UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA TESIS DOCTORAL Estudio sobre la funcionalidad de los macrófagos renales de la trucha arcoíris en situaciones de estrés MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Lorenzo García Muñoz Directores José Antonio García Cabrera Luis Revuelta Rueda Madrid © Lorenzo García Muñoz, 2023 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA TESIS DOCTORAL ESTUDIO SOBRE LA FUNCIONALIDAD DE LOS MACRÓFAGOS RENALES DE LA TRUCHA ARCOÍRIS EN SITUACIONES DE ESTRÉS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR LORENZO GARCÍA MUÑOZ DIRECTORES JOSÉ ANTONIO GARCÍA CABRERA LUIS REVUELTA RUEDA 1 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA DOCTORADO EN VETERINARIA TESIS DOCTORAL ESTUDIO SOBRE LA FUNCIONALIDAD DE LOS MACRÓFAGOS RENALES DE LA TRUCHA ARCOÍRIS EN SITUACIONES DE ESTRÉS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Lorenzo García Muñoz Bajo la dirección de los doctores: José Antonio García Cabrera Luis Revuelta Rueda 2 4 5 6 ÍNDICE ÍNDICE ................................................................................................................................... 6 AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. 10 1. RESUMEN/ABSTRACT ................................................................................................... 15 1.1 RESUMEN ...................................................................................................................... 16 1.2 ABSTRACT ..................................................................................................................... 18 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 20 2.1 ACUICULTURA ............................................................................................................... 21 2.1.2 DATOS PRODUCTIVOS ........................................................................................... 22 2.1.3 TRUCHA ARCOÍRIS (Oncorhynchus mykiss) ........................................................... 23 2.1.3.1 FASES DEL CICLO DE CULTIVO ............................................................................ 24 2.1.3.2 CULTIVO TRUCHA ARCOÍRIS............................................................................... 26 2.1.3.3 MANEJO EN PISCIFACTORÍA DE ENGODE DE TRUCHA ARCOÍRIS ...................... 28 2.1.3.3.1 CONDICIONANTES AMBIENTALES ................................................................ 29 2.1.3.3.2 CONCENTRACIÓN PARA MANEJO (CROWDING) ........................................... 31 2.1.3.4 ESTADO ZOOSANITARIO ................................................................................... 33 2.1.3.4.1 VÍRICAS .......................................................................................................... 33 2.1.3.4.2 BACTERIANAS ................................................................................................ 34 2.1.3.4.3 FÚNGICAS ...................................................................................................... 34 2.1.3.4.4 PARASITARIAS ............................................................................................... 34 2.2. SISTEMA INMUNE TELEÓSTEOS. ................................................................................... 36 2.2.1 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 36 2.2.2 RESPUESTA INMUNE INESPECÍFICA ....................................................................... 37 2.2.2.1 BARRERAS DE SUPERFICIE ................................................................................. 38 2.2.2.2 FACTORES HUMORALES INESPECÍFICOS ........................................................... 38 2.2.2.2.1 COMPLEMENTO ............................................................................................ 38 2.2.2.2.2 PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS (AMP) ........................................................... 39 2.2.2.2.3 ENZIMAS LÍTICAS ........................................................................................... 39 2.2.2.2.4 LECTINAS ....................................................................................................... 40 2.2.2.2.5 ANTI-PROTEASAS ........................................................................................... 40 2.2.2.2.6 EICOSANOIDES .............................................................................................. 40 2.2.2.3 FACTORES CELULARES INESPECÍFICOS .............................................................. 41 2.2.2.3.1 CÉLULAS CITOTÓXICAS NATURALES ............................................................. 41 2.2.2.3.2 CÉLULAS FAGOCÍTICAS ................................................................................. 41 2.2.2.3.3 INFLAMACIÓN .............................................................................................. 43 2.2.3 RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA ........................................................................ 44 2.2.3.1 RESPUESTA HUMORAL ...................................................................................... 45 2.2.3.2 RESPUESTA CELULAR ........................................................................................ 47 2.2.4 MEDIADORES SOLUBLES DE INMUNIDAD ............................................................. 48 7 2.2.4.1 CITOQUINAS ...................................................................................................... 48 2.2.4.1.1 QUIMIOCINAS................................................................................................ 48 2.2.4.1.2 INTERFERONES (INF) ..................................................................................... 49 2.2.4.1.3 INTERLEUQUINAS (IL) .................................................................................... 49 2.2.4.1.4 OTRAS CITOQUINAS ..................................................................................... 50 2.2.5 BIOLOGÍA DE LOS MACRÓFAGOS ......................................................................... 51 2.2.5.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 51 2.2.5.2 PROCESO DE FAGOCITOSIS ............................................................................... 52 2.2.5.3 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS .................................................................. 56 2.2.5.3.1 VÍAS DE ACTIVACIÓN M1 .............................................................................. 58 2.2.5.3.2 VÍAS DE ACTIVACIÓN M2 .............................................................................. 61 2.3 FACTORES QUE AFECTAN A INMUNIDAD ...................................................................... 63 2.3.1 INTRÍNSECOS ........................................................................................................ 63 2.3.1.1 INDIVIDUO ........................................................................................................ 63 2.3.1.2 EDAD ................................................................................................................. 63 2.3.1.3 ESTADO FISIOLÓGICO ....................................................................................... 63 2.3.1.4 ESTRÉS ............................................................................................................... 64 2.3.1.5 NIVELES HORMONALES ..................................................................................... 65 2.3.1.6 NUTRICIÓN ........................................................................................................ 65 2.3.2 EXTRÍNSECOS ........................................................................................................ 66 2.3.2.1 TEMPERATURA .............................................................................................. 66 2.3.2.2 ESTACIONALIDAD .............................................................................................. 69 2.3.2.3 COMPUESTOS TÓXICOS CONTAMINANTES ...................................................... 70 2.3.2.3.1 METALES PESADOS ........................................................................................ 71 2.3.2.3.2 CONTAMINANTES INORGÁNICOS ................................................................. 71 2.3.2.3.3 CONTAMINANTES ORGÁNICOS ..................................................................... 71 2.3.2.3.4 OTROS CONTAMINANTES ............................................................................. 71 2.4 ESTRÉS EN TELEÓSTEOS ................................................................................................ 72 2.4.1 ESTRÉS Y AGENTES ESTRESANTES ........................................................................ 72 2.4.2 RESPUESTAS FISIOLÓGICAS AL ESTRÉS ................................................................. 72 2.4.2.1 EJE HIPOTÁLAMO-SIMPÁTICO-CÉLULAS CROMAFINES .................................... 74 2.4.2.2 EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-INTERRENAL ....................................................... 76 2.4.3 DETERMINACION DEL ESTRÉS .............................................................................. 81 2.4.3.1 RESPUESTAS PRIMARIAS .................................................................................... 81 2.4.3.2 RESPUESTAS SECUNDARIAS ............................................................................... 83 2.4.3.3 RESPUESTAS TERCIARIAS ................................................................................... 85 2.5 RESPUESTA INMUNE FRENTE AL ESTRÉS ....................................................................... 87 2.5.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 87 2.5.2 RESPUESTA INMUNE AL ESTRÉS AGUDO Y CRÓNICO ........................................... 90 2.5.3 RESPUESTAS A NIVEL DE INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA ........................... 94 2.5.4 ESTRÉS Y FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA.......................................................... 95 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ................................................................................................ 98 4. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................... 100 4.1 PECES .......................................................................................................................... 101 8 4.2 MUESTRAS .................................................................................................................. 101 4.3 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS ...................................................................................... 103 4.4 BACTERIAS .................................................................................................................. 103 4.5 RECOLECCIÓN DE MACRÓFAGOS ................................................................................ 103 4.6 CONTAJE DEL NUMERO DE MACRÓFAGOS POR POCILLO ........................................... 104 4.7 FAGOCITOSIS Y SUPERVIVENCIA BACTERIANA ........................................................... 104 4.8 EXPLOSIÓN RESPIRATORIA ......................................................................................... 105 4.9 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS ............................................................................ 105 4.10 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES ....................................... 105 4.11 ANÁLISIS DE DATOS ..................................................................................................... 106 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 107 5.1 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS MARCADORES DE ESTRÉS ............................................ 108 5.1.1 RESULTADOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS DE ESTRÉS .......................... 109 5.1.2 DISCUSIÓN PARÁMETROS BIOQUÍMICOS DE ESTRÉS .............................. 111 5.2 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA ............................................................................... 117 5.2.1 FUNCIONALIDAD SEGÚN EXPLOSIÓN RESPIRATORIA ......................................... 118 5.2.1.1 RESULTADOS EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR TEMPERATURAS ..................... 118 5.2.1.2 DISCUSIÓN EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR TEMPERATURAS ........................ 121 5.2.1.3 RESULTADOS EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR CROWDING ............................. 124 5.2.1.4 DISCUSION EXPLOSIóN RESPIRATORIA POR CROWDING ................................ 128 5.2.2 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA SEGÚN FAGOCITOSIS ..................................... 134 5.2.2.1 RESULTADOS FAGOCITOSIS POR CROWDING .................................................. 134 5.2.2.2 DISCUSIÓN FAGOCITOSIS POR CROWDING ..................................................... 136 5.2.3 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA SEGÚN SUPERVIVENCIA BACTERIANA ........... 142 5.2.3.1 RESULTADOS DE SUPERVIVENCIA BACTERIANA POR CROWDING .................. 142 5.2.3.2 DISCUSIÓN SUPERVIVENCIA BACTERIANA POR CROWDING ........................... 145 5.3 RECUENTO DE MACRÓFAGOS ..................................................................................... 149 5.3.1 RESULTADOS DE LA PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS .................................... 150 5.3.2 DISCUSIÓN PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS .................................................. 153 5.3.3 RESULTADOS PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES ......... 159 5.3.4 DISCUSIÓN PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES ............ 161 5.4 DISCUSIÓN INTEGRAL ................................................................................................. 164 6. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 168 7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 170 8. ANEXO I: ABREVIATURAS ............................................................................................ 211 9. ANEXO II: RELACIÓN DE TABLAS Y FIGURAS ................................................................ 216 9.1 RELACIÓN DE TABLAS .................................................................................................. 217 9.2 RELACIÓN DE FIGURAS ................................................................................................ 218 9 10 AGRADECIMIENTOS Cuando me embarqué en este proyecto, no imaginé que iba a cambiar tanto en mi vida, en mi forma de pensar, de trabajar y en mi capacidad de resiliencia. Este término se ha popularizado en los últimos años debido principalmente a la crisis sanitaria causada por la COVID 19, fenómeno a escala global que nos ha afectado a todos. Yo lo quiero hacer mío para definir mi andadura por este proyecto formativo que, desde que terminé mis estudios de licenciatura veterinaria en 2004, llevaba en mente realizarlo, pero siempre me pareció un camino largo y duro como finalmente me ha supuesto. Han sido muchas las piedras encontradas en el camino, debido sobretodo a mi situación personal, pues estoy inmerso en el mundo laboral, soy padre de familia y vivo en Cuenca, la España vaciada, en medio de ningun sitio, pero siempre he dicho que “cuando se quiere, se puede”. Es por tanto que quiero dar las gracias a todas las personas que han influido sobre mi durante todo este tiempo y es a vosotras a las que dedico estos renglones para agradecéroslo. Gracias por ayudarme a participar y luchar para conseguir llegar a meta sin rendirme. Primeramente, quiero dar las gracias a mis dos directores de tesis, José y Luis, por confiar en mí y darme la posibilidad de participar en este proyecto. También por la enorme paciencia y comprensión que han tenido conmigo durante todo el camino, aunque hayan sido muchas las curvas a sortear. También a Eva y María por acompañarme en parte de este viaje gracias a sus respectivos TFG. También quiero acordarme de mis compañeros de trabajo del Distrito de Tarancón, por echarme una mano cuando tenía más trabajo y por permitirme esos viajes a la facultad Gracias Lorena, Antonio, Juan Carlos y Carlos, a este último también por ese apoyo emocional en los momentos duros. Gracias Luis por permitírmelo y siempre hacerme ver que es lo importante en la vida. Igualmente, a Rosana, por abrirme las puertas de la piscifactoría nada más contarle mi proyecto sin ningún tipo de inconveniente. Por último, quiero agradecer a mi familia, primeramente, a Olivia, mi mujer, la cual ha sabido aguantar mi humor en los días más desesperantes durante todos estos años y, sobre todo, por permitírmelo y ocuparte de mi responsabilidad familiar durante mis ausencias. A mis padres, Gregorio y Cristina, por inculcarme los valores del trabajo que tanto me han servido no solo para este trabajo. A mis hermanos, Cristina y David, que, aunque no los veo mucho, sé que siempre están cuando se les necesita, ya sea para dejarme dormir 11 esas noches de desesperación en Madrid o para hacerse cargo de Darío cuando “no llego a recogerlo”. Y como punto final, no quiero dejar de nombrar al sol de mi vida, al lucero del alba, a la persona que por muy pequeña que sea y tan poco tiempo lleve en mi vida es el motor que me hace arrancar cada día para enfrentarte al mundo sin miedos, pues sé, que lo más importante se queda al margen de mis problemas y, lo demás que pueda pasar es secundario y sin importancia. Así quiero dar las gracias a mi hijo, Darío, simplemente por existir y hacer posible que todo vaya pasando sin darme cuenta, incluso este tiempo el cual, sin ti, hubiera sido aún más largo. A tod@s... GRACIAS. 12 “cuando segábamos a mano, surco a surco también acabábamos con el piazo…” Juliana Rubio Blanco, mi abuela, fallecida en enero 2022. En su memoria. 13 14 15 1. RESUMEN/ABSTRACT 16 1.1 RESUMEN La acuicultura es una de las actividades ganaderas que más ha aumentado en los últimos años para atender la demanda de una población creciente y ofrecer un producto de calidad para su alimentación. Dentro de ella, la cría de la trucha arcoíris en España y en todo el mundo también se ha visto en aumento desde mediados del siglo pasado consiguiendo un máximo de producción a principios de este siglo. Los peces son animales ectotermos, lo que los hace muy dependientes de los factores externos que les rodean, como son las condiciones climáticas, así como de los sistemas de producción cada vez más intensificados. En este sentido, prácticas de manejo durante su ciclo productivo, como es el hacinamiento intensivo (crowding), así como variaciones de las temperaturas del agua, que son cada vez más frecuentes y extremas, pueden llegar a alterar los niveles de estrés en estos animales, repercutiendo a su vez en su equilibrio fisiológico, incluyendo la respuesta inmune. La respuesta inmune innata es el primer y principal responsable de la respuesta frente a los patógenos en los peces, siendo capaz de reaccionar frente a antígenos de forma inespecífica y en etapas tempranas. Dentro de ésta, la fagocitosis ocupa una posición principal para dar respuesta a los procesos infecciosos, captando a los patógenos y respondiendo de manera contundente para su eliminación. Son varias las células que pueden llevar a cabo esa respuesta, y entre ellas, los macrófagos, que juegan un papel principal en todos estos mecanismos. Sin embargo, todos estos mecanismos de defensa se ven alterados en condiciones de estrés, lo que conlleva que, bajo estas situaciones, los peces sean más susceptibles a la acción de los agentes infecciosos. En el presente trabajo, hemos estudiado cómo se ve afectada la capacidad de los macrófagos renales de trucha arcoíris para enfrentarse y eliminar a los patógenos. Hemos utilizado como situación de estrés, una práctica habitual en las piscifactorías como es la concentración de los peces, en este caso durante un tiempo de 2 horas. Esta concentración produjo incrementos del cortisol sérico muy por encima de los niveles considerados como fisiológicos en esta especie, lo que denota un incremento de los niveles de estrés. También estudiamos el efecto de los incrementos de temperatura sobre la capacidad de los macrófagos para eliminar una infección, aunque en este caso los niveles de cortisol detectados se mantuvieron dentro del rango fisiológico. En estas condiciones, evaluamos la funcionalidad macrofágica de estas células al exponerlas a bacterias in vitro para comprobar cómo se afectaba la capacidad de endocitar bacterias y de eliminarlas por el proceso propio de fagocitosis, midiendo también la explosión respiratoria generada para llevar a cabo esta digestión. Finalmente, evaluamos el efecto de los niveles altos de cortisol sobre capacidad de proliferación de esos macrófagos para afrontar una infección. Los peces muestreados para este estudio fueron 300 truchas arcoíris, con un peso de entre 250-300 g y mantenidas en todo momento en la piscifactoría y, por tanto, sometidas a las prácticas habituales de producción. En cada muestreo, las truchas se separaron en grupos de 5 truchas cada uno, usándose el mismo número de truchas “estresadas” y control. En todo momento se tuvieron en cuenta las temperaturas medias de los días previos al muestreo y las acumuladas de las últimas semanas. Lo resultados obtenidos indican que los macrófagos de truchas sometidas factores de estrés como puede ser la concentración, ven afectada su capacidad para hacer frente a una infección. En estas células se ve una disminución de las bacterias fagocitadas, así como de los 17 mecanismos encaminados a la eliminación de las mismas. También se ve disminuida la respuesta proliferativa de estas células, lo que provoca que los agentes infecciosos tengan que hacer frente a un menor número de macrófagos, lo que aumentaría sus probabilidades de éxito. Los mecanismos de los macrófagos para eliminar a los agentes infecciosos también se ven afectados por temperaturas altas del agua, así como por cambios bruscos de las mismas, dejando en clara desventaja a los macrófagos de esos animales para hacer frente a una infección bacteriana cuando están sometidos a esas condiciones. 18 1.2 ABSTRACT Aquaculture has had one of the highest increases among all livestock activities in the last years to meet the demands to provide high quality food for the increasing world population. In this context, rainbow trout production in Spain and globally has seen an increase since the mid 20th century, reaching a peak by beginning of this century. Fish are ectothermic animals and, therefore, are highly dependent on external conditions, as climate and the increasingly intensive production systems. In this sense, handling practices during their production cycles, as intensive crowding and water temperature variations, that are becoming more frequents and extreme, can alter fish stress levels, having an impact on their physiological balance, including the immune response. Innate immune response is the first and main responsible of the response against pathogens in fish, being capable of reacting against antigens in an unspecific way and from early stages. Within this innate immune response, phagocytosis plays a pivotal role to respond infectious processes, capturing pathogens and giving a strong response to eliminate them. There are different cells involved in this response, but among them macrophages play a significant role in all these mechanisms. However, all this defence processes can be altered by stress conditions, which can result in fish being more susceptible to infectious agents under these conditions. In this work, we have studied how rainbow trout kidney macrophage capacity to face and eradicate pathogens can be affected by stress. As stressing factor we used a usual fishfarm practice as it is fish crowding. After crowding for 2 hours, blood cortisol levels were increased over those considered as normal or physiological for this species, which indicates an increase of stress levels. Temperature increases were also considered to evaluate macrophage capacity to eradicate an infection, although in this case cortisol levels remained within physiological range. Under these circumstances, we evaluated macrophage functionality by exposing these cells in vitro to a bacterial infection to test how it could affect macrophage capacity to endocytose and eliminate the bacterial invader by phagocytosis, and measuring also the respiratory burst to carry the bacterial digestion. Finally, we also evaluated the effect of high cortisol levels on the proliferation capacity of macrophages to face the infection. Fish used were 300 rainbow trout of 250-300g, kept in a fishfarm during all the production cycle, and, therefore, undergoing usual production practices. For each sampling, trouts were separated in groups of 5 fish each, and the same number of fish was used for control and stressed groups. Temperatures of previous days and accumulated of sampling and previous weeks were considered all the time. Results suggest that under stressing conditions, as crowding, trout macrophages capacity to face an infection is impaired. A reduction in the number of phagocytosed bacteria, and of the mechanisms responsible of the eradication of the infectious agents was observed under this circumstance in these cells. Proliferation response of macrophages was also reduced, and that would lead to a situation in which infectious agents would face a lower number of macrophages, and therefore, see increased their chances to succeed within the fish. Macrophages mechanisms to eradicate infectious agents can also be affected by high water temperatures, as well as by sudden changes in those, leaving macrophages in a clear disadvantage situation to face a bacterial infection when fish suffer these conditions. 19 20 2. INTRODUCCIÓN 21 2.1 ACUICULTURA La acuicultura es la producción en el agua de especies animales y plantas mediante técnicas encaminadas a hacer más eficiente su rendimiento. Es una actividad similar a lo que en tierra firme son la ganadería y la agricultura. Abarca variadas prácticas y una muy amplia gama de especies y sistemas de producción y cada vez son más especializados. (APROMAR, 2018). La acuicultura tiene una historia de 4.000 años, pero ha sido en los últimos 50 años cuando se ha convertido en una actividad socioeconómica relevante. La acuicultura no es un complemento de la pesca, sino su evolución, como la ganadería en su momento reemplazó a la caza. Tiene además a su favor que el 70% de la superficie del planeta es agua, que las tasas de reproducción de los animales acuáticos son superiores las de los vertebrados terrestres, que los animales acuáticos son más eficientes convertidores de su alimento porque flotan en el agua y porque no consumen energía para mantener su temperatura corporal. (APROMAR, 2021). Sin duda que el mayor desafío al que se enfrenta la humanidad para las próximas décadas, aparte de la obtención de energía y el cambio climático, será alimentar a los 9.600 millones de personas que habitarán el planeta Tierra hacia mediados de siglo. El reto es complejo, considerando la limitada disponibilidad de recurso natural y dado la necesidad de respetar los ecosistemas tal cual los conocemos. Será por ello necesario incrementar el rendimiento de la producción agrícola y ganadera, pero de manera sostenible y respetuosa con el medio ambiente los cuales poseen recursos limitados, en un contexto de cambio climático y en un mundo con grandes desigualdades económicas. El progreso científico y la innovación serán herramientas indispensables. (APROMAR, 2021). Nunca antes la humanidad ha consumido tal cantidad de productos procedentes del agua como lo estamos haciendo actualmente. Por otra parte, la globalización y la interconexión entre mercados hacen que los cambios en el aprovisionamiento de comida afecten a todos los países el mundo. Esta coyuntura probablemente se agravará con el inminente cambio climático, que está ya significando alteraciones en los modelos productivos tradicionales. Así, el aumento en la producción de pescado y otros alimentos acuáticos mediante técnicas cada vez más desarrolladas satisface cada vez mejor este gran reto al paso que, la obtención de pescado por la pesca extractiva cada vez se hace más dificultosa por la sobreexplotación incontrolada de los mares (APROMAR, 2021). El pescado es extraordinariamente nutritivo, fuente vital de proteínas, grasas y nutrientes esenciales. En primer lugar, porque la proteína de pescado tiene una biodisponibilidad mayor, aproximadamente entre un 5% y 15% que la derivada de fuentes vegetales, además de contener aminoácidos esenciales. Segundo, la composición lipídica del pescado es excepcional, al comprender ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga que ofrecen múltiples efectos beneficiosos para la salud a diferencia de la ingesta de grasas saturadas procedentes de carne de origen animal. En tercer lugar, el pescado es una fuente 22 importante de vitaminas, micronutrientes y minerales básicos para una completa alimentación (calcio, fósforo, yodo, zinc, hierro, selenio). Por último, añadir que la preparación culinaria de este tipo de alimentos es bastante sencilla y rápida, ideal para el ritmo de vida a la que gran parte de la población se ve sometida en la época actual, además de componer alimentos de los llamados “sin procesar” en muchos de los casos, primordiales para una alimentación saludable (APROMAR, 2021). 2.1.2 DATOS PRODUCTIVOS La producción acuícola mundial de animales acuáticos cultivados creció, en promedio, un 2.4% anual en las tres últimas décadas, superando el ritmo de crecimiento de la población mundial, que ha sido del 1,6 %. El consumo per cápita mundial de productos acuáticos ha pasado de 9,0 kg/año/persona en 1961 a 20.5 kg/año/persona en 2018, gracias al incesante aumento de las producciones y rendimientos, las mejoras en las técnicas de producción y conservación del pescado y unos canales de distribución más eficientes (APROMAR, 2021). El análisis de las estadísticas de producción mundial de acuicultura de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), destaca que, aunque la acuicultura es común a todos los países del mundo, es una actividad especializada, en la que únicamente los países que apuestan estratégicamente por ella, logran avances reales mantenidos en el tiempo. Si hablamos mundialmente de productores de pescado, China encabeza la lista de productos acuáticos cultivados con más de 68.4 millones de toneladas en 2019, seguido muy de lejos por Indonesia con casi 15.9 millones de toneladas. España, ocuparía el puesto 21º con una producción anual de casi 0.308 millones de toneladas disminuyendo los datos del año precedente y ocupando el primer puesto de la UE en producción acuícola, segundo en cuanto a producción de pescado (77.066 Tm). De las especies producidas en España, destacan en el contexto mundial, la producción de trucha arcoíris con la cual ocupamos el puesto 29º en producción a nivel mundial; mejillones, con los cuales ocupamos el puesto 54º; dorada, con la que estamos en el puesto 59º; lubina, en el puesto 57º y rodaballo, ocupando el puesto 91º (APROMAR, 2021). Prácticamente, de toda la cosecha mundial de acuicultura en 2019, la mitad consistió en la producción de pescado con el 49,6 %, (56,3 millones de toneladas). La cosecha de vegetales (algas) representó el 28,9 % de las toneladas; la de moluscos el 14.6 %, la de crustáceos el 8,7 %, mientras que la producción de anfibios, reptiles y de otros invertebrados es del 0.4% (APROMAR, 2021). El 56,5 % de la producción mundial de acuicultura se lleva a cabo en aguas marinas y el 43,5 % en aguas continentales (APROMAR 2021). Contrariamente a los sistemas de explotación agropecuarios terrestres en los que la mayor parte de la producción se obtiene en un reducido número de especies muy domesticadas de animales y plantas con un alto grado de selección 23 productiva, en el año 2018 se estaban criando en el mundo más de 466 “partidas de especies acuáticas” entre peces, moluscos, crustáceos, algas y otros (FAO, 2020). En la Unión Europea (UE), estos porcentajes varían notablemente siendo el 78.9% lo producido en aguas marinas y 21.1% en agua dulce. En la UE, las especies más producidas han sido el mejillón (ambas variedades): 477.293 Tm; el salmón del atlántico: 203.307 Tm y la trucha arcoíris: 191.262 Tm (APROMAR, 2021). Si hablamos exclusivamente de acuicultura continental o también llamada de agua dulce, según la FAO, a nivel mundial en 2018 se produjeron 51,3 millones de toneladas de animales acuáticos, lo que equivale al 62,5% de la producción mundial de pescado comestible cultivado. En este tipo de producción, la posición dominante de los peces de aleta se ha ido reduciendo a lo largo de los años desde el 97,2% que había en el año 2000 al 91,5% obtenido en 2018 (FAO, 2018). La principal especie de pescado de aleta producido en cautividad en la UE en el año 2019 es la trucha arcoíris con 179.372 Tm, seguida de la dorada y la lubina (APROMAR, 2021). 2.1.3 TRUCHA ARCOÍRIS (Oncorhynchus mykiss) Clasificación taxonómica (Camacho et al, 2000): Reino: Animalia Phylum: Chordata Subphylum: Vertebrata Superclase: Pisces Clase: Osteichthyes Subclase: Actinopterygii Orden: Salmoniformes Familia: Salmonidae Género: Oncorhynchus Especie: mykiss NOMBRE CIENTÍFICO: Oncorhynchus mykiss 24 Figura 1. Dibujo de trucha arcoiris adulta (freepng.es) La trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) es una especie originaria de América del Norte, la cual está presente de forma natural en los ríos que desembocan en el océano Pacífico, desde el sur de Alaska hasta el norte de México. Fue descrita por primera vez por Walbaum en 1792. Fue introducida para la pesca deportiva y la acuicultura en todos los continentes (salvo la Antártida) a finales del siglo XIX, iniciándose su cría en España en la década de 1960. Se reproduce sólo de forma esporádica en nuestros ríos, por lo que no suele dar lugar a poblaciones estables. Además, últimamente se empieza a producir, con mayor impulso, animales triploides para evitar su reproducción incontrolada tanto en explotación como en el entorno natural (JACUMAR, 2009). En lo que a su producción se refiere, se realiza con poblaciones mayoritariamente de hembras, que alcanzan la talla comercial “de ración” de manera más eficiente. Tiene escamas bastante pequeñas y de colores tornasolados. El dorso es de color azul a verde oliva, los flancos plateados y vientre blanquecino. Presenta manchas negras en la cabeza, cuerpo, aletas dorsales y cola. Su coloración varía en función del hábitat, la alimentación, el tamaño y la condición sexual. Su cuerpo es alargado y un tanto comprimido bien diferenciado de la trucha común (salmo trutta fario), que es una especie más territorial y con comportamiento más bentónico. Presenta además una amplia banda irisada de tono rosáceo en la línea lateral que le da nombre a la especie (arcoíris). Puede alcanzar los 80 cm, aunque el tamaño más común es entre 20 y 40 cm, con un peso que va desde los 300 g a los 6 kg. (JACUMAR, 2009). 2.1.3.1 FASES DEL CICLO DE CULTIVO El cultivo de la trucha arcoíris abarca diferentes fases dentro de su ciclo biológico natural, empezando por la fase reproductiva de adultos en madurez sexual, su apareamiento controlado, el cultivo de los huevos fecundados, el nacimiento de alevines y su crecimiento como juveniles, el engorde y finalmente la consecución del producto final, como trucha de 25 ración, animales mayores para consumo (carne y huevos) o como futuros reproductores (ver Figura 2). Hoy en día, cada una de estas etapas se suele realizar en piscifactorías independientes y muy especializadas tanto en instalaciones, como en materiales, personal y métodos para obtener el máximo rendimiento (Luz Arregui Maraver, 2013): Reproducción: Las truchas no desovan de forma natural en las instalaciones acuícolas, por lo que se hace necesario el desove artificial de los huevos, utilizando para ello peces reproductores maduros de 3 o 4 años de edad. La proporción sexual de los reproductores suele ser de un macho por cada tres hembras. Machos y hembras se mantienen generalmente separados (JACUMAR, 2009). Fertilización: El método más empleado es la fertilización en seco, sin adición de agua. Los huevos y el semen son recolectados manualmente de los ejemplares anestesiados y mezclados a continuación para una controlada fecundación. Suele usarse el semen de más de un macho para evitar la endogamia. Los huevos son incubados hasta que se alcanza la etapa de huevos embrionados (con ojos visibles), en bandejas de incubación o en incubadoras de flujo vertical (JACUMAR 2009). Cría de alevines: El tiempo de eclosión varía en función de la temperatura variando de entre 100 días a 3,9 °C a 21 días a 14,4°C. A medida que los huevos eclosionan, los alevines, llamados “con saco” por tener restos del saco vitelino como reserva alimenticia, caen en una bandeja donde pueden permanecer hasta que comienzan a tener un comportamiento pelágico, permaneciendo en la columna de agua hasta los 10 o 14 días. En este momento, en el que el saco vitelino ha sido absorbido y comienzan la búsqueda activa de alimento, son trasladados a distintos tipos de estanques de fibra de vidrio de 2 m de diámetro máximo, donde son alimentados automáticamente con dietas iniciales especializadas. Conforme van creciendo son clasificados a estanques más grandes (JACUMAR 2009). Engorde: Cuando los alevines alcanzan 8-10 cm de longitud son trasladados a instalaciones de engorde al aire libre de la misma explotación o de explotaciones de producción especializadas. Suelen albergarse en estanques abastecidos con flujo de agua abierto de fuentes naturales (ríos), proporcionando a las truchas aguas bien oxigenadas y de calidad. Estos estanques suelen tener de 2 a 3 m de ancho, por 12-30 m de largo y 1-1,2 m de profundidad. Son engordados hasta tamaño comercial (30-40 cm) en aproximadamente entre 6 y 9 meses si se van a comercializar en “tamaño ración”, o hasta tamaños más grandes en unos 20 meses si son destinadas a otros formatos comerciales (trucha grande o extra grande). En algunas ocasiones, los ejemplares son engordados en jaulas flotantes de unos 25 m de diámetro y unos 20 m de profundidad asegurando un buen suministro de agua y oxígeno (JACUMAR 2009). En nuestro país, la trucha arcoíris es la principal especie de la acuicultura continental. Su cría es altamente eficiente en muchos aspectos, utiliza sistemas bien establecidos y presenta una fuerte mecanización de las operaciones. Se trata de un sector ampliamente consolidado, 26 estable, exportador, con márgenes estrechos, pero innovador y en expansión. Las líneas de investigación actuales tratan de mejorar la eficacia de la producción y la comercialización, así como la calidad del producto. Se están llevando a cabo estudios en muy diversos aspectos para mejorar las tecnologías de producción sostenibles. Se quiere asegurar el crecimiento futuro de las producciones mediante instalaciones adecuadas, mejorando la imagen de esta interesante industria del mundo rural, dando una oportunidad laboral a la “España vaciada”, conservando el medio ambiente, que es vital para este tipo de ganadería y, teniendo en cuenta el bienestar animal en todas las etapas de su producción. (FAO, 2014). Figura 2. Ciclo de producción de trucha arcoíris (FAO, 2014) 2.1.3.2 CULTIVO TRUCHA ARCOÍRIS Jacobi (1758), publica las primeras experiencias en fecundación artificial de huevos de trucha y salmón. En 1842, dos pescadores de los Vosgos (Francia) fecundan óvulos de trucha y repueblan ríos durante varios años, hasta que sus experiencias son estudiadas y difundidas. Gracias a estas primeras prácticas, surgen los primeros centros o granjas dedicadas a investigación y repoblación de truchas y salmones en Francia. Estos centros se generalizan en el resto de Europa durante ese siglo (Luz Arregui Maraver, 2013). En España, la acuicultura moderna surge en 1866 con la puesta en marcha de la primera piscifactoría en los Jardines del Palacio de La Granja de San Ildefonso, en Segovia. Al año siguiente, se construyó el primer centro privado de acuicultura en el Monasterio de Piedra en Zaragoza, cuna de la piscicultura española. En poco tiempo, se convierte en la especie más 27 cultivada de España para fines de repoblación fluvial (Blanco Cachafeiro, 1984). Con la llegada de los piensos compuestos secos para la alimentación y aprovechando la mejoría en los índices de conversión, se construyen multitud de granjas para producción y a diferencia de Europa, en España, el sacrificio de los animales ya se realizaba en la misma explotación. En 1994, apareció en Galicia la primera explotación de reproductores, tendencia que permitió que las granjas dejaran la cría de etapas juveniles a este tipo de granjas más especializadas, para centrarse exclusivamente en el engorde a partir de alevines (Luz Arregui Maraver, 2013). Las piscifactorías para truchas de engorde o de producción, son establecimientos construidos principalmente al margen de los ríos, donde el agua del mismo abastece a toda la explotación. El agua fluvial corre por los diferentes estanques construidos de obra principalmente y nutre de agua de calidad a los animales allí criados (ver Figura 4). Es por tanto que, este tipo de trucha en España, se cría principalmente en sistemas monocultivo, generalmente en estanques de hormigón, que permite aumentar las densidades y producir más eficientemente sin poner en riesgo la sanidad de la explotación y minimizando también los gastos. En otros países, existen grandes producciones de esta especie en viveros o jaulas flotantes, donde alcanza mayores tamaños para su comercialización. Casi toda se produce en agua dulce, pero hay un porcentaje de trucha que acaba su producción en agua salada sobretodo en Noruega y Chile (JACUMAR 2009; APROMAR, 2018). A nivel mundial los principales productores de trucha arcoíris son Irán (22.5% del total mundial), Turquía (13.4%), Noruega (9.1%), Chile (9%) y Perú (5.5%). A nivel europeo, la producción de trucha arcoíris ha crecido de forma exponencial desde los años 50, donde el mayor productor europeo es Francia con 43%, seguido de Dinamarca con un 38% y España ocupa el tercer lugar con un 21% (APROMAR, 2020, 2021). La producción de trucha arcoíris en España en 2020 se estima en 19.400 toneladas. Por comunidades, Castilla y León es en la que se produce mayor cantidad de trucha (26.9%), seguida por La Rioja (12.9%), Cataluña (12.3%), Andalucía (11.8%), Galicia (10.2%), Principado de Asturias (8.6%) y Castilla-La Mancha (7.4%). Estas son seguidas en menor medida por Navarra, Cantabria y País Vasco, existiendo un total de 89 instalaciones con cultivo de trucha arcoíris en el año 2018. En España, el cultivo de peces de agua dulce se reduce principalmente a la trucha arcoíris, varias especies de esturión y la tenca (datos MAPA, 2020; APROMAR 2021). 28 Figura 3. Evolución de la cría de trucha arcoíris en España desde mediados del siglo XX. (Datos MAPA- APROMAR, 2020). Como se puede observar en la gráfica (ver Figura 3), en España comenzó a prosperar el cultivo de trucha arcoíris en los años 70, para alcanzar un pico máximo a principios de siglo. Luego va disminuyendo, hasta estabilizarse en los últimos años en cifras próximas a 20.000 Tm/año. 2.1.3.3 MANEJO EN PISCIFACTORÍA DE ENGODE DE TRUCHA ARCOÍRIS Una vez el alevín alcanza los 8-10 cm tras la fase de alevinaje, comienza la fase de engorde. Estos, si la explotación no es de ciclo cerrado, son trasladados por carretera principalmente, en cubas de agua de transporte con un control exhaustivo de las condiciones de la misma, con destino a las explotaciones de producción de trucha de engorde, donde acabaran el ciclo como “truchas de ración” o de mayor tamaño, para obtener otros formatos del producto o de sus huevos, para la obtención de “caviar” de trucha (Luz Arregui Maraver, 2013). Una vez en los nuevos estanques, se procede a su aclimatación previa ya que ahora pasan a estanques mucho más grandes, más poblados y al aire libre. Se alimentarán con piensos concentrados de diferentes tamaños, dependiendo del tamaño de los animales, y con una composición nutritiva adecuada. La frecuencia de la alimentación también dependerá del tamaño de los animales (desde 4 veces/día para acabar con 1 vez/día en animales mayores de 20 cm) y serán distribuidos en varios puntos del estanque para evitar competencias. La cantidad dependerá del tipo de alimento, de la temperatura y calidad del agua, y del estado y densidad animal (FAO, 2014). 29 Además, se llevarán a cabo diversas clasificaciones a lo largo de toda esta fase productiva para agrupar a los animales por tamaños iguales y evitar grupos heterogéneos, donde aumentan las perdidas por mortalidad y bajan los índices productivos por dominancia de los más grandes sobre los pequeños (FAO, 2014). Se recomienda que la conducción del agua se haga por gravedad a partir del canal de distribución y, que la entrada al estanque sea en forma de cascada para su aireación, buscando abarcar la mayor parte del ancho del estanque. La salida del agua debe ser de tal manera que se permita renovar especialmente la del fondo, que es la de menor calidad. Con un caudal de agua abundante el sistema de disposición más utilizado es el denominado en paralelo, en donde los estanques se encuentran unidos o comparten sus paredes laterales. En este caso cada uno recibe su caudal independientemente de los restantes (FAO, 2014; Huet, 1978). Figura 4. Esquema piscifactoría de estanques en paralelo de ciclo cerrado. Modificado de Gustavo Salazar Ariza, 2001. 2.1.3.3.1 CONDICIONANTES AMBIENTALES El proceso de engorde, requiere unas condiciones ambientales óptimas que el piscicultor debe mantener lo más estables posibles, ya que los peces dependen totalmente de las mismas para su supervivencia y producción. La mayoría de ellas, se pueden intervenir artificialmente para mitigarlas o modificarlas y, conseguir así, los mejores rendimientos. Los siguientes condicionantes son los más importantes a controlar según Luz Arregui Maraver, (2013): Oxígeno disuelto: debe ser el más próximo posible a la saturación, sobre todo en las primeras fases de engorde y cuando los animales son alevines. En fase de engorde, valores por encima de 5 mg/L son tolerables, siendo letales por debajo de 4 mg/L y óptimos por encima de 7 mg/L. El oxígeno disuelto va en consonancia con la temperatura del agua siendo inversamente proporcional a ésta. Para corregirlo en épocas de escasez, se proyectan saltos de agua o se incorporan inyectores de oxígeno líquido. 30 Caudal: es la cantidad de agua que fluye por el estanque por unidad de tiempo. En juveniles en engorde es de entre 3.5 litros/min en las primeras fases, y hasta 14 litros/min por cada 1000 juveniles cuando son adultos. Y en los adultos pueden llegar a ser necesario hasta 65 litros/min para albergar a 1000 truchas de tamaño ración. El caudal de ingreso tiene especial importancia debido a que la cantidad de agua que entra al estanque, influirá en el nivel de oxigeno disponible para las truchas y por consiguiente en la densidad adecuada. Es aquí donde se llevan a cabo una serie de operaciones normalmente muy mecanizadas, que afectan de forma directa o indirecta a la producción. Velocidad del agua: esta es proporcional al caudal y es necesaria una velocidad adecuada para no ser perjudicial tanto en exceso como en defecto. Así se podría decir que sería adecuada una velocidad de 1 cm por segundo por cada centímetro de longitud de pez hasta un máximo de 20 cm/seg. Una corriente excesiva genera un ejercicio constante de natación, con los consecuentes gastos energéticos que pueden reducir las tasas de crecimiento esperado. Por el contrario, un flujo demasiado reducido puede resultar peligroso para los peces tanto por la insuficiencia en oxigeno disponible como por una deficiente eliminación de los productos de desecho metabólico. Una velocidad máxima del agua del orden de 2 a 3 cm por segundo se considera aceptable. Temperatura: como sabemos, las truchas son animales de preferencia por aguas frías como así demuestra su biología en la naturaleza (Hokanson, 1977; Spigarelli & Thommes, 1979). Podemos decir que la temperatura preferente de cultivo para engorde es entre 14ºC y 18ºC como un rango ideal de temperatura con el que se logren los mejores resultados (Boeuf, 1988). Por desgracia, casi todas las piscifactorías de engorde en España son a cielo abierto, siendo muy dependientes de la temperatura estacional en nuestro país por su latitud. El apetito de las truchas en engorde es adecuado entre 7⁰C y 18⁰C, decayendo a partir de estos rangos hasta llegar a ser letal por encima de 23⁰C o muy próximos a 0⁰C. Hay que añadir que existe una relación inversa entre la intensidad de alimentación y la eficacia de la digestión. Se ha visto que cuando la temperatura ronda los 14-15⁰C se obtienen los mejores rendimientos e índices de conversión. Materia en suspensión: partículas disueltas en el agua de un tamaño adecuado para aumentar la turbidez y disminuir la viabilidad de estos animales en el estanque. No todas las partículas en suspensión causan los mismos efectos y la edad de los animales también influye en su susceptibilidad (Brown, 2000). La turbidez puede interferir en la búsqueda del alimento y también en la cantidad de oxígeno disuelto, pues estas partículas pueden provocar un consumo adicional de oxigeno del agua y una posible eutrofización del medio (Newcombe & Jensen, 1996; Boyd, 2000). pH: es muy dependiente de la composición de los terrenos por donde discurre el rio, además de otros factores endógenos de la propia explotación. Dependiendo de la edad, las truchas toleran rangos de pH mayores o menores. En el caso de truchas en estadio de engorde, son adecuados entre 6.5-8.5, siendo estos más estrechos en truchas juveniles. Los niveles de pH 31 están influenciados por la cantidad de CO₂ disuelto y aumentan en estanques con alta densidad animal. Por debajo de 5, los salmónidos pierden la capacidad de regular la concentración del cloro y sodio en plasma y conduce a alteraciones en su osmoregulación (Roberts, 2001); valores excesivamente básicos afectan al cristalino de las truchas, producen hipertrofia de branquias y erosiones en la piel (Daye & Garside, 1976; Fivelstad, 2003). Amoniaco y compuestos nitrogenados: son principalmente procedentes de los excrementos de los propios animales. Las moléculas de NH₃ pueden ser letales a dosis superiores a 0.02mg/L. Su concentración es dependiente del pH y de la temperatura del agua y por supuesto, de la biomasa animal que contenga el estanque. Densidad animal por estanque: es cantidad de peces por unidad de volumen. Esta densidad podrá variar dependiendo del tipo de estanque, del tamaño de los peces y de la calidad del agua. Esta calidad se basará en el oxígeno presente, en el caudal de ingreso y en la tasa de renovación del agua. Así pues es importante realizar análisis físico-químicos del agua constantemente; la toma de datos de temperatura y oxígeno disuelto debe efectuarse diariamente y en lo posible dos veces (mañana y tarde), el pH mensualmente y otros parámetros como dureza o alcalinidad se harán por lo menos dos veces al año junto con otros parámetros tales como amonio, nitritos, nitratos, etc. que deberán monitorizarse con frecuencia debido a que el cultivo intensivo disminuye el nivel de oxígeno disuelto en el interior de la unidad de cultivo y simultáneamente se incrementa el del amonio (Luz Arregui Maraver, 2013). Visto todo lo anterior, las truchas de producción por su sistema productivo durante toda su fase de engorde, se verán sometidas a diferentes condicionantes ambientales y por tanto operaciones por parte del ser humano para aumentar los índices productivos de la explotación, evitar enfermedades y mantener el estado sanitario de la explotación en un alto nivel para que la producción sea sostenible económica y sanitariamente, respetando el bienestar de los animales. Entre estas operaciones, incluimos manejos propios de prácticas ganaderas intensivas como pueden ser vacunaciones, tratamientos veterinarios, clasificaciones, desovados, muestreos, ayunos o purgas, pesajes y conteos, cambios de alimentación, etc., que modificaran el comportamiento fisiológico del animal pudiéndolo comprometer, en algunos casos, inmunológicamente. 2.1.3.3.2 CONCENTRACIÓN PARA MANEJO (CROWDING) Dentro de todas estas prácticas de manejo dentro del cultivo de la trucha arcoíris de engorde, se repite una constante para llevar a cabo muchas de las demás, y es la de concentrar los animales en una parte del estanque, hacinándolos mediante una barrera de separación para facilitar su captura y posterior trato en cualquier práctica a la que se vayan a someter. Esta 32 aglomeración, donde la densidad animal aumenta varía en el tiempo dependiendo del fin para el que se practique. En la explotación en la que nosotros trabajamos y según volumen de producción, se ha estipulado un tiempo medio de 2h donde los animales son hacinados intensamente para facilitar su captura y ejercer sobre ellos cualquiera de las prácticas de manejo a los que son sometidos posteriormente (clasificación, sacrificio, vacunación intraperitoneal, desove, etc.). Normalmente, esta concentración de animales se lleva a cabo barriendo manualmente el estanque con una malla metálica plegable de la misma anchura que el propio estanque para dejar escapar el mínimo número de animales posible, quedando atrapadas la mayoría de truchas dentro de este espacio reducido en el otro extremo (ver Figura 5). Esta barrera es empujada de forma manual por uno o dos operarios y posee un diámetro de malla apropiado que evita el paso de estos animales en cualquiera de sus tamaños. Posteriormente, se iniciará el manejo propio de los animales, dependiendo del fin último para el que han sido concentrados (FAO, 2014). Figura 5. Foto manejo por crowding (piscifactoría PISZOLLA, Illana, Guadalajara) En este tiempo de concentración, se disminuye notablemente el espacio y la disponibilidad de recursos por parte de los animales (disminución de oxígeno disuelto y de pH) además de disminuir también el flujo del agua que sirve de arrastre de residuos; la fricción entre animales se hace constante, causando lesiones cutáneas por pérdida de la mucosa protectora. Se hace evidente, por tanto, el aumento de estrés en los animales durante este tipo de manejo (Luz Arregui Maraver, 2013). El control de la temperatura y el oxígeno se hace imprescindible en estas explotaciones, pues puede provocar estrés a través de fluctuaciones de temperatura, hipoxia o sobresaturación y la acumulación de dióxido de carbono (Tang et al., 2009). Los peces también experimentan estrés durante el hacinamiento, al atraparlos con la red y salabardo, así como durante el bombeo, la carga y descarga (Nomura et al., 2009). 33 2.1.3.4 ESTADO ZOOSANITARIO Debido a las características intrínsecas y extrínsecas de estos animales, así como a los factores bióticos y abióticos que rodean a este tipo de ganadería, estos animales se van a ver expuestos a una serie riesgos que pueden derivar en la aparición de diferentes enfermedades durante todo su ciclo productivo. Viven en un medio con presencia constante de multitud de tipos de patógenos, con lo que el estado de su sistema inmune se hace crucial (Magnadóttir, et al., 2006) El comportamiento de la trucha cuando está enferma o sufre cualquier tipo de aflicción pueden variar desde la aparición de movimientos bruscos hasta la falta de apetito. La sintomatología presentada es diversa, pudiendo reflejarse en signos externos y/o internos, o la combinación de ambos. La aparición de síntomas externos (áreas descoloridas y erosionadas en el cuerpo, hinchazón del cuerpo o agallas, ojos hinchados, hemorragias sangrantes) y/o la presencia de lesiones internas (permutas de color de órganos o tejidos, hemorragias en órganos u otros tejidos o el acúmulo de fluidos en cavidades del cuerpo) son señales evidentes de un aumento de la prevalencia de enfermedades en la explotación con las consecuentes pérdidas económicas que esto significa. Todas las enfermedades que afectan a la trucha arcoíris, las podemos clasificar según el agente etiológico que las desencadena (Chimbor Mejía, 2010). Así tenemos, que a nivel mundial encontramos enfermedades de origen vírico, bacteriano, fúngico y parasitario: 2.1.3.4.1 VÍRICAS Las enfermedades víricas son las más importantes debido a la falta de tratamientos específicos y a la alta mortalidad que provocan. Por ello la mayoría son de declaración obligatoria y están englobadas en la lista A de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Encontramos a virus de la familia Rabdoviridae, como es el virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) aislado en trucha arcoíris por primera vez en 1963 (Jensen, 1965) y del que se han descubierto cuatro genotipos diferentes hasta la fecha. Otro virus de la misma familia es el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV). Ambos son de declaración obligatoria. Por otro lado, dentro de la familia Birnaviridae y el género Aquabirnavirus, encontramos el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) aislado en trucha arcoíris por primera vez en 1957 y el virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), pertenece al género Isavirus, de la familia Orthomyxoviridae, que provoca un efecto hemoaglutinante en diferentes órganos (Falk et al., 1997; Mjaaland et al., 1997) Hay otros virus como el denominado alfa virus del salmón perteneciente a la familia Togaviridae y género Alphavirus que provoca la enfermedad del páncreas (Wolf & Quimby, 1971; McLoughlin & Graham, 2007). 34 2.1.3.4.2 BACTERIANAS Son las enfermedades de origen bacteriano, como la denominada enfermedad de la “boca roja” provocada por Yersinia ruckeri; todos los salmónidos del mundo son potencialmente susceptibles a este microorganismo. La enfermedad del agua fría, donde las bacterias Myxobacterium, Flavobacterium y Chondrococcus se han asociado en varios procesos de estos procesos patológicos. El síndrome de mortalidad alevín donde el agente causante es Cytophaga psychrophila. La enfermedad de columnaris, donde todas las especies de peces de agua son susceptibles al agente causante, Chondrococcus columnaris. La enfermedad bacteriana renal (BKD), donde el agente causal es Renibacterium salmoninarum. Las estreptococosis, capaces de afectar a peces tanto de agua dulce como salada. Las furunculosis provocadas por Aeromonas salmonicida spp. Las septicemias por aeromonas, donde encontramos la aeromona móvil más virulenta como es la Aeromona hydrophila. Las septicemias por pseudomonas, causadas por Pseudomonas spp. como es la P. fluorescens y que son comunes en todo el mundo. Las lactococosis producidas por Lactococus garvieae. Por último, las vibriosis causadas por el Vibro anguillarium, que tiene difusión mundial. Cabe destacar que todas estas enfermedades pueden ser tratadas por antibióticos pero que su uso desmedido ha hecho generar resistencias y estas enfermedades empiezan a ser un problema cada vez más emergente para este tipo de cultivos. 2.1.3.4.3 FÚNGICAS Hay pocas enfermedades micóticas importantes que afecten a la trucha arcoíris y suelen ser hongos saprofitos oportunistas con mayor prevalencia en aguas frías. La infección por Saprolegnia parasítica y la infección por Ichthyophonus son las más destacables. 2.1.3.4.4 PARASITARIAS Las enfermedades parasitarias son causadas principalmente por protozoos como la frecuente Ichthyophthiriosis o enfermedad del punto blanco, causada por Ichthyophthirius multifilis. Otros protozoos que causan enfermedades en peces son Ichthyobodo (Costia) necatrix, Trichodínicos (Trichodina, Trichodinella, Tripartiella), Chilodonella, Paramoeba, Myxosoma cerebralis, Ceratomyxa shasta, Hexamita (Otomitus) y Metazoos como Gyrodactylus, Dactylogyrus, Argulus, Lernaea, Diplostomum spathaceum y Diphyllobothrium. También la enfermedad proliferativa del riñón causada por un endoparásito llamado Tetracapsuloides bryosalmonae causa anemia severa en trucha arcoíris. Para estas y otras enfermedades, la propia gestión sanitaria de la explotación junto con los programas zoosanitarios de vigilancia, control y seguimiento de enfermedades legamente 35 establecidos a nivel europeo, asumen la operatividad para mitigarlas, evitarlas y vigilarlas (Reglamento (UE) 429/2016); Teniendo en cuenta las enfermedades que afectan a la trucha arcoíris en producción en España, el MAPA (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación) publica la legislación relativa a los “requisitos zoosanitarios de los animales y de los productos de la acuicultura”, así como a la “prevención y el control de determinadas enfermedades de los animales acuáticos” donde se clasifican las enfermedades que pueden afectar a esta especie en dos grupos según su origen. Las denominadas “no exóticas”, como son la Necrosis Hematopoyética Infecciosa (IHNV), la Septicemia Hemorrágica Vírica (VHSV) y la Anemia Infecciosa del Salmon (ISAV); Por otro lado, las llamadas “exóticas”, la cual comprende únicamente a la Necrosis Hematopoyética Epizoótica (Real Decreto 1614/2008). 36 2.2. SISTEMA INMUNE TELEÓSTEOS. 2.2.1 INTRODUCCIÓN Los peces constituyen un grupo de organismos interesantes para estudiar el origen y la evolución de los sistemas inmunitarios presentes en los vertebrados (subphylum Vertebrata), porque los sistemas inmunitarios capaces de desarrollar respuestas inmunitarias adaptativas o adquiridas, aparecieron con los peces cartilaginosos (clase Chondrichthyes) y los peces óseos (clase Osteichthyes), hace unos 450 millones de años y están presentes en sus descendientes evolutivos como son todos los demás organismos mandibulados (superclase Gnathostomata), que incluye a anfibios, reptiles, aves y mamíferos. Por el contrario, los peces sin mandíbulas (superclase Agnatha), cuyos únicos representantes son las lampreas y los mixines, parecen carecer por completo de respuestas inmunitarias adaptativas. Se ha llamado el “big bang” de la inmunología, al hecho de que la inmunidad adaptativa haya aparecido evolutivamente a partir del linaje de los peces óseos (Rubio-Godoy, 2010). Estudios moleculares, han demostrado en peces teleósteos, la conservación de casi todos los conjuntos de genes relacionados con la inmunidad presentes en los vertebrados superiores. En esta perspectiva, hay que destacar, que hallazgos obtenidos con peces teleósteos, han llevado a la identificación de funciones previamente no reconocidas en la inmunidad de mamíferos, como por ejemplo la capacidad fagocítica de las células B y las reacciones inmunitarias de las mucosas (Sunyer, 2013). En los últimos años, las investigaciones sobre la fisiología, filogenia y ontogenia del sistema inmune de los peces, han aumentado considerablemente, sobre todo en las especies económicamente más rentables como es el caso de los todos los salmónidos, por su nivel de producción a nivel mundial. En términos generales, la respuesta inmune de todos los vertebrados, incluidos los peces, puede dividirse en dos tipos. El primero, que está presente incluso en los invertebrados, es la respuesta innata o inespecífica, que consiste en una serie de mecanismos filogenéticamente muy antiguos que pueden eliminar los patógenos del organismo o bloquear su entrada de forma inespecífica, es decir, independientemente del tipo de antígeno. El segundo, constituye la denominada respuesta inmune combinada, específica y también llamada adaptativa, que es inducible y requiere la presencia de una serie de células especializadas que reaccionan específicamente con el antígeno inductor y que se caracteriza por desarrollar memoria inmunológica hacia ese antígeno en particular. La denominación de respuesta combinada se debe, a que en ella, intervienen dos elementos: la respuesta humoral, mediada por anticuerpos y la respuesta celular, mediada principalmente por linfocitos T (Tizard, 2013). A pesar de la diferenciación entre distintos tipos de respuesta inmune, debemos tener en cuenta que esta es una clasificación artificial y que siempre que un agente patógeno ataca al organismo, este se defiende mediante la interacción de la mayoría de los elementos que conforman su sistema inmunológico de una manera combinada para ser lo más efectiva posible (Castro & Tafalla, 2015). 37 Las células inmunocopetentes en peces, al igual que en vertebrados superiores, son los leucocitos o glóbulos blancos, que se encuentran circulantes en sangre o almacenados en los tejidos. Estos leucocitos están formados por tres grandes grupos celulares muy diferentes entre ellos, como son: linfocitos (T y B), granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y monocitos o macrófagos (Ellis, 1977). Los principales órganos linfoides de los teleósteos son el timo, el riñón anterior o parte cefálica, el bazo y el tejido linfoide asociado a mucosas MALTs: como son NALT (tejido linfoide asociado a la nariz), GIALT (tejido linfoide asociado a branquias), GALT (tejido linfoide intestinal) y SALT (tejido linfoide en la mucosa de la piel). Los peces carecen de medula ósea y es la parte anterior del riñón y, en menos proporción, la parte blanca del bazo, la que asume la función de diferenciación celular y producción de células componentes del sistema inmune (entre otras). La parte cefálica del riñón, es el órgano linfohematopoyético por excelencia en peces óseos. El riñón se ha descrito como un órgano análogo a la médula ósea de los mamíferos, en el que se produce la eritropoyesis, la granulopoyesis y la linfopoyesis (Razquin et al., 1990). En trucha, se ha descrito la distribución de diferentes estadios de maduración de linfocitos B en las distintas regiones del riñón y es el primer órgano donde aparecen células IgM+ durante el desarrollo del animal (Irwin & Kaattari, 1986; Kaattari et al., 1986). Además, en los teleósteos existen unas acumulaciones de células linfoides que obran como verdaderos órganos linfoides adicionales; entre ellos encontramos los centros melanomacrofágicos (CMMs), los cuales se distribuyen en diferentes órganos como en el bazo, en el hígado, en el riñón, en la tiroides y en el timo. Se forman principalmente por acumulación de células fagocíticas que contienen material foráneo, melanina, linfocitos y células reticulares (Lamers & Parmentier, 1985; Tatner & Findlay, 1991; Press et al., 1994). Además, la melanina y sus precursores, también presentan actividad microbicida (Mackintosh, 2001). Por otra parte, encontramos el sistema reticuloendotelial (SER), que es un sistema de células con alta actividad fagocítica (monocitos y macrófagos principalmente), ampliamente distribuidas por todo el organismo y cuya función es retirar de la circulación células envejecidas y material de desecho. Se localizan principalmente en los sinusoides y capilares peritubulares del riñón, en los elipsoides esplénicos, en la cavidad peritoneal y en el revestimiento auricular cardiaco. Las células gigantes y células epitelioides que se observan en las lesiones inflamatorias crónicas también se consideran parte del SER (Roberts, 1989). 2.2.2 RESPUESTA INMUNE INESPECÍFICA Este tipo de respuesta, comprende una serie de mecanismos, en los que están implicados factores humorales, celulares y tisulares y que constituyen la primera y más importante línea de defensa frente a gran variedad de agentes foráneos. Los mecanismos de actuación son inespecíficos, es decir, independientes del agente invasor (Laird & Needman, 1988). 38 Aunque en vertebrados superiores, el sistema inmune alcanza su máxima evolución en la respuesta mediada por anticuerpos, en vertebrados inferiores, ese tipo de respuesta se desarrolla de forma relativamente lenta tras una infección. Es por ello, que el sistema inmune inespecífico cobra en estas especies mayor relevancia en la defensa del organismo (Alexander, 1985). 2.2.2.1 BARRERAS DE SUPERFICIE Las principales vías de entrada de microorganismos son la piel, branquias e intestino. Son superficies que, por su funcionalidad, están en contacto con el medio exterior y que a su vez, actúan como primeras barreras mediante una serie de mecanismos que limitan la entrada de agentes patógenos (Ruiz & Blas, 2003). Están protegidas por una constante secreción de mucus hidrófobo que está compuesto por una matriz de glicoproteínas (mucinas), que confieren una estructura de gel y contiene diversos factores inmunes humorales con actividades bioestáticas o biocidas contra la infiltración de patógeno además de actuar como barrera mecánica (Xu & Rogers, 1991). Contiene sustancias biológicamente activas, incluyendo inmunoglobulinas naturales, factores del complemento, proteínas C-reactivas, lectinas, lisozimas, enzimas proteolíticas, péptidos antimicrobianos y fosfatasas entre otras (Alexander & Ingram, 1992; Jones, 2001; Palaksha et al., 2008). Las células epidérmicas, son capaces de reaccionar ante distintas agresiones (engrosamiento e hiperplasia celular) y, su integridad, es fundamental para el equilibrio osmótico, así como para evitar la entrada de agentes extraños (Hibiya, 1994). Por otra parte, se ha descrito la presencia de células leucocitarias con actividad defensiva mediante mecanismo de inflamación, como son células linfocíticas, macrófagos y eosinófilos (Peleteiro & Richards, 1985, 1990, Sveinbjørnsson et al., 1996). 2.2.2.2 FACTORES HUMORALES INESPECÍFICOS 2.2.2.2.1 COMPLEMENTO Compuesto por una serie de proteínas séricas que tienen tres funciones defensivas primordiales: recubrir patógenos y partículas extrañas (ajenas o propias pero alteradas del organismo) para facilitar su reconocimiento y destrucción por parte de las células fagocíticas (opsonización); iniciar las respuestas inflamatorias estimulando la contracción del músculo liso, la vasodilatación y la quimio atracción de leucocitos (quimiotaxis); y por último, lisar patógenos mediante la perforación de sus membranas (Rubio-Godoy, 2010). Normalmente están presentes como precursores inactivos hasta que el sistema es activado por uno de las tres vías de 39 activación bioquímica: la vía clásica, la vía alternativa, y la vía de la lectina. La proteasa C3 convertasa está presente en todos los vertebrados y es la pieza clave en la activación del sistema. La vía clásica es parte de la respuesta inmune específica y requiere complejos inmunes (anticuerpo-antígeno) para la activación del complejo C1 que, junto con el C2 y los componentes C4, conducen a la formación de la proteasa C3 convertasa. La vía alternativa y la vía de la lectina, pueden activarse por la hidrólisis de C3 o por antígenos, sin la presencia de anticuerpos como parte de la respuesta innata (Holland & Lambris, 2002). Una vez activado, la proteína C3 se separa en los componentes C3a y C3b: el componente C3b es el principal promotor de la fagocitosis, tanto en peces como en mamíferos, y se ha demostrado que los macrófagos y los neutrófilos de varias especies de teleósteos tienen receptores para el complemento (Yano, 1996). Ya se había comprobado, que el complemento de los peces tiene actividad bactericida contra cepas no virulentas de bacterias Gram-negativas (Yano, 1996). Posteriormente, estudios de expresión realizados con inmunoestimulantes o infecciones microbianas, sugieren que el complemento en los peces es un poderoso mecanismo de defensa contra virus e infecciones bacterianas y parasitarias (revisado por Boshra & Sunyer, 2006; Nakao et al., 2011). 2.2.2.2.2 PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS (AMP) Son péptidos pequeños con bajo peso molecular y con actividades microbicidas directas. La función principal de los AMPs es la actividad lítica directa sobre los patógenos, aunque también se han descrito otras funciones relevantes como la neutralización de endotoxinas, la actividad quimiotáctica y la inmunomodulación (Mihajlovic & Lazaridis, 2010a, 2010b). En su mayoría, son de naturaleza catiónica como los derivados de grandes proteínas como las histonas, los derivados de hemoglobina, los derivados de hemocianinas. Hay péptidos catiónicos unidos a cisteínas que forman enlaces intramoleculares como es el caso de defensinas y hepcidinas (revisado Rajanbabu & Chen, 2011; Valero et al., 2013). Además, existen algunos péptidos aniónicos (Song et al, 2012). Una vez que los propéptidos se activan, son liberados principalmente por el endotelio de la piel a la mucosa, pero también se ha visto en tejidos como riñón, hígado, bazo, branquias, ojos, gónadas y sangre (Rajanbabu & Chen, 2011; Valero et al., 2013). Estas, interactúan directamente con los agentes patógenos, lo que lleva a la destrucción rápida del patógeno, ya sea bacterias, virus, protozoos, hongos o células tumorales (Cuesta et al., 2008; Rajanbabu & Chen, 2011). 2.2.2.2.3 ENZIMAS LÍTICAS Como pueden ser la Quitinasa o la Lisozima, que son enzimas bacteriolíticas ampliamente distribuida por el organismo. Esta última es una enzima lítica que actúa sobre el peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas. También se sabe que actúa como opsonina y que es capaz de activar el sistema del complemento y a algunos fagocitos (Grinde, 1989). Se encuentra en el moco cutáneo, tejido linfoide y plasma fisiológico (Saurabh & Sahoo, 2008). https://translate.googleusercontent.com/translate_f#39 40 2.2.2.2.4 LECTINAS Participan en la aglutinación de microorganismos o en la precipitación de sustancias solubles (Arason, 1996). Son proteínas o glicoproteínas de origen no inmunitario, que se unen a carbohidratos del patógeno y de este modo, operan como moléculas de reconocimiento y opsonización, además de ser capaces de activar también al complemento (Yano, 1996). Los peces presentan un repertorio de lectinas muy diversificado con representantes de la mayoría de las familias descritas hasta ahora, como son: lectinas de tipo C, galectinas, pentraxinas; lectinas / intelectinas de tipo X, calnexina y calreticulina; lectinas de tipo F, lectinas de unión a ramnosa y puflectinas (Vasta et al., 2011). Ejemplos son la Transferrina, que es una lectina de alto poder quelante, que se une al hierro e inhibe el crecimiento bacteriano al limitar la disponibilidad de este nutriente esencial ( Manning et al., 1998). La Proteína C-Reactiva (PCR) es una pentraxina que actúa como una opsonina que activa al complemento al unirse a la superficie bacteriana (Nakanishi et al, 1991). Se ha detectado en muchos teleósteos, incluida la trucha arcoíris, en la que se ha demostrado que favorece la acción del complemento y la fagocitosis (Lund & Olafsen, 1998). La Proteína Amieloide Sérica (SAP), es otra pentraxina que muestra afinidad por la fosforil-etanolamina y se une a lipopolisacáridos (LPS) de bacterias Gram negativas (Lund & Olafsen, 1998). El nivel de pentraxinas es normalmente alto en peces en comparación con mamíferos (Lund & Olafsen, 1999). 2.2.2.2.5 ANTI-PROTEASAS Son inhibidores de enzimas, cuya principal función es la defensa del organismo contra la autodigestión. Son capaces de inhibir las proteasas con las que ciertos agentes penetran en el organismo y consiguen los nutrientes (Ellis, 1987). También están involucrados en reacciones de fase aguda y en la defensa contra los patógenos que secretan enzimas proteolíticas (Bayne & Gerwick, 2001). El más ampliamente estudiado es el α2- macroglobulina (α2-M) que tiene una amplia especificidad y que implica la inhibición de los cuatro tipos de proteasas (serino, metalo, carboxil y tiol) (Sottrup, 1989). 2.2.2.2.6 EICOSANOIDES Son moléculas de carácter lipídico (ácidos carboxílicos) originadas por la oxidación de ácidos grasos esenciales. Participan en varios procesos fisiológicos, incluyendo la homeostasis, la regulación inmunitaria y la inflamación, y pueden incrementar la fagocitosis y actuar como quimioatrayentes para los neutrófilos. Incluyen a las prostaglandinas, los tromboxanos y los leucotrienos, y son potentes mediadores proinflamatorios ( Manning et al., 1998); (Secombes, 1996a; Secombes et al., 1994). 41 2.2.2.3 FACTORES CELULARES INESPECÍFICOS La inmunidad celular no específica comprende tres mecanismos defensivos principalmente: la citotoxicidad natural no específica, la fagocitosis y la inflamación. 2.2.2.3.1 CÉLULAS CITOTÓXICAS NATURALES La citotoxicidad mediada por células es un proceso por el cual, el sistema inmune detecta y mata células alteradas, tumorales o infectadas por virus, para mantener la homeostasis. Constituyen la primera línea de defensa, junto con la fagocitosis, como parte del sistema inmune innato. Se han visto en peces, células citotóxicas no específicas (NCC) y células asesinas tipo NK, análogas a las de los mamíferos. Estas últimas, poseen gránulos citotóxicos y su actividad asesina es similar a la de los linfocitos T citotóxicos, excepto que utilizan receptores innatos inespecíficos para reconocer antígenos (Lieberman, 2003). Las células NCC, se encuentran en la sangre periférica de algunas especies, en el fluido peritoneal, en el timo, en el bazo y en el riñón de los peces. Se ha demostrado que producen toxicidad en una serie de líneas celulares normales, así como infectadas por virus y protozoos, tanto en mamíferos como en peces teleósteos (Manning et al., 1998; Utke et al., 2007). Son pequeñas, agranulares y se ha visto, en el pez gato, que desarrollan una proteína de membrana tipo III como receptor de células NCC, y que también son reactivas al anticuerpo 5c6 (Yoder et al., 2004). Las células tipo NK predominantes en peces son grandes, granulosas y no expresan mensajeros de TCR (T cell receptor) ya que son negativas para la reactividad con el anticuerpo 5c6, tanto para neutrófilos como para marcadores de macrófagos. También son capaces de matar células infectadas con virus (Nakanishi et al., 2011); Actúan reconociendo al Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase I (MHC-I) en la superficie de las células objetivo, a través de la acción de tres diferentes tipos de receptores: receptores similares a inmunoglobulinas de células asesinas, leucocitos receptores de tipo inmunoglobulina y receptores de la familia de tipo C-lectina. Dependiendo del receptor reconocido pueden activarse o inhibirse (Yoder & Litman, 2011). 2.2.2.3.2 CÉLULAS FAGOCÍTICAS Dentro de la inmunidad inespecífica, la fagocitosis es uno de los procesos más importantes en la defensa de los animales poiquilotermos, porque es el menos influenciado por la temperatura externa a la que se ve sometida el organismo (MacArthur et al, 1985; Blazer, 1991). Es el mecanismo que permite al sistema inmune eliminar, de forma inespecífica, el material extraño (antigénico o no) a través de un mecanismo celular de ingestión y digestión de material extraño particulado, que también puede incluir sustancias de desecho, y es https://translate.googleusercontent.com/translate_f#45 42 probablemente, la reacción de defensa más ampliamente distribuida en el mundo animal, tanto en vertebrados como en invertebrados (MacArthur et al., 1985). El proceso de la fagocitosis en los teleósteos, es muy similar al observado en los vertebrados superiores. Incluye las etapas de reconocimiento, unión, incorporación, destrucción, digestión de la partícula endocitada y eliminación de los restos de desecho como desglosaremos en profundidad más adelante (ver capítulo 2.2.5.2). Las células efectoras de la fagocitosis por excelencia son los neutrófilos y los macrófagos. Estos además, colaboran con los linfocitos por medio de la presentación de antígenos y la secreción de citoquinas (Blazer, 1991; MacArthur et al., 1985). Ellis (1977), clasificó las células fagocíticas de los peces en dos grandes grupos: 1) GRANULOCITOS: Se encuentran en distintas proporciones en la sangre circulante según la especie. Los más comunes son los neutrófilos y los eosinófilos, mientras que los basófilos no están en muchas de las especies. Son células móviles y muy activas fagocÍticamente, conteniendo en su citoplasma gránulos lisosomales, vacuolas, mitocondrias y otras organelas. Los neutrófilos son el tipo predominante en todas las especies, aunque alguna posee otros gránulos acidófilos y basófilos en lugar de estas células (Rowley, 1996). Estos constituyen del 4,5%-18% de los leucocitos circulantes y se los llama también polimorfonucleares o leucocitos específicos (PMNs). Tienen una marcada acción fagocítica, con una digestión predominante mediada por la acción de óxido nítrico (NO). Su citoplasma contiene numerosos gránulos para la lisis extracelular de antígenos por secreción de histonas y otras sustancias antimicrobianas. Forman las llamadas “trampas neutrofílicas” (NETs), que son redes extracelulares de ADN y proteínas que inmovilizan agentes microbianos, normalmente de gran tamaño y difíciles de fagocitar, exponiéndolos a agentes microbicidas como son la mieloperoxidasa, elastasa, proteinasa 3, catepsina G, lactoferrina, triptasa y gelatinasa. Además, segregan mediadores celulares para activar y madurar a otros leucocitos (Henry et al., 2013; Pijanowski et al., 2013). Los eosinófilos (EGCs) o células Mast (CM), contienen gránulos citoplásmicos que se tiñen con los colorantes ácidos (según especies) y que en la mayoría de los peces teleósteos son escasos en sangre y sin embargo están muy presentes en el peritoneo y tejidos perivasculares. Se ha demostrado que posteriormente a la exposición a antígenos, estas células pueden desgranularse o proliferar (Reite, 1998). Dichas células liberan una amplia gama de compuestos bioactivos al desgranularse como la heparina, neuropéptidos, proteasas neutras (Baccari et al., 2011). Poseen otros péptidos antimicrobiales (PAMs) como son la lisozima, las piscidinas y las pleurocidinas, que son abundantes en la mucosa de los peces, y reaccionan fuertemente a la inflamación. Contienen además componentes comunes con los gránulos de los mamíferos (Rombout Jan H.W.M. et al., 2011). La producción de estas células en peces adultos tiene lugar en el riñón craneal y el bazo principalmente (Baccari et al., 2011), aunque dicha producción también es posible en otros órganos como son en tejido linfoide asociado a mucosas y timo ( Press & Evensen, 1999). En la dorada, muestran una alta expresión del gen MHC clase II y gran capacidad fagocítica, lo que sugiere que también tienen capacidad presentadora de antígenos (Cuesta et al., 2008). 43 Los basófilos contienen gránulos en el citoplasma que se tiñen con los colorantes básicos y su presencia es escasa y rara en la sangre periférica. Los estudiados en peces solo se han diferenciado en unas pocas especies en base a características morfologías y estructurales (Tavares-Dias & Moraes, 2006). 2) AGRANULOCITICOS: Los componen las células monocíticas y macrófagos que serán parte de estudio específico más adelante (ver capítulo 2.2.5). Brevemente, los monocitos son móviles, ya poseen capacidad fagocítica y suelen ser de menor tamaño. Tienen un citoplasma vacuolado y basofílico. Se encuentran principalmente en sangre circulante. Los macrófagos son células fagocÍticamente activas derivadas de los monocitos (en su mayoría) que se encuentran en tejidos y en las cavidades peritoneal y pericárdica. Son de mayor tamaño que los anteriores, y por esta razón pueden fagocitar partículas más grandes. En teleósteos, los macrófagos son especialmente abundantes en el bazo y en el tejido linfomieloideo renal. También puede haber en otros tejidos, por ejemplo, en las mucosas. No obstante, se ha observado que otros tipos de células también poseen capacidades fagocíticas como son los trombocitos (equivalentes a las plaquetas en mamíferos) donde se ha estudiado en la carpa, en la lubina y también en la trucha. Además de la capacidad fagocítica, se les ha supuesto un posible papel en la presentación de antígeno (Haugland et al., 2012; Steinman et al., 2003). Por otro lado, también las células dendríticas (CD), que se encuentran principalmente en mucosas, se ha demostrado una gran actividad fagocítica, reactividad a ligandos de receptores TLRs (Toll like receptors) y capacidad estimuladora de linfocitos T (Granja et al., 2015; Haugland et al., 2012; Steinman et al., 2003). 2.2.2.3.3 INFLAMACIÓN La inflamación comprende una serie de modificaciones ante una agresión de cualquier tipo, tendentes a mantener la integridad de la estructura básica del tejido afectado, asegurando el suficiente aporte sanguíneo para mantener la homeostasis y proporcionando, en el lugar de la lesión, las condiciones necesarias para que la curación pueda realizarse (Ferguson & Drahushchak, 1989). El mecanismo inflamatorio ocurre cuando cualquier tejido se deteriora por afecciones físicas, químicas o biológicas, provocando la liberación de aminas vasoactivas y detritus celular. Estas aminas actúan sobre la microcirculación del tejido afectado, produciendo una vasodilatación que aumenta la circulación local, el lumen y la permeabilidad de los endotelios capilares lo que permite una exudación de proteínas del plasma desde la sangre a los tejidos circundantes, así como una intensa diapédesis de leucocitos. Las inmunoglobulinas y el complemento procedentes de sangre ejercen su actividad biológica y, el fibrinógeno, proteína de fase aguda de origen hepático que aumenta durante la inflamación, se polimeriza en fibrina, la cual delimitará la lesión al formar una red. Esta migración leucocitaria es estimulada por una variedad de factores derivados tanto del huésped como de los patógenos. Los quimioatrayentes 44 producidos por el huésped incluyen al fragmento del complemento C5a, leucotrienos y algunas citocinas, que son secretadas por los granulocitos que son el primer tipo celular que se acumula en torno al foco inflamatorio. Después de la vasodilatación, los neutrófilos pasan a la circulación desde el pronefros y migran hasta el lugar de inflamación por quimiotaxis. Por ello, una neutrofilia puede ser signo de las primeras fases de inflamación aguda. El número de monocitos se eleva en sangre y, los macrófagos, migran a la zona inflamada. Finalmente, los macrófagos se activan en respuesta al daño tisular, pues estas células se activan al entrar en contacto con colágeno (Castillo-Briceño et al., 2009). Estos fagocitan patógenos, desechos celulares del tejido dañado y restos de eritrocitos y neutrófilos degenerados durante el proceso. Por último, se observa una leucopenia sanguínea debida a un descenso de linfocitos circulantes, los cuales muchos de ellos serán inmaduros, como consecuencia de la migración a los tejidos y de la degeneración citotóxica causada por las proteínas catiónicas de los eosinófilos durante el proceso (Lamas et al., 1994). Las respuestas inflamatorias se pueden iniciar rápidamente, al cabo de una hora de la exposición al foco inflamatorio y, alcanzan el pico, después de unos dos días. Sin embargo, si el desafío persiste, la inflamación puede ser crónica y conducir a la formación de granulomas o al encapsulamiento de la fuente antigénica (Secombes, 1996b). La importancia para los peces de la inmunidad innata, por sus condiciones como animales poiquilotermos, más exactamente ectotermos pues no pueden mantener una temperatura corporal constante ante los cambios de la temperatura exterior, se evidencia porque cuando los peces se encuentran a temperaturas muy bajas, no son capaces de activar adecuadamente algunas funciones inmunitarias adaptativas, como la producción de anticuerpos (Bly et al., 1997) y dependen por lo tanto, sobre todo de las defensas innatas. O cuando la inmunidad adquirida no funciona eficientemente, se incrementa la actividad del complemento y los factores de coagulación, componentes de la inmunidad innata, ya que se demostró en el pez cebra cuando eran incapaces de producir anticuerpos (Jima et al., 2009). 2.2.3 RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA El sistema inmune específico es un componente del sistema protector basado en una serie de cambios adaptativos que tienen lugar dentro de las poblaciones linfoides (linfocitos T y linfocitos B) y células asesinas naturales NK, dirigidos hacia la estructura molecular antigénica que provoca su estímulo. Dentro del sistema inmune, esta respuesta engloba los mecanismos más complejos y desarrollados y, se caracteriza, por su especificidad y capacidad de memoria. En términos generales, se habla de respuesta específica cuando nos referimos a la producción de anticuerpos, pero la inmunidad específica está compuesta por dos elementos: la respuesta humoral, mediada por anticuerpos procedentes de linfocitos B y desarrollada básicamente en el 45 medio extracelular, y la respuesta celular, mediada por linfocitos T y con acción intracelular (Bernstein et al, 1998). Se ha considerado, que las verdaderas células ejecutoras del sistema inmune específico, son los linfocitos circulantes. Estas células, presentan en sus correspondientes membranas, una serie de receptores capaces de reconocer ciertas moléculas antigénicas. Los linfocitos B, expresan secuencias génicas de inmunoglobulinas para receptor tipo B (B cell receptor o BCR) cuando están anclados a la membrana celular, o de anticuerpo cuando se liberan al medio. Los linfocitos T, sin embargo, siempre están ligados a membrana con receptores tipo T (T cell receptor o TRC). Se cree que cada linfocito lleva impreso un número muy limitado de estos receptores, por lo que su capacidad para reconocer determinantes antigénicos es también muy limitada. Cuando un linfocito entra en contacto con un antígeno al que es capaz de reconocer, sufre una serie de cambios, tanto morfológicos como estructurales, que implican la proliferación de células mediante división por mitosis (Tatner, 1990). La respuesta, por tanto, podrá ser de tipo humoral mediante la síntesis de moléculas de anticuerpo, o de tipo celular, dependiendo del tipo de linfocito de que se trate (Laird y Needham, 1988). 2.2.3.1 RESPUESTA HUMORAL Se produce a través mecanismos que constituyen una compleja red de células especializadas, proteínas, mensajes bioquímicos y genes, que aportan los medios necesarios para que el organismo responda específicamente a los antígenos, procedentes de agentes patógenos, células alteradas u otras sustancias extrañas, mediante síntesis inmunoglobulinas efectoras de alta especificidad y afinidad por el antígeno que ha inducido su producción (principalmente por parte de las células B). Estos anticuerpos, son considerados mediadores solubles de carácter específico de la inmunidad. Las principales funciones de los linfocitos B, principales células involucradas en la respuesta inmune humoral, son la producción de anticuerpos y, en el caso de los teleósteos, también incluyen capacidades fagocíticas (Aquilino et al., 2016); son buenas presentadoras de antígeno (Zhu et al., 2014), y poseen actividad fagocítica y capacidades bactericidas intracelulares (Li et al, 2006; Zhu et al., 2014). Por tanto, se podría decir que las células B de teleósteos comparten características de inmunidad innata y adaptativa. En peces adultos, las células B se pueden encontrar en el riñón anterior y tronco renal, en el bazo, en el hígado, en los tejidos MALT y en la sangre (Abós et al., 2013; Salinas et al., 2011); y suponen un 30% de todos los linfocitos circulantes. https://translate.googleusercontent.com/translate_f#35 https://translate.googleusercontent.com/translate_f#35 46 Los anticuerpos producidos frente a los antígenos por este tipo de leucocitos, son proteínas del grupo de las inmunoglobulinas (Igs). Todos tiene acción extracelular y, según su actividad biológica, los anticuerpos pueden clasificarse en anticuerpos aglutinantes: producidos frente a antígenos particulados en los que induce la formación de agregados, probablemente menos tóxicos y más fáciles de fagocitar; anticuerpos precipitantes: que precipitan antígenos de naturaleza soluble y son importantes como antitoxinas; y anticuerpos neutralizantes: que neutralizan la acción del agente patógeno, mediante su unión a la membrana evitando así su unión a la célula diana (De Kinkelin, 1995). En teleósteos, se han informado tres isotipos de inmunoglobulinas presentes, IgM, IgD e IgT (también llamada IgZ en algunas especies, como en el pez cebra), con funcionalidades similares a sus homólogas en vertebrados superiores. Mientras que IgM e IgD parecen ser esenciales, pues están presentes en todas las especies de teleósteos, IgT solo están presentes en algunas de ellas (Fillatreau et al., 2013). La producción de anticuerpos, básicamente se produce siguiendo el mismo proceso que en mamíferos. Los linfocitos B se activan por la unión del antígeno entero a los sus receptores de superficie (B Cell Receptor o BCR), que son moléculas de inmunoglobulinas ancladas a su membrana y que son capaces de reconocer multitud de ellos. Así, en las células B activadas se desencadena la proliferación y secreción de anticuerpos, para lo que es necesaria en ocasiones la asociación con las células T previamente activadas. La colaboración entre estos tipos celulares, requiere gran proximidad entre ellos, por lo que las interacciones se producen principalmente en órganos linfoides como bazo y riñón (Vallejo et al., 1992). El fundamento de la respuesta inmune adaptativa, es la selección de clones. Cada linfocito expresa sólo un tipo de receptor y sólo es capaz de responder a uno, o, a una cantidad limitada de antígenos. Sólo las células con los receptores apropiados, se estimulan por un antígeno y se expanden clónicamente, lo que permite la regulación precisa de la respuesta inmune y la generación de una respuesta adaptativa y muy específica. Aunque la función principal de las células B es la producción de anticuerpos, tanto en peces como en mamíferos, estas células también tienen cierta capacidad presentadora de antígeno a células T (Zhu et al., 2014). En cualquier caso, cuatro subconjuntos diferentes de células B parecen estar presentes en los teleósteos en base a su expresión de inmunoglobulinas en membrana. Tres subconjuntos con expresión de superficie única de IgM+, IgD+ o IgT+ (Castro & Tafalla, 2015); y un subconjunto que coexpresa en superficie IgM+ e IgD- en el pez gato (Edholm et al., 2010), también encontrada en la trucha como fenotipo IgM (Castro et al., 2017). El hecho de que se pueda inmunizar o vacunar a los peces frente a varios procesos, pone de manifiesto la presencia de un fenómeno de memoria inmunológica. Este proceso permite al organismo producir una respuesta inmune mucho más rápida y eficaz en el segundo o posteriores encuentros con el antígeno (Arkoosh & Kaattari, 1991). 47 2.2.3.2 RESPUESTA CELULAR La inmunidad celular está mediada por los linfocitos T y es necesaria cuando los agentes escapan al sistema humoral y llegan a ser intracelulares, como ocurre en las infecciones víricas o cuando las células de propio hospedador se transforman en tumorales y es necesario destruirlas. Las células T se caracterizan por la presencia de un receptor en membrana (T Cell Receptor o TCR) por el cual reconocen antígenos y que, a diferencia de los linfocitos B, estas no son capaces de reconocer antígenos en ausencia de ayuda para su presentación (con la excepción de superantígenos), porque el receptor de células T está restringido a reconocer antígenos solo cuando está expuesto en el contexto de un Complejo de Histocompatibilidad Mayor (MHC), clase I o II, presente en la superficie celular. Los linfocitos T, se dividen en dos subpoblaciones principales en función de las cadenas TCRs que expresan: las células αβ-T catalogadas como convencionales y que se pueden diferenciar en T citotóxicas (Tc): caracterizadas por la expresión en membrana de glicoproteínas CD8+, que eliminan células infectadas y tumorales reconocidas por MHC tipo I; y T cooperantes (Th): las cuales expresan glicoproteínas CD4+, cuya principal función es la secreción de citoquinas y se han reconocido varias respuestas de este tipo de célula dependiendo de las diferenciación de su precursora: Th1, Th2, Th17, Th22 y Treg, con secreción de citoquinas diferentes. Y por otro lado las células γδ-T, las cuales reconocen antígenos sin procesar de manera similar a la de los receptores de reconocimiento de patrones (PAMPs) (Toda et al., 2011). Se han identificado en varias especies de teleósteos (y elasmobranquios) las cuatro cadenas del TCR (Flajnik & Kasahara, 2010). Las células Tc citotóxicas (CD8+) se encargan de destruir a las células que presentan péptidos extraños reconocidos por los linfocitos T a través de los MHC I y II (Cuesta et al., 2006; Forlenza et al., 2011 ; Köllner et al., 2004) y también muestran acción frente a células infectadas por virus (Fischer et al., 2006). Por otro lado, las células Th secretoras de citoquinas (CD4+), ayudan a los macrófagos para eliminar los microorganismos fagocitados e inducen al linfocito B a diferenciarse y secretar anticuerpos que se unen a los antígenos diana. Estudios genómicos realizados en diferentes especies de teleósteos, han identificado la mayoría de los componentes asociados con la función de las células Th de mamíferos (Th1, Th2, Th17, Th22 y Treg), lo que permite especular que los peces tienen todos los diferentes subconjuntos de células Th que éstos (Laing & Hansen, 2011). También se han obtenido buenos resultados en diseños experimentales enfocados en el estudio de moléculas específicas de los linfocitos T, como es el caso de la molécula CD3. Es otra molécula que facilita la traducción de señales tras el acoplamiento del Complejo de Histocompatibilidad Mayor con los receptores de células T (MHC-TCR) (Maisey et al., 2011). Además, proporciona al linfocito una diana de unión de determinados anticuerpos (Boardman et al., 2012). https://translate.googleusercontent.com/translate_f#38 https://translate.googleusercontent.com/translate_f#38 https://translate.googleusercontent.com/translate_f#38 48 2.2.4 MEDIADORES SOLUBLES DE INMUNIDAD Todo el sistema inmunitario está comunicado entre sí y con otros sistemas, para que la respuesta sea coordinada y homogénea. Ya vimos que los anticuerpos actuaban como mediadores solubles dentro de la inmunidad específica. Anteriormente estudiamos a la proteína C reactiva (PCR) y al sistema del complemento como mediadores dentro de la inmunidad innata. Ahora vamos a estudiar a las citoquinas (o citocinas) como mediadores solubles de inmunidad capaces de actuar a todos los niveles. 2.2.4.1 CITOQUINAS Son proteínas de pequeño tamaño (5-20 KDa) que median la señalización celular dentro del sistema inmune. Las citoquinas, son liberadas por las células (principalmente leucocitos) y regulan las funciones inmunes a través de la interacción con un receptor específico en la superficie de otras células o la misma célula que las produjo. En algunos casos, también pueden producir efectos sistémicos. Cada citoquina puede ser producida por diferentes tipos de células y, de la misma manera, su receptor puede expresarse en la superficie de muchos tipos de leucocitos diferentes. Finalmente, varias citoquinas pueden ejercer roles muy similares funcionalmente (Castro & Tafalla, 2015). 2.2.4.1.1 QUIMIOCINAS Son una familia de citoquinas quimioatrayentes que regulan la migración de leucocitos, su maduración y la funcionalidad de las células reclutadas en respuesta a la inflamación. También, de forma activa, juegan un papel en el tránsito fisiológico de los leucocitos dentro de los órganos linfoides (Cyster, 1999; Warnock et al., 2000) . El primer gen de quimiocinas identificado en un teleósteo fue precisamente en trucha arcoíris, designado como CK1 en 1998. Son producidas por diferentes tipos de células y actúan sobre los leucocitos a través de interacción con receptores ligados a proteínas G en la superficie de la célula diana. Se definen por la presencia de cuatro residuos de cisteína y se dividen en cuatro subfamilias, dependiendo de la disposición de las dos primeras cisteínas conservadas en su secuencia: CXC, CC, C y CX₃C. Los extensos eventos de duplicación genómica y, el hecho de que las quimiocinas evolucionan más rápidamente que otros genes inmunes, hacen que sea muy difícil establecer verdaderas homologías entre las quimiocinas de peces y mamíferos que nos ayuden con la atribución de funciones inmunes (Alejo & Tafalla, 2011). https://translate.googleusercontent.com/translate_f#38 49 2.2.4.1.2 INTERFERONES (INF) Son un tipo de citoquina muy abundantes en infecciones víricas. Hay tres tipos I, II y III dependiendo de los receptores afines con lo que interactúan y de la respuesta inmune desarrollada (tipo I y III inmunidad innata frente a virus; tipo II inmunidad mediada por células). Se ha comprobado su evolución temprana desde vertebrados inferiores (Nakatani et al., 2007). Los tipos de IFN presente en una especie varían, pero en general, los peces óseos avanzados parecen tener más copias que las especies inferiores, como el pez globo ( Zou & Secombes, 2011). Además, los IFN en peces, se pueden dividir según el número de cisteínas en su secuencia. Así en el IFN tipo I se divide en grupo 1 (2 cisteínas) y grupo 2 (4 cisteínas), pero hasta ahora, solo se han encontrado IFN del grupo 2 en salmónidos y ciprínidos donde su expresión parece estar restringida a tipos de células como los leucocitos (Zou & Secombes, 2011). Los efectos antivirales directos del IFN tipo I en las células, están mediadas por la inducción de un conjunto de genes estimulados por IFN como oligo-2', 5'-adenilato sintetasa o proteína quinasa R (PKR). Del IFN tipo II, se han descrito dos genes que codifican subgrupos IFN-γ (análogo a mamíferos) e IFN-γrel especifico de teleósteos (Igawa et al., 2006). El IFN III, parece estar ausente en peces óseos, pero si lo encontramos en tetrápodos inferiores sugiriendo una evolución posterior o perdida evolutiva con respecto a los otros INF en peces (Secombes & Zou, 2017). Se han descubierto otras proteínas antivirales inducidas por IFN en peces, incluyendo la viperina, proteínas quinasas, proteína ISG15, galectinas y proteínas fin, denominadas TRIM (Verrier et al., 2011). 2.2.4.1.3 INTERLEUQUINAS (IL) Son un tipo muy amplio de citoquinas, producidas por una amplia variedad de tipos de células (células T auxiliares CD4+, macrófagos/monocitos y células endoteliales). Están involucradas en la regulación intercelular inmunitaria. Aunque hay 35 descritas en mamíferos, las variantes de empalme y la variación alélica, aumentan aún más esta diversidad en peces (Secombes et al., 2011a). La familia IL-1 agrupa a 11 miembros desde la IL-1F1 a la IL-1F11: IL-1α (IL-1F1), IL-1β (IL-1F2), antagonista del receptor de IL-1 (IL-1ra / IL-1F3), IL-18 (IL-1F4), después IL-1F5 a la IL- 1F10 y por último la IL-33 (IL-1F11). Todas estas moléculas, tienen un marcado carácter pro- inflamatorio o actúan como agonistas de otras citoquinas proinflamatorias. IL-1β fue la primera descubierta en peces (Zou et al., 1999). Hay otras citoquinas proinflamatorias fuera de la familia IL-1, como la IL-6, que engloban, entre otras, a subfamilias como la IL-11 con subtipos IL-11a e IL-11b, e IL-31, ambas con claros homólogos en peces (Secombes et al., 2011b). https://translate.googleusercontent.com/translate_f#52 https://translate.googleusercontent.com/translate_f#50 50 La familia IL-2, está formada por IL-2, IL-21 e IL-4, todas ellas liberadas por diferentes subconjuntos de células Th tras su estimulación (Secombes et al., 2011b) y, además, IL-7 e IL-15 con dos subtipos IL-15La y IL-15Lb, presentan ambas importantes funciones en la memoria de células T (Osborne & Abraham, 2010). La familia IL-10, agrupa IL-10, IL-19, IL-20, IL-24, IL-22, IL-26, e IFN-γ, con efectos reguladores o antiinflamatorios (Lutfalla et al., 2003). Se ha demostrado la presencia de IL-10 en respuesta a infecciones bacterianas o en presencia de LPS (Seppola et al., 2008). La familia IL-17 en mamíferos, está compuesta por 6 miembros, desde la IL-17A a la IL- 17F, con IL-17E también denominada IL-25. Todas estas, se encuentran también en invertebrados y peces, pero ha sido difícil esclarecer su homología con los primeros y, en salmónidos, también se han descubierto genes de IL-17A / F, dos de IL-17C y un gen de IL-17D (Kumari et al., 2009). Hay otras interleuquinas con funciones muy diversas, como IL-12, IL-23, IL-27 e IL-35. Se pueden agrupar en un mismo grupo, porque se forman como heterodímeros y comparten algunos de los elementos que las forman. También han sido reconocidas en peces teleósteos, que son donde más se han estudiado (Secombes et al., 2016). Existen otras como la IL-14 que potencia la proliferación de células B; IL-16 con efectos quimioatrayentes y moduladores de células T CD4; IL-34 relacionada con el factor estimulante de colonias (CSF-1) y que se ha visto que aumenta la viabilidad de monocitos (Castellani et al., 2010). 2.2.4.1.4 OTRAS CITOQUINAS Otras familias importantes de citocinas incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF), el factor de crecimiento transformante (TGF) y los factores estimuladores de colonias (CSF). TNF-α (Factor de necrosis tumoral alfa) es citoquina que media las respuestas proinflamatorias a través de la promoción de expresión de selectina y quimiocinas en células endoteliales con un posterior reclutamiento y activación de fagocitos (Roca et al., 2008). TGF-β (Factor de crecimiento transformante beta) es la citocina más conocida, que pertenece a una familia de citocinas multifuncionales, involucrado en el crecimiento celular, la migración, la diferenciación y la apoptosis (Ten Dijke & Hill, 2004). También actúa como un regulador importante en la proliferación de células T y B, teniendo efectos sobre macrófagos, células dendríticas y células NK (Li et al., 2006). CSF (Factor estimulante de colonias), son citocinas con un papel central en la hematopoyesis, activando la señal intracelular que pueden hacer que las células proliferen y se diferencien en un tipo de célula sanguínea (heterogeneicidad). Además, pueden influir en células maduras específicas para modular funciones inmunes tardías y mantener la homeostasis y la competencia inmune (Barreda et al., 2004). Dentro de este grupo, cabe destacar los factores 51 estimulantes de macrófagos (M-CSF o CSF-1) y de granulocitos (G-CSF) que son relativamente específicos de linaje y tienen un papel primordial en la proliferación, diferenciación y supervivencia de macrófagos, neutrófilos y sus precursores. En contraste, la granulocito/macrófago CSF (GM-CSF) y multi-CSF funcionan en las primeras etapas del compromiso de linaje, que regula la expansión y maduración de los progenitores primitivos en el órgano hematopoyético (Barreda et al., 2004). 2.2.5 BIOLOGÍA DE LOS MACRÓFAGOS 2.2.5.1 INTRODUCCIÓN Como hemos visto anteriormente, los macrófagos son leucocitos no granulados de mayor tamaño y con función fagocítica. Los macrófagos en etapas juveniles se denominan monocitos. En salmónidos, los monocitos suelen encontrarse en sangre circulante y los macrófagos en órganos hematopoyéticos y, donde más abundan es en el riñón anterior y en el bazo, donde forman parte de los centros melanomacrofágicos (CMMs). Estas células son la línea de defensa más importante de los peces óseos. Son células irregulares de gran tamaño con citoplasma claro y ocasionalmente con vacuolas, que presentan un núcleo grande de forma variable (redonda, ovalada, arriñonada) (ver Figura 6). Figura 6. Imagen con microscopia óptica de macrófagos teñidos en un frotis sanguíneo (Educaplay) Los macrófagos constituyen la población celular más pleiotrópica del sistema inmune. Al igual que los macrófagos humanos, son efectores de la respuesta inmune innata y están involucrados en el inicio y regulación de respuestas adaptativas (Duque Correa & Rojas López, 2007). 52 Los macrófagos son las principales células fagocíticas, y al igual que los neutrófilos, también tienen una gran actividad microbicida gracias a la explosión respiratoria. Además de estas funciones, también participan en la respuesta adquirida reconociendo, procesando y presentando antígenos, y secretando factores solubles que regulan la actividad de los linfocitos y ayudan a mantener la homeostasis. Cuando hay infección, suelen ser de las primeras células en encontrarse con el agente patógeno y desencadenar una respuesta inmune apropiada (Hodgkinson et al., 2015). En teleósteos, el mayor número de macrófagos que encontramos es similar al fenotipo M1 de mamíferos con actividad efectora. Estas células destruyen antígenos rápidamente mediante la fagocitosis y la producción de reactivos intermediarios tóxicos. Además, estos macrófagos fabrican gran cantidad de citoquinas, quimioquinas y mediadores lipídicos que potencian la inflamación y la respuesta inmune adaptativa (Hodgkinson et al., 2015). 2.2.5.2 PROCESO DE FAGOCITOSIS En la actualidad, el término de fagocitosis se usa para describir el proceso por el cual las células engloban partículas como bacterias u otros microorganismos, glóbulos rojos envejecidos, materias extrañas, sustancias de desecho, etc. para su posterior eliminación. La ultraestructura del proceso fagocítico se ha estudiado para los macrófagos de peces principalmente mediante el uso de células bacterianas como partículas objetivo. Se ha demostrado que este proceso es variable en cuanto al número de bacterias endocitadas por fagocito y que el tiempo requerido para la absorción y digestión de estas por el macrófago, era dependiente de muchos factores (Secombes & Fletcher, 1992; Esteban & Meseguer, 1997). Las fases del proceso de fagocitosis en macrófagos de teleósteos vienen desarrolladas a continuación (ver Figura 7): Figura 7. Etapas del funcionamiento efector de macrófagos durante la fagocitosis (Hernán Rodríguez, 2016). 53 1º) Activación de macrófagos: La activación es necesaria para que el macrófago ejerza sus funciones. Enane et al, (1993), demostraron que la activación en trucha arcoíris ocurre de forma análoga a lo que ocurre en los fagocitos de mamíferos. En este proceso, que en ocasiones va precedido de una acumulación de todo tipo de fagocitos en el lugar de infección (quimiotaxis), además del perfeccionamiento de sus capacidades fagocíticas y digestivas, se caracteriza por cambios en la membrana plasmática, con un aumento de colesterol y aumento en la liberación de oxígeno reactivo. Además, se produce un descenso en los niveles de la ecto 5´nucleotidasa. Sin embargo, en teleósteos, no se observa un aumento en la actividad fosfatasa ácida, como si ocurre en mamíferos. La activación puede producirse por la presencia de un antígeno o material extraño (Enane et al., 1993; Skarmeta et al., 1995). Sin embargo, existen otros factores que incrementan la actividad fagocítica y bactericida, como la presencia de factores activadores de macrófago (MAFs) liberados por linfocitos (Hardie et al., 1996), opsonización de la partícula a fagocitar (Blazer, 1991), acción del complemento (Yoshida & Kitao, 1991), presencia de la hormona adrenocorticotropa ACTH (Bayne & Levy, 1991) y efecto de determinadas citoquinas (revisado por Hodgkinson et al, 2015). Además de la acción de determinadas sustancias, también diferentes tipos de mediadores celulares (y otros compuestos) que se liberan de los propios macrófagos y restos de leucocitos cuando detectan material para actuar, producen la activación de estas células fagocíticas. Así y en comparación con mamíferos, dependiendo de las vías de activación de los macrófagos vamos a observar diferentes respuestas inmunes de los mismos, es decir, diferentes fenotipos. Los macrófagos son notablemente plásticos y pueden cambiar su fenotipo funcional dependiendo de las señales ambientales que reciben. En función de estas señales, los macrófagos se dividen tradicionalmente en macrófagos activados clásicamente e inducidos en un entorno de citoquinas Th1 (M1), y macrófagos activados alternativamente e inducidos en un entorno de citoquinas Th2 (M2a,b,c) (Zhou et al., 2014). 2º) Opsonización: Consiste en el recubrimiento de las partículas a fagocitar por factores séricos como son anticuerpos específicos, proteínas del complemento u opsoninas inespecíficas como la proteína C reactiva o lecitinas, que ayudan en el reconocimiento y unión de la parte extraña a la superficie celular del fagocito. En su presencia de estos factores, la eficacia de la fagocitosis aumenta notablemente (Blazer, 1991). El proceso de fagocitosis es provocado por la interacción de las moléculas diana con los receptores de la superficie fagocítica presentes en las estas células. La superficie de los fagocitos tiene muchos receptores que pueden reconocer y decodificar sus ligandos afines expresados en la superficie del objetivo fagocítico. Estos receptores, pueden reconocer directamente el antígeno mediante sus patrones moleculares asociado a patógenos (PAMPs) o reconocer objetivos que están recubiertos con moléculas opsónicas (Moretti & Blander, 2014). 3º) Ingestión: Una vez reconocido el objetivo a fagocitar y fijado en la membrana del macrófago, se lleva a cabo el proceso de endocitosis de partículas de gran tamaño, por el cual, el material seleccionado y fijado a la membrana, es introducido al interior de la célula. Es lo que llamamos literalmente “proceso de fagocitosis”. Por partes, una vez reconocido y unida la partícula a la membrana del macrófago, se produce una invaginación de la membrana de la 54 célula fagocítica hacia el citoplasma, formando dos pseudópodos hacia la luz extracelular. Una vez se unen ambos pseudópodos se completa el proceso. La partícula queda aislada dentro del citoplasma del macrófago en una capsula llamada fagosoma temprano. Los lisosomas, organelas digestivas dispersas en el citoplasma celular, se fusionan con los fagosomas y forman fagolisosomas (Meseguer et al., 1994). Estas son las vesículas donde se internalizan las partículas que serán destruidas por una serie de compuestos generados, los cuales incluyen enzimas degradativas, péptidos antimicrobianos y un ambiente de pH ácido (Canton, 2014). Además, la fagocitosis activa varios mecanismos microbicidas de los macrófagos donde, el más importante y conocido, implica la producción de radicales intermedios de oxígeno reactivo (radicales superóxido o ROS) y de nitrógeno (óxido nítrico) que se sabe que poseen la más importante acción microbicida en los fagolisosomas (Neumann et al., 2001). 4º) Digestión: La actividad microbicida en los macrófagos se produce principalmente por el proceso denominado estallido respiratorio. Este abarca un cambio oxidativo dentro del fagosoma previamente formado, con un incremento en el consumo de oxígeno y glucosa, aumento en la actividad del ciclo de pentosas o hexosas monofosfato y la producción de compuestos reactivos de oxigeno (ROS) (revisado por Grayfer et al., 2018). Tras la estimulación de la membrana del fagocito, la enzima NADPH oxidasa (nicotinamida-adenin-dinucleótido- fosfato-hidrógeno oxidasa) presente en esta, es capaz de reducir el O2 en anión superóxido O2 - a través de un catalizador espontáneo (DeLeo & Quinn, 1996). Este complejo está formado por dos partes: en la membrana celular se encuentra la parte llamada flavohemocitocromo (b558), con dos subunidades proteicas unidas: gp91-phox y p22-phox (Parkos, Allen, et al., 1988; Parkos, Dinauer, et al., 1988). En el citosol se encuentran las subunidades p40-phox, p47-phox y p67- phox (Volpp et al, 1989; Leto, et al., 1990; Tsunawaki et al., 1996). Cuando se activa el sistema, la proteína quinasa C (PKC), activa a las subunidades citosólicas que migran para unirse a la parte del citocromo (promovido por enzimas reguladoras Rap-1) y activan el sistema, produciendo que el b558 capture oxigeno molecular y lo transforme en anión superóxido (O2 ⁻). Los NADPH generados por la vía de la hexosa monofosfato (mediante el paso de glucosa 6- fosfato a ribulosa 5-fosfato), aportan los equivalentes reductores. Los dos procesos, el regulado por la NADPH oxidasa y el de la hexosa monofosfato, se activan y actúan conjuntamente al estimularse la membrana, siendo independientes de la respiración celular de las mitocondrias. La mayoría del O2⁻, se transforma en peróxido de hidrogeno (H2O2), bien espontáneamente o por la enzima superóxido dismutasa (ver Figura 8). Estos compuestos reactivos de oxígeno formados (ROS), también denominados metabolitos de oxígeno, incluyen especies como los radicales hidroxilo (OH¯), peróxido de hidrógeno (H2O2); en presencia de cloro, el ácido hipocloroso (OCl¯) y en combinación con el óxido nítrico, el peroxinitrito (ONOO¯) (Ischiropoulos et al., 1992; Borregaard & Cowland, 1997; Sheppard et al., 2005). Estos compuestos junto con otros que se sintetizan de forma secundaria e independientes de oxígeno, como son las hidrolasas lisosomales y péptidos microbicidas, que se activan al acidificarse el medio lisosomal, son los compuestos microbicidas más importantes de los fagocitos y los que llevan a cabo la eliminación del antígeno fagocitado (Chung & Secombes, 1988). La actividad de la enzima NADPH y sus metabolitos microbicidas ha sido ampliamente revisada (Mizrahi et al., 2006; Robinson, 2008, 2009; Sheppard et al., 2005). 55 Figura 8. Dibujo de activación y proceso estallido respiratorio dependiente de oxígeno en el fagolisosoma. Modificado de Greyfer et al, 2018. ROS: reactivos de oxigeno; b558: citocromo; PKC: proteincinasa C; rap1: proteína reguladora; pXphos/gp91phos: subunidades de la enzima NADPH OXIDASA. Similar a la producción de superóxido, el sistema de óxido nítrico inducible (NO⁻) de los macrófagos teleósteos es bien conservado en comparación con los descritos en mamíferos. Los macrófagos activados clásicamente se distinguen por la expresión de óxido nítrico, producido por la enzima sintasa inducible (iNOS / NOS2) que cataliza la conversión de L -arginina a L - citrulina, lo que resulta en la producción de NO⁻, el cual es un potente compuesto antimicrobiano (Nathan & Xie, 1994b, 1994a; MacMicking et al., 1997). La producción simultánea de superóxido (O2⁻) y óxido nítrico (NO⁻) intermedios, también puede formar peroxinitrito (ONOO⁻), que además cumple potentes funciones antiparasitarias/antimicrobianas (Hodgkinson et al., 2015). Sin embargo, la interdependencia del estallido respiratorio de los macrófagos con las respuestas de óxido nítrico, sugiere que la regulación secuencial de las respuestas antimicrobianas de los macrófagos no es una estrategia exclusiva de los teleósteos, pudiendo ser independientes la una de la otra y estar relacionadas con la degradación del triptófano (Iyengar et al, 1987) (ver Figura 9). Además, hay otros compuestos antimicrobianos potentes generados por los fagocitos activados que incluyen, enzimas degradantes (proteasas, nucleasas, fosfatasas y lipasas) y péptidos antimicrobianos (proteínas básicas y péptidos neutrofílicos). Estos median en la destrucción de patógenos fagocitados mediante un ambiente ácido en el interior del fagosoma, una privación de nutrientes por proteínas de resistencia natural de macrófagos NRAMP1 (codificada por el gen Slc11a1), o por el canal de transporte de iones divalentes de la membrana. La ferropoptina (reduce el hierro intracelular necesario por el antígeno) y varias enzimas macrofágicas que catalizan la degradación de triptófano evitando su aprovechamiento por los patógenos, como son la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) y la triptófano 2,3 dioxigenasa (TDO) ( Hodgkinson et al., 2015; Grayfer et al, 2018). 56 Figura 9. Secuenciación de los diferentes tipos de digestión en macrófagos efectores (Grayfer et al, 2018). También se ha demostrado la degradación del triptófano por la enzima indoleamina 2,3- dioxigenasa (IDO) y la formación de ácido picolínico y quinolínico, los cuales tienen alto poder microbicida (Grohmann & Bronte, 2010). Este estallido respiratorio puede verse aumentado por la acción de diferentes citoquinas como pueden ser TNF-α (Grayfer et al., 2008), IFN-γ (Grayfer et al., 2010; Grayfer & Belosevic, 2009), CSF-1 (Grayfer et al., 2009) e IL-8 (Omaima Harun et al., 2008). En ocasiones, la fagocitosis de algunos agentes no finaliza con la destrucción de los mismos por la propia resistencia que albergan los patógenos o por una inhibición de los procesos microbicidas de las células fagocíticas, como así indican estudios sobre algunos microorganismos como Mycobacterium marinum o Edwardsiella tarda (revisado por Grayfer et al, 2014). La fagocitosis y la explosión respiratoria pueden ser complementarias, pero no son dependientes la una de la otra a la hora de actuar como mecanismos antimicrobianos (Rieger & Barreda, 2011). 2.2.5.3 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS Más de casi siglo y medio después de la primera descripción de los macrófagos por Metchnikoff (nombrado por Hodgkinson et al., 2015), todavía hay preguntas sobre los mecanismos que conducen a la heterogeneidad de su linaje. Las vistas antiguas se basan en la teoría del sistema de fagocito mononuclear (MP), donde todos los macrófagos de mamíferos se derivan de monocitos sanguíneos circulantes y finalmente de células madre hematopoyéticas en medula ósea (van Furth et al., 1972). Diversos estudios sobre la regulación del desarrollo de macrófagos de peces sugieren que los teleósteos tienen vías alternativas de monopoyesis que contribuyen a una heterogeneidad fenotípica de los macrófagos en estos animales (Belosevic et al., 2006). 57 Figura 10. Diferentes vías de activación y resultado en macrófagos en peces óseos. Modificado de Hodgkinson et al, 2015. FNT-α: factor necrosis tumoral alfa; INF-γ (rel): interferón gama (recombinante); CSF-1: factor estimulante de colonias 1; IL: interleuquina; TGF-β: factor de crecimiento trasnformante betta; AMPc: adenosin monofosfato cíclico; MHC II: Complejo Mayor Histocompatibilidad 2. Se han caracterizado distintos subconjuntos de macrófagos dependiendo de su vía de activación, incluidas las células activadas por interferon (IFN-γ), factor de necrosis tumoral TNFα), factor estimulante de colonias (CSF-1) y/o reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAPM). Esta es la denominada activación clásica o M1 cuyas células resultantes mostraran un fenotipo de respuesta inmune Th1 y que detonan mecanismos efectores como son la producción de reactivos intermediarios tóxicos, con predominancia de ROS o de NO⁻ (Grayfer et al., 2018), acidificación fagolisosómica (Rieger et al., 2010), restricción de nutrientes y, síntesis y secreción de citoquinas, quimiocinas y mediadores lipídicos para potenciar la inflamación (Grayfer et al., 2014). Estudios in vitro han dejado claro que, a pesar de una conservación general de las funciones efectoras típicas de los macrófagos activados de forma innata o clásica, existen diferencias entre las especies de peces (Florenza et al, 2011). Por otro lado, estas células activadas alternativamente o M2, exhiben un fenotipo Th2 con funciones de inmunoregulación y remodelación de tejidos en términos generales. Aquí podemos diferenciar los macrófagos M2a activados por IL-4, IL-13(a/b) y/o Adenosín Monofosfato Cíclico (AMPc). Estos muestran actividad arginasa (Joerink et al., 2006ab; Takizawa et al., 2011) y producen poliamina, IL-10 y antagonistas del receptor de la IL-1 (IL-1Ra). Están involucrados en respuestas Th2, reacciones alérgicas y muerte de parásitos. Los macrófagos M2b están activados por complejos inmunes, lipopolisacáridos bacterianos (LPS), receptores tipo Toll y IL-1Ra (Laing et al., 1996; Saeij et al., 2000) y están implicados en la activación de linfocitos Th2 e inmunoregulación. Y por último, macrófagos reguladores M2c que se polarizan tras efectos de la IL-10 o de hormonas glucocorticoides inducidas por estrés, por ejemplo, el cortisol; producen IL-10, factor de crecimiento transformante betta (TGF-β) y presentan un carácter inmunosupresor, desactivador y reparador (Castro et al., 2011). 58 Anteriormente autores como Mosser y Edwards (2008), clasificaron las células resultantes de una activación alternativa simplemente como cicatrizantes e inmunoreguladoras y Mantovani et al, (2004), estudiaron como estos fagocitos están sometidos a una plasticidad y polarización funcional debidos a una modulación por citoquinas. 2.2.5.3.1 VÍAS DE ACTIVACIÓN M1 Una de las citoquinas actuantes que impulsan un fenotipo efector de los macrófagos es denominada CSF-1 (Colony Stimulating Factor-1) o M-CSF (Colony Stimulating Factor of Macrophages). Esta citoquina se encarga de regular la función de los macrófagos y los mecanismos de defensa ya que contribuye a la quimiotaxis, a la fagocitosis y a la actividad microbicida de estos (Rieger et al., 2014). CSF-1 se sintetiza por una variedad de tipos de células incluyendo células endoteliales, fibroblastos, células de medula ósea, osteoblastos, células epiteliales tímicas, queratinocitos, astrocitos, mioblastos, células mesoteliales, células de la glándula endometrial y trofoblastos de la placenta (Stanley et al., 1994). El factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF-1) es el principal regulador de la supervivencia, proliferación y diferenciación de los macrófagos y sus precursores (Stanley et al., 1983; Hume et al., 1988; Barreda et al., 2004). La actividad de la tirosina quinasa en su receptor afín (CSF-1R), da como resultado el reclutamiento y la activación de vías de señalización discretas que confieren su actividad biológica. Estos eventos, ocurren rápidamente en presencia de cantidades diminutas de CSF-1 circulante. En consecuencia, han evolucionado mecanismos para controlar eficazmente la magnitud y la duración de la función biológica de CSF-1 (Stanley et al., 1983; Hume et al., 1988; Barreda et al., 2004). La actividad de CSF-1 está estrictamente controlada a través del endocitosis mediada por receptores, así como a través de mecanismos intracelulares que regulan la expresión génica de CSF-1 y de su receptor unido a la membrana (CSF-1R). Ya se sabía que esta glicoproteína homodimérica se sinergia con otras citoquinas para mediar en la proliferación hematopoyética temprana de las células progenitoras (Praloran, 1991). Fue detectada en extractos de una gran variedad de tejidos y en los sobrenadantes de diversos cultivos de células y órganos (Stanley, 1981). En humanos, la máxima estimulación de CSF-1 a la que se puede observar proliferación macrofágica es a concentraciones de 250 pM, y en el caso de formación de colonias celulares en médula ósea, la proliferación se puede detectar a concentraciones tan bajas como 1 pM (Stanley, 1981). El rango normal de concentración en el suero para CSF-1, está entre 150 y 500 U/ml o 3 - 8 ng/ml (Hanamura et al, 1988). En todas las especies de vertebrados examinados hasta la fecha, la supervivencia, proliferación, diferenciación y funcionalidad de la mayoría de las células del linaje de macrófagos se rige por la estimulación de colonias por citoquinas (CSF-1) mediante la unión a su receptor afín (CSF-1R) (Grayfer et al, 2018). El receptor de esta citoquina (CSF-1R), es una tirosina quinasa de gran afinidad que se encuentra de manera exclusiva en células macrofágicas. Este tipo de citoquina tiene una actividad biológica muy potente que necesita de mecanismos efectivos de regulación. Por ello, cuando se activa su receptor tirosina quinasa de CSF-1 (CSF-1R), son reclutadas y activadas una serie de moléculas citoplásmicas que media la respuesta celular e inician, de forma específica, 59 las rutas de señalización necesarias para llevar a cabo sus funciones de una forma correcta. Estos mecanismos controlan, de forma efectiva, la magnitud y duración de la actividad de estas citoquinas, así como la regulación de la expresión de los genes de CSF-1 y de su receptor (Belosevic et al., 2006). Los monocitos, son producto que un proceso llamado monocitopoyesis, que comienza con la generación de precursores comunes para el linaje monocítico y granulocítico en el pronefros de los peces teleósteos. Estos precursores, son estimulados por factores estimulantes de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF) y factor estimulante de colonias macrófago (CSF- 1). Darán lugar a los promonoblastos, que se convertirán posteriormente en promonocitos y, finalmente, en monocitos, los cuales son liberados al torrente sanguíneo (Bertrand et al, 2007). Por otra parte, se descubrió en doradas, que había una proliferación de macrófagos ya maduros sin pasar por las fases tempranas como monocitos, es lo que se llamó, autoproliferación (AP), como una autorenovación celular macrofágica controlada por factores de crecimiento endógeno de macrófagos (MGF) y controlados por una nueva forma soluble del receptor de CSF- 1 (sCFR-1R) (Belosevic et al, 2006). Es aquí, donde estos monocitos se convierten en macrófagos residentes con un determinado fenotipo mediante la activación macrofágica (AM) y que va a tener una gran heterogeneidad. Siguiendo con esta autosuficiencia en el desarrollo de macrófagos, también se ha observado en peces que carecen del gen c-myb funcional, lo que demuestra el desarrollo de estas células en diversos tejidos en ausencia de hematopoyesis (Soza-Ried et al, 2010). El descubrimiento de sCSF-1R en la dorada, resaltó la complejidad inherente en la regulación del sistema hematopoyético de teleósteos (revisado por Belosevic et al, 2006). Se demostró que sCSF-1R regula negativamente la expresión, proliferación y diferenciación de macrófagos en peces óseos (Barreda et al, 2005). El sCSF-1R también inhibió la expresión génica de varias citoquinas proinflamatorias y promovió la expresión de un mediador antiinflamatorio como es la IL-10. El fenotipo de los macrófagos ya formados, también cambia significativamente en presencia de sCSF-1R hacia una reducción de la capacidad para la fagocitosis de estas células y mayor supervivencia de los patógenos (Rieger et al, 2014). Desde una perspectiva filogenética, es notable que las aves y los mamíferos posean una sola alternativa de unión del gen CSF-1 a su receptor (Rieger et al, 2014). Se ha documentado que varias especies de peces teleósteos poseen dos genes CSF-1 (csf1.1 y csf1.2), y que en su mayor parte, no parecen sufrir una unión alternativa (Wang et al, 2008). Se ha visto que el CSF- 1 de mamíferos (equivalente al CSF-1.1 de peces) también parece ser un importante factor de crecimiento y diferenciación de macrófagos (Haningtong et al, 2007, 2009; Grayfer et al, 2009). Curiosamente, mientras CSF-1 de mamíferos es conocido por conducir hacia la vía alternativa la diferenciación de macrófagos (M2), en los ciprínidos el CSF-1.1 parece facilitar la diferenciación funcional de macrófagos inflamatorios tipo M1, con un alto grado de aumento de componentes proinflamatorios tardíos y que favorecen la digestión celular (Grayfer et al, 2009). Esto se ve respaldado por los hallazgos recientes en doradas, donde este factor sCSF-1R, sirve para eliminar las respuestas proinflamatorias (M1) de los peces al reducir el CSF-1 dispuesto (Liu et al, 2014). Además, la señalización celular a través del CSF-1R no solo gobierna la proliferación, diferenciación y supervivencia de macrófagos en peces, también las respuestas antimicrobianas que portarán esos macrófagos (revisado por Wiegertjes et al, 2016). Es interesante que los teleósteos posean múltiples genes para CSF-1 y algunas especies de peces, como el pez globo, https://translate.googleusercontent.com/translate_f#13 https://translate.googleusercontent.com/translate_f#14 60 también expresen dos genes distintos para su receptor CSF-1R (Williams et al, 2002). Es convincente considerar que estas combinaciones distintas de ligando-receptor, pueden facilitar consecuencias monopoyéticas del teleósteo diferentes a las de los mamíferos (Grayfer et al, 2018). El eje CSF-1/CSF-1R está bien conservado evolutivamente en muchas de las especies superiores, incluida los peces. Por ejemplo, algunas de estas especies que muestran un genotipo de CSF-1 coincidente con el de humanos son, el de las doradas (21%), pez cebra (21% en MCSF- 1 y 15% en MCSF-2) y en la trucha (22% en MCSF-1 y 16% en MCSF-2). También se observa un escenario similar con el propio receptor CSF-1R en los respectivos macrófagos. El genotipo de este receptor en la dorada, la trucha y el pez globo es del 44%, 45%, y 45% de similitud respectivamente con la nuestra. Aunque la secuencia de homología genética para los peces en comparación con los humanos esta algo disminuida, estos conservan la caracterización funcional (Rieger et al, 2014). A diferencia de los macrófagos de mamíferos que dependen de otras células para producir CSF-1 , los monocitos y macrófagos de peces son capaces de producir CSF-1 ellos mismos, luego actúan de manera autocrina induciendo una mayor proliferación y diferenciación de células mieloides (Van Der Vaart et al, 2012). Este enfoque, para la proliferación mieloide y la diferenciación macrofágica, implica de un proceso regulador único que existe en los peces para controlar adecuadamente la mielopoyesis, para que no continúe expandiéndose hasta comprobar la medida de las poblaciones de monocitos y macrófagos existentes. Este rol regulador lo realiza el factor soluble del receptor del factor estimulante de colonias (sCSF-1R). Además, se ha comprobado que este sCSF-1R a parte de disminuir las funciones fagocíticas del macrófago llega a producir un aumento de apoptosis de estos (Barreda et al, 2005). Así pues, se puede considerar al factor estimulante de colonias-1 (CSF-1) como principal regulador de la supervivencia, proliferación, diferenciación y función de los macrófagos y sus precursores en peces, además de que se ha demostrado que desempeña un papel importante en la etiología de la inflamación (Rieger et al, 2014). No obstante, existen otras diferentes proteínas en peces que también generan proliferación macrofágica como las granulinas (Hanington et al, 2006). Por otra parte, existen otras citoquinas que, al igual que el CSF-1, activan la diferenciación funcional del macrófago en peces teleósteos hacia una respuesta M1. Así es el caso del IFN-γ, TNF-α y GM-CSF (revisado por Grayfer et al., 2018). En cuanto al IFN-γ (interferón gamma) producido por células NK activadas y auxiliares Th1, se ha visto, al igual que en mamíferos, que los macrófagos de peces teleósteos poseen receptores específicos para ellos. Se ha demostrado que mejora las especies reactivas de oxígeno (ROS) producidas en la fagocitosis de macrófagos renales de la trucha entre otros (Zou et al., 2005). También, en combinación con LPS, produce efectos más productivos del óxido nítrico inducible (NO⁻) en los macrófagos renales de la carpa (Arts et al., 2010). En cuanto al TNF-α (factor de necrosis tumoral alpha), los peces también poseen receptores tnfr1 y tnfr2 y al igual que en mamíferos, aumentan la quimiotaxis de todo tipo de https://translate.googleusercontent.com/translate_f#7 61 fagocitos, potencian la inflamación y canalizan intermediarios de NO⁻ y ROS, también en la trucha (Kutyrev et al., 2016, 2017). El factor estimulante de colonias macrófago-granulocitos (GM-CSF) ayuda en la supervivencia, proliferación y diferenciación durante mielopoyesis a través de las cadenas receptoras csf2rα y csf2rβ (Hamilton, 2008). Por último, la polarización a M1 de los macrófagos, también puede ser impulsada solo por estímulos microbianos a través de la activación del receptor de reconocimiento de patrones PAMP (van der Vaart et al., 2012). Estos receptores pueden ser de cinco tipos en base a su estructura y funcionalidad: 1) Receptores tipo Toll (TRL); 2) lectinas tipo C; 3) nucleótidos de unión ricos en leucina (NLR); 4) ácido retinoico como receptor (RLR) y 5) ausencia de melanoma como receptor (ALR). Además del reconocimiento específico de distintos componentes de agentes patógenos (p. ej., LPS, dsRNA y flagelina), los PAMP también detectan patrones moleculares asociados al daño tisular (Hansen et al., 2011). Se ha comprobado el aumento sanguíneo de complemento por parte de macrófagos activados por PAMP, con funciones proinflamatorias equivalentes a las de mamíferos (Markiewski & Lambris, 2007). También se ha comprobado que macrófagos activados por TRL, segregan citoquinas proinflamatorias capaces de regular la producción de proteínas de fase aguda (APPs), que aumentan en inflamaciones tempranas (Gruys et al., 2005). 2.2.5.3.2 VÍAS DE ACTIVACIÓN M2 Como hemos visto, la activación de macrófagos por la vía M2 conlleva una activación de macrófagos anti-M1, es decir, de efectos moduladores, procicatrizantes o “curativos” y antiinflamatorios. Los agentes más ampliamente caracterizados en la polarización M2a son las citoquinas IL-4 e IL-13 producidas por células Th2, eosinófilos, basófilos, células NKT y los propios macrófagos (Martinez & Gordon, 2014). Se han identificado, al menos, dos genes en peces que comparten homología con las citoquinas antiinflamatorias IL-4 e IL-13 de mamíferos, la IL-4 / 13A e IL-4 / 13B. Además, se ha comprobado en la trucha, en la lubina, en la carpa y en la dorada, que IL-4 / 13A e IL-4 / 13B poseen muchos de estos roles antiinflamatorios, incluida la regulación positiva de genes inmunosupresores (TGF-β, IL-10, SAP1 y SOCS3), modulación de la expresión de genes de citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β e IFN-γ) y capacidad de elevar la expresión del gen de la arginasa y su actividad en los fagocitos renales (Hodgkinson et al., 2017; Stocchi et al., 2017). Por otra parte, mientras la enzima sintasa inducible iNOS de macrófagos M1 convierte la L-arginina en L-citrulina y potencia el óxido nítrico inducible (NO⁻) para la digestión, en los macrófagos M2 se convierte la L-arginina en L-ornitina como precursor de las poliaminas y componentes prolina de colágeno, importantes para la reparación de tejidos (Mills, 2001). En peces, la arginasa-1 y la arginasa-2 se identificaron por primera vez en la trucha arcoíris siendo filogenéticamente equivalentes con las respectivas en mamíferos (Wright et al., 2004). La actividad arginasa ha sido demostrada en macrófagos de ratones estimulados con Adenosín 62 Monofosfato Cíclico (AMPc), cuyos valores aumentaron intracelularmente durante la transducción de IL-13. Del mismo modo, los macrófagos de carpa estimulados con AMPc muestran una mayor actividad de activación alternativa de macrófagos (M2) y resulta en la inducción de expresión de arginasa-2 en lugar de arginasa-1, a diferencia de los mamíferos (Joerink et al., 2006b). También se ha visto, que los macrófagos de mamíferos M2b o de tipo 2, se generan en respuesta a complejos inmunes y lipopolisacáridos de bacterias Gram-negativas (LPS), lo que resulta en una IL-12 más baja y una mayor producción de IL-10 (Martinez & Gordon, 2014). Se cree, que este es un punto esencial para amortiguar la inflamación promovida por repetidas activaciones de macrófagos M1 y, por tanto, promueve así la remodelación y regeneración de tejidos (Gensel et al., 2015). Igualmente, se ha documentado la desactivación de macrófagos por glucocorticoides (GC) e IL-10, que promueven la activación de macrófagos M2c, también conocido como "macrófagos reguladores” (Hodgkinson et al., 2015). La estimulación por glucocorticoides de los macrófagos antagoniza la activación M1 de estas células, incluida una reducción de citoquinas inflamatorias. Amortigua también la producción de reactivos intermedios para la digestión, siendo un inhibidor de la producción de NO⁻ en macrófagos de peces (Wang et al, 1995; van de Garde et al., 2014). Además, el tratamiento de macrófagos de trucha arcoíris con componentes antiinflamatorios y cortisol, da como resultado una mayor expresión de IL-10, sugiriendo que el tratamiento con cortisol anula la inducción de respuestas proinflamatorias (Castro et al, 2011). IL-10 es producida por prácticamente todos los leucocitos y generada por macrófagos tras su activación mediada por receptores tipo Toll, lectinas tipo C y glucocorticoides (Martinez & Gordon, 2014). Se han identificado dos receptores para esta interleucina, un IL-10r1 en pez cebra, dorada y carpa (Wei et al., 2013), así como IL-10r2 en trucha arcoíris (Monte et al., 2015). En doradas, la IL-10 modula la estimulación de IFN-γ a la baja, para rescindir la respuesta de especies reactivas de oxigeno (ROS) y la expresión de genes inflamatorios de los monocitos (Grayfer et al., 2011). Todos estos hallazgos, demuestran una regulación conservadora de estos compuestos (cortisol endógeno y exógeno), que inhiben la función efectora de los macrófagos de teleósteos a varios niveles funcionales (Hodgkinson et al., 2015). 63 2.3 FACTORES QUE AFECTAN A INMUNIDAD El desarrollo de la respuesta inmune en teleósteos se ve afectado por numerosos procesos que dependen de tres ejes principales: del propio hospedador, del agente patógeno y del medio externo (Ruiz & Blas, 2003). Históricamente se han estudiado los factores intrínsecos y extrínsecos que afectan a la inmunidad de los peces y aquí hacemos un repaso a los más importantes: 2.3.1 INTRÍNSECOS La propia especie animal es un factor fundamental en la respuesta inmune, pero dentro de ella se pueden observar grandes variaciones debidas a otros factores intrínsecos que pasamos a desarrollar: 2.3.1.1 INDIVIDUO Se ha observado una gran variabilidad genética individual en la respuesta inmune de los peces, tanto en el mecanismo de inmunidad adquirida como en mecanismos inmunes inespecíficos que presentan grupos de peces homogéneos que habitan en las mismas condiciones y sometidos a iguales tratamientos (Michel et al., 1990; Anderson, 1992). 2.3.1.2 EDAD Los peces teleósteos no son inmunológicamente competentes hasta mucho después de la eclosión de los huevos por lo que estos animales en los estadios primarios dependen de las inmunoglobulinas maternas. Aunque los macrófagos aparecen antes que los linfocitos en el desarrollo de los órganos linfohemopoyéticos durante su desarrollo, en salmónidos se demostró que la actividad linfocitaria no se detecta hasta que los alevines comienzan a comer y se completa así el desarrollo los órganos hematopoyéticos completamente (Zapata, 1985; Razquin et al., 1990). Por tanto, si existe exposición al antígeno en los estados larvarios o como alevines en desarrollo, es posible que se establezca tolerancia inmunológica y no sea capaz de desarrollar una respuesta inmune frente a dicho antígeno (Ellis, 1981). 2.3.1.3 ESTADO FISIOLÓGICO El estado corporal del animal es totalmente influyente en el estado de su sistema inmunitario. Este se hace más patente en los animales salvajes al estar menos condicionados 64 artificialmente. Así, por ejemplo, en el periodo de esmoltificacion, que supone un intenso estado de estrés además de una perdida de la protección mucosa, conlleva un debilitamiento en el sistema defensivo en esta preparación para migrar (Hatai y Hoshiai, 1992; Zapata et al, 1992). El estrés producido, se traduce en aumentos del cortisol plasmático acompañados de la supresión de la respuesta inmune y de una reducción en la resistencia a las enfermedades (Maule et al., 1987). Otro momento importante donde el sistema inmune puede verse comprometido, es durante la maduración sexual y época reproductiva. En las especies libres migratorias se suma el efecto negativo que produce el estrés debido a la migración hacia la cabecera del río en busca de lugares idóneos de desove, en el que el sobreesfuerzo realizado y la falta de nutrición afecta notablemente a la capacidad de resistencia en salmónidos (Maule et al, 1996). Los cambios fisiológicos que se producen aquí, implican un incremento en los niveles plasmáticos de corticoides y esteroides sexuales (Pickering & Christie, 1981; Slater & Schreck, 1993; Maule et al, 1996), hormonas capaces de afectar el funcionamiento del sistema inmune, que se unen a modificaciones en la epidermis y que influyen en la resistencia superficial en estos animales. 2.3.1.4 ESTRÉS El estrés es una respuesta adaptativa del organismo que produce cambios en el sistema de defensa y que cuando es muy severo o prolongado en el tiempo conlleva la supresión de la respuesta o un desarrollo desmesurado de la misma, que puede desequilibrar al resto de sistemas fisiológicos y desencadenar el desarrollo de enfermedad (Ellis, 1981). Sin embargo, aunque se sabe que la relación entre el estrés, la función inmune y la resistencia a enfermedades está regulada hormonalmente, esta es una relación muy complicada (Maule et al., 1996) como veremos más detenidamente en un capítulo exclusivo (ver capítulo 2.5). Dependiendo de la naturaleza, intensidad y duración de los factores estresantes, los efectos en la resistencia a la enfermedad pueden ser completamente diferentes (Pegg et al., 1995). También, si ha existido una exposición previa al mismo estímulo y este se hace rutinario, como es habitual durante los manejos en la explotación (Dhabhar, 2002). Aunque el estrés es un estado del organismo y así lo veremos como tal, los factores desencadenantes del mismo, pueden ser procesos biológicos propios de la especie o factores externos. Entre los procesos biológicos, la esmoltificacion, la migración durante la época reproductiva o la reproducción misma como hemos visto, son causas de estrés. Así mismo, en la acuicultura puede desencadenarse por múltiples factores casi todos dependientes de las actividades antropogénicas como son el transporte y manejo intensivo, alta densidad de población, nutrición inadecuada, inadecuados niveles de oxígeno, niveles subletales de materiales tóxicos, mala calidad del agua, temperaturas extremas o cambios bruscos de la misma, etc. (Zapata, 1985; Fletcher, 1986; Zapata, 1992; Maule et al., 1996). 65 2.3.1.5 NIVELES HORMONALES Ya se había demostrado que los corticosteroides, principalmente el cortisol, pueden afectar a la distribución de leucocitos, dan lugar a linfocitopenia y suprimen el crecimiento de linfocitos. Además, producen marcada linfopenia, monocitopenia y neutrofilia, así como depleción celular en órganos linfoides y retraso en la respuesta inmune. Por otra parte, inhiben la actividad microbicida intracelular de los fagocitos, disminuyen la respuesta humoral, probablemente por reducción del número de células B, e inhiben la proliferación linfoide estimulada por mitógenos, así como su migración in vitro primaria (revisado por Yada y Tort, 2016). No obstante, también se sabía que la acción de los corticoides y su reflejo en el sistema inmune, también dependerán de la concentración del mismo, estado fisiológico del animal y tiempo de exposición al agente que provoca esta reacción (Ellis, 1981; Fletcher, 1986; Zapata et al, 1992; Maule et al, 1996). Por otra parte, las hormonas sexuales también tienen su papel en el nivel de inmunidad del animal. Se ha visto que las concentraciones de esteroides sexuales en sangre aumentan notablemente durante la migración en las especies de carácter anádromo y en la maduración sexual, aunque el perfil de estas hormonas difiere mucho entre macho y hembra (Maule et al, 1996). Se ha visto que, en salmónidos, estas hormonas, producen una regresión notable o incluso desaparición del timo y prolongada linfopenia (Zapata et al, 1992). Se describió un descenso sobre la producción de células B por efecto de la testosterona (Slater y Schrek, 1993) y descenso de inmunoglobulinas circulantes en trucha arcoiris, doradas y pez de roca (Nakanishi, 1986; Suzuki et al., 1996, 1997). Se han visto diferencias inmunitarias entre estrógenos y andrógenos, y se sabe que es por la interacción del cortisol y estos esteroides sexuales (Tatner, 1996; Yano, 1996). Así, en los machos, los andrógenos producen hiperplasia de la epidermis y descenso en la secreción de mucus, lo que puede contribuir a un descenso en las defensas a nivel superficial (Richards y Pickering, 1978). Por último, la madurez sexual provoca descenso de la actividad de lisozimas, de producción de anticuerpos y del número total de leucocitos en salmónidos (Pickering and Pottinger, 1987; Maule et al., 1996). 2.3.1.6 NUTRICIÓN Es sabido que una nutrición deficiente debilita al sistema inmune en todas las etapas de la producción. En esta afirmación se engloba la presentación del alimento y la composición nutricional según la especie y etapa productiva. Así, por ejemplo, deficiencias en vitamina C afectan negativamente a los mecanismos de la inmunidad mejorando la producción de leucocitos tras su implementación en la dieta en truchas arcoiris (Hardie et al., 1993). Suplementos en vitamina E mostraron una mortalidad menor frente a Yersinia ruckeri en truchas (Furones et al., 1992). Mismos resultados se encontraron en salmones expuestos A. samonicida (Hardie et al., 1990) . La composición de los ácidos grasos de la dieta también puede influir en la actividad fagocítica, sobre todo a bajas temperaturas, mediante alteración de la fluidez de 66 membrana, por efectos sobre mediadores de inmunidad o por una combinación de ambos procesos (Blazer, 1991). Se estudió la peor adaptación de peces carnívoros a las dietas prefabricadas usadas en las piscifactorías debido al uso masivo de hidratos de carbono y proteínas de origen vegetal, causando enfermedades inflamatorias intestinales recurrentes (Buddington et al., 1997). Debido a la disminución en el uso de antibióticos profilácticos y como alternativa para proteger la producción intensiva, se han empezado a usar probióticos en la alimentación de los peces, observándose el fortalecimiento de la respuesta inmune en varias facetas (revisado por Hoseinifar et al., 2018). Por otra parte, técnicas de ayuno presacrifico, también han demostrado que causan estrés en los animales dependiendo de los grados de ayuno, pudiendo producir así una alteración del sistema inmune debido a esta práctica (Bermejo-Poza et al., 2015). 2.3.2 EXTRÍNSECOS El hecho de que estos animales sean poiquilotermos y que su producción se haga principalmente en piscifactorías a cielo abierto, expuestos a las diferentes estacionalidades en nuestras latitudes, y depender de la calidad y salubridad del agua de ríos donde se explotan, estos factores extrínsecos pasan a considerarse esenciales en la influencia sobre la respuesta inmune de estos animales. 2.3.2.1 TEMPERATURA Es uno de los factores medioambientales que más influye no solo en el sistema inmune, sino globalmente en la vida de los animales poiquilotermos, los cuales dependen de su temperatura corporal, afectando a todos los procesos metabólicos y actividad celular, incluyendo los mecanismos de la respuesta inmune (Fries et al, 1986; Bly & Clem, 1992; Manning & Nakanishi, 1996; Schreck, 1996; Bly et al., 1997; Le Morvan et al., 1998; Hernández & Tort, 2003). Ya se vio que la influencia de la temperatura, es una de las principales diferencias entre el sistema inmune de homeotermos y poiquilotermos (O´Neill, 1985; Bly & Clem, 1992; Bowden, 2008). Esta, es trascendental en los peces cuando deben responder a un agente patógeno (Le Morvan, 1998) el cual, también se ve influenciado por esta temperatura (Guijarro et al., 2015). Se han denominado temperaturas no permisivas (Le Morvan, 1998), a las temperaturas en las cuales el sistema inmune prácticamente no responde. Aunque los peces pueden vivir en un amplio rango de temperaturas consideradas fisiológicas, los mecanismos inmunes no funcionan de igual manera en todas ellas. Las óptimas para cada especie se han considerado como las más altas dentro del rango de las fisiológicas o la denominada “temperatura de verano del hábitat natural de la especie”. Para los salmónidos, se estima que por debajo de 4ºC se compromete gravemente la capacidad de respuesta, mientras que, para otras especies de aguas 67 más cálidas, las temperaturas mínimas de funcionamiento del sistema inmune están entre 12 o 14ºC (Ellis, 1981; Bly & Clem, 1992). Se demostró en tilapias, que una temperatura adecuada del agua produce niveles más altos de factores inmunes específicos (anticuerpos) así como inespecíficos (lisozimas) que entornos más extremos (Domínguez et al., 2004, 2005). El efecto de la temperatura en los sistemas inmunes de teleósteos, varía de acuerdo con la duración y magnitud del cambio de temperatura y las especies de peces examinadas, ya que los teleósteos se han adaptado a una amplia variedad de temperaturas ambientales. Las temperaturas por encima del rango fisiológico desencadenan respuestas de estrés que pueden influir negativamente en el sistema inmunológico (Le Morvan et al., 1998). Por ejemplo, en truchas arcoiris se ha comprobado un aumento de mortalidad por S. agalactiae cuando la temperatura del agua es de 18ºC con respecto a 12ºC (Sepahi, et al, 2013) y también de una menor efectividad de la fagocitosis de granulocitos de tencas frente a Candida albicans a temperaturas de verano (30ºC) y de invierno (12ºC) en comparación con 22ºC (Collazos et al, 1994b). Si bien, un aumento de la temperatura ambiental está relacionada principalmente con respuestas inmunitarias específicas, su disminución se relaciona principalmente con respuestas humorales inespecíficas (Alcorn et al., 2002; Bowden et al., 2007). Así, las temperaturas más bajas conducen a una supresión de los mecanismos de respuesta inmune, que generalmente es reversible al regresar a temperaturas más cálidas, lo que sugiere algunas estrategias de hibernación. Los componentes del sistema inmune innato han mostrado históricamente respuestas variadas al estrés por frío, con una menor afectación de los componentes celulares innatos que proporcionaron una compensación parcial a deficiencias en la inmunidad adaptativa, ya que hay una supresión mayor del sistema inmune adaptativo en respuesta a temperaturas más frías (Ainsworth et al, 1991; Collazos et al., 1994b; Dexiang & Ainsworth, 1991; Kurata et al., 1995). Las temperaturas subóptimas se definen como temperaturas por debajo de temperatura óptima de crecimiento del organismo in vivo y por debajo de la temperatura óptima de crecimiento de la línea celular in vitro. Se sabe que las temperaturas subóptimas tienen un impacto negativo en el sistema inmunológico de los teleósteos. Por ejemplo, una vía importante para la defensa antiviral, que implica la presentación de péptidos endógenos en la superficie celular para su reconocimiento por células T citotóxicas, se ve reducida a temperaturas de 4ºC en la trucha arcoiris (Abram et al., 2017). Como resultado del cambio climático, los eventos de temperaturas extremas ocurren con mayor frecuencia y magnitud (Hengeveld, 2005; IPCC., 2007; Tingley & Huybers, 2013). Estas temperaturas inusuales, combinadas con las bajas temperaturas que enfrentan las especies de teleósteos durante los meses de invierno en nuestro país, pueden suponer problemas añadidos a la repuesta inmune de estos animales. Temperaturas por debajo del rango óptimo de la especie reflejan respuestas inmunes deprimidas en algunas funciones de inmunidad específica, tanto celular como humoral (revisado por Manning & Nakanishi, 1996), aunque hay evidencia controvertida con respecto a vías de presentación de antígeno (Abram et al., 2017; Makrinos & Bowden, 2016). Estudios previos, demostraron que la activación de las células T, que colaboran en la producción de inmunoglobulinas, es el mecanismo más afectado por las bajas temperaturas (Clem et al, 1984; Miller & Clem, 1984). Por ello, este factor es fundamental en el 68 desarrollo de la respuesta frente a antígenos T-dependientes, pero no tanto cuando se trata de antígenos T-independientes. Así, otros autores, sugirieron que células Th cooperantes son sensibles a temperaturas más bajas basadas en la respuesta proliferativa de los linfocitos y producción de anticuerpos (revisado por Bly y Clem, 1992; Manning & Nakanishi, 1996; Le Morvan et al., 1998). Otros estudios demuestran que son los descensos bruscos de temperatura, por ejemplo, de 23ºC a 11ºC en pez gato, los que inhiben la actividad de células T, células B y la producción de anticuerpos, mientras que la aclimatación durante 5 semanas de los peces a ese cambio o descensos menos bruscos, permite el desarrollo de una buena respuesta específica, aunque retardada (Clem et al., 1984; Miller & Clem, 1984; Bly & Clem, 1991). Las fluctuaciones de temperatura tienen un efecto doble en relación con la presentación de enfermedades infecciosas. Por un lado, altera en el pez los mecanismos de respuesta y por el otro, presiona el crecimiento de los patógenos en el ambiente (Le Morvan, 1998). Los principales problemas se presentan cuando se producen fluctuaciones repentinas de temperatura y casi siempre, en estos casos, la enfermedad y la mortalidad se asocian a procesos de origen bacteriano (Ndong et al., 2007). En cuanto a inmunidad de memoria, se ha visto que a bajas temperaturas se alcanzan menores concentraciones de anticuerpos y/o su producción se retrasa en el tiempo o incluso se inhibe pero que la duración de esta inmunidad era mayor en salmón del atlántico (O´Neill, 1980; Eggset et al., 1997; Rijkers et al., 1980). Sin embargo, con temperaturas por encima del rango óptimo de la especie, se ha visto un aumento en la síntesis de anticuerpos en varias especies de peces (Bowden, 2008) . Otro estudio, examinó la expresión de una variedad de genes antivirales en larvas de pez cebra y mostró, generalmente, niveles más altos de expresión a temperaturas más altas (Dios et al., 2010). No obstante, los resultados encontrados son muy controvertidos, lo que puede deberse a que la respuesta varía enormemente dependiendo de la especie animal, de la naturaleza del antígeno y de la adaptación previa a la temperatura (Avtalion, 1981; Ellis, 1981; Bly & Clem, 1992, Makrinos & Bowden, 2016). Es así que algunos autores afirman que, aunque la respuesta primaria se vea comprometida por una temperatura baja, el fenómeno de memoria aparece siempre que la inmunización secundaria se produzca a temperatura óptima (Miller y Clem, 1984; Bly & Clem, 1991, Le Morvan, 1998). Se ha observado que la protección inferida por vacunaciones realizadas en salmón a menos de 6ºC, puede ser mayor que a temperaturas más elevadas, a pesar de que el título de anticuerpos producido sea menor (Lillehaug et al., 1993). Por todo esto, se deduce que intervienen otros mecanismos inmunes, generalmente inespecíficos más dependientes del patógeno que de la temperatura del medio. Es el caso de la fagocitosis, que depende más de la fluidez de membrana que de reacciones enzimáticas, y por ello se ve menos influenciada por la temperatura que otros procesos como la actividad microbicida intracelular (O´Neill, 1985; Blazer, 1991; MacArthur et al., 1985). Como hemos visto, los efectos de las bajas temperaturas sobre el sistema inmune son principalmente sobre el componente celular; así se demostró la disminución de la respuesta mediada por linfocitos, particularmente sobre la función de las células T cooperantes sin afectar las funciones de procesamiento de antígeno y producción de IL-1 por parte de las células 69 presentadoras de antígeno (Le Morvan, 1998). También se ha descrito la alteración de la fagocitosis y de la citotoxicidad (Ellis, 1981, Le Morvan, 1998); la afectación sobre el estallido respiratorio (Hardie et al, 1994), la actividad alternativa del complemento y la actividad lisozímica ( Cheng et al., 2009); además del bloqueo de la activación de las células T y células B, con la consecuente disminución de la respuesta primaria de anticuerpos (Miller & Clem, 1984). Estudios in vitro han demostrado que la respuesta linfoproliferativa del pez gato (Ictalurus punctatus) a concanavalina A (ConA) y fitohemaglutinina, se reduce a temperaturas bajas para la especie (Cuchens & Clem, 1977). Por otro lado, las temperaturas bajas cambian la relación entre ácido oleico y esteárico a favor del primero y, de este modo, aumentan la rigidez de la membrana celular y dificultan la fagocitosis, la migración transepitelial y otras funciones de los leucocitos fagocíticos (Le Morvan, 1998, Cheng et al, 2009). Adicionalmente, la activación de la proteína quinasa C y la síntesis de otros componentes de la membrana plasmática, tales como proteínas y glúcidos (principalmente ácido siálico), son afectados in vitro por las temperaturas bajas (Le Morvan, 1998). La trucha arcoíris, es un teleósteo muy importante económicamente y que está ampliamente distribuida de forma salvaje en América del Norte de donde es su origen (ver capítulo 2.1.3). Si bien es capaz de tolerar temperaturas de entre 0 ° C y 26 ° C, las truchas arcoíris prefieren de manera óptima temperaturas en torno a 15°C (Hokanson, 1977; Spigarelli & Thommes, 1979). Sin embargo, en la región de los Grandes Lagos de Ontario, la trucha arcoíris y otras especies de peces están expuestas a temperaturas de 2°C en promedio, muy por debajo de su preferencia térmica y crecimiento óptimo (Madenjian et al., 2018). Se había observado en esta especie, menores niveles de IgM en desove, cuando estaba sometida a temperaturas bajas (Suzuki, 1997) y más tarde, en esta línea, consiguieron una mejor expresión de genes de inmunoglobulinas y apolipoproteina cuando aumentaban gradualmente la temperatura del agua hasta 25ºC (Lewis et al, 2010). 2.3.2.2 ESTACIONALIDAD La causa de variaciones estacionales en el sistema inmune se ha atribuido a factores medioambientales, principalmente a la temperatura y al fotoperiodo, que producen cambios en los ritmos circadianos (Bromage et al., 2001). La influencia de la temperatura del medio en la inmunidad de los peces queda patente en diversos trabajos como hemos estudiado en el punto anterior. El ciclo anual de fotoperiodo es una señal muy precisa para determinar la época del año. Está claro que los cambios en el fotoperiodo permiten a un animal seguir los ritmos diarios y estacionales y alterar su fisiología en consecuencia, incluido el sistema inmunológico (Bowden, 2008). 70 Hay varias evidencias que indican la importancia de la inmunidad innata en vertebrados poiquilotermos, con su predominio durante los períodos fríos cuando la respuesta inmune adaptativa está deprimida, sugiriendo un papel más importante de esta vía en el invierno (Collazos et al., 1994b). Se ha sugerido que un acortamiento de la duración del día puede inducir cambios en el sistema inmunológico en una preparación para el invierno, y esto se ve corroborado por los recuentos más altos de glóbulos blancos registrados en la tenca durante los meses de otoño, donde se ha demostrado que la actividad de la vía alternativa del complemento es mayor en invierno (Collazos et al., 1994b). Los niveles linfoides en sangre periférica encontrados en los peces, como norma general, son menores en invierno y mayores en verano, aunque en trucha común, los recuentos más altos se han producido en primavera y otoño y los más bajos en invierno y verano (Álvarez et al., 1998). Otros autores, encontraron en truchas, una marcada leucopenia (linfocitos y trombocitos) tras exponerlas a más horas de luz que de oscuridad (Leonardi & Klempau, 2003). Así mismo, se han observado cambios estacionales en los órganos linfoides en los que se produce una regresión transitoria, particularmente del timo, durante el periodo estival y en invierno (Zapata et al., 1992). Se ha comprobado en trucha arcoíris, que hay variaciones estacionales en los niveles de ARNm de los receptores de corticoides expresados en leucocitos en el bazo, que coinciden con el aumento de los niveles plasmáticos de las hormonas tiroideas y del cortisol en primavera (Yada et al., 2014). También se ha constatado variación estacional en algunos de los mecanismos inespecíficos. Entre ellos, la actividad lítica del complemento y los niveles de lisozima en plasma o suero, que aumentan con el aumento de las horas de luz (Bowden, 2008). Por otra parte, los niveles en el suero de proteína C reactiva son mínimos cuando las horas de luz son escasa, pero la afinidad de este compuesto por su ligando es mayor en invierno, cuando la concentración es menor (Fletcher, 1986; Bly & Clem, 1992). Las alteraciones del sistema inmune ocasionan un incremento en la susceptibilidad de los peces a las infecciones secundarias por hongos acuáticos. Existe una mayor prevalencia de infecciones causadas por mohos saprolegniales en peces durante las épocas invernales (Bly et al., 1992). 2.3.2.3 COMPUESTOS TÓXICOS CONTAMINANTES En acuicultura, el origen del agua de la explotación es la base del éxito. Un agua con calidad para la cría de estos animales hace que estos se desarrollen con mínimas perturbaciones en su sistema inmune. Muriel Dunier (1996), realizó una revisión de los principales xenobióticos que afectan al sistema inmune de los peces de agua dulce, incluidas las truchas: 71 2.3.2.3.1 METALES PESADOS Se ha demostrado que altas concentraciones de metales pesados como el cadmio, mercurio o cobre, tienen efecto inmunosupresor, constatado por el descenso de la actividad de macrófagos y los niveles de lisozima (Fletcher, 1986; Elsasser el al., 1986), que en parte es producido por su efecto estresante, pero en parte por acción directa del contaminante (Elsasser et al., 1986). En el caso del cobre, es un compuesto que independientemente del estrés, es tóxico para el sistema inmune (Heath, 1984, 1987), en cual produce un descenso de la respuesta inmune humoral y celular, incluyendo el nivel de linfocitos circulantes y la respuesta fagocítica (Carballo & Muñoz, 1991; Carballo et al, 1995), siendo estos animales, más susceptibles a infecciones (Knittel, 1981). 2.3.2.3.2 CONTAMINANTES INORGÁNICOS Insecticidas organoclorados, organofosforados o herbicidas pueden acumularse en los cauces fluviales a través del drenaje de agua desde los campos de cultivo en los que se utilizan y, pueden producir leucopenia, atrofia de órganos linfoides y supresión de la respuesta humoral (Dunier & Siwicki, 1993). 2.3.2.3.3 CONTAMINANTES ORGÁNICOS Fenoles, tributilos, hidrocarburos aromáticos y bifenilos policlorados, tienen efectos negativos sobre la respuesta no humoral, la capacidad de los macrófagos y también producen leucopenia. Sin embargo, la mayoría de las veces, esto depende del tiempo de exposición y concentración del contaminante, puesto que los peces son capaces de adaptarse a exposiciones crónicas de compuestos estables presentes a baja concentración (Dunier & Siwicki, 1993). 2.3.2.3.4 OTROS CONTAMINANTES También se ha demostrado que dosis subletales de amoniaco, nitritos y cianuro, aumentan la susceptibilidad a enfermedades como la saprolegniosis, debido en parte a la inmunodepresión que inducen por estrés en trucha arcoiris (Carballo, et al, 1995). 72 2.4 ESTRÉS EN TELEÓSTEOS 2.4.1 ESTRÉS Y AGENTES ESTRESANTES El estrés se define como la cascada de eventos fisiológicos que ocurren cuando el organismo trata de resistir a la muerte o restablecer su homeostasis ante un agente estresante (Schreck, 2000). Un agente estresante, se define como cualquier situación, intrínseca o extrínseca al propio animal, que es capaz de producir cambios a diferentes niveles metabólicos, preparando al animal para superar esa situación. Tort (2011), clasificó a los factores estresantes de diferentes formas dependiendo de varios criterios como son el origen, la intensidad, la duración en el tiempo o la percepción del mismo por el propio animal: Factores físicos y ambientales: derivan de las diferentes manipulaciones a las que se somete los animales en la práctica de la acuicultura (handling); en este caso la duración e intensidad del factor son determinantes. También las relacionadas con la calidad del agua como propiedades físico-químicas y biológicas necesarias para su uso en acuicultura (temperatura, oxígeno disuelto, compuestos de nitrógeno, salinidad, pH, presencia de contaminantes químicos, patógenos). En este segundo grupo de factores físicos-ambientales, es importante si el factor estresante es introducido en el ambiente de una forma gradual, porque los animales tienen capacidad de adaptación. Factores sociales y simbólicos: como son la dominancia, hacinamiento, agresividad, etc., pueden provocar cambios en la respuesta al estrés, y al igual que los simbólicos como es la percepción y evaluación de la amenaza, pueden provocar cambios similares a factores de estrés físico. Factores de estrés agudo y crónico: hay que diferenciar que los factores estresantes pueden actuar en un corto periodo de tiempo o ser de alta intensidad, derivando en un estrés agudo, donde la respuesta del organismo seria la lucha o huida para garantizar la supervivencia del animal. Estos son a los que mayormente se enfrentan los animales en la vida salvaje. Por otra parte, hay factores estresantes que son de baja intensidad, pero persistentes en el tiempo y son los que producen un estrés denominado crónico en el organismo. Estos son más comunes en la producción acuícola. El estrés podría llegar a ser adaptativo ya que, si el resultado al desafío es satisfactorio, podría resultar en una experiencia de aprendizaje. 2.4.2 RESPUESTAS FISIOLÓGICAS AL ESTRÉS Para que se desencadene la respuesta fisiológica de estrés en un animal, primero tiene que estar sometido a un factor estresante y ser este percibido por el propio organismo. Así se inicia una activación de mecanismos fisiológicos, metabólicos, energéticos, inmunes, endocrinos 73 y neuronales que intentan restablecer el orden en el organismo, tratando de reequilibrar su homeostasis y produciendo un gasto elevado de energía (Pickering & Pottinger, 1985). Una vez que los estímulos estresantes han comprometido la homeostasis del animal, éste reacciona con una serie de respuestas de adaptación que le permitirán enfrentarse a las alteraciones de su equilibrio interno y así poder mantener o recuperar su homeostasis. Si esto no fuera posible, tendría lugar una inadaptación que comprometería su rendimiento y, por último, su supervivencia. Este conjunto de respuestas, presenta una serie de características comunes: transcurren de un modo secuencial y están reguladas conjuntamente por el sistema nervioso y el sistema endocrino (Schreck & Maule, 2001). La activación inicial de estos dos sistemas, da lugar a la liberación de las hormonas típicas del estrés (las catecolaminas y el cortisol), que actuarán para atenuar los efectos del mismo. A diferencia de los mamíferos, los peces carecen de corteza suprarrenal y es la parte anterior del riñón la que suple las funciones endocrinas de este órgano ausente. Aquí, el cortisol es producido en las células interrenales. Se cree que la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) regula la producción de cortisol en situaciones de estrés agudo, mientras que la hormona estimulante de los melanocitos (α-MSH), aumenta y parece asumir esta función corticotrópica en condiciones que desembocan en un estrés más crónico (Lamers et al., 1994; Arends et al., 2000; Metz et al., 2005) dependiendo así del factor estresante (Wendelaar Bonga, 1997). Por conveniencia, las respuestas al estrés han sido clasificadas en primarias, secundarias y terciarias según a que niveles fisiológicos afectan (Mazeaud et al., 1977; Wedemeyer et al., 1981,1990) (ver Figura 11): Respuestas primarias o de alarma: implican inicialmente la percepción de un estímulo estresante. Son de naturaleza neuroendocrina y conllevan la liberación de las catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) y glucocorticoides (cortisol) a la circulación sanguínea (Wendelaar Bonga, 1997). Dentro de las respuestas primarias, hay una primera fase de actuación inmediata con la activación del eje nervioso simpático y células cromafines, con la liberación de catecolaminas. La segunda fase, es más retardada y se asocia con la activación del eje hipotálamo-hipófisis-interrenal (HHI) con la liberación de cortisol desde las células interrenales (Schreck & Maule, 2001). Respuestas secundarias: son la consecuencia directa de la liberación de las catecolaminas y el cortisol, reflejando las alteraciones inducidas por estas hormonas en los diferentes órganos del pez. Los cambios promovidos por estas hormonas se podrían resumir en dos aspectos fundamentales. Por un lado, cambios que tienen lugar en el sistema circulatorio, respiratorio y en la osmoregulación, y por otro, en la movilización de los sustratos energéticos. Además de estas alteraciones, también tienen lugar cambios en la secreción de diversas hormonas (hipofisarias y tiroideas) y en la actividad de diversos sistemas de neurotransmisión cerebral, como el serotoninérgico y el dopaminérgico (Barton, 2002). Respuestas terciarias: surgen como consecuencia de mantener en el tiempo los cambios que tienen lugar durante las respuestas secundarias. Cuando la acción de algunos agentes 74 estresantes es prolongada o repetitiva, existe una constante perturbación de la homeostasis y es a lo que se ha llamado disestrés (Schreck & Tort, 2016). Esta perturbación, es la que finalmente puede producir una disminución del rendimiento del animal que afecta negativamente al desarrollo y reproducción (revisado por Pankhurst, 2016), al crecimiento y engorde (revisado por Sadoul & Vijayan, 2016) y al estado inmunitario (revisado por Yada & Tort, 2016), pudiendo llegar a disminuir sus probabilidades de supervivencia. Estas respuestas terciarias se reflejan tanto a nivel individual como poblacional (Barton, 2002; Wendelaar Bonga, 1997). Figura 11. Esquema informativo (modificado de Schreck & Tort, 2016) del efecto del estrés en respuestas orgánicas por activación de hormonas: catecolaminas y corticosteroides. CRH: hormona liberadora de adenocorticotropina; ACTH: hormona adrenocorticotropa; ACH: acetilcolina. Finalmente indicar, que no se puede hablar de respuestas uniformes y estereotipadas, dado que diferentes tipos de estrés pueden generar diferentes respuestas, muchas veces no comparables (revisado por Winberg et al, 2016). Hay que tener en cuenta que el sistema nervioso central (SNC) puede responder de diferentes maneras, incluso frente a un mismo tipo de estímulo, dependiendo de las condiciones ambientales, el estado nutricional, la etapa de desarrollo o el estado reproductivo en el que se encuentra el animal, además de las exposiciones previas que haya tenido al mismo (revisado por Yada & Tort, 2016). 2.4.2.1 EJE HIPOTÁLAMO-SIMPÁTICO-CÉLULAS CROMAFINES En los peces, al igual que en los mamíferos, la secreción de las catecolaminas hacia la circulación sanguínea es una respuesta inmediata al estrés agudo, de modo que el incremento de sus niveles en sangre tiene lugar muy rápidamente (Mazeaud & Mazeaud, 1981), mucho más 75 que para el cortisol (Barton, 2002). Situaciones de estrés como pueden ser la hipoxia, manipulación, captura, transporte o estrés térmico, provocan un rápido incremento de las catecolaminas en la sangre (Mazeaud et al., 1977). Además, se produce un aumento de niveles de glucosa sanguínea que tendrá como misión la de preparar al organismo frente a un aumento de la demanda energética necesaria para el mantenimiento de las funciones vitales. Así pues, se incrementará la movilización de la glucosa a través de la estimulación de la glucógenolisis y de la gluconeogénesis desde sus depósitos de reserva hepáticos (Iwama et al., 2004). Figura 12. Ultraestructura liberacion de catecolaminas en célula cromafín (modificado de Ana Verónica Belingheri, 2016). Ach: acetilcolina; nAchR: receptor nicotínico; ΔV: despolarización; PA: potencial de acción; Ca²⁺: iones calcio; CCDV: canales calcio dependientes de voltaje; A: adrenalina; NA: noradrenalina. En los peces teleósteos, las catecolaminas: adrenalina (A) y noradrenalina (NA), se sintetizan en el tejido cromafín que se encuentra disperso, en grupos celulares o individualmente, en la zona craneal del riñón (Perry et al., 1991; Reid et al, 1996, 1998), particularmente revistiendo las paredes de los principales vasos (Mazeaud & Mazeaud, 1981). Se produce, a partir de la tirosina, por una serie de enzimas. Su liberación desde las células cromafines se encuentra bajo el control del sistema nervioso simpático (SNS), estando inervadas estas células por fibras colinérgicas preganglionares. Su estimulación induce la liberación del neurotransmisor acetilcolina (ACh), que al actuar sobre los receptores colinérgicos (nicotínicos y muscarínicos) presentes en la membrana de las células cromafines, inducen la liberación de estas catecolaminas a la sangre por exocitosis (Mazeaud y Mazeaud, 1981; Perry et al., 1991) (ver Figura 12). No obstante, en la trucha arcoiris, tanto la ACTH como la serotonina (5-HT) y otros mediadores, también pueden estar implicados en el control de la secreción de catecolaminas (Reid et al., 1998). También el propio cortisol participa en esta regulación, aumentando la liberación de las mismas en las células cromafines (Reid et al. 1992, Reid et al. 1998). Se ha demostrado que el efecto hiperglucémico de las catecolaminas en el hígado es el resultado final de su acción sobre los receptores β-adrenérgicos, aunque hay estudios que señalan también la presencia de receptores α-adrenérgicos mediando su acción (Wendelaar Bonga, 1997). 76 Durante el estrés crónico, el papel de las catecolaminas en la homeostasis de la glucosa no parece ser tan evidente como en el caso del estrés agudo. En este caso, el incremento de los niveles de glucosa, parecen ser dependientes de la acción del cortisol principalmente (Pankhurst & Van der Kraak, 1997). 2.4.2.2 EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-INTERRENAL La activación del eje hipotálamo-hipófisis-glándula interrenal (HHI), forma parte integral de las respuestas primarias al estrés en peces. Frente a un estímulo estresante, los niveles plasmáticos de la ACTH se incrementan en pocos segundos, provocando una rápida elevación de los niveles circulantes del cortisol, que persisten durante horas (Sadoul & Geffroy, 2019). El colesterol es el precursor del cortisol. Brevemente, este puede ser captado de la circulación, específicamente de la lipoproteína LDL, mediante receptores específicos para su apoproteína APO-B100 formándose un endosoma, el cual se fusiona con el lisosoma que lo hidroliza y forma el colesterol y ácidos grasos. También puede ser generado dentro de la misma célula interrenal utilizando Acetil-Coa como precursor, formando el HMG-Coa. Luego, una enzima, la HMG-Coa reductasa, lo transforma en mevalonato (esta transformación constituye el principal punto de regulación de la síntesis de colesterol). Después, mediante una serie de procesos, el mevalonato se transforma en isopreno activo; 6 unidades de este isopreno, se unen y forman un escualeno. Gracias a otros cambios adicionales (como oxidaciones), se obtiene colesterol. Una vez obtenido el colesterol (vía LDL o vía Acetil-CoA), este puede almacenarse (si se encuentra en exceso) en forma de colesterol ester, por la enzima ACAT (Acil-Coa Colesterol Acil Transferasa) y despolimerizarse cuando se requiera (por la enzima colesterol-ester- hidrolasa). Si el colesterol no está en exceso como para almacenarse, se utiliza directamente para la síntesis de cortisol (ver Figura 13). https://www.monografias.com/trabajos5/aciba/aciba.shtml https://www.monografias.com/trabajos7/sipro/sipro.shtml https://www.monografias.com/trabajos14/administ-procesos/administ-procesos.shtml#PROCE 77 Figura 13. Vía bioquímica de la síntesis de cortisol en células interrenales (modificado de NEFTALI, Eduardo Antonio-Villa, 2018). LDL: lipoproteínas de baja densidad; ACAT: acetil Coenzima A transferasa; MGH- CoA: 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A. El colesterol, para formar cortisol, primero ingresa a la mitocondria de la célula interrenal y, gracias a la acción de una enzima llamada desmolasa (P450 SCC), forma pregnenolona (este es el principal punto de regulación de la síntesis de cortisol. Aquí empiezan la acción de diferentes enzimas, hasta obtener como producto final al cortisol (ver Figura 14). La pregnenolona, una vez formada, sale al medio citoplasmático y puede seguir 3 caminos: formar andrógenos y ser secretados; formar deoxi-cortisol sin crear progesterona como intermediario y/o formar esta molécula creando progesterona como intermediario. El deoxi-cortisol citoplásmico, puede regresar a la mitocondria y gracias a una 11β-hidroxilación, también formar cortisol. Procesos mitocondriales posteriores, pueden transformar al cortisol en aldosterona, que también será liberada al torrente sanguíneo (ver Figura 13). https://www.monografias.com/trabajos35/categoria-accion/categoria-accion.shtml 78 Figura 14. Esquema formación de cortisol en la mitocondria de células interrenales (esquema de Bello Chavolla & Antonio Villa: Fisiología de la glándula suprarrenal, 2018); P450scc: enzima escisión cadena lateral del colesterol; 3β-HSD: 3β -hidroxiesteroide deshidrogenasa. El eje HHI es quien controla la secreción del cortisol desde las células interrenales, células que se encuentran dispersas en la región cefálica del riñón en estrecha proximidad con las células cromafines (Reid et al., 1996). La regulación de la secreción del cortisol comienza con la liberación hipotalámica de la hormona liberadora de la corticotropina (CRH), que controla mayoritariamente la secreción hipofisaria de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH). Esta hormona también posee la capacidad de regular la síntesis de catecolaminas en estos animales (Reid et al, 1996). Una vez que la ACTH es liberada hacia el torrente sanguíneo, llega hasta las células interrenales, donde su principal función va a ser la de controlar la síntesis y secreción del cortisol (Mommsen et al., 1999). No obstante, en el control de la secreción hipofisaria de la ACTH intervienen otras sustancias. Por un lado, la arginina vasotocina (AVT), la isotocina (IT), las angiotensinas I y II, las urotensinas, hormona tiroidea (TRH) y el neuropeptido-Y (NPY) con una modulación positiva (Fryer, 1989; Pierson et al., 1996; Kelsall & Balment, 1998; Gilchriest et al., 2000). Por otro lado, encontramos la hormona concentradora de la melanina (MCH) (Green et al., 1991; Gilchriest et al., 2001) y la dopamina (DA) (Olivereau et al., 1988; Flik et al., 2006) que presentan una modulación negativa a nivel hipofisario. Se ha observado que un ligero bloqueo dopaminérgico de las células productoras de ACTH es fundamental en el papel estimulador de la CRH (Flik et al., 2006) (ver Figura 15). En los teleósteos, el control de la secreción del cortisol es aún más complejo, dado que, a parte del control hipofisario por parte de la ACTH (Mommsen et al., 1999), la hormona estimulante de los melanocitos (α-MSH) también estimula su secreción. Además, en ambos casos, la β-endorfina (β-END) puede actuar como un factor potenciador de sus acciones. A su vez, la secreción hipofisaria de la α-MSH se encuentra bajo un doble control hipotalámico: positivo por parte de la hormona tiroidea (TRH), el neuropeptido-Y (NPY) y la hormona liberadora de la corticotropina (CRH); y negativo, por parte de la hormona concentradora de melanina (MCH) y de la dopamina (DA) (Wendelaar Bonga, 1997) (ver Figura 15). 79 Figura 15. Esquema regulación eje Hipotálamo Hipófisis Interrenal (modificado de Robilson Antonio Weber, 2009) AVT: arginina vasotocina; IT: isotocina; NPY: neuropeptido Y; TRH: hormona tiroidea; CRH: hormono liberadora de adenocorticotropina; ACTH: hormona adrenocorticotropa; ACh: acetilcolina; MCH: hormona concentradora de melanina; DA: dopamina; β-END: beta endorfina; α-MSH: hormona alfa estimulante de melanocitos; 5-HT: hidroxi-triptamina; SNC: sistema nervioso central. Entre un 30% y un 55% del cortisol secretado a la sangre desde el tejido interrenal se encuentra ligado reversiblemente a una glucoproteína plasmática (α-globulina), siendo sólo la fracción libre del cortisol la que es fisiológicamente activa. De este modo, también las alteraciones de la concentración de esta α-globulina pueden controlar indirectamente la concentración del cortisol libre en sangre y, por tanto, su funcionalidad. Además, la unión a dicha glucoproteína, protege al cortisol de su inactivación en el hígado (Van der Boon et al., 1991; Mommsen et al., 1999). Una vez que el cortisol libre penetra en las células diana, se une a un receptor nuclear. A continuación, el complejo cortisol-receptor se unirá a una diana molecular del ADN, modulando la transcripción génica de ARNm específicos. La inducción de esta síntesis de ARNm, tiene como consecuencia la síntesis de muchas clases de enzimas, que finalmente determinarán el efecto de la hormona a muchos niveles (Van der Boon et al., 1991). Los niveles basales de cortisol se suelen recuperar hacia las 24 horas de media tras un estímulo agudo, aunque se sabe que, a partir de una hora, puede empezar a descender su producción y por tanto sus efectos (Montoya et al, 2017). Por el contrario, cuando un pez es sometido a un estrés crónico, los niveles del cortisol permanecen elevados durante más tiempo (Pickering & Pottinger, 1989). También se sabe que, bajo condiciones de estrés muy continuado, los niveles del cortisol pueden llegar a retornar hacia valores normales para evitar las 80 consecuencias negativas de altos niveles de cortisol mantenidos en el tiempo, por el auto mecanismo de retroalimentación o “feed back negativo” al que se ve sometido (Van der Boon et al., 1991; Wendelaar Bonga, 1997; Mommsen et al., 1999; Jeffrey et al., 2014b). En los peces, el hígado, las branquias y el intestino, son importantes tejidos diana sobre los que va a actuar el cortisol. En circunstancias de estrés crónico, con unos niveles elevados de cortisol durante días o semanas, se detectaron variaciones de los mecanismos de aclaramiento plasmático y una disminución del número de receptores para el cortisol (Pickering, 1989). La magnitud de la liberación del cortisol, puede variar ampliamente dependiendo de diversas circunstancias, como pueden ser: el tipo de estrés (Donaldson, 1981), la especie animal (Pickering & Pottinger, 1989), el ritmo diario (Spieler, 1979), la estación y/o el grado de madurez sexual (Pickering & Christie, 1981). En cualquier caso, la estima de sus niveles plasmáticos es uno de los indicadores de estrés más ampliamente utilizados en los peces (Mommsen et al., 1999), ya que es considerada la hormona del estrés por excelencia. En los peces, se puede decir que el cortisol opera generalmente como una hormona hiperglucémica. Incrementa la tasa gluconeogénica hepática, aumenta la movilización de los aminoácidos plasmáticos (inhibe la síntesis y estimula el catabolismo de las proteínas) y su conversión a glucosa a través de la gluconeogénesis (Erikson et al., 1999). También se puede hacer uso del lactato y del glicerol como sustratos gluconeogénicos como veremos más adelante (Van der Boon et al., 1991; Mommsen et al., 1999). La presencia de cortisol periférico tras un estímulo estresor, provoca la aparición de metabolitos energéticos en sangre dispuestos para su uso por los diferentes tejidos. Así es el caso de la producción, como hemos adelantado, de glucosa libre en sangre, procedente de la glucogenólisis y gluconeogenesis (disminución del glucógeno muscular y hepático), pero también es el caso de aumento de piruvato para producir lactato, procedente de una glucolisis de los hepatocitos, y de triglicéridos, derivados de una movilización de tejido adiposo muscular y hepático (Eldridge et al., 2015); así como una mayor presencia de aminoácidos circulantes procedentes de una proteólisis muscular (ver Figura 16). 81 Figura 16. Esquema de la ruta hiperglucémica como respuesta a un estímulo estresante (Modificado de Rubén Bermejo, 2016). No obstante, la exposición a niveles elevados de cortisol no siempre se traduce en una hiperglucemia, dado que también se han detectado casos en los que puede disminuir o no producir ningún efecto sobre los niveles de la glucosa plasmática y del glucógeno hepático (Mommsen et al., 1999; De Boeck et al., 2001). Según ciertos autores, la ausencia de efectos sobre la glucemia podría ser el resultado de la elevada utilización de esta por los mismos (Mommsen et al., 1999); mientras que, para otros autores, los efectos hiperglicemicos del cortisol podrían justificarse por su baja utilización en los tejidos periféricos (Van der Boon et al., 1991). 2.4.3 DETERMINACION DEL ESTRÉS 2.4.3.1 RESPUESTAS PRIMARIAS Actualmente, es posible detectar y cuantificar los cambios en casi todos los elementos asociados a las respuestas primarias del estrés (Pottinger, 2008), aunque de éstas, el indicador más utilizado de la activación del eje HHI es la determinación de los niveles plasmáticos de cortisol (Pottinger, 2008), el cual puede ser medido por técnicas de radioinmunoensayo (RIA) (Costas, et al., 2008) y/o técnica por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (Tintos et al., 2006). Además, se ha demostrado como una hormona con un componente genético suficiente para ser utilizado como criterio de selección para medir estrés en truchas (Fevolden et al., 2002). Con respecto al posible uso de las catecolaminas (adrenalina, noradrenalina y dopamina) como índices de estrés, hay dos problemas; en primer lugar, sus niveles circulantes se incrementan casi de inmediato después de la generación de un mínimo estrés y, en segundo lugar, la complejidad de su extracción desde la sangre y de su análisis, hacen que su uso esté prácticamente restringido a la investigación sobre el estrés en laboratorio (Pottinger, 2008). En este último caso, también podríamos incluir a la determinación de los niveles de neurotransmisores cerebrales, los niveles sanguíneos de la hormona adrenocorticotropa (ACTH) 82 (Sumpter et al., 1986), la prolactina (PRL) (Pottinger et al., 1992) y somatolactina (SL) (Rand- Weaver et al., 1993) o los del ARNm de la hormona liberadora de corticotropina (CRH) (Doyon et al., 2005). Para una operatividad más eficiente, debemos tener en cuenta que las catecolaminas aumentan en segundos, pero también se eliminan rápidamente de la circulación, mientras que el cortisol se eleva en minutos en respuesta a un desafío estresante y persiste durante más tiempo (Vijayan et al., 2010). Trenzado (2004), en su tesis doctoral, había recogido que los niveles basales de cortisol en sangre para la trucha arcoiris se encontraban entre 2.66 ng/ml y 33.26 ng/ml (Trenzado, 2004). Anteriormente, autores como Pottinger y Moran (1993), ya habían comprobado que los valores normales en plasma en esta especie son generalmente de 0,4-7,5 ng/ml y después de 5 minutos de acción estresante se elevan, alcanzando el máximo de 70-150 ng/ml a los 45 minutos. Posteriormente otros autores, acotaron ese rango basal entre 10.12ng/ml y 15.56ng/ml (Bermejo-Poza et al., 2015). En la mayoría de los peces, el cortisol alcanza su máxima concentración una hora después de estar estresado, volviendo a niveles basales pasadas seis horas post-estrés (Iwama et al. 2006). Se ha visto en trucha arcoiris que estos niveles elevados de cortisol post estimulación pueden mantenerse hasta 48h postevento (Olsen et al., 2005). En consonancia, se observó en ejemplares jóvenes de trucha arcoíris, que los niveles de cortisol plasmático aumentaron en la exposición aguda al estrés, mientras que volvieron a ser basales después de una exposición crónica. Así, los valores de cortisol pueden superar los 100ng/ml y descender a valores fisiológicos 10-20 ng/ml, aunque el estímulo estresante persista (Pickering & Christie, 1981). Se ha visto que el estrés agudo en doradas, eleva el cortisol con un pico máximo a la hora, para reducirse a las 16h y, el estrés crónico, lo eleva 90 veces más que los controles (Castillo et al, 2008). Ostrander (2000), demostró que hay variabilidad interespecie en cuanto a las elevaciones de cortisol plasmático tras un estrés agudo; aseguró que, los salmónidos alcanzan mayores elevaciones (400-600ng/ml) en comparación con otras especies menos reactivas (50- 200 ng/ml), dando cabida a la diferenciación interespecie en este parámetro de medición de estrés. Posteriormente, los niveles de cortisol tienden a ser basales, aunque el factor estresante permanezca, para evitar daño en los tejidos (Wendelaar Bonga, 1997). Esto nos indica que, medir los niveles plasmáticos de cortisol es una buena opción para medir estrés agudo pero una posible fuente de error para medir estrés crónico. La exposición a factores estresantes repetidos o a otros, pero simultáneos, puede trascribirse en una adaptación a ese estrés (Schreck, 2000), pudiendo verse reflejado en una variación en los niveles de cortisol en esos mismos animales. Barton (2005), comprobó que el nivel de cortisol variaba de 70 ng/ml en peces confinados puntualmente pero que estaban previamente aclimatados a una alta densidad, de los que se crían en baja densidad y son concentrados en un momento puntual, sin haber tenido esa previa aclimatación (139 ng/ml). 83 Indicar, que los efectos del cortisol afectan a la regulación del equilibrio iónico y osmótico, al crecimiento, a la reproducción, a la respuesta inmune y al bienestar de los animales durante la producción (Barton & Iwama, 1991; Mommsen et al., 1999; Wendelaar Bonga, 1997; Ellis et al., 2012), consecuencias reflejadas cómo respuestas terciarias dentro de este capítulo. 2.4.3.2 RESPUESTAS SECUNDARIAS Al igual que determinar los niveles de cortisol como respuesta primaria al estrés, los análisis de algunos de los parámetros relacionados con las respuestas secundarias son también fáciles de determinar y, por tanto, de potenciar su uso en acuicultura para determinar niveles de estrés y sus consecuencias. Entre ellos, podríamos citar el análisis plasmático de glucosa y lactato, que pueden ser verificados con el empleo de kits comerciales (Aragão et al., 2008; Vijayan et al., 1997a). La determinación de los índices hematológicos como la hemoglobina, que puede ser fácilmente determinada mediante el empleo de un kit comercial. El hematocrito, mediante el método del microhematocrito (Morales et al., 2005). Existen otras medidas, pero su uso está restringido a la investigación más minuciosa en laboratorio: niveles de glucógeno hepático, niveles de enzimas metabólicas, como creatin fosfoquinasa (CPK) (Feidantsis et al., 2015) o lactato deshidrogenasa (LDH) (Peres et al., 2013); niveles de aminoácidos libres en el plasma (Pinto et al, 2007); niveles de triglicéridos en sangre (Bennet et al., 2007) e incluso los niveles de cloro sanguíneo (Devashish, 2016). La determinación de la glucosa en sangre, es un método menos preciso que el del cortisol, sobre todo si se utiliza como único para determinar el nivel de estrés al que el animal se ve sometido (Flodmark et al., 2002; Mommsen et al., 1999). La producción de glucosa esta mediada principalmente por la acción de cortisol, además de las catecolaminas, que estimula la gluconeogénesis hepática y detiene a la absorción periférica de azúcar como hemos visto anteriormente (Barton & Iwama, 1991) (ver Figura 16). Los altos niveles de glucosa en sangre tras un estímulo estresante, responden primero al efecto de las catecolaminas, pasando a ser a largo plazo por el cortisol (Pottinger & Carrick, 2001). Pero hay factores que influyen en los niveles plasmáticos de glucosa en respuesta al estrés, como pueden ser el estado nutricional del propio animal, la dieta, la etapa de la vida en la que se encuentre, el tiempo desde la última alimentación e incluso, la estación del año, porque también puede afectar a las reservas de glucógeno en el hígado (Barton et al., 1988; Wedemeyer et al, 1990). Además, el nivel de glucosa en sangre, puede responder a otra serie de factores, no solo los estresantes, sino también patológicos. Se ha comprobado en trucha arcoíris en manejos de ayuno en lotes, que las diferencias de glucosa en sangre aparecían a partir del cuarto día de ayuno presacrificio (Bermejo-Poza et al., 2015). Por otra parte, existen autores que indican que no hay cambios significativos en los niveles de glucosa en sangre, o incluso, se ven disminuidos, pues bajo el efecto de factores estresantes, los peces consumen rápidamente los sustratos energéticos para mantener la 84 homeostasis, y esto dependerá también de la duración del estímulo y de los factores intrínsecos del propio animal (Wood et al., 1990). Los valores basales de glucosa en sangre también son diferentes según la especie y etapa de desarrollo, como ya hemos indicado para el cortisol (Iwama et al., 2004; Woodward & Strange, 1987). Se consideran valores normales de glucosa en sangre en la trucha arcoíris, entre 71.89 mg/ml hasta 78.79 mg/ml (Bermejo-Poza et al., 2016) y, según Trenzado (2004), sobre 77.8 mg/ml. El aumento de la concentración de lactato en sangre ocurre porque el lactato muscular se forma al efectuar un esfuerzo durante períodos de anaerobiosis, donde el estrés puede estar acompañado, o implicar, reducciones significativas del contenido de oxígeno en la sangre, que pueden acabar con la muerte del animal (Wood et al., 1983). Las situaciones que involucran un alto nivel de actividad aumentan el metabolismo y se definen mejor por los parámetros que se utilizan generalmente para determinar el aumento del ejercicio (Wood & LeMoigne, 1991). Durante una actividad intensa, los peces comienzan a metabolizar la glucosa anaeróbicamente en el musculo, generando lactato muscular a través de la enzima lactato deshidrogenasa reductasa. Durante periodos de estrés agudo, este metabolito se libera al torrente, aumentando su concentración (Pankhurst, 2011). El Ácido láctico (C3-H6-O3) es una molécula mono carboxílica orgánica, que se produce en el curso del metabolismo anaeróbico láctico (glucólisis anaeróbica). El aumento de la concentración de lactato, ocurre generalmente cuando la demanda de energía en tejidos (principalmente musculares), sobrepasa la disponibilidad de oxígeno en sangre. Bajo estas condiciones, la piruvato deshidrogenasa, no alcanza a convertir el piruvato a Acetil-CoA lo suficientemente rápido y, el piruvato, comienza a acumularse. Esto generalmente inhibiría la glucólisis y reduciría la producción de ATP, si no fuera porque la lactato deshidrogenasa reductasa (LDH-R), también presente en truchas (Polakof & Soengas, 2008), reduce el piruvato a lactato: piruvato + NAD + H+ → lactato + NAD+ (Grutter & Pankhurst, 2000). La función de la producción de lactato es oxidar NADH + H, para regenerar la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) necesaria para la glucólisis, y por tanto, para que continúe la producción de ATP y la obtención directa de energía. En estudios recientes, se ha demostrado que la LDH-R juega un papel importante en el suministro de energía a través de la glucólisis anaeróbica en condiciones estresantes, permitiendo que la vía de producción de energía del consumo de carbohidratos produzca ATP en ausencia de oxígeno (Cheng et al., 2018; Dalvi et al., 2017; Ekström et al., 2017). Posteriormente, el lactato se libera de las células musculares a través del sistema circulatorio y es absorbido por el hígado, que a través de la actividad de la encima lactato deshidrogenasa oxidasa (LDH-O), produce una gluconeogénesis (García et al., 1994; Katz y Tayek, 1999). Adicionalmente y a la vista de que hay autores (Iwama et al., 2004) que consideran insuficiente medir el nivel de estrés solo comprobando niveles de cortisol y glucosa, surgen vías complementarias para afianzar estos datos. Por ejemplo, la determinación de metabolitos dependientes del cortisol tal como aminoácidos, o glutamina-sintasa. También de enzimas intermedias de la glucolisis, influenciadas por la síntesis de cortisol y catecolaminas (Vijayan et al., 2003). Así como la determinación de diferentes parámetros mediante el uso de métodos no invasivos: como la tasa de ventilación y el consumo de oxígeno como reflejo la tasa metabólica https://www.biolaster.com/rendimiento_deportivo/metabolismo_energetico/anaerobico_lactico https://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno https://es.wikipedia.org/wiki/Piruvato_deshidrogenasa https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_pir%C3%BAvico https://es.wikipedia.org/wiki/Acetil-CoA https://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3lisis https://es.wikipedia.org/wiki/LDH https://es.wikipedia.org/wiki/Nicotinamida_adenina_dinucle%C3%B3tido https://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3lisis 85 en situaciones de estrés (Thompson et al., 2008); la medición de excreción de nitrógeno en forma de urea o amoniaco; la medición de gases como el dióxido de carbono (Evans et al., 2003). Por otra parte, se puede estudiar el estrés a nivel celular mediante cambios en una serie de proteínas, como las denominadas Proteínas del Estrés (HSP, Heat Shock Proteins). Estas son unas proteínas producidas en todos los organismos celulares de todos los animales, incluidos los peces (revisión por Iwama et al., 1998) y expresadas bajo una amplia gama de factores estresantes tanto bióticos como abióticos. Las HSP funcionan como moléculas auxiliares o “chaperonas” para todas las actividades metabólicas de proteínas y lípidos de la célula, permitiendo el normal funcionamiento de estas durante las situaciones de estrés. Ahora se reconoce que la regulación positiva de estas proteínas en la respuesta al estrés es universal para todas las células y no se limita únicamente al estrés por calor, como se pensaba al principio (de ahí el nombre de proteínas de choque térmico). Desempeñan un papel fundamental en la regulación de la síntesis normal de proteínas dentro de la célula. Las familias de HSP, como HSP90 y HSP70, son críticas para el plegamiento y ensamblaje de otras proteínas celulares y también participan en la regulación de la partición cinética entre el plegamiento, la translocación y la agregación dentro de la célula. Junto con la HSP30, forman los tres grandes grupos de proteínas del estrés en peces, pues son las consideradas como moléculas que se unen a los receptores de cortisol modulando así las señales intracelulares (revisado por Yada and Tort, 2016). Estas tres superfamilias de proteínas de choque térmico han demostrado ser una parte integral de la respuesta celular al estrés en gran cantidad de especies, aunque hay estudios que indican que no son unos indicadores claros de estrés, por ejemplo, en la cría del salmón del Atlántico (Zarate & Bradley, 2003). Las HSP también tienen un papel más amplio en relación con la función del sistema inmunológico, la apoptosis y diversas facetas del proceso inflamatorio. En los animales acuáticos, se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la salud, en relación con la respuesta del huésped a los contaminantes ambientales, a las toxinas alimentarias y, en particular, en el desarrollo de la inflamación y las respuestas inmunitarias específicas y no específicas frente a bacterias y virus (Roberts et al., 2010). Aunque los efectos de las HSP en la inmunosupresión de los peces aún no están claros, las HSP median controles endocrinos sobre la respuesta al estrés a nivel de los receptores corticoide. 2.4.3.3 RESPUESTAS TERCIARIAS Finalmente, como hemos mencionado, cuando la situación estresante persiste y se vuelve crónica o el estrés generado es de carácter agudo pero muy severo, entonces las llamadas respuestas terciarias son fácilmente visibles y detectables ya que los valores productivos se van a ver afectados. Durante el estrés, los peces responden de diversas formas para recuperar la homeostasis y dos procesos fisiológicos importantes se modulan cuando los peces están expuestos al estrés. Son el estado hormonal y la función inmunológica (Wendelaar-Bonga, 1997). 86 En este punto, el resultado del efecto del estrés lo podemos observar como clínica sobre el animal, ya que todos los procesos fisiológicos se verán afectados. Se necesita aportar energía para superar el factor estresante (carga alostática) y esa energía no estará disponible para otros procesos de la vida (Cannon, 1926, 1932). Así, se podrán observar alteraciones en la salud y resistencia a enfermedades (revisado por Yada & Tort, 2016), cambios en el comportamiento normal de esos animales (revisado por Noakes & Jones, 2016), ralentización del crecimiento (revisado por Sadoul & Vijayan, 2016) y deterioro reproductivo (revisado por Pankhurts, 2016). En este estado, donde las respuestas terciarias se hacen evidentes, es donde puede verse afectado el sistema inmune de los peces a todas las escalas (inmunidad innata y adaptativa tanto humoral como celular), haciéndolos más vulnerables a ser colonizados por diferentes patógenos y viéndose por tanto perjudicada su capacidad de combatirlos (revisado por Schreck y Tort, 2016; Yada & Tort, 2016) como veremos en el siguiente capítulo específicamente. 87 2.5 RESPUESTA INMUNE FRENTE AL ESTRÉS 2.5.1 INTRODUCCIÓN Como hemos visto, el estrés es considerado uno de los factores intrínsecos determinantes en la respuesta inmunológica en peces y, sin descartar la acción conjunta de varios de ellos, podemos considerarlo como un protagonista importante sobre la viabilidad de la respuesta inmune frente a desafíos microbiológicos (ver capítulo 2.3.1.4). El estrés puede suprimir la función inmune en algunas condiciones y mejorarla en otras (Tort, 2011). Entonces, es probable que los efectos del estrés sean beneficiosos o perjudiciales según las características del factor que lo produce y el tipo de la respuesta inmune afectada (revisado por Yada & Tort, 2016). Otros autores, aúnan estudios que demuestran que son varios los factores críticos que influyen en la dirección de los efectos del estrés sobre la función inmune, teniendo en cuenta no solo las hormonas propias del estrés, sino también otros factores endocrinos, nerviosos y genéticos (Dhabhar, 2009). Según este autor, las variaciones del sistema inmune frente al estrés estarán condicionadas por: a) Duración del estrés: el estrés agudo o de corta duración puede mejorar las respuestas inmunes innatas y adaptativas. El estrés crónico o a largo plazo, puede suprimir la inmunidad al disminuir el número y la función de las células inmunes y/o aumentar los mecanismos inmunosupresores activos (por ejemplo, las células T reguladoras). El estrés crónico también puede desregular la función inmune al promover respuestas proinflamatorias y de tipo 2 impulsadas por citocinas. b) Efectos del estrés sobre la distribución de leucocitos: durante las fases de estrés agudo hay una redistribución de leucocitos a los compartimentos diana, lo cual indica una inmunoestimulación, mientras que en sangre o bazo se detecta leucopenia debida a esta migración. c) Los efectos diferenciales de las concentraciones fisiológicas Vs farmacológicas de los glucocorticoides, y los efectos diferenciales de los glucocorticoides endógenos Vs sintéticos: las hormonas endógenas del estrés pueden tener efectos inmunológicos estimulantes o supresores mientras que las hormonas sintéticas siempre parecen mostrar efectos inmunosupresores. d) El momento de la exposición al estresor en relación con el tiempo de activación y el curso temporal de la respuesta inmune: se observa inmunoestimulación cuando se 88 experimenta estrés agudo en las primeras etapas de la activación inmune, mientras que se observa inmunodepresión en las últimas etapas de la respuesta inmune debido al efecto del cortisol. Dentro del cultivo piscícola, hay factores estresantes conocidos por causar cuadros de inmunodepresión y que incluyen aquellos asociados con las prácticas de cría intensiva, como pueden ser los desafíos sociales de comportamiento, la contaminación ambiental y las alteraciones dietéticas principalmente. La carga alostática planteada por un factor estresante puede reducir la efectividad en el funcionamiento de los mecanismos inmunes, permitiendo que los patógenos actúen con mayor virulencia (revisado por Yada & Tort, 2016). Los efectos más relevantes sobre el sistema inmune tienen que ver con alteraciones de las mucosas del pez (como vías de entrada de patógenos) y la depresión de la respuesta leucocitaria de forma sistémica. Algunos ejemplos de los primeros son: el incremento de la permeabilidad epitelial; el incremento en el recambio celular y, a su vez, desarreglo estructural en piel y branquias. Y ejemplos de los segundos son: el incremento en los neutrófilos circulantes en contraste con los bajos niveles plasmáticos de linfocitos y macrófagos ocasionado por la extravasación de estas células a branquias, piel e intestino (Wendelaar Bonga, 1997); la disminución funcional de los linfocitos de memoria B y T; la alteración en la migración, la fagocitosis y la presentación de antígenos por parte de los macrófagos; la disminución de la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) y la producción de trampas extracelulares de los neutrófilos (NETs) (Deane et al., 2006; Ortuño et al., 2001; Ruiz & Blas, 2003; Tort, 2011; Palić et al., 2007). Todos estos efectos, se traducen en una mayor susceptibilidad a enfermedades, principalmente de tipo infeccioso (Ndong et al., 2007). Las enfermedades en peces, como en todos los animales, aparecen cuando el sujeto se ve sometido a un factor estresante y este es capaz de afectar a la homeostasis del organismo, haciendo que el consumo de energía para resistir y recuperarse de este factor estresante afecte a la disponibilidad de energía para el sistema inmune y otros procesos metabólicos (revisiones Schreck y Tort, 2016; Yada & Tort, 2016). Consecuentemente, la respuesta inmune va a verse afectada, por lo que también se verá afectada la salud y bienestar del individuo (Seyle, 1976). Los sistemas nervioso y endocrino comparten la capacidad de sintetizar proteínas específicas del sistema inmune que son capaces de actuar como moduladores metabólicos (Borghetti et al, 2009). Ante un estímulo estresante, el eje HHI se activa y aumenta los niveles de cortisol, lo que conlleva el desarrollo de un amplio número de reacciones al unirse con receptores de glucocorticoides en numerosos órganos diana, influyendo en muchos procesos fisiológicos y, entre ellos, en la inmunidad (Shepherd et al., 2018). El aumento de cortisol va a afectar a tejidos como las branquias, el hígado, el corazón y el músculo esquelético, con el fin de movilizar energía y enfrentarse al desafío mediante la lucha o la huida, influyendo así sobre el metabolismo, el gasto cardiaco y la también sobre la actividad natatoria (Kiilerich et al., 2018). El cortisol atraviesa las membranas celulares y se une a factores de transcripción intracelulares, como el receptor de glucocorticoides (GR). En la unión, las proteínas de choque 89 térmico HSP70 y HSP90 son esenciales como chaperonas. El complejo receptor de hormonas formado, se trasladará al núcleo donde activa o reprime la transcripción de genes efectores (Pratt & Toft, 1997). La parte anterior del riñón o pronefros, ocupa un lugar particular en el estudio de las interacciones inmunoendocrinas en el linaje de los peces (Hofmann et al, 2010). Se combina en un mismo órgano, la hematopoyesis (eritropoyesis y leucopoyesis) con la producción de anticuerpos. También la síntesis de diferentes hormonas en las células cromafines e interrenales (catecolaminas y cortisol), implicando así una comunicación estrecha entre los tres sistemas reguladores: el endocrino, el inmunológico y el neuronal (Gorissen & Flik, 2016; Tort, 2011; Verburg-van Kemenade et al., 2017). Figura 17. Representación esquemática de las vías de comunicación entre SNC y el sistema inmune en peces teleósteos vía riñón anterior. Modificado de Weyts et al, 1999. En la parte anterior del riñón, las células productoras de cortisol y catecolaminas se entremezclan con los leucocitos, lo que permite una interacción directa y paracrina. Sistema nervioso central (SNC); hormona liberadora de corticotropina (CRH); hormona liberadora de tirotropina (TRH); dopamina (DA); Acetilcolina (ACh) hormona adrenocorticotrópica (ACTH); hormona estimulante de alfa–melanocitos (α-MSH); beta-endorfina (β-END). El riñón en los peces, ofrece la oportunidad de una comunicación paracrina directa entre los sistemas inmunitario y endocrino en un microambiente específico que, tras la recepción del estímulo estresante y su procesamiento, es capaz de combinar todas las respuestas (Weyts et al., 1999). Los leucocitos, así como las células endocrinas, comparten receptores. Las catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) son liberadas a través de la activación del tejido cromafín por la acetilcolina (ACh), vehiculada por el sistema nervioso simpático desde el cerebro (Mazeaud et al., 1977; Perry et al., 1991). El cortisol es secretado por las células interrenales después de la estimulación por hormona adrenocorticotrópica (ACTH) procedente de la hipófisis (Mommsen et al., 1999). Los leucocitos son producidos para su maduración y precoz diferenciación y, los eritrocitos que se sintetizan, tendrán funciones de transporte de oxígeno y reconocimiento de antígenos (Morera et al., 2011). La regulación metabólica y osmótica, el intercambio iónico junto con la modulación de la respuesta inmune, además de proporcionar células sanguíneas y oxígeno como recursos necesarios, son funciones muy relevantes para una eficaz respuesta al estrés. (ver Figura 17). Se ha demostrado que la ACTH puede regular 90 directamente la secreción de catecolaminas en la trucha arcoiris, por lo que está involucrada en la interacción endocrino-inmune a través de ambos ejes de la fisiología del estrés (Reid et al, 1996). Una respuesta integrada, impulsa al sistema inmunológico a destruir a los patógenos invasores, organizando todos los recursos para evitar efectos dañinos y desviando los nutrientes para apoyar a estos esfuerzos. Después de una situación estresante, varias moléculas incluidos neurotransmisores, citoquinas y hormonas, orquestan una respuesta homeostática compleja que está coordinada entre los tres sistemas reguladores. Se modula la respuesta inmunitaria innata, controlando por ejemplo, los efectos dañinos de la inflamación, ademas de orientar rutas energéticas y metabólicas específicas para apoyar las acciones anteriores. También prepara al organismo para una duracion en el tiempo del agente estresante o para desafíos repetidos. Estas acciones, involucrarán vías de activación o supresión dependiendo de las características del factor estresante (Tort, 2011). 2.5.2 RESPUESTA INMUNE AL ESTRÉS AGUDO Y CRÓNICO Dependiendo de las características del factor estresante, así será la afectación del sistema inmune (Tort, 2011). La respuesta inmune como respuesta al estrés se produce en dos fases: en la primera, la principal reacción es activar el número de mecanismos para responder a la nueva situación. Aquí se activa la fase de producción de proteínas, hormonas y péptidos que movilizarán los recursos. Se incrementan los marcadores inflamatorios, proteínas C3 del complemento con mecanismos bactericidas (Demers & Bayne, 1997; Sunyer & Tort, 1995), aumenta el número de receptores de glucocorticoides en los leucocitos del riñón (Maule & Schreck, 1991) y aumenta las citoquinas proinflamatorias (IL-1B, IL-8), las lisozimas y los genes antibacterianos (Caipang et al., 2008). Pero si el factor estresante persiste, la segunda fase conduce a un cuadro de inmunosupresión, basado en dos mecanismos: el gasto de los recursos para mantener la demanda de procesos como la división celular y síntesis de proteínas y el efecto de mediadores, que inducen el descenso de los mecanismos inmunes (Dhabhar, 2009). Esta supresión, está asociada a la liberación de hormonas típicas del estrés del eje HHI (cortisol), así como otras hormonas reguladoras como catecolaminas y la hormona liberadora de corticotropina (CRH) (Schreck and Maule, 2001; Shepherd et al., 2018;). Esta respuesta dual al factor estresante, depende principalmente del tiempo de exposición, la perseverancia del mismo y de las experiencias previas del animal a ese mismo estresor (revisado por Yada & Tort, 2016). 91 Figura 18. Relación entre estresores y activación / supresión inmune. CRH: hormona liberadora de corticotropina; ACTH: hormona adrenocorticotrópica; MSH: hormona estimulante de melanocitos. (Yada y Tort, 2016). Según el estímulo estresante y la percepción del mismo por el animal, se generan unas respuestas u otras, involucrando a unas determinadas hormonas, entre las que destacan las catecolaminas y el cortisol. Las respuestas agudas se caracterizan por mecanismos de activación, en particular, producción y movilización celular en el riñón y respuestas proinflamatorias sintetizadas por los linfocitos cooperantes Th1. Estas respuestas, van a estar mediadas por diferentes compuestos como las catecolaminas (Dhabhar, 2002), la hormona liberadora de corticotropina (CRH), la hormona adrenocorticotropa (ACTH) (Mola, 2005) y la hormona estimulante de melanocitos (MSH) (Sakai, 2001). Las respuestas crónicas, son a menudo supresoras, lo que lleva a una disminución de la respuesta innata, disminución de diferenciación de leucocitos y un cambio a la supresión de la inflamación mediada por linfocitos cooperantes Th2 (Sunyer & Tort, 1995). Estas respuestas crónicas estarán mediadas por el cortisol en un primer momento, la hormona del crecimiento (GH); las hormonas tiroideas: triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) y por la prolactina (ver Figura 18) (revisado por Yada & Tort, 2016). Se puede suponer que esta respuesta dual dependerá de la magnitud y de la duración del factor que causa el estrés. La fase de activación mediada por las catecolaminas y hormona CRH está relacionada con la producción de proteínas de fase aguda, la liberación de citocinas y la movilización de recursos. Los efectos supresores se han asociado principalmente a la actividad de corticosteroides, las hormonas del estrés del eje hipotálamo-pituitario-interrenal y, en particular, al cortisol (Tort, 2011). Así pues, una amplia variedad de cambios inmunes que ocurren en peces estresados pueden ser descritos como supresores de los procesos inmunes debidos a altos valores de cortisol (Dhabhar, 2009). En particular, se ha visto que durante la concentración en lubinas se ha reducido su inmunocompetencia como así lo indican las tasas reducidas de citotoxicidad y actividades de quimioluminiscencia (Vazzana et al., 2002). Del mismo modo, la alta densidad en la cría de doradas y besugo, redujo los niveles de proteínas del complemento como respuesta al cortisol elevado (Rotllant & Tort, 1997; MacKenzie et al., 2006a, b). El hacinamiento en doradas también deprimió las proteínas del complemento y actividades fagocíticas en leucocitos del pronefros y activó la migración de células en la sangre (Ortuño et al., 2001). La persecución repetida en doradas, resultó en una disminución de la actividad del complemento, niveles de 92 lisozima y títulos de anticuerpos (Sunyer y Tort, 1995). Por otra parte, se ha visto que bajos niveles de estrés pueden dar lugar a niveles ligeramente elevados de cortisol, que tienen un efecto positivo en la capacidad inmune mediante la regulación positiva de la redistribución de leucocitos, potenciación de la inmunidad innata e inmunidad mediada por células (Dhabhar and McEwen, 2001; Dhabhar, 2008; Schreck, 2010). El estrés también se ve reflejado en cambios del número y la tasa de reclutamiento de leucocitos que se dirigen a tejidos u órganos diana para aumentar la inmunoprotección efectiva. El estrés agudo estimula la producción de células sanguíneas en el riñón anterior, lo que resulta en un mayor número de leucocitos circulantes que son distribuidos a los tejidos diana (Wojtaszek et al., 2002). El tipo de leucocito presente en sangre también cambia. Se vio que el número y porcentaje de linfocitos y monocitos es significativamente más reducido, mientras que el número de neutrófilos aumenta. Los animales con estrés agudo, mostraron un mayor número de macrófagos activados en la sangre, así como una mayor activación de células T y reclutamiento de estas hacia la piel. Por lo tanto, el estrés agudo, mejora significativamente la cinética y la magnitud de determinadas subpoblaciones de leucocitos y su infiltración hacia el sitio de activación (Dhabhar, 2002). Pero esto no significa que exista una mejor respuesta inmunitaria, pues se ha visto que los efectos de las catecolaminas (A y NA) causan una reducción de fagocitosis (Roy & Rai, 2008) y una más baja tasa de niveles de ARNm de citoquinas proinflamatorias (Castillo et al, 2009). Hay también evidencia, de que varios mecanismos de respuesta inmune primaria son activados, incluso cuando un patógeno no está presente en la ecuación del experimento, aplicando estresores no antigénicos (Xia et al., 2013). Todos estos hallazgos, muestran importantes componentes interactivos de respuesta innata (macrófagos y neutrófilos) y de inmunidad adaptativa (células T de vigilancia), consecuencia de la mejora inducida por el estrés en una respuesta primaria, como es la activación del sistema simpático y la secreción de catecolaminas (Dhabhar, 2002). Por otra parte, debido a la activación continua del eje hipotalámico-hipofisiario-interrenal (HHI) como consecuencia del estrés continuo, la movilización y distribución inicial de leucocitos sanguíneos es seguida de una disminución general en el número de leucocitos en sangre, que será dependiente de la intensidad y duración del estrés. Los leucocitos, tienden a concentrarse en los órganos afectados y, por lo tanto, en los órganos centrales y en sangre periférica, se verá reflejada una marcada leucopenia (Dhabhar, 2002; Tort, 2011). Se sabe de los efectos de corticoides (endógenos o exógenos) a nivel leucocitario en los peces: disminución de proliferación y circulación de linfocitos, disminución de producción de anticuerpos por células B, atenuación de citotoxicidad de las células asesinas NK y, en los macrófagos, se produce una alteración del proceso de fagocitosis con un descenso de producción de citoquinas proinflamatorias en comparación con las antiinflamatorias que se verán aumentadas (revisado por Tort, 2011). Así, en términos generales, el cortisol suprime muchos aspectos del sistema inmunitario de los peces como es la producción de anticuerpos, la sintesis de leucocitos y la fagocitosis (Wendelaar Bonga, 1997; Weyts et al., 1999; Yada & Nakanishi, 2002). El descenso en el número de células productoras de anticuerpos también se ha descrito después del tratamiento con cortisol exógeno (Saha et al., 2004). Por ejemplo, la 93 administración de cortisol induce apoptosis de células B en la carpa común (Weyts et al., 1998b). Aun así, hay algunos estudios que indican que el cortisol no inhibe completamente la respuesta inmune, pero que si regula la redistribución de linfocitos durante la respuesta al estrés (Weyts et al, 1999; Dhabhar & McEwe, 2001; Schreck & Maule, 2001). Existen otros estudios, que demuestran que también podría mejorar el sistema inmune en alguna de sus fases, por ejemplo, en la producción de proteína C-reactiva durante procesos inflamatorios (MacKenzie el al, 2006 a, b). Figura 19. Representación conceptual de los efectos sobre la función inmune del receptor del cortisol. GR: receptor glucocorticoide. (Yada & Tort, 2016) Los peces teleósteos, tienen tres receptores de glucocorticoides diferentes como resultado de la duplicación de genes (GR1 y GR2) y el empalme alternativo (GR1a y GR1b) (Stolte 2006), además de un receptor mineralocorticoide (MR) identificado en trucha arcoiris (Colombe et al, 2000). La inmunomodulación inducida por el cortisol en los leucocitos de los peces podría estar mediada por ambos tipos de receptores. Los receptores de corticosteroides en el sistema inmunológico de peces tienen dos patrones de expresión después de una elevación del cortisol secretado. Una alta regulación del receptor de corticoides (GR2) parece estar correlacionada con la inmunosupresión y, a la inversa, una baja regulación del receptor de corticoides (GR1), donde la expresión puede resultar en una desensibilización de la función inmune al cortisol generado (Yada et al., 2007; Stolte et al., 2008 a b; Teles et al., 2013) (ver Figura 19). Las respuestas de tipo supresor se observan también a nivel genómico, porque los genes que expresan propiedades inmunológicas pueden regularse significativamente en peces estresados. Por ejemplo, la trucha arcoíris sometida a factores estresantes como la exposición al cobre o los lipopolisacáridos bacterianos (LPS), mostraron una significativa diferencia en la expresión de los genes inmunes de interleucinas IL-1β, IL-6, y TNF-α (Teles et al., 2011). La sustitución del aceite de pescado por aceite vegetal en las dietas de besugo, también indujo depresión de genes de citoquinas proinflamatorias junto con supresión de respuestas inmunes (Montero et al., 2003, 2010). Un manejo repetido de estrés en el bacalao, aumentó la expresión constitutiva de IL-1β, pero mostró una disminución de la supervivencia de los leucocitos en el salmón expuesto a Aeromonas salmonicida (Fast et al., 2008a). Situaciones de hipoxia en la 94 perca eurasiática, redujo la expresión del complemento C3 y la sobreexpresión de transferrina (Douxfils et al., 2014). También se ha demostrado que la mayoría de los genes relacionados con la inflamación se reducen tras tratamientos con cortisol (MacKenzie et al., 2006a). La expresión génica de varias citoquinas proinflamatorias en doradas era inhibida por el cortisol (Sternberg, 2006) y también, por la acción de la adrenalina en las branquias de esta misma especie (Castillo et al., 2009). 2.5.3 RESPUESTAS A NIVEL DE INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA Uno de los tipos de células clave de la respuesta inmune son los linfocitos B. Las células B de teleósteos comparten características de inmunidad innata y adaptativa. Las características innatas incluyen secreción natural de anticuerpos, producción de citoquinas y capacidades fagocíticas que son relevantes en términos de desarrollar una respuesta, sobre todo de llamada o alarma (Sunyer, 2013). Los peces expresan tres clases diferentes de inmunoglobulinas: IgM, IgD e IgT (IgZ) (ver capítulo 2.2.4). La IgM es la inmunoglobulina más común en el suero y en el mucus de la piel y juega un papel clave en las respuestas inmunes sistémicas, mientras que la IgT es la principal inmunoglobulina de la mucosa intestinal (Salinas et al., 2011). Las células B con actividad fagocítica están presentes en todos los compartimientos sistémicos (incluida la sangre, el bazo y la cabeza del riñón) y representan el 60% del cómputo total de células B (Zhang et al., 2010). Así, el papel en la inmunidad innata de las células B en peces, parece ser mucho más importante que en los mamíferos y, también su función de conectar las respuestas innatas y adaptativas del sistema inmune (Zhu et al., 2014). Por ejemplo, factores estresantes en carpas parecen reducir la cantidad de circulación linfocitos B y disminuir la respuesta de anticuerpos después de una inmunización previa (Stolte et al., 2008 b). También inducen una reducción de niveles de IgM, mostrando una mayor susceptibilidad a Nodavirus en lubinas (Varsamos et al., 2006). Muchos estudios han demostrado que el estrés induce alteración de los factores inmunes innatos sobre componentes como la lisozima, las proteínas del complemento o péptidos antimicrobianos (AMPs) (Saurabh & Sahoo, 2008; Montero et al., 2009; Mauri et al., 2011; Costas et al., 2011). El estrés también produce cambios a nivel de inmunidad humoral, con activación de proteínas relacionadas con respuestas inespecíficas, primeramente, y después, con una secreción de citoquinas que median la respuesta en diferentes células y tejidos. Se sabe de la capacidad del cortisol para inhibir la liberación de citoquinas proinflamatorias. La activación de las hormonas del estrés en mamíferos inhibe sistémicamente las respuestas Th1, las respuestas proinflamatorias y potencia un cambio a respuestas Th2, al suprimir la producción de citoquinas como: TNF-α, INF-γ, IL-2, IL-12, potenciando la producción de citoquinas pertenecientes a otros subconjuntos como: IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β (Elenkov & Chrousos, 1999). Alternativamente, los glucocorticoides modulan la adaptación de mediadores de inmunidad, inhibiendo la síntesis de IL-12 e IFN-y, regulando positivamente la sintesis de IL- 4, IL-10 e induciendo la secreción de TGF-β (Borghetti et al., 2009). También se ha visto que 95 tratamientos con cortisol en carpas, han demostrado una marcada apoptosis de células B (Weyts, 1998b) e inhibición del ARNm de la IgM, provocando así, un descenso de secreción de estos anticuerpos (Saha et al, 2004). Aunque los estudios in vivo e in vitro de cortisol se han utilizado principalmente como modelo para comprender el proceso de estrés en los teleósteos y su respuesta en base a esta hormona, hay otros componentes que también podrían estar involucrados en esta respuesta al estrés y en su reflejo en la inmunidad. Por ejemplo, carpas sujetas a cambios bruscos de temperatura, mostraron niveles altos de cortisol, pero sin reducción de la producción de anticuerpos o cambios en el número de células secretoras de anticuerpos (Saha et al., 2002). Por lo tanto, aunque el cortisol es la principal hormona involucrada en los cambios de estrés y como norma general, relacionada con la supresión del sistema inmune, la regulación inmune por el sistema neuroendocrino es más compleja que solo la acción de esta hormona (revisado Yada & Tort, 2016). El papel de las HSP y los GR en las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas de los peces teleósteos, aún necesita más aclaraciones. Los peces teleósteos producen señales de estrés a través de su eje hipotálamo-hipófisis-interrenal (HHI), que es análogo al eje hipotálamo- pituitaria-adrenales (HPA) de los mamíferos. También se considera que la formación del complejo cortisol-receptor y la transactivación o transrepresión, utilizan rutas intracelulares similares a las descritas en los mamíferos (Stolte, 2006). De hecho, para la trucha arcoíris se demostró la interferencia de HSP70 en el complejo del receptor GR y se encontró que el estrés (estrés por calor y tratamiento con cortisol) estimula esta asociación de HSP70 con el receptor de glucocorticoides (Basu et al., 2003). Así pues, según hemos visto, los factores que causan estrés en peces también inducen una serie de cambios en la respuesta del sistema inmune, caracterizadas principalmente por la activación de numerosas proteínas relacionadas con respuestas inmunes no específicas, pero que, secundariamente, mediante la acción de determinados mediadores, también afectará a diferentes células y tejidos mediante la influencia sobre la respuesta inmune específica, siendo la afección del mismo por tanto, de forma global (Montero et al., 2009; Saurabh & Sahoo, 2008; Mauri et al., 2011; Costas et al., 2011; Teles et al., 2011). 2.5.4 ESTRÉS Y FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA Ya hemos visto que el estrés es un factor capaz de producir alteraciones en la respuesta inmune a nivel global, pero este, también será capaz de modificar la funcionalidad de los macrófagos específicamente. Los macrófagos son células cruciales para el sistema inmune innato y también adaptativo. Son extremadamente flexibles y, dependiendo de la citoquina que lo active, el microambiente que le rodea y la presencia de patógenos, pueden polarizarse 96 clásicamente hacia un comportamiento efector (M1) lo que implica la eliminación directa del patógeno; o una polarización alternativa (M2) produciendo macrófagos como células cicatrizantes o inmunoreguladoras (Mosser & Edwards, 2008) (ver capítulo 2.2.5.3). El efecto del estrés sobre la respuesta inmune de los peces teleósteos se ha estudiado intensamente (revisión Yada & Tort, 2016), aun así, se sabe poco sobre su participación en la polarización de macrófagos en los peces. Se sabe, que el entorno de maduración de los monocitos y macrófagos en la cabeza del riñón está bajo la acción paracrina directa de las hormonas del estrés: cortisol y catecolaminas (entre otras). Esto ayuda, a que los fagocitos de esta zona, pasen a polarizarse en la dirección alternativa (M2) a diferencia de los producidos en el tronco renal, donde no se ha podido observar esta mayor incidencia hacia la producción de macrófagos inmunoreguladores en las carpas (Maciuszek et al., 2019). Diferentes estudios han demostrado que el número de leucocitos presentes en el riñón anterior aumenta cuando los peces están estresados (MacKenzie et al, 2006a, b), y que los macrófagos del pronefros producirán en mayor medida una citoquina proinflamatoria como es la IL-1β, que presenta un papel importante en las respuestas locales y sistémicas frente a infecciones, heridas y desafíos inmunológicos (Fast et al., 2008b). Sin embargo, otros autores han comprobado que la respuesta de IL-1β, al administrar una endotoxina, es similar en macrófagos de peces estresados y no estresados (Yada et al., 2019). Por otra parte, se ha visto una disminución en la supervivencia de macrófagos de peces al ponerse en contacto con ciertas bacterias como Aeromonas salmonicida bajo situaciones estresantes (Fast et al., 2008b). También, que la experimentación con lipopolisacáridos bacterianos (LPS) en truchas durante 5 días, inhibía la expresión de citoquinas proinflamatorias como TNF-α2 y IL-1β (Teles et al, 2011). Se están acumulando cada vez más evidencias de que los macrófagos de los peces se polarizan de manera similar a sus homólogos de mamíferos, como, por ejemplo, que su estimulación con lipopolisacáridos (LPS) o LPS con IFN-γ, induce la expresión de marcadores de polarización clásica (M1) con una liberación de citoquinas proinflamatorias, quimiocinas CXC, enzima sintasa inducible (iNOS) y producción de óxido nítrico (NO⁻) (Arts et al., 2010). Por otra parte, en una estimulación in vitro con AMPc, los macrófagos de la carpa expresan marcadores de polarización alternativa (M2): arginasa-2 y actividad arginasa (Joerink et al., 2006b). Además, en los macrófagos de la cabeza renal de la corvina amarilla, se regula a la baja la expresión de IL-1β, TNF-α e iNOS, pero aumenta la expresión de ARNm de citoquinas antiinflamatorias (TGF- β), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y arginasa-2 (Mao, 2018). Del mismo modo, se descubrió en doradas, que las citoquinas recombinantes IL-4 / 13A e IL-4 / 13B aumentaron la actividad de la arginasa y regulaban negativamente la producción inducida por IFN-γ de NO⁻ y ROS (Hodgkinson et al., 2017). Si bien, autores como Weyts (1998) o Stolte (2008), afirmaban que el cortisol produciría una inhibición de la iNOS y de la producción de NO⁻, vieron que su efecto sobre las citoquinas y quimiocinas pro y antiinflamatorias era poco significativo y, que el estallido respiratorio, no se veía gravemente afectado a no ser que los niveles de cortisol fueran muy elevados. En esta línea, diferentes estudios han demostrado que se puede ver afectada la actividad de los macrófagos bajo el efecto del cortisol o glucocorticoides, in vivo e in vitro. Por ejemplo, en la cabeza renal del pez globo se observó una producción inducida de IL-6 tras inyección 97 intraperitoneal de lipopolisacáridos (LPS) y dexametasona (Kumar et al, 2019), mientras que en trucha arcoíris, la inyección de cortisol refleja una expresión génica regulada con disminución de IL-1β, TNF-α y proteína C3 del complemento (Cortes et al., 2013). Del mismo modo, estos fagocitos de la cabeza renal de carpa tratados con el cortisol, disminuyeron la producción de NO⁻ y la expresión génica regulada por disminución de IL-1β, TNF-α, iNOS, IL-12p35 y suero amieloide A (Saeij et al., 2003; Stolte et al., 2008b). En un experimento de amputación de la cola en el pez cebra tratado con el glucocorticoide sintético beclometasona, se vio que se inhibía la diferenciación de macrófagos hacia un fenotipo M1 efector (Xie et al, 2019). Por lo tanto, tanto en mamíferos como en peces, los glucocorticoides consiguen alentar una polarización alternativa de macrófagos. También, las hormonas del estrés liberadas durante un desafío estresante (cortisol), afectarán en la respuesta inflamatoria y proceso de regeneración de tejidos mediante el control activo de la polarización de los macrófagos. Sabemos que la comunicación neuroendocrina-inmune, asegurará una regulación de los macrófagos activados por contacto con agentes infecciosos para que no dañen los tejidos diana por un exceso de respuesta innata, modificando su respuesta hacia una polarización inmunoreguladora de los mismos (Verburg-van Kemenade et al., 2017). En esta línea, recientemente se ha demostrado que puede haber una reprogramación metabólica de los macrófagos M1 en la carpa tras someterse a un estrés, similar a lo demostrado en mamíferos (Wentzel et al., 2020). Además de los factores estresantes, son numerosos los factores que pueden afectar al proceso de fagocitosis por los macrófagos. Entre estos, destaca las especies de peces estudiadas, la fuente de las células utilizadas, las diferentes metodologías aplicadas, la elección de la partícula a fagocitar o la relación célula-partícula (Esteban et al., 2015). 98 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 99 La acuicultura ha experimentado un importante crecimiento en los últimos años debido al aumento en la demanda de los animales producidos para alimentación a nivel mundial. Los peces son animales muy dependientes de las condiciones ambientales, por lo que van a verse afectados por las condiciones climáticas, pero también por las prácticas de manejo habituales en producción. Estos factores, ambientales y de producción, pueden dar lugar a alteraciones de los niveles de estrés, que, a su vez, tendrían repercusiones sobre su estado fisiológico, incluyendo también su respuesta inmune. En este sentido, la respuesta inmune innata constituye la primera y principal línea de defensa de los peces, y, dentro de ella, la fagocitosis juega un papel primordial en la respuesta a los procesos infecciosos, por lo que, se podría ver afectada por esos incrementos del nivel de estrés en los peces. El objetivo principal de este trabajo fue determinar si la aparición de factores estresantes podría alterar la capacidad de los macrófagos para responder a una infección bacteriana, y si la duración de ese factor estresante podría tener alguna influencia sobre esa respuesta de los macrófagos. Para ello hemos utilizado un efecto agudo de duración establecida, reconocido por el aumento de los niveles de cortisol sérico, el hacinamiento de las truchas durante 2 horas, y otro crónico, en el que los niveles de cortisol sérico estuvieran en el rango fisiológico, las variaciones de temperatura. La influencia de estos factores estresantes sobre los macrófagos se determinó mediante la valoración de distintos aspectos de esa respuesta, como son: 1. Explosión respiratoria: medición de los compuestos reactivos de oxígeno que se producen en la digestión de los agentes bacterianos. 2. Capacidad de los macrófagos para fagocitar bacterias. 3. Reducción del número de bacterias fagocitadas, también expresada como número de bacterias capaces de sobrevivir en los macrófagos tras la fagocitosis. 4. Capacidad de los macrófagos para aumentar su número (proliferación) ante una amenaza. 5. Alteración de la producción de factores solubles de los propios macrófagos que pudieran influir sobre esa capacidad de proliferación. 100 4. MATERIAL Y MÉTODOS 101 4.1 PECES Para este estudio se utilizaron 300 truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) de entre 250- 300g de peso y en buen estado de salud. Los peces se mantuvieron en una piscifactoría de la zona este (o noreste) de España, en estanques de 75m de longitud x 6m de ancho x 1,5m de profundidad en las condiciones de densidad y calidad de agua normales de la piscifactoría. La piscifactoría usa agua directamente tomada del río Tajo, que es enriquecida con oxígeno líquido a la entrada según necesidades para mantener su concentración más o menos constante en torno a 7 mg/L en todo momento. Los datos de densidades y parámetros físico-químicos del agua (temperatura, oxígeno disuelto, etc.) fueron tomados de los datos de la propia piscifactoría a partir de los sistemas de medición en continuo de la misma. Contamos con la autorización de la piscifactoría para realizar el muestreo y sacrificio de los animales de forma humanitaria para llevar a cabo este estudio. Los datos de temperaturas del agua se obtuvieron de las mediciones diarias de la propia piscifactoría. Para ello se utilizó la media de las temperaturas de los siete días previos desde el muestreo, acabando en ese día, denominada SEMANA DE MUESTREO, y la de los siete días anteriores a esa semana, es decir, desde el día 13 al día 7 previos al día de muestreo, denominada SEMANA PREMUESTREO. Finalmente, también se utilizaron las temperaturas acumuladas de cada una de estas semanas, como la suma de todas las medias de cada día de la semana correspondiente (muestreo y premuestreo). 4.2 MUESTRAS Para cada muestreo, las truchas, siempre del mismo tanque, se dividieron aleatoriamente en dos grupos (ver Figura 20), con n=5 en cada uno de ellos: 1. ESTRESADAS (S): fueron concentradas (crowding) durante 2 h antes de su captura; y, 2. CONTROL (C): truchas que no habían sido sometidas a crowding antes de su captura. Tal como se ha comentado en el apartado anterior, todas las truchas se mantuvieron en las condiciones normales de la piscifactoría, y no fueron sometidas a ningún otro factor de estrés de origen antropogénico en las semanas anteriores. 102 Figura 20. Fotografía de un estanque en hacinamiento intenso de la propia piscifactoría PISZOLLA. A la izquierda el grupo de truchas en crowding (S) y a la derecha, el grupo control (C). Una vez capturados, los peces fueron introducidos de 5 en 5 en una solución anestésica de benzocaína al 2% (ACUACEN BENZOCAINA 200mg/ml (Cenavisa), hasta su sedación, pérdida completa del equilibrio. A continuación, se realizó la extracción de 3mL de sangre de cada una, mediante punción de la vena caudal, para determinación de los datos bioquímicos, y se procedía a medir y pesar cada animal por separado, tras lo cual se realizaba la extracción del riñón. Para ello, se diseccionaba lateralmente y se extraía la parte anterior del riñón de cada trucha (ver Figura 21), y se introducía en tubos con medio de extracción previamente preparado (L-15 suplementado con 2% suero fetal bovino + 50 U ml⁻¹ de penicilina y 50 µg ml⁻¹ de estreptomicina + 10 U ml⁻¹ de heparina). Los riñones de las truchas de cada grupo (S o C) se incluían de 5 en 5 en un mismo tubo. Figura 21. Extracción de la parte del riñón anterior de una de las truchas del estudio (in situ). Finalmente, todas las muestras, tanto sanguíneas como tisulares, fueron transportadas al laboratorio en refrigeración en menos de 2 horas. 103 4.3 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS Los parámetros bioquímicos séricos determinados relacionados con el estrés fueron los niveles de glucosa, lactato y cortisol. Para su determinación, en la propia explotación se realizó la medición del valor de glucosa y lactato sanguíneo a cada una de las truchas que componían cada grupo (n=5) de muestreo. Para ello se utilizaron dos lactosimetros idénticos (ACCUTREND PLUS GLUCOSA, Cobas) para trabajar en paralelo con cada muestra, siguiendo en todo momento las instrucciones del fabricante tanto para las mediciones como para mantenimiento y limpieza. Para las determinaciones se utilizaron las tiras reactivas correspondientes, en las que se depositó una gota de sangre introduciéndola en el lactosimetros con las indicaciones para cada parámetro, y se anotó el resultado mostrado en el aparato tras esperar el tiempo correspondiente (60 segundos para lactato y 12 segundos para glucosa). La determinación del cortisol se realizó en un laboratorio externo, mediante una prueba ELISA. Para ello, las muestras de sangre se trasladaron a nuestro laboratorio en refrigeración, donde se centrifugaron a 3000rpm 10min⁻¹ para separar el suero. Una vez obtenidos, lo sueros de cada grupo se unificaron en un mismo tubo, se separaron en alícuotas de 500µL cada uno y se mantuvieron a -20°C. Para la determinación del cortisol, se envió al laboratorio externo una muestra de 100µL por cada grupo. 4.4 BACTERIAS Para evaluar la actividad de los macrófagos renales (fagocitosis, explosión respiratoria y proliferación) se utilizaron dos tipos de bacterias aisladas en nuestro laboratorio (Escherichia coli y Yersinia ruckeri cepa O-1). Previamente, se realizó un estudio comparativo con ambas bacterias, consiguiendo resultados similares, por lo que, para este trabajo, éstas se usaron indistintamente (resultados no mostrados). Las bacterias se cultivaron en medio TSA líquido a 32°C durante 24h, tras lo cual el cultivo fue centrifugado a 10000 rpm 10 min⁻¹ y posteriormente, el sedimento obtenido fue resuspendido en igual volumen de solución salina estéril (duplicado) para eliminar las sustancias extracelulares que pudieran tener un efecto tóxico sobre los macrófagos. Finalmente, se realizó el cálculo de la concentración bacteriana en esa suspensión mediante diluciones decimales y siembra de alícuotas en TSA. 4.5 RECOLECCIÓN DE MACRÓFAGOS Para la obtención de macrófagos, se siguió la metodología descrita por García y Villarroel, (2009). La muestra de tejido de cada grupo se pasó a través de una malla de nylon de 100 µm, puesta en hielo durante 10 minutos y finalmente centrifugada (1000 G durante 15 104 min⁻¹). A continuación, el sedimento se resuspendió en medio con bajo porcentaje de suero fetal (L-15 + 0.1% suero fetal bovino + 50 U ml⁻¹ de penicilina y 50 µg ml⁻¹ de estreptomicina), y se pipetearon 0.1 ml de la suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos dejándose durante toda la noche a 20°C para permitir su fijación al fondo de los mismos. Tras la incubación, se procedía a lavar tres veces cada pocillo con medio L-15 suplementado con 2% suero fetal bovino para eliminar las células no adheridas. 4.6 CONTAJE DEL NUMERO DE MACRÓFAGOS POR POCILLO El número de células (macrófagos) adheridas a los pocillos se calculó en cada muestreo para cada grupo. Para ello, las células de 4 pocillos por grupo, fueron desprendidas mediante tratamiento con tripsina, e inmediatamente introducidas en un tubo con medio con 2% SFB en una proporción 1:1. Tras lo cual se contaron en una cámara de Neubauer para poder ajustar el número de bacterias que iban a infectarlos a 100 bacterias/macrófago (100:1) en ambos grupos (C y S) para que los resultados obtenidos fueran comparables. 4.7 FAGOCITOSIS Y SUPERVIVENCIA BACTERIANA A cada uno de los pocillos de ambos grupos se añadió 90 µL de medio sin antibiótico (L- 15 + 2% suero fetal bovino) y 10 µL de suspensión bacteriana a la concentración necesaria para conseguir una moi de 100:1, tal como se comentó en el apartado anterior. A las 4hpi, se retiró el medio de cada pocillo y se lavaron tres veces con PBS para eliminar las bacterias no adheridas a los macrófagos. Tras lo cual, una vez retirado el PBS, a los pocillos destinados a obtener los resultados de fagocitosis (4hpi) se les añadió 100 µL de tripsina, que se dejó actuar durante 20 minutos (tripsina-EDTA, SIGMA) para lisar los macrófagos, y el número de bacterias presentes se contó siguiendo la misma metodología descrita anteriormente (diluciones decimales y siembra en TSA). En cuanto a los pocillos destinados a obtener resultados de supervivencia bacteriana (24hpi), tras la retirada del PBS se les añadió 100 µL de medio completo (L-15 suplementado con 2% suero fetal bovino + 50 U ml⁻¹ de penicilina y 50 µg ml⁻¹ de estreptomicina) y fueron incubadas hasta las 24hpi. Tras lo cual, fueron lisados como se ha descrito en el párrafo anterior, y nuevamente las bacterias presentes en cada pocillo se calculó mediante diluciones decimales y siembra en TSA. 105 4.8 EXPLOSIÓN RESPIRATORIA La explosión respiratoria se midió mediante el test de reducción de NBT (Nitro-Blue Tetrazolium) que mide la producción de O₂⁻ intracelular. Para ello, se utilizó una placa con macrófagos sembrados como se ha descrito en al apartado 4.5. Los macrófagos de 8 pocillos por grupo (S y C) fueron lavados con PBS para eliminar todo resto de medio que pudiese producir interferencias en las mediciones posteriores. Posteriormente, en 4 de ellos se añadió 100µL de una solución de NBT (1mg mL-1 en PBS) para determinar la explosión respiratoria basal. En los 4 restantes se añadió una suspensión de las bacterias en la misma solución de NBT ajustada para conseguir nuevamente una moi de 100:1 (bacterias:macrófagos). La placa se incubó 1h a 20°C, tras lo cual se retiró la solución de NBT de todos los pocillos y se les añadió 100 µL metanol 100% durante 20 minutos para fijar los macrófagos. Una vez fijados, los macrófagos fueron lavados 2 veces con una solución de metanol al 70%, se dejaron secar al aire y se añadieron 120 µL de KOH (2M) y 140 µL de DMSO a cada uno de los pocillos para resuspender el formazán formado. Finalmente, se realizó la lectura en un espectrofotómetro a 620nm. 4.9 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS El número de macrófagos en cada una de las fases del estudio (0hpi, 4hpi y 24hpi) fue contabilizado igualmente mediante la cámara de Neubauer. Para ello, las células infectadas de 6 pocillos por grupo fueron desprendidas mediante el tratamiento con tripsina y rápidamente neutralizadas en un tubo con medio con 2% SFB en una proporción 1:1. Posteriormente fueron teñidas con Azul de Tripán y contadas a las 0hpi, 4hpi y 24hpi. 4.10 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES Para estudiar las diferencias observadas en cuanto al número de macrófagos en los dos grupos a los distintos tiempos postinfección empleados y la posible influencia de sustancias solubles en la capacidad proliferativa de los macrófagos, se contó el número de macrófagos en 4 pocillos por grupo a las 0h y 4hpe tras añadir el sobrenadante obtenido de pocillos de cada grupo inoculados e incubados 4h. Para ello, 4 pocillos por grupo fueron inoculados como se ha descrito en el apartado de fagocitosis e incubados 4h. Tras ese tiempo, el sobrenadante de cada pocillo fue recogido y añadido a estos pocillos sin inocular, a los que se había retirado el medio. De esta manera, el sobrenadante de cada grupo (S´y C´) se añadió a pocillos de ambos grupos. Así el sobrenadante de los pocillos S se añadió tanto a macrófagos del grupo S como del C, y viceversa, y se incubaron 4h. Tras la exposición, se procedió a contar el número de macrófagos en cada uno de los pocillos empleados según el método ya descrito. 106 4.11 ANÁLISIS DE DATOS El análisis de datos de los resultados se realizó mediante pruebas estadísticas para asociación de variables usando el programa informático “IBM SPSS Statistis 25”, aplicando la prueba para los estudios transversales de U Mann-Whithney o T de Students y de Wilcoxon o T de Students para los estudios longitudinales. Las diferencias se consideraron significativas con valores de p menores de 0,05. 107 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 108 5.1 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS MARCADORES DE ESTRÉS 109 5.1.1 RESULTADOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS DE ESTRÉS Los indicadores utilizados para la evaluación del estrés en estos animales, durante todo el trabajo, fueron los niveles de cortisol sérico y los de glucosa y lactato sanguíneo. Parámetro CORTISOL (ng mL¯¹) GLUCOSA (mg dL¯¹) LACTATO (nmol dL¯¹) Grupo S C S C S C Medias Totales 50.5 5.23 80.64 64.9 2.08 1.99 Medias Tª <15ºC 49.2 5.57 85.8 69 2.38 1.99 Medias Tª>15ºC 52.9 4.48 70.9 58 1.61 1.98 Valor Máximo 172 14.6 141.8 109.8 3.24 2.98 Valor Mínimo 13.5 1.5 60 36.2 1.1 0.9 Tabla 1. Resultados medios totales obtenidos en ambos grupos estudiados (S y C) sobre cortisol sérico (ng/mL¯¹), glucosa sanguínea (mg/dL¯¹) y lactato sanguíneo (nmol/dL¯¹), también por temperaturas medias del agua superiores e inferiores a 15ºC en la semana del muestreo. Valores máximos y mínimos mostrados de cada parámetro por grupo. Los valores medios de cortisol sérico encontrados en los dos grupos pueden observarse en la Tabla 1. En dicha tabla se incluyen también los valores máximos y mínimos encontrados para cada grupo. No se observaron diferencias en los valores de cada grupo que pudieran relacionarse con la temperatura (Tabla 1), aunque sí se observaron diferencias significativas (p<0.05) entre ambos grupos, tanto en general como atendiendo a la temperatura superior e inferior a 15ºC. En todos los casos, los valores de las truchas del grupo C se mantuvieron dentro del rango considerado como fisiológico para estos peces (Pottinger & Moran, 1993), mientras que los valores del grupo S, concentradas, fueron siempre significativamente mayores. Esto demuestra que las truchas del grupo S estaban sometidas a estrés agudo, al contrario que las truchas del grupo C. 110 En la Tabla 1 también se muestran los valores medios, máximo y mínimo de glucosa sérica. Al igual que lo encontrado en el cortisol, las diferencias entre los valores de glucosa obtenidos entre ambos grupos fueron significativas, al igual que cuando los comparamos a diferentes rangos de temperaturas (p<0.05). Sin embargo, no observamos diferencias significativas entre los valores de glucosa de las truchas de cada grupo según la temperatura del agua, aunque los valores obtenidos a temperaturas inferiores a los 15°C fueron mayores que los obtenidos a temperaturas superiores (p>0.05). La Tabla 1 también muestra los resultados medios de lactato sérico de ambos grupos. En este caso, las diferencias no fueron significativas (p>0.05) ni dentro de cada grupo, ni entre los dos grupos. Sin embargo, si observamos los resultados por rangos de temperatura considerando temperaturas medias del agua por debajo y por encima de 15ºC, vemos como los resultados son dispares entre ambos grupos. A temperaturas medias por debajo de 15ºC, las medias de lactato obtenidas en el grupo S son mayores (2.38 mmol dL¯¹), aunque no significativamente que las mostradas por el grupo C (1.99 mmol dL¯¹) (p>0.05). Cuando las temperaturas medias del agua aumentan y superan los 15ºC, la comparación de resultados de lactato entre ambos grupos se invierte, obteniendo medias de 1.98 mmol/dL¯¹ en el grupo control, frente a medias de 1.61 mmol dL¯¹ en el grupo S, diferencias igualmente no significativas (p>0.05). 111 5.1.2 DISCUSIÓN PARÁMETROS BIOQUÍMICOS DE ESTRÉS El estrés es la respuesta fisiológica de un organismo frente a un agente estresante (Schreck, 2000) y estos factores estresantes se pueden categorizar en diferentes formas dependiendo principalmente del origen y duración (Tort, 2011). Según este autor, las respuestas fisiológicas al estrés se ven condicionadas por la naturaleza del agente estresante y por la duración e intensidad del mismo. En nuestro caso, la concentración a la que fueron sometidas las truchas del grupo S puede considerarse como un factor estresante físico de origen antropogénico, dentro del manejo habitual de una piscifactoría. De acuerdo con Tort (2011), las respuestas primarias son las que primero se activan una vez percibido el factor estresante. Son de naturaleza neuroendocrina y están basadas en la liberación de catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) en un primer momento, y de corticoesteroides (cortisol) a continuación. Por tanto, para determinar esta respuesta se podría recurrir a determinar la concentración de estos compuestos en la sangre de los peces. Sin embargo, la medición de las catecolaminas es más costosa y menos fiable, además de por las técnicas empleadas, por la velocidad a la que desaparecen una vez se producen. Por el contrario, el cortisol tarda unos segundos más en aumentar, pero persiste lo suficiente para poder ser determinado en un tiempo prudencial. Este se libera de las glándulas adrenales del riñón una vez activado el eje hipotálamo hipófisis interrenal (HHI), donde el hipotálamo libera la hormona CRH que incide sobre la hipófisis haciendo que esta genere ACTH en pocos segundos, la cual viaja vía sanguínea hasta las células interrenales donde se forma y libera el cortisol (ver capítulo 2.4.2.2). El cortisol ha sido denominado como la “hormona del estrés”, ya que aumenta en la fase primaria de la cascada de reacciones fisiológicas frente a un agente estresante y es de fácil medición a nivel sanguíneo. Además, se ha demostrado que es el mejor candidato a mostrar cambios fenotípicos en las truchas debidas al estrés (Fevolden et al., 2002). Por otra parte, debemos tener en cuenta la conversión temprana de cortisol a cortisona (Pottinger & Moran, 1993). De acuerdo con estos autores, esa transformación comienza tras 15 minutos, por lo que los valores obtenidos tras 2h de confinamiento podrían estar influidos por dicha conversión. Esta conversión podría ser, al menos en parte, la responsable de que los niveles de cortisol vuelvan a niveles fisiológicos para no dañar al animal, incluso aunque el factor estresante se mantenga en el tiempo (Wendelaar-Bonga, 1997). Gesto et al, (2015), observaron en truchas sometidas a un estrés agudo (persecución) unos valores altos de cortisol, glucosa y lactato a los 15 y 45 minutos, con una vuelta a valores basales en las mediciones a los 240 minutos, lo que indicaban la necesidad de comprobar estos valores en un punto intermedio entre los 45 y los 240 minutos. Nuestro trabajo podría arrojar luz sobre estos valores en un punto intermedio (120min), aunque en nuestro estudio, el factor estresante de concentración intensa (crowding) fue aplicado durante mucho más tiempo que el expuesto en el trabajo citado (Gesto et al., 2015), donde estudiaron la variación de la respuesta al estrés agudo dependiendo de la duración del mismo. Estos autores encontraron valores de cortisol en torno a 120 ng mL-1 en las truchas sometidas a estrés y observaron que estos valores regresaban a valores basales tras 240 minutos. 112 Como se puede observar en la tabla de resultados (Tabla 1), los valores medios de cortisol fueron siempre significativamente superiores en el grupo de truchas sometidas a concentración (crowding) que en el grupo control. El valor medio de cortisol sérico en el grupo S fue prácticamente 10 veces el valor medio del grupo C, 50.5 ng mL-1 y 5.23 ng mL-1 respectivamente, valores que se encuentran dentro de lo esperable tanto para truchas con valores basales de cortisol, como para truchas sometidas a algún factor estresante (Pottinger & Moran, 1993). Dhabhar (2002), afirmó que la exposición previa a un tipo de factor estresante genera en el individuo un “aprendizaje”, no causando en el mismo una cascada estresante tan marcada como cuando no están acostumbrados. Anteriormente, Barton (1997), comprobó la variación de niveles de cortisol plasmático en truchas confinadas cuando previamente habían sido criadas en medios con alta densidad comparándolas con truchas criadas en baja densidad. En el primer caso, truchas aclimatadas a altas densidades, los valores de cortisol fueron de 70 ng/mL-1 frente a valores de 139 ng/mL-1 en las criadas en baja densidad (sin contacto con este estrés previamente). El crowding en cualquier piscifactoría, es una práctica de manejo frecuente y repetitiva durante todas las etapas por las que pasa una trucha a lo largo de su ciclo productivo, lo cual podría explicar que nuestros niveles de cortisol no hayan subido tanto como los de trabajos citados hasta ahora, ya que estas truchas estarían aclimatadas a este factor recurrente, y, por tanto, estar así en la línea de estos autores. Sin embargo, otros autores como Olsen et al, (2005), afirman que, tras la exposición al factor estresante en truchas, el cortisol puede alcanzar el pico máximo en una hora y que se puede mantener relativamente alto hasta 48h después. Otros autores ya aseguraban que estos niveles pueden descender hasta niveles basales si el estrés se hace crónico (Pickering & Christie, 1981), la percepción del estresante desencadenante se dilata en el tiempo o los animales están aclimatados a ese estresor (Barreto et al, 2006). La intensidad de respuestas del cortisol no solo depende del factor estresante, también pueden ser moduladas por factores no directos y que estos pueden ser intrínsecos y/o extrínsecos (Martinez-Porchas et al., 2009). En este caso, fluctuaciones repentinas de temperatura del agua, entre otros, pueden variar estos niveles pasajeramente, pero si los niveles de temperatura no difieren bruscamente, los niveles de cortisol serán bajos (basales) (Cho et al, 2015), como demuestran en nuestro trabajo, las medias de cortisol del grupo control cuando han podido verse afectadas por fluctuaciones de temperatura. El aumento de temperatura es un factor ambiental que empieza a cobrar vital importancia hoy debido al cambio climático cada vez más patente. Así el aumento de la temperatura está suponiendo muchos cambios en los seres vivos y sobre todo en aquellos que se ven influenciados por la temperatura del agua (Harrod et al., 2018; Hastings et al., 2020). Esto supone un problema para los peces, ya que son animales poiquilotermos, incapaces de regular su temperatura interna de forma completamente independiente a la ambiental. Debido a esto, los peces tienen unos límites adaptativos y se mueven en unos rangos de temperatura óptimos, teniendo, eso sí, un amplio margen de adaptación que depende de la especie. Ya se delimitaron rangos de temperatura en las truchas desde los 0⁰C a los 26⁰C, pero las truchas en estado salvaje tienen un rango óptimo de temperatura más estrecho, oscilando entre 12⁰C y 16⁰C (Hokanson, 1977; Spigarelli & Thommes, 1979). 113 Nuestros muestreos se llevaron a cabo en diferentes épocas del año, con un amplio margen de diferencia de temperatura del agua (desde 3.3⁰C a 23.1⁰C como temperaturas medias de la semana del muestreo). Sin embargo, los resultados no muestran una variación de los niveles medios de cortisol dentro de cada grupo relacionada con la media de la temperatura del agua. En este sentido, en el grupo S apenas varían las medias de cortisol sérico medido entre muestreos a temperaturas inferiores a 15ºC (49.2 ng/mL-1) y los obtenidos a temperaturas superiores a 15ºC (52.9 ng/mL-1). Por otra parte, los valores medios que obtenemos en el grupo control en los muestreos realizados a temperaturas superiores a 15ºC son algo menores (4.48 ng/mL-1) que los encontrados a temperaturas inferiores a 15ºC (5.57 ng/mL-1), pero hay que indicar que estos se encuentran dentro de lo estipulado como basales o fisiológicos para la especie (Bermejo-Poza et al, 2015). En ningún caso, las diferencias encontradas dentro de cada grupo fueron significativas (p>0.05). Así, podemos concluir que las diferencias en niveles medios de cortisol mostradas en la Tabla 1 entre ambos grupos son principalmente son debidas al factor estresante que ejerce el crowding, ya que son significativamente superiores en el grupo de truchas sometidas a este (S) con respecto al grupo control, independientemente de la temperatura media del agua en los dias previos al muestreo, lo cual denota un efecto de estrés agudo en los animales debido a este factor estresante de origen antropogénico. Además, hay autores que indican que el estrés crónico posiblemente provocado por altas temperaturas descienda los niveles de cortisol a niveles basales con el tiempo de adaptación, pero que los individuos son capaces de responder a otro factor de estrés adicional agudo, como en este caso, sería el factor de concentración intensa (Barcellos et al, 1999). En este contexto, la determinación de parámetros típicos de respuestas secundarias al estrés podría ser determinante para complementar a los de cortisol y así determinar los niveles de estrés y sus consecuencias. Por ello, la medición de glucosa y lactato en sangre podría jugar un papel importante también en nuestro trabajo. La glucosa en sangre aumenta por los procesos fisiológicos que desencadena el estrés, ya que el propio cortisol liberado es una hormona hiperglucémica, al igual que las catecolaminas. Estas últimas son las primeras en aparecer tras la percepción del factor estresante y generan un aumento de glucosa en sangre activando glucolisis en el hígado. Después, el cortisol hace que este nivel de glucosa se mantenga en el tiempo a través de una glucogenólisis y gluconeogénesis directa, además de activar metabolitos intermedios capaces de convertirse en glucosa como son los triglicéridos, el lactato y los aminoácidos procedentes de diferentes vías (Mommsen et al., 1999). Aun así, la medición de glucosa en sangre por si sola se hace menos fiable que la del cortisol para determinar estrés en estos animales pues es un parámetro que varía en otro tipo de condiciones y no solo las estresantes. Los niveles de glucosa van a depender directamente de factores como el estado nutricional, la etapa de la vida, la dieta, el estado fisiológico e incluso de la época del año en la que se encuentren los animales (ver capítulo 2.4.2.2). Además, al igual que ocurre con el cortisol, algunos otros factores pueden alterar indirectamente los niveles de glucosa en sangre (Vijayan & Moon, 1994). Nuestro estudio vuelve a mostrar resultados significativamente diferentes entre ambos grupos de truchas (Tabla 1), siendo los niveles medios de glucosa en sangre superiores en el grupo (S), media de 80.64 mg dL-1, que en el grupo C, con valores inferiores en torno a 64.9 mg dL-1. Estos niveles medios obtenidos se ajustan a los publicados en diferentes estudios, ya que los valores basales de glucosa en truchas están en torno a los 75 mg dL-1 (Miller et al., 2007), 114 encontrándonos aquí valores por debajo en el grupo control y ligeramente superiores en el grupo sometido a crowding. También hay que considerar que los valores de glucosa durante el estrés pueden ir disminuyendo en el tiempo, pues los animales consumirán este metabolito para mantener su homeostasis. Asi, estos valores pueden verse afectados directamente si el estímulo es persistente al igual que pueden variar por factores intrínsecos del propio animal ( Wood et al., 1990; West et al., 1993). El valor de la temperatura media del agua en los días de la semana de muestreo sobre este parámetro no parece tener influencia, pues igualmente observamos diferencias significativas a temperaturas tanto superiores como inferiores a los 15°C entre ambos grupos. Así observamos valores medios en truchas del grupo S de 85.8 mg dL-1 frente a 69 mg dL-1 del grupo C a temperaturas inferiores a 15ºC y de 70.9 mg dL⁻¹ y 58 mg dL⁻¹ respectivamente a temperaturas superiores a esos 15°C. Nuestros resultados muestran un aumento de los niveles de glucosa en ambos grupos a bajas temperaturas con respecto a temperaturas por encima de 15ºC, pero en este caso, sin mostrar diferencias significativas. En el caso del grupo S a temperaturas más frías, los valores medios encontrados fueron de en torno a 85.8 mg dL-1 frente a 70.9 mg dL-1 a temperaturas más altas. En el grupo control estos valores variaron entre 69 mg dL-1 a temperaturas superiores a 15ºC y de 58 mg/ dL-1 a temperaturas inferiores a 15ºC. Se ha descrito en otros peces de hábitats fríos (bacalao), como el aumento gradual de la temperatura del agua no provocaba cambios significativos en los valores de la glucosa (a diferencia del cortisol) (Pérez-Casanova et al., 2008), por lo que nuestros resultados parecen apuntalar la teoría de que no es un buen parámetro para medir el estrés crónico en estos animales. Por otra parte, los valores de cortisol y glucosa podrían haberse visto influidos por otros factores, como el anestésico utilizado (benzocaína 2%), pero se ha demostrado que el uso de este anestésico no produce variaciones significativas en los niveles de estas sustancias en truchas (Huanca-Ramos & Carpio-Vázquez, 2017). Otro de los factores que puede afectar a la concentración de cortisol y glucosa sería la calidad de agua. Durante la fase de hacinamiento intensivo, la calidad del agua en esa zona del estanque podría disminuir con el consiguiente acúmulo sustancias tóxicas, que también podrían ser causa directa de estrés en los peces (Pottinger & Carrick, 1999). Así, se ha visto que altos niveles de amoniaco excretado por los propios animales, provocaría en este tipo de teleósteos un aumento de estrés, que se traduciría en altos niveles de cortisol y glucosa (Knoph & Thorud, 1996; Sanderson et al., 2010). Además de que ese estrés se vería acentuado con el incremento de la temperatura del agua (Eddy, 2005). Los estanques donde se concentraron los peces para este experimento, eran aquellos en los que habitaban durante su producción y poseen un sistema de circulación constante de agua con arrastre de partículas en suspensión fuera del mismo, evitando así el acumulo de sustancias de desecho que hubieran podido modificar estos parámetros en los individuos. Por último, la medición del lactato en sangre, fue incluido como parámetro a determinar en nuestro estudio dentro de las respuestas secundarias al estrés, al igual que la glucosa. Es un metabolito que se libera al torrente sanguíneo bajo situaciones de estrés agudo. El ácido láctico se produce como metabolito final del glucólisis en el músculo blanco de la trucha arcoíris después de un ejercicio exhaustivo y se acumula de forma ionizada en el mismo (ver capítulo 2.4.3.2). El lactato producido metabólicamente provoca una acidosis intramuscular que debe 115 eliminarse, ya sea por transporte fuera del músculo o por conversión a glucógeno, reponiendo así la reserva de energía muscular (Sharpe & Milligan, 2003). Las truchas, como todos los salmónidos, son denominados liberadores de lactato, pues la tasa que se encuentra en sangre tras el ejercicio es entre el 15-20% del retenido en el musculo (Milligan & Wood, 1986) y éste, aumenta hasta valores próximos a 3mM tras un ejercicio intenso de persecución, aunque sea durante pocos minutos, descendiendo a valores basales a las 4h (Gesto et al, 2015). Nuestros resultados muestran medias de lactato sanguíneo similares entre ambos grupos, con mínimas diferencias (no significativas) a favor de las truchas concentradas (S) en el cómputo de todo el trabajo. Así, como podemos observar en la Tabla 1, encontramos valores medios de 2.08 nmol dL-1 para las truchas sometidas a concentración intensa (S) y de 1.99 nmol dL-1 en el grupo control (C). Hay estudios que demuestran que, bajo condiciones estresantes, se produce el cambio de la vía del metabolismo de los carbohidratos al metabolismo anaeróbico y la reducción de la producción de ATP en varios tipos de teleósteos (Pörtner et al., 2007; Sokolova et al., 2012, Chang et al, 2019) aumentando por tanto los niveles de lactato en estos individuos. Según algunos autores como Pankhurst y Dedual (1994), los valores de lactato en sangre de truchas atrapadas con caña de pescar aumentan desde los 15 minutos de la captura, siendo máximos en una hora y recuperándose a las 24h. En nuestro caso, el grupo sometido al hacinamiento intensivo debería mostrar niveles de lactato mayores que el grupo control por el efecto de este estrés agudo a las 2h, pero según el trabajo de estos autores, no sabemos cómo es el descenso desde primera hora hasta la siguiente medición, ya a las 24h, con lo que no nos da una referencia clara de lactato a las 2h del experimento. Por otra parte, el procedimiento de atrapar las truchas con el salabardo fue el mismo en ambos grupos para el muestreo, así que esto podría equiparar estos niveles también en el grupo control, por usarse una técnica de captura con una posible fuente de metabolización de lactato por glucolisis anaeróbica durante este proceso. Comparando los resultados medios obtenidos por rangos de temperatura media a 7 días del muestreo, tampoco se obtuvieron diferencias significativamente importantes entre ambos grupos. Sin embargo, a temperaturas inferiores a 15ºC los valores son superiores para el grupo S mientras que a temperaturas superiores a 15ºC son mayores en el grupo C. Finalmente, observamos como varia este parámetro dentro de cada grupo según la temperatura media por encima o debajo de 15ºC. Aquí, podemos observar como en el grupo S, la reducción de niveles de lactato en sangre sí que se hace notable, pues de 2.38 nmol dL-1 obtenido a bajas temperaturas desciende a valores de 1.61 nmol dL-1 en altas temperaturas, haciendo patente que a temperaturas superiores a 15ºC, el lactato es significativamente inferior en este grupo de truchas sometidas a factor estresante por concentración. Sin embargo, en el grupo control, las diferencias de temperatura no afectan a la variación mínima de este parámetro, pues no se observan diferencias. Chang (2020), por su parte, encontró menores niveles de lactato en sangre tras someter a sus peces a un estrés por bajas temperaturas (a diferencia nuestra), pero estas diferencias pudieran deberse a que este autor utilizó una especie de clima tropical (Chanos chanos), aunque dejó constancia de que la salinidad del agua también influía en sus resultados, como los nuestros en este caso por la concentración intensiva a la que están sometidos. 116 117 5.2 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA 118 5.2.1 FUNCIONALIDAD SEGÚN EXPLOSIÓN RESPIRATORIA 5.2.1.1 RESULTADOS EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR TEMPERATURAS Para el estudio de la influencia del estrés por las fluctuaciones de temperatura sobre la respuesta de los macrófagos, se consideraron las temperaturas medias de dos periodos de 7 días, el que acababa el día del muestreo (semana muestreo), y el inmediatamente anterior a éste (semana premuestreo) (Tabla 2). Además, con el fin de poder evaluar mejor la influencia de las fluctuaciones de la temperatura sobre dicha respuesta, se consideró también la diferencia entre las temperaturas acumuladas de ambos periodos (Tabla 2). Estas observaciones se realizaron entre febrero de 2017 y junio del mismo año. Como era esperable, por la situación de la piscifactoría en una zona con inviernos fríos y veranos calurosos, las diferencias en los valores de la temperatura son muy amplia, con una mínima de 9,6°C en febrero y una máxima de 23,1°C en junio. MUESTREOS Tªmedia 7d (⁰C) Tª acum 7d (⁰C) Tª media 7- 13d (⁰C) Tª acum 7- 13 (⁰C) dif Tª acum (⁰C) febrero 9,6 67,4 8,67 60,7 6,7 marzo 11,6 81,1 10,04 70,3 10,8 abril 16,3 114,2 15,79 110,5 3,7 mayo 18,8 131,3 17,63 123,4 7,9 junio 23,1 161,3 21,61 151,3 10 Tabla 2: Temperaturas medias de semana del muestreo (Tª media 7d) y de la semana premuestreo (Tª media 7-13d). Tª acumulada de la semana del muestreo (Tª acum 7d) y de la semana premuestreo (Tª acum 7-13d). Diferencia de Tª acumulada entre ambas semanas (dif Tª acum). Como hemos comentado, en la Tabla 2, también se incluye la diferencia de temperatura acumulada durante la semana del muestreo con respecto a los 7 días previos a esa semana, la premuestreo. Observamos cómo ésta ha sido muy variable, desde únicamente 3.7ºC de diferencia entre una semana y otra en abril, hasta superar los 10ºC de diferencia en marzo y junio. 119 MUESTREOS C0 (basal) nm C1 (inducida) nm febrero 172 205 marzo 186 171 abril 118 112,83 mayo 102 96,67 junio 122,67 111,67 Tabla 3: Explosión respiratoria (nm) obtenidas a 620nm en cada muestreo sin utilizar bacterias (basal) y utilizando estas (inducida) sobre los macrófagos a estudio (C). Para evaluar la influencia de la temperatura en la respuesta de los macrófagos de las truchas, solo consideramos al grupo control, ya que en el caso del grupo S, la respuesta podría estar condicionada por el efecto del confinamiento, lo que podría suponer un sesgo al interpretar estos resultados. Para estas primeras observaciones usamos exclusivamente la medida de la explosión respiratoria, ya que ésta se considera una buena indicadora de la respuesta macrofágica. Los resultados medios de esa ER se muestran en la Tabla 3. Figura 22. Valores medios de explosión respiratoria basal e inducia (nm) en cada muestreo (meses) y líneas de evolución de temperatura (⁰C) media en la semana de muestreo y acumulada. Como podemos observar en la Tabla 3, los resultados muestran que la explosión respiratoria basal (C0), se mantuvo en valores similares en los meses de febrero y marzo (p>0,05) aunque en el mes de marzo fue ligeramente más alta que en el mes de febrero (186 nm y 172 nm, respectivamente). En los siguientes muestreos, abril, mayo y junio, la ER basal, aunque varió ligeramente, también se mantuvo en valores muy similares en los tres casos (p>0,05). Sin embargo, al comparar los resultados de los dos primeros muestreos (febrero y marzo) con los 0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 feb mar abr may jun Explosión Respiratoria y Temperaturas C0 basal C1 inducida Tª media 7d 120 siguientes (abril, mayo y junio) sí se observan diferencias claras y significativas (p<0,05). Estas diferencias entre los muestreos de febrero y marzo con los restantes, pueden relacionarse con las diferencias en la temperatura, hasta marzo las temperaturas estuvieron por debajo de los 15°C, mientras que a partir de abril estuvieron siempre por encima de esos 15°C (Tabla 2). Esto sugeriría la existencia de un umbral de temperatura que, una vez excedido, reduciría la capacidad de los macrófagos para responder a un agente infeccioso. En el caso de las truchas, dicho umbral parece ser los 15°C, como podemos observar gráficamente en la Figura 22. Al comparar los resultados del estallido respiratorio inducido en esos mismos macrófagos (C1), éstos solo fueron capaces de aumentar significativamente su estallido respiratorio con respecto a su resultado basal en febrero (172 nm vs 205 nm) (p<0,05), mientras que en el resto de meses los macrófagos fueron incapaces de aumentar la respuesta, es más, siempre fue menor que su correspondiente resultado basal, aunque no significativamente (p>0,05). Aunque no se encontraron diferencias significativas en los resultados de marzo a junio (p>0,05), sí hubo diferencias significativas entre esos meses y febrero (p<0,05), mostrando una menor capacidad de los macrófagos para hacer frente a la invasión bacteriana a medida que aumenta la temperatura (ver Figura 22). En este sentido, resulta llamativo el resultado de marzo. Aunque no hay diferencias significativas entre el resultado basal de febrero y marzo, las diferencias sí son significativas al comparar los resultados inducidos de ambos meses. Sin embargo, al relacionar estos resultados con los cambios en la temperatura, se puede ver una diferencia de 10,8°C entre la temperatura acumulada en la semana de muestreo de marzo y la semana anterior o premuestreo, mientras que en febrero esa diferencia fue menor a esos 10°C. De hecho, el incremento de marzo fue el mayor registrado en todo el periodo estudiado, y podría ser el responsable de que las truchas no hubieran sido capaces de responder adecuadamente. Un incremento similar (10°C) se pudo observar en junio, aunque en este caso, la temperatura media había sobrepasando el umbral de los 15°C y podría explicar por qué ese efecto fue menos evidente. 121 5.2.1.2 DISCUSIÓN EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR TEMPERATURAS Los peces son animales poiquilotermos, ya que son incapaces de mantener su temperatura corporal constante de forma independiente a la temperatura ambiental. Algunas especies del suborden Scombroidae, usan mecanismos de intercambio de calor para mantener una temperatura central elevada para mejorar la eficiencia de la natación (Boye et al, 2009), pero no es el caso de la trucha arcoíris. Autores como Hokanson (1977), Spigarelli y Thommes (1979), ya estudiaron como las truchas son capaces de adaptarse a un amplio margen de temperaturas, pero que en torno a 15ºC encontraban su temperatura óptima, considerando por tanto a estos animales, como peces que prefieren aguas frías. El aumento de temperatura del agua en los peces afecta a los procesos inmunológicos (O´Neill, 1985; Kim et al, 2017), entre ellos a la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS) como metabolitos de digestión en el fagocito, ya que la alta temperatura del agua induce estrés oxidativo en los peces al alterar el equilibrio entre la generación y la eliminación de ROS por la acción de distintas enzimas antioxidantes (catalasa, superóxido dismutasa, glutatión S transferasa o peroxidasa) (Sharma et al., 2015). Entre estos cambios en la respuesta inmune se incluye La capacidad de los macrófagos de los peces para adaptarse a los cambios de temperatura, que ha sido un tema que ha interesado a los autores durante años (Nikoskelainen et al., 2004). Al observar cómo evoluciona la explosión respiratoria basal según aumenta la temperatura del agua, se hace evidente que cuando ésta es inferior a 15ºC de media en la última semana, la ER es significativamente superior a las observadas cuando la temperatura media supera este umbral. Esto demostraría una pérdida notable de poder microbicida de esos macrófagos cuando las truchas están sometidas a temperaturas cálidas en comparación a temperaturas frías propias de esta especie. Estos resultados están acordes a los obtenidos por Le Morvan-Rocher et al, (1995), quienes estudiaron in vivo como los macrófagos de las carpas mantenidas durante 28 días a 12ºC presentaban mejor explosión respiratoria (e índice fagocítico) que las mantenidas a 20ºC. También con los obtenidos por Collazos et al, (1994), que observaron una mejor capacidad fagocítica y de producción de aniones superóxido en granulocitos sanguíneos en tencas mantenidas a 12ºC que a 22ºC. Por su parte, Ainsworth et al, (1991), demostraron también en pez gato que, al aclimatar a estos animales a bajas temperaturas, se perdía capacidad fagocítica de sus macrófagos, pero que la explosión respiratoria no se modificaba con respecto a los peces mantenidos a temperaturas superiores. Sin embargo, nuestros datos sugieren que la explosión respiratoria varía con la temperatura en las truchas, consiguiendo una mejor respuesta a temperaturas más bajas, aunque esta diferencia puede deberse a los diferentes peces utilizados (tenca y trucha arcoíris). Más recientemente, Nikoskelainen et al, (2001), consiguieron demostrar un aumento de la explosión respiratoria en truchas arcoíris mantenidas en un amplio margen de temperaturas (entre 5ºC y 25ºC), pero estos autores responsabilizaron de estos índices altos de ER obtenidos, al elevado número de células fagocíticas presentes a temperaturas más elevadas. Nosotros intentamos evitar la influencia del número de células utilizando 10⁵ macrófagos/pocillo y, por lo tanto, nuestros resultados estarían libres de este posible sesgo. El estrés térmico provoca estrés oxidativo en los peces debido a que altas temperaturas inducen la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la recuperación (Kim et 122 al., 2017). Estos autores afirman que, el aumento de la temperatura del agua induce un aumento en el consumo de oxígeno que promueve la producción de estos ROS en lubinas. En nuestro caso, pensamos que el efecto de enzimas antioxidantes protege al animal del daño oxidativo causado por este estrés térmico, reduciendo los ROS de la fagocitosis del experimento, mostrando en nuestro caso valores más bajos a medida que aumenta la temperatura a diferencia de lo que indican estos autores. Por otra parte, autores como Hardie et al, (1994), comprobaron que a muy bajas temperaturas (6ºC), los macrófagos mostraban también un peor estallido respiratorio que a temperaturas superiores (10ºC y 18ºC), hubiera o no aclimatación previa de los mismos, y debido principalmente, a la modulación de ciertas citoquinas a tan bajas temperaturas. Nosotros no llegamos a registrar en este trabajo temperaturas tan extremas para poderlo comprobar. Al comparar la explosión respiratoria inducida con respecto a la basal de cada uno de los muestreos, observamos unas diferencias significativamente importantes de C1 frente a C0 en los meses de invierno a favor de la explosión respiratoria inducida (C1), como prueba de la correcta funcionalidad macrofágica y capacidad de eliminar bacterias a esas temperaturas del agua por debajo de 15ºC. Así vemos como en febrero, con temperaturas medias del agua de 9.6ºC los resultados fueron acorde a lo esperado, con una diferencia significativa de 18.9% entre la explosión respiratoria inducida con respecto a su basal (205 nm vs 172 nm), pero en marzo, también con una media de temperatura de 11.6ºC (<15ºC) el resultado no fué el esperado, pues su ER basal es superior a su ER inducida, efecto que ocurre ya de forma sistemática a partir de este muestreo con los siguientes meses, en los que las temperaturas fueron más cálidas (>15ºC), lo que era de esperar. Profeta et al, (2006), encontraron que un aumento de 5ºC en la temperatura del agua durante 1 día afectaba significativamente a la producción de ROS en los macrófagos renales de medaka común (Oryzias latipes), pez de origen japonés, pero la producción de ROS después de una exposición de 14 días al mismo aumento de temperatura solo se reducía mínimamente. Si comprobamos la temperatura acumulada de las semanas premuestreo y muestreo (Tabla 2), podemos apreciar un ascenso brusco de temperatura del agua en los días previos al muestreo de marzo (10.8ºC de diferencia en la temperatura acumulada entre la semana de muestreo y la anterior), lo cual indicaría una fluctuación estresante sin tiempo para adaptarse y que se reflejaría en esas diferencias en las explosiones respiratorias inducida y basal en ese mes. Este descenso en la C1 con respecto a la C0 en este mes de aguas frías, indicaría una peor capacidad para eliminar las bacterias por esos macrófagos a pesar de las temperaturas frías, lo que coincidiría con los datos aportados en el estudio de Profeta et al, (2006). También demostraría lo indicado por autores como Makrinos y Bowden (2016), quienes aseguran que los cambios agudos de temperatura a corto plazo pueden compensarse con cambios a nivel celular como es nuestro caso, mientras que los cambios progresivos de temperatura pueden no inducir esos cambios, aunque sí tendrían un impacto en la fisiología de los peces. El resto de meses (abril, mayo y junio), con temperaturas medias por encima de 15ºC y sin registrarse cambios bruscos de temperaturas días antes del muestreo (solo junio tiene una subida brusca, pero está condicionado por las altas temperaturas del agua ya de por sí), la funcionalidad de los macrófagos para eliminar bacterias estaría comprometida por esas altas temperaturas. Por ello, en abril y mayo los resultados de la ER basal e inducida son similares, mientras que, en junio, con temperaturas por encima de 20ºC, la explosión respiratoria basal supera a la inducia debido a ese factor térmico, al igual que ocurrió en marzo por el aumento brusco de Tª. En esta línea, Ainsworth et al, (1991), aseguraron en su trabajo 123 sobre pez gato expuesto a temperaturas de aclimatación diferentes a las del ensayo, que el único cambio funcional en temperaturas de aclimatación fue en el estallido respiratorio, aunque ellos obtenían mejores funciones fagocíticas a temperaturas de 18ºC que a 10ºC, puesto que son animales con rangos óptimos de temperatura superiores a los de la trucha arcoíris. Debemos recordar que los valores de cortisol de todos los animales en el momento del muestreo, estuvieron siempre dentro de los limites fisiológicos (véase resultados de cortisol en grupo control del capítulo 5.1.1). Pérez-Casanova et al, (2008) observaron un aumento en los niveles de cortisol plasmático cuando la temperatura del agua alcanzaba los 16ºC en diferentes especies, para luego descender a los niveles basales. El cortisol es la hormona propia del estrés y sabemos de su influencia inhibidora sobre el sistema inmune de estos animales (Wendelaar Bonga, 1997; Vijayan et al 2010; Tort, 2011), pero en este caso, los resultados no parecen influidos por esta hormona. Estos resultados parecen apuntar a un deterioro de la capacidad de los macrófagos para hacer frente a las infecciones bacterianas directamente relacionadas con el aumento de la temperatura, y que los aumentos repentinos y significativos de la misma conducen a una disminución más grave de la capacidad de los macrófagos de la trucha arcoíris para hacer frente a cualquier amenaza de este tipo, equiparables al efecto encontrado con altas temperaturas del agua. 124 5.2.1.3 RESULTADOS EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR CROWDING Los resultados de explosión respiratoria (ER) para ambos grupos se muestran en la Tabla 4. Igualmente, en la Figura 23, se compara la ER de cada grupo. S0 (nm) S1 (nm) C0 (nm) C1 (nm) 140,5 165,5 613,75 745 720,5 418,5 1122 799,25 172,5 335 346 433,75 144,75 162,5 126 137 402,5 411 597,5 1203,5 212 235,25 172 205 146 144,75 175,75 149,75 403 441 419 503 336 327,25 365 298,5 396,25 513,25 524,33 504,67 550 919 854 996 229,67 182 186 171 338 289 120 128 115,33 121,67 118 112,83 627,5 802 392,25 461 123 107,25 168,5 159,75 109,33 105,67 102 96,67 197,67 147,17 123 115 152,67 131 122,67 111,67 290,38 313,62 349,88 385,86 Tabla 4. Resultados de explosión respiratoria (nm) en cada uno de los muestreos en macrófagos procedentes de truchas concentradas (S) y control (C), de forma basal (0) e inducida por bacterias (1). Medias en negrita en la última fila. 125 Figura 23. Porcentaje explosión respiratoria obtenidas de media por comparación entre el grupo S y grupo C dependiendo si son basales (0) o inducidas (1). S0-S1: porcentaje de ER de los macrófagos S inducidos por fagocitosis con respecto de los basales.C0-C1: porcentaje de ER de los macrófagos C inducidos por fagocitosis con respecto de los basales. S0-C0: porcentaje de ER basal del grupo C frente al grupo S. S1-C1: porcentaje de ER inducida del grupo C frente al grupo S. Como puede observarse en la Tabla 4, la explosión respiratoria (ER) en el grupo C fue siempre significativamente mayor que la observada en el grupo S (p<0.05), tanto en la respuesta basal como en la inducida por la adición de las bacterias. Estos resultados sugieren una influencia negativa del estrés en la capacidad de estas células para enfrentarse a patógenos. Sin embargo, ambos grupos son capaces de aumentar esa respuesta al añadir las bacterias con respecto a la basal. Así, la media del grupo S pasa de 290.38 nm a 313.62 nm, mientras que en el grupo C se pasa de 349.88 nm a 385 nm. Como puede verse en la Figura 23, ese incremento es similar (p>0.05) en ambos grupos (8% en el grupo S y 10.3% en el C). Sin embargo, las diferencias sí resultan significativas al comparar los resultados basales e inducidos de ambos grupos, S0-C0 y S1-C1 (Figura 23). Esto indicaría que los macrófagos del grupo C serían capaces de responder con una explosión respiratoria significativamente mayor (p<0.05), tanto en la respuesta basal como en la inducida, que los del grupo S (S0-C0 20%, S1-C1 23%) (Figura 23). Estas diferencias fueron prácticamente iguales en ambos casos, lo que podría sugerir que los macrófagos de truchas no sometidas a estrés tendrían una mayor capacidad para responder a los agentes infecciosos que los de truchas estresadas. Dicho de otra manera, los macrófagos de truchas estresadas pierden parte de su capacidad para producir la explosión respiratoria como respuesta a una infección, lo que podría traducirse en una mayor susceptibilidad a los agentes infecciosos. 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140% S0-S1 C0-C1 S0-C0 S1-C1 EXPLOSION RESPIRATORIA crowding 126 La Tabla 5 y la Figura 24, muestran los resultados obtenidos teniendo en cuenta la temperatura media del agua en el periodo de la semana de muestreo: Tª media agua S0 (nm) S1 (nm) C0 (nm) C1 (nm) M<15ºC 321,14 354,58 458,44 512,20 % 100% 110% 100% 111.7% M>15ºC 237,64 243,39 163,77 169,27 % 100% 102.4% 100% 103.4% Tabla 5. Niveles medios de explosión respiratoria mostrada (nm) y los porcentajes correspondientes en cada uno de los grupos (S y C) tanto basal (0) como inducida (1) según temperatura media del agua superior e inferior a 15ºC en la semana del muestreo. Figura 24. Comparación de explosión respiratoria (nm) basal e inducida de cada grupo (S y C) según temperatura media del agua superior e inferior a 15ºC en la semana del muestreo. De acuerdo con los resultados mostrados en la Tabla 5, podemos ver como se produce un aumento de la ER inducida con respecto a la basal en ambos grupos a temperaturas por debajo de 15ºC, aunque estos incrementos no son significativamente distintos (p>0.05); Cuando la temperatura supera esos 15°C, las diferencias entre la respuesta basal y la inducida se reducen casi completamente. Sin embargo, si se encuentran diferencias significativas al comparar los resultados de ER basal e inducida de ambos grupos tanto a temperaturas inferiores a 15ºC, con 142.7% (S0-C0) y de 144% (S1-C1) (p<0.05), asi como a temperaturas superiores a 15ºC, siendo de 68.9% (S0-C0) y de 69.5% (S1-C1) (p<0.05) (resultados no mostrados en la Tabla 5). 0 100 200 300 400 500 600 S0 (nm) S1 (nm) C0 (nm) C1 (nm) ER por grupo segun Tª media agua M<15ºC M>15ºC 127 Del mismo modo, puede observarse en la Figura 24, como la influencia de la temperatura media del agua durante la semana de muestreo (superior o inferior a 15ºC) sobre la explosión respiratoria es evidente. A temperaturas por debajo de los 15°C, los resultados, tanto basales como inducidos, son significativamente mayores (p<0.05) que los obtenidos a temperaturas por encima de esos 15°C en los dos grupos, aunque las diferencias son mucho mayores en el grupo C que en el grupo S (Figura 24), lo que podría indicar que el nivel de estrés podría jugar algún papel beneficioso en este caso. 128 5.2.1.4 DISCUSION EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR CROWDING La actividad fagocítica de los macrófagos puede estimarse midiendo la producción de radicales libres de oxígeno (ROS, siglas en inglés de Reactive Oxygen Species) durante la explosión respiratoria. Durante esta reacción, los macrófagos incrementan el consumo de oxígeno y forman los intermediarios reactivos del oxígeno (ROS) (Secombes, et al. 1996). El estallido respiratorio con la formación de ROS es común de todas las células fagocíticas. La explosión respiratoria (ER) de los macrófagos es un sello distintivo del arsenal antimicrobiano de estas células y la eficacia de esta respuesta, a menudo, se refleja en la capacidad de los macrófagos para destruir los microorganismos fagocitados. Todos los componentes de NADPH oxidasa, enzima encargada de producir los ROS (Briggs et al, 1975), se han identificado en teleósteos y la explosión respiratoria de macrófagos de peces se han documentado bien en contextos de estimulación de PAMP (Sepulcre et al, 2007), respuestas antimicrobianas (Sharp et al, 1993) y estimulación de citoquinas recombinantes como con TNF-α, IFN-γ y CSF-1 (Zou et al, 2005; Grayfer et al, 2008; Grayfer y Belosevic, 2009). La medición de ROS generados durante la digestión de bacterias por los macrófagos basada en la emisión de absorbancia por estos compuestos usando el test de reducción del NTB (por sus siglas en ingles de Nitro-Blue Tetrazolium), es una técnica utilizada desde hace mucho tiempo y que estima la magnitud de la explosión respiratoria producida por estas células en la función de digestión fagocítica. Nuestros resultados (Tabla 4), muestran como los macrófagos de truchas sometidas a estrés por una concentración intensa, presentan una menor producción de ROS que los provenientes de truchas no estresadas. Estos resultados indicarían una peor capacidad de los macrófagos de truchas estresadas para responder a un agente infeccioso, lo que podría traducirse en un aumento de las posibilidades de supervivencia del agente cuando el hospedador está sometido a un factor estresante, al tener que enfrentarse a una menor concentración de esos ROS, cuya finalidad es destruirlos. Lo que permitiría al agente infeccioso eludir, al menos en parte, la respuesta inmune del hospedador y obligaría al hospedador a enfrentarse a una mayor concentración del patógeno. En mamíferos se ha descrito un aumento de la explosión respiratoria en individuos estresados (Engelsma et al., 2002), pero los estudios sobre el efecto del incremento del cortisol en la explosión respiratoria y la fagocitosis en los peces muestra resultados muy variables. Algunos investigadores como Stave y Roberson (1985), describieron una menor respuesta quimio-luminiscente, como método de medición de respuesta oxidativa emitida por los fagocitos, en los macrófagos de lubinas al enfrentarse a bacterias cuando era tratadas con acetato de hidrocortisona, aunque esta respuesta era dependiente de la dosis inyectada del corticoide. Flory y Bayne (1991), estudiaron los mecanismos por los cuales los neurotransmisores autónomos, o sus análogos, podrían afectar a esta respuesta, concluyendo que la adrenalina (A) en truchas aumentaba la explosión respiratoria de sus macrófagos. No obstante, al ser las catecolaminas de rápida liberación y eliminación, dejarían pronto el paso a los efectos propios del cortisol (Vijayan et al, 2010), que sería la hormona predominante en nuestro trabajo a las 2h de concentración. Como comentamos en el capítulo 2.5.4, valores elevados de cortisol inducidos como respuesta a los estímulos estresantes, pueden provocar una inmunosupresión a muchos 129 niveles, incluyendo la inmunidad innata y afectando, más específicamente, a los procesos llevados a cabo por los macrófagos (Pagniello et al, 2002; MacKenzie et al, 2005; Fast et al, 2007; Maciuszek et al, 2019). Por su parte, Esteban et al, (2004), demostraron que niveles elevados de cortisol producían una disminución significativa de la explosión respiratoria en leucocitos del pronefros de doradas, pero que al aumentar el tiempo de exposición más de 30 minutos, esta reducción era menor. De igual forma, estudios en peces planos ya habían demostrado que el estrés causado por altas dosis de contaminantes, producían una disminución de la fagocitosis y de la explosión respiratoria, mientras que a dosis bajas no se veía este efecto (Pulsford et al, 1995). Similares resultados de explosión respiratoria se obtuvieron en macrófagos de doradas tratadas con estradiol y cortisol (Wang & Belosevic, 1995). Sin embargo, estudios llevados a cabo por Ortuño et al, (2001), demostraron una disminución de la fagocitosis de estas células en el riñón anterior de doradas expuestas a un hacinamiento previo, pero no encontraron efecto sobre la explosión respiratoria. La elevación transitoria de las hormonas del estrés observadas tanto en el trabajo de Ortuño como en el nuestro, evidencian características de estrés agudo, pero a diferencia de lo encontrado por estos autores, la explosión respiratoria en nuestro trabajo si se veía afectada por este factor, ya que como hemos visto en nuestros resultados, al comparar el grupo estresado y el control (Tabla 4), podemos observar diferencias significativas entre ellos tanto a nivel basal (S0: 290nm vs C0: 349nm) como inducido (S1:313nm vs C1: 386nm). Los transmisores nerviosos adrenérgicos y colinérgicos pueden afectar a los fagocitos al aumentar su habilidad para producir las especies reactivas del oxígeno (ROS) que participan en el proceso fagocítico (Lambris 1993), lo que produciría un aumento de las concentraciones de anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo (Graves et al. 1985). Sin embargo, nuestros resultados no concuerdan con lo descrito por estos autores, ya que nosotros encontramos mayores absorbancias en el grupo control frente al estresado al inducirse la cascada fisiológica del estrés por el crowding. Esto podría ser debido a que esos transmisores se liberan al inicio de la cascada del estrés y nosotros muestreamos tras 2h expuestos a este factor estresante, por lo que los efectos de estos transmisores podrían haberse pasado en ese tiempo. En esta línea, autores como Narnaware et al, (1994), observaron específicamente en truchas, que la administración de agonistas adrenérgicos (α y β) mostraban efectos depresores de la actividad fagocítica, a diferencia de lo que ocurría con la inyección de cortisol en una concentración de 200 nM. El efecto de las catecolaminas no se ha estudiado en peces tanto como el de los glucocorticoides debido a las dificultades de muestreo, ya que las catecolaminas, como ya se ha comentado, se eliminan rápido tras el factor estresante. Además, hay autores que aseguran que la adrenalina y noradrenalina (A y NA) propias de la vía simpática del estrés, mejorarían la capacidad de los macrófagos estimulados para producir especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que discreparía de nuestros resultados, en los que las absorbancias basales entre S y C son significativamente diferentes. Nuestros resultados también discreparían de otros autores como Bayne y Levy, (1991), que afirman que la explosión respiratoria en células mieloides de trucha arcoíris estaría aumentada por la ACTH, además de las catecolaminas, aunque estas diferencias con respecto a nuestros resultados podrían explicarse igualmente, porque la ACTH y las catecolaminas tienen un efecto temprano en la cascada del estrés para luego pasar a predominar los efectos supresores del cortisol (Tort, 2011). Por otro lado, la forma de medir los ROS de estos trabajos es diferente a la nuestra, pues nosotros usamos un test de reducción NBT 130 y lectura en espectrofotómetro a 620nm y estos autores lo hacen mediante quimioluminiscencia con luminol y reducción con citocromo-C con posterior lectura a 550nm. Wentzel (2020), describió la tendencia a una polarización alternativa (M2) de los macrófagos en carpas tras someterse a un factor estresante y como estos reflejan un deterioro en la respiración y menor producción de óxido nítrico (NO). La administración de cortisol en carpas (Cyprinus carpio) ha demostrado inhibir significativamente la expresión inducida por los LPS, de las citoquinas antiinflamatorias (TNF-α e IL-12) además de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) (Stolte et al., 2008b). Estudios sobre la secuencia en la digestión macrofágica han mostrado que el óxido nítrico inducible (NO⁻) actuaría en la parte final del proceso tras la explosión respiratoria, alentado por la degradación del triptófano (Grayfer et al, 2018) y, por tanto, los índices de ROS reflejados en las absorbancias del espectrofotómetro serían de la parte inicial del proceso, donde predominaría el origen de superóxidos previos (ROS) (ver capítulo 2.2.5.2). Por ejemplo, Kumar et al, (2019), comprobaron como la acción de un glucocorticoide (dexametasona) además de reducir la fagocitosis también inhibía la iNOS, así como los NO basales o inducidos (NO⁻) por LPS, en los macrófagos del pronefros de pez gato (Heteropneustes fossilis). Otros estudios han demostrado que el óxido nítrico, compuesto microbicida propio del proceso, aumentaría después de tratamientos in vitro con LPS y que la adrenalina podría amortiguar tanto este aumento de NO como de TNF-α con un aumento concurrente de IL-10, citoquina moduladora (Zinyama et al, 2001), pudiendo estar interfiriendo en nuestro trabajo sobre los ROS obtenidos en el grupo S afectado por esta adrenalina (no cuantificada en nuestro trabajo). Todo esto, parece avalar los resultados de absorbancias detectadas en nuestro experimento ya que hay diferencias significativas entre ambos grupos de truchas (S0-C0 y S1- C1) a favor de las del grupo C, lo que nos permitiría concluir que el factor de concentración intensiva al que fueron sometidas las truchas del grupo S ( en crowding) produciría la activación de la cascada fisiológica del estrés con unos aumentos significativos del cortisol, hormona propia del estrés, que interferiría en la producción de ROS durante el proceso de fagocitosis dentro del fagosoma de los macrófagos y, por tanto, en la eliminación de bacterias por los procesos propios de digestión macrofágica. Si tenemos en cuenta las temperaturas medias del agua en la semana de muestreo (Tabla 5), y manteniendo el valor de 15ºC como temperatura límite en estos animales (ver el capítulo 5.2.1.1) dentro del rango óptimo que citan algunos autores (Hokanson, 1977; Spigarelli & Thommes, 1979), podemos observar como los niveles de explosión respiratoria en ambos grupos son muy superiores a temperaturas bajas (<15ºC), aunque los macrófagos de las truchas control presentan valores de explosión respiratoria superiores a los del grupo S. A estas temperaturas, en el grupo control obtenemos resultados mucho más elevados de absorbancia tanto basal (458.44 nm), como inducida (512.2 nm), lo que supondría aproximadamente un incremento de dicha explosión respiratoria en más de un 40% con respecto a los mismos valores en el grupo S (S0-C0 y S1-C1). Estos resultados sugerirían que los macrófagos de las truchas pertenecientes al grupo C, serían capaces de generar una mejor respuesta de digestión por ROS que los de las del grupo S a esas temperaturas más frías, con lo que parece evidente que el factor de concentración intensa (crowding), generaría una modulación a la baja de la producción de ROS durante la explosión respiratoria. Sin embargo, cuando las temperaturas del agua ascienden 131 por encima de ese límite de 15ºC, observamos que las absorbancias obtenidas en ambos grupos están muy por debajo de las obtenidas a temperaturas frías, siendo además mucho más notable esta diferencia en el grupo control. Estos resultados indicarían que los macrófagos de ambos grupos, tendrían una peor capacidad de generar esos ROS para eliminar bacterias a temperaturas superiores a los 15°C, independientemente de si están estresadas o no. El aumento de la temperatura del agua en los peces afecta al sistema inmunitario al ser animales poiquilotermos (O´Neill, 1985) y las truchas reflejan una mejor respuesta inmune cuando están en aguas frías que en aguas más cálidas (Le Morvan et al, 1998). Al comparar los resultados obtenidos de explosión respiratoria basal e inducida de ambos grupos y tomando como valor crítico el de 15ºC de temperatura media de la semana de muestreo (Figura 24), observamos como a temperaturas por debajo de este límite, las absorbancias mostradas en cada uno de los grupos estudiados son siempre mayores que a temperaturas superiores a 15ºC (p<0.05), coincidiendo por tanto con estos autores. Si nos centramos en el grupo control, donde estas diferencias son mayores, podemos asegurar que esta modulación de la explosión respiratoria encontrada a temperaturas más cálidas es debido principalmente a este factor ambiental, pues los niveles de cortisol en estos animales se encontrarían dentro de los considerados como fisiológicos (ver capítulo 5.1.1) y la menor respuesta de emisión de ROS a temperaturas superiores a 15°C es muy notable con respecto a temperaturas por debajo de dicho límite. Autores como Patino et al, (1987), ya vieron como la capacidad para resistir enfermedades en animales estresados por hacinamiento crónico, pero con niveles de cortisol basales, estaba disminuida. La disminución en la producción de ROS durante la fagocitosis debido al incremento de las temperaturas del agua es algo que ha sido observado en otras especies de teleósteos por otros autores como Collazos et al, (1994) o Le Morvan et al, (1995). Esto nos indicaría una peor capacidad para eliminar patógenos por parte de esos macrófagos cuando esos animales son sometidos a temperaturas por encima de 15ºC. Sin embargo, en el grupo S, además de la variabilidad ambiental, están sometidos a un factor de estrés agudo adicional (crowding), como denotan los mayores niveles de cortisol y glucosa séricos detectados tras la concentración intensa, y ello hace que estas diferencias, aunque significativas, no sean tan exacerbadas como en el grupo C. Además, a temperaturas superiores a 15ºC muestran absorbancias superiores al grupo control debido a que, a estas temperaturas, la producción de ROS a través del proceso fagocítico en los macrófagos del grupo control estaría mucho más condicionado por este factor ambiental, lo que parece sugerir la existencia de un mecanismo de “aprendizaje” en los macrófagos de truchas S al someterse a otro factor estresante adicional. Cuando dos factores estresantes diferentes se encuentran simultáneamente (por ejemplo, hacinamiento en ambientes con poco oxígeno), la presencia de un factor estresante puede disminuir la tolerancia a otro adicional (Schreck, 2000). El estrés agudo, a menudo asociado a ligeros aumentos de cortisol, en determinadas circunstancias puede estar asociado a ventajas inmunológicas potenciales, lo que implica inmunoactivación a diferentes niveles (también a nivel celular) y es a lo que diferentes autores denominaron como “eustres” (Dhabhar & McEwen, 2001; Dhabhar, 2008; Schreck, 2010). Los peces en acuicultura están sujetos a una serie de restricción de movimiento en un ambiente regular, con lo que no pueden cambiar de escenario y deben aguantar las perturbaciones ambientales (Markrinos y Bowden, 2016). Esto significaría que las características de aprendizaje 132 serían diferentes a la de los peces de vida libre. La adaptación fisiológica es la suma de mecanismos que permiten al organismo recuperarse del desafío estresante. Estos mecanismos implican respuestas compensatorias y de habituación, y así, se involucran todos los mecanismos de respuesta fisiológica, incluyendo la gestión de la energía, respuestas inmunes y también el factor de aprendizaje o estrategia de afrontamiento a nuevos desafíos (Tort, 2011). Sin embargo, hay dos factores, como son la pérdida de control y la imprevisibilidad, que siempre harían muy difícil este afrontamiento, ya que podrían suponer una carga para el resto del organismo, incluyendo el sistema inmune (Korte et al., 2007; Schreck, 2010). Nuestros resultados sugieren que las truchas cuando están sometidas a temperaturas por encima de 15ºC, pierden capacidad para afrontar desafíos inmunológicos como denotan las peores ER obtenidas en ambos grupos a estas temperaturas. Pero también que los macrófagos del grupo sometido a crowding, muestran mejores resultados en ER que los del grupo C, lo que coincidiría con lo afirmado por estos autores, donde la pérdida de carga alostática que supone afrontar un nuevo factor estresante agudo cuando estas inmerso en otro de carácter ambiental, es menor. En nuestro caso, las truchas del grupo S serían capaces de afrontar mejor una invasión bacteriana mediante el estallido respiratorio a altas temperaturas, que cuando no están sometidas a este estrés por concentración. La mala adaptación a menudo se asocia con el estrés crónico, ya que los factores estresantes agudos intensos pueden provocar la muerte y los leves la recuperación. Los factores estresantes crónicos que conducen a esa mala adaptación, son muy relevantes en los animales en producción (Tort, 2011). Un eje HPI activado contribuye a la reorganización de los recursos mediante el aumento de las vías catabólicas, el suministro de fuentes glucídicas, el procesamiento de ácidos grasos para obtener energía y la supresión de otros procesos energéticos de alto costo y a más largo plazo, como los de las respuestas inmunitarias. El cortisol es uno de los principales causantes de esas respuestas. Al unirse este a los receptores de glucocorticoides (GR) o mineralocorticoides (MR), el cortisol regula los circuitos neuro- inmunoendocrinos, provoca inmunosupresión inducida por el estrés y contribuye a los desequilibrios en la carga alostática. Por eso, es especialmente adecuado para estudios relacionados con el estrés en entornos naturales y artificiales y el foco de la búsqueda de marcadores globales comunes de estados de estrés en los peces. Sin embargo, los niveles de cortisol en los peces estresados y, en consecuencia, la percepción individual y los efectos fisiológicos de la intensidad de los factores estresantes, suelen estar fuertemente sesgados por los sistemas neuroendocrino e inmunológico de una manera altamente específica de la especie (Balasch & Tort, 2019). Boonstra (2012), ya argumentaba que cuando ocurren factores estresantes de carácter crónico (por ejemplo, períodos de alto riesgo de depredación, limitación de alimentos, clima severo prolongado, conflicto social, etc.), aunque el animal puede estar crónicamente estresado, sus respuestas son adaptativas y continúan promoviendo la aptitud, proponiendo así que el estrés crónico evoluciona en una especie solo si ésta es capaz de adaptarse al mismo. Por otra parte, otros autores ya habían estudiado que la experiencia previa a la exposición a un mismo tipo de estrés determina la capacidad de generar una respuesta posterior y, por lo tanto, la eficiencia de los sistemas reguladores, incluida la actividad inmunológica (Dhabhar,2002). Al analizar los efectos de las temperaturas del agua altas o bajas en el rendimiento fisiológico de las especies ectotermos, la elección de unos límites de temperatura óptimos 133 específicos de especie, como hemos planteado nosotros, y usarlos como valores de referencia, permite comparar los efectos de los factores estresantes comunes como indicaron algunos autores (Roberts, 2012; Semple et al, 2017). Este enfoque asume que, la referencia térmica resume el camino adaptativo hacia la tolerancia a la temperatura variante en un ambiente particular y garantiza una descripción más realista de las respuestas al estrés (Balasch & Tort, 2019). En nuestro caso podemos pensar que el grupo S muestra una adaptación tras someterse a un factor crónico ambiental para someterse a un factor estresante adicional (crowding), que se ha visto modulador de la inmunidad en esos mismos macrófagos, ya que han sabido asimilar mejor la pérdida de carga alostática supuesta por las altas temperaturas que el grupo C y, por tanto, muestran una menor perdida de explosión respiratoria en referencia a cuando están a bajas temperaturas (a diferencia del grupo control, en el que esta pérdida en forma de ER es mucho mayor). Bajo la activación del eje del estrés el crecimiento se detiene, los procesos reproductivos se deprimen y los factores estresantes crónicos inducen la supresión inmunológica, en particular en procesos costosos como la producción de glóbulos blancos y la producción de anticuerpos, pero también se ha demostrado que otras respuestas, como la fagocitosis, pueden mantenerse (Tort, 2011; Yada & Tort, 2016). Sin embargo, como se ve en las respuestas fisiológicas de todo el organismo a nivel celular, el delicado equilibrio entre el estrés adaptativo y el no adaptativo, es lo normal. Las especies reactivas de oxígeno (ROS), por ejemplo, señalan el estrés oxidativo como una respuesta fagocitaria conservada evolutivamente a la infección (Lushchak, 2016). Podemos resumir que temperaturas superiores a 15ºC modifican a la baja la ER obtenida en macrófagos de las truchas arcoíris con respecto a la obtenida a temperaturas inferiores a 15ºC. Pero si luego, estas truchas se ven sometidas a otro factor estresante de carácter agudo (crowding), se produciría una mejor adaptación, puesto que este grupo muestra mayores ER que el grupo control (no confinado) en estas temperaturas más altas. La visión clásica de estas hormonas del estrés, afirma que el cortisol, la adrenalina y la ACTH serían supresores del sistema inmunológico, sin embargo, trabajos más recientes parecen demostrar que estas hormonas son agentes moduladores en lugar de supresores (Tort, 2011). 134 5.2.2 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA SEGÚN FAGOCITOSIS 5.2.2.1 RESULTADOS FAGOCITOSIS POR CROWDING Hemos usado el termino fagocitosis en nuestro trabajo para referirnos a la cantidad de bacterias que los macrófagos eran capaces de introducir en su interior (endocitar) en un periodo de 4 horas. En esta cantidad se incluirían también las bacterias adheridas a los macrófagos, pero hemos considerado que éstas se encontraban en el primer paso de la fagocitosis, adherencia a la célula, previa a su internalización. Inóculo (UFC) S 4phi (UFC) % S 4hpi C 4hpi (UFC) % C 4hpi 5,75E+06 5,86E+06 7,94E+06 1,53E+07 8,69E+06 9,12E+06 8,00E+06 1,14E+07 1,71E+07 9,00E+04 1,47E+05 1,27E+05 9,25E+06 7,06E+06 1,82E+07 1,40E+08 4,01E+07 4,19E+07 3,90E+07 1,66E+07 1,79E+07 8,25E+06 2,55E+06 3,00E+06 7,25E+06 1,89E+06 1,68E+06 7,52E+07 2,91E+06 3,51E+07 6,75E+06 6,63E+06 1,63E+07 1,18E+07 1,50E+07 1,84E+07 2,72E+07 9,90E+06 36.4% 1,56E+07 57.4% Tabla 6. Resultados de fagocitosis (4hpi) en unidades formadoras de colonias (UFC) en el grupo sometido a crowding (S) y grupo control (C) con respecto a la bacteria expuesta (inóculo). Medias y porcentajes en negrita en la última fila. 135 Figura 25. Porcentaje de bacterias encontradas a las 4hpi en los macrófagos del grupo en crowding (S) y del grupo control (C), con respecto al inóculo. Según observamos en la Figura 25, los macrófagos del grupo S fueron significativamente menos eficaces (p<0.05) a la hora de fagocitar las bacterias, en comparación con los del grupo C (36.4% y 57.4% respectivamente). Al analizar los resultados de cada grupo en función a la temperatura de la semana de muestreo (Tabla 7), observamos que, a temperaturas inferiores a los 15°C, las diferencias entre ambos grupos no son significativamente distintas. Esto es, los macrófagos del grupo S y del C son capaces de fagocitar una cantidad similar de bacterias. Sin embargo, a temperaturas superiores a esos 15°C sí se observan diferencias significativas entre los macrófagos de ambos grupos, puesto que en los del grupo S se observa una caída en la capacidad de fagocitar bacterias hasta un 26.1% y un aumento en el grupo C hasta un 70.8%. Si tenemos en cuenta las temperaturas medias del agua de la semana de muestreo: Tª media 7d (ºC) Inóculo (UFC) S 4hpi (UFC) % S4hpi C 4hpi (UFC) % C4hpi M <15ºC 2.82E+07 1.16E+07 41.1% 1.44E+07 51.1% M >15ºC 2.53E+07 6.61E+06 26.1% 1.79E+07 70.8% Tabla 7. Resultados medios de fagocitosis 4hpi (UFC) y porcentajes correspondientes en ambos grupos con temperaturas medias inferiores y superiores a 15ºC de la semana de muestreo. 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140% Inóculo S4hpi C4hpi FAGOCITOSIS BACTERIANA 136 5.2.2.2 DISCUSIÓN FAGOCITOSIS POR CROWDING: Una de las funciones de los macrófagos es la fagocitosis, es decir la internalización de material ajeno al organismo para su posterior eliminación. Durante la respuesta inflamatoria, los monocitos y macrófagos, llevan a cabo el proceso de fagocitosis mediada por receptores fagocíticos o interacciones hidrofóbicas de la membrana del fagocito y las partículas diana a fagocitar (ver capítulo 2.2.5.2). Una vez los macrófagos reconocen el material extraño, éste es internalizado por la célula fagocítica mediante su endocitosis. Este proceso de fagocitosis comienza con la adhesión de las bacterias a la membrana de la célula fagocítica, y, acto seguido, se produce una invaginación de la membrana celular para formar dos pseudópodos que rodean y envuelven a las bacterias fijadas. Tras este proceso, las bacterias son introducidas en el citoplasma del macrófago quedando dentro del fagosoma (ver capítulo 2.2.5.2). Para que la fagocitosis sea un mecanismo de defensa inmunológico eficaz debe ocurrir tanto la endocitosis como la maduración fagosómica posterior (Flannagan et al., 2009) y todas estas etapas dependen de muchos factores (Secombes & Fletcher, 1992). Teniendo en cuenta los resultados totales expuestos en la Tabla 6, sin tener en cuenta las temperaturas a las que las truchas han estado sometidas en los últimos días, los macrófagos de las truchas sometidas a crowding (S) son capaces de fagocitar un 36.4% de bacterias, mientras que los macrófagos de las truchas control (C) fagocitan muchas más, llegando a casi un 57.4% del total del inóculo. Como podemos observar, se produce una endocitosis de las bacterias expuestas en ambos grupos de forma considerable, pero existe una diferencia significativa de 21 puntos porcentuales a favor de la eficacia de los macrófagos de las truchas del grupo C con respecto a los macrófagos de las del grupo S. Esto parece señalar que la aparición de un factor estresante, el confinamiento en nuestro caso, sería capaz de afectar a la capacidad de estas células para captar y endocitar las bacterias. Esto implicaría que las truchas estresadas tendrían una capacidad más limitada para enfrentarse a un agente invasor como las bacterias y que estas últimas, tendrían que enfrentarse a menos desafíos que en el caso de truchas no estresadas. Por tanto, la probabilidad de que las bacterias fueran capaces de diseminarse por el organismo de los peces aumentaría considerablemente en el caso de que éstos tuvieran que afrontar algún factor estresante. Ya se ha comentado la capacidad del cortisol para producir inmunosupresión a diferentes niveles, también a nivel de la fagocitosis (Wendelaar Bonga, 1997; Weyts et al 1999; Yada & Nakanishi, 2002; Tort, 2011). Pickering y Pottinger (1985), ya detectaron una mayor predisposición a enfermedades en los peces cuando tenían niveles altos de cortisol, los cuales no iban acompañados de una disminución en leucocitos en los mismos. En nuestro caso, los niveles de cortisol encontrados en el grupo sometido al confinamiento intensivo durante 2h son elevados con respecto a los fisiológicos de la especie (ver capítulo 5.1.1), síntoma inequívoco de que estos animales están bajo los efectos del eje HHI por la acción de un factor estresante de carácter agudo. En el caso de las truchas sometidas al factor estresante, grupo S, se observa (Figura 25) como la capacidad fagocítica de los macrófagos se vio disminuida con respecto a la presentada por los macrófagos de las truchas del grupo C, ya que el número de bacterias 137 captadas e ingeridas por los macrófagos S a las 4h fue significativamente más bajo que las ingeridas por los macrófagos C en el mismo periodo de tiempo. La inhibición en la fagocitosis de los macrófagos renales ya fue demostrada por autores como Deane et al, (2001, 2006), en su estudio acerca de los efectos del cortisol en doradas sobre la menor tasa de fagocitosis en macrófagos de estos peces con hipercortisolemia. Law et al, (2001), también relacionaron el descenso en índices fagocíticos en dos especies como son tilapias y carpas, con altas tasas de cortisol. Nuestros resultados también están en la línea de lo expuesto por Ortuño et al, (2001), quien demostró una disminución del sistema de complemento y fagocitosis de los macrófagos renales, aunque este autor lo atribuyó a una redistribución de éstos desde el órgano a la sangre por efectos del estrés. En este sentido, otros autores como Esteban et al, (2004), también demostraron que los niveles de cortisol eran capaces de disminuir la capacidad fagocítica de los leucocitos del pronefros de la dorada, pero si se usaban concentraciones muy altas y exposiciones duraderas. Se ha detectado la existencia de células diana portadoras de receptores de cortisol en muchos órganos y células de teleósteos, incluidos los leucocitos (Maule & Schreck, 1990; Weyts, Flik, et al., 1998c; Weyts, Verburg-Van Kemenade, et al., 1998). En el riñón anterior confluye una comunicación paracrina directa entre el sistema endocrino y el sistema inmunológico, donde leucocitos y células endocrinas comparten receptores dentro del mismo órgano (Weyts et al., 1999). Así pues, las catecolaminas llegadas desde el cerebro vía sistema nervioso simpático y la producción de cortisol tras estimulación por la ACTH procedente de la hipófisis tras una estimulación estresante (eje HHI), generarían una interacción con los leucocitos sintetizados en este mismo órgano y en la síntesis de citoquinas, provocando una adaptación a la situación estresante (Weyts et al., 1999). Dependiendo del tipo de estrés generado por el agente perturbador (según factores como la intensidad, duración y exposiciones previas) podría ser positiva promoviendo un aumento de parte de la respuesta inmune con migración de leucocitos, producción celular y respuestas efectoras (Th1); o, si las respuestas son crónicas y/o intensas, provocaría una supresión de la inmunidad, disminuyendo la migración de leucocitos y producción celular y alentando respuestas moduladoras (Th2) de los mismos (Revisado por Yada & Tort, 2016) (ver capítulo 2.5.2). Los receptores de corticosteroides en el sistema inmunológico de los peces tienen dos patrones de expresión después de una elevación del cortisol secretado. La regulación al alza de los receptores de corticoides por un estrés agudo parece estar relacionada con la inmunosupresión. Por el contrario, una regulación a la baja de la expresión de los receptores de corticoides puede resultar en una desensibilización de la función inmune al cortisol (Yada et al., 2007; Stolte et al., 2008a, b; Teles et al., 2013). El cortisol es la hormona típica de estrés que al ser secretada en los primeros momentos de la cascada del estrés tiene efectos de respuestas agudas (Shreck y Tort, 2016). Su actuación a nivel de receptores en la membrana plasmática de los macrófagos puede modular a la baja y de forma supresora la unión, plegamiento e ingestión de bacterias en los individuos sometidos a esta hormona (grupo S), al generar al alza una regulación de los receptores de glucocorticoides (GR2) en los mismos. Después de un estrés agudo (como nuestro caso), se ha observado un aumento transitorio en el ARNm del receptor corticoide (GR2) en los leucocitos de trucha y carpa, y éste fue seguido por características inmunosupresoras en los mismos (Yada et al., 2007; 138 Stolte et al., 2008a, 2008b). Teles et al, (2013), encontraron, implantando cortisol de liberación lenta en trucha arcoíris, un aumento en los receptores de corticosteroides (GR2) en diferentes tejidos como en el riñón, cerebro, branquias y gónadas sobre todo al principio del experimento, emulando un estrés agudo; pero también, observaron una reducción de ARNm para ese receptor en el bazo, el hígado y el músculo. Sin embargo, tras 10 días de tratamiento, ya no se observaron variaciones en los receptores de glucocorticoides a nivel renal. En esta línea, usando glucocorticoides exógenos (dexametasona) en el pez gato, Kumar et al, (2019) observaron una reducción de fagocitosis en los macrófagos del pronefros, como es nuestro caso por su equivalente endógeno, el cortisol. Los glucocorticoides (GC) suprimen las respuestas inmunitarias siguiendo la vía genómica clásica. Este lento modo de acción se caracteriza por la interacción de GC con el receptor citoplasmático de glucocorticoides, que activa la translocación del complejo GC-GR al núcleo, donde se une a los elementos sensibles a GR en las regiones promotoras de los genes diana (Franchimont, 2004). En vertebrados superiores, se ha visto como los GC median su efecto no genómico mucho más rápido, a través de una interacción fisicoquímica no específica con la membrana plasmática, receptores de membrana específicos como el receptor acoplado a proteína G, o la forma del receptor GR unida a la membrana plasmática (Tasker & Malcher- Lopes, 2006). En esta línea, hay autores que también sugieren que el cortisol regula la fagocitosis a través de mecanismos genómicos y no genómicos en especies como en Corydoras punctatus (Roy & Rai, 2009). Estos autores observaron el rápido efecto inhibidor del cortisol sobre la fagocitosis en un amplio rango de concentración, lo que indica la participación de un receptor específico en la mediación del efecto no genómico del cortisol. La activación de los macrófagos es una parte esencial de la fagocitosis, y se realizaría tras recibir las señales por distintas vías (Mosser & Edwards, 2008; Zhou et al, 2014). Esta activación por presencia de antígenos se realizaría a través de la activación del receptor de reconocimiento de patrones antigénicos (PAMP), y daría como resultado una respuesta clásica o efectora (Th1) de los mismos, caracterizadas por un aumento de citoquinas proinflamatorias, una depleción de nutrientes y también por una potenciación en la digestión de antígenos (ver capítulo 2.2.5.3). Además, esta activación clásica de los macrófagos también puede ser impulsada por una serie de citoquinas como el TFN-α, el INF-γ y la CSF-1 (Hodgkinson et al., 2015). Los niveles de cortisol detectados en las truchas del grupo S de nuestro trabajo podrían estar interfiriendo sobre la acción de los macrófagos renales de forma moduladora, disminuyendo su capacidad de fagocitar bacterias extracelulares, alentando las teorías de la predisposición de esta hormona a la activación alternativa (M2) en estas células (Hodgkinson et al., 2015) y disminuyendo así su capacidad efectora típica donde implicaría mayores índices de fagocitosis y de eliminación bacteriana como se ha demostrado recientemente, aunque solo en los macrófagos de la cabeza renal y no del tronco renal (Maciuszek et al., 2019). Durante las interacciones con organismos bacterianos y fúngicos, las membranas plasmáticas de los fagosomas están sujetas a una tensión y pueden sufrir una variedad de cambios y alteraciones dinámicas. En el caso de macrófagos y células dendríticas, la remodelación de la membrana puede ayudar en la endocitosis de microorganismos y la formación de fagosomas, para su posterior eliminación (Niedergang & Grinstein, 2018). Las vías 139 y la maquinaria de reparación molecular son críticas en cada uno de estos encuentros con microorganismos. Durante la infección, los microorganismos invasores pueden tensionar las membranas plasmáticas de estas células y causar estiramiento y daño a las mismas (Gunther & Seyfert, 2018). Las células eucariotas han desarrollado mecanismos celulares para protegerse contra el daño inducido mecánicamente y otras lesiones en su membrana (Andrews et al, 2014). Esto es importante considerando que la doble capa de membrana tiene una capacidad limitada para estirarse, calculada para ser aproximadamente del 3% antes de la ruptura (Evans et al, 2003; Zimmerberg & Kozlov, 2006). El aparente “estiramiento” es el resultado de una variedad de cambios dentro de la membrana o la formación de endomembranas a través de la fusión de membranas. Por ejemplo, algunas células como los neutrófilos que se especializan en la fagocitosis de microorganismos, tienen membranas altamente enrevesadas y plegadas y como resultado pueden aumentar fácilmente su área de superficie en aproximadamente un 30% al "desarrugarse" evitando así su daño y ruptura (Herant et al, 2005). Aunque estas membranas pueden tener alguna capacidad intrínseca para aliviar esa tensión, respuestas adicionales y mecanismos de reparación han evolucionado para ayudar a la célula a sobrevivir a factores estresantes como el de la fagocitosis de patógenos (Andrews et al., 2014; Lambert et al, 2008). Durante situaciones de estrés, los receptores de membrana y/o la dinámica de los lípidos de membrana pueden verse alterados lo que llevaría a respuestas celulares disfuncionales. De La Haba et al, (2016), analizaron en células humanas, las modificaciones de la fluidez de la membrana y la función celular bajo estrés oxidativo en macrófagos activados por lipopolisacáridos bacterianos (LPS), demostrando que la activación por LPS provocaría la fluidificación de la membrana plasmática de los macrófagos y la producción de TNF-α. Sin embargo, el estrés oxidativo induciría rigidez de la membrana plasmática de los macrófagos y la inhibición de la activación celular, lo que se evidenciaría por una disminución de la secreción de TNF-α. Por lo tanto, en condiciones oxidativas, la respuesta proinflamatoria o efectora de los macrófagos podría desarrollarse de manera ineficiente. Sin embargo, hay otros estudios sobre el cortisol y su implicación sobre la fagocitosis que no indican que module a la baja la capacidad endocítica de estas células. Por ejemplo, un estrés causado por la frecuencia de alimentación en otros teleósteos como son las tilapias, difiere de nuestros resultados, ya que tras 4hpi, independientemente del nivel de cortisol encontrado, las bacterias recuperadas de los macrófagos eran muy similares en todos los casos (García & Villarroel, 2009). También en esta línea, en otros estudios ya en truchas, la administración de cortisol (200 nM) a macrófagos in vitro no logró deprimir la actividad fagocítica en un período de 3 h, pero los agonistas adrenérgicos α y β (10 µM) si mostraban resultados disminuidos (Narnaware et al., 1994), haciendo pensar en este último caso, que la fagocitosis al principio de la cascada fisiológica desencadenada por la percepción del factor estresante está más condicionada por el sistema simpático que por el eje HHI, dependiente del cortisol. En este sentido, las catecolaminas formadas durante el evento del estrés también parecen interferir en la fagocitosis de algunos leucocitos. Diferentes autores han comprobado que la adrenalina (A) y noradrenalina (NA) parecen reducir la fagocitosis de macrófagos en el Channa puntactus, y la norepinefrina (NE) y epinefrina (E) disminuir la fagocitosis a través del receptor β-adrenérgico (Roy & Rai, 2008). Al igual que usando agonistas de los receptores adrenérgicos se consiguen menores tasas de fagocitosis, tratamientos con fenilefrina la reducen 140 también, aunque en este caso, aumentaría la explosión respiratoria según otros autores (Flory & Bayne, 1991). Por otra parte, hormonas como la α-MSH y la MCH participan en la cascada fisiológica del estrés a través del eje HHI (ver capítulo 2.4.2.2). Se ha visto que estas hormonas aumentan la cantidad de levaduras fagocitadas por macrófagos y neutrófilos del pronefros de la trucha arcoíris, pero luego, esos fagocitos necesitaban de otros componentes activadores de macrófagos (MAF) para aumentar el índice fagocítico (Harris & Bird, 1998, 2000a). Si tenemos en cuenta la temperatura del agua como media de la semana de muestreo, observamos que a temperaturas por debajo de 15ºC, ambos grupos se comportan de manera similar, siendo capaces de fagocitar un porcentaje de bacterias similares, pues la diferencia entre ellos es del 10% aunque siempre las truchas control muestran mayor cantidad de bacterias captadas y endocitadas y por lo tanto mejor respuesta fagocítica (p>0.05). A temperaturas por encima de 15ºC, los índices de fagocitosis en ambos grupos se asemejan más a los conseguidos de media durante todos los muestreos (resultados totales), pues el grupo control muestra unos mejores índices de bacterias fagocitadas (71%) que el grupo S (26%), el cual denota peores resultados obtenidos aquí que sus medias generales de todo el trabajo. Podemos asegurar que las bajas temperaturas apenas condicionan a ambos grupos para la ingestión de bacterias in vitro ya que muestran valores parecidos entre ellos, con lo que el factor estresante agudo por crowding a estas temperaturas no indica que fagociten significativamente menos bacterias. Cuando las temperaturas aumentan (>15ºC), éstas lastran notablemente al grupo sometido a crowding para fagocitar en 4hpi las bacterias expuestas con respecto al grupo control, el cual aumenta notablemente su índice fagocítico. Los componentes del sistema inmune innato han mostrado históricamente respuestas variadas al estrés por frío, con una menor afectación de los componentes celulares innatos que proporcionaron una compensación parcial a deficiencias en la inmunidad adaptativa, ya que hay una mayor supresión del sistema inmune adaptativo a diferencia del innato en respuesta a temperaturas más frías (Ainsworth et al, 1991; Collazos et al., 1994b; Dexiang & Ainsworth, 1991; Kurata et al., 1995). Acorde a nuestros resultados a bajas temperaturas, la fagocitosis de las bacterias in vitro, muestra índices solventes en ambos grupos, ya que los dos muestran similares índices de fagocitosis, con una mejoría en el grupo S con respecto a las medias totales del estudio (p>0.05), pero estando en valores inferiores, aunque no significativamente al grupo control. Esto indicaría que, a bajas temperaturas, el factor estresante crowding no parece ser tan determinante para endocitar bacterias in vitro por estas células como cuando la temperatura aumenta. En el caso de la fagocitosis, que depende más de la fluidez de membrana que de reacciones enzimáticas, se ve menos influenciada por la temperatura del agua a la que están sometidos estos animales que otros procesos como la actividad microbicida intracelular de la misma (O´Neill, 1985; MacArthur et al., 1985; Blazer, 1991). Así, Le Morvan (1997), encontró mejores índices de fagocitosis (también de ER) de levaduras, cuando las carpas se sometían a reducción de temperaturas. Sin embargo, este mismo autor encontró un efecto sobre la función inmune celular mediante la modulación de la estructura de la membrana plasmática por una disminución brusca de la temperatura del agua, probablemente como un efecto del estrés agudo ocasionado. Éste, podría ser equiparable a la concentración por crowding del grupo S en nuestro 141 trabajo, pues también encontraron niveles altos de cortisol que puede estar causando este efecto en las membranas (Le Morvan, 1995). Cuando la temperatura aumenta y sobrepasa los límites propios de temperaturas óptimas de esta especie, los porcentajes cambian y se observa como la fagocitosis cae en el grupo S hasta el 26.1% mientras que el grupo C es capaz de subir los índices fagociticos hasta un 70.8%, denotando que las aguas cálidas no afectan tanto a las truchas control como si lo hacen con el grupo estresado por confinamiento agudo, expuestos a niveles altos de cortisol. Por tanto, la capacidad de fagocitar bacterias por los macrófagos del riñón se ve claramente disminuida cuando las truchas se someten a un factor estresante agudo como es el crowding con temperatura del agua superiores a 15ºC. En este sentido autores como Cheng (2009), en un estudio sobre aclimatación de tilapias a altas y bajas temperaturas en referencia a su temperatura óptima (27ºC) encontró peores índices de fagocitosis al principio y final del experimento (3h, 6h y a 96h del inicio de la perturbación) a temperaturas de 35ºC, aunque también los encontró cuando eran sometidas a bajas temperaturas (19ºC). Parecidos resultados obtuvieron en ER para ambas temperaturas. Esto indicaría como, aunque las tilapias son peces que prefieren temperaturas del agua mucho más cálidas, someterlos a estrés térmico afectaría a la capacidad de sus macrófagos para fagocitar bacterias. Nuestros resultados indicarían que, al ser las truchas animales de aguas frías, solo muestran modulación en su fagocitosis a temperaturas cálidas, por encima de 15ºC cuando se someten a crowding. Para resumir, todos estos resultados nos inducen a pensar que el factor estresante crowding soportado por las truchas durante 2h genera peores respuestas fagocíticas en términos generales como mecanismo de endocitar bacterias pero que, este mecanismo se ve muy disminuido cuando la temperatura del agua aumenta por encima de 15ºC. Esto supone una desventaja para las truchas que son concentradas a la hora de combatir una infección bacteriana, pues se traduce en unos menores índices de captación de bacterias durante el proceso de fagocitosis por sus macrófagos renales, aumentando aún más la susceptibilidad de estos individuos a contraer enfermedades de origen bacteriano si además están sometidos a elevadas temperaturas. 142 5.2.3 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA SEGÚN SUPERVIVENCIA BACTERIANA 5.2.3.1 RESULTADOS DE SUPERVIVENCIA BACTERIANA POR CROWDING Hemos utilizado el término supervivencia bacteriana para indicar la cantidad de bacterias encontradas en el interior de los macrófagos una vez pasadas 24 horas desde el inicio del contacto de estos con el inóculo. Constituiría el siguiente paso de la fagocitosis tras la endocitosis de los agentes bacterianos, y así nos indicaría la capacidad que tienen estas células fagocíticas para eliminar los agentes bacterianos previamente introducidos en la fase de endocitosis. S 4phi (UFC) S 24hpi (UFC) % S 24hpi C 4hpi (UFC) C 24hpi (UFC) % C 24hpi 3,66E+05 1,94E+06 2,51E+07 2,01E+07 6,25E+05 1,29E+06 3,71E+02 8,08E+02 1,27E+06 2,77E+06 2,38E+06 5,67E+06 4,37E+06 5,21E+06 3,15E+05 1,51E+04 3,38E+06 4,46E+06 7,15E+07 6,00E+07 3,29E+06 1,99E+07 9,90E+06 1,02E+07 103% 1.56E+07 1.10E+07 70.5% Tabla 8. Resultados en unidades formadoras de colonias (UFC) de supervivencia bacteriana tras 24hpi en el grupo en crowding (S) y el control (C) en función de las UFC fagocitadas a las 4hpi. Medias y porcentajes en negrita en la última fila. 143 Figura 26. Porcentaje de supervivencia bacteriana del grupo estresado (S) y del control (C) a las 24hpi en comparación con lo fagocitado a las 4hpi por cada grupo. Tal como ya se apuntó en el capítulo 2.2.5.2, la fagocitosis es un proceso encaminado a la reducción de los agentes infecciosos que han sido capaces de entrar en el organismo. Consta de tres etapas, adherencia del agente al macrófago, introducción de éste por endocitosis y, finalmente, digestión y eliminación del mismo (explosión respiratoria). Por tanto, una vez endocitadas las bacterias, se debería producir una reducción de las mismas en el interior del macrófago. Esto puede observarse en la Figura 26 con el grupo C, en el que se puede apreciar una reducción significativa (p<0.05) de un 29.5% con respecto al número observado a las 4hpi. Sin embargo, en el caso de los macrófagos del grupo S, no se observa tales resultados, pues no son capaces de reducir nada la cantidad de bacterias endocitadas previamente (Tabla 8). Si bien es cierto que las diferencias entre el número de bacterias a las 4hpi y a las 24hpi en este grupo S no son significativas, sí muestran una clara diferencia con el grupo C, con el que a las 24hpi las diferencias sí fueron significativamente distintas (p<0.05). Si tenemos en cuenta las temperaturas medias del agua en la semana del muestreo: Tªmedia S4hpi S24hpi %S24hpi C4hpi C24hpi %C24hpi Tª<15ºC 1,16E+07 4,30E +06 37.1% 1,44E+07 4,62E+06 32.1% Tª>15ºC 6,61E+06 2,61E+07 395% 1,79E+07 2,81E+07 157% Tabla 9. Resultados medios de supervivencia bacteriana y porcentajes de bacterias contabilizadas en el interior de los macrófagos a las 24hpi con respecto a las fagocitadas a las 4hpi, según temperatura media del agua (Tªmedia) en la semana del muestreo, superior o inferior a 15ºC. 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% S4hpi S24hpi C4hpi C24hpi SUPERVIVENCIA BACTERIANA 144 En la Tabla 9 se muestra la evolución de esta eliminación de bacterias según las temperaturas medias del agua en la semana de muestreo. A temperaturas medias por debajo de 15ºC, los resultados de supervivencia bacteriana en ambos grupos son similares, aunque superior en el grupo S (37.1%) con respecto al grupo C (32.1%), si bien estas diferencias no fueron significativas. Sin embargo, cuando la temperatura del agua asciende por encima de 15ºC, se afecta de manera sustancial la digestión fagocítica de bacterias por los macrófagos de ambos grupos, los cuales no son capaces de reducir las bacterias fagocitadas, viéndose claramente perjudicado el grupo sometido a crowding (S), ya que, en éste, las bacterias se multiplican en el interior de los macrófagos de forma exponencial (395%). Mientras, el grupo control, como ocurre con el grupo S, tampoco es capaz de reducir el número de bacterias, pero éste aumenta significativamente menos que en el grupo S (157%). 145 5.2.3.2 DISCUSIÓN SUPERVIVENCIA BACTERIANA POR CROWDING La reducción bacteriana mediante el proceso de fagocitosis llevado a cabo por los macrófagos finaliza con la etapa de digestión o eliminación de agentes fagocitados previamente en la etapa de ingestión de estos (ver capítulo 2.2.5.2). Para ello, los lisosomas, vesículas intracitoplasmáticas muy ácidas (pH < 5,5) que contienen proteasas y lipasas activas y enzimas hidrolíticas (Tjelle et al, 2000), se unen al fagosoma formando el fagolisosoma, donde vierten enzimas degradativas (hidrolasas lisosomales), péptidos antimicrobianos, generando también un pH ácido con acción microbicida (Esteban & Meseguer, 1994) y donde se producen los compuestos reactivos de oxígeno (ROS) (Briggs, et al., 1975; Tapper, 1996). Todos, forman el componente degradativo de estas células en el fagolisosoma (revisado por Grayfer et al., 2018). Nuestros resultados se muestran en concepto de supervivencia bacteriana, y son por tanto la cuantificación de las bacterias observadas dentro de los macrófagos tras el proceso de eliminación dentro de los fagolisosomas. Estos valores nos indicarían el número de bacterias capaces de sobrevivir en el interior de los macrófagos una vez pasadas 24hpi, tiempo suficiente para que fueran visibles los efectos del proceso de digestión en condiciones normales. Estos mismos resultados también pueden definirse en términos de reducción bacteriana, que se referiría al concepto contrario, es decir, la cantidad de bacterias que no han podido sobrevivir y por tanto han sucumbido a este proceso degradativo propio de las células fagocíticas. Hemos considerado como el 100% de las bacterias a eliminar la cantidad de bacterias fagocitadas por ambos grupos, es decir, aquella encontrada a las 4hpi. Así, en el grupo S la supervivencia media es de 103% y de 70.5% en el grupo C. Ambos grupos muestran diferencias significativas de 32.5 puntos porcentuales entre ambos, lo que demostraría una mayor capacidad en los macrófagos de las truchas control sobre los macrófagos de las truchas sometidas a crowding para eliminar las bacterias. Por su parte, observamos como las truchas no sometidas a este hacinamiento intensivo (control) son capaces de eliminar un 29.5% de las que fueron ingeridas en la fase de fagocitosis y dispuestas dentro de los fagosomas formados. Distintos autores (Ellis, 1981; Zapata et al, 1992; Bly & Clem, 1992) han descrito como una elevación crónica de los niveles de cortisol plasmático en peces eran capaces de aumentar la susceptibilidad de éstos a sufrir enfermedades. Autores como Pickering y Pottinger (1985), ya observaron una mayor mortalidad por furunculosis en truchas sometidas a implantes de cortisol de liberación lenta. Otros autores posteriormente (Ruiz & Blas, 2003), recogían en una revisión como niveles altos de cortisol de origen endógeno eran capaces de provocar una disminución en la capacidad para eliminar bacterias por estos fagocitos. Los agentes estresantes activan la respuesta neuroendocrina después de ser percibidos por el animal, mientras que la activación posterior de los mecanismos inmunitarios está mediada por hormonas, principalmente cortisol, que tienen receptores (GR) en todas las células. Las células inmunitarias, por tanto, también tienen receptores para estas sustancias lo que puede también modular sus funciones como respuesta al cortisol circulante. Además, para entender mejor estos resultados de supervivencia bacteriana obtenidos en cada grupo, hay que tener en cuenta el número de bacterias introducidas previamente en la 146 fase de fagocitosis, es decir, de las bacterias dispuestas por el macrófago en su interior para degradar. En este sentido, hay que señalar que en los macrófagos del grupo de truchas sometidas a crowding, el número de bacterias fagocitadas y listas para eliminar fue menor que las presentes en el grupo control puesto que los índices fagocíticos a las 4hpi fueron inferiores que en el grupo control (un 21% menos). Esto indicaría que los fagocitos del grupo control muestran una mejor capacidad para hacer frente y reducir el número de agentes patógenos pues partirían de un mayor número de bacterias previamente fagocitadas (1.56 x 10⁷ UFC), siendo capaces de eliminar prácticamente el 30% de todas ellas. El grupo S por su parte, partiría de una menor cantidad de bacterias fagocitadas previamente (9.90 x 10⁶ UFC) y su número aumenta mínimamente (p>0.05), presentando así una capacidad microbicida mucho menor que las del grupo control. Durante la infección, las células de linaje de macrófagos eliminan los patógenos a través de una batería de respuestas antimicrobianas, donde la eficacia de estas respuestas es fundamental para las consecuencias inmunológicas y, donde también la propia resistencia de estos mismos patógenos se hace determinante para ello (Grayfer et al., 2014). Por lo tanto, al analizar los resultados totales encontrados (Tabla 8), se observa como el grupo S, condicionado por el cortisol que supone la concentración aguda a la que están sometidos, presentan una menor capacidad de eliminación bacteriana que si no están hacinados, lo que se traduce en una nula reducción de las mismas, pues los resultados son similares a los encontrados a las 4hpi (p>0.05). En este sentido, a los resultados expuestos en la fase de fagocitosis por diferentes autores (ver capítulo 5.2.2.2), donde encuentran una clara relación en la disminución de la endocitosis de bacterias en diferentes tipos de peces debido al cortisol (Deane et al, 2001; Law et al, 2001; Ortuño et al, 2001), también se obtienen menores índices fagocíticos en peces por el efecto del estrés al finalizar las 24hpi. Por ejemplo, Deane et al, (2001), observaron esta disminución en los porcentajes fagocíticos en doradas únicamente cuando estos animales estaban en una fase moribunda tras una infección por vibrios, que era cuando mostraban altos índices de cortisol. Watanuki et al, (2002), en un estudio sobre modulación de la fagocitosis en macrófagos renales en carpas, a los 1 y 3 días desde la administración de cortisol observaron que este era capaz de inhibir la fagocitosis, la producción de ROS y de NO. Por su parte, Kumar y Joy (2018), encontraron que la dexametasona (agonista del cortisol) disminuía la fagocitosis y la acción de la enzima iNOS en los macrófagos de Heteropneustes fosilis, al igual que las catecolaminas (epinefrina y norepinefrina) inhibieron la producción de NO inducido previamente por LPS en estos fagocitos en la línea con nuestros resultados, pues son compuestos producidos al principio durante la cascada fisiológica del estrés y provocan una pérdida de los componentes propios para la digestión en los macrófagos. Si tenemos en cuenta la temperatura media del agua durante la semana del muestreo (Tabla 9), podemos observar cómo afecta la misma a la hora de eliminar bacterias previamente fagocitadas en ambos grupos. En nuestros muestreos a temperaturas por debajo de 15ºC, las bacterias fagocitadas previamente sucumbirían al proceso de digestión fagocítica en ambos grupos de manera eficiente. En este sentido, obtenemos una reducción de un 67.9% de las bacterias endocitadas en el grupo control y de un 62.9% en el grupo sometido a crowding (p>0.05). Aquí podemos observar como las bajas temperaturas del agua no influyen tanto en la funcionalidad macrofágica para eliminar a estos patógenos, pues a temperaturas bajas (<15ºC) ambos grupos son capaces de eliminar gran parte de las bacterias fagocitadas en 24h, incluso el 147 grupo sometido a crowding, ya que se obtienen resultados similares con respecto al grupo control. Esto estaría en consonancia con la idea de que las bajas temperaturas del agua afectan menos al sistema inmune innato, el cual se ve más afectado por temperaturas cálidas en estos peces (Ainsworth et al, 1991; Dexiang & Ainsworth, 1991; Collazos et al., 1994b; Kurata et al., 1995; Alcorn et al., 2002; Bowden et al., 2007). Por ejemplo, se observó en el pez gato (Ictalurus punctatus) que el efecto de la temperatura sobre la fagocitosis estaba en función de la temperatura del ensayo y no de la de aclimatación, además de que los fagocitos parecían ser más resistentes a bajas temperaturas que los linfocitos (Scott et al, 1985; Ainsworth et al. 1991). También se ha observado en esta misma especie, que bajas temperaturas implicarían una mejor capacidad bactericida (Dexiang & Ainsworth, 1991), lo que fue también descrito por Collazos et al, (1994) en tencas (Tinca tinca). Hardie et al, (1994), encontraron que los macrófagos aislados de trucha arcoíris cultivados a bajas temperaturas eran capaces de responder al factor activador de macrófagos y de mostrar un mayor aumento relativo en la actividad del estallido respiratorio y, por tanto, mejores capacidades para eliminar bacterias por este proceso en comparación con sus homólogos cultivados a temperaturas más altas. También nuestros resultados del capítulo 5.2.1.1, sugieren que temperaturas bajas permitirían una mejor respuesta de explosión respiratoria que cuando la temperatura supera los 15ºC en estos animales. Nosotros encontramos que el factor de estrés agudo crowding no parece interferir a temperaturas bajas con la digestión y eliminación de bacterias, pues los resultados están en armonía con los mostrados por el grupo control en estas condiciones. Si tenemos en cuenta los resultados de explosión respiratoria, como mecanismo principal de digestión de patógenos por estas células, en estos animales concentrados a Tª por debajo de 15ºC (ver capítulo 5.2.1), vemos como el grupo S presenta menor estallido respiratorio que el grupo C (S1-C1: 144%) al someterlos a bacterias in vitro, con lo que los resultados obtenidos aquí sobre eliminación de bacterias por éstos podrían indicar que estos macrófagos procedentes de truchas en crowding podrían estar eliminando bacterias por otras vías de degradación del fagolisosoma y no solo a través de generación de compuestos reactivos de oxigeno (ROS), pues los índices de supervivencia encontrados entre ambos grupos no muestran diferencias significativas. Los fagocitos presentan otros medios de degradación secundarios independientes del oxígeno (Chung & Secombes, 1988; Alberdi et al, 1995a b; Ganz & Lehrer, 1997, Rieger et al, 2010; Grayfer et al, 2014), como son la acción de hidrolasas lisosomales y péptidos microbicidas (acidificación fagosómica, privación de nutrientes, activación canales iónicos de la membrana…) que pueden no estar tan modulados por los efectos de un estrés agudo como si parece estarlo la producción de ROS. Sin embargo, a temperaturas superiores a 15ºC la situación cambia completamente en ambos grupos. En este caso, las bacterias son capaces de multiplicarse en el interior de los macrófagos superando los valores detectados a las 4hpi, aunque en el caso del grupo S el número de bacterias en los macrófagos se incrementó significativamente más que en el grupo C (395% y 157% respectivamente). Diferentes autores han revisado las capacidades de las bacterias para eludir la eliminación por los macrófagos, mediante diferentes mecanismos de evasión (revisado por Grayfer et al, 2014). Beauregard et al, (1997), ya describieron la capacidad de evadir la respuesta inmune de algunos microorganismos en estas células fagocíticas en 148 mamíferos utilizando diferentes estrategias de evasión e incluso llegando a prosperar dentro del citosol tras escapar del fagosoma. En peces, Mycobacterium marinum puede servir como ejemplo al haber desarrollado un gran abanico de estrategias para contrarrestar, superar y manipular a los macrófagos, utilizando la infección intracelular de éstos, no sólo como residencia y barrera ante los componentes inmunes humorales, sino también como medio de difusión y quiescencia (Jacobs et al, 2009). Otro patógeno bacteriano como Edwardsiella tarda, capaz de afectar diversas especies de peces económicamente importantes, también presenta varias estrategias para combatir la respuesta inmune innata mediada por los macrófagos, por ejemplo, mediante una enzima propia, la superóxido dismutasa con un cofactor de hierro (Cheng et al, 2010). Igualmente, se ha demostrado como Yersinia ruckeri, una de las bacterias utilizadas por nosotros, también es capaz de reproducirse en el citosol de los macrófagos, donde se vio que era capaz de sobrevivir 24h después de la infección (in vitro e in vivo) e incluso replicarse dentro de los macrófagos del pronefros de la trucha arcoíris (Ryckaert et al., 2010). No obstante, hay muchos otros patógenos capaces de evadir las respuestas digestivas de los macrófagos, aunque aún se desconocen los mecanismos utilizados (Grayfer et al., 2014). Además, a estos argumentos podemos sumarle los encontrados por autores ya citados como Verma et al, (2007), o Profeta et al, (2006), los cuales obtuvieron peores índices de digestión macrofágica en truchas sometidas a altas temperaturas como consecuencia de una menor producción de ROS durante la fagocitosis a estas temperaturas, lo que indicaría la pérdida de capacidad de los macrófagos para eliminar esas bacterias a temperaturas por encima de 15ºC. Todos estos resultados sugieren que un estrés agudo e intenso, como es el crowding de 2h, sería capaz de limitar la capacidad bactericida de los macrófagos renales de la trucha arcoíris, pero que, si las temperaturas del agua se mantuvieran dentro de los rangos propios de la especie, estos peores índices de eliminación de bacterias pueden verse compensados y mostrar mejoría. Sin embargo, si las temperaturas del agua aumentan por encima de sus rangos óptimos, la pérdida de capacidad para eliminar patógenos no solo afectaría a los macrófagos de truchas sometidas a un estrés agudo, sino que se hace extensiva también a las truchas no sometidas a crowding, haciendo evidente la importancia de la temperatura del agua para estos animales y su resistencia a infecciones bacterianas. En esta línea, Sepahi (2013), describió una mayor mortalidad de origen bacteriano (Streptococcus agalactiae) en truchas criadas a 18ºC con respecto a las criadas a 12ºC. 149 5.3 RECUENTO DE MACRÓFAGOS 150 5.3.1 RESULTADOS DE LA PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS Los resultados de recuento de macrófagos en ambos grupos obtenidos con las dos bacterias empleadas, E. coli y Y. ruckeri, se muestran en la Tabla 10. Mientras que en la Figura 27, se compara el efecto en la proliferación macrofágica en ambos grupos dependiendo de la bacteria utilizada. Bacteria S0h S4hpi S24hpi C0h C4hpi C24hpi E coli 7,80E+05 3,40E+05 2,82E+06 2,20E+06 1,48E+06 5,98E+06 E coli 5,64E+06 4,46E+06 4,78E+06 4,02E+06 5,58E+06 5,86E+06 E coli 1,26E+06 2,36E+06 9,80E+05 8,10E+05 8,00E+05 1,76E+06 E coli 4,80E+05 1,06E+06 8,80E+05 9,40E+05 1,48E+06 9,80E+05 E coli 2,26E+06 1,96E+06 1,68E+06 1,42E+06 1,82E+06 1,18E+06 E coli 1,41E+06 5,20E+05 2,36E+06 1,02E+06 8,80E+05 1,84E+06 E coli 1,42E+06 2,58E+06 2,35E+06 1,34E+06 2,96E+06 3,41E+06 Y rukeri 1,90E+06 2,04E+06 2,84E+06 2,03E+06 2,18E+06 3,52E+06 E coli 1,58E+06 1,85E+06 2,27E+06 1,56E+06 2,81E+06 3,68E+06 Y rukeri 2,00E+06 2,14E+06 2,53E+06 2,10E+06 2,49E+06 2,80E+06 E coli 1,78E+06 1,55E+06 2,37E+06 1,33E+06 2,29E+06 2,24E+06 Y rukeri 1,78E+06 1,79E+06 2,06E+06 1,32E+06 2,06E+06 2,74E+06 E coli 1,13E+06 1,00E+06 1,29E+06 1,09E+06 1,36E+06 1,58E+06 Y rukeri 1,13E+06 1,18E+06 1,35E+06 1,09E+06 1,34E+06 1,71E+06 E coli 9,60E+05 7,65E+05 1,18E+06 8,30E+05 1,12E+06 1,27E+06 Y rukeri 9,60E+05 8,00E+05 1,13E+06 8,30E+05 1,16E+06 1,24E+06 MEDIAS 1,65E+06 1,65E+06 2,05E+06 1,50E+06 1,99E+06 2,61E+06 151 M. E coli 1,70E+06 1,68E+06 2,09E+06 1,51E+06 2,05E+06 2,71E+06 M. Y rukeri 1,55E+06 1,59E+06 1,98E+06 1,47E+06 1,85E+06 2,40E+06 Tabla 10. Número de macrófagos contabilizados a las 0h, 4hpi y 24hpi en ambos grupos (S y C) tras someterlos a bacterias. E coli: Escherichia coli; Y rukeri: Yersinia rukeri. M: medias. Figura 27. Porcentaje de recuento de macrófagos en ambos grupos (S y C) a las 0h, 4hpi y 24hpi según la bacteria utilizada: E. coli: Escherichia coli y Y. rukeri: Yersinia rukeri. Como puede apreciarse, tanto en la Tabla 10 como en la Figura 27, el número de macrófagos tanto en el grupo C como en el S no varió al usar ninguna de las dos bacterias testadas (E. coli y Y. ruckeri), por lo que el uso de una u otra no tuvo ninguna influencia sobre los resultados. Tan solo se observaron mínimas diferencias en el grupo control (Figura 27), con un ligero aumento en el número de macrófagos con E. coli frente al observado con Y. ruckeri, aunque en ningún caso esas diferencias fueron significativas. Por este motivo, utilizamos los datos obtenidos independientemente de la bacteria utilizada. 0% 50% 100% 150% 200% 250% S0h S4hpi S24hpi C0h C4hpi C24hpi RECUENTO MACRÓFAGOS E.coli-Y.rukeri E.coli Y.rukeri 152 Figura 28. Porcentaje del número de macrófagos en ambos grupos (S y C) a las 0h, 4hpi y 24hpi de todos los muestreos. Como puede observarse en la Tabla 10, el número medio de macrófagos (MØ) al inicio del experimento es ligeramente superior en el grupo de truchas sometidas a crowding (1.65x10⁶ MØ) que en el grupo control (1.50x10⁶ MØ) aunque no muestran diferencias significativamente importantes entre ambos (p>0.05). Tal como puede observarse en la Tabla 10 y Figura 28, la evolución del número de macrófagos a lo largo del estudio fue diferente según el grupo de truchas del que procedían. En el grupo de truchas sometidas a crowding, el número se mantuvo sin variación a las 4hpi (1.65x10⁶ MØ) con respecto al inicial, es decir, no se produjo proliferación ni reducción alguna (p>0.05). Por el contrario, en el grupo control, a las 4hpi sí observamos un aumento del 33% en su número (1.99x10⁶MØ), lo que resulta un aumento significativo en este periodo (p<0.05). En la segunda parte del recuento a las 24hpi, el número de células evolucionó al alza significativamente en ambos grupos. Se evidencia un aumento del 24% (2.05x10⁶MØ) en el grupo sometidas a crowding, lo que resulta un incremento significativo con respecto al número de macrófagos contado a las 4hpi (p<0.05). Por su parte, en el grupo de truchas control, el número de macrófagos siguió incrementándose de forma significativa (31%) respecto a los valores de las primeras 4 horas (p<0.05), hasta alcanzar una media de 2.61x10⁶MØ. Este incremento en los macrófagos del grupo C representó un aumento total de más del 74% con respecto al número de células con las que partimos al inicio del estudio (p<0.05). 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140% 160% 180% 200% S0h S4h S24h C0h C4h C24h RECUENTO DE MACRÓFAGOS 153 5.3.2 DISCUSIÓN PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS El sistema inmune innato constituye la primera línea de defensa contra los patógenos microbianos y se inicia mediante el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y patrones moleculares asociados a daños endógenos mediante receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Entre estos, los receptores tipo Toll (TLR) comprenden una de las clases más importantes asociadas con la eliminación de bacterias por varias vías (Akira & Takeda, 2004). Tras el reconocimiento de esos patrones moleculares asociados a patógenos por parte de los receptores de los macrófagos, se reclutan células inmunitarias y se activan múltiples vías de señalización antibacterianas/virales, lo que lleva a la producción de citoquinas, quimioquinas e interferones relacionados con el sistema inmune. Diversos autores han señalado como el estrés produce inmunosupresión a muchos niveles, pero la prolongación de sus efectos es muy variable y depende de muchos factores (revisado por Yada & Tort, 2016). La evolución de la respuesta está relacionada con el factor estresante, el cual, dependiendo del tipo, intensidad y duración de la exposición, genera diferentes respuestas (Tort, 2011). También, la respuesta del organismo depende del indicador medido, la localización en el cuerpo (sangre, órganos o tejidos periféricos) y el estado del pez (Altimiras, et al. 1994; Rotllant & Tort, 1997; Montero, et al. 1999; Acerete, et al. 2004; Barton, et al. 2005). Durante la primera fase de activación del estrés agudo producido por perturbaciones sociales o confinamiento, las células inmunocompetentes de los tejidos linfoides, tales como el riñón anterior, el bazo o el timo, pueden mejorar la respuesta proliferativa o mitótica (Pickering et al. 1991; Pottinger et al. 1995; Demers & Bayne, 1997; Cubero, et al, 1997). Sin embargo, otros factores estresantes tales como el transporte o hacinamiento crónico y repetitivo, se ha demostrado que originan una importante disminución de la tasa mitótica (Maule, et al. 1989; Mazur, et al. 1993). Ya nos hemos referido a la capacidad del cortisol para disminuir o incluso suprimir la síntesis de células inmunes y los procesos que conducen a la producción y movilización de leucocitos en capítulos anteriores. La fase inicial de una respuesta al estrés por el sistema inmune es la activación de ciertas respuestas inespecíficas como es la apoptosis celular (Schreck & Tort, 2016). Pagniello et al, (2002), ya sugirieron en sus experimentos que la proliferación de macrófagos de la trucha arcoíris podría estar regulada por el cortisol y también por la dexametasona, y que este efecto estaría modulado por el microambiente celular, posiblemente a través de la liberación de citoquinas. Belosivech et al, (2006), observaron en doradas como los macrófagos ya maduros eran capaces de aumentar su número sin pasar por las fases tempranas. Es lo que llamaron autoproliferación (AP), y describieron como una “autorenovación” celular macrofágica controlada por factores de crecimiento endógeno de macrófagos (MGF) y también por una nueva forma soluble del receptor de CSF-1 (sCSF-1R). Por lo tanto, los monocitos se convierten en macrófagos residentes en diferentes tejidos con una activación macrofágica (AM) y mostrando una gran heterogeneidad en cuanto a su comportamiento. Esta autosuficiencia en el desarrollo (AP), también se ha observado en peces que carecen de genes c-myb funcionales, lo que demuestra el desarrollo de los macrófagos en diversos tejidos y en ausencia de 154 hematopoyesis, ya que estos genes están relacionados con el metabolismo y diferenciación celular (Soza-Ried et al., 2010). Maule & Schreck (1991), observaron en otros salmónidos (Oncorhynchus kisutch) expuestos a dietas suplementadas con cortisol, un aumento en el número de leucocitos en el timo y en el riñón anterior, mientras que, en otros órganos (bazo), disminuía el número de leucocitos. También hay que reseñar, que, en situaciones de estrés, se produce una redistribución general de los leucocitos (revisado por Yada & Tort, 2016). El estrés agudo estimularía la producción de células en el pronefros, incluidos eritrocitos y leucocitos, lo que resultaría en un aumento de los leucocitos circulantes para su distribución por los tejidos diana (Dhabhar, 2002). Debido a la continua activación del eje hipotálamo-pituitario-suprarrenal (HHI) como consecuencia del estrés continuo, la movilización inicial y posterior distribución de las subpoblaciones de leucocitos en sangre sería seguida por una disminución general en el número de leucocitos circulantes, que sería dependiente de la intensidad y duración del estrés. Los leucocitos, tenderían entonces a concentrarse en los órganos afectados (diana) y, por lo tanto, los órganos centrales, así como la sangre, mostrarían una disminución en el número de estas células (Dhabhar, 2002; Tort, 2011). Según el recuento obtenido a las 4hpi en ambos grupos (ver Tabla 10), el número de células se vio significativamente aumentado en el grupo C, mientras que el grupo S mostró valores similares a los iniciales, lo que indicaría que, en este periodo, los efectos del estrés son capaces de modificar notablemente la capacidad de proliferación del grupo sometido a crowding, bajo los efectos del cortisol, ya que impidieron una proliferación activa. Hodgkinson et al, (2015), describieron como los glucocorticoides (in vitro) y el cortisol (in vivo) eran capaces de anular la respuesta efectora en los macrófagos, induciendo una inhibición de las respuestas proinflamatorias y aumentado la síntesis de citoquinas moduladoras, como la IL-10. Esta citoquina antinflamatoria es producida por prácticamente todos los leucocitos y es generada por macrófagos en respuesta a la participación de receptores tipo Toll (TLR), glucocorticoides y señalización de lectina tipo C (Martínez & Gordon, 2014). Debido al efecto del cortisol generado por los animales en respuesta al factor estresante crowding, la producción de citoquinas antiinflamatorias aumentaría, pudiendo promover la disminución de otras citoquinas proliferativas como ha descrito Tort (2011). Es evidente que casi todos los tipos de células del sistema inmune se ven afectados por los glucocorticoides (Ehrchen et al, 2007), pero los efectos supresores del cortisol se han descrito en leucocitos cuando éstos se encuentran en unos órganos a diferencia de cuando están en otros (Fast et al, 2008; Philip et al, 2012, Khansari et al, 2019). Además, la administración de cortisol, ha sido capaz de suprimir la respuesta inmune a nivel determinadas citoquinas en unas especies, pero no en otras. Así, Khansari et al, (2019), encontraron diferentes expresiones de genes de citoquinas como la IL-1β, TNF-ἀ, TGF-β1 o IL- 10 en hígado y bazo de truchas arcoíris, de doradas y de peces cebra, cuando eran sometidos a los efectos del estrés. Esto sugiere que el efecto de los glucocorticoides en los peces podría actuar de manera específica según el tejido en el que se encuentran esos leucocitos y también que podrían ser dependiente de la especie animal de la que se trate. El entorno de maduración de los monocitos y macrófagos en la zona anterior del riñón está bajo la acción paracrina directa de las hormonas del estrés como es el cortisol; esto ayudaría, según Maciuszek (2019), a que los macrófagos de esta zona (parte cefálica del riñón), se polaricen en la dirección alternativa (M2), lo que provocaría una disminución en la producción 155 de citoquinas proinflamatorias y un aumento de citoquinas como la IL-10, efecto que no observaron en los leucocitos del tronco renal. Además, se ha descrito también el efecto del cortisol (y sus receptores) como potenciador de la apoptosis de leucocitos (Weyts et al, 1998a b c), y de un aumento en los genes relacionados con esta apoptosis debido a situaciones de estrés (Du et al, 2014). Estos resultados podrían explicar por qué en nuestro caso el número de macrófagos no hubiese aumentado en el grupo S a las 4hpi, ya que podrían estar sometidos a una apoptosis parcial debido a los efectos inmediatos de esta hormona. Adelman y Martin, (2009), describieron como los glucocorticoides tienden a amortiguar la función inmune induciendo la apoptosis en los leucocitos, reduciendo la liberación de citocinas proinflamatorias como un efecto protector ante la enfermedad, y aumentando el letargo del animal para protegerse. De esta manera, la regulación a la baja de las citocinas inflamatorias por parte de los glucocorticoides también puede servir para disminuir los efectos de la enfermedad durante condiciones sociales estresantes, como podría estar pasando en los animales del grupo S al estar bajo un hacinamiento intenso. La adición de cortisol y LPS a los macrófagos da lugar a una disminución de citocinas proinflamatorias (Castillo et al., 2009, Maciuszek et al, 2019). En este sentido, Castro et al, (2011), observaron como el cortisol también era capaz de activar ciertas funciones macrofágicas para resolver la inflamación. A nivel genómico, MacKenzie et al, (2006 a), observaron como cuando los macrófagos se tratan con LPS más cortisol, la expresión de los genes implicados en el proceso inflamatorio se regulaba en su mayoría a la baja y se recuperaban algunas de las actividades celulares básicas (metabolismo energético, biosíntesis de proteínas y citoesqueleto). Esto también podría explicar por qué los macrófagos del grupo S, bajo los efectos del cortisol, estarían más condicionados desde el principio a una menor proliferación inmediata al contacto con las bacterias en nuestro experimento. Otros autores han descrito una disminución en la supervivencia de macrófagos de peces bajo situaciones estresantes al ponerse en contacto con ciertas bacterias, como Aeromonas salmonicida (Fast et al, 2008). En nuestro caso, el número de macrófagos sometidos a crowding podrían no aumentar a las 4hpi al estar afectados por los efectos del cortisol y ser más susceptibles a las bacterias utilizadas en el trabajo, aunque nosotros no hemos podido detectar el descenso descrito por estos autores, aunque sí una falta de proliferación de éstos en este punto. Algo similar ha sido demostrado recientemente en macrófagos de carpas por Wentzel et al, (2020). Los macrófagos de las truchas control, en las que sus niveles de cortisol se mantuvieron siempre dentro de los límites fisiológicos, mostraron una mayor capacidad inicial de auto proliferación al ponerlos en contacto con los patógenos, posiblemente debido a la acción de citoquinas proinflamatorias con efectos proliferativos producidas como respuesta a esa “agresión” bacteriana (Hodgkinson et al, 2015). Esto podría indicar que este tipo de citoquinas se estarían produciendo de forma activa en estas células y que, además, se podrían unir sin restricciones a sus receptores específicos, los cuales también parecen estar operativos. Los factores estimulantes de colonias (CSF) son un grupo de citocinas fundamentales para la hematopoyesis de las células sanguíneas, la modulación de sus respuestas funcionales, así como el mantenimiento de la homeostasis y la competencia inmunitaria general. Incluirían el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF o CSF-1), el factor estimulante de colonias de 156 granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor estimulante de colonias múltiples, conocido como interleucina-3. Dentro de estas citoquinas estimulantes de colonias, la CSF-1 es una citoquina proinflamatoria con efectos directos sobre la proliferación, supervivencia y desarrollo de los macrófagos, capaz de ser sintetizada por ellos mismos y tener efectos directos sobre ellos (Praloran, 1991). Es interesante notar que una variedad de citocinas inflamatorias puede regular al alza la expresión de estas citoquinas en fagocitos mononucleares, lo que sugiere que la CSF-1 específicamente puede jugar un papel importante en la proliferación local y/o respuestas funcionales, además de aumentar actividades quimiotácticas, fagocíticas y destructoras de los macrófagos (revisado por Barreda et al, 2005). Los efectos de estas citoquinas promoverían en estas células una rápida y efectiva proliferación desde el primer momento, como indican nuestros resultados desde las 4hpi en este grupo. Hodgkinson et al, (2015), demostraron como la exposición de los macrófagos a un desafío antigénico (bacteriano en este caso), era capaz de promover un comportamiento efector en estas células, con respuestas Th1, con predominio de la síntesis de citoquinas proinflamatorias, una depleción de nutrientes celulares y unas respuestas efectivas de ROS y NO⁻ para la digestión y eliminación de los antígenos. También generarían una activación del reclutamiento y proliferación de los macrófagos para hacer frente al desafío antigénico en algunos órganos diana (Dhabhar 2002), como muestra la proliferación de los macrófagos en este grupo no estresado a las 4hpi. Se ha descrito la función de la citoquina estimuladora de macrófagos (CSF-1 o M-CSF) como principal regulador de la supervivencia, proliferación y diferenciación de macrófagos y sus precursores (Stanley et al., 1994; Fixe et al., 1997) y su efecto sobre la capacidad para formar sinergias con otras citoquinas y mediar en la proliferación hematopoyética temprana de las células progenitoras (Praloran, 1991). A diferencia de los macrófagos de mamíferos, que dependen de otras células para producir CSF-1, los monocitos y macrófagos de los peces son capaces de producir CSF-1 ellos mismos, luego actúan de manera autocrina induciendo una mayor proliferación y diferenciación de células mieloides (van der Vaart et al., 2012). El receptor de esta citoquina, CSF-1R, es una tirosina quinasa de gran afinidad que se encuentra principalmente en los macrófagos y juega un papel importante en los efectos que este mediador inmune produce sobre estas células. La expresión selectiva del CSF-1R también lo hace muy útil en la identificación de macrófagos y sus progenitores hematopoyéticos. La CSF-1 estimula la proliferación, diferenciación y supervivencia de progenitores hematopoyéticos a través de la vía de diferenciación de los macrófagos (Belosevic et al, 2006). Esto estaría respaldado por el análisis del crecimiento de macrófagos en una variedad de modelos in vitro e in vivo, donde la administración de CSF-1 en mamíferos conduce a un aumento de hasta 10 veces los monocitos circulantes, así como de los macrófagos en algunos órganos diana (Hume et al, 1988). Por su parte, los receptores específicos de los macrófagos también pueden estar restringidos por diferentes sistemas que incluyen la internalización activa y la degradación de los complejos ligando-receptor, la regulación de las vías de transducción de señales tras la unión de la citoquina con su receptor, así como la inducción de mecanismos de retroalimentación negativa que implicarían la liberación de factores inhibidores al receptor, como es el factor soluble regulador sCSF-1R (revisado por Barreda et al, 2005). Se ha demostrado que este factor soluble del receptor para esta citoquina (sCSF-1R), es capaz de regular negativamente la expresión, proliferación y diferenciación de macrófagos en peces óseos a través de su unión competitiva con CSF-1, lo que impediría la unión de esta citoquina a su receptor especifico en la superficie 157 del macrófago, interrumpiéndose así la señalización de CSF-1 y los efectos posteriores en macrófagos de teleósteos (Rieger et al, 2014). Además, se ha comprobado que este sCSF-1R, aparte de disminuir las funciones fagocíticas del macrófago, puede producir también un aumento de los fenómenos de apoptosis en estas células (Barreda et al, 2005) y recientemente, se ha descrito que este receptor soluble está altamente regulado por macrófagos en presencia de células apoptóticas en los teleósteos (Rieger et al, 2014), pudiendo estar condicionando la falta de proliferación en el grupo S por este motivo. De acuerdo con Rieger et al, (2014), la adición de sCSF-1R recombinante purificado al desarrollo de cultivos primarios de macrófagos conduce a una disminución en la proliferación de macrófagos e inhibe las funciones antimicrobianas de los macrófagos, incluidas la quimiotaxis, la fagocitosis y la producción de intermedios de oxígeno reactivo. Estos estudios en macrófagos in vitro, parecen demostrar que los macrófagos del riñón en doradas, serían capaces de expresar selectivamente sCSF-1R durante la fase de senescencia, lo que correspondería a una etapa definida del desarrollo del cultivo, donde la inhibición de la proliferación de macrófagos y la muerte celular apoptótica serían prominentes (Rieger et al., 2014). Esto se correspondería, en nuestro estudio, con los datos obtenidos a las 4hpi en el grupo S, donde los receptores CSF-1R en estos macrófagos podrían estar sometidos a este factor soluble del receptor promovido por el estrés. Igualmente, estos autores afirman que los cultivos de macrófagos primarios que experimentaron una proliferación activa, mostraron niveles bajos de expresión de sCSF-1R, como parece ser el caso de nuestro grupo C, los cuales parecen presentar receptores a la CSF-1 viables sin bloquear por sCSF-1 R. Estos autores comprobaron también in vivo, que este sCSF-1R era capaz de reducir la inflamación, inhibir la síntesis de esta CSF-1, disminuir el reclutamiento de macrófagos a la zona de infección y de la producción de ROS, dependientes de la dosis en estas células (Rieger et al, 2014). Así podemos asumir también que el efecto de ese factor soluble del receptor de CSF-1 en el grupo S, podría alterar la proliferación de macrófagos en este grupo al impedir una acción directa de esta citoquina proliferativa por no poderse unir a su receptor. A las 24hpi del experimento, los macrófagos de ambos grupos (S y C) presentaron unos recuentos celulares significativamente más altos que a las 4hpi, lo que denotaría una buena producción de las citoquinas estimuladoras de colonias en esta parte final del mismo, tanto en el grupo C como también en el S. Por tanto, observamos como en los macrófagos del grupo sometido a crowding, tras el contacto de estos con las bacterias y sobrepasar la primera etapa de falta de proliferación, también se produce un aumento tardío en el número de los mismos, en la línea de autores como Dhabhar (2002), quien describe un aumento en la proliferación de los macrófagos al ponerse en contacto con las bacterias. Si bien en nuestro caso, el incremento se produce de una forma más retardada a la observada en el grupo C, aunque al final el número de estas células aumenta significativamente con respecto al inicial. En estudios in vivo, se ha observado como otros parámetros del estrés, como la hormona de crecimiento y la prolactina, son capaces de recuperar recursos después de situaciones de estrés, lo que permite realizar funciones reguladoras en tejidos inmunes y endocrinos (Huising et al, 2007). Dicha modulación puede ejercerse como resultado de una acción compensatoria de la actividad supresora del cortisol, con lo que el eje somatotrópico podría actuar como compensatorio del corticotrópico. Yada et al., (2005), observó como el cortisol era capaz de estimular la síntesis de hormona de crecimiento en truchas arcoíris y que esta hormona, junto con la prolactina y la somatolactina, generan en situaciones de estrés agudo, inmunoestimulación a nivel de fagocitosis, síntesis de anticuerpos, aumento capacidad bacteriolítica de leucocitos y de la actividad del complemento 158 en salmónidos (Yada et al, 2002, Cuesta et al, 2006) En la trucha, la expresión del gen ARNm de la hormona de crecimiento en el sistema inmune ha sido descrita en diferentes leucocitos (Calduch-Giner y Pérez-Sánchez, 1999, Yang et al., 1999, Yada et al. , 2001; Yada et al, 2002), lo que indicaría que podría actuar de forma paracrina y por tanto, ser sintetizada por estos propios leucocitos para contrarrestar los efectos del cortisol (Yada, 2007), actuando de forma compensatoria a los efectos de éste, produciendo proliferación de estas células en el grupo S a término del estudio (24hpi). Las conexiones entre las citoquinas, los glucocorticoides y el sistema inmune son bidireccionales, con citoquinas inflamatorias que inducen la liberación de glucocorticoides y, por lo tanto, actuando como freno a la inflamación sistémica (Dantzer, 2004). Todo esto demostraría como la conexión neuro-inmune-endocrina es clave para una respuesta integrada y completa al estrés (Tort, 2011). El índice de proliferación obtenido a las 24hpi en el grupo S es de un 124%, el cual es notablemente inferior al conseguido por el grupo control (174%) desde el inicio del experimento. Esto indicaría que este grupo control, además de no estar sometido a las restricciones propias para su multiplicación debidas principalmente al cortisol, podría presentar un mayor número de macrófagos activos sintetizando citoquinas estimulantes de colonias, las cuales actuarían sin restricción de sus receptores y sin acción de factores solubles que pudieran modificarlas (sCSF-1R) desde el principio, como muestran los resultados a las 4hpi, pudiendo también existir un bucle positivo por el cual se retroalimentaría esta proliferación activa en este grupo control durante más tiempo, desde el primer momento, a diferencia del grupo S donde éstos aumentan solo en la parte final del mismo, cuando los efectos del cortisol han sido compensados. Kepka et al, (2013), observaron en carpas, que la inyección de zimosán y adrenalina (catecolamina producida bajo estrés) reducía el porcentaje de monocitos/macrófagos 24h después del tratamiento, como refleja en nuestro caso el grupo S a término del trabajo en comparación con los producidos en el grupo C. Resumiendo, nuestros resultados parecen demostrar que las truchas sometidas a un factor de estrés agudo como es el crowding, ven disminuida la capacidad de proliferación de sus macrófagos renales con respecto a las que no están sometidas a este hacinamiento, ya sea por una menor cantidad de CSF-1, por un bloqueo de sus receptores por otros factores solubles o por ambos factores. Además, esta pérdida de la capacidad de proliferación se produce, sobre todo al principio y, aunque luego son capaces de reestablecer un correcto funcionamiento del eje CSF-1/CSF-1R, ya no son capaces de alcanzar resultados similares a los alcanzados en el grupo no sometido a crowding. 159 5.3.3 RESULTADOS PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES En el capítulo anterior hemos descrito cómo el número de macrófagos de truchas del grupo C se incrementaba a las 4hpi, mientras que en el grupo S ese número se mantenía prácticamente invariable. La multiplicación de los macrófagos se produce como respuesta a la producción de distintas citoquinas o mediadores celulares estimulantes de colonias, como es el CMSF o el CSF-1, entre otros. Estos mediadores, una vez producidos por macrófagos estimulados, se excretarían al medio externo induciendo un aumento en la multiplicación de los macrófagos. Por tanto, si esa estimulación se produjera, los factores responsables se encontrarían en el medio de los pocillos. Para poder comprobarlo, procedimos a obtener el medio de los pocillos de macrófagos a las 4hpi con el agente bacteriano, tanto del grupo S como del C. Ese sobrenadante se utilizaba para incubar macrófagos de los dos grupos tal como hemos descrito en el capítulo correspondiente de material y métodos (capítulo 4.10). S´-S4hpe S´-C4hpe C´-S4hpe C´-C4hpe 4,20E+05 5,60E+05 7,80E+05 8,00E+05 1,08E+06 1,30E+06 1,68E+06 1,96E+06 2,58E+06 2,26E+06 2,08E+06 2,22E+06 1,55E+06 1,81E+06 2,22E+06 1,91E+06 1,70E+06 1,53E+06 2,14E+06 1,71E+06 9,90E+05 1,07E+06 1,21E+06 1,30E+06 9,60E+05 1,11E+06 1,16E+06 1,15E+06 7,50E+05 1,05E+06 1,33E+06 1,55E+06 8,10E+05 8,40E+05 1,29E+06 1,12E+06 S´-S4hpe: 1,20E+06 S´C4hpe: 1,28E+06 C´-S4hpe: 1,54E+06 C´-C4hpe: 1,52E+06 S0h: 1,36E+06 C0h: 1,24E+06 S0h: 1,36E+06 C0h: 1,24E+06 Tabla 11. Recuento de macrófagos en ambos grupos (S y C) tras añadirles sobrenadantes procedentes de macrófagos estresados (S´) y tranquilos (C´), a las 4h post exposición. Medias en negrita. Última fila, resultados iniciales (0h). S´-S4hpe: es el recuento de macrófagos de truchas estresadas a las 4h post exposición a los que se les añade sobrenadante de macrófagos de truchas estresadas en contacto previo con bacteria. S´-C4hpe: es el recuento de macrófagos de truchas control a las 4h post exposición a los que se añade sobrenadante de células de truchas estresadas en contacto previo con bacterias. C´-S4hpe: es el 160 recuento de macrófagos de truchas estresadas a las 4h post exposición a las que se añade sobrenadante de macrófagos de truchas no estresadas en contacto previo con bacterias. C´-C4hpe: es el recuento de macrófagos de truchas control a las 4h post exposición a las que se añade el sobrenadante de macrófagos de truchas no estresadas en contacto previo con bacterias. Figura 29. Porcentaje de recuento de macrófagos de los grupos S y C tras añadirles sobrenadantes procedentes de macrófagos infectados estresados (S´) y tranquilos (C´) a las 4h post exposición. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 11. De acuerdo con los mismos, la utilización del sobrenadante de los macrófagos S no produce ningún efecto significativo (p>0.05) sobre el número de macrófagos de ambos grupos. De hecho, en la Figura 29 puede observarse como en los macrófagos S incubados con el sobrenadante de macrófagos S´ expuestos a la bacteria, lo que se observa es un descenso significativo de casi el 12% en el número de los mismos (88.24%). Por el contrario, en el caso de los macrófagos C incubados con sobrenadante de macrófagos S´ expuestos a la bacteria, el número prácticamente permanece igual (103.23%). Por otra parte, al utilizar el sobrenadante de macrófagos C´, se puede observar (Tabla 11) un incremento significativo (p<0.05) del número de macrófagos C, tal como cabía esperar de acuerdo con los resultados ya comentados (22.58%, Figura 29). Sin embargo, en este caso y de forma sorprendente, también se observa un incremento significativo en el número de macrófagos S tras ser incubados con el sobrenadante de macrófagos C´ expuestos al agente bacteriano (13.24%, según Figura 29). Estos resultados parecen indicar que, tal como sospechábamos inicialmente, existe algún factor soluble presente en el sobrenadante de los macrófagos que es capaz de estimular la multiplicación de los macrófagos. Si bien, no podemos descartar algún efecto sobre los receptores de dichas sustancias, ya que los resultados de los macrófagos S expuestos al sobrenadante de macrófagos C´ son inferiores a los obtenidos con los macrófagos C en idénticas condiciones (13.24% con macrófagos S y 22.58% con macrófagos C). 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140% S0h S´-S4hpe C´-S4hpe C0h S´-C4hpe C´-C4hpe Proliferación macrófagos (con sobrenadantes) 161 5.3.4 DISCUSIÓN PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES La proliferación de macrófagos en órganos distantes está condicionada directamente por un factor inmunológico a través de la formación y acción de citoquinas proliferativas (como es la CSF-1), pero también existen factores que inhiben la función de estas citoquinas impidiendo la unión a sus receptores naturales en estas células (CSF-1R) (Barreda et al, 2005). En el capítulo anterior, observamos como un estrés agudo era capaz de alterar la capacidad proliferativa de los macrófagos renales en el grupo S a las 4hpi, a diferencia de lo que ocurría en el grupo C en el que se conseguían también mejores resultados al final del experimento (24hpi). En nuestro caso, al añadir sobrenadantes donde se pudieran encontrar citoquinas (CSF-1) en mayor o menor proporción producidas por los macrófagos expuestos ante un desafío bacteriano, los resultados obtenidos nos deberían indicar si la ausencia de proliferación temprana en este grupo sometido a crowding, a diferencia de lo encontrado en el grupo control, pudiera deberse bien a una escasez de citoquina en ese medio, a alguna modificación en los receptores de esos macrófagos o a la combinación de ambos factores. Autores como Castillo et al, (2009), estudiaron como el cortisol secretado en estrés de carácter agudo, provocaba una disminución de citoquinas secretadas por los macrófagos (TNF-α, IL-1β, IL-6 y TGF-β1), pero se ha visto que algunas funciones principales de éstos, como la fagocitosis, por ejemplo, siguen siendo eficaces (Tort, 2011). Los patógenos, son reconocidos por los receptores de reconocimiento de patógenos (PRR) que se encuentran en las células del sistema inmunitario, incluidos los linfocitos, los macrófagos y los neutrófilos. Los componentes solubles de los compartimentos celulares, como son endosomas, lisosomas y endolisosomas (Akira et al, 2001), se activan haciendo un gasto alostérico de energía (Tort, 2011). Una vez reconocidos los patógenos, las células del sistema inmune van a producir una serie de moléculas que servirán como señales para activar la respuesta del organismo para hacer frente al patógeno. Entre esas moléculas producidas se encuentran las citocinas o citoquinas (Yada, 2007). La cabeza del riñón juega un papel central en la organización de la respuesta al estrés implicando una estrecha comunicación entre los tres sistemas regulatorios, el nervioso, el endocrino y el inmunológico (revisado por Gorissen & Flick, 2016). La expresión de mediadores inmunes en las células de la parte anterior del riñón en los peces teleósteos está influenciada por las hormonas relacionadas con el estrés, lo que indica que el sistema endocrino juega un importante papel en la modulación de la respuesta inmune en estos animales ante situaciones estresantes (Castillo et al., 2009). El cortisol o glucocorticoides alternativamente, provocan una inhibición de respuestas Th1, traducido en una modulación a la baja en la síntesis de citoquinas proinflamatorias (Elenkov & Chrousus, 1999; Borghetti et al, 2009). Al analizar el grupo de macrófagos procedentes de truchas control (C), a los que suponemos con receptores no modificados por la respuesta del eje HHI para su unión a los mediadores extracelulares al no estar sometidos a los efectos del factor estresante, se puede observar como el recuento de los mismos aumenta únicamente un 3% al añadirles sobrenadante procedente de macrófagos S´ en contacto previo con bacterias, lo que resulta inapreciable con respecto al recuento de estos mismos macrófagos sin estimular (C0). Esto parecería indicar que el sobrenadante de los macrófagos S´, no contendría citoquinas suficientes para estimular la 162 proliferación de estas células. Sin embargo, si a estos mismos macrófagos les añadimos sobrenadante procedente de macrófagos C´, es decir de macrófagos no estresados previamente en contacto previo con bacterias, se obtienen índices de proliferación del 22.6% (p<0.05). Esto confirmaría la presencia de mayores cantidades de citoquinas en los medios procedentes de los macrófagos no estresados por crowding (C´) que en los sometidos a este factor de estrés agudo (S´), cuando responden a una infección bacteriana. Por su parte, la utilización de macrófagos de truchas sometidas a crowding, podría indicarnos la afectación de sus receptores por los efectos del estrés agudo. Al añadir a estos macrófagos S, el sobrenadante procedente de macrófagos de truchas también estresadas (S´), el recuento de macrófagos disminuye ligeramente un 12% (p<0.05), pero si el medio al que exponemos a esos macrófagos del grupo S es procedente de macrófagos de truchas no estresadas (C´), estos macrófagos aumentan un 13% (p<0.05). Si comparamos este aumento con el descenso conseguido al añadir suero S´ a esos mismos macrófagos, la diferencia entre ambos resultados parece confirmar la teoría de que este sobrenadante C´ poseería una mayor cantidad de citoquinas que el sobrenadante S´. Sin embargo, al obtenerse diferencias en el número de macrófagos S y C tras añadirles el sobrenadante C’, no podemos descartar completamente la existencia de algún efecto sobre los receptores. Pero sí parece evidente que, en caso de existir ese efecto sobre los receptores, éste no podría explicar por sí solo la ausencia de proliferación en los macrófagos S, ya que afectaría igual a estos macrófagos independientemente del sobrenadante (S’ o C’) que se les añadiera. En cualquier caso, el hecho de que el número de macrófagos S tras exponerse al sobrenadante C’ sea menor que el de los macrófagos C en las mismas condiciones, sí que parece indicar que existe algún efecto sobre los receptores. No obstante, al analizar el grupo de macrófagos procedentes de truchas control (C), a los que suponemos con receptores no modificados por la respuesta del eje HHI para su unión a citoquinas al no estar sometidos a los efectos del factor estresante, observamos como al añadirles sobrenadante S’ procedente de macrófagos de truchas estresadas en contacto previo con bacterias, el recuento de estas células aumenta únicamente un 3%, siendo inapreciable con respecto al número de macrófagos no estimulados (C0). Esto parece confirmar que este sobrenadante (S´) no contiene cantidades de citoquinas suficientes para inducir la proliferación de estas células. Tanto los tipos de células del sistema inmunitario como del endocrino comparten receptores comunes (Baigent, 2001). El cortisol tiene receptores en diferentes leucocitos y otros tipos de células y se ha demostrado que es capaz de modular la respuesta inmune (Harris & Bird, 2000b). Se han estudiado los efectos de la adrenalina, la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y el cortisol sobre la expresión de determinadas citoquinas proinflamatorias en células renales de besugo, mostrando una regulación a la baja en la expresión de estas citoquinas después de 2h de tratamiento (Castillo et al., 2009). Por el contrario, otros autores como Khansari et al, (2017ab), aseguran que el cortisol no muestra ningún efecto modulador significativo en la expresión de citoquinas en trucha arcoíris, mientras que, en el besugo, el cortisol sí que producía un efecto inhibidor sobre citoquinas proinflamatorias y anti-inflamatorias. La concentración de cortisol es de importancia relevante ya que se ha demostrado que los receptores de glucocorticoides (GR1 y GR2) en peces pueden responder a diferentes concentraciones de cortisol (Stolte et al., 2006; Sturm et al., 2011), lo que puede explicar las diferencias en la 163 respuesta observada entre la trucha arcoíris y el besugo no solo para las citoquinas, sino también para los patrones de expresión del gen del receptor de este glucocorticoide (GR). Nuestros resultados parecen confirmar lo expuesto por Tort (2011), ya que de acuerdo con este autor, estos resultados se deberían al efecto del cortisol sobre los macrófagos, haciendo que éstos disminuyan la producción de determinadas citoquinas implicadas en la proliferación, como podría ser CSF-1. No obstante, esta conclusión no se puede asegurar completamente hasta realizar una identificación y cuantificación de esta citoquina en ambos medios, aunque los resultados de esta prueba así lo sugieren. Durante la activación del sistema inmune o después de un proceso infeccioso, los glucocorticoides funcionan para modificar la respuesta inflamatoria y normalmente se considera como un mecanismo de ahorro de energía durante desafíos estresantes que implican mayores gastos de la misma. En este sentido, la interacción bidireccional entre el sistema neuroendocrino y el inmunológico parece ser indispensable y crucial para la integridad animal y hacer que el enfrentamiento a la invasión de patógeno acabe con éxito (Yada & Tort, 2016). 164 5.4 DISCUSIÓN INTEGRAL 165 Ya hemos hablado a lo largo de este trabajo, como diferentes autores han descrito como los factores estresantes, dependiendo de su duración e intensidad, pueden provocar una disminución de la capacidad de defensa ante patógenos del sistema inmune de los peces a distintos niveles (revisado por Yada & Tort, 2016), lo que se traduciría en un estado de inmunosupresión y, por tanto, en una mayor susceptibilidad a los patógenos. Los macrófagos constituyen la principal línea de defensa frente a los patógenos, así que era esperable que su acción se viera comprometida por un incremento de los niveles de estrés en los peces. En condiciones normales, peces no estresados, una vez localizados e identificados los patógenos, los macrófagos comienzan los procesos encaminados a su eliminación. Para ello, en primer lugar, van a endocitar al patógeno y se va a estimular la explosión respiratoria para la digestión y eliminación del material endocitado (Esteban & Messeguer, 1997; Hodgkinson et al, 2015; Grayfer et al, 2018). Además de esto, el contacto de los macrófagos con el agente infeccioso va a estimular la producción de diversos factores, muy probablemente citoquinas (Barreda et al, 2004; Yada, 2007) que van a excretarse al medio para estimular la proliferación de estas células, lo que se traduciría en un aumento de macrófagos preparados para enfrentarse al patógeno (Hodgkinson et al, 2015). Todo ello, conllevaría un ambiente hostil diseñado para la eliminación del agente infeccioso y cuyo fin sería eliminarlo o, al menos, disminuir el riesgo de que la infección se pudiera extender (Zhou et al, 2014). Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados, el aumento de los niveles de estrés en las truchas, y muy probablemente en todos los peces, afectaría por distintas vías a la capacidad de los macrófagos para enfrentar la entrada de un agente infeccioso. En primer lugar, la capacidad de los macrófagos para endocitar el agente infeccioso se ve disminuida, pero una vez en el interior del macrófago, el patógeno ve incrementada su posibilidad de supervivencia al encontrar disminuidos los fenómenos de digestión y eliminación de los macrófagos. Además, esta situación se ve agravada por el hecho de que también se ve afectada la capacidad de los macrófagos para incrementar su número en los primeros estadios de la infección, por lo que el patógeno tendría que enfrentarse a un menor número de células preparadas para su eliminación. Por tanto, las condiciones en las primeras fases de la infección serían claramente favorables a los patógenos, que podrían incrementar su número de tal manera que, una vez recuperada la capacidad de los macrófagos para proliferar, podrían encontrarse en clara ventaja para enfrentarse a ese incremento en el número de fagocitos. Así pues, en el caso de peces sometidos a estrés, las condiciones derivadas de ese estado conducirían a una situación en la que el hospedador tendría que enfrentarse a una mayor cantidad de patógenos que han sido capaces de penetrar en el mismo, lo que finalmente resultaría en mayores probabilidades de establecer y extender la infección en los peces afectados. Estos resultados, en líneas generales, están de acuerdo a los encontrados por otros autores a la hora de evaluar las condiciones que tienen este tipo de células para eliminar patógenos mediante la fagocitosis bajo condiciones estresantes. Como hemos citado anteriormente en cada capítulo, autores como Deane et al, (2001, 2006), Esteban et al, (2004) y Ortuño et al, (2001), encontraron menores tasas de fagocitosis en doradas, aunque este último no encontró este hecho asociado a un descenso de la explosión respiratoria cuando confinaban a sus animales, como si indican nuestro trabajo en truchas. Más recientemente, Kumar y Joy, (2019), también encontraron resultados parecidos 166 trabajando con peces gato en tratamientos con dexametasona y Maciuszek et al, (2019), igualmente los encontraron en carpas cuando eran sometidas a tratamientos con cortisol o ante una situación de estrés. Por su parte, autores como Pulsford (1995), o Esteban et al, (2004), encontraron menores tasas de estallido respiratorio en sus trabajos cuando los animales estaban sometidos a diferentes tipos de estrés, significando una pérdida clara en la capacidad de digerir a los patógenos fagocitados. De igual forma, Wang & Belosevic (1995), Watanuki et al, (2002) o Pijanowski et al, (2015), también observaron menores índices de producción de compuestos reactivos de oxígeno (ROS) en tratamientos con cortisol o sus análogos, produciendo de tal manera una disminución del potencial para eliminar bacterias en los animales bajo los efectos de esta hormona típica del estrés. Por otra parte, Esteban y Meseguer (1997), encontraron una relación directa entre la cantidad de bacterias eliminadas y el número de leucocitos expuestos, por lo que todo indica que esta desventaja numérica de los macrófagos procedentes de truchas bajo los efectos del estrés, provocaría una pérdida clara de capacidad para eliminar las bacterias, haciendo plausible que los macrófagos, como primera línea de defensa para estos patógenos, no pudieran detener la infección, permitiendo que ésta se propagara por el resto del organismo causando enfermedad. La proliferación de los macrófagos de la trucha arcoíris está regulada por el cortisol (Pagniello et al, 2002). Este autor vio como esta hormona inhibía el aumento de número de estas células en el riñón, aunque este proceso estaba modulado por la presencia de citoquinas en el medio. Fast et al, (2008), describieron una menor supervivencia de los macrófagos bajo situaciones estresantes, lo que daría ventaja a las bacterias para superar a estos fagocitos cuando proceden de animales estresados. Además, Grayfer et al, (2014), revisaron los mecanismos que utilizaban muchos patógenos para evadir la respuesta fagocítica de estas células, usando diversas estrategias para escapar del fagosoma e incluso sobrevivir y reproducirse en el citosol de los macrófagos. Cuando los macrófagos se encuentran debilitados bajo estas circunstancias, como puede ser por los efectos del cortisol o por algún efecto estresante crónico, se produce una disminución clara del poder bactericida de estas células para afrontar desafíos bacterianos. Autores como Collazos et al, (1994) o Le Morvan et al, (1995), observaron cómo altas temperaturas producían una disminución de producción de ROS durante la fagocitosis, y otros como Profeta et al, (2016), comprobaron que este descenso también puede ir asociado a ascensos bruscos de la temperatura. La aparición de enfermedades en todos los animales puede relacionarse con los efectos causados por el estrés, ya que el organismo deriva parte de la energía para resistir y superar esta situación que desafía al mantenimiento del equilibrio fisiológico, mientras que sistemas como el inmune se ven privados de ésta, situando a ese animal en desventaja para hacer frente a los patógenos (revisado por Yada & Tort, 2016). Schreck (2000), indicó que, si el factor estresante es agudo y no demasiado dañino, puede ocurrir una recuperación rápida de la homeostasis sin consumo de muchos recursos. Sin embargo, ante un factor estresante prolongado y crónico o uno agudo pero muy severo, el organismo puede que no sea capaz de restablecer el equilibrio homeostático y, por tanto, sea probable así la aparición de enfermedades infecciosas. En nuestro caso, las altas temperaturas como factor estresante de carácter crónico, donde los niveles de cortisol han sido compensados, así como el crowding como factor estresante agudo 167 pero severo, condicionarían una pérdida de carga alostática a nivel del sistema inmune innato que afectaría al comportamiento de los macrófagos renales de estas truchas en producción, impidiendo por tanto, que lleven a cabo con normalidad, sus funciones para enfrentarse a una infección bacteriana con garantías, siendo más probable la aparición de morbilidad y mortalidad por esta causa en la explotación. 168 6. CONCLUSIONES 169 1. La concentración de los peces durante 2 horas produce un aumento significativo de los niveles de cortisol y glucosa sanguíneos compatibles con situaciones de estrés agudo. Por el contrario, las variaciones de temperatura no implican que esos niveles aumenten por encima de los niveles considerados como normales o fisiológicos para la trucha arcoíris. 2. La magnitud de la explosión respiratoria de los macrófagos de trucha arcoiris se ve reducida por temperaturas del agua superiores a 15°C, así como por cambios bruscos de la misma y por la concentración durante 2 horas de los peces, lo que se traduce en una reducción significativa del arsenal bactericida de estas células. 3. La concentración durante 2 horas reduce la cantidad de bacterias fagocitadas por los macrófagos de trucha arcoíris, lo que implica una mayor cantidad de bacterias libres para producir la infección de los peces afectados. 4. La reducción de la explosión respiratoria debida a la concentración durante 2 horas también aumenta la cantidad de bacterias viables en el interior de los macrófagos de trucha arcoíris tras la fagocitosis, facilitando así la infección de estos peces. 5. La respuesta proliferativa de los macrófagos se ve ralentizada tras la concentración de las truchas arcoíris durante 2 horas, lo que se traduce en una menor cantidad de estas células para enfrentarse a los agentes bacterianos en las primeras horas tras la infección. 6. El retraso en el incremento del número de macrófagos renales en trucha arcoíris (respuesta proliferativa) tras una concentración de 2 horas parece inducido por una menor producción de factores solubles, probablemente citoquinas, aunque no puede descartarse que los receptores para esos factores no estén implicados. 7. En las truchas afectadas por fenómenos de estrés, los agentes infecciosos se encuentran, al menos en las fases iniciales de la infección, con condiciones más favorables para su supervivencia, lo que facilitaría su diseminación y aumentaría las probabilidades para que se produzca la infección. 170 7. BIBLIOGRAFÍA 171 Abós, B., Castro, R., Luque, A., González, L., & Tafalla, C. (2013). Heterogenity of IgM cells in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) tissues. Fish & Shellfish Immunology, 34(6), 1636. https://doi.org/10.1016/J.FSI.2013.03.007 Abram, Q. H., Dixon, B., & Katzenback, B. A. (2017). Impacts of low temperature on the teleost immune system. Biology, 6(4). https://doi.org/10.3390/biology6040039 Acerete, L., Balasch, J. C., Espinosa, E., Josa, A. and Tort, L. (2004). Physiological responses in Eurasian perch (Perca fluviatilis, L.) subjected to stress by transport and handling. Aquaculture, 237, 167-178. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2004.03.018 Adelman J.S, Martin L.B. (2009). Vertebrate behaviours: Adaptive and integrated neuroendocrine responses. In Biology PMI, editor. Integrative and comparative biology society symposium. Boston; p. 202–14. https://doi.org/10.1093/icb/icp028 Ainsworth, A.J., Dexiang, C., Waterstrat, P.R., Greenway, T. (1991). Effect of temperature on the immune system of channel catfish (Ictalurus punctatus).1 Leucocyte distribution and phagocyte function in the anterior kidney at 10 degrees C, Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. Vol 100 pag: 907-912. https://doi.org/10.1016/0300-9629(91)90313-2 Alberdi F Jr, Alderton M.R, Coloe P.J, Smith S.C. (1995a). Characterization of immunorelated peptides to porcidin P1. Immunol Cell Biol (1995) 73:505–10. doi:10.1038/icb.1995.80 Alberdi F Jr, Alderton M.R, Korolik V, Coloe P.J, Smith S.C. (1995b). Antibacterial proteins from porcine polymorphonuclear neutrophils. Immunol Cell Biol. (1995) 73:38–43. doi:10.1038/icb.1995.6 Alcorn, S.W., Murra A.L., Pascho R.J., (2002). Effects of rearing temperature on immune functions in sockeye salmon (Oncorhynchus nerka), Fish Shellfish Immunol. Vol 12, Pag 303-334. https://doi.org/10.1006/fsim.2001.0373 Alejo, A., & Tafalla, C. (2011). Chemokines in teleost fish species. Developmental and Comparative Immunology, 35(12), 1215–1222. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.03.011 Alexander, J.B. (1985). Non-immunoglobulin humoral defence mechanisms in fish. Fish Immunology. M.J. Manning y M.F. Tatner. Academic Press. Londres. 133-140. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-469230- 5.50014-3 Alexander, J. B., & Ingram, G. A. (1992). Noncellular nonspecific defence mechanisms of fish. Annual Review of Fish Diseases, 2(C), 249–279. https://doi.org/10.1016/0959-8030(92)90066-7 Akira S, Takeda K, Kaisho T, (2001). Toll-like receptors: Critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immunol 2: 675-680. https://doi.org/10.1038/90609 Akira, S; Takeda, K. (2004). Toll-like receptor signalling Nat. Rev. Immunol., 4 (7) (2004), pp. 499-511. https://doi.org/10.1038/nri1391 Altimiras, J., Champion, S. R., Puigcerver, M. and Tort, L. (1994). Physiological- responses of the gilthead sea bream Sparus aurata to hypoosmotic shock. Comparative Biochemistry and Physiology A-Physiology 108, 81-85. https://doi.org/10.1016/0300-9629(94)90058-2 Álvarez, F., Razquin, B. E., Villena, A. J., & Zapata, A. G. (1998). Seasonal changes in the lymphoid organs of wild brown trout, Salmo trutta L: A morphometrical study. Veterinary Immunology and Immunopathology, 64(3), 267–278. https://doi.org/10.1016/S0165-2427(98)00137-8 Anderson, D.P. (1992). Immunostimulants, adjuvants and vaccine carriers in fish: applications to aquaculture. Ann. Rev. Fish Dis., 2:281-307. https://doi.org/10.1016/0959-8030(92)90067-8 https://doi.org/10.1093/icb/icp028 https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.03.011 https://doi.org/10.1016/0959-8030(92)90066-7 https://doi.org/10.1038/nri1391 172 Andrews, N. W., Almeida, P. E., Carrotte, M. (2014). Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. Volume 24, Issue 12, December 2014, Pages 734-742. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2014.07.008 APROMAR. (2018). Informe La Acuicultura en España. Informe realizado por la Asociación Empresarial de Acuicultura de España (APROMAR). https://apromar.es/wp-content/uploads/2021/12/La-Acuicultura-en- Espana-2018.pdf APROMAR. (2020). Informe La Acuicultura en España. Informe realizado por la Asociación Empresarial de Acuicultura de España (APROMAR). https://apromar.es/wp-content/uploads/2021/12/La-Acuicultura-en- Espana-2020.pdf APROMAR. (2021). Informe La Acuicultura en España. Informe realizado por la Asociación Empresarial de Acuicultura de España (APROMAR). https://apromar.es/wp-content/uploads/2021/12/La-Acuicultura-en- Espana-2021.pdf Aquilino, C., Granja, A. G., Castro, R., Wang, T., Abos, B., Parra, D., Secombes, C. J., & Tafalla, C. (2016). Rainbow trout CK9, a CCL25-like ancient chemokine that attracts and regulates B cells and macrophages, the main antigen presenting cells in fish. Oncotarget, 7(14), 17547–17564. https://doi.org/10.18632/oncotarget.8163 Aragão, C., J. Corte-Real, B. Costas, M. T. Dinis, L. E. C. Conceição. (2008). Stress response and changes in amino acid requirements in Senegalese sole (Solea senegalensis Kaup 1858). Amino Acids, 34: 143-148. https://doi.org/10.1007/s00726-007-0495-2 Arason, G. J. (1996). Lectins as defence molecules in vertebrates and invertebrates. Fish and Shellfish Immunology, 6(4), 277–289. https://doi.org/10.1006/fsim.1996.0029 Arends, R. J., Rotllant, J., Metz, J. R., Mancera, J. M., Wendelaar Bonga, S. E., & Flik, G. (2000). α-MSH Acetylation in the pituitary gland of the sea bream (Sparus aurata L.) in response to different backgrounds, confinement and air exposure. Journal of Endocrinology, 166(2), 427–435. https://doi.org/10.1677/joe.0.1660427 Arkoosh, M. R., & Kaattari, S. L. (1991). Development of immunological memory in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). I. An immunochemical and cellular analysis of the B cell response. Developmental & Comparative Immunology, 15(4), 279–293. https://doi.org/10.1016/0145-305X(91)90021-P Arts, J. A. J., Tijhaar, E. J., Chadzinska, M., Savelkoul, H. F. J., & Verburg-van Kemenade, B. M. L. (2010). Functional analysis of carp interferon-γ: Evolutionary conservation of classical phagocyte activation. Fish and Shellfish Immunology, 29(5), 793–802. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.07.010 Avtalion, R.R. (1981). Environmental control of the immune response in fish. CRC Critical Reviews in Environmental Control, 11:163-188. https://doi.org/10.1080/10643388109381687 Baccari, G. C., Pinelli, C., Santillo, A., Minucci, S., & Rastogi, R. K. (2011). Mast Cells in Nonmammalian Vertebrates. An Overview. In International Review of Cell and Molecular Biology (Vol. 290). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-386037-8.00006-5 Baigent S.M. (2001). Peripheral corticotropin-releasing hormone and urocortin in the control of the immune response. Peptides 22: 809-820. https://doi.org/10.1016/S0196-9781(01)00395-3 Balasch, J.C and Tort, L. (2019). Netting the Stress Responses in Fish (rewiew). Frontiers in endocrinology. doi: 10.3389/fendo.2019.00062 Barcellos L.J.G., Nicolalewsky S, de Souza S.M.G, Luhlier F. (1999). Plasmatic levels of cortisol in the response to acute stress in Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.), previously exposed to chronic stress. Aquaculture Res; 30: 437–44. https://doi.org/10.1046/j.1365-2109.1999.00348.x https://doi-org.bucm.idm.oclc.org/10.1016/j.tcb.2014.07.008 173 Barreda, D. R., Hanington, P. C., & Belosevic, M. (2004). Regulation of myeloid development and function by colony stimulating factors. Developmental and Comparative Immunology, 28 (5), 509–554. https://doi.org/10.1016/j.dci.2003.09.010 Barreda, D.R; Hanington, P.C; Stafford, J.L; Belosevic, M. (2005). A novel soluble form of the CSF-1 receptor inhibits proliferation of self-renewing macrophages of goldfish (Carassius auratus L.). Developmental and Comparative Immunology. Volume 29. Issue 10. Page: 879-894. doi10.1016/j.dci.2005.02.006 Barreto, R. E., Volpato, G. L., & Pottinger, T. G. (2006). The effect of elevated blood cortisol levels on the extinction of a conditioned stress response in rainbow trout. Hormones and Behavior, 50(3), 484–488. https://doi.org/10.1016/j.yhbeh.2006.06.017 Barton, B. A., Schreck, C. B., & Fowler, L. G. (1988). Fasting and diet content affect stress-induced changes in plasma glucose and cortisol in juvenile chinook salmon1. Progressive Fish-Culturist, 50(1), 16–22. https://doi.org/10.1577/1548-8640050[0016:FADCAS]2.3.CO;2 Barton, B. A., & Iwama. G. K. (1991). Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids. Annual Review of Fish Diseases, 1: 3-26. https://doi.org/10.1016/0959-8030(91)90019-G Barton, B. A. (1997). Stress in finfish: past, present and future - a historical perspective. Fish stress and health in aquaculture. Editado por G. K. Iwama, A. D. Pickering, J. P. Sumpter, C. B. Schreck. Cambridge University Press, USA, pp. 1-33. www.cambridge.org/9780521281706 Barton, B. A. (2002). Stress in Fishes: A diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids 1. 42, 517–525. https://outlook.live.com/owa/?fid=flinbox&path=/attachmentlightbox Barton, B. A., Ribas, L., Acerete, L. and Tort, L. (2005). Effects of chronic confinement on physiological responses of juvenile gilthead sea bream, Sparus aurata L., to acute handling. Aquacult. Res. 36, 172–179. https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2004.01202.x Basu, N., Kennedy, C. J., & Iwama, G. K. (2003). The effects of stress on the association between hsp70 and the glucocorticoid receptor in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 134(3), 655–663. https://doi.org/10.1016/S1095-6433(02)00372-0 Bayne, C. J., & Gerwick, L. (2001). The acute phase response and innate immunity of fish. Developmental and Comparative Immunology, 25(8–9), 725–743. https://doi.org/10.1016/S0145-305X(01)00033-7 Bayne, C. J., & Levy, S. (1991). The respiratory burst of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, phagocytes is modulated by sympathetic neurotransmitters and the ‘neuro’peptide ACTH. Journal of Fish Biology, 38(4), 609–619. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1991.tb03147.x Beauregard, K.E., Lee, K.D., Collier, R.J., Swanson, J.A., (1997). PH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159–1163. https://doi.org/10.1084/jem.186.7.1159 Belosevic, M., Hanington, P. C., & Barreda, D. R. (2006). Development of goldfish macrophages in vitro. Fish & Shellfish Immunology, 20(2), 152–171. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2004.10.010 Bennet, A. M; Di Angelantonio, E; Ye, Z; Wensley, F; Dahlin, A; Ahlbom, A; Keavney, B; Collins, R; Wiman, B; de Faire, U; Danesh, J. (2007). Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk. JAMA-JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. Volume 298. Issue 11. Page 1300-1311. DOI10.1001/jama.298.11.1300. Bermejo-Poza, R., de la Fuente, J., Pérez, C., Lauzurica, S., González, E., Diaz, M. T., & Villarroel, M. (2015). The effect of intermittent feeding on the pre-slaughter fasting response in rainbow trout. Aquaculture, 443, 24–30. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2015.03.007 https://doi.org/10.1016/j.dci.2003.09.010 https://doi.org/10.1016/j.fsi.2004.10.010 https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2015.03.007 174 Bermejo-Poza, R., de La Fuente, J., Pérez, C., Lauzurica, S., González De Chávarri, E., Diaz, M. T., & Villarroel, M. (2016). Reducing the effect of pre-slaughter fasting on the stress response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Animal Welfare, 25(3), 339–346. https://doi.org/10.7120/09627286.25.3.339 Bernstein, R.M., S.F. Schluter, J.J. Marchalonis (1998). Immunity. The physiology of fishes. D.H. Evans. 2ª ed. CRC Press LLC. USA. 215-242. Bertrand, J.Y; Kim, A.D; Violette, E.P; Stachura, D.L; Cisson, J.L; Traver, D. (2007). Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. Volume 134. Issue 23. Page: 4147-4156 DOI10.1242/dev.012385 Blanco Cachafeiro, M. C. (1984). La Trucha: Cría Industrial. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid, España. 238 p.https://scholar.google.com/scholar_lookup?title=La%20Trucha%3A%20Cr%C3%ADa%20Industrial&pu blication_year=1995&author=M.C.%20Blanco%20Cachafeiro Blazer, V. S. (1991). Piscine macrophage function and nutritional influences: A review. Journal of Aquatic Animal Health, 3(2), 77–86. https://doi.org/10.1577/1548-8667(1991)003<0077:PMFANI>2.3.CO;2 Bly, J.E. y L.W. Clem (1991). Temperature mediated processes in teleost immunity: in vivo immunosuppression induced by in vivo low temperature in channel catfish. Vet. Immunol. Immunopathol., 28:365-377. https://doi.org/10.1016/0165-2427(91)90127-X Bly, J. E., Lawson, L. A., Dale, D. J., Szalai, A. J., Durborow, R. M., & Clem, L. W. (1992). Winter saprolegniosis in channel catfish. Diseases of Aquatic Organisms, 13(3), 155–164. https://doi.org/10.3354/dao013155 Bly, J.E. y L.W. Clem (1992). Temperature and teleost immune functions. Fish Shellfish Immunol., 2:159- 171. https://doi.org/10.1016/S1050-4648(05)80056-7 Bly, J. E., Quiniou, S. M., & Clem, L. W. (1997). Environmental effects on fish immune mechanisms. Developments in Biological Standardization, 90, 33–43. https://europepmc.org/article/med/9270832 Boardman, T., Warner, C., Ramirez-Gomez, F., Matrisciano, J., & Bromage, E. (2012). Characterization of an anti-rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) CD3 monoclonal antibody. Veterinary Immunology and Immunopathology, 145(1–2), 511–515. https://doi.org/10.1016/J.VETIMM.2011.11.017 Boeuf, G. & A. Medina. (1988). «Evolución de la piscicultura en Chile». La Pisciculture Française, 93: 3-23. Borghetti, P., Saleri, R., Mocchegiani, E., Corradi, A. and Martelli, P. (2009). Infection, immunity and the neuroendocrine response. Vet. Immunol. Immunopathol. 130, 141–162. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2009.01.013 Borregaard, N., Cowland, J.B., (1997). Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood 89, 3503–3521. https://www.researchgate.net/profile/Jack- Cowland/publication/14057283_Granules_of_the_Human_Neutrophilic_Polymorphonuclear_Leukocyte /links/0fcfd506c03db489ea000000/Granules-of-the-Human-Neutrophilic-Polymorphonuclear- Leukocyte.pdf Boshra, H., Li, J., & Sunyer, J. O. (2006). Recent advances on the complement system of teleost fish. Fish and Shellfish Immunology, 20(2), 239–262. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2005.04.004 Bowden T.J., Thompson, K.D., Morgan, A.L. Gratacap, R.M., Nikoskelainen, S. (2007). Seasonal variation and the immune response: a fish perspective, Fish Shellfish Immunol. 22, pag 695-706. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2006.08.016 Bowden, T. J. (2008). Modulation of the immune system of fish by their environment. Fish and Shellfish Immunology, 25(4), 373–383. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2008.03.017 Boyd, C.E. (2000). Water quality: An introduction. Kluwer Academic Publishers. https://doi.org/10.1007/978-3-03025335-8 175 Briggs, R.T., Drath, D.B., Karnovsky, M.L., Karnovsky, M.J., (1975). Localization of NADH oxidase on the surface of human polymorphonuclear leukocytes by a new cytochemical method. J. Cell. Biol. 67, 566– 586. https://doi.org/10.1083/jcb.67.3.566 Bromage, N., Porter, M., & Randall, C. (2001). The environmental regulation of maturation in farmed finfish with special reference to the role of photoperiod and melatonin. Aquaculture, 197(1–4), 63–98. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(01)00583-X Buddington, R. K., Krogdahl, A., & Bakke-McKellep, A. M. (1997). The intestines of carnivorous fish: Structure and functions and the relations with diet. Acta Physiologica Scandinavica, Supplement, 161(638), 67–80. https://europepmc.org/article/med/9421581 Caipang, C. M. A., Hynes, N., Puangkaew, J., Brinchmann, M. F., & Kiron, V. (2008). Intraperitoneal vaccination of Atlantic cod, Gadus morhua with heat-killed Listonella anguillarum enhances serum antibacterial activity and expression of immune response genes. Fish & Shellfish Immunology, 24(3), 314– 322. https://doi.org/10.1016/J.FSI.2007.11.018 Calduch-Giner, J. A & Pérez-Sánchez, J; (1999). Expression of growth hormone gene in the head kidney of gilthead sea bream (Sparus aurata). J. Exp. Zool., 283, pp. 326-330. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097- 010X(19990215)283:3<326::AID-JEZ10>3.0.CO;2-3 Camacho B., E., M. Moreno R., M. Rodríguez G., C. Luna Romo y M. Vásquez. (2000). Guía para el cultivo de trucha. Secretaría de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca. México D.F. 135p. https://scholar.google.com/scholar?hl=es&as_sdt=0%2C5&q=%29.+Gu%C3%ADa+para+el+cultivo+de+tr ucha.+Secretar%C3%ADa+de+Medio+Ambiente%2C+&btnG= Cannon, W. B. (1926). Physiological regulation of normal states: some tentative postulates concerning biological homeostatics. In A Charles Richet: ses amis, ses collegues, ses eleves (ed. A. Pettit), p. 91. Paris: Les Editions Medicales. https://scholar.google.com/scholar_lookup?title=Physiological%20regulation%20of%20normal%20state s%3A%20some%20tentative%20postulates%20concerning%20biological%20homeostatics&publication_ year=1926&author=W.B.%20Cannon Cannon, W. B. (1932). The Wisdom of the Body. New York, NY: W.W. Norton & Company, Inc. https://psycnet.apa.org/record/1939-15032-000 Canton, J. (2014). Phagosome maturation in polarized macrophages. Journal of Leukocyte Biology, 96(5), 729–738. https://doi.org/10.1189/jlb.1mr0114-021r. Carballo, M. y M.J. Muñoz (1991). Effect of sublethal concentrations of four chemicals on susceptibility of juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) to saprolegniosis. Appl. Environ. Microbiol., 57:1813-1816. https://doi.org/10.1128/aem.57.6.1813-1816.1991 Carballo, M., M.J. Muñoz, M. Cuellar y J.V. Tarazona (1995). Effects of waterborne copper, cyanide, ammonia, and nitrite on stress parameters and changes in susceptibility to saprolegniosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Appl. Environ. Microbiol., 61:2108-2112. https://doi.org/10.1128/aem.61.6.2108- 2112.1995 Castellani, M. L., Anogeianaki, A., Felaco, P., Toniato, E., de Lutiis, M. A., Shaik, B., Fulcheri, M., Vecchiet, J., Tetè, S., Salini, V., Ciampoli, C., & Cerulli, G. (2010). IL-34 a newly discovered cytokine. European Journal of Inflammation, 8(2), 63–66. https://doi.org/10.1177/1721727X1000800202 Castillo, J., Castellana, B., Acerete, L., Planas, J.V., Goetz, F.W., Mackenzie, S., et al., (2008). Stress-induced regulation of steroidogenic acute regulatory protein expression in head kidney of Gilthead seabream (Sparus aurata). J. Endocrinol. 196 (2), 313–322. DOI: 10.1677/JOE-07-0440 Castillo, J., Teles, M., Mackenzie, S. and Tort, L. (2009). Stress-related hormones modulate cytokine expression in the head kidney of gilthead seabream (Sparus aurata). Fish Shellfish Immunol. 27, 493–499. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2009.06.021 https://doi.org/10.1016/J.FSI.2007.11.018 https://doi.org/10.1189/jlb.1mr0114-021r https://doi.org/10.1177/1721727X1000800202 176 Castillo-Briceño, P., Sepulcre, M. P., Chaves-Pozo, E., Meseguer, J., García-Ayala, A., & Mulero, V. (2009). Collagen regulates the activation of professional phagocytes of the teleost fish gilthead seabream. Molecular Immunology, 46(7), 1409–1415. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2008.12.005 Castro, R., Zou, J., Secombes, C. J., & Martin, S. A. M. (2011). Cortisol modulates the induction of inflammatory gene expression in a rainbow trout macrophage cell line. Fish and Shellfish Immunology, 30(1), 215–223. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.10.010 Castro, R., & Tafalla, C. (2015). Overview of fish immunity. Mucosal Health in Aquaculture. Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417186-2.00002-9 Castro, R., Abós, B., González, L., Granja, A. G., & Tafalla, C. (2017). Expansion and differentiation of IgM+ B cells in the rainbow trout peritoneal cavity in response to different antigens. Developmental and Comparative Immunology, 70, 119–127. https://doi.org/10.1016/j.dci.2017.01.012 Chang, C. H; Zhou, X. W; Wang, Y. C; Lee, T. H. (2020). Differential effects of hypothermal stress on lactate metabolism in fresh water- and seawater-acclimated milkfish, Chanos chanos. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. Volume 248. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2020.110744 Cheng, A. C., Cheng, S. A., Chen, Y. Y., & Chen, J. C. (2009). Effects of temperature change on the innate cellular and humoral immune responses of orange-spotted grouper Epinephelus coioides and its susceptibility to Vibrio alginolyticus. Fish & Shellfish Immunology, 26(5), 768–772. https://doi.org/10.1016/J.FSI.2009.03.011 Cheng, S.A; Zhang, M; Sun, L. (2010). The iron-cofactored superoxide dismutase of Edwardsiella tarda inhibits macrophage-mediated innate immune response. Fish & Shellfish Immunology. Volume 29. Issue 6. Page: 972-978. DOI: 10.1016/j.fsi.2010.08.004 Cheng, C. H., Guo, Z. X., Luo, S. W., & Wang, A. L. (2018). Effects of high temperature on biochemical parameters, oxidative stress, DNA damage and apoptosis of pufferfish (Takifugu obscurus). Ecotoxicology and Environmental Safety, 150, 190–198. https://doi.org/10.1016/J.ECOENV.2017.12.045 Chimbor Mejía, C. R., (2001). Enfermedades en trucha arcoíris: Descripción y tratamiento. ACUAHOY. Informes. https://www.aquahoy.com/informe/11630-principales-enfermedades-en-la-trucha-arco-iris Cho, H.C., Kim, J.E., Kim, H.B., Baek, H.J. (2015). Effects of water temperature change on the hematological responses and plasma cortisol levels in growing of red spotted grouper, Epinephelus akaara. Dev. Reprod. 19 (2015) 19e24. doi: 10.12717/DR.2015.19.1.019 Chung, S., & Secombes, C. J. (1988). Analysis of events occurring within teleost macrophages during the respiratory burst. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 89(3), 539–544. https://doi.org/10.1016/0305-0491(88)90171-X Clem, L.W., E. Faulmann, N.W. Miller, C.F. Ellsaesser, C.J. Lobb y M.A. Cuchens (1984). Temperature- mediated processes in teleost immunity: diferential effects of in vitro and in vivo temperatures on mitogenic responses of channel catfish lymphocytes. Dev. Comp. Immunol., 8: 313-322. https://doi.org/10.1016/0145-305X(84)90038-7 Collazos, M. E., Ortega, E., & Barriga, C. (1994b). Effect of temperature on the immune system of a cyprinid fish (tinca tinca, l). Blood phagocyte function at low temperature. Fish and Shellfish Immunology, 4(3), 231–238. https://doi.org/10.1006/fsim.1994.1021 Colombe, L., Fostier, A., Bury, N., Pakdel, F. and Guiguen, Y. (2000). A mineralocorticoidlike receptor in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: cloning and characterization of its steroid binding domain. Steroids 65, 319–328. https://doi.org/10.1016/S0039-128X(00)00090-8 Cortes, R., Teles, M., Tridico, R., Acerete, L., Tort, L. (2013). Effects of cortisol administered through slow- release implants on innate immune responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), Int. J. Genom. 2013. 1–7, https://doi.org/10.1155/ 2013/619714. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2008.12.005 https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.10.010 https://doi.org/10.1016/J.FSI.2009.03.011 https://doi.org/10.1016/J.ECOENV.2017.12.045 https://doi.org/10.1006/fsim.1994.1021 177 Costas, B., C. Aragão, J. M. Mancera, M. T. Dinis, L. E. C. Conceição. (2008). High stocking density induces crowding stress and affects amino acid metabolism in Senegalese sole Solea senegalensis (Kaup 1858) juveniles. Aquaculture Research, 39: 1-9. https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2007.01845.x Costas, B., Conceicaõ, L., Aragaõ, C., Martos, J. A., Ruiz-Jarabo, I., Mancera, J. M., et al. (2011). Physiological responses of Senegalese sole (Solea senegalensis Kaup, 1858) after stress challenge: effects on non-specific immune parameters, plasma free amino-acids. Aquaculture 316, 68–76. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2011.03.011 Cubero, L. and Molinero, A. (1997). Handling, confinement and anaesthetic exposure induces changes in the blood and tissue immune characteristics of gilthead sea bream. Dis. Aquat. Org. 31, 89-94. DOI: 10.3354/dao031089 Cuchens M. A; Clem, W, (1977). Phylogeny of lymphocyte heterogeneity .2. differential effects of temperature on fish t-like and b-like cells. Cellular immunology. Volume 34. Page: 219-230. DOI 10.1016/0008-8749(77)90245-3 Cuesta, A., Ángeles Esteban, M., & Meseguer, J. (2006). Cloning, distribution and up-regulation of the teleost fish MHC class II alpha suggests a role for granulocytes as antigen-presenting cells. Molecular Immunology, 43(8), 1275–1285. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2005.07.004 Cuesta, A., Meseguer, J., & Esteban, M. A. (2008). The antimicrobial peptide hepcidin exerts an important role in the innate immunity against bacteria in the bony fish gilthead seabream. Molecular Immunology, 45(8), 2333–2342. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2007.11.007 Cyster, J. C. (1999). Chemokines and cell migration in secondary lymphoid organs. Science, 286(5447), 2098–2102. https://doi.org/10.1126/science.286.5447.2098 Dalvi, R. S., Das, T., Debnath, D., Yengkokpam, S., Baruah, K., Tiwari, L. R., & Pal, A. K. (2017). Metabolic and cellular stress responses of catfish, Horabagrus brachysoma (Günther) acclimated to increasing temperatures. Journal of Thermal Biology, 65, 32–40. https://doi.org/10.1016/J.JTHERBIO.2017.02.003. Dantzer, R. (2004). Cytokine-induced sickness behaviour: a neuroimmune response to activation of innate immunity. European Journal of Pharmacology Volume 500; Issue 1-3; Page: 399-411. DOI: 10.1016/j.ejphar.2004.07.040 Daye, P.G. & Garside, E.T. (1976). «Histopathologic changes in superficial tissues of brook trout Salvelinus fontinalis exposed to acute and chronic levels of pH». Can. J. Zool. 54: 2140-2155. https://doi.org/10.1139/z76-248 Deane, E. E., Li, J., & Woo, N. Y. S. (2001). Hormonal status and phagocytic activity in sea bream infected with vibriosis. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 129(2–3), 687–693. https://doi.org/10.1016/S1096-4959(01)00369-4 Deane, E. E., Zhou, L., & Woo, N. Y. S. (2006). Cortisol can be pro- or anti-apoptotic in sea bream cells: Potential role of HSP70 induction for cytoprotection. Molecular and Cellular Endocrinology, 259(1–2), 57– 64. https://doi.org/10.1016/j.mce.2006.08.006 De Boeck, G., D. Alsop, C. Wood. (2001). Cortisol effects on aerobic and anaerobic metabolism, nitrogen excretion, and whole-body composition in juvenile rainbow trout. Physiological and Biochemical Zoology, 74: 858-868. https://www.journals.uchicago.edu/doi/abs/10.1086/323796 De Kinkelin, P. (1995). Vaccination in fish. Veterinary Research, 26(3), 205–206. HAL Id: hal-02702140 https://hal.inrae.fr/hal-02702140 De la Haba, C; Morros, A; Martínez, P; Palacio, J. R. (2016). LPS-induced macrophage activation and plasma membrane fluidity changes are inhibited under oxidative stress. J Membrane Biol. 249:789–800. doi10.1007/s00232-016-9927-9 https://doi.org/10.1016/J.JTHERBIO.2017.02.003 178 De Leo, F. R., & Quinn, M. T. (1996). Assembly of the phagocyte NADPH oxidase: Molecular interaction of oxidase proteins. Journal of Leukocyte Biology, 60(6), 677–691. https://doi.org/10.1002/jlb.60.6.677 Demers, N. E., & Bayne, C. J. (1997). The immediate effects of stress on hormones and plasma lysozyme in rainbow trout. Developmental and Comparative Immunology, 21(4), 363–373. https://doi.org/S0145- 305X(97)00009-8 [pii]. Devashish K. (2016). Epizootic ulcerative fish disease syndrome. Elsevier Inc. Department of life Science Assam (central). University Silchar, India 294 p. https://scholar.google.es/scholar?hl=es&as_sdt=0%2C5&q=Epizootic+ulcerative+fish+disease+syndrom e.&btnG= Dexiang, C., & Ainsworth, A. J. (1991). Effect of temperature on the immune system of channel catfish (Ictalurus punctatus)—II. Adaptation of anterior kidney phagocytes to 10°C. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology, 100(4), 913–918. https://doi.org/10.1016/0300-9629(91)90314-3 Dhabhar, F. S. and McEwen, B. S. (2001). Bidirectional effects of stress and glucocorticoid hormones on immune function: possible explanations for paradoxical observations. Psychoneuroimmunology, vol. 1 (eds. R. Ader, D. L. Felten and N. Cohen), p. 301. San Diego: Academic Press. https://cir.nii.ac.jp/crid/1570291225533058944 Dhabhar, F. S. (2002). Stress-induced augmentation of immune function the role of stress hormones, leukocyte trafficking, and cytokines. Brain Behav. Immun. 16, 785–798. https://doi.org/10.1016/S0889- 1591(02)00036-3 Dhabhar, F. S. (2008). Enhancing versus suppressive effects of stress on immune function: implications for immunoprotection versus immunopathology. Allergy Asthma Clin. Immunol. 4, 2–11. https://doi.org/10.1159/000216188 Dhabhar, F. S. (2009). Enhancing versus suppressive effects of stress on immune function: Implications for immunoprotection and immunopathology. NeuroImmunoModulation, 16(5), 300–317. https://doi.org/10.1159/000216188 Dios, S., Romero, A., Chamorro, R., Figueras, A., & Novoa, B. (2010). Effect of the temperature during antiviral immune response ontogeny in teleosts. Fish & Shellfish Immunology, 29(6), 1019–1027. https://doi.org/10.1016/J.FSI.2010.08.006 Domínguez, M., Takemura, A., Tsuchiya, M., & Nakamura, S. (2004). Impact of different environmental factors on the circulating immunoglobulin levels in the Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Aquaculture, 241(1–4), 491–500. https://doi.org/10.1016/J.AQUACULTURE.2004.06.027 Domínguez, M., Takemura, A., & Tsuchiya, M. (2005). Effects of changes in environmental factors on the non-specific immune response of Nile tilapia, Oreochromis niloticus L. Aquaculture Research, 36(4), 391– 397. https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2005.01220.x Donaldson, E. M. (1981). The Pituitary-interrenal Axis as an indicator of Stress in fish. Stress and fish. Editado por A. D. Pickering. Academic Press, London, pp. 11-47. https://scholar.google.com/scholar?hl=es&as_sdt=0%2C5&q=The+Pituitary- interrenal+Axis+as+an+indicator+of+Stress+in+fish&btnG= Douxfils, J., Lambert, S., Mathieu, C., Milla, S., Mandiki, S. N. M., Henrotte, E., et al. (2014). Influence of domestication process on immune response to repeated emersion stressors in Eurasian perch (Perca fluviatilis, L.). Comp. Biochem. Physiol. A 173, 52–60. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2014.03.012 Doyon, C., V. L. Trudeau, T. W. Moon. (2005). Stress elevates corticotropinreleasing factor (CRF) and CRF- binding protein mRNA levels in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Endocrinology, 186: 123- 130. https://doi.org/10.1677/joe.1.06142 https://doi.org/10.1016/J.FSI.2010.08.006 179 Du, F., Xu, G., Nie, Z., Xu, P. and Gu, R. (2014). Transcriptome analysis gene expression in the liver of Coilia nasus during the stress response. BMC Genomics 15, 558. https://link.springer.com/article/10.1186/1471-2164-15-558 Dunier, M. y A.K. Siwicki (1993). Effects of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish Shellfish Immunol. 3:423-438. https://doi.org/10.1006/fsim.1993.1042 Dunier, M. (1996). Water pollution and immunosuppression of freshwater fish. Italian Journal of Zoology, 63(4), 303–309. https://doi.org/10.1080/11250009609356150 Duque Correa, M. A., & Rojas López, M. (2007). Alternative macrophage activation: The diversity of one cell involved in innate immunity in response to its environmental complexity | Activación alternativa del macrófago: La diversidad en las respuestas de una célula de la inmunidad innata ante la compl. Inmunologia, 26(2), 73–86. https://doi.org/10.1016/s0213-9626(07)70077-x Eddy, F. B. (2005). Ammonia in estuaries and effects on fish. Journal of Fish Biology, 67(6), 1495–1513. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.2005.00930.x Edholm, E.-S., Bengtén, E., Stafford, J. L., Sahoo, M., Taylor, E. B., Miller, N. W., & Wilson, M. (2010). Identification of two IgD+ B cell populations in channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of Immunology, 185(7), 4082–4094. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1000631 Eggset, G., Mikkelsen, H., & Killie, J. E. A. (1997). Immunocompetence and duration of immunity againstVibrio salmonicida and Aeromonas salmonicida after vaccination of Atlantic salmon (Salmo salar L.) at low and high temperatures. Fish & Shellfish Immunology, 7(4), 247–260. https://doi.org/10.1006/FSIM.1997.0080 Ekström, A., Sandblom, E., Blier, P. U., Cyr, B.-A. D., Brijs, J., & Pichaud, N. (2017). Thermal sensitivity and phenotypic plasticity of cardiac mitochondrial metabolism in European perch, Perca fluviatilis. Journal of Experimental Biology, 220(3), 386–396. https://doi.org/10.1242/jeb.150698. Eldridge, W.H., Sweeney, B.W., Law, J.M., (2015). Fish growth, physiological stress, and tissue condition in response to rate of temperature change during cool or warm diel thermal cycles. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 72, 1527-1537. https://doi.org/10.1139/cjfas-2014-035 Elenkov, I. J. and Chrousos, G. P. (1999). Stress hormones, Th1/Th2 patterns, pro/ anti-inflammatory cytokines and susceptibility to disease. Trends Endocrinol. Metab. 10, 359–368. https://doi.org/10.1016/S1043-2760(99)00188-5 Ellis, A. E. (1977). The leucocytes of fish: A review. Journal of Fish Biology, 11(5), 453–491. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1977.tb04140.x Ellis, A.E. (1981). Stress and the modulation of defence mechanisms in fish. Stress and Fish. A.D. Pickering (ed). Academis Press. Londres. 147-169. https://scholar.google.com/scholar_lookup?title=Stress%20and%20the%20modulation%20of%20defenc e%20mechanisms%20in%20fish&publication_year=1981&author=A.E.%20Ellis Ellis, A. E. (1987). Inhibition of the Aeromonas salmonicida extracellular protease by α2- macroglobulin in the serum of rainbow trout. Microbial Pathogenesis, 3(3), 167–177. https://doi.org/10.1016/0882-4010(87)90093-3 Ellis, T., Yavuzcan, H., Y., López-Olmeda, J., Maria, Spedicato, T., Lluis, T., Øverli, Ø., & Martins, C. I. M. (2012). Cortisol and finfish welfare. Fish, physhiology and biochemistry, vol 38, pages 163-188. https://doi.org/10.1007/s10695-011-9568-y. Elsasser, M.S., B.S. Roberson y F.M. Hetrick (1986). Effects of metals on the chemiluminescent response of rainbow trout (Salmo gairdneri) phagocytes. Vet. Immunol. Immunopathol., 12:243-250. https://doi.org/10.1016/0165-2427(86)90128-5 https://doi.org/10.1016/s0213-9626(07)70077-x https://doi.org/10.1007/s10695-011-9568-y 180 Enane, N. A., Frenkel, K., O’Connor, J. M., Squibb, K. S., & Zelikoff, J. T. (1993). Biological markers of macrophage activation: Applications for fish phagocytosis. Immunology, 80(1), 68–72. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1422119/ Engelsma MY, Huising MO, van Muiswinkel WB, Flik G, Kwang J, Savelkoul HFJ, et al. (2002). Neuroendocrine immune interactions in fish: a role for interleukin-1. Vet Immunol Immunopathol. 87: 467–79. https://doi.org/10.1016/S0165-2427(02)00077-6 Erikson, U., Sigholt, T., Rustad, T., Einarsdottir, I. E., & Jørgensen, L. (1999). Contribution of bleeding to total handling stress during slaughter of Atlantic salmon. Aquaculture International, 7(2), 101–115. https://doi.org/10.1023/A:1009236628690 Esteban, M.A., & Meseguer, J. (1994). Phagocytic defence mechanism in sea bass (Dicentrarchus labrax L.): An ultrastructural study. The Anatomical Record, 240(4), 589–597. https://doi.org/10.1002/ar.1092400416 Esteban, M. A., & Meseguer, J. (1997). Factors influencing phagocytic response of macrophages from the sea bass (Dicentrarchus labrax L.): An ultrastructural and quantitative study. Anatomical Record, 248(4), 533–541. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0185(199708)248:4<533::AID-AR5>3.0.CO;2-M Esteban, M. A., Rodriguez, A., Ayala, A. G., & Meseguer, J. (2004). Effects of high doses of cortisol on innate cellular immune response of seabream (Sparus aurata L.). General and Comparative Endocrinology, 137(1), 89–98. https://doi.org/10.1016/J.YGCEN.2004.02.006. Esteban, M. A., Cuesta, A., Chaves-Pozo, E., & Meseguer, J. (2015). Phagocytosis in Teleosts. Implications of the new cells involved. Biology, 4(4), 907–922. https://doi.org/10.3390/biology4040907 Evans, E., Heinrich, V., Ludwig, L., Rawicz. W. (2003). Dynamic Tension Spectroscopy and Strength of Biomembranes. Biophysical Journal Volume 85, Issue 4, October 2003, Pages 2342-2350. https://doi.org/10.1016/S0006-3495(03)74658-X Evans, J. J., Shoemaker, C. A., & Klesius, P. H. (2003). Effects of Sublethal Dissolved Oxygen Stress on Blood Glucose and Susceptibility to Streptococcus agalactiae in Nile Tilapia Oreochromis niloticus. Journal of Aquatic Animal Health, 15(3), 202–208. https://doi.org/10.1577/H03-024 Falk, K., Namork, E., Rimstad, E., Mjaaland, S., & Dannevig, B. H. (1997). Characterization of infectious salmon anemia virus, an orthomyxo-like virus isolated from Atlantic salmon (Salmo salar L.). Journal of Virology, 71(12), 9016–9023. https://doi.org/10.1128/jvi.71.12.9016-9023.1997 FAO (2014). ORGANIZACIÓN DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA ALIMENTACION Y LA AGRICULTURA Manual Práctico para el cultivo de la trucha arcoíris. Guatemala, 2014. FAO Fisheries and Aquaculture, 44. http://www.fao.org/3/a-bc354s.pdf FAO (2018). ORGANIZACIÓN DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA ALIMENTACION Y LA AGRICULTURA. De La Pesca Y La Acuicultura. In Marine Pollution Bulletin (Vol. 3, Issues 1–2). http://www.fao.org/publications/es%0Ahttp://dx.doi.org/10.1016/j.marpolbul.2013.01.032%0Ahttp://d x.doi.org/10.1016/j.tws.2012.02.007%0Ahttp://www.fao.org/publications/es FAO (2020). ORGANIZACIÓN DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA ALIMENTACION Y LA AGRICULTURA. Fish StatJ. Programa de estadísticas pesqueras, 2020. http://www.fao.org/fishery/statistics/software/fishstatj/es FAO (2020) ORGANIZACIÓN DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA ALIMENTACION Y LA AGRICULTURA. El estado mundial de la pesca y la acuicultura 2020. La sostenibilidad en acción. Roma. https://doi.org/10.4060/ca9229es Fast, M. D., Hosoya, S., Johnson, S. C., & Afonso, L. O. B. (2008a). Cortisol response and immune-related effects of Atlantic salmon (Salmo salar Linnaeus) subjected to short- and long-term stress. Fish and Shellfish Immunology, 24(2), 194–204. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2007.10.009 https://doi.org/10.1016/S0165-2427(02)00077-6 https://doi.org/10.1023/A:1009236628690 https://doi.org/10.1016/J.YGCEN.2004.02.006 https://www-sciencedirect-com.bucm.idm.oclc.org/science/article/pii/S000634950374658X?via%3Dihub#! https://www-sciencedirect-com.bucm.idm.oclc.org/science/article/pii/S000634950374658X?via%3Dihub#! https://www-sciencedirect-com.bucm.idm.oclc.org/science/article/pii/S000634950374658X?via%3Dihub#! https://www-sciencedirect-com.bucm.idm.oclc.org/science/article/pii/S000634950374658X?via%3Dihub#! https://doi-org.bucm.idm.oclc.org/10.1016/S0006-3495(03)74658-X https://doi.org/10.1577/H03-024 https://doi.org/10.1128/jvi.71.12.9016-9023.1997 http://www.fao.org/3/a-bc354s.pdf 181 Fast, M. D., Hosoya, S., Johnson, S. C., & Afonso, L. O. B. (2008b). Cortisol response and immune-related effects of Atlantic salmon (Salmo salar Linnaeus) subjected to short- and long-term stress. Fish and Shellfish Immunology, 24(2), 194–204. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2007.10.009. Feidantsis, K; Portner, HO; Antonopoulou, E; Michaelidis, B (2015). Synergistic effects of acute warming and low pH on cellular stress responses of the gilthead seabream Sparus aurata. Journal of comparative physiology b-biochemical systems and environmental physiology. Volume 185. Issue 2. Page 185-205. DOI:10.1007/s00360-014-0875-3 Ferguson, M. M., & Drahushchak, L. R. (1989). Effects of tissue collection and storage methods on nucleic acid determinations in white muscle of fishes. Transactions of the American Fisheries Society, 118(6), 709– 713. https://doi.org/10.1577/1548-8659(1989)118[0709:NEOTCA]2.3.CO;2 Fevolden, S.-E., Røed, K. H., & Fjalestad, K. T. (2002). Selection response of cortisol and lysozyme in rainbow trout and correlation to growth. Aquaculture, 205(1–2), 61–75. https://doi.org/10.1016/S0044- 8486(01)00660-3 Fillatreau, S., Six, A., Magadan, S., Castro, R., Sunyer, J. O., & Boudinot, P. (2013). The astonishing diversity of Ig classes and B cell repertoires in teleost fish. Frontiers in Immunology, 4(FRB). https://doi.org/10.3389/fimmu.2013.00028 Fischer, U. R., Wieltschnig, C., Kirschner, A. K. T., & Velimirov, B. (2006). Contribution of virus-induced lysis and protozoan grazing to benthic bacterial mortality estimated simultaneously in microcosms. Environmental Microbiology, 8(8), 1394–1407. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2006.01032.x Fivelstad, S., Waagbø, R., Zeitz. S.F., Hosfel., A.C.D., Olsen, A.B., Stefansson, S. (2003). A major water quality problem in smolt farm: combined effects of carbon dioxide, reduced pH and alumi¬nium on Atlantic salmon (Salmo salar L.) smolts: physiology and growth. Aquaculture. 215: 339-357. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(02)00197-7 Fixe P., Praloran V. (1997). Macrophage colony-stimulating-factor (M-CSF or CSF-1) and its receptor: structure-function relationships. Eur Cytokine Netw.; Vol 8 pag: 125-36. https://www.jle.com/en/revues/ecn/e- docs/macrophage_colony_stimulating_factor_m_csf_or_csf_1_and_its_receptor_structure_function_re lationships_90247/article.phtml Flajnik, M. F., & Kasahara, M. (2010). Origin and evolution of the adaptive immune system: Genetic events and selective pressures. Nature Reviews Genetics, 11(1), 47–59. https://doi.org/10.1038/nrg2703 Flannagan, R.S., Cosio, G., Grinstein, S. (2009). Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies Nat. Rev. Microbiol., 7, pp. 355-366. https://doi.org/10.1038/nrmicro2128 Fletcher, T.C. (1986). Modulation of nonspecific host defenses in fish. Vet. Immunol. Immunopathol., 12:59-67. https://doi.org/10.1016/0165-2427(86)90110-8 Flik, G., H. M. Peter, E. H. Vand den Burg, J. R. Metz, M. O. Huising. (2006). CRF and stress in Fish. General and Comparative Endocrinology, 146: 36-44. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2005.11.005 Flodmark, L. E. W., Urke, H. A., Halleraker, J. H., Arnekleiv, J. V., Vøllestad, L. A., & Poléo, A. B. S. (2002). Cortisol and glucose responses in juvenile brown trout subjected to a fluctuating flow regime in an artificial stream. Journal of Fish Biology, 60(1), 238–248. https://doi.org/10.1006/jfbi.2001.1845 Florenza, M., Fink, I. R., Raes, G., & Wiegertjes, G. F. (2011). Heterogeneity of macrophage activation in fish. Developmental and Comparative Immunology, 35(12), 1246–1255. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.03.008 Flory, C. M., & Bayne, C. J. (1991). The influence of adrenergic and cholinergic agents on the chemiluminescent and mitogenic responses of leukocytes from the rainbow trout, Oncorhyncus mykiss. Developmental and Comparative Immunology, 15(3), 135–142. https://doi.org/10.1016/0145- 305X(91)90004-I https://doi.org/10.1016/j.fsi.2007.10.009 https://doi.org/10.1038/nrg2703 https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.03.008 182 Franchimont, D. (2004). Overview of the actions of glucocorticoids on the immune response, A good model to characterize new pathways of immunosuppression for new treatment strategies glucocorticoid action: basic and clinical implications. Book series: Annals of the New York Academy of Sciences. Volume 1024. Page: 124-137. DOI10.1196/annals.1321.009. Fries, C. R. (1986). Effects of environmental stressors and immunosuppressants on immunity in Fundulus heteroclitus. Am. Zool. 26, 271–282. https://doi.org/10.1093/icb/26.1.271 Fryer, J. N. (1989). Neuropeptides regulating the activity of goldfish corticotropes and melanotropes. Fish Physiology and Biochemistry, 7: 21-27. https://link.springer.com/article/10.1007/BF00004686 Furones, M. D., Alderman, D. J., Bucke, D., Fletcher, T. C., Knox, D., & White, A. (1992). Dietary vitamin E and the response of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), to infection with Yersinia ruckeri. Journal of Fish Biology, 41(6), 1037–1041. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1992.tb02731.x Ganz, T, Lehrer, R.I. (1997). Antimicrobial peptides of leukocytes. Curr Opin Hematol. Vol 4; pag 53–8. Doi 10.1097/00062752-199704010-00009 García, C.K; Goldstein, L.G; Pathak, R.K; Anderson, R.G; Brown, M.S. (1994). Molecular characterization of a membrane transporter for lactate, pyruvate, and other monocarboxylates: implications for the Cori cycle. Cell, Vol 76, Issue 5. Pag 865-873. https://doi.org/10.1016/0092-8674(94)90361-1 García, J. A., & Villarroel, M. (2009). Effect of feed type and feeding frequency on macrophage functions in tilapia (Oreochromis niloticus L.). Fish and Shellfish Immunology, 27(2), 325–329. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2009.05.018 Gensel, J. C., Wang, Y., Guan, Z., Beckwith, K. A., Braun, K. J., Wei, P., McTigue, D. M., & Popovich, P. G. (2015). Toll-Like receptors and Dectin-1, a C-type lectin receptor, trigger divergent functions in CNS macrophages. Journal of Neuroscience, 35(27), 9966–9976. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0337- 15.2015 Gesto, M., López-Patiño, M. A., Hernández, J., Soengas, J. L., & Míguez, J. M. (2015). Gradation of the stress response in rainbow trout exposed to stressors of different severity: rhe role of brain serotonergic and dopaminergic systems. Journal of Neuroendocrinology, 27(2), 131–141. https://doi.org/10.1111/jne.12248. Gilchriest, B. J., D. R. Tipping, L. Hake, A. Levy, B. I. Baker. (2000). The effects of acute and chronic stresses on vasotocin gene transcripts in the brain of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Neuroendocrinology, 12: 795-801. https://doi.org/10.1046/j.1365-2826.2000.00522.x Gilchriest, B. J., D. J. Tipping, L. Hake, A. Levy, B. I. Baker. (2001). Differences in Arginine Vasotocin Gene Transcripts and cortisol secretion in trout with high or low endogenous melanin-concentrating hormone secretion. Journal of Neuroendocrinology, 13: 407-411. https://doi.org/10.1046/j.1365- 2826.2001.00648.x Gorissen, M., & Flik, G. (2016). The Endocrinology of the Stress Response in Fish: An Adaptation- Physiological View. Fish Physiology (Vol. 35). Biology of stress in fish. Edited by Anthony P. Farrell and Colin J. Brauner Honorary Editors: William S. Hoar and David J. Randall. Academic Press is an imprint of Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802728-8.00003-5 Granja, A. G., Leal, E., Pignatelli, J., Castro, R., Abós, B., Kato, G., Fischer, U., & Tafalla, C. (2015). Identification of teleost skin CD8α + dendritic-like cells, representing a potential common ancestor for mammalian cross-presenting dendritic cells. The Journal of Immunology, 195(4), 1825–1837. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1500322 Graves, S.S., D. Evans & D.L. Dawe. (1985). Antiprotozoan activity of nonspecific cytotoxic cells from the cannel catfish. J. Immunol. 13:47885. https://www.jimmunol.org/content/134/1/78.short Grayfer L, Walsh J.G, Belosevic M. (2008). Characterization and functional analysis of goldfish (Carassius auratus L.) tumor necrosis factor-alpha. Dev Comp Immunol. 32:532–43. doi: 10.1016/j.dci.2007.09.009 https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1992.tb02731.x https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0337-15.2015 https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0337-15.2015 https://doi.org/10.1111/jne.12248 183 Grayfer, L., Hanington, P. C., & Belosevic, M. (2009). Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) induces pro-inflammatory gene expression and enhances antimicrobial responses of goldfish (Carassius auratus L.) macrophages. Fish and Shellfish Immunology, 26(3), 406–413. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2008.12.001 Grayfer, L., & Belosevic, M. (2009). Molecular characterization of tumor necrosis factor receptors 1 and 2 of the goldfish (Carassius aurutus L.). Molecular Immunology, 46(11–12), 2190–2199. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2009.04.016 Grayfer, L., Garcia, E. G., & Belosevic, M. (2010). Comparison of macrophage antimicrobial responses induced by type II interferons of the goldfish (Carassius auratus L.). Journal of Biological Chemistry, 285(31), 23537–23547. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.096925 Grayfer, L., Hodgkinson, J. W., Hitchen, S. J., & Belosevic, M. (2011). Characterization and functional analysis of goldfish (Carassius auratus L.) interleukin-10. Molecular Immunology, 48(4), 563–571. https://doi.org/10.1016/J.MOLIMM.2010.10.013 Grayfer, L., Hodgkinson, J. W., & Belosevic, M. (2014). Antimicrobial responses of teleost phagocytes and innate immune evasion strategies of intracellular bacteria. Developmental & Comparative Immunology, 43(2), 223–242. https://doi.org/10.1016/j.dci.2013.08.003 Grayfer, L., Kerimoglu, B., Yaparla, A., Hodgkinson, J. W., Xie, J., & Belosevic, M. (2018). Mechanisms of fish macrophage antimicrobial immunity. Frontiers in Immunology, 9(MAY). https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01105 Green, J. A., B. I. Baker, H. Kawauchi. (1991). The effect of rearing rainbow trout on black or white backgrounds on their secretion of melanin-concentrating hormone and their sensitivity to stress. Journal of endocrinology, 128: 267- 274. https://doi.org/10.1677/joe.0.1280267 Grinde, B. (1989). Lysozyme from rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, as an antibacterial agent against fish pathogens. Journal of Fish Diseases, 12(2), 95–104. https://doi.org/10.1111/j.1365- 2761.1989.tb00281.x Grohmann, U., & Bronte, V. (2010). Control of immune response by amino acid metabolism. Immunological Reviews, 236(1), 243–264. https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2010.00915.x Grutter, A. S., & Pankhurst, N. W. (2000). The effects of capture, handling, confinement and ectoparasite load on plasma levels of cortisol, glucose and lactate in the coral reef fish Hemigymnus melapterus. Journal of Fish Biology, 57(2), 391–401. https://doi.org/10.1006/jfbi.2000.1312 Gruys, E., Toussaint, M. J. M., Niewold, T. A., & Koopmans, S. J. (2005). Acute phase reaction and acute phase proteins. Journal of Zhejiang University: Science, 6 B (11), 1045–1056. https://doi.org/10.1631/jzus.2005.B1045 Guijarro, J. A., Cascales, D., García-Torrico, A. I., García-Domínguez, M., & Méndez, J. (2015). Temperature- dependent expression of virulence genes in fish-pathogenic bacteria. Frontiers in Microbiology, 6(JUL). https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00700. Gunther, J., and Seyfert H. M. (2018). The first line of defence: insights into mechanisms and relevance of phagocytosis in epithelial cells. Seminars in Immunopathology. Volume 40, pages: 555–565. https://link.springer.com/article/10.1007/s00281-018-0701-1 Hamilton, J. A. (2008). Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nature Reviews Immunology, 8(7), 533–544. https://doi.org/10.1038/nri2356 Hanamura, T; Motoyoshi, K ; Yoshida, K ; Saito, M ; Miura, Y ; Kawashima, T ; Nishida, M ; Takaku, F. (1988). Quantitation and identification of human monocytic colony-stimulating factor in human-serum by enzyme-linked immunosorbent-assay. Blood. Volume 72. Issue 3. Page 886-892. https://doi.org/10.1182/blood.V72.3.886.886 https://doi.org/10.1016/j.molimm.2009.04.016 https://doi.org/10.1074/jbc.M109.096925 https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00700 https://doi.org/10.1038/nri2356 184 Hanington, P.C; Barreda, D.R; Belosevic, M. (2006). A novel hematopoietic granulin induces proliferation of goldfish (Carassius auratus L.) macrophages. Journal of Biological Chemistry. Volume 281. Issue 15. Page: 9963-9970. doi10.1074/jbc.M600631200 Hanington, P.C; Wang, T; Secombes, C.J; Belosevic, M, (2007). Growth factors of lower vertebrates: characterization of goldfish (Carassius auratus L.) macrophage colony-stimulating factor-1. J. Biol. Chem., 282 (2007), pp. 31865-31872. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M706278200 Hanington, P.C; Hitchen, S.J; Beamish, L.A; Belosevic, M. (2009). Macrophage colony stimulating factor (CSF-1) is a central growth factor of goldfish macrophages. Fish & Shellfish Immunology. Volume 26. Issue 1. Page: 1-9. doi10.1016/j.fsi.2008.09.020 Hansen, J. D., Vojtech, L. N., & Laing, K. J. (2011). Sensing disease and danger: A survey of vertebrate PRRs and their origins. Developmental and Comparative Immunology, 35(9), 886–897. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.01.008 Hardie, L. J., Fletcher, T. C., & Secombes, C. J. (1990). The effect of vitamin E on the immune response of the Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquaculture, 87(1), 1–13. https://doi.org/10.1016/0044- 8486(90)90206-3 Hardie, L. J., Marsden, M. J., Fletcher, T. C., & Secombes, C. J. (1993). In vitro addition of vitamin C affects rainbow trout lymphocyte responses. Fish & Shellfish Immunology, 3(3), 207–219. https://doi.org/10.1006/FSIM.1993.1021. Hardie, L, J., Fletcher T. C., and Secombes C. J. (1994). Effect of temperature on macrophage activation and the production of macrophage activating factor by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) leucocytes. Developmental and Comparative Immunology, Vol. 18, No. 1, pp. 57--66, 1994. https://doi.org/10.1016/0145-305X(94)90252-6 Hardie, L. J., Ellis, A. E., & Secombes, C. J. (1996). In vitro activation of rainbow trout macrophages stimulates inhibition of Renibacterium salmoninarum growth concomitant with augmented generation of respiratory burst products. Diseases of Aquatic Organisms, 25(3), 175–183. https://doi.org/10.3354/dao025175 Harris, J., & Bird, D. J. (1998). Alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) and melanin-concentrating hormone (MCH) stimulate phagocytosis by head kidney leucocytes of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in vitro. Fish & Shellfish Immunology, 8(8), 631–638. https://doi.org/10.1006/FSIM.1998.0172 Harris, J., & Bird, D. J. (2000a). Supernatants from leucocytes treated with melanin-concentrating hormone (MCH) and α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) have a stimulatory effect on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) phagocytes in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology, 76(1– 2), 117–124. https://doi.org/10.1016/S0165-2427(00)00205-1 Harris J, Bird D.J. (2000b). Modulation of the fish immune system by hormones. Vet Immunol Immunopathol 77: 163-176. https://doi.org/10.1016/S0165-2427(00)00235-X Harrod C., Ramirez A., Valbo-Jørgensen J., Funge-Smith S. (2018). How climate change impacts inland fisheries In M. Barange, T. Bahri, Beveridge M.C.M., K.L. Cochrane, S. Funge-Smith, and F. Poulain (eds). Impacts of climate change on fisheries and aquaculture. FAO Fisheries and Aquaculture Technical Paper. No. 627. Rome, FAO. pp. 375-391. https://www.researchgate.net/publication/326274448 Hastings R.A., Rutterford L.A., Freer J.J., Collins R.A., Simpson S.D., Genner M.J. (2020). Climate change drives poleward increases and equatorward decline in marine species. Current Biology, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.02.043. Hatai, K. y G. Hoshiai (1992). Mass mortality in cultured coho salmon (Oncorhynchus kisutch) due to Saprolegnia parasitica Coker. J. Wildlife Dis., 28:532-536. https://doi.org/10.7589/0090-3558-28.4.532 https://doi.org/10.1006/FSIM.1993.1021 https://doi.org/10.1016/S0165-2427(00)00205-1 185 Haugland, G. T., Jordal, A.-E. O., & Wergeland, H. I. (2012). Characterization of Small, Mononuclear Blood Cells from Salmon Having High Phagocytic Capacity and Ability to Differentiate into Dendritic like Cells. PLoS ONE, 7(11). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049260 Heath, A.G. (1984). Changes in tissue adenylates and water-content of bluegill, lepomis-macrochirus, exposed to copper. Journal of fish biology. Volume 24. Issue 3 Page:299-309. doi 10.1111/j.1095- 8649.1984.tb04801.x Heath, A. G., (1987). Effects of waterborne copper or zinc on the osmoregulatory response of bluegill to a hypertonic nacl challenge. Comparative biochemistry and physiology c-pharmacology toxicology & endocrinology. Volume 88, Issue 2, Page: 307-311. DOI10.1016/0742-8413(87)90126-5 Hengeveld, H (2005). The science of changing climates. Climate Change and Managed Ecosystems. Pages 17 - 44 Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K. B., & Renshaw, S. A. (2013). Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology, 94(4), 633–642. https://doi.org/10.1189/jlb.1112594 Herant, M., Heinrich, V., Dembo, M, (2005). Mechanics of neutrophil phagocytosis: behavior of the cortical tension. Journal of cell science. Volume 118. Issue 9. Page: 1789-1797. DOI10.1242/jcs.02275 Hernández, A. & Tort, L. (2003). Annual variation of complement, lysozyme and haemagglutinin levels in serum of the gilthead sea bream Sparus aurata. Fish Shellfish Immunol. doi:10.1016/S1050- 4648(03)00024-X Hibiya, T. (1994). An Atlas of Fish Histology. Normal and Pathological Features. Gustav Fischer Verlag. Stuttgart. 5-125 Hodgkinson, J. W., Grayfer, L., & Belosevic, M. (2015). Biology of bony fish macrophages. Biology, 4(4), 881–906. https://doi.org/10.3390/biology4040881 Hodgkinson, J. W., Fibke, C., & Belosevic, M. (2017). Recombinant IL-4/13A and IL-4/13B induce arginase activity and down-regulate nitric oxide response of primary goldfish (Carassius auratus L.) macrophages. Developmental and Comparative Immunology, 67, 377–384. https://doi.org/10.1016/j.dci.2016.08.014 Hofmann, J., Greter, M., Pasquier Du, L. and Becher, B. (2010). B-cells need a proper house, whereas T- cells are happy in a cave: the dependence of lymphocytes on secondary lymphoid tissues during evolution. Trends Immunol. 31, 144–153. /http://dx.doi.org/10.1016/j. it.2010.01.003S. Hokanson, K.E.F. (1977). Temperature requirements of some percids and adaptations to seasonal temperature cycle; Journal of the fisheries research board of Canada. Volume 34, page 1524-1550 special issue 10. doi 10.1139/f77-217 Holland, M. C. H., & Lambris, J. D. (2002). The complement system in teleosts. Fish and Shellfish Immunology, 12(5), 399–420. https://doi.org/10.1006/fsim.2001.0408 Hoseinifar, S. H., Sun, Y.-Z., Wang, A., & Zhou, Z. (2018). Probiotics as means of diseases control in aquaculture, a review of current knowledge and future perspectives. Frontiers in Microbiology, 9(OCT). https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02429 Huanca-Ramos, E. U., & Carpio-Vazquez, B. (2017). Niveles de cortisol y glucosa como indicadores de estrés en truchas arcoiris (Oncorhynchus mykiss), utilizando anestésicos en la laguna de Arapa. Universidad Nacional Del Altiplano, 051, 234–243. URI: http://repositorio.unap.edu.pe/handle/UNAP/4664 Huet, M. (1978). Tratado de piscicultura. 2º edición. Ediciones Mundi - Prensa. Madrid. 745 p. https://scholar.google.com/scholar?hl=es&as_sdt=0%2C5&q=huet+M+1978%2C+Tratado+de+piscicultu ra.+2%C2%BA+edici%C3%B3n.+Ediciones+Mundi+-+Prensa.+Madrid.+745+p&btnG= https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049260 https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02429 186 Huising, M.O., van der Aa, L.M., Metz, J.R., de Fatima Mazon, A., Kemenade, B.M., Flik, G., (2007). Corticotropin-releasing factor (CRH) and CRH-binding protein expression in and release from the head kidney of common carp: evolutionary conservation of the adrenal CRH system. J. Endocrinol. 193 (3), 349– 357. DOI: https://doi.org/10.1677/JOE-07-0070 Hume, D.A; Pavli, P; Donahue, R.E; Fidler, I.J, (1988). The effect of human recombinant macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) on the murine mononuclear phagocyte system in vivo. J. Immunol., 141, pp. 3405-3409. https://www.jimmunol.org/content/141/10/3405.short Igawa, D., Sakai, M., & Savan, R. (2006). An unexpected discovery of two interferon gamma-like genes along with interleukin (IL)-22 and -26 from teleost: IL-22 and -26 genes have been described for the first- time outside mammals. Molecular Immunology, 43(7), 999–1009. https://doi.org/10.1016/J.MOLIMM.2005.05.009 IPCC (2007). “Fourth assessment report. Climate change 2007 synthesis report” Irwin, M. J., & Kaattari, S. L. (1986). Salmonid B lymphocytes demonstrate organ dependent functional heterogeneity. Veterinary Immunology and Immunopathology, 12(1–4), 39–45. https://doi.org/10.1016/0165-2427(86)90108-X Ischiropoulos, H., Zhu, L., Chen, J., Tsai, M., Martin, J.C., Smith, C.D., Beckman, J.S., (1992). Peroxynitrite- mediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase. Arch. Biochem. Biophys. 298, 431–437. https://doi.org/10.1016/0003-9861(92)90431-U Iwama, G. K., Thomas, P. T., Forsyth, R. B., & Vijayan, M. M. (1998). Heat shock protein expression in fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. Volume 8. Issue 1. Page 35-56. DOI 10.1023/A:1008812500650 Iwama, G. K., Afonso, L. O. B., Todgham, A., Ackerman, P., & Nakano, K. (2004). Are hsps suitable for indicating stressed states in fish? Journal of Experimental Biology, 207(1), 15–19. https://doi.org/10.1242/jeb.00707 Iwama, G. K., Afonso, L. O. B. and Vijayan, M. M. (2006). Stress in fishes. In the Physiology of Fishes (eds. D. H. Evans and J. B. Claiborne), pp. 319–342. Boca Raton: Taylor & Francis. DOI: 10.1111/j.1749- 6632.1998.tb09005.x Iyengar, R., Stuehr D.J, Marletta M.A. (1987). Macrophage synthesis of nitrite, nitrate, and N-nitrosamines: precursors and role of the respiratory burst. Proc Natl Acad Sci USA. Vol 84. Pag 6369–73. doi:10.1073/pnas.84.18.6369 Jacobs, J.M., Stine, C.B., Baya, A.M., Kent, M.L., (2009). A review of mycobacteriosis in marine fish. J. Fish Dis. 32, 119–130. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2008.01016.x JACUMAR. Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos. (2009). https://www.mapa.gob.es/app/jacumar/especies/Documentos/Trucha.pdf Jeffrey, J. D., Cooke, S. J. and Gilmour, K. M. (2014b). Regulation of hypothalamic–pituitary– interrenal axis function in male smallmouth bass (Micropterus dolomieu) during parental care. Gen. Comp. Endocrinol. 204, 195–202. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2014.05.023 Jensen, M. H. (1965). Research on the virus of egtved disease. In Annals of the New York Academy of Sciences (Vol. 126, Issue 1). https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.1965.tb14292.x Jima, D. D., Shah, R. N., Orcutt, T. M., Joshi, D., Law, J. M., Litman, G. W., Trede, N. S., & Yoder, J. A. (2009). Enhanced transcription of complement and coagulation genes in the absence of adaptive immunity. Molecular Immunology, 46(7), 1505–1516. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2008.12.021 Joerink, M., Forlenza, M., Ribeiro, C. M. S., de Vries, B. J., Savelkoul, H. F. J., & Wiegertjes, G. F. (2006a). Differential macrophage polarisation during parasitic infections in common carp (Cyprinus carpio L.). Fish and Shellfish Immunology, 21(5), 561–571. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2006.03.006 https://doi.org/10.1016/J.MOLIMM.2005.05.009 https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2008.01016.x 187 Joerink, M., Savelkoul, H. F. J., & Wiegertjes, G. F. (2006b). Evolutionary conservation of alternative activation of macrophages: Structural and functional characterization of arginase 1 and 2 in carp (Cyprinus carpio L.). Molecular Immunology, 43(8), 1116–1128. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2005.07.022 Jones, S. R. M. (2001). The occurrence and mechanisms of innate immunity against parasites in fish. Developmental and Comparative Immunology, 25(8–9), 841–852. https://doi.org/10.1016/S0145- 305X(01)00039-8 Kaattari, S. L., Irwin, M. J., Yui, M. A., Tripp, R. A., & Parkins, J. S. (1986). Primary in vitro stimulation of antibody production by rainbow trout lymphocytes. Veterinary Immunology and Immunopathology, 12(1– 4), 29–38. https://doi.org/10.1016/0165-2427(86)90107-8 Katz, J. Tayek, J.A. (1999). Recycling of glucose and determination of the Cori cycle and gluconeogenesis. American Jorney of Phsyiology. Vol 277, pag. 401-407. https://doi.org/10.1152/ajpendo.1999.277.3.E401 Kelsall, C. J. and Balment, R. J. (1998). Native urotensins influence cortisol secretion and plasma cortisol concentration in the euryhaline flounder, Platichthys flesus. Gen. Comp. Endocrinol. 112, 210–219. https://doi.org/10.1006/gcen.1998.7166 Kepka M., Verburg-van Kemenade B.M.L., Chadzinska M. (2013). Neuroendocrine modulation of the inflammatory response in common carp: Adrenaline regulates leukocyte profile and activity. Gen Comp Endocrinol 188: 102-109. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2012.11.014 Khansari, A.R; Parra, D; Reyes-Lopez, F.E; Tort, L; (2017a). Cytokine modulation by stress hormones and antagonist specific hormonal inhibition in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and gilthead sea bream (Sparus aurata) head kidney primary cell culture. General and Comparative Endocrinology. Volume 250; Page: 122-135. DOI 10.1016/j.ygcen.2017.06.005 Khansari, A.R., Carles Balasch, J., Reyes-López, F. E., & Tort, L. (2017). Stressing the inflammatory network: Immuno-endocrine responses to allostatic load in fish. Thematic Network on Welfare and Stress In Fish View project Inter-university Attaction Pole (IAP) “AquaStress” project View project. In Article in Journal of Marine Science and Technology (Vol. 8). https://www.researchgate.net/publication/322104346 Khansari, A.R; Balasch, J.C; Vallejos-Vidal, E; Teles, M; Fierro-Castro, C; Tort, L; Reyes-Lopez, F.E. (2019). Comparative study of stress and immune-related transcript outcomes triggered by Vibrio anguillarum bacterin and air exposure stress in liver and spleen of gilthead seabream (Sparus aurata), zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish & Shellfish Immunology. Volume 86. Page: 436-448. DOI 10.1016/j.fsi.2018.11.063 Kiilerich, P., Servili, A., Péron, S., Valotaire, C., Goardon, L., Leguen, I., & Prunet, P. (2018). Regulation of the corticosteroid signalling system in rainbow trout HPI axis during confinement stress. General and Comparative Endocrinology, 258, 184–193. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2017.08.013 Knittel, M. D., (1981). Susceptibility of steelhead trout salmo-gairdneri Richards on to redmouth infection Yersinia-ruckeri following exposure to copper. Journal of fish diseases. Volume 4, Issue 1. Page: 33-40. doi10.1111/j.1365-2761.1981.tb01107.x Knoph, M. B., & Thorud, K. (1996). Toxicity of ammonia to Atlantic salmon (Salmo salar L.) in seawater - Effects on plasma osmolality, ion, ammonia, urea and glucose levels and hematologic parameters. Comparative Biochemistry and Physiology - A Physiology, 113(4), 375–381. https://doi.org/10.1016/0300- 9629(95)02078-0 Köllner, B., Fischer, U., Rombout, J. H. W. M., Taverne-Thiele, J. J., & Hansen, J. D. (2004). Potential involvement of rainbow trout thrombocytes in immune functions: A study using a panel of monoclonal antibodies and RT-PCR. Developmental and Comparative Immunology, 28(10), 1049–1062. https://doi.org/10.1016/j.dci.2004.03.005. Korte, S. M., Olivier, B. and Koolhaas, J. M. (2007). A new animal welfare concept based on allostasis. Physiol. Behav. 92 (3), 422–428. https://doi.org/10.1016/j.physbeh.2006.10.018 https://doi.org/10.1016/S0145-305X(01)00039-8 https://doi.org/10.1016/S0145-305X(01)00039-8 https://doi.org/10.1016/0165-2427(86)90107-8 https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2017.08.013 https://doi.org/10.1016/j.dci.2004.03.005 188 Kumar, R & Joy, K.P; (2018). In vitro Effects of Lipopolysaccharide and Stress Hormones on Phagocytosis and Nitric Oxide Production by Enriched Head Kidney Macrophage Cultures in the Catfish Heteropneustes fossilis. Proceedings of the Indian National Science Academy. Volume 84. Issue 3. Page 707-721. DOI10.16943/ptinsa/2018/49312 Kumar, R. & Joy, K.P; (2019). Stress hormones modulate lipopolysaccharide stimulation of head kidney interleukin-6 production in the catfish Heteropneustes fossilis: In vivo and in vitro studies, General and Comparative Endocrinology. Volume 279 Page: 109-113 DOI10.1016/j.ygcen.2019.01.005 Kumari, J., Larsen, A. N., Bogwald, J., & Dalmo, R. A. (2009). Interleukin-17D in Atlantic salmon (Salmo salar): Molecular characterization, 3D modelling and promoter analysis. Fish & Shellfish Immunology, 27(5), 647–659. https://doi.org/10.1016/J.FSI.2009.08.009 Kurata, O., Okamoto, N., Suzumura, E., Sano, N., & Ikeda, Y. (1995). Accommodation of carp natural killer- like cells to environmental temperatures. Aquaculture, 129(1–4), 421–424. https://doi.org/10.1016/0044- 8486(94)00282-S Kutyrev, I., Cleveland, B., Leeds, T., & Wiens, G. D. (2016). Proinflammatory cytokine and cytokine receptor gene expression kinetics following challenge with Flavobacterium psychrophilum in resistant and susceptible lines of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish and Shellfish Immunology, 58, 542–553. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2016.09.053 Kutyrev, I., Cleveland, B., Leeds, T., & Wiens, G. D. (2017). Dataset of proinflammatory cytokine and cytokine receptor gene expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) measured using a novel GeXP multiplex, RT-PCR assay. Data in Brief, 11, 192–196. https://doi.org/10.1016/j.dib.2017.02.014 Laing, K. J., Grabowski, P. S., Belosevic, M., & Secombes, C. J. (1996). A partial sequence for nitric oxide synthase from a goldfish (Carassius auratus) macrophage cell line. Immunology and Cell Biology, 74(4), 374–379. https://doi.org/10.1038/icb.1996.65 Laing, K. J., & Hansen, J. D. (2011). Fish T cells: Recent advances through genomics. Developmental & Comparative Immunology, 35(12), 1282–1295. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2011.03.004 Laird, L. y Needham, T. (1988). The immune system. En: Salmon and trout farming. Ellis Hordwood Series in Aquaculture and Fisheries support. England. 44-46. https://agris.fao.org/agris- search/search.do?recordID=XF2016031148 Lamas, J., Santos, Y., Bruno, D. W., Toranzo, A. E., & Anadón, R. (1994). Non-specific cellular responses of rainbow trout to Vibrio anguillarum and its extracellular products (ECPs). Journal of Fish Biology, 45(5), 839–854. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1994.tb00949.x Lambert, I. H., Hoffmann E. K., Pedersen, F. S. (2008). Cell volume regulation: physiology and pathophysiology. Acta physiologica. Volume 194. Issue 4. Page: 255-282. https://doi- org.bucm.idm.oclc.org/10.1111/j.1748-1716.2008.01910. Lambris, J.D. (1993). The chemistry, biology and phylogeny of C3 Complement Today. Complement Profiles. Karger Basel. I: 1645. https://scholar.google.com/scholar?hl=es&as_sdt=0%2C5&q=The+chemistry%2C+biology+and+phyloge ny+of+C3+Complement+&btnG= Lamers, C. H. J., & Parmentier, H. K. (1985). The fate of intraperitoneally injected carbon particles in cyprinid fish. Cell and Tissue Research, 242(3), 499–503. https://doi.org/10.1007/BF00225414 Lamers, A. E., Flik, G., & Bonga, S. E. W. (1994). A specific role for TRH in release of diacetyl α-MSH in tilapia stressed by acid water. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology, 267(5 36-5). https://doi.org/10.1152/ajpregu.1994.267.5.r1302 Law W-Y, Chen W-H, Song Y-L, Dufour S. (2001). Differential in vitro suppressive effects of steroids on leukocyte phagocytosis in two teleosts, tilapia and common carp. Gen Comp Endocrinol; 121:163–72. https://doi.org/10.1006/gcen.2000.7593 https://doi.org/10.1016/j.dib.2017.02.014 https://doi.org/10.1016/J.DCI.2011.03.004 https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1994.tb00949.x https://doi.org/10.1007/BF00225414 189 Le Morvan-Rocher, C., Troutaud, D., & Deschaux, P. (1995). Effects of temperature on carp leukocyte mitogen-induced proliferation and nonspecific cytotoxic activity. Developmental & Comparative Immunology, 19(1), 87–95. https://doi.org/10.1016/0145-305X(94)00057-M Le Morvan, C; Troutaud, D; Deschaux, P. (1998), Differential effects of temperature on specific and nonspecific immune defences in fish, J. Exp. Biol. 201 pag: 165-168. https://doi.org/10.1242/jeb.201.2.165 Leonardi, M. O., & Klempau, A. E. (2003). Artificial photoperiod influence on the immune system of juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in the Southern Hemisphere. Aquaculture, 221(1–4), 581– 591. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(03)00032-2 Leto, T.L., Lomax, K.J., Volpp, B.D., Nunoi, H., Sechler, J.M., Nauseef, W.M., Clark, R.A., Gallin, J.I., Malech, H.L., (1990). Cloning of a 67-kD neutrophil oxidase factor with similarity to a noncatalytic region of p60c- src. Science 248, 727–730. DOI: 10.1126/science.1692159 Lewis, J.M., Hori, T. S., Rise, M.L., Walsh, P.J., Currie, S. (2010). Transcriptome responses to heat stress in the nucleated red blood cells of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Physiological Genomics, Volume 42, Issue 3 Page: 361-373. DOI 10.1152/physiolgenomics.00067.2010 Li, M. O., Sanjabi, S., & Flavell, R. A. A. (2006). Transforming Growth Factor-β Controls Development, Homeostasis, and Tolerance of T Cells by Regulatory T Cell-Dependent and -Independent Mechanisms. Immunity, 25(3), 455–471. https://doi.org/10.1016/J.IMMUNI.2006.07.011 Li F, Zeng B, Chai Y, Cai P, Fan C, et al. (2009). The linker region of Smad2 mediates TGF- b -dependent ERK2-induced collagen synthesis. Biochem. Biophys Res Commun 386: 289-293. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2009.05.084 Lieberman, J., (2003). The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons in the arsenal. Nat. Rev. Immunol. 3, 361–370. https://doi.org/10.1038/nri1083 Lillehaug, A., A. Ramstad, K. Bekken y L.J. Reitan (1993). Protective immunity in Atlantic salmon (Salmo salar L.) vaccinated at different water temperatures. Fish Shellfish Immunol., 3:143-156. https://doi.org/10.1006/fsim.1993.1015 Liu H, Leo C, Chen X, Wong BR, Williams LT, Lin H, et al. (2014). The mechanism of shared but distinct CSF- 1R signaling by the non-homologous cytokines IL-34 and CSF-1. Biochim Biophys Acta. 1824:938–45. doi:10.1016/j.bbapap.2012.04.012 Lund, V., & Olafsen, J. A. (1998). A comparative study of pentraxin-like proteins in different fish species. Developmental & Comparative Immunology, 22(2), 185–194. https://doi.org/10.1016/S0145- 305X(97)00051-7 Lund, V., & Olafsen, J. A. (1999). Changes in serum concentration of a serum amyloid P-like pentraxin in Atlantic salmon, Salmo salar L., during infection and inflammation. Developmental & Comparative Immunology, 23(1), 61–70. https://doi.org/10.1016/S0145-305X(98)00038-X Lushchak V.I; (2016). Contaminant-induced oxidative stress in fish: a mechanistic approach. Fish Physiol Biochem. Vol 42:711–47. doi: 10.1007/s10695-015-0171-5 Lutfalla, G., Crollius, H. R., Stange-Thomann, N., Jaillon, O., Mogensen, K., & Monneron, D. (2003). Comparative genomic analysis reveals independent expansion of a lineage-specific gene family in vertebrates: The class II cytokine receptors and their ligands in mammals and fish. BMC Genomics, 4. https://doi.org/10.1186/1471-2164-4-29. Luz Arregui Maraver (2013). El cultivo de la trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss). Cuadernos de acuicultura. Fundación Observatorio Español de Acuicultura. Maquetación e impresión: DiScript Preimpresión, S. L. ISBN: 978-84-939800-4-7. http://www.fundacionoesa.es/publicaciones MacArthur, J. I., Thomson, A. W., & Fletcher, T. C. (1985). Aspects of leucocyte migration in the plaice, Pleuronectes platessa L. Journal of Fish Biology, 27(5), 667–676. https://doi.org/10.1111/j.1095- 8649.1985.tb03211.x https://doi.org/10.1016/J.IMMUNI.2006.07.011 https://doi.org/10.1006/fsim.1993.1015 https://doi.org/10.1016/S0145-305X(98)00038-X https://doi.org/10.1186/1471-2164-4-29 190 Maciuszek, M., Rydz, L., Świtakowska, I., Verburg-van Kemenade, B. M. L., & Chadzińska, M. (2019). Effects of stress and cortisol on the polarization of carp macrophages. Fish and Shellfish Immunology, 94, 27–37. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.08.064 MacKenzie, S., Iliev, D., Liarte, C., Koskinen, H., Planas, J. V., Goetz, F. W., et al. (2006a). Transcriptional analysis of LPS-stimulated activation of trout (Oncorhynchus mykiss) monocyte/macrophage cells in primary culture treated with cortisol. Mol. Immunol. 43, 1340–1348. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2005.09.005 MacKenzie, S; Montserrat, N; Mas, M; Acerete, L; Tort, L; Krasnov, A et al. (2006b). Bacterial lipopolysaccharide induces apoptosis in the trout ovary. Reprod. Biol. Endocrinol. 4, 46. https://link.springer.com/article/10.1186/1477-7827-4-46 Mackintosh, J. A. (2001). The antimicrobial properties of melanocytes, melanosomes and melanin and the evolution of black skin. Journal of Theoretical Biology, 211(2), 101–113. https://doi.org/10.1006/jtbi.2001.2331 MacMicking, J., Xie, Q.-W., & Nathan, C. (1997). Nitric oxide and macrophage function. In Annual Review of Immunology (Vol. 15). https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.15.1.323 Madenjian, C. P., Hayden, T. A., Peat, T. B., Vandergoot, C. S., Fielder, D. G., Gorman, A. M., Pothoven, S. A., Dettmers, J. M., Cooke, S. J., Zhao, Y., & Krueger, C. C. (2018). Temperature regimes, growth, and food consumption for female and male adult walleye in lake huron and lake erie: A bioenergetics analysis. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 75(10), 1573–1586. https://doi.org/10.1139/cjfas- 2017-0280 Magnadóttir, B. (2006). Innate immunity of fish (overview). Fish & Shellfish Immunology 20, 137-151. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2004.09.006 Maisey, K., Toro-Ascuy, D., Montero, R., Reyes-López, F. E., & Imarai, M. (2011). Identification of CD3ɛ, CD4, CD8β splice variants of Atlantic salmon. Fish & Shellfish Immunology, 31(6), 815–822. https://doi.org/10.1016/J.FSI.2011.07.022 Makrinos, D. L., & Bowden, T. J. (2016). Natural environmental impacts on teleost immune function. Fish and Shellfish Immunology, 53, 50–57. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2016.03.008 Manning, M. J., & Nakanishi, T. (1996). The Specific Immune System: Cellular Defenses. In Fish Physiology (Vol. 15, Issue C). https://doi.org/10.1016/S1546-5098(08)60274-5 Manning, J. M., Dumoulin, A., Li, X., & Manning, L. R. (1998). Normal and abnormal protein subunit interactions in hemoglobins. Journal of Biological Chemistry, 273(31), 19359–19362. https://doi.org/10.1074/jbc.273.31.19359 Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., & Locati, M. (2004). The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends in Immunology, 25(12), 677–686. https://doi.org/10.1016/J.IT.2004.09.015 Mao, K., W. Chen, Y. Mu, J. A.O, X. Chen, (2018). Identification of two IL-4/13 homologues in large yellow croaker (Larimichthys crocea) revealed their similar roles in inducing alternative activation of monocytes/macrophages. Fish Shellfish Immunol. 80 pag: 180–190, https://doi.org/10.1016/j.fsi.2018.06.002. MAPA 2014. Ministerio de Agricultura y Pesca, Alimentación y Medio Ambiente. Plan Estratégico Plurianual de la Acuicultura Española. Madrid 2014. https://www.mapa.gob.es/es/pesca/temas/acuicultura/plan_estrategico_6_julio_tcm30-77594.pdf MAPA 2020. Ministerio de Agricultura y Pesca, Alimentación y Medio Ambiente. Informe de consumo alimentario en España (2020). Madrid. 2021. https://www.mapa.gob.es/es/alimentacion/temas/consumo-tendencias/3jun2021-presentacion- ministro-consumo-2020_tcm30- 562992.pdf https://doi.org/10.1139/cjfas-2017-0280 https://doi.org/10.1139/cjfas-2017-0280 https://doi.org/10.1016/J.FSI.2011.07.022 https://doi.org/10.1016/j.fsi.2018.06.002 191 MAPA. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. La pesca mes a mes en España. Años 2014 a 2020 Subdir. Gral. Estructura de la Cadena Alimentaria. Dir. Gral. Industria Alimentaria. Madrid. 2020 https://www.mapa.gob.es/es/alimentacion/temas/consumo-tendencias/panel-de-consumo- alimentario/ultimos-datos/ MAPA 2021. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación Estadísticas pesqueras. Encuesta de acuicultura abril 2021. Madrid 2021 https://www.mapa.gob.es/es/estadistica/temas/estadisticas- pesqueras/ 9. Bibliografía LA ACUICULTURA EN ESPAÑA I 111 Markiewski, M. M., & Lambris, J. D. (2007). The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight. American Journal of Pathology, 171(3), 715–727. https://doi.org/10.2353/ajpath.2007.070166 Martinez, F. O., & Gordon, S. (2014). The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000 Prime Reports, 6. https://doi.org/10.12703/P6-13 Martinez-Porchas, M., Martinez-Cordova, L. T., & Ramos-Enriquez, R. (2009). Cortisol and Glucose: Reliable indicators of fish stress? Journal of Aquatic Sciences, 4, 158–178. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2010.01.025 Maule, A.G., C.B. Schreck y S.L. Kaattari (1987). Changes in the immune system of coho salmon (Oncorhynchus kisutch) during the parr-to-smolt transformation and after implantation of cortisol. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 44:161-166. https://doi.org/10.1139/f87-021 Maule, A. G., Tripp, R. A., Kaattari, S. L. and Schreck, C. B. (1989). Stress alters immune function and disease resistance in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). J. Endocrinol. 120, 135-142. https://doi.org/10.1677/joe.0.1200135 Maule, A. G., & Schreck, C. B. (1990). Glucocorticoid receptors in leukocytes and gill of juvenile coho salmon (Oncorhynchus kisutch). General and Comparative Endocrinology, 77(3), 448–455. https://doi.org/10.1016/0016-6480(90)90236-F Maule, A. G., & Schreck, C. B. (1991). Stress and cortisol treatment changed affinity and number of glucocorticoid receptors in leukocytes and gill of coho salmon. General and Comparative Endocrinology, 84(1), 83–93. https://doi.org/10.1016/0016-6480(91)90067-G Maule, A.G., Schrock, C. Slater, M.S. Fitzpatrick y C.B. Schreck (1996). Immune and endocrine responses of adult chinook salmon during freshwater immigration and sexual maduration. Fish Shellfish Immunol., 6:221-233. https://doi.org/10.1006/fsim.1996.0022 Mauri, I., Romero, A., Acerete, L., MacKenzie, S., Roher, N., Callol, A., et al. (2011). Changes in complement responses in Gilthead seabream (Sparus aurata) and European seabass (Dicentrarchus labrax) under crowding stress, plus viral and bacterial challenges. Fish Shellfish Immunol. 30, 182–188. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.10.006 Mazeaud, M. M., Mazeaud, F., & Donaldson, E. M. (1977). Primary and secondary effects of stress in fish: Some new data with a general review. Transactions of the American Fisheries Society, 106(3), 201–212. https://doi.org/10.1577/1548-8659(1977)106 [201: PASEOS]2.0.CO;2 Mazeaud, M. M. and Mazeaud, F. (1981). Adrenergic responses to stress in fish. Stress and Fish (ed. A. D. Pickering), pp. 49–75. London: Academic Press. https://agris.fao.org/agris- search/search.do?recordID=XF2015032145 Mazur, C. F. and Iwama, G. K. (1993) Effect of handling and stocking density on hematocrit, plasma- cortisol, and survival in wild and hatchery-reared chinook salmon (Oncorhynchus-tshawytscha) Aquaculture 112, 291-299. https://doi.org/10.1016/0044-8486(93)90390-K McLoughlin, M. F., & Graham, D. A. (2007). Alphavirus infections in salmonids - A review. Journal of Fish Diseases, 30(9), 511–531. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2007.00848.x https://www.mapa.gob.es/es/alimentacion/temas/consumo-tendencias/panel-de-consumo-alimentario/ultimos-datos/ https://www.mapa.gob.es/es/alimentacion/temas/consumo-tendencias/panel-de-consumo-alimentario/ultimos-datos/ 192 Meseguer, J., Esteban, M. A., Lopez-ruiz, A., & Bielek, E. (1994). Ultrastructure of nonspecific cytotoxic cells in teleosts. I. Effector-target cell binding in a marine and a freshwater species (Seabream: Sparus aurata L., and Carp: Cyprinus carpio L.). The Anatomical Record, 239(4), 468–474. https://doi.org/10.1002/ar.1092390412 Metz, J. R., Geven, E. J. W., van den Burg, E. H., & Flik, G. (2005). ACTH, α-MSH, and control of cortisol release: Cloning, sequencing, and functional expression of the melanocortin-2 and melanocortin-5 receptor in Cyprinus carpio. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology, 289(3 58-3). https://doi.org/10.1152/ajpregu.00826.2004 Michel, C., R. Gonzalez y S. Avrameas (1990). Opsonizing properties of natural antibodies of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). J. Fish Biol., 37:617-622. https://doi.org/10.1111/j.1095- 8649.1990.tb05894.x Mihajlovic, M., & Lazaridis, T. (2010a). Antimicrobial peptides bind more strongly to membrane pores. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, 1798(8), 1494–1502. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2010.02.023 Mihajlovic, M., & Lazaridis, T. (2010b). Antimicrobial peptides in toroidal and cylindrical pores. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, 1798(8), 1485–1493. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2010.04.004. Miller, N.W. y L.W. Clem (1984). Temperature mediated processes in teleost immunity: differential effects of temperature on catfish in vitro antibody responses to thymus-dependent and thymus-independent antigens. J. Immunol., 133:2356-2359 21. Miller, L. L., Wang, F., Palace, V. P., & Hontela, A. (2007). Effects of acute and subchronic exposures to waterborne selenite on the physiological stress response and oxidative stress indicators in juvenile rainbow trout. Aquatic Toxicology, 83(4), 263–271. https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2007.05.001 Milligan C. L and Wood, C.M. (1986). Tissue intracellular acid-base status and the fate of lactate after exhaustive exercise in the rainbow trout. Journal of Experimental Biology. Volume VOL. 123, Pages 123 – 1441986. https://doi.org/10.1242/jeb.123.1.123 Mills, C. D. (2001). Macrophage arginine metabolism to ornithine/urea or nitric oxide/citrulline: A life or death issue. Critical Reviews in Immunology, 21(5), 399–425. DOI: 10.1615/CritRevImmunol.v21.i5.10 Mizrahi, A., Berdichevsky, Y., Ugolev, Y., Molshanski-Mor, S., Nakash, Y., Dahan, I., Alloul, N., Gorzalczany, Y., Sarfstein, R., Hirshberg, M., Pick, E., (2006). Assembly of the phagocyte NADPH oxidase complex: chimeric constructs derived from the cytosolic components as tools for exploring structure-function relationships. J. Leukoc. Biol. 79, 881–895. https://doi.org/10.1189/jlb.1005553 Mjaaland, S., Rimstad, E., Falk, K., & Dannevig, B. H. (1997). Genomic characterization of the virus causing infectious salmon anemia in Atlantic salmon (Salmo salar L.): an orthomyxo-like virus in a teleost. Journal of Virology, 71(10), 7681–7686. https://doi.org/10.1128/jvi.71.10.7681-7686.1997 Mola, L., Gambarelli, A., Pederzoli, A. and Ottaviani, E. (2005). ACTH response to LPS in the first stages of development of the fish Dicentrarchus labrax L. Gen. Comp. Endocrinol. 143, 99–103. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2005.02.021 Mommsen, T. P., Vijayan, M. M., & Moon, T. W. (1999). Cortisol in teleosts: Dynamics, mechanisms of action, and metabolic regulation. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 9(3), 211–268. https://doi.org/10.1023/A:1008924418720 Monte, M. M., Wang, T., Collet, B., Zou, J., & Secombes, C. J. (2015). Molecular characterisation of four class 2 cytokine receptor family members in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Developmental & Comparative Immunology, 48(1), 43–54. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2014.08.012. Montero, D., Izquierdo, M. S., Tort, L., Robaina, L. E. and Vergara, J. M. (1999). High stocking density produces crowding stress altering some physiological and biochemical parameters in gilthead seabream, https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2007.05.001 https://doi.org/10.1016/J.DCI.2014.08.012 193 Sparus aurata, juveniles. Fish Physiol. Biochem. 20, 53-60. https://link.springer.com/article/10.1023/A:1007719928905 Montero, D., Kalinowski, T., Obach, A., Robaina, L., Tort, L., Caballero, M. J., et al. (2003). Vegetable lipid sources for gilthead seabream (Sparus aurata): effects on fish health. Aquaculture 225, 353–370. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(03)00301-6 Montero, D., Lalumera, G., Izquierdo, M. S., Caballero, M. J., Saroglia, M. and Tort, L. (2009). Establishment of dominance relationships in gilthead sea bream (Sparus aurata) juveniles during feeding: effects on feeding behaviour, feed utilization, and fish health. J. Fish. Biol. 74, 1–16. https://doi.org/10.1111/j.1095- 8649.2008.02161.x Montero, D., Mathlouthi, F., Tort, L., Afonso, J. M. and Torrecillas, S. (2010). Replacement of dietary fish oil by vegetable oils affects humoral immunity and expression of pro-inflammatory cytokines genes in gilthead sea bream Sparus aurata. Fish Shellfish Immunol. 29, 1073–1081. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.08.024 Montoya, L.N.F; Martins, T.P; Talisia P; Gimbo, R.Y; Rodrigo Y; Zanuzzo, F.S; Urbinati, E.C; Elisabeth C. (2017). Beta-Glucan-induced cortisol levels improve the early immune response in matrinxa (Brycon amazonicus). Fish & Shellfish Immunology. Volume 60. Page: 197-204. DOI 10.1016/j.fsi.2016.11.055 Morales, A. E., G. Cardenete, E. Abellán, L. García-Rejón. (2005). Stress-related physiological responses to handling in common dentex (Dentex dentex Linnaeus, 1758). Aquaculture Research, 36: 33-40. https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2004.01180.x Morera, D., Roher, N., Ribas, L., Balasch, J. C., Doñate, C., Callol, A., Boltaña, S., Roberts, S., Goetz, G., Goetz, F. W., Goetz, F. W., & MacKenzie, S. A. (2011). Rna-seq reveals an integrated immune response in nucleated erythrocytes. PLoS ONE, 6(10). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026998 Moretti, J., & Blander, J. M. (2014). Insights into phagocytosis-coupled activation of pattern recognition receptors and inflammasomes. Current Opinion in Immunology, 26(1), 100–110. https://doi.org/10.1016/j.coi.2013.11.003 Mosser, D. M., & Edwards, J. P. (2008). Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology, 8(12), 958–969. https://doi.org/10.1038/nri2448 Nakanishi, T. (1986). Seasonal changes in the humoral immune response and the lymphoid tissues of the marine teleost, Sebastiscus marmoratus. Vet. Immunol. Immunopathol. 12, 213–221. https://doi.org/10.1016/0165-2427(86)90125-X Nakanishi, Y., Kodama, H., Murai, T., Mikami, T. e Izawa, H. (1991) Activation of rainbow trout complement by C-reactive protein. Am. J. Vet. Res., 52: 397-401. https://europepmc.org/article/med/1903618 Nakanishi, T., Toda, H., Shibasaki, Y., & Somamoto, T. (2011). Cytotoxic T cells in teleost fish. Developmental & Comparative Immunology, 35(12), 1317–1323. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2011.03.033 Nakao, M., Tsujikura, M., Ichiki, S., Vo, T. K., & Somamoto, T. (2011). The complement system in teleost fish: Progress of post-homolog-hunting researches. Developmental and Comparative Immunology, 35(12), 1296–1308. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.03.003 Nakatani, Y., Takeda, H., Kohara, Y., & Morishita, S. (2007). Reconstruction of the vertebrate ancestral genome reveals dynamic genome reorganization in early vertebrates. Genome Research, 17(9), 1254– 1265. https://doi.org/10.1101/gr.6316407 Narnaware, Y. K., Baker, B. I., & Tomlinson, M. G. (1994). The effect of various stresses, corticosteroids and adrenergic agents on phagocytosis in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Fish Physiology and Biochemistry, 13(1), 31–40. https://doi.org/10.1007/BF00004117. https://doi.org/10.1016/j.coi.2013.11.003 https://doi.org/10.1007/BF00004117 194 Nathan, C., & Xie, Q. -w. (1994a). Nitric oxide synthases: Roles, tolls, and controls. Cell, 78(6), 915–918. https://doi.org/10.1016/0092-8674(94)90266-6 Nathan, C., & Xie, Q.-W. (1994b). Regulation of biosynthesis of nitric oxide. Journal of Biological Chemistry, 269(19), 13725–13728. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(17)36703-0 Ndong, D., Chen, Y. Y., Lin, Y. H., Vaseeharan, B., & Chen, J. C. (2007). The immune response of tilapia Oreochromis mossambicus and its susceptibility to Streptococcus iniae under stress in low and high temperatures. Fish and Shellfish Immunology, 22(6), 686–694. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2006.08.015 Neumann, N. F., Stafford, J. L., Barreda, D., Ainsworth, A. J., & Belosevic, M. (2001). Antimicrobial mechanisms of fish phagocytes and their role in host defense. Developmental and Comparative Immunology, 25(8–9), 807–825. https://doi.org/10.1016/S0145-305X(01)00037-4 Newcombe, C.P., Jensen, J.O.T. (1996). «Channel suspended sediment and fisheries: A synthesis for quantitative assessment of risk and impact». North American Journal of Fisheries Management. 16: 693- 727. https://doi.org/10.1577/1548-8675(1996)016<0693:CSSAFA>2.3.CO;2 Niedergang, F., Grinstein, S. (2018). How to build a phagosome: new concepts for an old process. Current Opinion in Cell Biology. Volume 50, February 2018, Pages 57-63. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2018.01.009 Noakes, D. L. G. and Jones, K. M. M. (2016). Cognition, Learning, and Behavior. In Fish Physiology - Biology of Stress in Fish, Vol. 35 (eds. C. B. Schreck, L. Tort, A. P. Farrell and C. J. Brauner), San Diego, CA: Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802728-8.00009-6 Nomura, M., Sloman, K.A., von Keyserlingk, M.A.G. and Farrell, A.P. (2009). Physiology and behaviour of Atlantic salmon (Salmo salar) smolts during commercial land and sea transport. Physiol. Behav. 96, 233– 243. https://doi.org/10.1016/j.physbeh.2008.10.006 Olivereau, M., J. M. Olivereau, J. F. Lambert. (1988). Cytological responses of the pituitary (rostral pars distalis) and immunoreactive corticotropin-releasing factor (CRF) in the goldfish treated with dopamine antagonists. General and Comparative Endocrinology, 71: 506-515. https://doi.org/10.1016/0016- 6480(88)90281-X Olsen, R. E., Sundell, K., Mayhew, T. M., Myklebust, R., & Ringø, E. (2005). Acute stress alters intestinal function of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Aquaculture, 250(1–2), 480–495. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2005.03.014 Omaima Harun, N., Zou, J., Zhang, Y. A., Nie, P., & Secombes, C. J. (2008). The biological effects of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) recombinant interleukin-8. Developmental & Comparative Immunology, 32(6), 673–681. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2007.10.005 O´Neill, J.G. (1980). Temperature and the primary and secondary immune responses of three teleosts, Salmo trutta, Cyprinus carpio and Notothenia rossii, to MS2 bacteriophage. Phylogeny of Immunological Memory. M.J. Manning. Elsevier/North Holand Biomedical Press. Amsterdam. 123-130. https://scholar.google.com/scholar_lookup?title=Temperature%20and%20the%20primary%20and%20s econdary%20immune%20responses%20of%20three%20teleosts%2C%20Salmo%20trutta%2C%20Cyprin us%20carpio%20and%20Notothenia%20rossii%2C%20to%20MSZ%20bacteriophage&pages=123- 130&publication_year=1980&author=O%27Neill%2CJ.G. O´Neill, J.G. (1985). An in vitro study of polymorphonuclear phagocytosis and the effect of temperature. En: Fish Immunology. M.J. Manning y M.F. Tatner. Academic Press. Londres. 47-56. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-469230-5.50008-8 Ortuño, J., Esteban, M. A., & Meseguer, J. (2001). Effects of short-term crowding stress on the gilthead seabream (Sparus aurata L.) innate immune response. Fish and Shellfish Immunology, 11(2), 187–197. https://doi.org/10.1006/fsim.2000.0304 https://doi-org.bucm.idm.oclc.org/10.1016/j.ceb.2018.01.009 195 Osborne, L. C., & Abraham, N. (2010). Regulation of memory T cells by γc cytokines. Cytokine, 50(2), 105– 113. https://doi.org/10.1016/J.CYTO.2009.09.008 Ostrander, G. (2000). The Laboratory Fish. Academic press. Johns Hopkins University Baltimore, MD USA. 525 p. Pagniello, K. B., Bols, N. C. and Lee, L. E. (2002). Effect of corticosteroids on viability and proliferation ofthe rainbow trout monocyte/macrophage cell line, RTS11. Fish Shellfish Immunol. 13, 199–214. https://doi.org/10.1006/fsim.2001.0395 Palaksha, K. J., Shin, G.-W., Kim, Y.-R., & Jung, T.-S. (2008). Evaluation of non-specific immune components from the skin mucus of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Fish and Shellfish Immunology, 24(4), 479– 488. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2008.01.005 Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., & Roth, J. A. (2007). Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Developmental & Comparative Immunology, 31(8), 805–816. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2006.11.010. Pankhurst, N. W. and Dedual, M. (1994). Effects of capture and recovery on plasma levels of cortisol, lactate and gonadal steroids in a natural population of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. J. Fish. Biol. 45, 1013–1025. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1994.tb01069.x Pankhurst, N. W. and Van Der Kraak, G. (1997). Effects of stress on growth and reproduction. In Fish Stress and Health in Aquaculture (eds. G. K. Iwama, A. D. Pickering, J. P. Sumpter and C. B. Schreck), pp. 73–93. Cambridge: Cambridge University Press. Pankhurst, N. W. (2011). The endocrinology of stress in fish: An environmental perspective. General and Comparative Endocrinology, 170(2), 265-275.https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2010.07.017 Pankhurst, N. W. (2016). Reproduction and Development. In Fish Physiology-Biology of Stress in Fish, Vol. 35 (eds. C. B. Schreck, L. Tort, A. P. Farrell and C. J. Brauner), San Diego, CA: Academic Press. Parkos, C. A., Allen, R. A., Cochrane, C. G., & Jesaitis, A. J. (1988). The quaternary structure of the plasma membrane b-type cytochrome of human granulocytes. BBA - Bioenergetics, 932(C), 71–83. https://doi.org/10.1016/0005-2728(88)90140-5 Parkos, C. A., Dinauer, M. C., Walker, L. E., Allen, R. A., Jesaitis, A. J., & Orkin, S. H. (1988). Primary structure and unique expression of the 22-kilodalton light chain of human neutrophil cytochrome b. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85(10), 3319–3323. https://doi.org/10.1073/pnas.85.10.3319 Patino, R., Redding, J. M. and Schreck, C. B. (1987). Interrenal secretion of corticosteroids and plasma cortisol and cortisone concentrations after acute stress and during seawater acclimation in juvenile coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Gen. Comp. Endocrinol. 68, 431–439. https://doi.org/10.1016/0016- 6480(87)90082-7 Pegg, J.R., S.K. Balfry, L. Gordon, J.R. Roome, y G.K. Iwama (1995). Stress, immune function and disease resistance in juvenile salmonids. Bull. Aquacul. Assoc. Canada, 4:28-34. https://scholar.google.com/scholar_lookup?title=Stress+immune+function+and+disease+resistance+in+ juvenile- salmonids&author=J.R.+S.K.+L.+J.R.+G.K.+Pegg%2C+Balfry%2C+Gordon%2C+Roome%2C+Iwnma%2C&p ublication_year=1995&journal=Bul.+Aquaculture+Assn.+Can.&volume=95&pages=28-35 Peleteiro, M. C., & Richards, R. H. (1985). Identification of lymphocytes in the epidermis of the rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. Journal of Fish Diseases, 8(2), 161–172. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.1985.tb01211.x Peleteiro, M. C., & Richards, R. H. (1990). Phagocytic cells in the epidermis of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, 1836. Journal of Fish Diseases, 13(3), 225–232. https://doi.org/10.1111/j.1365- 2761.1990.tb00777.x. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2006.11.010 https://doi.org/10.1073/pnas.85.10.3319 https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.1990.tb00777.x https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.1990.tb00777.x 196 Peres, H; Santos, S; Oliva-Teles, A (2013). Selected plasma biochemistry parameters in gilthead seabream (Sparus aurata) juveniles. Journal of Applied Ichthyology. Volume 29. Issue 3. Page 630-636. DOI10.1111/j.1439-0426.2012.02049.x. Pérez-Casanova, J. C., Rise, M. L., Dixon, B., Afonso, L. O. B., Hall, J. R., Johnson, S. C., & Gamperl, A. K. (2008). The immune and stress responses of Atlantic cod to long-term increases in water temperature. Fish & Shellfish Immunology, 24(5), 600–609. https://doi.org/10.1016/J.FSI.2008.01.012 Perry, S. F., Fritsche, R., Kinkead, R., & Nilsson, S. (1991). Control of catecholamine release in vivo and in situ in the Atlantic cod (Gadus morhua) during hypoxia. Journal of Experimental Biology, 155, 549–566. https://doi.org/10.1242/jeb.155.1.549 Pickering, A. D. & Christie, P. (1981). Sexual differences in the incidence and severity of ectoparasitc infestation of the brown trout, Salmo trutta L. J. Fish Biol., 16:669-683. https://doi.org/10.1016/0016- 6480(81)90337-3 Pickering, A. D & Pottinger T. G. (1985). Cortisol can increase the susceptibility of brown trout, Salmo trutta L., to disease without reducing the white blood cell count. Journal of Fish Biology. Volume 27. Issue 5. Pages: 611-619. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1985.tb03206.x Pickering, A. D. & Pottinger, T. G. (1987). Poor water quality suppresses the cortisol response of salmonid fish to handling and confinement. J. Fish. Biol. 30, 363–374. https://doi.org/10.1111/j.1095- 8649.1987.tb05761.x Pickering, A. D. & Pottinger, T. G. (1989). Stress responses and disease resistance in salmonid fish - effects of chronic elevation of plasma-cortisol. Fish Physiology and Biochemistry. Volume 7. Issue 1-6. Page: 253- 258. doi10.1007/bf00004714 Pickering, A. D., Pottinger, T. G., Sumpter, J. P., Carragher, J. F. and Le Bail, P. Y. (1991). Effects of acute and chronic stress on the levels of circulating growth hormone in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 83, 86–93. https://doi.org/10.1016/0016-6480(91)90108-I Pierson, P. M., Guibbolini, M. E. and Lahlou, B. (1996). A V1-type receptor for mediating the neurohypophysial hormone-induced ACTH release in trout pituitary. J. Endocrinol. 149, 109–115. https://doi.org/10.1677/joe.0.1490109 Pijanowski, L., Golbach, L., Kolaczkowska, E., Scheer, M., Verburg-van Kemenade, B. M. L., & Chadzinska, M. (2013). Carp neutrophilic granulocytes form extracellular traps via ROS-dependent and independent pathways. Fish and Shellfish Immunology, 34(5), 1244–1252. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2013.02.010. Pijanowski, L; Verburg-van Kemenade, B.M.L; Irnazarow, I; Chadzinska, M. (2015). Stress-induced adaptation of neutrophilic granulocyte activity in K and R3 carp lines. Fish & Shellfish Immunology. Volume 47. Issue 2. Page 886-892. DOI 10.1016/j.fsi.2015.10.030. Pinto, W; Aragao, C; Soares, F; Dinis, M.T; Conceicao, L.E.C. (2007). Growth, stress response and free amino acid levels in Senegalese sole (Solea senegalensis, Kaup 1858) chronically exposed to exogenous ammonia. Aquaculture research. Volume 38. Issue 11. Page 1198-1204. DOI10.1111/j.1365- 2109.2007.01788.x Polakof, S., & Soengas, J. L. (2008). Involvement of lactate in glucose metabolism and glucosensing function in selected tissues of rainbow trout. Journal of Experimental Biology, 211(7), 1075–1086. https://doi.org/10.1242/jeb.014050 Pörtner, H. O; Peck, L; Somero, G. (2007). Thermal limits and adaptation in marine Antarctic ectotherms: an integrative view. Philos. Trans. R. Soc. B. Vol 362. pag. 2233-2258. https://doi.org/10.1098/rstb.2006.1947 Pottinger, T. G., P. Prunet, A. D. Pickering. (1992). The effects of confinement stress on circulating prolactin levels in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in fresh water. General and Comparative Endocrinology, 88: 454-460. https://doi.org/10.1016/0016-6480(92)90240-K https://doi.org/10.1016/j.fsi.2013.02.010 https://doi.org/10.1242/jeb.014050 197 Pottinger, T. G., & Moran, T. A. (1993). Differences in plasma cortisol and cortisone dynamics during stress in two strains of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Fish Biology, 43(1), 121–130. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1993.tb00415.x Pottinger, T. G., Balm, P. H. M. and Pickering, A. D. (1995) Sexual maturity modifies the responsiveness of the pituitary-interrenal axis to stress in male rainbow trout. Gen. Comp. Endocrinol. 98, 311-320. https://doi.org/10.1006/gcen.1995.1073 Pottinger, T. G., & Carrick, T. R. (1999). Modification of the Plasma Cortisol Response to Stress in Rainbow Trout by Selective Breeding. General and Comparative Endocrinology, 116(1), 122–132. https://doi.org/10.1006/GCEN.1999.7355 Pottinger, T. G., & Carrick, T. R. (2001). Stress Responsiveness Affects Dominant–Subordinate Relationships in Rainbow Trout. Hormones and Behavior, 40(3), 419–427. https://doi.org/10.1006/hbeh.2001.1707 Pottinger, T. G. (2008). The stress response in fish - Mechanisms, effects and measurement. En: Fish welfare. Editado por E. J. Branson. Blackwll Publishing, USA, pp. 32-48. https://scholar.google.com/scholar?hl=es&as_sdt=0%2C5&q=Pottinger%2C+T.+G.+%282008%29.+The+ stress+response+in+fish+- +Mechanisms%2C+effects+and+measurement.+En%3A+Fish+welfare.+Editado+por+E.+J.+Branson.+Blac kwll+Publishing%2C+USA%2C+pp.+32-48.&btnG= Praloran, V. (1991). Structure, biosynthesis and biological roles of monocyte-macrophage colony stimulating factor (CSF-1 or M-CSF). Nouvelle Revue Francaise d’Hematologie, 33(4), 323–333. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1838150/ Pratt, W. B. and Toft, D. O. (1997). Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306–360. https://go.gale.com/ps/i.do?id=GALE%7CA536274685&sid=googleScholar&v=2.1&it=r&linkaccess=abs& issn=0163769X&p=HRCA&sw=w&userGroupName=anon%7Ea3babe3f Press, C. M., Dannevig, B. H., & Landsverk, T. (1994). Immune and enzyme histochemical phenotypes of lymphoid and nonlymphoid cells within the spleen and head kidney of atlantic salmon (salmo salar l.). Fish and Shellfish Immunology, 4(2), 79–93. https://doi.org/10.1006/fsim.1994.1007 Press, C. M. L., & Evensen, O. (1999). The morphology of the immune system in teleost fishes. Fish & Shellfish Immunology, 9(4), 309–318. https://doi.org/10.1006/FSIM.1998.0181 Pulsford AL, Crampe M, Langston A, Glynn PJ. (1995). Modulatory effects of disease, stress, copper, TBT and vitamin E on the immune system of flatfish. Fish Shellfish Immunol; 5: 631–43. https://doi.org/10.1016/S1050-4648(95)80046-8 Rajanbabu, V., & Chen, J.-Y. (2011). Applications of antimicrobial peptides from fish and perspectives for the future. Peptides, 32(2), 415–420. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2010.11.005 Rand-Weaver, M., T. G. Pottinger, J. P. Sumpter (1993). Plasma somatolactin concentrations in fish are elevated by stress. Journal of Endocrinology, 138: 509-515. https://doi.org/10.1677/joe.0.1380509 Razquin, B. E., Castillo, A., López-Fierro, P., Alvarez, F., Zapata, A., & Villena, A. J. (1990). Ontogeny of IgM- producing cells in the lymphoid organs of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson 1836: an immuno- and enzyme-histochemical study. Journal of Fish Biology, 36(2), 159–173. https://doi.org/10.1111/j.1095- 8649.1990.tb05592.x Real Decreto 1614/2008, de 3 de octubre, relativo a los requisitos zoosanitarios de los animales y de los productos de la acuicultura, así como a la prevención y el control de determinadas enfermedades de los animales acuáticos BOE» núm. 242, de 7 de octubre de 2008, páginas 40185 a 40206 (22 págs.). https://www.boe.es/eli/es/rd/2008/10/03/1614 https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1993.tb00415.x https://doi.org/10.1006/FSIM.1998.0181 https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1990.tb05592.x https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1990.tb05592.x https://www.boe.es/eli/es/rd/2008/10/03/1614 198 Reid, S. G., Vijayan, M. M. and Perry, S. F. (1996). Modulation of catecholamine storage and release by the pituitary interrenal axis in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. J. Comp. Physiol. B 165, 665–676. https://link.springer.com/article/10.1007/BF00301135 Reid, S. G., Bernier, N. J. and Perry, S. F. (1998). The adrenergic stress response in fish: control of catecholamine storage and release. Comp. Biochem. Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 120, 1–27. https://doi.org/10.1016/S0742-8413(98)00037-1 Reid, S. D., Moon, T. W. and Perry, S. F. (1992). Rainbow trout hepatocyte adrenoceptors, catecholamine responsiveness and effects of cortisol. Am. Physiol. Soc. 262, 794–799. https://doi.org/10.1152/ajpregu.1992.262.5.R794 Reite, O. B. (1998). Mast cells/eosinophilic granule cells of teleostean fish: A review focusing on staining properties and functional responses. Fish and Shellfish Immunology, 8(7), 489–513. https://doi.org/10.1006/fsim.1998.0162 Richards, R. H. and Pickering, A. D. (1978). Frequency and distribution patterns of Saprolegnia infection in wild and hatchery-reared brown trout Salmo trutta L. and char Salvelinus alpinus (L.). J. Fish Dis. 1, 69–82. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.1978.tb00006.x Rieger, A. M., Hall, B. E., & Barreda, D. R. (2010). Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Developmental and Comparative Immunology, 34(11), 1144–1159. https://doi.org/10.1016/j.dci.2010.06.006 Rieger, A. M., & Barreda, D. R. (2011). Antimicrobial mechanisms of fish leukocytes. Developmental and Comparative Immunology, 35(12), 1238–1245. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.03.009 Rieger, A. M., Hanington, P. C., Belosevic, M., & Barreda, D. R. (2014). Control of CSF-1 induced inflammation in teleost fish by a soluble form of the CSF-1 receptor. Fish and Shellfish Immunology, 41(1), 45–51. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2014.03.035 Rijkers, G. T., Frederix-Wolters, E. M. H., & van Muiswinkel, W. B. (1980). The immune system of cyprinid fish. Kinetics and temperature dependence of antibody-producing cells in carp (Cyprinus carpio). Immunology, 41(1), 91–97. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1458243/ Roberts, R.J. (1989) The immunology of Teleost. Fish Pathology. Baillière Tindall. London. pp: 135-150. https://scholar.google.com/scholar?hl=es&as_sdt=0%2C5&q=Roberts%2C+R.J.+%281989%29+The+imm unology+of+Teleost.+Fish+Pathology.+Bailli%C3%A8re+Tindall.+London.+pp%3A+135-150.&btnG= Roberts, R.J. (2001). Fish Pathology. Wd Saunders. Harcourt Publishers Ltd. https://scholar.google.com/scholar?hl=es&as_sdt=0%2C5&q=Roberts%2C+R.J.+%281989%29+The+imm unology+of+Teleost.+Fish+Pathology.+Bailli%C3%A8re+Tindall.+London.+pp%3A+135-150.&btnG= Roberts, R. J., Agius, C., Saliba, C., Bossier, P., & Sung, Y. Y. (2010). Heat shock proteins (chaperones) in fish and shellfish and their potential role in relation to fish health: A review. Journal of Fish Diseases, 33(10), 789–801. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2010.01183.x Roberts R.J. (2012). Fish Pathology. Oxford: JohnWiley & Sons. https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=4oZCaGTL7WIC&oi=fnd&pg=PR6&dq=Roberts+R.J.+(2012) .+Fish+Pathology.+Oxford:+JohnWiley+%26+Sons.&ots=99aO9kU9yy&sig=2krE4lz2qMpgrPqIiw1crRUGK ug&redir_esc=y#v=onepage&q=Roberts%20R.J.%20(2012).%20Fish%20Pathology.%20Oxford%3A%20Jo hnWiley%20%26%20Sons.&f=false Robinson, J.M., (2008). Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochem. Cell Biol. 130, 281– 297. https://link.springer.com/article/10.1007/s00418-008-0461-4 Robinson, J.M., (2009). Phagocytic leukocytes and reactive oxygen species. Histochem. Cell Biol. 131, 465– 469. https://link.springer.com/article/10.1007/s00418-009-0565-5 https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2010.01183.x 199 Roca, F. J., Mulero, I., López-Muñoz, A., Sepulcre, M. P., Renshaw, S. A., Meseguer, J., & Mulero, V. (2008). Evolution of the inflammatory response in vertebrates: Fish TNF-α is a powerful activator of endothelial cells but hardly activates phagocytes. Journal of Immunology, 181(7), 5071–5081. https://doi.org/10.4049/jimmunol.181.7.5071 Rombout J. H.W.M., Abelli, L., Picchietti, S., Scapigliati, G., & Kiron, V. (2011). Teleost intestinal immunology. Fish and Shellfish Immunology, 31(5), 616–626. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.09.001 Rotllant, J. and Tort, L. (1997). Cortisol and glucose responses after acute stress by net handling in the sparid red porgy previously subjected to crowding stress. J. Fish Biol. 51, 21–28. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1997.tb02510.x Rowley, A. F. (1996). The Evolution of Inflammatory Mediators. Mediators of Inflammation, 5(1), 3–13. https://doi.org/10.1155/S0962935196000014 Roy, B., & Rai, U. (2008). Role of adrenoceptor-coupled second messenger system in sympatho- adrenomedullary modulation of splenic macrophage functions in live fish Channa punctatus. General and Comparative Endocrinology, 155(2), 298–306. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2007.05.008 Roy, B., & Rai, U. (2009). Genomic and non-genomic effect of cortisol on phagocytosis in freshwater teleost Channa punctatus: An in vitro study. Steroids, 74(4–5), 449–455. https://doi.org/10.1016/j.steroids.2008.12.013 Rubio-Godoy, M. (2010). Inmunología de los peces óseos. Revisión Teleost fish immunology. Rev Mex Cienc Pecu, 1(1), 47–57. https://inecol.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1005/5/1/217_2010- 10013.pdf Ruiz, I., & Blas, I. de. (2003). El sistema inmune de los teleósteos (IV): Principales factores que afectan a la respuesta inmune. Aquatic, Revista, IV, 1–7. http://www.revistaaquatic.com/ojs/index.php/aquatic/article/view/253 Ryckaert, J., Bossier, P., D’Herde, K., Diez-Fraile, A., Sorgeloos, P., Haesebrouck, F., & Pasmans, F. (2010). Persistence of Yersinia ruckeri in trout macrophages. Fish and Shellfish Immunology, 29(4), 648–655. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.06.009. Sadoul, B. and Vijayan, M. M. (2016). Stress and Growth. In Fish Physiology - Biology of Stress in Fish, Vol. 35 (eds. C. B. Schreck, L. Tort, A. P. Farrell and C. J. Brauner), San Diego, CA: Academic Press. Sadoul, B., & Geffroy, B. (2019). Measuring cortisol, the major stress hormone in fishes. Journal of Fish Biology, 94(4), 540–555. https://doi.org/10.1111/jfb.13904 Saeij, J. P. J., Stet, R. J. M., Groeneveld, A., Verburg-Van Kemenade, L. B. M., van Muiswinkel, W. B., & Wiegertjes, G. F. (2000). Molecular and functional characterization of a fish inducible-type nitric oxide synthase. Immunogenetics, 51(4–5), 339–346. https://doi.org/10.1007/s002510050628 Saeij, J. P., Verburg-van Kemenade, L. B., van Muiswinkel, W. B. and Wiegertjes, G. F. (2003). Daily handling stress reduces resistance of carp to Trypanoplasma borreli: in vitro modulatory effects of cortisol on leukocyte function and apoptosis. Dev. Comp. Immunol. 27, 233–245. https://doi.org/10.1016/S0145- 305X(02)00093-9 Saha, N. R., Usami, T. and Suzuki, Y. (2002). Seasonal changes in the immunr activities of common carp (Cyprinus carpio). Fish Physiol. Biochem. 26, 379–387. https://link.springer.com/article/10.1023/B:FISH.0000009275.25834.67 Saha, N. R., Usami, T. and Suzuki, Y. (2004). In vitro effects of steroid hormones on IgM secreting cells and IgM secretion in common carp (Cyprinus carpio). Fish Shellfish Immunol. 17, 149–158. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2004.01.001 https://inecol.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1005/5/1/217_2010-10013.pdf https://inecol.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1005/5/1/217_2010-10013.pdf https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.06.009 200 Sakai, M., Yamaguchi, T., Wananuki, H., Yasuda, A. and Takahashi, A. (2001). Modulation of fish phagocytic cells by N-terminal peptides of proopiomelanocortin (NPP). J. Exp. Zool. 290, 341–346. https://doi.org/10.1002/jez.1074 Salinas, I., Zhang, Y. A., & Sunyer, J. O. (2011). Mucosal immunoglobulins and B cells of teleost fish. Developmental & Comparative Immunology, 35(12), 1346–1365. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2011.11.009 Sanderson, L. A., Wright, R. A., Robinson, J. W., Ballantyne, J. S., & Bernier, N. J. (2010). Inhibition of glutamine synthetase during ammonia exposure in rainbow trout indicates a high reserve capacity to prevent brain ammonia toxicity. Journal of Experimental Biology, 213(13), 2343–2353. https://doi.org/10.1242/jeb.039156 Saurabh, S., and Sahoo, P. K. (2008). Lysozyme: An important defence molecule of fish innates immune system. Aquaculture Research, 39(3), 223–239. https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2007.01883.x Schreck, C. B. (1996). Immunomodulation: endogenous factors. In Fish Physiology - The Fish Immune System: Organism, Pathogen, and Environment, Vol. 15 (eds. G. Iwama and T. Nakanishi), pp. 311–337. New York, NY: Academic Press. Schreck, C. B. (2000). Accumulation and long-term effects of stress in fish. In the Biology of Animal Stress: Basic Principles and Implications for Animal Welfare (eds. G. P. Moberg and J. A. Mench), pp. 147–158. Wallingford: CAB International. Schreck, C. B. and Maule, A. G. (2001). Are the endocrine and immune systems really the same thing? In International Symposium on Comparative Endorinology (eds. H. J. T. Goos, R. K. Rostogi, H. Vaudry and R. Pierantoni), pp. 351–357. Naples: Monduzzi Editore. https://pubs.er.usgs.gov/publication/70180085 Schreck, C. B. (2010). Stress and fish reproduction: the roles of allostasis and hormesis. Gen. Comp. Endocrinol. 165, 549–556. /http://dx.doi.org/10.1016/j.ygcen.2009.07.004S. Schreck, C. B., & Tort, L. (2016). The Concept of Stress in Fish. In Fish Physiology (Vol. 35). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802728-8.00001-1 Scott, A. L., Rogers, A. and Klesius, P. H. (1985). Chemiluminescence by peripheral blood phagocytes from channel catfish: function of opsonin and temperature. Dev. comp. Immunol. 9, 241–250. https://doi.org/10.1016/0145-305X(85)90115-6 Secombes, C. J. (1996a). 2 The Nonspecific Immune System: Cellular Defenses. In Fish Physiology (Vol. 15, Issue C). https://doi.org/10.1016/S1546-5098(08)60272-1 Secombes, C. J. (1996b). 2 The Nonspecific Immune System: Cellular Defenses. In Fish Physiology (Vol. 15, Issue C). https://doi.org/10.1016/S1546-5098(08)60272-1 Secombes, C. J., Clements, K., Ashton, I., & Rowley, A. F. (1994). The effect of eicosanoids on rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, leucocyte proliferation. Veterinary Immunology and Immunopathology, 42(3–4), 367–378. https://doi.org/10.1016/0165-2427(94)90080-9 Secombes, C. J., & Fletcher, T. C. (1992). The role of phagocytes in the protective mechanisms of fish. Annual Review of Fish Diseases, 2(C), 53–71. https://doi.org/10.1016/0959-8030(92)90056-4 Secombes, C. J., Wang, T., & Bird, S. (2011a). The interleukins of fish. Developmental and Comparative Immunology, 35(12), 1336–1345. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.05.001 Secombes, C. J., Wang, T., & Bird, S. (2011b). The interleukins of fish. Developmental and Comparative Immunology, 35(12), 1336–1345. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.05.001 Secombes, C. J., Wang, T., & Bird, S. (2016). Vertebrate Cytokines and Their Evolution. In the Evolution of the Immune System: Conservation and Diversification. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801975- 7.00005-0 https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802728-8.00001-1 201 Secombes, C. J., & Zou, J. (2017). Evolution of interferons and interferon receptors. Frontiers in Immunology, 8(MAR). https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00209 Selye, H. (1976). Stress in Health and Disease. Boston: Butterworth. https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=wrfYBAAAQBAJ&oi=fnd&pg=PP1&dq=Selye,+H.+(1976).+S tress+in+Health+and+Disease.+Boston:+Butterworth.&ots=_koxtjbfpe&sig=FaMd8DpCRwh00J6gzWVAk DVRUZY&redir_esc=y#v=onepage&q&f=false Semple S.L, Vo N.T.K, Li A.R, Pham P.H, Bols N.C, Dixon B. (2017). Development and use of an Arctic charr cell line to study antiviral responses at extremely low temperatures. J Fish Dis. Vol 40. Pag: 1423–39. doi: 10.1111/jfd.12615 Sepahi, A., Heidarieh, M., Mirvaghefi, A., Rafiee, G.R., Farid, M., Sheikhzadeh, N. (2013). Effects of water temperature on the susceptibility of rainbow trout to Streptococcus agalactiae. Acta Scientiae Veterinariae. Volume 41, Issue 1. Article number 1097. https://www.redalyc.org/pdf/2890/289031817003.pdf Seppola, M., Larsen, A. N., Steiro, K., Robertsen, B., & Jensen, I. (2008). Characterisation and expression analysis of the interleukin genes, IL-1β, IL-8 and IL-10, in Atlantic cod (Gadus morhua L.). Molecular Immunology, 45(4), 887–897. https://doi.org/10.1016/J.MOLIMM.2007.08.003 Sepulcre MP, Lopez-Castejon G, Meseguer J, Mulero V; (2007). The activation of gilthead seabream professional phagocytes by different PAMPs underlines the behavioural diversity of the main innate immune cells of bony fish. Mol Immunol. Vol 44; pag: 2009–16. doi:10.1016/j.molimm.2006.09.022 Sharma, N. K., Akhtar, M. S., Pandey, N., Singh, R., & Singh, A. K. (2015). Seasonal variation in thermal tolerance, oxygen consumption, antioxidative enzymes and non-specific immune indices of Indian hill trout, Barilius bendelisis (Hamilton, 1807) from central Himalaya, India. Journal of Thermal Biology, 52, 166–176. https://doi.org/10.1016/j.jtherbio.2015.07.005 Sharp, G.J.E., Secombes, C.J. (1993). The role of reactive oxygen species in the killing of the bacterial fish pathogen Aeromonas salmonicida by rainbow trout macrophages. Fish Shellfish Immunol. Vol 3, pag: 119– 29. doi:10.1006/fsim.1993.1013 Sharpe, R.L., Milligan, C.L. (2003). Lactate efflux from sarcolemmal vesicles isolated from rainbow trout Oncorhynchus mykiss white muscle is via simple diffusion. Journal of Experimental Biology. Open Access. Volume 206, Issue 3, Pages 543 – 549. https://doi.org/10.1242/jeb.00126 Shepherd, B. S., Spear, A. R., Philip, A. M., Leaman, D. W., Stepien, C. A., Sepulveda-Villet, O. J., Palmquist, D. E., & Vijayan, M. M. (2018). Effects of cortisol and lipopolysaccharide on expression of select growth- stress- and immune-related genes in rainbow trout liver. Fish and Shellfish Immunology, 74, 410–418. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2018.01.003 Sheppard, F.R., Kelher, M.R., Moore, E.E., McLaughlin, N.J., Banerjee, A., Silliman, C.C., (2005). Structural organization of the neutrophil NADPH oxidase: phosphorylation and translocation during priming and activation. J. Leukoc. Biol. 78, 1025–1042. https://doi.org/10.1189/jlb.0804442 Skarmeta, A. M., Bandin, I., Santos, Y., & Toranzo, A. E. (1995). In vitro killing of Pasteurella piscicida by fish macrophages. Diseases of Aquatic Organisms, 23(1), 51–57. https://doi.org/10.3354/dao023051 Slater, C.H. y C.B. Schreck (1993). Testosterone alters immune response of chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Gen. Comp. Endocrinol., 89:291-298. https://doi.org/10.1006/gcen.1993.1035 Sokolova, I. M; Frederich, M; Bagwe, R; Lannig, G; Sukhotin, A. A. (2012). Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Reseach. Vol 79, pag. 1-15. https://doi.org/10.1016/j.marenvres.2012.04.003 Song, R., Wei, R.B., Luo, H.Y., Wang, D.F., (2012). Isolation and characterization of an antibacterial peptide fraction from the pepsin hydrolysate of half-fin anchovy (Setipinna taty). Molecules 17, 2980–2991. https://doi.org/10.3390/molecules17032980 202 Sottrup, L., Borth, A., Hall, M., Quigley, J.P., Armstrong, P.B. (1989). Sequence similarity between alpha-2- macroglobulin from the horse shoe-crab, limulus-polyphemus, and proteins of the alpha-2-macroglobulin family from mammals. Comparative biochemistry and physiology b-biochemistry & molecular biology. Volume 96. Issue 3. Page: 621-625. doi10.1016/0305-0491(90)90066-3 Soza-Ried, C., Hess, I., Netuschil, N., Schorpp, M., & Boehm, T. (2010). Essential role of c-myb in definitive hematopoiesis is evolutionarily conserved. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(40), 17304–17308. https://doi.org/10.1073/pnas.1004640107 Spieler, R. E. (1979). Diel rhythms of circulating prolactin, cortisol, thyroxine, and triiodothyronine levels in fishes: a review. Review of Canadian Biology, 38: 301-315. https://pascal- francis.inist.fr/vibad/index.php?action=getRecordDetail&idt=PASCAL8050390311 Spigarelli, S.A., Thommes, M.M. (1979). Temperature selection and estimated thermal-acclimation by rainbow trout (salmo-gairdneri) in a thermal plume, 1979, Journal of the fisheries research board of Canada. Volume 36. Issue 4 page 366-376. Doi 10.1139/f79-056 Stanley, E.R.; Guilbert, L.J. (1981). Methods for the purification, assay, characterization and target-cell binding of a Colony Stimulating Factor (CSF-1). Journal of Immunological Methods. Volume 42. Issue 3. Page 253-284. Doi 10.1016/0022-1759(81)90156-3. Stanley, E.R; Guilbert, L.J; Tushinski, R.J; Bartelmez, S.H; (1983). CSF-1 – a mononuclear phagocyte lineage- specific hemopoietic growth factor J. Cell. Biochem. 21 (1983), pp. 151-159. https://doi.org/10.1002/jcb.240210206 Stanley, E.R.; Berg, K. L., Einstein, D. B., Lee, P. S. W., & Yeung, Y. G. (1994). The biology and action of colony stimulating factor-1. Stem Cells, 12(SUPPL.), 15–24. https://doi.org/10.1002/(SICI)1098- 2795(199701)46:1<4::AID-MRD2>3.0.CO;2-V Stave, J.W., Robertson, B.S. (1985). Hydrocortisone suppresses the chemiluminescent response of striped bass phagocytes. Dev. Comp. Immunol. 9, 77-84. https://doi.org/10.1016/0145-305X(85)90061-8 Steinman, R. M., Hawiger, D., & Nussenzweig, M. C. (2003). Tolerogenic dendritic cells. In Annual Review of Immunology (Vol. 21). https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.21.120601.141040 Sternberg, E. M. (2006). Neural regulation of innate immunity: a coordinated nonspecific host response to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 6, 318–328. https://doi.org/10.1038/nri1810 Stocchi, V., Wang, T., Randelli, E., Mazzini, M., Gerdol, M., Pallavicini, A., Secombes, C. J., Scapigliati, G., & Buonocore, F. (2017). Evolution of Th2 responses: Characterization of IL-4/13 in sea bass (Dicentrarchus labrax L.) and studies of expression and biological activity. Scientific Reports, 7(1). https://doi.org/10.1038/s41598-017-02472-y Stolte, E. H., van Kemenade, B. M. L. V., Savelkoul, H. F. J. and Flik, G. (2006). Evolution of glucocorticoid receptors with different glucocorticoid sensitivity. J. Endocrinol. 190, 17–28. https://doi.org/10.1677/joe.1.06703 Stolte, E. H., de Mazon, A. F., Leon-Koosterziel, K. M., J˛esiak, M., Bury, N. R., Strum, A., et al. (2008a). Corticosteroid receptors involved in stress regulation in common carp, Cyprinus carpio. J. Endocrinol. 198, 403–417. https://doi.org/10.1677/JOE-08-0100 Stolte, E. H., Nabuurs, S. B., Bury, N. R., Sturm, A., Flik, G., Savelkoul, H. F. J., & Lidy Verburg-van Kemenade, B. M. (2008b). Stress and innate immunity in carp: Corticosteroid receptors and pro-inflammatory cytokines. Molecular Immunology, 46(1), 70–79. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2008.07.022 Sturm, A; Colliar, L; Leaver, M.J; Bury, N.R. (2011). Molecular determinants of hormone sensitivity in rainbow trout glucocorticoid receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Endocrinology. Volume 333. Issue 2. Page: 181-189. DOI 10.1016/j.mce.2010.12.033 https://doi.org/10.1073/pnas.1004640107 https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.21.120601.141040 https://doi.org/10.1038/s41598-017-02472-y 203 Sumpter, J. P., H. M. Dye, T. J. Benfey. (1986). The effects of stress on plasma ACTH, alpha-MSH, and cortisol levels in salmonid fishes. General and Comparative Endocrinology, 62: 377-385. https://doi.org/10.1016/0016-6480(86)90047-X Sunyer, J. O., & Tort, L. (1995). The alternative complement pathway effects natural hemolytic and bactericidal activities of sea bream Sparus aurata serum. Veterinary Immunology and Immunopathology, 45(3–4), 333–345. https://doi.org/10.1016/0165-2427(94)05430-Z. Sunyer, J. O. (2013). Fishing for mammalian paradigms in the teleost immune system. In Nature Immunology (Vol. 14, Issue 4, pp. 320–326). Nature Publishing Group. https://doi.org/10.1038/ni.2549 Suzuki, Y., Orito, M., Iigo, M., Kezuka, H., Kobayashi, M. and Aida, K. (1996). Seasonal changes in blood IgM levels in goldfish, with special reference to water temperature and gonadal maturation. Fish Sci. 62, 754–759. https://doi.org/10.2331/fishsci.62.754 Suzuki, Y., Otaka, T., Sato, S., Hou, Y. Y. and Aida, K. (1997). Reproduction related immunoglobulin changes in rainbow trout. Fish Physiol. Biochem. 17, 415–421. https://link.springer.com/article/10.1023/A:1007795827112 Sveinbjørnsson, B., Olsen, R., & Paulsen, S. (1996). Immunocytochemical localization of lysozyme in intestinal eosinophilic granule cells (EGCs) of Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases, 19(5), 349–355. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.1996.tb00373.x Takizawa, F., Koppang, E. O., Ohtani, M., Nakanishi, T., Hashimoto, K., Fischer, U., & Dijkstra, J. M. (2011). Constitutive high expression of interleukin-4/13A and GATA-3 in gill and skin of salmonid fishes suggests that these tissues form Th2-skewed immune environments. Molecular Immunology, 48(12–13), 1360– 1368. https://doi.org/10.1016/J.MOLIMM.2011.02.014 Tang, S., Brauner, C. J. and Farrell, A. P. (2009). Using bulk oxygen uptake to assess the welfare of adult Atlantic salmon, Salmo salar, during commercial live-haul transport. Aquaculture 286, 318–323. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2008.09.033 Tapper, H. (1996). “Out of the phagocyte or into its phagosome: signalling to secretion,”. European Journal of Haematology, vol. 57, no. 3, pp. 191–201, 1996. https://doi.org/10.1111/j.1600- 0609.1996.tb01363.x Tasker, J. G. & Malcher-Lopes, R. (2006). Minireview: Rapid glucocorticoid signaling via membrane- associated receptors. Endocrinology. Volume 147 Issue 12 Page: 5549-5556 DOI10.1210/en.2006-0981 Tatner, M. F. (1990). Quantitative and qualitative differences in the antibodies produced by immunosuppressed rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, to Aeromonas salmonicida. Aquaculture, 88(3– 4), 205–211. https://doi.org/10.1016/0044-8486(90)90148-G Tatner, M. F., & Findlay, C. (1991). Lymphocyte migration and localisation patterns in rainbow trout Oncorhynchus mykiss, studied using the tracer sample method. Fish and Shellfish Immunology, 1(2), 107– 117. https://doi.org/10.1016/S1050-4648(06)80011-2 Tatner, M. F. (1996). Natural changes in the immune system of fish. In the Fish Immune System: Organism, Pathogen, and Environment (eds. G. Iwama and T. Nakanishi), pp. 255–287. San Diego: Academic Press. Tavares-Dias, M., & Moraes, F. R. (2006). Morphological, cytochemical, and ultrastructural study of thrombocytes and leukocytes in neotropical fish, Brycon orbignyanus Valenciennes, 1850 (Characidae, Bryconinae). Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 38(2–3), 209–215. https://www.researchgate.net/profile/Marcos-Tavares- Dias/publication/6055180_Morphological_cytochemical_and_ultrastructural_study_of_thrombocytes_a nd_leukocytes_in_neotropical_fish_Brycon_orbignyanus_Valenciennes_1850_Characidae_Bryconinae/li nks/5be96545299bf1124fcc8a95/Morphological-cytochemical-and-ultrastructural-study-of- thrombocytes-and-leukocytes-in-neotropical-fish-Brycon-orbignyanus-Valenciennes-1850-Characidae- Bryconinae.pdf https://doi.org/10.1016/J.MOLIMM.2011.02.014 204 Teles, M., Mackenzie, S., Boltana, S., Callol, A. and Tort, L. (2011). Gene expression and TNFalpha secretion profile in rainbow trout macrophages following exposures to copper and bacterial lipopolysaccharide. Fish Shellfish Immunol. 30, 340–346. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.11.006 Teles, M., Tridico, R., Cortes, R., Alcerete, L., Callol, A., Fierro-Castro, C., Tort, L. (2013). Effects of cortisol on innate immune responses and on mRNA levels of corticosteroid receptors in rainbow trout. Fish & Shellfish Immunology. Volume 34, Issue 6, June 2013, Page 1741. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2013.03.324 Ten Dijke, P., & Hill, C. S. (2004). New insights into TGF-β–Smad signalling. Trends in Biochemical Sciences, 29(5), 265–273. https://doi.org/10.1016/J.TIBS.2004.03.008 Thompson, L. A., Cooke, S. J., Donaldson, M. R., Hanson, K. C., Gingerich, A., Klefoth, T., & Arlinghaus, R. (2008). Physiology, behavior, and survival of angled and air-exposed largemouth bass. North American Journal of Fisheries Management, 28(4), 1059–1068. https://doi.org/10.1577/M07-079.1 Tingley, M. P., & Huybers, P. (2013). Recent temperature extremes at high northern latitudes unprecedented in the past 600 years. Nature, 496(7444), 201–205. https://doi.org/10.1038/nature11969. Tintos, A; Miguez, J. M; Mancera, J. M; Soengas, J. L, (2006). Development of a microtitre plate indirect ELISA for measuring cortisol in teleosts, and evaluation of stress responses in rainbow trout and gilthead sea bream. Journal of Fish Biology. Volume 68. Issue 1. Page 251-263. DOI10.1111/j.0022- 1112.2006.00898.x Tizard, I. (2013). Innate Immunity: Proinflammatory and Antimicrobial Mediators. Veterinary Immunology, 30–40. http://evolve.elsevier.com/Tizard/immunology/ Tjelle, T. E., T. Løvdal, and T. Berg, (2000). “Phagosome dynamics and function,” BioEssays, vol. 22, no. 3, pp. 255–263. https://doi.org/10.1002/(SICI)1521-1878(200003)22:3<255::AID-BIES7>3.0.CO;2-R Toda, H., Saito, Y., Koike, T., Takizawa, F., Araki, K., Yabu, T., Somamoto, T., Suetake, H., Suzuki, Y., Ototake, M., Moritomo, T., & Nakanishi, T. (2011). Conservation of characteristics and functions of CD4 positive lymphocytes in a teleost fish. Developmental & Comparative Immunology, 35(6), 650–660. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2011.01.013 Tort, L. (2011). Stress and immune modulation in fish. Developmental and Comparative Immunology, 35(12), 1366–1375. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.07.002 Trenzado Romero, Cristina (2004). Seleccion parental y dieta comno estrategias de atenuacion del estres cronico e la trucha (Oncorhynchus mykiss). Tesis Doctoral. Departamento de Biologia Animal y Ecologia. Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, España, 350p. https://digibug.ugr.es/bitstream/handle/10481/1780/17332825.pdf?sequence=1&isAllowed=y Tsunawaki, S., Kagara, S., Yoshikawa, K., Yoshida, L. S., Kuratsuji, T., & Namiki, H. (1996). Involvement of p40 (phox) in activation of phagocyte NADPH oxidase through association of its carboxyl-terminal, but not its amino-terminal, with p67(phox). Journal of Experimental Medicine, 184(3), 893–902. https://doi.org/10.1084/jem.184.3.893 Utke, K., Bergmann, S., Lorenzen, N., Köllner, B., Ototake, M., & Fischer, U. (2007). Cell-mediated cytotoxicity in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, infected with viral haemorrhagic septicaemia virus. Fish and Shellfish Immunology, 22(3), 182–196. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2006.04.008 Valero, Y., Cuesta, A., Abellán, E., Esteban, M. A., Meseguer, J., & Chaves-Pozo, E. (2013). Antimicrobial peptides in the gonad of european sea bass and gilthead seabream upon infection with nodavirus. Fish & Shellfish Immunology, 34(6), 1744. https://doi.org/10.1016/J.FSI.2013.03.331 Vallejo, A. N., Miller, N. W., & William Clem, L. (1992). Antigen processing and presentation in teleost immune responses. Annual Review of Fish Diseases, 2(C), 73–89. https://doi.org/10.1016/0959-8030 (92)90057-5 https://doi.org/10.1038/nature11969 http://evolve.elsevier.com/Tizard/immunology/ 205 Van de Garde, M. D. B., Martinez, F. O., Melgert, B. N., Hylkema, M. N., Jonkers, R. E., & Hamann, J. (2014). Chronic exposure to glucocorticoids shapes gene expression and modulates innate and adaptive activation pathways in macrophages with distinct changes in leukocyte attraction. Journal of Immunology, 192(3), 1196–1208. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1302138 Van der Boon, J., G. Van den Thillart, A. D. F. Addink. (1991). The effects of cortisol administration on intermediary metabolism in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology A, 100: 47-53. https://doi.org/10.1016/0300-9629(91)90182-C Van der Vaart, M., Spaink, H. P., & Meijer, A. H. (2012). Pathogen recognition and activation of the innate immune response in zebrafish. Advances in Hematology, 2012. https://doi.org/10.1155/2012/159807 Van Furth, R., Cohn, Z. A., Hirsch, J. G., Humphrey, J. H., Spector, W. G., & Langevoort, H. L. (1972). The mononuclear phagocyte system: a new classification of macrophages, monocytes, and their precursor cells. Bulletin of the World Health Organization, 46(6), 845–852. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2480884/ Varsamos, S., Flik, G., Pepin, J. F., Bonga, S. E. W. and Breuil, G. (2006). Husbandry stress during early life stages affects the stress response and health status of juvenile sea bass, Dicentrarchus labrax. Fish Shellfish Immunol. 20, 83–96. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2005.04.005 Vasta, G. R., Nita-Lazar, M., Giomarelli, B., Ahmed, H., Du, S., Cammarata, M., Parrinello, N., Bianchet, M. A., & Amzel, L. M. (2011). Structural and functional diversity of the lectin repertoire in teleost fish: Relevance to innate and adaptive immunity. Developmental and Comparative Immunology, 35(12), 1388– 1399. https://doi.org/10.1016/j.dci.2011.08.011 Vazzana, M., Cammarata, M., Cooper, E. L. and Parrinello, N. (2002). Confinement stress in sea bass (Dicentrarchus labrax) depresses peritoneal leukocyte cytotoxicity. Aquaculture. 210, 231–243. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(01)00818-3 Verburg-van Kemenade, B. M. L., Cohen, N., & Chadzinska, M. (2017). Neuroendocrine-immune interaction: Evolutionarily conserved mechanisms that maintain allostasis in an ever-changing environment. Developmental and Comparative Immunology, 66, 2–23. https://doi.org/10.1016/j.dci.2016.05.015 Verrier, E. R., Langevin, C., Benmansour, A., & Boudinot, P. (2011). Early antiviral response and virus- induced genes in fish. Developmental & Comparative Immunology, 35(12), 1204–1214. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2011.03.012 Vijayan, M.M., Moon, T.W. (1994). The stress-response and the plasma disappearance of corticosteroid and glucose in a marine teleost, the sea raven by view web of science researcherid and orcid (provided by clarivate), 1994; Canadian journal of zoology-revue canadienne de zoologie. Volume 72, issue 3, page 379- 386. doi 10.1139/z94-054 Vijayan, M. M., C. Pereira, E. G. Grau, G. K. Iwama. (1997a). Metabolic responses associated with confinement stress in tilapia: The role of cortisol. Comparative Biochemistry and Physiology C, 116: 89-95. https://doi.org/10.1016/S0742-8413(96)00124-7 Vijayan, M. M., Raptis, S., & Sathiyaa, R. (2003). Cortisol treatment affects glucocorticoid receptor and glucocorticoid-responsive genes in the liver of rainbow trout. General and Comparative Endocrinology, 132(2), 256–263. https://doi.org/10.1016/S0016-6480(03)00092-3 Vijayan, M. M., Aluru, N. and Leatherland, J. F. (2010). Stress response and the role of cortisol. In Fish Diseases and Disorders. Vol 2: Non-Infectious Disorders (eds. J. F. Leatherland and P. Woo), pp. 182–201. Oxfordshire: CABI. www.cabi.org Volpp, B.D., Nauseef, W.M., Donelson, J.E., Moser, D.R., Clark, R.A., (1989). Cloning of the cDNA and functional expression of the 47-kilodalton cytosolic component of human neutrophil respiratory burst oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 7195–7199. https://doi.org/10.1073/pnas.86.18.7195 https://doi.org/10.1016/S0016-6480 206 Wang R, Belosevic M. (1995). The in vitro effects of estradiol and cortisol on the function of a long-term goldfish macrophage cell line. Dev Comp Immunol; 19: 327–36. https://doi.org/10.1016/0145- 305X(95)00018-O Wang T, Hanington P.C, Belosevic M, Secombes CJ. (2008). Two macrophage colony stimulating factor genes exist in fish that differ in gene organization and are differentially expressed. J Immunol; 181:3310- 22. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.181.5.3310 Warnock, R. A., Campbell, J. J., Dorf, M. E., Matsuzawa, A., McEvoy, L. M., & Butcher, E. C. (2000). The role of chemokines in the microenvironmental control of T versus B cell arrest in Peyer’s patch high endothelial venules. Journal of Experimental Medicine, 191(1), 77–88. https://doi.org/10.1084/jem.191.1.77 Watanuki, H; Yamaguchi, T; Sakai, M. (2002). Suppression in function of phagocytic cells in common carp Cyprinus carpio L. injected with estradiol, progesterone or 11-ketotestosterone. View Web of Science Researcher ID and ORCID (provided by Clarivate). Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology. Volume 132. Issue 4. Page 407-413. Article Number PII S1532-0456(02)00100-X. DOI 10.1016/S1532-0456(02)00100-X Wedemeyer, G. A. and McLeay, D. J. (1981). Methods for determining the tolerance of fishes to environmental stressors. In Stress and Fish (ed. A. D. Pickering), pp. 295–321. London: Academic Press. https://scholar.google.com/scholar_lookup?hl=en&publication_year=1981&pages=242- 275&author=G.+A.+Wedemeyer&author=D.+J.+McLeay&title=+Stress+and+Fish+ Wedemeyer, G. A., Barton, B. A. and Mcleay, D. J. (1990). Stress and acclimation. In Methods for Fish Biology (eds. C. B. Schreck and P. B. Moyle), pp. 451–489. Maryland: American Fisheries Society. Wei, H., Yang, M., Zhao, T., Wang, X., & Zhou, H. (2013). Functional expression and characterization of grass carp IL-10: An essential mediator of TGF-β1 immune regulation in peripheral blood lymphocytes. Molecular Immunology, 53(4), 313–320. https://doi.org/10.1016/J.MOLIMM.2012.08.021 Wendelaar Bonga, S. E. (1997). The stress response in fish. Physiological Reviews, 77(3), 591–625. https://doi.org/10.1152/physrev.1997.77.3.591 Wentzel, A. S., Janssen, J. J. E., de Boer, V. C. J., van Veen, W. G., Forlenza, M., & Wiegertjes, G. F. (2020). Fish Macrophages Show Distinct Metabolic Signatures Upon Polarization. Frontiers in Immunology, 11. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00152 West, T. G., Arthur, P. G., Suarez, R. K., Doll, C. J., & Hochachka, P. W. (1993). In vivo utilization of glucose by heart and locomotory muscles of exercising rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Experimental Biology, 177(1), 63–79. https://doi.org/10.1242/jeb.177.1.63 Weyts, F. A. A., Flik, G., & Verburg-Van Kemenade, B. M. L. (1998a). Cortisol inhibits apoptosis in carp neutrophilic granulocytes. Developmental & Comparative Immunology, 22(5–6), 563–572. https://doi.org/10.1016/S0145-305X(98)00027-5 Weyts, F. A. A., Flik, G., Rombout, J. H. W. M. and Verburg-Van Kemenade, B. M. L. (1998b). Cortisol induces apoptosis in activated B cells, not in other lymphoid cells of common carp, Cyprinus carpio. Dev. Comp. Immunol. 22, 551–562. https://doi.org/10.1016/S0145-305X(98)00033-0 Weyts, F. A. A., Verburg-Van Kemenade, B. M. L., & Flik, G. (1998c). Characterisation of Glucocorticoid Receptors in Peripheral Blood Leukocytes of Carp, Cyprinus carpioL. General and Comparative Endocrinology, 111(1), 1–8. https://doi.org/10.1006/GCEN.1998.7080 Weyts, F. A. A., Cohen, N., Flik, G., & Verburg-van Kemenade, B. M. L. (1999). Interactions between the immune system and the hypothalamo-pituitary-interrenal axis in fish. Fish and Shellfish Immunology, 9(1), 1–20. https://doi.org/10.1006/fsim.1998.0170 Wiegertjes, G.F; Wentzel, A.S; Spaink, H.P; Elks, P.M; Fink, I.R. (2016). Polarization of immune responses in fish: The 'macrophages first' point of view. Molecular Immunology. Volume 69. Page: 146-156. DOI10.1016/j.molimm.2015.09.026 https://doi.org/10.1084/jem.191.1.77 https://doi.org/10.1006/GCEN.1998.7080 https://doi.org/10.1006/fsim.1998.0170 207 Williams H, Brenner S, Venkatesh B. (2002). Identification and analysis of additional copies of the platelet- derived growth factor receptor and colony stimulating factor 1 receptor genes in fugu. Gene 295:255–64. doi:10.1016/S0378-1119(02)00736-9 Winberg, S., Höglund, E. and Øverli, Ø. (2016). Variation in the Neuroendocrine Stress Response. In Fish Physiology - Biology of Stress in Fish, Vol. 35 (eds. C. B. Schreck, L. Tort, A. P. Farrell and C. J. Brauner), San Diego, CA: Academic Press. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-802728-8.00002-3 Wojtaszek, J., Dziewulska-Szwajkowska, D., Lozin´ska-Gabska, M., Adamowicz, A. and Dzugaj, A. (2002). Hematological effects of high dose of cortisol on the carp (Cyprinus carpio L.): cortisol effect on the carp blood. Gen. Comp. Endocrinol. 125, 176–183. https://doi.org/10.1006/gcen.2001.7725 Wolf, K., & Quimby, M. C. (1971). Salmonid viruses: Infectious pancreatic necrosis virus - Morphology, pathology, and serology of first european isolations. Archiv Für Die Gesamte Virusforschung, 34(2), 144– 156. https://doi.org/10.1007/BF01241716 Wood, C. M., Turner, J. D., & Graham, M. S. (1983). Why do fish die after severe exercise? Journal of Fish Biology, 22(2), 189–201. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1983.tb04739.x Wood, C. M., Walsh, P. J., Thomas, S., & Perry, S. F. (1990). Control of red blood cell metabolism in rainbow trout after exhaustive exercise. Journal of Experimental Biology, 154, 491–507. https://doi.org/10.1242/jeb.154.1.491 Wood, C. M., & LeMoigne, J. (1991). Intracellular acid-base responses to environmental hyperoxia and normoxic recovery in rainbow trout. Respiration Physiology, 86(1), 91–113. https://doi.org/10.1016/0034-5687(91)90042-H Woodward, C. C., & Strange, R. J. (1987). Physiological stress responses in wild and hatchery-reared rainbow trout. Transactions of the American Fisheries Society, 116(4), 574–579. https://doi.org/10.1577/1548-8659(1987)116[574:PSRIWA]2.0.CO;2 Wright, P. A., Campbell, A., Morgan, R. L., Rosenberger, A. G., & Murray, B. W. (2004). Dogmas and controversies in the handling of nitrogenous wastes: Expression of arginase Type I and II genes in rainbow trout: Influence of fasting on liver enzyme activity and mRNA levels in juveniles. Journal of Experimental Biology, 207(12), 2033–2042. https://doi.org/10.1242/jeb.00958 Xia, J. H., Liu, P., Liu, F., Lin, G., Sun, F., Tu, R., et al. (2013). Analysis of stress-responsive transcriptome in the intestine of Asian seabass (Lates calcarifer) using RNA-Seq. DNA Res 2, 449–460. https://doi.org/10.1093/dnares/dst022 Xie, Y., Tolmeijer, S., Oskam, J.M., Tonkens, T., Meijer, A.H., Schaaf, M.J.M. (2019). Glucocorticoids inhibit macrophage differentiation towards a pro- Inflammatory phenotype upon wounding without affecting their migration. Disease Models and Mechanisms. Vol 12, Issue 5. Art dmm037887. https://doi. org/10.1242/dmm.037887 Xu, D. y Rogers, W.A. (1991). Electron microscopy of infection by Saprolegnia spp. in channel catfish. J. Aquat. Anim. Health, 3: 63-69. https://doi.org/10.1577/1548-8667(1991)003<0063:EMOIBS>2.3.CO;2 Yada, T. Azuma, T. Hirano, T, Grau, E.G. (2001). Effects of hypophysectomy on immune functions in channel catfish. Perspective in comparative endocrinology: unity and diversit. 14th International Congress of Comparative Endocrinology. Monduzzi Editore, Bologna,2001; pp. 369-376. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2008.02.009 Yada, T. & Nakanishi, T. (2002). Interaction between endocrine and immune systems in fish. International Review of Cytology, 220, 35–92. https://doi.org/10.1016/S0074-7696(02)20003-0 Yada, T., Uchida, K., Kajimura, S., Azuma, T., Hirano, T., Grau, E.G., (2002). Immunomodulatory effects of prolactin and growth hormone in the tilapia, Oreochromis mossambicus. J. Endocrinol. 173 (3), 483–492. https://doi.org/10.1677/joe.0.1730483 https://doi.org/10.1242/jeb.00958 https://doi.org/10.1016/S0074-7696(02)20003-0 208 Yada, T; Muto, K, Azuma, T; Hyodo, S; Schreck, C.B. (2005). Cortisol stimulates growth hormone gene expression in rainbow trout leucocytes in vitro. General and Comparative Endocrinology. Volume 142. Issue 1-2. Page: 248-255. DOI 10.1016/j.ygcen.2005.01.008 Yada, T. (2007). Growth hormone and fish immune system. Gen. Comp. Endocrinol. 152, 353–358. Doi 10.1016/j.ygcen.2007.01.045 Yada, T; Azuma, T; Hyodo, S; Hirano, T; Grau, E.G; Schreck, C.B (2007). Differential expression of corticosteroid receptor genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) immune system in response to acute stress Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. Volume 64. Issue 10. Page:1382-1389. https://doi-org.bucm.idm.oclc.org/10.1139/f07-110 Yada, T., Miyamoto, K., Miura, G., & Munakata, A. (2014). Seasonal changes in gene expression of corticoid receptors in anadromous and non-anadromous strains of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 85(4), 1263–1278. https://doi.org/10.1111/jfb.12521 Yada, T., & Tort, L. (2016). Stress and Disease Resistance: Immune System and Immunoendocrine Interactions. Fish Physiology (Vol. 35). Biology of stress in fish. Edited by Anthony P. Farrell and Colin J. Brauner Honorary Editors: William S. Hoar and David J. Randall. Academic Press is an imprint of Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802728-8.00010-2 Yada, T., Abe, M., & Miyamoto, K. (2019). Down-regulation of corticosteroid receptor in leucocytes of stressed rainbow trout. General and Comparative Endocrinology, 280, 54–61. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2019.04.011 Yang, B. Y; Greene, M; Chen, T.T. (1999). Early embryonic expression of the growth hormone family protein genes in the developing rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Mol. Reprod. Dev., 53 (1999), pp. 127-134. https://doi.org/10.1002/(SICI)1098-2795(199906)53:2<127::AID-MRD1>3.0.CO;2-H Yano, T. (1996). 3 The Nonspecific Immune System: Humoral Defense. In Fish Physiology (Vol. 15, Issue C). https://doi.org/10.1016/S1546-5098(08)60273-3 Yoder, J. A., Litman, R. T., Mueller, M. G., Desai, S., Dobrinski, K. P., Montgomery, J. S., Buzzeo, M. P., Ota, T., Amemiya, C. T., Trede, N. S., Ostrov, D. A., & Litman, G. W. (2004). Resolution of the novel immune- type receptor gene cluster in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(44), 15706–15711. https://doi.org/10.1073/pnas.0405242101 Yoder, J. A., & Litman, G. W. (2011). The phylogenetic origins of natural killer receptors and recognition: Relationships, possibilities, and realities. Immunogenetics, 63(3), 123–141. https://doi.org/10.1007/s00251-010-0506-4 Yoshida, T., & Kitao, T. (1991). The Opsonic Effect of Specific Immune Serum Phagocytic on the Phagocytic Chemiluminescent Response in Rainbow Trout Onchorynchus mykiss Phagocytes Fish Pathology. Volume 26. Issue 1. Page: 29-33. DOI10.3147/jsfp.26.29 Zapata, A. (1985). Inmunología de peces teleósteos. Primer curso teórico-práctico sobre acuicultura. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Madrid. 123-205 Zapata, A.G., A. Varas y M. Torroba (1992). Seasonal variations in the immune system of lower vertebrates. Immunol. Today, 12:142- 147. https://doi.org/10.1016/0167-5699(92)90112-K Zarate, J., & Bradley, T. M. (2003). Heat shock proteins are not sensitive indicators of hatchery stress in salmon. Aquaculture, 223(1–4), 175–187. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(03)00160-1 Zhang, Y. A., Salinas, I., Li, J., Parra, D., Bjork, S., Xu, Z., et al. (2010). IgT, a primitive immunoglobulin class specialized in mucosal immunity. Nat. Immunol. 11, 827–835. https://doi.org/10.1038/ni.1913 Zhou, D., Huang, C., Lin, Z., Zhan, S., Kong, L., Fang, C., & Li, J. (2014). Macrophage polarization and function with emphasis on the evolving roles of coordinated regulation of cellular signaling pathways. Cellular Signalling, 26(2), 192–197. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2013.11.004 https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802728-8.00010-2 https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2019.04.011 https://doi.org/10.1016/S1546-5098(08)60273-3 https://doi.org/10.1073/pnas.0405242101 209 Zhu, L.-Y., Lin, A.-F., Shao, T., Nie, L., Dong, W.-R., Xiang, L.-X., & Shao, J.-Z. (2014). B cells in teleost fish act as pivotal initiating apcs in priming adaptive immunity: An evolutionary perspective on the origin of the B-1 cell subset and B7 molecules. Journal of Immunology, 192(6), 2699–2714. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1301312 Zimmerberg, J. & Kozlov, M.M. (2006). How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. Volume 7, Issue 1, Page: 9-19. DOI:10.1038/nrm1784 Zinyama R.B, Bancroft G.J, Sigola L.B. (2001) Adrenaline suppression of the macrophage nitric oxide response to lipopolysaccharide is associated with differential regulation of tumour necrosis factor-alpha and interleukin-10. Immunol 104: 439-446. https://doi.org/10.1046/j.1365-2567.2001.01332.x Zou, J., Cunningham, C., & Secombes, C. J. (1999). The rainbow trout Oncorhynchus mykiss interleukin-1β gene has a different organization to mammals and undergoes incomplete splicing. European Journal of Biochemistry, 259(3), 901–908. https://doi.org/10.1046/j.1432-1327.1999.00121.x Zou, J., Carrington, A., Collet, B., Dijkstra, J. M., Yoshiura, Y., Bols, N., & Secombes, C. (2005). Identification and bioactivities of IFN-γ in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: The first Th1-type cytokine characterized functionally in fish. Journal of Immunology, 175(4), 2484–2494. https://doi.org/10.4049/jimmunol.175.4.2484 Zou, J., & Secombes, C. J. (2011). Teleost fish interferons and their role in immunity. Developmental & Comparative Immunology, 35(12), 1376–1387. https://doi.org/10.1016/J.DCI.2011.07.001 https://doi.org/10.4049/jimmunol.1301312 210 211 8. ANEXO I: ABREVIATURAS 212 A: adrenalina. ACAT: enzima Acil-Coa colesterol Acil transferasa. ACh (ACH): acetilcolina. ACTH: hormona adrenocorticotropa. ADN: ácido desoxirribonucleico. ALR: receptor ausencia de melanoma. AM: actividad macrofágica. AMP: péptido antimicrobiano. AMPc: adenosin monofosfato cíclico. AP: autoproliferación. APP: proteína de fase aguda. ARNm: ácido ribonucleico mensajero. ATP: adenosin trifosfato. AVT: arginasa vasotocina. BKD: enfermedad bacteriana renal. b558: citocromo. CCDV:canales calcio dependientes de voltaje. CD: célula detrítica. CSF: factor estimulante de colonias. CM: célula Mast. CMM: centro melanomacrofágicos. CPK: creatina fosfoquinasa. CRH: hormona liberadora de corticotropina. DA: dopamina. E: epinefrina. EGC: eosinófilos. ELISA: ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. END: endorfina. GC: glucocorticoide. 213 G-CSF: factor estimulante de colonias de granulocitos. GH: hormona del crecimiento. GR: receptor de glucocorticoide. HHI: eje hipotálamo-hipófisis-interrenal. HSP: proteína de estrés (térmico). 5-HT: hidroxi-triptamina o serotonina. IDO: indoleamina 2,3 dioxigenasa. Ig: inmunoglobulinas. IL: interleuquinas. iNOS: enzima sintasa inducible. IT: isotocina. IHNV: virus necrosis hematopoyética infecciosa. INF: interferon. IPNV: virus necrosis pancreática infecciosa. ISAV: virus anemia infecciosa del salmón. LDH-R: lactato deshidrogenasa reductasa. LDL: lipoproteínas de baja densidad. LPS: lipopolisacáridos bacterianos. MAF: factor activador de macrófagos. MALT: tejido linfoide asociado a mucosas. MCH: hormona concentradora de melanina. M-CSF (CSF-1): factor estimulante de colonias de macrófagos. MGF: factor de crecimiento endógeno de macrófagos. MGH- CoA: 3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A. MHC: complejo mayor de histocompatibilidad. MØ: macrófago. MPO: mieloperoxidasa. MPS: sistema fagocito mononuclear. MR: receptor de mineralocorticoides. MSH: hormona estimulante de melanocitos. 214 M1: respuesta efectora de macrófagos. M2: respuesta alternativa de macrófagos. NA: noradrenalina. nAchR: receptor nicotínico. NE: norepinefrina. NAD⁺: nicotinamida adenina dinucleótido. NADPH: nicotinamida adenin dinucleótido fosfato hidrogeno oxidasa. NCC: célula citotóxica no específica. NET: trampa extracelular de neutrófilos. NK: célula asesina o célula citotóxica. NLR: receptor rico en leucina. NP Y: neuropeptido Y. PAMP: patrones moleculares asociados a patógenos. PCR: proteína C reactiva. PCR-RT: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. PKC: proteincinasa. PKR: proteína quinasa R. PMN: leucocito circulante polimorfonucleares. PRL: prolactina. P450 SCC: desmolasa o enzima de escisión del colesterol. RLR: receptor de ácido retinoico. RIA: técnica de radioinmunoensayo. ROS: compuestos reactivos de oxígeno. SAP: proteína amieloide sérica. sCSF-1R: forma soluble del receptor de CSF-1. SER: sistema reticuloendotelial. SL: somatolactina. SNC: sistema nervioso central. SNS: sistema nervioso simpático. https://es.wikipedia.org/wiki/Nicotinamida_adenina_dinucle%C3%B3tido 215 TCR: receptor de linfocito T. TDO: triptófano 2,3 dioxigenasa. TGF-β: factor de crecimiento transformante betta. Tm: tonelada. TNF-α: factor de necrosis tumoral alpha. TRH: hormona tiroidea. TRIM: proteína fin. T3: triyodotironina. T4: tiroxina. VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular. VHSV: virus septicemia hemorrágica viral. 216 9. ANEXO II: RELACIÓN DE TABLAS Y FIGURAS 217 9.1 RELACIÓN DE TABLAS: Tabla 1: Resultados medios totales, máximos y mínimos, obtenidos en ambos grupos de truchas estudiados (concentradas y control) sobre cortisol sérico (ng/mL¯¹), glucosa sanguínea (mg/dL¯¹) y lactato sanguíneo (nmol/dL¯¹), también por temperaturas medias del agua de la semana de muestreo superiores e inferiores a 15ºC. Tabla 2: Temperaturas medias y acumuladas del agua de la semana de muestreo y de la semana premuestreo. Tabla 3: Explosión respiratoria (nm) obtenidas a 620nm en cada muestreo sin utilizar bacterias (basal) y utilizando estas (inducida) sobre los macrófagos a estudio (C). Tabla 4: Resultados de explosión respiratoria (nm) en cada uno de los muestreos en macrófagos procedentes de truchas estresadas (S) y control (C), de forma basal (0) e inducida (1) por bacterias. Tabla 5: Niveles medios de explosión respiratoria mostrada (nm) y los porcentajes correspondientes en cada uno de los grupos (S y C) tanto basal (0) como inducida (1) según temperatura media del agua superior e inferior a 15ºC en la semana del muestreo. Tabla 6: Resultados de fagocitosis 4hpi, en unidades formadoras de colonias (UFC) en el grupo sometido a crowding (S) y grupo control (C) con respecto a la bacteria expuesta (inóculo). Tabla 7: Resultados medios de fagocitosis 4hpi (UFC) y porcentajes correspondientes en ambos grupos con temperaturas medias del agua inferiores y superiores a 15ºC en la semana del muestreo. Tabla 8: Resultados en unidades formadoras de colonias (UFC) y sus porcentajes, de supervivencia bacteriana tras 24hpi en el grupo estresado (S) y el control (C) en función de las UFC fagocitadas a las 4hpi. Tabla 9: Resultados medios de supervivencia bacteriana y porcentajes de bacterias contabilizadas en el interior de los macrófagos a las 24hpi con respecto a las fagocitadas a las 4hpi, según temperatura media del agua en la semana del muestreo, superior o inferior a 15ºC Tabla 10: Número de macrófagos contabilizados a las 0h, 4hpi y 24hpi en ambos grupos (S y C) tras someterlos a bacterias. Tabla 11: Recuento de macrófagos en ambos grupos (S y C) tras añadirles sobrenadantes procedentes de macrófagos estresados (S´) y tranquilos (C´), a las 4h post exposición. 218 9.2 RELACIÓN DE FIGURAS: Figura 1: Dibujo de trucha arcoíris adulta. Figura 2: Ciclo de producción de trucha arcoiris. Figura 3: Evolución de la cría de trucha arcoiris en España desde mediados del siglo XX. Figura 4: Esquema piscifactoría de estanques en paralelo de ciclo cerrado. Figura 5: Foto del manejo de crowding en la propia piscifactoría. Figura 6: Imagen con microscopia óptica de macrófagos teñidos en un frotis sanguíneo. Figura 7: Etapas del funcionamiento efector de macrófagos durante la fagocitosis. Figura 8: Dibujo de activación y proceso estallido respiratorio dependiente de oxígeno en el fagolisosoma. Figura 9: Secuenciación de los diferentes tipos de digestión en macrófagos efectores. Figura 10: Diferentes vías de activación y resultado en macrófagos en peces óseos. Figura 11: Esquema informativo del efecto del estrés en respuestas orgánicas por activación de hormonas: catecolaminas y corticosteroides. Figura 12: Ultraestructura liberacion de catecolaminas en célula cromafin. Figura 13: Vía bioquímica de la síntesis de cortisol en células interrenales. Figura 14: Esquema formación cortisol en la mitocondria de células interrenales. Figura 15: Esquema regulación eje Hipotálamo Hipófisis Interenal. Figura 16: Esquema de la ruta hiperglucémica como respuesta a un estímulo estresante. Figura 17: Representación esquemática de las vías de comunicación entre sistema nervioso central y el sistema inmune en peces teleósteos vía riñón anterior. Figura 18: Relación entre estresores y activación/supresión inmune. Figura 19: Representación conceptual de los efectos sobre la función inmune del receptor del cortisol. Figura 20: Fotografía de un estanque en hacinamiento intenso de la propia piscifactoría PISZOLLA. 219 Figura 21: Extraccion de la parte del riñon anterior de una de las truchas del estudio. Figura 22: Valores medios de explosión respiratoria basal e inducia (nm) en cada muestreo (meses) y líneas de evolución de temperatura (⁰C) media en la semana de muestreo y acumulada. Figura 23: Porcentaje explosión respiratoria obtenidas de media por comparación entre el grupo S y grupo C dependiendo si son basales (0) o inducidas (1). Figura 24: Comparación de explosión respiratoria (nm) basal e inducid de cada grupo (S y C) según temperatura media del agua a 7 días del muestreo superior e inferior a 15ºC. Figura 25: Porcentaje de bacterias encontradas a las 4hpi en los macrófagos del grupo estresado (S) y del grupo control (C), con respecto al inóculo. Figura 26: Porcentaje de supervivencia bacteriana del grupo estresado (S) y del control (C) a las 24hpi en comparación con lo fagocitado a las 4hpi por cada grupo. Figura 27: Porcentaje de recuento de macrófagos en ambos grupos (S y C) a las 0h, 4hpi y 24hpi según la bacteria utilizada. Figura 28: Porcentaje del número de macrófagos en ambos grupos (S y C) a las 0h, 4hpi y 24hpi de todos los muestreos. Figura 29: Porcentaje de recuento de macrófagos de los grupos S y C tras añadirles sobrenadantes procedentes de macrófagos infectados estresados (S´) y tranquilos (C´) a las 4h post exposición. 220 221 Tesis Lorenzo García Muñoz PORTADA ÍNDICE AGRADECIMIENTOS 1. RESUMEN/ABSTRACT 1.1 RESUMEN 1.2 ABSTRACT 2. INTRODUCCIÓN 2.1 ACUICULTURA 2.1.2 DATOS PRODUCTIVOS 2.1.3 TRUCHA ARCOÍRIS (Oncorhynchus mykiss) 2.1.3.1 FASES DEL CICLO DE CULTIVO 2.1.3.2 CULTIVO TRUCHA ARCOÍRIS 2.1.3.3 MANEJO EN PISCIFACTORÍA DE ENGODE DE TRUCHA ARCOÍRIS 2.1.3.3.1 CONDICIONANTES AMBIENTALES 2.1.3.3.2 CONCENTRACIÓN PARA MANEJO (CROWDING) 2.1.3.4 ESTADO ZOOSANITARIO 2.1.3.4.1 VÍRICAS 2.1.3.4.2 BACTERIANAS 2.1.3.4.3 FÚNGICAS 2.1.3.4.4 PARASITARIAS 2.2. SISTEMA INMUNE TELEÓSTEOS. 2.2.1 INTRODUCCIÓN 2.2.2 RESPUESTA INMUNE INESPECÍFICA 2.2.2.1 BARRERAS DE SUPERFICIE 2.2.2.2 FACTORES HUMORALES INESPECÍFICOS 2.2.2.2.1 COMPLEMENTO 2.2.2.2.2 PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS (AMP) 2.2.2.2.3 ENZIMAS LÍTICAS 2.2.2.2.4 LECTINAS 2.2.2.2.5 ANTI-PROTEASAS 2.2.2.2.6 EICOSANOIDES 2.2.2.3 FACTORES CELULARES INESPECÍFICOS 2.2.2.3.1 CÉLULAS CITOTÓXICAS NATURALES 2.2.2.3.2 CÉLULAS FAGOCÍTICAS 2.2.2.3.3 INFLAMACIÓN 2.2.3 RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA 2.2.3.1 RESPUESTA HUMORAL 2.2.3.2 RESPUESTA CELULAR 2.2.4 MEDIADORES SOLUBLES DE INMUNIDAD 2.2.4.1 CITOQUINAS 2.2.4.1.1 QUIMIOCINAS 2.2.4.1.2 INTERFERONES (INF) 2.2.4.1.3 INTERLEUQUINAS (IL) 2.2.4.1.4 OTRAS CITOQUINAS 2.2.5 BIOLOGÍA DE LOS MACRÓFAGOS 2.2.5.1 INTRODUCCIÓN 2.2.5.2 PROCESO DE FAGOCITOSIS 2.2.5.3 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS 2.2.5.3.1 VÍAS DE ACTIVACIÓN M1 2.2.5.3.2 VÍAS DE ACTIVACIÓN M2 2.3 FACTORES QUE AFECTAN A INMUNIDAD 2.3.1 INTRÍNSECOS 2.3.1.1 INDIVIDUO 2.3.1.2 EDAD 2.3.1.3 ESTADO FISIOLÓGICO 2.3.1.4 ESTRÉS 2.3.1.5 NIVELES HORMONALES 2.3.1.6 NUTRICIÓN 2.3.2 EXTRÍNSECOS 2.3.2.1 TEMPERATURA 2.3.2.2 ESTACIONALIDAD 2.3.2.3 COMPUESTOS TÓXICOS CONTAMINANTES 2.3.2.3.1 METALES PESADOS 2.3.2.3.2 CONTAMINANTES INORGÁNICOS 2.3.2.3.3 CONTAMINANTES ORGÁNICOS 2.3.2.3.4 OTROS CONTAMINANTES 2.4 ESTRÉS EN TELEÓSTEOS 2.4.1 ESTRÉS Y AGENTES ESTRESANTES 2.4.2 RESPUESTAS FISIOLÓGICAS AL ESTRÉS 2.4.2.1 EJE HIPOTÁLAMO-SIMPÁTICO-CÉLULAS CROMAFINES 2.4.2.2 EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-INTERRENAL 2.4.3 DETERMINACION DEL ESTRÉS 2.4.3.1 RESPUESTAS PRIMARIAS 2.4.3.2 RESPUESTAS SECUNDARIAS 2.4.3.3 RESPUESTAS TERCIARIAS 2.5 RESPUESTA INMUNE FRENTE AL ESTRÉS 2.5.1 INTRODUCCIÓN 2.5.2 RESPUESTA INMUNE AL ESTRÉS AGUDO Y CRÓNICO 2.5.3 RESPUESTAS A NIVEL DE INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA 2.5.4 ESTRÉS Y FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1 PECES 4.2 MUESTRAS 4.3 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS 4.4 BACTERIAS 4.5 RECOLECCIÓN DE MACRÓFAGOS 4.6 CONTAJE DEL NUMERO DE MACRÓFAGOS POR POCILLO 4.7 FAGOCITOSIS Y SUPERVIVENCIA BACTERIANA 4.8 EXPLOSIÓN RESPIRATORIA 4.9 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS 4.10 PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES 4.11 ANÁLISIS DE DATOS 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS MARCADORES DE ESTRÉS 5.1.1 RESULTADOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS DE ESTRÉS 5.1.2 DISCUSIÓN PARÁMETROS BIOQUÍMICOS DE ESTRÉS 5.2 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA 5.2.1 FUNCIONALIDAD SEGÚN EXPLOSIÓN RESPIRATORIA 5.2.1.1 RESULTADOS EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR TEMPERATURAS 5.2.1.2 DISCUSIÓN EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR TEMPERATURAS 5.2.1.3 RESULTADOS EXPLOSIÓN RESPIRATORIA POR CROWDING 5.2.1.4 DISCUSION EXPLOSIóN RESPIRATORIA POR CROWDING 5.2.2 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA SEGÚN FAGOCITOSIS 5.2.2.1 RESULTADOS FAGOCITOSIS POR CROWDING 5.2.2.2 DISCUSIÓN FAGOCITOSIS POR CROWDING: 5.2.3 FUNCIONALIDAD MACROFÁGICA SEGÚN SUPERVIVENCIA BACTERIANA 5.2.3.1 RESULTADOS DE SUPERVIVENCIA BACTERIANA POR CROWDING 5.2.3.2 DISCUSIÓN SUPERVIVENCIA BACTERIANA POR CROWDING 5.3 RECUENTO DE MACRÓFAGOS 5.3.1 RESULTADOS DE LA PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS 5.3.2 DISCUSIÓN PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS 5.3.3 RESULTADOS PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES 5.3.4 DISCUSIÓN PROLIFERACIÓN DE MACRÓFAGOS CON SOBRENADANTES 5.4 DISCUSIÓN INTEGRAL 6. CONCLUSIONES 7. BIBLIOGRAFÍA 8. ANEXO I: ABREVIATURAS 9. ANEXO II: RELACIÓN DE TABLAS Y FIGURAS 9.1 RELACIÓN DE TABLAS: 9.2 RELACIÓN DE FIGURAS: