UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Rafael Samaniego García DIRECTOR: Susana Moreno Díaz de la Espina Madrid, 2015 © Rafael Samaniego García, 2004 Análisis de los homólogos nucleares de MFP1 en A cepa : caracterización, presencia en distintos tipos celulares y posible funcionalidad Departamento de Bioquímica y Biología Molecular UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE BIOLOGIA DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Analisis de /os homologos nucleates de MFP1 en A. cepa; caraclerizaclon, presencia en distintos fipos celulares y posible funcionalidad Memoria para optar al grade de Doctor en Biologie per la U.C.M. presentede per RAFAEL SAMANIEGO GARCIA 'T / V°B° de la Directore SusajTO Moreno Diàz-de la Espine V°B° de la Tutore del Departemento Dre. Dolores Arogonés Senz Madrid, ]unlode2004 AGRADECIMIENTOS Agraaecimienros En primer lugar me gustaria agradecer a la Dra. Susana Moreno Diaz de la Espina la direccion de esta Tesis Doctoral. Agradezco también a las Dras. Iris Meier, Consuelo de la Torre y al Dr. Rafael Giraldo el tiaber puesto a mi disposicion sus laboratorios y su experiencia en los experimentos de clonacion y fosforilacion de MFPl, sincronizacion celular, e inmunoprecipitacion, respectivamente. Asi como la colaboracion de mi tutora en el Departamento de Bioquimica y Biologfa Molecular, la Dra. Dolores Arogonés. Agradezco a los servicios del Centro de Investigadones Biologicas (CSIC), y a sus responsables técnicos, su excelente trabajo y profesionalidad: M° Angeles Ollacarizqueta (microscopia confocal), M° Dolores Guirao y Jasminka Boscovick (microscopta electrônica). Pedro Lastres (citômetrîa de flujo), Ramôn Toro y Mario Garcia (informâtica), asi como a Diego Megia del servicio de Microscopia Confocal de la Facultad de Medicina de la UAM, y a Matoya Lafita (secretaria). Ha sido un verdadero placer trabajar todos estos arios con Mercedes Carnota y José Luis Marcilla, muctios de los resultados de esta Tesis se han conseguido gracias a su esfuerzo y colaboracion. Agradezco a todos mis comparieros del laboratorio de Matriz Nuclear del Centro de Investigadones Biologicas su inagotable ayuda y colaboracion: Fernando Novillo, Wendou Yu, Nieves Fonturbel, M® del Mar Robles, Elsa Alverca, Hua Li, Ping Cui, Veronica Dominguez y Adriana Ôerna, asi como a Ricardo Acevedo, Eido Gonzalez, M° Encamaciôn Fernandez, Gerardo Vazquez-Nin y Olga Ectievema. También debo incluir a mis comparieros del Departamento de Plantas y de otros departamentos o centres por su colaboracion: Fernando Gonzalez, Victoria Rodriguez, David Lôpez, Isabel Matia; M® José Coronado; Myriom Molino, Israel Pagan, Gem a Vila; Ismael Sânctiez, Marta de la Poza, Gema Pérez, Beatriz Beroiz, Agradecimienfos Mercedes Mendoza, Cristina Magana, M® Luisa Ruiz, Pedro Hernandez; M® José Tobojas; Dolores Bernardo; Teresa Diaz, Ana Munoz; Jesus Corbollo, Margarita Carrascosa; asi como a Javier Medina, Félix Ortego, Concepcion Garcia, Rata Escribano, y a todos los que por motivos de espacio me es imposible citar. También agradezco sinceramente la colurosa ocogido y colaboracion a mis comparieros de laboratorio del Plant Biotechnology Center durante mi estancia en Ohio: Annkatrin Rose, Shalaka Patel, Tomasz Calikowsky y muy especialmente a Sun Yong Jeong y Louis Tang. En este pdrrafo me gustaria ademds reconocer de monera especial mi mas sincera admiracion, tanto en lo cientifico como en lo personal, a Ricardo Acevedo, Elsa Alverca, Cristina Caballero y Mercedes Camota. Por supuesto, ha sido fundamental en estos arios el apoyo, lo pociencio y la comprension de mi familia, especialmente mis padres, Oscar Blanco y el resto de mis amigos, y por supuesto de Laura. A ella y a mi hija Paula me gustaria dedicaries esta Tesis Doctoral. También quiero dar las gracias al Dr. Michael J. Harvey de la Universidad de Wisconsin, por cedernos la genoteco de Allium cepa, y de nuevo a la Dra. Iris Meier por los sueros contra MFPl utilizados. Agradezco por ultimo al Ministerio de Ciencia y Tecnologfo el habeime concedido una Beca de FPI asociado al proyecto DGICYT P98-0647 y una estancia de corta duracion en The Ohio State University en Columbus, Ohio. RESUMEN I I MFPl (MAR-binding Flamenf-like Protein 1) es una proteina con capoddad para unip regiones MARs (Matrix Attachment Regions) de ADN, y contiene un extenso dominio coiled-coil. Se conoce su secuencia compléta en tomate, Arabidop^ y tabaco. Su secuencia esta dividida en dos dominios principales, el mas corto corresponde al extremo N-terminal de la proteina y contiene dos regiones hidrofôbicas y una serial de transiciôn a cloroplastos. El resto de la secuencia la ocupa un largo dominio coiled-coil, donde se localizan una serial de locaBzaciôn nuclear y un subdominio de union a ADN, con dos sitios de fosforilacion para Casefna Kinasa CK2 con la capacidad de inhibir diclia union. Sueros especfficos contra distintos dominios de MFPl detectan esta proteina de 80 KDa en distintos tejidos y especies vegetales, indicando su conservaciôn en plantas. Mediante técnicas de fraccionamiento celular y andlisis de MFPl-GFP en células transfectadas, se ha detectado la proteina en los plostidios, y con cierta controversia en el nùcleo y la matriz nuclear, que es la estructura nuclear no-cromatinica implicada en la organizaciôn del genoma y los distintos subdominios del nùcleo. Se desconoce la funciôn de MFPl, aunque basdndose en sus potenciales caracterîsticas estructurales y su capacidad para unir ADN, se ha propuesto que podria ejercer un papel en la organizaciôn de los genomas del cloroplasto y el nùcleo. Estudios onteriores mediante un suero anti-LeMFPl nos permitieron identificar dos proteinas nucleares antigénicamente relacionodas en Allium cepa de 80 y 90 KDa. La primera es una proteina nuclear soluble, mientras que la segunda forma parte de la matriz nuclear y se distribuye por los filamentos del nucleoesqueleto y en una nueva categorîa de cuerpos nucleares. En esta Tesis Doctoral se han caracterizado las dos proteinas nucleares de AHium cepa mediante inmunodetecciôn e inmunoprecipitacion con dos sueros anti-MFPl desarrollados contra las proteinas de tomate y Arab/dops/s. AcMFPl-78 KDa tiene un valor de pl experimental ligeramente acido (5,5) y es inmunoprecipitada e inmunodetectada por ambos sueros. Es una proteina constitutiva, que se distribuye en distintos subdominios nucleares en funciôn del I I I tipo celular y el tejido, como se ha demostrado mediante inmunofluorescencia con los mismos sueros. El analisis de microscopia electrônica ha demostrado que se distribuye por pequerios dominios localizados preferentemente en la periferia de las masas de heterocromatina densa. AcMFPl-78 KDa posee una doble localizaciôn subcelular, en el nùcleo y en los cloroplastos, con un patrôn de distribuciôn similar al de MFPl en otras especies. Atlium cepa posee una segunda proteina homôloga de 90 KDa y pl bâsico (8,5-9,5) con distintos estados de fosforilaciôn de los que depende su uniôn a la matriz nuclear. Se ha demostrado que la Caseina Kinasa CK2 endôgena estô implicada en la regulaciôn de dicha uniôn. AcMFPI-90 KDa se acumula en cuerpos nucleares cuya presencia en el nùcleo esta favorecida por la proliferaciôn celular y la presencia de luz. También se distribuye por el reticulo de la matriz nuclear, habiéndose detectado osociada a los filamentos del nucleoesqueleto. Se ha comprobado mediante estudios de co-localizaciôn que las proteinas AcMFPl no forman parte de los complejos de replicaciôn del ADN ni de los de procesamiento co-tronscripcional de! ARN, ni tampoco parecen estar relacionadas con los procesos de maduraciôn y almacenamiento de los factores de splicing en los grônulos intercromatinicos o los cuerpos de Cojal. Las distintas caracterîsticas y patrones de distribuciôn y expresiôn de ambas proteinas AcMFPl sugieren funciones diferentes, o al menos formas distintas de regulaciôn. El conjunto de los resultados sugiere una interacciôn de AcMFPl-78 KDa con la cromatina descondensada, asi como una funciôn estructural para AcMFPl-90 KDa en la matriz nuclear. INDICE AGRADECIMIENTOS......................................................................................... 1 RESUMEN............................................................................................................ 3 INDICE................................................................................................................. 5 ABREVIATURAS....................................................................................................10 INTRODUCCIÔN................................................................................................ 13 Organizaciôn del genoma en el nùcleo eucariota.................................. 13 Organizaciôn de los distintos subdominios nucleares.............................. 17 La Matriz Nuclear............................................................................................ 21 Dinamica de las proteinas nucleares......................................................... 23 Proteinas coiled-coil y Filamentos Intermedios..........................................25 Proteinas relacionadas con la matriz nuclear de plantas....................... 26 MFPl { MAR-binding FHamenf-Tike Protein J)..............................................27 OBJETIVOS........................................................................................................... 31 MATERIAL Y MÉTODOS...................................................................................... 32 I. MATERIAL......................................................................................................... 32 1. Especies......................................................................... 22 2. CuHlvos.........................................................................................................32 2.1. Cultives de cebolla................................................................................ 32 2.2.1. Cultives sincronizados de cebolla..................................................... 33 2.2. Cultive de tabaco, tom ate y Arabidopsis.......................................... 33 3. Anffcuerpos.................................................................................................34 II. MÉTODOS.........................................................................................................35 1. Fraccionamiento celular..........................................................................35 1.1 .Aislamiento de nùcleos.........................................................................35 1.2.Extracciôn de matrices nucleares mediante alta fuerza iônica 36 1.3.Extracciôn de matrices nucleares mediante el método de LIS 38 2. Anân îs de proteinas................................................................................. 38 2.1. Electrotoresis monodimensional (SDS-PAGE)...................................... 38 2.1.1. Preparacion de muestras....................................................................39 2.1.2. Desnaturalizaciôn de proteinas......................................................... 39 2.1.3. Valoraciôn de proteinas.....................................................................40 2.1.4. Desarrollo de la electrotoresis............................................................ 40 2.2. Electrotoresis bidimensional................................................................ 41 2.2.1. Doble solubilizaciôn de muestras de nùcleos y MN para electrotoresis bidimensional..........................................................................41 2.2.2. Isoelectroenfoque (lEF) o primera dimension................................. 42 2.3. SDS-PAGE (segunda dimension).......................................................... 42 2.4. Electrotransferencia............................................................................... 43 2.5. Inmunodetecciôn en m embrana........................................................ 43 2.6. Tinciôn de geles con azul de Coomassie............................................44 2.7. Tinciôn de geles con p la ta ....................................................................45 2.8. Inmunoprecipitaciôn de proteinas...................................................... 45 3. Ensayos de fosforilacion............................................................................ 46 3.1. Defostorilaciôn in vitro de la fracciôn F2 con Fostatasa Alcalina... 46 3.2. Fosforilaciôn de la matriz nuclear con Caseina Kinasa CK2 47 3.3. Inhibiciôn / estimulaciôn de CK2 endôgena..................................... 47 3.3.1. Inhibiciôn de la CK2............................................................................ 47 3.3.2. Estimulaciôn de CK2.................. 48 3.4. Analisis estadfetico.................................................................................. 48 4. Inmunofluorescencia (IF).......................................................................... 48 4.1. Nùcleos aislados y fracciones subnucleares...................................... 48 4.1.1. Preparaciôn de las muestras............................................................. 49 4.1.2. Reacciôn en suspensiôn.....................................................................49 4.2. Células enteras........................................................................................50 4.2.1. Preparaciôn de muestras de aplastados celulares........................50 4.2.2. Reacciôn inmunolôgica......................................................................51 4.3. Observaciôn, contrôles y analisis estadistico................................... 52 5. Localizacion de proteinas mediante inmunomarcado con oro y microscopia electrônica convenclonal.....................................................53 5.1. Preparaciôn de las muestras................................................................ 53 5.1.1. Fijaciôn...................................................................................................53 5.1.2.Desh'idrataciôn, inflltraciôn e inclusiôn en LR White.........................53 5.1.3. Ultramicrotomia................................................................................... 54 5.2. Inmunomarcado con oro................................................................... 55 6. Citometria de flujo..................................................................................... 56 7. Clonaclôn de AcMFPl a partk de una genoteca de cDNA de A. cep a ...................................................................................................... 57 7.1. Rastreo de la genoteca mediante PCR.............................................57 7.1.1. Selecciôn de los cebadores especificos......................................... 57 7.1.2. PCR y clonaciôn de fragmentes amplificados...............................58 7.2. Hibridociôn de colonies con sondas de cDNA de M FPl..................59 7.2.1. Preparaciôn de las sondas................................................................ 59 7.2.2. Hibridaciôn sobre colonies (Southern)..............................................59 RESULTADOS...................................................................................................... 61 1. Caracterfzaclôn de las proteinas reconocidas por los sueros antf-MFPl en células proliférantes de rmz de AlSum c e p a . ... .. .. . ... 61 1.1. Coracterizaciôn mediante inmunodetecciôn en membrana 61 1.1.1 Suero anti-MFPl de tomate (288)................................................... 61 1.1.2. Suero anti-MFPl de Arabidopsis (91)................................................63 1.2. Inmuoprecipitaciôn mediante los sueros 288 y 91............................. 64 1.3.Asociaciôn de la proteina de 90 KDa a la matriz nuclear.................66 1.3.1. Efecto de la defostorilaciôn con Fosfota Alcalina..........................67 1.3.2. Efecto de la fosforilaciôn con Caseina Kinasa CK2.......................68 1.3.3. Efecto de la estimulaciôn de la CK2 endôgena............................ 71 1.3.4. Efecto de la inhibiciôn de la CK2 endôgena.................................. 72 1.3.5. Estudio de la proteina de 90 KDa en geles bidimensionales 73 1.3.6. Estudio de las proteinas de 78 KDa en geles bidimensionales.... 78 2. Clonaclôn de AcMFPl............................................................................... 79 2.1. Rastreo de una genoteca de cDNA de cebolla mediante PCR..................................................................................................79 2.2. Rastreo de una genoteca de cDNA de cebolla mediante hibridaciôn de colonias.................................................................................85 3. Expresiôn y locaHzaclôn topolôgica de las proteinas de 78 y 90 KDa en distintos tejidos y situaciôn fisioiôgicas............................88 3.1. Nùcleos de células proliférantes asincrônicas y sincronizadas durante el ciclo celular..................................................................................88 3.1.1. Inmunofluorescencia y microscopia confocal................................88 3.1.2. Inmunomarcado con oro y microscopia electrônica....................99 3.2. Distribuciôn de las proteinas en células meristemâticas durmientes....................................................................................................... IC I 3.3. Expresiôn y distribuciôn de las proteinas AcMFPl en células diferenciadas de raiz...................................................................104 3.4. Expresiôn y distribuciôn de las proteinas AcMFPl en hoja............... 107 4. Relaciôn con otros dominios nucleares.................................................112 4.1. Dominios de splicing co-transcripcional y maduraciôn de los snRNAs.........................................................................112 4.2. Focos de replicaciôn de ADN............................................................... 114 4.2.1. Marcado con anti-5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU).........................116 4.2.2. Estudio de co-localizaciôn entre BrdU y AcMFPl............................118 5. Distribuciôn de MFPl en distintos especies vegetales........................119 5.1. MFPl en tom ate...................................................................................... 121 5.2. AtMFPl en Arabidopsis y su knockout................................................ 123 5.3. NtMFPl en tabaco y en plantas transformadas con AtMFPl 126 DiSCUSIÔN........................................................................................................... 131 1. identificaciôn de dos proteinas homôlogas de MFPl en cebolla 131 1.1. Especificidod de los sueros 288 y 91 e identificaciôn de las proteinas AcMFPl..................................................................................... 131 1.2. Clonaciôn de AcMFP 1 ............................................................................134 2. La asociaciôn de AcMFPl-90 KDa a la matriz nuclear esta regulada por fosforilaciôn con Caseina Kinasa CK2................................ 136 8 2.1. La CK2 régula la union de AcMFP 1-90 KDa a la M N ..........................136 2.2. AcMFPl-90 KDa es la ùnica proteina MFPl con pl bâsico............... 140 3. Expresiôn y locaBzaciôn de las proteinas AcMFPl en cBstfeitos tejidos y lipos celulares de ceboUa.......................................................... 142 3.1. AcMFP 1-78 KDa es una proteina constitutiva de cebolla............... 142 3.2. Localizaciôn subcelulcx de las isoformas de AcMFP 1-78 KDa 143 3.3. AcMFP 1-78 KDa posee una doble localizaciôn nuclear y cloropiôstica, pero no co-localiza con el ADN condensado del nucleoide...................................................................................................146 3.4. AcMFP 1-90 KDa no es una proteina constitutiva de cebolla........... 147 3.5. AcMFPl-90 KDa se localize asociada al nucleoesqueleto y en una nueva categoria de cuerpos nucleares.....................................................146 4. Implicaciones funcionales de AcMFPl................................................ 151 CONCLUSIONES......................................................................................... 155 BIBLIOGRAFIA............................................................................................ 158 APÉNDICE A................................................................................................ 177 APÉNDICE B................................................................................................183 ABREVIATURAS Abreviaturas 2-DE: Electrotoresis bidimensional A: Adenina ADN: Acido DesoxirriboNucleico ARN: Âcido RiboNucleico BrdU: 5-Bromo-2’-deoxiUridina BSA: Seroolbumina bovino C: Otosina cDNA: ADN complementario CENP-E: Proteina centromérica E Cfh Fracciôn citoplasmatica CK2: Caseina Kinasa 2 COPl: Constifufively Photomorphogenic Protein 1: proteina constitutiva fotomorfogénica 1 CSK: Tampôn de citoesqueleto DAPI: 4 \ 6-diamino-2-fenilindol DB: Digestion Buffer, Tampôn de digestiôn DNasa I: Desoxinibon ucleasa I D.O.: Densidad Ôptica DIT: Ditiofreitol EDTA: Acido etilendiamino tetracético FA: Fosfatasa Alcalina FI: Filamentos Intermedios FISH: fluorescence in situ hibridisation: hibridaciôn in situ de fluorescencia G: Guanina G A: Giutaraldehido GFP: Green fluorescence Protein; proteina verde fluorescente h: Hora IF: Inmunofluorescencia IFA: Intermediate Filament Antigen: antigeno de filamentos intermedios HU: Hidroxiureo Kb: Kilobase KDa: Kilodalton LIS: 3, 5- diiodosalicilato de litio 10 Abreviaturas M: Molar MAR: Matrix Attachment Region: region de union a la matriz nuclear mA: Miliamperio ME: Microscopia Electrônica de transmisiôn MFPl: MAR-binding Filament-like Protein 1 min: Minuto ml: Mililitro MN: Matriz Nuclear MN-US: Matriz Nuclear obtenida mediante el método de LIS mM: Milimolar Mr: Movilidod relative electroforética en gel de acrilamida N: Nùcleo NAC: Nuclear Acidic Coiled-coil proteins: proteinas nucleares acidas con dominios coiled-coil NCBI: National Center for Biotechnology Information NLS: Nuclear Localization Signal: serial de localizaciôn nuclear nm / pm: Nanometro / micrômetro No: Nucleolo NuMA: Nuclear Mitotic Apparatus protein pb: Par de bases de nucleôtidos PBS: Tampon fosfato salino PCR: Reacciôn en cadena de la polimerasa PFA: Paraformaldehido PMSF: Fluoruro de fenil metil sulfonilo pl: Punto Isoeléctrico RNoso: Ribonucleasa RNP: Ribonucleoproteina rpm: Revoluciones por minuto S: Fase de sintesis de ADN del ciclo celular SDS-PAGE: Electrotoresis en Gel de Poliacrilomida en presencia de SDS sg: segundos snRNA: Acido ribonucleico nuclear de pequerio tamario T: Timidinc 11 /MDreviaruras TCA: Âcido Tricloro Acético TX-lOO: Detergente no ionico Triton X-10Ô U: Unidodes UBF: Upstream Binding Factor V: Voltio v/v: volumen/volumen W: Votio 0 : Diametro medio 12 INTRODUCCIÔN MFPl {MAR-binding Filament-like Protein ]_} es una proteina nuclear de plantas con un extenso dominio coHed-coil, dos regiones hidrofôbicas en el extremo amino terminal y un subdominio de uniôn a regiones de ADN orgonizadoras del genoma denominadas S/MAR (Scaffold/Matrix Attachment Region) (Harder et al, 2000: Meier et al, 1996). Se ha descrito un gen MFPl en tom ate y Arabidopsis, y dos en tabaco, cuya conservaciôn de secuencia es variable. MFPl se localize en nùcleos y matrices nucleares aisladas, y recientemente se ha descrito también en plastidios de células de tabaco en suspensiôn (Jeong et al, 2003). Su funcionalidad exacte esta todavîa por determiner. Aunque esta catalogada como une proteina MAR-binding, se ha propuesto recientemente que podria tener edemas un papel en la organizaciôn del ADN del cloroplasto (Jeong et al, 2003). Organizaciôn del genoma en el nùcleo eucarfota El genoma eucariota présenta varies niveles de organizaciôn implicados en la expresiôn génica. El primero esta constituido por la ordenaciôn lineal de los genes y las secuencias reguladoras en la doble hélice de ADN, que proporcionan su potencial genético (van Driel e t al, 2003). Actualmente, este nivel de organizaciôn esta bastante bien establecido en plantas, ya que se han secuenciado los genomas completes o parciales de varias especies (Arabidopsis, maïz, arroz, trigo, tomate, etc: www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Genome/PlantBlast). A partir de este nivel, la organizaciôn del ADN esta determinada por proteînas. Consiste en la organizaciôn nucleosômica y supranucleosômica de la cromatina, que facilita su empaquetamiento, favorece la interacciôn entre elementos reguladores y los hoce compétentes para interaccionar con otros factores regulando la expresiôn génica (Jackson, 2003 a) En el primer nivel de organizaciôn o nivel de secuencia, el propio ADN expérimenta modificaciones, produciéndose silenciamiento génico al metilarse los pares CG (SIeimer et al, 2004; Johnson et al, 2002). La expresiôn de un gen o grupo de genes puede estar controlada también por elementos reguladores 13 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Genome/PlantBlast como los enhancers, que aumentan la tasa de transcripcion de determinados promotores desde posiciones incluso fîsicamente alejadas, aunque son susceptibles al efecto silenciador de la cromatina adyacente (Brown, 2003). Los insulators o elementos délimitantes afslan un gen o grupo de genes del efecto de un enhancer al situarse entre ambos, participando ademds en la re-localizacion de los dominios cromatinicos por distintos dominios del nùcleo (Kutin y Geyer, 2003; Loot y Grosveld, 2003; en plantas Ctiua et al, 2003). El segundo nivel de organizaciôn se corresponde con la cromatina, que es un complejo macromolecular de ADN y un nùmero considerable de proteinas asociadas como las tiistonas y diversas proteinas estructurales y reguladoras (Belmont, 2003; Vermaak et al, 2003; Heslop-Hanison, 2000). El ADN lineal interacciona con las tiistonas centrales del nucleosoma formando fibras de ADN nucleosômico, y con la histona HI produciendo empaquetamientos supranucleosômicos (Houshalter y Kadonaga, 2003). El ADN puede adopter dos estados fundamentales de empaquetamiento, que originan a su vez dos estados funcionales en la cromatina: el transcripcionalmente activo o descondensado, y el estado transcripcionalmente inactive, silenciado o condensado (Fig I ) (Lawrence et al, 2004). Ambos estân determinados por su interacciôn con diversas protemas nucleares. Las mds relevantes son las tiistonas nucleosômicas, modificadas postraduccionalmente mediante acetilaciôn, metilaciôn y/o fosforilaciôn. Las distintas combinaciones de estas modificaciones originan un “côdigo" que contrôla el acceso de fos factores de regulaciôn a las secuencias (Tessodori et al, 2004; Houben et al, 2003; Probst et al, 2003). La organizaciôn estructural de la cromatina también esta determinada por otros proteinas, como las que participan en el propio ensombloje de las histonos, la presencia de proteinas no-histônicas, la acciôn de proteinas remodeladoras de la cromatina, y el efecto de las moléculas de ARN de cadena doble (siRNA, small interfering RNA) en plantas (Grosser e t al, 2004; Steimer et al, 2004; Tuteja, 2003; Lusser, 2002). 14 El tercer nivel de organizaciôn del genoma se sustenta en la interacciôn entre determinados elementos de la cromatina denominados S/MARs iSçaffold/MaMx Attachment Region) y determinados proteinas con capacidad de asociarse a ellas localizados en subdominios nucleares especificos, que proporcionan una distribuciôn intranuclear ordenada de las secuencias, las octividades génicas y los factores reguladores (Tessodori ef al, 2004; van Driel et al, 2003). Los elementos MAR son regiones de ADN con propiedades de enhancer que constituyen un tipo especial de insulators. Se distribuyen por el genoma a intervalos de 5-200 Kb délimitando dominios independientes de expresiôn génica (Bode et al, 2003). Las MARs son reconocidas por proteinas especificos de la matriz nuclear o nucleoesqueleto, que es la estructura nuclear no-cromatinica que organiza tanto el genoma como los distintos subdominios funcionales del nùcleo (Brouwer e t al, 2002; Petersen et al, 2002; Allen et al, 2000). El ADN lineal se ancla a la matriz nuclear originando lazos de cromcriina (Heng e t al, 2004; Paul y Ferl, 1999) (Fig 1). Se calcula que el genoma de mamiferos esta organizado en unos 60.000 lazos de cromatina de -70 Kb de longitud, anclados a la matriz nuclear mediante regiones MAR de -1 Kb, que contienen uno o mas genes por lozo (Bode et al, 2003). Estos lazos fueron descubiertos por Mirckovitch y colaboradores en 1984 mediante microscopia electrônica en nùcleos deshistonizados, donde observoron un halo de extensos lazos de ADN anclados a la matriz nuclear. In vivo, coda grupo de lazos origina una unidad bôsica funcional (Fig 1 ), en la que cada lazo présenta un estado condensado o descondensado dependiendo de su estado funcional (van Driel y Fransz, 2004). Cada uno de estos lazos flanqueados por regiones MAR contiene un gen o grupo de genes (Lawrence et al, 2004). Las regiones MARs no poseen secuencias especificos conservadas, sino que forman motivos estructurales reconocidos por proteinas de la matriz nuclear (Bode e t al, 2003). La interacciôn entre las MARs y las proteinas sucede a través de la hendidura menor del ADN de doble cadena, o bien a través de regiones de ADN de cadena sencilla, estabilizando en este ùltimo caso los estados 15 transcripcionalm ente actives de la crom atina (Jackson, 2003 a; Mortens e f a i 2002). Doble hélce de ADN Rbia de ciomatina Nucleosoma Rbra de cromatina de 30 nm Enhance Gen CROMATINA DESCONDfîNSADA CROMATINA CONDBiSADA LA2D DE CROMA'BNA MATRIZ NUCLEAR (NUCLBDESQUELETD) Complejo de transe r^cio AGRLPACION DE LA2DSDE CROMATINA ARNm Complejo de spiking Pioteînasde la matriz nuclear que unen MARs Figura 1. Representociôn de los distintos niveles de organizaciôn del ADN genômico. La dob le hélice de ADN lineal se organiza en torno a las histonas de los nucleosomas originando dos niveles de em paquetam iento de la crom atina: las fibras de 10 y 30 nm. La crom atina se anc la a la matriz nuclear m ediante la union especifica de las regiones MAR del genom a a las proteinas MAR-binding de la misma, originando lazos de crom atina condensada (rojo) y descondensada (azul), que pueden contener uno o varies genes. Las regiones MAR inhiben el e fec to de un enhancer sobre un prom oter cuando se sitûan entre ambos. Los distintos complejos enzimdticos del nùcleo tam bién se unen a la MN. El genom a esta organizado en unidodes bdsicas formadas por agrupaciones de lazos de crom atina (recuadro), que contienen en muchos cosos genes relocionados funcionalmente o que siguen patrones similares de expresiôn. 16 inwoauccton Las MARs poseen otros caracterîsticas: son ricos en bases AT; son inestables y tienden a formar estructuros de triple hélice que dejon libre uno cadena sencilla de ADN; son hipersensibles a la digestion con DNasa I; y co-localiza n frecuentemente con orîgenes de replicaciôn y sitios de uniôn de la Topoisomerasa II y la histona Ht (Allen et al, 2000; Holmes-Davis y Cornai, 1998). La asociaciôn de las MARs a la MN se produce mediante protemas especîficas con afinidad por las mismas (Tessodori et al, 2004). Las MARs aumentan la expresiôn y a veces la estabilidad de los transgenes que flanquean (Kohii et al, 2003; Holmes- Davis y Comai, 1998). Organizaciôn de ios distintos subdominios nucleares El genoma esta localizado ordenadamente en el nùcleo. Los distintos genes y cromosomas ocupa n un espacio discreto, y la cromatina interacciona con distintos subdominios nucleares en funciôn de su actividad génica (Stein et al, 2003 b). Mediante hibridaciôn in situ de fluorescencia (FISH) se ha demostrado que cada cromosoma ocupa un espacio concreto en el nùcleo interfôsico denominado territorio cromosômico (von Driel y Fransz, 2004). Un cromosoma no invade el territorio ocupodo por los cromosomas adyacentes, y su movilidad esta restringida a un radio de -0,5 p.m. La eucromatina, la heterocromatina y los brozos de un cromosoma ocupan distintas regiones en el interior de su territorio. Los genes actives se localizan en las zonas de contacte con la regiôn intercromatmica, que corresponde al espacio nuclear que no esta ocupado por el genoma, donde se localizan la mayoha de los subdominios especfficos nucleares y la matriz nuclear que los organize (Kiseleva e t al, 2004; Ragoczy et al, 2003; Weierich et al, 2003). El ejemplo mas claro y évidente de subdominio nuclear es el nucleolo (Fig 2). Se organize airededor de los tandems repetidos de los genes ribosomales mayores (ADNr), que constituyen las regiones orgonizadoras del nucleolo (NOR) 17 por efecto de su actividad. Ademds de la biosintesis de los ribosomes, en el nucleolo se realizan otras funciones relacionadas con la maduraciôn de los snRNAs (Gerbi e f al, 2003) y la retenciôn de proteinas (Cafala ef al, 2004; Eilbracht ef al, 2004; Le Goff e f al, 2004; Gao e f al, 2003), constituyendo un reservorio de dichas proteinas que évita su degradaciôn proteolitica, y facilita su rapide disponibilidad en el nùcleo en determinados momentos o estados celulares, y el mantenimiento del equilibrio homeostôfico intranuclear (Oison e f al, 2002; Pederson, 2002). Los telômeros y los centrômeros constituyen dos subdominios cromatinicos y nucleares de especial interés, ya que entre otras funciones participan en el ya descrito tercer nivel de organizaciôn del genoma (Fig 2). Ambos subdominios constituyen zonas nucleares de silenciamiento génico o cromocentros (Parada et al, 2004). Los telômeros previenen la degradaciôn de los extremos lineales de los cromosomas por nucleasas, la fusiôn ilegitima de sus extremos o de los producidos por trogmentaciôn cromosômico, y el acortamiento del ADN lineal por replicaciôn incomplete de sus extremos (McKinght et al, 2002). El silenciamiento se produce mediante la propagaciôn del complejo Sir (Silent Information Regulator) por la cromatina, que contiene una enzima desacetilasa de histonas (Kuhn y Geyer, 2003). Los centrômeros y la heterocromatina peri-centromérica contienen secuencias repetidos de ADN satélite, que forman las estructuros cromocentroméricas (Fig 2). Estas estructuros producen represiôn estable sobre los genes cercanos fîsicamente, aunque se desconoce el mécanisme. Se ha observado que determinados genes pueden recorrer largos distancias hasta coincidir con la posiciôn ocupodo por los cromocentros, lo que sucede principalmente durante los procesos de diterenciaciôn celular en los que cambian los patrones génicos de expresiôn (Parada et al, 2004; Alcobia et al, 2003; Houben y Schubert, 2003). En células vegetales, los telômeros y centrômeros ocupan posiciones opuestas en el nùcleo intertôsico anôlogas a las de anatase, lo que se conoce como contigurociôn de RabI (Show et al, 2002). En estos nùcleos los territorios 18 cromosômicos son longitudinales, y la transcripciôn ocurre por todo el nücleo (Tessodori et al, 2004; von Driel y Fransz, 2004). Los ejemplos mas claros de interacciôn entre el genoma y un subdominio nuclear son los sHios de franscripcfôn y procesamîento, repHcaciôn y reparaciôn del ADN. En todos ellos confluyen de forma regulada tanto las secuencias de los âcidos nucleicos que se transcriben o replican como las enzimas, factores y cofactores que participan en cada proceso (Stein e t o/, 2003 a, b; Jackson 2003 b; Cook, 2002). En plantas, los sitios de transcripciôn se encuentran disperses en la region intercromatfnica coincidiendo con la red formada por los granules intercromatmicos observables mediante microscopfa electrônica (Cerna e t al, 2004: Moreno Diaz de la Espina et ai, 1993; Medina et al, 1989). Este ultime subdominio es un compartimente de almocenamiento, ensomblaje y modificaciôn de factores de splicing, con el que estôn relacionados los sitios de transcripciôn y splicing co-transcripcional detectados media nte anticuerpos contra distintos factores de splicing (Echevema et al, 2004; Cui y Moreno Diaz de la Espina, 2003; Acevedo et al, 2002) (Figs 1 y 2). En células animales los procesos de transcipciôn y splicing son bôsicamente los mismos aunque su organizaciôn topolôgica difiere de la existente en plantas, probablemente debido a la distinta organizaciôn de los granules intercromotinicos que forman los speckles nucleares (Lamond y Specter, 2003; Shopiand et al, 2003). Existen otros subdominios nucleares con funciones especificas (Stein et al, 2003 a, b). Algunos son ubicuos, como los cuerpos de Cajoi (Fig 2), denominados anteriormente coiled-bodies, que son subdominios de ensomblaje y maduraciôn de los snRNAs después de ser re-importados al nùcleo, donde expérimenta n modificaciones como metilociôn y pseudourilizociôn dirigidos por los scaRNAs, antes de incorporarse a la red de granules intercromotinicos, donde continua su maduraciôn previa a su incorporaciôn al espliceosoma (Gerbi et al, 2003). Otros cuerpos tienen funciones especificas, como los cuerpos PML (Promyelocitic Leukemia) de animales (Wang et al, 2004) o los cuerpos de COPl {Constitutively 19 Phofom orphogenic protein I) de plantas, que participan en la represiôn de la fotomorfogénesls y co-localizan con protefnas reguladoras com o DET, FUS y COPl, siendo esta ultima una proteîna coHed-coil con activ idad ligasa de ubiquitina E3 (Seo e t o#, 2004), y diverses protefnas fotoreceptoras transductoras de senales luminosas (Un y Shalitin, 2003; Kircher e t af, 2002; Wang e t a i 2001 ). Cromosoma CitoesqueletD Stio de slicing c o-tta nsc ripciona i Grânub Inteiciomatinico Telômero CuefposdeCaja Cueipos A:MFPt Lamina Membiana piasmàtica / Retculo endopiasmàtico CentiômeiD I cromocento Zbna de aienciamisnto génco Fi lamente del nucieoesqueleto ISkJCleob Poro nucbar Figura 2. Esquemo de los principales subdominios nucleares. El nùcleo celular esta fisicomente delim itodo por la envoltura nuclear, form ada por la m em brane nuclear, los pores nucleares y la lamina. En su interior se encuentran el nucleolo y otros subdominios com o los sitios de procesamîento co-transcripcional, los grânulos intercromotinicos, los cuerpos de Cajal o los cuerpos de AcMFPl, todos ellos organizados por la motriz nuclear. En el nùcleo vegeta l los centromeres tienden a ocupar el polo nuclear opuesto (rosa) al ocupado por los telômeros (azul), en la denom inada configuraciôn de Rabl. La replicaciôn transcurre de una forma ordenada espacio-tem poralm ente, donde la eucrom atina descondensada replica antes que la heterocrom atina condensada (Jackson, 2003 a). C oda foco de replicaciôn esta constituido por un grupo de replicones adyacentes que comienzan a replicar simultdneamente 20 I l l irc ru u o o lo r i (Hand, 1978). Muchos de estos focos se “encienden" simultâneamente en distintos perîodos de la fase S, originando distintos patrones de distribuciôn (Samaniego ef ah 2002; Jasencakova ef ah 2001; en animales Nakamura et oh 1986; Nakayasü y Berezney, 1989) que conservan su distribuciôn topolôgica durante sucesivas generaciones (Sparvoli et ah 1994). Los sitios de replicaciôn no sôlo contienen las secuencias de los replicones y el ADN recién sintetizado, sino que se han detectado muchas de las protefnas, factores y enzimas involucradas en la replicaciôn, como la ADN Polimerasa a, Primasa a, PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), ADN Metiltransferasa, Ligasa I, RPA (Replication Protein A) o CAF-1, y otras que ejercen funciones reguladoras como la ciclina A y la kinasa CDK2 (referencias en Stein ef ah 2003 a). La Matriz Nuclear La matriz nuclear (MN) es la estructura macromolecular no cromatfnica que organize los subdominios funcionales del nùcleo. En un principio se definiô como la estructura nuclear observable mediante microscopfa electrônica después de la extracciôn del ADN (Fawcett, 1966), y se corresponde bastonte aproximadomente con la red de ribonucleoprotefnas descrita por Monneron y Bemhard (1969), conteniendo la red de granules intercromotinicos, las fibrillas pericromatfnicas correspondientes a los transcrites primaries, los granules pericromatfnicos y los cuerpos de Cajal. La matriz nuclear se distribuye por las regiones intercromatfnicas. Esta formada por dos estructuras distintas conectadas entre sf: la lamina asociada a la capa interna de la envoltura nuclear, y la matriz interna que se extiende por el interior del nùcleo, y que contiene a su vez una red de filamentos ordenados que forman un nucieoesqueleto al que se asocian el resto de los componentes de la matriz, los lazos de cromatino y los distintos subdominios nucleares de la regiôn intercromatfnica (Yu y Moreno Dfoz de la Espina, 1999) (Figs 1, 2). Se ha comprobado mediante microscopfa electrônica (ME) que las redes de filamentos del citoesqueleto y el nùcleoesqueleto conectan en la lamina, y que la estructura de los filamentos del nùcleoesqueleto observable mediante ME en cortes sin résina es semejante a la de los Filamentos 21 Intermedios del citoesqueleto, lo que sugiere que podrîon estar constituidos por protéines de coracterîsticas similares (Nickerson, 2001). Recientemente Kiseleva y colaboradores (2004) han visualizadp en oocitos de X. laevis mediante feSEM, la red heterogénea de filamentos del nùcleoesqueleto a los que se asocian los cuerpos de Cajal y otros organulos subnucleares. Contienen actina y protefna 4.1 y parecen constituir conales nucleares libres de cromatina impllcados en el transporte nuclear de protefnas y RNAs. La composicion polipeptfdica de la matriz nuclear depende no solo del tipo celular y el estado fisiologico, sino también del método de preparaciôn utilizado, ya que los distintos procedimientos extraen del nùcleo diferentes tipos de protefnas (Cerezuela, 1991 ). En general, casi todos los métodos, incluido el original disehado por Berezney y Coffey (1974), se boson en el uso de detergentes para los Ifpidos de la membra no nuclear; nucleasas y tampones de baja y alto fuerza ionica para extraer los âcidos nucleicos y las protefnas que no estan fuertemente unidos a la MN. Los métodos que uson alto fuerza ionica (^ M NaCI) introducen inevitablemente cierto “colapso” en la estructura de la matriz nuclear (Pederson, 2000; Moreno Dfaz de la Espina, 1995; Cerezuela, 1991). Esto no implica sin embargo que se produzco un reordenamiento significative de los distintos subdominios nucleares, que conservan su morfologfa y distribuciôn general, al igual que tampoco se altera la estructura de los teiritorios cromosômicos durante la preparaciôn de matrices nucleares sin tratar con DNoso (Ma et a i 1998). Los protocoles alternatives en los que se évita n los detergentes no iônicos o los lavados hipertônicos (Jackson y Cook, 1988; Mirkovitch et a i 1984), producen estructuras similares a las observadas mediante microscopfa electrônica (Nickerson, 2001), aunque producen MNs con una composiciôn prêtefnica distinta (Moreno Dfaz de la Espina, 1995). Se han conseguido identificar algunas protefnas de la MN de plantas. Algunas de ellas son componentes de la maquinaria nuclear de replicaciôn, como el PCNA (Samaniego et al, 2002) y la TOPO II (Moreno Dfaz de la Espina, 1995), de splicing como las protefnas Sm (Echevema et ai, 2004; Cui y Moreno Dfaz de la Espina, 2003; Acevedo et al, 2002), que participan en la sfntesis y el 22 Il IIIUIUUL t̂ l̂UI I ensomblaje de ribosomas, como la nucleolina {Mfnguez y Moreno Dfaz de la Espina, 1996), la TOPO I y la fibrilarina (Moreno Dîaz de la Espina, 1995), UBF, ASE-1 y SURF-6 (Moreno Dîaz de la Espina y de la Torre, 2003; Novilk), 1999), o que tienen un papel potencialmente estructural como NMP1 (Rose e f a i 2003). Algunas son proteînas MAR-binding y estân implicadas en el anclaje de la cromatina, como MARBPs (Hatton y Gray, 1999) y AHM1 (Morisawa ef ah 2000), y otras corresponden a enzimas nucleares modificadoras de proteînas, como la Caseîna Kinasa II (U y Roux, 1992) y la Disulfuro Isomerasa (Xu et ah 2002), o contienen largos dominios coiled-coil involucrados potencialmente en el anclaje de âcidos nucleicos y otras proteînas a componentes nucleares mâs estables, como NMCP1 (Masüda e t ah 1999 y 1997), MFP1 (Jeong et ah 2004; Samaniego et ah 2001; Meier et ah 1996), las proteînas relacionadas con las laminas (Mînguez y Moreno Dîaz de la Espina, 1993; ü y Roux, 1992; McNulty y Saunders, 1992) y NuMA (Yu y Moreno Dîaz de la Espina, 1999). Recientemente se ha realizado el primer estudio proteômico de la MN de plantas en Arabidopsis, identificândose como componentes de la misma los homologos de varias proteînas nucleolares, algunas proteînas MAR-binding, componentes ribosomales y una posible Desacetilasa de histonas (Calikowski e t ah 2003). Dinàmica de las proteînas nucleares Los estudios in vivo del nùcleo y las proteînas nucleares han sido posibles gracias a la aplicacion de la tecnologîa que permite la producciôn de proteînas de fusion con proteînas fluorescentes, y técnicos de microscopfa de fluorescencia como el fotoblanqueado y la captura de imâgenes a distintos intervalos de tiempo (Iborra et ah 2003). Estos estudios in vivo demuestran que la cromatina es una estructura dinâmica, a la que se asocian y disocian protefnas constantemente, lo mismo que en el resto de las estructuras y subdominios nucleares, que aunque son morfolôgicamente estables su contenido estâ en constante y râpido intercambio con el nucleoplosma (Misteli, 2001). Las distintas protefnas nucleares muestran 23 inrroauccion también dinâmicas diferentes, incluse en un mismo subdominio nuclear. En los cuerpos de Cajal, el intercambio con el nucleoplosma de la protefna SMN es 50 veces mener que el de la coilina (SIeeman et ah 2003). Incluse una misma protema puede tener una fracciôn inmôvil retenida en un subdominio nuclear, y otra mévil capaz de difundir râpidamente por el nucleoplosma, como el transductor de senales y activador de la transcripciôn STAT3, cuya fracciôn inmôvil permanece en cuerpos nucleares co-localizando con enhancers y protefnas marcadoras de transcripciôn (Herrmann et ah 2004), o el case de la ARN Polimerasa II. donde el 25% de la enzima permanece inmôvil en los complejos de pre-iniciaciôn y el 75% restante difunde râpidamente por el nùcleo (Kimura et ah 2002). Los estudios in vivo también se han aplicado a protefnas de la matriz nuclear. La difusiôn de la Topoisomerasa II ha resultado ser mayor de lo esperado, descartândose como protefna capaz de formar los filamentos del nùcleoesqueleto o el eje cromosômico (Christensen et ah 2002). De las protefnas de MN estudiadas, sôlo las laminas muestran un bajo coeficiente de difusiôn nuclear compatible con una funciôn estructural, coeficiente parecido al de las histonas del core (Kimura y Cook, 2001 ). La informaciôn aportada por los estudios in vivo en los ùltimos arios sugiere un modelo de dinâmica de protefnas basado en la difusiôn pasiva como sistema de alfa movilidad dentro del nùcleo, que asegura su disponibilidad de una forma energéticamente econômica. Este transporte estâ aporentemente facilitado por la red de filamentos del nucieoesqueleto que lleva asociadas protefnas endôgenas que incluirîan protefnas cargo y la actina, que se une al ATP y lo hidroliza al polimerizar facilitando este tipo de movimiento (Kiseleva et oh 2004). Dicha movilidad estarîa reducida cuando las protefnas se incorpora n a grandes complejos, o cuando interoccionan de forma transitoria con componentes nucleares de mener movilidad como la matriz nuclear (Parada et ah 2004; Misteli, 2001 ). Obviamente, la difusiôn pasiva no incluye el trôfico regulado y selective de protefnas de gran tamaho entre el citoplasma y el nùcleo, que sucede a trovés de los complejos de pore nuclear de la envoltura nuclear, y donde son 24 necesarias seriales de localizaciôn nuclear y protefnas que las reconozcan y participen en su transporte, como las importinas o las protefnas RanGAP (Rose et af, 2004 b). Proteînas colted-coil y Filamentos Intermedios Los dominios coiled-coil constituyen motives proteicos de oligomerizaciôn. Estân constituidos por dos o mâs a-hélices anfipâticas con patrones repetidos de siete amino âcidos. donde residues polares y apolares ocupan posiciones determinadas que permiten el superenrollamiento de dos o mâs dominios coiled- coil (Burkhard et al, 2001). Los dominios coiled-coil pueden ser certes, como las cremalleras de leucinas de los factores de transcripciôn (Newman y Keating, 2003). También pueden ser dominios largos de varies cientos de aminoôcidos, localizados en protefnas con voriadas funciones, asociadas en numerosas ocasiones con telômeros, centrômeros, centrosomos, la cromatina y la matriz nuclear (Moreno Dfaz de la Espina y de la Torre, 2003). Los Filamentos Intermedios (Fis) son un tipo de protefnas coiled-coil. Son los componentes mayoritarios del citoesqueleto y del nùcleoesqueleto. Poseen una organizaciôn tripartita, con dos dominios con estructura no en a-hélice que flanquean a un dominio central formado generalmente por cuatro subdominios coiled-coil, separados entre sf por secuencias de conexiôn sin estructura en a- hélice (Herrmann y Foisner, 2003;). El dominio central varia en secuencia y longitud entre especies, lo que provoca la heterogeneidad de esta familia de protefnas (Mattout-Drubezki y Gruenboum, 2003). Los Fis estôn divididos en cinco familias multigénicos, en funciôn de la similitud de secuencia, contenido intrônico y potrôn de expresiôn, siendo la familia de las laminas los ùnicos Fis nucleares (Strelkov ef a i 2003). El ensomblaje de los Fis sucede mediante oligomerizaciôn de los dominios centrales de las protefnas, que originan heteropolfmeros en cuyo ensamblaje participan diversas protefnas especfficas asociadas (Herrmann y Aebi, 2001). La 25 fosforilaciôn-defosforilaciôn regulada de los Fis, y de las protemas coiled-coil en general, permite la creaciôn de una réserva de subunidades solubles capaces de repolimerizar con gran celeridad (Eriksson e f al, 2004: Inagaki e f al, 1996). Se piensa que dichas modificaciones podrfan modular la dinâmica de la MN in vivo (Moreno Diaz de la Espina y de la Torre, 2003), como sucede en el caso de las laminas, donde la fosforilaciôn coordinada de determinados sitios de sus secuencias provoca el ensamblaje o desensamblaje de la lâmina dependiente del ciclo celular (Moirefai, 2000). Protemas relacionadas con los Fis de la matriz nuclear de plantas Aparté de las laminas, otras protefnas de la MN comparten caracteristicas funcionales o estructurales con los Fis. Poseen dominios coiled-coil u otros dominios que confieren capacidad de polimerizar y formar filamentos similares a los Fis, o la capacidad para unir regiones MAR o ADN satélite (Moreno Dfaz de la Espina y de la Torre, 2003). Ademâs, los Fis citoplasmâticos estân conectados con los elementos estructurales de la MN (Tolstonov e f al, 2002), por lo que se piensa que el nùcleoesqueleto podrîa estar constituido por protefnas de tipo FI (Barboro ef al, 2003; Nickerson, 2001 ). Flasta el momento no se han detectado los genes de las laminas ni los de sus protefnas asociadas en los genomas secuenciados de Arabidopsis y arroz, aunque parece improbable que la ausencia de los ortôlogos de las laminas signifique también la pérdida de sus funciones en plantas, que estân probablemente conservadas en protefnas estructural y funcionalmente similares (Rose e f al, 2004 a; Moreno Dfaz de la Espina y de la Torre, 2003). Anticuerpos onti- laminas de animales reconocen algunas protefnas coiled-coil en la MN vegetal (Blumenthal ef al, 2004), algunas de ellas con Mr, pl y distribuciôn nuclear similar a la de las laminas de vertebrados (Mfnguez y Moreno Dfaz de la Espina, 1993; Li y Roux, 1992; McNulty y Sounders, 1992). Ademâs, aunque las protefnas asociadas a laminas no estén conservadas en Arabidopsis, la célula transformada es capaz de dirigir a la lâmina un fragmente del receptor de la lamina B conjugado con GFP (Irons e fa i, 2003). 26 Al contrario que en animales y levaduras, sôlo se han descrito unas pocas protefnas con extensos dominios coiled-coil en plantas (Rose e f al, 2004 a), incluidas las de la familia FPP IFilamenf-like Planf Profeins} de Arabidopsis, tomate y arroz (Gindulfis ef al, 2002). Solamente cuatro de ellas forman parte de la MN de plantas: las protefnas relacionadas antigénicamente con las laminas (Mfnguez y Moreno Dfaz de la Espina, 1993; ü y Roux, 1992; McNulty y Saunders, 1992), los homôlogos de NuMA (Yu y Moreno Dfaz de la Espina, 1999), NMCP1 (Masuda ef al, 1999 y 1997) y MFP1 (Jeong e f al, 2004 y 2003; Samaniego ef al, 2001 ; Harder ef al, 2000; Samaniego, 1999; Meier e fa i, 1996). MFP1 {MAR-binding Filamenf-like ^ofein JJ Se conoce la secuencia compléta de la protefna MFP1 de très especies vegetales distintas: LeMFPI de tomate [Lycopersicon esculenfum), AtMFPl de Arabidopsis fhaliana y las dos protefnas de tabaco (Nicofiana tabacum), NfMFPI- 1 con una longitud de 722 aminoôcidos similar a las anteriores, y NfMFPl-2, con sôlo 398 aminoôcidos (Harder e f al, 2000: Meier ef al, 1996), aunque hasta el momento sôlo se ha detectado la de mayor tamario. La similitud de las secuencias MFPJ varia entre especies, estando muy conservadas entre sf las dos protefnas de tabaco (92%), conservadas entre tomate y tabaco (-78%), y poco conservadas entre tabaco / tomate y Arabidospis (42%) (Harder e f al, 2000). Sin embargo, todos las protefnas poseen una estructura similar compuesta por dominios muy conservados (Fig 3). En el extremo N-terminal se encuentra un dominio corto sin estructura secundaria en a- hélice en el que se bcalizan dos regiones hidrofôbicas, una de ellas conservada en protefnas transmembrana, que permitirian la interacciôn de MFP1 con las membra nas lipfdicas (Meier ef af, 1996). Desde este subdominio hasta el extremo C-terminal se extiende un largo dominio en a-hélice, cuya disposiciôn periôdica de aminoôcidos apolares predice un extenso dominio coiled-coil, que présenta similitud de secuencia con otros protefnas coiled-coil, como la lamina B, NuMA y 27 CENP-E de la matriz nuclear, y filamentos intermedios citoplasmâticos com o la miosina y la tropomiosina (Meier e fa i, 1996). MFP1: MAR-binding Füament-iike Protein 1 Regiones hidrofôbicas Dom'nb en a-hélice (coied-coB) SübdcMTiinio de union a ADN ( a ) Péptïdo de transie ion a l cioropiasto -C Sehalde localizaciôn nuclear (NLS) SËios conserva dos de fosforilaciôn con CNl Figura 3. Esquemo de los dominios conservados en las proteînas MFP1 de tomate, tabaco y Arabidopsis. LeMFPI, NtMFPl y AtMFPl poseen dos dominios principales, uno en el extremo N-terminal que corece de estructuras en a-hélice, donde se han de tec tad o un péptido de transicion a cloroplastos y dos regiones hidrofôbicas, una de ellas conservada en proteînas transmembrana. El resto de la proteîna forma un extenso dominio coiled-coil, que incluye en el extremo C- terminal una serial de localizaciôn nuclear (MIS) y un subdominio de uniôn a ADN, o a regiones MAR en el caso de LeMFPI, donde se han de tec tad o dos sitios de fosforilaciôn especrficos para la Caseîna Kinasa CK2 que probablem ente regulan d icha uniôn. En la porte mas proximo ol extremo C-terminal de LeMFPI se encuentra un subdominio de reconocimiento y union a regiones MAR (Meier ef alA996), o de union a ADN en general en el caso de AtMFPl (Jeong e f al, 2003). En todos las secuencias MFPl se tion detectad o numerosos motivos potencioles de fosforilaciôn para la Caseîna Kinasa CK2, y dos de ellos muestran una posiciôn conservada entre especies en el subdominio de uniôn ADN, hobiéndose demostrodo que la fosforilaciôn d e los mismos inhibe y probablem ente régula la uniôn a ADN in vivo (Jeong e fa i, 2004). MFPl es una proteîna conservada en plantas detectad o com o una banda de 80 KDo en soja, arroz, mofz y trigo (Harder e f al, 2000). Su localizaciôn 28 subceluiar se ha estudiodo prindpolmente mediante fraccionamiento celular, habiéndose detectado la proteîna en fracciones de nûcleos y matrices nucleares alsiadas (Jeong et al, 2003; Meier ef al, 1996). Mediante el mismo suero anti- LeMFPl también se han identificado dos proteînas homôlogas de 80 y 90 KDa en fracciones nucleares de cebolla. La primera es una proteîna soluble que se extroe de los nûcleos mediante detergente, mientras que una proporciôn importante de la proteîna de 90 KDa forma parte de la matriz nuclear (Samaniego ef al, 2001; Samaniego, 1999). Poco se sa be sobre la distribuciôn nuclear de MFPl, aunque se ha detectado la proteîna de fusiôn MFPl-GFP en los plostidios vegetales que rodean al nùcleo de células en suspensiôn (Jeong ef al, 2003; Gindullis y Meier, 1999). LeMFPI, NtMFPl y AtMFPl contienen una serial de localizaciôn nuclear (NLS) en el extremo C-terminal, y un péptido de transiciôn a cloroplastos en el N-terminal, por lo que se piensa que MFPl podrîa tener una doble localizaciôn en los cloroplastos y el nùcleo celular (Jeong ef al. 2003), aunque hasta el momento sôlo la proteîna de 90 KDa de cebolla muestra una inequîvoca distribuciôn nuclear, localizada en una nueva categorîa de cuerpos nucleares anclados a la matriz nuclear y distribuida por los filamentos del nùcleoesqueleto (Samaniego ef al, 2001; Samaniego y Moreno Dîaz de la Espina, 2000; Samaniego, 1999). Se conocen muy pocas proteînas con una doble distribuciôn en nûcleos y cloroplatos. El genoma del cioropiasto contiene mâs de 120 genes, unos 80 de ellos relacionados con los componentes del aparato fotosintético (Koumandou ef al, 2004). Sin embargo, el genoma nuclear contiene mâs de 3.000 genes que codifican proteînas localizados en el cioropiasto, y se sa be que ambos genomas estân coordinados mediante una vîa de serializaciôn actualmente poco conocida. Se especula que proteînas como la Mg-protoporfirina podrîan participar en esta ruta de transducciôn de seriales (Gray, 2003). Recientemente, se ha detectado en el nùcleo la isoforma de la proteîna de uniôn a ARN de! cioropiasto STEP1 {Single-sfranded TEIomere-b/nding Profein /), que se une a los telômeros nucleares donde podrîa regular la longitud de los mismos reprimiendo la actividad de la telomerasa (Kwon y Chung, 2004). 29 Introduccion En esta Tesis Doctoral se pretende caracterizar las proteînas homôlogas de MFPl en A. cepa mediante nuevos sueros anti-MFPl, lo que supone la continuaciôn de los estudios iniciados durante la Tesina de Licendatura (Samaniego, 1999). Se profundizarô en la expresiôn, fosforilaciôn y distribuciôn subceluiar de las proteînas en distintos estados, tipos y tejidos celulares de cebolla, estudiândose ademâs cômo se régula la uniôn del homôlogo de 90 KDa a la matriz nuclear. También se investigarô la controvertida fracciôn nuclear de MFPl en tabaco, tomate y Arabidopsis, asî como la relaciôn de MFPl con el ADN del nucleoide. 30 OBJETIVOS En base a los antecedentes expuestos, los objetivos propuestos en esta Tesis Doctoral fueron los sigulentes: 1. Identificaciôn y caracteiizaciôn de las proteînas AcMFPl mediante sueros especfficos y clonaciôn de las mismas. 2. Estudio de su expresiôn y distribuciôn subceluiar en distintos tejidos y tipos celulares. 3. Analisis de su relaciôn con otros subdominios nucleares funcionales. 4. Analisis comparative de la distribuciôn de MFPl en cebolla y otras especies en las que se conoce la secuencia de la proteîna. 31 MATERIAL Y METODOS Matenal y Métodos I. MATERIAL 1. Especies Se utilizaron células de rac y hoja de bulbes de Allium cepa L variedad francesa. Para el analisis comparative de distribuciôn en otras especies se utilizaron plantas de Nicofiana fabacum L, Lycopersicon esculenfum L y Arabidopsis fhaliana L, asî como plantas de N. fabacum transformadas con AfMFPI y el knockout de AfMFPI en A. fhaliana, cuyas semillas fueron facilitadas por el Dr. Sun Yong Jeong y la Dra. Iris Meier del Planf Biofechnology Cenfer, The Ohio Sfafe Universify, EEUU. 2. CulMvos 2.1. CuIRvos dé cebolla Los bulbes de cebolla se pelaron, lavaron y dispusieron sobre tubes con la corona radicular sumergida en agua contente que se rénové coda 24 horas, incubdndose en la mayoria de los cases a 25 ± 0,5° C, en oscuridad y con aireaciôn constante {10-20 ml / min). En estas condiciones se produjo el desarrollo de roîces y hojas. Las raîces tardaron de dos a très dîas en alcanzor los 2-3 cm necesarios para que la poblaciôn meristemâtica alcance el equilibrio de proliferaciôn. En los estudios sobre el efecto de la luz los bulbes se incubaron a temperature ambiente siguiendo un ciclo de luz solar / oscuridad (10 / 14h), o en oscuridad total. Se hicieron entonces tomes de segmentes de 0,5 mm de distintas zonas radiculares y foliares mediante escisiôn con une cuchilla sobre une superficie milimetrada (Fig 4 a). Los meristemos durmientes se obtuvieron con une pinza directamente de la corona radicular de los bulbes, tomando la raîz y escindiendo con une cuchilla la zona meristemâtica situada entre el primer y el segundo milîmetro desde el extremo apical de la misma. 32 Material y Métodos 2.1.1. Culiivos sincronizados de cebolla La sincronizaciôn celular se realize en raîces con una longitud minima de 2 cm. Se cambiaron entonces los bulbes a nuevos tubes que contenîan 0,75 mM hidroxiurea (Sigma) disuelto en agua contente, en la que permanecieron durante las sigulentes 14 horas en las mismas condiciones de cultive. Pasado este tiempo, los bulbes se lavaron y cambiaron de nuevo a agua contente, liberando a las células del bloquée de la replicaciôn inducido por la hidroxiurea (HU) y permitiendo la entrada sincrônica de la poblaciôn celular proliférante en la fase S del ciclo celular. La evoluciôn de la ola de células sincronizadas se monitorizô mediante citometrîa de flujo valorando los contenidos de ADN celular (Apartado 6 de Material y Métodos). En las poblaciones celulares sincronizadas se estudiô la distribuciôn de los sitios de replicaciôn durante la fase S mediante la incorporaciôn de pulsos de 45 min. a 1 hora con BrdU (anôlogo de la Tîmidina) en los sitios de nueva sfntesis de ADN, seguido de su inmunodetecciôn con anticuerpo anti-BrdU (Amersham). Se analizaron cuatro momentos de la fase S: G1 / S-temprano, S-temprano, S-tardfo y S-tardfo / G2. Para ello, 2 horas (h) antes de compléter las 14 h de tratamiento con HU, y 1, 4 y 6 horas después de la liberaciôn del bloqueo con agua se dieron los respectivos pulsos incubondo los bulbos en agua contente con ICM M BrdU (Sigma) durante 45 min-lh en oscuridad (Fig 26 a). A continuaciôn se tomaron las muestras sincronizadas seccionando, fijando y procesando los meristemos radiculares para inmunodetecciôn en membrane y de fluorescencia (Apartedos 2 y 4 de Material y Métodos). 2.2. Culfivo de tabaco, tomate y Arabidopsis Las semillas se sumergieron durante 30 minutes en ague esterilizada que contente 1,5% lejfa concentrada y 1% Tween-20, después se lavaron 4 x 30 min. en 33 Material y Métodos agua esterilizada y se dejaron en el ultimo lavado a 4° C toda la noctie. Las semillas depositadas en el fondo del tubo se sembraron sobre plaças con medio de cultive Murashige y Skoog pH 5,8 (0,4% MS; 3% sacarosa; agar 0,6%), se sellaron y se incubaron en câmara de cultive con un foto-periodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad a 25°C durante 2-3 semanas. También se sembraron semillas sobre tierra estéril y se incubaron en la misma câmara de cultive, cubiertos con una boisa de plâstico para favorecer la mâxima humedad durante las primeras semanas. 3. Anticuerpos - Sueros 288 y 91: Sueros policlonales desarrollados en conejo contra el dominio central en a-hélice de LeMFPI y el dominio en a-hélice complete de AtMFPl, respectivamente (Fig 5). Los sueros preinmunes 288 y 91 corresponden a sangrados del animal previos a la inoculacion antigénica. Estos sueros fueron facilitados por la Dra. Iris Meier y el Dr. Sun Yong Jeong, del Planf Biotechnology Center, The Ohio State Universify, Estados Unidos. - Anticuerpo 4G3: Anticuerpo monoclonal comercial (Organon Teknica) de raton que reconoce la protefna U2B” de la partfcula ribonucleoproteica U2 del espliceosoma. - Suero Y12: Anticuerpo monoclonal comercial (Neomarkers) que reconoce los epftopos simétricos de dimetilarginina (sDMA) de las protefnas Sm y otras protefnas nucleares como la coilina. - Anticuerpo anti-BrdU (don B-Ul): anticuerpo comercial (Amersham) de raton que reconoce la 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU), anâlogo de la Timidina. 34 Matenal y Métodos II. MÉTODOS 1. Fraccionamiento celular 1.1. Alslamiento de nûcleos Los segmentos correspondientes de hojas y/o raîces se recogieron en medio de aislamiento de nûcleos (Apéndice A, tabla 1 ). Los nûcleos se aislaron siguiendo el protocole que se describe a continuaciôn: ♦ Equilibrado de las muestras en medio de aislamiento 1. Se sumergieron los fragmentes de raîces u hojas en medio de aislamiento fresco y se dejaron sobre hielo en una câmara de vacîo durante 15- 30 min, para favorecer la entrada del medio al interior de las células. ♦ Rotura celular 2. A continuaciôn se sustituyô el medio de aislamiento por medio fresco, en la proporciôn de -3 ml de medio por gramo de muestra. Las muestras se homogeneizaron sobre hielo mediante 3 golpes consécutives de 10-30 segundos en un homogeneizador ULTRA-TURRAX de alto velocidod (20.000 rpm). El homogeneizado obtenido se filtrô a trovés de très mallas de nylon de 100, 50 y 30 |im, superpuestas de tal forma que la muestra las atraviesa de mayor a mener tamario de pore. 3. Se repitiô el proceso 2 veces mâs, resuspendiendo el material retenido en los filtres en nuevo medio de aislamiento de nûcleos. ♦ Purificaciôn de los nûcleos 4. Todo el material filtrado se centrifugé a 2.500 rpm, 4°C durante 10 min. en una centrifuga Hettich Universal-32R. Se conservé el primer sobrenadante que contenta gran parte del material citoplasmatico (fracciôn CIt), excluyendo los orgânulos que co-purifican con los nûcleos. El sedimento se lavé en medio de 35 aislamiento fresco varias veces mâs, comprobando el grade de pureza e integridad de los nûcleos mediante un microscopio ôptico, tiriéndolos con verde de metilo-pironina. 5. Una vez conseguido el grade de pureza optimo, los nûcleos aislados (fracciôn N) se utilizaron inmediatamente para la obtenciôn de otras fracciones, se procesoron para el anôlisis de proteînas o microscôpico, o se conservaron a - 28°C en medio de extracciôn de nûcleos, que contiene un 30% de glicerol. 1.2. Extracciôn de matrices nucleares mediante alta tuerza lônica Se utilizô el procedimiento usual del laboratorio, descrito por Yu y Moreno Dîaz de la Espina (1999) (Fig 4), consistente en: I. Resuspensiôn de los nûcleos aislados en tampôn CSK, que contiene 0,5% del detergente no-iônico Triton X-100 (Apéndice A, tabla 2) e incubaciôn en tiielo 15 min. II. Centrifugaciôn a 2.500 rpm 15 min. a 4°C, recogiendo los restos de las membranes nucleares y las proteînas nucleares solubles en el sobrenadante (SI). III. Digestiôn del sedimento (FI) con 200 ^g / ml DNasa I libre de RNasa (Sigma), diluida en medio de digestiôn DB (Apéndice A, tabla 3), que contiene NaCI, incubondo durante 30 min. a temperature ambiente. IV. Adiciôn de sulfato amônico 1 M disuelto en medio DB hasta alcanzor une concentraciôn 0,25 M, e incubaciôn en hielo durante 15 min. adicionales. V. Centrifugaciôn a 3.000 rpm 10 min. a 4°C, recogiendo entre otros el ADN digerido y sus proteînas asociadas en el sobrenadante (52). VI. Obtenciôn de las matrices nucleares ariadiendo lentamente NaCI 4M en medio DB al sedimento F2, resuspendido en el mismo medio, hasta conseguir une concentraciôn final 2M, e incubaciôn en hielo durante 15 min. adicionales. VII. Centrifugaciôn a 3.000 rpm 10 min. a 4°C, recogiéndose las proteînas unidas mâs débilmente a la matriz nuclear en el sobrenadante (S3), y la fracciôn correspondiente a la matriz nuclear en el sedimento (MN). 36 VIII. Lavado adicional en medio DB d e la fracciôn MN para eliminar las sales, repitiendo la centrifugaciôn. Meristemos radiculares Azul de coomassie ? Aislamiento -4- ► "% Cit Nûcleos aislados (N) CSK-Triton X-100 15 min. DB-DNoso 1,30 min DB-(NH4)2S040,25M 15 min, 4°C S2 F2 DB-NaCI 2M I 15 min, 4®C S3 Matrices nucleares (MN) m FI F2 MN SI S2 S3 Figura 4. Método de exiracclôn de mohices nucleares de céhtias meristemàiicas con oHa fuerza lénica. (a) BuIbo de cebdia en cultive con hojas y robes, (b) Esciaôn de las zonas meristemâticas de las raîces sobre una superficie mBimeIrada, (c) Esquemo del método utiRzodo de aislamiento de matrices nucleares. Se indicon en rojo las distintos fracciones obtenidas durante el proceso. Oit: contenido citopkjsmàfico recogido en el sobrenadante tras la rotura celular; N: nûcleos aislados; SI: sobrenadante recogido tras permeabiizor con Triton X-100, contiene RNPs, las proteînas nucleares solutés y las asociadas a la membrana nuclear. Esta enriquecido en bandas <120 KDa; FI: proteînas nucleares residuales no recogidas en SI; S2: sobrenadante recogido tras digerir con DNasa I y baja fuerza ionica, contiene la mayor parte del ADN y las histonas. La mayoria de las bandas son <100 KDa, identificândose las dos variantes de la histona H1 por debojo de 45 KDa; F2: proteînas nuclear^ residuales no recogidas en SI y S2; S3: sobrenadante recogido tras extraer con alto fuerza ionica, contiene las proteînas unidas débilmente a la matriz nuclear. Sus bandas principales corresfxxiden a las variantes de la histona H1 y a varias proteîixis de -60 KDa; y MN: proteînas del nucieoesqueleto y las fuertemente unidas a la matriz nuclear. Se muestran dos imâgenes de microscopîa ôptico correspondientes a nûcleos tenidos con verde de metilo-pironina y matrices nucleares aislados. (d) Proteînas de las distintas fracciones separados mediante SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 8% y tenidos con azul de Coomassie. 37 Morenai y /vierooos Los sobrenadantes (Cit, SI, S2 y S3) obtenidos en los distintos pesos de la extracciôn se precipitaron con acido tricloroocético (TCA) y se utilizaron en el estudio de la solubilidad de las proteînas, como se describirâ mas adelante. De igual forma, los sedimentos se utilizaron en el analisis de proteînas y la inmunodetecciôn in situ. 1.3. Extracciôn de matrices nucleares mediante et método de US Se utilizô el procedimiento usual del laboratorio descrito en Moreno Dîaz de la Espina (1995), consistente en: I. Digestiôn de los nûcleos aislados en 100 ng / ml DNasa I diluida en medio DB durante 30 min. a temperature ambiente, y centrifugaciôn posterior a 3.000 rpm 10 min. II. Incubaciôn durante 15 min. en 25 mM 3,5-diiodosalicilato de litio (LIS) diluida en medio de LIS (Apéndice A, tabla 4), y centrifugaciôn a 3.000 rpm 10 min. III. Digestiôn adicional del sedimento con 200 |ig / ml DNasa I diluîda en medio DB durante 30 min. a temperature ambiente, centrifugando a 3.000 rpm 10 min. IV. Lavados adicionales en medio DB, 3x10 min. 2. ANALISIS DE PROTEINAS 2.1. Electroforesis monodlmenslonal (SDS-PAGE) Los electroforesis de proteînas se realizaron en une cubeta de SDS-PAGE MINI-PROTEAN II de BIO-RAD para geles verticales (11 cm largo x 7,5 cm ancho), separando las proteînas en funciôn de su movilidad relotiva (Mr) en geles de acrilamida / bisacrilamida. 38 Material y Métodos La concentraciôn de acrilamida se determinô en funciôn del rango de peso molecular de las proteînas en estudio, siendo las concentraciones mas usadas las comprendidas entre 8-10% para el gel de separaciôn y 3-4% para el de concentraciôn, lo que nos permitiô obtener una ôptima separaciôn de proteînas en el intervalo 40-160 KDa. Previamente a la realizaciôn de las electroforesis monodimensionales, las muestras se sometieron a un proceso de preparaciôn, desnaturalizaciôn y valoraciôn de la concentraciôn de proteînas: 2.1.1. Preparaciôn de muestras - Se precipitaron las proteînas solubles de los sobrenadantes (SI, S2, S3), ariadiendo TCA (ôcido tricloroacético) hasta el 10% incubondo de 30 a 60 min. en hielo. Pasado este tiempo, se centrifugaron los sobrenadantes a 12.000 rpm durante 5 min. a 4° C. - Se lavaron los sedimentos con etanol/éter (1:1 v/v) al menos très veces para eliminar el TCA. Las muestras se pueden dejar en uno de los lavados toda la noche a -20°C. 2.1.2. Desnaturalizaciôn de protemas 1. Las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm, 10 min. a 4° C y se disolvieron en el medio odecuado, normalmente medio de disociaciôn 2x (Apéndice A, tabla 5). Se utilizaron aproximadomente 2 volûmenes de medio de disociaciôn por coda volumen de muestra. 2. Se calentaron las muestras 3 min. a 95° C, dejôndolas atemperar después. 3. Las muestras se ultrasonicaron en un sonicador BRANSON sonifier 150, al 40% de potencia con très golpes de 5 segundos, en hielo y a intervalos de 5 segundos, se dejaron atemperar. Se calentaron de nuevo a 95° C durante 3- 5 min. para conseguir una mejor desnaturalizaciôn de las proteînas (el calentamiento se repitiô inmediatamente antes de cargar las muestras durante la electroforesis). 39 Material y Métodos 2.1.3. Valoraciôn de proteînas La valoraciôn se realizô utilizendo la técnica de réplica en gota o Dot Blot, exceptuando cuando se utilizaron las muestras en analisis cuantitativos que se realizô de forma môs précisa mediante el método de Bradford. Éste se basa en la absorciôn especffica a 595 nm de las protemas unidas a azul de Coomassie G-250 en medio ôcido, empleando el reactivo comercial de Bio-Rad Protein Assay. Técnica de réplica de gota o Dot Blot: 1. Se pusieron sobre la membrana 5 gotas de la soluciôn patrôn de seroclbûmina bobina (BSA) a distintos concentraciones: 50,25, 10, 5 y Ijig/nl. 2. A su lado se colocaron gotas de 1 fil de coda una de las muestras. 3. Después de tenir la membrana 5 min. con Amidoblack (Apéndice A, tabla 6) y desteriir con soluciôn de desteriir geles (Apéndice A, tabla 7), se valorô la concentraciôn por la semejanza de tonalidad azulada entre las muestras y las gotas de BSA. M étodo de Bradford: 1. Se tomaron alicuotas de las protemas y se completaron hasta 0,8 ml con agua destilada, ariadiendo posteriormente 0,2 ml del reactivo comercial. Se agitaron para conseguir la formaciôn de complejos entre el azul de Coomassie y las protemas présentes. 2. La lectura de densidad ôptica se realizô a 595 nm después de 5 min. a 1 hora de espera tras ariadir el reactivo. Los valores obtenidos se refirieron a uno curva patrôn realizada simultâneamente con la protema patrôn BSA (1,25-25 ng / ml), intervalo para el que existe una relaciôn lineal entre densidad ôptica y concentraciôn de protema. 2.1.4. Desarrollo de la electroforesis Se cargaron normalmente lO^g de proteîna por pocillo. Las electroforesis se realizaron a temperaturo ambiente y con un voltaje constante de 60 V para el gel 40 Material y Métodos de concentraciôn y 100-120 V para el gel de separaciôn. La electroforesis se llevô a cabo en tampôn de electroforesis Ix (Apéndice A, tabla 8), utilizando normalmente patrones de medio y bajo rango (Bio-Rad) para determinar la movilidad relativa de las proteînas. 2.Z Becirofforesis bkfimensional Las proteînas se separaron en funciôn de su cargo eléctrica neta en una primera fase (isoelectroenfoque, lEF) y en funciôn de su movilidad relative en una segunda (SDS-PAGE). Como medios de solubilizaciôn de proteînas se utilizaron tampôn de disociaciôn para lEF (Apéndice A, tabla 10) y otras combinaciones resumidos en la Tabla 1. 2.2.1. Doble solubiUzacion de muestras de nûcleos y MN para electroforesis bidimensloncd Las muestras de MN se lavaron en medio DB y a continuaciôn en un medio sin sales (agua dd; 0.5% Triton X-100; 1 mM PMSF; 2 mg / ml aprotinina; 20 mM DIT) 2x30 min. y / o una noche a 4° C, para extraer las sales que puedan quedar de los medios CSK y DB. A continuaciôn se realizô una doble solubilizaciôn de las muestras: • En primer lugar se solubilizaron las fracciones MN en un pequerio volumen de medio que contenîa SDS (0,125 M Tris-HCI pH 6,8; 1-2% SDS; 10% 2-mercaptoetanol; 20% glicerol; 0,002% azul de bromofenol), seguido de ultrasonidos y calentamiento a 95° C durante 5 min. • A continuaciôn, el volumen de muestra se diluyô en un medio de diluciôn para bidimensionales (9,8 M urea; 2% pharmalitos pH 3-10; 5% Triton X-100; 100 mM DIT) hasta alcanzar una razôn SDS : TX-lOO de al menos 1:8 y una concentraciôn final de SDS <0,25%. 41 Material y Métodos 2. 2. 2. Isoeleciroenffoque (lEF) o primera dimension Se cargaron las soiuciones de protéines y se sepororon en tiras de geles de acrilamida de 7 û 11 cm (PHARMACIA o Bio-Rad), retiidratadas en medio de retiidrataciôn para lEF (Apéndice A, tabla 11). Los geles contenian phaimalitos y un gradiente de pH inmovilizodo de 3 a 10, creciente de anodo a cdtodo. Las muestras se aplicaron cerca del ânodo y comenzaron a migrer en el cempo eléctrico en funciôn de su cerge nete. Le dureciôn del lEF oscilô entre les 22-24 Fiores y se deserrollô en une cubete MULTIPHOR II de PHARMACIA con un circuito de refrigeraciôn, modificendo el volteje de le siguiente mènera: V mA W Tiempo rpose 300 Maxime Maxime 3 horas 2? Pose De 300 a 1400 (intervalos d e 30') Maxime Maxime 4 hores 3° Pose 1400 Maxime Maxime 13 Flores 4° Pose 2000 Maxime Maxime 3-4 hores Les tires de lEF que no se utilizeron inmedietemente pare le segunde dimension se conserveron a -20°C 6 -80®C. 2.3. SDS-PAGE (segunda dimension) Se utilizeron geles de acrilamida el 8-10% pare el gel de sepereciôn y el 4% para el de concentraciôn. Como petrones de peso molecular se utilizeron los mismos mercadores de rengo medio y bejo de peso molecular que en las electroforesis monodimensionales. Los geles de lEF, que contenian las proteinas separadas segûn su pl, se equilibraron en soluciôn de equilibrado (Apéndice A, tabla 12) en dos fases de 10 42 Material y Métodos min. coda una. En la primera, las tiras se introdujeron en soluciôn de equilibrado con DTT 25mg /10ml. En la segunda, la soluciôn de equilibrado contenta iodo acetamida 0,45g /lO ml. Una vez equilibradas las tiras de lEF, se colocaron sobre el gel de la segunda dimensiôn y se iniciô la electroforesis como se describiô anteriormente. 2.4. Elecfroiransferencia Se utilizô un sistema de transferencia tiûmedo. La eu beta utilizada tue la MINI-PROTEAN II de BIO-RAD con el môdulo MINI TRANS-BLOT para geles de 7,5 x 10 cm y membranes de nitrocelulosa de 0,45 pm de poro (Schleicher & Schuell ). Las condiciones de transferencia fueron de 100 V constantes durante 1-2 h en hielo y en el tampôrr indicado en el Apéndice A, tabla 9. Una vez finalizada la transferencia se detectaron las proteinas transferidas como control de cargo tihendo la membrane con rojo Ponceau al 2%, y se marcaron con lâpiz los limites del gel y la posiciôn de los marcadores de peso molecular en las membranes, conservândose a -20® C si no se usaban inmediatamente. 2.5. Inmunodeteccîon en membrana Se utilizô el siguiente protocole; 1. Prelavado de la membrane con PBS (Apéndice A, tabla 13) + 0,05% Tween-20 durante 10 min. 2. Bloquée de las posibles uniones inespecificas de los onticuerpos incubando de 30 min. a 1 Fiera en une soluciôn de bloquée, que contente lecFie en polvo descremada al 5% en PBS + 0,05% Tween-20. 3. Incubaciôn de la membrane con el onticuerpo primario diluido en soluciôn de bloquée, durante dos hores a temperature embiente o tode le noche a 4® C. Les diluciones utilizades pare cede enticuerpo primario se especificon en el Apéndice B, tabla 1. 43 Matenal y Metoaos 4. Lavados con PBS + 0,05% Tween-20, 3x10 min. 5. Incubaciôn con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidase, especifico contra la clese de inmunoglobuline y especie animal del anticuerpo primario, diluido en soluciôn de bloquée durante 1 Fiera. Les diluciones utilizades pare cede anticuerpo secundario se especificon en el Apéndice B, tabla 2. 6. Lavados con PBS + 0,05% Tween-20,3x10 min. 7. Pare visuelizer les proteinas reconocides se utilizô un sistema de detecciôn besedo en le incubaciôn de le membrane con los réactivés ECL (AmersFiem) pare Western Blot, durante 1 min. a temperature embiente y oscurided. 8. Une vez trenscurrido el tiempo, se eliminô el reactive ECL de le membrane y se puso éste sobre une pelfcule fotogrâfica X-OMAT de KODAK en un cesete de exposiciôn de autorradiografies, durante un tiempo variable de 2- 10 min, de forme que le emisiôn luminose impresione le pelicula detectândose le bande o bandes con le intensided adecuede. 9. En elgunos expérimentes se esceneeron les bandes impresionedes en le pelicula fotogrâfica mediente un densitômetro (Bio-Rad GS 800) pare su posterior enâlisis mediente el software Quantity one (Bio-Rad). Dicho progreme nos permitiô determiner velores de Mr, pl est como detector varieciones de densided ôptice en el area ocupede por les bandes de distintos enseyos. El pl de les proteinas se celculô segûn su posiciôn en el gradiente de pH de très expérimentes independientes, comprobendo siempre mediente marcadores comercioles que los gredientes efectivemente se extendion lineelmente entre 3- 10. 2.6. Tincion de geles con azul de Coomassîe Se siguiô el siguiente protocolo: 1. Lavado de! gel en ague bidestilade durante 5 min. 2. Fijaciôn en fijador de geles (Apéndice A, tabla 14) durante 30 min. 44 Marenai y /vteroaos 3. Tincion con azul de Coomassie (Apéndice A, table 15) durante 30 min. 4. Lavado del gel con soluciôn de destenir geles (Apéndice A, tabla 7). 5. Una vez destehido, se conserva en acético al 10% al menos 30 min. 6. Lavado en agua bidestilada durante 5 min. y estabilizaciôn del gel en 10% glicerol 2 x 20 min. El gel se puede entonces deshidratar para su conservaciôn. 2.7. Tincion de geles con plata Se siguiô el siguiente protocolo: 1. Fijaciôn en fijador de geles (Apéndice A, tabla 14) 30 min-1 h. 2. Incubaciôn en soluciôn de incubaciôn (5% etanol, 1% acético) 30 min- noche. 3. Lavados en agua bidestilada 3 x 5 min. 4. Incubaciôn en soluciôn de revelado (0,05% nitrato de plata, formaldetiido fresco 20%) en oscuridad durante 15 min, controlando la reacciôn. 5. Interrupciôn de la reacciôn con 5% acético cuando la tinciôn es la adecuada. 6. Lavados en agua bidestilada 3 x 5 min. y estabilizaciôn del gel en 10% glicerol 2 x 20 min. A continuaciôn se puede deshidratar el gel para su conservaciôn. 2.8. inmunoprecipitacion de proteinas La inmunoprecipitaciôn de proteinas se realizô mediante el siguiente protocolo: • Resuspensiôn de una fracciôn de nûcleos aislados en medio DB que contiene 0,5% TX-100 durante 15 min. en agitaciôn en cômara frfa. • Centrifugaciôn a 3.000 rpm 10 min. a 4° C, desechando el sobrenadante. 45 Matenal y Metoaos • Resuspensiôn del sedimento en 200 ng/ml DNasa I libre de RNasa diluida en medio DB e incubaciôn en agitaciôn durante 1 h en cômara fna. Anadir a continuaciôn 1 M sulfato amônico disuelto en DB tiasta alcanzar una concentraciôn 0,25 M e incubar 1 h en las mismas condiciones. • Centrifugaciôn a 3.500 rpm 15 min. a 4® C, descartando esta vez el sedimento. • Anodir al sobrenadante (S2) el anticuerpo primario incubando en agitaciôn y cômara frîa durante 2h. A continuaciôn, anadir 25 1̂ de Protefna-A-Agarosa (Amersham) por coda 200 1̂ de muestra, incubando en las mismas condiciones 2h odicionales. • Centrifugaciôn a 10.000 rpm 2 min., descartando suavemente el sobrenadante y lavando el precipitado en DB dos veces môs. • Iras la ultima centrifugaciôn se solubiliza el inmunoprecipitado en medio de disociaciôn 2x que contiene SDS y mercaptoetanol (Apéndice A, tabla 5), hirviendo la muestra durante 5 min. En ella quedarôn disueltas las proteinas inmuno-precipitadas, la proteina A y las cadenas pesadas y ligeras de las IgGs de los sueros. Se separan entonces todas las proteinas mediante SDS-PAGE para su posterior anôlisis o inmunodetecciôn. 3. ENSAYOS DE FOSFORIlAClÔN 3.1. Defosforilacion in vitro de la fracciôn F2 con Fosfatasa Alcallna El protocolo de extracciôn de matrices nucleares se utilizô tiasta obtener la fracciôn F2, que fue resuspendida en 100 îl de medio DB (que contenta 100 mM dietilamina pH 9,9) y al que se le ariadieron 4, 18, 36 y 54 unidades de fosfatasa alcalina (FA) de intestine de temera (Roche). Se incubaron o 35®C durante Ih. Se utilizaron como control la reacciôn sin FA o con el enzima inactivado (hervido). Tras la incubaciôn las muestras se diluyeron en medio DB frîo y se ahadiô goto a goto 4M NaCI en DB hasta alcanzar una concentraciôn final de 2M, incubando durante 15 min. en hielo. Se centrifugô a 3.500 rpm 15 min. recogiéndose el sobrenadante y el sedimento de coda ensayo para el posterior anôlisis de la variaciôn de densidad ôptica de las bandas reconocidas por el suero. Los volores 46 Matenal y Metoaos medios y su desviaciôn estândar se calcularon a partir de très expérimentes independientes. 3.2. FosforHaciôn de la malriz nuclear con Caseina KInasa CK2 Los ensayos de fosforilaciôn se realizaron en muestras de 50̂ ,1 que contenian 20 ng de fracciôn MN, 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 200p.M ATP y 500 unidades de Caseina Kinasa CK2 comerciai (New England Biolabs). La muestra control carecfa de CK2. Todas las muestras se incubaron durante Ih a 30° C, y a continuaciôn las proteinas se separaron en geles de acrilamida al 8-10% y se analizaron mediante inmunodetecciôn en membrana con el suero correspondiente. La detecciôn de fosfoproteinas en la MN se realizô mediante incorporaciôn de y-^P, por lo que a coda muestra (incluido el control) se ariadieron 10 jiCi de [y-^P]-ATP. La co-localizaciôn de la proteina detectada por el suero y una de las proteinas fosforiladas mediante CK2 se realizô comparando las peliculas impresionadas de la inmunotransferencia (expuesta 5 min) y la autoradiografia de la misma membrana (expuesta 24-48 ti). 3.3. Inhibiclôn / eslimulaclôn de la CK2 endôgeno 3.3.1. Inhibiclôn de la CK2 Se incubaron nûcleos recién aislados en medios de reacciôn (50 mM Hepes; 150 mM NaCI; 10 mM MgCb; 1 mM PMSF; 2 mg / ml aprotinina) con 100, 200, 300 y 400 nM heparina, un inhibidor especifico de la CK2, durante 1 Fi a 35°C. En el tubo control no se ariadiô heparina. A continuaciôn se realizô el protocolo habituai de extracciôn de MNs con alfa fuerza iônico (Apartado 1.2. de Material y Métodos), oriadiendo en todos los medios utilizados durante la extracciôn la concentraciôn de heparina correspondiente en coda ensayo -exceptuando el control-, para evitar que el efecto de la droga revirtiera durante el tiempo que dura la extracciôn. Finalmente, se analizaron los sobrenadantes S3 para calcular las cantidades relatives de la proteina detectada por el suero en coda ensayo. 47 Material y Méfodos 3.3.2. Esfimulacion de la CK2 Se incubaron nûcleos aislados frescos en 1 mM espermina y 2 mM espermidina (estimuladores de CK2) diluidas en medio CSK (Apéndice A, tabla 2) a temperature ambiente durante 5, 10, 15 6 20 min. La reacciôn control consistiô en la incubaciôn de una muestra nuclear durante 20 min. en medio CSK sin espermina ni espermidina. Se analizaron los sobrenadantes S3 para calculer las cantidades relatives de la proteina detectada por el suero en code ensayo. En ambos casos las proteinas de las fracciones S3 se separaron mediante SDS-PAGE y transfirieron a membranes de nitrocelulosa. Previamente a la incubaciôn con el suero, las membranes se tirieron con rojo Ponceau al 2% para confirmer que cede carril contenia la misma cantidad de proteina, utilizando las variantes de la histona H1 como control de cargo en el densitômetro. 3.4. Anôlisis estodislfco Los ensayos con FA e inliibiciôn-estimulaciôn de la CK2 endôgena se basaron en la detecciôn de variaciones en la densidad ôptica (D.O.) y el area (mm^j de las bandas detectadas por el suero escaneodas densitométricomente. Los datos originales de très experimentos independientes se utilizaron para hacer los distintos grôficos. Se utilizô un diserio en bloque para detectar variaciones significatives entre las médias de los experimentos y los datos se analizaron mediante ANOVA seguido de un test de Newman-Keuls. 48 Material y Métodos 4. INMUNOFLUORESCENCIA (IF) 4.1. Nûcleos aislados y fracciones subnucleares 4.1.1.Preparaciôn de las muesfras Los sedimentos de centrifugaciôn correspondientes a las distintas fracciones se fijaron con 2% paraformoldehido (PFA) en PBS pH 7,4 y 0,5% TX-tOO recién preparado durante 30 min. en hielo. Se eliminô el fijador por centrifugaciôn, y se lavaron con PBS 3x15 min., centrifugando coda vez. Para preparar el fijador se colentô el PBS pFI 7,4 a 60° C y se ariadiô el PFA, formandose una suspensiôn lechosa que tras un periodo de agitaciôn se toma cristalina. Una vez atemperado se ariadiô 0,5% TX-100 y se filtrô a través de un filtro de 0,22 fim. 4.1.2. Reacciôn en suspensiôn Las incubaciones se realizaron en tubos conteniendo las fracciones celulores y en agitaciôn para favorecer la penetraciôn de los sueros. Las muestras ya marcadas se depositaron sobre los pocillos de un portoobjetos, donde se realizô la tinciôn con DAPI. El protocolo fue el siguiente (a menos que se especifique, todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente en un agitador circular en movimiento): • Los nûcleos aislados o las fracciones subnucleares se resuspendieron en 200^1 de 2% PFA en PBS + 0,5% Triton X-100 y se incubaron durante 30 min. a temperatura ambiente. Antes de centrifuger a 3.000 rpm 15 min. se ariadiô PBS hasta compléter 1 ml. • Se resuspendiô bien el sedimento y se lavô otros 15 min. en 1ml de PBS + 0,5% TX-lOO, centrifugando después. • Se resuspendiô bien el sedimento en 200 p.1 de 20 mM glicina en PBS durante 15 min. Antes de centrifuger a 3.000 rpm 15 min. ariadimos PBS + 0,05% Tween-20 hasta completar 1 ml. 49 Matenal y Metoaos • Se resuspendiô bien el sedimento en soluciôn de bloquée {PBS + 0.05% Tween-20 + 2% de BSA), incubando 30 min. A continuaciôn y sin centrifugar, se puede ariadir el anticuerpo primario o suero preinmune hasta alcanzar la concentraciôn adecuada e incubar 1 hora o toda la noche, a 4°C en este ultimo case. • Se ariadiô PBS +0,05% Tween-20 hasta completar 1 ml y se lavô 15 min. antes de centrifugar. • Se resuspendiô bien el sedimento en PBS +0,05% Tween-20 y se incubô 20 min. antes de centrifugar. • Se resuspendiô bien el sedimento en PBS +0,05% Tween-2 que contenia el anticuerpo secundario conjugado al fluorocromo, incubândose 45 min. en oscuridad. • Se ariadiô PBS +0,05% Tween-20 hasta com pletar 1 ml y se lavô 15 min. en oscuridad antes de centrifugar. • Se lavô otra vez el sedimento durante 20 min. en oscuridad y se centrifugô, resuspendiéndolo después bien en un volumen adecuado de PBS de modo que la suspensiôn quede ligeramente turbia. A continuaciôn se depositaron alicuotas de 5-10 ni de coda muestra sobre los pocillos del portoobjetos, dejando secar en oscuridad. • Una vez seco se tiriô eventualmente con DAPI y se montaron las preparaciones como en el apartado 4.2.2. Es importante filtrar todos los medios a través de un tamario de poro de 22 nm para evitar contaminaciones bacterianas. Las preparaciones se pueden observer directamente o guardar a 4°C en oscuridad para su posterior observaciôn. 50 Material y Métodos 4.2. Células enteras 4.2.1. Preparacion de muestras de aplostados celulares Los meristemos rodiculores se fijaron en 2% PFA en tampon PBS pH 7,4 con 0,5% TX-lOO durante 1h a temperatura ambiente y se lavaron en PBS 3x10 min. Entonces se digirieron las rafces con un côctel de enzimas de 1% Pectinasa (Serva), 2% Celulasa RIO (Serva), 0,5% Macerozima RIO (Serva) y 0,4 M Manitol (Merck) en PBS pH 7,4 durante 30-45 min. a 37°C, se lavaron en PBS 2 x 1 5 min, dejando la muestra en el ultimo lavado toda la noche a 4°C. Al dfa siguiente se trocearon y aplastaron los meristemos sobre los pocillos del portoobjetos, golpeando suavemente un cubreobjetos circular sobre la muestra y retirando los residues sôlidos. Se dejaron secar los portoobjetos al aire, conservândolos a -20°C hasta su uso. 4.2.Z Reacciôn inmunologica Bloqueo de grupos aldehîdos: 1. Incubaciôn de las muestras 2x15 min. en 20 mM Glicina en PBS. 2. Lavado con PBS + 0,05% de Tween-20 durante 10 min. Permeabilizaciôn de las muestras: 3. Permeabilizaciôn con PBS +0,5-1% TX-100 durante 30 min. a temperatura ambiente. 4. Incubaciôn en soluciôn de bloqueo (PBS + 0,05% Tween-20 + 2% de BSA) durante 30 min. a temperatura ambiente. 51 Material y Métodos Incubaciôn de anticuerpos: 5. Incubaciôn de las muestras con 10-20 jaI de anticuerpos primarios diluidos en soluciôn de bloqueo en cômara hûmeda durante Hi a temperatura ambiente, o toda la noche a 4®C. 6. Lavado de los pocillos con PBS + 0,05% Tween-20, dejôndolos cubiertos con dicha soluciôn 3x15 min. a temperatura ambiente. 7. Incubaciôn con el anticuerpo secundario conjugado con un fluorocromo en soluciôn de bloqueo, 1 h en oscuridad a temperatura ambiente. 8. Lavados en PBS + 0,05% Tween-20,3x10 min. 9. Tinciôn de contraste de los pocillos que contengan nûcleos o cloroplastos con l^ig / ml DAPI 5 min, a temperatura ambiente y en oscuridad, para visualizar el ADN. 10. Para evitar que la fluorescencia decayera rôpidamente se montaron las preparaciones en un medio anti-fading (Vectashield). Posteriormente se sellaron con un cubreobjetos y esmalte de urias, dejôndolos secar en oscuridad. 4.3. Observaciôn, contrôles y anôlisis estadisfico La reacciôn se controlô con un microscopio de fluorescencia Zeiss standard. Las muestras fueron analizadas mediante un Microscopio Confocal Ultraespectra! Leica TCS-SP2-AOBS-UV con rango de excitaciôn ultravioleta y visible. Para coda muestra se tomaron una serie de secciones ôpticas separadas coda 0,3-0,5 pm. Las imôgenes fueron sometidas a la acciôn de un filtro Kalman y se grabaron a baja velocidad a una resoluciôn de 1024 x 1024 pixels. En estas condiciones obtuvimos imôgenes con una buena relaciôn serial-ruido. En todos los casos el barrido fue aumentado a una media de zoom 2x para el objetivo de lOOx, ô 4x para el objetivo de 63x. Las imôgenes obtenidas fueron procesadas con el software de Leica y el programa Adobe PhotoShop 5.5. Finalmente fueron 52 Material y Métodos impresas en una impresora HP-1120 de inyecciôn de tinta de color a su maxima resoluciôn. Como contrôles se incubaron las muestras sin anticuerpo primario o con los sueros preinmunes, sin varier el resto de las condiciones. El efecto de las caracterîsticas celulares y el tejido vegetal sobre el numéro de cuerpos nucleares fue analizado por medio de la prueba Kruskall-Wallis seguido de la prueba de Dunn (Dunn, 1964), para determiner la existencia de diferencias significatives. Cuando fue necesaria la comparaciôn de proporciones, como en el caso de nûcleos y matrices nucleares marcadas y no- marcadas con el suero 288, esta se llevô a cabo por medio de la prueba de Ctii- cuedredo. En dictias comparaciones el nûmero de grades de libertad fue iguol a 1, y se aplicô la correcciôn de Yates. 5. MICROSCOPIA ELECTRÔNICA DE TRANSMISIÔN E INMUNOAAARCADO CON ORO 5.1. Preparacion de las muestras 5.1.1. Fijaciôn Las diferentes muestras, como segmentes de roices u tiojas, sedimentos de matrices nucleares aisladas o protoplastos de tioja de tabaco, se fijaron en una soluciôn recién preparado de PFA 2% en PBS pFI 7,4 durante 1 h en hielo, y se lavaron posteriormente con PBS 3x10 min. 5.1.2 Desliidrataciôn, intiitraciôn e inclusiôn en LR Wtiite • Deshidrotaciôn Una vez fijodas las muestras, se sometieron a un proceso d e deshidrataciôn en una serie de alcoholes: 53 Matenal y Metoaos Etanol al 30% 30 min 4°C Etanol al 50% 30 min 4°C Etanol al 70% Noche 4®C Etanol al 90% 1 hora 4®C Etanol al 100% 45 min 4°C Etanol al 100% 45 min 4°C Etanol al 100% 45 min 4°C • Infillraciôn e Inclusion en résina Se utilizô la résina com erciai LR White (London Resin), que viene directamente preparado para su uso. La intiitraciôn se llevô a cabo en très fases, con mezclas que contenian concentraciones crecientes de résina en alcohol: Etanol al 100%:LR White 2:1 .........................................1 h y 30 min, 4°C. Etanol al 100%:LR White 1:2.......................................... 1 h y 30 min, 4®C. LR White .......................................................................... 3-4 dias, se cambia très veces por dia. La inclusiôn se realizô utilizando capsulas de gelatina. Las muestras se depositaron en el fondo y se cubrieron con résina hasta llenarias totalmente. Se taparon y se introdujeron en una estufa a 60°C durante 20-22 horas para su polimerizaciôn. 54 Matenal y Métodos 5.1.3. Ulframicrotomia Se seleccionaron las zonas de Inférés en los diferentes bloques de inclusion mediante cortes semifinos obtenidos en un PYRAMITONE LKB 11.800, observados en microscopia de fase, y se tallaron las pirdmides correspondientes conteniendo las zonas seleccionadas en el mismo equipo. Una vez talladas las piezas se obtuvieron cortes ultrafinos de entre 80-100 nm mediante una cuchilla de diamante Drukker International en un ultramicrotomo REICHERT ULTRACUT, recogiéndolos sobre rejillas de nfquel de 100 cuadrîculas recubiertas con una pelicula de 0.50% de soluciôn de formvor en dicloroetileno (TAAB). Estas ultimas se tiabian preparado previamente tras flotar sobre agua filtrada una pelicula de soluciôn de formvar, sobre la que se dispusieron las rejillas y un pape! de filtro, que se sacô del agua y volteô con cuidado. Sobre el papel se quedan pegados las rejillas de niquel recubiertas con la pelicula de formwar. 5.2. inmunomcffcado con oro Se utilizô una técnica indirecte. Tras incubar con los sueros que reconocian especificamente los epitopos sobre la superficie del corte, éstos fueron reconocidos por un anticuerpo secundario conjugado con oro coloidal de 10 nm de diômetro. Todo el proceso se realizô a temperatura ambiente y flotando las rejillas sobre gotas de las distintas soiuciones utilizados, con la cara de los cortes en contacte con la goto, mediante el siguiente protocolo: Bloqueo de grupos aldehîdos 1. Flotaciôn de las rejillas 15 min. sobre 20 mM glicina en PBS. Reacciôn de inmunodetecciôn 2. Lavado de las muestras con PBS + 0,05% Tween-20 durante 10 min. 55 Material y Métodos 3. Incubaciôn en soluciôn de bloaueo (PBS + 0,05% Tween-20 + 2% de BSA) 30 min. 4. Incubaciôn con los anticuerpos primarios diluidos en soluciôn de bloqueo durante toda la noche en cômara hûmeda a 4°C. 5. Lavados con PBS + 0,05% Tween-20,3x10 min. 6. Incubaciôn con el anticuerpo secundario correspondiente, conjugado con oro coloidal, y diluido en soluciôn de bloqueo durante 1 h. 7. Lavados con PBS + 0,05% Tween-20,3x10 min. Contrastaciôn de los cortes con acetato de uranilo y citrato de plomo 8. Lavados con agua bidestilada, 3 x 1 0 min. 9. Las rejillas se dejan secar sobre un papel de filtro durante 10 min. y se contrastan con acetato de uranilo al 5% en agua bidestilada (previamente centrifugado durante 30 min. a 1000 rpm), en oscuridad, durante 30 min. 10. Lavados con agua bidestilada, 3 x 1 0 min. 11. Una vez secas las rejillas, se dejan secar sobre un papel de filtro durante 10 min. y se contrastan con citrato de plomo al 0,4% en agua bidestilada, previamente centrifugado durante 5 min. a 1000 rpm, durante 1-2 min. 12. Lavados con agua bidestilada, 3 x10 min. Los contrôles fueron incubados con los sueros pre-inmunes y/o con tan solo el anticuerpo secundario conjudado con oro coloidal. Las muestras se observaron en microscopios electrônicos de transmisiôn modelos Philips 300 y Jeol 1230 normalmente a 80 KV. Las correspondientes fotograffas se tomaron automôticamente, y sus negativos se escanearon en un escôner AGFA snapscan-1236. Las imôgenes se procesaron mediante el programa Adobe PhotoShop 5.5. y se imprimieron mediante una impresora HP 1200. 56 Material y Métodos 6. CiTOMETRIA DE FLUJO El anôlisis del ciclo celular se realizô mediante dtometrîa de flujo utilizando el protocolo desarrollodo por Pelayo y colaboradores (2001) para A. cepa. Los meristemos celulares fueron sincronizados segûn lo descrito anteriormente. 1. Los segmentos de rafces se fijaron en 2% PFA en medio Tris-salino pFI 7,5 (Apéndice A, tabla 16) conteniendo 0,1% TX-100 durante 20 min. en hielo. 2. Tras la fijaciôn se lavaron 3 x 10 min. en medio Tris-salino y se homogeneizaron en el Ultra-Turrax en medio de lisis pH 7,5 (Apéndice A, tabla 17). 4. El homogeneizado se filtrô a través de una malla de nylon de 30 ^m y se centrifugô a 600 g durante 20 min. a 4° C, resuspendiendo en 500 ni de medio de lisis. Las muestras se mantuvieron a 4° C hasta su anôlisis en el citômetro. 5. Inmediatamente antes del anôlisis en el citômetro, las muestras se incubaron 30 min. en 30 ng / ml de RNasa (Boehringer-Mannheim) y se tiriô su ADN con 100 pg / ml ioduro de propidio (Sigma) durante al menos 5 min. Para el anôlisis de las muestras se utilizô un citômetro de flujo EPICS XL equipado con un lôser de argôn de 488 nm. La serial del ioduro de propidio se recogiô mediante un filtro de pose de banda de 620 nm. 7. CLONACION DE AcMFPI A PARTIR DE UNA GENOTECA DE cDNA DE A. cepa Se intentô la clonaciôn de AcMFPI a partir de una genoteca normalizada construida a partir de cDNA de rafces, bulbos y hojas de cebolla, facilitada por el Dr. Michael J. Harvey, Universidad de Wisconsin, EEUU. La clonaciôn se a bord ô mediante dos técnicas distintas: PCR e hibridaciôn de colonies. 57 Material y Métodos 7.1. Rastreo de la genoteca mediante PCR 7.1.1. Selecciôn de los cebadores especiflcos Se alinearon todas las secuencias conocidas de cDNA de MFPl. Très dicotiledôneas: AtMFPl, LeMFPl, NtMFPl-1 y NtMFPl-2 (Arabidopsis, tomate y tabaco, respectivamente) y cuatro monocotiledôneos (moîz, arroz, trigo y Hordeum). Se seleccionaron entonces las très regiones mas conservadas entre todas las secuencias de la parte C-terminal de la proteina. Los nucleôtidos que no coincidion en todos los casos se seleccionaron en funciôn del nucleôtido mayoritorio de todas las especies, o en su caso el de las monocotiledôneas (como A. cepa) Hordeum y arroz. Asf, se seleccionaron très cebadores o primers, uno para amplificar en sentido 5' (GAG AGA GAA GTG CTC TCA AA) y dos en sentido 3 ’ (CGC AAC ATC TCA CCC TH GCT y TTT GCT AAC GCC AAT TCC TCT TC), todos con una temperatura de anillamiento similar. 7.1.2. PCR y clonaciôn de fragmentes amplîficados Los vectores (pCMV-SPOT6) contenian los distintos insertos de cDNA de cebolla entre los sitios de restricciôn Not I (extreme poli-dA) y Eco RV. estando flonqueados odemâs por los primers M l3 [Forward y Reverse) y los promotores T7 y SP6. Los plôsmidos fueron purificados mediante un kit comerciai (Plasmids MiniPrep, QIAGEN). La reacciôn en cadena de la polimerasa (PCR) se llevô a cabo en un termociclador (Perkin Elmer 9.600) en las siguientes condiciones: un ciclo de desnaturalizaciôn durante 2 min. a 96° C seguido de 30 ciclos de 95° C-45 sg / 50-55° C-45 sg / 72° C-90 sg y un ultimo ciclo de extensiôn de 5 min. a 72°C. Las bandas mas intensas se eluyeron de los geles de agarosa y se purificaron de Gcuerdo a lo descrito por Sambrook y colaboradores (1989): - Se diluyô el volumen de la muestra tiasta 0,5 ml, para minimizar la pérdida de ADN en el pipeteo, y se ariadieron 0,5 ml de fenol: cloroformo: alcotiol isoamilico (25:24:1), agitando en vortex durante 2 min. si el ADN era menor de 10 Kb y centrifugando a 12.000 rpm 5 min. 58 Matenal y Metoaos - Se eliminô el fenol lavando con cloroformo en la proporciôn 3 volûmenes muestrp: 1 volumen cloroformo, se agitô en vortex 2 min. y se centrifugô. - Se précipité el ADN oriadiendo a 1 volumen de muestra 2 volûmenes de etanol absoluto frîo y 0,1 volûmenes de acetato sôdico 3M. Se agitô suavemente y se dejô a -20°C de 30 min. a toda la noche. Después se centrifugô y resuspendiô el ADN en agua, conservândolo a -80° C. Las bandas eluîdas, o en ocasiones el producto total de PCR, se clonaron mediante el kit comerciai en el plâsmido PCRII-TOPO (Stratagene). Las colonias TOP 10’ transformadas se seleccionaron mediante X-gal en dimetilformamida (DMF), se purificaron sus plôsmidos y se analizaron sus insertos mediante enzimas de restricciôn. Los insertos seleccionados se secuenciaron y se compararon sus secuencias con las existantes en el NCBI. 7.2. Hibridaciôn de colonias con sondas de cDNA de MFPl 7.2.1. Preparaciôn de ias sondas Las sondas elegidas fueron fragmentos de cDNA de 0,6-1 Kb correspondientes a la zona C-terminal de MFPl de Arabidopsis, tabaco, tomate y maîz. Las sondas se prepararon mediante amplificaciôn por PCR de los fragmentos de cDNA en presencia de [a^^J-dATP. 7.2.2. Hibridaciôn sobre colonias (Southern) • Preparacion de las colonias sobre membranas de nylon - Se prepararon plaças de LB+antibiôtico ((j>=llcm) sobre las que se extendieron unas 6.000 colonias de la genoteca, dejôndolos a 37° C toda la noche. 59 MaTenai y Meroaos - Al dia siguiente se coloco suavemente un filtro de nylon sobre las colonias de capla plaça, y se dejô 1 min. durante el que se realizaron marcas identificativas de su posiciôn. - Se levant© suavemente este filtro-réplica y se depositô 2 min. sobre un papel mojado en medio de desnaturalizaciôn de ADN (0,5 M NaOH; 1 M NaCI). La plaça se volviô a incubar a 37° C durante 4ti, conservôndola después a 4° C. - Se cambiô el filtro-réplica a un segundo papel mojado en medio de neutralizaciôn (1 M Tris-HCI pH 7,4; 1 M NaCI) donde se dejô 2 min. - Se lavô el filtro-réplica en un gran volumen de SSC 2x al que se le ariadiô 0,1% SDS, se secô suavemente el filtro y el ADN desnaturalizado de las colonias se fgô al filtro de nylon exponiéndolo a luz UV (Stratalinker). • Incubaciôn - Las membranas del filtro-réplica se pre-incubaron a 50° C durante 45 min. en medio de tiibridaciôn (250 mM CFiurch buffer; 1% seroalbùmina bobina; 1 mm EDTA;7%SDS). - Se desnaturalizaron las sondas tiirviéndolas durante 5 min. pasândolas inmediatamente a hielo y diluyendo en medio de hibridaciôn nuevo. Se incubô durante toda la noche a 50° C en agitaciôn. - Se lavaron los filtros-réplica en SSC 2x; 0,1% SDS durante 30 min. comprobando a partir de entonces la radioactividad emitida hasta que el lavado parecfa ôptimo, exponiéndose la pelicula en un casete de 6-24h a -80° C. Una vez seleccionadas las seriales radioactives môs prometedoras se identificaron las colonias correspondientes en la plaça y se realizô una segunda vuelta de todo el proceso. Coda colonia seleccionada se inoculô en LB+ antibiôtico y se volvieron a extender unas 600 colonias por plaça. Esta vez los filtros-réplica se incubaron con las sondas a 55° C toda la noche. Se realizô una tercera vuelta con las colonias seleccionadas de la segunda vuelta, esta vez incubando con coda sonda por separado, para detectar los distintos grados de reconocimiento. De las colonias seleccionadas se purificaron los plôsmidos y se secuenciaron los insertos de cDNA de cebolla. 60 RESULTADOS 1. CARACTERIZACION DE LAS PROTEINAS RECONOCIDAS POR LOS SUEROS ANTI-MFP1 EN CÉLULAS PROLIFERANTES DE LA RAIZ DE CEBOLLA 1.1. Caracterizaclôn mediante Inmunodetecciôn en membrana 1.1.1. Suero anti-MFPI de tomate (288) La presencia y solubilidad d e las proteinas antigénicam ente relacionadas con MFPl se analizô en nûcleos aislados y en las sucesivas fracciones obtenidas durante la preparacion de MNs d e cebolla (Fig 4) m ediante inm unodetecciôn en m em brana. Para ello se utilizaron sueros desarrollados contra distintos dominios de las proteinas d e tom ate y Arabidopsis (Fig 5). Suero 288 / ----------------------- N- a-hélice Union ADN T------------- 1------------- 1------------- 1------------- 1---------- - C Suero 91 Figura 5. Dominios de MFPl utilizados en la producciôn de los sueros 288 y 91. El suero 288 se desarrollô contra el fragm ente centra l del dom inio a-hélice com prendido entre los am inoâcidos 236-432 de LeMFPl. Para la producciôn del suero 91 se utilizô toda la proteina AtMFPl, a excepciôn del dom inio N-terminal que contiene las regiones tiidrotôbicas conservadas en otras proteinas. El suero 288 desarrollodo contra el fragm ente central en a-hélice reconociô très bandas principales (una banda y un doblete) en fracciones d e nûcleos aislados, a concentraciones en las que el suero preinmune no dab a reacciôn (Fig 6). Sus movilidades electroforéticas relatives (Mr) en geles de acrilam ida al 8% fueron d e aproxim adam ente 90 KDa para la banda ûnica y de 78 KDa (±2 KDa) para el doblete, coincidiendo éste ultimo con la Mr descrito para MFPl en otras especies vegetales (Harder e t a i 2000). La banda superior del doblete no se hobio d e tec tad o en estudios anteriores, ya que el suero 288 del primer sangrado 61 del anim al solo d e tec tab a la banda inferior del mismo (Somoniego et al, 2001; Som aniego, 1999), por lo que la banda superior d e 78 KDa solo se puso en evidencia con los sueros 288 d e sangrados posteriores. El suero 288 tam bién d e te c tab a dos bandas débiles d e aproxim adam ente 160 y 210 KDa, esta ultima presente en la fracciôn d e MNs (Fig 6). La d e 160 KDa corresponde a una form a polim erizada d e la protetna d e la banda superior d e 78 KDa, com o se demostrô al desnaturalizar con urea, calor y concentraciones mas alfas d e SDS, com o se verâ mas adelante. Suero 288 288P^ -2 5 0 - 150 - 100-9 0 KDa ^ -78 KDa ^ - 75 - 50 (KDa) Cit N FI F2 MN SI 82 S3 Cit N MN Figura 6. Identüicaciôn de las bandas de MFPl de A. cepa con el suero 288, y detecciôn de las mismas en las fracciones subcelukires obtenidas durcmte la preparacion de matrices nucleares. Inmunodetecciôn en membrana con el suero ontReMFPI (288) y su suero pre-inmune (288^^) en las fracciones Cit, N, FI, F2, MN, y los sobrenadantes SI, S2, S3. Las flectias rojas indican las bandas especrficas princifxiles. El suero d e tectô otras bandas que podrian corresponder a reacciones cruzadas con protetnas con dominios conservados, o bien a fragm entes proteoifticos d e las protetnas de 78 y 90 KDa, ya que son bandas d e m enor M r no reconocidas por el suero preinmune. Ninguna d e elles se localizô en el range de Mr descrito para los homôlogos d e MFPl (Harder e t al, 2000), incluyendo une intense banda d e aproxim adam ente 55 KDa d e te c tad a en las fracciones cifoplasmàiica y ocasionalm ente en el sobrenadante SI (Fig 6). 62 La banda principal de 90 KDa no se detectô en la fracciôn cifoplasmàfico, y una proporciôn muy baja de la proteina se extraia con DNasa y sulfato amônico, recuperôndose como una banda de poca intensidad en el sobrenadante S2. Una alto proporciôn de la proteina se extrajo posteriormente con 2M NaCI y se recogiô en el sobrenadante S3, aunque otra fracciôn importante resistia la extracciôn con alto fuerza iônica y permanecia fuertemente anclada a la MN (Fig 6). Las proteinas del doblete de 78 KDa présenta ban caracteristicas distintas de solubilidad, y ninguna era un componente de la MN. La banda inferior se detectô en las fracciones cifoplasmàtica y nuclear, siendo extraida totalmente del nûcleo mediante detergente en el sobrenadante S I. La banda superior es eminentemente nuclear, y no es detectable en el citoplasma ni se extrae con detergente, pero si mediante digestiôn con DNasa y sulfato amônico, y extracciôn con alto fuerza iônica, recogiéndose en los sobrenadantes S2 y S3 (Fig 6). 1.1.2. Suero antî-MFPI de Arabidopsis (91) El suero 91 se desarrollô utilizando el dominio completo en a-hélice de AtMFPl, incluyendo el subdominio de reconocimiento de ADN (Fig 5). En un anôlisis similar al descrito anteriormente, este suero reconociô de forma especffica una banda de gran intensidad y très de menor intensidad en fracciones nucleares de células meristemâticas de raiz, a concentraciones en las que el suero preinmune no daba serial. La de mayor intensidad fue una banda de aproximadamente 78 KDa (Fig 7). Sus caracterîsticas de solubilidad eran similares a las de la banda superior del doblete de 78 KDa detectado con el suero 288; es decir, una parte se extraia y recogia en el sobrenadante S2 junto con el ADN y las histonas, y el resto se extraia mediante 2M NaCI recuperôndose en el sobrenadante S3. Esta banda no se detectaba después de la extracciôn con detergente en el sobrenadante SI ni en la fracciôn de MN (Fig 7). Como en el caso del suero 288, el suero 91 detectaba dos bandas de alto peso molecular de aproximadamente 160 y 210 KDa en los nûcleos aislados. La 63 banda de 160 KDa presentaba la misma intensidad que la de 78 KDa en los sobrenadantes S2 y S3. Para comprobar si esta banda correspondra a una forma polimerizada de la proteina de 78 KDa que no hubiero sido completamente desnaturalizado, se solubilizaron las proteinas de los sobrenadantes S2, precipitados con TCA, en medios que contenian mayor concentraciôn de SDS (8%) o en presencia de urea 6 M. Al separar las proteinas mediante SDS-PAGE, esta banda desaparecfa y el suero 91 reconocfa exdusivamente la banda de 78 KDa (Fig 7). B suero 91 también detectaba una banda de 70 KDa de muy baja intensidad en las fracciones cifoplasmàtica y de nûcleos asilodos (Fig 7). Suero 91 91P» -250 -150 -100 -75 -50 (KDa) cm N H 12 MN SI SZ S3 I___ s Figura 7. kJenlHcaciôn de los bandas de MFPl de A cepa con el suera 71, y detecciôn de las mismas en las fracdones subceMores obtenidas durante la praparadôn de matrices nucleares. Inmunodetecciôn en membrana con el suero onli-AtMFPl (91) y su suero pre-inmune (91**®) en las fracdones Cit, N, FI, F2, MN, y los sobrenadantes SI, S2, S3. Los flectias azules indican las txsndas espedficas princpdes. Las bandas de 1 éO KDa corresponden a tormas pofimerizodas de las bandas mayoritarias, como se demuesfro por su d^apcmdon Iras desnaturaBzodôn con 6 M urea (U) û 8% SDS (S), con y sin calentamiento 5 rrân. a 95* C (ü^, S )̂. 1.Z InmuoprecipHaciôn mediante los sueros 288 y 91 Se comprobô mediante inmunodetecciôn en membrane que el suero 288 reconoce la banda de 78 KDa con mayor intensidad que el suero 91, aunque éste ultimo reconoce môs intensomente la forma polimerizada de la protefna en 64 la banda d e 160 KDa (Fig 8 a ). Con el objetivo d e com probar si las bandas detectadas por c a d a suero correspondfan a la misma protefna, se inmunoprecipitaron con am bos sueros los sobrenadantes S2, en los que estas son muy abundantes, y se separaron m ediante SDS-PAGE las protefnas inm unoprecipitadas, realizândose a continuaciôn las correspondientes inm unodetecciones directes y cruzadas (Fig 8 b). Las protefnas inm unoprecipitadas por los sueros 288, 91 y sus correspondientes sueros preinmunes se separaron en geles d e acrilam ida al 10%. El suero 288 reconociô en su propio inm unoprecipitado la banda d e 78 KDa, y ligeram ente la d e 90 KDa. Ninguna d e ellas coincidfa con las inmunoprecipitadas por el suero 288 preinm une. El suero 288 reconociô adem as la banda d e 78 KDa en el inm unoprecipitado del suero 91, dem ostrando que ambos sueros reconocen una misma protefna (Fig 8 b). 288 91 (KDa) 250^ 150 100 ̂ 75 50 288 91 (KDa) 250- 150- 100 - 75 - 50- M w r ^ P <1 M î # V 4 <3 <] ■ife-, : <3 91 91i“ 288 288P= 288 91 288P^ N Irmunopreâpitacios del sobr&vadahte 82 Figura 8. Inmunoprecipitaciôn de las protemas AcMFPI con los sueros 288 y 91. (a) Inmunodetecciôn con los sueros 288 y 91 de pirotefnas nucleares de una misma fracciôn nuclear (N). La membrana donde tiabfan skJo transferidas se corfô en dos mifades a lo largo del carril de micyaciôn, y se incubaron separadamenfe. Ambos sueros reconocen una banda de 78 KDa (flécha), aunque con disfinfo intensidad. (b) Inmunodetecciôn con los suerc» 288 y 91 de las proteinas de! sobrenadante S2 inmunoprecipitadas con 288, 91 y los sueros preinmunes 288̂ ®̂ y 91P̂®. Se indican: las bandas reconocidas por el mismo suero utifeado en la inmunoprecipitaciôn (fléchas negras); la banda de 78 KDa reconocida por el suero 288 en el inmunoprecipwtado del suero 91 (flécha roja) y viceversa (fleclia azul); las bandas reconocidas por los sueros preinmunes control (fléchas blancas); y las correspondientes a las cadenas p>esadas de las inmunoglobulinas de los sueros (IgG). 65 De forma similar, el suero 91 reconociô en su propio inmunoprecipitado las bandas esperadas de 78 y 160 KDa, muy abundantes en el sobrenadante S2, que no coincidian con ninguna de las bandas inmunoprecipitadas por el correspondiente suero pretnmune. El suero 91 también detectô la banda de 78 KDa en el inmunoprecipitado del suero 288, lo que de nuevo demuestra que ambos sueros reconocen la misma proteina de 78 KDa (Fig 8 b). El hecho de que la intensidad de la banda de 78 KDa sea menor con el suero 91 que con el suero 288, debido probablemente a una menor reactividad del primer suero (Rg 8 a), dificulta su observaciôn en las membranas de los inmunoprecipitados (Fig 8 b). Las bandas de 78 y 90 KDa apenas se detectabon mediante tinciôn con plata en las muestras inmunoprecipitadas mas concentradas (no mostrado), lo que indica que no alconzaban los 10 îg en dichas muestras, imposibilitando su posterior purificaciôn y anâlisis mediante espectrometrfa de masas MALDI-TOF. 1.3. Asociaciôn de la protema de 90 KDa a la mafriz nuclear La proteina de 90 KDa présentaba dos frocciones nucleores distintas, una extrafble mediante alta fuerza iônica (S3) y otra resistente a dicha extracciôn y por tanto fuertemente unida a la MN (Fig 6). Este comportamiento sugkiere que la proteina podrîa experimentar modificaciones que afecten a su asociaciôn a la MN, lo que es muy frecuente entre las proteinas de la MN. Esta asociaciôn esta regulada en numerosas ocasiones mediante fosforilaciôn, como en el caso de las laminas (Gerace y Blobei, 1980), la nucleolina (Gotzman et af, 1997), NuMA (Sparks et ai, 1995), las proteinas remodeladoras de la cromatina (Bérubé et al, 2000; Reyes et al, 1997; Muchardt e t al, 1996), etc. La proteina kinasa Caseina Kinasa CK2 esta asociada a la MN (Yu et al, 2001 ) y es una de las kinasas que regulan la uniôn de proteinas a la MN, como en el caso de las proteinas vegetales relacionadas con las laminas (Li y Roux, 1992). La proteina de 90 KDa es reconocida especificamente por el suero anti-LeMFPl, y por lo tanto es un homôlogo potenciol de MFPl en cebolla. LeMFPl es fosforiloble por la CK2 (Meier 66 Resultados et al, 1996) y posee numerosos sitios especificos de fosforilaciôn para CK2 en su secuencia, dos de ellos conservados en tomate, tabaco y Arabidopsis (Jeong et af, 2004: Harder ef al, 2000). Para investigar si la fosforilaciôn era una de las modificaciones que modula ban la asociaciôn de la proteina de 90 KDa a la MN, se analizô el efecto de la defosforüaciôn con Fosfotasa Alcolina y la fosforilaciôn con CK2 exôgena y endôgena sobre la union de esta protefna a la MN. 1.3.1. Effecto de la defosforilaclon con Fosfata Alcolina Para com probar si la defosforilaciôn con Fosfotasa Alcolina (FA) afectaba a la extracciôn de la protefna con alta fuerza iônica de las MNs, los nucleos extrofdos secuencialmente con detergente, DNoso y sulfato amônico (frocciones F2) se incubaron en presencia de concentraciones crecientes de FA ( 18, 36 y 54 U) durante 1 hora a temperature ambiente, ariadiendo a una de las frocciones medio de reacciôn sin fosfafosa como control. Tras la incubaciôn se extrajeron las frocciones F2 con 2M NoCI, se separaron mediante SDS-PAGE y se identificaron las bandas con el suero 288 mediante inmunodetecciôn en membrana de las dos frocciones résultantes: soluble (S3) e insoluble (MN). En coda corril se cargaron idénticas cantidades de protefna total, lo que permitfa la comparaciôn de las bandas detectadas en coda ensayo (Fig 9 a). Se cuantificaron peliculas densitométricamente escaneadas valorando la Densidad Optica (D.O.) y el area de las bandas, mostrando un enriquecimiento progresivo de la banda de 90 KDa detectada en la MN al aumentar las concentraciones de FA. Asi, la cantidad de protefna fuertemente anclada a la MN alcanzaba el 160% del control tras una incubaciôn con 54U de FA, que tue la concentraciôn mas alto utilizada (Fig 9 b). La banda de la fracciôn soluble S3 disminuyô correlativa y progresivamente tiasta un 30% en relaciôn con el control (Fig 9 b). Ambos tendencias indicaban que la protefna defosforilada permonecfo retenida en la MN, mientras que la protefna fosforilada se extrafa mediante alto fuerza iônica. 67 Com o control se cuantificaron las variantes d e la histona HI del sobrenadante S3 en la misma m em brana teriida con rojo Ponceau, sin d e tectar variaciones significativas a lo largo del ensayo (Fig 9 a, b). Fosfatasa Alcaina (1*4 + 2M NaCI 175i 90 KDa (KDa) S3 FA H I m: 0 16 36 54 0 18 36 54 (I# 90 M b « 100 75 25 b (MN) a % ^ N 6 H1 (S3) b 1 b — 1 90 KDa b (S3) 0 18 36 54 Control Ib^tasa Alcafna (U| Figura 9. Efecfo de la Fosfotasa Aicafina sobre la asociaciôn de la protema de 90 KDa a la MN. (a) Las frocciones F2 de nucleos proliférantes de roc de cebolla, ver Rg. 1, se frafaron con concentraciones crecientes de Fostatasa Alcolina (18, 36 y 54 U; y 0 U como control) y se extrajeron a continuociôn con 2M NoCI, recogiendo las frocciones S3 y MN de coda tratamiento. Se muestron las inmunodetecciones de ambos frocciones con el suero 288, y como el oumenfo de la concentraciôn de la FA produce un incremento en la proteina asociada a la MN y un descenso de la que se récupéra en el sobrenadante S3. Como control de cargo se muestron las mismos membranas tenidas con rojo Ponceau antes de la incubaciôn con el suero. En la membrana de los sobrenadantes S3 se distinguen las cantidades crecientes de Fostatasa Alcolina (FA) utiGzadas en el ensayo, y las cantidades tiomogéneas de la tiistono H1 (Fil) y del resto de las tiistonas del core (FIG), (b) Representociôn de las médias y desviaciones estôndor de los valores de Densidad Ôptica X Âreo (y) de las bandas detectadas con el suero 288 en las frocciones S3 y MN de très experimentos independientes, trente a los distintos trotomientos con Fostatasa Alcolina (x). Se induyen los valores de la histona H1 como contrd de cargo. Los letros indicon diterencios agniticativas (pO,05) al comporor coda valor con el del control (=100%) y el inmediotomente anterior. 1.3.2. Efecto de la fosforflaclôn con Cosefna Kinasa CK2 Una vez dem ostrodo cuontitotivam ente que la defosforilaciôn d e la proteina d e 90 KDa débilita su asociaciôn a la MN, se investigô si la enzima CK2 era ca p a z d e producir el efecto contrario al fosforilar la proteina. 68 Para ello, los MNs extraidas con 2M NaCl (M N l) se incubaron con CK2 exôgena y AIR com o fuente de grupos fosfatos. Com o control se incubaron MNs (M N l) en las mismas condiciones con ATP, pero sin CK2. Tras 1 hora de incubaciôn se realizô una segunda extracciôn con 2M NoCI, y las proteinas solubilizadas por la alta fuerza iônica se recogieron en el sobrenadante SA, perm aneciendo el resto en la fracciôn de matrices nucleares doblem ente extraidas (MN2) (Fig 10 a ). 3i Nucleos IX-100 DNasa I + sel 0.25M 4 ^ 2 NaCI 2M MN1 Control (-CK2 / + A7F) NaCi 2M Caseina Kinasa CK2 (+ e ra / + ATF̂ Si MN2 Aail de Coomassie 288 (KDa) S3 MNl Si MN2 84 MN2 S3 MN1 Si MN2 Si MN2 250 - 150- Contiol CIG Control CK2 Figura 10. Efecto de la Caseina Kinasa CK2 exôgena sobre la asociaciôn de la proteina de -90 KDa a la MN. (a) Esquema de los ensayos con Caseina Kinasa CK2 y control en nucleos proliférantes de la raiz de cebolla. (b) Gel de SDS-PAGE correspondiente a las fracciones analizadas en los ensayos CK2 y contrôles, tenido con azul de Coomossie. A su lado se muestro la correspondiente membrana de transferencia incubada con el suero 288. La acciôn de la CK2 exôgena {*) sobre la proteina de 90 KDa en presencia de ATP permite su extracciôn parcial (flécha) de la matriz nuclear (M Nl), y su recogida en el sobrenadante S4. En el ensayo control, realizado en ausencia de CK2 exôgena y presencia de ATP, la proteina de 90 KDa résisté la extracciôn con NaCI permaneciendo fuertemente unida a la matriz nuclear (MN2). La fosforilaciôn con CK2 focilitô lo extracciôn con NoCI de vorios protein os de lo MN, que se recogieron en el sobrenodonte SA y eron detectobles con ozul de Coomossie, entre ellos lo propio CK2. En el sobrenodonte SA del control no se observoron bondos m edionte esto tinciôn (Fig 10 b). Los correspondientes 69 inm unodetecciones con el suero 288 revelaron que la protefna d e 90 KDa se solubilizaba parcialm ente después d e la fosforilaciôn con CK2, pero no lo hacfa en los ensayos control (Fig 10b ). Para com probar si la solubilizaciôn d e la protefna se debfa a la fosforilaciôn m ediada por la CK2 exôgena, o bien correspondfa al e fecto final d e una cad en a d e m odificaciones, repetimos el ensayo utilizando [y-^P04]-ATP com o fuente d e grupos fosfato. Se observô que la CK2 incorpora ba fosfatos radioactivos en al menos 5 bandas d e las fracciones soluble (34) e insoluble (M N2), fras 48h d e exposiciôn d e las peliculas (Fig 11 a ). Sin em bargo, las fracciones S4 y MN2 control incubadas en presencia d e ^P sin CK2 exôgena m ostraban una ausencia total d e radioactividad, a excepciôn d e la residual del pocillo d e aplicaciôn (Fig 11 b). Caæina Kinasa CK2 (+ CK2 / + [y-32P0JnATP) 32p + sueio 288 L ^ r H 48h 5 Control (-CK2 / + [y-32po J-ATP) + sueiD 288 MN2 Si S3 MN2 S4 S3 1 5 0 - 112 - M N 2SIS3 MN2SiS3 Figimi 11. Efecto de la Casenia Kinasa CK2 sobre la asociacion de la protema de 90 KDa a la MN: mcorporaclôn de ̂ a la protema. Los ensayos son similares a los descritos en la Rg 1 Oa, utilizando esta vez ^̂ P-ATP radioactive como tuente de grupos tostato. (a) En presencia de ka CK2 exôgena se détecta incorporaciôn de ^̂ P en anco proteinas de la MN. que son parcialmente extraidas mediante NaCI (cabezas de flécha) y recogidas en el sobrenadante S4. La posictôn de una de ellas ccxncide con la de la protefna de 90 KDa detectada con el suero %8 en la misma membrana (tlechas rojas). (b) El ensayo control se realizô en presencia de ^P ATP y ausencia de CK2 exôgena, y no se detectô incorporaciôn de ^̂ P en ninguna protefna. La bxanda de 90 KDa no se detectô en el sobrenadante S4, ano en las fracciones MN2 y S3. 70 Incubaciones de las mismas membranas con el suero 288 mostroron la posicion coïncidente de la protema de 90 KDa con una de las bandas radioactivas, tanto en MN2 como en S4 (Rg 11a). Dicha banda estaba ausente en el carril S4 del control (Rg 11b). 1.3.3. Effecto de la estimulaclon de la CK2 endogena Una vez demostrado que la CK2 exôgena puede fosforilar la proteina de 90 KDa unida a la MN, posibilitando su posterior extracciôn con alto fuerza iônica, nos preguntamos si este fenomeno podria ser reproducido por la CK2 endogena. Para ello se usaron policationes como la espermina y la espermidina que estimulan la actividad de la CK2 (Tujera et af, 2003; Westmark ef of, 2002; Li y Roux, 1992), F>eimitiéndonos estimufar la actividad de la kinasa endôgena de nucleos proliférantes de cebolla y observar su efecto sobre la solubilidad de la proteina de 90 KDa durante la extracciôn de MNs. Se incubaron volùmenes idénticos de fracciones nucleares con Im M espermina / 2mM espermidina inmediatamente después de su purificaciôn, durante distintos tiempos (5, 10, 15 y 20 min) y a una misma temperatura de 35° C. La muestra control estaba libre de policationes y se incubé durante 20 min. Tras la incubaciôn se lavaron los nucleos con el mismo medio sin espermina ni espermidina, ya que la digestiôn con DNasa I en su presencia produce destrucciôn nuclear, y se continué la extracciôn de MNs a 4° C. Después de extraer con 2M NaCI se recogiô la fracciôn S3, que contiene la forma fosforilada de la protefna (Rg 12a). Como se esperabo, el anâlisis densitométrico de las bandas reflejô que tras 20 min de incubaciôn, la protefna fosforilada de 90 KDa se enriquecfa en los sobrenadantes S3 hasta un 50% en comparaciôn con la banda control (Fig 12 a, b). Los mismas membranas se tirieron con rojo Ponceau y se analizô la D.O. de las 71 variantes de la tiistona Ht como control de cargo antes de la incubaciôn (Fig 12 a), sin detectarse variaciones significativas. S3 Nùcleosaiëados Heparina Espermina /Espermidina Espermina / Espermidina 1 R2 MN TC-IOO DNasa 1+ sal NaCI 2M 90 lOa HËonasHI 0100 200300 400 (nM) Control #4 m ^ (min) C 5 10 15 20 (mit) 90 KDa (S3) 0 100 200 300 400 Control ^M ) Heparina Figura 12. EMdo de la inhbiclén y esHnuioclôn de la CcBeéra iOnosa CK2 endôgena sobre la asociaciôn de la protevKi de 90 KDa a la MN. (a) Nüdeos recién aislados de células profiferantes de la roc de œboHc trotados con concentraciones crecientes de heparina: 100,200 y 300 nM; y 0 nM como control; o con espermma / espermidina durante distintos lierrpos: 5, 10, 15 y 20 min, y 20 rrûn sm tratamiento como control; provocando respectivamente la intâbkâôn o estknulaciôn especifica de la Caseina Kôiasa CK2 endôgena. Una vez conduido cada tratamiento se continuô ta prepcaaciôn de MNs, ver Fig. 1. La cantidad de proteina de ta banda de 90 KDa, detectada con el suero 288 tras extracciôn con NaCI en el S3, variaba debido al efecto de los tratamientos sobre ta CK2, disminuyendo con concentradones crecientes de treparina y aumentando con el tiempo de incubaciôn con esperrrûna / espermidna. Los rûveles de ta tâstona Ml tenida con rojo Ponceau como control de ccaga apenas vartaban. (b) Representadôn de tas médias y desviaciones estôrKkv de los valores de Densidad Ôptica x Area (y) de tas bandas respecte a coda tratcvniento (x) de très experimentos independientes. Las letras kicfican dterenctas significativas |p<0,05) al conr^xirar cada vdor con el de! control (=100%) y el inmedtatamente anterior. 1.3.4. Efecto de la InMblcIôn de la CK2 endôgena Contrariamente al efecto sinérgico de les policationes, la heparina es capaz de inhibir especificamente la CK2 (Tujera ef al, 2003; Westmark ef al, 2002). Se incubaron fracciones nucleares recién preparadas con concentraciones crecientes de heparina (100, 200, 300 y 400nM) durante 1 hora a temperatura ambiente, siguiendo a continuaciôn el protocolo de extracciôn de MNs a 4°C. La ùnica variaciôn tue que durante dicho protocolo se ariadiô a los distintos medios 72 las correspondientes concentraciones de heparina de cada ensayo, para impedir que su efecto revirtiera durante el proceso de extracciôn. Al ensayo control no se le ahadiô heparina en ningûn caso. Una vez extraidas las fracciones F2 de los distintos tratamientos con 2M NaCI, se recogieron los correspondientes sobrenadantes S3 que se analizaron mediante inmunoblot con el suero 288 (Fig 12 a). Contrariamente al caso de los policationes, concentraciones superiores a 300 nM de heparina inhibieron la actividad de la CK2 endôgena y provocaron una reducciôn en la cantidad de protefna de 90 KDa recogida en el sobrenadante S3, de hasta un 30% en comparaciôn con el control (Fig 12b). 1.3.5. Estudio de la protefna de 90 KDa en geles bidimenslonales Una vez demostrado que la proteina de 90 KDa era fosforilable por la CK2 y que su forma defosforilada permanecfa asociada a la MN, mientras que la fosforilada se extrafa con alta fuerza iônica; se investigô la existencia de distintos estados de fosforilaciôn calculando su pi en las fracciones S3 y MN, ya que dichos estados varîan mfnimamente el valor de punto isoeléctrico (pl) de una protefna sin que se produzca en muchos casos un retardo visible de la Mr, pudiendo visualizarse en geles bidimenslonales alineados horizontalmente (Droillard ef of, 1997; Cupo 1991). El anâlisis de la fracciôn S3, con una concentraciôn de sales mayor a 2M, no se pudo realizar. Pese a precipitar sus protefnas con 10% TCA y dializar y/o lavar exhaustivamente en medio acuoso con inhibidores de proteasas, no se pudo reducir la concentraciôn de sales hasta un valor de 0,01 M que permitirîa realizar el isoelectroenfoque (lEF). Por este motivo, la forma fosforilada de la protefna de 90 KDa no pudo ser analizada directamente en esta fracciôn. Otra alternativa para estudiar los dos estados de fosforilaciôn de la protefna era la comparaciôn de geles bidimenslonales de la fracciôn nuclear, que incluye teôricamente los dos estados, con los de la fracciôn MN que incluye solamente la 73 protefna defosforilada. En este caso surgiô el problema de la baja solubilidad de la protefna de 90 KDa, que résisté la extracciôn con baja y alta fuerza iônica durante la extracciôn de MNs. • Solubilizaciôn de la protefna de 90 KDa Para su inmunodetecciôn en filtres monodimensionales se utilizô un medio de solubilizaciôn de muestras que contenfa 4-8% de SDS, asf como sonicaciôn a 22,5 KHz durante 5 segundos a 4° C seguido de 5 minutes de calentamiento a 95° C. Esto nos permitiô solubilizer une cantidad de protefna suficiente para su estudio. Sin embargo, los medios de solubilizaciôn utilizados en 2-DE no deben contener detergentes iônicos como SDS, ya que su cargo influirfa en la migraciôn de la protefna a lo largo del gradiente de pH, y tampoco deben ser calentados, ya que contienen urea que con el color puede modificar el pl de las protefnas. Se probaron distintos medios de solubilizaciôn especfficos para 2-DE basados en distintos combinociones de urea, 2-mercaptoetanol, DTT, Tris-HCI y detergentes no iônicos como CHAPs y Triton X-100 (Tabla 1), que solubilizaron eficazmente un gran numéro de protefnas nucleares, entre las que no se detectaba la protefna de 90 KDa con el suero 288. Por ello se desarrollô un método de doble solubilizaciôn. En primer lugar se solubilizaron las muestras en un volumen mfnimo de 20-30pl de medio con 2- mercaptoetanol, Tris-HCI y tiasta un 2% SDS, seguido de sonicaciôn a 22,5 KHz durante 5 segundos a 4°C y calentamiento a 95°C durante 5 minutes (Tabla 1 ). A continuaciôn, se ariadiô medio sin SDS pero con una cantidad suficiente de Triton X-100 para consegurr una proporciôn final de SDSiTX-lOO de al menos 1:8, y una concentraciôn de SDS menor del 0,25%, lo que garantiza el desplazamiento de! detergente iônico por el no iônico en contacte con las protefnas. De esta forma se consiguiô solubilizar la protefna de 90 KDa de las fracciones nucleares y de MN, y se abordô su estudio mediante 2-DE. 74 Medios de solubilizaciôn Nùcieo MN (NoCI) MN (US) SI S3 288 91 288 288 288 288 91 Medio 2-DE (1) 8M urea; 2% Triton X-100; 2% Mercoptoetanol; 2% Phormditos pH 3-10 (-) 78 KDa p1-5.5 (-) (-) 78« KDa p /-7 ,5 * 2-DE Media 2-DE (2) 8M urea; 4% CHAPS; 40mM Tfis4ta pH 9,6; 0.5% Phormditos pH 3-10 (-) (-) (-) * Media 2-DE (3) 9.8M urea; 100 mM DTT; 2-5% T X-100; 2% Pharmdlitos pH 3-10 {-) (-) {-) * Doble st^uUUzadon 'Mecio de dluciôn 1-DE (<2% SDS)+ 9 5 ^ -rsonicaciôn; ^Dikiclôn en Medh 2-DE (3) 90 KDa pl -8,5 90 KDa pl -9,5 (-) 78« KDa pl -7,5 * SDS- PAGE Media de dHuciôn 1-DE 4% SDS; 10% Merccptoetand 0,125 M Tris-Hcl pH 6,8 90, 78, 78"* KDa 78 KDa 90 KDa 90 KDa 78W KDa 78 KDa 78 KDa Tabla 1. Medios de sdubifizaciôn especHIcos para SDS-PAGE y utflizados durante la Inmunodetecciôn en membrana de AcMFPI. electrofforesis bkSmenslonal En la tabla se muestra la composiciôn de los très medios especfficos para electroforesis bidimensfonal (2-DE) utilizados para la solubifeaciôn de las proteinas AcMFPI en distintos muestras subcelulores: nûcleos aislados, matrices nucleares (MNs) extraidas mediante alta fuerza iônica (NoCI) y el método de US, y en los sobrenadantes SI y S3. También se muestra el método de doble solubilizaciôn, el ûnico que permite disolver la proteina de 90 KDa en medios 2-DE. En la ultima fila se muestra la composiciôn del medio de dBuciôn utHizado en electroforesis monodimensional (SDS- PAGE), que permite la solubilizaciôn de todas las proteinas AcMFPI. (-) Los medios de scrfubilizaciôn 1, 2 y 3 especfficos para 2-DE no permifen la sofubifeaciôn de la proteina de 90 KDa. (*) La alta concentraciôn de sales del sobrenadante S3 impide su estudio en geles bidimenslonales. • Estudio de las fracciones nuclear y de MN en geles bidimenslonales Utilizando el método descrito se solubilizaron cerca de un centenor de protefnas de la fracciôn de matrices nucleares, que fueron detectadas con tinciôn de plata. La mayor parte se distribufa por la parte bôsica de un gel con gradiente de pH de 3,0 a 10,0 (Fig 13 a). En las MNs, el suero 288 detectô cuotro monchas alineados horizontalmente de 90 KDa con valores de pl en el rango 9,3-9,7, demostrando la existencia de varies estados hipo-fosforilados en la fracciôn insoluble de la protefna (Fig 13 b). Al sobrexponer la pelfcula se detectaron ademôs de las cuatro seriales mas intensas (9,3-9,7), una fila de manchas môs pequerias y de baja intensidad entre 8,5-9,3 correspondientes 75 probablem ente a trazas d e los estados hiper-fosforilodos, que no fueron com pletcm ente extrofdos m ediante 2M NaCI (Fig 13b ). (KDa) MN Tincion con Plata 90 KDa Hi pe r-Fo sibrilada Nudeo M po-Fosforiiada MN Sobffexpoâdôn MN MN-US Figura 13. Seporaciôn y detecciôn de la proteina de 90 KDa en fracciones de nucleos y matrices nucleares mediante electroforesis bkfimensioncri. (a) Protefnas de MN preparadas mediante doble solubiSzaciôn y separadas mediante electroforesis bidimensional. Tinciôn con plata. (b) Inmunodetecciôn en membrana con el suero 288 de p>rotefnas de nucleos y matrices nucleares separadas mediante electroforesis bidimensional. Se observan los estados hiperfosforilados de la protefna de 90 KDa en la fracciôn nuclear (pl -8,5) , y los estados fiipofosforilados en la fracciôn de MNs (pl -9,5). (c) Inmunodetecciôn de la protefna de 90 KDa con el suero 288 en MNs preparadas por el método de US. Sorprendentem ente, la incubaciôn d e fracciones nucleares separadas m ediante 2-DE con el suero 288 sôlo mostraba dos m anchas d e 90 KDa y pl -8 ,5 (Fig 13 b), cuando en esta fracciôn esperôbam os d e te c tar todos los estados d e fosforilaciôn d e la protefna. Esto podrîa deberse a que el lavado d e una estructura celular con NaCI previo a su solubilizaciôn en medios 2-DE, enriquece la muestra en determ inadas protefnas y la em pobrece en otras, com o demostraron Friso y Wikstrôm (1999). Por esta razôn detectam os las formas hipo- 76 fosforiladas en las MNs lavodas previamente con 2M NaCI, pero no en los nucleos que no se lavaron con NaCI. • Estudio de la fracciôn MN-US La utillzaciôn de alta fuerza Iônica (2M NaCI) durante la preparaciôn de MNs puede provocar un reordenamiento general de sus componentes, incluyendo la precipitacion de complejos como los de transcripcion y replicacion (Jackson y Cook, 1995). Por ello se preparoron MNs mediante un procedimiento de extracciôn de bqja fuerza iônica, con detergente LIS y digestion con DNasa I desarrollado en el laboratorio (Mfnguez, 1995; Moreno Dfaz de la Espino, 1995) basado en el de M'ffkovitch y cdaboradores (1984), y sin utilizar en ningûn caso extracciôn con alta fuerza iônica ni estabilizaciôn por color. Aunque ultraestructuralmente la MN-US y la MN obtenida mediante alta fuerza iônica son similares, su composiciôn polipeptfdica en geles bidimenslonales es distinta (Mînguez, 1995; Moreno Diaz de la Espino, 1995). Se comprobô mediante inmunodetecciôn en membranas monodimensionales que el suero 288 detectaba la banda de 90 KDa, pero no la de 78 KDa, en las MN-LIS tras solubilizar con 4% SDS, sonicaciôn y calentamiento a 95° C (Fig 13 c), confirmando que, independientemente del método usado para la preparaciôn de matrices nucleares, la p>rotefna de 90 KDa es un componente de las mismas (MN y MN-LIS), pero no asf la de 78 KDa (Figs 6, 7 y 13 c). Cuando se solubilizô la fracciôn MN-LIS en medios especfficos para 2-DE o mediante el método de doble solubilizaciôn descrito anteriormente (Tabla 1 ), el suero 288 no detectaba ninguna banda en estas fracciones, coincidiendo con el resultado obtenido para los nûcleos en el sentido de que los estados hipo- fosforilados de la protefna unidos fuertemente a la MN, necesitan ser trotados con NaCI para su solubilizaciôn en medios especfficos para electroforesis bidimensional, que contienen menos de un 2% de SDS. 77 1.3.6. Estudio de los proteinas de 78 KDa en geles bidimenslonales Se calculoron los valores de pl de la banda superior de 78 KDa, detectada en nûcleos aislados por los sueros 288 y 91 (Figs 6 y 7), y de la banda inferior de 78 KDa detectada exdusivamente por el suero 288 (Rg 6). Para el cdlculo del pl de las bandas de 78 KDa se utilizaron nûcleos aislados y el sobrenadante SI procedente del lavado con TX-1(X) de los nûcleos. En estos casos la solubilizaciôn de las protefnas no tue com plicada, obteniéndose resultados positivos tanto con los medios especfficos para 2-DE (Tabla 1) como con el método de doble solubiUzaciôn. La obtenciôn de idénticos resultados en ambos casos confirma la validez del segundo método, en el que se utiliza una pequeria concentraciôn final de SDS menor del 0,25%. 97- 66- Nûdeo 288 97- pl~7,5 66 - Hguia 14. hmunodetecdon de los protema* de 78 KDa con k» sueros 91 y 288 en las fracciones nudearySI separadas medkmte eiedrotorrals bMmensionaL (a) Proteinas de nüdeos aislados incubadas con el suero 91. Las dos manchas detectadas tienen un volor de pl ~5,5, (b) Proteinas de! sobrenadante SI incubadas con el suero 288. Las manctKis detectadas poseen un pl 7,5 y corresponden por su Mr o la banda inferior de 78 KDa, ver Rg 6. También se detectan varias manchas de -55 KDa. Los fracciones nucleares se solubilizaron en medio de disociaciôn para lEF que contenfa urea, 2-mercaptoetanol y Triton X-100, y se separaron bidimensionolmente. Los membranas transferidas de estos geles se incubaron con el suero 91, que detectô dos manctios de 78 KDa con un pl de ~5,5 (Fig 14 78 a), valor oproximodo al pl de AtMFPI y LeMFPl (Jeong et ah 2004; Meier ef ah 1996). El medio de disociaciôn para lEF contenta urea, razôn por la que no detectamos la forma polimerizada de 160 KDa. De forma similar, se solubilizaron en el mismo medio las proteinas del sobrenadante SI, precipitado con 10% TCA, que contiene la banda inferior de 78 KDa reconocida por el suero 288. Se obtuvieron varias manchas de 78 KDa con un pl -7 ,5 y otras manchas de 55 KDa con el mismo pl (Fig 14 b), que suelen ocompahar a la primera en las fraccionescifoplasmâtica y SI. 2. ClONAClÔN DE AcMFPI 2.1. Rasireo de una genoteco de cDNA de cebolla mediante PCR Se diseharon distintos cebodores especfficos a partir de los regiones mas conservadas de los genes MFPl conocidos, localizadas en el dominio cercano al extremo C-terminal de las protefnas. Este dominio es el mas especffico por contener la region de uniôn a MARs, evitondo asf la region central coHed-coH mas conservada con otras protefnas tipo Filamento Intermedio y la region hidrofôbico N-terminal conservada en protefnas transmembrana. Se alinearon 800 nucleôtidos de las secuencias de très especies de dicotiledôneas [AtMFPK LeMFP), NtMFPl-J y NfMFPJ-2) con cuatro secuencias parciales conocidas de monocotiledôneas obtenidas del NCBI (Hordeum, mafz, arroz y trigo). Se seleccionaron las très regiones mas conservadas tanto en secuencia de nucleôtidos (Fig 15} como de aminoacidos (Rg 16). No todos los nucleôtidos coincidfan en la alineaciôn de las secuencias, principalmente diferîan las secuencias de Arabidopsis y mafz. En estos casos se optô por el nucleôtido moyoritorio en el resto de las especies. Asf, se disehô un cebador que permitfa una amplificaciôn en sentido 5’-3’ (denominado MFPl-5’) y dos complementarios en sentido 3 ’-5' (MFPl-3' a y b) (Figs 15 y 16). 79 H v M F P l Z m M FP l O s M F P l T s M F P l ----------------------------TC iïG C -----------------------------AC ÜAC— -------------------A r c TTC '3CA3G A;rA y !, ' ! ' AAACAC G A3C 1 -------------------A I kGAA:' I G A A -A C A A îiA A A A iA C GA; r ■ T ::-CT 3CT GAT lA A C : G A A -A C A A G A A A A G A A I'A r ; T GO I uT T A A I GAAC I 'GAA-ACAACIAAAAGAA: A; 1 ^9CA-------------------------------------- CAG G C -A G r A A : rC A T GAAC1C A TC .XAAl-ACT AGAAGAAGAGT ; A A C G I G AC ACT 3TAGAAAG AÇC. A A C GT GAC AT !' GGAGAAAGAGC T A A H v M F P l Zm M FP l O s M F P l T s M F P l jktmm LaÊ IF V l mMFBl-l CA 1-2 C A (4 CAT GAG---------------------------------------'GCA- ----------- C AC — A T -------------------------------------- G AT- -G A T4A G 7A — T GTC2AGGA— A A I 1 TC I -GAOG: TAG CAT TTAAACTA C 1 — C AAGAACC AGA'IC T 1 A A A : : AC A T G AGAT lA A A C A C C AAA ; : ATAAG A TATAA A G A 'C I 'A A A ’ T AT A A J ACAGAAAGAGT :CAAT.CATvAT-g - a : TO: A : - : c : a g > c : c a a a c - a ; TACAV TAAAC-C TAAAOC aaeuuuhaauk&-T0CTJKTCJ eaaiMMUUt-TarTxrcMiL aaoTfi amaaamemme-TacTccj mwrmMouhg-TocTccj M F P 1 H v M F P l Zm M FPl O s M F P l T s M F P l A t t a r i — A -t A 'aAAlTAAATAAAA: A yA ' % A . AG T'TAATAAAG- :J^G T A A TA T :A A '..A 'T A : AAT TAA — A l A TAA.AA ATA A A ATTG A TA ATC G A — A - A Î CAAA3GTAO.T:' G A '* A - A A TAC A A T T C A 3 :'T I CAAGACA-------AT . IGT' AG T AC r A lA GAAAT G A A C A A i-------AGT 'V T -'r I TATC A C A A c A A A : TAG: A vt A A A A A A TAGTAGAAG A AA A A A A A A A A A A -A A A TAAA------A TAT ; OAC-C- AAGA 3A------AT : GT CAC T A A A T A G A C TT TAAT A A TA A A A TC ̂ 3TAAÇ A TAAA------AT C : : TAAG A TAAA------ATC : : TAAT H v M F P l Zm M FPl A A A c A A AAA H v M F P l A A A I ; T s M F P l A A A AAAG- T.TAGAT : A A . ACT OCCAC : _ A /.A . \ ;A ,A A ^ ?A jA . A _ A A_AAC GGGACAC J T G A A A -: CA'TGTC C-AAT C : GA .TAAC : vTAAA-T CA'GGT T TGAAA-T CATTTC TAAT A A 'i-A A C AC ATCAAT AC I cT C A T - lAiTA . ̂ A A „A A C TC TAAA -;C I i C A 3 A A -0 A 0 A G ' ; OGCT AAGTAAT CCT C A G A 'f C ; G G AO A A- TAGAGC : CCCAAGGAAC CCGAGATTC i GGACAA-CATAOC flaaflMBMCTGacarrT-aacg , ecA-aaacTcrjMC-T9-UCA maVl-l A AAG AAA t r a i m - 2 a a a t a a a - A A A S A A A I G M i i f f i T f l a a i r r a a c - A - a c a a c -CAOC aareaflaierT oca«mma«nx:acjMK;cg osraiaarJtrTOca eareaetoOTTec® TTag»g œreuieeiTTTOcs @6rr@KmTTTTac8ggraaaarTTTgca T — T A A C -A - A A l : : AAG A - C — C : A A O -A - C — C : AAC TA - —G—ATT-AT — CC : ATC TAT — TCTGTGCAT (com piem entaria^ MFP1-3’a 80 continua H v M F P l Z m M F P l O s M F P l T s M F P l A - a a v i LéUTBl --AGGTA'TAT- —AAACACA'l— r TC AAG—CAAAT CCCAGAAAA—C AAC AT AT GT TCCC-AGAAC AA CA œ'T —CAGAAC -C ; ! A'C A—CAAGGC TT GATA: ACA3AAG TA —acgaga: — gtcagat AAAGAAO: A- T TAAA: AAA - 1 CCAAGAAA M t > a v i - 2 acaa'.taaa: -A G I AC A A C A G A I - AC-T GCAAG--C A A AT ' TCAACGAC-AC i C A Ç T A A A A G ' AGX'GGTAAAAGCT'C - C GG : AAAA TG V ' Ç. C AC ACAAA :—C AAAAAC ! C ! TCC A-AAC AC AA CCC A iAAAA—C AAC AT AT GT TCC I’-A8A0C AA —AGGA-'TAÜCC AAAGAAI GC ATCAAAAGAA— GGAGGA G A3:,AAAAAGTT GT T %: T G G3GAAAA AATAAT GAGGAAAAAGTTCAAGCTGGGGAAAA ; AA: AAA : A-GTAAAAAC-TT GAACC T CiCG -'AAAA H v M F P l Z m M F P l O s M F P l T s M F P l Atimi L eam i a t t a v i - i Mtimi-2 H v M F P l Zm M FP l O s M F P l T s M F P l A t t m i Lmmvi attm i-i atMOVX-2 H v M F P l Z m M F P l O s M F P l T s M F P l A t t a v i Lm uni MtüFPl-1 M ta m -2 ■■-----------------: '3CATCCACA- TAA-A-CTAG: A—C T C-----------CTCCCAG---------------------- C-----------------AGC : :TGAA: : GAG-G- . 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AAAv. : TAA T: ; G: :CCCACAA-CAAGT G TTCCCÇ G:TATA— CAAGAAATT ' TAAT------ t c t a g :t 'GTc t vC : TC : g a a t c a : TATAT AT CT T TCCTTT TT GT'TC TATAT AT ATC T T CCTC : :T- :CC CA TATAT T'AG. TA TACT A A 3 A AAACA - ' ------------------AC CACC'T . TATAC A: ATT : A TA:' : — A A T - 'T A T T A G C A A A A -A - 'T taaa; : T A . : T A -c A A : A A : CA-AT T AG A-GAA-A a?:;attag 'GA-ATTAG T CAT TA TAAT A TA -AA TAA TATCG ATA -A AC : C : 'TT —CAAT CA; GTT AC GTATAA T' A A -------T A — G C A A G A -G -.A C C A T C A ^ G c ACCT T T — T^AA------------------------------------------------- A T 'T c : - - G A A : g a ; : x : -------a t : c a t a a c a ■T----------------- : G C AA-AG TTG TCAÏATAC : 3 T -G C ■ A g ; t g c a a t a t t : a : a g a g a g g c t t a g a r AT T -A T AGAGAATÎTCAT A t a : - A AT A A A A X C A TA H v M F P l Z m M FP l O s M F P l T s M F P l AOÊW Vl Lm M FPl S tM W S l-1 A a t m i - 2 A TAAA CAAA' TT ACA A A -A-T : T : TAAC--------TACT AATC C T.A-A: GA— AATA; AAAC ----------T A:AA: TA­ CT TAAA : A -tA-.-\TA--------- T AT : AC.A'A T A TCA A T.A:,TA A AAT A ATA TA A -A- TC---T CGA : T AA-AAG----- AACAAÙ ; GT TT -AT T G—T : AATAAAT : ' ' , AA -■ ' T AT : AA AAA C AAT C A . 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Alineaciôn de los ûltimos 800 nucleôtidos del extremo C-terminal de MFPl de tomate (Le), tabaco - los dos genes- (Nt), Arabidopsis (At); Hordeum (Hv), mafz (Zm), arroz (So) y trigo (Ts). Se indican las secuencias utiSzadas durante el diseno de los cebadores MFPl-5' y MFPl-3' a y b, y aparecen subrayadas las secuencias menos conservadas. 81 HvMFPl OsMFPl A ttŒ P l XeMSPl N t i a P l - 1 V tH B P l-2 HvMFPl OsMFPl A tM E P l L eU S P l N t iO P l- 1 N tH F P l-2 HvMFPl OsMFPl AtMEPl XalffPl J f tü S P l - l irtMEPl-2 HvMFPl OsMFPl AtMEPl N tM F P l-1 FtMfPl-2 HvMFPl OsMFPl A tïŒ P l XaMEPl fftMEPl-1 N t t S P l - 2 ..JŒISASELAL EKDLRRRVKD ELEGVTHELK ESSVKNQSLQ KELVEIYKKV -------------------------------------------------------------------------- TENCraJLQ TELVDVYKKA -------------------------------------------------------------------------------------------------------------k k a ELVEE RKIVTALNKE LEALAKQLQV DSEARKSLES DLEEATKSLD ETSNKELEEE KKTVLSLNKE VKGMEKQILM EREARKSLET DLEEAVKSLD -HTRNELK(^ KTIVRTLEEE LKFLESQITR EKELRKSLED ELEKATESLD ERAADELK(^ KNIW TLEKE LTFLEAQITR EKESRKNLEE ELERATESLD ERAVNELKQE K N IW T IE K E LTFLEAQITR EKESRKNLEE ELERATESLD EMNNSALLLS EMNKNTSILS EINRNVLALA EMI®NAFALA EMNRNAFALA AQNLITRLET AQNLISRLQT AHILVMSLGK AHSLVMKLŒ AHSLVMKLGK AHSLVMKLGK KELESTHSRS AT RETSSRK DT RELEKVWHA SN EELELATSRN SS KELELANSHI SS KELELANSRI SS IKALAEQTKI ïKALAEQQKI 2RSLGEAKNA IQSVSEQKQI 3KSVSEQKQI 2KSVSEQKQI TTEAKENTED TTEAHENTED SKEAKENVED SQEAQENLED SQESRENLED SQEARENLED MFP1 EKESFEIRCR H EKESFEMRAR H EREVLEKKVK K ERESLEKRAK K ERESLEKRAK K ERESLEKRAK K IZ Z L A L AK IZŒLALtAK I£Q>LGS LEEEMAA I£0B 4A S I£ED 4A S AK AK AK AK G E IL R IR R Q I GKEL R IR R Q I G E IL RMRSQP G E IL RLRSQI G E IL RLRTQV G E IL RLRTQV STNSSQKPRA STSRSQK----- DSVKAVNS-- NSVKAPVE— NSVKAPVN-- NSVKAPVN-- MFP1-3’ la RGPPEASETL KEQPVNDYNQ KTSGWAGTP QPVKRTVRRR KGGA- ------------ AKTL P NT NASPEVSQAP X— RAGCE— ---------- TDNKE KS DNTVTVKKW R R R K S S TS S ------------- DEEKV VAG------------- E KEKVNVQQ— --------------------- ------------ NEEKV EAG------------- E KAAVTVKRTR RRKTATQPAS QQESS KEEKV EAG------------- E KATVTVKRTT RRRKTATPAS QÇ^GS Figura 16. Alineaciôn de las secuencias de aminoacidos de las proteinas MFPl de disfintas especies. Alineaciôn de las secuencias de aminoôcidos de MFPl de tomate (Le), las dos proteinas de tabaco (Nt), Arabidopsis (At), arroz (So) y Hordeum (Hv). Aparecen recuadradas las secuencias traducidas de los cebadores MFPl-5' y MFPl-3' o y b, véase Fig. 15. 82 El cDNA d e cebolla venio integrodo en el vector pCMV-SPORT 6 (Rg 17 a ). Se am plified la genoteca a 50°C d e tem peratura d e anillam iento, utilizando distintas com binaciones d e cebadores: bien ambos especfficos sim ultdneam ente o bien uno especffico con uno no especffico d e zonas cerca nas del vector (Rg17b). a SP6 MFPl “EcoRV” / V " 77 poliW/Vod pCMV SPORTS cDNA de cebolla pCMV SPORTS Figura 17. Mopo de la inserciôn del cDNA de cebolla en el vector de la genoteca. (a) M apa del vector pCMV-SPORT6 de la genoteca . (b) M apa de inserciôn de los fragmentos de cDNA de cebolla en el vector. La co la poliA-Nofl del fragm ento de cDNA se ligô al sitio de restricciôn NofI del plâsmido. El extremo romo 5' del cDNA esta ligado al sitio romo de restricciôn EcoRV. Se muestron los cebadores utilizados durante el rastreo por PCR, tan to los disenados especificam ente (rosa) com o los utilizados pertenecientes al vector (negro). Las reacciones con ambos cebadores especfficos no produjeron am plificaciôn, mientras que las reacciones de cebadores especfficos com binados con cebadores externes inespecfficos, produjeron largos m anchas sobre las que se distingufan algunas bandas mas prominentes (Rg 18). A partir de este m om ento se siguieron dos estrategias distintas. En una primera estrategia se clonaron los productos d e co d a reacciôn en un nuevo vector pCRII-TOPO, tronsformondo bocterias com pétentes de E. coli TOP 10. Se realizô un rastreo d e 200 colonies transformadas seleccionando los insertos de cDNA d e m ayor tam aho (Fig 19). Las secuencias d e estos insertos d e cDNA inclufon une regiôn correspondiente a los vectores pCRII-TOPO ô pCMV-SPORT6, seguido de une cola poli-dT o cebador especffico, y finolm ente une secuencia d e unas 700 bases de cDNA de cebolla. 83 M 4^ -i» ^ üV M (Kb) 5 Figura 18. Productos de PCR obterHdos con cfislinias combinaciones de cebadores MFPl. Productos de amplificaciôn por PCR separados en gel de agarosa, se observan mancfias entre 0,3- 1,6 Kb, entre las que destacan ligeramente algunas bandas. Las reacciones se hicieron a una temperatura de anillamiento de 50® C, utilizando combinaciones de cebadores especrficos-MFPl con cebadores extemos situados en el vector (SP6 6 T7). Ninguna d e las secuencias obtenidas se pudo alinear con las secuencias de nucleôtidos o am inoacidos d e M FPl. La büsqueda en las bases d e datos del NCBI dem ostrô similitud parcial d e las secuencias obtenidas con diversos genes vegetales, ninguno d e ellos MFPl . Insertos de cONA seiecdonados del producto MFP1-3’a / SP6 Figura 19. Rastreo de colonios transformadas con el producto de cmnpIRicaciôn MFPl -3'a / SP6. Se rastrearon 200 colonios transformadas con el producto de amplificaciôn de MFPl-3' a / SP6. Se muestron las bandas correspondientes a los insertos seleccionados (mayores de 0,5 Kb) de cDNA de cebolla. La clonaciôn se reafeô sobre el vector pCRII-TOPO (derectia), gracias a la adenina libre del extremo 3' gen^ada por la Transcriptasa Inversa. 84 En una segunda estrategia se purificaron las bandas d e ADN mas intensas d e las distintas reacciones d e am plificaciôn por PCR a 55° C d e tem peratura d e anillam iento. En concreto, dos bandas am plificadas por los cebadores SP6/MFP1- 3 ’a y b; y cuatro bandas d e la reacciôn M FPl-5’/T7 (Figs 17 b y 20 a ). Genoteca; vector occ — Purificaciôn de las bandas + Clonaciôn / T ræ^fbrmaciôn + Digestiôn con EcoRI ► Insertos secuenciados de cDNA Rgura 20. Purificaciôn y clonaciôn de las bandas amplificadas mecSanfe disfinfas combmaciones de cebadores MFPl. (a) Productos de PCR obtenidos durante la amplificaciôn de una genoteca de cebolla mediante las siguientes combinaciones de cebadores: SP6 / MFPl 3' a; SP6 / MFPl-3' b y MFPl 5' / T7, a 55*C de temperatura de aniBamiento. Se purificaron y se clonaron en el vector pCRIl TOPO las bandas mas patentes (tlechas rojas). (b) Productos de digestiôn con EcoRI de los plôsmidos las colonias transformadas con las bandas puriticadas en (a). Se muestra el misrrK) gel de agarosa sobrexpuesto para resaltar algunas de las bandas. 2.2. Rastreo de une genoteca de cDNA de cebolla mediante hibridaclon de colonias El rastreo d e una genoteca m ediante Fiibridaciôn directe d e sondas especfficas sobre colonias bacteria nas im plica un calcule previo. Asumiendo que MFPJ no sea un gen raro. se estimô que su concentraciôn en una geno teca norm alizada serîa >0,1%. Asf, analizando 50.000 colonias se tendrîa un 99% de probabilidades d e d e tec tar A cM FPI, asum iendo que las sondas se unan con suficiente afinidad al fragm ento d e cDNA. 85 Se utilizaron cuatro sondas consistentes en fragmentos d e 0,8-1,0 Kb correspondientes a la zona C-term inal d e MFPl d e Arabidopsis, tom ate, ta b a c o y mafz. Las sondas fueron preparadas m ediante PCR en presencia d e una proporciôn mfnima d e [a-32p]-dATP (Fig 21 a ). Se analizaron en una primera ronda 11 plaças con unas 6.000 colonias/placa (Fig 21 b). Para ello, se tiibridô el ADN bacteria no desnaturalizado y unido a filtros-réplica d e nylon, con las 4 sondas desnaturalizadas sim ultôneam ente a 50°C (Fig 21 c ). Las colonias con m ayor serial se aislaron en nuevas plaças (Fig 21 d ), extendiendo esta vez unas 600 colonias/placa y volviendo a fiibridar a 55°C en una segunda ronda. Plaça Maestra n'3 (kb) Sondas (PCR) m rid a q ô n de Plaça 3 con las 4 sondasM fîP f CkMiS 6h exp Figura 21. Roslreo de una genoteca de cDNA de ceboHa medkmte tubridacion de colonias con sondas MFPU prinera y segunda rondas de hbridacién. (a) Las cuatro sondas MFPl de tabaco, tomate, Arabidopsis y m ac utilizadas durante el rastreo de la genoteca separadas en un gel de agarosa. (b) Imagen de la plaça maestra n®3, contiene una extension de unas 6.CKX) colonias de la genoteca. En azul se indican las marcas de posicion relative entre la plaça maestra y el tiltro réplica de nylon sobre el que se realize la tiibridaciôn. (c) Imagen de une pelfcula expuesta sobre el tiltro réplica de la place maestra n®3 hibridada con las cuatro sondas simultôneamente. En rojo se muestron los clones seleccionados para une segunda ronde de tiibridociôn. (d) Place maestro con une extenaôn de -600 colonias del don n® 9 seleccionado durante la primera ronde. 86 Las colonias que d e nuevo presentaron serial intensa se hibridaron esta vez con c a d a una d e las sondas p)or separado en una tercera ronda (Fig 22), secuenciando sus insertos d e cDNA. Ninguna d e las secuencias estudiadas résulté ser AcA/IFPJ, aunque com partfan cierta similitud con fragmentos d e variadas protefnas vegetales. El anâlisis d e la predicciôn d e estructuras secundarias d e las secuencias traducidas clonadas no inclufa dominios coiled- coil. Sondas MFPl pa-dATP) Todas At Nt (aon) 1- 2 - 3- 4 5- 6 — 7- 8 - 9 - 10 - Figura 22. Roslreo de uno genoteca de cDNA de cebolla mettante hibridaciôn de colonias con sondas MFPl: tercera ronda de tiibridaaon. Hibridaciones en goto de las colonias seleccionadas tras la segunda ronda de tiibridaciôn (ver Fig. anterior) con las cuatro sondas simultâneamente y con coda una de ellas por separado. 87 3. EXPRESIÔN Y LOCAUZAClÔN TOPOLÔGICA DE LAS PROTEInAS DE 78 y 90 KDa EN DISnNTOS TEJIDOS Y SITUAClÔN RSIOLÔGICAS 3.1. Nucleos de células proOferanies asincronicas y sincronizadas durante el clclo celular 3.1.1. Inmuncfluorescencia y microscopia confocai La distribuciôn topolôgica de las proteinas detectadas por los sueros anti- LeMFPl (288) y anti-AtMFPl (91) se estudio mediante inmunofluorescencia (IF) en cplostados celulares y fracciones nucleares de células proliférantes del meristemo radicular de cebolla. Ambos sueros presentaron dificultodes para pénétrer en el nùcieo siguiendo los protocolos convencionoles de IF para este material, como se comprobô en incubaciones simultanées con otros sueros monoclonaies que occedian sin problema al interior del mismo. Por este motivo, las incubaciones se reolizaron moyoritariamente en nûcleos aislados, en movimiento constante y durante los mismos periodos de tiempo, lo que incremento considerablemente la efectividad de los marcados. • Nûcleos proliférantes no slncronlzodos La môxima intensidad del marcado nuclear con el suero 286 se detectô en subdominios nucleares o cuerpos de numéro y tomorio variable, con uno locolizaciôn en muchos casos polorizodo dentro del nùcieo (Rg 23 a. b). Los cuerpos se clasificaron segùn su tomorio, de menor (0: 0,8-1 ̂ m) o mayor didmetro (0: 1,5-2 )im). No se pudo estoblecer ningûn tipo de relaciôn entre el numéro de cuerpos y las caracterîsticas estructurales del nùcieo observodas al microscopic ôptico. 88 □ r O.S-1 um M 1.5-2 lUTî 288̂ « fNucleok) 0,1 -0.3 iim fîgura 23. Distribuciôn de los proteinas AcMFPI detectadas con el suero 288 en nûcleos CHsIados de céiirias proliférantes de raiz cte cebolla. (a) Imagen cofrespondiente o la proyecciôn de diez certes virtuales tornades mediante Micrescepia Cenfecal de fluerescencia. El inmunemarcade cen el suere 288 se acumula en cuerpos nucleares de tamafie variable (recuadres amarilles); en numerosos tocos fluorescentes distribuidos por el nùdeo que adoptan un patron punteado: y en el nudeolo. (b) Sucesiôn de certes virtuales tomados cada micra a lo largo del z del nùcieo anterior, mostrando la distribuciôn de estas estructuras a distintos niveles del nùcieo. (c y d) Detalles del nùcieo anterior mostrando la distribuciôn del marcado en el nucleolo (c) y los cuerpos y la alineaciôn de tocos en la envoltura nuclear (EN) (d). (e) Incubaciôn de fracciones nucleares con el suero preinmune control (288̂ )̂. (f) Tinciôn con DAPI de la preparaciôn anterior. Nüdeos media =7,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 > Numéro de cuerpos / nûdeo Figura 24. Recuento del numéro de cuerpos de AcMFPI en nucleos proliférantes de la ran de cebolla. Representociôn de las trecuencias de nûcleos (eje y) con distintos numéros de cuerpos de AcMFPI morcados con el suero 288 (eje x) de poblaciones de nûcleos proliférantes de raiz. La modo es 8, y la media de cuerpos por nûcleo marcado es 7,5. 89 Ademâs de los cuerpos, los nûcleos proliférantes mostroron un marcado general por el retfculo nuclear sobre el que se distingufan numerosos focos fluorescentes circulares de pequeno tamaflo (0 : 100-300nm) dando lugar a un patron punteado de distribuciôn, observable en secciones confocales {Rg 23 a, b, c). Algunos nûcleos presentaban marcado nucleolar mas intenso (Fig 23 c), y pequerios focos de marcado alineados a lo largo de la envoltura nuclear (Rg 23 d). La incubaciôn de los nûcleos con el correspondiente suero preinmune control, a la misma concentraciôn y en las mismas condiciones, no dio serial especifica de fluorescencia (Rg 23 e, f). El anâlisis cuantitativo de la distribuciôn del marcado de al menos 100 nûcleos de células proliférantes del meristemo radicular, revelô que el 91% de los nûcleos posefa cuerpos en nûmero variable, que oscilaba entre 1 y 18. Los nûcleos con 6-9 cuerpos fueron los môs frecuentes, siendo môs escasos los nûcleos con nûmeros de cuerpos comprendidos entre 2-5 y 10-18, y una media de 7,5 cuerpos por nûcleo meristemôtico proliférante marcado (Fig 24). En los nûcleos con menos de diez cuerpos observamos frecuentes combinaciones de cuerpos grandes y pequerios, mientras que en nûcleos con môs de 10 cuerpos éstos solfan ser todos pequerios. Por otro lado, el 77% de los nûcleos presentaba el patrôn punteado descrito; y un 19% adicional posefa el mismo patrôn, incluyendo marcado de mayor intensidad en el nucleolo. Un porcentaje mfnimo de nûcleos (4%) posefa los focos ordenados o alineados originando un patrôn reticulado de distribuciôn, con numerosas zonas sin marcado que le hace distinguible del patrôn punteado y que describiremos môs adelante. El mismo anôlisis con el suero 91 mostrô un patrôn de marcado punteado similar al detectado con el suero 288 (Fig 25 o, b, d), incluyendo la alineaciôn de focos en la envoltura nuclear (Rg 25 d). Con este suero se detectô una mayor proporciôn de nûcleos (49%) con serial adicional en el nucleolo (Fig 25 c). La 90 incubaciôn con el suero 91 preinmune control no mostro send en estos mismos nucleos incubondo en las mismas condiciones (Fig 25 e, f). La principal diferencia entre las distribuciones topologicas obtenidas con am bos sueros fue la ausencia d e cuerpos m arcados con el suero 91. Solo ocasionalm ente se detectaron tocos d e tam ario similar a los detectados con 288 (Fig 25 b), pero que no necesariam ente corresponden a los mismos subdominios nucleares. Estos resultados sugieren que los sitios d e acum ulaciôn d e la protefna d e 90 KDa sérian los cuerpos nucleares detectados exclusivam ente con el suero 288, sin excluir su distribuciôn por otras partes del nûcleo. Nludeolo 0,1-0,3 um Figura 25. Distribuciôn de las proteuKis AcMFPI detectados con et suero 91 en nucleos aislados de cétutas proliférantes de ran de cetralta. (a) Imogen correspondiente a la proyeccîôn de diez certes virtuoles tornade» mediante Microscopia Confocal de fluorescencia. El marcado con el suero 91 se detectô en numerosos pequenos focos fluorescente distnbuidos por el nûcleo adoptando un patron punteado: y en el nucleolo. No se observaron cuerpos de AcMFPl. (b) Sucesiôn de certes virtuoles tornados coda micro o lo largo del z nuclear, (c y d) Detolle de los certes onteriore mostrondo el marcado del nucleolo (c) y la olineocion de tocos en la envoltura nuclear (EN) (d). (e) Incubaciôn de fracciones nucleares con el suero preinmune control (91’̂ ). (!) Tinciôn con DAPI de la preporaciôn anterior. 91 Kesuiraaos • Expresiôn y distribuciôn a lo largo del cicio celulor Muchas protéines nucleares varia n sus niveles de expresiôn y su localizaciôn subnudear a lo largo de) ciclo celular. Estas variaciones estân relacionadas con su funcionalidad y responden a modificaciones especificas en la protefna. Para estudiar si las protefnas AcMFPl experimentaban este tipo de variaciones, analizamos los niveles de las mismas mediante inmunodetecciôn en membrane y sus petrones de distribuciôn nuclear mediante IF en distintos momentos del ciclo celular. Se utilizeron células proliférantes de! meristemo radicular sincronizadas mediante 14h de exposiciôn a 0,1 M hidroxiurea (HU), que las detiene temporalmente en el punto de chequeo del comienzo de la fase S, de tel forma que las células detenidas comienzan a replicar simultâneamente cuendo se retra la droga. El porcentaje de células proliférantes de! meristemo radicular de cebolla es elevado (70-75%), lo que permite sincronizar la mayor parte de la poblaciôn meristemâtica y analizaria en distintos momentos del ciclo celular. Se estudiaron cuatro puntos concrètes del ciclo celular. El Gl-tardfo/S- temprano, en el que los complejos pre-replicativos estân ya montados sobre los sitios de replicaciôn temprana sin que se produzca replicociôn, excepte la de una pequeria proporciôn de células que comienza a saltarse el bloquée del punto de chequeo. El S-temprano, que incluye la primera mitad de la fase S en la que replican los genes transcripcionalmente actives. El S-tardfo, correspondiente a la segunda mitad de la fase S, période en el que replica el ADN heterocromatfnico. Y el S-tardfo/G2, que incluye una gron proporciôn de nucleos en G2 que ya han finalizado su replicaciôn (Fig 26 a). Los contrôles de sincronizaciôn se realizaron mediante citometrîa de flujo y recuento de los distintos patrônes de distribuciôn de los sitios de replicaciôn (Fig 26 a), ya que éstos son caracteristicos para cada subperîodo de la fase S (véase el Apartado 4.2.1. de Resultados). 92 ^ HU 14h ^ Agua G1 S-temprano S-tardio G2 M 17% (1,110 33(288) 74% (III) 63% (IV,V) 9%(IV,V) Nucleos (288) Nucleos (91) -1 +2 +5 90 KDa # 78 KDa ^ Membrsnas teiSdas com rojo Ponceau antes de la incubaciôn Hi Figura 26. Niveles de los profeinas AcMFPl detectados con l<» sueros 288 y 91 a lo largo del ciclo celutar de células meristemdticas de ta ran de cebolla. (a) Esquema de la sincronizaciôn celular con hidrojdurea (HU) y de los momentos estudiados del ciclo celular. Se conadero hora cero (Oh) el memento de retirada del tratamiento con HU. Se analizaron el Gl-tardio / S-temprano: -Ih , en pvesencia de HU; S^temprano: +2h; S-tardio: +5h: S- tardio / G2: +7h. Las imagenes de citometria de flujo del contenido de ADN muestran la evolucion de la ola de células sincronizadas tehidas con loduro de Propwdio. Los contenidos de ADN en G1 y G2 corresponden a 2C y 4C, respectivamente. Como control de la sincronizaciôn se retlejan los porcentajes de nucleos que replican en cada memento detectados por la incorporacion de BrdU. Se indican entre paréntesis los patrones de distribuciôn mayoritarios para los sitios de rep>licaciôn, caracteristicos de coda periodo de la fase S (ver Rg. 39). (b) Inmunodetecciôn en membrane de las protéines con los sueros 288 y 91 en las fracciones S3 y nuclear correspondientes a cuatro poblaciones celulares sincronizadas en los tiempos -1 h, +2h, +5h y +7h, sin detectarse variaciones significatives en las canfidades de proteina a lo largo del ciclo. La histona H1 tehida con rojo Ponceau se muestra como control de cargo. Con une flécha roja se indice la banda de 90 KDa hiper-fostorilada y ligeramente retardada de las poblaciones sincronizadas en los tiempos +2h, +5h y+7h. El anâlisis m ediante inm unodetecciôn en m em branes demostrô que las intensidades d e las bandas AcMFPl detectadas con los sueros 288 y 91 en las fracciones nucleares sincronizadas, no experim entaban variaciones importantes entre los cuatro puntos del ciclo celular (Fig 26 b). Tam poco se detectaron bandas en las correspondientes fracciones cifoplasmàticas (datos no mostrados). 93 Para comprobar si la proteina de 90 KDa era fosforilada en determinadas fases del ciclo celulcB' se investigô su presencia en los sobrenodantes S3, donde se recoge la proteina tîiper-fosforilada, procedentes de la extracciôn de muestras sincronizadas en los cuatro momentos de! ciclo celular. Mediante inmunodetecciôn en membrana con el suero 288 se detectô que la intensidad de la banda de 90 KDa liiper-fosforilada aumentaba progresivamente a lo largo del periodo S con una môxkna intensidad en el S- tardio y G2 {Rg 26 b). Este resultodo se confirmô al observer el ligero retardo de la forma hiper-fosforilada de la proteina en las fracciones nucleares en los mismos momentos del ciclo (Rg 26 b). Aunque no se detectaron variaciones importantes en las cantidades de coda proteina durante la fase S, se analizô su distribuciôn nudear mediante IF para detectar los posibles movimientos de las mismas entre subcompartimentos nucleares, indicatives de su pape! fisiolôgico. Nuestros resultados demostraron que el numéro de cuerpos nucleares marcados con el suero 288 no experimentaba variaciones significatives a lo largo del ciclo celular en relaciôn a los de nucleos no sincronizados (Fg 27 b, c). Aparentemente, no se observaron diferencias significativas en la distribuciôn intranuclear de las protéines desde GI/S-temprano tiosta el final del S, donde todos los nucleos mostraban un patrôn punteado. Solamente en el periodo S- tardio/G2 (+7ti) se observô un patrôn reticulado en el nucleoplasma en el 13% de los nucleos (Fig 27 a, c), indicando una posible redistribuciôn de la proteina antes de la entrada en mitosis. 94 % : ' . ' Nucleos (+7h) 288 ' %"- ■ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 > Nwnero cuerpos / nudeo C Nucleos sncronizados de Æ c^saaio largo de la fase S (288) Patrones de Distribuciôn (%) PunAeado Punteado + tihicteolo Reticulado Reticulado + Nucleolo Nùdeoscon cuerpos (%) Media de cuerpos G1 / S Temp (-1h) 83 17 0 0 88 7,9= S-T emprano (+2h) 81 19 0 0 94 7,8= S-Tardio (+5h) 84 16 0 0 96 6,6= S-Tardio/G 2(+7ti) 81 6 6 7 84 8,3= PotWadôn celular no sincronizada 77 19 2 2 91 7,5= Rgura 27. Disfribuciôn nuclear de las profemas AcMFPl detectadas con el suero 288 a lo largo del ciclo celular. (a) Nucleos pertenecienfes a una poblaciôn celular sincronizada en S-tardio/G2 incubados con el suero 288. 0 marcado se détecta en cuerpos nucleares (lleclias), en el nucleolo (No) y en numerosos tocos brillantes que forman un patrôn reficufado de distribuciôn. (b) Representaciôn de las trecuencias de nucleos (y) con distintos numéros de cuerpos marcados fx) de poblaciones celulares ancronizadas en las tases Gl-tardio/S-tenrgrano, S-temp»rano. S-tardio y S-tardio/G2. También se muestran los recuentc» obtenidos de la poblaciôn celular no sincronizada. (c) Tabla de trecuencias de los patrones de distribuciôn a lo largo del ciclo celular. Las médias de cuerpos por nûcleo m arcado sincronizado y no-a'ncronizado no mostraron diferencias significativas (p<0,05), como indica la presencia de una misma letra en el superindice. El patrôn reticulado estaba constituido por focos d e tam ano similar a los del m odelo punteado, pero la m ayorîa se observa ban alineados sobre el retfculo del nucleoplasm a, aparecien do extensas zonas sin m arcado (Fig 28 a, b, c, d ). Sin em bargo, los focos asociados a la envoltura nuclear o el nucleolo no presentaron variaciones (Fig 28 c ). Las diferencias entre am bos modelos punteado y reticulado se aprecian con môs facilidad en los cortes virtuoles tom ados m ediante microscopfa confocal, que en sus proyecciones (com parense las Figs 23 a y 28 a, con 23 b y 28 b). 95 g - J K Figura 28. Patron reffculacfo de distittxiciôn de las protenas AcMFPl detectado con el suero 288. (a) Imogen correspondiente a la proyecciôn de diez cortes virtuoles tomados mediante microscopia confocal de fluorescencia. 0 inmunomarcado se acumula en numerosos tocos fluorescentes distribuidos por el nûcleo que adoptan un patron reficukjdo discontinuo y en cuerpos nucleares de tamano variable. También se observa un marcado mas débil en el nucleolo. Barra: 8pm. (b) Sucesiôn de cortes virtuoles tomados coda micro a lo largo del eje z del nûcleo anterior, (c, d y e) Detalles del nûcleo anterior a mayor aumento mostrondo la distribuciôn del marcado en el nucleolo (c), las alineaciones de focos del patrôn reticulado (tlectias) (d) y de un cuerpo nuclear (e). • Disfribuciôn de las profemas en la mafriz nuclear de células proliferanfes La distribuciôn d e las protefnas detectad as con los sueros 288 y 91 en las matrices nucleares (MN) y en las fracciones intermedias obtenidas durante su preparaciôn (FI y F2), se analizô en paralelo m ediante inm unodetecciôn en m em brana, IF y microscopfa confocal. La extracciôn total d e la banda inferior del doblete d e 78 KDa con Triton X- 100 no supuso ningûn com bio visible en la distribuciôn del m arcado con el suero 288 entre nucleos y fracciones FI (im agen no m ostrada). 96 A su vez, la extracciôn parcial de la banda superior del doblete, detectado con ambos sueros, correlaciona con un importante descenso del marcado punteado y la detecciôn de un patrôn difuso en las fracciones F2, llegando a desaparecer simultâneamente la banda y el marcado punteado en la matriz nuclear (Rg 29 a, b). La proteina AcMFPl detectado con el suero 288 en la matriz nuclear corresponde a los estados hipo-fosforilados de la proteina de 90 KDa, que se distribuyen en cuerpos nucleares brillantes y de forma difusa por el reticulo de la MN (Figs 29 c, d, e). La extracciôn con NaCI de los formas tiiper-fosforitodas no produce una reducciôn en el tamano o en el numéro de los cuerpos brillantes de la MN, sino que produce una pérdida total de marcado en el 21% de las MNs, correspondiente a la diferencia entre el 30% de MNs sin cuerpos (marcados y el 9% de los nucleos (Fig 29 f), que es estadisticamente significativa (p>0,05). En conjunto, todos estos resultados demuestran por las formas hipo- fosforiladas de la proteina de 90 KDa se distribuyen por el reticulo de la MN y se acumulon en cuerpos nucleares anclados a la misma, superponiéndose en los nucleos el marcado de la proteina de 78 KDa distribuida en focos brillantes, en el nucleolo y también de forma dispersa por el reticulo del nucleoplasma. 97 Nûcleo N F1 F2 MN S1 S2 S3 Nûcleo N F1 F2 MN 81 82 83 o « Ë z Nucleos media = 7,5 6 8 10 12 14 16 18 > Matriz Nuclear media = 8,2 30% MNs sin m arcado 2 4 6 8 10 12 14 16 18> Numéro de cuerpos / nûcleo ô MN Figura 29. Distribuciôn de las profeinas AcMFPl en las fracciones N, F2 y MN de células merisfemoticas de la raiz. (a y b) Solubilidad de las bondes de tectadas con los sueros 288 (a) y 91 (b) durante el proceso de extracciôn de MNs m ediante inm unodetecciôn en m em brana, y distribuciôn de las mismas en las fracciones insolubles correspondientes de tec tadas m ediante IF con los mismos sueros. La proteina de 90 KDa se encuentra enriquecida en las MNs, mientras que la d e 78 KDa es indé tec tab le en esta fracciôn. El inserto en (b) muestra la im agen de contraste interterencial de la MN correspondiente. (c) Proyecciôn de diez cortes virtuoles tom ados m ediante m icroscopia con foca l de fluorescencia, de un grupo de matrices nucleares aislados (MN) incubados con el suero 288, m ostrondo la im agen del m arcado en la fracciôn. (d) Imagenes correspondientes a dos cortes centrales de las mismas MNs. (e) Im agen de las mismas tom ada m ediante contraste interterencial. (ff) C om paraciôn de las trecuencias de cuerpos m arcados en nucleos y MNs. Nôtese que el 30% de las MNs no muestra m arcado con el suero 288. 3.1.2. Inmunomarcado con oro y microscopia electronica El anâlisis mediante inmunomarcado para microscopia electronica de transmisiôn (ME), demostrô que el marcado con el suero 288 se distribuia en très subdominios nucleares correspondientes a los patrones observados mediante IF. Cuerpos nucleares con alto densidad de marcado, localizados en las regiones intercromatfnicas y correspondientes a los cuerpos brillantes fluorescentes. Estructuras laxos de tamano variable asociadas a la periferia de las masas de cromatina condensada, con una densidad de marcado menor que podrîan corresponder a los focos del patron punteado de IF, y un marcado disperso por el nucleolo y el nucleoplasma, principalmente en las regiones intercromatfnicas (Fig 3 0 a, c, d). Los cuerpos de AcMFPl tienen una organizacion estructural distinta a la de los principales cuerpos o estructuras nucleares descritas en plantas: cuerpos de Cojol, cuerpos fibrilares y estructuras centroméricas, donde no se detectô marcado significotivo con los sueros anti-MFPl (Fig 30 g). Los cuerpos AcMFPl son densos, de tamario variable y en la mayorîa de los casos menor ai de todas ellas. Su numéro varia enormemente en funciôn del tipo celular, y en ningûn caso coincide con el de los cuerpos de Cojal ni con el de las estructuras centroméricas. Présenta n sin embargo similitud estructural con los cuerpos densos donde se acumulon protefnas fosforiladas (Samoniego, 1999). Los cuerpos densos aporecen marcados en matrices nucleares aislados, donde también se detectaron particules de oro distribuidos por el reticulo de la matriz (Fig 30 h). Estos resultados concuerdon con el marcado observodo en cortes sin résina, donde el suero détecta la proteina en los agregados densos y los filamentos del nucleoesqueleto (Samoniego et al, 2001 : Samoniego, 1999). El suero 288 también detectô marcado en el citoplosmo, en unos estructuras redondeadas localizados en la parte externa de la membrana nuclear y a menudo conectadas con ello (Fig 30 f). 99 Nucleolo Masas de . ^ heterocnomatina 500 nm 288 288 288 288 EN I Matriz nuclear (288)Cuerpo \ de Cajal, Figura 30. Disfribuciôn subnudear de los profemas AcMFPl en célirias meristemâficas de la rem (moRzada medkmfe mmunomicroscopia de alfa resoluciôn. a-g: En el nûcleo las protefnas reconocidas por el suero 288 localizan en cuerpos nucleares densos de tamano variable (a, d, e) con una alta densidad de partfculas de oro (tlectias rojas), y en la region intercromatfnica y el nucleolo con un marcado dispeiso (a). B suero 91 no marca los cuerpos densos, pero sf unas estructuras nucleares laxas (tlectias) localizadas en la periferia de la cromatina (b), que también se marcan con el suero 288 (c). (f) Estructuras cifoplasmàticas marcadas con 288 (tlectia blanca) localizadas trecuentemente en la parte extema de la envoltura nuclear (EN), (g) Los cuerpos de Cajal y centromeres no presentan un marcado significativo con el suero 288, bc. En la matriz nuclear el marcado con el suero 288 se distribuye por el reticulo de la matriz interna, con acumulaciones en zonas que podrîan corresponder a los cuerpos nucleares de AcMFPl (tlectia roja). Barras: 500 nm. 100 En concordancia con los resultados d e IF, se observô m arcado con el suero 91 en estructuras laxas asociadas a las masas d e tieterocrom atina, pero no en los cuerpos nucleares densos, y tam bién d e forma difusa por el nûcleo y el nucleolo (Fig 30 b). 3.2. Distribuciôn de las protefnas en células meristemâticas durmientes Se estudiô la presencia d e las protefnas AcMFPl en células meristemâticas quiescentes (GO) d e rafz m ediante inm unodetecciôn en m em bra nas e IF. Estas células se encuentra n entre el primer y segundo milfmetro del a pice d e las rafces no brotadas d e bulbos d e cebolla. M ediante citom etrîa d e flujo se demostrô que las células tiabfan abando nado el ultimo ciclo celular proliférante durante las fases G1 ô G2, ya que posefan contenidos d e ADN 2C (GO) y 4C (G0,2). El porcentaje d e células con contenidos d e ADN intermedios apenas llegaba al 3% (Fig 31 a ), com parado con el 30% que presentaba estos contenidos en las células proliférantes (Fig 33). G1 G2 E GO,2 b (KDa) Células meristemâticas DURMIEiyrTES 288 91 250 100- 75- Contenido de ADN N MN N S2 Figura 31. Identificaciôn de les proteinos AcMFPl con los sueros 288 y 91 en fracciones de células durmientes del blastema radicular del bulbo de ceboUa. (a) Valoracion del contenido de ADN mediante citometria de flujo en nucleos aislados de células dumnientes de blastemas radiculares del bulbo. Se distfriguen dos poblaciones celulares durmientes, una mayoritaria con contenido 2C de ADN (GO), y otra con contenido 4C (G0,2), sin células en replicaciôn con contenidos intermedios de ADN. (b) Inmunodetecciôn en membrana de las protefnas AcMFPl en células durmientes, con el suero 288 en fracciones de nucleos y MNs aislados, y con el suero 91 en fracciones nucleares y el sobrenadante S2. 101 Se demostrô m ediante inm unodetecciôn en m em brane con el suero 288 que tanto el doblete d e 78 KDa, com o la banda d e 90 KDa estaban présentes en las fracciones d e nucleos durmientes. Esta ultima banda tam bién aparecfa en la fracciôn d e MN (Fig 31 b). Con el suero 91, se d e tec tô la banda correspondiente d e 78 KDa en la fracciôn d e nucleos durmientes y en el sobrenadante S2, asf com o su forma polim erizada de 160 KDa (Fig 31b) . 8 10 12 14 16 18> Proliférantes 8 10 12 14 16 18 > Numéro de cuerpos/ nudeo C Nucleos de células quiescentes o durmientes de A cepa (288 y 91) Patrones de Distribuciôn (%) Punteado Punteado + Nucleolo Reticulado Reticulado + Nucleolo Nucleos con cuerpos (%) Media de cuerpos Proliférantes (meristemo) 77 19 2 2 91 7,5- 51 49 0 0 0 0 Durmientes (meristemo) 56 44 0 0 81 4,9" 47 53 0 0 0 0 Figura 32. Disfribuciôn de los profeinas AcMFPl en células durmientes de cebolla. (a) Nucleos durmientes incubados con los sueros 288 y 91 respectivamente. El marcado con 288 se acumula en los cuerpos nucleares, distribuyéndose también por el nucleolo (No) y en numerosos y pequenos focos fluorescentes que adoptan un patrôn punteado de distribuciôn. El marcado del suero 91 también sigue el patrôn punteado y se acumula en el nucleolo, pero no en cuerpos. Se muestran las correspondiente imôgenes de contraste interterencial. (b) Representaciôn de las trecuencias de cuerpos marcados con MFPl en células meristemâticas proliférantes o durmientes. (c) Tabla comparatrva resumen de las trecuencias de los patrones de marcado con los sueros 288 y 91 en nucleos meristemôticos proliférantes o durmientes. Las médias reflejan el numéro de cuerpos por nûcleo marcado con 288, los superindices a y b muestran diferencias significativas entre ambos tipos celulares (p<0,05). Los resultados d e IF con el suero 288 demostraron que las protefnas AcMFPl tienen en nucleos durmientes un patrôn d e distribuciôn punteado sem ejante al descrito en nucleos proliférantes, con algunas diferencias cuantitativas com o un 102 m enor numéro d e puntos fluorescentes y una m ayor proporciôn d e nucleos con m arcado nucleolar adicional, el 44% en células durmientes trente al 21% d e las proliférantes (Fig 32 a, c ). La principal diferencia se d e tec tô en los cuerpos nucleares: el 25% d e los nucleos durmientes carecfa d e cuerpos m arcados, trente al 9% d e nucleos proliférantes. Adem âs, la m edia d e cuerpos por nûcleo durm iente m arcado era significativa m ente m enor que d e la d e nûcleos proliférantes, 4,9 y 7,5, respectivam ente (Fig 32 b, c ). Con el suero 91 no se detectaron diferencias d e m arcado importantes ni cualitativas ni cuantitativas respecte a las células proliférantes, a excepciôn d e un m enor nûmero d e focos fluorescentes (Fig 32 a, c ). Com o en nûcleos proliférantes, se d e tec tô un m arcado ocasional en focos d e m ayor tam ario . X 4C (Contenido de ADN) 10-12 mm ! jk I 4-6 mm 1-2 mm lA Maduraciôn Bongacion RDNferaciôn Figura 33. Contenidos de ADN de las poblaciones celulares de cfistintas zonas de la raiz de cebolla. Los contenidos de ADN se calcularon mediante citometria de flujo en poblaciones celulares cuyos nûcleos se tiabian teriido previamente con ioduro de propidio. En la zona meristemâtica, localizada entre el primer y segundo mifimetro apical, se detectczon tiasta un 30% de células en refriicaciôn con contenidos de ADN intermedios entre 2C y 4C. En la zona de elongacion, entre los milimetros cuarto y sexto, las células muestran contenidos de ADN 2C 6 4C, pero no valores intermedios, indicando que no estân en proliferaciôn. Los valores mayores de 4C corresponden a células cuyo genoma esta endoreplicando. En la zona de maduraciôn entre los milimetros 10 y 12 desde el ôpice radicular las células muestran contenidos 2C, 4C y superiores, observôndose valores intermedios indicativos de endoreplicaciôn. Se muestra una totogratia de très raices alineadas sobre una superficie mifimetrada utilizada en la escisiôn de las zonas recuadradas. 103 3.3. Expresiôn y distribuciôn de las proteCnos AcMFPl en células diferenciadas de raiz Se estudiaron mediante inmunodetecciôn en membrana e IF los niveles y la distribuciôn de las protefnas AcMFPl en fracciones nucleares de distintos tipos celulares de! eje radicular. En el bulbo de cebolla, la zona meristemâtica se situa entre el primer y segundo mü&netro de! extremo apical de la rafz. La zona de elongaciôn del segundo al sexto milfmetro, donde las células no se dividen y comienzan a crecer longitudinclmente y a diferenciarse. La zona de maduraciôn se extiende a partir del sexto m #netro, en elka las células dejan de elongarse alcanzando la madurez funcional (Beemster efoL 2003). Mediante citometrîa de flujo se comprobô que el perfil de ADN en el paquete meristemâtico era el correspondiente a proliferaciôn, con un ~30% de las células con contenidos de ADN intermedios entre 2C y 4C, indicando que estaban en replicaciôn activa en el periodo S. Las células de la zona de elongaciôn entre el cuarto y sexto milfmetro mostraban exclusivamente valores 2C ô 4C de ADN, indicando que no tiabfa sfntesis de ADN ni proliferaciôn celular. Entre los milimetros diez y doce de la zona de maduraciôn existe una alta proporciôn de nûcleos con un contenido de ADN mayor de 4C, indicando la apariciôn de procesos de endoreplicaciôn asociado a la diferenciaciôn de aigu nos tejidos de plantas (Fig 33). Para valorar los niveles de las protefnas AcMFPl en las très zonas descritas de la rafz, se comparé la intensidad de las bandas de 78 y 90 KDa detectadas en las correspondientes fracciones nucleares identificadas con ambos sueros. Con el suero 288 se observô que sus niveles decrecfan gradualmente desde la zona meristemâtica hacia las zonas de diferenciaciôn (Fig 34), mientras que la intensidad de la banda control correspondiente a la tiistona H1 teriida con rojo 104 Ponceau apenas variaba a lo largo del eje radicular, aumentando ligeramente en la zona de maduraciôn debido a la mayor proporciôn de nûcleos con contenidos de ADN >4C (Fig 34). M KDa 78 KDa 78 KDa 63 KDa riiiaiir 1-2 2-4 4-6 6-8 10-12 1-2 2-4 4 6 6-8 10-12 Segmentos de rak (mm) 78 KDa 63 KDa 1 ^ 2 -4 4 6 6 6 10-12 1 ^ 2-4 4 6 6 6 10-12 Segmenlos de raiz (mn| Figura 34. Niveles de los prafeeras AcMFPl en dUtintas zonas de la ior de cebda. Se estudiaron les niveles de las profemas en fracciones nucleares obtenidas de disfinfas zonas de la rac de cebolla. concrefamenfe las comprendidas entre los m&nefros 1-2, 2-4, 4-6, 6-8 y 10-12. Los niveles se vakxaron mediante la cuantiMcacion de las bandas detectadas con los sueros 288 y 91. Los niveles de las profeinas de 90 KDa y 78 KDa detectados con el suero 288 fueron mcodmos en la zona meristemâtica, decredendo al cdejaise del âpice de la rac. 0 suero 91 detectaba una banda abundante de 78 KDa en la zona meristemâtica. que no aparece en las zonas de elongaciôn y maduraciôn de la raÉ. Simultâneamente con la desaparidôn de esta banda se observô la apariciôn de un intense doblete de 63 KDa en estas zonas. Como control de cargo se vakxaron los niveles de la histona H1 tehida con rojo Ponceau en las mismas merrtranas. Las repr^entaciones enfrentan los niveles de las protefnas, vdoradas por su Densidad Ôptica x Ârea (y), con las zonas de la roc (x) comprendidas entre los mümetros 1-2. 4-6 y 10-12, correspondientes a las zonas meristemâtica, de elongaciôn y madixadon. El comporlamiento de las bandas reconocidas por el suero 91 fue disfinto de! caso anterior. La gran intensidad de la banda de 78 KDa en la zona meristemâtica, decrecia bruscamente en la zona de elongaciôn hasta prâcticamente desaparecer en la de maduraciôn. Sorprendentemente, el suero 91 detectaba un doblete de aproximadamente 63 KDa de gran intensidad a partir del cuarto milfmetro de la rafe, que aum entaba progresivamente coincidiendo con la bajada de la protefna de 78 KDa (Fig 34). 105 En paralelo al estudio d e los niveles de las protefnas se analizô su distribuciôn nuclear m ediante IF a lo largo del eje radicular, utilizando fracciones d e nûcleos aislados correspondientes a las zonas meristemâticas (milfmetros 1-2), elongaciôn (4-6) y m aduraciôn (10-12). (1-2 mm) 0 2 4 G 8 10 12 14 16 18 > (4-6 mm) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 > 45, 2f (10-12 mm) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 > Numéro de cuerpos / nûcleo b m 288 Nûcleos (10-12 mm) h is m % » C Distribuciôn nuclear en distintas zonas de la rafz de A. cepa (288 y 91) Pafrones de Distribuciôn (%) Punteado Punteado + Nucleolo Reticulado Reticulado + Nucleolo Nùdeoscon cuerpos (%) Media de Cuerpos Meristemâtica (1-2 mm) 77 19 2 2 91 7,5= Elongaciôn (4-6 mm) 63 0 37 0 33 3‘> Maduraciôn (10-12 ) 12 25 25 38 50 2,8b Meristemâtica (1-2 mm) 51 49 0 0 0 0 Elongaciôn (4-6 mm) 0 0 Maduraciôn (10-12 ) 0 0 Figura 35. Disfribuciôn nucieor de las protefnas detectadas con ios sueros 288 y 91 en las distintas zonas de la raiz de cebolla. (a) Representaciôn de les frecuencios de nûcleos (y) con distinto nûmero de cuerpos marcados (x) en las zonas meristemâtica, de elongaciôn y maduraciôn de la raiz de cebolla, situadas respectivamente entre los milimetros 1-2, 4-6 y 10-12. (b) Nûcleos de la zona de maduraciôn incubados con el suero 288 que muestran los patrones de distribuciôn punteado (izquierda) y reticulado (derecha), junto al marcado nucleolar (No) y los cuerpos nucleares (fléchas), (c) Tabla comparativa de las trecuencias de los patrones de marcado detectados con los sueros 288 y 91 en las distintas zonas radiculares. Las médias reflejan el nûmero de cuerpos por nûcleo m arcado con 288, detectôndose diferencias significativas (p<0,05) entre la media de los nûcleos meristemôticos y las del reste de las zonas, indicado mediante letras diferentes en el superindice. El suero 91 no reconoce los cuerpos ni présenta los patrones punteado ni reticulado en las zonas de elongaciôn y maduraciôn, véase la siguiente Figura. El patrôn d e distribuciôn d e las protefnas detectadas con el suero 288 fue distinto en las très zonas estudiadas d e la rafz. Se d etectô un im portante y significativo descenso del numéro d e cuerpos nucleares enriquecidos en la 106 proteina de 90 KDo desde la zona meristemâtica (media de 7,5) a las zonas de células diferenciadas de la raiz (2,9), donde una alta proporciôn de los nûcleos (50-65%) carecfa de cuerpos marcados (Fig 35 a, c). Este descenso coincidfa con la graduai pérdida de intensidad de la banda de 90 KDa detectada con el suero 288 mediante inmunodetecciôn en membrana (Fig 34). Los nûcleos de la zona meristemâtica mostraron un patrôn punteado en el 77% de los casos, un 19% presentaba un patrôn punteado con marcado nucleolar, y solamente una baja proporciôn presentaba el patrôn reticulado (2%), y otro 2% reticulado con marcado nucleolar adicional (Fig 35 c). En la zona de elongaciôn, el 63% de los nûcleos mostraba un patrôn punteado, y el 37% restante lo mostraba reticulado. No se detectô marcado nucleolar en ningûn caso en esta zona de la rafz (Fig 35 c). En la zona de maduraciôn los valores se invertfan, el 37% de los nûcleos mostraba patrôn punteado, mientras que el 63% restante presentaba el patrôn reticulado. El 70% de los nûcleos de la zona de maduraciôn mostraba un intenso marcado nucleolar, proporciôn bastante mayor que el 21% detectado en los nûcleos proliférantes del meristemo (Fig 35 b, c). También varié la distribuciôn de las protefnas detectada con el suero 91 en las zonas de elongaciôn y maduraciôn. Se detectô un patrôn de marcado distinto de los patrones punteado y reticulado descritos liasta el momento (Figs 23, 28, 36 b), y constituido por agrupaciones de focos brillantes distribuidos por las regiones intercromatfnicas y el nucleolo (Fig 36 a), como demuestra la tinciôn simultânea con DAPI (Fig 36 c), mientras que los puntos del marcado reticulado detectados en los mismos nûcleos con el suero 288 estân mâs extendidos y solapan con la tinciôn con DAPI en la parte exterior de las masas de cromatina (Fig 36 d). 107 e ri,. %. Figura 36. Distribuciôn nucieor de las protefnas detectadas con los sueros 288 y 91 en las zonas de elongaciôn y maduraciôn de la rafz de cebolla. (a) Cortes virtuoles consécutives tomados mediante microscopia confocal, correspondientes a un nûcleo de la zona de maduraciôn radicular incubado con el suero 91 y tehido con DAPI. El marcado esta constituido por pequenos focos disperses por el interior del nûcleo y el nucleolo (ampliado), pero no corresponde exactamente a los denominados patrones punteado ni reticulado del suero 288. (b) Serie de cortes virtuoles anôlogos correspondientes a nûcleos de la misma zona incubados con el suero 288. En este caso los focos de marcado se distribuyen con un patrôn reticulado, y el marcado del nucleolo parece môs dituso (ampliado). (c y d) Superposiciôn de los cortes centrales de los nûcleos anteriores con DAPI y los correspondientes sueros. El marcado del suero 91 se acumula preferentemente en las zonas nucleares no teriidas con DAPI (regiones intercromatfnicas) (c), mientras que el marcado del suero 288 ademâs de ocupar estas regiones se superpone al DAPI en la periferia de las mismas (d). Barras: 8pm. 108 3.4. Expresiôn y distribuciôn de los proteinos AcMFPl en tiojos Se analizaron los niveles de las protefnas y su distribuciôn en nûcleos de hojos crecidos en un ciclo solar de luz / oscuridad o solo oscuridad. El suero 288 detectô las bandas de 78 y 90 KDa en las fracciones de nûcleos aislados de las hojas crecidas en am bas condiciones lumfnicas, y la banda de 90 KDa en las correspondientes fracciones de MN (Fig 37). (KDa) 100 288 91 288 91 - - - — - N MN N S2 N MN N S2 Luz / OaciHidad Oscuridad Figura 37. Detecclon de las protenas AcMFPl en hotjos de ceboHo con los sueros 288 y 91. En la fotografid se encuodro la zona foliar utiBzada para preparar las distintas fracciones subnucleares. en plantas crecidas en régimen de luz / oscuridad, el suero 288 détecta las bandas de 78 y 90 KDa en la fracciôn nuclear, y solo la de 90 KDa en la MN. En solo oscuridad la banda de 90 KDa es mucho menos intensa. El suero 91 détecta las bandas de 78 y 160 KDa en las fracciones nuclear y del sobrenadante 52 de plantas crecidas en presencia de luz / oscuridad, y en solo oscuridad con menor intensidad en el sobrenadante 52. El suero 91 detectô la banda de 78 KDa y su forma polimérica de -160 KDa en las fracciones de nûcleos aislados y en el sobrenadante S2 de hojas (Fig 37), independientemente de si las cebollas se habfan cultivado en presencia o ausencia de luz, aunque la cantidad de protefna en hojas crecidas en oscuridad era menor. La protefna de 78 KDa detectada mediante IF por ambos sueros 288 y 91 se distribufo con un patrôn reticulado en môs del 60% de los nûcleos de hojas, mostrando un marcado punteado en el resto (Fig 38 b, c). En todos los casos se observô marcado nucleolar, de mayor intensidad con el suero 91 (Fig 38 b, c). 109 288 ^ Nucleos de hoja / Il 17 / o c f - i Ir ir i a H 1 % b 25, 15 wo au‘3 Z 60. 5? 20 10 0 Hoja Luz / Oscuridad 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18> Hoja Oscuridad Ü 2 4 e ~ 8 10 i 5*T4 16 18> Numéro de cuerpos / Nudeo C Nûcleos de hojas de A. cepa (288 y 91 ) Patrones de Distribuciôn (%) Punteado Punteado + Nudeolo Reticulado Reticulado + Mjcieolo Nùdeoscon cuerpos (%) Media de cuerpos Luz / Oscruridad 0 38 0 62 91 6,1= Oscuridad 0 29 0 71 41 6 ,3 b Luz / Oscruridad 0 34 0 65 0 0 Oscuridad 0 37 0 63 0 0 d Cloroplastos 91 Autôflüorescencià DAPI Figura 38. Distribuciôn subceiuior de ios proteinos AcMFPl en tiojo de ceboiia. (o) Nûcleos de hojas crecidas en presencia de luz incubados con el suero 288. El marcado mâs intenso con el suero 288 se acumula en los cuerpos nucleares (fléchas), ligeramente en los nucleolos y en numerosos focos de pequeho tamano que adoptan el patron reticulado de distribuciôn. Con el suero 91 se observa el patrôn reticulado y un marcado nucleolar muy intenso. (b) Representaciôn de las trecuencias de cuerpos nucleares marcados (x) por nûcleo (y) en células de hoja de cebolla crecidas en un ciclo solar de luz / oscuridad y en sôlo oscuridad. (c) Tabla de distribuciôn de los patrones de marcado nuclear detectados con 288 y 91 en hojas crecidas en un ciclo solar de luz / oscuridad y en sôlo oscuridad. Las médias reflejan el nûmero de cuerpos por nûcleo m arcado, habiéndose detectado diferencias significativas entre las proporciones celulares crecidas en luz/oscuridad y sôlo oscuridad (p<0,05), como muestran los distintos superîndices. (d) Cloroplastos autofluorescentes (rojo) de un aplastado celular de hoja de cebolla incubado con el suero 91 (verde), cuyos nucleoides aporecen tenidos con DAPI (azul). La superposiciôn de los canales verde y azul muestra que no existe co-locolizociôn preferente en los nucleoides, aunque ambos marcados se superponen por el resto del cloroplosto. 110 La ausencia de luz produjo un drâstico descenso en el numéro de nûcleos con cuerpos enriquecidos en la protefna de 90 KDa y marcados con el suero 288, aunque no variaba la media de cuerpos por nûcleo marcado (Fig 38 a, c). La ausencia de luz sin embargo no afectaba a las trecuencias de los patrones de distribuciôn detectados con ambos sueros, donde el marcado reficulado- nucleolar era siempre moyoritario (Fig 38 c). MFPl se localize en los cloroplastos de Arabidopsis, por lo que se investigô su distribuciôn en los cloroplastos de cebolla, utilizando preparaciones de oplostados celulares de Fiojos crecidas en presencia de luz. El suero 91 detectô AcMFPl mediante IF en la gran mayorfa de los cloroplastos (>95%), mostrando un marcado punteado y disperso por el retfculo de los mismos (Fig 38 d). En estas muestras la mayorîa de los nûcleos no aparecfan marcados, ya que los sueros anti-MFPl no penetran fâcilmente en su interior. 111 4. RELACIÔN DE AcMFPl CON OTROS DOMINIOS NUCLEARES Se investigô la distribuciôn de las protefnas de 78 y 90 KDa en distintos subdominios tuncionales del nûcleo, analizando su co-localizaciôn con protefnas marcadoras de los mismos para tratar de establecer la relaciôn funcional entre AcMFPl y dichos subdominios, asf como su posible implicaciôn en la funciôn o funciones que en elles se desarrollan. Del mismo modo, si se demuestra la exclusion de las protefnas AcMFPl de un determinado subdominio nuclear, se podrîo descartor que tuviero una funciôn relacionada con la actividad nuclear que en él se desarrolla. En concrete, se estudiô la relaciôn de AcMFPl con los dominios de splicing co-transcripcional y los sitios de maduraciôn de los snRNAs, asf como con los focos de replicaciôn de ADN. 4.1. Dominios de splicing co-transcripcionai y maduraciôn de ios snRNAs Se utilizaron los onticuerpos 4G3, especffico contra la protefna U2B” del espliceosoma, e Y12, que reconoce las protefnas Sm de las snRNPs, como marcadores especfficos de los sitios de splicing co-transcripcional y maduraciôn de los snRNAs. El anticuerpo 4G3 détecta mediante IF el retfculo nucleoplâsmico correspondiente a los sitios de splicing co-transcripcional, y numerosos cuerpos de Cojal distribuidos por el nûcleo donde se produce la maduraciôn de los snRNAs, cuyo nûmero medio en células proliférantes de rafz de cebolla es de 27, alcanzando maximos de hasta 57 cuerpos de Cojal en un solo nûcleo (Cui y Moreno Dfaz de la Espina, 2002). La incubaciôn simultanée de nûcleos proliférantes aislados de rafz con los onticuerpos 4G3 y 288, revelô que las protefnas U2B" y AcMFPl se distribufo n en subdominios nucleares distintos. Mediante microscopfa confocal (Fig 39 a, b, c) se observa claramente que los cuerpos de Cojal son distintos en tamano y nûmero que los cuerpos de AcMFPl, y sus protefnas marcadoras no co-locolizon en 112 ninguna d e las dos estructuras, aunque pueden observarse ocasionalmente zonas de co-localizaciôn en la periferia d e algunos cuerpos d e Cajal. La ausencia d e luz produjo un drâstico descenso en el numéro d e nûcleos con cuerpos enriquecidos en la protefna d e 90 KDa y marcados con el suero 288, aunque no variaba la m edia d e cuerpos por nûcleo m arcado (Fig 38 a, c). La ausencia d e luz sin em bargo no a fe c ta b a a las trecuencias d e los patrones d e distribuciôn detectados con ambos sueros, donde el m arcado reficulado- nucleolar era siempre mayoritario (Fig 38 c). 4G3 + 288 C u e rp o - y A c M F P l " ^ : C u e rp o s d e C a ja l CUERPOS DE CAJAL Figura 39. Relaciôn topoiôgica de ias protefnas AcMFPl con los dominios nucleares de transcripciôn / splicing en nûcleos meristemôticos de raa de cebolla. (a y b) Nûcleos meristemâticos de la rafz de cebolla incubados simultâneamente con un marcador de splicing, el anticuerpo 4G3, que détecta la protefna U2B”de la partfcula U2 snRNP del espliceosoma (a), y el suero 288 (b). (c y d) Imagenes correspondientes a la superposiciôn de los dos canales del nûcleo anterior (c), y a una zona ampliada de la misma (d). La baja intensidad relativa del marcado de splicing se debe a la baja potencia del laser He-Ne utilizado (1,2 mW) en contraste con la del laser de argôn utilizado para el verde (5 mW). Aunque ambos marcadores coinciden en la regiones intercromatfnicas, la co-localizaciôn entre elles no es significativa, aunque algunos cuerpos de Cajal se encuentran muy prôximos a los puntos brillantes de AcMFPl (fléchas), (e) Mediante inmunomarcado con oro para ME se comprueba que los cuerpos de Cajal, que son dominios de maduraciôn de las snRNPs, tienen una alta intensidad de marcado con el anticuerpo Y12, que détecta el dominio Sm de las protefnas de splicing, pero no con el 288. 113 MFPl se locallza en los cloroplastos d e Arabidopsis, por lo que se investigô su distribuciôn en los cloroplastos de cebolla, utilizando preparaciones d e aplastados celulares d e hojas crecidas en presencia d e luz. El suero 91 d e tec tô AcMFPl m ediante IF en la gran mayorîa d e los cloroplastos (>95%), mostrando un m arcado punteado y disperso por el reticulo d e los mismos (Fig 38 d). En estas muestras la mayorîa d e los nucleos no aparecfan marcados, ya que los sueros anti-MFPl no penetran fâcilm ente en su interior. 4.2. Focos de replicaciôn De todos los modelos o patrones d e distribuciôn d e protefnas nucleares descritos (Stein e t al, 2003 b), los focos d e replicaciôn observables durante el S-temprano presentan el patrôn punteado môs parecido al d e las protefnas AcMFPl d e te c tad o m ediante los sueros 288 y 91. Esto nos llevô a estudiar si las protefnas AcMFPl co-localizaban con los complejos de replicaciôn actives, incubando nûcleos de! meristemo radicular en los que se habfa incorporado previam ente BrdU (anâlogo d e la Timidina), simultâneamente con el suero 288 y un anticuerpo anti-BrdU. Al comienzo d e estos experimentos el conocimiento de la distribuciôn topoiôgica d e los focos d e replicaciôn en plantas era muy rudimentario (Sparvoli e t al, 1994), y se desconocfa en cebolla. Por ello y previam ente al estudio de co-localizaciôn con los sueros anti-MFPl, caracterizamos m ediante IF los sitios d e replicaciôn en células sincronizadas del meristemo radicular d e esta especie, para establecer su evoluciôn espacio-temporaI a lo largo d e la fase S. 114 14h Hidroxiurea - i A ------------------------------ M G1 à-temprano S-tardio G2 1 1 1 1 1 1 ► s_®uoc « ■a Oh Ih 2h 3h 4h 5h 6h 7h 100., 75 14hHU 50. +1 h agua 25- 1 II II \ 4Li 14hHU +2h agua 14hHU +3h agua 14h HU +4h agua 14hHU +5h agua 14h HU i+7h agua 2C f4 C Contenido ADN +1h 71% I II III IV V +2h 71% +3h 76% I II III IV V +4h 69% H i I II III IV V +5h 56% I II III IV V +7h 15% I II III IV V Patron de replicaciôn Figura 40. Secuencia espocio-temporal de la replicaciôn de células proliférantes de la ran de cebolla. (a ) Esquema del diseno experimental utilizado para la sincronizaciôn con hidroxurea (HU), y de los puntos de la fase S estudiados. La longitud de las barras es proporcional a la duraciôn de los com partim entos del cic lo. Las horas îndicadas en la parte interior son relatives a la hora cero (Oh), m om ento en que se libera o las raices del b loqueo con HU. En c a d a una de las tomas se suministrô IQ-^M BrdU durante los 45 min previos a la misma, para m arcar los focos de replicaciôn. (b) Los histogramas del c itôm etro de flujo muestran la progresiôn de la ola de células sincronizadas (flécha roja) a lo largo de la fase. 2C y 4C son los contenidos de ADN en G1 y G2, respectivamente. (c) Frecuencias de los patrones de m arcado I, II, III, IV y V de los focos de replicaciôn observables m ediante inm unodetecciôn con un anticuerpo anti-BrdU durante la fase S a intervalos de una hora (ver Fig. 41). Los porcentajes a la de recha de los histogramas indican la proporciôn de células proliférantes (BrdU+) en c a d a una de las horas. 115 Resultados 4.2.1. Marcado con anti>5-bromo-2’-deoxIuridina (BrdU) Se estudio la secuencio espaciotemporal de los sitios de replicacion en céiulos meristemâticos sincronizodos con HU, a las que se dieron pulses de BrdU despues de liberarlas del bloquée. Posteriomnente se detectaron les feces de sintesis de ADN medianfe IF con un anticuerpe anii-BrdU (Fig 40 a). El avance de las células una vez liberadas del blequee a través del periede S se contrôle mediante citemetrîa de fluje (Fig 40 b). Esta tecnelegfa nos permitlo seguir el peso de la ela de células sincrenizadas a través de les distintes périodes de! S y establecer une secuencie temporel de les petrenes de replicacion detectades mediante IF. Se detectaron cince modèles de distribuciôn pare les feces de replicacion (I, II, III, IV, V), coda une de elles caractenstice de un perîede concrete de le fese S del cicle celular (Semaniego ef al. 2002). En el periede S-temprene se encienden numereses feces de replicacion de pequene temane (<|> 100-400 nm), distribuides principelmente per la peiiferia nuclear y/e en une de les polos nucleeres (patron I) (Fig 41 a). En el S-temprane tembién se observe un patron en el que les feces se concentra ben exclusivamente en el nucleele (patron II), ne detectândese replicacion simultanée en el reste del nûclee en eses mementos (Fig 41 b). Ambes petrenes se detectaron durante las des primeras heras de la fese S, que dura cince héros (Fig 40 b, c). En este periede se observa tembién une alto preperciôn de nùclees que presenten el patron III, cen numereses puntes fluorescentes cerrespendientes a les feces de replicacion ( 100-400 nm), distribuides hemegéneemente per el nûclee, excluyende el nucleele (Fig 41 c, d). El patron III es el mas abundante durante la primera mitad de la fase S (Fig 40 b, c). 116 B rd U ;b B r d U ill d B r d U (II I) Proyecc ion e B r d U ( P ro y ecc io n f B r d U (V ) Proyeccion Figura 41. Orgonizocion topologlco de los sitios de replicacion a io largo del perlodo S. Imâgenes de nûcleos proliférantes del meristemo radicular de la raiz de cebo lla procedentes de las tomas e fectuadas en distintos momentos de la fase S, com o se expresa en la figura anterior, incubados con el anticuerpo antl-BrdU y observados m ediante IF. Se detectaron c inco patrones de m arcado distintos, y carocteristicos para c a d a periodo de la fase S. (a) Pafrôn I: los focos de replicacion de pequeno tam ano se distribuyen principalm ente por la periferia nuclear y /o en uno de los polos nucleares. (b) Pafrôn II; los sitios se localizan en la periferia y /o el interior del nucleolo. (c) Imâgenes que muestran el parecido topo lôg ico entre el patron III de distribuciôn de los sitios de replicaciôn y el patrôn punteado de distribuciôn de las protefnas AcMFPI de tec tado con los sueros 288 y 91. En los très casos se muestra un corte sencillo correspondiente a la parte central del nûcleo (d) Patrôn III: los numerosos sitios de replicaciôn se distribuyen hom ogéneam ente por el interior del nûcleo, excluyendo el nucleolo. (e) Patrôn IV: los sitios de replicaciôn son mayores que los de (a-d), y estôn formados por ogrupaciones de focos de mener fom ano que originan focos heferogéneos distribuides por el nûcleo (ver detalle). (f) Patrôn V: focos de gran fom ano que se acum ulan preferentem ente en el polo felom érico del nûcleo. Todas las imâgenes se fomaron m edianfe Microscopia C onfocal de fluorescencia, mostrândose las correspondientes proyecciones de certes virtuales sucesivos en (b,d,e,f), y las imâgenes de confraste Interferencial en (a,b,e). Barras=4^im. KGSUiraaos En el S-tardio el mas abundante era el pafrôn IV (Fig 40 b, c), constituido por focos de replicacion mayores que los del S-temprano, formados a su vez por ogrupaciones de focos de menor famano que originan focos heferogéneos distribuides por el nûcleo (Fig 41 e). El patron V (Fig 40 b, c) estobo formodo por focos de gran tamaho que se acumulaban preferentemente en el polo felomérico del nûcleo (Fig 41 f), como se vio en células binucleodas (Somoniego et al, 2002). En este période se observon tombién nûcleos con los patrones I, Il y III correspondientes a las células que inician una nueva ronda de replicaciôn (Fig 40 c). 4.2.2. Estudio de co-locallzacion entre BrdU y AcMFPI La distribuciôn del marcado de AcMFPI no coincidfa de forma generalizada con la de los focos de replicaciôn. No obstante, se observô cierto grado de co-localizaciôn en una pequerio proporciôn de estos ûltimos, donde se acumula la proteina de 78 KDo (Fig 42 a). Este resultado era esperable, ya que se habia observado ultraestructurolmente que la protefno se acumula en estructuras laxas situadas en la periferia de las masas densas de cromatina (Fig 30 b, c), localizaciôn coïncidente con la de los focos de replicaciôn. Los cuerpos nucleares enriquecidos en la proteina de 90 KDa no presentaron co-localizaciôn significative con los sitios de replicaciôn tipicos del S- tardfo (patrôn V) (Fig 42 b). Estos resultados sugieren que AcMFPI no es un componente de los focos de replicaciôn, pero muestra una asociaciôn transitoria con los mismos cuyo significodo desconocemos por el momento. 118 a BrdU (lll/IV) 288 + BrdU Nucleolo b BrdU (V) 288 + BrdU + DAPI Figura 42. Reiocion topologlco de los proteinas AcMFPI con los sitios de replicacion en células proliférantes de la ran de cebolla. (a) Imogen correspondiente a la proyeccion de seis certes virtuales sucesivos de un nûcleo con un patrôn de replicaciôn III, caractenstice de la mitad de la fase S, al que se le ha suministrado un puiso con BrdU y posteriormente incubado con antl-BrdU y 288. La distribuciôn de MFPl no co- localiza con el ADN recién sintetizado, ni coincide de forma generalizada con los focos de replicaciôn, aunque se détecta co-localizaciôn en una pequeno proporciôn de focos con (fléchas), (b) Imogen correspondiente a la proyecciôn de certes virtuales sucesivos de un nûcleo incubado como el anterior, con un patrôn V de replicaciôn. Los cuerpos de MFPl no presenton co- localizaciôn con los focos de replicaciôn grandes del S-tardfo, a pesar de la similitud de tamahos. Se muestra tombién una serie de cinco certes virtuales del mismo nûcleo. Barras: 8pm. 5. DISTRIBUCION DE MFPl EN DISTINTAS ESPECIES VEGETALES Las coroctensticas genéticas y la organizaciôn d e los nûcleos d e las especies vegetales en las que se ha caracterizado MFPl son muy distintas. Varîan principalmente en la cantidad d e ADN, el nûmero d e cromosomas y la organizaciôn cromatfnica (Fig 43 e). A. cep a (33,5 pg ADN) (Fig 43 a, e) y N. fabacum (15,5 pg ADN) en menor proporciôn (Fig 43 b, e), poseen gran cantidad 119 de heterocromatina distribuida po rtod o el nûcleo, que adopta una organizaciôn topolôgica reticulada y semireticulada, respectivamente. Cebolla ' , " ' - f e Numéro de cromosomas Ploidia Contenido ADN / Nûcleo Organizaciôn de la cromatina Alliian cepa 16 2 33,5 pg RetciHada Nicodma tsbacum 48 4 15,5 pg SerrtreHculada Lycopersicon esculentum 24 2 2-5,1 pg Cromocénirica Ambiclopsis thaliana 10 2 0,5 pg Eucromàtica Figura 43. Corocteristicas uttroestrucfurales de les nûcleos de cebolla, fabaco, tomate y Arab/dopsis. Imâgenes de certes ultrafinos observados mediante Microscopia Electrônico de Tronsmisiôn de nûcleos de cebolla (A. cepa) (a), toboco (N. fabacum) (b), tomate (L esculentum) (c) y Arabidopsis thaliana (d). Los certes se controstoron con acetate de uronilo y citrate de plomo. (e) Tabla resumen de olgunos corocteristicas nucleares para coda especie. Barras: 1 pm. En L esculentum (~3 pg ADN) (Fig 43 c, e), la escasa heterocromatina existente se distribuye principalmente en cromocentros asociados a la envoltura nuclear, mientras que apenas se observa n masas densas d e heterocromatina en 120 el pequeno nûcleo de A. thaliana (0,5 pg ADN) (Fig 43 d, e). Asi, los nûcleos de cebolla orgonizon 33,5 pg de ADN (contenido 2C) de los que el 95% son secuencios repetidos heterocromctinicas (Pitch y Schubert, 1998; Barnes et al, 1985), mientras que en el nûcleo de Arabidopsis se organizan solo 0,5 pg de ADN, 70 veces menos (Marie y Brown, 1993). Estas diferencias en contenido y organizaciôn de su ADN, van acompahadas también de diferencias en la organizaciôn de otros subdominios nucleares, como los cuerpos de Cajal (Echeverrfa et al, 2004; Cul y Moreno Dfaz de la Espina, 2002), y probablemente influyan en la distribuciôn de MFPl, una proteina que se asocia al ADN. Por este motivo decidimos analizar la distribuciôn subcelular de MFPl en las très especies vegetales donde se ha secuenciado la proteina, usando la misma metodologia de IF utilizada en cebolla. 5.1. MFPl en tomate Se estudiô la distribuciôn de LeMFPl en raiz y hoja de tomate mediante IF utilizando ambos sueros 288 y 91. Debido a la similitud de tamaho, durante el procedimiento de preparaciôn de nûcleos aislados co-purifican con ellos cloroplastos y otros orgônulos celulares de hoja de tomate, que se diferencian en IF por su autofluorescencia roja en el caso de cloroplastos y la tinciôn con DAPI de! ADN de los nucleoides, distinta de la detectada en los nûcleos. Nûcleos y cloroplastos mostraron distribuciones caracterîsticas para las protefnas en cada orgônulo con el suero 288 (Fig 44 a, b, c, d). En los nûcleos, la proteina se distribufa en focos de pequeno tamaho y de forma difusa por el retfculo del nucleoplasma, mostrando un intense marcado periférico sobre la envoltura nuclear (Fig 44 c). Con el suero 91 el marcado intranuclear era similar, pero no se detectaba la intensa sehal de la envoltura nuclear (Fig 44 d). 121 Los cloroplastos, que se destacobon del resto d e las estructuras celulares co-purificadas por su autofluorescencia roja debida a la clorofila y otros pigmentos, osf com o por la presencia del ADN cloroplâstico d e los nucleoides tehido con DAPI, presentaron en la inmensa mayorîa d e los cloroplastos m arcado con el suero 288. a N û c le o s y c lo ro p la s to s de ho ja 288 A u to flu o re s c e n c ia D A F! b C lo ro p la s to de hoja 288 A u to flu o re s c e n c ia D A P I C N u c le o d e h o ja 288 i ‘ Q N û c le o s de hoja 91 Figura 44. Distribuciôn de LeMFPl en nûcleos y cloroplastos de tomate. Las Imâgenes corresponden a cortes centrales de nûcleos y/o cloroplastos obtenidas mediante microscopia confocal. Los cloroplastos muestran autofluorescencia (rojo), los nûcleos aporecen tehidos con DAPI (azul) y las protefnas MFPl en verde. (a) Fraccion de nûcleos y cloroplastos co- purificados de hoja de tomate incubados con el suero 288. Se obsen/o un marcado con el suero caracterfstico para cada orgânulo. (b) Cloroplasto de hoja incubado con el suero 288. En este caso el ADN del nucleoide aparece tehido con DAPI. Nûcleos de hoja (c) y ratz (e) incubados con 288. Se observa claramente el marcado perinuclear con el suero 288, tfpico de esta especie. Nûcleos de hoja (d) y rafz (f) incubados con el suero 91, el marcado perinuclear no es évidente. Barras: 4 jim. 122 Los focos de marcado se observoron disperses por el cloroplasto, ocupando algunas veces posiciones adyacentes a la de los nucleoides tehidos con DAPI, sin detectarse verdadera co-localizaci6n entre ambos subdominios. No obstante, el marcado difuso de LeMFPl y el correspondiente al ADN cloroplâstico descondensado, se superponian por distintas areas del cloroplasto (Fig 44 b). En los nûcleos de rak la distribuciôn del marcado observado con ambos sueros fue similar a la descrita para los nûcleos de hoja (Fig 44 e, f). 5.2. AtMFPI en Arabidopsis y su knockout Se estudiô mediante IF la distribuciôn de AtMFPI en nûcleos aislados de hojas y raices enteras de plantas silvestres de A. thaliana y del knockout para AtMFPI. El pequeho tamaho del nûcleo de Arabidopsis, similar al de un nucleolo de cebolla, hizo diffcil su anôlisis mediante microscopia de fluorescencia. Mediante el suero 91, producido contra la proteina de esta especie, MFPl mostrô un patrôn de marcado mayoritariamente punteado, incluyendo aigu nos focos de mayor tamaho y marcado nucleolar adicional en el 10% de los nûcleos (Fig 45 a). Se realizaron incubaciones simultanées con el suero 91 y el anticuerpo 4G3, especifico contra la proteina nuclear U2B” del espliceosoma, que demostraron que tal y como sucede en cebolla (Fig 39) la co-localizaciôn entre am bas proteinas no era signiOcativa (Fig 45 b). Los marcados detectados con el suero 288 en esta especie fueron similares a los detectados con el suero 91, y nunca se observô el marcado perinuclear tipico de los nûcleos de tomate (Fig 45 c, d). Para com probar si AtMFPI estaba asociada a la matriz nuclear, se utilizaron fracciones de MN preparadas segûn el protocole utilizado en cebolla a partir de nûcleos aislados de hojas de Arabidopsis. AtMFPI mostrô un marcado difuso con el suero 91 por el reticulo de estas fracciones (Fig 45 e), demostrondo que la 123 proteina pemnonece fuertemente unido cl nucleoesqueleto tros une extrocciôn con DNqsq y alto fuerzo iônico. g N uc leo de ho ja N û c le o s de raiz 91 4G 3 D / 1̂1 N ucleo de l aiz 0 MN de hoja f C lo ro p la s to de hoja 91 A u to flu o re sc e n c ia DAPI Figura 45. Distribuciôn de AtMFPI en nûcleos y cloroplastos de JVabidopsis. Imâgenes de cortes centrales de nûcleos y cloroplastos tomadas mediante microscopia confocal (a) Nûcleos de hoja incubados con el suero 91. MFPl sigue un patrôn de distribuciôn difuso por el retfculo nuclear, acumulândose ademâs en algunos focos de gran tamaho. (b) Nûcleos de rafz marcados simultâneamente con el suero 91 (verde) y 4G3 (rojo), que détecta la proteina nuclear U2B" de splicing. No se observa co-localizaciôn significative, (c y d) Nûcleos de hoja (c) y rafz (d) incubados con el suero 288. Se observa un patrôn de distribuciôn de MFPl similar al detectado con el suero 91. En el nûcleo de hoja un marcado nucleolar adicional. Se muestran las correspondientes imâgenes de contraste de fase y tinciôn con DAPI. (e) Matriz nuclear de hoja incubada con el suero 91, donde MFPl muestra una distribuciôn similar a la detectada en los nûcleos aislados. Se muestra la correspondiente imagen de contraste interferencial, ya que al haberse extrafdo el ADN la tinciôn con DAPI résulta negativa. (Q Cloroplasto de hoja incubado con el suero 91. El ADN del nucleoide aparece tehido con DAPI (azul), y la autofluorescencia emitida por los pigmentos del cloroplasto se recoge en el canal rojo de emisiôn. El marcado de MFPl no co-localiza con el ADN condensado del nucleoide, aunque se distribuye por zonas del cloroplasto donde existe ADN descondensado. Barras: 4 jim. El m arcado con el suero 91 en cloroplastos d e hoja de Arabidopsis (co- purificados durante el aislamiento d e nûcleos) fue similar al descrito m ediante el suero 288 en cloroplastos d e tom ate, donde los focos d e m arcado roromente coincidfa n con la posiciôn ocupada por el nucleoide tehido con DAPI (Fig 45 f). AtMFPI se distribufa de forma difusa por el retfculo del cloroplasto coincidiendo 124 en numerosas ocasiones con el ADN descondensado, por lo que no es descartable una interacciôn entre la proteîna y el ADN cloroplâstico, aunque ésta no suceden'a en el nucleoide. Se connprobô nnediante inmunodetecciôn en m embra no que el suero 91 d etec tab a una banda d e 80 KDa correspondiente a AtMFPI en fracciones de nûcleos aislados de hojas d e la estirpe silvestre d e Arabidopsis. Esta banda prâcticam ente desaparecfa en las fracciones correspondientes a la planta knockout para AtMFPI (Fig 46 a). De igual forma aparecfan marcados m ediante IF con el suero 91 el 95% d e ambos nûcleos y cloroplastos en la planta silvestre (Fig 46 c), mientras que en la planta knockout el m arcado solo se de tec tab a en un 5% d e ambas estructuras celulares (Fig 46 b). Este resultado, adem âs del interés para la caracterizaciôn del knockout demuestra la efectividad del m étodo de IF en suspension, volidondo los marcados descritos hosto el momento para AcM FPI. Hoja 3 Arabidopsis 91 (KDa) 250- 150- 100 - 75-' 50- 37- At WT 91 WT KO Fig 46. Detecciôn de AtMFPI en Arabidopsis y el knockout para MFPL (a) Inmunodetecciôn en membrana de AtMFPI en fracciones nucleares de hoja de Arabidopsis de plantas silvestres (WT) y del knockout para AtMFPI (KO), (b y c) Imâgenes a bajo aumento de preparaciones incubadas con el suero 91 de nûcleos y cloroplastos co-purificodos de las plantas knockout (b) y silvestre (c). Se muestran las imâgenes superpuestas de IF y contraste interferencial. No se detectô marcado en las preparaciones de la planta knockout con ninguno de las dos técnicas. Barras: 20 jim. 125 5.3. MFPl en fabaco y en plantas fransformadas con AtMFPI Por ultimo se estudiô la presencia y distribuciôn de NtMFPl en tabaco, donde se ha descrito la existencia de dos genes NfMFPJ de distinto tamaho (Gindullis y Meier, 1999), muy conservados entre si y con LeMFPl (90%), y menos conservados con AtMFPI (45%) (Harderet a/, 2000). (KDa) Nucleo de tabaco 91 25 0 - 150 100 - 75- Raiz Hoja Figura 47. Inmunodetecciôn de NtMFPl en fracciones nucleares de ran y tioja de tabaco con el suero 91. El suero 91 no détecta los protefnas de tabaco en nûcleos aislados de la rafz, ni m ediante inmunodetecciôn en membrana ni mediante IF (no mostrado). En nûcleos aislados de hoja détecta una banda de 80 KDa correspondiente a NtMFPl, y une banda intensa de 160 KDa que corresponde probablemente a la forma polimerizada de la protefno, como sucede en cebolla y tomate. Mediante el suero 91 se detectaron dos bandas en fracciones de nûcleos aislados de hoja de tabaco. Una banda de 80 KDa correspondiente a NtMFPl (Fig 47), y una banda adicional de 160 KDa correspondiente a la forma polimerizada no completamente desnaturalizada de NtMFPl, como sucede en cebolla (Fig 6) y probablemente en tomate, donde también se habfa detectado una banda similar con anterioridad (Harder ef al, 2000), lo que sugiere que se trotarîa de un fenômeno habituai en MFPl, protefna capaz de formar estructuras superenrolladas en coiled-coil. 126 3 Nûcleos y cloroplastos 288 4G3 co-purificados de hoja C lo ro p la s to s Contraste b Nûcleo de hoja Q Nucleo de hoja 0 Cloroplasto de hoja 288 Autofluorescencia f Cloroplasto de hoja 91 Autofluorescencia 288 4G3Nucleo de raiz Figura 48. Distribuciôn topolôgica de NtMFPl en nûcleos y cloroplastos de tabaco. Las imâgenes de fluorescencia confocal corresponden a cortes centrales de nûcleos y/o cloroplastos. (a) Nûcleos y cloroplastos de hoja co-purificados y marcados simultâneamente con el suero 288 y el marcador de splicing 4G3, que détecta la protefna nuclear U2B" del espliceosoma. En la correspondiente imagen de contraste de fase se observan a menor aumento otros numerosos orgânulos vegetales claramente distintos, que también co-purifican con los nûcleos y los cloroplastos pero no contienen ninguna de las dos protefnas. (b) Nûcleo de hoja tehido con DAPI e incubado simultâneamente con 288 y 4G3. En la superposicion de las imâgenes es évidente que las protefnas no co-localizan y se observa claramente un cuerpo de Cajal grande distinto de los cuerpos de MFPl. El marcado del nucleolo es muy bajo. (c) Nûcleo de hoja incubado con el suero 91 y la correspondiente imagen de contraste interferencial. (d) Matriz nuclear de células de hoja incubada con el suero 288, mostrando una distribuciôn asociada a la matriz interna. Se muestra la imagen de contraste interferencial correspondiente superpuesta a la de fluorescencia. (e y f) Cloroplastos de hoja incubados con los sueros 288 (e) y 91 (f). En ambos casos la autofluorescencia de los pigmentos del cloroplasto se observa en rojo, y el ADN del cloroplasto aparece tehido con DAPI. El marcado de la protefna es difuso-punteado y no co-localiza con el ADN condensado del nucleoide, aunque sf se distribuye por zonas en las que también se détecta el ADN descondensado. (g) Nûcleo de rafz incubado simultâneamente con 288 y 4G3. Se observa una distribuciôn periférica tfpica de rafz que es anâloga a la observada en tomate (Fig 44). Queda patente asf mismo que MFPl no co-localiza con las protefnas de splicing, aunque ambos se distribuyen en el dominio intercromatfnico. El suero 91 no détecta NtMFPl en los nûcleos de la rafz (no mostrado), véase la figura anterior. Barras: 4 jim. 127 Se estudiô mediante IF la distribuciôn de NtMFPl en nûcleos y cloroplastos co-purificados de hojas de tabaco. La serial nuclear detectada mediante el suero 288 se acumulaba en numerosos focos fluorescentes que no coincidîan significativamente con los cuerpos de Cajal, detectados simultâneamente con el anticuerpo 4G3; y en el nucleoplasma de forma difusa (Fig 48 a, b), asociada a la envoltura nuclear y sôlo en el 30% de los nucleolos. Mediante el suero 91 (anti-AtMFPI) se detectaron marcados nucleares similares a los descritos con el suero 288 (anti-LeMFPl), pese a que AtMFPI y NtMFPl no poseen secuencias muy conservados (Fig 48 c). Con este suero se demostrô que NtMFPl permanecîo unida a la MN de hojas de tabaco, presentando un marcado de fluorescencia (Fig 48 d) parecido a los descritos en Arabidopsis y cebolla. En cloroplastos, como ocurrîa en tomate y Arabidospsis, la proteina presentaba un patrôn difuso-punteado, en el que los focos raramente coincidîan con los nucleoides tehidos con DAPI (Fig 48 e, f: 49 c). No se observoron variaciones cualitativas en la distribuciôn de MFPl en nûcleos y cloroplastos de hojas de tabaco transformadas con el gen AtMFPI, que es similar a la descrita anteriormente en plantas silvestres para ambos sueros. Se detectô sin embargo un aumento importante (6x) en el nûmero de cloroplastos existentes en coda célula de hoja, como se puede observer en muestras correspondientes a plantas silvestres y transformadas con una misma densidad nuclear (Fig 49 a, b, c). 128 Q Cloroplastos de tabaco-AtMFPI 91 DAPI Autofluorescencia Figura 49. Distribuciôn topolôgica de MFPl en hojas de plantas de tabaco silvestres y transformadas con AtMFPI. (a y b) Imageries a bajo aumento de fracciones de nûcleos (flécha) y cloroplastos co-purificados de hojas de plantas silvestres de tabaco (a) y transformadas con AtMFPI (b) incubados con el suero 288. Se muestran las imâgenes correspondientes de contraste interferencial, asf como las superposiciones de ambas. La distribuciôn de MFPl es similar a la descrita en la figura anterior. Barras: 20 jxm. (c) Cloroplastos de plantas transformadas con AtMFPI incubados con el suero 91 a mayor aumento. La autofluorescencia de los pigmentos de los cloroplastos en rojo, su ADN tehido con DAPI en azul y MFPl en verde. La distribuciôn de MFPl no varia en el nûcleo y los cloroplastos de las plantas silvestres y transformadas, aunque se observa un incremento importante (6x) del nûmero de cloroplastos en las plantas transformadas, como se comprobô mediante recuentos en muestras que tenfan una misma densidad nuclear. Barra: 5pm. Por ultime, se incubaron muestras de protoplcstos d e tabaco con el suero 288 y se visualizô el m arcado con anticuerpos conjugados con oro para ME. El m arcado nuclear observado fue disperse con acumulaciones de partfculas d e oro ocasionales (Fig 50 a). Sobre los cloroplastos se observoron tante acumulaciones de partfculas d e oro com o partfculas aislados localizadas sobre las membra nas d e los tilacoides (Fig 50 b), lo que concuerda con el m arcado detec tad o m ediante IF que révéla un m arcado difuso con focos de fluorescencia ocasionales (Figs 48 e, f; 49 c). 129 Cioropiasta 288 # Nucleo Figura 50. Distribuciôn de NtMFPl a oita resoiuciôn en protopiostos de hoja de tabaco. Inmunomarcado con oro para ME. (a) Imagen de un corte ultrafino incubado con el suero 288, en la que se observan una agrupacion de particules de oro sobre el nucleo, que se muestra ampliada en el recuadro. (b) Imagen de un cloroplasto en un corte similar. Se observan un grupo dense de particules de oro, y numerosas particules individueles distribuides por les membranes de los tilacoides. Berras: 500 nm. 130 DISCUSIÔN 1. IDENTIFICAClÔN DE DOS PROTEINAS HOMÔLOGAS DE MFPl EN CEBOLLA 1.1. Especificidad de los sueros 288 y 91 e idenfificacion de los proteinas AcMFPI Los sueros 288 y 91 reconocen las proteinas MFPl heterôlogas del resto de las especies vegetales en las que se han probado hasta el momento, a pesar de las diferencias de secuencia entre ellas (Jeong et al, 2003; Harder et al, 2000), quedando la especificidad de las reacciones garantizada por la ausencia de reacciôn con los sueros preinmunes correspondientes. La especificidad de las técnicas de inmunodetecciôn in situ en A. cepa esta también garantizada por la ausencia de reacciôn con los sueros preinmunes, y con los sueros anti-MFPl en muestras de plantas de A. thaliana knockout para MFPl, asi como por la alta concordancia entre los patrones de distribuciôn topolôgica detectados con los sueros tiomôlogos y heterôlogos, especialmente en Arabidopsis y tomate, a excepciôn del marcado perinuclear de este ultimo que sôlo se détecta con el suero homôlogo. Estos mismos sueros detectan en A. cepa una familia o grupo de proteinas antigénicamente relacionadas con MFPl, que migra n a 210, 160, 90, 63, 55 KDa y en un doblete de 78 KDa. Mediante técnicas de inmunoprecipitaciôn seguida de inmunodetecciôn en membrana, que proporciona un reconocimiento de las proteinas tanto en su conformaciôn nativa como desnaturalizada con SDS, se han identificado entre ellas dos proteinas heterôlogas de MFPl, correspondientes a las proteinas de 90 y 78 KDa. En el caso de ésta ultima el reconocimiento es doble, al ser inmunoprecipitada por uno de los sueros e inmunodetectada por el otro. Los extractos celulares analizados de A. cepa contienen, como ya se ha comentado, una familia de proteinas inmunoreactivas con los sueros anti-MFPl. Una de ellas, la banda de 160 KDa, corresponde g una forma de polimerizaciôn de la proteina de 78 KDa, como queda demostrado por su compléta solubilizaciôn con SDS y urea, y con altos concentraciones de SDS. Al tratarse de 131 un heterologo potencial de MFPl en cebolla, es probable que la proteina de 78 KDa p o s ^ el extenso domino en coiled-coil tipico de estas proteinas (Harder ef ah 2000), capaz de formar estructuras poliméricas superenrolladas dificiles de desnaturalizar, habiendo sido detectados bandas similares de 160 KDa en tabaco y anteriormente en tomate (Meier ef a/, 1996). A falta de las secuencias que lo confirmen, las proteinas de 90 y 78 KDa séria n los heterôlogos principales de MFPl en cebolla, ya que ademâs de com partir dominios antigénicos con ellas, poseen otras caracteristicas de las MFPl s de otras especies. AcMFPI-78 KDa posee una Mr similar a la descrita para MFPl de tomate (Merer et ah 1996), tabaco, soja, arroz, moK trigo (Harder et al, 2000) y Arabidopsis (Jeong et al, 2003), y como en esta ultima migra formando un doblete de aproximadamente 80 KDa (Jeong et ah 2004); posee un valor de pl ligeramente âcido similar al de LeMFPl (Meier et al, 1996) y NtMFPl (Jeong ef al, 2004); forma polimeros que migran como una banda de 160 KDa, detectada también en tabaco y tomate (Meier et oh 1996); y présenta una doble localizaciôn subcelular en nûcleos y cloroplastos, como en tabaco y Arabidopsis (Jeong et al, 2003 y 2004). Por su parte, AcMFPI-90 KDa es un componente de la matriz nuclear, independientemente de la fuerza iônica del método de extrocciôn utilizado, como las proteinas NtMFPl y AtMFPI; y présenta multiples isoformas de fosforilaciôn, como se ha descrito en la proteina de la fracciôn plastidica de la proteina de tabaco (Jeong et al, 2004). Aunque al no estar secuenciado no se conoce si contiene secuencias consenso para fosforilaciôn por CK2, hemos demostrado que es fosforilable por esta enzima, al igual que las proteinas de tomate (Meier et ah 1996) y Arabidopsis (Jeong ef ah 2004). Ambas proteinas de cebolla presenton corocteristicas tipicos de MFPl, por lo que serian isoformas potenciales de AcMFPI producidos por un uso variable de sitios de iniciaciôn de traducciôn, por modificaciones postraduccionales o mediante splicing altemativo de un mismo gen; aunque también podrian ser proteinas homôlogas codificadas por dos genes diferentes, como en el caso de 132 tabaco donde se tian detectado dos genes NtMFPl, aunque liasta ahora solo se haya caracterizado una proteina (Harder ef al, 2000). En estos momentos carecemos de informacion que permita descartar cualquiera de estas opciones, ya que se desconoce si el gen MFPl posee intrones, al haberse clonado en todos los casos a partir de genotecas de cDNA; o si existen uno o mas genes AcMFPJ, al haber sido infructuoso el rastreo de la genoteca de cDNA de cebolla. Las proteinas antigénicamente relacionadas con MFPl, incluidas las isoformas principales de 78 y 90 KDa, son detectados con distinta afinidad por los sueros anti-MFPl, y presenton diferentes patrones de expresiôn y distribuciôn nuclear. La proteîna citoplasmâtica de 55 KDa sôlo es reconocida por el suero 288, mientras que las del doblete de 63 KDa son reconocidas exclusivamente por el suero 91. Estas ultimas no son constitutivas y se inducen en células diferenciadas de raiz cuando disminuyen los niveles de la proteina de 78 KDa. Ademâs de los posibles orîgenes de las isoformas de AcMFPI ya expuestos, estas dos proteinas podrian formarse también por proteolisis de las proteinas principales de mayor peso molecular. Respecte a la proteina de 210 KDa, su reacciôn con los sueros es muy débil y depende de la concentraciôn de los mismos. Su Mr es similar a la de uno de los homôlogos de AcNuMA, y présenta caracteristicas similares de solubilidad (Yu y Moreno Diaz de la Espina, 1999), por lo que es posible que correspondo a uno reacciôn cruzada de los sueros coir AcNuMA, ya que MFPl y NuMA tienen dominios coiled-coil parcialmente conservados y los sueros estôn desarrollados precisamente contra este dominio de MFPl (Meier et al, 1996). Los sueros anti-MFPl detectan ocasionalmente algunas bandas nucleares môs, de intensidad variable y en el rango de 65-70 KDa, tanto en cebolla como en tomate y tabaco (Gindullis y Meier, 1999; Meier ef al, 1996). Bandas del mismo rango de Mr también se detectan en cebolla y otras plantas (Blumenthal et al, 2004) mediante IFA, anticuerpo que reconoce un epitopo del extreme carboxilico del dominio coiled-coil conservado en todos los de Filamentos Intermedios que es esencial para su dimerizaciôn (Yu y Moreno Diaz de la Espina, 133 1999), sugiriendo que estas bandas podrian ser reacciones cruzadas con proteinas, de este tipo, cbundantes en la ffanja de 60-70 KDa de fracciones nucleares de plantas {Blumenthal et al, 2004: Frederick ef al, 1992), y mas concretamente podrid ser las proteinas antigénicamente relacionadas con las laminas, que migran en cebolla en el rango de 65-70 KDa (Minguez y Moreno Dîaz de la Espina, 1993) y tienen una cierta conservaciôn de secuencia con MFPl (Meier ef a/, 1996). Recientemenfe, Blumenthal y colaboradores (2004) han demostrado en guisante que proteinas tipo coiled-coil de 65, 60 y 54 KDa reconstituyen filamentos de 6-12 nm in vitro y tienen una distribuciôn nuclear uniforme. El anôlisis de secuencia de los péptidos de digestiôn de las proteinas de 65 y 60 KDa révéla que tienen regiones de similitud con varias proteinas de Arabidopsis, entre ellas MFPl, y forman un grupo de proteinas nucleares acidicas con segmentos largos en coiled-coil denominadas NAC {Nuclear Acidic Coiledcoil proteins), que serian el tipo de proteinas del nucleoesqueleto que sustituirian a las laminas en plantas, aunque sus Mr son mayores. Por tanto, los sueros anti-MFPl reconocen dos proteinas homôlogas principales de MFPl en cebolla de 78 y 90 KDa; detectan varias isoformas potenciales especificas de diferenciaciôn; y presentan una débil reacciôn cruzada con NuMA y las proteinas NAC. 1.2. Clonaciôn de AcMFPI Se ha intentado construir una genoteca de cebolla en numerosas ocasiones, aunque sin mucho éxito. Una genoteca de A. cepa séria de gran utilidad ya que este sistema posee caracteristicas nucleares muy interesantes. Destacan la elevada cantidad de ADN de su genoma diploide, constituido mayoritariamente por secuencias repetidas (95%), y la alta proporciôn de heterocromatina, que origina un extenso reticulo nuclear de cromatina condensada; posee secuencias teloméricas distintas de las secuencias consenso 134 de A. thaliona conservados en plantas; y un elevado nûmero de copias de ADNr (Pich y Schubert, 1998; Panzera et al, 1997; Bornes et al, 1985). Ademâs, los bulbos de cebolla son un sistema muy favorable para el fraccionamiento celular y la obtencion de matrices nucleares, y las células de raiz incorporan fâcilmente drogas y otros metabolitos del medio de cultivo facilitando los estudios fisiolôgicos. La accesibilidad del meristemo radicular, donde se concentra hasta un 75% de células proliférantes, hace a esta especie particularmente favorable para estudios de ciclo celular (Somoniego et al, 2002; Pelayo et al, 2001). Sin embargo, la alto cantidad de ADN, particularmente de secuencias repetidas no codificantes, suponen una clara desventaja a la hora de construir una genoteca compétente de cDNA de cebolla. Desgraciadamente, no se consiguiô clonar AcMFPI durante el rastreo de la genoteca de cDNA de cebolla utilizado. Este resultado negativo puede estar relacionado tanto con la calidad de la genoteca empleada, como con la conservaciôn de las secuencias de los oligonucleôtidos y las sondas utilizadas en los rastreos. De hecho, la secuencia de AtMFPI, poco conservado con la de LeMFPl y NtMFPl, no se consiguiô detector mediante el rastreo de una genoteca de Arabidopsis (Dra. Meier, comunicaciôn personal), sino cuando se publicô la secuencia compléta de este genoma. Sin embargo, las secuencias de NtMFPl-1 y NtMFPl-2 se obtuvieron con facilidad a partir de una genoteca de tabaco, debido a la alto conservaciôn de secuencia de las sondas de LeMFPl utilizadas (Dra. Meier, comunicaciôn personal). No obstante, suponiendo que algûn fragmente de AcMFP! hubiera sido clonado en la genoteca en una proporciôn aceptable, la bajo conservaciôn de las secuencias MFPl podria haber dificultado el diseho de cebadores efectivos durante el rastreo por PCR, pese a haberse utilizado el dominio môs conservado de la proteina, que abarca los ûltimos 800 nucleôtidos del extreme 3’-OH de MFPL Incluse dentro de este dominio de la proteina fue imposible encontrar una secuencia conservada en todas las especies, por lo que se tuvieron que utilizar cebadores en los que el 10-30% de los nucleôtidos no coincidfa n en todas ellas. 135 El Intente de confimnar la identidad de las proteinas AcMFPI mediante purificacipn a partir de fracciones nucleares inmunoprecipitadas o separadas en geles bidimensionales, y digestion con Tripsina para conseguir su m apa peptidico y/o secuenciaciôn de los fragmentes obtenidos, fue imposible debido a la baja cantidad de proteina obtenida, por debajo del umbral de tinciôn con plata, que impidiô su posterior purificaciôn y anôlisis. Pese a no haber conseguido secuenciar las proteinas AcMFPI, su gran semejanza con MFPl indice que las proteinas de 78 y 90 KDa son probablemente los heterôlogos principales de la proteina en A. cepa. Une caractenstice compartida con MFPl es su fosforilaciôn. AcMFP 1-90 KDa se fosforila por la misma kinasa que MFPl de Arabidopsis, tabaco (Jeong ef al, 2004) y tom ate (Meier et al, 1996). No disponemos de resultados definitivos en el caso de AcMFP 1-78 KDa, que migra como un doblete con volores de pl moderadamente distintos y se recoge en sobrenadantes distintos durante la extracciôn de matrices nucleares, sugiriendo la existencia de modificaciones postraduccionales. Estas posibles modificaciones podrian ser diferentes de las descritas para AcMFP 1-90 KDa, o implicar a otras kinasas y fosfatasas en el caso de que también se trate de fosforilaciôn. La obtenciôn de las secuencias de las dos proteinas AcMFPI habrîa aportado informaciôn relevante en este sentido, ya que se conocen numerosas secuencias consenso dianas de modificaciones postraduccionales. 2. LA ASOCIACIÔN DE AcMFPI-90 KDa A LA MATRIZ NUCLEAR ESTA REGULADA POR FOSFORILAQÔN CON CASEÎNA KINASA CK2 2.1. La CK2 régula la union de AcMFPI -90 KDa a la MN Aproximadamente la tercera parte de las proteinas nucleares y citoplasmôticas estô regulada mediante procesos de fosforilaciôn-defosforilaciôn en eucariotas, existiendo kinasas y fosfatasas especificas para cada uno de estos compartimentes celulares, y unas pocas que actûan en ambos (Bollen y Beullens, 2002}. La fosforilaciôn-defosforilaciôn afecta a numerosos procesos, uno 136 ampliamente estudiado pero no connpletamente conocido es el ensamblaje y desensanjblaje nuclear que sucede durante el ciclo celular, en el que se fosforilan principalmente protefnas de la envoltura nuclear, como las laminas y otras protefnas asociadas (Hactiet e t af, 2004; Takano et al, 2004; Otto et of, 2001 ; Dechat et al, 1998), y del nucleoesqueleto como NuMA {Saredi et af, 1997). La mayor parte de las protefnas de la matriz nuclear estdn reguladas mediante fosforilaciôn. Sus efectos son muy variados, afectando principalmente a la funciôn de las protefnas y /o a su distribuciôn intranuclear (Imai et al, 2004; Nicoll et al, 2003; Pilipuk et al, 2003). En el caso de AcMFP 1-90 KDa la fosforilaciôn modula la fuerza con la que se une la protefna a la matriz nuclear, sin afectar aparentemente a su distribuciôn nuclear. Las formas hipo- e hiper-fosforiladas de AcMFPI-90 KDa estôn distribuidas de manera similar en el nûcleo, ya que la extracciôn de las formas hiper-fosforiladas con NaCl no induce variaciones significatives del numéro, tamaho y distribuciôn topolôgica de los cuerpos de AcMFPI-90 KDa, ni en el marcado del retfculo de la MN, detectôndose como ûnico cambio significativo un incremento de! nûmero de matrices nucleares sin marcado, que indica que en estas células toda la protefna del nûcleo estaba hiper-fosforilada. La incorporaciôn de grupos fosfatos a AcMFP 1-90 KDa provoca una menor afinidad en la uniôn de la protefna a la MN, ya que se introducen cargas negatives que reducen la interacciôn electrostôtica entre la protefna y la molécula de la MN a la que se une, que no ha sido identificado hasta el momento. Este fenômeno es habituai entre las protefnas de la MN, y afecta a las laminas (Gerace y BlobeL 1980), a distintas protefnas remodeladoras de la cromatina pertenecientes a la familia SWI/SNF (Bérubé et al, 2000; Reyes et al, 1997; Muchardt et al, 1996), a NuMA (Saredi et al, 1997), al polipéptido p73 de la familia de p53 (Ben-Yehoyada et al, 2003), a la protefna FIIRA de uniôn a histonas (De Lucfa e t al, 2001 ), etc. En todos estos casos la hipo-fosforilaciôn de la protefna correlaciona con una fuerte asociaciôn a la MN, y su hiper-fosforilaciôn con la liberaciôn o una uniôn môs débil a la MN. Se ha demostrado también que la fosforilaciôn juega un papel muy importante en la modulaciôn de la 137 funcionalidad y asociaciôn al ADN de muchas protefnas nucleares, incluyendo las ARN potimerasas (Albert ef al, 2004), factores de transcripciôn (Joaquin y Watson, 2003; Lin y Shalitin, 2003) y protefnas implicadas en la organizaciôn de la cromatina (Allard ef al, 2004; Kamemura y Hart, 2003). El nivel de fosforilaciôn de AcMFP 1-90 KDa aumenta a lo largo del ciclo celular desde G 1/S-temprano hasta G2. Este patrôn de fosforilaciôn es habituai en protefnas nucleares de uniôn a la cromatina, a la MN, o a ambas (Miccoli et al, 2003; Qiao et al, 2001; Mine et al, 1999). Un patrôn similar de fosforilaciôn durante el ciclo celular se observa para la protefna represora de tumores RB, cuya distribuciôn entre el nûcleo y el citoplasma varia de forma dinâmica segûn el estado de fosforilaciôn (Yen et al, 1997; Mancini et al, 1994), fenômeno que sin embargo no sucede en el caso de AcMFP 1-90 KDa, ya que no se han detectado incrementos significativos de la protefna en el citoplasma en ningûn momento del ciclo celular. Nuestros resultados con inhibidores y estimuladores de la CK2 demuestra n que AcMFP 1-90 KDa es un sustrato de esta enzima. Ésta es la primera vez que se describe la regulaciôn de la asociaciôn de la protefna a la MN por esta kinasa (Moreno Dfaz de la Espina et al, 2003), ya que sôlo muy recientemente se ha descrito que la CK2 inhibe la uniôn de MFPl al ADN in vitro (Jeong et al, 2004). La CK2 es una kinasa de serina-treonina multifuncional présente en el citoplasma y el nûcleo de células proliférantes y diferenciadas de plantas, animales y levaduras, asociôndose a la matriz nuclear en funciôn de su propio estado de fosforilaciôn (Yu et al, 2001; Suk et al, 1997). Posee numerosos substratos nucleares, entre los que se encuentran factores de transcripciôn y protefnas organizadoras de la cromatina (Barz ef al, 2003). La CK2 de plantas esta formada por un complejo tetramérico de unidades catalfticas (a) y reguladoras (p) similar al de otros organismos, donde sôlo las primeras se expresa n de manera constitutiva (Riera et al, 2001 a). Esta involucrada en procesos esenciales para la viabilidad vegetal, como son la expresiôn génica regulada por la luz y la progresiôn del ciclo celular (Riera et al. 138 2001 b). Su actividad es esencial en la iniciaciôn y organizaciôn de la actividad meristematica (Espunya y Martinez, 2003), tepdo en el que se detectan precisamente los môximos niveles de las proteinas AcMFPI. Se conocen distintos substratos vegetales como Robl7, involucrada en procesos de crecimiento y embriogénesis {Riera ef al, 2004); CCA-1 (Orcadian Clock Associated-1) relacionado con el ciclo circadiano y sus efectos sobre por ejemplo el movimiento de las hojas, la apertura de los estomas o la expresiôn génica (Daniel et al, 2004); la Topoisomerasa I y la ADN Helicasa (Tuteja, 2003; Tuteja et af, 2001 ); la proteîna SSRPl relacionada con la transcripciôn y la replicaciôn (Krohn et al, 2003); factores estructurales de la cromatina como las protefnas HMGB y Dof2 (Krohn et al, 2002: Stemmer et al, 2002); factores de transcripciôn (Ferraris et al, 2002); o protefnas de virus vegetales (Ivanov et al, 2003). Sin embargo, las ûnicas protefnas de matriz nuclear de plantas identificadas como substratos de la CK2 son las protefnas semejantes a laminas de guisante (Li y Roux, 1992), LeMFPl (Meirer et al, 1996), AtMFPI (Jeong et al, 2004) y AcMFP 1-90 KDa. La fosforilaciôn de protefnas nucleares, incluida la producida por la CK2, régula cuatro fenômenos principales: la redistribuciôn de las protefnas entre el nûcleo y el citoplasma, su uniôn al ADN, su ensamblaje en complejos mocromoiecuiares y/o su funcionalidad. Los datos de IF e inmunodetecciôn en membrana sugieren que la fosforilaciôn no influye sobre los patrones de distribuciôn de AcMFP 1-90 KDa en el nûcleo, ni produce un flujo de la protefna hocia el citoplasma durante el ciclo celular. Recientemente se ha demostrado que la fosforilaciôn por CK2 in vitro puede inhibir la uniôn de MFPl al ADN, sugiriéndose que la kinasa podria regular la uniôn MFPl-ADN in vivo (Jeong et al, 2004). El hecho de que la fosforilaciôn contrôle la uniôn de AcMFPI-90 KDa a la MN, sugiere que podria modular también su ensamblaje en esta estructura, y posiblemente su funcionalidad, como sucede en el caso de muchas otras protefnas, como la subunidad AKAP149 de la PPl (Protein Phosphatase 1 ), que se ensambla sobre la lamina en su estado defosforilado para estabilizar a su vez el ensamblaje de las laminas durante G l. Cuando mediante fosforilaciôn es liberada de la lamina induce la fosforilaciôn y despolimerizaciôn de las laminas A 139 y B, provocando el desensamblaje de la lamina y la envoltura nuclear (Steen et aL 2003)., Ademâs, el hecho de que les tratamientos in vivo con drogas inhibidoras y estimuladoras de la CK2 endôgeno reproduzcan el mismo efecto, sugiere que esta kinasa participarîa en la regulaciôn de la union de la protefna al nucleoesqueleto celular in vivo. AcMFPl-90 KDa se comporta como un componente de la MN, aunque nuestros resultados son insuficientes para concluir si forma parte de los filamentos bâsicos del nucleoesqueleto expansible como EAST (Wasser y Ctiia, 2000), skelefor (Walker et a i 2000), enaptin y nuance (Padmakumar et al, 2004) en animales, o es una protefna asociada a ellos como NuMA (Yu y Moreno Dfoz de la Espina, 1999) y actina (Kiseleva et ah 2004), que presentan una regulaciôn similar por fosforilaciôn-defosforiiaciôn. 2.2. AcMFPl-90 KDa es la ûnica proleina MFP1 con pi boslco La utilizaciôn del método de dob/e solubilizaciôn nos ha permitido calcular el valor experimental de pl de AcMFPl-90 KDa, que no es posible obtener con los métodos habitudes de solubilizaciôn. Este método ya se habfa usado con otras protefnas de la MN, como por ejemplo EBNA-5, una de las seis protefnas nucleares del virus Epstein-Barr. En este caso, mediante la combinaciôn de detergentes no iônicos, DNasa, RNasa, Fosfatasa Alcalino, NoCI 1M y/o ureo 8M sôlo se liberô un 10% de la protefna de la MN, mientras que utilizando 2% SDS y calor se consiguiô liberar de la MN la mayor porte de la misma (Szekely et af, 1995). El método de doble solubilizaciôn supone una ventaja adicional, y es que la combinaciôn de 2-mercaptoetanol, SDS y color utilizodo durante la primera solubilizaciôn rompe los puentes de hidrôgeno inter e intramoleculares y cancela las interacciones hidrofôbicas, favoreciendo la compléta desnaturalizaciôn de AcMFPl-90 KDa y previniendo su agregaciôn con otras protefnas, lo cual évita su migraciôn anômala por asociaciôn a otra protefna, como sucede en el caso de 140 la nucleolina {Gotzman et al, 1997), o que se produzca una desnaturalizaciôn incompleta de la protefna exponiéndose sobre su superficie los dominios mas bâsicos, ocultândose en su interior los mas ôcidos. El detergente no iônico ariodldo durante la segunda solubilizaciôn desplaza al SDS de la superficie de las protefnas, evitando el efecto de su cargo negativa durante el lEF. Esto se pudo com probar tanto para los marcadores de pl, como para las bandas superior e inferior del doblete de AcMFPl-78 KDa, cuyos pis expérimentales fueron respectivamente de 5,5 y 7,5, independientemente del método de solubilizaciôn utilizodo. El primero de ellos es similar al valor de pl de MFPl de tabaco y tom ate {Jeong et al, 2004: Meier et al, 1996). El método de doble solubilizaciôn es por tanto fiable, y permite establecer el pl experimental de AcMFPl-90 KDa como inequfvocomente bôsico. Los estados hiper-fosforilados de AcMFPl-90 KDa (pl~8,5) poseen lôgicamente un pl mas ôcido que los liipo- fosforilados (pl~9,5), debido a la presencia de un mayor numéro de fosfatos. Son también môs solubles, por su mayor contenido de fosfatos y por tanto de grupos hidroxilos que hocen a la protefna mas hidrofflica y soluble en medios ocuosos, siendo innecesaria la neutralizaciôn previa de los enlaces iônicos con NaCI para su solubilizaciôn, que se liace necesaria para la doble solubilizaciôn de los estados hipo-fosforilodos fuertemente onclodos a la MN. La diferencia de pl entre AcMFPl-90 KDa y el resto de las protefnas MFPl, incluida AcMFPl-78 KDa, se debe probablemente a variaciones entre sus secuencias, ya que algunas de ellas estân muy poco conservadas (-40%) entre especies (Harder et al, 2000). Se tian detectado también diferencias interespecfficas de pl en otras protefnas de matriz nuclear (Stuurman et al, 1990). Ademâs en el caso de trotorse efectivamente una protefna ADN-binding, se sa be que éstas se localizan en dos rongos de pl, uno ligeramente âcido (-5,7) y otro bôsico (-9,0), donde estarîo incluida AcMFPl-90 KDa (Bickmore y Sutherland, 2002). Este pl experimental bôsico de AcMFPl-90 KDa contrasta también con el de las protefnas NAC, grupo de siete protefnas nucleares vegetales componentes de 141 la MN entre las que se encuentra AtMFPI, todas ellas con un extenso dominio coiled-cojl, una serial de localizaciôn nuclear (NLS) en el extreme carboxilo de la protefna y un pl experimental comprendido entre 4,9 y 7,0, y que son candidates a reemplazar funcionalmente en plantas a las laminas animales (Blumenttial et al, 2004). En el caso de AcMFPl-78 KDa sucede todo lo contrario, tiene un pl experimental que esta en el range del de estas protefnas, y es probable que como MFPl de otras especies posea una serial NLS y un dominio coiled-coH, ya que se localiza en el nùcleo y forma polfmeros con una Mr de 160 KDa, es ademâs constitutiva y una fracciôn de la misma se une a la MN, aunque no forma parte de la misma, mostrando por tanto gran semejanza con las protefnas NAC. 3. EXPRESIÔN Y LOCAUZAClÔN DE LAS PROTBNAS AcMFPI EN DISnNTOS TEJIDOS Y nPOS CELULARES DE CBOUA 3.1. AcMFPI-78 KDa es uno protema consMtuNva de cebolla Nuestros resultados suponen el primer estudio comparative de la expresiôn o presencia de las protefnas AcMFPI en células meristemâticas y en distintos tipos celulares dentro de un mismo ôrgono, donde se tian observodo variaciones de expresiôn para las protefnas principales, y detectado isoformos potenciales especfficas de tejido y tipo celular. Independientemente de estas variaciones, se puede afirmar que AcMFPl- 78 KDa es una protefna constitutiva de plantas, ya que se Fia detectado en todas las células estudiadas, independientemente del tipo, estado de diferenciaciôn y tejido. Esto contrasta con los estudios en distintos tejidos diferenciados de tomate, tabaco y Arabidopsls, en los que la expresiôn de MFPl parece ser ôrgano- especffica y depender del estado de desarrollo, detectândose los niveles 142 mâximos de expresiôn en hojas (Jeong et al, 2003; Harder et al, 2000: Meier et al, 1996). , No parecen existir variaciones significativas en los niveles de AcMFPI-78 KDa durante el ciclo celular en células de ratz, lo que sugiere que es poco probable que la protefna pueda estar relacionada con procesos como la serializaciôn de las distintas tases del ciclo o la replicaciôn, como se ha confirmado mediante estudios de co-localizaciôn con marcadores de replicaciôn. Existe un descenso importante en los niveles de la protefna desde la zona de proliferaciôn a las de elongaciôn y maduraciôn de la rafz de cebolla, en la que llega a ser casi indétectable, sugiriendo una menor expresiôn de la protefna en estas ultimas. Este descenso correlaciona con la aporiciôn de un doblete de 63 KDa que no se détecta en células meristemâticas. que podrîa corresponder a protefnas antigénicamente relacionadas o a isoformas de AcMFPI expresadas especfficamente en estas zonas de la rac; o a productos de proteolisis fisiolôgica de AcMFPI-78 KDa, explicando el descenso simultâneo de los niveles de la protefna. En la misma zona radicular y mediante el mismo suero se détecta un patrôn de marcado intercromatfnico topolôgicamente diferente de los patrones de AcMFPI-78 KDa, que refleja probablemente la distribuciôn nuclear de los fragmentos proteoifticos o isoformas de 63 KDa. 3.2. Localizacion subcelular de las isoformas de AcMFPI -78 KDa Existen très fracciones de AcMFPI-78 KDa con distinta solubilidad, que se recogen durante la preparaciôn de MNs en los sobrenadantes Cit / SI : S2 y S3. La primera fracciôn corresponde a la isoforma de mayor Mr del doblete de 78 KDa detectada con el suero 288, que posee un pl experimental de 7,5. Aunque desconocemos su localizaciôn subcelular de manera précisa, nuestros resultados de inmunodetecciôn a alto resoluciôn con este suero muestran un marcado sobre estructuras citoplasmâticos esféricos, algunas asociadas a la parte externa de la envoltura nuclear de células de rafz, cuyo contenido polipeptfdico 143 esperarîamos recoger precisamente en los sobrenadante Gif y SI, y que por su morfologîa y localizaciôn perinuclear podrîan corresponder a plastidios inmaduros ricos en esta isoforma de AcMFPI-78 KDa, similares a los descritos por Meier y colaboradores en células de tabaco en suspensiôn (Jeong et al, 2003; Gindullis y Meier, 1999). La segunda fracciôn, extrafda junto con el ADN y sus protefnas asociadas y recogida en el sobrenadante S2, se localiza fundamentalmente en los îocos nucleares. Hemos demostrado mediante inmunomarcado de alta resoluciôn que estos focos se corresponden con pequerios dominios situados en la periferia de la heterocromatina, donde se localizan entre otras estructuras los lazos de la cromatina activa (Gonzôlez-Melendi et al, 1998), a los que podrîa asociorse de conservarse la capacidad de unir ADN tîpica de MFPl en otras especies (Jeong et al, 2003; Meier et al, 1996). La tercera fracciôn de AcMFPI-78 KDa se extrae con alta fuerza iônica de la matriz nuclear recogiéndose en el sobrenadante S3, junto con el resto de las protefnas nucleares que se unen débilmente a la MN, incluidos las formas hiper- fosforiladas de AcMFPI-90 KDa. La distribuciôn subnuclear de esta fracciôn de AcMFPI-78 KDa por el retfculo de la MN, a la que se une pero de la que no forma parte, se puede observer mediante el suero 91 en nûcleos extrafdos con detergente, DNasa y baja fuerza iônica, al no mezclarse con la serial de las otras dos fracciones de la protefna que ya Han sido extrafdas. Existen cambios en los patrones de distribuciôn de la protefna correlacionados con distintas fases del ciclo y actividades celulares, siendo los môs llamotivos los producidos entre células proliférantes y diferenciadas. La distribuciôn de AcMFPI-78 KDa en células proliférantes de la rafz, donde los niveles de la protefna doblan ampliamente a los de células diferenciadas, coincide mayoritariamente con el modelo punteado de distribuciôn de los focos; mientras que en las células no-meristemôticas se detectan dos poblaciones celulares, que presentan los patrones punteado y reticulado, siendo el ultimo el mayoritorio. Esta redistribuciôn de los focos de AcMFPI-78 KDa entre células 144 proliférantes y diferenciadas es similar a la de muctias protefnas organizadoras de la cromatina, que son redistribuidas durante la reestructuraciôn de la eucromotina en los cambios de expresiôn génica que suceden durante la transiciôn proliferaciôn-diferenciaciôn (Parada et al, 2004; Reimer et al. 2003), y que obedecen en la mayorîa de los casos a modificaciones postraduccionales, como sucede por ejemplo con las protefnas HMG de uniôn a los nucleosomas, la nucleolina o el factor UBF (Tu et al, 2003; Hock et al, 1998), estando dichas modificaciones aùn por determiner en el caso de AcMFPI-78 KDa. Se ha detectado también un pequerio porcentaje de células de la zona de proliferaciôn en la fase G2 del ciclo celular que sigue el patrôn reticulado para los focos de AcMFPI-78 KDa. Esta redistribuciôn de los focos del patrôn punteado al reticulado podrîa ser rapide, transitoria y producirse en todas las células proliférantes antes de su entrada en mitosis; aunque también podrîa afectar a una pequeria fracciôn celular de la zona de proliferaciôn que comienza a diferenciarse durante su “ultima” fase G2, ya que en la zona de elongaciôn adyacente muchas de las células que siguen el patrôn reticulado muestran contenidos 4C de ADN. En el nucleolo, AcMFPI-78 KDa se distribuye de manera relativamente homogénea y sin asociaciôn preferente con ninguno de sus très subdominios funcionales, lo que descartarîo una asociaciôn de la protefna al ADN descondensado como en el nucleoplasma, ya que éste se localiza en la periferia de los centros fibrilares (Show et al, 2002; Gonzôlez-Melendi et al, 2001 ; Bossy et al, 2000). La localizaciôn nucleolar de AcMFPI-78 KDa no es constante en todas las células, siendo poco frecuente en las proliférantes y frecuente en las células diferenciadas. Existe protefna nucleolar en todos los nucleolos de células de hojas, y sin embargo en ninguno en las de la zona de elongaciôn radicular. Esto indica que la protefna no tendrîa una funciôn en la actividad biosintética del nucleolo, sino que estorîa relacionada con otras funciones nucleolares distintas de la biosfntesis de ribosomas, como la maduraciôn y el "secuestro” de protefnas (Catala et al, 2004; Eilbracht et al, 2004; Le Goff et al, 2004; Goo et al, 2003; Oison et al, 2002; Pederson, 2002). Esta posibilidad no se podrô com probar hasta 145 conocer mas detalladam ente su fundonalidad y dinamica intranuclear, o la existendq de una cadena de modificaciones en subdominios concretos del nucleo. Los focos de AcMFPI-78 KDa se localizan en la region intercromatinica siguiendo el reticulo intranuclear. En algunos casos adoptan posiciones adyacentes a los cuerpos de Cojal, en lo que podn'a ser una interaccion transitoria entre ambos dominios nucleares, como sucede con otros cuerpos nucleares andodos a la MN (Ariumi et al, 2003: Weger et al, 2003), aunque también podria ser una coincidencia provocada por la alta densidad nuclear de ambas estructuras. A su vez, el analisis de co-localizacion de los focos de AcMFPI y los de sintesis activa de ADN descarta su implicaciôn directa en los procesos de replicaciôn, aunque demuestre la presencia de ADN en al menos una proporciôn de focos de AcMFPI-78 KDa. 3.3. AcMFPI-78 KDa posee una doble localizacion nuclear y cloroplasfica, pero no co-locailza con e# ADN condensodo del nucleoide El genoma del cloroplasto se organize en estructuras denominadas nucleoides, cuya morfologfa, numéro, tamorio y localizaciôn cambian durante el desarrollo de los plastidios a cloroplastos maduros fotosintéticamente compétentes, asi como durante su conversiôn a otro tipo de plastidios (Kuroiwa, 1991). El genoma del cloroplasto codifica productos génicos involucrados en la fotosfntesis y la cadena de transferencia de electrones, asi como protefnas que forman parte de la maquinaria transcripcional y traduccional del organulo, aunque la mayorîa de las protefnas del cloroplasto estân codificadas en el nûcleo y se im porta n postraduccionalmente (Chi-Ham et al, 2002). El nucleoide es un complejo de unas 2^m formado por unas diez copias de ADN cloroplôstico, ARN, enzimas de transcripciôn y replicaciôn, factores de transcripciôn y protefnas estructurales de uniôn a ADN (Sato, 2001), aunque poco se sa be sobre estas ultimas; ni sobre el mecanismo de organizaciôn topolôgica del ADN del 146 cloroplasto (Kobayashi et al, 2002). Se han descrito algunas de ellas, aunque ninguno posee una Mr de 80 KDa como MFPl (Sato, 2001), y solo STEPl (Single- stranded TEIomere-binding Protein I) ho sido recientemente descrito como protefna con une doble localizaciôn en nûcleos y cloroplastos (Kwon y Chung, 2004). Ambos sueros anti-MFPl detectan la protefna en los cloroplastos maduros de hojas de tabaco, Arabidopsls y cebolla, y por tanto en este ultimo caso se tratorîa de la isoforma de 78 KDa, ya que es la ûnica detectada por ambos sueros. MFPl se acumula en focos de tamorio similar al del nucleoide, aunque normalmente en mayor nûmero, y no co-localiza con el ADN condensodo del mismo, como demuestra la tinciôn con DAPI, en contra de lo que se habfa propuesto (Jeong et al, 2003). Las seriales de fluorescencia de MFPl coinciden con las del ADN cloroplôstico descondensado, distribuidos por distintas zonas del cloroplasto, y conectadas entre sf en muchos casos (Sato, 2001 ). La coincidencia topolôgica en estas regiones séria compatible con la interacciôn propuesta entre MFPl y el ADN (Jeong et al, 2003), ya que la fracciôn nuclear de la protefna también interacciona con las regiones menos condensadas del ADN nuclear. El patrôn de distribuciôn de MFPl en el cloroplasto esta altamente conservado entre especies, a diferencia del patrôn nuclear, que varia segûn las caracterîsticas ultraestructurales especfficas de sus nûcleos. Esta distribuciôn conservada de la protefna refleja a su vez la organizaciôn conservada del cloroplasto, debido probablemente a su comûn origen unicelular ancestral (Koumandoü et al, 2004). 3.4. AcMFPI -90 KDa no es une protema consfifutiva de cebolia A diferencia de AcMFPI-78 KDa, la protefna de 90 KDa no es constitutiva ya que no esta présente en todas las células, y su patrôn de expresiôn varia entre células de un mismo ôrgono. Los estudios comparotivos de los niveles de AcMFPl- 90 KDa en células sincronizadas muestran que no existen variaciones durante el ciclo celular, aunque la apariciôn de formas hiper-fosforiladas de la protefna al 147 final de la fase de sintesis y durante G2, que no afectan de manera apreciable a la distribuciôn de la protefna, podrîa estar asociada a su desensamblaje de la MN previo a la mitosis, lo que como se lia descrito anteriormente es muy frecuente en las protefnas del nucleoesqueleto, como sucede con NuMA por ejemplo {Saredi et a i 1997). Los estudios de inmunodetecciôn en membrana demuestran variaciones significativas en los niveles de AcMFPI-90 KDa entre las distintas zonas de la ralz, siendo môs abundante la protefna en células proliférantes que en diferenciadas. Aunque existe una relaciôn clara entre el descenso de los niveles de la protefna y la reducciôn del numéro de cuerpos a lo largo de la ralz, no podemos asegurar que ésta ultima esté producida por la disminuciôn de la expresiôn de la protefna, ya que no tenemos una estimaciôn de la concentraciôn total de protefna en los cuerpos y ademôs éstos podrîan fusionarse, como hacen por ejemplo los cuerpos de Cajal (Boudonck et al, 1999). Nuestros resultados demuestran una expresiôn ôrgano-especffica de MFPl de acuerdo con la descrita en otras especies, donde se expresa en una forma (Harder et al, 2000), pero ademôs reflejan diferencias de expresiôn dentro de un mismo ôrgono vegetal, indicando la existencia de un nivel môs fino de regulaciôn. 3.5. AcMFPI -90 KDa se localiza asociada al nucleoesqueleto y en una nueva categorîa de cuerpos nucleares Nuestros resultados sobre la expresiôn de AcMFPI son novedosos y serôn sin duda de gran utilidad para el futuro descubrimiento de la funciôn (es) de la protefna, pero los resultados quizô môs interesantes sobre AcMFPI-90 KDa sean los relocionados con su distribuciôn intranuclear, ya que es una de las pocas protefnas descritos del nucleoesqueleto de plantas (Samaniego et al, 2001; Samoniego, 1999), junto con los protefnas semejantes a laminas (Mfnguez y Moreno Dfoz de la Espina, 1993), NMCPl (Masuda et al, 1999), los homôlogos de 148 NuMA (Yu y Moreno Diaz de la Espina, 1999) y las protefnas nucleares tipo filomentaintennedlo (Blumenttial et ah 2004). Ademâs, cantidades importantes de la protefna se acumulan en una nueva categorîa de cuerpos nucleares, distintos en tamorio, nûmero y distribuciôn de los cuerpos descritos hasta el momento, no sôlo en cebolla, sino en plantas en general, entre los que se encuentran los cuerpos de Cajal (Gui y Moreno Dfaz de la Espina, 2003) y los cuerpos de GOPl (Reyes, 2001). Son diferentes también de las estructuras centroméricas, que constituyen subdominios nucleares ultraestructuralmente distinguibles mediante ME, y que como en el caso de los cuerpos de Gajal carecen de marcado significativo con los sueros anti-MFPl. El analisis estadfstico del nûmero de cuerpos marcados en distintos tipos de células y tejidos, muestra la existencia de cuatro grupos celulares con diferencias significativas en sus médias de cuerpos de AcMFPI-90 KDa: las môs altas corresponden a las células proliférantes, independientemente de la fase del ciclo celulan le siguen las células no meristemôticas de las hojas crecidas en presencia de un ciclo de luz/oscuridad; el tercer grupo lo constituyen las células meristemôticas en estado durmiente o quiescente; y el ûltimo grupo estô formado por las células en distintos estados de diferenciaciôn de las zonas de elongaciôn y maduraciôn de la rafz, y por las células no meristemôticas de hojas crecidas en total oscuridad. Estos cuatro grupos muestran claramente que el nûmero de cuerpos, y quizô la expresiôn de la protefna, estôn estimulados por la proliferaciôn celular y la luz, en el caso de las células no meristemôticas; aunque también podrîa suceder que el nûmero de cuerpos se vea disminuido durante la diferenciaciôn celular. La localizaciôn de AcMFPI-90 KDa en el nucleoesqueleto y en cuerpos anclados al mismo sugieren un papel estructural para la protefna en la matriz nuclear, desde donde podrîa participar en la organizaciôn de! genoma y/o los subdominios funcionales del nûcleo. Sin embargo, es poco probable que AcMFPI-90 KDa constituya los filamentos bôsicos del nucleoesqueleto vegetal, ya 149 que ni se distribuye de forma regular por los mismos {Samoniego et ol, 2001; Samaniego, 1999), ni se expresa de manera constitutiva, que séria lo esperable para una protefna de este tipo. AcMFPI-90 Kda présenta similitudes con la protefna 4.1 de la MN de células animales, principalmente en la existencia de isoformas y la localizaciôn de la protefna fosforilada, que refuerzan la hipôtesis de que MFPl tiene un papel estructural en el nucleoesqueleto de plantas. La protefna 4.1 présenta numerosas bandas nucleares inmunoreactivas con caracterîsticas de solubilidad y Mr muy parecidas a algunas de las bandas de la fa milia de protefnas antigénicamente relacionadas con MFPl en cebolla, incluyendo entre otras una banda de 55 KDa detectada en la fracciôn citoplasmôtica y en el sobrenadante recogido tras la extracciôn con detergente; un doblete de 75 KDa en el que la banda superior perm anece unida a la MN y la inferior se extrae con detergente; y dos bandas de 135 y 175 KDa extrafbles con DNasa y sulfato amônico (de Career et ah 1995). Estas isoformas se generon mediante el uso variable de sitios de iniciaciôn de la traducciôn, splicing altemativo y modificaciones postraduccionales, incluida la fosforilaciôn (Krauss et ah 1997; Correas, 1991). La fracciôn nuclecr de la protefna 4.1 se redistrîbuye durante el ciclo celular y el desarrollo por la MN (Krauss et ah 2002). Posee dos secuencias NLS y distintos dominios que le permiten interaccionar con NuMA, y former estructuras triméricas con la actina y la espectrina (Krauss et ah 2002 y 1997; de Career et ah 1995). Se ha comprobado recientemente mediante feSEM que la protefna 4.1 se distribuye de forma periôdica sobre los filamentos del nucleoesqueleto, acumulôndose ademôs en estructuras esféricas nucleares no identificodas (Kiseleva et ai, 2004), lo que supone uno distribuciôn similar a la de AcMFPI-90 KDa, detectada mediante inmunomarcado para ME en cortes semifinos sin résina (Samoniego et ol, 2001 ; Samaniego, 1999). 150 La protefna 4.1 forma parte de un grupo emergente de protefnas estructurales clâsicas del citoesqueleto que estân revelando también como protefnas estructurales del nucleoesqueleto, como la actina y sus protefnas relacionadas (ARPs: Acfin Related Profeins), la miosina y la espectrina (Bettinger et al, 2004); los Fieterôlogos de esta ultima se han detectado en la matriz nuclear vegetal {De Ruijter et al, 2000), y también se han descrito varios tipos de ARPs en el nûcleo vegetal (Kandasamy et al, 2004). Estas protefnas podrîan formar parte de la estructura del nucleoesqueleto (Bettinger et al, 2004), y mas concretamente de la red de filamentos que conecta los poros nucleares con regiones perinucleolares y con distintos cuerpos nucleares, en la que se han detectado la actina y la protefna 4.1 (Kiseleva et al, 2004), protefnas clâsicas de la matriz nuclear como EAST, skeletor, enaptin y nuance (Bettinger et al, 2004; Padmakumar et af, 2004; Wasser y Chia, 2000; Walker et al, 2000), y protefnas coiled-coil como TRP (Translocated Promoter Region) (Fontouro et af, 2001). Se piensa que esta red de filamentos forma una espacio intercromatfnico protegido de la oclusiôn de la cromatina, que constituye una red de “canales de difusiôn” a través de la cromatina, desde y hacia los poros nucleares y distintos subdominios nucleares, involucrada en la arquitectura nuclear y en el transporte de moléculas por el nûcleo (Kiseleva et al, 2004). 4. IMPLICACIONES FUNCIONALES DE MFPl Los estudios ultraestructurales de microscopfa electrônica muestran que las protefnas AcMFPI se distribuyen en pequerios subdominios y cuerpos nucleares situados en la region intercromatfnico, dominio nuclear en el que se localizan, entre otros, los complejos de replicaciôn del ADN, los de transcripciôn y procesamiento del ARN, las moléculas de ôcidos nucleicos que von siendo sintetizadas, los cuerpos de Cajal, los grônulos intercromatfnicos, los lazos de cromatina activa descondensado, y la matriz nuclear que los organize a todos ellos (Jaunin y Fakan, 2002: Show et al, 2002: Gonzôlez-Melendi et al, 1998). Los estudios de co-localizaciôn con distintos marcadores nucleares han demostrado que no existe una asociaciôn espacioI preferente o significativo de las protefnas 151 AcMFP 1 con los focos de replicaciôn, ni con los de transcripciôn-procesamiento; ni tampopo con los sitios de acumulaciôn y maduraciôn de los snRNAs como los cuerpos de Cajal o los grônulos intercromatfnicos. Los estudios de fraccionamiento celular han demostrado a su vez que las protefnas MFPl forman parte de la MN, y que en el caso de AcMFPt-78 KDa una fracciôn de la protefna podrfa estar unida a matriz, mientras que otra se unirîa a la cromatina. Estudios anteriores habfan demostrado también que MFPl puede reconocer y unir secuencias MAR (Meier et al. 1996) y/o ADN (Jeong et al. 2004 y 2003), aunque en nuestro caso no disponemos de las pruebas directes que demuestran dicha capacidad para las protefnas de cebolla, al no ser definitives nuestros resultados de South-Westem. Si a todo lo anterior se suma el hecho de que presentan cierta simHitud de secuencia con protefnas componentes de la matriz nudear como las laminas, NuMA y la miosina (Meier et al, 1996), asf como su semejanza en muchos aspectos con la protefna 4.1 del nucleoesqueleto animal, se podrîa sugerir que MFPl es una protefna estructural de la matriz nuclear, y que podrîa participar en algunas(s) de las funciones de la misma, desde las relacionadas con la arquitectura nuclear y la organizaciôn del genoma, hasta las implicadas indirecta pero vitalmente en procesos nucleares como la expresiôn génica, cuyos complejos enzimôticos y factores de regulaciôn se ensamblan y organizan sobre la MN (Jackson, 2003 a, b). Nuestros resultados sobre la distribuciôn subcelular de MFPl suponen un importante avance en el conocimiento de MFPl, ya que hasta el momento no se habfa podido demostrar la distribuciôn de la protefna en el nûcleo (Jeong et al, 2003; Gindullis y Meier, 1999), ni tompoco su asociaciôn a la matriz nuclear. Se habfa sugerido incluso que las bandas de MFPl detectadas en las fracciones nucleares de distintas especies podrîan corresponder a contaminociones con la protefna de los cloroplastos (Jeong et al, 2003). Nuestro protocolo de incubociôn de nûcleos en suspensiôn ha permitido la incorporaciôn de los sueros anti-MFPl a su interior, detectando la protefna de manera inequfvoca en subdominios nucleares de cuatro especies distintas. Aunque tos cloroplastos contominan las fracciones de nûcleos aislodos de hojo, ya que ambos orgônulos co-purificon 152 durante el fraccionamiento celular, las técnicas de inmunodetecciôn in situ permiten'determinar con precisiôn la distribuciôn de las protefnas en cada uno de ellos. Los estudios previos de localizaciôn de MFPl-GFP en células transfectadas de tabaco en suspensiôn, sôlo habfan permitido detector la protefna de fusiôn en los plastidios vegetales que rodean al nûcleo (Jeong et af, 2003; Gindullis y Meier, 1999), donde al contrario que en los nûcleos no parecen existir limitaciones de acceso para la protefna quimérica. Nuestros resultados de IF demuestran que MFPl esta también localizada en los cloroplastos maduros de hojas de plantas silvestres. Aparté de la funciôn o funciones exactes de MFPl, existen otras cuestiones desconocidas actualmente, como si la fundonalidad nuclear de MFPl esta conservada en el cloroplasto, o en el caso de cebolla si las dos protefnas AcMFPI comparten una misma funciôn. Evidentemente no podemos resolver estas cuestiones con total fiabilidad, pero nuestros resultados serian compatibles con una funciôn organizadora del ADN en el nûcleo y el cloroplasto, ya que en ambos orgônulos MFPl se localiza en dominios donde existe ADN descondensado de ambos genomas. En el caso de cebolla, las diferencias entre las dos protefnas AcMFPI principales son importantes, AcMFP 1-78 KDa es constitutiva y estô asociada a la eucromatina y la MN; mientras que AcMFP 1-90 KDa no es constitutiva, sigue patrones de expresiôn relocionados con la proliferaciôn celular y la luz, y es una protefna estructural de la matriz nuclear. Todo ello sugiere que podrîan ejercer funciones nucleares diferentes, o al menos que ejercen una funciôn similar reguladas de distinta manera. Hemos culminado con éxito la mayorîa de los objetivos propuestos en esta Tesis Doctoral, caracterizando dos protefnas principales homôlogos de MFPl en cebolla, lo que supone una interesante peculiaridad para la especie, ya que en el resto de los organismos estudiodos sôlo se ha detectado una protefna. Se han 153 descrito por primera vez sus patrones de expresiôn y distribuciôn nuclear a lo largo dej ciclo celular, y en distintos tipos celulares y tejidos vegetales; habiéndose demostrado también que la CK2 endôgeno es capaz de regular la uniôn de AcMFP 1-90 KDa a la MN. Aunque no tiemos logrado esclarecer la fundonalidad exacta de MFPl, se han acotado de manera significativo las distintos posibilidades, al descartar su implicaciôn directe en la replicaciôn del ADN, la transcripciôn y el procesamiento del ARNm, la maduraciôn de los snRNAs en los cuerpos de Cajal y grônulos intercromatfnicos, asf como la organizaciôn de la tieterocromatina y las estructuras centroméricas. Las isoformas de AcMFPI de 78 KDo y 90 KDo ejercen sus funciones asociadas a la eucromatina y el nucleoesqueleto, respectivamente. AcMFP 1-90 KDa es probablemente una protefna estructural del nucleoesqueleto, pudiendo participar en la organizaciôn del genoma y/o la de los distintos dominios nucleares, y se acumula en cuerpos nucleares que no habfan sido descritos hasta el momento. Hemos demostrado ademôs que existe una fracciôn nuclear de MFPl y que forma parte de la MN en distintas especies vegetales, y otra segunda fracciôn de MFPl en los cloroplastos maduros de hojo, donde présenta un patrôn de distribuciôn conservado entre especies, sin que se produzca co-localizaciôn total entre la protefna y el nucleoide, pero con interacciôn con el ADN descondensado del cloroplasto. 154 CONCLUSIONES 1- Existen dos homôlogos principales de la protefna MFPl en Afiium cepa: AcMFP 1-90 KDa y AcMFPI-78 KDa, éste ûltimo con valores de movilidod relative y de pl (-5,5) similares a los de MFPl en otros sistemas vegetales. 2- Existen dos fracciones subnucleares de AcMFPI-78 KDa con distinta solubilidad. La primera se extrae de los nûcleos mediante baja fuerza iônica, mientras que la segunda se une débilmente a la matriz nuclear siendo necesario utilizer alta fuerza para su extracciôn. 3- AcMFP 1-78 KDa présenta un estado polimerizado detectado como una banda de 160 KDa, que sôlo se desnaturaliza completamente mediante calor y altos concentraciones de detergente y urea. 4- AcMFP 1-78 KDa es una protefna constitutiva, detectada en el nûcleo de células proliférantes, y en el de células durmientes y diferenciadas de rafz y de hojo de cebolla. En la rafz, la maxima expresiôn de la protefna se détecta en las células meristemâticas, siendo menor en las no meristemôticas. 5- La protefna AcMFP 1-78 KDa se distribuye por très subdominios nucleares: en numerosos focos de 100-300 nm de diômetro, en el nucleolo y de forma dispersa por el retfculo nucleopiôsmico, redistribuyéndose entre ellos en funciôn del tipo celular. Los focos de m arcado pueden adoptar dos patrones de distribuciôn, uno punteado donde a parecen distribuidos por todo el espacio nuclear de células meristemôticas y no meristemôticas, a excepciôn del nucleolo; y un patrôn reticulado detectado principalmente en células no meristemôticas y caracterizado por su coexistencia con una red nuclear sin marcado. 6- Los focos de marcado detectados mediante inmunofluorescencia se observan mediante microscopfa electrônica como estructuras taxas distribuidas por la periferia de las masas densas de cromatina. El resto del marcado es môs disperse y se distribuye preferentemente por la regiôn intercromatfnica y el nucleolo. 155 7- E| suero 288 detecto una isoforma adicional de AcMFP 1-78 KDa con diferencias mfnimas de Mr y pl, observada como la banda inferior de un doblete de 78 KDa en geles de electroforesis, y se comporta como una protefna nuclear soluble y/o asociada a la envoltura nuclear. 8- AcMFPI-78 KDa no forma porte de los complejos de transcripciôn y splicing del pre-ARNm, la maduraciôn del snRNA ni la replicaciôn del ADN, a pesarde la semejanza entre el patrôn punteado de AcMFP 1-78 KDo y el patrôn III de los focos de replicaciôn. 9- La protefna AcMFP 1-90 KDo présenta distintos estados de fosforilaciôn, y su asociaciôn a la matriz nuclear esta regulada mediante Casefna Kinasa CK2. Las formas hipo-fosforiladas, cuyo valor de pl es -9,5, permanecen fuertemente unidas a la MN, resistiendo una extracciôn con alta fuerza iônica; mientras que las hiper-fosforiladas, cuyo pl es de -8,5, estân asociadas mas débilmente y se extraen con alta fuerza iônica. En células proliférantes la fosforilaciôn varia a lo largo del ciclo celular, aumentando las formas hiper-fosforiladas de manera creciente en el S-tardfo y G2. 10- AcMFP 1-90 KDa no es una protefna constitutiva, y su expresiôn varia en funciôn del tipo celular y la presencia de luz. Se distribuye por el retfculo de la matriz nuclear, y se acumula en cuerpos nucleares de tamario variable comprendidos en dos rangos de diômetro: -1,7 îm y -0 ,9 nm. 11- El numéro de cuerpos nucleares de AcMFP 1-90 KDa alcanza môximos en células no meristemôticas de hoja crecidas en presencia de luz y en células proliférantes de rafz, en estas ultimas su numéro y distribuciôn no varia a lo largo del ciclo celular. 12- AcMFP 1-78 KDa, al igual que NtMFPl y AtMFPI, posee una doble localizaciôn en el nûcleo celular y los cloroplastos, en estos ûltimos MFP1 muestra un marcado en focos y difuso por el retfculo del cloroplasto, y no colocaliza con 156 el ADN condensodo del nucleoide, aunque podria hacerio con el ADN cloroplâstico descondensado. 13- Debido a sus caracterîsticas, AcMFP 1-78 KDo podria ser una protefna relacionada con la eucromatina, mientras que las de AcMFPI-90 KDo apuntan a una protefna estructural del nucleoesqueleto, donde podria participar en alguna(s) de las funciones atribuidas a esta estructura. 157 BIBLIOGRAFIA • Acevedo R, Samaniego R y Moreno Diaz de la Espina S (2002) Coiled bodies in nuclei from plant cells evolving from dormancy to proliferation. 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