Recolección Limpieza Molturación Batido Extracción - Sensibilidad a la luz/temperatura y separación compleja. Búsqueda de nuevos extractantes. - Técnicas útiles para determinar el poder antioxidante global, de un grupo, para un analito concreto o varios al mismo tiempo. Lo más indicado es plantear diferentes métodos. - Innovación y mejoras en nuevos métodos y en los disponibles por mejoras tecnológicas. - La cantidad de antioxidantes de las olivas es muy baja, proporcionalmente en cuanto a composición total, pero dentro del 1,5% de la porción insaponificable supone casi la totalidad y, debido a las importantes acciones, beneficios y utilidades de éstos hacen que el aceite sea acertadamente llamado “oro líquido” y las olivas uno de los alimentos indispensables en la dieta Mediterránea. - Las olivas y el aceite son una joya antioxidante de la que nos queda mucho por conocer. Búsqueda bibliográfica en bases de datos: PubMed, Google Académico, ScienceDirect, SciELO, Google Patents, Tesis Doctorales en Red, y en distintas webs como FAO, Brunswick Labs.; el Instituto de la Grasa y el Consejo Oleícola Internacional; y libros en internet de la biblioteca de Farmacia UCM. 1. Revisión bibliográfica de la determinación de antioxidantes en olivas y su aceite. 2. Conocer nuevos avances en la tecnología y enfoques analíticos para superar los retos que supone la determinación de antioxidantes en alimentos. MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTIOXIDANTES EN OLIVAS TRABAJO FIN DE GRADO. CONVOCATORIA FEBRERO 2018 Laura Diez de la Iglesia Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid Determinación Método Medición Fundamento Capacidad antioxidante por captación de radicales libres ORAC ORAC5 y ORAC6 (Capacidad antioxidante total) Total ORAC Total ORAC HORAC, NORAC SORAC, SOAC y CORAC Fluorimetría Pérdida de fluorescencia DPPH Radicales Espectrofotometría abs UV-visible Pérdida de fluorescencia DPPH⦁ + (AH)n→ DPPH-H + (A) ⦁ n Capacidad antioxidante reductora Folin-Ciocalteu (Fenoles totales) Oxidación polifenoles -OH → -φ Espectrofotometría abs UV-visible Mo 6+ a Mo5+ CUPRAC Oxidación polifenoles -OH → -φ Espectrofotometría abs UV-visible Reducción Cu2+ a Cu+ FRAP Transferencia electrones Espectrofotometría abs UV-visible Reducción Fe3+ → Fe2+ Incoloro → coloreado EXTRACTO ORAC HORAC NORAC SORAC SOAC Pureza (%) BDP (%) ORAC5 (µmol/TE/g) Curcumina 6211 8916 906 577 66292 98 <10 82922 Resveratrol 30499 81989 1330 266 43429 98 25 157513 Exto fenoles* 20501 34354 83 20924 3917 40 99 79779 Antioxidante Métodos Ensayo Compuestos fenólicos HPLC - Extracción SPE con metanol - HPLC con acetonitrilo y metanol Otros métodos: TLC, GC-FID, GC-MS, HPLC UV-visible, HPLC-DAD, Centrifugación y ultracentrifugación Vitamina E (α-tocoferol) HPLC-DAD 1. Saponificación 2. HPLC-DAD - Recta de calibrado - LC fase móvil metanol y agua - Estandar interno acetato de tocoferol Otros métodos: TLC-GC, NPC, RPC Escualeno GC - Extracción con hexano - Purificación LLE - Estandarización externa con escualeno Otros métodos: TLC, GC-MS, RP-HPLC (acetona:acetonitrilo 1/1), NP-HPLC (n-hexano7dietileter) CONCLUSIONES RESULTADOS Y DISCUSIÓN INTRODUCCIÓN METODOLOGÍA OBJETIVOS Tipo de Oliva Ácido oleico (%) Composición antioxidantes Estabilidad aceite (horas a 98,8ᴼC) Oxidación Arbequina 40,5 Alta 40,5 No estable Corniblanca 77,1 Alta 106,8 Muy estable Empeltre 69,6 Alta 58,3 Estable Hojiblanca 76,1 Baja 53,2 No estable Picual 78,4 Muy alta 119,4 Muy estable Picudo 63,4 Baja 37,6 No estable Tabla 2. Métodos espectrofotométricos para la determinación de la capacidad antioxidante de olivas y aceite de oliva. 50% Agua Componentes hidrosolubles - Fenoles - Flavonoides - Secoiridoides - Ácidos fenólicos 22% Aceite (grasas) Componentes liposolubles - Tocoferoles (α,β,γ,δ) - Carotenoides Hidratos de carbono 20% Otros 8% Fig. 2. Olea Europea L. Las olivas presentan una fracción saponificable que supone el 98,5% constituida por ácidos grasos libres y triglicéridos. La composición de los ácidos grasos variará según la especie, el tipo de cultivo y el clima. Los más abundantes son los monoinsaturados, ácido oleico en el 75%, que le dará una alta estabilidad al aceite y oliva y nos aportará efectos beneficiosos frente a diversas enfermedades. La fracción insaponificable corresponde a una concentración inferior al 1,5% donde están los antioxidantes. Oxidantes Especies reactivas de oxígeno (ROS) Oxígeno singulete O2 Radical anión superóxido O2 ⦁ - Peróxido de hidrógeno H2O2 Radical hidroxilo OH - Óxido nítrico NO Antioxidantes Las olivas tienen antioxidantes como: tocoferoles, escualeno, carotenoides y compuestos fenólicos (Simples: hidroxitirosol, tirosol, ácido vanílicos; Flavonoides: apigenina y luteolina; Complejos: aldehídos secoiridoides, verbascósidos. En algunas lignanos). Tabla 1. Composición de antioxidantes en diferentes variedades de olivas Recolección Limpieza Molturación Batido Extracción Fig. 3. Procesos sufridos por las olivas para la obtención del aceite. Fig. 1. Composición nutricional de la oliva. Tabla 4. Métodos cromatográficos de determinación de antioxidantes en olivas y aceite de oliva. Tabla 3. Base de datos de Brunswick Labs (USA).* extracto de fenoles Olivesan. Otros: como el método Rancimat, el método TBARS o el índice de anisidida. En el futuro podrían desarrollarse nuevos estudios como la técnica “in vitro” GAR BIBLIOGRAFÍA La saponificación de los ácidos grasos permite la separación de la materia insaponificable para eliminar la interferencia de los triglicéridos. Suele utilizarse metanol para la extracción pero se está investigando en extractantes seguros, inocuos y eficaces para intentar aprovechar el potencial terapéutico. Condiciones anaerobias o medios inertes (antioxidantes sensibles en condiciones alcalinas) Dependiendo de la especie de oliva y la época de recolección, la composición es variable y afectará a su sabor, color, estabilidad y oxidación y a si se consume como aceite u oliva de mesa y a su calidad alimentaria. 1Barranco D, et al. El cultivo del olivo. 7ª ed. Madrid: Mundi-Prensa. ProQuest Ebook Central; 2017 2Olives and olive oil in health and disease prevention. 1ªed. Preedy, V. R. Watson, R. R. (Eds). Amsterdam: Elsevier; 2010 3Instituto de la Grasa www.ig.csic.es 4Consejo Oleicola Internacional www.internationaloliveoil.org 5Oliveras MJ. Calidad del aceite de Oliva Virgen Extra. Antioxidantes y Función biológica. Universidad de Granada; 2005 6Samaniego C. Estudio y evaluación de la capacidad antioxidante de aceites de oliva virgen extra. Implicación en la salud Universidad de Granada; 2006 7Brunswick Labs. (USA) Brunswick Laboratories Database for ORAC 6.0 (replacing ORAC 5.0) and Cellular Antioxidant Assay (CAA) http://www.brunswicklabs.com/tech-library/orac-database-preface 8Girbés T, et al. Cuaderno de prácticas de Radicales libres y antioxidantes dieta. Facultad de Medicina, Universidad de Valladolid; 2010 9Quirantes R, et al. Técnicas de análisis del aceite de oliva. www.economiaandaluza.es