. 

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 
 

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS 
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I 

 

 
 
 

RIBOTOXINAS FÚNGICAS: DEL ANÁLISIS 
MOLECULAR DE SU MECANISMO CITOTÓXICO 

A SUS POSIBLES APLICACIONES CLÍNICAS. 
 
 

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR 

PRESENTADA POR 

 
Elisa Álvarez García 

 
 

Bajo la dirección de los doctores 
 

Álvaro Martínez del Pozo 
José G. Gavilanes 

 
  

Madrid, 2009 
 
 

• ISBN: 978-84-692-8405-6                                                                                                                                                  
 

                                                                                                                                                                   
                                                                                                              



UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS 

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I 
 
 

 
 
 

Ribotoxinas fúngicas: del análisis molecular 
de su mecanismo citotóxico a sus posibles 

aplicaciones clínicas 
 

Elisa Álvarez García 
 
 

TESIS DOCTORAL 
 

Directores:  
Dr. Álvaro Martínez del Pozo 

Dr. José G. Gavilanes 
 

Madrid, 2009 



ÍNDICE 

 

‐ Abreviaturas                   1 

‐ Introducción:                   3 

Ribotoxinas: análisis molecular de una familia de ribonucleasas fúngicas   

  Resumen                  5 

  Introducción                  6 

  Características estructurales              11 

  Paso a través de membranas              16 

  Propiedades enzimáticas                19 

  Interacción con el SRL y el ribosoma            25 

  Actividad de las ribotoxinas frente a células intactas         28 

  Las ribotoxinas como alérgenos              30 

  Inmunotoxinas                  32 

  Conclusiones y futuras perspectivas            34 

  Fungal ribotoxins: molecular dissection of a family of natural killers       36 

‐ Objetivos                    63 

‐ Resultados                    67 

  A. Relaciones estructura‐función en las ribotoxinas        69 

    A1. La tirosina 48, un residuo conservado de las ribotoxinas, está  
implicada en la degradación del RNA por parte de la α‐sarcina    69 

A2. Papel del carácter básico de la horquilla β amino‐terminal de la  
α‐sarcina en el reconocimiento del ribosoma y en la interacción  
con fosfolípidos              77 

A3. Influencia de algunos residues clave en la producción extracellular  
heteróloga de la ribonucleasa U2 en la levadura Pichia pastoris    87 

B. Implicación biológica de la acción de las ribotoxinas en la  
funcionalidad del ribosoma              103 

B1. La ruptura del lazo sarcina/ricina en el rRNA 23S inhibe la  
translocación dependiente de EF‐G          103 



 

C. Posibles aplicaciones clínicas de las ribotoxinas        127 

C1. Una variante de deleción del alérgeno Asp f 1 provoca una  
inflamación alérgica de las vías respiratorias atenuada en un  
modelo múrido de sensibilización          127 

C2. Lactococcus lactis como vehículo para la expression heteróloga  
de variants de ribotoxinas fúngicas con afinidad reducida por IgE   141 

‐ Discusión                    151 

  Funcionalidad de las ribotoxinas            153 

    Paso a través de membranas            153 
    Reconocimiento del ribosoma            155 
    Mecanismo catalítico. El centro activo de las ribotoxinas      158 
    El patrón de puentes disulfuro de las ribotoxinas        163 

  Implicación biológica de la acción de las ribotoxinas en la  
funcionalidad del ribosoma              166 

  Posibles aplicaciones clínicas de las ribotoxinas          168 

  Consideraciones finales               173 

‐ Conclusiones                   175 

‐ Bibliografía                    179 



ABREVIATURAS 

 

ABPA    Aspergilosis broncopulmonar alérgica 

ATR    Reflexión total atenuada 

CD    Dicroísmo circular 

cDNA    DNA codificante, sintetizado utilizando RNA como molde 

DMPG    Dimiristoilfosfatidilglicerol 

DT    Toxina de la difteria 

ELISA    Enzyme‐linked immunosorbent assay 

EF    Factor de elongación 

FTIR    Espectroscopía de infrarrojo asistida por transformada de Fourier 

G    Guanina 

GRAS    Generalmente considerada segura (generally regarded as safe) 

HPLC  Cromatografía líquida de alta eficiencia (high performance liquid cromatography) 

HtA  Hirsutelina A 

Ig  Inmunoglobulina 

IMTX  Inmunotoxina 

mAb  Anticuerpo monoclonal 

PAGE  Electroforesis en geles de poliacrilamida 

PBS  Tampón fosfato salino  

PCR  Reacción en cadena de la polimerasa 

PDB  Protein data bank 

PE  Exotoxina de Pseudomonas 

pI  Punto isoeléctrico 



RIP  Proteína inactivadora de ribosomas 

RMN  Resonancia magnética nuclear 

rRNA  Ácido ribonucleico ribosomal 

RNasa  Ribonucleasa 

SDS  Dodecil sulfato sódico 

SIT  Inmunoterapia alérgeno‐específica 

SRL  Lazo sarcina‐ricina 

TA  Toxina‐antitoxina 

TFR  Receptor de transferrina 

tRNA  RNA de transferencia 

UV  Ultravioleta 



 
3 Introducción 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Introducción 



 
4  Introducción 

   



 
5 Introducción 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ribotoxinas: análisis molecular de una familia de ribonucleasas 
fúngicas 
 

Resumen 

La  ribonucleasa T1 es  la proteína más  representativa y mejor  conocida de  toda una gran 
familia  de  ribonucleasas  secretadas  por  hongos,  principalmente  por  especies  de  los  géneros 
Aspergillus y Penicillium. Dentro de esta familia destacan  las ribotoxinas por su carácter citotóxico, 
que se basa en dos actividades independientes. Por una parte, son capaces de atravesar membranas 
lipídicas y entrar en  las células y por otra, poseen una actividad ribonucleolítica con  la que rompen 
un  único  enlace  fosfodiéster  localizado  en  una  secuencia  universalmente  conservada  dentro  del 
mayor  fragmento del RNA  ribosomal, conocida como  lazo  sarcina/ricina. De esta  forma  inhiben  la 
biosíntesis de proteínas, provocando  la muerte celular por apoptosis. No se ha encontrado ningún 
receptor proteico para  las  ribotoxinas; en cambio, estas proteínas atacan principalmente a células 
con una permeabilidad de membrana alterada, como aquellas infectadas por virus o transformadas. 
Gracias a una amplia variedad de aproximaciones metodológicas y a la construcción y purificación de 
diferentes  versiones mutantes  de  estas  ribotoxinas  se  ha  conseguido  dilucidar  en  gran  parte  su 
mecanismo  citotóxico  a  nivel  molecular.  Haciendo  uso  de  su  toxicidad,  las  ribotoxinas  se  han 
utilizado en  la  construcción de  inmunotoxinas. Por otra parte,  se ha demostrado que Asp f 1, una 
ribotoxina producida por Aspergillus  fumigatus, es uno de  los principales alérgenos  implicados en 
patologías  relacionadas  con  la  aspergilosis  alérgica.  La  ingeniería  de  proteínas  y  la  síntesis  de 
péptidos han permitido comprender  las bases de estos mecanismos patogénicos así como producir 
proteínas hipoalergénicas con potenciales aplicaciones diagnósticas e inmunoterapéuticas. 



 
6  Introducción 

Introducción 

Las  ribotoxinas  son  una  familia  de  ribonucleasas  (RNasas)  fúngicas,  extracelulares  y 
citotóxicas, que ejercen su actividad ribonucleolítica sobre la mayor molécula de RNA del ribosoma, 
provocando  la  inhibición de  la biosíntesis de proteínas y  la muerte celular por apoptosis (Gasset et 
al., 1994; Kao et al., 2001; Martínez‐Ruiz et al., 2001). Varios estudios han propuesto que existe una 
relación entre  su  localización en  la  superficie de  los  conidióforos  fúngicos  y  la maduración de  los 
conidios, lo que sugiere que su producción podría estar relacionada con una función defensiva para 
los hongos  a  la hora de  reproducirse  (Brandhorst  y Kenealy, 1992;  Yang  y Kenealy, 1992a,b).  Las 
ribotoxinas  fueron  descubiertas  durante  un  programa  de  búsqueda  de  antibióticos  y  agentes 
antitumorales iniciado en 1956 en el Departamento de Salud de Michigan. Se observó que el filtrado 
del medio de cultivo de un hongo aislado del suelo de una granja de Michigan contenía una sustancia 
inhibitoria tanto del sarcoma 180 como del carcinoma 755 inducidos en ratón. (Olson et al., 1965b). 
El hongo fue  identificado como Aspergillus giganteus MDH18894  (Figura 1a), y se demostró que  la 
molécula responsable del efecto era una proteína, que se denominó α‐sarcina  (Figura 1b) (Olson y 
Goerner,  1965).  Más  tarde  se  observó  que  dos  proteínas  antitumorales  más,  restrictocina  y 
mitogilina,  ambas producidas por A.  restrictus, presentaban  actividades  similares  a  la  α‐sarcina,  y 
fueron por tanto  incluidas en el mismo grupo de moléculas antitumorales. Asp f 1, otra ribotoxina, 
producida por Aspergillus fumigatus, fue identificada mucho después como un alérgeno principal en 
las enfermedades relacionadas con Aspergillus (Arruda et al., 1992). Desafortunadamente, estudios 
posteriores desvelaron la citotoxicidad inespecífica de estas proteínas, lo que limitó sus potenciales 
usos clínicos  (Roga et al., 1971). Así, el estudio de estas  toxinas se abandonó hasta  la mitad de  la 
década de los 70, cuando se descubrió que inhibían la biosíntesis de proteínas a concentraciones tan 
bajas como 0.1 nM, debido a la ruptura específica de un único enlace fosfodiéster del RNA ribosomal 
(rRNA) mayor (Schindler y Davies, 1977; Endo y Wool, 1982). De hecho, la actividad específica de las 
ribotoxinas es tan efectiva que basta una sola molécula de α‐sarcina para matar a una célula (Lamy 
et al., 1992). El enlace que rompen  las ribotoxinas es especialmente  interesante por su  localización 
en el lazo sarcina/ricina (SRL), una región evolutivamente conservada con papeles importantes en la 
funcionalidad  del  ribosoma,  pues  parece  estar  relacionada  con  la  unión  de  aminoacil‐tRNA 
dependiente  del  factor  de  elongación  1  (EF‐1)  y  la  hidrólisis  de  GTP  y  posterior  translocación 
dependientes de EF‐2 (Wool et al., 1992).  

Además de poseer esta actividad ribonucleolítica,  las ribotoxinas son capaces de atravesar 
membranas lipídicas en ausencia de receptores proteicos (Oñaderra et al., 1993; Gasset et al., 1994; 
Martínez‐Ruiz et al., 2001) y por este motivo, aunque potencialmente cualquier ribosoma podría ser 
inactivado por estas proteínas dado que el SRL está universalmente conservado, las ribotoxinas son 
especialmente  activas  sobre  células  transformadas  o  infectadas  por  virus  (Olson  et  al.,  1965; 
Fernández‐Puentes  y  Carrasco,  1980;  Olmo  et  al.,  2001).  Esta  diferencia  se  ha  explicado  por  la 
permeabilidad alterada de estas células  junto con  la habilidad de  las ribotoxinas para  interaccionar 
con membranas que  contengan  fosfolípidos ácidos  (Gasset et al., 1989,1990; Martínez‐Ruiz et al., 
2001; Olmo et al., 2001). 



 
7 Introducción 

La α‐sarcina,  la restrictocina y Asp f 1 son  las ribotoxinas más exhaustivamente estudiadas 
(Arruda et al., 1992; Gasset et al., 1994; Wool, 1997; Kao et al., 2001; Martínez‐Ruiz et al., 2001; 
García‐Ortega et al., 2005a), pero se han identificado y caracterizado parcialmente muchas otras, de 
distintas especies  fúngicas  (Lin et al., 1995; Parente et al., 1996; Huang et al., 1997; Wirth et al., 
1997; Martínez‐Ruiz  et  al.,  1999a,b).  Estos  estudios  sugieren  que  entre  las  ribotoxinas  existe  un 
elevado grado de conservación, pues todas las estudiadas muestran secuencias de aminoácidos con 
similitudes de más del 85% (Figura 2). La única excepción conocida sería la hirsutelina A (HtA), otra 
proteína ribonucleolítica extracelular producida por el hongo patógeno de  invertebrados Hirsutella 
thompsonii que ha sido incluida recientemente en la familia de las ribotoxinas (Herrero‐Galán et al., 
2008b)  y  sólo muestra  alrededor  de  un  25%  de  identidad  de  secuencia  con  los miembros  de  la 
familia descritos anteriormente  (Boucias et al., 1998; Martínez‐Ruiz et al., 1999a; Herrero‐Galán et 
al.,  2008b).  Según  esto,  parece  que  la  presencia  de  las  ribotoxinas  entre  los  hongos  está más 
extendida  de  lo  que  inicialmente  se  consideró  (Martínez‐Ruiz  et  al.,  1999b).  Por  ejemplo,  se  ha 
descrito que una RNasa  específica purificada de  las  semillas maduras de una  cupresácea oriental 
(Biota orientalis)  también  rompe un único enlace  fosfodiéster del  rRNA 28S en  ribosomas de  rata, 
pero en una región distinta al SRL, aunque cercana a ella espacialmente (Xu et al., 2004). 

El género Aspergillus comprende un grupo complejo y ubicuo de hongos filamentosos con 
más de 185 especies,  incluidas 20 patógenos humanos así  como otras usadas para  la producción 
industrial de alimentos y enzimas. La publicación de  la secuencia genómica del organismo modelo 
Aspergillus nidulans (Galagan et al., 2005) ha creado grandes expectativas en la búsqueda de avances 
en el conocimiento de  la biología de estos microorganismos. También  se ha publicado un estudio 
genómico  comparativo,  incluyendo  dos  especies más,  Aspergillus  fumigatus  y  Aspergillus  oryzae 
(Machida  et al., 2005; Nierman  et al., 2005). Aspergillus nidulans no produce ninguna  ribotoxina, 
mientras  que  A.  fumigatus,  un  patógeno  importante  de  humanos,  produce  Asp  f  1,  una  de  las 
ribotoxinas mejor conocidas (Moser et al., 1992). Aspergillus oryzae (Machida et al., 2005) se utiliza 
en la producción de sake, miso y salsa de soja, y también de RNasa T1 (Sato y Egami, 1957), una de 
las  proteínas más  exhaustivamente  caracterizadas.  La  RNasa  T1  es  de  hecho  el miembro mejor 
conocido de la familia de RNasas extracelulares fúngicas (Yoshida, 2001; Loverix y Steyaert, 2001), un 
grupo que, obviamente, incluye a las ribotoxinas. Todas ellas muestran un elevado grado de similitud 

Figura  1.  (a)  Fotografía  de  un  cultivo  de  Aspergillus  giganteus  MDH  18894.  (b)  Estructura 
tridimensional de la α‐sarcina (PDB ID 1DE3). El diagrama se generó con el programa MOLMOL (Koradi 
et al., 1996). 



 
8  Introducción 

de secuencia  (Sato y Uchida, 1975a; Sacco et al., 1983; Martínez‐Ruiz et al., 1999a,b) y estructura 
tridimensional  (Pace et al., 1991; Noguchi et al., 1995; Yang y Moffat, 1996; Campos‐Olivas et al., 
1996a,b; Pérez‐Cañadillas et al., 2000)  (Figura 2) pero, aparte de  las ribotoxinas, no se ha descrito 
que ninguna de estas RNasas extracelulares tenga actividad citotóxica. 

Otra proteína a destacar es  la RNasa U2, de Ustilago sphaerogena (Figura 2) (Arima et al., 
1968a,b; Sato y Uchida, 1975a). Se trata de la RNasa extracelular microbiana no tóxica más cercana a 
las  ribotoxinas desde un punto de  vista  filogenético  (Sacco  et al., 1983; Martínez del Pozo  et al., 
1988; Martínez‐Ruiz et al., 1999a,b,2001). La RNasa U2 es una proteína pequeña y extremadamente 
ácida que muestra una fuerte preferencia por el enlace fosfodiéster en posición 3’ de nucleótidos de 
purina  (Rushizky  et  al.,  1970; Uchida  et  al.,  1970),  algo  bastante  inusual  en  el  grupo  de  RNasas 
microbianas.  La  RNasa  T1, por  ejemplo,  presenta una  especificidad  estricta  por  el  grupo  guanilo. 
Ambas  enzimas  también difieren  en  sus  valores de pH óptimo, que  es  ácido para  la RNasa U2  y 
neutro  para  la  RNasa  T1,  pero  las  dos  son  enzimas  ciclantes,  que  rompen  el  RNA  en  dos  pasos 
independientes, transfosforilación e hidrólisis (Yasuda y Inoue, 1982).  

Las ribotoxinas son proteínas más grandes, generalmente básicas, que contienen bucles más 
largos y cargados que no están presentes en las RNasas fúngicas no tóxicas (Figura 2), lo que sugiere 
que estos bucles son  la base estructural de su toxicidad (Martínez del Pozo et al., 1988). Es posible 
que en algún momento una RNasa similar a la T1 adquiriera especificidad por el ribosoma mediante 
la  inserción de pequeños dominios de  reconocimiento que  la habrían  llevado hacia  sustratos más 
específicos. Esto hace muy interesante el estudio de la evolución y el mecanismo de específicos. Esto 
hace muy  interesante el estudio de  la evolución y el mecanismo de acción de  las ribotoxinas, pues 
parecen  ser  toxinas  diseñadas  con  un  objetivo,  evolucionadas  a  partir  de  las  otras  RNasas 
microbianas no tóxicas para entrar en las células e inactivar específicamente los ribosomas (Lamy et 
al., 1992; Kao y Davies, 1995). Identificar las características estructurales que han permitido a estas 
proteínas  llegar a  ser  toxinas  tan eficientes podría  ser un paso decisivo hacia  la utilización de  las 
ribotoxinas, nativas o modificadas, como armas contra distintas patologías humanas. 

Se ha  especulado durante mucho  tiempo  sobre  el mecanismo desarrollado por  el hongo 
productor para superar la toxicidad de las ribotoxinas, pues sus propios ribosomas son susceptibles 
de  ser  atacados  (Miller  y Bodley, 1988). No hay evidencias de que  se produzca  simultáneamente 
ninguna  antitoxina  o  proteína  inhibidora  que  pueda  bloquear  la  actividad  citotóxica  antes  de  su 
secreción  al  medio  extracelular  (Martínez‐Ruiz  et  al.,  1998b)  como  ocurre  con  algunas  toxinas 
ribonucleolíticas bacterianas (Muñoz‐Gómez et al., 2005; Condon, 2006; Kamphuis et al., 2006; Luna‐
Chávez  et  al.,  2006).  Las  ribotoxinas  son  sintetizadas  como  precursores  que  maduran  en 
compartimentos de membrana celular (Endo et al., 1993a,b). Además, la caracterización de la pro‐α‐
sarcina, producida por Pichia pastoris, reveló que es ribonucleolíticamente activa  (Martínez‐Ruiz et 
al.,  1998).  En  consecuencia,  los  datos  acumulados  hasta  ahora  sugieren  que  la  protección  de  las 
células  productoras  frente  a  los  efectos  tóxicos  de  las  ribotoxinas  se  basa  en  un  reconocimiento 
eficiente  de  sus  secuencias  señal,  seguido  de  una  adecuada  compartimentación  antes  de  ser 
secretadas al medio extracelular.  



 
9 Introducción 

 

Figura 2. Alineamiento de secuencia de varias ribotoxinas (α‐sarcina, gigantina, clavina, restrictocina y 
HtA) y de  las RNasas T1 y U2. Los residuos de cisteína de  las ribotoxinas se  indican en azul y  los tres 
residuos  catalíticos  de  todas  las  proteínas  en  rojo.  También  se  muestran  las  estructuras 
tridimensionales de la α‐sarcina, la restrictocina y las RNasas T1 y U2. Las estructuras tridimensionales 
de  las  proteínas  se  ajustaron  con  las  coordenadas  atómicas  de  los  residuos  del  centro  activo  (α‐
sarcina: 48, 50, 96, 121, 137, 145; restrictocina: 47, 49, 95, 120, 136, 144; RNasa T1: 38, 40, 66, 77, 92, 
100; RNasa U2: 39, 41, 62, 85, 101, 110) y con los puentes disulfuro comunes a las cuatro proteínas (α‐
sarcina,  6‐148;  restrictocina,  5‐147; RNasa  T1,  6‐103; RNasa U2,  9‐113)  (raíz  cuadrada media de  la 
desviación del ajuste, 1.877). Los diagramas y ajustes se generaron con el programa MOLMOL (Koradi 
et al., 1996). 



 
10  Introducción 

Las  proteínas  inactivadoras  del  ribosoma  (RIPs)  son  otro  grupo  de  proteínas  tóxicas 
altamente  especializadas,  producidas  por  plantas  y  hongos  (Stirpe  et  al.,  1988,1992;  Nielsen  y 
Boston, 2001) que actúan en la misma región del rRNA que las ribotoxinas (Schindler y Davies, 1977; 
Endo y Wool, 1982; Endo et al., 1987; Correll et al., 1998,1999; Mears et al., 2002). Desde este punto 
de vista, se podría considerar que las ribotoxinas están incluidas entre las RIPs, pero algunos autores 
(Nielsen  y Boston, 2001; Peumans  et al., 2001) prefieren que el nombre RIP  se  restrinja  a  las N‐
glicosidasas de plantas, representadas por la ricina, que despurinan un nucleótido contiguo al enlace 
fosfodiéster  que  hidrolizan  las  ribotoxinas  (Endo  et  al.,  1987;  Endo  y  Tsurugi,  1987).  Por  estas 
razones,  la  secuencia  conservada  del  rRNA  diana  de  las  ribotoxinas  y  las  RIPs  se  conoce 
universalmente como lazo sarcina/ricina, o SRL (Figura 3). 

En el genoma de muchos procariotas aparecen codificadas tanto una toxina estable como 
una  antitoxina  lábil  bajo  el  control  de  un  operón  simple.  Estos  sistemas  toxina‐antitoxina  (TA) 
constituyen otra interesante familia de endo‐RNasas tóxicas (Christensen et al., 2003; Muñoz‐Gómez 
et  al.,  2005;  Condon,  2006;  Kamphuis  et  al.,  2006;  Luna‐Chávez  et  al.,  2006).  Normalmente  la 
antitoxina  se  sintetiza  en  cantidades  equimoleculares  a  la  toxina,  y  así  se  inhibe  la  acción 
ribonucleolítica,  pero  cuando  las  células  se  encuentran  bajo  algunas  condiciones  de  estrés,  la 
antitoxina se inactiva y la acción de la toxina provoca una parada del crecimiento celular en espera 
de condiciones más  favorables. La diana de estas proteínas no está del  todo establecida, pero  los 
datos publicados hasta ahora apuntan al mRNA como mejor candidato. No puede descartarse, en 

Figura  3.  (a)  Diagrama  de  la  estructura  de  la  subunidad  mayor  del  ribosoma  de  Halobacterium 
marismortui (PDB ID 1JJ2): en negro, el RNA 23S; en cian, el RNA 5S; en azul, el SRL; en rojo, la proteína 
ribosomal L3; en verde, la proteína ribosomal L6; en amarillo, la proteína ribosomal 10e; en púrpura, la 
proteína ribosomal L14; y en gris, otras proteínas ribosomales. (b) Diagrama de  la estructura del SRL 
(Correl et al., 1998). La numeración corresponde las posiciones de los nucleótidos en el rRNA 28S (23S) 
de  rata o de Escherichia coli  (entre paréntesis). Las  ribotoxinas  rompen el enlace en el  lado 3’ de  la 
G4325 (2661) (verde oscuro). La ricina despurina la A4324 (2660) (verde oscuro). La G prominente es la 
G4319  (2655)  (naranja). Se han  coloreado  la  región Watson‐Crick de  la horquilla  (violeta),  la  región 
flexible (cian), el cruce de la hebra que incluye a la G prominente (amarillo) y el tetrabucle (verde). Los 
diagramas se generaron con el programa MOLMOL (Koradi et al., 1996) 



 
11Introducción 

cambio,  que  el  ribosoma  o, más  probablemente,  el  complejo  translacional,  ejerza  algún  tipo  de 
estimulación o actividad moduladora  sobre  los  sistemas TA  (Christensen y Gerdes, 2003), aspecto 
que parece haber sido recientemente confirmado para  las toxinas RelE y Kid  (Diago‐Navarro et al., 
2008). Así, estas endo‐RNasas también pueden considerarse como moduladores de la biosíntesis de 
proteínas y en este sentido presentan una conexión funcional con las ribotoxinas fúngicas. De hecho, 
comparten con ellas el mecanismo de hidrólisis, pues también se comportan como RNasas ciclantes 
(véase más adelante). Sin embargo, aquí terminan las similitudes, pues es sabido que los procariotas 
no  producen  ribotoxinas,  que  sus  toxinas  utilizan  un  par  de  cadenas  laterales  de  aminoácidos 
diferentes  para  la  catálisis  ácido‐base,  y  que  hasta  ahora  no  se  ha  descrito  la  producción  de 
antitoxinas  específicas  de  ninguna  ribotoxina  (Martínez‐Ruiz  et  al.,  1998,2001;  Kamphuis  et  al., 
2006). 

 

 

Características estructurales 

Durante casi dos décadas se han determinado las secuencias completas o parciales de varias 
ribotoxinas (Rodríguez et al., 1982; Sacco et al., 1983; López‐Otín et al., 1984; Fernández‐Luna et al., 
1985; Arruda  et  al.,  1990; Wirth  et  al.,  1997; Martínez‐Ruiz  et  al.,  1999a,b)  comprobándose  que 
todas muestran  un  elevado  grado  de  identidad  en  su  secuencia  de  150  aminoácidos  (Figura  2), 
incluida la conservación de sus dos puentes disulfuro (Martínez del Pozo et al., 1988; Martínez‐Ruiz 
et al., 2001). Las diferencias entre ellas se concentran principalmente en los bucles (Martínez‐Ruiz et 
al., 1999a). Estas observaciones  incluyen también a  la HtA (Martínez‐Ruiz et al., 1999a), a pesar de 
ser 20 residuos más corta que el resto de las ribotoxinas conocidas (Figura 2). 

La similitud de secuencia también se manifiesta en  la estructura tridimensional de  las tres 
ribotoxinas  estudiadas  a  ese nivel,  la  restrictocina  (Yang  y Moffat, 1996;  Yang  et al., 2001),  la  α‐
sarcina (Pérez‐Cañadillas et al., 2000,2002; García‐Mayoral et al., 2005a,b) y la hirsutelina (Viegas et 
al., 2009). La resonancia magnética nuclear (RMN) y otras técnicas han permitido además construir 
un  mapa  muy  detallado  de  las  propiedades  estructurales  y  dinámicas  de  la  segunda  de  ellas 
(Campos‐Olivas et al., 1996a,b; Pérez‐Cañadillas et al., 2000,2002; García‐Mayoral et al., 2005a,b). En 
cuanto a la estructura tridimensional (Figura 1), la α‐sarcina se pliega en una estructura α+β con una 
lámina β central antiparalela de 5 hebras y una hélice α de casi tres giros. La lámina se compone de 
las hebras β3, β4, β5, β6 y β7, con una topología ‐1, ‐1, ‐1, ‐1 (Figuras 1 y 2) (Campos‐Olivas et al., 
1996a,b; Pérez‐Cañadillas et al., 2000). Está muy alabeada, definiendo una cara convexa contra  la 
que la hélice α se empaqueta ortogonalmente, y una superficie cóncava donde se alojan los residuos 
del centro activo: His 50, Glu 96, Arg 121 e His 137, con sus cadenas  laterales proyectándose hacia 
fuera de  la  cavidad  (Figura 4). Por otra parte,  los  residuos 1‐26  forman una gran horquilla  β que 
puede  considerarse  como  dos  pequeñas  subhorquillas  β  consecutivas  conectadas  por  una  región 
bisagra.  La primera  está más  cerca del  extremo  abierto de  la horquilla, mientras que  la  segunda 
subhorquilla está formada por dos pequeñas hebras β1b y β2b conectadas por un giro β de tipo  I. 



 
12  Introducción 

Esta última parte de  la horquilla  amino  terminal  sobresale de  la  estructura, quedando  como una 
protuberancia muy expuesta al disolvente, un detalle que es  importante para su  función, como se 
explica más  adelante.  Los  demás  tramos  de  su  secuencia  forman  largos  bucles  que  conectan  los 
elementos de estructura secundaria (Figura 1). A pesar del carácter expuesto de esos bucles y de su 
falta de estructura  secundaria ordenada,  su  conformación está bien definida, manteniéndose por 
redes  de  interacciones  entre  átomos  de  un mismo  o  de  distinto  bucle,  que  incluyen  enlaces  de 
hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y puentes salinos (Yang y Moffat, 1996; Pérez‐Cañadillas et al., 
2000). Desde un punto de vista dinámico,  las medidas de RMN han mostrado que  la  α‐sarcina  se 
comporta  como un  rotor  con  simetría axial de  tipo prolato, y que está  compuesta por un núcleo 
hidrofóbico  rígido  y  algunos  segmentos  expuestos,  principalmente  los  bucles,  que  experimentan 
movimientos  internos rápidos (de picosegundos a nanosegundos) (Pérez‐Cañadillas et al., 2002). La 
α‐sarcina  y  la  restrictocina  muestran  estructuras  prácticamente  idénticas  (Figura  2),  pero  se 
observan algunas pequeñas diferencias concernientes a los largos bucles de estructura aperiódica y 
especialmente a la horquilla β arriba mencionada, una región cuya gran movilidad (Pérez‐Cañadillas 
et al., 2002)  impidió que apareciese en  la estructura  cristalina de  la  restrictocina  (Yang  y Moffat, 
1996).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 4. Representación de la disposición geométrica de las cadenas laterales de residuos localizados 
en el centro activo de la α‐sarcina y la RNasa T1. Sólo se muestran las cadenas laterales de los residuos 
catalíticos  implicados  directamente  en  el  mecanismo  de  corte  general  ácido‐base.  También  se 
muestran  las  estructuras  tridimensionales  de  ambas  proteínas.  Los  diagramas  se  generaron  con  el 
programa MOLMOL (Koradi et al., 1996). 



 
13Introducción 

Las ribotoxinas comparten su núcleo estructural con las RNasas de la familia de la T1, hecho 
que concuerda con la similitud de secuencia observada (Figuras 2 y 4). Por ejemplo, la comparación 
de  las estructuras  tridimensionales de  la  α‐sarcina y  la  restrictocina  con  la de  las RNasas T1 y U2 
revela que las cuatro proteínas comparten idénticos elementos de estructura secundaria ordenada, 
así como  la disposición de  los residuos  implicados en el centro activo, a pesar de  las diferencias en 
sus  secuencias de  aminoácidos  (Figuras  2  y  4). Así,  todas  las RNasas  fúngicas  extracelulares  cuya 
estructura tridimensional se conoce muestran bastantes diferencias en  la especificidad enzimática, 
pero comparten ese plegamiento estructural común que concierne a  la arquitectura y conectividad 
de los elementos de estructura secundaria (Yang y Moffat, 1996; Campos‐Olivas et al., 1996b; Pérez‐
Cañadillas  et al., 2000; Martínez‐Ruiz  et al., 2001).  Las diferencias estructurales más  significativas 
entre  ellas  están,  de  nuevo,  relacionadas  tanto  con  la  presencia  de  una  gran  horquilla  β  amino‐
terminal en las ribotoxinas como con las diferencias de longitud y carga de sus bucles de estructura 
aperiódica (Figuras 2 y 4). 

El bucle 2 de  la α‐sarcina  (de  la Thr 53 a  la Tyr 93)  (Figura 2), con una conformación bien 
definida, merece una mención  especial por  sus  implicaciones  funcionales  (Pérez‐Cañadillas  et  al., 
2000). Es altamente móvil, rico en glicocolas y residuos cargados positivamente, y está muy expuesto 
al  disolvente.  En  este  bucle,  la  secuencia  comprendida  entre  los  residuos  52  y  54  se  encuentra 
inmovilizada en el armazón molecular (Pérez‐Cañadillas et al., 2002). La Asn 54 de esa secuencia es 
un  residuo  conservado  entre  las  RNasas  extracelulares  fúngicas  (Mancheño  et  al.,  1995a)  que 
establece un enlace de hidrógeno entre el protón de su cadena lateral amida y el grupo carbonilo de 
la  Ile 69,  siendo esos protones muy  resistentes  al  intercambio  con el disolvente. Esta  interacción 
también está conservada en el resto de RNasas de la familia de la T1 (Sevcik et al., 1991; Pfeiffer et 
al., 1997, Hebert et al., 1998). Modelos de ajuste (docking) de la α‐sarcina con el ribosoma también 
sugieren  que  el  segmento  formado  por  los  residuos  51  a  55  de  la  proteína  (Figura  2)  podría 
interaccionar  específicamente  con  el  SRL  en  las  proximidades  del  enlace  a  hidrolizar  (Pérez‐
Cañadillas et al., 2000), una predicción que parece confirmada por cristalografía de rayos X (Figura 
5a) (Yang et al., 2001). En esa interacción hay tres residuos de Lys del bucle 3 (Lys 111, Lys 112 y Lys 
114) que parecen ser especialmente importantes, pues contactan con el elemento más identificativo 
del SRL, la G prominente (ver más adelante y Figura 5a) (Yang y Moffat, 1996; Pérez‐Cañadillas et al., 
2000; Yang et al., 2001). 

Siguiendo con las zonas de interacción de la α‐sarcina con su sustrato, el ribosoma, también 
debe destacarse la horquilla β amino‐terminal. Un mutante en el que se eliminó la parte externa de 
esa  horquilla,  denominado  α‐sarcina  Δ(7‐22)  (García‐Ortega  et  al.,  2002),  mantiene  la  misma 
conformación que  la proteína silvestre, como se comprobó  tras su caracterización espectroscópica 
(García‐Ortega  et  al.,  2002)  y  la  determinación de  su  estructura  tridimensional  en disolución por 
RMN (García‐Mayoral et al., 2004). Modelos predictivos in silico y análisis enzimáticos han revelado 
que  esta  parte  expuesta  de  la  horquilla  β  amino‐terminal  podría  establecer  interacciones  con 
proteínas ribosomales específicas para así dirigir  la ribotoxina a  la región SRL del ribosoma (García‐
Ortega et al., 2002; García‐Mayoral et al., 2005b) (Figura 5). 



 
14  Introducción 

La  α‐sarcina  es  una  proteína  muy  cargada,  con  un  punto  isoeléctrico  elevado.  El  gran 
contenido en residuos cargados positivamente posiblemente es un requisito necesario no sólo para 
el  reconocimiento  y  unión  a  su  diana, muy  cargada  negativamente,  el  rRNA,  sino  también  a  las 
membranas celulares. Además, contiene ocho residuos de tirosina y dos de triptófano, que han sido 
estudiados  espectroscópicamente.  Inicialmente,  usando medidas  de  absorbancia  UV,  emisión  de 
fluorescencia  y  dicroísmo  circular  (CD),  se  describieron  cinco  transiciones  conformacionales 
inducidas por pH, correspondientes a valores de pKa de 2.5, 4.5, 8.0, 10.2 y 11.4 (Martínez del Pozo 
et al., 1988).  Los dos últimos  (10.2 y 11.4) corresponden a dos poblaciones diferentes de Tyr  con 
distinta accesibilidad al disolvente. La transición a pH 8.0 se asignó al grupo amino en posición α del 
residuo amino terminal; los residuos de Asp y Glu se desprotonan a pH 4.5; y los valores de pKa de 
2.5  y  10.2  se  consideraron  transiciones  de  desnaturalización.  Esta  caracterización  adquirió 
posteriormente mucho mayor  detalle,  cuando  los  valores  de  pKa  de  todos  los  residuos  de  ácido 
aspártico,  ácido  glutámico  e  histidina  de  la  α‐sarcina  se  determinaron  por  RMN.  Entonces  se 
encontró que muchos de esos valores de pKa están muy alterados, incluidos algunos de residuos del 
centro  activo  (Pérez‐Cañadillas  et  al.,  1998). Mucho más  recientemente  también  se  han medido 
sistemáticamente  los valores de pKa de  todos  los  residuos  susceptibles de  ser  titulados, o  se han 
predicho, cuando la medida directa no ha sido posible por el desplegamiento de la proteína (García‐
Mayoral et al., 2003). Estas medidas y predicciones se extendieron también a una serie de mutantes 
del  centro  activo  (E96Q,  H50Q,  H137Q,  y  H50/137Q)  (García‐Mayoral  et  al.,  2003,2006).  Esta 
caracterización tan detallada se completó determinando el estado tautomérico de todas las cadenas 
laterales de los residuos de histidina (Pérez‐Cañadillas et al., 2003). 

En  cuanto  a  los  dos  residuos  de  triptófano  de  la  α‐sarcina,  en  posiciones  4  y  51,  se 
encuentran  conservados  en  todas  las  ribotoxinas  estudiadas  hasta  ahora  (Figura  2).  La 
caracterización de mutantes en los que uno o ambos se sustituyeron por Phe (los mutantes sencillos 
W4F  y  W51F,  y  el  doble  mutante  W4/51F)  mostró  que  no  son  esenciales  para  la  actividad 
ribonucleolítica específica de la proteína, aunque la actividad de los mutantes del Trp 51 sí aparece 
disminuida  (De  Antonio  et  al.,  2000).  Pero  aún  más  importante  es  que  con  esos  mutantes  se 
descubrió  que  el  Trp  51,  que  no  es  fluorescente,  es  responsable  de  la mayoría  de  la  señal  de 
dicroísmo  circular en el UV próximo de  la proteína  y que  contribuye  a  su elipticidad  global en  la 
región del enlace peptídico (De Antonio et al., 2000). 

Finalmente,  también es  importante desde un punto de vista estructural mencionar que el 
centro activo de la α‐sarcina está formado por, al menos, los residuos His 50, Glu 96, His 137, Tyr 48, 
Leu  45  y Arg  121,  aunque  sólo  los  tres  primeros  están  directamente  implicados  en  los  pasos  de 
transferencia de protones en el mecanismo  catalítico  (Lacadena et al., 1999; Martínez‐Ruiz et al., 
2001). Como ya se ha mencionado, están localizados en la lámina β central, con sus cadenas laterales 
apuntando hacia  la cara cóncava de  la estructura de  la proteína  (Figura 4). Las características más 
representativas de este centro activo son: (1) una alta densidad de residuos cargados; (2) valores de 
pKa  inusuales para His 50, Glu 96, e His 137; (3) formas tautoméricas Nδ  inusuales en His 50 e His 
137,  característica  común  de  las  RNasas microbianas;  (4)  presencia  de  un  enlace  de  hidrógeno 
estructuralmente  importante entre  la His 137 catalítica y un oxígeno del esqueleto en el bucle 5; y 



 
15Introducción 

(5)  baja  accesibilidad  de  superficie  de  todos  los  átomos  susceptibles  de  ser  titulados  (Pérez‐
Cañadillas et al., 1998,2000,2003).  

Figura 5. (a) Diagrama de la estructura cristalina de un complejo de la restrictocina con un análogo del 
SRL (Yang et al., 2001) (PDB 1JBS). La estructura del análogo está distorsionada con respecto a  la del 
SRL silvestre, y esto explica que no se produjera el corte, lo que permitió la cristalización del complejo. 
También se muestran  las cadenas  laterales de  la His 49  (azul), el Glu 95  (rojo), y  la His 136  (rojo). El 
esqueleto del RNA se muestra en negro, con las bases en gris excepto la G prominente, en amarillo, el 
tetrabucle  en  verde,  y  el  grupo  fosfato del  enlace  susceptible  de  ruptura  en magenta.  También  se 
indican los bucles equivalentes a los bucles 2, 3 y 5 de la α‐sarcina. (b) Diagrama de las regiones de la 
α‐sarcina  presumiblemente  implicados  en  el  establecimiento  de  interacciones  con  las  bicapas  de 
fosfolípidos:  azul,  residuos  7‐22;  naranja,  residuos  116‐139  y  51;  rojo,  residuos  53‐93  (bucle  2). 
También se muestran las cadenas laterales de Trp 51, Arg 121 e His 137. (c) Modelo de ajuste reducido 
de la interacción de la α‐sarcina silvestre (PDB ID 1DE3) y el mutante Δ(7‐22) (PDB ID 1R4Y) con el SRL 
(PDB ID 430D) y las proteínas ribosomales L6 y L14 de Halobacterium marismortui (García‐Mayoral et 
al., 2005 a,b). Los diagramas se generaron con  los programas MOLMOL  (a, c)  (Koradi et al., 1996) y 
VMD (b) (Humphrey et al., 1996). 



 
16  Introducción 

 

Paso a través de membranas 

La actividad antitumoral de la α‐sarcina aparece cuando ejerce su actividad ribonucleolítica 
tras su paso selectivo a través de algunas membranas celulares. Así, aunque el SRL es una estructura 
universalmente conservada, la célula sólo resulta dañada si la ribotoxina ha sido capaz de atravesar 
la membrana  plasmática  para  acceder  a  los  ribosomas.  Ya  que  hasta  ahora  no  se  han  descrito 
receptores  proteicos  para  la  α‐sarcina,  su  especificidad  debe  relacionarse  con  una  interacción 
diferencial  con  los  componentes  lipídicos de  las membranas. Hace  tiempo  se demostró que  la  α‐
sarcina  es un potente  inhibidor  de  la  síntesis de proteínas  en  células  infectadas por picornavirus 
(Fernández‐Puentes y Carrasco, 1980), y que ionóforos (Alonso y Carrasco, 1981,1982), ATP externo 
(Otero y Carrasco, 1986) o un tratamiento con fosfolipasa C (Otero y Carrasco, 1986) convierten a las 
células  de  mamífero  en  diana  de  la  α‐sarcina.  Todas  estas  observaciones  se  interpretaron 
considerando la existencia en todos esos casos de una permeabilidad de membrana alterada. 

Usando sistemas modelo de lípidos se probó que la α‐sarcina interacciona específicamente 
con vesículas de  fosfolípidos que a pH neutro o  ligeramente ácido están cargados negativamente, 
dando como resultado complejos proteína‐lípido que pueden ser aislados por centrifugación en un 
gradiente  de  sacarosa  (Gasset  et  al.,  1989).  Experimentos  de  unión  revelaron  que  la  fuerte 
interacción entre la ribotoxina y los liposomas (Kd = 60.0 nM) causa la agregación de éstos, seguida 
por  su  fusión  hasta  estructuras  lipídicas mucho mayores  (Gasset  et  al.,  1989).  La  relación molar 
fosfatidilcolina/fosfatidilglicerol  mínima  requerida  para  este  comportamiento  es  1:10,  y  no  es 
dependiente ni de la longitud ni del grado de insaturación de la cadena acilo del fosfolípido, siendo 
más  efectivo  a  temperaturas  inferiores  a  la  temperatura  de  fusión  del  fosfolípido  empleado.  La 
saturación se alcanza a una relación molar  lípido/proteína de 50:1, y el efecto es máximo a 0.15 M 
de fuerza iónica. En cambio, se abole a pH básico (Gasset et al., 1990). 

El paso inicial en la interacción entre la α‐sarcina y las vesículas lipídicas es la formación de 
un dímero de vesículas mantenido por puentes proteína‐proteína, según revelaron estudios cinéticos 
de dispersión de luz (light‐scattering) empleando técnicas de flujo detenido (Mancheño et al., 1994). 
Una  vez  que  la  agregación  ha  comenzado,  ocurre  la mezcla  de  lípidos  entre  las  bicapas  de  las 
vesículas agregadas, de  la misma  forma que ocurriría con  liposomas  fusionándose. De hecho, esta 
fusión  está  provocada  por  el  efecto  desestabilizante  de  la  proteína,  que  simultáneamente  sufre 
cambios conformacionales hasta unirse a las vesículas (Mancheño et al., 1994), como se vio por CD, 
emisión  de  fluorescencia  y  espectroscopía  de  infrarrojo  ATR‐FTIR  (Gasset  et  al.,  1991b).  Estos 
cambios conformacionales sugieren un  incremento en el contenido en hélice α que,  junto con  los 
otros cambios espectroscópicos observados, se interpretó como un mecanismo mediante el cual los 
grupos polares de  la proteína se protegen de  los  lípidos,  lo que provocaría  la formación de enlaces 
de hidrógeno intracatenarios y un menor apagamiento estructural (Gasset et al., 1991b). De hecho, 
cuando la proteína se une a las vesículas, los enlaces peptídicos se protegen frente a la hidrólisis con 
tripsina  (Gasset  et al., 1989; Oñaderra  et al., 1989)  a pesar del  gran número de  residuos básicos 



 
17Introducción 

presentes  en  su  secuencia  (Sacco  et  al.,  1983).  El  efecto  fusogénico  atribuido  a  la  α‐sarcina  fue 
corroborado  por  micrografías  electrónicas  de  criofractura  en  las  que,  a  la  relación  molar 
fosfolípido/proteína  más  alta  (50:1),  había  una  completa  ausencia  de  estructuras  vesiculares 
pequeñas, estando los lípidos, en cambio, organizados exclusivamente en láminas planas, indicando 
que los procesos de fusión habían tenido lugar de forma exhaustiva (Gasset et al., 1990). Como paso 
final,  y  muy  probablemente  como  consecuencia  de  la  formación  de  estas  grandes  estructuras 
inestables,  la  α‐sarcina  también  modifica  la  permeabilidad  de  las  membranas,  provocando  la 
liberación de  calceína atrapada en  vesículas de  fosfatidilglicerol  (Gasset et al., 1990). Medidas de 
polarización  de  fluorescencia,  calorimetría  diferencial  de  barrido  y  marcaje  con  fosfolípidos 
fotoactivos  revelaron  además  que  la  α‐sarcina,  una  proteína  soluble  en  agua  e  hidrofílica, 
interacciona  con  bicapas  fosfolipídicas  a  través  de  una  combinación  de  fuerzas  electrostáticas  e 
hidrofóbicas (Gasset et al., 1991a). De acuerdo con esto,  la proteína sería  inicialmente adsorbida a 
las cabezas polares y cargadas de los fosfolípidos, y entonces penetraría parcialmente en la interfase 
de  la  bicapa  para  interaccionar  con  una  porción  de  las  cadenas  hidrocarbonadas  de  los  lípidos 
(Gasset et al., 1991a). El conjunto de todas estas observaciones es consistente con una intercalación 
de la proteína en la matriz lipídica, provocando la fusión y cambios de permeabilidad de las bicapas, 
procesos que presumiblemente están implicados en el paso de la proteína a través de la membrana 
de sus células diana ya que está descrito que en  las membranas de células transformadas hay una 
mayor concentración de  fosfolípidos cargados negativamente, como  fosfatidilserina  (Connor et al., 
1989;  Gasset  et  al.,  1989,  1990;  Zachowski,  1993).  Desafortunadamente  aún  no  hay  evidencias 
directas de que esta abundancia de  fosfolípidos ácidos  sea  lo que  realmente explique  la actividad 
antitumoral de la α‐sarcina. 

Corroborando  esta  teoría,  dos  tipos  de  ensayo  demostraron  la  habilidad  innata  de  la  α‐
sarcina para atravesar membranas fosfolipídicas, si éstan son lo suficientemente ácidas, en ausencia 
de  ninguna  otra  proteína  (Oñaderra  et  al.,  1993).  En  el  primero,  la  proteína  se  degradaba 
completamente cuando se añadía externamente a vesículas de asolectina que encapsulaban tripsina, 
un experimento llevado a cabo en presencia de tal cantidad de inhibidor de tripsina en el exterior de 
las vesículas que era imposible la degradación debida a trazas de proteasa liberadas de las vesículas. 
En  el  segundo,  la  α‐sarcina  añadida  externamente  era  también  capaz  de  romper,  de  forma 
dependiente de  su  concentración, moléculas encapsuladas de  tRNA de  levadura  (Oñaderra  et al., 
1993). 

En cuanto a las regiones de la proteína implicadas en la interacción con lípidos, los primeros 
indicios  se  obtuvieron  usando  péptidos  sintéticos  solubles  correspondientes  a  secuencias  de  la 
lámina β central de la α‐sarcina. Algunos de esos péptidos, uno de ellos de sólo 9 aminoácidos, son 
capaces  de  mimetizar,  al  menos  de  forma  cualitativa,  los  efectos  producidos  por  la  proteína 
completa  sobre  vesículas  de  fosfolípidos  ácidos,  indicando  que  probablemente  esa  región  de  la 
proteína  (residuos  116‐139)  está  implicada  en  la  interacción  con  las  membranas  celulares 
(Mancheño et al., 1995b, 1998a). Estas conclusiones son compatibles con la observación de que una 
forma desnaturalizada de  la  α‐sarcina que  contiene hebras  β  como único elemento de estructura 
secundaria ordenada provoca la desestabilización del núcleo hidrofóbico de las bicapas (Gasset et al., 



 
18  Introducción 

1995). Usando los mutantes de Trp mencionados antes, también se demostró que ni el Trp 4 ni el Trp 
51 se requieren para la interacción de la α‐sarcina con membranas lipídicas (De Antonio et al., 2000). 
En  cambio,  esta  interacción  provoca  un  gran  incremento  en  el  rendimiento  cuántico  del  Trp  51, 
situado  en  la  lámina  β  de  la  proteína  (Figura  5b),  viéndose  su  emisión  de  fluorescencia 
simultáneamente apagada por el antraceno incorporado a la región hidrofóbica de esas bicapas. Por 
otra parte, un estudio con mutantes que afectan a la Arg 121 del centro activo de la α‐sarcina (R121K 
y R121Q), también localizado en la lámina β central (Figuras 4 y 5b), mostró que la pérdida de carga 
positiva  en  esa  posición  supone  un  enorme  impedimento  para  que  la  proteína  interaccione  con 
membranas fosfolipídicas (Masip et al., 2001). Estos resultados  llevaron a formular  la propuesta de 
que  las proteínas que han evolucionado para  interaccionar con RNA, como  las ribotoxinas, habrían 
desarrollado determinantes estructurales y químicos para reconocer entramados de polifosfatos que 
podrían permitir el reconocimiento de una bicapa de fosfolípidos (Masip et al., 2001). Resulta muy 
interesante que cuando se resolvió la estructura cristalina de la restrictocina, el residuo equivalente 
a la Arg 121 (la Arg 120) se encontraba unido por un enlace de hidrógeno a una molécula de fosfato 
cocristalizada en el centro activo (Yang y Moffat, 1996). En resumen, todos estos resultados indican 
que la lámina β central de la α‐sarcina, que se predecía como una de las regiones menos apolares de 
la proteína (Martínez del Pozo et al., 1988; Mancheño et al., 1995b), está de hecho localizada en el 
núcleo hidrofóbico de  la bicapa  tras  la  interacción proteína‐vesícula  (Figura 5b)  (De Antonio et al., 
2000).  

Aparte  de  este  núcleo  hidrofóbico  de  la  α‐sarcina, mutaciones  puntuales  que  afectan  a 
residuos localizados en la horquilla β amino‐terminal (Lys 11 y Thr 20) y la variante de deleción Δ(7‐
22) sugirieron que esta porción de la proteína también podría estar implicada en la interacción con 
membranas celulares (García‐Ortega et al., 2001,2002), pues presentan un patrón de interacción con 
vesículas  lipídicas  diferente  al  de  la  proteína  silvestre.  Cuando  es  la  restrictocina  la  proteína 
ensayada, el  comportamiento  también es diferente al de  la  α‐sarcina nativa  (García‐Ortega et al., 
2001). Debe mencionarse que  las  secuencias de  la  α‐sarcina  y  la  restrictocina difieren  sólo en 20 
aminoácidos, y que seis de esos cambios se concentran en la horquilla β amino‐terminal (Figura 2). 
De  acuerdo  con  esta  idea,  el  comportamiento  del mutante  α‐sarcina  Δ(7‐22)  es  perfectamente 
compatible con la ausencia de una región de la proteína capaz de interaccionar con vesículas (García‐
Ortega et al., 2002). 

Finalmente, el bucle 2 ha sido también propuesto por varios autores (Yang y Moffat, 1996; 
Martínez del Pozo et al., 1988; Kao y Davies, 1999; Pérez‐Cañadillas et al., 2000) como una de  las 
regiones de  la proteína  implicadas en  la  interacción con  lípidos (Figura 5b). Las diferencias entre  la 
estructura refinada por RMN de este bucle en  la α‐sarcina y  la restrictocina  (García‐Mayoral et al., 
2005a,b) podrían ayudar a explicar su distinto comportamiento al atravesar membranas celulares, 
pero esta posibilidad aún no ha sido directamente estudiada. 

 

 



 
19Introducción 

Propiedades enzimáticas 

Tras el descubrimiento de las ribotoxinas, su actividad enzimática permaneció desconocida 
durante mucho tiempo (Lamy et al., 1992) hasta que en 1977 Schindler y Davies publicaron que la α‐
sarcina  es  capaz  de  inactivar  tanto  los  ribosomas  de  Saccharomyces  cerevisiae  como  los  de 
Escherichia coli, aunque con eficiencias diferentes  (Schindler y Davies, 1977). Sorprendentemente, 
ninguno de estos organismos, ni  las  células HeLa, eran  susceptibles  a  la  toxicidad de  la  α‐sarcina 
cuando  las  células  están  intactas,  sugiriendo que  son  refractarias  a  la entrada de  la proteína. Un 
estudio más detallado concluyó que la acción de la α‐sarcina sobre ribosomas purificados afecta a la 
translocación  y  a  la  hidrólisis  de  GTP  catalizada  por  el  factor  de  elongación  EF‐2.  Finalmente, 
mediante  electroforesis  en  gel  se  separaron  las  distintas  especies  de  rRNA  de  los  ribosomas  de 
levadura tras la incubación con α‐sarcina, observándose la aparición de un fragmento extra de unos 
300 nucleótidos  (el denominado  fragmento α) correspondiente al extremo 3’ del rRNA 28S  (Figura 
6a)  (Schindler  y  Davies,  1977).  Experimentos  posteriores  mostraron  que  la  α‐sarcina  rompe  el 
esqueleto  fosfodiéster  en  el  lado  3’  de  la  G2661  (numeración  de  E.  coli)  (Endo  y Wool,  1982), 
mientras  que  la  ricina  despurina  el  enlace  N‐glicosídico  entre  la  ribosa  y  la  base  nitrogenada 
correspondiente al nucleótido adyacente a la A2660 por el lado 5’ (posiciones que corresponden a la 
G4325 y la A4324 en el rRNA 28S) (Figura 3) (Endo y Tsurugi, 1987; Endo et al., 1987). 

Por  tanto,  las  ribotoxinas  son RNasas altamente específicas  frente a  ribosomas  intactos y 
conservan esta especificidad cuando se ensayan frente a un rRNA desnudo que contiene al SRL. Sin 
embargo, si se emplean concentraciones elevadas también puede causar una digestión progresiva de 
todo el rRNA 28S sin que aparezca el fragmento α (Endo et al., 1993a,b; Wool, 1996,1997). Incluso se 
ha observado que cuando se ensayan relaciones enzima/sustrato elevadas  la α‐sarcina digiere DNA 
(Wool, 1984; Endo et al., 1993a,b). Esta actividad inespecífica ha sido aprovechada en algunos otros 
ensayos  ribonucleolíticos mucho menos  específicos,  que  no  se  basan  en  seguir  la  liberación  del 
fragmento α. En estos ensayos, la falta de significado biológico (por la falta de especificidad y por las 
concentraciones requeridas, mucho mayores que las catalíticas) se compensa por una cuantificación 
de los resultados mucho más sencilla, así como por la posibilidad de analizar los productos o incluso 
los  intermedios de  la  reacción. Así, aunque  son menos específicos, estos ensayos han contribuido 
significativamente al estudio detallado del mecanismo de corte de  las ribotoxinas (Lacadena et al., 
1994,1998; Kao et al., 2001; Martínez‐Ruiz et al., 2001). 

Normalmente  se  emplean  cuatro  tipos  de  ensayos  enzimáticos  en  el  estudio  de  las 
ribotoxinas (Kao et al., 2001; Martínez‐Ruiz et al., 2001). El primero y más específico es uno que usa 
su sustrato natural: ribosomas purificados o, al menos, un lisado de reticulocitos libre de células (Kao 
et al., 2001). La actividad específica puede visualizarse detectando  la  liberación de un fragmento α 
de  300‐400  nucleótidos  (dependiendo  del  origen  de  los  ribosomas)  en  un  gel  de  agarosa 
desnaturalizante  teñido  con  bromuro  de  etidio  (Figura  6a).  La  sensibilidad  de  este  ensayo  ha 
mejorado  recientemente con  la posibilidad de detectar este  fragmento  α por hibridación con una 
sonda específica de DNA marcada con fósforo 32P (Korennykh et al., 2006). 



 
20  Introducción 

En  orden  decreciente  de  complejidad,  y  por  tanto  de  especificidad,  un  segundo  ensayo 
usado  frecuentemente  se  basa  en  el  empleo  de  cortos  oligorribonucleótidos  sintéticos  que 
mimetizan  la  secuencia y estructura del SRL  (oligos  tipo SRL).  Las  ribotoxinas  rompen estos oligos 
tipo SRL de forma específica, produciendo sólo dos fragmentos, que pueden separarse en un gel de 
poliacrilamida  (Figura  6b)  (Endo  et  al.,  1988; Wool  et  al.,  1992),  aunque  esta  ruptura  es  varios 
órdenes de magnitud menos eficiente que la producida en ribosomas intactos (Glück y Wool, 1996; 
Wool, 1997). 

El tercer ensayo, mucho menos específico, es el zimograma (Figura 6c), en el que se evalúa 
la actividad ribonucleolítica frente a un homopolímero, como poli(A) o poli(I), embebido en un gel de 
poliacrilamida, tras la separación de las proteínas con una electroforesis en gel de poliacrilamida en 
presencia de SDS (PAGE‐SDS) y su conveniente renaturalización eliminando el detergente. En algunos 
casos,  este  tipo  de  ensayo  puede  también  llevarse  a  cabo  en  disolución,  usando  dispositivos  de 
ultrafiltración  para  fraccionar  los  pequeños  oligonucleótidos  producidos  en  la  reacción 
ribonucleolítica  (Kao et al., 2001). Una ventaja del zimograma es su uso adicional como control de 
homogeneidad  de  la  muestra  de  proteína  en  cuanto  a  la  ausencia  de  otras  actividades 
ribonucleolíticas contaminantes. 

El  cuarto  ensayo  se  basa  en  el  hecho  de  que  las  ribotoxinas  son  también  capaces  de 
hidrolizar distintos dinucleósidos (o dinucleótidos) fosfato, como ApA (o ApAp), aunque con mucha 
menor eficiencia  (Lacadena et al., 1998). Este  tipo de  sustrato debe  ser  considerado  como el que 
contiene  los elementos mínimos para  ser  roto por una RNasa.  La ventaja en este caso es que  los 
productos,  sustratos e  intermedios de  la  reacción pueden  ser  separados y cuantificados por HPLC 
(Figura 6d), suministrando información sobre las distintas etapas (Lacadena et al., 1998). 

Figura 6. Ejemplos de los distintos ensayos utilizados para estudiar la actividad ribonucleolítica de las 
ribotoxinas. Se indica la presencia (+) o ausencia (‐) de α‐sarcina en el ensayo. (a) Ruptura específica de 
ribosomas  de  conejo.  El  fragmento  α  está  indicado  por  una  flecha.  (b)  Ruptura  específica  de  un 
oligonucleótido  de  35‐mer que mimetiza  el  SRL.  (c)  Zimograma  frente  a poli(A).  (d) Resolución por 
HPLC de los productos obtenidos tras la incubación de α‐sarcina con ApA. 



 
21Introducción 

La  combinación de estos diferentes ensayos y  la producción y  caracterización de muchos 
mutantes  diseñados  tanto  aleatoriamente  como  de  forma  dirigida  (Yang  y  Kenealy,  1992a,b; 
Lacadena et al., 1995,1999; Kao et al., 1998) han permitido no sólo la identificación de los residuos 
de las ribotoxinas implicados en la reacción catalítica, sino también la determinación de sus distintas 
funciones durante la ruptura del enlace fosfodiéster. Las RNasas no citotóxicas T1 y U2 han sido de 
gran ayuda en estos estudios como modelos de referencia. El mecanismo enzimático de la RNasa T1, 
por ejemplo, está perfectamente establecido (Figura 7), con la mayoría de los residuos que forman el 
centro activo asignados (Steyaert, 1997; Loverix y Steyaert, 2001; Yoshida, 2001). Esta enzima sigue 
el mecanismo general ácido‐base de ruptura endonucleolítica de RNA en dos etapas. Primero, hay 
una  reacción  de  transfosforilación  para  formar  un  intermedio,  fosfato  cíclico‐2’,3’.  Segundo,  este 
intermedio de reacción es hidrolizado al correspondiente fosfato‐3’ (Figura 7). La aparición de este 
intermedio  cíclico,  común  a  todas  las  RNasas  de  la  familia  de  la  T1  estudiadas  hasta  ahora, 
incluyendo a la RNasa U2, hace que estas enzimas se denominen RNasas ciclantes. El análisis de las 
reacciones de  ruptura desarrolladas por  la  α‐sarcina  frente  a distintos dinucleósidos monofosfato 
probó que  también es una RNasa ciclante  (Lacadena et al., 1998,1999),  con un pH óptimo de 5.0 
(Pérez‐Cañadillas  et  al.,  1998;  Lacadena  et  al.,  1999).  Por  tanto,  las  ribotoxinas  siguen  el mismo 
esquema  general  de  reacción  que  los  otros miembros  de  la  familia  de  la  RNasa  T1  aunque  la 
eficiencia  catalítica  de  las  RNasas  T1  y  U2  frente  a  RNA  desnudo,  homopolinucleótidos  o 
dinucleótidos  es  varios  órdenes  de  magnitud  mayor.  En  cambio,  cuando  se  ensayan  frente  a 
sustratos  naturales,  las  ribotoxinas  rompen  y  consecuentemente  inactivan  el  ribosoma  con  una 
constante  de  velocidad  de  segundo  orden  (kcat/Km  de  1.7  x  10

10M‐1  s‐1)  que  iguala  a  la  eficiencia 
catalítica de las enzimas más rápidas conocidas (Korennykh et al., 2006). 

Figura 7. Modelo propuesto para el mecanismo  catalítico de  las RNasas  ciclantes  frente a  sustratos 
dinucleósido (ApA o GpA). Un proceso de transfosforilación (en el que se producen el correspondiente 
mononucleótido  cíclico  2’‐3’  y  adenosina)  va  seguido  por  la  hidrólisis  del  nucleótido  cíclico,  para 
producir el correspondiente mononucleótido‐3’. (A), (B) y (C) son His 92, Glu 58 e His 40 en la RNasa T1 
(Steyaert, 1997), e His 137, Glu 96 e His 50 en la α‐sarcina (Lacadena et al., 1999). 



 
22  Introducción 

En el caso de la RNasa T1, durante el primer paso de la reacción, el Glu 58 actúa como una 
base general y la His 92, como un ácido general (Figuras 4 y 7). La hidrólisis del derivado cíclico está 
catalizada por los mismos grupos, pero con sus papeles intercambiados (Steyaert, 1997). De hecho, 
el  par  de  residuos  catalíticos  más  comúnmente  encontrados  en  RNasas  microbianas  es  esta 
combinación Glu/His  (Yoshida, 2001). Otro residuo de histidina,  la His 40, se requiere en su  forma 
protonada para asistir a  la estabilización electrostática del estado de  transición y,  si es necesario, 
parece ser capaz de adoptar la función de base general, como se vio con las variantes de la RNasa T1 
con  el Glu  58 mutado  (Steyaert  et al., 1990;  Steyaert,  1997).  La  superposición de  las  estructuras 
tridimensionales de  las RNasas T1 y U2 con  las de  la α‐sarcina y  la restrictocina mostraron que  los 
aminoácidos equivalentes eran la His 137, el Glu 96 y la His 50 en la α‐sarcina, y la His 136, el Glu 95 
y la His 49 en la restrictocina (Figura 4) (Sacco et al., 1983; Martínez del Pozo et al., 1988; Campos‐
Olivas et al., 1996b). Además, cuando se intentó producir la restrictocina silvestre y varios mutantes 
en  S.  cerevisiae  se observó que  sólo era  capaz de  crecer  la  cepa que producía el mutante H136L 
(Yang y Kenealy, 1992a,b). Los mismos autores produjeron y caracterizaron parcialmente este mismo 
mutante en A. niger y A. nidulans (Brandhorst et al., 1994) con resultados muy similares. No mucho 
después,  otras  variantes  equivalentes  de  la  α‐sarcina  (H137Q)  y  la  restrictocina  (H136Y)  fueron 
aisladas  y  caracterizadas  en  detalle  desde  puntos  de  vista  estructurales  y  funcionales;  lo  que 
confirmó que su falta de toxicidad se debía a la ausencia de actividad ribonucleolítica y no a cambios 
conformacionales importantes (Kao y Davies, 1995; Lacadena et al., 1995). Gracias a la producción y 
posterior caracterización de más mutantes que afectaban a esos tres residuos, en  la α‐sarcina y  la 
restrictocina, ahora es bien conocido que la His 137 y el Glu 96 son los únicos residuos de la α‐sarcina 
esenciales para  llevar a cabo  la reacción de tipo ácido‐base  (Brandhorst et al., 1994; Kao y Davies, 
1995,1999; Lacadena et al., 1995,1999; Sylvester et al., 1997; Kao et al., 1998). La His 50 contribuiría 
a la estabilización del estado de transición, como la His 40 de la RNasa T1, pero en este caso no sería 
capaz de sustituir al Glu 96 como base general en el mutante E96Q (Figura 7) (Lacadena et al., 1999). 
Esto  se  dedujo  porque  la  sustitución  de  la  His  50  (o  la  His  49  en  la  restrictocina)  por  distintos 
aminoácidos no  inactiva completamente a  la enzima, pero disminuye bastante  sus valores de kcat, 
mostrando solo actividades  residuales enzimáticas o citotóxicas, dependiendo de  la naturaleza del 
ensayo empleado  (Nayak y Batra, 1997; Sylvester et al., 1997;  Lacadena et al., 1999). Además,  se 
probó  que  los  tres  residuos  mencionados  se  requieren  para  la  inactivación  específica  de  los 
ribosomas, pues cada mutante  individual, así como  los mutantes dobles y el triple, carecen de esta 
actividad tan particular (Lacadena et al., 1999). 

El perfil de dependencia de  la actividad de  la  α‐sarcina  frente al pH es el  típico para una 
catálisis ácido‐base, pero sensiblemente distinto de  los descritos para  las RNasas T1 y U2 (Arima et 
al., 1968a,b; Sylvester et al., 1997; Pérez‐Cañadillas et al., 1998; Lacadena et al., 1999). El mutante 
H50Q  de  la  α‐sarcina  también  muestra  un  comportamiento  bastante  diferente,  debido 
probablemente a la ausencia de la carga positiva en el entorno del Glu 96. Finalmente, mientras que 
la α‐sarcina muestra una baja eficiencia para hidrolizar el intermedio cíclico, como hacen la mayoría 
de  las RNasas ciclantes, su variante H50Q es mucho más eficiente produciendo el AMP‐3’ a pH 7.0 
(Lacadena et al., 1999). Las medidas de RMN mencionadas antes  también  se usaron para calcular 
cómo estos residuos del centro activo muestran valores de pKa  lejanos a sus valores  intrínsecos,  lo 



 
23Introducción 

que explicaría  los distintos comportamientos no sólo en términos de especificidad sino también de 
dependencia con el pH (Pérez‐Cañadillas et al., 1998; Lacadena et al., 1999). 

En el cristal del complejo de la RNasa T1 con el sustrato mínimo 3’‐GMP (Loverix y Steyaert, 
2001),  la Tyr 38,  la Arg 77 y  la Phe 100 también aparecen  formando parte del sitio catalítico de  la 
enzima. Se ha especulado que esos tres residuos,  junto con  la His 40, formarían un microambiente 
dieléctrico  y  estructural  complementario  en  forma  y  carga  al  estado de  transición  y que  además 
tendría capacidad para formar enlaces de hidrógeno con los oxígenos ecuatoriales de este estado de 
transición, contribuyendo a  su  solvatación/desolvatación óptima  (Loverix y Steyaert, 2001).  La Tyr 
48, la Arg 121 y la Leu 45 son sus tres correspondientes estructurales en la α‐sarcina (Figuras 2 y 4), y 
por tanto también han sido estudiados. 

La Arg 77 de la RNasa T1 se localiza en las proximidades del grupo fosfato del sustrato, pero 
su posible papel funcional no se conoce, pues todos los intentos de aislar alguna RNasa T1 con una 
mutación  que  afecte  a  ese  residuo  han  sido  infructuosos  (Steyaert,  1997).  Así,  se  ha  propuesto 
durante mucho tiempo que  la Arg 77 de  la RNasa T1 debía de  facilitar el ataque nucleofílico, pero 
nunca se ha probado directamente por mutagénesis dirigida  (Steyaert, 1997). Por otro  lado,  la Arg 
121 de la α‐sarcina se ha reemplazado por Gln o Lys, mutaciones que no modifican la conformación 
de  la proteína, pero que abolen su actividad  inactivadora de ribosomas. Sorprendentemente, estos 
mutantes aún son activos frente a sustratos pequeños e inespecíficos como ApA (con una Km similar 
y una eficiencia catalítica menor a la de la proteína silvestre) (Masip et al., 2001). Además, como se 
mencionaba antes, la pérdida de la carga positiva en esa posición produce cambios dramáticos en la 
habilidad de la α‐sarcina para interaccionar con membranas fosfolipídicas (Masip et al., 2001). 

La Leu 145 de la α‐sarcina ocupa la posición equivalente a la Phe 100 de la RNasa T1 (Figuras 
2  y  4).  La  cadena  lateral  de  la  Phe  100  es  un  elemento  catalítico  apolar  que  estabiliza  las 
separaciones  de  carga  que  se  dan  en  el  estado  de  transición, mediante  el  control  del  entorno 
dieléctrico  (Doumen et al., 1996). La caracterización de una variante de  la α‐sarcina, L145F, reveló 
que este mutante  sigue  siendo una RNasa activa  (exhibe una Km  similar y una eficiencia  catalítica 
ligeramente  inferior frente a ApA), pero muestra una menor especificidad que  la proteína silvestre 
frente a rRNA y a sustratos tipo‐SRL (Masip et al., 2003). La Leu 145 también se reveló como esencial 
para  preservar  el  entorno  electrostático  del  centro  activo  requerido  para  mantener  el  pKa 
anormalmente bajo descrito para la His 137 catalítica (Masip et al., 2003). 

En el mutante L145F de  la α‐sarcina se observó que  la Asn 54 era uno de  los residuos que 
mostraba un mayor desplazamiento en el espectro de RMN con respecto a  la proteína silvestre. Se 
trata de un residuo conservado del bucle 2 (Figura 2) que no sólo contribuye a la estabilidad de las 
ribotoxinas, sino que además se requiere para su acción específica sobre los ribosomas, de acuerdo 
con los resultados obtenidos tras la caracterización de cinco mutantes distintos con cambios en esa 
posición  (Siemer  et  al.,  2004).  Estos  resultados  sugirieron  que  la  Asn  54  está  implicada  en  la 
disposición conformacional local del sitio de unión del sustrato. Las mutaciones en esa posición dan 
lugar  a  RNasas menos  eficientes,  especialmente  frente  a  sustratos  no  específicos  como  poli(A). 
Normalmente, los residuos implicados en la interacción con la base en el lado 5’ del enlace diana se 



 
24  Introducción 

denominan residuos de reconocimiento. Los resultados obtenidos con los mutantes de la Asn 54 de 
la α‐sarcina señalan que  los residuos 53 a 56 (52 a 55 en  la restrictocina) formarían ese bolsillo de 
reconocimiento en las ribotoxinas (Yang y Moffat, 1996). Sin embargo, el reconocimiento específico 
del ribosoma implica una red de interacciones mucho más compleja, en la que la mayoría no se ven 
perturbadas  por  la  mutación  de  la  Asn  54,  lo  que  explicaría  por  qué  casi  todos  los  mutantes 
mantenían la capacidad de liberar específicamente el fragmento α (Siemer et al., 2004). En conjunto, 
estos resultados concordaban perfectamente con la idea de los reordenamientos conformacionales 
locales de  los mutantes del centro activo de  la Asn 54 y  la Leu 145, dando  lugar a enzimas menos 
específicas y menos citotóxicas (Masip et al., 2003; Siemer et al., 2004). Otra observación importante 
de este trabajo fue comprobar que las ribotoxinas carecen de un residuo equivalente al Glu 46 de la 
RNasaT1,  implicado en discriminar entre guanina  y  adenina  (Gohda et al., 1994).  La  falta de este 
residuo podría explicar por qué esta ribotoxina se limita a preferir purinas cuando se ensaya frente a 
RNA desnudo, y no es específica de guanina,  como en el  caso de  la RNasa T1  (Endo et al., 1983, 
1988). 

La Tyr 48 de la α‐sarcina está conservada no sólo dentro de la familia de las ribotoxinas, sino 
también en  todas  las RNasas extracelulares  fúngicas  (Figura 2)  (Martínez‐Ruiz  et al., 1999a,b).  Su 
equivalente,  la Tyr 38 de  la RNasa T1,  forma un puente de hidrógeno con uno de  los oxígenos del 
fosfato en el complejo RNasa T1/3’‐GMP, interacción que debe de ser más favorable en el estado de 
transición  (Loverix y Steyaert, 2001). El mutante Y48F de  la  α‐sarcina  resultó  ser  inactivo  frente a 
sustratos de RNA polimérico, descubriéndose con este experimento el papel esencial del grupo OH 
en el anillo fenólico de  la Tyr 48 (Álvarez‐García et al., 2006). Este mutante, en cambio, sí es activo 
frente a ApA, lo que revela que retiene la actividad ribonucleolítica a ese nivel. En resumen, el grupo 
OH eliminado  sólo  contribuye  ligeramente a  la eficiencia  catalítica  frente a ApA, pero es esencial 
para la actividad característica de las ribotoxinas (la degradación específica del rRNA y los sustratos 
tipo SRL). 

Así, la Tyr 48, la Arg 121 y la Leu 145 parecen ser determinantes en la actividad ribotoxina 
de la α‐sarcina. Al estudiar las estructuras cristalinas de complejos de la restrictocina con inhibidores 
se  propuso  que  estas  ribotoxinas  debían  usar  un  mecanismo  que  permitiese  distorsionar  la 
disposición de las bases nitrogenadas de los nucleótidos de su enlace diana para facilitar la ruptura 
del  SRL  en  el  sitio  adecuado  (Yang  et  al.,  2001).  Todos  los  estudios  llevados  a  cabo  hasta  ahora 
sugieren que estos tres residuos contribuirían a facilitar esta distorsión de las bases que permitiría al 
triplete  His50/Glu96/His137  llevar  a  cabo  la  rotura  de  un  único  enlace  fosfodiéster  (Yang  et  al., 
2001). 

Además, en estudios con distintos mutantes de la α‐sarcina (García‐Ortega et al., 2001) y la 
mitogilina  (otra  ribotoxina que  sólo  se diferencia de  la  restrictocina en un  residuo)  (Kao y Davies, 
1999;2000)  se  ha mostrado  que  la  horquilla  amino‐terminal modula  la  actividad  catalítica  de  las 
ribotoxinas.  Estos  estudios  incluyeron  variantes  de  deleción  en  los  que  esa  horquilla  había  sido 
eliminada  sin  afectar  a  la  estructura  tridimensional  global  de  la  proteína  (García‐Ortega  et  al., 
2002,2005a;  García‐Mayoral  et  al.,  2004).  Estos mutantes  [α‐sarcina  Δ(7‐22)  y  Asp  f  1  Δ(7‐22)] 



 
25Introducción 

conservan  su  actividad  ribonucleolítica  inespecífica  así  como  su  capacidad  para  romper 
específicamente  oligonucleótidos  tipo  SRL,  pero  no  son  capaces  de  inactivar  específicamente 
ribosomas de conejo, y por tanto son mucho menos citotóxicas (García‐Ortega et al., 2002,2005a). 

Para  concluir,  es  importante  destacar  las  diferencias  exhibidas  por  la HtA.  Como  era  de 
esperar, ya que es una ribotoxina, esta proteína provoca una ruptura específica no sólo del rRNA 28S 
de conejo, sino también de los oligonucleótidos tipo‐SRL usados como sustrato (Herrero‐Galán et al., 
2008b).  En  cambio,  cuando  se  emplean  sustratos  menos  específicos,  la  HtA  muestra  un 
comportamiento bastante distinto, como refleja el hecho de que no es activa frente a poli(A), pero sí 
lo es  frente a poli(C)  (Herrero‐Galán et al., 2008b). Este comportamiento, que se ha observado en 
otras  ribotoxinas  silvestres  y  mutantes  (Nayak  et  al.,  2001),  debe  ir  unido  a  las  diferencias 
estructurales que presenta  la HtA, pero  la  interpretación no es obvia. Lo más probable es que este 
comportamiento refleje elementos del mecanismo catalítico aún desconocidos. 

 

 

Interacción con el SRL y el ribosoma 

Los  ribosomas  de  los  tres  dominios  filogenéticos,  Archea,  Bacteria  y  Eukarya, muestran 
diferencias  en  cuanto  a  sus  componentes,  pero  algunas  regiones  funcionales  están  siempre 
conservadas, probablemente porque son esenciales para preservar  la maquinaria de biosíntesis de 
proteínas (Mears et al., 2002; Uchiumi et al., 2002). Una de ellas es el SRL (Szewczak y Moore, 1995; 
Glück  y  Wool,  1996).  Esta  región  es  de  particular  interés  por  su  papel  crucial  en  los  eventos 
relacionados con  la elongación,  tanto en  ribosomas procariotas como eucariotas. Contiene una de 
las secuencias  ribosomales más  largas conservadas universalmente que se conocen  (A2654–A2665 
en  el  rRNA23S  de  E.  coli,  y A4318–A4329  en  el  rRNA  28S  de  rata),  y muestra  una  conformación 
característica, también conservada estructuralmente. Está tan conservada que cuando se elucidó  la 
estructura  cristalina  de  la  subunidad  grande  del  ribosoma  de  Halobacterium  marismortui,  la 
secuencia  del  rRNA  23S  se  encajó  en  el mapa  de  densidad  electrónica,  nucleótido  a  nucleótido, 
empezando  precisamente  por  la  secuencia  del  SRL  (Ban  et  al.,  2000).  Este  SRL  es  una  horquilla 
distorsionada, con una parte central  inusualmente rígida, y un tetrabucle GAGA, una G prominente 
en  un  cruce  de  la  hebra,  una  región  flexible,  y  un  dúplex  terminal  de  tipo A  (Figura  3). No  está 
asociado  con  ningún  bolsillo  de  potencial  electrostático  intenso  del  ribosoma,  pero  junto  con  la 
región  de  unión  a  la  L11,  el  tallo  L7/L12,  y  las  proteínas  ribosomales  L6  y  L14  (Figuras  3  y  5c), 
constituye un sitio de unión de factores de elongación requerido para un correcto  funcionamiento 
del  ribosoma  (Endo y Wool, 1982; Cameron et al., 2002; Van Dyke et al., 2002).  La  secuencia del 
dominio de unión de  la proteína L11 está  también universalmente conservada, de acuerdo con su 
papel esencial  (Mears et al., 2002). Curiosamente,  la orientación espacial del SRL y el dominio de 
unión  de  la  L11  en  el  ribosoma,  región  conocida  como  centro  GTPasa,  varía  no  sólo  entre  los 
distintos filos (Ramakrishnan y Moore, 2001; Mears et al., 2002; Uchiumi et al., 2002), sino también 
durante  las  distintas  etapas  de  la  formación  del  enlace  peptídico  (Gabashvili  et  al.,  2000).  Estas 



 
26  Introducción 

diferencias podrían explicar por qué distintas RIPs muestran afinidades distintas cuando se ensayan 
frente  a  ribosomas  diferentes  (Schindler  y  Davies,  1977;  Endo  y Wool,  1982; Wool  et  al.,  1992; 
Uchiumi et al., 2002). Las mutaciones que afectan a la secuencia contenida en el SRL dan lugar a una 
unión  deficiente  de  los  factores  de  elongación  y  de  los  aminoacil‐tRNA,  así  como  a  una menor 
fidelidad translacional (Liu y Liebman, 1996). Algunas de esas mutaciones son  letales, reforzando  la 
importancia  de  esta  región  para  la maquinaria  translacional  (Leonov  et  al.,  2003).  Estudios  de  la 
dinámica y la cinética del ribosoma muestran una movilidad considerable de ese centro GTPasa, y es 
posible que sufra cambios conformacionales esenciales para el correcto desarrollo de  la traducción 
(Nilsson y Nissen, 2005). 

Los estudios con oligonucleótidos sintéticos pequeños que mimetizan  la secuencia del SRL 
(Correll et al., 1998,1999,2003; Correll y Swinger, 2003) han vertido luz sobre los elementos del rRNA 
necesarios para que las ribotoxinas reconozcan el enlace fosfodiéster que va a ser hidrolizado. Estos 
análogos del SRL son de hecho reconocidos y rotos específicamente por las ribotoxinas (Endo et al., 
1988; Kao et al., 2001), aunque, como se mencionó en el apartado anterior, se necesitan cantidades 
de enzima mayores, lo que indica que el reconocimiento no es tan específico como con el ribosoma 
completo.  Incuestionablemente,  han  sido  de  gran  ayuda,  porque  mantienen  las  características 
estructurales que posee el SRL en el ribosoma completo y se han usado para establecer cuáles son 
los determinantes necesarios para el  reconocimiento del  SRL por parte de  las  ribotoxinas. Así,  se 
usaron modelos de ajuste (docking) y experimentos cinéticos para predecir  las regiones del rRNA y 
de las proteínas ribosomales capaces de establecer interacciones con las ribotoxinas (Yang y Moffat 
1996; Pérez‐Cañadillas et al., 2000; Correll et al., 2004; García‐Mayoral et al., 2005b). Algunas de 
estas predicciones se confirmaron con  la determinación de  las estructuras cristalinas de complejos 
restrictocina‐inhibidor hechos con distintas variantes de oligos de RNA tipo SRL (Figura 5a) (Yang et 
al.,  2001).  Estos  estudios  incluían  la  resolución  de  las  estructuras  de  dos  versiones mutantes  de 
oligonucleótidos que mimetizan el motivo SRL del rRNA 28S (Correll et al., 2003), así como de otros 
tres  análogos  distintos  del  SRL  acomplejados  con  la  restrictocina  (Yang  et  al.,  2001).  Según  los 
resultados obtenidos, hay dos áreas del SRL reconocidas tanto por las toxinas como por los factores 
de elongación: el tetrabucle GAGA y  la G2655 prominente  (Figura 3)  (Moazed et al., 1988; Glück y 
Wool, 1996; Munishkin y Wool, 1997; Pérez‐Cañadillas et al., 2000). La G2655 representa el sitio más 
crítico para  la unión de  los factores de elongación (Munishkin y Wool, 1997). En cambio, el tipo de 
nucleótido no parece ser determinante en el reconocimiento, sino más bien la conformación del SRL 
(Munishkin  y Wool,  1997;  Correll  et  al.,  1999,2003).  La  simulación  dinámica  molecular  de  dos 
estructuras del SRL basadas en estructuras cristalinas de motivos SRL de E. coli y rata revelaron que 
el tetrabucle GAGA es  la parte más dinámica de este motivo (Špačková y Šponer, 2006). De hecho, 
los  tetrabucles  GNRA  adoptan  una  geometría  desplegada  hasta  el momento  de  la  unión  de  los 
factores de elongación y/o  las  toxinas, como se observó en  los complejos SRL‐restrictocina que se 
han mencionado (Yang et al., 2001). Ya se ha indicado que esos estudios llevaron a proponer que las 
ribotoxinas debían de usar un mecanismo de distorsión de la orientación de la base para facilitar la 
ruptura de los sustratos SRL en el sitio adecuado (Yang et al., 2001), y que esa distorsión debía de ser 
un mecanismo común para todas las endonucleasas que actúan sobre sustratos plegados, como es el 
caso  de  las  ribotoxinas  (Yang  et  al.,  2001).  En  resumen,  según  los  resultados  mencionados 



 
27Introducción 

anteriormente,  hay  dos  regiones  distantes  de  las moléculas  de  ribotoxina  que  participan  en  su 
interacción específica con el SRL. Por un lado, la región rica en Lys correspondiente al bucle 3 de la α‐
sarcina  interacciona  con el enlace  fosfodiéster  cargado negativamente en  los alrededores de  la G 
prominente. Y, por otra parte,  la  secuencia dentro del bucle 2 que comprende  los  residuos 52‐55 
(una  secuencia extendida que  incluye a  la ya mencionada Asn 54) y algunos  residuos del bucle 5, 
contactan con el tetrabucle GAGA conservado que contiene el enlace que hidroliza la toxina (Figura 
5a). 

Es bastante obvio, sin embargo, que estas interacciones con el SRL no explican por sí solas la 
exquisita actividad específica mostrada por las ribotoxinas frente a los ribosomas intactos. Por tanto, 
se requieren otras interacciones con elementos ribosomales adicionales. En este sentido, se ha visto 
recientemente que el  contexto  ribosomal aumenta  la velocidad de  reacción en varios órdenes de 
magnitud. Esta ventaja catalítica parece surgir de  las  interacciones electrostáticas favorables con el 
ribosoma (Korennykh et al., 2006). Las ribotoxinas cargadas positivamente se unen al ribosoma con 
gran  afinidad  y  velocidad,  aumentando  así  la  velocidad  de  ruptura  del  SRL  en  varios  órdenes  de 
magnitud,  igualando  la eficiencia catalítica de  las enzimas más rápidas conocidas (Korennykh et al., 
2006).  La  α‐sarcina, por  ejemplo,  está muy  cargada:  el 39% de  su  superficie  está  compuesta por 
cadenas laterales cargadas y el 26% por cadenas laterales polares (Pérez‐Cañadillas et al., 2000). Por 
tanto,  se  sugiere  un mecanismo  de  localización  de  la  diana  en  el  que  la  α‐sarcina  encuentra  al 
ribosoma de forma aleatoria y entonces difunde por el campo electrostático ribosomal hasta el SRL. 
Hace  tiempo  se  describió  no  sólo  que  la  actividad  ribonucleolítica  de  la  α‐sarcina  se  ve 
completamente  inhibida por NH4

+, K+ o Na+ en  concentraciones  superiores a 0.2 M, así  como por 
niveles milimolares  de  algunos  cationes  divalentes  como  Ca2+, Mn2+  o Mg2+  (Endo  et  al.,  1983; 
Martínez  del  Pozo  et  al.,  1989),  sino  también  que  une  Zn2+,  Cd2+  y  Co2+  con  una  afinidad 
correspondiente a constantes de disociación en el rango milimolar (Martínez del Pozo et al., 1989). 
Se  propuso  que  esta  unión  está mediada  por  interacciones  con  las  cadenas  laterales  de  His  del 
centro  activo,  y  que  afecta  a  la  emisión  de  fluorescencia,  probablemente  modificando  al 
microambiente del Trp 51. En esos estudios se vio que los cationes Zn2+ son inhibidores efectivos de 
la  actividad  ribonucleolítica,  mientras  que  la  inhibición  promovida  por  la  mayoría  de  los  otros 
cationes estudiados se debe al establecimiento de interacciones con los sustratos usados, más que a 
la existencia de interacciones específicas con la proteína (Martínez del Pozo et al., 1989). 

En  este  contexto,  debe  considerarse  que  hay movimientos  internos  que  permiten  a  los 
elementos  de  reconocimiento  del  ribosoma  sondear  una  parte  significativa  del  espacio 
conformacional, incrementando las posibilidades de una unión exitosa. Como se ha explicado antes, 
los residuos 1‐26 en la α‐sarcina forman una gran horquilla β que puede ser considerada como dos 
láminas β consecutivas conectadas por una región bisagra. La segunda lámina β, que coincide con los 
residuos 7‐22, es una de  las  regiones  con mayor  flexibilidad  conformacional,  apareciendo  con un 
plegamiento  independiente  del  núcleo  de  la  proteína  (Pérez‐Cañadillas  et  al.,  2000,2002; García‐
Mayoral  et  al.,  2004).  Los  resultados  obtenidos  con  el  mutante  α‐sarcina  Δ(7‐22)  mencionado 
sugirieron que  la proteína  interaccionaría  con el  ribosoma a  través de, al menos, dos  regiones, el 
bien  conocido  SRL  del  rRNA  y  una  región  diferente  reconocida  por  la  horquilla  β  de  la  proteína 



 
28  Introducción 

(García‐Ortega et al., 2002). La estructura tridimensional del mutante en disolución (García‐Mayoral 
et al., 2004) mostró que conserva el plegamiento de la α‐sarcina silvestre, incluida la conformación 
espacial  de  los  bucles.  Las  diferencias más  significativas  se  concentran  en  el  bucle  2,  la  nueva 
orientación  del  bucle  3,  y  la  dinámica  del  bucle  5,  donde  la  heterogeneidad  conformacional  se 
observa como consecuencia de haber eliminado interacciones importantes con residuos del motivo 
original  (García‐Mayoral  et  al.,  2004). Además  de  su  integridad  estructural mantiene  la  habilidad 
para  romper  específicamente  oligonucleótidos  tipo  SRL,  pero  desaparece  el  reconocimiento 
altamente  específico  de  la  α‐sarcina  por  el  ribosoma.  Al  modelar  este  reconocimiento  de  las 
ribotoxinas por el ribosoma usando las estructuras tridimensionales de las α‐sarcinas silvestre y Δ(7‐
22)  se propusieron dos  interacciones más no  identificadas hasta  entonces  (García‐Mayoral  et  al., 
2005b). Una de ellas ocurriría entre una pequeña secuencia extendida del bucle 2 de la α‐sarcina y la 
proteína ribosomal L6 (Figura 5c). La segunda ocurriría entre los residuos correspondientes a la parte 
distal delecionada de  la horquilla  β y  la proteína  L14  (Figura 5c). Estas dos proteínas  ribosomales 
procariotas se localizan junto al SRL (Figura 3a), están presentes en los tres filos de organismos vivos 
(Ban et al., 2000), y parecen sufrir los cambios más sustanciales durante el proceso de biosíntesis de 
proteínas, de acuerdo con  los mapas del ribosoma de rayos X y criomicroscopía electrónica (Ban et 
al.,  2000; Gabashvili  et  al.,  2000). Obviamente,  la  interacción  que  implica  a  la  horquilla  β  no  es 
posible  en  el  mutante  de  deleción  y  parece  ser  crucial  para  el  reconocimiento  específico  del 
ribosoma  (García‐Mayoral et al., 2005b). Esta hipótesis se vio reforzada con  la observación de que 
una  región  homóloga  a  la  secuencia  11‐16  de  la  α‐sarcina  puede  encontrarse  en  el  EF‐2  de  S. 
cerevisiae  (Kao  y  Davies,  1999;  García‐Mayoral  et  al.,  2005b).  Tanto  las  ribotoxinas  como  las 
proteínas  ribosomales  L14  (o  sus  correspondientes  L23  en  organismos  eucariotas)  representan 
familias de proteínas altamente homólogas. Las regiones de interacción de la α‐sarcina y la L14 están 
conservadas  pero  exhiben  un  cierto  grado  de  variabilidad  (García‐Mayoral  et  al.,  2005b), 
especialmente considerando  los residuos  implicados de  la L14  (las proteínas L23 tienen secuencias 
que se relacionan sólo lejanamente). Este hecho ayuda a explicar no sólo la extraordinaria eficiencia 
catalítica  de  las  ribotoxinas  frente  a  los  ribosomas,  sino  también  sus  diferencias  potenciales, 
dependiendo del origen del ribosoma ensayado (Schindler y Davies, 1977; Endo y Wool, 1982; Endo 
et al., 1983; García‐Mayoral et al., 2005b). 

 

 

Actividad de las ribotoxinas frente a células intactas 

Ya se ha explicado que  la α‐sarcina es capaz de  inactivar  ribosomas en sistemas  libres de 
células de una gran variedad de organismos (Endo et al., 1993a,b; Kao y Davies, 1995), mientras que 
presenta una marcada selectividad cuando se usan células  intactas como diana. Esta especificidad 
parece venir determinada por  su habilidad para penetrar en  las células. Así,  la  α‐sarcina es activa 
frente  a  células  de mamífero  transformadas  o  infectadas  por  virus,  en  ausencia  de  ningún  otro 
agente permeabilizante (Fernández‐Puentes y Carrasco, 1980; Carrasco y Esteban 1982; Olmo et al., 
1993,2001; Turnay et al., 1993; Stuart y Brown, 2006). La proteína también es citotóxica, inhibiendo 



 
29Introducción 

la biosíntesis de proteínas, cuando se ensaya frente a ocho líneas celulares tumorales humanas y de 
rata  de  origen  mesenquimal,  glial  y  epitelial  (Turnay  et  al.,  1993).  Este  efecto  se  satura  y  es 
consistente con el hecho de que el paso a través de  la membrana celular sea el paso  limitante de 
velocidad pero,  en  cambio, no  se detecta daño de  esa membrana ni  alteraciones de  la  actividad 
mitocondrial (Turnay et al., 1993). De nuevo, estos experimentos confirmaron que la α‐sarcina posee 
un  carácter  citotóxico  intrínseco  y  bastante  específico,  en  ausencia  de  ningún  agente 
permeabilizante  externo,  virus  incluidos,  cuando  se  ensaya  frente  a  algunas  líneas  celulares 
transformadas.  Las  razones  particulares  para  esta  selectividad  a  nivel molecular  aún  no  se  han 
establecido completamente; sin embargo, como se mencionaba antes,  la presencia de  fosfolípidos 
ácidos en la cara externa de la membrana parece ser uno de los factores determinantes (Connor et 
al., 1989; Gasset et al., 1989,1990; Zachowski, 1993). 

Se  ha  estudiado  el  mecanismo  de  internación  de  la  α‐sarcina  en  células  intactas  de 
rabdomiosarcoma humano y los eventos que inducen la muerte celular (Olmo et al., 2001). Según los 
resultados obtenidos, la toxina se internaliza vía endocitosis viajando en endosomas ácidos y a través 
del  aparato  de  Golgi,  como  se  dedujo  del  requerimiento  de  ATP  y  de  los  efectos  del  NH4Cl,  la 
monensina y la nigericina en su citotoxicidad. Además de la inhibición de la biosíntesis de proteínas 
asociada a la ruptura específica del rRNA 28S, la α‐sarcina mata a las células de rabdomiosarcoma vía 
apoptosis. Mediante análisis comparativos de los efectos de la α‐sarcina y la ciclohexamida se dedujo 
que  esta  apoptosis  no  es  simplemente  una  consecuencia  directa  y  general  de  la  inhibición  de  la 
biosíntesis de proteínas (Olmo et al., 2001), aunque experimentos con un mutante catalíticamente 
inactivo  de  la  α‐sarcina  (H137Q),  que  no  es  citotóxico  ni  apoptótico,  revelaron  que  esta muerte 
celular programada está directamente relacionada con  los efectos catalíticos de  la toxina sobre  los 
ribosomas,  pues  ese mutante  exhibe  capacidades  de  interacción  con  lípidos  idénticas  a  las  de  la 
proteína silvestre (Lacadena et al., 1995). 

La falta de carga positiva en la posición correspondiente a la Arg 121 de la α‐sarcina produce 
un dramático impedimento de su capacidad para interaccionar con membranas fosfolipídicas (Masip 
et al., 2001), apoyando  la conclusión de que  la Arg 121 es un residuo esencial para  la citotoxicidad 
característica de la α‐sarcina y, presumiblemente, de otras ribotoxinas fúngicas. De acuerdo con sus 
actividades ribonucleolíticas y de interacción con lípidos alteradas, todas las variantes estudiadas con 
mutaciones que afectan a la especificidad de la proteína, especialmente el mutante de deleción Δ(7‐
22), muestran efectos de citotoxicidad disminuida sobre células de rabdomiosarcoma (García‐Ortega 
et al., 2002). Incluso la restrictocina muestra una capacidad de interacción con fosfolípidos menor, lo 
que está correlacionado con una citotoxicidad disminuida (García‐Ortega et al., 2001), como ya se ha 
mencionado antes en esta  revisión. Por otro  lado,  la HtA exhibe una citotoxicidad muy  similar en 
términos  de  IC50  (concentración  requerida  para  producir  un  50%  de  inhibición  de  biosíntesis  de 
proteínas) (Herrero‐Galán et al., 2008b). 

 

 



 
30  Introducción 

 

Las ribotoxinas como alérgenos 

Los  hongos  representan  una  de  las  principales  fuentes  de  alérgenos.  Dentro  de  ellos, 
Aspergillus  fumigatus,  un  patógeno  oportunista  humano,  ha  sido  bien  estudiado  (Walsh  y  Pizzo, 
1988; Bodey y Vartivarian, 1989). Normalmente una infección invasiva de esta especie es fatal si no 
se trata pronto, e  incluso entonces,  la terapia antifúngica fracasa frecuentemente. La  incidencia de 
infecciones por hongos ha aumentado últimamente, por el  incremento en el número de pacientes 
inmunodeprimidos, y  la  infección por A.  fumigatus es común en  los postoperatorios  (Pasqualotto, 
2006).  Entre  las  razones  por  las  que  A.  fumigatus  puede  comportarse  como  un  patógeno  de 
humanos está la capacidad para crecer rápidamente a temperaturas tan altas como 50°C, siendo la 
especie más  termófila  de  todas  las  de  Aspergillus  (Ronning  et  al.,  2005).  El  resto  de  los  hongos 
productores de  ribotoxinas crecen escasamente al cultivarlos por encima de  los 30°C. También es 
remarcable  que  A.  fumigatus  es  una  fuente  de  alergia  y  asma más  común  que  A.  nidulans  o  A. 
oryzae, las otras dos especies de Aspergillus spp. cuyas secuencias genómicas han sido determinadas 
(Galagan et al., 2005; Machida et al., 2005; Nierman et al., 2005). Curiosamente, todos los alérgenos 
de  A.  fumigatus  tienen  homólogos  cercanos  en  las  otras  dos  especies,  con  la  excepción  de  la 
ribotoxina Asp f 1 y la metaloproteasa Asp f 5 (Ronning et al., 2005), pero aún no está claro si Asp f 1 
es un  factor crítico en  la provocación de una respuesta alérgica. En este aspecto, debe recordarse 
que los alérgenos normalmente se definen como aquellas proteínas reconocidas por anticuerpos IgE 
contenidos  en  el  suero  de  los  pacientes  alérgicos.  En  relación  con  esto,  es  destacable  que  se 
encontró  restrictocina  en  la  orina  de  pacientes  con  aspergilosis  diseminada  (Arruda  et  al., 
1990,1992; Lamy et al., 1991), así como acumulada en las proximidades de los nodos de la infección 
fúngica  (Lamy  et  al.,  1991).  Aunque  se  ha  probado  que  Asp f 1  no  es  un  factor  de  virulencia 
importante  en  las  infecciones  de  A.  fumigatus  (Paris  et  al.,  1993;  Smith  et  al.,  1993,1994),  esta 
proteína está claramente  implicada en  la patogenicidad de  la aspergilosis broncopulmonar alérgica 
(ABPA), la más severa de las enfermedades alérgicas por inhalación, pues estos pacientes presentan 
altos niveles de  IgE específicos de Asp f 1 (Kurup et al., 1994; García‐Ortega et al., 2005a). El ABPA 
tiene una prevalencia del 1‐2% en pacientes con asma persistente, y este valor aumenta hasta el 15% 
en pacientes de  fibrosis quística  (Greenberger, 2002; Kurup et al., 2006). La explicación de que A. 
fumigatus  sea el hongo normalmente  implicado en estas enfermedades parece  ser, de nuevo,  su 
ubicuidad  y  sus  pequeñas  esporas,  que  crecen  de  forma  óptima  a  37°C.  De  esta  forma  puede 
colonizar  el  tracto  respiratorio  del  huésped,  provocando  el  comienzo  de  eventos  patológicos 
(Banerjee y Kurup, 2003). 

En  la diagnosis de  reacciones alérgicas  se usan  con  frecuencia extractos de A.  fumigatus, 
pero  se  trata de mezclas  complejas de hasta 200 proteínas,  glicoproteínas  y  compuestos de bajo 
peso molecular (Piechura et al., 1983) que son muy difíciles de estandarizar. Los intentos de mejorar 
la  diagnosis  se  centran  en  el  empleo  de  preparaciones  estándar  homogéneas  de  alérgenos 
producidos de  forma  recombinante  (Crameri  et al., 1998; Kurup  et al., 2006). A  este  respecto  es 
interesante destacar que Asp f 1 fue el primer alérgeno recombinante testado in vivo (Moser et al., 



 
31Introducción 

1992),  y  que  presentó  una  total  concordancia  con  las  determinaciones  serológicas  (Moser  et  al., 
1992;  Crameri  et  al.,  1998;  Hemmann  et  al.,  1999).  Desgraciadamente  el  alérgeno  nativo 
recombinante no está desprovisto de actividad citotóxica, y puede provocar anafilaxias. 

Como se ha mencionado anteriormente, las ribotoxinas tienen bucles mucho más largos que 
las  otras  RNasas  fúngicas  no  tóxicas,  que presumiblemente  están  implicados  en  su  especificidad, 
toxicidad  y  antigenicidad. De nuevo, debe  tenerse  en  cuenta que  la  región 7‐22,  contenida  en  la 
horquilla  β  amino‐terminal  característica  de  las  ribotoxinas,  presenta  la  mayor  variabilidad  de 
secuencia de aminoácidos entre  las  ribotoxinas  (Figura 3)  (Martínez‐Ruiz  et al., 1991a,b,2001), es 
altamente flexible y está muy expuesta al disolvente (Pérez‐Cañadillas et al., 2000; García‐Mayoral et 
al., 2004). De hecho, Asp f 1 difiere de  la  α‐sarcina en  sólo 19 aminoácidos  (87% de  identidad de 
secuencia),  y  cinco  de  esos  19  residuos  se  localizan  en  esa  horquilla  β  amino‐terminal.  Como  se 
asume  generalmente  que  las  regiones  expuestas  y  flexibles  de  las  proteínas  son  normalmente 
buenos candidatos a epítopos de células B, esta horquilla β podría ser un determinante principal de 
la  inmunorreactividad de estas proteínas. Esto se confirmó con  la producción y caracterización de 
Asp f 1,  α‐sarcina,  y  sus  correspondientes  variantes  Δ(7‐22)  (García‐Ortega  et al., 2002,2005a). En 
primer  lugar, estos datos confirmaron  la prevalencia significativa de anticuerpos  IgE específicos de 
Asp f 1  en  el  suero  de  pacientes  sensibilizados  a  Aspergillus  (García‐Ortega  et  al.,  2005a),  como 
habían  descrito  anteriormente  otros  autores  (Kao  et  al.,  2001;  Greenberger,  2002;  Kurup  et  al., 
2006). Este resultado fue particularmente importante en los pacientes de ABPA estudiados, pues en 
el  100%  de  ellos  se  encontraron  anticuerpos  IgE  anti‐Asp f 1.  En  segundo  lugar,  y  aunque  varios 
estudios  preliminares  con  péptidos  sintéticos  que  solapan  con  la  región  antes  mencionada 
produjeron resultados controvertidos en cuanto a su comportamiento antigénico (Kurup et al., 1998; 
Madan  et  al.,  2004),  las  tres  proteínas  estudiadas,  Asp f 1  Δ(7‐22),  α‐sarcina  y  α‐sarcina  Δ(7‐22), 
presentaron marcados  descensos  en  su  reactividad  frente  a  anticuerpos  IgE  anti‐Asp f 1  (García‐
Ortega et al., 2005a),  indicando que  la porción eliminada está  implicada en, al menos, un epítopo 
alergénico. Sin embargo, aunque  importante, éste no puede ser el único epítopo alergénico dentro 
de  esta  molécula,  como  se  dedujo  de  experimentos  de  inhibición  por  ELISA  (enzyme  linked 
immunosorbent assay). Los residuos esenciales de  los epítopos de Asp f 1 están cambiados en  la α‐
sarcina  silvestre,  pues  la  respuesta  frente  al  suero  de  los  pacientes  fue  incluso menor  para  esta 
proteína que para el mutante Asp f 1 Δ(7‐22). A pesar de su disminuida reactividad IgE, la prevalencia 
de las tres variantes de Asp f 1 se mantuvo prácticamente inalterada, y todas conservaron la mayoría 
de  los  epítopos  IgG  (García‐Ortega  et  al.,  2005a). De  esta  forma,  estas  variantes  de  deleción  no 
citotóxicas de  las  ribotoxinas  son moléculas prometedoras para uso en  la diagnosis  y en  terapias 
inmunomoduladoras en hipersensibilidad a Aspergillus. Sin embargo, aún  se  requieren ensayos  in 
vivo para evaluar esa posibilidad. 

 

 

 



 
32  Introducción 

 

Inmunotoxinas 

Una  de  las  estrategias  de  la  terapia  antitumoral  es  la  preparación  de  inmunotoxinas, 
siguiendo la idea descrita por Ehrlich en 1956. Este premio Nobel fue quien presentó el concepto de 
convertir a  las  células  tumorales en diana de  “balas mágicas”, que  consisten en un  transportador 
específico de tejido que distribuiría agentes tóxicos al tejido neoplásico (Ehrlich, 1956). En la pasada 
década  se  publicó  una  gran  cantidad  de  investigación  orientada  a  la  clínica  en  relación  a  las 
inmunotoxinas  (Reiter y Pastan, 1998; Kreitman et al., 1999; Brinkmann, 2000; Li et al., 2004). Las 
inmunotoxinas  son  agentes  terapéuticos  con  un  alto  grado  de  especificidad,  compuestas  por  un 
motivo  que  dirige  a  la  molécula  a  su  diana,  como  anticuerpos  o  ligandos  fisiológicamente 
importantes (factores de crecimiento o citoquinas), unidos a una toxina, sobre todo proteínas tóxicas 
de plantas o bacterias (Brinkmann y Pastan, 1994; Reiter y Pastan, 1998; Kreitman, 2001). 

Inicialmente, las inmunotoxinas se preparaban por conjugación de las toxinas a anticuerpos 
monoclonales.  El motivo  que  dirigía  a  la  inmunotoxina  a  su  diana  era  la molécula  de  anticuerpo 
completa (Kreitman, 2000). Como  los sitios de unión al antígeno están en  las regiones variables de 
los anticuerpos,  los estudios posteriores  trataron de verificar que esos  fragmentos Fab, obtenidos 
por digestión de las IgG con papaína, retenían la capacidad de interaccionar con antígenos (Ward et 
al.,  1989; Wörn  y  Plückthun,  2001),  dando  lugar  a  las  llamadas  inmunotoxinas  Fab  o  Fv,  que  se 
internaban más  fácilmente por  su menor  tamaño  (Brinkmann, 2000). El desarrollo de  tecnologías 
avanzadas  ha  permitido  la  producción  de  inmunotoxinas  recombinantes,  estabilizadas  por  un 
péptido flexible (scFv) o por un puente disulfuro entre los dominios variables (dsFv), con las ventajas 
de que pueden expresarse en varios organismos modelo, son fácilmente modificadas por ingeniería 
genética y son más estables (Kreitman, 2003; Li et al., 2004). 

En cuanto a la porción tóxica de la molécula, las toxinas más representativas empleadas han 
sido  la  ricina  (de plantas) y  la exotoxina A de Pseudomonas  (PE) o  la  toxina de  la difteria  (DT)  (de 
bacterias). La ricina está compuesta por dos subunidades unidas por un puente disulfuro, siendo  la 
cadena  A  la  responsable  de  la  actividad  glicosidasa  que  lleva  a  la  inactivación  de  los  ribosomas 
(Olsnes  y  Pihl,  1973a,b;  Endo  et  al.,  1987),  y  la  única  que  normalmente  se  usa  para  hacer 
inmunotoxinas (Ghetie et al., 1993; Engert et al., 1997; Schnell et al., 1998). La ricina despurina un 
único nucleótido contiguo al enlace fosfodiéster que rompen  las ribotoxinas (Endo y Tsurugi, 1987; 
Endo  et  al.,  1987),  una  actividad  catalítica  que  también  inactiva  al  ribosoma.  Se  han  obtenido 
también  diferentes  inmunotoxinas  que  contienen  la molécula  de  ricina  completa  o  la  cadena  A 
desglicosilada (Pastan et al., 1992; O’Toole et al., 1998). En cuanto a las toxinas bacterianas, PE y DT 
son proteínas de cadena única que inhiben la síntesis de proteínas al ADP‐ribosilar el EF‐2 (Carroll y 
Collier, 1987). Entre las inmunotoxinas derivadas de PE y DT, las más comúnmente usadas implican 
versiones truncadas de las toxinas, producidas por escisión genética de su dominio de unión, dando 
como resultado  las variantes PE38 o PE40  (Kondo et al., 1988; Kreitman et al., 1990,1993; Pastan, 
2003), y las variantes DT388 o DT389 (Foss et al., 1998; LeMaistre et al., 1998), respectivamente. 



 
33Introducción 

Las ribotoxinas presentan varias ventajas para su uso en el diseño de inmunotoxinas, como 
su  pequeño  tamaño,  su  alta  termoestabilidad,  su  resistencia  a  proteasas  y  su  actividad 
ribonucleolítica  tan eficiente  (Gasset et al., 1994; Kao et al., 2001; Martínez‐Ruiz et al., 2001). En 
cuanto a la restrictocina se han descrito, además, una baja inmunogenicidad y una menor toxicidad 
en  ratón  (Rathore  y  Batra,  1996).  Así,  se  han  usado  distintas  ribotoxinas  como  componentes  de 
inmunotoxinas (Orlandi et al., 1988; Conde et al., 1989; Hertler y Frankel, 1989; Wawrzynczak et al., 
1991;  Better  et  al.,  1992;  Rathore  y  Batra,  1996;1997a,b;  Rathore  et  al.,  1997).  Inicialmente,  las 
inmunotoxinas  basadas  en  ribotoxinas  se  construían  por  conjugación  química,  como  se  describió 
para, entre otras, la mitogilina (Better et al., 1992), la restrictocina (Orlandi et al., 1988; Conde et al., 
1989;  Rathore  y  Batra,  1996)  y  la  α‐sarcina  (Wawrzynczak  et  al.,  1991).  Las  inmunotoxinas  de 
segunda generación se diseñaron, principalmente con  la restrictocina, por  la fusión del cDNA de  la 
restrictocina con el que codifica la región scFv del anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor 
de la transferrina humana (anti‐TFR) (Rathore y Batra, 1997a,b), unidos por un péptido lineal flexible 
para  promover  el  plegamiento  independiente  de  las  dos  fracciones  de  la  inmunotoxina.  Estas 
construcciones  se  sometieron  posteriormente  a  ingeniería  para  mejorar  el  procesamiento 
intracelular y la distribución de la restrictocina (Goyal y Batra, 2000). 

Se han descrito algunas  inmunotoxinas basadas en  la α‐sarcina (Wawrzynczak et al., 1991; 
Rathore  et  al.,  1997),  con  la  ribotoxina unida químicamente  a  anti‐TFR o  anti‐Fib75.  La  α‐sarcina 
usada en estas construcciones se obtuvo de cultivos de A. giganteus (Wawrzynczak et al., 1991) o de 
la expresión heteróloga en E. coli  (Goyal y Batra, 2000). Se obtuvieron resultados prometedores al 
medir  la  citotoxicidad,  con  valores  de  IC50  similares  a  los  de  inmunotoxinas  basadas  en  toxinas 
bacterianas  o  de  plantas  (Goyal  y  Batra,  2000).  La  inmunotoxina  con  α‐sarcina  presentó  una 
estabilidad  equivalente  a  la  de  otras  análogas,  así  como  similares  actividades  farmacocinéticas  y 
específica sobre las células diana (Wawrzynczak et al., 1991). Sin embargo, no se han llevado a cabo 
estudios  posteriores  con  inmunotoxinas  basadas  en  la  α‐sarcina,  incluyendo  ensayos  clínicos, 
probablemente  por  el  gran  tamaño  de  la molécula  resultante,  que  podría  dificultar  la  correcta 
internación en tumores sólidos, o por la baja estabilidad estructural de los inmunoconjugados. Pero 
debe  tenerse  en  cuenta  que  estas  inmunotoxinas  de  α‐sarcina  no  se  produjeron  como 
inmunotoxinas de  segunda  generación  recombinantes,  como  las  inmunotoxinas de  cadena  simple 
(scFv‐IMTX) descritas después para  la restrictocina  (Rathore y Batra, 1997a,b), que dieron mejores 
resultados en  términos de estabilidad y ensayos de  citotoxicidad  in  vivo. E  incluso una  scFv‐IMTX 
podría  ser modificada  fácilmente  por  ingeniería  genética  para mejorar  la  actividad  citotóxica  o 
disminuir la toxicidad inespecífica in vivo o la inmunogenicidad. 

En relación con esto, recientemente se ha producido una inmunotoxina de cadena única en 
la  levadura  metilotrófica  Pichia  pastoris,  compuesta  por  el  dominio  variable  del  anticuerpo 
monoclonal  B5,  específico  contra  los  carbohidratos  de  LewisY,  que  son  muy  abundantes  en 
carcinomas, unido a la α‐sarcina a través de un péptido que contiene un sitio de ruptura por furina 
(scFv‐IMTXαs) (Lacadena et al., 2005). P. pastoris ha surgido como un sólido anfitrión de expresiones 
heterólogas, debido  a  la expresión  secretora eficiente de proteínas  recombinantes  complejas  con 
puentes disulfuro intermoleculares e intramoleculares correctos que no requiere estrategias in vitro 



 
34  Introducción 

adicionales de desplegamiento  y  replegamiento,  a diferencia de  la mayoría de  las  inmunotoxinas 
expresadas  de  forma  heteróloga  en  bacterias  (Cregg  et  al.,  1993; Gurkan  y  Ellar,  2003,2005). De 
hecho, P. pastoris posee promotores regulados estrictamente, como el del gen de la alcohol oxidasa 
1, que son perfectamente convenientes para  la expresión controlada de genes exógenos  (Cregg et 
al., 1989). De esta forma se han producido con éxito varias  inmunotoxinas extracelularmente en P. 
pastoris (Woo et al., 2002,2004,2006; Lacadena et al., 2005; Liu et al., 2005). 

El  anticuerpo  monoclonal  (mAb)  B5  pertenece  a  una  familia  de  mAbs  dirigidos  contra 
antígenos  relacionados  con  el  carbohidrato  de  LewisY  que  se  sobreexpresa  en  la  superficie  de 
muchos carcinomas,  incluidos  los tumores sólidos de mama y colon  (Pastan y Fitzgerald, 1991). Se 
han usado distintos miembros de la familia en muchas inmunotoxinas, como mAb B3 (Brinkmann et 
al., 1991,1993; Pai et al., 1991,1996; Benhar y Pastan, 1995a; Bera y Pastan, 1998), mAb B1 (Pastan y 
Fitzgerald,  1991;  Benhar  y  Pastan,  1995b;  Kuan  y  Pastan,  1996),  y  mAb  B5  (Benhar  y  Pastan, 
1995a,b). De hecho, mAb BR96 y vAb3S193  también  se han evaluado para  inmunoterapia dirigida 
(Trail et al., 1993; Rosok et al., 1998; Scott et al., 2000). Al menos  tres de estas  inmunotoxinas o 
inmunoconjugados han sido evaluados recientemente en ensayos en fase I en pacientes con cáncer, 
con resultados prometedores (Pai et al., 1996; Brinkmann, 2000). 

La scFv‐IMTXαs producida en P. pastoris presenta la actividad ribonucleolítica característica 
de  la α‐sarcina y una citotoxicidad específica frente a  líneas celulares que contienen el antígeno de 
LewisY (Lacadena et al., 2005). Y se ha ido más allá, caracterizándose inmunotoxinas basadas en ésta 
y modificadas genéticamente para aumentar la afinidad y la estabilidad (Lacadena et al., 2005). 

 

 

Conclusiones y futuras perspectivas 

Las  ribotoxinas  son RNasas únicas en  cuanto a  su especificidad  y  citotoxicidad. Su acción 
ribonucleolítica  destacable  y  exquisitamente  específica,  así  como  su  capacidad  para  atravesar 
membranas, han sido objeto de estudio durante muchos años, y ahora se conocen bien en términos 
moleculares,  gracias  a  la  combinación  de  una  amplia  variedad  de  técnicas  estructurales, 
espectroscópicas,  bioquímicas  y  celulares,  junto  con  la  producción  y  caracterización  de  un  gran 
número de mutantes (Lamy et al., 1992; Gasset et al., 1994; Wool, 1997; Kao et al., 2001; Martínez‐
Ruiz et al., 2001). La determinación de varias estructuras ribosomales de alta resolución y el uso de 
distintas vesículas lipídicas modelo y líneas celulares transformadas, susceptibles o no a la acción de 
estas  toxinas, han  sido de  gran  ayuda para descifrar  los detalles del mecanismo  citotóxico de  las 
ribotoxinas  a  nivel  molecular.  También  ha  sido  muy  útil  la  existencia  de  RNasas  extracelulares 
fúngicas no tóxicas bien conocidas, como la RNasa T1. Presumiblemente, estas RNasas no son tóxicas 
porque carecen de la capacidad antes mencionada de atravesar una bicapa fosfolipídica. Aún así han 
sido, y aún son, excelentes modelos de referencia con los que aproximarse al estudio de esta familia 
de  proteínas.  Desafortunadamente,  la  función  natural  de  las  ribotoxinas  aún  permanece 



 
35Introducción 

desconocida,  siendo  ésta,  definitivamente,  una  de  las  cuestiones más  interesantes  que  debe  ser 
resuelta.  En  relación  con  esto  aún  se  requieren  estudios  sobre  la  regulación de  la producción de 
ribotoxinas en su ambiente natural. En realidad, hay muchas evidencias indirectas que sugieren que 
estas proteínas  son  sintetizadas bajo algunas  condiciones de estrés  (Olson et al., 1965b; Meyer y 
Stahl,  2002,2003; Meyer  et  al.,  2002),  pero  aún  se  necesita  una  caracterización  directa  de  estos 
mecanismos. A este respecto no debe descartarse la conexión funcional con los sistemas procariotas 
TA (Condon, 2006). En efecto, el descubrimiento y caracterización de la HtA, una ribotoxina singular 
desde puntos de vista estructurales y funcionales, ha abierto una nueva puerta a  la adquisición de 
pistas  adicionales  sobre  el  origen  y  funcionalidad  de  las  ribotoxinas  fúngicas.  La  futura 
caracterización de esta proteína y otras similares, que probablemente aparecerán, dado el acelerado 
descubrimiento de nuevas  ribotoxinas, mejorará enormemente nuestro conocimiento de  la acción 
ribotóxica en su contexto natural.  

Esta falta de conocimiento sobre  la función natural, en cambio, no  limita su empleo como 
agentes terapéuticos. A pesar de que su uso como agentes antitumorales se abandonó enseguida, 
debido a su alta toxicidad (Roga et al., 1971), es cierto que la actual acumulación de datos sobre su 
mecanismo de acción permite la visión optimista de que estas ribotoxinas, o probablemente algunas 
variantes modificadas, puedan ser usadas con fines terapéuticos. En este sentido,  la producción de 
mutantes  hipoalergénicos  e  inmunotoxinas  destacan  como  las  alternativas más  plausibles  en  el 
futuro a medio plazo. 

En cuanto a  la primera aproximación, debe  remarcarse el posible empleo de  Lactococcus 
lactis, que  es un  constituyente primario de muchos  cultivos  iniciadores  industriales  y  artesanales 
usados  para  la  producción  de  una  amplia  variedad  de  productos  lácteos  fermentados.  En  la 
actualidad,  además,  se  han  convertido  en  “fábricas  celulares”  en  la  producción de metabolitos  y 
proteínas de membrana, y como un sistema de distribución de moléculas terapéuticas en el tracto 
gastrointestinal  (Steidler et al., 2000, Kunji et al., 2005). El estatus de L.  lactis como un organismo 
“generalmente considerado seguro”  (GRAS, generally  regarded as safe) confiere a este sistema  las 
características requeridas para probar protocolos  inmunoterapéuticos para enfermedades alérgicas 
relacionadas con Asp f 1. Con este objetivo en mente, se han obtenido cepas de L. lactis capaces de 
secretar  las variantes hipoalergénicas de Asp f 1 mencionadas antes  (Alegre‐Cebollada et al., 2005; 
García‐Ortega et al., 2005a), y aunque su uso como sistema potencial de distribución aún debe ser 
probado,  constituyen  una  de  las  direcciones  de  investigación  que  deberían  ser  exploradas 
inmediatamente. 

Las  inmunotoxinas  son  otra  alternativa  prometedora  para  el  empleo  de  las  ribotoxinas 
como  agentes  terapéuticos  contra  procesos  tumorales.  La  producción  de  grandes  cantidades  de 
versiones  de  inmunotoxina  mejoradas  de  α‐sarcina  (Lacadena  et  al.,  2005)  y  otras  RNasas 
microbianas ya está en marcha y es definitivamente una de las trayectorias de investigación a seguir 
en el futuro próximo. 



 
36  Introducción 



 
37Introducción 



 
38  Introducción 



 
39Introducción 



 
40  Introducción 



 
41Introducción 



 
42  Introducción 



 
43Introducción 



 
44  Introducción 



 
45Introducción 



 
46  Introducción 



 
47Introducción 



 
48  Introducción 



 
49Introducción 



 
50  Introducción 



 
51Introducción 



 
52  Introducción 



 
53Introducción 



 
54  Introducción 



 
55Introducción 



 
56  Introducción 



 
57Introducción 



 
58  Introducción 



 
59Introducción 



 
60  Introducción 



 
61Introducción 

 



 
63Objetivos 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Objetivos 



 
64  Objetivos 

 

   



 
65Objetivos 

 

 

 

En esta Tesis Doctoral se ha pretendido ahondar en el conocimiento de las ribotoxinas fúngicas 
y de algunas de sus posibles aplicaciones clínicas, abordando su estudio desde diferentes puntos de 
vista para alcanzar los siguientes objetivos: 

 

‐ Estudio de las relaciones estructura‐función de las ribotoxinas, en lo referente a: 

‐  Complementar  el  estudio  del  centro  activo  de  esta  familia  de  proteínas.  Para  ello,  se 
planteó el análisis de  la  función del único residuo conservado en el centro activo de  la α‐
sarcina cuyo papel aún no se había determinado. Este estudio se completó con el análisis de 
residuos clave para la actividad ribonucleolítica de la ribonucleasa microbiana no tóxica más 
próxima filogenéticamente a las ribotoxinas, la RNasa U2. 

‐ Avanzar en el análisis del elemento de estructura más característico de las ribotoxinas, la 
horquilla  β  del  extremo  amino‐terminal,  en  cuanto  a  su  función  de  reconocimiento  del 
sustrato y de interacción con membranas celulares. 

  ‐ Elucidar el efecto de la acción de las ribotoxinas en la funcionalidad del ribosoma. 

 

‐ Sentar las bases iniciales de algunas aplicaciones clínicas de las ribotoxinas. En concreto: 

‐ Desarrollar un modelo de ratón con hipersensibilidad a Asp f 1 para poder evaluar in vivo 
la hipoalergenicidad de algunos mutantes de α‐sarcina y Asp f 1. 

‐ Desarrollar cepas de Lactococcus  lactis productoras de α‐sarcina, Asp f 1 y mutantes con 
afinidad  reducida por  IgE para emplearlas  como vehículo de administración oral de estas 
proteínas. 



 
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RELACIONES ESTRUCTURA‐FUNCIÓN EN LAS RIBOTOXINAS 

 

A1. La tirosina 48, un residuo conservado de las ribotoxinas, está implicada en la 

degradación del RNA por parte de la α‐sarcina. 

En  el  centro  activo  de  la  ribonucleasa  T1,  junto  al  par  ácido/base  (His  92  y  Glu  58, 
respectivamente) y a la His 40, aparece un grupo de residuos que contribuyen a la estabilización del 
estado de transición de la reacción: la Tyr 38, la Arg 77 y la Phe 100. Sus equivalentes en la α‐sarcina 
son la Tyr 48, la Arg 121 y la Leu 145. Estos dos últimos residuos ya fueron estudiados anteriormente, 
comprobándose su implicación en la catálisis específica de las ribotoxinas. Pero la Tyr 48, a pesar de 
ser un residuo conservado no sólo dentro de  la familia de  las ribotoxinas sino en todo el grupo de 
ribonucleasas extracelulares fúngicas, nunca había sido objeto de estudio. En este trabajo se muestra 
cómo se produjo y purificó a homogeneidad un mutante de  la proteína en el que esa tirosina está 
sustituida  por  fenilalanina.  El  análisis  espectroscópico, que  incluyó dicroísmo  circular,  emisión  de 
fluorescencia y resonancia magnética nuclear, demostró que el mutante mantenía  la conformación 
de  la proteína nativa. Tampoco  se detectaron diferencias en cuanto a  la estabilidad  térmica de  la 
proteína  silvestre,  ni  a  su  capacidad  de  interacción  con  vesículas  de  fosfolípidos.  En  cambio,  los 
estudios enzimáticos  revelaron el papel esencial del grupo –OH del anillo  fenólico de  la Tyr 48. La 
sustitución mencionada da como  resultado una proteína que, aunque mantiene  la capacidad para 
romper el enlace fosfodiéster de un sustrato mínimo como el dinucleósido ApA, carece totalmente 
de actividad ribonucleolítica frente a sustratos poliméricos de RNA, incluidos los ribosomas, sustrato 
natural de las ribotoxinas. 

Trabajo A1:   Álvarez‐García E, García‐Ortega L, Verdún Y, Bruix M, Martínez del Pozo Á 
y Gavilanes  JG  (2006) Tyr‐48,  a  conserved  residue  in  ribotoxins,  is  involved  in  the RNA‐degrading 
activity of α‐sarcin. Biol Chem. 387: 535‐541.  



 
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A2. Papel del carácter básico de la horquilla β amino‐terminal de la α‐sarcina en 

el reconocimiento del ribosoma y en la interacción con fosfolípidos. 

Los  residuos  1‐26  de  la  α‐sarcina  forman  una  gran  horquilla  β  que  puede  considerarse 
compuesta por dos horquillas β consecutivas conectadas por una región bisagra. La parte más distal 
de esta gran horquilla  (que  comprende  la  secuencia 7‐22) aparece  como una protuberancia de  la 
proteína  y  es  una  de  las  regiones  con mayor  variabilidad  de  secuencia  entre  las  ribotoxinas.  La 
caracterización previa de una variante de la α‐sarcina carente de esta protuberancia mostró que se 
trata de una  región esencial para  la  citotoxicidad de  la proteína. Estudios  con modelos de ajuste, 
enzimáticos  y  de  interacción  lípido‐proteína  sugirieron  que  la  horquilla  β  amino‐terminal  está 
implicada en  la  interacción con membranas celulares y que establece  interacciones específicas con 
proteínas  ribosomales, orientando el centro activo de  la α‐sarcina hacia el SRL. Con el objetivo de 
analizar la influencia del carácter básico de esta horquilla β amino‐terminal en la actividad citotóxica 
de  las  ribotoxinas  (pues  a  lo  largo  de  sus  16  residuos  se  encuentran  1  arginina  y  4  lisinas),  se 
produjeron, purificaron a homogeneidad y caracterizaron cinco mutantes puntuales en los que esos 
cinco  residuos  básicos  se  sustituyeron  por  ácido  glutámico.  En  cuanto  al  reconocimiento  del 
ribosoma, todos  los mutantes mostraron una menor actividad que  la proteína silvestre frente a un 
lisado de  reticulocitos  libre de  células, mientras que  la  actividad  frente  a un oligorribonucleótido 
sintético que mimetiza el SRL o frente al homopolímero poli(A) no se vio afectada, confirmando que 
los  residuos  básicos  mutados  participan  en  interacciones  electrostáticas  con  otros  elementos 
ribosomales distintos del SRL y que estas interacciones mejoran el reconocimiento entre la enzima y 
su sustrato. El estudio de la interacción con vesículas de fosfolípidos mostró que la Lys 17, la Arg 22 
y,  sobre  todo,  las  Lys  14  y  21  son  residuos  cruciales  en  las  primeras  etapas  del  fenómeno  de 
agregación, en el que se requieren interacciones proteína‐vesícula y proteína‐proteína. En resumen, 
los datos obtenidos revelan que  las  interacciones electrostáticas en  las que participan  los residuos 
básicos  de  la  horquilla  β  son  esenciales  no  sólo  para  establecer  interacciones  específicas  con 
regiones  ribosomales distintas  al  SRL  sino  también para explicar  la  capacidad de  la proteína para 
interaccionar con bicapas de fosfolípidos ácidos. 

Trabajo A2:  Álvarez‐García E, Martínez del Pozo Á y Gavilanes JG (2009a) Role of the basic 
character of α‐sarcin’s NH2‐terminal β‐hairpin in ribosome recognition and phospholipid interaction. 
Arch Biochem Biophys. 481: 37‐44.  



 
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A3. Influencia de algunos residuos clave en la producción extracelular heteróloga 
de la ribonucleasa U2 en la levadura Pichia pastoris. 

La  ribonucleasa U2,  secretada por el hongo Ustilago  sphaerogena, es una RNasa  ciclante 
con una especificidad bastante  inusual dentro del grupo de  las RNasas extracelulares microbianas, 
familia representada por la RNasa T1. La superposición de las estructuras tridimensionales de ambas 
proteínas sugiere que el residuo equivalente a la histidina 92, esencial en el centro activo de la RNasa 
T1, es  la histidina 101 en  la RNasa U2. Por otra parte,  la RNasa U2 contiene tres puentes disulfuro, 
que se establecen entre las cisteínas 1‐54, 55‐96 y 9‐113. La presencia de dos cisteínas consecutivas 
en  la secuencia de  la proteína (Cys 54 y Cys 55) podría dar  lugar a una formación  incorrecta de  los 
puentes disulfuro que quizás constituya la explicación a la existencia de una fracción de proteína mal 
plegada que aparece en la producción heteróloga de RNasa U2 en Pichia pastoris.  

Con el objetivo de estudiar ambas hipótesis, se produjeron dos mutantes: U2 H101Q y U2 
C1/54S. Su purificación y caracterización desvelaron que la histidina 101 es un residuo esencial para 
el correcto plegamiento de  la proteína, al menos cuando se expresa en  la  levadura P. pastoris. La 
obtención  del  mutante  U2  H101Q  únicamente  bajo  la  forma  de  una  proteína  desnaturalizada 
imposibilitó, sin embargo, la extracción de conclusiones sobre la función puramente catalítica de ese 
residuo. En  cuanto al mutante de  las  cisteínas,  se pudo comprobar que  la eliminación del puente 
disulfuro entre los residuos 1 y 54, el único no conservado de los tres que aparecen en la proteína, 
no  afecta  en  absoluto  al  correcto  plegamiento  de  la  RNasa U2,  aunque  se  obtenga  un mutante 
mucho menos estable que la proteína silvestre. 

Trabajo A3:  Álvarez‐García E, García‐Ortega L, de los Ríos V, Gavilanes JG y Martínez del Pozo Á 
(2009b)  Influence  of  key  residues  on  the  heterologous  extracellular  production  of  fungal 
ribonuclease U2 in the yeast Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. (En prensa)   



 
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Influence of key residues on the heterologous extracellular production 
of fungal ribonuclease U2 in the yeast Pichia pastoris. 

 

Elisa Álvarez‐Garcíaa, Lucía García‐Ortegaa, Vivian De los Ríosb, José G. Gavilanesa*, Álvaro Martínez‐
del‐Pozoa* 

 

aDepartamento  de  Bioquímica  y  Biología Molecular  I,  Facultad  de  Ciencias Químicas, Universidad 
Complutense, Avenida Complutense s/n, Ciudad Universitaria, 28040 Madrid, Spain. 

bCentro de Investigaciones Biológicas – C.S.I.C., Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid, Spain 

 

*Corresponding  authors:  JGG  (ppgf@bbm1.ucm.es)  and  AMP  (alvaro@bbm1.ucm.es).  Fax:  34‐91‐
394‐4159 

 

Short title: Key residues in the production of ribonuclease U2 

 

 

Abstract 

Ribonuclease  U2,  secreted  by  the  smut  fungus  Ustilago  sphaerogena,  is  a  cyclizing 
ribonuclease  that  displays  a  rather  unusual  specificity within  the  group  of microbial  extracellular 
RNases, best represented by RNase T1. Superposition of the three‐dimensional structures of RNases 
T1 and U2  suggests  that  the RNase U2 His 101 would be  the  residue equivalent  to  the RNase T1 
catalytically essential His 92. RNase U2  contains  three disulfide bridges but only  two of  them  are 
conserved  among  the  family  of  fungal  extracellular  RNases.  The  non‐conserved  disulfide  bond  is 
established between Cys residues 1 and 54. Mispairing of the disulfide network due to the presence 
of  two consecutive Cys residues  (54 and 55) has been  invoked  to explain  the presence of wrongly 
folded RNase U2 species when produced in P. pastoris. In order to study both hypotheses, the RNase 
U2  H101Q  and  C1/54S  variants  have  been  produced,  purified,  and  characterized.  The  results 
obtained  support  the major  conclusion  that  His 101  is  required  for  proper  protein  folding when 
secreted by  the  yeast P. pastoris. On  the other hand,  substitution of  the  first Cys  residue  for  Ser 
results in a mutant version which is more efficiently processed in terms of a more complete removal 
of  the yeast  α‐factor  signal peptide.  In addition,  it has been  shown  that elimination of  the Cys 1‐
Cys 54 disulfide bridge does not interfere with RNase U2 proper folding, generating a natively folded 
but much less stable protein. 

 

Keywords: microbial ribonucleases, RNase T1, fungal ribonucleases, disulfide. 



 
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Introduction 

Ribonuclease  U2  (RNase  U2)  is  a  single  polypeptide  chain  enzyme  of  114  amino  acid 
residues secreted by the smut fungus Ustilago sphaerogena [1‐4]. This cyclizing ribonuclease displays 
a rather unusual specificity within the group of microbial extracellular RNases, best represented by 
RNase T1  [5‐7], showing a strong preference  for 3’‐linked purine phosphodiester  linkages  [8]. This 
unique specificity converts RNase U2 in a very useful biotechnological tool of increasing importance 
regarding RNA sequencing and processing [9‐11]. Indeed, this enzyme is the fungal non‐toxic RNase 
which  appears  to be  the phylogenetically  closest  relative of  ribotoxins,  a  family of highly  specific 
ribosome‐inactivating  fungal proteins with antitumoral properties  [12]. Therefore, RNase U2  is  the 
best model  to  compare  the mechanisms of both  toxic  and non‐toxic  groups of microbial RNases. 
Nevertheless, all these extracellular fungal RNases of the RNase T1 family, ribotoxins included, share 
an identical structural core [12‐15] and comparison of their three‐dimensional structures reveals that 
they have  equivalent  regular  secondary  structure  elements,  as well  as  an  almost  identical  spatial 
arrangement of  the  residues  involved  in  the active  site  (Fig. 1).  Superposition of  these  structures 
suggests that the RNase U2 residue equivalent to RNase T1 catalytically essential His 92 [5] would be 
His 101  [13,16]  (Fig.  1). With  the  purpose  of  verifying  this  hypothesis,  this  potentially  catalytic 
His 101 has been replaced by a Gln residue and the resulting mutant protein has been purified and 
characterized.  

Besides  being  a  small  enzyme,  RNase  U2  also  shows  a  good  number  of  unusual  structural 
attributes which may be related to its particular specificity and mode of action. For example, one of 
its most distinctive features is the absence of any Lys residue and the presence of just a single Arg, 
what  results  in  a highly  acidic pI  value of  about 3.0  [1,17,18],  and  an  anomalous  electrophoretic 
behavior, even in the presence of SDS [19]. It is also a peculiar protein from a spectroscopic point of 
view since it contains a single but strongly quenched Trp residue [20,21]. Natural wild‐type RNase U2 

Figure 1. Representation of the structures and active site residues of RNase T1 and RNase U2. The 
images were generated with the MOLMOL program [42] from the atomic coordinates deposited  in 
PDB (entries 1rnt and 1rtu, respectively). Superposition of side‐chain residues corresponding to the 
active  site  of  both  RNase  T1  (black)  and  RNase  U2  (grey)  is  also  represented.  Numbers within 
brackets correspond to RNase U2. 



 
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in  solution  is  slowly  converted  upon  ageing  into  two  other  isoforms  containing  one  or  two 
isoaspartate  bonds  and  different  secondary  structure  and  specific  enzymatic  activity  [17,21‐23]. 
Finally, RNase U2 contains three disulfide bridges being only two of them conserved among most of 
the  fungal  extracellular  RNases  known  [4,24].  Interestingly,  the  non‐conserved  one  is  established 
between Cys 1 and Cys 54, contiguous to Cys 55, also involved in another bridge with Cys 96 [1,25]. 
Mispairing of the disulfide network due to the presence of these two consecutive Cys residues (54 
and 55) has been invoked to explain the presence of two isoforms upon recombinant production of 
RNase U2  in  the  yeast  Pichia  pastoris  [4,21].  In  the  present work  this  hypothesis  has  been  also 
further explored  through production, purification, and characterization of a double mutant where 
both Cys residues 1 and 54 have been replaced by Ser. 

 

 

Materials and methods 

 

DNA Manipulations 

All of the materials and reagents were of molecular biology grade. Cloning procedures and 
bacteria manipulations were carried out according to standard methods [26], as described previously 
[27,28].  In  vitro  site‐directed  mutagenesis  using  a  double‐stranded  DNA  template  and  two 
oligonucleotides  annealing  to  the  complementary  strands  was  used  to  obtain  the  mutants  as 
described [26]. Two different mutants were constructed: A single one where His 101 was replaced by 
Gln  (H101Q)  and  a  double  one where  Cys 1  and  54 were  both  substituted  by  Ser  (C1/54S).  The 
template employed was the plasmid pPICZαU2, used before to produce the wild‐type protein  in P. 
pastoris [19], or that one corresponding to the mutated Cys 1 for the double mutant. These plasmids 
confer  resistance  to  the antibiotic  zeocin. The mutagenic primers used are  shown  in Table 1. PCR 
amplification of the mutagenic mixture was performed in standard conditions using a mixture of Taq‐
Gold and Vent DNA polymerases and  the Taq‐extender buffer  to  complete  the copy of  the entire 
lengths  of  both  template  complementary  DNA  strands.  Selection  of mutants was  achieved  after 
treatment  with  DpnI,  which  specifically  cleaves  methylated  sequences  [29].  The  expression 
constructs were obtained using  the Escherichia coli strain DH5αF’  [26‐28,30]. Presence of only  the 
mutations expected  in each  case was  confirmed by  sequencing  the  complete  cloned  cDNA at  the 
Universidad Complutense DNA‐Sequencing Facility. 

 

Production and purification of the proteins 

P.  pastoris  GS115  or  KM71  cells  carrying  the  corresponding  plasmids were  screened  as 
described [19,21,31]. The appropriate clones were first selected on zeocin‐containing agar plates and 
then  through  small‐scale  production  experiments.  Large‐scale  production  of  the  recombinant 
proteins was carried out  in buffered minimal medium as described [19,21]. The extracellular media 
of the corresponding cultures were exhaustively dialyzed against 20 mM piperazine, pH 6.0, and then 



 
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loaded onto DEAE‐cellulose equilibrated in the same buffer. The protein was eluted in each case with 
a 0‐0.5 M NaCl  linear gradient. Fractions containing the wild‐type RNase U2 or  its mutant variants 
were pooled, dialyzed against 50 mM sodium acetate, pH 4.5, and chromatographied on a 2’,5’‐ADP‐
Sepharose (Pharmacia) column, which acts as an affinity bed for fully active RNase U2 [21]. Proteins 
were finally eluted with a  linear gradient, 50 mM sodium acetate (pH 4.5)/50 mM Tris‐HCl (pH 7.0) 
containing  50 mM  NaCl. When  purifying  the  H101Q mutant,  volume  excluded  from  the  affinity 
column was also collected, concentrated, and further fractionated by means of a gel filtration step 
on a Bio‐Gel P10 column (2 x 150 cm) equilibrated in 50 mM Tris‐HCl, pH 7.0, containing 0.1 M NaCl. 
After both chromatographic steps,  fractions containing the mutant RNases U2 were  finally pooled, 
concentrated, dialyzed against 50 mM ammonium acetate, pH 4.5, and lyophilized. 

 

Table  1. Mutagenic  primers  used  to  construct  the  RNase U2 mutants H101Q  and  C1/54S.  The 
bases that change the original codon are underlined. 

mutation oligonucleotide sequence

C1S forward  5’‐ AAA AGA GAG GCT GAA GCT GAA TTG TCC GAC ATC CCT CAG TCC ACC 
AAC TGC ‐3’ 

C1S reverse  5’‐ GCA GTT GGT GGA CTG AGG GAT GTC GGA CAA TTC AGC TTC AGC CTC TCT 
TTT ‐3’ 

C54S forward  5’‐ GAA GCG TCT GAA GAC ATT ACT CTT TCC TGT  GGA TCC GGT CCT TGG TCC 
GAA ‐3’ 

C54S reverse  5’‐ TTC GGA CCA AGG ACC GGA TCC ACA GGA AAG AGT AAT GTC TTC AGA 
CGC TTC ‐3’ 

H101Q forward  5’‐ GGA GAG TTT TGT GCA ACC GTC ACT CAA ACG GGT GCA GCT AGT TAT 
GAC GGC ‐3’ 

H101Q reverse  5’‐ GCC GTC ATA ACT AGC TGC ACC CGT TTG AGT GAC GGT TGC ACA AAA CTC 
TCC ‐3’ 

 

 

Electrophoretic and chemical characterization 

Given  the  particular  electrophoretic  behavior  of  RNase  U2,  polyacrylamide  gel 
electrophoresis  and Western  blots were  performed  as  described  before  [19].  Glycoproteins  and 
glycopeptides were detected with biotinylated‐Con A lectin following a standard procedure [32,33]. 
Protein  hydrolysis  and  amino  acid  analysis  were  performed  according  to  standard  procedures 
[27,34].  These  analyses  were  employed  to  estimate  extinction  coefficients  (E0.1%)  and  protein 
concentrations  (Table  2).  Immunodetection  of  the  blotted  proteins was  performed with  a  rabbit 
polyclonal  sera  raised  against  purified  recombinant wild‐type  RNase  U2  [19].The  amino‐terminal 
sequences  were  determined  by  Edman  degradation  using  an  Applied  Biosystems  model  477A 
sequencer at the C.I.B.‐C.S.I.C. (Madrid, Spain) Protein Sequencing Facility. 



 
92  Resultados 

Table  2.  ‐  Purification  yields  and  structural  features  of  the  different  RNase  U2  protein  versions 
studied. 

Protein  yielda 
E0.1% 

(280 nm, 1 cm) 
Tm (ºC) 
pH 4.5 

Tm (ºC) 
pH 7.0 

NH2‐terminal sequence 

WTb  0.95  1.80  61  50  Glu‐Ala‐Glu 

H101Q  0.71  n.d.c  n.d.c  n.d.c 
Glu‐Ala‐Glu 
Glu‐Leu‐Cys 
Ala‐Glu‐Ala 

C1/54S  0.78  1.74  50  42  Glu‐Leu‐Ser 
 

aexpressed as mg of protein isolated by liter of original yeast culture. 
b[19] 
cnot determined 

 

 

Spectroscopic characterization 

Absorbance measurements were performed on an Uvikon 930  spectrophotometer at 100 
nm/min scanning speed, at room temperature and in 1 cm optical path cells. Circular dichroism (CD) 
spectra were obtained on a Jasco 715 spectropolarimeter, equipped with a thermostated cell holder 
and a NesLab‐111 circulating water bath, at 0.2 nm/s scanning speed. The instrument was calibrated 
with (1)‐10‐camphorsulfonic acid. CD spectra were recorded in cylindrical cells of 0.1 cm optical path. 
Mean  residue  weight  ellipticities  were  expressed  in  units  of  degree  x  cm2  x  dmol‐1.  Thermal 
denaturation profiles were obtained by measuring the temperature dependence of the ellipticity at 
220nm in the 25–85ºC range. The temperature was continuously changed at a rate of 0.5ºC/min. Tm 
(temperature at the midpoint of the thermal transition) values were calculated assuming a two‐state 
unfolding mechanism  [35]. Fluorescence emission spectra were  recorded on an SLM Aminco 8000 
spectrofluorimeter at 25ºC using a slit width of 4 nm  for both excitation and emission beams. The 
spectra were recorded for excitation at 275 and 295 nm and both were normalized by considering 
that Tyr emission above 380 nm  is negligible. The Tyr contribution was calculated as the difference 
between the two normalized spectra. Thermostated cells with a path length of 0.2 and 1.0 cm for the 
excitation  and  emission  beams,  respectively,  were  used.  The  temperature  was  controlled  by  a 
circulating water bath. All these experiments were performed with the proteins dissolved in 50 mM 
sodium acetate pH 4.5. 

 

Mass spectrometry 

Protein samples were analyzed as described before [19] on an Autoflex  III MALDI‐TOF‐TOF 
instrument (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) with a smartbeam laser. The spectra were acquired 
using a  laser power  just above the  ionization threshold. Samples were analysed  in the positive  ion 
detection and delayed extraction linear mode. Typically, 1000 laser shots were summed into a single 



 
93Resultados 

mass  spectrum.  External  calibration was  performed,  using  the  Protein  Calibration  I  from  Bruker, 
covering  the  range  from  5000  to  17000  Da.  The  2,5‐dihydroxy‐acetophenone  (2,5‐DHAP) matrix 
solution was prepared by dissolving 7.6 mg (50 μmol) in 375 μl ethanol followed by the addition of 
125 μl of 80 mM diammonium hydrogen citrate aqueous solution. For sample preparation, 2.0 μl of 
the sample were diluted with 2.0 μl of 2% trifluoro acetic acid aqueous solution and 2.0 μl of matrix 
solution. A volume of 1.0 μl of this mixture was spotted onto the stainless steel target and allowed to 
dry at room temperature. 

 

Ribonucleolytic Activity. 

The activity of  the purified proteins was assayed by using a zymogram against poly  (A)  in 
15% (w/v) polyacrylamide gels containing 0.1% (w/v) SDS and 0.3 mg/ml of the homopolynucleotide 
as previously described [19,27,28,30,36‐38]. After electrophoresis, the gel was washed to eliminate 
the SDS, incubated at pH 4.5 for 1.5 h at 37 °C, and then stained with 0.2% (w/v) toluidine blue. The 
proteins exhibiting  ribonuclease activity appear as  colorless bands, because of degradation of  the 
polynucleotide, after appropriate distaining. This assay is also useful to detect the presence of other 
RNA degrading activities in the protein samples. Volumograms of these bands (based on integrating 
all of the pixel intensities composing the spot) were obtained with the photo documentation system 
UVI‐Tec  (Cambridge, UK)  and  the  software  facility UVIsoft UVI band Windows Application V97.04 
[19,27,28,30,38]. These data were used to quantify the activity. 

 

 

Results and Discussion 

 

Protein production and purification 

In order to study the potentially catalytic role of His 101, the RNase U2 H101Q mutant was 
prepared,  produced  in  P.  pastoris  and  purified.  Unexpectedly,  no  2’,5’‐ADP‐Sepharose  binding 
fraction was detected but rather all the mutant protein appeared in the void volume of the column, 
according  to  its  electrophoretic  and  immunogenic  behavior  (Fig.  2).  This  affinity  chromatography 
step was  introduced previously [4,21], when first purifying the recombinant wild‐type RNase U2,  in 
order to remove a presumably misfolded fraction of the protein with an apparent Trp fluorescence. 
However,  now  the  production  of H101Q  in  identical  conditions  rendered  only  a  protein  fraction 
unable to bind to the affinity column. The 2’,5’‐ADP ligand should still be recognized if the active site 
geometric arrangement was being preserved in the mutant. In fact, substitution of the equivalent His 
residue  in  other  fungal  extracellular  RNases  has  resulted  in  inactive mutant  proteins which  still 
retained the native conformation [28,39]. So, this result suggested a misfolded conformation of the 
H101Q mutant to explain its inability to bind to the column. In order to confirm this suggestion, this 
excluded protein fraction was further fractionated by means of a gel filtration column, pooled and 
characterized (Table 2). 



 
94  Resultados 

 

Cysteine  pairing  isomerism  involving  Cys  residues  1,  54,  55  and  96  has  been  invoked  to 
explain the presence of a misfolded wild‐type RNase U2 fraction within the extracellular media of P. 
pastoris cells harboring the pPICZαU2 plasmid [4,21]. Given the result obtained upon purification of 
the H101Q mutant, and now  in order  to study  the  role of  the non‐conserved disulfide bridge,  the 
RNase U2 C1/54S double mutant was also produced and purified (Fig. 2). In this case, the mutant did 
bind to the column with no  immunoreactive protein detected  in the excluded fractions, suggesting 
that only a properly folded protein fraction was being produced, with a very similar yield than in the 
case of the wild‐type RNase U2 (Table 2). 

 

Structural characterization 

Amino acid analyses matched those ones expected according to their cDNA‐deduced amino 
acid  sequences  (data  not  shown).  Furthermore,  both  protein mutants  isolated  were  purified  to 
electrophoretic homogeneity (Fig. 2). RNase U2 does not bind SDS under the SDS‐PAGE conditions, 
its  electrophoretic mobility  being  only  determined  by  its  electrostatic  charge  and  hydrodynamic 
properties. Accordingly, the C1/54S mutant, lacking one disulfide bridge, exhibited a lower mobility 
when applied under non‐reducing  conditions  (Fig. 3),  suggesting a more  relaxed  conformation.  In 
both  cases  studied  the presence of  a predominant  immunoreactive band was  evident  confirming 
that a protein with  the RNase U2 polypeptide primary  structure was  the main  component  in  the 
purified preparations (Fig. 2). 

Figure 2. Electrophoretic analysis. (A) SDS‐PAGE and (B) 
Western blot of wild  type RNase U2  (1) and  its C1/54S 
(2) and H101Q  (3) mutants. All  samples were boiled  in 
the presence of 5.0 % β‐mercaptoethanol before being 
loaded onto the gel. 

Figure 3.  (A) SDS‐PAGE and  (B)  zymogram against poly 
(A), at pH 4.5, of wild type RNase U2 (1) and its C1/54S 
(2) and H101Q  (3) mutants. Prior  to be applied on  the 
gel,  all  samples were  boiled  but  in  the  absence  of  β‐
mercaptoethanol.  (C)  Biotinylated‐Con  A  staining  of  a 
Western  blot where  the  equivalent  samples  had  been 
electrotransferred.  In  this  case,  samples were  reduced 
with 5.0% β‐mercaptoethanol before being loaded onto 
the  polyacrylamide  gel.  The  first  line  on  the  left 
corresponds  to  pre‐stained  Precision  Plus  ProteinTM 
Standard.



 
95Resultados 

In wild‐type  RNase U2,  Cys 1  impairs  proper  proteolytic  processing  of  the  yeast  α‐factor 
signal peptide artificially fused to the RNase U2 sequence when produced in P. pastoris (Fig. 4). This 
fact explains why  the  recombinant wild‐type protein still  retains six amino acids belonging  to  that 
signal peptide  (Fig. 4 and Table 2) [16,18]. Amino‐terminal sequencing revealed the presence of at 
least  three different  sequences  for  the H101Q  sample  (Table 2),  corresponding  to  three different 
sites of signal‐peptide proteolytic processing (Fig. 4), and confirming the inefficiency of this cleavage 
which  is  indeed  heterogeneous  for  this mutant. On  the  other  hand,  substitution  of  Cys 1  by  Ser 
rendered  a  protein  with  a  single  amino‐terminal  sequence  (Table  2)  corresponding  to  a  more 
efficient signal‐peptide cleavage. Thus, only two extra residues remain  in the C1/54S mutant when 
compared  to  the  natural mature  protein  (Fig.  3).  These  observations were  further  confirmed  by 
MALDI‐TOF  analyses  (Fig.  5).  The  results  obtained matched  the molecular mass  expected  for  the 
C1/54S  protein while  they were  higher  and more  heterogeneous  for  the  other mutant  (Fig.  5), 
suggesting  the presence of posttranslational modifications  for  the H101Q RNase U2 as well as  the 
presence  of  small  size  contaminants.  Heterologous  protein  glycosylation  in  P.  pastoris  is  rather 
frequent even if that protein is not glycosylated by  its native host [40,41]. Wild‐type RNase U2 and 
the two mutants studied do not contain an Asn‐glycosylation consensus sequence. Nevertheless,  it 
has been shown that P. pastoris can also add O‐oligosaccharides composed of mannose to different 
residues of the same protein [40]. In fact, the H101Q mutant showed high degree of heterogeneous 
glycosylation  (Fig.  3) while  the wild‐type  and  the  C1/54S  variant were  not modified  in  identical 
culture conditions. Interestingly, the substituted His 101 is flanked by two Thr residues (Thr 100 and 
Thr 102)  that  eventually  might  become  accessible  to  glycosylation  upon  protein  misfolding. 
Furthermore, P. pastoris secretes mannans at high concentration that can non‐covalently associate 
with heterologous proteins expressed extracellularly and copurify with them [41], which may explain 
the presence of many of the small size contaminants observed in the H101Q MS spectrum. In good 
agreement with all results shown above, far‐UV CD spectra of wild‐type RNase U2 [19] and its C1/54S 
variant  were  indistinguishable  (Fig.  6),  while  the  H101Q  mutant  displayed  a  much  different 
spectrum, consistent with high content of random secondary structure (Fig. 6).  

One of  the most distinct  spectral  features of RNase U2  is  the  low  fluorescence  emission 
above  340  nm  besides  the  existence  of  a  Trp  residue.  Consequently,  the  C1/54S mutant  protein 
showed the characteristic  fungal natural RNase U2  fluorescence emission spectra centered around 
300 nm when excited at 275 nm (Fig. 7). On the other hand, quantum yields were much higher and 
Trp fluorescence emission was much more evident in the H101Q preparation (Fig. 7), as it had been 

Figure  4.  Scheme  showing  the 
different  signal  peptide  cleavage 
processing  sites  found  for  the 
different  recombinant  proteins 
studied  according  to  their  amino‐
terminal amino acid sequences. 



 
96  Resultados 

observed before with  the excluded protein  fraction of  the wild  type RNase U2  [4,21], and  in good 
agreement with a misfolded conformation.  

Thermal denaturation profiles of both wild‐type and C1/54S RNases U2  (Fig. 5) confirmed 
that  the mutant protein displayed a native conformation. The absence of  the disulfide bridge was 
however evidenced by its much lower Tm values when compared to the wild‐type protein (Table 2). 

In  summary,  the  structural  characterization  revealed  that  the  C1/54S  mutant  protein, 
capable of binding to the 2’,5’‐ADP‐Sepharose, exhibited the wild‐type native conformation but with 
a much reduced thermostability and a shorter amino‐terminal remain of the artificially fused signal 
peptide.  On  the  other  hand,  the  H101Q  variant  was  not  retained  by  the  affinity  column  and 
displayed  structural  and  spectroscopic  features  that were not  compatible with  the natural  fungal 
RNase U2 native conformation. 

Figure 5. Maldi‐TOF analyses of wild‐type 
RNase  U2  and  its  mutants  C1/54S  and 
H101Q. 

Figure  6.  Spectroscopic  characterization.  (A)  Far‐UV 
circular dichroism spectra of wild‐type  (    ), C1/54S  (    ), 
and H101Q  (    )  recombinant  versions of RNase U2  (B) 
Thermal  denaturation  profiles  at  pH  4.5  for wild‐type 
RNase  U2  (black)  and  its  mutant  C1/54S  (grey) 
measured by  recording  the ellipticity change at 220nm 
(Θ220)  vs  temperature. Mean  residue weight  ellipticity 
([Θ]MRW or Θ220) is expressed in deg cm

2 dmol‐1. 



 
97Resultados 

 

Enzymatic characterization 

Zymogram assays showed that the C1/54S mutant did cleave the homopolynucleotide poly 
(A) to a comparable extent (60%) as the native recombinant wild‐type RNase U2 at pH 4.5, a unique 
feature of  this enzyme  (Fig. 3).  In agreement with  the structural data discussed above,  the H101Q 
mutant was devoid of detectable enzymatic activity when assayed under identical conditions (Fig. 3). 

 

Conclusions 

Structural comparisons suggest RNase U2 His 101 as the best candidate residue to fulfill the 
role of general acid during  the  transphosphorylation  step  leading  to RNA  cleavage. Unexpectedly, 
mutation of this residue by Gln strongly supports the major conclusion that this residue is essential 
for proper protein  folding upon production  in P. pastoris. On  the other hand,  the non‐conserved 
disulfide bond very  clearly  influences  the  stability of  the protein,  since  its elimination  results  in a 
native  and  fully  active  but  less  stable  mutant  RNase  U2,  as  evidenced  by  the  thermostability 
experiments. However,  the  presence  of  Cys 1  leads  to  a  deficient  removal  of  the  yeast  α–factor 
signal peptide used to  induce  its secretion to the extracellular medium. Both Cys 1 and 54 do also 
seem to allow a percentage of incorrect disulfide bridges arrangement resulting in the production of 
a  significant  amount  of wild‐type  protein molecules  exhibiting  a  non‐native  folding  pattern  and 
therefore unable to bind to the affinity column employed for their purification. 

Figure  7.  Fluorescence  emission  spectra  of 
wild‐type RNase U2 and the mutants C1/54S 
and H101Q. All  spectra were  recorded using 
proteins  with  identical  280  nm‐absorbance 
values.  Spectra  labeled  ‘1’  resulted  from 
excitation at 275 nm and  spectra  labeled  ‘2’ 
from  excitation  at  295  nm  (tryptophan 
contribution). These spectra were normalized 
at  wavelengths  above  380  nm.  Spectra  ‘3’ 
(tyrosine  contribution)  were  calculated  by 
subtracting  spectra  ‘2’  from  spectra  ‘1’. 
Fluorescence emission units were arbitrary. 



 
98  Resultados 

Acknowledgements 

   

This  work  was  supported  by  grant  BFU2006‐04404  from  the Ministerio  de  Educación  y 
Ciencia  (Spain).  E.  A.‐G.  is  recipient  of  a  fellowship  from  the Ministerio  de  Educación  y  Ciencia 
(Spain). L.G.‐O.  is a  Juan de  la Cierva  research  fellow, a position partially  funded by  the European 
Social Foundation. 

 

 

References 

 

[1]  S.  Sato, T. Uchida, The amino acid  sequence of  ribonuclease U2  from Ustilago  sphaerogena, 
Biochem. J. 145 (1975) 353‐360. 

[2]  T. Arima, T. Uchida, F. Egami, Studies on extracellular ribonucleases of Ustilago sphaerogena. 
Purification and properties. Biochem. J. 106 (1968) 601–607. 

[3]  T. Arima, T. Uchida, F. Egami, Studies on extracellular ribonucleases of Ustilago sphaerogena. 
Characterization of substrate specificity with special reference to purine‐specific ribonucleases. 
Biochem. J. 106 (1968) 609–613. 

[4]  A. Martínez‐Ruiz, L. García‐Ortega, R. Kao, J. Lacadena, M. Oñaderra, J.M. Mancheño, J. Davies, 
A. Martínez del Pozo, J.G. Gavilanes, RNase U2 and α‐sarcin: a study of relationships. Methods 
Enzymol. 341 (2001) 335–351. 

[5]  J.  Steyaert,  A  decade  of  protein  engineering  on  ribonuclease  T1‐atomic  dissection  of  the 
enzyme‐substrate interactions. Eur. J. Biochem. 247 (1997) 1‐11. 

[6]  H. Yoshida, The ribonuclease T1 family. Methods Enzymol. 341 (2001) 28‐41. 

[7]  S. Loverix, J. Steyaert, Deciphering the mechanism of RNase T1. Methods Enzymol. 341 (2001) 
305–323. 

[8]  T. Uchida, T. Arima, F. Egami, Specificity of RNase U2. J. Biochem. 67 (1970) 91‐102. 

[9]  M.  Escaffre,  A.  Favre,  J.C.  Chottard,  S.  Bombard.  Determination  of  platinated  purines  in 
oligoribonucleotides by limited digestion with ribonucleases. Anal. Biochem. 310 (2002) 42‐49. 

[10]  N.N. Singh, R.N. Singh, E.J. Androphy. Modulating role of RNA structure in alternate splicing of a 
critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Res. 35 (2007) 371‐389. 

[11]  J.S. Yu, R.J. Kokoska, V. Khernici, D.A. Steege.  In‐frame overlapping genes: The challenges  for 
regulating gene expression. Molec. Microbiol. 63 (2007) 1168‐1172.  



 
99Resultados 

[12]  J.  Lacadena,  E.  Álvarez‐García,  N.  Carreras‐Sangrà,  E.  Herrero‐Galán,  J.  Alegre‐Cebollada,  L. 
García‐Ortega, M. Oñaderra, J.G. Gavilanes, A. Martínez del Pozo, Fungal ribotoxins: molecular 
dissection of a family of natural killers. FEMS Microbiol. Rev. 31 (2007) 212‐237. 

[13]  R. Campos‐Olivas, M. Bruix,  J.  Santoro, A. Martínez del Pozo,  J.  Lacadena,  J.G. Gavilanes, M. 
Rico, Structural basis for the catalytic mechanism and substrate specificity of the ribonuclease 
α‐sarcin. FEBS Lett. 399 (1996) 163‐165. 

[14]  X. Yang, K. Moffat,  Insights  into specificity of cleavage and mechanism of cell entry  from  the 
crystal structure of the highly specific Aspergillus ribotoxin, restrictocin. Structure 4 (1996) 837‐
852. 

[15]  J.M.  Pérez‐Cañadillas,  J.  Santoro,  R.  Campos‐Olivas,  J.  Lacadena,  A. Martínez  del  Pozo,  J.G. 
Gavilanes, M. Rico, M. Bruix, The highly refined solution structure of the cytotoxic ribonuclease 
α‐sarcin  reveals  the  structural  requirements  for  substrate  recognition  and  ribonucleolytic 
activity. J. Mol. Biol. 299 (2000) 1061‐1073. 

[16]  E. Herrero‐Galán, J. Lacadena, A. Martínez del Pozo, D.G. Boucias, N. Olmo, M. Oñaderra, J.G. 
Gavilanes,  The  insecticidal  protein  hirsutellin  A  from  the  mite  fungal  pathogen  Hirsutella 
thompsonii is a ribotoxin. Proteins 72 (2008) 217‐228. 

[17]  S.  Kanaya,  T.  Uchida,  Comparison  of  the  primary  structures  of  ribonuclease  U2  isoforms. 
Biochem. J. 240 (1986) 163‐170. 

[18]  S. Kanaya, T. Uchida, Revised sequence of  ribonuclease U2  in  the substrate‐binding  region.  J. 
Biochem. 118 (1995) 681–682. 

[19]  L. García‐Ortega, V. De  los Ríos, A. Martínez‐Ruiz, M. Oñaderra,  J.  Lacadena, A. Martínez del 
Pozo, J.G. Gavilanes, Anomalous electrophoretic behavior of a very acidic protein: ribonuclease 
U2. Electrophoresis 26 (2005) 3407‐3413. 

[20]  S.  Minato,  A.  Hirai,  Characterization  of  Ustilago  Ribonuclease  U2.  Effects  of  chemical 
modification  at  glutamic  acid‐61  and  cystine‐1  and  of  organic  solvents  on  the  enzymatic 
activity. J. Biochem. 85 (1979) 327–344. 

[21]  A. Martínez‐Ruiz, L. García‐Ortega, R. Kao, M. Oñaderra, J.M. Mancheño, J. Davies, A. Martínez 
del  Pozo,  J.G. Gavilanes, Ribonuclease U2:  cloning, production  in  Pichia  pastoris  and  affinity 
chromatography  purification  of  the  active  recombinant  protein.  FEMS Microbiol.  Lett.  189 
(2000) 165–169. 

[22]  T. Uchida, Y. Shibata, An affinity adsorbent, 5'‐adenylate‐aminohexyl‐sepharose.  I. Purification 
and properties of two forms of RNase U2. J. Biochem. 90 (1981) 463‐471. 

[23]  S.  Noguchi,  Y.  Satow,  T.  Uchida,  C.  Sasaki,  T.  Matsuzaki,  Crystal  structure  of  Ustilago 
sphaerogena ribonuclease U2 at 1.8 A resolution. Biochemistry 34 (1995) 15583–15591. 



 
100  Resultados 

[24]  J.M. Mancheño, M. Gasset,  J.  Lacadena, A. Martínez  del  Pozo, M. Oñaderra,  J.G. Gavilanes, 
Predictive  study of  the  conformation of  the  cytotoxic protein  α‐sarcin: a  structural model  to 
explain α‐sarcin‐membrane interaction. J. Theor. Biol. 172 (1995) 259–267. 

[25]  S.  Sato,  T.  Uchida,  The  disulfide  bridges  of  ribonuclease  U2  from  Ustilago  sphaerogena.  J. 
Biochem. 77 (1975) 1171‐6. 

[26]  J.  Sambrook,  D.W.  Russell, Molecular  Cloning:  A.  Laboratory Manual  3rd  edn.  Cold  Spring 
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 

[27]  J.  Lacadena, A. Martínez del Pozo,  J.L. Barbero,  J.M. Mancheño, M. Gasset, M. Oñaderra, C. 
López‐Otín, S. Ortega, J.L. García, J.G. Gavilanes, Overproduction and purification of biologically 
active native fungal α‐sarcin in Escherichia coli. Gene 142 (1994) 147‐151. 

[28]  J.  Lacadena,  A.  Martínez  del  Pozo,  A.  Martínez‐Ruiz,  J.M.  Pérez‐Cañadillas,  M.  Bruix,  J.M. 
Mancheño, M. Oñaderra,  J.G. Gavilanes, Role of histidine‐50, glutamic acid‐96, and histidine‐
137 in the ribonucleolytic mechanism of the ribotoxin α‐sarcin. Proteins 37 (1999) 474‐484. 

[29]  G.F. Vovis,  S.  Lacks, Complementary  action of  restriction  enzymes  endo R‐DpnI  and  Endo R‐
DpnII on bacteriophage f1 DNA. J. Mol. Biol.115 (1977) 525‐538. 

[30]  L. García‐Ortega, M. Masip,  J.M. Mancheño, M. Oñaderra, M.A. Lizarbe, M.F. García‐Mayoral, 
M. Bruix, A. Martínez del Pozo,  J.G. Gavilanes, Deletion of  the NH2‐terminal  β‐hairpin of  the 
ribotoxin  α‐sarcin  produces  a  nontoxic  but  active  ribonuclease.  J.  Biol.  Chem.  277  (2002) 
18632–18639. 

[31]  A. Martínez‐Ruiz, A. Martínez del Pozo,  J.  Lacadena,  J.M. Mancheño, M. Oñaderra, C.  López‐
Otín, J.G. Gavilanes, Secretion of recombinant pro‐ and mature fungal α‐sarcin ribotoxin by the 
methylotrophic yeast Pichia pastoris: the Lys‐Arg motif is required for maturation. Protein Expr. 
Purif. 12 (1998) 315–322. 

[32]  K.L. Hsi,  L.  Chen, D.H. Hawke,  L.R.  Zieske,  P.M.  Yuan, A  general  approach  for  characterizing 
glycosylation sites of glycoproteins. Anal. Biochem. 198 (1991) 238‐245. 

[33]  E. Batanero, M. Villalba, R. Rodríguez, Glycosylation site of the major allergen from olive tree 
pollen. Allergenic implications of the carbohydrate moiety. Mol. Immunol. 31 (1994) 31‐37. 

[34]  J.G. Gavilanes, D. Vázquez, F. Soriano, E. Méndez, Chemical and spectroscopic evidence on the 
homology of three antitumor proteins: α‐sarcin, mitogillin, and restrictocin. J. Protein Chem. 2 
(1983) 251–261. 

[35]  W.J. Becktell, J. A. Schellman, Protein stability curves. Biopolymers 26 (1987) 1859–1877. 

[36]  A.  Blank,  R.H.  Sugiyama,  C.A.  Dekker,  Activity  staining  of  nucleolytic  enzymes  after  sodium 
dodecyl  sulfate‐polyacrylamide  gel  electrophoresis:  use  of  aqueous  isopropanol  to  remove 
detergent from gels. Anal. Biochem. 120 (1982) 267‐275. 



 
101Resultados 

[37]  J.M. García‐Segura, M.M. Orozco,  J.M.  Fominaya,  J.G. Gavilanes,  Purification, molecular  and 
enzymic characterization of an acid RNase  from  the  insect Ceratitis capitata. Eur.  J. Biochem. 
158 (1986) 367‐372. 

[38]  L.  García‐Ortega,  J.  Lacadena,  J.M. Mancheño, M.  Oñaderra,  R.  Kao,  J.  Davies,  N. Olmo,  A. 
Martínez  del  Pozo,  J.G.  Gavilanes,  Involvement  of  the  amino‐terminal  β‐hairpin  of  the 
Aspergillus ribotoxins on the interaction with membranes and nonspecific ribonuclease activity. 
Protein Sci. 10 (2001) 1658‐1668. 

[39]  J.  Steyaert,  K. Hallenga,  L. Wyns,  P.  Stanssens, Histidine‐40  of  ribonuclease  T1  acts  as  base 
catalyst when the true catalytic base, glutamic acid‐58, is replaced by alanine. Biochemistry 29 
(1990) 9064‐9072. 

[40]  J.L. Cereghino, J.M. Cregg, Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia 
pastoris. FEMS Microbiol. Rev. 24 (2000) 45‐66. 

 [41] J.M. O’Leary, C.M. Radcliffe, A.C. Willis, R.A. Dwek, P.M. Rudd, A.K. Downing,  Identification and 
removal of O‐linked and non‐covalently linked sugars from recombinant protein produced using 
Pichia pastoris.Protein Expr. Purif. 38 (2004) 217‐227. 

[42]  R.  Koradi,  M.  Billeter,  K.  Wüthrich,  MOLMOL:  a  program  for  display  and  analysis  of 
macromolecular structures. J. Mol. Graph. 14 (1996) 51‐55. 

   



 
102  Resultados 

 

   



 
103Resultados 

 

 

 

Resultados B 

IMPLICACIÓN BIOLÓGICA DE LA ACCIÓN DE LAS RIBOTOXINAS EN LA 
FUNCIONALIDAD DEL RIBOSOMA 

 

B1.  La  ruptura  del  lazo  sarcina/ricina  en  el  rRNA  23S  inhibe  la  translocación 
dependiente de EF‐G. 

Las  ribotoxinas  son  potentes  inhibidores de  la  biosíntesis  de  proteínas  y  son  capaces  de 
inactivar  los  ribosomas  de  diversos  organismos  al  hidrolizar  un  único  enlace  fosfodiéster  en  una 
región  del  rRNA  23S  conocida  como  lazo  sarcina/ricina  (SRL).  Esta  región  es  esencial  en  la 
funcionalidad del ribosoma y por eso se encuentra universalmente conservada. El SRL forma parte 
del sitio de interacción de los factores de elongación, EF‐G y EF‐Tu en el caso de las bacterias, con el 
rRNA  de  la  subunidad  mayor  del  ribosoma.  En  cada  ciclo  de  elongación,  en  el  que  la  cadena 
polipeptídica aumenta en un aminoácido, ocurren tres etapas. En  la primera, EF‐Tu•GTP  forma un 
complejo  ternario  con  un  aminoacil‐tRNA,  que  se  une  al  ribosoma.  Al  reconocerse  un  codón 
adecuado el factor de elongación hidroliza el GTP colocándose el aminoacil‐tRNA en el sitio A. En la 
segunda, se produce la reacción peptidil transferasa, quedando un tRNA desacilado en el sitio P y la 
cadena  peptídica  creciente, unida  a  otro  tRNA,  en  el  sitio A.  La  última  etapa  de  cada  ciclo  es  la 
translocación, catalizada por el EF‐G, en  la que el  tRNA desacilado y el peptidil‐tRNA,  junto con el 
mRNA, se desplazan para comenzar un nuevo ciclo, hasta  los sitios E y P, respectivamente. En este 
trabajo  se  ha  observado  que  la  ruptura  del  SRL  por  parte  de  la  α‐sarcina  provoca  un  efecto 
moderado  en  la unión del  complejo  ternario  al  ribosoma pero  reduce  la unión del EF‐G  e  inhibe 
significativamente  su  actividad  para  hidrolizar  GTP.  Ello  impide  la  translocación,  con  lo  que  la 
inhibición de la biosíntesis de proteínas queda completamente explicada. No obstante, los resultados 
también sugieren que la integridad del SRL no es esencial para el movimiento del mRNA y los tRNAs 
per se, pero sí para la unión del EF‐G que contribuye a facilitar estos desplazamientos. 

Trabajo B1:  García‐Ortega  L,  Álvarez‐García  E,  Gavilanes  JG, Martínez  del  Pozo  Á  y 
Joseph S  (2009) Cleavage of  the sarcin‐ricin  loop of 23S  rRNA differentially affects EF‐G and EF‐Tu 
binding. Enviado a RNA.   



 
104  Resultados 

Cleavage of the Sarcin‐Ricin Loop of 23S rRNA Differentially Affects EF‐
G and EF‐Tu Binding 
 

Lucía  García‐Ortega1*,  Elisa  Álvarez‐García1,2*,  José  G.  Gavilanes2,  Álvaro Martínez‐del‐Pozo2  and 
Simpson Joseph1 

 

1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California at San Diego, La Jolla, CA 92093, 
USA. 

2Departamento  de  Bioquímica  y  Biología Molecular  I,  Universidad  Complutense,  28040 Madrid, 
Spain. 

 

Corresponding  author:  Simpson  Joseph.  Phone:  (858)  822‐2957.  Fax:  (858)  534‐7042.  E‐mail: 
sjoseph@ucsd.edu  

 

*Equally contributed to this work. 

 

 

 

Abstract 

 

Ribotoxins  are potent  inhibitors of protein biosynthesis  and  inactivate  ribosomes  from  a 
variety  of  organisms.    The  ribotoxin  α‐sarcin  cleaves  the  large  23S  ribosomal  RNA  (rRNA)  at  the 
universally  conserved  sarcin‐ricin  loop  (SRL)  leading  to  complete  inactivation of  the  ribosome and 
cellular death.  The SRL is important for binding translation factors that hydrolyze GTP, but its precise 
role is not yet understood.  We studied the effect of α‐sarcin on defined steps of translation by the 
bacterial  ribosome.    α‐Sarcin‐treated  ribosomes  showed  no  defects  in mRNA  and  tRNA  binding, 
peptide‐bond formation and sparsomycin‐dependent translocation.  Cleavage of SRL slightly affected 
binding of elongation  factor Tu  ternary complex  (EF‐Tu●GTP●tRNA)  to  the  ribosome.    In contrast, 
the  activity  of  elongation  factor  G  (EF‐G)  was  strongly  impaired  in  α‐sarcin‐treated  ribosomes.  
Importantly,  cleavage of SRL  inhibited EF‐G binding, and  consequently GTP hydrolysis and mRNA‐
tRNA translocation.   These results suggest that the SRL  is more critical for binding EF‐G than EF‐Tu 
ternary  complex  to  the  ribosome.    The  SRL  may  interact  differentially  with  EF‐Tu  and  EF‐G  to 
dynamically modulate their activity during the elongation cycle of protein synthesis. 



 
105Resultados 

Introduction 

 

Ribotoxins  are  a  family of  toxic  extracellular  fungal  ribonucleases  (RNases)  that  exert  an 
exquisite ribonucleolytic activity on the  larger rRNA,  leading to protein synthesis  inhibition and cell 
death  by  apoptosis  (Lacadena  et  al.  2007).    α‐Sarcin,  a  well  studied  ribotoxin,  cleaves  the 
phosphodiester bond between G2661‐A2662  located  in helix 95 of 23S rRNA (Schindler and Davies 
1977; Endo and Wool 1982; Hausner et al. 1987; Lacadena et al. 2007) (Figure 1A and 1B).  Helix 95 is 
also targeted by ricin, a N‐glycosidase that inactivates the ribosome by depurinating A2660 (Endo et 
al. 1987).  Hence helix 95 of 23S rRNA is known as the sarcin‐ricin loop (SRL).  The SRL comprises one 
of the  longest stretches of universally conserved rRNA sequence  indicating a crucial role  in protein 
synthesis (2654‐2665 in E. coli 23S rRNA) (Egebjerg et al. 1990; Gutell et al 1992).  Consistent with an 
important functional role, mutations or deletions in the SRL sequence result in lethal effects on cell 
growth (Macbeth and Wool 1999; Chan et al. 2000, Lancaster et al. 2008).  

The SRL together with the GTPase‐associated center (GAC, helices 43 and 44 of 23S rRNA) 
form  the main  interaction  site  for  EF‐G  and  EF‐Tu with  the  rRNA  in  the  large  ribosomal  subunit 
(Moazed  et  al.  1988; Valle  et  al.  2003a,  2003b).   More  recently,  studies  have  shown  that  E.  coli 
initiation factor 2 (IF2) and release factor 3 (RF3) interact with the same region of the ribosome (La 
Teana et al. 2001; Klaholz et al. 2004).    In general, all these proteins are GTPases that bind to the 
ribosome,  hydrolyze  GTP  and  undergo  conformational  changes  before  dissociating  from  the 
ribosome.   A challenging problem  is  to understand how  the  ribosome  regulates  the association of 
specific factors during defined steps of protein biosynthesis.   

Three  major  steps  occur  during  protein  elongation  (Wintermeyer  et  al.  2004).  First,  a 
ternary complex  formed by EF‐Tu, GTP and the cognate aminoacyl‐tRNA binds to the A site of the 
ribosome carrying either an initiator fMet‐tRNAfMet or peptidyl‐tRNA in P site.  EF‐Tu●GDP dissociates 
from  the  ribosome and  tRNA  is accommodated  into  the A site.    In  the second step,  the  ribosome 
catalyzes  the  peptidyl  transferase  reaction,  resulting  in  a  deacylated  tRNA  at  the  P  site  and  a 
peptidyl‐tRNA at the A site. The cycle is completed by the translocation of the tRNAs‐mRNA complex 
catalyzed by  EF‐G.   After  translocation  and  release of  EF‐G,  the  ribosome  repeats  the  elongation 
cycle  until  a  stop  codon  is  encountered.    The  entry  of  a  stop  codon  into  the  A  site  signals  the 
termination of protein synthesis.  

Recent  biochemical  studies  as well  as  structural  information  from  cryo‐EM  images  have 
helped  to  elucidate  the  role  of  EF‐Tu  and  EF‐G.   During  tRNA  selection  by  the  ribosome,  codon 
recognition  triggers GTP hydrolysis by EF‐Tu  that catalyzes  the accommodation of  tRNA  into  the A 
site (Pape et al. 1999).  Interestingly, GTP hydrolysis by EF‐G is not directly coupled to the movement 
of the tRNAs and mRNA (Rodnina et al. 1997).    In this case, GTP‐hydrolysis  induces conformational 
changes  in the ribosome, called “unlocking”, that allow the disruption of the  interactions between 
the A site tRNA and the 30S subunit decoding center promoting a rapid translocation of the mRNA‐
tRNA  complex  (Frank and Agrawal 2000; Valle et al. 2003b; Taylor et al. 2007).   Moreover,  it has 
been suggested that GTP hydrolysis by EF‐Tu and EF‐G are triggered by ribosomes  in two different 



 
106  Resultados 

conformational states corresponding to the different steps in the elongation cycle (Valle et al. 2003a, 
2003b; Sergiev et al. 2005).  How binding of EF‐G and EF‐Tu to the ribosome triggers GTP hydrolysis 
is still not clear.   Since the SRL  interacts  intimately with the GTPase domain of EF‐Tu and EF‐G,  it  is 
likely to play a crucial role during GTP hydrolysis  (Moazed et al. 1988; Connell et al. 2007). 

Interestingly,  Nierhaus  and  co‐workers  showed  that  cleavage  of  the  SRL  by  �‐sarcin
modestly affected the binding of EF‐Tu ternary complex, while the binding of EF‐G and translocation 
were  strongly  inhibited  (Hausner et al. 1987).    In  this  study, however,  just more  than 50% of  the 
ribosomes were estimated to be cleaved by α‐sarcin and it was not possible to directly correlate the 
ribosomal activity with the extent of cleavage.  Furthermore, recent studies suggest that the SRL may 
participate  in additional steps catalyzed by EF‐G and EF‐Tu.   For example, G2655C mutation  in the 
SRL which was lethal and strongly inhibited translocation, only moderately affected binding of EF‐G 
and  GTPase  activity  (Leonov  et  al.  2003).    Additionally,  a  single‐molecule  study  showed  that 
ribosomes  treated with  the α‐sarcin homolog, restrictocin, were able  to bind  ternary complex and 
progress up to the GTPase‐activated state (Blanchard et al. 2004).  Thus, in some instances, EF‐G and 
EF‐Tu can bind to the ribosome with an inactive SRL.   

In order  to  further explore  the  importance of  the  SRL  for  the elongation  step of protein 
synthesis, we  cleaved  the  SRL with  α‐sarcin.    Conditions were  optimized  to  get  a more  uniform 
extent  of  cleavage  by  α‐sarcin  and  the  level  of  cleavage  was  quantitated  precisely  by  primer 
extension analysis.   Consistent with  the earlier  study  (Hausner et al. 1987), our  results  show  that 
cleavage of the SRL has modest effects on ternary complex binding, while more significantly affecting 
EF‐G  binding,  GTP  hydrolysis  and  translocation.    These  results  suggest  that,  compared  to  EF‐Tu 
ternary complex, EF‐G requires an intact SRL for stably binding to the ribosome.  Interestingly, EF‐G‐
independent  translocation,  induced by  sparsomycin,  is not  affected  indicating  that  the  SRL  is not 
required for the movement of the mRNA‐tRNA complex in the ribosome.   

 

 

Results 

 

Inactivation of E. coli ribosomes by α‐sarcin 

It  is well known  that E. coli ribosomes are  less susceptible  to α‐sarcin cleavage  than  their 
eukaryotic  counterparts  (Schindler  and Davies  1977;  Endo  and Wool  1982; Hausner  et  al.  1987).  
Previous studies have reported inactivation of E. coli ribosome preparations ranging from 10 to 50%.  
Thus, our first goal was to optimize the inactivation procedure and minimize the contamination with 
intact ribosomes.  Consequently, different buffers, concentration of reagents and length of time for 
the cleavage reaction were assayed.   Primer extension was used to quantify the extent of cleavage 
and agarose gel electrophoresis was used to analyze the specificity of the cleavage and the integrity 
of the rRNA after treatment with the toxin (Figure 1C and 1D).  The buffers tested were variations of 
the  standard  polymix  buffer  (buffer  A  in  Figure  1C)  since  this  would  be  the  one  employed  in 



 
107Resultados 

subsequent  functional  assays  (Bartetzko  and Nierhaus 1988).   Previous  reports  indicated  that  the 
presence  of millimolar  concentrations  of mono  or  divalent  cations  inhibited  the  ribonucleolytic 
activity  of  α‐sarcin  (Endo  et  al.  1983;  Martínez  del  Pozo  et  al.  1989;  Korennykh  et  al.  2006). 
Therefore,  we  tested  polymix  buffer  containing  different  concentration  of  magnesium  and 
polyamines.   We  tested  buffer  A without  polyamines  (buffer  B),  and  decreased  the magnesium 
concentration  to  2  mM  (buffer  C)  or  to  0  mM  (buffer  D)  by  adding  EDTA  (see Materials  and 
Methods).   We  obtained  75%  specifically  cleaved  ribosomes  in  buffer  C, which  contained  2 mM 
magnesium,  no  polyamines  and  0.3  µM  α‐sarcin.    Increasing  the  α‐sarcin  concentration  or 
completely eliminating magnesium (buffer D)  in the reaction resulted  in additional cleavages other 
than that producing the specific �‐fragment (Figure 1D).  Thus, in o
75%  of  specifically  cleaved  ribosomes  and  these  were  used  for  future  experiments  (Figure  1C).  
Ribosome requires a minimum concentration of magnesium and polyamines (Blaha et al. 2000), so 
these were restored after �‐sarcin treatment for functional assays (Bar

Interestingly, the most efficient conditions gave a slightly different specificity with respect 
to  the position of cleavage  in  the 23S  rRNA.   The expected cleavage   was at  the 3’ side of G2661 
resulting in the primer extension a stop at position A2662 (Figure 1C).  However, in addition, a band 
appeared at position G2661 due to cleavage at the 3’ side of A2660.   Close  inspection of previous 
published results revealed a similar heterogeneity in the cleavage of E. coli ribosomes (Macbeth and 
Wool 1999).   Most probably this second cleavage site corresponded to a  less specific action of the 
toxin since the conditions employed were very drastic, which might have affected the conformation 
of the SRL.   

 

In vitro translation is inhibited by cleaving the SRL 

Protein composition of the α‐sarcin treated ribosomes was analyzed to determine whether 
cleavage of the SRL caused  loss of ribosomal proteins.   This was accomplished by  filtering α‐sarcin 
treated ribosomes to separate possible unbound ribosomal proteins. The filtered fractions were then 
analyzed  by  SDS‐PAGE  (Figure  2A).    Both  untreated  control  ribosomes  and  α‐sarcin  treated 
ribosomes showed similar  levels of ribosomal proteins  indicating no significant  loss of proteins due 
to  cleavage  of  the  SRL.    Although  the  protein  electrophoresis  cannot  resolve  all  the  ribosomal 
proteins, proteins L6, L11 and L14 that bind close to the SRL and are more likely to be affected by the 
action of  α‐sarcin, have molecular weights within  the  resolution  range of  the gel.   These proteins 
were  present  at  similar  levels  in  the  α‐sarcin  treated  ribosomes.    Supporting  this  conclusion,  no 
proteins were found in the filtrate besides α‐sarcin. 

Next, the ability of α‐sarcin treated ribosomes to bind aminoacylated tRNAs to the A site without the 
help  of  EF‐Tu  was  determined.    Ribosomes  programmed  with  a  defined mRNA  and  f‐[35S]Met‐
tRNAfMet  in  the P  site were  incubated with Phe‐tRNAPhe.   The  amount of  f‐[35S]Met‐Phe dipeptide 
formed corresponds to the amount of Phe‐tRNAPhe bound to the A site.   Dipeptides formed by the 
ribosome were separated by electrophoretic TLC (eTLC) and quantitated (Figure 2B).  The extent of 
dipeptide  formed  was  similar  with  untreated  control  ribosomes  and  α‐sarcin  treated 



 
108  Resultados 

 

Figure 1. Cleavage of E. coli ribosomes by α‐sarcin.   (A) The x‐ray crystal structure of the E. coli 50S 
ribosomal subunit  (PDB accession code 2aw4).   The  rRNAs are represented by  the grey  ribbons and 
the ribosomal proteins by cyan tubes.  Indicated are the SRL (red), GAC (purple), ribosomal proteins L6 
(yellow) and L11 (orange).  (B) Secondary structure of the SRL.  The universally conserved bases in the 
SRL are shown in red.  The sites of cleavage by α‐sarcin and modification by ricin are indicated by the 
arrows.    (C) Primer extension analysis of the SRL cleavage after rRNA extraction.   Cleavage of E. coli 
ribosomes  in buffers A  (polymix buffer), B  (A minus polyamines) and C  (B + 6mM EDTA)  for 30 min 
with 0.3 or 3 μM α‐sarcin.   Control reaction without α‐sarcin  is  indicated by (‐).   The arrows  indicate 
the  position  in  the  23S  rRNA  where  the  reverse  transcription  stops.    The  cleavage  efficiency  is 
indicated below the  lanes.   (D) Agarose gel electrophoresis of rRNAs extracted from α‐sarcin‐treated 
ribosomes.   The cleavage reaction was performed  in buffers C and D (B + 8 mM EDTA) with 0.3 or 3 
μM α‐sarcin and the reaction was  incubated for 0.5 or 1 hour as  indicated above the  lanes.   Control 
reaction  without  α‐sarcin  is  indicated  by  (‐).    23S,  16S,  5S  rRNA  molecules  and  α‐fragment  are 
indicated by the arrows. 



 
109Resultados 

 

ribosomes.  Thus, the intrinsic ability of the ribosomes to bind mRNA and tRNAs and catalyze peptide 
bond formation in a factor‐independent manner was not impaired by cleaving the SRL.  

The activity of α‐sarcin treated ribosomes was further studied using an  in vitro translation 
assay, which monitors  the synthesis of  the  reporter protein Renilla  luciferase  in a cell‐free system 
(Figure  2C).   When  ribosomes were  treated with  α‐sarcin  before  being  added  to  the  translation 
mixture, 75%  inhibition of  luciferase biosynthesis was observed  in agreement with the efficiency of 
the cleavage. The addition of α‐sarcin to the translation mixture without previous inactivation of the 
ribosomes did not affect  the  reaction  indicating  that  the  final concentration of α‐sarcin employed 
showed no degradation of rRNAs, mRNAs and tRNAs. 

 

Figure  2.  Effect  of  α‐sarcin  cleavage  on 
ribosome  structure  and  activity.    (A) 
Protein profile of untreated control (‐) and 
α‐sarcin‐treated  (+)  ribosomes.    Proteins 
bound  to  the  ribosome  (bound) and  free 
in  solution  (unbound) were  separated by 
filtration  and  analyzed  by  SDS‐PAGE.  
Position  of  α‐sarcin  (17,000  Da)  is 
indicated  by  the  arrow.   MW  represents 
protein standards from 250 to 10 KDa.  (B) 
Non‐enzymatic  binding  of  tRNA  and 
peptidyl transferase reaction. Time course 
of  dipeptide  formation with  untreated  (‐ 
Sarcin) and α‐sarcin‐treated  ribosomes  (+ 
Sarcin).   The products were separated by 
electrophoretic  TLC  and  the  dipeptide 
formed  (fMet‐Phe)  is  indicated  by  the 
arrow.   Normalized  fraction  of  dipeptide 
obtained is indicated below the lanes.  (C) 
In vitro translation.  Synthesis of luciferase 
reporter enzyme by untreated  ribosomes 
(open circles) and ribosomes cleaved with 
α‐sarcin  (open  squares).    A  control 
reaction  with  α‐sarcin  added  to  the 
translation  mixture  was  performed  for 
any  non‐specific  activity  (closed  circles).  
In addition, a reaction without ribosomes 
was  used  as  a  negative  control  (open 
triangles).  



 
110  Resultados 

EF‐Tu binding is not completely inhibited by cleaving the SRL 

A  previous  study  showed  that  cleaving  the  SRL  did  not  affect  the  initial  binding  of  the 
ternary  complex  to  the  ribosome  but  stalled  the  accommodation  of  the  tRNA  into  the  A  site 
(Blanchard  et  al.  2004).   We  tested  binding  of  the  ternary  complex  to  the  ribosome  using  the 
dipeptide assay described above (Figure 3A).  In order to ensure EF‐Tu‐dependent tRNA binding, a 3‐
fold molar excess of EF‐Tu over Phe‐tRNAPhe was used and the reaction was allowed to proceed for a 
short  time  (30 seconds).   This permited discrimination of  the EF‐Tu‐dependent  tRNA binding  from 
the much slower EF‐Tu‐independent tRNA binding.   α‐Sarcin‐treated ribosomes showed about 35% 
activity compared to the untreated control ribosomes  (after subtracting 25% background  from the 
intact ribosomes  in the α‐sarcin reaction).   This  indicated that cleavage of the SRL partially allowed 
ternary complex  functionality although  it was possible  that  the  rates of  tRNA accommodation and 
peptide  bond  formation  were  significantly  affected  when  the  SRL  was  cleaved,  parameters  not 
tested here. 

To further analyze the binding of ternary complex, we used a centrifugal filtration method 
to separate free EF‐Tu from EF‐Tu bound to the ribosome (Wilson and Nechifor 2004).    In order to 
stabilize  the binding,  a non‐hydrolyzable GTP  analog  (GDPNP) or  an  inactive EF‐Tu mutant  (EF‐Tu 
H84A)  (Daviter  et  al.  2003) were  used  in  the  binding  assay.    EF‐Tu  bound  to  the  ribosome was 
analyzed  by  SDS‐PAGE  (Figure  3B).    α‐Sarcin‐cleaved  ribosomes  could  bind  the  GTPase  inactive 
ternary complexes although at lower levels compared to the untreated ribosomes.  Similarly, binding 
of EF‐Tu●GDPNP was slightly reduced with α‐sarcin‐treated ribosomes.  Overall, our results showed 
that cleavage of the SRL moderately reduced ternary complex binding and progress of the aminoacyl 
tRNA to the peptidyl transferase reaction.  

Figure 3. Interaction of EF‐Tu Ternary complex with the ribosome.  (A) Binding of EF‐Tu●GTP●Phe‐
tRNAPhe  to  the  A  site  and  peptide  bond  formation  analyzed  by  electrophoretic  TLC.    Untreated 
control  ribosomes  (‐ Sarcin) and  α‐sarcin‐treated  ribosomes  (+ Sarcin) were  incubated with EF‐Tu 
ternary complex for the indicated time.  The dipeptide formed (fMet‐Phe) is indicated by the arrow.  
Normalized value of dipeptide  formed  is  indicated below  the  lanes.    (B) Binding of EF‐Tu  ternary 
complex to ribosomes analyzed by filtration and SDS‐PAGE.  WT or H84A mutant EF‐Tu was bound to 
the ribosome in the presence of GTP or GDPNP and kirromycin.  Control untreated ribosomes and α‐
sarcin‐treated  ribosomes  are  indicated  by  (‐)  and  (+),  respectively.    Lanes:  Total,  samples  before 
filtration; MW, protein molecular weight standards of 75, 50 and 37 KDa.  The position of EF‐Tu and 
the ribosomal protein S1 are indicated by arrows.  Normalized value of EF‐Tu bound to the ribosome 
is indicated below the lanes. 



 
111Resultados 

Translocation catalyzed by EF‐G is drastically inhibited by cleaving the SRL 

The  effect  of  cleaving  the  SRL with  α‐sarcin  on  EF‐G‐dependent  translocation was  next 
analyzed.  Pre‐translocation complexes were formed with either deacylated or aminoacylated tRNAs 
in  the  P  and  A  sites.    Toeprinting  assay  showed  that  α‐sarcin  treated  ribosomes  formed  pre‐
translocation complexes with similar efficiency as control ribosomes (Figure 4A).  Translocation was 
triggered by adding a large excess of EF‐G●GTP to the pre‐translocation complex and movement of 
mRNA‐tRNA complex was monitored by the toeprinting assay (Joseph and Noller 1998).  Untreated 
ribosomes  translocated  efficiently,  in  contrast,  α‐sarcin‐treated  ribosomes  translocated  poorly 
(Figure  4A).    The  background  translocation  observed  could  be  attributed  to  the  small  amount  of 
intact ribosomes present after α‐sarcin treatment.  Consistent with this idea, increasing the amount 
of  tRNAs, EF‐G●GTP or  time of  the  reaction did not  improve  the extent of  translocation  (data not 
shown). 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

Figure  4.  EF‐G‐dependent  translocation.    (A)  Toeprinting  analysis  of  translocation.    Untreated 
control  ribosomes  (‐ Sarcin) and α‐sarcin‐treated  ribosomes  (+ Sarcin) were  incubated with mRNA 
and  either  deacylated  tRNAs  (deacyl‐tRNAs)  or  aminoacylated  tRNAs  (aa‐tRNAs)  to  form  pre‐
translocation complexes.   Lanes: P, ribosome with  tRNAfMet  in P site; A, pre‐translocation complex 
with  tRNAfMet  in  the P and  tRNAPhe  in  the A  site; Post, post‐translocation  complex  formed by  the 
addition of  EF‐G‐GTP  to  the pre‐translocation  complex.    The  toeprints  corresponding  to  the pre‐
translocation complex (Pre) and the post‐translocation complex (Post) are indicated by the arrows.  
(B) Translocation monitored by a  fluorescence‐based assay.   Pre‐translocation  complex  contained 
fMet‐tRNAfMet in the P site and Phe‐tRNAPhe in the A site.  Post‐translocation complex was formed by 
incubating the pre‐translocation complex with EF‐G and GTP.  Emission spectra of pre‐ (open circles) 
and post‐translocation complexes (closed circles).  The decrease in pyrene emission at 376 nm was 
used  to  quantify  the  extent  of  EF‐G‐dependent  translocation.    Left  panel,  untreated  control 
ribosomes; right panel, α‐sarcin‐treated ribosomes.



 
112  Resultados 

Figure 5. Sparsomycin‐dependent translocation.   (A) Time courses of translocation  induced by 
EF‐G  (upper  panel)  or  sparsomycin  (lower  panel),  analyzed  by  toeprinting.    Pre‐  and  post‐
translocation toeprint bands are  indicated by arrows. –  lane, no EF‐G or sparsomycin added; – 
Sarcin, untreated ribosomes; + Sarcin, α‐sarcin‐treated ribosomes.  (B) Graphical representation 
of  data  in  (A).    Data  were  normalized  to  the  maximum  translocation  value  for  untreated 
ribosomes. Open circles, untreated  ribosomes; closed circles,  ribosomes  treated with α‐sarcin.  
Left panel, EF‐G‐dependent translocation; right panel, sparsomycin‐dependent translocation. 

We  corroborated  this  result  with  another,  fluorescence‐based,  assay  to  monitor  EF‐G‐
dependent translocation (Studer et al. 2003).  In this assay, translocation of the mRNA‐tRNA complex 
causes a decrease in fluorescence intensity of the pyrene probe attached to the 3’ end of a synthetic 
mRNA.   Again,  α‐sarcin‐treated  ribosomes  showed  only  a  25% decrease  in  fluorescence  intensity 
compared to the untreated control ribosomes in the presence of a large excess of EF‐G (Figure 4B).  
The background fluorescence intensity correlated with the amount of intact ribosomes present after 
treatment with  α‐sarcin.    Thus,  both  the  toeprinting  data  and  the  fluorescence‐based  assay  for 
translocation showed that cleavage of the SRL strongly inhibited EF‐G‐dependent translocation. 

To identify the step(s) in translocation that was inhibited by cleavage of the SRL, we tested 
EF‐G‐independent translocation.  The antibiotic sparsomycin can induce translocation of the mRNA‐
tRNA complex, albeit at a slower rate than EF‐G (Fredrick and Noller 2003).  Sparsomycin‐dependent 
translocation was monitored by toeprinting (Figure 5).  Ribosomes treated with α‐sarcin showed the 
same  rate of  translocation as  the untreated  control  ribosomes.    In  contrast, experiments done  in 
parallel  to monitor  the  time  course of EF‐G‐dependent  translocation  showed  significant  inhibition 
with the α‐sarcin‐treated ribosomes (Figure 5).   These results suggested that the movement of the 
mRNA‐tRNA within the ribosome was not affected by cleaving the SRL, but some step(s) specific to 
the EF‐G catalyzed process was inhibited.  

 



 
113Resultados 

EF‐G binding and GTPase activity are impaired by cleaving the SRL 

Binding  of  EF‐G  to  the  ribosome was  next  tested  using  the  filtration method  described 
above  for  EF‐Tu.    Stable  EF‐G  binding  was  observed  with  GDPNP  and  the  untreated  ribosomes 
(Figure 6A).    In  contrast,  reduced EF‐G binding was observed with  the  α‐sarcin‐treated  ribosomes 
which was  consistent with  the background of  intact  ribosomes.    Increasing  the  ratio of EF‐G over 
ribosomes did not improve binding (data not shown).  Thus, cleavage of the SRL reduced the affinity 
of EF‐G for the ribosome. 

Finally, we tested the ability of EF‐G to hydrolyze GTP in the presence of vacant ribosomes 
(Figure  6B).    Time  course  experiments were  performed  under multiple  turnover  conditions with 
untreated and  α‐sarcin‐treated  ribosomes mixed with varying concentrations of EF‐G.   The kinetic 
constants were extracted  from  the  study of  the dependence of  initial velocities of GTP hydrolysis 
versus EF‐G concentration of three independent experiments (Saarma et al. 1997; Savelsbergh et al. 
2005;  Seo  et  al.  2006;  Nechifor  et  al.  2007).    Parameters  for  the  SRL  cleaved  ribosomes  were 
calculated by taking into account the presence of 25% intact ribosomes after α‐sarcin treatment (see 
Materials and Methods) (Saarma et al. 1997).  We observed almost a 50‐fold defect in kcat/KM for GTP 
hydrolysis by EF‐G with the SRL cleaved ribosomes (Table I).  Although the experimental data showed 
substantial  errors,  especially  in  KM,  a  dramatic  defect  in  GTP  hydrolysis  was  observed  when 
ribosomes were  treated with sarcin  (Figure 6B). This defect  in GTPase activity was consistent with 
the impaired binding of EF‐G to the SRL cleaved ribosomes.   

 

Figure  6.  Interaction  of  EF‐G  with  the 
ribosome.    (A)  Binding  of  EF‐G  to  vacant 
ribosomes  analyzed  by  filtration  and  SDS‐
PAGE.    EF‐G  in  the  presence  of  GTP  or 
GDPNP was used.  (‐), untreated ribosomes; 
(+),  α‐sarcin‐treated  ribosomes.    Total 
indicates  samples  before  separating 
unbound  proteins.   MW  indicates  protein 
standards of 100 and 75 KDa.   The position 
of  EF‐G  and  ribosomal  protein  S1  are 
indicated by arrows.  EF‐G fraction bound to 
ribosomes is indicated below the lanes.  (B) 
Rate  of  GTP  hydrolysis  versus  EF‐G 
concentration.    Open  circles,  untreated 
ribosomes;  closed  circles,  α‐sarcin‐treated 
ribosomes.  Three independent experiments 
were  averaged  and  the  data  fitted  to  a 
Michaelis‐Menten  equation.    Dotted  curve 
is theoretically obtained from the calculated 
kinetic constants  in Table I for a population 
containing only cleaved ribosomes (Pure). 



 
114  Resultados 

Table I. GTP hydrolysis by EF‐G in vacant ribosomes 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Discussion 

 

Ribotoxins are an  interesting  family of enzymes due  to  their powerful and deadly activity 
against numerous types of living cells. Besides their ability of reaching the cytoplasm, the ribosome 
inactivation  that  results  from  their  ribonucleolytic  activity has  stimulated  a  lot of  research  in  the 
field. 

 

Prokaryotic SRL cleavage by α‐sarcin 

Ribotoxins do not affect in the same manner ribosomes from different origins even with the 
conserved SRL as  the  substrate  (Schindler and Davies 1977; Miller and Bodley 1991).    It has been 
proposed  that  the presence of C2666  instead of  the corresponding eukaryotic G at  the equivalent 
SRL position might  explain  the  lower  susceptibility of  E.  coli  ribosomes  against  α‐sarcin  cleavage.  
Previous  studies  with  small  synthetic  oligoribonucleotides  mimicking  the  SRL  sequence  have 
suggested that there are at least two SRL areas that are recognized by this toxin, the GAGA tetraloop 
and the bulged G2655 (Figure 1B),  indicating that the primary determinant for recognition  is, more 
than  the  sequence,  the SRL conformation  (Moazed et al. 1988; Wool et al. 1992; Glück and Wool 
1996; Correll et al. 1999; Pérez‐Cañadillas et al. 2000; Correll et al. 2003; Correll and Swinger 2003).  
Furthermore,  crystal  structures  with  different  analogs  that mimicked  the  SRL  revealed  that  the 
residue equivalent to A2662 docked in the active site of the ribotoxin instead of the expected G2661, 
leading the authors to propose an alternative pathway for cleavage (Yang et al. 2001). 

Our observation that two contiguous phosphodiester bonds within the prokaryotic SRL are 
susceptible to the action of the toxin (Figure 1C), not only agrees with previous published data, some 
of them unnoticed, but also reveals that the recognition of intact ribosomes by ribotoxins might be 
more complex.  In fact, a recent hypothesis focuses on the ability of ribotoxins to interact with other 

Ribosome  kcat (s
‐1)  KM (μM) 

kcat/KM 

(μM‐1 s‐1) 

‐  Sarcin  0.80 ± 0.12  2.08 ± 0.94  0.38 

+ Sarcin  0.26 ± 0.09  2.90 ± 2.55  0.09 

Pure  0.03  3.41  0.008 

‐ Sarcin, ribosomes not treated with α‐sarcin.  + Sarcin, ribosomes treated 
with α‐sarcin, having 25% of intact ribosomes.  Pure, kinetic constants 
calculated for a pure population of cleaved ribosomes (Saarma et al. 1997). 



 
115Resultados 

elements of  the  ribosomal machinery, such as  the proteins L6 and L14,  in order  to access  the SRL 
(García‐Ortega et al. 2002; García‐Mayoral et al. 2005).    In addition, electrostatics has an essential 
role in locating the ribotoxin on the ribosome surface contributing to its high affinity (Korennykh et 
al. 2006).    In  this  study,  relaxed  specificity of  ribotoxins  is observed when  trying  to  improve  their 
activity  against  prokaryotic  ribosomes  by  using  certain  conditions  of magnesium  and  polyamines 
concentration.   These counter  ions directly affect the stability and conformation of the ribosomes, 
which could be the cause for the second cleavage site in the SRL by α‐sarcin.   

 

Effect of SRL cleavage on EF‐G‐dependent translocation 

The SRL is not essential for factor‐independent peptide synthesis (Chan and Wool 2008).  In 
contrast,  elongation  factor  related  functions  have  been  observed  to  be  defective  after  ribotoxin 
treatment of different ribosomes.  In general, the binding of either EF‐Tu ternary complex or EF‐G (or 
their  eukaryotic  homologs)  had  been  concluded  as  the  main  defect  in  the  targeted  ribosomes 
(Fernández‐Puentes and Vázquez 1977; Hausner et al. 1987; Brigotti et al. 1989; Miller and Bodley 
1991; Nierhaus et al. 1992).    In a more recent study, a single‐molecule based analysis showed that 
cleavage  of  the  SRL  allowed  initial  binding  and  GTPase  activation  by  EF‐Tu  ternary  complex  but 
blocked  further progress  to  the accommodation step  (Blanchard et al. 2004).   The single‐molecule 
study with EF‐Tu motivated us to examine whether EF‐G can also transiently  interact with the SRL‐
cleaved ribosome and activate GTP hydrolysis.   

Translocation  catalyzed  by  EF‐G  consists  of many  sub‐steps  that  are  poorly  understood 
(Wintermeyer et al. 2004; Frank et al. 2007; Pan et al. 2007; Spiegel et al. 2007).  Binding of EF‐G‐GTP 
to the ribosome induces a ratchet‐like rotation of the small subunit relative to the large subunit and 
stabilizes the P and A site tRNAs in the P/E and A/P hybrid states (Frank and Agrawal 2000; Spiegel et 
al. 2007).   This  is  followed by GTP hydrolysis and  conformational  changes  in  the  ribosome,  called 
“unlocking”, which  allow  the  rapid movement  of  the mRNA‐tRNA  complex  (Katunin  et  al.  2002; 
Savelsberg  et  al.  2003).    After  translocation,  the  ribosome  undergoes  additional  conformational 
changes  called  “relocking”  and  EF‐G‐GDP  dissociates  (Savelsbergh  et  al.  2003).    Even  though  the 
ribosome undergoes extensive structural rearrangements, the SRL maintains its interaction with EF‐G 
in  the pre‐ and post‐translocation state  (Agrawal et al. 1999; Frank and Agrawal 2000; Stark et al. 
2000;  Connell  et  al.  2007).    The  SRL may,  thus,  play  an  important  role  in  stabilizing  the  various 
transition  states of EF‐G during  translocation.    Interestingly,  the  SRL  interacts  intimately with  the 
GTP‐binding domain of EF‐G  implying a more direct role  in catalyzing GTP hydrolysis (Connell et al. 
2007; Taylor et al. 2007).   

We  show  that  cleavage  of  the  SRL  inhibits  EF‐G‐dependent  translocation,  while 
sparsomycin‐dependent translocation is not affected (Figures 4 and 5).  These results are consistent 
with  a  previous  report  that  EF‐G‐dependent  translocation  is  inhibited,  while  spontaneous 
translocation  is  not  (Hausner  et  al.  1987).    Therefore,  the  intrinsic  ability  of  the  ribosome  to 
translocate  tRNAs  is  not  inhibited  by  cleaving  the  SRL.    Moreover,  sparsomycin‐dependent 
translocation  also  requires  the  tRNAs  to  be  in  the  hybrid  state  suggesting  that  a  SRL  cleaved 



 
116  Resultados 

ribosome can form this translation intermediate (Dorner et al. 2006).  Therefore, changes produced 
in  the  SRL  once  cleaved  do  not  appear  to  have  long  range  effects,  but  mainly  affect  rapid 
translocation catalyzed by EF‐G. 

Our  results  show  that  cleavage  of  the  SRL  significantly  reduces  the  binding  of  EF‐G  and 
inhibits  its GTP hydrolysis activity  (Figure 6).   The strong defect  in GTP hydrolysis corroborates the 
binding deficiency when GTP and not an analog  is used.   These data also allows us  to discard  the 
possibility of a further progress to the GTPase‐activated state as is the case for EF‐Tu.  

 

The SRL interacts differently with EF‐G and EF‐Tu 

In this study, binding of both elongation factors to the ribosome was analyzed and only EF‐
Tu can bind to the cleaved SRL (Figures 3 and 6), suggesting that they interact with the ribosome in a 
different conformation during the process of elongation.  This is consistent with the single‐molecule 
study  that  showed  EF‐Tu  ternary  complex  binding  to  unmodified  ribosomes  and  SRL  cleaved 
ribosomes with equal efficiency (Blanchard et al. 2004).  According to these authors, the SRL cleaved 
ribosomes stall at the tRNA accommodation step after ternary complex binding.  In our case, much 
longer times of dipeptide reaction give a significant fraction of accommodated tRNA, suggesting that 
this  is  a  very  slow  reaction  in  a  SRL‐cleaved  ribosome.    Thus,  initial binding of  the EF‐Tu  ternary 
complex to the ribosome is not significantly affected by cleavage of the SRL, but subsequent events 
in tRNA selection are inhibited.  This is markedly different from the effects on EF‐G, which requires 
an intact SRL for stably binding to the ribosome.  In agreement with this observation, other kind of 
ribosome‐inactivating proteins,  the N‐glycosidases, have been observed  to differentially affect  the 
function of elongation factors  in a eukaryotic system by depurinating a specific base  in the SRL (Xu 
and Liu 2000).  Finally, the antibiotic thiostrepton weakens the interaction of EF‐G with the ribosome 
by  interacting with  the GAC  and  L11  (Rodnina et  al. 1999; Cameron et  al. 2002;  Seo et  al. 2006; 
Harms et al. 2008).   The defect observed with a  cleaved SRL appears very  similar  to  thiostrepton 
suggesting  that  a  network  of  interactions  between GAC,  SRL,  L11  and  EF‐G  are  required  for  the 
stability of EF‐G on the ribosome and for translocation.  In contrast, thiostrepton bound to the GAC 
does not affect  the  initial binding of EF‐Tu  ternary complex  (Blanchard et al. 2004; González et al. 
2007).   

These  differences  in  interaction  of  the  SRL with  EF‐Tu  and  EF‐G may  support  the  idea  that  the 
ribosome  switches  between  two  different  conformational  states  to  discriminate  between  the 
elongation factors (Valle et al. 2003b).  The sarcin/ricin loop is located at the surface of the ribosome 
but it is not a very mobile structure and it does not present dramatic conformational changes when 
elongation factors are bound.  It has been proposed that an important determinant for binding one 
factor or  the other  is  the distance between  the SRL and  the GAC  (Sergiev et al. 2005).   From our 
results we can conclude that EF‐G binding is more dependent on the SRL conformation than the EF‐
Tu  ternary  complex.    Binding  of  EF‐Tu  ternary  complex  may  be  stabilized  by  codon‐anticodon 
interaction and other contacts with the ribosome, which may partially compensate for the loss of the 
SRL interaction.  



 
117Resultados 

Materials and Methods 

 

Preparation of ribosomes, mRNAs, tRNAs, elongation factors and α‐sarcin 

Tightly coupled 70S ribosomes were isolated from E. coli MRE 600 cells in mid‐log phase and 
purified  by  sucrose  density  gradient  (Powers  and  Noller  1991).    Phage  T4  gene  32 mRNA  was 
transcribed  by  T7  RNA  polymerase  from  a  linearized  plasmid  containing  the  appropriate  insert. 
mRNA  +9 was purchased  from Dharmacon  and  labeled  at  the  3’‐end with pyrene  succinimide  as 
described  (Studer  et  al.  2003).    EF‐Tu,  EF‐Tu H84A  and  EF‐G were overexpressed  and purified  as 
native forms using the  IMPACT system (New England Biolabs) (Feinberg and Joseph 2006a).   E. coli 
PheRS, MetRS  and Methionyl‐tRNAfMet  formyltransferase were  produced  as  recombinant  proteins 
with His‐tag to facilitate their purification.  Native E. coli tRNAfMet and tRNAPhe were purchased from 
Sigma and aminoacylated and purified as described before (Feinberg and Joseph 2001).  Aspergillus 
giganteus natural  α‐sarcin was produced,  isolated  to homogeneity and characterized as described 
previously (Olson et al. 1965; Olson and Goerner 1965; Kao et al. 2001; Martínez‐Ruiz et al. 2001). 

 

Treatment with α‐sarcin 

Cleavage  of  70S  ribosomes  by  α‐sarcin was  assayed  in  four  different  buffers.    Buffer  A 
(polymix  buffer):  20  mM  Hepes‐KOH  (pH  7.6),  8  mM  MgCl2,  150  mM  NH4Cl,  4  mM  2‐
mercaptoethanol, 0.05 mM spermine and 2 mM spermidine (Bartetzko and Nierhaus 1988).  Buffer B 
(A without polyamines): 20 mM Hepes‐KOH  (pH 7.6), 8 mM MgCl2, 150 mM NH4Cl, and 4 mM 2‐
mercaptoethanol.  Buffer C (B with 6 mM EDTA): 20 mM Hepes‐KOH (pH 7.6), 8 mM MgCl2, 150 mM 
NH4Cl, 4 mM 2‐mercaptoethanol, and 6 mM EDTA.  Buffer D (C with 8 mM EDTA): 20 mM Hepes‐KOH 
(pH 7.6), 8 mM MgCl2, 150 mM NH4Cl, 4 mM 2‐mercaptoethanol, and 8 mM EDTA.   Different toxin 
concentrations and  time of  incubation were also  tried.   The highest efficiency of  specific cleavage 
without unspecific degradation was obtained when 0.6 μM  isolated 70S ribosomes were  incubated 
with 0.3 μM α‐sarcin during 30 min at 37ºC in buffer C.  These conditions were used for cleaving the 
SRL  in  all  subsequent  experiments  (α‐sarcin‐treated  ribosomes).    Intact  ribosomes  were  also 
incubated without α‐sarcin.  A slightly increase in EDTA concentration from 6 mM (buffer C in Figure 
1D) to 8 mM (buffer D in Figure 1D) made the ribosomes more susceptible to non‐specific cleavage. 

Most  translation experiments  involving prokaryotic  ribosomes were usually performed  in 
the standard polyamine buffer (buffer A).  When the functionality of cleaved ribosomes was studied, 
standard buffer conditions were restored and activation of ribosomes was performed (incubation at 
42ºC for 10 min and slow cool down to 37ºC followed by an additional incubation for another 10 min 
at 37ºC).  

The  integrity  of  α‐sarcin  cleaved  ribosomes,  before  and  after  the  functional  assays was 
assessed by estimating their protein and rRNA content.  The rRNA was phenol extracted and loaded 
onto  a  denaturing  2%  agarose  gel.  The  result was  visualized  by  ethidium  bromide  staining.    For 
protein content, ribosomes were separated from unbound proteins by filtration  in 100 KDa MWCO 



 
118  Resultados 

Microcon spin filters (Amicon).  Bound and unbound fractions were analyzed by 17% SDS‐PAGE and 
coomassie blue staining. 

 

Primer extension analysis 

The  extent  and  site  of  α‐sarcin  cleavage was  determined  by  primer  extension.  Reverse 
transcription using  the primer 5’‐ACCAGTGATGCGTCCACTCCG‐3’,  complementary  to  the  sequence 
2634‐2665 of E. coli 23S RNA  (Figure 1B), and a mixture of dNTPs  (‐dATP) + ddATP, gave different 
products for an  intact and a cleaved template.   The uncleaved rRNA was transcribed up to the first 
uridine in the sequence due to the ddATP in the extension mixture (U2656).  The extension with the 
α‐sarcin cleaved template stopped at the cleavage site.  The products of reverse transcription were 
separated  in  a  15%  denaturing  polyacrylamide  gel  and  quantitated  with  a  PhosphorImager 
(Molecular Dynamics). 

 

In vitro translation assay 

The overall activity of cleaved ribosomes was determined by an  in vitro  translation assay.  
Plasmid  pRL‐null  (Promega)  was  modified  by  inserting  a  Shine‐Dalgarno  sequence  (5’‐
AAGGAGATATACATATG‐3’) upstream of the start codon of the Renilla  luciferase gene. The plasmid 
was linearized with Bam HI and used as the template for coupled transcription and translation of the 
luciferase gene in vitro. The linearized plasmid (1μg) was mixed with 8 μl of synthesis mix (200 mM 
Hepes‐KOH,  pH  8.2,  7  mM  DTT,  4  mM  ATP,  3.3  mM  of  CTP,  GTP  and  UTP,  0.1  M 
phosphoenolpyruvate, 7.5% PEG‐6000, 0.13 mg/ml  folinic acid, 240 U/ml pyruvate kinase, 0.14 M 
NH4Ac, 0.28 M KAc), 4 μL of 100 mM MgCl2, 4 μl of E. coli S100 extract and T7 RNA polymerase.  This 
mix was incubated for 45 min at 37ºC to produce excess of mRNA for the assay. Then, 2 μl of 55 mM 
methionine, 6 μg of total tRNA from E. coli and 4 μl of 50 μM coelenterazine were added.  The final 
volume  of  the  reaction  mixture  was  55  μl.    Activated  ribosomes  were  prepared  separately  in 
standard buffer (6 pmols in 20 μl) and then combined with the reaction mixture and transferred to a 
96‐well plate.   α‐Sarcin treatment was performed either before the activation of the ribosomes or 
simultaneously with  the  translation  reaction.    The  plate was  incubated  at  37°C  in  a plate  reader 
(Genios, Tecan) and the synthesis of luciferase enzyme was monitored in real‐time by measuring the 
luminescence every 90 seconds. 

 

Peptidyl‐transferase assay 

The assay was performed essentially as described (Feinberg and Joseph 2006b). f[35S]Met‐
tRNAfMet was obtained by aminoacylation and  formylation of  tRNAfMet  in  the presence of  [35S]Met.  
Initiation complexes (ribosomes with mRNA and initiator tRNA in P site) were formed by incubating 
activated 70S ribosomes  (0.15 μM  final concentration) with gene 32 mRNA  fragment  (0.3 μM final 
concentration)  for  15 min  at  37°C  followed  by  the  addition  of  f[35S]Met‐tRNAfMet  (0.25  μM  final 
concentration)  and  further  incubation  for  another  20 min.    A‐site was  filled with  Phe‐tRNAPhe  or 



 
119Resultados 

ternary  complex  (0.4  μM  final  concentrations)  for  different  times  at  room  temperature.  Ternary 
complex binding should be completed in a second time scale, whereas factor‐independent binding is 
a very slow process (minutes).  EF‐Tu ternary complex was formed by incubating 9 μM EF‐Tu with 1 
mM GTP, 1 μL pyruvate kinase (10mg/mL) and 3 mM phosphoenolpyruvate for 30 min at 37ºC, then 
adding 3 μM Phe‐tRNAPhe and  incubating again  for 15 min at 37ºC. The excess of EF‐Tu warranties 
that not free Phe‐tRNAPhe is present in the sample. The dipeptide formation (transfer of the fMet in P 
site to Phe‐tRNAPhe in A site) was initiated by Phe‐tRNAPhe or ternary complex addition and stopped 
at different times with 1/5 volumes of 1M KOH and placed on  ice.   The pH of the reaction mixture 
was  neutralized  and  1.5  μl  aliquots  were  analyzed  by  electrophoretic  TLC  as  described  before 
(Feinberg and Joseph 2006b).  The amount of f[35S]Met‐Phe and f[35S]Met were quantitated using a 
PhosphorImager  (Molecular  Dynamics)  and  the  fraction  of  dipeptide  calculated  per  sample  was 
normalized to the maximum formed with intact ribosomes in each experiment. 

 

Translocation assays 

Standard toeprinting assays for translocation were performed in standard polyamine buffer 
A as described before (Joseph and Noller 1998).  Final concentrations were 0.15 μM ribosomes, 0.3 
μM gene 32 mRNA hybridized with 5’‐[32P]‐AL2 primer, 0.35 μM tRNAfMet or fMet‐tRNAfMet for the P 
site and 0.5 μM of tRNAPhe or Phe‐tRNAPhe for the A site.  After the addition of EF‐G•GTP (1.2 μM EF‐G 
and 1 mM GTP  final  concentrations) aliquots were  stopped after 10 min at  room  temperature by 
placing  them on  ice.   The sparsomycin‐induced  translocation was performed according  to Fredrick 
and Noller (Fredrick and Noller 2003).  Ribosomes programmed with mRNA301 contained tRNA2

Tyr in 
the  P  site  N‐acetyl‐Phe‐tRNAPhe  in  the  A  site.    Translocation  was  induced  by  adding  0.5  mM 
sparsomycin  (final  concentration).    For  the  time  course  analyses,  aliquots were withdrawn  at  the 
various  time  points  and mixed  with  viomycin  (1 mM  final  concentration)  to  stop  the  reaction.  
Reverse transcription and gel analysis followed standard procedures (Joseph and Noller 1998). The 
gels were quantitated using a PhosphorImager (Molecular Dynamics). 

Steady‐state fluorescence measurements were also used to analyze translocation (Studer et 
al.  2003).   Activated  ribosomes  (0.25  μM) were  incubated with  a  21  nucleotide  pyrene‐modified 
mRNA+9  (0.5 μM)  for 10 min at 37ºC.   Pre‐translocation complexes were  formed by adding  fMet‐
tRNAfMet (0.5 μM) and incubated for 20 min at 37ºC followed by Phe‐tRNAPhe (0.6 μM) for another 20 
min.   Post‐translocation complexes were obtained by adding 10 μl of EF‐G•GTP mix (0.8 μM and 1 
mM respectively, final concentrations) to the pre‐translocation complexes and incubating at 25ºC for 
15 min.   Samples were excited at 343 nm and the emission spectrum of pyrene from 360–420 nm 
was recorded at 25ºC in a photon‐counting fluorometer (Fluoromax‐P, JY Horiba). Translocation was 
followed by a decrease of fluorescence emission at 376 nm (Studer et al. 2003). 

 

EF‐G‐dependent GTP hydrolysis 

Activated  ribosomes  (0.2  μM  final concentration) were mixed with EF‐G  (from 1  to 9  μM 
final concentration) and GTP (1mM final concentration with traces of [γ‐32P]‐GTP, specific activity 25 



 
120  Resultados 

Ci/mmol) at room temperature.  Aliquots at different times were quenched with 5% SDS (1.25% final 
concentration).    1  μl  samples were  spotted  on  PEI  cellulose  TLC  plates  and  developed  in  0.5 M 
KH2P04  (pH 3.5).  The  amount of  32Pi  formed was quantitated using  a  PhosphorImager  (Molecular 
Dynamics).   The  initial velocities  (as GTP hydrolyzed/ribosome/sec) were plotted versus each EF‐G 
concentration and fitted to a Michaelis‐Menten equation. The analysis of the data gave kcat, KM and 
kcat/KM  kinetic  constants  of  intact  and  75%  α‐sarcin‐cleaved  ribosomes.    The  parameters  for  a 
population  containing  only  α‐sarcin‐cleaved  ribosomes were  obtained  according  to  Saarma  et  al. 
(1997), using the equations: 

kcatsar/KMsar=[(kcatmix/KMmix)‐(1‐0.75)kcatWT/KMWT]/0.75 

KMsar=0.75/[(1/KMmix)‐(1‐0.75)/KMWT)] 

Where,  sar,  mix  and  WT  stand  for  pure  cleaved  ribosome  population,  cleaved  ribosomes 
contaminated with 25% of intact ribosomes and intact ribosomes, respectively. 

 

EF‐G and EF‐Tu‐ternary complex binding to ribosomes 

Binding  of  EF‐G  and  EF‐Tu  ternary  complex  to  the  ribosome  was  analyzed  by  filtration 
(Wilson  and Nechifor  2004).    For  EF‐G  binding,  activated  ribosomes  (0.2  μM  final  concentration) 
were formed in standard polyamine buffer in 60 μl volume. Then, 20 μL of EF‐G solution (minimum 
of 0.4 μM  final concentration) with GTP or GDPNP  (1 mM  final concentration) were added  to  the 
reaction and incubated for 5 min at room temperature before filtering.  For ternary complex binding, 
initiation complexes were  formed  in 60 μl  final volume  (0.2 μM  ribosomes, 0.4 μM gene 32mRNA 
and 0.4 μM fMet‐tRNAfMet , final concentrations). EF‐Tu (or EF‐Tu H84A) ternary complex was formed 
by  incubating  1.6  μM of  elongation  factor with  4 mM GTP  (or GDPNP)  for  45 min  at  37ºC,  then 
adding 2 μM Phe‐tRNAPhe and incubating again for 15 min at 37ºC. 20 uL of ternary complex (0.4 μM 
final  concentration)  in  the  presence  or  absence  of  the  antibiotic  kirromycin  (25  μM  final 
concentration) were added and incubated for 5 min at room temperature.  Unbound EF‐G or ternary 
complex was removed using 100,000 MWCO Microcon spin filters (Amicon) and washing the samples 
twice with 300  μL of buffer  containing  the  corresponding nucleotide and  antibiotic.   The washed 
samples were  concentrated  to 10  μl and analyzed by SDS‐PAGE.   The gels were  scanned and  the 
amount of factor bound to the ribosome was determined relative to the ribosomal protein S1 using 
ImageQuant (Molecular Dynamics). 

 

 

Acknowledgements 

This work was  supported by project BFU 2006‐04404  from  the Ministerio de Educación y 
Ciencia  (Spain) and a grant  from  the National Science Foundation  (to S.J.).  L.G.‐O. and E.A.‐G. are 
recipients of fellowships from the Ministerio de Educación y Ciencia (Spain). 

 



 
121Resultados 

References 
 

Agrawal, R. K., Heagle, A. B., Penczek, P., Grassucci, R. A. & Frank,  J.  (1999) EF‐G‐dependent GTP 
hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome. 
Nature Struct. Mol. Biol. 6, 643–647. 

Bartetzko,  A.  &  Nierhaus,  K.  H.  (1988)  Mg2+/NH4
+/polyamine  system  for  polyuridine‐dependent 

polyphenylalanine synthesis with near in vivo characteristics. Methods Enzymol. 164, 650–658. 

Blaha, G., Stelzl, U., Spahn, C.M., Agrawal, R. K., Frank,  J. & Nierhaus, K. H.  (2000) Preparation of 
functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryo‐
electron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292‐309. 

Blanchard, S. C., Gonzalez, R. L., Kim, H. D., Chu, S. & Puglisi, J. D. (2004) tRNA selection and kinetic 
proofreading in translation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 1008‐1014. 

Brigotti, M.,  Rambelli,  F.,  Zamboni, M., Montanaro,  L. &  Sperti,  S.  (1989)  Effect  of  α‐sarcin  and 
ribosome‐inactivating proteins on the  interaction of elongation factors with ribosomes. Biochem. J. 
257, 723‐727. 

Cameron, D. M., Thompson, J., March, P. E. & Dahlberg, A. E. (2002) Initiation factor IF2, thiostrepton 
and micrococcin prevent the binding of elongation factor G to the Escherichia coli ribosome. J. Mol. 
Biol. 319, 27‐35. 

Chan, Y. L. & Wool, I. G. (2008) The integrity of the sarcin/ricin domain of 23S ribosomal RNA is not 
required for elongation factor‐independent peptide synthesis. J. Mol. Biol. 378, 12‐19. 

Chan,  Y.L.,  Sitikov,  A.S.  &  Wool,  I.G.  (2000)  The  phenotype  of  mutations  of  the  base‐pair 
C2658.G2663 that closes the tetraloop  in the sarcin/ricin domain of Escherichia coli 23 S ribosomal 
RNA. J. Mol. Biol. 298, 795‐805. 

Connell, S. R., Takemoto, C., Wilson, D. N., Wang, H., Murayama, K., Terada, T., Shirouzu, M., Rost, 
M., Shuler, M., Giesebrecht,  J., Dabrowski, M., Mielke, T., Fucini, P., Yokoyama, S. & Spahn, C. M. 
(2007)  Structural  basis  for  interaction  of  the  ribosome  with  the  switch  regions  of  GTP‐bound 
elongation factors. Mol. Cell 25, 751‐764. 

Correll, C. C. & Swinger, K. (2003) Common and distinctive features of GNRA tetraloops based on a 
GUAA tetraloop structure at 1.4 Å resolution. RNA 9, 355–363. 

Correll, C. C., Beneken,  J., Plantinga, M.  J., Lubbers, M. & Chan, Y. L.  (2003) The common and  the 
distinctive features of the bulged‐G motif based on a 1.04 Å resolution RNA structure. Nucleic Acids 
Res. 31, 6806–6818. 

Correll,  C.  C., Wool,  I. G. & Munishkin, A.  (1999)  The  two  faces  of  the  Escherichia  coli  23S  rRNA 
sarcin/ricin domain: the structure at 1.11 Å resolution. J. Mol. Biol. 292, 275–287. 

Daviter, T., Wieden, H. J. & Rodnina, M. V. (2003) Essential role of histidine 84 in elongation factor Tu 
for the chemical step of GTP hydrolysis on the ribosome. J. Mol. Biol. 332, 689‐699. 



 
122  Resultados 

Dorner,  S.,  Brunelle,  J.  L.,  Sharma, D. & Green,  R.  (2006)  The  hybrid  state  of  tRNA  binding  is  an 
authentic translation elongation intermediate. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 234‐241. 

Endo, Y. & Wool,  I.  (1982) The site of action of α‐sarcin on eukaryotic ribosomes. The sequence at 
the α‐sarcin cleavage site in 28 S ribosomal ribonucleic acid. J. Biol. Chem. 257, 9054‐9060. 

Endo, Y., Huber, P. W. & Wool,  I. G. (1983) The ribonuclease activity of the cytotoxin α‐sarcin. The 
characteristics  of  the  enzymatic  activity  of  α‐sarcin  with  ribosomes  and  ribonucleic  acids  as 
substrates. J. Biol. Chem. 258, 2662–2667. 

Endo, Y., Mitsui, K., Motizuki, M. & Tsurugi, K. (1987) The mechanism of action of ricin and related 
toxic  lectins on eukaryotic  ribosomes. The  site and  the  characteristics of  the modification  in 28  S 
ribosomal RNA caused by the toxins. J. Biol. Chem. 262, 5908‐12. 

Egebjerg, J., Larsen, N. & Garrett, R. A. (1990) Structural map of 23S rRNA. In: Hill, E.W., Dahlberg, A., 
Garrett, R. A., Moore, P. B., Schlessinger, D. & Warmer, J. R. (Eds.), The Ribosome Structure, Function, 
and Evolution. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp. 168–179. 

Feinberg, J. S. & Joseph, S. (2001)  Identification of molecular  interactions between P site tRNA and 
the ribosome essential for translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11120–11125. 

Feinberg, J. S. & Joseph, S. (2006a) Ribose 2′‐hydroxyl groups in the 5′ strand of the acceptor arm of 
P‐site tRNA are not essential for EF‐G catalyzed translocation. RNA 12, 580–588  

Feinberg,  J.  S., &  Joseph,  S.  (2006b) A  conserved  base‐pair  between  tRNA  and  23  S  rRNA  in  the 
peptidyl transferase center is important for peptide release. J. Mol. Biol. 364, 1010‐1020. 

Fernández‐Puentes, C. & Vázquez, D. (1977) Effects of some proteins that  inactivate the eukaryotic 
ribosome. FEBS Lett. 78, 143‐146. 

Frank, J. & Agrawal, R. K.  (2000) A ratchet‐like  inter‐subunit reorganization of the ribosome during 
translocation. Nature 406, 318–322 

Frank,  J.,  Gao,  H.,  Sengupta,  J.,  Gao,  N.  &  Taylor,  D.J.  (2007)  The  process  of  mRNA‐tRNA 
translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 19671‐19678. 

Fredrick, K. & Noller, H. F. (2003) Catalysis of ribosomal translocation by sparsomycin. Science 300, 
1159‐1162. 

García‐Mayoral MF, García‐Ortega L, Álvarez‐García E, Bruix M, Gavilanes JG & Martínez del Pozo A 
(2005) Modelling the highly specific ribotoxin recognition of ribosomes. FEBS Lett. 579, 6859–6864. 

García‐Ortega. L., Masip, M., Mancheño, J. M., Oñaderra, M., Lizarbe, M. A., García‐Mayoral, M. F., 
Bruix, M., Martínez del Pozo, A. & Gavilanes, J. G. (2002) Deletion of the NH2‐terminal β‐hairpin of 
the ribotoxin α‐sarcin produces a nontoxic but active ribonuclease. J. Biol. Chem. 277, 18632–18639. 

Glück, A. & Wool, I. G. (1996) Determination of the 28 S ribosomal RNA identity element (G4319) for 
α‐sarcin and  the  relationship of  recognition  to  the  selection of  the catalytic site.  J. Mol. Biol. 256, 
838–848. 



 
123Resultados 

González,  R.L.Jr,,  Chu,  S.  &  Puglisi,  J.D.  (2007)  Thiostrepton  inhibition  of  tRNA  delivery  to  the 
ribosome. RNA 13, 2091‐2097.  

Gutell, R.R., Schnare, M.N. & Gray, M.W.  (1992) A compilation of  large subunit  (23S‐ and 23S‐like) 
ribosomal RNA structures. Nucleic Acids Res. 20 Suppl:2095‐109. 

Harms, J. M., Wilson, D. N., Schluenzen, F., Connell, S. R., Stachelhaus, T., Zaborowska, Z., Spahn, C. 
M.  T.,  &  Fucini,  P.  (2008)  Translational  regulation  via  L11: Molecular  switches  on  the  ribosome 
turned on and off by thiostrepton and micrococcin. Mol. Cell 30, 26‐38. 

Hausner, T. P., Atmadja, J. & Nierhaus, K. H. (1987) Evidence that the G2661 region of 23S rRNA  is 
located at the ribosomal binding sites of both elongation factors. Biochimie 69, 911‐923. 

Joseph,  S., & Noller, H.  F.  (1998)  EF‐G‐catalyzed  translocation  of  anticodon  stem‐loop  analogs  of 
transfer RNA in the ribosome. EMBO J. 17, 3478‐3483. 

Kao, R., Martínez‐Ruiz, A., Martínez del Pozo, A., Crameri, R. & Davies, J. (2001) Mitogillin and related 
fungal ribotoxins. Methods Enzymol. 341, 324–335. 

Katunin, V. I., Savelsbergh, A., Rodnina, M. V. & Wintermeyer W. (2002) Coupling of GTP hydrolysis 
by  elongation  factor  G  to  translocation  and  factor  recycling  on  the  ribosome.  Biochemistry  41, 
12806–12812. 

Klaholz B. P., Myasnikov A. G. & Van Heel M. (2004) Visualization of release factor 3 on the ribosome 
during termination of protein synthesis. Nature 427, 862‐865. 

Korennykh, A. V., Piccirilli, J. A. & Correll. (2006) The electrostatic character of the ribosomal surface 
enables extraordinarily rapid target location by ribotoxins. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (5) 436‐443. 

Lacadena, J., Álvarez‐García, E., Carreras‐Sangrà, N., Herrero‐Galán, E., Alegre‐Cebollada, J., García‐
Ortega, L., Oñaderra, M., Gavilanes, J. G. & Martínez del Pozo, A. (2007) Fungal ribotoxins: molecular 
dissection of a family of natural killers. FEMS Microbiol. Rev. 31, 212‐237. 

Lancaster, L., Lambert, N. J., Maklan, E. J., Horan, L. H. & Noller, H. F. (2008) The sarcin‐ricin loop of 
23S rRNA is essential for assembly of the functional core of the 50S ribosomal subunit. RNA 14, 1999‐
2012. 

La Teana A., Gualerzi, C. O. & Dahlberg, A. E.  (2001)  Initiation  factor  IF 2 binds to the alpha‐sarcin 
loop and helix 89 of Escherichia coli 23S ribosomal RNA. RNA 7, 1173‐1179. 

Leonov, A.  A.,  Sergiev,  P.  V.,  Bogdanov, A.  A.,  Brimacombe,  R. & Dontsova, O. A.  (2003) Affinity 
purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23S rRNA that affects the translocation. J. 
Biol. Chem. 278, 25664‐25670. 

Macbeth, M. R. & Wool, I. G. (1999) The phenotype of mutations of G2655 in the sarcin/ricin domain 
of 23 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 285, 965–975. 

Martínez del Pozo, A., Gasset, M., Oñaderra, M. & Gavilanes, J. G. (1989) Effect of divalent cations on 
structure –  function  relationships of  the antitumour protein  α‐sarcin.  Int.  J. Pept. Protein Res. 34, 



 
124  Resultados 

416–422. 

Martínez‐Ruiz, A., García‐Ortega, L., Kao, R., Lacadena, J., Oñaderra, M., Mancheño, J. M., Davies, J., 
Martínez  del  Pozo,  A. & Gavilanes,  J. G.  (2001)  RNase U2  and  α‐sarcin:  a  study  of  relationships. 
Methods Enzymol. 341, 335–351. 

Miller, S. P. & Bodley, J. W. (1991) α‐Sarcin cleavage of ribosomal RNA is inhibited by the binding of 
elongation factor G or thiostrepton to the ribosome. Nucleic Acids Res. 19, 1657‐1660. 

Moazed, D., Robertson, J. M. & Noller, H. F. (1988) Interaction of elongation factors EF‐G and EF‐Tu 
with a conserved loop in 23 S RNA. Nature 334, 362–364. 

Nechifor, R., Murataliev, M. & Wilson, K. S. (2007) Functional interactions between the G’ subdomain 
of  bacterial  translation  factor  EF‐G  and  ribosomal  protein  L7/L12.  J.  Biol.  Chem.  282(51),  36998‐
37005. 

Nierhaus, K. H., Schilling‐Bartetzko, S. & Twardowski, T. (1992) The two main states of the elongating 
ribosome and the role of the α‐sarcin stem‐loop structure of 23S RNA. Biochimie 74, 403‐410. 

Olson,  B.H.  &  Goerner,  G.L.  (1965)  α‐Sarcin,  a  new  antitumour  agent.  I.  Isolation,  purification, 
chemical composition, and the identity of a new amino acid. Appl. Microbiol. 13, 314–321. 

Olson,  B.H.,  Jennings,  J.C.,  Roga,  V.,  Junek,  A.J.  &  Schuurmans,  D.M.  (1965)  α‐Sarcin,  a  new 
antitumour agent. II. Fermentation and antitumour spectrum. Appl. Microbiol. 13, 322–326. 

Pan,  D.,  Kirillov,  S.V.  &  Cooperman,  B.S.  (2007)  Kinetically  competent  intermediates  in  the 
translocation step of protein synthesis. Mol. Cell 25, 519‐529. 

Pape T, Wintermeyer, W & Rodnina, M.  (1999)  Induced  fit  in  initial  selection and proofreading of 
aminoacyl‐tRNA on the ribosome. EMBO J. 18(19), 3800‐3807. 

Pérez‐Cañadillas, J. M., Santoro, J., Campos‐Olivas, R., Lacadena, J., Martínez del Pozo, A., Gavilanes, 
J. G., Rico, M. & Bruix, M. (2000) The highly refined solution structure of the cytotoxic ribonuclease 
α‐sarcin reveals the structural requirements for substrate recognition and ribonucleolytic activity. J. 
Mol. Biol. 299, 1061–1073. 

Powers, T. & Noller, H. F. (1991) A functional pseudoknot in 16 S ribosomal RNA. EMBO J. 10, 2203–
2214. 

Rodnina, M.  V.,  Savelsbergh,  A.,  Katunin,  V.  I.  & Wintermeyer, W.  (1997)  Hydrolysis  of  GTP  by 
elongation factor G drives tRNA movement on the ribosome. Nature 385, 37–41. 

Rodnina, M.,  Savelsbergh,  A., Matassova, N.B.,  Katunin,  V.I.,  Semenkov,  Y.P. & Wintermeyer, W. 
(1999) Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome. 
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 9586‐9590. 

Saarma, U., Remme, J., Ehrenberg, M. & Bilgin, N. (1997) An A to U transversion at position 1067 of 
23S rRNA from Escherichia coli impairs EF‐Tu and EF‐G function. J. Mol. Biol. 272, 327‐335. 

Savelsbergh, A., Katunin, V.  I., Mohr, D., Peske,  F., Rodnina, M. V. & Wintermeyer, W.  (2003) An 



 
125Resultados 

elongation factor G‐induced ribosome rearrangement precedes tRNA‐mRNA translocation. Mol. Cell 
11, 1517‐1523. 

Savelsbergh, A., Mohr, D., Kothe, U., Wintermeyer, W. & Rodnina, M. V. (2005) Control of phosphate 
release from elongation factor G by ribosomal protein L7/12. EMBO J. 24, 4316‐4323. 

Schindler, D. G. & Davies, J. E. (1977) Specific cleavage of ribosomal RNA caused by α‐sarcin. Nucleic 
Acids Res. 4, 1097–1110. 

Seo, H.  S., Abedin,  S.,  Kamp, D., Wilson, D. N., Nierhaus,  K. H. &  Cooperman, B.  S.  (2006)  EF‐G‐
dependent GTPase on the ribosome. conformational change and fusidic acid inhibition. Biochemistry 
45, 2504‐2514. 

Sergiev, P. V., Bogdanov, A. A. & Dontsova, O. A. (2005) How can elongation factors EF‐G and EF‐Tu 
discriminate the functional state of the ribosome using the same binding site? FEBS Lett. 579, 5439‐
5442. 

Spiegel, P. C., Ermolenko, D. N. & Noller, H. F. (2007) Elongation factor G stabilizes the hybrid‐state 
conformation of the 70S ribosome. RNA 13, 1473‐1482. 

Stark,  H.,  Rodnina, M.  V., Wieden,  H.  J.,  van  Heel, M.,  & Wintermeyer, W.  (2000)  Large‐scale 
movement  of  elongation  factor  G  and  extensive  conformational  change  of  the  ribosome  during 
translocation. Cell 100, 301–309. 

Studer,  S. M.,  Feinberg,  J.  S. &  Joseph,  S.  (2003) Rapid  kinetic  analysis of  EF‐G‐dependent mRNA 
translocation in the ribosome. J.Mol.Biol. 327, 369‐381. 

Taylor, D.  J., Nilsson,  J., Merrill, A. R., Andersen, G. R., Nissen, P. &  Frank,  J.  (2007)  Structures of 
modified eEF2 80S ribosome complexes reveal the role of GTP hydrolysis  in translocation. EMBO J. 
26, 2421‐2431. 

Valle, M.,  Zavialov,  A.,  Li, W.,  Stagg,  S. M.,  Sengupta,  J., Nielsen,  R.  C., Nissen,  P., Harvey,  S.  C., 
Ehrenberg, M. &  Frank,  J.  (2003a)  Incorporation of aminoacyl‐tRNA  into  the  ribosome as  seen by 
cryo‐electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 10 (11), 899‐906. 

Valle, M.,  Zavialov,  A.,  Sengupta,  J.,  Rawat,  U.,  Ehrenberg, M.  &  Frank,  J.  (2003b)  Locking  and 
unlocking of ribosomal motions. Cell 114, 123‐134. 

Wilson,  K.  S.  &  Nechifor,  R.  (2004)  Interactions  of  translational  factor  EF‐G  with  the  bacterial 
ribosome before and after mRNA translocation. J. Mol. Biol. 337, 15‐30. 

Wintermeyer, W., Peske, F., Beringer, M., Gromadski, K. B. Savelsbergh, A. & Rodnina, M. V. (2004) 
Mechanisms of elongation on the ribosome: dynamics of a macromolecular machine. Biochem. Soc. 
Trans. 32, 733‐737. 

Wool,  I. G., Glück, A. & Endo, Y.  (1992) Ribotoxin recognition of ribosomal RNA and a proposal for 
the mechanism of translocation. Trends Biochem. Sci. 17, 266–269. 

Xu, Y.‐Z. & Liu, W.Y. (2000) Effects of the active aldehyde group generated by RNA N‐glycosidase in 



 
126  Resultados 

the sarcin/ricin domain of rat 28S ribosomal RNA on peptide elongation. Biol. Chem. 381, 113‐119. 

Yang, X., Gerczei, T., Glover, L. T. & Correll, C. C. (2001) Crystal structures of restrictocin –  inhibitor 
complexes with implications for RNA recognition and base flipping. Nat. Struct. Biol. 8, 968–973. 

  



 
127Resultados 

 

Resultados C 

POSIBLES APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS RIBOTOXINAS 

 

La ribotoxina Asp f 1 es uno de los principales alérgenos de Aspergillus fumigatus, el hongo 
anemófilo  patógeno más  común.  La  parte más  expuesta  al  disolvente  de  su  horquilla  β  amino‐
terminal  (residuos 7‐22) está  implicada en, al menos, un epítopo alergénico. Se puede  considerar 
que  la  α‐sarcina, producida por un hongo no patógeno, A. giganteous, es una variante natural de 
Asp f 1,  pues  ambas  proteínas  presentan  una  identidad  de  secuencia  del  87%  y  una  estructura 
tridimensional  casi  idéntica. Más  de  una  cuarta  parte  de  los  19  residuos  que  las  diferencian  se 
encuentran  en  esa  horquilla  β.  Estudios  previos mostraron  una menor  reactividad  a  IgE  de  los 
mutantes de deleción de Asp f 1 y α‐sarcina, así como de  la propia α‐sarcina silvestre, aunque  los 
epítopos  IgG  se  conservaban,  lo que  convertía a  las  tres moléculas en buenos  candidatos para  la 
diagnosis y las terapias inmunomoduladoras en la hipersensibilidad a Aspergillus.  

 

C1.  Una  variante  de  deleción  del  alérgeno  Asp f 1  provoca  una  inflamación 

alérgica  de  las  vías  respiratorias  atenuada  en  un  modelo  múrido  de 
sensibilización. 

Como  se  ha  mencionado,  la  variante  de  deleción  α‐sarcina  Δ(7‐22)  es  un  prometedor 
candidato para su uso en inmunoterapias de casos de hipersensibilidad a Aspergillus, pues carece de 
actividad  citotóxica  frente  a  células  de  rabdomiosarcoma  humano  y,  además,  presenta  una 
reactividad muy reducida  frente a  las  IgE anti Asp f 1. El primer paso a dar en este sentido es una 
evaluación  in vivo de  sus propiedades hipoalergénicas. Para ello, en este  trabajo  se estableció un 
modelo de ratón sensibilizado frente a Asp f 1, administrando de forma intraperitoneal e intranasal 
una mezcla  de  la  proteína  Asp f 1  recombinante  purificada  y  una  suspensión  de  un  extracto  de 
Aspergillus fumigatus. Los ratones sensibilizados presentaron niveles elevados de IgE en suero junto 
con lesiones histológicas en pulmones y fosas nasales. En cambio, cuando en las dosis intranasales se 
administró el mutante α‐sarcina Δ(7‐22) en vez de Asp f 1, estos síntomas se vieron muy reducidos, 
verificándose la menor alergenicidad del mutante de deleción. 

Trabajo C1:   Álvarez‐García E, Batanero E, García‐Fernández R, Villalba M, Gavilanes JG 
y Martínez  del  Pozo  Á  (2009c)  A  deletion  variant  of  the  allergen  Asp f 1  attenuates  Aspergillus 
fumigatus  induced allergic airway  inflammation  in a mouse model of sensitization. Enviado a FEMS 
Letters.



 
128  Resultados 

A  deletion  variant  of  the  allergen  Asp f 1  attenuates  Aspergillus 
fumigatus  induced allergic airway  inflammation  in a mouse model of 
sensitization. 

 

Elisa Álvarez‐Garcíaa, Eva Bataneroa, Rosa García‐Fernándezb, Mayte Villalbaa, José G. Gavilanesa and 
Álvaro Martínez‐del‐Pozoa. 

aDepartamento  de  Bioquímica  y  Biología Molecular  I,  Facultad  de  Ciencias Químicas, Universidad 
Complutense, 28040 Madrid, Spain. 

bDepartamento  de Medicina  y  Cirugía Animal,  Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense, 
28040 Madrid, Spain. 

 

Short title: Asp f 1 allergen variant with diminished allergic response 

 

Corresponding author: Álvaro Martínez del Pozo, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 
I,  Facultad  de  Ciencias  Químicas,  Universidad  Complutense,  28040  Madrid,  Spain.  Telephone 
number: 0034 913944259. Fax number: 0034 913944159. E‐mail: alvaro@bbm1.ucm.es 

 

Keywords: Aspergillus, sarcin, ribotoxin, Asp f 1 

 

 

Abstract 

 

Background: Aspergillus  fumigatus  is  the most prevalent airbone  fungal pathogen, being  the 
ribotoxin Asp f 1 one of  its major allergens. α‐Sarcin  is a natural variant of Asp f 1 produced by the 
non‐pathogenic  fungus Aspergillus giganteus. Both proteins  show  sequence  identities of 87% and 
almost identical three‐dimensional structures. The α‐sarcin Δ(7‐22) deletion variant was shown to be 
much less cytotoxic against human rhabdomyosarcoma cells and indeed it displayed a 50% reduction 
of Asp f 1‐IgE reactivity. 

Objectives: To establish a murine model of IgE sensitization to Asp f 1 and to use it to test the 
immunologic response elicited by the α‐sarcin Δ(7‐22) mutant. 

Methods: BALB/c mice were sensitized with mixtures of recombinant wild type Asp f 1 and/or 
an Aspergillus  fumigatus  extract  and  challenged with Asp f 1  or  α‐sarcin  Δ(7‐22). Mice  sera were 
collected for subsequent measurement of Ig levels and histological analysis of nostrils and lungs was 
performed. 



 
129Resultados 

Results: Development of a murine model of sensitization to Asp f 1 was only possible when the 
purified protein Asp f 1 was administered together with an extract of A. fumigatus. The model was 
characterized by elevated  levels of  total  IgE  in  serum and histological  lesions  in  lung and nostrils. 
These symptoms were greatly reduced when the deletion variant was the protein administered. 

Conclusions: A mouse model of A.  fumigatus  sensitization has been established and used  to 
show the decreased allergenicity of α‐sarcin Δ(7‐22) which appears as a suitable candidate to test for 
future immunotherapy.  

 

 

Introduction 

 

  Aspergillus  fumigatus  is  an  exceptional  fungus  among  microorganisms  in  being  both  a 
primary and opportunistic pathogen as well as an  important source of allergens  [1].  Its ubiquitous 
spores  are  continuously  inhaled  by  humans  leading  to  an  almost  constant  exposure  of  the 
respiratory tract and, therefore, to the possibility of being colonized [2]. This inhalation has adverse 
effects  only  very  rarely  as  the  conidia  are  usually  eliminated  efficiently  by  the  innate  immune 
system. Nevertheless,  immunosuppressive therapies are changing significantly this scenario  leading 
to an  increase of  the onset of pathologic events  involving A.  fumigatus  infections. Perhaps  for all 
these reasons, this microorganism  is now the most prevalent airborne fungal pathogen [2] and the 
etiological  agent  identified  in  80%  of  Aspergillus‐related  diseases,  including  hypersensitivity 
pneumonitis,  allergic  rhinitis,  IgE‐mediated  asthma,  and  the  severe  allergic  bronchopulmonary 
aspergillosis  (ABPA),  as well  as  different  invasive  infections  in  immunocompromised  patients  [1]. 
ABPA  is  characterized by  the presence of  specific  IgE  against  a number of A.  fumigatus proteins, 
enhanced peripheral blood and lung eosinophilia, mild bronchospasm and airway hyperreactivity to 
inhaled allergens [1,3]. 

  Over the past few years, a number of allergens have been identified and characterized from 
A.  fumigatus.  Asp f 1,  a  protein  belonging  to  the  ribotoxins  family,  is  one  of  its major  allergens, 
showing prevalence higher than 80% [4,5]. Asp f 1‐specific IgE antibodies are generally found in sera 
from patients sensitized to Aspergillus, but particularly in ABPA patients [1,5‐6]. 

  α‐Sarcin  from  the  non‐pathogenic  fungus  Aspergillus  giganteus  is  the  best  characterized 
member of the fungal ribotoxins family, a group of highly specific secreted ribonucleases [7]. Asp f 1 
belongs to the same family and shows 87% amino acid sequence identity with α‐sarcin [4] as well as 
almost identical three‐dimensional structures [5, Yang and Moffat, 1996, Campos‐Olivas et al., 2001]. 
In this regard, both proteins can be considered as natural variants from the same toxins family. Their 
toxicity comes first from their ability to reach the cytosol via receptor‐independent endocytosis [8]. 
Then, once inside the host cell, ribotoxins inhibit protein biosynthesis by inactivating the ribosomes, 
leading  to  cell death  [7]. Based on mutational  studies of  α‐sarcin,  the NH2‐terminal  β‐hairpin has 
been shown to play a key role both  in the cytotoxic effect of ribotoxins as well as  in  IgE mediated 



 
130  Resultados 

responses [5,9]. According to these data, the deletion mutant α‐sarcin Δ(7‐22), where this β‐hairpin 
had been eliminated  [9], showed a much  lower cytotoxicity and a 50%  reduction of  IgE  reactivity. 
Interestingly, the mutant still maintained the wild‐type three‐dimensional structure [García‐Mayoral 
et al., 2005] and its prevalence in sera from ABPA patients [5]. 

  Currently,  immunotherapy  of  A.  fumigatus  allergy  is  performed  with  allergenic  extracts 
containing up to 200 different allergens, which are difficult to standardize [10]. In addition, the risk 
of anaphylactic side reactions during the treatment cannot be ruled out. These problems could be 
overcome with the use of recombinant allergens with reduced  IgE‐binding capacity  [11‐13].  In this 
regard,  the  deletion  variant  of  ribotoxins  described  above  is  a  promising  molecule  for  use  in 
immunomodulating therapies for Aspergillus hypersensitivity. Taking into account its high sequence 
and three‐dimensional structure identities, altogether with its reduced IgE binding capacity, α‐sarcin 
Δ(7‐22)  can  be  also  considered  as  an  hypoallergenic  variant  of  Asp f 1.  However,  the  in  vivo 
evaluation of such hypoallergenicity is still required to assess this possibility. Therefore, the primary 
aim of  this  study was  to  establish  a murine model of  IgE  sensitization  to  the  recombinant major 
allergen of Aspergillus fumigatus Asp f 1 and then to use it to test the immunologic response elicited 
by this deletion variant [5,9]. 

 

 

Materials and methods 

 

Mice 

Female, 6‐8 week old BALB/c mice were obtained from Harlan Interfauna Ibérica SA (Barcelona, 
Spain). Animals were maintained at the Animal Care Services of the Faculty of Biology (Universidad 
Complutense, Madrid,  Spain),  according  to  the  local  guidelines  for  animal  care.  The  studies were 
approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of the Complutense University. 

 

Protein production and purification 

E. coli BL21  (DE3) cells cotransformed with a  thioredoxin‐producing plasmid  (pT‐Trx) and  the 
corresponding Asp f 1 or  the deletion mutant α‐sarcin Δ(7‐22) plasmids were used  to produce  the 
proteins, as previously described [14‐16]. Protein purification  included  ion exchange and molecular 
size exclusion chromatographies [17]. SDS‐PAGE of proteins, protein hydrolysis, amino acid analysis, 
and circular dichroism spectra were performed according to standard procedures [6,14,17]. Western 
blots were performed as described before [5] using rabbit sera raised against wild‐type α‐sarcin or 
Asp f 1. Homogeneity of the protein samples used  in this study was assessed according to all these 
previous criteria, as describe before. 

 

 



 
131Resultados 

Aspergillus fumigatus extract preparation 

Spores  and mycelia  inactivated by  gamma  radiation  (Allergon AB, Ängelholm,  Sweden) were 
resuspended in PBS 1mg/ml (w/v) and this suspension was shaken for 2 hours at 250 rpm and 4ºC. 
This suspension is referred as the “Af extract” through the text. 

 

Induction of experimental allergy (sensitization and challenge) 

Mice (n=5) were sensitized by 2 intraperitoneal (i.p.) injections with 1 µg of Asp f 1 and 10 µl of 
the Af extract adsorbed to 2 mg Al(OH)3 in 150 µl of PBS in 7 day‐intervals. After 7 days mice were 
challenged by intranasal (i.n.) administration of different amounts of Asp f 1 or the mutant α‐sarcin 
Δ(7‐22)  in 50 μl PBS on 3 consecutive days under anaesthesia  (Fig.1, table 1). Seven days after the 
last i.n. challenge, blood samples were collected from the retroorbital plexus (terminal bleeding) and 
tissues were removed for histological examination. 

 

Table 1. ‐ Different doses of Asp f 1 and Af extract used in the final sensitization protocol. The intranasal 
administrations of Asp f 1 were of 1, 5, or 10 µg. 

Mice group Intraperitoneal injection Intranasal challenge 

A  None None 

B 

10 µl Af extract + 1 µg Asp f 1 

PBS 

C  1 µg Asp f 1 

D  5 µg Asp f 1 

E  10 µg Asp f 1 

F  1 µg α‐sarcin Δ(7‐22) 

Fig.  1.  –  (A)  Experimental  protocol. 
Mice  were  sensitized  by 
intraperitoneal  (i.p.) Asp f 1  (1µg) and 
Af extract  (10 µl) on Al(OH)3  followed 
by  intranasal  (i.n.)  challenge    with 
Asp f 1 (1, 5 or 10 µg) or α‐sarcin Δ(7‐
22)  (1µg)  on  three  consecutive  days. 
After  one  week,  blood  and  serum 
tissues  samples  were  collected.  (B) 
Survival  of mice  treated  according  to 
these  protocols,  expressed  as 
percentage  of  mice  surviving  as  a 
function of  time of  treatment. A  to E 
are  the  different  mice  group  (see 
Table 1). 



 
132  Resultados 

Determination of specific allergen IgG1, IgG2a and total IgE in serum 

Antibodies  (Ab)  binding  was  measured  by  ELISA  as  previously  described  [18].  In  order  to 
quantitate Asp f 1 specific antibodies, serum samples were diluted 1:25000 for IgG1, 1:400 for IgG2a, 
and 1:5 for  IgE. Antibody  levels were expressed as optical density (OD) values at 492 nm. Total  IgE 
(diluted 1:40)  levels  in  serum were measured by  sandwich ELISA using  the OptEIA mouse  IgE  set 
(PharMingen, San Diego, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions.  

 

Histopathology 

Nostrils  and  lung  samples  were  fixed  in  10%  buffered  formalin,  routinely  processed  and 
paraffin‐embedded. Sections of 3 µm were stained with haematoxylin and eosin (H&E) to examine 
the general morphology and cellular  infiltration and Periodic acid‐Schiff (PAS) technique to observe 
the mucus production. Sections were examined under light microscope by pathologist blinded to the 
protocol  design.  The  intensity  and  severity  of  lung  and  nostrils  affections  were  assessed  on  a 
semiquantitative score ranging from 0 to 4. 

 

 

Results 

 

Sensitization protocol 

In order to establish a murine model of allergic sensitization to recombinant Asp f 1, different 
approaches were tried. The success of each protocol was evaluated by means of measuring total and 
specific antibody  levels,  including  IgE,  IgG1 and  IgG2a, as well as by assessing clinical manifestations 
such as histopathological alterations, pilar erecti and weight‐loss. The final strategy tried was based 
on the intraperitoneal co‐administration of recombinant Asp f 1 and Af extract in alum, followed by 
i.n.  challenge with different doses of  recombinant Asp f 1  (C, D,  and  E  groups;  Table 1). Group A 
(non‐treated mice)  and  group  B  (mice  challenged with  PBS)  represent  controls. Mice  in  group  E 
systematically died  after  the  third  i.n.  challenge  (Fig.1). Consequently,  it was not  further  studied. 
Groups C and D did experience adverse effects, as evidenced by weight loss and pilar erecti, but fully 
recovered once the Asp f 1 challenge was interrupted. 

 

Antibody response 

Intraperitoneal injection of the Asp f 1–Af extract mixture was sufficient to induce a seven‐fold 
increase in the total IgE serum levels when comparing to group A (Fig. 2). This response was further 
strengthened  after  i.n.  challenge  with  5  μg  of  Asp f 1  (Fig.  2).  No  significant  differences  were 
observed between groups B and C. Asp f 1‐specific IgE and IgG1 antibody levels were not detected in 
the sera of any of the immunized mice within the limits of ELISA and Western blot.  



 
133Resultados 

 

 

 

 

 

 

 

 

Lung and nostril histology 

Lung  tissues were  obtained  from  each  experimental  group,  except  for  group  E,  seven  days 
following  the  last  i.n.  challenge  to  assess  the  effect  of  the  sensitization  protocol  on  airway 
inflammation. Histological examination revealed that Asp f 1 challenge promoted severe perivascular 
and  peribronchial  infiltrations  of  inflammatory  cells  ‐lymphocytes,  neutrophils  and  occasional 
eosinophils  and macrophages‐  in  all  lobes of  lungs,  in  comparison with naïve mice. These effects 
were  even  more  evident  in  mice  of  group  D  where  a  marked  reepithelization  and  fibrosis, 
characterized by an enrichment of collagen  fibers, were also observed  in all over  the parenchyma 
(Fig. 3).  

 

 

 

 

 

 

Fig.  2.  ‐  Total  serum  IgE  levels  in  the 
different  groups  of  sensitized  mice 
determined  by  ELISA.  Bars  represent 
group means ± standard error (SEM) of 5 
mice per group. 

Fig. 3. – (A‐F) Representative photomicrograph H&E stained of lung section from mice in groups A, 
B, C, D, and F. Histological examination  revealed numerous  zones of  inflammation  (white arrows) 
and epithelial hyperplasia  (black arrows)  in  lungs  from C and D animals  in  comparison  to  control 
mice (groups A and B). B, bronchium; V, Blood vessel. Fibrosis was especially noteworthy in group D 
(See  the  inset photomicrograph  in panel D).  (G) Histological score  for  lung  inflammation. Data are 
the mean ± SEM of 5 mice per group. 



 
134  Resultados 

 

Examination of nostril tissues revealed that they were also affected by Asp f 1 sensitization (Fig. 
4). A mixed infiltrate of cells, especially lymphocytes and neutrophils, were observed into the nostrils 
compared  to  naïve  mice.  Again,  the  most  severe  effects  were  obtained  in  group  D.  Mucus 
hypersecretion  in  the  nostrils  cavities  was  a  notable  histopathological  feature  of  the  Asp f 1 
challenged mice.  

 

 

 

 

 

Effect of a deletion mutant with diminished IgE response 

The Δ(7‐22) deletion mutant of α‐sarcin was also  included  in  this study with  the  final goal of 
evaluating its effect on the onset of the allergic sensitization. Thus, mice of group F were intranasally 
challenged with 1 µg of  Δ(7‐22)  α‐sarcin,  the  amount of  recombinant Asp f 1 used  for  animals  in 
group C. No significant effects on total IgE were observed in the mutant challenged mice compare to 
group  C  (Fig.  2). Nevertheless,  i.n.  administration  of  the mutant  decreased  the  perivascular  and 
peribronchial cellular infiltration and inhibited epithelial cell hyperplasia in lung (Fig. 3). With respect 
to nostrils,  the use of  the mutant protein  failed  to  induce a  lower cellular  inflammatory response, 
but reduced notably mucus release (Fig. 4).  

 

 

 

Fig. 4. – (A‐F) Representative photomicrograph of H&E stains of nostrils sections from mice in groups 
A, B, C, D and F  showing  the  cellular  infiltration. The  insets are photomicrograph PAS  stains of a 
wider field where the mucus plugs are marked with asterisks. (G) Histological score of inflammation 
and mucus secretion. Data are the mean ± SEM of 5 mice per group. 



 
135Resultados 

Discussion 

 

One of the alternative approaches to conventional  immunotherapy for allergy  is based on the 
use of hypoallergenic derivatives as vaccines [11,19]. Before clinical application,  in vitro and  in vivo 
evaluation of hypoallergens  is required to  identify the best candidates.  In the present study, the  in 
vivo allergenicity of a potential hypoallergenic variant of Asp f 1, α‐sarcin Δ(7‐22) mutant, has been 
investigated in a mouse model of A. fumigatus sensitization in comparison to the recombinant wild‐
type protein. Previously, the murine model of sensitization to this fungus has been established. 

  Murine models mimicking clinical events are useful tools as preclinical test systems for new 
prophylactic and therapeutic approaches against allergy, as well as for studying the  immunological 
events  involved  in Type  I sensitization. The majority of animal models of A. fumigatus sensitization 
have  been  achieved  in mice  by  i.n.  administration  of  crude  extracts  of  the  fungus or with  intact 
organisms, particularly the conidia [20‐22]. Although it has been described that potent sensitization 
occurs  in  absence  of  exogenous  adjuvants  [23],  we  were  not  able  to  sensitize  mice  to  the 
commercially available extract used  in  this study. This could be due  to  the no detectable  levels of 
Asp f 1 in it. On the basis of previous studies [20‐22,24‐26], BALB/c mice were then sensitized by i.p. 
administration  of  Asp  f  1/Af  extract  in  Al(OH)3  followed  by  i.n.  challenge.  The  allergic  state was 
characterized by the induction of high levels of total IgE in serum, which were further enhanced after 
i.n. challenge, as well as histological lesions in the lung and nostrils. However, neither Asp f 1‐specific 
IgE, IgG1 nor IgG2a antibodies were detected. This is in agreement with the studies of Svirshchevskaya 
et  al.  [27]  who  observed  that  immunization  of  animals  with  A.  fumigatus  extract  induced  an 
increased level of total serum IgE, but not specific IgE/IgG antibodies. Lung lesions typically consisted 
of perivascular and peribronchial  infiltrates of  inflammatory  cells, emigration of  some eosinophils 
into the  lumen and  in severe cases epithelial hyperplasia. Accumulation of collagen was frequently 
noted  at  the  parenchymal  area.  In  addition,  the  strong  inflammation  in  the  lungs  induced  by A. 
fumigatus antigens persisted over seven days after the last i.n. challenge. Similar results have been 
also obtained by other groups [28‐30]. The histological study was further extended to the nostrils of 
the animals and the obtained results were compatible with the induction of an allergic response to 
A. fumigatus antigens. Overall, the results suggest that the allergic response observed in the present 
murine model  is not  just the typical  IgE‐dependent response but rather the result of a much more 
complex  interaction  between  the  host  immune  system  and  A.  fumigatus  antigens,  including 
ribotoxins.  The  specific  roles  of  the  individual  allergens  are  still  to  be  clearly  determined.  These 
results suggest that the allergic state induced by Asp f 1/Af extract could result from the cumulative 
effects of various  toxins, esterases and proteases present  in  the extract  that can act as adjuvants, 
perhaps by inducing epithelial damage and allowing normally antigens to bypass the mucosal barrier 
[22,26,31].  In  addition,  it  has  been  shown  that  proteases  preferentially  induce  Th2  responses, 
suggesting  that  they  could  be  skewing  the  response  to  A.  fumigatus  antigens  to  a more  allergic 
phenotype [32, Lamhamedi‐Cherradi et al., 2008]. 

  Finally,  the most encouraging  results presented  in  this work are probably  those obtained 
with the hypoallergenic derivative of Asp 1. Few studies have analyzed the ability of hypoallergens to 



 
136  Resultados 

induce  an  IgE  response  in  an  animal model  [33‐3].  Challenge  of mice with  the  α‐sarcin  Δ(7‐22) 
mutant resulted in substantially decrease in lung and nostril lesions when compared to that induced 
by wild  type Asp  f  1,  but  total  IgE  levels  remained  unaffected. Our  data  demonstrated  that  this 
mouse model of A.  fumigatus  sensitization  is  a  suitable  system  for  the  in  vivo  testing  of mutant 
allergens.  Moreover,  these  data  confirmed  the  low  toxicity  and  the  hypoallergenic  character 
suggested previously for the deletion mutant [5]. Obviously, toxicity at higher doses cannot be ruled 
out and therefore must be explored further in the near future. However, the good correlation of in 
vivo  and  in  vitro  experiments  allows  us  to  consider  the  α‐sarcin  Δ(7‐22) mutant  as  a  reasonable 
vaccine candidate. 

  In summary, a mouse model of A. fumigatus sensitization has been established. Despite of 
its  limitations,  this  in  vivo  model  has  provided  valuable  information  for  preclinical  testing  of 
recombinant  allergen  and  its  derivatives.  The  decreased  allergenic  activity  of  α‐sarcin  Δ(7‐22),  in 
terms of a reduced airways inflammatory response and the previously described [5] lower human IgE 
binding activity, identified this molecule as suitable candidate for immunotherapy, although further 
studies are required to establish its efficiency and safety for treatment of allergic patients. 

 

 

Acknowledgements 

This work was supported by grant BFU2006‐04404 from the Ministerio de Educación y Ciencia 
(Spain). E. A.‐G.  is recipient of a  fellowship  from  the Ministerio de Educación y Ciencia  (Spain).The 
useful discussion and suggestions made by Dr. Rosalía Rodríguez are greatly appreciated. 

 

 

References 

[1] Greenberger PA: Allergic bronchopulmonary aspergillosis. J Allergy Clin  Immunol 2002; 10: 685‐
692. 

[2] Latgè JP: The pathobiology of Aspergillus fumigatus. Trends Microbiol 2001; 9: 382‐389. 

[3] Wark PA and Gibson PG: Allergic bronchopulmonary aspergillosis: new concepts of pathogenesis 
and treatment. Respirology 2001; 6: 1‐7. 

[4] Arruda LK, Platts‐Mills TA, Fox JW and Chapman MD: Aspergillus fumigatus allergen I, a major IgE‐
binding protein, is a member of the mitogillin family of cytotoxins. J Exp Med 1990; 172: 1529‐1532.  

[5] García‐Ortega L, Lacadena J, Villalba M, Rodríguez R, Crespo JF, Rodríguez J, Pascual C, Olmo N, 
Oñaderra  M,  Martínez  del  Pozo  A  and  Gavilanes  JG:  Production  and  characterization  of  a 
noncytotoxic deletion  variant  of  the Aspergillus  fumigatus  allergen Asp f 1 displaying  reduced  IgE 
binding. FEBS J 2005; 272: 2536‐2544. 



 
137Resultados 

[6] Kao R, Martínez‐Ruiz A, Martínez del Pozo A, Crameri R and Davies J: Mitogillin and related fungal 
ribotoxins. Methods Enzymol 2001; 341: 324‐335. 

[7]  Lacadena  J,  Alvarez‐García  E,  Carreras‐Sangrà N,  Herrero‐Galán  E,  Alegre‐Cebollada  J,  García‐
Ortega L, Oñaderra M, Gavilanes JG and Martínez del Pozo A: Fungal ribotoxins: molecular dissection 
of a family of natural killers. FEMS Microbiol Rev 2007; 31: 212‐237. 

[8] Olmo N,  Turnay  J, González  de  Buitrago G,  López  de  Silanes  I, Gavilanes  JG  and  Lizarbe MA: 
Cytotoxic mechanism of the ribotoxin α‐sarcin. Induction of cell death via apoptosis. Eur J Biochem 
2001; 268: 2113‐2123. 

[9] Garcia‐Ortega L, Masip M, Mancheño JM, Oñaderra M, Lizarbe MA, García‐Mayoral MF, Bruix M, 
Martínez del Pozo A  and Gavilanes  JG: Deletion of  the NH2‐terminal  β‐hairpin of  the  ribotoxin  α‐
sarcin produces a nontoxic but active ribonuclease. J Biol Chem 2002; 277: 18632‐18639. 

[10] Kurup VP and Kumar A: Immunodiagnosis of aspergillosis. Clin Microbiol Rev 1991; 4: 439‐456. 

[11]  Valenta  R  and  Niederberger  V:  Recombinant  allergens  for  immunotherapy.  J  Allergy  Clin 
Immunol 2007; 119: 826‐830. 

[12] Crameri R, Hemmann S,  Ismail C, Menz G and Blaser K: Disease‐specific recombinant allergens 
for the diagnosis of allergic bronchopulmonary aspergillosis. Int Immunol 1998; 10: 1211–1216. 

[13] Kurup VP, Knutsen AP, Moss RB and Bansal NK: Specific antibodies to recombinant allergens of 
Aspergillus fumigatus in cystic fibrosis patients with ABPA. Clin Mol Allergy 2006; 4: 11. 

[14] Lacadena J, Martínez del Pozo A, Barbero JL, Mancheño JM, Gasset M, Oñaderra M, López‐Otín 
C, Ortega S, García J and Gavilanes JG: Overproduction and purification of biologically active native 
fungal α‐sarcin in Escherichia coli. Gene 1994; 142: 147‐151. 

[15] Lacadena J, Martínez del Pozo A, Martínez‐Ruiz A, Pérez‐Cañadillas JM, Bruix M, Mancheño JM, 
Oñaderra  M  and  Gavilanes  JG:  Role  of  histidine‐50,  glutamic  acid‐96,  and  histidine‐137  in  the 
ribonucleolytic mechanism of the ribotoxin α‐sarcin. Proteins 1999; 37: 474‐484. 

[16] García‐Ortega L, Lacadena J, Lacadena V, Masip M, De Antonio C, Martínez‐Ruiz A and Martínez 
del Pozo A: The solubility of the ribotoxin α‐sarcin, produced as a recombinant protein in Escherichia 
coli, is increased in the presence of thioredoxin. Lett Appl Microbiol 2000; 30: 298‐302. 

[17] Martínez‐Ruiz  A,  García‐Ortega  L,  Kao  R,  Lacadena  J, Oñaderra M, Mancheño  JM,  Davies  J, 
Martínez del Pozo A and Gavilanes  JG: RNase U2 and  α‐sarcin: A  study of  relationships. Methods 
Enzymol 2001; 341: 335‐351. 

[18] Batanero E, Barral P, Villalba M and Rodríguez R: Sensitization of mice with olive pollen allergen 
Ole e 1 induces a Th2 response. Int Arch Allergy Immunol 2002; 127: 269‐275. 

[19] Vrtala S: From allergen genes to new forms of allergy diagnosis and treatment. Allergy 2008; 63: 
299‐309. 



 
138  Resultados 

[20] Kurup VP,  Seymour BWP, Choi H  and Coffman RL: Particulate Aspergillus  fumigatus  antigens 
elicit a Th2 response in BALB/c mice. J Allergy Clin Immunol 1994; 93: 1013‐1020. 

[21] Kurup VP, Xia JQ, Crameri R, Rickaby DA, Choi HY, Flückiger S, Blaser K, Dawson CA and Kelly KJ: 
Purified recombinant A. fumigatus allergens induce different responses in mice. Clin Immunol 2001; 
98: 327‐336. 

[22]  Kurup  VP  and  Grunig  G:  Animal  models  of  allergic  bronchopulmonary  aspergillosis. 
Mycopathologia 2001; 153: 165‐177. 

[23] Kurup VP, Xia  JQ, Rickaby DA, Dawson CA, Choi H and Fink  JN: Aspergillus  fumigatus antigen 
exposure  results  in  pulmonary  airway  resistance  in wild‐type  but  not  in  IL‐4  knockout mice.  Clin 
Immunol 1999; 90: 404‐410. 

[24] Kurup VP, Kumar A, Kenealy WR and Greenberger PA: Aspergillus ribotoxins react with IgE and 
IgG antibodies of patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis.  J Lab Clin Med 1994; 123: 
749‐756. 

[25] Grünig G, Corry DB,  Leach MW, Seymour BW, Kurup VP and Rennick DM:  Interleukin‐10  is a 
natural  suppressor  of  cytokine  production  and  inflammation  in  a  murine  model  of  allergic 
bronchopulmonary aspergillosis. J Exp Med 1997; 185, 1089‐1099. 

[26]  Shen  HD,  Tam  MF,  Tang  RB  and  Chou  H:  Aspergillus  and  Penicillium  allergens:  focus  on 
proteases. Curr Allergy Asthma Rep. 2007; 7: 351‐356.  

[27] Svirshchevskaya EV, Viskova N, Shevchenko M, Alekseeva L, Marchenko A, Benevolensky S and 
Kurup VP: High‐affinity IgG to a major A. fumigatus allergen, Asp f 2, retards allergic response. Med 
Sci Monit 2004; 10: 371‐380. 

[28]  Kurup  VP, Mauze  S,  Choi  HY,  Seymour  BWP  and  Coffman  RL:  A  murine  model  of  allergic 
bronchopulmonary aspergillosis with elevated eosinophils and IgE. J Immunol 1992; 148: 3783‐3788. 

[29] Hogaboam CM, Blease K, Mehrad B, Steinhauser ML, Standiford TJ, Kunkel SL and Lukacs NW: 
Chronic  airway  hyperreactivity,  goblet  cell  hyperplasia,  and  peribronchial  fibrosis  during  allergic 
airway disease induced by Aspergillus fumigatus. Am J Pathol 2000; 156: 723‐732.  

[30] Kurup VP, Choi H, Resnick A, Kalbfieisch J and Fink JN: Immunopathological response of C57BL/6 
and C3H/Hen mice to Aspergillus fumigatus antigens. Int Arch Allergy Appl Immunol 1990; 91: 145‐
154. 

[31]  Reed  CE  and  Kita  H:  The  role  of  protease  activation  of  inflammation  in  allergic  respiratory 
diseases. J Allergy Clin Immunol 2004; 114: 997‐1008. 

[32] Tomee  JF, Wierenga AT, Hiemstra PS and Kauffman HK: Proteases  from Aspergillus  fumigatus 
induce  release of proinflammatory  cytokines  and  cell detachment  in  airway  epithelial  cell  lines.  J 
Infect Dis 1997; 176: 300‐303.  



 
139Resultados 

[33] Orlandi A, Grasso F, Corinti S, Marinaro M, Bonura A, Boirivant M, Colombo P and Di Felice G: 
The  recombinant  major  allergen  of  Parietaria  judaica  and  its  hypoallergenic  variant:  in  vivo 
evaluation in a murine model of allergic sensitization. Clin Exp Allergy 2004; 34: 470‐477. 

[34] Marazuela EG, Rodríguez R, Barber D, Villalba M and Batanero E: Hypoallergenic mutants of Ole 
e 1, the major olive pollen allergen, as candidates for allergy vaccines. Clin Exp Allergy 2007; 37: 251‐
260. 

   



 
140  Resultados 

 

  



 
141Resultados 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

C2. Lactococcus lactis como vehículo para la expresión heteróloga de variantes de 

ribotoxinas fúngicas con afinidad reducida por IgE. 

Lactococcus lactis es una bacteria Gram positiva, no patogénica, no invasiva, ni colonizante, 
considerada  GRAS  (generally  regarded  as  safe),  ideal  como  vehículo  para  la  administración  de 
fármacos o vacunas en nuestro tracto digestivo. Con esta idea en mente, se obtuvieron cepas de L. 
lactis capaces de producir y secretar el alérgeno Asp f 1 y las tres variantes con afinidad reducida por 
IgE:  la α‐sarcina  silvestre y ambos mutantes de deleción. Además,  se  incluyó un mutante de  la α‐
sarcina sin actividad  ribonucleolítica y por  tanto no citotóxico: α‐sarcina H137Q. Con un medio de 
cultivo  tamponado,  las  proteínas  se  secretan  al  medio  extracelular  en  su  forma  nativa,  pues 
presentan actividad ribonucleolítica, salvo el mutante catalítico, obviamente. 

Como  una  primera  prueba,  se  administró  intragástricamente  la  cepa  productora  de  α‐
sarcina silvestre a ratones sanos durante un periodo de 14 días, resultando inocua. En resumen, los 
resultados que se presentan se discuten en  términos de su potencial aplicación como vehículo de 
distribución oral de variantes hipoalergénicas así como de punto de partida con el que enfocar el 
diseño  de  estrategias  para  lograr  una  forma  segura  de  distribuir  estas  proteínas  como  agentes 
antitumorales. 

Trabajo C2:  Álvarez‐García E, Alegre‐Cebollada  J, Batanero E, Monedero V, Pérez‐Martínez G, 
García‐Fernández R, Gavilanes JG y Martínez del Pozo Á (2008) Lactococcus lactis as a vehicle for the 
heterologous expression of fungal ribotoxin variants with reduced IgE‐binding affinity. J Biotechnol. 
134:1‐8.    



 
142  Resultados 

 



 
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151Discusión 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Discusión 



 
152  Discusión 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Las especiales características de las ribotoxinas en términos de citotoxicidad y especificidad 
de acción las hacen únicas dentro de todas las ribonucleasas, a pesar de que presentan una estrecha 
relación estructural y filogenética con algunas de ellas, como las de la familia de la RNasa T1. 

La primera característica que se pone de manifiesto en la actividad de las ribotoxinas es su 
capacidad  para  atravesar membranas  celulares  sin  que medie  ningún  receptor  proteico.  En  este 
sentido se ha estudiado la implicación de la horquilla β amino‐terminal en este proceso, en concreto, 
, el papel de su carácter básico. Una vez dentro de la célula, el siguiente paso es el reconocimiento 
de su sustrato, el ribosoma, y en él, de un único enlace fosfodiéster en el SRL. El trabajo que se ha 
desarrollado  ha  permitido  determinar  la  importancia  de  las  interacciones  electrostáticas  que 
establece  esta  horquilla  amino‐terminal  con  el  ribosoma.  La  última  etapa  en  la  acción  de  las 
ribotoxinas es  la actividad ribonucleolítica en sí. Y a este respecto se ha estudiado  la función de  la 
Tyr 48 de la α‐sarcina, un residuo conservado del centro activo.  

En  la  célula  atacada  por  una  ribotoxina,  se  produce  una  inhibición  de  la  biosíntesis  de 
proteínas que provoca  irremediablemente un proceso apoptótico. También se ha analizado, a nivel 
molecular,  los  efectos  de  esa  acción  ribonucleolítica  que  inhabilita  al  ribosoma  para  sintetizar 
proteínas. 

Por último, se han abierto vías para futuras aplicaciones terapéuticas de estas proteínas. Por 
un lado, se ha considerado el posible carácter hipoalergénico de determinados mutantes de uno de 
los  principales  alérgenos  de  Aspergillus  fumigatus,  Asp f 1,  perteneciente  a  la  familia  de  las 
ribotoxinas,  ante  la  posibilidad  de  utilizarlos  en  el  tratamiento  y  prevención  de  procesos  de 
hipersensibilidad a este hongo. Y, por otra parte, se han desarrollado varias cepas de Lactococcus 
lactis recombinantes con vistas a utilizarlas como vehículo para hacer  llegar  las ribotoxinas al tubo 
digestivo. 



 
153Discusión 

FUNCIONALIDAD DE LAS RIBOTOXINAS 

 

Paso a través de membranas 

Dentro  del  amplio  grupo  de  RNasas  microbianas  extracelulares  al  que  pertenecen,  las 
ribotoxinas destacan por  su mayor  tamaño  (alrededor de 40 aminoácidos más que  las RNasas no 
tóxicas), su basicidad y su citotoxicidad. Este carácter citotóxico es el resultado de la conjunción de 
su elevada especificidad de acción ribonucleolítica y su capacidad para interaccionar con membranas 
(Lacadena  et  al.,  2007;  Herrero‐Galán  et  al.,  2008a).  Desde  un  punto  de  vista  estructural,  las 
principales diferencias con respecto a  las RNasas del tipo T1 radican en  la  longitud y ordenamiento 
del extremo amino‐terminal y de los bucles de estructura aperiódica que conectan los elementos de 
estructura  secundaria  ordenada,  aspectos  que  son  consecuentemente  considerados  como 
determinantes  de  la  actividad  característica  de  las  ribotoxinas.  Durante  años  se  ha  estudiado  la 
implicación  de  estos  bucles  en  los  procesos  que  confieren  a  las  ribotoxinas  sus  características 
diferenciales, esto es,  la  capacidad de  interacción  con membranas  fosfolipídicas y  la especificidad 
frente al ribosoma. En todos los casos, los resultados han apuntado principalmente a dos zonas de la 
α‐sarcina, el bucle 2 y la horquilla β amino‐terminal. Precisamente, aunque existe un elevado grado 
de similitud entre  las secuencias de  las  ribotoxinas conocidas  (Rodríguez et al., 1982; Sacco et al., 
1983; López‐Otín et al., 1984; Fernández‐Luna et al., 1985; Arruda et al., 1992; Wirth et al., 1997), es 
en estas zonas donde se observan las principales diferencias, aunque la mayoría de los cambios son 
conservativos. 

El bucle 2 ha sido propuesto por varios autores (Yang & Moffat, 1996; Martínez del Pozo et 
al., 1988; Kao & Davies, 1999; Pérez‐Cañadillas et al., 2000) como una de las regiones de la proteína 
implicadas en  la  interacción con  lípidos  (Figura 5b, página 15), aunque esta es una posibilidad que 
aún  está  por  estudiar.  Por  su  parte,  también  se  han  atribuido  a  la  horquilla  β  amino‐terminal 
propiedades importantes en cuanto a la interacción con lípidos. El comportamiento del mutante de 
deleción α‐sarcina Δ(7‐22) y otros mutantes puntuales (García‐Ortega et al., 2001,2002) en ensayos 
con vesículas lipídicas modelo sugieren que esta región interviene en la interacción con membranas 
celulares (García‐Ortega et al., 2001,2002). 

En  esta  Tesis  se  ha  estudiado  la  posible  importancia  del  carácter  básico  de  esta  región 
amino‐terminal, pues 5 de  los 16 residuos que  la componen son  lisinas o argininas. La α‐sarcina es 
una  proteína  muy  cargada,  con  un  punto  isoeléctrico  elevado.  El  39%  de  su  superficie  está 
compuesta por cadenas  laterales cargadas y el 26% por cadenas  laterales polares (Pérez‐Cañadillas 
et  al.,  2000). De  hecho,  ya  se  ha  demostrado  en  otras  ribonucleasas  la  importancia  del  carácter 
básico en su citotoxicidad (Di Donato et al., 1994; Vatzaki et al., 1999; Ilinskaya et al., 2002). En las 
ribotoxinas,  la abundancia de  residuos  cargados positivamente  cumple una doble  función pues es 
imprescindible  para  el  reconocimiento  y  unión  tanto  a  su  diana  catalítica,  muy  cargada 
negativamente, el rRNA, como a las membranas celulares. Una prueba de que existe un componente 



 
154  Discusión 

electrostático  fundamental  en  la  interacción  proteína‐lípido  es  la  inhibición que  se  observa  en  la 
interacción entre α‐sarcina y vesículas de fosfatidil glicerol al aumentar la fuerza iónica (Gasset et al., 
1989). Por otra parte, que  la  α‐sarcina  interaccione específicamente  con  vesículas de  fosfolípidos 
cargadas  negativamente  a  pH  neutro  o  ligeramente  ácido  (Gasset  et  al.,  1989)  probablemente 
explica su especificidad por células transformadas, con una mayor presencia de  fosfolípidos ácidos 
en  la  cara  externa  de  la  membrana  plasmática  (Connor  et  al.,  1989;  Gasset  et  al.,  1989,1990; 
Zachowski, 1993).  

Todos  estos  datos  llevaron  a  plantear  que  el  carácter  básico  de  la  horquilla  β  amino‐
terminal podía ser  fundamental en  la  interacción con  fosfolípidos que se  requiere en  las primeras 
etapas  del  paso  de  la  proteína  a  través  de membranas.  Cuando  la  α‐sarcina  se  encuentra  con 
vesículas lipídicas, interacciona electrostáticamente y mediante uniones hidrofóbicas, provocando la 
agregación de las vesículas seguida de la mezcla de componentes lipídicos resultante de su fusión. En 
las primeras  fases de este proceso  se  forman pequeños agregados de  vesículas, estabilizados por 
interacciones  proteína‐proteína  y  proteína‐vesícula,  que  agregan  y  se  fusionan  dando  lugar  a 
estructuras mucho mayores  (Gasset  et  al.,  1989,1990; Martínez‐Ruíz  et  al.,  2001).  De  los  cinco 
residuos básicos de la horquilla β amino‐terminal, todos excepto la Lys 11 han resultado tener algún 
efecto  en  esa  primera  fase  de  interacción  con  vesículas  de  dimiristoilfosfatidilglicerol  (DMPG).  El 
comportamiento, en cambio, del mutante K11E es muy similar al de  la proteína silvestre  (Figura 9, 
página 84) sugiriendo que este residuo, que además no está conservado dentro de  las ribotoxinas, 
no cumple una función muy  importante en  la unión de  la α‐sarcina a  los fosfolípidos. Al estudiar  la 
agregación de vesículas de DMPG provocada por los otros cuatro residuos estudiados, Lys 14, Lys 17, 
Lys 21 y Arg 22, se observan patrones muy distintos a los de la α‐sarcina nativa (Figura 9, página 84), 
compatibles  con  su  participación  en  la  estabilización  de  esas  interacciones  proteína‐proteína  y 
proteína‐vesícula que provocan la agregación inicial de vesículas. Estos resultados sugieren, además, 
que  estas  interacciones  son,  al menos  en  parte,  de  carácter  electrostático.  Las  diferencias más 
notables  con  la  proteína  silvestre  las muestran  los mutantes  de  Lys 14  y  Lys 21  (Figuras  9  y  10, 
páginas 84 y 85), que se orientan en una misma dirección, ortogonal a Lys 17 y Arg 22 y opuesta a 
Lys 11 (Figura 1, página 79). De hecho, el cambio en esas posiciones de una carga positiva por una 
negativa  provoca  efectos  cualitativamente  distintos  a  los  causados  por  las  mutaciones  en  los 
residuos 17 y 22, pues no sólo retardan  la primera fase  (que equivale a  la formación de pequeños 
agregados de vesículas fosfolipídicas) sino también la segunda (correspondiente a la unión y/o fusión 
de  esos  pequeños  agregados)  (Figura  9,  página  84).  Las  dos  cargas  positivas  orientadas  en  esa 
dirección parecen, por tanto, esenciales en el establecimiento de uniones electrostáticas requeridas 
para la interacción de la α‐sarcina con las membranas fosfolipídicas.  

Como  se  ha  comentado,  parece  que  la  interacción  que  la  α‐sarcina  establece  con  la 
membrana  celular  que  va  a  atravesar  se  forma  principalmente  a  través  de  la  horquilla  β  amino‐
terminal y del bucle 2. Los abundantes residuos básicos de estas regiones están orientados de forma 
que permiten proponer un modelo de unión de la proteína a la membrana como el que muestra la 
figura 8, en el que  las  cadenas  laterales de estos aminoácidos básicos establecerían  interacciones 
electrostáticas con las cabezas polares de fosfolípidos ácidos. 



 
155Discusión 

 

 

 

Reconocimiento del ribosoma 

Además  de  la  capacidad  para  interaccionar  con  fosfolípidos  y  atravesar  membranas 
celulares, la exquisita especificidad ribonucleolítica de las ribotoxinas es la otra característica que las 
distingue  del  resto  de  las  RNasas  extracelulares  microbianas.  Esta  especificidad  se  debe  a  un 
reconocimiento  sutil  y muy  específico  que  les  permite  degradar  un  único  enlace  fosfodiéster  de 
todos  los presentes en el ribosoma. Obviamente  las ribotoxinas deben reconocer el SRL, donde se 
encuentra este enlace objeto de su acción enzimática, pero también debe de haber otros elementos 
de  reconocimiento,  distantes  espacialmente  del  SRL,  que  interaccionen  con  ellas.  De  nuevo,  el 
extremo  amino‐terminal  y  los  largos bucles de  estructura  aperiódica,  los  elementos  estructurales 
más característicos de las ribotoxinas, parecen ser los principales responsables en el reconocimiento 
del ribosoma. 

Dentro de las interacciones que la α‐sarcina establece directamente con el SRL, se cree que 
la más determinante es la que forma una región rica en Lys (Lys 111, Lys 112 y Lys 114) del bucle 3 
con  el  enlace  fosfodiéster  cargado  negativamente  en  los  alrededores  de  la  G  prominente,  el 
elemento más  identificativo del SRL  (Figura 9)  (Yang &Moffat, 1996; Pérez‐Cañadillas et al., 2000; 
Yang et al., 2001). Por otra parte, la otra interacción propuesta, entre los residuos 52‐55 del bucle 2 y 
el tetrabucle GAGA conservado que contiene el enlace que hidroliza la toxina (Pérez‐Cañadillas et al., 
2000), parece confirmada por cristalografía de rayos X (Yang et al., 2001) (Figuras 9 y 5a, página 15). 
Pero el papel del bucle 2 en el reconocimiento del ribosoma no termina aquí. Sus características, en 
cuanto  a movilidad,  basicidad  y  exposición  al  disolvente,  le  confieren  importantes  implicaciones 
funcionales  (Pérez‐Cañadillas  et  al.,  2000).  En  este  sentido,  mediante  la  modelización  del 
reconocimiento  de  las  ribotoxinas  por  el  ribosoma,  se  ha  propuesto  que  debe  de  existir  una 
interacción entre una pequeña secuencia extendida de este bucle y la proteína ribosomal L6 (Figura 
5c, página 15) (García‐Mayoral et al., 2005b).  

 

Figura 8. Modelo de interacción entre la α‐sarcina 
y una bicapa de fosfolípidos ácidos. Se señalan en 
rojo  algunos  de  los  residuos  básicos  (lisinas  y 
argininas) de  la horquilla  β amino‐terminal y del 
bucle 2 de  la proteína, posiblemente  implicados 
en uniones electrostáticas con las cabezas polares 
de los fosfolípidos. El diagrama de la α‐sarcina fue 
generado  con  el  programa MOLMOL  (Koradi  et 
al., 1996). 



 
156  Discusión 

 

La horquilla β amino‐terminal es otro elemento esencial para el correcto reconocimiento del 
ribosoma, al igual que para la interacción con lípidos y el paso a través de membranas. Como el bucle 
2,  este  elemento  estructural  presenta  características  de  basicidad  y  exposición  al  disolvente  que 
parecen ser claves en su funcionalidad. El mutante de deleción α‐sarcina Δ(7‐22)  (García‐Ortega et 
al., 2001,2002) proporcionó  información muy valiosa en este aspecto. Este mutante, con  la misma 
conformación  que  la  proteína  nativa  y  con  capacidad  para  hidrolizar  específicamente 
oligonucleótidos que mimetizan el SRL, no reconoce al ribosoma como sustrato específico  (García‐
Ortega et al., 2002). Estudios  recientes apuntan a que, una vez  internada en  la célula, el carácter 
básico de la α‐sarcina hace que rápidamente encuentre al ribosoma, de naturaleza ácida, y entonces 
difunda por su superficie hasta colocarse en la posición adecuada para hidrolizar el SRL, igualando la 
eficiencia catalítica de  las enzimas más rápidas conocidas  (Korennykh et al., 2006; Plantinga et al., 
2008).  Para  encontrar  esta  posición  debe  establecer  interacciones  con  distintas  regiones  del 
ribosoma,  no  sólo  con  el  SRL,  pues  la  velocidad  con  la  que  la  α‐sarcina  hidroliza  el  ribosoma 
completo es unas 1000  veces mayor que  la que muestra  con análogos del  SRL  (Korennykh et al., 
2006; Endo et al., 1988). Estas interacciones pueden determinar que, a pesar de que el SRL esté muy 
conservado  tanto en secuencia como en estructura  (García‐Mayoral et al., 2005; Korennykh et al., 
2006),  la eficacia en  la actividad de  la ribotoxina frente a ribosomas de distintas fuentes biológicas 
sea diferente (Schindler y Davies, 1977; Miller y Bodley, 1991). Por ejemplo, es bien conocido que los 
ribosomas de E. coli, y los de los procariotas en general, son menos susceptibles a la acción de la α‐
sarcina  que  ribosomas  de  organismos  eucariotas  (Schindler  y  Davies,  1977;  Endo  y Wool,  1982; 
Hausner  et  al.,  1987).  En  el  trabajo  aquí  presentado  se  ha  tratado  este  aspecto  ya  que  se  ha 

Figura 9. (A) Diagrama de cintas del complejo  restrictocina‐SRL. En el SRL  se muestra en verde el 
tetrabucle GAGA y en amarillo la G prominente. Los bucles L1, L2, L3, L4 y L5 de la restrictocina se 
corresponden  con  la  horquilla  β  amino‐terminal,  y  los  bucles  1,  2,  3  y  4  de  la  α‐sarcina, 
respectivamente.  (B)  Contactos  entre  Lys 110,  Lys 111  y  Lys 113  de  la  restrictocina 
(correspondientes a Lys 111, Lys 112 y Lys 114 del bucle 3 de  la α‐sarcina) con el giro del SRL que 
incluye a la G prominente. Figura tomada de Yang et al., 2001. 



 
157Discusión 

demostrado que, además de esta menor eficacia, la α‐sarcina muestra una menor especificidad por 
estos  ribosomas,  ya  que  no  sólo  hidroliza  el  enlace  entre  la G2661  y  la  A2662,  sino  también  el 
contiguo en el  lado 3’ (Figura 1, página 108). Esta menor especificidad y eficacia pueden deberse a 
un peor reconocimiento del ribosoma por parte de la α‐sarcina, en lugares distintos, pero próximos, 
al SRL, aunque  tampoco  se pueda descartar que  las  condiciones de  reacción empleadas  se alejen 
tanto  de  las  fisiológicas,  sobre  todo  en  cuanto  a  concentración  de  iones  divalentes,  que  la 
conformación del SRL se esté viendo afectada. 

Volviendo  a  la  horquilla  β  amino‐terminal,  cualquier  comparación  entre  las  distintas 
ribonucleasas  microbianas  extracelulares  (Figura  10)  pone  de  manifiesto  que  es  el  elemento 
estructural más  característico de  las  ribotoxinas. Esta protuberancia que,  como  se ha  comentado, 
puede  ser eliminada  sin distorsionar ni  la estructura global de  la enzima, ni  su actividad  catalítica 
(García‐Mayoral et al., 2004; García‐Ortega et al., 2002), debe de cumplir una función importante. En 
consonancia  con  esta  idea,  su  deleción  le  impide  reconocer  específicamente  el  ribosoma.  Dicha 
variante, sin embargo, sigue siendo capaz de hidrolizar específicamente análogos del SRL, sugiriendo 
que al eliminar la horquilla no se eliminan los elementos de reconocimiento de esta región del rRNA, 
sino que son otras interacciones, con otras zonas del ribosoma, las que dejan de tener lugar (García‐
Ortega et al., 2002).  

Mediante  la  modelización  de  la  interacción  que  tendría  lugar  entre  la  α‐sarcina  y  el 
ribosoma  de  Haloarcula  marismortui,  se  predijo  que  la  horquilla  participaría  en  interacciones 
específicas mediadas  por  la  proteína  ribosomal  L14  (Figura  5c,  página  15)(García‐Mayoral  et  al., 
2005b) y que las interacciones de carácter electrostático serían importantes en este reconocimiento 
(García‐Mayoral et al., 2005). Al menos este segundo aspecto parece ya probado tras la obtención de 
los  resultados  que  se  presentan  en  esta Memoria.  Al  cambiar  cada  una  de  las  cargas  positivas 
presentes en la horquilla β amino‐terminal (posiciones 11, 14, 17, 21 y 22), y sustituirlos por cargas 
negativas, no se altera la actividad frente a análogos del SRL o poli A (Figuras 7 y 8, página 83) pero sí 

Figura 10. Superposición de las estructuras tridimensionales de la α‐sarcina (en rojo) con  las de las 
RNasas  microbianas  no  tóxicas  más  representativas  (en  azul),  la  RNasa  T1  y  la  U2.  Diagramas 
generados con el programa MOLMOL (Koradi et al., 1996). 



 
158  Discusión 

se ve sensiblemente afectada su acción frente a ribosomas completos (Figura 6, página 82). La Lys 11 
y la 14 son los dos residuos que precisamente se habían predicho como presuntamente involucrados 
en  la  interacción con  la proteína  ribosomal L14  (García‐Mayoral et al., 2005b). El hecho de que  la 
lisina 11 sea el único residuo no conservado en  las ribotoxinas conocidas, y que su sustitución por 
Leu (el residuo presente en la restrictocina) no altere su capacidad para reconocer específicamente 
los  ribosomas  (García‐Ortega  et al., 2001) permiten  especular  acerca de  su diferente papel  en  el 
reconocimiento de ribosomas de orígenes distintos. 

Más sorprendente aún  resulta  la observación de que de  los 5 mutantes caracterizados, el 
correspondiente  a  la  Lys 14 mostró  además  un  cambio muy  significativo  a  la  hora  de  reconocer 
sustratos  menos  específicos.  Así,  este  mutante  K14E  se  mostró  capaz  de  degradar  poliC  en 
condiciones en  las que ni  la proteína silvestre, ni ninguno de  los otros cuatro mutantes puntuales 
ensayados son capaces de hacerlo. Desde que se resolvió la estructura tridimensional de la α‐sarcina 
(Pérez‐Cañadillas et al., 2000) se presume que algunas de las interacciones que se establecen entre 
residuos de  la horquilla  y  residuos de  la  lámina  β  central  serían  claves para mantener  la especial 
configuración del centro activo de la α‐sarcina. Sin ir más lejos, parece probado que precisamente la 
interacción electrostática que  se establecería entre  las  cadenas  laterales de  la  Lys 11 y el Glu 140 
sería una de las más importantes en este sentido (Pérez‐Cañadillas et al., 2000). Este mismo Glu 140 
forma,  a  su  vez, un puente de hidrógeno  con el Asp 9, mientras que el  residuo  catalítico His 137 
interacciona con  la Asn 8. Por último, ya hace años que se demostró que  la sustitución de esta Asn 
por Ala rendía un mutante de restrictocina mucho menos específico (Kao y Davies, 2001). Es decir, a 
pesar de  ser un pequeño dominio estructural que  se puede eliminar  sin alterar drásticamente  las 
propiedades de la enzima, la horquilla β amino‐terminal parece estar involucrada en toda una red de 
interacciones que mantienen  su  conformación  en  la  configuración óptima para  su  acción  letal. El 
conjunto de resultados presentado, y muy especialmente el concerniente al mutante K14E de  la α‐
sarcina,  confirmarían  esta  hipótesis.  La  reversión  de  carga  en  esta  posición  tendría  la  suficiente 
trascendencia sobre  la mencionada red de  interacciones como para alterar  la distribución espacial 
del centro activo, o su accesibilidad, provocando un cambio muy significativo en su capacidad para 
degradar homopolinucleótidos. 

 

 

Mecanismo catalítico. El centro activo de las ribotoxinas 

El centro activo de las ribotoxinas constituye otra de sus características diferenciales. Por un 
lado, mantiene  una  configuración  espacial muy  parecida  a  la  de  todas  las  demás  ribonucleasas 
microbianas  extracelulares  (Figura  4,  página  12)  pero,  por  otro,  reúne  unas  propiedades  muy 
especiales en términos de constante dieléctrica y accesibilidad al disolvente. 

Los residuos clave del centro activo de las ribotoxinas se identificaron por comparación con 
la RNasa T1. A pesar de  sus diferencias, entre  las que destacan  la baja especificidad y  la  falta de 



 
159Discusión 

citotoxicidad de ésta, son proteínas extremadamente parecidas, en  las que  los residuos del centro 
activo se superponen perfectamente (Figura 11). El centro activo de la RNasa T1, la más estudiada de 
todas  las RNasas extracelulares microbianas, está perfectamente caracterizado (Steyaert, 1997). En 
la reacción global (la producción de un nucleótido cíclico seguida de su hidrólisis) (Figura 7, página 
21) intervienen el Glu 58 y la His 92. Durante la primera reacción, la formación del producto cíclico 
2’,3’, el Glu 58 actúa como base general y la His 92 como ácido general. La hidrólisis de este derivado 
cíclico  la  llevan a cabo  los mismos grupos, pero con  los papeles  intercambiados. Además, hay otra 
histidina,  en  posición  40,  con  un  papel  crítico,  que  asiste  a  la  catálisis  ejercida  por  el  Glu 58, 
probablemente orientando el ataque nucleofílico sobre el fósforo (Steyaert, 1997). En la α‐sarcina, el 
Glu 96, la His 137 y la His 50 son los equivalentes estructurales y funcionales a Glu 58, His 92 e His 40 
de  la RNasa T1  (Lacadena et al., 1999; Martínez‐Ruiz et al., 2001). El centro activo de  la RNasa T1 
contiene  tres aminoácidos más, Tyr 38, Arg 77 y Phe 100, que aunque no están  implicados en  los 
pasos de transferencia de protones contribuyen a la catálisis formando un microambiente dieléctrico 
complementario  en  forma  y  carga  al  estado  de  transición  y  contribuyendo  a  su  óptima 
solvatación/desolvatación (Loverix y Steyaert, 2001). La cadena lateral de la Phe 100 es un elemento 
catalítico  apolar,  que  controla  el  entorno  dieléctrico  estabilizando  las  separaciones  de  carga  que 
aparecen en el estado de transición  (Doumen et al., 1996). Se cree que  la Arg 77  facilita el ataque 
nucleofílico, aunque esto nunca se ha podido probar pues todos los intentos de producir un mutante 

en el que se sustituyese esa Arg han resultado  fallidos  (Steyaert, 1997). Por último,  la Tyr 38 de  la 
RNasa T1 estabiliza al estado de transición al formar un enlace de hidrógeno con él.  

Los equivalentes a estos residuos de  la RNasa T1 (Phe 100, Arg 77 y Tyr 38) en  la α‐sarcina 
son la Leu 145, la Arg 121 y la Tyr 48 (Figura 11). En esta Tesis se ha estudiado el papel de la Tyr 48, 
el único de estos residuos que quedaba sin analizar. Para ello, se ha sustituido este residuo por una 
fenilalanina. La caracterización estructural del mutante Y48F mostró que conserva  la conformación 
nativa. Los ensayos funcionales que siguieron a esta caracterización estructural se dividieron en dos 
bloques. Por un lado, se analizó la capacidad de interacción con fosfolípidos, midiendo la agregación 
de vesículas de DMPG provocada por el mutante. Así se comprobó que la sustitución de la Tyr 48 por 
Phe no modifica la capacidad de la α‐sarcina para interaccionar con fosfolípidos y así penetrar en sus 
células diana (Figura 7, página 74). Esta tirosina se encuentra en una zona, la lámina β central de la 
proteína, muy  importante en esa  interacción, pues constituye el núcleo con el que  interacciona  la 

Figura 11. Superposición de la estructura de la lámina β 
central  de  la  RNasa  T1  y  la  α‐sarcina.  También  se 
superponen los residuos que componen el centro activo 
de  ambas.  En  verde  aparecen  los  residuos 
correspondientes  a  la  RNasa  T1  y  en  amarillo,  a  la  α‐
sarcina.  El  diagrama  se  generó  con  el  programa 
MOLMOL (Koradi et al., 1996). 



 
160  Discusión 

parte hidrofóbica de la bicapa lipídica. Muy próxima, por ejemplo, se encuentra la Arg 121 (Figura 1, 
página 71), también constituyente del centro activo, cuya carga positiva es esencial en la interacción 
con fosfolípidos (Masip et al., 2001). Se podría interpretar que la Tyr 48 no forma parte de ese grupo 
de residuos en la lámina β de la α‐sarcina que son decisivos para su paso a través de membranas, así 
como tampoco lo es, por ejemplo, el Trp 51, (De Antonio et al., 2000). Pero debemos considerar que 
Trp 51 y Tyr 48 tienen orientaciones prácticamente opuestas dentro de esta  lámina β  (Figura 12) y 
que  en  el  mutante  Y48F  la  tirosina  se  ha  sustituido  por  una  fenilalanina,  un  residuo  aún  más 
hidrofóbico.  Así,  continúa  siendo  probable  que  la  Tyr 48  sí  intervenga  en  la  interacción  con  las 
bicapas lipídicas. 

 

Cuando se estudió la funcionalidad del mutante en lo que a actividad catalítica se refiere, los 
resultados fueron muy diferentes. El cambio de Tyr por Phe, que únicamente supone la eliminación 
de un grupo hidroxilo, es suficiente para abolir  la capacidad de  la proteína de reconocer sustratos 
poliméricos,  incluyendo  al  sustrato  natural,  el  ribosoma  (Figura  6,  página  73).  En  cambio,  la 
capacidad  para  hidrolizar  enlaces  fosfodiéster  en  general  se  ve  poco  afectada,  pues  la  eficiencia 
catalítica frente a ApA se mantiene muy similar a la de la proteína silvestre (Tabla 2, página 73). En 
resumen,  la Tyr 48 ejerce un papel clave en  la especificidad de  la α‐sarcina. Ya se menciona en  la 
Introducción  que  las  ribonucleasas  que  actúan  frente  a  sustratos  de  RNA  poliméricos  deben 
distorsionar  la orientación de  las bases  (Yang  et  al., 2001),  y que  esta  función  en  las  ribotoxinas 
parece llevarla a cabo el triplete Tyr 48, Arg 121 y Leu 145. El hecho de que el mutante Y48F hidrolice 
perfectamente ApA (Tabla 2, página 73), e incluso hidrolice de forma inespecífica análogos sintéticos 
del SRL (datos no mostrados) siendo, en cambio, incapaz de reconocer específicamente al ribosoma 
(Figura 6, página 73), indica que, efectivamente, la Tyr 48 cumple un papel esencial facilitando a la α‐
sarcina romper el SRL en el sitio adecuado.  

Los resultados obtenidos con el mutante de  la Tyr 48 son muy similares a  los de Arg 121 y 
Leu 145.  También  la  sustitución  de  estos  residuos  provoca  una  disminución  notable  en  la 
especificidad de la ribotoxina. En estos casos, además, la constante catalítica de la enzima disminuye 
alrededor de un orden de magnitud. Resulta muy interesante que tres residuos que en la RNasa T1 
mejoran la catálisis de reacciones de ruptura inespecífica de RNA, en la α‐sarcina cumplen un papel 

Figura 12. Diagrama de la α‐sarcina en la 
que se destaca la orientación geométrica 
de  los  residuos Tyr 48, Trp 51 y Arg 121. 
Diagrama  generado  con  el  programa 
MOLMOL (Koradi et al., 1996). 



 
161Discusión 

mucho más completo. No sólo aumentan la capacidad catalítica (en todos los casos, excepto en el de 
la  Tyr 48  los mutantes  exhiben  constantes  catalíticas  sensiblemente menores  a  la  de  la  proteína 
silvestre)  sino  que,  además,  proporcionan  especificidad  a  la  α‐sarcina,  permitiendo  el 
reconocimiento de un único enlace fosfodiéster en todo el ribosoma. 

 

El centro activo de la RNasa U2 

Dentro de las ribonucleasas extracelulares no tóxicas, la RNasa U2, producida por el hongo 
Ustilago sphaerogena, es la más cercana a las ribotoxinas. Posee alrededor de 10 aminoácidos más 
que el resto de proteínas de su  familia  (114  frente a 101‐106) y su  identidad de secuencia con  las 
ribotoxinas  es  del  34%,  lo  que  la  sitúa  a  la  menor  distancia  filogenética  respecto  a  ellas.  Los 
aminoácidos adicionales que la RNasa U2 presenta con respecto a la T1 se localizan principalmente 
en  los bucles externos, siendo algo más  largos  los bucles 2 (44‐59) y 3 (65‐83) y el extremo amino‐
terminal, características que, de nuevo,  la sitúan más cerca de  las ribotoxinas. Por todo esto,  lleva 
años empleándose en nuestro grupo como el mejor modelo comparativo entre las ribotoxinas y las 
RNasas de la familia T1. En cuanto a su mecanismo catalítico, está demostrado que también se trata 
de  una  RNasa  ciclante,  aunque  con  una  especificidad  bastante  inusual  dentro  del  grupo  de 
ribonucleasas microbianas extracelulares al que pertenece, pues prefiere purinas en el extremo 3’ 
del enlace que hidroliza, y no sólo guaninas, como el resto de las RNasas tipo T1 (Uchida et al., 1970). 
Otra particularidad es su intervalo funcional de pH, entre 3.5 y 5.5 (Arima et al., 1968b). Pero a pesar 
de estas diferencias, la RNasa U2 mantiene el mismo plegamiento general que el resto de miembros 
de su familia, superponiéndose de manera casi perfecta con  la RNasa T1 (Figura 1, página 89). Esta 
superposición,  junto con estudios de modificación química, permitió hace tiempo proponer que  los 
residuos catalíticos del centro activo serían el Glu 62, la His 101 y la His 41 (Sato y Uchida, 1975b,c; 
Egami et al., 1980; Noguchi et al., 1995).  

Con el objetivo de verificar que, efectivamente, la His 101 de la RNasa U2 es el residuo que 
actúa  como  ácido  general  durante  la  formación  del  intermedio  cíclico  en  la  ruptura  del  RNA,  se 
produjo  y  purificó  a  homogeneidad  un mutante  puntual  en  el  que  este  residuo  se  sustituyó  por 
glutamina (Figuras 2 y 3, página 94). Pero  la  información proporcionada por este mutante fue muy 
distinta  a  la esperada. El dato más  interesante es el  sorprendente papel esencial que posee este 
residuo en el plegamiento de  la proteína, papel que no comparten  los residuos equivalentes de  la 
RNasa  T1 ni  de  la  α‐sarcina.  En  ambas  proteínas,  la  histidina  catalítica  correspondiente  (His 92  e 
His 137 respectivamente) se ha mutado obteniéndose proteínas con conformación nativa (Lacadena 
et al., 1999; Steyaert y Wyns, 1993). Sin embargo, la sustitución de la His 101 en la RNasa U2 provoca 
un plegamiento incorrecto de la proteína, lo que, por otra parte, impide hacer ninguna afirmación en 
cuanto  a  su mera  función  catalítica.  La  conformación del mutante  se  analizó mediante dicroísmo 
circular  y  emisión  de  fluorescencia,  viéndose  reflejada  por  ambas  técnicas  la  adopción  de  una 
estructura no nativa. El espectro de dicroísmo circular de U2 H101Q tiene una forma completamente 
distinta al correspondiente a  la proteína nativa y perfectamente compatible con un alto contenido 
en  estructura  secundaria  aperiódica.  En  cuanto  a  la  fluorescencia,  el  espectro  de  emisión  de  la 



 
162  Discusión 

proteína  silvestre  excitada  a  275 nm  está dominado por  la  emisión de  las  tirosinas, quedando  la 
emisión de un triptófano presente en la proteína fuertemente apagada. En el mutante U2 H101Q la 
emisión de este triptófano se hace evidente. Y no sólo cambia  la emisión de este residuo sino que 
también aumenta el rendimiento cuántico de las tirosinas (Figura 7, página 97), sugiriendo que en la 
estructura nativa éstas  también se encuentran apagadas. Este hecho  recuerda a  lo observado con 
una  fracción que aparece  cuando  se purifica  la proteína  silvestre producida en Pichia pastoris. En 
este  caso,  sólo es una  fracción  la que no  se pliega  correctamente, pudiendo obtenerse en  forma 
nativa alrededor de 1 mg de RNasa U2 silvestre por litro de cultivo (tabla 2, página 92). Sin embargo, 
la  sustitución  de  la  His 101  impide  completamente  la  adopción  de  la  conformación  nativa,  y  la 
totalidad de  la proteína obtenida aparece desnaturalizada. Este resultado demuestra, por tanto, el 
carácter esencial de la His 101 en el plegamiento de la RNasa U2.  

La adopción de una conformación no nativa tiene como consecuencia, además, que varias 
características de la proteína, como el procesamiento del extremo amino‐terminal o modificaciones 
postraduccionales, se vean afectadas. En primer lugar, el mutante U2 H101Q constituye un ejemplo 
del carácter impredecible de las glicosilaciones introducidas por Pichia pastoris. En toda la secuencia 
primaria de la RNasa U2 no aparece ninguna secuencia consenso de glicosilación en Asn, pero hace 
unos años se observó que Pichia pastoris también es capaz de O‐glicosilar las proteínas que expresa 
(Cereghino & Cregg, 2000; Tsujikawa et al, 1996; Juge et al, 1996; Heimo et al, 1997). No parece que 
exista  ninguna  secuencia  consenso  de  aminoácidos  para  las  O‐glicosilaciones,  en  las  que  los 
eucariotas  inferiores unen residuos de manosa al grupo hidroxilo de residuos de serina y treonina. 
Además, está descrito que proteínas, como el factor de elongación I similar a insulina (IGF‐I, insulin‐
like growth  factor  I), que no están glicosiladas en humanos, unen residuos de manosa cuando son 
expresadas de forma heteróloga en Pichia pastoris (Brierley, 1998). Ni siquiera tienen por qué ser los 
mismos  residuos de Ser y/o Thr glicosilados  los que  se glicosilan en Pichia pastoris y en  la  fuente 
natural de la proteína. Con todos estos datos, no es extraño que cuando la conformación de la RNasa 
U2 varía al sustituir la His 101 por glutamina la levadura encuentre algún residuo susceptible de unir 
azúcares.  Precisamente,  la His 101  de  la  RNasa U2  está  flanqueada  por  dos  residuos  de  Thr  (en 
posiciones 100 y 102) que podrían pasar de un entorno protegido,  cuando  la proteína está en  su 
conformación nativa, a quedar expuestos a glicosilaciones en el mutante. Esta hipótesis cobra aún 
más sentido si se considera que estos tres residuos forman parte de una hebra β en la que His 101 
estaría hacia el disolvente, expuesta, pues  forma parte del  centro activo, mientras que  las Thr  se 
orientarían  en  la  dirección  opuesta,  mucho  menos  accesibles  (Figura  13).  Otra  posibilidad 
alternativa,  que  también  debe  tenerse  en  cuenta,  sería  que  la  sustitución  de  la His 101  por Gln 
cambiase  sólo  ligeramente  el  entorno  de  las  treoninas  pero  lo  suficiente  como  para  permitir  su 
glicosilación y que esta glicosilación fuese la verdadera causa del mal plegamiento de la proteína.  

Otro efecto  inesperado de  la sustitución de  la His 101 por glutamina fue  la observación de 
que el procesamiento del extremo amino‐terminal se veía afectado. Cuando se expresa la RNasa U2 
silvestre en Pichia pastoris, la estructura terciaria de la proteína y la presencia de un puente disulfuro 
en el que  interviene una cisteína en posición 1  impiden que  los mecanismos proteolíticos procesen 
adecuadamente el péptido señal del factor‐α de Saccharomyces cerevisiae, que es el que dirige a la 



 
163Discusión 

RNasa  U2  al  medio  extracelular.  Concretamente,  se  ve  afectada  la  última  etapa  de  ese 
procesamiento, en la que interviene la proteasa Ste13 eliminando repeticiones de Glu‐Ala (Brake et 
al., 1984). Así,  la RNasa U2 expresada en Pichia pastoris presenta 6 aminoácidos adicionales en el 
extremo  amino‐terminal: Glu‐Ala‐Glu‐Ala‐Glu‐Leu  (Martínez‐Ruiz  et al., 2000; García‐Ortega  et al., 
2005b). Al secuenciar el extremo amino terminal del mutante H101Q se observó que el péptido señal 
tampoco se había eliminado por completo, pero en este caso no se encontró una única secuencia. 
Además  de  los  6  aminoácidos  extra  que  se  encuentran  en  la  proteína  silvestre,  aparecen  dos 
secuencias más, con sólo 5 ó 2 aminoácidos extra (Figura 4, página 95). Probablemente el mutante, 
más  desplegado  que  la  proteína  silvestre,  deja más  accesibles  los  sitios  de  corte  de  la  proteasa, 
permitiendo  una  mayor  variedad  de  cortes  y  un  procesamiento  postraduccional  mucho  menos 
homogéneo.  

 

 

El patrón de puentes disulfuro de las ribotoxinas 

Un punto importante en el estudio de las relaciones estructura‐función de las ribotoxinas es 
el patrón de puentes disulfuro, por su implicación en la estructura y estabilidad de las proteínas. De 
hecho,  en muchos  casos,  las  relaciones  filogenéticas  de  las  proteínas  han  sido  determinadas  en 
primera  instancia  a  partir  de  dicho  patrón  (Irie,  1997).  Dentro  de  la  familia  de  las  ribotoxinas 
aparecen dos puentes disulfuro perfectamente conservados  (Lacadena et al., 2007). El primero de 
ellos, el que une los extremos amino y carboxilo terminales, aparece también en todas las RNasas de 
la familia T1, mientras que el segundo, más interno, reproduce el que adicionalmente presentan los 
miembros de esta familia producidos por hongos basidiomicetos (RNasas U1, U2 y Po1) (Wool, 1997; 
Martínez‐Ruíz et al., 1999b; Kao et al., 2001). Fijándonos en esta disposición, de nuevo la RNasa U2 
se  encuentra  en  un  punto  intermedio  entre  las  RNasas  no  tóxicas  de  la  familia  de  la  T1  y  las 
ribotoxinas. Además de estos dos enlaces mencionados  (que  se establecen entre  los  residuos 9 y 
113, y 55 y 96, respectivamente) presenta un tercero con su equivalente en  las RNasas no tóxicas, 
pero no en las ribotoxinas (entre las cisteínas 1 y 54) (Figura 14) (Sato y Uchida, 1975d).  

Figura 13. Diagrama de  la estructura  tridimensional de  la 
RNasa U2 en el que se destaca  la disposición geométrica 
de  los  residuos  Thr 100,  His 101  y  Thr 102.  Diagramas 
generados con el programa MOLMOL (Koradi et al., 1996). 



 
164  Discusión 

Este  último  puente  disulfuro merece  un  estudio  especial  por  varios motivos.  En  primer 
lugar,  por  ser  el  único  de  los  conservados  en  la  familia  de  la  RNasa  T1  que  no  aparece  en  las 
ribotoxinas.  También  es  interesante  porque  la  existencia  de  una  cisteína  en  posición  1  de  la 
secuencia  primaria  de  la  RNasa  U2  podría  impedir  que  el  extremo  amino  terminal  se  procese 
correctamente cuando se expresa de forma heteróloga en Pichia pastoris (Martínez‐Ruíz et al., 2000; 
García‐Ortega et al., 2005b). Por último,  como  ya  se ha mencionado, al expresar  la RNasa U2 de 
forma  recombinante en Pichia pastoris aparece una  fracción de proteína mal plegada, y existía un 
especial  interés por comprobar si el  intercambio de  las Cys 54 y 55 en  los puentes disulfuro en  los 
que están implicadas era la causa de ese mal plegamiento. Dada la orientación y proximidad de esos 
dos puentes disulfuro (Figura 15) no puede descartarse que en esa fracción de la proteína se formen 
los enlaces entre las cisteínas 1‐55 y 54‐96, en vez de los nativos 1‐54 y 55‐96 (Figura 15).  

Para intentar dar respuesta a estas preguntas se produjo un doble mutante de las Cys 1 y 54 
de  la  RNasa  U2,  en  el  que  faltaba  ese  puente  disulfuro.  Su  expresión  en  Pichia  pastoris,  y  su 
purificación  desveló  que,  estructuralmente,  este  mutante  doble  presenta  características 
equivalentes a las de la proteína silvestre, excepto en dos detalles poco sorprendentes. Por un lado, 

Figura 14. Patrón de puentes disulfuro en  las RNasas 
T1, U2 y α‐sarcina. El mismo color  indica equivalencia 
del enlace en las distintas secuencias. 

Figura 15. Diagrama de la estructura de la RNasa U2 y detalle de dos de sus puentes disulfuro, entre los 
pares de cisteínas 1‐54, y 55‐96. Diagramas generados con el programa MOLMOL (Koradi et al., 1996). 



 
165Discusión 

su estabilidad térmica, con un puente disulfuro menos en su estructura, resultó ser mucho menor 
que  la  de  la proteína  silvestre  (Tabla  2,  página  92).  Por  otra  parte,  como  habíamos  esperado,  la 
sustitución de  la cisteína en posición 1 por una  serina permitió que el procesamiento del péptido 
señal  en  Pichia  pastoris  se  produjera  correctamente.  Las  proteasas  que  eliminan  los  últimos 
aminoácidos de ese péptido no encuentran  impedimentos cuando no existe ese puente disulfuro, 
obteniéndose una secuencia primaria de la misma longitud que la de la proteína silvestre. En cuanto 
a  la capacidad enzimática del mutante, no se observan grandes diferencias con  lo medido para  la 
proteína nativa, hecho que concuerda con la equivalencia estructural observada. Lo más llamativo de 
este mutante se observó en el momento de su purificación, en  la que, a diferencia de  la proteína 
silvestre,  no  se  detectó  ninguna  fracción  de  proteína  con  un  plegamiento  no  nativo  y  con 
características espectroscópicas distintas a las nativas, lo que parece confirmar la hipótesis de que el 
patrón  de  puentes  disulfuro  tiene  algo  que  ver  con  la  aparición  de  esta  fracción  de  proteína 
desnaturalizada. 

   



 
166  Discusión 

IMPLICACIÓN BIOLÓGICA DE  LA ACCIÓN DE  LAS  RIBOTOXINAS 
EN LA FUNCIONALIDAD DEL RIBOSOMA 

Desde que se descubrió a finales de los años 70 la exquisita actividad ribonucleolítica de las 
ribotoxinas  (Schindler y Davies, 1977; Endo y Wool, 1982), parte de  los estudios sobre ellas  se ha 
centrado en la implicación biológica de su actividad, esto es, en cómo afecta la actividad de la toxina 
al ribosoma y a la célula en general. Además del valor del conocimiento en sí mismo, no cabe duda 
de que profundizar en este aspecto puede ser de gran utilidad en un futuro uso de estas proteínas 
como agentes terapéuticos.  

La  α‐sarcina  se  interna  en  la  célula  mediante  un  mecanismo  de  endocitosis,  en  un 
transporte  independiente de  clatrina en el que pasa por endosomas ácidos  y el aparato de Golgi 
antes de  llegar al  citosol  (Olmo et al., 2001),  siendo el  cruce de  la membrana plasmática el paso 
limitante en la actividad citotóxica de la proteína (Turnay et al., 1993). Ya en el citosol, actúa sobre 
los ribosomas, provocando  la  inhibición de  la biosíntesis de proteínas, que  lleva a  la célula a morir 
por apoptosis (Olmo et al., 2001). Profundizando en las consecuencias del corte producido por la α‐
sarcina, se ha estudiado su efecto en la funcionalidad del ribosoma. 

Sin duda, la zona donde se encuentra el enlace hidrolizado por la α‐sarcina no es casual. La 
ribotoxina ataca un punto débil del  ribosoma, el  SRL,  con un papel  funcional  tan  importante que 
mutaciones en su secuencia provocan en efectos letales en las células (Macbeth y Wool, 1999; Chan 
et  al.,  2000).  Ese  carácter  esencial  del  SRL  se  explica  por  formar  parte  del  sitio  de  unión  de  los 
factores de elongación EF‐G y EF‐Tu  (Moazed et al., 1988; Valle et al., 2003a,2003b). Por eso este 
estudio se centró en la fase de elongación dentro de la biosíntesis de proteínas, que previsiblemente 
sería la fase afectada por el corte de la α‐sarcina. 

En  general,  todos  los  trabajos  en  los  que  se  ha  analizado  el  efecto  del  corte  de  las 
ribotoxinas sobre el ribosoma apuntan como principales consecuencias a una unión deficiente de los 
factores de  elongación  (Fernández‐Puentes  y Vázquez, 1977; Hausner  et  al., 1987; Brigotti  et al., 
1989; Miller y Bodley, 1991; Nierhaus et al., 1992). Y los más recientes, a que la función de EF‐Tu no 
se  ve modificada  sino  únicamente  la  de  EF‐G  (Blanchard  et  al.,  2004),  sugiriendo  que  el  SRL  no 
interacciona de la misma forma con los dos factores de elongación. De hecho, aunque los ribosomas 
tratados con α‐sarcina conservan  la capacidad de unir el complejo ternario (EF‐Tu•GTP•aa‐tRNA) y 
catalizar  la  formación  del  enlace  peptídico  (Figura  3,  página  110),  son  incapaces  de  sufrir  la 
translocación  dependiente  de  EF‐G  (Figura  4,  página  111),  que  dejaría  al  ribosoma  listo  para  la 
incorporación de un nuevo complejo ternario al sitio A. Dentro de todas  las etapas que conforman 
esta translocación, se ha determinado que la que se ve afectada por la ruptura del SRL es la inicial, la 
unión del complejo EF‐G•GTP al ribosoma, alcanzándose un nivel de detalle en esta determinación 
muy  superior  al  descrito  en  los  trabajos  publicados  hasta  la  fecha.  En  los  ribosomas  tratados,  la 
translocación  de mRNA  y  tRNAs  sobre  el  ribosoma  no  está  inhibida  en  sí misma,  pues  sí  ocurre 
cuando es promovida por esparsomicina (Figura 5, página 112). La que está impedida es la unión del 
EF‐G, cuya actividad GTPasa cataliza ese movimiento en condiciones normales. De nuevo se observa 



 
167Discusión 

la distinta interacción del ribosoma con ambos factores de elongación. En las condiciones en las que 
se encuentra el SRL tras  la acción de  la α‐sarcina sólo uno de ellos, el EF‐Tu, reconoce y se une al 
ribosoma, indicando que la conformación del SRL afecta de forma mucho más dramática a la unión 
de EF‐G que a la del complejo ternario en el que se incluye el EF‐Tu.  

Desde  otro  punto  de  vista,  estos  experimentos  también  demuestran  que  la  α‐sarcina 
compite con los factores de elongación a la hora de unirse al ribosoma. De hecho, la porción 11‐16 
de  la α‐sarcina presenta una gran similitud de secuencia con una región del factor de elongación 2 
(EF‐2) (Figura 16) y probablemente esta porción 11‐16 de  la α‐sarcina tiene un papel determinante 
en el reconocimiento del ribosoma. Para evaluar esta hipótesis se está construyendo un mutante en 
el que se remplace la región 11‐16 de la ribotoxina por los residuos equivalentes de estos factores. 
De acuerdo con el alineamiento de secuencia que se muestra en  la figura 16, se planea sustituir  la 
Gln 10  y  la  Lys 11  de  la  α‐sarcina  por  sendas  Phe,  que  es  el  residuo  que  suele  aparecer  en  esa 
posición  en  los  factores  de  elongación.  Simultáneamente,  y  por  las mismas  razones,  también  se 
sustituirá la Asn 16 por Lys. 

 

9   10  11  12  13  14  15  16  17  18 

D Q K N P K T N K Y  α‐sarcina 
  
S Y F N P K T K K W  Saccharomyces cerevisiae 

S Y F N P K T K K W  Pichia pastoris 

N Y F N P Q T K K W  Aspergillus fumigatus 

N F F D P A T R K W  Arabidopsis thaliana 

N F F N A K T K K W  Spodoptera exigua 

N F Y N Q K T K K N  Xenopus laevi 

R Y F D P A N G K F  Mus musculus 

N F F N A K T K K W  Drosophila melanogaster 

R Y F D P A N G K F  Homo sapiens 
 

Figura 16. Comparación de las secuencias de la α‐sarcina y el factor de elongación 2 (EF‐2) de distintos 
organismos. Aparecen sombreados los residuos conservados en cuatro o más secuencias.  

 

   



 
168  Discusión 

POSIBLES APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS RIBOTOXINAS 

Como  se ha  comentado  repetidamente,  las  ribotoxinas  fueron descubiertas  gracias  a  sus 
propiedades antitumorales y quizás el final más deseable para todo el tiempo que se ha dedicado a 
su  estudio  sea  su  utilización  en  biomedicina.  Dentro  de  esta  perspectiva,  se  contemplan  dos 
posibilidades como las más viables. La más obvia es llegar a una posible terapia antitumoral a partir 
de  las ribotoxinas, previsiblemente utilizando α‐sarcina, que es  la que mejor se conoce. La otra se 
deriva  de  que  otra  ribotoxina, Asp f 1,  constituye  un  alérgeno  principal  de Aspergillus  fumigatus. 
Dado  que  éste  es  el  hongo  responsable  de  la mayor  parte  de  las  infecciones  y  alergias  fúngicas 
causadas  en  humanos,  se  planteó  la  posibilidad  de  usar  las  ribotoxinas,  o  variantes  de  éstas,  en 
diagnosis o terapias inmunomoduladoras para casos de hipersensibilidad a Aspergillus.  

Para poder llegar a utilizar las ribotoxinas en terapias antitumorales es necesario aumentar 
su especificidad por  las células  transformadas y así disminuir su  indeseable efecto tóxico sobre  las 
células  sanas. La principal estrategia en este  sentido es  la producción de  inmunotoxinas, como  se 
explicó  en  la  introducción  de  esta  tesis.  En  lo  que  se  refiere  a  la  porción  inmunológica  de  estas 
moléculas,  los  últimos  esfuerzos  se  han  dirigido  hacia  la  disminución  del  tamaño,  pues  así  se 
simplifica el proceso de producción de la molécula por su mayor estabilidad y además le permite a la 
inmunotoxina  una  mejor  penetración  en  tumores  sólidos  y  una  salida  más  fácil  de  los  vasos 
sanguíneos. Así,  la  segunda generación de  inmunotoxinas utiliza una  cadena  simple que  contiene 
únicamente los dominios variables del anticuerpo, donde reside la capacidad de reconocimiento del 
antígeno  (Brinkmann,  2000;  Kreitman,  2003;  Li  et  al.,  2004).  En  cuanto  a  la  porción  tóxica,  las 
ribotoxinas son prometedores candidatos, precisamente por el profundo conocimiento que se tiene 
de ellas tras años de estudio y, de hecho, se ha dedicado otra Tesis Doctoral a desarrollar esta idea 
(Carreras‐Sangrà,  2009).  Las  versiones  de  inmunotoxinas  basadas  en  la  α‐sarcina  que  se  han 
producido han ido mejorando hasta llegar a una inmunotoxina de cadena simple compuesta por los 
dominios variables del anticuerpo monoclonal B5 unido a  la α‐sarcina a  través de un péptido que 
contiene una diana de la proteasa furina (Lacadena et al., 2005). En la actualidad, se está aplicando 
el conocimiento adquirido en  las ribotoxinas para, mediante  ingeniería genética, obtener variantes 
de esta inmunotoxina con una estabilidad y afinidad aumentadas.  

Por  otra  parte,  ya  se  lleva  trabajando  varios  años  con  el  fin  de  conseguir  una  posible 
aplicación de las ribotoxinas en el tratamiento y/o prevención de hipersensibilidad a Aspergillus. Una 
de las últimas estrategias que se están investigando para el tratamiento de la alergia y el asma es la 
llamada  inmunoterapia alérgeno‐específica  (SIT: allergen‐specific  immunotherapy). Se basa en que 
una  exposición  continuada  a una molécula  con  capacidad  inmunogénica provoca  la  activación de 
mecanismos  de  tolerancia  que  evitan  el  desarrollo  de  una  respuesta  alérgica.  Alcanzar  esta 
tolerancia  puede  requerir  un  tratamiento  de  varios  días  a  varios  meses,  pero  los  efectos  se 
prolongan  durante  años  (Durham  et  al.,  1999).  Este  tratamiento  es  aún  más  interesante  si  se 
considera que numerosos estudios han probado que también disminuye  la sensibilización a nuevos 
alérgenos  así  como  el  riesgo  de  nuevos  procesos  asmáticos,  pudiendo  emplearse  también  como 
vacuna  (Des  et  al.,  1997;  Purello‐D’Ambrosio  et  al.,  2001).  La  tolerancia  se  induce  por  distintos 



 
169Discusión 

mecanismos. Se reduce el reclutamiento de mastocitos, basófilos y eosinófilos en la piel, la nariz, los 
ojos  y  la mucosa bronquial. Además,  aumentan  los niveles de  anticuerpos  IgA  e  IgG4  específicos 
contra el alérgeno, que evitan la unión de las IgE, que a su vez también se ven disminuidas. Por otra 
parte, se activan células T reguladoras, que producen citoquinas que atenúan las respuestas de tipo 
TH2  (Holgate  y  Polosa,  2008;  Larché,  2007).  El  factor  limitante  de  la  SIT  son  las  reacciones 
anafilácticas que los alérgenos administrados pueden producir, con una incidencia del 0.1 al 5.0 % de 
los casos  (Williams et al., 2004). Para disminuir estos efectos secundarios se trabaja con alérgenos 
modificados  químicamente  (alergoides)  (Lund  et  al.,  2007),  con  péptidos  derivados  de  alérgenos 
(Larché,  2007),  con  alérgenos  recombinantes  con  una  capacidad  de  unión  a  IgE  reducida 
(hipoalergenos) (Valenta y Niederberger, 2007), etc.  

Obviamente, para  llegar a estas terapias específicas para cada alérgeno,  la diagnosis debe 
también avanzar en ese sentido. De hecho,  la tendencia en  la diagnosis de patologías relacionadas 
con  Aspergillus  es  usar  alérgenos  purificados  obtenidos  de  forma  recombinante  (Crameri  et  al., 
1998; Kurup et al., 2006) en lugar de la práctica más común actualmente, el empleo de extractos de 
A. fumigatus sin estandarizar y constituidos por una variedad grandísima de compuestos (Piechura et 
al., 1983) que  llevan a diagnósticos  incompletos e  incluso erróneos. Así, en un diagnóstico  ideal no 
sólo se conoce la fuente alergénica que provoca la hipersensibilidad sino exactamente las moléculas 
a  las  que  cada  determinado  individuo  es  sensible.  De  esta  forma  se  posibilita  desarrollar 
tratamientos personalizados, más eficaces y seguros. La expresión heteróloga del alérgeno Asp f 1 en 
Escherichia  coli,  así  como  el método  para  su  purificación  están  perfectamente  establecidos.  De 
hecho, Asp f 1 fue el primer alérgeno recombinante testado in vivo (Moser et al., 1992), y presentó 
una total concordancia con las determinaciones serológicas (Moser et al., 1992; Crameri et al., 1998; 
Hemmann et al., 1999), por lo que podría ser empleado en este tipo de diagnosis. 

La  aceptación  de  una  molécula  como  hipoalergénica  requiere  de  un  gran  número  de 
estudios  tanto  a  nivel molecular  como  celular.  La  primera  aproximación,  a  nivel molecular,  con 
resultados prometedores, surgió al estudiar a  la α‐sarcina como variante natural de Asp f 1, y a  los 
mutantes  de  deleción  de  la  horquilla  amino‐terminal  de  ambas  ribotoxinas  (García‐Ortega  et  al., 
2005a). Las características de esta  región, polar, protuberante y con una estructura  relativamente 
independiente  del  resto  de  la  proteína,  hacían  pensar  que  albergaría  una  región  inmunológica 
importante, pudiendo constituir un epítopo de la molécula. Efectivamente, el mutante α‐sarcina Δ(7‐
22) dio los mejores resultados, mostrando una reducción del 50% de la reactividad a IgE a la vez que 
mantenía la prevalencia en el suero de los pacientes alérgicos a Asp f 1 (García‐Ortega et al., 2005a). 
Considerando  que  este  mutante  de  deleción  carece  casi  por  completo  de  actividad  citotóxica 
(García‐Ortega  et al., 2002),  sus posibilidades para  ser usada en  aplicaciones  clínicas aumentaron 
notablemente. En esta Tesis se ha dado un paso más en el  largo camino necesario para  llegar a un 
uso  clínico,  la  evaluación  in  vivo  de  la  aparente  hipoalergenicidad  de  α‐sarcina  Δ(7‐22)  (Álvarez‐
García et al., 2009). 

Para comparar  la alergenicidad  in vivo del mutante α‐sarcina Δ(7‐22) con  la de Asp f 1 fue 
necesario  establecer  previamente  un  modelo  múrido  de  sensibilización  a  Asp f 1.  Las  mejores 



 
170  Discusión 

respuestas  inmunes obtenidas en  ratón  se han obtenido  siempre  combinando una  sensibilización 
sistémica con provocaciones repetidas de  las vías respiratorias que produzcan su  inflamación. Esto 
suele conseguirse mediante inyecciones (subcutáneas o intraperitoneales) del alérgeno adsorbido en 
hidróxido de aluminio, un coadyuvante bien conocido que  induce respuestas Th2, seguidas de una 
exposición  repetida  de  las  vías  respiratorias,  que  se  consigue  con  un  aerosol  del  alérgeno,  o 
aplicándoselo  de  forma  intranasal  o  intratraqueal  a  los  ratones.  Por  lo  general,  estos  protocolos 
inducen una respuesta  inmune e  inflamatoria en  las vías respiratorias máxima y reproducible (Herz 
et  al.,  2004).  La  administración  a  ratones  BALB/c  de  este  tratamiento  con  Asp f 1  recombinante 
purificada no provocó ningún tipo de respuesta inmunológica. Tampoco lo hizo la administración de 
una  suspensión  de A.  fumigatus  obtenida  a  partir  de  un  preparado  comercial  del  hongo.  Sólo  la 
administración de una mezcla con ambos componentes indujo una respuesta inmune en los ratones, 
caracterizada  por  altos  niveles  de  IgE  total  en  suero,  lesiones  histológicas  en  pulmones  y  fosas 
nasales y pérdida de peso. En cambio, como ya habían descrito otros autores (Svirshchevskaya et al., 
2004) no se detectaron niveles altos de IgE, IgG1 ni IgG2a específicas anti Asp f 1. Muy probablemente 
las moléculas de IgE total que se observan como consecuencia del protocolo de sensibilización son, 
en efecto, específicas de Asp f 1, pero esta especificidad no puede  confirmarse por ELISA pues  la 
concentración  de  IgG  en  suero  es mucho mayor  que  la  de  IgE  (Plebani  et  al.,  1986).  Así,  en  la 
detección de esta última se puede producir una competencia entre ambos anticuerpos por la unión 
al alérgeno, lo que llevaría a subestimar los niveles de IgE específica (Adel‐Patient et al., 2000). Por 
otra parte, la sinergia observada entre Asp f 1 y el extracto de A. fumigatus podría explicarse por la 
presencia en este último de otras  toxinas, o de esterasas o proteasas que eventualmente podrían 
actuar como coadyuvantes de Asp f 1, quizás afectando al epitelio de manera que la permeabilidad al 
alérgeno se vea aumentada (Kurup y Grunig, 2001; Reed y Kita, 2004; Shen et al., 2007).  

El modelo de sensibilización a Asp f 1 establecido se empleó para estudiar  la alergenicidad 
del mutante α‐sarcina Δ(7‐22). Para ello, en  la segunda fase de  la sensibilización, en  la que  las vías 
respiratorias se exponen al alérgeno, se administró este mutante en vez de Asp f 1 nativa. Los daños 
histológicos  observados  fueron  notablemente más  leves  que  los  producidos  por  Asp f 1.  En  los 
pulmones,  tanto  la hiperplasia de  las  células  epiteliales  como  la  infiltración  celular perivascular  y 
peribronquial se vio considerablemente disminuida (Figura 3, página 133). Y en las fosas nasales, el 
mutante provocó una disminución  importante de  la producción de moco (Figura 4, página 134). En 
cambio, los niveles de IgE de los ratones tratados con α‐sarcina Δ(7‐22) fueron muy similares a los de 
los animales tratados con una cantidad equivalente de Asp f 1 (Figura 2, página 133). Esto no debe 
considerarse un resultado negativo, de hecho, era de esperar, pues ni siquiera esta dosis equivalente 
del alérgeno nativo, Asp f 1, fue suficiente para provocar un aumento en  los niveles de IgE total en 
suero  (Figura  2,  página  133).  A  pesar  de  este  inconveniente,  estos  estudios  in  vivo  han 
proporcionado  resultados  esperanzadores  pues  confirman  la  menor  toxicidad  del  mutante, 
imprescindible  para  su  potencial  uso  clínico,  y  constituyen  nuevas  pruebas  de  su  menor 
alergenicidad. Por  supuesto,  se  requieren estudios más profundos, que  confirmen  la efectividad y 
seguridad de esta molécula para el  tratamiento de pacientes alérgicos, pero cada vez existen más 
evidencias  de  que  la  α‐sarcina  Δ(7‐22)  es  un  firme  candidato  a  ser  usado  como  molécula 
hipoalergénica  en  el  tratamiento  clínico  de  la  hipersensibilidad  a  Aspergillus.  Incluso,  si  fuera 



 
171Discusión 

necesario y ya que se dispone de la metodología, se podría continuar el estudio, tomando como base 
el mutante de deleción ya caracterizado, y eliminando o modificando otras zonas como el bucle 5, 
también interesante desde el punto de vista de su funcionalidad y alergenicidad. 

 

En el caso de que efectivamente se admitiese el uso de alguno de estos hipoalergenos de 
Asp f 1, habría que plantearse el modo de administración de estas moléculas. En general, la vía oral 
resulta más sencilla y más segura que una ruta de administración sistémica y, además, puede inducir 
una  respuesta  inmune  en  las mucosas  del  tracto  digestivo.  En  cambio,  presenta  las  dificultades 
derivadas de  las numerosas barreras que  supone  el  tracto digestivo,  lo que obliga  a proteger de 
alguna  forma  el  fármaco  (Lavelle  and  O'Hagan,  2006).  Con  este  objetivo,  se  han  desarrollado 
distintos sistemas, entre  los que se encuentran  los biofármacos  (del  inglés “biodrugs”), que hacen 
referencia a la manipulación genética de los microorganismos apropiados para la producción in vivo 
de fármacos (Steider et al., 2000), agentes antimicrobiales (Beninati et al., 2000) y vacunas (Shaw et 
al.,  2000),  así  como  para  la  inducción  de  tolerancia  en  enfermedades  autoinmunes  o  alérgicas 
(Maassen et al., 1999). El desarrollo de herramientas de ingeniería genética llevó hace tiempo al uso 
de  microorganismos  modificados  genéticamente  para  producir  fármacos  a  gran  escala  en 
biorreactores  (Primrose,  1986).  Hace  pocos  años  ha  surgido  esta  extensión  innovadora,  la 
producción  del  fármaco  directamente  en  el  aparato  digestivo  del  receptor  por  la  ingestión  de 
microorganismos  recombinantes  vivos.  Algunas  ventajas  de  esta  forma  de  administración  en 
comparación con sistemas clásicos consisten en la posibilidad de administrar fármacos sensibles a las 
secreciones digestivas, de dirigir  los fármacos a zonas específicas del tubo digestivo y de ocasionar 
efectos terapéuticos con dosis bajas del fármaco (Blanquet et al., 2001). Con este propósito se han 
estudiado distintas bacterias y  levaduras recombinantes, principalmente bacterias del ácido  láctico 
(Chang y Prakash, 1998; Corthier y Renault, 1999). Este grupo de bacterias Gram positivas, que no 
corresponde a una clase filogenética sino a una clasificación fenotípica, pues todas producen ácido 
láctico  al  fermentar  azúcares,  se han  empleado desde hace  siglos  en  la producción de productos 
lácteos,  lo  que  ya  da  idea  de  su  inocuidad.  Poseen  el  estatus  de  G.R.A.S.  (del  inglés  “generally 
regarded  as  safe”)  y,  además,  algunas  cepas  ejercen  efectos  probióticos  (Foligne  et  al.,  2007; 
Rosenfeldt  et  al.,  2003).  Todas  estas  consideraciones  situaron  a  Lactococcus  lactis  en  una  buena 
situación para elegirla como vehículo de ribotoxinas y posibles hipoalergenos. A pesar de que sólo un 
porcentaje de L. lactis sobrevive al paso por el duodeno (Drouault et al., 1999) se ha demostrado en 
varios casos que estos microorganismos son efectivos en hacer llegar moléculas al colon (Steidler et 
al.,  2000)  o  antígenos  a  la  mucosa  del  tubo  digestivo  induciendo  respuestas  inmunes  locales 
(Robinson et al., 1997; Vaassen et al., 1999; Adel‐Patient et al., 2005; Pérez et al., 2005). Por todo 
esto se consideró a la bacteria L. lactis como un vehículo ideal para la administración de Asp f 1 y/o 
moléculas hipoalergénicas, y se obtuvieron cepas recombinantes productoras de Asp f 1, α‐sarcina, 
los  respectivos mutantes  de  deleción  Δ(7‐22)  y  un mutante  inactivo  de  la  α‐sarcina  (H137Q)  sin 
actividad ribonucleolítica ni citotóxica. 



 
172  Discusión 

Por  supuesto, no debe descartarse  la posibilidad de utilizar  también  las cepas de L.  lactis 
recombinantes que se han obtenido para hacer llegar la α‐sarcina silvestre a tumores localizados en 
el tubo digestivo, más concretamente, en el colon. Según un informe de la Organización Mundial de 
la  Salud de  julio  de 2008  el  cáncer  colorrectal  causó  677000 muertes  en  2007  siendo,  tras  el de 
mama y pulmón, el tercer cáncer más frecuente en el mundo, y el segundo, si sólo consideramos los 
que  llegan  a  producir  la  muerte  del  paciente.  La  posibilidad  de  usar  α‐sarcina  como  agente 
antitumoral vuelve a ser contemplada en este contexto, pues quizás este sistema de administración 
solvente los problemas de citotoxicidad inespecífica de las ribotoxinas. Por un lado, L. lactis se dirige 
únicamente al  tubo digestivo y allí secreta  la α‐sarcina, sobre  todo en  los últimos  tramos de éste, 
donde el pH es más alto (Figura 2, página 145). En el estómago y las primeras porciones del intestino, 
la supervivencia de L.  lactis es baja, como ya se ha comentado, pero además el pH ácido de estas 
regiones  inhibe  la  secreción  de  α‐sarcina  y  provocaría  la  inactivación  de  la  poca  que  se  pudiera 
producir  (Figura  2,  página  145).  A  diferencia  de  otras  bacterias  lácticas,  L.  lactis  no  coloniza  el 
intestino y parece no tener capacidad de replicación in vivo en una situación fisiológica normal (Klijn 
et al., 1995; Drouault et al., 1999), características esenciales si se va a administrar intragástricamente 
una cepa con capacidad secretora de α‐sarcina. Con vistas a explorar esta posibilidad, la inocuidad de 
esta  administración  se  analizó  en  ratones  sanos. Durante 14 días  consecutivos  se  administró una 
suspensión  de  L.  lactis  productor  de  α‐sarcina  por  vía  intragástrica  a  ratones  BALB/c.  El  análisis 
histológico  reveló  que  las  características  de  su  tubo  digestivo  fueron  idénticas  a  las  de  ratones 
control no tratados (Figura 3, página 146), sugiriendo que es posible un tratamiento continuado sin 
efectos  deletéreos  sobre  los  ratones.  Resta,  por  tanto,  evaluar  directamente  este  sistema  en  el 
tratamiento de  tumores  gastrointestinales  y para  ello  lo  ideal  es usar  un modelo  animal  de  esta 
patología.  El  cáncer  colorrectal  es  tan  frecuente  en  humanos  que  el  número  de  estos modelos 
disponibles, sobre todo en ratón, es muy alto. Entre todos ellos, resulta muy adecuado un modelo 
genético  de  ratones  de  la  cepa  C56BL/6J  en  el  que  la mutación  APCMin,  autosómica  dominante, 
predispone a  los  ratones a desarrollar adenomas en el  tracto  intestinal. Los  ratones heterocigotos 
para esta mutación desarrollan a lo largo de todo el intestino más de 50 adenomas que evolucionan 
hasta  tumores  benignos,  sin  capacidad  de  producir metástasis.  Este modelo  resulta,  pues, muy 
conveniente  para  probar  la  capacidad  de  la  α‐sarcina  secretada  por  L.  lactis  en  la  inhibición  del 
crecimiento de tumores y su utilización con este propósito se encuentra ya en desarrollo durante el 
proceso de redacción de esta Memoria. 

   



 
173Discusión 

CONSIDERACIONES FINALES 

La  actividad  antitumoral  de  las  ribotoxinas  provocó  su  descubrimiento  en  los  años  50, 
suscitando  importantes  expectativas  en  cuanto  a  su  potencial  uso  clínico,  pero  su  estudio  se 
abandonó completamente al desvelarse su citotoxicidad inespecífica. Poco tiempo después, y tal vez 
desde un punto de vista más académico, volvieron a resultar interesantes por su exquisita actividad 
ribonucleasa, que  inactiva al ribosoma mediante  la hidrólisis de un único enlace  fosfodiéster entre 
los  más  de  7000  presentes,  y  por  su  capacidad  adicional  de  atravesar  membranas  celulares. 
Paradójicamente,  tras  años  de  estudio  de  sus  características  estructurales,  de  sus  propiedades 
enzimáticas  y  de  su  interacción  con  membranas  lipídicas  se  ha  llegado  a  un  conocimiento  tan 
exhaustivo de estas proteínas que su uso en aplicaciones biomédicas ya no puede descartarse. En 
esta Tesis aparece una pequeña muestra de ello. Se ha profundizado en  las  relaciones estructura‐
función de estas proteínas, estudiando su centro activo y el de las RNasas microbianas extracelulares 
en general, donde  las  ribotoxinas  se  incluyen. También  se ha analizado  si el  carácter básico de  la 
horquilla  β  amino‐terminal  es  determinante  en  su  función  de  reconocimiento  del  ribosoma  y  de 
interacción con fosfolípidos. Y se ha estudiado el efecto de las ribotoxinas sobre la unión y actividad 
de  los  factores  de  elongación  en  el  ribosoma.  Por  último,  se  ha  utilizado  todo  el  conocimiento 
acumulado para plantear dos aproximaciones para el uso de las ribotoxinas en aplicaciones clínicas. 
Por un  lado,  se ha  tratado de evaluar  in  vivo el posible  carácter hipoalergénico de determinados 
mutantes de la ribotoxina Asp f 1, estableciendo previamente un modelo de hipersensibilidad a esta 
proteína en ratón. Por otra parte, se ha propuesto una nueva vía de administración de ribotoxinas o 
variantes de  ellas  al  tubo digestivo,  empleando  la producción heteróloga de una bacteria  láctica, 
Lactococcus lactis.  

En resumen, el trabajo con las ribotoxinas constituye un buen ejemplo de cómo en algunos 
casos  los  estudios  y  descubrimientos  de  la  investigación  básica  pudieran  llegar  a  dar  lugar  a 
aplicaciones clínicas insospechadas inicialmente. 



 
175Conclusiones 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Conclusiones 



 

   

176  Conclusiones 

   



 
177Conclusiones 

 

 

 

Las  conclusiones generales que pueden extraerse de  los  resultados presentados en esta Tesis 
Doctoral son: 

‐ La  Tyr 48  de  la  α‐sarcina  es  un  residuo  del  centro  activo  esencial  en  su  especificidad, 
resultando clave en el reconocimiento de sustratos de RNA polimérico. 

‐ La His 101 de  la RNasa U2 es un  residuo  fundamental para el correcto plegamiento de  la 
proteína, al menos cuando se expresa en la levadura Pichia pastoris. 

‐ La eliminación del puente disulfuro que se establece entre  los residuos 1 y 54 de  la RNasa 
U2  permite  su  correcto  procesamiento  postraduccional  y  evita  la  producción  de  formas 
incorrectamente plegadas en P. pastoris. 

‐ Parte de la funcionalidad de la horquilla β amino‐terminal en la citotoxicidad de la α‐sarcina 
reside  en  su  carácter  básico.  Los  residuos  de  Lys  y  Arg  de  esta  horquilla  establecen 
interacciones electrostáticas claves tanto para el reconocimiento del sustrato como para la 
interacción con bicapas de fosfolípidos ácidos. 

‐ La  ruptura  del  SRL  por  parte  de  la  α‐sarcina  dificulta  la  unión  del  complejo  ternario  al 
ribosoma,  reduce  la  unión  del  factor  de  elongación  G  y  por  ello  inhibe  muy 
significativamente su actividad para hidrolizar GTP, impidiendo la translocación e inhibiendo 
así la biosíntesis de proteínas. 

‐ Se ha optimizado la inducción de un modelo de alergia a Asp f 1 en ratones. Este modelo es, 
asimismo, mucho más fácilmente reproducible que los descritos hasta la fecha. 

‐ Utilizando  el  mencionado  modelo,  se  ha  verificado  in  vivo  la  menor  alergenicidad  del 
mutante de deleción α‐sarcina Δ(7‐22) en relación con el alérgeno Asp f 1. 

‐ Se  han  obtenido  cepas  de  Lactococcus  lactis  capaces  de  producir  y  secretar  el  alérgeno 
Asp f 1 y tres variantes con afinidad reducida por IgE.  

‐ Se ha demostrado que la administración intragástrica durante 14 días de la cepa de L. lactis 
modificada para producir α‐sarcina silvestre resulta inocua para ratones sanos. 



 
179Bibliografía 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bibliografía 



 
180  Bibliografía 

   



 
181Bibliografía 

Adel‐Patient K, Créminon C, Bernard H, Clément G, Négroni L, Frobert Y, Grassi J, Wal JM y Chatel JM 
(2000) Evaluation of a high IgE‐responder mouse model of allergy to bovine β‐lactoglobulin (BLG): 
development of  sandwich  immunoassays  for  total  and allergen‐specific  IgE,  IgG1  and  IgG2a  in 
BLG‐sensitized mice. J Immunol Methods 235: 21‐32. 

Alegre‐Cebollada  J,  Álvarez‐García  E,  Monedero  V,  Pérez‐Martínez  G,  Martínez  del  Pozo  Á  y 
Gavilanes  JG  (2005)  Heterologous  production  of  natural  and  non‐cytotoxic  variants  of  fungal 
ribotoxins in Lactococcus lactis. 8th Symposium on Lactic Acid Bacteria. Genetics, Metabolism, and 
Applications. Egmond aan Zee (The Netherlands). Abstract number H021. 

Alonso MA y Carrasco L  (1981) Permeabilization of mammalian cells  to proteins by  the  ionophore 
nigericin. FEBS Lett 127: 112–114. 

Alonso MA  y  Carrasco  L  (1982) Molecular  basis  of  the  permeabilization  of mammalian  cells  by 
ionophores. Eur J Biochem 127: 567–569. 

Álvarez‐García E, García‐Ortega L, Verdún Y, Bruix M, Martínez del Pozo Á y Gavilanes JG (2006) Tyr‐
48, a conserved residue  in ribotoxins,  is  involved  in the RNA‐degrading activity of α‐sarcin. Biol 
Chem 387: 535–541. 

Álvarez‐García E, Alegre‐Cebollada J, Batanero E, Monedero V, Pérez‐Martínez G, García‐Fernández 
R, Gavilanes JG y Martínez del Pozo Á. (2008) Lactococcus lactis as a vehicle for the heterologous 
expression of fungal ribotoxin variants with reduced IgE‐binding affinity. J Biotechnol. 134: 1‐8. 

Álvarez‐García E, Martínez del Pozo Á y Gavilanes JG (2009a) Role of the basic character of α‐sarcin's 
NH2‐terminal  β‐hairpin  in  ribosome  recognition  and  phospholipid  interaction.  Arch  Biochem 
Biophys. 481: 37‐44. 

Álvarez‐García E, García‐Ortega L, De los Ríos V, Gavilanes JG, Martínez‐del‐Pozo Á (2009b) Influence 
of  key  residues on  the heterologous extracellular production of  fungal  ribonuclease U2  in  the 
yeast Pichia pastoris. Prot Exp Purification, en prensa. 

Álvarez‐García  E, Batanero  E, García‐Fernández R, Villalba M, Gavilanes  JG  y Martínez‐del‐Pozo Á 
(2009c)  A  deletion  variant  of  the  allergen  Asp  f  1  attenuates  Aspergillus  fumigatus  induced 
allergic airway inflammation in a mouse model of sensitization. Enviado a FEMS Letters. 

Arima T, Uchida T y Egami F (1968a) Studies on extracellular ribonucleases of Ustilago sphaerogena. 
Purification and properties. Biochem J 106: 601–607. 

Arima T, Uchida T y Egami F (1968b) Studies on extracellular ribonucleases of Ustilago sphaerogena. 
Characterization of substrate specificity with special  reference  to purine‐specific  ribonucleases. 
Biochem J 106: 609–613. 

Arruda LK, Platts‐Mills TA, Fox  JW y Chapman MD  (1990) Aspergillus  fumigatus allergen  I, a major 
IgE‐binding protein,  is  a member of  the mitogillin  family of  cytotoxins.  J  Exp Med 172: 1529–
1532. 



 
182  Bibliografía 

Arruda LK, Mann BJ y Chapman MD  (1992) Selective expression of a major allergen and cytotoxin, 
Asp f 1, in Aspergillus fumigatus. Implications for the immunopathogenesis of Aspergillus‐related 
diseases. J Immunol 149: 3354–3359. 

Ban N, Nissen P, Hansen J, Moore PB y Steitz TA (2000) The complete atomic structure of the large 
ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science 289: 905–920. 

Banerjee B y Kurup VP (2003) Molecular biology of Aspergillus allergens. Front Biosci 8: S128–S139. 

Batanero E, Barral P, Villalba M y Rodríguez R(2002) Sensitization of mice with olive pollen allergen 
Ole e 1 induces a Th2 response. Int Arch Allergy Immunol 127: 269‐275. 

Benhar  I  y  Pastan  I  (1995a)  Characterization  of  B1(Fv)PE38  and  B1(dsFv)PE38:  single‐chain  and 
disulfide‐stabilized  Fv  immunotoxins with  increased activity  that  cause  complete  remissions of 
established human carcinoma xenografts in nude mice. Clin Cancer Res 1: 1023–1029. 

Benhar I y Pastan I (1995b) Identification of residues that stabilize the single‐chain Fv of monoclonal 
antibodies B3. J Biol Chem 270: 23373–23380. 

Beninati C, Oggioni MR, Boccanera M, Spinosa MR, Maggi T, Coni S, Magliani W, de Bernardis F, Teti 
G, Cassone A, Pozzi G y Polonelli L (2000) Therapy of mucosal candidiasis by expression of an anti‐
idiotype in human commensal bacteria. Nature Biotechnology 18: 1060‐1064. 

Bera TK y Pastan I (1998) Comparison of recombinant immunotoxins against LeY antigen expressing 
tumour cells: influence of affinity, size, and stability. Bioconjug Chem 9: 736–743. 

Better M, Bernhard SL, Lei SP, Fishwild DM y Carroll SF (1992) Activity of recombinant mitogillin and 
mitogillin immunoconjugates. J Biol Chem 267: 16712–16718. 

Blanchard SC, Gonzalez RL, Kim HD, Chu S y Puglisi JD (2004) tRNA selection and kinetic proofreading 
in translation. Nat Struct Mol Biol 11: 1008‐1014. 

Blanquet  S, Marol‐Bonnin  S,  Beyssac  E,  Pompon  D,  Renaud M  y  Alric M  (2001)  The  “biodrug” 
concept: an innovative approach to therapy. TRENDS in Biotechnology 19: 393‐400. 

Bodey GP y Vartivarian S (1989) Aspergillosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 8: 413–437. 

Boucias DG, Farmerie WG y Pendland JC (1998) Cloning and sequencing of cDNA of the  insecticidal 
toxin hirsutellin A. J Invertebr Pathol 72: 258–261. 

Brandhorst T y Kenealy WR (1992) Production and localization of restrictocin in Aspergillus restrictus. 
J Gen Microbiol 138: 1429–1435. 

Brandhorst T, Yang R y Kenealy WR (1994) Heterologous expression of the cytotoxin restrictocin  in 
Aspergillus nidulans and Aspergillus niger. Protein Expr Purif 5: 486–497. 

Brake  AJ,  Merryweather  JP,  Coit  DG,  Heberlein  UA,  Masiarz  FR,  Mullenbach  GT,  Urdea  MS, 
Valenzuela P yBarr PJ (1984) α‐Factor‐directed synthesis and secretion of mature foreign proteins 
in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642, 4646. 



 
183Bibliografía 

Brierley RA (1998) Secretion of recombinant human insulin‐like growth factor I (IGF‐1). Methods Mol. 
Biol. 103: 149‐177. 

Brigotti M, Rambelli F, Zamboni M, Montanaro L y Sperti S (1989) Effect of α‐sarcin and ribosome‐
inactivating proteins on the interaction of elongarion factors with ribosomes. Biochem J 257: 723‐
727. 

Brinkmann U (2000) Recombinant antibody fragments and immunotoxin fusions for cancer therapy. 
In Vivo 14: 21–27. 

Brinkmann U y Pastan I (1994) Immunotoxins against cancer. Biochim Biophys Acta 1198: 27–45. 

Brinkmann U, Pai LH, FitzGerald DJ, Willingham M y Pastan I (1991) B3(Fv)‐PE38KDEL, a single‐chain 
immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice. Proc Natl Acad Sci 
USA 88: 8616–8620. 

Brinkmann U, Reiter Y,  Jung SH, Lee B y Pastan  I  (1993) A  recombinant  immunotoxin containing a 
disulfide‐stabilized Fv fragment. Proc Natl Acad Sci USA 90: 7538–7542. 

Cameron DM, Thompson  J, March PE  y Dahlberg AE  (2002)  Initiation  factor  IF2,  thiostrepton and 
micrococcin prevent  the binding of elongation  factor G  to  the Escherichia coli  ribosome.  J Mol 
Biol 319: 27–35. 

Campos‐Olivas R, Bruix M, Santoro J, Martínez del Pozo Á, Lacadena J, Gavilanes JG y Rico M (1996a) 
1H and 15N nuclear magnetic  resonance assignment and  secondary  structure of  the  cytotoxic 
ribonuclease α‐sarcin. Protein Sci 5: 969–972. 

Campos‐Olivas R, Bruix M, Santoro J, Martínez del Pozo Á, Lacadena J, Gavilanes JG y RicoM (1996b) 
Structural basis for the catalytic mechanism and substrate specificity of the ribonuclease α‐sarcin. 
FEBS Lett 399: 163–165. 

Carrasco  L  y  Esteban M  (1982) Modification  of membrane  permeability  in  vaccinia  virus‐infected 
cells. Virology 117: 62–69. 

Carroll SF y Collier RJ (1987) Active site of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Glutamic acid 553 is 
photolabeled by NAD and shows functional homology with glutamic acid 148 of diphtheria toxin. 
J Biol Chem 262: 8707–8711. 

Cereghino JL y Cregg JM (2000) Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia 
pastoris. FEMS Microbiology Reviews 24: 45‐66. 

Chan YL, Sitikov AS y Wool IG (2000) The phenotype of mutations of the base‐pair C2658.G2663 that 
closes the tetraloop in the sarcin/ricin domain of Escherichia coli 23 S ribosomal RNA. J Mol Biol 
298: 795‐805. 

Chang TM y Prakash S  (1998) Therapeutic uses of microencapsulated genetically engineered  cells. 
Mol Med Today 4: 221‐227. 



 
184  Bibliografía 

Christensen SK y Gerdes K (2003) RelE toxins from bacteria and Archaea cleave mRNAs on translating 
ribosomes, which are rescued by tmRNA. Mol Microbiol 48: 1389–1400. 

Christensen SK, Pedersen K, Hansen FG y Gerdes K  (2003) Toxin–antitoxin  loci as  stress‐response‐
elements: ChpAk/ MazF and ChpBK  cleave  translated RNAs and are  counteracted by  tmRNA.  J 
Mol Biol 332: 809–819. 

Conde FP, Orlandi R, Canevari S,Mezzanzanica D, Ripamonti M, Muñoz SM,  Jorge P y Colnaghi MI 
(1989)  The  Aspergillus  toxin  restrictocin  is  a  suitable  cytotoxic  agent  for  generation  of 
immunoconjugates with monoclonal  antibodies  directed  against  human  carcinoma  cells.  Eur  J 
Biochem 178: 795–802. 

Condon C (2006) Shutdown decay of mRNA. Mol Microbiol 61: 573–583.  

Connor  J,  Bucana  C,  Fidler  IJ  y  Schroit  AJ  (1989)  Differentiation‐dependent  expression  of 
phosphatidylserine  in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer‐leaflet 
lipid by prothrombinase complex formation. Proc Natl Acad Sci USA 86: 3184–3188. 

Correll CC y Swinger K (2003) Common and distinctive features of GNRA tetraloops based on a GUAA 
tetraloop structure at 1.4 Å resolution. RNA 9: 355–363. 

Correll CC, Munishkin A, Chan YL, Ren Z, Wool IG y Steitz TA (1998) Crystal structure of the ribosomal 
RNA domain essential for binding elongation factors. Proc Natl Acad Sci USA 95: 13436–13441. 

Correll CC, Wool IG y Munishkin A (1999) The two faces of the Escherichia coli 23S rRNA sarcin/ricin 
domain: the structure at 1.11 Å resolution. J Mol Biol 292: 275–287. 

Correll CC, Beneken  J, Plantinga MJ, Lubbers M y Chan YL  (2003) The common and  the distinctive 
features of the bulged‐G motif based on a 1.04 Å resolution RNA structure. Nucleic Acids Res 31: 
6806–6818. 

Correll CC, Yang X, Gerczei T, Beneken J y Plantinga MJ (2004) RNA recognition and base flipping by 
the toxin α‐sarcin. J Synchrotron Radiat 11: 93–96. 

Corthier G y Renault P (1999) Future directions for research on biotherapeutic agents: contribution 
of genetics approaches on  lactic acid bacteria.  In Biotherapeutic agents and  infections diseases 
(Elmer GW, ed.) pp.269‐304, Humana Press Inc., Totowa, NJ, USA. 

Crameri R, Hemmann S, Ismail C, Menz G y Blaser K (1998) Disease‐specific recombinant allergens for 
the diagnosis of allergic bronchopulmonary aspergillosis. Int Immunol 10: 1211–1216. 

Cregg JM, Madden KR, Barringer KJ, Thill GP y Stillman C A (1989) Functional characterization of the 
two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris. Mol Cell Biol 9: 1316–1323. 

Cregg  JM, Vedvick TS y Raschke WC  (1993) Recent advances  in  the expression of  foreign genes  in 
Pichia pastoris. Biotechnology (NY) 11: 905–910. 

De Antonio C, Martínez del Pozo Á, Mancheño JM, Oñaderra M, Lacadena J, Martínez‐Ruiz A, Pérez‐
Cañadillas  JM, Bruix M y Gavilanes  JG  (2000) Assignment of the contribution of the tryptophan 



 
185Bibliografía 

residues  to  the  spectroscopic  and  functional properties of  the  ribotoxin  α‐sarcin.  Proteins  41: 
350–361. 

Des Roches A, Paradis L, Menardo JL, Bouges S, Daurés JP y Bousquet J (1997) Immunotherapy with a 
standardized Dermatophagoides pteronyssinus extract. VI. Specific immunotherapy prevents the 
onset of new sensitizations in children. J Allergy Clin Immunol. 99: 450‐453. 

Diago‐Navarro  E, Mora  L, Buckingham RH, Díaz‐Orejas R  y  Lemonnier M  (2008) Novel  E.  coli RF1 
mutants with decreased translation termination activity and increased sensitivity to the cytotoxic 
effect of the bacterial toxins Kid and RelE. Mol Microbiol. En prensa. 

Di  Donato  A,  Cafaro  V  y  D’Alessio  G  (1994)  Ribonuclease  A  can  be  transformed  into  a  dimeric 
ribonuclease with antitumor activity. J Biol Chem 269, 17394‐17396. 

Doumen  J, Gonciarz M,  Zegers  I,  Loris  R, Wyns  L  y  Steyaert  J  (1996) A  catalytic  function  for  the 
structurally conserved residue Phe 100 of ribonuclease T1. Protein Sci 5: 1523–1530. 

Drouault S, Corthier G, Ehrlich SD y Renault P  (1999) Survival, physiology, and  lysis of Lactococcus 
lactis in the digestive tract. Appl Environ Microbiol. 65:4881‐6. 

Durham SR et al.  (1999) Long‐term clinical efficacy of gras‐pollen  immunotherapy. N Engl.  J. Med. 
341: 468‐475. 

Egami F, Oshima T, Uchida T (1980) Specific  interaction of base‐specific nucleases with nucleosides 
and nucleotides. En: Molecular Biology, Biochemistry and Biophysics. Chapeville F y Haenni AL, 
eds. (Berlin, Alemania: Springer‐Verlag), pp250‐277. 

Ehrlich P  (1956) The relationship between chemical constitution, distribution, and pharmacological 
action. The Collected Papers of Paul Ehrlich, Vol. 1 (Himmelweit F, Marquardt M y Dale H, eds), 
pp. 596. Pergamon Press, New York. 

Endo Y y Tsurugi K  (1987) RNA N‐glycosidase activity of  ricin A‐chain. Mechanism of action of  the 
toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. J Biol Chem 262: 8128–8130. 

Endo Y y Wool IG (1982) The site of action of α‐sarcin on eukaryotic ribosomes. The sequence at the 
α‐sarcin cleavage site in 28 S ribosomal ribonucleic acid. J Biol Chem 257: 9054–9060. 

Endo  Y,  Huber  PW  yWool  IG  (1983)  The  ribonuclease  activity  of  the  cytotoxin  α‐sarcin.  The 
characteristics  of  the  enzymatic  activity  of  α‐sarcin  with  ribosomes  and  ribonucleic  acids  as 
substrates. J Biol Chem 258: 2662–2667. 

Endo Y, Mitsui K, Motizuki M y Tsurugi K (1987) The mechanism of action of ricin and related toxic 
lectins  on  eukaryotic  ribosomes.  The  site  and  the  characteristics  of  the modification  in  28  S 
ribosomal RNA caused by the toxins. J Biol Chem 262: 5908–5912. 

Endo  Y, Chan YL,  Lin A,  Tsurugi K  y Wool  IG  (1988)  The  cytotoxins  α‐sarcin  and  ricin  retain  their 
specificity when tested on a synthetic oligoribonucleotide (35‐mer) that mimics a region of 28 S 
ribosomal ribonucleic acid. J Biol Chem 263: 7917–7920. 



 
186  Bibliografía 

Endo Y, Oka T, Tsurugi K y Natori Y  (1993a) The biosynthesis of a cytotoxic protein,  α‐sarcin,  in a 
mold of Aspergillus giganteus.  I. Synthesis of prepro‐ and pro‐α‐sarcin  in vitro. Tokushima J Exp 
Med 40: 1–6. 

Endo Y, Oka T, Yokota  S, Tsurugi K  y Natori Y  (1993b) The biosynthesis of  a  cytotoxic protein,  α‐
sarcin,  in a mold of Aspergillus giganteus.  II. Maturation of precursor  form of  α‐sarcin  in vivo. 
Tokushima J Exp Med 40: 7–12. 

Engert A, Diehl V, Schnell R et al. (1997) A phase‐I study of an anti‐CD25 ricin A‐chain immunotoxin 
(RFT5‐SMPT‐dgA) in patients with refractory Hodgkin’s lymphoma. Blood 89: 403–410. 

Fernández‐Luna JL, López‐Otín C, Soriano F y Méndez E (1985) Complete amino acid sequence of the 
Aspergillus cytotoxin mitogillin. Biochemistry 24: 861–867. 

Fernández‐Puentes C y Carrasco L  (1980) Viral  infection permeabilizes mammalian cells  to protein 
toxins. Cell 20: 769–775. 

Fernández‐Puentes  C  y Vázquez D  (1977)  Effects  of  some  proteins  that  inactivate  the  eukaryotic 
ribosome. FEBS Lett. 78: 143‐146. 

Foligne B, Nutten S, Grangette C, Dennin V, Goudercourt D, Poiret S, Dewulf J, Brassart D, Mercenier 
A y Pot B (2007) Correlation between in vitro and in vivo immunomodulatory properties of lactic 
acid bacteria. World J Gastroenterol, 13:236‐243. 

Foss FM, Saleh MN, Krueger JG, Nichols JC y Murphy JR (1998) Diphtheria toxin fusion proteins. Curr 
Top Microbiol Immunol 234: 63–81. 

Gabashvili IS, Agrawal RK, Spahn CM, Grassucci RA, Svergun DI, Frank J y Penczek P (2000) Solution 
structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 Å resolution. Cell 100: 537–549. 

Galagan  JE,  Calvo  SE,  Cuomo  C  et  al.  (2005)  Sequencing  of Aspergillus  nidulans  and  comparative 
analysis with A. fumigatus and A. oryzae. Nature 438: 1105–1115. 

García‐Mayoral MF, Pérez‐Cañadillas JM, Santoro J,  Ibarra‐ Molero B, Sánchez‐Ruiz JM, Lacadena J, 
Martínez del Pozo Á, Gavilanes JG, Rico M y Bruix M (2003) Dissecting structural and electrostatic 
interactions of charged groups in α‐sarcin. An NMR study of some mutants involving the catalytic 
residues. Biochemistry 42: 13122–13133. 

García‐Mayoral MF, García‐Ortega L, Lillo MP, Santoro J, Martínez del Pozo Á, Gavilanes JG, Rico M y 
Bruix M  (2004) NMR structure of  the noncytotoxic α‐sarcin mutant Δ(7–22):  the  importance of 
the native conformation of peripheral loops for activity. Protein Sci 13: 1000–1011. 

García‐Mayoral MF, Pantoja‐Uceda D, Santoro J, Martínez del Pozo Á, Gavilanes JG, Rico M y Bruix M 
(2005a) Refined NMR structure of α‐sarcin by 15N‐1H  residual dipolar couplings. Eur Biophys  J 
34: 1057–1065. 

García‐Mayoral MF, García‐Ortega L, Álvarez‐García E, Bruix M, Gavilanes JG y Martínez del Pozo Á 
(2005b) Modelling  the highly specific  ribotoxin  recognition of  ribosomes. FEBS Lett 579: 6859–
6864. 



 
187Bibliografía 

García‐Mayoral MF, Martínez del Pozo Á, Campos‐Olivas R, Gavilanes JG, Santoro J, Rico M, Laurents 
DV y Bruix M  (2006) pH‐dependent  conformational  stability of  the  ribotoxin  α‐sarcin and  four 
active site charge substitution variants. Biochemistry 45: 13705–13718. 

García‐Ortega L, Lacadena J, Mancheño JM, Oñaderra M, Kao R, Davies J, Olmo N, Martínez del Pozo 
Á y Gavilanes JG  (2001)  Involvement of the NH2‐terminal β‐hairpin of the Aspergillus ribotoxins 
on the  interaction with membranes and nonspecific ribonuclease activity. Protein Sci 10: 1658–
1668. 

García‐Ortega  L, Masip M, Mancheño  JM, Oñaderra M,  Lizarbe MA, García‐Mayoral MF, Bruix M, 
Martínez del Pozo Á y Gavilanes JG (2002) Deletion of the NH2‐terminal β‐hairpin of the ribotoxin 
α‐sarcin produces a nontoxic but active ribonuclease. J Biol Chem 277: 18632–18639. 

García‐Ortega  L,  Lacadena  J,  Villalba M,  Rodríguez  R,  Crespo  JF,  Rodríguez  J,  Pascual  C, Olmo N, 
Oñaderra M, Martínez del Pozo Á y Gavilanes  JG  (2005a) Production and characterization of a 
noncytotoxic deletion variant of the Aspergillus fumigatus allergen Aspf1 displaying reduced IgE 
binding. FEBS J 272: 2536–2544. 

García‐Ortega  L, De  los  Ríos V, Martínez‐Ruíz A, Oñaderra M,  Lacadena  J, Martínez del  Pozo Á  y 
Gavilanes JG (2005b) Anomalous electrophoretic behavior of a very acidic protein: Ribonuclease 
U2. Electrophoresis 26, 3407‐3413. 

García‐Ortega L, Álvarez‐García E, Martínez del Pozo Á, Gavilanes JG y Joseph S  (2009) Cleavage of 
the sarcin‐ricin loop of 23S rRNA differentially affects EF‐G and EF‐Tu binding. Enviado a RNA. 

Gasset M, Martínez del Pozo A, Oñaderra M y Gavilanes JG (1989) Study of the interaction between 
the antitumour protein α‐sarcin and phospholipid vesicles. Biochem J 258: 569–575. 

Gasset M, Oñaderra M, Thomas PG y Gavilanes JG (1990) Fusion of phospholipid vesicles produced 
by the anti‐tumour protein α‐sarcin. Biochem J 265: 815–822. 

Gasset M, Oñaderra M, Martínez del Pozo Á, Schiavo GP, Laynez J, Usobiaga P y Gavilanes JG (1991a) 
Effect of  the  antitumour protein  α‐sarcin on  the  thermotropic behaviour of  acid phospholipid 
vesicles. Biochim Biophys Acta 1068: 9–16. 

Gasset M, Oñaderra M, Goormaghtigh E y Gavilanes JG (1991b) Acid phospholipid vesicles produce 
conformational changes on the antitumour protein α‐sarcin. Biochim Biophys Acta 1080: 51–58. 

Gasset M, Mancheño JM, Lacadena J, Turnay J, Olmo N, Lizarbe MA, Martínez del Pozo Á, Oñaderra 
M  y Gavilanes  JG  (1994)  α‐Sarcin, a  ribosome‐inactivating protein  that  translocates across  the 
membrane of phospholipid vesicles. Curr Topics Pept Protein Res 1: 99–104. 

Gasset M, Mancheño  JM,  Lacadena  J, Martínez  del  Pozo  Á,  Oñaderra M  y  Gavilanes  JG  (1995) 
Spectroscopic  characterization  of  the  alkylated  α‐sarcin  cytotoxin:  analysis  of  the  structural 
requirements for the protein–lipid bilayer hydrophobic  interaction. Biochim Biophys Acta 1252: 
43–52. 



 
188  Bibliografía 

Ghetie  V,  Swindell  E,  Uhr  JW  y  Vitetta  ES  (1993)  Purification  and  properties  of  immunotoxins 
containing one vs. two deglycosylated ricin A chains. J Immunol Methods 166: 117–122. 

Glück A yWool  IG (1996) Determination of the 28 S ribosomal RNA  identity element (G4319) for α‐
sarcin and  the  relationship of  recognition  to  the  selection of  the  catalytic  site.  J Mol Biol 256: 
838–848. 

Gohda K, Oka K, Tomita K y Hakoshima T (1994) Crystal structure of RNase T1 complexed with the 
product  nucleotide  30‐GMP.  Structural  evidence  for  direct  interaction  of  histidine  40  and 
glutamic acid 58 with the 20‐hydroxyl group of the ribose. J Biol Chem 269: 17531–17536. 

Goyal A y Batra JK (2000) Inclusion of a furin‐sensitive spacer enhances the cytotoxicity of ribotoxin 
restrictocin containing recombinant single‐chain immunotoxins. Biochem J 345: 247–254. 

Greenberger PA  (2002) Allergic bronchopulmonary  aspergillosis.  J Allergy Clin  Immunol 110: 685–
692. 

Gurkan  C  y  Ellar  DJ  (2003)  Expression  in  Pichia  pastoris  and  purification  of  a membrane‐acting 
immunotoxin  based  on  a  synthetic  gene  coding  for  the  Bacillus  thuringiensis  Cyt2Aa1  toxin. 
Protein Expr Purif 29: 103–116. 

Gurkan C y Ellar DJ  (2005) Recombinant production of bacterial  toxins and  their derivatives  in  the 
methylotrophic yeast Pichia pastoris. Microb Cell Fact 4: 33–40. 

Hausner TP, Atmadja J y Nierhaus KH (1987) Evidence that the G2661 region of 23S rRNA is located 
at the ribosomal binding sites of both elongation factors. Biochimie 69: 911‐923. 

Hebert EJ, Giletto A, Sevcik J, Urbanikova L,Wilson KS, Dauter Z y Pace CN (1998) Contribution of a 
conserved  asparagine  to  the  conformational  stability  of  ribonucleases  Sa,  Ba,  and  T1. 
Biochemistry 37: 16192–16200. 

Heimo H, Palmu K y Suominen  I  (1997) Expression  in Pichia pastoris and purification of Aspergillus 
awamori glucoamylase catalytic domain. Protein Expr. Purif. 11: 304. 

Hemmann  S, Menz G,  Ismail C, Blaser K  y Crameri R  (1999)  Skin  test  reactivity  to 2  recombinant 
Aspergillus  fumigatus  allergens  in A.  fumigatus‐sensitized  asthmatic  subjects  allows diagnostic 
separation  of  allergic  bronchopulmonary  aspergillosis  from  fungal  sensitization.  J  Allergy  Clin 
Immunol 104: 601–607. 

Herrero‐Galán E, Álvarez‐García E, Carreras‐Sangrà N, Lacadena  J, Alegre‐Cebollada  J, Martínez del 
Pozo Á, Oñaderra M y Gavilanes JG (2008a) Fungal ribotoxins: structure, function and evolution. 
En: Microbial  toxins: current  research and  future  trends. T. Proft, ed.  (Nueva Zelanda: Horizon 
Bioscience), en prensa.  

Herrero‐Galán E, Lacadena J, Martínez del Pozo Á, Boucias DG, Olmo N, OñaderraM y Gavilanes JG 
(2008b) The insecticidal protein hirsutellin A from the mite fungal pathogen Hirsutella thompsonii 
is a ribotoxin. Proteins 72: 217‐228. 



 
189Bibliografía 

Hertler  AA  y  Frankel  AE  (1989)  Immunotoxins:  a  clinical  review  of  their  use  in  the  treatment  of 
malignancies. J Clin Oncol 7: 1932–1942. 

Herz U, Renz H y Wiedermann U (2004) Animal models of type I allergy using recombinant allergens. 
Methods 32: 271‐280. 

Holgate ST y Polosa R (2008) Treatment strategies for allergy and asthma. Nat Rev Immunol. 8: 218‐
30. 

Huang K‐C, Hwang YY, Hwu L y Lin A  (1997) Characterization of a new  ribotoxin gene  (c‐sar)  from 
Aspergillus clavatus. Toxicon 35: 383–392. 

Humphrey W, Dalke A y chulten K (1996) VMD: visual molecular dynamics. J Mol Graph 14: 33–38, 
27–28. 

Ilinskaya ON, Dreyer  F, Mitkevich  VA,  Shaw  KL,  Pace  CN  y Makarov AA  (2002)  Changing  the  net 
charge form negative to positive makes ribonuclease Sa citotoxic. Protein Sci 11: 2522‐2525. 

Irie  M  (1997)  RNase  T1/RNase  T2  family  RNases.  En  Ribonucleases:  structures  and  functions. 
D’Alessio G y Riordan JF, eds. Academic Press, pp. 101‐130. 

Juge N, Andersen  JS, Tull D, Roepstorff P and Svensson B  (1996) Overexpression, purification, and 
characterization of recombinant barley alpha‐amylases 1 and 2 secreted by the methylotrophic 
yeast Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 8: 204‐214. 

Kamphuis MB, Bonvin AM, Monti MC,  Lemonnier M, Muñoz‐Gómez A,  van den Heuvel RH, Díaz‐
Orejas R y Boelens R (2006) Model for RNA binding and the catalytic site of the RNase Kid of the 
bacterial parD toxin–antitoxin system. J Mol Biol 357: 115–126. 

Kao R y Davies J (1995) Fungal ribotoxins: a family of naturally engineered targeted toxins Biochem 
Cell Biol 73: 1151–1159. 

Kao R y Davies  J  (1999) Molecular dissection of mitogillin  reveals  that  the  fungal  ribotoxins are a 
family of natural genetically engineered ribonucleases. J Biol Chem 274: 12576–12582. 

Kao R y Davies J (2000) Single amino acid substitutions affecting the specificity of the fungal ribotoxin 
mitogillin. FEBS Lett 466: 87–90. 

Kao R, Shea JE, Davies J y Holden DW(1998) Probing the active site of mitogillin, a fungal ribotoxin. 
Mol Microbiol 29: 1019–1027. 

Kao R, Martínez‐Ruiz A, Martínez del Pozo Á, Crameri R y Davies J (2001) Mitogillin and related fungal 
ribotoxins. Methods Enzymol 341: 324–335. 

Klijn N; Weerkamp AH y de Vos WM (1995) Genetic marking of Lactococcus lactis shows its survival 
in the human gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 61: 2771‐2774) 

Kondo  T,  FitzGerald  D,  Chaudhary  VK,  Adhya  S  y  Pastan  I  (1988)  Activity  of  immunotoxins 
constructed with modified Pseudomonas exotoxin. A  lacking  the cell  recognition domain.  J Biol 
Chem 263: 9470–9475. 



 
190  Bibliografía 

Koradi  R,  Billeter  M  yW¨uthrich  K  (1996)  MOLMOL:  a  program  for  display  and  analysis  of 
macromolecular structures. J Mol Graph 14: 51–55. 

Korennykh AV, Piccirilli  JA y Correll CC  (2006) The electrostatic character of  the  ribosomal  surface 
enables extraordinarily rapid target location by ribotoxins. Nature Str Mol Biol 13: 436–443. 

Kreitman RJ (2000) Immunotoxins. Expert Opin Pharmacother 1: 1117–1129. 

Kreitman RJ (2001) Toxin‐labeled monoclonal antibodies. Curr Pharm Biotechnol 2: 313–325. 

Kreitman RJ (2003) Recombinant toxins for the treatment of cancer. Curr Opin Mol Ther 5: 44–51. 

Kreitman  RJ,  Chaudhary  VK, Waldmann  T, Willingham MC,  FitzGerald  DJ  y  Pastan  I  (1990)  The 
recombinant immunotoxin anti‐Tac(Fv)‐Pseudomonas exotoxin 40 is cytotoxic toward peripheral 
blood malignant cells from patients with adult T‐cell leukemia. Proc Natl Acad Sci USA 87: 8291–
8295. 

Kreitman  RJ,  Batra  JK,  Seetharam  S,  Chaudhary  VK,  FitzGerald  DJ  y  Pastan  I  (1993)  Single‐chain 
immunotoxin  fusions between anti‐Tac and Pseudomonas exotoxin:  relative  importance of  the 
two toxin disulfide bonds. Bioconjug Chem 4: 112–120. 

Kreitman  RJ, Wilson WH,  Robbins D, Margulies  I,  Stetler‐Stevenson M, Waldmann  TA  y  Pastan  I 
(1999)  Responses  in  refractory  hairy  cell  leukemia  to  a  recombinant  immunotoxin.  Blood  94: 
3340–3348. 

Kuan CT y Pastan  I (1996)  Improved antitumour activity of a recombinant anti‐LewisY  immunotoxin 
not requiring proteolytic activation. Proc Natl Acad Sci USA 93: 974–978. 

Kunji  ER,  Chan  KW,  Slotboom DJ,  Floyd  S, O’Connor  R  y Monne M  (2005)  Eukaryotic membrane 
protein overproduction in Lactococcus lactis. Curr Opin Biotechnol 16: 546–551. 

Kurup VP and Grunig G: Animal models of allergic bronchopulmonary aspergillosis. Mycopathologia 
2001; 153: 165‐177. 

Kurup VP, Kumar A, Kenealy WR y Greenberger PA (1994) Aspergillus ribotoxins react with  IgE and 
IgG antibodies of patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis. J Lab Clin Med 123: 749–
756. 

Kurup  VP,  Banerjee  B,  Murali  PS,  Greenberger  PA,  Krishnan  M,  Hari  V  y  Fink  JN  (1998) 
Immunodominant peptide epitopes of allergen, Asp f 1  from  the  fungus Aspergillus  fumigatus. 
Peptides 19: 1469–1477. 

Kurup VP, Knutsen AP, Moss RB y Bansal NK (2006) Specific antibodies to recombinant allergens of 
Aspergillus fumigatus in cystic fibrosis patients with ABPA. Clin Mol Allergy 4: 11–17. 

Lacadena  J, Martínez del Pozo Á, Barbero  JL, Mancheño  JM, Gasset M, Oñaderra M, López‐Otín C, 
Ortega  S, García  J  y Gavilanes  JG  (1994) Overproduction  and purification of biologically  active 
native fungal α‐sarcin in Escherichia coli. Gene 142: 147–151. 



 
191Bibliografía 

Lacadena J, Mancheño JM, Martínez‐Ruiz A, Martínez del Pozo Á, Gasset M, Oñaderra M y Gavilanes 
JG  (1995)  Substitution  of  histidine‐137  by  glutamine  abolishes  the  catalytic  activity  of  the 
ribosome‐inactivating protein α‐sarcin. Biochem J 309: 581–586. 

Lacadena  J,  Martínez  del  Pozo  Á,  Lacadena  V,  Martínez‐Ruiz  A,  Mancheño  JM,  Oñaderra  M  y 
Gavilanes JG (1998) The cytotoxin α‐sarcin behaves as a cyclizing ribonuclease. FEBS Lett 424: 46–
48. 

Lacadena  J, Martínez  del  Pozo Á, Martínez‐Ruiz A,  Pérez‐  Cañadillas  JM, Bruix M, Mancheño  JM, 
Oñaderra M y Gavilanes JG (1999) Role of histidine‐50, glutamic acid‐96, and histidine‐137 in the 
ribonucleolytic mechanism of the ribotoxin α‐sarcin. Proteins 37: 474–484. 

Lacadena J, Carreras‐Sangrà N, Oñaderra M, Martínez del Pozo A y Gavilanes JG  (2005) Production 
and purification of an immunotoxin based on the ribotoxin α‐sarcin. In: 7th International Meeting 
on Ribonucleases. (Urbániková, ed), pp. 65, Abstract number P10. ASCO Art y Science, Bratislava, 
Stará Lesná (Slovak Republic). 

Lamy B, Moutaouakil M, Latge JP y Davies J (1991) Secretion of a potential virulence factor, a fungal 
ribonucleotoxin, during human aspergillosis infections. Mol Microbiol 5: 1811–1815.  

Lamy B, Davies J y Schindler D (1992) The Aspergillus ribonucleolytic toxins (ribotoxins). Genetically 
Engineered Toxins (Frankel AE, ed), pp. 237–258. Marcel Dekker Inc., New York, NY. 

Larché M (2007) Update on the current status of peptide immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 
119: 906‐909. 

Lavelle EC, O'Hagan DT  (2006) Delivery systems and adjuvants  for oral vaccines. Expert Opin Drug 
Deliv. 3:747‐62.   

LeMaistre CF, Saleh MN, Kuzel TM et al. (1998) Phase I trial of a ligand fusion‐protein (DAB389IL‐2) in 
lymphomas expressing the receptor for interleukin‐2. Blood 91: 399–405. 

Leonov AA, Sergiev PV, Bogdanov AA, Brimacombe R y Dontsova OA  (2003) Affinity purification of 
ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23S rRNA that affects the translocation. J Biol Chem 
278: 25664–25670. 

Li Q,  Verschraegen  CF, Mendoza  J  y Hassan  R  (2004)  Cytotoxic  activity  of  the  recombinant  anti‐
mesothelin  immunotoxin,  SS1(dsFv)PE38,  towards  tumor  cell  lines  established  from  ascites  of 
patients with peritoneal mesotheliomas. Anticancer Res 24: 1327–1335. 

Lin A, Huang KC, Hwu L yTzean SS (1995) Production of type II ribotoxins by Aspergillus species and 
related fungi in Taiwan. Toxicon 33: 105–110. 

Liu R y Liebman SW (1996) A translational fidelity mutation in the universally conserved sarcin/ricin 
domain of 25S yeast ribosomal RNA. RNA 2: 254–263. 

Liu  YY,  Woo  JH  y  Neville  DM  Jr  (2005)  Overexpression  of  an  anti‐CD3  immunotoxin  increases 
expression  and  secretion  of molecular  chaperone  BiP/Kar2p  by  Pichia  pastoris.  Appl  Environ 
Microbiol 71: 5332–5340. 



 
192  Bibliografía 

López‐Otín C, Barber D, Fernández‐Luna JL, Soriano F y Méndez E (1984) The primary structure of the 
cytotoxin restrictocin. Eur J Biochem 143: 621–634. 

Loverix S y Steyaert J (2001) Deciphering the mechanism of RNase T1. Methods Enzymol 341: 305–
323.  

Luna‐Chávez C, Lin YL y Huang RH (2006) Molecular basis of inhibition of the ribonuclease activity in 
colicin E5 by its cognate immunity protein. J Mol Biol 358: 571–579. 

Lund L, Henmar H, Würtzen PA, Lund G, Hjortskov N y Larsen JN (2007) Comparison of allergenicity 
and  immunogenicity of an  intact allergen vaccine and commercially available allergoid products 
for birch pollen immunotherapy. Clin. Exp. Allergy 37: 564‐571. 

Maassen  CBM,  Laman  JD,  Heijne  den  Bak‐Glashouwer  MJ,  Tielen  FJ,  van  Loteen‐Neelen  JCPA, 
Hoogteijling L, Antonissen C, Leer RJ, Pouwels PH, Boersma WJA y Shaw DM (1999) Instruments 
for oral disease‐intervention strategies: recombinant Lactobacillus casei expressing tetanus toxin 
fragment C  for vaccination or myelin proteins  for oral  tolerance  induction  in multiple sclerosis. 
Vaccine 17: 2117‐2128. 

Macbeth  MR y Wool IG (1999) The phenotype of mutations of G2655 in the sarcin/ricin domain of 
23 S ribosomal RNA. J Mol Biol. 285: 965‐975. 

Machida M,  Asai  K,  SanoM  et  al.  (2005) Genome  sequencing  and  analysis  of  Aspergillus  oryzae. 
Nature 438: 1157–1161. 

Madan  T,  Priyadarsiny  P, Vaid M,  Kamal N,  Shah A, HaqW,  Katti  SB  y  Sarma  PU  (2004) Use of  a 
synthetic peptide  epitope of Asp f 1,  a major  allergen or  antigen of Aspergillus  fumigatus,  for 
improved  immunodiagnosis  of  allergic  bronchopulmonary  aspergillosis.  Clin  Diag  Laboratory 
Immunol 11: 552–558. 

Mancheño  JM, Gasset M,  Lacadena  J, Ramón F, Martínez del Pozo Á, Oñaderra M y Gavilanes  JG 
(1994)  Kinetic  study  of  the  aggregation  and  lipid  mixing  produced  by  α‐sarcin  on 
phosphatidylglycerol  and  phosphatidylserine  vesicles:  stopped‐flow  light  scattering  and 
fluorescence energy transfer measurements. Biophys J 67: 1117–1125. 

Mancheño  JM, Gasset M,  Lacadena  J, Martínez  del  Pozo  Á, Oñaderra M  y Gavilanes  JG  (1995a) 
Predictive  study  of  the  conformation  of  the  cytotoxic  protein  α‐sarcin:  a  structural model  to 
explain α‐sarcin – membrane interaction. J Theor Biol 172: 259–267. 

Mancheño  JM, Gasset M, Albar  JP,  Lacadena  J, Martínez del  Pozo Á, Oñaderra M  y Gavilanes  JG 
(1995b) Membrane  interaction of a b‐structure‐forming synthetic peptide comprising  the 116–
139th sequence region of the cytotoxic protein α‐sarcin. Biophys J 68: 2387–2395. 

Mancheño JM, Martínez del Pozo Á, Albar JP, Oñaderra M y Gavilanes JG  (1998) A peptide of nine 
amino acid residues from α‐sarcin cytotoxin  is a membrane‐perturbing structure. J Pept Res 51: 
142–148. 



 
193Bibliografía 

Marazuela EG, Rodríguez R, Barber D, Villalba M and Batanero E  (2007) Hypoallergenic mutants of 
Ole e 1,  the major olive pollen allergen, as  candidates  for allergy vaccines. Clin Exp Allergy 37: 
251‐260. 

Martínez  del  Pozo  Á, Gasset M, Oñaderra M  y Gavilanes  JG  (1988)  Conformational  study  of  the 
antitumour protein α‐sarcin. Biochim Biophys Acta 953: 280–288. 

Martínez  del  Pozo  Á, Gasset M, Oñaderra M  y Gavilanes  JG  (1989)  Effect  of  divalent  cations  on 
structure–function  relationships of  the  antitumour protein  α‐sarcin.  Int  J Pept Protein Res 34: 
416–422. 

Martínez‐Ruiz  A, Martínez  del  Pozo  Á,  Lacadena  J, Mancheño  JM,  Oñaderra M,  López‐Otín  C  y 
Gavilanes  JG  (1998) Secretion of recombinant pro‐ and mature  fungal α‐sarcin ribotoxin by  the 
methylotrophic yeast Pichia pastoris: the Lys‐Arg motif  is required  for maturation. Protein Expr 
Purif 12: 315–322. 

Martínez‐Ruiz A, Martínez del Pozo Á, Lacadena J, Oñaderra M y Gavilanes JG (1999a) Hirsutellin A 
displays significant homology to microbial extracellular ribonucleases. J Invertebr Pathol 74: 96–
97. 

Martínez‐Ruiz A, Kao R, Davies  J y Martínez del Pozo Á  (1999b) Ribotoxins are a more widespread 
group of proteins within the filamentous fungi than previously believed. Toxicon 37: 1549–1563. 

Martínez‐Ruíz A, García‐Ortega L, Kao R, Oñaderra M, Mancheño JM, Davies J, Martínez del Pozo Á y 
Gavilanes  JG  (2000)  Ribonuclease  U2:  cloning,  production  in  Pichia  pastoris  and  affinity 
chromatography purification of the active recombinant protein. FEMS Microbiol. Lett. 189: 165‐
169. 

Martínez‐Ruiz A, García‐Ortega L, Kao R, Lacadena J, Oñaderra M, Mancheño JM, Davies J, Martínez 
del  Pozo  Á  y  Gavilanes  JG  (2001)  RNase  U2  and  α‐sarcin:  a  study  of  relationships. Methods 
Enzymol 341: 335–351. 

Masip M, Lacadena J, Mancheño JM, Oñaderra M, Martínez‐ Ruiz A, Martínez del Pozo Á y Gavilanes 
JG  (2001) Arginine 121  is a crucial  residue  for  the specific cytotoxic activity of  the  ribotoxin α‐
sarcin. Eur J Biochem 268: 6190–6196. 

Masip M, García‐Ortega L, Olmo N, García‐Mayoral MF, Pérez‐Cañadillas JM, Bruix M, Oñaderra M, 
Martínez del Pozo Á y Gavilanes JG (2003) Leucine 145 of the ribotoxin α‐sarcin plays a key role 
for determining the specificity of the ribosome‐inactivating activity of the protein. Protein Sci 12: 
161–169. 

Mears  JA, Cannone  JJ,  Stagg  SM, Gutell RR, Agrawal RK  y Harvey  SC  (2002) Modelling  a minimal 
ribosome based on comparative sequence analysis. J Mol Biol 321: 215–234. 

Meyer V  y Stahl U  (2002) New  insights  in  the  regulation of  the afp gene encoding  the antifungal 
protein of Aspergillus giganteus. Curr Genet 42: 36–42. 



 
194  Bibliografía 

Meyer V, Wedde M y Stahl U (2002) Transcriptional regulation of the antifungal protein in Aspergillus 
giganteus. Mol Genet Genomics 266: 747–757. 

Meyer V y Stahl U (2003) The  influence of co‐cultivation on expression of the antifungal protein  in 
Aspergillus giganteus. J Basic Microbiol 43: 68–74. 

Miller SP y Bodley  JW  (1988) The ribosomes of Aspergillus giganteus are sensitive to the cytotoxic 
action of α‐sarcin. FEBS Lett 229: 388–390. 

Miller  SP  y  Bodley  JW  (1991)  α‐Sarcin  cleavage  of  ribosomal  RNA  is  inhibited  by  the  binding  of 
elongation factor G or thiostrepton to the ribosome. Nucleic Acids Res. 19: 1657‐1660. 

Moazed D, Robertson JM y Noller HF (1988) Interaction of elongation factors EF‐G and EF‐Tu with a 
conserved loop in 23S RNA. Nature 334: 362–364. 

Moser M, Crameri R,Menz G, Schneider T, Dudler T, Virchow C, Gmachl M, Blaser K y Suter M (1992) 
Cloning and expression of  recombinant Aspergillus  fumigatus allergen 1/a  (rAsp  f 1/a) with  IgE 
binding and type I skin test activity. J Immunol 149: 454–460. 

Munishkin  A  yWool  IG  (1997)  The  ribosome‐in‐pieces:  binding  of  elongation  factor  EF‐G  to 
oligoribonucleotides that mimic the sarcin/ricin and thiostrepton domains of 23S ribosomal RNA. 
Proc Natl Acad Sci USA 94: 12280–12284. 

Muñoz‐Gómez AJ, Lemonnier M, Santos‐Sierra S, Berzal‐Herranz A y Díaz‐Orejas R (2005) RNase/anti‐
RNase activities of the bacterial parD toxin–antitoxin system. J Bacteriol 187: 3151–3157. 

Nayak  SK  y  Batra  JK  (1997)  A  single  amino  acid  substitution  in  ribonucleolytic  toxin  restrictocin 
abolishes its specific substrate recognition activity. Biochemistry 36: 13693–13699. 

Nayak  SK, Bagga  S, Gaur D, Nair DT,  Salunke DM  y Batra  JK  (2001) Mechanism of  specific  target 
recognition and RNA hydrolysis by ribonucleolytic toxin restrictocin. Biochemistry 40: 9115–9124. 

Nielsen K y Boston RS  (2001) Ribosome‐inactivating proteins: a plant perspective. Annu Rev Plant 
Physiol Plant Mol Biol 52: 785–816. 

Nierhaus  KH,  Schilling‐Bartetzko  S  y  Twardowski  T  (1992)  The  two main  states  of  the  elongating 
ribosome and the role of the α‐sarcin stem‐loop structure of 23S RNA. Biochimie 74: 403‐410. 

Nierman WC, Pain A, Anderson MJ et al. (2005) Genomic sequence of the pathogenic and allergenic 
filamentous fungus Aspergillus fumigatus. Nature 438: 1151–1156. 

Nilsson J y Nissen P (2005) Elongation factors on the ribosome. Curr Opin Struct Biol 15: 349–354. 

Noguchi  S,  Satow  Y,  Uchida  T,  Sasaki  C  y  Matsuzaki  T  (1995)  Crystal  structure  of  Ustilago 
sphaerogena ribonuclease U2 at 1.8 Å resolution. Biochemistry 34: 15583–15591. 

Olmo  N,  Turnay  J,  Lizarbe  MA  y  Gavilanes  JG  (1993)  Cytotoxic  effect  of  α‐sarcin,  a  ribosome 
inactivating protein, in cultured Rugli cells. STP Pharma Sciences 3: 93–96. 



 
195Bibliografía 

Olmo N,  Turnay  J, González  de Buitrago G,  López  de  Silanes  I, Gavilanes  JG  y  Lizarbe MA  (2001) 
Cytotoxic  mechanism  of  the  ribotoxin  α‐sarcin.  Induction  of  cell  death  via  apoptosis.  Eur  J 
Biochem 268: 2113–2123. 

Olsnes S y Pihl A (1973a) Isolation and properties of abrin: a toxic protein inhibiting protein synthesis. 
Evidence  for different biological  functions of  its  two constituent‐peptide chains. Eur  J Biochem 
35: 179–185. 

Olsnes  S  y Pihl A  (1973b) Different biological properties of  the  two  constituent peptide  chains of 
ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis. Biochemistry 12: 3121–3126.  

Olson BH y Goerner GL (1965) α‐Sarcin, a new antitumour agent.  I.  Isolation, purification, chemical 
composition, and the identity of a new amino acid. Appl Microbiol 13: 314–321. 

Olson BH, Jennings JC, Roga V, Junek AJ y Schuurmans DM (1965) α‐Sarcin, a new antitumour agent. 
II. Fermentation and antitumour spectrum. Appl Microbiol 13: 322–326. 

Oñaderra M, Gasset M, Martínez del Pozo Á  y Gavilanes  JG  (1989) Molecular  aspects of  α‐sarcin 
penetration in phospholipid bilayers. Biochem Soc Trans 17: 999–1000. 

Oñaderra M, Mancheño  JM, Gasset M,  Lacadena  J, Schiavo G, Martínez del Pozo Á yGavilanes  JG 
(1993) Translocation of α‐sarcin across the lipid bilayer of asolectin vesicles. Biochem J 295: 221–
225. 

Orlandi  R,  Canevari  S,  Conde  FP,  Leoni  F, Mezzanzanica  D,  Ripamonti M  y  Colnaghi MI  (1988) 
Immunoconjugate generation between the ribosome inactivating protein restrictocin and an anti‐
human breast carcinoma MAB. Cancer Immunol Immunother 26: 114–120. 

Otero MJ  y  Carrasco  L  (1986)  External  ATP  permeabilizes  transformed  cells  to macromolecules. 
Biochem Biophys Res Commun 134: 453–460. 

Otero MJ y Carrasco L (1988) Exogenous phospholipase C permeabilizes mammalian cells to proteins. 
Exp Cell Res 177: 154–161. 

O’Toole JE, Esseltine D, Lynch TJ, Lambert JM y Grossbard ML (1998) Clinical trials with blocked ricin 
immunotoxins. Curr Top Microbiol Immunol 234: 35–56. 

Pace  CN,  Heinemann  U,  Hahn  U  y  Saenger W  (1991)  Ribonuclease  T1:  structure,  function,  and 
stability. Angew Chem Int Ed Engl 30: 343–360. 

Pai  LH,  Batra  JK,  FitzGerald  DJ,  Willingham  MC  y  Pastan  I  (1991)  Anti‐tumour  activities  of 
immunotoxins made of monoclonal  antibody B3  and  various  forms of  Pseudomonas exotoxin. 
Proc Natl Acad Sci USA 88: 3358–3362. 

Pai LH, Wittes R, Setser A, Willingham MC y Pastan  I  (1996) Treatment of advanced solid  tumours 
with immunotoxin LMB‐1: an antibody linked to Pseudomonas exotoxin. Nat Med 2: 350–353. 



 
196  Bibliografía 

Parente  D,  Raucci  G,  Celano  B  et  al.  (1996)  Clavin,  a  type‐1  ribosome‐inactivating  protein  from 
Aspergillus  clavatus  IFO  8605.  cDNA  isolation,  heterologous  expression,  biochemical  and 
biological characterization of the recombinant protein. Eur J Biochem 239: 272–280. 

Paris  S, Monod M,  Diaquin M,  Lamy  B,  Arruda  LK,  Punt  PJ  y  Latge  JP  (1993)  A  transformant  of 
Aspergillus  fumigatus deficient  in  the antigenic cytotoxin Asp f 1. FEMS Microbiol Lett 111: 31–
36. 

Pasqualotto A (2006) Post‐operative aspergillosis. Clin Microbiol Infect 12: S25. 

Pastan I (2003) Immunotoxins containing Pseudomonas exotoxin A: a short history. Cancer Immunol 
Immunother 52: 338–341. 

Pastan I y FitzGerald DJ (1991) Recombinant toxins for cancer treatment. Science 254: 1173–1177. 

Pastan I, Chaudhary V y FitzGerald DJ (1992) Recombinant toxins as novel therapeutic agents. Annu 
Rev Biochem 61: 331–354. 

Pérez‐Cañadillas JM, Campos‐Olivas R, Lacadena J, Martínez del Pozo Á, Gavilanes JG, Santoro J, Rico 
M  y  Bruix  M  (1998)  Characterization  of  pKa  values  and  titration  shifts  in  the  cytotoxic 
ribonuclease  α‐sarcin  by NMR.  Relationship  between  electrostatic  interactions,  structure,  and 
catalytic function. Biochemistry 37: 15865–15876. 

Pérez‐Cañadillas JM, Santoro J, Campos‐Olivas R, Lacadena J, Martínez del Pozo Á, Gavilanes JG, Rico 
M y Bruix M  (2000) The highly refined solution structure of the cytotoxic ribonuclease α‐sarcin 
reveals  the structural requirements  for substrate recognition and ribonucleolytic activity.  J Mol 
Biol 299: 1061–1073. 

Pérez‐Cañadillas  JM, Guenneugues M, Campos‐Olivas R, Santoro  J, Martínez del Pozo Á, Gavilanes 
JG, Rico M y Bruix M  (2002) Backbone dynamics of  the  cytotoxic  ribonuclease  α‐sarcin by  15N 
NMR relaxation methods. J Biomol NMR 24: 301–316. 

Pérez‐Cañadillas JM, García‐Mayoral MF, Laurents DV, Martínez del Pozo Á, Gavilanes JG, Rico M y 
Bruix M  (2003) Tautomeric state of α‐sarcin histidines. Nδ  tautomers are a common  feature  in 
the active site of extracellular microbial ribonucleases. FEBS Lett 534: 197–201. 

Peumans WJ, Hao Q y Van Damme EJ (2001) Ribosome inactivating proteins from plants: more than 
RNA Nglycosidases FASEB J 15: 1493–1506. 

Pfeiffer S, Karimi‐Nejad Y y Ruterjans H (1997) Limits of NMR structure determination using variable 
target function calculations: ribonuclease T1, a case study. J Mol Biol 266: 400–423. 

Piechura  JE, Huang CJ, Cohen SH, Kidd  JM, Kurup VP y Calvanico NJ  (1983) Antigens of Aspergillus 
fumigatus. II. Electrophoretic and clinical studies. Immunology 49: 657–665. 

Plantinga MJ, Korennykh AV, Piccirilli JA y Correll CC (2008) Electrostatic interactions guide the active 
site face of a structure‐specific ribonuclease to its RNA substrate. Biochemistry 47: 8912‐8918. 



 
197Bibliografía 

Plebani A, Ugazio AG, Avanzini AM, Monafo V y Burgio GR (1986) An enzyme‐linked immunosorbent 
assay for cow's milk protein‐specific IgE using biotinylated antigen. Avoidance of interference by 
specific IgG. J Immunol Methods 90: 241‐246. 

Primrose SB  (1986) The application of genetically engineered microorganisms  in  the production of 
drugs. J Appl Bacteriol 61: 99‐116. 

Purello‐D’Ambrosio F, Gangemi S, Merendino RA, Isola S, Puccinelli P, Parmiani S y Ricciardi L (2001) 
Prevention  of  new  sensitizations  in  monosensitized  subjects  submitted  to  specific 
immunotherapy or not. A retrospective study. Clin Exp Allergy. 31: 1295‐1302. 

Ramakrishnan V y Moore PB (2001) Atomic structures at last: the ribosome in 2000. Curr Opin Struct 
Biol 11: 144–154. 

Rathore D y Batra JK (1996) Generation of active immunotoxins containing recombinant restrictocin. 
Biochem Biophys Res Commun 222: 58–63. 

Rathore  D  y  Batra  JK  (1997a)  Construction,  expression  and  characterization  of  chimaeric  toxins 
containing  the  ribonucleolytic  toxin  restrictocin:  intracellular mechanism  of  action.  Biochem  J 
324: 815–822. 

Rathore D y Batra  JK  (1997b) Cytotoxic activity of  ribonucleolytic  toxin  restrictocin‐based chimeric 
toxins targeted to epidermal growth factor receptor. FEBS Lett 407: 275–279. 

Rathore D, Nayak SK y Batra JK (1997) Overproduction of fungal ribotoxin α‐sarcin in Escherichia coli: 
generation of an active immunotoxin. Gene 190: 31–35. 

Reed CE and Kita H: The role of protease activation of inflammation in allergic respiratory diseases. J 
Allergy Clin Immunol 2004; 114: 997‐1008. 

Reiter Y y Pastan I (1998) Recombinant Fv immunotoxins and Fv fragments as novel agents for cancer 
therapy and diagnosis. Trends Biotechnol 16: 513–520. 

Rodríguez R, López‐Otín C, Barber D, Fernández‐Luna JL, González G y Méndez E (1982) Amino acid 
sequence homologies in α‐sarcin, restrictocin and mitogillin. Biochem Biophys Res Commun 108: 
315–321. 

Roga V, Hedeman  LP  y Olson BH  (1971) Evaluation of mitogillin  (NSC‐69529)  in  the  treatment of 
naturally occurring canine neoplasms. Cancer Chemother Rep 55: 101–113. 

Ronning CM, Fedorova ND, Bowyer P et al. (2005) Genomics of Aspergillus fumigatus. Rev Iberoam 
Micol 22: 223–228. 

Rosenfeldt V, Benfeldt E, Nielsen SD, Michaelsen KF, Jeppesen DL, Valerius NH, Paerregaard A (2003) 
Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol, 
111:389‐395. 



 
198  Bibliografía 

Rosok MJ, Eghtedarzadeh‐Kondri M, Young K, Bajorath J, Glaser S y Yelton D (1998) Analysis of BR96 
binding sites for antigen and anti‐idiotype by codon‐based scanning mutagenesis. J Immunol 160: 
2353–2359. 

Rushizky GW, Mozejko JH, Rogerson DL Jr y Sober HA (1970) Characterization of enzymatic specificity 
of a ribonuclease from Ustilago sphaerogena. Biochemistry 9: 4966–4971. 

Sacco G, Drickamer K y Wool IG (1983) The primary structure of the cytotoxin α‐sarcin. J Biol Chem 
258: 5811–5818. 

Sato K y Egami F (1957) Studies on ribonucleases in takadiastase. J Biochem 44: 753–767. 

Sato S y Uchida T (1975a) The amino acid sequence of ribonuclease U2 from Ustilago sphaerogena. 
Biochem J 145: 353–360. 

Sato S, Uchida T  (1975b) On the  interaction of ribonuclease U2 and substrate analogues. Biochem. 
Biophys. Acta 383: 168‐177. 

Sato S, Uchida T (1975c) Ethoxyformation of ribonuclease U2 from Ustilago sphaerogena. J. Biochem. 
77: 795‐800. 

Sato S y Uchida T  (1975d) The disulfide bridges of  ribonuclease U2  from Ustilago  sphaerogena.  J. 
Biochem. 77, 1171‐1176. 

Schindler DG y Davies JE (1977) Specific cleavage of ribosomal RNA caused by α‐sarcin. Nucleic Acids 
Res 4: 1097–1110. 

Schnell R, Vitetta E, Schindler J, Barth S, Winkler U, Borchmann P, Hansmann ML, Diehl V, Ghetie V y 
Engert  A  (1998)  Clinical  trials with  an  anti‐CD25  ricin  A‐chain  experimental  and  immunotoxin 
(RFT5‐SMPT‐dgA) in Hodgkin’s lymphoma. Leuk Lymphoma 30: 525–537. 

Scott  AM,  Geleick  D,  Rubira  M  et  al.  (2000)  Construction,  production,  and  characterization  of 
humanized anti‐LewisY monoclonal antibody 3S193 for targeted immunotherapy of solid tumors. 
Cancer Res 60: 3254–3261. 

Sevcik  J, Dodson EJ y Dodson GG  (1991) Determination and restrained  least‐squares refinement of 
the structures of ribonuclease Sa and its complex with 30‐guanylic acid at 1.8 Å resolution. Acta 
Crystallogr B 47: 240–253. 

Shaw DM, Gaerthé B,  Leer RJ, Van der Sap  JGMM, Smittenaar C, Heijne den Bak‐Glashouwer MJ, 
Thole JER, Tielen FJ, Pouwels PH y Havenith CEG (2000) Engineering the microflora to vaccinate 
the mucosa:  serum  immunoglobulin G  responses  and  activated  draining  cervical  lymph nodes 
following mucosal application of  tetanus  toxin  fragment C‐expressing  Lactobacilli.  Immunology 
100: 510‐518. 

Shen HD, Tam MF, Tang RB and Chou H: Aspergillus and Penicillium allergens:  focus on proteases. 
Curr Allergy Asthma Rep. 2007; 7: 351‐356. 



 
199Bibliografía 

Siemer  A, Masip M,  Carreras  N,  García‐Ortega  L,  Oñaderra M,  Bruix M, Martínez  del  Pozo  Á  y 
Gavilanes JG (2004) Conserved asparagine residue 54 of α‐sarcin plays a role  in protein stability 
and enzyme activity. Biol Chem 385: 1165–1170. 

Smith  JM, Davies  JE y Holden DW  (1993) Construction and pathogenicity of Aspergillus  fumigatus 
mutants that do not produce the ribotoxin restrictocin. Mol Microbiol 9: 1071–1077. 

Smith JM, Tang CM, Van Noorden S y Holden DW (1994) Virulence of Aspergillus fumigatus double 
mutants lacking restrictocin and an alkaline protease in a low‐dose model of invasive pulmonary 
aspergillosis. Infect Immun 62: 5247–5254.  

Špačková N  y  Šponer  J  (2006) Molecular dynamics  simulations of  sarcin‐ricin  rRNA motif. Nucleic 
Acids Res 34: 697–708. 

Steidler  L,  Hans  W,  Schotte  L,  Neirynck  S,  Obermeier  F,  Falk  W,  Friers  W  y  Remaut  E  (2000) 
Treatment of murine  colitis by  Lactococcus  lactis  secreting  interleukin‐10.  Science 289:  1352–
1355. 

Steyaert  J  (1997)  A  decade  of  protein  engineering  on  ribonuclease  T1.  Atomic  dissection  of  the 
enzyme–substrate interactions. Eur J Biochem 247: 1–11. 

Steyaert  J,  Hallenga  K,Wyns  L  y  Stanssens  P  (1990)  Histidine‐40  of  ribonuclease  T1  acts  as  base 
catalyst when the true catalytic base, glutamic acid‐58,  is replaced by alanine. Biochemistry 29: 
9064–9072. 

Steyaert J, Haikal AF, Wyns L, Stanssens P (1991) Subsite interactions of ribonuclease T1: Asn36 and 
Asn98  accelerate  GpN  transesterification  through  interactions with  the  leaving  nucleoside  N. 
Biochemistry. 30:8666‐70 

J Steyaert y L Wyns.  (1993) Functional  interactions among  the His40, Glu58 and His92 catalysts of 
ribonuclease T1 as studied by double and triple mutants. J Mol Biol. 229, 770‐81?? Mutante H92 

Stirpe  F,  Bailey  S,  Miller  SP  y  Bodley  JW  (1988)  Modification  of  ribosomal  RNA  by  ribosome‐
inactivating proteins from plants. Nucleic Acids Res 16: 1349–1357. 

Stirpe  F,  Barbieri  L,  Batelli MG,  Soria M  y  Lappi  DA  (1992)  Ribosome‐inactivating  proteins  from 
plants: present status and future prospects. Biotechnology 10: 405–412. 

Stuart  AD  y  Brown  TD  (2006)  Entry  of  feline  calicivirus  is  dependent  on  clathrin‐mediated 
endocytosis and acidification in endosomes. J Virol 80: 7500–7509. 

Sylvester  ID, Roberts LM y Lord  JM  (1997) Characterization of prokaryotic  recombinant Aspergillus 
ribotoxin α‐sarcin. Biochim Biophys Acta 1358: 53–60. 

Szewczak AA y Moore PB (1995) The sarcin/ricin loop, a modular RNA. J Mol Biol 247: 81–98. 

Trail  PA, Willner D,  Lasch  SJ, Henderson AJ, Hofstead  S, Casazza AM,  Firestone  RA, Hellstrom  I  y 
Hellstrom  KE  (1993)  Cure  of  xenografted  human  carcinomas  by  BR96‐doxorubicin 
immunoconjugates. Science 261: 212–215. 



 
200  Bibliografía 

Tsujikawa M, Okabayashi K, Morita M and Tanabe T (1996) Secretion of a variant of human single‐
chain urokinase‐type plasminogen activator without an N‐glycosylation site in the methylotrophic 
yeast, Pichia pastoris and characterization of the secreted product. Yeast  12: 541‐553. 

Turnay J, Olmo N, Jiménez A, Lizarbe MA y Gavilanes JG (1993) Kinetic study of the cytotoxic effect of 
α‐sarcin, a ribosome inactivating protein from Aspergillus giganteus, on tumour cell lines: protein 
biosynthesis inhibition and cell binding. Mol Cell Biochem 122: 39–47. 

Uchida T, Arima T y Egami F (1970) Specificity of RNase U2. J Biochem (Tokyo) 67: 91–102. 

Uchiumi T, Honma S, Endo Y y Hachimori A (2002) Ribosomal proteins at the stalk region modulate 
functional rRNA structures in the GTPase center. J Biol Chem 277: 41401–41409. 

Valenta  R  and  Niederberger  V  (2007)  Recombinant  allergens  for  immunotherapy.  J  Allergy  Clin 
Immunol 119: 826‐830. 

Valle M, Zavialov A,  Li W, Stagg SM, Sengupta  J, Nielsen RC, Nissen P, Harvey SC, Ehrenberg M y 
Frank  J  (2003a)  Incorporation  of  aminoacyl‐tRNA  into  the  ribosome  as  seen  by  cryo‐electron 
microscopy. Nat Struct Biol 10: 899‐906. 

Valle M, Zavialov A, Sengupta J, Rawat U, Ehrenberg M y Frank J  (2003b) Locking and unlocking of 
ribosomal motions. Cell 114: 123‐134. 

Van Dyke N, XuWyMurgota EJ (2002) Limitation of ribosomal protein L11 availability  in vivo affects 
translation termination. J Mol Biol 319: 329–339. 

Vatzaki EH, Allen SC, Leonidas DD, Trautwein‐Fritz K, Stackhouse  J, Benner SA y Acharya KR  (1999) 
Crystal structure of a hybrid between ribonuclease A and bovine seminal ribonuclease – the basic 
surface, at 2.0 Å resolution. Eur J Biochem 260, 176‐182. 

Viegas A, Herrero‐Galán E, Oñaderra M, Macedo AL y Bruix M (2009) Solution structure of Hirsutellin 
A: new insights into the active center and interacting interfaces of ribotoxins. FEBS Journal, minor 
revisions. 

Walsh  TJ  y  Pizzo  A  (1988)  Treatment  of  systemic  fungal  infections:  recent  progress  and  current 
problems. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 7: 460–475. 

Ward ES, Gussow D, Griffiths AD,  Jones PT y Winter G  (1989) Binding activities of a  repertoire of 
single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341: 544–546. 

Wawrzynczak EJ, Henry RV, Cumber AJ, Parnell GD, Derbyshire EJ y Ulbrich N  (1991) Biochemical, 
cytotoxic and pharmacokinetic properties of an immunotoxin composed of a mouse monoclonal 
antibody Fib75 and the ribosome‐inactivating protein α‐sarcin from Aspergillus giganteus. Eur J 
Biochem 196: 203–209. 

Williams AP, Krishna MT y Frew AJ (2004) The safety of  immunotherapy. Clin. Exp. Allergy 34: 513‐
514. 



 
201Bibliografía 

Wirth J, Martínez del Pozo Á, Mancheño JM, Martínez‐Ruiz A, Lacadena J, Oñaderra M y Gavilanes JG 
(1997) Sequence determination and molecular  characterization of gigantin, a  cytotoxic protein 
produced by the mould Aspergillus giganteus IFO 5818. Arch Biochem Biophys 343: 188–193. 

Woo JH, Liu YY, Mathias A, Stavrou S, Wang Z, Thompson J y Neville DM Jr (2002) Gene optimization 
is necessary to express a bivalent anti‐human anti‐T cell immunotoxin in Pichia pastoris. Protein 
Expr Purif 25: 270–282. 

Woo  JH,  Liu  YY,  Stavrou  S  y  Neville  DM  Jr  (2004)  Increasing  secretion  of  a  bivalent  anti‐T‐cell 
immunotoxin by Pichia pastoris. Appl Environ Microbiol 70: 3370–3376. 

Woo JH, Liu YY y Neville DM Jr (2006) Minimization of aggregation of secreted bivalent anti‐human T 
cell immunotoxin in Pichia pastoris bioreactor culture by optimizing culture conditions for protein 
secretion. J Biotechnol 121: 75–85. 

Wool  IG  (1984) The mechanism of action of  the cytotoxic nuclease α‐sarcin and  its use  to analyse 
ribosome structure. Trends Biochem Sci 9: 14–17. 

Wool IG (1996) Extraribosomal functions of ribosomal proteins. Trends Biochem Sci 21: 164–165.  

Wool IG (1997) Structure and mechanism of action of cytotoxic ribonuclease α‐sarcin. Ribonucleases. 
Structures and Functions (D’Alessio G y Riordan JF, eds), pp. 131–162. Academic Press, New York. 

Wool  IG, Glück A y Endo Y  (1992) Ribotoxin  recognition of  ribosomal RNA and a proposal  for  the 
mechanism of translocation. Trends Biochem Sci 17: 266–269. 

Wörn A y Plückthun A (2001) Stability engineering of antibody single‐chain Fv fragments. J Mol Biol 
305: 989–1010. 

Xu H, He WJ y Liu WY (2004) A novel ribotoxin with ribonuclease activity that specifically cleaves a 
single phosphodiester bond  in  rat 28S  ribosomal RNA and  inactivates  ribosome. Arch Biochem 
Biophys 427: 30–40. 

Yang R y Kenealy WR  (1992a) Effects of amino‐terminal extensions and  specific mutations on  the 
activity of restrictocin. J Biol Chem 267: 16801–16805. 

Yang R y Kenealy WR  (1992b) Regulation of  restrictocin production  in Aspergillus  restrictus.  J Gen 
Microbiol 138: 1421–1427. 

Yang X yMoffat K  (1996)  Insights  into specificity of cleavage and mechanism of cell entry  from the 
crystal structure of the highly specific Aspergillus ribotoxin, restrictocin. Structure 4: 837–852. 

Yang  X,  Gerczei  T,  Glover  LT  y  Correll  CC  (2001)  Crystal  structures  of  restrictocin  –  inhibitor 
complexes with implications for RNA recognition and base flipping. Nat Struct Biol 8: 968–973. 

Yasuda  T  y  Inoue  Y  (1982)  Studies  of  catalysis  by  ribonuclease  U2.  Steady‐state  kinetics  for 
transphosphorylation of oligonucleotide and synthetic substrates. Biochemistry 21: 364–369. 

Yoshida H (2001) The ribonuclease T1 family. Methods Enzymol 341: 28–41. 



 
202  Bibliografía 

Zachowski  A  (1993)  Phospholipids  in  animal  eukaryotic  membranes:  transverse  asymmetry  and 
movement. Biochem J. 294: 1–14. 

 


	ÍNDICE
	ABREVIATURAS
	Introducción
	Ribotoxinas: análisis molecular de una familia de ribonucleasas fúngicas
	Resumen
	Introducción
	Características estructurales
	Paso a través de membranas
	Propiedades enzimáticas
	Interacción con el SRL y el ribosoma
	Actividad de las ribotoxinas frente a células intactas
	Las ribotoxinas como alérgenos
	Inmunotoxinas
	Conclusiones y futuras perspectivas
	Fungal ribotoxins: molecular dissection of a family of natural killers


	Objetivos
	Resultados
	Resultados A RELACIONES ESTRUCTURA‐FUNCIÓN EN LAS RIBOTOXINAS
	A1. La tirosina 48, un residuo conservado de las ribotoxinas, está implicada en la degradación del RNA por parte de la α‐sarcina.
	A2. Papel del carácter básico de la horquilla β amino‐terminal de la α‐sarcina en el reconocimiento del ribosoma y en la interacción con fosfolípidos.
	A3. Influencia de algunos residuos clave en la producción extracelular heteróloga de la ribonucleasa U2 en la levadura Pichia pastoris.

	Resultados B IMPLICACIÓN BIOLÓGICA DE LA ACCIÓN DE LAS RIBOTOXINAS EN LA FUNCIONALIDAD DEL RIBOSOMA
	B1. La ruptura del lazo sarcina/ricina en el rRNA 23S inhibe la translocación dependiente de EF‐G.

	Resultados C POSIBLES APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS RIBOTOXINAS
	C1. Una variante de deleción del alérgeno Asp f 1 provoca una inflamación alérgica de las vías respiratorias atenuada en un modelo múrido de sensibilización.
	C2. Lactococcus lactis como vehículo para la expresión heteróloga de variantes de ribotoxinas fúngicas con afinidad reducida por IgE.


	Discusión
	FUNCIONALIDAD DE LAS RIBOTOXINAS
	Paso a través de membranas
	Reconocimiento del ribosoma
	Mecanismo catalítico. El centro activo de las ribotoxinas
	El patrón de puentes disulfuro de las ribotoxinas

	IMPLICACIÓN BIOLÓGICA DE LA ACCIÓN DE LAS RIBOTOXINAS EN LA FUNCIONALIDAD DEL RIBOSOMA
	POSIBLES APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS RIBOTOXINAS
	CONSIDERACIONES FINALES

	Conclusiones
	Bibliografía