FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE TRABAJO FIN DE GRADO TÍTULO: LA CURACIÓN DEL SIDA Autor: Sofia Elena Tesolato Tutor: Luis Miguel Bedoya del Olmo Convocatoria: Junio 2017 Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 2 de 24 1. RESUMEN Y PALABRAS CLAVE Resumen: A día de hoy, la infección por VIH es crónica pese a la mejora de la terapia antirretroviral (TAR), debido a la presencia de reservorios en los cuales el virus permanece oculto del sistema inmunitario y de los fármacos antirretrovirales. Por ello, en pacientes en los cuales se ha logrado controlar la infección mediante la TAR se busca dar un paso más y eliminar estos reservorios para así poder eliminar la infección. Entre las estrategias investigadas con este fin se encuentra la llamada “shock and kill”, que consiste en el empleo de agentes revertidores de latencia o LRAs para inducir la expresión del virus latente en los reservorios, de forma que éstos puedan identificarse como células infectadas y puedan ser eliminados. Tras revisar varios estudios publicados en las base de datos PMC y ClinicalTrials.gov, se ha encontrado que existen varios grupos de compuestos que constituyen potenciales LRAs útiles, entre ellos los agonistas de PKC y los HDACis han adquirido bastante protagonismo. Sin embargo, pese a que existen compuestos que han demostrado inducir la expresión de los provirus en pacientes, a día de hoy no se ha encontrado un compuesto que por sí solo haya demostrado llevar a la reducción del reservorio viral del organismo. El futuro parece estar en el empleo de combinaciones sinérgicas de fármacos. También se plantea la posibilidad de combinar el empleo de LRAs y vacunas para reforzar la eliminación inmunitaria. Palabras clave: VIH, latencia, reservorios, LRA. 2. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES El Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad infecciosa causada por un retrovirus llamado virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y caracterizada por la disminución en el infectado de los linfocitos T CD4+ (linfocitos Th o colaboradores) 1 . Como consecuencia de esto se produce una disminución significativa y progresiva en la respuesta inmunitaria del paciente, lo que lo expone a una o más infecciones o neoplasias oportunistas que generalmente son las que le causan la muerte 2 . Existen tres vías reconocidas de transmisión de la enfermedad entre seres humanos: la vía sanguínea (por contacto sanguíneo directo entre el infectado y un sujeto sano susceptible), la vía sexual (por contacto sexual directo sin el uso de preservativo) y la vía vertical (de una madre infectada a su hijo, ya sea durante el parto o en la lactancia posterior). El descubrimiento del SIDA data del año 1981, cuando se registró en EEUU un número inesperadamente elevado de casos de sarcoma de Kaposi y neumonía por Pneumocistis Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 3 de 24 jiroveci en varones jóvenes homosexuales 1 . Fue en el año 1983 cuando se logró aislar por primera vez el retrovirus a partir de los nódulos linfáticos de un paciente infectado, el cual posteriormente recibiría el nombre de VIH 1 . Desde entonces, la enfermedad se ha extendido por todo el mundo hasta convertirse en la pandemia que conocemos hoy en día 2 : sólo en la región europea se diagnosticaron casi 30.000 nuevas infecciones por el VIH en el año 2015. Y estos casos sólo constituyen la punta del iceberg puesto que, al tratarse de una enfermedad con un período de incubación de varios años, existe un alto número de infectados que desconoce su situación por lo que no recibe tratamiento y puede transmitir el virus (se estima que 1 de cada 7 personas infectadas de VIH que viven en la región UE/EEE no saben que lo están) 3 . 1.1. El VIH como agente causante del SIDA El VIH es un virus de forma prácticamente esférica. La estructura del virión o partícula viral consiste en una envuelta lipídica, una matriz y en el interior de ésta una cápsida. Dentro de la cápsida se encuentran el genoma, compuesto por dos moléculas idénticas de ARN monocatenario positivo y asociado a unas proteínas, y una serie de enzimas necesarias para el desarrollo del virión en el interior de la célula huésped: transcriptasa inversa, nucleasa, integrasa y proteasa. El virus también presenta una serie de proteínas estructurales: p24 en la cápsida, p17 en la matriz, y las glicoproteínas gp120 (de superficie) y gp41 (transmembrana) presentes en la envuelta y responsables de la entrada del virus a la célula 1 . En la gp120 se encuentran 2 zonas clave para la infección de la célula huésped: la zona de unión al receptor CD4 (que determina la selectividad del virus hacia los linfocitos CD4+) y la zona de unión a los receptores de quimiocinas, principalmente CXCR4 y CCR5 4 . El VIH es un virus que se caracteriza por tener una gran capacidad mutagénica. Esto explica que exista una gran diversidad genética, distinguiéndose hasta la fecha dos tipos de VIH: VIH-1, el más virulento y el más distribuido (circula en Europa, Asia, América y Oceanía) y es el principal responsable de las infecciones; y VIH-2, menos virulento y con ello menos frecuente (se encuentra principalmente en la zona de África Central y Occidental). A su vez, existen varios grupos filogenéticos de VIH-1 y VIH-2. La mayor parte de las transmisiones entre humanos se deben al VIH-1 grupo M 1 . Figura 1. Estructura de un virión de VIH50 Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 4 de 24 1.2. Ciclo celular del VIH El ciclo del VIH dentro de la célula hospedadora se divide en dos etapas: temprana y tardía. La etapa temprana del ciclo comienza con la unión de gp120 al receptor CD4, lo que provoca en ella un cambio conformacional que expone su dominio de unión al correceptor de quimiocinas (CXCR4 o CCR5). La nueva unión de gp120 al correceptor induce a su vez un cambio conformacional en gp41 exponiendo un dominio hidrofóbico de ésta, el llamado “péptido de fusión”, que se inserta en la membrana de la célula hospedadora y forma un puente de unión entre ésta y la envuelta viral. Tras esto se produce la fusión de las membranas y la entrada de la cápside vírica al interior de la célula, seguida de la decapsidación (liberación del genoma), y seguidamente el proceso de retrotranscripción (obtención de ADN bicatenario a partir del ARN monocatenario viral por la acción del complejo enzimático de la transcriptasa inversa, también de origen vírico). Para que la retrotranscripción sea completa y efectiva el linfocito debe estar activado, ya que durante la activación y proliferación linfocitaria incrementan los niveles de nucleótidos celulares. Si el linfocito infectado se encuentra en reposo, la retrotranscripción queda incompleta y el ADN resultante es degradado en cuestión de poco tiempo por ADNasas celulares. Tras la retrotranscripción generalmente se produce la integración de una parte del ADN bicatenario vírico en el genoma de la célula, formando el provirus. El provirus puede permanecer latente un período variable (lo más habitual), replicarse de forma controlada o hacerlo de forma masiva causando un efecto citopático en el linfocito infectado. Cuando se activa la expresión del VIH integrado da comienzo la etapa tardía del ciclo, en la que se lleva a cabo la transcripción del ADN provírico por la ARN polimerasa II, la síntesis de las proteínas iniciales y la maduración de éstas por la acción de proteínas de la célula y de la proteasa viral, y finalmente el ensamblaje de los nuevos viriones que abandonan la célula huésped 4 . Hoy en día se conoce que la principal barrera frente a la total erradicación del VIH son los reservorios. Los principales reservorios identificados del VIH son los linfocitos Th de memoria 5 , los cuales constituyen una población muy pequeña en proporción al total de linfocitos Th del organismo. Estos reservorios se generan a partir de linfocitos Th activados que, tras ser infectados por el VIH, revierten a un estado de reposo en el que la transcripción del genoma provírico está inhibida 6 . El desarrollo de la terapia antirretroviral (TAR), basada en el empleo de combinaciones de fármacos que actúan sobre distintas etapas del ciclo del VIH, ha supuesto un enorme avance en el control de la infección y en el pronóstico de la enfermedad para los pacientes con acceso a dicho tratamiento (con el adecuado tratamiento y Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 5 de 24 seguimiento, la mayoría ha alcanzado una esperanza de vida equiparable a la de una persona no infectada) 7 . Sin embargo, aunque los fármacos antirretrovirales puedan llegar a controlar completamente la replicación del VIH, evitando la infección de nuevas células, no han demostrado poder actuar eficientemente frente a los reservorios ya establecidos, por lo que por sí solos no constituyen una estrategia de curación y, en caso de interrumpir la TAR, la replicación y la viremia terminan por reaparecer 6 . Esto obliga a los infectados a mantener la TAR durante toda su vida, lo que puede llevar a problemas de toxicidad y resistencias. Por este motivo en las últimas décadas ha habido un creciente interés por desarrollar otras técnicas que, combinadas o no con la TAR, puedan algún día llevar a la completa erradicación del VIH del organismo 5 . 1.3. Primeros casos de curación de la infección por VIH Durante los últimos años han aparecido algunos aparentes casos de curación del SIDA en humanos que posteriormente han resultado en fracaso, como el del famoso “Mississippi baby”, un niño nacido de una madre infectada por VIH-1 que no había recibido tratamiento prenatal. En un intento por prevenir la formación de reservorios, la TAR comenzó tan sólo 30 horas después de su nacimiento, y continuó durante 18 meses. Sin embargo, y en contra del consejo médico, finalmente fue interrumpida y, a pesar de no presentar indicios de viremia durante el año subsiguiente, a los dos años apareció repentinamente una viremia detectable, lo que indica que llegaron a formarse los reservorios 8 . A día de hoy el único caso considerado de curación del VIH es el de Timothy Brown (el conocido como “paciente de Berlín”) 9 , un paciente infectado por VIH que desarrolló una leucemia y por motivo de ésta recibió un trasplante de médula ósea de un donante homocigoto para la depleción del correceptor CCR5. En su caso, los reservorios pudieron desaparecer junto con el resto de células inmunitarias en parte por la quimioterapia y en parte por la enfermedad del injerto contra huésped. Aún en caso de que algún reservorio del paciente hubiera sobrevivido y hubiera liberado el virus, éste habría sido incapaz de propagar la infección a otras células puesto que las nuevas células CD4+ recibidas del donante no presentaban el correceptor CCR5 necesario para la entrada del virus 6, 8 . 1.4. Estrategias de curación de la infección por VIH El caso del paciente de Berlín ha demostrado que es posible llegar a evitar un repunte de viremia incluso sin el control de la TAR. Sin embargo, en pacientes que no requieran un trasplante de médula por otros motivos, la estrategia aplicada en dicho paciente no resultaría Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 6 de 24 viable por lo que es necesario desarrollar otras técnicas orientadas hacia la mayoría de personas infectadas por VIH. Entre las técnicas actuales en investigación para la erradicación del VIH se encuentran la vacuna terapéutica y la “shock and kill”. La vacuna terapéutica busca potenciar una respuesta inmunitaria temprana frente al VIH que actúe en etapas iniciales de la infección y elimine el virus antes de que éste pueda establecer reservorios. Normalmente los reservorios llegan a establecerse en las primeras semanas de infección debido a que la replicación viral es muy alta y aún no existe una respuesta inmunitaria específica. Por ello, una inmunidad específica precoz inducida por la vacuna ayudaría en esta primera etapa. Se han estudiado dos estrategias de vacuna terapéutica: la inducción de anticuerpos neutralizantes, que ayudan a neutralizar las partículas virales antes de que éstas puedan infectar nuevos linfocitos pero no son eficaces una vez que ya se ha producido la infección de la célula, y la inducción de una respuesta celular basada en linfocitos T citotóxicos (LTCs) 6 , que constituyen la principal defensa inmunitaria natural en la infección por VIH 4 . Una respuesta temprana inducida por vacunación permitiría controlar la infección y evitar la formación de los reservorios incluso después de que se haya producido la infección de los linfocitos puesto que la transición al estado de reposo dura varias semanas durante las cuales estas células siguen siendo susceptibles de ser reconocidos como infectados y destruidos por los LTCs. Las dos estrategias de vacunación pueden ser utilizadas combinadas entre sí y con la TAR y podrían constituir una forma de erradicar la infección si aplicadas de forma temprana. Sin embargo, en pacientes que ya tienen la infección establecida y presentan reservorios no son suficientes 6 . La técnica de “shock and kill” o “kick and kill” consiste en la utilización de fármacos capaces de reactivar las formas latentes del VIH en el organismo e inducir su expresión, para así hacer que los reservorios puedan ser eliminados por la respuesta inmunitaria o por los propios efectos citopáticos del virus. Estas pequeñas moléculas reciben el nombre de agentes revertidores de latencia (“latency reversing agents”, LRAs), y se han estudiado varios tipos de compuestos con diferentes mecanismos 10 . En un principio, los intentos por revertir la latencia del VIH se centraron en promover la activación de los linfocitos CD4+ del reservorio (ej. con IL-2 o anticuerpos anti-CD3). Sin embargo esto llevaba a una activación generalizada de los linfocitos T, asociada a un exceso de citoquinas y con ello a problemas de toxicidad. Esto hizo necesario buscar LRAs para activar vías más específicas que lograran inducir la expresión del virus sin llevar a la activación de la célula 11 . Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 7 de 24 1.5. Cultivos celulares para la evaluación “in vitro” de los LRA Para probar la eficacia de distintas moléculas como agentes revertidores de la latencia, lo ideal sería poder utilizarlos directamente sobre los linfocitos Th reservorio obtenidos de un paciente enfermo de VIH y en tratamiento con la TAR, puesto que éste es el tipo de paciente al cual irán destinados estos fármacos. Sin embargo, este tipo de ensayo es más complicado debido a que las células reservorio son extremadamente escasas en el organismo (se estima que hay 1 por cada 10 6 linfocitos Th en reposo). Por ello, se han buscado otros modelos celulares para la mayoría de los ensayos “in vitro”. Los más sencillos son cultivos de células epiteliales transformadas a los que se ha añadido el genoma del VIH (proceso llamado transfección), que actualmente se emplean para el screening de fármacos. También existen varios ensayos realizados sobre líneas celulares de linfocitos T transformados, a veces incluso clónicos. Sin embargo, estos cultivos no alcanzan a imitar totalmente los reservorios reales del VIH en el organismo (las células reservorio se encuentran en estado de quiescencia o G0, esto es, no se dividen, mientras que las células transformadas se comportan como células cancerígenas, por lo que proliferan de forma continua). Más recientemente se han desarrollado cultivos primarios de linfocitos Th: en ellos primero se ha inducido la vía de señalización celular del bcl-2 (una vía que evita su muerte por apoptosis y asegura su supervivencia fuera del organismo), luego se ha llevado a cabo la infección por el VIH y posteriormente se han cultivado el tiempo suficiente para que algunos de ellos entren en estado de latencia. La mayoría de datos acerca del efecto de los LRA derivan de su utilización en estos modelos de latencia 11 . Sin embargo, algunos también se han probado en linfocitos Th de memoria infectados procedentes de individuos enfermos en tratamiento con TAR 7 . 1.6. Biomarcadores del VIH asociados a célula El biomarcador tradicional de la presencia del VIH-1 en el organismo humano es la concentración de virus en el plasma sanguíneo o viremia, representada mediante las copias de ARN vírico por mL de plasma y medida mediante PCR. Sin embargo, la introducción de la TAR permite controlar la replicación del virus y mantener la viremia por debajo de niveles detectables. Para evaluar el efecto de la técnica de “shock and kill” en los pacientes ha sido necesario ir más allá de este parámetro y encontrar otros biomarcadores que permitan medir los reservorios del VIH y así poder evaluar su desaparición: los biomarcadores del VIH asociados a célula (“CA HIV biomarkers”), esto es, diferentes formas de ácidos nucleicos generadas a lo largo del ciclo del virus dentro de la célula infectada. Uno de los biomarcadores usados es el ADN de VIH asociado a célula (CA DNA, el ADN vírico Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 8 de 24 presente en las células infectadas), el cual puede encontrarse integrado en el genoma pero también en algunas formas no integradas. Otro biomarcador usado más frecuentemente es el ARNm de VIH asociado a célula (CA mRNA). Éste último se encuentra en diferentes formas a lo largo del ciclo del VIH: el msRNA (“multiply spliced mRNA” o ARNm sometido a splicing completo, que codifica para proteínas reguladoras), el isRNA (“incompletely spliced mRNA” o ARNm sometido a splicing incompleto, que codifica para proteínas accesorias y algunas estructurales), y el usRNA (“unspliced mRNA” o ARNm no procesado, el RNA mensajero que abarca la secuencia entera del genoma y codifica para proteínas estructurales, y que contiene entre otras la secuencia estructural “gag” usada para su cuantificación). El “splicing” del ARNm conlleva, entre otras cosas, la eliminación de intrones. La traducción de los isRNA y usRNA a proteínas depende de la proteína viral Rev. Como estos ARNm presentan intrones en su estructura, no pueden salir del núcleo mientras los niveles de esta proteína se encuentren por debajo de un umbral. Cuando se ha producido suficiente proteína Rev a partir del msRNA, ésta se une a los isRNA y usRNA y permite exportarlos al citoplasma para la síntesis de las proteínas para las que codifican 12 . 2. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo es el de indagar sobre los principales grupos de fármacos investigados como potenciales agentes revertidores de la latencia y los compuestos que han obtenido resultados más prometedores como estrategia de curación de la infección por VIH. 3. METODOLOGÍA Para obtener información acerca de las investigaciones en la técnica “shock and kill”, se han consultado artículos científicos disponibles en las bases de datos del NHC (Pubmed y PMC) y la base de datos “Retrovirology.BioMed Central”. También se ha consultado la base de datos ClinicalTrials.gov para obtener detalles acerca de los ensayos clínicos. Se ha procurado que los documentos consultados fueran recientes (con una antigüedad máxima de 10 años) para proporcionar una información lo más actualizada posible. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para poder determinar las mejores opciones para revertir la latencia del VIH es necesario conocer primero qué mecanismos están implicados en la regulación de la expresión del genoma provírico en la célula. Estos mecanismos están muy caracterizados en el caso del VIH-1. Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 9 de 24 4.1. Mecanismos que regulan la expresión del VIH-1 en una célula infectada Como se muestra en la figura 2, el genoma del VIH-1 (verde) se encuentra integrado y asociado a las histonas formando los nucleosomas 13 . Sus extremos contienen una secuencia denominada repetición terminal larga (LTR) 1 . En el LTR del extremo 5’ del genoma se encuentran puntos de reconocimiento y unión de los principales factores de transcripción (representados en morado, azul y rosa). El punto de inicio de transcripción (TSS) aparece representado mediante una flecha amarilla 13 . En el caso del VIH-1 siempre existen dos nucleosomas, independientemente de cómo se produzca la integración: Nuc-0, situado por delante de la zona de regulación, y Nuc-1, situado por detrás de la misma 14 . 4.2. Inhibidores de las HDACs Uno de los primeros mecanismos que interviene en la regulación de la expresión del VIH es, como en el caso de cualquier otro gen, la modulación del grado de compactación de la cromatina. La acetilación-desacetilación de histonas permite modificar el estado de la cromatina en una determinada región del genoma y con él la accesibilidad de los genes en esa zona para la maquinaria de transcripción. En este proceso intervienen dos enzimas: las histona acetiltransferasas (HATs) y las histona desacetilasas (HDACs). Las HATs catalizan la transferencia de grupos acetilo a residuos de lisina en las histonas, lo que reduce las cargas positivas en estas proteínas y hace que su interacción con el ADN (de carga intrínseca negativa por la presencia de los grupos fosfato) se debilite. Esto logra que la cromatina en esa zona quede menos compacta y los genes sean accesibles para el complejo de la ARN Polimerasa, permitiendo su expresión. Las HDACs logran el efecto contrario: catalizan la desacetilación de los residuos de lisina acetilados de las histonas, aumentando su carga positiva y con ella su interacción con el ADN. El resultado es una cromatina más compacta cuyos genes no son accesibles, por lo que la expresión está inhibida. Considerando esto, se ha planteado la utilización de inhibidores de HDACs (HDACis) para la curación de la infección por VIH 15 . Figura 2. Regulación de la expresión del VIH13 Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 10 de 24 Las HDACs se dividen en 4 clases (I, II, III y IV), y dentro de cada clase existen varios subtipos. Por el momento las únicas que se cree están implicadas en la regulación de la transcripción del VIH integrado son las HDACs 1, 2 y 3 (todas de clase I y dependientes de zinc para funcionar) 14 . Por ello, a la hora de buscar LRAs, se prefieren inhibidores de HDACs que sean más selectivos para esta clase, para minimizar la posibilidad de efectos adversos. Concretamente, en un estudio de inhibición selectiva de las HDAC se observó que la inhibición de las HDAC 1 o 2 solas no provoca una reversión de la latencia, mientras que la inhibición de la HDAC 3 parece le verdadera responsable de la reversión 16 . Los HDACis son el grupo de LRAs más estudiado, y se dividen en 4 familias principales en función de su estructura: ácidos alifáticos de cadena corta, ácidos hidroxámicos, benzamidas, y tetrapéptidos cíclicos y depsipéptidos. En general, su estructura consiste en una región llamada “cap”, que reconoce y se une a la superficie de la enzima, una cadena hidrofóbica o linker (de 5-6 carbonos) y el grupo funcional o cabeza, el cual puede actuar como quelante de Zn 2+ o bien unirse de forma covalente al centro activo de la HDAC 17 . Dentro de los ácidos alifáticos de cadena corta destaca el ácido valproico (VPA). Éste es un fármaco previamente aprobado por la FDA y la AEMPS para el tratamiento de la epilepsia, y que se ha visto que puede además inhibir las HDACs de clase I y II. El VPA demostró revertir la latencia tanto en modelos de líneas celulares (U1 y J-LAT) como en linfocitos Th reservorio obtenidos de pacientes infectados en tratamiento con TAR: el tratamiento de estas células con VPA inducía la expansión del virus en el cultivo, sin llegar a producir la activación celular 10 . En un primer ensayo clínico el VPA se probó en 4 pacientes en tratamiento con TAR y con viremia indetectable desde hacía 2 años, y los resultados fueron prometedores: tras intensificar la TAR con enfurtivida (fármaco inhibidor de la fusión) y posteriormente añadir dos dosis diarias de 500-750mg de VPA al tratamiento durante 3 meses, se observó una disminución del número de células reservorio en todos los pacientes (significativa en 3 de los 4) 18 . Sin embargo, unos ensayos observacionales llevados a cabo Figura 3. HDACis17 Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 11 de 24 más tarde no llegaron a la misma conclusión. En ellos se estudió la evolución de los reservorios en pacientes en tratamiento con TAR que además estaban tomando VPA por otros motivos (neurológicos o psiquiátricos), y los resultados indicaron que en no existía una reducción importante en el reservorio 19, 20 . Posteriormente se realizó otro ensayo empleando métodos y dosis parecidas al primero (1000 mg/día 16 semanas) pero con 11 pacientes y sin intensificar la TAR, y el VPA sólo logró reducir de forma significativa el reservorio en 4 de estos 11 pacientes 21 . Otro ensayo clínico incluyó 56 pacientes que se asignaron a 2 grupos aleatorizados: uno recibió TAR con VPA (2 dosis diarias de 500mg) durante 16 semanas seguido por sólo TAR durante 32 semanas, y el otro lo contrario (sólo TAR durante 16 semanas seguida de TAR con VPA durante 32). En ninguno de los 2 grupos se apreció una reducción significativa en el reservorio, y tampoco se apreciaron grandes diferencias pese a que el segundo grupo había recibido un tratamiento con VPA más prolongado 22 . A raíz de estos fracasos, el VPA ya no se está incluyendo en los ensayos clínicos para la búsqueda de LRAs 23 , y ésta se está centrando en compuestos más selectivos para las HDAC 1, 2 y 3. En el grupo de los ácidos hidroxámicos se han investigado varios compuestos, y entre ellos los más importantes que han entrado en ensayos clínicos son el vorinostat (VOR, también llamado ácido hidroxámico-suberoilanilida o SAHA) y el panobinostat. El VOR es un fármaco ya aprobado por la FDA para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T refractario (Zolinza™) 23 , y que ha demostrado ser un inhibidor más selectivo de las HDAC de clase I y más potente que el VPA 24 . Se vio que este compuesto era capaz de revertir la latencia e inducir la transcripción del VIH en líneas celulares, cultivos primarios de linfocitos T y en linfocitos CD4+ reservorio de pacientes infectados en tratamiento con TAR 17 . Más allá de esto, el VOR demostró inducir la salida de virus de los reservorios en un estudio realizado en 2009, donde se determinó la producción de antígeno p24 en el sobrenadante tras el tratamiento con el fármaco de cultivos de linfocitos Th en reposo de pacientes infectados en TAR 25 . En un primer ensayo clínico publicado en 2012, el VOR se probó primero en los linfocitos Th en reposo obtenidos de 16 pacientes (ensayo ex vivo) y, tras esto, se administró vía oral a 8 de los 11 pacientes en los cuales el ensayo ex vivo había dado resultado: una dosis inicial de 200 mg (para evaluar la tolerabilidad), seguida de una dosis de 400 mg (para evaluar la farmacocinética y la acetilación de las histonas), y finalmente de una segunda dosis de 400mg, todas ellas a una distancia entre sí de 4 o más semanas. Tras esto se extrajeron los linfocitos Th en reposo en el período que correspondía a la máxima concentración de VOR en sangre. En 7 pacientes hubo un aumento significativo del CA usRNAm, demostrando que una Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 12 de 24 sola dosis de 400mg de VOR era capaz de revertir la latencia in vivo 26 . En otro ensayo clínico que incluía 20 pacientes, en el cual se administró una dosis de 400mg de VOR al día durante 14 días, se registró un aumento importante del CA usRNAm ya a las 8 horas de la primera dosis, que aumentaba progresivamente con las dosis siguientes y se mantenía elevado hasta 70 días después de la última dosis 27 . Sin embargo, se observó que existía bastante variabilidad interindividual en este aumento: en la mitad de los pacientes, había un primer aumento de usRNA y hacia los 1-3 días los niveles caían pese al tratamiento para volver a aumentar nuevamente un tiempo después. Además, en algunos pacientes la producción de ARNm vírico en las células seguía aumentando incluso después de terminar el tratamiento con VOR. Estas diferencias entre individuos fueron razonadas en un estudio posterior mediante un modelo matemático denominado “modelo de activación retardada de múltiples etapas”. Este modelo considera que normalmente, en respuesta a una exposición inicial a VOR, una célula infectada en estado latente produce una pequeña cantidad de ARNm vírico. Sin embargo, la célula no dispone de los mecanismos moleculares para mantener un nivel transcripción de VIH importante, por lo que entra en una especie de estado de espera en el cual apenas hay producción de ARNm vírico y en el cual se producen una serie de cambios (entre ellos el aumento de factores de transcripción de la célula implicados en la expresión de los genes de VIH) que finalmente le permiten alcanzar un estado de transcripción activa del VIH. La caída inicial en la producción de CA usRNAm medido correspondería a esa etapa de espera, y el aumento ya en ausencia de VOR se explicaría por el hecho de que estas modificaciones han inducido cambios profundos a largo plazo en la transcripción celular. El tiempo de espera sería distinto entre individuos, puesto que los patrones de expresión pueden diferir y no todas las células infectadas parten del mismo grado de latencia 28 . En ninguno de los dos ensayos clínicos mencionados del VOR se observó un aumento del RNA vírico plasmático, y tampoco una reducción del reservorio (medido entre otros parámetros por el CA DNA del VIH) ni un aumento de la inmunidad adaptativa frente al VIH (linfocitos Th y Tc específicos frente a gag), que también se esperaría como respuesta a un aumento de la producción del virus. Esto parece indicar que, aunque active la transcripción, el VOR no llega a activar la producción de virus por parte de los reservorios in vivo 26, 27 . Este no es el único aspecto negativo de este fármaco, ya que según un estudio, el VOR podría aumentar la susceptibilidad de linfocitos Th sanos a ser infectados. Parece ser que el fármaco no afecta a la fusión del VIH con las células pero sí acelera todos los procesos del ciclo que ocurren una vez que el virus está dentro de la misma. En un paciente que recibe VOR como Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 13 de 24 tratamiento además de la TAR, este mecanismo no debería suponer un problema ya que los fármacos antirretrovirales impedirían que los virus que salen de los reservorios infecten nuevos linfocitos, pero sí podría ser importante en zonas en las que se acumulan reservorios y donde los fármacos antirretrovirales no llegan tan fácilmente. Como este efecto se asocia a la inhibición de ciertas HDAC de clase II, se cree otros HDACis más selectivos hacia las de clase I no presentan este riesgo 29 . El panobinostat, aprobado en el 2015 para el tratamiento del mieloma reincidente o refractario (Farydak®) 23 , también ha demostrado inducir la expresión en modelos de líneas celulares (ACH2, U1) y en cultivos primarios de linfocitos Th, con mayor potencia que otros HDACis como el VOR, y también ha entrado en ensayos clínicos 10 . En un ensayo clínico realizado recientemente por el Hospital Universitario de Aarhus (Dinamarca), en el cual participaron 15 individuos avirémicos en TAR, se administró una dosis oral de 20mg de panobinostat 3 veces por semana durante 8 semanas. Se observó que el panobinostat era bien tolerado e inducía un aumento importante en la producción de CA usRNA y RNA plasmático y, aunque transitoria y sólo en algunos pacientes, también una disminución del DNA vírico total. Sin embargo tampoco se apreció que el fármaco por sí solo lograra reducir el tamaño del reservorio in vivo 30 . En el grupo de las benzamidas destaca el entinostat, el cual ha demostrado inducir la expresión de VIH en modelos de líneas celulares y en modelos de linfocitos T CD4+ primarios 10 . Sin embargo aún no ha entrado en ensayos clínicos 23 . Como tetrapéptidos cíclicos y depsipéptidos destaca la romidepsina (RMD), que al igual que el vorinostat y el panobinostat es un fármaco ya aprobado como antineoplásico: desde 2009 está aprobado por la FDA para el tratamiento del linfoma refractario de células T (Istodax®) 23 . Se trata de un compuesto natural producido por Chromobacterium violaceum, que debe administrarse por vía parenteral puesto que es degradado por vía oral. En un estudio realizado con modelos celulares de linfocitos Th obtenidos en el laboratorio, así como linfocitos Th de memoria obtenidos de individuos infectados en TAR, la RMD demostró inducir la transcripción de los provirus así como la liberación de viriones por parte de dichas células (esto último se ha interpretado a raíz del aumento del RNA vírico extracelular tras el tratamiento con RMD). Además, en comparación con otros HDACis como el VOR, que también ensayaron en este estudio, demostró tener mayor potencia y mayor selectividad por las HDAC de clase I, y presentó un efecto claro a concentraciones bastante por debajo a las usadas para su indicación como antineoplásico 31 . En un ensayo clínico con 6 pacientes en Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 14 de 24 TAR, la RMD se administró a una dosis intravenosa de 5mg/m 2 , muy inferior a la empleada habitualmente en el cáncer (de 14 mg/m 2 ), durante 4h una vez a la semana por 3 semanas. Se observó un aumento considerable del CA usRNAm a lo largo del tratamiento, que a diferencia del inducido por el VOR era continuo y no decrecía hacia las 48h. Además, se observó un aumento del RNA vírico plasmático en 5 de los 6 pacientes, lo que indicaba la salida de viriones de las células reservorio. Sin embargo, al igual que en los otros HDACis no se observó una reducción clara del reservorio durante el tratamiento 32 . En otro estudio, la RMD se ha asociado a una disminución de la respuesta citotóxica de los linfocitos T CD8+. Esto tal vez podría explicar que aunque se produzca virus no se reduzca el reservorio 33 . 4.3. Inhibidores de las HMTs Además de la acetilación/desacetilación, la metilación de las histonas por parte de las histona metil transferasas (HMTs) es otro mecanismo que regula su unión al DNA. Concretamente, la metilación de la histona H3 nivel de un residuo de lisina por parte de las HMT G9a, EZH2 y SUV39H1 se ha asociado a una inhibición de la transcripción. Como inhibidores de estas enzimas investigados como potenciales LRAs destacan el compuesto BIX01294 (inhibidor específico de la G9a y primero que demostró revertir la latencia del VIH), la cateocina (inhibidor específico de SUV39H1) y DZNep (3-deazaneplanocina A, un inhibidor de varios tipos de HMT). Todos ellos han demostrado inducir la producción de virus en líneas celulares y cultivos primarios de linfocitos T, y el BIX01294 y la cateocina también en linfocitos Th reservorio obtenidos de enfermos en TAR, pero aún no se han realizado ensayos clínicos 14 . 4.4. Activadores directos del P-TEFb e inhibidores de BET Una vez que la cromatina se encuentra accesible, la transcripción del genoma del VIH es llevada a cabo desde los extremos LTR por el complejo de la RNA Polimerasa II. Éste no puede avanzar en estado de latencia debido a la presencia de dos factores que bloquean la transcripción, el NELF y el DSIF. Por ello sólo se producen tránscritos de ARNm cortos y abortivos 5 . Cuando la célula se reactiva, se activan factores como el NF-kB que llevan a la descompactación de la cromatina en la zona donde se encuentra el provirus y activan la producción de la proteína viral Tat 7 . Ésta se une a una zona en horquilla al principio del ARNm viral llamada “elemento TAR” 1 , y una vez unida recluta el factor positivo de la elongación de la transcripción b o P-TEFb (heterodímero CDK9/ciclina 1, que en estado de reposo se encuentra secuestrado en el citoplasma por un complejo llamado 7SK RNP, Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 15 de 24 compuesto por 7SK RNA y proteínas como la HEXIM1), además de otras proteínas, conformando el llamado el complejo de súper elongación o SEC 7 . El P-TEFb cataliza la fosforilación de la RNA Polimerasa II y de los factores NELF y DSIF, lo que permite la elongación de la transcripción de forma que ésta resulte efectiva 5 . Los BET (bromodominios extraterminales) son una familia de proteínas nucleares que presentan 2 bromodominios muy conservados capaces de reconocer los residuos de lisina acetilados de las histonas, concretamente las H3 y H4. En esta familia se encuentran el BRD4 y el BRD2, los cuales se ha observado regulan negativamente la expresión de las proteínas virales. Normalmente el BRD4 se encuentra unido a la eucromatina y en respuesta a ciertas señales celulares recluta el P-TEFb (al cual se une mediante un dominio específico llamado PID o “P-TEFb interacting domain”) a promotores celulares y así facilita la expresión de genes, especialmente aquellos implicados en el avance del ciclo celular. Por este mismo mecanismo, el BRD4 podría ayudar a la expresión del VIH integrado en el genoma. Sin embargo, cuando en la célula infectada se produce la sobreexpresión del dominio PID, éste actúa como secuestrador del P-TEFb evitando que quede factor disponible para la unión a la proteína Tat, por lo que el BRD4 unido a la zona del promotor del VIH actúa como inhibidor la expresión del virus. El BRD2, por otro lado, ha demostrado inhibir la expresión del VIH de forma independiente a la Tat 7 , pero a día de hoy no se ha esclarecido si también interactúa con el P-TEFb (ya que carece del dominio PID) 34 . Como inhibidores de BET encontramos varias moléculas. JQ1 es un compuesto con estructura de tienotriazolodiazepina 35 inicialmente diseñado para el carcinoma de células escamosas, que es capaz de unirse a los bromodominios de los BET evitando que éstos reconozcan los residuos de lisina acetilados 7 . Su efecto inhibitorio afecta principalmente al BRD4 y ha demostrado revertir la latencia en varios modelos de líneas celulares (ACH-2, J-Lat), así como en linfocitos CD4+ en reposo de pacientes infectados en TAR (ha demostrado inducir la producción de virus en 1 de los 3 pacientes ensayados) 14 . Otros inhibidores como I-BET, I-BET151 y MS417, de estructura parecida a JQ1, han demostrado también activar la expresión del VIH en varios modelos celulares y cultivos primarios de linfocitos T CD4+ 36 . Recientemente se está ensayando un nuevo compuesto de estructura parecida al JQ1, el OTX015, que ha demostrado inducir la producción de ARNm Figura 4. Estructura del JQ114 Figura 5. Estructura del OTX01537 Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 16 de 24 y de virus en distintos modelos celulares de latencia así como en linfocitos reservorio obtenidos de pacientes en TAR, con mayor potencia que el JQ1 y baja toxicidad 37 . Además del mecanismo principal de inhibición del BRD4 (dependiente de Tat), JQ1 ha demostrado tener un mecanismo secundario independiente de Tat: liberar el P-TEFb de su complejo citoplasmático con el 7K RNP, y reclutarlo directamente al promotor del VIH para estimular la transcripción. Esto explicaría cómo JQ1 estimula inicialmente la expresión en las células latentes, cuando los niveles de Tat aún se encuentran por debajo del umbral considerado efectivo 38 , y por qué también se ha visto que revierte la latencia en líneas celulares que no expresan Tat (ej. A72) 36 . Algo parecido se ha visto en el caso de algunos HDACis, concretamente el VOR. Según un estudio del Peterlin laboratory, el VOR, además de modular la acetilación de las histonas, es capaz de liberar el P-TEFb del complejo 7K RNP y permitir que sea reclutado en el LTR 7 . Este hecho también se comentó en otro estudio, en el cual además no se pudo encontrar una correlación clara entre la reactivación del VIH por el VOR y el grado de acetilación de las histonas, sugiriendo que la liberación del P-TEFb sería el mecanismo principal implicado en el efecto como LRA de este grupo de fármacos 39 . Puesto que en una célula Th en reposo los niveles de P-TEFb suelen ser muy bajos, este mecanismo de acción descubierto recientemente ofrecería una respuesta a por qué tanto los inhibidores de BET como los HDACis tienen un efecto bastante escaso y variable en estas células 7 . 4.5. Agonistas de PKC Otro agente implicado en la expresión del VIH integrado en las células es el factor de transcripción NF-kB, que está presente en la mayoría de las células y, una vez liberado, regula positivamente la síntesis de múltiples proteínas, y también la expresión del VIH integrado. La forma activa del NF-kB (heterodímero p65/p50) se encuentra normalmente secuestrada en el citoplasma por su unión al inhibidor IkB. Para liberarla, el IkB debe ser fosforilado por quinasas específicas y posteriormente degradado por el proteasoma, dejando el NF-kB libre para desplazarse al núcleo y unirse a zonas específicas del ADN. La activación de la PKC conduce a la activación de la expresión del VIH latente debido a que ésta modula múltiples elementos regulatorios a nivel del promotor viral, mediante las vías de señalización del factor de transcripción NF-kB y también AP-1. Cuando la PKC se activa lleva a la fosforilación de varias proteínas, incluyendo el IkB. Por ello, usar moléculas que actúen como activadores de la PKC es otra posible forma de reactivar la latencia del VIH 13,14 . Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 17 de 24 En este grupo se han investigado inicialmente unos diterpenos llamados forbol-13- ésteres, entre los cuales destacan la prostratina y el DPP (12-desoxiforbol 13-fenilacetato) 14 , ambos procedentes de fuentes vegetales 40 . La prostratina, a diferencia de agonistas de PKC mitógenos como el PMA, no estimula la proliferación de células T y no induce la formación de tumores. Ha demostrado activar la expresión del VIH en líneas celulares y en linfocitos Th reservorio de individuos enfermos en TAR 14 , y además reduce la expresión de correceptores CCR5 y CXCR4, lo que contribuye a frenar la diseminación del virus 40 . Sin embargo, aumenta la expresión del marcador de activación CD69 y también de varias citoquinas, pudiendo tener efectos tóxicos. El DPP presenta un efecto parecido a la prostratina en reservorios del virus, y tampoco induce la proliferación celular, pero se ha relacionado con un aumento en la expresión de la citoquina TNF-α. En caso de realizar ensayos clínicos con estos dos compuestos, por tanto, sería necesario monitorizar cuidadosamente los niveles de citoquinas 14 . Además de los forbol-13-ésteres, existen otros diterpenos agonistas de la PKC, como los obtenidos de plantas del género Euphorbia. Entre ellos encontramos el ingenol y sus derivados 14 . El ingenol reactiva el VIH latente pero también induce la activación de los linfocitos T 41 . Por ello se han ensayado ésteres derivados del ingenol que presenten menor toxicidad. Uno de ellos, el ingenol B (ingenol-3-hexanoato), ha obtenido resultados prometedores en modelos de líneas celulares de linfocitos T (J-Lat), así como en linfocitos Th en reposo obtenidos de pacientes en TAR, además de reducir la expresión del receptor CD4 y los correceptores CXCR4 y CCR5. Sin embargo, también se ha asociado a un aumento en la producción de CD69, por lo que podría tener efectos secundarios importantes in vivo 40 . Entre otros diterpenos encontramos la gnidimacrina, un diterpeno natural que destaca porque, a diferencia de los compuestos mencionados anteriormente, ha demostrado una reducción significativa en el reservorio viral. En un ensayo ex vivo realizado sobre células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de pacientes en TAR (entre las cuales se encontraban linfocitos Th reservorio), la gnidimacrina provocó una reducción significativa de los reservorios virales (lo que se determinó mediante la reducción del CA DNA vírico total y de las células capaces de producir virus de forma inducida), sin llevar a la activación celular y a concentraciones muy bajas (del orden de pM) 14,42 . Figura 6. Estructuras de la prostratina y el DPP14 Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 18 de 24 Por último, recientemente se ha investigado la briostatina-1, un compuesto natural obtenido de la especie marina Bugula neritina, como posible LRA. Este fármaco, estudiado inicialmente como antineoplásico y como un potenciador de la memoria en el Alzheimer, ha demostrado tener un potente efecto agonista PKC y revertir la latencia del VIH tanto in vitro como ex vivo. Por el momento se ha realizado un ensayo clínico doble ciego con este fármaco, que involucraba 12 pacientes avirémicos en tratamiento con TAR. Los pacientes se dividieron en 3 grupos de 4 pacientes. En dos de los grupos se administró una única dosis de briostatina (10 o 20μg/m, puesto que este fármaco había demostrado tener cierta toxicidad) y en el tercer grupo se administró placebo. No se observaron diferencias en los niveles de CA usRNAm entre grupos y tampoco respecto al placebo, y tampoco en la actividad de la PKC. Esto posiblemente se relacione con el hecho de que la cantidad de briostatina en sangre era muy baja, según se observó al monitorizar las concentraciones plasmáticas 23 . Al igual que la RMD, la briostatina-1 parece tener un efecto negativo en la respuesta de linfocitos Tc 33 . 4.6. Otros tipos de LRAs Además de los LRAs mencionados se ha investigado el efecto de otros compuestos con mecanismos de acción diferentes que no permiten clasificarlos en ninguno de los grupos anteriores. Uno de los más investigados es el disulfiram, un fármaco usado durante más de 60 años para el tratamiento de la dependencia alcohólica (Antabus®) 23 que ha demostrado activar la expresión del VIH sin inducir la activación del linfocito T ni la liberación de citoquinas 14 . El mecanismo para esto parece ser la disminución de los niveles de PTEN, una fosfatasa que ayuda a finalizar la vía de señalización de PI3K/Akt. Al disminuir el PTEN se promueve el funcionamiento de esta vía 43 , y la Akt activada por ella lleva a la fosforilación, entre otras proteínas, del factor NF-kB, activando de esta manera la expresión del VIH 44 . En modelos primarios de linfocitos T obtenidos por la vía del Bcl-2, el disulfiram demostró activar la expresión y también la producción de viriones, pero esto último no se observó cuando las células tratadas fueron linfocitos Th en reposo obtenidos de pacientes infectados en TAR 45 . En un ensayo clínico se administraron 500mg de disulfiram diarios durante 14 días, y no se observaron ni un aumento Figura 7. Estructura del ingenol y el ingenol B40 Figura 8. Estructura de la gnidimacrina y la briostatina-114 Figura 9. Estructura del disulfiram14 Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 19 de 24 del RNA plasmático ni una reducción del reservorio 46 . Sin embargo, en otro ensayo los pacientes se dividieron 3 grupos destinados a recibir una de las posibles dosis de disulfiram (500, 1000 y 2000mg) a diario durante 3 días, se observó un aumento del CA usRNAm en todos los grupos y, aunque más modesto que en la romidepsina, también un aumento del ARNm plasmático en el grupo tratado con la dosis de 2000mg (lo que demuestra que a esta dosis hay producción de virus) 23 . En general, los LRAs estudiados presentan bastante variabilidad en su capacidad para inducir la producción de ARNm y de virus por parte de los linfocitos Th reservorio, observándose resultados prometedores en algunos estudios y una falta de efecto significativo en otros. Cabe destacar que los modelos de latencia obtenidos en el laboratorio, aunque algunos consistan en cultivos primarios de linfocitos Th reservorio, pueden no presentar exactamente el mismo comportamiento que los reservorios reales, puesto que la infección y la reversión a la latencia se han producido en un entorno que no es el organismo humano. Esto explicaría la discrepancia entre resultados obtenidos en estas células y los obtenidos en reservorios reales o bien in vivo 11 . Además, como se ha mencionado en el caso de los HDACis y los inhibidores de BET, la mayor o menor efectividad de algunos LRAs podría estar ligada a los niveles basales de P-TEFb en la célula, pues no todos los reservorios parten del mismo grado de latencia ni de la misma transcripción basal. A excepción de la gnidimacrina, ninguno de los fármacos anteriormente expuestos ha demostrado claramente reducir el reservorio viral in vitro, y como era de esperar tampoco en los pacientes en los que se han ensayado. Esto podría deberse a que, aunque los fármacos induzcan la salida de virus de los reservorios, la respuesta inmunitaria no sea lo suficientemente fuerte para lograr eliminarlos. Un estudio ex vivo realizado por el grupo de Siciliano plantea otra posibilidad: que el ARNm cuantificado como usRNAm en los ensayos de LRAs sea en realidad ARNm quimérico obtenido como consecuencia de la estimulación de un promotor celular. Según este estudio, la integración aleatoria del ADN del VIH en el genoma puede llevar a que éste quede integrado en una zona correspondiente a un gen celular que se exprese con frecuencia. El resultado es que, al transcribirse el gen, también se transcribe el genoma del VIH, obteniéndose un ARNm quimérico (el llamado “read-through mRNA”) que contiene las secuencias del VIH (entre ellas la gag) pero no está relacionado con una activación de la expresión del VIH sino con los mecanismos normales de expresión de la célula. Por ello, si para cuantificar el usRNAm sólo se recurre a cebadores específicos para la secuencia gag, sin otros cebadores que permitan distinguir entre ambos tipos de ARNm, se podría interpretar Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 20 de 24 erróneamente un aumento del ARNm quimérico como una inducción de la expresión del VIH. En este mismo estudio se comprobó el efecto ex vivo de varios LRAs ensayados anteriormente (VOR, panobinostat, romidepsina, disulfiram y briostatina-1) empleando para ello una técnica de RT-PCR mejorada que emplea cebadores adicionales para distinguir el ARNm quimérico del CA usRNAm, y el único fármaco que pareció tener algún efecto sobre la transcripción del VIH fue la briostatina-1. Los resultados de este estudio ponen en duda el efecto real de los LRA que han resultado prometedores en ensayos que han utilizado como prueba la cuantificación exclusiva de la secuencia gag 47 . Sin embargo, según un estudio realizado un tiempo después, el ARNm quimérico supondría sólo un pequeño porcentaje del CA RNA total con secuencia gag medido en los pacientes infectados en TAR, por lo que no existiría tal error 48 . En cualquier caso, lo que parece claro es que hasta la fecha ningún LRA ha tenido un efecto claro e importante sobre el reservorio viral cuando se ha utilizado de manera individual. Por ello, lo más probable es que el futuro de esta técnica esté en el empleo de combinaciones de LRAs que hayan demostrado tener un sinergismo en la activación del VIH. Las combinaciones de HDACis o de inhibidores de BET con agonistas de PKC son las que han demostrado un mayor sinergismo, debido a que los agonistas de PKC por su mecanismo aumentan entre otros factores el P-TEFb disponible para ser liberado por los HDACis o inhibidores de BET, lo que incrementa su efecto 49 . Además, las combinaciones de LRAs permitirán revertir la latencia de un mayor espectro de virus (teniendo en cuenta que se trata de un virus con mucha variabilidad y que puede integrarse en muchas zonas diferentes del genoma). 5. CONCLUSIONES A lo largo de estos años, la búsqueda de LRAs ha traído compuestos interesantes para la curación del VIH. De entre ellos el agonista de PKC briostatina-1 y los HDACis ácido valproico, vorinostat, panobinostat y romidepsina y el disulfiram se han probado en ensayos clínicos. Sin embargo, los ensayos con estos compuestos han dado resultados variables tanto in vitro como in vivo, y aunque algunos como el panobinostat o la romidepsina hayan demostrado provocar la salida de viriones de los reservorios de pacientes reales, ninguno ha demostrado lograr una reducción importante y mantenida de estas células, por lo que por ahora no resultan útiles para el fin último al cual se destinan que es la erradicación del virus del organismo. Posiblemente el uso de combinaciones sinérgicas de fármacos, como las de algunos agonistas de PKC con HDACis o inhibidores de BET, permitirá obtener resultados Es te tr ab aj o tie ne u na fi na lid ad d oc en te . L a Fa cu lta d de F ar m ac ia n o se h ac e re sp on sa bl e de la in fo rm ac ió n co nt en id a en e l m is m o. Página 21 de 24 más prometedores en este último aspecto. En caso de que el problema resida en la incapacidad del sistema inmunitario para eliminar los reservorios tras la inducción de la expresión por LRAs, una opción será reforzar esta eliminación mediante algún tipo de vacuna. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Sánchez-Merino V, B. Ferreira C, Yuste E. El virus de la inmunodeficiencia humana: Agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida. En: Gatell Artigas J.M., Clotet Sala B., Podzamczer Palter D. Miró Meda JM, Mallolas Masferrer J. Guía práctica del SIDA. Clínica, diagnóstico y tratamiento. 12ª Edición. Barcelona: ed. Antares; 2013. p. 1-17. 2. Del Rio C, W. Curran J. Epidemiología y prevención del SIDA y de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana. En: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R. Enfermedades infecciosas: síndrome de inmunodeficiencia adquirida. 7ª edición. Barcelona: ed. Elsevier España S.L., 2012. p. 17-45. 3. 1 in 7 people living with HIV in the EU/EEA are not aware of their HIV status [Internet]. 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