UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL TERAPIA GÉNICA IN UTERO PARA LA CORRECCIÓN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYÉTICAS HEREDITARIAS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María Eugenia Alonso Ferrero Bajo la dirección de los doctores: José Carlos Segovia Sanz   Juan A. Bueren Roncero      Madrid, 2010 ISBN: 978-84-693-3372-3 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TERAPIA GÉNICA IN UTERO PARA LA CORRECCIÓN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYÉTICAS HEREDITARIAS María Eugenia Alonso Ferrero TESIS DOCTORAL MADRID, 2009 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TERAPIA GÉNICA IN UTERO PARA LA CORRECCIÓN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYÉTICAS HEREDITARIAS Memoria presentada por MARÍA EUGENIA ALONSO FERRERO para optar al grado de doctor europeus por la Universidad Complutense de Madrid. Directores de tesis: Jose Carlos Segovia Sanz Juan A. Bueren Roncero María Eugenia Alonso Ferrero TESIS DOCTORAL MADRID, 2009 TERAPIA GÉNICA IN UTERO PARA LA CORRECCIÓN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYÉTICAS HEREDITARIAS Jose Carlos Segovia Sanz, Jefe de la Unidad de Diferenciación y Citometría de la División de Hematopoyesis y Terapia Génica del Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas y Juan A. Bueren Roncero, Jefe de la División de Hematopoyesis y Terapia Génica del Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas, certifican que la memoria adjunta, titulada “TERAPIA GÉNICA IN UTERO PARA LA CORRECCIÓN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYÉTICAS HEREDITARIAS” ha sido realizada por la licenciada María Eugenia Alonso Ferrero bajo la dirección de los que suscriben, y cumple las condiciones exigidas para optar al título de Doctor por la Universidad Complutense de Madrid. Jose Carlos Segovia Sanz Juan A. Bueren Roncero El presente trabajo de investigación ha sido realizado en la División de Hematopoyesis y Terapia Génica del CIEMAT y del centro CIBER de Enfermedades Raras del Instituto de Salud Carlos III y con la colaboración del Proyecto CONSERT del programa de Salud de la Unión Europea, de la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología y de la Fundación Marcelino Botín para la transferencia de tecnología en el campo de la Terapia Génica. María Eugenia Alonso Ferrero ha disfrutado de una beca predoctoral y de un contrato de investigación concedidos por la Fundación Marcelino Botín. ABREVIATURAS ABREVIATURAS ADA-SCID Inmunodeficiencia severa combinada con deficiencia en adenosina d esaminasa (adenosine deaminase-deficient severe combined immunodeficiency). ADN Ácido desoxirribonucleico. ADNc ADN copia. AF Anemia de Fanconi. AF-D1 Anemia de Fanconi D1. ARN Ácido ribonucleico. ARNm ARN mensajero. ATCC Colección americana de líneas celulares (American Type Culture Collection). CFU Unidad formadora de colonias. CFU-GM Unidad formadora de colonias granulo-macrofágicas. CMH Células madre hematopoyéticas. CMV Citomegalovirus (Cytomegalovirus ). DEB Diepoxibutano. DMEM Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco. DPK Deficiencia en Piruvato Kinasa. EDTA Ácido etilendiaminotetraacético. EGFP Proteína verde fluorescente potenciada (enhanced green fluorescent protein). EICH Enfermedad injerto contra huésped. ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ). FANCA Gen humano de Anemia de Fanconi A. FANCC Gen humano de Anemia de Fanconi C. FBS Suero fetal bovino. FITC Isotiocianato de fluoresceína. h Horas. HLA Antígenos leucoc itarios humanos (Human leukocyte antigen). IRES Sitio interno de entrada al ribosoma (Internal ribosome entry site). IMDM Medio de cultivo Dulbecco modificado por Iscove. IP Yoduro de propidio. IUHCT Trasplante in utero de células hematopoyéticas (in utero hematopoietic cell transplantation) ABREVIATURAS IUHSCT Trasplante in utero de células madre hematopoyéticas (in utero hematopoietic stem cell transplantation). IUT Trasplante in utero (in utero transplantation). Lin- Células linaje negativas. LMPP Precursores primitivos linfo-mieloides (lymphoid-primed multipotent progenitors). LT-HSC Células madre hematopoyéticas con capacidad de autorrenovación a largo plazo (Long-term hematopoietic stem cells). LTRs Secuencias repetidas largas de los extremos (Long Terminal Repeats). LV Vectores lentivirales. Min Minutos. MMC Mitomicina C. MLV Virus de la leucemia murina (Murine Leukemia Virus). MO Médula ósea. MOI Multiplicidad de infección (Multiplicity of infection). nM Nanomolar. ORF Marco abierto de lectura (open reading frame). pb Pares de bases. PBS Solución salina tamponada con fosfato. PCR Reacción en cadena de la polimerasa. PE Ficoeritrina. PHA Fitohemaglutinina (Phytohaemagglutinin). pre Elementos reguladores post-transcripcionales (Post-transcriptional regulatory elements). Q-PCR PCR cuantitativa o a tiempo real. RN Retronectina. rpm Revoluciones por minuto. RV Vectores Gammaretrovirales. Seg Segundos. SP Sangre periférica. SRCs Células repobladoras de NOD/SCID. ST-HSC Células madre hematopoyéticas con capacidad de autorrenovación a corto plazo (short-term hematopoietic stem cells). VIH Virus de la inmunodeficiencia humana (Human immunodeficiency virus, HIV). ABREVIATURAS VSV-G Glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein G). X1-SCID Inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X. ÍNDICE I I. SUMMARY………………………………………………………………………………. 1 II. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………. 7 1. EL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO……………………………………………… …. 7 1.1. Descripción del sistema hematopoyético……………………………………….. 7 1.2. Ontogenia del sistema hematopoyético………………………………………… 12 2. TERAPIA GÉNICA DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO………………………… 15 2.1. Vectores utilizados en terapia génica…………………………………………… 16 2.2. Protocolos clínicos de terapia génica…………………………………………… 23 3. DIAGNÓSTICO PRENATAL DE ENFERMEDADES GENÉTICAS………………. 25 4. TERAPIA PRENATAL DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO…………………….. 27 4.1. Terapia celular……………………………………………………………………... 27 4.1.1. Fuentes de células utilizadas en terapia prenatal………………………. 27 4.1.2. Trasplante in utero de células hematopoyéticas (IUHCT)…………….. 30 4.2. Terapia génica ex vivo……………………………………………………………. 31 4.3. Terapia génica in vivo…………………………………………………………….. 33 4.4. Principales riesgos asociados a la terapia prenatal…………………………… 34 4.4.1. Riesgo fetal y materno…………………………………………………….. 34 4.4.2. Riesgos asociados a la terapia génica fetal…………………………….. 35 5. ENFERMEDADES GENÉTICAS QUE PUEDEN TRATARSE MEDIANTE TERAPIA PRENATAL……………………………………………………………………. 36 5.1. Experiencia clínica en trasplantes in utero (IUT)………………………………. 38 5.2. Anemia de Fanconi………………………………………………………………... 40 5.3. Deficiencia en Piruvato Kinasa Eritrocitaria…………………………………….. 42 6. INMUNIDAD PRENATAL……………………………………………………………... 43 III. OBJETIVOS…………………………………………………………………………… 47 IV. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………… 48 1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN………………………………………………. 48 2. VECTORES DE TRANSFERENCIA GÉNICA……………………………………… 49 2.1. Vectores gamma-retrovirales…………………………………………………….. 49 2.1.1. Generación de líneas productoras y sobrenadantes retrovirales utilizando la línea celular empaquetadora Phoenix-Eco………………………. 49 2.1.2. Titulación de sobrenadantes gamma-retrovirales.……………………... 51 2.2. Vectores lentivirales……………………………………… ………………………. 51 2.2.1. Generación de sobrenadantes lentivirales………………………………. 51 2.2.2. Titulación de sobrenadantes lentivirales………………………………… 54 II 3. PURIFICACIÓN DE SUBPOBLACIONES HEMATOPOYÉTICAS……………….. 55 3.1. Purificación de subpoblaciones hematopoyéticas de médula ósea………….. 55 3.2. Purificación de subpoblaciones hematopoyéticas de hígado fetal…………… 56 4. INFECCIÓN IN VITRO DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS CON VECTORES VIRALES……………………………………………………………………. 57 4.1. Transducción de progenitores hematopoyéticos con vectores gamma-retrovirales……………………………………………………………………... 57 4.2. Transducción de progenitores hematopoyéticos con vectores lentivirales…. 58 5. ENSAYOS CLONOGÉNICOS………………………………………………………... 59 6. TRASPLANTE IN UTERO…………………………………………………………….. 60 7. TRASPLANTE SINGÉNICO EN RATONES ADULTOS IRRADIADOS LETALMENTE……………………………………………………………………………… 61 8. GENOTIPADO DE RATONES BRCA2…………………………………………….… 61 9. ANÁLISIS HISTOLÓGICO…………………………………………………………….. 62 9.1. Descalcificación de ratones recién nacidos……………………………………... 62 9.2. Estudio histológico de neonatos para la evaluación de EICH………………… 63 10. ANÁLISIS HEMATOLÓGICOS……………………………………………………… 63 11. ANÁLISIS DE QUIMERISMO………………………………………………………... 64 11.1. Citometría de flujo………………………………………………………………… 64 11.2. Q-PCR……………………………………………………………………………… 65 12. ESTIMACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL TRANSGEN POR Q-PCR…... 65 13. CUANTIFICACIÓN DEL PORCENTAJE DE VARIACIÓN DE POBLACIONES ERITROIDES………………………………………………………………………………. 66 14. ESTUDIOS DE RESPUESTA INMUNE……………………………………………. 67 14.1. Reinmunización de ratones trasplantados in utero…………………………… 67 14.2. Respuesta humoral frente a EGFP……………………………………………... 67 14.3. Respuesta celular frente a EGFP………………………………………………. 68 14.3.1. Ensayo de proliferación…………………………………………………... 68 14.3.2. Detección de INF -gamma………………………………………………… 69 15. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS………………………………………………………….. 69 V. RESULTADOS…………………………………………………………………………. 70 1. APR OXIMACIONES DE TERAPIA CELULAR MEDIANTE TRASPLANTE IN UTERO DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS ALOGÉNICAS………………………. 70 III 2. OPTIMIZACIÓN DEL MARCADO GENÉTICO DE LA HEMATOPOYESIS MEDIANTE TRASPLANTE IN UTERO DE CÉLULAS DE HÍGADO FETAL TRANSDUCIDAS CON VECTORES LENTIVIRALES………………………………. 73 2.1. Trasplante in utero de células hematopoyéticas de hígado fetal utilizando protocolos estándar de transducción in vitro……………………………………..… 75 2.2. Optimización de las condiciones de transducción de las células hematopoyéticas de hígado fetal con vectores lentivirales……………………….. 76 2.3. Estudios preliminares de transplante in utero de progenitores hematopoyéticos de hígado fetal transducidos en condiciones de mínima manipulación…………………………………………………………………………… 79 2.4. Transplante de progenitores hematopoyéticos de hígado fetal transducidos en condiciones optimizadas…………………………………………………………... 83 2.5. Estudios de respuesta inmune en ratones trasplantados in utero con células marcadas genéticamente……………………………………………………. 96 3. TERAPIA PRENATAL EN MODELOS MURINOS DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS 103 3.1. Terapia celular en un modelo de ratón de Anemia de Fanconi (AF -D1)…… 103 3.2. Modelo de terapia génica ex vivo en ratones deficientes en Piruvato Kinasa Eritrocitaria…………………………………………………………………….. 105 VI. DISCUSIÓN………………………………………………………………………...… 112 1. EL TRASPLANTE IN UTERO DE POBLACIONES ENRIQUECIDAS EN PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS ALOGÉNICOS PUEDE INDUCIR ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED…………………………………….. 112 2. EL TRASPLANTE IN UTERO DE PROGENITORES DE HÍGADO FETAL SINGÉNICO CORREGIDOS GENÉTICAMENTE COMO ALTERNATIVA AL TRASPLANTE PRENATAL DE CÉLULAS ALOGÉNICAS………………………….. 115 2.1. Las células Lin- de hígado fetal se transducen con elevada eficiencia utilizando vectores lentivirales durante periodos muy cortos de infección y bajas multiplicidades de infección……………………………………………………. 117 2.2. Las células Lin- de hígado fetal transducidas con vectores lentivirales durante tiempos cortos de infección mantienen su capacidad de injerto hematopoyético a largo plazo tras trasplante in utero……………………………... 118 2.3. Los ratones trasplantados in utero con células transducidas son capaces de generar una respuesta inmune frente a EGFP…………………………………. 120 IV 3. EL TRASPLANTE IN UTERO DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS COMO ALTERNATIVA AL TRASPLANTE POSTNATAL EN MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD……………………………………………………...… 123 3.1. Los progenitores hematopoyéticos sanos trasplantados in utero en ratones AF -D1 pueden desarrollar ventaja proliferativa frente a la hematopoyesis endógena……………………………………………………………………………….. 123 3.2. Los progenitores hematopoyéticos de ratones DPK transducidos con vectores retrovirales que portan el gen corrector y trasplantados in utero restauran parcialmente el fenotipo anémico………………………………………... 125 4. CONSIDERACIONES ÚLTIMAS……………………………………………………. 126 VII. CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 128 VIII. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………….. 130 IX. ANEXO………………………………………………………………………………... 154 SUMMARY SUMMARY 1 Allogeneic bone marrow transplantation in adult recipients is frecuently used for the treatment of a wide range of hematopoietic disorders (Flake, 2004) . This kind of transplant requires a compatible donor and a myeloablative or submyeloablative conditioning to fa cilitate the engraftment of the exogenous healthy cells. Major complications of this therapy are graft versus host disease (GVHD) and graft rejection, that compromise the success of the treatment and the survival of the patient (Surbek et al., 2008). In some inherited diseases, the allogeneic transplantation of hematopoietic cells after birth is not effective because the pathological manife stations of the disease have already occurred during fetal development (Waddington et al., 2005) (Coutelle et al., 1995) . Improvements of molecular biology techniques and the possibili ty of collecting biopsies during the early stages of fetal development, such as chorionic villus samples obtained in the first trimester of gestation, facilitates an early prenatal diagnosis of the disease (Alfirevic y von Dadelszen, 2003) . These technical improvements permit to treat t he fetus during the theoretical window of opportunity (between the last weeks of the first trimester and the second trimester in humans), which confers advantage in the receptivity of the graft and specific tolerance induction to exogenous cells (Hayashi y Flake, 2001) . Therefore, in utero hematopoietic cell transplantation (IUHCT) might avoid many of the problems of postnatal therapy, because the early gestatio nal immune system undergoes a process of self -education that could facilitate the engraftment of allogeneic or genetically corrected autologous cells in the developing fetus without the need of myeloablation (Flake, 2004) (Muench, 2005). Most IUHCT approaches have been conducted with allogeneic hematopoietic stem cells. Prenatal transplants in animal models, including mice, are numberless a nd there have been more than 50 protocols performed in humans, obtaining real success only in Xl-SCID immunodeficiencies (Muench, 2005). Recently, evidences of the presence of an immune barrier in mice transplanted in utero with allogeneic hematopoietic cells has been reported (Peranteau et al., 2007) . In that study, the percentages of quimerism in fetal mice transplanted with allogeneic cells were lower than in mice transplanted with syngeneic ce lls. Additionally, none of the mice transplanted with allogeneic cells maintained the quimerism beyond 30 days after birth. With the aim of improving the success of IUHCT for the treatment of inherited disorders, we injected allogeneic hematopoietic graft s enriched in hematopoietic progenitors in 14.5 days old fetuses. When we trasplanted purified Lin -Sca1+ cells we SUMMARY 2 observed a decrease in mice survival, as well as in the engraftment of the animals, which was coincident with previous reports using non-purified grafts. Moreover, 10% of born mice were smaller than their littermates, showed darker skin and died between seven to ten days after birth. These mice presented intradermic infiltrations of white blood cells and lymphocyte infiltrations in dermis and ep idermis, indicating the generation of graft versus host disease (GVDH) in these animals. This phenotype was coincident with that described in adult recipients with acute GVDH (Heymer, 2002). The principal sources for hematopoietic transplantation in humans are adult bone marrow, G-CSF mobilized peripheral blood and also umbilical cord blood. For IUHCT, fetal liver HSCs might constitute a good alternative to these HSCs sources, because in that case the recipient and the hematopoietic graft would have the same developmental age (Muench, 2005). Thus, the use of autologous genetically corrected fetal liver cells would be an option that should be investigated i n IUHCT approaches. Recent studies have shown that fetal liver hematopoietic stem cells (HSCs) are proliferating more actively compared to adult bone marrow HSCs (Bowie et al., 2006) (Nygren et al., 2006) and have a different regulation by transcription factors (Kim et al., 2007). These differences may imply the necessity of optimizing the conditions for the in vitro manipulation and genetic correction of FL -HSCs. In addition, differences in surface markers (Kim et al., 2005) could confer fetal li ver HSCs engraftment and homing advantages over adult HSCs after IUHCT. Since lentiviral vectors can transduce non dividing cells (Naldini et al., 1996) (Sutton et al., 1998) , a prestimulation period is unnecessary to transduce HSCs with these vectors. This observation together with the inherent features of fetal liver HSCs, would permit to shorten the transduction period of these samples with lentiviral vectors. With the aim of improving the efficiency of transduction of fetal liver HSCs, we tested different combinations of cytokines in plates pretreated or not with the fibronectin fragment CH-296 (retronectin) using short transduction periods (3 or 6 hours ) and low multiplicities of infection (MOI 5 or 10). The highest percentages of transduction were reached with MOIs of 10 pfu/cell after 6 hours of infection in plates pretre ated with retronectin. The total number of progenitors was increased when retronectin was included during the infection process , supporting previously reported studies about the enhanced ex vivo gene transfer and inhibition of apoptosis in CD34+ cells transduced in presence of ret ronectin (Donahue et al., 2001) . Additionally, the combination of mSCF, SUMMARY 3 Flt3 and hTPO was the most efficient to increase the transduction efficiency and survival of fetal liver hematopoietic progenitors. This combination has been widely used for the transduction and culture of cord blood progenitors (Li et al ., 2006) (Lam et al., 2001). Since it has been reported that mSCF y hTPO promote fetal liver HSCs survival and expansion (Matsunaga et al., 1998) (Sitnicka et al., 1996 ) (Yagi et al., 1999) as well as HSCs self -renewal in culture (Miller y Eaves, 1997) (Albella et al., 1999) , we tested whether hIL11 could also favour fetal liver growth and transduction. Our results were consistent with those reported by Bowie et al (2007) showing that hIL11 has an inhibitory effect in self-renewal of fetal liver HSCs. Previous data obtaine d in our laboratory showed a long -term and m ultilineage engraftment of retrovirally transduced bone marrow transplanted in utero in syngeneic mice (Rio et al., 2005). Evidences of in utero engraftment of allogeneic cells have been reported in different animal models and also in humans (Flake, 2004) (Merianos et al., 2008a). However, recent studies have shown failures of lon g-term engraftment after IUHCT of allogeneic grafts in m ice (Peranteau et al., 2007) suggesting an immuno - competent status of the fetus (Merianos et al., 2008b). The use of autologous corrected cells could avoid rejection problems associated to the transplantation of allogeneic cells. Moreover, animal models of ex -vivo gene therapy would prevent the direct injection of the vector in the recipient avoiding the risks of gene transfer to the germ-line and would reduce the risks of immunoreaction to the transgen e (Bigger et al., 2006) (Waddington et al., 2005). Immunoresponse to transgenes expres sed in cells transplanted into adult animals has been previously described (Morris et al., 2004) (Stripecke et al., 1999) . EGFP, EYFP (Morris et al., 2004) , β-galactosidase (Izembart et al., 1999) and neomycin phosphotranspherase (neo) (Heim et al., 2000) are known immunogens, but until now there are no repor ts about immunoreactivity to xenogeneic proteins expressed in cells transplanted in utero. In our experiments we have observe d a decrease in the percentage of chimeric mice when we transplanted in utero fetal liver progenitors transduced with EGFP LVs . When we analyzed the immunoreactivity against EGFP, 61% of the animals showed anti-EGFP antibodies in serum and 33 % of analyzed mice showed a cellular response against the xenogeneic protein. A group of animals previously transplanted in utero were re -immunized by recombinant EGFP injection , 180 days after birth. Twenty percent of them sho wed secondary immunoresponse to SUMMARY 4 EGFP. None of them had EGFP + cells engrafted. On the other hand, other animals engrafted with EGFP + cells did not show antibodies or cellular response to EGFP at 5 months post-birth. All these data suggest for the first time that mice transplanted in utero with EGFP transduced hematopoietic progenitors can generate a complete and specific immunoresponse to EGFP. This reaction generates engraftment failure of the hematopoietic cells expressing EGFP. Significantly, some mice were able to develop tolerance to the exogenous protein after the injection , and maintain ed a long term engraftment. Tolerance to exogenous transgene products has been previous ly described in transplanted adult animals (Puig et al., 2002) (Morris et al., 2004) (Stripecke et al., 1999) , but as far as we know these are the first observations of tolerance to transgene products after IUT. Fanconi Anemia (FA) and Piruvate Kinase Deficiency (PKD) are two diseases in which prenatal therapy may constitute a therap eutic alternative to postnatal transplant (Muench, 2005) (Steiner y Gallagher, 2007) (Afriat et al., 1995) (D'Andrea y Grompe, 1997). With the aim of testing the efficiency of IUHCT in these two pathologies, we performed two different transplantation protocols of cell and gene therapy i n FA-D1 mice and PKD mice, respectively. FA-D1 mice have a hypomorphic mutation in exon 27 of the Brca2/FancD1 gene, and exhibit a proliferative defect in the HSCs, as well as chromosomal instability, hypersensitivity to DNA crosslinkers and cancer predi sposition (Navarro et al., 2006) (Cohn y D'Andrea, 2008) . Bone marrow progenitors from syngeneic healthy mice were transplanted in utero in wild type as well as in heterocygous and homozygous Brca2/FancD1 mice. All animals analyzed except one showed microquimerism . This mouse was homozygous for the mutation and showed a 99% of engraftment 60 days post-birth. This result suggests that syngeneic wild type hematopoietic progenitors present a proliferativ e advantage when transplanted in FA-D1 fetuses , facilitating the complete replacement of their endogenous defective hematopoiesis. The same observation was reported in adult non -irradiated FA-D1 animals transplanted with high numbers of wild type bone marr ow cells (Navarro et al., 2006) . Rio et al. also reported complete reconstitution of mild conditioned FA -D1 mice after injecting 5x10 5 Lin- cells from FA-D1 mice after genetic correction (Rio et al., 2008). SUMMARY 5 PKD is an autosomal recesive disorder with a wide rang e of pathological manifestations. Currently, there is no definitive treatment for the most severe PKD cases (Zaucha et al., 2001) (Richard et al., 2004) (Cazzola, 2005). While splenectomy can be clinically usef ul some PKD patients , in some cases, allogeneic hematopoietic transplantation is required (Tanphaichitr et al. , 2000) (Suvatte et al., 1998) . In these patients, transplantation of autologous hematopoietic pro genitors transduced with therapeutic vectors could be a good therapeutic alternative. Since PKD can be diagnosed during fetal development (Steiner y Gallagher, 2007) (Afriat et al., 1995) , these patients could be prenatally treated by means of ex vivo gene therapy . Thus, we tested this therap eutic strategy by using a mouse model of PKD. Hematopoietic progenitors were retrovirally transduced with vectors expressing the human erythroid piruvate kinase (RPK) and the EGFP reporter gene (Meza et al., 2007), and transplanted in to 14.5 days old PKD mouse fetuses. Engraftment and phenotype correction were evaluated until day 90 post -birth. Corrected EGFP + cells were detected by fl ow cytometry and Q -PCR. Forty percent of the animals showed corrected cells in peripheral blood, bone marrow and spleen. The percentage of quimerism analyzed by flow cytometry was 0.3% on average , and we could detect EGFP+ erythrocytes in peripheral blood. By Q-PCR the percentage of transduced engrafted ce lls in bone marrow was 0.8%. This low number of engrafted cells only allowed a partial correction in the phenotype of the animals (higher levels of erythrocytes, haemoglobin and hematrocrit) but not comple te reversion of the anemic phenotype. Erythrodifferentiation dynamics in peripheral blood and bone marrow were normalized after IUT , despite the low percentage of quimerism . In summary, low percentages of EGFP + engrafted cells in PKD mice transplanted in utero were enough to achieve a partial phenotyp ic correction, similar to what has been reported in irradiated adult animals engrafted with 8-10% of corrected cells (Meza et al., submmited). This obs ervation suggests that , in PKD , the IUT of genetically corrected cells is more efficient compared to transplantations conducted in adults. Overall, prenatal gene therapy could be a therapeutic alternative for the treatment of a number of diseases with ear ly pathological manifestations. We have studied different approaches of gene and cell therapy by means of in utero transplantation of hematopoietic progenitors. Transplantation of autologous corrected cells could be a useful solution to avoid problems asso ciated with allogeneic transplantation, but our SUMMARY 6 studies show that cells expressing exogenous transgenes can generate immunoresponses in recipient mice after in utero transplantation. Most probably, the transplantation of limited numbers of transduced cells and the use of weak promoters could overcome this problem. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 7 1. EL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO 1.1. DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO Se denomina hematopoyesis al proceso de producción y mantenimiento de to dos los tipos celulares presentes en la sangre, llevado a cabo por las células hematopoyéticas. El sistema hematopoyético es un tejido altamente jerarquizado en el que un número reducido de células, denominadas células madre, son capaces de dar lugar a todos los linajes hematopoyéticos presentes en la sangre (Figura 1). Figura 1. Esquema de la organización jerárquica del sistema hematopoyético. La homeostas is del sistema hematopoyético la realizan las células hematopoyéticas junto con factores de regulación y células estromales (fibroblastos, macrófagos, células endoteliales, mesenquimales y adipocitos) y acce sorias (linfocitos Célula madre Progenitor multipotente Progenitor comprometido Células maduras linfoidemieloide Cél. Dendrítica Eritrocitos Plaquetas Macrófagos Cél. B Cél. T Cél. NK Megacariocito Osteoclasto Neutrófilo BasófiloEosin ófilo Célula madre Progenitor multipotente Progenitor comprometido Células maduras linfoidemieloide Cél. Dendrítica Eritrocitos Plaquetas Macrófagos Cél. B Cél. T Cél. NK Megacariocito Osteoclasto Neutrófilo BasófiloEosin ófilo INTRODUCCIÓN 8 T y monocitos) presentes en los diferentes nichos hematopoyéticos. Todos ellos son capaces de influir en el automantenimiento, proliferación y diferenciación de las células madre y precursores hematopoyéticos comprometidos (Mayani et al., 1992). El tejido hematopoyético se compone de dos líneas principales de diferenciación: la línea mieloide (células eritroides, monocitos, granulocitos y megacariocit os) y la línea linfoide (linfocitos T, linfocitos B y células NK ). Además, hay que incluir todas aquellas células que, originadas en los órganos hematopoyéticos, se asientan en diversos tejidos, como pueden ser macrófagos tisulares y células dendríticas del tejido linfoide. El tejido hematopoyético se ha clasificado en distintos compartimentos celulares: - Células de morfología reconocible. Incluye células en maduración y células maduras funcionales. La mayor parte de estas células presenta baja o nula capacidad de proliferación y de automantenimiento. - Compartimento de progenitores comprometidos. Son células morfológicamente irreconocibles dirigidas a diferenciarse a un tipo celular concreto (Metcalf, 1989) , poseen una elevada capacidad proliferativa pero una baja capacidad de automantenimiento. Su frecuencia es aproximadamente de 1:1000 células de médula ósea. Mediante técnicas de cultivo in vitro se pueden detectar, cuantificar y caracterizar a los precursores hematopoyéticos compr ometidos según su capacidad para generar colonias de células maduras hematopoyéticas al ser estimulados por determinados factores de crecimiento hematopoyético (Martin et al., 1970) (Morrison et al., 1995) . Esta es la base d e los ensayos clonogénicos. De esta manera, la formación de colonias hematopoyéticas es una prueba indirecta de la presencia de determinados precursores hematopoyéticos, principalmente: • Precursores eritroides primitivos (BFU -E) y comprometidos (CFU -E). (Gregory y Eaves, 1978). • Precursores gránulo -macrofágicos (CFU-GM). (Bradley y Metcalf, 1966; Pluznik y Sachs, 1965). • Precursores megacariocíticos (CFU -Meg). (McLeod et al., 1976; Metcalf et al., 1975; Nakeff y Daniels -McQueen, 1976). INTRODUCCIÓN 9 - Compartimento de células madre. Son células morfológicamente irreconocibles, multipotentes, con elevada capacidad de automantenimiento y baja tasa de proliferación. La frecuencia de células madre hematopoyéticas (CMH) en la médula ósea adulta es baja: entre 1/10 4 y 1/10 5. En condiciones estacionarias, un pequeño porcentaje de estas células (<10%) se encuentra en fase de síntesis de ADN; el resto se encuentra en esta do quiescente (G 0). Existen ensayos in vitro que tratan de identificar esta población celular, como son los cultivos de células iniciadoras de cultivos a largo plazo (LTC-IC, Long term culture-iniciating cell) (Lemieux et al., 1995) , y las células formadoras de áreas de empedrado (CAFC, Cobblestone area forming cell) (Ploemacher et al., 1989). En un principio se asumió que la célula madre era la unidad formadora de colonias esplénicas en ratones irradiados y trasplantados con células hematopoyéticas (CFU -S). Actualmente, el ensayo que mejor define a una célula madre hematopoyética e s el ensayo de repoblación competitiva (ERC) (Harrison, 1980). Este ensayo tiene como fundamento la reconstitución hematopoyética a largo plazo de receptores trasplantados, previamente tratados con dosis altas de radiación. Los ratones son trasplantados con una población celular procedente de un donante singénico y otra población competidora diferenciable (ratón congénico). Si alguna de las poblaciones competidoras tiene un potencial de repoblación superior a la otra, en los receptores trasplantados predominarán las células procedentes de esa población (Harrison, 1980) (Harrison et al., 1993) (Szilvassy et al., 1990). Existen varios sistemas para diferenciar las dos poblaciones competidoras, pero el más utilizado se basa en el análisis del marcador panleucocitario Ly5 en sus variantes alélicos Ly5.1 y Ly5.2, que son fácilmente detectables por citometría de flujo mediante anticuerpos monoclonales específicos (Laterveer et al., 1995) (Varas et al., 1998) (Szilvassy et al., 1990). No se conoce ningún marcador restringido exclusivamente a las células madre hematopoyéticas, pero se ha descrito la expresión de algunas proteínas de membrana que pueden ser utilizadas como marcadores asociados a p rogenitores y a CMH. Recientemente se están haciendo grandes esfuerzos por conocer los distintos marcadores que definen las CMH en los diferentes estadíos del desarrollo (Tabla I). Aunque la expresión de las proteínas de membrana que definen las CMH no es universal durante la ontogenia del sistema hematopoyético (Ratajczak, 2008) , se ha demostrado ampliamente que, en un ratón adulto, los progenitores hematopoyéticos tienen capacidad de repoblación a largo plazo, se encuentran en la población de INTRODUCCIÓN 10 células que no expresan ma rcadores de linajes hematopoyéticos eritroides, monocíticos, granulocíticos y linfocíticos (Lin-), y que sí expresan los marcadores Ly6A (Stem-cell antigen 1, Sca1+), y cKit + (LSK). Esta población LSK comprende el 0,5% de la médula ósea (Morrison et al., 1995) . Tan sólo 100 células LSK son suficientes para repoblar a largo plazo un ratón en todos sus linajes linfohematopoyéticos (Jordan y Lemischka, 1990). Las células hematopoyéticas débilmente marcadas con Rhodamina 123 (Rho low) (Visser et al., 1984) y las que presentan baja capacidad para retener el marcador de ADN Hoechst 33342 (side-population, SP) (Bunting, 2002) (Goodell et al., 2005), corresponden a poblaciones con elevada capacidad de repoblación hematopoyética a largo plazo. Con estos y otros marcadores de superficie adicionales, se pueden distinguir tres subpoblaciones de células LSK: - Células madre hematopoyéticas con capacidad de autorrenovación a largo plazo (long-term hematopoietic stem cells, LT-HSCs): Lin-, Sca1+, cKit+, Thy1.1 low, FLT3-, SP+, CD38+,CD150+, Rho low, N-cad+, TIE2 +, Endoglin + y MYC low (Kiel et al., 2005) (Wilson y Trumpp, 2006). - Células madre hematopoyéticas con capacidad de autorrenovación a corto plazo (short-term hematopoietic stem cells, ST-HSCs): Lin-, Sca1+, cKit+, Thy1.1low, FLT3-, CD34+ y CD11blow (Wilson y Trumpp, 2006) (Yang et al., 2005). - Células progenitoras hematopoyéticas comprometidas, precursores primitivos de linaje linfo -mieloide pero sin capacidad de diferenciación a linajes eritroide y megacariocítico. (lymphoid-primed multipotent progenitors; LMPPs): Lin -, Sca1 +, cKit+, CD34+ y FLT3+ (Adolfsson et al., 2005). INTRODUCCIÓN 11 Tabla I. Fenotipo de CMHs murinas y humanas en diferentes estadíos del desarrollo. Los marcadores indicados en cada caso se usan combinados para aislar poblaciones muy enriquecidas en CMHs. * algunas poblaciones de CMH muy primitivas se han descrito como CD34-CD38-Lin-. CMH Ratón Humano Hemangiblasto (oleada primitiva, saco vitelino) Flk-1 (Kdr)+ ND Pre-CMH (AGM) CD34+ CD41 + Sca-1- CD45- ND CMH (AGM, placenta) CD34+ CD45 + CD41+/- Sca-1 +/- CD34+ CMH (hígado fetal) Sca-1+ CD34 + CD45+ Mac1+ CXCR4+ CD34+ CD133 + CXCR4+ Lin- CMH (médula ósea) c-kit+ Thy1.1(CD90) lo Lin- Scahi (KTLS) CD34+CD38-Lin-b Sca-1+CD34+/- CD45+ Lin- CD34+ CD133 + CXCR4+ Lin- CD150+ CD48- CD244- (SLAM) Rh123low, Hoe3342low, PyroninYlow Rh123low, Hoe3342 low, PyroninY low ALDHhigh (e.g., ALDHhiCD133+Lin-) 5-FU resistant CD150+ CD48 - CD244- (SLAM) Aldehyde dehydrogenasehigh Side-population cells Fr25 (small cells) Lin - Side-population cells Para el estudio de las células madre hematopoyéticas human as se han utilizado ratones NOD/LtSz-scid/scid (Civin et al., 1996) (Kamel-Reid y Dick, 1988) (Larochelle et al., 1996) (McCune et al., 1988) . Estos ratones fueron generados a partir del retrocruzamiento durante 10 generaciones de la mutación scid con la ce pa NOD/Lt, produciéndose ratones inmunodeficientes, que carecen de células linfoides funcionales y de inmunoglobulinas (Shultz et al., 1995) . Utilizando este modelo se ha demostrado que la población de células hematopoyéticas humanas CD34 + tiene capacidad de reconstitución a largo plazo (Krause et al., 1996) (Yabe et al., 1996) (Civin et al., 1996) (Kamel-Reid y Dick, 1988) (Larochelle et al., 1996) (McCune et al., 1988) . Las células con capacidad de iniciar injerto multilinaje en ratones NOD/SCID se denominan células repobladoras de ratones SCID ( SCID repopulating cells, SRCs). Posteriorme nte se descubrió una fracción de células hematopoyéticas humanas, con fenotipo Lin -CD34- CD38-, con actividad SRC (Bhatia et al., 1998) , que resultaba ser precursora de la fracción de células CD34 +. La caracterización más detallada de la fracció n de células con capacidad SRC desveló la existencia de dos poblaciones: células con capacidad de repoblación a corto plazo (short term SRCs, ST-SRCs), y células con capacidad de repoblación a largo plazo. (long term SRCs, LT-SRCs) (Guenechea et al., 2001). En los últimos años, diferentes publicaciones han demostrado la capac idad de las células madre presentes en tejidos adultos, entre ellas las células madre hematopoyéticas, para dar lugar a tipos celulares de otros tejidos. Este proceso es conocido como plasticidad celular (Graf, 2002) (Herzog et al., 2003) (Krause, 2002) INTRODUCCIÓN 12 (Theise et al., 2003) . La incidencia de este fenómeno parece se r muy variable y ha sido demostrada en diferentes modelos animales. De este modo, se han observado fenómenos de generación de célu las de músculo esquelético (Gussoni et al., 1999) (Jackson et al., 1999) , músculo cardiaco (Jackson et al., 2001) , hepatocitos (Lagasse et al., 2000) (Petersen et al., 1999) (Theise et al., 2000) y tejido epitelial (Krause et al., 2001) a partir de células hematopoyéticas. Sin embargo, también son recientes los artículos que apuntan a que esa capacidad de transdiferenciación es el resultado de la fusión de células hematopoyéticas co n células diferenciadas de los tejidos diana (Quintana-Bustamante et al., 2006) (Terada et al., 2002) (Vassilopoulos et al., 2003) (Wagers et al., 2002) (Wang et al., 2003) (Ying et al., 2002). 1.2. ONTOGENIA DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO El sistema hematopoyético es uno de los primeros tejidos comp lejos que se desarrollan en mamíferos . El proceso de generación de células hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario es particularmente complejo ya que se produce en varios emplazamientos que están separados tanto espacial como temporalmente (Moore y Metcalf, 1970), característica que hace especialmente complicado describir la ontogenia de la hematopoyesis (Dzierzak y Speck, 2008). La hematopoyesis es un proceso muy conservado a lo largo de la evolución en vertebrados. Durante el desarrollo embrionario en mamíferos, la producción de células hematopoyéticas ocurre secuencialmente en el saco vitelino, un área que rodea la aorta dorsal denominada región aorta -gónada mesonefros (AGM) (Medvinsky y Dzierzak, 1996) (Sanchez et al., 1996) , en el hígado fetal y finalmente en la médula ósea (Dieterlen-Lievre et al., 1994) (Tavassoli, 1991) (figura 2). Recientemente la placenta ha sido reconocida como un sitio adicional que participa durante el mismo periodo que la región AGM y el hígado fetal (Orkin y Zon, 2008). Las propiedades de las CMH difieren en cada uno de los sitios descritos anteriormente, probablemente reflejando los diversos nichos que dan soporte a su expansión y/o diferenciación y a las características extrínsecas de las células madre INTRODUCCIÓN 13 en cada una de las etapas (Orkin y Zon, 2008) . Por ejemplo, las CMH de hígado fetal se encuentran en un estadío proliferativamente activo mientras que las de médula ósea adulta están, en su mayor parte, quiescentes, en organismos sanos (Bowie et al., 2006). Figura 2. Desarrollo de la hematopoyesis en el ratón. La hematopoyesis comienza en los islotes sanguíneos del saco vitelino y durante el des arrollo del feto prosigue en la región AGM, la placenta y el hígado fetal, finalizando en la médula ósea, donde tiene lugar también en adultos. En cada localización se favorece la producción de linajes sanguíneos específicos que van cambiando a lo largo del desarrollo. En las imágenes superiores, las diferentes estructuras hematopoyéticas se visualizan mediante marcaje con LacZ en ratones transgénicos. Abreviaturas: ECs, células endoteliales; RBCs, eritrocitos; LT -HSC, células madre hematopoyéticas con capa cidad de repoblación a largo plazo; ST -HSC, células madre hematopoyéticas con capacidad de repoblación a corto plazo; CMP, progenitor mieloide común; CLP, progenitor linfoide común; MEP, progenitor megacariocítico/eritroide; GMP, progenitor granulomacrofágico. [Modificado de (Orkin y Zon, 2008) ] INTRODUCCIÓN 14 El origen de las células madre hematopoyéticas se encuentra en el mesodermo ventral (Murry y Keller, 2008) . La primera oleada de producción de las mismas en mamíferos se da en el saco vitelino, se denomina “hematopoyesis primitiva” y su principal función es producir eritrocitos para facilitar la oxigenación de l os diferentes tejidos embrionarios en formación. Estos eritrocitos proceden, junto con las células vasculares, de un precursor de origen mesodérmico denominado hemangioblasto (Choi et al., 1998) (Fehling et al., 2003) (Huber et al., 2004) . Los hemangioblastos migran al saco vitelino donde se convierten en progenitores hematopoyéticos o endoteliales comprometidos y generan los islotes sanguíneos (Ferkowicz y Yoder, 2005) (Ueno y Weissman, 2006) . En estos islotes es donde se generan las células rojas cuya característica principal es la expresión de globinas embrionarias. El sistema hematopoyético primitivo es reemplazado rápidamente por la hematopoyesis de tipo adulto o “definitiva”, que en mamíferos comienza en la región AGM. Una hoja del mesodermo lateral migra hacia el centro del embrión, toca el endodermo y forma un único tubo aórtico. Los clusters de células hematopoyéticas aparecen posteriormente en la pared ventral de la aorta (Muller et al., 1994). En el embrión de ratón también existe actividad hematopoyética en las arterias umbilicales y en el alantoides (Inman y Downs, 2007) . Además se han encontrado células madre hematopoyéticas en la placenta del ratón (Gekas et al., 2005) (Ottersbach y Dzierzak, 2005) , coincidiendo con la aparición de las mismas en AGM y días más tarde . En la placenta, las CMH pueden generarse de novo o colonizar la placenta a través de la circulació n. Aun no se conoce bien la contribución relativa de las anteriores estructuras al pool final de células madre hematopoyéticas. El siguiente paso implica la colonización del hígado fetal, el timo, el bazo y finalmente la médula ósea (Orkin y Zon, 2008) (Dieterlen-Lievre et al., 1994) (Tavassoli, 1991). Se cree que en ninguno de estos sitios tiene lugar generación de células madre de novo, pero sí expansión de las poblaciones de células madre que migran a los otros órganos hematopoyéticos. Sin embargo, hasta el momento no se han podido visualizar directamente las células madre migrando de un nicho hematopoyético a otro y colonizándolos. Mientras que en individuos adultos de la especie hu mana la hematopoyesis se localiza fundamentalmente en la médula ósea, en ratón el bazo INTRODUCCIÓN 15 tiene también capacidad hematopoyética (Morrison et al., 1995) (Till y McCulloch, 1961). A pesar de la dificultad que conlleva el estudio de la hematopoyesis durant e el desarrollo del individuo, definir el origen embrionario de los linajes celulares específicos es importante para entender como se desarrollan los tejidos en un organismo adulto. 2. TERAPIA GÉNICA DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO La terapia génica consiste en la modificación genética de las células de un individuo mediante la introducción de vectores que expresan transgenes de interés con el objeto de tratar enfermedades hereditarias y adquiridas. Algunas enfermedades hematológicas son candidatas para ser tratadas mediante terapia génica. Clásicamente, las enfermedades monogénicas tales como la s inmunodeficiencias severa s combinada s (X1-SCID y ADA-SCID), las hemoglobinopatías, las enfermedades de almacenamiento enzimático y la s patologías que afectan a las células madre hematopoyéticas, como la Anemia de Fanconi, han sido tratadas con genes terapéuticos que suplen al gen defectuoso o mutado . En tales casos lo ideal sería una terapia génica de sustitución, en la cual la secuencia terapéutica reemplaza la mut ación del gen defectuoso . La terapia de sustitución aún está en desarrollo , por lo que el único método de terapia génica utilizado en la clínica se basa en la terapia génica de adición, en la cual se introduce en la célula el vector con el gen de interés, sin eliminar el gen defectuoso. En los últimos años ha habido un interés creciente en conferir a las CMH propiedades nuevas, una estrategia que ha sido aplicada principalmente para el tratamiento del cáncer (Vollweiler et al., 2003) . Las diferentes aproximaciones que se han aplicado incluyen la utilización de genes que inhiben la expresión de los genes tumorales, o bien genes suicidas que destruyen las células cancerosas en pres encia de una droga. Las CMH manipuladas genéticamente también se están utilizando para INTRODUCCIÓN 16 dar lugar a linfocitos con resistencia a la infección principalmente en protocolos para el tratamiento del VIH. Los protocolos de terapia génica se pueden llevar a cabo mediante dos estrategias fundamentales: in vivo y ex vivo. La terapia génica in vivo se realiza mediante la infusión directa de los vectores que portan los genes de interés en los tejidos del paciente. La terapia génica ex vivo consiste en el tratamiento in vitro de células previamente extraídas del paciente con vectores que portan el transgén terapéutico y su posterior reinfusión en el paciente. La mayor parte de los protocolos de terapia génica se llevan a cabo utilizando una estrategia de terapia génica ex vivo. De esta manera, la introducción del gen de interés en la célula diana es más eficiente y se evita la presencia del transgén en tejidos no deseados. El injerto y la proliferación clonal de un número relativamente pequeño de células hematopoyéticas normales puede mantener la hematopoyesis de un individuo durante toda su vida. Esta observación fundamenta el trasplante de médula ósea en pacientes con enfermedades hematológicas en ocasiones letales. Las células para este tipo de trasplante proceden, en la mayoría de los casos, de donantes HLA -compatibles, pero tras su infusión en el paciente estas células pueden ser rechazadas por el sistema inmune del mismo o bien puede generarse una enfermedad del injerto contra el huésped. Para evitar los problemas asociados a los trasplantes alogénicos de médula ósea, se puede aplicar la terapia génica a las enfermedades del sistema hematopoyético. Las principales dianas para la terapia génica ex vivo son las células madre y los progenitores hematopoyéticos del indi viduo enfermo que una vez corregidas con el vector terapéutico adecuado se reinfunden en el paciente. 2.1. VECTORES UTILIZADOS EN TERAPIA GÉNICA Los vectores más usados para transferencia génica pueden subdividirse en virales y no virales. Los vectores viral es (tabla II) pueden ser a su vez integrativos o no integrativos, dependiendo de si son capaces de introducirse en el genoma de la célula diana y así transmitirse a su descendencia. Los vectores no virales (p.e. liposomas, ADN desnudo) no son integrativos y se utilizan principalmente cuando no se requiere INTRODUCCIÓN 17 una expresión a largo plazo del transgén. En cualquier caso, es necesario elegir el vector adecuado para cada enfermedad a tratar. Tabla II. Vectores virales más utilizados en terapia génica. ESTADO TÍTULO TIPO DE CELULAR cfu/mL** INSERCIÓN En unidades de transcripción (> cerca de promotores) Mitosis/ Hasta 8 kb En unidades de transcripción Quiescentes (transgén) (> Intrones) Mitosis/ Hasta 10 kb