UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Secuenciación masiva de exoma en Esclerosis Múltiple familiar MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Laura Torre Fuentes Directores Jorge Matías-Guiu Guía Ulises Gómez Pinedo Jordi Matías-Guiu Antem Madrid © Laura Torre Fuentes, 2021 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Secuenciación masiva de exoma en Esclerosis Múltiple familiar MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Laura Torre Fuentes DIRECTOR Jorge Matías-Guiu Guía Ulises Gómez Pinedo Jordi Matías-Guiu Antem UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA SECUENCIACIÓN MASIVA DE EXOMA EN ESCLEROSIS MÚLTIPLE FAMILIAR LAURA TORRE FUENTES Dirigida por los doctores Jorge Matías-Guiu Guía Ulises Gómez Pinedo Jordi Matías-Guiu Antem III Agradecimientos Me gustaría dedicar unas líneas a todos los que han hecho posible este trabajo. En primer lugar, al Dr. Jorge Matías-Guiu Guía por involucrarme en este proyecto y por su dedicación en el mismo, enseñándome lo que estaba en su mano para el correcto desarrollo de este trabajo. Al Dr. Jordi Matías-Guiu Antem, por formar parte de este trabajo y aportar sus conocimientos al mismo. Por enseñarme a poner especial atención en los detalles. Al Dr. Ulises Gómez Pinedo por guiarme en el pensamiento científico de este trabajo. Por hacerme crecer y querer ser la mejor versión de mí misma. A la Dra. Elena Mª Vara Ameigeiras por ser la tutora de esta tesis y facilitar todo el proceso, estando atenta a cualquiera duda. Este trabajo no hubiera sido posible sin la colaboración de todos aquellos pacientes y familiares que han formado parte del mismo de forma desinteresada. A ellos, muchas gracias por seguir haciendo posible la ciencia y la investigación básica. Al equipo de NIMGenetics por formar parte de este proyecto. En especial a la Dra. Sara Álvarez y al Dr. Paolo Maietta que han estado siempre disponibles para cualquier duda o cambio. Ha sido un placer trabajar y aprender con vosotros. A la Dra. Vanesa Pytel, que ha facilitado el estudio clínico de todos los participantes y el desarrollo de este proyecto. Gracias por tus explicaciones clínicas y tu ánimo durante el proceso. Gracias a Mati y a Raquel, las enfermeras que han estado siempre dispuestas para realizar las extracciones. También gracias a todos los médicos, administrativos y IV auxiliares del hospital que de algún modo han participado y han dado su apoyo durante la realización de este trabajo. Al Dr. Raúl Sanz y la Dra. Nieves Gómez de ATG Medical, muchas gracias por hacerme un hueco y enseñarme tanto durante mi paso por vuestra empresa. Gracias por vuestra acogida y por el buen trato recibido. A cada una de las personas del laboratorio que han pasado por él y me han dado su apoyo. En especial a Marisol, por mostrar siempre su cara amable y por ayudar con las muestras y con lo que haga falta. Gracias también a Lidia, por buscar un hueco para ayudar en lo posible. Muchas gracias a todos los que no necesitan que les nombre y que saben quiénes son. Gracias por mostrar vuestro apoyo y comprensión y por hacer más fácil este camino. V Listado de abreviaturas ADN Ácido desoxirribonucleico AID Enfermedad autoinmune ARN Ácido ribonucleico ATP Adenosín trifosfato BAM del inglés Binary Alignment Map BOC Bandas oligoclonales CADD del inglés Combined Annotation Dependent Depletion CIS del inglés Clinically isolated síndrome (Síndrome clínico aislado) CMH Complejo mayor de histocompatibilidad DAMP del inglés Damage-associated molecular pattern (Patrón molecular asociado a daño) DBP del inglés Vitamin D-binding protein (Proteína de unión a la vitamina D) EAE Encefalitis autoinmune experimental EBV del inglés Epstein-Barr virus (Virus Epstein-Barr) EDSS del inglés Expanded disability status scale (Escala expandida del estado de discapacidad) EM Esclerosis múltiple EMPP Esclerosis múltiple primaria progresiva EMRR Esclerosis múltiple recurrente remitente EMSP Esclerosis múltiple secundaria progresiva FMF Fiebre mediterránea familiar GRCh37 del inglés Genome Reference Consortium Human build 37 GWAS del inglés Genome-wide association studies (Estudios de asociación del genoma completo) VI HGMD del inglés Human Gene Mutation Database HLA del inglés Human leukocyte antigen (Antígeno leucocitario humano) HWE Equilibrio de Hardy-Weinberg IC Intervalo de confianza IFN Interferón Ig Inmunoglobulina IGV del inglés Integrative genome viewer IL Interleuquina IMSGC del inglés International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (Consorcio Internacional de Genética en Esclerosis Múltiple) LCR Líquido cefalorraquídeo MAF del inglés Minor allele frequency (Frecuencia del alelo minoritario) miARN microARN NAWN del inglés Normal-appearing white matter (Sustancia blanca de apariencia normal) NCBI del inglés National Center for Biotechnology Information NF-κB del inglés nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas) NfL Neurofilamentos NGS del inglés Next-Generation Sequencing (Secuenciación de última generación) NK del inglés Natural killer cells NLR del inglés Nucleotide-binding domain leucine-rich repeat receptors (receptores con dominio de unión a nucleótidos que contienen repeticiones ricas en leucina) OR del inglés Odds ratio PAMP del inglés Pathogen-associated molecular pattern (Patrón molecular asociado a patógeno) pb Pares de bases PET del inglés Positron-emission tomography (Tomografía por emisión de positrones) RM Resonancia magnética VII SNC Sistema nervioso central SNP del inglés Single nucleotide polymorphism (polimorfismo de un solo nucleótido) Th del inglés T helper cells (linfocitos T colaboradores) TLR del inglés Toll-like receptor TNF del inglés Tumor necrosis factor (Factor de necrosis tumoral) TRAF del inglés Tumor necrosis factor receptor-associated factor (Factor asociado al receptor del factor de necrosis tumoral) UCSC University of California Santa Cruz VCF del inglés Variant Call Format VD Vitamina D VDR Receptor de la vitamina D VDRE Elementos de respuesta a la vitamina D WES del inglés Whole-exome sequencing (Secuenciación del exoma completo) WGS del inglés Whole-genome sequencing (Secuenciación del genoma completo) VIII Índice de tablas Tabla 1.1. Riesgo de desarrollar EM de acuerdo al parentesco familiar ......................33 Tabla 4.1. Características demográficas y clínicas del grupo de casos con EM .........73 Tabla 4.2. Características demográficas y clínicas del grupo de casos con otras AID ............................................................................................................................................73 Tabla 4.3. Características demográficas y clínicas del grupo de individuos no afectos ............................................................................................................................................75 Tabla 4.4. Características demográficas y clínicas de los casos con EM en las familias tipo A ................................................................................................................................76 Tabla 4.5. Características demográficas y clínicas de los casos con EM en las familias tipo B ................................................................................................................................79 Tabla 4.6. Características demográficas y clínicas de los casos con EM agrupados según su pertenencia a familias tipo A o B ........................................................83 Tabla 4.7. Genes estudiados y su correspondiente identificación mediante el transcrito elegido en cada caso ..............................................................................83 Tabla 4.8. Características de las variantes no sinónimas con valores de OR mayores de 2 o menores de 0,5 al comparar los pacientes con EM frente a los individuos no afectados por la enfermedad ......................................................89 Tabla 4.9. Características de las variantes no sinónimas con valores de OR mayores de 2 o menores de 0,5 al comparar casos con EM y casos con otras AID frente a individuos no afectos ................................................................................91 Tabla 4.10. Variantes genéticas con diferencias en la presentación de homocigosis ............................................................................................................................................94 IX Tabla 4.11. Características y frecuencias de las variantes obtenidas tras el proceso de priorización .............................................................................................................96 Tabla 4.12. Relación de las familias estudiadas con las variantes genéticas ........... 105 Tabla 5.1. Limitaciones asociadas a los GWAS .................................................................... 109 Tabla 5.2. Principales estudios realizados con anterioridad mediante WES en familias con esclerosis múltiple .......................................................................... 144 X Índice de figuras Figura 1.1. Paso de linfocitos a través de la barrera hematoencefálica .......................... 8 Figura 1.2. Interacción de los factores de riesgo asociados a la EM ...............................11 Figura 1.3. Esquema de la vía de señalización de la vitamina D ......................................14 Figura 1.4. Organización y localización de los genes HLA en el cromosoma 6 ..........17 Figura 1.5. Diferencias entre los estudios de ligamiento y los estudios de asociación ............................................................................................................................................36 Figura 1.6. Mapa genético de la esclerosis múltiple .............................................................40 Figura 1.7. Relación genética entre distintas enfermedades autoinmunes ................43 Figura 3.1. Esquema de la clasificación de familias realizada ..........................................52 Figura 3.2. Proceso de extracción de ADN genómico mediante el sistema MagNA Pure ...................................................................................................................................53 Figura 3.3. Diagrama de la preparación de las librerías .....................................................55 Figura 3.4. Tecnología de secuenciación Ion Torrent ..........................................................56 Figura 3.5. Extracto del cuerpo de un archivo VCF ...............................................................57 Figura 3.6. Ejemplo de búsqueda del gen NLRP3 en la base de datos HGMD .............61 Figura 3.7. Visualización de una variante genética mediante el programa IGV ........66 Figura 4.1. Frecuencia de individuos por grupos ..................................................................70 Figura 4.2. Clasificación de las familias según las generaciones que se encuentran afectadas por la enfermedad ...................................................................................71 Figura 4.3. Frecuencia de las formas clínicas de EM ............................................................72 XI Figura 4.4. Frecuencia de las enfermedades autoinmunes presentes en el grupo con otras AIDs .......................................................................................................................74 Figura 4.5. Árboles genealógicos correspondientes a las 14 familias del tipo A .......78 Figura 4.6. Árboles genealógicos correspondientes a las 9 familias del tipo B .........82 Figura 4.7. Clasificación de las variantes genéticas según el tipo de efecto de las variantes y la región en la que se localizan .......................................................86 Figura 4.8. Esquema de priorización de variantes genéticas de los genes involucrados en la vía metabólica de la vitamina D, la vía de señalización del factor de necrosis tumoral y la vía de señalización del inflamasoma ............................................................................................................................................95 Figura 4.9. Representación de la segregación familiar de las variantes rs34355135 (c.11092G>A) del gen LRP2 y rs141172155 (c.620G>A) del gen METTL21B ......................................................................................................................97 Figura 4.10. Representación de la segregación familiar de la variante rs35041805 (c.784C>T) del gen TNFRSF19 ................................................................................99 Figura 4.11. Representación de la segregación familiar de la variante rs4149584 (c.362G>A) del gen TNFRSF1A ............................................................................ 100 Figura 4.12. Representación de la segregación familiar de la variante rs761774576 (c.1136G>A) del gen NFKB1 ................................................................................. 101 Figura 4.13. Representación de la segregación familiar de la variante rs2230625 (c.1204A>G) del gen TNFRSF8 ............................................................................ 102 Figura 4.14. Representación de la segregación familiar de la variante genética rs116270651 (c.277G>A) del gen IFI16 .......................................................... 103 Figura 4.15. Representación de la segregación familiar de la variante rs28360472 (c.944A>G) del gen P2RX4 .................................................................................... 104 Figura 5.1. Vías de señalización del receptor TNFR1 ....................................................... 123 Figura 5.2. Activación y señalización del inflamasoma NLRP1 en el SNC ................. 131 XII Índice Agradecimientos ................................................................................................................... III Listado de abreviaturas ...................................................................................................... V Índice de tablas .................................................................................................................. VIII Índice de figuras .....................................................................................................................X 1. Introducción ........................................................................................................................ 1 1.1. Definición ................................................................................................................................... 1 1.2. Epidemiología ........................................................................................................................... 1 1.3. Síntomas y diagnóstico. Clínica de la EM ....................................................................... 2 1.4. Fisiopatología y etiopatogenia de la enfermedad ....................................................... 3 1.4.1. Inmunidad innata en la EM ......................................................................................... 4 1.4.2. Desarrollo de la EM ........................................................................................................ 7 1.5. Tratamiento ............................................................................................................................... 9 1.6. Factores de riesgo en EM ...................................................................................................10 1.6.1. Factores ambientales ...................................................................................................11 1.6.2. Factores genéticos ........................................................................................................15 1.6.3. Factores epigenéticos ..................................................................................................19 1.7. Biomarcadores en EM .........................................................................................................22 1.7.1 Biomarcadores de imagen ..........................................................................................23 1.7.2. Biomarcadores de líquido cefalorraquídeo y sangre ......................................27 1.7.3. Biomarcadores genómicos ........................................................................................29 1.8. Genética de la esclerosis múltiple ...................................................................................31 1.8.1. Abordaje epidemiológico ...........................................................................................32 1.8.2. Abordaje genético .........................................................................................................34 1.8.3. Estudios de ligamiento ................................................................................................37 XIII 1.8.4. Estudios de asociación del genoma completo ....................................................38 1.8.5. Secuenciación de nueva generación ......................................................................45 1.9. Justificación de la investigación.......................................................................................48 2. Hipótesis y objetivos ...................................................................................................... 49 3. Materiales y métodos .................................................................................................... 50 3.1. Diseño del estudio .................................................................................................................50 3.2. Población de estudio ............................................................................................................50 3.3. Período de estudio ................................................................................................................50 3.4. Evaluación clínica ..................................................................................................................50 3.5. Secuenciación completa de exoma .................................................................................52 3.5.1. Extracción de las muestras de sangre ...................................................................52 3.5.2. Extracción de ADN ........................................................................................................52 3.5.3. Control de calidad de las muestras ........................................................................53 3.5.4. Preparación de las librerías y control de calidad .............................................53 3.5.6. Secuenciación .................................................................................................................55 3.6. Análisis bioinformático .......................................................................................................56 3.6.1. Tratamiento de los datos brutos de secuenciación ..........................................56 3.6.2. Combinación de los VCFs ...........................................................................................57 3.6.3. Anotación funcional de variantes ...........................................................................58 3.6.4. Selección de los genes de estudio ...........................................................................60 3.6.5. Análisis de coberturas .................................................................................................62 3.6.6. Priorización de variantes ...........................................................................................62 3.6.7. Visualización de las variantes genéticas ..............................................................65 3.7. Análisis estadístico ...............................................................................................................66 3.8. Aspectos éticos .......................................................................................................................68 4. Resultados ......................................................................................................................... 69 4.1. Características de la población de estudio ..................................................................69 4.1.1. Características generales ...........................................................................................69 4.1.2. Características del grupo con EM ............................................................................71 4.1.3. Características del grupo con otras AID ...............................................................73 4.1.4. Características del grupo no afecto ........................................................................75 4.1.5. Características de las familias tipo A .....................................................................75 XIV 4.1.6. Características de las familias tipo B .....................................................................79 4.1.7. Comparación de las familias A y B ..........................................................................82 4.2. Análisis genéticos ..................................................................................................................83 4.2.1. Descripción de las variantes genéticas .................................................................83 4.2.2. Comparación de las variantes genéticas entre los grupos ............................88 4.2.3. Variantes genéticas en homocigosis ......................................................................93 4.2.4. Priorización de variantes ...........................................................................................94 4.2.5. Segregación familiar.....................................................................................................97 5. Discusión ......................................................................................................................... 107 5.1. Limitaciones de los GWAS .............................................................................................. 107 5.2. Características demográficas y clínicas de la población de estudio ............... 110 5.2. Análisis de la secuenciación completa de exoma ................................................... 112 5.3. Vía metabólica de la vitamina D ................................................................................... 113 5.3.1. METTL21B ..................................................................................................................... 116 5.3.2. LRP2 ................................................................................................................................. 117 5.4. Vía de señalización del TNF ........................................................................................... 118 5.4.1. TNFRSF8 y TNFSF11 .................................................................................................. 119 5.4.2. TNFAIP6 ......................................................................................................................... 121 5.4.3. TNFRSF1A ...................................................................................................................... 121 5.4.4. TNFRSF19 y NFKB1 .................................................................................................... 125 5.5. Vía de señalización del inflamasoma .......................................................................... 128 5.5.1. Receptores purinérgicos y NOD2 ......................................................................... 130 5.5.2. TLR10 .............................................................................................................................. 135 5.5.3. NLRP2 y NLRP11 ......................................................................................................... 136 5.5.4. NLRP6 e IFI16 .............................................................................................................. 138 5.5.5. MEFV ............................................................................................................................... 140 5.6. Comparación entre la EM familiar y a la EM esporádica .................................... 142 5.7. Consideraciones finales y perspectivas futuras ..................................................... 143 5.8. Limitaciones ......................................................................................................................... 147 6. Conclusiones .................................................................................................................. 149 Resumen… ........................................................................................................................... 151 Introducción ................................................................................................................................. 151 XV Materiales y métodos ................................................................................................................ 152 Resultados ..................................................................................................................................... 152 Discusión ........................................................................................................................................ 153 Conclusiones ................................................................................................................................. 154 Abstract…… ......................................................................................................................... 155 Introduction .................................................................................................................................. 155 Material and methods ............................................................................................................... 155 Results ............................................................................................................................................ 156 Discussion...................................................................................................................................... 157 Conclusions ................................................................................................................................... 157 Bibliografía ......................................................................................................................... 158 Anexos………… ..................................................................................................................... 193 1 1. Introducción 1.1. Definición La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por lesiones desmielinizantes (Nicholas & Rashid, 2013; Yamout & Alroughani, 2018). A su vez, está considerada la causa más frecuente de discapacidad neurológica en adultos jóvenes, lo que supone una pérdida en la calidad de vida de los pacientes y sus familias (Faguy, 2016). 1.2. Epidemiología Los síntomas de la EM comienzan a menudo entre los 20 y los 40 años aunque pueden ocurrir a cualquier edad (Bishop & Rumrill, 2015; Didonna & Oksenberg, 2015). La enfermedad es tres veces más frecuente en mujeres que en hombres (Bishop & Rumrill, 2015; Goodin, 2016; Yamout & Alroughani, 2018) y se encuentra presente en todas las poblaciones del planeta (Howard, Trevick, & Younger, 2016; Yamout & Alroughani, 2018). La prevalencia e incidencia de la enfermedad han aumento de manera global en los últimos años (Koch-Henriksen & Sørensen, 2010), aunque varían significativamente según la región geográfica, incrementando a medida que aumenta la distancia desde el ecuador, siendo Norteamérica y Europa las regiones con mayor tasa de prevalencia de EM (Amato et al., 2017; Faguy, 2016). Por el contrario, los niveles más bajos de prevalencia de la EM se sitúan en el este de Asia y en África subsahariana (Howard et al., 2016; Leray, Moreau, Fromont, & Edan, 2016). A pesar de esta tendencia observada durante muchos años, la incidencia de la EM también está incrementando en las áreas meridionales del planeta. Sin embargo, determinadas regiones siguen siendo excepciones, ya que presentan un predominio mayor de los casos de EM, como el sur de Canadá, el norte de Estados 2 Unidos, los países escandinavos y las islas británicas (Howard et al., 2016; Pérez- Carmona, Fernández-Jover, & Sempere, 2019). Los datos varían según las distintas regiones, pero se estima que la prevalencia media en Europa se encuentra en 83 casos por 100.000 habitantes (Pugliatti et al., 2006). En España también se han realizado diferentes estudios epidemiológicos para conocer la incidencia y la prevalencia de la EM. El aumento de la prevalencia que se ha observado en los últimos años a nivel mundial también se refleja en España, colocándola como una región con una prevalencia media-alta y tasas de entre 47,7 y 79 casos por 100.000 habitantes. Aunque el número de estudios de incidencia de la EM realizados ha sido menor, esta se estima entre 2,8 a 5,5 nuevos casos por 100.000 habitantes al año (Bártulos Iglesias, Marzo Sola, Estrella Ruiz, & Bravo Anguiano, 2015; Izquierdo, Venegas, Sanabria, & Navarro, 2015; Mallada Frechín et al., 2000; Matias‐Guiu et al., 1990; Pérez-Carmona et al., 2019; Uria et al., 1997). 1.3. Síntomas y diagnóstico. Clínica de la EM Los síntomas de la EM son variables y pueden manifestarse por separado o como una combinación de ambos. Los síntomas más comunes en la enfermedad incluyen fatiga, rigidez muscular, espasmos musculares, temblores, entumecimiento, mareos, parálisis, anomalías visuales, déficits cognitivos (como problemas de memoria y capacidad atencional reducida) depresión o cambios de humor (Faguy, 2016). Los criterios diagnósticos para la EM han ido cambiando y actualizándose a lo largo del tiempo desde que surgieran los primeros criterios diagnósticos de McDonald en 2001 (W. I. McDonald et al., 2001). Recientemente, en el 2017, se realizó la última revisión de los criterios, que son los empleados actualmente (Thompson, Banwell, et al., 2018). Estos criterios se basan en la presentación clínica con síntomas y señales relacionados a lesiones de desmielinización. El diagnóstico se realiza a través de la combinación de la historia clínica, el examen neurológico, las imágenes de resonancia magnética (RM) y los resultados de los análisis en el laboratorio (Gelfand, 2014; Sand, 2015; Thompson, Baranzini, Geurts, Hemmer, & Ciccarelli, 2018). 3 La presentación clínica de la EM en los pacientes es variable. De acuerdo al curso clínico de la enfermedad, ésta se clasifica en tres tipos: EM recurrente-remitente (EMRR), EM secundaria progresiva (EMSP) y EM primaria progresiva (EMPP). La forma EMRR, la más frecuente (85%), presenta un curso clínico caracterizado por la aparición de episodios o brotes que conllevan disfunción neurológica. Los pacientes con EMRR, tras los brotes, pueden tener una recuperación total o parcial con un curso estable entre los episodios. (Bendszus & Storch-Hagenlocher, 2013; Correale, Gaitán, Ysrraelit, & Fiol, 2017; Lublin & Reingold, 1996). Tras 10-15 años de evolución, un 70% de estos pacientes evoluciona a una forma progresiva de la enfermedad correspondiente a la EMSP (Correale et al., 2017; Ontaneda, Thompson, Fox, & Cohen, 2017). Un tercer grupo de pacientes con EM, entre el 10% y el 15%, muestra un curso progresivo de la enfermedad que corresponde a la forma clínica EMPP. En estos pacientes se evidencia una progresión desde el inicio de la enfermedad, además de presentar un comienzo más tardío, en torno a los 40 años de edad (Gajofatto, Turatti, & Benedetti, 2017; Ontaneda, 2019; Salter, Thomas, Tyry, Cutter, & Marrie, 2018). 1.4. Fisiopatología y etiopatogenia de la enfermedad La etiología y la patogénesis de la EM son complejas y muchos aspectos permanecen aún desconocidos. Entre los factores implicados en la enfermedad se encuentran los factores genéticos o los factores ambientales y su conjunto provoca la pérdida de la homeostasis y de la autotolerancia inmune (Baranzini & Oksenberg, 2017). A pesar de las diferencias en la etiología de la enfermedad, hoy en día se sabe que se producen tres procesos principales: la inflamación, la desmielinización y la neurodegeneración. Esta última representa el factor clave que promueve la discapacidad y la disminución de la calidad de vida de los pacientes. Aunque existe heterogeneidad en su manifestación clínica, una característica fundamental en los pacientes con EM es la aparición sucesiva de lesiones focales inflamatorias, denominadas placas, en la sustancia blanca del sistema nervioso central (SNC) que causan desmielinización, destrucción axonal y formación de cicatrices astrocíticas reactivas. Mientras que el proceso de la enfermedad comienza con lesiones desmielinizantes focales impulsadas por la inflamación, con el tiempo se produce 4 una neurodegeneración difusa que afecta a todo el SNC. (Gruchot et al., 2019; Lassmann & Van Horssen, 2011; Yamasaki & Kira, 2019). Para entender el desarrollo de la EM es esencial conocer el papel fundamental que juega el sistema inmune. Así, las lesiones inflamatorias desmielinizantes mencionadas poseen una variación de características patológicas e inmunológicas que se diferencian por presentar infiltrados perivasculares que contienen células T CD8+ y, en menor medida, células T CD4+ (Th), células T γδ, monocitos, células B y células plasmáticas (Nylander & Hafler, 2012). Esta caracterización ha ayudado a entender y sugerir las diferentes hipótesis de mecanismos patogénicos que suceden en la EM. Aunque aún se desconoce cómo se origina la reacción inflamatoria, los distintos autores coinciden que se produce una activación persistente periférica de las células T autorreactivas. (Garg & Smith, 2015; G. F. Wu & Alvarez, 2011; Yamasaki & Kira, 2019). Estos hallazgos, junto con los estudios realizados en el modelo de la encefalitis autoinmune experimental (EAE), han conducido a centrar el estudio de la inmunidad de la EM en la inmunidad adaptativa. La activación de las células T CD4+ por las células presentadoras de antígenos a través del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II ha sido considerada tradicionalmente como el factor desencadenante de la cascada inmunopatogénica. Sin embargo, de manera reciente también se han destacado otras células inmunitarias o mecanismos, como las células T CD8+ o las células B (Disanto, Morahan, Barnett, Giovannoni, & Ramagopalan, 2012). De igual modo, diferentes investigaciones han destacado que la inmunidad innata juega un papel en la patogénesis de la enfermedad, debido, principalmente, a su función efectora sobre las células T y B (Gandhi, Laroni, & Weiner, 2010). 1.4.1. Inmunidad innata en la EM La inmunidad innata actúa como la primera barrera de defensa del organismo frente a patógenos y la actividad de las células involucradas en ella influye de manera principal sobre la función de las células T y B. Dentro de este grupo de células se encuentran las células dendríticas, las células natural-killer (NK) y las células microgliales y macrófagos, entre otras. 5 Células dendríticas Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígenos que, junto con los macrófagos, actúan en la primera línea de defensa en la inmunidad innata. Son capaces de reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, por sus siglas en inglés pathogen-associated molecular patterns) y patrones moleculares asociados a daño (DAMP, por sus siglas en inglés danger-associated molecular patterns) gracias a los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que presentan en su superficie. Entre los receptores encargados de reconocer estas señales los receptores tipo Toll (TLR, por sus siglas en inglés toll-like receptors) y los receptores tipo NOD (NLR, por sus siglas en inglés NOD-like receptors) son los más caracterizados. Como resultado de la activación de estos receptores se estimulan cascadas de señalización intracelulares que conllevan el inicio de la respuesta inflamatoria (Kelly & O’Neill, 2015). Entre las principales funciones de las CD se encuentra la presentación de antígenos mediante el complejo mayor de histocompatibilidad a las células T, esencial para la diferenciación de éstas en células T efectoras o células T reguladoras. Además, las CD pueden activar y afectar a la función de las células NK (Gandhi et al., 2010). Las CD presentan funciones críticas para el inicio y el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Dado el papel relevante de estas, no es de extrañar que estén presentes en las lesiones desmielinizantes de pacientes con EM o que se observe una mayor presencia de estas células en el LCR de pacientes respecto a controles (Henderson, Barnett, Parratt, & Prineas, 2009; G. F. Wu & Laufer, 2007). Asimismo, se ha observado que las CD poseen una actividad alterada en los pacientes con EM. De este modo, se ha evidenciado que los pacientes con EM presentan una alteración de la activación de los PRR en este tipo de células así como de los productos que se expresan tras la activación de esta señalización (Bayas et al., 2009) y, además, se ha observado que las células aisladas de muestras de pacientes presentan un perfil proinflamatorio activado en el que producen mayor cantidad de citoquinas proinflamatorias como son el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α, por sus siglas en inglés tumor necrosis factor), el interferón gamma (IFN-γ) o la interleuquina 6 (IL-6) (Huang et al., 1999; G. F. Wu & Laufer, 2007). Microglía y macrófagos 6 La microglía y los macrófagos son las principales células del sistema inmune en el SNC. Los macrófagos son células del sistema inmune innato que se encuentran en todos los tejidos del cuerpo humano con fenotipos distintos que ayudan a regular la homeostasis de los distintos órganos. Además de formar parte de la primera línea de defensa también participan en el inicio y en el control de la respuesta inmune adaptativa. Entre sus funciones se encuentra la producción de citoquinas proinflamatorias como el TNF-α, la IL-12, la quimioquina 10 con motivo CXC (CXCL10) y la quimioquina 2 con motivo CC (CCL2). Dado que pertenecen al grupo de células fagocíticas también actúan eliminando los restos de tejidos y las células apoptóticas. Asimismo, estas células participan en la regulación de la actividad inflamatoria mediante la producción de citoquinas antiinflamatorias (Chu et al., 2018). Por su parte, la microglía representa a las principales células del sistema inmune innato residentes en el SNC y sus funciones se centran, al igual que los macrófagos, en regular la homeostasis y la defensa del huésped frente a patógenos (Hickman, Izzy, Sen, Morsett, & El Khoury, 2018; Prinz, Jung, & Priller, 2019). A pesar de que la microglía es la encargada de la protección en el SNC, también se encuentra involucrada en el desarrollo y la progresión de desórdenes neurológicos. Así, en la EM la microglía promueve la neuroinflamación, la desmielinización y la neurodegeneración (Bogie, Stinissen, & Hendriks, 2014). Estas células responden rápidamente a los cambios que se producen en el SNC y provocan la neuroinflamación mediante la secreción de diferentes citoquinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-18 (Prinz et al., 2019). Igualmente, liberan proteasas y especies reactivas de oxígeno causando toxicidad tanto a las neuronas como a los precursores de oligodendrocitos, tal y como se ha observado en el modelo de ratón con EAE. Las células de la microglía se han encontrado en zonas de lesión que presentan una desmielinización activa. Sin embargo, también se ha observado que presentan un fenotipo anti-inflamatorio y que son capaces de promover la regeneración axonal y la remielinización (Hickman et al., 2018). Tanto los macrófagos como la microglía son células multifuncionales que a menudo cambian de estado según el ambiente en el que se encuentran (Chu et al., 2018). 7 Células natural killer Las células natural killer (NK) son linfocitos efectores pertenecientes al sistema inmune innato y conocidos por su actividad antiviral y anticancerígena. Entre sus funciones efectoras ejercen citotoxicidad hacia las células diana y son grandes productoras de la citoquina IFN-γ. Asimismo, pueden regular el desarrollo de la respuesta inmune adaptativa (Gardiner & Finlay, 2017). Al igual que con los macrófagos y la microglía, las células NK tienen un papel controvertido en la EM y el modelo de EAE, ya que se ha observado que estas células presentan un papel tanto protector como perjudicial (Mimpen, Smolders, Hupperts, & Damoiseaux, 2020). En uno de los estudios llevados a cabo se ha observado que pacientes con EM presentan una menor actividad funcional de estas células que en individuos sanos y, además, los periodos en los que se observaba esta reducción de NK en la sangre se asociaban con una mayor tendencia a presentar recaídas en estos pacientes (Høglund & Maghazachi, 2014). 1.4.2. Desarrollo de la EM Dos principales hipótesis se discuten como posibles causas de la activación de las células T autorreactivas a nivel periférico. Esta activación puede producirse mediante un mecanismo de mimetismo molecular, referido al proceso por el que se produce una respuesta cruzada por un epítopo común entre un patógeno y un autoantígeno (Podbielska, O’Keeffe, & Hogan, 2018; Sospedra & Martin, 2006). Así, por ejemplo, la presencia de linfocitos dentro de las placas desmielinizantes y en las áreas adyacentes sugiere que la destrucción inflamatoria se debe a la pérdida de la autotolerancia hacia la mielina y otros antígenos del SNC (Garg & Smith, 2015). Otra posible causa es que se produzca la activación de las células inmunes a través de antígenos de patógenos infecciosos, como bacterias o virus (Brocke, Piercy, & Steinman, 1996; Libbey, Cusick, & Fujinami, 2014). La activación a nivel periférico de las células T CD4+ provoca un reclutamiento de otras células del sistema inmune (células CD8+, células B, granulocitos, monocitos y mastocitos) mediante un aumento de la respuesta inmune. Las células T CD4+ activadas y las células proinflamatorias producen citoquinas proinflamatorias tales como IL-1, TNF-α e IFN-γ (Disanto et al., 2012; Sospedra & Martin, 2005; G. F. Wu & 8 Alvarez, 2011). La secreción de citoquinas proinflamatorias puede alterar la organización molecular de la barrera hematoencefálica (BHE) afectando a la expresión de ocludina y otros elementos de unión de la BHE y provocando una permeabilidad aumentada en la EM (Minagar & Alexander, 2003). Las citoquinas proinflamatorias inducen la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio como la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), la molécula de adhesión vascular 1 (VCAM-1), la molécula de adhesión de plaquetas y células endoteliales 1 (PECAM-1) y diferentes selectinas. Gracias a la acción de las selectinas, las células T establecen contacto con las células endoteliales, lo que provoca una ralentización de los linfocitos a lo largo de la pared vascular. Este contacto se produce por la activación de integrinas o moléculas de adhesión en las células T, como el antígeno asociado a la función linfocitaria 1 (LFA-1) y el antígeno muy tardío tipo 4 (VLA-4) (también llamado integrina α4β1), y su reconocimiento por los receptores del endotelio, ICAM-1 y VCAM-1. Además, las citoquinas proinflamatorias también inducen la segregación de metaloproteasas por parte de los linfocitos permitiendo la degradación de la matriz extracelular, del colágeno y de la fibronectina, facilitando la entrada de las células T, células B y macrófagos al SNC (figura 1.1) (Archelos, Previtali, & Hartung, 1999; Butcher & Picker, 1996; Domínguez Moreno, Morales Esponda, Rossiere Echazarreta, Olan Triano, & Gutiérrez Morales, 2012; Minagar & Alexander, 2003; Rosenberg, 2002). Figura 1.1. Paso de linfocitos a través de la barrera hematoencefálica. Los linfocitos se adhieren a la BHE mediante integrinas. La segregación de metaloproteasas produce la 9 alteración de la BHE y con ella el paso de las células inmunitarias. BHE: barrera hematoencefálica; SNC: sistema nervioso central. Una vez en el SNC, las células T son reactivadas a través del contacto con péptidos del CMH clase II expresados en las células presentadoras de antígenos (APC), que pueden ser células dendríticas, macrófagos y células B. Esta reactivación provoca una cascada inflamatoria en la que se desarrollan dos tipos de respuestas. Por un lado, las células T CD4+ helper 1 (Th1) liberan citoquinas proinflamatorias, IFN-γ, IL-2 y TNF-α, que son las principales señales mediadoras de la inflamación. Por otro lado, las células T CD4+ helper 2 (Th2) secretan interleuquinas 4, 5 y 10 encargadas de regular el daño causado por las células Th1. Esta cascada inflamatoria provoca el reclutamiento de células T, monocitos y células B, generando una activación continua de la microglía y de los macrófagos. Aunque aún se desconoce el mecanismo exacto de desmielinización y daño axonal, los macrófagos dan inicio a las primeras lesiones en la EM, promoviendo la desmielinización y el daño en los oligodendrocitos, potenciado por el daño causado por las células T CD8+ y las células B (Hernández-Pedro, Espinosa-Ramirez, De La Cruz, Pineda, & Sotelo, 2013; Ortiz et al., 2014; G. F. Wu & Alvarez, 2011). Muchos de los avances y conocimientos sobre la EM se deben al uso de modelos experimentales. A día de hoy no existe un modelo que haya conseguido asemejar por completo la enfermedad. No obstante, el uso de diferentes modelos in vitro e in vivo ha permitido alcanzar diferentes aproximaciones que reflejan distintos aspectos de la patología de la enfermedad. El modelo experimental más empleado, mencionado con anterioridad, es la EAE que ha proporcionado conocimiento sobre gran parte del mecanismo inmunológico de la enfermedad y hoy en día sigue siendo uno de los más utilizados (Torre-Fuentes et al., 2017). 1.5. Tratamiento Los dos objetivos principales en el tratamiento de la enfermedad son disminuir la progresión de la enfermedad y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Gracias al uso de diferentes modelos experimentales que han ampliado el conocimiento sobre la patogenia de la enfermedad, ha sido posible el desarrollo de diferentes tipos 10 de tratamientos según el abordaje terapéutico de cada uno de ellos. Por ello, los tratamientos para la EM están divididos en tres grupos: los primeros enfocados a disminuir la gravedad de los brotes y acelerar la recuperación de los mismos; en segundo lugar los enfocados a reducir la frecuencia de los brotes y prevenir la progresión de la discapacidad, conocidos como las terapias modificadoras de la enfermedad y, por último los empleados para aliviar los síntomas de la enfermedad (Bishop & Rumrill, 2015; Yamasaki & Kira, 2019). En general se emplea el uso de corticoesteroides para el tratamiento de los brotes, como la metilprednisolona intravenosa. Aunque, debido a la ineficacia de estos tratamientos frente a la progresión de la discapacidad, no son empleados para largos periodos de tiempo (Yamasaki & Kira, 2019). Los tratamientos modificadores de la enfermedad son los más empleados en los pacientes con EM y pueden tener efectos sobre la disminución de la tasa de brotes, sobre la reducción de la progresión de la discapacidad y sobre el acúmulo de lesiones. Entre estos tratamientos se encuentran: interferón-beta (INF-β) -1a y -1b, acetato de glatirámero, dimetil fumarato, fingolimod, natalizumab, teriflunomida, alemtuzumab, daclizumab y ocrelizumab. Presentan diferentes dianas biológicas como puede ser la inmunomodulación (interferón-beta, daclizumab), el descenso selectivo de linfocitos (alemtuzumab, ocrelizumab) o el tráfico de linfocitos (natalizumab) (Soleimani, Murray, & Hunt, 2019). 1.6. Factores de riesgo en EM Los diferentes estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto la variabilidad de casos con EM en las diferentes latitudes y zonas geográficas. La EM es considerada una enfermedad compleja o poligénica en la que intervienen diferentes factores ambientales, genéticos y epigenéticos (figura 1.2) (Oksenberg & Baranzini, 2010). 11 Figura 1.2. Interacción de los factores de riesgo asociados a la EM (Modificado de Oksenberg & Baranzini, 2010). 1.6.1. Factores ambientales A lo largo de la historia de la enfermedad se han asociado diferentes factores ambientales que pueden contribuir a una mayor susceptibilidad de la enfermedad. Los factores de riesgo ambientales que más se han asociado a la EM son los niveles bajos de vitamina D o baja exposición solar, el tabaquismo y la infección provocada por el virus Epstein-Barr (Ascherio & Munger, 2007a, 2007b; Belbasis, Bellou, Evangelou, Ioannidis, & Tzoulaki, 2015). Aun así, otros factores ambientales han sido relacionados, como la obesidad, una dieta alta en sal, la microbiota (Olsson, Barcellos, & Alfredsson, 2016) o incluso presentar otra enfermedad autoinmune como la tiroiditis, la diabetes tipo I o la enfermedad inflamatoria intestinal (Faguy, 2016). Vitamina D Las regiones en las que se presenta más incidencia de EM destacan por una menor exposición solar que otras zonas. En estas áreas se ha encontrado una asociación de los bajos niveles tanto de exposición solar como de vitamina D (VD) con un riesgo 12 aumentado de susceptibilidad a la EM (Pierrot-Deseilligny & Souberbielle, 2017; C. Zheng, He, Liu, Zhu, & Jin, 2018). Además diferentes trabajos han señalado unos menores niveles de vitamina D en pacientes con EM frentes a individuos sanos (Ferre’ et al., 2018; Langer-Gould et al., 2018). La VD es una hormona soluble que juega un papel esencial en la homeostasis del calcio, contribuyendo al desarrollo y mantenimiento de los huesos. Regula más de 1.000 genes en diferentes tipos de células y condiciones y en distintos niveles del desarrollo. Sus efectos en el desarrollo y su relación sobre los efectos del sistema inmune han sido estudiados durante más de 30 años (Lemire, Adams, Sakai, & Jordan, 1984) (Lemire JM 1984). Además de las funciones bien conocidas que presenta la VD posee un papel importante tanto en la inmunidad innata como en la inmunidad adaptativa (Christakos, Dhawan, Verstuyf, Verlinden, & Carmeliet, 2015; Nurminen, Neme, Seuter, & Carlberg, 2018). Su deficiencia, entre otros aspectos, ha demostrado estar relacionada con una reducción de la actividad microglial contra patógenos mediante la disminución de la producción de citoquinas como TNFα y IL- 6 (Voo, O’Brien, Butzkueven, & Monif, 2019). La deficiencia de vitamina D se ha asociado a multitud de enfermedades y desórdenes metabólicos y cardiovasculares, entre los que se incluyen el cáncer y la hipertensión, y también a enfermedades infecciosas y autoinmunes. Algunas de las enfermedades autoinmunes a las que se ha relacionado la deficiencia de vitamina D son la artritis reumatoide, la diabetes tipo I o la EM, aunque también se ha asociado a diferentes enfermedades del SNC como el parkinson y la esquizofrenia (Bizzaro, Antico, Fortunato, & Bizzaro, 2017; Fernandes de Abreu, Eyles, & Féron, 2009; Hayes et al., 2015; Holick & Chen, 2008). La VD tiene dos formas principales la vitamina D2 o ergocalciferol y la vitamina D3 o colecalciferol. La VD2 se obtiene principalmente de las plantas mientras que la VD3 se genera en la epidermis gracias a la acción de la radiación ultravioleta B (UVB). La VD3 es sintetizada inicialmente como un precursor inactivo. Así, en primer lugar, gracias a la acción de la enzima 7-dehidrocolesterol reductasa (DHCR7) se genera la molécula 7-dehidrocolesterol (7-DHC), aquella sobre la que actúan los rayos UVB transformándola en pre-vitamina D y que tras una isomerización térmica da lugar a la VD. En el hígado se hidroxila mediante la enzima del citocromo P450 2R1, ó 25- 13 hidroxilasa vitamina D, (CYP2R1) y se convierte en 25-hidroxivitamina D3 (25(OH)D3) o calcidiol, que es la principal forma circulante de VD y la que se emplea para medir los niveles de VD en el organismo. Asimismo, en el hígado la VD también puede ser hidroxilada por las enzimas CYP27A1 y CYP3A4. Posteriormente, en el riñón se produce la segunda hidroxilación mediante la enzima del citocromo P450 27B1, o 1-alfa hidroxilasa (CYP27B1) que la transforma en 1-alfa,25- dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) o calcitriol, la forma activa de la VD (figura 1.3) (Bizzaro et al., 2017; Matías-Guíu, Oreja-Guevara, Matias-Guiu, & Gomez-Pinedo, 2018; Pierrot-Deseilligny & Souberbielle, 2017). Esta última hidroxilación puede estar regulada por diferentes moléculas, entre ellas la hormona paratiroidea y el factor de crecimiento de fibroblastos 23, que a su vez podrían ver regulados sus efectos por dos metiltransferasas (METTL1 y METTL21B) (Christakos, 2017). La forma activa de la VD, 1,25(OH)2D3, puede ser degradada por la enzima citocromo P450 24A1, ó 24-hidroxilasa (CYP24A1). Cuando no es degradada, la 1,25(OH)2D3 es principalmente transportada por la proteína de unión a la vitamina D (DBP, por sus siglas en inglés vitamin D-binding protein), aunque un pequeño porcentaje de VD también puede circular de forma libre. La DBP es una proteína multifuncional, codificada por el gen GC, que se encuentra en muchos tipos de células. Su unión a la VD y a otros metabolitos presentes en el plasma permite transportarlos a los tejidos diana. La internalización de la VD en las células puede variar, estando mediada en algunos casos por el complejo DBP-megalina (LRP2) o producirse mediante la unión a otras proteínas o difusión pasiva. Una vez internalizada, la 1,25(OH)2D3 se une al receptor de vitamina D (VDR), presente en un gran número de células del organismo. La unión de VD con el VDR genera un cambio conformacional que al entrar en el núcleo es reconocido por el receptor X retinoide alfa (RXRA). De este modo, el VDR y el RXRA se asocian formando un heterodímero, que es capaz de unirse a elementos de respuesta de la vitamina D (VDRE). Los VDRE constituyen una secuencia específica del ADN dentro de regiones promotoras de diferentes genes diana (figura 1.3). Así, como se ha comentado anteriormente, la unión de 1,25(OH)2D3 con el VDR regula hasta más de 1.000 genes implicados en diferentes células y procesos fisiológicos (Arem et al., 2015; Fernandes de Abreu et al., 2009; Pierrot-Deseilligny & Souberbielle, 2017). 14 Figura 1.3. Esquema de la vía de señalización de la vitamina D. La vitamina D es metabolizada por distintas enzimas que generan la forma activa de la vitamina D, 1.25(OH)2D3. La forma activa de la VD puede ser internalizada de forma libre o unida a la proteína de unión a la VD (DBP). A su vez la VD unida a DBP puede ser internalizada mediante su interacción con distintos receptores, como son la megalina, la cubilina o receptores gamma FC. Una vez en la célula la VD se une al receptor de la vitamina D (VDR) y tras entrar en el núcleo se forma un heterodímero al producirse la unión con el receptor de ácido retinoico alfa (RXRA). Este complejo es capaz de actuar en el ADN sobre elementos de respuesta a la vitamina D (VDRE). En gris se presentan los genes codificantes de las proteínas involucradas en la vía. 7-DHC: 7-dehidrocolesterol; UVB: rayos ultravioleta B; VD: vitamina D; DBP: proteína de unión a la vitamina D; LRP2: megalina; CUBN: cubilina; VDR: receptor de la vitamina D; RXRA: receptor X retinoide alfa; VDRE: elementos de respuesta de la vitamina D. Virus Epstein-Barr El virus Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés Epstein-Barr virus) es uno de los agentes infecciosos que más se han asociado al riesgo de susceptibilidad de EM. El EBV es un herpesvirus ubicuo humano que contiene un genoma de ADN bicatenario. La presencia de anticuerpos del antígeno nuclear tipo 1 EBV (EBNA1) se ha observado en niveles mayores en pacientes con EM. Además, la seropositivad del 15 EBV o la presencia de anticuerpos previa al desarrollo de la EM han sido asociados en pacientes con EM de diferentes etnias (Munger, Levin, O’Reilly, Falk, & Ascherio, 2011; Nourbakhsh & Mowry, 2019; Pfuhl et al., 2015; Tselis, 2014). Sin embargo, si bien su presencia parece necesaria para el desarrollo de la EM, no es suficiente (Olsson et al., 2016; Pender, 2012). Así, el riesgo de desarrollar EM es más alto en aquellas personas que presentan una combinación de factores de riesgo, como el EBV junto con variantes genéticas en genes de riesgo a la enfermedad. De este modo, muchos factores de riesgo genético que se han asociado con la susceptibilidad de EM juegan un papel fundamental en la respuesta a la infección del EBV, aunque aún hay que seguir aclarando el papel del EBV en la inmunopatogénesis de la EM (Afrasiabi et al., 2019). Tabaco Cada vez se enfatiza más el efecto que el tabaco puede tener en la EM. Tanto es así que numerosos estudios han trabajado con los efectos que puede acarrear su consumo antes del inicio de la enfermedad y durante la misma. El humo del cigarrillo incrementa el riesgo de desarrollar EM y otras enfermedades inflamatorias. Entre sus consecuencias en pacientes con EM puede causar inflamación, estrés oxidativo y cambios en el ADN (Alrouji, Manouchehrinia, Gran, & Constantinescu, 2019; Marabita et al., 2017). Las evidencias demuestran que el tabaco puede afectar a la respuesta inmune a través de las vías metabólicas de las células Th17. El receptor de hidrocarburos de arilo es un factor de transcripción dependiente de ligando que actúa como receptor de muchos contaminantes ambientales, algunos de los cuales se encuentran presentes en el humo del tabaco (Weston & Constantinescu, 2015). 1.6.2. Factores genéticos La influencia de los estudios epidemiológicos ha permitido conocer, entre otros aspectos, el impacto de los factores genéticos en la susceptibilidad a desarrollar EM. El riesgo de recurrencia en la enfermedad es mayor en familiares de individuos afectos de EM, especialmente en hermanos gemelos, y su incidencia varía en función del origen de la población de estudio. Además, las familias estudiadas no presentan una disminución lineal del riesgo de enfermedad. Estas observaciones han llevado a 16 denegar un modelo de herencia mendeliano en la EM y a establecer que la enfermedad se rige por un modelo de herencia poligénico, en el que la susceptibilidad a la enfermedad depende de múltiples factores genéticos (Baranzini, Oksenberg, & Hauser, 2002; Hollenbach & Oksenberg, 2015). Aunque a día de hoy no se conoce el mecanismo que desencadena la enfermedad, no existe ninguna duda del impacto que presentan los factores genéticos en la EM. Actualmente, gracias a los esfuerzos por desentrañar las bases genéticas de la EM, se han identificado más de 200 variantes genéticas implicadas en la enfermedad. Sin embargo, hay una región del genoma que presenta la asociación más fuerte con la EM. Este es el grupo de genes del antígeno leucocitario humano (HLA, por sus siglas en inglés human leukocyte antigen). Los genes HLA se localizan en el brazo corto del cromosoma 6, en la región 6p21.3 y forman parte del CMH en humanos (McElroy & Oksenberg, 2011; Patsopoulos, 2018; Sawcer, Franklin, & Ban, 2014). El CMH es una familia de genes codificantes de glicoproteínas cuya función principal es el reconocimiento, procesamiento y presentación de antígenos a las células T (Janeway, Travers, Walport, & Shlomchik, 2001). Su localización en el genoma comprende la región más densa en genes de todo el genoma y abarca una región génica de 8 Mb. Se divide en tres regiones: HLA clase I, HLA clase II y HLA clase III (figura 1.4), que presentan tanto los genes HLA clásicos, así como más de 200 genes no-HLA (Klein & Sato, 2000; D. Meyer, Vitor, Bitarello, Débora, & Nunes, 2018). Además, esta región se caracteriza por un elevado polimorfismo y un fuerte desequilibrio de ligamiento. El desequilibrio de ligamiento hace referencia a la asociación no aleatoria de dos o más alelos de diferentes loci en una población específica, lo que provoca que se encuentren juntos en una mayor frecuencia que la esperada por el azar (Baisch & Capra, 1993; Vandiedonck & Knight, 2009). 17 Figura 1.4. Organización y localización de los genes HLA en el cromosoma 6. En la imagen solo aparecen representados algunos de los genes de cada clase ya que cada una contiene numerosos genes (Klein & Sato, 2000). Los genes HLA clase I y los genes HLA clase II forman las dos principales clases del CMH. Por un lado, las moléculas clásicas HLA clase I (HLA-A, HLA-B y HLA-C) se encuentran como heterodímeros en la mayoría de las células nucleadas. Estos heterodímeros se encuentran formados por una cadena alfa, codificada por moléculas HLA clase I, y un polipéptido, microglobulina β2, codificado por el gen B2M, presente en el cromosoma 15. En conjunto se unen a péptidos derivados principalmente de proteínas sintetizadas en el interior de la célula, como péptidos virales y tumorales, y los presentan a los linfocitos T CD8+. Igualmente, las moléculas HLA clase I también actúan como ligandos para los receptores killer immunoglobulin-like (KIR) que se localizan en la superficie de las células NK. Por otro lado, las moléculas clásicas HLA clase II (HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP) forman heterodímeros constituidos por péptidos homogéneos, una cadena alfa y una cadena beta, ambas codificadas por los genes HLA. Estos se localizan en la superficie celular de las células presentadoras de antígenos, como las células B, las células dendríticas 18 o los macrófagos. Actúan como receptores de antígenos derivados principalmente de proteínas extracelulares y los presentan a los linfocitos T CD4+ (Hollenbach & Oksenberg, 2015). Dentro de los genes que forman el complejo HLA, los genes HLA clase II han sido los más relacionados con el riesgo de EM. Concretamente, la señal de susceptibilidad principal a la enfermedad se localiza en el gen HLA-DRB1, del cual el alelo HLA- DRB1*15:01 es el que ha presentado la asociación más fuerte con la EM, siendo más frecuente en estos pacientes con EM que en individuos controles (Creary et al., 2019; Hollenbach & Oksenberg, 2015; Patsopoulos et al., 2013; Yamasaki & Kira, 2019). Además de esta asociación con el alelo HLA-DRB1*15:01, en algunas poblaciones, entre ellas la población caucásica, también se ha observado una fuerte asociación del alelo HLA-DQB1*06:02 con la EM. Dado que la región HLA presenta un fuerte desequilibrio de ligamiento, no es de extrañar que el alelo HLA-DRB1*15:01 forme parte de un haplotipo extendido en el que se incluyen los alelos HLA-DQB1*06:02, HLA-DRB5*01:01 y HLA-DQA1*01:02 (De Silvestri et al., 2019; Hollenbach & Oksenberg, 2015). Sin embargo, a causa del desequilibrio de ligamiento ha habido dificultad en descifrar el riesgo causado por cada uno de estos alelos. La susceptibilidad a la enfermedad de estos dos alelos también se ha observado de manera independiente en estudios con ratones transgénicos. En el caso de los ratones transgénicos que expresaban HLA-DRB1*15:01, estos desarrollaban una enfermedad similar a la EM, provocada por reacciones autoinmunes contra la proteína básica de mielina o la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG, por sus siglas en inglés myelin oligodendrocyte glycoprotein). De manera similar, los ratones transgénicos que expresaban solamente HLA-DQB1*06:02 presentaban reacciones autoinmunes contra la proteína básica oligodendrocítica de mielina (MOBP, por sus siglas en inglés myelin oligodendrocytic basic protein), una proteína encargada de estabilizar la mielina, provocando también una enfermedad parecida a la EM (Kaushansky & Ben-Nun, 2014). Aunque existe un alto grado de variabilidad en las diferentes poblaciones, la región HLA sigue siendo la que presenta mayor susceptibilidad a la EM. No obstante, no es 19 la única región asociada a la enfermedad, ya que otros genes no-HLA se han asociado al riesgo de desarrollar la EM. Los primeros genes que se identificaron fuera de la región HLA fueron los genes del receptor de interleuquina 7 (IL7R) y de la subunidad alfa del receptor de interleuquina 2 (IL2RA) (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2007). Ambos presentaban un riesgo moderado por lo que explican una pequeña proporción del riesgo. Estas asociaciones apoyaban por primera vez la idea de que los polimorfismos de genes involucrados en la regulación de la respuesta inmune son factores importantes en la EM (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2007). Hoy en día muchos de los genes identificados se encuentran fuera de la región HLA, pero la mayoría están asociados con la inmunidad, lo que pone en evidencia de nuevo la importancia de la misma en la EM y su complejidad, debido a la interacción de múltiples factores genéticos (Baranzini et al., 2002). 1.6.3. Factores epigenéticos La información procedente de los estudios epidemiológicos pone de manifiesto que la EM presenta una heredabilidad perdida en la que un alto porcentaje de la enfermedad no puede ser explicada por los cambios genómicos (Hojati, 2017; Zheleznyakova et al., 2017). Parte de esta heredabilidad del riesgo de EM puede ser explicada por las modificaciones epigenéticas (Huynh & Casaccia, 2013). La epigenética hace referencia a los mecanismos que afectan a la expresión génica y que resultan en fenotipos celulares alterados sin producir cambios en la secuencia del ADN. Estos cambios, que pueden ser heredados, consisten en la adicción o eliminación de diferentes grupos químicos a la molécula de ADN o a las diferentes histonas asociadas. Son modificaciones necesarias que pueden estar moduladas por diferentes factores ambientales o endocrinos, de modo que se logren las adaptaciones esenciales para la supervivencia en un ambiente dinámico. Asimismo, estos mecanismos epigenéticos también pueden estar involucrados en el desarrollo de enfermedades. Las modificaciones epigenéticas principales que se han asociado a la susceptibilidad a la EM y que pueden tener un papel en la etiología de la enfermedad son tres: la 20 metilación del ADN, las modificaciones de las histonas y la regulación epigenética asociada a ARN no codificantes (Yuan Zhou et al., 2014). Metilación del ADN La metilación del ADN es el mecanismo epigenético más estudiado que consiste en la adicción de un grupo metilo (-CH3) al carbono 5 de la citosina. Generalmente se produce en los dinucleótidos CpG (citosina seguida de guanina) por la acción de enzimas metiltransferasas de ADN (DNMT, por sus siglas en inglés DNA methyltransferase). En mamíferos hay una alta frecuencia de dinucleótidos CpG, que se conocen como islas CpG y se encuentran principalmente en las regiones promotoras del 40% de los genes. Son capaces de producir el silenciamiento de genes y bloquear sus dianas de acción (Hojati, 2017). En la EM se han observado diferentes patrones de metilación en pacientes afectos respecto a controles. En 2014 Huynh JL y colaboradores demostraron que la sustancia blanca de los pacientes con EM presentaba un 33% menos de metilación que en individuos controles, lo que sugiere que algunos genes no se encuentran expresados en los pacientes con EM (Huynh et al., 2014). También se ha observado que los linfocitos T CD4+ presentan cambios en la metilación del ADN durante su diferenciación a células Th1 o Th2, lo que puede estar relacionado a reacciones inmunes y podría explicar el mecanismo de acción de la EM (Rito, Torre-Villalvazo, Flores, Rivas, & Corona, 2016). De manera específica, algunos genes también han mostrado diferencias en la metilación en pacientes con EM respecto a individuos sanos. Así, se ha observado una hipometilación en el gen de la subunidad alfa del receptor de interleuquina 2 (IL2RA) en pacientes con EM que se ha correlacionado con una mayor expresión de las células T respecto a individuos controles (Field et al., 2017). Por otro lado, también se ha evidenciado una alteración en la región promotora del gen VDR (receptor de vitamina D) en células T de pacientes con EMRR respecto a controles (Ayuso et al., 2017; Zheleznyakova et al., 2017). Modificación de las histonas Los nucleosomas son las unidades básicas de la cromatina, la forma de organización del ADN en el núcleo, y están constituidos por octámeros de proteínas histonas 21 estrechamente envueltos por aproximadamente 147 pb de ADN. El octámero de histonas está compuesto por dímeros de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 cuyas colas son ricas en residuos de lisina y arginina. Bajo estímulos extracelulares estos residuos pueden ser modificados y cambiar su interacción con la secuencia de ADN. De este modo, se permite la regulación de la expresión de genes (Castro & Casaccia, 2018; Hojati, 2017). Las histonas pueden sufrir distintas modificaciones como la acetilación, la metilación o la ubiquitinación, entre otras. La acetilación de las histonas consiste en la adicción de un grupo acetilo a los residuos de lisina, lo que provoca que se debilite la interacción del nucleosoma con el ADN. Este proceso se encuentra asociado a unos niveles mayores de transcripción de genes (Hojati, 2017; Zijun Wang, Yin, Lau, & Lu, 2016). La metilación puede ocurrir en residuos de lisina y de arginina en las histonas H3 y H4. En este caso la metilación debilita la interacción química entre las histonas y la secuencia de ADN, lo que impulsaría la transcripción de genes (He, Hu, Xiao, Zhou, & Yang, 2018; Zijun Wang et al., 2016). En la EM se han observado diferentes modificaciones de las histonas que podrían explicar algunos de los procesos fisiopatológicos que se producen en la enfermedad. Así, en los oligodendrocitos de pacientes con EM se ha observado que estos presentaban una mayor acetilación de la histona H3 respecto a individuos sanos. Además, observaron mayor desacetilación en las histonas oligodendrogliales en etapas tempranas de la enfermedad y cuya eficiencia disminuía con el transcurso de la enfermedad (Pedre et al., 2011). Del mismo modo, se ha observado que la desacetilación en células precursoras de oligodendrocitos es necesaria para una adecuada diferenciación y formación de mielina (Popko, 2008). Las modificaciones de las histonas también se han observado en respuesta a tratamientos. Un ejemplo de ello es el fingolimod, que ha demostrado incrementar la acetilación de las histonas y por tanto la expresión de distintos genes asociados con la memoria y el aprendizaje (Hait et al., 2014). Regulación epigenética asociada a ARN no codificantes Los ARN no codificantes, principalmente los microARN (miARN), también pueden llevar a cabo funciones de regulación epigenética. Los miARN son un grupo de ARN 22 de entre 18-23 nucleótidos de doble cadena que actúan como unos de los reguladores postranscripcionales de la expresión génica. Además, presentan funciones en la diferenciación, la apoptosis, la proliferación celular y procesos de metabolismo celular. Su importancia ha aumentado en los últimos años ya que se pueden encontrar en muestras de plasma o suero, lo que los propone como potenciales biomarcadores para el diagnóstico y evolución de la enfermedad (Aslani et al., 2017). Son varios los trabajos que han evidenciado diferentes perfiles de expresión de miARN en muestras de pacientes desde que surgiera el primer estudio de este tipo en pacientes con EM en 2009 (Junker et al., 2009; Otaegui et al., 2009). Otaegui y colaboradores evidenciaron una mayor sobreexpresión de miR-18b y miR-599 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés peripheral blood mononuclear cell) de pacientes con EM (Otaegui et al., 2009). A partir de aquí se desarrollaron diferentes trabajos en los que se encontraron 85 miARN de células T CD4+ que presentaban diferentes niveles de expresión entre pacientes con EM y controles (Guerau-de-Arellano et al., 2011). En posteriores trabajos se observó una sobreexpresión de miR-223 en sangre y en células T de pacientes con EM respecto a controles que se relacionó con el papel esencial que llevaría a cabo durante la respuesta inmunitaria, ya que es uno de los moduladores de la vía de señalización del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB). También se ha observado una sobreexpresión de otros miARN como miR-155, miR-338 y miR-491 en la sustancia blanca de pacientes con EM que podría estar relacionada con la disminución de los niveles de neuroesteroides en estos pacientes (Aslani et al., 2017; Jamebozorgi et al., 2020). 1.7. Biomarcadores en EM Un biomarcador se define como aquel parámetro que se mide y evalúa objetivamente como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas a una exposición o intervención (Califf, 2018; Katsavos & Anagnostouli, 2013). En la EM, a día de hoy, no existe un biomarcador que refleje el estado de la enfermedad en su totalidad. Sin embargo, existen diferentes 23 biomarcadores que pueden ayudar a predecir la susceptibilidad a la enfermedad, el diagnóstico, la evolución o la respuesta frente a un determinado tratamiento. Al mismo tiempo, los biomarcadores pueden clasificarse de acuerdo a su implicación fisiológica. Así, encontramos biomarcadores de imagen, biomarcadores medidos en fluidos biológicos o potenciales biomarcadores genómicos (Katsavos & Anagnostouli, 2013). 1.7.1 Biomarcadores de imagen Las diferentes técnicas de neuroimagen pueden ser utilizadas como biomarcadores en la EM y en otras enfermedades neurológicas. Su uso ayuda al diagnóstico, pero también a monitorizar el curso clínico de la enfermedad o incluso a determinar la elección adecuada de un tratamiento. Es por ello, que estas técnicas no invasivas ayudan a entender mejor la fisiopatología de la enfermedad. Resonancia magnética La técnica de neuroimagen más empleada en la EM es la RM cerebral. Su uso está establecido en la identificación de lesiones características de la EM formando parte de los criterios diagnósticos de la enfermedad (Polman et al., 2011; Thompson, Banwell, et al., 2018). La RM permite la detección de lesiones tanto en el cerebro como en la médula espinal (Oh, Vidal-Jordana, & Montalban, 2018). El uso de esta técnica facilita estudiar la actividad de la enfermedad y se ha convertido en una herramienta muy útil para evaluar la progresión de la misma (Brownlee et al., 2019; Saade et al., 2018). Una de sus utilidades es que puede predecir el desarrollo de EM en aquellos pacientes con síndrome clínico aislado (CIS) a partir de las lesiones observadas en RM (Fisniku et al., 2008). En algunos trabajos se ha observado que la carga lesional en sustancia blanca en la secuencia T2 se asocia positivamente con el aumento de la discapacidad medida mediante la escala expandida del estado de discapacidad (EDSS, por sus siglas en inglés de expanded disability status scale) (Brownlee et al., 2019; Fisniku et al., 2008; Housley, Pitt, & Hafler, 2015). Asimismo, las lesiones en secuencia T2 correlacionan con la pérdida del tejido cerebral y con la severidad de la enfermedad (Rudick, Lee, Simon, & Fisher, 2006). Además, el gadolinio puede ser 24 empleado en la RM para mostrar la presencia de inflamación en las lesiones de los pacientes con EM (Saade et al., 2018). Este compuesto es un medio de contraste capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y entrar en el SNC en aquellos sitios que presentan daño o inflamación, por lo que el número y el tamaño de las lesiones en estas RM pueden predecir tanto el comienzo como la severidad de los brotes en la enfermedad (Housley et al., 2015). Igualmente, la RM y las lesiones observadas también se han asociado a un empeoramiento cognitivo de los pacientes con EM (Brownlee et al., 2019; Eijlers et al., 2018), por lo que el uso de esta técnica como biomarcador se extiende más allá del diagnóstico de la enfermedad. Tomografía por emisión de positrones Una de las técnicas de imagen que ha visto incrementada su relevancia en la EM es la tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés de positron- emission tomography). La PET es una técnica no invasiva funcional de medicina nuclear que permite conocer la actividad metabólica cerebral mediante la generación de imágenes tridimensionales. Para ello se pueden emplear distintos componentes químicos que se administran al paciente mediante inyección intravenosa (Niccolini, Su, & Politis, 2015). Estos compuestos químicos o radioligandos se encuentran marcados con isótopos emisores de positrones como el 18F o el 11C y reciben el nombre de trazadores de PET (De Paula Faria, Copray, Buchpiguel, Dierckx, & De Vries, 2014). Una de las dianas de estudio en la EM es la neuroinflamación. La generación de una lesión o la presencia de lesiones desmielinizantes provocan la activación y acumulación de microglía en el SNC (Zrzavy et al., 2017). La activación de la microglía se ha observado en la EM en varias localizaciones, tanto en las lesiones de sustancia blanca como en la sustancia gris y en las sustancias blanca y gris de apariencia normal. Una de las características de la microglía activada es que presenta una expresión incrementada de proteína translocadora mitocondrial (TSPO) que no se observa en la microglía inactiva (Singhal, Weiner, & Bakshi, 2017). Por ello esta proteína ha sido uno de los objetivos en el desarrollo de trazadores de PET. Entre los radiotrazadores empleados para la detección de TSPO se encuentran 11C-vinpocetina, 11C-PK11195 o 11C-PBR28. Estos han facilitado la identificación de 25 regiones con acumulación de microglía en la EM y han permitido estudiar la actividad y la progresión de la enfermedad mediante el marcaje celular (Banati et al., 2000; Vas et al., 2008). Así, por ejemplo, en 2008 se realizó un trabajo con PET que comparaba la detección de microglía en las lesiones identificadas mediante RM utilizando 11C-vinpocetina y 11C-PK11195. Los autores encontraron que la 11C- vinpocetina se observaba mejor en las lesiones de los pacientes por lo que su potencial de unión a la microglía fue mayor con respecto al 11C-PK11195 (Vas et al., 2008). Otro de los trazadores empleados en la PET y que es uno de los más empleados en enfermedades neurológicas es el 2-fluoro-2-deoxi-D-glucosa marcada con 18F (18F- FDG). Este trazador se emplea para generar imágenes del metabolismo de la glucosa. Su uso ha permitido estudiar tanto la inflamación como la neurodegeneración debido a que ambos son procesos en los que se ve alterada la tasa metabólica (De Paula Faria et al., 2014; Niccolini et al., 2015). En la EM se ha observado que las lesiones en el cerebro presentan hipermetabolismo, lo que indica un consumo mayor de glucosa que en la NAWM y la presencia de la activación de células inflamatorias. Sin embargo, también se han observado lesiones hipometabólicas, lo que podría hacer referencia a lesiones crónicas (Schiepers et al., 1997). Otros autores también han demostrado una disminución significativa en el metabolismo cerebral cortical con la progresión de la enfermedad. Asimismo, se ha observado que esta manifestación se asociaba con una disminución cortical de N-acetil- aspartato/creatina, marcador de deterioro neuronal, en áreas corticales relevantes para la función cognitiva (Blinkenberg et al., 2012). Dado que una de las características principales que sufren los pacientes con EM es la pérdida de mielina, se ha incrementado el estudio de diferentes trazadores que puedan detectar este parámetro en la enfermedad. Uno de los trazadores empleados en esta línea es el 11C-componente Pittsburgh B (11C-PiB). El 11C-PiB ha sido ampliamente utilizado en la enfermedad de Alzheimer, ya que permite la detección in vivo del depósito de amiloide (Zeydan et al., 2020). Adicionalmente, su uso se ha extendido recientemente como un posible marcador de la desmielinización y remielinización en EM (Niccolini et al., 2015). La mielina presenta una estructura en 26 forma de lámina-β agregada y se cree que el trazador se une a aquellas proteínas con este tipo de conformación. Por ello, una degradación de la mielina provocaría una disminución en la unión de este trazador (De Paula Faria et al., 2014). Este campo, aún en investigación, comenzó con modelos in vivo de ratón y monos babuinos y con el estudio de dos pacientes con EM. En este trabajó se estudió la captación de 11C-PiB y se observó una disminución de esta en las lesiones desmielinizantes (Stankoff et al., 2011). También se ha observado que la captación de 11C-PiB en pacientes con EM es menor en regiones hiperintensas de sustancia blanca con respecto a la sustancia blanca de apariencia normal (NAWN, por sus siglas en inglés de normal-appearing white matter) (Zeydan et al., 2018, 2019). El abordaje en la detección de la pérdida de mielina ha llevado al desarrollo de más trazadores, además del 11C-PiB. Esto ha dado lugar a la generación de trazadores de mielina marcados con 18F que presentan una vida media más larga que el 11C-PiB y que pueden ser una mejor opción. Dentro de estos trazadores marcados con 18F se encuentran el 18F-florbetapir, 18F-flutemetamol y 18F-florbetabén (Richards & Sabbagh, 2014). De los tres, el 18F-florbetapir y el 18F-florbetabén son los que presentan una mayor unión a la sustancia blanca (Auvity et al., 2020). Los trabajos realizados en EM hasta ahora se han centrado en estos dos trazadores. Recientemente, en un estudio in vivo con pacientes de EM que el 18F-florbetapir puede detectar desmielinización en regiones de NAWM que no son captadas a través de la RM (Carotenuto et al., 2020). Nuestro grupo lleva varios años investigando con trazadores de amiloide en la EM. En concreto, en 2015 se desarrolló el primer trabajo en esta línea, utilizando el 18F-florbetabén. Este estudio permitió identificar una menor captación del trazador en las lesiones de sustancia blanca respecto a la NAWM en los pacientes con EM (Matías-Guiu et al., 2015). Asimismo, en otro estudio reciente de nuestro grupo han asociado la captación del 18F-florbetabén con marcadores clínicos, cognitivos y de neuroimagen estructural, lo que refleja tanto el grado de desmielinización como la actividad de la enfermedad. Además, también se ha observado una menor captación en NAWM asociada a un empeoramiento cognitivo (Pytel et al., 2020). 27 Aún es necesario conocer más datos acerca de los trazadores de amiloide utilizados con PET en EM. A pesar de ello, el campo es prometedor y los recientes datos muestran un elevado potencial en el estudio de la desmielinización/remielinización y en la actividad de la enfermedad. Por ello no debe descartarse su uso como posibles biomarcadores de la enfermedad (Auvity et al., 2020; De Paula Faria et al., 2014; Matías-Guiu et al., 2016; Pytel et al., 2020; Zeydan et al., 2020). 1.7.2. Biomarcadores de líquido cefalorraquídeo y sangre El biomarcador procedente de líquido cefalorraquídeo más empleado en la EM son las bandas oligoclonales (BOC). Durante años su análisis ha formado parte de los criterios diagnósticos de la enfermedad. Aunque, actualmente, la presencia de las BOC no es obligatoria para el diagnóstico de la enfermedad, su análisis sigue siendo de utilidad en ciertos casos, ya sea para descartar otras enfermedades, para pronosticar el desarrollo de la enfermedad o para aumentar la confianza en el diagnóstico (Housley et al., 2015; Thompson, Banwell, et al., 2018). La presencia de dos o más bandas oligoclonales en el LCR indica la síntesis intratecal de anticuerpos, como las inmunoglobulinas G (IgG), lo que a su vez indica un riesgo incrementado de desarrollar EM en ciertos pacientes. Aunque la sensibilidad de la prueba es >95% se requiere el análisis también en muestras de suero, de modo que se pueda confirmar que la presencia de las BOC es exclusiva del LCR (Thompson, Banwell, et al., 2018). Además, su especificidad varía ya que las BOC se pueden detectar en otras enfermedades que presenten un contexto autoinmune (Link & Huang, 2006). Si bien en la actualidad se están estudiando nuevos biomarcadores en LCR y sangre que pueden ser de utilidad en la enfermedad, las BOC siguen siendo una herramienta útil en determinados casos (Link & Huang, 2006). A pesar de que el papel de las células B en la EM aún es desconocido, éstas participan en la respuesta inmune y se ha detectado su presencia en el SNC. Asimismo, parecen ser las encargadas de la producción de IgG y, por tanto, de la presencia de las BOC en el LCR. De acuerdo a esto, se ha identificado que la administración de natalizumab provoca la disminución de las BOC en la mitad de los pacientes. Aunque su origen no sea conocido aún en su totalidad, las BOC son un biomarcador a tener en cuenta no solo 28 para el ayudar al diagnóstico diferencial sino también como indicador del comportamiento de la enfermedad (Tomescu-Baciu et al., 2019). Debido a las diferencias observadas en la presencia de BOC en pacientes con EM, se han tratado de buscar otros biomarcadores de la enfermedad. Las inmunoglobulinas están formadas por cadenas pesadas y ligeras y en condiciones fisiológicas normales hay una producción de cadenas ligeras libres. El estudio de estas cadenas ligeras libres puede ayudar a predecir la síntesis intratecal de inmunoglobulinas en condiciones patológicas y, por tanto, la actividad de las células B en el LCR. Debido a esto, las cadenas ligeras libres podrían ser utilizadas como un biomarcador adicional para el diagnóstico de la EM (Gudowska-Sawczuk, Tarasiuk, Kułakowska, Kochanowicz, & Mroczko, 2020; Schwenkenbecher et al., 2018). Aunque se siguen estudiando biomarcadores en LCR como la quitinasa 3 tipo 1, glicoproteína extracelular cuya presencia se ve aumentada en el LCR de pacientes con enfermedades inflamatorias y que podría ser un biomarcador de la EM (Kušnierová, Zeman, Hradílek, Zapletalová, & Stejskal, 2020), muchos trabajos se centran en estudiar la presencia de otros biomarcadores en sangre. Uno de ellos es la proteína ácida fibrilar glial (GFAP, por sus siglas en inglés glial fibrillary acidic protein) que forma parte de los filamentos intermedios de los astrocitos. Los niveles de este biomarcador de astrogliosis se han correlacionado tanto con la severidad en la EM, medida mediante la escala EDSS, y el número de lesiones en RM (Abdelhak, Huss, Kassubek, Tumani, & Otto, 2018) como con la progresión de la enfermedad (Axelsson et al., 2011). Sin embargo, en los últimos años se ha incrementado el estudio de las cadenas ligeras de neurofilamentos (NfL, por sus siglas en inglés neurofilament light chain) entre los biomarcadores en sangre, como un biomarcador del daño neuroaxonal en la enfermedad. Los neurofilamentos forman parte del citoesqueleto de las neuronas y el estudio de las NfL como biomarcador se ha estudiado tanto en suero como en plasma con resultados similares (O’Connell, Alder, Webel, & Moore, 2019). Si bien es cierto que las NfL se han asociado a otras enfermedades neurológicas, como la enfermedad de Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica, su uso sería más 29 indicado como potencial biomarcador de la progresión de la enfermedad (Bridel et al., 2019; Gaiottino et al., 2013). En concreto, en la EM, diferentes trabajos apoyan que los niveles de NfL se correlacionan con parámetros clínicos y de RM. Su uso facilita el diagnóstico diferencial entre CIS y EM. Así, en la EM se ha observado que puede aportar información sobre el pronóstico de la evolución de la enfermedad y puede ayudar en la toma de decisiones terapéuticas (Bittner et al., 2020; Manouchehrinia et al., 2020; Rosso et al., 2020). 1.7.3. Biomarcadores genómicos Como se ha comentado previamente, los factores genéticos condicionan una parte de la susceptibilidad a la EM. El conocimiento de variantes o polimorfismos genéticos asociados a la enfermedad puede ser de gran utilidad para estudiar su asociación con la progresión de la enfermedad, la severidad e incluso la respuesta a determinados tratamientos. Dado que la región HLA es la más asociada a la enfermedad, muchos de estos trabajos se han enfocado en los efectos que pueden causar diferentes alelos de genes HLA. Así, uno de los alelos más estudiados, debido a su fuerte asociación, es el alelo HLA-DRB1*15:01. De esta forma, se ha observado una correlación positiva entre este alelo y un inicio más temprano de la EM. Además, la presencia de este alelo se ha asociado a una mayor atrofia en el cerebro de pacientes y a lesiones mayores en T1 en resonancia magnética cerebral (Katsavos & Anagnostouli, 2013). Asimismo, pacientes que presentan el alelo DRB1*15:01 han relacionado menores niveles de N- acetil aspartato (NAA), marcador de integridad neuronal, dentro de la sustancia blanca de apariencia normal (NAWM, por su sigla en inglés normal appearing white matter) (Okuda et al., 2009). Aun así, el uso de HLA-DRB1*15:01 sigue generando controversias ya que, en un estudio realizado recientemente, se ha observado que los pacientes que presentaban este alelo tenían 5 veces menos probabilidades de presentar nuevas lesiones en la RM en la evolución (Lysandropoulos et al., 2020). La región HLA es la que muestra una mayor asociación a la EM y el alelo DRB1*15:01 no se encuentra presente en todos los individuos con EM (Goodin, 2016). Además, como se ha comentado previamente, generalmente se encuentra formando en un 30 haplotipo con otros alelos HLA. Por ello, también se han estudiado otros alelos HLA como posibles biomarcadores de la enfermedad. Así, los alelos HLA-DQB1*03:01 y HLA-DQB1*06:02 se han asociado a mayores niveles de atrofia cerebral y atrofia de la sustancia gris respectivamente (Katsavos & Anagnostouli, 2013). También se han estudiado alelos de HLA clase I y se ha observado que, evaluando variables clínicas y resultados de RM, la presencia de HLA-B*07, HLA-B*08 y HLA-B*44 estaba relacionada con un peor estado o progresión de la enfermedad (Lysandropoulos et al., 2020). A su vez se ha observado que variantes genéticas en genes involucrados en vías metabólicas del CMH pueden predisponer al desarrollo de una mayor neurodegeneración de la retina en pacientes con EM (Fitzgerald et al., 2019). Los genes HLA no han sido los únicos estudiados en torno a la relación con la evolución de la EM. Con el descubrimiento de genes no-HLA asociados con la enfermedad se ha incrementado también su estudio como posibles biomarcadores de diferentes características clínicas de la misma. La mayoría de estos genes no-HLA, como ya se ha mencionado, se relacionan con vías de señalización relacionadas con el sistema inmune. Entre ellos se encuentran algunos genes del inflamasoma, un complejo multiproteico citosólico caracterizado por actuar como barrera de defensa ante patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o daño (DAMP) como parte del sistema inmune innato. De acuerdo a esto, variantes en genes del inflamasoma, como la variante de ganancia de función rs35829419 en el gen NLRP3, representan un factor de riesgo para el desarrollo de la EM y para la progresión a formas severas de la enfermedad (Soares, Oliveira, & Pontillo, 2019). De la misma forma, se han identificado variantes genéticas de otros genes, CPXM2, IGSF9B y NLRP9, que presentan diferentes efectos en la evolución de la enfermedad (Gil- Varea et al., 2018). Todos estos genes podían emplearse como biomarcadores de la actividad de la EM en las diferentes formas de la enfermedad. Muchas de las variantes genéticas asociadas a la EM y a otras enfermedades autoinmunes pertenecen a genes involucrados en vías de señalización relacionadas con la respuesta inmune. Aunque cada una de estas variantes, de manera individual, presenta un pequeño riesgo de asociación a la enfermedad, en conjunto pueden ayudar a representar una asociación mayor con la EM (Housley et al., 2015). 31 El uso de biomarcadores genómicos también puede ser de gran utilidad a la hora de establecer la mejor diana terapéutica. Este campo, que se encuentra, actualmente, en constante evolución, hace referencia a la farmacogenética y por tanto a una medicina personalizada. En la actualidad ya existen variantes genéticas que se han asociado con una mejor respuesta frente a determinados tratamientos en la EM. Así, por ejemplo, la presencia de homocigosis del polimorfismo rs7298096 en pacientes con EM tratados con IFN-β, se asocia a un menor tiempo desde el inicio del tratamiento hasta el desarrollo del primer brote. Este polimorfismo se sitúa aguas arriba del gen NINJ2 y la asociación observada también se relaciona con mayores niveles en la expresión de NINJ2 (Peroni et al., 2019). Asimismo, se ha observado una asociación del polimorfismo rs479333 G>C del gen NLRC4 con el tratamiento de IFN-β. De este modo, la presencia del mismo es más frecuente en aquellos pacientes que responder de una manera más efectiva al tratamiento (Soares et al., 2019). La respuesta a un tratamiento específico puede verse alterada no solo por un polimorfismo en concreto, sino por la interacción de varios componentes genéticos. Como se ha explicado, la EM es una enfermedad heterogénea en la que están involucrados múltiples factores genéticos. Por ello, es de esperar que también se observen múltiples factores relacionados con las diferentes características de la enfermedad. Así, Kulakova O. y colaboradores identificaron en 2017 varios loci de riesgo estudiados previamente por GWAS y observaron diferentes combinaciones bialélicas de genes que presentaban una mejor respuesta al acetato de glatirámero en los pacientes con EM (Kulakova et al., 2017). Dado que múltiples polimorfismos se han asociado a la EM es difícil encontrar un único biomarcador que se encuentre involucrado en los distintos aspectos de la enfermedad. Sin embargo, conocer cada una de estas contribuciones puede ayudar a obtener un mayor conocimiento de las bases fisiológicas de la enfermedad y a seleccionar el tratamiento adecuado. 1.8. Genética de la esclerosis múltiple De acuerdo a lo comentado previamente, los estudios epidemiológicos en gemelos y en familias abrieron la puerta a considerar que la EM tiene una base genética. De 32 este modo, el impacto de los factores genéticos en la enfermedad ha sido especialmente observado en los estudios realizados en gemelos monocigóticos (Goodin, 2016; Hansen et al., 2005; Kuusisto et al., 2008; Willer et al., 2003). Como sucede con otras enfermedades autoinmunes los individuos con EM tienden a agruparse en familias por lo que los estudios realizados en estas familias, con varios sujetos con EM, también han influenciado en la importancia que han adquirido los factores genéticos en la enfermedad (Sawcer et al., 2014). Actualmente, como se ha explicado, son muchas las variantes genéticas implicadas en la EM, pero su descubrimiento ha estado marcado por diferentes estrategias regidas principalmente por el conocimiento de la enfermedad en cada momento de estudio y por las técnicas disponibles para llevarlas a cabo. 1.8.1. Abordaje epidemiológico El primer registro histórico que consideró la EM una enfermedad hereditaria fue desarrollado en 1896 por Eichhorst (Eichhorst, 1896). Los trabajos posteriores que se desarrollaron se basaron en características epidemiológicas que permitieran explicar las bases genéticas de la EM, dada la falta de disponibilidad de estudios moleculares por aquel entonces. Así, comenzaron a llevarse a cabo estudios familiares de casos con EM y surgió el concepto de EM familiar definida como aquellos casos con EM que al menos presentaban otro miembro de la familia afectado por la enfermedad (Harirchian, Fatehi, Sarraf, Honarvar, & Bitarafan, 2018). Además, para la determinación de un posible patrón de herencia se comenzó a realizar un registro de aquellas familias que presentaban varios miembros afectados por EM (familias multiplex) (Multiple Sclerosis Genetics Group, 1998). La prevalencia de EM familiar se encuentra alrededor del 15-20% en la población general (Compston & Coles, 2002). Los estudios epidemiológicos en familias han permitido identificar una mayor tasa de concordancia en los gemelos monocigóticos (20-30%) respecto a los gemelos dicigóticos (3-5%) (Goodin, 2016; Hansen et al., 2005; Kuusisto et al., 2008; Willer et al., 2003). Igualmente, se observa un menor porcentaje de riesgo de la enfermedad en aquellos familiares más alejados genéticamente. Mientras que, en el caso de los familiares de primer grado, los 33 hermanos presentan un riesgo de desarrollar la EM del 3%, más alto que para padres e hijos (2%), los familiares de segundo grado – tíos – tienen entre un 1-2% de riesgo y los familiares de tercer grado, como los primos, presentan menos del 1% de riesgo (Tabla 1.1) (Baranzini & Oksenberg, 2017; Compston & Coles, 2002; Goodin, 2014; Patsopoulos, 2018). Tabla 1.1. Riesgo de desarrollar EM de acuerdo al parentesco familiar. Familiar Riesgo de desarrollar EM Gemelos monocigóticos 20-30% Gemelos dicigóticos 3-5% Hermanos/as 3% Padres e hijos/as 2% Tíos/as 1-2% Primos/as <1% Gracias a las conclusiones de estos trabajos se remarcó la incidencia del componente genético en la patogénesis de la EM. Asimismo, estos resultados evidenciaban que la enfermedad no sigue un patrón de herencia monogénico o mendeliano y que, entre otros aspectos, la tasa de discordancia entre gemelos monocigóticos también era alta, alrededor del 70%, lo que ponía de manifiesto que la EM era una enfermedad poligénica, influenciada además por varios factores (Didonna & Oksenberg, 2015). Una de las observaciones que también se realizó gracias a los estudios en las familias multiplex fue la prevalencia de otras enfermedades autoinmunes (AID) en este tipo de familias. Aunque existen algunas controversias según el tipo de AID, en general los trabajos muestran una prevalencia mayor de otras AID en familias multiplex respecto a población control (Barcellos et al., 2006; Deretzi et al., 2010; Nielsen et al., 2008). La presencia de varias AID en las familias con más de un miembro afecto de EM pone de manifiesto una susceptibilidad generalizada que podría ser explicada por factores genéticos. Entre las AID con mayor prevalencia en estas familias se encuentran las enfermedades tiroideas, ya sean en los pacientes con EM o en sus familiares. Además, también se observa una asociación entre la EM y enfermedades 34 autoinmunes como la psoriasis o la enfermedad inflamatoria intestinal (Dobson & Giovannoni, 2013). En nuestro grupo, desarrollamos un trabajo donde estudiamos 40 familias con al menos dos miembros afectos por EM y observamos que estas familias se podían clasificar en dos grupos: familias tipo A, cuyos individuos afectos por EM pertenecían a la misma generación, y familias tipo B, en las que los casos con EM pertenecían, al menos, a dos generaciones distintas. En los dos grupos se observaron diferencias en la presentación clínica, pero, además, las familias de tipo B presentaban una mayor tasa de otras AID que las familias del tipo A, lo que vuelve a orientar en la búsqueda de factores genéticos que ayuden a esclarecer las bases de la EM y de otras enfermedades autoinmunes (Pytel et al., 2018). 1.8.2. Abordaje genético A partir de 1972, gracias a la realización de estudios serológicos, y antes de que se produjera el desarrollo de las técnicas de genotipado, se consiguió identificar el que hasta ahora es el principal locus que genera susceptibilidad a la enfermedad: la región HLA (Bertrams, Kuwert, & Liedtke, 1972). Los esfuerzos para conocer factores de susceptibilidad a la EM comenzaron con estudios caso-control en genes candidatos de la enfermedad. Sin embargo, estos estudios no consiguieron señalar otra región relacionada fuera del CMH (Didonna & Oksenberg, 2015). La región génica del CMH está asociada con más enfermedades que cualquier otra región del genoma y ha sido asociada principalmente a enfermedades autoinmunes e infecciosas (Hollenbach & Oksenberg, 2015; Trowsdale & Knight, 2013). La asociación de los genes HLA con la EM se ha observado en todas las poblaciones estudiadas, independientemente de la forma clínica de la enfermedad. Concretamente, el gen HLA-DRB1 explica hasta el 10,5% del riesgo genético existente y presenta un OR aproximado de 3.5 (Baranzini & Oksenberg, 2017; Didonna & Oksenberg, 2015). Pero la señal principal asociada a la EM pertenece al alelo HLA-DRB1*15:01 (Creary et al., 2019; Hollenbach & Oksenberg, 2015; Patsopoulos et al., 2013; Yamasaki & Kira, 2019). Aunque el alelo HLA-DRB1*15:01 presenta frecuencias altas (>10%) en Europa y Asia, su presencia es relativamente rara en el resto de poblaciones (Hollenbach & Oksenberg, 2015). No obstante, su 35 asociación con la EM se ha observado en poblaciones de diferentes etnias: caucásicos, chinos Han, colombianos, poblaciones de Oriente Medio, caribeños, sudamericanos, japoneses y norteafricanos (De Silvestri et al., 2019). Además de este alelo, muchos otros de los genes HLA, principalmente de la clase II, se han asociado al riesgo de EM. Debido a que el alelo HLA-DRB1*15:01 forma parte de un haplotipo extendido ya comentado (HLA-DRB1*15:01 - HLA-DQB1*06:02 - HLA-DRB5*01:01 - HLA-DQA1*01:02) es difícil descifrar la influencia de cada uno de los alelos en la enfermedad (Hollenbach & Oksenberg, 2015; Kaushansky & Ben- Nun, 2014). La presencia única del HLA-DQB1*06:02 se ha observado en poblaciones de pacientes noruegos con EM. También ha presentado una mayor asociación en poblaciones afrobrasileñas, mientras que el alelo HLA-DRB1*15:01 se asocia más a poblaciones afroamericanas (Kaushansky & Ben-Nun, 2014). Aparte, el alelo HLA- DQB1*06:02 ha mostrado asociación con la EM en pacientes de España, en ausencia del alelo HLA-DRB1*15:01 (Fernández et al., 2004). Asimismo, se han identificado otros alelos que confieren un riesgo en poblaciones del norte de Europa: HLA- DRB1*03:01, HLA-DQB1*02:01 y HLA-DRB1*13:03 (Didonna & Oksenberg, 2015). Debido a estas asociaciones se ha sugerido que el alelo HLA-DRB1*15:01 no es el único determinante de la susceptibilidad a la EM (De Silvestri et al., 2019). Teniendo en cuenta el papel relevante de la molécula HLA-DRB1 en la presentación de antígenos a las células T, es lógico esperar que diferentes alelos del gen HLA-DRB1 puedan afectar a la patogénesis de la EM. Así, se ha observado que el alelo DRB1*15:01 y otros presentan un efecto aditivo en la enfermedad, es decir, un riesgo incrementado en aquellos individuos que presentan varios alelos de riesgo (Parnell & Booth, 2017). Este hecho no es único de la EM, sino que también se observa en otras enfermedades autoinmunes con otros alelos de genes HLA clase II (MacKie et al., 2012). Al mismo tiempo que evolucionaron las técnicas en la biología molecular, evolucionaron las aproximaciones para comprender y descifrar las bases moleculares de la EM. Como en otras enfermedades comunes y complejas, el abordaje genético para la identificación de genes de susceptibilidad en la 36 enfermedad ha estado representado por dos estrategias principales: los estudios de ligamiento y los estudios de asociación. A pesar de ello, en la actualidad los esfuerzos se centran en el uso de técnicas de secuenciación de última generación que se comentarán más adelante. Por un lado, los estudios de ligamiento se basan en la búsqueda de la relación entre un determinado locus y la enfermedad dentro de una familia. Este tipo de análisis se realiza en familias que presenten dos o más individuos afectados por la enfermedad y permiten obtener información sobre la transmisión de un locus dentro de la familia estudiada. Por el contrario, los estudios de asociación se centran en estudiar la relación entre un determinado locus y la enfermedad dentro de una población clasificada en pacientes y controles sanos, por lo que permiten determinar las diferencias entre los dos grupos (figura 1.5) (Kebede & Attie, 2014). Figura 1.5. Diferencias entre los estudios de ligamiento y los estudios de asociación. A) En los estudios de ligamiento se identifican aquellos marcadores genéticos compartidos por los individuos afectos. Estos estudios tienen un poder estadístico alto pero una baja resolución en la identificación de la región cromosómica relacionada, ya que el fenotipo estudiado se relaciona con regiones amplias que contienen muchos genes. B) En los estudios de asociación se busca la asociación entre un grupo amplio de polimorfismos de un solo nucleótido que abarcan todo el genoma y un fenotipo dado en una población no emparentada. Este tipo de estudios presentan un menor poder estadístico, pero la 37 resolución de mapeo es mucho mayor que en los estudios de ligamiento (Modificado de Kebede & Attie, 2014). 1.8.3. Estudios de ligamiento La búsqueda de nuevas estrategias después de los estudios de asociación de genes candidatos continuó con los estudios de ligamiento. Para realizar estos estudios se empleaban familias con varios miembros con EM, pero que en general no incluían más de tres o cuatro individuos afectos. Los estudios de ligamiento han presentado un éxito limitado en la EM, a pesar de los buenos resultados obtenidos en otras enfermedades. Aun así, los resultados obtenidos en estos trabajos volvieron a señalar a la región HLA como el principal locus de susceptibilidad a la enfermedad. En un metaanálisis realizado en 2003, con todos los trabajos de estudios de ligamiento que se habían realizado hasta ese momento, se observó que la región del genoma que presentaba valores estadísticamente significativos relacionados con la enfermedad era la región del CMH (Haines et al., 2003). Los trabajos que se incluyeron en el estudio formaban parte de distintas poblaciones, lo que ponía en evidencia que la región CMH se encontraba relacionada a la EM en todas ellas. Hasta ese momento los estudios de ligamiento se realizaban empleando microsatélites como marcadores genéticos. Pero en 2005 se realizó uno de los últimos estudios de ligamiento en el que por primera vez se emplearon polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés single nucleotide polymorphisms) (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2005). El uso de SNP como marcadores genéticos permitió obtener una mayor potencia estadística que los trabajos realizados con microsatélites. Sin embargo, la única región que mostró resultados estadísticamente significativos fue la región HLA, en concreto el HLA- DRB1*15:01. El hecho de que no se encontraran otras regiones con resultados significativos puso en evidencia que el tamaño del efecto de otras variantes de riesgo era mucho menor que el de la región HLA y esto hizo esperar que para ganar potencia estadística sería necesario un mayor tamaño muestral. Sin embargo, la dificultad de reunir miles de familias provocó la llegada de una nueva estrategia que permitiera contrarrestar este problema (Didonna & Oksenberg, 2015). 38 1.8.4. Estudios de asociación del genoma completo De nuevo, las mejoras tecnológicas y la generación de microarrays de ADN posibilitaron la llegada de los estudios de asociación del genoma completo (GWAS, por sus siglas en inglés genome-wide association studies) (Canto & Oksenberg, 2018) mediante el estudio de millones de SNP de manera simultánea. Los GWAS se enfocan en estudiar en poblaciones amplias asociaciones entre la enfermedad y variaciones genéticas en el genoma, fundamentalmente SNP con una frecuencia poblacional mayor del 5% y que suelen llegar a cientos de miles de millones (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2007). Este tipo de estudios permiten la comparación de marcadores genéticos entre un grupo de pacientes y un grupo de controles no afectos. A diferencia de los estudios realizados anteriormente, los GWAS permiten el análisis de marcadores en el genoma completo en individuos que no están emparentados. Gracias a ellos se ha permitido obtener una aproximación imparcial de polimorfismos relacionados con la enfermedad. Para medir el nivel de asociación de la frecuencia de un alelo con la presencia o ausencia de la enfermedad se utiliza la medida estadística Odds Ratio (OR). No obstante, uno de los desafíos más llamativos respecto a la potencia estadística de los GWAS es el hecho de estudiar cientos de miles de variantes genéticas, ya que esto incrementaba la probabilidad de falsos positivos. Por ello, el límite del nivel de significación estadística que se utiliza en general en los GWAS es un p-valor de 5 x 10-8 (Baranzini & Oksenberg, 2017; Oksenberg & Baranzini, 2010; Patsopoulos, 2018). El comienzo de los GWAS en EM estuvo influenciado por la hipótesis de que la enfermedad presenta un modelo de herencia poligénico (enfermedad común – variantes comunes), lo que permitió comenzar a realizar estudios multicéntricos con grandes conjuntos de datos de ADN (Baranzini & Oksenberg, 2017). En la EM se han llevado a cabo múltiples GWAS desde que se realizó el primer trabajo en 2007 (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2007) y, principalmente, han estado protagonizados por el Consorcio Internacional de Genética en Esclerosis Múltiple (IMSGC, por sus siglas en inglés International Multiple Sclerosis Genetics Consortium). En este primer GWAS, se identificaron los primeros genes fuera de la región HLA asociados a la enfermedad, el receptor α de interleuquina 7 (IL7R) y el receptor α de interleuquina 2 (IL2RA). Estos genes, junto con otros loci que se 39 identificaron en posteriores GWAS, mostraban un efecto modesto en la EM (OR<1.35). Esto provocó la inclusión de tamaños muestrales más grandes con colaboraciones a nivel internacional que presentaran al menos 10.000 casos y controles para poder detectar polimorfismos de riesgo asociados con la enfermedad. Con el tiempo y con posteriores GWAS realizados aumentó el número de loci asociados a la EM, muchos de ellos involucrados con el sistema inmune (Patsopoulos, 2018). Uno de los últimos trabajos desarrollados mediante GWAS en la EM ha sido realizado también por el IMSGC y en él utilizaron muestras de 47 429 casos con EM y 68 374 controles (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2019). Con estos últimos trabajos se ha permitido identificar hasta 233 asociaciones estadísticamente independientes con susceptibilidad a la EM que eran significativas en el genoma (figura 1.6). 32 de las 233 asociaciones correspondían a la región del CMH. El resto son un conjunto de 200 asociaciones pertenecientes a regiones no- CMH en el genoma y la primera asociación descrita en el cromosoma X. Los OR de estas asociaciones presentaban valores entre 1,06 – 2,06 y las frecuencias alélicas de los alelos de riesgo variaban desde el 2,10 al 98,40% según datos de muestras europeas procedentes del proyecto 1000 Genomas (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2019). 40 Figura 1.6. Mapa genético de la esclerosis múltiple. El diagrama de “circos” muestra los genes priorizados en la región más periférica de la figura. Los p-valores se encuentran dibujados como líneas en la parte interna, siendo los de color verde aquellos que muestran valores significativos (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2019). Desde que se identificaron los primeros genes no-HLA (IL2RA e IL7R) ha crecido en gran medida el número de SNPs asociados con la EM. Los GWAS han identificado muchos genes de interés en la enfermedad y la asociación presentada por muchos de ellos ha sido replicada en posteriores estudios. Gran parte de estos SNPs identificados se localizan en regiones cercanas a genes que codifican proteínas relacionadas con el sistema inmune. Uno de los genes que ha presentado una alta asociación con la EM es el gen TNFRSF1A (tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A). Se encuentra en 41 el cromosoma 12 y codifica uno de los receptores del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα, por sus siglas en inglés tumor necrosis factor). Variantes en este gen están asociadas con el síndrome periódico asociado al receptor del TNF (TRAPS, por sus siglas en inglés TNF receptor-associated periodic syndrome) y también con la fiebre mediterránea familiar (FMF) (Jéru et al., 2013; Marek-Yagel et al., 2010; Ruiz-Ortiz et al., 2017). Desde que se realizó la primera asociación entre el gen TNFRSF1A y la EM, los estudios han estado principalmente protagonizados por un polimorfismo común, rs1800693, que parece presentar un efecto modesto en la enfermedad, y por la variante rs4149584. Esta variante, de baja frecuencia en la población general, provoca un cambio de arginina por glutamina (R92Q) y presenta un mayor efecto que el polimorfismo rs1800693 (De Jager et al., 2009). En trabajos posteriores se observó que el rs4149584 se relacionaba con un comienzo de la enfermedad más temprano y una progresión más lenta de la EM en aquellos pacientes que portaban la variante. Sin embargo, no se observaron diferencias para el polimorfismo rs1800693 (Comabella et al., 2013). En España también se estudió la asociación de este gen con la EM y señalaron a otro polimorfismo relacionado con la misma, el rs1860545 (Swaminathan et al., 2010). Adicionalmente, se ha observado que el polimorfismo rs1800693 genera una isoforma de ARN que no presenta los dominios transmembrana y citoplasmático y que provoca una alteración en la respuesta de los monocitos ante el TNF-α (Ottoboni et al., 2013). Por otro lado, el cambio R92Q se ha asociado con una mayor interacción entre el receptor y el TNFα lo que podría indicar una potenciación de esta vía de señalización y una afección distinta en aquellos individuos que la presentan (Agulló, Malhotra, Fissolo, Montalban, & Comabella, 2015). El gen CD58 ha sido otro de los genes altamente relacionados con la EM. Desde su modesta asociación con la enfermedad observada en el primer GWAS realizado en 2007 (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2007), han sido varios los trabajos que con posterioridad han replicado su asociación. El CD58 codifica para un ligando miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y actúa como potenciador en la activación de los linfocitos. Entre los polimorfismos de este gen asociados a la EM se encuentran el rs2300747 y el rs1335532. El rs2300747A>G ha sido principalmente relacionado con un efecto protector en la susceptibilidad de la 42 enfermedad. Así, en un metaanálisis de 2016 evidenciaron que este polimorfismo se encuentra relacionado con un menor riesgo de desarrollar EM en un grupo de hombres con la enfermedad (J. Liu et al., 2016). Además, esta asociación también ha sido replicada recientemente en un grupo de mujeres con EM (Chorąży et al., 2019). Aunque, aunque los trabajos que señalan al polimorfismo rs1335532A>C son menos numerosos, este podría presentar también un efecto protector frente a la enfermedad. Uno de los motivos observados de este efecto protector podría recaer en la creación de un sitio de unión al factor de transcripción ASCL2, una diana de la vía de señalización Wnt (Mitkin et al., 2018). No obstante, también hay trabajos que no han logrado replicar esta asociación entre el gen CD58 y la EM por lo que se necesitan más estudios que ayuden a esclarecer su papel en la enfermedad (Ghavimi et al., 2020). Muchos de los genes que han mostrado asociación con la EM también se han relacionado con otras enfermedades autoinmunes, lo que sugiere que estas enfermedades podrían presentar mecanismos comunes como se ha explicado con anterioridad (figura 1.7) (Baranzini, 2009; Didonna & Oksenberg, 2015). Esta relación entre la EM y otras enfermedades autoinmunes es bien conocida y lleva años estudiándose, como se ha comentado previamente. Así, por ejemplo, la EM y la diabetes tipo I son dos enfermedades que comparten un componente genético común (Handel, Handunnetthi, Ebers, & Ramaǵopalan, 2009). Si bien es cierto que las AID más asociadas con la EM son las enfermedades tiroideas (Magyari & Sorensen, 2020; Marrie et al., 2015), esta relación confirma que la susceptibilidad a estas enfermedades puede llevar un riesgo heredado y compartido que se desarrollará de una u otra forma según los factores ambientales y epigenéticos de cada individuo (Baranzini & Oksenberg, 2017). 43 Figura 1.7. Relación genética entre distintas enfermedades autoinmunes. La enfermedad se encuentra representada por círculos y los genes por triángulos. Los genes asociados con más de una enfermedad están representados en amarillo y situados en el centro de la relación (Baranzini & Oksenberg, 2017). A pesar de las asociaciones descritas con los GWAS en la EM, estos estudios presentan varias limitaciones a la hora de encontrar variantes relacionadas con la enfermedad. Por un lado, estos estudios presentan un poder estadístico limitado para identificar todos los loci asociados. Si bien los GWAS han permitido identificar polimorfismos asociados a la EM, estos solo explican una parte de la heredabilidad de la enfermedad. Por otro lado, la mayoría de los polimorfismos identificados también se encuentran en población sana, ya que los GWAS se diseñan bajo la hipótesis de “enfermedad común – variantes comunes” (Oksenberg & Baranzini, 44 2010). Esto provoca que muchos de los SNP identificados no sean capaces de mostrar una asociación fuerte con la enfermedad y que los que se han asociado no puedan utilizarse como marcadores de la misma. Gran parte de la “heredabilidad perdida” que aún se desconoce puede deberse al efecto de variantes raras (MAF < 0,05%) que presenten un efecto mayor en la EM que las variantes comunes identificadas mediante los GWAS. Además, las asociaciones descritas en los GWAS presentan valores OR modestos, lo que implica que las variantes encontradas presentan una frecuencia similar tanto en los casos como en los controles, por lo que el tamaño del efecto en la EM es bajo (Baranzini & Oksenberg, 2017; Hou & Zhao, 2013). De igual manera, los GWAS presentan dificultades a la hora de interpretar los resultados, ya que muchas de las variantes asociadas a la enfermedad pertenecen a regiones no codificantes del genoma, lo que entorpece la interpretación de la relevancia biológica de las mismas (Hou & Zhao, 2013). Asimismo, el desequilibrio de ligamiento presente en muchos de los alelos de riesgo descritos, especialmente en la región del CMH, dificulta la detección de las variantes genéticas más relevantes en la enfermedad, ya que es muy difícil distinguir el impacto real de las variantes de manera individual (Housley et al., 2015). Además, dada la alta frecuencia alélica de los polimorfismos identificados, es difícil señalar alguno que haya sido identificado como patogénico. Uno de los problemas de las asociaciones encontradas en los GWAS es que se han presentado muy pocos estudios funcionales posteriores que muestren el nivel de patogenicidad de estas variantes comunes. De igual modo, si bien se han encontrado relaciones entre determinados polimorfismos y la EM, ha sido difícil identificar el riesgo que produce cada uno de ellos en la susceptibilidad a la enfermedad. Algunos de los SNPs identificados, como los mencionados en párrafos anteriores, presentan un efecto sobre la edad de inicio de la EM o incluso sobre la severidad de la enfermedad, pero ha sido difícil establecer el riesgo real que presentan sobre el desarrollo de la EM. La EM es una enfermedad compleja con una parte de la heredabilidad genética explicada por variantes comunes, cada una de las cuales explica una pequeña fracción de la enfermedad. Sin embargo, al igual que otras enfermedades comunes y complejas, estas variantes no pueden explicar la enfermedad en su totalidad 45 (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2018). Por ello, debido a la dificultad de los GWAS de estudiar variantes raras o polimorfismos de baja frecuencia (< 5%) y al desarrollo de nuevas técnicas, se han planteado en los últimos años nuevas estrategias que permitan una mejor aproximación del estudio del genoma y de su análisis. 1.8.5. Secuenciación de nueva generación La metodología de secuenciación del ADN comenzó con el desarrollo del método enzimático Sanger (Sanger, Nicklen, & Coulson, 1977). A pesar de la gran precisión de lectura que presenta esta metodología, requiere mucho tiempo en su ejecución ya que realiza un número limitado de reacciones en paralelo. La secuenciación Sanger ha formado las bases de técnicas ampliamente utilizadas en la actualidad, conocidas como secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés next generation sequencing) que, entre otros aspectos, han permitido optimizar el tiempo de realización. La tecnología NGS, surgida en el año 2005, ha sufrido un gran desarrollo en los últimos años y permite abordar de manera más completa la genética de un determinado individuo. Las técnicas utilizadas en esta tecnología son capaces de leer miles de secuencias en paralelo de manera mucho más rápida que la secuenciación por Sanger y también con un coste más barato. Su uso ha permitido un aumento de los diagnósticos de distintas enfermedades (Shademan, Biray Avci, Nikanfar, & Nourazarian, 2020). A su vez, la tecnología NGS también permite la identificación de variantes raras con un efecto alto en la enfermedad, lo que ha permitido adentrarse en la detección de la “heredabilidad perdida” de muchas enfermedades complejas, entre ellas la EM (Jiang, Tan, Tan, & Yu, 2014). La NGS ha permitido un nuevo enfoque en los estudios de secuenciación, pudiendo desarrollar trabajos dirigidos a estudiar determinados genes, análisis de exoma o de genoma completos. Dentro de estas metodologías de NGS, una de las más empleadas actualmente es la secuenciación completa de exoma (WES, por sus siglas en inglés whole-exome sequencing). El exoma comprende el conjunto de exones de los genes que dan lugar a proteínas, esto es, un 2% del total del genoma. A pesar del pequeño 46 porcentaje que representa respecto al genoma total, la secuenciación completa de exoma ha permitido conocer múltiples variantes causantes de muchas enfermedades monogénicas. Esto se debe a que se estima que alrededor de un 85% de las variantes causantes de enfermedades se localizan en regiones codificantes (Rabbani, Tekin, & Mahdieh, 2014). Además, permite la detección tanto de SNP como de variantes raras que tengan un mayor efecto en el fenotipo. El estudio del exoma también permite detectar variantes en regiones de splicing, regiones intrónicas adyacentes, regiones promotoras y regiones no traducidas. Estas regiones son de extrema importancia ya que cambios en ellas pueden afectar a la regulación génica y por tanto afectar al fenotipo de estudio. En la EM se han identificado distintas variantes con un posible impacto en la enfermedad. Uno de los primeros trabajos realizados con secuenciación de exoma consiguió identificar una variante rara en un gen previamente asociado a la enfermedad mediante GWAS, el gen CYP27B1 (cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1) (Bahlo et al., 2009). Este gen codifica para un miembro de las enzimas de las superfamilia del citocromo P450 y una de sus funciones principales es la síntesis de 1-alfa, 25-dihidroxivitamina D3, la forma activa de la VD. Los autores identificaron la variante rs118204009, que produce un cambio de arginina por histidina en la posición 389 (R389H), mediante el abordaje de la secuenciación de exoma. Aunque el gen se había asociado previamente con GWAS, esta era la primera vez que se identificaba una variante rara del CYP27B1 y no se encontraba en ninguno de los individuos controles estudiados. Además, esta variante conduce a la pérdida de función de la enzima codificada, lo que se traduce en menores niveles de la forma activa de la vitamina D, que como se ha explicado en apartados anteriores también están relacionados al riesgo de EM (Ramagopalan et al., 2011). Aun así, debido a los posteriores trabajos donde no se han replicado estos resultados (Ban et al., 2013; Barizzone et al., 2013), siguen siendo necesarios más estudios para establecer el papel del CYP27B1 en la enfermedad. Al igual que con el gen CYP27B1, el gen TYK2 (tyrosine kinase 2) había sido previamente relacionado con la EM como un posible candidato de riesgo gracias a diferentes trabajos con GWAS. Este gen codifica para un miembro de la familia de 47 proteínas quinasas Janus (JAK, por sus siglas en inglés de janus kinases). Esta proteína permite la transducción de la señal de citoquinas mediante su unión al dominio citoplasmático de receptores de citoquinas I y II. En el 2012, Dyment y colaboradores identificaron una variante rara del gen TYK2, rs55762744, que produce un cambio de alanina por treonina en la posición 53 (A53T) en una familia multiplex. Tras realizar validaciones en otras familias observaron que se presentaban individuos portadores de este cambio sin EM, por lo que otros factores podían estar influyendo en el riesgo de la enfermedad (Dyment et al., 2012). Gracias al desarrollo y la mejora de la NGS se han realizado más estudios que, a través de la WES, han identificado variantes raras en diferentes genes, entre los que se encuentran NLRP3, NLRP12, SLC24A6, NFATC2, C6orf10 (Popplewell et al., 2020; Vilariño-Güell et al., 2019; Ziliotto et al., 2019). Sin embargo, hasta hoy solo se ha conseguido explicar alrededor del 50% de la heredabilidad que presenta la EM (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2019). En general, los genes identificados relacionados con la EM codifican proteínas que pertenecen a vías de señalización del sistema inmune y como se ha comentado anteriormente también se asocian a otras enfermedades autoinmunes (Baranzini, 2009). El estudio de estos genes puede arrojar luz sobre la fisiopatología de la enfermedad. Dada la relación de muchos genes con el sistema inmune, un comportamiento alterado de las vías de señalización a las que pertenecen podría impactar en la susceptibilidad de desarrollar la enfermedad. Por ello, es importante detectar qué vías de señalización se ven alteradas por variantes presentes en genes involucrados en las mismas. Entre las principales vías de señalización que se han identificado, gracias al análisis de los GWAS, de estudios de expresión, y de los modelos animales, se encuentran la vía señalización del procesamiento y la presentación de antígenos, la vía de señalización JAK-STAT (por sus siglas en inglés janus kinase/signal transducer and activator of transcription), señalización de los receptores de células T, la vía de señalización de quimioquinas y la vía de señalización de receptores tipo NOD (NLR, por sus siglas en inglés nod-like receptor) (Hojati, 2017; G. Liu, Zhang, Hu, et al., 2017; G. Liu, Zhang, Jiang, et al., 2017). Además, se han identificado diferencias de expresión en genes pertenecientes a vías relacionadas con el desarrollo de neuronas, la diferenciación de neuronas, el desarrollo del sistema nervioso central y el revestimiento de los 48 axones entre otros (W. Zheng et al., 2018). Asimismo, las variantes identificadas hasta hoy con las diferentes tecnologías y que son causantes de una parte del riesgo de la EM permiten esclarecer vías metabólicas de posible interés en la enfermedad. 1.9. Justificación de la investigación El conocimiento creciente de la implicación de la inmunidad innata en el desarrollo de la EM ha promovido en este trabajo a la búsqueda de genes o variantes genéticas pertenecientes a vías de señalización relacionadas con la misma mediante el uso de WES. Las vías de señalización en las que se centra este trabajo son la vía metabólica de la vitamina D, la vía de señalización del TNF y la vía de señalización del inflamasoma. 49 2. Hipótesis y objetivos De acuerdo a la revisión de la literatura mencionada en el apartado anterior, nos hemos planteado las siguientes hipótesis: - La secuenciación completa de exoma permite la identificación de variantes genéticas poco frecuentes o raras en regiones codificantes del genoma, que pueden explicar parte del componente genético de la EM. - El estudio de familias con más de un miembro afecto por EM puede ayudar a conocer la base genética de la EM. - Las familias objeto de este estudio presentan variantes genéticas que afectan a vías metabólicas potencialmente relacionadas con la EM. - La EM comparte una base genética con otras enfermedades autoinmunes. A partir de estas hipótesis se plantearon los siguientes objetivos: - Generar una base de datos de familias con más de un miembro con EM. - Realizar la secuenciación completa de exoma a los pacientes y familiares de las familias identificadas. - Analizar vías de señalización pertenecientes a la inmunidad innata y relacionadas con la EM. - Establecer un flujo de trabajo con diferentes estrategias para la búsqueda de variantes potencialmente relacionadas con la enfermedad. 50 3. Materiales y métodos 3.1. Diseño del estudio Con el fin de contrastar las hipótesis planteadas y desarrollar los objetivos señalados se diseñó un estudio observacional, descriptivo, con seguimiento clínico y análisis genético de una cohorte de familias con EM. 3.2. Población de estudio El ámbito de reclutamiento fue la unidad de desmielinizante del Servicio de Neurología del Hospital Clínico San Carlos (HCSC). De la población de estudio disponible, se incluyeron 23 familias con al menos dos miembros afectos de EM, de la mismas o distinta generación, cumpliendo los criterios de McDonald de 2010 (Polman et al., 2011). Todos los pacientes y familiares dieron su consentimiento para participar en el estudio. 3.3. Período de estudio El reclutamiento de pacientes y familiares se realizó durante el periodo entre enero de 2017 y enero de 2019. 3.4. Evaluación clínica Se elaboró un protocolo con el fin de recopilar datos demográficos y clínicos de cada uno de los participantes del estudio. El protocolo con el que fueron evaluados todos los pacientes y familiares incluyó: Datos demográficos 51 - Edad - Sexo - Lugar de nacimiento - Ciudad de residencia Situación clínica relacionada con la EM - Fecha de inicio de la enfermedad - Forma clínica de la EM: EMRR, EMSP, EMPP - Tiempo de evolución de la enfermedad: considerada como el tiempo en años desde el primer síntoma neurológico relacionado con la EM hasta el momento de análisis del estudio - Número de brotes totales: considerando los episodios de déficit neurológico agudo que tienen una duración mayor de 24 horas Cuestionario de otros antecedentes - Otras enfermedades autoinmunes (AID) - Fecha de inicio de la enfermedad (en caso de que el inicio fuera posterior a la EM, se evaluaba la relación con cambios de la misma) - Antecedentes familiares de otras AID El listado de otras AID se obtuvo de una versión modificada de la lista de enfermedades autoinmunes de la American Autoimmmune Related Diseases Association (AARDA, n.d.) (Anexo I) Los sujetos del estudio se clasificaron de la siguiente manera: - Sujetos afectados de EM con o sin otra enfermedad autoinmune (AID) - Sujetos con otra AID diferente de la EM - Sujetos no afectos de EM ni otra AID Asimismo, las distintas familias fueron clasificadas de acuerdo al número de generaciones dentro de la familia afectadas por la enfermedad. Como se describe en el estudio realizado previamente por nuestro grupo con 40 familias con EM (Pytel et al., 2018), las familias fueron clasificadas en familias de tipo A si los individuos con EM pertenecían a la misma generación o familias de tipo B, si los individuos con 52 EM pertenecían a dos o más generaciones distintas. En la figura 3.1 se muestra un esquema de la clasificación. Los árboles genealógicos de las familias incluidas en el estudio fueron realizados con la herramienta Pedigree Chart Designer v2.2 de la compañía CeGaT (CeGaT, 2012). Figura 3.1. Esquema de la clasificación de familias realizada. Familias tipo A: una única generación afecta de EM. Familias tipo B: al menos dos generaciones afectas por EM. 3.5. Secuenciación completa de exoma 3.5.1. Extracción de las muestras de sangre Se realizó la extracción de la sangre periférica de los individuos durante una visita a tal propósito y bajo un procedimiento de venopunción estandarizado. Se recogieron 10 ml de sangre en tubo anticoagulante con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para el posterior aislamiento de ADN, sin necesidad de que los participantes se encontraran en ayunas para la extracción de sangre. 3.5.2. Extracción de ADN La extracción de ADN genómico de las muestras de sangre periférica se realizó con el sistema MagNA Pure (Roche Molecular Systems, Inc.), de acuerdo con las 53 instrucciones del fabricante. Los pasos del proceso se incluyen ilustrados en la figura 3.2. Figura 3.2. Proceso de extracción de ADN genómico mediante el sistema MagNA Pure (Modificado de Roche Molecular Systems Inc., 2018). 3.5.3. Control de calidad de las muestras La cantidad de DNA genómico necesaria fue 1 µg a una concentración superior a 50 ng/µl, disuelto en agua, buffer Low TE (0.1 mM EDTA, 10 mM TRIS-HCl, pH 8.0) o 10 mM TRIS-HCl (pH 8.0). El grado de pureza del ADN, determinado por el ratio de absorbancia medida a 260 y 280 nm (NanoDrop), A260/A280 se encontraba entre 1.8 y 2.0. Asimismo, el ratio de absorbancias A260/A230 deberá estar en el rango 1.6-2.2. La concentración de ADN se cuantificó mediante la medición de la fluorescencia con Qubit™ (Thermo Fisher Scientific Inc.). La pureza del ADN se midió con NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc.) y la integridad del ADN mediante electroforesis en gel de agarosa. 3.5.4. Preparación de las librerías y control de calidad El panel utilizado para la preparación de las librerías fue diseñado mediante Ion AmpliSeq™ Exome RDY Panel y Ion AmpliSeq™ Exome S5 RDY Panel (Thermo Fisher 54 Scientific Inc.). Estos paneles capturan >97% de las CCDS (Census Consensus Coding Sequence) (>19.000 genes, >198.000 exones, >85% de las alteraciones responsables de enfermedades con origen genético) y las regiones adyacentes de splicing (5pb). Tienen un tamaño aproximado de 58Mb y comprende un total de 293.903 amplicones. La selección de las regiones de interés se realizó con parejas de primers que permitieron una amplificación de las regiones exónicas mediante PCR. Una vez amplificadas las regiones de interés, se realizó la digestión parcial de los primers con FuPa Reagent. A continuación, se procedió a realizar el ligamiento de los adaptadores a las secuencias genómicas utilizando Ion Adapter, y Ion Xpress Barcode X. Tras esto, se llevó a cabo la purificación de las librerías y, por último, se realizó una cuantificación de las mismas mediante el fluorímetro Qubit™. El procedimiento fue llevado a cabo según las instrucciones del fabricante. En la figura 3.3 se presenta el esquema seguido para la preparación de las librerías. Posteriormente, se utilizó el equipo Ion Chef™ System para preparar las esferas cargadas con las librerías para la secuenciación. 55 Figura 3.3. Diagrama de la preparación de las librerías (Thermo Fisher Scientific Inc., 2015). 3.5.6. Secuenciación La secuenciación de las librerías se llevó a cabo con las plataformas de secuenciación masiva Ion Proton™ y Ion S5-XL™ (Thermo Fisher Scientific Inc), que proporcionan una alta uniformidad en la cobertura con más del 90% de los amplicones cubiertos a 20X de profundidad. Ambas plataformas utilizan la tecnología de secuenciación NGS de Ion Torrent™. Esta tecnología se basa en la secuenciación por síntesis en la que se emplea un sistema de detección basado en un cambio de pH, causado por iones de hidrógeno o protones (H+) que son liberados cada vez que se une un nucleótido a la cadena (figura 3.4). 56 La secuenciación de exoma y el tratamiento de los datos brutos de secuenciación fueron realizados en la empresa biomédica NIMGenetics, especializada en el desarrollo de plataformas genómicas de última generación. Figura 3.4. Tecnología de secuenciación Ion Torrent (Goodwin, McPherson, & McCombie, 2016). 3.6. Análisis bioinformático 3.6.1. Tratamiento de los datos brutos de secuenciación Las plataformas de secuenciación de Ion Proton™ y Ion S5-XL™ posibilitan el uso de distintas herramientas que han sido diseñadas y optimizadas para el tratamiento de archivos de secuenciación procedentes de esta tecnología. Las lecturas obtenidas con estos secuenciadores fueron procesadas y analizadas en servidores dedicados que emplean la última versión disponible de la plataforma Torrent Suite™. Esta plataforma lleva a cabo el análisis primario, en el que en primer lugar se realiza una conversión de la señal detectada a bases nucleotídicas, y el análisis secundario. Una vez convertida la señal del secuenciador, el flujo de trabajo continúa con la eliminación de los adaptadores usados durante la preparación de las librerías. Posteriormente se realizó el alineamiento de las secuencias con el genoma de referencia Genome Reference Consortium human build 37 (GRCh37). El alineamiento se llevó a cabo con el programa Torrent Mapping Alignment Program (TMAP), que está específicamente diseñado y optimizado para el tratamiento de datos 57 procedentes de las plataformas de secuenciación mencionadas. El alineamiento genera archivos en formato BAM (Binary Alignment Map) que almacenan los datos en formato binario. Posteriormente, una vez las secuencias están alineadas y filtradas, según criterios de calidad específicos, se analizan para realizar la llamada de las variantes (Variant calling) mediante la comparación de la información del archivo BAM frente a la secuencia de referencia. En este paso, que fue realizado con la herramienta Torrent Variant Caller (TVC), se obtuvieron los archivos denominados VCF (Variant Call Format). Los archivos VCF (GitHub Inc., 2020) son archivos de texto que se componen de una cabecera y del cuerpo del archivo en el que se desglosa la información genética. En la cabecera del VCF se especifican diferente información sobre el procesamiento de los datos, como los programas empleados, el genoma de referencia utilizado y una información detallada de la información contenida en el cuerpo del archivo VCF. Por su parte, el cuerpo del VCF (figura 3.5) detalla las variantes identificadas, especificando la localización, el alelo de referencia, el o los alelos alternativos, información adicional como la calidad y el genotipo de la variante en la muestra. Figura 3.5. Extracto del cuerpo de un archivo VCF. 3.6.2. Combinación de los VCFs A continuación, una vez obtenidos los archivos VCF de todas las muestras, se realizó la combinación de los 138 archivos VCF, para permitir un adecuado manejo, análisis y comparación de los datos. La combinación de los VCF requiere, en primer lugar, que los archivos estén comprimidos con la herramienta bgzip y, en segundo lugar, la creación de un archivo indexado mediante la herramienta tabix. Ambas 58 herramientas forman parte del paquete HTSlib v1.9. De acuerdo a ello, se utilizaron los siguientes comandos en cada una de las muestras. bgzip file.vcf tabix -p vcf file.vcf.gz La combinación de los 138 VCF se realizó con el programa Bcftools v1.9, utilizando la función merge, tal como se muestra en el siguiente comando: bcftools merge –l listado_muestras 3.6.3. Anotación funcional de variantes La anotación funcional de las variantes genéticas permite obtener información adicional relevante de las variantes presentes en el archivo VCF. Mediante este proceso se produce la asignación de diferentes valores a cada variante que permiten interpretar el efecto de cada cambio. La anotación se centró en detectar todas aquellas variantes comprendidas en regiones exónicas. Para realizar la anotación, se empleó SnpEff v4.3T (Cingolani, Platts, et al., 2012), una herramienta de código abierto que analiza las variantes de entrada, las anota y calcula los efectos que producen en genes conocidos. Esta herramienta, a su vez, genera un archivo que resume las estadísticas principales del VCF. El comando empleado fue el siguiente: java -Xmx4g -jar snpEff.jar -v -stats estadisticas.html hg19 EMgenes.vcf > EMgenes_ann.vcf Igualmente, se utilizó SnpSift (Cingolani, Patel, et al., 2012), un conjunto de herramientas vinculadas a SnpEff para manipular el VCF anotado, que permite agregar más información acerca de las variantes genéticas detectadas. A continuación, se explican las diferentes anotaciones empleadas con esta herramienta. Función annotate 59 La función annotate permite la anotación de las variantes utilizando información contenida en diferentes bases de datos. En este caso se utilizaron las bases de datos de dbSNP del NCBI (Build 151) y ClinVar (versión 21-10-2019). El comando empleado para esta función fue: java -jar SnpSift.jar annotate BaseDeDatos.vcf.gz EMgenes_ann.vcf > EMgenes_ann2.vcf Función dbNSFP La función dbNSFP permite anotar el VCF con la base de datos dbNSFP v2.9. dbNSFP es una base de datos integrada con predicciones funcionales de múltiples algoritmos (SIFT, PolyPhen2, LRT y MutationTaster, PhyloP and GERP++, etc.) y con datos de diferentes bases de frecuencias poblaciones (gnomAD, ExAC, 1000genomes, etc.). El comando empleado para la anotación con esta base de datos fue el siguiente: java -jar SnpSift.jar dnnsfp –v –db dbNSFP2.9.txt.gz EMgenes_ann2.vcf > EMgenes_ann3.vcf Función CaseControl La función CaseControl permite contar cuántas muestras pertenecen al grupo de casos o al grupo control con cada una de las variantes. En este caso es necesaria la creación de un archivo tfam que incluya la siguiente información: - 1ª columna: número identificador de la familia - 2ª columna: número identificador del individuo - 3ª columna: número identificador del padre (0 en caso de ser desconocido) - 4ª columna: número identificador de la madre (0 en caso de ser desconocido) - 5ª columna: sexo del individuo (1=hombre, 2=mujer, 0=desconocido) - 6ª columna: fenotipo del individuo (1=control, 2=caso, 0=desconocido) El comando empleado para esta función fue: java -jar SnpSift.jar caseControl –v –tfam Phenotypes.tfam EMgenes_ann3.vcf > EMgenes_ann4.vcf Función Private 60 La función Private facilita la identificación de aquellas variantes genéticas que únicamente se encuentren en una de las familias estudiadas, mediante el siguiente comando: java -jar SnpSift.jar private Phenotypes.tfam EMgenes_ann4.vcf > EMgenes_ann5.vcf 3.6.4. Selección de los genes de estudio Tras terminar la anotación del archivo VCF, se realizó una búsqueda de variantes genéticas candidatas mediante un análisis de genes involucrados en vías de señalización de interés en la EM que estuvieran relacionadas con la inmunidad innata. Así, se diseñó un panel virtual de genes de la vía metabólica de la vitamina D, de la vía de señalización del TNF y de la vía de señalización del inflamasoma. Una vez seleccionados los genes codificantes de proteínas involucradas en estas vías, se procedió a extraer las coordenadas genómicas de los mismos. Para ello, primero se identificó el transcrito principal de cada uno. El transcrito de cada gen, elegido con nomenclatura correspondiente al National Center for Biotechnology Information (NCBI) (ejemplo: NM_000417.2) o con nomenclatura Ensembl (ejemplo: ENST00000543859) se eligió basándonos en aquel más empleado previamente en estudios clínicos y/o de investigación. Para determinar el transcrito principal se utilizaron las siguientes bases de datos en orden de preferencia: 1. The Human Gene Mutation Database (HGMD) (Stenson et al., 2017) (figura 3.6) 2. ClinVar (Agarwala et al., 2018) 3. Locus Reference Genome (LRG) (Dalgleish et al., 2010; MacArthur et al., 2014) 4. APPRIS (Rodriguez et al., 2018) 5. NCBI (Agarwala et al., 2018) 6. UniProt (Bateman, 2019) 7. Ensembl (Cunningham et al., 2019) 8. University of California, Santa Cruz (UCSC) Genome Browser (Kent et al., 2002) 61 Figura 3.6. Ejemplo de búsqueda del gen NLRP3 en la base de datos HGMD. La versión del transcrito fue seleccionada mediante la plataforma UCSC Genome Browser. Una vez seleccionado el transcrito de cada gen se obtuvieron las coordenadas genómicas de los mismos mediante la herramienta Table Browser de la página UCSC (Karolchik et al., 2004). Esta herramienta permite obtener un archivo BED, un formato de archivo empleado para definir regiones genómicas. El archivo BED contiene las coordenadas genómicas especificadas que comprenden las regiones exónicas de los genes seleccionados. A continuación, se empleó el software Bedtools v2.25.0 (Quinlan & Hall, 2010) y la función intersect para la selección de las coordenadas genómicas del archivo VCF combinado. El archivo resultante es un VCF con las coordenadas genómicas de los genes de interés. bedtools intersect -a input.vcf.gz -b FILE1.bed -header > output.vcf -a: corresponde al archivo VCF de entrada en el que se quiere realizar la selección -b: corresponde al archivo BED que contiene las coordenadas genómicas que se quieren seleccionar -header: muestra la cabecera del archivo VCF antes de los resultados Posteriormente se empleó la herramienta FixVcfMissingGenotypes, que forma parte del paquete de herramientas Jvarkit (Lindenbaum, 2015) para corregir los genotipos perdidos e identificar aquellos que fueran homocigotos para el alelo de referencia. La herramienta utiliza la información recogida en los archivos BAM de cada muestra para comprobar la profundidad de cada una de las variantes. En este caso se utilizó una profundidad mínima de 15. 62 java -jar dist/fixvcfmissinggenotypes.jar -d 15 --filtered zz -B input.list < input.vcf < output.vcf 3.6.5. Análisis de coberturas Una vez seleccionadas las regiones de interés a estudiar se realizó un análisis de coberturas con los archivos BAM de cada individuo para conocer el porcentaje de regiones cubiertas con una profundidad superior a 20X. Para ello, se utilizó la herramienta Samtools v1.9 con el siguiente comando: samtools depth -a -b file.bed sample.bam > results.bed 3.6.6. Priorización de variantes La priorización bioinformática fue llevada a cabo en los archivos VCF con la función filter de la herramienta SnpSift para identificar posibles variantes genéticas que puedan ser causales de la enfermedad de acuerdo a su localización, a su frecuencia poblacional y a su posible patogenicidad. El primer paso corresponde al filtrado de calidad mientras que los pasos posteriores corresponden al filtrado bioinformático. A continuación, se detallan los pasos que se ejecutaron para la priorización de variantes. Filtrado de calidad El filtrado de calidad tiene como objetivo eliminar aquellas variantes cuya calidad no sea suficiente para asegurar su presencia. En este caso se consideró una puntuación mínima de calidad igual o mayor que 15. Se utilizó el siguiente comando para el filtrado: cat EM_ann.vcf | java -jar SnpSift.jar filter "(QUAL>= 15)" > EMfiltered_Q15.vcf Filtrado por posición y efecto Este paso tuvo como objetivo eliminar aquellas variantes fuera de regiones exónicas y aquellas dentro de regiones exónicas que no tuvieran efecto en la proteína 63 codificada (variantes sinónimas). De este modo, se eliminaron las variantes con las siguientes anotaciones:  '5_prime_UTR_variant': variante situada en región 5’ no traducida.  '3_prime_UTR_variant': variante situada en región 3’ no traducida.  'downstream_gene_variant': variante situada en la región aguas abajo del área fin de transcripción.  'upstream_gene_variant': variante situada en la región aguas arriba del área fin de transcripción.  'intergenic_region': variante en región intergénica.  'intron_variant': variante en región intrónica.  'conserved_intergenic_variant': variante conservada en región intergénica.  'conserved_intron_variant': variante conservada en región intrónica.  'NMD_transcript_variant': variante en transcrito aberrante  'non_coding_transcript_exon_variant': variante exónica en transcrito no codificante.  'non_coding_transcript_variant': variante en transcrito no codificante.  'synonymous_variant': variante sinónima. cat EMfiltered_Q15.vcf | java -jar SnpSift.jar filter "(ANN[*].EFFECT != '3_prime_UTR_variant') && (ANN[*].EFFECT != '5_prime_UTR_variant') && …… && (ANN[*].EFFECT != 'synonymous_variant')" > EMfiltered_effect.vcf Filtrado por frecuencia poblacional Se seleccionaron variantes genéticas con una frecuencia poblacional menor al 5% o que no presentaran anotación en la base de datos del ExAC. cat EMfiltered_effect.vcf | java -jar SnpSift.jar filter "(AF_EXAC < 0.05) || (na AF_EXAC)" > EMfiltered_MAF.vcf Filtrado por impacto Se eliminaron las variantes genéticas cuyo impacto en la proteína fuera bajo. cat EMfiltered_MAF.vcf | java -jar SnpSift.jar filter "(ANN[*].IMPACT != 'LOW')" > EMfiltered_impact.vcf Filtrado por ClinVar 64 Se mantuvieron aquellas variantes que pudieran tener relevancia clínica en la enfermedad. Para ello se incluyeron todas aquellas que presentaran las siguientes anotaciones en la base de datos de ClinVar:  Pathogenic  Likely pathogenic  Risk_factor  Uncertain significance  Not provided  Missing  Conflict_interpretations_of_pathogenicity  Conflicting_data_from_submitters cat EMfiltered_impact.vcf | java -jar SnpSift.jar filter "(CLNSIG has 'Pathogenic') | (CLNSIG has 'Likely_pathogenic') | …… | (CLNSIG has 'not_provided') | (CLNSIG has 'Missing') | (CLNSIG has 'missing')" > EMfiltered_ClinVar.vcf Filtrado por programas de predicción Los programas de predicción in silico estiman el efecto funcional de una variante detectada en una proteína. En este filtrado se emplearon los programas SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) (Vaser, Adusumalli, Leng, Sikic, & Ng, 2016), PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping v2) (Adzhubei et al., 2010) y la herramienta CADD (Combined Annotation Dependent Depletion) (Kircher et al., 2014; Rentzsch, Witten, Cooper, Shendure, & Kircher, 2019) para identificar las variantes con un posible efecto negativo. Se realizaron las combinaciones posibles para la selección de variantes con los siguientes criterios: - SIFT = D (deletérea) - SIFT = na (sin valor) - Polyphen2 = D (deletérea) - Polyphen2 = P (patogénica) - Polyphen2 = na (sin valor) - CADD > 15 - CADD = na (sin valor) cat EMfiltered_ClinVar.vcf | java -jar SnpSift.jar filter "((dbNSFP_SIFT_pred has 'D') & (na dbNSFP_SIFT_pred)) || ((dbNSFP_SIFT_pred has 'D') & (dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'D')) || ((dbNSFP_SIFT_pred has 'D') & 65 (dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'P')) || ((dbNSFP_SIFT_pred has 'D') & (na dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred)) || ((dbNSFP_SIFT_pred has 'D') & (dbNSFP_CADD_phred > 15)) || ((dbNSFP_SIFT_pred has 'D') & (na dbNSFP_CADD_phred)) || ((na dbNSFP_SIFT_pred) & (dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'D')) || ((na dbNSFP_SIFT_pred) & (dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'P')) || ((na dbNSFP_SIFT_pred) & (na dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred)) || ((na dbNSFP_SIFT_pred) & (dbNSFP_CADD_phred > 15)) || ((na dbNSFP_SIFT_pred) & (na dbNSFP_CADD_phred)) || ((dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'D') & (dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'P')) || ((dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'D') & (na dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred)) || ((dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'D') & (dbNSFP_CADD_phred > 15)) || ((dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'D') & (na dbNSFP_CADD_phred)) || ((dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'P') & (na dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred)) || ((dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'P') & (dbNSFP_CADD_phred > 15)) || ((dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred has 'P') & (na dbNSFP_CADD_phred)) || ((na dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred) & (dbNSFP_CADD_phred > 15)) || ((na dbNSFP_Polyphen2_HVAR_pred) & (na dbNSFP_CADD_phred)) || ((dbNSFP_CADD_phred > 15) & (na dbNSFP_CADD_phred))" > EMfiltered_prediction.vcf Filtrado por frecuencia en la cohorte Una vez obtenida la selección de variantes según los criterios de arriba mencionados, se priorizaron las variantes genéticas que se encontraban en un mayor número de casos con EM que en el resto de individuos. Asimismo, se estudió la segregación de las variantes encontradas considerando también los familiares con otras AID como casos, de modo que las variantes seleccionadas pudieran ser relevantes para la EM o para las enfermedades autoinmunes. 3.6.7. Visualización de las variantes genéticas Las variantes genéticas de interés se visualizaron utilizando la herramienta Integrative Genome Viewer (IGV) v2.8.0 (figura 3.7). 66 Figura 3.7. Visualización de una variante genética mediante el programa IGV. 3.7. Análisis estadístico El análisis estadístico fue desarrollado con diferentes programas y herramientas según los estadísticos a calcular. Se empleó el programa IBM SPSS Statistics v22.0 para la creación de una base de datos anonimizada y su posterior análisis. Para el análisis descriptivo de los datos, se obtuvieron las frecuencias absolutas y porcentajes (n(%)) de las variables categóricas cualitativas. Para las variables cuantitativas continuas, éstas se expresaron como medias ± desviación estándar o mediana [rango intercuartílico, Q1 – Q3] si no se obtenía una distribución normal de dichas variables. La distribución normal de los datos se comprobó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la homocedasticidad se calculó mediante la prueba de Levene. Para la comparación de variables cualitativas se empleó el test estadístico chi- cuadrado. En el caso de que no se cumplieran las condiciones para su aplicación se empleó el test exacto de Fisher. La prueba U Mann-Whitney fue empleada para comparar variables continuas independientes entre dos grupos. Se consideraron niveles de significación estadística p<0.05. Para el análisis de las frecuencias de las variantes alélicas en los distintos grupos se emplearon los softwares PLINK v1.9 (Chang et al., 2015; Purcell & Chang, n.d.) y 67 MQLS-XM (Thornton & McPeek, 2012) y se aplicó la corrección de Bonferroni para análisis múltiples. El software PLINK permitió analizar las posibles desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) en la población. Asimismo, se valoraron todas aquellas variantes que tuvieran valores de Odds Ratio (OR) mayores de 2 o menores de 0,5 con un intervalo de confianza al 95% (IC 95%), al comparar casos con individuos no afectos y poder identificar aquellas variantes con un posible efecto de riesgo o efecto protector en la enfermedad respectivamente. Para poder trabajar con PLINK primero es necesario generar archivos con un formato manejable por el mismo. El software genera tres archivos con distintos formatos que recogen tanto la información de las variantes como la información de cada una de las familias. De este modo, el archivo VCF combinado con las regiones de interés fue transformado a formato PLINK con el comando siguiente: ./plink --vcf file.vcf --keep-allele-order --indiv-sort file file.txt --const-fid --allow-extra-chr 0 --split-x b37 no- fail --make-bed --out mydata Para calcular las desviaciones del HWE se empleó el siguiente comando: ./plink --bfile mydata --hardy midp --nonfounders --keep- allele-order --out fileHWE MQLS-XM es un programa empleado para detectar asociaciones entre casos y controles que se encuentran emparentados, mediante el uso de los estadísticos MQLS (Thornton & McPeek, 2007) y XM (Thornton, Zhang, Cai, Ober, & McPeek, 2012), diseñados para este tipo de estudios. El programa requiere cuatro tipos de archivos para el análisis, un archivo tped con la información genotípica, un archivo tfam con la información de cada una de las familias, un archivo de texto con la prevalencia de la enfermedad y un archivo que contiene el grado de parentesco entre los distintos miembros de la familia. Este último archivo fue creado mediante los programas KinInbcoef v1.1 (Bourgain & Zhang, 2009) y KinInbcoefX v2.0 (Q. Zhang, 68 Bourgain, & McPeek, 2009). El comando utilizado en PLINK para la creación de los archivos requeridos por MQLS-XM fue el siguiente: ./plink --bfile mydata --output-missing-genotype 0 --recode 12 transpose --keep-allele-order --out MQLSfile El comando empleado para el cálculo estadístico de las variantes genéticas con el MQLS-XM fue: ./MQLS-XM -g genofile -p phenofile -k kinfile -r myprevalence (-x) 3.8. Aspectos éticos El estudio fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica (CEIC) del Hospital Clínico San Carlos (C.I. 16/487-E). Los pacientes o sus tutores legales firmaron un consentimiento informado para su inclusión y participación en el estudio. Los datos fueron manejados conforme a la ley Española de protección de Datos (Ley Orgánica 15/1999 de 13 de diciembre), solamente los investigadores autorizados han tenido acceso a los datos de los pacientes. El proyecto se realizó de acuerdo a las normas de Helsinki (Recommendations Guiding Physicians in Biomedical Research Involving Human Subjects, Helsinki 1964, enmendadas en octubre de 2013). 69 4. Resultados A continuación, se detallan los resultados obtenidos a partir de las familias incluidas en el estudio y la aplicación de los métodos descritos. 4.1. Características de la población de estudio 4.1.1. Características generales Se incluyeron en total 138 individuos pertenecientes a 23 familias que presentaban más de un miembro con EM. De los 138 individuos, 85 (61,60%) eran mujeres mientras que 53 (38,40%) eran hombres. La edad media al momento de inclusión en el estudio fue de 51,01±16,29 años. A su vez, de los 138 individuos secuenciados, 52 (37,70%) individuos presentaban EM, 19 (13,80%) individuos presentaban otra AID distinta de la EM y 67 (48,60%) correspondían a individuos no afectos (figura 4.1). 70 Figura 4.1. Frecuencia de individuos por grupos. EM: esclerosis múltiple; AID: enfermedad autoinmune. Las 23 familias, a su vez se clasificaban en 14 (60,10%) familias que presentaban los individuos afectos por EM en una misma generación, nombradas como familias de tipo A, y 9 (39,10%) familias cuyos individuos afectos con EM se encontraban en dos o más generaciones distintas, denominadas familias tipo B, según la clasificación mencionada anteriormente (Pytel et al., 2018) (figura 4.2). 71 Figura 4.2. Clasificación de las familias según las generaciones que se encuentran afectadas por la enfermedad. 4.1.2. Características del grupo con EM Los 52 pacientes con EM se dividían en 29 (55,80%) mujeres y 23 (44,20%) hombres. La edad media fue 44,10±10,91 y la edad de inicio de la EM, considerada como la edad en la que apareció el primer síntoma neurológico relacionado con la enfermedad, fue 27,19±8,55. El tiempo de evolución de la enfermedad (tiempo en años desde el inicio de la enfermedad) fue 16,40±9,25. No se pudo obtener el número total de brotes de uno de los pacientes con EM por lo que la tasa anual de brotes de los pacientes con EM fue calculada en 51 casos y resultó en una mediana de 0,36 (IQR 0,14 – 0,62) (tabla 4.1). La clasificación de los casos con EM según la forma clínica de la enfermedad correspondía a 40 (76,90%) pacientes con la forma clínica recurrente remitente, 7 (13,50%) pacientes con secundaria progresiva y 5 (9,60%) pacientes con primaria progresiva. 72 Figura 4.3. Frecuencia de las formas clínicas de EM. EMRR: esclerosis múltiple recurrente remitente; EMSP: esclerosis múltiple secundaria progresiva; EMPP: esclerosis múltiple primaria progresiva. Además, de los 52 pacientes, 12 (23,10%) presentaban coexistencia con otra enfermedad autoinmune distinta de la EM. Entre las enfermedades autoinmunes que presentaban estos pacientes se encontraban:  Fiebre reumática: 3 casos (5,80%)  Diabetes mellitus tipo I (DM1): 2 casos (3,80%)  Hipotiroidismo autoinmune: 1 caso (1,90%)  Colitis ulcerosa: 1 caso (1,90%)  Uveítis: 1 caso (1,90%)  Lupus eritematoso sistémico: 1 caso (1,90%)  Síndrome Guillain-Barré: 1 caso (1,90%)  Hipertiroidismo: 1 caso (1,90%)  Síndrome antifosfolipídico: 1 caso (1,90%) En solo uno de los casos se estableció una relación temporal del inicio de la otra AID (lupus eritematoso sistémico), con un cambio de tratamiento de la EM (inicio por laquinimod). 73 De los 52 pacientes 29 (55,80%) correspondían a casos pertenecientes a 14 (60,90%) familias del tipo A y 23 (44,20%) casos correspondientes a 9 (39,10%) familias del tipo B. Tabla 4.1. Características demográficas y clínicas del grupo de casos con EM. EM n= 52 (37,68%) Edad 44,10±10,91 Sexo Mujer: 29 (55,80%) Hombre: 23 (44,20%) Forma clínica de EM EMRR: 40 (76,90%) EMSP: 7 (13,50%) EMPP: 5 (9,60%) Edad de inicio de la enfermedad 27,19±8,55 Tiempo de evolución de EM (años) 16,40±9,25 Tasa anual de brotes 0,36 (IQR 0,14 – 0,62) Otra enfermedad autoinmune (AID) 12 (23,10%) Tipo de familia Tipo A: 29 (55,80%) Tipo B: 23 (44,20%) La tasa anual de brotes fue calculada en 51 de los casos con EM presentes en las familias del tipo A. 4.1.3. Características del grupo con otras AID El grupo de familiares con otras enfermedades autoinmunes distintas de EM estaba formado por 19 casos. Correspondían a 17 (89,50%) mujeres y 2 (10,50%) hombres. La edad media de este grupo fue 58,68±11,37 (tabla 4.2). Tabla 4.2. Características demográficas y clínicas del grupo de casos con otras AID. Otras AID n=19 (13,80%) Edad 58,68±11,37 Sexo Mujer: 17 (89,50%) Hombre: 2 (10,50%) Tipo de familia Tipo A: 12 (63,20%) Tipo B: 7 (36,80%) Las enfermedades autoinmunes que presentaban son (figura 4.4):  Hipotiroidismo autoinmune: 12 casos (63,20%)  Diabetes mellitus tipo I (DM1): 2 casos (10,50%) 74  Artritis reumatoide: 2 casos (10,50%)  Hipertiroidismo: 1 caso (5,30%)  Psoriasis: 1 caso (5,30%)  Fibromialgia: 1 caso (5,30%)  Uveítis: 1 caso (5,30%)  Lupus eritematoso sistémico: 1 caso (5,30%)  Fiebre reumática: 1 caso (5,30%) De los 19 casos, dos de ellos presentaban más de una enfermedad autoinmune. Un caso de una familia de tipo A presentaba DMI, hipotiroidismo y fiebre reumática mientras que el otro caso perteneciente a una familia de tipo B, presentaba psoriasis e hipertiroidismo. Los 19 casos se dividían en 12 (63,20%) casos pertenecientes a 7 (58,30%) familias del tipo A y 7 (36,80%) casos correspondientes a 5 (41,70%) familias del tipo B. Figura 4.4. Frecuencia de las enfermedades autoinmunes presentes en el grupo con otras AIDs. AID: enfermedad autoinmune. 75 4.1.4. Características del grupo no afecto Los 67 individuos del grupo no afectos correspondían consistía en 39 (58,20%) mujeres y 28 (41,80%) hombres. La edad media de los familiares no afectos fue 54,21±18,93 (tabla 4.3). Los 67 familiares se dividían en 42 (62,70%) casos pertenecientes a 14 (60,90%) familias del tipo A y 25 (37,30%) casos correspondientes a 9 (39,10%) familias del tipo B. Tabla 4.3. Características demográficas y clínicas del grupo de individuos no afectos. Individuos no afectos n= 67 (48,60%) Edad 54,21±18,93 Sexo Mujer: 39 (58,20%) Hombre: 28 (41,80%) Tipo de familia Tipo A: 42 (62,70%) Tipo B: 25 (37,30%) 4.1.5. Características de las familias tipo A Las familias de tipo A, aquellas cuyos individuos afectos con EM se presentaban en la misma generación, estaban formadas por 14 (60,90%) familias, que incluían en total 83 (60,10%) individuos. La edad media al momento de inclusión fue de 52,36±14,61. De las 83 personas que formaban parte de estas familias 53 (63,90%) eran mujeres y 30 (36,10%) hombres. Este grupo presentó una mediana de 2 [2 – 2] individuos afectos con EM por familia. En la tabla 4.4 se observan las características demográficas y clínicas de los individuos afectos con EM que fueron secuenciados. 76 Tabla 4.4. Características demográficas y clínicas de los casos con EM en las familias tipo A. Casos EM familia tipo A n= 29 (55,80%) Edad 43,93 ± 6,91 Sexo Mujer: 17 (58,60%) Hombre: 12 (41,40%) Formas clínicas de EM EMRR: 24 (82,80%) EMSP: 4 (13,80%) EMPP: 1 (3,40%) Edad de inicio de la enfermedad 26,69 ± 6,88 Tiempo de evolución de la EM (años) 16,55 ± 8,89 Tasa anual de brotes* 0,44±0,33 (0,39; IQR 0,22 – 0,60) Coexistencia con otras enfermedades inmunes (otras AID) 5 (17,20%) La tasa anual de brotes fue calculada en 28 de los casos con EM presentes en las familias del tipo A. Las enfermedades autoinmunes que se presentaron en coexistencia con la EM fueron DM1 en 2 casos (40,00%), hipertiroidismo en un caso (20,00%) y fiebre reumática en 2 casos (40,00%). De los 83 individuos de las familias tipo A, 12 (14,50%) casos presentaban otra AID distinta de la EM. En total 17 (20,50%) individuos presentaban otra AID independientemente de la presencia o ausencia de EM. La mediana del número individuos con otras AID por familia correspondía a 1,5 [0 – 2,25]. Al excluir los pacientes con EM y coexistencia con otra AID, la mediana del número de casos con otras AID fue 1 [0 – 2]. En la figura 4.5 se muestran los árboles genealógicos de las familias tipo A. 77 78 Figura 4.5. Árboles genealógicos correspondientes a las 14 familias del tipo A. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. 79 4.1.6. Características de las familias tipo B Las familias del tipo B estaban formadas por 9 (39,10%) familias y correspondían a aquellas que presentaban los individuos afectos de EM en distintas generaciones. El total de individuos de las familias del tipo B fue 55 (39,90%). Del total de individuos, 32 (58,20%) eran mujeres y 23 (41,80%) hombres con una edad media en el momento de inclusión de 48,98±48,49. Estas familias presentaron una mediana de 3 (2,50 – 3,50) individuos afectos con EM por familia. En la tabla 4.5 se presentan las características demográficas y clínicas de los casos con EM secuenciados. Tabla 4.5. Características demográficas y clínicas de los casos con EM en las familias tipo B. Casos EM familia tipo B n= 23 (44,20%) Edad 44,30±14,66 Sexo Mujer: 12 (52,20%) Hombre: 11 (47,80%) Formas clínicas de EM EMRR: 16 (69,60%) EMSP: 3 (13,00%) EMPP: 4 (17,40%) Edad de inicio de la enfermedad 27,83±10,43 Tiempo de evolución de la EM (años) 16,22±9,89 Tasa anual de brotes 0,42±0,45 (0,33; IQR 0,04 – 0,70) Coexistencia con otras enfermedades inmunes (otras AID) 7 (30,40%) Las enfermedades autoinmunes que se presentaban en coexistencia con la EM fueron hipotiroidismo, fiebre reumática, colitis ulcerosa, síndrome antifosfolipídico, uveítis, lupus eritematoso sistémico y síndrome de Guillain-Barré. Cada una de ellas se presentó en un caso (14,30%) con EM. Además, de los 55 individuos que formaban este grupo de familias, 7 (12,70%) individuos presentaban otra AID diferente de la EM. De manera independiente de la presencia o ausencia de EM, en total en estas familias 14 (25,50%) casos presentaban otra enfermedad autoinmune. La mediana del número de individuos 80 con otras AID por familia fue de 2 (0 – 3,5) y al excluir los pacientes que presentaban EM y coexistencia con otra AID, la mediana del número de casos con otras AID correspondía a 1 (0 – 2). La EM se heredó de la madre en 4 familias (44,40%) y del padre en 5 familias (55,60%). Las familias con herencia materna presentaron una media de 3,00±0,82 (3; IQR 2,25 – 3,75) pacientes afectos con EM por familia mientras que las familias con herencia paterna tuvieron una media de 3,00±0,71 (3; IQR 2,5 – 3,5). Asimismo, los pacientes con EM de las familias con transmisión materna correspondían a 6 (54,50%) casos con EMRR, 3 (27,30%) casos con EMSP y 2 (18,20%) casos con EMPP. Por otro lado, 10 (83,30%) de los pacientes con EM de las familias con herencia paterna presentaron EMRR y 2 (16,70%) casos presentaron EMPP. No se observaron diferencias significativas en ninguna de estas comparaciones. Respecto a la edad de inicio de la enfermedad de los pacientes con EM, las familias con transmisión materna obtuvieron una media de 32,00±10,25 y los pacientes de las familias con herencia paterna presentaron menor edad de inicio con una media de 24,00±9,41 (p = 0,091). No hubo diferencias significativas al comparar la tasa anual de brotes entre estas familias. De igual modo, se realizó una comparación de los pacientes con EM de las diferentes generaciones. Se observó una mayor frecuencia de formas recurrentes-remitentes en la descendencia. Así, la primera generación comprendía 12 (75,00%) casos con EMRR, 3 (18,80%) casos con EMSP y 1 (6,30%) caso con EMPP, mientras que la generación anterior presentaba 4 (57,10%) casos con EMRR y 3 (42,90%) con EMPP (p = 0,071). No se observaron diferencias significativas en la edad de inicio de la EM ni en el resto de variables clínicas estudiadas. En la figura 4.6 se presentan los árboles genealógicos correspondientes a las familias de tipo B. 81 82 Figura 4.6. Árboles genealógicos correspondientes a las 9 familias del tipo B. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. 4.1.7. Comparación de las familias A y B Las familias clasificadas en A y B se compararon a fin de observar las diferencias entre ellas. Las familias del tipo A presentaron una media de edad al momento de inclusión de 52,36±14,61 años, mientras que las familias del tipo B tuvieron una media de 48,98±18,49 años (p = 0,495). Al comparar el número de afectos por familia de ambos tipos se encontraron diferencias significativas con una media de afectos con EM por familia de 2,07±0,27 (2; IQR 2 - 2) en las familias del tipo A y una media de 3,00±0,71 (3; IQR 2,5 – 3,5) en las familias de tipo B (p = 0,003). Los pacientes afectos con EM presentaron las características clínicas que se pueden observar en la tabla 4.6. Al analizar los casos con otras AID por familia, las familias del tipo A presentaron una media de 1,43±1,34 (1,5; IQR 0 – 2,25) casos con otra AID y las familias del tipo B tuvieron una media de 2,00±1,66 (2; IQR 0 – 3,5) (p = 0,403). Cuando se excluyeron los pacientes con EM que presentaban coexistencia con otras AID, la media del 83 número de casos con otras AID de las familias del tipo A fue 1,07±1,14 (1; IQR 0 - 2) y de las familias del tipo B fue de 1,22±1,09 (1; IQR 0 - 2) (p = 0,734). Tabla 4.6. Características demográficas y clínicas de los casos con EM agrupados según su pertenencia a familias tipo A o B. Familias tipo A n= 29 (55,80%) Familias tipo B n=23 (44,20%) p-valor Edad 43,93±6,91 44,30±14,66 0,423 Sexo Mujer: 17 (58,60%) Hombre: 12 (41,40%) Mujer: 12 (52,20%) Hombre: 11 (47,80%) 0,642 Formas clínicas de EM EMRR: 24 (82,80%) EMSP: 4 (13,80%) EMPP: 1 (3,40%) EMRR: 16 (69,60%) EMSP: 3 (13,00%) EMPP: 4 (17,40%) 0,236 Edad de inicio de la enfermedad 26,69±6,88 27,83±10,43 0,803 Tiempo de evolución de la EM (años) 16,55±8,89 16,22±9,89 0,861 Tasa anual de brotes 0,44±0,33 (0,39; IQR 0,22 – 0,60) 0,42±0,45 (0,33; IQR 0,04 – 0,70) 0,477 Coexistencia con otras enfermedades autoinmunes 5 (17,20%) 7 (30,40%) 0,262 La tasa anual de brotes fue calculada en 28 casos en el grupo de familias del tipo A. 4.2. Análisis genéticos 4.2.1. Descripción de las variantes genéticas Los genes analizados, involucrados con vías de señalización relacionadas con la inmunidad innata, fueron seleccionados de acuerdo a las coordenadas genómicas de cada transcrito. Así, en total se estudiaron 144 genes cuyo transcrito seleccionado se puede observar en la tabla 4.7. Tabla 4.7. Genes estudiados y su correspondiente identificación mediante el transcrito elegido en cada caso. La nomenclatura utilizada para la identificación del transcrito corresponde a las bases de datos del NCBI y a la base de datos del Ensembl. A) Vía metabólica de la vitamina D. B) Vía de señalización del inflamasoma. C) Vía de señalización del factor de necrosis tumoral (TNF). Vía metabólica de la vitamina D Vía de señalización del inflamasoma Gen Transcrito Gen Transcrito Gen Transcrito DHCR7 NM_001360.2 P2RX7 NM_002562.6 AIM2 NM_004833.3 84 CYP2R1 NM_024514.4 P2RX4 NM_002560.3 IFI16 NM_005531.3 CYP3A4 NM_017460.6 CAMKK2 NM_006549.3 NOD1 NM_006092.4 CYP27A1 NM_000784.4 SLC17A9 NM_022082.4 NOD2 NM_022162.3 LRP2 NM_004525.3 PANX1 NM_015368.4 TLR1 NM_003263.4 CUBN NM_001081.4 PANX2 NM_052839.4 TLR2 NM_003264.5 CYP27B1 NM_000785.4 PANX3 NM_052959.3 TLR3 NM_003265.2 CYP24A1 NM_000782.5 NLRP1 NM_033004.4 TLR4 NM_138554.5 VDR NM_001017535.1 NLRP2 NM_017852.5 TLR5 NM_003268.6 RXRA NM_002957.6 NLRP3 NM_004895.4 TLR6 NM_006068.4 GC NM_000583.4 NLRP4 NM_134444.5 TLR7 NM_016562.4 FCGR2A NM_021642.4 NLRP5 NM_153447.4 TLR8 NM_138636.5 FCGR2B NM_004001.4 NLRP6 NM_138329.2 TLR9 NM_017442.3 FCGR2C ENST00000466542 NLRP7 NM_206828.3 TLR10 NM_030956.4 FCGR3A NM_000569.7 NLRP8 NM_176811.2 CIITA NM_000246.3 FCGR3B NM_000570.4 NLRP9 NM_176820.4 MEFV NM_000243.2 DAB2 NM_001343.4 NLRP10 NM_176821.4 PTH NM_000315.4 NLRP11 NM_145007.3 FGF23 NM_020638.3 NLRP12 NM_144687.3 METTL1 NM_005371.6 NLRP13 NM_001321057.1 EEF1AKMT3 NM_015433.3 NLRP14 NM_176822.3 CDK4 NM_000075.4 NLRX1 NM_024618.4 TSFM NM_001172696.2 PYCARD NM_013258.5 AGAP2 NM_014770.4 NLRC3 NM_178844.4 AVIL NM_006576.3 NLRC4 NM_021209.4 PDIA3 NM_005313.5 NLRC5 NM_032206.4 Vía de señalización del TNF Gen Transcrito Gen Transcrito Gen Transcrito TNFRSF1A NM_001065.4 TNFSF13B NM_006573.4 TNFRSF14 NM_003820.3 TNF NM_000594.4 EDA NM_001399.5 TNFRSF25 NM_148965.1 ADAM17 NM_003183.6 LTBR NM_001270987.2 TRAF1 NM_005658.5 TRADD NM_003789.4 TNFRSF4 NM_003327.4 TRAF2 NM_021138.4 RIPK1 NM_001354930.2 CD27 NM_001242.4 TRAF3 NM_003300.4 NFKB1 NM_003998.4 CD40 NM_001250.6 TRAF3IP1 NM_015650.4 NFKB2 NM_001077494.3 TNFRSF8 NM_001243.5 TRAF4 NM_004295.4 FADD NM_003824.3 TNFRSF9 NM_001561.6 TRAF5 NM_001033910.3 TNFRSF1B NM_001066.3 FAS NM_000043.6 TRAF6 NM_145803.3 BIRC2 NM_001166.4 TNFRSF10A NM_003844.4 TRAF7 NM_032271.3 BIRC3 NM_001165.5 TNFRSF10B NM_147187.3 LITAF NM_004862.3 LTA NM_000595.4 TNFRSF10C NM_003841.4 TNFAIP1 NM_021137.5 TNFSF18 NM_005092.3 TNFRSF6B NM_003823.4 TNFAIP2 NM_006291.3 TNFSF9 NM_003811.4 TNFRSF11B NM_002546.4 TNFAIP3 NM_006290.4 85 CD70 NM_001252.5 TNFRSF11A NM_003839.4 EFNA1 NM_004428.3 TNFSF8 NM_001244.3 TNFRSF10D NM_003840.5 TNFAIP6 NM_007115.4 TNFSF15 NM_005118.4 TNFRSF12A NM_016639.3 TNFAIP8 NM_014350.4 TNFSF4 NM_003326.5 TNFRSF18 NM_148901.2 TNFAIP8L1 NM_152362.3 TNFSF14 NM_003807.4 EDAR NM_022336.4 TNFAIP8L2 NM_024575.5 TNFSF13 NM_003808.3 EDA2R NM_021783.5 TNFAIP8L3 NM_001311175.2 TNFSF12 NM_003809.3 TNFRSF19 NM_018647.5 TANK NM_001199135.3 CD40LG NM_000074.3 RELT NM_152222.2 TIFA NM_052864.3 FASLG NM_000639.3 TNFRSF21 NM_014452.5 TIFAB NM_001099221.2 TNFSF11 NM_003701.4 TNFRSF17 NM_001192.3 TRAIP NM_005879.3 TNFSF10 NM_003810.4 TNFRSF13B NM_012452.3 LTB NM_002341.2 TNFRSF13C NM_052945.3 La anotación de las variantes y la selección de coordenadas genómicas de los genes de interés, permitió obtener una clasificación de las variantes genéticas identificadas en cada vía, según el efecto de la variante y según su localización genómica (figura 4.7). A) B) 86 C) Figura 4.7. Clasificación de las variantes genéticas según el tipo de efecto de las variantes y la región en la que se localizan. A) Variantes correspondientes a la vía metabólica de la vitamina D. B) Variantes correspondientes a la vía de señalización del TNF. C) Variantes correspondientes a la vía de señalización del inflamasoma. Una vez seleccionadas las regiones de los genes de las vías metabólicas estudiadas se llevó a cabo el análisis de cobertura de los mismos. Este resultó en una cobertura media del 59,66% con una profundidad mayor de 20X. Tras el procesamiento de los datos se identificaron un total de 888 SNP en regiones exónicas. De ellos, 471 SNP correspondían a cambios no sinónimos. En el Anexo II 87 se pueden encontrar todos los SNP exónicos con las características principales de cada uno de ellos. De las variantes encontradas, todas se encontraban en equilibrio de Hardy- Weinberg excepto cinco de ellas. Estas fueron la variante rs74341264 del gen FCGR2C, la variante rs5030738 del gen FCGR3B, la variante rs112120355 del gen TNFSF10, la variante rs5743614 del gen TLR1 y la variante rs1672867 del gen NLRC5. Se tuvieron en cuenta estas desviaciones del equilibrio para la consideración de los resultados posteriores. El análisis de los genes de la vía metabólica de la vitamina D reveló un total de 95 SNP no sinónimos. Se analizaron los genes codificantes de proteínas involucradas en la VD circulante, así como aquellos que afectan a la internalización de la misma. Además, se analizaron los genes METTL1, METTL21B, PTH y FGF23 por estar implicados en la regulación del gen CYP27B1. Asimismo, dada la localización de este gen en una zona con alto desequilibrio de ligamiento en el cromosoma 12, también se estudiaron los genes comprendidos en esta región, correspondientes a CDK4, TSFM, AGAP2 y AVIL, además de METTL1 y METTL21B. De todos los genes estudiados no se observó ninguna variante en METTL1, AVIL y CDK4. Por otro lado, todas las variantes observadas en los genes DHCR7, CYP2R1, TSFM y PTH correspondían a SNP sinónimos. El análisis de los 76 genes de la vía de señalización del TNF reveló un total de 128 SNP no sinónimos. Los genes analizados correspondían a la amplia familia de receptores y ligandos del TNF. Asimismo, se incluyeron genes codificantes de proteínas relacionados con esta vía de señalización. Algunos de los genes estudiados en esta vía no presentaron ningún polimorfismo, entre ellos RIPK1, FADD, TNFSF18, TNFSF4, TNFSF13B, EDA, TRAF6, TANK y TIFAB. De igual manera, 9 de los genes analizados no mostraban ninguna variante. Estos son TNFSF8, LTBR, TRAF7, TNFSF12, TNFAIP1, TRAF4, TNFAIP8L1, CD70 y CD40LG. El análisis de los 42 genes de la vía de señalización del inflamasoma reveló 248 SNP no sinónimos. Al igual que en las vías anteriores, dos de los genes estudiados en esta vía no presentaron ningún polimorfismo, PYCARD y AIM2. Los genes analizados en esta vía conforman los principales receptores que actúan como la primera barrera 88 de defensa en la inmunidad innata, los TLR. Además, se incluyen todos aquellos genes encargados de codificar las proteínas que conforman los distintos tipos de inflamasoma, así como aquellos involucrados en la activación del mismo, como los receptores purinérgicos. 4.2.2. Comparación de las variantes genéticas entre los grupos Para estudiar la asociación de las variantes encontradas con la enfermedad, se tuvo en cuenta la corrección de Bonferroni por análisis múltiples, en la que se consideró un umbral del valor p de 1,062e-4. Bajo este umbral, ninguna variante presentó resultados significativos al comparar casos con EM y familiares sin EM ni al comparar casos con EM o AID y familiares no afectos mediante el uso del programa MQLS-XM. En la tabla 4.8 se indican aquellas variantes no sinónimas que a pesar de no haber obtenido p-valores significativos, presentaban valores de OR (Odds Ratio) mayores de 2 o menores de 0,5, que indicarían un efecto de riesgo o un efecto protector respectivamente al comparar los pacientes con EM con los individuos no afectos por la enfermedad. Los valores OR más destacados de este análisis corresponden a la variante rs2230625 (c.1204A>G) del gen TNFRSF8 (5,426; IC 95% 1,074 – 27,420) correspondiente a la vía de señalización del TNF. Esta variante se encontraba en seis pacientes con EM y dos individuos no afectos, correspondientes a tres familias, todos ellos en heterocigosis. La variante segregaba con la EM y otra AID, hipotiroidismo, en la familia 22, de tipo B, en la que los individuos afectos presentaban EMRR y EMPP. Asimismo, el paciente con EMPP presentaba otra AID correspondiente al síndrome antifosfolipídico. Las otras dos familias correspondían a la familia 16 de tipo A en la que un único miembro con EMRR mostraba la variante en heterocigosis y, la familia 13 del tipo B que presentaba el cambio en tres pacientes afectos con EMRR, aunque no segregaba en todos los individuos con la enfermedad. Otro de los valores más altos pertenece también a la vía de señalización del TNF y corresponde a una variante no descrita previamente situada en la coordenada genómica chr13:43148564 (c.126delT) del gen TNFSF11 (7,087; IC 95% 0,780 – 89 64,360). La variante se presentaba en heterocigosis en tres individuos afectos con EMRR, un individuo con otra AID (hipotiroidismo) y un individuo no afecto, todos ellos en diferentes familias siendo cuatro de ellas del tipo A (familias 5, 7, 9 y 17) y una familia del tipo B (familia 13). Respecto a la vía de señalización del inflamasoma el valor más destacado corresponde a la variante rs28360447 (c.448G>A) del gen P2RX7 (5,289; IC 95% 0,543 – 51,540). La variante se presentaba en heterocigosis en un individuo afecto con EM e hipertiroidismo y en un individuo no afecto de la familia 21 del tipo A. Los dos individuos restantes corresponden a un padre y un hijo afectos con EM, pertenecientes a la familia 22 del tipo B, con EMPP y EMRR respectivamente. Ambos presentaban la variante en heterocigosis. Tabla 4.8. Características de las variantes no sinónimas con valores de OR mayores de 2 o menores de 0,5 al comparar los pacientes con EM frente a los individuos no afectados por la enfermedad. A) Variantes de genes pertenecientes a la vía metabólica de la vitamina D. B) Variantes de los genes involucrados en la vía de señalización del TNF. C) Variantes genéticas de los genes involucrados en la vía de señalización del inflamasoma. MAF: minor allele frequency; EM: esclerosis múltiple; AID: enfermedad autoinmune; ND: no disponible; OR: Odds Ratio; IC: intervalo de confianza. A) Gen dbSNP Efecto de la variante MAF Cambio nucleotídico EM (n=52) Otras AID + No afectos (n=86) OR (IC 95%) EM versus otras AID + no afectos FCGR3A rs148181339 missense 0,265 c.631A>G 4 (7,69%) 2 (2,33%) 3,532 (0,635 – 19,650) LRP2 rs17848169 missense 0,029 c.7894A>G 2 (3,85%) 13 (15,12%) 0,245 (0,054 – 1,107) LRP2 rs61995915 missense 0,012 c.7253A>G 2 (3,85%) 7 (8,14%) 0,471 (0,096 – 2,314) LRP2 rs150752263 missense 0,001 c.2603C>G 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,521 (0,315 – 39,340) LRP2 rs34291900 missense 0,027 c.2006G>A 2 (3,85%) 13 (15,12%) 0,242 (0,053 – 1,093) CYP27A1 rs2229381 missense 0,001 c.524C>T 1 (1,92%) 4 (4,65%) 0,424 (0,047 – 3,849) CYP27A1 ND (chr2:219677655) missense ND c.853C>G 1 (1,92%) 4 (4,65%) 0,424 (0,047 – 3,849) CUBN rs2796835 missense 1,000 c.8150C>G 51 (98,08%) 85 (98,84%) 0,396 (0,065 – 2,411) CUBN rs3740168 missense 0,042 c.7724C>G 1 (1,92%) 4 (4,65%) 0,424 (0,047 – 3,849) CYP27B1 rs8176344 missense 0,008 c.496G>C 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) CYP24A1 rs6068812 missense <0,001 c.1226T>C 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,449 (0,309 – 38,530) B) 90 Gen dbSNP Efecto de la variante MAF Cambio nucleotídico EM (n=52) Otras AID + No afectos (n=86) OR (IC 95%) EM versus otras AID + no afectos TNFRSF14 rs2234163 missense 0,011 c.349G>A 3 (5,77%) 2 (2,33%) 2,576 (0,423 – 15,680) TNFRSF8 rs2230625 missense 0,048 c.1204A>G 6 (11,54%) 2 (2,33%) 5,426 (1,074 – 27,420) FASLG rs530390117 missense <0,001 c.259T>C 1 (1,92%) 4 (4,65%) 0,4242 (0,047 – 3,849) ADAM17 rs55796712 missense 0,011 c.2240C>T 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,49 (0,312 – 38,980) TNFSF10 rs16845759 missense 0,011 c.141C>A 1 (1,92%) 5 (5,81%) 0,3374 (0,039 – 2,929) NFKB1 rs761774576 missense <0,001 c.1136G>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) TNFRSF10B rs1047266 missense 0,093 c.200C>T 7 (13,46%) 5 (5,81%) 2,514 (0,776 – 8,143) BIRC3 rs2276113 missense 0,021 c.779A>G 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,449 (0,309 – 38,530) TNFRSF19 rs35041805 missense 0,016 c.784C>T 5 (9,62%) 2 (2,33%) 4,474 (0,852- 23,500) TNFSF11 ND (chr13:43148564) frameshift variant ND c.126delT 3 (5,77%) 2 (2,33%) 7,087 (0,780 – 64,360) TNFAIP8L3 rs144316469 missense <0,001 c.416A>T 3 (5,77%) 2 (2,33%) 2,629 (0,432 – 16,010) LITAF rs141862602 missense <0,001 c.146C>T 3 (5,77%) 2 (2,33%) 2,629 (0,432 – 16,010) TNFSF9 rs2234174 missense 0,012 c.124G>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,596 (0,322 – 40,180) TNFSF14 ND (chr19:6665328) missense ND c.332C>G 1 (1,92%) 10 (11,63%) 0,1636 (0,021 – 1,298) C) Gen dbSNP Efecto de la variante MAF Cambio nucleotídico EM (n=52) Otras AID + No afectos (n=86) OR (IC 95%) EM versus otras AID + no afectos IFI16 rs116270651 missense <0,001 c.277G>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) IFI16 rs6940 missense 0,155 c.2167A>T 4 (7,69%) 13 (15,12%) 0,497 (0,157 – 1,568) TLR5 rs764535 missense 0,005 c.245C>T 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) TLR10 rs761695729 missense <0,001 c.350C>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,449 (0,309 – 38,530) TLR10 rs138645932 missense 0,003 c.287A>G 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,438 (0,307 -38,410) TLR6 rs5743820 missense 0,010 c.2267C>T 3 (5,77%) 2 (2,33%) 2,629 (0,432 – 16,010) NLRP6 rs772833407 missense <0,001 c.2096G>C 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) NLRP10 rs116880092 missense 0,013 c.1898G>A 4 (7,69%) 3 (3,49%) 2,275 (0,498 – 10,390) NLRX1 rs145673513 missense <0,001 c.1411C>T 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) NLRX1 rs146800118 missense <0,001 c.2120G>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) P2RX7 rs28360447 missense 0,012 c.448G>A 3 (5,77%) 1 (1,16%) 5,289 (0,543 – 51,540) P2RX7 rs2230911 missense 0,139 c.1070C>G 7 (13,46%) 27 (31,40%) 0,429 (0,188 – 0,979) P2RX4 rs25644 missense 0,162 c.724A>G 10 (19,23%) 31 (36,05%) 0,491 (0,237 – 1,018) CAMKK2 rs35403710 missense 0,009 c.368G>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) NLRC3 rs77463028 missense 0,037 c.1301C>T 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,543 (0,317 – 39,610) 91 CIITA rs201764329 missense <0,001 c.631C>T 1 (1,92%) 5 (5,81%) 0,337 (0,039 – 2,929) NLRP1 rs11657747 missense 0,043 c.2633C>T 2 (3,85%) 7 (8,14%) 0,481 (0,098 – 2,362) NLRP1 rs52795654 missense 0,049 c.2345C>G 2 (3,85%) 7 (8,14%) 0,418 (0,087 – 2,010) NLRP1 rs11651595 missense 0,042 c.737C>G 2 (3,85%) 7 (8,14%) 0,475 (0,097 – 2,333) NLRP12 rs35401786 missense 0,002 c.956C>G 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) NLRP12 rs34330210 missense 0,002 c.424G>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,490 (0,312 – 38,980) NLRP2 rs113204023 missense 0,001 c.1474G>A 2 (3,85%) 2 (2,33%) 2,629 (0,432 – 16,010) NLRP2 rs145736130 missense <0,001 c.2758C>G 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,449 (0,309 – 38,53) NLRP8 rs147934431 missense 0,002 c.2171C>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,408 (0,305 – 38,070) NLRP5 rs3103057 missense 0,953 c.3289G>A 52 (100,00%) 86 (100,00%) 0,298 (0,027 – 3,330) TLR7 rs189681811 missense <0,001 c.2759G>A 2 (3,85%) 1 (1,16%) 3,662 (0,327 – 41,040) Asimismo, en la tabla 4.9 se presentan los OR tras la comparación de los casos con EM y con otras AID respecto a los individuos no afectos. En este caso los valores más destacados correspondieron a dos variantes de genes de la vía de señalización del TNF. Por un lado, la variante rs35041805 (c.784C>T) del gen TNFRSF19 (5,866; IC 95% 0,697 – 49,390), que se observó en heterocigosis en siete individuos de tres familias distintas. En total, esta variante se presentó en 5 (9,62%) pacientes con EM, 1 (5,26%) individuo con otra AID (hipotiroidismo) y 1 (1,49%) individuo no afecto. En la familia dos, del tipo B, la variante segregaba con la enfermedad ya que se mostraba únicamente en los dos casos afectos con EM, siendo la forma clínica EMRR en ambos. La familia cinco, del tipo A, presentaba la variante en los dos únicos casos con EM, ambos EMRR, y en un individuo con otra AID (hipotiroidismo). Por último, la familia seis, del tipo A, presentaba la variante en un caso afecto con EMRR y en un individuo no afecto. Por otro lado, la segunda variante correspondía al rs2230625 (c.1204A>G) del gen TNFRSF8 (6,895; IC 95% 0,837 – 56,820). Corresponde a una de las variantes que presentaron un valor elevado al comparar los individuos con EM respecto al resto de la cohorte. Tabla 4.9. Características de las variantes no sinónimas con valores de OR mayores de 2 o menores de 0,5 al comparar casos con EM y casos con otras AID frente a individuos no afectos. A) Variantes de genes pertenecientes a la vía metabólica de la vitamina D. B) Variantes de los genes involucrados en la vía de señalización del TNF. C) Variantes genéticas de los genes involucrados en la vía de señalización del inflamasoma. MAF: minor allele frequency; EM: esclerosis múltiple; AID: enfermedad autoinmune; ND: no disponible; OR: Odds Ratio; IC: intervalo de confianza. A) 92 Gen dbSNP Efecto de la variante MAF Cambio nucleotídico EM + Otras AID (n=71) No afectos (n=67) OR (IC 95%) EM + otras AID versus no afectos FCGR3B rs448740 missense 0,637 c.194A>G 66 (92,96%) 57 (85,07%) 2,400 (0,431 – 13,350) LRP2 rs34564141 missense 0,007 c.13803G>A 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) LRP2 ND (chr2:170097620) missense ND c.3923A>T 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,468 (0,042 – 5,219) LRP2 rs17848149 missense 0,030 c.3836A>C 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,468 (0,042 – 5,219) CYP27A1 rs2229381 missense 0,001 c.524C>T 1 (1,41%) 4 (5,97%) 0,230 (0,025 – 2,087) CUBN ND (chr10:16918947) frameshift variant ND c.9054delC 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,468 (0,042 – 5,219) CUBN rs144626884 missense <0,001 c.7837A>C 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,4599 (0,041 – 5,133) CUBN rs3740168 missense 0,042 c.7724C>G 1 (1,41%) 4 (5,97%) 0,2302 (0,025 – 2,087) CUBN rs148869805 missense 0,004 c.2756A>G 2 (2,82%) 4 (5,97%) 0,4638 (0,084 – 2,575) CUBN rs757328692 missense <0,001 c.1265C>T 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,468 (0,042 – 5,219) B) Gen dbSNP Efecto de la variante MAF Cambio nucleotídico EM + Otras AID (n=71) No afectos (n=67) OR (IC 95%) EM + otras AID versus no afectos TNFRSF25 ND (chr1:6525592) missense ND c.68G>C 2 (2,82%) 4 (5,97%) 0,4062 (0,069 – 2,396) TNFRSF8 rs2230625 missense 0,048 c.1204A>G 7 (9,86%) 1 (1,49%) 6,895 (0,837 – 56,820) TNFRSF1B rs2229700 missense 0,002 c.791T>C 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,4676 (0,042 – 5,219) TNFAIP8L2 rs139852088 missense <0,001 c.158G>A 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,825 (0,290 – 27,500) TNFAIP6 rs79800957 missense 0,002 c.394G>A 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) LTA rs2229092 missense 0,047 c.152A>C 5 (7,04%) 3 (4,48%) 2,866 (0,568 – 14,460) TNFAIP3 rs142253225 missense 0,001 c.1939A>C 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,4676 (0,042 – 5,219) TNFRSF10C ND (chr8:22974279) missense ND c.515C>G 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) TNFRSF10D rs11135703 missense 0,194 c.103C>T 6 (8,45%) 9 (13,43%) 0,4925 (0,177 – 1,372) FAS rs56006128 missense 0,001 c.580G>A 1 (1,41%) 3 (4,48%) 0,2977 (0,031 – 2,901) TNFRSF19 rs35041805 missense 0,016 c.784C>T 6 (8,45%) 1 (1,49%) 5,866 (0,697 – 49,390) TNFSF11 ND (chr13:43148564) frameshift variant ND c.126delT 4 (5,63%) 1 (1,49%) 3,846 (0,424 – 34,890) TNFSF14 ND (chr19:6665328) missense NA c.332C>G 3 (4,23%) 8 (11,94%) 0,3394 (0,088 – 1,308) TNFRSF13C rs61756766 missense 0,005 c.475C>T 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,4348 (0,039 – 4,867) C) 93 Gen dbSNP Efecto de la variante MAF Cambio nucleotídico EM + Otras AID (n=71) No afectos (n=67) OR (IC 95%) EM + otras AID versus no afectos IFI16 rs6940 missense 0,155 c.2167A>T 6 (8,45%) 11 (16,42%) 0,476 (0,171 – 1,328) TLR10 rs11466658 missense 0,026 c.1573C>T 7 (9,86%) 4 (5,97%) 2,606 (0,676 – 10,040) TLR1 rs3923647 missense 0,028 c.914A>T 8 (11,27%) 5 (7,46%) 2,198 (0,660 – 7,319) NLRP6 rs76744706 missense 0,007 c.560G>A 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,91 (0,299 – 28,340) NLRP14 rs16921697 missense 0,062 c.275A>G 5 (7,04%) 2 (2,99%) 2,407 (0,459 – 12,630) NLRP14 rs117823353 missense 0,026 c.293C>T 6 (8,45%) 2 (2,99%) 2,910 (0,577 – 14,680) NLRP14 rs117124176 missense 0,026 c.2851T>A 6 (8,45%) 2 (2,99%) 2,866 (0,568 – 14,460) NLRP14 rs117583918 missense 0,029 c.2861T>C 8 (11,27%) 3 (4,48%) 2,566 (0,666 – 9,888) NLRP10 rs116880092 missense 0,013 c.1898G>A 5 (7,04%) 2 (2,99%) 2,326 (0,443 – 12,210) MEFV rs11466045 missense 0,010 c.1772T>C 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2.869 (0.295 – 27.930) NLRC3 rs74760019 missense 0,016 c.2785G>A 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) NLRC3 rs200989243 missense 0,002 c.2716G>A 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) CIITA rs137895901 missense <0,001 c.1225C>T 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) NOD2 rs2066844 missense 0,025 c.2104C>T 1 (1,41%) 3 (4,48%) 0,309 (0,032 – 3,012) NOD2 rs759456303 missense <0,001 c.2653G>C 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,468 (0,042 – 5,219) NLRC5 rs151217415 missense <0,001 c.3649G>A 1 (1,41%) 5 (7,46%) 0,183 (0,021 – 1,585) NLRC5 rs117587884 missense 0,015 c.3769G>A 2 (2,82%) 5 (7,46%) 0,368 (0,070 – 1,931) NLRC5 rs140644178 missense 0,002 c.4036G>A 1 (1,41%) 2 (2,99%) 0,460 (0,041 – 5,139) NLRP7 rs201379032 missense <0,001 c.2788A>T 1 (1,41%) 3 (4,48%) 0,309 (0,032 – 3,012) NLRP7 rs772746060 frameshift variant ND c.1460_1462delGGG 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) NLRP7 rs79513034 missense 0,014 c.931C>A 2 (2,82%) 4 (5,97%) 0,464 (0,084 – 2,575) NLRP7 rs77812009 missense 0,014 c.929A>G 2 (2,82%) 4 (5,97%) 0,464 (0,084 – 2,575) NLRP2 rs149295176 missense <0,001 c.1571A>G 1 (1,41%) 3 (4,48%) 0,309 (0,032 – 3,012) NLRP2 rs201735558 missense <0,001 c.1942C>G 1 (1,41%) 3 (4,48%) 0,309 (0,032 – 3,012) NLRP13 rs149110821 missense <0,001 c.211C>A 5 (7,04%) 2 (2,99%) 2,407 (0,459 – 12,630) NLRP8 rs371245984 missense <0,001 c.319A>G 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) NLRP8 rs11880691 missense 0,018 c.700G>A 3 (4,23%) 1 (1,49%) 2,869 (0,295 – 27,930) 4.2.3. Variantes genéticas en homocigosis Con el objetivo de identificar una diferencia en los genotipos de las variantes estudiadas entre los pacientes afectos con EM y los individuos no afectos por la enfermedad, se realizó una comparación de la frecuencia de homocigosis en las variantes no sinónimas con la prueba de chi-cuadrado. Aunque no se observaron 94 diferencias significativas, en la tabla 4.10 se presentan aquellas variantes con las diferencias más destacadas. Tabla 4.10. Variantes genéticas con diferencias en la presentación de homocigosis. MAF: minor allele frequency; EM: esclerosis múltiple; AID: enfermedad autoinmune; ND: no disponible; OR: Odds Ratio; IC: intervalo de confianza. Gen dbSNP MAF Efecto de la variante Cambio nucleotídico EM (n=52) Otras AID + No afectos (n=86) p-valor TNFRSF1B rs1061622 0,216 missense c.587T>G 9 (17,31%) 4 (4,65%) 0,018 TNFAIP6 rs1046668 0,151 missense c.431A>G 4 (7,69%) 0 (0,00%) 0,019 TLR10 rs11466657 0,025 missense c.1418T>C 3 (5,77%) 0 (0,00%) 0,052 NLRX1 rs643423 0,564 missense c.187C>T 11 (21,15%) 37 (43,02%) 0,009 NLRX1 rs4245191 0,564 missense c.2378C>A 10 (19,23%) 36 (41,86%) 0,006 NLRP2 rs1043673 0,370 missense c.3155C>A 3 (5,77%) 16 (18,60%) 0,042 Se utilizó el test exacto de Fisher cuando no fue posible aplicar la prueba Chi-cuadrado. Tres variantes mostraron una mayor frecuencia de homocigosis en los pacientes con EM que en el resto de familiares. La variante rs1046668 del gen TNFAIP6 se observó en homocigosis en 4 (7,69%) pacientes con EM de tres familias distintas. Solo en una de estas familias, la familia 19 del tipo A, se observó que los pacientes presentaban la variante en homocigosis y el resto de individuos no afectos de la familia no mostraban la variante o la mostraban en heterocigosis. De igual modo, la variante rs11466657 del gen TLR10 se encontró en homocigosis en 3 (5,77%) pacientes con EM de dos familias distintas. Una de estas familias, la familia 12 del tipo B, presentaba dos individuos afectos con EM con la variante en homocigosis pero no se presentaba o se presentaba en heterocigosis en el resto de individuos no afectos. 4.2.4. Priorización de variantes Además de realizar una búsqueda de variantes que puedan estar relacionadas con la EM, de acuerdo a las diferencias observadas entre los grupos, también se realizó una priorización bioinformática. Esta priorización, siguiendo el esquema explicado en la metodología, buscaba obtener variantes genéticas que puedan ser causales de la enfermedad de acuerdo a su localización, a su frecuencia poblacional y a su posible patogenicidad. Para ello, la priorización de variantes fue llevada a cabo bajo los siguientes criterios: 95  Calidad de genotipado mayor de 15 para descartar variantes que pudieran ser errores de secuenciación  SNP presentes en regiones exónicas y con efecto no sinónimo  MAF menor del 5%  Impacto moderado, modificador o alto según la clasificación de la herramienta SnpEff  Efecto patogénico, posiblemente patogénico, de riesgo o desconocido según la base de datos de ClinVar  Consecuencia funcional severa de acuerdo a los programas de predicción SIFT, Polyphen y CADD  Frecuencia mayor en pacientes con EM y/o otra AID que en individuos sanos De este modo, partiendo de un total de 1.291 SNP en el total de los genes estudiados, se obtuvieron 10 variantes de posible interés (figura 4.8). Figura 4.8. Esquema de priorización de variantes genéticas de los genes involucrados en la vía metabólica de la vitamina D, la vía de señalización del factor de necrosis tumoral y la vía de señalización del inflamasoma. MAF: minor allele frequency; EM: esclerosis múltiple; AID: enfermedad autoinmune. 96 La tabla 4.11 muestra las 10 variantes que se obtuvieron en el último paso de la priorización, con mayor frecuencia en individuos afectos (EM y/o AID) que en individuos no afectos. Ninguna de las variantes identificadas segregaba con la esclerosis múltiple en ninguna de las familias. Tabla 4.11. Características y frecuencias de las variantes obtenidas tras el proceso de priorización. A) Variantes genéticas correspondientes a la vía metabólica de la vitamina D. B) Variantes genéticas correspondientes a la vía de señalización del TNF. C) Variantes genéticas correspondientes a la vía de señalización del inflamasoma. MAF: minor allele frequency; ND: no disponible; CADD: Combined Annotation Dependent Depletion; EM: esclerosis múltiple; AID: enfermedad autoinmune; ND: no disponible. A) Gen Localización dbSNP MAF Alelo de referencia Efecto de la variante Cambio nucleotídico CADD EM (n=52) Otra AID (n=19) No afectos (n=67) LRP2 chr2:169997024 rs764880181 ND TG frameshift variant c.13139delC ND 1 0 0 CUBN chr10:16930419 rs45569534 0.015 C missense c.8902G>C 22.9 1 0 0 CYP24A1 chr20:52774635 rs6068812 <0.001 A missense c.1226T>C 28.3 2 0 1 B) Gen Localización dbSNP MAF Alelo de referencia Efecto de la variante Cambio nucleotídico CADD EM (n=52) Otra AID (n=19) No afectos (n=67) FASLG chr1:172628482 rs749237778 ND A frameshift variant c.153_158dupGCCACC ND 1 0 0 TNFRSF13B chr17:16852187 rs34557412 0.003 A missense c.310T>C 26.1 0 1 0 C) Gen Localización dbSNP MAF Alelo de referencia Efecto de la variante Cambio nucleotídico CADD EM (n=52) Otra AID (n=19) No afectos (n=67) TLR4 chr9:120475248 rs137853920 0.002 G missense c.842G>A 23.1 0 2 1 CIITA chr16:11000574 rs137895901 <0.001 C missense c.1225C>T 16.85 2 1 1 NOD2 chr16:50741791 rs61755182 0.002 C missense c.566C>T 24.6 1 1 0 NOD2 chr16:50745330 rs767278572 ND AG frameshift variant c.1515delG ND 2 0 0 NLRP7 chr19:55435139 rs144955489 <0.001 G missense c.2912C>T 5.360 0 1 0 97 4.2.5. Segregación familiar De manera independiente a la priorización bioinformática y con el objetivo de no descartar variantes que pudieran ser de interés también se estudió la segregación familiar de las variantes genéticas de los genes estudiados. Vía metabólica de la vitamina D Se observó que el gen METTL21B, relacionado con la regulación de la conversión a la forma activa de la VD, presentaba una variante que segregaba con la EM en la familia 10, de tipo B. Así, la variante rs141172155 (c.620G>A) se encontraba en heterocigosis en 2 (3,85%) individuos afectos de una misma familia tipo B. Ambas pacientes presentaban EMRR y una de ellas mostraba también otra enfermedad autoinmune (uveítis), mientras que ninguno de los individuos no afectos de la familia presentaba la variante (figura 4.9). Respecto a los genes codificantes de proteínas involucrados en la internalización de la vitamina D se detectó que el gen LRP2 presentaba una variante que segregaba con la enfermedad en una de las familias. Esta variante, rs34355135 (c.11092G>A) se encontraba en heterocigosis en los 2 (3,85%) individuos afectos con EM de la familia 10, la misma que mostraba la variante del gen METTL21B. Del mismo modo, ninguno de los individuos no afectos de la familia presentaba la variante (figura 4.9). A) B) Figura 4.9. Representación de la segregación familiar de las variantes rs34355135 (c.11092G>A) del gen LRP2 y rs141172155 (c.620G>A) del gen METTL21B. A) Segregación familiar de la variante rs34355135. B) Segregación familiar de la variante rs141172155. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. 98 Vía de señalización del factor de necrosis tumoral En la vía de señalización del TNF también se observaron varias variantes que segregaban con la EM en distintas familias. En primer lugar, se detectó la variante rs35041805 (c.784C>T) del gen TNFRSF19, que, como se ha explicado con anterioridad, mostró un OR elevado con una mayor frecuencia alélica en los individuos con EM que en los individuos no afectos. Esta variante segregaba en dos de las tres familias que la portaban. Estas eran la familia dos, de tipo B y la familia cinco de tipo A, en la cual la variante segregaba con la EM y otra enfermedad autoinmune (figura 4.10). A) B) 99 Figura 4.10. Representación de la segregación familiar de la variante rs35041805 (c.784C>T) del gen TNFRSF19. A) Segregación de la variante en una familia de tipo A. B) Segregación de la variante en una familia tipo B. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. Asimismo, la variante rs4149584 (c.362G>A) del gen TNFRSF1A se presentaba también en la familia cinco, una de las familias que mostraba el rs35041805 del gen TNFRSF19. En este caso, el rs4149584 se encontraba en total en 2 (3,85%) pacientes afectos con EM, 1 (5,26%) caso con otra AID (hipotiroidismo) y 5 (7,46%) individuos no afectos. No obstante, la variante solo se encontraba en homocigosis en los pacientes afectos con EM, que presentaban EMRR, mientras que se observaba en heterocigosis en los seis individuos restantes. De esta manera, el rs4149584 segregaba con la enfermedad con un patrón de herencia recesivo en la familia del tipo A comentada (figura 4.11). 100 Figura 4.11. Representación de la segregación familiar de la variante rs4149584 (c.362G>A) del gen TNFRSF1A. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. De nuevo, en la familia cinco también se observó otra variante genética correspondiente al rs761774576 (c.1136G>A) del gen NFKB1 que segregaba en los 2 (3,85%) casos con EMRR y en 1 (5,26%) familiar con otra enfermedad autoinmune, hipotiroidismo. La variante se encontraba en heterocigosis en estos pacientes mientras que no se observó en los individuos no afectos (figura 4.12). Esta fue la única familia que portaba esta variante genética. 101 Figura 4.12. Representación de la segregación familiar de la variante rs761774576 (c.1136G>A) del gen NFKB1. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. El gen TNFRSF8 mostró la variante genética rs2230625 (c.1204A>G) en 6 (11,54%) pacientes con EM, 1 (5,26%) individuo con otra AID y 1 (1,49%) individuo no afecto pertenecientes a tres familias distintas, dos de tipo B y una familia de tipo A. Esta variante fue una de las que mostró un elevado OR (5,426; IC 95% 1,074 – 27,420) al comparar pacientes respecto a individuos no afectos. A su vez, la variante segregaba con la EM y otra AID en una de estas familias, la familia 22, de tipo B. Los casos con EM de esta familia presentaban EMRR y EMPP respectivamente. Además, el caso con EMPP también presentaba síndrome antifosfolipídico. Por su parte, el familiar con otra AID tenía hipotiroidismo. El rs2230625 se encontraba en heterocigosis en estos tres individuos (figura 4.13). Los pacientes con EM que mostraban la variante en las dos familias restantes presentaban EMRR. 102 Figura 4.13. Representación de la segregación familiar de la variante rs2230625 (c.1204A>G) del gen TNFRSF8. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. Asimismo, el gen TNFRSF8 también mostró la variante rs777410629, en heterocigosis, únicamente en 2 (3,85%) casos con EMSP pertenecientes a la familia 15, de tipo B. Sin embargo, la variante no segregaba con la enfermedad, ya que la familia presentaba otro caso con EMRR que no portaba la variante. Por último, la variante rs2234163 (c.349G>A) del gen TNFRSF14 también llamó la atención en esta vía de señalización, ya que se observó únicamente en 3 (5,77%) pacientes con EM y 2 (10,53%) individuos con otra AID correspondientes a dos familias distintas de tipo B. Por un lado, el rs2234163 se observó en dos individuos afectos con EMRR y EMPP respectivamente y un familiar con hipotiroidismo. Sin embargo, la variante no segregaba con la enfermedad ya que en la familia se encontraba otro caso con EMRR que no presentaba la misma. Por otro lado, la segunda familia mostraba la variante en un paciente con EMPP y en un familiar con hipotiroidismo. Este paciente con EM también presentaba síndrome antifosfolipídico. No obstante, al igual que en el caso anterior, la variante genética tampoco segregaba con la enfermedad. 103 Vía de señalización del inflamasoma En la vía de señalización del inflamasoma también se detectaron algunas variantes genéticas de posible interés mediante el estudio de la segregación familiar. De este modo se encontró que la variante genética rs116270651 (c.277G>A) del gen IFI16 se encontraba únicamente en 2 (3,85%) individuos afectos con EM y 1 (5,26%) caso con otra AID, hipotiroidismo. Los tres individuos pertenecían a la familia tres de tipo B y los dos pacientes con EM presentaban EMRR. La variante se encontraba en heterocigosis en estos tres individuos (figura 4.14). Asimismo, esta familia también mostró una variante que no se observó en ninguna otra familia, el rs772833407 (c.2096G>C) del gen NLRP6 que, del mismo modo, se observó en los 2 (3,85%) pacientes con EM y 1 (5,26%) caso con otra AID. Estos tres individuos mostraban la variante en heterocigosis y no se observaba en ningún individuo no afecto. Figura 4.14. Representación de la segregación familiar de la variante genética rs116270651 (c.277G>A) del gen IFI16. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. 104 Otra de las variantes que llamó la atención fue la variante rs28360472 (c.944A>G) del gen P2RX4, que únicamente se encontraba en 2 (3,85%) individuos afectos pertenecientes a la familia 22 tipo B. La variante se encontraba en heterocigosis en ambos casos y los pacientes, correspondientes a un padre y un hijo, presentaban EMPP y EMRR respectivamente (figura 4.15). El padre, a su vez, presentaba coexistencia con otra AID, síndrome antifosfolipídico y uno de los familiares presentaba hipotiroidismo. Figura 4.15. Representación de la segregación familiar de la variante rs28360472 (c.944A>G) del gen P2RX4. Flecha: probando; asterisco: whole-exome sequencing; sombreado izquierdo: EM; sombreado derecho: otra AID. Esta misma familia presentaba otras dos variantes genéticas que segregaban con la EM. Una de ellas pertenece también al gen P2RX4, pero no está registrada previamente en las bases de datos (chr12:121671347, c.1162C>A). La otra variante corresponde al rs2066847 (c.3019dupC) del gen NOD2. Ambas se presentaban en heterocigosis en los 2 (3,85%) pacientes con EM y no se observaban en los individuos no afectos por la enfermedad. Estos pacientes también mostraban la variante rs28360447 (c.448G>A) del gen P2RX7, que a su vez se observó en otro paciente con EMRR y un individuo no afecto de la familia 21, de tipo A. Además, esta variante presentó un valor alto de OR al comparar pacientes con EM respecto con 105 los individuos sin la enfermedad (5,289; IC 95% 0,543 – 51,540). En total, la variante rs28360447 del gen P2RX7 se encontraba en 3 (5,77%) pacientes con EM y 1 (1,49%) individuo no afecto en heterocigosis. Finalmente, se observó que la variante rs147804224 (c.1400G>A) del gen NLRP2 se encontraba en heterocigosis en 2 (3,85%) individuos afectos de la familia 12, de tipo B, así como la variante rs76935241 (c.94C>T) del gen NLRP11. Los pacientes correspondían a dos hermanos que presentaban EMPP y EMRR respectivamente. A modo de resumen, en la tabla 4.12 se muestran las familias incluidas en este estudio y su relación, en caso de que la hubiera, con variantes encontradas durante el análisis, ya sea por la frecuencia de estas en la cohorte o por la presencia de las mismas en determinadas familias. Así, se observó que, de las 23 familias estudiadas, 13 (56,52%) de ellas presentaban una relación con alguna variante de posible interés. De estas trece familias, 6 (46,15%) de ellas mostraron más de una variante relacionada. Tabla 4.12. Relación de las familias estudiadas con las variantes genéticas. Número de familia Tipo de familia Nº de afectos con EM en la familia dbSNP Gen Causa de la relación Segregación familiar Odd Ratio elevado 1 B 3 - - - - 2 B 3 rs35041805 TNFRSF19 Sí Sí 3 B 3 rs116270651 IFI16 Sí No rs772833407 NLRP6 Sí No 4 A 2 - - - - 5 A 2 rs35041805 TNFRSF19 Sí Sí rs4149584 TNFRSF1A Sí No rs761774576 NFKB1 Sí No chr13:43148564 TNFSF11 No Sí 6 A 2 rs35041805 TNFRSF19 No Sí 7 A 2 chr13:43148564 TNFSF11 No Sí 8 A 2 - - - - 9 A 3 chr13:43148564 TNFSF11 No Sí 10 B 2 rs34355135 LRP2 Sí No rs141172155 METTL21B Sí No 11 A 2 - - - - 12 B 3 rs147804224 NLRP2 Sí No 106 rs76935241 NLRP11 Sí No 13 B 4 rs2230625 TNFRSF8 No Sí chr13:43148564 TNFSF11 No Sí 14 B 3 - - - - 15 B 4 - - - - 16 A 2 rs2230625 TNFRSF8 No Sí 17 A 2 chr13:43148564 TNFSF11 No Sí 18 A 2 - - - - 19 A 2 - - - - 20 A 2 - - - - 21 A 2 rs28360447 P2RX7 No Sí 22 B 2 rs2230625 TNFRSF8 Sí Sí rs28360472 P2RX4 Sí No chr12:121671347 P2RX4 Sí No rs2066847 NOD2 Sí No rs28360447 P2RX7 Sí Sí 23 A 2 - - - - Se muestran las coordenadas genómicas en aquellas variantes que no presenten identificador de dbSNP. 107 5. Discusión La EM es una enfermedad compleja y heterogénea en la que interaccionan diferentes factores genéticos, ambientales y epigenéticos. No obstante, a día de hoy se siguen buscando señales que puedan influir en el desarrollo de la enfermedad. Hasta la fecha, gracias a los diferentes estudios enfocados a conocer los factores genéticos implicados en la enfermedad, se han logrado identificar diferentes variantes genéticas y genes involucrados en el riesgo de desarrollar EM. Los GWAS han permitido obtener la mayor parte de la información existente sobre los factores genéticos involucrados en la EM. Tanto es así que hoy en día se han logrado identificar hasta 233 variantes genéticas en el genoma asociadas con el riesgo de susceptibilidad a la enfermedad. Sin embargo, la mayoría de las variantes identificadas presentan un pequeño efecto por lo que no es posible explicar con estos estudios toda la influencia genética en la EM. A pesar de que los GWAS han sido exitosos a la hora de identificar genes y vías de señalización que pueden estar implicadas en la enfermedad, presentan sesgos relevantes que hay que tener en cuenta a la hora de considerar sus resultados. 5.1. Limitaciones de los GWAS La necesidad en los GWAS de realizar una corrección por comparaciones múltiples debido al gran número de SNP estudiados, obliga a diseñar los estudios con grandes tamaños muestrales para ganar potencia y poder encontrar SNP asociados a la enfermedad (Riancho, 2012). Esta necesidad de utilizar un gran tamaño muestral conlleva un aspecto muy discutido en los GWAS que es la selección de los grupos de casos y controles. Para generar estos estudios en general se llevan a cabo colaboraciones internacionales que permitan aumentar el tamaño muestral. No 108 obstante, este hecho provoca un sesgo en la selección de los grupos, dado que los sujetos pertenecen a diferentes poblaciones y determinados marcadores genómicos presentan diferencias en su frecuencia a causa de la diversidad entre las distintas poblaciones. De este modo, se produce una estratificación de la población, que provoca diferencias en la prevalencia de la enfermedad, además de variaciones en las frecuencias alélicas (Cardon & Palmer, 2003). Asimismo, las diferencias en el origen geográfico de los sujetos incluidos en el estudio también repercuten en la exposición que tienen a distintos factores ambientales, lo que provoca, a su vez diferencias en las interacciones entre los genes y el ambiente. Otro aspecto a destacar en la selección de los individuos en los GWAS viene dado por la selección de los pacientes con EM, ya que los casos no suelen ser representativos de todos los pacientes que sufren la enfermedad. Además, entre los sujetos incluidos en los grupos control pueden encontrarse individuos con otras enfermedades autoinmunes asociadas, lo que también genera un sesgo de selección. Este no es el único aspecto a destacar sobre el grupo control ya que a veces se incluyen familiares no afectos de los individuos incluidos como casos. La heterogeneidad en el grupo control que incluye familiares de los individuos afectos e individuos no relacionados genera sesgos a la hora de realizar los análisis estadísticos. Estos aspectos mencionados pueden actuar como factores de confusión y generar resultados erróneos de la asociación observada entre un determinado polimorfismo y la enfermedad, de modo que deben ser tenidos en cuenta durante el análisis. Asimismo, los GWAS presentan una dificultad a la hora de replicar los resultados obtenidos, debido principalmente al tamaño muestral. Las asociaciones que se encuentran suelen ser más fuertes en estos estudios que en los estudios de replicación, con poblaciones más pequeñas, lo que conlleva una difícil interpretación de los resultados (Dehghan, 2018). Sin embargo, uno de los principales inconvenientes de los GWAS es que solo permiten detectar asociaciones con polimorfismos frecuentes. Los GWAS se han diseñado principalmente bajo la hipótesis de “enfermedad común – variantes comunes” en la que los polimorfismos con una alta frecuencia poblacional, mayor del 5%, ejercerían un efecto leve sobre la susceptibilidad total a la enfermedad. Así, las variantes que se han asociado con EM gracias a los GWAS, presentan odds ratio 109 bajos alrededor de 1,5 (Bodmer & Bonilla, 2008; International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2019; Oksenberg & Baranzini, 2010). El inconveniente de los SNP identificados es que, debido a su frecuencia alta en la población, también se observan en población sana, por lo que es difícil interpretar el efecto individual de cada uno de ellos. Asimismo, el número de polimorfismos genotipado en los GWAS generalmente representa entre el 0,3 y 0,5% de todas las variantes del genoma, lo que conlleva una baja representación de las mismas (Uitterlinden, 2016). A estos problemas se le añade que muchas variantes identificadas se encuentran en regiones intrónicas e intergénicas, por tanto, es difícil llevar a cabo estudios funcionales para demostrar su patogenicidad. Con todo ello, los GWAS han permitido identificar muchas variantes de posible riesgo para la EM y para otras enfermedades complejas. No obstante, bajo esta aproximación, las variantes identificadas muestran una asociación muy baja y solo se ha conseguido explicar una parte de la heredabilidad de la EM (Hou & Zhao, 2013; International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2018; Zrzavy et al., 2020). En la tabla 5.1 se observan los sesgos comentados de estos estudios. Tabla 5.1. Limitaciones asociadas a los GWAS (Schooling, 2019; Tam et al., 2019). Limitaciones en los GWAS Relacionadas con la población  Gran tamaño muestral  Estratificación de la población  Familias incluidas en la población Relacionadas con los SNP  Polimorfismos comunes, presentes en población sana  Efecto leve sobre la susceptibilidad, baja asociación  SNP en regiones intrónicas e intergénicas, dificultad en su interpretación biológica  Desequilibrio de ligamiento  Heredabilidad perdida Aunque la hipótesis de “enfermedad común – variantes comunes” ha sido un buen abordaje para la identificación de variantes con un efecto pequeño, esto no excluye que existan variantes raras que jueguen un papel importante en enfermedades 110 complejas como la EM y que ayuden a explicar la heredabilidad perdida en la misma. Con el desarrollo de las tecnologías de NGS como la WES es posible abarcar variantes raras (MAF < 0,05) que no pueden ser detectadas mediante los GWAS y sobrepasar las limitaciones de estos estudios. Además, estas tecnologías también permiten la identificación de polimorfismos. La aproximación al estudio de variantes genéticas a través de la WES permite obtener información de toda la región codificante del genoma, en la que más variantes causantes de enfermedades han sido identificadas hasta hoy (Dehghan, 2018; Jiang et al., 2014; Rabbani et al., 2014). De igual manera, la contribución de los estudios familiares también ha sido relevante en la EM desde que se realizaran los primeros estudios epidemiológicos, observándose que el riesgo de desarrollar la enfermedad es mayor en aquellos individuos que tienen algún familiar con EM, lo que señala la importancia del componente genético en la enfermedad (Dobson & Giovannoni, 2013). En este sentido, las familias que presentan varios miembros afectos por la enfermedad pueden ayudar a identificar variantes y genes de alto riesgo con la ayuda de la WES. De este modo, en este trabajo se ha llevado a cabo una secuenciación completa de exoma en familias con al menos dos individuos afectos por la enfermedad con el objetivo de buscar variantes genéticas que puedan explicar una parte del componente genético en vías de señalización relacionadas con la inmunidad innata, susceptibles de estar alteradas en la EM. Así, tras realizar la WES y el análisis bioinformático de las 23 familias, se han identificado variantes genéticas en determinadas familias que pueden estar involucradas en el desarrollo de la enfermedad. 5.2. Características demográficas y clínicas de la población de estudio La población estudiada constaba de 23 familias independientes, con al menos dos individuos afectos con EM por familia, que sumaban 138 individuos. En total se observaron 85 (61,60%) mujeres y 53 (38,40%) hombres con una edad media en el momento de inclusión en el estudio de 51,01±16,29 años. La población de estas familias fue clasificada en tres grupos: 52 (37,70%) pacientes con EM, 19 (13,80%) casos con otras AID distintas de la EM y 67 (48,60%) individuos no afectos. 111 Las características clínicas de los pacientes con EM estudiados corresponden con los datos publicados por diferentes autores con una predominancia de mujeres, una mayor presencia de formas recurrentes-remitentes frente a formas progresivas y una edad de inicio de la enfermedad que se da lugar en adultos jóvenes (Compston & Coles, 2002; Faguy, 2016; Yamasaki & Kira, 2019). Además de que, como se ha comentado, los familiares de individuos con EM tienen un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad, también es importante destacar la asociación que presentan pacientes con EM y sus familiares con otras enfermedades autoinmunes, evidenciando que pueden presentar mecanismos comunes. Las enfermedades autoinmunes afectan en torno al 3 y 5% de la población general (Hayter & Cook, 2012; Lifeng Wang, Wang, & Gershwin, 2015) y en los últimos años se ha mostrado un mayor interés en la asociación entre estas enfermedades y la EM (Magyari & Sorensen, 2020; Marrie et al., 2015). En este trabajo se ha evidenciado una alta presencia de AID asociadas con la EM. Así, se observó que el 23,10% de los pacientes con EM presentaba coexistencia con otra enfermedad autoinmune, siendo la fiebre reumática y la DM1 las que más destacaban en frecuencia con el 5,80% y el 3,80% respectivamente. Por otro lado, el 13,80% de los familiares presentaba otra AID. En este grupo de familiares sin EM los casos de AID que más destacaron fueron: el hipotiroidismo autoinmune con un 63,20%, la DM1 y la artritis reumatoide en un 10,50% de los casos cada una. Existen algunas controversias en la literatura respecto a cuál es la AID más asociada con la EM. Sin embargo, en muchos trabajos se describe que los desórdenes tiroideos forman parte del grupo de enfermedades que más se asocian a pacientes con EM (Magyari & Sorensen, 2020; Marrie et al., 2015) y sus familiares (Barcellos et al., 2006; Dobson & Giovannoni, 2013). Asimismo, también se ha detectado una asociación entre la EM y la DM1 (Dobson & Giovannoni, 2013; Magyari & Sorensen, 2020) observándose que presentan factores genéticos comunes (Handel et al., 2009). De igual modo, en este trabajo se realizó una clasificación de las familias según el modo de herencia de la enfermedad. Así, se encontraron 14 (60,10%) familias cuyos individuos afectos con EM se encontraban en la misma generación, denominadas como familias tipo A, y nueve (39,10%) familias del tipo B, en las que los individuos afectos con EM se encontraban en dos o más generaciones distintas. La frecuencia 112 de ambos tipos de familias en este trabajo concuerda con un estudio previo de nuestro grupo en el que realizamos una descripción clínica de 40 familias con más de dos individuos afectos con EM (Pytel et al., 2018). Esta clasificación según el tipo de presentación de la enfermedad en la familia podría ayudar a entender mejor los marcadores genómicos asociados a la heredabilidad de la EM. De la misma manera, aunque no se han observado diferencias significativas entre las características demográficas y clínicas de los individuos con EM de ambas familias, sí que se observó que las familias del tipo A presentan una mayor frecuencia de la forma EMRR (24; 82,80%), lo que concuerda con un trabajo previo en la literatura (Fernández Pérez et al., 1999). Asimismo, en los individuos afectos con EM de estas familias también se detectó una menor coexistencia con otras AID, replicando los resultados obtenidos en el estudio previo de nuestro grupo (Pytel et al., 2018). Son necesarios más estudios clínicos con familias con varios miembros que presenten EM para poder corroborar las diferencias entre los distintos tipos de familias. 5.2. Análisis de la secuenciación completa de exoma Este trabajo se ha centrado en estudiar los genes de vías de señalización pertenecientes a la inmunidad innata que pueden estar alteradas en pacientes con EM mediante la secuenciación completa de exoma. Las vías de señalización en las que nos hemos centrado han sido la vía metabólica de la vitamina D, la vía de señalización del TNF y la vía de señalización del inflamasoma. Este estudio ha tenido distintos abordajes para detectar variantes genéticas que puedan estar influyendo en el desarrollo de la enfermedad. Por un lado, se han identificado todas las variantes genéticas exónicas de los genes seleccionados y se ha estudiado su posible asociación estadística con la enfermedad. Por otro lado, se ha puesto a punto una priorización bioinformática para poder identificar variantes patogénicas o posiblemente patogénicas relacionadas con la enfermedad. Asimismo, el estudio de las familias ha permitido seleccionar variantes genéticas exclusivas de determinadas familias dado que los pacientes relacionados presentan un componente genético común. 113 5.3. Vía metabólica de la vitamina D La vitamina D es uno de los factores ambientales que más se han estudiado en la EM; en concreto, los niveles bajos de VD se asocian con un riesgo de susceptibilidad a la enfermedad (Pierrot-Deseilligny & Souberbielle, 2017). La forma activa de la VD presenta funciones importantes tanto en la inmunidad innata como en la inmunidad adaptativa (Bahlo et al., 2009). No solo presenta beneficios en el sistema inmune, sino que también ha mostrado tener efectos positivos sobre el SNC. Por ello se ha propuesto la suplementación de la VD en la EM. (Fernandes de Abreu et al., 2009). Aunque en algunos trabajos se ha observado que la VD no tiene efectos sobre el curso clínico de pacientes con EM (C. Zheng et al., 2018), la acción terapéutica de la vitamina D es un tema en auge y se ha demostrado que podría tener un efecto positivo sobre la remielinización en los pacientes con EM (Fernandes de Abreu et al., 2009; Gomez-Pinedo et al., 2020; Matías-Guíu et al., 2018; Pierrot-Deseilligny & Souberbielle, 2017). No obstante, aún se debe seguir estudiando su administración, ya que, por ejemplo, se ha observado que una dieta con alta dosis de vitamina D y IFN-beta en pacientes con EM resulta más efectiva que cualquiera de estos dos compuestos por separado (Christakos et al., 2015). Debido a su acción demostrada sobre la inmunidad y sobre el SNC (Christakos et al., 2015; Fernandes de Abreu et al., 2009; Goodin, 2014; Hayes et al., 2015; Ruiz- Ballesteros, Meza-Meza, Vizmanos-Lamotte, Parra-Rojas, & de la Cruz-Mosso, 2020; Voo et al., 2019), es esperable que variantes localizadas en algunos de los genes que forman parte de esta vía metabólica puedan afectar a la misma, provocando alteraciones en los niveles de VD y en los genes de respuesta a la VD. Así, por ejemplo, se ha observado una relación entre los niveles de VD en suero de pacientes y polimorfismos en genes involucrados en esta vía metabólica (Ruiz-Ballesteros et al., 2020). Entre los genes de esta vía que más se han estudiado predomina el gen codificante del receptor de la VD, el VDR, que se encuentra localizado en el cromosoma 12. Se han estudiado muchos polimorfismos en el gen VDR, pero los SNP en los que más se ha centrado la atención corresponden a FokI (rs2228570), BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232), y TaqI (rs731236). Estos polimorfismos se han relacionado con un incremento de la incidencia de enfermedades autoinmunes (Bizzaro et al., 2017; 114 Imani, Razi, Motallebnezhad, & Rezaei, 2019; Moosavi, Rafiei, Yazdani, Eslami, & Saeedi, 2021; Ruiz-Ballesteros et al., 2020). Dos de estos SNP, BsmI y ApaI, se encuentran en regiones intrónicas, por lo que no han sido objeto de estudio en este trabajo. Aunque en nuestro estudio no hemos encontrado ninguna asociación significativa con la enfermedad, los polimorfismos FokI y TaqI han sido relacionados con la EM previamente en varios trabajos (Hayes et al., 2015; Křenek, Benešová, Bienertová-Vašků, & Vašků, 2018; Yucel et al., 2018). En concreto, en un estudio reciente, se ha observado que ambos polimorfismos presentan diferencias significativas en su frecuencia entre pacientes y controles (Moosavi et al., 2021). Aun así, en un metaanálisis realizado en 2019 se observó que el polimorfismo TaqI es el único que mostraba una asociación significativa con la susceptibilidad a la EM (Imani et al., 2019). A pesar de que la asociación entre SNP del gen VDR y la EM ha sido encontrada en varios trabajos, algunos han presentado resultados contradictorios (Elkama & Karahalil, 2018; D. Zhang, Wang, Zhang, & Li, 2019). Esto, como explican Zhang y colaboradores, puede deberse a diferencias que existen entre las distintas poblaciones estudiadas. Así, en este estudio de 2019 observaron una asociación del polimorfismo TaqI principalmente en población caucásica, mientras que el riesgo de EM en población asiática se asociaba con los polimorfismos FokI y ApaI (D. Zhang et al., 2019). El resto de genes involucrados en la vía metabólica de la vitamina D no han sido tan ampliamente estudiados como el gen VDR. En nuestro trabajo hemos abarcado los genes implicados en esta vía, dado que variantes encontradas en la misma pueden suponer una alteración de la vía y por tanto tener un efecto en el desarrollo de la EM. Aunque los trabajos que se centran en estos genes relacionados con la vía metabólica de la VD son menos frecuentes, algunos de ellos han mostrado una asociación con la EM. Los primeros genes que se identificaron relacionados con esta vía metabólica fueron CYP27B1 y CYP24A1 (Scazzone, Agnello, Bivona, Lo Sasso, & Ciaccio, 2021). De ellos, el gen CYP24A1 también ha sido uno de los que ha mostrado una señal en el último estudio GWAS realizado por el International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2019). El gen CYP24A1 se encuentra en el cromosoma 20 y codifica la enzima del citocromo P450 24A1 (CYP24A1), también llamada 1, 25-dihidroxivitamina D3 24-hidroxilasa. 115 Esta enzima es la encargada del catabolismo de la vitamina D y la asociación entre el gen codificante de la misma, CYP24A1, y la EM sigue siendo controvertida a día de hoy. Mientras en algunos estudios se encuentran polimorfismos que generan riesgo de desarrollar la enfermedad (Agnello et al., 2018), hay trabajos que no observan resultados significativos (Orton et al., 2011). Nosotros no hemos observado ninguna asociación con este gen, pero, dado su papel regulador en esta vía, deberán realizarse más estudios para esclarecer su influencia genética en la EM. Por su parte, el gen CYP27B1 es uno de los que más relación ha mostrado con el riesgo de EM (Bahlo et al., 2009; Krizova, Kollar, Jezova, & Turcani, 2013; Ramagopalan et al., 2011; Ross et al., 2014; Sundqvist et al., 2010). Este gen se localiza en el cromosoma 12 y codifica la enzima del citocromo P450 27B1 (CYP27B1), también llamada 25-hidroxivitamina D3 1-alfa-hidroxilasa, que se encarga de catalizar la hidroxilación del calcidiol a la forma activa de la vitamina D: el calcitriol. El primer SNP del CYP27B1 asociado con la EM corresponde al rs703842 (Bahlo et al., 2009). Este polimorfismo se encuentra en la región aguas arriba del CYP27B1 y ha presentado relación con el riesgo de susceptibilidad a la EM en diferentes poblaciones. Además, su asociación con la enfermedad podría estar influenciada por la presencia del alelo HLA-DRB1*15:01 (Čierny et al., 2019). Otra de las variantes estudiadas en este gen corresponde al rs118204009, que ha presentado resultados controvertidos en diferentes trabajos. Esta variante, de baja frecuencia, está caracterizada como patogénica o probablemente patogénica en ClinVar asociada con raquitismo tipo 1A dependiente de VD. El cambio que provoca en el receptor lleva a una pérdida de la actividad enzimática y a la disminución de los niveles de la forma activa de la VD (Krizova et al., 2013). Asimismo, en un trabajo realizado previamente, la variante rs118204009 segregaba con la EM en una familia que presenta varios miembros afectos, por lo que se ha sugerido que podría tener un efecto sobre el desarrollo de la enfermedad (Ross et al., 2014). En nuestro trabajo solo hemos identificado una variante en este gen, rs8176344, que no presenta resultados que muestren una relación con la EM. Asimismo, ha habido otros estudios que tampoco han encontrado evidencias de asociación entre el CYP27B1 y la enfermedad (Ban et al., 2013; Barizzone et al., 2013). Aun así, el gen CYP27B1 tiene un papel relevante en esta vía metabólica y se deberán realizar más estudios con 116 poblaciones más grandes para corroborar el efecto de alteraciones en este gen con la enfermedad. En nuestro estudio hemos realizado diferentes aproximaciones en busca de posibles variantes que se puedan encontrar relacionadas con la EM. Dado que nuestra población se encuentra formada por familias que presentan varios miembros con la enfermedad, hemos realizado la búsqueda de variantes que segregaran con la misma para establecer una posible relación. Gracias a ello, hemos identificado dos variantes genéticas en los genes METTL21B y LRP2 en los pacientes afectos con EM en una familia del tipo B. 5.3.1. METTL21B El gen METTL21B, también llamado EEF1AKMT3 o FAM119B, se encuentra en el cromosoma 12, en una región con un fuerte desequilibrio de ligamiento y en la que también se presenta el gen CYP27B1. El METTL21B codifica para una proteína-lisina metiltransferasa cuyas funciones se encuentran relacionadas con la síntesis de proteínas, la apoptosis o la biogénesis de miARN, entre otras (Gresle et al., 2020). Además, este gen ha demostrado una participación en la regulación de la hormona paratiroidea (PTH) y el factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23), que, a su vez, están involucrados en la regulación de la hidroxilación llevada a cabo por la enzima CYP27B1 (Christakos, 2017; M. B. Meyer et al., 2019; M. B. Meyer & Pike, 2020). A pesar del papel que ejerce METTL21B sobre la enzima CYP27B1 no se han encontrado muchos trabajos que estudien alteraciones en el gen METTL21B y su asociación con la EM. Dado que la región en la que se encuentra el METTL21B es una zona con un alto desequilibrio de ligamiento, es difícil identificar el polimorfismo asociado con la EM, además de que los genes que se presentan en esta región parecen estar estrechamente coordinados entre ellos. Sin embargo, en un estudio realizado en esta región del cromosoma 12 se ha identificado un SNP, rs10877013, localizado aguas arriba del METTL21B, que afecta en gran medida a la actividad del potenciador (enhancer) de esta región y que podría causar diferencias en la expresión de varios genes entre los que se encuentran METTL21B, CYP27B1, TSFM o AVIL (Alcina et al., 2013). Asimismo, otra variante, el rs923829, del gen METTL21B ha demostrado 117 alterar los niveles de expresión del mismo, los cuales se asocian a su vez con la EM (Mo et al., 2019). En este trabajo hemos identificado la variante rs141172155 p.(Arg207Gln) que no ha sido relacionada previamente con la EM ni con otras enfermedades. Esta variante se encuentra en una única familia, la familia 10, segregando con la enfermedad. Esto podría señalar una relación entre el rs141172155 y la EM, aunque es necesario realizar más estudios con una población mayor, teniendo en cuenta, además el desequilibrio de ligamiento de la región y así poder establecer una asociación. Sin embargo, dado el papel del gen METTL21B, las alteraciones en el mismo podrían causar diferencias en la regulación de la enzima CYP27B1 mediante una alteración de los genes reguladores de la misma. De este modo, se podría provocar un cambio en los niveles de vitamina D. No es raro pensar esto, ya que, además, como se ha comentado anteriormente, variantes de genes presentes en esta región, como CYP27B1, se han relacionado con los niveles de VD en el suero de pacientes con EM (Krizova et al., 2013). 5.3.2. LRP2 De igual modo, hemos identificado una variante del gen LRP2 que segrega con la EM en la familia 10. El gen LRP2 se encuentra en el cromosoma 2 y codifica para la proteína megalina. Esta participa en la internalización de la VD mediante su unión a la proteína DBP. Además, el LRP2 presenta también un papel clave en el desarrollo del SNC. Así, alteraciones en este gen se asocian con desórdenes neurológicos siendo el síndrome Donnai-Barrow la enfermedad con la que más se han relacionado (Deml, Reis, Muheisen, Bick, & Semina, 2015). Aunque la región del cromosoma 2, donde se encuentra el LRP2, ha sido señalada con anterioridad mediante los GWAS, no fue hasta el 2017 cuando se detectó una variante en este gen como relevante para la EM. La variante correspondía al rs12988804 y su asociación con la enfermedad se ha replicado en un estudio posterior (Hilven et al., 2018). En nuestro estudio hemos identificado la variante rs34355135 p.(Val3698Met) en los pacientes con EM de la familia mencionada. No obstante, esta variante ha sido clasificada previamente como benigna o probablemente benigna en la base de datos de ClinVar y presenta un efecto probablemente benigno de acuerdo a los programas de predicción. Para corroborar su inocuidad en la EM son necesarios nuevos estudios funcionales que 118 permitan conocer si hay algún proceso biológico afectado y relacionado con la enfermedad. La presencia de las dos variantes de los genes METTL21B y LRP2 segregando con la enfermedad en una misma familia puede ser la responsable de una parte del riesgo de la EM, especialmente la variante del gen METTL21B, dado el efecto probablemente benigno de la variante del LRP2. Sería interesante estudiar los niveles de VD en esta familia para poder esclarecer la relación entre estos y las variantes identificadas. Además, ambas son variantes raras que pueden presentar un efecto mayor sobre la susceptibilidad a la EM. Aun así, es extremadamente necesario realizar una replicación de estos resultados. Aunque el hallazgo de estas dos variantes de METTL21B y LRP2 podría ser interesante, en nuestro trabajo no hemos encontrado otras variantes genéticas con diferencias significativas de los genes implicados en la vía metabólica de la vitamina D relacionados con la EM. De igual modo, en otros estudios tampoco se han encontrado asociaciones entre estos genes y la EM (Ban et al., 2013; Barizzone et al., 2013; Orton et al., 2011). No obstante, se ha sugerido que la relación que se establece entre variantes de genes involucrados en esta vía y la EM puede dividirse en dos tipos. Por un lado, se han encontrado genes que se han relacionado tanto con el riesgo de la enfermedad como con los niveles de vitamina D. Por otro lado, parece que hay un grupo de genes que se asociaría con los niveles de VD en pacientes con EM pero no con el riesgo de la enfermedad (Krizova et al., 2013). Como se ha mencionado, sería interesante abarcar en el futuro el estudio de los niveles de VD en estas familias y realizar una replicación de los resultados para comprender mejor esta relación de los genes de la vía metabólica de la VD y la EM. 5.4. Vía de señalización del TNF Algunos de los genes involucrados en la vía de señalización del TNF han sido previamente relacionados con la EM en la literatura. Aunque en este trabajo no hemos identificado diferencias significativas entre los grupos, podemos destacar algunos resultados relevantes que se deberían considerar para futuras investigaciones. 119 Las variantes que se han identificado y que se discutirán a continuación muestran la importancia de los genes involucrados en esta vía de señalización, ya codifiquen para receptores, ligandos o moléculas asociadas. Una alteración en alguno de estos genes puede provocar una alteración que termine repercutiendo en la patogénesis de la EM. Así, los trabajos previos realizados con el objetivo de descifrar las alteraciones genéticas en la EM señalan a esta vía de señalización en repetidas ocasiones. Entre los genes que más se han asociado con la enfermedad, el que más destaca es el gen TNFRSF1A. Sin embargo, en el último GWAS llevado a cabo por el International Multiple Sclerosis Genetics Consortium también se han identificado variantes dentro o en regiones cercanas a los genes LTA, TNFSF14, CD40, TRAF3, TNFAIP8, además del TNFRSF1A (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2019). La identificación de estos genes señala no solo la vía de señalización del TNFα, sino también genes involucrados en diferentes vías de la superfamilia del TNF que se encuentran relacionadas con la inmunidad. 5.4.1. TNFRSF8 y TNFSF11 Al comparar la frecuencia de las variantes genéticas entre los distintos grupos hemos encontrado algunas variantes con un OR por encima de dos, lo que podría estar indicando un posible efecto de riesgo en la EM. Entre ellas, hemos encontrado la variante rs2230625 p.(Ser402Gly) del gen TNFRSF8 que se encontraba en seis pacientes con EM, un individuo con otra AID y un individuo no afecto, correspondientes a tres familias y todos ellos en heterocigosis. Además, la variante segregaba con la EM y otra AID, hipotiroidismo, en la familia 22. El TNFRSF8 se encuentra en el cromosoma 1 y codifica para el miembro 8 de la superfamilia de receptores del TNF, también llamado CD30R y se expresa en las células Th activadas (Shinoda et al., 2016). Este receptor se activa mediante la unión a la molécula CD30L, un tipo de proteína transmembrana. Al igual que con otros receptores de esta superfamilia, la señalización continúa con factores asociados a receptores de TNF (TRAF, por sus siglas en inglés TNF receptor-associated factors) conduciendo en último lugar a la activación de la vía de señalización del NF-κB (Vaklavas & Forero- Torres, 2012). El CD30R también actúa como el receptor específico de la tiorredoxina 1 (TrxI), una proteína implicada en la regulación del sistema redox de procesos inmunitarios y neurológicos (Contasta et al., 2010). A pesar del 120 conocimiento adquirido de este receptor, sus funciones no están del todo claras, además de no haberse detectado alteraciones en el mismo o en su ligando que hayan sido asociadas a alguna enfermedad (Vaklavas & Forero-Torres, 2012). El CD30 y el CD30L se expresan en células T activadas, pero también en neutrófilos, eosinófilos y células B. De igual manera, el CD30R se ha identificado como un marcador de una subpoblación reguladora de células dendríticas, las cuales tienen un papel esencial en el mantenimiento del equilibrio de las respuestas de las células Th1 y Th2 (Pellegrini et al., 2005). Así, el CD30L ha sido utilizado como biomarcador de alteraciones inmunológicas (Contasta et al., 2012). De este modo, se podría decir que alteraciones en el TNFRSF8 pueden producir un cambio en la respuesta inflamatoria de las vías de señalización mencionadas. En esta línea, se ha observado que la expresión de CD30R en las células T CD4 está relacionada con la patogénesis de la autoinmunidad del SNC (Shinoda et al., 2016). Otra de las variantes con un OR mayor de dos pertenece al gen TNFSF11 que se encuentra en el cromosoma 13 y codifica para el miembro 11 de la superfamilia de ligandos del TNF, también llamado el ligando del receptor activador del NF-κB (RANKL, por sus siglas en inglés receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand). La variante identificada, no descrita previamente, corresponde a una deleción de timina en la posición genómica chr13:43148564 p.(Ala43fs) que genera una proteína truncada. A pesar de que hemos observado esta variante con mayor frecuencia en pacientes con EM que en individuos no afectos, debe ser considerada con precaución debido a que, tras revisar la herramienta IGV, podría considerarse un error de secuenciación e incluso, si fuera real, puede que se encuentre presente en más individuos de los identificados. Es difícil asegurar su presencia sin realizar un estudio de validación. Asimismo, no hay literatura previa que describa variantes en este gen relacionadas con la EM. El RANKL ha mostrado una expresión en varias células y tejidos entre los que se encuentran los linfocitos T, los osteoblastos, los osteocitos y el estroma del hueso y el pulmón. El RANKL forma parte de un sistema que presenta un papel importante en la inmunidad y en regular la homeostasis del hueso mediante la regulación de los osteoclastos. Por ello, variantes en este gen se han relacionado con la osteopetrosis (Walsh & Choi, 2014). En la activación inmune, el RANKL se expresa 121 en los linfocitos T lo que potencia la respuesta inmune, promueve, por tanto, la supervivencia y la función de las células dendríticas. Además, en el modelo de EAE, su expresión parece jugar un papel clave en el tráfico de los linfocitos T patogénicos. Así, se ha observado que mediante el uso de un inhibidor de RANKL se ha retrasado el inicio de los síntomas y se ha reducido la severidad de la EAE (Glasnović et al., 2018). 5.4.2. TNFAIP6 Los valores de OR pueden dar una idea de la asociación entre determinadas variantes genéticas y la EM. No obstante, es importante destacar también aquellas que presentan diferencias en su patrón de presentación. Es decir, aquellas variantes que se observan en homocigosis en mayor medida en los pacientes con EM, ya que esto podría indicar diferencias en el riesgo a la enfermedad según el genotipo observado. De este modo, hemos detectado que uno de los genes de esta vía presentaba una variante cuyos únicos casos en homocigosis correspondían a pacientes con EM. Esta variante correspondía al rs1046668 p.(Gln144Arg) del gen TNFAIP6 y cuatro casos con EM, pertenecientes a tres familias distintas, portaban esta variante en homocigosis. Cabe destacar que, en una de estas familias, la familia 19, la variante se mostraba en homocigosis en los dos pacientes con EM y no así en sus familiares no afectos. Sin embargo, el rs1046668 también se presentaba en heterocigosis en 10 pacientes con EM, por lo que resulta difícil interpretar el posible riesgo de esta variante frente a la enfermedad. El TNFAIP6 se encuentra en el cromosoma 2 y codifica para la proteína 6 inducida por TNFα. Este gen puede ser inducido por citoquinas proinflamatorias como TNFα e IL-1. A su vez, la proteína que codifica presenta propiedades protectoras y antiinflamatorias (Day & Milner, 2019). Aunque no se han encontrado variantes de este gen asociadas con la EM, el patrón de herencia recesiva de la familia mencionada podría señalar una relación. Además, variantes en TNFAIP6 se han asociado con otras enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (Saeed, 2017). 5.4.3. TNFRSF1A Gracias al estudio individual de las familias hemos podido identificar variantes genéticas de interés con la EM. Uno de los hallazgos más relevantes respecto a la vía 122 de señalización del TNF es la presencia de la variante rs4149584 perteneciente al gen TNFRSF1A. Este gen, presente en el cromosoma 12, codifica para el receptor 1A de la superfamilia de receptores del TNF (TNFR1), el cual presenta mayor afinidad por la citoquina TNFα y es en gran parte el responsable de los efectos inflamatorios de la señalización del TNF (Tienari & Hohlfeld, 2013). Los miembros de las familias del TNF y de sus receptores tienen un papel fundamental en la respuesta innata y adaptativa del sistema inmune. Tanto es así, que su desregulación se encuentra involucrada en la inflamación y se ha relacionado con diferentes enfermedades autoinmunes (Hu et al., 2019). Entre estas enfermedades, la señalización del TNFα presenta un papel relevante en la patofisiología de la EM (Caminero, Comabella, & Montalban, 2011). El TNFα es una citoquina proinflamatoria producida por células del sistema inmune y responsable de un gran número de eventos involucrados con la inmunidad, inflamación, proliferación celular, diferenciación y apoptosis, en respuesta a una gran variedad de estímulos. Esta citoquina puede presentarse en dos formas: en forma soluble (sTNF) y en forma transmembrana (tmTNF) (Caminero et al., 2011; Hu et al., 2019; Probert, 2015). El TNFα interactúa con dos receptores, el TNFR1 y el TNFR2, siendo el TNFR1 por el que presenta mayor afinidad, como se ha comentado. Es esencial una regulación óptima de la señalización realizada por el TNFα para el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos y para prevenir patologías inflamatorias (Van Quickelberghe, De Sutter, van Loo, Eyckerman, & Gevaert, 2018). El TNFR1 se expresa en todos los tipos celulares, salvo en los eritrocitos, mientras que el TNFR2 se expresa generalmente en la células inmunes y endoteliales. La activación del receptor TNFR1 puede dar lugar a dos vías de señalización dependiendo del tipo de células y del estado de la misma. Por un lado, puede activar señales proinflamatorias y anti-apoptóticas mediante la activación del NF-κB y, por otro lado, puede activar señales apoptóticas mediante la acción de caspasas (figura 5.1). Por su parte, la señalización del receptor TNFR2, codificado por el gen TNFRSF1B, conduce a la activación del NF-κB, promoviendo la supervivencia de la célula (Caminero et al., 2011). 123 Figura 5.1. Vías de señalización del receptor TNFR1 (Caminero et al., 2011). Determinadas variantes en el gen TNFRSF1A se han relacionado con el síndrome periódico asociado al receptor del TNF (TRAPS, por sus siglas en inglés TNF receptor-associated periodic syndrome), un desorden autoinflamatorio con un patrón de herencia autosómico dominante. Además, algunas variantes en TNFRSF1A se han asociado a la fiebre mediterránea familiar (FMF) (Kümpfel & Hohlfeld, 2009; Marek-Yagel et al., 2010; Mulazzani et al., 2020), una de las enfermedades monogénicas autoinflamatorias más frecuentes que se encuentra asociada principalmente con variantes en el gen MEFV (Georgin-Lavialle et al., 2019). La relación entre la EM y el TNFRSF1A se conoce desde hace unos años gracias a la asociación observada con las variantes rs4149584 y rs1800693 principalmente (De Jager et al., 2009; International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2011; Leppä et al., 2011), como se comentaba en el primer capítulo de este trabajo. Tras esto, los estudios se han centrado con mayor énfasis en la relación de la variante rs4149584 con la enfermedad, ya que el SNP rs1800693 presenta un efecto más modesto. Así, la variante rs4149584 se ha asociado con un comienzo anterior de la EM y una evolución más lenta de la enfermedad (Comabella et al., 2013; Javor et al., 2018). En nuestra cohorte hemos identificado la variante rs4149584 en ocho individuos 124 pertenecientes a dos familias distintas. Por un lado, la familia cinco, del tipo A, porta la variante en heterocigosis en dos miembros no afectos y en un individuo con otra AID, mientras que se encuentra en homocigosis en los dos individuos afectos con EM. Los tres individuos restantes son miembros no afectos de la familia cuatro de tipo A que portan el cambio en heterocigosis. La variante rs4149584 p.(Arg121Gln) ha sido referida en la literatura previa como R92Q, su nombre más común. A pesar de ser una variante que presenta interpretaciones conflictivas respecto a su patogenicidad en ClinVar, son varios los autores que la relacionan con el desarrollo de la EM. Esta variante se ha observado tanto en heterocigosis como en homocigosis previamente en pacientes con EM. Además, se ha demostrado que el suero de estos pacientes muestra un incremento en la producción del receptor TNFR1 en su forma soluble (Comabella et al., 2013). De igual modo, gracias a estudios in vitro se ha identificado una mayor interacción entre el TNFα y el receptor TNFR1 que presenta la variante. Esto podría indicar una potenciación de esta vía de señalización y una afección distinta en aquellos individuos que la presentan (Agulló et al., 2015; Comabella et al., 2013). Esta variante también corresponde a uno de los cambios que se ha relacionado con el síndrome TRAPS (Caminero et al., 2011). Sin embargo, se ha observado que los pacientes con TRAPS que portan esta variante presentan unos síntomas más leves respecto a aquellos pacientes con variantes patogénicas de TNFRSF1A. Por este motivo, se ha sugerido que el cambio R92Q pueda ser una variante con baja penetrancia y que no actúe como el único factor desencadenante de la enfermedad (Ravet et al., 2006; Ruiz-Ortiz et al., 2017). Aun así, en la EM, la señalización del receptor TNFR1 es esencial para la inducción de la inflamación y de la desmielinización en etapas tempranas de la EM. Mientras, el receptor TNFR2 parece actuar promoviendo la reparación y la supervivencia de la célula como un mecanismo de neuroprotección en etapas bien establecidas de la enfermedad (Javor et al., 2018). De igual manera, ratones transgénicos con una sobreexpresión de TNF presentan una desmielinización severa, lo que confirma el papel proinflamatorio del TNFR1 (S. Yang, Wang, Brand, & Zheng, 2018). A pesar de que son necesarios más estudios funcionales para desentrañar el efecto de esta variante, el cambio R92Q podría provocar una alteración de la vía de señalización 125 del TNFR1 que produciría una mayor inflamación y desmielinización en los pacientes que lo portan. 5.4.4. TNFRSF19 y NFKB1 Otro aspecto llamativo de la familia cinco, que muestra la variante rs4149584 segregando con la enfermedad, es que los dos pacientes con EM de la misma también portaban otras dos variantes correspondientes al rs35041805 en el gen TNFRSF19 y al rs761774576 en el gen NFKB1. Además, ambas se encontraban en un familiar afecto con otra AID, hipotiroidismo. Por un lado, la variante rs35041805 p.(Pro262Ser) del gen TNFRSF19, localizado en el cromosoma 13, mostraba un OR mayor de dos, debido a una mayor presencia en pacientes con EM que en individuos no afectos. Aparte de encontrarse presente en la familia mencionada, se observó en la familia dos, de tipo B, segregando con la enfermedad en los dos pacientes afectos con EM. Esta variante podría ser interesante debido a las diferencias en su frecuencia en los distintos grupos y a que, además, segrega en dos de las tres familias que la presentan. Este cambio, a diferencia del rs4149584, no se ha asociado con anterioridad a la EM ni a otras enfermedades. El gen TNFRSF19 codifica para el receptor 19 de la superfamilia de receptores del TNF, también llamado TROY o TAJ, y se encuentra altamente expresado durante el desarrollo embrionario y en el sistema nervioso en adultos. El TROY, forma parte de un complejo que se asocia con el receptor de Nogo 1 (NgR1) cuando se produce su activación. Este complejo, formado por el NgR1 y el LINGO-1, tiene un tercer integrante que puede ser el TROY o el receptor de neurotrofinas p75 (p75NTR). El receptor NgR1, que se expresa fundamentalmente en neuronas, se activa con la unión de cualquiera de estas tres moléculas: Nogo-A, la glicoproteína asociada a la mielina (MAG) o la glicoproteína de oligodendrocitos asociada a la mielina (MOG). Las tres actúan como inhibidores del crecimiento de los axones en el SNC (Lee & Petratos, 2013; C. L. McDonald, Bandtlow, & Reindl, 2011; Park et al., 2005; Theotokis & Grigoriadis, 2018). Asimismo, se ha mostrado, por ejemplo, que Nogo- A inhibe la maduración de los oligodendrocitos, lo que termina afectando a la 126 mielinización o incluso a la remielinización como ocurre en la EM (Lee & Petratos, 2013). Los receptores TROY y p75NTR presentan un patrón de expresión diferente. De este modo, el p75NTR parece presentar una expresión limitada después del nacimiento, lo que puede llevar al TROY a tener un papel más relevante en el SNC de adultos (Theotokis & Grigoriadis, 2018). Aun así, en el modelo de la EAE el p75NTR podría jugar un papel en la regeneración axonal en situaciones de inflamación crónica, mientras que el TROY se expresa en situaciones de inflamación aguda. Así, la expresión del TROY se ha visto incrementada en lesiones del cerebro de pacientes con EM, en concreto en poblaciones de astrocitos reactivos y de macrófagos y microglía (Satoh, Tabunoki, Yamamura, Arima, & Konno, 2007; Theotokis & Grigoriadis, 2018). No hay variantes del gen TNFRSF19 que se hayan asociado previamente a la EM y aún no está claro el motivo del aumento de la expresión del TROY en las áreas de lesión, pero esta vía de señalización controlada por este complejo de varios receptores puede tener un papel relevante en la regulación después de producirse una lesión axonal inflamatoria (Theotokis et al., 2016). De esta manera, la presencia de la variante del TNFRSF19 en las dos familias mencionadas cosegregando con la EM puede indicar una relevancia en la enfermedad que no ha sido descrita previamente. Por otro lado, la variante rs761774576 p.(Ser379Asn) del gen NFKB1 únicamente se encontraba presente en la familia cinco, segregando con la enfermedad y con otra AID. Al igual que el cambio del gen TNFRSF19, esta variante tampoco se ha asociado con anterioridad a la EM ni a otras enfermedades. El NFKB1 se encuentra en el cromosoma 4 y codifica para la subunidad p105 y p50 del NF-κB. El NF-κB es un complejo formado por varias subunidades, entre ellas las mencionadas. El NF-κB se activa a través de una gran variedad de estímulos, como citoquinas o productos virales, y se encuentra en diferentes células del sistema inmune. Una regulación incorrecta del mismo se relaciona con un aumento de la inflamación en enfermedades inflamatorias y autoinmunes como el asma, la artritis autoinmune o la EM. La activación del NF-κB puede realizarse a través de la vía de señalización canónica o no canónica. La vía canónica o clásica se activa a través de un amplio rango de citoquinas proinflamatorias como TNFα, moléculas de reconocimiento de 127 patrones o antígenos. Por su parte, la vía de señalización no canónica se activa a través de un conjunto específico de estímulos mediante un subgrupo de receptores de la familia del TNF y sus ligandos. Dependiendo de la vía de señalización, el NF-κB es ensamblado en diferentes conformaciones, que son las que finalmente regulan la expresión de cientos de genes (Hoeger, Serwas, & Boztug, 2018; Mc Guire, Prinz, Beyaert, & van Loo, 2013; Yifan Zhou et al., 2020). En cuanto a la relación del NF-κB con la EM, se ha observado una activación del NF- κB en tejido cerebral de pacientes con EM en diferentes células como son los astrocitos, oligodendrocitos, microglía y macrófagos que se encuentran infiltrados en lesiones del SNC o cerca de ellas (Fazia et al., 2020; Mc Guire et al., 2013). Además, algunos estudios han demostrado una relación entre el incremento del NF-κB y una recaída en los pacientes con EM (Yifan Zhou et al., 2020). De igual forma, esta relación con la enfermedad también se observa en las variantes identificadas a través de los estudios GWAS, ya que el 20% de todas las variantes pertenecen a genes de esta vía de señalización y algunas de ellas se han localizado cerca del gen NFKB1 (Fazia et al., 2020). Así, se ha observado una respuesta alterada de la vía de señalización del NF-κB en pacientes que portan la variante de riesgo rs228614, cercana al gen NFKB1. Esta no es la única variante que ha sido relacionada, ya que otra variante de riesgo a la EM, cerca de la región del NFKB1, ha mostrado ejercer una regulación sobre la señalización del NF-κB (Yifan Zhou et al., 2020). Asimismo, determinados polimorfismos dentro o en regiones cercanas a genes como el TNFAIP3, que codifica para un regulador negativo del NF-κB, también se han relacionado con la patogénesis de la EM (Hoffjan et al., 2015). Estos hallazgos ayudan a profundizar en el papel de esta vía de señalización en la EM. Si bien no se conoce el riesgo de la variante identificada en nuestra cohorte, su presencia en los pacientes con EM y el familiar afecto con hipotiroidismo podría señalar una implicación en la enfermedad y en otras enfermedades autoinmunes que deberá ser estudiada en futuros trabajos. Además de la observación de estas variantes por separado, es especialmente llamativo el hecho de que la familia cinco presente las tres variantes de los genes TNFRSF1A, TNFRSF19 y NFKB1 segregando con la EM. Esto explicaría que por sí solas quizá no son suficientes para generar un riesgo elevado en la enfermedad, pero 128 su efecto puede ser mayor al considerarse de manera conjunta. Además, las tres son variantes raras que presentarían un mayor efecto en la enfermedad que otros polimorfismos previamente relacionados. Al igual que las variantes anteriormente mencionadas, será necesario realizar estudios funcionales para estas variantes de manera individual y de forma conjunta con el fin de aclarar el riesgo que pueden generar para el desarrollo de la EM. 5.5. Vía de señalización del inflamasoma El inflamasoma es un complejo multiproteico intracelular que se caracteriza por actuar como una barrera de defensa en el sistema inmune innato. Son varios los receptores citoplasmáticos capaces de formar un inflamasoma ante la detección de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o daño (DAMP). En función del tipo de patrón molecular se produce la activación de unos u otros receptores, como el NLRP3, el NLRC4 o el NLRP1, entre otros. Todos ellos son capaces de la formación del inflamasoma (Soares et al., 2019) y pertenecen a la familia de receptores con dominio de unión a nucleótidos que contienen repeticiones ricas en leucina (NLR, por sus siglas en inglés nucleotide-binding domain leucine-rich repeat receptors). Las diferentes subfamilias y los distintos receptores presentan diferentes estímulos que promueven la formación del inflamasoma. Los inflamasomas están formados de un receptor NLR capaz de reconocer un estímulo, una molécula adaptadora (ASC) y una proteína catalítica, la procaspasa-1. Una vez se produce la activación del inflamasoma, comienza una cascada de señalización en la que se produce la forma activa de la caspasa-1, la cual es capaz de inducir las formas activas de las citoquinas IL-1B e IL-18, que posteriormente serán secretadas, iniciando, por tanto, una respuesta inflamatoria (Barclay & Shinohara, 2017; De Rivero Vaccari, Dietrich, & Keane, 2014; Popplewell et al., 2020). Hay distintos tipos de inflamasoma según el tipo de receptor NLR que desencadene su formación. Los NLR forman una familia de receptores que contienen un dominio C-terminal con repeticiones ricas en leucina (LRR), un dominio central de unión a nucleótidos y oligomerización (NOD o NACHT) y un dominio efector N-terminal que difiere en cada subfamilia de receptores. Los diferentes inflamasomas son capaces de reconocer diferentes moléculas, entre las que se encuentran ácidos nucleicos, 129 proteínas bacterianas, toxinas o metabolitos. Así, una alteración de estos complejos contribuye a la patogénesis de distintas enfermedades, entre las que se encuentran enfermedades infecciosas, autoinmunes y neurodegenerativas (Olcum, Tastan, Kiser, Genc, & Genc, 2020). En el SNC, el inflamasoma también presenta una función importante, ya que su activación establece la iniciación y la persistencia de la inmunidad innata (Heneka, McManus, & Latz, 2018). Así, se cree que los inflamasomas llevan a cabo un papel crucial en la EM y en el modelo de la EAE. De hecho, se han observado señales de caspasa-1 y de IL-1β en placas de pacientes con EM y un aumento de los niveles de caspasa-1 e IL-18 en las células mononucleares de la sangre periférica de estos pacientes, así como mayores niveles de IL-18 en el suero de individuos afectos respecto a controles. La acción de los inflamasomas se ha relacionado también con la patogénesis de la EAE en distintas etapas del desarrollo de la misma como la ruptura de la barrera del SNC o la neurodegeneración (Barclay & Shinohara, 2017; Keane, Dietrich, & de Rivero Vaccari, 2018). A pesar de los diferentes inflamasomas descritos solo algunos de ellos se han descrito en el SNC. Entre los más estudiados se encuentran los inflamasomas NLRP1 y AIM2 en neuronas, el inflamasoma NLRP2 en astrocitos y el NLRP3 en la microglía (De Rivero Vaccari et al., 2014). Como se comentaba en el primer capítulo de este trabajo, variantes en los genes que forman parte de esta vía de señalización se han relacionado con distintas enfermedades, entre ellas la EM (Popplewell et al., 2020). Sin duda, el inflamasoma que más se ha estudiado en la EM es el formado por el receptor NLRP3. Así, alteraciones de ganancia de función en el gen que lo codifica, el NLRP3, se han asociado con el riesgo de EM, lo que pone de manifiesto la contribución del inflamasoma en la patogénesis de la enfermedad (Soares et al., 2019). Además, gracias al último trabajo GWAS del International Multiple Sclerosis Genetics Consortium se ha identificado una señal en el gen NLRC5 de esta vía de señalización. Aunque se han identificado algunas funciones del receptor codificado por este gen, aún queda trabajo por realizar. A pesar de ello, se ha observado que actúa como un regulador negativo de las vías de señalización del NF-κB y del interferón tipo I, por lo que parece presentar un papel regulador en la inmunidad innata (Cui et al., 2010; J. quan Wang et al., 2019). 130 En nuestro trabajo hemos estudiado los genes codificantes de proteínas que participan en esta cascada de señalización, tanto los receptores encargados de la formación del inflamasoma como las proteínas que forman el complejo y la cascada de señalización, pero también los receptores tipo toll (TLR, por sus siglas en inglés toll-like receptors) que participan en la preparación del inflamasoma, los receptores purinérgicos y los canales de panexinas, que se encuentran involucrados en la activación de algunos inflamasomas. Gracias a las diferentes estrategias empleadas para la búsqueda de variantes de interés hemos identificado diferentes cambios que podrían jugar un papel clave en la patogénesis de la EM. 5.5.1. Receptores purinérgicos y NOD2 Los receptores purinérgicos de la familia P2X, como el P2X7 y el P2X4, se han asociado con anterioridad a la patogénesis de la EM, dado que presentan un papel importante en la activación de determinados inflamasomas como el NLRP1 o el NLRP3. Estos receptores actúan como canales iónicos transmembrana activados por la unión de ATP extracelular y una vez activados permiten el paso selectivo de cationes de pequeño tamaño como Na+, K+ y Ca2+. El flujo que se genera es capaz de activar el inflamasoma (figura 5.2). El ATP se acumula en lugares de lesión y de inflamación y es una de las señales más importantes de peligro. Este tipo de receptores se encuentran involucrados en diferentes funciones como la transmisión sináptica, la contracción de músculos, la inflamación o el daño inflamatorio y neuropático (Domercq & Matute, 2019; Suurväli, Boudinot, Kanellopoulos, & Rüütel Boudinot, 2017). 131 Figura 5.2. Activación y señalización del inflamasoma NLRP1 en el SNC. Una alta concentración extracelular de ATP activa el receptor P2X4 provocando un flujo de K+. Altos niveles de K+ extracelular provocan la apertura del canal de panexina-1 que libera ATP de la célula, generando un aumento del ATP extracelular. Este incremento de ATP activa el receptor P2X7 que promueve la activación del inflamasoma (De Rivero Vaccari et al., 2014). Varios trabajos han asociado cambios en los genes codificantes de estos receptores con el riesgo de EM. En concreto, se han identificado variantes con ganancia de función que se relacionan con un mayor riesgo de la enfermedad, mientras que variantes detectadas con pérdida de función se relacionan con un efecto protector frente a la EM (Gu et al., 2015; Sadovnick et al., 2017). En nuestro trabajo hemos identificado variantes tanto en el P2RX7 como en el P2RX4, ambos localizados en el cromosoma 12, que se relacionan con la EM. Por un lado, hemos identificado una variante con un OR mayor de dos en el gen P2RX7, que se presentaba en tres pacientes con EM y un individuo no afecto. Esta variante corresponde al rs28360447 p.(Gly150Arg) y ha sido identificada previamente como una variante de pérdida de función. Variantes de pérdida de función como esta provocan que el receptor reduzca su respuesta a la señal del ATP (Roger et al., 2010). En trabajos realizados con el modelo de la EAE se ha observado que ratones deficientes en P2RX7 muestran una reducción de la incidencia de la enfermedad, con una menor activación astroglial y daño axonal que los ratones control (Sharp et al., 2008). Estos datos no parecen concordar con la forma de presentación de la variante rs28360447 en nuestra cohorte, ya que además de 132 presentarse en mayor frecuencia en pacientes con EM, la variante segregaba en una de estas familias con la EM, en la familia 22. Sin embargo, en un estudio de 2006 se muestra que ratones deficientes de P2RX7 son más susceptibles a la EAE, causada principalmente por una disminución de los linfocitos T en el cerebro (Chen & Brosnan, 2006). Los resultados contradictorios en estos estudios pueden deberse a la estrategia de recombinación utilizada en cada uno de ellos, ya que mientras unos utilizan el exón 5 del gen como diana para la recombinación, en el trabajo de 2006 emplean el exón 1. Por lo tanto, las diferencias observadas en los resultados podrían deberse a formas alternativas del P2RX7 o a la diferencia en las respuestas según el subtipo celular (Domercq, Zabala, & Matute, 2019; Sharp et al., 2008). Aun así, los trabajos que han estudiado la variante rs28360447 la catalogan como una variante de pérdida de función, por lo que este hallazgo, en nuestro trabajo, se deberá corroborar en estudios mayores y con trabajo de laboratorio para realizar un seguimiento de los pacientes y entender mejor esta relación observada. El receptor P2X7 es el que se encuentra más relacionado con la inmunidad y la inflamación y parece presentar un papel clave en el desarrollo de la enfermedad, por lo que es importante seguir estudiando variaciones en el gen P2RX7 (Domercq et al., 2019). El resto de cambios que hemos observado en este gen en nuestra cohorte no presentan ninguna relación con la EM en nuestro estudio, pero algunos de ellos han sido identificados previamente como posibles variantes de riesgo para la enfermedad. Este es el caso, por ejemplo, de la variante rs17525809, que provoca una reducción de la actividad del receptor. Asimismo, hemos identificado variantes que provocan una ganancia de función en el receptor, como son rs208294 y rs1718119 (Roger et al., 2010). Asimismo, en la misma familia que presenta la variante rs28360447 del gen P2RX7 hemos identificado dos variantes del gen P2RX4 que no se encuentran en ninguna otra familia. El P2RX4 es uno de los receptores purinérgicos más sensibles, hasta mil veces más que el receptor P2RX7 (Suurväli et al., 2017). Las variantes identificadas en nuestro estudio corresponden al rs28360472 p.(Tyr315Cys) y a una variante no descrita, localizada en las coordenadas genómicas chr12:121671347 p.(Gln388Lys). Ambas segregan con la EM en la familia 22. La variante rs28360472 está clasificada 133 como una variante de pérdida de función y ha sido relacionada con el riesgo de osteoporosis (Suurväli et al., 2017; Wesselius et al., 2013). Trabajos previos con familias con EM han permitido identificar variantes raras tanto en el P2RX7 como en el P2RX4 que alterarían la función de los receptores (Sadovnick et al., 2017; Zrzavy et al., 2019). Las tres variantes identificadas en los genes P2RX7 y P2RX4 son variantes raras por lo que se pone de manifiesto la importancia de este tipo de trabajos para ampliar el conocimiento de estos genes que parecen marcar un papel fundamental en la alteración del receptor. No obstante, también hay que tener en cuenta que algunos de los polimorfismos de estos genes se encuentran en desequilibrio de ligamiento entre ellos, lo que también dificulta establecer una asociación. A pesar de que las dos variantes descritas e identificadas en los genes P2RX7 y P2RX4 han mostrado alterar el papel del receptor disminuyendo su función principal como canal transmembrana, es importante destacar otros aspectos de estos receptores. El receptor P2X7 es el que se encuentra más relacionado con la inmunidad y la inflamación y se expresa en la gran mayoría de células del sistema inmune innato y adaptativo (Domercq et al., 2019). Sin embargo, a pesar de las funciones llevadas a cabo relacionadas con la inmunidad, se cree que puede tener un papel importante en ausencia del ATP y que presente otras funciones no inflamatorias en el SNC. Así, se ha observado que presenta actividad fagocítica y que los macrófagos, que presentan una alta expresión de este receptor, son capaces de fagocitar linfocitos apoptóticos y células neuronales. Aunque los polimorfismos identificados afectan a la permeabilidad del receptor, parece que no alteran esta otra función. Aun así, se ha observado una asociación entre el haplotipo formado por las variantes rs28360447 del gen P2RX7 y rs28360472 del P2RX4 y el riesgo de desarrollar EMPP ya que este haplotipo actuaría inhibiendo la actividad fagocítica mediada por el P2RX7. Los pacientes de la familia 22, en los que hemos hallado estas variantes segregando con la EM corresponden a un paciente con EMPP y a otro caso con EMRR. Dado que los macrófagos y la microglía se encargan de la degradación de los restos de mielina y neuroaxonales en las zonas de lesión desmielinizante, estos pacientes podrían tener una fagocitosis defectuosa dependiente de P2RX7. Aunque no se ha observado previamente una asociación entre este haplotipo y formas clínicas 134 distintas de EMPP, este haplotipo podría ser uno de los factores que hayan contribuido al desarrollo de la EM en estos pacientes (Gu & Wiley, 2018). Asimismo, la familia 22 es la que ha mostrado más variantes segregando con la EM. Además de las tres comentadas, los pacientes con EM de esta familia presentan la variante rs2066847 p.(Leu1007fs) del gen NOD2, localizado en el cromosoma 16. El NOD2 es uno de los receptores de la familia NLR, también llamada receptores tipo NOD (por sus siglas en inglés NOD-like receptors) y concretamente pertenece a la subfamilia NLRC que presentan un dominio de reclutamiento de caspasas (CARD). Este dominio permite la unión y la activación del receptor que interacciona con la quinasa serina-treonina 2 (RIP2, por sus siglas en inglés receptor-interacting serine/threonine kinase 2). El NOD2 actúa como un receptor de reconocimiento de patrones siendo capaz de reconocer productos bacterianos en el citoplasma del huésped. La activación de este receptor conlleva el reclutamiento de RIP2 que genera una cascada de señalización que termina con la activación del NF-κB, lo que provoca la transcripción de genes proinflamatorios entre los que se incluyen las citoquinas TNFα, IL-1β e IL-6 (Kufer & Sansonetti, 2011; Ranson & Eri, 2013). Por tanto, la activación del NOD2 forma parte de la respuesta de la inmunidad innata activando señales proinflamatorias y antimicrobianas. De este modo, alteraciones en el gen NOD2 se han relacionado con la enfermedad de Crohn, con el síndrome de Blau y con la sarcoidosis de inicio temprano (Caruso, Warner, Inohara, & Núñez, 2014; Kufer & Sansonetti, 2011; Negroni, Pierdomenico, Cucchiara, & Stronati, 2018; Song, Li, Tao, Luo, & Chen, 2020). La variante identificada en esta familia corresponde a una duplicación de una citosina que provoca una proteína truncada. No ha sido relacionada previamente con la EM, pero se ha considerado como un factor de riesgo para la enfermedad de Crohn. Este cambio se localiza en el dominio rico en repeticiones de leucinas que presenta funciones reguladoras y de reconocimiento del ligando. Así, se ha observado que alteraciones en este dominio pueden causar una menor respuesta del NOD2 ante determinados patógenos (Frade-Proud’hon-Clerc et al., 2019; Negroni et al., 2018; Ogura et al., 2001). En esta familia, por tanto, se observan diferentes variantes que pueden alterar la vía de señalización en diferentes puntos y, aunque aún queda por desentrañar el papel que confieren conjuntamente en la EM, dada su implicación en la inmunidad, parece 135 claro que juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad. Además, esta familia presenta la variante rs2230625 del gen TNFRSF8 que se ha mencionado anteriormente y que puede estar involucrada en una respuesta inmune alterada. 5.5.2. TLR10 Otra de las variantes identificadas que puede relacionarse con el desarrollo de la EM se encuentra en el gen TLR10. Tras realizar la búsqueda de variantes que se presentaran en homocigosis en mayor frecuencia en los pacientes con EM que en los individuos no afectos hemos identificado una única variante de esta vía de señalización. La variante corresponde al rs11466657 p.(Ile473Thr) del gen TLR10, localizado en el cromosoma 4, que se presentó únicamente en homocigosis en tres casos con EM. Al igual que sucede con otras variantes que hemos mencionado, esta tampoco se ha relacionado previamente con la EM, sin embargo, algunas alteraciones en este gen se han relacionado con la artritis reumatoide, la enfermedad tiroidea autoinmune y con cáncer, entre otros. El receptor TLR10 forma parte del grupo de receptores TLR encargados también del reconocimiento de patrones. Los TLR actúan como una de las primeras barreras de defensa reconociendo componentes bacterianos, fúngicos o virales en la superficie de las células presentadoras de antígenos. Su señalización promueve la activación del NF- κB lo que finaliza con una producción de quimioquinas y citoquinas proinflamatorias y moléculas de adhesión celular. En concreto, esta cascada de señalización incluye la síntesis de pro-IL-1β, una de las señales necesarias para la preparación de ciertos inflamasomas como el NLRP3. Asimismo, algunos de los TLR son los principales receptores encargados de la inducción de genes del interferón (IFN). Las distintas moléculas de IFN desencadenan cascadas de señalización que activan la transcripción de múltiples genes inducidos por IFN con funciones antivirales e inmunorreguladoras (Lester & Li, 2014). A diferencia de otros TLR, cuyos ligandos y actividad se conocen muy bien, el receptor TLR10 es bastante desconocido (De Rivero Vaccari et al., 2014; Oosting et al., 2014; Su et al., 2021; Torices et al., 2016; Xing et al., 2017). Uno de los avances que se han llevado a cabo con este receptor es que puede considerarse como el único de esta familia que presenta funciones activadoras e inhibitorias y, por tanto, determinados cambios en 136 el gen TLR10 pueden alterar el equilibrio entre las respuestas proinflamatoria y anti- inflamatoria (Oosting et al., 2014; Su et al., 2021). La variante rs11466657 identificada no ha presentado diferencias en su frecuencia en las familias estudiadas, pero su presencia en homocigosis únicamente en los pacientes con EM podría estar relacionada con la enfermedad. De los tres casos con EM que portan la variante en homocigosis, dos de ellos pertenecen a una misma familia de tipo B, la familia 12, de la cual dos individuos no afectos presentan la variante en heterocigosis y un familiar no afecto no porta la variante. El rs11466657 ha sido previamente relacionado con la artritis reumatoide y se ha sugerido que este cambio, presente en el dominio LRR, provoca la falta de la actividad inhibidora sobre el NF-κB, lo que se asocia con una enfermedad más severa. Aún no está claro el ligando que utiliza el receptor TLR10, pero parece que esta variante podría jugar un papel importante en este receptor en respuesta a estímulos inflamatorios (Torices et al., 2016). Además, dos de los casos con EM que portan la variante en homocigosis presentan la forma clínica EMPP, por lo que se podría pensar que esta variante afecta a la progresión de la enfermedad. No obstante, se necesita valorar esta relación en una población mayor para comprender mejor el papel de esta variante en la EM. Aunque aún se desconoce mucho sobre el TLR10, esta familia de receptores parece estar muy involucrada en la patogénesis de la enfermedad (Miranda-Hernandez & Baxter, 2013). 5.5.3. NLRP2 y NLRP11 Dentro de la familia de los receptores NLR, los que más se conocen son los que pertenecen a la subfamilia NLRP, que se caracterizan por presentar un dominio pirina (PYD) que permite el ensamblaje del inflamasoma y la unión a una proteína adaptadora (ASC o PYCARD) que es la encargada de promover la activación de la caspasa-1 (Kufer & Sansonetti, 2011; Negroni et al., 2018). Dentro de esta subfamilia de receptores hemos encontrado dos variantes correspondientes a los genes NLRP2 y NLRP11 segregando con la EM en una de las familias estudiadas, la familia 12. Ninguna de las dos variantes identificadas se ha asociado previamente con la EM o con otras enfermedades. 137 A diferencia del NOD2, que reconoce componentes bacterianos exógenos, el receptor NLRP2 parece responder a cambios de las proteínas homeostáticas debido a señales de peligro de moléculas como el ácido úrico (Masters, Simon, Aksentijevich, & Kastner, 2009). NLRP2 es uno de los inflamasomas reconocido por expresarse en el SNC. En concreto, el receptor NLRP2 se encuentra expresado en los astrocitos y se ha demostrado su activación mediante la interacción con el receptor P2X7 y la panexina-1. El bloqueo del receptor NLRP2 provoca una disminución de los niveles de caspasa-1, por lo que se considera que presenta una función crítica en la respuesta innata de estas células (Minkiewicz, de Rivero Vaccari, & Keane, 2013). Además, variantes en el gen NLRP2, localizado en el cromosoma 19, también se han relacionado con desórdenes inflamatorios como el síndrome Muckle-Wells. La variante que hemos identificado en NLRP2 corresponde al rs147804224 p.(Arg467Gln) y se encuentra localizada en el dominio NATCH. Se ha demostrado que el NLRP2 también presenta una función relacionada con la inhibición de la señalización del NF-κB y se ha sugerido que variantes en el dominio NACHT causan una disminución de esta función inhibitoria, lo que podría contribuir a una amplificación de las respuestas inflamatorias (Fontalba, Gutierrez, & Fernandez- Luna, 2007). NLRP2 también se ha relacionado con la vía de señalización del interferón tipo I. Los IFN, como se ha comentado, actúan como proteínas con funciones antivirales e inmunorreguladoras de modo que, determinadas variantes en este receptor podrían causar también una desregulación de la homeostasis inmune debido a una alteración en esta vía de señalización (Y. Yang et al., 2018). Por su parte, no se conoce tanta información del receptor NLRP11 y, hasta hace poco, se desconocían su señalización y su función. Los últimos trabajos han permitido identificar que el NLRP11 es un regulador negativo de la señalización de receptores TLR mediante la degradación del TRAF6 (C. Wu et al., 2017). De este modo, no se produce la activación de las respuestas del NF-κB y del IFN tipo I. El NLRP11 presenta, por tanto, funciones reguladoras de las respuestas inflamatorias. El gen NLRP11 también se localiza en el cromosoma 19 y alteraciones en el mismo se han relacionado con la enfermedad de Crohn y con la enfermedad inflamatoria intestinal. Así, parece evidente que este receptor presenta un papel inmunorregulador a pesar de no poseer, en un principio, funciones relacionadas con el inflamasoma (Ellwanger et al., 2018). La variante que hemos encontrado en la 138 familia 12 de nuestro estudio corresponde al rs76935241 p.(Arg32Cys) localizado en el dominio pirina de la proteína. Es difícil interpretar las consecuencias que pueden tener las variantes localizadas en este dominio, debido a que la represión de la señalización del NF-κB y del IFN se produce mediante el dominio LRR y aún son necesarios más estudios para avanzar en el conocimiento del papel del NLRP11. 5.5.4. NLRP6 e IFI16 En nuestro estudio hemos identificado otra familia que presenta dos variantes de los genes NLRP6 e IFI16 segregando con la EM. Estas dos variantes se encuentran en la familia tres y segregan con la EM y con otra AID, presente en un familiar y correspondiente al hipotiroidismo. El receptor NLRP6, codificado por el gen con el mismo nombre, presenta, hoy en día, funciones aún desconocidas. Sin embargo, se conoce que tiene capacidad para la formación del inflamasoma, por lo que se cree que posee un papel relevante en diferentes enfermedades inflamatorias. La estimulación del NLRP6 y el ensamblaje del inflamasoma han demostrado activar la caspasa-1 y el NF-κB en estudios in vitro. Asimismo, también se ha demostrado que el inflamasoma formado por el NLRP6 es capaz de controlar la señalización del NF- κB, ejerciendo efectos inflamatorios o antiinflamatorios según las condiciones fisiológicas (D. Zheng, Kern, & Elinav, 2021). El NLRP6 se encuentra altamente expresado en las células epiteliales del colon por lo que sus funciones han sido relacionadas con la regulación de la homeostasis intestinal, pero también ha revelado tener un papel importante en la neuroinflamación. De este modo, se ha observado que ratones deficientes en NLRP6 podrían presentar una inflamación aumentada, que retrasaría la recuperación de una lesión nerviosa (Ghimire, Paudel, Jin, & Jeyaseelan, 2020). Previamente se han identificado variantes del NLRP6 en familias con varios miembros con EM, sin embargo, no se ha podido establecer una relación entre estas y la enfermedad (Popplewell et al., 2020). En nuestro trabajo hemos identificado la variante rs772833407 p.(Gly699Ala) en el gen NLRP6, localizado en el cromosoma 11, la cual no ha sido relacionado con la EM ni con otras enfermedades con anterioridad. Al igual que sucede con la variante identificada en el NLRP11, aún quedan funciones por conocer del NLRP6 y es difícil establecer una relación entre la variante y la EM. No obstante, queda claro que este receptor juega un papel 139 importante en la inflamación, por lo que son necesarios más trabajos para conocer su función en la patogénesis de la EM. Por su parte, el gen IFI16 (interferon-γ-inducible factor 16), localizado en el cromosoma 1, codifica un receptor involucrado en la detección de ADN de doble cadena. Al igual que los receptores NLR, este también es capaz de formar un inflamasoma; sin embargo, el receptor IFI16 pertenece a la familia de proteínas nucleares inducibles por interferón (PYHIN, por sus siglas en inglés haematopoietic interferon-inducible nuclear protein). Su estructura está formada por un dominio PYD N-terminal y dos dominos HIN200. Al igual que la subfamilia de receptores NLRP, este grupo también es capaz de reclutar la molécula adaptadora ASC, que es la que posteriormente se une a la procaspasa-1 tras un estímulo. Por lo tanto, IFI16 también se encarga de la activación de la caspasa 1 para la maduración de la IL-1β y la IL-18. Este receptor es capaz de detectar ADN de doble cadena a través del domino HIN200, lo que conlleva la cascada de señalización mencionada (Ranson & Eri, 2013; Unterholzner et al., 2010). Asimismo, además de la formación del inflamasoma, el receptor IFI16 también es capaz de estimular la expresión del IFN-β mediante una cascada de señalización en la que se produce la activación del factor regulatorio del IFN 3 (IRF3) y el NF-κB (Dunphy et al., 2018; Ling Wang & Ning, 2017). Además, el IFI16 presenta efectos inhibitorios sobre el inflamasoma AIM2 (por sus siglas en inglés absent In melanoma 2), el otro receptor perteneciente a la familia PYHIN y también con capacidad de detección de moléculas de ADN de doble cadena (P. Wang et al., 2018). El gen IFI16 se ha relacionado con otras enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico, por lo que podría presentar un papel relevante en la EM. Además, dado que uno de los factores ambientales en la EM es la infección por el virus Epstein-Barr, este podría ser un nexo de relación con el receptor IFI16, ya que se ha demostrado que es capaz de reconocer el virus y promover la formación del inflamasoma. No obstante, a día de hoy, no se han identificado variantes del IFI16 relacionadas con la EM (Guerini et al., 2014). En nuestro trabajo, como se ha comentado, hemos identificado una variante, el rs116270651 p.(Ala93Thr), que se encuentra en la familia tres segregando tanto con la EM como con el hipotiroidismo, presente en uno de los familiares. Aunque no hay datos sobre esta variante ni su efecto en el gen, podría ser de importancia para el desarrollo de la EM. Del mismo modo que sucede con otras 140 familias mencionadas, la presencia conjunta de estas dos variantes en los genes NLRP6 e IFI16 podría ser de interés para la patogénesis de la enfermedad. 5.5.5. MEFV Por último, queremos discutir el posible papel del gen MEFV en la EM. Como se ha comentado en apartados previos, las alteraciones descritas en este gen se asocian principalmente a la FMF, una enfermedad autosómica recesiva, en la que también se han descrito variantes en el gen TNFRSF1A. Al igual que sucedía con el síndrome TRAPS, la FMF también se ha desarrollado en pacientes con EM, lo que ha llevado a investigar el papel del gen MEFV en esta enfermedad (Pauwels, Cosemans, Boonen, Dubois, & Goris, 2013). La FMF es más prevalente en la cuenca del Mediterráneo oriental y en Oriente Medio, aunque también se han presentado casos en Grecia, Italia o España. El gen MEFV se encuentra en el cromosoma 16 y codifica una proteína denominada pirina, también llamada marenostrina, que actúa como reguladora de la inmunidad innata, ya que es capaz de desencadenar la formación del inflamasoma y, por tanto, controlar la producción de la IL-1β y la IL-6 y modular procesos inflamatorios (Elhani et al., 2021; Masters et al., 2016). En la FMF se cree que las variantes en MEFV causan una producción excesiva de la citoquina proinflamatoria IL-1β, lo que se traduce en un incremento de la inflamación. Por esto, se podría pensar que variantes en este gen también podrían generar susceptibilidad a la EM debido a este aumento de la inflamación (Kümpfel et al., 2012). De este modo, se ha observado, en estudios realizados con el modelo de EAE, que la microglía con un fenotipo proinflamatorio es la responsable de un estado neuroinflamatorio global que se caracteriza por la producción de altos niveles de IL- 1β e IL-6 y por la destrucción de la mielina. Además, se ha demostrado que la IL-1β favorece la inducción de las células Th17 en la EM y que pacientes con la enfermedad presentan un aumento de esta citoquina tanto en el suero como en el LCR, lo que correlaciona con la severidad de la EM (Elhani et al., 2021). Debido al papel del MEFV en la inmunidad innata y a la coexistencia de la EM y la FMF observada en pacientes, muchos trabajos han intentado establecer la relación entre el gen MEFV y la EM. Una de las variantes que se han estudiado con anterioridad es la rs3743930 p.(Glu148Gln), una de las más comunes asociadas con FMF. Aunque su estudio no detectó diferencias significativas en la frecuencia de esta 141 variante frente al grupo control, este cambio se observó en varias familias segregando con la enfermedad, de modo que la variante podría ser una candidata de riesgo para la EM (Kümpfel et al., 2012). En nuestra cohorte hemos identificado esta variante en 4 (7,69%) pacientes con EM, 1 (5,26%) caso con otra AID y 5 (7,46%) individuos no afectos, pertenecientes a 5 familias de tipo A. Los pacientes con EM que portaban la variante formaban parte de dos familias, con dos casos cada una de ellas. En ambas familias se presentaban individuos no afectos con la variante, de modo que en nuestro trabajo no hemos observado una segregación de la variante con la enfermedad ni diferencias en cuanto a la frecuencia en los distintos grupos. Aun así, hemos identificado otra variante que ya ha sido asociada previamente con la EM, el rs104895094 p.(Lys695Arg). Sin embargo, esta variante solo se muestra en dos individuos no afectos por lo que no podemos establecer ninguna asociación. Asimismo, aunque se ha asociado previamente con una evolución más severa de la enfermedad, son pocos los pacientes con EM en los que se ha identificado esta variante, por tanto será necesario realizar más estudios para conocer su implicación en la enfermedad (Kümpfel et al., 2012). También se han estudiado otras variantes de este gen en diferentes trabajos, entre ellas las M694V, M694I, V726A, M680I y E148Q. Esta última es la correspondiente al cambio p.Glu148Gln mencionado previamente. Estas variantes han sido identificadas en una mayor frecuencia en pacientes con EM que en la población control. Igualmente, los pacientes que las portaban presentaban una evolución más progresiva de la enfermedad (Unal, Dursun, Emre, Tascilar, & Ankarali, 2010; Yigit, Karakus, Kurt, & Ates, 2013). El riesgo de desarrollar EM también se ha estudiado en niños que desarrollan la enfermedad y se ha observado que estos pacientes presentan una proporción mayor de variantes en el MEFV que los pacientes adultos con EM, lo que sugiere que las alteraciones en este gen podría contribuir al desarrollo de la EM en la niñez (Blaschek et al., 2018). Estas observaciones sugieren que determinadas variantes en este gen podrían incrementar el riesgo de desarrollar EM. Aunque en nuestra cohorte no hemos observado ninguna de estas variantes mencionadas anteriormente, hemos encontrado otro cambio que corresponde a una de las variantes patogénicas más comunes del gen MEFV asociadas con la FMF 142 (Arakelov, Arakelov, & Nazaryan, 2018; Salehzadeh et al., 2020). Esta variante corresponde al rs61732874 p.(Ala744Ser) y se encuentra en un paciente con EM y un paciente con otra AID de una misma familia del tipo B. Sin embargo, el resto de pacientes con EM de la misma familia no presentan esta variante, por lo que tampoco podemos establecer una relación con la EM. Aunque se han observado asociaciones descritas con la EM, los resultados son controvertidos ya que algunos trabajos no han encontrado relación entre variantes del gen MEFV y la enfermedad (Pauwels et al., 2013; Terzi, Taskin, Unal Akdemir, Bagci, & Onar, 2015). A pesar de los esfuerzos por estudiar la relación de este gen con la EM y de la implicación observada de la IL-1β en la patogénesis de la enfermedad, la frecuencia de pacientes con EM que presentan variantes en este gen es baja y la coexistencia de la FMF y la EM es poco frecuente (Elhani et al., 2021), lo que dificulta establecer una relación de riesgo entre el gen MEFV y la EM. 5.6. Comparación entre la EM familiar y a la EM esporádica Desde hace años se estudian las diferencias entre la EM esporádica y la EM familiar. Aunque no son independientes una de la otra, se han realizado distintos estudios para tratar de abordar las diferencias entre las formas esporádicas y familiares. De este modo, gran parte de los autores han centrado el análisis de las diferencias en las manifestaciones clínicas de la enfermedad. A pesar de no haberse encontrado diferencias demográficas o clínicas en algunos de los trabajos (Ceccarelli, Mifsud, & Dogar, 2020), otros autores señalan distintas formas de presentación de algunos aspectos clínicos. Así, por ejemplo, se ha observado que pacientes con EM familiar presentan una distribución distinta de las lesiones observadas en el cerebro frente a pacientes con EM esporádica (Katsavos et al., 2018). De igual modo, se ha evidenciado que los casos con EM familiar presentan una mayor frecuencia de la forma EMRR que de formas progresivas respecto a los casos con EM esporádica (Steenhof et al., 2019). Muchos trabajos se han centrado fundamentalmente en la búsqueda de diferencias en los patrones de presentación de aspectos clínicos entre casos familiares y esporádicos y pocos son los trabajos que han estudiado estas diferencias desde el 143 punto de vista genético. Uno de estos estudios concluye que los perfiles inmunogenéticos de alelos correspondientes al gen HLA-DRB1 podrían ser distintos y que, del mismo modo, se podrían observar diferencias correspondientes a genes no-HLA entre casos familiares y esporádicos (Katsavos et al., 2019). Asimismo, los probandos pertenecientes a familias con varios miembros con EM presentan una mayor carga genética que los probandos de familias con un único paciente afecto debido a una mayor agregación de variantes de susceptibilidad para la EM (Gourraud et al., 2011). Aunque en la actualidad es difícil señalar diferencias genéticas entre los pacientes familiares y esporádicos, más allá de una mayor agregación de potenciales variantes en los casos familiares, algunos genes se han asociado con anterioridad a la EM esporádica mientras que no se ha encontrado relación con pacientes de formas familiares. Este es el caso de uno de los genes estudiados en este trabajo: el gen CIITA. Este gen, localizado en el cromosoma 16, codifica el transactivador del CMH clase II, un factor de transcripción encargado de la regulación del gen involucrado en la presentación de antígenos del CMH clase II. Determinados polimorfismos de este gen se han relacionado con el riesgo de desarrollar EM (Bronson et al., 2010; Gyllenberg et al., 2014; Pereira et al., 2019). Sin embargo, en nuestro estudio no hemos observado ninguna relevancia respecto a alteraciones en este gen. A pesar de que es necesario un mayor tamaño muestral para validar los resultados obtenidos en este trabajo, la ausencia de alteraciones en el gen CIITA en nuestro estudio podría deberse a que las asociaciones observadas en trabajos previos se relacionan con pacientes con EM esporádica. Son necesarios más trabajos desde el punto de vista genético para conocer las diferencias de los factores genéticos entre la EM familiar y la EM esporádica. 5.7. Consideraciones finales y perspectivas futuras Son pocos los estudios realizados hasta hoy que busquen conocer la heredabilidad perdida de la EM que no se ha podido detectar mediante los GWAS. Gracias a los nuevos avances y metodologías, hoy en día se pueden realizar distintos abordajes para maximizar el conocimiento sobre la enfermedad. La implementación de la WES 144 para el estudio genético de la EM ha permitido, en los últimos años, identificar variantes raras que hasta ahora pasaban desapercibidas. Además, la agregación de pacientes afectos en familias nos puede ayudar a identificar los factores comunes relacionados con la enfermedad. Es por ello que la aplicación de la WES ya ha sido desarrollada previamente en varios estudios con familias con el objetivo de identificar variantes relacionadas con la EM. En la tabla 5.2 se pueden identificar los principales trabajos con esclerosis múltiple familiar realizados hasta ahora mediante esta tecnología. Tabla 5.2. Principales estudios realizados con anterioridad mediante WES en familias con esclerosis múltiple. Referencia Población de estudio Resultados principales Ramagopalan et al., 2011 43 familias con 4 casos con EM o más. Identificación de una variante rara en el gen CYP27B1. Dyment et al., 2012 Una familia con 15 casos con EM. Caracterización de una variante novel en el gen TYK2. Z. Wang et al., 2016 Familias con varios casos de EM y una serie de casos-control correspondiente a 2.053 pacientes con EM y 799 individuos sanos no relacionados. Identificación de una variante rara en el gen NR1H3 que puede estar relacionada con formas progresivas de EM. Traboulsee et al., 2017 270 pacientes con EM de los cuales 170 presentaban historia familiar de la enfermedad. Identificación de siete variantes raras en seis genes segregando con la enfermedad en familias con al menos dos miembros afectos. Los genes identificados estaban relacionados con desórdenes mendelianos con fenotipos que incluyen similitudes con la EM. 145 Maver et al., 2017 Estudio de una familia con EM y melanoma maligno. Búsqueda de variantes patogénicas en 38 pacientes con historia familiar de EM, 44 pacientes con EM esporádica y 92 controles. Identificación de una variante rara del gen NLRP1 en la familia con EM y melanoma maligno. Se identificaron cinco variantes potencialmente dañinas de NLRP1 en casos familiares de EM. Ziliotto et al., 2019 WES en tres familias con EM y validación de los resultados en 120 pacientes con EM no relacionados. Se seleccionaron nueve potenciales variantes en las familias estudiadas y se genotiparon en el resto de la serie. Identificación de variantes raras del gen C6orf10 relacionadas con al EM. Mescheriakova et al., 2019 WES en una familia con 11 casos con EM y validación de variantes candidatas en 591 pacientes con EM y 3.169 controles. Una variante rara del FKBP6 segregaba con la EM pero no se encontró una asociación en la cohorte independiente estudiada. Vilariño-Güell et al., 2019 WES en 34 familias con EM y validación de variantes candidatas en muestras adicionales. Identificación de variantes probablemente patogénicas en 12 genes involucrados en el sistema inmune innato. Zrzavy et al., 2020 Cuatro familias con EM. No se seleccionó ninguna variante como causal en ninguna de las familias. Identificación de genes con potencial relacionado con la EM. La realización de estudios genéticos en familias con varios miembros con EM ha permitido identificar variantes raras en genes implicados en la patogénesis de la enfermedad. Nuestro trabajo, realizado con 23 familias con al menos dos miembros afectos de EM, también nos ha permitido identificar variantes genéticas candidatas de posible relación con la EM, gracias a las distintas estrategias empleadas para la búsqueda de variantes de interés. Los genes estudiados corresponden a tres vías de señalización que han mostrado con anterioridad una fuerte relación con la EM. Tras analizar los diferentes datos de estas variantes genéticas podemos destacar el posible efecto en la enfermedad de algunas de ellas, que se corresponden a las situadas en los genes: METTL21B perteneciente a la vía metabólica de la vitamina D; TNFRSF1A, TNFRSF19, NFKB1, TNFRSF8 y TNFAIP6 correspondientes a la vía de 146 señalización del factor de necrosis tumoral y P2RX7, P2RX4, NOD2, TLR10, NLRP2, NLRP11, NLRP6 e IFI16 involucrados en la vía de señalización del inflamasoma. Seis de las familias estudiadas en este trabajo presentaban alguna variante de los genes mencionados segregando con la EM. Además, cinco de estas familias portaban más de una variante. Como se ha comentado anteriormente hay que tener en cuenta que las variantes identificadas pueden estar relacionadas con la EM familiar, pero no así con la forma esporádica. Asimismo, algunos genes y variantes identificados por estar asociados con la EM también se han relacionado con otras enfermedades autoinmunes. En este trabajo podemos ver que algunas de las variantes candidatas segregan con la EM y con otras enfermedades autoinmunes, lo que implica que estas variantes no sean específicas de la EM y que deben tenerse en cuenta otros factores para el desarrollo de la misma. La WES ha permitido en este trabajo la identificación de variantes raras en genes pertenecientes a vías se señalización relacionadas con la inmunidad innata, confirmando el papel relevante de las mismas en procesos críticos de la EM. Por ello, para corroborar el papel de estas variantes genéticas en la enfermedad, será necesario realizar una validación de las mismas, comprobar estos resultados en un mayor número de familias y realizar trabajo experimental que permita conocer la patogenicidad de las variantes y los genes identificados. Además, como se ha mencionado, es importante tener en cuenta que la EM es una enfermedad influenciada también por factores ambientales y epigenéticos que deben valorarse para conocer el efecto real de cada una de las variantes identificadas. Sin duda, estos hallazgos señalan el papel esencial que juega la inmunidad innata en la EM y nos ofrecen conocimiento sobre nuevos genes y variantes que hasta ahora no habían sido relacionados y que pueden conducir a largo plazo a una mejor atención de los pacientes, tanto en su evolución como en la elección de un determinado tratamiento. 147 5.8. Limitaciones Este trabajo presenta varias limitaciones que deben tenerse en cuenta para la valoración de los resultados. En primer lugar, el tamaño muestral utilizado es reducido, lo que debilita el poder estadístico del estudio. Asimismo, el grupo de pacientes con EM es pequeño dificultando la identificación de variantes genéticas relacionadas con la enfermedad. Debido a ello, como se ha comentado con anterioridad, es necesario la replicación de estos resultados en poblaciones de estudio mayores para garantizar la relación de los hallazgos con la enfermedad. De igual modo, para verificar la calidad de los resultados obtenidos se deberán validar las variantes identificadas con otra técnica como la secuenciación por Sanger. Dado que en nuestro trabajo no se realizó esta validación, se emplearon varios filtrados de calidad y herramientas como el IGV que permitieran obtener unos resultados más fiables. Una de las desventajas de este estudio familiar es que se incluyeron familiares que no presentaban historia clínica ni resonancia magnética realizada en nuestro servicio. Esto ha podido conllevar la inclusión de individuos clasificados como no afectos que presentaran alguna lesión o criterio clínico que impidiera agruparlos como tal. Aun así, como se ha explicado durante este trabajo, todos los individuos participantes fueron evaluados mediante un cuestionario con el fin de minimizar esta problemática. Asimismo, el hecho de emplear como controles a los individuos no afectos de las familias puede suponer un sesgo en el análisis de los resultados, ya que los individuos comparten un componente genético. Para ello, el análisis estadístico empleado durante este trabajo se realizó con programas que tienen en cuenta este sesgo para la identificación de variantes relacionadas con la enfermedad. Por otro lado, respecto a la metodología de secuenciación, esta se ha realizado con la tecnología Ion Torrent™ que presenta una serie de desventajas frente a otras tecnologías más empleadas hoy en día, como Illumina. La tecnología Ion Torrent™ presenta ciertos errores durante el proceso de secuenciación. Debido al mecanismo de detección de la señal, la inserción de varias bases idénticas genera una imprecisión en la detección de la longitud de las repeticiones de estos 148 homopolímeros de un solo nucleótido. Por lo tanto, la secuencia generada no concuerda con la secuencia de referencia y puede generar errores en la detección de variaciones genómicas. Además, se generan con frecuencia errores tipo indels, que en determinadas ocasiones son generados tras la presencia de estos homopolímeros (Feng et al., 2016; Marine et al., 2019). Otro de los inconvenientes de la tecnología de secuenciación de Ion Torrent™ viene ligado con el análisis de los datos. A diferencia de Illumina, que permite realizar un análisis de los datos adecuado con softwares libres, Thermo Fisher Scientific, la compañía de Ion Torrent™, ha desarrollado herramientas propias para el análisis de sus datos que requieren una licencia para su uso. Aunque estos programas están diseñados para minimizar los errores producidos durante la secuenciación, es difícil poder recurrir a ellos, por lo que los resultados que se obtienen con softwares libres no son tan óptimos en comparación con el software propio de la compañía. Con el fin de reducir la posibilidad de realizar una interpretación errónea, el análisis primario y secundario de los datos fue desarrollado por la plataforma propia de Thermo Fisher Scientific. De este modo, se eliminaron errores que no obstaculizaron el pipeline desarrollado para el análisis terciario de los datos. Al margen de la tecnología de secuenciación empleada, una de las desventajas que presenta la WES es el hecho de que se obtiene poca uniformidad en la cobertura de las regiones capturadas. Esto provoca que haya regiones con muy baja cobertura que no se hayan podido detectar y, por tanto, que no se haya podido realizar la identificación de variantes en estas regiones (Q. Wang, Shashikant, Jensen, Altman, & Girirajan, 2017). De igual modo, la cobertura observada en nuestro trabajo, alrededor del 60% para regiones mayores de 20X, es baja teniendo en cuenta los resultados de cobertura que se pueden obtener hoy en día. 149 6. Conclusiones A partir de los resultados obtenidos y tras su comparación con la literatura previa, se ha llegado a las siguientes conclusiones: 1. La secuenciación de exoma ha permitido identificar variantes genéticas nuevas y variantes genéticas previamente descritas y relacionadas con la esclerosis múltiple. Las variantes genéticas identificadas como candidatas son variantes raras que podrían explicar parte del componente genético de la EM. 2. La alteración genética de los genes involucrados en vías de señalización relacionadas con la inmunidad innata está relacionada con el riesgo de desarrollar EM. De igual modo, se obtuvieron las siguientes conclusiones secundarias: 1. La secuenciación completa de exoma es una herramienta útil para la identificación de potenciales factores genéticos en enfermedades complejas como la esclerosis múltiple. 2. El estudio de familias con varios individuos afectos permite la identificación de factores genéticos involucrados en la patogénesis de la EM. 3. La puesta a punto del flujo bioinformático de trabajo llevado a cabo en este estudio ha permitido la identificación de variantes y genes de interés mediante distintas estrategias de trabajo que pueden ser empleadas en futuros estudios relacionados. 4. La presencia de varias variantes genéticas segregando con la esclerosis múltiple en una misma familia subraya la complejidad de la enfermedad y la importancia de la presencia de varios factores para el desarrollo de la EM. 150 5. Las variantes genéticas identificadas podrían explicar parte de la susceptibilidad a la EM familiar, pero no así a la EM esporádica. 6. La mayor prevalencia de enfermedades autoinmunes en estas familias y la segregación de variantes genéticas con la EM y con otras AIDs sugiere la existencia de una base genética común relacionada con la inmunidad entre estas enfermedades. 7. Es imprescindible la validación de las variantes identificadas potencialmente relacionadas con la esclerosis múltiple, así como la replicación de estos hallazgos en poblaciones mayores y el estudio de la posible patogenicidad de las variantes mediante experimentos funcionales, teniendo en cuenta siempre el efecto de los factores ambientales y epigenéticos. 151 Resumen Secuenciación masiva de exoma en Esclerosis Múltiple familiar Introducción La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad compleja y heterogénea que se caracteriza por la influencia de diferentes factores, como son genéticos, ambientales y epigenéticos. Gracias a los estudios realizados hasta la fecha se han identificado variantes genéticas y genes que están involucrados con el riesgo de desarrollar EM. Los estudios que han permitido conocer gran parte de la información genética conocida son los estudios de asociación del genoma completo (GWAS). La gran parte de las variantes de riesgo identificadas se encuentran en genes que pertenecen a vías de señalización relacionadas con la inmunidad. En concreto, muchos de las variantes y genes de interés pertenecen a vías de señalización relacionadas con la inmunidad innata. A pesar del éxito de los GWAS, estos estudios presentan diferentes sesgos que solo han permitido conocer una parte del componente genético de la enfermedad. La secuenciación completa de exoma (WES) es una técnica que permite profundizar en el conocimiento del componente genético de la EM mediante la secuenciación de la región codificante de todo el genoma. Los pacientes con EM, al igual que en otras enfermedades autoinmunes (AID), tienden a agruparse en familias, por lo que el estudio de estas familias es especialmente interesante para conocer las bases genéticas de la enfermedad. 152 El objetivo de este estudio fue llevar a cabo la secuenciación completa de exoma en familias con al menos dos miembros afectos por la enfermedad y analizar los genes involucrados en vías de señalización relacionadas con la inmunidad innata. Materiales y métodos Se incluyeron 23 familias con al menos dos miembros afectos de EM, de la misma o distinta generación. Con el fin de evaluar a los pacientes y a sus familiares se desarrolló un protocolo para recopilar datos demográficos y clínicos de cada uno de los participantes. Asimismo, se prestó especial atención a la presencia de otras enfermedades autoinmunes dentro de la familia. De este modo, la cohorte de familias se dividió en tres grupos, pacientes con EM, casos con otras AID distintas de la EM e individuos no afectos. Se realizó la secuenciación completa de exoma a todos los individuos incluidos en el estudio y se desarrolló un flujo bioinformático para el análisis de genes involucrados en las vías de señalización correspondientes a la vitamina D, el factor de necrosis tumoral y el inflamasoma. Se realizó una priorización bioinformática bajo criterios específicos para la identificación de variantes potencialmente relacionadas con la EM. Asimismo, se realizó un análisis estadístico con los softwares PLINK y MQLS-XM para la identificación de variantes asociadas con la enfermedad. Resultados En total se incluyeron 138 individuos pertenecientes a 23 familias, clasificados en 52 (37,70%) pacientes con EM, 19 (13,80%) individuos con otra AID distinta de la EM y 67 (48,60%) familiares no afectos. A su vez, las familias fueron clasificadas en 14 (60,10%) familias cuyos individuos afectos con EM se encontraban en la misma generación, denominadas como familias de tipo A, y 9 (39,10%) familias cuyos individuos afectos con EM se presentaban en dos o más generaciones distintas, nombradas como familias tipo B. Se estudiaron 144 genes involucrados en vías de señalización de la inmunidad innata y tras el procesamiento de los datos de identificaron 888 SNP en regiones exónicas, de los cuales 471 correspondían a variantes no sinónimas. Ninguna de las 153 variantes estudiadas presentó resultados significativos al comparar las frecuencias alélicas entre los grupos. Sin embargo, se prestó especial atención a aquellas variantes con valores de Odds Ratios (OR) mayor de 2, entre las que se identificaron variantes de los genes TNFRSF8, TNFRSF19 y P2RX7. Por otro lado, se observaron dos variantes en los genes TNFAIP6 y TLR10 que se presentaron en homocigosis únicamente en pacientes con EM. Por último, con el objetivo de no eliminar variantes de interés se estudió la segregación familiar de las mismas. Esto permitió la identificación de variantes en las tres vías de señalización estudiadas que segregaban con la EM. Los genes fueron METTL21B, LRP2, TNFRSF1A, TNFRSF19, NFKB1, TNFRSF8, IFI16, NLRP6, P2RX4, P2RX7, NOD2, NLRP2 y NLRP11. En total, de las 23 familias estudiadas, 13 (56,52%) presentaban una relación con una potencial variante de interés. Discusión Este es de los pocos trabajos que se han realizado hasta ahora mediante el estudio de familias con varios individuos afectos con EM. Este estudio ha permitido la identificación de potenciales genes y variantes genéticas relacionadas con la EM que no habían sido relacionadas hasta ahora. La secuenciación completa de exoma ha facilitado la identificación de variantes genéticas candidatas que no son posibles de identificar mediante otros abordajes como los GWAS. Estas alteraciones pertenecen a variantes de baja frecuencia o raras involucradas en vías de señalización relacionadas con la inmunidad innata, que permiten profundizar en el conocimiento del componente genético de la EM. Asimismo, el estudio de familias ha posibilitado la identificación de gran parte de las variantes mediante la segregación familiar. Una alteración genética en varios puntos de una misma vía de señalización sugiere la importancia de la presencia de varios factores para el desarrollo de la enfermedad. El conocimiento de la afectación de estas vías de señalización puede ayudar a futuras investigaciones en la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas. Las variantes identificadas en este trabajo pueden estar involucradas con el riesgo de desarrollar EM familiar y no encontrarse relacionadas con los casos de EM esporádica. Asimismo, es importante destacar la asociación de otras enfermedades 154 autoinmunes en estas familias y la presencia de variantes genéticas segregando tanto con la EM como con otras AID, lo que sugiere que estas enfermedades presentan una base genética común. Conclusiones La secuenciación completa de exoma ha permitido la identificación de nuevas variantes genéticas que son potenciales de estar relacionadas con la EM y que ayudan a profundizar en el conocimiento de la enfermedad. Los hallazgos obtenidos recalcan la importancia de genes involucrados en vías de señalización relacionadas con la inmunidad innata en el desarrollo de la EM. Palabras clave: esclerosis múltiple familiar, secuenciación completa de exoma, inmunidad innata, vitamina D, TNF, inflamasoma 155 Abstract Whole-exome sequencing in familial multiple sclerosis Introduction Multiple sclerosis (MS) is a complex and heterogeneous disease, characterized by genetics, environmental and epigenetics factors. Several genes and genetic variants involved with the risk of developing MS have been identified. The majority of this known information has been detected by genome-wide association studies (GWAS). Many of the identified variants are located in genes implicated in pathways related to innate immunity. Despite the success of GWAS, these studies have only revealed part of the genetic component of MS due to different biases involved in these studies. Whole-exome sequencing (WES) is a technique which sequences the coding region of the entire genome allowing us to improve our knowledge of genetic basis of MS. Patients with MS, as other autoimmune diseases (AID), tend to be clustered in families. Therefore, the study of this type of families is especially interesting in order to know the genetic component of MS. The aim of the study was conducting WES in families with at least 2 affected members with MS and analyze the genes involved in pathways related to innate immunity. Material and methods 23 families with at least two MS patients were included in the study. A protocol with demographic and clinical information was used in each participant in order to 156 evaluate all patients and family members. Besides, special attention was also paid to the presence of other AID within the family. Likewise, all participants were classified in three groups, MS patients, cases with other AID different from MS and unaffected individuals. Whole-exome sequencing was performed in each participant of the study and a bioinformatics pipeline was developed for the analysis of genes involved in pathways corresponding to vitamin D, tumor necrosis factor and inflammasome. In addition, a bioinformatics prioritization under specific criteria was performed for the identification of variants potentially related to MS. Moreover, a statistical analysis was performed with PLINK and MQLS-XM softwares for the identification of variants involved in the disease. Results Our study included 138 individuals belonging to 23 families. Participants were classified into 52 (37.70%) MS patients, 19 (13.80%) cases with other AID different from MS and 67 (48.60%) unaffected individuals. Likewise, families were classified into 14 (60.10%) families, in which MS affected individuals belonged to the same generation, referred as type A families, and 9 (39.10%) families, in which MS patients were distributed in two or more different generations, referred as type B families. A total of 144 genes involved in signaling pathways of innate immunity were studied. After data processing, 888 SNPs were identified in exonic regions and 471 SNPs corresponded to nonsynonymous variants. None of the variants studied showed significant results when comparing allelic frequencies between groups. However, special attention was paid to those with Odds Ratio (OR) values greater than 2. These variants belonged to TNFRSF8, TNFRSF19 and P2RX7 genes. In addition, only two variants were identified in homozygosis in MS patients but not in all other individuals. These variants were located in TNFAIP6 and TLR10 genes. Finally, familial segregation was studied with the aim of keeping variants of interest. This allowed to identify variants segregating with MS in all of the signaling pathways studied. The identified genes were METTL21B, LRP2, TNFRSF1A, TNFRSF19, NFKB1, 157 TNFRSF8, IFI16, NLRP6, P2RX4, P2RX7, NOD2, NLRP2 and NLRP11. In total, 13 (56.52%) of all families showed relation with a variant of interest. Discussion This is one of the few studies that have been performed studying families with several MS affected individuals. This study has allowed the identification of potential genes and genetic variants related with MS which had not been previously linked. Whole-exome sequencing has provided the identification of candidate genetic variants that cannot be identified by other approaches such as GWAS. These alterations correspond to rare variants involved in pathways related to innate immunity which allow us a deeper understanding of the genetic basis of MS. Besides, this familial study has facilitated the identification of most of the potential variants through familial segregation. A genetic alteration at several points of the same signaling pathway suggests the importance of the presence of several factors for the development of MS. The knowledge of these alterations in innate immunity pathways may help to search new therapeutic targets in future researches. The variants identified in this work may be involved in the risk of developing familial MS but not in sporadic MS. It is also important to highlight the association of other autoimmune diseases in these families and the presence of genetic variants segregating with both MS and other AID, suggesting that these diseases have a common genetic basis. Conclusions Whole-exome sequencing has allowed the identification of new genetic variants that are potentially related to MS and help to deepen the understanding of the disease. The findings of this study emphasize the relevance of genes involved in signaling pathways related to innate immunity in the development of MS. Keywords: familial multiple sclerosis, whole-exome sequencing, innate immunity, vitamin D, TNF, inflammasome. 158 Bibliografía AARDA. (n.d.). Autoimmune Disease List – AARDA. Retrieved February 29, 2020, from https://www.aarda.org/diseaselist/ Abdelhak, A., Huss, A., Kassubek, J., Tumani, H., & Otto, M. (2018). Serum GFAP as a biomarker for disease severity in multiple sclerosis. Scientific Reports, 8(1). https://doi.org/10.1038/s41598-018-33158-8 Adzhubei, I. A., Schmidt, S., Peshkin, L., Ramensky, V. E., Gerasimova, A., Bork, P., … Sunyaev, S. R. (2010). A method and server for predicting damaging missense mutations. 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Enfermedad autoinmune Sí / No Agammaglobulinemia Artritis reumatoide Enfermedad de Behçet Colitis ulcerosa Dermatomiositis Diabetes juvenil (diabetes tipo I) Enfermedad celíaca Enfermedad de Crohn Fibromialgia Fiebre reumática Glomerulonefritis Hepatitis autoinmune Lupus eritematoso sistémico Enfermedad de Ménière Miastenia gravis Narcolepsia Neuromielitis óptica (enfermedad de Devic) Neuropatía axonal y neuronal Poliarteritis nodosa Polimialgia reumática Psoriasis 194 Púrpura trombocitopénica Sarcoidosis Síndrome antifosfolipídico Síndrome POEMS Síndrome de Sjögren Enfermedad tiroidea autoinmune Uveítis Vasculitis Vitiligo Otros (especificar) 195 Anexo II: SNP exónicos identificados a partir del trabajo de los 144 genes estudiados en los 138 individuos pertenecientes a 23 familias distintas. A) Variantes exónicas de genes involucrados en la vía metabólica de la vitamina D. B) Variantes exónicas de genes involucrados en la vía de señalización del TNF. C) Variantes exónicas de genes involucrados en la vía de señalización del inflamasoma. MAF: minor allele frequency; CADD: Combined Annotation Dependent Depletion; EM: esclerosis múltiple; AID: enfermedad autoinmune; ND: no disponible. A) Gen Localización dbSNP MAF Alelo de referencia Alelo alterado Efecto de la variante Cambio nucleotídico CADD EM (n=52) Otra AID (n=19) No afectos (n=67) FCGR2A chr1:161476204 rs201218628 ND CA TG missense c,184_185delCAinsTG ND 10 3 14 FCGR2A chr1:161479745 rs1801274 0.479 A G missense c.497A>G 0.019 45 16 61 FCGR2A chr1:161480649 rs11810143 0.100 A G synonymous c.642A>G 0.662 10 3 14 FCGR2A chr1:161487863 rs12029217 0.111 C T synonymous c.876C>T 5.958 11 5 7 FCGR3A chr1:161512873 rs115866423 0.010 T A missense c.1009A>T 12.86 2 0 3 FCGR3A chr1:161514542 rs396991 0.324 A C missense c.841T>G 0.163 35 16 43 FCGR3A chr1:161518214 rs148181339 0.265 T C missense c.631A>G 0.001 4 0 2 FCGR3A chr1:161518314 rs114535887 0.039 C T synonymous c.531G>A 0.284 6 0 7 FCGR3A chr1:161518333 rs10127939 0.044 A C missense c.512T>G 12.69 8 3 8 FCGR3A chr1:161518333 rs10127939 0.054 A T missense c.512T>A 4.921 6 1 14 FCGR3A chr1:161518336 rs77144485 0.115 C T missense c.509G>A 0.002 22 7 31 FCGR3A chr1:161519601 rs770473456 <0.001 A G missense c.241T>C 14.23 0 1 0 FCGR3A chr1:161519622 rs773823413 <0.001 C T missense c.220G>A 0.036 0 1 0 196 FCGR2C chr1:161559571 rs138747765 0.279 C T missense c.353C>T 16.82 14 6 20 FCGR2C chr1:161561062 ND ND T A missense c.520T>A 10.13 1 0 0 FCGR2C chr1:161561151 rs74341264 0.122 G A synonymous c.609G>A 7.403 13 4 11 FCGR2C chr1:161561156 rs76016754 0.010 A T missense c.614A>T 6.165 2 0 0 FCGR2C chr1:161569569 rs138731942 0.120 C T synonymous c.948C>T 0.894 1 1 4 FCGR3B chr1:161595986 rs200215055 0.001 C A missense c.526G>T 0.381 1 1 1 FCGR3B chr1:161596032 rs114169903 0.019 T C synonymous c.480A>G 1.544 2 1 3 FCGR3B chr1:161599575 rs200303549 0.009 G T synonymous c.312C>A 0.323 0 1 0 FCGR3B chr1:161599654 rs5030738 0.040 G T missense c.233C>A 0.609 2 1 3 FCGR3B chr1:161599693 rs448740 0.637 T C missense c.194A>G 0.023 49 17 57 FCGR3B chr1:161600168 rs748717781 <0.001 G C synonymous c.51C>G 1.215 0 0 1 FCGR2B chr1:161641237 rs5017568 0.002 G A synonymous c.189G>A 0.510 1 0 1 FCGR2B chr1:161641267 rs144573139 0.005 G A synonymous c.219G>A 0.464 1 0 1 FCGR2B chr1:161641384 rs6665610 0.147 G A synonymous c.336G>A 2.988 16 3 23 FCGR2B chr1:161642985 rs182968886 0.110 G A synonymous c.612G>A 0.026 8 4 10 FCGR2B chr1:161647148 rs193030032 <0.001 A G missense c.848A>G 12.08 1 0 1 LRP2 chr2:169985338 rs34564141 0.007 C T missense c.13803G>A 24.2 2 1 1 LRP2 chr2:169995880 rs370978040 <0.001 G A synonymous c.13269C>T 0.008 1 1 1 LRP2 chr2:169996070 rs41268685 0.014 C T missense c.13250G>A 24.2 1 1 2 LRP2 chr2:169997024 rs764880181 ND TG T frameshift variant c.13139delC NA 1 0 0 LRP2 chr2:169997051 rs990626 0.682 G A synonymous c.13113C>T 7.187 48 17 59 LRP2 chr2:170003432 rs4667591 0.711 T G missense c.12628A>C 25.8 51 18 64 LRP2 chr2:170009350 rs34663643 <0.001 G A synonymous c.12420C>T 1.724 1 0 0 LRP2 chr2:170010985 rs2075252 0.763 T C missense c.12280A>G 21.3 47 17 62 LRP2 chr2:170013904 rs79723119 0.008 A C missense c.11996T>G 0.111 1 0 1 197 LRP2 chr2:170025083 rs2229268 0.199 A G synonymous c.11601T>C 8.789 21 5 25 LRP2 chr2:170029657 rs34355135 0.005 C T missense c.11092G>A 11.90 2 0 0 LRP2 chr2:170032989 rs2229265 0.476 C T synonymous c.10503G>A 0.016 39 13 52 LRP2 chr2:170038761 rs3213760 0.003 C T missense c.9914G>A 22.9 1 1 0 LRP2 chr2:170048473 rs145179638 <0.001 G C synonymous c.8901C>G 0.327 2 0 1 LRP2 chr2:170048482 rs149148763 0.005 C T synonymous c.8892G>A 0.016 1 0 1 LRP2 chr2:170053505 rs2228171 0.267 C T missense c.8614G>A 0.001 12 7 21 LRP2 chr2:170060603 rs17848169 0.029 T C missense c.7894A>G 11.70 2 5 8 LRP2 chr2:170062078 rs13397109 0.074 G C synonymous c.7626C>G 7.716 6 7 11 LRP2 chr2:170062977 rs61995915 0.012 T C missense c.7253A>G 9.632 2 3 4 LRP2 chr2:170063250 rs886055084 ND G A missense c.6980C>T 23.7 0 0 2 LRP2 chr2:170063263 rs149367019 0.003 G A synonymous c.6967C>T 7.739 1 0 1 LRP2 chr2:170063471 rs35114151 0.038 A G synonymous c.6759T>C 9.172 1 0 2 LRP2 chr2:170070172 rs4667596 0.025 C T missense c.6035G>A 17.53 3 1 5 LRP2 chr2:170070348 rs11886219 0.081 T C synonymous c.5859A>G 8.497 10 2 8 LRP2 chr2:170088351 rs2302694 0.128 G A synonymous c.5100C>T 0.145 17 4 18 LRP2 chr2:170089934 rs145384264 0.008 C T synonymous c.5085G>A 0.735 3 0 2 LRP2 chr2:170092395 rs2229267 0.338 A G synonymous c.4875T>C 11.01 32 6 33 LRP2 chr2:170096095 rs34915742 0.019 C G synonymous c.4236G>C 6.478 1 1 2 LRP2 chr2:170097620 ND ND T A missense c.3923A>T 21.6 0 1 2 LRP2 chr2:170097707 rs17848149 0.030 T G missense c.3836A>C 12.87 1 0 2 LRP2 chr2:170099473 rs831042 0.521 T C synonymous c.3660A>G 7.192 36 11 48 LRP2 chr2:170100011 rs150552608 0.009 G A missense c.3452C>T 14.66 1 1 2 LRP2 chr2:170103336 rs831043 0.536 T C synonymous c.3069A>G 0.648 37 12 49 LRP2 chr2:170103351 rs2075249 0.490 G T synonymous c.3054C>A 0.409 36 12 41 198 LRP2 chr2:170113670 rs150752263 0.001 G C missense c.2603C>G 20.1 2 0 1 LRP2 chr2:170115588 rs2241190 0.544 T C synonymous c.2460A>G 0.809 38 12 49 LRP2 chr2:170115672 rs33954745 0.071 A G synonymous c.2376T>C 10.15 10 1 11 LRP2 chr2:170127461 ND ND GA G frameshift variant c.2272delT ND 0 1 0 LRP2 chr2:170127559 rs141180155 0.007 G A synonymous c.2175C>T 7.039 0 1 0 LRP2 chr2:170129448 rs538946388 <0.001 C T missense c.2105G>A 0.046 1 1 2 LRP2 chr2:170129528 rs830994 0.627 G A synonymous c.2025C>T 9.242 46 18 60 LRP2 chr2:170129547 rs34291900 0.027 C T missense c.2006G>A 26.5 2 5 8 LRP2 chr2:170136882 ND ND CA C frameshift variant c.1318delT NA 1 0 0 LRP2 chr2:170147502 rs34693334 0.062 C G missense c.775G>C 12.07 7 1 11 LRP2 chr2:170150671 rs2229266 0.322 G A synonymous c.639C>T 10.92 29 9 37 LRP2 chr2:170163816 rs34104660 0.060 G T synonymous c.402C>A 0.120 9 6 11 LRP2 chr2:170175334 rs2229263 0.278 T C missense c.248A>G 0.012 28 10 30 LRP2 chr2:170218847 rs1559014 0.996 C G synonymous c.63G>C 10.04 51 19 67 CYP27A1 chr2:219677022 rs2229381 0.001 C T missense c.524C>T 22.7 1 0 4 CYP27A1 chr2:219677655 ND ND C G missense c.853C>G 22.8 1 1 3 CYP27A1 chr2:219677690 rs61733619 0.017 A G synonymous c.888A>G 0.296 2 1 2 CYP27A1 chr2:219677819 rs200553205 <0.001 G A synonymous c.1017G>A 22.1 1 0 0 GC chr4:72618296 rs9016 0.997 T C missense c.1334A>G 0.318 52 19 67 GC chr4:72618311 rs1332637756 <0.001 T C missense c.1319A>G 1.153 1 0 0 GC chr4:72618323 rs4588 0.250 G T missense c.1307C>A 0.101 33 14 40 GC chr4:72618334 rs7041 0.514 A C missense c.1296T>G 0.001 43 15 54 GC chr4:72620788 rs76803094 0.018 C T synonymous c.1071G>A 6.182 6 1 6 GC chr4:72629139 rs111261486 0.001 C T synonymous c.687G>A 12.93 1 1 1 199 GC chr4:72631184 rs114932951 0.009 C T synonymous c.438G>A 6.636 1 0 1 DAB2 chr5:39376840 rs61742957 0.030 G A synonymous c.2049C>T 10.82 9 1 11 DAB2 chr5:39376858 rs61744160 0.030 C A synonymous c.2031G>T 9.177 9 1 11 DAB2 chr5:39376988 rs3733801 0.132 C T missense c.1901G>A 17.69 16 5 19 DAB2 chr5:39377132 rs700241 0.024 G A missense c.1757C>T 15.54 0 0 1 DAB2 chr5:39383257 rs34507990 0.030 T C synonymous c.804A>G 12.10 9 1 11 DAB2 chr5:39388413 rs74808556 0.002 A G synonymous c.681T>C 11.34 2 1 3 DAB2 chr5:39394408 rs34529705 0.032 T C synonymous c.15A>G 4.768 4 1 5 CYP3A4 chr7:99361620 ND ND A G missense c.884T>C 24.0 0 1 0 RXRA chr9:137309155 rs61751479 0.002 G A missense c.762G>A 17.46 0 0 3 RXRA chr9:137328442 rs1805348 0.013 G A synonymous c.1371G>A 8.549 2 0 0 CUBN chr10:16870912 rs1801232 0.085 G T missense c.10656C>A 18.73 7 5 11 CUBN chr10:16873396 rs141937843 0.002 G A synonymous c.10383C>T 3.684 2 0 1 CUBN chr10:16877080 rs7898873 0.023 G C missense c.10295C>G 8.647 1 1 1 CUBN chr10:16877110 rs1801230 0.017 G A missense c.10265C>T 15.52 1 1 2 CUBN chr10:16878295 rs139596037 0.001 G T synonymous c.10119C>A 1.914 1 0 2 CUBN chr10:16882518 rs703064 0.698 T C synonymous c.9843A>G 8.643 45 18 61 CUBN chr10:16911671 rs148491916 <0.001 C T missense c.9418G>A 20.9 0 0 1 CUBN chr10:16918947 ND ND AG A frameshift variant c.9054delC NA 1 0 2 CUBN chr10:16918972 rs1801241 0.161 A G synonymous c.9030T>C 0.313 8 3 11 CUBN chr10:16918997 rs1801240 0.105 T C missense c.9005A>G 16.88 11 7 17 CUBN chr10:16919052 rs1801239 0.087 T C missense c.8950A>G 15.42 10 6 16 CUBN chr10:16930419 rs45569534 0.015 C G missense c.8902G>C 22.9 1 0 0 CUBN chr10:16932490 rs1801238 0.027 G T missense c.8635C>A 19.92 4 1 3 200 CUBN chr10:16942818 ND ND T C missense c.8216A>G 23.0 1 0 2 CUBN chr10:16943371 rs2796835 1.000 G C missense c.8150C>G 23.0 51 18 67 CUBN chr10:16948277 rs144626884 <0.001 T G missense c.7837A>C 23.2 1 0 2 CUBN chr10:16948390 rs3740168 0.042 G C missense c.7724C>G 11.98 1 0 4 CUBN chr10:16949550 rs3740165 0.057 T C synonymous c.7662A>G 5.788 4 1 7 CUBN chr10:16961995 rs2271460 0.016 A C missense c.6788T>G 25.1 0 0 2 CUBN chr10:16962122 rs143291127 <0.001 C T missense c.6661G>A 4.393 0 0 2 CUBN chr10:16967362 ND ND A C missense c.6524T>G 25.2 3 2 7 CUBN chr10:16967401 rs1276712 0.994 C T missense c.6485G>A 0.561 52 19 67 CUBN chr10:16967586 rs62619939 0.129 C G missense c.6459G>C 23.2 11 3 16 CUBN chr10:16979606 rs2356590 0.063 G T missense c.5911C>A 24.9 1 0 1 CUBN chr10:16979661 rs1801234 0.468 T C synonymous c.5856A>G 0.219 27 9 39 CUBN chr10:16979714 rs41289305 0.144 T C missense c.5803A>G 12.94 8 2 14 CUBN chr10:16982061 rs2271462 0.075 C T missense c.5518G>A 16.93 1 0 2 CUBN chr10:16989271 rs74116778 0.017 C T missense c.5305G>A 11.31 1 1 0 CUBN chr10:16989272 rs61841454 0.059 G A synonymous c.5304C>T 0.994 9 2 11 CUBN chr10:16990552 rs2271468 0.075 G A synonymous c.5134C>T 8.307 1 0 2 CUBN chr10:17024503 rs1801231 0.766 G A missense c.4675C>T 15.85 51 19 65 CUBN chr10:17024615 rs1801229 0.766 A T synonymous c.4563T>A 11.23 51 19 65 CUBN chr10:17087156 rs1873469 0.032 G A synonymous c.3522C>T 5.935 0 0 1 CUBN chr10:17088006 rs1801228 0.053 T C synonymous c.3417A>G 9.220 7 2 7 CUBN chr10:17110639 rs148869805 0.004 T C missense c.2756A>G 13.23 2 0 4 CUBN chr10:17113456 rs138083522 0.007 C T missense c.2594G>A 8.946 1 1 2 CUBN chr10:17113479 rs17432826 0.020 G A synonymous c.2571C>T 4.555 1 2 3 201 CUBN chr10:17113563 rs1801225 0.427 C T synonymous c.2487G>A 0.388 34 14 45 CUBN chr10:17126383 rs7905349 0.028 G A missense c.2188C>T 0.619 0 0 1 CUBN chr10:17130199 rs41289311 0.050 G A synonymous c.1911C>T 3.202 8 4 9 CUBN chr10:17146570 rs757328692 <0.001 G A missense c.1265C>T 24.3 1 0 2 CUBN chr10:17146590 rs12571671 0.073 A G synonymous c.1245T>C 11.53 1 1 1 CUBN chr10:17147521 rs1801224 0.614 G T missense c.1165C>A 17.20 42 16 51 CUBN chr10:17152970 rs150309054 0.002 G A synonymous c.963C>T 0.582 1 2 2 CUBN chr10:17152994 rs1801223 0.212 G A synonymous c.939C>T 2.709 21 7 27 CUBN chr10:17153023 rs78201384 0.004 C T missense c.910G>A 19.54 2 1 2 CUBN chr10:17156151 rs1801222 0.728 A G missense c.758T>C 10.23 48 19 64 CUBN chr10:17157572 rs41289313 0.084 G A synonymous c.618C>T 0.035 11 6 14 CUBN chr10:17171176 rs12259370 0.007 C T missense c.196G>A 27.1 1 1 0 PTH chr11:13514053 rs6256 0.153 G T synonymous c.247C>A 3.114 15 7 22 CYP2R1 chr11:14900714 rs140424660 0.005 G A synonymous c.1276C>T 11.04 2 0 1 CYP2R1 chr11:14900931 rs117913124 0.017 G A synonymous c.1059C>T 5.689 1 0 4 CYP2R1 chr11:14901809 rs184549196 <0.001 T C synonymous c.873A>G 9.918 1 0 2 CYP2R1 chr11:14913575 rs12794714 0.405 G A synonymous c.177C>T 6.135 31 12 45 DHCR7 chr11:71146577 rs909217 0.560 G A synonymous c.1272C>T 9.824 50 17 61 DHCR7 chr11:71146691 rs760241 0.853 A G synonymous c.1158T>C 0.063 49 19 64 DHCR7 chr11:71152461 rs949177 0.875 A G synonymous c.438T>C 2.364 52 19 67 DHCR7 chr11:71155129 rs4316537 0.078 G A synonymous c.231C>T 0.176 6 3 6 DHCR7 chr11:71155153 rs1790334 0.876 A G synonymous c.207T>C 0.283 50 19 66 DHCR7 chr11:71155171 rs1044482 0.567 C T synonymous c.189G>A 7.795 46 17 59 FGF23 chr12:4479549 rs7955866 0.127 G A missense c.716C>T 0.098 9 3 14 202 VDR chr12:48238757 rs731236 0.327 A G synonymous c.1056T>C 0.149 40 16 48 VDR chr12:48251305 rs2229828 0.002 G A synonymous c.444C>T 1.168 1 0 2 VDR chr12:48272840 rs2228572 0.022 G A synonymous c.57C>T 0.777 3 0 7 VDR chr12:48272895 rs2228570 0.631 A G missense c.2T>C 23.8 46 17 61 AGAP2 chr12:58120855 rs779464227 <0.001 C G missense c.2170G>C 24.6 1 0 0 AGAP2 chr12:58125375 rs140471383 0.002 C T synonymous c.996G>A 8.426 2 1 1 AGAP2 chr12:58125592 rs1257645556 <0.001 C T synonymous c.945G>A 29.3 2 0 1 AGAP2 chr12:58126234 rs17852479 0.317 C A synonymous c.738G>T 10.59 40 15 52 CYP27B1 chr12:58158558 rs8176345 0.022 C T synonymous c.942G>A 13.06 5 2 5 CYP27B1 chr12:58159173 rs8176344 0.008 C G missense c.496G>C 16.69 2 0 1 METTL21B chr12:58166590 rs34913183 0.008 C T missense c.83C>T 22.1 1 1 1 METTL21B chr12:58174275 rs111299874 0.006 T C missense c.527T>C 24.3 1 1 1 METTL21B chr12:58174306 rs923829 0.369 T C synonymous c.558T>C 6.375 22 8 31 METTL21B chr12:58174368 rs141172155 0.001 G A missense c.620G>A 23.8 2 0 0 TSFM chr12:58176614 rs10747783 0.357 T C synonymous c.30T>C 9.580 22 8 31 AVIL chr12:58194954 rs111647711 0.008 A G synonymous c.2193T>C 2.098 2 0 1 AVIL chr12:58196129 rs151180457 <0.001 C T synonymous c.1965G>A 12.60 1 0 1 AVIL chr12:58204283 rs2172521 1.000 T C missense c.610A>G 19.18 52 19 67 AVIL chr12:58209772 rs753181730 <0.001 C T missense c.52G>A 14.73 1 0 1 AVIL chr12:58209788 rs148769359 0.005 G A synonymous c.36C>T 7.750 6 2 5 PDIA3 chr15:44038766 ND ND C T missense c.29C>T 10.19 0 0 2 PDIA3 chr15:44038898 ND ND C CT frameshift variant c.161_162insT NA 0 0 1 PDIA3 chr15:44038899 rs2411284 0.672 C T synonymous c.162C>T 10.77 48 18 63 PDIA3 chr15:44055344 rs139812953 <0.001 A G missense c.542A>G 19.10 1 1 2 203 PDIA3 chr15:44061802 rs1053492 0.656 C T synonymous c.1224C>T 11.13 48 18 63 PDIA3 chr15:44061838 rs147712601 0.001 C T synonymous c.1260C>T 12.09 0 0 1 CYP24A1 chr20:52774635 rs6068812 <0.001 A G missense c.1226T>C 28.3 2 0 1 CYP24A1 chr20:52775528 rs2296239 0.281 C T synonymous c.1125G>A 4.214 28 8 34 CYP24A1 chr20:52781091 rs6068816 0.120 C T synonymous c.744G>A 2.262 9 2 9 CYP24A1 chr20:52786219 rs2296241 0.493 G A synonymous c.552C>T 10.08 39 12 50 CYP24A1 chr20:52788189 rs35051736 0.002 C T missense c.470G>A 23.0 1 1 2 B) Gen Localización dbSNP MAF Alelo de referencia Alelo alterado Efecto de la variante Cambio nucleotídico CADD EM (n=44) Otra AID (n=16) No afectos (n=56) TNFRSF18 chr1:1139055 rs575286334 <0.001 G A synonymous c.684C>T 0.112 1 0 1 TNFRSF18 chr1:1139202 rs2298213 0.100 T C synonymous c.537A>G 0.774 11 3 16 TNFRSF18 chr1:1139862 rs11466691 0.020 T C synonymous c.315A>G 0.875 1 0 1 TNFRSF18 chr1:1141885 rs368710708 <0.001 T C missense c.67A>G 7.369 2 0 2 TNFRSF18 chr1:1141934 rs371411514 0.001 C T synonymous c.18G>A 5.307 2 0 2 TNFRSF4 chr1:1147342 ND ND C A missense c.614G>T 9.265 0 1 0 TNFRSF4 chr1:1147422 rs17568 0.358 C T synonymous c.534G>A 11.37 19 6 28 TNFRSF4 chr1:1148445 rs34160451 0.017 G A synonymous c.297C>T 12.26 0 1 2 TNFRSF4 chr1:1149105 rs199733493 <0.001 G A missense c.206C>T 15.18 0 0 1 TNFRSF14 chr1:2488153 rs4870 0.516 A G missense c.50A>G 10.77 36 15 48 TNFRSF14 chr1:2491306 rs2234163 0.011 G A missense c.349G>A 2.225 3 2 0 204 TNFRSF14 chr1:2494330 rs2234167 0.126 G A missense c.721G>A 0.164 16 6 17 TNFRSF25 chr1:6521503 rs1059332 0.011 G A synonymous c.1272C>T 12.58 1 0 0 TNFRSF25 chr1:6524501 rs11800462 0.076 T C missense c.476A>G 22.4 4 0 6 TNFRSF25 chr1:6524688 rs3170675 0.038 T C synonymous c.387A>G 0.405 10 4 9 TNFRSF25 chr1:6524703 rs45497599 0.004 C T synonymous c.372G>A 16.41 0 0 1 TNFRSF25 chr1:6525592 ND ND C G missense c.68G>C 10.41 0 2 4 TNFRSF9 chr1:7998253 rs752649731 ND CT C frameshift variant c.345delA ND 1 0 0 TNFRSF8 chr1:12164437 rs2230622 0.282 C T synonymous c.270C>T 0.058 17 9 28 TNFRSF8 chr1:12170249 ND ND A C missense c.664A>C 13.95 1 1 0 TNFRSF8 chr1:12175729 ND ND C CT frameshift variant c.889_890insT ND 3 0 5 TNFRSF8 chr1:12175729 rs1763642 1.000 C T missense c.889C>T 19.67 14 6 28 TNFRSF8 chr1:12186058 rs2230625 0.048 A G missense c.1204A>G 6.375 6 1 1 TNFRSF8 chr1:12198297 rs476488 0.197 T C synonymous c.1347T>C 0.290 13 3 18 TNFRSF8 chr1:12198362 rs144498730 0.011 C A missense c.1412C>A 10.35 1 0 1 TNFRSF8 chr1:12198401 rs777410629 <0.001 C T missense c.1451C>T 13.67 2 0 0 TNFRSF8 chr1:12198423 ND ND CGGGGGC CGGGGC frameshift variant c.1478delG ND 1 0 0 TNFRSF8 chr1:12202412 ND ND CGGGG CGGG frameshift variant c.1616delG ND 0 1 0 TNFRSF1B chr1:12248942 rs945439 0.215 A G synonymous c.168A>G 3.367 27 6 32 TNFRSF1B chr1:12252955 rs1061622 0.216 T G missense c.587T>G 11.50 27 6 32 TNFRSF1B chr1:12253062 rs5746026 0.026 G A missense c.694G>A 12.52 5 1 5 TNFRSF1B chr1:12254015 rs2229700 0.002 T C missense c.791T>C 17.43 1 0 2 TNFRSF1B chr1:12262095 rs201872077 <0.001 G C synonymous c.972G>C 1.066 1 0 1 205 TNFAIP8L2 chr1:151131331 rs139852088 <0.001 G A missense c.158G>A 26.9 2 1 1 EFNA1 chr1:155106227 rs4745 0.444 A T missense c.476A>T 15.26 48 17 59 FASLG chr1:172628482 rs749237778 ND A ACCACCG frameshift variant c.153_158dupGCCAC C ND 1 0 0 FASLG chr1:172628600 rs530390117 <0.001 T C missense c.259T>C 22.5 1 1 3 TRAF5 chr1:211533352 rs2230779 0.051 A G synonymous c.477A>G 11.23 8 1 10 TRAF5 chr1:211534099 rs149809182 0.001 C T missense c.599C>T 13.98 0 2 1 ADAM17 chr2:9630541 rs55796712 0.011 G A missense c.2240C>T 11.90 2 0 1 ADAM17 chr2:9633092 rs61754177 0.008 C T missense c.2017G>A 27.4 3 0 3 ADAM17 chr2:9634856 rs1048610 0.509 A G synonymous c.1824T>C 6.146 47 17 58 ADAM17 chr2:9637331 rs56237316 0.013 A G synonymous c.1695T>C 3.647 3 1 4 EDAR chr2:109513654 rs12623957 0.812 G A synonymous c.1056C>T 8.253 52 19 67 EDAR chr2:109522788 rs752662417 <0.001 C T missense c.1000G>A 22.1 0 0 1 EDAR chr2:109524409 rs3749099 0.007 G A synonymous c.870C>T 1.298 2 0 3 EDAR chr2:109524466 rs3749098 0.007 A G synonymous c.813T>C 1.830 2 0 3 EDAR chr2:109526969 rs260632 0.916 G A synonymous c.750C>T 0.904 52 19 67 EDAR chr2:109527239 rs3749108 0.007 C T synonymous c.723G>A 10.02 2 0 3 TNFAIP6 chr2:152220510 rs75961064 0.012 A G missense c.148A>G 25.3 0 2 1 TNFAIP6 chr2:152222731 rs79800957 0.002 G A missense c.394G>A 27.7 2 1 1 TNFAIP6 chr2:152226570 rs1046668 0.151 A G missense c.431A>G 14.71 14 5 14 TNFAIP6 chr2:152226616 rs78264792 0.012 A G synonymous c.477A>G 15.18 0 2 1 TRAF3IP1 chr2:239229325 ND ND C A synonymous c.22C>A 14.31 2 1 4 TRAF3IP1 chr2:239229372 rs13398676 0.726 C A synonymous c.69C>A 10.79 17 4 22 TRAF3IP1 chr2:239237388 rs61742338 0.025 G A missense c.416G>A 8.783 4 1 6 TRAF3IP1 chr2:239253224 rs58277463 0.082 A T missense c.1246A>T 14.01 4 0 3 206 TRAF3IP1 chr2:239306268 rs3739070 0.063 A C missense c.1858A>C 15.11 8 1 12 TRAIP chr3:49866584 rs35129566 0.140 T G synonymous c.1362A>C 1.494 11 7 11 TRAIP chr3:49881329 rs1223758990 <0.001 C T missense c.313G>A 17.62 2 0 0 TRAIP chr3:49881339 rs145932323 0.006 C T synonymous c.303G>A 3.796 0 1 2 TNFSF10 chr3:172224302 rs112120355 ND C CG frameshift variant c.825_826insC ND 2 1 2 TNFSF10 chr3:172224303 rs1131532 0.660 A G synonymous c.825T>C 2.274 50 19 65 TNFSF10 chr3:172224615 rs56119116 0.004 A G synonymous c.513T>C 7.714 1 0 1 TNFSF10 chr3:172232780 rs16845759 0.011 G T missense c.141C>A 8.283 1 2 3 NFKB1 chr4:103514651 rs761774576 <0.001 G A missense c.1136G>A 15.92 2 1 0 NFKB1 chr4:103514658 rs1609993 0.940 T C synonymous c.1143T>C 0.157 50 19 66 NFKB1 chr4:103518700 rs4648072 0.009 A G missense c.1519A>G 8.326 2 0 0 NFKB1 chr4:103527655 rs4648093 0.009 G A synonymous c.1755G>A 0.003 0 0 1 NFKB1 chr4:103533631 rs4648109 0.003 G C synonymous c.2460G>C 8.443 2 0 0 TIFA chr4:113199075 rs701759 0.566 A G synonymous c.498T>C 0.083 35 12 44 TNFAIP8 chr5:118728586 rs376335031 <0.001 A G missense c.107A>G 24.3 0 0 2 TNFAIP8 chr5:118728953 rs3203922 0.280 G C synonymous c.474G>C 16.23 22 8 28 LTA chr6:31540556 rs2229094 0.267 T C missense c.37T>C 11.64 26 13 38 LTA chr6:31540757 rs2229092 0.047 A C missense c.152A>C 11.89 4 1 3 LTA chr6:31540784 rs1041981 0.350 C A missense c.179C>A 17.89 19 6 22 TNF chr6:31544562 rs4645843 0.002 C T missense c.251C>T 15.28 1 1 1 LTB chr6:31548754 ND ND G C missense c.467C>G 24.0 0 0 1 LTB chr6:31548927 ND ND C G missense c.294G>C 14.54 2 1 2 LTB chr6:31549357 rs4647187 0.002 G A missense c.259C>T 22.1 8 1 2 LTB chr6:31550145 ND ND C G missense c.50G>C 19.11 2 1 2 207 TNFRSF21 chr6:47202564 rs144939843 <0.001 T C missense c.1580A>G 5.917 0 0 1 TNFRSF21 chr6:47253696 rs756089168 <0.001 G A synonymous c.732C>T 10.63 1 0 1 TNFAIP3 chr6:138192395 rs900039415 ND T C missense c.31T>C 25.6 0 0 1 TNFAIP3 chr6:138195991 rs146534657 0.012 A G missense c.305A>G 26.2 0 0 1 TNFAIP3 chr6:138196066 rs2230926 0.061 T G missense c.380T>G 20.1 10 2 9 TNFAIP3 chr6:138201240 rs142253225 0.001 A C missense c.1939A>C 14.10 1 0 2 TNFRSF10B chr8:22881720 ND ND AT A frameshift variant c.902delA ND 1 0 1 TNFRSF10B chr8:22885935 rs141760693 0.001 T C synonymous c.570A>G 1.059 0 0 1 TNFRSF10B chr8:22900701 rs1047266 0.093 G A missense c.200C>T 16.07 7 0 5 TNFRSF10B chr8:22926310 ND ND CGGG CGG frameshift variant c.95delC ND 0 2 4 TNFRSF10B chr8:22926313 rs1129424 0.680 G A missense c.95C>T 8.940 42 14 52 TNFRSF10B chr8:22926313 ND ND G C missense c.95C>G 13.54 1 0 0 TNFRSF10C chr8:22972207 rs74480765 0.003 G A synonymous c.204G>A 0.405 3 1 1 TNFRSF10C chr8:22972228 rs61736402 0.008 C T synonymous c.225C>T 2.802 3 3 5 TNFRSF10C chr8:22974279 ND ND C G missense c.515C>G 11.13 2 1 1 TNFRSF10C chr8:22974315 rs61736405 ND A C missense c.551A>C 13.28 1 0 0 TNFRSF10C chr8:22974325 rs11780493 0.485 G A synonymous c.561G>A 0.143 3 5 10 TNFRSF10C chr8:22974370 rs151239314 <0.001 G A synonymous c.606G>A 0.039 0 0 1 TNFRSF10C chr8:22974414 ND ND C CA frameshift variant c.650_651insA ND 1 0 0 TNFRSF10C chr8:22974415 rs11780526 0.020 G A synonymous c.651G>A 0.486 2 0 3 TNFRSF10C chr8:22974450 rs9644063 0.283 T C missense c.686T>C 9.684 50 19 67 208 TNFRSF10D chr8:23001988 rs1133782 0.652 A G missense c.929T>C 0.224 44 15 55 TNFRSF10D chr8:23002086 rs117862321 0.005 G A synonymous c.831C>T 0.025 2 1 1 TNFRSF10D chr8:23002090 rs55636833 0.032 C T missense c.827G>A 5.574 3 3 6 TNFRSF10D chr8:23002107 rs35763670 0.016 C T synonymous c.810G>A 0.071 2 1 2 TNFRSF10D chr8:23021346 rs11135703 0.194 G A missense c.103C>T 16.03 6 0 9 TNFRSF10A chr8:23049292 rs2230229 0.877 C T missense c.1322G>A 1.868 51 19 66 TNFRSF10A chr8:23058220 rs20576 0.150 T G missense c.683A>C 11.01 20 12 33 TNFRSF10A chr8:23059324 rs20575 0.525 C G missense c.626G>C 0.313 36 12 50 TNFRSF10A chr8:23060256 rs17620 0.523 T C missense c.422A>G 0.008 36 12 50 TNFRSF10A chr8:23082477 rs20577 0.024 G A missense c.98C>T 17.03 1 1 0 TNFRSF11B chr8:119936669 rs1804854 0.027 A G synonymous c.1150T>C 13.12 2 1 0 TNFRSF11B chr8:119936978 rs140782326 0.004 C T missense c.841G>A 25.5 0 1 1 TNFRSF11B chr8:119938782 rs2228568 0.104 T C synonymous c.768A>G 12.38 12 2 9 TNFRSF11B chr8:119938836 rs11573930 0.007 C T synonymous c.714G>A 9.668 1 0 0 TNFRSF11B chr8:119964052 rs2073618 0.530 G C missense c.9C>G 20.6 42 16 60 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synonymous c.642T>C 1.641 44 16 63 NFKB2 chr10:104159196 rs4919633 0.995 A G synonymous c.1269A>G 3.330 52 19 67 NFKB2 chr10:104160434 rs4919634 <0.001 A G synonymous c.1821A>G 2.470 52 19 67 NFKB2 chr10:104160575 rs201623844 0.002 C T synonymous c.1962C>T 12.59 0 0 1 NFKB2 chr10:104160959 rs11574851 0.041 C T synonymous c.2094C>T 6.688 7 4 16 NFKB2 chr10:104161010 rs200006038 <0.001 G A synonymous c.2145G>A 9.311 0 1 1 NFKB2 chr10:104161221 rs11191279 0.010 C T synonymous c.2239C>T 1.834 0 1 1 NFKB2 chr10:104162111 ND ND AC A frameshift variant c.2686delC ND 0 1 0 RELT chr11:73100205 ND ND G T synonymous c.24G>T 6.069 0 1 0 RELT chr11:73105341 rs141813904 0.009 C T missense c.767C>T 25.0 1 0 1 RELT chr11:73105728 rs12362779 0.001 C T missense c.995C>T 21.8 1 1 0 RELT chr11:73106186 rs34304845 0.029 G A synonymous c.1101G>A 20.6 2 0 3 RELT chr11:73106237 rs11544311 0.083 A C synonymous c.1152A>C 8.734 9 1 22 RELT chr11:73106294 rs17851510 0.112 A C synonymous c.1209A>C 0.054 11 1 23 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T missense c.476C>T 23.8 2 1 4 TNFRSF19 chr13:24234517 rs3751364 0.738 A G synonymous c.624A>G 0.049 51 19 64 TNFRSF19 chr13:24242165 rs61745191 0.048 C T synonymous c.783C>T 9,928 1 0 3 TNFRSF19 chr13:24242166 rs35041805 0.016 C T missense c.784C>T 0.076 5 1 1 TNFRSF19 chr13:24243012 rs768185710 <0.001 C T missense c.1021C>T 8.780 1 0 1 TNFRSF19 chr13:24243200 rs3751363 0.860 T C synonymous c.1209T>C 0.138 51 19 65 TNFRSF19 chr13:24243204 rs3751362 0.125 G A missense c.1213G>A 0.012 8 6 14 TNFSF11 chr13:43148546 rs138818878 0.020 C G missense c.107C>G 19.36 0 0 3 TNFSF11 chr13:43148564 ND ND CT C frameshift variant c.126delT ND 3 1 1 TNFSF11 chr13:43148565 rs2296533 0.448 T C synonymous c.126T>C 15.3 31 14 47 TRAF3 chr14:103336727 rs142350527 0.008 G A synonymous c.189G>A 0.447 0 1 0 TRAF3 chr14:103342049 rs1131877 0.327 T C missense c.386T>C 10.19 37 10 40 TNFAIP2 chr14:103593950 rs1132339 0.567 C G missense c.844C>G 23.7 35 14 49 211 TNFAIP8L3 chr15:51350277 rs144316469 <0.001 T A missense c.416A>T 20.7 3 0 2 TNFAIP8L3 chr15:51350287 rs78897873 0.033 T G missense c.406A>C 19.25 9 2 18 TRAF7 chr16:2222286 rs11547311 0.045 C T synonymous c.570C>T 9.037 10 2 5 LITAF chr16:11647418 ND ND C T stop gained c.348G>A 48 0 1 0 LITAF chr16:11647433 rs34448402 0.002 G A synonymous c.333C>T 2.227 0 0 2 LITAF chr16:11647436 rs139116481 <0.001 G A synonymous c.330C>T 0.081 1 0 0 LITAF chr16:11647492 rs4280262 0.165 T C missense c.274A>G 3.162 25 6 27 LITAF chr16:11647532 rs9282774 0.010 C T synonymous c.234G>A 0.213 4 2 3 LITAF chr16:11650441 rs141862602 <0.001 G A missense c.146C>T 15.03 3 0 2 TNFRSF17 chr16:12060163 rs373496 0.980 A G missense c.242A>G 4.137 52 19 67 TNFRSF17 chr16:12061572 ND ND C A missense c.423C>A 15.47 0 0 2 TNFRSF17 chr16:12061626 rs2017662 0.110 G A synonymous c.477G>A 12.75 6 2 4 TNFRSF17 chr16:12061674 rs2071336 0.065 G A synonymous c.525G>A 7.446 4 2 3 TRADD chr16:67189053 ND ND G C missense c.574C>G 4.589 0 1 0 TNFSF12 chr17:7453505 rs62059804 0.190 C A synonymous c.276C>A 12.64 20 8 32 TNFSF12 chr17:7460517 rs3803798 0.543 G C synonymous c.600G>C 2.688 44 16 49 TNFSF12 chr17:7460559 rs4968189 0.994 T G synonymous c.642T>G 18.27 52 19 67 TNFSF13 chr17:7462555 rs11552708 0.129 G A missense c.199G>A 16.48 20 8 19 TNFSF13 chr17:7462969 rs3803800 0.690 A G missense c.287A>G 18.69 49 18 62 TNFRSF13B chr17:16842912 rs11078355 0.439 A G synonymous c.831T>C 1.257 35 14 40 TNFRSF13B chr17:16842991 rs34562254 0.137 G A missense c.752C>T 12.26 7 3 10 TNFRSF13B chr17:16843084 rs56063729 0.016 A G missense c.659T>C 0.909 2 0 3 TNFRSF13B chr17:16852187 rs34557412 0.003 A G missense c.310T>C 26.1 0 1 0 TNFRSF13B chr17:16852206 rs35062843 0.041 A C synonymous c.291T>G 5.436 4 1 3 212 TNFRSF13B chr17:16852282 rs55916807 0.002 C T missense c.215G>A 0.501 1 0 1 TNFRSF13B chr17:16855878 rs8072293 0.808 C T synonymous c.81G>A 0.398 48 16 63 TNFAIP1 chr17:26671614 rs145418568 0.002 C T synonymous c.939C>T 5.150 1 0 2 TRAF4 chr17:27075423 rs2070265 0.205 C T synonymous c.606C>T 11.32 10 4 18 TNFRSF11A chr18:60021761 rs35211496 0.118 C T missense c.421C>T 20.5 17 8 23 TNFRSF11A chr18:60027241 rs1805034 0.545 C T missense c.575C>T 14.65 44 17 60 TNFRSF11A chr18:60036083 rs8092336 0.957 A G synonymous c.933A>G 2.966 50 19 66 TNFRSF11A chr18:60036669 rs61751992 0.006 G A missense c.1519G>A 16.83 1 0 1 TNFRSF11A chr18:60052192 rs769676947 <0.001 C T synonymous c.1776C>T 4.233 0 0 1 TNFRSF11A chr18:60052201 rs1240940580 ND C T synonymous c.1785C>T 5.078 0 0 2 TNFAIP8L1 chr19:4651911 rs143527230 0.002 T C synonymous c.30T>C 13.33 2 0 2 TNFSF9 chr19:6531171 rs2234174 0.012 G A missense c.124G>A 12.62 2 0 1 TNFSF9 chr19:6534689 ND ND A G missense c.377A>G 22.2 0 1 1 CD70 chr19:6586268 rs1862511 0.314 G A synonymous c.345C>T 6.758 24 9 38 TNFSF14 chr19:6665020 rs344560 0.947 T C missense c.640A>G 15.65 52 19 67 TNFSF14 chr19:6665328 ND NA G C missense c.332C>G 22.3 1 2 8 TNFSF14 chr19:6665330 ND NA C G synonymous c.330G>C 0.099 2 1 6 TNFSF14 chr19:6669934 rs2291668 0.186 G A synonymous c.147C>T 0.563 17 5 23 CD40 chr20:44750990 rs776893342 <0.001 C T synonymous c.249C>T 12.58 2 0 1 CD40 chr20:44757524 rs11086998 0.020 C G missense c.679C>G 0.005 3 0 3 CD40 chr20:44757534 ND ND AG GC missense c.689_690delAGinsG C ND 1 0 0 TNFRSF6B chr20:62328267 rs2257440 0.245 C T synonymous c.147C>T 8,182 28 11 31 TNFRSF6B chr20:62328375 rs2738787 0.939 A G synonymous c.255A>G 20.7 51 18 65 213 TNFRSF6B chr20:62328453 rs2258056 0.251 T C synonymous c.333T>C 8.489 30 11 32 TNFRSF6B chr20:62328480 rs55765053 0.047 C T synonymous c.360C>T 8.702 5 3 8 TNFRSF6B chr20:62328741 ND ND GCT GT frameshift variant c.486delC ND 1 0 1 TNFRSF6B chr20:62328742 rs909341 0.240 C T synonymous c.486C>T 20.5 29 11 32 TNFRSF6B chr20:62328829 rs1291205 0.233 C G synonymous c.573C>G 12.77 29 11 32 TNFRSF13C chr22:42321451 rs61756766 0.005 G A missense c.475C>T 26.7 1 0 2 EDA2R chrX:65822607 rs1385698 0.976 T C missense c.385A>G 14.20 52 19 67 EDA2R chrX:65824281 rs12837393 0.002 G A missense c.334C>T 22.1 1 0 1 EDA2R chrX:65824986 rs1385699 0.776 C T missense c.170G>A 17.54 47 19 61 CD40LG chrX:135730555 rs1126535 0.232 T C synonymous c.148T>C 11.52 15 2 20 C) Gen Localización dbSNP MAF Alelo de referencia Alelo alterado Efecto de la variante Cambio nucleotídico CADD EM (n=52) Otra AID (n=19) No afectos (n=67) IFI16 chr1:158984475 ND ND GAAAAAA GAAAAA frameshift variant c.12delA ND 0 0 1 IFI16 chr1:158985673 rs116270651 <0.001 G A missense c.277G>A 0.877 2 1 0 IFI16 chr1:158986477 rs866484 0.734 G C missense c.536G>C 0.546 50 19 64 IFI16 chr1:158988270 rs11539423 0.048 T C synonymous c.801T>C 0.065 4 2 5 IFI16 chr1:158990247 rs1057024 0.228 A G synonymous c.1089A>G 0.729 8 4 12 214 IFI16 chr1:159002376 ND ND G GA frameshift variant c.1224_1225insA ND 2 0 0 IFI16 chr1:159002377 rs1057027 0.770 C A missense c.1225C>A 8.041 44 19 57 IFI16 chr1:159002389 rs1057028 0.770 T A missense c.1237T>A 1.048 52 19 65 IFI16 chr1:159021506 rs62621173 0.034 C T missense c.1535C>T 15.26 2 2 3 IFI16 chr1:159021727 rs3737523 0.011 C T synonymous c.1756C>T 5.661 6 2 3 IFI16 chr1:159024668 rs6940 0.155 A T missense c.2167A>T 16.57 4 2 11 TLR5 chr1:223283837 rs5744177 0.007 T C missense c.2537A>G 13.48 1 0 1 TLR5 chr1:223283851 rs1053954 0.073 T C synonymous c.2523A>G 5.471 12 7 17 TLR5 chr1:223283881 rs75283814 0.006 T C synonymous c.2493A>G 9.470 1 0 1 TLR5 chr1:223283910 rs7512943 1000 A G missense c.2464T>C 14.31 52 19 67 TLR5 chr1:223284069 rs56243703 0.003 G A missense c.2305C>T 25.3 0 0 1 TLR5 chr1:223284444 rs5744175 0.007 T A missense c.1930A>T 15.91 1 0 1 TLR5 chr1:223284528 rs5744174 0.381 A G missense c.1846T>C 0.003 28 9 40 TLR5 chr1:223284599 rs2072493 0.151 T C missense c.1775A>G 0.002 16 6 18 TLR5 chr1:223284915 rs5744171 0.006 G T missense c.1459C>A 18.10 1 0 1 TLR5 chr1:223286129 rs764535 0.005 G A missense c.245C>T 7.735 2 0 1 TLR5 chr1:223286191 rs5744165 0.022 G A synonymous c.183C>T 0.459 2 0 2 NLRP3 chr1:247587343 rs121908147 0.008 G A missense c.598G>A 0.023 0 0 2 NLRP3 chr1:247587408 rs7525979 0.083 C T synonymous c.663C>T 0.015 6 1 9 NLRP3 chr1:247587477 rs3806268 0.411 G A synonymous c.732G>A 0.247 39 16 53 NLRP3 chr1:247587531 rs4925543 0.944 A G synonymous c.786A>G 6.626 52 19 67 NLRP3 chr1:247587681 rs143840033 0.001 C T synonymous c.936C>T 0.226 1 1 4 NLRP3 chr1:247587982 rs148478875 0.006 C T synonymous c.1237C>T 9.987 2 1 2 NLRP3 chr1:247588053 rs34298354 0.100 C T synonymous c.1308C>T 7.766 10 5 15 215 NLRP3 chr1:247588140 rs111400208 0.003 C T synonymous c.1395C>T 0.521 0 1 4 NLRP3 chr1:247588152 rs141637807 <0.001 C T synonymous c.1407C>T 6.780 3 1 3 NLRP3 chr1:247588225 ND ND C A missense c.1480C>A 23.3 2 1 2 NLRP3 chr1:247588858 rs35829419 0.038 C A missense c.2113C>A 2.170 7 0 9 NLRC4 chr2:32449832 rs61754192 0.007 C A missense c.2785G>T 5.770 0 0 1 NLRC4 chr2:32460512 rs34716166 0.001 A G synonymous c.2740T>C 1.759 2 0 2 NLRC4 chr2:32475109 rs455060 0.596 G A synonymous c.1824C>T 0.614 44 17 54 NLRC4 chr2:32475391 rs35653927 0.008 T C synonymous c.1542A>G 0.192 1 1 3 NLRC4 chr2:32476390 rs408813 0.558 T G synonymous c.543A>C 11.89 44 17 54 NLRC4 chr2:32476528 ND ND T C synonymous c.405A>G 10.47 2 0 1 TLR9 chr3:52255392 rs445676 0.011 G A synonymous c.2940C>T 1.061 1 1 3 TLR9 chr3:52255744 rs5743845 0.008 C T missense c.2588G>A 0.004 0 1 0 TLR9 chr3:52255818 rs138032346 0.002 G A synonymous c.2514C>T 9.084 1 0 1 TLR9 chr3:52256697 rs352140 0.490 C T synonymous c.1635G>A 0.061 41 14 51 TLR9 chr3:52256707 rs200585692 <0.001 G A missense c.1625C>T 22.4 0 0 1 TLR9 chr3:52256805 rs35342983 0.005 C T synonymous c.1527G>A 0.171 0 1 0 TLR9 chr3:52257183 rs35654187 0.006 C T synonymous c.1149G>A 0.887 0 1 0 TLR9 chr3:52257240 rs138527358 <0.001 G A synonymous c.1092C>T 0.239 0 1 0 TLR9 chr3:52257600 rs150165198 <0.001 G A synonymous c.732C>T 0.058 0 1 0 TLR10 chr4:38774785 rs10776482 0.245 A G synonymous c.2427T>C 1.262 32 12 42 TLR10 chr4:38774889 rs4129009 0.162 T C missense c.2323A>G 0.140 27 11 37 TLR10 chr4:38774898 rs145139818 0.001 G A stop gained c.2314C>T 35 1 0 1 TLR10 chr4:38775040 rs10776483 0.252 A G synonymous c.2172T>C 5.260 32 12 43 TLR10 chr4:38775043 rs747963911 <0.001 A T missense c.2169T>A 20.9 1 1 2 TLR10 chr4:38775502 rs149045737 0.002 G A synonymous c.1710C>T 0.032 1 1 0 216 TLR10 chr4:38775639 rs11466658 0.026 G A missense c.1573C>T 10.90 3 4 4 TLR10 chr4:38775794 rs11466657 0.025 A G missense c.1418T>C 19.86 11 4 15 TLR10 chr4:38776070 rs11466655 0.031 C T missense c.1142G>A 4.061 4 0 5 TLR10 chr4:38776107 rs11096955 0.414 T G missense c.1105A>C 11.06 36 16 46 TLR10 chr4:38776180 rs11096956 0.246 C A synonymous c.1032G>T 6.344 31 12 42 TLR10 chr4:38776235 rs11466653 0.060 A G missense c.977T>C 24.5 5 1 5 TLR10 chr4:38776303 rs11466652 0.167 T C synonymous c.909A>G 7.827 8 6 11 TLR10 chr4:38776320 rs11466651 0.061 C T missense c.892G>A 14.71 6 1 5 TLR10 chr4:38776491 rs11096957 0.415 T G missense c.721A>C 21.5 37 17 49 TLR10 chr4:38776725 rs11466649 0.067 C A missense c.487G>T 19.23 6 1 5 TLR10 chr4:38776862 rs761695729 <0.001 G T missense c.350C>A 11.94 2 0 1 TLR10 chr4:38776925 rs138645932 0.003 T C missense c.287A>G 17.54 2 0 1 TLR10 chr4:38777059 rs10856837 0.084 C T synonymous c.153G>A 1.148 7 1 7 TLR10 chr4:38777173 rs10856838 0.243 A T synonymous c.39T>A 5.162 15 7 18 TLR1 chr4:38798648 rs5743618 0.522 C A missense c.1805G>T 12.42 38 15 49 TLR1 chr4:38798935 rs5743614 0.378 C T synonymous c.1518G>A 0.069 10 4 12 TLR1 chr4:38799315 rs200264939 <0.001 G A stop gained c.1138C>T 35 1 0 1 TLR1 chr4:38799539 rs3923647 0.028 T A missense c.914A>T 18.82 4 4 5 TLR1 chr4:38799710 rs4833095 0.383 T C missense c.743A>G 0.171 36 15 48 TLR1 chr4:38800101 rs5743612 0.011 G A missense c.352C>T 14.95 1 1 2 TLR1 chr4:38800214 rs5743611 0.073 C G missense c.239G>C 16.39 5 2 9 TLR1 chr4:38800339 rs5743610 0.020 G A synonymous c.114C>T 0.072 2 3 3 TLR6 chr4:38828827 rs5743821 0.001 C A synonymous c.2268G>T 0.024 2 0 0 TLR6 chr4:38828828 rs5743820 0.010 G A missense c.2267C>T 8.520 3 0 2 TLR6 chr4:38829163 rs5743818 0.196 A C synonymous c.1932T>G 1.870 10 3 13 217 TLR6 chr4:38829815 rs5743815 0.019 A G missense c.1280T>C 0.302 1 1 1 TLR6 chr4:38829832 rs3775073 0.382 T C synonymous c.1263A>G 4.608 17 8 22 TLR6 chr4:38830012 rs3821985 0.379 G C synonymous c.1083C>G 15.79 18 9 25 TLR6 chr4:38830350 rs5743810 0.727 A G missense c.745T>C 8.300 41 17 60 TLR2 chr4:154624173 rs5743697 0.001 C A synonymous c.114C>A 2.880 0 0 3 TLR2 chr4:154624656 rs3804099 0.411 T C synonymous c.597T>C 0.124 21 8 37 TLR2 chr4:154625409 rs3804100 0.087 T C synonymous c.1350T>C 0.190 2 2 9 TLR2 chr4:154625682 rs5743700 0.038 C T synonymous c.1623C>T 5.787 2 1 3 TLR2 chr4:154625951 rs5743704 0.028 C A missense c.1892C>A 24.6 1 1 1 TLR2 chr4:154626402 rs5743709 0.024 G A synonymous c.2343G>A 5.895 1 1 0 TLR3 chr4:187003729 rs35311343 0.001 C G missense c.889C>G 23.1 2 0 2 TLR3 chr4:187004074 rs3775291 0.274 C T missense c.1234C>T 24.0 21 9 34 TLR3 chr4:187004216 ND ND TC T frameshift variant c.1377delC ND 0 0 1 TLR3 chr4:187004217 rs3775290 0.298 C T synonymous c.1377C>T 6.904 24 8 36 TLR3 chr4:187005865 rs73873710 0.025 C T synonymous c.2553C>T 10.10 3 1 2 NOD1 chr7:30477264 ND ND C A missense c.2462G>T 27.9 0 0 2 NOD1 chr7:30490975 rs149096738 0.001 G A synonymous c.2058C>T 2.056 2 0 1 NOD1 chr7:30491311 rs2075821 0.267 C T synonymous c.1722G>A 0.012 21 7 23 NOD1 chr7:30491919 rs5743342 0.004 C T missense c.1114G>A 4.017 0 0 1 NOD1 chr7:30492237 rs2075820 0.271 C T missense c.796G>A 22.7 22 7 24 NOD1 chr7:30492550 rs2235099 0.272 G A synonymous c.483C>T 5.629 22 7 24 NOD1 chr7:30492598 rs5743340 0.011 C A synonymous c.435G>T 10.77 1 0 3 NOD1 chr7:30496382 rs2075818 0.283 G C synonymous c.156C>G 0.160 22 7 24 TLR4 chr9:120474895 rs5030712 <0.001 A G synonymous c.489A>G 6.108 3 0 0 218 TLR4 chr9:120475248 rs137853920 0.002 G A missense c.842G>A 23.1 0 2 1 TLR4 chr9:120475302 rs4986790 0.061 A G missense c.896A>G 12.03 10 1 9 TLR4 chr9:120475468 rs56070048 0.003 A G synonymous c.1062A>G 2.499 3 1 3 TLR4 chr9:120475602 rs4986791 0.056 C T missense c.1196C>T 11.38 10 1 9 NLRP6 chr11:280221 rs6421985 0.789 A C missense c.487A>C 11.19 49 18 65 NLRP6 chr11:280294 rs76744706 0.007 G A missense c.560G>A 15.83 2 1 1 NLRP6 chr11:280464 rs77447196 0.175 C G missense c.730C>G 13.14 19 6 22 NLRP6 chr11:280529 rs199475803 <0.001 G A synonymous c.795G>A 13.82 1 0 2 NLRP6 chr11:280673 rs12807092 0.688 C T synonymous c.939C>T 13.44 49 18 64 NLRP6 chr11:280816 rs113686637 0.793 AT TC missense c.1082_1083delATins TC ND 51 18 66 NLRP6 chr11:281300 rs143558820 <0.001 G C synonymous c.1566G>C 5.979 3 0 1 NLRP6 chr11:281830 rs772833407 <0.001 G C missense c.2096G>C 19.97 2 1 0 NLRP6 chr11:284257 rs11246050 0.155 G A synonymous c.2229G>A 1.066 16 6 13 NLRP6 chr11:284299 rs7108261 0.052 A G synonymous c.2271A>G 1.097 8 2 4 NLRP6 chr11:284341 rs7108246 0.045 G A synonymous c.2313G>A 0.046 4 3 9 NLRP6 chr11:284477 rs74044411 0.019 T C missense c.2375T>C 13.47 3 1 2 NLRP6 chr11:284538 rs6598047 0.661 T C synonymous c.2436T>C 0.937 50 18 67 NLRP14 chr11:7059825 rs150458659 0.002 A G missense c.8A>G 14.10 1 1 1 NLRP14 chr11:7059827 rs149195401 <0.001 T A missense c.10T>A 3.203 1 1 2 NLRP14 chr11:7059960 rs12801277 0.989 A C missense c.143A>C 2.918 52 19 67 NLRP14 chr11:7059981 rs61063081 0.147 G A missense c.164G>A 19.95 24 9 35 NLRP14 chr11:7060092 rs16921697 0.062 A G missense c.275A>G 17.79 3 2 2 NLRP14 chr11:7060948 rs117823353 0.026 C T missense c.293C>T 8.629 3 3 2 219 NLRP14 chr11:7063651 ND ND G GA frameshift variant c.399dupA ND 1 1 0 NLRP14 chr11:7063755 rs7123944 0.985 C T synonymous c.498C>T 9.783 52 19 67 NLRP14 chr11:7063850 ND ND T C missense c.593T>C 25.4 0 0 1 NLRP14 chr11:7064457 rs76429148 0.040 T C synonymous c.1200T>C 7.400 4 4 3 NLRP14 chr11:7064551 rs140537839 0.002 G T missense c.1294G>T 24.7 1 1 1 NLRP14 chr11:7071031 rs1552726 0.978 G A synonymous c.2253G>A 7.815 52 19 67 NLRP14 chr11:7071046 rs191925618 <0.001 A G synonymous c.2268A>G 7.041 1 0 0 NLRP14 chr11:7079038 rs10839708 0.604 G A missense c.2422G>A 24.3 39 13 54 NLRP14 chr11:7081202 rs753514126 <0.001 A G missense c.2711A>G 22.7 1 1 1 NLRP14 chr11:7081265 rs371450991 <0.001 G A missense c.2774G>A 14.59 0 0 1 NLRP14 chr11:7083610 rs117124176 0.026 T A missense c.2851T>A 24.2 3 3 2 NLRP14 chr11:7083620 rs117583918 0.029 T C missense c.2861T>C 9.202 4 4 3 NLRP14 chr11:7091569 rs17280682 0.147 C T missense c.3028C>T 15.82 24 9 35 NLRP10 chr11:7981261 rs116880092 0.013 C T missense c.1898G>A 3.243 4 1 2 NLRP10 chr11:7981294 ND ND TGGA TGA frameshift variant c.1863delC ND 1 0 0 NLRP10 chr11:7981366 rs201769171 <0.001 C T missense c.1793G>A 0.989 2 0 2 NLRP10 chr11:7981521 rs11608118 0.071 C T synonymous c.1638G>A 6.733 16 6 8 NLRP10 chr11:7982016 rs143970775 <0.001 G A synonymous c.1143C>T 1.253 3 0 1 NLRP10 chr11:7982094 rs12363522 0.040 G A synonymous c.1065C>T 0.199 7 1 12 PANX1 chr11:93862493 rs1138800 0.678 A C missense c.15A>C 18.17 48 17 56 PANX1 chr11:93913036 rs12793348 0.103 A G missense c.814A>G 0.586 6 0 6 PANX1 chr11:93913988 . ND A T missense c.1234A>T 16.64 0 0 1 NLRX1 chr11:119042152 rs11828801 0.004 T C missense c.40T>C 16.76 3 2 3 220 NLRX1 chr11:119043656 rs643423 0.564 C T missense c.187C>T 0.010 45 15 59 NLRX1 chr11:119045723 rs145673513 <0.001 C T missense c.1411C>T 26.1 2 0 1 NLRX1 chr11:119045951 rs145779362 0.007 C T missense c.1639C>T 25.8 0 0 2 NLRX1 chr11:119050850 rs146800118 <0.001 G A missense c.2120G>A 24.8 2 0 1 NLRX1 chr11:119050896 rs145666904 0.017 C T synonymous c.2166C>T 1.712 1 0 1 NLRX1 chr11:119052826 rs4245191 0.564 C A missense c.2378C>A 6.813 44 15 59 PANX3 chr11:124481494 rs35027803 0.053 T C synonymous c.42T>C 11.08 4 3 14 PANX3 chr11:124489274 rs35569094 0.013 A G missense c.622A>G 16.56 4 2 3 PANX3 chr11:124489567 rs34237602 0.021 T C synonymous c.915T>C 16.91 3 1 3 P2RX7 chr12:121592689 rs17525809 0.057 T C missense c.227T>C 4.624 6 4 10 P2RX7 chr12:121600238 rs28360447 0.012 G A missense c.448G>A 27.8 3 0 1 P2RX7 chr12:121600252 rs28360448 0.020 G A synonymous c.462G>A 0.391 3 0 0 P2RX7 chr12:121600253 rs208294 0.520 T C missense c.463T>C 23.5 46 14 56 P2RX7 chr12:121605355 rs7958311 0.247 G A missense c.809G>A 20.5 36 12 42 P2RX7 chr12:121605373 rs7958316 0.017 G A missense c.827G>A 25.2 3 1 5 P2RX7 chr12:121615103 rs1718119 0.354 G A missense c.1042G>A 18.70 30 6 35 P2RX7 chr12:121615131 rs2230911 0.139 C G missense c.1070C>G 22.3 7 6 21 P2RX7 chr12:121618257 rs10160951 0.017 C G missense c.1289C>G 22.4 3 0 2 P2RX7 chr12:121622196 rs2230912 0.129 A G missense c.1379A>G 16.98 17 1 18 P2RX7 chr12:121622239 rs3751144 0.139 C T synonymous c.1422C>T 8.917 7 6 21 P2RX7 chr12:121622304 rs3751143 0.184 A C missense c.1487A>C 27.7 10 5 15 P2RX7 chr12:121622419 rs3751142 0.140 G T synonymous c.1602G>T 17.13 7 6 21 P2RX7 chr12:121622520 rs1653624 0.984 A T missense c.1703A>T 22.1 52 19 67 P2RX4 chr12:121655063 rs2303998 0.014 G A synonymous c.261G>A 1.079 0 0 1 P2RX4 chr12:121659917 rs25642 0.051 G A synonymous c.375G>A 3.319 3 3 3 221 P2RX4 chr12:121660787 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0.039 T C synonymous c.2910A>G 0.131 2 2 5 NLRP1 chr17:5440248 rs11657249 0.040 T C synonymous c.2883A>G 0.061 2 2 5 NLRP1 chr17:5445243 rs11657747 0.043 G A missense c.2633C>T 0.065 2 2 5 NLRP1 chr17:5445314 rs12942931 0.042 G A synonymous c.2562C>T 1.785 2 2 5 NLRP1 chr17:5461671 rs52795654 0.049 G C missense c.2345C>G 0.557 2 2 5 NLRP1 chr17:5461847 rs61753136 0.049 G A synonymous c.2169C>T 6.055 0 0 1 NLRP1 chr17:5462007 rs61753139 <0.001 G A missense c.2009C>T 12.73 1 1 1 NLRP1 chr17:5462135 rs12950235 0.049 T C synonymous c.1881A>G 11.08 2 2 5 NLRP1 chr17:5462171 rs61753140 0.006 G A synonymous c.1845C>T 0.689 3 0 1 NLRP1 chr17:5462240 rs61753142 0.061 C T synonymous c.1776G>A 0.513 12 4 11 NLRP1 chr17:5462654 rs2001363 0.047 G A synonymous c.1362C>T 0.515 2 2 5 NLRP1 chr17:5463194 rs148499417 <0.001 A C missense c.822T>G 0.547 1 1 1 NLRP1 chr17:5463279 rs11651595 0.042 G C missense c.737C>G 0.017 2 2 5 NLRP1 chr17:5463280 rs61754792 <0.001 T C missense c.736A>G 0.002 1 1 1 NLRP1 chr17:5485367 rs12150220 0.361 A T missense c.464T>A 16.17 36 15 47 NLRP1 chr17:5486027 ND ND CA C frameshift variant c.410delT ND 0 1 0 NLRP1 chr17:5487164 rs884367 0.236 C G synonymous c.114G>C 0.489 24 8 29 227 NLRP12 chr19:54301594 rs104895570 0.003 G T synonymous c.2830C>A 0.613 1 1 2 NLRP12 chr19:54301640 rs104895569 0.004 G A synonymous c.2784C>T 0.042 2 0 1 NLRP12 chr19:54307322 rs12460528 0.523 G A synonymous c.2469C>T 0.525 44 18 58 NLRP12 chr19:54307322 rs12460528 0.072 G T synonymous c.2469C>A 0.379 7 2 8 NLRP12 chr19:54308554 rs4806773 0.849 C T synonymous c.2394G>A 0.064 50 19 66 NLRP12 chr19:54312963 ND ND G A synonymous c.1950C>T 6.226 2 0 2 NLRP12 chr19:54313566 rs111234757 0.007 G C synonymous c.1347C>G 0.404 1 0 2 NLRP12 chr19:54313707 rs34971363 0.050 G C missense c.1206C>G 14.89 10 3 12 NLRP12 chr19:54313957 rs35401786 0.002 G C missense c.956C>G 19.31 2 0 1 NLRP12 chr19:54314489 rs34330210 0.002 C T missense c.424G>A 26.8 2 0 1 NLRP12 chr19:54327313 rs34436714 0.227 C A missense c.116G>T 17.05 18 7 22 NLRP7 chr19:55435139 rs144955489 <0.001 G A missense c.2912C>T 5.360 0 1 0 NLRP7 chr19:55441889 rs201379032 <0.001 T A missense c.2788A>T 0.224 0 1 3 NLRP7 chr19:55441902 rs269950 0.584 T C synonymous c.2775A>G 0.161 46 16 53 NLRP7 chr19:55441995 rs269951 0.584 A G synonymous c.2682T>C 0.029 45 15 53 NLRP7 chr19:55445037 rs139417508 <0.001 G A synonymous c.2542C>T 4.343 1 0 1 NLRP7 chr19:55449447 rs104895524 0.002 G A synonymous c.2094C>T 0.005 3 0 2 NLRP7 chr19:55450462 rs73055288 0.036 C A synonymous c.1725G>T 0.025 4 4 11 NLRP7 chr19:55450655 rs61743949 0.015 T C missense c.1532A>G 0.037 2 0 3 NLRP7 chr19:55450696 rs775880 0.048 G A synonymous c.1491C>T 0.166 6 2 5 NLRP7 chr19:55450724 rs772746060 ND TCCC T frameshift variant c.1460_1462delGGG ND 2 1 1 NLRP7 chr19:55450727 rs775881 <0.001 C T missense c.1460G>A 2.344 3 1 4 NLRP7 chr19:55450746 rs61747414 0.089 C T missense c.1441G>A 1.088 7 4 12 228 NLRP7 chr19:55451050 rs10418277 0.208 C T synonymous c.1137G>A 0.174 20 11 29 NLRP7 chr19:55451083 rs1654636 <0.001 A C missense c.1104T>G 0.081 0 1 0 NLRP7 chr19:55451229 rs754786619 <0.001 T G synonymous c.958A>C 0.385 0 0 1 NLRP7 chr19:55451232 rs775882 0.245 C T missense c.955G>A 0.001 22 13 32 NLRP7 chr19:55451256 rs79513034 0.014 G T missense c.931C>A 0.731 2 0 4 NLRP7 chr19:55451258 rs77812009 0.014 T C missense c.929A>G 0.001 2 0 4 NLRP7 chr19:55451797 rs775883 0.345 C T synonymous c.390G>A 0.026 28 14 39 NLRP2 chr19:55481394 rs142463014 0.008 C T missense c.11C>T 14.46 0 0 3 NLRP2 chr19:55481398 rs269912 0.147 G A synonymous c.15G>A 0.335 15 5 25 NLRP2 chr19:55481546 rs756248472 <0.001 C G missense c.163C>G 22.3 1 1 1 NLRP2 chr19:55485899 rs2217659 0.179 G A synonymous c.312G>A 0.420 25 2 23 NLRP2 chr19:55493651 rs10403648 0.101 C T synonymous c.585C>T 0.812 0 1 0 NLRP2 chr19:55493728 rs17699678 0.088 C T missense c.662C>T 18.02 16 5 26 NLRP2 chr19:55493847 rs56073572 0.065 C T synonymous c.781C>T 0.303 12 5 16 NLRP2 chr19:55494126 rs61735077 0.005 A G missense c.1060A>G 0.001 2 0 2 NLRP2 chr19:55494157 rs4306647 0.099 G A missense c.1091G>A 15.34 0 1 0 NLRP2 chr19:55494188 rs3826883 0.164 C T synonymous c.1122C>T 0.016 18 7 28 NLRP2 chr19:55494283 rs139903547 0.006 C G missense c.1217C>G 19.04 2 1 2 NLRP2 chr19:55494320 rs61735078 0.020 G A synonymous c.1254G>A 0.049 7 1 3 NLRP2 chr19:55494466 rs147804224 <0.001 G A missense c.1400G>A 1.755 2 0 0 NLRP2 chr19:55494540 rs113204023 0.001 G A missense c.1474G>A 8.955 2 0 2 NLRP2 chr19:55494563 rs138179625 <0.001 C T synonymous c.1497C>T 0.143 0 1 0 NLRP2 chr19:55494632 rs3745905 0.109 A G synonymous c.1566A>G 0.194 0 1 0 NLRP2 chr19:55494637 rs149295176 <0.001 A G missense c.1571A>G 9.179 0 1 3 229 NLRP2 chr19:55494651 rs34804158 0.180 A G missense c.1585A>G 0.001 16 7 27 NLRP2 chr19:55494740 rs10412915 0.290 T C synonymous c.1674T>C 0.150 25 8 31 NLRP2 chr19:55494881 rs11672113 0.333 C G synonymous c.1815C>G 0.058 29 11 43 NLRP2 chr19:55495008 rs201735558 <0.001 C G missense c.1942C>G 12.04 1 0 3 NLRP2 chr19:55496494 rs61733928 0.020 C T synonymous c.2110C>T 0.179 7 1 3 NLRP2 chr19:55497556 rs753727675 <0.001 C G missense c.2239C>G 13.35 0 1 0 NLRP2 chr19:55501424 rs117066658 0.009 G A missense c.2401G>A 9.513 0 0 2 NLRP2 chr19:55501447 rs61735087 0.011 A G synonymous c.2424A>G 0.131 4 0 4 NLRP2 chr19:55505686 rs145736130 <0.001 C G missense c.2758C>G 0.437 2 0 1 NLRP2 chr19:55512137 rs12768 0.559 C A synonymous c.3060C>A 0.024 46 14 55 NLRP2 chr19:55512232 rs1043673 0.370 C A missense c.3155C>A 0.542 34 14 45 NLRP9 chr19:56223314 rs148511077 0.006 G A missense c.2695C>T 0.032 2 0 2 NLRP9 chr19:56241265 rs193384 0.999 A G synonymous c.1926T>C 0.161 52 19 67 NLRP9 chr19:56244398 rs199546349 <0.001 G A missense c.799C>T 18.77 1 0 0 NLRP9 chr19:56244558 rs747611549 <0.001 G A synonymous c.639C>T 0.082 0 0 1 NLRP9 chr19:56244837 rs45597436 0.007 A G synonymous c.360T>C 1.275 2 0 2 NLRP9 chr19:56249672 rs56211941 0.211 A G synonymous c.69T>C 13.98 19 10 16 NLRP11 chr19:56307553 rs114591455 0.030 G A synonymous c.2235C>T 0.145 0 0 1 NLRP11 chr19:56307583 rs2616940 0.701 A G synonymous c.2205T>C 0.079 45 17 64 NLRP11 chr19:56320200 rs16986626 0.099 C T synonymous c.1776G>A 0.707 7 2 9 NLRP11 chr19:56320629 rs140090548 0.003 T G synonymous c.1347A>C 0.060 2 0 1 NLRP11 chr19:56320663 rs12461110 0.315 G A missense c.1313C>T 0.149 39 13 51 NLRP11 chr19:56321295 rs12977654 0.086 G A synonymous c.681C>T 3.192 1 1 2 NLRP11 chr19:56321414 rs299163 0.956 C A missense c.562G>T 0.011 52 19 67 230 NLRP11 chr19:56321517 rs7249635 0.089 T C synonymous c.459A>G 3.591 3 1 2 NLRP11 chr19:56329334 rs8113630 0.067 G C synonymous c.207C>G 0.040 6 4 10 NLRP11 chr19:56329447 rs76935241 <0.001 G A missense c.94C>T 16.95 2 0 0 NLRP4 chr19:56369189 rs441827 0.443 G A missense c.430G>A 0.002 29 12 39 NLRP4 chr19:56369215 rs395503 0.477 C T synonymous c.456C>T 4.856 29 12 39 NLRP4 chr19:56369314 rs16986718 0.239 G A synonymous c.555G>A 0.002 30 7 37 NLRP4 chr19:56369572 rs34062458 0.043 G A synonymous c.813G>A 0.159 7 2 9 NLRP4 chr19:56369593 rs421810 0.473 T C synonymous c.834T>C 0.102 31 12 44 NLRP4 chr19:56369908 rs17857373 0.036 G C missense c.1149G>C 0.056 6 2 9 NLRP4 chr19:56369914 rs113444208 0.004 C T synonymous c.1155C>T 0.193 3 0 1 NLRP4 chr19:56370166 rs379327 0.126 C T synonymous c.1407C>T 0.127 5 3 12 NLRP4 chr19:56373462 rs12462372 0.079 G A missense c.2123G>A 0.036 4 2 4 NLRP4 chr19:56388527 rs117456828 0.022 T A synonymous c.2691T>A 0.180 4 3 3 NLRP4 chr19:56390202 rs139521551 0.004 C G synonymous c.2739C>G 0.041 1 0 0 NLRP4 chr19:56390237 rs302453 0.210 A T missense c.2774A>T 0.207 23 7 36 NLRP4 chr19:56392875 rs302456 0.256 T G synonymous c.2907T>G 0.075 29 8 38 NLRP4 chr19:56392920 rs12975929 0.249 C T synonymous c.2952C>T 0.070 16 8 16 NLRP13 chr19:56410222 rs302827 0.270 C T synonymous c.2871G>A 0.308 29 13 43 NLRP13 chr19:56413532 rs7258847 0.232 G A synonymous c.2658C>T 0.175 15 4 19 NLRP13 chr19:56416409 rs28506091 0.069 G A synonymous c.2517C>T 0.003 9 2 8 NLRP13 chr19:56419263 rs17711239 0.105 T C missense c.2342A>G 11.76 12 6 15 NLRP13 chr19:56423074 rs977070 0.478 C G synonymous c.2109G>C 0.841 33 15 48 NLRP13 chr19:56423074 rs977070 ND C T synonymous c.2109G>A 1.425 2 0 1 NLRP13 chr19:56423254 rs304002 0.477 G A synonymous c.1929C>T 0.033 33 15 48 231 NLRP13 chr19:56423668 rs304001 0.595 G A synonymous c.1515C>T 0.243 43 19 59 NLRP13 chr19:56423692 rs304000 0.600 C T synonymous c.1491G>A 0.070 43 19 59 NLRP13 chr19:56423728 rs303999 0.601 A G synonymous c.1455T>C 0.514 43 19 59 NLRP13 chr19:56423869 rs61742924 0.015 C T synonymous c.1314G>A 0.047 2 1 3 NLRP13 chr19:56423893 rs303998 0.595 G A synonymous c.1290C>T 0.368 43 19 59 NLRP13 chr19:56424443 rs303997 0.601 T C missense c.740A>G 15.23 43 19 59 NLRP13 chr19:56424532 rs731338 0.121 G A synonymous c.651C>T 0.224 21 8 26 NLRP13 chr19:56443467 rs149110821 <0.001 G T missense c.211C>A 14.94 2 3 2 NLRP13 chr19:56443519 rs12610617 0.046 C T synonymous c.159G>A 0.101 3 0 1 NLRP8 chr19:56459342 rs306507 0.655 C T missense c.74C>T 10.41 48 18 63 NLRP8 chr19:56459458 rs61195059 0.056 C T missense c.190C>T 0.029 5 2 12 NLRP8 chr19:56459587 rs371245984 <0.001 A G missense c.319A>G 0.053 2 1 1 NLRP8 chr19:56459614 rs306506 0.657 G C missense c.346G>C 5.898 48 18 63 NLRP8 chr19:56466124 rs11880691 0.018 G A missense c.700G>A 0.003 2 1 1 NLRP8 chr19:56466227 rs7259764 0.057 A G missense c.803A>G 7.168 5 2 12 NLRP8 chr19:56467281 rs61750024 0.052 A G synonymous c.1857A>G 0.158 5 2 12 NLRP8 chr19:56467375 rs41481648 0.086 C T missense c.1951C>T 14.02 13 7 14 NLRP8 chr19:56473460 rs6509975 0.318 T C synonymous c.2070T>C 0.943 30 11 35 NLRP8 chr19:56473561 rs147934431 0.002 C A missense c.2171C>A 6.773 2 0 1 NLRP8 chr19:56477687 rs306497 0.816 A G synonymous c.2322A>G 0.167 50 18 67 NLRP8 chr19:56477710 rs306496 0.588 T C missense c.2345T>C 6.687 42 16 56 NLRP8 chr19:56485077 rs61740015 0.062 A G missense c.2594A>G 4.045 9 1 8 NLRP8 chr19:56487603 rs306481 0.573 A G missense c.2810A>G 0.037 45 14 54 NLRP8 chr19:56490778 rs306475 0.635 C T synonymous c.2895C>T 0.967 47 18 63 232 NLRP8 chr19:56499279 rs306457 0.746 G C stop_lost c.3147G>C 0.002 48 18 64 NLRP5 chr19:56515331 rs35669530 0.030 C T synonymous c.312C>T 0.753 2 3 8 NLRP5 chr19:56515334 rs1560691 0.165 C T synonymous c.315C>T 0.029 12 5 11 NLRP5 chr19:56538520 rs34274738 0.014 A G synonymous c.921A>G 0.023 2 3 2 NLRP5 chr19:56538832 rs1808663 0.050 C T synonymous c.1233C>T 0.369 13 4 17 NLRP5 chr19:56538966 rs200829045 0.001 G A missense c.1367G>A 0.065 0 1 0 NLRP5 chr19:56538976 rs471979 0.123 G C missense c.1377G>C 2.824 7 2 9 NLRP5 chr19:56539224 rs112347103 <0.001 G A missense c.1625G>A 0.001 2 0 2 NLRP5 chr19:56539240 rs397977 0.429 C T synonymous c.1641C>T 0.016 32 11 46 NLRP5 chr19:56543982 rs17713875 0.028 G T missense c.2282G>T 0.327 5 0 5 NLRP5 chr19:56549510 rs16986899 0.201 T C missense c.2735T>C 1.284 14 6 14 NLRP5 chr19:56549532 rs306447 0.251 A G synonymous c.2757A>G 0.714 18 8 18 NLRP5 chr19:56552456 rs61732213 0.202 G T synonymous c.2955G>T 5.287 7 6 16 NLRP5 chr19:56565127 rs392801 0.150 G A synonymous c.3252G>A 0.030 18 7 21 NLRP5 chr19:56565164 rs3103057 0.953 G A missense c.3289G>A 7.995 52 19 67 NLRP5 chr19:56569629 rs12462795 0.165 C G missense c.3323C>G 19.34 10 3 15 NLRP5 chr19:56572832 rs10409555 0.298 G A missense c.3541G>A 0.001 17 7 25 NLRP5 chr19:56572875 rs36118060 0.165 G A missense c.3584G>A 20.2 11 3 18 SLC17A9 chr20:61588159 rs2245341 0.719 A G synonymous c.102A>G 1.931 47 18 59 SLC17A9 chr20:61588865 rs76379118 0.052 C T synonymous c.330C>T 0.186 4 2 5 SLC17A9 chr20:61594105 ND ND A G synonymous c.627A>G 21.1 0 0 1 SLC17A9 chr20:61594679 rs2427463 0.991 A G missense c.683A>G 0.058 52 19 67 SLC17A9 chr20:61595614 rs199653809 0.001 C T missense c.857C>T 23.2 3 1 3 SLC17A9 chr20:61595636 rs2248900 0.202 C T synonymous c.879C>T 0.146 13 1 11 233 SLC17A9 chr20:61598731 rs7271712 0.027 C T missense c.1190C>T 24.2 5 2 3 PANX2 chr22:50615417 rs150278474 0.002 G A synonymous c.276G>A 9.896 1 0 0 PANX2 chr22:50616806 rs5771206 0.593 A G synonymous c.1665A>G 10.47 4 0 2 PANX2 chr22:50617593 ND ND GGC G frameshift variant c.1922_1923delGC ND 0 1 0 TLR7 chrX:12903659 rs179008 0.179 A T missense c.32A>T 5.466 20 10 24 TLR7 chrX:12905286 rs201852856 <0.001 G A synonymous c.1659G>A 11.32 2 1 2 TLR7 chrX:12905676 ND ND CA C frameshift variant c.2054delA ND 0 0 1 TLR7 chrX:12906030 rs864058 0.082 G A synonymous c.2403G>A 1.750 7 3 13 TLR7 chrX:12906386 rs189681811 <0.001 G A missense c.2759G>A 16.49 2 0 1 TLR8 chrX:12924826 rs3764880 0.305 A G missense c.1A>G 0.540 27 7 33 TLR8 chrX:12937513 rs2159377 0.268 C T synonymous c.354C>T 1.462 19 4 18 TLR8 chrX:12937804 rs5744080 0.525 C T synonymous c.645C>T 0.192 34 12 41 TLR8 chrX:12939112 rs2407992 0.543 G C synonymous c.1953G>C 0.042 34 12 41 TLR8 chrX:12939201 ND ND G A stop gained c.2042G>A 38 0 0 1 TLR8 chrX:12939412 rs3747414 0.450 C A synonymous c.2253C>A 1.842 30 10 34 TLR8 chrX:12939928 rs2109135 0.997 T C synonymous c.2769T>C 9.153 51 18 66 234 Anexo III: Disponibilidad de los datos Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este estudio están disponibles en el repositorio European Genome-Phenome Archive bajo el número de referencia EGAD00001005952, en la siguiente dirección https://ega- archive.org/datasets/EGAD00001005952. https://ega-archive.org/datasets/EGAD00001005952 https://ega-archive.org/datasets/EGAD00001005952 Tesis Laura Torre Fuentes PORTADA LISTADO DE ABREVIATURAS ÍNDICE DE TABLAS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 3. MATERIALES Y MÉTODOS 4. RESULTADOS 5. DISCUSIÓN 6. CONCLUSIONES RESUMEN ABSTRACT BIBLIOGRAFÍA ANEXOS