. UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Microbiología TROPISMO DEL VIH-1: METODOLOGÍAS DIAGNÓSTICAS Y APLICACIONES CLÍNICAS. MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Verónica Briz Sebastián Bajo la dirección de los doctores Vicente Soriano Vázquez Eva Poveda López Madrid, 2009 • ISBN: 978-84-692-6745-5 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Microbiología TROPISMO DEL VIH-1: METODOLOGÍAS DIAGNÓSTICAS Y APLICACIONES CLÍNICAS TESIS DOCTORAL Verónica Briz Sebastián Madrid, 2008 Tesis Doctoral TROPISMO DEL VIH-1: METODOLOGÍAS DIAGNÓSTICAS Y APLICACIONES CLÍNICAS Esta memoria ha sido presentada para optar al grado de Doctora en Microbiología Médica por la Universidad Complutense de Madrid por la licenciada: Verónica Briz Sebastián Directores de la Tesis: Dr. Vicente Soriano Vázquez Doctor en Medicina. Jefe de Sección. Servicio de Enfermedades Infecciosas. Hospital Carlos III, Madrid. Dra. Eva Poveda López Doctora en Microbiología Médica. Responsable del Área de envoltura viral del Laboratorio de Biología Molecular. Servicio de Enfermedades Infecciosas. Hospital Carlos III, Madrid. VªBª de los Directores de la Tesis: AGRADECIMIENTOS Son muchas las personas a las que quiero agradecer el apoyo y la ayuda que me han prestado durante estos tres años de tesis. A los Drs. Juan González-Lahoz y Vicente Soriano por haberme dado la oportunidad de realizar esta tesis y haber confiado en mí para este proyecto. A mi directora de tesis la Dra. Eva Poveda, por haberme guiado y ayudado durante estos tres años. Al Dr. José Miguel Benito, por las numerosas horas empleadas en ayudarme, tanto profesional como personalmente, sin tener obligación alguna, incluso en ocasiones anteponiéndome a sus propios doctorandos. A la Dra. Mariola López, por enseñarme, compartir sus conocimientos y por las largas discusiones profesionales mantenidas, así como por su incondicional apoyo. A la Dra. África Holguín, por su apoyo constante en los buenos y malos momentos, así como por sus sabios consejos. Por tener siempre una palabra amable y una cálida sonrisa. A Mar González, mi mano derecha en muchas ocasiones en el laboratorio, por su inestimable y constante ayuda tanto a nivel profesional como personal, así como por la amabilidad y dulzura mostrada. A Marisa, por su incondicional sonrisa y apoyo, tanto profesional como personal, en los buenos y malos momentos, porque como una buena amiga me dijo una vez, para ir de copas todos servimos. A Pilar, por su gran paciencia, por los buenos consejos, por saber transmitirme tranquilidad por ser tan buena amiga. A Mar Molinero, por la energía y fuerza que desprende así como por su constante apoyo y amistad. A Marcelle, por el apoyo que me ha ofrecido en todo momento y por su incondicional amistad. A Norma, por estar siempre cuando la he necesitado compartiendo mis alegrías y tristezas. Gracias por escucharme, apoyarme, aconsejarme y estar siempre ahí. A Eva Ramírez, por su constante apoyo, a Carolina y María, por su incondicional ayuda y su sonrisa amable, a Judith, Gonzalo, Miguel, Julio, por su paciencia, a Laura, por sus buenos consejos, a Alejandra por su apoyo, a Clara por su dulzura, y a Belén, Jose y Julie, por su amabilidad y disposición. A Vicky y Ainhoa, por ofrecerme una sonrisa siempre que lo he necesitado, por escucharme y por su amabilidad, a Gema, por confiar en mi capacidad para escribir este tríptico, a Alma por su ayuda, siempre que la he solicitado y a Angélica por su inmensa disposición en todo momento, facilitándome el trabajo. A Ester, mi compi de tesis, por su paciencia, disposición, gran sonrisa y amabilidad. A Carmen, Berta, Carlos, Sonia, Antonio (farmacia), Antonio (hepatitis), Sara, Goyi, Conchi y Eduardo, por ayudarme siempre que lo he pedido. También quisiera agradecer los médicos, Lola, Eugenia, Pilar, Yvana, José, Pablo Rivas, Pablo Barreiro, Nuria, Andrés, Luz y Pablo Labarga por sus consejos y ayuda. A Rocío, por su paciencia y por la inestimable ayuda prestada con ese quebradero de cabeza llamado estadística, a Ana y Josefina, por la paciencia y amabilidad con la que me han tratado, así como por la rapidez mostrada en conseguir los papers que he solicitado, facilitándome el trabajo. A Pablo y Eduardo, del servicio de informática, por solucionarme los problemas informáticos. A Eugenia y Gema, del departamento de contabilidad, por facilitarme el papeleo que supuso la concesión de la beca FIS; a Ana y Clara del departamento de compras, por su amabilidad y ayuda con el pedido de material, y al equipo del almacén por su paciencia y ayuda cada vez que la solicitaba. A la Dra. Mª Ángeles Muñoz por creer en mí y por facilitarme la posibilidad de incorporarme en mi actual grupo de trabajo. A Jorge, por transmitirme calma y sensatez, por su apoyo incondicional constante y por estar ahí en los buenos y malos momentos. Y en especial quisiera dar las gracias al gran puntal de mi vida: mi familia. A mis padres, por quererme y apoyarme, y a mis hermanas Holanda y Marta, por confiar en mí, apoyarme y ayudarme en todo momento. Muchas gracias por facilitarme la vida. INDICE i 1. INTRODUCIÓN ..................................................................................................... 1 1.1. Estructura del VIH-1 .................................................................................... 2 1.2. Ciclo replicativo del VIH-1............................................................................ 5 1.3. Entrada del VIH-1 en la célula .....................................................................6 A. Unión de la glicoproteína de superficie gp120 al receptor celular CD4 ....................................................................................................8 B. Interacción del complejo CD4-gp120 con los receptores de quimiocinas ........................................................................................ 9 C. Fusión de las membranas viral y celular.......................................... 11 1.4. Tropismo viral: definición y bases moleculares......................................... 13 1.5. Dinámica del tropismo viral durante la progresión de la enfermedad....... 15 1.6. Impacto de la terapia antirretroviral en el tropismo viral y en la expresión del correceptor CCR5 a nivel celular ................................... 20 1.7. Implicaciones del tropismo viral en la era de los antagonistas de CCR5 y CXCR4 .................................................................................... 22 1.8. Herramientas para determinar el tropismo viral en la práctica clínica ......24 2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 30 3. PACIENTES Y MÉTODOS ................................................................................. 33 3.1. Pacientes ................................................................................................... 34 3.2. Obtención de plasma................................................................................. 35 3.3. Viremia plasmática .................................................................................... 35 3.4. Recuento de linfocitos T CD4+.................................................................. 35 3.5. Extracción del ARN viral ............................................................................ 36 3.6. Análisis genético del gen pol y de la región gp41 del gen env ................. 36 3.7. Análisis genético de la región V3 de la envuelta viral .............................. 37 3.8. Purificación del amplicón ........................................................................... 38 3.9. Secuenciación del ADN............................................................................. 38 3.10. Determinación genotípica del uso del correceptor .................................. 39 3.11. Determinación fenotípica del uso del correceptor ................................... 43 ii 3.12. Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) ...... 43 3.13. Extracción del ADN.................................................................................. 44 3.14. Determinación genotípica del receptor CCR5 (CCR5∆32) ..................... 45 3.15. Determinación del nivel de interleuquina 7 (IL-7) en plasma.................. 45 3.16. Cuantificación de la expresión del correceptor CCR5 en distintas subpoblaciones de linfocitos T ................................................................ 46 3.17. Análisis del nivel de activación en linfocitos T......................................... 47 3.18. Datos epidemiológicos y marcadores biológicos .................................... 49 3.19. Análisis estadístico .................................................................................. 49 4. RESULTADOS.................................................................................................... 52 Estudio 1: Evaluación de herramientas genotípicas para la determinación del uso del correceptor en muestras clínicas tomando como referencia un ensayo fenotípico basado en virus recombinantes .......................................... 53 4.1. Población de estudio ............................................................................ 53 4.2. Concordancia entre métodos genotípicos y fenotípicos para la determinación del uso del correceptor.................................................. 55 Estudio 2: Prevalencia de variantes VIH-1 según el uso del correceptor en diferentes etapas de la infección por VIH........................................................... 57 4.3. Población de estudio ............................................................................ 57 4.4. Prevalencia de variantes R5 y X4 ................................................ 57 4.5. Asociación entre tropismo viral y características epidemiológicas ...... 59 4.6. Asociación entre tropismo viral y parámetros clínicos ......................... 61 4.7. Asociación entre tropismo viral y presencia de mutaciones de resistencia a las distintas familias de antirerretrovirales ................ 62 4.8. Asociación entre tropismo viral y nivel de interleuquina IL-7 en plasma.............................................................................................. 66 iii Estudio 3: Impacto del tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA) en el uso del correceptor en pacientes VIH+ ..................................... 67 4.9. Diseño del estudio ................................................................................ 67 4.10. Población de estudio .......................................................................... 69 4.11. Prevalencia de cepas X4-trópicas en el momento basal ................... 71 4.12. Factores asociados con el tropismo viral en el momento basal ........ 71 4.13. Características del cambio en el uso del correceptor durante el seguimiento longitudinal .................................................................... 74 4.14. Factores asociados con el cambio del uso del correceptor durante el seguimiento longitudinal................................................................. 75 Estudio 4: Influencia del tratamiento antirretroviral de gran actividad en la expresión del correceptor CCR5 ......................................................................... 77 4.15. Población de estudio .......................................................................... 77 4.16. Perfil de expresión de la molécula CCR5 en linfocitos T CD4+ y CD8+...................................................................................... 77 4.17. Influencia de la infección por VIH-1 en la expresión de CCR5 ....... 80 4.18. Influencia de la terapia antirretroviral en la expresión de CCR5........ 82 4.19. Nivel de activación en linfocitos T CD4+ y T CD8+ y evolución bajo TARGA ........................................................................................ 84 5. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 86 6. CONCLUSIONES ............................................................................................. 108 7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 111 8. ANEXOS ........................................................................................................... 135 9. ABREVIATURAS.............................................................................................. 144 INTRODUCCIÓN Introducción 2 1.1. ESTRUCTURA DEL VIH-1 El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), es el agente infeccioso causante del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Es un virus ARN clasificado dentro de la familia de los retrovirus humanos (Retroviridae) que pertenece al género Lentivirus (Barré-Sinoussi et al. 1983, Gallo RC et al. 1983). La estructura y organización genómica del VIH-1 se muestran en la figura 1. El VIH-1 está formado por una membrana lipídica en la que se insertan las glicoproteínas gp120 (SU) y gp41 (TM), codificadas por el gen de la envuelta (env). Tras la membrana viral interna se encuentra la proteína de matriz, p17, (MA), seguida de la cápside viral (CA), constituida por la proteína p24. El material genético, formado por dos copias de ARN con polaridad positiva, se localiza dentro de la cápside viral y se encuentra estabilizado a través de complejos con la proteína de la nucleocápside, p7, (NU). Las enzimas esenciales para la replicación viral, transcriptasa inversa (TI), proteasa (PR) e integrasa (IN), además de las proteínas reguladoras (Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu) se encuentran situadas en el interior de la cápside (Emerman et al. 1998, Varmus 1998, Seelamgari et al. 2004). El genoma del VIH-1 posee una longitud de aproximadamente 9,8 kb. Está formado por tres genes esenciales: gag y env, que codifican las proteínas Introducción 3 estructurales y pol que codifica las enzimas virales esenciales para el ciclo replicativo viral, y 6 genes que codifican las proteínas reguladoras (Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu). Las secuencias repetidas largas (LTR), no codificantes, flanquean los extremos 3’ y 5’ del genoma viral, donde se encuentran regiones reguladoras esenciales para el ciclo replicativo del virus. Integrasa (IN) Transcriptasa Inversa (TI) (+) ARN genómico Matriz (MA) Bicapa lipídica Nucleocápside (NU) gp120 (SU) gp41 (TM) Proteasa (PR) Cápside (CA) . LTR LTR rev1 tat2 gag pol vif vpr vpu env nef tat1 rev2 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 Longitud (nt) a) b) Figura 1. Estructura y genoma de los retrovirus. a) Esquema de la estructura del virión del VIH; b) esquema de su organización genómica. Introducción 4 En la tabla 1 se muestran los diferentes genes que van a codificar para las distintas proteínas del virus, así como su localización y función. Gen Proteínas Función env gp120 (SU) gp41 (TM) Proteína de superficie de la envuelta. Interacciona con la molécula CD4+. Proteína transmembrana de la envuelta. Implicada en el anclaje de gp120 y en la fusión de la membrana viral y celular. gag p24 (CA) p17 (MA) p7 (NU) p6 Proteína estructural que forma la cápside. Proteína estructural que forma la matriz. Nucleoproteína asociada a 2 moléculas de ARN genómico, en el interior de la cápside. Implicada en la liberación del virión. pol PR TI IN Proteasa. Interviene en el procesamiento postransduccional de las poliproteínas gag y gag-pol. Transcriptasa inversa. Encargada de transformar el ARN genómico en ADN complementario. Integrasa. Encargada de integrar el ADN viral en el ADN de la célula huésped. tat Tat Factor de transactivación transcripcional. Proteína reguladora esencial para la replicación del virus. Se une a la secuencia TAR, sitio de unión del primer iniciador de la reacción de la transcriptasa inversa, del genoma. Crítica para el inicio y elongación de la transcripción. rev Rev Segunda proteína reguladora esencial para el virus. Regulador del transporte y procesamiento de los ARNm. Se une al elemento de respuesta a Rev (RRE). nef Nef Regulador negativo de la presencia del receptor CD4 en la membrana celular. Disminuye la expresión de los genes del complejo principal de histocompatibilidad de tipo I. vif Vif Proteína implicada en el transporte de complejos de preintegración, transactivación de genes celulares y parada del ciclo celular. vpr Vpr Proteína única al VIH-1 Implicada en la degradación de CD4 en el retículo endoplasmático y liberación de viriones. Introducción 5 1.2. CICLO REPLICATIVO DEL VIH-1 La replicación del VIH-1 se puede dividir en las siguientes etapas: 1) entrada del virus en la célula huésped tras la unión de la glicoproteína de la envuelta gp120 del VIH al receptor celular CD4 y a un receptor de quimiocinas, CCR5 o CXCR4); 2) liberación al citoplasma de la cápside viral; 3) transcripción reversa del ARN genómico viral y formación del ADN complementario de doble cadena mediado por la transcriptasa inversa; 4) transporte del ADN al núcleo celular; 5) integración en el genoma de la célula hospedadora mediante las secuencias LTR, por la acción de la integrasa; 6) transcripción de los genes provirales; 7) procesamiento de los tránscritos primarios hasta ARN genómico viral y ARNm viral; 8) traducción de los ARNm a las distintas proteínas virales en el citoplasma; 9) ensamblaje de las proteínas virales, 10) salida del virión de la célula por gemación, y 11) maduración del virión fuera de la célula huésped, por medio de la acción de la proteasa viral que corta las poliproteínas precursoras en proteínas maduras formando el virión infectivo (Levy 1993) (figura 2). Introducción 6 1.3. ENTRADA DEL VIH-1 EN LA CÉLULA El VIH-1 es un virus con envuelta, siendo la proteína de la envuelta, la que media la entrada del virus en la célula diana. La glicoproteína de la envuelta es una proteína integral de membrana, que se genera como un poliproteína precursora de 160 kDa, denominada gp160. En el aparato de Golgi, mediante la acción de una proteasa celular, se genera la envuelta madura, formada por la unión no covalente de dos subunidades asociadas: la glicoproteína de superficie gp120 y la proteína transmembrana gp41 (Hallenberg et al. 1992). La glicoproteína de la envuelta se encuentra anclada en una bicapa lipídica formando trímeros. 1.- Unión al receptor y correceptor Precursor Gag-Pol RE RE Golgi Núcleo Citoplasma 2.- Liberación de la cápside 3.-Transcripción inversa 4 y 5.- Transporte e integración 8.- Traducción 7.- Procesamiento 9 y 10.- Ensamblaje y salida por gemación 6.- Transcripción RE, retículo endoplasmático Figura 2. Ciclo replicativo del VIH-1 11.- Maduración y formación del virión infectivo Precursor Gag Introducción 7 La proteína viral gp120 está formada por dos dominios, uno interno y otro externo, unidos por un puente de láminas β. En dichos dominios se localizan cinco regiones conservadas (C1 a C5) y cinco regiones variables (V1 a V5). Las regiones V1/V2, V3 y C4 son las más críticas en el proceso de entrada viral. Los puentes disulfuro (Hoxie 1991, Leonard et al. 1990) formados entre ambos dominios darán lugar a la estructura tridimensional funcional de gp120. Uno de estos dominios, será el encargado del reconocimiento del receptor CD4 y de su unión. El proceso de entrada consta fundamentalmente de tres etapas (figura 3): A. Unión de la glicoproteína de superficie gp120 al receptor celular CD4. B. Interacción del complejo CD4-gp120 con los receptores de quimiocinas, principalmente, CCR5 y/o CXCR4. C. Fusión de las membranas viral y celular. Figura 3. Entrada del VIH-1 en la célula. (A) Unión CD4-gp120, (B) interacción gp120- correceptor, (C) fusión de membranas viral y celular. gp41 V3 CCR5 / CXR4 CD4 CD 4 A B Péptido de fusión C gp120 Introducción 8 A. Unión de la glicoproteína de superficie gp120 al receptor celular CD4 En 1984 se identificó la molécula CD4 como el principal receptor del VIH-1 en las células (Dalgleish et al. 1984, Klatzmann et al. 1984, Sattentau et al. 1988), siendo la interacción de gp120 con el receptor CD4 el primer paso del proceso de entrada viral. El antígeno CD4 es una inmunoglobulina de unos 55 KDa, localizada principalmente en la membrana plasmática de los linfocitos T (Reinherz et al. 1979, Maddon et al. 1985), y en menor medida en otros tipos celulares como macrófagos, monocitos, células de la microglía y células dendríticas, que incluyen a las células de Langerhans y a las células de la mucosa rectal, vaginal e intestinal (Reinherz et al. 1979, Hussain et al. 1995, Jordan et al. 1991). Su función es la de iniciar la activación de las células T CD4+. El sitio de interacción entre CD4 y gp120 no está accesible a la superficie y está bien conservado estructuralmente. Estas características han llevado a considerar dicha unión como una posible diana terapéutica, buscando agentes que puedan unirse específicamente y bloquear esta etapa inicial de la infección viral (tabla 2). Como consecuencia de la unión CD4-gp120, el núcleo conservado de gp120 sufre cambios conformacionales, pasando de un estado flexible a otro rígido, permitiendo la posterior interacción con los receptores de quimiocinas (Myszka et al. 2000). Introducción 9 B. Interacción del complejo CD4-gp120 con los receptores de quimiocinas Hasta mediados de los años noventa se pensó que la entrada del VIH-1 en las células requería únicamente la unión del virus al receptor celular CD4. Sin embargo, estudios posteriores demostraron que miembros de la familia de los receptores de quimiocinas, son igualmente necesarios para el proceso de entrada del VIH-1 en las células. En 1996 se identificó el primer correceptor asociado al proceso de entrada del VIH-1: el receptor de quimiocinas CXCR4, denominado inicialmente fusina e involucrado en el proceso de inflamación y hematopoiesis. CXCR4 interviene en el proceso de fusión entre la célula T y las variantes virales T-trópicas, pero no se utiliza como correceptor por las cepas M-trópicas en la infección de macrófagos (Feng et al. 1996). SDF-1 (“Stromal Cell Derived Factor-1”) es el ligando natural de CXCR4 (Bleul et al. 1996). La identificación de las quimiocinas RANTES, MIP-1α y MIP-1β, ligandos naturales de CCR5, como factores supresores del VIH-1 (Cocchi et al. 1995), así como la gran afinidad de MIP1-β por el receptor CCR5, hizo pensar que CCR5 era el correceptor principal, que junto a la molécula CD4, facilitaba la entrada de las cepas M-trópicas al interior de la células. (Alkhatib et al. 1996, Deng et al. 1996). Aunque in vitro se ha demostrado que existen variantes del VIH-1 que pueden usar otros correceptores celulares para entrar en las células (Zhang et al. 1998, Introducción 10 Björndal et al. 1997), no se han encontrado evidencias del uso de correceptores alternativos a CCR5 y CXCR4 in vivo. Los correceptores CCR5 y CXCR4 pertenecen a la familia de receptores de siete dominios transmembrana acoplados a la proteína G (“G protein-coupled receptors”). Presentan una estructura α-hélice de cuatro dominios transmembrana: 3 bucles extracelulares y un dominio N-terminal (Nt). La unión del complejo CD4-gp120 a los correceptores se produce a través de la región V3 de gp120, aunque existen otras regiones de gp120 que también participan en esta interacción. En particular, el brazo de la región V3 de gp120, junto con residuos del dominio conservado C4, son los responsables de la unión de gp120 al dominio Nt de CCR5, mientras que tanto la corona como el brazo de V3 son requeridos para la unión de gp120 a la superficie de CCR5 (Comier et al. 2002). En el caso de CXCR4, es la región V3 de gp120 la que interacciona directamente con CXCR4, con independencia de las regiones V1/V2 de gp120 (Sakaida et al. 1998). La consideración de los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4 como posibles dianas terapéuticas en el tratamiento de la infección por VIH-1, ha promovido el desarrollo de dos nuevas familia de fármacos, los antagonistas de CCR5 y de CXCR4 (tabla 2), que actúan inhibiendo la unión de la gp120 con estos correceptores (figura 4). Introducción 11 ECL2 Antagonista CCR5 brazo V3 Nt CCR5 V1/V2 corona V3 gp120 CD4 CD4 CD4 Figura 4. Modelo del mecanismo de unión del VIH-1 al receptor CCR5 en ausencia y presencia de un antagonista del correceptor C. Fusión de las membranas viral y celular La glicoproteína gp41 es la principal responsable del proceso de fusión de las membranas del VIH-1 y de la célula diana. Si se analiza de forma lineal la estructura de gp41, en el extremo Nt se encuentra el dominio correspondiente al péptido de fusión. Su carácter hidrofóbico permite su inserción en la membrana celular. A continuación se encuentran las regiones repetidas HR1 (“heptad-repeat 1”) y HR2 (“heptad-repeat 2”), que presentan aminoácidos con Introducción 12 un patrón de repetición característico de 7 residuos (abcdefg), de los cuales los correspondientes a las posiciones “a” y “d” son aminoácidos hidrofóbicos. Son ellos los que median la unión de los monómeros de gp41 en la forma trimérica de la envuelta viral. Durante el proceso de fusión se produce una reorganización estructural de gp41 que provoca la interacción entre las regiones HR1 y HR2 y lleva a la formación de una estructura termoestable de 6 hélices (“six helix bundle”), que es fundamental para que se produzca la fusión entre las membranas del VIH-1 y la célula diana (Lu et al. 1995). La estructura de 6 hélices está compuesta por un trímero interno, formado por las estructuras en espiral enrolladas de HR1, y otro trímero externo formado por las regiones HR2. Las regiones HR2 se unen de forma antiparalela a las estructuras en espiral enrollada de HR1 a través de cavidades hidrofóbicas (Weiss 2003, Cammack 2001). Las interacciones hidrofóbicas entre las regiones HR1 y HR2 confieren a la estructura de 6 hélices una gran estabilidad. El cambio en energía libre asociado a la formación de la estructura de 6 hélices es la que suministra la fuerza necesaria para producir la formación de un poro de fusión y, en consecuencia, la entrada de la cápside viral al interior celular (Mellikan et al. 2000). Enfuvirtida fue el primer inhibidor de la fusión aprobado para el tratamiento de la infección por VIH-1. Actualmente, una segunda generación de inhibidores de la fusión está en desarrollo. Introducción 13 * Fármacos aprobados para uso clínico † Fármacos en desarrollo preclínico Tabla 2. Inhibidores de la entrada viral aprobados para uso clínico o en desarrollo clínico en la actualidad. 1.4. TROPISMO VIRAL: DEFINICIÓN Y BASES MOLECULARES La definición de tropismo ha evolucionado desde que a finales de los años 80 se identificasen dos variantes fenotípicas del VIH-1. En un primer momento, el tropismo hacía referencia al efecto citopático del VIH-1 en células mononucleares de sangre periférica (CMSP). De esta manera, aquellos virus capaces de formar sincitios (células multinucleadas gigantes) se denominaron aislados inductores de sincitios (IS), mientras que el resto fueron denominados no inductores de sincitios (NIS) (Asjö et al. 1986, Tersmette et al. 1988). Una segunda clasificación de las variantes del VIH-1 fue establecida basándose en diferencias en la cinética de replicación observadas en CMSP, denominándola . Fármacos Mecanismo de acción Inhibidores CD4-gp120 TNX-355 Anticuerpo monoclonal frente a CD4 Antagonistas de CCR5 Maraviroc* Vicriviroc PRO-140 INCB9471 SHC 532706 Unión al dominio transmembrana de CCR5 Unión al dominio transmembrana de CCR5 Anticuerpo monoclonal frente a CCR5 Unión al dominio transmembrana de CCR5 Unión al dominio transmembrana de CCR5 Inhibidores de la fusión Enfuvirtida* TRI1144† Péptido sintético que mimetiza HR2 y bloquea la fusión de las membranas viral y celular Introducción 14 “alta/rápida” o “baja/lenta” (Asjö et al. 1986, Evans et al. 1987, Cheng-Mayer et al. 1988, Tersmette et al. 1988, Fenyö et al. 1988). Más recientemente, se propuso una nueva clasificación basada en la habilidad del virus de replicar en dos líneas celulares: monocito-macrófagos y células T CD4+, diferenciando las variantes M-trópicas de las variantes T-trópicas (Schuitemaker et al. 1991, Schuitemaker et al. 1992, Collman et al. 1989). En 1996, la identificación de los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4, que junto con el receptor celular CD4 eran requeridos por el VIH-1 para entrar en la célula, clarificó las bases moleculares del tropismo en función del receptor de quimiocinas usado para infectar la célula. El tropismo del VIH-1 por los receptores de quimiocinas fue rápidamente relacionado con algunas de sus características fenotípicas previamente establecidas. Se observó que las cepas clasificadas como NSI y M-trópicas utilizaban preferentemente el receptor CCR5 para entrar en la célula, mientras que aquellas que utilizaban CXCR4 eran generalmente cepas SI y T-trópicas (Berger 1997, Moore et al. 1997, Doms et al. 1997). Estos hallazgos permitieron una nueva clasificación de los aislados del VIH-1 basándose en el uso del correceptor, estableciendo tres categorías: cepas CCR5-trópicas (R5), CXCR4-trópicas (X4), y duales/mixtas (R5/X4) (Berger et al. 1998) (figura 5). Introducción 15 R5-trópicas DM X4-trópicas R5 (NIS) R5/X4 X4 (IS) Monocitos/Macrófagos Linfocitos T CD4+ Naïve Memoria Figura 5. Clasificación de las variantes del VIH-1 en función del uso del correceptor 1.5. DINÁMICA DEL TROPISMO VIRAL DURANTE LA PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD En los últimos años se ha relacionado el tropismo viral por los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4, con la evolución de la infección y con la progresión de la enfermedad. Las variantes R5-trópicas, parecen ser las responsables de la transmisión y establecimiento de la infección por VIH-1 independientemente de la ruta de transmisión (van´t Wout et al. 1994, Connor et al. 1997, Schuitemaker et al. 1992), predominan durante la etapa asintomática (Pope et al. 2003) y se han asociado al fenotipo biológico NIS (Spijkerman et al. 1995, van´t Wout et al. 1994). Las variantes X4-trópicas Introducción 16 emergen en un 40-60% de los individuos en etapas más avanzadas de la enfermedad, presentan un fenotipo viral IS y su aparición se ha asociado con una rápida caída de los linfocitos T CD4+ y con una progresión más rápida de la enfermedad (Schuitemaker et al. 1992, Brumme et al. 2005, Daar et al. 2007, Moyle et al. 2005, Koot et al. 1993, Tersmette et al. 1988, Richman et al. 1994) (figura 6). Sin embargo, este cambio de fenotipo viral no es imprescindible para la progresión de la enfermedad (Schuitemaker et al. 1992). Figura 6. Evolución del tropismo viral a lo largo de la historia natural del VIH-1 No se conocen los factores que determinan la restricción de la infección por cepas R5-trópicas en etapas iniciales de la infección. Sin embargo, diferencias Introducción 17 en la expresión de los correceptores CCR5 y CXCR4 en las células diana en el momento de la transmisión (Fear et al. 1998, Zaitseva et al. 1997), podrían explicar dicha restricción. El inicio de la infección podría deberse al transporte de partículas virales a los nódulos linfáticos a través de células dendríticas, (Moore et al. 2004, Pope et al. 2003) donde el virus podría pasar a las células T CD4+ activadas que expresan más CCR5 que CXCR4, y por tanto los virus R5- trópicos podrían infectar un mayor número de células inmediatamente después de la transmisión que los virus X4, independientemente de la ruta a través de la cual el virus llegue a los nódulos linfáticos. La replicación preferente del VIH-1 en el tejido linfoide asociado a la mucosa intestinal (GALT), también podría explicar la prevalencia de virus R5-trópicos en etapas iniciales de la infección, independientemente de la ruta de transmisión del virus. El GALT es el mayor reservorio de células memoria T CD4+ que expresan CCR5 (CD4+RO+CCR5+), y el principal sitio de replicación del VIH-1 en macacos y humanos (Veazey et al. 1998, Harouse et al. 1999, Brenchley et al. 2004, Mehandru et al. 2004, Li et al. 2005, Mattapallil et al. 2005). Por tanto, la abundancia de células memoria CD4+RO+CCR5+, podría favorecer la replicación temprana de virus R5 independientemente de la ruta de transmisión a través del cual el virus alcance el tejido linfoide. Diversos estudios han mostrado la importancia del correceptor CCR5 en la infección y patogénesis del VIH-1. La deleción de 32 pares de bases en el gen Introducción 18 ccr5 en homocigosis, disminuye significativamente, aunque no elimina por completo, el riesgo de infección por VIH-1 (Huang et al. 1996, Liu et al. 1996, Samson et al. 1996, Theodorou et al. 1997, Biti et al. 1997, Dean et al. 1996), mientras que en heterocigosis, se ha asociado con una menor tasa de progresión a SIDA (Huang et al. 1996, Moore et al. 1997, van Rij et al. 1999), lo que también sugiere la selección preferente de variantes R5-trópicas durante la transmisión viral y el establecimiento de la infección. Estudios previos han mostrado que individuos homocigotos portadores del polimorfismo CCR5∆32 pueden infectarse con variantes X4-trópicas (O´Brien et al. 1997, Michael et al. 1998, Sheppard et al. 2002), lo que demuestra que estas variantes pueden ser transmitidas. El hecho de que las infecciones por variantes X4-trópicas se produzcan en raras ocasiones demuestra, que estas variantes virales presentan una desventaja comparadas con virus R5-trópicos para el establecimiento de nuevas infecciones. Aunque las variantes virales X4, son poco prevalentes durante las primeras fases de la infección (Roos et al. 1992), a medida que la infección por VIH-1 progresa, se ha observado una evolución en el fenotipo viral de variantes R5 a DM y X4, cambio asociado a una evolución en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4 (Connor et al. 1997). Los mecanismos celulares y moleculares responsables del cambio a cepas más patogénicas todavía no están claros. El bajo número de mutaciones en la región V3 necesarias para provocar el cambio en el uso del correceptor (Pastore et al. 2004, Mosier et al. 1999, Introducción 19 Chesebro et al. 1996, Bozzette et al. 1993) y la elevada tasa de mutación y recombinación en el genoma del VIH-1, podrían favorecer la rápida y frecuente evolución de variantes X4 (Connor et al. 1993, Liu et al. 2002). Sin embargo, esto no es lo observado en pacientes infectados, por lo que debe haber una presión selectiva negativa de variantes X4 que impida el cambio en el uso del correceptor. Las diferencias de disponibilidad de las células diana para las distintas poblaciones virales (Douek et al. 2003), así como el cambio en los niveles de expresión de CCR5 y CXCR4 a lo largo de la infección por VIH-1 (van Rij et al. 2003), favoreciendo el uso de CXCR4 en etapas más avanzadas de la enfermedad y por tanto la aparición de variantes X4-trópicas, podría explicar este cambio en el uso del correceptor. Por último, la disfunción gradual del sistema inmune a medida que avanza la enfermedad (Schellekens et al. 1990) evitando el reconocimiento efectivo inicial de las variantes X4-trópicas (Tersmette et al. 1990, Miedema et al. 1990), llevaría a una disminución de la presión ejercida por el sistema inmune frente a virus X4-trópicos, favoreciendo su emergencia. Actualmente no está claro si la aparición de cepas X4-trópicas es causa o consecuencia de la disminución de la cifra de linfocitos T CD4+. Se desconoce si las variantes X4-trópicas son naturalmente más patogénicas y directamente responsables de la progresión de la enfermedad o si la emergencia de dichas variantes podría ser una consecuencia de la progresiva disfunción inmune (Shaheen et al. 2004). Introducción 20 1.6. IMPACTO DE LA TERAPIA ANTIRRETROVIRAL EN EL TROPISMO VIRAL Y EN LA EXPRESIÓN DEL CORRECEPTOR CCR5 A NIVEL CELULAR El uso de TARGA en pacientes VIH-1 ha modificado drásticamente el curso natural de la infección por VIH-1 (Palella et al. 1998), aproximando la esperanza de vida en personas infectadas en países occidentales a la de personas no infectadas. Sin embargo, la influencia de TARGA en la selección de variantes X4-trópicas podría modificar el ideal establecido sobre el beneficio indefinido que presenta TARGA. Existen resultados controvertidos respecto al impacto que TARGA pudiera tener en la emergencia de variantes X4-trópicas y por tanto en el cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4. Estudios previos han asociado la emergencia de variantes X4-trópicas con el uso del tratamiento antirretroviral (Johnston et al. 2003, Delobel et al. 2005) sugiriendo que TARGA podría facilitar las condiciones necesarias que permiten la emergencia gradual de variantes virales X4-trópicas a lo largo de la infección. Sin embargo, otros estudios han mostrado que el uso de TARGA podría retrasar la selección de variantes X4-trópicas (Skrabal et al. 2003, Galán et al. 2004). Si TARGA induce el cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4, está por evaluar. Según la historia natural de la infección por VIH-1, se ha observado un cambio fenotípico en la evolución de las variantes virales en Introducción 21 aproximadamente el 40-60% de los pacientes. Por ello, cabe esperar que la mitad de los individuos infectados por variantes R5 en el momento basal mantuvieran el fenotipo independientemente del desarrollo de la enfermedad y del fracaso al tratamiento antirretroviral. Por tanto, es difícil evaluar si fracasos repetidos al tratamiento tienen algún impacto en el curso natural del desarrollo de variantes fenotípicas del VIH-1. En un estudio longitudinal llevado a cabo recientemente en 40 pacientes multifracasados se observó, que fracasos recurrentes a TARGA no parecen ser predictivos del cambio en el uso del correceptor (Lehmann et al. 2006). El análisis de la expresión de CCR5 en pacientes VIH-1 vs individuos VIH-1 negativos, ha mostrado una regulación al alza en la expresión de CCR5 en pacientes VIH-1 positivos (Ostrowski et al. 1998). Existe una asociación directa entre el nivel de expresión del receptor de quimiocinas CCR5, y la progresión de la infección por VIH-1, de modo que individuos que expresan un elevado número de moléculas de CCR5 en la superficie de linfocitos T CD4+ tienden a mostrar elevadas cargas virales (Reynes et al. 2000), una mayor activación inmune (Ostrowski et al. 1998) y un número bajo de linfocitos T CD4+ (de Roda Husman et al. 1999). Sin embargo, apenas existen datos sobre el efecto de TARGA en la expresión de CCR5 en los linfocitos T. Si la regulación al alza de CCR5 está ligada al fenómeno de activación inmunológica inducida por la replicación viral, sería esperable un descenso en la expresión de CCR5 en pacientes con TARGA y carga viral suprimida, como consecuencia de la Introducción 22 disminución en el nivel de activación inmune que acompaña al control de la replicación viral (Benito et al. 2005). Estudios previos, han mostrado de hecho una disminución de la expresión de CCR5 en pacientes en tratamiento (Smith et al. 2002, Giovanetti et al. 1999). Sin embargo, no todos los estudios han mostrado una variación en la expresión de CCR5 en pacientes VIH-1 después de tomar TARGA, indicando que el nivel de expresión del correceptor, podría ser inherente a cada individuo (Reynes et al. 2000). La aprobación de maraviroc, el nuevo antagonista de CCR5, hace necesario estudiar la posible influencia de TARGA en el nivel de expresión de CCR5 de las células infectadas. Diferencias en dicha expresión, podrían influir en a la actividad antiviral de estos compuestos debido a su mecanismo de acción (Lin et al. 2007). 1.7. IMPLICACIONES DEL TROPISMO VIRAL EN LA ERA DE LOS ANTAGONISTAS DE CCR5 Y CXCR4 Los antagonistas de los correceptores CCR5 y CXCR4, representan una nueva familia de fármacos que inhiben la entrada viral. Maraviroc (MVC), (CelsentriTM), es el primer antagonista de CCR5 aprobado por la FDA (Food and Drug Administration, USA) (Anonymous 2007), para el tratamiento de la infección por VIH-1 en adultos infectados con variantes virales R5-trópicas, resistentes a múltiples fármacos antirretrovirales. Los estudios MOTIVATE-1 y MOTIVATE-2 demostraron que pacientes multifracasados con viremia Introducción 23 detectable, que tomaban MVC en combinación con una terapia optimizada recibiendo 150 o 300 mg una o dos veces al día, presentaban una respuesta virológica e inmunológica superior a la del grupo control que tomaba placebo, a 24 (Lalezari et al. 2007, Nelson et al. 2007) y 48 semanas de tratamiento (Hardy et al. 2008). La eficacia de MVC en pacientes pretratados infectados con variantes virales D/M o X4-trópicas, ha sido evaluada en el estudio A4001029 (Mayer et al. 2006). No se observaron diferencias significativas en el nivel de descenso de viremia plasmática en el grupo que tomaba MVC, comparado con los pacientes que recibían placebo, destacando la limitada actividad antiviral de estos fármacos en pacientes infectados con variantes DM o X4 trópicas. Sin embargo, el grupo que tomaba MVC experimentó una mayor ganancia de linfocitos T CD4+ que el grupo placebo. El estudio MERIT, evaluó la eficacia de MVC vs efavirenz (EFV) administrados en combinación con los análogos de nucleótido zidovudina y lamivudina, como terapia de inicio en pacientes naïve. Este estudio no ha podido demostrar hasta el momento la no inferioridad de MVC frente a efavirenz (EFV) para el objetivo de alcanzar una supresión de la viremia plasmática < 50 cop/mL (Saag et al. 2007). Introducción 24 MVC ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes VIH positivos infectados por variantes R5-trópicas con experiencia previa a TARGA. Actualmente, existen otros antagonistas en fases avanzadas de su desarrollo clínico como es el caso de Vicriviroc (VCV). 1.8. HERRAMIENTAS PARA DETERMINAR EL TROPISMO VIRAL EN LA PRÁCTICA CLÍNICA A pesar de la relación establecida entre el uso del correceptor y la progresión de la enfermedad en pacientes VIH-1, la determinación del tropismo viral no se ha utilizado como un parámetro habitual de seguimiento clínico de los pacientes con infección por VIH. Sin embargo, la introducción de los antagonistas de CCR5 dentro de la terapia antirretroviral, y su limitada actividad antiviral para variantes R5-trópicas, requiere del conocimiento previo del uso del correceptor en cada paciente, antes de las prescripción clínica de dichos fármacos. Existen diversos métodos fenotípicos y genotípicos para determinar el tropismo del VIH-1 (tabla 3). El ensayo con la línea celular MT-2, fue ampliamente utilizado a finales de los años 80. Este ensayo determina el efecto citopático de los aislados virales, estableciendo la clasificación de las cepas virales como IS y NIS. El ensayo MT-2 se basa en que estas células expresan únicamente en su superficie celular el correceptor CXCR4 y no el CCR5, de modo que la Introducción 25 replicación viral refleja de un modo indirecto la presencia de virus X4 (Koot et al. 1992). La principal desventaja de este ensayo es la necesidad de stocks virales a partir de CMSP de los pacientes (Hosoya et al. 2006, Louder et al. 1999), proceso laborioso que requiere personal cualificado, lo que limita el uso de este ensayo para la determinación del tropismo en la práctica clínica. Más recientemente, se han comercializado líneas celulares para la determinación del tropismo viral. Las células GHOST, constituyen una línea celular derivada del osteosarcoma humano (HOS) que expresa en su superficie celular CD4 y varios receptores de quimiocinas (CCR5, CCR3, CCR5, CXCR4 (Louder et al. 1999). Por otro lado, la línea celular U87, derivada de un glioma maligno, ha sido modificada genéticamente para expresar CD4 y varios receptores de quimiocinas en su superficie celular (Princen et al. 2004). U87 es actualmente la línea celular más utilizada para determinar el tropismo del VIH, ya que presenta algunas ventajas frente a otros tipos celulares como las células GHOST. Una de esas ventajas es su capacidad para crecer en superficies sólidas, lo cual es preferible a los cultivos en suspensión para muchos métodos de detección. Además, las células U87 sostienen una elevada replicación del VIH-1, manteniendo de forma estable los niveles de expresión de los distintos receptores celulares, circunstancia que tiende a desaparecer en otros tipos celulares. Entre las desventajas del uso de líneas celulares para determinar el tropismo viral hay una de especial relevancia. Los niveles de expresión de los receptores situados en la superficie celular, podrían diferir de Introducción 26 los presentes en las dianas naturales para el VIH-1, y por tanto no reflejar lo que ocurre in vivo (Coakley et al. 2005). El interés por los estudios de tropismo ha aumentado desde que se iniciaron los ensayos clínicos con antagonistas de CCR5. Este hecho ha favorecido el diseño de nuevos ensayos para determinar el tropismo viral. En la actualidad, se han desarrollado diversos métodos fenotípicos para la determinación del tropismo basados en virus recombinantes disponibles para uso clínico o en desarrollo. El ensayo de Trofile (Monogram Biosciences) ha sido y es extensamente utilizado para determinar el tropismo viral en todos los ensayos con antagonistas de correceptores incluyendo MVC y VCV. Por tanto, actualmente, es el único método validado para la determinación del tropismo en la práctica clínica y por ello, actualmente, es el que se utiliza para determinar el uso del correceptor en todos aquellos pacientes que planean iniciar MVC como parte de su terapia antirretroviral. Estos ensayos fenotípicos amplifican el gen de la glicoproteína de la envuelta a partir de muestras de plasma de pacientes infectados, para producir virus recombinantes con replicación competente o replicación defectiva. Los virus generados son usados para infectar líneas celulares que expresan CD4 y uno de los correceptores, CCR5 o CXCR4, lo que permite determinar el tropismo viral. El gen indicador utilizado en cada Introducción 27 método, permite clasificar a los distintos aislados virales como R5-trópicos, X4- trópicos o aislados dual-mixtos (Kuhmann et al. 2005). Los ensayos basados en virus recombinantes permiten estudios a gran escala, lo cual no era posible utilizando los clásicos ensayos de cultivo celular a partir de aislados virales derivados de CMSP de pacientes. Sin embargo, el principal problema que presentan radica en el límite de detección de cepas minoritarias X4-trópicas presentes en la población viral de un individuo. La presencia de variantes X4 en el momento basal por debajo del límite de detección del ensayo de Trofile se ha relacionado con fracaso virológico durante el tratamiento con antagonistas de CCR5. El límite de detección para variantes virales minoritarias en el ensayo de Trofile oscilaba del 5-10%. Sin embargo, mejoras recientes en dicho ensayo, han permitido un aumento de la sensibilidad, pudiendo detectar variantes minoritarias presentes en la población viral por debajo del 1%. (Reeves et al. 2007). Por último, el tropismo viral se puede determinar a través de métodos genotípicos basados en algoritmos matemáticos que predicen el fenotipo viral (IS/NIS) o el uso del correceptor (X4/R5) de los aislados virales. La región V3 de la glicoproteina de la envuelta gp120 es el principal determinante del tropismo del VIH-1 por los receptores de CCR5 y CXCR4. Introducción 28 Tabla 3. Metodología para la determinación del tropismo viral. Principales obstáculos para su introducción en la práctica clínica. En los últimos años, varios grupos han analizado la variabilidad natural en secuencias del dominio V3, y han identificado residuos de interés y patrones que pueden predecir el fenotipo de una determinada cepa viral por el uso del Método Metodología Limitaciones MT-2 Capacidad de los aislados virales de formar sincitios en células MT-2 Obtención de los aislados virales Líneas celulares Capacidad de los aislados primarios o virus recombinantes de replicar en líneas celulares que expresan los receptores CCR5 y CXCR4 en su superficie Diferentes niveles de correceptores entre las líneas celulares y las dianas naturales del VIH Virus recombinantes Trofile (Monogram Biosciences, San Francisco, CA, USA) PhenoScriptTM (Eurofins-VirAlliance, Kalmazoo, MI, USA) Antivirogram (Virco BVBA, Mechelen, Bélgica) PhenX-R (InPheno, Basel, Suiza) Veritrop (Dyagnostic Hybrids, Cleveland, OH, USA) Tropitest HIV (Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España) Umbral de detección de virus X4 en una población mixta de virus (R5+X4). Necesidad de instalaciones y personal cualificado para su desarrollo en centros de referencia. Predicción del fenotipo en la región V3 Identificación de residuos en V3 que influyen fuertemente el uso viral del correceptor Baja sensibilidad para la detección de variantes X4. Pocos datos que relacionan el fenotipo virtual y el fenotipo real Introducción 29 receptor de quimiocinas. Con estos datos, se han diseñado varios algoritmos que permiten predecir el uso del correceptor del VIH-1 basándose en la secuencia genética de la región V3 de un determinado aislado viral (Jensen et al. 2003). La “regla 11/25” es la primera herramienta genotípica descrita que identifica a una variante como X4-trópica por la presencia de aminoácidos básicos en las posiciones 11 y/o 25 de la región V3 (De Jong et al. 1992). Sin embargo, actualmente existen algoritmos más complejos que utilizan diferentes métodos estadísticos para evaluar distintas posiciones y patrones de aminoácidos de la región V3 con el fin de mejorar el valor predictivo. Algunos están disponibles en páginas web de libre acceso (tabla 4). La utilización de herramientas genotípicas evita la necesidad de obtener aislados virales primarios o la generación de virus recombinantes; en este caso, es suficiente con amplificar y secuenciar la región V3 de la envuelta del VIH-1 a partir de ARN extraído de plasma o de ADN extraído de CMSP. En la actualidad, existe un especial interés en conocer la exactitud y concordancia entre las herramientas genotípicas y las fenotípicas. Tabla 4. Páginas web de acceso público que predicen el uso del correceptor del VIH basándose en la secuencia genética de la región V3. - wetcat: (http:/genomiac2.ucsd.edu:8080/wetcat/v3.html) (Pillai et al. 2003) - PSSM (http://ubik.microbiol.washington.edu/computing/pssm/) (Jensen et al. 2003). - geno2pheno (http://coreceptor.bioinf.mpi-sb.mpg.de/cgi-bin/coreceptor.pl) (Sing et al. 2004) OBJETIVOS Objetivos 31 El tropismo del VIH-1 por los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4 se ha relacionado desde hace años con la patogénesis de la infección. A pesar de ello, la carga viral y el recuento de linfocitos T CD4+ continúan siendo los parámetros más utilizados para el seguimiento clínico de los pacientes VIH+. Los estudios de tropismo han adquirido una especial relevancia desde la introducción de fármacos para el tratamiento de la infección por VIH que bloquean la entrada del virus en la célula, uniéndose selectivamente a los receptores CCR5 o CXCR4. La familia de los antagonistas de CCR5, representada hasta el momento por maraviroc (MVC), ya forma parte del conjunto de fármacos disponibles para el tratamiento de la infección por VIH. En consideración de la dinámica del tropismo viral en pacientes VIH+ a lo largo de la infección, y el mecanismo de acción que presenta esta nueva familia de fármacos, inhibiendo exclusivamente la replicación de variantes R5-trópicas, se plantean los siguientes objetivos: 1. Evaluar la utilidad de herramientas genotípicas para la determinación del uso del correceptor en muestras clínicas de pacientes VIH+, tomando como referencia los resultados obtenidos mediante ensayos fenotípicos basados en virus recombinantes. 2. Caracterizar la prevalencia de variantes X4-trópicas en pacientes VIH+ en diferentes estadios de la infección por VIH. Objetivos 32 3. Analizar la evolución del tropismo viral en pacientes naïve y en pacientes que inician tratamiento antirretroviral, con el fin de valorar el impacto del tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA) sobre el tropismo viral. 4. Evaluar la influencia de la supresión de la replicación del VIH con TARGA en la expresión del correceptor CCR5 en linfocitos T CD4+ y T CD8+, y en las subpoblaciones linfocitarias naïve y memoria. Cualquier interacción podría modificar la actividad antiviral de los antagonistas de CCR5. PACIENTES Y MÉTODOS Pacientes y Métodos 34 3.1. Pacientes Los pacientes incluidos en esta tesis fueron seleccionados de forma retrospectiva a través de la base de datos del Hospital Carlos III de Madrid. Los pacientes seleccionados fueron pacientes VIH-1+ en seguimiento clínico en el Servicio de Enfermedades Infecciosas del Hospital Carlos III y que pudieron ser clasificados en una de las siguientes categorías: A. Seroconvertores recientes: sujetos con evidencias de infección aguda (viremia plasmática detectable junto con un test de anticuerpos frente a VIH indeterminado o negativo); reactividad al ensayo Combo con resultado positivo para la detección de antígenos y negativo para los anticuerpos; o seropositividad para la infección por VIH-1 (mediante ELISA y un Western blot), habiendo obtenido resultados negativos en un test VIH negativo previo realizado durante los 12 meses anteriores. B. Naïve: individuos VIH-1 positivos, con infección determinada durante más de 3 años, que nunca habían sido expuestos al tratamiento antirretroviral. C. Pretratados: pacientes VIH-1 positivos en tratamiento, con resistencias documentadas a más de un miembro de cada una de las familias de antirretrovirales: ITIAN (inhibidores de la transcriptasa inversa análogo de nucleósidos), ITINAN (inhibidores de la transcriptasa inversa no análogo de nucleósidos), IP (inhibidores de la proteasa) o IF (inhibidores de la fusión), Pacientes y Métodos 35 habiendo sido expuestos a fármacos antirretrovirales durante más de 3 años y en la actualidad en situación de fracaso virológico. 3.2. Obtención de plasma Las muestras de plasma se obtuvieron a partir de sangre de los pacientes por punción venosa en tubos Vacutainer conteniendo EDTA (ácido etilendiamin tetraacético) como anticoagulante. El plasma libre de células fue aislado por centrifugación a 800 x g durante 10 minutos (min). Las muestras de plasma fueron divididas en alícuotas de 1,5 mililitros (mL) y almacenadas a -20º C hasta su posterior uso. 3.3. Viremia plasmática La viremia plasmatica se cuantificó utilizando un ensayo comercial (branched DNA assay Versant 440, Siemens Medical Solutions, Barcelona, España) con un límite de detección inferior de 50 copias de ARN-VIH por mililitro y cuyo rango lineal oscila de 50 a 75.000 cop/mL. 3.4. Recuento de linfocitos T CD4+ El recuento de linfocitos T CD4+ se realizó mediante marcaje directo en sangre total (Beckman-Coulter, Miami, FL). La cuantificación se realizó por citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo FC500 (Coulter Instruments, Miami, FL, Pacientes y Métodos 36 USA), y se expresó en forma de cifra absoluta por microlitro (µL) de sangre y como porcentaje respecto al total de linfocitos circulantes. 3.5. Extracción del ARN viral La extracción de ARN se llevó a cabo a partir de 500 µl del plasma obtenido previamente y mediante el kit comercial QIA® RNA Blood Mini kit (50) (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN obtenido (60 µL) se almacenó a -80 ºC hasta su posterior uso. 3.6. Análisis genético del gen pol y de la región gp41 del gen env Ambos análisis se llevaron a cabo a partir de ARN-VIH extraído del plasma. El análisis genético del gen pol incluyó las regiones de la transcriptasa inversa y de la proteasa. Dicho análisis se realizó mediante secuenciación automática (ABI Prism 3100; Celera Diagnostics) utilizando los kit comerciales Viroseq HIV-1 Genotyping System v2.0 (Abbott Laboratorios, Chicago, IL, USA) y TRUGENE HIV-1 Genotyping Kit (Siemens Medical Solutions, Barcelona, España). El análisis genético del gen env se llevó a cabo amplificando un fragmento de 567 nucleótidos de la región gp41 del gen de la envuelta que incluía la regiones HR1 y HR2, mediante una RT-nested-PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: E41 ext-1 (5’ GAGAAGAGTGGTGCAGAGAG 3’) y Pacientes y Métodos 37 E41ext-2 (5’ ATTCCTTCGGGCCTGTCGGG 3’) como cebadores externos y E41int-1 (5’ GCAGCAGGAAGCACTATGGGCG 3’) y E41int-2 (5’ GGTGARTATCCCTGCTAACTC 3’) como cebadores internos. Las condiciones de la amplificación para la RT-PCR fueron las siguientes: 48 ºC - 45 min, 94 ºC - 2 min, 94 ºC - 15 segundos (seg) / 50 ºC - 30 seg / 72 ºC - 30 seg (40 ciclos), 72 ºC - 30 seg, 4 ºC - ∞. El ADN obtenido fue amplificado mediante el uso del kit comercial Master Mix PCR System (Promega, Madison, WI, USA) a partir de 5µl del producto obtenido en la RT-PCR. Las condiciones para la nested- PCR fueron: 94 ºC - 3 min, 94 ºC - 30 seg/ 55 ºC - 30 seg/ 72 ºC - 1 min (40 ciclos), 72 ºC – 7 min, 4ºC - ∞ (Poveda et al. 2002). 3.7. Análisis genético de la región V3 de la envuelta viral El análisis genético de la envuelta viral se realizó a partir de ARN-VIH extraído de plasma de cada paciente. Tras la obtención de ARN viral se llevó a cabo la amplificación de la región V3 de gp120 de 105 nucleótidos por nested-PCR (Polymerasse Chain Reaction). Las condiciones de la amplificación fueron las siguientes: RT-PCR: 48 ºC - 45 min, 94 ºC - 2 min, 94 ºC - 15 seg / 55 ºC - 30 seg / 72 ºC - 30 seg (35 ciclos), 72 ºC - 30 seg, 4 ºC - ∞; Nested-PCR: 94 ºC - 3 min, 94 ºC - 30 seg/ 55 ºC - 30 seg/ 72 ºC - 1 min (35 ciclos), 72 ºC - 7min, 4ºC- ∞. Los oligonucleótidos específicos empleados para la determinación de la secuencia de V3 fueron: E80 (5’ CCAATTCCCATACATTATTGTG 3’) y E105 (5’ GCTTTTCCTACTTCCTGCCAC 3’) como cebadores externos y ES7 (5’ CTGTTAAATGGCAGTCTAGC 3’) y E125 (5’ Pacientes y Métodos 38 CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3’) como cebadores internos. Los oligonucleótidos utilizados fueron cedidos por M. Quiñones-Mateu (Dyagnostic Hybrids, Cleveland, OH) 3.8. Purificación del amplicón El producto de la PCR (amplicón) fue visualizado mediante un gel de agarosa al 1% y fue purificado mediante el kit comercial GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healhcare Biosciences, UK). 3.9. Secuenciación del ADN El producto de PCR purificado fue secuenciado en ambas direcciones mediante secuenciación automática uilizando el kit comercial ABI PRISM dRhodamine Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) en un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Los cebadores utilizados en la reacción de secuencia fueron los mismos que se utilizaron en la nested-PCR como cebadores internos, es decir, los oligonucleótidos E41int-1 (5’ GCAGCAGGAAGCACTATGGGCG 3’) y E41int-2 (5’ GGTGARTATCCCTGCTAACTC 3’) cuando se secuenció la región gp41 de la envuelta, y los oligonucleótidos ES7 (5’ CTGTTAAATGGCAGTCTAGC 3’) y E125 (5’ CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3’) en el caso de la secuenciación de la región V3. Pacientes y Métodos 39 Todas las secuencias se editaron utilizando el programa SeqScape Software v. 2.5 (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA). Se consideró mezcla de nucleótidos cuando el pico más pequeño del electroferograma representaba al menos el 25% del área del pico principal. Los tripletes de nucleótidos que contenían mezclas fueron traducidos a cada uno de los posibles aminoácidos. Para cada muestra, todas las diferentes secuencias de V3 generadas como consecuencia de todas las posibles combinaciones de aminoácidos, fueron consideradas para la determinación del tropismo. Las mutaciones de resistencia de cada paciente en el gen pol se analizaron utilizando el kit comercial estandarizado para el análisis de resistencias en TI y PR ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System (Applied Biosystems, Foster City, CA). 3.10. Determinación genotípica del uso del correceptor La determinación genotípica del uso del correceptor en los distintos aislados virales se llevó a cabo para cada muestra usando los predictores genotípicos virtuales wetcat, geno2pheno[coreceptor] y PSSM disponibles online (tabla 4) que se describen a continuación en más detalle: Wetcat. Alberga diferentes clasificadores: C4.5, C4.5p8p12, PART, SVM (Support Vector Machine) y la “regla 11/25”. Estos clasificadores se basan en Pacientes y Métodos 40 distintos algoritmos, que evalúan distintas posiciones y patrones de aminoácidos de la región V3 con el fin de mejorar su valor predictivo. Las secuencias deben ser alineadas de modo manual, según la secuencia consenso “CTRPNNNT-RK*I*I--GPG*AFY*-TG*I-IGDIRQAHC”. Los asteriscos (*) indican que puede haber cualquier aminoácido en esa posición, y los guiones (-) que debe haber un espacio entre aminoácidos. El número total de posiciones de cada secuencia debe ser 40, de modo que secuencias de V3 con más o menos de 35 aminoácidos fueron modificadas eliminando o incluyendo guiones en las posiciones adecuadas hasta conseguir un total de 40 posiciones en cada una de las secuencias. El fichero creado con las secuencias alineadas con formato FASTA, se insertó en el clasificador SVM, debido a que ha demostrado ser el método más exacto (90,86%) para la predicción del uso del correceptor (Pillai et al. 2003). SVM, es un método de aprendizaje estadístico que clasifica las secuencias de V3 de un modo binario, es decir, como secuencias R5 o X4, incluyendo las secuencias R5/X4 como secuencias X4. Una de las ventajas de wetcat es que permite incluir todas las secuencias V3 de una sola vez, independientemente del número de secuencias incluidas en el archivo. Sin embargo, el formato restrictivo en el que tienen que ser presentadas las secuencias requiere de bastante tiempo. La validación de wetcat, se llevó a cabo utilizando 271 secuencias, con resultados genotípico- fenotípicos pareados: 168 secuencias fueron CCR5-trópicas y 103 secuencias CXCR4-trópicas. La actualización de esta técnica con un mayor grupo de datos, podría mejorar la predicción del tropismo viral. Pacientes y Métodos 41 Geno2pheno[coreceptor]. Las predicciones se realizan basándose en el algoritmo support vector machine (SVM) (Sing et al. 2004), al igual que uno de los clasificadores de wetcat. El uso del correceptor puede determinarse a través de las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, pudiendo incorporarlas directamente a la web o insertándolas a través de un fichero en formato FASTA y alineándolas con la secuencia V3 del aislado de referencia HXB2. Este predictor permite elegir el nivel de sensibilidad y especificidad. El valor máximo de sensibilidad elegido para el reconocimiento de variantes X4 en nuestro análisis fue 0,80 y la especificidad 0,10. La versión 2.0 de geno2pheno[coreceptor], ha sido validada con 1100 secuencias pareadas genotipo-fenotipo (769 CCR5- trópicas, 210 CXCR4-trópicas y 131 dual/mixtas, incluyendo las variantes virales dual/mixtas como variantes CXCR4-trópicas). Los parámetros clínicos carga viral, número de linfocitos T CD4+ y T CD8+ en valor absoluto, porcentaje de linfocitos T CD4+ y genotipo de CCR5 pueden ser incluidos junto con la secuencia de V3. Este predictor, incluye un valor “p” que evalúa el grado de confianza de la predicción. Geno2pheno[coreceptor] no está restringido a un único subtipo. Aunque la mayoría de las secuencias usadas para valorar la técnica pertenecen a virus subtipo B, también se han incluido secuencias con otros subtipos genéticos en el proceso de valoración. PSSM. A diferencia de wetcat y geno2pheno[coreceptor], PSSM no sólo predice si un virus puede usar el correceptor CXCR4 o no, sino que da información adicional de las predicciones, interpretando la tendencia a utilizar CXCR4 como Pacientes y Métodos 42 baja, intermedia y alta para virus R5, R5/X4 y X4 respectivamente (Jensen et al. 2003) y por tanto, puede actuar como indicador continuo de la evolución de variantes X4. Existen dos matrices generadas para la clasificación variantes virales subtipo B: la primera generada con secuencias fenotípicas del uso del correceptor conocidas (matriz X4-R5), y la segunda generada en función de la capacidad de las variantes virales de inducir sincitios (matriz IS-NIS) en la línea celular MT-2. Una tercera matriz ha sido generada con variantes del subtipo genético C, según su capacidad para inducir sincitios (IS-NSI). En nuestro estudio, la clasificación de las variantes virales según el uso del correceptor se realizó a través de la matriz X4-R5. La validación de PSSM se llevó a cabo con 213 secuencias con genotipo-fenotipo pareado (17 CXCR4- trópicas, 168 CCR5-trópicas, y 28 dual/mixtas) y 257 secuencias (70 IS y 187 NIS). Una ventaja de este predictor es que puede alinear 100 secuencias de la región V3 a la vez. Sin embargo, solamente existen matrices para secuencias subtipo B y subtipo C y por tanto no se aconseja la predicción en variantes con otros subtipos genéticos. En todos los casos, las secuencias V3 obtenidas en nuestros estudios fueron clasificadas como secuencias de aislados R5 o X4. Pacientes y Métodos 43 En nuestro estudio, en el caso de muestras con más de una combinación posible de aminoácidos, la presencia de una única secuencia de V3 clasificada como X4 fue identificada como X4. 3.11. Determinación fenotípica del uso del correceptor La determinación fenotípica del uso del correceptor en las distintas muestras de pacientes se llevó a cabo utilizando el ensayo fenotípico PhenoScript (Eurofins, Kalamazoo, Michigan, USA) (Labernardiere et al. 2004), basado en la tecnología de virus recombinantes. A partir del ARN viral obtenido del plasma de cada paciente, se amplificó la envuelta del genoma del VIH-1 por PCR. El amplicón obtenido, se cotransfectó en las células productoras (293T) junto al plásmido que portaba un clon del VIH-1 defectivo en la región de la envuelta. El virus recombinante obtenido se usó para infectar las células U373 que expresan CXCR4 o CCR5, junto al receptor CD4. La especificidad de la infección se evaluó en cada ensayo incubando las células indicadoras en presencia o ausencia de antagonistas de los correceptores y 5 controles portadores de secuencias de la envuelta derivadas de pacientes con distinto tropismo e infectividad. 3.12. Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Las CMSP se obtuvieron a partir de las muestras de sangre total de los pacientes recogidas en tubos Vacutainer con EDTA mediante una Pacientes y Métodos 44 centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Histopaque (Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri, USA) a 1600 x g durante 30 min. La fracción que contenía las CMSP, se recogió y se lavó con tampón fosfato salino (PBS; Lonza, Verviers Bélgica) y se procedió al contaje de CMSP para la separación en alícuotas conteniendo un rango entre 5 y 10 millones de células. Para su criopreservación, las CMSP se resuspendieron en 90% de SBF y 10% de DMSO. Las muestras de CMSP de cada paciente fueron mantenidas previamente a -80 ºC durante las primeras 24 h y posteriormente en nitrógeno líquido hasta su procesamiento. Además se separaron alícuotas de 1 millón de CMSP que se conservaron en pellet seco, para la extracción de material genético a -20 ºC hasta su posterior uso. En el momento del análisis las CMSP fueron descongeladas en baño de agua a 37ºC y se resuspendieron en R10. La viabilidad de las células fue siempre superior al 85%. 3.13. Extracción del ADN La extracción de ADN se llevó a cabo a partir de una alícuota de CMSP conservadas como pellet seco y usando el QIAamp® DNA Blood Mini kit (250) (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN obtenido (50 µL) se almacenó a -20 ºC hasta su posterior uso. Pacientes y Métodos 45 3.14. Determinación genotípica del receptor CCR5 (CCR5∆32) El genotipo para la deleción de 32 pb del receptor de quimiocinas CCR5 se analizó en ADN celular extraído en pacientes naïve y pretratados. No se dispusieron de CMSP de pacientes seroconvertores por lo que en este grupo no se pudo determinar este parámetro. La presencia del polimorfismo se analizó mediante una PCR específica utilizando los siguientes oligonucleótidos: CCR5-D (5’ CCTGGCTGTCGTCCATGCTG 3’) como cebador directo y CCR5-I (5’ CCAGCAGCGGCAGGACCAGC 3’) como cebador inverso (Samson et al. 1996). El producto de PCR fue visualizado mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2,5%: wt/CCR5∆32 (fragmentos de 242 y 210 pb); CCR5∆32/CCR5∆32 (fragmento de 210 pb); wt/wt (fragmento de 242 pb). 3.15. Determinación del nivel de interleuquina 7 (IL-7) en plasma La cuantificación de la IL-7 en plasma se llevó a cabo utilizando un kit ELISA comercial ultrasentible (Quantikine® HS Immunoassay; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), con un nivel de sensibilidad de 0,1 pg/mL. Se añadieron 200 µL de cada muestra a una placa de 96 pocillos que contenía un anticuerpo monoclonal específico para la IL-7. Las muestras se incubaron durante 14-20 horas a temperatura ambiente y en condiciones de humedad. Tras 4 lavados, se añadieron 200 µL de anticuerpo policlonal específico para IL-7 conjugado a la enzima. Tras 2 horas de incubación, se procedió al lavado de los pocillos y se añadieron 50 µL de solución de sustrato. Tras incubar 45 Pacientes y Métodos 46 minutos, se añadió la solución de revelado. Transcurridos 45 minutos se añadió la solución de parada de la reacción enzimática. La intensidad de color se midió a una absorbancia de 492/620 nm. La cantidad de producto coloreado es directamente proporcional a la cantidad de IL-7 unida en la etapa inicial. 3.16. Cuantificación de la expresión del correceptor CCR5 en distintas subpoblaciones de linfocitos T La cuantificación de la expresión de CCR5 en las subpoblaciones naive (CD45RO-) y memoria (CD45RO+) de linfocitos T CD4+ y CD8+, se llevó a cabo utilizando el siguiente panel de anticuerpos monoclonales: CD4-ECD, CD8-PE/Cy5, CD45RO-PE (Beckmann-Coulter, Miami, FL), CCR5-FITC e IgG2 (Becton Dickinson Co). Se utilizó un ensayo cuantitativo de citometría de flujo a partir de CMSP congeladas, que permite cuantificar el número de moléculas CCR5 que se expresan por célula (Cellquant Calibrator, Biocytex, Marsella, Francia). El ensayo utiliza una curva estándar formada a partir de 4 grupos de bolitas sintéticas, que llevan unidas un número conocido de moléculas de IgG de ratón. Para el análisis de las muestras se empleó el citómetro de flujo FC500 (Beckman-Coulter). En dos alícuotas que contenían 50.000 CMSP previamente descongeladas, se incubaron independientemente 10 µl del anticuerpo monoclonal CCR5 y 5 µL del control isotípico. A continuación se añadieron 10 µL del anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón marcado con el fluorocromo FITC. El lavado de Pacientes y Métodos 47 células se realizó añadiendo 2 mL de solución de lavado y centrifugando durante 5 min a 300 x g. El pellet de células se resuspendió en 50 µL de solución neutralizante. Seguidamente, se añadieron 5 µL de los anticuerpos CD4-ECD, CD8-PE/Cy5 y CD45RO-PE y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente y en la oscuridad. A continuación se procedió con un segundo lavado y centrifugación (5 min; 300 x g). El pellet de células obtenido se resuspendió en 250 µL del tampón de lavado. Las muestras se analizaron inmediatamente en el citómetro de flujo. Para cada muestra se analizó un mínimo de 2.500 linfocitos T CD4+ y CD8+. A partir de la intensidad media de fluorescencia y el número de molélucas IgG de cada grupo de bolitas, se construyó una recta patrón que se empleó para convertir la intensidad media de fluorescencia obtenida para cada muestra en moléculas de CCR5. La cuantificación de la expresión de CCR5 se llevó a cabo midiendo dos parámetros: el nivel de expresión, medido como la proporción de células CCR5+, y la densidad de expresión, medido como el número de moléculas/célula en la fracción de células CCR5+. 3.17. Análisis del nivel de activación en linfocitos T La activación del sistema inmune se analizó cuantificando la intensidad de la expresión de la molécula CD38, definida como un marcador de activación celular. El nivel de expresión de CD38 en linfocitos T CD4+ y CD8+ se determinó utilizando un ensayo cuantitativo de citometría de flujo a partir de Pacientes y Métodos 48 CMSP, que permite cuantificar el número de moléculas CD38 que se expresan por célula (Cellquant CD38/CD8-PE, Biocytex, Marsella, Francia). El ensayo utiliza una curva estándar formada a partir de 4 grupos de bolitas sintéticas, que llevan unidas un número conocido de moléculas de IgG de ratón. Se incubaron 2 alícuotas de 25 µL de CMSP (conteniendo cada una 50.000 células) con el anticuerpo monoclonal anti-CD38 y con un control isotípico respectivamente, y una alícuota de 25 µL de una suspensión de bolitas sintéticas con el control isotípico. Después se añadió a cada una de las muestras un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón marcado con el fluorocromo FITC. A continuación, las muestras se incubaron con una solución neutralizante y finalmente (excepto el calibrador) con el siguiente panel de anticuerpos monoclonales: CD4-ECD y CD8-PE/Cy5. El tiempo de incubación con cada uno de los reactivos fue de 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, las células se lavaron 2 veces con un tampón de lavado y se resuspendieron en 250 µL del mismo tampón. Para cada muestra se analizó un mínimo de 2.500 linfocitos T CD4+ y CD8+ en el citómetro de flujo FC500 (Beckton-Coulter). A partir de la intensidad media de fluorescencia y el número de molélucas IgG de cada grupo de bolitas, se construyó una recta patrón que se empleó para convertir la intensidad media de fluorescencia obtenida para cada muestra en moléculas de CD38. Pacientes y Métodos 49 3.18. Datos epidemiológicos y marcadores biológicos Los datos epidemiológicos de los distintos pacientes recogidos para realizar esta tesis fueron el sexo, la edad, la ruta de transmisión y el año de infección. Los marcadores biológicos utilizados fueron la carga viral, el recuento de linfocitos T CD4+ y el nadir de linfocitos T CD4+. Otros parámetros analizados fueron: el tratamiento antiretroviral, la presencia de mutaciones de resistencia a las distintas familias de antirretrovirales, presencia del polimorfismo CCR5∆32 y el tropismo viral. 3.19. Análisis estadístico En los tres estudios, se comprobó la normalización de las distintas variables incluidas, mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. En el estudio 1, la comparación de medias de los parámetros analizados en los distintos grupos de pacientes se realizó mediante un test de la T de student. En el estudio 2, las características basales de la población de estudio se recogieron como porcentajes, media + desviación estándar, o mediana + amplitud intercuartílica (AIQ). Las diferencias entre los tres grupos de pacientes se analizaron mediante un test de la T de student (para parámetros normales), o el test de la U de Mann-Whitney (para parámetros no normales). Las asociaciones entre variables se analizaron utilizando un test de chi-cuadrado Pacientes y Métodos 50 para variables cualitativas y un test de correlación de Pearson o Spearman para variables cuantitativas normales o no normales respectivamente. En el estudio 3, se recogieron las características basales de la población de estudio como números absolutos, porcentajes y medias + desviaciones estándar para variables cuantitativas. La asociación entre variables cualitativas fue determinada mediante la chi-cuadrado de Pearson o el test exacto de Fisher. El test de la T de Student o los análisis de la varianza (ANOVA) se usaron para comparar las medias de variables cuantitativas de dos o más grupos, respectivamente. La asociación entre variables cuantitativas fue estudiada usando el coeficiente de correlación de Pearson. El tiempo de cambio en el uso del correceptor fue estimado mediante el método de Kaplan- Meier y los distintos subgrupos fueron comparados usando el test log-rank. En el estudio 4, las características basales de la población de estudio se recogieron como porcentajes y mediana + amplitud intercuartílica (AIQ). Las diferencias entre grupos para las variables inmunológicas se analizaron mediante el test de la U de Mann-Whitney. Las diferencias entre los distintos momentos del seguimiento en el grupo de pacientes se analizaron mediante el test de Friedman. Las asociaciones entre variables se analizaron utilizando un test de chi-cuadrado para variables cualitativas y un test de correlación de Spearman para variables cuantitativas no normales. Pacientes y Métodos 51 En todos los estudios, se consideró estadísticamente significativo valores de p<0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete estadístico SPSS v 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). RESULTADOS Resultados 53 I. Estudio 1: Evaluación de herramientas genotípicas para la determinación del uso del correceptor en muestras clínicas, tomando como referencia un ensayo fenotípico basado en virus recombinantes. 4.1. Población de estudio Se incluyeron un total de 83 pacientes con infección crónica por VIH-1: 37 eran pacientes naïve y 46 pacientes pretratados que habían fracasado a distintos regímenes terapéuticos y con viremia detectable en el momento de la selección. La media de viremia plasmática fue similar en ambos grupos de pacientes (4,1 ± 0,6 vs 3,9 ± 0,8 log cop/mL; p=0,21, respectivamente). Sin embargo, la media de linfocitos T CD4+ fue significativamente mayor en pacientes naïve que en pacientes en tratamiento (437 ± 361 vs 246 ± 204 células/µL; p<0,01, respectivamente). Todos los pacientes incluidos en este estudio estaban infectados con variantes virales del subtipo genético B. La determinación genotípica del tropismo se realizó con los predictores wetcat- SVM, geno2pheno y PSSM-X4R5 en todas las muestras seleccionadas (n=83), mientras que el ensayo fenotípico Phenoscript, se realizó en un 94% de las muestras (n=78), debido a una falta en la disponibilidad de plasma para alguna muestra. En pacientes que recibían terapia antirretroviral, el análisis de la prevalencia de variantes CXCR4-trópicas en función del predictor utilizado, fue de un 56,5% Resultados 54 cuando se utilizó el predictor wetcat-SVM, de un 50% con geno2pheno y de un 41,3% con PSSM-X4R5. Cuando se utilizó el ensayo fenotípico Phenoscript, la prevalencia de variantes X4-trópicas obtenida fue del 30,4%. En individuos que no recibían tratamiento, la prevalencia de variantes CXCR4-trópicas obtenida fue de un 43,2% cuando se determinió el correceptor mediante el predictor geno2pheno, de un 37,8% con wetcat-SVM, y de un 10,8% cuando se utilizó PSSM-X4R5. La prevalencia observada con Phenoscript fue del 15,6%. En la tabla 1 se encuentran resumidas la prevalencia de variantes X4-trópicas en función de los métodos empleados. Pacientes con TARGA (n=46) Individuos sin TARGA (n=37) Métodos Total R5 (%) X4 (%) p R5 (%) X4 (%) p Wetcat-SVM 83 20 (43,5) 26 (56,5) 0,21* 23 (62,2) 14 (37,8) 0,036 Geno2pheno 83 23 (50) 23 (50) >0,999 21 (56,8) 16 (43,2) 0,245 PSSM-X4R5 83 27 (58,7) 19 (41,3) 0,095 33 (89,2) 4 (10,8) <0,001 Phenoscript 78 32 (69.6) 14 (30,4) 0,002 27 (84.4) 5 (15,6) <0,001 * “p” obtenida al comparar el porcentaje de cepas R5 y X4-trópicas obtenido en cada uno de los predictores. Tabla 1. Predicción del uso del correceptor en pacientes VIH-1 usando un método fenotípico y 3 herramientas bioinformáticas. Resultados 55 4.2. Concordancia entre métodos genotípicos y fenotípicos para la determinación del uso del correceptor El nivel de concordancia más elevado para la determinación del tropismo entre el ensayo Phenoscript y los predictores genotípicos se obtuvo con el predictor PSSM-X4R5 (85,9%), seguido de geno2pheno (71,8%) y de wetcat-SVM (70,5%) La sobreestimación de variantes CXCR4-trópicas por los métodos genotípicos, fue la principal causa de la discordancia observada entre Phenoscript y las distintas herramientas bioinformáticas. El mayor porcentaje de discordancia observado en cepas identificadas como CXCR4-trópicas por los predictores genotípicos, cuando Phenoscript las identificaba como variantes CCR5- trópicas, se observó en la herramienta wetcat-SVM, con un 26,9% de las muestras analizadas, seguido del predictor geno2pheno (24%) y por último, el predictor PSSM-X4R5 (8,9%). Sin embargo, la discordancia observada en cuanto a la predicción de variantes CCR5-trópicas por métodos genotípicos, siendo identificadas como variantes CXCR4-trópicas según el ensayo fenotípico, fue menor resultando en un 2,5%, 3,8% y 5,1% de las muestras analizadas según wetcat-SVM, geno2pheno y PSSM-X4R5 respectivamente (tabla 2). La sensibilidad y especificidad observada en las herramientas bioinformáticas para la detección de variantes X4-trópicas, comparadas con el ensayo fenotípico Phenoscript fue del 89,5% y 64,4% para wetcat-SVM, 88,8% y 67,8% con geno2pheno y 78,9% y 88,1% para PSSM (tabla 2). Métodos N R5 X4 Concordancia (%) Discordancia R5/X4a (%) Discordancia X4/R5b (%) Sensibilidad (%) Especificidad (%) Wetcat-SVM 83 43 40 70,5 2,5 26,9 89,5 64,4 Geno2pheno 83 44 39 71,8 3,8 24 88,8 67,8 PSSM-X4R5 83 60 23 85,9 5,1 8,9 78,9 88,1 Phenoscript 78 59 19 -- -- -- -- -- aMuestras informadas como R5 por métodos genotípicos y X4 por métodos fenotípicos. bMuestras informadas como X4 por métodos genotípicos y R5 por métodos fenotípicos. Tabla 2. Concordancia entre herramientas genotípicas (wetcat, geno2pheno, y PSSM) y el ensayo fenotípico Phenoscript para la determinación del uso del correceptor. Sensibilidad y especificidad de las herramientas genotípicas para la determinación de variantes X4-trópicas. Resultados 57 II. Estudio 2: Prevalencia de variantes VIH-1 según el uso del correceptor en diferentes etapas de la infección por VIH. 4.3. Población de estudio Se seleccionaron un total de 206 pacientes VIH+ con viremia detectable: 67 seroconvertores recientes, 52 pacientes naïve con infección crónica, y 87 pacientes en tratamiento antirretroviral que se encontraban en fracaso virológico. La media de carga viral en pacientes en tratamiento, fue significativamente más baja que en seroconvertores recientes y pacientes naïve (p<0,001). Sin embargo, el grupo de seroconvertores presentó un mayor número de linfocitos T CD4 que pacientes naïve y pretratados (p=0,001). En la tabla 3 se presentan éstas y otras características de la población de estudio. 4.4. Prevalencia de variantes R5 y X4-trópicas La determinación del tropismo viral se realizó en un 95% (n=196) de los 206 pacientes seleccionados, utilizando el predictor genotípico PSSM, ya que en el estudio anterior había demostrado la mejor concordancia con los resultados obtenidos mediante el ensayo fenotípico. El 21% (n=44) de los pacientes, presentaron variantes X4-trópicas: un 9% (n=6) en seroconvertores recientes, un 15% (n=8) en pacientes naïve y un 35% (n=30) en los pacientes pretratados en fracaso virológico, observándose diferencias estadisticamente significativas (p=0,009) entre los distintos grupos de pacientes (tabla 3). Total (n=206) Seroconvertores (n=67) Naïve (n=52) Pretratados (n=87) p Hombres, n (%) 173 (84) 59 (88) 39 (75) 75 (86,2) 0,06 Tropismo X4, n (%) 44(21) 6 (9) 8 (15) 30 (35) 0,009 Ruta transmisión, n (%) UDVP 50 (24) 6 (9) 11 (21) 33 (38) <0,001 Homosexuales 103 (50) 48 (72) 23 (44) 32 (37) 0,007 Heterosexuales 38 (18) 9 (13) 15 (29) 14 (16) Otros 15 (7) 4 (6) 3 (6) 8 (9) Edad*, años 39 [10] 31 [10] 37[10] 42 [8] <0,001 VIH-RNA†, log cop/mL 4,1 (0,8) 4,4 (0,8) 4,2 (0,8) 3,8 (0,9) <0,001 Linfocitos T CD4†, células/µL 425 (267,6) 543,4 (246,1) 443,4 (315,8) 383,5 (233,9) 0,001 Mutaciones a ITIAN* 0 0 0 1 [4] Mutaciones a ITINAN* 0 0 0 1 [2] <0,0001 Mutaciones a IP* 2 [3] 1 [1] 1 [1] 5 [7] Mutaciones a IF* 0 0 0 0 * Mediana [amplitud intercuartílica] † Media (desviación estándar) Tabla 3. Características basales de población de estudio. Resultados 59 4.5. Asociación entre tropismo viral y características epidemiológicas La determinación de la presencia de la deleción ∆32 en el gen que codifica para el correceptor CCR5 (figura 1), pudo realizarse en un 97% (n=200) de los pacientes incluidos en el estudio. La prevalencia de la deleción CCR5∆32 fue del 9% en sujetos recientemente infectados, del 16% en pacientes naïve y del 13% en pacientes pretratados. No se observó ninguna asociación entre la presencia de la deleción ∆32 en el gen ccr5 y el tropismo viral (p=0,55) (tabla 4). Figura 1. Gel de agarosa al 2,5%. El producto amplificado es un fragmento de 242 pb del gen que codifica para el correceptor CCR5. Pocillos: MM: marcador de peso molecular; CPwt/wt: control positivo homocigoto wild type (wt); CPwt/∆32: control positivo heterocigoto para ∆32; CN: control negativo. Los números 3 y 6 muestran dos fragmentos de 242 y 210 pb, indicando la presencia del polimorfismo CCR5∆32 en heterocigosis. Por otro lado, el tropismo viral tampoco mostró significativa con el sexo, edad o ruta de transmisión del VIH-1 en los pacientes analizados (tabla 4). CP CP MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 wt/wt wt/∆32 CN MM Seroconvertores (n=67) Naïve (n=52) Pretratados (n=87) R5 X4 p R5 X4 p R5 X4 p Hombre (%) 89 78 0,30 81 75 0,47 80 87 0,02 Edad (años), media (DS) 31,7 (3,6) 34,2 (8) 0,44 40,1 (8,4) 38,3 (7,1) 0,58 42,5 (6,7) 41,2 (7,6) 0,44 Genotipo CCR5∆∆∆∆32 (%) wt/wt 83 89 0,68 75 100 0,14 85 89 0,55 wt/CCR5∆32 17 11 25 0 15 11 Ruta de transmisión (%) Parenteral 7 22 0,2 24 17 0,45 47 32 0,18 Sexual 93 78 76 83 53 68 DS: desviación estándar wt: wild type o genotipo salvaje Tabla 4. Asociación entre el tropismo viral y diversas características epidemiológicas de los pacientes. Resultados 61 4.6. Asociación entre tropismo viral y parámetros clínicos La presencia de variantes X4-trópicas en individuos recientemente infectados y sujetos naïve, no se asoció con la viremia plasmática. Sin embargo, sí se observó una relación entre el tropismo viral y la viremia plasmática en pacientes pretratados, observándose cargas virales más elevadas en pacientes portadores de variantes X4-trópicas que en pacientes portadores de variantes R5-trópicas (4,2 vs 3,5 log cop/mL, respectivamente; p=0,02). Por otro lado, no se observó asociación entre la presencia de variantes X4 y el número de linfocitos T CD4+, en ninguno de los grupos de pacientes (tabla 5). Seroconvertores (n=67) Naïve (n=52) Pretratados (n=87) R5 X4 p R5 X4 p R5 X4 p carga viral, log cop/mL 4,4* (0,74) 4,2 (0,89) 0,41 4,1 (0,81) 4,2 (0,81) 0,93 3,5 (0,9) 4,2 (0,7) 0,02 linfocitos T CD4+, células/µL 547,9 (246,4) 510,7 (275) 0,93 521,8 (342,9) 334 (201,3) 0,1 392,8 (236,9) 367,6 (231,6) 0,63 *Media (desviación estándar) Tabla 5. Asociación entre tropismo viral y parámetros clínicos: carga viral y linfocitos T CD4+. Resultados 62 4.7. Asociación entre tropismo viral y presencia de mutaciones de resistencia a las distintas familias de antirretrovirales El análisis de las mutaciones de resistencia a los inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (ITIAN), inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos (ITINAN) e inhibidores de la proteasa (IP), mostró una mediana de mutaciones de resistencia en individuos seroconvertores y sujetos naïve, como era de esperar, significativamente menor que en pacientes pretratados (p<0,001). En este último grupo, la mediana de mutaciones de resistencia por familias de fármacos fue la siguiente: ITIAN 1 [4], ITINAN 1 [2] e IP 5 [7] (tabla 2). Analizando la población en conjunto, las mutaciones de resistencia más prevalentes fueron: la T215YF (26,8%) y la M41L (25,8%) para los ITIAN; la K103N (16,7%) y la Y181C (11,1%) para los ITINAN y las mutaciones L10I/R/V/F (28,3%), A71V/T (27,8%) y L90M (23,2%) para los IP. En la figura 2 se muestra la prevalencia de mutaciones de resistencia por familias de fármacos antirretrovirales ITIAN, ITINAN e IP. En seroconvertores recientes (n=67), se observaron mutaciones de resistencia a ITIAN (4,5%), ITINAN (6%) y a IP, (26,9%). Las mutaciones de resistencia más frecuentes fueron la D67N (3%) para los ITIAN, la K103N (16,7%) para los ITINAN y la A71V/T (19,4%) para los IP. Resultados 63 En el grupo de pacientes naïve, (n=52), se observaron mutaciones de resistencia a los ITIAN (7,7%), y a IP (17%). No se encontró ninguna mutación de resistencia a los ITINAN. La mutación M41L (8,5%) fue la única mutación de resistencia observada en la RT así como cambios en la posición 10 (L10I/R/V/F) de la PR (21,2%). El polimorfismo L63P, fue la mutación más común en pacientes seroconvertores recientes (50,7%) y en pacientes naïve (61,7%). En pacientes pretratados (n=87), el 86,2% de los pacientes, presentaban mutaciones de resistencia a ITIAN, un 57,5% a ITINAN y un 62,1% a IP. La mutación más prevalente para los ITIAN fue la T215YF (61,9%), seguida de la M41L (54,8%). Para los ITINAN, la K103N (34,5%) y para los IP, la mutación L90M (51,2%), cambios en la posición 10 de la PR L10I/R/V/F (48,8%) y la mutación A71V/T (47,6%) fueron las mutaciones más prevalentes. Con el fin de analizar si el tipo de tratamiento antirretroviral influía en la emergencia de cepas X4-trópicas, se seleccionó dentro de los 87 pacientes pretratados incluidos en el estudio un subgrupo de 23 pacientes, que estaban fracasando a ITINAN y que nunca habían sido expuestos a IP y 15 pacientes fracasando a regímenes terapéuticos que contenían un IP y que nunca habían recibido ITINAN como parte de su tratamiento antirretroviral. No se encontró ninguna asociación entre la presencia de variantes X4-trópicas y el número de mutaciones de resistencia en el gen pol (RT/PR) cuando se Resultados 64 analizó la población en conjunto. Del mismo modo, el análisis de la prevalencia de variantes X4-trópicas observada en pacientes que fracasaban a ITINAN y en pacientes que fracasaban a IP, no mostró ninguna asociación entre la presencia de variantes X4-trópicas y las mutaciones de resistencia en el gen pol en ambos grupos de pacientes (21,7% vs 33,3%, p=0,43, respectivamente). Figura 2. Prevalencia de mutaciones de resistencia a las familias de fármacos antirretrovirales ITIAN, ITINAN e IP. ITIAN ITINAN IP 5 10 15 20 25 30 0 F re c u e n c ia ( % ) M41L A62V K65R D67N T69ND K70R L74V Q151M M184V L210W L215YF T215DLNS K219QERN L100I P225H K103N V106AM V108I Y181C Y188CLH Y190SA L10IRVF M46L L33F A71VT I54VLMAT L90M V82AFTS G73SCA N88S I84V I47VA I50V L24I V32I G48V Resultados 66 4.8. Asociación entre tropismo viral y el nivel de interleuquina-7 en plasma El nivel de IL-7 en plasma se realizó en un total de 62 pacientes: 30 pacientes naïve a tratamiento y 32 pacientes pretratados. En el resto de pacientes la determinación de IL-7 no pudo realizarse por falta de muestra. El análisis en conjunto de la población de estudio, mostró una asociación directa entre la viremia plasmática y el nivel de IL-7 en plasma (r=0,335, p=0,009), cuando se ajustó por el número de linfocitos T CD4+. En individuos naïve a tratamiento antirretroviral, el nivel de IL-7 en plasma se asoció inversamente con el número de linfocitos T CD4+, cuando se ajustó por la viremia plasmática, (r=-0,47, p=0,014). Sin embargo, cuando se examinó si existía asociación de la IL-7 con la viremia plasmática, cuando se ajustó por el número de CD4, se observó una tendencia, aunque no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (r=0,59, p=0,05). Por otro lado, en pacientes pretratados, aunque el nivel de IL- 7 en plasma se asoció directamente con la viremia plasmática, ajustando por el número de linfocitos T CD4+ (r=0,37, p=0,026), no se observó ninguna asociación con el número de linfocitos T CD4+ (p=0,3). No se observó ninguna asociación entre el tropismo viral y el nivel de IL-7 en plasma, cuando se analizó la población en conjunto (p=0,8). Tampoco cuando se consideraron los grupos de pacientes naïve (p=0,9) y pretratados (p=0,8) de forma independiente. Resultados 67 III. Estudio 3: Impacto del tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA) en el uso del correceptor en pacientes VIH+ 4.9. Diseño del estudio En total se seleccionaron para este estudio 73 pacientes con infección crónica por VIH-1: 42 pacientes pretratados y 31 individuos naïve a tratamiento con un número de linfocitos T CD4+ superior a 350 células/µL. Se realizó una búsqueda retrospectiva de la muestra basal de los 73 pacientes. En los 42 pacientes pretratados, se consideró la muestra basal, la muestra previa al inicio de TARGA. En el grupo de pacientes naïve, se consideró como muestra basal, la primera visita del paciente realizada en nuestro hospital. Dentro del grupo de pacientes pretratados, 21 de los 42 pacientes, habían tomado tratamiento antirretroviral en monoterapia o biterapia con zidovudina (AZT) y didanosina (ddI) antes de 1996. El número de muestras seleccionadas en los 42 pacientes pretratados coincidieron con cada uno de los fracasos virológicos que presentó cada paciente. En individuos naïve (n=31), las muestras se seleccionaron cada 12 o 24 meses. Tanto en pacientes pretratados como en individuos naïve, se seleccionaron entre 3 y 6 muestras a lo largo de los 6 años del periodo de estudio, en función de la disponibilidad de muestra. En total se seleccionaron 253 muestras, 158 de pacientes pretratados y 95 de individuos naïve. En la figura 3 se presenta un esquema del diseño del estudio. Figura 3. Esquema del diseño del estudio 3. Selección de la población de estudio n=73 Búsqueda retrospectiva de la muestra basal Selección de muestras: de 3 a 6 en cada paciente durante los 6 años de seguimiento Pacientes pretratados n=42 Individuos naïve n=31 Muestra previa a TARGA Primera visita a nuestro hospital Muestras seleccionadas en cada fracaso virológico n=158 Muestras seleccionadas cada 12 ó 24 meses de seguimiento n=95 Resultados 69 4.10. Población de estudio La muestra basal para pacientes que continuarían sin tratamiento fue considerada la primera visita realizada en nuestro hospital y en los pacientes que iban a iniciar tratamiento se tomó la muestra previa al inicio de TARGA. Un 84% (n=173) de los pacientes fueron hombres. La media de edad en pacientes que iban a iniciar TARGA y en individuos que continuarían sin tratamiento fue similar en ambos grupos (44 vs 41años; p=0,079). En el momento basal, la media de carga viral fue menor en pacientes naïve que no iban a iniciar tratamiento, que en aquellos pacientes que iban a iniciar tratamiento (p<0,0004). Sin embargo, la media de linfocitos T CD4+ fue significativamente más elevada en el primer grupo, comparada con el último (p<0,001). El nadir de linfocitos T CD4+, en pacientes que iban a iniciar terapia, se consideró el número más bajo de células T CD4+ que alcanzó un individuo antes de iniciar terapia antirretroviral, mientras que en pacientes que continuaron sin tratamiento, el nadir de linfocitos T CD4+, se consideró la cifra más baja alcanzada en cualquier momento del seguimiento. Los pacientes que permanecieron sin tratamiento, mostraron un nadir más elevado que pacientes que iban a iniciar TARGA (p=0,034). Todos los pacientes incluidos en el estudio estaban infectados con variantes virales subtipo genético B. En la tabla 6 se presentan éstas y otras características basales de la población de estudio. * Media (desviación estándar) UI: Unidades Internacionales; UDVP: Usuarios de Drogas por Vía Parenteral Tabla 6. Características basales de la población de estudio Total (n=73) Naïve (n=31) Pacientes que inician TARGA (n=42) p Sexo masculino, n (%) 61 (84) 27 (81) 34 (81) 0,541 Ruta de transmisión, n (%) UDVP 27 (40) 11 (42) 16 (38) Homosexuales 24 (35) 8 (31) 16 (38) 0,828 Heterosexuales 17 (25) 7 (27) 10 (24) Edad, años* 42,5 (6,9) 41(8,5) 44 (5,3) 0,079 VIH-ARN, log cop/mL* 4,2 (0,9) 3,8 (0,9) 4,5 (0,9) 0,004 Linfocitos T CD4+, células/µL* 386 (229) 536 (191) 278 (192) <0,001 Nadir linfocitos T CD4+, células/µL* 328,9 (180,9) 380,9 (174,9) 290,4 (177,7) 0,034 Año de infección* 1994,7 (6,2) 1997 (6) 1993 (5) 0,002 Niveles de IL-7 en plasma, UI/mL* 4,9 (4,3) 4 (4,5) 5,4 (4,2) 0,309 VIH-1 variantes CXCR4-trópicas, n (%) 7 (10) 1 (3) 6 (15) 0,227 Resultados 71 4.11. Prevalencia de cepas X4-trópicas en el momento basal La determinación del uso del correceptor se llevó a cabo en 237 (94%) de las 253 muestras, procedentes de 73 pacientes incluidos en el estudio. En el resto de muestras (n=16), la determinación del tropismo viral no pudo realizarse por insuficiencia de muestra. 148 (62%) muestras pertenecían a pacientes que iban a iniciar tratamiento y 89 (38%) muestras, a pacientes que iban a continuar sin tratamiento. En el momento basal, la prevalencia global de variantes X4- trópicas fue del 10%. Aunque no se observaron diferencias estadísticamente significativas, cuando se analizó la proporción de variantes CXCR4-trópicas en el momento basal entre ambos grupos, se observó un aumento en el grupo de pacientes que iban a iniciar TARGA comparado con el grupo de pacientes que no iban a iniciar tratamiento (15% vs 3%; p=0,112) (tabla 6). 4.12. Factores asociados con el tropismo viral en el momento basal En pacientes que inician tratamiento, no se observó ninguna asociación entre el tropismo viral y el sexo, ruta de transmisión, año de infección o la edad. Tampoco se observó ninguna asociación entre el tropismo viral y la presencia de la deleción ∆32 en el gen ccr5, la viremia plasmática basal o el número de linfocitos T CD4+ en el momento basal (tabla 7). Resultados 72 En el grupo de pacientes que continuaron sin tratamiento, sólo uno de los 31 pacientes presentaba variantes virales X4-trópicas, por lo que no se pudo llevar a cabo el análisis estadístico en el momento basal. El nivel de IL-7 en plasma en el momento basal fue cuantificado en 52 de 73 pacientes: en 15 individuos naïve que continuaron sin tratamiento y 37 pacientes crónicos que iban a iniciar TARGA. En el resto de pacientes no se pudo llevar a cabo la determinación de la concentración de IL-7 por falta de muestra. Aunque niveles elevados de IL-7 en plasma se asociaron con cargas virales elevadas, cuando se ajustó por el número de linfocitos T CD4+, sólo se observó una correlación positiva entre la carga viral y el nivel en plasma de IL-7 en pacientes que no iban a ser tratados (r=0,6, p=0,018). No se observó asociación entre el nivel de IL-7 basal y el tropismo viral en ninguno de los grupos de pacientes. Basal Seguimiento Naïve (n=31) Pacientes que inician TARGA (n=42) Naïve (n=31) Paciente que inician TARGA (n=42) R5 (n=30) X4 (n=1) p R5 (n=36) X4 (n=6) p Cambio R5 a X4 (n=6) No cambio† (n=25) p Cambio R5 a X4 (n=9) No cambio† (n=33) p VIH-RNA, log cop/mL* 3,8 (0,9) -- 4,6 (0,9) 4,2 (1,3) 0,390 3,5 (0,8) 3,9 (0,9) 0,44 4,8 (0,6) 4.4 (1,04) 0,220 Linfocitos T CD4+, céls/µL* 525,5 (190,1) -- 251,7 (172,6) 398,8 (247,8) 0,120 540,7 (179,7) 537,7 (198,6) 0,97 148,4 (198,6) 329.9 (166,4) 0,016 Nadir CD4+, céls/µL* 377,8 (177) -- 281,9 (180,5) 341,7 (164,9) 0,450 325,3 (177,2) 397,2 (174,6) 0,35 165,5 (143,5) 340.4 (166,7) 0,003 Nivel IL-7, UI/mL* 3,1 (3,2) -- 5,5 (4,4) 4,5 (3,6) 0,610 4,8 (6,4) 3,6 (3,7) 0,66 6,1 (4,5) 5.1 (4,2) 0,540 Año de infección* 1997,3 (6,4) -- >0,9 1992,6 (5,5) 1991,8 (1,3) 0,480 1994,9 (5,6) 1998,2 (6,5) 0,23 1992,3 (4,5) Hombres, n (%) 26 (86,7) 1 (100) >0,9 29 (80,6) 5 (83,3) >0,90 6 (100) 21 (84) 0,56 8 (88,9) 26 (78,8) 0,660 Edad, años 40,6 (8,6) -- -- 43,3 (5,1) 46,2 (6,5) 0,220 44,1 (8) 39,7 (8,5) 0,24 43,4 (4,2) 43,8 (5,8) 0,820 Genotipo CCR5∆∆∆∆32, n (%) wt/wt 22 (97,5) 1 (100) >0,9 27 (93,1) 5 (83,3) 0,440 6 (100) 17 (94,4) >0,9 7 (87,5) 22 (1.7) 0,550 wt/CCR5∆∆∆∆32 1 (4,3) -- 2 (6,9) 1 (16,7) -- 1 (5,6) 1 (12,5) 2 (8.3) Ruta de transmisión, n (%) Parenteral 10 (40) 1 (100) 0,42 15 (41,7) 1 (16,7) 0,380 3 (42,9) 8 (42,1) >0,9 5 (41,7) 11 (36.7) >0,90 Sexual 15 (60) -- 21 (58,3) 5 (83,3) 4 (57,1) 11 (57,9) 7 (58,3) 19 (63.3) * Media (desviación estándar) † Parámetros estudiados en el momento basal UI: Unidades internacionales; wt: wild type o genotipo salvaje Tabla 7. Asociación entre el tropismo viral y las características de la población de estudio en el momento basal y durante el seguimiento Resultados 74 4.13. Características del cambio en el uso del correceptor durante el seguimiento longitudinal La frecuencia de cambio en el uso del correceptor a lo largo del seguimiento en toda la población de estudio (n=73), fue del 26% (n=19). Cuando se comparó la frecuencia de cambio en el uso del correceptor en pacientes que continuaron sin tratamiento (n=31) y pacientes que iniciaron terapia (n=42), se observaron datos similares (23% (n=7) vs 29% (n=12) respectivamente, p=0,564). De los 19 pacientes en los que se observó cambio en el uso del correceptor, un 79% (n=15), independientemente de si estaban o no tomando tratamiento antirretroviral, experimentaron un cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4. Cuando se analizaron los grupos por separado, se observó que de los 7 sujetos naïve que experimentaron un cambio, un 86% (n=6) lo experimentaron de CCR5 a CXCR4. No se observó asociación en la cifra de linfocitos T CD4+ entre el momento basal y el momento del cambio (439 ± 50,9 vs 307,8 ± 164,1 células/µL, p=0,273) en este grupo de pacientes. De los 12 pacientes que iniciaron TARGA y que experimentaron cambio en el uso del correceptor, en un 75% (n=9) de ellos, el cambio ocurrió de CCR5 a CXCR4. Al igual que en pacientes naïve, no se asoció el número de linfocitos T CD4+ en el momento basal y en el momento del cambio (88,5 ± 91,7 vs 172,8 ± 109,6 células/µL, p=0,174). Además, en 4 de los 12 pacientes que iniciaron Resultados 75 terapia, se observó una oscilación en cuanto al cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4 y de nuevo a CCR5. Sin embargo, en el grupo de individuos naïve, no se observó ninguna oscilación en el cambio de tropismo. 4.14. Factores asociados con el cambio del uso del correceptor durante el seguimiento longitudinal La media de tiempo de seguimiento en pacientes que iniciaron terapia y en individuos que continuaron sin tratamiento fue de 84,2 y 76,7 meses, respectivamente. Analizando la población en conjunto, la tasa de cambio de tropismo viral de CCR5 a CXCR4 y viceversa, durante los primeros 12 meses de seguimiento fue del 4,1%. Ningún paciente que continuó sin tratamiento sufrió cambio en el uso del correceptor tras el primer año de seguimiento, mientras que en 3 pacientes que iniciaron terapia, se observó un cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4. Cuando el análisis se realizó tras 72 meses de seguimiento, la tasa de cambio de tropismo viral de CCR5 a CXCR4 y viceversa, fue del 22%. Analizando independientemente pacientes con y sin tratamiento, la tasa de cambio de CCR5 a CXCR4 y viceversa, fue similar en ambos grupos (26,2% vs 16,1% respectivamente, p=0,481). Del mismo modo, cuando el estudió se acotó a pacientes en los que se observó solamente cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4, la tasa de cambio de tropismo viral tras 72 meses de seguimiento, fue similar en pacientes pretratados e individuos naïve (19% vs 13% respectivamente, p=0,483). Resultados 76 No se observó asociación entre el cambio en el uso del correceptor con el género, la edad, la ruta de transmisión o el año de infección. Tampoco se observó una asociación entre la presencia del polimorfismo CCR5∆32 y el cambio de tropismo viral. En pacientes naïve, se observaron valores de linfocitos T CD4 basales similares en pacientes que sufrieron cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4, y los que no sufrieron cambio (540,7 ± 179,7 vs 537,7 ± 198,6 células/µL respectivamente p=0,97) y en el nadir de linfocitos T CD4+ (325,3 ± 177,2 vs 397,2 ± 174,6 células/µL respectivamente, p=0,35,). Sin embargo, en pacientes que tomaban TARGA, el cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4 se asoció con un menor número de linfocitos T CD4+ en el momento basal (148,4 ± 198,6 vs 329,9 ± 166,4 células/µL, p=0,016), así como con un nadir de células T CD4+ inferior (165,5 ± 143,5 vs 340,4 ± 166,7 células/µL, p=0,003). Cuando se evaluó a lo largo del seguimiento la relación entre el nivel de IL-7 en plasma y la viremia plasmática, independientemente de si los pacientes tomaban o no TARGA, no se observó ninguna asociación. Finalmente, el nivel de IL-7 en plasma tampoco se asoció con el cambio en el uso del correceptor ni en pacientes que iniciaron TARGA ni en individuos naïve. Resultados 77 IV. Estudio 4: Influencia del tratamiento antirretroviral de gran actividad en la expresión del correceptor CCR5 4.15. Población de estudio En este estudio, se incluyeron 26 pacientes con infección crónica por VIH-1 que iniciaron TARGA y mantuvieron carga viral indetectable (<50 copias/mm3) durante dos años de seguimiento. De los 26 pacientes, un 81% (n=21) fueron hombres y todos los pacientes incluidos en el estudio estaban infectados con variantes virales del subtipo genético B. La mediana de edad de los pacientes del estudio fue 43 [9] años y en el momento basal (antes de iniciar TARGA), la mediana de carga viral fue 4,70 [0,66] log copias/mL y la de linfocitos T CD4+ fue 308 [248] células/µL. Como grupo control se seleccionaron 11 individuos VIH negativos. 4.16. Perfil de expresión de la molécula CCR5 en linfocitos T CD4+ y CD8+ En la figura 4, se muestra un ejemplo ilustrativo del análisis de expresión de la molécula de CCR5 en linfocitos T CD4+ y T CD8+ totales en un paciente del estudio. El análisis de la expresión de la molécula de CCR5 tanto en nivel (% de células CCR5+) como en densidad (nº moléculas de CCR5/célula en la población celular CCR5+) en linfocitos T CD4+ y T CD8+ totales de pacientes VIH positivos, mostró tanto para niveles como para densidad, valores significativamente más elevados en linfocitos T CD8+ que en linfocitos T CD4+ (p<0,001). Cuando se analizaron las células con fenotipo naïve (CD45RO-) y memoria (CD45RO+), se observaron niveles de CCR5 más elevados en células Resultados 78 con fenotipo memoria que en células con fenotipo naïve tanto en linfocitos T CD4+ como en linfocitos T CD8+ (p<0,001). Resultados similares se observaron cuando se comparó la densidad de expresión de la molécula CCR5 en la población total de linfocitos T CD4+ o CD8+ y en sus subpoblaciones con fenotipo naïve o memoria, en pacientes VIH positivos (tabla 8). Individuos sanos, también mostraron un mayor nivel y densidad de expresión de CCR5, en linfocitos T CD8+ que en T CD4+ totales y en sus subpoblaciones naïve y memoria (tabla 8). CD4 TOTALES CD8 TOTALES CCR5-FITC IgG2-FITC 0,26% 5,47% 0,69% 23,1% N ú m er o d e c él u la s N ú m e ro d e c él u la s N ú m er o d e c él u la s N ú m e ro d e c él u la s Figura 4. Ejemplo ilustrativo en el que se compara la expresión de la molécula CCR5 en linfocitos T CD4+ y T CD8+, tanto en el control isotópico (IgG2) como en la molécula CCR5. Nivel de expresión del correceptor CCR5 (porcentaje de células CCR5+) Densidad de expresión del correceptor CCR5 (moléculas/célula en las células CCR5+) Pacientes VIH+ Linfocitos T CD4+ Linfocitos T CD8+ p Linfocitos T CD4+ Linfocitos T CD8+ p población total 6,9 (6,5)* 14,6 (27,23) <0,001 3285 (1288) 4814 (5364) <0,001 CD45RO- 1,45 (5,44) 10,7 (19,58) <0,001 2299 (1939) 4122 (4014) 0,007 CD45RO+ 10,6 (11,1) 22,9 (37,8) <0,001 3150 (1608) 4727 (2166) <0,001 Individuos sanos población total 6,87 (6,5) 19,96 (18,58) 0,004 1970 (873) 4165 (2275) 0,003 CD45RO- 1,32 (1,16) 6,7 (28,38) 0,006 1987 (743) 4156 (4073) 0,008 CD45RO+ 13,9 (12,21) 51 (28,38) 0,003 2259 (1228) 3669 (2500) 0,003 *Mediana (amplitud intercuartílica) Tabla 8. Perfil de expresión de la molécula CCR5, como nivel y como densidad, en linfocitos T CD4+ y T CD8+ en pacientes VIH-1 antes de iniciar terapia y en individuos sanos. Resultados 80 4.17. Influencia de la infección por VIH-1 en la expresión de CCR5 El nivel de expresión de CCR5 en la población total, así como en la subpoblación con fenotipo naïve de linfocitos T CD4+ y CD8+, fue similar en pacientes VIH positivos y en individuos sanos (p>0,05) (tabla 9). Sin embargo, el nivel de expresión de CCR5 en linfocitos T CD8+ con fenotipo memoria, fue significativamente más bajo en pacientes infectados que en controles sanos (22,9% [37,8] vs 51% [28,4], p=0,03). La densidad de expresión de la molécula CCR5 en linfocitos T CD4+, mostró valores significativamente mayores en pacientes VIH+ que en individuos sanos, tanto en la población total (CD4+: 3285 [1288] vs 1970 [873] moléculas/célula; P=0,001)], como en las subpoblaciones con fenotipo naïve (CD4+CD45RO-: 2999 [1939] vs 1987 [743] moléculas/célula, p=0,006) y memoria (CD4+CD45RO+: 3150 [1608] vs 2259 [1228] moléculas/célula, p=0,012). El análisis llevado a cabo en linfocitos T CD8+ mostró valores similares de densidad de CCR5 tanto en pacientes infectados como no infectados en la población total y en las subpoblaciones con fenotipo naïve (CD8+CD45RO-). Sin embargo, en linfocitos T CD8+ con fenotipo memoria (CD8+CD45RO+) se observó una tendencia a un número de moléculas de CCR5 más elevada en pacientes infectados que en individuos sanos (4727 [2166] vs 3669 [2500] moléculas/célula, respectivamente, p=0,040) (tabla 9). Nivel de expresión del correceptor CCR5 (porcentaje de células CCR5+) Densidad de expresión del correceptor CCR5 (moléculas/célula en las células CCR5+) Linfocitos T CD4+ Individuos sanos Pacientes VIH+ p Individuos sanos Pacientes VIH+ p población total 6,87 (4,4)* 6,9 (6,5) 0,690 1970 (873) 3285 (1288) 0,001 CD45RO- 1,32 (1,16) 1,45 (5,4) 0,700 1987 (743) 2999 (1939) 0,006 CD45RO+ 13,99 (12,21) 10,6 (11,1) 0,225 2259 (1228) 3150 (1608) 0,012 Linfocitos T CD8+ población total 19,96 (18,58) 14,6 (27,23) 0,618 4165 (2275) 4814 (5364) 0,181 CD45RO- 6,71 (11,74) 10,68 (19,58) 0,303 4156 (4073) 4122 (4014) 0,566 CD45RO+ 51 (28,4) 22,9 (37,8) 0,030 3669 (2500) 4727 (2166) 0,040 *Mediana (amplitud intercuartílica) Tabla 9. Perfil de expresión de la molécula CCR5, como nivel y como densidad, en pacientes VIH positivos en el momento basal del seguimiento y en individuos sanos. Resultados 82 4.18. Influencia de la terapia antirretroviral en la expresión de CCR5 Cuando se analizó si TARGA tenía algún efecto en la expresión de la molécula CCR5, se observó un nivel de expresión en pacientes VIH positivos similar en el momento basal y tras 24 meses de tratamiento antirretroviral, en linfocitos T CD4+ totales y en las subpoblaciones con fenotipo naïve y memoria. El análisis en linfocitos T CD8+, también mostró datos similares en el momento basal y tras el tratamiento tanto en la población total como en la subpoblaciones con fenotipo naïve (CD8+CD45RO-) y memoria (CD8+CD45RO+) (tabla 10). Del mismo modo, la densidad de expresión de CCR5 en linfocitos T CD4+ totales y en las subpoblaciones con fenotipo naïve y memoria, permaneció similar en el momento basal y tras 24 meses de terapia antirretroviral exitosa (tabla 10), permaneciendo más elevada en pacientes VIH+ que en individuos sanos tras 2 años de seguimiento. Nivel de expresión del correceptor CCR5 (porcentaje de células CCR5+) Densidad de expresión del correceptor CCR5 (moléculas/célula en las células CCR5+) Linfocitos T CD4+ (n=18) Basal Mes 12 Mes 24 p Basal Mes 12 Mes 24 p población total 6,9 (5,5)* 6,2 (4,9) 6 (6,43) 0,23 3285 (1235) 3196 (2592) 3702 (1271) 0,29 CD45RO- 1,45 (4,43) 1,37 (1,68) 1,5 (2,18) 0,69 2922 (1449) 4557 (4016) 4419 (4120) 0,23 CD45RO+ 11,5 (6,71) 13 (12,97) 10,3 (10,11) 0,93 3150 (1430) 3722 (2430) 3315 (1331) 0,79 Linfocitos T CD8+ (n=18) población total 17,95 (29,49) 17,25 (21) 15,16 (27,2) 0,41 4677 (5086) 4188 (3413) 4175 (1521) >0,99 CD45RO- 10,48 (23,28) 11,37 (18,53) 10,93 (21,53) 0,93 3871 (5312) 4965 (3341) 3907 (2149) 0,93 CD45RO+ 22,9 (37,8) 40,4 (33,8) 38 (45) 0,61 4727 (1969) 5222 (2349) 4827 (1387) 0,79 *Mediana (amplitud intercuartílica) Tabla 10. Nivel de expresión de CCR5 en pacientes VIH positivos en el momento basal y durante la terapia TARGA. Resultados 84 4.19. Nivel de activación en linfocitos T CD4+ y CD8+ y evolución bajo TARGA El nivel de activación medido con el marcador CD38, antes de iniciar TARGA, mostró valores significativamente más elevados en pacientes VIH positivos (n=26) que en controles sanos (n=11), tanto en linfocitos T CD4+ totales (4201 [2220] vs 3126 [1046] moléculas/célula, p=0,024) como en linfocitos T CD8+ totales (5130 [3856] vs 1206 [742] moléculas/célula, p<0,0001). Como era de esperar, los niveles de expresión del marcador CD38 disminuyeron significativamente desde el momento basal, es decir, antes de iniciar TARGA, hasta después de 12 y 24 meses de tratamiento tanto en linfocitos T CD4+ totales (p=0,021), como en linfocitos T CD8+ totales (p=0,005) (tabla 11). Pacientes VIH+ Basal Mes 12 Mes 24 p CD4+ 4201 (2220)* 3839 (1756) 3286 (967) 0,021 CD8+ 4395 (3687) 1795 (1536) 1399 (894) 0,005 *Mediana (amplitud intercuartílica) Tabla 11. Nivel de activación del marcador CD38 en linfocitos T CD4+ y CD8+ totales en individuos VIH+ durante la terapia con TARGA . Resultados 85 A nivel basal, la expresión del marcador CD38 en la población de linfocitos T CD8+, se correlacionó positivamente con la carga viral (Rho=0,493, p=0,012), mientras que la expresión de este marcador en células T CD4+ se correlacionó de forma inversa con el contaje de células T CD4 (Rho= -0.437, p=0,033). El nivel de expresión de la molécula de CCR5, no mostró asociación significativa, tanto en porcentaje como en densidad, con la carga viral, el contaje de linfocitos T CD4 o el nivel de activación inmune en linfocitos T CD4 y T CD8+. DISCUSIÓN Discusión 87 El proceso de entrada del VIH en la célula requiere de la interacción de la glicoproteina de la envuelta viral gp120 con el receptor celular CD4 (Dalgleish et al. 1984, Klatzmann et al. 1984, Sattentau et al. 1988) y con uno de los receptores de quimiocinas, CCR5 y/o CXCR4 (Alkhatib et al. 1996, Deng et al. 1996, Feng et al. 1996). El tropismo del VIH por los receptores de quimiocinas clasifica las variantes virales como R5-trópicas, X4-trópicas o duales, en función del uso del correceptor (Berger et al. 1998). Las variantes R5-trópicas predominan en etapas iniciales de la infección, mientras que las cepas X4- trópicas emergen en etapas más avanzadas de la enfermedad y su aparición se ha asociado con un descenso en la cifra de linfocitos T CD4+ y con una rápida progresión a SIDA (van´t Wout et al. 1994, Connor et al. 1997, Schuitemaker et al. 1992, Pope et al. 2003, Philpott et al. 2006, Daar et al. 2007, Koot et al. 1993). La evolución del tropismo viral durante la infección por VIH, su relación con la patogénesis y la progresión de la enfermedad son aspectos todavía no bien comprendidos. El interés por los estudios de tropismo del VIH, ha aumentado desde que se iniciaron los ensayos clínicos con los antagonistas de los receptores CCR5 y CXCR4. Estas nuevas moléculas impiden la entrada del VIH en la célula inhibiendo la interacción entre la glicoproteína de envuelta viral gp120 y los receptores de quimiocinas CCR5 o CXCR4. Hasta el momento, el antagonista de CCR5 maraviroc (MVC, Celsentri® Pfizer), que inhibe específicamente la replicación de variantes R5-trópicas, es el único fármaco de esta familia Discusión 88 aprobado para el tratamiento de la infección por VIH. El mecanismo de acción de MVC difiere del resto de fármacos antirretrovirales desarrollados hasta el momento. La unión de MVC a la cavidad transmembrana formada entre las hélices 2, 3, 6 y 7 (Dorr et al. 2005, Castonguay et al. 2003) de CCR5, provoca cambios conformacionales, especialmente en la región ECL2 de CCR5, impidiendo la interacción entre dicha región y la corona de la región V3 de la glicoproteína gp120 del VIH-1. De este modo se inhibibe la fusión entre la membrana viral y celular. Datos obtenidos en los ensayos clínicos MOTIVATE, llevados a cabo en pacientes VIH+ que fracasaban a tratamiento antirretroviral, mostraron una mayor prevalencia de cambio de tropismo de R5 a dual/mixto, en pacientes que tomaban MVC, que en el grupo placebo (64% vs 5%) (Nelson et al. 2007). Estudios de clonaje posteriores en pacientes que fracasaron a MVC han sugerido la existencia de variantes X4 en el momento basal, aunque en concentraciones inferiores al límite de detección por el ensayo fenotípico utilizado para la determinación del tropismo viral (Westby et al. 2006), de manera que la emergencia de variantes X4 preexistentes, más que el cambio en el uso del correceptor, sería responsable de la resistencia a MVC en la mayoría de casos in vivo. Debido al mecanismo de acción de estos compuestos, así como a la asociación observada entre la emergencia de variantes X4-trópicas y el fracaso con MVC, Discusión 89 el desarrollo y uso clínico de estos fármacos requiere de la determinación del uso del correceptor antes y durante el tratamiento con dichos fármacos, si hay fracaso virológico. El único método validado hasta el momento para la determinación del tropismo viral en muestras clínicas es el ensayo fenotípico Trofile® (Monogram, Biosciences, USA) (Huang et al. 2001), basado en el uso de virus recombinantes. Sin embargo, los métodos fenotípicos son sofisticados, caros, requieren de infraestructuras especiales no disponibles en todos los laboratorios de VIH, así como de personal altamente cualificado. La disponibilidad de estudios genotípicos basados en la determinación de la secuencia de la región V3 de gp120, para la estimación del uso del correceptor, pueden ser una alternativa atractiva. Estos métodos son fiables, rápidos y accesibles a casi todos los laboratorios de VIH. Su uso facilitaría la incorporación de los antagonistas de los correceptores en el tratamiento de los pacientes VIH positivos. Estudios previos han mostrado un elevado grado de exactitud en la estimación del tropismo viral utilizando predictores genotípicos, en secuencias de V3 derivadas de clones (Jensen et al. 2003, Resch et al. 2001, Sing et al. 2005). Sin embargo, es motivo de discusión si dichas técnicas son idóneas para su aplicación en la práctica clínica. Conocer la concordancia, la sensibilidad y la Discusión 90 especificidad que presentan las herramientas genotípicas es fundamental, para poder incorporarlas en la práctica clínica. Los resultados de concordancia obtenidos en esta tesis cuando se compararon las herramientas genotípicas PSSM_X4R5, geno2pheno y wetcat_SVM, para la determinación del uso del correceptor con el ensayo fenotípico Phenoscript® (Eurofins, Viralliance Inc), fueron elevados, del 85,9%, 71,8% y 70,5%, respectivamente, para muestras clínicas con subtipo B. Con los tres predictores, se observó una alta sensibilidad, próxima al 90%, en wetcat_SVM y geno2pheno y del 80% en PSSM_X4R5. Sin embargo, la especificidad observada en wetcat_SVM y geno2pheno, fue relativamente baja, entre 65% y 68%, mientras que la obtenida con PSSM_X4R5 fue bastante elevada, próxima al 90%. A la vista de los resultados obtenidos, PSSM_X4R5, parece ser el método más fiable para la determinación de variantes minoritarias X4-trópicas. Datos de concordancia similares se han observado en un estudio realizado en 74 pacientes naïve, en el que se compararon los predictores fenotípicos Trofile® (Monogram Biosciences) y Phenoscrit® (Eurofins, Viralliance Inc) con el predictor genotípico geno2pheno, resultando en un 86,5% y en un 79,7%, respectivamente. La sensibilidad obtenida, para la determinación de variantes X4-trópicas en este estudio fue ligeramente inferior a la observada en el nuestro, siendo de un 67% y 55%, respectivamente cuando se compararon Trofile® y Phenoscript® con geno2pheno. Por el contrario, la especificidad observada fue superior a la observada en nuestro estudio, prácticamente del Discusión 91 100% cuando se compararon ambos predictores fenotípicos con geno2pheno (Skrabal et al. 2007). Existen datos controvertidos en cuanto a la sensibilidad y especificidad que presentan las técnicas genotípicas para la determinación de variantes virales minoritarias. Low et al. evaluaron el valor predictivo de diferentes algoritmos genotípicos para determinar el tropismo viral en 977 muestras de pacientes VIH+ naïve en comparación con los datos obtenidos utilizando el ensayo fenotípico Trofile®. Aunque los algoritmos utilizados demostraron una alta especificidad (88-97%), la sensibilidad para detectar variantes X4 fue inferior a la obtenida en nuestro estudio (22-45%) (Low et al. 2007). Estudios realizados en muestras clínicas de poblaciones diferentes (seroconvertores, naïve, pretratados y subtipos no-B), han mostrado datos de sensibilidad similares a los obtenidos en nuestro estudio para la detección de variantes X4 empleando algunas herramientas genotípicas específicas (Garrido et al. 2008, de Mendoza et al. 2008). La discordancia observada en nuestro estudio entre métodos fenotípicos y genotípicos no pudo ser explicada mediante diferencias en la viremia plasmática, el número de linfocitos T CD4+ o el régimen terapéutico que recibían los pacientes. Hay que señalar que aunque la región V3 de la envuelta viral es el principal determinante del uso del correceptor (Hwang et al. 1991), otras regiones de la envuelta podrían influir en el tropismo viral (Hwang et al. Discusión 92 1991, Andeweng et al. 1993, Boyd et al. 199, Groenink et al. 1993, Hoffman et al. 2002). La exclusión de dichas regiones podría afectar a la estimación del uso del correceptor utilizando pruebas genotípicas. Los métodos genotípicos se basan exclusivamente en secuencias de la región V3 de gp120, mientras que la mayoría de los ensayos fenotípicos, como Phenoscript® (Labernardiere et al. 2004) y Trofile® (Huang et al. 2001), incluyen otras regiones de la envuelta. De este modo, podrían ser métodos más exactos para evaluar el tropismo viral. Por otro lado, la sensibilidad para la detección de variantes minoritarias X4- trópicas utilizando PCR, oscila entre un 10 y un 25%, siendo inferior a la sensibilidad que presentan los ensayos fenotípicos, lo que también podría explicar las diferencias de resultados entre métodos fenotípicos y genotípicos. Hay que destacar que también se han observado diferencias en la determinación del tropismo viral utilizando diversos métodos fenotípicos. La comparación entre Trofile® y Phenoscript® mostró una concordancia del 85%. El 15% de discrepancia no pudo explicarse por diferencias entre los niveles de viremia o de linfocitos T CD4+. La discordancia podría deberse los distintos tamaños de los RNAs amplificados, al tipo de células usadas para expresar los correceptores y/o a los diferentes genes indicadores utilizados por los diferentes métodos fenotípicos (Skrabal et al. 2007). Se han observado discrepancias entre las tres herramientas genotípicas utilizadas, que podrían ser debidas a diversos factores. En primer lugar, las Discusión 93 diferencias existentes en el número de secuencias pareadas genotipo-fenotipo, utilizadas para la validación de las herramientas informáticas wetcat-SVM, geno2pheno y PSSM_X4R5, podrían influir en la determinación del tropismo. La validación en el predictor wetcat se llevó a cabo con 271 secuencias pareadas (Pillai et al. 2003), geno2pheno se validó con 1100 secuencias pareadas (Sing et al. 2004) y, por último, la matriz X4-R5 de PSSM se validó utilizando 213 secuencias pareadas (Jensen et al. 2003). Por último, detalles técnicos de los predictores virtuales, como los distintos modelos estadísticos usados para llevar a cabo las predicciones, también podrían contribuir a las diferencias observadas. Mientras wetcat-SVM y geno2pheno emplean support vector machine, herramienta estadística que clasifica las secuencias de un modo binario, es decir, como secuencias R5 o X4, incluyendo las secuencias R5/X4 como secuencias X4 (Pillai et al. 2003, Sing et al. 2004), PSSM_X4R5 interpreta la tendencia a utilizar CXCR4 como baja, intermedia o alta para virus R5, R5/X4 y X4, respectivamente (Jensen et al. 2003). Por ello, PSSM_X4R5 presenta una especificidad más elevada para la detección de variantes X4- trópicas que las otras dos herramientas bioinformáticas. El conocimiento de la prevalencia de variantes X4 en nuestra población de pacientes infectados por VIH podría facilitar conocer la proporción de pacientes que podrían beneficiarse de un tratamiento con antagonistas de CCR5. La elevada prevalencia de variantes X4-trópicas observada en pacientes con infección crónica multitratados que se encontraban en fracaso virológico Discusión 94 (34,5%), así como la observada en individuos VIH-1 naïve para tratamiento (15,4%) y en sujetos seroconvertores recientes (9%), concuerda con los datos de otros estudios transversales. En estos trabajos se ha observado una prevalencia de variantes X4 del 22-50% en pacientes pretratados y del 12-20% en individuos naïve y seroconvertores (Brumme et al. 2005, Demarest et al. 2004, Melby et al. 2006, Wilkin et al. 2006, Hunt et al. 2006, De Mendoza et al. 2007). Los ensayos MERIT (Saag et al. 2007) evaluaron la eficacia de MVC vs EFV en pacientes naïve. No han podido demostrar la no inferioridad de MVC vs EFV, de manera que MVC sólo ha sido aprobado para pacientes pretratados. Según los datos obtenidos en nuestra población, más de la mitad de los pacientes pretratados podrían beneficiarse del tratamiento con antagonistas de CCR5. Los datos obtenidos en nuestro estudio sobre la prevalencia de variantes X4 en distintos grupos de pacientes, concuerdan con la hipótesis de que las variantes R5-trópicas son las responsables de la transmisión y establecimiento inicial de la enfermedad, mientras que a medida que avanza la enfermedad emergen las variantes X4-trópicas (Moore et al. 2004, Margolis et al. 2006). El elevado nivel de expresión del correceptor CCR5 en las células de la mucosa genital (Kawamura et al. 2005), así como la elevada expresión de CCR5 y no de CXCR4 en las células epiteliales del intestino (Bomsel et al. 2002), podrían favorecer la transmisión de variantes R5-trópicas por vía sexual. Sin embargo, Discusión 95 tras la exposición al VIH-1 por vía parenteral, como sucede en individuos hemofílicos o usuarios de drogas por vía parenteral, el tamaño del inóculo es mayor y las células diana difieren de las presentes por vía sexual. Esto permitiría a las variantes X4 establecer la infección más fácilmente. En un estudio llevado a cabo en 203 seroconvertores recientes, se observó una tendencia a una mayor prevalencia de variantes X4 en individuos que adquirieron la infección por vía parenteral comparada con la observada en individuos infectados mediante contactos sexuales (35,7% vs 16,5%, respectivamente, p=0,07) (de Mendoza et al. 2007). Individuos que presentan la deleción de 32 pares de bases en el gen ccr5 (CCR5∆32) en heterocigosis, tienen sólo un alelo CCR5 funcional y presentan niveles de expresión del correceptor CCR5 inferiores a los sujetos que no presentan el polimorfismo (Wu et al. 1997). Por tanto, si la disponibilidad de la molécula de CCR5 en la superficie celular disminuye, cabría esperar una relativa resistencia a la infección por VIH en pacientes portadores del polimorfismo en homocigosis o heterocigosis (de Roda Husman et al. 1999). En un estudio realizado en 55 individuos VIH+ y en 30 individuos sanos, la comparación entre el genotipo del gen ccr5 y la expresión de la molécula CCR5 en células T CD4+, concluyó que individuos portadores de la deleción, tanto en homocigosis como en heterocigosis, presentaban una expresión de CCR5 en células T CD4+, significativamente menor que en individuos homocigotos que no presentaban el polimorfismo (de Roda Husman et al. 1999). Discusión 96 La presencia del polimorfismo CCR5∆32 podría tener un efecto negativo y aumentar la prevalencia de variantes X4 en individuos portadores de la deleción (D’Aquila et al. 1998). En un estudio realizado en 979 pacientes naïve se observó que pacientes que presentaban el polimorfismo CCR5∆32 en heterocigosis tenían casi el doble de posibilidades de tener variantes X4 que sujetos que no presentaban la deleción (Brumme et al. 2005). Sin embargo, otro estudio llevado a cabo en 258 pacientes no mostró diferencias al comparar pacientes VIH-1 heterocigotos para la deleción y homocigotos con genotipo salvaje (de Roda Husman et al. 1997). Los datos obtenidos en esta tesis no apoyan ninguna de estas dos hipótesis. De todos modos, la falta de asociación entre la presencia del polimorfismo CCR5∆32 y el tropismo viral, o entre el polimorfismo CCR5∆32 y el nivel de expresión de CCR5 podría explicarse por el bajo número de pacientes que presentaron el polimorfismo. La interleuquina 7 (IL-7) es una de las principales citoquinas que regula la homeostasis de las células T induciendo la timopoiesis (Grabstein et al. 1990, Plum et al. 1996, Hofmeister et al. 1999, Fry et al. 2001, Tan et al. 2001) y estimulando la proliferación y función citotóxica de las células T maduras (Chazen et al. 1989, Hickman et al. 1990). Diversos estudios han demostrado que el nivel de IL-7 en plasma es mayor en sujetos infectados por VIH que en individuos seronegativos y se correlaciona inversamente con el número de linfocitos T CD4+ (Napolitano et al. 2001, Mastroianni et al. 2001, Llano et al. Discusión 97 2001, Darcissac et al. 2001). Además, se ha observado que pacientes pretratados que fracasan a la terapia antirretroviral presentan elevadas concentraciones de IL-7 en plasma (Mastroianni et al. 2001). Todos estos estudios sugieren que la IL-7 está implicada en la homeostasis de las células T periféricas en pacientes con linfopenia. Los resultados obtenidos en esta tesis apoyan esta hipótesis; en pacientes naïve, elevados niveles de IL-7 se relacionaron con un bajo número de linfocitos T CD4+. Por otra parte, la IL-7 podría tener un efecto perjudicial, induciendo la expresión del correceptor CXCR4 en células T CD4+ memoria, provocando una mayor susceptibilidad de dichas células a la infección y favoreciendo la emergencia de virus X4-trópicos (Jourdan et al. 2000). Sin embargo, en nuestro estudio no se observaron diferencias en los niveles de IL-7 en plasma cuando se compararon pacientes infectados con variantes X4 o R5-trópicas, tal como se ha observado en un estudio reciente (Lin et al. 2005). Una mayor selección y acumulación de mutaciones de resistencia en el genoma del VIH-1 a otras familias de fármacos antirretrovirales (ITIAN, ITINAN e IP), podría influir en la selección de mutaciones de resistencia en el gen de la envuelta, y en particular en la región V3 de gp120, donde se une el correceptor, provocando modificaciones estructurales virales que impidiesen la unión de la glicoproteína gp120 del VIH, en particular de la región V3, al correceptor CCR5. Esto podría facilitar un cambio en el uso del correceptor. La elevada Discusión 98 variabilidad observada en la región V3 en nuestros pacientes seroconvertores comparada con pacientes naïve y pretratados impidió que pudiéramos comprobar esta hipótesis. Por tanto, no podemos conocer si las mutaciones de resistencia en el gen pol, influyen en la aparición de mutaciones secundarias asociadas a V3, que modularían la unión a CCR5 basada en impedimentos estructurales. Cuando se evaluó el porcentaje de variantes X4-trópicas que presentaban los distintos grupos de pacientes, se observó que los pacientes pretratados tenían una mayor proporción de variantes X4-trópicas. La falta de asociación observada entre la presencia de mutaciones de resistencia a las distintas familias de fármacos (ITIAN, ITINAN e IP), y la presencia de variantes X4, podría estar influida por el hecho de que la población de estudio presentó un número de mutaciones muy similar, lo que podría dificultar la detección de diferencias entre los distintos pacientes. Por otro lado, las mutaciones de resistencia se determinaron a partir del plasma, analizándose la secuencia consenso de diversas cuasiespecies, y no a través de estudios de clonaje, por lo que no podemos afirmar si las mutaciones observadas coexistirían en el mismo o en distintos genomas. Los resultados obtenidos en el grupo de pacientes que fracasaban a IP y nunca habían tomado ITIAN y en pacientes que fracasaban a ITIAN y nunca habían recibido IP, no mostró diferencias en cuanto a la emergencia de variantes X4 Discusión 99 en función del tratamiento recibido. Sin embargo, el reducido número de pacientes analizados en este estudio, podría influir en los resultados obtenidos. En este sentido, algunos estudios previos han mostrado que el uso de HAART podría retrasar la selección de variantes X4-trópicas. En un estudio llevado a cabo en 32 pacientes, 24 de los cuales presentaron variantes R5-trópicas de forma exclusiva antes del inicio de la terapia antirretroviral, y 8 presentaron cepas dual-mixtas, no se observó cambio en el tropismo viral en pacientes que presentaban variantes R5-trópicas, y además en la mitad de los pacientes con variantes virales dual-mixtas, la población de variantes virales X4-trópicas llegó a ser indetectable (Skrabal et al. 2003). Sin embargo, hay que destacar que la supresión de las variantes virales X4, fue sólo transitoria y todos los pacientes mostraron una reversión a una población dual-mixta. Por otro lado, otro estudio llevado a cabo en 20 niños VIH+ que habían tomado terapia antirretroviral e iban a comenzar un régimen terapéutico basado en lopinavir/ritonavir, mostró respuesta virológica junto con un cambio en el uso del correceptor. Las variantes X4-trópicas fueron suprimidas de modo preferente, sugiriendo que el cambio en el uso del correceptor podría contribuir a la eficacia clínica de algunos fármacos anti-VIH (Galán et al. 2004). Sin embargo, existen resultados controvertidos respecto al impacto que TARGA pudiera tener en la emergencia de variantes X4-trópicas y por tanto en el cambio en el uso del correceptor de CCR5 a CXCR4. Diversos estudios sugieren que HAART podría facilitar las condiciones necesarias que permiten la Discusión 100 emergencia gradual de variantes virales X4-trópicas a lo largo de la infección. En un estudio transversal llevado a cabo en 28 pacientes infectados con VIH-1 subtipo C, la emergencia de variantes X4-trópicas se asoció con el uso del tratamiento antirretroviral (Johnston et al. 2003). Por otro lado, un estudio longitudinal llevado a cabo en 32 pacientes, los cuales presentaban viremia plasmática suprimida durante más de 5 años con HAART, el cambio en el uso de CCR5 a CXCR4 se observó en 11 de 23 pacientes, mientras que las variantes X4-trópicas permanecieron predominantes en 9 de los pacientes con virus X4 en el momento basal (Delobel et al. 2005). Los pacientes con variantes X4-trópicas mostraron una menor ganancia de linfocitos T CD4+ a pesar de la completa supresión de la carga viral plasmática (Delobel et al. 2005). La incidencia de cambio en el tropismo viral observada en esta tesis, tanto en pacientes naïve como pacientes que iniciaron tratamiento, fue relativamente baja y similar a lo largo del tiempo en ambos grupos (22,6% vs 28,6%, respectivamente), así como el número de oscilaciones en el cambio de tropismo observadas. Diversos estudios confirman estos resultados. En un estudio longitudinal realizado en 38 pacientes VIH que recibían TARGA y fracasaban al tratamiento, se observó que solamente un 13% de los pacientes, experimentó cambio en el uso del correceptor durante los 20 meses de media de seguimiento. Al igual que en nuestro estudio, se observó un cambio en el uso del correceptor en ambas direcciones, R5-X4-R5 y X4-R5-X4, en particular en dos pacientes (Lehmann et al. 2006). De modo similar, en otro estudio, tras Discusión 101 evaluar el cambio en el uso del correceptor en 73 pacientes pretratados que se encontraban en fracaso virológico, se observó que un 12% de los pacientes que presentaban un tropismo R5 en el momento basal, sufrieron un cambio a tropismo DM en un año, mientras que en uno de los pacientes, se observó un tropismo oscilante, R5-X4-R5, tras el mismo periodo de tiempo. Un 11% de los pacientes que inicialmente tenían tropismo DM en el momento basal, sufrieron un cambio en el uso del correceptor a CCR5 tras el mismo periodo (Hunt et al. 2007). Hay que destacar que el estudio realizado para esta tesis es el primero que compara pacientes pretratados en fracaso virológico con sujetos naïve. Por otro lado, el periodo de seguimiento fue de 6 años, mayor que en el resto de estudios longitudinales analizados. Numerosos estudios han asociado, tanto en individuos naïve como en pacientes pretratados, la emergencia de variantes X4-trópicas con una rápida caída de los linfocitos T CD4+, y con una progresión más rápida a SIDA (Schuitemaker et al. 1992, Brumme et al. 2005, Daar et al. 2007, Moyle et al. 2005, Koot et al. 1993). La selección de variantes X4 en pacientes que iniciaron tratamiento y que presentaron repetidos fracasos virológicos, se asoció con un bajo número de linfocitos T CD4 en el momento basal así como con un bajo nadir de CD4, en pacientes pretratados, lo que concuerda con el concepto de que la selección de variantes X4 emerge como consecuencia del deterioro inmune profundo (Koot et al. 1993, Schuitemaker et al. 1992). Sin embargo, aunque el cambio de tropismo de R5 a X4 no se asoció con elevadas cargas Discusión 102 virales en el momento basal, sí se observó una correlación entre la presencia de variantes X4 con valores de cargas virales elevadas cuando se evaluó de manera transversal la asociación de variantes X4 con la carga viral, en pacientes que fracasaban a TARGA. Estos resultados concuerdan con un estudio llevado a cabo en pacientes pretratados en los cuales CXCR4 fue el correceptor más usado por aislados primarios derivados de pacientes virémicos con un número de linfocitos T CD4+ constante o con tendencia a aumentar bajo la presencia de TARGA (Holtkamp et al. 2000). Cuando se compararon pacientes naïve que experimentaron cambio de tropismo y pacientes que no lo experimentaron, nuestros resultados no mostraron diferencias en el número de linfocitos T CD4+, así como en el nadir de CD4. La falta de asociación observada entre la presencia de variantes X4 y un bajo número de CD4 en el momento basal y a lo largo del estudio en pacientes naïve, probablemente se deba a que los pacientes naïve seleccionados en nuestro estudio, mantuvieron un sistema inmunológico relativamente poco deteriorado a lo largo del seguimiento. En este sentido, un estudio reciente en el que se evaluaron 402 individuos naïve durante 12 meses, mostró que los pacientes con cepas X4 o DM en el momento basal, presentaban un nivel de CD4 más bajo que los pacientes que tenían cepas virales R5-trópicas (Waters et al. 2008). Estos datos apoyan la hipótesis de que las variantes X4, emergen como consecuencia del daño inmune progresivo, en vez de ser responsables de de una mayor caída de CD4. Por otro lado, los Discusión 103 datos obtenidos en esta tesis en pacientes naïve, cuando se realizó un análisis transversal en el tiempo, también apoyan esta hipótesis, ya que muestra una tendencia hacia una disminución de linfocitos T CD4+ en pacientes portadores de variantes X4-trópicas, comparada con aquellos pacientes con virus R5- trópicos (334 vs 522 células/µL, respectivamente). En un estudio llevado a cabo en 979 individuos naïve a tratamiento, se observó que pacientes que tenían variantes virales R5/X4 trópicas, presentaban un número de linfocitos T CD4 significativamente menor que individuos portadores de variantes R5-trópicas (p<0,0001) (Brumme et al. 2005), lo que concuerda con nuestros datos. Una de las limitaciones de nuestro estudio fue, que el tropismo viral se estimó usando una herramienta bioinformática, el predictor PSSM. Aunque se ha demostrado que existe una elevada concordancia entre ensayos fenotípicos y genotípicos (Poveda et al. 2007, Skrabal et al. 2007), en particular con PSSM (Labernardiere et al. 2004), hasta la fecha los métodos fenotípicos deberían ser considerados como la técnica de referencia. Sin embargo, nuestros resultados son similares a los obtenidos por Lehmann et al. que utilizó el predictor geno2pheno y Hunt et al., que utilizó el ensayo fenotípico Trofile para la determinación del tropismo viral, por lo que aunque el uso de herramientas bioinformáticas podría considerarse una limitación, hay que destacar la similitud en la incidencia de cambio de tropismo observada a lo largo del tiempo en los distintos estudios (Lehmann et al. 2006, Hunt et al. 2007). Discusión 104 La expresión de los correceptores en la superficie de los linfocitos T, podría influir en el tropismo viral y por tanto en la patogénesis viral y en la progresión de la enfermedad (Connor et al. 1997, Paxton et al. 1998). La aprobación de maraviroc, el nuevo antagonista de CCR5, para uso clínico, hace necesario estudiar el impacto que TARGA podría tener sobre el nivel de expresión de la molécula CCR5 en linfocitos T. Diferencias en la expresión del correceptor, podrían influir en a la actividad antiviral de estos compuestos debido a su mecanismo de acción (Lin et al. 2007). Estudios previos han mostrado que el nivel de expresión del correceptor CCR5 en linfocitos T CD4+ y T CD8+, está regulado al alza en pacientes con infección crónica por VIH, comparado con individuos seronegativos (Ostrowski et al. 1998, Giovannnetti et al. 1999, Nicholson et al. 2001). En otras enfermedades tales como hepatitis C (Ostrowski et al. 1998), mononucleosis infecciosa, tuberculosis (Wolday et al. 2005) y esclerosis múltiple, también se ha observado una regulación al alza de la molécula de CCR5 en linfocitos T CD4+, sugiriendo que esas alteraciones pueden representar una característica común de enfermedades inflamatorias ya sean de origen infeccioso o autoinmune. La particularidad de la infección VIH en relación con CCR5, reside en que esta molécula es precisamente uno de los receptores utilizados por el virus para entrar en la célula diana y por tanto la regulación al alza de su expresión podría ser empleada por el virus en su beneficio, haciendo más susceptible a las células diana. Discusión 105 La expresión del correceptor CCR5 normalmente se analiza como el porcentaje de células T CD4+ o CD8+ que muestra la molécula CCR5 en su superficie. Sin embargo, en la infección VIH in vivo, este parámetro parece ser menos determinante que la densidad de CCR5 (número de moléculas de CCR5/célula en la población celular CCR5+), debido a que se ha observado que la frecuencia varía a lo largo del tiempo en las células T CD4+ (de Roda Husman et al. 1999) de un individuo. Nuestros resultados muestran una regulación al alza en el nivel de expresión de CCR5 en la subpoblación memoria de linfocitos T CD8+ en pacientes VIH-1 positivos comparada con individuos sanos, siendo similar a controles sanos en el resto de subpoblaciones de células T CD8+ y CD4+. A diferencia del nivel de expresión de CCR5, la densidad de expresión mostró una regulación al alza en linfocitos T CD4+ totales y en las subpoblaciones, naïve y memoria de pacientes VIH positivos, comparada con individuos sanos, lo que concuerda con las observaciones de otros investigadores (Smith et al. 2002). La elevada activación inmune observada en pacientes VIH positivos en comparación con individuos sanos tanto en células T CD4+ como en T CD8+ concuerda con estudios previos (Smith et al. 2002, Giovanetti et al. 1999). La expresión de CD38 en células T CD8+ se relacionó directamente con la carga viral, mientras que la expresión de CD38 en linfocitos T CD4+ se correlacionó Discusión 106 inversamente con el contaje de CD4, como se ha observado previamente (Nicholson et al. 2001). Aunque algunos estudios han mostrado una asociación entre el nivel de activación en linfocitos T CD4+ y T CD8+ y el nivel de expresión de CCR5 en ausencia de TARGA (Ostrowski et al. 1998, Smith et al. 2002, Nicholson et al. 2001), sin embargo nuestro estudio no confirma esa observación. Las diferentes metodologías usadas para detectar y medir la activación inmune (Ostrowski et al. 1998, Smith et al. 2002), podrían explicar las diferencias observadas entre esos estudios y nuestros resultados. Existe controversia respecto a la evolución del nivel de expresión de CCR5 en linfocitos T, tras administrar TARGA. Algunos autores han observado una disminución en el nivel y/o densidad de expresión de CCR5 en células T CD4+ y T CD8+ en pacientes que no fracasaban a TARGA, en periodos de seguimiento de 12 a 28 semanas (Smith et al. 2002, Giovannetti et al. 1999, Zhang et al. 2006). Sin embargo, hay que destacar que algunos de los pacientes en los que se observó esa disminución en el nivel de expresión de CCR5, mostraron un rebrote tras 6 meses de tratamiento (Giovanneti et al. 1999). Por otro lado, otros autores no han observado una disminución en la densidad de CCR5 en pacientes VIH tras el inicio de TARGA, (Reyness et al. 2001), estableciendo que la densidad de expresión de CCR5 en linfocitos T CD4+ es constante a lo largo del tiempo en cada individuo, incluso en pacientes en tratamiento que presentan un aumento de linfocitos T CD4+. Los resultados obtenidos en esta tesis, muestran que tras 2 años de éxito Discusión 107 terapéutico, la densidad de CCR5 en células T CD4+ no varió, sino que continuó significativamente aumentada en pacientes VIH positivos comparada con individuos sanos. Por tanto, una distinta evolución en la expresión de CCR5 dependiente del tiempo de seguimiento tras el inicio de la terapia antirretroviral, podría explicar estas diferencias. En contraste con la evolución de CCR5, la expresión del marcador de activación CD38, tendió a disminuir en pacientes en tratamiento antirretroviral con viremia suprimida, lo que concuerda con estudios previos realizados tanto en linfocitos T CD8+ (Kaufmann et al. 1999, Bouscarat et al. 1998) como en T CD4+ (Benito et al. 2005, Zhang et al. 2006). Por tanto, observamos una distinta evolución en la activación inmunológica y en la expresión de CCR5, en pacientes en tratamiento con viremia suprimida, lo cual es concordante con la falta de asociación observada entre ambos parámetros en el momento basal. Nuestros resultados sugieren que la supresión de la replicación viral debido al efecto de TARGA durante al menos dos años, no influye significativamente en la expresión de CCR5 en linfocitos T CD4+ y CD8+. Por tanto, la actividad de los antagonistas de CCR5 no debería diferir en un individuo VIH positivo antes y después del control de la replicación viral con TARGA. CONCLUSIONES Conclusiones 109 1. Las herramientas genotípicas para la determinación del uso de los correceptores CCR5 o CXCR4 por el VIH, presentan una buena concordancia con los resultados fenotípicos en muestras de pacientes VIH+, infectados por subtipos B. La herramienta bioinformática PSSMX4- R5 presentó los mejores resultados de concordancia (86%), con una buena sensibilidad para la detección de variantes X4-trópicas. 2. La prevalencia de variantes X4-trópicas en pacientes VIH+, parece estar directamente relacionada con el estadio de la infección, siendo de hasta un 35% en los pacientes que reciben tratamiento antirretroviral, del 15% en los pacientes naïve con infección crónica, y de sólo un 9% en seroconvertores recientes. 3. La tasa de cambio del tropismo viral de CCR5 a CXCR4 y viceversa, es relativamente baja en pacientes en tratamiento antirretroviral. También lo es en pacientes naïve seguidos durante varios años. 4. La emergencia de variantes X4-trópicas parece ser independiente de la exposición a TARGA. Los principales determinantes de la selección de variantes X4-trópicas parecen ser un bajo nivel de linfocitos T CD4+ antes de iniciar TARGA y un bajo nadir de linfocitos T CD4+. En pacientes bajo tratamiento antirretroviral con fracaso virológico, la emergencia de variantes X4-trópicas podría ser la consecuencia más Conclusiones 110 que la causa del progresivo deterioro inmunológico provocado por el VIH. 5. La supresión de la replicación viral por el TARGA no influye significativamente en la expresión de CCR5 en linfocitos T CD4+ y T CD8+. Por tanto, la actividad de los antagonistas de CCR5, no debería diferir en individuos VIH+ antes y después del control de la replicación viral con otros antirretrovirales. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 112 Alkhatib G, Combadiere C, Broder C, et al. CC CKR5: a Rantes, MIP-1α, MIP- 1β receptor as a fusion cofactor for macrophage-tropic HIV-1. Science 1996, 272:1995-1958. Andeweng A, Leeflang P, Osterhaus A, et al. Both the V2 and V3 regions of the HIV-1 surface glycoprotein functionally interact with other envelope regions in syncytium formation. J Virol 1993, 67:3232-3239. Anonymous. FDA approves maraviroc tablets. AIDS patient care and STDs 2007, 21:702. Asjö B, Morfeldt-Mänson L, Albert J, et al. Replicative capacity of human immunodeficiency virus from patients with varying severity of HIV infection. Lancet 1986, 2:660-662 Barre-Sinoussi F, Chermann J, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983, 220:868-871. Benito J, López M, Lozano S, et al. Differential upregulation of CD38 on different T-cell subsets may influence the ability to reconstitute CD4+ T cells under successful highly active antiretroviral therapy. J Acquir Immune Defic Syndr 2005, 38:373-381. Berger E. HIV entry and tropism: the chemokine receptor connection. AIDS 1997, 11(Suppl A):S3-S16. Berger E, Doms R, Fenyö E, et al. A new classification of HIV-1. Nature 1998, 391:240. Bibliografía 113 Biti R, Ffrench R, Young J, et al. HIV-1 infection in an individual homozygous for the CCR5 deletion allele. Nat Med 1997, 3:252-253. Björndal A, Deng H, Jasson M, et al. Co-receptor usage of primary human immunodeficiency virus type 1 isolates varies according to biological phenotype. J Virol 1997, 71:7478-7487. Bleul C, Farzan M, Choe H, et al. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature 382:829-832. Bomsel M and David V. Mucosal gatekeepers: selecting HIV viruses for early infection. Nat Med 2002, 8:114-116. Bouscarat F, Levacher M, Landman R, et al. Changes in blood CD8+ T lymphocyte activation status and plasma HIV-RNA levels during antiretroviral therapy. AIDS 1998, 12:1267-1273. Bozzette S, McCutchan J, Spector S, et al. A cross-sectional comparison of persons with syncytium- and non-syncytium-inducing human immunodeficiency virus. J Infect Dis 1993, 168:1374-1379. Boyd M, Simpson G, Cann A, et al. A single amino acid substitution in the V1 loop of HIV-1 gp120 alters cellular tropism. J Virol 1993, 67:3649-3652. Brumme Z, Goodrich J, Mayer H, et al. Molecular and clinical epidemiology of CXCR4-using HIV-1 in a large population of antiretroviral-naive individuals. J Infect Dis 2005, 192:466-474. Chesebro B, Wehrly K, Nishio J, et al. Mapping of independent V3 envelope determinants of human immunodeficiency virus type 1 macrophage Bibliografía 114 tropism and syncytium formation in lymphocytes. J Virol 1996, 70:9055- 9059. Connor R, Mohri H, Cao Y, et al. Increased viral burden and cytopathicity correlate temporally with CD4+ T-lymphocyte decline and clinical progression in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals. J Virol 1993, 67:1772-1777. Connor R, Sheridan K, Ceradini D, et al. Change in correceptor use correlates with disease progression in HIV-1 infected individuals. J Exp Med 1997, 185:621-628. Brenchley J, Schacker R, Ruff L, et al. CD4+ T cell depletion during all stages of HIV disease occurs predominantly in the gastrointestinal tract. J Exp Med 2004, 200:749-759. Brumme Z, Goodrich J, Mayer H, et al. Molecular and clinical epidemiology of CXCR4-using HIV-1 in a large population of antiretroviral-naive individuals. J Infect Dis 2005, 192: 466-474. Cammack N. The potencial for HIV fusion inhibition. Curr Opin Infect Dis 2001, 14:13-16. Castonguay L, Wengg Y, Adolfsen W, et al. Binding of 2-aryl-4(piperidin-1yl) butanmines and 1,3,4-trisubstitued pyrrolidines to human CCR5: a molecular modelling-guide mutagenesis study of the binding pocket. Biochemistry 2003, 42:1544-1550. Chazen G, Pereira G, Le Gros G, et al. IL-7 is a T cell growth factor. Proc Natl Acad Sci 1989, 86:5923-7. Bibliografía 115 Cheng-Mayer C, Seto D, Tateno M, et al. Biologic features of HIV-1 that correlate with virulence in the host. Science 1988, 240:80-82. Coakley E, Petroupoulos C and Whitcomb J. Assessing chemokine co- receptor usage in HIV. Curr Opin Infect Dis 2005, 18:9-15. Cocchi F, DeVico A, Garzino-Demo A, et al. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells. Science 1995, 270:1811-1815. Collman R, Hassan N, Walter R, et al. Infection of monocyte-derived macrophages with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). J Exp Med 1989, 170:1149-1163. Comier E and Dragic T. The crown and stem of the V3 loop play distinct roles in HIV type 1 envelope glycoprotein interactions with the CCR5 coreceptor. J Virol 2002, 76: 8953-8957. Connor RI, Sheridan KE, Ceradini D, et al. Change in correceptor use correlates with disease progression in HIV-1-infected individuals. J Exp Med 1997, 185:621-628. Daar E, Kesler K, Petropoulos C, et al. Baseline HIV-1 coreceptor tropism predicts disease progression. Clin Infect Dis 2007, 45:643-649. Dalgleish A, Beverley P, Clapham P, et al. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus. Nature 1984, 312:763-767. Bibliografía 116 Darcissac E, Vidal V, De La Tribonniere X, et al. Variations in serum IL-7 and 90K/Mac-2 binding protein (Mac-2 BP) levels analyzed in cohorts of HIV-1 patients and correlated with clinical changes following antiretroviral therapy. Clin Exp Immunol 2001, 126:287-294. D’Aquila R, Sutton L, Savara A, et al. CCR5/∆CCR5 heterozygosity: a selective pressure for the syncytium-inducing human immunodeficiency virus type 1 phenotype. J Infec Dis 1998, 177:1549-53. De Mendoza M, Rodríguez C, García F, et al. Prevalence of X4 tropic viruses in patients recently infected with HIV-1 and lack of association with transmission of drug resistance. J Antimicrob Chemother 2007, 59:698-704. De Mendoza C, Van Baelen K, Poveda E, et al. Performance of a population- based HIV-1 tropism phenotipic asssay and correlation with V3 genotypic prediction tools in recent HIV-1 seroconverters. AIDS 2008, (en prensa). De Jong J, De Ronde A, Keulen W, et al. Minimal requirements for the human immunodeficiency virus type 1 V3 domain to support the syncytium-inducing phenotype: analysis by single amino acid substitution. J Virol 1992, 66: 6777-80. de Roda Husman A, Blaak H, Brouwer M, et al. CC chemokine receptor cell- surface expression in relation to CC chemokine receptor 5 genotype and the clinical course of HIV-1 infection. J Immunol 1999, 163:4597-603. de Roda Husman A, Koot M, Cornelissen M, et al. Association between CCR5 genotype and the clinical course of HIV-1 infection. Ann Intern Med 1997, 127:882-890. Dean M, Carrington M, Winkler C, et al. Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. Bibliografía 117 Hemophilia Growth and Development Study, Multicenter AIDS Cohort Study, Multicenter Hemophilia Cohort Sudy, San Francisco City Chohort, ALIVE Study. Science 1996, 273:1856. Deng H, Liu R, Ellmeier W, et al. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature 1996, 381:647-648. Delobel P, Sandres-Sauné K, Cazabat M, et al. R5 to X4 switch of the predominant HIV-1 population in cellular reservoirs during effective highly active antiretroviral therapy. J Acquir Immune Defic Syndr 2005, 38:382-392. Demarest J, Bonny T, Vavro C, et al. HIV-1 co-receptor tropism in treatment naive and experienced subjects. 44th Interscience Conference on Antmicrobial Agents and Chemotherapy. Octubre 2004 [Abstract H-1136]. Doms R and Peiper S. Unwelcomed guest with master keys: how HIV uses chemokine receptors for cellular entry. Virology 1997, 235:179-190. Emerman M and Malim M. HIV-1 regulatory/accessory genes: keys to unravelling viral and host cell biology. Science 1998, 280:1880-1884. Dorr P, Westby M, Dobbs S, et al. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-HIV type 1 activity. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:4721-4732. Douek D, Picker L and Koup R. T cell dynamics in HIV-1 infection. Annu Rev Immunol 2003, 21:265-304. Bibliografía 118 Evans L, McHugh T, Suites D, et al. Differential ability of human immunodeficiency virus isolates to productively infect human cells. J Immunol 1987, 138:3415-3418. Fear W, Kesson A, Naif H, et al. Differential tropism and chemokine receptor expression of human immunodeficiency virus type 1 in neonatal monocytes, monocyte-derived macrophages, and placental macrophages. J Virol 1998, 72:1334-1344. Feng Y, Broker CC, Kennedy PE, et al. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane G protein-coupled receptor. Science 1996, 272:872-877. Fenyö E, Morfeldt-Mäson L, Chiodi F, et al. Distinct replicative and cytopathic characteristics of human immunodeficiency virus isolates. J Virol 1988, 62:4414-4419. Fry T, Connick E, Falloon J, et al. A potential role for interleukin 7 in T-cell homeostasis. Blood 2001, 97:2983-90. Galán I, Jimenez J, González-Rivera M, et al. Virological phenotype switches under salvage therapy with lopinavir-ritonavir in heavily pretreated HIV-1 vertically infected children. AIDS 2004, 18:247-255. Gallo R, Sliski A and Wong-Staal F. Origin of human T-cell leukaemia- lymphoma virus. Lancet 1983, 2:962-963. Garrido C, Roulet V, Chueca N, et al. Evaluation of eight different bioinformatics tools to predict viral tropism in different human immunodeficiency virus type 1 subtypes. J Clin Microb 2008, 46:887-891. Bibliografía 119 Giovannetti A, Ensoli F, Mazzetta F, et al. CCR5 and CXCR4 chemokine receptor expression and β-chemokine production during early T cell repopulation induced by highly active antiretroviral therapy. Clin Exp Immunol 1999, 118:87-94. Grabstein K, Namen A, Shanebeck K, et al. Regulation of T cell proliferation by IL-7. J Immunol 1990, 144:3015-20. Groenink M, Fouchier R, Broersen S, et al. Relation of phenotype evolution of HIV-1 to envelope V2 configuration. Science 1993, 260:1513-1516. Hallenberg S, Bosh V, Angliker H, et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature 1992, 360:358-361. Hardy D, Reynes J, Konourina I, et al. Efficacy and safety of maraviroc plus optimized background therapy in treatment-experienced patients infected with CCR5-tropic HIV-1: 48-week combined analysis of the MOTIVATE studies. 15th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Febrero 2008 [Abstract 792]. Harouse J, Gettie A, Tan R, et al. Distinct pathogenic sequela in rhesus macaques infected with CCR5 or CXCR4 utilizing SHIVs. Science 1999, 284:816-819. Hickman C, Crim J, Mostowski H, et al. Regulation of human cytotoxic T lymphocyte development by IL-7. J Immunol 1990, 145:2415-20. Hofmeister R, Khaled A, Benbernou N, et al. Interleukin-7 physiological roles and mechanisms of action. Cytok Growth Factor Rev 1999, 10:41-60. Bibliografía 120 Hoffman N, Seillier-Moiseiwitsh F, Ahn J, et al. Variability in the HIV-1 gp120 env protein linked to phenotype-associated changes in the V3 loop. J Virol 2002, 76:3852-3864. Holtkamp N, Otteken A, Findhammer S, et al. Unexpected coreceptor usage of primary human immunodeficiency virus type 1 isolates from viremic patients under highly active antiretroviral therapy. J Infect Dis 2000, 181:513-521. Hosoya N, Su Z, Wilkin T, et al. Assessing HIV-1 tropism in ACTG 5211: a comparison of assays using replication-competent virus from peripheral blood mononuclear cells versus plasma-derived pseudotyped virions. 2nd Workshop Targeting HIV Entry, Octubre 2006 [Abstract 33]. Hoxie J. Hypothetical assignment of intrachain disulfide bonds for HIV-2 and SIV envelope glycoproteins. AIDS Res Hum Retroviruses 1991, 7:495- 499. Hwang S, Boyle T, Lyerly H, et al. Identification of the envelope V3 loop as the primary determinant of cell tropism in HIV-1. Science 1991, 253:71-74. Huang Y, Paxton W, Wolinsky S, et al. The role of a mutant CCR5 allele in HIV-1 transmission and disease progression. Nat Med 1996, 2:1240-1243. Huang W, Wrin T, Uap J, et al. A rapid multifunctional HIV-1 entry assay for measuring drug susceptibility, coreceptor tropism, and antibody neutralization. 41st Interscience Conference on Antmicrobial Agents and Chemotherapy. Septiembre 2001 [Abstract 1968]. Bibliografía 121 Hunt P, Harrigan P, Huang W, et al. Prevalence of CXCR4 tropism among antiretroviral-treated HIV-1-infected patients with detectable viremia. J Infect Dis 2006, 194:926-930. Hunt P, Huang W, Coakley E, et al. Longitudinal evaluation of viral co- receptor tropism switches among HIV-infected patients with drug- resistant viremia. 14th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Febrero 2007 [Abstract 619]. Hussain LA and Lehner T. Comparative investigation of Langerhans´cells and potential receptors for HIV in oral, genitourinary and rectal epithelia. Immunology 1995, 85:475-484. Jensen M, Li F, van´t Wont A, et al. Improved co-receptor usage prediction and genotypic monitoring of R5 to X4 transition by motif analysis of HIV type 1 env V3 loop sequences. J Virol 2003, 77:13376-13388. Johnston E, Zijenah L, Mutetwa S, et al. High frequency of syncytium- inducing and CXCR4-tropic viruses among HIV type 1 subtype C-infected patients receiving antiretroviral treatment. J Virol 2003, 77:7682-7688. Jordan C, Watkins B, Kufta C, et al. Infection of brain microglial cells by human immunodeficiency virus type 1 is CD4 dependent. J Virol 1991, 65: 736-42. Jourdan P, Vendrell J, Huguet M, et al. Cytokines and cell surface molecules independently induce CXCR4 expression on CD4+ CCR7+ human memory T cells. J Immunol 2000, 165:716-24. Kaufmann G, Zaunders J, Cunningham P, et al. Phenotypic analysis of CD8+ T lymphocytes in a cohort of HIV type 1-infected patients treated with Bibliografía 122 saquinavir, ritonavir, and tow nucleoside analogs for 1 year, and association with plasma HIV type 1 RNA. AIDS Res Hum Retroviruses 1999, 15:963-972. Kawamura T, Kurtz S, Blauvelt A, et al. The role of Langerhans cells in the sexual transmission of HIV. J Dermatol Sci 2005, 40:147-155. Klatzmann D, Champagne E, Chamaret S, et al. T-lymphocyte T4 molecule behaves as the receptor for human retrovirus LAV. Nature 1984, 312:767- 768. Koot M, Keet I, Vos A, et al. Prognostic value of HIV-1 syncytium-inducing phenotype for rate for CD4+ cell depletion and progression to AIDS. Ann Intern Med 1993, 118:681-688. Koot M, Vos A, Keet R, et al. HIV-1 biological phenotype in long term infected individuals, evaluated with an MT-2 cocultivation assay. AIDS 1992, 6:49-54. Kuhmann S and Moore J. The HIV-1 phenotypic variants: deadly and deadlier. J Viral Entry 2005, 1:4-16. Labernardiere J, Lebel-Binay S, Faudon J, et al. Tropism determination and performance of Phenoscript HIV-1 entry inhibitors assay. Antivir Ther 2004, 9:S141. Lalezari J, DeJesus E, Lampiris H, et al. Efficacy and safety of maraviroc plus optimized background therapy in viremic ART-experienced patients infected with CCR5-tropic HIV-1: 24-week results of a Phase 2b/3 study in the US and Canada. 14th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Febrero 2007 [Abstract 104bB]. Bibliografía 123 Lehmann C, Däumer M, Boussaad I, et al. Stable coreceptor usage in patients with ongoing treatment failure on HAART. J Clin Virol 2006, 37:300-304. Leonard C, Spellman M, Riddle L, et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant HIV envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem 1990, 265:10373-10382. Levy J. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection. Microbiol Rev 1993, 57:183-189. Li Q, Duan L, Estes J, et al. Peak SIV replication in resting memory CD4+ T cells depletes gut lamina propria CD4+ T cells. Nature 2005, 434:1148-1152 Lin Y, Mettling C, Portales P, et al. The chemokine CCL5 regulates the in vivo cell surface expression of its receptor, CCR5. AIDS 2007, 22:430-2. Lin Y, Portales P, Segondy M, et al. CXCR4 overexpression during the course of HIV-1 infection correlates with the emergence of X4 strains. J Acquir Immune Defic Syndr 2005, 39:530-536. Liu S, Mittler J, Nickle D, et al. Selection for human immunodeficiency virus type 1 recombinants in a patient with rapid progression to AIDS. J Virol 2002, 76:10674-10684. Liu R, Paxton W, Choe S, et al. Homozogous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals to HIV-1 infection. Cell 1996, 86:367-377. Bibliografía 124 Llano A, Barretina J, Gutiérrez A, et al. Interleukin-7 in plasma correlates with CD4 T cell depletion and may be associated with emergence of syncytium-inducing variants in HIV type 1-positive individuals. J Virol 2001, 75:10319-10325. Louder M and Mascola J. Determination of syncytium-inducing phenotype of primary HIV-1 isolates using MT-2 cells. HIV Protocols. Editado por Nelson M, Kim JH. New Cork Human Press. 199. pp: 23-27. Low A, Winnie D, Chan D, et al. Current V3 genotyping algorithms are inadequate for predicting X4-coreceptor usage in clinical isolates. AIDS 2007, 21:F17-F24. Lu M, Blacklow S and Kim P. A trimeric structural domain of the HIV-1 transmembrane glycoprotein. Nature Struct Biol 1995, 2:1075-1082. Maddon PJ, Littman DR, Godfrey M, et al. The isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the T cell surface protein T4: a new member of the immunoglobulin gene family. Cell 1985, 42: 93-104. Margolis M and Shattock R. Selective transmission of CCR5-utilizing HIV-1: the “gatekeeper” problem resolved? Nat Rev Microbiol 2006, 4:312-327. Mastroianni C, Forcina G, d´Etorre G, et al. Circulating levels of interleukin-7 in antiretroviral-naive and highly active antiretroviral therapy-treated HIV- infected patients. HIV Clin Trials 2001, 2:108-112. Mattapallil J, Douek D, Hill B, et al. Massive infection and loss of memory CD4+ T cells in multiple tissues during acute SIV infection. Nature 2005, 434:1093-1097. Bibliografía 125 Mayer H, van der Ryst E, Saag M, et al. Safety and efficacy of Maraviroc, a novel CCR5 antagonist, when used in combination with optimized background therapy for the treatment of antiretroviral-experienced subjects with dual/mixed-tropic HIV-1: 24-week results of a phase 2b exploratory trial. 16th International AIDS Conference. Julio 2006 [Abstract THLB0215]. Mehandru S, Poles M, Tenner-Racz K, et al. Primary HIv-1 infection is associated with preferential depletion of CD4+ T lymphocytes from effector sites in the gastrointestinal tract. J Exp Med 2004, 200:761-770. Melby T, Despirito M, Demasi R, et al. HIV-1 co-receptor tropism in triple- class-experienced patients: baseline correlates and relationship to Enfuvirtide response. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Febrero 2006 [Abstract 233]. Mellikan G, Markosyan R, Hemmati H, et al. Evidence that the transition of HIV-1 gp41 into a six-helix bundle, not the bundle configuration, induces membrane fusion. J Cell Biol 2000, 151:413-423. Michael N, Nelson J, Kewalramani V, et al. Exclusive and persistent use of the entry coreceptor CXCR4 by human immunodeficiency virus type 1 from a subject homozygous for CCR5 delta32. J Virol 1998, 72:6040-6047. Miedema F, Tersmette M and van Lier R. AIDS pathogenesis: a dynamic interaction between HIV and the immune system. Immunol Today 1990, 11:293-297. Moore J, Kitchen S, Pugach P, et al. The CCR5 and CXCR4 coreceptors – central to understanding the transmission and pathogenesis of human Bibliografía 126 immunodeficiency virus type 1 infection. AIDS Res Hum Retroviruses 2004, 20:111-126. Moore J, Trkola A and Dragic T. Co-receptors for HIV-1 entry. Curr Opin Immunol 1997, 9:551-562. Mosier D, Picchio G, Gulizia R, et al. Highly potent RANTES analogues either prevent CCR5-using human immunodeficiency virus type 1 infection in vivo or rapidly select for CXCR4-using variants. J Virol 1999, 73:3544-3550. Moyle G, Wildfire A, Mandalia S, et al. Epidemiology and predictive factors for chemokine receptor use in HIV-1 infection. J Infect Dis 2005, 191:866- 872. Myszka D, Sweet R, Hensley P, et al. Energetics of the HIV gp120-CD4 binding reaction. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97:9026-9031. Napolitano L, Grant R, Deeks S, et al. Increased production of IL-7 accompanies HIV-1-mediated T-cell depletion: Implications for T-cell homeostasis. Nat Med 2001, 7:73-79. Nelson M, Konourina I, Lazzarin A, et al. Efficacy and safety of maraviroc plus optimized background therapy in viremia, ART-experienced patients infected with CCR5-tropic HIV-1 in Europe, Australia and North America: 24-Week results. 14th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Febrero 2007 [Abstract 104aLB]. Bibliografía 127 Nicastri E, Sarmati L, d´Etorre G, et al. Replication capacity, biological phenotype, and drug resistance of HIV strains isolated from patients failing antiretroviral therapy. J Med Virol 2003, 69:1-6. O´Brien TR, Winkler C, Dean M, et al. HIV-1 infection in a man homozygous for CCR5-delta-32. Lancet 1997, 349:1219. Nicholson J, Browning S, Hengel R, et al. CCR5 and CXCR4 expression on memory and naïve T cells in HIV-14 infection and response to highly active antiretroviral therapy. J Acquir Immune Defic Syndr 2001, 27:105-5. Ostrowski M, Justement S, Catanzaro A, et al. Expression of chemokine receptors CXCR4 and CCR5 in HIV-1-infected and uninfected individuals. J Immunol 1998, 161:3195-201. Palella F, Delaney K, Moorman A, et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced HIV infection. N Engl J Med 1998, 338:853- 860. Pastore C, Ramos A and Mosier D. Intrinsic obstacles to human immunodeficiency virus type 1 coreceptor switching. J Virol 2004, 78:7565- 7574. Paxton W, Kang S and Koup R. The HIV type 1 coreceptor CCR5 and its role in viral transmission and disese progression. AIDS Res Hum Retroviruses 1998, 14(Suppl1):S89-S92. Philpott S, Ledergerber B, Klimkait T, et al. CXCR4-specific viral load predicts clinical HIV-1 disease progression during HAART. 16th Internacional AIDS Conference. Agosto 2006 [Abstract ThAa0201]. Bibliografía 128 Pillai S, Good B, Richman D, et al. A new perspective on V3 phenotype prediction. AIDS Res Hum Retroviruses 2003, 19:145-149. Plum J, De Smedt M, Leclercq G, et al. Interleukin 7 is a critical growth factor in early human T-cell development. Blood 1996, 88:4239-45. Pope M and Haase A. Transmission, acute HIV-1 infection and the quest for strategies to prevent infection. Nat Med 2003, 9:847-852. Poveda E, Rodés B, Toro C, et al. Evolution of the gp41 env region in HIV- infected patients receiving T-20, a fusion inhibitor. AIDS 2002, 16:1959- 1961. Princen K, Hatse S, Vermeire K, et al. Establishment of a novel CCR5 and CXCR4 expressing CD4+ cell line which is highly sensitive to HIV and suitable for high-throughput evaluation of CCR5 and CXCR4 antagonists. Retrovirology 2004, 1:2-9. Reeves J, Han D, Hunt P, et al. Enhancements to the Trofile HIV co-receptor tropism assay enable improved detection of CXCR4-using subpopulations and earlier detection of CXCR4-using viruses in sequential patient samples. 3er Workshop Targeting HIV Entry. Diciembre 2007 [Abstract 11]. Reinherz E, Kung P, Goldstein G, et al. Separation of functional subsets of human T cells by a monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci USA 1979, 76:4061-4065. Resch W, Hoffman N and Swanstrom R. Improved success of phenotype prediction of the human immunodeficiency virus type 1 from envelope variable loop 3 sequence using neural networks. Virology 2001, 288:51-62. Bibliografía 129 Reynes J, Portales P, Segondy M, et al. CD4+ T cell surface CCR5 density as a determining factor of virus load in persons infected with HIV type 1. J Infect Dis 2000, 181:927-32. Reynes J, Portales P, Segondy M, et al. CD4 T cell surface CCR5 density as a host factor in HIV-1 disease progression. AIDS 2001, 15:1627-34. Richman D and Bozzette S. The impact of the syncytium-inducing phenotype of human immunodeficincy virus on disease progression. J Inf Dis 1994, 169:968-974. Roos M, Lange J, de Goede R, et al. Viral phenotype and immune response in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Infect Dis 1992, 165:427-432. Samson M, Libert F, Doranz B, et al. Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature 1996, 385:722-725. Schellenkes P, Roos M, De Wolf F, et al. Low T-cell responsiveness to activation via CD3/TCR is a prognostic marker for acquired- immunodeficiency-syndrome (AIDS) in human immunodeficiency virus-1 (HIV-1-infected men. J Clin Immunol 1990, 10:121-127. Saag M, Ive P, Heera J, et al. A multicenter, randomized, double-bind, comparative trial of a novel CCR5 antagonist, maraviroc vs. efavirenz, both in combination with combivir (zidovudine/lamivudine), for the treatment of antiretroviral naïve patients infected with R5 HIV-1: week 48 results of the MERIT study. 4th IAS Conference on HIV pathogenesis, treatment and prevention. Julio 2007 [Abstract WESS104]. Bibliografía 130 Sakaida H, Hori T, Yonezawa A, et al. T-tropic HIV-1-derived V3 loop peptides directly bind to CXCR4 and inhibit T-tropic HIV-1 infection. J Virol 1998, 72:9763-9770. Sattentau Q and Weiss R. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell 1988, 52:631-633. Schuitemaker H, Koot M, Kootstra N, et al. Monocytotropic HIV-1 variants detectable in all stages of HIV-1 infection lack T-cell line tropism and syncytium-inducing ability in primary T-cell culture. J Virol 1991, 65:356- 363. Schuitemaker H, Koot M, Kootstra N, et al. Biological phenotype of HIV type 1 clones at different stages of infection: progression of disease is associated with a shift from monocytotropic to T-cell-tropic virus populations. J Virol 1992, 66:1354-1360. Seelamgari A, Maddukuri A, Berro R, et al. Role of viral regulatory and accessory proteins in HIV-1 replication. Front Biosci 2004, 9:2388-2413. Shaheen F and Collman R. Co-receptor antagonists as HIV-1 entry inhibitors. Curr Opin Infect Dis 2004, 17:7-16. Sheppard H, Celum C, Michael N, et al. HIV-1 infection in individuals with the CCR5-Delta32/Delta32 genotype. J Acquir Immune Defic Syndr 2002, 29:307-313. Sing T, Beerenwinkel N and Lengauer T. Learning mixtures of localized rules by maximizing the area under the ROC curve. 1st workshop on ROC (receiver operator characteristic) analysis. 16th European Conference on Artificial Intelligence. Agosto 2004. Bibliografía 131 Sing T, Harrigan R, Beerenwinkel N, et al. Immunologic markers improve genotypic prediction of HIV-1 coreceptor usage. 1st Workshop Targeting HIV Entry, Diciembre 2005 [Abstract 30]. Skrabal K, Trouplin V, Labrosse B, et al. Impact of antiretroviral treatment on the tropism of HIV-1 plasma virus populations. AIDS 2003, 17:809-814. Skrabal K, Low A, Dong W, et al. Determining human immunodeficiency virus correceptor use in a clinical setting: degree of correlation between two phenotypic assays and a bioinformatics model. J Clin Microb 2007, 45:279-284. Smith K, Kumar S, Pulvirenti J, et al. CCR5 and CXCR4 expression after highly active antiretroviral therapy (HAART). J Acquir Immune Defic Syndr 2002, 30:458-60. Spijkerman IJ, Koot M, Prins M, et al. Lower prevalence and incidence of HIV-1 syncytium-inducing phenotype among infecting drug users compared with homosexual men. AIDS 1995, 9:1085-1092. Tan J, Dudl E, Le Roy E, et al. IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival of naïve T cells. Proc Natl Acad Sci 2001, 98:8732-7. Tersmette M and Miedema F. Interaction between HIV and the host immune system in the pathogenesis of AIDS. AIDS 1990, 4:S57-S66. Tersmette M, de Goede R, AI B, et al. Differential syncytium-inducing capacity of human immunodeficiency virus isolates: frequent detection of syncytium-inducing isolates in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and AIDS-related complex. J Virol 1988, 62:2026-2032. Bibliografía 132 Theodorou I, Meyer L, Magierowska, M, et al. HIV-1 infection in an individual homozygous for CCR5 delta 32. Seroco Study Group. Lancet 1997, 349: 1219-1220. van Rij R, Hazenberg M, van Benthem B, et al. Early viral load and CD4+ T cell count, but not percentage of CCR5+ or CXCR4+ CD4+ T cells, are associated with R5-toX4 HIV type 1 virus evolution. AIDS Res Hum Retroviruses 2003, 19:389-398. van Rij R, Portegies P, Hallaba T, et al. Reduced prevalence of the CCR5 delta32 heterozygous genotype in human immunodeficiency virus- infected individuals with AIDS dementia complex. J infect Dis 1999, 182:854-857. van´t Wout A, Kootstra N, Mulder-Kampinga G, et al. Macrophage-tropic variants initiate human immunodeficiency virus type 1 infection after sexual, parenteral, and vertical transmisión. J Clin Invest 1994, 94: 2060- 2067. Varmus H. Retroviruses. Science 1998, 240:1427-1435. Veazey R, DeMaria M, Chalifoux L, et al. Gastrointestinal tract as a major site of CD4+ T cell depletion and viral replication in SIV infection. Science 1998, 280:427-431. Waters L, Mandalia S, Randell P, et al. The impact of HIV tropism on decreases in CD4 cell count, clinical progression, and subsequent response to a first antiretroviral therpay regimen. Clin Infect Dis 2008, 46:1617-1623. Bibliografía 133 Weiss C. HIV-1 gp41: Mediator of fusion and target for inhibition. AIDS Rev 2003, 5:214-221. Westby M, Lewis M, Whitcomb J, et al. Emergence of CXCR4-using HIV type 1 variants in a minority of HIV-1 infected patients following treatment with the CCR5 antagonist maraviroc is from a pre-treatment CXCR4-using virus reservoir. J Virol 2006, 80:4909-4920. Wilkin T, Su Z, Kuritzkes D, et al. Co-receptor tropism in patients screened for ACTG 5211, a Phase 2 study of Vicriviroc, a CCR5 inhibitor. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Febrero 2006 [Abstract 655]. Wolday D, Tegbaru B, Kassu A, et al. Expression of chemokine receptors CCR5 and CXCR4 on CD4+ T cells and plasma chemokine levels during treatment of active tuberculosis in HIV-1-coinfected patients. J Acquir Immune Defic Syndr 2005, 39:265-271. Wu L, Paxton W, Kassam N, et al. CCR5 levels and expresión patterns correlate with infectabililty by macrophage-tropic HIV-1 in vitro. J Exp Med 1997, 185:1681-1691. Zaitseva M, Blauvelt A, Lee S, et al. Expression and function of CCR5 and CXCR4 on human Langerhans cells and macrophages: implications for HIV primary infection. Nat Med 1997, 3:1369-1375. Zhang Y, Dragic T, Cao Y, et al. Use of coreceptors other than CCR5 by non-syncytiun-inducing adult and pediatric isolates of human immunodeficiency virus type 1 is rare in vitro. J Virol 1998, 72:9337-9344. Bibliografía 134 Zhang Z, Shang H, Jiang Y, et al. Activation and coreceptor expression of T lymphocytes induced by highly active antiretroviral therapy in Chinese HIV/AIDS patients. Chin Med J 2006, 119 :1966-1971. ANEXOS Anexo 1: Interpretación de los Genotipos de Resistencia a los Fármacos Antirretrovirales. Interpretación de resistencia a ITIAN FARMACO AZT D4T DDI ABC TDF 3TC FTC Grupo 3 (3 puntos) T215F/Y M41L T215F/Y L74I/V K65R K65R L74I/V K65R M184V/I M184V/I Grupo 2 (2 puntos) K70R L210W M41L V75M/T/S T69D/G K70E T215F/Y K70E Y115F M184I/V T215F/Y M41L K70E L210W K65R K65R Grupo 1 (1 punto) D67E/G/N K70G T215C/D/E/I/V/S K219E/N/Q/R/T/W K65R D67E/G/N T69D/G/N K70R V75A/I L210W T215C/D/E/I/V/S K219E/N/Q/R/T/W M41L K65N D67E/G/N T69N V75A/IM/T/S M184V L210W M41L K65N K70R L210W K65N D67E/G/N K70R T215F/Y K65N K70E T215F/Y K65N K70E T215F/Y Hipersusceptibilidad (- 1 punto) K65R M184V M184V M184V Multirresistencia: Del 67 / 69 69ins Q151M/L (complejo) ≥ 5 TAMs R R R R R R R R R R R R R R R R I R I R R I I I R I I I Interpretación ≥ 5 4 – 3 ≤ 2 = = = Resistente (R) Resistencia Intermedia (I) Sensible (S) Rojo: Aquellas mutaciones que por sí solas comprometen la respuesta al fármaco. Verde: Mutaciones que producen hipersusceptibilidad y que restan 1 punto al computo total. Complejo Q151M: A62V, V75I, F77L, F116Y, Q151M TAMs: M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q/E Anexos 138 Interpretación de resistencia a ITINAN Fármaco NVP (nevirapina) EFV (efavirenz) ETV (etravirina)* Grupo 3 (3 puntos) L100I K103N/S/T V106A/M V179F Y181C/I/V/S Y188C/L G190A/C/E/G/S/V/T F227C M230L K238T/N Y318F L100I K103N/S/T V106A/M Y181C/I/V Y188L G190A/C/E/Q/S/V/T P225H M230L V179F Grupo 2 (2 puntos) K101E/P E138K Y188H K103I/P E138K V179F Y181S Y188C/H F227C E138K Y181C/I/V Y188L G190C/E/Q/S/V/T M230L Grupo 1 (1 punto) A98G L100V K101H/N K103Q/E V106L V108I V179D/E/M F227L/Y A98G L100V K101E/H/N K103Q/E V106L V108I V179ED/E/M K238T/N Y318F V90I A98G L100I/V K101E/P K103N/S/T V106A/M/I V179D/E/M Y181S Y188C/H G190A P225H F227C/L Interpretación ≥ 3 puntos = Resistencia (R) ≤ 2 puntos = Sensible (S) * Existen pocos datos clínicos hasta la fecha. La interpretación de resistencias a ETV se basa en los datos obtenidos en los ensayos DUET. Polimorfismos frecuentes en subtipos no-B en posiciones de resistencia: A98S; V179I Interpretación de resistencia a IP IDV SQV ATV* FPV LPV TPV DRV FARMACO Potenciados con ritonavir Grupo 3 (3 puntos) V82A/F/S/T G48A/M/S/T/V L90M I84A/V I50L N88S I50V I84A/V I47A V82L/T I50V Grupo 2 (2 puntos) M46I/L L76V V82M I84A/C/V L90M I54V I84C M46I/L V82A/F/S/T I84A/C/V N88T/G L90M M46I/L I47A/V I54L/M L76V I84C L90M M46I/L I50V I54L/M/V V82A/F/S/T I84V I47V I54A I84V I47V I54M L76V I84A/C/V Grupo 1 (1 punto) V32I M46V G48M/V I54A/L/M/S/T/V V82C/L N88S I54A/L/M/S/T G73C/S/T V82A/F/L/M/T N88D V32I M46V G48V/M I54A/M/S/T/V V82L/M N88D M46V I54A/T/V V82A/F/L/M/S/T V32I M46V I47V G48M/V I54A/S/T L76V V82C/L/M I84C L90M M46I/L/V I54V Q58E T74P V82A/C/M/F/S N83D V32I M46I/L/V 47A I54L V82A/F/S/T/M/L/C Hipersusceptibilidad (- 1 punto) I50L I50L N88S I50L I50L/V I54L I50L Interpretación ≥≥≥≥ 5 puntos 4 – 3 puntos ≤≤≤≤ 2 puntos = = = Resistente (R) Resistencia intermedia (I) Sensible (S) * La resistencia a ATV sin potenciar con ritonavir se considera a partir de 4 puntos. Rojo: Aquellas mutaciones que por sí solas comprometen la respuesta al fármaco. Verde: Mutaciones que producen hipersusceptibilidad y que restan 1 punto al computo total. Mutaciones compensatorias: L10I/F/R/V/Y; V11I; L24I; L33F; F53L/Y; A71I/T/V; G73A/C/S/T; L89I/M/T/V. Sólo en caso de resistencia intermedia con 4 puntos otorgan resistencia. Polimorfismos frecuentes en subtipos no-B en posiciones de resistencia: L10V/I; K20I/R; M36I; V82I; L89M/I Anexos 140 Mutación Interpretación HR1 G36V/S/D/E R I37V R V38A/E/M R Q40H R N42K/T R N43D/K R L45W R Las mutaciones Q39R/H, L44M/V y L45M en HR1, así como las mutaciones N126K y S138A en HR2, suelen aparecer generalmente en combinación con las de la tabla. Por sí solas podrían disminuir parcialmente la sensibilidad al fármaco. N42S es un polimorfismo y no confiere resistencia S138A es un polimorfismo natural en variantes del grupo O y N del VIH-1. G I V Q Q Q N N L L D V A H H T D V M V E R K K M W S M 36 37 38 39 40 42 43 44 45 HR2 N S K A 126 138 Mutaciones en el gen env (región HR1 y HR2 de gp41) asociadas con resistencia a enfuvirtida Anexo 2: Publicaciones surgidas de esta Tesis Doctoral. Anexos 142 • Briz V, Poveda E and Soriano V. HIV entry inhibitors: mechanisms of action and resistance pathways. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2006, 57:619-27. • Briz V, Poveda E and Soriano V. Entrada del VIH en las células: mecanismos y posibilidades terapéuticas. Medicina Clínica 2006, 126:341-8. • Poveda E, Briz V, Quiñones-Mateu M and Soriano V. HIV tropism: diagnostic tools and implications for disease progression and treatment with entry inhibitors. AIDS 2006, 20:1359-67. • Poveda E, Briz V, Roulet V, Del Mar González M, Faudon JL, et al. Correlation between a phenotypic assay and three bioinformatics tools for determining HIV co-receptor use. AIDS 2007, 21:1487-90. • Poveda E, Briz, V, de Mendoza C, Benito JM, Corral A, Zahonero N, et al. Prevalence of X4 tropic HIV-1 variants in patients with differences in disease stage and exposure to antiretroviral therapy. Journal of Medical Virology 2007, 79:1040-6. • Briz V, Poveda E, González MM, Martín-Carbonero, L, González-González R and Soriano V. Impact of antiretroviral therapy on viral tropism in HIV- Anexos 143 infected patients followed longitudinally for over 5 years. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2008, 61:405-10. • Briz V, Poveda E, López M, González MM, Soriano V and Benito JM. Impact of antiretroviral therapy on CCR5 expression in HIV patients followed for over two years. AIDS (in press). ABREVIATURAS Abreviaturas 145 ADN Ácido desoxirribonucleico AIQ Amplitud intercuartílica ARN Ácido ribonucleico ARNm Ácido ribonucleico mensajero β Beta AZT Zidovudina CA Cápside CCR5∆32 deleción de 32 pares de bases en el gen ccr5 CMSP Células mononucleares de sangre periférica CN Control negativo cop/mL Copias por mililitro CP Control positivo ddI Didanosina DM Dual/mixtas DMSO Dimetil sulfóxido ECD Ficoeritrina-Rojo de Texas X EDTA Ácido etilendiamin tetraacético EFV Efavirenz FDA Food and drug administration FP Péptido de fusión GALT Tejido linfoide asociado al intestino gp41 Glicoproteína 41 gp120 Glicoproteína 120 h horas HOS Osteosarcoma humano HR1 Heptad-repeat 1, región repetida HR2 Heptad-repeat 2, región repetida IF Inhibidores de la fusión IgG Inmunoglobulina G IgG2 Inmunoglobulina G 2 IL-7 Interleuquina 7 Abreviaturas 146 IN Integrasa IP Inhibidores de la proteasa IS Inductoras de sincitios ITIAN Inhibidores de la transcriptasa inversa análogo de nucleósidos ITINAN Inhibidores de la transcriptasa inversa no análogo de nucleósidos Kb Kilobase KDa Kilo Dalton log Logaritmo LTR Long terminal repeat, secuencias terminales largas M-trópicas Línea celular monocito-macrófago MA Matriz mg Miligramo min Minuto MIP Macrophage inflammatory protein, proteína inflamatoria de macrófagos mL Mililitro MM Marcador de peso molecular MVC Maraviroc NIS No inductoras de sincitios nm nanometro nt Nucleótido Nt N-terminal NU Nucleocápside µL Microlitro pb Pares de bases PBS Phosphate buffered saline, tampón fosfato salino pH 7,2 PCR Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa PE Ficoeritrina PECy5 Ficoeritrina cianina 5 pg/mL Picogramo por mililitro PR Proteasa Abreviaturas 147 R5 Variantes CCR5-trópicas R10 Medio de cultivo RPMI suplementado con 10% de SBF RE Retículo endoplasmático REE Elemento de respuesta a la proteina Rev RT Retrotranscriptasa SBF Suero bovino fetal SDF-1 Stromal Cell Derived Factor-1 seg Segundo SIDA Síndrome de la inmunodeficiencia adquirida SU Superficie T-trópicas Línea celular linfocitos T CD4+ TARGA Terapia antirretroviral de gran actividad TI Transcriptasa inversa TM Transmembrana UDVP Usuario de drogas por vía parenteral UI Unidades internacionales VCV Vicriviroc vs versus VIH-1 Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 VIH-2 Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2 wt wild type, fenotipo salvaje X4 Variantes virales CXCR4-trópicas ºC Grado centígrado AGRADECIMIENTOS INDICE INTRODUCCIÓN 1.1. ESTRUCTURA DEL VIH-1 1.2. CICLO REPLICATIVO DEL VIH-1 1.3. ENTRADA DEL VIH-1 EN LA CÉLULA A. Unión de la glicoproteína de superficie gp120 al receptor celular CD4 B. Interacción del complejo CD4-gp120 con los receptores de quimiocinas C. Fusión de las membranas viral y celular 1.4. TROPISMO VIRAL: DEFINICIÓN Y BASES MOLECULARES 1.5. DINÁMICA DEL TROPISMO VIRAL DURANTE LA PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD 1.6. IMPACTO DE LA TERAPIA ANTIRRETROVIRAL EN EL TROPISMO VIRAL Y EN LA EXPRESIÓN DEL CORRECEPTOR CCR5 A NIVEL CELULAR 1.7. IMPLICACIONES DEL TROPISMO VIRAL EN LA ERA DE LOS ANTAGONISTAS DE CCR5 Y CXCR4 1.8. HERRAMIENTAS PARA DETERMINAR EL TROPISMO VIRAL EN LA PRÁCTICA CLÍNICA OBJETIVOS PACIENTES Y MÉTODOS 3.1. Pacientes 3.2. Obtención de plasma 3.3. Viremia plasmática 3.4. Recuento de linfocitos T CD4+ 3.5. Extracción del ARN viral 3.6. Análisis genético del gen pol y de la región gp41 del gen env 3.7. Análisis genético de la región V3 de la envuelta viral 3.8. Purificación del amplicón 3.9. Secuenciación del ADN 3.10. Determinación genotípica del uso del correceptor 3.11. Determinación fenotípica del uso del correceptor 3.12. Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) 3.13. Extracción del ADN 3.14. Determinación genotípica del receptor CCR5 (CCR5L32) 3.15. Determinación del nivel de interleuquina 7 (IL-7) en plasma 3.16. Cuantificación de la expresión del correceptor CCR5 en distintas subpoblaciones de linfocitos T 3.17. Análisis del nivel de activación en linfocitos T 3.18. Datos epidemiológicos y marcadores biológicos 3.19. Análisis estadístico RESULTADOS I. Estudio 1: Evaluación de herramientas genotípicas para la determinación del uso del correceptor en muestras clínicas, tomando como referencia un ensayo fenotípico basado en virus recombinantes. 4.1. Población de estudio 4.2. Concordancia entre métodos genotípicos y fenotípicos para ladeterminación del uso del correceptor II. Estudio 2: Prevalencia de variantes VIH-1 según el uso delcorreceptor en diferentes etapas de la infección por VIH. 4.3. Población de estudio 4.4. Prevalencia de variantes R5 y X4-trópicas 4.5. Asociación entre tropismo viral y características epidemiológicas 4.6. Asociación entre tropismo viral y parámetros clínicos 4.7. Asociación entre tropismo viral y presencia de mutaciones de resistencia a las distintas familias de antirretrovirales 4.8. Asociación entre tropismo viral y el nivel de interleuquina-7 en plasma III. Estudio 3: Impacto del tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA) en el uso del correceptor en pacientes VIH+ 4.9. Diseño del estudio 4.10. Población de estudio 4.11. Prevalencia de cepas X4-trópicas en el momento basal 4.12. Factores asociados con el tropismo viral en el momento basal 4.13. Características del cambio en el uso del correceptor durante elseguimiento longitudinal 4.14. Factores asociados con el cambio del uso del correceptor durante el seguimiento longitudinal IV. Estudio 4: Influencia del tratamiento antirretroviral de gran actividad en la expresión del correceptor CCR5 4.15. Población de estudio 4.16. Perfil de expresión de la molécula CCR5 en linfocitos T CD4+ y CD8+ 4.17. Influencia de la infección por VIH-1 en la expresión de CCR5 4.18. Influencia de la terapia antirretroviral en la expresión de CCR5 4.19. Nivel de activación en linfocitos T CD4+ y CD8+ y evolución bajo TARGA DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS ABREVIATURAS