UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I TESIS DOCTORAL Valor de los compuestos orgánicos volátiles en aire exhalado en el diagnóstico del cáncer de pulmón MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María de los Ángeles Muñoz de Lucas Directores Luis Callol Sánchez Javier Jareño Esteban Concepción Civera Tejuca Madrid, 2017 ©María de los Ángeles Muñoz de Lucas, 2015         UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID  FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS  DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR I        VALOR DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES EN AIRE EXHALADO EN EL  DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER DE PULMÓN      Memoria que para optar al Grado de Doctor presenta  María Ángeles Muñoz Lucas    Madrid 2015  D. Luis Callol Sánchez, Profesor Titular de Universidad del Departamento de Medicina y Especialidades Médicas de la Universidad de Alcalá, D. José Javier Jareño Esteban, Profesor Asociado de Medicina del Departamento de Medicina y Especialidades Médicas de la Universidad de Alcalá, Y Dª María Concepcion Civera Tejuca, Profesora Contratada Doctor del Departamento de Química Física II (Fisicoquímica Farmacéutica) de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid CERTIFICAN Que el trabajo titulado “VALOR DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES EN AIRE EXHALADO EN EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER DE PULMÓN” realizado bajo nuestra dirección por Dª Mª Ángeles Muñoz Lucas, reúne los requisitos necesarios de interés científico y rigor metodológico para ser presentado y defendido para optar al grado de Doctora. Y para que conste a los efectos oportunos, firmamos la presente en Madrid, a 5 de Agosto de 2015. Fdo. Prof. Luis Callol Sánchez   Fdo. Prof. Javier Jareño Esteban Fdo. Prof. Concepción Civera Tejuca   1                                                                                  Esta Tesis se realizó con un Proyecto FIS: PI07/1116, y ayudas a la investigación por las  Sociedades  Científicas: Neumomadrid  y  Sociedad  Española  de Neumología  y  Cirugía  Torácica (SEPAR).      2              3                      T Å| ytÅ|Ä|t? ctwÜxá? {xÜÅtÇtá ç Å|á ÂÇ|©SáÊ         4        AGRADECIMIENTOS Agradecimientos  7    AGRADECIMIENTOS    Es difícil expresar en pocas líneas el agradecimiento que siento hacia todas las  personas que de una manera u otra han colaborado para  la  realización de esta  tesis  doctoral. He  de  destacar  que  este  trabajo  es  el  fruto  del  esfuerzo,  perseverancia  y  apoyo de muchas personas que lo han hecho posible.   En primer  lugar, mi más sincero agradecimiento al Profesor Luis Callol por su apoyo,  por  sus  enseñanzas,  su  compromiso,  por  transmitir  sus  ganas  de  mejorar  en  la  investigación, por su confianza en mí, y por inculcarnos su “Fe ciega en la victoria”.  Al Dr.  Javier  Jareño, eres un ejemplo de  trabajo y compromiso.  Javier, gracias por  tu  amistad, dedicación y constante ayuda.   A  la  Profesora  Concepción  Civera  Tejuca,  por  su  paciencia,  su  buen  hacer,  sus  enseñanzas y todo el apoyo que siempre me has prestado.  A “Maldi”, por todo su apoyo mostrado desde un inicio y sus sabios consejos.   A Manuel Caamaño por su amistad, colaboración y ayuda.   Al  grupo  de  investigación  en  diagnóstico  precoz  de  cáncer  de  pulmón. Gracias  por  vuestra colaboración. Este trabajo es fruto del buen hacer de todos vosotros.   Agradecer especialmente a Regina y a Javier, vuestra ayuda y apoyo, sobre todo en los  momentos más críticos del estudio. Mil gracias.    Agradecimientos  8      A “Uni‐Químicas” y a “hola”, por todos esos buenos ratos que pasamos y que siempre  nos  sacan  una  sonrisa.  Por  ese  apoyo  continuo  y  esa  forma  de  tan  particular  de  animarme para la finalización de la tesis.   A todas mis amigas y amigos. Gracias por estar ahí.   Y el más sincero de los agradecimientos para todos los participantes que han formado  parte de este estudio, por su colaboración desinteresada. Un millón de gracias.                                                      ÍNDICE Índice  11  ÍNDICE  Abreviaturas  ____________________________________________________________________ 15  Summary  _______________________________________________________________________  19  Resumen  _______________________________________________________________________ 27  1. Introducción __________________________________________________________________ 35 1.1.  Etiología del cáncer de pulmón ____________________________________________ 37  1.2.  Diagnóstico  ___________________________________________________________ 38  1.3.  Alteraciones genéticas en el cáncer de pulmón _______________________________ 40  1.4.  Clasificación histológica del cáncer de pulmón y clasificación TNM _______________ 41  1.5.  Diagnóstico precoz del cáncer de pulmón ___________________________________ 44  1.6.  Metabólomica, metabonómica: biomarcadores  ______________________________ 52  1.7.  Estrés oxidativo. Radicales libres. Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno  _______ 57  1.8.  Estrés oxidativo y cáncer _________________________________________________ 59  1.9.  Mecanismos de neutralización de ROS por el citocromo P450 ___________________ 64  1.10. Radicales libre y daño tisular _______________________________________________ 65  1.11. Análisis del aire exhalado. Determinación de compuestos orgánicos volátiles (VOC) ___ 71  1.11.1. Estudios de VOC en EPOC ______________________________________________ 85  2. Hipótesis  _____________________________________________________________________ 93 3. Objetivos _____________________________________________________________________ 97 4. Materiales y métodos __________________________________________________________ 101 4.1. Materiales ______________________________________________________________ 101  4.2. Métodos _______________________________________________________________ 103  4.2.1. Diseño del estudio y definición de los grupos ______________________________ 103  4.2.2. Toma de la muestra __________________________________________________ 105  4.2.3. Selección de compuestos a estudiar _____________________________________ 106  4.2.4. Técnica analítica _____________________________________________________ 108  4.2.5. Análisis estadístico ___________________________________________________ 118  5. Resultados ___________________________________________________________________ 123 5.1. Validación del método analítico _____________________________________________ 123  5.1.7. Estabilidad de muestra ________________________________________________ 130  5.2. Análisis demográfico ______________________________________________________ 132  5.3. Categorización según la determinación de los VOC ______________________________ 136  5.3.1. Estudio del grupo control ______________________________________________ 137  Índice  12  5.3.2. Estudio del grupo EPOC _______________________________________________ 142  5.3.3. Estudio del grupo cáncer de pulmón _____________________________________ 146  5.3.4. Sensibilidad y especificidad del ácido nonanoico y ácido propanoico en cáncer de  pulmón _________________________________________________________________ 158  6. Discusión ____________________________________________________________________ 165 6.1. Metodología analítica _____________________________________________________ 165  6.1.1. Recogida de la muestra  _______________________________________________ 165  6.1.2. Almacenaje de la muestra _____________________________________________ 167  6.1.3. Técnicas analíticas  ___________________________________________________ 169  6.2. Desarrollo del método analítico _____________________________________________ 170  6.2.1. Obtención de la muestra. El problema del agua en el aire alveolar _____________ 170  6.2.2. Selección de compuestos ______________________________________________ 171  6.3. Estudio de los VOC en el grupo control _______________________________________ 174  6.4. Comparación del grupo EPOC frente al grupo control  ___________________________ 176  6.5. Comparación del grupo de cáncer de pulmón frente al resto de los grupos  __________ 178  6.6. Comparación de subgrupos de cáncer de pulmón con EPOC y sin EPOC _____________ 180  7. Conclusiones  _________________________________________________________________ 185 8. Anexos ______________________________________________________________________ 190 9. Bibliografía ___________________________________________________________________ 195 ABREVIATURAS Abreviaturas  15    ABREVIATURAS  ABC   Área bajo la curva  ADN   Ácido desoxirribonucleico  AMDIS  Automated Mass spectral Deconvolution and Identification System  CP   Cáncer de pulmón  CYP   Citocromo P450 (siglas en inglés)  DRS   Deconvolution Report Software   DPCP   Diagnóstico Precoz de Cáncer de Pulmón  EBUS   Ecobroncoscopia  EF   Ex fumador  ELCAP   Early Lung Cancer Action Project.  EPOC   Enfermedad pulmonar obstructiva crónica  F   Fumador  GC    Cromatografía de gases (siglas en inglés)  GOLD   Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease  HPLC  Cromatografía de líquidos de alta eficacia (siglas en inglés)  ICP   Carcinoma de pulmón microcítico  IPA    Índice tabáquico acumulado  LOD   Límite de detección  LOH    Pérdida de heterocigosidad (siglas en inglés)  LOQ   Límite de cuantificación  MS   Espectrometría de masas  NICP   Carcinoma de pulmón no microcítico  NF   No fumador  NPS   Nódulo pulmonar solitario   OMS   Organización mundial de la salud  PAFF   Punción‐aspiración con aguja fina  Abreviaturas  16    ppm   Partes por millón (µg/mL)  PET   Tomografía por emisión de positrones  Rédox   Reducción‐oxidación  RL   Radicales libres   RMN   Resonancia magnética nuclear  RX   Radiografía de tórax   SPME   Microextracción en fase sólida (siglas en inglés ‐ Solid‐phase microextraction)  TC   Tomografía computerizada  TIC  Cromatograma (Total ion chromatogram)  TCBR   TC de baja radiación   TD   Desorción térmica  TIC   Total Ion Chromatogram ‐ Cromatograma  TNM   Sistema de estadificación de cáncer de pulmón basado en características del tumor  (T), adenopatías tumorales (N), y metástasis (M)  RLO   Radicales libres de oxígeno  ROS  Especies reactivas de oxígeno (siglas en inglés)  RNS  Especies reactivas de nitrógeno        SUMMARY Summary  19    SUMMARY  BACKGROUND  Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer death in men and the third in women.  Less  than 20% of cases are diagnosed  in early stages, with a 5‐year survival  rate of 15%.  However, with a diagnosis at an early stage, survival might be as high 80%.  As  shown by  these numbers,  it  is of  an utmost  importance  to develop  screening  methods  for  high‐risk  population.  In  2012  it  was  shown  that  an  early  diagnosis  of  LC  through low‐radiation CT compared to conventional radiology decreased mortality by 20%.  In order to  increase profit and diminish risk and reduce costs, patients should meet strict  inclusion criteria. Biomarkers might be a helpful tool.  The analysis of the exhaled breath is of special interest. It is a noninvasive technique  that analyzes patients’ breath samples and aims to discriminate between subjects with and  without LC.  It has been observed  that exhaled breath  compounds differ  in patients with  and  without  LC.  Although  these  results  are  very  encouraging,  the  lack  of  standardization  regarding  sample  collection,  the  use  of  supplies,  technical  and  analytical method,  and  compounds with greater discriminatory power, make it difficult to compare results.  HYPOTHESIS  "As a result of neoplastic disease, there might be specific VOC to patients with LC".  AIMS  1) To determine whether there are significant differences between volatile organic  compounds  (VOCs) of exhaled breath samples of patients with LC, and samples obtained  Summary  20    from patients with COPD and control groups.  2) To determine  the effect of  smoking on VOCs of exhaled breath of presumably  healthy subjects.  3)  To  determine  whether  there  are  differences  in  exhaled  VOC  in  patients  diagnosed with COPD and presumably healthy volunteers.  MATERIAL AND METHODS  Case‐control  study with non probabilistic  consecutive  sampling. We  included 210  subjects  from  the Hospital Central de  la Defensa  "Gómez Ulla", Cuartel General del Aire  and Hospital Clínico San Carlos between October 2010 and December 2011. Subjects were  divided  into 3 groups:  control group  (n = 89 healthy  subjects); COPD group: 40 patients  with stable COPD; LC group : 81 patients with histological diagnosis of LC.  Inclusion  criteria:  Informed  consent,  40years older, no  limitation  as  to  gender or  smoking habit.  Exclusion criteria (no tumor groups): Current or previous malignant disease of any  kind, and pulmonary disease other than COPD. Refusal to participate in the study.  We obtained samples of exhaled breath from each subject and the room’s ambient  air the patient hat stayed in by means of BioVOC® sample tubes. The collected air was then  transferred to a thermal desorption tube.  The analyzed compounds were hexanal, heptanal, octanal, nonanal, nonanoic acid  and propionic acid.  Samples  were  analyzed  by  thermal  desorption‐gas  chromatography‐mass  spectrometry.    Summary  21    Statistical analysis:   Index of central tendency for VOC: median and interquartile range.   Kruskal Wallis and Mann Whitney test. Qualitative study: Odds Ratio test based on  logistic regression.   Linear correlation of quantitative variables: Spearman test.   Diagnostic test: positive predictive value, negative predictive value, sensitivity and  specificity.   Statistically significant association: p <0.05.   Statistical program SPSS v.15.  RESULTS  Control group  We  observed  statistically  significant  differences  between  values  of  nonanal  in  healthy subjects with a smoking history (either current or former smoker) as compared to  healthy nonsmokers  (p = 0.019).  This  finding  is  related  to  the patients’  smoking history,  either current o an ex‐smoker.  It  is  independent of gender (male: r = 0.05, p = 0.753 and  female: r= 0.081, p = 0.588) and the amount of consumed tobacco (p = 0.823).  COPD and Control groups  We observed no statistically significant differences between VOCs of the COPD and  control groups in both quantitative and qualitative analyses.  Lung cancer, COPD and Control groups  Nonanoic acid values were the only showing statistical significance as we compared  the LC to the Control (p = 0.011) and COPD groups (p = 0.001). The probability of finding  Summary  22    this VOC was three 3 times higher in patients with LC (p = 0.001) as compared to subjects  without  LC  (COPD  and Control  groups).  The  observed  sensitivity was  32%,the  specificity  was 87.6%,the positive predictive value (PPV) 62% and the negative predictive value (NPV)  was 67%.  Lung Cancer group: With and without COPD  We observed  statistically  significant differences of propionic acid values between  groups with an OR of 4.71 and p = 0.003.  Interestingly,  in 85% of non‐COPD  ‐ LC patients  we  failed  to  determine  any  levels  of  propionic  acid  in  exhaled  breath  samples.  Most  subjects  of  this  subgroup  were  non‐smokers  with  a  diagnosis  of  adenocarcinoma.  The  sensitivity was 66.7% and specificity 70.18%, with a PPV of 48.5% and NPV of 83%.  CONCLUSIONS  1. Nonanoic  acid might  discriminate  LC  from  and  other  groups,  and  in  this way  might be considered a tumor marker (specificity: 87%).  2. The absence of propionic acid might be associated with LC patients without COPD.  In the subgroup of non‐smokers with adenocarcinoma, the absence becomes 100%.  3.  Nonanal  values  were  higher  in  healthy  subject  with  smoking  history  (either  current or former smokers) as compared to the values in healthy non‐smokers. It relates to  the fact of being or having been a smoker. It is independent of gender and the amount of  consumed tobacco.  4. We found no single VOC that discriminated COPD from control groups.  5. We  developed  an  analytical method  for  determining  and  identifying  VOCs  in  exhaled breath. However it is no enough for proper reproducibility in carboxylic acids.  Summary  23    6.  A  standardization  of materials,  collection  and  analysis methods  employed  are  needed to allow the use of VOC as tumor markers in clinical practice.    24                                        RESUMEN Resumen  27    RESUMEN  INTRODUCCIÓN  En  la actualidad el cáncer de pulmón  (CP)  representa  la primera causa de muerte  por cáncer en el hombre y  la tercera en  la mujer. Menos de un 20% de  los casos que se  diagnostican  se  encuentran  en  estadios  tempranos,  con  una  supervivencia  a  5  años  del  15%. Sin embargo,  cuando el  tumor  se diagnostica en  fases  tempranas,  la  supervivencia  puede llegar a ser del 80%.  Con estos datos es necesario disponer de programas de cribado para una población  de  alto  riesgo.  En  2012  se  demostró  que  el  diagnóstico  precoz  con  tomografía  computerizada de baja radiación disminuía la mortalidad en un 20% con un seguimiento a  6.5 años frente a la radiología convencional.   Para aumentar  la  rentabilidad y disminuir  los  riesgos y costes, hay que establecer  criterios de  inclusión más acotados. El empleo de biomarcadores podría contribuir a este  fin.  El análisis del aire exhalado es de especial  interés. Es una metodología no  invasiva  que trata de establecer diferencias entre muestras de aire de población con y sin cáncer,  tras los efectos del estrés oxidativo.   Se ha visto que existen diferencias en  los compuestos exhalados en pacientes con  CP frente a personas sin CP. Aunque estos resultados son muy esperanzadores, la falta de  estandarización  en  cuanto  a  la  recogida  de  muestra,  consumibles,  técnica  y  método  analítico, y compuestos con mayor poder discriminatorio, hacen difícil  la comparación de  los resultados obtenidos.   Resumen  28    HIPÓTESIS  “Como  consecuencia  de  la  enfermedad  neoplásica,  podrían  existir  VOC  específicos  en  pacientes con CP frente a una población sin CP”.  OBJETIVOS  1)  Buscar  diferencias  significativas  de  los  VOC  en  aire  exhalado  en  una  población  con  cáncer de pulmón frente a grupos EPOC y control.   2) Determinar el efecto del hábito tabáquico sobre los VOC detectados en aire exhalado en  una población presuntamente sana.   3) Determinar si existen diferencias en los VOC exhalados en pacientes con diagnóstico de  EPOC frente a una población presuntamente sana.  PACIENTES Y MÉTODOS  Estudio  casos  control,  con muestreo  consecutivo  no  probabilístico.  Se  reclutaron  210 personas entre el Hospital Central de  la Defensa  "Gómez Ulla", Cuartel General del  Ejército del Aire y Hospital Clínico San Carlos, desde octubre de 2010 a diciembre de 2011.  Se dividieron en 3 grupos: grupo control: (n=89 personas sanas); grupo EPOC: 40 pacientes  con diagnóstico de EPOC en estabilidad clínica y seguimiento ambulatorio; y grupo CP: 81  pacientes con diagnóstico histológico de CP.   Criterios de  inclusión:  aceptación personal, mayor de 40  años,  sin  restricción por  género ni tabaquismo.   Criterios  de  exclusión  (grupos  no  tumorales):  Existencia  de  enfermedad  tumoral  actual o previa de cualquier aparato o sistema, y enfermedad pulmonar con excepción de  EPOC. La negativa a participar en el estudio.   Resumen  29    A los participantes se les tomó una muestra de aire exhalado mediante BioVOC®. A  continuación  se  recogió  una muestra  de  aire  ambiental  de  la  sala.  El  aire  recogido  se  traspasó a un tubo de desorción térmica.   Los  compuestos  estudiados  fueron  hexanal,  heptanal,  octanal,  nonanal,  ácido  propanoico y ácido nonanoico.   Las  muestras  fueron  analizadas  por  desorción  térmica‐cromatografía  de  gases‐ espectrometría de masas.   Variables:  Estadística  descriptiva:  Índice  de  tendencia  central  para  VOC:  mediana  y  rango  intercuartílico.  Estadística analítica: Test de Kruskal Wallis y de Mann Whitney. Estudio cualitativo:  Odds Ratio basado en la regresión logística.   Correlación lineal de las variables cuantitativas: test de Spearman.   Prueba diagnóstica: valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, sensibilidad  y especificidad.   Asociación estadísticamente significativa: valor de p<0,05.   El programa estadístico SPSS® v.15.  RESULTADOS   Estudio del grupo control   El  nonanal muestra  significación  estadística  entre  personas  sanas  con  historia  de  tabaquismo  (actual  o  previo)  frente  a  personas  sanas  no  fumadoras  (p=0.019).  Este  hallazgo se  relaciona con  la cualidad de ser o haber sido  fumador.   Es  independiente del  género  (hombres:  r=0,05,  p=0,753  y  en mujeres:  r=0,081,  p=0,588)  y  de  la  cantidad  de  Resumen  30    tabaco consumido (p=0.823).  Estudio del grupo EPOC frente a grupo control   No se han observado diferencias estadísticamente significativas en ninguno de  los  VOC entre los grupos de EPOC y control tanto en el estudio cuantitativo como cualitativo.  Estudio del grupo cáncer de pulmón frente a grupo control y grupo EPOC  El  ácido  nonanoico  es  el  único VOC  que muestra  significación  estadística  para  el  grupo CP frente a los grupos control (p=0.011) y EPOC (p=0.001). La probabilidad de hallar  este compuesto en personas con CP 3 veces mayor (p=0,001) que en personas sin CP (EPOC  y  Control).  La  sensibilidad  es  del  32%  y  la  especificidad  del  87.6%,  con  valor  predictivo  positivo (VPP) del 62% y valor predictivo negativo (VPN) del 67%.  Grupo cáncer de pulmón: con EPOC vs sin EPOC  El ácido propanoico muestra diferencias significativas con una OR de 4.71  y p=0.003.  No se ha detectado ácido propanoico en el 85% de los casos del subgrupo CP sin EPOC. La  mayor parte de este subgrupo corresponde a pacientes no fumadores con adenocarcinoma.  La sensibilidad es del 66.7% y la especificidad del 70,18%, con un VPP de 48,5% y un VPN de  83%.   CONCLUSIONES  1. El  ácido  nonanoico  discrimina  entre  el  grupo  CP  y  el  resto  de  grupos,  pudiendo  considerarlo marcador de cáncer, con una especificidad del 87%.  2. La ausencia de ácido propanoico se asocia al subgrupo de CP sin EPOC. En el subgrupo  de pacientes no fumadores y con histología de adenocarcinoma llega a ser del 100%.  Resumen  31    3. El  nonanal  muestra  significación  estadística  entre  personas  sanas  con  historia  de  tabaquismo (actual o previo) frente a personas sanas no fumadoras. Se relaciona con la  cualidad de ser o haber sido fumador. Es independiente del género y de la cantidad de  tabaco consumido.  4. No se ha encontrado ningún VOC que diferencie entre los grupos EPOC y Control.  5. Se ha puesto a punto un método analítico que permite determinar e identificar VOC en  aire  exhalado,  pudiendo  reprocesar  con  facilidad  en  busca  de  posibles  nuevos  marcadores.  No  obstante  es  insuficiente  para  la  correcta  reproducibilidad  en  la  determinación de ácidos carboxílicos.   6. Es necesario un acuerdo de consenso para normalizar  la recogida y procesamiento de  las muestras  de  aire  exhalado  que  permita  la  posible  aplicación  de  los  VOC  como  marcadores en la práctica clínica.    32      INTRODUCCIÓN Introducción  35    1. INTRODUCCIÓN  El cáncer de pulmón (CP) fue citado por primera vez como una curiosidad en 1422  por  Parecelso  (Bergkrankheit),  pero  no  fue  hasta  1879  cuando  Hesse  llevó  a  cabo  la  primera  descripción  de  esta  patología,  filiándola  de manera  incorrecta  como  sarcoma  pulmonar1. Sin embargo, desde principios del siglo XX, la incidencia ha ido en aumento de  manera  alarmante  con  el  consumo  de  tabaco.  Tanto  es  así,  que  el  cáncer  primario  de  pulmón ha pasado de ser una patología prácticamente desconocida a principios del siglo  XX  a  ser  actualmente  un  problema  de  salud  pública.  Representa  el  12%  de  todos  los  cánceres,  su  mortalidad  es  la  más  elevada  de  todos  los  cánceres  y  además  se  ha  convertido en la segunda causa de muerte por cáncer en el hombre y la cuarta en la mujer  (tabla 1), según los dato publicados en el informe de GLOBOCAN‐20122, para las cifras del  cáncer en España en 2014 (figura 1) la primera causa de muerte por cáncer en el hombre y  la tercera en la mujer, después del cáncer de mama y de colon.     Tabla 1. Localizaciones más frecuentes del cáncer en España, según el nº de casos. Datos de 2012    Hombre  Mujer 1ª  Próstata  Mama 2ª  Pulmón  Colorrectal  3ª  Colorrectal  Cuerpo de Útero  4ª  Vejiga  Pulmón 5ª  Estómago  Ovario       Fuente: Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D, Bray,  F. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC. (2)   Introducción  36      Figura 1.  Incidencia y mortalidad del CP en hombre y mujeres de  todas  las edades en España en  2012.Proporciones por 100.000 habitantes. Fuente: Ferlay  J, Soerjomataram  I, Ervik M, Dikshit R,  Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D, Bray, F. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence  and Mortality Worldwide: IARC2.    En España, según datos publicados por el Centro Nacional de Epidemiología, en el  año 2012, fallecieron por esta causa 21.476 personas (17.654 hombres y 3.822 mujeres),  observándose  un  incremento,  en  el  número  de  defunciones  por  cáncer  de  pulmón  en  mujeres,  respecto  al  año  2006,  atribuible  al  incremento  del  consumo  de  tabaco  en  mujeres3.  La  distribución  por  estirpes  histológicas  es  muy  variable  y  va  a  depender  de  muchos  factores externos como el  tabaco, exposición  laboral, exposición a otro  tipo de  carcinógenos o bien de  factores biológicos  como  el  género.  Las  estirpes más  ligadas  al  consumo de tabaco son los tipos epidermoide y microcítico, mientras el adenocarcinoma,  que predomina más  frecuentemente entre  las mujeres, tiene una relación menor con el  mismo4. Durante las últimas décadas se han producido cambios en la incidencia en el sexo  Incidencia Mortalidad 0,00% 5,00% 10,00% 15,00% 20,00% 25,00% 30,00% Hombres Mujeres Global 16,90% 5,70% 12,40% 27,40% 9,40% 20,60% Incidencia Mortalidad Introducción  37    femenino  y  en  la  epidemiología,  con  una  tendencia  universal  al  incremento  de  la  proporción de adenocarcinomas y a la disminución de epidermoides, porcentaje que varía  según  los  países5. Últimos  estudios  apuntan  a  que  el CP  en  las mujeres  presenta  unas  características  biológicas  diferentes  que  en  los  hombres,  siendo más  vulnerables  a  los  efectos del tabaco. Además, los estrógenos parecen afectar de forma directa o indirecta al  crecimiento tumoral6,7, 8.  1.1. Etiología del cáncer de pulmón  La etiología del CP, como cualquier otra neoplasia, es multifactorial. Sin embargo,  la componente genética es muy escasa frente al papel que desempeñan  los compuestos  carcinógenos presentes en el humo del tabaco.   Se ha demostrado que existe una relación entre la cantidad de tabaco consumido y  el  riesgo  de  desarrollar  un  tumor  pulmonar. De  tal modo  que  a mayor  consumo, más  duración,  y edad más  temprana de  inicio del  tabaquismo, existe mayor  riesgo para CP.  Tomando  como  referencia a población no  fumadora, el  riesgo de CP aumenta de 2 a 8  veces en fumadores de 15 cigarrillos al día y de 16 a 25 veces más cuando el consumo es  superior a 30 cigarrillos al día.   También se ha establecido relación entre CP y tabaquismo pasivo. La combustión  del tabaco genera humo con 2 corrientes diferentes: corriente principal (la que se forma  por medio  de  la  aspiración  del  fumador)  y  la  corriente  secundaria  que  se  produce  al  consumirse  el  cigarrillo,  y  que  puede  ser  inhalada  por  los  fumadores  pasivos9.  Esta  corriente secundaria contiene mayor cantidad de radicales libres (RL)10 y gran cantidad de  Introducción  38    sustancias  cuya  toxicidad  es  tan  importante  como  las  de  la  corriente  principal,  lo  que  podría explicar patologías que aparecen en  fumadores pasivos,  tales  como enfermedad  pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma bronquial, enfermedades cardiovasculares, CP  en adultos no fumadores, y otras neoplasias11.  No obstante, sólo entre un 10% a un 15% de los fumadores acaban desarrollando  un CP.  Este hecho  y que personas no  fumadoras  también  lo desarrollen,  sugiere  cierta  susceptibilidad genética.  1.2. Diagnóstico  Actualmente, menos  del  20%  de  los  CP  que  se  diagnostican  se  encuentran  en  estadio  I,  limitando  las posibilidades de curación. La mortalidad a 5 años supera el 80%,  debido en gran parte a un diagnóstico  tardío con presencia de metástasis,  recidiva  tras  cirugía o la escasa eficacia mostrada frecuentemente por la quimioterapia12.  El pronóstico de  la enfermedad no ha variado sustancialmente, aunque sí parece  apreciarse un incremento de la supervivencia en los últimos años gracias al desarrollo de  nuevos  fármacos  y  una  ligera  disminución  de  la  mortalidad  probablemente  por  la  disminución en el consumo de tabaco, según se muestra en el informe del National Cancer  Institute de 201313.  A  día  de  hoy,  el  diagnóstico  se  realiza mediante  técnicas  de  imagen  (radiología  convencional de tórax (RX), tomografía computerizada (TC), resonancia magnética nuclear  (RMN),  tomografía  por  emisión  de  positrones  (PET),  ecografía  transtorácica)  y  por  Introducción  39    métodos de diagnóstico histológico (citología de esputo, broncoscopia, punción‐aspiración  con  aguja  fina  (PAFF)  y  ecobroncoscopia  (EBUS),  mediastinoscopia,  pleuroscopia  y  toracotomía). Generalmente estos métodos se activan cuando ya existe sintomatología, lo  que habitualmente tiene lugar cuando la enfermedad se encuentra en fase avanzada.  Los  resultados obtenidos en  cuanto a  supervivencia  son desalentadores,  con un  índice de mortalidad elevadísimo y que apenas se han podido mejorar en décadas (figura  2). Únicamente  entre un 1%  y 10% de  los pacientes diagnosticados  sobreviven  a  los 5  años,  siendo  la  resección quirúrgica el principal  tratamiento  curativo de  la enfermedad  cuando todavía está localizada, llegando a ofrecer la posibilidad de curación entre el 60%  y 80% de los casos14,15, 16.    Figura 2.Tasa de mortalidad de cáncer en España por  100.000 habitantes. Tomado de España y  la UE: una  comparativa  sobre  la mortalidad  por  cáncer.  Cifras  INE.  Boletín  informativo  del  Instituto  Nacional  de  Estadística. 2012        Introducción  40    1.3. Alteraciones genéticas en el cáncer de pulmón  En el CP  se han descrito multitud de alteraciones genéticas. La mayoría de ellas  son anormalidades moleculares acumuladas a lo largo de varios años tras la exposición al  humo del tabaco y que persisten durante mucho tiempo después del abandono del hábito  de fumar17.  De  forma  general,  existen  2  grandes  grupos  de  genes  implicados  en  la  carcinogénesis pulmonar:   1. Proto‐oncogenes (cuya función biológica es la activación del crecimiento y división  celular).  Genéticamente  son  dominantes,  por  lo  que  cualquier mutación  en  un  alelo  conlleva  el  desarrollo  de  la  alteración  provocando  una  sobreexpresión  de  proteína codificante.  2. Genes  supresores  de  tumores  (inhiben  el  crecimiento  y  división  celular).  Genéticamente son recesivos, por lo que hace falta la alteración de los dos alelos  para desarrollar su disfunción. La pérdida de heterocigosidad (LOH) es un ejemplo,  donde la pérdida de función se llega mediante una mutación puntual en un alelo y  pérdida de secuencia en el otro.  Se han descrito varias LOH en genes supresores de tumores de pulmón como son  en  el  p53,  p16,  PTEN,  RB,  SMAD2  y  SMAD4,  FHIT.  De  ellos  el más  importante  es  la  mutación del p53 presente en 80‐100% de los casos en carcinoma microcítico de pulmón  (ICP) y entre un 50‐80% de  los no microcíticos  (NICP)18,19. Sanz‐Ortega et al.20 describen  Introducción  41    una alta incidencia de LOH en varios genes supresores de tumores en células tumorales y  peritumorales aparentemente sanas. Tseng et al.21 describen varias zonas microsatélites  donde las LOH están relacionadas con un peor pronóstico del CP.  Otra alteración molecular descrita en el CP es  la  inestabilidad microsatélite que  provoca  múltiples  errores  en  la  replicación  del  ADN  bien  por  mutaciones,  bien  por  silenciamiento de genes reparadores del ADN (MLH1, MLH2, PMSL1, PMSL2 y MSH6). Esta  falta de reparación favorece la carcinogénesis22.   La hipermetilación dela región promotora silencia genes supresores23, la actividad  de  la  telomerasa,  que  se  asocia  a  la  proliferación  celular  y  estadio  avanzado  de  la  enfermedad, se ha descrito en un 80‐85% de los NICP y en un 100% de los ICP. Éstas son  otras de las alteraciones frecuentes en el CP.  En  pacientes  con NICP  se han  descrito mutaciones  somáticas  del  gen  EGFR  que  responden a tratamientos con inhibidores de tirosina‐quinasa24. Además de esta mutación,  reordenamientos  entre  los  genes  EML4‐ALK  también  se  han  descrito  en  pacientes  no  fumadores con NICP, lo que permite identificar otro grupo de pacientes que se benefician  de una nueva  terapéutica  como  crizotinib,  inhibidores de ALK 25, 26,27. Estas mutaciones,  fácilmente identificables, se encuentran en un 15 % de todos los NICP descritos en algunas  poblaciones asiáticas.   1.4. Clasificación histológica del cáncer de pulmón y clasificación TNM  En la tabla 2 queda recogida la clasificación histológica para tumores pulmonares,  malignos y benignos.   Introducción  42    Tabla 2 Clasificación histológica de tumores pulmonares. La numeración corresponde al comportamiento biológico se codifica en: /3 para  los tumores malignos; /2 para las neoplasias in situ; /1 para el comportamiento indeterminado o borderline; /0 para los tumores benignos.  Tomado de Travis et al , 2004. 28  TUMORES EPITELIALES MALIGNOS  Tumores mesenquimales   Hemangioendotelioma epitelioide  9133/1 Carcinoma de células escamosas  8070/3 Angiosarcoma 9120/3 Carcinoma escamoso papilar  8052/3 Blastoma pleuropulmonar 8973/3 Carcinoma escamoso células claras  8084/3 Condroma 9220/0 Carcinoma escamoso células pequeñas 8073/3 Tumor miofibroblástico peribronquial congénito  8827/1 Carcinoma escamoso basaloide  8083/3 Linfangiomatosis pulmonar difusa    Tumor miofibroblástico inflamatorio  8825/1 Carcinoma de células pequeñas  8041/3 Linfangioleiomiomatosis 9174/1 Combinado de células pequeñas  8045/3 Sarcoma sinovial 9040/3   Monofásico 9041/3 Adenocarcinoma  8140/3 Bifásico 9043/3 Adenocarcinoma subtipo mixto  8255/3 Sarcoma de la arteria pulmonar  8800/3 Acinar  8550/3 Sarcoma de la vena pulmonar  8800/3 Papilar  8260/3 Bronquioloalveolar  8250/3 TUMORES EPITELIALES BENIGNOS  No mucinoso  8252/3 Mucinoso  8253/3 Papilomas Indeterminado  8254/3 Papiloma de células escamosas  8052/0 Adenocarcinoma sólido con producción de mucina  8230/3 Exofítico 8052/0 Adenocarcinoma fetal  8333/3 Invertido 8053/0 Carcinoma mucinoso o coloide  8480/3 Papiloma glandular 8260/0 Cistoadenocarcinoma mucinoso  8470/3 Papiloma mixto escamoso y glandular   8560/0 Adenocarcinoma células en anillo de sello   8490/3 Adenocarcinoma de células claras 8310/3 Adenomas   Adenoma alveolar 8251/0 Carcinoma de células grandes  8012/3 Adenoma papilar 8260/0 Carcinoma neuroendocrino de células grandes   8013/3 Adenomas de tipo glándula salivar  Carcinoma neuroendocrino combinado de células grandes  8013/3 Adenoma mucoglandular  8140/0 Carcinoma basaloide  8123/3 Adenoma pleomórfico 8940/0 Carcinoma tipo ‐ linfoepitelioma  8082/3 Otros Carcinoma de células claras   8310/3 Cistoadenomamucinoso 8470/0 Carcinoma de células grandes con fenotipo rabdoide  8014/3   TUMORES LINFOPROLIFERATIVOS  Carcinoma adenoescamoso  8560/3   Linfoma de células B de la zona marginal de tipo MALT* 9699/3 Carcinoma sarcomatoide  8033/3 Linfoma difuso B de células grandes  9680/3 Carcinoma pleomórfico  8022/3 Granulomatosis linfomatoidea  9766/1 Carcinoma de células fusiformes  8032/3 Histiocitosis de células de Langerhans  9751/1 Carcinoma de células gigantes  8031/3 Carcinosarcoma  8980/3 MISCELÁNEA Blastoma pulmonar  8972/3   Hamartoma Tumor carcinoide  8240/3 Hemangiomaesclerosante 8832/0 Carcinoide típico  8240/3 Tumor de células claras 8005/0 Carcinoide atípico  8249/3 Tumor de células germinales   Teratoma maduro 9080/0 Tumores tipo glándulas salivares  Teratomainmaduro 9080/3 Carcinoma mucoepidermoide  8430/3 Otros tumores germinales  Carcinoide quístico  8200/3 Timoma intrapulmonar 8580/1 Carcinoma epitelial‐mioepitelial  8562/3 Melanoma 8720/3   Lesiones preinvasivas  TUMORES METASTÁSICOS Carcinoma escamoso in situ  8070/2 Hiperplasia adenomatosa atípica  Hiperplasia pulmonar difusa idiopática de células neuroendocrinas *MALT:Mucosa associated lymphoid tissue.   Introducción  43    Tamaño del tumor primario (T):  T0 ‐ No hay signos de un tumor primario.  TX ‐ Cáncer oculto, demostrado en la citología  del  lavado bronquial pero no  radiológicamente ni en  la  fibrobroncoscopia.  Las  secreciones  broncopulmonares  contienen  células  malignas  pero  no hay otros datos de  la existencia de un cáncer de  pulmón.  TIS ‐ Carcinoma in situ  T1 – Subdividido en :  T1a: tumor ≤ 2cm  T1b: tumor entre [2, 3) cm  Tumor rodeado por tejido pulmonar o pleural  visceral y sin invasión proximal al bronquio lobar en la  fibrobroncoscopia.  También  se  clasifican  en  T1  los  tumores  poco  frecuentes,  superficiales,  de  cualquier  tamaño,  con  invasión  limitada  a  la  pared  bronquial  que  se  extienden  proximalmente  al  bronquio  principal.  T2  ‐  Tumor  mayor  de  3  centímetros  de  dimensión mayor o  tumor de  cualquier  tamaño que  invade  la  pleura  visceral  o  con  atelectasia  o  neumonitis  obstructiva  que  se  extiende  a  la  región  hiliar.  En  la  broncoscopia,  la  extensión  proximal  del  tumor  puede  limitarse  al  bronquio  lobar  o  estar  al  menos  a  2  cm  de  la  carina.  La  atelectasia  o  la  neumonitis  obstructiva  no  deben  afectar  a  todo  un  pulmón.  T3  ‐  Tumor mayor  de  7cm,  o  de    cualquier  tamaño  con  extensión  directa  a  la  pared  costal  (incluidos  los  tumores  de  la  cisura  superior)  diafragma,  pleuramediastínica  o  pericardio,  sin  afectación  del  corazón,  grandes  vasos,  tráquea,  esófago, cuerpos vertebrales o un tumor del bronquio  principal a menos de 2 cm de la carina, sin infiltración  de  la misma. La atelectasia afecta a todo un pulmón.  Existe derrame pleural no maligno.  T4  ‐  Tumor  de  cualquier  tamaño  con  infiltración  del  mediastino  o  del  corazón,  grandes  vasos, tráquea, esófago, cuerpos vertebrales o carina  o  con  derrame  pleural  maligno.  Los  derrames  pleurales  no  hemáticos  ni  exudativos  y  con  varios  estudios  citológicos  negativos  no  se  clasifican  como  malignos con fines de determinación del estadio.  En la tabla 3 queda reflejada la clasificación TNM que actualmente está vigente.   Tabla 3.Séptima edición de clasificación TNM para cáncer de pulmón. 2009                                                      La  séptima  edición  de  la  clasificación  TNM  del  cáncer  de  pulmón  es  la  primera  que  se  basa  en  datos  realmente  internacionales  de  pacientes  tratados  de muy  diversa  manera;  donde  se  da  más  importancia  al  tamaño  tumoral,  reconcilia  la clasificación de  los tumores con nódulos adicionales con su pronóstico real y adapta  la clasificación de  la  diseminación pleural a su pronóstico. 29     Ganglios linfáticos regionales (N):  N0  ‐  Sin metástasis  demostrables  en  los  ganglios  linfáticos   N1  ‐  Metástasis  en  los  ganglios  linfáticos  peribronquiales  o  hiliaresipsolaterales,  o  ambos,  incluyendo la extensión directa del tumor.   N2  ‐  Metástasis  en  los  ganglios  mediastínicos  o  subcarínicosipsolaterales.   N3  ‐  Metástasis  en  los  ganglios  mediastínicos  o  hiliares  contralaterales,  escalénico  ipso  o  contralateral o supraclaviculares.   Metástasis a distancia (M):  M0 ‐ Sin metástasis a distancia conocidas.   M1a  M1b  ‐  Metástasis  a  distancia  presentes,  especificando  su  localización  por  ejemplo  en  cerebro.   Estadificación del cáncer de pulmón  Carcinoma oculto  TX   N0   M0   Estadio 0  TIS   Carcinoma in situ   Estadio I  IA  T1 N0 M0   IB  T2 N0 M0   Estadio II  IIA T1 N1 M0   IIB T2 N1 M0/T3 N0 M0   Estadio IIIa  T3 (ó T1 ó T2 con N2)   N0, N1 ó N2   M0   Estadio IIIb  Cualquier T   N3 ( ó cualquier N con T4)   M0   Estadio IV.   Cualquier T   Cualquier N   M1.   Introducción  44    1.5. Diagnóstico precoz del cáncer de pulmón  De la experiencia clínica acumulada, junto con los datos expuestos en los epígrafes  anteriores,  se  hace  necesaria  de  búsqueda  de  métodos  de  cribado  poblacional  que  ofrezcan  la posibilidad de un diagnóstico precoz o  temprano de  la enfermedad, y  cuyo  objetivo final sea disminuir la mortalidad.  Según la Real Academia Española, el diagnóstico es el “Arte o acto de conocer  la  naturaleza  de  una  enfermedad mediante  la  observación  de  sus  síntomas  y  signos”.  Cuando  se  refiere  a  “Diagnóstico  Precoz”,  lo  define  como  “relativo  a  las  etapas  tempranas de una enfermedad o proceso orgánico”30. Es decir, el diagnóstico precoz de  cáncer de pulmón es  llegar  a una detección de  la enfermedad en estadios  tempranos,  habitualmente antes de que los síntomas clínicos se manifiesten.   En  los  años  70  surgieron  los  primeros  intentos  de  cribado  con  la  radiografía  convencional de tórax y la citología de esputo31.   En 1991  se publican  los  resultados de  tres estudios  randomizados  a  gran escala  patrocinados por The National Cancer  Institute de EEUU  realizados en el  Johns Hopkins  Medical  Institutions, The Memorial Sloan–Kettering Cancer Center, y  la Clínica Mayo con  personas de elevado riesgo y de un cuarto estudio realizado en Checoslovaquia32 con una  metodología  semejante.  La  metodología  de  cribado  se  basó  en  la  aplicación  de  la  radiografía de tórax y la citología de esputo, centrando el estudio en personas fumadoras  asintomáticas  y  con  estado  psicofísico  aceptable  y  que  permitiera,  en  su  caso,  el  tratamiento  quirúrgico. A  los  grupos  de  estudio  de  Johns Hopkins Medical  y Memorial  Introducción  45    Sloan–Kettering Cancer Center se  les realizó una RX de  tórax anual más una citología de  esputo cada 4 meses, mientras que al grupo control se  les ofreció  la  realización de una  radiografía anual. En la Clínica Mayo, se realizó una RX de tórax y citología de esputo cada  4 meses a  los  incluidos en el grupo de estudio,  frente a un grupo  control en el que  se  realizaron  ambas  pruebas  al menos  una  vez  al  año.  Aun  cuando  las  características  del  grupo control en este estudio adolecen de falta de rigor, se demostró un aumento en  la  detección de CP en estadio precoz en personas asintomáticas con factores de riesgo por  tabaco,  resecables  en  la  práctica  totalidad  de  los  casos,  así  como  una  supervivencia  superior  en  el  grupo  de  estudio  frente  al  grupo  control.  La  citología  de  esputo  no  demostró  ninguna  ventaja  en  cuanto  a  la  disminución  de  la mortalidad.  A  pesar  de  la  esperanza suscitada, en ninguno de los cuatro estudios se pudo demostrar diferencia en la  mortalidad entre ambos grupos, estudio y control33.  A raíz de estos estudios se  llegó a la conclusión de que recomendaciones para  los  programas  de  detección  precoz  eran  ineficaces,  pues  aunque  si  aumentaba  la  supervivencia y se detectaban más tumores en estadios tempranos, al final no se reducía  la mortalidad, y además generaba falsos positivos lo que suponía la realización de pruebas  de diagnóstico  invasivas y tratamientos innecesarios. Estas conclusiones estaban basadas  en 3 sesgos difíciles de demostrar hasta el momento:    Sobrediagnóstico: consiste en el diagnóstico de  lesiones de  tamaño pequeño cuyo  crecimiento es muy  lento y que podrían permanecer asintomáticas durante toda  la  vida del paciente. Habrían pasado desapercibidas si no hubieran sido detectadas por  Introducción  46    el programa de cribado (figura 3)34,35.      Figura  3.  Sobrediagnóstico.  Detección  de  tumores  mediante  cribado  que  permanecerían asintomáticos hasta que haya muerte por otras causas. Modificado  de Black C et al. 200634.        Lead Time Bias:(adelanto de diagnóstico): Existe un aumento de la supervivencia  porque  el  diagnóstico  se  hace  precozmente  por  un  programa  de  cribado  (figura4). Explicaría que, en algunos casos en  los cuales el cáncer es motivo de  muerte  el  hecho  de  haberlo  diagnosticado  antes  aumentaría  el  “tiempo  de  supervivencia”, pero manteniendo invariable la mortalidad.    Figura 4. Lead time bias. Con el cribado, aumenta la supervivencia aunque no retrasa  la muerte. Modificado de black c et al. 200634.     Length  time  bias(duración  de  la  enfermedad):  En  el  diagnóstico  precoz  se  detectan  aquellos  casos  cuya  progresión  de  la  enfermedad  es  más  lenta  aumentando  así  la  supervivencia,  mientras  que  los  casos  más  agresivos  son  Introducción  47    menos  detectados,  y  la  supervivencia  se  ve  disminuida  (figura5),  sin  que  forzosamente tenga que influir en la mortalidad.    Figura 5.Length  time bias. El cribado detecta  los  tumores de progresión más  lenta  modificado de Black C et al. 200634.     Estos  estudios  fueron  revisados  posteriormente  por  presentar  serios  problemas  metodológicos. Cabe destacar  la  falta de un grupo CONTROL  riguroso, pues en  los  tres  casos  los  grupos  controles  se  asemejaban  bastante  a  los  grupos  de  estudio,  al  haber  aconsejado la realización de una RX de tórax y citología anual, siguiendo la práctica clínica  aceptada por las sociedades americanas de la época, y describiendo los hallazgos en este  grupo como diagnóstico basado en  los síntomas, cuando no siempre fue así. Además  los  estudios  se  restringieron  a  hombres,  no  teniendo  en  cuenta  que  en  las  mujeres  la  incidencia y mortalidad estaba aumentando ya considerablemente.  Dominioni et al.36 critican muy seriamente los sesgos anteriormente mencionados  como explicación de los hallazgos en  los programas de cribado. En su experiencia clínica,  la  tasa  de  supervivencia  a  5  años  de  los  pacientes  con NICP  detectados  en  estadio  I  y  resecados radicalmente, alcanza entre el 60% y 80 %, mientras que la supervivencia en los  Introducción  48    casos NICP en estadio  I  y no  sometidos  a  cirugía disminuye  al 10 %. En  todo  caso,  sus  hallazgos son muy llamativos.  En  1999,  es  decir,  27  años  después  de  la  puesta  en  marcha  de  los  primeros  programas  de  cribado  descritos  anteriormente,  Henschke  et  al.37 publicaron  su  primer  trabajo  en  diagnóstico  precoz  de  CP  aplicando  TC  de  baja  radiación  (TCBR)  dentro  del  programa  Early  Lung  Cancer  Action  Project  (ELCAP).  En  este  trabajo  se  evaluaban  las  personas  incluidas al  inicio  (línea basal) y anualmente. Se  incluyeron en el estudio 1000  voluntarios con alto riesgo de CP, asintomáticos, con buen estado  físico, mayores de 60  años con un consumo de tabaco mayor de 10 paquetes por año. Se les realizó una RX y un  TCBR inicialmente, y se siguió el protocolo establecido por ELCAP para el seguimiento del  nódulo  pulmonar  solitario  (NPS)  no  calcificado  (figura6)  repitiendo  las  exploraciones  anualmente,  en  el  caso  de  no  hallar  imágenes  sugestivas  o  dudosas  de  tumor.  Se  detectaron 233  (23%)   NPS no  calcificados mediante  TCBR  frente  a 68  (7%) por RX.  Se  biopsiaron  28  de  los  detectados  mediante  TCBR  y  de  ellos,  27  (2,7%)  resultaron  ser  malignos (el otro fue un nódulo benigno), frente a 7 (0,7%) detectados por RX. De los 27  tumores detectados, 26 fueron resecados. En tres casos dudosos se  llevó a cabo biopsia,  resultando ser todas negativas para malignidad. Se concluyó que el TCBR puede detectar  pequeños nódulos no calcificados, y por lo tanto detectar el CP en etapas potencialmente  más curables.   En 2001 Henschke et al.38 publican un trabajo de incidencia de CP con cribaje anual  con  TCBR.  Realizado  sobre  el  mismo  grupo  de  personas  incluidas  inicialmente,  se  eliminaron  los diagnosticados de cáncer en el corte de prevalencia y  los que  fallecieron  Introducción  49    por otras causas, no quisieron seguir, o se perdieron, quedando al  final un  total de 841  personas. Se diagnosticaron 7 tumores, 6 de ellos NICP y 1microcítico (ICP), 5 de ellos en  estadio pIA y 1 en estadio pIIIA.    Figura 6. Seguimiento del NPS. ELCAP    En  2002,  Swensen  SJ  et  al.39 realizan  un  estudio  de  prevalencia,  parecido  al  de  Henschke, sobre un total de 1520 personas fumadoras con un índice tabáquico acumulado  (IPA)  de más  de  20  y  de  edad  superior  a  50  años,  obtiene  unos  resultados  parecidos,  diagnosticando 25 CP, 12 de ellos en estadio pIA. Llama la atención que fueron operados 7  nódulos benignos  (falsos positivos), y el elevado porcentaje de adenocarcinomas que se  obtuvieron.  Se han realizado estudios similares en  los que cabe destacar  los de Nowa et al.40,  Introducción  50    Bastarrika et al.41, Callol et al.42 y ELCAP43, cuyos resultados y rentabilidad se recogen en la  tabla 4.   Tabla 4. Diferentes estudios de DPCP mediante TCBR   N  CP DETECTADOS ESTADIO IA RENTABILIDAD  HENSCHKE  1000  34 28 3.4%  SWENSEN  1520  23 12 1.5%  NOWA  7956  40 32 0.5%  BASTARRIKA  911  14 1.5%  CALLOL  466  5 5 1.1%  ELCAP  27456  376 300 1.4%    Según se muestra en el  Informe de Evaluación de Tecnologías Sanitarias ‐ avalia‐t  Núm.  2007/0644  de  2009,  para  el  cribado  del  CP,  estos  estudios  presentan  serias  limitaciones metodológicas.  Por  ejemplo,  el  no  tener  un  grupo  control,  un  período  de  seguimiento adecuado que permita conocer la verdadera efectividad del cribado de CP, ya  que en la mayoría de éstos el periodo de seguimiento es inferior a 5 años, o la utilización  de  diferentes  criterios  de  selección  para  población  de  riesgo  (rango  de  edad,  hábito  tabáquico,  etc.).  Además,  en  estos  estudios  se  refleja  que  no  existen  protocolos  establecidos  acerca  de  cómo manejar  los  nódulos  sospechosos  y  tampoco  valoran  las  repercusiones  sobre  la  seguridad  de  los  pacientes  de  los  sucesivos  cribados  con  TC  (sometiéndolos quizás a un exceso de radiación  innecesaria), ni tampoco hay un estudio  exhaustivo sobre coste – efectividad.     El  sobrediagnóstico  está  presente  en  muchos  trabajos.  El  número  de  falsos  positivos es superior en el TCBR que en  la radiografía de tórax, dado que es una técnica  Introducción  51    cuatro  veces más  sensible,  y  es mayor  aún  en  el  cribado  basal  que  en  las  sucesivas  repeticiones (5‐50 % vs. 3‐12 %, respectivamente)45. Este sesgo es muy difícil de eliminar  para el CP46.  Los estudios realizados hasta ese momento no alcanzaron evidencia suficiente para  su  recomendación  en  la  práctica  clínica.  A  este  respecto,  en  2009  la  American  Cancer  Society indica que el cribado debería ser realizado exclusivamente en aquellos casos en los  que personas con riesgo elevado lo deseasen47.  En 2012  se publican  los  resultados del estudio del National  Lung  Screening Trial  Research48 con un total de 53454 voluntarios divididos en dos grupos, de estudio y control,  a  los que  se  les  realizó un TCBR al grupo de estudio, y  sólo una  radiografía de  tórax al  grupo control, con un seguimiento de 6,5 años. Por primera vez sus resultados muestran  una reducción de la mortalidad en un 20% (p=0.004) entre el grupo sometido a técnica de  cribado con TCBR frente al grupo control.  Este estudio, fundamental en la valoración de las técnicas de imagen para cribado  de CP, ha servido de base para el desarrollo de una guía de práctica clínica basada en  la  evidencia  aceptada  por  varias  sociedades  científicas  americanas  de  prestigio  (American  Cancer  Society,  American  College  of  Chest  Physicians,  American  Society  of  Clinical  Oncology  y National Comprehensive  Cancer Network),  según  se  recoge  en  una  revisión  sistemática publicada en  JAMA49 en 2012. En ella,  se hace una  revisión de 591 artículos  publicados  en  inglés  acerca  del  diagnóstico  precoz  de  CP  con  TCBR,  seleccionando  8  ensayos  aleatorios  y  13  estudios  de  cohortes.  Se  evalúan  los  beneficios  y  riesgos  del  cribado con esta  técnica. Como conclusiones se extraen que  las personas de alto  riesgo  Introducción  52    para  desarrollar CP  se  verían  beneficiadas  aun  existiendo  riesgos  potenciales  como  los  falsos  positivos,  calidad  de  vida  para  los  falsos  positivos,  el  sobrediagnóstico,  complicaciones en los procedimientos en el diagnóstico y la dosis de radiación recibida.   Basado  en  los  resultados  del  National  Lung  Screening  Trial  Research48  y  recomendaciones de las sociedades científicas americanas, Pyenson et al.50 en un estudio  actuarial  publicado  en  2012  calculan  que  el  cribado  de  CP  en  población  de  riesgo  supondría un  incremento del  coste de $1/mes por asegurado. El  coste por año de vida  salvado sería inferior a $19.000, cantidad comparable con el cribado para el cáncer cérvix,  mama o colorrectal.  Por tanto, la única técnica aceptada en la actualidad como método de cribado de CP  para población de riesgo es el TCLR. Al efecto de aumentar su rentabilidad y disminuir los  riesgos y costes, es preciso  la búsqueda de nuevos parámetros que ayuden a establecer  criterios de inclusión más acotados. En este aspecto, el empleo de biomarcadores podría  contribuir a este fin.  1.6. Metabólomica, metabonómica: biomarcadores  La metabolómica  es  el  análisis  sistemático  y  completo  de  un  gran  número  de  compuestos  de  bajo  peso  molecular  (metabolitos)  a  partir  de  un  fluido  biológico.  El  metaboloma  es  el  conjunto  de  todos  los metabolitos  en  una  célula,  tejido,  órgano  u  organismo  que  son  producto  de  los  procesos  celulares.  Es  un  campo  emergente  de  la  investigación “ómicas” cuyo objetivo es  identificar y cuantificar todos  los metabolitos en  un sistema biológico para poder descubrir enfermedades, factores de riesgo y determinar  Introducción  53    biomarcadores.   La idea del diagnóstico a partir de los metabolitos se remonta al menos a la antigua  Grecia y a la Edad Media con el uso de tablas de orina para diagnosticar enfermedades51.  Sin embargo, el desarrollo de nuevas  técnicas analíticas GC‐MS, RMN y  la secuenciación  del genoma humano 52 hacen que resurja con fuerza como alternativa para el diagnóstico  precoz  de  enfermedades.  Esto  va  unido  al  avance  en  paralelo  de  las  herramientas  informáticas y de tratamiento estadístico necesario para manejarla complejidad de datos.  Dentro  del  estudio  de  los metabolitos  se  acuña  el  término metabonómica  para  definir " a  la medición cuantitativa de  la respuesta metabólica de naturaleza dinámica y  multiparamétrica  de  los  sistemas  vivos  ante  estímulos  patofisiológicos,  o  bien,  ante  la  modificación  genética".  El  origen  de  la  palabra  es  del  griego  μεταβολή  que  significa  cambio y ‐nomos que significa conjunto de reglas o leyes53. Este término fue iniciado por  Jeremy  Nicholson  en  el  Imperial  College  London  y  ha  sido  usado  en  toxicología,  diagnóstico  de  enfermedades  y  demás  campos.  Históricamente,  el  método  de  la  metabonómica fue uno de los primeros en aplicar la visión de la biología de sistemas para  los estudios del metabolismo54.  Podríamos decir que metabolómica y metabonómica son métodos de estudios de  perfiles metabólicos que ofrecen  la oportunidad de  identificar biomarcadores o patrones  de  cambios  de  biomarcadores  relacionados  con  la  una  enfermedad,  un  fármaco  o  cualquier agente externo en  las muestras de  fluidos biológicos,  tales como  la orina o  la  sangre, que puede recogerse con relativa facilidad.   Introducción  54    Si bien en  la metabolómica  tiene un mayor énfasis en el perfilado metabólico a  nivel celular o de órganos y su campo de  trabajo primario es el metabolismo endógeno  normal, en  la metabonómica  se  incluye  información acerca de  las perturbaciones en el  metabolismo causadas por factores ambientales (incluyendo dietas y toxinas), procesos de  enfermedad  y  contribuciones  por  influencias  de  tipo  extragenómico,  como  los  componentes  de  la  flora  intestinal.  Esto  no  es  una  diferencia  trivial;  los  estudios  metabolómicos  deberían,  por  definición,  excluir  las  contribuciones  de  fuentes  extragenómicas, ya que esas son externas en relación al sistema estudiado. Sin embargo,  en el campo de investigación de enfermedades humanas, se usan ambos términos, siendo  en ocasiones sinónimos.  El objetivo de  los estudios metabolómicos es  la  identificación de biomarcadores.  Un biomarcador o marcador biológico es aquella molécula que indica un estado biológico.  Debe  poder medirse  objetivamente  y  ser  evaluado  como  un  indicador  de  un  proceso  biológico normal, un estado patológico o como respuesta a un tratamiento con fármacos.  Las características que debe  reunir un biomarcador para poder  ser empleado en  métodos de cribado son:  ‐ Diferente expresión en células pre‐neoplásicas en relación a las normales  ‐ Estar presente en muestras obtenidas de forma mínimamente invasiva.  ‐ Ser un sistema bien establecido para cuantificar sus niveles.  ‐ Ser estable en el tiempo y con el procesamiento de las muestras.  ‐ Ser un método rutinario y automatizado de análisis.  Introducción  55    Hasta  el momento,  el  empleo  de  biomarcadores  no  puede  considerarse  como  método de cribado de manera individualizada, pero sí contribuir como prueba de apoyo a  las  técnicas  de  imagen  en  el  diagnóstico  precoz,  pudiendo  evitar  la  realización  de  determinadas  pruebas  invasivas  innecesarias,  tal  y  como  se  recoge  en  la  revisión  sistemática que Aberle et al.55 publican en 2008 sobre biomarcadores moleculares como  pruebas diagnósticas en el CP.   La  citología  de  esputo  ya  fue  empleada  anteriormente  con  resultados  muy  limitados31,33,56.  En  la primera década de este siglo se desarrollan  trabajos con biomarcadores en  los que  se estudian alteraciones específicas en microsatélites de ADN donde  se pueden  observar diferencias entre el ADN de tejido normal y el tumoral57,58. La proteómica, con la  determinación de determinados anticuerpos específicos59 presenta un gran potencial para  el  diagnóstico  de  tumores  tanto  invasivos  como  preinvasivos,  pero  de  difícil  aplicación  clínica por su complejidad60.  Actualmente se sigue investigando en posibles marcadores en esputo, secreciones  bronquiales  o  aire  exhalado  que  podrían  ayudar  en  la  detección  precoz  del  CP.  Por  el  momento,  cualquiera  de  ellas  está  lejos  de  poder  utilizarse  en  el  cribado,  aunque  sí  podrían  contribuir  en  la  selección  de  los  criterios  para  su  inclusión  en  programas  de  diagnóstico precoz.  Es de especial interés el análisis del aire exhalado como herramienta futura para la  detección  precoz  del  CP.  Es  una  metodología  no  invasiva  que  trata  de  establecer  Introducción  56    diferencias entre muestras de aire de población con y sin cáncer, tras los efectos del estrés  oxidativo. Actualmente se están desarrollando tres vías de análisis del aire exhalado:    Condensado de aire exhalado (CAE)61: Contempla la posibilidad de efectuar el  análisis de un gran abanico de mediadores de la inflamación, estrés oxidativo  e  incluso marcadores  tumorales en  cualquier  sujeto  y  sin necesidad de una  gran  colaboración.  Hay  que  tener  en  cuenta  su  "contaminación"  por  sustancias  procedentes  de  la  orofaringe,  boca  e  incluso  el  tubo  digestivo  superior. Esto dificulta la interpretación de los resultados del análisis62. El CAE  contiene  macromoléculas,  como  por  ejemplo  proteínas,  que  pueden  ser  empleadas como herramienta para el diagnóstico de problemas pulmonares e  incluso usadas como potenciales pruebas de cribado.   Nariz Electrónica: Son multisensores sensibles a diferentes compuestos y que  emulan a la nariz biológica. Son sistemas caros y difíciles de utilizar. Dragonieri  et  al. 63  emplearon  una  nariz  electrónica  comercial,  Cyranose  320,  para  diferenciar  entre  pacientes  con  CP  y  voluntarios  sanos  (10  y  20  respectivamente) con una sensibilidad del 85%. Machado et al.64 usaron otra  nariz electrónica para diferenciar entre pacientes con y sin CP (14 y 62 sujetos  respectivamente)  con  una  sensibilidad  del  71.4%.  Di  Natale  et  al. 65  identificaban  el  94%  de  personas  (35  con  cáncer,  18  sanos  y  9  después  de  cirugía).  Uno  de  los  grandes  problemas  de  estos  estudios  es  la  falta  de  reproducibilidad, bien sea por las condiciones de diseño o por la fabricación de  los sensores electrónicos. En cualquier caso, una baja reproducibilidad implica  Introducción  57    que  los  diferentes  estudios  con  narices  electrónicas  no  serían  comparables  entre sí.    Análisis  cromatográfico del aire exhalado. Primeros estudios de  compuestos  orgánicos  volátiles  (VOC)  identificados  mediante  análisis  cromatográfico  mostraban una  sensibilidad y una especificidad  superiores al 90% en ambos  casos para el CP66,67.Estos estudios  resultaron muy atractivos  y  sentaron  las  bases de multitud de estudios realizados hasta la fecha.   En  cualquiera  de  los  tres  casos  existen  problemas  de  contaminación  en  las  determinaciones  debido  a  diversas  causas,  pero  principalmente  por  contaminantes  ambientales que se inhalan continuamente, así como medicamentos, ingesta de comida y  bebidas o el empleo de productos de higiene bucal.   Sin  embargo,  la  técnica de  cromatografía de  gases  (GC) ofrece  la posibilidad de  estudiar  en  profundidad  una  gran  cantidad  de  compuestos  originados  en  el  estrés  oxidativo,  todavía  poco  explorado.  Dado  la  facilidad  de  obtención  de  muestra  y  la  ausencia total de morbilidad, su posible aplicación como cribado podría estar justificada.    1.7. Estrés oxidativo. Radicales libres. Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno  El oxígeno imprescindible para la vida, también puede ser fuente de enfermedad a  través de una producción incontrolada de radicales libres de oxígeno (RLO) que provocan  daños  irreversibles estructurales y  funcionales de  las células, tales como alteraciones en  proteínas esenciales, peroxidación lipídica, ruptura de cadenas y modificación de las bases  Introducción  58    nitrogenadas del ADN, un aumento  intracelular elevado de Ca2+  libre y, en ciertos casos,  apoptosis o necrosis68,69.  El  estrés  oxidativo  está  causado  por  un  desequilibrio  entre  la  producción  de  especies  reactivas de oxígeno  (ROS) o de nitrógeno  (RNS) y  la  capacidad de un  sistema  biológico  de  detoxificar  rápidamente  los  compuestos  intermedios  y de  reparar  el  daño  causado. Este desequilibrio puede ser debido a un aumento en  la concentración de ROS  intracelular o por una disminución de los agentes antioxidantes que los degradan.  Se  han  descrito  numerosos  procesos  y  enfermedades  donde  está  implicado  el  estrés oxidativo, bien como causa principal o bien aumentando las complicaciones clínicas,  donde destacamos:    El  envejecimiento,  que  es  un  proceso, no  una  enfermedad,  lleva  consigo  una  acumulación  de  lesiones  orgánicas  debidas  a  RLO,  una  disminución  de  las  concentraciones de antioxidantes e inactivación de las enzimas detoxificadoras  de RLO y una acumulación de proteínas oxidadas no degradadas.    Enfermedades del tejido nervioso tales como Alzheimer, Parkinson y esclerosis  lateral  amiotrófica.  El  sistema  nervioso  parece  ser  un  blanco  perfecto  de  ataque para los RL por sus características químicas, como son el alto contenido  en  ácidos  grasos  poliinsaturados,  altas  concentraciones  de  hierro  y  bajo  contenido en enzimas antioxidantes.    La ateroesclerosis: Existe una oxidación de determinados  aminoácidos de  las  lipoproteínas, generando LDL oxidadas de carácter citotóxico para el endotelio.   Introducción  59     Otras muchas enfermedades como  isquemia o  infarto cerebral,  traumatismos  craneales,  artritis  reumatoide,  síndrome  auto  inmune,  nefrotoxicidad  por  metales,  catarata  senil,  Insuficiencia  renal  aguda,  crónica  y  diálisis,  diabetes  mellitus, hipertensión arterial (aumento de la peroxidación de lípidos, tanto en  plasma  como  en  las membranas  celulares,  así  como  una  disminución  de  la  capacidad  antioxidante),  cirrosis,  insuficiencia  hepática  y  hepatopatía  alcohólica.   Otros  procesos  y  enfermedades,  por  ejemplo:  reoxigenación  o  reperfusión,  desmielinización,  distrofia  muscular,  enfisema  pulmonar,  amiloidosis,  colagenosis, conectivopatías  (esclerodermia, enfermedad de Wegener), colitis  ulcerosa,  demencia  senil,  dermatitis  de  contacto,  displasia  broncopulmonar,  distrés  respiratorio  del  adulto,  mutaciones,  EPOC,  síndrome  de  apnea  e  hipoapnea obstructiva del  sueño,  infección pulmonar grave, asma,  cáncer de  pulmón,  enfisema,  fibroplasia  retrolental,  Kawshiorkor,  isquemia  cerebral,  glomerulonefritis,  miocardiopatías,  insuficiencia  cardiaca,  muerte  súbita  cardiaca,  porfirias,  úlcera  péptica,  síndromes  de  ataxia‐teleangiectasia,  de  Down, de Bloom, de Dubin‐Johnson‐Sprinz, entre otras. 69,70,71,72,73,74.  1.8. Estrés oxidativo y cáncer  Es de destacar la relación existente entre estrés oxidativo y el cáncer: el desarrollo  tumoral  es  un  proceso muy  complejo  que  se  caracteriza  por  la  presencia  de  necrosis  celular del tejido sano, crecimiento incontrolado de las células cancerosas y angiogénesis  Introducción  60    del  área  afectada,  entre  otros  muchos  fenómenos.  Se  ha  observado  la  activación  temprana  de  algunos  genes  que  podrían  participar  en  el  control  de  la  trascripción  de  factores de crecimiento necesarios para el desarrollo tumoral. No hay que olvidar que  la  transformación  oncogénica  viene  condicionada  por  la  presencia  de  genes  mutados  u  oncogenes que  controlan  funciones  celulares  clave,  y esto  también puede  influenciarse  por  el  estado  redox  celular.  Se  han  detectado  niveles  disminuidos  de  enzimas  antioxidantes en diversos tipos de células tumorales así como alteraciones en el estado de  los tioles celulares 69.  La mayoría de las ROS que se producen en condiciones normales de metabolismo  aerobio,  lo  hacen  a  niveles  bajos  y  el  daño  causado  a  las  células  es  reparado  continuamente.  Pero  también  tienen  funciones  biológicas  bien  definidas  e  importantísimas como las de generar descargas oxidativas por parte de los neutrófilos o la  inducción de  vías de  señalización  intracelulares  relacionadas  con el  crecimiento  74. Una  producción  excesiva  de  ROS  es  tóxica,  las  especies  ión  superóxido  O2 ‐,  peróxido  de  hidrogeno, H2O2,  radical hidroxilo OH •  son oxidantes muy potentes que  reaccionan  con  todos  los  componentes  celulares  (lípidos,  proteínas  hidratos  de  carbono  y  ADN)  inactivando  su  función71,  generan  necrosis  y  conducen  a  un  agotamiento  de  ATP  impidiendo la muerte celular por apoptosis, provocando un descontrol de la célula75.  La generación de ROS va unida a  la formación de especies reactivas de nitrógeno  (RNS)  porque  el O2 ‐  puede  reaccionar  con  otros  radicales  como  el  óxido  nítrico  (NO•)  generando  peroxinitrito  (OONO‐),  precursor  de  los  RNS76considerado  como  uno  de  los  Introducción  61    oxidantes biológicos más potentes.  Las RNS pueden dañar y matar  células por distintos  mecanismos:  inactivación  de  los  distintos  complejos  de  la  cadena  respiratoria,  daño  a  proteínas  y  a  lípidos,  inhibición  de  síntesis  proteica  o  de  ADN,  depleción  del  glutatión  (GSH)  o  de  ATP.  En  células  de mamíferos  la  principal  fuente  de  RNS,  es  la  oxidación  enzimática de L‐arginina por la NO sintasa, dependiente de calcio 70.  El origen de los ROS puede ser endógeno o exógeno:   Endógeno:  1. La principal fuente endógena de ROS es la cadena de transporte de electrones que  tiene  lugar  en  la mitocondria.  En  su  última  etapa  de  fosforilación  oxidativa,  el  oxígeno actúa como aceptor final de electrones, con la producción de 2 moléculas  de agua (figura 7), además de la formación de varias moléculas con diferente grado  de oxidación, que pueden entregar 1 ó 2 electrones al oxígeno y producir RL  71.  Aproximadamente  un  3 %  de  los  electrones  procedentes  del NADH2  se  desvían  hacia la formación de ROS.  Figura 7. Cadena respiratoria.    Introducción  62    Por una parte, el H2O2 generado puede reaccionar con metales divalentes (libres o  unidos a proteínas) y producir OH•, vía reacción de Fenton:    Fe 2+ +H++H2O2                Fe  3+ +OH• + H2O  O  bien,  puede  reaccionar  con  el  grupo  prostético  de  metaloproteínas  que  contienen átomos de hierro según la reacción de Haber Weis:    Otras fuentes son:   Peroxisomas que contienen flavin‐oxidasas como acil‐CoA oxidasa, genera  H2O2 tras procesos de β‐oxidación de ácidos grasos.   Leucocitos  polimorfonucleares  (PMN)  que  poseen  en  sus membranas  la  enzima NADPH‐oxidasa  que  produce O2  y  que  en  presencia  de  hierro  se  transforma  en  OH•,  que  se  da  particularmente  en  los  procesos  inflamatorios.   enzima xantina deshidrogenasa que predomina en los endotelios y genera  O2 ‐ 71, 76.      Introducción  63    Exógeno:  El  origen  exógeno  de  las  ROS  puede  ser muy  diverso.  El  tabaco,  la  polución,  la  ingesta, radiaciones ionizantes (RX, radiaciones gamma…), radiación ultravioleta, generan  multitud  de  ROS.  Además,  compuestos  carcinógenos  aromáticos,  como  el  benceno,  producen también ROS tras su catabolismo, lo que multiplica su acción destructora 75,77.  En  el  humo  del  tabaco  se  han  descrito  más  de  1000  RL78 y  más  de  4700  compuestos químicos, gran parte de ellos tóxicos, pero sólo una pequeña fracción ha sido  estudiada e incluida en el Grupo I de carcinógenos humanos por la Agency for Research on  Cancer79.Entre  los carcinógenos más  importantes  identificados en el humo del tabaco se  encuentran  los  hidrocarburos  policíclicos  aromáticos  y  las  nitrosaminas.  A  la  toxicidad  propia de estos compuestos hay que sumarle  la de sus metabolitos generados mediante  reacciones de oxidación catalizadas por sistemas enzimáticos asociados al citocromo P450  80,81.  Todo  lo  anterior  genera  una  reacción  en  cadena,  cuya  extraordinaria  complejidad  dificulta los estudios de toxicidad del humo del tabaco.  El  organismo  posee  sistemas  enzimáticos  capaces  de  metabolizar  todas  las  sustancias ajenas al organismo, realizándose en 2 fases:   Fase  I,  catalizada  principalmente  por  el  sistema  de  monooxigenasas  dependiente del citocromo P450 (CYP).   Fase  II,  en  la  que  participan  una  serie  de  transferasas  que  catalizan  reacciones de conjugación con diversas moléculas de naturaleza endógena  para facilitar su excreción del organismo.   Introducción  64    1.9. Mecanismos de neutralización de ROS por el citocromo P450  El citocromo P450  (CYP)  (hemoproteína) es  la última oxidasa perteneciente a un  complejo multienzimático de monooxigenasas que  se encuentra presente en diferentes  tejidos como el riñón, pulmón, piel, intestino, corteza adrenal, testículos, placenta y otros,  pero es particularmente activo en el hígado82,83.  Su  actividad  es  la  de  participar  en  el metabolismo  de  sustratos  de  naturaleza  exógena,  reacciones  de  detoxificación  (drogas,  pesticidas,  procarcinógenos,  solventes  orgánicos, etc.) y en el metabolismo de sustratos endógenos  (colesterol, ácidos biliares,  hormonas esteroideas y ácidos grasos)  83. A  su  vez, participa en procesos de activación  metabólica, de manera que compuestos inertes y poco reactivos son convertidos en otros  de gran reactividad química que son tóxicos para el organismo, capaces de causar graves  lesiones a los tejidos o de provocar mutaciones.  Se  han  descrito más  de  160  isoformas  de  CYP.  Son  fácilmente  inducibles  y  su  expresión y actividad vienen influenciadas por factores como la edad, sexo, dieta, especie,  tejido y estado hormonal 82.   La  isoforma CYP2E1 merece una  gran  atención.  Se  encuentra principalmente  en  hígado  (alrededor  de  7%  del  CYP  total),  aunque  también  está  presente  en  cerebro  y  pulmón.  No  sólo  participa  en  el metabolismo  del  etanol,  sino  también  activando  pro‐ carcinógenos  (N‐dimetilnitrosamina,  tetracloruro de carbono y benceno). Se ha descrito  como  una  de  las  enzimas  que  produce  mayor  cantidad  de  ROS  (O2 ‐  y  H2O2).  Los  hidrocarburos  policíclicos  aromáticos  del  humo  del  tabaco  inducen  a  CYP1A1  (que  se  Introducción  65    encuentra  en  pulmón)  y  CYP1A2  y  posiblemente  al  CYP2E1.  Se  ha  comprobado  que  aquellas  personas  que  tienen  los  genotipos  CYP2E1  y  CYP1A1,  tienen  más  riesgo  de  padecer cáncer de pulmón 82.  Cada persona responde de forma diferente a la acción de determinadas sustancias,  esto se debe a la existencia de un polimorfismo genético, que produce variantes genéticas  que difieren en su actividad de metabolizar estos compuestos ajenos al organismo84.  1.10. Radicales libre y daño tisular  Los  RL  atacan  cualquier molécula  oxidándola  y  haciendo  que  pierda  su  función  específica en la célula. Se han descrito multitud de modificaciones, las principales quedan  recogidas en la tabla 5.      Introducción  66    Tabla 5. Alteraciones en las macromoléculas y consecuencias por efecto del ataque de RL.   Macromolécula  Alteración Consecuencia  Lípidos de membrana 71 Peroxidación  lipídica: reacción  en  cadena.  El  ácido  graso  al  oxidarse  se  convierte  en  radical  de  ácido  graso  y  oxida  a  otra  molécula  vecina.  Se  generan  numerosos  subproductos,  hidrocarburos  volátiles, alcoholes o aldehídos.   Todos  ellos  pueden  difundir  lejos  de  donde  se  originaron  y  causar  edema  celular  e  influir  en  la  permeabilidad  vascular  e  inflamación.  Aumento  de  la  permeabilidad:  provoca  un  edema  celular  y  por  tanto,  muerte celular.  Alteración  en  la  interacción  con proteínas.  Proteínas 71   Oxidación  de  aminoácidos:  fenilalanina,  tirosina,  triptófano,  histidina  y  metionina  (preferentemente)         Modificaciones  reversibles  inducidas por H2O2   Entrecruzamientos  de  cadenas  peptídicas,  fragmentación  de  la  proteína  y  formación  de  grupos  carbonilos.  Alteración de la estructura.  Pérdida de actividad.   Regulación  de  la  actividad  proteica.  ADN 75  Oxidación  de  las  bases  nitrogenadas y/o desoxirribosa    Ruptura  de  una  o  de  ambas  cadenas,  aductos  entre  la  base  nitrogenada  y  la  desoxirribosa,  uniones  covalentes  con  proteínas.     Desarrollo de mutaciones y  carcinogénesis.   Pérdida  de  expresión  por  daño al gen específico.   Ej:  modificación  de  la  guanina  en  7‐hidro‐8‐oxo  deoxignanosina  (8‐oxo‐Gu).  Produce  un  cambio  de  bases:  G  por  T.  La  transversión  de  G:C  a  T:A,  es  la  mutación  más  frecuente en el p53.  Además  de  los  antioxidantes  que  se  ingieren  en  la  dieta,  las  células  han  desarrollado diferentes sistemas de defensa frente a la formación de RL y los ya formados.  Su  actividad  dependerá  de  la  afinidad  hacia  los  diferentes  RL  actuando  de  manera  diferente. Los más importantes se recogen en la siguiente tabla 6.      Introducción  67    Tabla 6. Principales sistemas de defensa celulares frente a la formación de RL   SISTEMA ENZIMÁTICO FUNCIÓN  ENDÓGENOS      Sistema  Citocromo‐oxidasa de  la  cadena  respiratoria mitocondrial.  Reducción del 90% de oxígeno en  el organismo 71.    Enzima  superóxido dismutasa (SOD)  (metaloenzima).   Diferentes  isoformas  (dependiendo  del  ion  metálico  que  contenga  en  su  centro  activo):  Cu,ZnSOD,  (enzima  dimérica.  En  su  centro  activo  tiene un  ión de Zn(II) de función estructural y uno  de Cu(II)  cuya oxidación/reducción  es  importante  para  la  actividad  catalítica  de  la  enzima).   (citoplasmática).  MnSOD, (mitocondrial) (tetramérica con un ión de  Mn(III) por subunidad).  FeSOD, Fe/MnSOD y NiSOD70, 71, 76.   Mantener  concentraciones  no‐ tóxicas  de  O2 ‐  Dismutación  O2 ‐  a  H2O2  y  O2  ,  llevada  a  cabo  en  2  etapas.     Grupo de enzimas catalasa, glutatión peroxidasa  (GPx) y peroxirredoxina (Prx):   Catalasa  en  peroxisomas  y  que  catalizan  la  reacción de dismutación siguiente:  Baja  afinidad  y  muy  elevada  eficiencia  catalítica 71, 76.     La  glutation‐peroxidasa  (GPx),  considerada  la peroxidasa más  importante por tener una  elevada  especificidad  por  el  sustrato  y  una  mayor  afinidad  por  H2O2  que  la  catalasa.  Utiliza  un  residuo  de  cisteína  para  reducir  peróxidos como H2O2. 2 tipos:    GPx clásicas (cGPx).     PHGPx:  específica  de  peróxidos  de  la  membrana lipídica.        Las peroxirredoxinas  (Prx), muy abundantes  aunque  su  eficiencia  catalítica  es  muy  inferior que la de las catalasas76.     Disminuir  las  concentraciones  de  H2O2  H2O2  + H2O               2H2O + O2    2GSH + H2O2                  GSSG + 2H2O  GSH=glutatión reducido;    GSSG = glutatión oxidado          Implicada en  la  reparación de  los  lípidos  de  membrana  peroxidados71, 76.    Glutation‐S‐transferasas (GSTs)76, dos tipos:  GSTs solubles o citosólicas.   GSTs  asociadas  a  la membrana  del  retículo  endoplasmático.  Detoxificación  de  muchos  xenobióticos*.  Intervienen  en  la  reacción  entre  el  glutation  y  xenobiótico  electrófilo,  para  generar  compuestos  menos  Introducción  68    reactivos y más solubles.    Glutation  (GSH, g‐L‐glutamil‐L‐cisteinil‐glicina), es  un tripeptido que contiene un grupo tiol (‐SH), Alta  concentración  intracelular  (5‐10  mM).  Se  encuentra  principalmente  en  su  estado  reducido  (GSH). Sólo un 1% del total, se encuentra oxidado  (GSSG).La forma reducida se genera al formarse un  puente  disulfuro  entre  los  grupos  tioles  de  los  residuos  de  cisterna  de  2 moléculas  de  GSH.  La  oxidación  se  revierte  gracias  a  la  actividad  de  la  enzima  glutatión  reductasa.  Un  ligero  desplazamiento  del  equilibrio  hacia  la  forma  oxidada afecta drásticamente al estado rédox de la  célula,  debido  a  su  participación  en multitud  de  equilibrios  óxido/reducción  acoplados.  Un  ejemplo,  resulta  crítico  para  la  regulación    de  algunos  factores  de  transcripción,  cuya  actividad  depende  del  estado  rédox  en  el  que  se  encuentren70, 76.    Principal sistema no‐enzimático  implicado en  la defensa celular  antioxidante.    Eliminación de peróxidos.    Mantener  reducidos  los grupos  tioles  (R–SH)  de  muchas  proteínas.    Participa de  forma  indirecta en  la  eliminación  de  peróxidos,  al  actuar  como  cofactor  de  (GPx)  y  como  agente  reductor  de  la  enzima glutarredoxina (Grx).   También puede conjugarse con  sustratos  electrofílicos,  formando  compuestos  que  generalmente  son  menos  reactivos y más solubles.    Otros  sistemas  enimaticos  con  actividad  antioxidante72:   Sistema glutarredoxina (Grx).        Sistema tiorredoxina. tiorredoxinareductasa  (TrxR).  Reduce  puentes  disulfuro  entre  proteína y glutatión.   El  sistema  de  la  tiorredoxina  reduce  directamente  puentes  disulfuro  de  ciertas  proteínas  y,  de forma indirecta, está implicado  en  la  detoxificación  de  peróxidos  sirviendo  como  dador  de  electrones  para  enzimas  como  peroxirredoxinas (Prx).  EXÓGENOS       Vitamina  E  o  alfa‐tocoferol:  Actúa  en  las  membranas  biológicas.  Considerada  el  protector más  importante  de  las moléculas  lipídicas.          Vitamina C o ácido ascórbico.           Beta‐carotenos:   Neutraliza  al  radical  hidroxilo  producido  en  el  ciclo  de  Haber‐ Weiss,  oxígeno  singlete,  peróxidos,  y  neutraliza  y  captura  anión superóxido.     Agente  reductor  o  donador  de  electrones  y  reacciona  rápidamente  con el  radical OH•  y  al anión superóxido O2 ‐.     Neutralizan el oxígeno singlete. Es  necesaria  la  incorporación  al  organismo  de  ciertos  Introducción  69    oligoelementos  como  el  cobre,  hierro, cinc, selenio y manganeso,  pues  forman  parte  del  núcleo  activo  de  las  enzimas  antioxidantes76.   *Los xenobióticos (del griego xeno ('extraño') y bio ('vida'), son compuestos que en  la naturaleza son poco frecuente o  inexistentes pues  son  compuestos de  síntesis) penetran  en  el organismo  continuamente a  través de  la piel,  sangre o  pulmones y pudiendo ocasionar trastornos a corto y/o a largo plazo.    Hay  estudios  que  han  demostrado  que,  en  células  de mamífero,  los  oxidantes  están  implicados  en  vías  de  señalización  relacionados  con  procesos  como  tumores  o  envejecimiento 76.  El estado rédox de las células o de los tejidos es una realidad compleja y no puede  ser medido  con  un  único  parámetro.  No  hay métodos  estandarizados  de medición  y  ninguno  de  los  biomarcadores  de  estrés  oxidativo  consiguen,  de manera  aislada,  una  valoración  precisa  del  estado.  Se  han  utilizado  una  gran  diversidad  de  métodos  de  aproximación. Estas determinaciones varían en función de diversos factores como el ritmo  circadiano, el tiempo, la temperatura, distintos órganos y condiciones de procesamiento69.  Tabla 7. Métodos de aproximación para medir estrés oxidativo BIOMOLÉCULAS  MÉTODOS Lípidos     Quimioluminiscencia   MDA(malondialdehído)   Dienos conjugados   Peróxidos   Pentano, etano   Compuestos carbonilos Proteínas  Grupos sulfhidrilos   Fragmentación de proteínas   Actividad de enzimas   Grupo aminos libres ADN Base modificada Introducción  70    Ej. 1.‐ El NO es una molécula lipofílica y de vida media muy corta que es sintetizado  en  epitelio  pulmonar.  Está  relacionado  con  procesos  inflamatorios  de  diferentes  patologías pulmonares. En los últimos años la determinación de NO en el condensado de  aire  exhalado  ha  permitido  la  cuantificación  indirecta  de  la  inflamación  en  patologías  como el asma85,86.  Ej.  2.‐  La  peroxidación  lipídica  de  los  ácidos  grasos  poliinsaturados  de  las  membranas,  produce  aldehídos  e  hidrocarburos  alifáticos  de  cadena  sencilla  (alcanos  principalmente)  (figura 8), compuestos muy volátiles, pueden ser  fácilmente estudiados  mediante el aire exhalado. La presencia de hidrocarburos ramificados en el aire exhalado  no proviene de la peroxidación lipídica pues no existen ningún ácido graso poli insaturado  ramificado. Ej.  Isopreno  (2‐metil‐1,3‐butadieno) muy presente en el aire exhalado  tiene  que ver con el metabolismo del colesterol pero no de la peroxidación lipídica77.      Figura 8. Esquema de peroxidación lipídica.Tomado de M. Kinter. 1995. 87     Introducción  71    1.11. Análisis del aire exhalado. Determinación de compuestos orgánicos volátiles  (VOC)  En  la  determinación  de  los  VOC,  es  necesario  diferenciar  entre  el  aire  exhalado  mezclado y el aire exhalado  final. El primero de ellos, es obtenido a  través del proceso  normal de la respiración. Éste constituye una mezcla entre la porción de aire alveolar y el  aire procedente del volumen muerto del sistema respiratorio. El aire exhalado final es el  que  se  obtiene  al  final  de  una  exhalación  profunda  (próxima  a  CRF)  y  que  refleja  la  fracción alveolar. Esta fracción de aire será la de estudio.   La  composición del aire que  se exhala  con  la  respiración,  refleja  las alteraciones  que tienen lugar en el metabolismo. Sin duda, una de las aplicaciones más interesantes de  del análisis del aire exhalado podría ser su utilización como herramienta complementaria  para  el  diagnóstico  precoz  de  CP,  pero  todavía  difícil  de  aplicar  ante  la  falta  de  una  estandarización en  la metodología de  la  recogida de muestra y el  conocimiento de qué  compuestos parecen  ser  los que presentan mayor poder discriminatorio para pacientes  con factores de riesgo.   Ya en el año 1971, Pauling et al.88 identificaron más de 250 compuestos presentes  en el aire exhalado de voluntarios, y a partir de esa  fecha muchos han sido  los estudios  que han  relacionado estas sustancias con diferentes enfermedades. En 1985, Gordon et  al.89 en un primer estudio con 12 pacientes con CP y 17 controles fumadores, analizaron el  aire  exhalado  de  todos  ellos.  El  diagnóstico  de  CP  se  realizó mediante  broncoscopia  o  biopsia de  la  lesión pulmonar. Las muestras de aire se  recogieron antes de comenzar el  Introducción  72    tratamiento  de  quimioterapia  y/o  radioterapia  mediante  un  sistema  especialmente  diseñado  para  la  recolección  de  aire  (figura  9)  y  se  analizaron mediante  la  técnica  de  TD/GC/MS.         De  los cromatogramas obtenidos, seleccionaron 22 picos que  fueron  identificados  mediante su  tiempo de  retención y espectro de masas, que marcaban diferencias entre  ambas  poblaciones. De  estos  22,  sólo  7  eran necesarios para  discriminar  entre  los dos  grupos.  Su modelo  demostró  con  una  exactitud  del  93%  la  diferenciación  de  los  dos  grupos. En ningún caso  los espectros de masas de  los compuestos seleccionados  fueron  comparados con una librería espectral para su identificación inequívoca.  Tres años más  tarde, otros dos grupos90 confirmaron  sus  resultados, pero  con un  tamaño de muestra relativamente pequeño. O’Neil et al.91pertenecientes al mismo grupo  de investigación de Gordon, consiguieron identificar, mediante un laborioso algoritmo de  análisis  de  espectros  de masas,  diversos  compuestos, mayoritariamente  hidrocarburos  Figura 9. Sistema de recolección de aire exhalado. Tomado de  Gordon et al 89 .  Introducción  73    (alcanos, dienos y arenos principalmente) y compuestos que contenían átomos de oxígeno,  azufre, nitrógeno, o algún halógeno.    De  los  386  compuestos  detectados,  sólo  28  aparecían  con mayor  frecuencia  en  pacientes  con CP,  y de  ellos,  sólo 9  eran potencialmente marcadores,  el  resto  eran de  origen ambiental (tabla 8). Además es relevante que ninguno de los compuestos contenía  ni azufre ni nitrógeno.  Tabla 8. Lista de compuestos presentes en aire exhalado de pacientes con cáncer de pulmón. Modificado de  O'Neil et al.91. En el recuadro quedan señalados los potenciales marcadores.  C  H  O  Cl  F  Rt(s)  FÓRMULA  COMPUESTO  6  14        486  C6H14  Hexano  6  14        470  C6H14  n‐metilpentano  10  22        856  C10H22  n‐trimetilheptano  5  8        500  C5H8  Isopreno  6  6        713  C6H6  Benceno  7  8        814  C7H8  Tolueno  8  10        900  C8H10  Etilbenceno  9  12        1001  C9H12  Etil,metilbenceno  9  12      1019 C9H12 Trimetilbenceno  9  12      1056 C9H12 Alquilbenceno 9  12      1037 C9H12 Alquilbenceno 8  8      1028 C8H8 Estireno 10  8        1500  C10H8  Naftaleno  11  10        1555  C11H10  Metilnaftaleno  3  4        646  C3H4  Propenal  3  6  1      628  C3H6O  Acetona  4  8  1      681  C4H8O  2‐butanona  6  6  1      1600  C6H6O  Fenol  7  6  1      1300  C7H6O  Benzaldehído  8  8  1      1413  C8H8O  Acetofenona  9  18  1      1154  C9H18O  Nonanal  5  8  2      765  C5H8O2  Propanoato de etilo  5  8  2      776  C5H8O2  Isobutenoato de metilo  1  2    2    700  CH2Cl2  Diclorometano  6  4    2   1200 C6H4Cl2 Diclobenceno 2  1    3   766 C2HCl3 Tricloroetano 2  1    3 1  474 C2HCl3F Triclorofluormetano  2      4    800  C2Cl4  Tetracloroetileno    En 1994 M Phillips et al92 publican un  trabajo donde  tratan de discriminar entre  compuestos exógenos y los producidos por el metabolismo, dado que estudios anteriores  Introducción  74    no tienen en cuenta esta cuestión. Analizan el aire exhalado de 20 voluntarios sanos y el  aire ambiental de la sala donde se realiza la prueba. Las muestras son analizadas mediante  TD/GC  y  espectroscopia  de  masa  de  trampa  iónica.  Las  concentraciones  para  cada  compuesto se calculan mediante el área bajo la curva de los picos cromatográficos de los  24 compuestos más abundantes presentes tanto en el aire exhalado como en el del aire  de  la  sala.  Definieron  “gradiente  alveolar”  para  cada  compuesto  como  la  resta  de  las  concentraciones del aire exhalado menos las del aire ambiental (figura 10). Si la diferencia  era  positiva,  el  compuesto  posiblemente  era  de  origen  endógeno, mientras  que  si  era  negativo, su origen probablemente fuera exógeno.       En este trabajo no se tuvo en cuenta la dieta de los participantes y probablemente  alguno de  los  compuestos  clasificados  como endógenos pueda  tener un origen externo  como la comida o el agua. Igualmente sucede con los supuestos de origen endógeno que  han podido ser excretados al ambiente por otras vías que no sea la respiratoria (hepática  o renal). En cualquier caso, aunque no se explicaba cuál era la vía metabólica de formación  de  los  compuestos;  este  fue  un  primer  paso  para  la  discriminación  entre  compuestos  endógenos y exógenos.  Figura 10. Gradientes de los VOC más abundantes en aire exhalado. Tomado de Phillips et al. 1994.  92   Introducción  75    En  1997  M  Phillips  et  al.93 describen  un  dispositivo  de  diseño  propio  para  la  recogida  del  aire  alveolar  (figura  11),  eliminando  en  lo  posible,  los  contaminantes  procedentes del ambiente y del espacio muerto anatómico. Mediante este sistema en una  muestra  de  10  litros  de  aire  alveolar  y  tras  el  análisis  por  desorción  térmica  y GC/MS  identificaron más de 1200 VOC. Uno de los problemas que presentaba este dispositivo era  la existencia de muchos compuestos que se sabían presentes en el aire exhalado y que no  se  podían  determinar  mediante  este  sistema.  Los  autores  lo  referían  a  que  en  determinadas  etapas  de  la  purificación  del  aire  antes  de  su  análisis,  determinados  compuestos se perdían.    Figura 11. Esquema del aparato diseñado por el grupo de M  Phillips para la recolección del aire exhalado. 1997 93   Este  mismo  grupo  ha  realizado  diversos  estudios  de  los  que  destacamos  principalmente  dos  por  los  resultados  obtenidos,  uno publicado  en  1999  en  Lancet66  y  otro en 2003 en Chest67. En el primero, se analizaba el aire exhalado de 60 pacientes con  CP  (diagnosticados  histológicamente)  y  de  50  voluntarios  sanos.  Siguiendo  la  misma  metodología descrita en publicaciones previas, construyen un modelo matemático con 22  VOC,  principalmente  hidrocarburos  (alcanos  ramificados  e  hidrocarburos  aromáticos),  Introducción  76    incluyendo  también  un  derivado  halogenado  y  2  aldehídos  (tabla  9).  Este modelo  era  capaz  de  discriminar  entre  pacientes  con  y  sin  CP  con  una  sensibilidad  del  100%  y  especificidad  del  81%  para  tumores  en  estadio  I;  al  aumentar  el  estadio  del  tumor  la  especificidad y sensibilidad disminuían al 71.7% y 66.7% respectivamente. Aunque muchos  de  los compuestos descritos coincidían con  los citados por O’Neil et al.91, eran  incapaces  de describir las rutas metabólicas de formación de casi todos ellos.  Tabla 9. Modelo de 22 VOC exhalados para CP. Phillips et al. Lancet 1999 66  Estireno  metilciclopentano 3‐metiloctano Hexanal  2,2,4,6,6‐pentametilheptano  1‐metil, 2‐pentilciclopropano 1‐hexeno Heptanal  2‐metilheptano  Triclorofluorurometano 3‐metilnonano Ciclohexano  Decano  Benceno  1‐hepteno 1‐metiletilenbenceno Propil‐benceno  1,2,4‐trimetilbenceno 1,4‐ dimetilbenceno   Undecano  Isopreno  2,4‐dimetilheptano     En el estudio publicado en Chest  67, se analiza el aire exhalado de 219 personas,  divididas en 5 grupos – 67 con CP primario, 15 con CP metastásico; 5 CP  indeterminado  (sin llegar a establecer con certeza si el origen era primario de pulmón o metastásico); 91  con RX de tórax anormal pero con broncoscopia negativa para CP y un grupo control de 41  personas no  fumadores,  fumadores y exfumadores,  sin evidencia de EPOC. Del  total de  compuestos  determinados,  el  modelo  construido  con  9  VOC  (todos  ellos  alcanos)  mostraba una sensibilidad del 89% y una especificidad del 83% (tabla 10).      Introducción  77    Tabla 10. Modelo de 9 VOC para CP. Phillips et al. Chest. 200367  Butano*  4metiloctano Pentano  5metildecano Heptano  3‐metiltridecano 2metilhexano  7metiltridecano 3metilhexano  *mejor discriminante      Además  el  modelo  predictivo  no  se  ve  afectado  por  el  tabaquismo,  ni  por  el  estadiaje TNM, ni por  la histología del  tumor. El  “gradiente alveolar” de estos VOC era  positivo para el grupo control y negativo para el grupo CP. Para explicar este resultado se  basaron en la hipótesis de que su concentración estaba disminuida (por ello el “gradiente  alveolar” era negativo) porque el metabolismo de estos compuestos estaba aumentado  tras  activarse  determinados  polimorfismos  del  citocromo  P450  (CYP)  que  están  relacionados con el cáncer de pulmón. La inducción de CYP no sólo ocurre en el tejido fino  del tumor, también ocurre en otras regiones del cuerpo, explicando así porqué el perfil de  VOC es similar en todas  las etapas del cáncer de pulmón y tampoco varía después de  la  resección  del  tumor.  Se  suman  así  dos  factores  de  riesgo  para  el  cáncer  de  pulmón,  determinados polimorfismos del CYP, y el riesgo de  inhalar  los compuestos cancerígenos  presentes en el ambiente incluido el humo de tabaco.  Estos estudios de Phillips 66,67 fueron posteriormente, criticados por varios motivos  como haber seleccionado grupos de estudio mezclados (NICP e ICP), no diferenciar entre  la existencia o no de metástasis, no incluir un grupo de pacientes con EPOC y no estudiar  Introducción  78    la  influencia de  la  EPOC  como  factor de  confusión. Además,  la  fórmula  empleada para  calcular los gradientes alveolares no explicaba la complejidad de la absorción pulmonar.  En 2005 Poli et al.94 publicaron un trabajo donde se describe un nuevo método de  recogida de muestra y de análisis, cuyos resultados contradicen a los de Phillips. El estudio  transversal constaba de 36 pacientes con NICP en estadio temprano (T1‐T2) y con criterios  quirúrgicos, y se recogía la muestra antes y después de la cirugía. Introdujo en el estudio  25 pacientes con EPOC leve o moderado según escala GOLD (Global Initiative for Chronic  Obstructive  Lung  Disease)  y  un  grupo  de  pacientes  asintomáticos  compuesto  por  35  fumadores  y  50  no  fumadores,  sin  asma  y  con  espirometría  dentro  de  la  normalidad.  Además  analizó  20 muestras  de  aire  ambiental  de  la  habitación  donde  se  tomaron  las  muestras. El modelo predictivo propuesto contaba con 13 VOC, todos ellos hidrocarburos  alifáticos y aromáticos (tabla 11), de ellos, 10 de  los compuestos tenían concentraciones  superiores en pacientes con CP frente al resto de grupos. Para el grupo EPOC, 9 de los 13  VOC propuestos presentaban concentraciones aumentados frente al grupo control. No se  encontraron diferencias estadísticamente significativas en los VOC de los pacientes con CP  antes  y  después de  la  cirugía.  Este modelo  presentaba  una  sensibilidad  del  72%  y  una  especificidad del 94%.  Tabla 11. Modelo de VOC para CP. Poli et al. Repir Res. 200594 Isopreno  2,2,4,6,6‐pentametilheptano  Pentano  Benceno Heptano  Tolueno Octano  Etilbenceno Decano  1,2,4‐trimetilbenceno 2‐metilpentano      Introducción  79    Clasificó los compuestos en 3 tipos dependiendo del origen de estos. Los del grupo  1  eran  endógenos,  aunque  también  se  encuentran  en  el  ambiente.  El  grupo  2  son  exógenos y los del grupo 3 son heterogéneos y de difícil interpretación.  Además, demostraron que  las concentraciones de  isopreno y de decano, estaban  disminuidas después de la resección del tumor. De acuerdo con la hipótesis planteada por  los autores, existen VOC exhalados que son producidos por  las células tumorales,  lo que  explica que sus concentraciones se vean disminuidas después de la resección. Esta teoría  fue apoyada por otros estudios realizados mediante cultivo in vitro de células de tumores  no microcíticos de pulmón95.   Del estudio de Poli cabe destacar varios aspectos importantes. El primero de ellos  es  la recogida de  la muestra mediante cámaras BioVOC® (figura12), dispositivo de teflón  que  no  ofrece  resistencia  alguna,  de  fácil manejo  y  que  permite  analizar  siempre  un  volumen fijo. Al realizar la toma mediante una espiración forzada, se elimina en la medida  de  lo posible  la mayor parte del aire que proviene del espacio muerto anatómico. Y otro  de  los aspectos  importantes es  la utilización de fibras de micro‐extracción en  fase sólida  (SPME), que han sido utilizadas posteriormente por gran número de autores. Presentan  grandes ventajas aunque también tienen sus inconvenientes.    Figura 12. BioVOC breath Sampler. Markes Int.  Introducción  80    Los estudios de Poli et al. 94 o Phillips et al. 66,67, comprobaron que la combinación  de  diferentes  VOC  sólo  era  función  de  la  actividad  celular  y  no  del  estadio  de  la  enfermedad ni del consumo activo de tabaco.  Estos  estudios,  tanto  los  de  Phillips  como  los  de  Poli,  fueron  cuestionados  posteriormente,  al  no  poder  establecer  el  origen  metabólico  de  los  compuestos  propuestos como marcadores y por tener tamaños muestrales reducidos.  A finales de 2007, Phillips et al.96, describen una nueva combinación de 16 VOC muy  diferentes a los estudiados hasta el momento. El modelo propuesto mediante un análisis  multivariante  con  lógica difusa predijo CP primario  con una  sensibilidad del 85%  y una  especificidad del 80%, la precisión de la prueba era comparable a la del TC de tórax y no se  vio afectada ni por el estadio TNM del tumor ni por el tabaquismo actual o anterior. Los  valores de los VOC incluidos en el modelo estaban disminuidos en pacientes con cáncer de  pulmón frente a un grupo control con TC de tórax normal. La hipótesis (figura 13)97 se ve  apoyada  por  el  hecho  de  que  los  VOC  pueden  ser  alterados  antes  de  la  aparición  de  lesiones macroscópicas porque  se  inducen  las  formas del  citocromo CYP de alto  riesgo,  que preceden a  la aparición de una neoplasia. La  inducción de CYP en  los genotipos de  alto  riesgo, hace que  aumente  el  riesgo de  sufrir un  cáncer de pulmón  y  se  acelere el  catabolismo de los VOC reduciendo su abundancia en el aire exhalado.  Introducción  81      Figura  13.  Hipótesis  de  trabajo  sobre  la  producción  de  VOC  y  metabolismo de  los VOC  inhalados  y  su  relación  con CP. Tomado de  Phillips et al. 200897.     En 2007 Buszewski et al.98 y posteriormente Horváth et al.99 en 2009, publican dos  revisiones  de  los  estudios  de  biomarcadores  en  aire  para  CP más  importantes  escritos  hasta la fecha, siendo la mayor parte de ellos los correspondientes al grupo de Phillips et  al.66,67. De ellos se obtienen conclusiones muy importantes:  a) Los  compuestos  descritos  con  más  frecuencia,  que  son  acetona,  isopreno  e  hidrocarburos lineales, ramificados y aromáticos. Aunque explica los mecanismos  metabólicos de formación de parte de estos compuestos, bien es verdad que para  los 3 primeros  las causas de  formación son tan diversas que su valoración como  marcadores  pueden  devenir  en  factores  de  confusión.  Para  los  hidrocarburos  ramificados no existe, hasta el momento, ninguna explicación de cuáles  son  sus  mecanismos  de  formación  no  pudiendo  justificarlo  por  la  teoría  de  cambios  Introducción  82    inducidos  por  estrés  oxidativo.  Los  compuestos  hidrocarburos  aromáticos  son  contaminantes ambientales.   b) Los modelos planteados no  se ven afectados ni por el  tabaquismo  (que pudiera  considerarse como un  factor de confusión al  incrementar el estrés oxidativo), ni  por el estadio del tumor, lo que permitiría, en un futuro, tras mucha investigación,  la aplicación de los VOC dentro del campo del diagnóstico precoz.  En  2012  van  de  Kant  et  al.100 realizan  otra  revisión  sistemática  de  los  artículos  publicados  hasta  esta  fecha  sobre  los VOC  detectados  en  aire  exhalado  o mediante  el  empleo de nariz electrónica para diferentes patologías respiratorias. La mayor parte de los  estudios recogidos de VOC en esta revisión corresponden a cáncer de pulmón. En la tabla  12  se  recogen  únicamente  los  estudios  de  VOC  para  CP  determinados  mediante  cromatografía de gases.  Tabla 12. Principales estudios publicados de CP y VOC determinados por GC/MS o GC/FID. Modificado de  Van de Kant 2012100  Autor  Año  Grupos  de estudio  Nº  Pacientes  VOC  Ref.  Buszewski  (2012)  CP   Control  Sano  29  44  Acetona  Benceno  Butanal  2‐Butanona   Acetato de etilo  Etilbenceno    2‐Pentanona   Propanal  1‐Propanol   2‐Propanol   2‐Propenal  101  Rudnicka  (2011)  CP   Control  Sano  23  30  Propano  2‐Propenal   Disulfuro de Carbono     Isopropílico   Etilbenceno   Estireno  102  Ulanowska  (2011)  CP   Control  Sano  137  143  Etanol  Butano  Acetona  Sulfuro de dimetilo  Isopreno  Propanal    1‐Propanol  2‐Pentanona  Furano  o‐Xileno  Etilbenceno  103  Fuchs  (2010)  CP   Control NF  12  12  Pentanal  Hexanal  Nonanal  104  Introducción  83      Control F  12  Octanal  Kischkel  (2010)    CP  Control F   Control NF  31  31  31  Sulfuro de dimetilo  Dimetil formamida    Butano  Butanal  105  Poli  (2010)    CP  Control  Sano   40  38  Propanal  Butanal  Pentanal  Hexanal    Heptanal  Octanal  Nonanal  106  Song  (2010)    CP  Control  sano  43  41  1 – butanol  3‐hidroxi‐2‐butanona    107  Ligor  (2009)    CP  Control  sano  65  31  1‐propanol   2‐butanona   3‐butin2‐ol  Benzaldehído  2‐metilpentano  3‐metilpentano  n‐pentano  n‐hexano  108  Gaspar   (2009)    CP  Control  sano  18  10  Set de VOCS     109  Bajtarevic  (2009)    CP  Control  sano  285  472  Isopreno   Acetona   Metanol    110  Crohns  (2009)    CP  Control  sano  11  30  Pentano    111  Peng  (2009)    CP  Control  sano  40  56  Set 42 VOC    112  Poli  (2008)    CP*  Control  sano  36  50  Isopreno  Pentano   2‐Metilpentano  2,2,4,6,6‐ Pentametilheptano     Xilenos   1,2,4‐trimetilbenceno   Toluene   Etilbenceno    113  Phillips  (2008  y  2007)  CP  Control F  193   211      96  97  Poli  (2005)       CP  EPOC  Control F  Control NF  36   25   35   50  2‐Metilpentano   Pentano   Decano  Octano   2,2,4,6,6‐ Pentametilheptano   Tolueno   Benceno  Etilbenceno  Xylenos   1,2,4‐trimetilbenceno   94  Phillips  (2003)    CP  No CP*  Control  Sano  87   81  41   Butano  Pentano  2‐metilhexano  3‐metilhexano  Heptano    4‐metiloctano  5‐metildecano  3‐metiltridecano  7‐metiltridecano  67  Phillips  (1999)    CP   no CP*  60  48  Isopreno  Estireno  2‐Metilheptano   Pentano   Decano  undecano  3‐metiloctano   Propilbenceno  Benceno  hexanal  1‐metil,2‐metilciclopentano  pentilciclopropano  Triclorofluormetano  1,2,4‐trimetilbenceno  1‐hexeno  3‐metilnonano  1‐hepteno  1,4‐dimetilbenceno  2,4‐dimetilheptano  Ciclohexano  66  Introducción  84    2,2,4,6,6‐ Pentametilheptano  Heptanal  1‐metilvinilbenceno     Preti  (1988)  CP  Control  sano  10   16   o‐Toluidina      90  Gordon  (1985)    CP  Control  sano  12   9   22 VOC    89  *(Rx tórax anormal)    En relación a  los VOC determinados, de  los 16 estudios seleccionados para CP, se  observa  cómo  a  lo  largo  del  tiempo  la  naturaleza  de  los  compuestos  a  determinar  va  cambiando, pasando de estudios  iniciales con compuestos de naturaleza hidrocarburos a  estudios  donde  principalmente  se  determinan  compuestos  oxigenados,  aunque  sigan  incluyendo VOC de naturaleza aromática.   La carencia de un muestreo estandarizado114, los diferentes algoritmos estadísticos  aplicados, el número  y  los VOC  seleccionados parecen  ser  las  razones principales de  la  diversidad de resultados obtenidos.  De  todos  ellos,  destacamos  los  estudios  realizados  por  Ligor  H  et  al.108  que  describen  8  posibles  marcadores  de  CP  (1‐propanol,  2‐butanona,  3‐butyn‐2‐ol,  benzaldehído,  2‐metil‐pentano,  3‐metil‐pentano,  n‐pentano  y  n‐hexano).  Por  su  parte,  Song G et al.107, en un estudio publicado en 2010, apuestan por la utilidad de 1‐butanol y  3‐hidroxi‐2‐butanona, como marcadores de CP pues se encuentran significativamente más  elevados  en  pacientes  con  NICP  frente  a  una  población  control.  Los  últimos  estudios  publicados por Poli et al.106 y Fuch et al.104, afirman que los aldehídos, hexanal, heptanal,  octanal y nonanal muestran diferencias significativas entre los diversos grupos de estudio.  Introducción  85    Estos  compuestos  son  los metabolitos  finales  en  las  reacciones  de  peroxidación  de  los  ácidos grasos ω3 y ω6 y su presencia es muy superior en pacientes con CP frente a grupos  control.  Hay  que  tener  en  cuenta  que  estos  estudios  cuentan  con  un  número  muy  reducido de casos, lo que invita a continuar investigando en esta línea.   El estudio del aire exhalado está teniendo un gran auge no sólo para el estudio de  biomarcadores en CP, sino también en otras patologías respiratorias como EPOC, asma y  fibrosis. Y no sólo en patologías respiratorias, también se están estudiando en población  sana, como muestran  los estudios de  Jareño et al115 y Huang et al.116. También se están  estudiando posibles biomarcadores de otros  sistemas, por  ejemplo,  e  cáncer de mama  según  un  estudio  publicado  en  2014117.  En  él  se  determinan  aldehídos  alifáticos  como  marcadores de  cáncer.  El modelo propuesto para hexanal, heptanal, octanal  y nonanal  alcanza una sensibilidad del 92% y una especificidad del 96% para el diagnóstico temprano  de la enfermedad.   1.11.1. Estudios de VOC en EPOC  Los estudios de VOC en pacientes con EPOC requieren un trato especial. Como es  sabido,  esta  enfermedad  se  caracteriza  por  una  limitación  crónica  al  flujo  aéreo  y  una  respuesta  inflamatoria  crónica exagerada de  las vías aéreas y de  los pulmones  frente a  partículas  nocivas  o  gases,  como  el  humo  de  tabaco.  Al  ser  una  enfermedad  estrechamente  ligada  al  tabaco,  incrementa  el  riesgo  de  desarrollar  CP.  El  poder  caracterizar  los  VOC  en  este  grupo  parece  ser  necesario  para  poder  estudiar  correctamente al grupo CP.  Introducción  86    Son pocos los estudios de VOC y EPOC publicados hasta  la fecha. En 2003 Corradi  et  al.118,  pertenecientes  al  grupo  de  Poli,  analizan  aldehídos  en  el  condensado  de  aire  exhalado de pacientes con EPOC frente a un grupo control. Si bien, la técnica instrumental  es  diferente  al  tratarse  de  cromatografía  de  líquidos,  concluye  que  sólo  el  malondialdehído, consigue diferenciar pacientes con EPOC frente a controles.  En  2010  Van  Berkel  et  al.119 construyen  un modelo  con  13  VOC  (tabla  13)  que  permite clasificar población sana y pacientes con EPOC, alcanzando una  sensibilidad del  98% y especificidad del 88%, aumentando a una sensibilidad del 100% y especificidad del  81% cuando sólo se consideraban 6 de los 13 VOC propuestos (marcados con asterisco).  Tabla 13. Compuestos identificados. Sensibilidad y especificidad. (Van Berkel et al. 2010)119  COMPUESTO  SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD  Isopreno*   98%  88%  100%  81%  C16 hidrocarburo*   4,7‐Dimetill‐undecano*   2,6‐Dimetil‐heptano*   4‐Metil‐octano*  Hexadecano*   3,7‐Dimetil 1,3,6‐octatrieno   2,4,6‐Trimetil‐decano  Hexanal  Benzonitrilo  Octadecano  Undecano   Terpineol    En  2011  Fens  et  al.120 realizan  un  estudio  complicado  donde  correlacionan  un  patrón  de  VOC  analizados  por  cromatografía  y  un  perfil  obtenido  mediante  nariz  electrónica,  con  poblaciones  celulares  de  inflamación  (polimorfonucleares  (PMN)  y  eosinófilos (EO)), y marcadores  inflamatorios (proteína catiónica del eosinófilo (PCE) y  la  Introducción  87    mieloperoxidasa  (MPO))  en  esputo  inducido,  de  pacientes  con  EPOC  leve‐moderado  (subtipo bronquitis crónica).   Para GOLD I, los resultados que obtuvieron mostraron correlaciones de 8 VOC con  EO, y 17 VOC con PMN  (tabla 14), siendo uno de ellos  (alquilbenceno) común a  las dos  poblaciones  celulares. En el  caso de  los marcadores de  inflamación PCE  y MCO, ambos  presentan buena asociación con  los VOC (19 VOC con  la PCE (p<0.01) y 4 VOC con MPO  (p<0.01)). En cuanto a la aplicación de la nariz electrónica hallan buena correlación entre  los “breathprint” con PCE (r=0.84 y p=0.002) y con MPO (r =0,72, p = 0,008).  Tabla 14. VOC propuestos para el grupo de EPOC por Fens et al. 2012120.      Introducción  88    Concluyen  que  perfiles  moleculares  exhalados  (VOC  y  “breathprint”)  están  estrechamente relacionados con el tipo de células inflamatorias en el esputo y su estado  de activación en la EPOC leve. Esto les sugiere que el análisis del aire exhalado puede ser  de utilidad para la evaluación y seguimiento de la inflamación de las vías respiratorias en  la EPOC.  Basanta  et  al.121 en  2012  publican  un  trabajo  en  pacientes  con  EPOC  según  los  diferentes  fenotipos.  Los  compuestos  estudiados  son  aldehídos  y  ácidos  orgánicos.  Estudian 71 personas, de las cuales 39 eran EPOC y 32 controles, y construyen un modelo  compuesto principalmente por aldehídos (C6, C9, C10, C11, C12 y C15) y ácido pentanoico.  Al comparar el grupo EPOC con su grupo control obtienen una especificidad del 87% y una  sensibilidad del 50%. Sin embargo, cuando sólo seleccionan personas fumadoras del grupo  control con personas  fumadoras del grupo EPOC,  la  sensibilidad aumentaba al 92% y  la  especificidad al 90%. El modelo matemático era más efectivo en personas  fumadoras. El  único  compuesto  relacionado  con  la  medicación  con  tratamiento  esteroideo  fue  el  undecanal.  El estudio de Basanta para la EPOC, es el único que, hasta el momento, ha incluido  un ácido carboxílico como marcador de patología.  En  2014 C Phillips  et  al.122 publican  un  estudio  utilizando  la misma metodología  que  la  empleada  por  nosotros  (recogida  de muestra  con  BioVOC,  tubos  de  desorción  universales  y  TD‐GC/MS).  El  único  VOC  que  muestra  diferencias  estadísticamente  significativas entre el grupo control y EPOC es el isopreno.  Introducción  89    Besa V  et al.123, en un estudio  recientemente publicado  analizan  los VOC en un  grupo  EPOC  frente  un  grupo  de  controles  sanos,  fumadores  y  no  fumadores.  En  este  estudio,  seis VOC  son  suficientes para discriminar  correctamente a pacientes del grupo  EPOC en relación a controles sanos, con una precisión del 70%. Sólo encontraron 15 picos  que  diferenciaban  a  sanos  fumadores  frente  a  sanos  no  fumadores.  En  este  estudio  utilizan una metodología diferente (IMS) que identifica perfiles de VOC sin especificar qué  compuestos  están  implicados.  Este  trabajo  es  un  primer  paso  interesante  pero  deja  todavía muchas lagunas que aclarar.      En la actualidad, dada la elevada incidencia y prevalencia del cáncer de pulmón, son  muchos los estudios que pretenden identificar un marcador para el diagnóstico precoz de  la enfermedad o para  seleccionar grupos de pacientes que puedan  ser  incluidos en  los  programas  de  diagnóstico  precoz  de  cáncer  de  pulmón  (DPCP).  El  empleo  de  nuevas  técnicas  que  permitan  un  diagnóstico  en  fases  tempranas  es,  pues,  fundamental  para  obtener mejores resultados terapéuticos. El análisis del aire exhalado es particularmente  interesante  en  este  sentido  y  aunque  no  exista  una  estandarización  en  cuanto  a  la  metodología  de  recogida  de  muestra,  los  últimos  resultados  publicados  alcanzan  un  resultado común en cuanto qué familia de VOC parecen ser más específicos en pacientes  con CP.          Introducción  90              HIPÓTESIS Hipótesis  93    2. HIPÓTESIS    El  incremento del estrés oxidativo que  tiene  lugar en el  seno de un  tumor provoca  daños  estructurales  en  todas  las  macromoléculas  celulares.  La  peroxidación  lipídica  genera  la  destrucción  de  los  fosfolípidos  de  membrana,  dando  lugar  a  compuestos  orgánicos  volátiles  (VOC)  que  son  exhalados  durante  la  respiración,  y  que  pueden  ser  detectados en el aire exhalado. En este  sentido, es probable que  la presencia de estos  compuestos  pueda  ser  un  marcador  de  cáncer  y  que,  de  la  misma  forma,  sean  considerados  como  herramienta  complementaria  para  el  diagnóstico  precoz  de  la  enfermedad.    Dado lo anterior, enunciamos la siguiente HIPÓTESIS:    Como  consecuencia  de  la  enfermedad  neoplásica,  podrían  existir  VOC  específicos  en  pacientes con CP frente a una población sin CP.    94      OBJETIVOS Objetivos  97    3. OBJETIVOS    3.1 PRINCIPAL    1. Buscar diferencias significativas de los VOC en aire exhalado en una población con  cáncer de pulmón frente a grupos EPOC y control.    3.2 SECUNDARIOS    1. Determinar  el  efecto  del  hábito  tabáquico  sobre  los  VOC  detectados  en  aire  exhalado en una población presuntamente sana.  2. Determinar  si  existen  diferencias  en  los  VOC  exhalados  en  pacientes  con  diagnóstico de EPOC frente a una población presuntamente sana.        98    MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos  101    4. MATERIALES Y MÉTODOS  4.1. Materiales  Los materiales utilizados para el estudio  se han dividido en dos grupos, material  para  la toma de muestra de aire (exhalado y ambiental), y  los materiales para el análisis  cromatográfico.  a) Material para la toma de muestra de aire:   BioVOC Breath Sampler (Markes Int.)   Tubos  de  desorción  térmica Universal  /  TO‐17/2,  rellenos  de:  Tenax  TA  +  Graphitised Carbon Black + Carbonised Molecular Sieve.(Markes Int.)   Tapones DiffLokTM (Markes Int.)  b) Material cromatográfico – desorción térmica:   Jeringa Hamilton de 1 µl para cromatografía de gases.   Cold trap: Unity General purpose Hydrophobic. U‐T2GPH (Markes Int.)   Columna  cromatográfica  empleada:  DB1‐30m  x  0.25mm  x  1µm  (Agilent  Tech.)  Los equipos utilizados son:    Dispositivo CSLRTM (Calibration  Solution  Loading Ring) para  la  inyección de  patrones líquidos en tubos de desorción.   Inyector automático (Ultra TDTMmulti‐tube autosampler) (Markes Int.)  Materiales y métodos  102     Unidad de desorción térmica (TDU) UnityTM (MarkesInt.)   Cromatógrafo de gases 7890A GC System (Agilent Tech.)   Espectrómetro de masas cuadrupolo simple (5975C VL MSD), con fuente de  ionización de impacto electrónico (Agilent Tech.)   Válvula divisora de flujo automático (Deans‐Switch), (Agilent Tech.)  Programas informáticos utilizados:    ChemStation ‐ vE1701E02 E.02 (Agilent Tech.)   Data Analisys (Agilent Tech.)   AMDIS(Agilent Tech.)   Software de Deconvolución DRS (Agilent Tech.)   SPSS V‐15 para Windows ®  Reactivos:  En  este  trabajo  los  compuestos  químicos  empleados  han  sido  los  patrones  cromatográficos,  todos  ellos  de  calidad  para  cromatografía  de  gases,  que  fueron  los  siguientes: ácido propanoico, 2‐butanona, n‐pentano, n‐hexano, hexanal, 2‐metilpentano,  2‐metilhexano,  n‐heptano,  heptanal,  octanal,  nonanal,  ácido  nonanoico,  benceno,  tolueno, estireno e isopreno de la marca Fluka®.  Como  disolventes  para  las  distintas  preparaciones  de  patrones  se  emplearon  metanol  ultrapuro  para  cromatografía  de  líquidos  de  alta  eficacia  (HPLC)  al  99.9%  y  acetona al 99.8% ambas de Panreac®.    Materiales y Métodos  103    4.2. Métodos  Los métodos empleados en este trabajo se han agrupado en 4 apartados:  4.2.1. Diseño del estudio y definición de los grupos  Estudio  casos  control,  con  muestreo  consecutivo  no  probabilístico.  Se  seleccionaron un total de 210 personas, divididas en 3 grupos:    Grupo control: Se incluyeron 89 voluntarios sanos que accedieron a participar  en el estudio. Se  reclutaron mediante divulgación del estudio en el Hospital  Central  de  la Defensa  "Gómez Ulla",  Cuartel General  del  Ejército  del Aire  y  Hospital Clínico San Carlos de Madrid. Estas personas se subdividieron en tres  categorías en función del consumo de tabaco, resultando ser 35 no fumadores,  24 exfumadores y 30 fumadores activos.   Grupo EPOC: Se  incluyeron 40 pacientes con diagnóstico de EPOC en periodo  de  estabilidad  clínica  procedentes  de  los  hospitales  participantes  y  que  acudieron a consulta de revisión.   Grupo  CP:  Se  incluyeron  81  pacientes  con  diagnóstico  histológico  de  CP  procedentes  de  los  hospitales  participantes.  Para  el  TNM  se  aplicó  la  clasificación de Mountain del año 1997124.  El  periodo  de  inclusión  de  los  participantes  abarcó  desde  octubre  de  2010  a  diciembre de 2011.    Materiales y métodos  104    Criterios de inclusión  Los criterios de inclusión para los tres grupos exigieron la aceptación personal para  participar  en  el  estudio,  edad mayor  de  40  años,  ser  no  fumadores,  ex  fumadores,  o  fumadores activos, según criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS). A todos  ellos se  les realizó exploración clínica y complementaria,  incluyendo electrocardiograma,  RX de tórax, hemograma, bioquímica y curva flujo/volumen. Ningún participante presentó  signos o síntomas de enfermedad.   Criterios de exclusión  Se  consideraron  criterios de  exclusión,  la existencia de enfermedad pulmonar o  tumoral actual o previa de  cualquier aparato o  sistema, o  la negativa a participar en el  estudio. No se aplicó restricción por razón de género.     Se  informó  a  todos  los  participantes  del  estudio  de  los  objetivos,  riesgos  y  beneficios, pruebas a realizar y técnicas empleadas para la realización del mismo. Se hizo  entrega  de  un  documento  informativo  previo  a  la  firma  del  consentimiento  informado  (anexo  I).Todos  los  datos  recogidos  concernientes  al  estudio  se  hallan  sujetos  a  lo  establecido en la Ley Orgánica de Protección de Datos 15/1999, de 13 de diciembre, y en  la Ley 41/2002 de Autonomía del Paciente y de Derecho y Obligaciones en el Manejo de la  Información y Documentación Clínica, de 14 de noviembre.   Materiales y Métodos  105    El  protocolo  de  estudio  fue  autorizado  por  el  Comité  de  Ética  e  Investigación  Clínica  del  Hospital  Central  de  la  Defensa  “Gómez  Ulla”  (NºR:  IS‐404030‐S‐06‐000153)  (Anexo II).  4.2.2. Toma de la muestra  La muestra  de  aire  exhalado  de  cada  uno  de  los  participantes  en  el  estudio  se  recogió tras permanecer una hora en reposo, sin fumar y en ayuno. Para  la recogida del  aire  exhalado  se  utilizaron  cámaras  BioVOC®  (Markes  Int.)TM  (figura  14) mediante  una  maniobra  de  espiración  forzada.  El  aire  correspondiente  al  espacio muerto  anatómico  pasa a través del BioVOC, quedando recogido en la cámara la fracción que corresponde al  final de la capacidad vital forzada, siendo lo más representativo posible del aire alveolar.  Esta  maniobra  se  repitió  tres  veces  para  la  preconcentración  de  los  compuestos.  A  continuación se recogió una muestra de aire ambiental de la sala en donde permaneció la  persona estudiada, lo que permitiría comparar los niveles de VOC del aire ambiente y del  exhalado.  Tras cada maniobra, el aire recogido se  traspasó a un  tubo de desorción  térmica  (figura 15) capaz de adsorber compuestos desde C2 hasta C20. El tubo quedó sellado con  tapones DiffLoks para su posterior análisis. Todas  las muestras se analizaron en un plazo  inferior a 24 h desde su recogida.  Materiales y métodos  106        Figura  14.  BioVOC©  Breath  Sampler.  (Markes Int.TM)  Figura 15. Tubo de desorción TO‐17/2 y Dif Locks Caps  (Markes Int.TM)   4.2.3. Selección de compuestos a estudiar    Para delimitar la búsqueda de compuestos de entre los más de mil descritos en la  bibliografía, en una primera etapa, se creó en AMDIS una base de datos compuesta por  42  compuestos  químicos  volátiles  relacionados  con  la  oxidación  de moléculas  que  van  desde  hidrocarburos,  aldehídos  y  cetonas  hasta  ácidos  carboxílicos,  además  de  compuestos  de  naturaleza  exógena  como  son  los  hidrocarburos  aromáticos.  De  esta  manera se ha  limitado el campo de búsqueda a unas decenas de compuestos y no a  las  centenas que están descritas. La relación de compuestos incluidos se muestra en la tabla  15.   Tras aplicar el algoritmo de identificación de AMDIS – DRS se obtuvieron una serie  de  compuestos  que  aparecen  con  relativa  frecuencia  en  el  aire  exhalado  y  en  el  aire  ambiental. Esta selección de compuestos, que  inicialmente se  identificaron por espectro  de masas, posteriormente se confirmaron mediante el empleo del patrón cromatográfico  puro, que tras ser analizado bajo  las mismas condiciones debería de tener concordancia  en el  tiempo de aparición del compuesto  (tiempo de  retención: Rt) y en su espectro de  Materiales y Métodos  107    masas. Se han dado como positivos todos aquellos compuestos en  los que el tiempo de  retención coincidían y la pureza espectral superaba un score del 75%.  Tabla 15. Selección de compuestos Butano  2‐metilpentano Isopreno Hexanal Pentano  3‐metilpentano Limoneno Heptanal Hexano  2‐metilhexano Benceno Octanal Heptano  3‐metilhexano Tolueno Nonanal Octano  4‐metiloctano Estireno Ácido Acético Nonano  2‐metildecano p‐xileno Ácido Propanoico  Decano  5‐metildecano o‐xileno Ácido Hexanoico  Undecano  3‐metiltridecano Fenol Ácido Heptanoico  Dodecano  7‐metiltridecano Benzaldehído Ácido Octanoico  Tridecano  Ciclohexano Acetona Ácido Nonanoico  Tetradecano  Isoctano 2‐butanona   Para  la  selección  final  de  compuestos  a  estudiar,  se  tuvieron  en  cuenta  los  siguientes criterios:  1. Revisiones bibliográficas que  facilitaron descartar VOC no utilizables como  marcadores de CP 66,67,94.  2. Desconocimiento  del  origen metabólico  de muchos  VOC  presentes  en  el  aire exhalado, y que también fueron descartados.  3. Se  incluyeron  VOC  cuyo  origen metabólico  estaba  descrito  previamente  como compuestos resultantes de peroxidación lipídica.  4. La experiencia acumulada por nuestro grupo en cuanto a  la  frecuencia de  aparición de determinados VOC.  Materiales y métodos  108    Finalmente,  centramos  el  estudio  en  aldehídos  lineales  y  ácidos  carboxílicos  lineales, con un número de átomos de carbono comprendido entre 3 y 9. Los VOC a  los  que se ha dado preferencia para el estudio son los siguientes (tabla 16):    Tabla  16.  Nombre  y  fórmula  química  de  los VOC seleccionados para el estudio  Ácido Propanoico    Hexanal    Heptanal    Octanal    Nonanal    Ácido nonanoico      4.2.4. Técnica analítica  La técnica analítica utilizada para el análisis de muestras fue la desorción térmica‐ cromatografía  de  gases  y  espectrometría  de  masas  (DT‐GC/MS)  según  las  siguientes  etapas:   4.2.4.1. Desorción térmica:  Es  un  procedimiento  por  el  cual  se  extraen  de  la matriz  adsorbente  los  gases  contenidos  en  la  muestra  de  aire  exhalado.  Debido  a  la  complejidad  del  sistema,  el  Materiales y Métodos  109    manejo  de  estos  tubos,  la  preparación  de  patrones  para  la  calibración,  así  como  los  procesos  implicados  en  el  análisis  requieren  de  una  descripción más  detallada  que  se  ofrece a continuación.   Acondicionamiento de los tubos de desorción  Los  tubos  de  desorción  han  de  ser  acondicionados  antes  de  cada  análisis,  que  consiste en la desorción de los posibles compuestos que el tubo pueda contener antes de  la  introducción  de  una muestra;  para  ello  se  han  empleado  las  condiciones  térmicas  recomendadas por el  fabricante. Existen dos  tipos de acondicionamiento, uno previo al  primer uso del  tubo, más  intenso,  y otro para posteriores  ciclos de  análisis. Ambos  se  detallan en la tabla siguiente.  Tabla 17. Condiciones de tiempo (s) y temperatura (ºC)  para los acondicionamientos de los tubos  Acondicionamiento inicial Acondicionamiento en uso t (min)  T (ºC) t (min) T (ºC) 60  100 15 100 60  200 15 200 60  300 15 300 60  335 15 335   La vida media de  cada  tubo,  según  indica el  fabricante, es de aproximadamente  100 ciclos de desorción, incluyendo análisis y acondicionamientos.  Materiales y métodos  110     Desorción con fines analíticos  El proceso de desorción de los tubos con fines analíticos implica la introducción de  los mismos  en  un  sistema  automático  de muestreo Ultra  TDTMmulti‐tube  autosampler,  acoplado al sistema de desorción térmica Unity TM Thermal desorber con una trampa fría  hidrofóbica “coldtrap”(Unity General purpose Hydrophobic. U‐T2GPH (Markes Int. Ltd.).  El proceso de desorción comprende 3 etapas:  - Prepurga. Consiste en  limpiar el sistema con He durante 1 minuto a temperatura  ambiente (figura 16).     Figura  16.  Prepurga.  El  flujo  de  helio recorre todo el sistema.    - Desorción  térmica, el  tubo es calentado a 250ºC durante 10 minutos y  los gases  son almacenados en la coldtrap por condensación a 35ºC, actuando como sistema  de preconcentración. (figura 17).   Materiales y Métodos  111      Figura  17.  Calentamiento  del  tubo  de desorción. Se indica el flujo de He,  que va trasportando  la muestra a  la  coldtrap  - Calentamiento de  la coldtrap. Durante 3 minutos se calienta  la coldtrap a 250ºC  para  que  los  componentes  de  la muestra  pasen  a  fase  gaseosa  y  puedan  ser  inyectados en la columna del cromatógrafo de gases (figura 18).    Figura 18. Calentamiento de la  coldtrap y  flujo de He hacia el  GC  4.2.4.2. Separación cromatográfica   Los compuestos procedentes de la coldtrap son inyectados en el cromatógrafo de  gases, modelo 7890 A (Agilent Tech.). Se ha empleado una columna cromatográfica DB1‐ 30 m x 0.25 mm x 1 µm, como fase estacionaria, y helio como gas portador (fase móvil). Al  Materiales y métodos  112    final de  la columna y antes de  la entrada al detector de masas se  instaló una válvula de  división  de  flujo  (Deans  Switch)  que  permitió  dividir  el  flujo  de  la muestra  durante  el  proceso  cromatográfico. Esta  válvula  se  abre en el minuto 0.30 permaneciendo  abierta  hasta el minuto 4:30. Durante este periodo de tiempo se elimina la mayor parte del agua  contenida en la muestra del aire exhalado, sin llegar a perder ninguno de los compuestos  utilizados para la validación del método ni de los buscados en el aire exhalado.   Las  rampas de  temperatura empleadas se  recogen en el siguiente gráfico  (figura  19):            .  Figura 19. Método analítico de cromatografía  La cromatografía programada se inició con una fase isotérmica a una temperatura  de  45ºC  durante  10  minutos,  seguida  de  una  rampa  de  temperatura  programada  a  20ºC/min hasta  llegar a 250ºC, donde  se mantiene en  fase  isotérmica durante otros 10  minutos más. Como última etapa se programó un último gradiente hasta los 300ºC a una  velocidad de 30ºC/min permaneciendo a esta temperatura 5 minutos más. La finalidad de  esta  última  etapa  es  la  eliminación  de  cualquier  compuesto  que  haya  podido  quedar  Materiales y Métodos  113    retenido y evitar de esta manera la aparición de picos fantasma en posteriores análisis.  4.2.4.3.‐Determinación e identificación de compuestos por MS   El detector de masas empleado es un 5975C VL MSD  (Agilent Tech.) cuadrupolo  simple, con una fuente de ionización de impacto electrónico.   - Voltaje relativo de 200 eV del fotomultiplicador.  - La temperatura del cuadrupolo es de 150ºC y la de la fuente de ionización de  230ºC.  - El modo  de  adquisición  de  datos  fue  en  SCAN  con  una  velocidad  de  5.27  espectros por segundo.  - El rango de masas para la detección se fijó entre 40 y 300 m/z.    Figura 20. Equipo de Desorción térmica‐ GC/MSD utilizado  El tratamiento de datos se realizó a partir del cromatograma iónico total (TIC), que  fue procesado mediante el programa de deconvolución DRS y AMDIS 32. Los compuestos  Materiales y métodos  114    se  identificaron mediante su tiempo de retención  (Rt) y espectro de masas referenciado  en la librería de espectros NIST 08, por medio de patrones cromatográficos.  Se consideró el “límite de detección” (LOD) de un compuesto cuando éste se pudo  identificar mediante  su espectro de masas,  tiempo de  retención  y  con una  abundancia  relativa mayor o  igual a 3 veces  la  relación  señal/ruido, mientras que para el “límite de  cuantificación” (LOQ) se exigió 10 veces la relación señal/ruido (figura 21). De acuerdo con  estos “límites” ‐LOD y LOQ‐, definimos:  1. Compuestos no detectados (ND), aquéllos cuyo valor se encuentra por debajo de  su LOD.  2.  Compuestos  no  cuantificados  (NQ),  aquéllos  que  son  detectados  pero  no  es  posible su cuantificación, es decir, cuyos valores se encuentran entre su LOD y su  LOQ.  3. Compuestos cuantificados (Q), los que presentan valores por encima de LOQ.    Figura 21. TIC donde se indican el LOD y LOQ para cada compuesto y el siloxano con el ion 207  Materiales y Métodos  115    Los  datos  cuantitativos  se  obtuvieron mediante  la  integración  del  área  bajo  la  curva del  ión cuantificador del espectro de masas para cada uno de  los VOC, medido en  cuentas por segundo (cps). Dada  la posible variabilidad que pudiera existir en el proceso  de desorción, los datos se normalizaron en función del área del ión 207 (correspondiente  al hexametilciclotrisiloxano), utilizado como compuesto de referencia interno, procedente  de los tubos de desorción.   Todos los valores cuantitativos se calcularon mediante la fórmula:  ( ABCVOC) / (ABCSiloxano )  x  100  Donde ABC : área bajo la curva de cada compuesto.  Para  el  tratamiento  estadístico  de  los  datos,  se  acordó  que  los  compuestos  no  detectados se les asignarían el valor correspondiente a la mitad de su límite de detección,  mientras que para  los compuestos detectados pero no  cuantificados, el valor asignado  sería la mitad de su límite de cuantificación.  Se asumió que un compuesto era endógeno cuando mostraba relación de valor en  aire exhalado/ambiental mayor a 1 y exógeno cuando esta relación era menor de 1.   Preparación de los patrones cromatográficos    La identificación de los compuestos se realizó mediante el análisis de los patrones  de calibración, midiendo el tiempo de retención (Rt) bajo las condiciones cromatográficas  empleadas y contrastando su espectro de masas.  Materiales y métodos  116      Para  cada  uno  de  los  patrones  se  prepararon  dos  disoluciones  utilizando  como  disolventes:  acetona,  para  inyección  directa  a  la  columna  y  metanol,  para  inyección  mediante  tubos de desorción.  La  selección de estos disolventes  se  realizó  siguiendo  las  indicaciones de compatibilidad  recomendadas por los fabricantes.  Se realizaron 6 diluciones seriadas en acetona a diferentes concentraciones, de las  que  se  inyectó  1  µl  mediante  inyección  directa  a  través  del  puerto  de  inyección  y  aplicando un Split de 1:6.    En  una  segunda  fase  de  calibración  y  siguiendo  la  misma  metodología,  se  prepararon disoluciones en metanol a de los diferentes patrones y se introdujo 1 µl en los  tubos de desorción, utilizando un dispositivo de  inyección portátil CSLRTM  (figura 22). A  continuación,  los  tubos  son  secados  con una  corriente de He a un  flujo de 100 ml/min  durante 20 minutos, consiguiendo la eliminación mayoritaria del disolvente pero sin llegar  al  punto  de  ruptura  donde  se  empiezan  a  eliminar  nuestros  compuestos.  Este  procedimiento se ha realizado siguiendo  las  indicaciones del fabricante. Por último, cada  tubo es retirado del CSLR y sellado con tapones DiffLok, para su posterior análisis.     Figura 22. Dispositivo de inyección CSLR TM   Materiales y Métodos  117     Proceso de validación del método analítico  El método analítico ha sido validado basándonos en los criterios descritos en la ICH  Q2. Validation of Analytical Procedures‐2005125. Como estándar  interno en  los  tubos  se  utilizó  el  hexametilciclotrisiloxano  procedente  de  los  tubos  de  desorción.  Para  la  validación  del  método  se  han  utilizado  los  compuestos  descritos  anteriormente,  empleando además: 2‐butanona, n‐pentano, n‐hexano, 2‐metilpentano, 2‐metilhexano, n‐ heptano,  benceno,  tolueno,  estireno  e  isopreno.  Todos  ellos  se  hallan  descritos  en  la  bibliografía como compuestos presentes en el aire exhalado o en el aire ambiental. Nos  van  a  servir  para  identificar  compuestos  que  puedan  resultar  interferencias  o  contaminantes. Además, se pueden emplear para la validación del método analítico.  Para  evaluar  la  estabilidad  de  la muestra  en  los  tubos  de  desorción  durante  el  almacenamiento, se prepararon diversos tubos cargados con los patrones y se analizaron  a la hora, 24 horas, 1 semana y 2 meses.   Se ha estudiado:   Selectividad (para detectar y cuantificar diferentes compuestos a partir del tiempo  de retención de los picos cromatográficos y de la respuesta del detector).    Linealidad  del método:  Para  evaluar  la  posible  respuesta  lineal  se  analizarán  6  muestras control a diferentes concentraciones: 5, 10, 25, 50, 75 y 100 ppm, según  la  metodología  analítica  fijada  en  el  apartado  anterior.  Este  ejercicio  se  ha  realizado por duplicado.   Límite de la detección (LOD): calculado como 3 veces la relación señal/ruido.  Materiales y métodos  118     Límite de la cuantificación (LOQ): calculado como 10 veces el LOD.   Exactitud:  mediante  el  análisis  de  una  concentración  definida,  realizando  3  mediciones.   Precisión  analítica:  mediante  el  análisis  a  tres  concentraciones  diferentes,  realizando 2 duplicados de cada concentración.    Precisión intermedia: calculada como la desviación de estándar relativa (el RSD%).  En  este  apartado  queda  incluida  la  determinación  de  los  parámetros  analíticos  para los procesos de desorción, cromatografía y espectrometría de masas.  Así mismo,  las  condiciones  fijadas  sobre  los  patrones  disponibles,  se  aplicarán  sobre muestras de aire exhalado.  4.2.5. Análisis estadístico  Variables  Se  considerarán  variables  independientes:  edad,  género,  fumador,  exfumador,  no  fumador, personas  con y  sin  cáncer de pulmón y personas  con y  sin EPOC. También  se  considerará  variable  independiente  a  los  estadios  TNM  (politómica),  histología,  escala  GOLD de EPOC.  Serán variables dependientes cuantitativas  las derivadas de  las determinaciones de  los siguientes VOC: aldehídos y ácidos carboxílicos.  Estadística descriptiva  Previa verificación del test de normalidad de las distribuciones de los distintos VOC  en  aire  exhalado  (test  de  Kolmogorov‐Smirnov)  se  empleará  como  índice  de  tendencia  Materiales y Métodos  119    central  y  de  dispersión,  la media  aritmética  y  la  desviación  típica  para  distribuciones  paramétricas; o la mediana y el rango intercuartílico, para distribuciones no paramétricas.  Su representación gráfica se realizará mediante gráficos de barras de error con IC95%.   Las  variables  independientes  y  dependientes  categorizadas  se  expresarán  mediante sus frecuencias relativas y gráficamente mediante diagramas de sectores.   Estadística analítica  Las  asociaciones  entre  la  variables  independientes  dicotómicas  y  dependientes  cuantitativas  (VOC) se realizará mediante test de comparación de medias para muestras  independientes (t Student Fischer) o de medianas (test no paramétrico de las medianas o  test U‐Mann Whitney). El efecto y  la precisión de  los mismos se verificarán mediante  la  diferencia de medias o de medianas y sus correspondientes IC95%.   Las  asociaciones  entre  variables  independientes  politómicas  y  dependientes  cuantitativas (VOC) se comprobarán mediante ANOVA de una vía o test de Kruskal Wallis  para distribuciones paramétricas o no paramétricas, respectivamente.   Las comparaciones múltiples  se verificarán mediante  los  test de comparación de  medias  anteriormente  mencionadas  con  la  corrección  del  grado  de  significación  estadística en función del número de comparaciones o test de Bonferroni.   Se  comprobará  la  correlación  lineal  de  las  variables  dependientes  cuantitativas  mediante el test de Pearson (distribuciones paramétricas) o de Spearman (distribuciones  no  paramétricas).  La  asociación  entre  variables  independientes  y  dependientes  Materiales y métodos  120    categóricas se verificará mediante el test 2 de Pearson, y en el caso de ser dicotómicas, la  prueba exacta de Fischer. Para valorar  la determinación de VOC en aire exhalado como  prueba diagnóstica del CP se calculará el valor predictivo positivo  (VPP), valor predictivo  negativo (VPN), sensibilidad y especificidad.  Se realizará  la estimación del riesgo mediante  la razones de prevalencia (RP) y su  correspondiente IC95%.  Se consideró como asociación estadísticamente significativa para todos los análisis  estadísticos a un valor de p<0,05.   Para todo ello se empleará el programa estadístico SPSS® v.17. (SPSS  inc. Chicago,  IL, USA) Epidat 3.1.        RESULTADOS Resultados  123    5. RESULTADOS  5.1. Validación del método analítico    Debido a la gran cantidad de compuestos presentes en el aire exhalado, la mayoría  de ellos desconocidos, es difícil obtener picos cromatográficos completamente resueltos.  No obstante, no es  interesante el desarrollo de un método analítico específico para un  compuesto hasta no estar seguros de que este tiene un valor predictivo importante de la  enfermedad.  El  empleo  de  un  detector  de  masas  permite  la  deconvolución  de  los  espectros  de  masas  solapados  en  un  pico,  permitiendo  discriminar  las  señales  correspondientes  al  compuesto de  interés  y  eliminando en  gran medida  los problemas  derivados de la falta de selectividad.     Se  han  seguido  las  pautas  de  validación  del método  analítico  descritas  en  los  procedimientos  ICH  Q2.  Validation  of  Analytical  Procedures‐2005,  que,  si  bien,  están  orientadas  a  la  realización  de  análisis  en  entornos  regulados  como  la  industria  farmacéutica, es útil a la hora de establecer los límites de una técnica aplicada al análisis  de muestras biológicas.  5.1.1 Selectividad  Se analizan las diferentes disoluciones de patrones para identificarlos mediante su  espectro de masas  y  tiempo de  retención. En  las  figuras 23  y 24 quedan  recogidos  los  cromatogramas de las disoluciones en acetona y metanol respectivamente de los patrones  empleados. A la derecha aparece el tiempo de retención para cada uno de ellos. Se puede  Resultados  124    observar  que  el  ión  207  correspondiente  al  hexametilciclotrisiloxano  aparece  en  la  inyección mediante TDU con la utilización de los tubos de desorción. La introducción de la  etapa de desorción  térmica produce un desplazamiento de  los  tiempos de  retención de  aproximadamente un minuto, debido al tiempo que trascurre desde el calentamiento de  la coldtrap y la llegada de los compuestos a la columna cromatográfica.    Figura 23. Cromatograma de patrones tras la inyección directa (en acetona). Identificación y tiempo de  retención.      12  13 14  11  10 9 8 1 2 3 4 5 6 7 Resultados  125      Figura  24.  Cromatograma  de  patrones  tras  la  inyección  mediante  TDU  (disolución  en  metanol).  Identificación y tiempo de retención.    En  las muestras  de  aire  de  pacientes  reales  aparecen muchos más  compuestos  (más de 1600 picos cromatográficos), por  lo que obtener picos completamente resueltos  no es una prioridad de este método analítico. En cambio sí es prioritaria  la capacidad de  detectar un amplio rango de especies químicas.  5.1.2. Linealidad  El  comportamiento del  sistema  es  lineal para  valores  amplios de  concentración,  como puede apreciarse en las tablas siguientes. Tras la el ensayo con tubos de desorción  cargados  con  patrones,  se  obtuvo  respuesta  lineal  en  un  intervalo  de  concentraciones  equivalentes en aire exhalado desde de los 2 ng/l hasta más de 1000 ng/l.      1,2  3,4  5  6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Ion 207 Resultados  126    Tabla 18. Datos de calibración para los patrones en metanol mediante inyección con TDU.  Patrón (dilución en metanol)  Ión Tg Rt (min) X (106) C (*106)  r2  Pentano  43 5.55 5.16 ‐2.97  0.99  Isopreno  67 5.56 4.73 8.1  0.984  Hexano  57 7.54 6.02 1.04  0.993  Benceno  78 8.68 1.80 3.9  0.983  2‐metilhexano  43 8.95 7.99 1.38  0.992  Ácido propanoico 74 9.1 1.99 ‐1.38  0.999  Heptano  43 9.59 5.58 1.65  0.993  Tolueno  91 10.71 2.16 8.51  0.992  Hexanal  44  11.02  3.38  1.47  0.991  Heptanal  70 12.57 1.99 3.54  0.995  Estireno  104 12.63 1.76 2.74  0.994  Octanal  43 13.79 2.77 1.06  0.993  Nonanal  57 14.81 4.09 2.77  0.993  Ácido nonanoico 60 16.04 3.05 ‐2.11  0.940    Los  compuestos 2‐metilpentano  y 2‐butanona  representaron un  serio problema.  Este par  crítico  fueron eliminados del estudio por  su baja  resolución. Además,  son dos  compuestos  que  comparten  un  elevado  porcentaje  del  espectro  de masas.  Todo  ello,  unido  a  que  el  2‐metilpentano  ya  estaba  incluido  dentro  del  grupo  de  compuestos  de  origen incierto, llevó a eliminarlos y no optimizar esta parte de la cromatografía.  5.1.3. Límites de detección y cuantificación  Los valores de estos  límites ya normalizados  frente al  ión 207 de  los compuestos  objeto de estudio, se recogen en la tabla 19.         Resultados  127    Tabla 19. Valores de los LOD y LOQ para cada VOC a estudio.  Compuesto  LOD LOQ Ácido propanoico 0.21 0.35 Hexanal  0.19 0.40 Heptanal  0.11 0.29 Octanal  0.15 0.30 Nonanal  0.32 0.43 Ácido nonanoico  0.27 0.52   5.1.4. Exactitud  La exactitud se ha evaluado como porcentaje de contenido de los patrones de  concentración conocida sobre la recta de calibrado. Los datos quedan reflejados en la  tabla 20.  Tabla 20. Valores de exactitud Compuesto % Contenido Pentano 99% Isopreno 103% Hexano 102% Benceno 93% 2‐metilhexano 102% Ácido propanoico 101% Heptano 101% Tolueno 101% Hexanal 101% Heptanal 104% Estireno 109% Octanal 104% Nonanal 104% Ácido nonanoico 101%   5.1.5. Precisión analítica  La  precisión  se  evalúa  mediante  la  repetibilidad  instrumental  y  la  precisión  intermedia. Los datos obtenidos quedan recogidos en la tabla 21.  Resultados  128    Tabla 21. Repetibilidad instrumental Compuesto  Valor RT (min) Área (cps)  Pentano  Media  5,55  2585551  SD  0,002  205253,44  RSD %  0,05%  7,94%  Isopreno  Media  5,56  2604558  SD  0,002  183364,55  RSD %  0,04%  7,04%  Hexano  Media  7,54  1973844  SD  0,002  158154,76  RSD %  0,03%  8,01%  Benceno  Media  8,68  5872776  SD  0,002  383564,15  RSD %  0,02%  6,53%  2‐metilhexano  Media  8,95  2708977  SD  0,002  221884,47  RSD %  0,02%  8,19%  Ácido propanoico  Media  9,10  137545  SD  0,002  28368,51  RSD %  0,04%  20,62%  Heptano  Media  9,59  2561910  SD  0,002  197310,26  RSD %  0,01%  7,70%  Tolueno  Media  10,71  8782080  SD  0,002  489678,12  RSD %  0,02%  5,58%  Hexanal  Media  11,02  1089128  SD  0,002  41842,52  RSD %  0,02%  3,84%  Heptanal  Media  12,57  1039305  SD  0,002  33300,39  RSD %  0,02%  3,20%  Estireno  Media  12,63  6174170  SD  0,002  297378,28  RSD %  0,02%  4,82%  Octanal  Media  13,76  8396950  SD  0,002  29902,78  RSD %  0,02%  3,56%  Nonanal  Media  14,78  1025445  SD  0,0023  29572,50  RSD %  0,02%  2,88%  Ácido nonanoico  Media  16,02  7889852  SD  0,002  122715,55  Resultados  129    RSD %  0,02%  1,55%    Como se observa en la tabla 21, los valores de tiempo de retención muestran una  mínima  variabilidad,  siendo  muy  estables  y  bien  diferenciados.  Con  respecto  a  la  respuesta en área, a pesar de que esta muestra una variabilidad sensiblemente superior a  la del  tiempo de  retención, debe considerarse que  se han  realizado mediante  inyección  manual,  por  lo  que  los  valores  obtenidos  son  adecuados  para  la  cuantificación.  Caso  aparte  es  el  ácido  propanoico,  cuya  respuesta  en  masas  es  más  baja  debido  a  las  dificultades para su ionización.  5.1.6. Precisión intermedia  Los resultados de precisión intermedia que aparecen en la tabla 22, son adecuados  para  los objetivos de bioanálisis en un  sistema mucho más complejo que  los habituales  sistemas  de  cromatografía  de  gases  o  de HPLC. Globalmente  la  respuesta  presenta  un  coeficiente de variación en el entorno del 10%.  Tabla 22. Valores de precisión intermedia Compuesto  Valor RT (min) Área (cps)  Pentano  Media  5,55  2532780  SD  0,004  348004,04  RSD %  0,06%  13,74%  Isopreno  Media  5,56  2547224  SD  0,0033 304138,54  RSD %  0,05% 11,94%  Hexano  Media  7,54  1926886  SD  0,002  261478,43  RSD %  0,03%  13,57%  Benceno  Media  8,68  5703674  SD  0,003  708966,69  Resultados  130    RSD %  0,04%  12,43%  2‐metilhexano  Media  8,95  2634854  SD  0,003  355178,39  RSD %  0,03%  13,48%  Ácido propanoico  Media  9,10  133197  SD  0,003 24135,32  RSD %  0,04%  18,12%  Heptano  Media  9,59  2493616  SD  0,003  330154,80  RSD %  0,03%  13,24%  Tolueno  Media  10,71  8544158  SD  0,003 1006501,8  RSD %  0,03% 11,78%  Hexanal  Media  11,02  1063268  SD  0,002 118767,03  RSD %  0,02% 11,17%  Heptanal  Media  12,57  1022731  SD  0,002 105034,42  RSD %  0,02% 10,27%  Estireno  Media  12,63  6018995  SD  0,002 684359,75  RSD %  0,02% 11,37%  Octanal  Media  13,76  824743  SD  0,004 87505,186  RSD %  0,03% 10,61%  Nonanal  Media  14,78  1007232  SD  0,003 101126,07  RSD %  0,02% 10,04%  Ácido nonanoico  Media  16,02  7796375  SD  0,003  132196,44  RSD %  0,03%  1.69%    5.1.7. Estabilidad de muestra  Como  se muestra en  la  figura 25,  la muestra es estable a  los 60 días  cuando  se  conservan con un cierre hermético. Sin embargo, los aldehídos muestran una pérdida del  Resultados  131    10% cuando la muestra es conservada con el cierre de los tapones DiffLok, observándose  un aumento de ácido nonanoico proporcional a la pérdida de nonanal.             A la vista de estos resultados, puede concluirse que el método es adecuado para la  búsqueda de nuevos marcadores en muestras de aire exhalado de pacientes.      Figura 25. Análisis de estabilidad de los compuestos y fugas en los tubos  de desorción a los dos meses.  Resultados  132    5.2. Análisis demográfico  Nuestra población de estudio consta de 210 personas distribuidas en tres grandes  grupos, cuyas características demográficas quedan recogidas en la tabla 19.    Tabla 23. Características demográficas de la población de estudio    Controles=89  EPOC=40  CP=81  Edad (media en años)*  49.3 (9.5)  74.2(10.0)  68.5(11.1)  Género    Hombres  42  (47%)  37  (93%)  64  (79%)  Mujeres  47  (53%)  3  (7%)  17  (21%)  Historia de Tabaquismo    Fumadores  30  (34%)  34  (85%)  50  (62%)  Exfumadores  24  (27%)  5  (12.5%)  22  (27%)  no fumadores  35  (39%)  1  (2.5%)  9  (11%)  Tabaquismo (IPA)*    Fumadores  30.9(18.6)  123(29.5)  77.5(50.6)  Ex fumadores  26.5(21.6)  72.5(34.3)  63.0(34.1)  Histología   (%)    Epidermoide  ‐  ‐  27.2 %  Adenocarcinoma  ‐  ‐  39.5%  Indiferenciado  ‐  ‐  18.5%  Células Grandes  ‐  ‐  2.5%  Carcinoide  ‐  ‐  1.2%  Microcítico  ‐  ‐  11.1%  TNM    IA  ‐  ‐  8.6%  IB  ‐  ‐  6.2%  IIA  ‐  ‐  7.4%  IIB  ‐  ‐  2.5%  IIIA  ‐  ‐  28.4%  IIIB  ‐  ‐  14.8%  IV  ‐  ‐  32.1%  GOLD(%)    1  ‐  10%  13.6%  2  ‐  32.5%  25.9%  3  ‐  25%  13.6%  4  ‐  32.5%  17.3%  Sin EPOC      ‐  29.6%  *media    Resultados  133     Grupo 1: GRUPO CONTROL  Compuesto  por  89  personas,  todas  ellas  voluntarias,  asintomáticas  y  presuntamente  sanas,  con  una  edad media  de  49,3  (9.5)  años.  En  cuanto  a  la  distribución por género, un 47% eran hombres y un 53% mujeres. De ellos, un 39%  eran no fumadores, un 34% fumadores y un 27% exfumadores, con un consumo de  tabaco de 30.9  (18.6) paquetes por año  (IPA) para  los  fumadores, e  IPA de 26.5  (21.6)  para los exfumadores. (Figuras 26 y 27).  Figura  26.  Distribución  por  género  en  el  grupo control.  Figura 27. Distribución por tabaquismo e IPA en el  grupo control   Grupo 2: GRUPO EPOC  Compuesto por 40 pacientes con diagnóstico de EPOC en estabilidad clínica,  con una edad media de 74.2 (10.0) años. El 93% eran hombres y un 7% mujeres.  Con  respecto  al  tabaquismo,  el  85%  eran  fumadores  activos  con  un  IPA  de  123  (29.5), el 12.5% eran exfumadores con un IPA de 72,5(34.3) y el 2.5% no fumadores,  correspondiente a una persona con déficit de α1‐antitripsina (figura 28). En cuanto  a  la clasificación GOLD, el 10% eran EPOC  leves (GOLD 1), 32.5% eran moderados  (GOLD 2), el 25% severos (GOLD 3) y el 32.5% graves (GOLD 4), (figura 29).  53% 47% Mujeres Hombres 0 10 20 30 40 No fumadores Ex Fumadores Fumadores 39 27 34 0 30,9 26,5 % voluntarios IPA Resultados  134      Figura 28. Porcentaje de pacientes en función  del tabaquismo e IPA en el grupo EPOC.    Figura  29.  Distribución  en  %  de  los  pacientes con EPOC según escala GOLD.  Grupo 3: GRUPO CÁNCER DE PULMÓN  Compuesto  por  81  pacientes  con  diagnóstico  histológico  de  cáncer  de  pulmón, con una edad media de 68.5 (11.1) años, 64 de ellos hombres (79%) y 17  mujeres (21%) (figura30). El 62% eran fumadores activos con un IPA de 77.5 (50.6),  el 27% exfumadores, con un  IPA de 63.0  (34.1), y el 11% restante, no  fumadores  (figura 31).  Figura 30. Distribución por género del grupo CP.  Figura  31.  Porcentaje  de  pacientes  en  función  del   tabaquismo e IPA en el grupo CP.  El grupo histológico predominante entre los NICP eran adenocarcinomas con  un  39.5%  y  epidermoides  con  un  27,2%.  Los  carcinomas  no  microcíticos  indiferenciados representaron el 18,5%, mientras que  los de células grandes sólo  un 2,5%. El ICP se diagnosticó en el 11,1% de  los casos, y el carcinoide en el 1,2%  (figura 32). En referencia al estadio del tumor (TNM – Se utilizó la clasificación de  0 50 100 150 No Fumadores Ex Fumadores Fumadores 2,5 12,5 85 0 72,5 123 % pacientes Tabaquismo (paq*año) 10% 32,50 % 25% 32,50 % Leve Moderado Severo Grave 21% 79% Mujeres Hombres 0 20 40 60 80 No Fumadores Ex Fumadores Fumadores 9 22 50 0 63 77,5 nº pacientes IPA Resultados  135    Mountain de 1997), el 75,3% de los casos correspondieron a estadios avanzados –  IIIA (28,4%), IIIB (14,8%) y IV (32,1%), y el resto, 24,7% a los estadios IA (8,6%), IB  (6,2%), IIA (7,4%) y IIB ( 2,5%) (figura33).  Figura  32.  Distribución  del  grupo  CP  en  función  de  la  histología.     Figura  33.  Distribución  del  grupo  CP  según  estadio TNM  El 70% de los casos de CP están diagnosticados, a su vez, de EPOC, la mayoría  de  carácter  moderado  (26%).  El  30%  restante  no  presentaba  enfermedad  obstructiva (figura 34). La distribución por histología y estadio diferenciando entre  CP con EPOC y sin EPOC queda recogido en las figuras 35 y 36 respectivamente.        Figura 34. Distribución del grupo CP  según escala GOLD  Figura 35. Histología del grupo CP  diferenciando entre CP con EPOC y CP  sin EPOC.  Figura 36. Estadio TNM del grupo CP  diferenciando entre CP con EPOC y CP  sin EPOC.      39,50% 27,20% 11,10% 2,50% 18,50% 1,20% Adenocarcinoma Epidermoide Microcítico Células Grandes Indiferenciado Carcinoide 8,60% 6,20% 7,40%2,50% 28,40% 14,80% 32,10% IA IB IIA IIB IIIA IIIB IV 13% 25,9 %13,6% 17,3% 29,6% GOLD 1 GOLD 2 GOLD 3 GOLD 4 Sin EPOC 0 20 40 60 CP con EPOC CP sin EPOC Adenocarcinoma Epidermoide Indiferenciado Carcinoide Microcítico 0 20 40 CP con EPOC CP sin EPOC IA IB IIA IIB Estadio ‐TNM Resultados  136    5.3. Categorización según la determinación de los VOC  Se obtuvieron 3 categorías según los valores detectados fueran a) cuantificados (Q),  b) no cuantificados (NQ), y c) no detectados (ND), según criterios definidos anteriormente.  La distribución de las frecuencias queda recogida en la tabla 24 y representada en  la figura 37.  Tabla 24. Distribución de frecuencias en función de la categoría     Categorías       No detectado  No cuantificado  Cuantificado    Total  Hexanal   155  (74%) 13  (6%) 42  (20%) 210  Heptanal    124  (59%)  9  (4%)  77  (37%)    210  Octanal   173  (82%) 8  (4%) 29  (14%) 210  Nonanal   112  (53%) 14  (7%) 84  (40%) 210  Ácido Propanoico    91  (43%) 10  (5%) 109  (52%) 210  Ácido Nonanoico    167  (79.5%) 1  (0.5%) 42  (20%) 210        Figura 37. Distribución de frecuencias (%) según las categorías de no detectado (ND), no cuantificado (NQ)  y cuantificado (Q).  Q NQ ND0% 20% 40% 60% 80% 100% Hexanal Heptanal Octanal Nonanal Ácido Propanoico Ácido Nonanoico 20% 37% 14% 40% 52% 20% 6% 4% 4% 7% 5% 0,50% 74% 59% 82% 53% 43% 79,50% Q NQ ND Resultados  137    En  la  figura  38  quedan  representados  el  porcentaje  de  los  VOC  detectados  en  función de los diferentes grupos de estudio, Control, EPOC y CP.    Figura 38. Porcentaje de personas en  los que se detecta  la presencia de  los VOC  para cada grupo de estudio    5.3.1. Estudio del grupo control  El  grupo  control  se  divide  en  tres  categorías  en  función  del  tabaquismo:  no  fumadores, exfumadores y fumadores activos, según fueron descritos en el apartado 4.2.1  de Material y Métodos. Sus características demográficas están recogidas en  la tabla 19  ‐  características demográficas de la población de estudio.   Tras  aplicar  el  test  de  Kolmogorov‐Smirnov  se  comprobó  que  la  distribución  de  frecuencias  para  los  diferentes VOC  no  cumplía  criterios  de  normalidad,  por  lo  que  se  tomó  como  valor de  referencia de medida de  tendencia  central,  la mediana  y el  rango  intercuartílico. La distribución de las frecuencias queda recogida en la tabla 25.  Control CP EPOC 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 17% 32% 15% 35% 48% 16% 18% 40% 27% 44% 54% 32% 33% 43% 13% 44,4 58% 5% Control CP EPOC Resultados  138      En  la tabla 26 se recogen  los valores de mediana (IQR) para cada uno de  los VOC  estudiados  referidos  a  los  diferentes  subgrupos  del  grupo  control.  Únicamente  se  observan diferencias estadísticamente significativas para el nonanal entre las 3 categorías  dentro del GRUPO CONTROL: no  fumadores 0.160  (0.160 – 0.215), ex  fumadores 0.160  (0.160 – 5.650) y fumadores 2.050 (0.160 – 10.25), (p=0.04). Los valores de p, basados en  el test de Mann Whitney, comparando los grupos dos a dos, quedan reflejados en la figura  39.  *Test de Kruskal Wallis  (i) Valores adimensionales calculados mediante  la fórmula  ( ABCVOC) /  (ABCSiloxano )   x   100, donde ABC  : área  bajo la curva del ion cuantificador medido en cps para cada VOC y Siloxano que es utilizado como compuesto  de referencia interno.    Tabla 25. Distribución de frecuencias de detección de los VOC en el grupo control. Categorías   No detectado No cuantificado Cuantificado  Hexanal  64  (72%) 10  (11%) 15  (17%)  Heptanal  56  (63%) 5  (6%) 28  (31%)  Octanal  72  (81%) 4  (4%) 13  (15%)  Nonanal  49  (55%) 9  (10%) 31  (35%)  Ácido Propanoico  41  (46%) 5  (6%) 43  (48%)  Ácido Nonanoico  74  (83%) 1  (1%) 14  (16%)  Tabla 26. Mediana(i) y rango intercuartílico de cada VOC en cada grupo y valor de p*  Mediana y rango intercuartílico     No fumadores=35 Exfumadores=24 Fumadores=30    p* Hexanal    0.095  (0.095‐ 0.200) 0.095 (0.095 ‐ 0.200) 0.095 (0.095 – 6.19)    0.181 Heptanal    0.055 (0.055 ‐0.930) 0.055 (0.055 – 1.300) 0.055 (0.055 – 1.960)    0.701 Octanal    0.075 (0.075 ‐ 0.750) 0.075 (0.075 ‐ 0.750) 0.075 (0.075 ‐ 0.750)    0.604 Nonanal    0.160 (0.160 – 0.215) 0.160(0.160 – 5.650) 2.050 (0.160 – 10.25)    0.041 Ácido Propanoico    0.175 (0.105 – 2.090) 0.105(0.105 – 1.840) 2.200 (0.105 – 6.27)    0.153 Ácido  Nonanoico    0.135 (0.135 ‐ 0.260) 0.135 (0. 135 ‐ 0. 135) 0.135 (0. 135 ‐ 0. 135)    0.560 Resultados  139      Figura 39. Representación de medianas e IQR de nonanal referido a  los 3 subgrupos del grupo control. Valores de p basados en el test  de la U de Mann Whitney    Aunque la dispersión de datos es elevada, los resultados obtenidos en fumadores y  exfumadores ‐ es decir, en todas aquellas personas que tienen o han tenido contacto con  el tabaco‐ , resultan bastante coincidentes, tal como aparece reflejado en la figura 39, de  modo que  los valores de  los primeros se solapan en  los resultados de  los segundos. Este  comportamiento  nos  ha  llevado  a  considerar  a  fumadores  y  exfumadores  en  un  único  grupo de tabaquismo, al que enfrentaremos al subgrupo de no fumadores, para estudiar  el efecto del tabaco.   En el estudio de comparación de  los datos obtenidos entre estos dos grupos, el  nonanal  vuelve  a  mostrar  significación  estadística  entre  ambos  ‐tabaquismo  vs  no  tabaquismo‐  (test de U de Mann Whitney  (p= 0.019)). El  resto de  los VOC no muestran  diferencias entre los grupos citados (tabla 27).      Resultados  140    Tabla  27. Mediana(i)  de  cada  uno  de  los marcadores  en  el  grupo  control  y  el  valor  de  p  que  evalúa  la  diferencia entre ellos.      Mediana         No fumadores N=35  Fumadores + exfumadores N=54    Valor de p* Hexanal    0.095 0.095   0.256 Heptanal    0.055 0.055   0.427 Octanal    0.075 0.075   0.361 Nonanal    0.16 0.215   0.019 Ácido Propanoico    0.175 0.448   0.225 Ácido Nonanoico    0.135 0.135   0.285 *Test U de Mann‐Whitney  (i) Valores adimensionales calculados mediante la fórmula ( ABCVOC) / (ABCSiloxano )  x  100, donde ABC : área bajo la curva  del ion cuantificador medido en cps para cada VOC y Siloxano que es utilizado como compuesto de referencia interno.      Figura 40. Cromatogramas (TIC) superpuestos para los tres subgrupos del grupo Control.  En  la  figura 40  se muestran  los TIC  superpuestos de  los  tres  subgrupos del grupo  control, trazados en diferente color. Se puede observar  la presencia de nonanal en el TIC  correspondiente a un fumador.  Fumador Ex fumador  No fumador Nonanal Resultados  141    Se realiza un análisis cualitativo de detección / no detección de VOC en función de  nuestros  límites de  detección  y  cuantificación  (LOD  y  LOQ)  previamente  establecidos  y  definidos  en Materiales  y Métodos.  La  distribución  de  frecuencias  en  porcentaje  y  los  valores de “p” calculados con χ2 quedan recogidos en la tabla 28. De nuevo el nonanal fue  el único compuesto que presentó diferencias estadísticamente significativas entre todos y  cada  uno  de  los  subgrupos  del  grupo  control  (no  fumadores  20%,  fumadores  53%  y  exfumadores 29%), con una p=0.016.   * Test de Χ2 de Pearson    Dado que, en nuestra muestra,  los valores de nonanal están  relacionados con el  consumo de  tabaco, decidimos estudiar  la  relación entre  la cantidad de  tabaco  fumado  (expresado en  IPA) y  la cantidad de nonanal exhalado. Tras aplicar el test de correlación  lineal de Spearman, no observamos correlación estadística (p=0.823).   Tampoco  se  encontró  correlación  entre  el  nonanal  con  la  edad  y  el  género  (hombres: r=0,05, p=0,753 y en mujeres: r=0,081, p=0,588).       Tabla  28.  Comparación  del  porcentaje  según  tabaquismo  en  los  que  se  detectan  los marcadores  en  los  diferentes grupos. Porcentaje en cada grupo y valor de p basado en el test de χ2 de heterogeneidad      No fumadores (%)  Exfumadores (%)  Fumadores (%)    p*  Hexanal    11.4 8.3 30.0   0.059 Heptanal    25.7 37.5 33.3   0.609 Octanal    8.6 20.8 16.7   0.393 Nonanal    20.0 29.2 53.3   0.016 Ácido Propanoico    51.4 50.0 60.0   0.711 Ácido Nonanoico    20.0 12.5 13.3   0.670 Resultados  142    5.3.2. Estudio del grupo EPOC  El grupo EPOC  lo  conformaron 40 personas,  con una edad media de 74.2  (10.0)  años, donde el 93% de ellos eran hombres. Con respecto al hábito tabáquico, el 85% eran  fumadores activos con un  IPA de 123  (29.5). El 12.5% eran exfumadores con un  IPA de  72.5  (34.3), y  solamente un  caso  (2.5%) era no  fumador correspondiente a un paciente  con un déficit de α1‐antitripsina.   En cuanto a la gravedad de la enfermedad, según la escala GOLD, el 10% eran EPOC  leves (GOLD 1), un 32.5% eran moderados (GOLD 2), el 25% severos (GOLD 3) y el 32.5%  graves (GOLD 4).Todas estas características quedan recogidas en la tabla 19.  Tras  aplicar  el  test  de  Kolmogorov‐Smirnov  se  comprobó  que  la  distribución  de  frecuencias  para  los  diferentes VOC  no  cumplía  criterios  de  normalidad,  por  lo  que  se  tomó  como  valor de  referencia de medida de  tendencia  central,  la mediana  y el  rango  intercuartílico.  La  distribución  de  las  frecuencias  queda  recogida  en  la  tabla  29  y  representados en la figura 41.    Tabla 29. Distribución de frecuencias en la detección de los VOC en el grupo EPOC   Categorías   No detectado No cuantificado Cuantificado  Hexanal  26 (65%) 1  (2.5%) 23  (57.5%)  Heptanal  23  (57.5%) 0  (0%) 17  (42.5%)  Octanal  34  (81%) 1  (2.5%) 5  (12.5%)  Nonanal  23  (85%) 0  (0%) 17  (42.5%)  Ácido Propanoico  17  (42%) 0  (0%) 23  (57.5%)  Ácido Nonanoico  38  (95%) 0  (0%) 2  (5%)  Resultados  143      Figura 41. Distribución de frecuencias   En la tabla 30 quedan recogidos los valores de mediana (IQR) para cada uno de los  VOC estudiados referidos al grupo EPOC.  Tabla 30. Mediana(i) y rango intercuartílico para cada VOC en el grupo EPOC    Grupo EPOC Hexanal 0.095  (0.095‐ 1.980) Heptanal  0.055 (0.055 ‐1.810) Octanal 0.075 (0.075 ‐ 0.750) Nonanal 0.160 (0.160 – 5.400) Ácido Propanoico  1.430 (0.105 – 4.605) Ácido Nonanoico  0.135 (0.135 ‐ 0.135) (i) Valores  adimensionales  calculados  mediante  la  fórmula  (  ABCVOC)  /  (ABCSiloxano  )    x    100,  donde  ABC  :  área  bajo  la  curva  del  ion  cuantificador  medido en cps para cada VOC y Siloxano que es utilizado como compuesto de  referencia interno.    0 10 20 30 40 13 17 5 17 23 2 1 0 1 0 0 0 26 23 34 23 17 38 Cuantificado No Cuantificado No Detectado Resultados  144      Figura 42. TIC correspondientes al grupo EPOC y grupo control    En la figura 42 se muestran los cromatogramas superpuestos de los grupos control  y  EPOC,  trazados  en  negro  y  azul  respectivamente. Quedan  señalados  diferentes  VOC  detectados   Estudio del grupo EPOC frente al grupo control  Se han  realizado dos  tipos de estudio,  cuantitativo y  cualitativo de detección/no  detección.   Análisis cuantitativo:  Los resultados están recogidos en  la tabla 31, donde tras aplicar test U de Mann‐ Whitney, no se han observado diferencias estadísticamente significativas en ninguno de  los VOC entre los grupos de EPOC y control.  En  la  figura 43 se muestran  los cromatogramas superpuestos de un paciente con  EPOC (color rojo), control fumador (color azul) y control ex fumador (color negro). Quedan  Control Fumador EPOC  4 3 2 1 Abundancia  1. Ácido Propanoico  2. Hexanal  3. Heptanal  4. Nonanal  Resultados  145    indicados los VOC de estudio que son detectados.  Tabla 31. Comparación de marcadores entre grupos: Controles y EPOC. Valores de p* basados en test de U  de Mann‐Whitney.    EPOC vs. Controles    Valor de p*  Hexanal  0.362  Heptanal  0.370  Octanal  0.591  Nonanal  0.904  Ácido Propanoico  0.299  Ácido Nonanoico  0.063  *Test de U de Mann‐Whitney    Figura 43. Cromatogramas grupo EPOC y controles fumador y ex fumador.   Análisis cualitativo  Siguiendo la misma sistemática del análisis cuantitativo, realizamos a continuación  el estudio de los valores de OR para estudio cualitativo de detección/no detección de los  VOC. En la tabla 32 quedan reflejados los valores de OR basados en la regresión logística,  en  la  que  tampoco  se  han  encontrado  diferencias  estadísticamente  significativas  en  ningún compuesto entre  los grupos de EPOC y control, al  igual que sucede en el estudio  Control ex fumador  Control fumador  EPOC  Abundancia  2 3 1 1 Ácido Propanoico  2 Heptanal  3 Nonanal  4 Ácido Nonanoico  4 Resultados  146    cuantitativo. No obstante, es de notar que el hexanal alcanza una p=0,05, muy próxima al  nivel de significación.  Tabla 32. Relación entre la presencia de alguna cantidad detectable de marcadores y la presencia de EPOC  frente al grupo control. OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística.              Controles EPOC Valor de p       Hexanal    1.00 2.38 (1.00‐5.64) 0.05  Heptanal    1.00 1.61 (0.75– 3.48) 0.223  Octanal    1.00 0.84(0.28– 2.53) 0.75  Nonanal    1.00 1.45(0.68– 3.13) 0.338  Ácido Propanoico    1.00 1.16(0.54– 2.45) 0.707  Ácido Nonanoico    1.00 0.28(0.06– 1.31) 0.105  *OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística  5.3.3. Estudio del grupo cáncer de pulmón  El grupo CP lo conformaban 81 personas con diagnóstico histológico de NICP e ICP.  La edad media era de 68.5  (11.1) años, donde el 79% eran hombres y el 21 mujeres. El  62% eran  fumadores activos con un  IPA de 77.5  (50.6); el 27% son exfumadores con un  IPA de 63.0  (34.1), y un 11% eran no  fumadores  (8mujeres y 1 hombre,  todos ellos con  histología  de  adenocarcinoma).  Todos  estos  datos  quedan  recogidos  en  la  tabla  19  de  características demográficas de la población de estudio.   En referencia a la histología de los NICP, el 39.5% eran adenocarcinomas, el 27.2%  epidermoides,  los carcinomas no microcíticos  indiferenciados el 18,5% y células grandes  un 2,5%. El ICP supone el 11,1% de los casos y el carcinoide un 1,2%. En cuanto al estadio  del  tumor  (TNM)103, el 75,3% de  los casos correspondían a estadios avanzados –  IIIA un  Resultados  147    28,4%, IIIB un 14,8% y IV un 32,1% ‐ mientras que para los estadios IA eran de un 8,6%, IB  de un 6,2%, IIA de un 7,4% y IIB de un 2,5%.  El 70% de los casos de CP están diagnosticados, a su vez, de EPOC, correspondiendo  el grupo mayor a GOLD 2 (26%). El 30% restante no presentaban enfermedad obstructiva.  La distribución de  las  frecuencias de  cuantificación de  los diferentes VOC queda  recogida en la tabla 33 y en la figura 44.         Figura 44. Distribución de frecuencias en la detección de los diferentes VOC  NQ Q ND0,00% 20,00% 40,00% 60,00% 80,00% 100,00% 2,50% 5% 5% 4% 5% 0% 27% 39% 13,50% 44% 54% 32% 80% 56% 83% 49% 41% 68% NQ Q ND Tabla 33. Distribución de frecuencias de VOC detectados en el grupo CP.   Categorías   No detectado No cuantificado Cuantificado  Hexanal  65 (80%) 2  (2.5%) 14  (27%)  Heptanal  45  (56%) 4  (5%) 32  (39%)  Octanal  67  (83%) 3  (4%) 11  (13.5%)  Nonanal  40  (49%) 5  (6%) 36  (44%)  Ácido Propanoico  33  (41%) 4  (5%) 44  (54%)  Ácido Nonanoico  55  (68%) 0  (0%) 26  (32%)  Resultados  148    Al  igual  que  en  los  dos  grupos  anteriores,  tras  aplicar  el  test  de  Kolmogorov‐ Smirnov se comprobó que ninguna distribución de valores de detección cumplía criterios  de  normalidad,  por  lo  que  se  tomó  como  valor  de  referencia  de medida  de  tendencia  central, la mediana y el rango intercuartílico (tabla 34).    Tabla 34. Mediana(i) y rango intercuartílico de cada VOC en el Grupo CP  Cáncer de pulmón Hexanal  0.095  (0.095 ‐ 0.095) Heptanal  0.055 (0.055 ‐ 1.460) Octanal  0.075 (0.075 ‐ 0.750) Nonanal  0.215 (0.160 – 5.600) Ácido Propanoico  0.109 (0.105 – 3.020) Ácido  Nonanoico  0.135 (0.135 –3.990) (i) Valores  adimensionales  calculados  mediante  la  fórmula  (  ABCVOC)  /  (ABCSiloxano  )   x   100, donde ABC  : área bajo  la curva del  ion cuantificador  medido en cps para cada VOC y Siloxano que es utilizado como compuesto  de referencia interno.        Figura 45. Cromatograma de paciente con CP.  Resultados  149    En  la figura 45 se muestra un cromatograma de un paciente con CP. Se  indica un  pico cromatográfico en el minuto 15.9 para su identificación mediante espectrometría de  masas.      Figura 46. Espectro de masas extraído del cromatograma (TIC) en el minuto 15.90 y comprobación con el  espectro de masas de la librería espectral NIST 08.  En  la  figura  46  aparece  el  espectro  de  masas  del  pico  cromatográfico  correspondiente  del  Rt  15,90  min.  La  identificación  del  compuesto  se  analizó  con  el  programa  informático: ChemStation mediante  la  comparación del espectro extraído del  TIC  y  de  la NIST  08.  Los  resultados muestran  que  el  ácido  nonanoico  ocupa  el  primer  puesto en el ranking de probabilidad con una fiabilidad del 81%.         Espectro de masas extraído del TIC  en el minuto 15.90.  Espectro  de masas  NIST  08  en  el  minuto  15.90.  Identificación  y  grado de confianza.  Resultados  150    Estudio del grupo CP frente al grupo control  En  cuanto  a  la  comparación  de  los  grupos  de  estudio,  se  han  realizado  dos  comparaciones (análisis cuantitativo y cualitativo) enfrentando el grupo cáncer de pulmón  a la totalidad del grupo control.   i. Los datos del estudio cuantitativo quedan recogidos en la tabla 35, que tras  aplicar  el  test  de  U  de  Mann‐Whitney,  sólo  se  observan  diferencias  estadísticamente significativas en el ácido nonanoico con una p=0.011.    Tabla 35. Comparación de VOC entre los grupos CONTROL y CP.   Valores de p* basados en el test de U de Mann‐Whitney    Control vs CP Hexanal  0.276 Heptanal  0.308 Octanal  0.769 Nonanal  0.454 Ácido propanoico  0.534 Ácido nonanoico  0.011 * Test U de Mann‐Whitney  ii. Los datos del estudio cualitativo se recogen en  la tabla 36. Los valores de  OR  para  estudio  de  detección/no  detección  muestran  que  el  ácido  nonanoico  es  el  único  compuesto  que  presenta  diferencias  estadísticamente significativas.        Resultados  151    Tabla 36. Relación entre la presencia de VOC en el grupo de cáncer frente al grupo Control y frente al grupo  EPOC. OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística.      Controles CP Valor de p       Hexanal    1.00 1.03 (0.46‐2.29) 0.941  Heptanal    1.00 1.42 (0.76 – 2.68) 0.274  Octanal    1.00 0.92 (0.39 – 2.19) 0.848  Nonanal    1.00 1.57(0.85 – 2.93) 0.152  Ácido Propanoico    1.00 1.24(0.68 – 2.28) 0.484  Ácido Nonanoico    1.00 2.53(1.21 – 5.29) 0.014  *OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística      Figura 47. Cromatogramas grupo control y CP.    En la figura 47 se muestran los TIC correspondientes a grupo CP (azul) y control  (negro). Se indica el pico en el minuto 15.9 en el TIC de CP, correspondiente al ácido  nonanoico. Este pico no aparece en el TIC del control.    Resultados  152    Estudio del grupo CP frente al grupo EPOC  A continuación hemos comparado el grupo CP con el grupo EPOC.   i. Los  datos  del  estudio  cuantitativo  quedan  recogidos  en  la  tabla  37.  Tras  aplicar  el  test  de  U  de  Mann‐Whitney,  sólo  se  observan  diferencias  estadísticamente significativas en el ácido nonanoico con una p=0.001.    Tabla 37. Comparación de VOC entre los grupos EPOC y CP.  Valores de p* basados en el test de U de Mann‐Whitney.  EPOC vs CP Hexanal  0.098 Heptanal  0.851 Octanal  0.759 Nonanal  0.645 Ácido propanoico 0.533 Ácido nonanoico 0.001 *Test U de Mann‐Whitney  ii. Los datos del estudio cualitativo se recogen en  la tabla 38. Los valores de  OR  para  estudio  de  detección/no  detección  muestran  que  el  único  compuesto  que  presenta  diferencias  estadísticamente  significativas  es  el  ácido nonanoico.  Tabla 38. Relación entre la presencia de VOC en el grupo de cáncer frente al grupo EPOC. OR e intervalo de  confianza al 95% basado en la regresión logística.        EPOC CP Valor de p Hexanal      1.00 0.43 (0.18‐1.04) 0.062 Heptanal      1.00 0.88 (0.41 – 1.91) 0.752 Octanal      1.00 0.10(0.36 – 3.41) 0.869 Nonanal      1.00 1.08(0.0– 2.32) 0.839 Ácido propanoico      1.00 1.08(0.50 – 2.32) 0.853 Ácido nonanoico      1.00 8.99 (2.01 – 40.1) 0.004 *OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística  Resultados  153      Figura 48. TIC correspondientes a grupo CP (negro) y EPOC (azul).  Se señala el pico en el minuto  15.9 en el TIC de CP, correspondiente al ácido nonanoico. Este pico no aparece en el TIC de EPOC.  Estudio del grupo CP frente a grupos no tumorales (control+ EPOC)  Asumiendo el comportamiento semejante de  los grupos EPOC y control tal como  se refirió en el apartado de resultados 5.3.2, al no presentar diferencias estadísticamente  significativas  en  ninguno  de  los  VOC  analizados,  ambos  grupos  se  unificaron  para  su  comparación  frente  al  grupo  CP.  De  nuevo  resultó  una  diferencia  significativa  de  los  valores del ácido nonanoico tanto en el estudio cuantitativo  (test de U‐Mann‐Whitney  )  como en el cualitativo (OR basado en regresión logística) (p<0.001 y p=0.001), (tablas 39 y  40 respectivamente).              Rt (min) Abundancia  Resultados  154                    Tabla 40. Relación entre la presencia de VOC en el grupo CP frente a no CP (grupo Control + grupo EPOC).  OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística.      Controles +  EPOC  CP  Valor de  p*            Hexanal    1.00 0.57 (0.29 – 1.10) 0.093    Heptanal    1.00 1.26 (0.72 – 2.22) 0.415    Octanal    1.00 0.96 (0.46 – 2.00) 0.920    Nonanal    1.00 1.34(0.77 – 2.33) 0.308    Ácido propanoico    1.00 1.19(0.68 – 2.09) 0.548    Ácido nonanoico    1.00 3.11(1.56 – 6.22) 0.001    * OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística    Comportamiento  de  los  VOC  en  pacientes  con  CP  fumadores  frente  a  CP  no  fumadores.  A continuación vamos a estudiar cómo afecta el tabaquismo en  la determinación  de VOC dentro del grupo CP. En la tabla 41 quedan reflejados los datos de la comparación  de medianas dentro del  grupo CP al enfrentar pacientes  con hábito  tabáquico  frente  a  pacientes no fumadores. No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas  entre los dos subgrupos (fumadores con CP frente a no fumadores con CP).  Tabla 39. Comparación de VOC entre los grupos CP y No CP (Controles+EPOC).   Valores de p* basados en el test de U de Mann‐Whitney.    (Control +EPOC) Vs CP  Hexanal 0.139 Heptanal 0.497 Octanal  0.923 Nonanal 0.458 Ácido propanoico  0.842 Ácido nonanoico  <0.001 * Test U de Mann‐Whitney  Resultados  155    Tabla 41. Mediana(i) de cada uno de los VOC para el grupo CP y valor de p* que evalúa la diferencia entre  ellos    Mediana     No fumadores=9 Fumadores y Exfumadores=72  P* Hexanal  0.095 0.095 0.957 Heptanal  0.145 0.055 0.536 Octanal  0.075 0.075 0.758 Nonanal  2.720 0.0160 0.564 Ácido propanoico  0.105 1.245 0.331 Ácido nonanoico  0.135 0.135 0.807 *Test U de Mann‐Whitney   (i) Valores adimensionales calculados mediante  la fórmula ( ABCVOC) / (ABCSiloxano )   x   100, donde ABC  : área bajo  la  curva del ion cuantificador medido en cps para cada VOC y Siloxano que es utilizado como compuesto de referencia  interno.      Grupo cáncer de pulmón: con EPOC vs sin EPOC  La asociación de CP y EPOC es muy frecuente y, en nuestra muestra, el 70% de los  casos  de  CP  presentan  la  asociación  de  CP más  EPOC.  Dividimos  el  grupo  cáncer  de  pulmón en 2 subgrupos: con EPOC y sin EPOC, y  los comparamos entre ellos y, también,  con los grupos control y EPOC, según el siguiente orden:   CP con EPOC frente al grupo control   CP EPOC frente a grupo EPOC   CP sin EPOC frente al grupo control    CP sin EPOC frente al grupo EPOC   y finalmente CP con EPOC frente a CP sin EPOC.  Y realizamos estudios cuantitativo y cualitativo.  Resultados  156     Estudios cuantitativos  Los datos cuantitativos obtenidos se muestran en la tabla 42, donde se puede  observar  que  el  ácido  nonanoico  es  el  único  VOC  que muestra  diferencias  estadísticamente significativas cuando se compara el grupo cáncer, tenga o no  asociado EPOC, con el grupo control y con el grupo EPOC.   Aunque  el  grupo  CP  sin  EPOC  frente  a  controles  no  muestre  significación  estadística, está próximo a ella, por lo que marca una tendencia (p=0.006).    Existen  diferencias  estadísticamente  significativas  en  el  ácido  propanoico  cuando  se  comparan  los  subgrupos  CP  sin  EPOC  frente  a  CP  con  EPOC.  Finalmente,  el  ácido  propanoico  también  presenta  diferencias  estadísticamente  significativas  al  comparar  el  grupo  CP  sin  EPOC  frente  al  grupo EPOC.    Revisando los datos cuantitativos no se ha detectado ácido propanoico en el 85%  de  los casos del subgrupo CP sin EPOC. La mayor parte de este subgrupo corresponde a  pacientes no fumadores con adenocarcinoma.  Resultados  157    Tabla  42.  Comparación  de marcadores  entre  los  diferentes  grupos,  diferenciando  CP  con  EPOC  y  CP  sin  EPOC. Valores de p basados en el test de U de Mann Whitney.    CP con EPOC  Vs Control  CP con EPOC  Vs EPOC    CP sin EPOC  Vs Control  CP sin EPOC  Vs EPOC    CP con EPOC  Vs CP sin EPOC          Hexanal  0.180  0.068 0.918 0.516   0.426  Heptanal  0.728  0.051 0.092 0.469   0.231  Octanal  0.289  0.710 0.296 0.190   0.077  Nonanal  0.690  0.807 0.322 0.488   0.585  Ácido propanoico  0.085  0.802 0.091 0.033   0.005  Ácido nonanoico  0.024  0.001 0.060 0.044   0.935  *Test de U de Mann Whitney.   Estudio cualitativo  En  cuanto  al  estudio  cualitativo,  entre  el  subgrupo  de  CP  sin  EPOC  y  el  subgrupo de CP con EPOC, solamente el ácido propanoico muestra diferencias  significativas con una OR de 4.71  y p=0.003(tabla 43).      Tabla 43. Relación entre la presencia de alguna cantidad cuantificable de VOC y la presencia de EPOC frente  al grupo control. OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística.      CP sin EPOC CP con EPOC Valor de p*         Hexanal    1.00 0.49 (0.15 ‐ 1.61) 0.239  Heptanal    1.00 0.54 (0.21 – 1.42) 0.213  Octanal    1.00 0.45(0.12 – 1.64) 0.224  Nonanal    1.00 0.57 (0.22 – 1.50) 0.256  Ácido propanoico    1.00 4.71 (1.70 – 13.10) 0.003  Ácido nonanoico    1.00 0.92 (0.33 – 2.55) 0.877  *OR e intervalo de confianza al 95% basado en la regresión logística    Resultados  158      Figura 49. TIC de CP con EPOC y CP sin EPOC    En  la figura 49 se muestran  los TIC correspondientes a CP con EPOC  (negro) y CP  sin  EPOC  (azul).  Se  señala  el  pico  en  el  minuto  9.2  en  el  TIC  de  CP  con  EPOC,  correspondiente al ácido propanoico. Este pico no aparece en el TIC de CP sin EPOC.  Resumiendo lo anterior, el ácido nonanoico presenta diferencias estadísticamente  significativas cuando comparamos CP con EPOC frente a controles o EPOC, mientras que  el  ácido  propanoico  presenta  diferencias  estadísticamente  significativas  cuando  se  compara el subgrupo CP sin EPOC frente a controles, EPOC y CP con EPOC.  5.3.4.  Sensibilidad  y  especificidad  del  ácido  nonanoico  y  ácido  propanoico  en  cáncer de pulmón   Ácido nonanoico y cáncer de pulmón:    Con los datos anteriormente expuestos, al no encontrar diferencias en ninguno de  los VOC estudiados entre  los grupos Control y EPOC, se decide unificar ambos grupos y  compararlos frente al grupo cáncer, de tal forma que obtendríamos dos grupos de estudio,  uno sin enfermedad tumoral y otro con enfermedad tumoral.  CP con EPOC  CP sin EPOC  Ácido Propanoico Resultados  159    Se estudia  la sensibilidad y especificidad del ácido nonanoico como marcador de  cáncer de pulmón. Los datos obtenidos se recogen en las siguientes tablas:  Al 95% de nivel de confianza, el ácido nonanoico está presente en 26 de los pacientes con  CP y en 16 de las personas sin enfermedad tumoral.     Tabla 44. Validez como prueba diagnóstica del ácido nonanoico para CP  Prueba diagnóstica  Cáncer  Control + EPOC Total  Positivo  26 (32.1%) 16 (12.4%)  42 (20%)  Negativo  55(67.9%)  113 (87,6%)  168 (80%)  Total  81  129  210      Tabla 45. Resultados de los parámetros de validez del ácido nonanoico como prueba diagnóstica para CP   Valor IC (95%) Sensibilidad (%)  32.10 21.31 42.88  Especificidad (%)  87.6 81.52 93.67  Índice de validez (%)  66.19 59.55 72.83  Valor predictivo + (%) 61.90 46.03 77.78  Valor predictivo ‐ (%) 67.26 59.87 74.66  Prevalencia (%)  38.57 31.75 45.39      Índice de Youden  0.20 0.08 0.31  Razón de verosimilitud +  2.59 1.48 4.52  Razón de verosimilitud ‐  0.78 0.66 0.91      Los pacientes en los que se detecta ácido nonanoico tienen 3,11 veces más riesgo  (IC95%: 1,6 a 6,2) de manifestar CP que en los que no se detecta (p=0,001).  La  sensibilidad  del  ácido  nonanoico  como  marcador  de  CP  es  de  32%,  y  la  especificidad del 87.6%, un VPP del 62% y un VPN del 67%.      Resultados  160     Ácido propanoico en pacientes con CP sin EPOC  En  el  CP  con  EPOC,  el  ácido  propanoico  se  detecta  en  el  70%  de  los  casos.  La  determinación de ácido propanoico no muestra diferencias estadísticamente significativas  entre el grupo de CP con EPOC y los grupos EPOC o control individualmente.  En el 85% de  los  casos del  subgrupo de CP  sin  EPOC no  se ha detectado  ácido  propanoico. Cuando se comparan  los grupos CP  con EPOC y CP  sin EPOC, este hallazgo  muestra diferencias estadísticamente significativas entre ambos.   El subgrupo de CP sin EPOC se relaciona con la no detección del ácido propanoico  con una sensibilidad del 66.7%  ,especificidad del 70,18%, un VPP de 48,5% y un VPN de  83% (tablas 46 y 47).  Tabla 46. Validez como prueba diagnóstica del ácido propanoico para CP sin EPOC.  Prueba diagnóstica    CP sin EPOC CP con EPOC Total  Positivo    40 (70.2%) 8 (33.3%) 48 (59.3%)  Negativo    17 (29.8%) 16 (66.7%) 33 (40.7%)  Total    57 24 81        Resultados  161      Tabla 47. Resultados de  los parámetros de  validez del ácido propanoico  como prueba  diagnóstica para CP sin EPOC.    Valor IC (95%) Sensibilidad (%) 70.18 57.42 82.93  Especificidad (%)  66.67 45.72 87.61  Índice de validez (%)  69.14 58.46 79.81  Valor predictivo + (%)  83.33 71.75 94.92  Valor predictivo ‐ (%)  48.48 29.92 67.05  Prevalencia (%) 70.37 59.81 80.93      Índice de Youden  0.37 0.15 0.59  Razón de verosimilitud +  2.11 1.17 3.80  Razón de verosimilitud ‐  0.45 0.27 0.73                                    162          DISCUSIÓN Discusión  165    6. DISCUSIÓN    El  trabajo  aquí  presentado  trata  de  establecer  diferencias  entre  los  compuestos  exhalados en tres poblaciones bien diferenciadas como son un grupo control, clínicamente  sano, un  grupo  EPOC  y un  grupo diagnosticado de CP. Para  ello  se ha desarrollado un  método analítico que nos permitiese determinar los compuestos descritos anteriormente  en el apartado 4.2.3.  Existen numerosos  trabajos publicados en esta  línea pero con gran diversidad en  cuanto  a  características  de  la  población  de  estudio,  la  recogida  y  tratamiento  de  la  muestra, metodología analítica y búsqueda y hallazgos de posibles marcadores.  Hasta  el momento  no  existe  consenso  alguno  en  ninguno  de  estos  aspectos,  si  bien,  la  determinación  de  unos  compuestos  u  otros  va  a  estar  condicionado,  en  gran  medida, al tratamiento de la muestra antes de procesarla.  6.1. Metodología analítica  6.1.1. Recogida de la muestra   Una de  las grandes problemáticas que encontramos en  todos  los estudios  sobre  VOC es  la metodología, ya que  la mayoría de  los VOC  son excretados en concentración  nanomolar  (10‐9)  o  picomolar  (10‐12),  lo  que  exige  un  método  de  trabajo  especial,  incluyendo la recogida y conservación de muestras. Revisando la bibliografía no existe un  Discusión  166    acuerdo unánime sobre la recogida de la muestra, siendo este punto lo que va a marcar la  diferencia de los resultados obtenidos en los estudios publicados.   Para  la obtención de  la muestra se han empleado  las cámaras BioVOC®, tal como  se  refiere  en  el  apartado  material  y  métodos,  buscando  siempre  recoger  el  mismo  volumen de aire representativo de la fracción alveolar, evitando en lo posible la dispersión  en el origen de  la muestra y  facilitando  la  repetición del estudio. Además, el que estos  dispositivos sean reutilizables, ha mejorado la economía y la sostenibilidad del estudio.  Gordon et al.89 y O’Neill et al.91, pertenecientes al mismo grupo de  investigación,  diseñaron  un  dispositivo  propio  para  la  recolección  del  aire,  utilizando  colectores  para  cromatografía de gases rellenos de Tenax (retienen compuestos desde c6 – c30) y que se  analizaban por desorción térmica utilizando He como gas portador y N2 para condensar la  muestra en la trampa fría, antes de  la inyección al cromatógrafo de gases (figura 9). Esta  metodología es  incapaz de  retener  compuestos  con un número  inferior  a 6  átomos de  carbono, por lo que se pierden forzosamente muchos compuestos.  Phillips et al 66,67,92,93,96,97 utilizan un dispositivo de diseño propio para  la recogida  del aire alveolar (figura 11), eliminando en lo posible, los contaminantes procedentes del  ambiente y del espacio muerto anatómico. El aire es recogido en trampas rellenas de dos  adsorbentes y que posteriormente son analizadas tras la desorción térmica.   Otros  como Van Berkel et al.119,  Song et al.107 o Kischkel et al.105 utilizan bolsas  tedlar®  que  permiten  el  almacenaje  del  aire  exhalado  en  su  totalidad,  conteniendo  la  fracción  correspondiente  al espacio muerto  anatómico.  El empleo de estos dispositivos  Discusión  167    tiene el  inconveniente en que  la fracción alveolar queda muy diluida y que existe mayor  concentración de contaminantes que provienen del exterior.   Poli  et  al.94,106,  Fuch  et  al.104,  Jareño  et  al.115,  por  ejemplo,  han  recurrido  a  la  utilización de los dispositivos comerciales BioVOC® Breath Sampler (Markes Int.TM) (figura  12),  fácil de utilizar y que requiere una maniobra de espiración  forzada. Son cámaras de  teflón  que  permiten  el  paso  del  aire  correspondiente  al  espacio  muerto  anatómico,  quedando recogida en la cámara la fracción que corresponde al final de la capacidad vital  forzada, buscando la máxima representación del aire alveolar. Aunque esto no deja de ser  una  aproximación,  su  fácil manejo  y  su  reducido  tamaño  y  peso  favorecen  su  empleo.  Kwak  J  et  al.126 evaluaron  el  empleo  de  los  BioVOC  para  el  análisis  del  aire  exhalado.  Recomendaron  su  uso  únicamente  para  la  detección  de  VOC  presentes  en  altas  concentraciones, a menos que  se  llevasen a cabo  repetidas colecciones de muestras de  aire  y  almacenadas  en  un mismo  tubo  de  desorción,  tal  y  como  se  ha  hecho  en  este  estudio.   6.1.2. Almacenaje de la muestra  Tampoco existe unanimidad en cuanto a la forma de almacenar la muestra previa  al  análisis.  Gordon  et  al.89,  O’Neill  et  al.91  y  Phillips  et  al.66,67,92,93,96,97  analizaban  directamente  la muestra de  aire, obviando  su  almacenamiento.  Sin  embargo,  la mayor  parte de  los autores utilizan distintos consumibles para el almacenaje de  la muestra, sin  haber  llegado  a  acuerdo  sobre  su  idoneidad,  lo  que  plantea  un  nuevo  problema  en  la  determinación de los compuestos.   Discusión  168    La  mayoría  de  los  autores  se  decantan  por  la  utilización  de  fibras  de  microextracción en  fase sólida  (SPME) con posterior derivatización para  la estabilización  de compuestos inestables. Las fibras SPME permiten la adsorción de volátiles pero no de  agua,  lo que supone una gran ventaja. Además,  la sensibilidad y especificidad mostradas  son muy elevadas, pero se limitan a determinados grupos químicos funcionales. Es decir,  focalizan sobre un grupo obviando el resto de volátiles. Esto que “a priori” puede suponer  una ventaja pues la muestra está libre de agua y “purificada” de otros compuestos, obliga  a repetir la recogida de muestras en el caso de buscar otro tipo de compuestos, dado que,  hasta el momento, no hay acuerdo sobre qué familia/s de compuestos hay que dirigir  la  búsqueda. Además requieren de manipulación de la muestra para garantizar la estabilidad  de determinados compuestos (aldehídos, por ejemplo).  Otra de las opciones utilizadas es el empleo de tubos de desorción térmica rellenos  de  distintos  adsorbentes  en  función  del  tipo  de  compuesto  que  se  quiera  retener.  En  nuestro  estudio  se  han  empleado  tubos  de  acero  inoxidable  universales  (Universal  TO/17/2  de  Markes®)  rellenos  de  tres  materiales  diferentes  (Tenax  TA  +  Graphitised  Carbon Black + Carbonised Molecular Sieve) que permiten retener compuestos desde C3 a  C20  y  que  quedan  sellados  con  tapones DiffLok.  Curiosamente  esta  técnica  de  sencillo  manejo  y  que  no  requiere manipulación  de  la muestra,  apenas  ha  sido  empleada,  y  únicamente conocemos su utilización por Robroeks et al.127, Sponring et al.128 y Phillips C  et al.122.   El mayor  inconveniente  que  tiene  el  empleo  de  tubos  de  desorción  es  la  gran  cantidad de agua que queda retenida en los tubos, procedente del aire alveolar. Dado que  Discusión  169    el agua es una  sustancia  incompatible  con  la  cromatografía de gases,  la mayoría de  los  investigadores  ha  prescindido  de  su  empleo.  Sin  embargo,  el  empleo  de  los  tubos  de  desorción  universales  una  vez  eliminado  el  problema  del  agua,  nos  permitiría  el  reprocesamiento de la muestra, una vez analizada, en busca de nuevos marcadores.  6.1.3. Técnicas analíticas   En  cuanto  a  las  técnicas  analíticas,  existe  una  gran  diversidad  de  técnicas  empleadas  en  el  análisis  del  aire  exhalado.  Estudios  como  el  de Wehinger  et  al.129 o  Bajtarerevic A et al.110 utilizaron un reactor de transferencia de protones (PTR) asociado a  un  espectrómetro  de masas.  Fens  et  al.120  y  Basanta  et  al.121  utilizaron  un  equipo  de  cromatografía de  gases  acoplados  a un  espectrómetro de masas  en  tándem Q‐TOF  (Q:  cuadrupolo;  TOF:  “Time  of  fligth”),  que  permite  mejorar  la  identificación  de  los  compuestos  y  la  sensibilidad de  la  técnica,  llegando  a detectar  concentraciones mucho  más pequeñas e  incluso obtener masas exactas, que utilizando espectrómetro de masas  cuadrupolo simple; o métodos colorimétricos como el estudio de Mazzone et al.130, o el  empleo de  la nariz electrónica por  investigadores como Machado et al.64, Di Natale C et  al.65, Dragonieri S et al.63, y Gendron KB et al.131 . Todos estos son ejemplos de variantes  de la técnica analítica empleada en el análisis del aire exhalado.  La tecnología que ha sido empleada por la mayor parte de los estudios de VOC en  aire exhalado que se han realizado ha sido la cromatografía de gases y espectrometría de  masas utilizando un detector de masas con un cuadrupolo simple con ionización mediante  impacto electrónico, que ha permitido la separación e identificación de los compuestos.   Discusión  170    6.2. Desarrollo del método analítico  6.2.1. Obtención de la muestra. El problema del agua en el aire alveolar  Debido a  la baja concentración a  la que se encuentran  la mayor parte de  los VOC  que parecen ser de interés y que no son contaminantes ambientales, el empleo de tubos  de desorción requiere mayor cantidad de muestra de aire exhalado. Para la concentración  de  los compuestos hemos optado por  repetir  la maniobra de espiración  forzada en  tres  ocasiones. De esta manera, el volumen  final analizado es de 900ml, similar al analizado  por Phillips M et al.66,67, suficiente para la determinación de los VOC. Este procedimiento  ha  sido  recomendado  posteriormente  por  Kwak  J  et  al.126.  Este método  también  fue  parcialmente utilizado también por Phillips C et al.122 con la única diferencia de recolectar  el aire en 3 tubos en vez de en uno.   El problema de requerir mayor cantidad de aire exhalado es que también aumenta  la concentración de agua retenida en los tubos de desorción. Su eliminación parcial, de tal  manera que la muestra sea compatible con la técnica analítica, ha supuesto un reto.   Su solución se ha desarrollado en dos etapas del método analítico, tal y como se  describe en el apartado de material y métodos y que recordamos a continuación:  ‐ Etapa  de  condensación  en  la  trampa  fría  previa  a  la  inyección  a  la  columna  cromatográfica.  ‐ Final de  la columna cromatográfica y antes de  la entrada al espectrómetro de  masas, con la instalación de una válvula de división de flujo.  Discusión  171    6.2.2. Selección de compuestos   Desde  el  comienzo  nos  enfrentamos  a  varios  problemas:  El  primero  fue  la  dificultad de diferenciar dos compuestos químicamente muy diferentes, butano y acetona,  pero con  la misma masa y por tanto con espectro de masas similares. Para resolver este  problema diseñamos un método específico para la separación de hidrocarburos (alcanos e  hidrocarburos  aromáticos)  de  bajo  peso  molecular.  Una  vez  validado  el  método  procedimos al análisis de las muestras obtenidas de pacientes con CP y de los controles así  como del aire ambiental para cada una de las muestras de pacientes recogidas.    Entre  los  resultados obtenidos  sorprendía, primero,  la  ausencia de detección de  varios compuestos descritos por Phillips67 y Poli94  (butano y pentano), en segundo  lugar,  que  era  imposible  diferenciar  los  isómeros  estructurales  (ej:  los  C11  o  los  C14)  y,  finalmente,  que  los  compuestos  aromáticos  eran  de  procedencia  exógena  siendo  su  concentración mayor en el aire ambiental que en la muestra de aire exhalado, a pesar de  lo cual eran considerados como marcadores por los autores citados.  Por todo ello y coincidiendo con una revisión de Buszewski B et al.98 en  la que se  cuestionaban  los compuestos descritos por Phillips67 y Poli94 como biomarcadores al no  poder  explicar  su  origen metabólico,  replanteamos  el método  analítico  hacia  uno más  general.   Dado  que  los VOC  no  sólo  tienen  un  origen  sistémico  sino  también pueden  ser  exógenos,  procedentes  del  aire  ambiental  o  del  humo  del  tabaco,  discriminar  los  compuestos  de  procedencia  endógena  de  los  de  procedencia  exógena  es  fundamental  Discusión  172    para este tipo de estudios, en los cuáles la recogida y tratamiento de la muestra previa al  análisis cobra una gran relevancia   Se  han  propuesto  diversas  metodologías  al  respecto.  Phillips  M  et  al.66,67,96  proponen un sencillo cálculo matemático restando a las concentraciones normalizadas de  los VOC detectados en aire exhalado, las concentraciones determinadas en aire ambiente.  Esta  aproximación  ha  sido  cuestionada  al  no  explicar  la  complejidad  de  la  absorción  pulmonar de  los compuestos exógenos y  la exhalación posterior  tras el metabolismo de  los mismos en forma de diferentes VOC 98,99,114. Otro método propuesto fue mantener a la  persona  respirando aire puro,  libre de VOC ambientales, durante un periodo de  tiempo  entre 4  y 30 minutos  antes de  la  toma de  la muestra132. Aun  considerándose un buen  método, no ha sido seguido en la mayor parte de los trabajos por su complejidad logística.  Para diferenciar compuestos exógenos de endógenos, recogimos de forma paralela  una muestra de aire exhalado y otra de aire ambiental, comparando ambas. En lugar del  método de  aproximación descrito por Phillips  et al.66,67,96  se procedió  a normalizar    las  concentraciones con respecto a un patrón interno conocido, que se utiliza como factor de  corrección  de  la  variabilidad  del  proceso  de  desorción  de  los  tubos.  Se  asumió  como  compuesto endógeno aquél cuya relación exhalado/ambiental fue mayor a 1, ya que nos  aportaba la seguridad de tratarse de un compuesto de origen endógeno.   Una de  las grandes problemáticas que existe actualmente es qué compuestos se  pueden utilizar como marcadores y cuáles no. Existe una gran diversidad de compuestos  descritos  en  la  bibliografía,  que  van  desde  alcanos,  hidrocarburos  aromáticos,  otros  Discusión  173    hidrocarburos, alcoholes,  compuestos  carbonílicos y ácidos  carboxílicos, y otras muchas  familias  de  compuestos.  Estudios  como  los  de  Phillips  et  al.66,67  y  Poli  et  al.94  que  mostraban  una  elevadísima  sensibilidad  y  especificidad  utilizando  combinaciones  de  diferentes hidrocarburos,  fueron posteriormente criticados al no poder explicar cuál era  su  origen  metabólico  y  por  incluir  en  sus  modelos  compuestos  que  provienen  de  la  contaminación  ambiental  o  del  humo  del  tabaco,  y  que  fueron  propuestos  como  marcadores de  cáncer de pulmón,  según  se  recoge en  la publicación de Horvàth99 que  desarrolla un análisis crítico de los resultados de los autores citados en el mismo sentido.   En  2010,  Kischkel  et  al.105  publica  un  trabajo muy  interesante  para  CP.  Tras  la  determinación  de  VOC,  analiza  los  resultados  mediante  5  algoritmos  estadísticos  diferentes,  encontrando  que  la  combinación  de  14 VOC  era  suficiente  para discriminar  pacientes  con  CP  de  personas  sanas.  Aunque  el  trabajo  tiene  puntos  a  discutir,  lo  interesante  de  él  es  la  justificación  de  los  VOC  incluidos  en  el  modelo  predictivo,  justificando  cada  uno  de  los  compuestos.  El  que  existan  compuestos  que  muestren  significación estadística no es suficiente para la inclusión de éstos como biomarcadores. La  identificación de biomarcadores ha de estar bien fundada, para que la normalización y el  procesamiento de datos proporcionen información clínica relevante.  Actualmente adquiere gran relevancia el estudio de compuestos oxigenados al ser  el resultado de procesos de peroxidación de  los componentes celulares, entre éstos,  los  aldehídos y ácidos carboxílicos. Los primeros son referenciados por diversos autores como  posibles marcadores de estrés oxidativo104,106,115,117,121,133.  Discusión  174    Nuestro estudio se ha centrado en aldehídos y en ácidos carboxílicos (tal como se  describe en los apartado de Introduccion y en Material y Métodos), en base a la elevada  frecuencia de aparición de estos dos grupos de compuestos en múltiples determinaciones  llevadas a cabo previamente134,135,136 . Estos compuestos tienen un origen conocido, pues  son metabolitos  finales  de  procesos  de  peroxidación  lipídica  de  los  ácidos  grasos  que  forman  parte  de  las  membranas  celulares.  Por  ejemplo,  hexanal,  heptanal  y  nonanal  proceden de  la oxidación de  los ácidos grasos ω3 y ω6  (ácidos grasos poliinsaturados  ‐  ácido  linoleicoω‐6 y ácido  linolénicoω‐3), componentes principales de  los fosfolípidos de  membrana77.En  cuanto  al  ácido  propanoico,  proviene  biológicamente  de  la  escisión  de  ácidos grasos ω‐3 o bien del metabolismos de algunos aminoácidos y el ácido nonanoico  por escisión oxidativa de ácidos ω9, por ejemplo, del ácido oleico.  Todos  los  resultados  obtenidos  en  este  trabajo  son  consecuencia  de  la  metodología analítica empleada. A continuación se hace una discusión de  los mismos en  función de los grupos de estudio.  6.3. Estudio de los VOC en el grupo control  Se han evaluado las diferencias existentes en la concentración de los VOC del aire  exhalado  en  función  del  consumo  de  tabaco  en  un  grupo  de  estudio,  formado  exclusivamente por voluntarios sanos.  Según los resultados obtenidos, el único compuesto relacionado con el tabaco es el  nonanal (tablas 26, 27 y 28). Su origen biológico es conocido y este resultado se apoya en  que el  tabaco provoca estrés oxidativo,  lo que genera  la destrucción de  las  células y  la  Discusión  175    aparición de los VOC, cuestión importante para su aplicación como marcador. El hallazgo  de nonanal es independiente de la edad, género y cantidad de tabaco consumido, pero sí  está relacionado con la cualidad de “ser ó haber sido fumador” ó “no ser nunca fumador”.  Como dato importante, no se objetivó correlación cuantitativa entre tabaco consumido y  nonanal exhalado. Estos hallazgos no se han encontrado en  la bibliografía consultada. Es  decir, la detección de nonanal se ve influida por la cualidad de ser o haber sido fumador,  pero  es  independiente  de  la  cantidad  de  tabaco  consumido.  Obliga  a  pensar  en  la  persistencia de  la  lesión  celular producida por el  consumo de  tabaco, que mantiene un  estrés  oxidativo  elevado,  aun  cuando  se  haya  abandonado  el  hábito  de  fumar mucho  tiempo antes. El mantenimiento de esta alteración celular podría evolucionar a patología  inflamatoria  o  tumoral,  dependiendo  del  polimorfismo  del  citocromo  P450  (CYP2E1,  CYP1A1)97, lo que debe ser motivo de estudios posteriores.  Revisando  la bibliografía,  la mayor parte de  los estudios relacionados con VOC en  aire exhalado están orientados hacia la búsqueda de marcadores que permitan diferenciar  poblaciones con CP frente a otras no tumorales. En estos trabajos dividen  los grupos de  estudio en función del tabaquismo, agrupando por un lado fumadores activos y, por otro,  exfumadores y no fumadores, o bien sin hacer referencia clara a su cualidad de fumador o  exfumador.  Aunque  ha  sido  estudiada  la  determinación  de  VOC  en  fumadores,  exfumadores  y  no  fumadores  del  grupo  control  de  muchos  de  estos  trabajos,  los  resultados siempre vienen referidos a  los hallazgos respecto a CP y EPOC 67,94,137, siendo  muy escasas  las publicaciones que  comparan VOC en aire exhalado en  fumadores  y no  Discusión  176    fumadores  dentro  de  un  grupo  sano138,  y  que  permita  valorar  la  importancia  a  la  exposición del humo del tabaco como responsable del incremento del estrés oxidativo.   Huang  et  al.116  cuantifican  a  tiempo  real  aldehídos  saturados  (C3  a  C10)  en  aire  exhalado  de  voluntarios  sanos,  concluyendo  que  el  propanal  es  el  aldehído  más  abundante en el aire exhalado de voluntarios sanos. Sin embargo, los aldehídos de C4‐C10  también  están  presentes  pero  en  concentraciones muy  pequeñas,  inferiores  a  3  ppbv.  Emplazan a  trabajos  futuros  la  cuantificación de estos aldehídos en el aire exhalado de  pacientes con una enfermedad de base, con el objetivo de poder establecer si aldehídos  presentes en aire exhalado se pueden utilizar biomarcadores para fines diagnósticos.  6.4. Comparación del grupo EPOC frente al grupo control  En  la  comparación  de  los  resultados  obtenidos  del  grupo  EPOC  frente  al  grupo  control,  no  hemos  encontrado  ningún  compuesto  que  muestre  diferencias  estadísticamente significativas (tablas 31 y 32).   De los estudios publicados al respecto, nuestros datos sólo serían comparables con  los resultados obtenidos por Phillips C et al.122 que utilizan una metodología similar a  la  nuestra.  Aunque  este  grupo  concluye  que  únicamente  el  isopreno muestra  diferencias  estadísticamente significativas entre el grupo EPOC y el grupo control, nosotros no hemos  estudiado este compuesto al ser una molécula relacionada con  la síntesis del colesterol,  con lo que difícilmente puede atribuirse su origen al estrés oxidativo por lo que este VOC  puede resultar un factor de confusión.   Del  resto  de  los  estudios  comentar  que  el  estudio  de  Van  Berkel  et  al.119  no  Discusión  177    explican  cuál  es  el  origen  de  los  VOC  propuestos  para  su modelo.  Además  consideran  como  marcadores  compuestos  que  son  claramente  exógenos,  como  el  benzonitrilo  o  terpineol,  junto  con  otros  de  procedencia  incierta,  tales  como  alcanos  ramificados.  Igualmente valoran como marcador el isopreno. Los autores citados emplazan a justificar  la procedencia de  estos  compuestos  a  futuros  trabajos,  lo que  supone  la existencia de  seria  duda  de  los  autores  sobre  la  validez  en  la  valoración  de  estos  compuestos  como  marcadores.   En el  trabajo de Fens et al. 120 correlacionan  la eosinofilia y neutrofilia en esputo  inducido  con  VOC  de  origen  incierto  y  otros  no  identificados  que  se  les  caracterizan  únicamente  por  su  tiempo  de  retención,  si  bien,  no  parece  lógico  correlacionar  compuestos  no  identificados  con  otros  marcadores  biológicos.  Además  proponen   hidrocarburos  (alcanos, aromáticos…) como marcadores. Como ya hemos descrito no se  puede  aceptar  los  compuestos  procedentes  del  humo  del  tabaco  o  de  contaminación  ambiental como marcadores. Es  lógico pensar que compuestos que provienen del humo  del  tabaco  y  puedan  estar  elevados  en  personas  fumadoras  sin  que  signifique  su  producción  endógena.  Si  además,  el  consumo  del  tabaco  está  habitualmente  incrementado en el grupo EPOC, las cantidades exhaladas de estos compuestos serán muy  superiores  que  las  encontradas  en  un  grupo  control  no  fumador,  que  lo  único  que  inhalarán será el aire ambiental, que también puede contener estas sustancias pero más  diluidas, y por  tanto estarán en menor concentración. Por  todo esto y dado que no son  compuestos  que  genere  el  organismo,  no  deben  ser  utilizados  como  marcadores  de  ninguna patología, como se concluye en diferentes revisiones críticas 98,99,105,114.  Discusión  178    Por último, en  los estudios de nariz electrónica no se sabe qué es  lo que se está  determinando, siendo además estudios no reproducibles. Por otra parte, su utilización es  complicada y requiere un proceso de aprendizaje laborioso a base de análisis de muestras  y  la  aplicación  de  un  complejo  procesamiento matemático  que  “enseña”  a  la  nariz  a  distinguir entre diferentes tipos de pacientes. Una vez finalizada la vida útil del dispositivo,  hay que comenzar de cero, siendo necesario repetir las fases de aprendizaje y adecuación  matemática referidas anteriormente. Esto, unido a  la  influencia en  las variaciones de  los  contaminantes  ambientales,  hace  que  los  resultados  obtenidos  no  puedan  ser  reproducibles.  6.5. Comparación del grupo de cáncer de pulmón frente al resto de los grupos  En nuestro estudio,  se han evaluado  las diferencias existentes entre el grupo CP  frente a los dos grupos anteriormente descritos (grupo EPOC y grupo control). En la mayor  parte de los estudios publicados no se identifica un único compuesto como marcador, sino  que  son  un  conjunto  de  compuestos  los  que  permiten  diferenciar  entre  diferentes  poblaciones de estudio. A diferencia con el  resto de  los estudios, hemos encontrado un  único  compuesto,  ácido  nonanoico,  que  presenta  diferencias  estadísticamente  significativas  entre  el  grupo  CP  y  el  resto  de  los  grupos  (EPOC  y  control),  con  una  probabilidad  de  casi  tres  veces  superior  de  encontrar  este  VOC  en  CP  frente  al  grupo  control  (tabla  36),  y  de  casi  9  frente  al  grupo  EPOC  (tabla  38).  Este  hallazgo  es  independiente del tabaco (tabla 41).  Discusión  179    Es de especial relevancia que el ácido nonanoico (9 átomos de carbono con estado  de máxima  oxidación)  se  detecte más  en  pacientes  con  CP, mientras  que  el  nonanal  (mismo  número  de  átomos  de  C  pero  en  estado  de  oxidación  intermedio)  es  el  único  compuesto  que  se  ha  descrito  con  diferencias  significativas  entre  los  fumadores  y  exfumadores de personas clínicamente sanas. Es decir,  lo que marca  la diferencia entre  tumoral y no  tumoral es el estado de máxima oxidación de una molécula con el mismo  número de átomos de C  (9 en  total), en máximo estado de oxidación. Este  compuesto  hasta el momento no ha encontrado citado en ningún artículo revisado.   La  baja  sensibilidad  de  la  prueba  (32%),  se  debe  en  gran medida  a  la  técnica  instrumental utilizada. Sin embargo, aun utilizando esta técnica, la especificidad del ácido  nonanoico para cáncer de pulmón es del 88%.  Revisando  los  artículos  publicados  para  CP,  existe  una  gran  variedad  de  compuestos  propuestos  que  presentan  diferencias  entre  los  grupos  de  sanos  y  de  CP,  según  se muestra en  la  revisión  realizada por Van de Kant en 2012. De nuevo  se hace  notar,  como  ya  se  ha  reiterado  a  lo  largo  de  este  trabajo,  que  todos  los  estudios  que  incluyan  compuestos  de    origen  incierto  o  de  contaminantes  ambientales,  deberían  ponerse en cuestión  Actualmente  adquiere  gran  relevancia  el  estudio  de  aldehídos  como  biomarcadores  al  ser  el  resultado  de  procesos  de  peroxidación  de  los  componentes  celulares.  Estos  compuestos  han  sido  referenciados  por  diversos  autores  como  Discusión  180    marcadores de CP104, 106 o  incluso cáncer de mama102. Estos resultados hay que tomarlos  con cautela pues constan de un número muy reducido de pacientes.  Otro dato a valorar es que inicialmente se cuestionaron los estudios realizados por  Phillips et al.66,67 debido a la falta de inclusión el grupo EPOC para su comparación con el  grupo CP. Pues bien, en esta revisión de  todos ellos, únicamente  los estudios realizados  por Poli et al.94 incluyen al grupo EPOC como grupo de estudio frente al grupo CP, siendo  el cáncer una patología que se da altísima frecuencia en pacientes con EPOC, con fenotipo  enfisema139,140.  6.6. Comparación de subgrupos de cáncer de pulmón con EPOC y sin EPOC  El grupo CP es un grupo a tratar de forma especial. Coexisten diferentes  factores  que pueden dar  lugar a  interferencias o  simplemente a  confusión,  como pueden  ser  la  diferente histología tumoral, el tamaño del tumor, estadificación, existencia de historia de  tabaquismo y, sobre todo, la asociación con EPOC.   Se ha divido el grupo CP en dos, los que están asociados EPOC y los que no. Se ha  demostrado  en  nuestro  trabajo  que  el  ácido  propanoico  muestra  diferencias  estadísticamente significativas entre ambos. Recordemos que entre los diferentes grupos  (control,  EPOC  y  CP),  este  ácido  no mostraba  diferencias,  encontrándose  en  la mayor  parte de las muestras analizadas, con una excepción: en el subgrupo de cáncer de pulmón  sin EPOC, en el que no se ha detectado en el 85% de  los casos. Este subgrupo, un  tanto  especial, engloba pacientes fumadores de poco  índice tabáquico, así como, pacientes no  fumadores, casi todos ellos mujeres con histología de adenocarcinoma.  Discusión  181    No se han podido establecer diferencias entre fumadores y no  fumadores dentro  de este subgrupo por el escaso número de pacientes con los que contábamos.   La sensibilidad y especificidad de la prueba  para el ácido propanoico son de 67% y  69% respectivamente.  Es necesario continuar el estudio ampliando el número de pacientes que permita  una estratificación potente por TNM e histología.           182            CONCLUSIONES Conclusiones  185    7. CONCLUSIONES  1. El  ácido  nonanoico  discrimina  entre  el  grupo  CP  y  el  resto  de  grupos,  pudiendo  considerarlo marcador de cáncer, con una especificidad del 87%.  2. La ausencia de ácido propanoico se asocia al subgrupo de CP sin EPOC. En el subgrupo  de pacientes no fumadores y con histología de adenocarcinoma llega a ser del 100%.  3. El  nonanal  muestra  significación  estadística  entre  personas  sanas  con  historia  de  tabaquismo (actual o previo) frente a personas sanas no fumadoras. Se relaciona con  la cualidad de ser o haber sido fumador.  Es independiente del género y de la cantidad  de tabaco consumido.  4. No se ha encontrado ningún VOC que diferencie entre los grupos EPOC y Control.  5. Se ha puesto a punto un método analítico que permite determinar e  identificar VOC  en  aire  exhalado,  pudiendo  reprocesar  con  facilidad  en  busca  de  posibles  nuevos  marcadores.  No  obstante  es  insuficiente  para  la  correcta  reproducibilidad  en  la  determinación de ácidos carboxílicos.   6. Es necesario un acuerdo de consenso para normalizar la recogida y procesamiento de  las muestras  de  aire  exhalado  que  permita  la  posible  aplicación  de  los  VOC  como  marcadores en la práctica clínica.          186                  ANEXOS Anexos  189    8. ANEXOS  ANEXO 1    HOJA DE INFORMACION AL PACIENTE    PROYECTO DE  INVESTIGACION:  “Utilidad  de  los  compuestos  orgánicos  volátiles  en  aire  exhalado  en  el  diagnóstico y seguimiento evolutivo del cáncer broncogénico.”    INVESTIGADOR PRINCIPAL: Dr. Luis Callol Sánchez    Se  solicita  su  participación  en  el  siguiente  proyecto  de  investigación    cuyo  objetivo  principal  es  la  determinación  de  diversos  compuestos  orgánicos  volátiles  (VOC)  en  aire  exhalado  como  factor  diagnóstico y predictivo del Cáncer de Pulmón y su posible recidiva tras tratamiento.  En  este  estudio  participan    el Hospital  Central  de  la Defensa, Hospital  Clínico  San  Carlos,  Facultades  de  Medicina de Alcalá y UCM, Farmacia de la UCM, y San Pablo CEU, con un total de 800 participantes.  Participan  sólo  individuos  que  deciden  tomar  parte.  Le  rogamos  que  lea  con  detenimiento  el  presente  documento. Haga preguntas acerca de cualquier cosa que no comprenda. Tómese su tiempo para tomar una  decisión.    DISEÑO DEL ESTUDIO  Durante  la  primera  consulta  se  realizará  una  breve  historia  clínica.  Los  datos  del  estudio  incluyen  datos  personales necesarios para el proceso y  se analizarán y procesarán, pero  sólo para  fines de  investigación  relacionados con el presente estudio. Solamente se revisará la parte de historia clínica relevante al estudio.  Los  registros  que  contienen  estos  datos  pueden  ser  enviados  a  otros  países  y  publicados  pero  no  se  le  identificará por su  nombre en ningún caso.  Posteriormente se recogerá la muestra de aire exhalado mediante una maniobra de espiración forzada y se  almacenará  en  tubos  de  desorción  térmica  (tubos  de  acero  rellenos  de material  adsorbente)  especiales  debidamente etiquetados para su análisis en el día.  ¿CUÁLES SON LOS RIESGOS Y BENEFICIOS DEL ESTUDIO?   Los riesgos que supone someterse a este estudio son mínimos y poco molestos. No habrá coste alguno por  las consultas del médico relacionadas con el estudio ni por las pruebas realizadas.  CONFIDENCIALIDAD  Se mantendrá  la confidencialidad de todos  los datos recogidos concernientes al estudio de acuerdo con  lo  establecido en  la Ley General de Sanidad,  la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de  datos de Carácter Personal y la Ley 41/2002 de Autonomía del Paciente."  Entre  las organizaciones que podrán  inspeccionar  los registros de  investigación que  le conciernen a  fin de  verificar la exactitud de dichos registros y para analizar los datos son:  - El promotor del estudio (servicio de Neumología del Hospital Central de la Defensa) así como el  servicio de Medicina Preventiva.  -  El  Comité  ético  (  un  grupo  de  personas  que  revisan  la  investigación  para  proteger  sus  derechos), y   - Las  administraciones  sanitarias  (Ministerio  de  Sanidad  y  Consumo  de  España,  Comunidades  Autónomas y aquellas internacionales a efectos exclusivamente científicos).  Anexos  190    Todos  estos  grupos  aceptan  proteger  la  confidencialidad  de  los  datos  obtenidos  de  y  acerca  de  usted  durante el presente estudio.  ¿CUÁLES SON MIS DERECHOS COMO PARTICIPANTE EN EL PRESENTE ESTUDIO?  La participación en el presente estudio es voluntaria. Puede usted decidir no participar o puede abandonar  el estudio en  cualquier momento.  La decisión de no participar o de abandonar el estudio no ocasionará  ninguna penalización ni coste alguno.   Le comunicaremos cualquier nueva información que pueda afectar a su salud.  ¿A QUIÉN LLAMO SI TENGO PREGUNTAS O PROBLEMAS?  Para  formular  preguntas  acerca  del  estudio  póngase  en  contacto  con  un médico  o  con  un miembro  del  personal investigador.  Estas personas estarán disponibles para responder a sus preguntas antes, durante y después del estudio.    HOJA  DE  FIRMAS  DE  CONSENTIMIENTO  INFORMADO      Yo,                                  (Nombre del paciente en mayúsculas y D.N. I.)    - He leído la hoja de información que se me ha entregado.  - He podido hacer preguntas sobre el estudio.  - He recibido suficiente información sobre el estudio.  - He recibido una copia de este documento.  - Consiento que personal del  Servicio de Neumología encargado del estudio pueda  revisar mi  historial médico personal para verificar la fidelidad de los datos durante el éste.    He hablado con:                         (Nombre del investigador)    Comprendo que mi participación es voluntaria.  Comprendo que puedo retirarme del estudio:         ‐  Cuando quiera.         ‐  Sin tener que dar explicaciones.         ‐  Sin que esto repercuta en mis cuidados médicos.    Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio.                                    FECHA                                           FIRMA DEL PARTICIPANTE                                    FECHA                                         FIRMA DEL INVESTIGADOR    Nota:  Cada persona debe firmar y fechar de su puño y letra.      Anexos  191    ANEXO 2          192            BIBLIOGRAFÍA Bibliografía  195    9. 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(CDKN2A) mutation  status and promoter  inactivation  in head and neck  cancer.  Int  J  Mol Med. 1999;4(1):61‐5   24Paez,  J.G,  Jänne  PA,  Lee  JC,  Tracy  S,  Greulich  H,  Gabriel  S,  Herman  P,  Kaye  FJ,  Lindeman N, Boggon  TJ, Naoki  K,  Sasaki H,  Fujii  Y,  Eck MJ,  Sellers WR,  Johnson BE,  Meyerson M.  EGFR mutations  in  lung  cancer:  correlation  with  clinical  response  to  gefitinib. therapy. Science 2004;304:1497‐1500.  25 Varella‐García,  M.  Chromosomal  and  genomic  changes  in  lung  cáncer.  Cell  Adhesión& Migration. 2009; 4, 100‐6.  26Pao, W.; Girard, N. New driver mutations in non‐small‐cell lung cáncer. Lancet Oncol.  2011;12:175‐80.  27Shaw  AT,  Kim  DW, Nakagawa  K,  Seto  T,  Crinó  L,  Ahn MJ,  et  al.  Crizotinib  versus  chemotherapy in advanced ALK‐positive lung cancer. N Engl J Med. 2013;368(25):2385‐ 94.  28 Travis WD, Brambilla E, Müller‐Hermelink HK and Harris C Editors. Tumours of  the  Lung, Pleura, Thymus and Heart. Albany, NY (USA): WHO Publications Center; 2004.  Bibliografía  197                                                                                                                                                                    29Rami Porta R. Nueva clasificación TNM del cáncer de pulmón. Arch Bronconeumol.  2009;45(4):159‐61.  30Diccionario de la Lengua Española. 23ª ed. Madrid: Real Academia Española; 2014.  31Fontana RS, Sanderson DR, Miller WE, Woolner LB, Taylor WF, Uhlenhopp MA. The  Mayo  Lung  Project:  preliminary  report  of  "early  cancer  detection"  phase.Cancer.  1972;30(5):1373‐82.  32Kubic A, Parkin DM, Klat M, Erban  J,Polak  J, Ademec M. Lack of benefit  from semi‐ annual screening  for cancer of the  lung:  follow up report of a randomized controlled  trial on a population of high risk males in Czechoslovakia. Int J Cancer. 1990; 45:26‐33.  33Fontana RS, Sanderson DR,  Woolner LB, Taylor WF, Miller WE, Muhm JR Bernartz PE,  Payne Ws, Pairolero PC, Bergstralh.  Screening  for  lung  cancer: A  critique of  the  the  Mayo project. Cancer. 1991;67(4 Suppl):1155‐64.  34Black C, Bagust A, Boland A, Walker S, McLeod C, De Verteuil R, et al. The  clinical  effectiveness  and  cost‐effectiveness  of  computed  tomography  screening  for  lung  cancer: systematic reviews. Health Technol Assess. 2006;10(3):iii‐iv, ix‐x, 1‐90.  35National  Cancer  Institute  (NCI).  What  is  NLST?.  Bethesda  (MD):  National  Cancer  Institute; 2008 Disponible en: www.cancer.gov/NLST.  36Dominioni L, Strauss GM, Imperatori A, Rovera F, DionigiG. Screening for lung cancer.  Chest Surg Clin N Am. 2000;10(4):729‐36.  37Henschke CI, McCauley DI, Yankelevitz DF, Naidich DP, McGuinness G, Miettinen OS,  Libby DM, Pasmantier MW, Koizumi  J, Altorki NK, Smith  JP. Early Lung Cancer Action  Project: overall design and findings from baseline screening. Lancet. 1999;354:99‐105.  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                                                                                                                                                                tomography  and  positron  emission  tomography.  Am  J  Respir  Crit  Care  Med.  2005;171(12):1378‐83.  42Callol L, Roig F, Cuevas A, De Granda JI, Villegas F, Jareño J, Arias E, Martinez‐Albiach  JM. Low‐dose CT: A useful and accesible tool for the early diagnosis of  lung cancer  in  selected populations. Lung cancer. 2007;56(2):217‐21.  43The Early Lung Cancer Action Program  Investigators.Survival of patients with stage  I  Lung Cancer detected on CT screening. N Engl J Med. 2006; 355:1763‐71.  44Informes de Evaluación de Tecnologías Sanitarias ‐ avalia‐t Núm. 2007/06  45Humphrey  LL, Teutsch S,  Johnson M.  Lung  cancer  screening with  sputum  cytologic  examination,  chest  radiography,  and  computed  tomography:  an update  for  the U.S.  Preventive Services Task Force. Ann Intern Med. 2004;140(9):740‐53.  46Marcus PM, Bergstralh EJ, Zweig MH, Harris A, Offord KP, Fontana RS.Extended lung  cancer  incidence follow‐up  in the Mayo Lung Project and overdiagnosis. J Natl Cancer  Inst. 2006;98(11):748‐56.  47Smith  R,  Cokkinides V,  Brawley O.  Cancer  screening  in  the United  States,  2009:  a  review of current American Cancer Society guidelines and  issues  in cancer screening.  CA Cancer J Clin. 2009;59(1):27‐41.  48The National  Lung  Screening  Trial  Research  Team.  Reduced  Lung‐Cancer Mortality  with Low‐Dose Computed Tomographic Screening. N Engl J Med. 2011; 365:395‐409.  49Peter B. Bach;  Joshua N. Mirkin; Thomas K. Oliver; et al. Benefits and harms of CT  screening for lung cancer. JAMA. 2012;307(22):2418‐29.  50Pyenson BS, Sander MS, Jiang Y, Kahn H, and Mulshine JL. An actuarial analysis shows  that  offering  lung  cancer  screening  as  an  insurance  benefit  would  save  lives  at  relatively low cost. Health Aff (Millwood). 2012;31(4):770‐9.   51Nicholson JK, Lindon JC. Metabonomics. Nature. 2008;455:1054–6.  52 Venter  JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, et al. The Sequence of  the  Human Genome. Sci . 2001;291 (5507 ):1304–51.  53 Nicholson  JK.  Global  systems  biology,  personalized  medicine  and  molecular  epidemiology. Mol Syst Biol. 2006; 3;2(1)  54Holmes E, Wilson ID, Nicholson JK. Metabolic phenotyping in health and disease. Cell.  2008;134(5):714–7.    55Aberle DR, Brown K. Lung cancer screening with CT. Clin Chest Med. 2008;29(1):1‐14.  56Melamed MR.  Lung  cancer  screening  results  in  the National  Cancer  Institute New  York study. Cancer. 2000;89(11 Suppl):2356‐62.  Bibliografía  199                                                                                                                                                                    57Sanz‐Ortega  J, Roig F, Al‐Mousa MM, Saez MC, Muñoz A, Sanz‐Esponera  J, Callol L.  17p13  (p53  locus),  5q21  (APC  locus)  and  9p21  (p16  locus)  allelic  deletions  are  frequently found in oral exfoliative cytology cells from smoker patients with non small  cell lung cancer. Histol Histopathol. 2007;22(5):541‐5.  58Roig F. Estudio de PDH en los genes p53, p16 y APC en cavidad oral. Marcadores de  riesgo  para  cáncer  de  pulmón.  2011.  Saarbrücken,  Alemania.  Editorial  Académica  Española.  59Petricoin  EF,  Liotta  LA.  Clinical  applications  of  proteomics.  J  Nutr.  2003;133(7  Suppl):2476S‐84S.  60Rahman SM, Shyr Y, Yildiz PB, Gonzalez AL, Li H, Zhang X, et al. Proteomic patterns of  preinvasive bronchial lesions. Am J Respir Crit Care Med. 2005;172(12):1556‐62.  61Horvath  I, Hunt  J,  Barnes  PJ, Alving  K,  Antczak A,  Baraldi  E,  et  al.  Exhaled  breath  condensate: methodological recommendations and unresolved questions. Eur Respir J.  2005;26(3):523‐48.  62González‐Mangado N. Análisis del condensado exhalado: ¿una  técnica con  futuro?.  Arch Bronconeumol. 2005;41:540‐1.  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INTRODUCCIÓN 2. HIPÓTESIS 3. OBJETIVOS 4. MATERIALES Y MÉTODOS 5. RESULTADOS 6. DISCUSIÓN 7. CONCLUSIONES 8. ANEXOS 9. BIBLIOGRAFÍA