UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular CATABOLISMO DE LOS POLIHIDROXIALCANOATOS EN LA BACTERIA DEPREDADORA "BDELLOVIBRIO BACTERIOVORUS": APLIACIONES BIOTECNOLÓGICAS Y DISEÑO DE NUEVOS SISTEMAS PARA LA EXTRACCIÓN DE BIOPLÁSTICO EN CULTIVOS BACTERIANOS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Virginia Martínez López Bajo la dirección de la doctora María Auxiliadora Prieto Jiménez Madrid, 2013 © Virginia Martínez López, 2012 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR CATABOLISMO DE LOS DEPREDADORA BIOTECNOLÓGICAS Y DI EXTRACCIÓN DE BIOP MARÍA AUXILIADORA PRIETO JIMÉNEZ CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR LOS POLIHIDROXIALCANOATOS EN LA BACTERIA DEPREDADORA Bdellovibrio bacteriovorus: APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS Y DISEÑO DE NUEVOS SISTEMAS PARA EXTRACCIÓN DE BIOPLÁSTICO EN CULTIVOS BACTERIANOS TESIS DOCTORAL VIRGINIA MARTÍNEZ LÓPEZ DIRECTORA: MARÍA AUXILIADORA PRIETO JIMÉNEZ CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS Madrid, 2012 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID S EN LA BACTERIA : APLICACIONES NUEVOS SISTEMAS PARA LA BACTERIANOS CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Índice ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN 1 1. Bacterias depredadoras de bacterias 3 1.1. Bdellovibrio y organismos similares (BALOs) 5 1.1.1. Ciclo de vida depredador de Bdellovibrio bacteriovorus 7 1.1.2. Cepas independientes de presa 11 1.2. Potencial terapéutico y biotecnológico de las bacterias depredadoras 14 2. El papel del PHA en la fisiología microbiana 15 2.1. Características generales de los polihidroxialcanoatos (PHAs) 16 2.2. El ciclo del PHA: Síntesis y degradación de PHA 19 2.2.1. Síntesis de PHA 20 2.2.2. Degradación intracelular de PHA 23 2.2.3. Degradación extracelular de PHA 24 2.3. Función del PHA en la comunidad microbiana 27 3. Producción industrial de PHA 28 3.1. Aplicaciones de los PHAs 29 3.2. El proceso de producción de PHA 30 II. OBJETIVOS 33 III. RESULTADOS 37 1. Identificación y caracterización de una nueva despolimerasa de mcl-PHA como parte del arsenal hidrolítico del depredador B. bacteriovorus HD100 40 Índice 2. Mejora de la eficiencia biológica de B. bacteriovorus HD100 cuando preda sobre bacterias productoras de PHA 57 3. Autolisis celular controlada como sistema de procesamiento para la recuperación de mcl-PHA en Pseudomonas putida KT2440 85 IV. DISCUSIÓN INTEGRADORA 103 1. Importancia fisiológica de la degradación del PHA en B. bacteriovorus HD100 106 1.1. Producción de PhaZBd en el ciclo de vida depredador de B. bacteriovorus HD100 109 1.2. Influencia del contenido de PHA de la presa en la eficacia biológica de B. bacteriovorus HD100 110 2. Degradación periplásmica del PHA 113 3 Aplicaciones biotecnológicas: producción industrial de PHAs y de compuestos enantiopuros 118 3.1. Mejora de los sistemas de procesado de biomasa bacteriana para la producción industrial de PHA 119 3.2. Sistemas de producción de oligómeros y monómeros enantiopuros 123 V. CONCLUSIONES 126 VI. BIBLIOGRAFÍA 131 ANEXOS 157 1. The PHA Depolymerase Engineering Database: A systematic analysis tool for the diverse family of polyhydroxyalkanoate (PHA) depolymerases 159 2. Patente PCTES2010070858: Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la producción de polihidroxialcanoatos en P. putida KT2440 170 3. Patente 5120193/MAD: Procedimiento de fermentación para la producción de PHA y derivados que comprende la utilización de predadores bacterianos 175 Abreviaturas ABREVIATURAS ACS 1 acil-CoA sintetasa 1 ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico ARNm Ácido ribonucleico mensajero ATP Adenosín nucleósido trifosfato BALOs Bdellovibrio y organismos similares (Bdellovibrio and like organisms) CAT Ciclo de los ácidos tricarboxílicos CoA Coenzima A DED Base de datos de despolimerasas (PHA Depolymerase engineering database) EDTA Etilendiaminotetraacetato Ejh Holina del fago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae Ejl Enzima lítica del fago EJ-1 de S. pneumoniae GAPs Proteínas de unión a gránulo (granule associated proteins) GC Cromatografía de gases h Hora HI Independiente de presa (host independent) kb 1000 pares de bases kDa 1000 dalton LB Medio Lysogeny Broth mcl-PHA polihidroxialcanoato de cadena media (medium-chain length PHA) min Minuto NADP Fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido NADPH(+H+) Fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido reducido Abreviaturas ORF Open reading frame pb Pares de bases PHA Polihidroxialcanoato PhaC1 Polimerasa de PHA PhaZBd Despolimerasa de mcl-PHA de B. bacteriovorus HD100 PhaZGK13 Despolimerasa de mcl-PHA de Pseudomonas fluorescens GK13 PhaZKT Despolimerasa de mcl-PHA de Pseudomonas putida KT2442 PHB Polihidroxibutirato P(HO-co-HH) Poli-3-(hidroxioctanoato-co-hidroxihexanoato) RHA (R)-3-hidroxiácido RHA-CoA (R)-3-hidroxiacil-CoA scl-PHA Polihidroxialcanoato de cadena corta (short-chain length PHA) SDS Sodium dodecil sulfato I. INTRODUCCIÓN 1 Introducción 1. Bacterias depredadoras de bacterias La depredación es un tipo de interacción biológica en la que un individuo (el depredador) se alimenta de otro (la presa) para subsistir. Se trata de un tipo de relación interespecífica, es decir, que se da entre organismos de distintas especies, muy común en la naturaleza, incluyendo también el mundo microbiano. Dentro de este último, la depredación bacteriana es un modo de interacción según el cual un organismo depredador ataca y consume a una bacteria presa. Esta relación resulta interesante tanto desde un punto de vista ecológico como evolutivo, ya que las interacciones entre organismos han jugado un papel fundamental en la diversificación y organización de la vida (Thompson, 1999). Además, los microorganismos (bacterias y arqueas) están involucrados en todos los ciclos biogeoquímicos, por lo que el impacto de la depredación en la estructura y función de las comunidades bacterianas, su biodiversidad y la dinámica poblacional es de vital importancia (Jurgens, 2007; Jurkevitch y Davidov, 2007). Los principales grupos de depredadores de bacterias que se conocen son los metazoos, los protistas, las bacterias depredadoras y los bacteriófagos (Jurgens, 2007). En general, los dos primeros están formados por organismos eucariotas fagotróficos que engloban en su interior la bacteria presa, mientras que los dos segundos penetran y se multiplican en el interior de la misma. Las bacterias depredadoras de otras bacterias poseen una amplia distribución en la naturaleza, tanto en hábitats terrestres como acuáticos, incluyendo ambientes extremos (Pineiro et al., 2004) o anaerobios (Guerrero et al., 1986). Este tipo de bacterias muestran diferentes fenotipos y adaptaciones metabólicas, pudiendo ser depredadores obligados (incapaces de replicar en ausencia de presa) o facultativos (no dependientes de la presencia de una presa). Además, estas bacterias depredadoras utilizan diversas estrategias de depredación (Figura 1) (Martin, 2002), las cuales se pueden clasificar, en función de su interacción con la presa, de la siguiente manera: A) Depredación en grupo, llevada a cabo por depredadores facultativos, mediante la secreción de enzimas hidrolíticas al medio extracelular, degradando así las bacterias cercanas. A diferencia de los demás tipos de http://es.wikipedia.org/wiki/Interacci%C3%B3n_biol%C3%B3gica Introducción depredación, no requiere interacciones célula-célula. Ejemplos: Myxococcus y Lysobacter (Dworkin, 1999; Jurkevitch y Davidov, 2007). B) Depredación epibiótica, en la que el depredador permanece anclado a la pared de la célula presa, desde donde degrada sus componentes a medida que crece y se divide por fisión binaria. Ejemplos: depredadores obligados como Vampirococcus (Guerrero et al., 1986) y Micavibrio (Davidov et al., 2006). C) Invasión citoplásmica o diacitosis, en la que el depredador crece y se divide en el citoplasma de la presa. Este tipo de depredación ha sido únicamente descrito en Daptobacter, un depredador anaeróbico facultativo que crece sobre especies de Chromatium (Guerrero et al., 1986). D) Depredación periplásmica, en la que los depredadores invaden el espacio periplásmico de la presa, donde se establecen y degradan el contenido intracelular mientras crecen y se dividen. Esta estrategia de invasión periplásmica es característica del grupo de depredadores obligados denominado Bdellovibrio y organismos similares (BALOs, “Bdellovibrio and like organisms”), que constituye el grupo de bacterias depredadoras mejor estudiado hasta la fecha (Jurkevitch y Davidov, 2007). Figura 1. Estrategias de depredación de las bacterias depredadoras. A) Depredación en grupo. B) Depredación epibiótica. C) Invasión citoplásmica. D) Depredación periplásmica. Presa DepredadorA B DC Enzimas hidrolíticas Introducción A pesar de las evidentes diferencias entre los cuatro tipos de depredación descritos, los límites entre ellos son bastante difusos, ya que un mismo microorganismo puede compaginar más de una estrategia de depredación (Jurkevitch y Davidov, 2007). Además, algunas cepas de Bdellovibrio desarrollan una depredación de tipo epibiótica en vez de periplásmica, y se mantienen ancladas a la membrana externa de la presa mientras se dividen por fisión binaria, como por ejemplo Bdellovibrio sp. JSS (Koval y Hynes, 1991). Evolutivamente, se ha sugerido que la depredación entre bacterias está ligada a la simbiosis y al origen de la célula eucariota. La Teoría Endosimbiótica Seriada propuesta por Lynn Margulis hace más de cuatro décadas (Margulis, 1970) describe la aparición de las células eucariotas como consecuencia de la sucesiva incorporación estable de diferentes bacterias de vida libre. Una de las mayores críticas al origen de la mitocondria y los orgánulos eucariotas mediante procesos de simbiosis entre procariotas era la ausencia de mecanismos de incorporación de células, tipo fagocitosis, en estos últimos. Sin embargo, la localización periplásmica de Bdellovibrio o la citoplásmica de Daptobacter, indican el potencial bacteriano para penetrar en otras bacterias, proponiendo la depredación bacteriana como parte fundamental del proceso de la evolución de la célula eucariota (Guerrero et al., 1986; Davidov y Jurkevitch, 2009). 1.1. Bdellovibrio y organismos similares (BALOs) Los depredadores procariotas se conocen desde la década de los sesenta, cuando se descubrió y aisló por primera vez Bdellovibrio (Stolp y Starr, 1963). El grupo de los BALOs está formado por bacilos curvados Gram-negativos de pequeño tamaño, aeróbicos y altamente móviles, depredadores obligados de otras bacterias Gram negativas. Fueron aislados por primera vez a partir de muestras de suelo (Stolp y Starr, 1963) pero son ubicuos en la naturaleza, habiendo sido encontrados tanto en ambientes acuáticos como terrestres, incluyendo ambientes hipersalinos (Pineiro et al., 2004) y biofilms (Kadouri y O'Toole, 2005), así como en heces de mamíferos (Kelley et al., 1997; Schwudke et al., 2001). Hasta la fecha, las presas empleadas para aislar y Introducción caracterizar Bdellovibrio pertenecen exclusivamente al filo Proteobacteria, siendo principalmente Escherichia coli, Pseudomonas spp., y Erwinia spp. para hábitats terrestres y de agua dulce, y Vibrio parahaemolyticus para hábitats marinos (Jurkevitch y Davidov, 2007). Dependiendo de la cepa empleada como presa, la eficiencia de la depredación es diferente; de hecho, se ha determinado que en poblaciones de presas heterogéneas, Bdellovibrio infecta unas presas más eficientemente que otras (Rogosky et al., 2006). En la Tabla 1 se muestra un análisis del rango de presas de nuevos Bdellovibrios aislados de suelo y rizosfera, y de la cepa B. bacteriovorus 109J (Jurkevitch et al., 2000). La mayoría de los BALOS pertenecen a la clase de las delta proteobacterias, dentro del orden Bdellovibrionales, el cual comprende dos familias diferentes: Bdellovibrionaceae y Bacteriovoracaceae (Davidov y Jurkevitch, 2004). Una excepción es un miembro del grupo de los BALOs denominado Micavibrio spp., que ha sido clasificado como alfa proteobacteria (Davidov et al., 2006). Tabla 1. Rango de presa de las cepas de Bdellovibrio BEP2, BRP4, SRP1, TRA2 y 109J. Adaptada de (Jurkevitch et al., 2000). Presa BEP2 BRP4 SRP1 TRA2 109J Agrobacterium tumefaciens C58 – – – + – Agrobacterium tumefaciens IDI + + – – – Azospirillum brasilence – – – – – Bacillus megaterium – – – – – Chromobacterium violaceum + + + – + Enterobacter agglomerans + + – + + Erwinia amylovora + + – – – Erwinia carotova subsp. carotova 24 + + – – + Erwinia carotova subsp. carotova 2 – – – – – E. coli + + – – + Pseudomonas corrugata + + + – + Introducción Pseudomonas maltophilia – – – – + P. putida – – + – + Pseudomonas syringae pv. tomato + + + – + Rhizobium cicer – – + – + Rhizobium etli – – – + – Rhizobium tropici – – – + – Sinorhizobium melitoli Rm41 – – – + – Sinorhizobium melitoli AK 631 – – – + – Serratia marcescens – – – – + Vibrio fluvialis – – – – – Xanthomonas campestris pv. vesicatoria + + + – – 1.1.1. Ciclo de vida depredador de Bdellovibrio bacteriovorus Los BALOs presentan un ciclo de vida dimórfico, que alterna entre una fase extracelular móvil no reproductiva y una fase de crecimiento intraperiplásmica en el interior de otras bacterias Gram-negativas. Dentro de este grupo de bacterias depredadoras, la cepa B. bacteriovorus HD100 es el miembro mejor caracterizado así como el único del género Bdellovibrio en ser secuenciado (Rendulic et al., 2004). Debido a que esta Tesis Doctoral se centra en el estudio de B. bacteriovorus HD100, a continuación se describe de manera detallada el peculiar ciclo de vida de esta bacteria depredadora. El ciclo de vida predador de B. bacteriovorus en una típica célula presa consta de dos fases de crecimiento bien diferenciadas: una fase de vida móvil no reproductiva denominada fase de ataque, y una fase de crecimiento en la cual Bdellovibrio penetra en el periplasma de la bacteria presa donde crece, replica su ADN y se divide en células individuales. Finalmente, el proceso de multiplicación culmina con la lisis del huésped y la consecuente liberación los nuevos Bdellovibrios al medio extracelular para atacar futuras presas. Su ciclo de vida se detalla en la siguiente figura (Figura 2). Introducción A B Figura 2. Ciclo de vida de B. bacteriovorus HD100. A) Representación esquemática de las fases del ciclo de vida de Bdellovibrio en una típica célula presa: I) Localización de la presa: Bdellovibrio es impulsado hacia la célula mediante movilidad flagelar y quimiotaxis; II) Anclaje: Bdellovibrio colisiona con la célula huésped; III) Invasión: la movilidad flagelar desaparece según Bdellovibrio entra en el periplasma de su presa; IV) Establecimiento: la bacteria depredadora se estabiliza en el periplasma del huésped; V) Crecimiento en el bdelloplasto: la presa se va redondeando debido a la modificación de la pared celular y Bdellovibrio continúa creciendo en el periplasma y replica su ADN. VI) Septación: Bdellovibrio detecta que el citoplasma de la presa está exhausto, y se divide en células individuales. VII) Desarrollo: Bdellovibrio sintetiza el flagelo, que le permite nadar en el bdelloplasto. VIII) Lisis: la membrana celular de la presa se rompe y los nuevos Bdellovibrios se liberan para atacar futuras presas. El proceso completo de multiplicación de Bdellovibrio conlleva una media de 4 h. B) Micrografías electrónicas de las Bdellovibrio Pseudomonas II. Anclaje III. Invasión IV. Establecimiento V. Crecimiento en el bdelloplasto VI & VII. Septación y desarrollo VIII. Lisis I. Localización de la presa I II III IV Introducción fases del ciclo de vida de B. bacteriovorus HD100 empleando E. coli K12 como presa: I) Anclaje de las células de Bdellovibrio a la bacteria presa; II) Penetración en la presa; III) Bdelloplastos conteniendo Bdellovibrio creciendo en su interior; IV) Célula de Bdellovibrio liberada tras la lisis de la bacteria presa. Adaptado de (Strauch et al., 2007). Los Bdellovibrios en fase de ataque no se pueden replicar de manera autónoma, y para ello deben encontrar e infectar una célula huésped. En esta fase, la célula de Bdellovibrio es de pequeño tamaño (0,2 a 0,5 μm) y presenta un único flagelo polar envainado que rige el movimiento natatorio, permitiéndole alcanzar velocidades de unas 60 µm s–1 (Lambert et al., 2012). Cabe resaltar, que a pesar de su pequeño tamaño, B. bacteriovorus HD100 posee un genoma de 3,78 Mb, el cual codifica potencialmente 3.584 proteínas, y carece de plásmidos (Rendulic et al., 2004). En esta fase de ataque se desconoce qué tipo de señales pueden atraer a las células de Bdellovibrio hacia regiones con alta densidad de células presa. La ausencia de genes relacionados con el mecanismo de “quorum sensing” en el genoma de B. bacteriovorus HD100 (Rendulic et al., 2004), indica la falta de respuesta frente a la acumulación de moléculas señal generadas por poblaciones de la presa. Sin embargo, se ha sugerido la existencia de procesos de quimiotaxis frente a oxígeno y aminoácidos (Straley y Conti, 1974; LaMarre et al., 1977; Straley et al., 1979). Algunos autores han encontrado que la interrupción del gen codificante de una proteína quimiotáctica aceptora de metilo (MCP) en la cepa B. bacteriovorus 109J disminuye la eficiencia en la depredación (Lambert et al., 2003). Estas observaciones indican que Bdellovibrio puede dirigir su movimiento hacia regiones con alta densidad de células presa. El anclaje al huésped tiene lugar por el extremo no flagelado y es un proceso reversible, en el que la célula de Bdellovibrio es capaz de liberarse de nuevo. Sin embargo, tras un proceso de “reconocimiento” que lleva unos minutos, el anclaje se hace irreversible quedando firmemente unido a la célula huésped. Bdellovibrio provoca la formación de un pequeño poro en la membrana externa de la presa (Fenton et al., 2010) a través del cual penetra en el espacio periplásmico de la misma. La penetración en la célula presa requiere una gran acción enzimática por parte del depredador, el cual en un primer momento libera principalmente peptidasas y glicanasas encargadas de degradar el peptidoglicano (Thomashow y Rittenberg, 1978a; Introducción 1978b). Son numerosos los trabajos que demuestran la implicación de las fibras del pili del depredador en estos procesos de anclaje y penetración en la presa (Evans et al., 2007; Lambert et al., 2008; Mahmoud y Koval, 2010). Una vez dentro de la presa, la pared celular de la misma se deteriora debido a la actividad hidrolítica de Bdellovibrio, el cual se establece en el espacio periplásmico formando el bdelloplasto, una estructura esférica y osmóticamente estable limitada por la membrana externa de la presa. A partir de esta etapa, la fase de crecimiento del depredador se hace más evidente ya que la célula de Bdellovibrio se elonga formando una larga estructura espiral, y el ADN se replica múltiples veces. Aunque la membrana citoplásmica de la presa no es atravesada por el depredador, se hace porosa y permite el escape de constituyentes celulares. Bdellovibrio secreta nucleasas para hidrolizar el ADN (Matin y Rittenberg, 1972; Rosson y Rittenberg, 1979) y el ARN (Hespell y Odelson, 1978). Esta actividad hidrolítica permite al depredador crecer a partir de la presa con valores de YATP (rendimiento de masa celular, en gramos de peso seco, por mol de ATP) superiores al de la mayoría de bacterias. Esta eficiencia se debe en parte a la capacidad de Bdellovibrio para asimilar los nucleótidos de la presa conservando los enlaces fosfato ricos en energía (Rittenberg y Hespell, 1975). Bdellovibrio también es capaz de asimilar los ácidos grasos de la presa, incorporando algunos directamente a lípidos (Kuenen y Rittenberg, 1975). Carece de capacidad para catabolizar carbohidratos y presenta numerosas deficiencias en las rutas metabólicas de aminoácidos, pero es un organismo fuertemente proteolítico capaz de utilizar péptidos y aminoácidos de la presa como fuente de carbono y energía (Rendulic et al., 2004). En la etapa final del ciclo de crecimiento, la célula de Bdellovibrio se divide por fisión múltiple dando lugar a las células hijas, generalmente entre 5 y 8, dependiendo del tamaño celular del huésped (Kessel y Shilo, 1976). Por último, se sintetizan los flagelos de las células hijas y se lisan los restos de la pared celular de la presa, liberando de esta manera los nuevos Bdellovibrios en fase de ataque al medio ambiente en búsqueda de nuevas presas (Lambert et al., 2006b). A pesar de que el crecimiento de Bdellovibrio culmina con la lisis celular de la presa, cabe resaltar que una pequeña población residual de la misma siempre permanece intacta. Por el momento, no se ha encontrado ninguna mutación determinada que induzca el desarrollo de resistencias Introducción en la presa aunque sí se han descrito cambios fenotípicos que provocan una resistencia de tipo reversible a la depredación (Shemesh y Jurkevitch, 2004). En líneas generales, Bdellovibrio exhibe un metabolismo extremadamente eficaz, dependiente de la degradación programada y gradual de los contenidos de la presa. Como se ha detallado, emplea estrategias diversas para predar eficientemente, tales como quimiotaxis, movilidad, adhesión y un arsenal hidrolítico que utiliza en tres estados diferentes de su ciclo de vida: la entrada en la bacteria presa, la degradación de polímeros y componentes celulares, y la salida del bdelloplasto. Según ha revelado el análisis genómico de esta bacteria depredadora, además de numerosas enzimas hidrolíticas (20 genes codifican DNAasas, 9 RNAasas, 15 lipasas, 10 glucanasas, al menos 150 peptidasas y proteasas y 89 genes hidrolíticos más), posee múltiples copias de genes que codifican proteínas de la membrana externa, de los pili y del flagelo, además de gran cantidad de sistemas de transporte (empleados para transportar los sustratos desde el citoplasma de la presa a la célula de Bdellovibrio) y sistemas de secreción (exclusivamente de tipo I y II) (Rendulic et al., 2004). El estilo de vida único que muestra Bdellovibrio ha despertado el interés de la comunidad científica por su relevancia a la hora de desentrañar la fisiología y el metabolismo de las bacterias depredadoras, así como por el papel que ejercen en las comunidades bacterianas y en los procesos evolutivos. Asimismo, el estudio de esta bacteria depredadora resulta interesante debido a sus posibles aplicaciones terapéuticas (ver apartado 1.2. “Potencial biotecnológico de las bacterias depredadoras” de la Introducción). 1.1.2. Cepas independientes de presa A pesar de que los BALOs son depredadores obligados, en el laboratorio se pueden aislar cepas mutantes independientes de presa (cepas HI). La mayoría de las cepas HI son facultativas y mantienen la capacidad de invadir otras bacterias, aunque las placas de lisis resultantes son más turbias y de menor tamaño. Las cepas HI exhiben una amplia diversidad de fenotipos en cuanto a características morfológicas y fisiológicas (Figura 3). Curiosamente, el ciclo de vida de estos mutantes crecidos en ausencia de presa mantiene el patrón de crecimiento característico de los BALOs Introducción silvestres, con una fase de crecimiento filamentosa seguida de una división por fisión múltiple y diferenciación de las células hijas (Barel y Jurkevitch, 2001; Medina y Kadouri, 2009). Por todo ello, los mutantes HI resultan modelos atractivos para utilizar en el laboratorio y evitar así las complicaciones vinculadas a los co-cultivos de los BALOs silvestres con las correspondientes cepas presa. Figura 3. Crecimiento de B. bacteriovorus en el laboratorio. A) Crecimiento de la cepa silvestre de B. bacteriovorus HD100 sobre una superficie cubierta de células presa (P. putida KT2442) (esta Tesis). Las placas de lisis formadas son, en apariencia, semejantes a las producidas por una infección de bacteriófagos. B) Cepas mutantes de Bdellovibrio independientes de presa creciendo de manera axénica. En la imagen se aprecia la diferente morfología que presentan estas células HI. Adaptado de (Sockett, 2009). Cabe destacar el primer trabajo en el que se identificó la zona del genoma de Bdellovibrio involucrada en la transformación de cepas silvestres en cepas HI, y que los autores designaron locus hit (host-interaction) (Cotter y Thomashow, 1992b). En paralelo, estos mismo autores desarrollaron el primer protocolo de conjugación diseñado para transferir ADN de E. coli a Bdellovibrio (Cotter y Thomashow, 1992a). Mediante esta técnica, comprobaron que la complementación de los mutantes HI con el gen hit salvaje restauraba la capacidad de formar grandes placas de lisis (Cotter y Thomashow, 1992a). En función de la frecuencia de obtención de los mutantes HI, se clasifican en: (i) mutantes de tipo I: se obtienen sólo cuando el medio es suplementado con extractos celulares (crecimiento saprófito) y la frecuencia de aparición es elevada; A B Introducción y (ii) mutantes de tipo II: son capaces de crecer en medios ricos sin necesidad de extractos celulares (crecimiento axénico) y su frecuencia de aparición es menor (Thomashow y Cotter, 1992b). Sin embargo, análisis posteriores de mutantes HI han demostrado que algunos de ellos no presentan mutaciones en el gen hit (Barel y Jurkevitch, 2001; Medina et al., 2008). Por tanto, la mutacion del gen hit no es esencial, aunque muchas de las cepas HI aisladas tienden a adquirirla, quizás como un mecanismo para establecer un crecimiento en ausencia de presa más robusto. Por otro lado, la secuenciación del genoma de B. bacteriovorus HD100 ha localizado el gen hit formando parte del cluster génico responsable de la formación del pili tipo IV (crucial en los procesos de anclaje e invasión), aunque aún no se ha podido asignar ninguna función concreta a este locus (Rendulic et al., 2004; Schwudke et al., 2005). Muchas de las nuevas investigaciones actuales buscan resolver las incógnitas que plantea el proceso de la independencia de presa, el cual no se ha esclarecido completamente aún. En este sentido, se están llevando a cabo análisis transcripcionales comparativos entre cepas salvajes y cepas HI (Lambert et al., 2010) o la secuenciación de genomas de mutantes HI (Wurtzel et al., 2010; Roschanski et al., 2011). Por otro lado, las deficiencias metabólicas de los BALOs hacen suponer que en la naturaleza el crecimiento dependiente de presa sea más abundante que el axénico. La existencia de cepas HI en el medio ambiente parece ser ventajosa únicamente en el caso de que esta capacidad de crecer en ausencia de presa sea reversible, puesto que co-cultivos de Bdellovibrios silvestres y Bdellovibrios HI con bacterias presa conlleva siempre a la eliminación de las cepas HI (Varon y Shilo 1980; Strauch et al., 2007). El trabajo pionero de Cotter y Thomashow (1992a,b) permitió el desarrollo de nuevas técnicas para la manipulación genética de Bdellovibrio, tales como la construcción de mutantes knock out, mediante el uso de plásmidos suicidas incapaces de replicar en el depredador (plásmidos del grupo IncQ). Esta técnica de mutagénesis se ha empleado para identificar los genes implicados en la interacción depredador- presa, concluyendo, por ejemplo, que mutaciones que afectan a la movilidad, penetración o quimiotaxis de Bdellovibrio influyen en su interacción con la presa (Lambert et al., 2003; Lambert et al., 2006b; Medina et al., 2008; Tudor et al., 2008; Lambert et al., 2011). En la Tabla 2 figuran los principales plásmidos utilizados hasta la Introducción fecha para la generación de mutantes en Bdellovibrio. Estas técnicas junto con técnicas de proteómica (Dori-Bachash et al., 2008) y el análisis de genomas (Rendulic et al., 2004; Wurtzel et al., 2010) están permitiendo en la actualidad el estudio de Bdellovibrio a un nivel molecular. Tabla 2. Plásmidos empleados en la literatura para la manipulación genética de Bdellovibrio. Plásmido Origen de replicación Referencias pSET151 (6,2 kb) ori pMB1 Bierman et al., 1992; Lambert et al., 2003 pSSK10 (6,4 kb) ori R6K Steyert y Pineiro, 2007 pMMB206 (9,3 kb) ori RSF1010 Morales et al., 1991; Steyert y Pineiro, 2007 pRL27 (4 kb) ori R6K Larsen et al., 2002; Tudor et al., 2008 pSUP202 (7,8 kb) ori RSF1010 Roschanski y Strauch, 2010 pK18mobsacB (5,7 kb) ori ColE1 Schafer et al., 1994; Roschanski et al., 2011 1.2. Potencial terapéutico y biotecnológico de las bacterias depredadoras Bdellovibrio puede reducir poblaciones bacterianas rápidamente (incluyendo patógenos de humanos y animales), convirtiéndose así en un candidato interesante para potenciales aplicaciones terapéuticas; de hecho ha sido denominado “el antibiótico vivo” (Sockett y Lambert, 2004). A diferencia de los antibióticos, las cepas bacterianas encapsuladas y los biofilms no constituyen un obstáculo para el ataque de Bdellovibrio (Koval y Bayer, 1997; Kadouri y O'Toole, 2005). El uso de de este depredador para minimizar poblaciones microbianas se vislumbra como una técnica terapéutica factible ya que no invade células de mamíferos, y de hecho ha sido aislado de heces humanas, indicando su presencia en el intestino (Schwudke et al., 2001). En consecuencia, Bdellovibrio se propone como un potencial agente terapéutico Introducción antibiótico y probiótico (Sockett y Lambert, 2004; Dwidar et al., 2012). Recientemente, un estudio liderado por Elizabeth Sockett ha demostrado por primera vez la aplicación de Bdellovibrio como agente terapéutico en aves de corral infectadas por Salmonella enterica (Atterbury et al., 2011). Además de aplicaciones terapéuticas, otros trabajos han demostrado su posible utilidad en la industria alimentaria, reduciendo la contaminación bacteriana en las maquinarias empleadas (Fratamico y Cooke, 1996) o en la agricultura, como agentes de biocontrol (Scherff, 1973). Además, tal y como se ha indicado anteriormente, el análisis genómico de B. bacteriovorus HD100 ha revelado el complejo repertorio de enzimas hidrolíticas de esta bacteria (Rendulic et al., 2004). Bdellovibrio constituye, por tanto, un amplio reservorio de enzimas diferentes y de interés industrial por sus potenciales aplicaciones biotecnológicas (Jurkevitch y Davidov, 2007). En este sentido, unos de los objetivos de esta Tesis Doctoral ha sido la caracterización de una nueva despolimerasa de PHA en B. bacteriovorus HD100 de gran interés en el sector industrial. Además, el conocimiento derivado del estudio de esta despolimerasa a largo del ciclo de vida depredador de Bdellovibrio ha permitido el desarrollo de diversas estrategias novedosas para el uso de esta bacteria depredadora como herramienta biotecnológica en la producción industrial de PHAs y derivados enantiopuros. Sobre la base de estos objetivos, a continuación se describen de manera detallada los PHAs y su papel en la fisiología microbiana. 2. El papel del PHA en la fisiología microbiana Los PHAs constituyen una familia de poliésteres biodegradables y biocompatibles, sintetizados de forma natural por una gran variedad de microorganismos en condiciones de desequilibrio nutricional. Estos biopolímeros se acumulan en forma de gránulos de reserva y están compuestos de ácidos (R)-3- hidroxicarboxílicos (RHAs). En condiciones ambientales favorables, pueden ser degradados a los correspondientes monómeros u oligómeros, que son empleados como fuente de carbono y energía. Dependiendo del organismo, la producción de PHA Introducción puede alcanzar niveles de hasta el 90% del peso seco de la célula (revisado en Madison y Huisman, 1999; Jendrossek y Handrick, 2002; Luengo et al., 2003; Prieto et al., 2007). Además del interés derivado de su aplicación industrial como bioplásticos (ver apartado 4. “Producción industrial de PHA” de la Introducción), los PHAs han despertado interés debido a su importancia a la hora de dilucidar la fisiología celular y el metabolismo microbiano. La capacidad para sintetizar y/o catabolizar PHA se ha descrito en especies de los tres grandes dominios de la vida: arqueas, bacterias y eucariotas, incluyendo organismos metabólicamente muy diversos (p. ej., aerobios, anaeróbios, fotosintetizadores) y presentes en una gran variedad de nichos ecológicos, con diferentes formas de vida (p. ej., especies de vida libre, parásitos, simbiontes y comunidades microbianas) (Zinn et al., 2001; Luengo et al., 2003; Kadouri et al., 2005; Castro-Sowinski et al., 2010; Chen, 2010). También se han detectado genes relacionados con el PHA en depredadores como Bdellovibrio (Dori-Bachash et al., 2008), pero hasta esta Tesis Doctoral no se había estudiado su función en este tipo de bacterias. El hecho de que el metabolismo de los PHAs esté tan ampliamente distribuido en la naturaleza, unido al hecho de que los genes pha han estado sujetos a un proceso de transferencia horizontal entre distintos grupos filogenéticos, apoya la hipótesis de que la producción de PHA supone algún tipo de ventaja para los microorganismos que lo acumulan de manera natural (Kadouri et al., 2005; Kalia et al., 2007; Castro-Sowinski et al., 2010). 2.1. Características generales de los polihidroxialcanoatos (PHAs) Los PHAs son poliésteres lineales en los que la variabilidad reside en la longitud y naturaleza de la cadena lateral de cada monómero, así como en la proporción en que se encuentre cada tipo de monómero en el polímero final. Un esquema de la estructura general se muestra en la Figura 4. En función del número de carbonos que conformen la cadena lateral de los monómeros, los PHAs se clasifican en dos tipos principales: los PHAs de cadena corta (scl-PHA), compuestos por monómeros con 4 o 5 átomos de carbono, y los de cadena media (mcl-PHA), constituidos por monómeros con 6 a 14 átomos de carbono. Los diferentes PHAs identificados hasta la fecha son Introducción polímeros lineales compuestos de RHAs exclusivamente de la configuración R (Madison y Huisman, 1999). Además de la longitud, la naturaleza química de la cadena lateral también influye en las propiedades del poliéster. Hasta el momento, se han descrito una gran variedad de PHAs, con cadenas laterales lineales, ramificadas, saturadas, insaturadas, de tipo aromático, etc. (Figura 4) (Steinbüchel et al., 1992; Steinbüchel y Valentin, 1995). La presencia de grupos funcionales en la cadena lateral (p. ej., halogenados, carboxil, hidroxil, epoxi, fenoxi, cianofenoxi, nitrofenoxi, tiofenoxi, metiléster, etc.) abre nuevas expectativas a la síntesis de polímeros a la carta con nuevas propiedades estructurales y físico-químicas. Estos biopolímeros funcionalizados resultan excelentes candidatos para el desarrollo de una nueva generación de materiales dado que son susceptibles de sufrir modificaciones químicas posteriores a sus síntesis (Hazer y Steinbüchel, 2007; Rehm, 2010; Escapa et al., 2011). A su vez, los PHAs se clasifican de acuerdo con la naturaleza de sus unidades monoméricas; si el polímero está formado por solo un tipo de monómeros se denomina homopolímero, mientras que si está constituido por unidades monoméricas de distinta naturaleza se denomina heteropolímero o co-polímero (Madison y Huisman, 1999). Figura. 4. Representación esquemática de la estructura química de una subunidad de PHA y variabilidad de la cadena lateral. Según la longitud de la cadena lateral se puede distinguir entre PHA de cadena corta (scl-PHA) y PHA de cadena media (mcl-PHA). La longitud y naturaleza de las cadenas laterales del PHA así como su variabilidad monomérica varían en función del sustrato o mezcla de sustratos empleados en la fermentación. Tanto los scl-PHAs como los mcl-PHAs son polímeros termoplásticos y se comportan de forma similar a los plásticos derivados del petróleo. Sin embargo, scl-PHA mcl-PHA O O CH2 CH C nC1-C11 -Nitrofenoxi -Fenilo -Ciano -Fenoxi -Epoxi -Cianofenoxi Algunos grupos funcionales que pueden estar presentes en la cadena lateral: -Insaturaciones -Ramificaciones -Halogenaciones -Hidroxilo -Metiléster -Benzoilo -Carbonilo Introducción debido a su diferente composición monomérica, estos dos tipos de polímeros difieren en sus propiedades mecánicas y físico-químicas, tales como rigidez, fragilidad, cristalinidad, elasticidad, punto de fusión, temperatura de transición vítrea y resistencia a solventes orgánicos. En concreto, los scl-PHAs son polímeros rígidos y quebradizos, y poseen un alto grado de cristalinidad (Sudesh et al., 2000), mientras que los mcl-PHAs presentan temperaturas de fusión y de transición vítrea menores, una cristalinidad limitada y una gran flexibilidad (Huisman et al., 1991; Sudesh et al., 2000). Dentro de la bacteria, los PHAs se acumulan en forma de inclusiones citoplásmicas formando gránulos de naturaleza hidrofóbica, rodeados por una monocapa de fosfolípidos y por proteínas implicadas en el metabolismo del polímero denominadas GAPs (granule associated proteins) (Prieto et al., 2007). La Figura 5 detalla las GAPs caracterizadas hasta la fecha en Pseudomonas, un género ampliamente estudiado debido a su gran potencial biotecnológico en áreas como la producción de PHAs. Las principales GAPs de Pseudomonas son las polimerasas o sintasas del PHA, involucradas en la síntesis del polímero; las despolimerasas de PHA encargadas de la degradación intracelular del polímero; las fasinas, que son el componente principal de las GAPs y poseen un papel crucial en la segregación de los gránulos entre las células hijas durante la división celular, además de una función estructural y reguladora (Prieto et al., 1999; Moldes et al., 2004; Galán et al., 2011); y por último, la acil-CoA sintetasa 1 (ACS 1), encargada de activar los productos de la despolimerización del PHA en intermediarios CoA, convirtiéndolos de nuevo en sustratos de las polimerasas (ver apartado 2.2.1. “Síntesis de PHA” de la Introducción) (Ruth et al., 2008; de Eugenio et al., 2010a). El número y tamaño de los gránulos, así como su disposición y estructura macromolecular dependen del organismo productor y de las condiciones de producción (Madison y Huisman, 1999; Galán et al., 2011). Introducción Figura 5. El gránulo de PHA. A) Microfotografía al microscopio de contraste de fases de P. putida KT2442 acumulando gránulos de PHA, los cuales se ven como estructuras intracelulares refringentes. B) Microfotografía al microscopio electrónico de transmisión; los gránulos se observan como inclusiones citoplásmicas esféricas de tamaño variable. C) Representación esquemática del gránulo de PHA. El gránulo está compuesto por el polímero de PHA recubierto por una monocapa fosfolipídica (en gris en el esquema) en la que se integran proteínas de unión al gránulo o GAPs. Las principales GAPs son la polimerasa y la despolimerasa intracelular, las fasinas y la acil-CoA sintetasa 1. 2.2. El ciclo del PHA: síntesis y degradación de PHA Los trabajos relacionados con el estudio del metabolismo, la bioquímica y la fisiología de los PHAs han sido numerosos en las últimas décadas (de Eugenio et al., 2010a,b; Escapa et al., 2012b; Galán et al., 2011; Poblete-Castro et al., 2012). Se puede afirmar que las rutas metabólicas implicadas en el metabolismo de los PHAs son muy complejas y varían en función del origen filogenético y del nicho ecológico del microorganismo productor (Jendrossek y Handrick, 2002; Prieto et al., 2007; Castro- Sowinski et al., 2010). PHAPolimerasas de PHA (PhaC) Fasinas Despolimerasas de PHA (PhaZ) Acil-CoA sintetasa (ACS) A B C Introducción Actualmente, se ha establecido un nuevo modelo metabólico en P. putida KT2442 según el cual la síntesis y la degradación del PHA se producen de manera simultánea, y el flujo neto en una u otra dirección depende de las necesidades metabólicas globales de la célula. De esta manera, los procesos de síntesis y degradación intracelular de los PHAs (considerados a menudo como procesos independientes) se encuentran formando parte de un ciclo continuo (Ren et al., 2009; de Eugenio et al., 2010a). Las tres enzimas clave en el ciclo del PHA en P. putida KT2442 son la polimerasa, encargada de sintetizar el polímero utilizando 3-hidroxiacil- CoAs (RHA-CoAs), la despolimerasa intracellular, que libera los monómeros que forman el polímero (RHAs) y la acil-CoA sintetasa 1, que activa los RHAs liberados en la despolimerización a RHA-CoAs, susceptibles de ser reincorporados a la síntesis de polímero (Ruth et al., 2008; Ren et al., 2009; de Eugenio et al., 2010a). La acción coordinada de estas actividades enzimáticas da lugar al ciclo del PHA, que actúa como un ciclo metabólico amortiguador capaz de canalizar el flujo de carbono y energía dentro de la célula en respuesta a cambios ambientales (Escapa et al., 2012b). Estos trabajos ponen de manifiesto que el PHA no es un mero reservorio de fuente de carbono y energía, sino que juega un papel crucial en el mantenimiento del balance celular del carbono y la energía en las bacterias que lo producen. 2.2.1. Síntesis de PHA Las rutas de biosíntesis de los PHAs difieren en función del microorganismo estudiado, dando lugar a la acumulación de polímeros de tipo scl-PHA o mcl-PHA. En ambos casos, las polimerasas de PHA ensamblan los monómeros solubles para sintetizar el polímero insoluble, con la correspondiente liberación de una molécula de CoA (Rehm, 2003; Stubbe et al., 2005). El scl-PHA más abundante en bacterias y más estudiado hasta la fecha es el poli-(3-hidroxibutirato) (PHB), cuya ruta específica de síntesis ha sido ampliamente investigada en la cepa bacteriana Ralstonia eutropha H16, recientemente reclasificada como Cupriavidus necator H16 (Poehlein et al., 2011). Este polímero se sintetiza a partir de acetil-CoA en una serie de tres reacciones consecutivas. Como se muestra en Introducción la Figura 6, en primer lugar se acoplan dos moléculas de acetil-CoA, generando acetoacetil-CoA en una reacción de condensación catalizada por una β-cetoacil-CoA tiolasa (PhbA). A continuación, el acetoacetil-CoA generado es reducido estereoselectivamente dando (R)-3-hidroxibutiril-CoA en una reacción catalizada por la acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NADPH (PhbB). Finalmente, los monómeros de (R)-3-hidroxibutiril-CoA son polimerizados por la acción de una polimerasa de PHB (PhbC) (Peoples y Sinskey, 1989; Madison y Huisman, 1999). Figura 6. Esquema de la ruta de biosíntesis de PHB en R. eutropha. El PHB es sintetizado a partir del acetil-CoA en 3 pasos sucesivos gracias a la acción de una β-cetoacil-CoA tiolasa (PhbA), una acetoacetil- CoA deshidrogenasa (PhbB) y una polimerasa de PHB (PhbC). En el caso del mcl-PHA, el sustrato de las polimerasas son los RHA-CoAs (Kraak et al., 1997; de Roo et al., 2000). En las especies del género Pseudomonas estos monómeros se pueden obtener a partir de las rutas de la β-oxidación y síntesis de novo de ácidos grasos (Lageveen et al., 1988; Huijberts et al., 1992) (Figura 7). Además, se ha comprobado que los monómeros que forman el polímero presentan cadenas laterales de igual longitud que el ácido graso empleado como sustrato o acortadas en un número par de átomos de carbono (Lageveen et al., 1988; Durner et al., 2001). Esta correlación estructural sugiere que los ácidos grasos pueden incorporarse al PHA directamente a través de intermediarios de la β-oxidación sin necesidad de ser completamente oxidados a acetil-CoA. Por lo tanto, en estos microorganismos la ruta de síntesis de PHA es una rama de la β-oxidación, y la PHA polimerasa debe competir por sus sustratos con las enzimas del catabolismo de los ácidos grasos. De hecho, en distintas cepas de P. putida se ha observado que la producción de PHA se incrementa notablemente en mutantes defectivos en la β-oxidación, presumiblemente al haber más sustratos disponibles para las polimerasas de PHA (Olivera et al., 2001a; Olivera et al., 2001b; Prieto et al., 2007; Liu et al., 2011; Escapa et al., 2012a). PHB (scl-PHA) Acetoacetil-CoA (R)-3-hidroxibutiril-CoA NADPH + H NADP PhbBPhbA PhbC CoA+ Acetil-CoA Introducción Figura 7. Esquema de las rutas del metabolismo central del carbono interconectadas con el ciclo del PHA en P. putida. Las rutas centrales del metabolismo del carbono convergen en el intermediario central RHA-CoA, clave en la síntesis de PHA. El ciclo del PHA es un proceso continuo de síntesis y degradación del polímero en el que la acil-CoA sintetasa 1 activa los monómeros que resultan de la despolimerización en intermediarios CoA (RHA-CoA), que son sustratos para la propia polimerasa o para las enzimas del metabolismo de ácidos grasos (β-oxidación y síntesis de novo). La síntesis de PHA también se puede producir a partir de carbohidratos. En este caso, la síntesis del polímero está relacionada con la síntesis de novo de ácidos grasos, ya que los carbohidratos son metabolizados por las rutas centrales del catabolismo para dar acetil-CoA, el cual es empleado como sustrato principal en la ruta biosintética de los ácidos grasos. En Pseudomonas, cuando la fuente de carbono empleada para el crecimiento y producción de PHA no es un ácido graso, y por lo tanto su naturaleza no está químicamente relacionada con los RHA-CoAs, la composición final del poliéster es independiente de la fuente de carbono empleada y el polímero está compuesto mayoritariamente por monómeros de tipo 3-hidroxidecanoato (Haywood et al., 1990; Timm y Steinbüchel, 1990; Escapa et al., 2012a). Biomasa (R)-3-hidroxiacil-CoA Ácido (R)-3-hidroxicarboxílico Ciclo del PHA ACS PhaC PhaZ PHA CoA AMP + PPi ATP Síntesis de novo de ácidos grasos Ácidos grasos β-oxidación Carbohidratos Ciclo de los Ácidos Tricarboxílicos Entner-Doudoroff Gluconeogénesis Acetil-CoA Introducción 2.2.2. Degradación intracelular de PHA En condiciones de limitación de carbono, el PHA acumulado por la célula puede ser hidrolizado y empleado como fuente de carbono y energía (Prieto et al., 2007). La hidrólisis del polímero en estas condiciones está catalizada por enzimas intracelulares con actividad despolimerasa, que permanecen asociadas al gránulo de PHA (Figura 5) (Steinbüchel y Valentin, 1995; Foster et al., 1996; Jendrossek y Handrick, 2002; de Eugenio et al., 2007; de Eugenio, 2009). La degradación intracelular de PHA es un proceso escasamente estudiado a pesar de la importancia que tiene en la adaptación y supervivencia en ausencia de otras fuentes de carbono/energía (ver apartado 3. “Función del PHA en la comunidad microbiana” de la Introducción) (Tal y Okon, 1985; Okon y Itzigsohn, 1992; Kadouri et al., 2005). Este tipo de degradación ha sido estudiado en dos microorganismos productores de scl-PHA: Rhodospirillum rubrum, donde se describió por primera vez la degradación intracelular de scl-PHA (Merrick y Doudoroff, 1964) y R. eutropha H16, capaz de llevar a cabo hasta dos ciclos de división celular a partir del PHA previamente acumulado (Handrick et al., 2000). La despolimerización intracelular de mcl-PHA se ha descrito únicamente en la especie P. putida, concretamente en las estirpes GPo1 (Huisman et al., 1991; Ren et al., 2005) y KT2442 (de Eugenio et al., 2007; de Eugenio et al., 2010a). La única despolimerasa intracelular de mcl-PHA caracterizada hasta la fecha es la de P. putida KT2442 (PhaZKT) (de Eugenio et al., 2007; 2008). PhaZKT se localiza asociada a los gránulos de PHA, y es la única enzima responsable de la movilización intracelular del polímero (de Eugenio et al., 2007). El gen que codifica la despolimerasa PhaZKT se localiza dentro del cluster de genes responsable de la síntesis de mcl-PHA de P. putida KT2442, concretamente entre las dos polimerasas, responsables de la síntesis del polímero, PhaC1 y PhaC2 (Figura 8). Además, el cluster está compuesto por el gen phaD, que codifica un regulador transcripcional de la familia TetR, y los genes phaI y phaF, que codifican las fasinas (Figura 8). Recientemente, nuestro grupo ha descrito la regulación específica mediada por phaD que dirige la expresión de los genes del cluster pha en P. putida KT2442 (de Eugenio et al., 2010b). Introducción Figura 8. Esquema de la organización de los genes que codifican las principales enzimas involucradas en el ciclo del PHA. Los genes phaC1 y phaC2 codifican dos polimerasas y están separados por el gen phaZ que codifica la despolimerasa intracelular. El gen phaD codifica un regulador transcripcional y los genes phaF y phaI, que codifican dos fasinas y se transcriben en dirección opuesta. 2.2.3. Degradación extracelular de PHA La degradación de PHA por bacterias también puede llevarse a cabo mediante un proceso de hidrólisis que tiene lugar en el exterior celular (Jendrossek y Handrick, 2002). Este tipo de degradación del PHA tiene por objeto utilizar un polímero exógeno empleandolo como fuente de energía y carbono. En una comunidad microbiana, el polímero proviene de la lisis celular de otros microorganismos productores, cuyos gránulos de PHA son entonces liberados al entorno. La hidrólisis extracelular de PHA tiene lugar mediante despolimerasas extracelulares específicas que son secretadas al medio, donde hidrolizan el PHA hasta productos solubles que son finalmente incorporados por la célula (Figura 9). Dependiendo de la despolimerasa empleada, los productos de hidrólisis pueden ser monómeros, una mezcla de monómeros y dímeros o de oligómeros. Finalmente, los productos de la hidrólisis del PHA son metabolizados por la célula generando energía y/o biomasa. Al contrario que ocurre con las despolimerasas intracelulares, numerosos estudios han descrito la purificación y/o caracterización de despolimerasas extracelulares de PHA (Jendrossek y Handrick, 2002). Estas despolimerasas extracelulares tienen características bioquímicas, estructurales y funcionales diferentes de las despolimerasas intracelulares (de Eugenio et al., 2007; 2008). En parte, esto es debido a la distinta conformación estructural del sustrato, es decir, del PHA dentro y fuera de la célula. Según los estudios realizados en scl-PHA, el polímero se encuentran en estado amorfo dentro de la célula y no existe una disposición ordenada de las cadenas (Jendrossek y Handrick, 2002). El PHA en este estado se denomina PHA nativo y como se ha explicado anteriormente, los gránulos están phaC1 phaZ phaC2 phaD phaIphaF Introducción cubiertos por una capa de fosfolípidos y proteínas. No obstante, tras ser extraído de la célula, la capa de proteínas y fosfolípidos se daña o se pierde, y el scl-PHA tiende a cristalizar, con las cadenas de polímero dispuestas de forma ordenada. El poliéster en este estado tiende a adoptar una estructura parcialmente cristalina, en la que zonas cristalinas coexisten con otras amorfas, y se denomina PHA desnaturalizado (Jendrossek y Handrick, 2002). Las regiones cristalinas del polímero son responsables de su resistencia mecánica, mientras que las amorfas lo son de su flexibilidad y elasticidad. El nivel de cristalización depende de la estructura química y por tanto es diferente en scl-PHA y mcl-PHA. Aunque ambos son muy similares en su estructura química, el mcl-PHA es esencialmente amorfo incluso cuando se extrae del interior celular, probablemente debido a la secuencia aleatoria de unidades presente en la macromolécula, ya que se trata de un heteropolímero (Abraham et al., 2001). Figura 9. Tipos de degradación de PHA. La degradación intracelular se lleva a cabo por despolimerasas intracelulares de las bacterias productoras del PHA. La degradación extracelular se lleva a cabo por despolimerasas extracelulares que son secretadas por otros microorganismos al medio, donde degradan el PHA proveniente de la lisis de los organismos productores. Degradación extracelular del PHA Muerte y lisis celular Cepa productora de PHA Gránulos de PHA nativos PHA como fuente de carbono y energía Gránulos de PHA desnaturalizados PHA liberado Degradación intracelular del PHA Introducción Como ya se ha comentado, las despolimerasas de PHA se clasifican en función del tipo de degradación que catalizan (intra o extracelulares) y del sustrato de la reacción (scl-PHA o mcl-PHA). Cabe resaltar que de forma paralela al desarrollo de esta Tesis Doctoral, se ha construido una base de datos de despolimerasas de PHA (DED) (http://www.ded.uni-stuttgart) en la Universidad de Stuttgart en colaboración con nuestro grupo (Knoll et al., 2009) (Anexo 1). Esta base de datos constituye una herramienta útil para identificar in silico nuevas despolimerasas de PHA, clasificarlas, o predecir sus características bioquímicas, y diseñar así variantes con propiedades mejoradas. Está constituída por casi 600 secuencias de posibles despolimerasas de PHA, clasificadas en ocho superfamilias en función de la similitud en secuencia. En este estudio, se ha verificado que la capacidad para degradar scl-PHA está ampliamente distribuida entre las bacterias, mientras que las despolimerasas de mcl-PHA son menos frecuentes, encontrando tan solo tres especies del género Pseudomonas (Knoll et al., 2009) (Anexo 1). La gran similitud entre las secuencias de aminoácidos de estas despolimerasas, así como las características comunes que muestran, sugiere la posibilidad de que haya existido transferencia horizontal de genes que codifican despolimerasas de mcl-PHA entre estas cepas bacterianas (Kim et al., 2007). La única despolimerasa extracelular de mcl-PHA clonada y caracterizada al inicio de esta Tesis Doctoral es la despolimerasa de P. fluorescens GK13 (PhaZGK13) (Schirmer et al., 1993; Schirmer y Jendrossek, 1994; Gangoiti et al., 2010). Por todo ello, resulta interesante el estudio de nuevas despolimerasas de mcl-PHA procedentes de géneros diferentes a Pseudomonas. En este sentido, uno de los objetivos de esta Tesis Doctoral es caracterizar una nueva despolimerasa de mcl-PHA identificada en la bacteria depredadora B. bacteriovorus HD100. Muy recientemente, se han caracterizado nuevas despolimerasas de mcl-PHA en S. venezuelae SO1 (Santos et al., 2012), S. roseolus SL3 (Gangoiti et al., 2012) y en la bacteria termófila Thermus thermophilus HB8 (Papaneophytou et al., 2011). Esta última también comparte la mayor parte de las características comunes entre las despolimerasas anteriormente citadas, con la salvedad de que al proceder de una bacteria termofílica, presenta una temperatura óptima de actividad significativamente más elevada (70ºC) (Papaneophytou et al., 2011). http://www.ded.uni-stuttgart/ Introducción 2.3. Función del PHA en la comunidad microbiana Como se ha comentado anteriormente, una gran variedad de microorganismos de diferentes nichos ecológicos acumulan gránulos de PHA en determinadas condiciones. Las principales implicaciones que el metabolismo del PHA tiene sobre la eficacia biológica (fitness) de estos microorganismos se resumen en la Figura 10 (Castro-Sowinski et al., 2010). Clásicamente los PHAs se han definido como biopolímeros de reserva de fuente de carbono y energía, movilizables ante cambios medioambientales. Sin embargo, las funciones del PHA van más allá de ser una mera reserva y se han relacionado con la adaptación y supervivencia en nichos ecológicos muy competitivos en los que las condiciones nutricionales son altamente cambiantes, como suelos y rizosfera (Tal y Okon, 1985; Okon y Itzigsohn, 1992; Kadouri et al., 2005). La capacidad de acumular PHA ha sido relacionada también con la resistencia a diferentes tipos de estrés ambiental: incluyendo frío y calor, radiaciones UV, desecación, presión osmótica, y diferentes solventes y compuestos químicos (Dawes y Senior, 1973; Matin et al., 1979; Tal y Okon, 1985; Ruiz et al., 2001; Kadouri et al., 2003; Ruiz et al., 2004). Figura 10. Esquema de las principales implicaciones del metabolismo de PHA en la fisiología de las bacterias. Reserva de fuente de carbono y energía Tolerancia a diferentes tipos de estrés Adaptación/Supervivenciaen diferentes nichos ecológicos Control de la formación/germinación de esporas y quistes Establecimiento de comunidades microbianas Establecimiento/Mantenimiento en simbiosis planta-microorganismo Control del tamaño/morfología celular Control de la biomasa/número individuos de la población PHA Introducción Además, se ha señalado que el PHA podría mediar en las señales que desencadenan, tanto la formación y germinación de esporas, como la producción de quistes en diferentes especies (Emeruwa y Hawirko, 1973; Segura et al., 2003; Valappil et al., 2007). El metabolismo del PHA se ha relacionado a su vez con las interacciones entre microorganismos que tienen lugar en la formación de biofilms y tapetes microbianos (Rothermich et al., 2000; Pham et al., 2004; Villanueva et al., 2007; Campisano et al., 2008), así como en las relaciones de tipo simbionte que se establecen entre plantas y microorganismos de la rizosfera (Tal y Okon, 1985; Povolo et al., 1994; Cevallos et al., 1996; Lodwig et al., 2005; Wang et al., 2007b). Por último, se ha demonstrado recientemente que la producción de PHA condiciona la morfología celular al controlar la distribución de la biomasa en función del número y tamaño de las células (de Eugenio et al., 2010a; Escapa et al., 2012b). En este contexto, unos de los objetivos de esta Tesis Doctoral es estudiar las implicaciones de la degradación del PHA en la fisiología de una bacteria depredadora como Bdellovibrio. 3. Producción industrial de PHA El desarrollo de la biotecnología ha posibilitado, entre otras numerosas aplicaciones, la búsqueda de soluciones a uno de los problemas más importantes de la industria actual generado por el uso masivo de los plásticos derivados del petróleo o polímeros sintéticos producidos mediante procesos no sostenibles, difíciles de eliminar del medio ambiente debido a su gran estabilidad y baja tasa de degradabilidad. A pesar de ello, su producción mundial en el año 2011 alcanzó los 280 millones de toneladas, ya que son la base de muchos productos de alto consumo en la sociedad moderna. Como consecuencia del problema de contaminación medioambiental y del incremento del precio del crudo, la generación de bioplásticos constituye una alternativa real y viable al empleo de polímeros sintéticos (Luengo, et al., 2003; Gavrilescu y Chisti, 2005; Chen, 2009). Los PHAs son biopolímeros termoplásticos y desde el punto de vista mecánico se comportan de forma similar a los plásticos convencionales, con la ventaja frente a éstos de ser de origen renovable, biodegradables y biocompatibles, y por ello poseen Introducción gran interés industrial debido a su posible aplicación como bioplásticos (ver apartado 3.1. “Aplicaciones de los PHAs” de la Introducción). En comparación con otros bioplásticos disponibles en el mercado, es importante destacar las siguientes características diferenciales de los PHAs: (i) es posible generar más de 150 monómeros diferentes de PHA, por lo que las propiedades de estos plásticos pueden modificarse en función de la aplicación; (ii) son completamente biodegradables; (iii) la polimerización ocurre durante la fermentación, en un único proceso, de forma que las materias primas son transformadas en un solo paso; (iv) su producción es completamente sostenible, puesto que las fuentes de carbono empleadas son de origen renovable (Steinbüchel y Valentin, 1995; Prieto et al., 2007; Chen, 2010). Además, como ya se ha comentado anteriormente, existe la posibilidad de incrementar el valor de estos polímeros por funcionalización, y producir así polímeros novedosos con propiedades inusuales y que no se pueden obtener por síntesis química (Hazer y Steinbüchel, 2007; Rehm, 2010; Escapa et al., 2011). Por estas razones, los PHAs constituyen excelentes candidatos para sustituir a los polímeros sintéticos. La implantación de este tipo de biopolímeros en el mercado de forma competitiva exige una reducción de los costes de producción, debido al bajo coste que aún mantiene la síntesis de los polímeros plásticos derivados del petróleo (Luengo et al., 2003; Prieto et al., 2007). En este sentido, uno de los principales objetivos de esta Tesis Doctoral es el diseño y desarrollo de sistemas de producción de PHAs que disminuyan el coste final del proceso de producción del bioplástico, favoreciendo así su explotación a escala comercial. 3.1. Aplicaciones de los PHAs Las aplicaciones de los PHAs, y de sus derivados, están ampliamente documentadas a nivel industrial, médico, farmacéutico, agrícola y medioambiental (Philip et al., 2007; Chen, 2009; Gao et al., 2011; Rai et al., 2011). El interés de estos polímeros radica fundamentalmente en su posible aplicación como biomateriales, bien en la industria del plástico (como alternativa a los plásticos de la industria petroquímica) o en la biomedicina (en la generación de materiales de sutura, Introducción implantes o sistemas de liberación de fármacos) (Zinn et al., 2001; Prieto et al., 2007; Chen, 2009). Además del uso de los PHAs como biomateriales, estos polímeros son una fuente potencial de intermediarios quirales dada la naturaleza enantiopura de los monómeros de RHA que los constituyen. Estos compuestos quirales son de gran utilidad como precursores de productos de alto valor añadido en la industria farmacéutica y son difíciles de conseguir en estado puro mediante procesos químicos (Chen y Wu, 2005; Ren et al., 2005, de Eugenio et al., 2010a). De esta manera, los avances en el conocimiento de la biodegradación del polímero y de las despolimerasas de PHA son importantes por sus posibles aplicaciones biotecnológicas, tanto a nivel de eliminación de residuos derivados del uso del polímero, como en la producción de compuestos quirales. Por ello, la caracterización de una nueva despolimerasa de PHA es uno de los objetivos fundamentales de esta Tesis. 3.2. El proceso de producción de PHA Debido a que uno de los objetivos principales de esta Tesis Doctoral es el desarrollo de sistemas para la extracción y recuperación del mcl-PHA producido mediante fermentación bacteriana, a continuación se describen las principales etapas para la producción industrial de PHA. El coste total del proceso depende de varios factores tales como la fuente de carbono, el proceso de fermentación en sí mismo y el proceso de recuperación del polímero (Figura 11). Específicamente, se ha descrito que cada uno de estos factores supone un 30% del coste total de la producción de PHA (Sun et al., 2007; Elbahloul y Steinbüchel, 2009). La producción industrial de PHA aún mantiene un alto coste de producción en comparación con los plásticos convencionales. En este sentido, diferentes investigaciones han abordado el abaratamiento de los costes totales en la producción de PHA a través de diversas aproximaciones, tales como el aprovechamiento de subproductos industriales o el empleo de fuentes de carbono más baratas (Braunegg et al., 1998; Koller et al., 2010; Gómez et al., 2012; Escapa et al., 2012a), la mejora de los ratios de crecimiento y producción de PHA (Chen, 2010; Follonier et al., 2012) o el desarrollo de sistemas alternativos de recuperación y purificación del polímero Introducción Figura 11. Esquema de la producción microbiana de PHA a escala industrial. Las fases principales del proceso de producción de PHA son la selección de las materias primas, la fermentación bacteriana, y la recuperación, purificación y caracterización del polímero resultante. (Jacquel et al., 2008; Kunasundari y Sudesh, 2011). Con respecto a estos últimos, se han descrito una gran variedad de técnicas de rotura celular, que incluyen métodos de disrupción mecánica, química o enzimática. La principal desventaja de estos métodos es que en su mayoría requieren el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos, cócteles enzimáticos o detergentes, que además de ser contaminantes encarecen el proceso de producción (Jacquel et al., 2008; Elbahloul y Steinbüchel, 2009). Por estas razones, el diseño de sistemas que faciliten la extracción del PHA bacteriano de forma competitiva y ecológica es la clave para que disminuya de forma radical el coste final del producto y para que estos procesos sean competitivos, si bien requiere de un importante esfuerzo en el desarrollo y la optimización de cada una de las etapas. FERMENTACIÓN RECUPERACIÓN PURIFICACIÓN CONTROL DE CALIDAD PRODUCCIÓN DE PHA MEDIO DE CULTIVO FUENTE DE CARBONO MONITORIZACIÓN CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO II. OBJETIVOS 33 Objetivos El objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido el estudio del catabolismo del PHA en la bacteria depredadora B. bacteriovorus HD100 y así como el desarrollo y validación de nuevas herramientas biotecnológicas en el campo de la producción industrial de PHAs. Los objetivos particulares son los siguientes: • Identificación y caracterización bioquímica de la despolimerasa de mcl- PHA de B. bacteriovorus HD100, PhaZBd. • Estudio de PhaZBd en el ciclo de vida depredador de B. bacteriovorus. • Efecto de la actividad despolimerizante de PhaZBd en el desarrollo B. bacteriovorus predando sobre cepas de P. putida KT2442 acumulando PHA. • Aplicaciones biotecnológicas de la degradación de PHA en B. bacteriovorus: producción de PHAs y de monómeros enantiopuros. • Desarrollo de nuevos sistemas de extracción del PHA de cultivos bacterianos para la producción industrial de PHA. 35 III. RESULTADOS 37 Resultados Esta Tesis se presenta bajo el formato de artículos publicados. La sección de resultados es una sucesión de artículos que contienen las respuestas a los objetivos específicos planteados. El desarrollo experimental preciso para dar respuesta a algunos de estos objetivos ha sido abordado en los artículos presentados. 38 Resultados: Capítulo 1 1. Identificación y caracterización bioquímica de una nueva despolimerasa de mcl- PHA como parte del arsenal hidrolítico del depredador B. bacteriovorus HD100 40 Identification and Biochemical Evidence of a Medium-Chain-Length Polyhydroxyalkanoate Depolymerase in the Bdellovibrio bacteriovorus Predatory Hydrolytic Arsenal Virginia Martínez,a Fernando de la Peña,a Javier García-Hidalgo,b Isabel de la Mata,b José Luis García,a and María Auxiliadora Prietoa Department of Environmental Biology, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, Spain,a and Department of Biochemistry and Molecular Biology I, Faculty of Biology, Complutense University of Madrid, Madrid, Spainb The obligate predator Bdellovibrio bacteriovorus HD100 shows a large set of proteases and other hydrolases as part of its hydro- lytic arsenal needed for its predatory life cycle. We present genetic and biochemical evidence that open reading frame (ORF) Bd3709 of B. bacteriovorus HD100 encodes a novel medium-chain-length polyhydroxyalkanoate (mcl-PHA) depolymerase (PhaZBd). The primary structure of PhaZBd suggests that this enzyme belongs to the ��-hydrol fold family and has a typical serine hydrolase catalytic triad (serine-histidine-aspartic acid) in agreement with other PHA depolymerases and lipases. PhaZBd has been extracellularly produced using different hypersecretor Tol-pal mutants of Escherichia coli and Pseudomonas putida as recombinant hosts. The recombinant PhaZBd has been characterized, and its biochemical properties have been compared to those of other PHA depolymerases. The enzyme behaves as a serine hydrolase that is inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride. It is also affected by the reducing agent dithiothreitol and nonionic detergents like Tween 80. PhaZBd is an endoexohydrolase that cleaves both large and small PHA molecules, producing mainly dimers but also monomers and trimers. The enzyme specifi- cally degrades mcl-PHA and is inactive toward short-chain-length polyhydroxyalkanoates (scl-PHA) like polyhydroxybutyrate (PHB). These studies shed light on the potentiality of these predators as sources of new biocatalysts, such as an mcl-PHA depoly- merase, for the production of enantiopure hydroxyalkanoic acids and oligomers as building blocks for the synthesis of biobased polymers. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are optically active biopolyox- oesters composed of R-3-hydroxy fatty acids, which represent a complex class of storage polyesters. A wide variety of taxonom- ically different groups of microorganisms (domains Bacteria and Archaea) produce intracellular homopolymers or copolymers containing different alkyl groups at the beta position in aerobic and anaerobic environments (36, 37, 42). At present, PHAs are classified into two major classes, short-chain-length PHAs (scl- PHA) with C4 and C5 monomers and medium-chain-length PHAs (mcl-PHA) with C6 to C14 monomers (37). PHAs are accu- mulated as inclusions in the bacterial cytoplasm in response to inorganic nutrient limitations and play a role as a sink for carbon and reducing equivalents and in synchronizing global metabolism to the availability of resources in PHA-producing microorganisms (16). It is now evident that intracellular accumulation of PHAs enhances the survival of several bacteria under environmental stress conditions imposed in water or soil (6, 27, 35). PHAs can be catabolized by many microorganisms through extracellular or intracellular processes depending on the PHA lo- calization (11, 12, 26). Intracellular PHA can be hydrolyzed by intracellular depolymerases, which are permanently associated to the PHA granule (11, 49). Their hydrolytic activity is controlled by the carbon demand of the PHA producer cells (10, 11, 18, 19, 26). The study of the physiological role of intracellular depoly- merases in the mcl-PHA metabolism in Pseudomonas putida was recently addressed, demonstrating that the intracellular depoly- merase PhaZ plays a fundamental role in the bacterial carbon me- tabolism by maintaining the PHA turnover, where synthesis and mobilization constitute a continuous and simultaneous cycle (10, 11, 45, 61). Extracellular PHA can be utilized as a carbon and energy source by PHA producer or nonproducer microorganisms. This PHA is released to the medium by producer microorganisms after death, and the granules spread into the environment can be hy- drolyzed by secreted PHA depolymerases of microbial origin into water-soluble oligomers and monomers that can be used as a car- bon source (26). The ability to degrade extracellular scl-PHA is more widespread among bacteria than the ability to degrade mcl- PHA. Thus, many extracellular scl-PHA depolymerases have been characterized in depth over the last decade, and a considerable number of genes have been identified (1, 3, 4, 24, 26, 29, 40). The prototype of extracellular mcl-PHA depolymerases is that of Pseu- domonas fluorescens GK13 (here PhaZGK13) (21, 26, 52). Based on the analysis of the PHA depolymerase database (29), we identified a potential extracellular mcl-PHA depolymerase- coding sequence from the complete genome of Bdellovibrio bacte- riovorus HD100 (open reading frame [ORF] Bd3709). Bdellovibrio and related organisms known as BALOs (Bdellovibrio and like or- ganisms) (8, 55) are obligate bacterial predators ubiquitously found in the environment. The predator B. bacteriovorus HD100 is a highly motile Gram-negative deltaproteobacterium that invades the periplasm of other Gram-negative bacteria. This predator un- dergoes a complex life cycle in the periplasm of the prey, which Received 4 April 2012 Accepted 11 June 2012 Published ahead of print 15 June 2012 Address correspondence to María Auxiliadora Prieto, auxi@cib.csic.es. Supplemental material for this article may be found at http://aem.asm.org/. Copyright © 2012, American Society for Microbiology. All Rights Reserved. doi:10.1128/AEM.01099-12 September 2012 Volume 78 Number 17 Applied and Environmental Microbiology p. 6017–6026 aem.asm.org 6017 on A ugust 14, 2012 by guest http://aem .asm .org/ D ow nloaded from 42 http://aem.asm.org/ http://dx.doi.org/10.1128/AEM.01099-12 http://aem.asm.org http://aem.asm.org/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22706067 Resultados: Capítulo 2 2. Mejora de la eficiencia biológica de B. bacteriovorus HD100 cuando preda sobre bacterias productoras de PHA Artículo enviado a la revista Environmental Microbiology 57 Reward for Bdellovibrio bacteriovorus for preying on a polyhydroxyalkanoate producer Virginia Martínez1, Edouard Jurkevitch2, José Luis García1, and María Auxiliadora Prieto1* Environmental Biology Department, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, C/ Ramiro de Maeztu, 9, 28040 Madrid, Spain 1 Department of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agricultural, Food and Environmental Quality Sciences, the Hebrew University of Jerusalem, Rehovot 76100, Israel 2 Abstract Bdellovibrio bacteriovorus HD100 is an obligate predator that invades and grows within the periplasm of Gram-negative bacteria, including mcl-polyhydroxyalkanoate (PHA) producers such as Pseudomonas putida. We investigated the impact of prey PHA content on the predator fitness and the potential advantages for preying on a PHA producer. Using a new procedure to control P. putida KT2442 cell size we demonstrated that the number of Bdellovibrio progeny depends on the prey biomass and not on the viable prey cell number or PHA content. The presence of mcl-PHA hydrolyzed products (monomers, dimers and trimers) in the culture supernatant after predation on P. putida KT42Z, a PHA producing strain lacking PhaZ depolymerase confirmed the ability of Bdellovibrio to degrade the prey´s PHA. Predator motility was significantly higher when growing on PHA accumulating preys. External addition of PHA polymer (latex suspension) to Bdellovibrio preying on the PHA minus mutant P. putida KT42C1 restored predator movement, suggesting that PHA is a key prey component to sustain predator natatory speed. High velocities observed in Bdellovibrio preying on the PHA producing strain were correlated to high intracellular ATP levels of the predator. These effects brought Bdellovibrio fitness benefits as predation on PHA producers was more efficient than predation on non-producing bacteria. Accumulating data also indicated that Bdellovibrio can be potentially used as a novel lytic system for PHA extraction from accumulating bacteria. 59 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23227863 Resultados: Capítulo 3 3. Autolisis celular controlada como sistema de procesamiento para la recuperación de mcl-PHA en P. putida KT2440 85 Controlled autolysis facilitates the polyhydroxyalkanoate recovery in Pseudomonas putida KT2440mbt_257 533..547 Virginia Martínez,1 Pedro García,2 José Luis García1 and María Auxiliadora Prieto1* 1Environmental Biology Department, Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid, Spain. 2Molecular Microbiology and Infection Biology Department, Centro de Investigaciones Biológicas, and Ciber de Enfermedades Respiratorias, Madrid, Spain. Summary The development of efficient recovery processes is essential to reduce the cost of polyhydroxyalkanoates (PHAs) production. In this work, a programmed self- disruptive Pseudomonas putida BXHL strain, derived from the prototype medium-chain-length PHA pro- ducer bacterium P. putida KT2440, was constructed as a proof of concept for exploring the possibility to control and facilitate the release of PHAgranules to the extracellular medium. The new autolytic cell disrup- tion system is based on two simultaneous strategies: the coordinated action of two proteins from the pneu- mococcal bacteriophage EJ-1, an endolysin (Ejl) and a holin (Ejh), and the mutation of the tolB gene, which exhibits alterations in outer membrane integrity that induce lysis hypersensitivity. The ejl and ejh coding genes were expressed under a XylS/Pm monocopy expression system inserted into the chromo- some of the tolB mutant strain, in the presence of 3-methylbenzoate as inducer molecule. Our results demonstrate that the intracellular presence of PHA granules confers resistance to cell envelope. Condi- tions to control the cell autolysis in P. putida BXHL in terms of optimal fermentation, PHA content and PHA recovery have been set up by exploring the sensitivity to detergents, chelating agents and wet biomass solu- bility in organic solvents such as ethyl acetate. Introduction Human overpopulation combined with the current lifestyle urges the rational, efficient and sustainable use of natural resources to produce environmentally friendly plastic materials such as polyhydroxyalkanoic acids (PHAs), whose production/degradation cycle reduces undesirable wastes and emissions (Gavrilescu and Chisti, 2005). PHAs are optically active biopolyoxoesters composed of (R) 3-hydroxy fatty acids, which represent a complex class of storage polyesters. They are synthesized by some Archaea and a wide range of Gram-positive and Gram-negative bacteria in aerobic and anaerobic environ- ments (Madison and Huisman, 1999). These biopolymers are accumulated as inclusions (PHA granules) in the bac- terial cytoplasm in response to inorganic nutrient limita- tions, generally, when the microbes are cultured in the presence of an excess carbon source (Madison and Huisman, 1999). At present, PHAs are classified in two major classes: short-chain-length PHAs (scl-PHAs) with C4-C5 monomers and medium-chain-length PHAs (mcl- PHAs) with C6-C14 monomers. Mcl-PHAs are mainly pro- duced by Pseudomonas species (revised in Prieto et al., 2007). Because of structural differences, the physical properties of mcl-PHAs are generally quite different from the archetypal polyhydroxybutyrate (PHB) and other scl- PHAs (Gagnon et al., 1992). Using currently available technology, large-scale pro- duction of PHA is suitable with expenditures almost evenly divided between carbon source, fermentation process and separation process (30% each) (Sun et al., 2007; Elbahloul and Steinbüchel, 2009). Because PHAs accu- mulate intracellularly, the development of an efficient recovery process is indispensable to reduce the total cost of PHAs production (Prieto, 2007). At present, different separation processes have been described, like filtration, froth flotation (van Hee et al., 2006) and continuous cen- trifugation (Gorenflo et al., 2001). Recovery procedures for mcl-PHA mainly resemble those developed for PHB (Ramsay et al., 1994). PHB recovery using hypochlorite, SDS in an in situ extraction process (Thakor et al., 2005), or an enzyme cocktail (de Koning et al., 1997; Kellerhals et al., 1999) have been reported. The disadvantages related to applications of hypochlorite and detergents are the severe reduction in polymer molecular weight and the requirement of extensive washing steps to get rid of deter- gent residuals respectively. Furthermore, the use of acetone, ethylacetate or hexane extraction of PHAs from Received 11 August, 2010; accepted 22 November, 2010. *For correspondence. E-mail auxi@cib.csic.es; Tel. (+34) 918373112; Fax (+34) 915360432. Microbial Biotechnology (2011) 4(4), 533–547 doi:10.1111/j.1751-7915.2011.00257.x Published 2011. This article is a US Government work and is in the public domain in the USA. Journal compilation © 2011 Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd 87 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21418544 IV. DISCUSIÓN INTEGRADORA 103 Discusión Integradora A continuación se presenta una discusión global que trata de integrar las conclusiones alcanzadas en cada uno de los tres capítulos que componen esta Tesis Doctoral. El objetivo de esta sección no es por tanto discutir en profundidad los resultados individuales presentados en los artículos, sino integrar todos los argumentos ya expuestos para obtener una visión global del impacto del catabolismo del PHA sobre la fisiología de B. bacteriovorus, así como de las posibles aplicaciones biotecnológicas de esta bacteria depredadora en el campo de los PHAs, comparándolas con otras estrategias diseñadas para la producción industrial de este biopoliéster y sus derivados. 105 Discusión Integradora 1. Importancia de la degradación del PHA en la fisiología de B. bacteriovorus HD100. Uno de los objetivos principales de esta Tesis Doctoral ha sido el estudio del catabolismo del PHA en B. bacteriovorus HD100. Mediante el empleo de P. putida KT2442 acumulando gránulos de mcl-PHA como presa para Bdellovibrio, se han analizado las repercusiones desde el punto de vista fisiológico que supone la degradación de este polímero para el depredador y su utilización como fuente de carbono y energía. En este sentido, esta Tesis constituye un estudio pionero que aborda la degradación de PHA en el depredador B. bacteriovorus HD100, así como el impacto fisiológico que supone esta capacidad (Capítulos 1 y 2). Como se ha indicado en la Introducción, B. bacteriovorus HD100 es una bacteria depredadora obligada de otras bacterias Gram negativas. Su ciclo de vida en una típica célula presa ha sido ampliamente estudiado y consta de dos fases de crecimiento bien diferenciadas: una fase de ataque móvil, no replicativa y una fase de crecimiento dentro del periplasma de la bacteria presa donde crece, replica su ADN y se divide en células individuales (Rendulic et al., 2004; Sockett, 2009). Para llevar a cabo la degradación de los componentes celulares de la presa a lo largo del ciclo de vida depredador, el genoma de B. bacteriovorus HD100 codifica alrededor de 300 enzimas potencialmente hidrolíticas (Rendulic et al., 2004). Esta densidad de enzimas hidrolíticas es la más elevada de todos los genomas bacterianos secuenciados hasta la fecha, exceptuando el pequeño genoma del endosimbionte Buchnera aphidicola, de tan sólo 422 kb en la estirpe BCc (Rendulic et al., 2004; Pérez-Brocal et al., 2006). Uno de los resultados principales de esta Tesis Doctoral ha sido la identificación de una nueva despolimerasa de mcl-PHA formando parte del arsenal hidrolítico de B. bacteriovorus HD100 (Capítulos 1 y 2). Ya se ha señalado que el PHA se acumula como polímero de reserva de carbono y energía por algunas bacterias en caso de desbalance nutricional y es catabolizado ante cambios medioambientales (revisado en Madison y Huisman, 1999; Luengo et al., 2003; Prieto et al., 2007). Las despolimerasas intracelulares forman parte de la maquinaria del ciclo del PHA (de Eugenio et al., 2010). No obstante, la degradación extracelular del PHA también tiene lugar en la 106 Discusión Integradora naturaleza (Handrick y Jendrossek, 2002). Por tanto, el PHA juega un papel fundamental tanto en el metabolismo celular de la bacteria productora como en el resto de la comunidad bacteriana. La existencia de una nueva despolimerasa de mcl- PHA en Bdellovibrio resulta interesante no sólo por sus posibles aplicaciones biotecnológicas (ver apartado 3. “Producción industrial de PHAs y de compuestos enantiopuros” de la Discusión Integradora), sino desde el punto de vista del estudio global de la degradación de PHA en el ecosistema. En concreto, la degradación de mcl- PHA ha sido escasamente estudiada, tanto a nivel intracelular como extracelular, siendo las despolimerasas de P. putida KT2442 y P. fluorescens GK13 las enzimas prototipo, respectivamente (ver apartado 2. “Degradación periplásmica del PHA” de la Discusión Integradora) (Schirmer et al., 1993; 1994; de Eugenio et al., 2007; 2008). Al inicio de esta Tesis, la capacidad de Bdellovibrio para invadir y crecer a expensas de bacterias acumulando gránulos de PHA en su interior era desconocida. La identificación de PhaZBd junto con el hecho de que Bdellovibrio sea capaz de crecer predando sobre bacterias productoras de mcl-PHA tales como P. putida, abre la puerta a estudios sobre el metabolismo de PHA en bacterias depredadoras (Capítulos 1 y 2). Cabe destacar además, que la acumulación gránulos de PHA confiere ventajas a los microorganismos que lo producen en términos de supervivencia o resistencia a diferentes tipos de estrés ambiental (Castro-Sowinski et al., 2010) (ver apartado 2.3. “Función del PHA en la comunidad microbiana” de la Introducción). Además, la presencia del gránulo de mcl-PHA en el interior de P. putida KT2440 confiere resistencia a la lisis celular mediada por diversos agentes, químicos y biológicos (Capítulo 3). Sin embargo, se ha comprobado que B. bacteriovorus HD100 es capaz de predar sobre P. putida KT2442 acumulando gránulos de mcl-PHA (Capítulo 2) (Figura 12), demostrando, por tanto, que la presencia de PHA en el interior de la presa no le confiere resistencia a la depredación. La bacteria presa utilizada durante este trabajo ha sido la cepa Pseudomonas putida KT2442, debido a que las bacterias del género Pseudomonas han sido ampliamente estudiadas por su capacidad de producción de PHA, entre otras razones (Luengo et al., 2003; Prieto et al., 2007). Entre las bacterias del género Pseudomonas de importancia biotecnológica y medioambiental destaca P. putida, un microorganismo no patógeno capaz de vivir en suelos, rizosfera y aguas dulces, caracterizado por su amplia versatilidad metabólica (Clarke, 1982; Silby et al., 107 Discusión Integradora 2011). P. putida KT2440 se considera la bacteria modelo en biotecnología ambiental (Nelson et al., 2002; Wackett, 2003; dos Santos et al., 2004). Se trata de la una bacteria Gram negativa aislada del suelo, secuenciada (Nelson et al., 2002) y certificada por el “National Institutes of Health” (NIH) de los Estados Unidos como segura para la clonación y expresión de genes heterólogos. Gracias a esta acreditación P. putida KT2440, se ha convertido en un organismo modelo para estudios de biodegradación, adaptación a diversos ambientes y para el desarrollo de herramientas biotecnológicas (Wackett, 2003; dos Santos et al., 2004). La cepa P. putida KT2442 es un mutante espontáneo de la estirpe KT2440 resistente a rifampicina (Franklin et al., 1981). En esta Tesis Doctoral, la cepa P. putida KT2440 ha sido también seleccionada para el diseño de nuevos sistemas líticos que faciliten la producción industrial de PHAs (Capítulos 2 y 3). Figura 12. Representación esquemática del ciclo de vida de B. bacteriovorus HD100 predando sobre P. putida KT2442 acumulando gránulos de PHA en el citoplasma. En las condiciones testadas, Bdellovibrio hidroliza parte del mcl-PHA acumulado por la presa, liberando el resto de los gránulos de PHA al medio extracelular (Capítulo 2). Bdellovibrio Pseudomonas I. Localización de la presa II. Anclaje III. Invasión IV. Establecimiento V. Crecimiento en el bdelloplasto VI & VII. Septación y desarrollo VIII. Lisis Gránulos de PHA 108 Discusión Integradora 1.1. Producción de PhaZBd en el ciclo de vida depredador de B. bacteriovorus HD100 La detección de actividad despolimerasa en los extractos solubles de las cepas de E. coli y P. putida portadoras del gen phaZBd, ha permitido confirmar la existencia de un gen que codifica una verdadera despolimerasa de mcl-PHA en el genoma de B. bacteriovorus HD100. Sin embargo, a pesar de la presencia de un péptido señal en el extremo amino terminal de la secuencia aminoacídica, no se ha detectado actividad despolimerasa en los sobrenadantes de cultivo de las cepas recombinantes expresando la proteína de manera heteróloga. La localización subcelular de PhaZBd expresada en estas cepas ha revelado la acumulación de la despolimerasa procesada y activa en el espacio periplásmico (Capítulo 1). Este resultado guarda relación con el hecho de que el espacio extracelular del depredador durante su fase de crecimiento es el periplasma de la presa. Ante esta situación, se ha estudiado qué papel desentraña la despolimerasa PhaZBd en el peculiar ciclo de vida de Bdellovibrio (Capítulo 2). El gen phaZBd se expresa de manera constitutiva a lo largo de la fase de crecimiento del depredador, ya sea creciendo sobre cepas de P. putida acumulando o sin acumular gránulos de PHA (Capítulo 2). El análisis de esta bacteria muestra diversos patrones de expresión génica según el gen estudiado. Por ejemplo, los genes involucrados en la biosíntesis del flagelo se activan en la fase de ataque y su transcripción decae durante la fase de crecimiento (Lambert et al., 2006a), mientras que genes hidrolíticos como las lipasas, o implicados en la remodelación del peptidoglicano de la presa se expresan de manera constitutiva (Lambert et al., 2009). La producción constitutiva de PhaZBd es una prueba más del enorme y diverso arsenal de enzimas hidrolíticas que Bdellovibrio secreta a lo largo de su ciclo de vida depredador. La despolimerasa PhaZBd se produce de manera activa durante el desarrollo de Bdellovibrio predando sobre una cepa mutante en la despolimerasa PhaZKT, P. putida KT42Z (Capítulo 2). La localización subcelular de PhaZBd en las condiciones de crecimiento sobre KT42Z no ha sido determinada; sin embargo, se ha descrito que pocas proteínas extracelulares secretadas por Bdellovibrio son dirigidas desde el bdelloplasto al medio extracelular, lo que implica que estas proteínas secretadas en el bdelloplasto se localizan en el citoplasma o el periplasma de la presa (Cover et al., 109 Discusión Integradora 1984). Esta observación junto con el hecho de que PhaZBd se acumule en el periplasma de E. coli o P. putida cuando se expresa de manera heteróloga, sugiere la localización de la depolimerasa en el espacio periplásmico de la presa, desde donde podría degradar el PHA de la misma. Además, la detección e identificación de los productos de hidrólisis del PHA en el sobrenadante del co-cultivo (tanto predando sobre P. putida KT2442 como sobre KT42Z), confirmaron la degradación del polímero de la presa por parte del depredador (Capítulo 2). Como es de esperar, los productos de hidrólisis detectados son similares a los identificados en las reacciones de hidrólisis in vitro con la proteína semipurificada (monómeros, dímeros y trímeros) (Capítulo 1), lo que confirma la actividad despolimerasa de PhaZBd durante el ciclo de vida de Bdellovibrio liberando monómeros y oligómeros de PHA. De acuerdo con todo lo anteriormente expuesto, uno de los objetivos de esta Tesis Doctoral ha sido investigar el impacto de la presencia de PHA en la presa durante el desarrollo y crecimiento de Bdellovibrio, así como determinar las principales implicaciones que el catabolismo del polímero tiene sobre la eficiencia biológica (fitness) del depredador (Capítulo 2). La eficiencia biológica mide la adaptación de un microorganismo en su medio ambiente. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado la eficiencia biológica en términos de número, velocidad natatoria y eficiencia en la depredación de nuevas presas, de la progenie de Bdellovibrio producida tras predar sobre cepas de P. putida KT2442 en presencia y ausencia de PHA. 1.2. Influencia del contenido de PHA de la presa en la eficiencia biológica (fitness) de B. bacteriovorus HD100. Muchas especies bacterianas que Bdellovibrio puede emplear como células presa tienen la capacidad de acumular gránulos de PHA (p. ej., Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium, Azospirillum, Rhizobium, Enterobacter etc). Sin embargo, esta posibilidad no ha sido nunca estudiada en bacterias depredadoras, a pesar de la importancia de estas últimas en la diversidad de las comunidades microbianas naturales. De hecho, la depredación es un tipo de interacción biológica, que junto con otros como mutualismo, comensalismo, competencia o parasitismo, 110 Discusión Integradora contribuye a mantener el equilibrio ecológico en una población (Jurgens, 2007). Como se ha detallado en la Introducción, el metabolismo de los PHAs está ampliamente distribuido en la naturaleza y supone una ventaja para los microorganismos que lo producen (Castro-Sowinski et al., 2010; Kadouri et al., 2005; Kalia et al., 2007). Dado el contexto biológico en el que se puede encontrar Bdellovibrio en la naturaleza y la identificación de una despolimerasa de mcl-PHA formando parte de su arsenal hidrolítico (Capítulo 1), se han llevado a cabo estudios de depredación comparada de Bdellovibrio sobre bacterias en presencia y ausencia de gránulos de PHA en su interior (P. putida KT2442 y KT42C1, respectivamente) (Capítulo 2). Los resultados obtenidos han revelado que el numero de progenie del depredador es plenamente dependiente de la biomasa residual de la presa (biomasa libre de PHA), y no del contenido de PHA o del número de células de la misma. No obstante, las células de Bdellovibrio crecidas sobre P. putida KT2442 y KT42Z acumulando PHA alcanzan una velocidad muy superior a las crecidas sobre el mutante P. putida KT42C1 incapaz de producir PHA. Esta diferencia se explica por la capacidad de Bdellovibrio para hidrolizar y metabolizar un 25% del contenido inicial del PHA de la presa a lo largo de su ciclo de crecimiento (Capítulo 2). Además, las células de Bdellovibrio derivadas de P. putida KT42C1, adquieren una velocidad de natación similar a las crecidas sobre la cepa silvestre cuando se añade de manera exógena una solución del polímero al co-cultivo (PHA látex). De estos resultados se puede concluir que el PHA es el componente clave que determina la velocidad alcanzada por Bdellovibrio. El mecanismo a través del cual los RHAs liberados tras la hidrólisis del polímero son metabolizados por Bdellovibrio se puede explicar por su posible degradación hasta acetil-CoA, que puede canalizarse hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT o ciclo de Krebs) para la obtención de energía (ver la Figura 7 del apartado 2.2.1. “Síntesis de PHA” de la Introducción). Estos resultados se apoyan a su vez en los mayores niveles intracelulares de ATP cuantificados en estas mismas células de Bdellovibrio. Sin embargo, la progenie alcanzada por Bdellovibrio predando durante 24 h sobre P. putida acumulando PHA no resulta superior a la obtenida predando sobre P. putida KT42C1. Una posible explicación para estos resultados es la ausencia del ciclo del glioxilato en Bdellovibrio. La ausencia de la enzima clave en este ciclo, la isocitrato liasa, impide la canalización 111 Discusión Integradora de intermediarios hacia la ruta gluconeogénica generando biomasa (Kornberg, 1966; Krebs y Johnson, 1937). La mayor velocidad de natación de los Bdellovibrios crecidos sobre presas acumulando PHA permite una mayor eficiencia en la depredación de nuevas bacterias en ambientes líquidos (Capítulo 2), demostrando la importancia del movimiento de Bdellovibrio en la búsqueda de nuevas presas. Además, los altos niveles de ATP cuantificados en estas células de Bdellovibrio también contribuyen a una mayor eficiencia en la depredación, facilitando el funcionamiento de transportadores implicados en la secreción de enzimas, en la incorporación de los productos resultantes de la hidrólisis de macromoléculas, o en la posterior síntesis de macromoléculas (Rittenberg y Hespell, 1975; Rendulic et al., 2004). Asimismo, el ATP también es necesario para el funcionamiento de los pili tipo IV, esenciales durante el proceso de anclaje a la célula presa y penetración en el espacio periplásmico (Evans et al., 2007; Lambert et al., 2008; Mahmoud y Koval, 2010). En resumen, este trabajo proporciona nuevas perspectivas acerca del papel crucial del ciclo del PHA en la fisiología de bacterias depredadoras de bacterias. Se ha determinado que la capacidad para degradar PHA confiere a Bdellovibrio ventajas a la hora de localizar nuevas presas y adaptarse a condiciones ambientales desfavorables (Capítulo 2). A la luz de los resultados derivados de esta Tesis Doctoral se pueden presumir las consecuencias derivadas de la depredación de bacterias productoras de PHA dentro de la comunidad microbiana. El ciclo del PHA permite la síntesis y degradación del poliéster según las necesidades de la bacteria productora. Esta capacidad confiere ventajas en el medio ambiente a estas bacterias, ya que pueden llevar a cabo la degradación del PHA en condiciones de escasez de fuente de carbono o por ejemplo, liberar los RHAs al medio extracelular con objeto de tamponar una situación de pH extremo a la que se ve sometida la célula (Wang et al., 2007b). Como se ha comentado en la Introducción, todo ello conlleva a la supervivencia y adaptación en el nicho ecológico cuando las condiciones nutricionales son altamente cambiantes (Tal y Okon, 1985; Okon y Itzigsohn, 1992; Kadouri et al., 2005). Tras la muerte de estos 112 Discusión Integradora productores, el PHA es liberado al medio y empleado por otros microorganismos mediante la secreción de despolimerasas extracelulares (Handrick y Jendrossek, 2002). En este contexto, el impacto de los depredadores en las comunidades bacterianas se ve reflejado en la liberación de gránulos de PHA y RHAs tras la depredación y lisis de bacterias productoras (Capítulo 2). Además, el análisis del genoma de B. bacteriovorus HD100 ha revelado la existencia de otra despolimerasa de PHA, en este caso de scl- PHA (ORF Bd2637) (Rendulic et al., 2004; Dori-Bachash et al., 2008; Knoll et al., 2009) (Anexo 1) (Capítulo 1). Esta posible despolimerasa ha sido clasificada dentro de la superfamilia de las despolimerasas extracelulares de scl-PHA con dominio catalítico tipo II en la base de datos de despolimerasas (Knoll et al., 2009) (Anexo 1) y su papel en la fisiología de Bdellovibrio ha sido previamente discutido (Dori-Bachash et al., 2008). Experimentos de depredación llevados a cabo en el laboratorio con cepas recombinantes de E. coli capaces de acumular PHB, han revelado la capacidad de Bdellovibrio para infectar dichas presas y degradar completamente el polímero acumulado. El análisis de los sobrenadantes de estos co-cultivos reveló la acumulación en el medio extracelular de los productos de hidrólisis del PHB, en su mayoria trímeros y tetrámeros, posiblemente debido a la acción de dicha despolimerasa de scl-PHA (resultados no incluidos). Desde el punto de vista biotecnológico, la liberación de gránulos de PHA y de RHAs al sobrenadante de los co-cultivos durante el ciclo de vida de Bdellovibrio predando sobre presas productoras de PHA, abre nuevas perspectivas para el diseño de estrategias de cultivo novedosas para la producción industrial de PHA y de los compuestos quirales que lo conforman (Capítulo 2) (ver apartado 3. “Producción industrial de PHAs y de compuestos enantiopuros” de la Discusión Integradora). 2. Degradación periplásmica del PHA. Como ya se ha comentado en la Introducción, dentro de la degradación de los PHAs hay que diferenciar entre la degradación intracelular y la extracelular, llevadas a cabo gracias a la acción de despolimerasas intracelulares y extracelulares, respectivamente (ver apartado 2. “El papel del PHA en la fisiología microbiana” de la 113 Discusión Integradora Introducción) (Jendrossek y Handrick, 2002; Knoll et al., 2009) (Anexo 1). Hay que señalar que se ha propuesto una localización periplásmica para la despolimerasa de PHB de Rhodospirillum rubrum, PhaZ1Rru (Handrick et al., 2004; Sznajder y Jendrossek, 2011). Sin embargo, el significado fisiológico de la localización subcelular de esta despolimerasa permanece desconocido y además, resulta improbable dado que el polímero es acumulado en el citoplasma celular. Asimismo, la identificación de otras despolimerasas intracelulares de scl-PHA en R.rubrum cuestiona los resultados, ya que podrían ser las verdaderas causantes de la actividad despolimerasa descrita en la fracción soluble de esta bacteria. La existencia de una despolimerasa específica de mcl-PHA en el depredador B. bacteriovorus HD100 y la capacidad del mismo para degradar el gránulo de PHA acumulado por P. putida y emplearlo como fuente de carbono y energía ha sido ampliamente demostrada a lo largo de esta Tesis Doctoral (Capítulos 1 y 2). Estos resultados permiten reconsiderar, entre otras cosas, la actual clasificación de las despolimerasas de PHA e incluir entre las despolimerasas intracelulares y extracelulares, las despolimerasas periplásmicas. De esta manera, se proponen tres tipos de degradación del PHA: la degradación intracelular, la extracelular y la periplásmica (Figura 13) Los genes pha han estado sujetos a un proceso de transferencia horizontal entre distintos grupos filogenéticos (Kalia et al., 2007; Kim et al., 2007). El análisis de la secuencia aminoacídica de PhaZBd reveló la alta similitud existente entre esta despolimerasa y la despolimerasa extracelular prototipo de P. fluorescens GK13 (Capítulo 1). Esta observación, unida a la de que Bdellovibrio puede crecer a expensas de cepas del género Pseudomonas, sugiere la posibilidad de que haya existido transferencia horizontal de genes codificantes para despolimerasas de mcl-PHA entre ambas bacterias. Sin embargo, análisis del contenido en G+C y del uso de codones de la región codificante para PhaZBd en el genoma de Bdellovibrio sugirió una adquisición antigua de este gen. Por otro lado, el análisis de las regiones flanqueantes del gen phaZBd en el genoma de B. bacteriovorus HD100 reveló la ausencia de genes relacionados con el metabolismo de PHA en esta bacteria depredadora (Capítulo 1). 114 Discusión Integradora Figura 13. Tipos de degradación del PHA teniendo en cuenta la degradación periplásmica del polímero acumulado por la presa llevada a cabo por B. bacteriovorus HD100. Compárese con la Figura 9 del apartado 2.2.3. “Degradación extracelular de PHA” de la Introducción. Dada la alta similitud de secuencia existente entre PhaZBd y PhaZGK13 se considera necesario un estudio comparativo de la estructura y función de ambas enzimas. Tanto PhaZGK13 como PhaZBd han sido clasificadas dentro de la superfamilia de las despolimerasas extracelulares de mcl-PHA en la base de datos de despolimerasas (Knoll et al., 2009) (Anexo 1). Ambas despolimerasas son altamente específicas de mcl- PHA, y su estructura primaria no presenta una similitud significativa con la de las despolimerasas de scl-PHA, excepto por la caja lipasa (Gly-Ile-Ser-Ser-Gly), también presente en otras serín-hidrolasas, como lipasas, esterasas y serín proteasas (Arpigny y Jaeger, 1999) y también por la presencia de algunos residuos conservados en el centro activo (Schirmer et al., 1995). Hasta la fecha, no se ha resuelto la estructura tridimensional de ninguna despolimerasa de mcl-PHA pero sí se ha propuesto un modelo tridimensional para PhaZGK13 en comparación con el de la despolimerasa intracelular de mcl-PHA de P. putida KT2442, PhaZKT (de Eugenio et al., 2007; 2008) Degradación del PHA intracelular Degradación extracelular del PHA Cepa productora de PHA Gránulos de PHA nativos Gránulos de PHA desnaturalizados PHA liberado Depredación de una cepa productora de PHA Degradación periplásmica del PHA 115 Discusión Integradora (Figura 14B). Este modelo confirmó la identidad de los residuos que constituyen la triada catalítica de PhaZGK13 y los localizó en la superficie del núcleo α/β hidrolasa. Por consiguiente, se ha llevado a cabo el modelado de la estructura terciaria de PhaZBd empleándose como modelo la dipeptidil aminopeptidasa IV de Stenotrophomonas maltophilia con la que mostraba una identidad del 14% (Nakajima et al, 2008) (Figura 14A). Figura 14. Representación esquemática del modelo estructural de las despolimerasas extracelulares de mcl-PHA de B. bacteriovorus HD100 (A) y P. fluorescens GK13 (B). Se muestra la triada catalítica de las enzimas: serina (Ser, en rojo), Aspártico (Asp, en amarillo) e Histidina (His, en verde). Las posiciones de los residuos corresponden a la proteína madura. En azul se indican los residuos hidrofóbicos que rodean el centro activo. Según el modelo propuesto para PhaZBd (Figura 14A), el plegamiento de la enzima se corresponde al modelo α/β hidrolasa en el que es característico un núcleo de láminas β paralelas rodeadas por hélices α. Asimismo, se confirma que los residuos Ser145, Asp201 e His233 constituyen la triada catalítica de la enzima, al encontrarse en la superficie del núcleo α/β hidrolasa. Al igual que ocurre en PhaZGK13, estos residuos se encuentran totalmente expuestos al solvente, localizados en una región hidrofóbica implicada posiblemente en la interacción con el polímero. En cuanto a los productos de la reacción, PhaZBd hidroliza poli (3-hidroxihexanoato-co-3-hidroxioctanoato) [P(HH- co-HO)], siendo el principal producto de la reacción el dímero de 3-hidroxioctanoato, al igual que ocurre con PhaZGK13 (Schirmer et al., 1993; 1994; Gangoiti et al., 2010). Ser150 Asp228His238 Ser145 Asp201His233 116 Discusión Integradora Además de dímeros, PhaZBd también libera monómeros y trímeros por lo que se ha clasificado como exo-endohidrolasa (Capítulos 1 y 2). A pesar de la alta similitud entre PhaZGK13 y PhaZBd cabe destacar la notable diferencia en la estructura primaria del péptido señal de ambas despolimerasas. En principio, las secuencias de dichos péptidos (de aproximadamente 20 aminoácidos, de los que varios presentan carga positiva en el extremo amino terminal, además de una secuencia de 10 a 20 aminoácidos hidrofóbicos) indican la secreción de las proteínas vía el sistema de secreción tipo II (SSTII) (Pugsley, 1993). Esta vía también se conoce como sistema general de secreción y tiene lugar en dos etapas. Primeramente, la maquinaria Sec transloca el sustrato con el péptido señal a través de la membrana plasmática, por lo que el SSTII es una vía Sec-dependiente. En una segunda etapa, la proteína pierde el péptido señal y adquiere su conformación nativa en el espacio periplásmico, para posteriormente ser secretada a través de la membrana externa por un complejo sistema multiproteico llamado tipo II o secretón (Pugsley, 1993). Sin embargo, la baja similitud de la secuencia aminoacídica entre ambos péptidos podría explicar la diferente localización subcelular de las despolimerasas cuando se expresan de manera heteróloga en cepas de E. coli o P. putida. Como ya se ha indicado anteriormente, a pesar de la existencia del péptido señal, la proteína PhaZBd procesada se acumula en el espacio periplásmico (Capítulo 1), mientras que PhaZGK13 es secretada al medio extracelular (de Eugenio, 2009). Estos resultados se correlacionan a su vez con la detección de la actividad despolimerasa de PhaZBd en la fracción soluble de los co-cultivos de Bdellovibrio creciendo sobre P. putida y no en los sobrenadantes (Capítulo 2), ya que la despolimerasa es secretada por el depredador, pero en principio, ésta no se libera desde el periplasma de la presa al medio extracelular. 117 Discusión Integradora 3. Aplicaciones biotecnológicas: producción industrial de PHAs y de compuestos enantiopuros Como ya se ha comentado en la Introducción, los PHAs son una extensa familia de polímeros con diferentes propiedades que han sido ampliamente estudiados en virtud de su naturaleza biodegradable y sus múltiples aplicaciones. Estos biopolímeros presentan gran interés a nivel industrial, médico, farmacéutico, agrícola y medioambiental (Madison y Huisman, 1999; Zinn et al., 2001; Chen y Wu, 2005a; Valappil et al., 2006; Philip et al., 2007; Chen, 2009; Gao et al., 2011; Rai et al., 2011). Actualmente, como consecuencia del problema de contaminación medioambiental que ha generado el uso de los plásticos convencionales derivados de la industria petroquímica y el incremento del precio del petróleo, se está haciendo una apuesta clara por la implantación de procesos de tipo sostenible para la obtención de energía y la producción de materiales de alto consumo como son los polímeros plásticos como el PHA (Gavrilescu y Chisti, 2005; Chen, 2009; Thompson et al., 2009). Sin embargo, la producción industrial de PHA aún mantiene un alto coste de producción en comparación con los plásticos convencionales. Además, el estudio del PHA no sólo resulta interesante por su utilización como plástico biodegradable, sino por el posible empleo de estos polímeros como fuente de RHAs enantioméricamente puros, los cuales son precursores de productos de alto valor añadido en la industria químico-farmacéutica (Chen y Wu, 2005; Ren et al., 2005, de Eugenio et al., 2010a). Dado que el PHA es un componente intracelular, resulta indispensable el desarrollo de sistemas de extracción eficaces y sostenibles para abaratar el coste final del bioproducto (Prieto, 2007). Por esta razón, durante la presente Tesis Doctoral se han diseñado sistemas de producción de PHAs y de los intermediarios enantiopuros que los conforman, de tal manera que la extracción del bioproducto resulta menos costosa energéticamente y medioambientalmente menos contaminante, facilitando así el proceso de producción industrial. 118 Discusión Integradora 3.1. Mejora de los sistemas de procesado de biomasa bacteriana para la producción industrial de PHA Como se ha comentado en la Introducción, el coste total del proceso de producción de PHA mediante fermentación bacteriana se ve condicionado principalmente por factores como la fuente de carbono empleada, el proceso de fermentación, y la extracción y purificación del polímero (Sun et al., 2007; Elbahloul y Steinbüchel, 2009; Chen, 2010). Con el objetivo de abaratar el coste total de la producción industrial del PHA, muchos de los esfuerzos en la comunidad científica están enfocados hacia la optimización del proceso de extracción del polímero, habiéndose desarrollado una gran variedad de sistemas, mayoritariamente para la extracción de scl-PHA (Jacquel et al., 2008; Kunasundari y Sudesh, 2011). Los principales procesos se resumen en la Figura 14. Varios trabajos han descrito métodos de disrupción mecánica, como la homogenización a alta presión, el uso de perlas de vidrio, o la ultrasonicación (Tamer et al., 1998; Ghatnekar et al., 2002; Hwang et al., 2006). También se ha descrito la recuperación del PHA mediante el uso de disolventes orgánicos como el cloroformo, cloruro de metileno, carbonato de propileno o dicloroetano (Ramsay et al., 1994; Gorenflo et al., 2001; Fiorese et al, 2009). Además, existen métodos de extracción mediante digestión química con hipoclorito sódico o detergentes (Berger et al., 1989; Kim et al., 2003; Thakor et al., 2005; Yang et al., 2011) y digestión enzimática mediante el uso de cócteles enzimáticos (Harrison et al., 1991; de Koning y Witholt., 1997; Kellerhals et al., 1999; Kapritchkoff et al., 2006; Yasotha et al., 2006). Finalmente, se ha conseguido la extracción del polímero mediante estrategias como el fluido supercrítico, la fragilidad celular, la flotación por espuma o la liberación espontánea (Page et al., 1993; Hejazi et al., 2003; Khosravi-Darani et al., 2004; Jung et al., 2005; van Hee et al., 2006). Cabe destacar que pocos trabajos describen sistemas para la extracción de mcl-PHA, y se únicamente se basan en el uso de cócteles enzimáticos o métodos de flotación por espuma (van Hee et al., 2006; Yasotha et al., 2006). En líneas generales, las principales desventajas de la mayoría de estos métodos son el uso de solventes orgánicos tóxicos y volátiles, que provocan procesos peligrosos, energéticamente poco eficientes y medioambientalmente contaminantes. Asimismo, 119 Discusión Integradora los métodos de disrupción mecánicos requieren del empleo de un equipamiento complejo y costoso, además de un gasto de energía. Por último, los procedimientos químicos necesitan del uso de altas cantidades de detergente y agentes quelantes que encarecen los costes de producción y generan contaminantes. Además, en su mayoría, estos métodos de recuperación del PHA se realizan después de pre-tratamientos de la biomasa bacteriana que faciliten la posterior disrupción celular (p.ej., calor, congelación, tratamientos alcalinos o sal), lo que también encarece y complica el proceso de extracción (Williams et al., 1999; Furrer et al., 2007; Jacquel et al., 2008; Elbahloul y Steinbüchel, 2009). Figura 14. Principales estrategias de purificación de PHA. La complejidad de los sistemas de extracción de PHA descritos supone un obstáculo para reducir tanto los costes de producción como la contaminación medioambiental a la hora de escalar el proceso a nivel industrial. Por todo ello, el desarrollo de nuevos métodos o procesos para la producción y extracción de PHAs de las bacterias de forma competitiva y ecológica, se ha convertido en un objetivo fundamental para esta actividad industrial. En este sentido, se ha propuesto el diseño de sistemas que permitan la producción extracelular de los gránulos (Prieto, 2007). Sabirova et al. (2006) describieron el depósito extracelular, mediante un mecanismo desconocido, de los Células acumulando PHA Extracción Solventes Digestión Disrupción mecánica Fluido supercrítico Fragilidad celular Purificación Recuperación de PHA puro 120 Discusión Integradora gránulos de PHA producidos por Alcanivorax borkumensis. Una alternativa son los sistemas de lisis celular mediante el uso de enzimas líticas. El empleo de genes de bacteriófagos que codifican enzimas líticas para romper células acumulando PHB ha sido descrito en Bacillus megaterium (Hori et al., 2002) y en cepas recombinantes de E. coli (Fidler y Dennis, 1992; Resch et al., 1998; Yu et al., 2000). A pesar de que esta tecnología parece ser una de las más eficientes y económicas para recuperar el PHA, no ha sido testada en bacterias productoras de mcl-PHA (Chen, 2010). Por consiguiente, un objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el diseño de sistemas de procesado de la biomasa bacteriana que faciliten la producción industrial de mcl-PHA (Capítulos 2 y 3). Estos sistemas permiten la recuperación del PHA de forma competitiva y ecológica, lo que relativiza el coste de producción en relación al precio final del producto. Por un lado, el estudio del ciclo de vida de Bdellovibrio predando sobre P. putida KT2442 acumulando mcl-PHA ha permitido el diseño de estrategias de cultivo potentes e innovadoras de gran interés para la producción tanto de PHAs como de RHAs enantiopuros (Capítulo 2). Como se ha demostrado, la rápida acción lítica de Bdellovibrio conlleva la lisis celular de P. putida KT2442 en menos de 15 h, liberando un 50% del PHA acumulado al medio extracelular. La recuperación de prácticamente la totalidad de los gránulos de PHA liberados, con una pureza del 99%, se realizó mediante la disolución de la biomasa húmeda (sin necesidad de pre- tratamientos) en etil acetato y posterior precipitación con metanol (Capítulo 2). Este sistema de extracción está siendo actualmente optimizado en el laboratorio mediante la construcción de un mutante knock out de Bdellovibrio en el gen phaZBd. A pesar de la rapidez, facilidad y escaso coste económico de este sistema de procesado de la biomasa, hay que tener en cuenta que el proceso de escalado, desde la selección y desarrollo de las cepas adecuadas, pasando por la optimización de los cultivos en matraz y en plantas piloto, hasta llegar a las condiciones óptimas de producción industrial, implica una elevada inversión en concepto de investigación y desarrollo (Chen, 2009). Por el contrario, el sistema autolítico diseñado en P. putida KT2440 con el objetivo de facilitar la recuperación del mcl-PHA (Capítulo 3) supone una ventaja a nivel de escalado industrial. Como se ha comentado anteriormente, este tipo de sistemas de extraccion no han sido desarrollados en cepas productoras de mcl-PHA. La 121 Discusión Integradora cepa de P. putida KT2440 diseñada en esta Tesis Doctoral comprende un sistema lítico heterólogo compuesto por una holina (Ejh) y una enzima lítica (Ejl) del fago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae (Díaz et al., 1996) (Capítulo 3). En la mayoría de los fagos estas proteínas actúan de manera perfectamente coordinada en la rotura de la pared celular del huésped. Los genes que codifican estas proteínas suelen estar contiguos y su transcripción y traducción es tardía, iniciándose sólo cuando los viriones están en su última fase de empaquetamiento dentro del citoplasma bacteriano. Las holinas constituyen un grupo de proteínas fágicas de estructura primaria muy variada pero muy similares en su modo de acción. Son proteínas pequeñas, con dominios transmembranales que se localizan en la membrana citoplásmica formando un poro o agujero que en un momento genéticamente programado permite el paso de la enzima lítica (endolisina) encargada de romper la pared bacteriana y provocar la lisis (Wang et al., 2000). A pesar de que la expresión del casete Ejh-Ejl en P. putida acumulando PHA provoca una disminución de la viabilidad celular, la presencia de los gránulos de PHA confiere resistencia a la lisis, incluso en presencia de determinados agentes químicos (Capítulo 3). Por esta razón, este sistema lítico fue transferido a mutantes de P. putida KT2440 en el sistema Tol-pal (Capítulo 3). El complejo Tol-pal está localizado en la envoltura celular de las bacterias Gram-negativas y es crítico para el mantenimiento de su estructura (Figura 8, Capítulo 3). La alteración de estas proteínas conduce a situaciones de debilitamiento de la célula e incremento de la sensibilidad a detergentes o agentes quelantes (Llamas et al., 2000; 2003). La cepa de P. putida KT2440 diseñada en esta Tesis facilita la recuperación del PHA mediante la disolución de la biomasa húmeda en etil acetato, tras su incubación con pequeñas cantidades de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y SDS. Este método permite la recuperación de más de un 40% del PHA producido por P. putida, con una pureza del 98% (Capítulo 3). El uso de cepas mutantes en el sistema Tol-pal no solo ha permitido el desarrollo de este sistema lítico en P. putida KT2440, sino también la liberación al medio extracelular de la despolimerasa PhaZBd expresada en E. coli y P. putida, facilitando así su purificación y posterior caracterización, quedando patente la amplia aplicación de estos mutantes. Finalmente, hay que señalar que el uso de estos sistemas líticos no se 122 Discusión Integradora restringe únicamente a la producción de PHAs, sino también a otros compuestos de interés producidos mediante fermentacion bacteriana. 3.2. Sistemas de producción de monómeros y oligómeros enantiopuros Como se ha comentado anteriormente, los monómeros y oligómeros de PHA son importantes componentes con considerables aplicaciones biotecnológicas. Se ha demostrado que algunos RHAs son compuestos con actividad antimicrobiana, insecticida, antiviral, e incluso se han descrito RHAs como agentes antitumorales como la hapalosina y el ONO-4007 (de Roo et al., 2002). Los RHAs son sintones para la fabricación de vitaminas, aromatizantes, antibióticos y feromonas. Así, por ejemplo, el (R)-3-hidroxibutirato se utiliza para la síntesis de Tienamicina y Captopril (Ohashi y Hasegawa, 1992) y el (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato es un intermediario muy importante en la fabricación del Lipitor, un medicamento para el control de los niveles de colesterol (Roth, 2002). En los últimos años, se han descrito diferentes métodos para la síntesis de RHAs. Por un lado, estas moléculas se pueden sintetizar químicamente, o bien se pueden obtener mediante hidrólisis química del PHA (Chen y Wu, 2005; Ren et al., 2010). Sin embargo, una alternativa más favorable para la obtención de RHAs es la despolimerización enzimática del polímero. En este caso, la hidrólisis del PHA se puede llevar a cabo in vivo o in vitro. La despolimerización del PHA in vivo se basa en la incubación de las bacterias en condiciones que favorecen la liberación de los RHAs al exterior celular, gracias a la actividad de despolimerasas intracelulares (Lee et al., 1999; Ren et al., 2005; Ruth et al., 2007; Wang et al., 2007; de Eugenio et al., 2010a). Por otro lado, la despolimerización in vitro del polímero se puede llevar a cabo mediante el uso de biocatalizadores celulares o enzimáticos, consistentes en bacterias productoras de despolimerasas extracelulares o bien de las despolimerasas purificadas, respectivamente (de Eugenio et al., 2010; Gangoiti et al., 2010). En este contexto, el estudio de la degradación del PHA en Bdellovibrio (Capítulos 1 y 2), ha permitido diseñar estrategias de gran interés para la producción de compuestos quirales. La actividad de PhaZBd a lo largo del crecimiento de Bdellovibrio sobre P. 123 Discusión Integradora putida KT2442 y E. coli acumulando PHA, provoca la liberación de RHAs al medio extracelular (Capítulo 2). Este novedoso sistema abre nuevas perspectivas para el diseño de sistemas industriales de producción de compuestos de interés como el PHA o los RHAs mediante el uso de bacterias depredadoras. Además, la despolimerasa de mcl-PHA de B. bacteriovorus HD100 caracterizada en esta Tesis es un potencial biocatalizador cuyo uso para la producción de intermediarios enantiopuros podría resultar de interés biotecnológico en la producción industrial de estos compuestos quirales (Capítulo 1) (ver apartado 2. “Degradación periplásmica del PHA” de la Discusión Integradora). Por otro lado, el estudio de despolimerasas de PHA resulta también interesante debido a su posible aplicación en la síntesis de polímeros en medio orgánico, tradicionalmente llevada a cabo por enzimas de la familia de las lipasas (Kumar et al., 2000; Santos et al., 2012). Finalmente, los resultados alcanzados en esta Tesis Doctoral suponen un importante avance para la producción de PHA a nivel industrial y han permitido el desarrollo de dos patentes. En la patente PCTES2010070858 (licenciada por Biopolis S.L.) se describe un sistema de autolisis celular en P. putida KT2440 que facilita la extracción y recuperación del gránulo de mcl-PHA acumulado en el interior celular (Anexo 2). La segunda patente está en vías de solicitud, y se refiere al uso de B. bacteriovorus HD100 como herramienta biotecnológica para lograr la lisis de cepas productoras de compuestos de interés, como el PHA o los intermediarios enantiopuros (Anexo 3). 124 V. CONCLUSIONES 126 Conclusiones El trabajo descrito a lo largo de esta Tesis Doctoral ha dado lugar a las siguientes conclusiones: 1. Se ha demostrado la capacidad de B. bacteriovorus HD100 para predar sobre la cepa de P. putida KT2442 acumulando gránulos de PHA. 2. La ORF Bd3709 de B. bacteriovorus HD100 codifica una exo-endo- despolimerasa específica de mcl-PHA (PhaZBd) que presenta una estructura típica de α/β hidrolasas. 3. El principal producto de la reacción in vitro es el dímero del ácido (R)-3- hidroxioctanoico, aunque también genera los monómeros y los trímeros. Por tanto, la proteína PhaZBd caracterizada podría utilizarse como biocatalizador para la producción de hidroxiácidos enantiopuros y sus derivados. 4. PhaZBd se acumula en su forma activa en el espacio periplásmico de las cepas recombinantes de E. coli y P. putida cuando el gen de la despolimerasa se expresa de manera heteróloga. 5. La despolimerasa PhaZBd se produce de manera constitutiva durante todo el ciclo de vida de B. bacteriovorus cuando preda sobre P. putida. 6. La caracterización de PhaZBd ha permitido reconsiderar la actual clasificación de las despolimerasas de PHA. Se proponen tres tipos de degradación del PHA: la degradación intracelular, la extracelular y la periplásmica. 7. B. bacteriovorus hidroliza parcialmente el PHA de la presa in vivo generando monómeros y oligómeros de PHA en proporción similar a la identificada en las reacciones de hidrólisis in vitro con la proteína purificada. 8. El número de progenie del depredador es plenamente dependiente de la biomasa residual de la presa (biomasa libre de PHA), y no del número de células o del contenido de PHA de la misma. 9. La depredación de cepas productoras de PHA supone una ventaja fisiológica para B. bacteriovorus en términos de velocidad natatoria y eficiencia en la depredación de nuevas presas. 10. El conocimiento derivado del estudio del catabolismo de los PHAs en Bdellovibrio ha permitido el desarrollo de un nuevo sistema de procesado de la 128 Conclusiones biomasa bacteriana, consistente en el uso de depredadores para la lisis celular en procesos de fermentación para la generación de bioproductos intracelulares. 11. Se ha desarrollado una cepa recombinante derivada de P. putida KT2440 (P. putida BXHL) que permite la extracción del PHA de forma controlada mediante la adición de un inductor de la lisis celular. 12. La cepa P. putida BXHL es un mutante tolB y porta un sistema de autolisis celular insertado en cromosoma compuesto por una holina (Ejh) y una enzima lítica (Ejl) del fago EJ-1 de S. pneumoniae. 129 VI. BIBLIOGRAFÍA 131 Bibliografía Abraham, G.A., Gallardo, A., San Román, J., Olivera, E.R., Jodra, R., García, B., Minambres, B., García, J.L. y Luengo, J.M. 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