UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 

 
FACULTAD DE FARMACIA 

 
Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica 

 
 
 

 
 
 
 

SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN 
“h-MAM” EN CÁNCER DE MAMA HUMANO 

 
 
 
  

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR 

PRESENTADA POR 

María José Núñez Villar 
 

  
 

Bajo la dirección del doctor 

José Schneider Fontán 
 
 

 
Madrid, 2002 

 
 
ISBN: 84-669-2036-6 



1 INTRODUCCIÓN 

1.1 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS 
1.1.1  ETIOLOGÍA Y PATOGÉNESIS DEL CÁNCER DE MAMA 

HUMANO 

 Factores hormonales 

 Factores genéticos 

 Factores ambientales 

 Antecedentes de enfermedad benigna de mama 

1.2 FACTORES PRÓNOSTICOS EN CÁNCER DE 

MAMA 
1.2.1 FACTORES PRONÓSTICOS CLÁSICOS 

1.2.1.1 Edad 

1.2.1.2 Tamaño 

1.2.1.3 Tipo histológico 

1.2.1.4 Ganglios linfáticos 

1.2.1.5 Ploidía y actividad proliferativa 

1.2.1.6 Grado de diferenciación celular 

 

1.2.2.  FACTORES PRONÓSTICOS MOLECULARES 
 
2.2.1.  Aspectos generales 
 
1.3 ALTERACIONES MOLECULARES EN EL 

CARCINOMA DE MAMA 

1.3.1 GENES SUPRESORES Y PÉRDIDA DE HETEROCIGOSIDAD 

p53 
 
retinoblastoma 
 
ciclinas D 
 
ciclina E 
 

1.3.2 ONCOGENES Y AMPLIFICACIÓN GÉNICA 

 c-erbB2 
 
Bcl-2 y Bax 



1.4 EVENTOS TEMPRANOS Y TARDIOS EN EL DESARROLLO 

TUMORAL 

 

1.5 FACTORES PRONÓSTICOS MOLECULARES 

RELACIONADOS CON LA INVASIÓN Y METÁSTASIS  

 1.5.1 CRECIMIENTO 

 1.5.2 VASCULARIZACIÓN DEL TUMOR 

(ANGIOGÉNESIS) 

 1.5.3 SEPARACIÓN DE LAS CÉLULAS DEL TUMOR E 

INTRAVASACIÓN 

 1.5.4 EXTRAVASACIÓN 

 1.5.5 MIGRACIÓN E INVASIÓN 

 1.5.6 CRECIMIENTO 

  1.5.7 CAMBIOS GENÉTICOS IMPLICADOS EN LA 

METÁSTASIS 

CD44 
 
1.6 MAMOGLOBINA HUMANA (h-MAM) 

 

2 OBJETIVOS 
 

3 MATERIALES Y MÉTODOS 

 
 3.1 MUESTRAS TUMORALES 
 
 3.2 INMUNOHISTOQUÍMICA 

  3.2.1 Anticuerpos 

  3.2.2 Interpretación de resultados inmunohistoquímicos  

 3.3 CITOMETRÍA 
 3.3.1 Tratamiento de las muestras para análisis por 

citometría de flujo 
 
 



3.3.1.1  Tratamiento de las muestras tumorales para análisis del ciclo 

celular por citometría de flujo 

3.3.1.2  Tratamiento de las muestras tumorales para análisis de 

marcadores reguladores de la tumorogénesis: Bcl-2, Bax y VEGF 

3.3.2 Anticuerpos 

3.3.3 Interpretación de resultados citométricos  

3.4. EXTRACCIÓN DE RNA DE LAS MUESTRAS 
TUMORALES 
 
 
3.4.1 Tratamiento de las muestras para la extracción del RNA 
3.5 RT-PCR 
3.5.1  Interpretación de resultados 

3.6 ESPECTROFOTOMETRÍA 

3.7 CUANTIFICACIÓN DE h-MAM 
3.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 

4 DISCUSIÓN 

5 CONCLUSIONES 

6 BIBLIOAGRAFÍA 
 



              
  Abreviaturas 

 

Abreviaturas más comunes usadas en el texto 
 

 
 

 
AFs   proteínas receptoras intracelulares 
Apt   activador de plasminógeno tisular 
AT   ataxia-teleangiectasia 
CAMs   moléculas de adhesión celular 
CD44std   CD44 estándar 
CDI   carcinoma ductal infiltrante 
CDIS   carcinoma ductal “in situ” 
cdk   kinasa dependiente de ciclina 
cDNA   ácido desoxiribonucleico complementario 
CLI   carcinoma lobulillar infiltrante 
DNA   ácido desoxirribonucleico 
dNTP   deoxinucleótido trifosfato 
EF   factor de elongación 
EGF   factor de crecimiento epitelial 
EGFr   receptor de factor de crecimiento epitelial 
FAD   fibroadenoma 
fase S    fase de síntesis del ciclo celular 
FISH   “fluorescent in situ hybriditation” 
gap   proteína activadora de la GTPasa 
GH   grado histológico 
GN   grado nuclear 
Gp   glicoproteína 
GTP   guanosín trifosfato 
H2O2   peróxido de hidrógeno 
HDA   hiperplasia ductal atípica 
HDAC   histoadenilacetilasa 
HIER   “heat-induced epitope retrieval” 
h-MAM   mamoglobina humana 
hsp   proteína de estrés térmico 
HSR    “homogeneously staining regions” 
ID    índice de DNA 
IHQ   inmunohistoquímica 
ILE   intervalo libre de enfermedad 
Kb   kilobase 
LOH   pérdida de heterocigosidad 
MFQ   mastopatía fibroquística 
MHC   complejo principal de histocompatibilidad 
µ micra 
min   minuto 
ml    mililitro 
mm   milímetros 
nm   nanómetro 



              
  Abreviaturas 

 

jNMP   metaloproteinasas 
OMS   organización mundial de la salud 
pb    pares de bases 
PBS   “phosphate buffered saline” (solución fosfato tamponado) 
PCR   reacción en cadena de la polimerasa 
PCR-SSCP  “polimerase chain reaction-single strand polymorphism” 
p-Rb   retinoblastoma fosforilado 
RE   receptor de estrógeno 
RNA   ácido ribonucleico 
RNAm   ácido ribonucleico mensajero 
RP   receptor de progesterona 
rpm   revoluciones por minuto 
rPSC3   esteroide prostático de rata C3 de prostateína 
RT-PCR   “reverse transcriptase” PCR 
rUg   uteroglobina de conejo 
SBP-r   receptor de proteína de unión a los esteroides sexuales 
seg   segundo 
SERM   modulador selectivo de los RE 
SG   supervivencia global 
TGF-β   factor de crecimiento de transformación β 
TK   tirosín kinasa 
ug    nanogramos 
ul    microlitro 
Um   nanómetros 
uPA   activador del plasminógeno “urokinasa like” 
v    voltios 
VEGF   factor de crecimiento endotelial epitelial 



 
Introducción 

 2

1 INTRODUCCIÓN 
 

 

1.1 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS 

 

 

 El cáncer de mama es la neoplasia femenina más frecuente, ya que más del 

8-9% de las mujeres desarrollan la enfermedad a lo largo de su vida (Gairard B et 

al. 1998). 

 

 A lo largo de todo el siglo XX, se ha producido un aumento constante en la 

incidencia de cáncer de mama, tanto en países con mayores incidencias de la 

enfermedad (Estados Unidos de América, Europa y Australia), como en otros con 

incidencias menores (Japón y China). Así, por ejemplo, en 1999, en los Estados 

Unidos de América, se diagnosticaron 176.300 nuevos casos y fallecieron 43.700 

mujeres por cáncer de mama (Landis SH, 1999). 

  

 España es un país con una incidencia de tipo medio, al igual que los países 

del  sur de Europa. En el periodo de 1990-1994, fallecieron 28.250 mujeres a causa 

de la enfermedad, aumentando el número de casos desde 1980 (Levi et al. 1999). 

 

 Representando el cáncer de mama la causa de mayor mortalidad por cáncer 

en el sexo femenino, no resulta extraño que numerosos grupos de trabajo hayan 

centrado su actividad investigadora en el estudio de su biología, no sólo con el 

objetivo de conocer su génesis y evolución, sino también con el de trasladar a la 

clínica parámetros diagnósticos y pronósticos. 

 

 

 

 

 



 
Introducción 

 3

1.1.1 ETIOLOGÍA Y PATOGÉNESIS DEL CÁNCER DE MAMA 

HUMANO 

 

 

 No se conoce en la actualidad la causa del cáncer de mama. No obstante, 

existen factores, tanto exógenos como endógenos, que se asocian con un 

incremento de incidencia de la enfermedad. Esos factores se pueden clasificar en 

hormonales, genéticos, ambientales y asociados a la existencia de enfermedades 

benignas previas. 

 

 Factores hormonales 

 

 El desarrollo de la biología molecular ha establecido la asociación entre 

factores de riesgo de cáncer de mama y el polimorfismo genético de varias 

enzimas implicadas en la biosíntesis y el metabolismo estrogénico (Miyoshi et al. 

2000). Los estrógenos son mitógenos que incrementan el ritmo proliferativo 

celular, favoreciendo el paso de células de G0 al ciclo celular, reduciendo la 

duración de G1 y del ciclo en su conjunto (Schuchard et al. 1993). Debido a este 

mecanismo de acción, pueden favorecer la acumulación de errores genéticos 

producidos al azar, y finalmente podrían dar como resultado el desarrollo de la 

neoplasia (Colditz et al. 1998; Vergote et al. 2000). 

 

 Estudios epidemiológicos han mostrado que la exposición prolongada a 

niveles elevados de estrógenos, ya sean endógenos o exógenos, está asociada a alto 

riesgo de cáncer de mama. Así, menarquia temprana, menopausia tardía, 

nuliparidad, obesidad y el uso de hormonas en postmenopáusicas, son factores de 

riesgo para el desarrollo de la neoplasia (Miyoshi et al. 2000). La menarquia antes 

de los 14 años multiplica el riesgo de cáncer de mama por un factor de 1.1 a 1.9 

comparado con la menarquia después de los 14 años (MacMahon et al. 1982; 

Saracci et al. 1978). 

  



 
Introducción 

 4

 De forma similar, la menopausia tardía también incrementa el riesgo: 

mujeres con menopausia antes de los 45 años tienen la mitad de riesgo que las 

mujeres que la tuvieron después de los 55. (Henderson, 1989) Parece que cuanto 

más larga es la vida menstrual mayor es la incidencia de cáncer de mama (Verheul 

et al. 2000). 

 

 El riesgo de cáncer de mama para una mujer que tiene su primer hijo vivo 

después de los 30 años es casi el doble que el de la que lo tiene antes de los 20 

años. En las nulíparas el riesgo se multiplica por tres (Trichopoulus et al. 1983; 

Brinton et al 1983). El efecto protector del embarazo también ha sido estudiado en 

relación con la gestación múltiple, siendo menor el riesgo en mujeres con gemelos, 

que en aquellas que tuvieron un solo hijo (Lumbe et al. 1996). 

 

 Se han publicado numerosos estudios sobre la posible relación entre la 

administración de estrógenos exógenos y el riesgo de cáncer de mama, y parece 

que ésta podría aumentar moderadamente el riesgo de padecer la enfermedad, 

tanto en mujeres premenopáusicas, como postmenopáusicas. Sin embargo, son 

mayores los beneficios del tratamiento que el potencial de riesgo (Scheefe et al. 

1999; Koukoulis, 2000; Hulka et al. 2001). Además, los estudios publicados sobre 

la administración de estrógenos y progestágenos exógenos, ya sean 

anticonceptivos orales o terapia hormonal sustitutiva, son conflictivos y deben ser 

interpretados cautelosamente debido a los cambios en las dosis de hormonas en el 

tiempo y a los métodos de administración empleados (Helzlsouer et al. 1995). 

 

 En cuanto a la concentración de hormonas circulantes en postmenopáusicas, 

las concentraciones de estradiol, testosterona libre y prolactina en plasma están 

fuertemente asociadas con el riesgo de cáncer de mama. No existen diferencias 

significativas entre postmenopáusicas con y sin cáncer de mama, respecto a las 

concentraciones de 2-OH estrona y 16-OH estrona. En premenopáusicas, 

concentraciones elevadas de IGF-I se asocian a un riesgo elevado de cáncer de 

mama (Miyoshi et al. 2000). 

 



 
Introducción 

 5

 Factores genéticos 

 

 La historia familiar es probablemente el factor de riesgo más ampliamente 

conocido. Sin embargo, la mayoría de las mujeres  con una historia familiar de 

cáncer de mama no tienen la forma de la enfermedad transmitida genéticamente, y 

por tanto alteraciones genéticas predisponentes al cáncer de mama. Actualmente se 

considera que tan sólo del 5-10% de los cánceres que se diagnostican son 

hereditarios. 

 

 Existen factores que aumentan el índice de sospecha de que una mujer pueda 

tener riesgo de cáncer de mama transmitido genéticamente. Dichos factores son: 

múltiples parientes afectados, tanto maternos como paternos, historia familiar de 

cáncer de ovario asociado con cáncer de mama, e historia familiar de cáncer de 

mama bilateral y/o de aparición precoz. 

 

 El gen BRCA1 está asociado a una predisposición genética al cáncer, y fue 

aislado en el cromosoma 17q21. El estudio realizado por Couch et al (1997) en 

169 pacientes, puso de manifiesto que el 16% de las pacientes con historia familiar 

de cáncer de mama mostraron mutaciones en el gen BRCA1, siendo más frecuente 

en aquellas pacientes con historia familiar de cáncer de mama y de ovario (40%). 

 

 Una segunda anormalidad genética relacionada con el cáncer de mama es la 

mutación del gen BRCA2, que ha sido localizado en el cromosoma 13q12-13. Este 

gen no se asocia con el cáncer de ovario (Helzsouer KJ, 1995). 

 

 Otros genes implicados en el cáncer heredofamiliar de mama son el p53, AT 

(ataxia-telangiectasia) y PTEN /MMAC (Fackenthal et al. 2001; Marsh et al. 2001; 

Hamann et al. 2000; Tonin et al. 2000). 

 

 

 

 



 
Introducción 

 6

 Factores ambientales 

 

 El hecho de que exista una incidencia diferente de carcinoma de mama en la 

geografía, hace pensar que los factores ambientales contribuyan al riesgo de 

padecer la enfermedad. Así, América del Norte, el Norte de Europa y Oceanía, 

presentan una elevada incidencia, mientras que América del Sur y Central y Este 

de Europa presentan una incidencia media, y Africa y Asia cuentan con los niveles 

más bajos de incidencia de carcinoma de mama. 

  

 Antecedentes de enfermedad benigna de mama 

  

 La relación entre enfermedad benigna de mama y el riesgo de cáncer de 

mama se ha revisado recientemente en detalle. Fitzgibbons et al (1998) han 

clasificado las lesiones benignas mamarias en cuatro grandes grupos en función 

del riesgo de desarrollar un carcinoma invasivo, en comparación con las mujeres 

que no han sido sometidas a una biopsia de mama: 

 

-  sin aumento del riesgo: 

 adenosis (no adenosis esclerosante) 

 ectasia ductal 

 fibroadenoma sin rasgos complejos* 

 fibrosis 

 mastitis 

 hiperplasia ligera sin atipia 

 quistes 

 metaplasia apocrina simple (sin hiperplasia o adenosis) 

 metaplasia escamosa 

 

-  con riesgo ligeramente aumentado (por 1.5-2): 

 fibroadenoma con rasgos complejos* 

 hiperplasia moderada o intensa sin atipia 

 adenosis esclerosante 



 
Introducción 

 7

 papiloma solitario sin hiperplasia atípica asociada 

 

-  con riesgo medianamente aumentado (por 4-5): 

 hiperplasia ductal atípica 

 hiperplasia lobulillar atípica 

-  con marcado aumento del riesgo (por 8-10): 

 carcinoma ductal “in situ”, siempre y cuando sean lesiones pequeñas, de bajo 

grado y de tipo no comedo 

 carcinoma lobulillar “in situ” 

* Se entiende por rasgos complejos: quistes mayores de 3 mm, adenosis 

esclerosante, calcificaciones y cambios papilares apocrinos. 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
Introducción 

 8

1.2 FACTORES PRÓNOSTICOS EN CÁNCER DE MAMA 

 

 

1.2.1 FACTORES PRONÓSTICOS CLÁSICOS 

 

 

 Para una paciente en particular, el curso de la enfermedad es impredecible. 

Unas mueren por enfermedad metastática en un año mientras que otras con 

tumores aparentemente similares, sobreviven durante décadas. Debido a esta 

marcada variabilidad, hay un considerable interés en la identificación de 

características predictivas del comportamiento del tumor que ayuden a establecer 

una terapéutica más racional y efectiva. 

 

 El conocimiento de la extensión de la enfermedad es crucial para una 

primera aproximación al pronóstico, existiendo factores que nos dan idea del 

estadío. Entre ellos destacamos los siguientes: 

 

1.2.1.1 Edad 

  

 La edad es un importante factor de riesgo. Aunque una de cada ocho mujeres 

desarrollará cáncer de mama, ésta es una estimación del riesgo acumulativo, 

ocurriendo un 50% después de los 65 años. El nivel de riesgo para las mujeres en 

edades jóvenes es bastante bajo, y en ausencia de otros factores de riesgo, la 

posibilidad de desarrollar cáncer de mama entre los 35 y 55 años es solamente del 

2.5%. 

  

 Desde el punto de vista de la detección precoz, se ha observado que la 

mamografía es efectiva en todas las edades, pero es más sensible en mujeres 

mayores, que son las que presentan cáncer de mama más avanzado. Sin embargo, 

los peores pronósticos, asociados a recidivas tempranas, tienen lugar en mujeres 

menores de 35 años, al ser sus tumores más proliferativos (Varlemmens et al. 

1998). 



 
Introducción 

 9

1.2.1.2 Tamaño 

  

 Numerosos estudios han demostrado la correlación entre el tamaño y la 

afectación ganglionar axilar, de tal modo que se acepta que ésta es un parámetro 

independiente del tamaño, pero con efecto aditivo sobre aquél (Orr 1999).  

 

 Asimismo, el tamaño es un importante factor para establecer el riesgo de 

recidivas o metástasis  y se ha visto, en pacientes sin ganglios axilares invadidos, 

que el porcentaje de recidivas a los 5 años es del 11% para los carcinomas menores 

de 2 cm, del 22 % cuando oscilan entre 2 y 3 cm y del 25% cuando sobrepasan los 

5 cm. 

 

 Especial interés clínico posee conocer la probabilidad de recidivas en 

tumores menores de 1cm (12 %) en relación con los casos comprendidos entre 1 y 

2 cm (28 %). 

 

1.2.1.3 Tipo histológico 

  

 Existe un gran número de clasificaciones del cáncer de mama basadas en 

criterios morfológicos, microscópicos, citológicos, etc. Sin embargo, las más 

empleadas son la de la OMS (Organización Mundial de la Salud) (Scarf y Torloni, 

1968) y la de Azzopardi (Azzopardi et al. 1979). En ambas existe una división 

clara y con gran importancia pronóstica entre carcinomas infiltrantes y no 

infiltrantes. 

 

 Los carcinomas no infiltrantes son aquellos que no han roto la membrana 

basal, denominándose también carcinomas “in situ”. Pueden aparecer en los ductos 

o en los alveolos. Los primeros son los intraductales y los segundos los 

intralobulillares. Dentro de los intraductales se pueden distinguir cinco tipos: 

cribiforme, comedocarcinoma, micropapilar, sólido y carcinoma papilar. Tanto  los 

intraductales como los intralobulillares pueden hacerse infiltrantes, presentando los 

segundos un alto riesgo (Andersen, 1974). Estos carcinomas no invasores 



 
Introducción 

 10

raramente dan metástasis. Dentro de los carcinomas infiltrantes nos encontramos 

los ductales infiltrantes (CDI), que suelen ser el 70-80% de todos los carcinomas 

mamarios, y los lobulillares infiltrantes (CLI), que representan el 5% de todos los 

carcinomas infiltrantes y que poseen una mayor tendencia que los anteriores a ser 

multicéntricos, bilaterales y a dar metástasis en huesos y en meninges. Además, 

existen otros tipos especiales, como son el carcinoma medular, mucinoso, tubular 

y secretante, que poseen mejor pronóstico que el CDI clásico. El carcinoma papilar 

presenta un pronóstico similar, y el inflamatorio un pronóstico muy desfavorable 

(Pérez Manga, 1989; Winchester Det al. 1996). 

 

1.2.1.4 Ganglios linfáticos 

  

 La región axilar es la principal área del drenaje linfático de la mama por lo 

que no resulta extraño que el estudio de los ganglios linfáticos axilares constituya 

un importante indicador pronóstico en los tumores mamarios, siendo numerosos 

los trabajos que demuestran su valor en la clínica diaria. De hecho, el estado 

ganglionar sigue siendo aún hoy, el factor pronóstico más importante en cáncer de 

mama (Ellis et al. 1998; Maguire et al. 1998). 

 

 Así, para tumores de igual tamaño, la supervivencia a los cinco años es un 

20% mayor en ausencia que en presencia de afectación ganglionar axilar. También 

se ha demostrado de gran valor pronóstico el número de ganglios afectados, siendo 

4 un dintel con utilidad para distinguir dos subgrupos de pacientes con un diferente 

riesgo, cifrándose la supervivencia libre de enfermedad en un 20-30 % superior 

cuando el número de adenopatías invadidas es inferior a 4 (Jatoi I et al. 1999). 

 

1.2.1.5. Ploidía y actividad proliferativa 

  

 En los últimos años se han publicado un elevado número de artículos que 

han reseñado las aplicaciones de la citometría de flujo en investigación y en la 

práctica clínica. Aquellos ponen de relieve el valor de dicha técnica en la 



 
Introducción 

 11

identificación y cuantificación de parámetros celulares, tales como contenido de 

DNA y actividad proliferativa. 

 

 Se ha descrito una relación inversa entre la aneuploidía  y nivel de 

estrógenos; es decir, los tumores aneuploides son más frecuentemente RE-. Una 

relación semejante se ha encontrado con los RP. Asimismo la aneuploidía, es un 

factor pronóstico de menor intervalo libre  de enfermedad (ILE) y supervivencia 

total (Leers et al. 2000).  

 

 En cuanto a la fase S, o fracción de proliferación, ha sido también 

comparada con una gran variedad de características del tumor. Los tumores con 

fase S elevada son con frecuencia pobremente diferenciados y RE- (Silvestrini et 

al. 1979). También parece tener valor como parámetro pronóstico negativo de 

supervivencia global e ILE (Clark et al. 1992). 

 

 La ploidía celular y la fase de síntesis del DNA son factores pronósticos y 

predicen el estadío del desarrollo del cáncer de mama. La aneuploidía se asocia 

con ganglios axilares invadidos, alto grado histológico y ausencia de RE, mientras 

que los tumores diploides con bajos valores de fase S, cursan con  un buen 

pronóstico (Dieterich et al. 1995).  

  

 Algunos estudios demuestran un 80% de concordancia en el contenido de 

DNA entre CDIS y el carcinoma invasivo, lo que implica que los mayores cambios 

en el contenido de DNA suelen producirse durante la progresión de la neoplasia y 

no necesariamente en la transición de no invasivo a invasivo (Masood et al. 1998). 

 

 Los tumores tetraploides presentan mayor fase S y superiores porcentajes de 

positividad de fase S que los diploides. Asimismo, cursan con mayores 

concentraciones de receptor de estrógenos y menores de activador del 

plasminógeno tipo tisular, y de ácido hialurónico de membrana. Estos resultados 

sugieren que los tumores tetraploides presentan una mayor proliferación, así como 

ciertos indicadores biológicos sugestivos de una mayor indiferenciación celular, 



 
Introducción 

 12

todo lo cual podría explicar su diferente comportamiento clínico en relación al de 

los diploides. 

 

1.2.1.6 Grado de diferenciación celular 

 

 Otro parámetro anatomopatológico ampliamente utilizado es el grado de 

diferenciación tumoral. Se obtiene analizando tres aspectos del tejido tumoral: 

formación de túbulos, hipercromatismo y mitosis, e irregularidades en tamaño, 

forma y tinción de los núcleos. De esta manera se obtiene una valoración de 

diferenciación del tumor. Se dan valores de I a los más diferenciados y valores de 

III a los más indiferenciados y, por tanto, con mayor potencialidad agresiva. Un 

grado histológico (GH) elevado predice una recidiva más temprana y un intervalo 

de supervivencia más corto (Clark et al. 2000), así como una tasa de invasión 

ganglionar significativamente superior en tumores de menos de 2cm (Schneider et 

al, 1999). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
Introducción 

 13

1.2.2  FACTORES PRONÓSTICOS MOLECULARES 

 
 
1.2.2.1 Aspectos generales 
 

 

 En los últimos años se ha intentado correlacionar la patología clásica con los 

nuevos avances de la biología molecular, para hallar una relación entre eventos 

moleculares y etapas definidas en la historia natural del cáncer de mama. De este 

modo, la información molecular puede complementar el desarrollo histopatológico 

y ayudar a definir no sólo la evolución de la enfermedad sino el curso del 

tratamiento. 

 

 Uno de los factores moleculares más importantes, y primero en ponerse en 

práctica en el estudio del carcinoma de mama, fueron los receptores hormonales 

(RE y RP), por depender de ellos el pronóstico de la enfermedad, contribuir en la 

regulación de la proliferación y diferenciación de células epiteliales mamarias, así 

como en la selección de pacientes candidatas al tratamiento hormonal, a pesar de 

no ser factores pronósticos independientes muy potentes. 

 

 Los receptores esteroideos son fosfoproteínas, factores de transcripción 

latentes, que se activan tras la interacción con sus ligandos. En ausencia de éstos 

últimos, el receptor está secuestrado en complejos macromoleculares formados por 

monómeros del receptor y por proteínas asociadas (hsp 90, hsp 70, p59 y otras). 

 

 Los esteroides regulan el ciclo celular actuando sobre puntos definidos de la 

fase G1, pudiendo ejercer también su efecto sobre los genes que regulan dicha fase 

del ciclo celular, como son la ciclina D1, Myc, cdk2, cdk4, inhibidores de cdk y 

Cdc25A, así como sobre moléculas necesarias para entrar en la fase S (Foster et al. 

2001; Prall et al. 1998). Cassanelli et al. (1995) han obsevado que la capacidad de 

síntesis del receptor de progesterona y su concentración se relacionan con la fase 

del ciclo celular y el tiempo de duplicación de la población. Otro hecho interesante 

es que en las dos últimas décadas se ha visto un aumento en las concentraciones de 



 
Introducción 

 14

los RE, lo cual puede reflejar un cambio en la biología del carcinoma mamario y/o 

en los eventos normales que influyen en la génesis y crecimiento del mismo (Pujol 

et al. 1994). 

  

 Las hormonas esteroideas difunden a través de la membrana plasmática de la 

célula diana y se unen a proteínas receptoras intracelulares (AFs). La unión del 

ligando activa los receptores, los cuales regulan directamente la transcripción de 

determinados genes. Los receptores intracelulares, una vez que se han unido al 

ligando se unen a secuencias específicas del DNA adyacentes a los genes que están 

regulados por el ligando correspondiente. La unión del ligando altera la 

conformación de la proteína receptora, la cual entonces activa la transcripción 

génica. 

 

 Clínicamente, las hormonas esteroideas son factores clave en la génesis de 

los carcinomas mamarios, por tanto la determinación de sus receptores es 

obligatoria, pues constituyen indicadores pronósticos y de respuesta al tratamiento 

endocrino (Osborne 1998, Hilsenbeck et al. 1998). A este respecto, se sabe que esta 

respuesta se consigue en el 77% de los carcinomas RE+RP+, en el 46% de los RE-

RP+, en el 27% de los RE+RP- y en el 11% de los casos RE-RP-. Existen dos 

grupos bien diferenciados en cuanto a su comportamiento posterior: los carcinomas 

RE+RP+ y los RE-RP-, siendo conflictivos los RE+RP- y RE-RP+, donde se ha 

comprobado que 1/3 de los tumores RE+ no responden hormonalmente, 1/10 de los 

tumores RE- responden a terapia hormonal, 1/5 de los tumores RE+ son RP- y 1/3  

de los tumores RE- son RP+, lo cual induce a pensar que existe alguna variable, 

todavía desconocida, a nivel biológico o funcional, en la cadena de transducción 

esteroidea. 

   

 Bernoux et al. (1998) han estudiado el comportamiento de los tumores RE- 

en función o no de la positividad para los RP, observando que los tumores RE- 

RP+ tenían un menor tamaño, eran más frecuentemente GH1, se daban en mujeres 

más jóvenes y preferentemente premenopáusicas, asociándose a una mayor 

supervivencia a  los cinco años. 



 
Introducción 

 15

 Se ha visto que los estrógenos (principalmente el 17β estradiol) en los 

tumores RE+ tienen un efecto dual, pues estimulan el crecimiento de los mismos 

(Foster et al. 2001), pero inhiben la invasión y motilidad, posiblemente debido a 

otras proteínas inducidas y reguladas por los estrógenos, algunas de las cuales se 

localizan en la matriz extracelular (Prall et al. 1998). Los estrógenos producen un 

aumento de la actividad mitótica en tejido mamario y endometrial; errores en los 

mecanismos de división producen malignidad. La activación de los receptores 

esteroideos implica la interacción de éstos (localizados en el núcleo celular) con los 

estrógenos y progesterona, que son retenidos a nivel nuclear. Vergote et al. 2000, 

han estudiado la expresión de las dos isoformas (α formada por 595 aa y β con 485 

aa) de los RE , observando que se expresan en distinta proporción según el tejido y 

pueden ser activados con diferentes afinidades por componentes esteroideos y no 

esteroideos. Algunos órganos expresan ambos subtipos, y diferentes tipos de 

células dentro de cada órgano puede expresar ambos RE, indicando que los REα y 

REβ tienen diferentes funciones. Los REβ se expresan en mama, próstata, ovario, 

pulmón, riñón, tracto gastrointestinal y colon mientras que los REα se expresan en 

mama, SNC, útero e hígado (Gustafsson et al. 2000). Speirs et al. (1999) han visto 

que en el tejido mamario normal predomina la expresión de la isoforma β. Por el 

contrario los carcinomas de mama expresan la isoforma α, sola o en combinación 

con la β. La expresión de receptores β en tumores que muestran ambas isoformas 

puede explicar el fallo frente a la terapia antiestrogénica. Ambas isoformas se han 

clonado en humanos y roedores y poseen dominios funcionales (A-F), cada uno 

responsable de diferentes funciones, como son: unión hormonal, respuesta 

hormonal, activación de transcripción (AFs) o iniciación de transcripción génica 

(Vashisht et al. 2000). 

 

 En un estudio realizado por Cullen et al. (2001) en 104 carcinomas de mama 

y 22 fibroadenomas (FAD) mediante técnica RT-PCR, encontraron una mayor 

expresión de RNAm de REβ en FAD que en carcinoma. La expresión de RP se 

asoció con la de REα en carcinoma, y de forma inversa con la expresión de REβ. 

Existen dos tipos de receptores de progesterona, A y B, pudiendo el primero ejercer 



 
Introducción 

 16

un efecto represor sobre las funciones del tipo B y el receptor estrogénico α 

(Osborne, 1998). Los RE y RP se coexpresan aproximadamente en el 10-20% de 

las células epiteliales de mama normal, siendo fundamentales en el desarrollo y 

diferenciación funcional de la glándula mamaria (Sutherland, 1998). 

 

 Khan et al. 1994, examinaron la relación entre el diagnóstico de cáncer de 

mama y niveles de expresión de RE en tejido epitelial benigno de mama. Los 

niveles de expresión de RE fueron mayores en pacientes con cáncer de mama que 

en el grupo control de pacientes sanas, y estuvieron relacionados con riesgo de 

padecer la enfermedad en postmenopaúsicas.  

 

 Los beneficios de la terapia endocrina son proporcionales a la cantidad de RE 

presente en el tumor. Los RE se han determinado por inmunohistoquímica o 

midiendo sus niveles en citosol mediante ensayo de unión a ligando. La ventaja de 

esta última técnica es que podemos determinar las concentraciones y funcionalidad 

de los RE y es una técnica reproducible (Leake et al. 2000). El estudio 

inmunohistoquímico ofrece la ventaja de la visualización directa de los receptores 

en los núcleos de las células neoplásicas, lo que evita falsos positivos en la 

determinación bioquímica. 

 

 En cuanto al uso de hormonoterapia en el tratamiento de carcinoma de mama, 

el tamoxifeno, modulador selectivo de los RE (SERM), es la droga más utilizada, 

por reducir el riesgo de recidivas tanto en carcinoma “in situ” como en invasivo. 

Dhingra (2001), ha observado una disminución de la incidencia de cáncer de mama 

en pacientes postmenopaúsicas con riesgo para desarrollar la enfermedad, que 

realizaron tratamiento preventivo con tamoxifeno. 

 

 Recientemente se ha propuesto otro tipo de agentes como alternativa a la 

hormonoterapia, como son los isoflavonoides, los cuales se unen con mayor 

afinidad a los REβ (Kuiper et al. 1997). Los isoflavonoides se encuentran en la 

soja; sin embargo, en un estudio con pacientes control que consumían soja, no se 



 
Introducción 

 17

observó asociación entre este consumo y un menor riesgo de padecer la 

enfermedad en mujeres postmenopaúsicas. El consumo de soja en animales inhibe 

el efecto estimulatorio de proliferación celular en la mama. En relación con estos 

hechos, Messina, (2000) concluye que no existen suficientes datos acerca de los 

isoflavonoides y la posible terapia sustitutiva de la hormonoterapia. 

 

 Otro agente ligado a la hormonoterapia es la tibolona, progestágeno con parte 

estrogénica y efecto androgénico que reduce la densidad de la mama en mujeres 

postmenopaúsicas. Gompel et al. (2000) observaron que este agente disminuía la 

proliferación celular de la mama y aumentaba la diferenciación y apoptosis.  

 

 Se ha descrito un receptor específico de membrana, SBP-R (“sex steroid 

binding protein receptor) receptor de proteína de unión a los esteroides sexuales 

(Catalano et al. 1997), cuya expresión en los cánceres de mama se asocia con una 

menor proliferación celular y un mejor comportamiento clínico. 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
Introducción 

 18

1.3 ALTERACIONES MOLECULARES EN EL CARCINOMA DE 

MAMA 

 

 

 Existen dos tipos de alteraciones genéticas que ocurren en el cáncer en 

general y en el cáncer de mama en particular: pérdida de genes supresores con su 

manifestación cromosómica, que es la pérdida de heterocigosidad (LOH), y 

activación de oncogenes. 

 

 

1.3.1 GENES SUPRESORES Y PÉRDIDA DE HETEROCIGOSIDAD 

 

 

 Los genes supresores son genes que modulan la proliferación u otras 

actividades de los tejidos y que deben ser inactivados para permitir la progresión 

del proceso neoplásico (Marshal, 1991; Weinstein, 1991; Vogelstein et al. 1993). 

El mecanismo más común por el cual se inactiva la función de un gen supresor es 

la mutación de una de las copias del gen y la pérdida de la otra copia del gen como 

consecuencia de aberraciones cromosómicas mayores (deleciones, translocaciones 

y recombinaciones intracromosómicas) (Green, 1988). Este último mecanismo 

cromosómico se refleja en la pérdida de genes (alelos) maternos o paternos en una 

región definida del genoma (pérdida de heterocigosidad o LOH). 

  

 Se ha descrito la pérdida de LOH en numerosas regiones cromosómicas. Las 

más comunes son: 1p34-35, 1q23-32, 3p21-25, 6q, 7q31, 9 ,11p15, 11q22-23, 

13q14, 16q, 17p13, 17q, 18q23-ter y 22q. (Brenner et al. 1995; Borg et al. 1994; 

Callahan et al. 1992; Clenton-Jansen et al. 1994; Lindblon et al. 1993; Nagai et al. 

1995; Tsuda et al. 1994). La identidad de los genes responsables de estas 



 
Introducción 

 19

alteraciones cromosómicas ha sido concretada solamente en alguna de estas 

regiones. 

 

 LOH en 17p13 está asociada a la pérdida del gen supresor p53, que ha sido 

hallada en aproximadamente el 46% de los casos (Pezeshki et al. 2001). La 

proteína p53 es una fosfoproteína que actúa como factor de transcripción del 

núcleo y que tiene funciones de regulación de crecimiento, apoptosis y control de 

la fidelidad de la transcripción (Levine et al. 1991). Se le ha denominado el 

guardián celular por su especial acción; así, cuando la célula está dañada, se 

estimula la producción de p53, que  a su vez producirá: 

 

• Parada de la proliferación, para evitar que la célula defectuosa prolifere y se 

perpetúe. 

• Estimulación de la muerte celular programada (apoptosis). 

• Inhibición de la angiogénesis 

 

 La indución de p53 después del daño genético asegura la inhibición de la 

replicación genómica por medio de p21 y estimula la reparación del DNA por 

medio del gen dependiente de p53, GADD45. Las células que carecen de p53 

funcional, como ocurre en algunas células tumorales, no pueden evitar la 

replicación del DNA dañado, lo cual lleva a la inestabilidad genómica y a la 

progresión tumoral. 

 

 p53 es el gen somáticamente mutado más común en los cánceres esporádicos, y 

cuando es mutante en la línea germinal, hace que el locus de susceptibilidad del 

cáncer hereditario se vuelva responsable del síndrome de Li-Fraumeni (Varley 2001). 

Se han detectado alteraciones de p53 a nivel proteico entre un 15-50% en CDI (Done 

et al. 2001) y mutación del gen en el 46% de los casos (Pezeshki et al. 2001). 

También se han visto metilaciones aberrantes en CpG en la región del promotor de 



 
Introducción 

 20

p53, la cual es independiente del grado de invasión tumoral. Estas hipermetilaciones 

son una alternativa a la tumorogénesis cuando no existe mutación de p53 (Kang et al. 

2001). 

 

 El gen p53 está implicado en la progresión del carcinoma de mama, y para 

demostrarlo, Umekita et al. 1994 estudiaron por inmunohistoquímica su expresión 

en 83 CDI, 10 CDI con componente intraductal, 13 CDIS, 16 HDA y 27 

hiperplasias epiteliales benignas. p53 se expresó en el 29% de los CDI, 50% de los 

CDI con componente intraductal y 8% de CDIS, siendo la expresión mayor en los 

subtipos comedo. No se expresó ni en HDA ni en hiperplasias epiteliales benignas. 

En esta misma línea, Siziopikou et al. (1996) examinaron la expresión de p53 en 

tejido normal de mama, enfermedades de mama no patológicas y CDIS y vieron 

ausencia de expresión en tejido normal, hiperplasia normal, HDA y carcinoma 

lobulillar in situ. La mayoría de los CDIS eran p53 negativos correspondiendo su 

expresión a lesiones diferenciadas. Resultados similares fueron observados por 

Alexierv et al. 1997. 

 

 Ringberg et al (2001) también encontraron una mayor correlación entre 

mutación de p53 y carcinomas “in situ” del subtipo comedo, en el estudio que 

realizaron en 187 pacientes con CDIS, con un seguimiento de 62 meses. Resultados 

similares obtuvieron Iwase et al. (2001) en 65 CDIS, encontrando expresión de p53 

en el 33% de los casos relacionados con los carcinomas comedo. Además se han 

estudiado 35 carcinomas ductales apocrinos in situ, de perfil hormonal y 

morfológico distinto a CDIS, con grados histológicos 1-3, y se ha visto una 

expresión de p53 en el 62% de los casos (Leal et al. 2001). 

 

 La alteración de p53 ocurre en los CDIS con mayores grados histológicos y 

se mantiene en la evolución de los carcinomas, por lo que está implicado en las 

formas invasivas fomentando la inestabilidad genómica y resistencia a terapia 

(Done et al. 2001). 



 
Introducción 

 21

 Algunos autores no han visto correlación entre mutación de p53 y parámetros 

clínico-patológicos comunes (tamaño del tumor, expresión de RE, invasión 

ganglionar o diagnóstico histopatológico), siendo un factor pronóstico 

independiente que estaría relacionado con la agresividad del tumor (Khaliq et al. 

2001; Pezeshki et al. 2001). Sin embargo, Shoa et al. (2001), al estudiar el gen 

supresor p53 en 126 pacientes con cáncer de mama, detectaron mutaciones en el 

36% de los tumores primarios, y de ellos el 65% presentaba mutaciones de p53 en 

el DNA plasmático. Las mutaciones en p53 se relacionaron significativamente con 

el estadío clínico, índice mitótico, tamaño y expresión de RE. Tras seguimento de 

29 meses, realizaron análisis uni- y multivariable y vieron que mujeres con tumores 

primarios que presentaban p53 mutado en el DNA plasmático tuvieron una menor 

supervivencia, y ésta fue independiente de la afectación ganglionar, por lo que p53 

es un factor pronóstico de supervivencia e ILE y puede ser utilizado como 

marcador temprano de recurrencia y metástasis a distancia (Shao et al 2001; 

Takashima, 2001; Umekita et al. 1994; Mc Laughlin et al. 2001; Thor et al. 2000). 

Iwase et al (2001) en su estudio realizado sobre 65 CDIS y 60 CDI, vieron la 

misma expresión de p53 en CDIS que en CDI, la cual se correlacionaba con 

positividad para c-erb-B2 (estudiada también por Korkolis et al. 2001; Umekita et 

al. 1994), RE, y Ki67. 

  

 En relación con los receptores hormonales, en un estudio realizado por 

Ioakim-Liossi et al. (2001), se obtuvieron resultados que contradicen lo expuesto 

anteriormente, ya que encontraron una asociación negativa entre expresión de p53 

y positividad para RE y RP.  

 

 Alesiev et a (1997) han visto una correlación positiva entre la expresión de 

p53 y c-erb-B2 en un estudio inmunohistoquímico sobre 129 carcinomas de mama 

y 58 lesiones benignas, donde encontraron expresión conjunta de ambos 

marcadores en el 48% de los casos, concluyendo que ambos marcadores, bien por 

separado, o conjuntamente, están relacionados con el pronóstico del cáncer de 



 
Introducción 

 22

mama, permitiendo la definición de lesiones intraductales y diferenciación entre 

hiperplasia ductal atípica (HDA) (donde no se expresaron) y CDIS. Sin embargo, 

en otro estudio realizado por Ho et al. (2000) en 30 CDIS, encontraron expresión 

de p53 en el 20% de las muestras y de c-erb-B2 en el 40% de los CDIS, sin 

alteración en tejido normal, y no encontraron correlación entre ambas alteraciones 

genéticas. Además no vieron alteraciones entre los distintos subtipos de CDIS 

(comedo, micropapilar, papilar, cribiforme y sólido) ni correlación entre mutación 

de p53 y grado nuclear del tumor. 

  

 En dicho estudio, clasificaron tumores grado II en dos subgrupos: uno con 

menor potencial de malignidad, con p53- y positividad para RE y RP, y otro con 

mayor potencial de malignidad, con p53+ y negatividad para RE y RP, datos que 

no se relacionan con lo expuesto anteriormente. 

 

 En cuanto al valor predictivo de p53 en mujeres tratadas con tamoxifeno, no 

existe correlación entre expresión de este gen y respuesta a tamoxifeno en pacientes 

con RE+ en estadíos tempranos de cáncer de mama, si bien se ha visto que en 

mujeres con RE+, c-erb-B2+, y p53+ es útil la terapia con tamoxifeno durante el 

primer año (Knoop et al. 2001). 

  

 Otro gen supresor es el retinoblastoma (Rb), localizado en el cromosoma 

13q14, región que se encuentra delecionada en el 30% de los casos de cáncer de 

mama. El gen Rb codifica una proteína nuclear (pRb), regulada por estradiol 

(Alban et al. 2001). Rb se encuentra hipofosforilado en fases tempranas del ciclo 

celular pero cuando se fosforila mediante complejos ciclina-cdk, libera E2F y 

activa genes críticos para continuar el proceso de proliferación, permitiendo de esta 

forma la progresión del ciclo celular hacia la fase de síntesis (Weinberg, 1995). No 

se ha encontrado alteración de pRb en HDA ni en hiperplasias ductales benignas, 

pero sí en CDIS (8%) (Heffelfinger et al. 2000). Mayores niveles de expresión 

encontraron Gorgoulis et al. (1998) en 55 carcinomas de mama analizados por 



 
Introducción 

 23

inmunohistoquímica, con una expresión en el 29% de los casos, la cual se 

relacionaba inversamente con la expresión de p16. La expresión de pRb y p16, 

junto con alteraciones de microsatélites detectadas en el locus 9p21-22, revelan que 

existe una correlación entre la expresión normal de pRb e invasión ganglionar, y 

entre alteraciones de microsatélites (LOH y/o inestabilidad de microsatélites) y 

tamaño del tumor. Estos autores sugieren que la desregulación de p16-pRB junto 

con otros genes tumor supresores implicados en la región 9p21-22, podría jugar un 

papel importante en la invasión y progresión oncogénica. 

 

 Ceccarelli et al. (1998) estudiaron por inmunohistoquímica la expresión de 

pRb en 153 muestras de CDI, fijadas en parafina, y compararon los resultados con 

otros indicadores pronósticos biopatológicos, con el fin de determinar la 

agresividad del tumor. Los niveles de pRb se relacionaron con la actividad 

proliferativa (Ki67), tamaño, GH y GN del tumor y niveles de expresión de 

receptores esteroideos, y no se relacionaron con la expresión de p53. La expresión 

paralela de pRb y Ki67 sugiere que la proteína tiene un comportamiento normal en 

la regulación del ciclo celular. Encontraron, además, ausencia de expresión de pRb 

en 13 carcinomas con una mayor expresión de marcadores de agresividad 

(expresión de EGF-R, p53, RE y RP- y niveles elevados de Ki67). 

  

 Los mecanismos moleculares básicos que controlan el paso de la célula a 

través de las distintas etapas del ciclo celular dependen de una serie de 

holoenzimas, constituidas por una subunidad reguladora llamada ciclina y una 

subunidad catalítica llamada kinasa dependiente de ciclina (cdk). Su función es 

fosforilar sustratos clave y de esta manera inactivar los mecanismos que impiden la 

progresión de la célula hacia la división celular. Las ciclinas D y E son las ciclinas 

moduladoras de G1, mientras que la principal acción de la ciclina A ocurre en las 

fases S y G2, siendo la ciclina B clave durante la fase G2 del ciclo celular. 

 

 Las ciclinas D (D1, D2 y D3) son inducidas en células de cultivo durante la 

etapa temprana en la fase de G1 como respuesta a los factores de crecimiento, lo 



 
Introducción 

 24

que ha llevado a la hipótesis de que sirven como nexo entre las señales mitogénicas 

y el control del ciclo celular (Matsushime et al. 1991; Won et al. 1992; Winston et 

al. 1993). Las ciclina D se une y activa específicamente a las kinasas cdk4 y cdk6, 

y su actividad catalítica se detecta en una etapa tardía de la fase G1 (Matsushime et 

al. 1994; Meyerson et al. 1994). A diferencia de otras ciclinas que son expresadas 

ubicuamente en los distintos tipos celulares, parece haber algún grado de 

especificidad en la expresión de las ciclinas D, lo que ha llevado a especular que 

las ciclinas D podrían estar asociadas con distintos programas de diferenciación. 

 

 La ciclina D1 juega un papel crítico en el crecimiento y progresión del cáncer 

de mama. Existen pocos estudios en relación a la expresión de D1 en CDIS; 

estudios inmunohistoquímicos han revelado que su grado de positividad es 

variable, debido probablemente a los distintos tipos de anticuerpos utilizados, 

métodos inmunohistoquímicos y dinteles de positividad definidos (Umekita et al. 

2000). Umekita et al (2000) han estudiado la expresión de ciclina D1 en 57 CDIS, 

10 HDA, 70 HD benignas, 44 carcinomas con elevado componente intraductal, y 

92 CDI, y han visto que está implicada en varias etapas de carcinogénesis y 

progresión tumoral. Encontraron expresión de D1 en el 72% de CDIS, 50% de 

carcinomas con elevado componente intraductal y 43% de CDI, y no vieron 

expresión en HDA e hiperplasia ductal benigna, por lo que esta ciclina puede jugar 

un papel importante en estadíos tempranos de carcinoma de mama siendo su 

inmunohistoquímica útil en el proceso de diferenciación de HDA a CDIS 

incipientes. Steeg et al (1998) también encontraron una sobreexpresión de ciclina D 

y E en CDIS (que no coincide con los resultados que posteriormente comentaremos 

en el estudio de la ciclina E). 

 

 Sasano et al. (1997) han visto que existen diferentes patrones de expresión de 

ciclina D1, cdk2 y cdk4 en CDI y CLI. Encontraron inmunorreactividad de ciclina 

D1 en el núcleo de las células tumorales de 27 de 41 carcinomas, mientras que la 

inmunorreactividad para cdk4 fue en células tumorales y no tumorales en 39 de 41 

carcinomas, y para la cdk2 en el 100% de los casos tanto en células tumorales 



 
Introducción 

 25

como no tumorales. Además, observaron una correlación entre la expresión de 

ciclina D1 y cdk4 en CDI, pero no en CLI. 

 

 Otro estudio realizado por Park et al (2001) sobre 37 muestras de secreción 

de pezón de 51 pacientes con carcinoma de mama y 8 muestras de 20 pacientes con 

enfermedades benignas de mama, mostró expresión de ciclina D1. El 26% de los 

carcinomas de mama fueron positivos para ciclina D1 y la correlación entre 

expresión de ciclina D1 en muestras histológicas y secreciones de pezón fue del 

78%. 

 

 En cuanto a la correlación con parámetros clínico-patológicos, Umekita et al 

(2000) y Sasano H et al (1997), no han detectado correlación entre expresión de 

ciclina D1 y RE y grado histológico en CDIS, mientras que Park et al (2001) sí han 

visto una correlación entre la expresión de ciclina D1 y RE y RP, si bien no 

detectaron correlación con el tamaño tumoral y afectación ganglionar. Además han 

visto una mayor expresión de ciclina D1 en CDI con menor grado histológico 

(>80% frente a 61%) y en tumores con fase S <15%. La ciclina D1 se relacionó de 

forma inversa con la actividad proliferativa del tumor. Sin embargo Sasano H et al 

(1997) sí detectaron una relación directa en CDI y CLI entre expresión de ciclina 

D1 y proliferación celular (Ki67), así como con el estado patológico y grado 

histológico de CDI. 

  

 La ciclina E se expresa tardíamente en la fase G1, prácticamente en la 

interfase con la fase S. Esta ciclina se une y activa cdk2 , y se ha postulado que la 

activación  de esta kinasa permite la entrada de la célula en la fase S (Koff et al. 

1992) mediante la fosforilación de pRb. Durante la progresión del ciclo celular, el 

complejo de ciclina D1 fosforila pRb, liberando el EF2 (factor de elongación), que 

posteriormente puede activar la expresión de la ciclina E (Zhang, 1996). pRb suele 

colaborar con una histonaadenilcetilasa (HDAC1) para reprimir a la ciclina E, 

impidiendo el acceso del EF2 al promotor de la ciclina E a través de la 

estabilización de su estructura núcleosómica (Zhang, 1996). Gracias a la 

fosforilación de pRb, la ciclina E está implicada en un bucle de autorregulación 



 
Introducción 

 26

positiva donde, tras la unión con cdk2 y la fosforilación de pRb, EF2 continúa 

liberándose, y la expresión de la ciclina E se mantiene, asegurando la inactivación 

de pRb y la progresión del ciclo celular hacia la fase de síntesis (Zhang, 1996). 

Existe una independencia en la regulación de ciclina E respecto a pRb ( Nieslsen et 

al. 1998). La ciclina E es rápidamente degradada inmediatamente después de la 

entrada de la célula en la fase S. En este momento la ciclina A se une a cdk2 y 

mantiene la actividad de esta kinasa. 

 

 No se ha establecido el papel pronóstico de la expresión de ciclina E en 

carcinoma de mama y en recidivas. En este sentido, Kim et al. (2001), no han 

encontrado asociación entre sobreexpresión de ciclina E en carcinoma primario, y 

riesgo de recidiva locorregional, siendo independiente la sobreexpresión del riesgo 

de metástasis a distancia. 

 

 Para saber cómo contribuye la expresión de la ciclina E a la tumorogénesis, 

se sobreexpresó en fibroblastos de embriones de rata y en células epiteliales de 

mama y se vio que la sobreexpresión se relacionaba con inestabilidad 

cromosómica, además de producir un daño en la progresión a la fase S del ciclo 

celular, por lo que una regulación aberrante en la progresión del ciclo celular podría 

ser la causa de la inestabilidad cromosómica (Spruck et al. 1999). Nielsen et al. 

(1997) estudiaron por Western blot 114 tumores primarios de mama y encontratron 

una sobreexpresión de ciclina E en un 25% de los casos, además de una menor 

expresión de ciclina D1. Análisis inmunohistoquímicos demuestran inactividad 

para pRb en el 40% de los casos, un aumento en la  expresión de p16 y una mayor 

actividad proliferativa. Otro estudio fue realizado por Scott KA et al. (1997) sobre 

tejido benigno de la mama (47 casos), CDIS  (22 casos) y CDI (107 casos), donde 

no encontraron expresión en tejido benigno y el porcentaje de expresión de ciclina 

E en ambos tipos de carcinomas fue el mismo (5%). La expresión de ciclina E y 

p53 coincidió con una menor diferenciación de los tumores, así como con una 

mayor agresividad y proliferación de las células tumorales.  



 
Introducción 

 27

 En cuanto a la relación con receptores hormonales, existe una 

sobreexpresión de ciclina E asociada con ausencia de expresión de los receptores 

(Donellan et al. 2001; Nielsen et al. 1996; Sasano et al. 1997), lo que sugiere que 

el papel de la ciclina E en la regulación del crecimiento del tumor podría ser 

hormonoindependiente (Nielsen et al. 1996; Nielsen et al. 1997). 

 

 Sus niveles pueden ser controlados por mecanismos postraduccionales, por lo 

que la expresión de esta proteína puede alterarse por vías distintas a la mutación de 

su gen (Porter PL et al. 1997) 

  

 Existen dos familias de inhibidores de la actividad catalítica ciclina dependiente 

(cdks). La primera incluye a inhibidores específicos de las cdks, cuyos miembros 

representativos, con p21 y p27. 

 

 p21 

 

 El producto del gen p21 puede inhibir una variedad de cdks en G1-S y en G2-M 

dando lugar a una detención del ciclo celular en el marco de  una diferenciación o 

en respuesta al daño de DNA (Barbareschi et al. 1996). La actividad de p21 está 

sujeta a un mecanismo de fosforilación-defosforilación que precisa guanosín 

trifosfato (GTP), y está mediado por otras proteínas, como la proteína activadora de 

GTPasa (gap). Cuando la p21 está en fase activa es capaz de desencadenar nuevas 

reacciones bioquímicas que activarán una cascada secuencial de proteínkinasas 

(RAF-MAPKK-MEK-ERK) y transmitirá esta señal hasta el núcleo. Una 

característica de p21 es que parece estar regulada, por lo menos en algunas 

circunstancias, por el gen supresor tumoral p53, y mediaría así la inhibición de la 

proliferación celular que ocurre después del daño al DNA causado por las 

radiaciones ionizantes y otros agentes mutagénicos. 

 



 
Introducción 

 28

 Oh et al (2001) realizaron un estudio en 49 CDIS, y encontraron expresión de 

p21 en el 67% de los tumores diferenciados, que estuvo relacionada con parámetros 

de buen pronóstico, como grado histológico bajo, ganglios negativos, positividad 

para RE y negatividad para p53. Otro estudio similar fue el realizado por Thor et al 

(2000) sobre 798 pacientes con cáncer de mama, con un seguimiento de 16.3 años, 

en el que encontraron expresión de p21 en el 74% de los CDIS, 40% de las lesiones 

hiperplásicas y 3% de los tejidos tumorales adyacentes de mama. Pacientes con 

afectación ganglionar que no expresaron p21, presentaron mejor pronóstico. La 

expresión de p21 no estuvo asociada con la supervivencia en pacientes con 

ganglios negativos.  

 

 p27 

 

 p27 es otro inhibidor universal de esta familia implicado en la detención de 

proliferación, al intervenir en G1-S, hecho que ocurre como resultado de la señal 

antimitótica del factor de crecimiento TGF-β (factor de crecimiento de 

transformación β) y por inhibición del complejo D/cdk4 y E/cdk2. Sus niveles 

pueden ser controlados por mecanismos postransduccionales, por lo que la 

expresión de esta proteína puede alterarse por vías distintas a la mutación de su gen 

(Porter et al. 1997). 

  

 Se han visto alteraciones en la expresión de p27 en cáncer de mama, y éstas 

parecen relacionarse con la agresividad del tumor (Chiarle et al. 2001; Chapuuis et 

al. 2000). Lau R et al (2001) analizaron 147 pacientes con carcinomas invasivos, y 

vieron que la falta de expresión de p27 se relacionaba con estadíos más avanzados 

del tumor, es decir, tumores con un mayor grado histológico, mayor fase S y 

negatividad para receptores hormonales. Además, el análisis multivariable 

correlacionaba la no expresión de p27 y el aumento de la expresión de Ki67 con un 

menor ILE, por lo que ambos marcadores combinados son útiles para predecir 

recidivas en pacientes de alto riesgo. Chappuis PO et al. (2000), analizaron en 202 



 
Introducción 

 29

pacientes con carcinoma invasivo, la evolución de p27 por  inmunohistoquímica, 

con un seguimiento de 6.4 años, y observaron una expresión baja de p27 en el 63% 

de los casos, asociada con mutación en los genes BRCA1/2, y un peor pronóstico. 

Sin embargo, Volpi A et al (2000) concluyeron en el estudio que realizaron sobre 

286 pacientes con cáncer de mama sin afectación ganglionar, con tratamiento 

locorregional, y 5 años de seguimiento, que p27 no está relacionada con la 

supervivencia. 

  

 En otros trabajos, una expresión baja de p27 y ciclina D1 estuvo relacionada 

con un peor pronóstico (Nohara et al. 2001), y la expresión de p27 se reveló como 

un importante factor predictivo durante los 5 primeros años de padecer la 

enfermedad y dejó de serlo a partir de los 7 años de la enfermedad (Leivonen et al. 

2001). 

  

 La segunda familia de inhibidores de cdks incluye p16 (Serrano et al. 1993), 

p15 (Hannon et al. 1994), p18 (Guan et al. 1994; Hirai et al. 1995) y p19 (Chan et 

al. 1995). Todos estos inhibidores se caracterizan por tener motivos de ankyrina y 

por inhibir específicamente la actividad catalítica de la ciclina D1 con estas 

moléculas. 

 

 p16 

 

 La expresión de p16 puede ser negativamente regulada por Rb (Li et al. 

1994). Es posible que en células normales p16 sea desreprimido después de la 

fosforilación del Rb y funcione como un mecanismo de retroalimentación para 

inactivar cdk4/cdk6 hacia el final de G1 (Weinberg et al. 1995). 

 

 Se han propuesto como mecanismos de expresión anormal del gen, 

deleciones y cambios en posición de metilaciones, ya que se han visto 



 
Introducción 

 30

hipometilaciones de p16INK4a en carcinoma de mama primario y metastático 

asociada con expresión de RNAm de p16INK4a, mientras que en tejido normal, 

existe una hipermetilación de p16INK4a, asociada a una falta de expresión de 

p16INK4a, lo que sugiere que la metilación y falta de expresión de este gen no está 

asociada al desarrollo de carcinoma de mama, y el gen funcional se expresa en 

dicha enfermedad. 

 

 Este gen supresor está inactivado en líneas celulares cancerosas y tumores 

primarios, y se ha estudiado la pérdida de LOH de p16 en más de la mitad de los 

tumores primarios que no se relacionaban con mutación en p16INK4a. Brenner et 

al (1996) han visto una disminución de la expresión en el 48% de los tumores, 

debidas a deleciones homozigóticas de p16 y metilación del exón que codifica para 

p16. Emig et al. (1998) han estudiado mediante inmunohistoquímica (IHQ) la 

expresión de p16 en 368 carcinomas invasivos, 52 no invasivos, y 3 líneas 

celulares. Encontraron acumulación citoplasmática de p16 en el 9% de los 

carcinomas invasivos y en el 4% de los no invasivos, y no detectaron alteraciones 

genéticas, por técnica PCR-SSCP (“Polimerase Chain Reaction-Single Strand 

Polimorphism) y secuenciación de DNA, en líneas celulares que expresaron p16 

citoplasmático. Guo et al. (1998) vieron mayor expresión de p16, en el estudio 

realizado sobre 120 carcinomas primarios, analizados por hibridación “in situ”, y 

donde la positividad para p16 fue del 71%. En cuanto a la relación con otros 

parámetros clínicos y biológicos, la expresión de p16 se relacionó con un mayor 

GH, menor diferenciación, pérdida en la expresión de RE y RP y sobreexpresión de 

p53, y no se relacionó con edad, tamaño, c-erb-B2, Rb ni p-Rb (Emig R et al. 1998; 

Guo S et al. 1998; Milde-Langoschk et al. 2001). La expresión aberrante de p16 

estuvo relacionada con una mayor actividad proliferativa reflejada en mayor fase S 

y mayor niveles de Ki67 (Emig et al. 1998; Milde-Langoschk et al. 2001; Wong et 

al. 2001). 

 
 
 
 



 
Introducción 

 31

1.3.2 ONCOGÉNES Y AMPLIFICACIÓN GÉNICA 

 
 
 La amplificación génica es un mecanismo de desregulación genética común 

en las neoplasias. Este mecanismo ocurre cuando un fragmento cromosómico se 

duplica numerosas veces, dando lugar a múltiples copias de uno o más genes. En 

algunos casos, los fragmentos amplificados pueden estar representados docenas de 

veces hasta el punto de hacerse visibles microscópicamente en forma de segmentos 

cromosómicos que se tiñen diferencialmente del resto del cromosoma, llamados 

“HSR” (homogeneously staining regions), o bien como fragmentos de DNA 

extracromosómicos, llamados “double minute chromosomes”. En la mayoría de los 

casos, el gen que se amplifica es un posible oncogén que se sobreexpresa como 

resultado de la amplificación. 

  

 En el cáncer de mama hay varias regiones cromosómicas que se amplifican 

frecuentemente. Una de ellas se amplifica en aproximadamente el 30% de los casos 

y afecta a c-myc en el brazo largo del cromosoma 8 (Escot et al. 1986; Bishop et al. 

1970). Este  gen es un factor de transcripción con funciones en la regulación de la 

proliferación y diferenciación tisular (Gandarillas & Liebermann 1998; Iritani & 

Eisenman, 1999; Johnson et al. 1999; Schmidt, 1999; Schuhmacher et al. 1999) y 

participa en la replicación, crecimiento, metabolismo, diferenciación y apoptosis 

(Packham & Cleveland 1995; Hoffman & Lieberman 1998; Dang et al. 1999). Está 

implicado en la proliferación maligna de células humanas y animales (Amati et al. 

1998; Bouchard et al. 1998; Dang et al. 1999). Evan et al (1992) observaron que la 

expresión aberrante de c-myc podría se una de las causas de la apoptosis; este 

hecho fue estudiado anteriormente por Worm et al. (1986). 

  

 Deming SL et al (2000) estudiaron la expresión de este proto-oncogén en 

carcinomas de mama y encontraron amplificación en el 16% de los casos. La 

sobrexpresión de c-myc estuvo asociada al grado histológico del tumor, metástasis 

ganglionar, RP y estado menopaúsico de la paciente. Janocko et al (2001) 

relacionaron la amplificación de c-myc con la de c-erb-B2 y ciclina D1 mediante 



 
Introducción 

 32

hibridación “in situ” fluorescente (FISH) en  carcinomas de mama primarios no 

lobulillares. La frecuencia de amplificación de los tres oncogénes aumentaba 

progresivamente, al mismo tiempo que la aneuploidía del tumor y las múltiples 

anormalidades que tienen lugar en las células tumorales, como es la mutación de 

p53. 

  

 C-myc es un factor pronóstico independiente, cuya sobreexpresión está 

relacionada con una menor supervivencia global (SG) y menor ILE. 

  

 Otra región frecuentemente alterada se encuentra en 17q e incluye al gen c-

erb-B2 (Schneider et al. 1989). Este gen codifica a una glicoproteína transmembrana 

de 185 kDa, denominada p185 que consta de un dominio extracelular glicosilado de 

unión al ligando, una región hidrofóbica transmembrana y un dominio citoplasmático, 

con actividad tirosín quinasa (TK) (Coussens et al. 1985). 

  

 Posee una estructura similar al receptor de factor de crecimiento epitelial   

(EGF-r) (50% de aminoácidos homólogos), aunque no se une a ningún ligando de 

éste; es un receptor de factores de crecimiento, y se han purificado y clonado una serie 

de ligandos, entre los que cabe destacar dos glicoproteínas, gp30 y gp75, en células de 

cáncer de mama humano (Lupu et al. 1995).  

 La activación del protooncogén c-erb-B2 se puede realizar por distintos 

mecanismos: 

 

 - Mutación puntual que provoca el cambio de un residuo de valina por uno de 

glutamato en la posición 664, del dominio transmembrana (Bargmann et al. 1986). 

 - Deleción artificial del dominio N-terminal, siendo de 10 a 20 veces más 

efectivo en su actividad transformante que el gen completo (Bargmann y Weinberg. 

1988). 

 - Amplificación y/ó sobreexpresión del gen salvaje (Slamon et al. 1989). 

 - Sobreexpresión de su RNAm y de p185 en ausencia de amplificación génica 

(Kern y cols 1990). 

 - Formación de heterodímeros entre la p185 y el EGF-R (Lee et al. 1994). 



 
Introducción 

 33

 - Interacción entre la integrina α6β4 y p185, observada en la línea de 

adenocarcinoma de pulmón Calu-3 (Campiglio et al. 1994). 

 Todos estos mecanismos dan lugar a un incremento en la actividad TK. La 

unión del ligando al dominio extracelular de los receptores TK produce una 

dimerización de los mismos, que conlleva a una transmisión de señal a través de la 

membrana y la activación del dominio intracelular TK. 

  

 Se ha sugerido que p185 podría estar implicada en el proceso metastático, ya 

que ha sido localizada en las protuberancias de la membrana plasmática, necesarias 

para la motilidad celular (De Potter y Quatacker, 1993), lo cual es un paso esencial en 

el proceso de la invasión tumoral y metástasis. Asimismo, la implicación de p185 y 

moléculas de adhesión en la metástasis tumoral, podrían explicar la agresividad de los 

tumores que sobreexpresan p185 (Campiglio et al. 1994). 

  

 La amplificación del protooncogén c-erb-B2 ha sido detectada en un 15-40% de 

los carcinomas primarios de mama y en un 30% de los ováricos. Además, niveles 

elevados de la expresión de p185 en estos tumores se han relacionados con una 

supervivencia reducida, menor ILE, presencia de metástasis en ganglios linfáticos, 

pobre grado nuclear, hormonoindependencia y capacidad proliferativa (Slamon et al. 

1987; Marx et al. 1990; Meden et al. 1992). Asimismo, es un indicador de la 

resistencia al tamoxifeno en carcinomas de mama RE+ N+ (Borg et al. 1994), y Gion 

et al. (1994) demuestran que este oncogén, cuando está asociado a la positividad de 

ras en carcinomas N+, refleja una respuesta menor al CMF.  

   

 La cuantificación en suero de la proteina c-erb-B2 es útil para el diagnóstico y 

monitorización del cáncer de mama, reflejando preferentemente enfermedad avanzada 

y diseminada, pudiéndose incrementar seis meses antes de que aparezcan 

clínicamente las metástasis; se correlaciona estrechamente con el grado histológico y 

nuclear de los tumores (Go et al. 2000) y puede ser de utilidad como marcador de 

secreción en los tumores hormonoindependientes .  

  



 
Introducción 

 34

 En cuanto a la relación de c-erb-B2 con otros genes relacionados con el proceso 

tumoral, se ha descrito una falta de correlación con la edad, grado histológico y 

tamaño del tumor, catepsina D y estado de receptores hormonales (Korkolis et al. 

2001). Sí se observó correlación entre la expresión de c-erb-B2 y p53 e invasión 

ganglionar (Alexiev et al. 1997; Korkolis et al. 2001). El estudio inmunohistoquímico 

de c-erb-B2 y p53 permite la definición de lesiones intraductales y diferenciación 

entre HDA y CDIS (Alexiev et al. 1997). 

  

 Bcl-2 y Bax, son dos genes que codifican para dos proteínas reguladoras de 

apoptosis (Bcl-2, proteína antiapoptótica y Bax, proteína proapoptótica). Además de 

Bcl-2 (con hasta 12 homólogos) y Bax existen al menos 15 caspasas y distintos tipos 

de proteínas que modulan la respuesta apoptótica actuando sobre proteínas 

reguladoras de apoptosis como son las proteínas de estrés térmico (BAG-1 y 

hsp70/hsc70 de “Heat-Shock Proteins) (Krajewski et al. 1999). La expresión de 

ambas proteínas en tejido normal de mama e HDA, es similar y siempre inferior a la 

expresada en CDIS y CDI (Shilkaitis et al. 2000). En este sentido, y para ver la 

correlación entre estas proteínas y parámetros clínico-patológicos, Iochim et al. 

(2000)  estudiaron 95  muestras de carcinomas de mama y 20 hiperplasias epiteliales 

benignas. Bcl-2 se expresó en el 40% de los carcinomas (con más de un 10% de 

células positivas) y en el 85% de hiperplasias epiteliales benignas. La proteína Bax se 

detectó en el 8% de los carcinomas y en el 5% de las hiperplasias epiteliales benignas. 

Además, estudiaron la expresión en carcinomas de Rb y p53 que fue positiva en el 

75% y 45% de los casos respectivamente. No encontraron relación entre expresión de 

Bcl-2 y edad, tamaño, tipo y grado del tumor, invasión ganglionar, expresión de Rb e 

índice de proliferación. Sí encontraron correlación entre expresión de Bcl-2 y Bax, 

RE, RP (por lo que Bcl-2 puede estar sometida a control hormonal) y de forma 

inversa con p53. Sin embargo, Yang et al. (1999) no encontraron correlación entre la 

expresión de Bcl-2 y Bax. La expresión de Bcl-2 está relacionada con un fenotipo de 

cáncer de mama favorable (baja proliferación, expresión de receptores esteroideos y 

ausencia de expresión de p53 y c-erb-B2) (Schorrk et al. 1999, Yank et al. 1999, 

Daidone et al. 1999; Kymionis et al. 2001). Otro estudio realizado sobre proteínas 

antiapoptóticas (Bcl-2, Bcl-x y Mcl-1) y proteínas proapoptóticas (Bax y Bak), es el 



 
Introducción 

 35

de Rochaix et al. (1999) sobre 110 CDI mediante inmuhistoquímica, y donde la 

expresión de Bcl-2 y Bax fue mayor que en el estudio anteriormente comentado (62% 

y 60% respectivamente). Hallaron, además, una correlación entre un mayor índice 

apoptótico y una menor expresión de Bcl-2 y de receptores hormonales, así como una 

correlación entre expresión de Bax, y mayor grado histológico del tumor. Similares 

resultados en relación con niveles de positividades fueron obtenidos por Wu et al. 

(2000) en el estudio que realizaron sobre 91 pacientes con carcinomas de mama, con 

un seguimiento de 66 meses, donde también encontraron una relación entre elevados 

niveles de Bcl-2 y bajos de Bax con invasión ganglionar, recidivas postoperatorias y 

metástasis. Estos autores hicieron un análisis multivariable, en el que analizaron la 

expresión de Bcl-2, invasión ganglionar y GH y vieron que todos ellos son factores 

pronósticos independientes de SG e ILE. 

 

 En relación con la respuesta terapéutica, una sobreexpresión de Bcl-2 y Bcl-x 

están implicados en la quimiorresistencia, mientras que niveles elevados de Bax 

promueven la apoptosis y sensibilizan a las células tumorales para terapia 

anticancerosa (Krajewski et al. 1999; Wu et al. 2000; Daidone et al. 1999; Kymionis 

et al. 2001). En este sentido, Gao et al (2000) vieron que cuando el porcentaje de 

células en G1 era elevado, y por tanto los resultados presentaban niveles de expresión 

elevados de Bcl-2, la resistencia a inducir apoptosis era mayor que cuando existía una 

mayor población celular en fase S y menor expresión de Bcl-2. El ciclo celular, por 

tanto, depende de  Bcl-2, que contribuye a la regulación de quimiosensibilidad y 

apoptosis de células tumorales. 

 

 

 

 

 

 

 



 
Introducción 

 36

1.4 EVENTOS TEMPRANOS Y TARDÍOS EN EL DESARROLLO 

TUMORAL 

 

 
 En el desarrollo de cáncer de mama existen una serie de etapas premalignas 

denominadas HDA y CDIS que eventualmente derivan en carcinoma invasor 

(Radford et al. 1995; Brenner et al. 1997). La progresión de CDIS a CDI y 

metástasis son consecuencia de una expansión clonal de las células neoplásicas con 

alteraciones genéticas (Fujii et al. 1996). Cambios genéticos en CDIS implican 

ganancias y pérdidas en el material genético, siendo el cromosoma 22 el más 

implicado en este proceso.  
 
 Lakhani et al. (1995) han encontrado pérdida de LOH en el cromosoma 16q 

(microsatélite D16s413) y 17p (microsatélite D17S796) en HDA. En estadíos 

tempranos de CDIS existen pérdidas en 16q y 17p (38% y 34% respectivamente) 

(Fujii et al. 1996), y en estadíos más avanzados de CDIS se produce pérdida en 1p, 

1q, 6q, 8q, 9p, 11p, 11q, 16q, 13q, 17q y 17q, (Fujii et al. 1996; Ando et al. 2000; 

Radford et al. 1995; Anbazhagan et al. 1998; Lakhani et al. 1995; Kuukasjarvi et 

al. 1997), llegando hasta un 40% en los estadíos más avanzados de los CDIS. Bose 

et al. (1998) han estudiado la heterocigosidad en el cromosoma 10q23 en el 40% de 

los CDI. Además, se han observado ganancias en los cromosomas 1q, 8q, 3q, 6p, 

17q22-24, 20q13 en carcinomas invasores. En general, el patrón genético 

observado en CDIS coincide con los tumores infiltrantes, por lo que se asume que 

son derivados genéticamente de lesiones “in situ” (Fujii et al. 1996). 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
Introducción 

 37

1.5 FACTORES PRONÓSTICOS MOLECULARES RELACIONADOS   

CON LA INVASIÓN Y METÁSTASIS  

 

 El proceso invasivo-metastático incluye las siguientes fases: 

• Crecimiento progresivo en la localización primaria. 

• Vascularización del tumor (angiogénesis). 

• Separación de las células del tumor. 

• Entrada de las células tumorales en el torrente vascular (intravasación) ya sea     

sanguíneo o linfático. 

• Circulación en el torrente sanguíneo. 

• Detención en los vasos sanguíneos. 

• Salida o extravasación. 

• Migración e invasión por la célula tumoral del parénquima de un órgano. 

 

 

1.5.1 CRECIMIENTO 

 

 

 Las células cancerosas, por definición, proliferan desafiando los controles 

normales, es decir, son neoplásicas y son capaces de invadir y colonizar los tejidos 

que las rodean. Existe un paso previo antes de lograr la autonomía de crecimiento, que 

es la inestabilidad del genoma, la cual permite que sea fácil la aparición de lesiones en 

el DNA, que no se pueda reparar, o que la célula alterada no siga los mecanismos 

normales de destrucción (apoptosis). La inestabilidad genética y la autonomía de 

crecimiento, se correlacionan estrechamente con algunos de los genes implicados en 

los tumores. Así, los oncogenes codifican proteínas que pueden ser cualquier 

componente de la cadena de transducción de la señal celular, y los genes tumor 

supresores codifican proteínas que intervienen en condiciones normales en el control 

del ciclo celular (Kastan et al 1995). 

 

 



 
Introducción 

 38

1.5.2 VASCULARIZACIÓN DEL TUMOR (ANGIOGÉNESIS) 

 

 

 El crecimiento de un tumor sólido se halla limitado por el flujo sanguíneo. Para 

poder crecer, el tumor ha de inducir la formación de una red capilar que invada la 

masa tumoral. Las células endoteliales invasoras han de responder a una señal 

producida por el tejido que necesita aporte sanguíneo. La respuesta de las células 

endoteliales consta de cuatro etapas. En primer lugar, las células deben abrirse paso a 

través de la lámina basal que rodea a los vasos ya existentes; durante la angiogénesis 

las células endoteliales segregan proteasas, que les permiten la digestión de distintos 

materiales a su paso por la lámina basal del capilar. En la siguiente fase, las células 

endoteliales han de desplazarse hacia el origen de la señal. Seguidamente, tienen que 

proliferar y por último, tienen que formar conductos. También se han identificado 

factores de crecimiento que pueden manifestar conjuntamente los cuatro componentes 

de la respuesta angiogénica, como es el factor de crecimiento vascular endotelial 

(VEGF, de Vascular Endothelial Growth Factor), que actúa de forma selectiva en las 

células endoteliales, estimulando la angiogénesis, y que parece ser el responsable de 

la elevada irrigación sanguínea que presentan algunos tumores. Otros factores de 

crecimiento, incluyendo algunos miembros de la familia del factor de crecimiento de 

los fibroblastos, también estimulan la angiogénesis. Estos tipos de factores 

angiogénicos se liberan durante la reparación, inflamación y crecimiento de los 

tejidos; son fabricados por distintos tipos celulares, incluídos los macrófagos, los 

mastocitos y los adipocitos. También se ha identificado un cierto número de 

inhibidores que pueden bloquear la formación de nuevos vasos sanguíneos. Así, la 

angiogénesis parece que es regulada por complejas combinaciones de señales, más 

que por un solo tipo de señal. 

 

 

 

 

 

 



 
Introducción 

 39

1.5.3 SEPARACIÓN DE LAS CÉLULAS DEL TUMOR E INTRAVASACIÓN 

 

 

 Las células del un tumor sólido han de ser capaces de disminuir su adhesión a 

sus vecinas originales mediante la pérdida de expresión de cadherina E, y otras 

moléculas de adhesión entre células del epitelio, tales como CD44std. Deben 

atravesar la membrana basal y migrar a través del estroma  (invasión) para alcanzar la 

circulación sanguínea o vasos linfáticos. Para que las células tumorales crucen una 

lámina basal deben tener receptores de laminina, que permitan a las células adherirse 

a la lámina y han de segregar colagenasas de tipo IV, que les ayuden a digerir la 

lámina. El proceso de invasión diferencia carcinomas “in situ” de carcinomas 

invasivos.  

  

 Cuando las células llegan a los vasos sanguíneos, penetran (intravasación) 

formando nuevas asociaciones con otros tipos de células, en ellos. Deben evitar la 

destrucción dentro de los vasos y moverse en la dirección del flujo sanguíneo hacia 

sitios potenciales de crecimiento. El sistema circulatorio es un medio hostil, donde 

más del 99% de las células cancerígenas son destruidas por una combinación de 

mecanismos de estrés, destrucción proteolítica y respuesta inmune. La respuesta 

inmune puede tener lugar además fuera de los vasos, implicando células del sistema 

inmune y proteínas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, de Major 

Histocompatibility Complex) en las células cancerosas.  

 

 La contribución de la respuesta inmune en la invasión metastática es causa de 

debate, ya que además de los carcinomas virales que expresan proteínas extrañas, las 

células cancerígenas están formadas por proteínas propias del hospedador incapaces 

de activar el sistema inmune. Además, en las células cancerígenas tienen lugar 

cambios en el MHC. Las células T citotóxicas requieren proteínas MHC-I para la 

presentación antigénica, por lo que la pérdida de proteínas MHC supondrá un 

aumento en  la supervivencia de las células cancerígenas. Ensayos experimentales 

demuestran que una sobreexpresión de proteínas MHC-I disminuye el potencial 

metastático, el cual se correlaciona inversamente con la expresión de MHC en líneas 



 
Introducción 

 40

celulares de  melanoma. Clínicamente, metástasis en nódulos linfáticos de carcinoma 

de mama, colon y riñón tienen niveles de expresión de proteínas MHC-I inferiores a 

las células de las que derivan. 

 

 Las células cancerígenas son transportadas en la sangre como células 

individuales, o bien formando agregados con linfocitos y plaquetas. La formación de 

estos agregados protege a las células de mecanismos de estrés y respuesta inmune, 

además de facilitar la unión al endotelio y la posterior extravasación. Las plaquetas 

interaccionan con fibrinógeno en la superficie del endotelio y vía P-selectinas, con 

proteoglicanos del endotelio. Las células del endotelio tienen determinantes de 

membrana específicos de órganos, como son las selectinas y moléculas de adhesión 

intercelular (CAMs, de Cell-Cell Adhesion Molecules). La selectina E endotelial se 

une a los proteoglicanos de la célula tumoral. Las integrinas α4β1 de células tumorales 

y linfocitos contribuyen en el freno inicial del movimiento de los agregados y en el 

ensamblaje al endotelio. Además, existen interacciones fuertes entre las integrinas 

celulares α4β1 y V-CAM del endotelio, cuya expresión está regulada por citokinas 

(interleukina-1 y factor de necrosis tumoral). Estas interacciones entre células 

tumorales y endotelio, sirven de freno de las células tumorales y constituyen la 

primera etapa en el proceso de extravasación. Un proceso análogo es el que implica a 

las selectinas E y P endoteliales, las cuales reconocen carbohidratos de proteínas de 

membrana de células tumorales (E) o plaquetas (P) de los agregados, contribuyendo a 

parar el movimiento de las células tumorales. 

 

 

1.5.4 EXTRAVASACIÓN 

 

 

 La salida de las células tumorales de la circulación sanguínea implica tres 

etapas: unión a las paredes del endotelio, retracción de las células endoteliales que 

llevan unidas las células cancerígenas y destrucción de la membrana basal y 

migración al estroma adyacente. La retracción de las células endoteliales lleva 



 
Introducción 

 41

consigo la exposición de glicoproteínas de la membrana basal que se unen a las 

células tumorales, y que posteriormente éstas últimas digerirán con proteasas y 

glicosidasas. Las proteínas de la membrana basal son laminina, colagenasa IV y 

fibronectina, todas ellas ligandos de la familia de receptores de integrinas situadas en 

la superficie de las células tumorales. Las integrinas α1β1 reconocen colagenasa  y 

laminina, mientras que las α6β4 se unen a laminina. Los receptores de laminina se 

expresan en niveles elevados en carcinomas de colon, mama y pulmón, todos ellos 

epiteliales. 

  

 En el proceso de extravasación intervienen además los activadores de 

plasminógeno: el activador del plasminógeno “urokinasa like” (uPA), implicado en la 

proteolisis tisular, y el activador del plasminógeno tisular (tAP) encargado de la 

disolución de coágulos. La sobreexpresión de uPA favorece la invasión y metástasis 

tumoral. Además, en el proceso de metástasis intervienen las metaloproteinasas 

(NMP), activadas por plasmina, que digieren componentes de la MEC y destruyen 

barreras físicas. 

 

 

1.5.5 MIGRACIÓN E INVASIÓN 

 

 

 Tras la extravasación, las células tumorales migran a sitios nuevos para formar 

colonias, lo que requiere la producción continuada de proteasas que digieran la MEC. 

Intervienen las integrinas de las membranas de las células tumorales que median 

señales externas desde la matriz a la actina del citoesqueleto de las células. El 

movimiento se realiza por contracción y relajación del citoesqueleto. Los péptidos 

liberados durante la proteolisis de la MEC actúan como agentes quimiotácticos para 

atraer células cancerígenas. Los péptidos de la matriz se unen a integrinas y bloquean 

el acceso de las células a la matriz y facilitan el movimiento hacia otros lugares. 

 



 
Introducción 

 42

 Otros péptidos que intervienen son los factores de motilidad, fundamentales en 

la migración, que pueden ser secretados por células normales y actúan de forma 

paracrina sobre otras células, o bien son producidos por las propias células tumorales 

actuando de forma autocrina. 

 

 
1.5.6 CRECIMIENTO 

 

 

 La proliferación de células cancerígenas en un nuevo lugar de implantación, en un 

principio se localiza a una distancia de 1mm de los vasos sanguíneos. El crecimiento 

se desarrolla gracias a la influencia local de los factores de crecimiento, y al 02 

transportado por el sistema circulatorio. Es necesaria, además, la formación de nuevos 

vasos (angiogénesis) con el consiguiente aporte de nutrientes y 02. 

 

 

1.5.7 CAMBIOS GENÉTICOS IMPLICADOS EN LA METÁSTASIS 

 

 

 Los oncogénes y genes supresores están implicados en la metástasis, además de en 

otras etapas de la biología molecular del carcinoma de mama, tal y como hemos visto. 

Así, la activación del oncogén ras, está asociada a un aumento de la proliferación en 

las etapas iniciales de carcinoma de colon, además de incrementar el potencial 

metastático en los carcinomas en general. No está claro el hecho de que el gen ras 

pueda implicar transformación en algunas ocasiones y metástasis en otras. Los 

procesos de transformación y metástasis tienen lugar de forma separada. Otros 

oncogénes, como v-src y v-raf, intervienen en los procesos de proliferación e 

invasión. 

 

 En cuanto a los genes implicados en la angiogénesis, la producción de proteasas 

y moléculas de adhesión juega un papel fundamental, pero todavía hoy quedan 

muchas por caracterizar. La fusión de células metastáticas de melanoma de ratón con 



 
Introducción 

 43

células control producen híbridos no metastáticos, lo que indica que las células 

normales contienen “algo” que inhibe la metástasis. Se han identificado genes 

inhibidores de la metástasis, como el nm23, cuya pérdida lleva consigo en tumores de 

hígado un incremento en la metástasis, mientras que en carcinoma de ovario, su 

expresión está aumentada (Schneider et al. 2000). 

 

 CD44 es una glicoproteína transmembrana de la superficie celular, que 

consta de un dominio amino-terminal, un domino transmembrana y un dominio 

citoplasmático, implicado en la transducción de la señal e interacción con el 

citoesqueleto para regular la migración y/o división celular (Lesley 1994, Isacke 

1994). Ha sido implicado en una gran variedad de funciones entre las que se 

encuentran diferenciación epitelial, proliferación celular, migración celular, 

adhesión célula-célula y célula-MEC, invasión tumoral y metástasis tumoral en 

células de origen mesenquimal y epitelial (Sanchez Lockhart et al. 2001). 

 

 Las moléculas de adhesión CD44 están ligadas a la extensión de la metástasis. 

Su expresión disminuye en carcinomas de mama y colon, mientras que su variante 

CD44 std, está aumentada en unos casos, y disminuida en otros. CD44 constituye una 

familia de proteínas codificadas por un gen de aproximadamente 60kb, localizado 

en el cromosoma 11p13 y compuesto de, al menos, 20 exones (Sherrington et al. 

1992). Merecen destacar dos subgrupos: CD44H y CD44v. 

  

 La posible implicación de CD44v en la progresión tumoral se describió en una 

línea celular tumoral metastásica de adenocarcinoma pancreático de rata (Matzku et 

al. 1983), que expresaba predominantemente los exones variantes (v4-v7). La 

formación de metástasis en la línea celular con un crecimiento localizado era iniciada 

por la formación de transferencia de CD44 v4-v7 (Günthert et al. 1991), y el 

desarrollo metastático era inhibido por un anticuerpo (1.1 ASML), que reconocía a un 

epítopo con el exón v6 (Günthert et al. 1991; Matzku et al. 1989). 

 



 
Introducción 

 44

 Ha sido propuesto que CD44v y, en particular el exón v6, puede ser muy 

importante en la progresión tumoral (Berner et al. 2001), y concretamente en el 

carcinoma de mama (Morris et al. 2001; Sheen-Chen et al. 1999).  

  

 Aunque CD44v no puede ser considerado como un marcador general de 

metástasis, en algunos tipos de tumores se ha observado una fuerte correlación entre 

formación de metástasis y expresión de CD44v. Del mismo modo, es importante el 

hecho de que la metastatización de algunos tumores aparece cuando se pierde la 

expresión de CD44v. Sin embargo, Berner et al (2001) observaron, por 

inmunohistoquímica, mayor expresión de las isoformas CD44v3 en citoplasma, y de 

CD44v6 en membrana en carcinomas alveolares y mucinosos, mientras que la 

expresión de CD44v5 en membrana, se relacionó con invasión ganglionar. También 

se ha visto un  aumento de los niveles de CD44v6, por enzimoinmunoensayo, en 

suero de pacientes con carcinoma de mama, que se relacionó con metástasis a 

distancia y estadío del tumor (Sheen-Chen et al. 1999). Por otro lado, se ha 

relacionado una negatividad para la isoforma CD44s con tumores con GH3, Ki67 

positivo (en más del 10% de las células) y con invasión ganglionar (Schneider et al. 

1999). 

  

 En cuanto a la relación con parámetros de pronóstico, Morris et al (2001) 

estudiaron 109 pacientes con carcinoma de mama en estadío II, con un seguimiento 

de 5 años. Utilizaron técnica inmunohistoquímica y detectaron un 8% de positividad 

para CD44v6 que no se correlacionaba con edad, tamaño, grado histológico e 

invasión ganglionar. No encontraron asociación significativa entre CD44v6 e ILE y 

SG. Observaron similares resultados con la isoforma CD44s. Estos autores concluyen 

que ni CD4v6 ni CD44std son indicadores pronósticos de estadíos tempranos de 

carcinoma de mama, y el aumento en su expresión podría ser indicador de la pérdida 

de control sobre el proceso de “splicing” alternativo del RNAm en tejido tumoral. Sin 

embargo, Sanchez Lockhart et al. (2001) sí consideran útiles la expresión de 

isoformas de CD44, para el “screening” de detección de carcinoma de ovario y mama, 

ya que han visto una desregulación en los patrones de expresión de CD44 en tumores 

malignos de mama y ovario, comparado con patologías benignas y tejidos control. 



 
Introducción 

 45

Tampoco estos autores han encontrado correlación entre expresión de isoformas y 

edad de la paciente, tamaño, estadío, GH o agresividad del tumor. 

 

 Existen, por tanto, discrepancias a la hora de  relacionar las distintas isoformas 

de CD44 con la invasión ganglionar, si bien los últimos estudios relacionan este 

proceso con la pérdida de expresión de la isoforma CD44std. 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
Introducción 

 46

1.6 MAMOGLOBINA HUMANA (h-MAM) 

  

 

 Recientemente se ha aislado el gen de la mamoglobina en tejido mamario de 

humanos adultos. Su función concreta en tejido mamario, así como su posible papel 

en la activación oncogénica del mismo, es de momento desconocida. El gen de la 

mamoglobina humana (h-MAM), localizado en el cromosoma 11q.13 fue identificado 

en 1996 (Watson et al. 1996), y su secuencia de aminoácidos es homóloga a la de 

proteínas epiteliales de secreción de la familia de la uteroglobina. A esta familia, 

pertenecen la propia uteroglobina de conejo (rUg), con la que presenta un 40% de 

homología en su secuencia de aminoácidos, la proteína  hCC10, con un 26% de 

homología y la rPSC3 (esteroide prostático de rata unido a la subunidad C3 de la 

prostateína), con un 42% de homología (Watson et al. 1996). Aunque la función de h-

MAM es desconocida, no lo es la de los demás miembros de la familia a la que 

pertenece, formada, como decíamos, por proteínas secretores epiteliales. Estas 

proteínas, bien modulan procesos inflamatorios, o bien la unión a ligandos 

esteroideos. Las similitudes estructurales entre la h-MAM y estas proteínas, sugieren 

que h-MAM podría tener una funcionalidad relacionada con la glándula mamaria. 

  

 La rPSC3  es la principal proteína de secreción en próstata de rata (Lea et al. 

1979) cuya síntesis y unión a hormonas está regulada por testosterona; 

estructuralmente es un tetrámero formado inicialmente por tres subunidades de 8-

12KDa (rPSC1, rPSC2 y rPSC3) (Lea et al. 1979) cuyos genes preceden de un ancestro 

común (Parker et al. 1982). El gen rPSC3 se duplica, dando lugar al rPSC3 (I), 

regulado por andrógenos, que se transcribe y activa en la próstata, y el rPSC3 (II), que 

es un gen silente debido probablemente a mutación en el promotor (Hurst y Parker, 

1983). El promotor de rPSC3  se fusiona al antígeno SV40 y es capaz de producir 

carcinoma de mama y prostático en ratones transgénicos (Maroulakou et al. 1994). 

Sin embargo, su función biológica es desconocida, y hasta el momento no se ha 

identificado su homólogo en el genoma humano. 

  



 
Introducción 

 47

 El gen rUg de conejo se caracterizó como proteína de secreción en tejido 

endometrial de útero y se expresa también, aunque en menores niveles, en pulmón, 

próstata y mama (Miele et al. 1987). Su transcripción está también regulada por 

hormonas esteroideas (Sandmoller et al. 1994). Estructuralmente es una proteína 

homodimérica con dos puentes disulfuro. La rUg une progesterona y otros esteroides 

y es sustrato de transglutaminasas. Además, inhibe la fosfolipasa A2 y puede 

intervenir en la respuesta inmune e inflamatoria celular. 

 

 La proteína hCC10 humana y  sus homólogas en rata y ratón tienen funciones 

similares a la rUg  de conejo (Miele et al. 1994), aunque su función biológica está por 

determinar. 

 

 Para secuenciar el gen h-MAM, se aislaron dos clones superpuestos de una 

biblioteca genómica utilizando cDNA de h-MAM. Uno de estos clones (λMAM2) se 

utilizó para subclonar el fragmento Sal I de 4.3 Kb (kilobases). Este fragmento 

incluye una secuencia de unas 1000 pb en el extremo 5´que no se transcribe, una 

secuencia de unas 1300 pb del gen de la mama y una secuencia de unas 1200 pb en el 

extremo 3´que tampoco se transcribe. Se secuenció este fragmento y mostró un 100% 

de homología con el cDNA de h-MAM derivado de la línea tumoral de mama MDA-

MB415, así como del cDNA derivado de tejido normal de mama.. Las diferencias en 

la secuencia entre el cDNA y los clones genómicos, permitieron determinar los 

límites entre exones e intrones del gen h-MAM, formado por tres exones (de 119, 188 

y 199 pb, respectivamente) y dos intrones (de 603 y 1888 pb, respectivamente). Si se 

compara el gen h-MAM con los rPSC3 y CC10, se puede observar que existe 

conservación tanto en la disposición de intrones y exones, como en los sitios de corte, 

lo que sugiere que todos ellos pertenecen a una familia multigénica derivada de una 

secuencia ancestral común. La secuenciación de gen h-MAM reveló secuencias 

repetitivas que incluyen repeticiones AUU específicas de humanos en la región no 

transcrita 5´, una secuencia de 500 nucleótidos altamente repetitiva en el intrón b y 

repeticiones del dinucleótido CA en la región no transcrita 3´. 

  



 
Introducción 

 48

 La secuencia del promotor está formada por unas 1000 pb, con un sitio de inicio 

de  transcripción relativamente uniforme a 27 pb posterior a la secuencia que contiene 

el elemento TATA. No se han encontrado homologías con la secuencia de promotores 

de los otros miembros de la familia a la que pertenece (Toonen et al. 1996) y sí se han 

encontrado con promotores de genes específicos de mama como la proteína acíclica 

(Mcknight et al. 1992) y la β-caseína (Greenberg et al. 1992). Aunque la síntesis de β-

caseína esté asociada a lactogénesis, y su transcripción genética regulada por 

prolactina, la expresión de h-MAM, no está asociada a la lactancia, aunque sí se ha 

visto que está relacionada con  la proliferación y diferenciación de glándula mamaria 

en embarazo.  

  

 Para evaluar la conservación filogenética del gen h-MAM, se ha aislado el gen 

CC10 en humanos, mono, rata y ratón y se ha encontrado un rango de homología 

entre ellas del 50-90% (Miele et al. 1994). Si embargo el gen rPSC3 de la rata no se ha 

identificado en otras especies. Para determinar el grado de conservación interespecie y 

evaluar su utilidad en tumorogénesis mamaria en modelos animales, se examinó el 

DNA genómico de múltiples organismos por Southern blot con el subclón genómico 

p-MAM 4.3. Se observaron dos fragmentos genómicos Xba 1 en humanos y 

chimpancés y no se detectó hibridación en mono ni en otros mamíferos no primates. 

Estos resultados indican que h-MAM está pobremente conservado o ausente en esas 

especies; este hecho, junto con que la h-MAM sea específico de mama, sugiere que la 

expresión de este gen pueda estar asociada a la tumorogénesis de mama. 

  

 La localización cromosómica del gen se llevó a cabo por técnica “Fluorescent 

In Situ Hybriditation” (FISH), utilizando clones genómicos λ y el subclon de 

plásmido pMAM 4-3. Se seleccionaron 300 cromosomas en metafase al azar, de los 

cuales, 243 tenían ambas copias de cromosoma 11 marcado así como señales 

fluorecentes en el cromosoma 15. Se localizaron señales de hibridación en las 

regiones 11q12.3-13.1 y 15q23-24. Al igual que en el caso de la rPSC, existen 

múltiples copias de genes similares a h-MAM en el genoma humano. 

  



 
Introducción 

 49

 Los genes h-MAM y CC10 tienen localizaciones próximas, por lo que 11q12.3-

13.1 podría agrupar secuencias de genes tipo globina. Precisamente el cromosoma 

11q13, se encuentra amplificado en carcinoma de mama y contiene oncogénes 

implicados en la enfermedad, como son int-2 y ciclina D (Fantl et al. 1993), por lo 

que la localización del gen h-MAM en la posición 11q12.3-11.3 podría hacer pensar 

que niveles elevados de la proteína en carcinoma de mama podrían ser debidas a 

amplificación génica. Para verificar este dato, se realizó un Sourthern blot del clon 

MAM4-3 de h-MAM de líneas celulares y tumores donde previamente se había 

observado sobeexpresión de h-MAM respecto a tejido de mama control. No se vio 

amplificación génica ni reorganización en los tumores ni en las líneas celulares, por lo 

que la sobreexpresión de h-MAM en carcinoma de mama, detectada por algunos 

grupos, no parece ser debida a la amplificación ni reorganización genética. 

 

 Una de las características de los miembros de la familia del gen de la 

uteroglobina es su regulación transcripcional por hormonas esteroideas (Miele et al. 

1994). Sin embargo, la transcripción de h-MAM no se encuentra regulada por 

estradiol, progesterona, dexametasona o andrógenos en líneas celulares de carcinomas 

de mama  MCF7 o T47D con receptores hormonales positivos. Sí se han localizado 

elementos de respuesta esteroidea en la secuencia “alu” situada a 843 pb del lugar de 

inicio de la transcripción, que son idénticos a la existente en la región no transcrita 

5´del gen BRCA1. Además, se ha visto una secuencia de 2243 Nt similar a la que 

existe en el gen rPSC3(I) relacionada con la respuesta androgénica. 

  

 Se ha detectado expresión de h-MAM en líneas tumorales de células (MDA-

MB415 y MDA-MB-361 y con menor intensidad en las líneas BT474, MDA-MB175 

y MDA-MB468) y no se ha detectado en líneas celulares inmortalizadas no 

tumorogénicas, de células mioepiteliales de mama (hMMC) o estroma de mama. La 

expresión del gen h-MAM define un fenotipo único en un grupo de líneas celulares de 

cáncer de mama, cuya expresión está ausente en los constituyentes celulares de 

glándula mamaria (Mark et al. 1996). Además se ha testado el RNAm de h-MAM en 

ovario, útero y leucocitos de sangre periférica de pacientes con carcinoma de mama, 

mediante “Reverse-Transcriptase- Polimerase Chain Reaction” (RT-PCR), pero no se 



 
Introducción 

 50

ha encontrado expresión en ninguna de las muestras (Zach et al. 1999). Al ser un gen 

específico de mama, se ha utilizado, de modo experimental, para la detección de 

células circulantes de cáncer de mama. El límite de detección de células tumorales 

circulantes fue de 1 célula tumoral de la línea celular MD-MBA361, de cada 106 

células sanguíneas mononucleares (Grünewald et al. 2000). 

  

 Recientemente se ha clonado el gen B de h-MAM (MGB2), homólogo de la h-

MAM (Becker RM et al. 1998), el cual se ha visto sobreexpresado en tejido de 

carcinoma de mama, aunque su perfil de expresión no es idéntico al de h-MAM. 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 







Materiales y Métodos 

 54

3 MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 

3.1 MUESTRAS TUMORALES 
 
 
 Las muestras provienen de pacientes operadas en el Centro de Patología de la 

Mama de Madrid. En el acto operatorio el patólogo diagnostica la malignidad de la 

masa que posteriormente es confirmada mediante estudio en diferido tras inclusión 

en parafina. Para el presente trabajo, hemos utilizado exclusivamente los datos del 

análisis anatomopatológico definitivo, que, además de la variedad histológica, y el 

carácter invasor o no, incluye la determinación del grado histológico y el grado 

nuclear. 

 

 Hemos estudiado 77 tejidos tumorales mamarios, con un volumen  

aproximado de cada muestra de 1cm3. Las características de las muestras se expresan 

en la tabla 1. 

 
Tabla 1.  Características de las muestras de tejido mamario 

 

 

 Total 77 

 

 Tipo histológico 

         Carcinoma ductal infiltrante (CDI) 

         Carcinoma lobulillar infiltrante (CLI) 

           Carcinoma epidermoide 

         Carcinoma mucinoso 

         Metástasis ganglionar 

        Carcinoma ductal “in situ” (CDIS) 
 

  

 

56 

11 

  1     

  1    

  2  

  6 



Materiales y Métodos 

 55

 De todas las pacientes estudiadas, 10 recibieron tratamiento previo con 

quimioterapia y sus factores pronósticos serán estudiados en un grupo aparte. 

 

 El carcinoma de mama en su fase inicial está representado por el carcinoma “in 

situ” o intraductal (figura 1). 

 
Figura 1. Carcinoma “in situ” (CDIS). Proliferación epitelial con rasgos citoarquetecturales de 

carcinoma ductal, confinada en ductos mamarios de cualquier nivel, sin sobrepasar el límite de la 

membrana basal (ampliación electromicroscópica, x 100).  

 

 

 

 

 

 En las figuras 2 y 3 se representan un carcinoma ductal infiltrante de mama y 

carcinoma lobulillar infiltrante, respectivamente, que constituyen, por ese orden las 

variedades más frecuentes de cáncer de mama. 

 

 

 

 



Materiales y Métodos 

 56

Figura 2.  Carcinoma ductal infiltrante (CDI). Carcinoma integrado por nudos y cordones más o 

menos sólidos. 

 

 

 

 

 
Figura 3.  Carcinoma lobulillar infiltrante (CLI). Tumor de células pequeñas que crece en 

cordones sólidos. 

 

 

 

 



Materiales y Métodos 

 57

3.2 INMUNOHISTOQUÍMICA 

 

 

 El análisis de muestras tumorales mediante inmunohistoquímica es una técnica 

ampliamente utilizada en el entorno clínico debido a que permite detectar proteínas 

directamente sobre la célula, conocer el origen de las células tumorales así como el 

pronóstico de las mismas. 

 

 La inmunohistoquímica es una técnica que se basa en reproducir una reacción 

antígeno-anticuerpo en el laboratorio. El anticuerpo se une al antígeno en zonas 

específicas (llamadas epítopos) mediante uniones no covalentes.  

 

 Las muestras que van a ser utilizadas para análisis inmunohistoquímico se 

conservan en formol tamponado (para la fijación de los tejidos), se deshidratan, y 

posteriormente son incluidas en parafina. Una de las exigencias de la 

inmunohistoquímica es la adecuada conservación del antígeno en el tejido, para lo 

cual, éste debe ser fijado rápidamente después de ser extraído del organismo para 

detener la lisis celular. Cuanto mayor tiempo estén las muestras en formol, mayor es 

el número de enlaces que se forman entre los aminoácidos de una proteína, 

deteniendo así los procesos de lisis asociados a la muerte celular. Estos enlaces 

forman una malla que además de detener la lisis, también ocultan los epítopos con lo 

que no puede producirse la reacción antígeno-anticuerpo. Esta malla debe romperse 

para mostrar los epítopos. El proceso de rotura de la malla se realiza calentando los 

tejidos en una olla a presión superando los 100 ºC, o bien, en una estufa a 150 ºC. Al 

ser incluidas las muestras en parafina, no necesitan condiciones especiales de 

almacenamiento y pueden ser analizadas durante años.  

 

 Los análisis se realizaron sobre cortes de parafina correspondientes a los 

mismos carcinomas de mama de los cuales se habían obtenido muestras de tejido 

fresco (ver apartado 3.1) 

 



Materiales y Métodos 

 58

 La técnica empleada para la detección por inmunohistoquímica de todos los 

antígenos estudiados fue la de estreptavidina-biotina-peroxidasa, con pretratamiento 

de las muestras en “buffer” citrato en olla a presión (técnica “HIER”, “Heat-Induced 

Epitope Retrieval”). El anticuerpo primario o específico no está marcado y el 

secundario está biotinado. El tercer reactivo a emplear es el complejo estreptavidina-

peroxidasa (figura 4). La estreptavidina es una glucoproteína de alta afinidad por la 

biotina, con la que se obtiene una amplificación de la señal del complejo antígeno-

anticuerpo. 

 
Figura 4. Esquema de la técnica inmunohistoquímica “HIER”. 

 
 
 
 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

  

 

 

 

 El método para lograr evidenciar la peroxidasa, consiste en hacer reaccionar a 

ésta con un sustrato específico (peróxido de hidrógeno) en presencia del revelador o 

cromógeno (diaminobencidina) dando al final el producto coloreado. Debido a que 

en el tejido existe peroxidasa endógena que da una reacción de color, que puede 

 

Anticuerpo secundario 

     Anticuerpo específico 

  Complejo estreptavidina-peroxidasa 

Biotina 



Materiales y Métodos 

 59

interferir en el análisis, antes de añadir el complejo estreptavidina-peroxidasa, es 

necesario proceder a la inhibición de dicha peroxidasa endógena, mediante inmersión 

en metanol/H2O2 al 3%. 

 

 La secuencia de pasos, a partir de los bloques en parafina, es la siguiente: 

 

• Obtención de cortes de 4µm en microtomo y adhesión a portas pretratados para     

soportar tratamiento térmico; mantener en estufa a 37º durante 24h. 

• Desparafinación en xilol (3 x 5 min). 

• Rehidratación en alcoholes de concentración decreciente (desde 100% hasta 

70%) y posterior paso a baño de “buffer” durante 10 min. 

• Inmersión en metanol/H2O2 al 3% durante 10 min, para eliminar la actividad 

peroxidasa endógena. 

• Calentamiento en baño de “buffer” citrato 0.01M, pH 6.0, en olla a presión, 

durante 2 min a la máxima potencia, con el fin de desenmascarar el antígeno. 

• Dejar enfriar los cortes. 

 

A partir de este paso, todos los posteriores se llevan a cabo en cámara húmeda a 

temperatura ambiente. 

 

• Lavado en “buffer” (3 x 3 min). 

• Preincubación durante 10 min con suero normal de la misma especie que la 

utilizada para obtener el 2º anticuerpo puente biotinado, con el fin de evitar 

uniones inespecíficas. 

• Incubación durante 1h con el anticuerpo primario (anticuerpos y 

concentraciones utilizadas se detallan más adelante). 

• Lavados en “buffer” (3 x 3 min). 

• Incubación con el 2º anticuerpo puente biotinado durante 10 min. 

• Lavados en “buffer” (3 x 3 min). 

• Incubación con el complejo estreptavidina-peroxidasa durante 10 min. 

• Lavados en “buffer” (3 x 3 min). 



Materiales y Métodos 

 60

• Incubación con el cromógeno (diaminobenzidina) 5 min. 

• Lavado en agua corriente  (2 x 3 min). 

• Contratinción con hematoxilina de Harris 30 seg. 

• Lavado en agua corriente. 

• Deshidratación, siguiendo los pasos inversos a la rehidratación (ver paso 3). 

• Montaje con medio sintético. 

 

 

3.2.1 Anticuerpos utilizados para inmunohistoquímica 

 

 

Receptores de estrógenos (RE) 

 

Anticuerpo monoclonal NCL-ER-6F11 (Novocastra, Newcastle, Reino Unido), 1:40. 

 

Receptores de progesterona (RP) 

 

Anticuerpo monoclonal PR-2C5 (Zymed, U.S.A.), prediluído en el momento de ser 

utilizado. 

 

Ki67 

 

Anticuerpo monoclonal MIB1 (Zymed, U.S.A.), prediluído en el momento de ser 

utilizado. 

 

c-erb-B2 

 

Anticuerpo monoclonal NCL-CB11 (Novocastra, Newcastle, Reino Unido), 1:40. 

 

 

 



Materiales y Métodos 

 61

 

p53 

 

Anticuerpo monoclonal NCL-D07-p53 (Novocastra, Newcastle, Reino Unido), 1:50. 

 

 

3.2.2 Interpretación de resultados del análisis de las muestras por 

inmunohistoquímica  

 

 

• La reacción inmunohistoquímica se consideró positiva para RE, RP, y p53, 

cuando más del 10% de las células tumorales mostraron tinción específica 

nuclear. 

• La reacción inmunohistoquímica se consideró positiva para c-erb-B2, cuando más 

del 10% de las células tumorales mostraron tinción específica de membrana. 

• La positividad de Ki67 se evaluó como porcentaje de células tumorales positivas 

(tinción nuclear). 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Materiales y Métodos 

 62

3.3 CITOMETRÍA DE FLUJO 
 
 
 La citometría de flujo es, básicamente, un método analítico que permite la 

medida de emisión de fluorescencia y dispersión de luz inducidas por la iluminación 

apropiada de células o partículas microscópicas, a medida que desfilan de una en una 

arrastradas por un flujo portador, frente a un sistema de detección. En algunos 

sistemas, además, las células o partículas pueden ser separadas físicamente, de 

acuerdo a las propiedades citométricas exhibidas.  
 
 

 La citometría de flujo aprovecha el desarrollo de un amplio número de moléculas 

fluorescentes, que se unen específicamente a estructuras celulares, se acumulan 

selectivamente en compartimentos celulares, o modifican sus propiedades a través de 

reacciones bioquímicas específicas. De esta forma, la citometría de flujo permite 

detectar y cuantificar estructuras y funciones de células individuales o partículas 

biológicas aisladas, a elevada velocidad y siguiendo una aproximación 

multiparamétrica. Estas características la convierten en una técnica especialmente 

valiosa para caracterizar poblaciones celulares heterogéneas, a través de un amplio 

rango de propiedades biológicas. 

 

 Cualquier citómetro de flujo mide exclusivamente propiedades ópticas, es decir, 

luz emitida por fluorocromos o dispersada por las partículas en flujo. La conexión entre 

las propiedades biológicas de interés y los parámetros ópticos detectables, se establece 

con el uso de marcadores fluorescentes adecuados. 

 

 Los fluorocromos son moléculas químicas que absorben luz a una determinada 

longitud de onda, y emiten luz de una longitud de onda mayor que la absorbida. Se 

caracterizan por sus espectros de excitación y de emisión, por lo que su utilización está 

condicionada por el tipo de láser y la longitud de onda a la que se exciten. El espectro 

de excitación y de emisión varía con los diferente fluorocromos. Nuestro láser posee 

una longitud de onda de 488 nm, y el fluorocromo utilizado (ioduro de propidio), es 

capaz de ser excitado a esta longitud de onda. En citometría de flujo los anticuerpos 



Materiales y Métodos 

 63

monoclonales están conjugados con fluorocromos siendo la intensidad de  fluorescencia 

detectada por el citómetro directamente proporcional al número de moléculas unidas al 

antígeno. 

 

 El análisis por citometría de flujo nos proporciona datos cuantitativos y la 

posibilidad de cuantificar un gran número de células rápidamente. De todas las 

medidas que pueden obtener los métodos cuantimétricos, las de mayor aplicación 

práctica son la investigación de la ploidía y la proliferación celular. Los estudios 

realizados con esta técnica han sido: 

 
• Estudio del ciclo celular, es decir, establecer en qué fase del ciclo celular  está la 

célula midiendo su contenido de DNA, que se dobla durante la fase S. 

• Estudio de marcadores de apoptosis (Bcl-2 y Bax) y de angiogénesis (VEGF). 

 

 El ciclo celular comprende el conjunto de procesos que una célula debe llevar 

a cabo para producir un par de células hijas genéticamente idénticas. Para ello, es 

necesario que el DNA se replique y que los cromosomas replicados se segreguen en 

dos células distintas. La replicación del DNA nuclear sólo suele ocupar una parte de 

la interfase llamada fase S (síntesis) del ciclo celular. El intervalo entre la 

consumación de la mitosis y el comienzo de la síntesis del DNA se llama fase G1 

(“gap”, intervalo), y el intervalo entre el final de la síntesis del DNA y el principio de 

la mitosis, se denomina fase G2. Durante G1 la célula supervisa su entorno y su 

propio tamaño y, cuando llega el momento, da un paso decisivo que le conducirá a la 

replicación del DNA y a la consumación del ciclo de división celular. La fase G2 

proporciona una medida de seguridad, que permite a la célula asegurarse de que la 

replicación del DNA se ha completado, antes de comenzar la mitosis. G1, S, G2, y M 

son las subdivisiones tradicionales de ciclo celular (Figura 5). 

 

 

 

 



Materiales y Métodos 

 64

Figura 5.  Fases sucesivas del ciclo celular en una célula eucariota típica. En la interfase la célula 

crece continuamente y durante la fase M se divide. La replicación del DNA se produce en la fase S. 

G1 es un intervalo de tiempo entre las fases M y S. G2 es un intervalo entre las fases S y M. 

 

 

 

 

 

 Las células en G1 pueden, si no han iniciado la replicación del DNA, detener su 

progresión en el ciclo celular y entrar en un estado de reposo especial, llamado G0 (G 

cero), donde pueden permanecer durante días, semanas o años antes de volver a 

proliferar.  

 

 La ploidía en la citometría se recoge en histogramas que se comparan con los 

de poblaciones celulares control. Normalmente cerca del 90% de las células en un 

tejido están en fase G0 y G1 del ciclo celular, es decir, no se están dividiendo y su 

carga cromosómica está formada por el número de cromosomas de la especie. Esto 

se conoce como 2c. El resto de las células están adquiriendo material de DNA o ya 

han alcanzado la cantidad doble de DNA (4c) (fases S, G2 y M que se han expuesto 

anteriormente). Por ello, el histograma representativo de una población celular 

normal (figura 6), está formado por un pico alto y mayor (2c) que corresponde a las 

fases G0 y G1, una fase de meseta de las células en fase S, y otro pico menor (4c) 

correspondientes a las células en fase G2 y M. 

 

   G1     
(Gap1)        G2     

(Gap2) 

     M     
(Mitosis) 

  Células que 
cesan la división 

         Fase S        
(síntesis de DNA)  



Materiales y Métodos 

 65

Figura 6.  Fases del ciclo celular. Representación del hiostograma“Gaussiano” de las fases G0-G1, S 

y G2-M del ciclo celular que se obtiene en el citómetro de flujo. 

 

 

 
 
 
 

 
 
 

3.3.1 Tratamiento de las muestras para análisis por citometría de flujo 
 
 
3.3.1.1  Tratamiento de las muestras tumorales para análisis del ciclo celular por 

citometría de flujo 

 
 En el análisis del ciclo celular y según el protocolo seguido, que se expondrá 

seguidamente, los núcleos son marcados con fluorocromos que se unen 

estequiométricamente con los ácidos nucleicos, por lo que la emisión de 

fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de DNA nuclear. El 

fluorocromo que hemos utilizado es ioduro de propidio, el cual se excita en el visible 

a 488 nm. El ioduro de propidio tiene avidez tanto por el RNA como por el DNA, 

por lo que es necesario eliminar las cadenas de RNA para evitar posibles 

interferencias en la muestra. Esto se consigue incubando la suspensión celular con 

S  

G0-G1 (2n) 

S G2-M (4n) 



Materiales y Métodos 

 66

RNAasa, incluida en los reactivos de tratamiento de la muestra para el análisis del 

ciclo celular. 

 

 La cantidad de DNA es diferente en cada fase del ciclo celular. Así, en la fase 

G2 y en la de mitosis, la célula presentará doble cantidad de material genético que en 

las fases G0-G1, siendo la cantidad de DNA intermedia durante la fase de síntesis. 

Asimismo, es posible detectar y discriminar poblaciones con contenido de DNA 

aneuploide. 

 
 Las muestras tumorales llegaron al laboratorio suspendidas en solución fosfato 

tamponado (PBS, “Phosphate Buffered Saline”), tras su obtención en fresco. Los 

pasos a seguir para el análisis del estado celular son los siguientes:  

 

 Se trocea una porción de aproximadamente 1 cm3, con la ayuda de un bisturí y 

unas pinzas en un vidrio de reloj. A continuación, sobre la suspensión obtenida, se 

añaden 2 ml de reactivo “DNA-prep Stain” y 100 µl de reactivo “DNA-prep LPR” 

(Coulter), con el fin de lisar, permeabilizar las células, y teñir el DNA. En la 

composición de los reactivos añadidos está incluida, como decíamos, RNAasa, 

detergentes no iónicos, que eliminan las membranas plasmáticas celulares, dejando 

libres los núcleos, y fijadores que abren poros de membranas nuclear para permitir el 

acceso del fluorocromo al interior del núcleo. 

 

 Se incuba la solución a 37º durante 30 min, en estufa termostatizada, y se filtra 

con un filtro de tamaño de poro de 50 um, que permite el paso de los núcleos 

celulares fijados y teñidos. La muestra así obtenida se analiza en el citómetro de flujo 

EPICS XL (Coulter), determinándose la ploidía y el porcentaje de células en fase S. 

 

 

 

 

 



Materiales y Métodos 

 67

3.3.1.2  Tratamiento de las muestras tumorales para análisis de marcadores 

reguladores de la tumorogénesis: Bcl-2, Bax y VEGF 

 

 Las muestras tumorales llegaron al laboratorio en PBS, tras su obtención en 

fresco. Los pasos a seguir para determinar la expresión, por parte de las células 

tumorales, de los marcadores objeto del estudio, consisten en una primera fase de  

preparación de la muestra, seguida de una fase de fijación y permeabilización, para 

terminar con la incubación con los anticuerpos correspondientes. A continuación se 

detalla dicho proceso. 

 

Preparación de la muestra 

 

 Se trocea una porción de aproximadamente 1cm3 con la ayuda de un bisturí y 

unas pinzas en un vidrio de reloj. A continuación, se añaden 2 ml de pepsina con el 

fin de disgregar las células del tejido, y se incuba a 37º durante 30 min. Filtramos la 

muestra con un filtro de tamaño de poro de 50 um, y centrifugamos a 2000 rpm 

durante 10 min; desechamos el sobrenadante y sobre el botón celular añadimos PBS 

y centrifugamos con el fin de lavar dicho botón, eliminando la pepsina residual. 

Retiramos el sobrenadante y procedemos a la siguiente fase. 

 

Fijación de las células 

 

 Sobre el “pellet” obtenido, añadimos 1 ml de paraformaldehido (PFA) al 2% 

(PH=7.2) con el fin de fijar las células. Transcurridos 20 min (10min a 4º seguidos de 

10 min a temperatura ambiente), lavamos con PBS el botón celular obtenido, con el 

fín de eliminar el PFA residual, y desechamos el sobrenadante. 

 

Permeabilización de las células 

 

 El botón celular obtenido lo resuspendemos en 1 ml de metanol absoluto a –20º 

durante 5 min, con el fin de permeabilizar las células. Lavamos con PBS, 



Materiales y Métodos 

 68

centrifugamos (7000 rpm durante 5 min), para desechar el metanol residual, y 

eliminamos el sobrenadante.  

 

Incubación con los anticuerpos 
 

 El botón celular obtenido lo resuspendemos en PBS e incubamos con el primer 

anticuerpo a la dilución adecuada, durante 1h a 4º. El anticuerpo primario reconocerá 

el epítopo citoplásmico, y el secundario va conjudado al fluorocromo, y reconoce el 

anticuerpo primario. 

 

 En este estudio, utilizamos controles negativos, uno para los anticuerpos 

monoclonales y otro para los anticuerpos policlonales, obtenidos del botón celular 

tras permeabilizar las células. 

 

 Los anticuerpos primarios utilizados en nuestro estudio, son: Bcl-2, Bax y 

VEGF. En el caso de Bax, el botón se resuspende directamente sobre 100 ul del 

anticuerpo, mientras que para Bcl-2 la dilución es 1:80 y para VEGF 1:50. Lavamos 

con PBS, centrifugamos (7000 rpm durante 5 min), y desechamos el sobrenadante. 

Sobre el botón celular obtenido añadimos el segundo anticuerpo e incubamos a 4º 

durante 30 min. El segundo anticuerpo es monoclonal en el caso de Bcl-2 y Bax, y 

policlonal para VEGF, y la dilución utilizada en ambos casos es 1:100. Una vez 

transcurrida la incubación de la muestra con el segundo anticuerpo, añadimos PBS y 

yoduro de propidio, con el fín de seleccionar la población de células fijadas.  

 

 Finalmente, se analizan las muestras en el citómetro de flujo EPICS XL 

(Coulter). 

 

 

 

 

 

 



Materiales y Métodos 

 69

3.3.2 Anticuerpos utilizados para citometría de flujo 

 

 

Bcl2 

 

Anticuerpo monoclonal (Immunotech, Francia), 1:80. 

 

 

Bax 

 

Anticuerpo monoclonal (Immunotech, Francia). 

 

VEGF 

 

Anticuerpo policlonal (Chemicon), 1:50. 

 

 

3.3.3 Interpretación de resultados del análisis de las muestras por citometría  de 

flujo 

 
 

 Para la interpretación de los resultados del ciclo celular obtenidos en el 

citómetro de flujo, utilizamos el programa “MultiCycle for Windows”. El resultado 

del análisis referido a la ploidía puede presentar diferentes patrones:  

 

• Patrón diploide: el histograma se considera diploide si el primer pico, más alto, 

coincide con una desviación, en general, muy superior al 10% con el de una 

población control. Cuando la población de células coincide, con el del control se dice 

que el índice de DNA (ID), (cociente entre el valor del pico principal de la muestra y 

el del control diploide), es de 1. 



Materiales y Métodos 

 70

• Patrón aneuploide: el histograma se considera aneuploide si la población 

celular presenta un contenido de DNA diferente al del control. Todos los ID distintos 

de 1 se denominan aneuploides 

• Patrón tetraploide: el histograma se considera tetraploide cuando el contenido 

de DNA en la población es doble de la del control. En este caso el ID sería de 2. 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Materiales y Métodos 

 71

3.4. EXTRACCIÓN DE RNA DE LAS MUESTRAS TUMORALES 

 
 
 Para llevar a cabo la extracción de RNA de las muestras tumorales, hemos 

utilizado los “Kits de Rneasy Midi y Maxi”. El fundamento de la técnica de estos 

“Kits”, consiste en la propiedad de unión selectiva del RNA a la membrana de 

silicagel. El conjunto de “buffer” que incorpora, permite aislar moléculas de RNA de 

más de 200 pb, mediante la absorción a la membrana de silicagel. Las muestras 

biológicas son lisadas y homogeneizadas en presencia de un tampón desnaturalizante 

de guanidina isotiocianato (GITC) que inactiva de forma instantánea las RNAsas, 

asegurando el poder aislar RNA intacto.  

 

 Además, el proceso de extracción de RNA, lleva incorporado la adición de 

etanol, para favorecer las condiciones de unión de RNA a su paso a través de la 

membrana de silicagel. Finalmente, la muestra se pasa por la columna, donde 

quedará unido el RNA en la membrana, al mismo tiempo que los contaminantes son 

lavados y eluidos; el RNA es eluído con agua libre de RNAsas. 

 

 Con este procedimiento de “Rneasy” (figura 7), se aislan todas las moléculas 

de RNA con más de 200 nucleótidos. Además, se produce un enriquecimiento en el 

RNA mensajero (RNAm), ya que muchos de los RNAs de menos de 200 nucleótidos 

(como el RNAr 5.8S, RNAr 5S y RNAt) son excluídos selectivamente. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Materiales y Métodos 

 72

3.4.1 Tratamiento de las muestras para la extracción del RNA 
 
 
 Las muestras tumorales fueron congeladas en N2 líquido una vez obtenidas de 

las pacientes. Las piezas son almacenadas en un congelador a –80ºC, hasta el 

momento de su procesamiento, en el que se trituran en N2 líquido con un mortero de 

porcelana, hasta obtener un pulverizado. A continuación, se pasa a extraer el RNA de 

las muestras con el “Kit Rneasy de Qiagen” (cuyo fundamento se ha expuesto en el 

apartado 3.4), y se almacenan a –80ºC, hasta el momento de ser utilizado. 

 
 El proceso de extracción del RNA de las muestras tumorales, una vez obtenido 

el pulverizado, consiste, como decíamos anteriormente, en una primera etapa de lisis 

y homogeneizado de la muestra, seguido de un proceso de lavado, y por último la 

elución del RNA. Los pasos a seguir son los siguientes: 

 

Lisis y homogeizado de la muestra 

 

• Añadir al pulverizado 2ml de “buffer” de lisis RLT seguido de 2ml de etanol    

al 70%. 

• Agitar en vortex la suspensión obtenida y echarla rápidamente sobre una 

columna “midi spin”. 

• Centrifugar a 4000 rpm durante 4 min. El RNA quedará unido a la membrana 

de la columna. 

• Desechar el eluído. 

 

Lavado de la muestra 

 

• Añadir sobre la columna 4ml de “buffer” de lavado RW1. 

• Centrifugar a 4000 rpm durante 4 min. Desechar el eluído. 

• Añadir sobre la columna 2.5ml de “buffer” de lavado RPE (2x). 

• Centrifugar a 4000 rpm durante 4 min. Desechar el eluído. 

 

 



Materiales y Métodos 

 73

Elución de la muestra 

 

• Transferir la columna “midi spin” a un nuevo tubo. Añadir sobre la columna 

100 ul de agua libre de RNAasa. Dejar reposar 1min. 

• Centrifugar a 4000 rpm durante 4 min. El eluído obtenido contiene el RNA de 

la muestra tumoral. 

 

 Con el fin de obtener una mayor concentración de RNA, repetimos el proceso 

de elución utilizando el eluido obtenido en el último paso. 

 

 En la figura 7 se representa el proceso de extracción del RNA con el “Kit 

Rneasy de Qiagen”. 

 

 

 

 

 

 

 

 



Materiales y Métodos 

 74

 
 

 Figura 6.  Esquema de extracción del RNA con el “Kit Rneasy Midi y Maxi de Qiagen” 



Materiales y Métodos 

 75

3.5 RT-PCR 
 

 
 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es un método rápido para 

amplificación enzimática “in vitro” de un fragmento específico de DNA. La PCR es 

una metodología, resultante de la aplicación práctica de tres conceptos: 
 

1. Desnaturalización de la doble hebra de DNA para dar hebras sencillas 

2. Hibridación específica de la hebra sencilla con un oligonucleótido. 

También se conoce esta etapa como “annealing”, y tiene lugar una 

disminución de temperatura que permite la reasociación de hebras sencillas 

tras la desnaturalización térmica. 

3. Replicación de la hebra sencilla por una DNA polimerasa a partir del 

oligonucleótido cebador. También se conoce esta etapa como elongación 

del cebador. 
 
 En la RT-PCR (“reverse transcriptase PCR”), tiene lugar la retrotranscripción 

de RNAm en cDNA, a partir del cual se lleva a cabo la PCR. Es el método con 

mayor capacidad de detección para la medida de la expresión génica “in vitro”. 

 

 Para llevar a cabo la RT-PCR en el RNA extraído de las muestras tumorales, 

hemos utilizado el “kit One Step RT-PCR” de Qiagen. La mezcla inicial, para llevar 

a cabo tanto la transcripción inversa como la amplificación por PCR del gen h-MAM, 

contiene todos los componentes necesarios para llevar a cabo dichas reacciones en un 

sólo paso. Entre los componentes que incluye el “kit”, se encuentran las siguientes 

enzimas: 

 

• Transcriptasas inversas “Omniscript” y “Sensiscript” cuya función es la 

transcripción inversa de forma específica. Ambas enzimas poseen una elevada 

afinidad por el RNA, permitiendo la transcripción a través de estructuras 

secundarias, inhibiendo así otras transcriptasas inversas. La transcriptasa inversa 

“Omniscript” permite la transcripción inversa de cantidades de RNA superiores a 

50 ng, mientras que la transcriptasa inversa “Sensiscript” se encuentra optimizada 



Materiales y Métodos 

 76

para cantidades de RNA inferiores a 50 ng. La combinación de ambas enzimas 

permite la transcripción inversa de cualquier cantidad de RNA entre 1 pg y 2 µg, 

en condiciones de máxima sensibilidad y eficiencia. 

 

• DNA polimerasa “HotStarTaq”, que tiene una elevada especificidad en el 

proceso de amplificación de la PCR. Durante la etapa de transcripción inversa, 

esta enzima permanece inactiva, no interfiriendo en dicha reacción. Una vez 

concluída la transcripción inversa, la mezcla contenida en los “eppendorf” se 

calienta a 95º durante 15 min, inactivando así las transcriptasas inversas, al 

mismo tiempo que se activa la DNA polimerasa “HotStarTaq”. 

  

 Todas las enzimas están presentes en la mezcla de reacción, sin embargo, el 

uso de la DNA polimerasa “HotStarTaq” asegura la separación temporal de los 

procesos de transcripción inversa y PCR, permitiendo que ambos tengan lugar de 

forma secuencial. 

 

 Otro componente incluído en el “kit” que merece especial atención, es el 

“buffer” de reacción. La combinación de las enzimas y el “buffer” de reacción 

aseguran una elevada eficacia de las reacciones de RT-PCR. Dicho “buffer” debe 

permitir: 

 

• Eficacia del proceso de transcripción. La composición del “buffer” permite que 

se realice la reacción de transcripción inversa a elevada temperatura, lo que 

aumenta la eficiencia, ya que se deshacen las estructuras secundarias. 

 

• Eficacia en el proceso de  amplificación del cDNA. Para ello el “buffer” contiene 

una composición equilibrada de KCl y (NH4)2SO4 que permite el “annealing” de 

los “primers” en un rango más amplio de temperatura. 

 



Materiales y Métodos 

 77

 Los componentes de la mezcla de reacción, así como los volúmenes y 

concentraciones finales utilizados  se exponen en la tabla 2. El volumen final de cada 

“eppendorf” es de 50.0 µl 

 

Tabla 2.  Componentes de la mezcla de reacción para realizar la RT-PCR en un paso. 

 

 

COMPONENTE VOLUMEN CONCENTRACIÓN FINAL

   

Agua libre de RNAsas 25.0 µl  

Buffer 5x 10.0 µl                     1x 

dNTP mix (10mM de cada uno) 2.0 µl            400 µl (de cada uno) 

Primer A (6 µl) 5.0 µl                   0.6 µl 

Primer B (6 µl) 5.0 µl                   0.6 µl 

 

 

 El proceso comienza con la síntesis de una hebra de cDNA por la acción de la 

transcriptasa inversa, permaneciendo el cDNA unido al molde como dúplex 

RNA:cDNA. En una segunda etapa se desnaturaliza el dúplex y comienza la 

amplificación según el mecanismo de una PCR normal: la hebra de cDNA actúa 

como molde para una segunda hebra de cDNA y luego las dos hebras se amplifican 

en sucesivos ciclos. 

 

 En la figura 8 se representa un esquema con el conjunto de reacciones que 

tienen lugar en la RT-PCR. 

 
 
 
 
 
 
 





Materiales y Métodos 

 79

 El gen h-MAM, cuyo esquema de procesamiento y secuencia, se exponen en 

las figuras 9 y 10 respectivamente, está constituido por 3 exones, separados por 

intrones de gran tamaño, que evitan la aparición de falsos positivos, debidos a una 

eventual contaminación por DNA, en la cuantificación del gen en muestras tumorales 

mediante técnica RT-PCR. 

 
Figura 9.  Representación esquemática del procesamiento del gen h-MAM. 
 
 
 

 
 
 

  La pérdida precisa y selectiva de intrones no es rara en las células eucariotas, y 

requiere la unión exacta de las secuencias de DNA codificantes. La reacción tiene 

lugar en dos etapas: 

 

• En la primera etapa, un nucleótido A especial de la secuencia intrónica situado 

cerca del lugar de corte 3´reacciona con la secuencia de corte del lugar 5´, la cual 

es cortada; el extremo 5´ cortado de la secuencia del intrón se une covalentemente 

a este nucleótico A, formando un nucleótido ramificado. 

• En la segunda etapa, el extremo 3´-OH del primer exón que estaba expuesto en la 

primera etapa se añade al inicio del segundo exón, cortando la molécula por el 

lugar de corte 3´. Las dos secuencias exónicas quedan unidas y el intrón se libera 

en forma de lazo. 

 

  

Exón 1 Exón 2 Exón 3 

RNAm   269 pb

Exón 1 Exón 2 Exón 3 

44 pb 36 pb   189 pb

Intrón 1        Intrón 2 

          604 pb  1890 pb 



Materiales y Métodos 

 80

 

 Estas reacciones de maduración produce la molécula de RNAm del gen h-

MAM, a partir de los transcritos primarios, constituído por 269 pb que se puede 

copiar en DNA a través de la transcriptasa inversa. 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Materiales y Métodos 

 81

Figura 10.  Secuencia del gen h-MAM obtenida del “GenBank”. Las secuencias de 
nucleótidos que constituyen los exones 1,2 y 3 del gen se representan en rojo. La secuencia 
de los nucleótidos que forman los intrones del gen, se representan en verde. 
 
 
   1     GTCGACTCGATCTCGGCCCACTGCAACCTCCACCTCCTG GGTTCAAGC AATTCTCCTGCC 
  61    TCAGCCTCCTGAGTAGCTTGGACTACAGGCACGTACCACC ATGCCCA GCTAATT TTGT AT 

 
121    TTTTAGTAGAGAAGGGGTTTCTCCATGTTGGTCAAGCTG GTCTCAAAC TCCT GACCTCAG 

181     GTGATTCACCCACCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCATTGCGACC 
 

241    GGCCATGAAA CAATC TTTACATGAAGCATC CTTATACA AATTCTGCATG CTATCCCATTC 
301    CGCCTTTTATTTTCTTCAAGTGATGAAAAG GAAGGATGCTCAGAGAGACCAGCAAG GACA 

 

361    TGGCAGGACTGCAAGTTGCATCCAGGGTCCAAA CCCTCATCCCTGAT TCCAA TTC CATC 
421    ACCACCCACCACCCAGCACTGCCTGTCCAGCCCATCAGTTACGCTA CTAATTC ACAGCAT 

 

481    CCTTTGAATCAGTGGAAAGAAAACCCTAAAAAGTT ACCAAAGAACTA  AACAAAGTTAT CA 
541    ATTA ATTTATAATT AACCGAGAT AATCCTTGTAAAAATAACTTTCAGCG GAGGGTGG ATG 

 

601    GCCTTAAAT TTCCCC ACAAAA GGTAAAACTTTCCCAGACATCC CTTTCTGAAAATGAGAT 
 661    GTCAGTGGATGAGAAAAGCCTGCTCCCAAGAGTAGGTGTGAGGTATTGCACCTAGGCCCA 

 
721    CTGCTGGGATAAGCTGGCAC AGATACACGG GACATGATGCTTTCATTCTCACCTTAAAGA 

 781   AAGAGACAGAGAAGAAAAGGAAGGGGAGCAAGTGGAGAAGGAATACAAGAAAGAGGAAGA 
 

 841    GAAGCAGGAA GATTCTACATACAGGCTGGCTGTGTTTCCC CTGGGGCATGCTCCTGTTTA 
 901    CTGGTCCCATGCCA GGTTGACTCATTGCCTCGTTCATG GGTGGAAT TAAGATGCCTACCT 
 
 961    GGGGAATAAATAGAGCAAGGCTGGGTGCTCACCTCCACAGCGGCTTCCTTGATC CTTGCC 
1021  ACCCGCGACTGAACACCGACAGCAGCAGCCTCACCATGAAGTTGCTG ATGGTCCT CATGC 
 
1081 TGGCG GCCCTCTCCCAGCACTGCTACGCAGGTGAGTTCTGTGCAGGGAGGGCTGCCTCGG 
1141  GGTTAGGGGTTGTCACTTGGGCCTCTATGGAAGAACTCCTGCTCCC CA A TTCTCAG CAGA 
 
1201  GAT CAGCCCCAGT ACAAAGGCTGTAGGTTTAACAGATCTCACCATGT TGCCCAG GCTGGT 
1261 CTTGAACTCCTGAGCTCAGGCAGTCTGTCC ACCTCGGCCTCCAAAG T GCTGGGATTATA G 
 
1321  GTGTGAGCCACCACACTGCC TAGATACTGAAATCTTCTGTGATG CT CTGA ATGGT A ATAG 
1381  TGAAGCATCGTATGA TTTTGAACCAAAGAA GAC CAAATAATCT T CACGAT A TACTT CCAA 
   
1441  GTCC GAGTGTTT CAT TTCTCAAGTCTT GTCATTAAATGAA GTTTC ATGAG GT TTAGCT TT 
1501  TCTGGGCTGG GGAGTGGAGAGAAAGAAGTTGCAGGGCTTACAGGAAATCCCAGAGCCTGA 
  
1561  GGTTT TCTCC CAGATTTGA GAACTC TAG ATTATGCATCAT TATCTTT GAGTCTAT A TTCT 
1621  CTTGGGCTGTAAGAAG ATGAGGAATGTAATAGGTCTGCCCAAGC CTNTCATGCCT TCTGT 

 
1681  AGGAAGCTTGTTT CCTTGTGC ATCCT TCCCAGGCTCTGGCTGCCCC TTATTGGAGA ATGT 
1741  GAT TTCCA AGACAATCAATCC ACAAGTGTCT AAGA CTGAATACAAAGAACT TCTTCAAG A 
 
1801  GTTCA TAGACG ACAATGCCAC TACAAA TGCC ATAGATGAATTGAAGGAA TGTTT TCTTAA 
1861  CCAA ACGGAT GAAACT CTGAGC AATGTTGAGG TGTTTATGGTA ATTT CATTTTCTT CCTA 
 
1921  TAAGCTTTTTAAATCCCCTGACCAGGGACAAGT G GG CTCTTCATTTCT CACTG ACAAT GC 
1981  CAAAGCCACT A GTGAACAAGCC TTTT CT TACATTGGTTA ATTTA GTTGAATGGTTA GTCT 
 
2041  AATGACGTTT GCCATCAAGAAAAACA TCCA GTGTCCCT GTGTTGTCAC TCTACCCAGAGA 
2101 ATCCTCAGTG GATGATAAATGAAT AGGGCAAGAGAGG AAAAGGAAAGGTC GGTAGAAGTC 
 
 



Materiales y Métodos 

 82

2161  TTACCTATCCCCAGAGCTCT CTAATTC ATG CTCACAAACA CA GACACAATC ACACAAA CA 
2221  CAGAAACACAC ATACACACAT CCAGACACATGC AAACACACAGAC ACAGTCACAATC ACA 
 
2281  CAAACACACACACATT AGACATACACAAAC ATAGACAGAC AGGCAAAGAC A CAGACACAG 
2341  ACACAGACACAATC ACACCAGCACACAATCATCCAG ACAC AAACACAA ACACACAGA CAG 
 
2401  AACC ACACAACCACAGAAA ACAGAGACAC ACACAAA CACACTC AGACAC  ACACA TACAA 
2461  ACATATGTTCACTCTCTACAGAA AAAACAA T TTTCCAG AAG ACCCG CACCT ATA GACCAA 
 
2521  TCTGC AGAGA AAA CTTCTCTTC TTCA AAAA A AAGTAAAAG TGT TCTTTCTT AAAAAATGC 
2581  CCTAT TTTTC AACAGTT TGG AAAATACCATT TGAGCAAGATT CTATA CATC TCAA AT AAA 
 
2641  AAGAAT TTAA AATGCA CTTC CAGGCAATC ATAATTT GCTAG CATA AATGATG AGAAACCT 
2701  TGGACTATCCAAT AGGCAACTGTA GATCAT GGGT ATGAAA CCACCATGGAGGAAGAATTG 
 
2761  CCT CA AACA AA AAC CAAT AGT TTT GTA TTTCTTT TAACTA TACA TGTATAT TGTTGAGG 
2821   GTT  T TCT TAG CATTT ATTC CC TA TGTTAA A TTCTT  TTAATC GT TCCCTGGTA A AAA A 
 
2881  AAA A AAA AAAA AAAGT TAGA AATA TACCAA ACCCCTC CATT AGGATGAAAGTGAACATC 
2941  ACCTC AGGAAACCCTGA CGCTTTCT ACAACAT GGATGAA CCTTGAGGATATTATAGCGAG 
 
3001  TGAAGAGTGAA GCAAAGAGTCACAA AAACACAA ATGCTGCATGAC CCATGCATATGGGAA 
3061  TCTGGGGAGCCAGACTCAGAGA CAGTGAAAAAAAAA AAAA CAGTGGTTGTCAGGGCTTGG 
 
3121  GTGCAGAGAAGAAGGGGG AGTCATATTTAATG GGTCTG GA GTTTCAGTTGTGCAAAACAG 
3181  TAATATT CTGGAGTTAG GTTGCACAACCA CACGAATATA CA GAACACTCC GAACTGTCCC 
 
3241  CTTAAAAT GGC AAATTTT ATGAGAT GTACAT TTTA CCAC TAT TAAT AATTT GTTAAAA AC 
3301  TAATT ATCAACT GCAGGGAAGGGTGATGGAT TTGTTT CTTTT AAAACTT CCTCAG ACAGA 
 
3361  TCATAGTCTGCAGCTCCAATAATTAGTAGAGCACAATGGT GGTGGCAG AG GGCGTCGGAC 
3421  TGCTGGGAT GCTGGGAAT ATTTCCACAATG GAGGGTTA GACGAGAGCTCAAAGTTTCACT 
 
3481  TTTT TT TT TTTTTT TT TTT TTGCATTTG AG CTAAGATT TTAAC AAT CCTGTGAA AA TAGG 
3541  TAAT ATA GTCAC GTATT TGTTG AATA CATTATTTCAAAG AACC AC AAACACACAGAAAAA 
 
3601  ATATTTAAAAAGT CCATGGT  GGGGGA AATGAT CCAG AAACAACAGCTCTTCTACTTCCAG 
3661  CCCTAACCGTC TGGGATGC T AGATGGTTGTGGGCAAACCGTGGAAAAAGATAAGCTTCTG 
 
3721  TTTTT CA AGAT TTTA TTTT GTTAGAGAGTG CAG AAAATC TAAGTGAT GTCTCTG TTTTTG 
3781  C TTT TAGCAAT TAAT ATATG A CAGCA GTC TT TGTGATTT ATTTTAACTTT CTGC AAGAC 
 
3841  CTTTGGCT CA CA GAACTG CAGGGTATGGTGAGAAACCAACTACGGATTGCTGCAAACCAC 
3901  ACCTTC TCTT TCTTAT GTCT TTT TACTA CAA ACTACAA GACAATTGT TGAAACCT GCTAT 
 
3961  ACATGT TT ATTTTAATAAA TT GATGG CAA AAACTG AAGTTTCTC TTTG TTCTA CCGTAGA 
4021  AAAG AGGCGTTAGA GGGCCTCACA TATTTTACATACAC ACACACAC ACA CACTTACTTAT 
 
4081  TAAAGAACTCATGG TCATGGGT TGAGGACTCT GTGAAGC ATTTGT TTCCTCAGTCTGACC 
4141  TCTAAGCCTTGGTACTCTCTCTGAAGAGTG TTTCCCTGTC CCC ATCCCACCACC TCCCCC 
 
4201  GTCGAC 
 
 
 
 
 
 
 
 



Materiales y Métodos 

 83

 
 
 Elegimos β-globina como control interno, en la cuantificación del gen h-MAM, 

por ser un gen constitutivo que amplifica con “primers” muy permisivos los cuales 

permiten realizar el “annealing” en un rango de temperatura amplio. La técnica 

empleada para la cuantificación de los niveles de expresión de h-MAM y β-globina 

fue RT-PCR, con el “kit One Step RT-PCR”. Para ello, tomamos 1 µl del RNA total 

extraído y se retrotranscribió y amplificó por PCR (RT-PCR), utilizando los 

“primers” MG1 y MG2, diseñados por Zach et al. (1999) (Figura 11) y sintetizados 

por “Amersham Pharmacia Biotech”. Estos autores utilizaron además los “nested” 

primers (MG3 y MG4) de la h-MAM, para la detección de células tumorales 

circulantes en sangre periférica mediante “nested” PCR.  

 

 En nuestro estudio hemos utilizado la pareja de “primers” MG1 y MG2 

(reconstituídos cada semana para asegurar una concentración constante de los 

mismos), ya que con ellos fue posible amplificar el cDNA de la h-MAM en un único 

paso de PCR, y el tamaño del fragmento generado no se solapaba con el de nuestro 

control interno (β-globina). Estos “primers” flanquean una región del gen de 269 pb. 

 

 
Figura 11.  Secuencia de “primers” de h-MAM. Estos “primers” fueron diseñados para 
generar un producto de PCR que amplifica toda la región codificante de h-MAM. 
 
 

  
 MG-1: GAA GTT GCT GAT GGT CCT CAT GCT GGC 
 MG-2: CTC ACC ATA CCC TGC AGT TCT GTG AGC 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Materiales y Métodos 

 84

 
 La reaccción se llevó a cabo en tubos “eppendorf” de 0.5 ml. El proceso de 

retrotranscripción tuvo lugar durante un periodo de 30 min a 54º. Posteriormente se 

inactivó la retrotranscriptasa y activó la taq-polimerasa protegida, a 95º durante 15 

min. El cDNA obtenido se amplificó por PCR, utilizando el siguiente programa: 

 
 

95º      30 seg 
62º      15 seg 
72º      20 seg 
 

 
30 ciclos 

72º       7 min 1 ciclo 
 

 

 Los productos obtenidos por RT-PCR se analizaron por electroforesis en geles 

de agarosa al 2%, previamente impregnados con bromuro de etidio. Utilizamos un 

marcador de DNA (“ladder”), como marcador del tamaño de las bandas. Cargamos el 

gel con 10 µl de cada muestra, incluyendo el “ladder”. A continuación se procede a 

la electroforesis del gel en la cubeta de electroforesis (BioRad Power Pak 3000) 

durante 20 min a 100 v. Las bandas de DNA se visualizaron bajo transiluminación 

(transiluminador UVP). Fotografiamos el gel con cámara digital (“Kodak digital 

science DC40”), para proceder al análisis de bandas. 

 

 

3.5.1  Interpretación de resultados del análisis de las muestras por RT-PCR 

 
 
 El análisis de bandas fue llevado a cabo con el programa “1D Image Analisis 

Software” (Figuras 12 y 13). Este programa permite la obtención de valores de 

intensidades netas, que posteriormente se utilizarán para la cuantificación de h-MAM. 
 
 Al utilizar β-globina como control interno, en los casos en los que no 

obtuvimos banda en h-MAM, y sí de β-globina asumimos que en esa muestra no 

existía expresión del gen h-MAM. 
 

 



Materiales y Métodos 

 85

Figura 12.  Gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio, de la electroforesis de 

los fragmentos retrotranscritos y amplificados por RT-PCR de h-MAM (bandas en 

posiciones 1) y β-globina (bandas en posiciones 2). Cada calle corresponde al tumor de una 

paciente. El marcador del peso molecular (“ladder”), aparece en rosa. 

 

 

  

 

 Además, realizamos un control para cada gel mediante PCR con “primers” de 

h-MAM para comprobar que no existía DNA contaminante (Figura 13). La presencia 

de DNA contaminante podría servir de molde de unión de los “primers” que 

conllevaría amplificación de dicho DNA.  

 

 Otra posible contaminación, sería que el RNA estuviese contaminado con 

DNA. Este hecho no supone problema en la reacción de RT-PCR, ya que el tamaño 

del amplificado, a partir de un intrón del DNA, sería siempre superior al cDNA 

obtenido tras la retrotranscripción. 

 

 La ausencia de bandas en la calle control, indicaron que no había DNA 

contaminante en nuestras muestras. 

 

 

 

 

 

 

1
2

1
2

1
2

1
2

1
2

1
2

1234567
8
9

10



Materiales y Métodos 

 86

Figura 13.  Gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio, de la electroforesis de 

los fragmentos retrotranscritos y amplificados por RT-PCR de h-MAM (calles 1 y 3) y 

amplificados por PCR (calles 2 y 4). La ausencia de bandas en las calles 2 y 4 indica 

ausencia de DNA contaminante en ambas muestras. El marcador del peso molecular “ladder” 

aparece en rosa. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12345678
9

10

1
2

1
2



Materiales y Métodos 

 87

3.6 ESPECTROFOTOMETRÍA 

 

 

 El fundamento de la espectrofotometría es la medida del las absorbancias a 

230, 260, 280 y 320 nm para calcular las concentraciones de RNA de las muestras 

tumorales. Por espectrofotometría cuantificamos los ácidos nucleicos a una longitud 

de onda de 260 nm, ya que una solución de RNA con una densidad óptica de 1.0 

tiene una concentración de 40 ng/ml, en una cubeta de longitud de paso de 10 mm. 

 

 Se determinó la concentración de RNA, tras amplificación por PCR, a una 

longitud de onda de 260 nm. Además, el espectrofotómetro utiliza longitudes de 

onda de  230 y 280 nm, para cálculos de comprobación de pureza (mediante las 

razones 260/230 y 260/280). La longitud de onda a 320 nm se utiliza para 

compensación de fondo.  

 

 La técnica de espectrofotometría se basa en la cuantificación de los ácidos 

nucleicos a una longitud de onda de 260 nm, debido a que una solución de RNA con 

una densidad óptica de 1.0 tiene una concentración de 40 ng/ml, en una cubeta de 

longitud de paso de 10 mm. 

 

 En las determinaciones por espectrofotometría, es necesario realizar 

comprobaciones de pureza de los ácidos nucleicos (RNA, en nuestro estudio) ya que 

en el proceso de extracción de los mismos, también puede arrastrar proteínas, por lo 

que se requiere de una purificación a fondo para separar estas impurezas proteínicas. 

La razón 260/280 proporciona un indicador de pureza, sin embargo, no supone una 

evaluación definitiva. Los preparados puros de RNA tienen razones previstas ≥2.0. 

Las desviaciones de estos valores son indicativas de la presencia de impurezas en las 

muestras. 

 

 La lectura a 260 nm se determina cerca de la parte superior de un pico ancho en 

el espectro de absorbancia de ácidos nucleicos, mientras que la lectura a 280 nm se 

determina en una pendiente pronunciada. Esto significa que, cambios pequeños en la 



Materiales y Métodos 

 88

longitud de onda ocasionan cambios considerables de absorbancia, y pequeñas 

variaciones en longitud de onda a 280 nm tendrán un mayor efecto en la razón 

260/280, que las que ocasionarían variaciones a 260 nm. En consecuencia, cada 

instrumento producirá resultados reproducibles como resultado de medidas hechas en 

el mismo instrumento. 

 

 La concentración también afectará a las lecturas de la razón 260/280. Si una 

solución está demasiado diluida, las lecturas se harán en el límite de detección del 

instrumento, y los resultados pueden variar debido a que hay menos diferencias entre 

la absorbancia del fondo y la absorbancia del pico a 260 nm respecto a la pendiente a 

280 nm. Este es un motivo por el que las absorbancias pueden ser mayores de 0.05 

en la determinación de medidas exactas. 

 

 Asimismo, una absorbancia elevada a 230 nm puede indicar la presencia de 

impurezas debidas a sales reguladoras que absorben a esta longitud de onda; la 

longitud de onda de 230 nm está cerca del máximo de absorbancia de las uniones 

peptídicas. Al medir muestras de RNA, la razón 260/230 debe ser mayor a 2; una 

razón inferior a 2 es, por lo general, indicativa de la presencia de contaminantes que 

absorben en el intervalo 230 a 260 nm.  

 

 

3.6.1 Análisis de las muestras por espectrofotometría 

 

 

 Una vez extraído el RNA de las muestras tumorales, para análisis por RT-PCR, 

procedimos a la medida de la concentración de RNA con el espectrofotómetro. La 

medida para dicha cuantificación se realizó a una longitud de onda de 260 nm, que 

junto con la medida a una longitud de onda a 280 nm, comprobamos la pureza de las 

muestras mediante la razón 260/280.  

 



Materiales y Métodos 

 89

 Medimos el RNA de todas las muestras tumorales por técnica 

espectrofotométrica previa dilución 1:10 de las muestras tumorales en agua libre de 

RNAasas con la que previamente se extrajo el RNA. Las relaciones de absorbancias 

[260/280] estuvieron comprendidas entre los valores 1.8-2.1. 

 
 
3.7 CUANTIFICACIÓN DEL GEL GEN h-MAM 
 
 
 Para la cuantificación de la expresión de h-MAM, dividimos los valores de 

intensidades netas (obtenidas con el programa “1D Image Análisis Software”) de 

cada muestra entre las medidas de concentraciones de RNA de partida de dichas 

muestras (obtenidas por espectrofotometría). El espectrofotómetro utilizado fue 

“GeneQuant pro RNA/DNA Calculator” de “Amersham Pharmacia Biotech” De este 

modo, se obtuvieron unas cifras, que expresamos en unidades arbitrarias, y que, 

comparativamente reflejan el nivel de expresión del gen (en este caso h-MAM). 

 

 
3.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 

 

 
 Todas las variables del estudio se correlacionaron con la expresión de h-MAM. 

Para dicha correlación se utilizó el test de Spearman, previa obtención de un dintel de 

positividad en cada caso, y posterior dicotomización de la variable en positiva y 

negativa. Dicho dintel, a su vez, fue obtenido mediante la aplicación del test 

“CRITLEVEL” (Abel et al. 1984), que, como su nombre indica, establece el umbral 

de significación más nítido para cada correlación particular. 

 

 Los resultados se consideraron significativos cuando la posibilidad de que se 

debieran al azar fue inferior al 5%. Todas las operaciones fueron realizadas 

utilizando el paquete bioestadístico “Graph Pad PRISM 3.0”. 

 

 



Resultados 
 

 91

4 RESULTADOS 
 
 

 Se pudo obtener material suficiente para el análisis inmunohistoquímico, 

análisis citométrico y análisis por RT-PCR, de los 76 tumores de la serie.   

 

 Estudiamos la correlación de factores pronósticos de primera, segunda y 

tercera generación, con la expresión de h-MAM, mediante el test no paramétrico de 

Spearman, como previamente se ha expuesto en el capítulo de materiales y 

métodos. Los valores de expresión de h-MAM oscilaron entre 3.4-920.4 unidades 

arbitrarias. 

 

 

4.1 FACTORES PRONÓSTICOS  

 

 

 La evaluación anatomopatológica de la pieza operatoria, así como la 

realización y evaluación de factores pronósticos de primera generación, las 

determinaciones inmunohistoquímicas correspondientes a los factores pronósticos 

de segunda y tercera generación (receptores hormonales y parámetros relacionados 

con la actividad proliferativa de la célula), marcadores reguladores de la 

tumorogénesis, el estudio del ciclo celular y el estudio de la h-MAM fueron 

llevados a cabo en el laboratorio del Centro, con las mismas técnicas, los mismos 

reactivos y condiciones experimentales.  

 
 

4.1.1  Factores pronósticos de primera generación 
 
 
 Se estudiaron la variedad histológica, grado histológico (GH), grado 

nuclear (GN), y la invasión ganglionar de los tumores como parámetros de rutina 

para el informe anatomopatológico de la muestra tumoral. En la tabla 1 y 2 se 

muestran el número de casos con y sin invasión ganglionar de los diferentes 



Resultados 
 

 92

carcinomas, en pacientes que no recibieron quimioterapia previa y en las que sí la 

recibieron, respectivamente. 

 

Tabla 1.  Tipos de carcinomas e invasión ganglionar en pacientes que no recibieron 

quimioterapia previa. 

 

 

 N+ N- 

     CDI 21 28 

     CDIS  0  5 

     CLI  3  4 

     Metástasis  1  0 

 

 

Tabla 2.  Tipos de carcinomas e invasión ganglionar en pacientes que recibieron   

quimioterapia previa. 

 

 

 N+ N- 

     CDI 4 2 

     CLI 3 0 

     C. Epidermoide 0 1 

     C. Mucinoso 1 0 

     Metástasis 1 0 

 

 
 
 
 
 
 



Resultados 
 

 93

4.1.1.1 Grado histológico 

 

 De las 77 muestras estudiadas, se pudo determinar el GH en 49 casos, 30 

(61%) de los cuales presentaron GH1,2, frente a 19 casos (39%) con GH3. 

 

 Al estudiar la correlación entre el GH y h-MAM mediante el test no 

paramétrico de Spearman, no existió correlación entre ambos parámetros. 

Obtuvimos un dintel de positividad para h-MAM de 154 unidades, tras aplicar el 

test “CRITLEVEL”. Valores de h-MAM por encima de 154 fueron considerados 

como valores elevados de h-MAM, y valores de h-MAM iguales o inferiores a 154 

unidades se consideraron valores bajos de h-MAM. Obtuvimos 8 casos (16%), del 

total de casos estudiados, con GH3 y cuyos niveles de h-MAM fueron superiores a 

154  unidades y 11 casos (22%) con niveles de h-MAM inferiores a 154. Por otro 

lado, obtuvimos 17 casos (35%) con GH1, 2 y con niveles de h-MAM superiores a 

154 unidades y 13 casos (27%) con niveles inferiores a 154. En la figura 1 

aparecen los porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto al GH.  

 
Figura 1.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto al GH. 

 
 

 
 
 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 13 11
h-MAM+ 17 8

GH1,2 GH3

  n.s. 



Resultados 
 

 94

4.1.1.2 Grado nuclear 
 
 De las 77 muestras estudiadas, se pudo determinar el GN en 49 casos, 25 

(51%) de los cuales presentaron GN1,2, frente a 24 casos (49%) con GH3. 

 

 La correlación entre h-MAM y un GN bajo (1,2) fue casi significativa 

(p=0.09). Obtuvimos 10 casos (20%) con GN3 y niveles elevados de h-MAM, es 

decir, superiores a 154 unidades, dintel de positividad obtenido por el 

“CRITLEVEL”, y 14 casos (28%) con niveles de h-MAM inferiores a 154 

unidades. Por otro lado, 17 casos (35%) tuvieron GN1,2 y niveles de h-MAM 

superiores a 154 unidades y 8 (16%) casos niveles de h-MAM inferiores a 154. En 

la figura 2 aparecen los porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto al GN.  

 

Figura 2.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto al GN. 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 8 14
h-MAM+ 17 10

GN1,2 GN3

p= 0.09 



Resultados 
 

 95

4.1.1.3 Invasión ganglionar 

 

 De los 74 casos estudiados, 34 (44%) presentaron invasión ganglionar, 9 de 

los cuales correspondían a pacientes que recibieron quimioterapia previa, y 40 

casos (66%) no presentaron invasión ganglionar, 3 de los cuales correspondían a 

pacientes que recibieron quimioterapia previa. En el caso de este factor pronóstico 

clásico de carcinoma de mama encontramos una correlación significativa e inversa 

(r=-0.23 y p<0.05) con h-MAM (Figura 3), correlación que se mantuvo cuando 

prescindimos en el estudio, de pacientes tratadas con quimioterapia previa. 

 

 Tras aplicar el test “CRITLEVEL”, el dintel de positividad para h-MAM en 

relación con la invasión ganglionar fue de 235 unidades. Obtuvimos 7 casos (9%), 

del total de casos estudiados, donde existía invasión ganglionar y cuyos niveles de 

h-MAM fueron superiores a 235 unidades, y 27 casos (36%) con niveles de h-MAM 

inferiores a 235. Por otro lado, obtuvimos 17 casos (23%) sin invasión ganglionar y 

con niveles de h-MAM superiores a 235 unidades y 23 casos (31%) con niveles de 

h-MAM inferiores a 235. En la figura 3 se expresan los porcentajes de expresión del 

gen h-MAM respecto a la invasión ganglionar. 

 

Figura 3.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a la invasión ganglionar. 

 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 27 23
h-MAM+ 7 17

N+ N-p<0.05 



Resultados 
 

 96

4.1.2 Factores pronósticos de segunda generación 
 
 
4.1.2.1 Receptores de estrógenos y progesterona 

 

 Los receptores de estrógenos y de progesterona, han sido determinados por 

inmunohistoquímica. En las tablas 3 y 4 aparecen la frecuencia de expresión de los 

receptores esteroideos, en pacientes que no recibieron quimioterapia previa y en las 

que sí la recibieron, respectivamente. 

  

Tabla 3.  Frecuencia de combinación de receptores esteroideos en pacientes que no 

recibieron quimioterapia previa. 

 

 Nº de casos % 

     RE+RP+     34 53 

     RE-RP-     14 22 

     RE+RP-     16 25 

     RE-RP+      0  0 

 

 

Tabla 4.  Frecuencia de combinación de receptores esteroideos en pacientes que 

recibieron quimioterapia previa. 

 

 Nº de casos % 

     RE+RP+     4 31 

     RE-RP-     5 38 

     RE+RP-     4 31 

     RE-RP+      0  0 

 

 



Resultados 
 

 97

 La reacción inmunohistoquímica se consideró positiva para RE y RP, cuando 

más del 10% de las células tumorales mostraron tinción específica nuclear (Figura 

4 y 5). 

 

Figura 4.  Detección inmunohistoquímica de los RE en células tumorales. Las células 

tumorales aparecen intensamente teñidas en el núcleo en más del 10% de las mismas. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 
 

 98

Figura 5.  Detección inmunohistoquímica de los RP en células tumorales. Las células 

tumorales aparecen intensamente teñidas en el núcleo, en más del 10% de las mismas. 

 

 

 

 

 

 

 De las 77 muestras estudiadas, 58 (75%) presentaron RE positivos, de las 

cuales 8 correspondían a pacientes que habían recibido quimioterapia previa, y 19 

de las muestras (25%) presentaron RE negativos, 5 de las cuales correspondían a 

pacientes que habían recibido quimioterapia previa. 

  

 Observamos una correlación directa y significativa entre RE y h-MAM 

(r=0.40 y p<0.05), correlación que se mantuvo cuando prescindimos en el estudio 

de las pacientes tratadas con quimioterapia. 

 

 Obtuvimos 38 casos (50%) con RE+ y cuyos niveles de h-MAM fueron 

superiores a 140 unidades (dintel de positividad obtenido con “CRITLEVEL”), y 

17 casos (22%) con niveles de h-MAM inferiores a 140. Valores de h-MAM por 



Resultados 
 

 99

encima de 140 fueron considerados como valores elevados de h-MAM, y valores de 

h-MAM iguales o inferiores a 140 unidades se consideraron valores bajos de h-

MAM. Por otro lado, obtuvimos 5 casos (6%) con RE- y con niveles de h-MAM 

superiores a 140 unidades y 16 casos (21%) con niveles inferiores a 140. En la 

figura 6 aparecen los porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a la 

expresión de RE+ y RE-. 

 

Figura 6.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a la expresión de RE+ y 

RE-. 

 

 

 

 

  

 En cuanto a los RP, 34 (44%) de las 77 muestras estudiadas, presentaron 

positividad para los mismos, 4 de los cuales correspondían a pacientes que 

recibieron quimioterapia previa, y 39 (51%) fueron RP negativos, 9 de los cuales 

correspondían a pacientes que recibieron quimioterapia previa. En este caso no 

existió correlación significativa entre RP y h-MAM. 

 

 
 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 17 16
h-MAM+ 38 5

RE+ RE-

p<0.05 



Resultados 
 

 100

 Obtuvimos 25 casos (32%) con RP+ y cuyos niveles de h-MAM fueron 

superiores a 140 unidades (dintel de positividad obtenido con el “CRITLEVEL”), y 

15 casos (19%) con niveles de h-MAM inferiores a 140. Valores de h-MAM por 

encima de 140 fueron considerados como valores elevados de h-MAM, y valores de 

h-MAM iguales o inferiores a 140 unidades se consideraron valores bajos de h-

MAM. Por otro lado, obtuvimos 19 casos (25%) con RP- y con niveles de h-MAM 

superiores a 140 unidades y 18 casos (23%) con niveles inferiores a 140. En la 

figura 7 aparecen los porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a la 

expresión de RP+ y RP-. 

 

Figura 7.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a la expresión de RP+ y 

RP-. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 15 18
h-MAM+ 25 19

RP+ RP-

  n.s. 



Resultados 
 

 101

4.1.3 Factores pronósticos de tercera generación 
 

 

 Estudiamos parámetros moleculares relacionados  con la actividad 

proliferativa de la célula tumoral, como son el oncosupresor disfuncional p53, 

puesto que la inmunohistoquímica detecta el producto del gen mutado, que es más 

estable que la propia proteína salvaje, un antígeno relacionado directamente con la 

proliferación, Ki67, y finalmente el oncogén c-erb-B2. En las tablas 5 y 6, se 

expresan las frecuencias de expresión de c-erb-B2, p53 y Ki67 en pacientes que no 

recibieron quimioterapia previa y en las que sí la recibieron, respectivamente. 

 

Tabla 5.  Frecuencia de expresión de c-erb-B2, p53 y Ki67 en pacientes que no 

recibieron quimioterapia previa. 

 

 

 Nº de casos % 

     c-erb-B2+     13 21 

     c-erb-B2-     50 79 

     p53+     12  19 

     p53-     51 81 

     Ki67>20     28 44 

     Ki67≤20     36 56 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 
 

 102

Tabla 6.  Frecuencia de expresión de c-erb-B2, p53 y Ki67 en pacientes que recibieron 

quimioterapia previa. 

 

 

 Nº de casos % 

     c-erb-B2+      4 28 

     c-erb-B2-     10 72 

     p53+      4  28 

     p53-     10 72 

     Ki67>20      4 31 

     Ki67≤20      9 69 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 
 

 103

4.1.3.1 p53 

 

 La expresión de la proteína p53 fue estudiada por análisis 

inmunohistoquímico en las 77 muestras tumorales. 

 

 Se consideraron los resultados negativos cuando la expresión de p53 mutada 

fue inferior al 10% de los núcleos, y los resultados fueron positivos cuando la 

expresión de p53 mutada fue superior al 10% de los núcleos (Figura 8). p53 se 

expresó en 16 muestras (21%), 4 de las cuales procedían de pacientes que habían 

recibido quimioterapia previa, y no se expresó en 61 muestras (79%), 10 de las 

cuales procedían de pacientes que habían recibido quimioterapia previa. 

Encontramos una correlación inversa y significativa (r=-0.22 y p<0.05), entre 

ambos parámetros moleculares, correlación que no se mantuvo cuando 

prescindimos en el estudio de las pacientes tratadas con quimioterapia previa. 

 

Figura 8. Detección inmunohistoquímica del oncosupresor p53 en células tumorales. 

Las células tumorales aparecen intensamente teñidas en el núcleo en más del 10% de las 

mismas. 

 

 

 

  

 



Resultados 
 

 104

 Al estudiar la correlación entre p53 y h-MAM mediante el test no paramétrico 

de Spearman, obtuvimos un dintel de positividad para h-MAM de 122 unidades, 

tras aplicar el test “CRITLEVEL”. Valores de h-MAM por encima de 122 fueron 

considerados como valores elevados de h-MAM, y valores de h-MAM iguales o 

inferiores a 122 unidades se consideraron valores bajos de h-MAM. En 7 de los 

casos estudiados (9%) encontramos mutación del gen oncosupresor p53 y niveles 

de h-MAM superiores a 122 unidades mientras que 42 casos (54%) presentaron 

niveles de h-MAM mayores a 122, y no presentaron mutación de p53. Además, 9 

casos (12%) fueron p53+ con niveles de h-MAM iguales o inferiores a 122 

unidades y 19 casos (25%) p53- y niveles de h-MAM iguales o inferiores a 122. En 

la figura 9 se representan los porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a 

p53. 

 

Figura 9.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto al oncosupresor p53. 

  

 

 

 

 

 

 

 

   

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 9 19
h-MAM+ 7 42

p53+  p53-

  p=0.04 



Resultados 
 

 105

4.1.3.2 Ki67 

 

 Estudiamos la expresión del factor de proliferación celular Ki67 en las 77 

muestras tumorales. La positividad de Ki67 se evaluó como porcentaje de células 

tumorales positivas (tinción nuclear). Obtuvimos expresión de Ki67 mayor al 20% 

de las células, como muestra la Figura 10, en 32 muestras (42%) del total y Ki67 

menor o igual al 20%, en 45 muestras (58%). 

 

Figura 10.  Detección inmunohistoquímica de Ki67 en células tumorales. Las células 

tumorales aparecen intensamente teñidas en el núcleo en más del 20% de las mismas. 

  

 

 

 

 

 En el caso de este factor pronóstico de carcinoma de mama encontramos, al 

igual que ocurría con p53 y con la invasión ganglionar, una correlación inversa y 

significativa entre ambos parámetros moleculares   (r=-0.38 y p<0.05), correlación 

que se mantuvo cuando prescindimos en dicho estudio de las pacientes tratadas con 

quimioterapia previa (Figura 11). 



Resultados 
 

 106

 Al estudiar la correlación entre Ki67 y h-MAM, y tras aplicar el 

“CRITLEVEL”, el dintel de positividad para h-MAM fue de 163 unidades, por lo 

que valores superiores a 163 fueron considerados valores altos de h-MAM y valores 

iguales o inferiores a 163 fueron considerados bajos. Obtuvimos 9 casos (12%) con 

Ki67>20% y cuyos niveles de h-MAM fueron superiores a 163, y 24 casos (31%) 

con niveles de h-MAM inferiores a 163. Por otro lado, obtuvimos 29 casos (38%) 

con Ki67≤20% y con niveles de h-MAM superiores a 163 unidades y 15 casos 

(19%) con niveles de h-MAM inferiores a 163. En la figura 11 se representan los 

porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a Ki67. 

 

Figura 11.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a Ki67. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 24 15
h-MAM+ 9 29

Ki>20% Ki<20%

p<0.05



Resultados 
 

 107

4.1.3.3 c-erb-B2 

 

 Estudiamos la expresión de c-erbB2 por análisis inmunohistoquímico en 

todas las muestras tumorales. La reacción se consideró positiva cuando más del 

10% de las células mostraron tinción específica de membrana (Figura 12), y 

negativa cuando menos del 10% de las células mostraron tinción específica de 

membrana. 

 

Figura 12.  Detección de c-erb-B2 en muestras de carcinoma de mama mediante 

análisis inmunohistoquímico. Las células tumorales aparecen intensamente teñidas en la 

membrana. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 De los 77 casos estudiados, 17 (22%) presentaron reacción 

inmunohistoquímica positiva para c-erbB2, 4 de los cuales correspondían a 

pacientes que recibieron quimioterapia previa, y 60 casos (78%) presentaron 

reacción inmunohistoquímica negativa, 10 de los cuales correspondían a pacientes 

que recibieron quimioterapia previa. En el caso de este oncogén y, al igual que 



Resultados 
 

 108

ocurría con los RP, no encontramos correlación con h-MAM. En la figura 13 se 

representan los porcentajes de expresión de c-erbB2 respecto a h-MAM. 

 

 Al estudiar la correlación entre c-erb-B2 y h-MAM mediante el test no 

paramétrico de Spearman, obtuvimos un dintel de positividad para h-MAM de 122 

unidades, tras aplicar el test “CRITLEVEL”. Valores de h-MAM por encima de 

122 fueron considerados como valores elevados de h-MAM, y valores de h-MAM 

iguales o inferiores a 122 unidades se consideraron valores bajos de h-MAM. 

Obtuvimos 13 casos (17%) con c-erbB2+ y niveles de h-MAM superiores a 122 

unidades, y 4 casos (5%) con niveles de h-MAM inferiores a 122. Por otro lado, 

obtuvimos 40 casos (52%) con c-erbB2 negativo y niveles de h-MAM superiores a 

122 unidades, y 20 casos (26%) con niveles de h-MAM inferiores a 122 unidades. 

 

Figura 13.  Porcentaje de expresión del gen h-MAM respecto a c-erb-B2. 

 

 

 

 

 

 

 

 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 4 20
h-MAM+ 13 40

cerb-B2+ cerb-B2-

    n.s. 



Resultados 
 

 109

4.1.4 Ploidía 

 

 La ploidía de las 76 muestras tumorales fue estudiada por análisis 

citométrico. Se consideraron tumores diploides aquellos que presentaban índice de 

DNA=1 (Figura 14) y tumores aneuploides aquellos que presentaban índice de 

DNA distinto a 1 (Figura 15). De los 76 casos estudiados, 36 fueron diploides 

(48%), 5 de los cuales correspondieron a pacientes que habían recibido 

quimioterapia previa, y 39 fueron aneuploides (52%), 7 de los cuales 

correspondieron a pacientes que habían recibido quimioterapia previa. 

  

Figura 14.  Ploidía del ciclo celular. En la figura aparece un ciclo celular diploide con 

88.0% de células en fase G1, 6.7% de células en fase G2 y 5.3% de células en fase S.  

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 
 

 110

Figura 15.  Ploidía del ciclo celular. En la figura se muestra un ciclo celular aneuploide 

con índice de DNA de 1.9. 

 

 

 

 

 

 Encontramos 24 casos (31%) con ciclos celulares diploides y cuyos niveles 

de h-MAM fueron superiores a 205 unidades (dintel de positividad obtenido por 

“CRITLEVEL”), y 12 casos (15%) con niveles de h-MAM inferiores a 205 

unidades. Valores de h-MAM por encima de 205 fueron considerados como valores 

elevados de h-MAM, y valores de h-MAM iguales o inferiores a 205 unidades se 

consideraron valores bajos de h-MAM. Por otro lado, obtuvimos 7 casos (9%) con 

ciclos celulares aneuploides y con niveles de h-MAM superiores a 205 unidades y 

32 casos (41%) con niveles de h-MAM inferiores a 205. 

 

 Encontramos una correlación directa y significativa entre ciclos celulares 

diploides y h-MAM (r= 0.49 y p<0.05), correlación que se mantuvo cuando 

prescindimos en el estudio de pacientes que habían recibido quimioterapia previa. 

Sin embargo, no existió correlación entre h-MAM y ciclos celulares aneuploides. 



Resultados 
 

 111

 En la figura 16 aparecen los porcentajes de expresión del gen h-MAM 

respecto a muestras con ciclos celulares diploides y aneuploides. 

 

Figura 16.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a muestras con ciclos 

celulares diploides y aneuploides. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-M A M - 12 32
h-M A M + 24 7

D ip lo ide A neuplo ide

    p<0.05 



Resultados 
 

 112

4.1.5 Marcadores reguladores de la tumorogénesis 

 

 

4.1.5.1 VEGF 

 

 Estudiamos el factor de proliferación VEGF en 41 muestras tumorales. Se 

consideraron los resultados positivos cuando más del 1% de las células fueron 

positivas para VEGF, y los resultados fueron negativos cuando menos del 1% de 

las células fueron positivas para VEGF. En 10 casos (25%), menos del 1% de las 

células fueron positivas para VEGF, mientras que en 31 casos (75%), más del 1% 

de las células fueron positivas para VEGF.  

 

 El análisis estadístico no fue significativo cuando comparamos este marcador 

de tumorogénesis con las concentraciones de h-MAM. En la figura 17 se 

representan los porcentajes de expresión de del gen h-MAM respecto a VEGF. 

 

Figura 17 .  Porcentajes de la expresión del gen h-MAM respecto a VEGF. 

 

 

 

 

 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 11 4
h-MAM+ 20 6

VEGF>1% VEGF<1%

   n.s. 



Resultados 
 

 113

4.1.5.2 Bcl-2/Bax 

 

 Por último, estudiamos las proteínas reguladoras de la apoptosis Bcl-2 y Bax 

en 30 muestras tumorales. Se formaron dos subgrupos según si las relaciones entre     

Bcl-2/Bax fueron mayores o menores a 1/2. En 10 casos (33%), la relación Bcl-

2/Bax fue mayor de 1/2, mientras que en 20 casos (67%), dicha relación fue menor 

a 1/2. 

 

 El análisis estadístico no fue significativo cuando comparamos ambas 

proteínas con la expresión del gen h-MAM. En la figura 18 se representan los 

porcentajes de expresión de Bcl-2/Bax respecto a la expresión del gen h-MAM. 

 

Figura 18.  Porcentajes de expresión del gen h-MAM respecto a Bcl-2/Bax 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0%

20%

40%

60%

80%

100%

h-MAM- 6 10
h-MAM+ 4 10

Bcl2/Bax>0,5 Bcl2/Bax<0,5

  n.s. 



Resultados 
 

 114

 A continuación, se reflejan todos los resultados anteriormente expuestos de 

forma resumida en la tabla 7. 

 

Tabla 7.  Tabla resumen. Relación entre la expresión del gen h-MAM y factores 

pronósticos estudiados 

 

 
 

 
Parámetro biológico 

 
r 

 
p 
 

   
• GN -0.29   0.09 
• RE  0.40 <0.05 
• p53 -0.22 <0.05 
• Ki67 -0.38 <0.05 
• N -0.33 <0.05 
• Ciclo celular diploide  0.49 <0.05 
• GH  n.s.  
• RP  n.s.  
• c-erbB2  n.s.  
• VEGF  n.s.  
• Bcl-2/Bax  n.s.  

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Discusión 

 116

4. DISCUSIÓN 
 
  

 Nuestro estudio ha consistido en el análisis de la expresión del gen h-MAM 

en muestras tumorales, por estar su expresión alterada con relación a tejidos 

normales de mama. Para ello hemos utilizado la técnica RT-PCR, y hemos 

cuantificado sus niveles de expresión conociendo las concentraciones de RNA de 

las muestras tumorales. Además, hemos estudiado parámetros de primera, segunda 

y tercera generación, por técnica inmunohistoquímica y citometría de flujo, los 

cuales hemos relacionado con la expresión de la h-MAM. El gen h-MAM se expresa 

tanto en estadios tempranos de carcinoma (CDIS), como en estadios invasivos 

(CDI, carcinomas lobulillares infiltrantes y metástasis) y su sobreexpresión podría 

reflejar alteraciones celulares específicas del epitelio de mama. 

  

 Numerosos investigadores han utilizado ténicas modificadas de PCR y 

Northern blot para el estudio de genes que intervienen en el desarrollo del cáncer 

de mama, como es h-MAM, y son útiles como marcadores pronósticos para el 

control de las pacientes. Varios grupos han estudiado la expresión del gen h-MAM 

en sangre periférica, por lo que hemos incluido estos estudios en nuestro trabajo. 

Sin embargo, son escasos los trabajos previos en la bibliografía que estudian la 

expresión del gen h-MAM en tejido tumoral sólido de mama (Watson et al. 1996; 

Watson et al. 1998; Fleming et al. 2000), si bien sí se ha estudiado la correlación 

entre la expresión de h-MAM y otros marcadores biológicos y moleculares de cada 

tumor, tal y como hemos hecho nosotros. 

 

 

 

 

 

 

 



Discusión 

 117

4.1 EXPRESIÓN DEL GEN h-MAM EN SANGE PERIFÉRICA 

 

 

 Aproximadamente el 30% de las pacientes que desarrollan cáncer de mama y 

son intervenidas y sometidas a radiación, hormonoterapia y quimioterapia, 

finalmente desarrollan metástasis. Por esta razón, es muy importante la detección 

de células tumorales en tejidos periféricos, como son sangre y médula. Muchos 

investigadores han encontrado una correlación significativa entre la existencia de 

células tumorales en sangre periférica en pacientes con carcinoma de mama e ILE y 

SG (Pantel et al. 1999; Wong et al. 2000; Zach et al. 1999). La detección de células 

circulantes tumorales podría ser un indicativo temprano de la progresión de la 

enfermedad. El screening inmunocitoquímico con anticuerpos monoclonales contra 

marcadores epiteliales, podría ser un método de detección de células tumorales 

aisladas en sangre y médula ósea (Pantel, 1993). Sin embargo, resulta difícil 

seleccionar marcadores epiteliales para la detección de micrometástasis en 

carcinoma de mama, mediante técnica RT-PCR, debido a la baja especificidad de la 

técnica, ante la existencia de pseudogenes, como ocurre con la citokeratina 19. 

Además la detección de RNAm de genes específicos de tumor (CEA) o genes 

específicos de epitelio (citokeratina 19) como marcadores en sangre periférica en 

pacientes con carcinoma de mama, tienen un valor diagnóstico limitado debido a 

que aparecen también en células de individuos sanos (Zach et al. 1999). 

 

 El paso a sangre periférica de cualquier marcador tumoral está en función 

directa del volumen tumoral, a partir de la mayor o menor expresión individual del 

marcador. La presencia de RNAm en sangre periférica referida por los diversos 

investigadores probablemente refleje una mayor masa tumoral primaria y no una 

diferencia cualitativa en la expresión del gen, que es lo que hemos estudiado 

nosotros. Este dato debemos tenerlo en cuenta a la hora de relacionar los resultados 

obtenidos por estos investigadores en sangre periférica, con nuestros resultados en 

tejido tumoral de mama. 

 



Discusión 

 118

 Como decíamos anteriormente, las células epiteliales de cáncer de mama 

expresan marcadores epiteliales, como son la citokeratina 19, muc-1, EGF-R, c-

erbB2 (estudiadas por Grünewald et al. (2000) por técnica RT-PCT) y h-MAM 

(Grünewald et al. 2000; Fleming et al. 2000; Zach et al. 1999; Watson et al. 1996). 

Para calcular el límite de detección analítico de h-MAM por técnica RT-PCR, Zach 

et al. (1999), diluyeron células de cultivo de carcinoma de mama SKBR5 en sangre 

periférica de voluntarios sanos. El límite detectado fue de 1 célula SKBR5 de cada 

106-107 células sanguíneas. Los niveles de expresión de h-MAM en esta línea 

celular son menores que en otras, como es el caso de la línea celular MDA-MB415. 

Como ya hemos dicho, algunos tumores de mama sobreexpresan RNAm de h-

MAM (Watson et al. 1996) y la expresión de h-MAM en sangre periférica de 

pacientes con carcinoma de mama, depende no sólo del número de células 

tumorales sino también de la expresión de RNAm de h-MAM por célula. Por tanto, 

el límite de detección  de RNAm de h-MAM es interindividual. Todavía queda por 

saber si todas las células de cáncer de mama expresan h-MAM. 

  

 Para evaluar el impacto pronóstico de la presencia de la h-MAM en sangre 

periférica, Zach et al. (1999) estudiaron la expresión de transcritos de RNAm de h-

MAM en células tumorales de sangre periférica de distintos subgrupos de pacientes 

con enfermedad de mama, y detectaron expresión en el 28% de las pacientes 

operadas de carcinoma de mama que no presentaban metástasis, en el 6% de las 

pacientes con enfermedad en estadíos I-III y en el 49% de las pacientes con 

metástasis. No encontraron expresión de la proteína en pacientes sin carcinoma de 

mama, lo que implicaría una elevada especificidad de la h-MAM como marcador 

de células derivadas de glándula mamaria. En esta misma línea, Fleming et al. 

(2000) también observaron, por técnica RT-PCR presencia de h-MAM en sangre 

periférica de 9/15 casos (60%) en pacientes con cáncer de mama, y ausencia de la 

proteína en todas las pacientes sanas. Los 6 casos en los que no se detectó h-MAM, 

pudieron ser debidos a la ausencia de células tumorales que expresasen h-MAM, o 

bien a la falta de sensibilidad del ensayo. 

 



Discusión 

 119

 Zach et al. (1999) también estudiaron la posibilidad de detectar RNAm de h-

MAM en sangre periférica de pacientes con patologías distintas al carcinoma de 

mama. Sin embargo, sólo detectaron RNAm de dicha proteína en 2 de las 41 

pacientes estudiadas. Las dos muestras de pacientes en las que sí detectaron h-

MAM por técnica RT-PCR correspondían a pacientes que presentaban linfomas. 

Una posible translocación en el cromosoma 11q13 en las células tumorales podría 

ser la causa de la sobreexpresión de h-MAM y la consiguiente detección inesperada 

de RNAm de h-MAM  en sangre periférica de las dos pacientes con linfoma. 

 

 Grünewald et al. (2000) estudiaron la expresión de h-MAM en sangre 

periférica de un grupo control formado por 51 pacientes (31 de los cuales eran 

pacientes sanas y 20 con enfermedad hematopoyética) y un grupo formado por 145 

pacientes con carcinoma de mama (12 de las cuales presentaban CDIS y 133 CDI). 

Además, incluyeron en el estudio 40 tejidos sanos de mama. No detectaron 

expresión de h-MAM en pacientes sanas, pacientes con enfermedad 

hematopoyética, ni en pacientes con CDIS, pero sí en 11 (8%) de las pacientes con 

CDI. h-MAM se expresó en los 40 tejidos sanos de mama estudiados. Estos mismos 

autores estudiaron también en sangre periférica expresión de citokeratina 19 y 

EGF-R (marcadores epiteliales de células de carcinoma de mama) en un grupo 

control positivo formado por 10 tejidos de cáncer de mama, donde se expresaron 

ambos marcadores, un grupo control negativo formado por pacientes sanas donde 

la CK19 se expresó en el 39% de los casos y EGF-R no se expresó. También 

incluyeron en el estudio 20 pacientes con enfermedades hematopoyéticas, 

encontrando expresión de CK19 en el 10% de los casos y de EGF-R en el 25% de 

los casos, así como pacientes con CDIS y CDI. En las 12 pacientes con CDIS no 

encontraron expresión de EGF-R pero sí de CK19 (en el 25% de los casos). En las 

pacientes con CDI (133) encontraron expresión de EGF-R (en el 10% de los casos) 

y de CK19 (en el 48% de los casos). Estos autores no encontraron relación entre la 

expresión de h-MAM, CK19 y EGF-R en sangre periférica. 

 

 En contraposición al estudio realizado en sangre periférica por Grünewald et 

al. (2000), pero de acuerdo con el estudio realizado por Watson et al. (1999), 



Discusión 

 120

también en sangre periférica, en nuestro estudio sí hemos encontrado expresión de 

h-MAM en tejidos tumorales con CDIS. Tal como hemos enunciado anteriormente, 

el paso a sangre periférica de cualquier marcador tumoral está en función directa 

del volumen tumoral, a partir de la expresión del marcador tumoral. En nuestro 

trabajo hemos estudiado la expresión cualitativa del gen h-MAM en tejidos 

tumorales entre los que se han incluido tejidos con CDIS. 

 

 Queda por demostrar si la detección de expresión de h-MAM en células 

tumorales de sangre periférica  es un factor pronóstico, especialmente en pacientes 

con estadíos iniciales de la enfermedad. 

 

 Otros factores que podrían ser importantes para definir la utilidad clínica de 

h-MAM para una detección temprana, pronóstico y monitorización de cáncer de 

mama en suero, serían embarazo, ciclo menstrual y estado menopausico de la 

paciente (Fleming et al. 2000). 

 

 Para determinar la importancia pronóstica de h-MAM “in vivo” y su 

desregulación en tumores de mama primarios, Watson et al. (1996) estudiaron la 

expresión de dicha proteína en 35 tumores primarios de mama de diferentes tipos 

histológicos (carcinoma lobulillar infiltrante, carcinoma mucinoso, CDIS y CDI) 

por técnica Northern blot, así como en tejido normal de mama. Detectaron 

sobreexpresión de h-MAM en 8 de los 35 tumores (23%), así como en tejido normal 

de mama, aunque la expresión en estos últimos fue menor que en tejido tumoral. 

Estos autores concluyen que la sobreexpresión de h-MAM no está restringida a una 

especie de tumor y que existe una elevada frecuencia de expresión de dicha 

proteína entre tumores primarios de mama y su progresión de expresión en estadíos 

avanzados del tumor. Está por estudiar la expresión de h-MAM en enfermedades 

benignas; una menor expresión de h-MAM en enfermedades benignas con relación 

a carcinoma de mama, podría definir una relación entre progresión de la patología 

de la mama y expresión de la proteína. Watson et al. (1996) estudiaron la 

posibilidad de que h-MAM se expresase en otros tejidos, como útero y pulmón 

(lugar de expresión de la uteroglobina, homóloga a la h-MAM), ovario o placenta, 



Discusión 

 121

pero no detectaron expresión de la proteína en ninguno de los tejidos. Realizaron 

otro estudio sobre las mismas muestras, para ver la expresión de h-MAM, pero esta 

vez utilizando técnica RT-PCR, y también encontraron expresión de la proteína en 

todas las muestras tumorales de tejido adulto. Además, con esta técnica detectaron 

expresión de h-MAM en tejido normal. Al igual que cuando utilizaron la técnica 

Northern blot, no detectaron expresión en pulmón, útero o próstata, sitios de 

expresión de rPSC3 y uteroglobina. Tampoco encontraron expresión en tejidos con 

respuesta hormonal (ovario, testículos y placenta) ni en órganos epiteliales (colon y 

vejiga).  

 

 En esta misma línea, Watson et al. (1998) realizaron el análisis de h-MAM 

utilizando técnicas de Northern blot y RT-PCR en 15 tejidos de mama normal, 35 

carcinomas de mama primarios y 21 tumores de mama con metástasis, y 

encontraron expresión en glándula mamaria en todos los tejidos de mama normales 

(controles), en el 23% de carcinomas de mama primarios y en el 62% de los 

tumores de mama con metástasis, lo que sugiere que el nivel de expresión de h-

MAM es relevante en la biología del cáncer de mama. 

 

 Fleming et al. (2000), estudiaron la expresión de h-MAM en tejidos no 

tumorales adultos y fetales utilizando dot-blot de poli-A de RNAm de tejidos no 

malignos que híbrida con cDNA de h-MAM. Observaron, al igual que Watson et al. 

(1996), que h-MAM se expresaba en tejido de mama y no se expresaba en glándula 

apocrina (glándulas salivares), tejidos con respuesta hormonal (útero y próstata), 

leucocitos de sangre periférica, ganglios linfáticos, o médula espinal.  

 

 Fleming et al. (2000), también estudiaron por inmunohistoquímica la 

expresión de h-MAM en carcinomas de mama, y encontraron expresión en el 80% 

de los carcinomas ductales. La expresión de h-MAM tuvo lugar tanto en carcinomas 

bien diferenciados (78%), moderadamente diferenciados (67%), como pobremente 

diferenciados (63%). Estos hallazgos concuerdan con nuestros resultados, 

obtenidos por RT-PCR, ya que hemos observado que altos valores de expresión del 

gen h-MAM, se correlacionan con todos aquellos factores que definen un alto grado 



Discusión 

 122

de diferenciación del tumor. Además, encontraron expresión de la proteína en los 

tres CDIS que estudiaron. El patrón de expresión inmunohistoquímico de h-MAM 

fue difuso y citoplásmico. Por otra parte observaron expresión de h-MAM en 

algunas células epiteliales intraductales e intralobulillares. Al igual que se ha visto 

con otras proteínas secretoras, este aumento de expresión de h-MAM tiene lugar en 

tejidos metaplásicos apocrinos. En este sentido, en tejido benigno de mama con 

epitelio apocrino metaplásico, observaron inmunorreactividad para la h-MAM tanto 

en epitelio, como en líquido quístico apocrino. 

 

 Todos los autores concluyen que debido a la frecuencia con que se expresa h-

MAM en tumores poco diferenciados así como en tumores diferenciados, y la 

relativa baja expresión en tejido normal de la mama así como la ausencia de 

expresión en otros tejidos distintos a la mama, hacen de h-MAM un atractivo 

candidato como marcador tumoral. El hecho de que no encontraran expresión de h-

MAM en todas las muestras tumorales de mama estudiadas, podría ser debido a 

insuficiente cantidad de RNA en las muestras, mala calidad del mismo, o bien a la 

falta de sensibilidad del ensayo, que supone ausencia de expresión de la proteína.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Discusión 

 123

4.2. RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN h-MAM CON OTROS 

PARÁMETROS CLÍNICO-PATOLÓGICOS 

  

 

 Con relación a la invasión ganglionar, hemos encontrado una correlación 

inversa estadísticamente significativa (r=-0.23 y p=0.04) con la expresión del gen 

h-MAM.  

  

 No existen estudios que relacionen invasión ganglionar con expresión de 

RNAm de h-MAM en tejido tumoral de mama. Sin embargo, Fleming et al. (2000) 

estudiaron expresión del RNAm de h-MAM en ganglios linfáticos, y Grünewald et 

al. (2000), estudiaron la expresión de h-MAM en sangre periférica de pacientes con 

carcinoma de mama primario, y lo relacionaron con invasión ganglionar. h-MAM 

se expresa en un gran número de tumores primarios de mama y la ausencia de 

expresión en ganglios linfáticos no invadidos estudiada por Fleming et al. (2000), 

sugiere que podría ser un marcador específico en la detección de células tumorales 

en ganglios linfáticos en carcinoma de mama con metástasis. Para verificar esta 

idea, estos investigadores estudiaron la expresión de RNAm de h-MAM por técnica 

de Northern blot en ganglios linfáticos en tumores de mama y tumores no 

mamarios con metástasis. También estudiaron la expresión de RNAm de 

citokeratina 19, marcador de células epiteliales, como control de expresión de 

RNAm de h-MAM en células epiteliales tumorales en ganglios linfáticos. El estudio 

estuvo formado por 21 muestras de ganglios linfáticos procedentes de pacientes 

con carcinomas de mama con metástasis. Detectaron RNAm de h-MAM en 9 casos 

(43%); en 6 casos no detectaron expresión de RNAm de h-MAM ni de citokeratina 

19, lo que sugiere que las muestras de ganglios linfáticos no presentaban 

suficientes células tumorales como para ser detectadas por la técnica utilizada. 

Excluyendo estos 6 casos, el 60% de las muestras expresaban RNAm de h-MAM, y 

en 1 de los casos no se detectó expresión de RNAm de citokeratina 19, por lo que 

h-MAM podría ser un marcador más sensible en la detección de células tumorales. 

Además RNAm de la h-MAM sólo se detectó en 1 caso de metástasis no mamaria, 



Discusión 

 124

mientras que la citokeratina 19, se detectó en varios casos. En todos los casos sin 

invasión ganglionar, no se detectó RNAm de h-MAM ni de citokeratina 19.  

 

 Por otro lado, Grünewald et al. (2000), estudiaron la expresión de h-MAM en 

sangre periférica de pacientes con carcinoma de mama primario y encontraron 

relación significativa entre la expresión de h-MAM y factores pronósticos 

establecidos, como es la invasión ganglionar. Observaron expresión de RNAm de 

h-MAM en sangre periférica en el 25% de los pacientes que presentaban más de 4 

ganglios invadidos en el momento de diagnóstico. Además el RNAm de h-MAM se 

expresó en dos pacientes sin invasión ganglionar. Estos autores relacionaron la 

expresión de RNAm de h-MAM en sangre periférica con invasión ganglionar. Sin 

embargo, la relevancia pronóstica en pacientes sin invasión ganglionar está sin 

determinar. 

 

 Estos resultados aparentemente contradicen los nuestros, puesto que en 

nuestro estudio, hemos encontrado una correlación significativa entre expresión de 

RNAm de h-MAM y ausencia de invasión ganglionar. Sin embargo, la presencia de 

RNAm de h-MAM en sangre periférica referida por Grünewald et al. (2000), como 

decíamos anteriormente, probablemente sólo refleje una mayor masa tumoral 

primaria y no una diferencia cualitativa en la expresión del gen, que es 

precisamente lo que hemos estudiado nosotros. Es sabido que el tamaño tumoral se 

correlaciona significativamente con la invasión ganglionar de la axila, y es 

probable que tumores de mayor tamaño produzcan mayor cantidad de h-MAM 

circulante. 

 

 Con relación a los RE, hemos encontrado una correlación directa 

estadísticamente significativa (r=0.40 y p<0.05) con la expresión de h-MAM.  

 

 No existen estudios que relacionen expresión de RNAm de h-MAM con RE 

en tejido tumoral, pero sí en sangre periférica como es el trabajo realizado por Zach 

et al. (1999) en el cual relacionaron la expresión de transcritos de h-MAM en sangre 

periférica de pacientes con carcinoma de mama con el estado de RE. De un 15-23% 



Discusión 

 125

de las pacientes con cáncer de mama tienen amplificada la región q13 del 

cromosoma 11, que implica a h-MAM, y además estos tumores coinciden en ser 

RE+. Esta asociación es la razón de la elevada incidencia de expresión de RNAm 

de h-MAM en sangre periférica de pacientes con RE+, si bien no se ha estudiado la 

asociación de expresión de h-MAM en sangre periférica de pacientes con tumores 

RE-, por lo que habría que estudiar en estos tumores las amplificaciones del 

cromosoma 11q13. La amplificación de esta región en el cromosoma 11, también 

tiene lugar en otros tumores como en el carcinoma de esófago, pulmón o 

hepatocelular. 

  

 Nuestros resultados están de acuerdo con el estudio realizado por Zach et al. 

(1999), ya que la expresión de RNAm de h-MAM en muestras tumorales se ha 

relacionado con RE+. 

  

 La mutación del gen oncosupresor p53 también se correlacionó, de forma 

inversa (r=-0.23, p=0.04), con la expresión de h-MAM. Hasta el momento, no 

existe en la bibliografía ningún trabajo donde se haya relacionado la mutación del 

gen oncosupresor p53 con h-MAM. Según nuestros resultados, la expresión de h-

MAM se ha relacionado con factores de buen pronóstico y uno de ellos es 

precisamente ausencia de mutación de p53. 

 

 La proliferación de las células tumorales fue medida a través de Ki67 

mediante anticuerpos monoclonales por técnica inmunohistoquímica. Hemos 

podido hallar una correlación significativa e inversa  (r=-0.38 y p<0.05) entre 

proliferación elevada, medida con Ki67, y niveles de expresión del gen h-MAM.  

 

 Estudiamos la relación entre h-MAM y la ploidía del ciclo celular. h-MAM 

se relacionó con ciclos celulares diploides (r=0.49 y p<0.05). Tampoco en este caso 

hemos encontrado en la bibliografía estudios que relacionen la expresión de RNAm 

de h-MAM con la ploidía del ciclo celular. 

 



Discusión 

 126

 Existen, finalmente, trabajos en la bibliografía que relacionan la expresión de 

h-MAM en sangre periférica de pacientes con carcinoma de mama con otros 

parámetros clínicos-patológicos, como niveles elevados en suero de CA15.3 

(Grünewald et al. 2000) y de CEA (Zach et al. 1999). Grünewald et al. (2000), 

también relacionaron la expresión de h-MAM en sangre periférica de estas 

pacientes con metástasis a distancia, ya que el 25% de las pacientes con metástasis 

expresaban h-MAM frente al 5% de las pacientes con carcinoma de mama sin 

metástasis que expresaban la proteína. En este sentido, Zach et al. (1999) 

estudiaron la incidencia de transcritos de h-MAM en sangre periférica de distintos 

subgrupos de pacientes con carcinoma de mama. h-MAM se expresó en el 28% de 

las pacientes que no presentaban metástasis, en el 6% de las pacientes con 

enfermedad en estadíos I-III y en el 49% de las pacientes con metástasis. 

Relacionaron la positividad de expresión del gen h-MAM con metástasis a 

distancia.  

  

 Watson et al. (1998) no encontraron relación entre la expresión de h-MAM en 

tejido normal de mama y sobreexpresión en tejido tumoral de mama y parámetros 

clínico-patológicos como histología del tumor estadío del tumor y estado hormonal, 

por lo que la sobreexpresión de la h-MAM, podría estar restringida a una 

transformación específica de tumores primarios de mama. 

  

 En conclusión, y según nuestros estudios, niveles elevados de h-MAM se 

relacionaron con ausencia de invasión ganglionar, RE positivos, ausencia de 

mutación del oncogén supresor p53, una baja proliferación celular y ciclos 

celulares diploides, todos ellos factores de buen pronóstico en el carcinoma de 

mama, al reflejar, en conjunto, un alto grado de diferenciación de los tumores, así 

como una baja tasa de proliferación de los mismos. Por todo lo expuesto podríamos 

decir que niveles elevados de h-MAM en las muestras tumorales de mama podrían 

ser un factor pronóstico favorable en dicha patología. 

 

 

 







  Bibliografía 

 131

7 BIBLIOGRAFÍA 
 

 

Abel U, Berger J, Wiebelt H. CRITLEVEL: an exploraty procedure for the 

evaluation of quantitative prognostic factors. Methods Inf Med, Jul; 23 (3): 154-6, 

1984. 

 

Aihara T, Fujiwara Y, Ooka M, Sakita I, Tamaki Y, Monden M. 

Mammaglobin B, as a novel marker for detection of breast cancer micrometastasis 

in axillary limph nodes by reverse transcription-polymerase chain reaction.Breast 

cancer Research and Treatment 58: 137-140, 1999. 

 

Aihara T, Fujiwara Y, Ooka M, Sakita I, Tamaki Y, Monden M. 

Mammaglobin B, as a novel marker for detection of breast cancer micrometastasis 

in axillary limph nodes by reverse transcription-polymerase chain reaction.Breast 

cancer Research and Treatment 58: 137-140, 1999. 

 

Alban P, Hurd C, Dinda S, Khattree N, Moudgil VK. Differential regulation of 

retinoblastoma protein by hormonal and antihormonal agents in T47D breast 

cancer cells. J Steroid Biochem Mol Biol May; 77 (2-3): 135-141, 2001. 

 

Alexiev BA, Bassarova AV, popovska SL, Popov AA, Christov CZ. Expression 

of c-erbB-2 oncogene and p53 tumor suppressor gene in benign and malignant 

breast tissue: correlation with proliferative activity and prognostic index. Gen 

Diagn Pathol Jun; 142 (5-6): 271-279, 1997. 

 

Anbazhagan R, Fujii H, Gabrielson E. Allelic loss of chromosomal arm 8p in 

breast cancer progression. Am J Pathol 152 (3): 8 15-819, 1998. 

 

 

 



  Bibliografía 

 132

Ando Y, Iwase H, Ichihara S, Toyoshima S, Nakamura T, Yamashita H, 

Toyama T, Omoto Y, Karamatsu S, Mitsuyama S, Fujii Y, Kobayashi S. Loss 

of heterozygosity and microsatellite instability in ductal carcinoma in situ of the 

breast. Cancer Lett 11; 156 (2): 207-214, 2000. 

 

Baker ME. Amino acid sequence homology between rat prostatic steroid binding 

protein and rabbit uteroglobin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 114: 325-330, 

1983. 

 

Bargmann CI, Weinberg RA. Increased tyrosine kinase activity associated with the 

protein encoded by the activated neu oncogene. Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5394-

5398, 1988. 

 

Becker RM, DarrowC, Zimonjic DB, Popescu NC, Watson MA, Fleming TP: 

Identification of mammaglobin B, a novel member of the uteroglobin gene family. 

Genomics 54: 70-78, 1998. 

 

Berner HS, Nesland JM. Expresssion of CD44 isoforms in infiltraring lobular 

carcinoma of the breast. resast Cancer Res Treat Jan; 65 (1): 23-9, 2001. 

 

Borg A, Baldetorp B, Ferni M, et al. ErbB2 amplification is asociated with 

tamoxifen resistance in steroid receptor positive breast cancer. Cancer Letters 81: 

137-144, 1994. 

 

Bose S, Wang SI, Terry MB, Hibshoon H, Parsons R. Allelic loss of 

chromosome 10q23 is associated with tumor progression in breast carcinomas. 

Oncogene  

9;17(1):123-127, 1998. 

 

Brenner AJ, Paladugu A, Wang H, Olopade OI,  Dreyling MD, Aldaz CM. 

Preferential loss of expression of p16 (INK4a) rather than p19 (ARF) in breast 

cancer. Clin Cancer Res  Dec; 2 (12): 1993-8, 1996. 



  Bibliografía 

 133

Caldes T, Perez-Segura P, Tosar A, de la Hoya M, Diaz-Rubio E. Microsatellite 

Carcinog Mutagen 20 (5): 283-291, 2001. 

 

Campiglio M, Tagliabue E, Srinivas U, et al. Colocalization of the p185 HER2 

oncoprotein and integrin alpha 6 beta 4 in Calu-3 lung carcinoma cells. J Cell 

Biochem, 55: 409-418, 1994. 

 

Catalano MG, Comba A, Fazzari A, Benedusi-Pagliano E, Sberveglieri M, 

Revelli A, Massobrio M, Frairia R, Fortunati N. Sex steroid binding protein 

receptor (SBP-R) is related to a reduced proliferation rate in human breast cancer. 

 

Ceccarelli C, Santini D, Chieco P, Taffurelli M, Gamberini M, Pileri SA, 

Marrano D. Retinoblastoma (RB1) gene prosuct expression in breast carcinoma. 

Correlation with Ki-67 growth fraction and biophatological profile. J Clin Pathol 

Nov; 51 (11): 818-24, 1998. 

 

Chan FKM, Zhang J, Cheng L, Shapiro DN, Winoto A. Identification of human 

and mouse p19, a novel CDK4 and CDK6 inhibitor with homology to p16. Mol 

Cell Biol1, 5:2682-2688, 1995. 

 

Charlie R, Pagano M, Inghirami G. The cyclin dependent kinasa inhibitor p27 

and its prognostic role in breast cancer. Breast Cancer Res; 3 (2): 91-94, 2001. 

 

Clark GM. Oncology of breast cancer in older women. J Gerontol 1992 Nov; 47: 

19-23. 

 

Couch FJ, Deshano ML, Blackwood MA, Calzone K, Stopfer J, Campeau L, 

Ganguly A, Rebbeck T, Weber BL. BRCA1 mutations in women attending 

clinics that evaluate the risk of breast cancer. N Engl J Med 1997; 336: 1409-1415. 

 



  Bibliografía 

 134

Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C. Tyrosine kinase receptor with extensive 

homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science, 

230: 1132-1139, 1985. 

 

Cullen R, Maguire TM, McDermott EW, Hill AD, O´Higgins NJ, Duffy MJ. 

Studies on ostrogen receptor-alpha and –beta mRNA in breast cancer. Eur J Cancer  

Jun; 37 (9): 1118-1122, 2001. 

 

Daidone MG, Luisi A, Veneroni S, Benini E, Silvistrini R. Clinical Stdies of 

Bcl-2 and treatment benefit in breast cancer patients. Endocr Relat Cancer Mar; 6 

(1): 61-68, 1999. 

 

De Potter CR, Quatacker J. The p185 HER2 protein is localized on cell organelles 

involved in cell motility. Clin Exp Metastasis, 11: 453-461, 1993. 

 

Deming Sl, Nass SJ, Dickson RB, Trock BJ. C-myc amplification in breast 

cancer: a meta-analysis of its ocurrence and prognostic relevance. Br J Cancer  

Dec; 83 (12): 1688-95. 

 

Dhingra K. Selective estrogen receptor modulation: the search for an ideal 

hormonal therapy for breast cancer. Cancer Invest,19 (6): 649-659, 2001. 

 

Dieterich B, Albe X, Vissilakos P, Wieser S, Friedrich R, Krauer F. The 

prognostic value of DNA ploidy and S-phase estimate in primary breast cancer: a 

prospective study. Int J Cancer 1995 Sep 27; 63(1): 49-54. 

 

Done SJ, Arneson CR, Ozcelik H, Redston M, Andrulis IL. p53 protein 

accumulation in non-invasive lesions surrounding p53 mutation positive invasive 

breast cancers. Breast Cancer Res Treast Jan; 65 (2): 111-118, 2001. 

 



  Bibliografía 

 135

Done SJ, Eskandarian S, Bull S, Redston M, Andrulis IL. p53 missence 

mutations in microsissected high-grade ductal carcinoma in situ of the breast. J 

Natl Cancer Inst May 2; 93 (9): 700-704, 2001. 

 

Donnellan R, Chetty R. Cyclin E in human cancers. FASEB J May 13 (8): 773-

780, 1999. 

 

Donnellan R, Kleinschmidt I, Chetty R. Cyclin E immunoexpression in breast 

ductal carcinoma: pathologic correlations and prognostic implications. hum Pathol 

Jan; 32 (1): 89-94, 2001. 

 

Emig R, Magener A, Ehemann V, Meyer A, Stilgenbauer F, Volkmann M, 

Wallwiener D, Sinn HP. Aberrant cytoplasmic expression of the p16 protein in 

breast cancer is associated with accelerated tumour proliferation. Br J Cancer Dec; 

78 (12): 1661-8, 1998. 

 

Fackenthal JD, Marsh DJ, Richardson AL, Cummings SA, Eng C, Robinson 

BG, Olopade OI. Male breast cancer in Cowden syndrome patients with germline 

PTEN mutations. J Med Genet Mar; 38 (3): 159-164. 

 

Fantl V, Smith R, Brookes S, Dicksin C, Peters G. Chromosome 11q13 

abnormalities in human breast cancer. Cancer Surveys, 18: 77-94, 1993. 

 

Foster JS, Henley DC, Ahamed S, Wimalasema J. Estrogens and cell-cycle 

regulation in breast cancer. Trends Endocrinol Metab Sep; 12 (7): 320-327, 2001. 

 

Fujii H, Marsh C, Cairns P, Sidransky D, Gabrielson E. Genetic divergence in 

the clonal evolution of the breast cancer. Cancer Res 1;56(7): 1493-1497, 1996. 

 

Fujii H, Szu,el R, Marsh C, Zhou W, Gabrielson E. Genetic progression, 

histological grade, and allelic loss in ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer 

Res 15; 56 (22): 5260-5265, 1996. 



  Bibliografía 

 136

Gairard B, Mathelin C, Schaffer P, Brettes JP. Breast cancer: epidemiology, 

risk factors, screening. Rev Prat Jan 1; 48 (1): 21-7, 1998. 

 

Gairard B, Mathelin C, Schaffer P, Brettes JP. Breast cancer: epidemiology, 

risk factors, screening. Rev Prat Jan 1; 48 (1): 21-7, 1998. 

 

Gion M, Dittadi R, Mione R, Pagan V, Busetto A. Preliminary evaluation of 

CYFRA 21.1 in lung cancer cytosol. Int J Biol Markers 9: 258-259, 1994. 

 

Gorgoulis VG, Koutroumbi EN, Kotsinas A, Zacharatos P; Markopoulus C, 

Giannikos L, Kyriakou V, Voulgaris Z, Gogas I, Kittas C. Alteration of p16-

pRb pathway and chormosome locus 9p21-22 in sporadic invasive breasr 

carcinomas. Mol Med 1998 Dec; 4 (12): 807-822. 

 

Greenberg NM, Wolfe J, Rosen JM. Casein gen expression: from transfection to 

transgenics. Cancer Treatment Res, 61: 379-397, 1992. 

 

Grünewald K, Haun M, Urbanek M, Fiegl M, Müller-Holzner, Gunsilius E, 

Dünser M, Marth C, Gastl G. Mammaglobin gene expression: a superior marker 

of breast cancer cells in peripheral blood in comparison to epidermal-growth-factor 

receptor and cyrokeratin-19. Laboratory investigation,80, 7: 1071-77, 2000. 

 

Grünewald K, Haun M, Urbanek M, Fiegl M, Müller-Holzner, Gunsilius E, 

Dünser M, Marth C, Gastl G. Mammaglobin gene expression: a superior marker 

of breast cancer cells in peripheral blood in comparison to epidermal-growth-factor 

receptor and cyrokeratin-19. Laboratory investigation,80, 7: 1071-77, 2000. 

 

Guan KL, Jenkins CW, Li Y, Nichols MA, Wu X, O´Keefe CL, Matera AG, 

Xiong Y. Growth supression by p18, a p16 and p14 related CDK6 inhibitor, 

correlates with wild-type pRb function. Genes Dev, 8: 2939-2952, 1994. 

 



  Bibliografía 

 137

Guo S, Liao S, Ding H. In situ hybrid detection of p16 mRNA in primary breast 

carcinoma: its clinicopathologic significance. Zhonghua Yi Xue Za Zhi Jun; 78 (6): 

464-6, 1998. 

 

Hamann U. Hereditary breast cancer: high risk genes, genetic testing and clinical 

implications. Clin Lab; 46 (9-10): 447-461, 2000. 

 

Heffelfinger SC, Yassin R, Miller MA, Lower EE. Cyclin D, retinoblastoma, 

p53, and Her2/neu protein expression in preinvasive breast phatologies: correlation 

with vascularity. Pathobiology May; 68 (3): 129-136, 2000. 

 

Helzlsouer BE , Couzi R . Hormones and breast cancer. Cancer 36: 2059-63, 

1995. 

 

Helzlsouer KJ. Epidemiology, prevention, and early detection of breast cancer. 

Curr Opin Oncol 7 (6): 489-94, 1995. 

 

Helzlsouer KJ. Epidemiology, prevention, and early detection of breast cancer. 

Curr Opin Oncol  7 (6): 489-94, 1995. 

 

Hirai H, Roussel MF, Kato JY, Ashmun RA, Sherr CJ. Novel Ink 4 proteins, 

p19 and p18, are specific inhibitors of the cyclin D-dependient kinases CDK4 and 

CDK6. Mol Cell Biol, 15: 2672-2681, 1995. 

 

Hulka BS, Moorman PG. Breast cancer: Hormones and other risk factors. 

Maturitas Feb 28; 38 (1): 103-113, 2001. 

 

Hurst HC, Parker MG. Rat Prostatic steroid binding protein: DNA secuence and 

transcript maps of the two C3 genes. EMBO J, 2: 769-774, 1983. 

 

 

 



  Bibliografía 

 138

Ioakim-Liossi A, Karakitsos P, Markopoulos C, Aroni K, Athanassiadou P, 

Delivelioti K, Athanassiades P, Vaiopoulos G. p53 protein expression and 

oestrogen and progesterone receptor status in invasive ductal breast carcinomas. 

Cytopathology Jun; 12 (3): 197-202, 2001. 

 

Iochim EE, Malamou-Mitsi V, Kamina SA, Goussia AC, Agnantis NJ. 

Immunohistochemical expression of Bcl-2 protein in breast lesions: correlation 

with Bax, p53, Rb, c-erbB-2, EGFR and proliferation indices….. 

 

Iwase H, Ando Y, Ichihara S, Toyoshima S, Nakamura Ta, Karamatsu S, Ito 

Y, Yamashita H, Toyama T, Omoto Y, Fujii Y, Mitsuyama S, Kobayashi S. 

Immunohistochemical analysis on biological markers in ductal carcinoma in situ of 

the breast. Breast Cancer 8 (2): 98-104, 2001. 

 

Janocko LE, Brown KA, Smith CA, Gu LP, Pollice AA, Singh SG, Julian T, 

Wolmark N, Sweeney L, Silverman JF, Shackney SE. Distinctive patterns of 

Her-2/neu, c-myc, and cyclina D1 gene amplification by fluorescence in situ 

hybridization in primary human breast cancers. Cytometry Jun 15; 46 (3): 136-49, 

2001. 

 

Kang JH, Kim SJ, Noh DY, Park IA, Choe KJ, Yoo OJ, Kang HS. Methylation 

in the p53 promoter is a supplementary route to breast carcinogenesis: correlation 

between CpG methylation in the p53 promoter and the mutation of the p53 gene in 

the progression fromductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma. Lab 

Invest Apr; 81 (4): 573-579, 2001. 

 

Khaliq T, Afghan S, Nagi A, Haider MH, Islam A. p53 mutations in carcinoma 

breast a clinicopathological study. J Pak Med Assoc Jun; 51 (6): 210-213, 2001. 

 

Kim HK, Park IA, Heo DS, Noh DY, Choe KJ, Bang YJ, Kim NK. Cyclin E 

overexpression as an independent risk factor of visceral relapse in breast cancer. 

Eur J Surg Oncol Aug; 27 (5): 464-471, 2001. 



  Bibliografía 

 139

Knoop AS, Bentzan AM, Nielsen NM, Rasmussen BB, Rose C. Value of 

epiermal growth factor receptor, HER2, p53, and steroid receptors in predicting the 

efficacy of tamoxifen in high-risk postmenopausal breast cancer patients. J Clin 

Oncol Jul 15; 19 (14): 3376, 3384, 2001. 

 

Korkolis D, Ardavanis A, Yotis J, Kyroudi A, Gorgoulis V, Kittas C. HER-

2/neu overexpression in breast cancer: an immunohistochemical study including 

correlations with clinicopathological parameters, p53 oncoprotein and cathepsin-D. 

Anticancer Res May; 21(·C): 2207-2212, 2001. 

 

Koukoulis GN. Hormone replacement therapy and breast cancer risk. Ann Y Acad 

Sci, 900: 422-8, 2000. 

 

Krajewki S, Krajewska M, Turner BC, Pratt C, Howard B, Zapata JM, 

Frenkel V, Robertson S, Ionov Y, Yamamoto H, Perucho M, Takayama S, 

Reed JC. Prognostic significance of apoptosis regulators in breast cancer. Endocr 

Relat Cancer Mar; 6 81): 29-40, 1999. 

 

Kuukasjarvi T, Tanner M, Pennanen S, Karhu R, Kallioniemi OP, Isola J. 

Genetic changes in intraductal breast cancer detected by comparative genomic 

hybridization. Am J Pathol 150(4):1465-1471, 1997. 

 

Lakhani SR, Collins N, Stratton MR, Sloane JP. Atypical ductal hyperplasia of 

the breast: clonal proliferation with loss of heterozygosity on chromosomes 16q 

and 17p. J Clin Pathol 48(7): 611-615, 1995. 

 

Lambe M, Hsieh CC, Tsaih SW, Ekbom A, Adami HO Trichopoulos D. 

Maternal risk of breast cancer following multiple births: a nationwide study in 

Sweden. Cancer Causes Control 1996; 7: 533-538. 

 



  Bibliografía 

 140

Lau R, Grimson R, Sansome C, Tornos C, Moll UM. Low levels lof cell cycle 

inhibitor p27kip1 combined with high levels of ki-67 predict shortened disease-free 

survival in T1 and T2 invasive breast carcinomas. 

 

Lea O A, Petrusz P, and French FS. Prostatein. A major secretory protein of the 

rat ventral prostate. J. Biol.Chem, 254: 6196-6202, 1979. 

 

Lea OA, Petrusz P, French FS. Prostatein. A major secretory protein of the rat 

ventral prostate J Biol Chem,254: 6196-6202. 

 

Leal C, Henrique R, Monteiro P, Lopes C, Bento MJ, De Sousa CP, Lopes P, 

Olson S, Silva MD, Page DL. Apocrine ductal carcinoma in situ of  the breast: 

histologic classification and expression of biologic markers. Hum Pathol May; 32 

(5): 487-493, 2001. 

 

Lee EY, Cibull ML, Strodel WE, Haley JV. Expression of HER-2/neu oncoprotein 

and epidermal growth factor receptor and prognosis in gastric carcinoma. Arch Pathol 

Lab Med, 118: 235-239, 1994. 

 

Leivonen M, Nordling S, Lundin J, von Boguslawsli K, Hanglung C. p27 

expression correlates with short-term, but nor with long-term prognosis in breast 

cancer. Breast Cancer Res Treat May; 67 (1): 15-22, 2001. 

 

Levi F, Lucchini F, Negri E, Boyle P, La Vecchia C. Cancer mortality in Europe, 

1990-1994, and an overview of trends from 1955 to 1994. European Journal of 

Cancer, 35; 10: 1477-1516, 1999. 

 

Leygue E, Snell L, Dotzlaw H, Hole K, Troup S, Hiller-Hitchcock, Murphy L, 

Watson P. Mammaglobin, a potential marker of bresast cancer nodal metastasis. 

Journal of pathology, 189: 28-33, 1999. 

 



  Bibliografía 

 141

Leygue E, Snell L, Dotzlaw H, Hole K, Troup S, Hiller-Hitchcock, Murphy L, 

Watson P. Mammaglobin, a potential marker of bresast cancer nodal metastasis. 

Journal of pathology, 189: 28-33, 1999. 

 

Li M, Hu J, Heermeier K, Hennighausen L & Furth PA. Expression of a viral 

oncoprotein during mammary gland development alters cell fate and function: 

Induction of p53-independent apoptosis is followed by impaired milk protein 

production in surviving cells. Cell Growth Differ 7: 3-11, 1996. 

 

Li Y, Nichols MA, Shay JW, Xiong Y. Transcriptional repression of the D-type 

cyclin-dependent kinases inhibitor p16 by the retinoblastoma susceptibility gene 

product, pRB. Cancer Res, 54: 6078-6082, 1994. 

 

Liao DJ, Dickson RB. c-Myc in breast cancer. Endocr Relat Cancer Sep; 7 (3): 

143-64, 2000. 

 

Loden M, Nielsen NH, Ross G, Emdin SO, Landberg G. Cyclin E dependent 

Kinase activity in human breast cancer in relation to cyclin E, p27 and p21 

expression and retinoblastoma protein phosphorylation. Oncogene Apr 22; 18 (16): 

2557-2566, 1999. 

 

Lupu R, Cardillo M, Harris L, Hijazi M, Rosenberg K. Interaction between erbB 

receptors and heregulin in breast cancer tumor progression and drug resistance. Sem 

Cancer Biol 6, 135-145, 1995. 

 

Mark A, Watson and Timothy P. Fleming. Mammoglobin, a mammary-specific 

member of the uteroglobin gen family, is overexpressed in human breast cancer. 

Cancer Research  February (15); 56: 860-865. 

 

Maroulakou IG, Anver M, Garrett L, and Green JE. Prostate and mammary 

aenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor 

antigen fusion gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11236-11240, 1994. 



  Bibliografía 

 142

Marsh A, Spurdle AB, Turner BC, Fereday S, Thorne H, pupo GM, Mann 

GJ, Hopper JL, Sambrook KF, Chenevix-Trench G. The intronic G13964C 

variant in p53 is nor a high-risk mutation in familial breast cancer in Australia. 

Breast Cancer Res 3 (5): 346-349, 2001. 

 

Masood S, MD, FCAP, MIAC. Molecular distinction between atypical ductal 

hyperplasia and ductal carcinoma in situ. The Breast Journal, 4 (5), 336-343, 1998. 

 

McKnight RA, Burdon T, Pursel VG, Shamay A, Wall RJ, Hennighausen L. 

Cancer Treatment Res, 61: 399-412. 

 

MCLaughlin R, O¨Hanlon D, McHale T, Connolly CE, Given HF. Prognostic 

implications of p53 and bcl-2 expression in 108 women with stage two breast 

cancer. Ir J Sci Jan; 170 (1): 11-13, 2001. 

 

Meden H, Marx D, Hammadi H, et al. Immunohistochemical detected oncoprotein 

p185/NEU in ovarian cancer: a new prognostic factor? In Klapdor R (ed): Tumor 

associated antigens, oncogenes, receptors, cytokines in tumor diagnosis and therapy at 

the beginning of the nineties. Zuckschwerdt, München Bern Berlin, 431-432, 1992. 

 

Miele L, Cordella-Miele E, and Mukherjee AB. Uteroglobin: structure, 

molecular biology, and new perspectives on its function as a phospholipase A2 

inhibitor. Endocr. Rev., 8: 474-490, 1987. 

 

Miele L, Cordella-Miele E, Mantile E, Peri A, and Mukherjee AB. Uteroglobin 

and uteroglobin like proteins: the uteroglobin family of proteins. J. Endocrinol. 

Invest., 17: 679-692, 1994. 

 

Milde-Langosch K, Bamberger AM, Rieck G, Kelp B, Loning T. 

Overexpression of the p16 cell cycle inhibitor in breast cancer is associated with a 

more malignant phenotype. Breast Cancer Res Treat May; 67 (1). 61-70, 2001. 

 



  Bibliografía 

 143

Miyoshi Y, Iwao K, Ikeda N, Egawa C, Noguchi S. European Journal of Cancer 

36: 2375-2379, 2000. 

 

Mommers EC, Leonhart AM, Falix F, Michalides R, Meijer CJ, Baak JP, 

Diest PJ. Similarity in expression of cell cycle proteins between in situ and 

invasive ductal breast lesions of same differentiation grade. J Pathol Jul; 194 (3): 

327-333, 2001. 

 

Morris SF, O´Hanlon DM, McLaughlin R, McHale T, Connolly GE, Given 

HF. The prognostic significance of CD44s and CD44v6 expression in stage two 

breast carcinoma: an inmunohistochemical study. Eur J Surg Oncol Sep; 27 (6): 

527-31, 2001. 

 

Nielsen NH, Arnerlov C, Cajander S, Landberg G. Cyclin E expression and 

proliferation in breast cancer. Anal Cell Pathol; 17 (3): 177-188, 1998. 

 

Nielsen NH, Arnerlov C, Emdin SO, Landberg G. Cyclin E overespression, a 

negative prognostic factor in breast cancer with strong correlation to oestrogen 

receptor status. Br J Cancer Sep; 74 (6): 874-880, 1996. 

 

Nielsen NH, Emdin SO, Cajander J, Landberg G. Deregulation of cyclin E and 

D1 in breast cancer is associated with inactivation of the retinoblastoma protein. 

Oncogene Jan 23; 14 (3): 295-304, 1997. 

 

Nielsen NH, Ross G, Emdin SO, Landberg G. Methylation of the p16 (Ink4a) 

tumor suppressor gene 5´-CpG island in breast cancer. Cancer Lett  Feb 10; 163 

(1): 59-69, 2001. 

 

Nohara T, Ryo T, Iwamoto S, Gon G, Tanigawa N. Expression of cell- cycle 

regulator p27 is correlated to the prognosis and ER expression in breast carcinoma 

patients. 

 



  Bibliografía 

 144

Otto Zach, Hedwig Kasparu, Otto Krieger, Wolfgang Hehenwarter, Michael 

Girschikofsky, and Dieter Lutz. Detection of circulating mammary carcinoma 

cells in the peripheral blood of breast cancer patients via a nested reverse 

transcriptase polymerase chain reaction assay for mammaglobin mRNA. Journal of 

Clinical Oncology, Jun ;17 (7): 2015-2019, 1999. 

 

Pantel K, Cote RJ, Fodstad O. Detection and clinical importance of 

micrometastatic disease. J Natl Cancer Inst 91:1113-1124, 1999. 

 

Park K, Han S, Kim HY, Ko I. Cytologic evaluation of cyclin D1 expression in 

primary breast carcinoma. Cancer jun 25; 93 (3): 211-215, 2001. 

 

Parker M, Needham M, White R. Prostatic steroid binding protein: gene 

duplication and steroid binding. Nature, 298: 92-94, 1982. 

 

Parker MG, White R, Hurst H, Needham M, and Tilly R. Prostatic steroid-

binding protein. Isolation and characterization ov C3 genes. J. Biol. Chem., 258: 

12-15, 1983. 

 

Peri A, Cordella-Miele E, Miele L, and Mukherjee AB. Tissue-specific 

expression of the gene coding for human Clara cell 10 K-D protein, a phosphlipase 

A2-inhibitory protein. J. Clin. Invest., 92: 2099-2109, 1993. 

 

Pezeshki AM, Farjadian S, Talei A, Vasei M, Gharesi-Fard B, Doroudchi M, 

Ghaderi A. p53 gene alteration and protein expression in Iranian women with 

infiltrative ductal breast carcinoma. Cancer Lett Aug 10; 169 (1): 69-75, 2001. 

 

Porter PL, Malone KE, Heagerty PJ, Alexander GM, Gatti LA, Firpo EJ, 

Daling JR, Roberts JM. Expression of cell-cycle regulators p27kip1 and cyclin E, 

alone and in combination, correlate with survival in young breast cancer patients. 

Nat Med Feb; 3 (2): 222-225, 1997. 



  Bibliografía 

 145

Prall OW, Rogan EM, Sutherland RL. Estrogen regulation of cell cycle 

progression in breast cancer cells. J Steroid Biochem Mol Biol Apr; 65 (1-6): 169-

174, 1998. 

 

Radford DM, Fair KL, Phillips NJ, Ritter JH, Steinbrueck T, Holt MS, Donis-

Keller H. Allelotyping of ductal carcinoma in situ of the breast: deletion of loci on 

8p, 13q, 16q, 17p and 17q. Cancer Res 55 (15) 3399-3405, 1995. 

 

Rickles FR, Shoji M, Abe K. The role of hemostatic system in tumor growth, 

metastasis, and angiogenesis: tissue factor is a bifunctional molecule capable of 

inducing both fibrin deposition and angiogenesis in cancer. Int J Hematol Feb; 73 

(2): 145-150, 2001. 

 

Ringberg A, Anagnostaki L, Anderson H, Idvall I, Ferno M. Cell biological 

factors in ductal carcinoma in situ (DCIS) of the breast-relationship to ipsilateral 

local recurrence and histopathological characteristics. Eur J Cancer Aug; 37 (12): 

1514-1522, 2001. 

 

Rochaix P, Krajewxki S, Reed JC, Bonnet F, Voigt JJ, Brousset P. In vivo 

patterns of Bcl-2 family protein expression on breast carcinomas in relation to 

apoptosis. J Pathol Mar; 187 (4): 410-415, 1999. 

 

Sanchez Lockhart M, Hajos SE, Basilio FM, Mongini C, Alvarez E. Splice 

variant expression of CD44 in patients with breast and ovarian cancer. Oncol Rep 

Jan-Feb; 8 (1): 145-51, 2001. 

 

Sandmoller A, Halter R, Gomez-La-Hoz E, Grone HJ, Sske G, Paul D, and 

Beato M. The uteroglobin promoter targers expression of the SV40 T antigen to a 

variety of secretory epithelial cells in transgenic mice. Oncogene, 9: 2805-2815, 

1994.  

 



  Bibliografía 

 146

Sandmoller A, Halter R, Gomez-La-Hoz E, Grone HJ, Suske G, Paul D, Beato 

M. Oncogene, 9: 2805-2815. 

 

Sasano H, Frost AR, Saitoh R, Taniyama Y, Nagura H, Matsunaga G, 

Takehana K, Kimura M, Silverberg SG. Immunolocalization of cyclins D and E 

and cyclin dependent kinasa (cdK) 2 and 4 in human breast carcinoma. Anticancer 

Res Sep; 17 (5A): 3685-3690, 1997. 

 

Sasco AJ. Epidemiology of breast cancer: an environmental disease?. APMIS 

Suppl, (103): S80-91, 2001. 

 

Scheele F, Burger CW, Kenemans P. Postmenopausal hormone replacement in 

the woman with a reproductive risk factor for breast cancer. Maturitas Dec 15; 33 

(3): 191-6, 1999. 

 

Schneider J, Pollan M, Jimenez E, Marenbach K, Martinez N, Volm M, Marx 

D, Meden H. nm23-H1 expression defines a high-risk subpopulation of patients 

with early-stage epithelial ovarian carcinoma. Br. J Cancer May; 82 (10):1662-70. 

 

Schneider J, Pollan M, Ruibal A, Jimenez E, Lucas AR, Nunez MI, Sanchez J, 

Tejerina A. Histologic grade and CD44 are independent predictors of axillary 

limph node invasion in early (t1) breast cancer. Tumour Biol Nov-Dec; 20 (6): 

319-30, 1999. 

 

Schneider PM, Hung H-C, Chiocca SM, et al. Differential expression of the c-

erbB2 gene in human small cell and non-small cell lung cancer. Cancer Res, 49: 

4968-71, 1989. 

 

Schoenfeld A, Luqmani Y, Sinnett HD, Shousha S, Coombes RC. Keratin 19 

mRNA measurement to detect micrometastasis in lymph nodes in breast cancer 

patients. Br J Cancer; 76 (8): 1112-1113. 

 



  Bibliografía 

 147

Schorr K, Li M, Krajewski S, Reed JC, Furth PA. Bcl-2 gene family and related 

proteins in mamary gland involution and breast cancer. J Mammary Gland Biol 

Neoplasia Apr; 4 (2): 153-164, 1999. 

 

Schuchard M, Landers JP, Sandhu NP, Spelsberg TC. Steroid hormone 

regulation of nuclear proto-oncogenes. Endocr Rev  Dec; 14 (6): 659-69, 1993. 

 

Scott KA, Walker RA. Lack of cyclin E immunoreactivity in non-malignant 

breast anc association with proliferation in breast cancer. Br J cancer 76 (10): 

1288-1292, 1997. 

 

Serrano M, Gómez-Lahoz E, DePinho RA, Beach D, Bar-Sagi, D. Inhibition of 

ras-induced proliferation and cellular transformation by p16. Science, 267: 249-

252, 1993. 

 

Shao ZM, Wu J, Shen ZZ, Nguyen M. p53 mutation in plasma DNA and its 

prognostic value in breast cancer patients. Clin Cancer Res Aug; 7 (8): 2222-2227, 

2001. 

 

Sheen-Chen SM, Chen WJ, Eng HL, Sheen CC, Chou FF, Cheng YF. 

Evaluation of prognostic value of serum soluble CD44 in patients with breast 

cancer. Cancer Invest 17 (8): 581-5, 1999. 

 

Shen KL, Yang LS, Hsieh HF, Chen CJ, Yu JC, Tsai NM, Harn HJ. 

Microsatellite alterations on human chromosome 11 in situ and invasive breast 

cancer: a microdissection microsatellite analysis and correlation with p53, ER 

(estrogen receptor), and PR (progesterone receptor) protein immunoreactivity. J 

Surg Oncol Jun; 74 (2): 100-107, 2000. 

 

 

 

 



  Bibliografía 

 148

Shilkaitis A, Graves J, Mehta RR, Hu L, You M, Lubet R, Steele V, Kelloff G, 

Christov K. Bcl-2 and Bax are differentially expressed in hyperplastic, 

premalignant, and malignant lesions of mammary carcinogenesis. Cell Grow Differ 

Aug; 11 (8): 437-445, 2000. 

 

Siziopikou KP, Prioleau JE, Harris JR, Schnitt SJ. bcl-2 expression in the 

spectrum of preinvasive breast lesions. Cancer Feb 1; 77 (3): 199-506, 1996. 

 

Slamon DJ, Clark GM, Wong SC, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human 

breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER 2/neu 

oncogene. Science, 235: 177-182, 1987. 

 

Slamon DJ, Godolphin WJ, Holt LA, et al. Studies of the HER-2/neu 

protooncogene in human breast and ovarian cancer. Science, 244: 707-712, 1989. 

 

Spruck CH, Won KA, Reed SI. Deregulated cyclin E induces chromosome 

instability. Nature Sep 16; 401 (6750): 297-300, 1999. 

 

Stampfer MR, and Bartley JC. Metabolism of benzoapyrene by human 

mammary epithelial cells: toxicity and DNA adduct formation. Proc. Natl. Acad. 

Sci. USA, 82: 2394-2398, 1983. 

 

Steeg PS, Zhou Q. Cyclins and breast cancer. Breast Cancer Res Treat 52 (1-3): 

17-28, 1998. 

 

Struewing JP, Hartge P, Wacholder S, Baker SM, Berlin M, McAdams M, 

Timmerman MM, Brody LC, Tucker MA. The risk of cancer associated with 

specific mutations of BRCA1 and BRCA2 among Ashkenazi Jews. N Engl J Med 

1997; 336: 1409-1415. 

 



  Bibliografía 

 149

Sutherland RL, Prall OW, Watts CK, Musgrove EA. Estrogen and progestin 

regulation of cell cycle progression. J Mammary Gland Biol Neoplasia Jan; 3 (1): 

63-72, 1998. 

 

Tait L, Soule HD, and Russo J. Ultrastructural and immunocytochemical 

characterization of an immortalized human breast epithelial cell line. MCF-10. 

Cancer Res., 50: 6087-6094. 1990. 

 

Takashima T, Onoda N, Ishikawa T, Ogawa Y, Kato Y, Fujimoto Y, Sowa M. 

Proliferating cell nuclear antigen labeling index and p53 expression predict 

outcome for breast cancer patients with four or more lymph node metastases. Int J 

Mol Med Aug; 8 (2): 159-163, 2001. 

 

Tonin PN. Genes implicated in hereditary breast cancer syndromes. Semin Surg 

Oncol Jun; 18 (4): 281-286, 2000. 

 

Toonen RFG, Gowan S, Bingle CD. The lung enriched transcrption factor TTF-1 

and the ubiquitously expressed proteins Sp1 and Sp3 interact with elements located 

in the minimal promoter of the rat Clara cell secretory protein gene. Biochem. 

J.,316: 467-473 (1996). 

 

Umekita Y, Takasaki T, Yoshida H. Expression of p53 protein in benign 

epithelial hyperplasia, atypical ductal hyperplasia, non-invasive and invasive 

mammary carcinoma: an immunohistochemical study. Virchows Arch 424 (5): 

491-494, 1994. 

 

Umekita Y, Yoshida H. Cyclin D1 expression in ductal carcinoma in situ, atypical 

ductal hyperplasia and usual ductal hyperplasia: an immunohistochemical study. 

Pathol Int Jul; 50 (7): 527-530, 2000. 

 



  Bibliografía 

 150

Van Zee KJ, Calvano JE, Bisogna M. Hypomethylation and increased gene 

expression of p16INK4a in primary and metastatic breast carinoma as compared to 

normal breast tissue. Oncogene 1998 May 28; 16 (21): 2723-7. 

 

Vanlemmens L, HebbarM, Peyrat JP, Bonneterre J. Age as a prognostic factor 

in a breast cancer. Anticancer Res 1998 May-Jun; 18 (3B): 1891-96. 

Vashist A, Studd JWW.Molecular mechanismis of oestrogen-the gynaecologists´s 

viewpoint. Eur J Cancer, (36)(Suppl 4.) S14-S15, 2000. 

 

Vergote I, Bonneterre J, Thurlimann B, Robertson J, Krzakowski M, Mauriac 

L, Koralewski L, Webster A, Steinberg M, von Euler M. Randomised study of 

anastrozole versus tamoxifen as first-line therapy for advanced breast cancer in 

potmenopausal women. Eur J cancer Sep; 36 Suppl 4: S84-5, 2000 . 

 

Verheul HA, Coelingh-Bennink HJ, Kenemans P, Atsma WJ, Burger CW, 

Eden JA, Hammar M, Marsden J, Purdie DW. Effects of estrogens and 

hormone replacement therapy on breast cancer risk and on efficacy of breast cancer 

therapies. Manuritas Jul 31; 36 (1): 1-17, 2000. 

 

Volpi A, De paola F, Nanni O, Granato AM, Bajorko P, Becciolini A, Scarpi E, 

Riccobon A, Balzi M, Amadori D. Prognostic significance of biologic markers in 

node-negative breast cancer patients: a prospective study. Breast Cancer Res Treat 

Oct; 63(3): 181-92, 2000. 

 

Wang JC, Radford DM, Holt MS, Helms C, Goate A, Brandt W, Parik M, 

Phillips NJ, Deschryver K, Schuh ME, Fair KL, Ritter JH, Marshall P, Donis-

Keller H. Sequence-ready contig for the 1.4-cM ductal carcinoma in situ loss of 

heterozygosity region on chromosome 8p22-p23. Genomics 15;60(1):1-11, 1999. 

 

 

 

 



  Bibliografía 

 151

Watson M, Darrow C, Zimonjic D, Popescu N, Fleming T. Structure and 

transcriptional regulation of the human mammaglobin gene, a breast cancer 

associated member of the uteroglobin gene family localized to Chromosome 

11q13. Oncogene 16: 817-824, 1998. 

 

Watson MA, and Fleming, TP. Isolation of differentially expressed sequence tags 

from human breast cancer. Cancer Res, 54: 4598-4602, 1994. 

 

Watson MA, Dintzis S, Darrow C, Voss L, Dipersio J, Jensen R, Fleming T. 

Mammaglobin expression in primary, metastatic, and occult breast cancer. Cancer 

Research ,59: 3028-3031, 1999. 

 

Watson MA, Dintzis S, Darrow C, Voss L, Dipersio J, Jensen R, Fleming T. 

Mammaglobin expression in primary, metastatic, and occult breast cancer. Cancer 

Research ,59: 3028-3031, 1999. 

 

Watson MA, Dorrow C, Zimonjic D, Popescu N, Fleming T. Structure and 

transcriptional regulation of the human mammaglobin gene, a breast cancer 

associated member of the uteroglobin gene family localized to chromosome 11q13. 

Oncogene 16: 817-27, 1998. 

 

Watson MA, Dorrow C, Zimonjic D, Popescu N, Fleming T. Structure and 

transcriptional regulation of the human mammaglobin gene, a breast cancer 

associated member of the uteroglobin gene family localized to chromosome 11q13. 

Oncogene 16: 817-27, 1998. 



  Bibliografía 

 152

Watson MA, Fleming TP. Mammaglobin, a mammary-specific member of the 

uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer. Cancer Res 56: 

860-65, 1996. 

 

Watson MA, Fleming TP. Mammaglobin, a mammary-specific member of the 

uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer. Cancer Res 56: 

860-65, 1996. 

 

Weinberg RA. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell, 31: 323-

330, 1995. 

 

Wong IVY, Yeo W, Chan A, Johnson P. Quantitative correlation of cytokeratin 

19 mRNA level in peripheral blood with disease stage and metastasis in breast 

cancer patients: potential prognostic implications. International Journal of 

Oncology 18: 633-638, 2001. 

 

Wong SC, Chan JK, Lee KC, Hsiao WL. Differential expression of p16/p21/p27 

and cyclin D1/D3, and their relationships to cell proliferation, apoptosis, and 

tumour progression in invasive ductal carcinoma of the breast. 

 

Woodcock DM, Linsenmeyer ME, Doherty JP, Warren WD. DNA methylation 

in the promoter region of the p16 (CDKN2/MTS-1/INK4A) gene in human breast 

tumours. Br J Cancer Jan; 79 (2): 251-6, 1999. 

 

Yang Q, Sakurai T, Jing X, Utsunomiya H, Shan L, Nakamura Y, Nakamura 

M, Oura S, Suzuma T, Yoshimura G, Umemura T, Kokawa Y, Kakudo K. 

Expression of Bcl-2, but not bax, correlates with estrogen receptor status and tumor 

proliferetion in invasive breast carcinoma. Pathol Int Sep; 49 (9): 775-80, 1999. 
 

 

 



  Bibliografía 

 153

Zach O, Kasparu H, Krieger O, Hehenwarter W, Girschikofsky M, Lutz D. 

Detection of circulating mammary carcinoma cells in the peripheral blood of breast 

cancer patients via a nested reverse transcriptase polymerase chain reaction assay 

for mammaglobin Mrna. Journal of Clinical Oncology, Vol 17, 7: 2015-19, 1999. 

 

Zach O, Kasparu H, Krieger O, Hehenwarter W, Girschikofsky M, Lutz D. 

Detection of circulating mammary carcinoma cells in the peripheral blood of breast 

cancer patients via a nested reverse transcriptase polymerase chain reaction assay 

for mammaglobin Mrna. Journal of Clinical Oncology, Vol 17, 7: 2015-19, 1999. 

 

Zhang X. Progresses in radiology in China. Chung Hua I Hsueh Tsa Chih.;  76: 

938-9. 1996. 


	ÍNDICE
	ABREVIATURAS
	1. INTRODUCCIÓN
	1.1. ASPECTOS EPIDEMILÓGICOS
	1.2. FACTORES PRONÓSTICOS EN CÁNCER DE MAMA
	1.3. ALTERACIONES MOLECULARES EN EL CARCINOMA DE MAMA
	1.4. EVENTOS TEMPRANOS Y TARDÍOS EN EL DESARROLLO TUMORAL
	1.5. FACTORES PRONÓSTICOS MOLECULARES RELACIONADOS CON LA INVASIÓN Y METÁSTASIS
	1.6. MAMOGLOBINA HUMANA (h-MAM)

	2. OBJETIVOS
	3. MATERIALES Y MÉTODOS
	3.1 MUESTRAS TUMORALES
	3.2. INMUNOHISTOQUÍMICA
	3.3. CITOMETRÍA DE FLUJO
	3.4. EXTRACCIÓN DE RNA DE LAS MUESTRAS TUMORALES
	3.5. RT-PCR
	3.6 ESPECTROFOTOMETRÍA
	3.7 CUANTIFICACIÓN DEL GEL GEN h-MAM
	3.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

	4 RESULTADOS
	4.1 FACTORES PRONÓSTICOS

	4. DISCUSIÓN
	4.1 EXPRESIÓN DEL GEN h-MAM EN SANGE PERIFÉRICA
	4.2. RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN h-MAM CON OTROS

	6. CONCLUSIONES
	7. BIBLIOGRAFÍA