UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Papel del glicocálix como marcador de la disfunción endotelial secundaria al daño por isquemia reperfusión MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Ana Alcalde Pinilla Directores Lisa Rancan Gonzalo Marañón Pardillo Madrid © Ana Alcalde Pinilla, 2021 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR III TESIS DOCTORAL Papel del glicocálix como marcador de la disfunción endotelial secundaria al daño por isquemia reperfusión MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Ana Alcalde Pinilla DIRECTORES Dra. Lisa Rancan Dr. Gonzalo Marañón Pardillo Madrid, 2021 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Papel del glicocálix como marcador de la disfunción endotelial secundaria al daño por isquemia reperfusión TESIS DOCTORAL Ana Alcalde Pinilla Madrid 2021 Dra. Lisa Rancan, Profesor Ayudante Doctor del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la UCM. Dr. Gonzalo Marañón Pardillo, Profesor Asociaciado del Departamento de Medicina y Cirugía de la Facultad de Veterinaria de la UCM y Veterinario Asociaciado de Horsepital S.L. CERTIFICAN: Que el presente trabajo de investigación titulado: “Papel del glicocálix como marcador de la disfunción endotelial secundaria al daño por isquemia reperfusion”, presentado por Dñª. Ana Alcalde Pinilla para optar al Grado de Doctor, ha sido realizado bajo nuestra dirección, y que hallándose concluido autorizamos su presentación a fin de que sea juzgado por el tribunal correspondiente. VºBº directores: Fdo.: L. Rancan G. Marañón A mis padres, por estar siempre a mi lado, ayudándome a construir lo que soy A mi familia, por su amor y apoyo incondicional AGRADECIMIENTOS Agradecimientos En primero lugar, quiero mostrar mi agradecimiento a la Dra. Elena Vara Ameigeira, motor de innumerables proyectos, trabajadora, emprendedora y con gran capacidad de transmitir conocimientos. Gracias por haber confiado en mí y en mis posibilidades, sin ella este trabajo no hubiese sido posible. Gracias a la Dra. Lisa Rancan y al Dr. Gonzalo Marañón por aceptar la dirección de esta tesis. A la Dra. Lisa Rancan por su apoyo incondicional, su ayuda, su disponibilidad, sus consejos y su dedicación los cuales han sido fundamentales para mi a lo largo de estos años. Al Dr. Gonzalo Marañón, por haberme enseñado tanto durante mis años de formación en Horsepital, por su paciencia, su capacidad de trabajo y de transmitir los conocimientos de una forma sencilla. A mi familia, en especial a mis padres y a mi hermana, por haber estado siempre a mi lado para todo, por su apoyo en cada decisión que he tomado, por transmitirme tantas cosas importantes, tanta sabiduría, por ser los pilares fundamentales de mi vida. Gracias a vosotros, me he convertido en la persona que soy. Una parte de esta tesis es vuestra. A Mika y Jaime, la felicidad que me aportan hace que todo sea más sencillo. También agradecer a Bubu y a mis tios, que han estado conmigo siempre. A Natale, mi compañero de vida, por ser, por estar, por su cariño, su apoyo incondicional y su confianza en mi. A mi familia italiana, a pesar de la distancia siempre les he sentido muy cerca. Al Dr. William Manley, por haberme permitido participar en su equipo de Horsepital y haber sido una pieza importante en mi formación veterinaria, transmitiéndome su conocimiento y su gran experiencia en el mundo de los caballos. Trabajador incansable, con ganas de renovación constante y con una capacidad máxima de superación. Gracias por haber creído siempre en mí, por el cariño que me brindas y por hacerme sentir siempre en casa. Agradecimientos A todos los compañeros y amigos veterinarios, a los que llevan a mi lado desde el inicio de este largo camino y a los que poco a poco se han ido incorporando. He tenido la gran suerte de poder compartir con ellos profesión, conocimientos esfuerzo y dedicacion, los cuales me han aportado mucho tanto a nivel personal como profesional, en especial a Atocha Calvo, María Cazorla, Victor Casabona, Laura Vico, Isabel Martínez de Bartolome y Jose Luis García de Castro. Al equipo Horsepital, al núcleo de este gran equipo y a todos los veterinarios que han formado parte de él en algún momento. He tenido el placer de conocer a muchos de ellos y he podido compartir experiencias veterinarias muy enriquecedoras. A mis amigos de siempre, a los que he podido recurrir en cualquier momento y han estado ahí para lo bueno y para lo malo, de alguna manera han sido también parte de esta aventura. A los amigos que he ido haciendo a lo largo de los años y que tantas cosas buenas me han aportado. Agradecer a todas aquellas personas que han participado en mi formación académica a lo largo de estos años y los cuales me han ayudado en gran parte a llegar al punto en el que me encuentro. Gracias por todo. ÍNDICE RESUMEN ............................................................................................................. 11 SUMMARY ............................................................................................................ 14 INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 20 Isquemia-Reperfusión ................................................................................. 21 Fisiopatología del proceso de isquemia- reperfusión ................................. 21 Características de la isquemia reperfusión a nivel intestinal ..................... 26 Isquemia – reperfusión en el cólico equino ................................................ 29 Glicocálix ...................................................................................................... 34 Estructura del glicocálix: proteoglicanos .................................................... 37 Estructura del glicocálix: glucosaminoglicanos .......................................... 39 Estructura del glicocálix: glucoproteínas y componente solubles .............. 41 Funciones del glicocálix ............................................................................. 43 Alteraciones del glicocálix secundarias al estrés oxidativo ................... 48 Glicocálix y proceso inflamatorio .............................................................. 56 Inflamación ................................................................................................. 56 Alteraciones del glicocálix consecuencia del proceso inflamatorio ............ 65 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .................................................................................. 69 MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 72 RESULTADOS ...................................................................................................... 79 DISCUSIÓN ........................................................................................................... 92 CONCLUSIONES ............................................................................................... 100 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 102 RESUMEN Resumen 12 El daño por isquemia-reperfusión (I/R) es una de las principales causas de morbilidad tras cirugías con resección intestinal. El fenómeno de I/R es bastante frecuente y participa en múltiples procesos entre los que se encuentra el cólico equino, siendo esta una de las emergencias más comunes en caballos, con elevadas tasas de mortalidad y morbilidad. En él, se incluye una alteración en el aporte sanguíneo a un tejido determinado que tendrá como consecuencia una alteración en el metabolismo celular, a la cual se suma una posterior reperfusión sobre las células isquémicas que conlleva daños derivados de los radicales libres. Los daños ocasionados por este proceso varían en función de los tejidos, habiendo un factor común en este proceso patológico para todos los órganos: la disfunción endotelial. De hecho, después de fenómenos de isquemia- reperfusión, las células endoteliales sufren estrés oxidativo y presentan tumefacción y desprendimiento de la membrana basal. Como consecuencia, los leucocitos se adhieren y migran y aumenta la permeabilidad vascular. En los cólicos, las consecuencias causadas por este fenómeno varían desde un daño severo en la mucosa o la disfunción de la barrera, hasta shock endotóxico y muerte. Estas consecuencias de los fenómenos de I/R, sugieren que el glicocálix endotelial pueda estar involucrado en este proceso. El glicocálix endotelial es una capa dinámica de macromoléculas localizada en la cara luminal del endotelio, involucrada en la regulación y homeostasis de fluidos. Presenta múltiples funciones: media la síntesis de óxido nítrico y superóxido dismutasa, actúa como barrera filtro-protectora, inhibe la agregación plaquetaria y la coagulación y regula la inflamación previniendo la adhesión de leucocitos (modula las interacciones leucocito-endotelio). Por tanto, el glicocálix podría ser un marcador temprano de daño tisular y por eso se ha investigado Resumen 13 recientemente como uno de los principales componentes de procesos fisiopatológicos relacionados con la inflamación. Investigaciones clínicas y experimentales recientes, muestran que el glicocálix se ve gravemente afectado tras fenómenos de I/R. Parece ser que esto se debe a que, tanto las células endoteliales como el glicocálix, se ven afectados en fenómenos de isquemia- reperfusión y que, juntos, constituyen una doble barrera con los componentes necesarios para el control de la extravasación y la formación de edema. Como consecuencia, se puede encontrar edema tisular extenso, aumento en la producción de trasudado y disfunción endotelial después de la destrucción de esta estructura. El glicocálix es también importante como mediador de la respuesta bioquímica al estrés y su destrucción extensa, ha sido descrita tras el daño por I/R tanto en el miocárdico como a nivel intestinal. Sin embargo, a día de hoy, no se han estudiado en relación a los cólicos equinos. Hipótesis En los sujetos que presentan cólicos sometidos a cirugía con resección abdominal por patología en intestino delgado, se producirían alteraciones en el glicocálix endotelial, que podrían usarse con fines de diagnóstico. Objetivos Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado, los objetivos de este trabajo fueron determinar las posibles alteraciones en la estructura del glicocálix tras fenómenos de I/R intestinal en el cólico equino, así como ver la posible relación con las citoquinas inflamatorias. Resumen 14 Material y métodos Se incluyeron en el estudio, caballos sometidos a cirugía abdominal de intestino delgado de urgencia. Como grupo control, se utilizaron caballos eutanasiados por causas no relacionadas con el sistema cardiovascular ni gastrointestinal. Se tomaron muestras de sangre y tejido con el fin de analizar el edema intestinal, algunos componentes del glicocálix (syndecan 1, heparanasa, heparan sulfato), moléculas de adhesión (VCAM-1 y ICAM-1), metaloproteinasa 9 (MMP-9) y actividad mieoloperoxidasa (MPO). Los niveles de heparan sulfato, syndecan 1, mieloperoxidasa, heraparanasa, MMP-9, VCAM-1 e ICAM-1 se midieron en plasmas y/o muestras de biopsia intestinal usando kits específicos de ELISA. Resultados Nuestros resultados mostraron una disminución de los niveles intestinales de los principales marcadores del glicocálix (syndecan-1 y heparán sulfato) y un aumento de los mismos en plasma en caballos sometidos a cirugía abdominal. Esto sugiere una posible degradación del glicocálix en respuesta al daño por I/R, acompañado de edema intestinal y aumento de la expresión de moléculas de adhesión, con la consecuente activación de neutrófilos, proponiendo un posible mecanismo fisiopatológico para el daño intestinal y un impacto sistémico potencial. Resumen 15 Conclusiones Nuestros resultados sugieren que la actividad inflamatoria secundaria al fenómeno de I/R, da lugar a una alteración del glicocálix en caballos con cólico sometidos a cirugía, pudiendo contribuir también en la vulnerabilidad vascular. El glicocálix presenta un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis, por lo que prevenir la degradación del mismo podría suponer un beneficio durante las cirugías. Además, la presencia de componentes de glicocálix en muestras de plasma permite hacer un seguimiento del daño a los tejidos producido por I/R de forma no invasiva tras cirugía con resección abdominal. SUMMARY Summary 17 Ischaemia-reperfusion (I/R) injury is a main cause of morbidity after intestinal resection surgeries. The I/R syndrome is very frequent and takes part in many processes like equine colic, one of the most common emergency in horses, which present a high mortality and morbidity rates. It includes a deficient blood supply to tissues that causes the alteration of the cellular metabolism followed by the reperfusión of the ischemic cells, which increased the metabolic alteration and it is worsen by the presence of reactive oxygen species (ROS). Although the severity of the damage resulting from I/R varies between tissues, a common component of this pathologic process for all organs is the microvascular dysfunction. In fact, after I/R, endothelial cells suffer from increased oxidative stress and they exhibit swelling and detachment from the basement membrane. Consequently, leukocytes adhere and transmigrate and vascular permeability increases. In equine colics, the consequences caused by this phenomenon range from severe mucosal damage or barrier dysfunction, to endotoxic shock and death. These consequences of I/R suggest an involvement of the endothelial glycocalyx, which is a dynamic layer of macromolecules located on the luminal surface of vascular endothelium that is involved in fluid homeostasis and regulation. The glycocalyx has multiple functions: it mediates nitric oxide synthesis and superoxide dysmutation´s activity, acts as a protective "sieving" barrier, inhibits platelet adherence, and coagulation, and it regulates inflammation by preventing leukocyte adhesion. Then, glycocalyx damage may be an early marker of tissue damage. The endothelial glycocalyx has recently come into focus as a major player in many pathophysiologic states such as inflammation. Recent clinical and experimental investigations show that glycocalyx is severely affected after I/R. Both endothelial cells and glycocalyx are affected by I/R. Together, they constitute a double barrier, with both components necessary to Summary 18 control extravasation and oedema formation. As a consequence, an extensive tissue oedema, increases in transudate production and endothelial dysfunction are frequently found after destruction of this structure. The glycocalyx is also an important mediator of the biochemical response to stress and extensive destruction of the endothelial glycocalyx has been described after myocardial and intestinal ischaemia–reperfusion injury. Hyphotesis In subjects affected by colic that requires intestinal resection surgery due to small intestinal pathology, endothelial glycocalyx alterations occur. Then, glycocalyx damage may be used as an early marker of tissue damage. Aim The aim of this study was to investigate a possible alteration of the glycocalyx caused by intestinal I/R in horses with colic, and its possible relation with inflammatory cytokines. Materials and methods The study included horses subjected to emergency abdominal surgery (SC group) of the small intestine and horses destined for euthanasia (Control group) for reasons unrelated to the cardio-vascular system or gastrointestinal tract. Blood and tissue samples were obtained in order to analyse some glycocalyx components (heparan sulphate, syndecan-1, heparanase), endothelial cell adhesion molecules (VCAM-1 and ICAM-1), metalloproteinase 9 (MMP-9 and myeloperoxidase (MPO). Summary 19 Levels of heparan sulphate, syndecan-1, heparanase, MMP-9, VCAM-1 and ICAM-1 were measured in plasma and/or intestinal tissue biopsies samples using specific ELISA kits. The formation of intestinal oedema was assessed by the wet-to-dry ratio of the intestine biopsies. Results Our results show a decrease in intestinal levels and increased plasma levels of the principal glycocalyx components (heparan sulphate and syndecan- 1) in horses submitted to surgery. This suggests a possible degradation of the glycocalyx in response to I/R, which has been accompanied by the appearance of intestinal oedema and increased adhesion molecules, with subsequent activation of neutrophils. Our results suggest that glycocalyx is involved in the pathophysiological mechanisms that cause intestinal damage after I/R. Moreover, our results suggest that it could have a potential systemic impact given the results evidenced in plasma samples. Conclusions Our results suggest that the inflammatory activity caused by I/R leads to perturbation of the endothelial glycocalyx in horses with colic requiring surgery. This may contribute to the vascular vulnerability Since the endothelial glycocalyx has an important role in maintaining the homeostasis, preventing its shedding or degradation may have important clinical benefits during surgeries. In addition, the presence of glycocalyx components in plasma samples, allow to monitor in a quick and low invasive way the tissue injury caused by IR injury after intestinal resection surgery. INTRODUCCIÓN Introducción 21 ISQUEMIA – REPERFUSIÓN Fisiopatología del proceso de isquemia - reperfusión El síndrome de isquemia-reperfusión (I/R) es un mecanismo de lesión tisular que participa en la fisiopatología de múltiples procesos y comprende dos mecanismos: la isquemia y la reperfusión. En él, están involucrados el proceso de daño intracelular además de una respuesta inflamatoria perjudicial. Los daños producidos por este proceso varían en función de los tejidos, siendo la disfunción endotelial un factor común para todos los órganos (1). La isquemia produce daño celular por anoxia mientras que la reperfusión es esencialmente un fenómeno inflamatorio. La mayoría de los tejidos pueden mantener una disminución del flujo sanguíneo determinada, debido a sus reservas energéticas celulares y por su capacidad de aumentar la obtención de oxígeno. Si las necesidades metabólicas aumentan o el flujo sanguíneo disminuye por debajo de lo necesario para mantener las funciones celulares, los cambios producidos tanto funcionales como estructurales son inevitables. La isquemia se define como una deficiencia en el aporte sanguíneo a un determinado territorio (2), que tiene como consecuencia una disminución en el aporte de oxígeno y nutrientes a los tejidos. El daño provocado en los tejidos isquémicos, depende de la duración y magnitud en la reducción del flujo sanguíneo (3). Además, durante la isquemia se produce daño en el transporte iónico ATPasa-dependiente con alteración de los mecanismos reguladores celulares, los cuales dan lugar a lisis de organelas y membranas. A medida que aumenta la duración del proceso isquémico, se incrementa la muerte celular y se producen una serie de daños irreversibles los cuales se caracterizan por la pérdida de la integridad estructural en el tejido afectado. Introducción 22 Debido a la disminución de oxígeno producida durante la isquemia, se desencadena un fracaso en la fosforilación oxidativa y una disminución de la producción de ATP. Para mantener la producción de ATP, se produce cambio de glicolisis aerobia a anaerobia. Este cambio de metabolismo provoca un acumulo de ácido láctico, protones y NADH+, que causa una disminución del Ph citosólico (2). Para amortiguar el exceso de H+, la bomba Na/H extrae el exceso de H+ a través de su intercambio con Na. A medida que disminuyen los niveles de ATP se acumula hipoxantina (procedente de la degradación del ATP), debido a la disminución de flujo sanguíneo que permite eliminar los metabolitos de los tejidos, que posteriormente será sustrato para la formación de radicales libres de oxígeno (RLO) durante la reperfusión. La caída del nivel energético impide el correcto funcionamiento de las bombas enzimáticas, que necesitan ATP para llevar a cabo su función. Se produce hinchazón de la célula, debido a esta caída de los niveles energéticos, ya que no es posible mantener un balance iónico normal. Otra consecuencia es el aumento del calcio en el citosol. Además, hay que tener en cuenta que gran parte del calcio intracelular está, en condiciones normales, secuestrado en las mitocondrias y en el retículo endoplásmico, siendo debida esta distribución intracelular a un sistema activo situado en la cara interna de la mitocondria y acoplado a la fosforilación oxidativa (4). El calcio se elevará a través de dos vías: liberación del mismo desde el retículo endoplásmico y la mitocondria y a través de la entrada desde el espacio extracelular. El aumento de calcio intracelular induce la activación de proteasas citosólicas calcio-dependientes, entre las que se encuentran las calpainas, que degradan una serie de proteínas intracelulares incluyendo el citoesqueleto, retículo endoplásmico y proteínas mitocondriales (2), que darán lugar a la alteración de la superficie celular. Introducción 23 Por otro lado, el aumento de calcio intracelular causa la activación de la fosfolipasa A2, una enzima localizada en la membrana de las células responsable de la liberación de ácido araquidónico, la cual inicia una cascada de eventos que dan lugar a producción de numerosos mediadores lipídicos que desencadenan inflamación, aumento de permeabilidad vascular y activación de plaquetas (5). Entre los metabolitos finales del ácido araquidónico se encuentran el leucotrieno B4 y tromboexano A2, con potente efecto quimiotáctico para los neutrófilos polimorfonucleares, los cuales liberan elastasa, mieloperoxidasa (MPO) y otros oxidantes, con el consiguiente aumento de la permeabilidad vascular. Los oxidantes que derivan de los neutrófilos, son los que median la mayoría de los daños de la mucosa y la microcirculación. Además, los neutrófilos inducen daño por liberación de radicales libres de oxígeno y radicales libre de nitrógeno (RLN). La reperfusión consiste en el restablecimiento del flujo sanguíneo y aporte de oxígeno a los tejidos (3). Se ha denominado a este fenómeno como ´´la paradoja del oxígeno`` debido al daño producido por el propio oxígeno a través de las alteraciones sufridas por los sistemas metabólicos durante la isquemia. En esta fase, se inicia la respuesta inflamatoria. Los daños celulares que tienen lugar durante la reperfusión, pueden ser consecuencia de las alteraciones que se iniciaron previamente en la fase isquémica o pueden ser resultado de la respuesta inflamatoria (6). Durante esta fase, se elimina el exceso de hidrógeno acumulado en el espacio extracelular durante la isquemia y el oxígeno proporciona el sustrato adecuado para la producción de ATP de forma aeróbica (7). Se producen mayores daños que los que ocurren durante el proceso de isquemia, como consecuencia de las reacciones que inician los RLO. Estos pueden inducir alteraciones en proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y azúcares en células y tejidos, dando lugar a disfunción o muerte celular. Introducción 24 Los RLN derivados del óxido nítrico (NO), también juegan un papel modulador en la respuesta celular y sistémica a la I/R (2). Producen daños y modificación de macromoléculas, inducen muerte de células endoteliales, estimulan la liberación de mediadores inflamatorios y disminuyen la disponibilidad de NO. La xantino deshidrogenasa (XDH) es una enzima que se encuentra en condiciones normales en las células endoteliales (3). Durante el periodo de isquemia, se produce degradación de ATP con la consecuente acumulación de hipoxantina y xantina, las cuales servirán de sustrato para la formación de radicales libres (3) mediante la acción de la Xantino oxidasa (XO) (Fig. 1). En el periodo de reperfusión, se produce una conversión de XDH a XO por proteólisis o por oxidación. Fig. 1 Mecanismo de formación de radicales libres XO dependiente En el proceso de I/R, los RLO liberados tanto por mecanismo de la XO como a través de los neutrófilos activados, pueden producir peroxidación de los lípidos de la membrana. Además, el incremento de RLO desencadena la liberación de sustancias como leucotrieno B4, C5 del complemento y factor Introducción 25 activador de plaquetas (PAF) que promueven la quimiotaxis, adhesión y extravasación de leucocitos durante la reperfusión (3). Estas alteraciones debidas al estrés oxidativo inician un proceso apoptótico en las células debido a que los RLO inhiben a las proteínas antiapoptóticas dentro de las células, como en el caso de la B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) (1). Además, se produce una amplificación de la respuesta inflamatoria mediada por RLO, ya que se activan células perivasculares como macrófagos y mastocitos, que liberan otros mediadores inflamatorios (factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), otras citoquinas, PAF, LTB4). Fig 2. Proceso de Isquemia-Reperfusión (´´Cell Biology of Ischemia/Reperfusion Injury". Kalogeris, T. et al. International Review of Cell and Molecular Biology. 2012). Introducción 26 Características de la isquemia reperfusión a nivel intestinal La isquemia reperfusión a nivel intestinal es un fenómeno similar a la I/R en cualquier otro órgano, aunque presenta alguna característica peculiar. - El área esplénica, en situaciones de hipoperfusión, es una de las primeras en sacrificarse con el fin de mantener el flujo sanguíneo en órganos como el cerebro o el corazón. - El intestino presenta una superficie muy extensa, que drena al hígado a través del sistema venoso portal. Aquí juegan un papel importante las células de Kuffer produciendo RLO. - La traslocación bacteriana es uno de los mecanismos que contribuyen al mantenimiento del estado de shock. Las células epiteliales intestinales son altamente dependientes de energía, por lo que una reducción en el aporte sanguíneo y una disminución en el aporte de oxígeno, acaban produciendo daño celular rápido y muerte (8). La zona superficial de la mucosa intestinal presenta unas proyecciones en forma de dedo denominadas vellosidades. En los caballos, la vellosidad presenta una arteriola central (9). La punta de la vellosidad se encuentra en estado de hipoxia relativa, por lo que cuando se produce una reducción en el flujo sanguíneo, hace que sea más hipóxica progresivamente dando lugar a daño intestinal. Dependiendo del tiempo de hipoxia, se produce desprendimiento del epitelio desde la vellosidad hacia las criptas. La I/R a nivel intestinal lleva consigo una serie de consecuencias: - Alteración en la función de absorción: que da lugar a un déficit de absorción de nutrientes. - Translocación bacteriana: se entiende por traslocación al paso de bacterias autóctonas no agresivas, a través de la mucosa epitelial, desde el tracto gastrointestinal hasta lugares como los linfonódulos Introducción 27 mesentéricos, hígado y bazo (10). Se debe distinguir de la invasión por bacterias patógenas, que depende de los factores de virulencia propios de la bacteria y de alteraciones en la microflora del huésped. Los principales factores que promueven la translocación bacteriana son: • El aumento de permeabilidad intestinal consecuencia de la I/R, relacionado a su vez con una disminución de la inmunidad intestinal del huésped, alteraciones en el flujo sanguíneo intestinal, alteraciones nutricionales, agresiones directas, inflamación intraabdominal y estados inflamatorios sistémicos. • El sobrecrecimiento bacteriano y alteraciones cualitativas en la composición de la flora intestinal. - Daño en órganos distantes: a nivel intestinal, el fenómeno de I/R puede desencadenar un fallo multiorgánico como consecuencia de la liberación de una gran variedad de mediadores inflamatorios endógenos (3). Esto está relacionado con la translocación de bacterias y el paso de endotoxinas desde la luz intestinal al torrente sanguíneo. Los lugares en los que se produce daño secundario a I/R intestinal son el miocardio y el parénquima pulmonar además del hígado. Estos órganos son el objetivo principal, debido a que son los primeros a los que llegan las toxinas y los productos inflamatorios a través del sistema portal. El grado de daño en la mucosa intestinal es muy variable y depende del tipo y duración de la isquemia intestinal. La mucosa intestinal recibe un 80% del flujo sanguíneo que llega al intestino, por lo que en las primeras horas de isquemia intestinal la mucosa es el área más afectada con aparición de necrosis y ulceraciones, edema y hemorragias submucosas. Introducción 28 El mayor daño producido en el intestino, previamente sometido a isquemia, tiene lugar como consecuencia de la acción de RLO producidos por la XO durante la reintroducción del oxígeno, y el ácido hipocloroso procedente de los neutrófilos acumulados en el intersticio intestinal. Varios estudios han examinado la morfología de las lesiones asociadas al daño intestinal tras periodos de isquemia, comparados con las sometidas a una posterior reperfusión. Se ha concluido que la mayor parte de los daños en la mucosa intestinal tienen lugar durante el periodo de reperfusión y no durante el periodo isquémico (11). Introducción 29 Isquemia - reperfusión en el cólico equino El término ´´Cólico``deriva del latín, en concreto de “colicus”, que viene del griego “kólikos”, y el cual indica dolor de colon. Este significado se ha extendido, considerándose el cólico como cualquier dolor localizado en la cavidad abdominal y en el que inicialmente podrían estar implicados todos los órganos cavitarios. Desde el punto de vista clínico, hace referencia a patologías a nivel del tracto gastrointestinal. En la práctica clínica, el cólico representa la emergencia más común, con elevada mortalidad y morbilidad en caballos (12). Aproximadamente del 7 al 10% de los casos que acuden a urgencias requiere corrección quirúrgica (13). El número de caballos que sobreviven a la intervención quirúrgica ha mejorado en los últimos años y esto se debe, probablemente, a la suma de muchos factores como la mejora de la cirugía, de la anestesia y la rapidez en referirlos. Ya que, como se ha descrito, el término cólico hoy en día se aplica a múltiples patologías, existen muchas causas del mismo. Entre ellas, se encuentran las producidas por infecciones, parásitos, procesos alérgicos o procesos inflamatorios. Las propias características anatomo-fisiológicas del aparato digestivo de esta especie, como el tamaño del estómago con respecto al volumen del resto del aparato digestivo, el cambio de posición que pueden sufrir ciertos segmentos intestinales y los cambios de diámetro a lo largo del tubo digestivo, favorecen una mayor incidencia de casos de cólico. Además, los caballos son muy sensibles a cambios de alimentación, así como a la ingesta irregular de agua y alimento o cambios bruscos en el nivel de trabajo, lo que puede dar lugar a alteraciones de la motilidad entre las que se encuentran obstrucciones, estrangulaciones y desplazamientos, entre otros. Introducción 30 Estas alteraciones de la motilidad intestinal, dan lugar a desplazamiento del intestino a lugares en los que, en condiciones normales, no debería encontrarse, pudiendo sufrir torsiones o quedar atrapado en lugares inadecuados. Como consecuencia, se produce un proceso isquémico por la restricción o bloqueo del flujo sanguíneo a una zona determinada. La identificación y referencia a hospitales de los casos que presentan lesiones que requieren cirugía son críticas. La actuación rápida disminuye tanto la morbilidad como la mortalidad (13). Las lesiones que cursan con estrangulamiento son las que presentan mayor mortalidad. Este tipo de lesiones dan lugar a un bloqueo luminal y vascular, son de aparición violenta y muchas de ellas requieren cirugía de urgencia que, en muchas ocasionas, no resulta resolutiva. Los vólvulos de colon y las estrangulaciones de intestino delgado, son las causas más devastadoras de isquemia en caballos, dando lugar a daño severo de la mucosa, disfunción de la barrera, shock endotoxico y muerte (8). Fig 3: Intestino delgado de caballo sometido a cirugía afectado por isquemia Introducción 31 La identificación de las causas de cólico y la determinación de la severidad del problema, son claves para el manejo del mismo. Se debe hacer una evaluación completa del caballo que incluye: historia del paciente y determinación de signos clínicos, examen físico, uso de técnicas de diagnóstico por imagen y pruebas adicionales que ayudarán a determinar si el cólico puede resolverse mediante tratamiento médico o, por el contrario, requiere intervención quirúrgica. Muchas de las pruebas diagnósticas requieren tiempo, por lo que las primeras acciones que se ponen en marcha dependen de los signos clínicos. Se suele utilizar el dolor como patrón para medir la severidad del problema. Si el dolor es leve o intermitente, no se considera una emergencia y el objetivo principal es eliminar el mismo y restaurar la función intestinal. Por el contrario, si el dolor es severo o incontrolable, se considera una emergencia crítica. A pesar de los avances en los tratamientos médico-quirúrgicos, el porcentaje de mortalidad en casos de cólico sigue siendo muy elevado como consecuencia del shock endotóxico. La endotoxemia se define como la presencia de endotoxinas en la circulación sistémica. Se ha demostrado que presenta un papel fundamental en la sepsis severa, acompañado de un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y en caballos tiene un papel principal en muchas enfermedades del tracto gastrointestinal como colitis aguda y enfermedad isquémica (14). En el cólico, la mortalidad está muy relacionada con el grado de endotoxemia. Los signos clínicos y clínico-patológicos de endotoxemia, han sido evaluados como indicadores de pronóstico y correlacionados con el aumento de mortalidad (15). La endotoxina (lipopolisacarido bacteriano – LPS) es un constituyente de la pared celular de las bacterias Gram -, las cuales pueden causar daño severo y muerte en caballos, ya que es una de las especies más sensibles a la respuesta por exposición a LPS. En condiciones normales, los caballos presentan grandes cantidades de bacterias Gram - y, por consiguiente, grandes cantidades de LPS en el intestino grueso que, gracias a las uniones entre las células epiteliales, las Introducción 32 secreciones de las células epiteliales y las bacterias residentes, contribuyen a la efectividad de los mecanismos que previenen la absorción de grandes cantidades de LPS a la circulación (15). Su absorción a la circulación sanguínea puede llevarse a cabo a través de diferentes vías, siendo la más común la alteración de los mecanismos de defensa normales. La difusión de las endotoxinas en la circulación sanguínea activa endotelio, plaquetas y leucocitos, que darán lugar a la expresión y liberación de mediadores proinflamatorios y mediadores procoagulantes entre las que se incluyen TNF-α, interleuquina 1 (IL-1), unterleuquina 6 (IL-6), e interleuquina 10 (IL-10). Se ha demostrado ´´in vitro`` que LPS aumenta la producción de factor tisular (TF) por parte de las plaquetas, que aumenta la adherencia plaquetaria contribuyendo al desarrollo de lesiones intestinales isquémicas presentes en endotoxemia (16). Entre los signos clínicos que se pueden observar en la endotoxemia se encuentran, hipoxia arterial, acidosis metabólica e hiperlactatemia, entre otros. La hipoperfusión se presenta en lesiones estrangulantes (Fig. 4), obstrucciones o distención de las asas intestinales, que tienen como consecuencia una alteración de la permeabilidad vascular y la alteración de la permeabilidad de la mucosa. En los caballos afectados por cólico se produce, en mayor o menor grado, un problema isquémico que podría desencadenar la liberación de mediadores bioquímicos, además de la liberación de RLO durante la fase de reperfusión. Los fenómenos de I/R envuelven a mediadores bioquímicos, cambios celulares y estructurales caracterizados por la generación de RLO, activación de células inmunes, degeneración celular y muerte (8). Además, se produce una nueva translocación de bacterias y toxinas por alteración de la barrera intestinal, que agravaría el cuadro inicial y desencadenaría un fallo multiorgánico (17). Introducción 33 El pronóstico depende del grado de isquemia y la duración de la misma. Si sobreviven al periodo inicial de necrosis de la mucosa y existen enterocitos viables, la mucosa puede regenerarse por migración de estas células que cubrirán el epitelio en un periodo comprendido entre 12 y 24 horas. Si el proceso se magnifica, las consecuencias son irreversibles y fatales. Fig 4: Comparación de intestino delgado sano e intestino afectado por I/R Introducción 34 GLICOCÁLIX El glicocálix endotelial es una capa dinámica formada por proteoglicanos, glucoproteinas y proteínas solubles, que recubre la cara luminal de las células endoteliales (Fig. 5). Fig. 5 Estructura de glicocálix Presenta un grosor variable entre 1-3 µm y está involucrado en la regulación y homeostasis de fluidos, creando una barrera entre la sangre y la pared de los vasos. Se vio por primera vez en el año 1966 mediante microscopio electrónico. La composición y dimensiones del glicocálix están en constante cambio, existiendo un equilibrio entre la degradación y síntesis de sus componentes. La esfingosina -1 - fosfato se encarga de regular la composición del glicocálix y las uniones intercelulares (18). Introducción 35 Las moléculas principales del glicocálix son proteoglicanos y glucoproteínas que están, en su mayoría, unidas a la superficie de la célula endotelial (19). Los proteoglicanos poseen un núcleo proteico al que se unen cadenas laterales de glucosaminoglicanos (GAG) cargados negativamente (20). Las glucoproteínas, actúan como moléculas de adhesión y contribuyen a la coagulación, fibrinólisis y homeostasis. El glicocálix puede interactuar con diferentes componentes del plasma para formar una capa activa conocida como capa superficial endotelial (ESL) (18), ya que en sí mismo es inactivo. Presenta una carga neta negativa, consecuencia de la sulfatación de las cadenas de GAG, la cual proporciona una barrera electrostática para proteínas y células del plasma. Esta carga hace que el glicocálix actúe como filtro, repeliendo moléculas cargadas negativamente, además de células sanguíneas y plaquetas (21) y creando una zona de exclusión que mantiene la separación entre el plasma circulante y las células endoteliales. Las macromoléculas con un tamaño mayor de 70 kDa también están excluidas, a excepción de la albumina que, debido a su carácter anfótero, puede unirse al glicocálix. Presenta múltiples funciones, que se llevan a cabo cuando está intacto. Entre ellas se encuentra la regulación de la permeabilidad vascular, la inhibición de la agregación plaquetaria y la coagulación sanguínea y la regulación de la interacción entre las células sanguíneas circulantes y las células endoteliales. Además, es capaz de mediar la síntesis de óxido nítrico a través de la vía de la oxido-nítrico sintasa endotelial (NOSe) y superoxido dismutasa y actúa como mecanotransductor del estrés de cizalla del flujo sanguíneo. Por todo ello, recientemente se ha investigado su papel como uno de los principales componentes de diferentes procesos fisiopatológicos entre los que se incluye la inflamación (22). Introducción 36 La degradación del glicocálix se produce como consecuencia de diversos procesos como I/R, sepsis, hiperglucemia e hipervolemia, dando lugar a disfunción endotelial, fuga capilar, edema, inflamación, agregación plaquetaria, hipercoagulación y pérdida de sensibilidad vascular. Se ha sugerido que los fragmentos del glicocálix, procedentes de la degradación del mismo en situaciones patológicas, pueden ser indicadores diagnósticos o pronósticos. Introducción 37 Estructura del glicocálix: proteoglicanos Los proteoglicanos son complejos moleculares de gran tamaño, formados por hidratos de carbono (95%) y proteínas (5%), con gran importancia ya que tienen como función conectar el glicocálix al endotelio. Están formados por un núcleo proteico al cual se unen una o más cadenas de glucosaminoglicanos (GAG) cargados negativamente (20). Varían en el tamaño de su núcleo proteico, el número de cadenas de GAG unidas a ellos y en si están unidos o no a la membrana de la célula endotelial. Los diferentes grupos de proteínas que forman el núcleo de los proteoglicanos son: • Sydecans • Glypicans • Mimecans • Biglycans • Perlacans Los que están presentes con mayor frecuencia en el glicocálix son syndecans, glypicans, mimencans y biglycans (19). El grupo de syndecans está unido a la membrana de la célula a través de dominios transmembrana. Presentan un gran dominio extracelular, específico de cada tipo de syndecan, al que se unen las cadenas de GAG´s, además de un dominio citoplasmático con regiones muy conservadas. Está formado por 4 tipos diferentes (syndecan1-4), de los cuales las isoformas 1,2 y 4 se expresan en la mayoría de las células, a diferencia de la isoforma 3 que está presente en las células neuronales (23). La mayoría de ellos están unidos a heparan sulfato (HS) aunque los más grandes, como las isoformas 1 y 3, también se unen a condroitin sulfato (CS). Al Introducción 38 dominio extracelular se unen de 3 a 5 heparan sulfato (HS) o condroitin sulfato (CS). Syndecan 1 ha sido muy estudiado en relación al daño causado por traumatismos y se considera marcador de la descomposición del glicocálix (24). El grupo de glipycans está conectado a la membrana de celular a través de glicofosfatidilinositol (19), lo que hace que puedan liberarse por acción de la fosfolipasa. Está formado por 6 tipos diferentes, cada uno de los cuales presenta 14 residuos de cisteina, un dominio para la unión de glucosaminoglicanos y una secuencia C-terminal. A diferencia de la familia syndecan, solo se une a HS. Mimecan y biglycan se engloban dentro de un pequeño grupo de proteoglicanos ricos en leucina y los cuales se unen a CS, dermatan sulfato (DS) y keratan sufato (KS) (19). Estos dos, junto con perlecans, se secretan tras la unión de las cadenas de GAG, lo cual genera proteoglicanos solubles que formarán parte del glicocálix y pasarán al torrente sanguíneo. Introducción 39 Estructura del glicocálix: Glucosaminoglicanos Los glucosaminoglicanos (GAG) son estructuras formadas por polisacáridos lineales o unidades repetidas de disacáridos, modificados por sulfatación o acetilación. Cada una de estas unidades está, a su vez, formada por acido D-glucoronico, L-iduronixo o D-galactosa y un aminoácido (N- acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina). En condiciones fisiológicas presentan carga neta negativa debido al elevado grado de sulfatación, el cual puede variar dependiendo de la fisiología del medioambiente y por la presencia de grupos carboxilo. Existen cinco tipos de GAG: • Heparán sulfato • Condroitín sulfato • Dermatán sulfato • Keratán sulfato • Ácido hialurónico En el glicocálix, se encuentran unidos covalentemente al núcleo de proteoglicanos a través del acoplamiento del extremo reducido con el núcleo proteico (19). El más abundante es heparán sulfato (HS), que representa entre el 50- 90% de la cantidad total de GAG presentes en el glicocálix (25), siendo esta cantidad variable dependiendo de diferentes estímulos. Las cadenas de HS presentan una elevada carga negativa debido a la presencia de residuos ácidos de azúcar y/o grupos sulfatados (26). Pueden variar en relación a la composición de disacáridos, disposición de los dominios y tamaño. Esta diversidad estructural se debe a una serie de reacciones en el Aparato de Golgi, las cuales definen las propiedades funcionales de este GAG. Introducción 40 El segundo más abundante es condroitin sulfato (CS), presentándose en un ratio HS:CS de 4:1. Se une covalentemente al núcleo proteico y el número de cadenas unidas al núcleo es muy variable. Tanto HS como CS se producen en el retículo endoplasmático y Aparato de Golgi de las células endoteliales (25). El ácido hialurónico (HA) es otro de los GAG importantes dentro del glicocálix, representando más de un 40%. Es una molécula linear larga compuesta por unidades repetidas de ácido glucurónico y N-acetil-glucosamina, unidas unas a otras a través de enlaces glucosídicos. Es el único que no se encuentra unido a un núcleo proteico, formando una solución viscosa con el agua (20). Difiere también de otros GAG en el grado de sulfatación, ya que no está sulfatado y, por lo tanto, no presenta carga. Se une a la membrana celular a través de receptores CD44, hialuran sintasas o asociándose directamente con las cadenas de CS vía interacciones electrostáticas. A diferencia de los demás, se sintetiza en la cara interna de la membrana plasmática por HA sintasas (27), liberándose al medio extracelular donde pueden unirse a receptores de HA. Introducción 41 Estructura del glicocálix: glucoproteínas y componente solubles Las glucoproteínas forman otro de los grupos considerados como eje del glicocálix, encargadas de conectar a éste con la membrana celular. Son relativamente pequeñas (5-12 residuos de azúcares) y presentan cadenas laterales de carbohidratos cubiertas con ácido siálico (28). Su función principal es el reclutamiento y señalización celular. Dentro del glicocálix, encontramos selectinas, integrinas e inmunoglobulinas con un dominio estructural. Las selectinas representan una familia de receptores expresados en leucocitos, plaquetas y células endoteliales, o únicamente en el endotelio. Contienen una pequeña cola citoplasmática, un dominio transmembrana y un dominio lectina terminal. Su función se basa en la unión de grupos de carbohidratos a proteínas glicosiladas o lípidos. Las integrinas son receptores proteicos formados por dos subunidades, una glicoproteína transmembrana α y otra β, que forman un complejo no covalente. Cada subunidad contiene un gran dominio extracelular y otro pequeño citoplasmático. Las inmunoglobulinas se caracterizan por presentar un dominio transmembrana, uno citoplasmático y un número variable de dominios a nivel luminal. Dentro de este grupo, se encuentran las moléculas de adhesión como moléculas de adhesión intracelular 1 y 2 (ICAM-1, ICAM-2), moléculas de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1) y moléculas de adhesión celular a plaquetas 1 (PECAM-1), localizadas en el interior de la estructura del glicocálix. Una gran variedad de moléculas, derivadas del endotelio o del torrente sanguíneo, se conectan con el glicocálix. Desde un punto de vista funcional, el glicocálix contiene proteínas involucradas en inflamación, coagulación, fibrinólisis y hemostasia. Introducción 42 Entre las moléculas que forman parte de su estructura se encuentran receptores enzimáticos (receptor de factor de crecimiento de fibroblastos), moléculas derivadas del plasma (albumina), moléculas que se unen a las cadenas de GAG, en particular a HS, como factores de crecimiento, proteínas de matriz extracelular, proteínas plasmáticas (superoxido dismutasa) y factores que inhiben la coagulación (antitrombina III). Introducción 43 Funciones del glicocálix El glicocálix presenta varias funciones, las cuales se llevan a cabo cuando está intacto. 1. Permeabilidad vascular El movimiento de fluidos a través de la barrera vascular se ha basado tradicionalmente en el principio de Starling. En el principio clásico de Starling, el flujo neto de fluidos a través de las uniones inter-endoteliales se debe al equilibrio entre el gradiente de presión osmótica y oncótica (29). Una elevada presión hidrostática en el lumen vascular hace que el fluido se mueva hacia el espacio intersticial, mientras que bajos niveles de proteínas en el espacio intersticial, comparado con el plasma, resulta en una oposición de fuerzas en la filtración hidrostática (30). Se expresa por la siguiente ecuación: Jv/A=Lp (Pc −Pi)−σ(πc −πi) en la cual, Jv/A es el ratio de filtración por área, Lp es la conductancia hidráulica, Pc es la presión hidrostática intravascular, Pi es la presión hidrostática intersticial, σ es el coeficiente de reflexión, πc es la presión oncótica plasmática y πi es la presión oncótica intersticial. Se han realizado estudios cuantitativos en los que se observa que la filtración actual de fluidos difiere de la cantidad calculada con el principio clásico de Starling. La revisión del principio de Starling sugiere que el retorno de los fluidos a la circulación ocurre exclusivamente vía linfática. Introducción 44 Levick usó medidas precisas de presión oncótica intersticial y mostró que la presión de filtración neta, predicha en el principio clásico de Starling, excedía del flujo linfático observado (31). Adamson et al. observaron que el aumento de la presión oncótica intersticial en vénulas postcapilares de ratas resultaba en pequeños aumentos de filtración de fluidos (32). Esta discrepancia, indica que la concentración intersticial de proteínas tiene un papel poco importante en la generación de un gradiente de presión oncótico a través de la pared de los capilares (30). La introducción del concepto de glicocálix ayudó a resolver todas las cuestiones planteadas, y el principio de Starling quedó resumido en la siguiente ecuación: Jv/A=Lp (Pc −Pi)−σ(πc −πsg) donde πsg es la presión oncótica subendotelial. El glicocálix actúa como filtro de proteínas plasmáticas, teniendo un papel importante en la regulación de la permeabilidad vascular, siendo capaz de limitar el acceso de determinadas moléculas a la membrana de las células endoteliales. Esto se ha podido observar en las arterias mesentéricas de ratas con el uso de dextranos marcados con fluorescencia de diferentes pesos moleculares (33). En estudios de perfusión en corazones aislados de cerdo, Rehm et al (34) describieron el concepto de doble barrera, en la cual el glicocálix y las células endoteliales contribuían en la formación de una barrera vascular intacta, además de mostrar que la degradación del glicocálix impedía llevar a cabo su función de barrera endotelial. La eliminación de algunos componentes del glicocálix mediante enzimas da lugar a un aumento de la conductividad hidráulica, del flujo de proteínas y de la excreción de albumina, lo cual provoca finalmente edema. Introducción 45 Como consecuencia de la presencia de cadenas de GAG´s sulfatadas, el glicocálix presenta una carga neta negativa que le confiere un papel importante en la regulación de la permeabilidad y balance de fluidos, ya que repele moléculas con carga negativa como las células blancas, célula rojas y plaquetas. Además, también impide el paso de moléculas de tamaño mayor de 70 KDa (a excepción de la albumina, que puede unirse al glicocálix debido a su naturaleza anfótera) reduciendo la conductividad hidráulica, soportando la degradación y facilitando la trasmisión de esfuerzo de cizallamiento (35). 2. Mecanotransducción El endotelio vascular está expuesto a fuerzas mecánicas inducidas por el flujo sanguíneo. El glicocálix endotelial actúa como sensor de fuerzas mecánicas en la superficie endotelial, en conjunto con otros sensores como receptores de proteína G, canales iónicos, propiedades reológicas de la membrana plasmática, estructuras caveolares e integrinas y moléculas de adhesión focal (36). La estructura del glicocálix, traduce fuerzas bioquímicas y mecánicas en señales bioquímicas, consecuencia de los cambios hemodinámicos responsables de los cambios conformacionales que dan lugar a modificación en las respuestas celulares (19). Uno de estos cambios, es la regulación de la enzima óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y el aumento de producción de óxido nítrico (NO), importante determinante del tono vascular. La escisión de alguno de los componentes del glicocálix, elimina la capacidad de las células endoteliales de responder a las fuerzas de cizalla. Florian et al. (37) informaron que la eliminación de HS podía parar por completo la producción de NO en cultivos de células endoteliales sometidas a estrés de cizalla. Introducción 46 Las fuerzas de estrés producidas por el flujo sanguíneo se transmiten, desde el glicocálix endotelial a las células endoteliales adyacentes, a través de las cadenas de glucosaminoglicanos. Esta información se transmite posteriormente a un núcleo proteico (syndecan) unido a las células endoteliales y a la membrana plasmática de glipicans, que posteriormente median la señalización celular específica y la producción/liberación de NO. El NO produce vasodilatación y actúa como un scavenger de radicales libres para mantener la integridad del glicocálix endotelial. En este sentido, el NO tiene un papel crucial en la regulación del tono vascular, permeabilidad e inflamación (30), a través de la activación de la vía del factor nuclear kappa B y activador de proteína-1, que participan en la formación de un ambiente proinflamatorio en células endoteliales. Una disminución en la biodisponibilidad de eNOS, está asociada con un aumento del estrés oxidativo y nitroxidativo y con disfunción endotelial (38). 3. Protección vascular por inhibición de la coagulación y adhesión de leucocitos El glicocálix protege al endotelio de la interacción con las células sanguíneas circulantes (30). En primer lugar, esto se produce como consecuencia de su carga neta negativa la cual repele las células sanguíneas, y en segundo lugar se debe a que las moléculas de adhesión, en las que se incluyen las selectinas (PECAM, ICAM y VCAM) e integrinas (CD11/CD18), se encuentran en el interior del glicocálix y presentan una longitud menor que el grosor del mismo. En un modelo que utilizaba músculo cremaster de hámster, Vink et al. usaron lipoproteína oxidada para degradar la capa endotelial superficial y observaron un incremento de la interacción entre plaquetas y células endoteliales (39). Henry and Duling demostraron un aumento de la adhesión de leucocitos debido al estrés mediado por TNF-a (40). Estos trabajos sugieren que Introducción 47 cualquier daño en el glicocálix puede dar lugar a un aumento de la adhesión de plaquetas y leucocitos (18). Por otro lado, se ha sugerido la función del glicocálix como protector de las células endoteliales a través de los mediadores de estrés oxidativo (19). Su efecto vasoprotector, se basa en el acoplamiento de diferentes sistemas enzimáticos. Uno de los más importantes, la superoxido dismutasa (SOD) extracelular, se une a HS y contribuye a la disminución del estrés oxidativo y mantenimiento de la biodisponibilidad de NO (25). La unión de ligandos y enzimas al glicocálix endotelial, facilitan la señalización celular y la modificación enzimática, como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). De forma similar, el glicocálix también está involucrado en el sistema lipolitico mediante la unión tanto de lipoprotein lipasa y su ligando lipoproteína de baja densidad (LDL) (25). También juega un papel importante en la regulación de la coagulación, ya que pueden unirse a él mediadores anticoagulantes entre los que se encuentra, antitombina III, cofactor de heparina II, trombomodulina e inhibidor de la vía del factor tisular. Todas las moléculas anticoagulantes presentes en el glicocálix contribuyen a la tromboresistencia que, de manera natural, presenta el endotelio sano. Además, también modula la respuesta inflamatoria mediante la unión de citoquinas y atenúa la unión de citoquinas a la superficie de las células endoteliales. Introducción 48 ALTERACIONES DEL GLICOCÁLIX SECUNDARIAS AL ESTRÉS OXIDATIVO Se entiende por estrés oxidativo la alteración en el balance entre la producción de especies reactivas de oxígeno y los mecanismos fisiológicos que los neutralizan. Una especie reactiva de oxígeno o RLO es una molécula que presenta un electrón desapareado, lo que hace que sean muy inestables y altamente reactivas. Han sido considerados subproductos tóxicos del metabolismo aerobio y la causa principal de daño macromolecular (41). La vida media de estas moléculas es muy corta y tienden a unirse a otras para estabilizarse. Presentan un papel crítico en la regulación de varias de las funciones celulares y de los procesos biológicos (42) y dan lugar a daño en proteínas, lípidos y ADN. En condiciones normales, el oxígeno se encuentra en su forma más estable, que es una molécula de O2. En determinadas situaciones pueden producirse una serie de especies químicas derivadas del O2, denominadas RLO, que son capaces de reaccionar con otros compuestos y producir lesión celular. La producción de RLO, da lugar a pérdidas de estructura y función de determinadas macromoléculas implicadas en el correcto funcionamiento de la célula y como consecuencia, la muerte de la misma. Existen diferentes fuentes de RLO, entre las que se encuentran: • Xantina oxidasa Es una molibdoflavoenzima compleja, que se encuentra en la mayoría de las especies y se expresa en células endoteliales. En mamíferos presenta dos formas, xantina deshidrogenasa (XDH) y xantina oxidasa (XO), siendo la XDH la que se encuentra en el tejido sano. En condiciones normóxicas, la XO cataliza la oxidación de hipoxantina y xantina produciendo ácido úrico, ampliamente distribuido en los tejidos. Introducción 49 La diferencia entre ambas es que XO usa O2 como aceptor terminal de electrones y así muestra su capacidad para producir RLO (43), mientras que XDH requiere NADH. Presenta la capacidad de producir radical superóxido (O2 -) y peróxido de hidrógeno (H2O2). El radical superóxido derivado de XO y las especies secundarias, son las mayores responsables de la disfunción de la barrera endotelial (43). Tan et al. observaron que la XO se unía a GAG en las células endoteliales, concentrando la enzima productora de oxidantes en la superficie de las células endoteliales, incrementando su vida media en el plasma (44). • NADPH oxidasa Familia implicada también en la producción de RLO tras periodos de I/R (45). Está formada por 7 miembros, NOX del 1 al 5 y DUOX 1 y 2. Catalizan el transporte de electrones desde NADPH hasta el oxígeno molecular produciendo O2 -, el cual puede sufrir dismutación a H2O2 (46). Las enzimas DUOX producen H2O2 y las isoformas NOX producen O2 -. • Leucocitos Los neutrófilos son grandes productores de RLO, entre los que se encuentran H2O2 y O2 -. También secretan mieloperoxidasa, enzima que da lugar a la formación de ácido hipocloroso (HOCl) e iones cloro, además de ser capaz de unirse a las cadenas de GAG cargadas negativamente. Los neutrófilos activados, también producen potentes proteasas capaces de degradar prácticamente todos los componentes de la membrana basal de las células endoteliales y las uniones proteicas que mantienen la integridad de la barrera endotelial (47). Introducción 50 • Mitocondria Normalmente, el ratio de RLO producido en la mitocondria es comparativamente menor, debido a que presenta un eficiente sistema de defensa antioxidante (48). Sin embargo, ha sido considerada como una de las mayores fuentes productoras de RLO inducida por I/R en varios órganos, sobre todo en aquellos que presentan una elevada tasa metabólica (43). La mitocondria de los mamíferos puede generar H2O2 y O2 desde al menos once sitios diferentes, asociados con catabolismo de sustratos y cadena trasportadora de electrones. Contiene enzimas que pueden generar RLO tanto en la matriz como en la membrana. • Oxido Nitrico sintasa La producción de NO se lleva a cabo a través del metabolismo del aminoácido L-arginina. Las enzimas que catalizan este proceso son Óxido Nítrico Sintasa (NOS), de las cuales se conocen tres formas, endotelial (eNOS), neuronal (nNOS) e inducible (iNOS). Todas las formas de NOS contienen un dominio reductasa, el cual está formado por nucleótidos de flavina (FAD y FMN), además de un dominio oxigenasa que contiene hemo y tetrahidrobiopterin (BH4) y se une a arginina. Las NOS catalizan la formación de NO usando BH4 como cofactor esencial. Durante el proceso de I/R, los RLO formados oxidan BH4 y la pérdida de éste resulta en un desacoplamiento de NOS, produciendo RLO en lugar de NO (49). Además, NO puede reaccionar con O2 - y formar peroxinitrito, un potente oxidante que causa gran daño a nivel celular y tisular. Introducción 51 Los RLO más importantes son los derivados de oxígeno y entre ellos destacan: • Radical superóxido Es considerado como RLO primario, el cual puede interactuar con otras moléculas para generar RLO secundarios más agresivos. Se forma por la reducción del oxígeno molecular por transferencia de un electrón. No es el radical más lesivo, pero es precursor de otros radicales como el peróxido de hidrógeno, así como reductor de iones metálicos. O2+e- O2 - Es un radical muy inestable, con una vida media muy corta, que da lugar a la formación de peróxido de hidrógeno: 2O2 *+2H+ H2O2+O2 Su carga le hace incapaz de atravesar las membranas celulares, excepto a través de los canales iónicos (50). Produce alteración en la permeabilidad capilar, activación de la producción de citoquinas y reclutamiento de células inmunes específicas. • Peróxido de hidrógeno Se forma principalmente por la dismutación del radical superóxido, bien de forma espontánea o a través de una reacción catalizada por la enzima SOD. También puede sintetizarse de novo por el sistema de citocromo p450 y la monoaminooxidasa. Introducción 52 Es un radical más estable, con capacidad para difundir por células y tejidos para iniciar cambios en la forma de las células e iniciar la proliferación y reclutamiento de células inmunes (51). Actúa como segundo mensajero fisiológico señalizando moléculas por oxidación selectiva de proteínas diana (52). Si entra en contacto con O2, y en presencia de sales de hierro, se genera el radical hidroxilo, a través de la reacción de Heber-Weiss: O2+ H2O2 Fe O2 *+ OH- Mediante la reacción de Fenton, puede captar un tercer electrón y dar lugar al radical hidroxilo, en presencia de metales de transición, iones ferroso o cuproso o hemoproteinas. H2O2 + Fe 2+ OH*+ OH- + Fe3+ Además, puede dar lugar a la formación de ácido hipocloroso al entrar en contacto con halógenos, cloro en particular, mediante una reacción catalizada por la enzima mieloperoxidasa (MPO): H2O2 + Cl- + H+ HOCl+ H2O La mieloperoxidasa es una enzima liberada por los neutrófilos, con capacidad de inducir actividad colagenasa en los mismos, lo que podría favorecer el aumento de la permeabilidad vascular intestinal. Introducción 53 • Radical hidroxilo Es el radical producido en la reacción de Fenton, el cual reacciona con cualquier molécula debido a su elevada reactividad y pérdida de especificidad. Es capaz de producir reacciones en cadena de formación de nuevas especies reactivas, como en el caso de la peroxidación lipídica. H2O2 + Fe 2+ OH*+ OH- + Fe3+ • Peroxidación lipídica Es un proceso autoperpetuado bajo el cual los oxidantes, tanto radicales libres como las especies no radicales, atacan a los lípidos especialmente a los ácidos grasos poliinsaturados (53). Los RLO que afectan en mayor grado a los lípidos, son principalmente el radical hidroxilo (OH-) y radical hidroperoxilo (HO₂). La oxidación de lípidos da lugar a la liberación de un radical alquilo que, en presencia de oxígeno, se transforma en radical peroxilo, siendo este capaz a su vez de oxidar nuevamente a los ácidos grasos dando lugar a hidroperóxidos de lípidos, precursores de otros radicales libres y aldehídos. Una de las consecuencias de este proceso es la fragmentación de la membrana y aumento de la permeabilidad capilar. Introducción 54 También se producen nuevos productos reactivos, peróxidos de lípidos, que son potentes inhibidores de numerosas enzimas celulares, además de poder descomponerse en metabolitos tóxicos. HH22OO + + LL••••OHOH PropagaciPropagacióónn Peroxidación lipídica: Una reacción autoperpetuada Fe3+, Cu+ + LH+ LH LL•• + O+ O22 LOOLOO•• LOOLOO•• + LH+ LH LOOH + LOOH + LL•• IniciaciIniciacióónn AdiciAdicióón de On de O22 LOLO•• LOOLOO•• AldehAldehíídosdos •• OHOH:: Radical hidroxiloRadical hidroxilo LHLH:: LLíípido insaturadopido insaturado L L •• :: Radical alquiloRadical alquilo LOO LOO •• :: Radical Radical peroxiloperoxilo LO LO •• :: Radical hidroxiloRadical hidroxilo LOOHLOOH:: HidroperHidroperóóxidosxidos liplipíídicosdicos Fig. 6 Peroxidación lipídica Los sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos protegen contra los daños causados por el estrés oxidativo (54). El objetivo de estos sistemas es evitar el exceso de producción de RLO. Entre los sistemas antioxidantes enzimáticos se encuentran la SOD, las glucation peroxidasas, tioredoxina y peroxiredoxina. Dentro de los sistemas antioxidantes no enzimáticos se encuentran ascorbato, tocoferoles, glucation, bilirrubina, ácido úrico y eliminadores de OH- y otros radicales libres. A nivel extracelular, la SOD se encuentra unida a los GAG en el glicocálix vascular y regula el estatus oxidativo en el intersticio vascular. Introducción 55 Uno de los componentes más sensible a la oxidación de las células endoteliales, es el glicocálix (55). El estrés oxidativo y la producción de RLO parecen tener un papel central en la inflamación que induce la degradación del glicocálix. Los RLO median modificaciones en el glicocálix durante el daño por isquemia- reperfusión, en especial el peróxido de hidrógeno, tras periodos de hipoxia con capacidad de inducir TNFa (56). Se ha reconocido el glicocálix como lugar en el que se producen daños tras periodos de isquemia (57) y a las células endoteliales especialmente vulnerables (58), quizás como resultado de la producción de RLO (59). Se ha establecido que una de las primeras manifestaciones de I/R es el daño en las células endoteliales, y en particular, los procesos asociados con el glicocálix endotelial han sido descritos, con frecuencia, como alterados incluyendo hinchazón celular, pérdida de macromoléculas y adhesión de leucocitos y plaquetas (60). Hay tres RLO biológicamente relevantes, que inducen una escisión directa de cadenas de GAG a través de diferentes rutas (el radical hidroxilo (OH-), los radicales aniones carbonato (CO3 -) y el ácido hipocloroso (HOCl)) (55), pero la disponibilidad de O2 - y NO o la presencia combinada de H2O2 y MPO son necesarias en el daño del glicocálix inducido por RLO/RLN. Se ha reconocido que tanto los RLO como los RLN son capaces de degradar HA, HS y CS. Pero no todos los RLO/RLN son una amenaza directa para el glicocálix (19). La fragmentación del glicocálix está mediada por especies terciarias, como el radical hidroxilo o ácidos hipohalogenados, las cuales se forman por la catálisis de la enzima MPO, derivada de los neutrófilos, unida a las cadenas de GAG cargadas negativamente (55). Además, los RLO/RLN pueden potenciar la proteólisis del glicocálix vía activación de metaloproteinasas y a través de la inactivación de inhibidores endógenos de proteasas. Introducción 56 GLICOCÁLIX Y PROCESO INFLAMATORIO Inflamación Se puede definir la inflamación como una respuesta biológica del sistema inmune a un estímulo nocivo (61). Su objetivo principal es destruir, neutralizar o eliminar el agente lesivo y reparar el trastorno que este ha producido. Es una respuesta multimodal, que incluye a los sistemas endocrino, nervioso e inmunológico, e inespecífica siendo la respuesta siempre la misma con independencia de la causa originaria. Únicamente varía la intensidad y la duración de la respuesta, pero no los mecanismos básicos que constituyen dicha reacción. En función de la duración, se puede distinguir entre respuesta inflamatoria aguda o crónica. Durante la fase aguda, se minimizan de forma efectiva las lesiones inminentes o las infecciones, contribuyendo a la restauración de la homeostasis tisular y a la resolución de la inflamación aguda. Cuando este proceso no se puede controlar, se convierte en inflamación crónica. Las causas que la producen son múltiples: agentes físicos (calor, frío, radiación ionizante, traumatismo, cuerpos extraños, radiación ultravioleta), químicos (ácidos, álcalis, toxinas, venenos, irritantes) y biológicos (células dañadas). Entre los agentes infecciosos se encuentran virus, bacterias y hongos. Otra de las causas de inflamación, son las alteraciones inmunitarias (autoinmunidad, enfermedades por complejos inmunes e hipersensibilidad inmediata). A nivel tisular, se caracteriza por cinco síntomas; calor, rubor, hinchazón, dolor y alteración de la función del tejido afectado (62). A nivel microcirculatorio, se producen una serie de eventos entre los que se encuentran cambios en la permeabilidad vascular, reclutamiento y acumulación de neutrófilos y liberación de mediadores de inflamación. Introducción 57 Una respuesta inflamatoria típica presenta cuatro componentes: inductores de la inflamación, sensores que detectan a los anteriores, mediadores inflamatorios producidos por los sensores y el tejido diana afectado por los mediadores inflamatorios (63). Los agentes desencadenantes y mediadores de la respuesta inflamatoria, se pueden dividir en dos subgrupos; mediadores endógenos y exógenos. Mediadores exógenos Dentro de este subgrupo, el más importante es el lipopolisacarido bacteriano (LPS). Es un componente estructural localizado en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas (64). Está formado por una fracción antigénica variable, que contiene una larga y ramificada cadena de polisacáridos, unida al lípido A. La región de polisacáridos, se divide en una cadena O, específica, y un centro de oligosacáridos. El lípido A, es la porción con mayor responsabilidad en la actividad inmunológica del LPS (65), así como de su toxicidad y efecto biológico. Fig. 7 Lipopolisacárido bacteriano En el plasma el LPS puede unirse a proteínas, como proteínas de unión a LPS (LBS), formándose un complejo que puede unirse a la superficie de los leucocitos a través del receptor CD14. Posteriormente, el LPS puede interaccionar con el receptor TLR4 y su proteína co-receptora MD-2. La Introducción 58 endotoxina se une a un receptor, iniciando así una respuesta en el huésped y la activación de diversos procesos celulares. La interacción de la endotoxina con el receptor TLR4, desencadena una cascada de señalización celular, activación celular y síntesis de mediadores asociados a inflamación (66). Entre los mediadores, destaca la presencia de IL- 1, IL-6 y TNFa. En caballos, la expresión de LPS ha sido muy estudiada y se ha comprobado que produce múltiples efectos patológicos, resultando en daño severo o muerte. Las células del caballo, en especial los monocitos, son especialmente sensibles a la presencia de LPS y parece que esta especie es extremadamente sensible a la endotoxina, ya que se requieren pequeñas cantidades de la misma para dar lugar a la expresión genética de citoquinas proinflamatorias y la consecuente aparición de cuadro clínico asociado. Mediadores endógenos Citoquinas Son moléculas polipeptídicas de bajo peso molecular, sintetizadas y secretadas por diferentes tipos celulares, entre las que se incluyen monocitos, macrófagos y linfocitos, entre otros, en respuesta a numerosos estímulos. Actúan a concentraciones muy bajas, pudiendo hacerlo de forma directa o estimulando la liberación de otros mediadores tales como otras citoquinas, metabolitos de ácido araquidónico, nucleótidos cíclicos o RLO. Se clasifican en pro-inflamatorias o anti-inflamatorias, en función de si facilitan o inhiben la inflamación (61). Las principales citoquinas que actúan como mediadores de la inflamación son TNFa e IL-1, además de IL-6, IL-8 y los interferones. Introducción 59 Las citoquinas ejercen su acción al unirse a receptores específicos a cada una de ellas, en la superficie de la célula en la que ejercen su efecto. Entre sus múltiples funciones biológicas, se encuentran el control del desarrollo y la homeostasis del sistema inmune, el control del sistema hematopoyético y la participación en la defensa inespecífica, ya que influyen en inflamación, coagulación y presión sanguínea. Además, actúan en la estimulación o inhibición de la proliferación celular, citotoxicidad/apoptosis, crecimiento y diferenciación celular, respuesta inflamatoria y regulación de la expresión de las proteínas de la superficie de membrana (67). Mediadores primarios del plasma La escisión enzimática mediante proteasas de una serie de proteínas existentes en el plasma, genera mediadores los cuales también participan en la respuesta inflamatoria. Se agrupan en los siguientes sistemas: sistema de las quininas, sistema del complemento y sistema de la coagulación. Sistema de las quininas Las quininas son pequeños polipéptidos con una gran y prolongada acción vasodilatadora, responsables del dolor en el foco inflamatorio. Su acción consiste en vasodilatación arteriolar, contracción lenta del músculo liso, aumento de la permeabilidad capilar y efecto hipotensor. Su generación se inicia por la activación del factor XII de Hageman (68), el cual convierte la precalicreína en el enzima activo, la calicreína. Esta actúa sobre los quiminógenos dando lugar a bradiquinina, potente mediador primario de la inflamación, aunque de corta duración, ya que es inactivado por la quininasa. Introducción 60 La bradiquinina aumenta la permeabilidad vascular y vasodilatación, además de activar la fosfolipasa A2 (69). La calicreína permite la autoactivación del sistema, ya que es un potente activador del factor de Hageman. Sistema del complemento Es un componente importante tanto del sistema inmune innato como del adaptativo. Con respecto al sistema innato, es su mayor componente y proporciona un mecanismo poderoso y efectivo para proteger a los hospedadores frente a patógenos (70), además de considerarse pro- inflamatorio. Está formado por más de 50 proteínas de membrana circulantes, de las cuales los componentes fundamentales están numerados del 1 al 9, encontrándose en el plasma en su forma inactiva. La cascada del complemento puede activarse por tres vías diferentes: la clásica, la alternativa y la de las lectinas (71), que se diferencian tanto en el mecanismo desencadenante de la activación como en sus componentes iniciales. Todas tienen un objetivo común que consiste en la formación de la C3 convertasa, enzima capaz de convertir C3 en C3b y C3a. La vía clásica se inicia por complejos antígeno-anticuerpo, con la unión del factor C1 a IgG o IgM. La vía alternativa se inicia por la unión del factor C3b y B a un lipopolisacárido bacteriano. En esta, se activa directamente C3. De la activación de la cascada del complemento, se liberan una serie de factores con importancia en el foco inflamatorio. - C3a y C5a: son anafilotoxinas con un potente efecto como mediadores de la inflamación. Incrementan la permeabilidad vascular, induciendo la contracción muscular y el reclutamiento y activación de células inmunes. Introducción 61 C5a presenta un potente efecto quimiotáctico para neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos. - C3b: su activación favorece la fagocitosis. - Complejo de ataque de membrana: produce lisis de microorganismos y células. Sistema de la coagulación: La cascada de la coagulación, es una secuencia compleja de reacciones proteolíticas que finalizan con la formación del coágulo de fibrina. La cascada se inicia con el factor XII, que activa el sistema calicreína y la vía intrínseca de la coagulación (72). En la etapa final de la coagulación, la trombina divide el fibrinógeno para generar monómeros de fibrina, con liberación de fibrinopépidos que producen aumento de la permeabilidad vascular y quimiotáxis de leucocitos. El sistema fibrinolítico, puede participar también en el fenómeno inflamatorio a través de su relación con el sistema de las quininas. La calicreína transforma el plasminógeno en plasmina. Esta, además de disolver el coágulo de fibrina, actúa en el foco inflamatorio al iniciar la formación de bradiquinina por activación del factor de Hageman. La plasmina puede también activar el sistema de complemento por la vía alternativa. Los productos de degradación de fibrina producen alteración de la permeabilidad. Introducción 62 Fig.8 Mediadores primarios del plasma Factor activador de plaquetas (PAF) Es un fosfolípido biológicamente activo liberado por múltiples células del sistema inmune, como eosinófilos, neutrófilos y mastocitos (73), en respuesta a diferentes estímulos biológicos. Además, la mayoría de estas células expresan receptores de PAF. Se sintetiza en dos pasos a partir del sustrato 1-O-alkyl-2- araquidonilglicerol-fosfocolina, que se encuentra en altas concentraciones en las membranas de muchos tipos celulares. En el primer paso, se forma Liso PAF, por acción de la fosfolipasa A2. Posteriormente se forma PAF, a partir de su precursor Liso PAF por acción de acetil CoA, en una reacción catalizada por la liso-PAF acetil transferasa. Tiene una vida media corta, de unos 3-13 minutos, y su degradación está catalizada por acetil-PAF hidrolasa (74). PAF es un potente vasodilatador, así como un potente estimulador de la agregación plaquetaria que suele ir acompañado de la liberación de tromboxano Introducción 63 A2 (TXA2). También induce la agregación de leucocitos, la liberación de leucotrienos y enzimas lisosomales y generación de radical superóxido. Actúa como factor quimiotáctico de neutrófilos, eosinófilos y monocitos. Los receptores de PAF son receptores acoplados a proteína G. La unión al receptor induce diferentes efectos y los mediadores liberados, dependen del tipo celular y sus características. La unión induce la activación de fosfolipasas (C, D y A2), lo que conduce a la activación de inositol fosfatos (IP3), diacil glicero (DAG) y ácido araquidónico. Derivados del ácido araquidónico El ácido araquidónico (AA) es un ácido graso insaturado presente en las membranas plasmáticas celulares, en las que se une a los fosfolípidos. Cuando las células se encuentran bajo condiciones de estrés, el ácido araquidónico es liberado desde los fosfolípidos por acción de la fosfolipasa A2 y de la fosfolipasa C, el cual se convierte en precursor de mediadores proinflamatorios a través de tres vías metabólicas (75). Fig. 9 Cascada del Ácido Araquidónico Introducción 64 El AA puede convertirse en leucotrienos (LTXs) y lipoxinas a través de la vía de la lipooxigenasa, puede ser metabolizado en prostaglandinas (PGs), prostaciclinas y tromboxanos (TXs) a través de la vía de la ciclooxigenasa y además puede dar lugar a la formación de ácidos epoxieicosatrienoicos y ácidos hidroxieicosatrienoicos a través de citocromo P450. Los metabolitos de AA liberados, con ayuda de las diferentes enzimas, promueven la cascada inflamatoria de forma directa o indirectamente, regulando la formación de otros mediadores inflamatorios. Introducción 65 Alteraciones del glicocálix consecuencia del proceso inflamatorio El glicocálix ha sido recientemente investigado como uno de los principales componentes de diferentes procesos fisiopatológicos entre los que se encuentra la inflamación (76), ya que el endotelio vascular es uno de los primeros lugares donde se producen daños durante el proceso inflamatorio. Las funciones del glicocálix se llevan a cabo cuando este está intacto. La pérdida de las funciones del mismo, se evidencia directa o indirectamente bajo una respuesta inflamatoria local o sistémica, como puede ser durante el proceso de I/R. La inflamación da lugar a la alteración del glicocálix endotelial, que a su vez contribuye con la cascada de la respuesta inflamatoria (77). Fig.10 Comparación de glicocálix intacto (izquierda) y glicocálix alterado (derecha). (´´Glicocálix. Una estructura a considerar en el enfermo grave´´. Carrillo Esper, R. et al. Revista de la Asociación Mexicana de Medicina Crítica y Terapia Intensiva, 2016). La degradación del glicocálix puede abarcar desde la escisión selectiva de HS o CS hasta una mayor alteración, como la escisión de todos los núcleos proteicos syndecan y glypican con la unión de cadena de GAG (19). Se inicia con un estímulo inflamatorio; TNFa, LPS o trombina (78). Esta degradación, producida por mediadores inflamatorios, se ha visto en arterias, capilares y Introducción 66 vénulas en varios modelos experimentales de inflamación. TNFa es la principal citoquina inflamatoria en la cascada inflamatoria, especialmente en sepsis. Este da lugar a una alteración aguda del glicocálix, que tiene como resultado un aumento de la permeabilidad vascular de macromoléculas (40). En corazones aislados de conejillos de indias, también se ha visto que la aplicación de TNFa produce destrucción del glicocálix, asociado con un aumento de la resistencia vascular coronaria, edema tisular, filtración coronaria, aumento de la permeabilidad coloidal y degranulación de mastocitos (79). Para amplificar la inflamación, parece ser crucial la liberación de mediadores inflamatorios, los cuales producen degradación del glicocálix, facilitando el acceso de los leucocitos a las moléculas de adhesión expuestas (80). Además, bajo condiciones inflamatorias, las células activadas como leucocitos polimorfonucleares, macrófagos y mastocitos, liberan enzimas que también contribuyen a la degradación del glicocálix. Los neutrófilos activados producen daño en el glicocálix debido a la producción de RLO y RLN y liberación de proteasas localizadas en su interior (81). Una de las enzimas que produce alteración en el glicocálix es la heparanasa. Es una endo-β-D-glucosidasa activada tanto por citoquinas proinflamatorias como por RLO. Es secretada por numerosos tipos celulares, entre los que se encuentras macrófagos, podocitos y mastocitos. Se forma en el retículo endoplásmico, secretándose posteriormente en el aparato de Golgi. Escinde directamente las cadenas de HS unidas al núcleo de proteoglicanos (82). A su vez, también activa leucocitos y plaquetas con capacidad de aumentar la degradación del glicocálix. La enzima MPO también es liberada por los neutrófilos. Se ha sugerido que esta enzima puede interaccionar vía iónica con las cadenas de HS, causando el desprendimiento de syndecan-1 y produciendo un colapso de la estructura del glicocálix (83). Introducción 67 La enzima hyauronidasa se encarga de la eliminación del ácido hialurónico. Pertenece a un grupo de enzimas glucosidasas que alteran la homeostasis del ácido hialurónico. Otros mediadores importantes y producidos en el proceso inflamatorio son las proteasas, las cuales ejercen un papel fisiológico y patológico sobre la degradación de una gran variedad de sustratos entre los que se encuentra el glicocálix. La elastasa y la familia de las metaloproteinasas, son de gran relevancia en este proceso. - La elastasa es una serin proteasa, almacenada en los gránulos acidófilos de neutrófilos, con capacidad de unirse a HS o syndecan, siendo capaz de destruir este último. - Las metaloproteinasas (MMP), son una familia de proteasa Zn- dependientes que juegan un papel importante en la remodelación de los tejidos durante el crecimiento óseo, curación de heridas, reproducción, cáncer e inflamación. Se almacenan en el interior de las vesículas de fagocitos y en el endotelio, y sus formas activa y proactiva se liberan rápidamente bajo un estímulo apropiado (84). Se ha demostrado que MMP-7 tiene una elevada afinidad por HS y MMP-2, MMP-7 y MMP-9 son capaces de producir la desintegración completa de CS. Además, se ha sugerido que pueden producir daño en GAG, syndecan y receptores CD44 de HA. TNF-a podría aumentar la expresión de MMP-9, lo cual daría lugar al desprendimiento de syndecan-4 acoplado a cadenas de HS (85). Estas enzimas específicas, se activan durante el proceso inflamatorio mediante RLO y citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α y IL-1β. Introducción 68 La degradación del glicocálix da lugar, además de todo lo anteriormente descrito, a la pérdida de los componentes biológicamente activos unidos a él, como XOR, lipoprotein lipasa, inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF2), y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). También se exponen las moléculas de adhesión, lo que promueve la adhesión de leucocitos y una inflamación vascular focal. Por último, la liberación de los fragmentos del glicocálix a la circulación, contribuye a potenciar el proceso inflamatorio. Los fragmentos de glicocálix liberados, pueden servir como herramienta diagnóstica en determinados procesos, pudiéndose considerar al glicocálix como marcador temprano de daño tisular. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipotesis y Objetivos 70 El cólico es una de las patologías que se dan con mayor frecuencia en caballos, considerándose una de las emergencias más comunes y presentando una elevada tasa de mortalidad y morbilidad. El porcentaje de mortalidad en casos de cólico sigue siendo elevado, a pesar de los avances en los tratamientos médico-quirúrgicos, como consecuencia del shock endotóxico. Se ha demostrado que la endotoxemia presenta un papel fundamental en la sepsis severa, acompañado de un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS). La endotoxina (lipopolisacarido, LPS) induce la activación de endotelio, leucocitos y plaquetas, los cuales darán lugar a la liberación de mediadores pro- inflamatorios con la consecuente aparición de efectos adversos. En los casos de cólico se produce, en mayor o menor grado, un problema isquémico con la posible liberación de mediadores inflamatorios y la posterior producción de RLO durante la fase de reperfusión. Con el objetivo de mantener el equilibrio, se desencadenarían diferentes respuestas fisiológicas. Consecuencia de la disrupción de la barrera intestinal, el fenómeno de isquemia- reperfusión podría implicar la liberación de mediadores químicos y endotoxinas, los cuales agravarían el cuadro inicial y desencadenarían un fallo multiorgánico con liberación de metabolitos citotóxicos. El papel del glicocálix endotelial se ha investigado en muchos procesos fisiológicos entre los que se encuentra la inflamación. Además, investigaciones clínicas y experimentales muestran que se ve seriamente afectado tras fenómenos de isquemia-reperfusión. Sin embargo, no se han investigado las posibles alteraciones que podría presentar el glicocálix en caballos que han sufrido un síndrome cólico con posterior cirugía y resección intestinal. Esto, unido a la falta de factores pronósticos que presenta el clínico para poder informar al propietario, hace necesaria la investigación bioquímica de diferentes parámetros que nos ayudarían a determinar el pronóstico del paciente y que podrían usarse con fines diagnósticos. 71 Teniendo esto en cuenta, hemos planteado como objetivo general del trabajo investigar si la isquemia-reperfusión intestinal induce alteraciones en la estructura del glicocálix y su posible relación con citoquinas inflamatorias. Para ello, nos planteamos como objetivos específicos: 1. Investigar si en los caballos con cólico se produce edema intestinal. 2. Analizar la presencia de componentes del glicocálix (Syndecan-1, heparanasas, y heparan sulfato) tanto en plasma como en muestras de tejido. 3. Analizar moléculas de adhesión (VCAM, ICAM-1). 4. Analizar metaloproteinasa 9, debido a su capacidad para degradar el glicocálix. 5. Analizar la actividad mieloperoxidasa. MATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos 73 CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES SELECCIONADOS Se seleccionaron para el estudio todos los caballos que se presentaron a consulta por dolor abdominal, acompañado o no de otra sintomatología. A la hora de decidir la inclusión en el estudio, no se tuvo en cuenta la edad, ni el sexo, tipo de trabajo, nivel de entrenamiento ni intervenciones quirúrgicas previas. Con el fin de poder establecer la etiología del dolor, los pacientes se sometieron a una anamnesis completa que incluyó, inicio del problema, tiempo de evolución y tratamiento previo. Además, los pacientes se sometieron a una exploración clínica y a la toma de muestras para su análisis de laboratorio, según el protocolo de medicina basada en la evidencia recomendado por la British Equine Veterinary Association (Fig. 11), con el fin de poder diagnosticar y aplicar el tratamiento más adecuado a cada tipo de cólico. Tras la anamnesis y la exploración clínica, se excluyeron del estudio aquellos caballos que no requerían intervención quirúrgica para la resolución del cólico, pasando a un manejo médico para la resolución del mismo. Los pacientes se dividieron en dos grupos: 1. Grupo SC (Sometido a cirugía): Grupo de caballos sometidos a cirugía abdominal de urgencia. N=68 2. Grupo control: se utilizaron caballos sanos. N=4 Material y Métodos 74 Fig. 11: Protocolo recomendado por la British Equine Veterinary Association Material y Métodos 75 CRITERIOS DE INCLUSIÓN En el grupo SC se incluyeron caballos sometidos a cirugía abdominal de intestino delgado de urgencia. Los pacientes incluidos tenían que presentar síntomas de dolor severo sin respuesta al tratamiento analgésico, pulso superior a 60 pulsaciones por minuto, alteración en el color de las mucosas, presentándose congestivas e incluso cianóticas, hematocrito elevado y alteraciones a la palpación rectal. Como grupo control, se utilizaron caballos eutanasiados por causas no relacionadas con el sistema cardiovascular ni gastrointestinal. Se excluyeron del estudio aquellos caballos que no requerían intervención quirúrgica para la resolución del cólico, pasando a un manejo médico para la resolución del mismo. TOMA DE MUESTRAS Tras el primer reconocimiento, se procedió a la toma de muestras de sangre periférica. Las muestras de sangre se recogieron en tubos con EDTA, se sometieron a centrifugación (300 RPM, 3 min) y el plasma obtenido se congeló y se almacenó congelado a -80°C hasta el momento de las determinaciones bioquímicas. Evaluar el posible daño del glicocálix endotelial de forma directa mediante visualización representa un reto no del todo conseguido. Además, esta estructura, se altera con mucha facilidad en el momento en que se procede al aislamiento del endotelio (25). Por otro lado, la riqueza vascular de la mucosa intestinal hace que esta pueda servir para investigar las posibles alteraciones endoteliales causadas por la I/R. Material y Métodos 76 Por esos motivos, se decidió investigar los componentes del glicocálix, así como otros marcadores inflamatorios, en unas muestras provenientes de biopsias intestinales. Estas muestras se recogieron durante la cirugía abdominal en proximidad de la lesión isquémica, evitando las zonas claramente afectadas por procesos necróticos o daños vasculares. Las biopsias, se congelaron inmediatamente tras la obtención en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta el momento de las determinaciones bioquímicas. DETERMINACIONES REALIZADAS Edema intestinal Con objeto de cuantificar el ratio wet-to-dry, las muestras se incubaron durante 12h a 60 ºC, aproximadamente 50 mg de cada muestra de intestino, y se volvieron a pesar. Posteriormente, se evaluó la formación de edema intestinal a través del ratio wet-to-dry. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) Los niveles de heparan sulfato, syndecan 1, mieloperoxidasa (MPO), heparanasa, metaloproteinasa 9 (MMP-9) y moléculas de adhesión (vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) y intercellular adhesion molecule 1 (ICAM- 1)) se midieron en plasma y/o biopsias intestinales usando kits ELISA específicos (Cusabio Biotech Co. Wuhan Hubei, China and MyBiosource, San Diego, USA), siguiendo las instrucciones de uso. El fundamento de esta técnica se basa en la unión específica de cada uno de los componentes a determinar, localizados en la muestra extraída, a Material y Métodos 77 anticuerpos monoclonales específicos inmovilizados en la superficie de la placa de titulación. Se tomaron mediante pipeta las muestras y los estándares apropiados, se depositaron en la placa de titulación y se incubaron. Posteriormente, se sometieron a un lavado para eliminar todas aquellas sustancias que no se habían unido a los anticuerpos específicos y que pudiesen interferir con el ensayo. Se añadió al pocillo un segundo anticuerpo específico para el primero y conjugado con biotina, sometiendose a una segunda incubación. Se realizó un segundo lavado para eliminar aquel segundo anticuerpo no unido, y se incubaron de nuevo en presencia de un complejo estreptavidina peroxidasa (avidin conjugated horseradish peroxidase (HRP)). Tras 10 minutos, se produjo un cambio de color cuantificado mediante espectrofotometría a 450 nm. Se cuantificó la cantidad de compuesto unido a través de la reacción enzimática que produce cambio de color, el cual se detecta mediante espectrofotometría. El intra-ensayo tuvo una precisión de CV%<8% y el inter-ensayo una precisión CV%<10%. Actividad mieloperoxidasa La actividad de la mieloperoxidasa se determinó mediante método de Bradley modificado (86), definiendo como actividad mieloperoxidasa a la actividad de la enzima necesaria para degradar un mmol de peróxido de hidrogeno por minuto. Las muestras fueron tratadas brevemente con bromuro de hexadeciltrimetilamonio, para eliminar la actividad pseudoperoxidasa y solubilizar la mieloperoxidasa. Tras tres ciclos de sonicación, congelación y descongelación, las muestras fueron centrifugadas y una alícuota del sobrenadante se mezcló con tampón fosfato, con dehidrocloruro de O-dianisina y peróxido de hidrógeno. Por último, se determinó su absorbancia a 460 nm. Material y Métodos 78 Análisis estadístico Los resultados se expresaron como Media ±ESM (error estándar de la media). El análisis se realizó mediante la comparación de medias por métodos no paramétricos. Para las comparaciones entre grupos, se empleó el test de Kruskal-Wallis de análisis de la varianza por rangos, seguido en caso de dar significación, del test de Mann-Whitney para muestras independientes, con el fin de identificar el origen de las diferencias. Se consideraron resultados significativos y muy significativos unas confianzas superiores o iguales al 95% (p<0.05) y 99% (p<0.01) respectivamente. RESULTADOS Resultados 80 Syndecan -1 Syndecan 1 es uno de los proteoglicanos que componen el glicocálix, formando parte del núcleo del mismo y al que están unidas cadenas de GAG. En nuestro estudio, se detectaron diferencias significativas en los niveles de syndecan 1. En las biopsias intestinales, se observó una disminución significativa de los niveles de syndecan-1 en comparación con el grupo control (Fig. 12). En cambio, en plasma se observó un aumento significativo en los animales sometidos a cirugía, comparados con el grupo control (Fig. 13). Estos resultados sugieren que, en los individuos sometidos a cirugía, se produce un desprendimiento del syndecan-1 del glicocálix y que por ello sus niveles se encuentras disminuidos a nivel intestinal y aumentados en plasma. Fig. 12: Niveles de Syndecan-1 en muestras en intestino delgado de caballos sometidos a cirugía. 0 2 4 6 8 10 12 SY N D- 1 (p g/ m g pr ot ei na ) Control SC * *P<0,01 vs Control Resultados 81 Fig. 13: Niveles de Syndecan-1 en plasma en caballos sometidos a cirugía. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 SY N D- 1 (p g/ m g pr ot ei na ) Control SC * *P<0,01 vs Control Resultados 82 Heparan sulfato Heparán sulfato es el glucosaminoglicano más abundante en el glicocálix, unido principalmente a los núcleos de syndecan. Al igual que syndecan-1, se observó una reducción significativa de los niveles de heparán sulfato en las biopsias intestinales (Fig. 14), mientras que se observaron niveles más altos en plasma en comparación con los niveles del grupo control (Fig. 15), sugiriendo también la presencia de un desprendimiento de heparán sulfato del glicocálix en los pacientes sometidos a cirugía. Fig. 14: Niveles de heparán sulfato en muestras de intestino delgado en caballos sometidos a cirugía. 0 5 10 15 20 25 30 HS (p g/ m g pr ot ei na ) Control SC * *P<0,01 vs Control Resultados 83 Fig. 15: Niveles de heparán sulfato en plasma en caballos sometidos a cirugía 0 0,5 1 1,5 2 HS (p g/ m g pr ot ei na ) Control SC * *P<0,01 vs Control Resultados 84 Metaloproteinasa 9 (MMP-9) Las metalloproteinasas son una familia de enzimas que se almacenan en el endotelio y tienen una elevada afinidad por heparan sulfato. En este estudio, se observó un aumento significativo de los niveles de la enzima metaloproteinasa 9 (MMP-9) en las muestras provenientes de las biopsias intestinales del grupo sometido a cirugía, comparado con los niveles del grupo control (Fig. 16). Fig. 16: Niveles de metaloproteinasa 9 en muestras de intestino delgado en caballos sometidos a cirugía. 0 5 10 15 20 25 30 M M P- 9 (m g/ pg p ro te in a) Control SC * *P<0,01 vs Control Resultados 85 Edema En nuestro estudio se observó un aumento significativo del edema tisular en los animales sometidos a cirugía, comparados con el grupo control (Fig. 17). Fig. 17: Edema en muestras de intestino delgado en caballos sometidos a cirugía. 0 20 40 60 80 100 Ed em a (w et to d ry ra tio ) Control SC * *P<0,001 vs Control Resultados 86 Moléculas de adhesión (VCAM-1, ICAM-1) Las moléculas de adhesión son consideradas como marcadores de inflamación, pudiéndose producir un aumento de la expresión de las mismas por citoquinas proinflamatorias. En este estudio se observó un aumento significativo de los niveles de moléculas de adhesión tanto en muestras de tejido, en las que se investigaron los niveles de VCAM-1, una molécula de adhesión que podría mediar la adhesión inicial de los linfocitos T y monocitos en las células endoteliales activadas (VCAM-1, Fig. 18), así como en plasma, en cuyo caso se determinaron los niveles de ICAM-1, una molécula de adhesión importante en el refuerzo de la adhesión inicial promovida por los linfocitos T que facilita las subsecuente transmigración de otras células. (ICAM-1, Fig. 19). Fig. 18: Niveles de VCAM -1 en muestras de intestino delgado en caballos sometidos a cirugía intestinal. 0 2 4 6 8 10 12 VC AM -1 (p g/ m g pr ot ei na ) Control SC* *P<0,001 vs Control Resultados 87 Fig. 19: Niveles de ICAM-1 en muestras de plasma en caballos sometidos a cirugía. 0 10 20 30 40 50 IC AM -1 (n m ol /m l) Control SC * *P<0,001 vs Control Resultados 88 Heparanasa La heparanasa es una enzima localizada en el interior de mastocitos, la cual se activa por citoquinas proinflamatorias. Se estudió su presencia tanto en el intestino de caballos sometidos a cirugía de cólico como en plasma, debido al posible papel de la misma en la alteración del glicocálix, observándose un aumento significativo de los niveles de la misma en ambos tipos de muestra en el grupo sometido a cirugía, comparado con el grupo control (Figs. 20 y 21). Fig. 20: Niveles de heparanasa en muestras de intestino delgado en caballos sometidos a cirugía. 0 2 4 6 8 10 He pa ra na sa (p g/ m g pr ot ei na ) Control SC * *P<0,01 vs Control Resultados 89 Fig. 21: Niveles de heparanasa en muestras de plasma en caballos sometidos a cirugía. 0 20 40 60 80 100 120 140 He pa ra na sa (p g/ m l) Control SC * *P<0,05 vs Control Resultados 90 Actividad Mieloperoxidasa (MPO) La actividad mieloperoxidasa (MPO) mide de forma indirecta la actividad de los neutrófilos. En este estudio se observó que el cólico produjo un aumento significativo de la actividad MPO tanto en tejido como en plasma (Figs 22 y 23). Fig. 22: Actividad MPO en muestras de intestino delgado en caballos sometidos a cirugía. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 M PO (I U /M g Pr ot ei na ) Control SC * *P<0,001 vs Control Resultados 91 Fig. 23: Actividad MPO en plasma en caballos sometidos a cirugía. 0 1 2 3 4 5 M PO (i U /M l) Control SC* *P<0,001 vs Control DISCUSIÓN Discusión 93 El fenómeno de isquemia-reperfusión (I/R) es una de las principales causas de morbilidad tras cirugías de resección intestinal. A pesar de que los daños producidos por este proceso son variables, existe un componente común para todos los órganos, la disfunción microvascular (87). Tras la I/R, las células endoteliales sufren un estrés oxidativo que causa aparición de hinchazón y desprendimiento de las mismas de la membrana basal. Como consecuencia, los leucocitos se adhieren y migran y aumenta la permeabilidad vascular. Estas consecuencias del fenómeno de I/R sugieren que el glicocálix endotelial puede estar involucrado y se ha visto que este se altera por I/R. Investigaciones clínicas y experimentales recientes muestran que el glicocálix se ve severamente afectado tras I/R (88), pero no hay investigaciones que muestren que este pueda ser alterado en caballos con cólico sometidos a cirugía con resección intestinal. A pesar de los avances en el manejo clínico y quirúrgico de las enfermedades del tracto gastrointestinal, el cólico sigue siendo una de las causas más comunes de muerte en caballos, teniendo en cuenta la mejora del pronóstico en la actualidad. Ha habido una disminución considerable de caballos que terminan con desenlace fatal, pero no están exentos ni del dolor ni del malestar característico de este síndrome. Referente a los casos sometidos a cirugía, ha habido una mejora de la supervivencia debido a mejoras en las técnicas quirúrgicas y rapidez en referirlos. Además, en muchas ocasiones aparecen complicaciones posteriores que implican consecuencias negativas en el bienestar del caballo, probabilidad de supervivencia y el retorno a su actividad anterior (89), por ello cada vez son más las investigaciones encaminadas a prevenir y/o minimizas las consecuencias del cólico. Se acepta de forma general que todo cólico equino va asociado, en mayor o menor grado, a un proceso isquémico además de un compromiso vascular. La isquemia provoca una disminución de la oxigenación de los tejidos (90), los Discusión 94 cuales responden liberando toxinas y otros agentes químicos que dañan los tejidos adyacentes (91). Las lesiones producidas no son solo a causa del fenómeno isquémico. La mayor parte del daño a la mucosa, asociado con isquemia, ocurre en la fase de reperfusión del tejido isquémico (11). Durante la fase de reperfusión, se generan radicales libres de oxígeno que pueden inducir un daño adicional. Estos promueven la quimiotaxis y activación de leucocitos e inician la expresión genética de citoquinas a través de interacciones con el líquido extracelular, membranas lipídicas celulares y ácidos grasos poliinsaturados. Una segunda agresión, como una infección, translocación de bacterias o el paso de endotoxinas al torrente sanguíneo, da lugar a una amplificación del daño que puede desencadenar en un fallo multiorgánico. Es de gran importancia establecer un pronóstico del cólico, aunque suele ser difícil debido a la gran variedad de factores que se deben considerar. Existen diferentes factores utilizados para establecer un pronóstico del cólico, como color de las mucosas, grado de dolor, frecuencia cardiaca y tasa respiratoria, glucosa en sangre, concentración de lactato en sangre o color del líquido peritoneal. Uno de los principales factores que contribuyen al daño de los tejidos tras cirugías es el fenómeno de I/R. A pesar de que la patogénesis de la I/R no se comprende completamente, las investigaciones en curso sugieren que la degradación del glicocálix endotelial podría tener un papel importante en ello (92). El glicocálix es una capa compleja, cargada negativamente, compuesta por proteoglicanos y glucoproteínas, localizada en la superficie de las células endoteliales, en la que el syndecan y el ácido hialurónico son dos de los componentes mayoritarios (24). Varios procesos patológicos dan lugar a una alteración de la estructura y función del glicocálix, como puede ser I/R u otros estados inflamatorios como hiperglicemia o diabetes mellitus. Discusión 95 La pérdida de la integridad del glicocálix da lugar a un aumento de la permeabilidad vascular, pérdida capilar y exposición de las células endoteliales a leucocitos y plaquetas circulantes, los cuales inician una respuesta inflamatoria y alteración de la coagulación (93). Clínicamente no existe todavía un método para cuantificar el daño en el glicocálix, pero hay estudios que muestran una estrecha relación entre el desprendimiento de ciertos componentes del glicocálix, principalmente syndecan-1, y coagulopatía, edema y mortalidad (94). En este trabajo, hemos investigado los posibles daños en el glicocálix producidos por fenómenos de isquemia-reperfusión intestinal, en caballos sometidos a cirugía de intestino delgado, comparados con caballos sanos. Hemos encontrado que los caballos con cólico presentaban una significativa alteración en los componentes del glicocálix, comparados con los sujetos del grupo control. Existen estudios que muestran la importancia de los marcadores de degradación de glicocálix (syndecan-1, heparan sulfato y heparanasa, entre otros) como herramienta diagnóstica en sepsis (95). Sin embargo, no se les había relacionado con el daño producido por I/R en el cólico equino. En nuestro estudio, hemos observado que el fenómeno de I/R, además de comprometer el intestino tras cirugías de cólico con resección de intestino delgado, también afecta a la integridad del glicocálix. Este daño en el glicocálix es evidente tanto a nivel intestinal, donde se observa una disminución de los niveles de syndecan-1 comparados con los que se observan en el grupo control, como a nivel plasmático, donde se ha podido observar que los niveles de syndecan-1 estaban por encima de los niveles observados en el grupo control. Desde el punto de vista clínico, este dato resulta interesante ya que nos permite obtener información acerca del pronóstico del paciente, así como monitorizar el daño producido en el intestino de forma no invasiva. Discusión 96 El HS es otro de los componentes importantes y mayoritarios del glicocálix. Es un glucosaminoglicano, el cual se encuentra principalmente unido a los núcleos de syndecan. Varios estudios han identificado niveles elevados de heparán sulfato circulantes en pacientes enfermos (96-98). Al igual que lo ocurrido con los niveles de syndecan-1, en este estudio se ha observado una disminución de sus niveles en el grupo SC en las muestras provenientes de las biopsias intestinales, comparado con el grupo control, y un aumento del mismo en plasma. Como lo explicado para los resultados relativos a syndecan-1, en este caso también, estos valores sugieren la presencia de un daño estructural del glicocálix. Como se ha mencionado previamente, este daño a la estructura del glicocálix puede ser causado, durante la I/R, por la excesiva producción de RLO y por la inflamación relacionada con ello. Tanto los mediadores inflamatorios como la liberación de enzimas por parte de leucocitos polimorfonucleares, mastocitos y macrófagos, contribuyen en la degradación del mismo (22). Se ha observado que una de las enzimas que puede causar daño en el glicocálix es heparanasa. Esta enzima se sintetiza en forma de pre-heparanasa y es dirigida al retículo endoplásmico donde se formará la proheparanasa, posteriormente trasportada al aparato de Golgi para ser secretada (26). Se activa por citoquinas proinflamatorias y escinde de forma directa las cadenas de HS unidas a núcleos de proteoglicanos. Además, produce desprendimiento de syndecan-1 y representa un determinante importante en la patogénesis de varias alteraciones inflamatorias (99). Los resultados obtenidos en nuestro estudio muestran que los niveles de heparanasa se encuentran aumentados tanto en muestras de tejido como en muestras de plasma en caballos sometidos a cirugía intestinal, en comparación con los observados en el grupo control, lo que sugiere que, en el contexto de I/R intestinal, podría tener un papel importante en la degradación del glicocálix. Discusión 97 La degradación del glicocálix puede deberse también a una acción excesiva de enzimas como la MMP-9. Diversos estudios muestran que el uso de ciertas sustancias como doxiciclina u ortofenantrolina, inhibidores no selectivos de metaloproteinasas, puede atenuar el desprendimiento de syndecan y glypican y por lo tanto la destrucción del glicocálix (100). En nuestro estudio se observó un aumento significativo de los niveles de esta enzima en biopsias intestinales provenientes de los pacientes sometidos a cirugía, en comparación con los animales sanos. Estos resultados sugieren que esta enzima contribuye a la degradación del glicocálix que se observa en el cólico quirúrgico equino. El daño del glicocálix da lugar a múltiples alteraciones fisiopatológicas entre las que se encuentra aumento de la permeabilidad vascular, atenuación de la respuesta al estrés de cizalla, adhesión de leucocitos y plaquetas, producción de ambiente protrombótico y cambios en la reología microvascular. Entre las funciones del glicocálix, se encuentra la regulación de la permeabilidad vascular. Actúa como filtro de ciertas moléculas y, debido a su carga neta negativa, repele las moléculas de la misma carga. Además, impide el paso de moléculas con un tamaño mayor a 70 kDa. Por eso, la degradación del mismo, permite el paso de proteínas plasmáticas y movimiento de fluidos a través de la pared vascular, dando lugar a la formación de edema (82). Se produce una pérdida de las uniones celulares y la función de barrera desaparece (101). En este estudio hemos valorado la presencia de edema en intestino de caballos sometidos a cirugía comparado con el grupo de caballos sanos, apreciando niveles significativamente elevados en los primeros, comparado con el grupo control. Estos resultados sugieren que el daño en el glicocálix puede contribuir en la formación de edema, y por tanto la visualización de éste, puede aportar información sobre la gravedad de la situación. Discusión 98 Por otro lado, la carga eléctrica negativa del glicocálix hace que repela ciertas moléculas, entre las que se encuentran las células rojas, impidiendo la interacción de estas con las células endoteliales. Entre los componentes del glicocálix, se encuentran las glucoproteínas, que conectan a este con las células de membrana. Las más importantes en el glicocálix son selectinas, integrinas e inmunoglubulinas, dentro de las que se encuentran las moléculas de adhesión (ICAM-1, ICAM-, VCAM-1 e PECAM-1). La longitud de las proyecciones de las moléculas de adhesión es menor que el grosor del glicocálix, por lo que, si el glicocálix está intacto se inhibe la unión de leucocitos y plaquetas (30). En este estudio hemos valorado la presencia de moléculas de adhesión, observando un significativo aumento de la expresión de las mismas tanto en plasma, en el que hemos medido ICAM-1, como en muestras de intestino delgado, donde hemos valorado VCAM-1. Esto, junto con los resultados anteriormente expuestos, nos sugiere que se ha producido una degradación del glicocálix que permite la exposición de las moléculas de adhesión. El aumento de expresión de moléculas de adhesión, potencia la adhesión de leucocitos a la pared vascular (102) y la activación de los mismos. Esta, se puede determinar a través de la enzima mieloperoxidasa (MPO). La MPO es una enzima liberada por neutrófilos y la más abundante en los gránulos de estos, que da lugar a su reclutamiento y activación. Una vez liberada, se une a la pared de los vasos, oxida metaloproteinasas extracelulares y reduce la biodisponibilidad de NO (83). Entre sus funciones, se encuentra la producción de RLO, capaces de producir daño en el glicocálix. Además, se ha visto que MPO es liberada en el glicocálix o cerca de él, acumulándose a lo largo del endotelio y trasportada a través de las células endoteliales (103). En nuestro estudio, hemos utilizado la concentración de MPO como indicadora de la activación de neutrófilos, observándose niveles significativamente mayores tanto en muestras de tejido de caballos sometidos a Discusión 99 cirugía como en muestras de plasma, comparados con los observados en el grupo control, indicando también el posible daño en el glicocálix. En resumen, en este estudio hemos observado que varios componentes del glicocálix se encontraban significativamente disminuidos en las biopsias intestinales de caballos sometidos a cirugía debido a cólico intestinal en comparación con los resultados obtenidos en el grupo control. A su vez, en los animales que presentaban cólico intestinal se observó un aumento de los componentes del glicocálix en plasma en comparación con los resultados del grupo control. Este daño del glicocálix iba acompañado de un aumento en los niveles de enzimas que contribuyen a su degradación, de moléculas de adhesión y de neutrófilos activados. Todo ello sugiere que, durante estos procesos patológicos, se produce una degradación del glicocálix, y que esta alteración se acompaña de edema intestinal, aumento de expresión de moléculas de adhesión y consecuente activación de neutrófilos, sugiriendo un posible mecanismo fisiopatológico de daño intestinal y un daño sistémico potencial. Fig 24: Relación entre cólico y degradación del glicocálix consecuencia del proceso de I/R intestinal CONCLUSIONES Conclusiones 101 1. Los caballos con cólico y posterior cirugía de resección de intestino delgado, sufrieron una alteración del glicocálix como consecuencia de la inflamación secundaria al fenómeno de isquemia-reperfusión. 2. La degradación del glicocálix podría estar mediada por la acción de diferentes enzimas como mieloperoxidasa, metaloproteinasa-9 y heparasa, cada una de las cuales aparecía aumentada en muestras de plasma y tejido, comparado con el grupo control. 3. Se apreció edema en los tejidos, lo cual podría ser una consecuencia de la degradación del glicocálix y la consecuente alteración de la permeabilidad vascular. 4. Teniendo en cuenta el papel del glicocálix en el mantenimiento de la homeostasis, la prevención de su(la) degradación podría tener beneficios clínicos importantes durante cirugías. 5. Desde el punto de vista clínico, la presencia de componentes del glicocálix en muestras de plasma permite monitorizar de forma rápida y no invasiva el daño en los tejidos causado por I/R, tras cirugías de resección abdominal. Esto podría representar una posible herramienta diagnóstica a la hora de evaluar el cuadro clínico del animal durante el cólico, así como la evolución del mismo. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 103 (1) Seal JB, Gewertz BL. Vascular Dysfunction in Ischemia-Reperfusion Injury. Ann Vasc Surg 2005;19 (4): 572-584. (2) Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, Korthuis RJ. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. 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