que en estadios anteriores (Fig. 196>. En este estadio también se observa una lámina superficial de células meníngeas que rodean externamente a la capa subpial (Fig. 196). Estas prolongaciones astrocitarias subpiales al llegar a la sustancia gris se expanden en finas prolongaciones sin — 71 — que se marque con precisión un limite entre ambas sustancias, blanca y gris . Entre la sustancia blanca ventral y el comienzo de las laterales se ha observado la entrada de unas prolongaciones astrocíticas muy largas y finas hacia el epéndimo, que se expanden a su llegada a la sustancia gris, posiblemente, aunque no se observe de forma clara acompañan la entrada de un vaso (Fig. 198). En general, los astrocitos de esta zona subpial, forman hasta tres capas astrocíticas: a) Algunos somas están adosados a la pía y envían ramificaciones muy finas hacia la sustancia gris. b) Otros se encuentran en zonas intermedias; y desarrollan prolongaciones hacia ambos lados. c) Otros los más inmaduros, se encuentran más próximos a la sustancia gris y envían una prolongación corta hacia la sustancia blanca, manteniendo la misma disposición que en adulto (Fig.198). Zonas Laterales de la Sustancia Blanca; la franja subpial, está formada por somas alineados de forma continua en ella, y envían de forma paralela sus prolongaciones hacia la sustancia gris . También es frecuente observar como un estroma de prolongaciones astrocíticas con tinción incipiente que abarca todas estas zonas medulares. La limitante subpial de la zona dorsal es más fina y presenta somas y prolongaciones astrocitarias más diferenciadas . No obstante a pesar de la inmadurez morfológica de neuronas y gliocitos, ya se detectan los astrocitos y ependimocitos por la inmunotinción positiva. El surco medio dorsal es el lugar de emigración celular hacia la zona subpial, especialmente con astrocitos fibrosos, dispuestos en forma aleatoria en los bordes de este surco (Fig. 210>. Por último aparecen otras prolongaciones todavía más finas hacia las zonas laterales medulares, para formar la futura comisura gris dorsal (Fig. 210). Los diferentes tipos celulares que migran por el surco medí dorsal, se observan en la Fig. 211. Esta, sustancia gris dorsal, íntegra áreas de los núcleos de Stilling-Clarke, núcleo propio, sustancia gelatinosa de Rolando y núcleo de Waldeyer, en las que el grado de indiferenciación celular es todavía considerable, por lo que las tratamos de una forma global. Sin embargo, matizar que en la sustancia gelatinosa, el número de astrocitos encontrados es mínimo, mientras que en el núcleo de Stilling-Clarke y núcleo propio se mantienen los de soma redondeado con cortas prolongaciones . También en las mismas zonas laterales se ha encontrado un astrocito satélite de este mismo tipo, pero con menor tamaño, enviando sus incipientes prolongaciones en un solo sentido (Fig. 223>. En una zona próxima a la sustancia gris dorsal; se observan mayor número de elementos astrocitarios que las dos anteriores, siendo la zona próxima a las laterales la que tiene mayor densidad; sin embargo este número decrece a medida que nos situamos en la zona central de las propias astas dorsales; su tamaño somático también es similar con respecto a los de la zona ventral y lateral. — 76 — Ocasionalmente, se han observado en esta zona dorsal dos tipos astrocíticos: los perineuronales en área próxima al núcleo propio . También se ha observado como algunas prolongaciones astrocitarias que contactan dos somas de astrocitos distintos (Fig. 227). . Especificando más en la sustancia blanca dorsal, la distribución astrocítica permanece similar a días anteriores. Las prolongaciones astrocitarias aparecen más intensamente teñidas y su número es superior (Fig. 233>. En zonas próximas a los surcos paramedulares existe una mayor densidad astrocitaria, y algunas prolongaciones forman parte de ellos . — 77 — Los surcos paramedulares, al igual que el surco mediodorsal (central), presentan en su interior, varios astrocitos en fila, con repetición periódica de sus somas. Las prolongaciones tienen todas un trayecto uniforme, se van ramificando en los surcos y se entrecruzan con otras de astrocitos vecinos, formando un entramado, en el que se mezclan también somas neuronales y algún vaso. En el surco medio dorsal, cerca ya de la comisura gris se han observado, estos astrocitos de pequeño tamaño con una única prolongación fina hacia la sustancia gris mezclándose con otros que posiblemente son ependimocitos. Todas ellas positivas a la inmunotinción (Fig. 236). También, en la parte superior de esta imagen, se han observado, en los propios haces de Golí, prolongaciones muy finas y largas con trayectos ramificados al azar entre los somas neuronales . De nuevo en la sustancia gris; el área periependimaria dorsal también presenta astrocitos grandes, y aunque en este estadio no ha sido todavía posible visualizar ningún tanicito claramente, si se ha comprobado cierta positividad difusa a lo largo de todo este surco, sobre todo en la parte dorsal próxima al epéndimo (Fig. 237). ESTADIO 5 En este estadio, se comprueban cuatro rasgos de evolución: a> El epéndimo, está ya completamente diferenciado, en su zona dorsal. En su zona ventral, sin embargo, se aprecia todavía un espacio sin ependimocitos. En la zona dorsal, estos ependimocitos, tienen largas prolongaciones únicas que parten del soma y se elongan hacia el cordón dorsal de la sustancia blanca. Probablemente son tanicitos. Los astrocitos periependimarios dorsales siguen siendo de gran tamaño y numerosos. (Fig. 238). - 78 - b) En general, las prolongaciones astrocitarias de sustancia blanca aparecen con mayor longitud y grosor, con irununotinción fuertemente positiva. La zona de límite entre sustancia gris y sustancia blanca presenta astrocitos de tipo mixto . d) La densidad astrocítica aumenta en las zonas laterales periependimarias, con respecto a días anteriores, que prácticamente no se encontraban astrocitos visualizables maduros. Ocasionalmente en esta zona se ha observado un vaso con varios tipos astrocitarios perivasculares (Fig. 241). Por áreas en; la sustancia gris ventral, la zona próxima a la fisura media es la que se presenta algo más poblada de astrocitos, sin embargo en la zona central, esta población desciende drásticamente, para volver a aumentar en la zona ventral lateral más alejada de la fisura media. Los somas de neuronas motoras se han observado con grados de mayor madurez y se hacen claramente diferenciables de los somas astrocitarios . En las zonas laterales de la sustancia gris; el número de astrocitos se incrementa, sobre todo en las zonas periependimarias. Ocasionalmente se ha observado un astrocito - 79 - perineuronal satélite, con su soma próximo al soma neuronal . En las zonas periependimarias laterales, se han observado astrocitos de gran tamaño, que envían todas sus prolongaciones en sentido inverso al epéndimo, dejando su soma enfrentado a él (Fig. 246). En esta misma imagen, la capa externa del epéndimo formada por los ependimocitos, envían prolongaciones con inmunotinción positiva, y en la capa subependimaria se observan células astrocitarias que contactan con la luz del epéndimo, mediante prolongaciones, así como otras se elongan hacia la dorsal medular, también con inniunotinción positiva . Ocasionalmente también hemos visualizado astrocitos interneuronales (Fig. 250). Sustancia Blanca: la limitante subpial ventral, al igual que la fisura media, se observa claramente diferenciada, con una intensa inmunotinción positiva. Los astrocitos fibrosos así como sus prolongaciones más finas son fácilmente visualizables. Sin embargo, la arteria medular, que discurre - 80 - en el fondo de la fisura media y proporciona ramas que ingresan en el interior medular, es claramente negativa a la inmunotinción . Cuando estos ependimocitos, forman parte del epéndimo; sus prolongaciones e incluso su propio soma son inmunotinción positiva, y hacen contacto con la luz ependimaria, elogándose a su vez estas rpolongaciones hacia las zonas ependimarias dorsal y ventral . Las zonas laterales de sustancia gris, al igual que el día anterior presentan gran densidad astrocitaria, observándose de nuevo varios tipos astrociticos (Fig. 275). La zona ventral periependimaria de la sustancia gris, se observa con gran densidad astrocitaria, predominando astrocitos de gran tamaño (Fig. 276). También en el límite de separación entre sustancia gris y blanca se han observado motoneuronas multipolares y distintos tipos astrocitarios bastante bien diferenciados. . Un dato morfológico de particular interés ha sido la observación con microscopia electrónica de que en el caso de las terminaciones en vaina, la prolongación astrocitaria que circunda al vaso prácticamente no contiene más que haces de gliofilamentos en el interior de la cual se observan gliofilamentos, ribosomas, alguna mitocondria y pequeños fragmentos de retículo endoplásmico rugoso (Fig. 295). En el caso previamente descrito hay que considerar además que el núcleo astrocitario está muy próximo a la base del pie vascular y de otro lado que el soma astrocitario se une, en este caso mediante tres desmosomas bien diferenciados, a otro elemento astrocítico próximo (Fig. 295>. Un hecho que hemos observado en varias ocasiones, dentro de la sustancia blanca medular, ha sido la presencia de capilares con una configuración especial. Se trata de capilares cuyo endotelio está nítidamente rodeado por la correspondiente basal, bien desarrollada. Ahora bien, sobre este basal se apoyan uno o dos elementos celulares a su vez rodeados de otra membrana basal (Fig. 296). El endotelio capilar presenta un territorio, probablemente el correspondiente a la zona nuclear, bastante prominente hacia el lumen y emitiendo pequeñas microvellosidades hacia el mismo. La imagen tal y como la hemos observado nos sugiere la referida a los pericitos o células de Rouget. que son túbulos, cuya pared tiene un grosor de 2 o 2,5 nm. rodeando a un hueco central y constando (Wuerker, 1970) de cuatro subunidades densas, embebidas en una matriz oscura. El perfil de estos filamentos no es liso, sino que tiene unos apéndices cortos, que a veces, parecen formar puentes entre los filamentos adyacentes. Lazarides, 1982, ha realizado una clasificación global de todos los filamentos conocidos, como constituyentes de las células, agrupándolos en cinco clases: a) Neurofilainentos, que se encuentran, en los somas neuronales; b) Filamentos de vinmetina, encontrados principalmente en los somas de las células mesenquimáticas; c) Filamentos de desmina, predominantemente en las células de músculo liso, esquelético y cardiaco; d) Tonofilamentos o filamentos de queratina, presentes tanto en las células de origen epitelial, como en is propias células epiteliales adultas; e> Gliofilamentos, se encuentran también, tanto en las células de origen astrocitario, como en los propios astrocitos adultos. Posteriormente han sido muchos los autores estudiosos de estos gliofilamentos, Price, y cols. <1983), Traub, <1985>. Bennet y cols. (1987), Vicent, y cols. (1988), Dahí, y cols. <1989), Chabot y cols. <1990). — 93 — Ya se habían realizado, estudios acerca de la especificidad de los colorantes por estas gliofibrillas y su posterior visualización al M.O. . Al mismo tiempo que se determinó la cantidad de proteína que contenían estas células de neuroglía en su soma, también se determinó su composición en aminoácidos. Cuadro II. Así en tejido de corteza cerebral madura, (Tower, 1960); ; en una de sus primeras apreciaciones afirman, que la glutamina, a. - 94 - glutámico y a. aspártico, están presentes, en una fracción considerablemente grande, en extractos de células (somas> no neuronales (Utley, 1963>, (Margolis y col. 1968>, encuentran también G.A.B.A. (ácido-gamma-amino- butírico) abundantetanto en extractos de células neuronales como en células de neuroglía. También se han hecho determinaciones mediante, técnicas de microdisección en medula cervical donde se encontró que, en células gliales, la glutamina el a. glutámico y el a. aspártico eran los aminoácidos más abundantes de estas células, también se encontraba algo de glicina y alanina, pero con valores más moderados (Kelly y Dick, 1978). Una característica importante de los astrocitos, actualmente estudiada es la que concierne a condiciones patológicas, forman grandes acúmulos en su soma, de estas gliofibrillas. Hecho que tuvo una considerable importancia, para elegir tejidos patológicos en el descubrimiento y estudio de la G.F.A.P. (proteina-gliogibrillar-ácida) como proteína constituyente de estos gliofilamentos consta de una fracción soluble y otra insoluble (que se obtenía como residuo sólido por centrifugación Eng y cols., 1971>. El número total de aminoácidos, que componen la estructura primaria y secundaria, era de 370 y los más abundantes en toda ella eran: a. aspártico, a. glutámico y alanina y los menos: histidina y prolina (Eng y cola. 1973, 1979). Estos valores coincidían con un porcentaje marcadamente exacto, con los que anteriormente se expusieron , Tubulina, subunidad de microtúbulos aislada por . Sin embargo, presentaba algunas características comunes con ellas, tales como la precipitación con vinblastina, e iones calcio pero posteriormente esta propiedad se determinó que la presentaban todas las proteínas ácidas, por lo que quedó clasificada definitivamente como una nueva proteína ácida típica. Otros datos bioquímicos acerca de esta proteína fueron: su insolubilidad en solventes acuosos , (Ishizaki y cols. 1983). Sin embargo, no se han podido obtener unas conclusiones contundentes acerca de todos estos aspectos, por lo que todavía existe una cierta confusión, en cuanto a la caracterización completa de esta proteína. Ya se intuyó desde el inicio, que como tal proteína constituyente estructural de los gliofilamentos podía tener un importante poder antigénico, por lo que se justificaba, el inicio de su estudio inmunológico. Uyeda y cols. (1972), fueron los primeros que confirman este poder antigénico para la G.F.A.P. La hipótesis inmediata, despuésde conocer este dato de antigenicidad, fue poder producir inniunocitos, que fueran capaces de dar anticuerpos primarios frente a ella. Estos mismos autores lograron obtener anticuerpos policlonales primarios, frente a esta proteína glio-fibrillar-ácida (G.F.A.P.) en tejido humano. — 96 — En esta época habían surgido también, numerosos estudios inmnunológicos, produciendo anticuerpos frente a muy distintas proteínas, con resultados positivos. Así, Warecka y Bayer (1967), Hather y Macpherson (1969), Kosins}ci y Grabar (1969) obtienen anticuerpos primarios para extractos de proteína acuosa de cerebro completo. Moore y cois. <1968) para otra proteína típica del SAL, la S-100. Kornguth y cols. (1966) para la proteína base de la mielina, (aislada de sustancia blanca de la médula espinal en rata) y Samson y cols. (1971) Soblaepter y Cray (1972) para la tubulina g (de extractos de cerebro completo normal, es decir sustancia gris y sustancie blanca>. Sin embargo con QOpg de extractos de cerebro completo fetal, no se obtenían líneas de precipitado (reacción), cuando lo normal era ya obternerlos desde 5,lpg (con extractos de adulto) Dahí y Bignamí (1973 a). Este aumento en la cantidad reaccionante del tejido fetal, es debido a su bajo contenido en astrocitos, durante estos estadios de gliogénesis ya que esta, todavía no es completa. También se realizó un estudio para conocer la cantidad de proteína G.F.A-P. nativa, que era necesaria para producir estos anticuerpos primarios frente a ella, así Dahl y Bignami (1976) afirman que con valores inferiores a 15 pg. esta no es antigénica. Sin embargo, Eng y Bigbee (1978) Eng (1979) confirman esta cantidad como ya claramente antigénica y productora de anticuerpos primarios. 32 Por último, otro aspecto que influía en la producción de este primer anticuerpo era el. estado de degradación o proteolisis en que se encontraba esta proteína G.F.A.P. nativa. El proceso degradativo, se producta fundamentalmente en la extracción “post mortem’V. donde era usual, encontrar peptidos de bajo peso molecular Dahí (1976 a) Dahí y Bignamí (1974), (1975), <1976). Así, en autopsia de humanos, se confirmaba esta degradación (paulatina) dando diferentes peptidos, desde los veinte primeros minutos hasta las cinco horas, para degradarse completamente a las 24 h. de su extracción (técnica de inmunoblot). Anteriormente, ya se había demostrado su gran susceptibilidad a la tripsina, como enzina proteolitica, (Dahí y Eignami 1973 a) y también a las proteasas neutras en general (Eng y De Armond 1982, 1983). Esta degradación proteica, era producida por una proteasa, con un mecanismo dependiente del Ca-e+, similar al que se produce con los neurofilamentos (Schlaepfer y Zinmerman 1981), (Ishizaki y cois. 1983). Así “in vitro” esta degradación, podía ser prevenida, incubando el tejido con E.D.T.A. como agente quelante del Ca++ y así la degradación no se producía, por el contrario, si se incubaba con cloruro de calcio 3mW esta degradación se aceleraba, (Smith y cols., 1984). — 98 — Con todos estos datos, Eng y cois. (1985) concluyen con la afirmación, de que tanto la G.F.A.P. nativa (no degradada) como la G.F.A.P. degradada, en peptidos más pequeños, son igualmente inmunogénicas, y además sugiere que el recambio de los filamentos gliales, posiblemente esté en parte controlado por una proteasa actica, dependiente del Ca++ que tiene su actuación a un pH próximo al neutro. Dato expuesto anteriormente para filamentos gliales y para neurofilamentos por Schlaepfer W.W. y cois. (1981). Una vez obtenidas todas estas características, del primer anticuerpo anti—CFAP, también se le intentó clasificar con respecto a otras inmunog3.obulinas, se observó la banda principal de precipitado en la electroforesis, la banda tiene su lugar muy próximo al de las inmunoglobulinas alta 2. Este dato ha sido ratificado por Dahí y Bignamí (1973 a) en un estudio comparativo con otras proteínas, tales como la 14-3- 2, Moare y Perez, (1966), la alfa 2 - glicoproteina. Warecka. K. (1967) Warecka, 1< y MUller (1969), la glicoproteina l0-B, Eogoch. S (1966) y la S-100, Cicero y cols. <1970). El hecho de que esta banda principal se encuentre al nivel de las alta 2 - globulinas, no significa que pertenezca a ellas, sino que tiene una serie de aminoácidos comunes y que su centro antigénico se encuentra en unos lugares similares a los de estas globulinas. Lo que si, se confirmaba claramente es que esta C.F.A.P. es una proteína diferente a ellas. La inmunohistoquimica, comenzó hace 40 años con el uso de anticuerpos conjugados con fluorescencia, para la detección y visualización de antigenos en pneumococos (Coons y cols. 1942). Posteriormente han sido aceptadas estas técnicas, lográndose una purificación de los antígenos y el marcaje con anticuerpos secundarios y terciarios. Aislado y caracterizado el primer anticuerpo, para la proteína G.F.A.P. se logró llegar a una reacción inmunológica completa, visualizando el sitio que ocupa esta proteína en los tejidos. Se probaron comparativamente las siguientes técnicas, por varios autores: inmunofluorescencia indirecta (Coons y col. 1942) (Coons y Kaplan, M.H. 1950), (Coons y cols. 1958) ininunofluorescencia directa (Barnett y cols. 1964) (en astrocitos>, (Nakane, P.K. y Pierce, G.B., 1966), (Uyeda 0217. y cols., 1972), (Stermberger, L.A., 1979). (Mason, D.Y. y cols. 1980). - 99 - Finalmente, se descubrió una nueva técnica, la peroxidasa (enzima de rábano) - antiperoxidasa se comenzó en 1966, por Nakane, P.K. y Pierce, G.E., que utilizaban enzimas como marcadores de anticuerpos conjugando inmunoglobulinas con P.A.P. como marcador, abriendo así un nuevo campo en la inmunohistoquimica. Este método original dos brazos inferiores Fab y b) su brazo superior central Fc. Estos primeros brazos Fab (de este anticuerpo secundario) son los que reaccionan con el brazo Fc libre, del anticuerpo primario obtenido en conejo, al igual que esta inmunoglobulina G1. Este anticuerpo primario, ya estaba previamente unido al antígeno, también por sus brazos Fab, dejando solo libre este brazo central superior Fc, para esa posterior reacción con el anticuerpo secundario. Esta reacción del anticuerpo secundario la hemos realizado a temperatura ambiente y con un tiempo de reacción muy corto. El pH se sigue manteniendo en los mismos márgenes, de la primera reacción. Por último, en esta reacción como anticuerpo terciario, hemos utilizado el complejo (P.A.P.) descrito por Sternberger, N.A. y cols. (1970). Este complejo P.A.P., como ya mencionamos anteriormente tiene una estructura molecular, antiperoxidasa en sus fragmentos Fab, ya que son previamente sensibilizados frente a ella, pero además mantiene la capacidad de reaccionar con el anticuerpo secundario en su brazo libre Fc. Posteriormente en este complejo P.A.P. se polimeriza la 3-3’ diaminobenzina tal y como expusimos anteriormente en los lugares específicos donde se encuentra la G.F.A.P., en el tejido ofreciendo un color marrón (café) intenso. Pero este complejo también presenta inconvenientes: su gran tamaño molecular 210 A, por lo que en algunas ocasiones si las reacciones anteriores no son muy específicas y los anticuerpos primario y secundario no quedan perfectamente estirados este complejo puede quedar retenido entre ellos, llevándonos a resultado erróneos. Por esta razón, hemos recurrido con éxito a la preincubación de los tejidos, usando anticuerpos no específicos que rellenaran los espacios entre - 103 - los anticuerpos primarios produciéndose entre ellos solo reacciones proteína-proteína que no son específicas del antígeno en estudio, así se conseguía una homogeneidad en los brazos Fc de los anticuerpos primarios para la siguiente reacción. En otras ocasiones en vez de estos anticuerpos no específicos, hemos utilizado simplemente proteínas inespecíficas tales como la carregenina, e incluso soluciones detergente como el tritón X-l00, que se agregan al anticuerpo primario, después de haber reaccionado con el antígeno mejorando así por un lado la penetración de los siguientes anticuerpos y por otro, disminuyendo la adherencia inespecífica de éstos a los tejidos. Este complejo también fue utilizado posteriormente por Luwdin y cols. (1976) para cortes en congelación en tejidos que contenían la G.A.P.; por Taylor y Burns (1974) en cortes de tejidos incluidos en parafina, aunque no contenían G.A.F.P. Roding y cols. (1980) lo utilizan para detectar otro antígenos en tejidos incluidos en plástico metacrilato. Fueron Roessman y cols. (1980) los primeros que lo utilizaron, para tejidos con G.F.A.P.. incluidos en parafina, aplicando también esta técnica de anticuerpos sin conjugar. Nosotros hemos compartido en lo fundamental, sus criterios metodológicos a seguir a excepción de las siguientes pequeñas modificaciones: a) nosotros mantenemos prácticamente durante toda la inmunotinción, los cortes de parafina a baja temperatura, obteniendo así mejores resultados, que incluso utilizando la congelación, como Ludwin y cols. (1976). b) Hemos observado que la inmunotinción se ve influenciada también por la edad de los tejidos, por lo que hemos adoptado los siguientes criterios de fijación: a) para animales de más de 10 días, estos han sido fijados con los aldehidos rutinarios, compartiendo el criterio de Dixon y Eng (1981) y b) para tejidos de animales desde recién nacidos hasta 10 días, hemos utilizado el fijador B5, tomada su composición de los que se utilizaban en la Escuela Histológica Española: Cajal (1913), Achucarro (1915), Río Hortega <1918), obteniendo mejores resultados que fijando por congelación o por aldehídos rutinarios (Ver Material y Métodos Grupo 1>. - 104 - En este último tipo de fijación ha sido necesario ir considerando, el tiempo de duración de esta fijación, el pH óptimo y el tipo de inclusión que se va a realizar, además de considerar el posterior tratamiento enzimático en secciones que se van a realizar. Desde luego en estos últimos puntos no coincidimos con el criterio de De Armond y Eng (1984) que consideran la congelación como el mejor medio de inclusión. Nosotros hemos recurrido a la parafina. c) Otro aspecto importante influyente de forma directa en los resultados de la inmunotinción han sido, las diferentes concentraciones de anticuerpos utilizadas y como referencia hemos tomado las descritas por Dixon y Eng (1981) y De Armond y Eng (1984) sin embargo nosotros hemos preferido hacer otra experimentación, basándonos en pruebas de especificidad del anticuerpo primario, y una vez conocida la concentración idónea, realizar las gráficas correspondientes a las curvas ponderales de concentración para los subsiguientes anticuerpos, obteniendo así unos resultados claros para la concentración del segundo y tercer anticuerpo. Con la técnica inmunocitoquimica, que hemos aplicado para la proteína glial ácida, como constituyente de estas gliofibrillas, podemos confirmar su especificidad casi en un 90% de los astrocitos y por tanto nos ha sido válida, fundamentalmente para la determinación glioarquitectónica de la médula cervical. Esta técnica también es útil en la patología tumoral del S.N.C. Deck y cols. 1981. Mennel y cols. 1985, Rubinstein y cols. 1986 y progresivamente se han ido desarrollando nuevos métodos inmunocitoquimicos para el reconocimiento de astrocitos (Reyners y cols. 1982, Karschin y cols. 1986, Regan y cols. 1988, Alliot y cols. 1988 y Sasaki, y cols. 1989>. Una de las cuestiones planteadas en estudios realizados en el S.N.C. fue el estudio de células astrocitarias, que presentaban inmunotinción positiva (G.F.A.P.). Hay células gliales que en diferentes estadios de maduración presentan ya inmunotinción positiva (Ling y cols. 1973>, (Ling y Leblond, 1973), (Kosaka y cols. 1986), (Schnitzer, 1988), (Levine y cols, 1988), (Ling y cols. 1989). Esta opinión también la compartimos nosotros en esta especie estudiada. - 105 - Se pensó que la proteína fibrilar ácida era específica de astrocitos fibrosos, y por lo tanto los astrocitos de la sustancia gris presentaban inmunotinción negativa (Bignami y cols. 1922) Las células aracnoides. h) La microglía. i) Los macrófagos. - 106 - En la bibliografía consultada . Las membranas plasmáticas de astrocitos y neuronas en unas ocasiones se observan adyacentes unas a otras, pero en otras ocasiones estas membranas están separadas por laminillas gliales. Palay (1958), Zambrano y De Robertis (1967) las encuentran en perro, Conradi <1969) en médula de gato, Murakani (1962) en ratón y Stensaas (1968) en médula de sapo. Nosotros también observamos estas laminillas gliales o lamelas en ratón y se presentan fundamentalmente en las zonas finales de las prolongaciones astrocitarias y son más grandes que las observadas por Murakani <1962) también en ratón. Guldner y Walt (1973) acerca del número de lamelas que presentan estas prolongaciones astrocitarias, afirman que este número es mayor dependiendo del nivel de actividad de las neuronas. Peters, Palay (1965) Pappas y cols. (1966) Conradi <1969) Peters (Palay> y Waxman <1922), Culdner y Wolf (1973) Guldner (1976), Suárez y cols. (1983), Fernández y cols. (1984), son también estudiosos de estas formaciones lamelares en distintas zonas del S.N.C. Estudios todos ellos realizados con M.E. Galambos (1965>, Walt (1970), Guldner (1976), Spacek <1971), Meshul y cols. (1988) afirman que estas lamelas están revistiendo en algunas ocasiones lateralmente las hendiduras sináptícas. Murabe y Sano (1982) atribuyen a estas prolongaciones astrocitarias la capacidad de aislar sinápsis. Eak y Choi (1974) afirman que estas lamelas astrocitarias pueden ayudar a conseguir una mejor transmisión sináptica. - 108 - Toledano y Carrato (1974) con respecto a la función de estas lamelas, advierten de la posible preservación en la polarización de la membrana neural o (la conducción del estímulo), por medio de la actividad colinesterasa encontrada en estas elongaciones gliales, impidiendo la difusión de la acetilcolina. La astroglía se supone hoy que tiene capacidad para evitar la libre difusión de los neurotransmisores en la sinápsis incluso para degradarlos total o parcialmente. Actualmente se conoce que sólo los engloba en las zonas postsinápticas recaptándolos, sino que además los descomponen en otras sustancias tan específicas como el glutamato. (Balaar y cols. 1977), (Berger y cols. 1977a) (Bridges y cols., 1987). Sin embargo, Kuffler y Nocholís (1966), Trachtenberg (1970) y Pappas y Waxman <1972) afirman una función para estas lamelas sinápticas de modificadoras de la concentración de Potasio (K) influyendo también en la conducción del estímulo. Otras células astrocitarias, además de los propios astrocitos, tales como la microglía o la oligodendroglía también se relacionan con los somas nerviosos. Así la microglía forma auténticos satélites perineuronales, que están rodeando a neuronas de diferentes tipos , King (1966), Sensharma y Amrendra (1981a). También a nivel de M.E. (Mugnainí y Walberg (1965), Kruger y Maxwell (1967) fundamentalmente destacan auténticos pies chupadores en los vasos, indicando que la envuelta perívascular en ocasiones es casi completa. Otros estudiosos de M.E. Schonbach <1969), Stensaas y Stensaas (1968b) Phelps (1972) estudian la densidad electrónica de estas prolongaciones perivasculares, afirmando que existe una abundancia de gliofilamentos, dato que nosotros también hemos visualizado por medio de la inmunotinción; Gianonatti y cols. <1984) encuentra glucógeno en estas prolongaciones. A nivel histoquimico, Onteniente y cols. (1983) encuentra gran abundancia de G.F.A.P. en zonas perivasculares y relaciona elementos astroglíales con vasos sanguíneos, pero en ningún caso encuentra pies vasculares definidos, sin - 110 - embargo nosotros con las misma técnica, no sólo encontramos frecuentes pies vasculares, sino que incluso se visualizan a modo de gliofibrillas positivas en el interior de estos pies vasculares. Achucarro en 1913, expone que además de pies chupadores los somas astrocitarios protoplásmicos pueden encontrarse adosados a los vasos sanguíneos, estos astrocitos perívasculares satélites, posteriormente fueron estudiados por Bairatti y Maccagnaní (1950) y Ontenierite y cols. <1983). Desde luego en nuestros resultados se puede apreciar que con la técnica G.F.A.P., no sólo se observan frecuentes astrocitos perivasculares satélites que adosan su soma a los vasos, sino que además en algunos casos se puede observar que la cubierta astroglial del vaso es completa, formada por varios somas astrocitarios. También se puede apreciar que el número de láminas astrogliales es mayor en los vasos de mayor calibre. Los estudios con trazadores histoquimicos, para observar de forma clara la relación entre membranas astrocitarias y vasculares han sido realizados desde peces Gotow y Hashimoto (1984) hasta en mamíferos Reese y Karnousky (1967), Brightman y Reese <2969), De Juan y cols. (1986), Stone y cois. (1987) y Krum y cols. <1989) y a este respecto se han vertido múltiples opiniones desde que entre estas membranas existen uniones de tipo estrecho De Robertis (1965), Gotow y Hashimoto (1984), Ward y cols. <1988), hasta que la barrera hematoencefálica la forman las mismas células endoteliales del vaso. (Reese y Karnousky (1967), (Jancer y cols. 1987). Otros como Erightman y Reese (1969) observan uniones de tipo GAP, y por tanto estas prolongaciones tienen un valor secundario en la formación de la barrera hematoencefálica. Otros autores como Dermietzel <1974>, Landis y Reese <1981>, Gotow y Hashimoto (2984), encuentran con criofractura, unos agregados ortogónales membranosos en estos pies vasculares y afirman que su número aumenta en algunos de estos pies vasculares. La función de estas formaciones membranosas parecen estar concebida como un sistema de transporte de partículas desde el vaso al soma astrocitario, así de Gotow y Hashimoto (1984) encuentran actividades enzimáticas en estas membranas perivasculares, lo que — 111 — ratifica su función transportadora ya intuida por S. Ramón y Cajal (1916). También Newman (1984) <1985) y Lewis y cols. (1988) afirman que el K absorbido por un tipo de célula astroglial (c. de Muller), era realizado por estos sistemas membranosos de los pies chupadores. Desde luego, esta función de absorción por los pies vasculares parece clara, como función astrocitaria Phelps (1972>. Sin embargo no hemos estudiado a nivel molecular esta función, pero sí a nivel de M.E. hemos observado vesículas de secreción en el límite del endotelio vascular y las prolongaciones astrocitarias. También se ha postulado un posible papel secretor para los astrocitos por medio de estas prolongaciones perivasculares (Bodegay cols. 1986). Desdeluego nosotros a pesar de haber encontrado vesículas en estos pies vasculares, observamos que estas parten de la lámina basal terminal pegada a la superficie vascular por lo que intuimos que posiblemente sean partículas emitidas a partir de la propia pared vascular. La posesión de gliofilamentos en el soma y prolongaciones astrocitarias ha sido una característica diferencial contundente entre astrocitos y oligodendrocitos en los últimos años por carecer de gliofilamentos en su soma estos últimos, así nosotros en los resultados de este trabajo en ninguna ocasión hemos encontrado olígodendrocitos G.F.A.P. positivos. Sin embargo en estadios postnatales donde varias estirpes celulares se encuentran indiferenciadas, ha sido difícil determinar con precisión qué estirpes pertenecían a oligodendrocitos y cuáles a astrocitos, por este grado de inmadurez. Ramón Moliner (1958) en un estudio completo acerca de este aspecto, sugiere que entre oligodendroglía y astroglía existe la posibilidad de dos formas transicionales: a) una es una forma indiferenciada y otra es una forma transicional a oligodendroglía a la que denomina oligodendrocito musgoso. Sin embargo, Palay y Chan Palay (1974) denominan a este oligodendrocito musgoso como un astrocito protoplásmico liso, estudiándolo a M.E., también Bodega y cols. (1984) confirman este parecido encontrado por — 112 — Palay y chan Palay e incluso observan su capacidad para formar redes perineuronales. Río Hortega <1928) ya planteaba esta idea de que existieran, formas transicionales entre estirpes gliales. De Castro <1946> encuentra oligodendrocitos con grandes similitudes morfológicas a las células astrogliales. Este aspecto también fue estudiado a M.E. por D’Agata (1950>, Farquar y Hartmann <1957), Palay y Chan Palay (1974), Takahashi (1981), French y cols. <1986) Stalleup y cols. <1987), Small y cols. (1987>, Hoin (1989), Spranger y cols. (1989) y Ling y cols. (1989). Reyners (1982), Sijbesma y cols. (1986) y Aloisí y cols. (1988) describen las células astrogliales ricas en orgánulos como posibles formas transicionales entre oligodendrocitos y astrocitos. Los astrocitos reactivos varían su morfología dependiendo del grado de diferenciación celular en que se encuentren e incluso son capaces de formar otras estirpes astrogliales Wendell y Smith (1986), Codina (1987), Miyake y cols. (1988). También en caso de lesión se cree que impiden la regeneración axonal Olson y cois. (1982), Mackenzie, (1983), Bignamí y Eng, (1984), Raisman (1985), Giulian y cols. <1985), Linzzi y cols. (1987), (Janeczko, (1988), Hall y cols. (1989), Miyake y ocís. (1989), Poltorak y cols. (1989), formando ellos mismos unos agregados ortogonales que determinan su capacidad de regeneración. Wirdle y cols. (1952), Reier <1983), Anderson y cols. (1984) afirman que en médulas regeneradas existe un gran aumento de G.F.A.P. Desde luego la función clara de estos astrocitos reactivos, hoy es desconocida con exactitud y se maneja la hipótesis de que sea reparadora de la lesión. Anteriormente Fujita y Fujita (1964) habían propuesto a los glioblastos como células indiferenciadas, que posteriormente a su desarrollo, darán distintas estirpes de células gliales. Estos glioblastos después de sufrir varias transformaciones en las primeras fases de la gliogénesis, dejan de proliferar y se desarrollan como tales células astrogliales, Sturrock y cols, (1981). Nosotros encontramos en los primeros días posteriores al nacimiento, una agrupación periependimaria dorsal, de células indiferenciadas astrogliales , Pixley (1984) y Trimmer <1982) que afirman que la G.F.A.P. inmunotinción es útil en la demostración de cambios gliales durante el desarrollo. Pero existen otros tipos celulares indiferenciados que muestran en estos días prenatales una inmunotinción P.G.F.A. positiva, débil, que posteriormente han sido identificadas por nosotros como precursores de oligodendrocitos. El oligondendrocitos, es conocido que forma la mielina en el S.N.C. y que su maduración es un proceso lento. Man y Leblond (1970). A los 8 o 10 días del nacimiento se produce la mielinización total del S.N.C. en rata (Man y Leblond, 1970), (Ling y Leblond, 1973) , (Sturrock, 1974) y (Schwab M.E. 1988). Moni y Leblond (1970), Ling y Leblond (1973) y Sturrock (1974) afirman que el oligodendrocito pasa por tres estadios antes de su maduración: fase clara, media y oscura. En nuestros resultados con M.E. mostramos claramente estos estadios en la formación de las capas de mielina. La fase clara es la más inmadura, y a medida que evoluciona se produce una reducción del tamaño somático, una mayor complejidad de orgánulos y un incremento en su densidad electrónica. Este proceso también es visible en nuestros resultados de M.E. Schultz y Farquar (1957) sin embargo consideraron a los astrocitos como células de citoplasma claro, debido a una mala fijación. En posteriores estudios acerca del proceso de mielinización, se ha encontrado que la G.F.A.P. sirve como - 114 - marcador, en estados patológicos de hipomielinización en el S.N.C. por mutaciones del gen Jimpy en ratón hembra, Eng y cols. (1980), Matfield y cols. (1982), Ulrich y cols. (1983), Carolí y cols. (1987). Ling y cols. (1973) también confirman la posibilidad de identificarlos por la presencia o ausencia de mitosis. Nosotros en este aspecto no podemos opinar porque en nuestros resultados hemos omitido este aspecto, que nos ha parecido poco contundente. En estadios tempranos del desarrollo embrionario, cuando aún la neurogénesis no ha terminado ya existen precursores de células gliales Sturrock <1982), (1983). Estos precursores tal y como manifestábamos anteriormente no son exclusivos de células astrogliales. Sturrock en 1976 define las características atribuibles a los precursores astrocitarios y los encuentra en la médula de conejo embrionario. Eng y cols. (1971) afirman que en el desarrollo ontogenético de los astrocitos, existen cambios en las proteínas intermedias de los gliofilamentos, existiendo algunas proteínas comunes con las neuronas, ya que se observa antigenidad cruzada. La vinmetina y la proteína G, parecen ser dos proteínas que también están relacionadas con ellos, en los primeros estadios del desarrollo, como proteínas intermediarias de filamentos Dahí y cols. (1981), (1982), Bovolenta y cols. <1984), Rasper y cols. (1986). Esto justifica de alguna forma que nosotros encontráramos en los primeros estadios postnatales, precursores de oligodendrocitos con P.G.F.A. positiva débil. Aunque los gliofilamentos en adultos son considerados como exclusivos de las células astrogliales. Peters y cols. (1976). Sturrock (1976) afirma que los glioblastos suelen carecer de gliofilamentos y Salms y cols. (1982) afirman que la inmunotinción para la G.F.A.P., se produce en células con gliofilamentos o con capacidad para formarlos, porque esta proteína G.F.A.P. se puede encontrar también en estado nativo en las células embrionarias sin formar todavía los gliofilamentos. — 115 — También Schachner y cols. (1977), Monoury y cols. (1979), Salms y cols. <1982) confirman la presencia de tinción G.F.A.P positiva en células en que los gliofilamentos aún están ausentes y estudian la estrecha relación entre esta proteína y la formación de los gliofilamentos. Nosotros, hemos observado que la positividad para la G.F.A.P. en los astroblastos fibrosos de la sustancia blanca es mucho más temprana y se hace más patente que en la sustancia gris donde esta no aparece hasta estadios de 1 y 2 días de edad. Posiblemente esto es debido a que los astrocitos fibrosos, formen antes los haces de filamentos protéicos en sus somas, que los protoplásmicos y por esta razón contengan mayores cantidades de G.F.A.P. nativa en sus somas, aunque estén sin formar todavía estos gliofilamentos. Pero por la claridad, en esta tinción de días O y 1, nosotros creemos que al menos algunos gliofilamentos en sustancia blanca se forman antes que en sustancia gris. A medida que los astrocitos maduran se produce un recambio de microtúbulos por gliofibrillas, ocupando estos prácticamente todo el soma astrocitario, Vaughn y cols. <1967). También en médula espinal se ha descrito un astrocito mixto, localizado de forma asidua entre sustancia blanca y sustancia gris Ramón y Cajal (1916), con características intermedias entre astrocito protoplásmico y fibroso, pero recientemente se ha confirmado que su morfología es más bien una adaptación morfológica por su ubicación medular, que una simple estirpe celular intermedia Bodega y cols. <1984), Gianonatti y cols. (1984). Nosotros por las imágenes obtenidas en nuestros resultados consideramos a este astrocito mixto, como un astrocito claramente protoplásmico, por su escasasemejanzacon la inmunotinción a los astrocitos fibrosos. Por último comentar que se han estudiado también los RNA mensajeros capaces de sintetizar la G.F.A.P. (proteína de nuestro interés) in vitro. Beguin y cols. <1980), Bigbee y cols. (1982), Kitamura y cols. (1987). También son muy — 116 — numerosos los trabajos realizados en cultivos celulares, Moblrey y cols. (1986), Fedoroff y cols. (1987), O’Callaghan y cols. (1989), García Segura y cols. (1989) y Watabe y cols. (1989). — 117 — CONCLUSIONES 1.- La astroglía ya aparece diferenciada en el día del nacimiento. Responde a la inmunotinción de manera muy leve porque se la puede considerar una población inmadura. 2.- En el día del nacimiento la astroglía se localiza fundamentalmente en la limitante subpial de la sustancia blanca y en el territorio peiependimario dorsal. 3.- A partir del nacimiento, las reacciones positivas a la G.F.A.P. por parte de los astrocitos se intensifican. Los astrocitos progresivamente se van diferenciando primero en las zonas sensitivas de la sustancie gris y posteriormente en otras localizaciones. 4.- Los astrocitos en la médula de animales adultos, contribuyen no sólo a la formación de la limitante subpial, sino también a la configuración del tabique basal y a la delimitación del surco medio ventral. 5.- Existe una intensa reacción positiva a la G.F.A.P. en la sustancia blanca, en los limites de los haces medulares y en la sustancie gris en la delimitación de los núcleos. De donde se puede concluir que la astroglía interviene en la citoarquitectura medular. 6.- Las prolongaciones astrocitarías hacia los vasos sanguíneos adoptan distinta configuración en la sustancia gris medular que en la sustancia blanca. En la primera se distinguen los clásicos pies vasculares, mientras que en la segunda son vainas vasculares. 7.- Sea cual sea su localización los astrocitos presentan distintos tipos de uniones entre ellos, incluidos los desmosomas. 8.- En el limite entre la sustancia blanca y la sustancie gris se han observado astrocitos con características intermedias entre los fibrosos y protoplásmicos. — 118 — 9.— La relación entre somas neuronales o sus Libras y los astrocitos no responde a ningún patrón diferenciado, salvo el inherente a la propia constitución de una y otra sustancia. 10.-Por los resultados obtenidos podemos afirmar, bajo la base de la astroarquitectónica, que la astroglía contribuye a la delimitación territorial de los componentes neuronales y fibrilares en la médula y ello de manera progresiva a lo largo del desarrollo postnatal. — 119 — Lb 0 0 0 •¶ 0 o. 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