UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Mario Antonio Vargas Aguilar DIRECTOR: Fernando Bandrés Moya Madrid, 2015 © Mario Antonio Vargas Aguilar, 1996 Estudio de marcadores biológicos de drogas de abuso : utilidad médico-laboral Departamento de Toxicología y Legislación Sanitaria ^GS2^o UIMIVERSIDAD COMPLUTENSE 5 3 2 1 3 5 3 1 Umversidad Complutense de Madrid Facultad de Medicma DEPARTAMENTO DE TOXICOLOGIA Y LEGISLACIÔN SANITARIA TESIS DOCTORAL ESTUDIO DE MARCADORES BIOLOGICOS DE DROGAS DE ABUSO. UTILIDAD MÉDICO-LABORAL Mario Antonio V^gas Aguilar Director: Dr. Fernando Bandrés Moya AGRADECIMIEWroS Deseo expresar mi agradecimiento personal al Dr. Fernando Bandrés Moya, Director de esta tesis por su extraordinaria sensibilidad humana, compreensiôn y apoyo recibidos durante el asesoramiento para el désarroilo de esta tesis, Al Dr. José Maria Ruiz de la Cuesta por su inestimable ayuda, amistad y colaboraciôn en los momentos dificiles. Mi agradecimiento al Dr. David Martinez por su asesoramiento en los datos estadisticos. A los compafteros del Laboratorio de Anélisis Clinico-TENEO por su inestimable colaboraciôn en la realizaciôn de este trabajo. Mis agradecimientos a todos los profesores del Departamento por su esfuerzo y empefto en meiorar nuestra formaciôn. DEDICATORIA A mi esposA Eugenia, por su tolerancta y amabiMad. A mis hijos, Johann y Pablo por el cariSo y rompreensidn en los momentos dificiles. A mis padres, por todo lo que aprendf de eUos. INDICE Indigo_______________________________________________________ 1.- INTRODUCCIÔN 10 2.- HIPÔTESIS DE TRABAJO 12 2.1.- Planteamiento 13 2.2.- Hipôtesis de Trabajo 13 2.3.- Objetivos 14 3.- MARCADORES BIOLOGICOS 15 3.1.- Concepto actual de marcador biolôgico 16 3.2.- Definiciôn de marcador biolôgico 18 3.3.- Importancia de los marcadores en Medicina Legal 20 3.4.Aplicaciôn de marcadores en asuntos médico-légales 21 4.-ASPECT0S ACTUALES DEL METABOLISMO DE DROGAS DE ABUSO 23 4.1.- Consideraciones actuales sobre el metabolismo de opiàceos 24 4.1.1.- Introducciôn 24 4.1.2.- Importancia de la detecciôn de opiàceos en muestras forenses 25 4.1.3.- Metabolismo y Farmacocinética 26 4.1.4.- Heroina 30 4.1.5.- Codeina 34 4.1.6.- Dihidrocodeina 35 4.1.7.- Otros opiàceos 36 4.1.8.- Antagonistas opioides 36 4.1.9.- Folcodina 37 4.1.10.- Farmacologia 37 4.1.11.- Métodos de detecciôn 39 4.1.12.- Métodos cromatogràficos 41 Indice______________________________________________________ 4.1.13.- Cromatografia de Gases y Cromatografia de Gases Espectrometria de masas (GC y GC-MS) 42 4.1.14.- Cromatografia Liquida de Alta Eficacia 43 4.1.15.-Técnicas inmunolôgicas de an&lisis de opiàceos 43 4.1.16.- Tiempos de detecciôn en inmunoensayos 46 4.1.17.- Interpretaciôn de resultados en inmunoensayos 46 4.2.- Consideraciones actuales sobre el metabolismo del cannabis 50 4.2.1.- Introducciôn 50 4.2.2.- Farmacologia 51 4.2.3.- Metabolismo y Farmacocinética 53 4.2.4.- Métodos de detecciôn 61 4.2.5.- Interpretaciôn de resultados 62 4.3.- Consideraciones actuales sobre el metabolismo de cocaina 63 4.3.1.- Introducciôn 63 4.3.2.- Farmacologia 66 4.3.3.- Metabolismo y Farmacocinética 69 4.3.4.- Métodos de detecciôn 73 4.3.5.- Preparaciôn de la muestra 73 4.3.6.- Cromatografia Liquida de Alta Eficacia(HPLC) 74 4.3.7.- Métodos inmunolôgicos 75 4.3.8.- Tiempos de detecciôn 76 4.4.- Consideraciones actuales sobre el metabolismo de anfetaminas 78 4.4.1.- Introducciôn 78 4.4.2.- Metabolismo y Farmacocinética 79 Indice______________________________________________ 4.4.3.- Mécanisme de acciôn 84 4.4.4.- Métodos de detecciôn 84 4.4.5.- Métodos cromatogràficos 85 4.4.6.- Cromatografia a gas 86 4.4.7.- Cromatografia a gas-espectrometria de masas 87 4.4.8.- Cromatografia Liquida de Alta Eficacia(HPLC) 88 4.4.9.- Métodos inmunolôgicos 89 4.4.10.- Técnica de Inmunoensayo Multiple Enzimàtico 90 4.4.11.- Inmunoensayo de Fluorescencia Polarizada (FPIA) 91 4.4.12.- Reactividad cruzada de inmunoensayos 91 4.4.13.- Tiempo de detecciôn 92 4.4.14.- Recomendaciones 93 4.5.- Consideraciones actuales sobre el metabolismo de benzodiacepinas 95 4.5.1.- Introducciôn 95 4.5.2.- Farmacologia 97 4.5.3.- Metabolismo y Farmacocinética 99 4.5.4.- Métodos de detecciôn 102 4.5.5.- Métodos inmunoquimicos 102 4.5.6.- Método Cromatogràfico a Gas 102 4.5.7.- Interpretaciôn de resultados 103 5.- MATERIAL Y MÉTODOS 104 5.1.- Poblaciôn 105 5.2.- Aparatos y material 105 5.3.- Reactivos y disoluciones 106 ■Indi.ce______________________________________________ 5.4.- Procedimiento experimental 107 5.5.- Procesamiento de las muestras 109 5.6.- Umbrales de detecciôn 112 6.-MÉTODO DE INMUNOENSAYO DE FLUORESCENCIA POLARIZADA 118 6.1.- Descripciôn de la técnica 119 6.2.- Aplicaciôn en muestras biolôgicas de orina 128 6.3.- Screening de cinco drogas de abuso en orina 129 7.-MÉTODO KIM(CINÉTICA DE MICROPARTÎCULA EN SOLUCIÔN) 130 7.1.- Descripciôn de la técnica 131 7.2.- Aplicaciôn en muestras biolôgicas de orina 136 7.3.- Screening de cinco drogas de abuso en orina 136 8.- MÉTODO CEDIA(ENZIMOINMUNOENSAYO DONANTE DE ENZIMA CLONADA) 138 8.1.- Descripciôn de la técnica 138 8.2.- Aplicaciôn en muestras biolôgicas de orina 143 8.3.- Screening de cinco drogas de abuso en orina 143 9.- MÉTODO CROMATOGRAFICO A GAS 144 9.1.- Descripciôn de la técnica 145 9.2.- Aplicaciôn en muestras biolôgicas de orina 161 9.3.- Determinaciôn de drogas de abuso en orina 161 10.- MÉTODO ESPECTROMéTRICO 163 10.1.- Descripciôn de la técnica 164 10.2.- Aplicaciôn en muestras biolôgicas de orina 171 10.3.- Determinaciôn de drogas de abuso en orina 172 10.4.- Cromatogramas y espectros de masas de las drogas de abuso 172 Indice____________________ __________________________________ 11.- LEY DE PREVENCION DE RIESGOS LABORALES 181 12.- RESULTADOS Y DISCUSIÔN 186 12.1.-Screening de drogas de abuso por inmunoensayos y confirmaciôn por gases masas 186 13.- CONCLUSIONES 209 14.- BIBLIOGRAFIA 213 1. - INTOODUCCIÔN intx̂ ducci.àp_______________________________ lü 1.INTRODUCCIÔN Los marcadores biolôgicos ban sido utilizados a lo largo de la historia con gran interés desde el punto de vista médico. bien sea para el diagnôstico diferencial y desde el punto de vista médico legal de gran importancia para los examenes periciales para aclarar la causa de la muerte. Entre otras aplicaciones podemos citar para la utilizaciôn en la investigaciôn de imputabilidades sobre determinadas hechos en relaciôn con individuos principalmente las derivadas de siniestros laborales. La investigaciôn de drogas de abuso tanto légales como ilégales tienen una gran tradiciôn en la historia de la medicina legal, y en los ùltimos afios la incorporaciôn de marcadores biolôgicos bien sea marcadores de lesiôn, bien sea metabolites de las drogas en virtud de las nuevas tecnologias, ban permitido clarificar mucbos problemas concretamente no solamente desde el punto de vista diagnôstico terapéutico, y en aplicaciones tan significativas como la medicina del trabajo y la medicina legal. Al ser la ciencia forense una aplicaciôn de los principios cientificos a los procesos légales, por esta razôn se constituye en un auxilio a los jueces en la aportaciôn de pruebas o evidencias que pueden influenciar en la toma de decisiones de los jueces para juzgar o acusar un individuo. El érea de drogas de abuso es apenas una de las facetas por las Introducciôn_____________________________________il________ que la disciplina de la ciencia forense puede actuar, apreciando la composiciôn quimica de las drogas y correlacionandolas con sus posibles mecanismos de acciôn y efectos fisiopatolôgicos que las mismas puedan desencadenar en el individuo. Debemos llevar en consideraciôn que el estudio analltico de las muestras y la interpretaciôn de resultados deben siempre confrontarse con la cl inica del individuo en el contexto global de cada caso en particular, y que el resultado de cualquier anàlisis no debe solo ser interpretado en el contexto del caso, sino todavla a la luz de las leyes vigentes en cada pais, encuanto a control, posesiôn, manufactura y cultivo de la sustancia tôxica y/o trâfico de la misma, por parte de los individuos involucrados. Los marcadores biolôgicos de drogas de abuso ilégales y légales constituyen en la actualidad un desafio a la investigaciôn toxicolôgica, principalmente debido a que la detecciôn de los metabolitos de estas drogas requieren condiciones especiales para su determinaciôn y anàlisis, como puede demostrarse através de la historia en numerosos trabaios cientificos y cuyas referencias bibliogràficas aqui citadas as! lo corroboran. Es extremamente importante que los métodos de anàlisis sean precisos y regulados preferencialmente con patrônes internacionales.La reproducibilidad, exactitud, sensibilidadad y especificidad de cualquier técnica analltica debe ser en principio establecida antes de su incorporaciôn a cualquier rut ina de 1aborator i o (1). 2. - HIPOTESIS DE IHABAJO Hipôtesis de Trabajo__________________________________ Il 2.1.- Planteamiento En la actualidad con el incremento en el consumo de drogas de abuso por parte de los diversos sectores sociales, creemos oportuno y necesario ideal izar un disefio de protocoles metodolôgicos de laboratorio con aplicaciôn objetiva al mundo laboral, particularmente en reconocimientos laborales de nuevo ingreso y en personal de plantilla, con la finalidad de detectar por técnicas de screening presuntos positives, a seguir someterlos estes a técnicas de confirmaciôn por gases masas(GC-MS), luego discutir y analizar los resultados para ver la utilidad de estes procedimientos y de su apiicabilidad en funciôn de la nueva ley de prevenciôn de riesgos, someter estes criterios a la detecciôn de drogas "in situ", como medida extrictamente preventiva en los puestos de trabajo de elevada responsabilidad, como en conductores de véhiculés y manejo de armas en personal de seguridad en las empresas. 2.2.-Hipôtesis de Trabajo Establecer unos marcadores para detectar la exposiciôn a drogas de abuse, en la medida en que estes marcadores derivados del consumo de drogas como cocaina, cannabis y opiàceos , pueden tener una utilidad en la investigaciôn de los usuarios de drogas de abuse desde el punto de vista médico legal y médico laboral. Hipôtesis de Trabajo________________________________________ 14____ 2.3.- Objetivos A) Conocer y comparer las frecuencias de positividades a drogas de abuso por Inmunoensayos y sus respectives confirmaciones por gases masas de muestras de orina de pacientes de poblaciôn laboral de plantilla, nuevo ingreso y de rehabilitaciôn de drogodependientes. B) Diseftar un protocole de método de trabajo para anàlisis de drogas de abuso en orina como marcadores biolôgicos de la màxima utilidad, en la aplicaciôn a la exposiciôn de estas, y establecer los criterio de utilizaciôn de los marcadores en el contexto médico-laboral. C) Diseftar la utilidad médico-laboral de los marcadores investigados. 3.- MARCADORES BIOLOGICOS Margadoxes bioiôKîcoa________________________________ 16 3.1.- CONCEPTO ACTUAL DE MARCADOR BIOLOGICO Existe en la actualidad un extraordinario interés en désarroilar en laboratories tests bioquimicos de inmunoensayo en fluides biolôgicos, con la finalidad de detectar estados patolôgicos que caracterizen sin duda alguna estas condiciones, o bien la exposiciôn a determinadas sustancias de abuse que pueden estar involucradas e indirectamente relacionadas con cuestiones médico légales en poblaciones como la laboral o en cases forenses. Se reconocen 3 tipos de marcadores biolôgicos, los genéticos, los diagnôsticos y los clinicos, que tienen una basta aplicaciôn en patologias y particularmente para la detecciôn de estados de intoxicaciôn por drogas de abuse por la presencia de metabolitos de estas en fluides biolôgicos como la orina. En el caso del marcador genético ni siempre posible de demostrarse, es aquel que cuando positive en individuos sanos significa predisposiciôn biologica al riesgo de désarroilar un determinado estado patolôgico. El marcador diagnôstico por otra parte es aquel que se détecta en el estado patolôgico independientemente del grade de comprometimiento del paciente. Ya el marcador clinico permite detectar condiciones anormales através de la identificaciôn de compuestos en fluides biolôgicos capazes de orientâmes con relaciôn a exposiciôn del sujeto a determinados tôxicos o al respecte de la prevalencia del estado fisiopatolôgico de un ôrgano en cuestiôn(2). Marcadoxeg b iolôKicog_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 11__ La sensibilidad de un marcador relaciona el porcentaje de una poblaciôn especifica de individuos estar acometidos de una enfermedad que tienen positividad en el test de inmunoanàlisis y son considerados anormales. La especificidad de un marcador entretanto consiste en la proporciôn de los individuos de una determinada poblaciôn en estudio que no estàn acometidos de enfermedad y que poseen por tanto test de inmunoanàlisis negatives. Particularmente enfatizando en nuestra investigaciôn de la intoxicaciôn por drogas de abuso, podriamos expresario a seguir(3): Se= TP/(TP+FN) Sp= TN/(TN+FP) Donde Se=sensibilidad, Sp=especificidad, TP=verdaderos positives, TN=verdaderos negatives, FN=falsos negatives, FP=falsos positives. Marcadores biolôKicog____________________________ Ifî___ 3,2,- DEFINICION DE MARCADOR BIOLOGICO Podemos de forma simple expresar que un marcador es una prueba de laboratorio, objetiva, de prestigiosa credibilidad en la actualidad, que cuando realizada con todo rigor y cuidadoso procedimiento analltico nos permitirà obtener resultados mensurables y criteriosos para establecer correlaciones y ser de utilidad para esclarecer cuestiones en el âmbito médico legal en sus distintas facetas, particularmente en lo que se refiere a nuestro estudio, el anàlisis toxicolôgico, Considerando que existe una relaciôn ya demostrada en la actualidad entre consumo de drogas de abuso y diversos estados patolôgicos desencadenantes de la drogadicciôn(4), buscamos con los marcadores la detecciôn de alteraciones bioqulmicas induzidas por los tôxicos en fluidos biolôgicos que sean de caracter invariable, repetibles y permanentes que nos aseguren ser consecuencia del uso y exposiciôn prolongado de sustancias extradas en el organisme. Por esta razôn se proponen diversos paràmetros que comentaremos a lo largo de esta exposiciôn, con el propôsito de aprofundar en los mecanismos que controlan y gerencian estas modificaciones(5). Nos encontramos pues con fenômenos como son el grado de variabilidad de la actividad del comportamiento enzimàtico que sufre influencias directas de la acciôn de las sustancias de abuso o de sus metabolitos, causando cambios y transtornos metabôlicos que degeneran en Marcadores biolégicas__________________________________15_ lesiôn celular en la mayoria de las veces, en consecuencia de las reacciones de ôxido-reducciôn que expérimenta el tôxico en cuestiôn en su camino de metabolizaciôn y excreciôn en el organisme, resultando en la génesis de metabolitos que podràn ser bioactivos y por tanto màs tôxicos que el compuesto quimico inicial. El marcador es por tanto un paràmetro biolôgico con un grado determinado de sensibilidad y especificidad para determinada enfermedad o estado patolôgico. Al interaccionar el tôxico con las membranas celulares y otras macromoléculas, se establece el principle de lesiôn bioquimica, responsable por las alteraciones fisiolôgicas y anatomopatolôgicas. Las consecuencias derivadas del primer contacte del tôxico con las membranas celulares a nivel molecular détermina algunos efectos biolôgicos a partir de las interacciones fisico-quimicas entre los compuestos quimicos(drogas) y moléculas estructurales de los tejidos, como receptores, proteinas, enzimas, etc. siendo consecuencias de modificaciones en el metabolismo celular(6). Maxcadoreg biolôKicog____________________________ 2J3__ 3.3.- Importancia de los marcadores en Medicina Legal Gracias al creciente désarroilo de la ciencia en el campo tecnolôgico, ha sido posible cada vez mâs profundizar en la investigaciôn de indicios en la escena de los hechos en actos delictivos, con el obietivo de identificar los autores de los mismos y las causas relacionadas con el evento en si, como la participaciôn e influencia del uso de sustancias de abuso y sus metabolitos a las cuales estuviera expuesto el individuo al cometer el acto illcito, permitiendo esclarecer através del uso de paràmetros biolôgicos posibles condiciones baJo las cuales el individuo pueda haber sufrido alteraciones bioqulmicas y/o transtornos metabôlicos que justifiquen su comportamiento bizarro. Los marcadores en toxicologie laboral y forense ademàs de permitir orientâmes con relaciôn a la determinaciôn de la existencia y envolvimiento de individuos en el mundo de la drogadicciôn, juega un papel relevante en la identificaciôn, seguimiento, y rehabilitaciôn de los consumidores de drogas de abuso, como ocurre en los centres especializados en estes tratamientes. En el caso de ôbitos por muertes violentas el anàlisis y estudio toxicolôgico forense se torna cada vez mâs imprescindible en el esclarecimiento y causas de la muerte, aûn màs en la actualidad con el incremento del uso de drogas de abuse en la sociedad, cada vez màs notable en edades màs jovenes y todavia con el surgimiento de las drogas de slntesis Marcadores biolôgicos___________________________________21. (de disefio) el problema se agrava mâs. De manera que lo que se pretende con los marcadores es la identificaciôn de las respectivas sustancias de abuso y sus metabolitos en los fluidos biolôgicos, como medio de comprovar si hubo exposiciôn previa a las mismas, no caracterizando en ningûn momento ni drogadicciôn ni efectos clinicos, el simple hallazgo en orina de estas sustancias. 3,4.- APLICACION DEJMARCAD0IŒ8 EN ASUNTOS MÉDICO LEGALES Existe en la actualidad un arsenal considerable de marcadores bioquimicos en toxicologie,para identificaciones patolôgicas a través de determinaciôn de diversos tipos enzimâticos, asi como de la formaciôn de aducidos formados por la combinaciôn de ciertos metabolitos con macromoléculas, como ocurre con el acetaldehido ligado a proteinas, hemoglobina,etc.(7,8,9). También por el surgimiento de metabolitos a partir de bioaminas derivados de bloqueos de mecanismos enzimâticos como ocurre con el etanol, resultando como consecuencia un acentuado aumento en la formaciôn de 5- hidroxitriptofol. Sin embargo nuestro interés en el estudio de la detecciôn de consumidores de drogas de abuso como opiàceos, cannabis y cocaina por parte de la poblaciôn laboral tiene mucha importancia por la repercusiôn en el mundo laboral porque impi ica en exposiciôn al riesgo de accidentabilidad Marcadores biolôKîcos_____________________________________ 22. laboral y sus consecuencias médico légales que del consumo de estas sustancias pueda derivarse. D E a S ^ METABOLISMO DE DROGAS Opi&GAgg____________________________________________ Z!k__ 4.1 CONSIDERACIONES ACTUALES SOBRE EL METABOLISMO DE OPIACEOS 4.1.1 Introducciôn Los opi&ceos son drogas o compuestos estrncturalmente similares a la morfina y con semeJante actividad farmacolôgica. Derivan de las câpsulas inmaduras de la amapo1a (Papaver somniferum). Los opi&ceos son utilizados en cllnica por su facultad de aliviar el dolor moderado a severo y tienen un amplio rango de efectos farmacol6gicos difiriendo en potencia por la producciôn de analgesia, sedaciôn, depresiôn respiratoria, disminuciôn de la motilidad intestinal y supresiôn de la tos. El abuso de opi&ceos en general causa complejos efectos psicotrôpicos y se caracterizan por su capacidad de producir tolerancia y dependencia fisica con su consumo crônico(lO). La diacetilmorfina (heroina) seguida de una administraciôn intravenosa es rapidamente metabolizada a 6- monoacetilmorfina(6-MAM) en sangre humano como resultado de la hidrôlisis enzimâtica por colinesterasas y luego esta metabolizada a morfina. La presencia de 6-MAM en orina ha sido propuesto como un marcador especifico de abuso de la heroina(ll). La 6-MAM es excretada en la forma no conjugada en niveles de ng/mL en orina junto con la morfina el mayor metabolito de la heroina(12). La morfina tiene aproximadamente Qpiacects________________________________________________ 2Il una potencia media analgésica de la heroina, teniendo propiedades euforizantes semeiantes asi como produce dependencia(13). Las pruebas forenses para abuso de opiâceos usualmente relacionan la detecciôn y confirmaciôn de codeina y/o morfina en orina(14). La razôn codeina/morfina juega un papel relevante en la identificaciôn a la exposiciôn de opi&ceos,bien sea a morfina si este coeficiente es < 0.5, bien sea a codeina cuando esta fracciôn es > 2. La morfina al ser el mayor metabolito de ambas drogas de abuso heroina y codeina, su presencia en orina ha sido usado como indicador de uso de opiaceosdS). 4.1.2 Importancia de detecciôn de opi&ceos en muestras forenses La heroina al ser metabolizada rapidamente por hidrôlisis a 6-MAM por las esterasas plasm&ticas, se torna raramente identificable en orinas forenses. No obstante se pueden realizar determinaciones postmortem de 6-MAM utilizando la técnica cromatografia de gases/espectrometria de masas(GC-MS), siendo particularmente imprescindible en las investigaciones forenses como an&lisis confirmatoria de consumo de heroina en casos implicados en muerte sûbita(16). Infelizmente el abuso de heroina no puede ser confirmado por la detecciôn de solo morfina en orina, debido a saberse que la morfina es también excretada en orina después de ingestiôn de productos de semillas de amapolad?,12). Por otra parte la toma de codeina también conduce a la presencia de morfina en orina. Sin embargo la evidencia inequlvoca de abuso de heroina puede QpiacsQ̂ _____________________________________2îl obtenerse a través de la detecciôn en orina de la 6-MAM, la cual no es encontrada en semillas de amapola y no es un producto del metabolismo de la morfina o codeina(12). La codeina es otro opiaceo prescrite de forma terapéutica que hace parte de la composiciôn de jarabes antitusigenos y puede ser detectado en an&lisis de orina, asi como debemos recordar que el hallazgo de semillas de amapola usadas en la preparaciôn de algunos tipos de pan contienen pequeftas cantidades de opiaceos, apesar de que en estos casos las cantidades de opiaceos excretadas en orina son bajas(lO). Una vez administrada la codeina esta es metabolizada a morfina, siendo excretada en forma libre y conjugada con &cido glucurônico, pero la cantidad relativa es pequefia comparada a la cantidad total de codeina excretada. De forma general en todos los estudios donde se hace referenda a la excreciôn de codeina en orina esta procédé de una administraciôn oral de la codeina, aunque la codeina puede también ser abusada por via parenteral(14). 4.1.3 Metabolismo y Farmacocinética La morfina es uno de los m&s poderosos analgésicos para controlar y aliviar el dolor severo. Es rapidamente absorvido del tracto Gastrointestinal pero sufre una metabolizaciôn importante de primer paso al alcanzar el higado, siendo posterior a esta su disponibilidad sistémica variando entre 15 Opiaceos_____________________________________________21. y 70% en media 40%. Es ampliamente metabolizada por conjugaciôn con âcido glucurônico. La morfina-3-glucurônido es el principal metabolito de la morfina encontrado en orina, apr ox imadamente 50%. Cerca de 15% de la dosis de morfina administrada puede ser encontrada en la orina de forma libre, inalterada. Otros metabolites menores de morfina que pueden identificarse son: morfina-6-glucurônido, morfina-3, 6- diglucurônido, normorfina, normorfina-3-eter sulfato y normorfina-6-glucurônido(tabla 1)(10). Por otra parte la codeina puede producir metabolites de morfina (3-0-metilation). Estudios recientes han comprobado que seguidas repetidas dosis de morfina los metabolites morfina 3 y 6-glucuronidos son observadas en plasma, siendo la forma morfina-6-glucurônido de singular importancia por mostrar potente efecto analgésico, mucho mayor que la morfina, en contrapartida el metabolito morfina-3-glucurônido siendo el principal metabolito de la morfina es farmacologicamente inactive.(figura 1)(10). Los Opiaceos pueden ser administrados por via oral o parenteral tr&s una administraciôn oral su absorciôn es lenta y su biodisponibilidad tiende a disminuir devido a sufrir efecto del primer paso hep&tico. La vida media de la morfina varia en torno a las 2 hs, ya su metabolito active la M6G algo mâs. Al atravesar la barrera hematoencef&lica los opiaceos ejercen sus efectos a nivel de receptores opiodes (mu, delta, kappa y sigma), estimulande centres bulbares y Opiaceos vestibulares fundamentalmente entre otros, causando alteraciones del estado animico y analgesia. Los opiaceos por ser drogas de adicciôn su actuaciôn como droga ilegal se fundamenta en que produce euforia y sensaciôn de bienestar muy relacionadas con el poder adictivo(14). AcO N-CH Heroin (diocetyl morphine) Morphine glucuronides HO' N-CH AcO' 6-Monoocetyl morphine HO N-CH. HO Morphine it Codeine HO N-H HO Normorphine 1 N-H Norcodeine Glucuronide conjugales Figura 1. Via metabôlica de la morfina y drogas relacio nadas. Tomado de Braithwaite et al.(10) Qpiaceoa 23. N - CH Figura 2. Estructura quimica de la morfina t^ame Positional modification o f morphine structure 3 6 77 Other changes M orphine - O H - O H - C H , — 6-Monoacetyl morphine - O H -O C O C H , - C H , — Morphine-3-Glucuronide —O-Gluc - O H - C H , — Morphine-6-Olucuroaide - O H —O-Gluc - C H , — Diamorphine (heroin) -O C O C H , -O C O C H , - C H , — Codeine -O C H , - O H - C H , — Norcodeine -O C H , - O H - H — Normorphine - O H - O H - H — Dihydrocodeinc -O C H , - O H - C H , • Dihydromorphine - O H - O H - C H , • Hydromorphone - O H =o - C H , • Oxymorphone - O H =o - C H , •t Hydrocodone -O C H , = 0 - C H , • Oxycodone -O C H , =o - C H , • T Nalorphine - O H - O H -C H ,C H = C H , — Naloxone - O H =o -C H ,C H = C H , •r Naltrexone - O H =o - C H , - < •t Nalbuphine - O H - O H - C H , — 0 Pholcodine - 0 - 0 H j - 0 H , - N O - O H - C H , Buprenorphine - O H - O C H , - C H , - < •t •Single instead of double bond between C7 and C8. ^OH at C M . ^Endoethene bridge between 06 and '014; 1-hydroxy-1,2,2-trimethylpropyl substitution on 07. Tabla 1. Estructuras quimicas de la morfina y compues­ tos relacionados. Tomado de Ann.Clin.Biochem.1995,32.(10) OPi&GGOS_________________________________3LÛ_ 4.1.4 HEROINA (DIACETILMORFINA) La heroina es todavia usada como un analgésico y puede ser administrado oralmente o por via subcutanea o intravenosa. Apesar de que el mayor efecto analgésico es potenciado devido a su conversiôn a morfina, la heroina al ser màs lipofilica imprégna el cerebro mâs rapidamente. Como resultado los efectos euforizantes son mayores que los de la morfina, y por esta razôn la heroina es preferida por los adictos particularmente por inyecciones intravenosas. El mayor abuso es relacionado a preparaciones illcitas callejeras de drogas. La heroina de la calle es conocida como golpe, baratija blanca, y H es una cruda mezcla diluida conteniendo una cantidad de heroina, la cual tipicamente puede ser 30-50% pero puede ser tan baia como el 5%. En la mayoria de los casos la heroina ha sido prediluida(cortada) con una variedad de otros materiales taies como, tiza, almidôn, y âcido cltrico y puede ser adulterado desde su origen con drogas como fenobarbital, quinina, y cloroquina. La heroina de la calle puede ser tomada oralmente, por inyecciôn intravenosa o por inhalaciôn (snifada) de vapores. El abuso de la heroina es variable a veces puede progresar de una simple dosis de lOmg a la dependencia a severa cantidades por semana(lO). En relaciôn al metabolismo de la diacetilmorfina el 80% de una dosis de heroina es excretada en su mayor parte como morfina conjugada con âcido glucurônido y otra pequefia parte Opiaceos__________________________________________31. como morfina libre por procesos enzimâtico y quimicos, apenas 1% se excreta en la forma de 6-MAM devido a sufrir una metabolizaciôn veloz a morfina(18,19), La morfina es adem&s metabolizada por conjugaciôn a morfina glucurônido y por demetilaciôn a normorfina. La morfina y su coniugado de morfina, la morfina-6-glucurônido y morfina-3-glucurônido son los metabolites primaries de la heroina encontrados en orina, mas la heroina y 6-MAM estân présentes en un corto periôdo de tiempo después de la administraciôn de la droga(19,l). En condiciones normales cifras mayores al 90% de excreciôn total de morfina se metabolizan en 24 hs. después de la administraciôn de morfina, pudiendo encontrarse trazas de morfina dias después de la ûltima dosis, probablemente por mécanisme de recirculaciôn enterohepâtica, siendo en torno de 7-10% la morfina excretada a través de la bilis(21). La morfina por su vez es conjugada con âcido glucurônido y forma metabolitos activos y inactivos, siendo la M6G el metabolito de mayor importancia y el de mayor potencia farmacolôgica, ya el metabolito M3G es la forma mâs abundante en sangre y orina, pero es farmacologicamente inactivo(20). La estructura quimica de la heroina en relaciôn a la morfina es mostrada en figura 1(10). In vivo la heroina es rapidamente diacetilada por las esterasas sanguineas para originar la 6-MAM(monoacetilmorf ina), la cual ademâs es hidrolizada por enzimas hepâticas a morfina. La morfina es entonces el principal metabolito detectado en orina de los usuarios de heroina, lo cual hace dificil distinguir entre Qpiâceoa____________________________________________ 32. usuarios de morfina y heroina. La heroina de la calle puede también contener acetilcodeina, la cual es metabolizada a codeina. Cuando en muestras de orina contiene relativamente baja cantidad de codeina y morfina, es posible diferenciar entre ingesta de heroina, morfina o codeina utilizando técnicas de rutina. La presencia de 6-MAM lo cual puede algunas veces ser encontrada en orina indica abuso de heroina. La propia heroina es raramente encontrada en cualquier fluido corporal(10). El opio bruto o crudo(no procesado) es producido del zumo coagulado de la amapola Papaver somniferum, la cual se forma del latex expuesto a seco por algunas horas, adquiriendo una coloraciôn viscosa marrôn. Los residuos de la càpsula de semillas constituyen la résina y rica fuente de alcaloides opiaceos. Las résinas de plantas de diferentes regiones geogrâficas son caracterizadas por diferentes proporciones de alcaloides opiaceosd,21). Toda la diacetilmorfina originada del opio es preparada por la acetilaciôn de morfina, obtenido del opio. El proceso de extracciôn y acetilaciôn comunmente empleadas en la morfina resultan en la producciôn de un ndmero de drogas opiaceas figura 3(1). ÛPi4geQj 33 HO NCI I, HO'' Morphine Cl I COO NCI I .t-O -n ionicirci vliuorphinc HO NCH Cl I COO'' 6-0-ninnn.icc(yhnorpliiiu' Cl I COO NCI I Cl I COO" CH O NCH HO'' NCH Cl I COO' Codeine Aicl viendcinc Figura 3. Ejemplos de opiaceos encontrados en Opio.Toma do de COLE.D.M.(1) Opia ceos_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ M ______ 4.1.5 CODEINA La codeina estâ lejos de ser un potente analgésico como la heroina o morfina y por esta razôn no es una droga controlada. Numerosas preparaciones contienen en sus propiedades pequeftas cantidades de codeina en combinaciôn con analgésicos taies como el paracetamol o aspirina, pudiendo ser obtenidos sin prescripciôn médica. Por esta razôn se ha generalizado el abuso de las preparaciones que contienen codeina por mal uso de opiàceos. La codeina esté también présente en semillas de amapola y es un contaminante de la heroina ilicita . La codeina metabolizada en el higado fundamentaImente a 6- codeina-glucurônido, es eliminada del organisme humano en la orina, siendo una pequefta fracciôn 10-15% de la dosis de codeina demetilada a morfina, pudiendo encontrarse morfina libre o conjugada en orina de un individuo très administraciôn de codeinadS). Por proceso de 3-0-demetilaciôn la codeina pasa a morfina, y a norcodeina por N-demetilaciôn, ver figurai(10). Més del 80% de una dosis oral de codeina es excretada en la orina, como droga libreC5-17%), codeina- glucurônido y conjugados sulfates(32-64%), conjugados norcodeina(10-21%) y conjugados de morfina(5-13%). Pequeftas cantidades de morfina libre y norcodeina puede también ser encontrados en la orina. Durante la temprana fase de excreciôn predominan conjugados de codeina, pero aumenta seguido un periôdo de 20-40hs conjugados de morfina, favoreciendo la mayor excreciôn de estos productos. Existe ûpiégeog________________________________________________ 15. una gran variabilidad interindividual en la conversiôn metabôlica de codeina a morfina y la razôn cambiante de morfina a codeina durante la excreciôn, siendo que las proporciones codeina-morfina encontradas en las determinaciones analiticas urinarias orientarian en relaciôn al tipo de opiaceos al que el individuo a estado expuesto. Una muestra de orina colectada 2-3 dias después de ingesta de codeina puede aparecer conteniendo sôlo morfina y esto puede representar un problema de interpretaciôn(lO). 4.1.6 DIHIDROCODEINA (DF118) La dihidrocodeina es un producto que se encuentra entre codeina y morfina en su potencia analgésica y su estructura en relaciôn a morfina(tabla 1). La droga esté disponible sôlo con prescripciôn facultative, pero se puede encontrar en combinaciôn con otros analgésicos como el paracetamol. El metabolismo y excreciôn de dihidrocodeina es mal comprendido, pero la principal ruta es la conjugaciôn con écido glucurônico y sulfato con conversiones variables por 3- o-demetilaciôn a dihidromorfina y sus conjugados y N- demetilaciôn a nordihidrocodeina(figura 4). A diferencia de la codeina la droga no es metabolizada a morfina(lO). Qpiàceos Nor - d ihydrocodei ne HO Dihydro morphine Oihydrocodeine Glucuronide conjugotes Glucuronide conjugales Glucuronide conjugales Figura 4. Via metabôlica de la dihidrocodeina.Tomado de Braithwaite et al.(10) 4.1.7 OTROS OPIACEOS Algunos opiaceos taies como hidromorfona, oximorfona, hidrocodona, y oxicodona no son usados clinicamente, son usados como suministros illcitos por drogodependientes, no siendo faciImente disponibles. 4.1.8 ANTAGONISTAS OPIOIDES Los antagonistes opioides taies como nalorfina, naloxona y nalbufina(tabla 1) tienen un pequefto potencial para abuso, pero pueden ser administrados a pacientes en la profiIaxis y desintoxicaciôn de abuso de opiaceos. Estas drogas y sus metabolitos deben por lo tanto estar présentes en muestras de ■Qpiég&os_________________________________________________ 12. sangre o orina de taies pacientes y pueden interferir en tests destinados a detectar opiaceos(10). 4.1.9 FOLCODINA La folcodina es un anélogo de la morfina (tabla 1) usado en un nümero de preparaciones por sus propiedades antitusigenas como supresiôn de la tos. Existe una venda irrestricta y no potencia abuso. Pacientes tomando estos productos pueden dar resultados positives para opiaceos en algunos test inmunolôgicos que se encuentran en orina. Devido a este baio aclaramiento renal las muestras pueden quedar positivas a opiaceos, por lo minimo una semana seguido de la cesaciôn de la dosis de folcodina(lO). 4.1.10 FARMACOLOGIA Los opiaceos actuan sobre receptores cerebrales especificos localizados y distribuidos en el ârea Tegmental Ventral, Sustancia negra mesencefàlica, hipotâlamo, Nûcleo accumbens, Nûcleo pàlido y Amigdala fundamentaImente. La morfina es un agonista especifico para los receptores mu(m), y actuan también sobre receptores delta(d), kappa(k) y sigma, sitios implicados en la génesis de la adicciôn y mantenimiento de la propiedad adictôgena. La activaciôn y estimulaciôn de receptores induce a un aumento de la conductancia de potasio en la célula, inhibiendo la liberaciôn Q.p.iésfi.QS__________________________________________________ 36 de neurotransmisores, siendo posiblemente este mecanismo el responsable por la mayoria de los efectos producidos en la administraciôn de opiaceos. En virtud de existir una malla integradora o red de receptores relacionados entre si adem&s de los anteriormente citados los receptores GABA, alfa-2 adrenérgicos y M2 muscarinicos, los varios neurotransmisores al compartir un mismo sistema de canales de potasio justificaria las acciones analgésicas de los agonistas para los receptores alfa-2 adrenérgicos. A nivel de receptores mu los opiaceos causan inhibiciôn de la adenilato ciclasa que conlleva a una disminuciôn de la concentraciôn de AMPc y a la alteraciôn de la actividad de diverses proteinas en la capacidad de transcripciôn de genes, pudiendo generar disturbios en la transcripciôn de genes que codifican péptidos opioides(endorfinas) ocasionando reducciôn de la disponibilidad de estas endorfinas en las neuronas alterando su funcionalidad. No obstante très exposiciôn crônica de morfina ocurre una respuesta homeost&tica que se caracteriza por alteraciones moleculares no observandose màs disminuciôn del AMPc, produciendose elevaciôn de los niveles de Adenilato ciclasa con el consecuente surgimiento de tolerancia para los efectos de la droga devido a modificaciones estructurales en la plasticidad de los receptores mu por desacoplamiento de proteinas G. Los opiaceos al tener propiedades psicoestimulantes la euforia que ocasionan très su consumo es debido a su actuaciôn sobre el sistema de recompensa, la via dopaminérgica Û piàgSQS_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 36 mesolimbica en el àrea Tegmental Ventral, produciendo liberaciôn de dopamina en el Nûcleo accumbens, donde existen neuronas Gabaérgicas con receptores mu, en donde la hiperpolarizaciôn de estas neuronas causa reducciôn de la liberaciôn de GABA sobre las neuronas dopaminérgicas, contribuyendo al incremento de la actividad de las células dopaminérgicas. El abuso repetitivo de administraciôn de opiaceos conduce a tolerancia o sensibilizaciôn de los efectos sobre los receptores opioides a nivel comportemental relacionados al parecer con la activaciôn en el àrea Tegmental Ventral de las neuronas dopaminérgicas(22). 4.1.11 MÉTODOS DE DETECCION Existe una necesidad de los laboratories estar provistos de métodos sensibles para la detecciôn de opiaceos y para la identificaciôn y confirmaciôn de opiaceos. Es importante diferenciar entre abuso de heroina, dihidrocodeina, y mal uso de fârmacos, y el uso de codeina y folcodeina. Una de las dificultades en la detecciôn y confirmaciôn de abuso de opiaceos es la similaridad estructural entre morfina y sus muchos congéneris (tabla 1). Algunos opiaceos taies como heroina (diamorfina) y morfina son sustancias controladas , y donde otras taies como codeina son disponibles en forma diluida sin prescripciôn. La presencia de una sustancia parecida a opiaceos en orina ÛPÎÂCÆûS______________________________________________________ kîL de pacientes no es por lo tanto prueba suficiente de abuso de heroina. Ademàs opiaceos taies como heroina, morfina y codeina, dividen en comûn las vias de metabolismo(figura 1). La morfina puede ser detectada en orina seguido de la ingesta de todas las 3 drogas. El hallazgo de 6-acetilmorfina en orina es sôlo la inequivoca prueba de uso de heroina, pero la presencia de elevadas concentraciones de morfina libre o conjugada generalmente indica reciente uso de heroina o morfina. La presencia de bajas concentraciones de morfina en muestras de orina es mucho màs dificil de interpretar, particularmente cuando codeina es también detectada. La detecciôn de dehidrocodeina sôla en orina es evidencia de su uso. El uso médico o uso ilicito de otros menos bien conocidos opiaceos o antagonistes de morfina causa ademàs dificultades para el laboratorio, particularmente si relativamente los métodos de detecciôn utilizados no son especificos. Elegir la técnica de determinaciôn para abuso de opiaceos es también influenciada por factores taies como disponibilidad de personal experimentado, disponibilidad de capital para adquirir equipamientos y coste de réactives. Opiaceos_______________________________________________ kl______ 4.1.12 METODOS CROMATOGRAF10OS La cromatografia en capa fina (TLC) es ampliamente usada en procedimientos cromatogrâficos para detecciôn de opiaceos. Taies procedimientos basados en previa fase de extracciôn liquida o sôlida de muestras de orina son usadas para detectar comunmente opiaceos y algunos de sus metabolitos en concentraciones por encima aproximadamente de 1 mg/mL (10). En muchos métodos la orina es extraida a pH=8-9 sin hidrôlisis para optimizar la recuperaciôn de morfina sin extraccciôn de conjugados glucurônidos o sulfatos mâs solubles en agua. La no utilizaciôn de la hidrôlisis de las muestras de orina disminuye la sensibilidad del procedimiento particularmente para la detecciôn de morfina, la cual esté principalmente présente en orina unido al 3-glucurônido. Previa hidrôlisis de muestras de orina puede ser transportado por cal or con âcido fuerte o por tratamiento con betaglucuronidasa, siendo esta ahadida durante un tiempo considerable para que se produzca la reacciôn de hidrôlisis âcida en caso de la primera o hidrôlisis enzimâtica en caso de la segunda alternativa.La presencia de morfina sin hidrolizar en muestras de orina estâ generalmente asociado con reciente uso de heroina, mientras que las muestras detectadas con morfina seguida la hidrôlisis indica menor posibilidad de ingesta reciente. Un procedimiento alternativo es hidrolizar sôlo las muestras que estân positivas en inmunoensayo. Con la cromatografia de capa fina de alta eficacia(HPTLC) Qpiâceos_________________________________________________ 42. es una técnica mâs refinada de la TLC, mâs râpida y sensible. Los extractos pueden ser aplicados con un muestrador automatizado y las drogas acto seguido pueden ser cuantificadas por densitometria(10). 4.1.13 Cromatografia a Gas y Cromatografia a Gas- Espectrometria de Masas (GC Y GC-MS) La cromatografia a gas capilar sôla o en combinaciôn con espectrometria de masa, ha sido usada para indentificar morfina y sus congéneris en fluidos biolôgicos. En laboratorio con experiencia de GC, es una técnica de confianza para la confirmaciôn de opiaceos en muestras de orina encontradas estas positivas para opiaceos por inmunoensayo. La combinaciôn de GC con MS es una técnica particularmente poderosa para la identificaciôn inequivoca de opiaceos. La monitorizaciôn selectiva iônica(SIM) provee suficiente sensibilidad para la confirmaciôn de resultados de inmunoensayos bado umbrales de concentraciôn de 300 ug/L. En particular si ha sido usado para la identificaciôn de 6 MAM en orina con evidencia inambigua de ingesta de heroina. Las técnicas de dérivâtizaciôn taies como trimetilsililaciôn son necesarias para producir compuestos con buenas propiedades cromatogrâficas y caracteristicas de espectro de masa de ionizaciôn de electrones. La desventada de taies técnicas son relativamente elevado costo de los equipamientos y el demorado tiempo de anâlisis(lO). Opi&ceos________________________________________________43____ 4.1.14 Cromatografia Liquida de Alta Eficacia (HPLC) En aftos recientes se han descrito un largo nûmero de técnicas de HPLC para determinaciôn cualitativa y cuantitativa de opiaceos en fluidos biolôgicos, generalmente con el uso de detecciôn electroquimica la cual es capaz de incrementar la sensibilidad y selectividad. Sin embargo las técnicas de HPLC son en la actualidad de pequefia utilidad en laboratories de rutina, tanto para determinaciôn preliminares o para confirmaciôn de opiaceos en muestras de orina encontradas ser positivas para opiaceos por inmunoensayo. Es quizâ decepcionante esta técnica en vista de la escasa habilidad en resolver ambas formas de opiaceos la libre y la conjugada. La mayor desventaja de apiicaciôn de esta técnica es el elevado costo y el requerimiento de pericia para su operaciôn, y el relative demorado tiempo de anàlisis. 4.1.15 Técnicas Inmunolôgicas de Anàlisis de Opiâceos Los inmunoensayos para ambas anàlisis el cualitativo y cuantitativo de opiaceos estân comercialmente disponibles y son basadas en una de las 4 principales técnicas: 1- Técnica de Inmunoensayo Mûltiple Enzimâtico(EMIT), 2-Inhibiciôn de hemaglutinaciôn, 3- Inmunoensayo de Fluorescencia Polarizada(FPIA), 4- RIA inmunoensayos. Difieren todas ellas ampliamente en sensibilidad y reactividades cruzadas a morfina y otros opiaceos (tabla 2). Qpiâceos________________________________________________ 44_____ La sensibilidad de estos ensayos varia considerablemente. En situaciones reales puede ser mâs compleio devido a diferente reactividad cruzada respecto a morfina-3-glucurônido o otros opiaceos y sus metabolitos. Estos ensayos especificos son ademâs menos utiles como investigaciôn preliminar para uso de opiaceos. y son mâs apropiados para estudios farmacocinéticos de morfina o para el anàlisis cuantitativo de morfina en muestras forenses. En un estudio realizado en muestras de orina colectadas después de administraciôn conocida de dosis de heroina, morfina y codeina fueron testados inmunoensayos para opiaceos de Abbott TDX. Roche Abuscreen y Syva EMIT. Los resultados cuantitativos fueron comparados con resultados con Gases Masa(GC/MS). Los resultados estuvieron bien correlacionados con gases masa sobre un amplio rango de concentraciôn. Hubo sustancial variabilidad en resultados de codeina por inmunoensayo. Un inmunoensayo simple barato basado en inhibiciôn de hemaglutinaciôn(HT) usa viales sellados con eritrocitos congelados a seco recubiertos con anticuerpos. El test es cargado por reconstituciôn del vial contenido con agua, aftadiendo un pequefto volumen de muestra de orina y observando la sedimentaciôn del patrôn una hora mâs tarde. El test es bastante sensible para morfina, metabolitos de morfina y otros opiaceos, taies como codeina, y dihidrocodeina. Sin embargo el procedimiento puede algunas veces fallar si las instrucciones del manipulador del test no son seguidas ezactamente. Han ocurrido también problemas con la calidad OpiâceQS A 6 de ciertos lotes de réactives y resultados ambos falsos positives y falsos negatives pueden obtenerse. Devido a esto este sistema no goza de confianza y no puede ser recomendado como un procedimiento de investigaciôn para opiaceos. Syva* Syva* Abbott** PE’ PE’ Roche' DPL' DPL' Assay EMIT-d.a.u opiate EMIT-st opiate ADjt/TDx opiate PFI-20 PFI-20 Abuscreen Coat-a-Count Coat-a-Count opiate morphine morphine morphine (scrum) morphine (urine) Technique EMIT EM IT FPIA FPIA FPIA RIA RIA RIA Sample Urine Urine Urine Urine Urine Urine/blood Serum Urine Opiate cross-reactivity Morphine lOOW lOOW 100% 100% 100% 100% 100% 100% Morphine-3- glucuronide 24W 33% 47% 48% 0 001% 80% 0-04% 0 2% Normorphine 0-5W — 4% — — — 9-5% — Codeine 1049, 100% 127% 217% 0-001% 110% 0 06% 0 2% Dihydrocodeine 939, — 48% 132% 0 001% — 0 05% — Qualitative cut-off 0>g/L morphine)’ 300 500 200 10 000 1000 40 25 25 *Syva UK Ltd, Maidenhead, UK. **Abbott Diagnostics Division UK Ltd, Maidenhead, UK. T E " Perkin Elmer Ltd, High Wycombe, UK. ’Roche Diagnostics, Welwyn Garden City, UK. •DPL. Llanberis, UK. ’Differentiation between ‘positive’ and ‘negative* opiate. EM IT = Enzyme multiplied immunoassay technique; FPIA « fluorescence polarization immunoassay; RIA • radioimmunoassay. Tabla 2. Relativa reactividad cruzada entre inmunoensa­ yos de opiaceos. Tomado de Braithwaite et al.(10) La hidrôlisis de muestras libera conjugados de morfina previa extracciôn que puede mejorar la realizaciôn de la cromatograf i a en capa fina, pero sin embargo la HPTLC (cromatografia de capa fina de alta eficacia) podria ser màs apropiada. De preferencia HPLC, GC capilar con detecciôn nitrôgeno fôsforo o GC-MS. Las muestras positivas por Opi&GGOS_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 46 inmunoensayos pueden ser de forma màs potente confirmadas por técnicas cromatogrâf i cas. 4.1.16 TIEMPOS DE DETECCIÔN EN INMUNOENSAYOS El tiempo de detecciôn medio en general en las reacciones cruzadas inmunoensayos TDX. Abuscreen y EMIT es de 15 a 44 hs tienen nivel de umbra1 de 300 ug/L , después de la administraciôn de heroina y morfina y 3 3 - 5 4 hs después de administraciôn de codeina(lO), 4.1.17 Interpretaciôn de resultados en Inmunoensayos El procedimiento recomendado para la detecciôn preliminar y confirmaciôn de opiaceos en muestras de orina de drogas de abuso requiere la apiicaciôn de lo minimo dos diferentes técnicas. para la detecciôn preliminar en muestras de orina se prefiere un ràpido inmunoensayo isotôpico de reacciôn cruzada con todos los opiaceos comunes(morfina, codeina, y dihidrocodeina) y sus metabolitos. Los dos ensayos màs disponibles son el EMIT ensayo de opiaceos con umbra1 de 300 ug/L o el ensayo FPIA con umbra1 de 200 ug/L. La elecciôn entre estas dos técnicas dependerà de la carga de trabaio del laboratorio y la disponibilidad de existencia de instrumentaciôn. El procedimiento por el sistema Toxi-lab TLC tiene ventaja de ser barato y puede usarse para la detecciôn de opiaceos. Qpi.4ce-as_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 42. Sin embargo la sensibilidad es màs pobre que la técnica de inmunoensayo, El uso de GC capilar sôla o combinada con espectometria de masa es un procedimiento de confianza para confirmaciôn de la presencia especifica de opiaceos(10). Las pruebas en orina para opiaceos generalmente dependen de la detecciôn de morfina total y del hallazgo entre la suma de la morfina libre(inalterada) y la morfina conjugada. No obstante el procedimiento no es especifico para la heroina, porque la morfina puede estar présente como resultado de toma de heroina, morfina, codeina o incluso por ingesta de semillas de amapola, El legitimo uso de codeina puede usualmente ser distinguido por la presencia de una elevada relaciôn o cociente de codeina/morfina en orina, aunque puede ser algunas veces limitado cuando solo la morfina es detectable después de administraciôn de codeina(13). Por otra parte después de la administraciôn de heroina o de la ingesta de semillas de •amapola, predominan los metabolitos de la morfina en la forma libre y conjugada, visto que la codeina està présente en mucho menos cantidad. Intentes se han realizado para determiner cual tipo de opiâceo fue administrado basado en la abundancia de morfina o codeina en orina, pero existen problemas en este intente simpliste de acercarse a una correcte interpretaciôn, primero porque la simple presencia de codeina en orina no indica que la codeina ha sido usada de forma abusive, o sea que no se puede asegurar que haya ocurrido abuso de la codeina. porque puede haber sido introducida en el organisme como contaminante de la heroina o por consumo de semillas de Qpi&ceos_______________________________________ 46 amapola. En segundo lugar la ingesta de codeina de forma oral se metabolize rapidamente a morfina(14). La diferenciaciôn o distinciôn entre toma de heroina, morfina, o ingesta de semillas de amapola requiere estrategias adicionales entre las cuales podrian incluirse ensayos para un marcador especifico para heroina la 6-MAM y la evaluaciôn de signos clinicos de abuso de opiàceos. La codeina es detectada frecuentemente en la orina de usuarios de heroina, pero su presencia es faciImente atribuible a impurezas, siendo esto demostrado claramente por (SIM) monitorizaciôn iônica selectiva(13). No obstante très factores relevantes deben llevarse en consideraciôn siempre que se interpreten resultados de pruebas de opiàceos: 1- la contaminaciôn de heroina por codeina, 2- la presencia de morfina y codeina en semillas de amapola, y 3- la diferencia en las razones o cocientes de las tasas de excreciôn urinaria de codeina/morfina. Las muestras de orina colectadas durante la ûltima fase de eliminaciôn de opi&ceos conteniendo solo morfina o una razôn de morfina/codeina elevada, permitir&n asegurar que la presencia de morfina y la ausencia de codeina puede no ser un v&lido indicador de administraciôn de morfina o heroina, sino que puede sugerir que ocurriô administraciôn de codeina. En estos casos la interpretaciôn de resultados analiticos forenses de opi&ceos requieren una compreensiôn de la cinética de eliminaciôn de ambas formas libre y conjugada de los metabolitos de la droga, siendo imprescindible el estudio de las varia rutas de administraciôn de la droga como Opiàceos__________________________________________ factor que dependa e influencie el metabolismo de la droga(14). Cannabis_________________________________________ _________ 4.2 CONSIDERACIONES ACTUALES SOBRE EL METABOLISMO DEL CANNABIS 4.2.1 INTRODUCCIÔN El cannabis o caflamo indico es una planta (Cannabis sativa), que contiene muchos compuestos quimicos entre los que se destaca el Delta-9-THC psicotrôpico primario. La résina del caflamo denominada hash is que se consume ord inari ament e fumada es m&s enriquecida en este principio activo(23), cuya principal actividad farmacolôgica lo constituye el delta-9- tetrahidrocannabinol, que es un compuesto inestable y considerado un precursor del cannabinoKCBN)(1). La planta del caflamo fue utilizada secularmente por las culturas orientales y diverses sociedades como una poderosa sustancia psicoactiva alucinôgenaC22,24). El cannabis es un vegetal que cresce de forma silvestre o por cultivos en zonas tropicales y templadas. Es una planta dioica que cresce por separado plantas macho y hembra(l), siendo responsables por las propiedades psicoactivas del cannabis las flores y hojas adjacentes de ambas plantas hembra y macho. El principal componente psicoactivo de la marihuana es el delta-9-THC, no obstante este vegetal tiene màs de 60 componentes denominados cannabinoides(18), siendo para la mayoria de ellos desconocidos en el organisme sus efectos fisiolôgicos y no poseen propiedades psicoactivas. Se consume preferiblemente fumandola a partir del prepare de las flores y Cannaliis___________________________________________ 51. hojas secas de la planta Cannabis sativa, variando en concentraciôn de principio activo segun la cepa entre 1 y 14% de THC. Otra variedad es el prepare de la résina segregada de las hojas del Cannabis o a partir del hervido de la misma, cuya potencia de principle activo oscila entre 10-20% de THC. Otra modalidad de preparado es a partir de la destilaciôn de este vegetal en disolventes orgànicos, potenciando una mayor concentraciôn de principle activo de THC entre 15 y 30%(25,26). 4.2.2 FARMACOLOGIA Los efectos farmacolôgicos del delta-9-THC varian con la dosis, la via de administraciôn, la experiencia del usuario y la vulnerabilidad a los efectos psicoactivos dentro del marco de esta adicciôn. Los efectos derivan directamente de la dosis suministrada variando en los cases mâs severos de intoxicaciôn por reacciôn adversa a la droga desde una reacciôn psicôtica con toda una gama de transtornos del intelecto, pasando por una sensacion de euforia, relaJaciôn, somnolencia a moderadas alteraciones de la percepciôn y de la nociôn del tiempo y el espacio(21). La intoxicaciôn con marihuana produce cambios en el humer, percepciôn y motivaciôn,sin embargo los efectos buscados por la mayoria de los usuarios es la levitaciôn y sensaciôn de suavidad. Los efectos varian con la dosis, siendo en el case de la marihuana fumada de una duraciôn de 2 horas. Durante este tiempo ocurre Cannabis_________________________________________________ 52. una disminuciôn de las funciones cognitivas, de la percepciôn, del aprendizaje y alteraciones en la memoria. También surgen prejuicios sobre la coordinaciôn motora y el comportamiento de forma transitoria, que persisten algunas horas con obvias implicaciones en el rendimiento y la calidad en la productividad laboral muy particularmente en la operaciôn y manejo de vehiculos motores. Las alteraciones comportementales producidas por el consume de la marihuana son complejas, tales como vértigo, y aumento del apetito. Si bien se ban referido per parte de usuarios de esta droga aumento del plazer sexual y de la perspicacia. Reacciones desagradables pueden ocurrir tales como p&nico o alucinaciones hasta psicosis aguda, siendo referido un minime de ansiedad en un 60% de los usuarios de marihuana. Estas reacciones comummente parecen ser con elevadas dosis y relacionadas con el consume oral de la hierva, que de la marihuana fumada, debido a que el fumar la droga permite una regulaciôn de las dosis de acuerdo a los efectos. No hay evidencias convincentes que la marihuana pueda producir por ûltimo sindrome pseudoesquizofrénico. No obstante existen numerosos informes clinicos que se inclinan hacia la marihuana ser capaz de precipitar el surgimiento de la esquizofrenia en personas predispuestas o con antecedentes de esta enfermedad. Use de los efectos mâs controvertidos y contestados es la producciôn de un sindrome amotivacional. Este sindrome no estâ diagnosticado oficialmente, sin embargo ha sido descrito en gente joven quienes se abstienen de actividades sociales y CLannahls_____________________________________________ 52 muestran poco interés escolar, por el trabajo u otras actividades(27). 4.2.3 METABOLISMO Y FARMACOCINÉTICA El delta-9-tetrahidrocannabinol (THC), el principal constituyente psicoactivo de la marihuana es rapidamente transfer!do de los pulmones a la sangre durante el fumado de la hierva. El metabolismo oxidativo del THC produce un metabolite activo el 11-hidroxi-delta-9-tetrahidrocannabinol (11-OH-THC) y el metabolite inactive ll-nor-9-carboxi-delta-9- tetrahidrocannabinol(THC-COOH). La caracterizaciôn de la fase de absorciôn de los cannabinoles es importante porque rapidamente pénétra el THC en el sistema nervioso central produciendo sus efectos psicoactivos, siendo los niveles del 11-OH-THC sustancialmente mâs baies que los del THC. Por otra parte la formaciôn de metabolites de THC se debe a la hidroxilaciôn microsomial del THC que produce el 11-OH-THC y la oxidaciôn de este produce el metabolite inactive (THC-COOH) que se incrementa gradualmente y exceden los niveles del THC después de fumar el cannabis. El curso de tiempo de detecciôn del THC-COOH es mucho mâs largo que el del analito activo. Este tiempo extendido de detecciôn de estes metabolites se debe a la lenta liberaciôn y subsecuente metabolismo del THC de los teiidos almacenadores. El mayor metabolite del delta-9-tetrahidrocannabinol encontrado en orina es el ll-nor-delta-9-tetrahidrocannabinol gannabig________________________________________ 56_ (THC-COOH), el cual persiste en ambas formas libre y coniugada con âcido glucurônido. Se considéra que la presencia de concentraciones iguales o mayores de 15 ng/mL, determinadas en anàlisis de espectrometria de masa en muestras de orina indican positividad de uso de marihuana(21). La marihuana y otros productos del cannabis son usados ya sea fumado o ingerido, produciendo disturbios comportemen­ tales, perceptives, afectivos y cognitivos en los usuarios. El constituyente del cannabis, responsable por la mayoria de esta respuesta psicoactiva es el delta-9-tetrahidrocannabinol o THC cuya respuesta psicoactiva interfiere con efectos desfavora­ bles para realizar actividades complejas de destrezas de coordinaciôn motora(28). La via metabôlica del THC es mostrada en(figura 5), esta râpida tranformaciôn de los cannabinoides en una variedad de metabolites ocurre a nivel hep&tico y concretamente por la participaciôn en esta degradaciôn del citocromo P450(figura 6) que produce en primer término la formaciôn de derivados monohidroxilados que por su vez son metabolizados en derivados polihidroxilados y sucesivamente en cetonas, aldehidos y acides carboxilicos, entre los cuales el principal metabolito determinado en plasma y orina es el 11-nor-THC-9-carboxilico (21). El sistema monooxigenasa citocromo P450 es una fami lia de enzimas, siendo el mayor catalizador de reacciôn de biotransformaciôn de drogas. Es considerada una superfamilia de enzimas catalizadoras con una amplia variedad de reacciones Cannabis oxidativas y reductivas, que poseen actividad para un grupo diverse de sustratos quimicos. -TCH 11CH3 OH EPOXIDOS CANNABINOL HEXAHIDROCANNABINOL MONOHIDRaXI CONJUGADOS DIHIDROXI CETONA O ALDEHIDO A cm o TTUHIDROXI Figura 5. Via Metabôlica de los Cannabinoides. Tornado de Monografia de Drogas de Abuso,ABBOTT(21). Las enzimas citocromo P450 son proteinas que contienen en sus membranas "heme", localizadas en el reticulo endoplasmàtico liso(REL) de numerosos teiidos. Estas hemoproteinas estân en asociaciôn muy prôxima con una segunda proteina de membrana:;, la NADPH-citocromo P450 reduc tas a en una relaciôn de cerca de 10 moléculas de citocromo P450 por una de reductasa. La interacciôn entre el citocromo P450 y proteinas reductasa es facilitada por la doble capa de llpidos en la cual ellas est&n colocadas. Las reacciones oxidativas catalizadas por el sistema microsomial monooxigenasa requiere para su funcionamiento la citocromo P450 hemoproteina, NADPH- citocromo P450 reductasa, NADPH y oxigeno molecular. Gannabia_______________________________________________ ^ ______ Las reacciones de sustratos xenobiôticos con la forma oxidada(Fe3+) del citocromo P450 forma un compleio enzima sustrato. El citocromo P450 reductasa acepta un electrôn del NADPH el cual reduce el compleio citocromo P450-xenobiôtico oxidado. El compleio reducido citocromo P450-sustrato(Fe2+) reacciona con oxigeno molecular y un segundo electrôn de NADPH es donado a través de la reductasa flavoproteina para formar una especie de oxigeno activado. En el paso final un àtomo de oxigeno es liberado como H20 y el segundo âtomo de oxigeno es transferido al sustrato. Sobre liberado el sustrato oxidado, la enzima citocromo P450 oxidado es regenerado. Las biotransformaciones oxidativas catalizadas por citocromo P450 monooxigenasas incluyen cadenas arom&ticas y hidroxilaciôn, dealquilaciôn, deaminaciôn, dehalogenaciôn y desulfuraciôn. Un numéro de reacciones reductivas también son catalizadas por las enzimas citocromo P450 generalmente debaio de condiciones de escasa tensiôn de oxigeno. La caracterlstica comùn estructural de los diversos grupos de xenobiôticos oxidados por las enzimas citocromo P450 es su elevada liposolubilidad (tabla 1)(27). Cannabii _52. d = drug cytochrom e P450 Figura 6, Mecanismo de oxidaciôn de drogas por Citocromo P450. Tomado de Goodman e Gilman's(27). La biotransformaciôn de las drogas responds a las caracteristicas lipofilicas de las drogas que promueven su paso a través de las membranas biolôgicas y subsecuentemente acceden a los sitios de acciôn con la finalidad de impedir su eliminaciôn del cuerpo. La excreciôn renal de las formas inalteradas juega solo un papel modesto en todo el proceso de eliminaciôn. Los compuestos lipofilicos filtrados a través de glomérulos son amp li ament e reabsorbidos a través de las membranas tubulares. La biotransformaciôn de las drogas y otros xenobiôticos en metabolites màs hidrofilicos es por lo tanto esencial para la terminaciôn de su actividad biolôgica y la eliminaciôn de estos compuestos del cuerpo. En general las reacciones de biotransformaciôn generan mâs metabolites inactives polares que son rapidamente excretados del cuerpo. Cannabis No obstante en algunos casos son generados metabolites con actividad biolôgica potente o propiedades tôxicas. Las reacciones de biotransformaciôn de droga son clasificadas en dos fases I y II. Las reacciones fase I de biotransformaciôn generalmente resultan en la pérdida de actividad farmacolôgica, si bien existen casos en donde ocurre aumento de actividad. Raramente el metabolismo ha sido asociado con una actividad farmacolôgica alterada. Los productos metabôlicos de la fase I surgen fundamentalmente por hidrôlisis o ligaciones con esteras, siendo excretados en orina o entonces reaccionando con compuestos endôgenos para formar coniugados solubles en agua.(tabla 3) Reacciones oxidativas Reacciôn Edemplos N-dealquilaciôn RNHCH3 ----- > RNH2 + CH20 codeina,morfina 0-dealquilaciôn R0CH3 > ROM + CH20 code ina deaminaciôn OH R Ç H C H a -^ R -Ç -C H j-^ R -C -C H a + NH, NH, NH, diazepan,anfetaminas Reacciones conjugaciôn glucuronidaciôn morfina,diazepan THC Tabla 3. Reacciones de biotransformaciôn de drogas de abuso. Modificado de BENET,Z.L. e cols.(27). QannaMs________________________________________^ _______ Las reacciones fase II consisten en reacciones de conjugaciôn con ventaia de formar uniôn covalente entre grupos funcionales de compuestos parientes con âcido glucurônido, sulfato, aminoàcidos o acetato. Estos conjugados de elevada polaridad son generalmente inactivos y son excretados rapidamente en orina y heces como es el caso de la eliminaciôn del THC(27). El delta-9-THC al sufrir biotransformaciôn por la acciôn de citocromo P450 en higado produce los derivados 11-hidroxi- delta-9-THC y este el delta-8-THC a partir del cual se origina el ll-hidroxi-delta-8-THC. Estos originan otros metabolites mas polares y de menor actividad como el àcido ll-nor-delta-9- THC carboxilico, siendo este el metabolito mâs abundante en plasma y orina con capacidad de conJugarse con âcido glucurônido para su eliminaciôn en orina(18). Una caracterlstica farmacocinética de los cannabinoides es su elevada solubilidad en lipidos y baJa en agua, este factor juega un papel muy importante en la metabolizaciôn de esta droga y en la persistencia de sus efectos psicoactivos explicando en gran medida la elevada vida media de esta sustancia devido a su retenciôn en lipidos corporeos. Al ser la via de administraciôn fumada la mâs frecuente de consume del cannabis, los efectos de la droga van depender de la velocidad del fumado, del volumen inhalado, asi como del tiempo de retenciôn del humo inspirado en los pulmones. Se estima que cerca del 20% de delta-9-THC este contenido en el Cannabis_____________________________________________ èû_ humo inhalado del cannabis. Por otra parte el consumo oral menos habituai transforma el delta-9-THC en 11-hidroxi-delta- 9-THC por la acciôn de los âcido gâstricos causando efectos similares a los producidos en la modalidad fumada siendo no obstante de mayor intensidad y duraciôn. Se estima que el mecanismo de acciôn sea por depresiôn global del sistema nervioso central. Otra posibilidad es que actuen sobre los receptores benzodiacepinicos o inclusive por un mecanismo de receptores especificos(25). En virtud de la elevada afinidad lipofllica del THC es lento su retorno al plasma observandose una presencia de concentraciones de THC mensurables en plasma y orina muchas horas y hasta varios dias después de la ûltima administraciôn de la droga a través de métodos inmunoquimicos cuya sensibilidad del test dependerâ evidentemente del punto de corte que consideremos(21). En nuestro estudio hemos empleado eut off de 25 ng/mL para el método FPIA, de 50 ng/mL para el Cedia y de 50 ng/mL para el KIM. La vida media de eliminaciôn del delta-9-THC es de aproximadamente 30 hs, siendo la tasa de excreciôn del 70% de la dosis inicial en la primera semana y de aproximadamente un 65% de la dosis eliminada por via fecal(18). Cannabis__________________________________ 61______ 4.2.4.- METODOS DE DETECCION La detecciôn de metabolites de marihuana asi como de otras drogas de abuso en fluidos biolôgicos se ha extendido notablemente por inmunoensayos(29). Sin embargo existen dificultades en su detecciôn debido a su elevada liposolubilidad y consecuentemente baia concentraciôn en fluidos orgânicos. Ademàs puede ocurrir problèmes con la estabilidad de esta sustancia en muestras de orina que puede reducir sensiblemente las concentraciones del THC y sus metabolites en el transcurso del tiempo, que por su vez estâ intrinsicamente relacionado con la temperature de conservaciôn de la muestra, de la cantidad de muestra de orina y del tipo de recipiente que acondiciona la muestra para que ocurra oxidaciôn del carboxi-THC(21). Fundamentalmente los anâlisis de laboratorio que permiten detectar la presencia de cannabinoides en fluidos biolôgicos, tienen por obietivo confirmer en primer lugar el consumo de marihuana(25). En una fase preliminar de estudio de drogas de abuso en fluidos biolôgicos se apiican técnicas de rastreo por inmunoensayo, en este estudio fueron utilizadas la fluorescencia polarizada(FPIA), el inmunoanâlisis por interacciôn cinética de particules(KIM) y el Cedia, cuyos principios de acciôn estân explicados en los apartados correspondientes en material y métodos. En relaciôn a métodos confirmatorios fueron usados la cromatografia de gases-espectrometria de masas por ser Cannabis________________________________________ &2_ entre los existantes en la actualidad el método de confirmaciôn mâs fiable(21). 4.2.5.- TNTERPRETACION DE RESULTADOS La interpretaciôn de resultados por inmunoensayos se presta a controversias. principalmente con relaciôn a la precisiôn de los métodos, puntos de corte, selectividad y confiabi1idad de resultados. Actualmente es una técnica estimada y preferida en estas determinaciones de metabolites de drogas de abuso en primer lugar por la facilidad que représenta la automatizaciôn del proceso y en segundo lugar por su elevado rendimiento de trabaio(29). Es imprescindible que estos resultados se interpreten en funciôn del historial clinico del paciente y se considéré la farmacocinética y el metabolismo de la propia droga de abuso(18). Cocalna_______________________________________________61. 4.3 CONSIDERACIONES ACTUALES SOBRE EL METABOLISMO DE LA COCAINA 4,3.1. Introducciôn La cocaina es un estimulante del sistema nervioso central(SNC), pero también actua como simpaticomimético y anestésico local(30), incrementando la presiôn sanguinea. la tasa cardiaca y la temperatura corporal. Dosis de 25 mg producer! euforia dentro de 2 minutos por administraciôn intravenosa o entre 3-5 minutos cuando tomada intranasalmente. Una serie de manifestaciones pueden seguirse entre 20 y 60 minutos después de la administraciôn de cocaina entre ellas un shock o estrépita sensaciôn de ansiedad, depresiôn, fatiga y el deseo por més cocaina, resultando en una acciôn fuertemente reforzadora en el adicto que culminaré. en repetidas dosis, pudiendo alcanzar el consumo entre 1 a 4 gr de cocaina y estados de hebriedad cocainica que podràn durar entre 1 y 24 hs(10,31). La cocaina es el principal alcaloïde extraida como pasta cruda de las hojas de la Erythroxylon coca(21,32). La pasta de cocaina es derivada de las hojas secas de coca, disueltas en una soluciôn de querosene o gasolina, bases alcal inas, permanganate de potasio y àcido sulfûrico. La pasta de cocaina contiene cocaina, sulfato, otros alcaloïdes de coca disolventes y adultérantes. La sal formada de clorhidrato de Cocaina M. cocaina es preparada de la pasta de coca mezclada con âcido clorhidrico y es soluble en agua(30,33). La pasta de coca recibe su nombre vulgar de nieve, coca, etc. Es prâctica frecuente convertir hidroclorato de cocaina a la base libre antes de su cornercializaciôn ilegal. La hoja de cocaina contiene numerosos alcaloides de los cuales el mâs amp1lamente conocido es la cocaina.( Figura 7) CH CH COOCH OCOC H H COOH OCOC H H Cocaine Dcn/oylccgoninc COOCH OH H 6 5 COOl 011 H 6 s Ecgoninc mclhyl ester Ecgoninc Figura 7. Estructuras de la cocaina y metabolites. Torna­ do de COLE.M.D.(1) La cocaina como base libre pueden ser extraidas de las hojas de la planta en la forma de aceite viscoso. El clorhidrato de cocaina o hidroclorato de cocaina liberada de los iones CIH o sal, deia la cocaina alcaloïde libre que puede ser ailada por precipitaciôn con âcido clorhidrico de una soluciôn orgânica de la base libre. La sal hidroclorato de _________________________________________&5_ cocaina tiene aspecto de polvo bianco conocido como nieve, cuando en soluciôn acuosa es precipitado con bicarbonato sôdico constituyendo el conocido crack(l,30). El crack es 25 a 100% base libre de cocaina pura y no requiere otro procesamiento quimico como el hidroclorato de cocaina, siendo el crack de inmediato y completamente absorbido cuando fumado con pipa de agua. Su baJo costo ha incrementado su disponibilidad en el mundo particularmente en usuarios adolescentes(33). El clorhidrato de cocaina se descompone con el calor y ademâs no puede ser fumado comparado con la base libre, la cual es dos veces mâs volâtil. Es también de mayor liposolubilidad y como resultado absorbida por via pulmonar muy rapidamente. El consumo de cocaina se ha incrementado particularmente por la variedad y versatilidad en el modo de vias de administraciôn. La cocaina snifada a partir del derivado de la sal de cocaina, o bien fumada del derivado de la base son formas de administraciôn que eliminan la necesidad de administraciôn endovenosa, esto hace que los efectos producidos sean casi instantaneos anâlogos a la inyecciôn intravenosa y es por esto probablemente que la prâctica del abuso de la cocaina de esta forma cuenta con una râpida eztensiôn de la adicciôn, asociado a la reducciôn de la contaminaciôn de enfemedades parenterales como la hepatitis C y el contagio del SIDA en el intercambio y manipulaciôn de ieringuillas(30,34,18). El abuso de cocaina ha alcanzado elevadas proporciones Cocaina______________________________________________ ùA. en U.S.A superando a la heroina, compitiendo con las anfetaminas. siendo actualmente las drogas estimulantes de abuso favoritas, constituyendose el mayor problema de droga. Hasta muy recientemente la cocaina usada en Europa fue confinada a elevadas élites por los elevados precios, siendo en la actualidad el principal blanco para la importaciôn ilegal(30). 4.3,2 FARMACOLOGIA El alcaloïde cocaina dériva del àcido benzoico éster benzolco del aminoalcohol ecgonina. Posee la estructura quimica de una base azoada, similar a la atropina con efectos farmacolôgicos antagônicos(21). La cocaina es directamente tôxica para el cuerpo y poderosamente tôzica al cerebro, estando las complicaciones del uso de la cocaina en funciôn de la ruta de administra- ciôn(35). Los efectos fisiolôgicos dependen del modo de distribuciôn de la droga en los ôrganos diana, de entre los cuales el cerebro es el ôrgano màs afectado por la cocaina, siendo decorrentes los efectos fisiolôgicos directamente de la interacciôn quimica entre la cocaina y receptores cerebra- les(33). La acciôn de la cocaina sobre la neurotransmi s i ôn dopaminérgica es lo que condiciona la conducta reforzadora de su uso. Las neuronas dopaminérgicas del àrea tegmental ventral tienen la funciôn de mediar las propiedades reforzadoras de las drogas de abuso. 62___________ Seguida a una administraciôn de cocaina por via parenteral ocurre inhibiciôn de la recaptaciôn de catecolami- nas y de serotonina(36), debido a un cambio conformacional del receptor para dopamina en presencia de la cocaina, disminuyen- do asi la afinidad por dopamina y en consecuencia reduciendose con esto su recaptaciôn. El incremento de dopamina en el espacio intersinàptico y la acciôn sostenida de la dopamina desencadena los eventos neuroquimicos(22), que ocurren en esta interacciôn causando disturbios mentales y de comportamiento. La base quimica del ciclo euforizante y del deseo de la cocaina es denominada "Teoria de la reducciôn de la dopamina". Al formarse circuitos neuronales en el cerebro a través de la intercomunicaciôn y uniones sinàpticas de milIones de células nerviosas, la participaciôn de neurotransmisores como la epinefrina, norepinefrina y dopamina afectan el centro cerebral del placer, siendo responsables por el elevado estado de ànimo. La cocaina actuaria evitando el acoplamiento de la dopamina en los receptores dopaminérgicos presinàpticos, impidiendo su metabolizaciôn y degradaciôn por la monoaminoo- xidasa(MAO) en el terminal presinàptico, siendo de esta forma la dopamina responsable por permanecer estimulando el receptor post-sinaptico de las neuronas receptoras ubicadas en el centro cerebral del placer o sistema de recompensa mesolim- bico, ocurriendo una hipersensibilizaciôn de las células receptoras a la dopamina en un esfuerzo de compensaciôn de su deficit cuando la dopamina desaparece de la sinapsis. Esta in- g.Q-G.aina____________________________________________6Æ terferencia de la cocaina en el equilibrio neurotransmisor es responsable por el sindrome de abstinencia que puede traducirse como el intento del cuerpo para recuperar este equilibrio, siendo producto de la reducciôn neurotransmiso- ra(30). Se relaciona también a la cocaina con otros efectos periféricos agudos descargados en el sistema nervioso simpàti- co como lo son estimulaciôn simpôtica mediada por neurotrans- misores norepinefrina y epinefrina en ôrganos como el corazôn causando taquicardia, hipertensiôn. A nivel tegumental la estimulaciôn simpâtica determinaré. sudoresis profusa, por otra parte causarà hiperpirexia y retenciones urinaria e intestinal ademas de los efectos cerebrales caracteristicos que causa como alucinaciones sensoriales, temblores, irritabilidad,con- fusiôn mental y convulsiones epileptiformes. Estos disturbios PSiquicos con alteraciones de la percepciôn subietiva se manifiestan mâs a menudo en el consumidor crônico, que podrâ acompafiarse de rinitis crônica y de perfuraciones del tabique nasal. Debido al efecto anorexigeno el cocainômano sufre de malnutriciôn que condiciona a una inmunodeficiencia y por lo tanto es mâs susceptible al riesgo de infecciones(21). En elevadas dosis de cocaina asi como en el abuso crônico los efectos en el SNC conllevan a la amnesia, delirio, estupor y coma. Estados de intoxicaciôn crônica pueden conllevar a convulsiones sostenidas que detienen la respiraciôn e inducen a arritmias cardiacas fatales, como taquiarritmias atrial y ventricular,las cuales son mâs probables de llevar al éxito C-Qcaina létal si existe predisposiciôn a problemas cardiacos. La presiôn arterial puede elevarse severamente y producir subito accidente vascular cerebral dependiendo de la susceptibilidad del individuo(33,36,22), 4.3,3 METABOLISMO Y FARMACOCINÉTICA El metabolismo de la cocaina ocurre por dos procesos principales, siendo uno de los cuales enzimâtico. El proceso de hidrôlisis enzimâtico relaciona las colinesterasas plasmâ- ticas y hepâticas y es cuantitativamente el mâs importante. El metabolito producido por esta hidrôlisis enzimâtica es la ecgonina metil ester (EME), El otro proceso de metabolizaciôn no enzimâtico o quimico conduce a la producciôn de benzoylec- gonina(BZE)(37)(Figura 8). COOCHj 0“ =-(O> Norcocolo4 .C O O C H j CHj n Q ^ O O C— Cocûin# I .COOH CHjnQ ^ O O C - ^ CH3N CO O C H j O H Ecçonn# mrrtiyl i COOH -CHjN I y - O H Ergonir* Figura 8, Metabolismo de la cocaina, Tomado de Braith waite etal,(10) gg.gaina______________________________________________Zfi___________ La cocaina es hidrolisada espontaneamente en orina, plasma y sangre a sus metabolites. La benzoylecgonina résul­ tante de la metabolizaciôn de la cocaina constituye 40% de la dosis administrada y puede ser detectada con precisiôn por técnica de inmunoensayo superior a 2 dias después de su administraciôn. La cocaina en forma inalterada se excreta en 1% del total de la dosis suministrada y puede ser detectado por cromatografia de gases-espectrometria de masas (GC-MS) en tan solo 24 hs(38). Entre 12 y 21% de la dosis de cocaina es metabolizada a EME(39), Cerca del 80% de la dosis inicial de cocaina es excretada en la forma de estos metabolitos benzoylecgonina (BZE) y ecgonina metil ester (EME). La vida media plasmàtica de la cocaina,BZE y EME son respectivamente 30 a 90 minutos, 7.5 hs y 4 hs. Si bien el hallazgo de la cocaina y sus metabolitos en fluidos biolôgicos no demuestra acciôn psicôtica, su presencia en estos a menudo suele xelacionarse a solo una exposiciôn previa de intoxicaciôn por cocaina. Debe por tanto a este propôsito utilizarse técnicas de investigaciôn toxicolôgica con la finalidad de cuantificar la droga en fluidos biolôgicos para correlacionarla con la duraciôn de los efectos farmacocinéticos en los estudios de los casos. En anâlisis forenses para la determinaciôn de co­ caina y sus metabolitos en muestras biolôgicas se utilizan y se recomiendan la técnica cromatogrâfica a gas acoplada a la detecciôn por espectrometria de masas. Otros detectores mâs sencillos que pueden utilizarse son el detector nitrôgeno-fôs- foro y ionizaciôn de 1lama. Ambas técnicas requieren dériva- Cocaina___________________________________________________ Zl_ tizaciôn de las moléculas, la cual se puede aplicar en técni­ cas automati zadas(1). En virtud de las susceptibilidades individuales, la vida media de eliminaciôn de cocaina en plasma es cerca de 50 minutos, con un rango de 16-90 minutos. Por via intranasal tiene un tiempo medio de 75 minutos, por via intravenosa es de 54 minutos, y por via oral es de un promedio de 48 minutos. Solo entre 1-9% de la cocaina aparece inalterada en orina, y esto es usualmente detectable solo en pocas horas. La excre­ ciôn de la cocaina depende del pH urinario, la exposiciôn a cocaina se observa mejor analizando metabolitos urinarios(fi- gura 7), por otra parte parece ser que la cocaina aparece es- table en cabello(10). La mayor ruta de metabolismo de la cocaina envuelve la hidrôlisis de cada. uno de sus dos grupos es ter es. La benzoylecgonina producida sobre pérdida del grupo metil représenta el mayor metabolito y puede ser encontrado en orina entre 2-5 dias después de la administraciôn de la ultima dosis siendo en los consumidores excesivos la posibilidad de encontrarse este metabolito hasta 10 dias seguido su ultimo consumo{22). Segun la forma de administraciôn de la cocaina tendremos distintas caracteristicas farmacocinéticas(21), siendo su bio- disponibilidad y consecuentemente de sus efectos en funciôn de varios factores como la pureza de la cocaina, modalidad de administraciôn, frecuencia de administraciôn, si esta es combinada con otras drogas de abuso (efecto sinérgico), de la ÇiK^inâ__________________________________________ 22. condiciôn fisica y mental del individuo consumidor y por ûltimo del entorno social del usuario de cocaina que juega un pape1 importante(30). La cocaina bloquea los receptores de transporte de dopamina incrementando la estimulaciôn dopaminérgica en sitios criticos cerebrales, ademàs bloquea la recaptaciôn de norepinefrina y serotonina por los receptores especificos de estos neurotransmisores, produciendo el uso continuado y crônico de cocaina cambios en estos sistemas de neurotransmi- siôn cerebral, causando interferencia en el metabolismo de estos neurotransmisores como es la reducciôn en la formaciôn del metabolito de la serotonina 5-hidroxindol âcido acético(5- HIAA)(27). La metabolizaciôn de cocaina a sus principales metabolitos BZE y EME es de 29-54% y 26-60% formadas respectivamente por la hidrôlisis quimica y por la participaciôn de esterasas plasmâticas y hepâticas. Las enzimas plasmâticas tienen elevada afinidad por la cocaina, por lo tanto la formaciôn de los dos metabolitos es similar, salvo en usuarios con deficiencia de colinesterasas(10). Todavia once metabolitos de cocaina pueden ser identificados en orina incluyendo ecgonina, ecgonidina y norcocaina, pudiendo también formarse metabolitos derivados de la conjunciôn con el alcohol etilico. El ûnico metabolito potencialmente activo es norcocaina encontrado en pequehas concentraciones (figura 8) entre 3-87 ug/L en orina, permaneciendo mâs de 4 horas después de una dosis intravenosa Cocaina_________________________________________________Z2 de 100 mg de cocaina. Sin embargo la ingestiôn simultanea de alcohol conlleva a transesterificaciôn de la cocaina a etil- benzoylecgonina(coca-etileno), la cual potencia las acciones y efectos en el SNC y tiene un largo tiempo de eliminaciôn. La detecciôn de la presencia de coca-etileno en cabello puede confirmar indirectamente ingestiôn de cocaina. El cocaetileno es toxicologicamente importante porque simultaneamente al usarse cocaina con etanol se prolonge la acciôn de la cocaina y consecuentemente sus efectos hepatotôzicos. 4.3.4.- MÉTODOS DE DETECCIÔN La cocaina es termolàbil, tendiendo a perder àcido benzoico para formar metil-ecgonidina. La hidrôlisis de la cocaina ocurre a pH 5.5 y su vida media en soluciôn acuosa disminuye progrèsivamente. La cocaina es mâs estable en soluciôn acuosa a pH 3-4, siendo estable a pH<4 por mâs de 24 dias a 242C, mientras la base es estable indefinidamente si almacenada en metanol a -152C. Sin embargo dejando BZE en metanol puede originarse su metabolito metilester. La BZE es mâs estable a pH 1.8 y en orina a pH 5-9 a 42C puede ser estable por 200 dias. Muestras almacenadas a pH 9 pierden mâs de 50% entre 20-30 dias, especialmente si almacenada a temperatura ambiante. 4.3.5.- Preparaciôn de la muestra La cocaina es facilmente extraida de fluidos biolôgicos _________________________________________________ZA_ a pH neutro con cloroformo y a pH>8 per la mayor!a de disolventes. Condiciones excesivamente alcalinas pH>9 deben evitarse para prévenir la hidrôlisis de la cocaina. Es debilmente extraida por disolventes lipofilicos. Las mezclas de disolventes incluidos alcoholes de cadena corta por ejemplo el diclorometano o cloroformo + etanol o propanol ban provado ser los mas eficientes, cloroformo/propanol(9:1), cloroformo/etanol(4:1) o diclorometano/propanol(3:1). Se ban désarroilado tecnicas en fase sôlida para extracciôn de cocaina y sus metabolites por métodos con cartucbo certify, que ban sido utilizados en la presente investig.aciôn, Los métodos cromatogrâficos a gas para detecciôn de cocaina y sus metabolites en orina requieren de un proceso previo de derivatizaciôn de sus grupos carboxilo para meJorar su cromatografia, esto confiera estabilidad y volatilidad a las moléculas y protecciôn de sus grupos polares. Se utilizan para derivatizar formas de metil ester, propil, isopropil, butil, ciclobexyl, silil, y pentafluoropropil esteras 4,3,6.- Cromatografia Liquida de Alta Eficacia (HPLC) La elevada solubilidad de la BZE ba becbo del HPLC un buen método para su detecciôn, sin necesidad de derivatizar. Buenos limites de detecciôn pueden ser alcanzados menores de 20 ug/L, siendo la preparaciôn de la muestra simple, Sin embargo puede ocurrir pérdida de âcido benzoico y formaciôn de ecgonina metil ester y ecgonina, siendo que estos componentes Cocaina_________________________________________________ tienen baja absorciôn ultravioleta (UV). Se ban utilizado detectores electroquimicos con éxito para la determinaciôn de estos metabolitos predominantemente con columnas C18 fase reversa. Las fases môbiles son generalmente el metanol y el acetonitrilo/âcido buffer(pH 2-3) a menudo combinado con una amina modificada, cloreto de sodio o un par iônico. 4.3.7.- MÉTODOS INMITNOLÔGICOS En relaciôn a los métodos inmunolôgicos la mayoria de los inmunoensayos son designados para detectar BZE y son relativamente especificos. Niveles urinarios de BZE después de dosis intravenosas de 1.5 mg/Kg de clorbidrato de cocaina exceden 10 mg/L sobre las primeras 24 boras. Después de una dosis de 20 mg de clorbidrato de cocaina en bombre adultos, la BZE es detectable en orina por EMIT a partir de un umbra1 de 300 ug/L superior a 40 boras. Después de una dosis de clorbidrato de cocaina de 1.5 mg/Kg tomado nasalmente, un método màs sensible el RIA tiene una sensibilidad 25 ug/L, detectando BZE en orina entre 72-144 boras, refiriendo resultados positivos superiores a 10 dias por este método después de uso de elevadas dosis de cocaina. La valoraciôn de las diferentes técnicas de inmunoensayos, Abbott ADX, Rocbe Abuscreen, EMIT, tienen una muy buena sensibilidad cuanto a evaluaciôn cuantitativa se refiere en relaciôn a la técnica confirmativa GC-MS. La incidencia de cocaina entre muestras de drogodependientes es del orden de 2-15%. Cocaina.___________________________________________________ TA. Para determinar que una muestra biolôgica es negative debe ser usado un inmunoensayo, debido a que la cromatografia capa fina no es suficientemente sensible(lO). 4.3.6.- TIEMPO DE DETECCION El tiempo para el cual la cocaina y sus metabolitos son détectables en orina después de su administraciôn es regido por algunos factores. Estos incluyen el tamafio de la dosis, el modo de administraciôn, vo1umen urinario y pH. el metabolismo individual y el limite de detecciôn del test del procedimiento utilizado. La cocaina puede ser detectado de 2- 4 hs después de una administraciôn de una dosis de 1.5 mg de clorbidrato de cocaina/Kg peso por cromatografia en capa fina con una detecciôn limite de 500 ug/L. Anàlisis de cabello permite monitorizar exposiciôn a cocaina durante meses. Para la determinaciôn de cocaina y benzoylecgonina(BZE) en casos foreuses los métodos analiticos deben tener una elevada especificidad. La técnica por excelencia para detecciôn de cocaina y BZE en fluidos biolôgicos es GC-MS, pudiendo también emplearse otros detectores no con la misma especificidad que el masas pero de significativa resoluciôn como son el GC/NPD y GC/FID (40).El GC-MS con el sistema de monitorizaciôn iônica(SIM) es el preferido para determinaciôn de cocaina y sus metabolitos en sangre postmortem(40.19).En la interpretaciôn de la toxicologia postmortem los patôlogos y toxicôlogos bacen incapie acerca de la relaciôn entre las concentraciones de analitos de drogas medidas en ___________________________________________________ IZ. muestras de autopsias y las concentraciones existentes en el momento de la muerte debido a que muchas drogas son secuestradas en los teiidos en vida por la propiedad lipofilica que poseen y son liberados en sangre en el intervalo postmortem. Esto puede causar elevaciôn dràstica de concentraciones de droga en sangre postmortem procedentes de algunos sitios viscérales(41). Anfetamin&s______________________________________________IS________ 4.4.C0NSIDERACI0NES ACTUALES SOBRE EL METABOLISMO DE LAS ANFETAMINAS 4.4.1.- INTRODUCCIÔN La anfetamina y metanfetamina son poderosos estimulantes del sistema nervioso central(SNC),relacionados quimicamente y farmacologicamente con las catecolaminas. epinefrina y norepinefrina(42). las cuales tienen también acciones sobre el sistema nervioso periférico. Fue utilizado hace algunos aflos como anorexigeno para el tratamiento de la obesidad(l). Su pronunciado abuso potencial ha resultado en una dràstica reduccion en su uso médico. Dosis orales de 10-30 mg produce elevaciôn del huimor. incrementa confiaza en si mismo y la alerta con mejora de la forma fisica. El abuso crônico conduce al désarroilo de la tolerancia tal que algunos adictos consijimen o se inyectan 2000 mg diarios. Esto a menudo conduce a alucinaciones y psicosis bien como disforia y depresiôn en la abstinencia(lO). Las anfetaminas producen estado de alerta.de vigilia. incrementa la energia y la confianza en si mismo. reduce el hambre y aumenta la sensaciôn de bienestar. induce a psicosis con euforia y alucinaciones, pudiendo en determinadas circustancias de severa toxicidad conduzir a la muerte.la dosis létal suele estar alrededor de 20-25 mg/Kg de peso corporal(21). Las anfetaminas màs comunes son la d- anfetamina, d-metanfetamina y d,1-anfetamina. Su indicaciôn y utilizaciôn en cl inica esté limitada al tratamiento de la Anfetaminas______________________________________________12. narcolepsia y desordenes del deficit de atenciôn. La inducciôn a la tolerancia y dependencia psicolôgica en relaciôn con el consumo de elevadas dosis la destaca para su abuso. La d-anfetamina es cuatro veces més potente estimulante del SNC que la d,1-anfetamina, teniendo mucho mayor potencial para el abuso. Las anfetaminas pueden tomarse oralmente, intravenosa-mente, fumarse o inhalarse por via nasal(43). Son sustancias psicoestimulantes sintetizadas en laboratorio denominadas drogas de disefto, muy utilizadas como droga de diversiôn de grupos jovenes, sus principales efectos son estimular el estado de alerta o vigilia y la euforia ademés de producir rapidamente tolerancia. El consumo progrèsivo y continuado puede evolucionar a un estado psicôtico tôxico con alucinaciones auditives y visuales, pudiendo producirse éxito létal por depresiôn del centro respiratorio bulbar(1,22). 4.4.2.- METABOLISMO Y FARMACOCINÉTICA Anfetamina y metanfetamina son derivados de feniletilamina(l)(figura 9), otros congéneris taies como mefentermina,fentermina y dietipropion también tienen similares propiedades anoréxicas y estimulantes , y son ocasionalmente abusadas. Muchos otros complementos dietéticos y medicamentos antialérgicos contienen efedrina,pseudoefedrina o fenilpropanolamina. Anfetamina y metilanfetamina son Anfetaminas___________________________________________ &&. facilmente sintetizados por laboratorios ilicitos y la base libre o preparaciones fumables de metilanfetamina son conocidas como cristal o gelo. La MDMA(3,4-metilendioximetilanfetamina) o éstasis( fig.9) es un derivado de anfetamina ilicita usualmente tomada en dosis de 100-200 mg, la cual tiene actividad alucinôgena. La MDA(3,4.metilendioxietilanfetamina) tiene propiedades similares. La MDMA es usada casi exclusivamente como droga de recreaciôn. particularmente difundida en fiestas populares donde la musica pesada y ràpida requiere components de esfuerzo flsico, combinado con los efectos farmacolôgicos potenciados por la droga, causando paraielamente una exacerbaciôn hipertérmica corporal denominada hipertermia maligna acompaftada de un cuadro de severa desidrataciôn debido a carencia de fluidos corporales. Pueden ocurrir reacciones severas como convulsiones, rabdomiôlisis y insuficiencia renal aguda, incluso hasta la muerte en personas màs susceptibles después del uso de MDMA(10). Amplicüm inc McUiylaxnphcUniinc Mcihylcncdio\7aniphcuniine Mcihylcncdioxymclliylamphciaminc Figura 9. Estructuras de anfetamina y derivados. Tomado de COLE.D.M.(1). Anfetaminas__________________________________________SI________ La via de administraciôn de la anfetamina es preferible- mente oral, esta y la metilanfetamina son rapidamente absorbidas en el intestino delgado completandose su absorciôn entre 4 y 6 hs, por su elevada lipofilidad atraviesan rapidamente la barrera hematoencefâlica(22,18), Poseen una limitada uniôn a proteinas plasm&ticas, por lo que se encuentran en muy baias concentraciones plasm&tica del orden del 16%, con elevado volumen de distribuciôn(21), aparecen en orina después de 20 minutes de su ingestiôn. Una pequeha porciôn de la dosis de metilanfetamina es demetilada a anfetamina y otra es convertida a p- hidroximeti1anfetamina(figura 10). CH) ÇH) ÇH) ^ Q y ~ C K ^ C H N H CH)— »- C H^CH NH j — > CHCHNH^ OH Melhomphrtcmln# Amphefomine Phenyl proponolomine i 4 I I D^omingtloo ,p~hydroxyVTtion ond conjugohon Figura 10. Metabolismo de la Anfetamina. Tomado de Braithwaite et al.(10). La anfetamina es deaminada a fenil acetona, la cual es oxidada a écido benzoico(figura 11), una pequefta porciôn de anfetamina es convertida a fenilpropanolamina. Anfetaminas- <;|o )-chchnhj OH ÇH) <|0)— CHîCHNHj Amphefomin# GhjcufonW# and giycin# eonjugottoo p-Hydrwytatlcn ond conjugation I Benzoic ocid Figura 11. Metabolismo de la Anfetamina. Tomado de Braithwaite et al.(lO). El pH de la orina tiene un profundo efecto sobre la excrecion urinaria de ambos compuestos. En pH normal de la orina. acima del 43% de la dosis de metilanfetamina es eliminado inalterada en 24 hs en orina con 4-7% como anfetamina. Disminuyendo el pH de la orina alrededor de 5.0 incrementa estos valores a 76% y 7% respectivamente. En pH alcalino solo 2% de la dosis es metabolizada después de 24 hs como metilanfetamina y menos del 0.1% como anfetamina(10). El metabolismo de las anfetaminas ocurre en el higado de dos formas, por deaminaciôn o por hidroxilaciôn del anillo aromâtico de un lado de su cadena. Siendo la deaminaciôn la mayor via metabôlica en seres humanos con el producto final el àcido hipùrico que es conjugado con la glicina para su posterior excreciôn. La anfetamina es también excretada en la orina de forma inalterada. mientras la metanfetamina es parcialmente metabolizada a anfetamina. Las anfetaminas Anfetan^inas________________________________________________ _____________ aparecen en orina dentro de très horas después de cualquier forma de administraciôn y pueden ser detectadas por técnicas de inmunoensayo de 24 a 48 hs después de la ûltima dosis(5). Cerca del 30% de la dosis ingerida es excretada en 24 hs en orina bajo condiciones de pH urinario normal, pero en pH écidos aproximado a 5.0, cerca del 74% es eliminado en este mismo periôdo, este proceso es pH urinario dependiente debido que en orina alcalina la anfetamina se présenta en su forma no ionizada,siendo reabsorbida en tubulos renales, ya en orina écida ocurre lo inverso, en cuyo caso la excreciôn es màs abundante y râpida(21). Por otra parte en orina con pH alcalino se puede reducir su excreciôn a 1%. lo cual ha sido explotado por los abusadores de drogas. quienes toman amplias cantidades de bicarbonate sôdico para prolongar los efectos farmacolôgicos de las anfetaminas y al mismo tiempo reducir las cantidades disponibles para su detecciôn en la orina(lO). La vida media plasmâtica de las anfetaminas se altera en funciôn de la velocidad de excreciôn urinaria, disminuyendo cuando el pH urinario es àcido eliminandose cerca del 50% a 80% de la dosis administrada. y por el contrario persisten los niveles plasmàticos elevados cuando la orina es alcalina(18). La anfetamina posee una estructura quimica muy similar a las catecolaminas, debido a esta analogia estructural se caracterizan por tener propiedades simpaticomiméticas actuando sobre los receptores alfa y beta-adrenérgicos del sistema nervioso central. Por otra parte la presencia de grupos metilo en el lado alfa del nitrôgeno de la cadena résulta en que le Anfetaminas_______________________________________ BA_ confiere a la molécula propiedades inhibitorias de la acciôn de la enzima monoaminooxidasa, impidiendo la degradaciôn de catecolaminas(33). 4.4.3.- MECANISMO DE ACCIÔN Las anfetaminas actuan en las vias de recompensa cerebral (sistema mesolimbico), causando acentuada liberaciôn de dopamina del terminal presinâptico, consecuentemente se incrementa la actividad dopaminérgica en el sistema de recompensa, prolongandose los efectos de este neurotransmisor en el terminal sinâptico. debido a un aumento en la concentraciôn de dopamina por bloqueo de la recaptaciôn de dopamina y noradrenalina(23,22). 4.4.4.- MÉTODOS DE DETECCION La anfetamina y metilanfetamina son excretadas sustancialmente inalteradas en orina y por lo tanto los métodos de detecciôn son hacia los compuestos derivados de estas(lO). La metodologia utilizada para la detecciôn de anfetaminas en fluidos biolôgicos a lo largo de la historia ha sido a través de técnicas cromatogrâficas, fluorometria, microcristalografia, métodos colorimétricos, procedimientos espectrométricos ultravioleta, métodos de fluorescencia. radioinmunoensayo y enzimoinmunoensayo, siendo los métodos de inmunoensayo en la actualidad los màs utilizados en Anfetaminas_______________________________________ £L5l laboratorios clinicos para investigaciôn en orina humana, asi como la cromatografia a gas, como técnica confirmatoriaC 21.10). Devido a los inmunoensayos proveer sôlo un resultado presuntivo. se torna imprescindible utilizar técnicas anal iticas alternativas especificas basadas en un método quimico distinto para obtener un resultado analitico confirmâtorio, particularmente la cromatografia a gas- espectrometria de masas (GC-MS) es el método confirmatorio de elecciôn(21), ya que puede ocurrir reacciôn cruzada en el test de inmunoensayo para anfetaminas con otras especies farmacologicamente similares(43). Algunos eiemplos de reacciôn cruzada en el test de inmunoensayo de anfetaminas pueden ser con la clorpromazina, ranitidina, cloroquina. N- acetiIprocainamida, fentermina. efedrina y feni1propanolamina(21). 4.4.5.- MÉTODOS CROMATOGRAFICOS En relaciôn a la preparaciôn de muestras, las anfetaminas al ser excretadas excelentemente en disolventes a pH mayor de 10, permite un coeficiente de particiôn favorable al uso de disolventes de baja polaridad, lo que alcanza una extracciôn màs selectiva, el hexano, eter dietilico o eter di- isopropil son todos alternativas convenientes al cloroformo. Estas drogas son bastante volàtiles y perdidas sustanciales pueden ocurrir durante la evaporaciôn de extractos orgànicos. En cromatografia en capa fina las anfetaminas deben ser Antetaminas__________________________________________ 8A. convertidas a una sal àcido volâtil menor con reactivos, como acidos tartàrico, fosforico y hidrocloricos antes de evaporar a sequedad de nitrôgeno. El àcido hidroclôrico es preferido y el exceso de àcido es eliminado durante la fase de evaporaciôn. El eterdieti1ico es el disolvente de elecciôn debido a su punto de temperature de evaporaciôn. Si bien puede practicarse una extracciôn directe de anfetamina sin la necesidad del disolvente para evaporaciôn en un pequefio volumen (50 uL) de cloroformo de 2 mL de orina. Después de la centrifugaciôn una cantidad de la microextracciôn es inyectado en el cromatôgrafo a gas. El mismo principio ha sido usado en el método cromatografico a gas capi1er. usando el acetatobutil como disolvente. 4.4.6.- CROMATOGRAFIA A GAS Las aminas volàtiles taies como las anfetaminas, son idéales para adaptarse al anàlisis cromatografica a gas, pero la elecciôn de la columna es fundamental. Muchos sistemas disminuyen el rendimiento por picos asimétricos debido a la absorciôn sobre el material de soporte. Estos problemas pueden ser vencidos con pretratamiento del soporte con hidrôxido de sodio o potasio para suprimir la ionizaciôn. Dos columnas la Apiezon L con 10% de hidrôxido de potasio y la Carbowax 20M con 5% de hidrôxido potàsicos han provado su uso en laboratorio de rutina, siendo que estas columnas pueden usarse en cromatôgrafos a gas con varios detectores. El incoveniente de esta técnica es el surgimiento de colas en los picos, estas Anfetaminas_________________________________QJ_ pueden ser eliminadas siendo las muestras con anfetaminas primero acetiladas con àcido anhidrico. la derivatizaciôn de anfetaminas se ha empleado en la cromatografia a gas y se ha incluido en el método la formaciôn de trimetilsilil. tricloracetil. trifluoroacetil. heptafluorobutiril. y pentaflurobenzoyl derivados. Todos estos disponibles para coluirmas SE-30. OV-1 y OV-17. Las técnicas de derivatizaciôn con polifluoro cuando acoplado con detecciôn de captura electrônica. incrementa marcadamente la sensibilidad de detecciôn de anfetaminas en orina v niveles tan bados como 10 ug/L son facilmente detectados. Métodos conveneionales no derivatizado y con detecciôn ionizaciôn de 1lama ha detectado limites del orden de 100 ug/L. Sin embargo, estos procedimientos no son fàciles de estandarizar en pruebas de prog.ramas de rutina de drogas. La colijimna capilar de silica fundi da permite con fuerza v reproducibilidad hacer una detecciôn poderosa. En el caso del uso de detectores de ionizaciôn de llama y nitrôgeno fôsforo no es necesario derivatizar. Para lotes de muestras amplias un invector split/splitless puede usarse, permitiendo el uso de jeringas cromatogrâficas conveneionales con aguias de acero. las cuales son muy robustas. 4.4.7.Cromatografia a Gas-Espectrometria de Masas(GC-MS) El espectro de masa por ionizaciôn de electrones de anfetamina no està muy discriminada y es usual realizar formas acetil o isotiocianato derivado previo al anàlisis. Los Anfetaminas________________________________________ &&. fragmentos iônicos relevantes con masa/carga (m/z) 91 y 86 para el àcido benzôlico y isotiocianato, siendo el ion molecular 177. Es posible diferenciar anfetamina, meti1anfetamina y otras 9 aminas incluyendo efedrina, feni Ipropano lamina, 3,4-metilendioximetilanfet.amina y fentermina por cromatografia a gas y espectrometria de masa con SIM(sistema de monitorizaciôn iônica) después de derivatizar con anidrido heptafluorobutirico (HFBA) o 4- carbetoxihexafluoroburiri1 cloridro (4-CB), Debido a la disponibilidad de ionizaciôn auimica en ciertos tipos de bancos de espectrometro de masa, ha hecho posible diferenciar anfetamina y sus drogas anàlogas (metilendoximetilanfetamina) mucho màs facilmente. 4.4.8.- Cromatografia Liquida de Alta Eficacia (HPLC) El anàlisis de anfetamina con detecciôn fluorescente y columna C18 en fase reversa fue referido en 1981. Recientemente un amplio procedimiento de investigaciôn se ha désarroilado usando una técnica de preconcentraciôn sobre una precolumna envue1ta con absorbantes hidrofôbicos de cambio catiônico en serie. La identificaciôn de las drogas sin derivatizar fueron por detecciôn ultravioleta a 210 nm, Una amplia cantidad de tipos de anfetaminas con vasto rango de polaridad pueden ser detectados por este medio y el procedimiento puede ser totalmente automatizado, Otros trabajos se han concentrado sobre la detecciôn de la excreciôn de productos hidroxilados de anfetaminas y meti1anfetaminas, Anfetaminas______________________________________________&2_ usando extracciôn en fase sôlida y detecciôn electroquimica. Los datos de retenciôn por HPLC no son en media tan precisos como los alcanzados por cromatografia a gas. Ademâs la técnica HPLC es menos selectiva que la GC. Por otra parte al no excluir compuestos polares y no volàtiles. como consecuencia existe un potencial considerable para interferir con compuestos extrahos especialmente cuando el detector no selectivo ultravioleta es usado. 4.4.9.- MÉTODOS I1#UN0L0GIC0S El (RIA) radioinmunoensayo para anfetaminas en orina ha sido comercializado por Abuscreen. Roche diagnôsticos. en el cual el anticuerpo se lanza contra la d-anfetamina y tiene elevado grado de especificidad. la reactividad cruzada significativa viene a ser con p-hidroxianfetamina y p- metoxianfetamina. unas drogas ilicitas alucinôgenas. Si bien que no muestra reacciôn con dietilpropion. las muestras de orina de abusadores de drogas contienen metabolitos que pueden causar reacciones cruzadas. La reactividad cruzada con metilanfetamina es casi insignificante. pero resultados positivos pueden algunas veces ser obtenidos en orina debido a su conversiôn parcial a anfetamina. No obstante los ensayos no son un test de confianza para abuso de metilanfetamina, y esto es un claro incoveniente. AnfstamiJü&s__________________________________________ 9D________ 4.4,10.EMIT(Técnica de Inmunoensayo Multiple Enzimâtico) Los ensayos de detecciôn policlonal de anfetaminas metilanfetaminas y otras drogas feniletilaminas, en particular efedrina, pseudoefedrina y feniIpropanolamina, las cuales estàn présentes en descongestionantes, y al ser este ûltimo un metabolite de dietilpropion, el abuso de esta droga es también detectado por el sistema EMIT. El ensayo también exibe reactividad cruzada con MDMA y MDEA, pero con rendimientos de resultados positivos para concentraciones grandes entre 5000-10000 ug/L. Syva ha désarroilado un equipo de confirmaciôn para anfetaminas. el cual élimina interferencias de efedrina y feniIpropanolamina, pero no reacciones cruzadas de otras aminas. Un ensayo monoclonal EMIT d.a.u contiene 2 anticuerpos es màs especifico para d-anfetamina y d-metilanfetamina, y màs sensible respecte a MDMA que el equipo policlonal. El equipo monoclonal sin embargo tiene reacciôn cruzada con algûn metabolite de la fenotiazina y por lo tanto podria dar resultados false positivos, particularmente cuando usado para investigar psicosis inducidas por drogas de abuso. Con el surgimiento reciente del EMIT II ensayo monoclonal ha sido màs especifico que el EMIT d.a.u monoclonal, mostrando reactividad cruzada con benfetamina. benmetrazina y fentermina, bien como con 1- efedrina y mefentermina pero solo en elevadas concentraciones superiores a 200 mg/L. en suma la reactividad a d - y 1- anfetamina. d- y 1-metilanfetamina, MDA,MDMA, y MDEA. Los ensayos no detectan clorpromazina, cloroquina, N- Anfetaminas______________________________________________21. acetil-procainamida. quinacrina, ranitidina, y tiramina, las cuales son detectadas por el sistema EMIT d.a.u monoclonal. 4.4.11.- FPIA (Inmunoensayo de Fluorescencia Polarizada) En los equipos de test para diagnôstico de anfetaminas usadas en analizadores inmunoensayo de fluorescencia Polarizada(FPIA), poseen anticuerpos que tienen igual reactividad respecte de la anfetamina y metilanfetamina y tienen muy baja reactividad cruzada respecte efedrina y fenilpropanelamina, tanto como el anticuerpo de la anfetamina del EMIT. La ventaja de los ensayos monitorizados con drogas terapéuticas es que los instrumentes son calibrados una vez al mes probablemente permanecen estables por largos periôdos. Un analizador màs especializado como lo es el ADX tiene ventaja de analizar lotes de màs de un analito de diferentes test en variedad de combinaciones en muestras en serie. Esta tecnologia ha permitido habilmente cuantificar con exactitud concentraciones urinarias de drogas de abuso. 4.4.12.- REACTIVIDADES CRUZADAS DE INMUNOENSAYOS La tabla 4 muestra una amplia idea del rango de reactividad cruzada encontrada con alguno de los inmunoensayos comerciales. Las muestras que dan resultados positivos a anfetaminas deben siempre ser reanalizadas por una técnica cromatogrâfica. Anfetaminaa. 4.4.13.- TIEMPO DE DETECCION Después de una dosis de 10 mg de anfetaminas, concentraciones de ambas anfetaminas y metilanfetaminas alcanzan rango de 0.4 a 5 mg/L acima de las primeras 24 hs. Cambios en pH urinario pueden induzir profundas fluctuaciones en concentraciones de drogas tales que los ensayos menos sensibles (TLC.RIA) pueden dar negative y otras muestras resultados positivos de un mismo individuo. En la prâctica esto no es significativo porque los abusadores de anfetaminas consumen elevadas dosis y en todos los ensayos estan describes la detecciôn de anfetaminas por lo minimo durante 24 hs. Drug RIA FPIA (TDx) E M IT d.a.u. polyclonal E M IT d a .u . monoclonal E M IT 11 d-Amphetamine 100 90 100 250 100 dl-Amphetamine 50 100 100 100 67 d-Methylamphetamine 2-2 57 30 100 100 dl-Methylamphetamine — 57 — — 53 Diethylpropion 0* 0 0" — 0 1 Ephediine 0 0 30 2 0 7 Fenfluramine — 22 33 10 — Mephentermine 0 6 75 10 10 Methylenedioxyamphetamine (M D A ) 327 465 2*6 100 33 Methylenedioxymethamphetamine ( I ^ M A ) 0 6 84 2 8 33 17 Phenylethylamine 1 2 32 10 0 2 Phenmetrazine 0 1 0 30 1 17 Phentermine 1-7 6 75 333 50 Phenylpropanolamine 2 0 30 1 3 0*4 Pseudoephedrine 0 0 30 1 0 3 "Significant cross-reactivity with urinary metabolites R IA « Radioimmunoassay; FPIA s fluorescence polarizatioo immunoassay; E M IT = enzyme multiplied immunoassay technique. Tabla 4. Relativas reactividades cruzadas de anfetaminas en varios inmunoensayos. Tomado de Ann.Clin.Biochem.1995 Anfetamiaaa. 3^ 4.4.14.- RECOMENDACIONES En la tabla 5 observâmes comparâtivamente datos por sensibilidad de técnicas de detecciôn de anfetaminas en orina, velocidades y costo en equipos. Las anfetaminas son drogas menos ampliamente abusadas que los opiaceos, y la mayoria de los laboratorios clinicos quimicos refieren incidencias de detecciôn de menos del 15% en muestras de drogas de abuso en centres de tratamiento. El buen censo recomienda aplicar un método de inmunoensayo para investigar la elevada proporciôn de muestras negativas. Las muestras positivas por inmunoensayo pueden entonces ser confirmadas por técnicas cromatogrâficas. El sistema Syva EMIT d.a.u policlonal es recomendado como investigaciôn preliminar por lo siguiente: - puede detectar algunas drogas relacionadas con anfetaminas(fentermina.mefentermina. efedrina) las cuales son abusadas.- puede se adaptado para uso en equipo de analizador clinico quimico ya existante, y - los costos de reactivos son mucho menores. E M IT (d.a.u.)* R IA (Roche) FPIA (TDx) TLC GC HPLC G C /M S Sensitivity Otg/L) 300' 5 90 1000 300 500 5-10 Turnaround time for one test 3 min 30 min 5 min I h 20 min 20 min Ih Test/8 h day 300 300 300 100 100 100 10 Equipment costs (£) 25 000» 10000 25 000» 1000 10000 10000 35 000 *Syva E M IT d.a.u. polyclonal amphetamines kit. 'Manufacturer’s recommended threshold concentration. 'Manufacturers of these systems often provide and maintain the equipment in return for a guaranteed rate of reagent purchase. E M IT = Enzyme multiplied immunoassay technique; R IA - radioimmunoassay; FPIA = fluorescence polarization immunoassay; TLC = thin-layer chromatography; GC = gas chromatography; H PLC = high-performance liquid chromatography; G C /M S = gas chromatography/mass spectrometry. Tabla 5. Comparaciôn de técnicas de detecciôn de anfetaminas Tomado de Braithwaite v col.(10) An f e tami nas______________________________________________2A______ Caracterizada el tipo de droga anfetaminica présente, el cromatôgrafo a gas es el método de elecciôn preferible con el uso de columna capilar y detector nitrôgeno fôsforo. Esta técnica es mucho màs selectiva que el TLC y HPLC, puede ser facilmente automatizada y el costo de manutenciôn es bajo. La probabilidad de identificaciôn correcta para los tipos de drogas anfetaminicas es la combinaciôn de inmunoensayo y cromatografia a gas, siendo completamente suficiente para situaciones clinicas. Para casos médico légales sin embargo, es esencial técnica màs definitiva y especifica como lo es la cromatografia a gas - espectrometria de masas(10). Bsnzodiacepinas____________________________________ 2J5__________ 4.5.- CONSIDERACIONES ACTUALES SOBRE EL METABOLISMO DE LAS BENZODIACEPINAS 4.5.1.- INTRODUCCIÔN Las benzodiacepinas estàn entre los fàrmacos màs comunmente prescritos en el mundo(27,18). Son utilizados principalmente para el tratamiento de desordenes de ansiedad y insomnio. Considerando su extendido uso en prescripciones médicas. el abuso intencional de benzodiacepinas es relativamente raro(27). La molécula original protôtipo de las benzodiacepinas clasicas es el clordiazepoxido sintetizada en 1961. pertenecen a este grupo el flurazepan. oxazepan y lorazepan. La facil y comoda administraciôn por via oral ha difundido su enorme consumo y abuso. asi como por su capacidad para inducir euforia y sensaciôn de autocomplacencia. sobre todo si combinada con alcohol(21.18). Las benzodiacepinas son compuestos que fueron introducidos con la finalidad de reemplazar los barbituricos y su uso es estrictamente terapéutico como tranqui1izantes. hipnôticos. anticonvulsivan- tes y relayantes musculares(1). Cuando una benzodiacepina es tomada por màs de varias semanas. ocurre una pequeha tolerancia y no ocasiona dificultad de detener la medicaciôn cuando existe la orden médica de detener la administraciôn de esta droga. Sin embargo transcurridos algunos meses de consumo la proporciôn BsnaodiaGGPinas___________________________________ 2Æ de pacientes que désarroiIan tolerancia es elevada y al reducir la dosis o detener la medicaciôn les produce sindrome de abstinencia(tabla 6)(27). Puede ser dificil distinguir sindrome de abstinencia de la reapariciôn de los sintomas de ansiedad, que causô las benzodiacepinas al ser prescrite inicialmente. Algunos pacientes pueden aumentar su dosis extraordinarias porque la tolerancia sin lugar a dudas désarroila efectos sédatives. La funciôn de la tolerancia es mantener el balance homeostàtico para que el funcionamiento fisiolôgico continue dentro del rango normal, a pesar de los efectos de la droga como agente externo(33). Este mecanismo de tolerancia es traducido por la adaptaciôn neuronal al suministro crônico de la droga(22). Muchos pacientes y sus médicos. no obstante afirman que los beneficios antiansioliticos continuan a ocurrir mucho tiempo después de la tolerancia a los efectos sedantes. Ademâs estos pacientes continuan a tomar la medicaciôn por afios de acuerdo a las orientaciones médicas sin aumentar su dosis. El grado de tolerancia que se désarroila a los efectos ansioliticos de las benzodiacepinas es controvertido. El intermintente uso de benzodiacepinas cuanto a sintomas retarda el désarroilo de tolerancia y es por lo tanto preferible al uso diario. Pacientes con antecedentes de abuso de alcohol o otras drogas incrementan el riesgo para el désarroilo de abuso de benzodiacepinas y deben pocas veces ser tratadas con benzo­ diacepinas (27). BensodiaceRinas________________________________ 97 4.5.2.- FARMACOLOGIA La estructura quimica de las benzodiacepinas està constituida por la fusiôn de un nùcleo bencénico con un anillo diacepinico, son sustancias en general de caracter bàsico, liposolubles(2,3), cuya acciôn se caracteriza por su efecto selectivo en funciôn de la lipofilidad sobre el sistema nervioso central y por producir depresiôn nerurolôgica.(figura 12) * Figura 12. Estructura general de una benzodiacepina Tomado de COLE.M.D.(l) La benzodiacepina es fundamentalmente un fàrmaco hipnôtico sedante(33). que posee propiedades miorrelajantes, hipnôticas, ansioliticas, tranquilizantes y anticonvulsivantes. Su importancia està en su capacidad de influir en el comportamiento causando efectos de sedaciôn, desinhibiciôn y hipnôsis(18), Actuan inhibiendo la actividad cerebral en que participa la neurotransmi s i ôn GABA. esta es considerada la base molecular que explica los efectos sedativos. BgnsQdi.acep.inas________________________________ Ï&. anticonvulsivantes y relayantes de las benzodiacepinas(22). El consumo en pequefias dosis de benzodiacepinas conlleva a una reducciôn de la actividad motora espontanea y de la ideaciôn. siendo esta por tanto una acciôn terapéutica en el control de la ansiedad. Por otra parte cuando se administra dosis elevadas se produce depresiôn de los centros corticales superiores que inhiben los nûcleos de la base encefâlica. que conlleva a la euforia y a una alteraciôn en la capacidad de juicio v pérdida de autocontrol llevando a un comportamiento desinhibido(21). La sobre dosis puede conducir a la depresiôn de centros vitales que regulan reflejos cardiovasculares y respiratorios inclusive al coma. El mecanismo de acciôn de las benzodiacepinas se fundamenta en la existencia de los receptores para benzodiacepinas en el cerebro localizados fundamentalmente en la corteza cerebral, hipocampo y amigdala y en menor cantidad en tàlamo y tronco cerebral. Los receptores para benzodiacepinas bacen parte de un complejo proteico 1lamado GABA-A, que es un subtipo de receptor para el neurotransmisor GABA. Las benzodiacepinas se ligan en un sitio especifico del receptor GABA-A y en presencia de GABA potencian el efecto fisiolôgico mediado por este neurotransmisor. El GABA incrementa la permeabilidad de la membrana neuronal al ion cloruro lo que permite la entrada del ion (Cl) al interior de la neurona. esto produce un aumento del potencial negative de la membrana, lo que conduce a la hiperpolarizaciôn de la neurona(22). Los efectos clinicos de las benzodiacepinas son BeuzQAL^Q e p i nas___________________________________ consecuencia de la estimulaciôn de la inhibiciôn de los receptores GABA mediada por el âcido c-amino butirico(18). 4.5,3,- METABOLISMO Y FARMACOCINÉTICA Las benzodiacepinas como el clordiazepôxido, oxazepan, alprazolan, son absorbidas lentamente despnés de una administraciôn oral, El diazepan sin embargo es ràpidamente absorbido alcanzando picos de concentraciôn en plasma en cerca de una hora en adultos. Sobre todo aquellas benzodiacepinas de elevada 1 iposolubi 1 idad son absorbidas ma s rapid.amente( 21), con un rango que varia entre 0,5 a 6 hs, para las diferentes benzodiacepinas{18), Las benzodiacepinas alcanzan la circula- ciôn sistémica en la forma, de su metabolito activo, la mayoria de las benzodiacepinas y su metabolito activo estàn unidas a proteinas plasmàticas cerca del 85 a 95% con un volumen de distribuciôn alto. La extensa uniôn con proteinas estâ correlacionada fuertemente con la solubilidad lipidica de las benzodiacepinas(33), El grado de 1iposolubi1idad inversamente proporcional détermina la duraciôn de los efectos en virtud de que las moléculas poco solubles manifiestan un menor aclaramiento plamàtico y volumen de distribuciôn, con una vida media màs prolongada(21), (tabla 6) Bengpdiac££inag- IQSL A 10-100 r'-A'r t 3Tfr%Ü Oxazepam, DemoxepanClorodiazepôxido' 6-27 (201 2502500 Clorazepaio' A 15-60 Ulira-Corta - Oxazepam Diazepam' A 5-40 2050(35] 1001500 Oxazepam, Temazepam HaJazepam' A 40-120 = 35 20150 Oxazepam Ketazolam' A 15-60 = 1.5 = 20 Oxazepam Medazepam' A 1040 Coita lOOlOOO Oxazepam Prazepam' [nordiazepam]' A 10-60 Ultra-Cona 40100(50] 1002000 Oxazepam Oxazepam Flurazepam H 15-30 2-3 = 50 Hidroxietilflurazepam Quazepam A. H 15-30 25-40 5-50 3-Hidroxiqtiazepam Oxazepam A 15-60 4-11 (8] 1501500 Oxazepam Temazepam A 10-60 8-38(15] lOOlOOO Temazepam Lorazepam A 1-8 9-25(13] lOlOO Lorazepam Lormetazepam H 1-2 9-15(11] 2-30 Lormetazepam Bromazepam A 3-9 1025 (12] 10250 3-Hidroxibromazepam 3-Hidroxi-ABBP Nitrazepam H 5-10 18-57 (28] 10150 7-AoetamidoDiinizepaffi 7-Aminofiitnzepam Fliminazepam H 0,5-2 9-25 [15] 5-50 7-Ami nnflimiHMi-pm Clonazepam AC 0,5-10 2050(30] lOlOO 7-Animockmazepam 7-Aoeiaminoclooazepam Clobazam AC 2040 17-30 2001000 4-Hidroxiclobazam 4-Hidroxidemetilclob. Triazolam H 0,125-0,5 l,5-3,5(2,5] 5-15 Hitkoximetiliriazolam Alprazolam A 0,25-3 7-18(11] 5-60 Hidroximetilalprazolam -f Anilogo benârfenoiiM Midazolam H 5-30 1 > 4 (2 ] lOOlOOO Hidroximetrlmidazolam 4-Hidroximidazolaro Estazolam A 1-8 8-30 20500 4-Hidroxiestazolaro Brotizolam H 0,125-1 2-8(5] 5-20 1 -HidroximeiilbroiizoUm 4-Hidroxibrolizolam Cloitiazepam A 5 5-15 50200 1 Hidroxictil-Desalqutl- Clodazepom Loprxzolam H 0 > 2 3-13(7] 3-15 Loprazolam N-6xido NoU: ' e I Nofdiazcpmm es el principal metabolito de estes Hrmacos. El Qotodiazepôsido lambién es melabolizado hacia Norclorodiazepôxido y Demosepam. = Dosis ansiditica aproximada, H = Hipnética. AC = Anticonvulsiofume. De lodos modes, la mayoria de las bcnzodia/cpinas sc pueden utilizar en mis de una indicacün. ^Dosis aproximada. *La mayor parte de les metaboliies se hallan présentes en la orina en ferma de wlfato o glucuronato. Tabla 6. Niveles plasm&ticos, semivicia y eliminaciôn de las benzodiacepinas. Tornado de Monografia ABBOTT (21) Benzodiacepinas IQl. Las benzodiacepinas inducen enzimas microsomales hepâticas (18) (Figura 13). que metabolizan estas drogas por oxidaciôn a metabolitos mâs solubles en agua para su eliminaciôn en orina(22). La via metabôlica puede ser por très rutas la primera por dealquilaciôn que origina la formaciôn de metabolitos farmaco1ogicamente activos como el nordiazepan a partir del diazepan con una larga duraciôn de los efectos. El segundo mecanismo metabôlico es la hidroxilaciôn cuya reacciôn forma metabolitos con acciôn intermedia como el oxazepan a partir del nordiazepan y un tercer proceso es la conjugaciôn con el àcido glucurônico que permite una r&pida eliminaciôn via renal o biliar en funciôn de la hidrosolubilidad del coniugado glucurônico(21). ClordiafTpôxOo (I) I Desmetikloritoepôxido (I) Diuep«n (L) ClorxqMto (S) Pnzeptm (S) Haluepam (S) Fkjrwpam (S) t Tfuiotam (S) Ajpri20lam (I) Mtdazolam (5) I (II Figura 13. Metabollsmo de las benzodiacepinas. Tornade de GONZALEZ,G.R.(18) BenzodiajC&Rinas________________________________ 102____ 4.5.4.- MÉTODOS DE DETECCIÔN En virtud de la amplia metabolizaciôn que experimentan las benzodiacepinas y consecuentemente formaciôn de compuestos intermediaries que pueden interferir en su detecciôn es que suraen los principales problèmes analiticos. 4.5.5.- Métodos Inmunoquimicos El método analitico inmunoquimico tiene la ventaia de permitir determiner una emplie game de compuestos en plasma y en orina de forma râpida y segura. Entre los métodos analiticos mâs utilizados esté el Inmunoensayo de Fluorescencia Polarizada (FPIA) cuya aplicaciôn se destina fundamentalmente a muestras de orina. si bien que se aprecia un buen rendimiento en muestras de plasma. Por otra parte esté el EMIT (Técnica de Inmunoanâlisis de multiplicaciôn enzimâtica) que se fundamenta en la lecture de la densidad ôptica. 4.5.6.- Método Cromatogrâfico a Gas La Cromatografia a Gas se utiliza actualmente como método de detecciôn singular por su excelente especificidad y elevada sensibilidad con respecto a los métodos inmunoquimicos(21). Suele utilizarse la Cromatografia a Gas-Espectrometria de Masas (GC-MS) con la finalidad expresa de obtener la confirmaciôn de los resultados de aquellas muestras que han tenido resultado positive en el anâlisis presuntivo o Bensodiacepinas___________________________________ 103 preliminar por inmunoanâlisis(18). Debido a los niveles de estas drogas ser muy reducidos en orina y otros fluidos biologicos el método por Cromatografia Liquida de Alta Resoluciôn (HPLC) no es suficientemente sensible para validar los datos cuantitativos obtenidos por esa técnica por lo tanto no es recomendable(21). 4.5.7.- INTERPRETACIÔN DE RESULTADOS La interpretaciôn de los resultados obtenidos de un anâlisis de drogas de abuso como las benzodiacepinas en muestras de orina. estâ en funciôn de las técnicas de laboratorio aplicadas en virtud de la sensibilidad y especificidad de cada una de ellas, asi como del punto de corte de las mismas, ademâs otra variable a considerar es la dosis terapéutica a que este sometido el paciente. Es por esta razôn que debe tenerse el mayor cuidado de correlacionar los resultados obtenidos con la historia clinica del paciente(18). Es de extrema utilidad la prâctica de anâlisis de drogas de abuso "in situ" con procedimientos râpidos de inmunoensayo en muestras de orina, con la finalidad de detectar preliminarmente y de forma presuntiva los positivos a drogas de abuso para luego pasar a confirmaciôn de las mismas por Cromatografia de Gases-Espectrometria de Masas. s MATERIAL Y MÉTODOS Material v Métodos_____________________________ 105 5.- MATERIAL Y MÉTODOS 5.1.- POBLACIÔN Nuestra investigaciôn se désarroi 16 sobre muestras voluntarias y anônimas de dos poblaciones.la laboral de nuevo ing.reso, la poblaciôn de trabaiadores de plantilla(ambas del sector transportes de Madrid) con 627 y 5000 muestras de orina respectivamente y se disenô un protocole en reconocimientos laborales para perfilar los positivos por très técnicas de screening de caracter presuntivo y posterior confirmaciôn de los positivos Por GC-MS. también fueron analizada unas muestras de 111 pacientes trabaiadores dados de baJa de una clinica de rehabi1itaciôn ambulatorial en Madrid, 5.2.- APARATOS Y MATERIAL - Cromatôgrafo a Gas modelo 5890 con espectrômetro de masa - Sistema ADX - Sistema CEDIA D.A.U. - Sistema COBAX Roche - Balanza Anal itica - Bomba VAC ELUT SPS 24 - Sistema de fluJo de nitrôgeno - Vidraria: - vasos graduados . - tubos de ensayo - matrazes . - viales - pipetas graduadas - dosificadores de reactivos Matériel v Métodos________________________________ ______ - microviales - tubos de ensayo - microjeringas de 10 uL 5.3.- REACTIVOS Y DISOLUCIONES - Beta-glucuronidasa - KOH lOM - Tdjnpôn acetato sôdico pH 6.5 O.IM con 5% metanol - Tampôn fosfato pH 7 O.IM - TamPôn acetato sôdico pH 4 O.IM - Metanol - Agua destilada - HCl O.IM - Acetato de etilo - Metanol:agua al 50% - Hexano:acetato de etilo 75:25 al 1% de âcido acético - Tolueno - BSFTA bis (trimetiIsi1)-trifluoroacetamida para GC - Cloroformo:isopropanol 80:20 al 2% de amoniaco - Cloroformo - PFPA anhidrido pentafluoro propiônico - Hexafluoro propanol Mater ial 1Ü2___ 5.4.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Fueron tomadas muestras de orina de las poblaciones supracitadas de forma voluntaria y anônimas. con preyio consentimiento y atrayés de cadena de custodia. siendo analizadas en estas la presencia de 5 drogas y sus principales metabolitos a seguir: opiaceos(morfina. codeina. 6- monoacetiImorfina (6-MAM). cannabis(delta-9 tetrahidrocannabinol). cocaina(benzoylecgonina. ecgonina- metilester). anfetaminas y benzodiazepines. Fueron utilizados como estandares internos el levalorfano para opiaceos y cocaina. y el ketoprofeno para el cannabis(THC), Utilizamos un anâlisis preliminar semicuantitativo de reactiyos para la detecciôn de los metabolitos de la drogas en orina através del sistema ADX linea Abbot Diyisiôn DiagnôsticaCAlemania). ensayo ADX metabolito especifico. utilizando la técnica FPTA(Inmunoensayo de fluorescencia polarizada). el cual permite detectar la presencia del metabolito por interacciôn molecular con sus respectiyos anticuerpos marcados con fluoresceina. Fue utilizado también el aparato COBAX Roche anâlisis semicuantitatiyo para detecciôn de los metabolitos de las drogas de abuso en orina. cuyo principio consiste en una interacciôn molecular basado en la cinética de microparticulas en soluciôn(KIM). que se procesa por modificaciones en la transmitancia de la energia luminosa(turbimetria). Otro instrumente empleado en la detecciôn de drogas de Material v Métodos___________________________________IQ8 abuso es el enzimoinmunoensayo CEDIA para anâlisis Qualitative y semicuantitativo cuyo principio del ensayo consiste en interacciones anticuerpo monoclonales especificos para las moléculas de los metabolitos, siendo de elevada especifificidad y sensibilidad. Apartir de determinados umbrales o puntos de corte(eut off) establecidos previamente por el fabricante. por un lado nos informa en caracter cualitativo preliminar si el test es positive o negative y por otra parte permite cuantificar la concentraciôn de metabolito encontrado en orina. Acte seguido las muestras de orina con resultados positivos en el test preliminar por inmunoensayo son pasadas por una técnica mâs especifica y selectiva. la cromatografia a gas con detecciôn por espectrometria de masa para su respective, confirmaciôn. Utilizamos la cromatografia a gas con detector de masa(GC/MS) para la confirmaciôn definitiva de la presencia de los metabolitos de las drogas de abuso en orina por ser una técnica analitica fisica de separaciôn de analitos de una mezcla de elevadisima sensibilidad y especificidad. Material v Métodos____________________________109 5.5,- PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Un tratamiento previo de la muestra es necesario antes de pasarla por el cromatôgrafo, debido a que el metabolito de las drogas como los opiaceos y el cannabis son excretados yia urinaria en forma coniugada con âcido glucurônico en su mayor parte. Ya esto no ocurre con la cocaina y sus metabolitos. Si bien, es necesario someter la muestra de orina a un proceso de preparaciôn que consiste en varias etapas que se describen a seguir. 12) hidrôlisis de la muestra en el caso de los opiaceos que son drogas bésicas utilizando la beta-glucuronidasa(300uL) enzima especifica para romper los enlaces ester formados entre el metabolito y el âcido glucurônico. se incuba la muestra de 12-24hs a 372C. en esta etapa colocamos el patrôn interno levalorfano y un tampôn fosfato ph 7. Ya en el caso del cannabis que es una droga âcida la hidrôlisis se procesa con potasa. afiadiendo 300uL KOH lOM. ahadimos también en esta etapa el patrôn interno ketoprofeno(5uL) y el respective tampôn acetato sôdico pH7. Utilizamos en la etapa de extracciôn del metabolito de la orina una columna ELUT CERTIFY I en el caso de los opiaceos y cocaina. ya la columna ELUT CERTIFY II es utilizada para extraer los metabolitos del cannabis. El relleno de estas columnas es de gel de silica con propiedades qulmicas que facilitan interacciones moleculares del tipo hidrofôbicas y electrostâticas con los metabolitos de las drogas de abuso Material v Métodos__________________________________1111. anteriormente citadas encontrados en orina. Se procédé al acondicionamiento de la columna con disolventes con adecuadas polaridades en el caso de los opiaceos se utiliza metanol y agua, para la cocaina y sus metabolitos utilizamos metanol y tampôn fosfato pH 6-7 O.IM y en el caso del cannabis metanol y tampôn acetato sôdico pH 6.5 O.IM. Se pasa la muestra por la respectiva columna lentamente conectada a una bomba al vacio VAC ELUT SPS 24. Acto seguido se procédé a lavar la columna con disolventes con polaridades capazes de eliminar las sustancias no deseables que hayan Quedado retenidas en la columna junto con el metabolito. pero que no remuevan en esta etapa el metabolito retenido. Para opiaceos usâmes agua. tampôn acetato sôdico y metanol. en el caso de cocaina lavamos con agua. HCL O.IM y metanol. para el cannabis utilizamos metanol y acetato de etilo. Enseguida se procédé a la eluciôn de los metabolitos de la columna. através de la utilizaciôn de disolventes con polaridad capaz de remover de la colunna los metabolitos. siendo recogidos en un tubo de ensayo. En el caso de los opiaceos y cocaina utilizamos cloroformo:isopropanol 80:20 al 2% de amoniaco. ya para el cannabis eluimos con hexano:acetato de etilo 75:25 al 1% de âcido acético. Se prosigue con la evaporaciôn en corriente de nitrôgeno de toda la muestra eluida, se reconstituye con 250uL de cloroformo en el caso de opiâceos y cocaina. y con 250uL de tolueno en el cannabis.Se pasa a vial y se vuelve a evaporar Material v Métodos________________________________ 111. en corriente de nitrôgeno. Posteriormente se derivatiza con lOOuL de anhidrido penta fluoro propiônico y 50uL de hexafluro propanol en el caso de opiaceos y cocaina, para el cannabis se emplea 50uL de Bis(trimetiIsi1)-trifluoroacetamida para cromatografia a gas y 5uL de clorotrimetilsilosano. Esta etapa de derivatizaciôn es fundamental ya que propicia condiciones de volatilizaciôn a los analitos en la. muestra. propieda.d indispensable para, el ané.lisis por cromatograf ia, asi como protege sus grupos polares, Acto seguido se calienta la. muestra derivatizada a 702C durante 30 minutes para opiâceos y cocaina, en el caso del cannabis a 902C durante 15 minutes después de temperar se pasa a microvia.l y se pincha en el Cromatograf o a Gas- Espectrômetro de Masas(GC/MS) en el caso del cannabis. Ya para los opiâceos y cocaina debemos después de temperar reconstituir con lOOuL de acetato de etilo. se pasa a microvial y se pincha en el GC/MS. El estudio analitico cuenta con un sistema integrado cromatôgrafo a gas con detector espectrômetro de masas modelo 5890. acoplado a un ordenador Hewlett Packard 386. a través de un programa que posee una base de datos con las informaciones de los distintos métodos empleados en el anâlisis de drogas de abuso y con sus respective libreria con los espectros de masa para anâlisis comparatives, que permite la identificaciôn de la sustancia analizada una vez esta haber sido descompuesta en sus iones moleculares por el bombardeo de electrones del masas. como una huella quimica del compuesto. Finalmente el Material v Métodos________________________________ i l ordenador estâ conectado a una impresora Hewlett Packard que imprime el cromatograma de la muestra analizada con su respectivo espectro de masas. 5.6 UMBRALES DE DETECCIÔN Los umbrales de detecciôn o puntos de corte (eut off) con los que realizamos este trabaio, en los ensayos inmunoquimicos preliminares, estân preestablecidos por el fabricante. Para el sistema ADX(FPIA),son: opiâceos 200 ng/mL, cannabis 25 ng/mL, cocaina 300 ng/mL, anfetaminas 300 ng/mL, benzodiazepinas 200 ng/mL. Para la técnica CEDIA los limites de detecciôn son : opiâceos 300 ng/niL, cannabis 50 ng/mL, cocaina 300 ng/mL, anfetaminas 1000 ng/mL, y benzodiacepinas 300 ng/mL. En el caso de la técnica KIM Roche los limites de detecciôn son para opiâceos 300 ng/niL, cannabis 50 ng/mL, cocaina 300 ng/niL, anfetaminas 1000 ng/mL, y benzodiacepinas 100 ng/niL( tabla 7)(44,56,49). Sin embargo existe una polémica en relaciôn al valor ideal por encima del cual determinado limite de concentraciôn de los metabolitos de drogas de abuso en orina deberian ser considerados como positivo y abaio de cuales considerado negative. Deberâ no obstante ser escogido en nuestra opiniôn teniendose en cuenta como referencia la experiencia de un servicio de anâlisis toxicolôgico especializado de reconocido prestigio en el âmbito del pais, a la luz de las recomendaciones del NIDA. Material v Métodos 112. TABLA 7. LIMITES DE DETECCION PARA DROGAS DE ABUSO SISTEMAS CUT OFF FPIA ng/mL COBAS ng/mL CEDIA ng/mL 1 OPIACEOS 200 300 300 1 CANNABIS 25 50 50 1 COCAINA 300 300 300 1 ANFETAMINAS 300 1000 1000 1 BENZODIACEPINAS 200 100 300 A seguir se presentan el esquema 1 Método para anâlisis de drogas de abuso. esquema 2 Método para determinaciôn de opiâceos y sus metabolitos en orina. esquema 3 Método para determinaciôn de cannabis(THC) en muestras de orina y esquema 4 Método para determinaciôn de la cocaina y sus metabolitos en orina. Material v Métodos Ilk. RECEPCION DE LAS MUESTRAS CON CADENA DE CUSTODIA REGISTRO INFORMATIZADO DE LAS MUESTRAS ANALISIS PRELIMINAR POR FPIA, CEDIA. KIM LAS MUESTRAS POSITIVAS SON PASADAS POR GC-MS PARA SU CONFIRMACIÔN INFORME Esquema 1. Método para anâlisis de drogas de abuso Material v Métodas. 113. HIDROLISIS DE LA MUESTRA B-GLUCURONIDASA 12-24 hs,(3720 PASAR MUESTRA POR COLUMNA BOND ELUT CERTIFY LAVADO DE LA COLUMNA -AGUA^ -TAMPÔN ACETATO SODICO pH 4 O.IM -METANOL ELUCION CLOROFORMO:ISOPROPANOL 80:20 A 2% DE AMONIACO EVAPORAR EN CORRIENTE DE NITRÔGENO RECONSTITUIR CON CLOROFORMO PASAR A VIAL Y EVAPORAR CON CORRIENTE DE N2 DERIVATIZAR -PFPA -HEXAFLUOROPROPANOL EVAPORAR EN CORRIENTE DE NITRÔGENO RECONSTITUIR ACETATO DE ETILO PASAR A MICROVIAL Y PINCHAR GC-MS Esquema 2. Método para determinaciôn de metabolitos en orina opiâceos y sus Materially Métodoa I I L HIDROLISIS DE LA MUESTRA KOH 15 min.(602c) PASAR LA MUESTRA POR LA COLUMNA BOND ELUT CERTIFY II LAVADO DE LA COLUMNA -METANOL -ACETATO DE ETILO ELUCION -HEXANO‘.ACETATO DE ETILO 75:25 AL 1% ÂCIDO ACÉTICO EVAPORAR CON CORRIENTE DE NITRÔGENO RECONSTITUIR CON TOLUENO PASAR A VIAL Y EVAPORAR CON CORRIENTE DE N2 DERIVATIZAR -BSFTA -CLOROTRIMETILSILOSANO 15 MIN (9020 PASAR A MICROVIAL Y PINCHAR GC-MS Esquema 3.Método para determinaciôn de Cannabis(THC) en muestras de orina. Material v Métodos H Z PASAR LA MUESTRA POR COLUMNA BOND ELUT CERTIFY LAVADO DE LA COLUMNA -AGUA D.I. -HCL -METANOL ELUCION -CLOROFORMO;ISOPROPANOL 80:20 AL 2% DE AMONIACO EVAPORAR EN CORRIENTE DE NITRÔGENO RECONSTITUIR CON CLOROFORMO EVAPORAR CON CORRIENTE DE NITRÔGENO DERIVATIZAR -PFPA -HEXAFLUOROPROPANOL RECONSTITUIR ACETATO DE ETILO PASAR A MICROVIAL Y PINCHAR GC-MS Esquema 4. Método para determinaciôn de la cocaina y sus metabolitos en orina. 6. - MÉTODO DE INMUNOENSAYO DE FLUORESCENCIA POLARIZADA (FPIA) FPIA _______ 112__ 6.- Método de Inmunoensayo de Fluorescencia Polarizada 6.1.- Descripciôn de la Técnica Los ensayos ADX de drogas de abuso proporcionan un medio preliminar para la detecciôn de las drogas de abuso y sus metabolitos en orina, deben por tanto los tests con resultados positiyos ser sometidos a una confirmaciôn por un método mâs especifico. El método confirmatorio de elecciôn es la cromatogralia_dê gases/espectrometria de masas(CG/MS). No es aconsejable sacar conclusiones de los resultados positivos de los ensayos ADX de drogas de abuso, para fines de empleo laboral ni de ningùn otro tipo, sin efectuar antes anâlisis confirmatorios. Los ensayos de drogas de abuso efectuados en orina han sido désarroilados con las caracteristicas de funcionamiento para anâlisis de drogas en orina. difiriendo Por tanto de aquellos en suero y sangre, cuanto al propôsito e interpretaciôn de resultados. Cuanto al anâlisis de drogas de abuso se deben informer los resultados como positivos siempre y cuando se confirme su positiyidad o bien a falta de confirmaciôn el resultado sea identificado como no confirmado, debido a los eventuales conflictos de caracter legal, econômicos, entre otros que puedan surgir asociados a una informaciôn o aplicaciôn incorrectes de resultados erroneos. El principle del procedimiento se caractérisa porque el sistema ADX utiliza una metodologia de inmunoensayo de enlace competitive, el cual un antigeno marcado con trazador compite FPIA. JL2Û. con el antigeno presente en la muestra por ocupar los puntos de union de las moléculas del anticuerpo, Los participantes en esta reacciôn de enlace competitive son: el anticuerpo conteniendo el réactive, el antigeno que es la sustancia que se desea analizar en la muestra y el antigeno marcado con fluoresceinaCcomplejo trazador-antigeno) . contenido también en el reactive(figura 14), Al producirse el enlace competitive. cuanto mayor sea la cantidad del complejo trazador-antigeno que pase a formar parte de la molécula. mucho mayor del anticuerpo. menor sera la cantidad del que quedarà en la solueiôn. ANTICUERPO h h h - H e DROGA NO MARCADA DROGA MARCADA Figura 14. Principio de la uniôn competitive, tornado de la Monografia Drogas de Abuso ABBOT. 1994. Asi si una muestra contiens una concentraciôn baja de antigeno, cuando la reacciôn de enlace competitive alcanza su estado de equilibrio habrà un aumento de concentraciôn de trazador unido en la mezcla de reacciôn, y la polarizaciôn EPIA____________________________________________________ 12k serâ elevada. Ya inversamente si en la muestra analizada contiene una concentraciôn elevada de antigeno al alcanzar la reacciôn de equilibrio, habrâ una concentraciôn baja de trazador unido en la mezcla de reacciôn y la polarizaciôn serâ baja. Utilizando los valores de polarizaciôn generado por cada muestra en el ensayo, se calculan las concentraciones de droga en las muestras a partir de una curva de calibraciôn almacenada y los resultados se imprimen en unidades informâtles. El método utiliza anticuerpos selectivamente dotados de reactividad cruzada. Los ensayos ADX de drogas de abuso detectan las drogas nativas y/o sus principales metabolitos dentro de una clase de fârmacos. Una clase de fârmacos se define como un grupo de drogas con estructuras quimicas relacionadas. El umbra1 o eut off de un ensayo ADX de drogas de abuso se define como la concentraciôn de sustancia a partir de la cual indica la presencia o la ausencia de la droga o de sus metabolitos en la orina que estâ siendo analizada. El sistema ha sido ajustado por el fabricante a un umbra1 especifico para cada ensayo. siendo para opiâceos. cannabis, cocaina, benzodiacepina y anfetaminas los siguientes eut off: 200 ng/mL, 25 ng/mL, 300 ng/mL, 200 ng/mL y 300 ng/niL respectivamente. La sensibilidad de los ensayos ADX équivale a la concentraciôn minima medible que puede distinguirse de cero, con un 95% de seguridad. EPIA__________________________________________________ 122___________ CQntaminaciôn Por Arrastre: Las muestras para el anâlisis de drogas en orina pueden tener un amplio rango de concentraciones del analito, de tal forma que existe la posibilidad de transporte de la droga desde una muestra de alta concentraciôn a otra muestra libre de droga, durante el pipeteo del ensayo. Para minimizar esta contaminaciôn por arrastre el sistema estâ dotado de una rutina de pipeteo para los ensayos ADX de drogas de abuso que incluye frecuentes lavados de la sonda. El analizador ADX incorpora una instalaciôn con un vaso de lavado que permite el lavado interno y externo de la sonda. La presencia de una droga o de sus metabolitos en orina es solamente una indicaciôn de una exposiciôn anterior a la droga. En ningùn momento se pueden correlacionar las concentraciones de droga o de sus metabolitos detectadas en orina con niveles sanguineos de estas sustancias, ni ser atribuidos a estas sintomas clinicos(44). Los tests de investigaciôn por Inmunoensayo de fluorescencia polarizada para drogas de abuso en orina son considerados de extrema importancia en la actualidad, como recurso de rastreo en estudios preliminares en poblaciones y por tanto tienen un caracter extrictamente presuntivo en caso de positiyidad a la exposiciôn de una determinada droga. debido tener una elevadisima sensibilidad y especificidad. Sin embargo los tests presumiblemente positivos por esta técnica deben ser confirmados por una otra técnica de principio quimico distinto preferiblemente cromatografia de F P I A ________________________________________________________________________ m . gases/espectrometria de masas. Si bien falta al inmunoensayo una especificidad expresivamente significativa para ser considerado un procedimiento definitivo como ocurre en anâlisis de drogas en casos forenses. No obstante por ser una técnica muy sensible no se debe subestimar sus resultados(45). La técnica FPIA se basa en el principio de reacciôn antigeno-anticuerpo, de uniôn tipo competitive, estando los anticuerpos marcados con moléculas que emiten fluorescencia(la fluoresceina) al ser expuestos a la luz. Se coloca en la muestra de orina a analizar un trazador que es la droga marcada con fluoresceina y que junto con el analito o droga presente en la orina son incubados con el anticuerpo especifico y a seguir excitado con luz polarizada(figura 15), estableciendose asi la competiciôn del analito con el trazador por la uniôn con el anticuerpo, existiendo una relaciôn inversa entre la cantidad de analito en la muestra de orina y la intensidad de luz recibida por el receptor ôptico del equipo instrumental. Esto significa que las lecturas elevadas de fluorescencia deben ser interpretadas como bajas cantidades de analito en la muestra y viceversa bajas lecturas de fluorescencia corresponden a elevadas concentraciones de analito en la muestra. FPIA Ilk. Hltro Polahzador Cubeu Puente lumioosa Azul Verde i Fütro Pbfarizador Detector Pantalla Figura 15. Principle del FPIA, tornado de la Monografia de Drogas de Abuso (ABBOT), 1994. Ell virtud del FPIA seguir esta relaciôn inversa permite alcanzar resultados muy précisés con concentraciones de drogas muy baias. Esta relaciôn inversamente proporcional entre la concentraciôn del analito en la muestra y la cantidad de trazador unido al anticuerpo se fundamenta en la cinética de las moléculas en la soluciôn. La fuente emisora del sistema emite una luz con una longitud de onda de 485 nm verticalmente polarizada. que excita la fluoresceinaCfluorôforo) que a su vez emite luz fluorescente de longitud de onda entre 525-550 nm. siendo medido por el sistema ôptico del FPIA que solo es capaz de medir esta longitud de onda con una polarizaciôn vertical. Las moléculas del trazador unidas al anticuerpo forman macromoléculas que rotan lentamente emitiendo fluorescencia polarizada verticalmente. Cuando el trazador FPIA_______________________________________________125 por el contrario està libre, realize giros râpidos emitiendo fluorescencia con una orientaciôn distinta, que no alcanza el sistema ôptico del instrumente(21), FundamentaImente la prevenciôn del consume de drogas de abuso en poblaciôn laboral y la tendencia cada vez màs extendida en el mundo hacia la pr&ctica de la monitorizaciôn de droKas "in situ", particularmente el seguimiento de empleados que realizan funciones de alto riesgo y responsabi1idad como son maneio de armas, conductores de véhiculés,entre otras, con el proposito de prévenir riesgos de accidentes(46) v educar para una vida sana sin abuso de drogas, es el obietivo de un programa antidrogas en empresas. En un programa de screening de drogas es indispensable el control de calidad, de forma que todos los esfuerzos deben garantizar la reproducibi1idad de los ensavos con elevada sensibilidad v especificidad de los métodos. Se debe tener particular cuidado en la interpretaciôn de los resultados para no incurrir en errores, que pueden en algunos casos tener consecuencias desastrosas. Los resultados falsos positivos o falsos negativos de anâlisis de drogas son indeseados en situaciones donde los resultados estàn vinculados a algûn asunto legal o acciôn similar hacia el donante de la muestra, en tales casos los resultados analiticos e interpretaciôn pueden ser usados como evidencia de violaciôn de contratos o reglas con consecuencias disciplinarias severas en el trabajo. Se deben satisfacer los siguientes criterios en el uso de FPIA ........................................................................................... 126. los test de drogas de abuso para un programa antidrogas en empresas, cuando a) se sospeche que una persona està usando o comenzando a ser afectada por drogas de abuso, b)en la evidencia de presencia de intoxicaciôn y/o disminuciôn en el rendimiento laboral. c)cuando se sospeche que accidentes laborales son acreditados como resultado de intoxicaciôn por drogas. d)en casos de control a través de pruebas aleatorias en empleados relacionados con actividades de seguridad y de elevada responsabi1idad. como maneio de armas v conducciôn de vehiculos. El uso de pruebas de drogas de abuso en lugares de trabajo "in situ", en Estados Unidos de Norte América se està popularizando cada vez màs, con el obietivo de fomentar la educaciôn v conciencia de los efectos adversos que las drogas de abuso causan y minimizar consecuentemente la accidentabili- dad laboral y el absenteismo. La principal desventaia de los screening de drogas de abuso en muestras de orina es que los resultados positivos solo indican uso de drogas en un tiempo anterior a la colecta de la muestra, no pueden por tanto ser correlacionadas con este hallazgo efectos fisiolôgicos o comportementales en funciôn de concentraciones de drogas de abuso en orina. Si bien. los anàlisis cuantitativos en muestras de sangre son indicativos de su équivalente concentraciôn en cerebro y efectos adyersos sobre esfera cognitiya y comportemental del individuo consumidor de drogas de abuso. La principal yentaia del FPIA es su eficacia y la FRIA____________________________________________________________________________________________122. automatizaciôn instrumental en el anàlisis para numerosas drogas. Poco o ningun pretratamiento de la muestra es necesario y se requiere un minimo de pericia del operador. Una desventaia de los inmunoensayos comerciales disponibles es su escacez de especificidad. Los anticuerpos a menudo ofrecen reacciones cruzadas relacionadas con otras especies quimicas de drogas v sus rnetabolitos, manifestando asl especificidad para una f.ami lia de sustancias quimicamente relacionadas. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir posiblemente devido a interferencias de sustancias o errores técnicos. Algunos resultados falsos positivos en inmunoensayos como benzodiace- nas y cannabis han sido relatados en la literatura relacionados con agentes antinflamatorios no estereoides(AINE) taies como el ibuprofen. Los derivados de fenilamina como efedrina. pseudoefedrina y drogas anorexigênas interfieren con los inmunoensayos usados para anfetaminas. Los inmunoensayos para opiàceos no permiten diferenciar entre abuso de heroina del uso de una droga opiacea sin el uso de una técnica analitica de confirmaciôn como la cromatografia de gases/espectrometria de masas(47). En la actualidad los costes econômicos. de salud y en la productividad de las empresas por el consume de drogas de abuso son muy elevados en U.S.A., estando intrinsicamente correlacionado con el consume de estas sustancias en los lugares de trabaio. De este se desprende la necesidad imperiosa de poner en pràctica programas de screening de drogas de abuso en los lugares de trabaio para controlar.y FPIA______________________________________________ 126. fomentar una educaciôn continuada en los ambientes de trabajo al respecto del problema de las drogas de abuso y sus drâsticas consecuencias, asi como ser un medio de selecciôn de personal principe.Imente en actividades consideradas de alto riesgo y responsabi1idad. adem&s de conseguir con esta medida disuadir el consume de drogas de abuso, como tajnbién reducir el absenteismo y la accidentabilidad laboral(48). 6.2.- Aplicaciôn en muestras biolôgicas de orina Los ensayos ADX para opiaceos, cannabinoides, cocaina, benzodiazepinas y anfetaminas es un sistema semicuantitativo para la detecciôn de las drogas de abuso en muestras de orina y diseflado especif icamente para estas. proporcionando un resultado preliminar del test analitico. Para obtener una confirmaciôn de este resultado analitico debe usarse un método quimico alternative màs especifico. La Cromatografia de Gases y Espectrometria de Masas es el método de confirmaciôn preferido. El método ADX para determinaciôn de drogas de abuso utiliza la tecnologia FPIA (Inmunoensayo de Fluorescencia Polarizada). Los resultados pueden informarse en términos cualitativos > o < que el umbra1 seleccionado, o bien en términos semicuantitativos en forma de concentraciôn numérica y estos ûltimos permiten un control de calidad mensurable. Los resultados positivos deben confirmarse con un método adecuadamente sensible y especifico basado en principle quimico diferente, HPLC. GC. y la GC/MS. El Gases Masas se EPIA 129 acepta como solida técnica de confirmaciôn para todas las drogas porque ofrece el mejor nivel de fiabilidad en el resultado hasta el momento. 6.3.- Screening de 5 drogas de abuso y sus metaboiitos en orina La determinaciôn de las drogas y o sus rnetabolitos en orina se realizan en el momento de la recepciôn de las muestras. El anàlisis se realiza de forma automatizada por FPIA, para las 5 drogas siguientes; opiaceos, cannabis, cocaina,anfetaminas y benzodiazepinas. Tomando como criterio para positividad de las muestras el respective punto de corte(cut off) de cada una de las drogas, que es un paràmetro predeterminado para identificaciôn de consumidores de drogas, siendo indiscutiblemente precise en la comprovaciôn de exposiciôn a las drogas, la confirmaciôn por gases masas de las muestra positivas.(figura 16) Figura 16. Aparato para FPIA 7.- MÉTODO DE CINÉTICA DE MICROPARTfCULA EN SOLUCIÔN (KIM) KIM_______________________________________________________ m . 7. Método KIM (Cinética de Micropartieulas en Soluciôn) para detecciôn de drogas de abuso 7.1.- Descripciôn de la Técnica Los anâlisis a través del Método KIM se fundamentan en un principle de interacciôn cinética de microparticulas en soluciôn, siendo semicuantitativo y cualitativo. Esto ocurre por modificaciones producidas en la transmisiôn de la luz. siendo por tanto una turbimetria. Cuando nos encontramos con ausencia de droga en la muestra. tenemos que los anticuerpos libres en el reactivo especifico para la droga en estudio se unen a los respectives rnetabolitos coniugados a la micropartlcula que se encuentra en otro reactivo especifico para la droga a ser detectada. provocando en la muestra el surgimiento y formaciôn de agregados que se aglutinan formando un precipitado. Por otra parte al entrar en contacte los anticuerpos con la muestra de orina en presencia de metaboiitos de la droga. los metaboiitos especificos compiten con el metabolite de la droga coniugado a la micropartlcula por el anticuerpo libre, especificamente por los sitios de acciôn (receptores moleculares especificos). Entonces en esta situaciôn el anticuerpo unido al metabolite especifico de la droga va no puede producir la aglutinaciôn de las particulas, inhibiendose asi la formaciôn de la turbidez caracteristica de la presencia y formaciôn de agregados de particulas. La turbimetria ya medir el grade de absorbancia que es influenciado por la concentraciôn de la droga en la muestra. K I M .................................................162. Siendo que en la ausencia de la droga se produce un mâximo en el incremento de la absorbancia, mientras que en la presencia de la droga o sus metaboiitos en la muestra biolôgica (orina) produce una disminuciôn de la absorbancia por impedir la aglutinaciôn de las microparticulas, que es inversamente proporcional a la concentraciôn de la droga en la muestra. Existe un rimbral o range de valor medible en ng/mL, que se utiliza como paràmetro de exactitud para cada droga en particular en el método KIM. La sensibilidad y especificidad a partir de los cuales se consideran positivas para drogas de abuso son los siguientes puntos de corte:para opiaceos 300 ng/mL, cannabis 50 ng/mL, cocaina 300 ng/mL, benzodiacepinas 100 ng/mL, anfetaminas 1000 ng/mL. La positividad de reactividad cruzada con otras drogas no relacionadas, alcanzan valores del orden de 0,5% de reactividad cruzada. El resultado analitico por esta técnica deberâ siempre ser confirmado por otro método quimico màs especifico preferiblemente cromatografia de gases/espectrometria de masas(49). El inmunoensayo de cinética de microparticulas(KIM), utiliza la metodologia de interacciôn de microparticulas en soluciôn, Todos los resultados presuntivamente positivos por este método deben ser confirmados por GC-MS, El método utiliza una particula de latex de inhibiciôn de la aglutinaciôn del inmunoensayo. En el KIM el reactivo coniugado consiste de droga unido a microparticulas. Las microparticulas coniugadas en soluciôn minimamente bloquean KIM_____________________________________________________ 166 la transmisiôn de la luz a través de una cubeta siendo la absorbancia baia. Cuando el anticuerpo de la droga es afladido al coniugado de la soluciôn ocurre la formaciôn de un enmarafiado de anticuerpos con reacciôn cruzada de las microparticulas por uniôn a la droga. El resultado es una estructura enreiada que efectivamente bloquea la transmisiôn de la luz y disminuye la absorbancia. La presencia de droga libre en la muestra de orina no interfiere con la formaciôn de este enreiado de anticuerpos y la absorbancia aumentarâ por encima de un dado tiempo. Si la muestra de orina contiene la droga de interés esta es mezclada con los reactivos, la droga no coniugada en la muestra competiré. con la droga coniugada por los sitios de uniôn del anticuerpo, y el grado de formaciôn del enmarafiado de anticuerpos es inhibido de forma proporcional a la concentraciôn de la droga en orina. La diferencia entre las lecturas de absorbancia medidas inicial y final disminuye con el incremento de la concentraciôn de droga(figura 17)(50). KIM________________________________________________U4. MCAOPARTICl£-ORüG CONXIGATES AHTKORUG AfTTIBOOCS MICROPARTCLE-ANTBOOr LATTICE to (LOW ABSORBANCE) 1, (HGH ABSORBANCE) + + v + ^ lACnOPARTlCLE-ORUO AMTI-ORUO DRUG FROM MHIBTTION OF UtCROPARTCLELATDCE CONJUGATES ANTBOOIES URME FORMATION DUE TO COMPETITIVE BINDMG to (LOW ABSORBANCE) I, (LOW ABSORBANCE) Figura 17, Principle metodologico del KIM, para una orina negativa(arriba), y para una orina conteniendo analitos. Tornado de ARMBRUSTER,A .D e cols.(45) La droga presente en la muestra de orina inhibe la interacciôn de las microparticulas en proporciôn a su concentraciôn en la muestra(51). En los programas de screening de drogas de abuso, son utilizados los métodos de inmunoensayos muy frecuentemente asociados a un método de confirmaciôn GC/MS, debido a la baia especificidad del ensayo y la probabilidad de ocurrir reacciones cruzadas con otras especies quimicas estructuralmente similares, produciendo resultados falso positivos(52,53). Los inmunoensayos son de relevante utilidad en pruebas de drogas en anâlisis de muestras forenses. No obstante en el caso de los opiaceos puede ocurrir ambigüedades de interpretaciôn, prineipalmente con relaciôn a si la presencia KIM______________________________________________________ 166 de morfina y la ausencia de codeina puede o no ser un indicador vàlido de que la morfina o la heroina fue administrada, porque puede haber ocurrido por adminstraciôn de codeina. La interpretaciôn de los resultados en opiaceos requiere una compreensiôn de las cinéticas de eliminaciôn de ambos metaboiitos de la droga, su forma libre y la forma coniugada{14). Las pruebas de screening de drogas de abuso en orina se han tornado populares y controvertidas, debido a la capacidad de identificar y cuantificar los analitos en la muestra, Los tests pueden dividirse en dos tipos de procedimientos: 1-Las pruebas de screening presuntivas, las cuales tienen por finalidad intentar identificar de forma simple, râpida y econômica los analitos de drogas de abuso contenidos en la muestra, y el otro tipo de test de confirmaciôn, que puede confirmer la identificaciôn, Los inmunoensayos y los métodos cromatogrâficos son considerados como métodos presuntivos de pruebas de screening, mientras que la cromatografia de gases- espectrometria de masas (GC-MS) es un procedimiento confirma- torio. La seguridad del uso de inmunoensayos para detecciôn de drogas de abuso en orina depende de la especificidad del anticuerpo, del significado de la detecciôn de la droga y sus rnetabolitos, de la variabilidad de la sefial de detecciôn y de la capacidad del personal que ejecuta el test. Los inmunoensayos dependen de la uniôn de un analito al anticuerpo siendo la especificidad del anticuerpo hacia el analito dependiente de como el analito fue pegado al antigeno KIM________________________________________________________ 166 transportador. Debido a cambios en puntos de contacte del antigeno sobre el analito, puede ocurrir reactividad cruzada de un anticuerpo. La especificidad también depende de si el analito tiene una unica estructura que difiere significativamente de cualquier otra estructura que pueda estar presente en la muestra. Por eiemplo los ensayos Abuscreen-morfina tienen reacciôn cruzada muy significative, con codeina, los ensayos de anfetaminas con la fenetilamina, los ensayos de cannabinoles designados para el âcido delta-9- tetrahidrocannabinol(THC-COOH), tienen reacciôn cruzada con otros cannabinoles(54). 7.2,- Aplicaciôn en Muestras Biolôgicas de orina Los métodos KIM para instrumentos Gobas Mira fueron disefiados para anâlisis de drogas especif icamente en muestra de orina, y para las caracteristicas intrinsicas de esta muestra. 7.3.- Screening de 5 drogas de abuso y sus metaboiitos en Orina. Se procediô en los ensayos a identificar en orina 5 drogas de abuso y sus metaboiitos: Opiaceos, Cannabis(delta-9- tetrahidrocannabinol), Cocaina(benzoylecgonina,ecgonina metilester), Benzodiazepinas y Anfetaminas, cuyos resultados se encuentran en el apartado resultados y discusiôn. 8.- MÉTODO DE ENZIMOINMUNOENSAYO DONANTE DE ENZIMA CLONADA (CEDIA) CEDIA___________________________________________________ I M ________ 8 .- MÉTODO CEDIA(Enzimoinmunoensayo donante de enzima clonada) 8.1 Descripciôn de la Técnica La investigaciôn de drogas de abuso através del método CEDIA consiste en un enzimoinmunoensayo homogeneo, realizado in vitro para el anâlisis preliminar cualitativo y semicuantitativo de rnetabolitos de opiaceos, cannabis, cocaina, anfetaminas y benzodiacepinas, con la finalidad de diagnosticar el consume o exposiciôn a estas drogas. Los resultados de estos test son preliminares y por lo tanto provisionales, que deberân comprobarse con un método analitico mâs especifico, siendo de elecciôn la cromatografia de gases/espectrometria de masa (GC/MS). El ensayo se fundamenta en la enzima bacteriana Beta- galactosidasa dividida en 2 fragmentes inactives através de técnicas de ingenieria genética(55), que se recombinan espontaneamente, formando una enzima activa que reacciona con el sustrato(droga de abuso), ocasionando un cambio de color que puede cuantificarse por espectrofotometria. El metabolito especifico de la droga de abuso coniugado con una fracciôn inactive de esta enzima B-galactosidasa compite con la droga de la muestra en busca de un sitio de fiiaciôn de anticuerpos. Si la muestra contiene el metabolito de la droga, esta se fiia al anticuerpo especifico, en este caso los fragmentos inactivos de la B-galactosidasa forman una enzima activa, Por otra parte si la muestra no contiene el CEDIA______________________________________________ 166 metabolito de la droga especifico para la inmunoglobulina, el anticuerpo se fiia al metabolito coniugado con la fracciôn enzimàtica inactive impidiendo la formaciôn de la enzima activa. La razôn de B-galactosidasa formada esté en funciôn de la concentraciôn de la droga en la muestra(56). El método CEDIA para la investigaciôn en orina de drogas de abuso es de confianza y eficaz fund-amentalmente en la utilizaciôn de programas de rutina realizados para detectar drogas de abuso "in situ" en lugares de trabaio. Estos inmunoensayos son sencillos, répidos, y con la ventaia de ser capazes de automatizaciôn para amplio numéro de muestras, siendo todas las muestras presuntivamente positivas por este método confirmadas con ezcelente fiabilidad por cromatografia de gases y espectrometria de masas. Observâmes en la figura 18 una representaciôn esquemâtica del principle del método CEDIA. En el caso A. en la ausencia de la droga o el metabolito en una muestra de orina ocurre la inhibiciôn de la B-galactosidasa, y no se genera ningun producto después de adicionar el sustrato a la mezcla de la reacciôn. En el caso B, la droga o los metaboiitos de la droga en una muestra de orina compiten con la enzima donante- droga conjugada(ED), por los sitios de conbinaciôn del anticuerpo de la droga(Ab). La actividad de las moléculas B- galactosidasa se forma y se compléta en la proporciôn a la cantidad de droga o metabolito de droga présente en la muestra, siendo la conversiôn del sustrato o producto también proporcional a la concentraciôn de la droga en la muestra (EA) CEDIA I M L aceptor enzimâtico(57) B. A. ED-Drug Conjugate • • • • Free Drug Y ^ ^ Ab ED- Drug Conjugate u + Substrate + Substrate EA + Substrate A b - ED - EA Drug Conjugate Drug - Ab Active Conjugate Enzyme + Product Figura 18. Principio del método CEDIA,tomado de Armbruster,A.D, y col.(57) El anâlisis farmacocinético es un intento de describir expérimentaImente datos en términos de un modelo cinético, de este modo se caracteriza la dosis o proporciôn droga/metabolito en relaciôn con el tiempo. Los parâmetros cinéticos por tanto pueden usarse para hacer predicciones cuantitativas(58). En el enzimoinmunoensayo CEDIA, la droga es marcada con un enzima compitiendo con la droga libre de la muestra del paciente en su uniôn al anticuerpo, por uniôn tipo competitive. Siendo la concentraciôn de droga o metaboiitos determinada, a través de la medida de la cantidad de droga marcada enzimaticamente que queda libre en el medio de c m i È _________________________________________________________________________________1 6 L reacciôn. Esta medida es realizada por un espectrofotômetro a partir de la reacciôn del enzima unido a la droga con un sustrato(droga especifica) présente en la soluciôn del ensayo, produciendo una sustancia coloreada que es detectable espectrofotometricamente. La reacciôn enzimàtica se inhibe cuando la droga marcada se une al anticuerpo, esto ocurre cuando no existe la droga en la muestra. En este caso el anticuerpo se une exclusivamente a la droga marcada con la enzima, lo que implicarâ en una reduceiôn de la cantidad de enzima capaz de reaccionar con el sustrato, y con esto la intensidad de color que se detects, estarâ reducida, Ya por el contrario, cuanto mayor es la intensidad de color detectable, mayor es la concentraciôn de droga en la muestra del paciente, siendo que la variabilidad de coloraciôn de la soluciôn del ensayo en cuestiôn es directamente proporcional a la concentraciôn de droga en la muestra(2 1). La informaciôn que se desprende del inmunoanâlisis de caracter evidentemente preliminar es de considerable importancia pràctica, proveendo la base para la interpretaciôn de la exposiciôn a la sustancia abusiva, derivandose por tanto su presencia en niveles en plasma y orina en casos cllnicos y forenses(59). La corrects interpretaciôn de resultados de los anâlisis por inmunoensayos requiere un entendimiento y compreensiôn de la cinética de eliminaciôn de los metaboiitos, asi como de la propia droga, ya sea en su forma libre o coniugada. Es importante por otra parte considerar las varias y posibles CEDIA_____________________________________ Uto rutas de administraciôn de la droga, en la medida que juega un papel relevante que influye y de la cual depende la ruta metabôlica(14), Los metaboiitos de las drogas de abuso ilégales como los derivados de opiaceos, cannabis y cocaina, pueden utilizarse como indicadores o marcadores de exposiciôn a esta sustancia en los anâlisis por inmunoensayos en muestras de fluidos biolôgicos como la orina. Siendo estos propuestos como marcadores especificos del consumo y abuso de drogas ilégales, que sufren un proceso de metabolizaciôn algunas como la heroina en la propia sangre por hidrôlisis enzimàtica por colinesterasas plasmâticas, formando 6-MonoacetiImorfina, otras son metabolizadas por via hepâtica enzimàtica, formando coniugados con âcido glucurônico y sulfatos, siendo finalmente ciareados en el riftôn y excretados en orina(ll). La interpretaciôn exacta de un resultado positiyo de un inmunoensayo a una droga ilegal como las anteriormente citadas. requiere un conocimiento de las propiedades cinéticas y metabôlicas de la droga de abuso interpelada. Particularmente en el caso de los opiaceos debido al origen de los metaboiitos codeina y morfina ser un punto controvertido, que puede generar confusiôn en la interpretaciôn de resultados en tests de inmunoensayos positivos, en lo que se refiere a su formaciôn ser derivado de consumo de heroina, o de consumo del fârmaco codeina de forma indiscriminada y abusiva(13). CEDIA 143 8.2,- Aplicaciôn en muestras biolôgicas de orina Los ensayos CEDIA para drogas de abuso, es un sistema enzimoinmunoensayo disebado para el anâlisis y detecciôn de drogas de abuso en muestras de orina. Es de elevada sensibilidad predictiva y especificidad, Habiendo sido utilizados los siguientes puntos de corte para este estudio segûn recomendaciones del NIDA. Para opiaceos 300 ng/mL, cannabis 50 ng/mL, cocaina 300 ng/mL, anfetaminas lOOOng/mL y benzodiacepinas 300 ng/mL,(figura 19) Figura 19. Aparato para CEDIA 8.3.- Screening de 5 drogas de abuso en muestras de orina El anâlisis se realiza de forma automatizada para la determinaciôn de las drogas de abuso a saber opiaceos, cannabis, cocaina, anfetaminas, benzodiacepinas y sus metaboiitos en muestras de orina, siguiendo los criterios de positividad respecto a los puntos de corte(eut off) de cada una de las drogas, expresando su positividad apenas un significado de exposiciôn a la sustancia, debiendo someterse las muestras positivas indiscutiblemente después de este anâlisis preliminar a la confirmaciôn por GC/MS. 9.- MÉTODO CROMATOGRÂFICO A G AS CRQMATQGBAFIA A.-QAS_____________________________________ 165_______ 9.- MÉTODO CROMATOGRAFICO A GAS 9.1.- Descripciôn de la Técnica La Técnica Cromatogrâfica a Gas consiste en una metodologia analitica fisica de separaciôn de componentes o analitos de una mezcla determinada que se distribuyen entre dos fases, la fase estacionaria que es un lecho de superficie y la fase môvil que es un fluido que se infiltra a través del lecho estacionario(60), En la actualidad existen diversas técnicas cromatogrâficas en funciôn de la naturaleza de las fases, siendo en el estudio analitico de drogas de abuso particularmente usada la cromatografia Gas-liquido, donde la fase movil es un gas el helio, denominado gas portador y la fase estacionaria es un liquide. Existen numerosas fases estacionarias disponibles para el anâlisis de drogas, las cuales poseen una variedad de polaridades (tabla 8)(1). Las diferencias en polaridades de las drogas, su peso molecular y su volatilidad es en lo que se basa fundamentaImente el proceso de separaciôn(61,62). Los anâlisis toxicolôgicos son de extrema importancia en la identificaciôn de drogas desconocidas en fluidos biolôgicos, apesar de la dificultad que se incrementa cuando los compuestos forman algunos rnetabolitos, que son factibles de identificar en muestras de orina. La cromatografia de gases/espectrometria de masa (GC/MS) es en la actual idad la técnica de mayor cromatografia a Gas___________________________________ 146 sensibilidad y especificidad (63). En este método los analitos a identificar en la mezcla poseen diferentes afinidades por la fase estacionaria liquida, por lo que serân arrastradas por la fase movil en distintos momentos en funciôn de su coeficiente de reparte liquido-gas, separando los diferentes componentes de la mezcla en anâlisis. basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los analitos de la muestra al ser arratrados por la fase movil a través del lecho cromatogrâfico. Los analitos de la muestra interaccionan con la fase estacionaria, siendo arrastrados por la misma en funciôn de la temperatura y coeficiente de reparte de estos con ambas fases. En virtud de la técnica cromatogrâfica estar fundamentada en la termodinâmica y la cinética,los aspectos termodinâmicos son los que rigen el equilibrio de distribuciôn o reparte de los analitos entre las dos fases, y por lo tanto responsables de caracteristicas cromatogrâficas como la retenciôn y la selectividad. La cinética participa en las separaciones cromatogrâficas, determinando el tiempo en que se consigue el equilibrio de distribuciôn de cada plate teôrico, unidades utilizadas para medir la eficacia de la columna cromatogrâfica(61). En este contexte la técnica cromatogrâfica es de extrema relevancia, debido a que permite identificar sustancias quimicas(metaboiitos) en funciôn de sus propiedades fisico-quimicas. La muestra objeto del anâlisis es transportada por la fase môvil donde sus componentes atraviesan la columna cromatogrâfica que contiene la fase Cx.Qina.tc».firafia-a Gas IkJ. estacionaria, ocurriendo la separaciôn de los diversos analitos présentes en la muestra, dependiendo de las caracteristicas fisico-quimicas de cada sustancia, siendo identificadas y cuantificadas por medio de detectores de elevada sensibilidad y especificidad (figura 2 0). En el anal isis por GC/MS la fase môvil es un gas inerte el helio, ya la fase estacionaria de la columna cromatogrâfica capilar es un liquide que se adsorbe a un sôlido inerte, donde prevalecen los mécanismes de reparte(GLC) y tienen diversa permeabilidad a los gases portadores dependiendo del tipo de columria. INYECTOR RESULTADOS COLUMNA REGISTRADOR REVELADOR BOMBA Figura 20, Principio de la Cromatografia en columna tomado de Monografia Drogas de Abuso (21) Cromatografia a Gas_________________________________ UtS_________ La técnica Cromatografia de Gases es de mâzima fiabilidad en la determinaciôn cuantitativa de analitos de drogas de abuso, sin embargo es necesario utilizar un patrôn interno junto con la muestra al iniciar el procedimiento analitico, asi se asegura el control del anâlisis y se reducen factores de variabilidad que acompafian a las diferentes fases de preparaciôn, purificaciôn y eztracciôn de los metaboiitos de la muestra(21). Compuestos con elevado punto de ebulliciôn en condiciones de baJas temperaturas de la columna presentarân coeficientes de reparto elevados implicando en que el detector los liberarâ lentamente, debido a que en estas condiciones su concentraciôn en la fase movil sera. baia. En caso contrario si la columna esta condicionada a trabajar a temperaturas elevadas, encontraremos que los coeficientes de reparto de los componentes de la muestra de alto punto de ebulliciôn disminuyen, lo que significa en que ocurre un decrécimo del tiempo de anâlisis por aumento de las concentraciones de estos componentes en el gas portador, favorendendo ser arrastrados hacia el detector. No obstante en estas condiciones de temperatura la separaciôn de los componentes de la muestra pueden verse afectados debido a que al disminuir su tiempo de retenciôn en la columna, puede ocurrir eluciones de los componentes muy prôximos entre si, impidiendo una resoluciôn satisfactoria. La cromatografia gaseosa se emplea particularmente para anâlisis de compuestos volâtiles con punto de ebulliciôn < CromatQgrafia a Gas 11±3_ 4002C o para compuestos que puedan constituir derivados volatiles, su principal limitaciôn est& en la labilidad térmica de les analitos, les cuales deben ser estables a la temperatura requerida para su volatilizaciôn, siendo por tanto la temperatura decisiva en una separaciôn cromatogrâfica a gas. El cromatôgrafo de gases posee una estructura compuesta de Dinyector por donde se introduce la muestra al sistema, 2)gas portador que transporta la muestra por la 3)columna cromatogrâfica hasta el 4)detector que los identifica especificamente, enseguida procédé a transmitir estas informaciones hasta 5)el sistema de procesamiento datos informatizado, y de este al 6 )sistema de registre que lo realiza una impresora acoplada al ordenador(figura 21)(61). cromatôgrafo de gases: (1) Sistema de suministro de gas portador, (2) Hanorreductor, (3) Vélvula para controlar el flu- jo de gas portador. (4) Sistema de introducclôn de la muestra, (5) Sistema de termostataciôn, (6) Columna, (7) Sistema de detecciôn, y (8) Registrador o integrador. Figura 21. Cromatôgrafo de gases, tomado de VARCARCEL,C.M.(61) Cz&matografia a Gas___________________________________15H__________ Dinyector: El sistema de inyecciôn automâtica de muestras en el sistema cromatogrâfico, permite un mejor y mâs eficiente control del procedimiento en lo que se refiere a reproducibilidad y introducclôn de la muestra en la columna cromatogrâfica. Existen varias técnicas de inyecciôn automâtica de la muestra, la split y la splitless, son algunas de ellas, se harâ incapié en la que se utilisa inyecciôn en splitless. Esta técnica de inyecciôn se caractérisa por la entrada total de la muestra vaporisada en la columna, permitiendo el anâlisis de compuestos de forma exacta en la muestra inyectada. La cantidad de volumen de muestra inyectada con esta técnica splitless es de 2 uL, esto asociado a una adecuada velocidad de inyecciôn asegura la vaporisaciôn compléta de la muestra a su paso através de la columna cromatogrâfica. Una caracteristica indispensable en el anâlisis es el mantenimiento de una temperatura de inyecciôn constante(condiciôn isotérmica). La muestra es transferida al inyector splitless por una microJeringa a través de un septo de goma, que tiene por finalidad cerrar la zona de entrada de la muestra evitando la fuga ya sea del gas portador como de la muestra, al mismo tiempo evitar la entrada de oxigeno debido a que podria oxidar a altas temperaturas la fase estacionaria de la columna capilar disminuyendo su vida util. Es importante recorder de reemplazar el septo periodicamente, debido al desgaste que el mismo sufre en funciôn del uso, ya que particules de este terminan siendo arrastradas por el gas portador, junto con la CromatoKrafia_a Gaa_________________________Hi. muestra produciendo el efecto "septum bleed". Este efecto consiste en la apariciôn de una linea base sucia y ocurre pérdida de picos en el cromatograma. Ocurrida la inyecciôn de la muestra en fase liquida a través del septum a la cémara de vaporizaciôn se abre una vâlvula splitless y se calienta la cémara rapidamente alcanzando una temperatura de inyecciôn de 2502C. La cémara de vaporizaciôn consiste en un tubo recto de vidrio tratado que permite que la muestra sea transferida a la columna cromatogrâfica con la minima diluciôn posible con el gas portador. Una vez realizada la inyecciôn en splitless, vaporizada la muestra y arrastrada por la fase môvil existe el fenômeno "efecto solvente" para la focalizaciôn de la muestra en la columna capilar para obtener un pico cromatogrâfico lo mâs estrecho posible, y consecuentemente con una mayor eficacia(figura 22). El efecto solvente se denomina a la condensaciôn del disolvente en una pequefia pelicula al comienzo de la columna capilar, permitiendo la reconcentraciôn de los componentes vaporizados de la muestra, siendo particularmente importante que la longitud de esta pelicula de disolvente sea pequefia debido a que la muestra se distribuye a lo largo de ella de manera que a mayor longitud, mayor anchura del pico cromatogrâfico y consecuentemente menor eficacia. La longitud de la pelicula de disolvente depende de factores como el diâmetro de la columna, volurnen de muestra inyectado, temperatura del inyector, temperatura inicial de la columna y Cromatogrâfia a Gas___________________________________ H o afinidad entre el disolvente de la muestra y la fase estacionaria. A mayor diâmetro de la columna, mayor la longitud de la pelicula de solvente, como se utilizan columnas de diâmetros muy pequefios este factor influye muy poco en la longitud de la pelicula. Por otra parte a mayor volumen de inyecciôn tajnbién se producirâ un incremento proporcional en la longitud de la pelicula de solvente. Un aspecto importante es que la temperatura inicial de la columna debe de estar entre 15-202C por debaio del punto de ebulliciôn del disolvente para permitir la condensaciôn de este y la formaciôn de esa pequefia pelicula. Si bien, dicha temperatura debe ser minimo 3 52C menor que el componente de la muestra con mâs bajo punto de ebulliciôn para evitar su condensaciôn. Por otra parte el grado de polaridad del disolvente y de la fase estacionaria de la columna capilar debe ser similar para evitar que la pelicula de solvente sea muy large, y poco homogenea, debido a que esto produciria picos distorsionados en el cromatograma. La pelicula de disolvente se comporta de forma similar a una fina pelicula de fase estacionaria en la que la muestra vaporizada es altamente retenida debido a su elevada afinidad por el disolvente, con esto se disminuye el diâmetro de la columna y origina una pequefia relaciôn de fases. Beta. Finalmente la formaciôn de la pelicula de disolvente produce una disminuciôn en el diâmetro de la columna y una relaciôn de fases Beta pequefia. La disminuciôn de la relaciôn de fases causa un incremento del factor de capacidad, al Cromatogrâfia a Gas__________________________________ 153 aumentar la retendôn de los solutos y causa un aumento del coeficiente de reparto como consecuencia de la reconcentraciôn de la muestra al comienzo de la columna capi lar ( 64 ).. 2) El gas portador: El gas portador o fase movil del proceso debe ser adecuadamente seleccionado siendo fundamental para obtener un buen rendimiento en la eficacia de la columna. Su funciôn es conducir la mezcla de analitos introducida en el sistema cromatogrâfico hasta la salida del detector, pasando a través de la columna donde se produce la separaciôn. El gas debe ser quimicamente inerte y no interaccionar con la coluimna. ni con ninguno de los componentes de la mezcla, no afectando el proceso de reparticiôn y separaciôn en la coluumna. Su elecciôn deberâ hacerse en funciôn de la naturaleza de la muestra. de la fase estacionaria y el tipo de detector utilizado, otros aspectos a considerar es el coste, pureza y seguridad de su uso. El gas portador debe ser de elevada pureza, libre de cualquier contaminante que pueda afectar la fase estacionaria. Algunas caracteristicas mâs destacadas de los principales gases son: el nitrôgeno es seguro y econômico, pero présenta baJa conductividad térmica. Ya el hidrôgeno présenta elevada conductividad térmica, baJa viscosidad y es de bajo costo, pero tiene la desventaja de reducir o alterar los analitos de la muestra. El helio es seguro de manipuler, tiene alta conductividad térmica, es de baJa viscosidad, y es menos denso que el hidrôgeno, lo que le permite un mayor Cromatografia a Gas_____________________________________ HA. caudal. Su desventaja es el elevado costo. La fase môvil en Cromatogrâfia a Gas (GO afecta la duracion del proceso cromatogrâfico y a la resoluciôn cromatogrâfica a través de la velocidad de los analitos en el gas. De este modo cuanto menor sea la difusiôn del analito, menor es la velocidad ôptima del gas, aumentando la duraciôn del anâlisis. La resoluciôn cromatogrâfica depende del gas portador, ya que este influye en la eficacia de la columna. La eficacia de una columna en la separaciôn de un componente depende de la anchura del pico cromatogrâfico, que a su vez se évalua comparando el numéro de platos teôricos de la columna con el mimero de platos efectivos. La naturaleza del gas portador afecta el nûmero de platos teôricos a la altura équivalente a un plato y en consecuencia a la eficacia de la columna. Para elegir el gas portador y determinar el flujo ôptimo de éste a través de la columna manteniendo la mayor eficacia posible, se utiliza la ecuaciôn de Van Deemter(61). H = A + B/u + (CM +CS)u La ecuaciôn considéra las turbulencias del gas portador, su difusiôn y la resistencia a la transferencia de masa. Si enfrentamos el H frente a la velocidad lineal media de cada posible gas (nitrôgeno, helio, y hidrôgeno) obtendremos distintos grâficos como las representadas en la figura 23. CromatQgrafia a Gas. Septum Gas portador C a m a ra de vidrio Bloque metal ico calentado E n tra d a a la cd m a ra Figura 22. Bloque de inyecciôn. Tomado de Técnicas Analiticas de Separaciôn(61). En virtud de las caracteristicas intrinsicas de cada gas el H2 en teoria permite alcanzar mayores velocidades sin disminuir la eficacia de la columna, no obstante debido al riesgo de explosiôn que représenta se torna extremadamente peligroso la recomendaciôn para su utilizaciôn. Por otra parte el gas nitrôgeno causa pérdida de eficacia en la columna relacionada con pequefios aumentos en la velocidad del gas. Debido a esto el helio se tôrna la alternativa mâs idônea y viable como gas portador, ya que permite mantener una ôptima eficacia frente a una velocidad de gas adecuada para el anâlisis, ademâs su maneio no représenta ningùn riesgo al operador. CromatQgrafia a Gas___________________________ _______ 3)Columna cromatogrâfica: La fase estacionaria que se encuentra en la columna capilar de fenil-metil-silicona es liquida y estâ confinada en un tubo largo metâlico, que se encuentra fija a esta a través de enlaces iônicos covalentes a la superficie interna, formando una capa delgada. La ventaja del uso de estas columnas capilares es que confieren al anâlisis mayor resoluciôn. sensibilidad y velocidad, utilizando un minimo de muestra del orden de 2 uL. Al elegir una columna cromatogrâfica debe hacerse en funciôn del tipo de anâlisis a realizar, tomando en cuenta la fase estacionaria, espesor de la fase, longitud de la columna y diâmetro interno de la misma. En el caso del anâlisis y detecciôn de drogas de abuso, debido a que los metabolitos de las drogas a analizar son compuestos apolares, utilizamos fases apolares para su anâlisis cromatogrâfico. Estas fases apolares de la columna cromatogrâfica tienen por finalidad separar solutos en orden cresciente a sus puntos de ebulliciôn, alcanzando elevados rendimientos, con la ventaia de ser muy resistentes al oxigeno y a la temperatura, lo que les confiere una vida media amplia. Se puede relacionar los parâmetro diâmetro interno y espesor de la columna cromatogrâfica a través de la siguiente ecuaciôn: B = D/4u Donde B(beta) es la relaciôn de fases, D es el diâmetro interno de la columna en micras y u es el espesor de la fase estacionaria. Observando estos aspectos, alteraciones en el Cxomatofixafla a Gaa________________________________ 112. espesor de la fase estacionaria o bien en el diâmetro interno de la columna cromatogrâfica influyen directamente en la retenciôn de los solutos de la muestra. Si bien, columnas cromatogrâficas con espesores de la fase estacionaria elevados, presentan relaciones de fase pequeflas, lo que impi ica en mayor retenciôn de solutos y deberân ser utilizados para anâlisis particularmente de compuestos muy volâtiles, con la ventaja adicional que la capacidad de carga de la columna aumenta(64). Se présenta en la tabla 8 algunos eiemplos de fases estacionarias. Por otra parte, si los espesores de fase de las columnas cromatogrâficas son baios, se utilizarân estas columnas para separar compuestos poco volâtiles. En columnas capilares el diâmetro interno oscila entre 0.18-0.25 mm, el espesor de la fase entre 0.2-0.5 u. Elegir una longitud adecuada de la columna estarâ en funciôn de la complejidad del anâlisis de la muestra y en el caso del anâlisis de metabolitos de drogas de abuso dependerâ también de la proximidad entre los puntos de ebulliciôn de los compuestos a separar. Una mejor y mayor resoluciôn en la separaciôn entre los picos cromatogrâficos de los distintos compuestos de la mezcla de una muestra, serâ alcanzada cuanto mayor sea la longitud de la columna, debido a que a mayor longitud, mayor nûmero de platos teôricos. La longitud de las columnas capilares oscila entre 10 y 30 metros. CromatQftxaf ia.. iia. O.J- Velocidad lineal (cm/s) Figura 23. Variaciôn de la H con la velocidad de flujo de la fase môvil(N2,He,H2) en columna capilar. Tomado de Técnicas Analiticas de Separaci6n(61). 4)Detector: El detector es un dispositive capaz de medir una propiedad fisica del gas portador, que varia con la presencia de pequeflas cantidades de los componentes que se analizan en una muestra. Consiste en un sistema continue de detecciôn por el que pasa el gas portador con lo analitos separados previamente en la columna cromatogrâfica y genera una seflal eléctrica distinta para cada analito en la muestra. que es amplificada enviada al registrador o microprocesador. Una caracteristica del detector es su elevada sensibilidad. que se expresa por la razôn existante entre la seflal obtenida (respuesta del detector), frente a la concentraciôn del analito o velocidad de flujo. Para los detectores que dependen de la concentraciôn. la sensibilidasd viene definida por el producto del ârea del pico(A) por la velocidad de flujo(v). dividido por el peso de muestra(p): S = A.v.t/p Para detectores que dependen de la masa, la sensibilidad CxomatQgxatia a Gas_______________________________ 159. es el cociente entre el ârea del pico y el peso de muestra, no dependiendo de la velocidad de flujo. Siendo el limite de sensibilidad, la magnitud de la propiedad fisica que proporciona la minima seftal perceptible. El detector es un elo entre la separaciôn de los componentes de una muestra en una mezcla que pasa por la columna y el cromatograma. La detecciôn del analito genera un potencial eléctrico, sefSal esta que es transmitida a un registre, el cual disefia los respectives cromatogramas. La estabilidad del detector depende de la constancia de la seftal de fonde obtenida en funciôn del tiempo. La respuesta del detector debe ser continua y reproducible frente al mayor nûmero posible de sustancias. Debe poseer un range de concentraciones de soluto en el que la respuesta del detector sea lineal, bien sea que aumentos de la cantidad de soluto correspondan a un incremento proporcional de la seftal del detector, siendo la seftâl del detector directamente proporcional a la concentraciôn del analito en la muestra. El ruido de fondo del detector détermina el limite de detecciôn: cantidad minima de analito que puede ser detectada. Otras caracteristicas del detector debe tener tiempo de respuesta corto, resistencia mecânica y quimica y ser de facil manejo y mantenimiento (61). Existe un amplio nûmero de detectores usados en cromatogrâfia de gases como son: de lonizaciôn de llama, de Captura electrônica, de Conductividad térmica, de Nitrôgeno- fôsforo, de espectrometria de masa , siendo este ûltimo de CromatQg.rafia a Gas 160 caracter universal, devido que es capaz de producir una senal eléctrica frente a cualquier tipo de sustancia que eluya en la coKunna. Se représenta a seguir el procedimiento analitico de inyecciôn en Cromatogrâf ia a Gas (GO. INYECTOR COLUMNA MUESTRA REGISTRO DETECTOR GAS PORTADOR SISTEMA DE PROCESAMIENTO DE DATOS Figura 24. Esquema del procedimiento analitico Cromatografia a Gas______________________________________ 161______ 9,2.- Aplicaciôn en Nuestras Bîolôgicas de orina La muestra biolôgica utilizada en este trabajo fue la orina de los pacientes, que una vez determinado e identificado el metabolito por un método de inmunoensayo preliminar, se procediô a su confirmaciôn por Cromatografia de Gases/Espectrometria de masa(18). 9,3.- Determinaciôn de Drogas de Abuso en orina Fueron separados e identificados metabolitos de opiaceos(morfina,codeina,6-MAM), delta-9-tetrahidrocannabinol, cocaina(benzoyiecgonina,ecgonina metilester), en muestras de orina en poblaciones laboral y drogodependientes. CromatQgrafia a Gas Stnlionary Phase Max. Temp Phase Type Uses Apitzon L 300 Hydrocarbon grease Barbiturates Amphetamines SE-30 300 Dimeihyl- silicone General purpose OV-1 350 Dimelhyl- silicone General purpose O V -IO I 350 Dimelhyi- siiicone Général purpose O V -1 7 350 Phenylmelhyl- siiicone General purpose Carbowax 20M 225 Polyethylene glycol Alcohols Tabla 8. EJemplos de fases estacionarias usadas en anâlisis de drogas de abuso. Tomada de The Analysis of Drugs of Abuse an Instruction Manual (1). 10.- MÉTODO ESPECTROMÉTRICO (MS) Egpectrometria. de Maaaa______________________________ 166___ 10.- Método Espectrométrico 10.1.- Descripciôn de la Técnica Los principles de la técnica espectromètrica se fundamentan en la correlaciôn entre la estructura molecular y el tipo de fragmentaciôn iônica. Existe una correlaciôn directa entre la estructura quimica y el tipo de fragmentaciôn de masas que caracteriza el compuesto analizado como una huella quimica. Para la identificaciôn de las drogas de abuso y sus metabolitos, se utiliza la Espectrometria de masas a partir del impacto de electrones sobre la sustancia consiguiendose su fragmentaciôn molecular. La espectrometria de masa se basa en la ionizaciôn de las muestras en estado gaseoso y en la separaciôn de las moléculas que la componen, segûn una relaciôn masa/carga de los iones formados. El espectro de masas se compone de dos elementos la fuente iônica y el analizador fundamentalmente, en la primera las moléculas son convertidas a iones positives y otras con cargas neutras. Los iones moleculares una vez fragmentados pasan por un campo magnético intenso, el cual desvia los iones positives por un tubo curvo conforme a su relaciôn de masa/carga(m/z), siendo separados por el espectrômetro que los envia al detector, el cual registra picos con las relaciones m/z encontradas. Como el nûmero de carga suele ser uno, los picos de relaciôn m/z se resumen a la masa del iôn que se trate. En el analizador es donde se produce la Espectrometria de Masag______________________________ 165. diferenciaciôn de los iones en relaciôn a la m/z. El espectro de masa de un compuesto se présenta como una grâfica de barras cuyo eje de las abscisas présenta unidades de masa (valores m/z) y el eje de las ordenadas présenta intensidades relativas expresadas en numéro de iones de una relaciôn masa/carga dada que llega al detector. Al pico base considerado el mâs alto se le asigna de forma arbitraria una intensidad del 100%. Es importante recorder que existen excepciones en que los compuestos no presentan un iôn molecular en su espectro de masa, aunque suele ser fâcil de identificar por su amplia abundancia(65). Cuando se inyecta una muestra en el cromatôgrafo de gases,la sustancia en estudio es arrastrada en su totalidad(splidless) dispersandose en el gas portador, que es introducido dentro de la fuente iônica del espectrômetro a través de la interfase Gases/Masas. Los electrones actuan bombardeando las moléculas de la muestra, como proyectiles expulsados de la fuente iônica por un filamento incandescente atravesando enseguida la câmara iônica en direcciôn a un ânodo. De este modo el flujo de moléculas procédante de la muestra vaporizada que entra en contacte con la fuente iônica interactua con el haz de electrones ionizando las moléculas y formando los iones positives. Estos salen de la fuente iônica por un potencial siendo acelerados por el gran diferencial de potencial existante entre los dos electrodes (figura 25). Acto seguido al flujo de iones positives que pasan por entre las plaças de repulsiôn al salir de la fuente iônica se Espectrometria de Masas lèÂ. les aplica potenciales baios para que se produzca un haz definido de iones positives y se enfoca el rayo de luz en un espectrofotômetro(66). Fuente iônica Filamento Plaças aceleradoras de iones Plaça de repulsiôn Haz de electrones Plaças de enfoque de los iones Figura 25. Fuente iônica.Tomada de Interpretaciôn de los Espectros de Masas (66). EspectxQiaetriaL-ds.Jlasas__________________________162________ El haz iônico que se dériva de la fuente iônica impactando en las moléculas de la muestra, las divide en sus respectives masas iônicas (m/z), y a través de deflexiôn magnética ocurre la separaciôn de los iones positives, que colisionan con un colector de iones produciendo una corriente de electrones que es proporcional a la abundancia iônica (figura 26). La eficacia de la ionizaciôn de las moléculas y la formaciôn del espectro es de extrema sensibilidad(67), siendo capaz de obtenerse espectros patiendo de submicrogramos de muestra. Los compuestos de baja volatilidad pueden ser introducidos insertados directamente, mientras que otros es necesario utilizar un procedimiento de dérivâtizaciôn previa. Una pequefia f race iôn de la sustancia evaporada es ionizada por bombardiamiento de electrones en condiciones de elevado vacio en la fuente iônica, resultando en la descomposiciôn molecular de la sustancia con sus respectivos pesos moleculares definidos en fragmentes iônicos. Todos los iones positives son acelerados, focalizados y separados de acuerdo con su relaciôn masa/carga(m/z), en el campo magnético que sigue a su paso très el bombardeo con el haz de electrones, siendo medida la corriente de cada ion separado. Es de extrema importancia relacionar los iones positives formados de la muestra con el bombardeo de electrones indicado por el espectro de masa, con la estructura molecular de la muestra. El Espectro de Masas représenta la relaciôn entre la Espectrometria de Masas______________________ IM. proporciôn masa/carga de la variedad de fragmentes iônicos formados y la intensidad relativa de la corriente iônica. Lo que ocurre es que los electrones tienen energies del orden de 50-100V muy superiores a las energies necesarias para la ionizaciôn de las moléculas que es del orden de 7-16V. De esto résulta que de la interacciôn de un electrôn y una molécule surge un iôn molecular por eyecciôn de otro electrôn. El iôn molecular a su vez se descompone en fragmentes iônicos del espectro, que indican las partes que componen la molécule. La interpretaciôn del espectro de masas se fundamenta en la identificaciôn del iôn molecular que determine el peso molecular y la composiciôn elemental de una molécula(66). Un espectro de masa manifiesta esencialmente la masa de la molécule y los fragmentes que se originan de su rupture. El Espectro de Masas es usualmente representado graficamente por abscisas y ordenadas donde las abscisas corresponden a la proporciôn masa/carga en unidades de masa atômica(AMU) y las ordenadas représenta la intensidad relativa de la corriente iônica de la variedad de fragmentes iônicos formados, El tipo de fragmentaciôn es reproducible y caracteristico para cada compuesto orgènico. De esta forma la Espectrometria de Masas es el método mès especifico en la actualidad para la identificaciôn de compuestos orgânicos. El elevado poder de resoluciôn de la cromatografia de gases combinado con columnas capilares y la técnica espectromètrica permite alcanzar resultados practicamente définitives en Ea&ectrometria de Magas. cuanto a la identificaciôn y eluciôn estructural de los analitos(61). Del sistema de entrada por el depôsito Fuente iônica 'il A la bomba de vacfo o# Imôn 'Rendija de salida de iones Tubo analizador Haz de iones separados Colector de iones Figura 26. Representaciôn esquem&tica de un Espectro de Masas, Tomado de MCLAFFERTY.F.W. (6 6 ) La correlaciôn entre estructura quimica y fragmentaciôn iônica derivada de la ionizaciôn de la sustancia es el pilar Ê p.ectrQmetria-de. Masas Jim de identificaciôn en que se basa esta técnica. Todo compuesto orgânico tiene un tipo fundamental estructural correlacionado a sus fragmentes iônicos, cuyo càlculo puede obtenerse con exactitud por la medida de su masa o PM(peso molecular), esto se aplica para las drogas y sus metabolitos. Es por tanto un método de singular importancia, imprescindible y de extrema utilidad y fiabilidad para identificaciôn de drogas de abuso a partir del hallazgo de la masa molecular(6 8) (tabla 9). Los metabolitos usualmente poseen la misma estructura quimica fundamental que su pariente compuesto de origen y ademâs su Espectro de Masa contiene similares o identicas moléculas y consecuentemente tendrâ semejantes fragmentes iônicos al descomponerse en la fuente iônica(l). Los cambios quimicos de la estructura fundamental y los consecuentes al metabolismo de la sustancia o debido a los procedimientos de derivatizaciôn, conducen a los tipicos cambios en el Espectro de Masas. No se puede considerar una identificaciôn quimica précisa sin haber sido capaz de detectar su presencia particularmente de drogas en fluidos o materiales biolôgicos y su respective confirmaciôn por Gases Masas.(figura 27) DE IONES SEPARADORCAMARA DE IONIZACION REGISTRO AMPLIFICADOR DE LA SENAL Figura 27. Proceso Espectrométrico de Masas Espectrometria de 111. Trace Immunomethod Method(s) of comparison Results Reference cortisol ria hpic or ms (reference method) hpic more accurate than ria 1068 cortisol ria ms ria results 25% higher than ms 1069 6/)-hydroxycortisol ria hpIc good correlation, ria simple, rapid 1070 derivative of prostaglandin £ , ria gc-ms. tic ria least specific 1071 benzodiazepines EMIT tic EM IT faster than tic 1072 benzodiazepines EMIT gc EM IT frequently gives low v^ues for elevated diazepine concentrations 1073 diazepam ria gc ria consistently higher by about 60 ng/ml 1074 diazepam EM IT gc good agreement 1075 bupropion ria hpic excellent agreement 1076 doxepin ria hpic good correlation (r = 0.99) 1077 haJopcridol ria gc good agreement only after extraction before ria determination 1078 imipramine ria gc, gc-ms results of all 3 methods agree 1079 nomifensine ria gc results agree 1080 procainamide EMIT hpic results agree (r = 0.98) 1081 procainamide ria gc good correlation 1082 phenycyclidine ria gc, EMIT correlation between 3 methods acceptable 1083 phenycyclidine EMIT gc correlation good (r = 0.98) 1084 phenobarbitone, phenytoin EM IT hpic correlation (r = 0 99 and 0.97) 1085 methotrexate ria hpic. EMIT agreement 1086 gentamycin ria hpic, fluoresc. immunoassay fluorescence immunoassay gives best results 1087 gentamycin ria EMIT, microbiological assay, adénylation ria gives higher results, other methods agree 1088 indoI-3-ylacetic acid ria gc-ms agreement after chromatography before ria 1089 cannabinoids EMIT ria, gc^ns EM IT preferable to ria or gc 1090 A* tetrahydrocannabinol ria gc-ms results agree 1091 tobramycin EMIT microbiol. assay results agree 1092 tobramycin ria EMIT, microbiol. assay EM IT more precise 1093 drugs of abuse EMIT gc-ms excellent agreement in most cases 1094 morphine ria gc ria gives higher results 1095 morphine EM IT gc gc more precise 1096 quinidine EMIT fluorimetry EM IT more specific 1097 quinidine EM IT hpic EM IT gives higher results, hpic more specific 1098 quinidine EM IT hpic hpic mote specific, correlation r = 0.95 1099 Tabla 9. Comparaciôn de métodos de inmunoensayos. Tomado de Organic Trace Analysis(68) 1 0.2 .- Aplicaciôn en Muestras biolôgicas de orina El método espectrométrico de masas se aplicô para la confirmaciôn de muestras de orina positivas en técnicas de Espectrometria .de Masas_______________________________ 172 screening por inmunoensayos de poblaciôn laboral de nuevo ingreso y de plantilla, asi como también en poblaciôn de pacientes en reabilitaciôn de drogodependencia. 10.3.- Determinaciôn de drogas de abuso en orina Una vez constatada la positividad de las muestras a drogas de abuso por las très técnica de screening por inmunoensayo, se procédé a su confirmaciôn por Gases Masas. En el présente trabajo fueron identificados opiaceos(morfina,6- M A M , c o d e i n a ) , c a n n a b i s ( d e l t a - 9 - tetrahidrocannabinol),cocaina,benzoylecgonina,ecgonina-metil- ester). 10.4.- Cromatogramas y Espectros de masas de las drogas de abuso A seguir mostramos ilustraciones de los cromatogramas de los metabolitos de drogas de abuso(marcadores biolôgicos) investigados, con sus respectivos espectros de masas. Para opiâceos: morfina(figura 28), codeina(figura 29) y 6- MAM(figura 30). Para el cannabis delta-9-tetrahidrocannabinol (figura 31). Para cocaina(figura 32), benzoylecgonina(figura 33) y ecgonina metilester(figura 34). Espectrometria rift masas 12Jl Abundance TIC: 231.D 1.60+07 - 1.40+07 - 1.20+07 - 10+07 - 8000000 - 6000000 - 4000000 - 2000000 - Time— > 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 Abundance 3500000 -I 3000000 2500000 2000000 - 1500000 1000000 500000 - Scan 575 (11.785 min): 231.D 4l4 MORFINA 119 69 181 214 25%^^ 307i||ji .'è. .iè| Jî! , .Ji,—it. , i 361 • 11 386f* t ' : "4- f- 577 457 514 558 I ' ' ' ■ I ' ' ' ' I ' ' ' ' I ' ' ' ■ I ' ' ' ■ I ' ' • ' I ' ' ' ' I ' ' ' ' i 'm/2— > 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Figura 28. Cromatograma y Espectro de masas de la morfina Espectrometria de masas Abundance TIC: 231.D 1.60+07 - 1.4e+07 - 1.2e+07- le+07 - 8000000 - 6000000 - 4000000 - 2000000 - Time— > 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 Abundance Scan 589 (11.951 min): 231.D 2$2 100000 - CODEINA80000 - 60000 - 445 40000 - 5769 119 20000 - 266225 464414 211 388322 357 50 100 350 400 450m/z— > 150 250200 300 Figura 29. Cromatograma y Espectro de masas de la codeina Espectrometria de masas I I L Abundance 7000000 - TIC: 10260225.D 6000000 - 5000000 - 4000000 - 3000000 - 2000000 - 1000000 - Time— > 6.00 7.00 8.00 Scan 628 (12.339 min): 10260225.DAbundance 4] 500000 - 6-MONOACETIL MORFINA 400000 - 300000 - 204 473 361200000 - 100000 - 16281 430119 32015 266 37458 307225 m/z— > 400 45050 350100 300150 250200 Figura 30. Cromatograma y Espectro de masas de 6-MAM Espectrometria de masas 13Jl Abundance TIC: 8116 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000■ 500000 - Time— > 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 Scan 2027 (14.045 min): 8116.DAbundance 10000 - THC-COOH8000 - 297 6000 - 4000 2000 473 tn/z— > 460300 320 400 420 440340 380360 Figura 31. Cromatograma y Espectro de masas del cannabis Espectrometria <1e masaS- 111. Abundance TIC: 9180702.D 2000000 - 1500000 - 1000000 - 500000 - Time— > 6.00 7.00 8.00 Scan 536 (11.257 min): 9180702.D (-) 1Ô2 Abundance 4500 4000 COCÀINÀ 823500 3000 2500 2000 303207 961500 16254 141000 500 354272139 35050 300250100m/z— > 150 200 Figura 32. Cromatograma y Espectro de masas de la cocaina 12AEspectrometria de masas Abundance TIC: 9180702.D 2000000 - 1500000 - 1000000 - 500000 - Time— > 6.00 7.00 8.00 Scan 421 (9.918 min): 9180702.D 3l8 Abundance 120000 A 100000 BENZOIL ECGONINA 80000 8260000 - 40000 - 97 57 20000 - 439272 288122 149 354183 210 233 50 100 350 400m/z— > 150 300200 250 Figura 33, Cromatograma y Espectro de masas de la benzoylecgonina(BZE) EspectrnmAtria de masas. 12± Abundance TIC: 9180702.D 2000000 - 1500000 - 1000000 - 500000 - Time— > 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 Abundance Scan 60 (5.722 min): 9180702.D 1*2160000 - 140000 - CGONINA METIL ESTER120000 82 100000 80000 - 60000 - 345 40000 94 14 11920000 - 55 150 286198135 50 100m/z— > 250 300 350200150 Figura 34. Cromatograma y Espectro de masas de la ecgonina34 metil ester 11.- LEY DE PREVENCION DE RIESGOS LABORALES (LEY 31/1995) Ley £reyenc.i«̂ ii de BI&z&qs. LabQxal^s__________________ l&l_____ 11.- LEY DE PREVENCION DE RIESGOS LABORALES (LEY 31/1995) Se fundamenta esta ley en la normativa legal que busca el désarroilo de una polltica de protecciôn de la salud de los trabajadores mediante la prevenciôn de los riesgos derivados del trabajo, donde se configura en un marco general el désarroilar las distintas acciones preventiva en sintonia y Goncordancia con las decisiones de la uniôn europea con el compromise de meiorar progrèsivamente las condiclones de trabajo y de conseguir estes obietivos coniuntamente y en armonia en los diferentes paises europeos. De la incorporaciôn de Espafia a la CEE se dériva la necesidad de integrar armonicamente dentro del contexte politico comunitario la implementaciôn de una acciôn polltica que meior encause la prevenciôn de los riesgos derivados del trabajo. El tratado de la uniôn europea ha reforzado y promovido majoras en el medio laboral intentando aproximarse a la armonizaciôn en el progreso de las condiciones de seguridad y salud de los trabajadores. Esta ley 31/1995 de Prevenciôn de Riesgos Laborales se reviste de especial trascendencia al abarcar el universe del medio ambiante laboral, de la seguridad y la salud de los trabajadores, recogiendo de forma integrada la polltica de prevenciôn de riesgos laborales, enfatizando en que es precise establecer un adecuado nival de protecciôn de la salud de los trabajadores, frente a riesgos derivados de las condiciones de Ley Prevenciôn de Rieagos .Laborales___________________ 1&2. trabajo, partiendo del reconocimiento del derecho de los trabajadores en el âmbito laboral a la protecciôn de su salud e integridad. El ambito de aplicaciôn de la ley incluye los trabajadores vinculados por una relaciôn laboral en sentido estricto y tiene por finalidad mejorar y elevar el nivel de protecciôn de la salud y la seguridad de los trabajadores, y busca articular obligaciones y responsabilidades de los individuos directamente relacionados con el hecho laboral, fomentando una oultura preventiva mediante la promociôn de la mejora de la educaciôn en todos sus niveles, involucrando a toda la sociedad en su conjunto, con el fin de alcanzar su obietivo social la protecciôn del trabaiador en el medio laboral. La protecciôn del trabajador frente a los riesgos laborales exige una actuaciôn y compromise por parte de la empresa, que debe contemplar en todo momento desde el instante mismo del disefio del proyecto empresarial la planificaciôn de la prevenciôn de los riesgos laborales, asi como de su permanente actualizaciôn a medida que se alteran las circunstancias laborales. Es imprescindible que las medidas de acciôn preventivas sean adecuadas a la naturaleza de los riesgos detectados y el control de la efectividad de las mismas constituya la base de la prevenciôn de riesgos laborales, de forma que estas medidas aliadas a una adecuada informaciôn y formaciôn de los trabajadores se consolide, con el obietivo de meior conocimiento de los riesgos derivados del trabajo, como de la forma de prevenirlos y evitarlos, adaptados en funciôn de las Lev Prevenciôn .de . Rissficis Laborales__________________ 183. peculiaridades de cada actividad laboral y caracteristicas de los individuos que las désarroilan. La atenciôn a la confidencialidad y el respeto a la intimidad en relaciôn a las medidas particulares a adoptar en actuaciones de relaciôn laboral que como por eiemplo tiene su apiicabilidad en el contexto de la investigaciôn laboral de drogas de abuso o de anâlisis de drogas "in situ", fundamentalmente en aquellas funciones de elevada responsabilidad como maneio de armas y conducciôn de véhicules por eiemplo. El articule 22 del capitule 1 de la Ley de Prevenciôn de Riesgos Laborales expresa que esta tiene por obietivo promover la seguridad y la salud de los trabajadores a través de la aplicaciôn de medidas y el désarroilo de actividades necesarias para la prevenciôn de riesgos laborales. El articulo 42 del mismo capitulo se refiere a que debe tomarse un conjunto de medidas adaptadas en todas las fases de actividad de la empresa con el fin de evitar o disminuir los riesgos derivados del trabaio, que es la posibilidad de que un trabajador sufra un determinado dafio derivado del trabaio, asi como contempla todavia en este apartado todas aquellas medidas que deben ser adoptadas por la empresa de caracter colectivo o individuales, como son equipos de protecciôn colectivo e individual para los trabajadores, procurando con estas medidas protéger los trabajadores de dahos a la salud. Cabe a la Administraciôn Pùblica dice el articulo 72 del capitulo II de esta Ley el cumplimiento del désarroilo de las Lev Prevenciôn de Rle gRQ.s Laborales____________________ 18k. funciones de promociôn de la prevenciôn de riesgos laborales el cumplimiento del désarroilo de las funciones de promociôn de la prevenciôn, asesoramiento técnico, vigilancia y control del cumplimiento de esta normativa, asesorada por el Institute Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabaio.(BOE num 269, nov/1995)(69). Como se puede apreciar existe un compromise y preocupaciôn patente del Estado en los cuestionamientos médico-légales que pueden plantearse por eiemplo en cuanto a la exposiciôn de drogas de abuso se refiere por parte de la poblaciôn laboral, en virtud del riesgo a la salud y la integridad flsica implicites que pueden derivarse de la exposiciôn a las drogas de abuso en el medio laboral, que podrian contribuir a la accidentabi1idad. 12.- RESULTADOS Y DISCUSIÔN Resultados v Discusiôn___________________________________I M __ 12.- RESULTADOS Y DISCUSION 12.1.- Screening de drogas de abuso por inmunoensayos y confirmaciôn por gases masas(GC-MS) En el presente trabajo hemos investigado las frecuencias de positividades a la exposiciôn a drogas de abuso opiàceos, cannabis, cocaina, benzodiacepinas, anfetaminas y sus metabolites,en el caso de los opiâceos la morfina, codeina y 6-MAM, para el cannabis el delta-9-tetrahidrocannabinol, en el caso de la cocaina la benzoylecgonina y ecgonina metilester, en las anfetaminas hemos investigado anfetamina y metanfetamina derivados de feniletilamina, en el caso de las benzodiacepinas el oxazepan, como marcadores biolôgicos, utilizando tres técnicas de screening por inmunoensayos (KIM,FPIA y CEDIA) y estableciendo su correlaciôn de positividades con una técnica de referencia que fue el gases masas(GC-MS). Analizamos 5000, 627 y 111 muestras de orina en poblaciôn laboral de plantilla en reconocimientos anuales, nuevo ingreso y rehabilitaciôn de drogodependientes extrabajadores en tratamiento, respectivamente. La definiciôn de los positivos por inmunoensayo fue establecida previamente en los instrumentos a partir de determinados puntos de corte que para el método KIM fueron; para opiâceos 300 ng/mL, cannabis 50 ng/mL, cocaina 300 ng/mL, anfetaminas 1000 ng/mL y benzodiacepinas 100 ng/mL. Se consideraron positivos por FPIA a partir de los siguientes RegultadQg v Dlgcugiôn________________________________182 puntos de corte: opiâceos 200 ng/mL, cannabis 25ng/mL, cocaina 300 ng/mL, anfetaminas 300 ng/mL y benzodiacepinas 200 ng/mL, Los positivos por CEDIA tuvieron un punto de corte para opiâceos 300 ng/mL, cannabis 50 ng/mL, cocaina 300 ng/mL, anfetaminas 1000 ng/mL y benzodiacepinas 300 ng/mL. En el cuadro 1. se observa que ocurren baias frecuencias a la exposiciôn de drogas de abuso, prevaleciendo la exposiciôn a benzodiacepinas en personal de plantilla, encontramos 243 muestras positivas por la técnica KIM, de las cuales se confirman todas las muestras positivas a opiâceos(100%), no detectamos practicamente heroina apesar de haberlas pasado por el gases masas, porque no encontramos el marcador de exposiciôn a la heroina el 6-MAM y porque los coeficientes morfina/codeina son baios, por lo que corresponden a exposiciôn a fârmacos como el codeisan. En el caso de la cocaina se confirmô el 100% de los positivos en el screening, salvo para las muestras positivas a cannabis cuya confirmaciôn fue de 96,4%. Nos encontramos con dos falsos positivos a cannabis debido a problemas en la especificidad y sensibilidad del anticuerpo en el procedimiento turbimétrico KIM, habiendo sido constatado interferencias con otras especies farmacolôgicas por encontrarse tomando macrôlidos concretamente rifampicina, ocurriendo asi una reacciôn cruzada. En el grâfico 1. podemos observar la distribuciôn de los 243 positivos a drogas de abuso de la poblaciôn de plantilla por la técnica KIM. En el grâfico 2 sectorial analizamos la Re.gui.tadc>s. Y. Discusiôn________________________________188. frecuencia porcentual de cada una de las drogas en este grupo de plantilla, siendo la mayor exposiciôn a benzodiacepinas de un 46,5% y la menor frecuencia para cocaina y anfetaminas de 3,3% para ambas. En el cuadro 2 tenemos la comparaciôn por métodos KIM y CEDIA de las frecuencias a la exposiciôn a drogas de abuso de las 243 muestras positivas de las 5000 muestras analizadas en personal laboral de plantilla y observâmes que se confirman por gases masas el 100% de las muestras positivas en CEDIA, sin embargo ocurren dos falsos positivos en KIM lo que ratifica la importancia de usar la técnica de confirmaciôn gases masas. No fue posible confirmer por gases masas los positivos a benzodiacepinas ni a anfetaminas porque no era el obietivo de este trabaio, no obstante se observa un incremento en la exposiciôn a estas drogas de abuso en el grupo de plantilla que puede tener importantes repercusiones en la sinestrabilidad laboral por eiemplo, en virtud de que el interés médico laboral esté en establecer relaciones de la exposiciôn a drogas de abuso con la presunciôn de riesgo en el momento de asumir el puesto de trabaio y durante el desempefio del mismo. § I 1 1 ^ ill O Q _ OCO D _ Q 0 : 5 ■+— »1 % ^ Ë 2 CD " OCO co S 2CDo COCD O t :o Q _CO c c -ri ^ - m g ^ “Oc I ( 8 IE % E ÿ 0 0 4— * — )(D C Q ^ ■ § « ■S g oo Tl- g oo 1 1 CO 1o CDin COin 00 1 1 0 CO CO <3 COCMCM CO o' s1-œOCL O)in inin 00 CO 00 X 4—» c q) <0(C " O coN _co co co co üc CD D Ü (Dk_*4— CO _çO CD " O CO O ■ O O E o CL C 9ü co co CLEoü co Ci ■4= co 0 U) C O ) O O . ço CO 2c o CD"D 3Eo o o 0 CD ■Q ^ § 1 CO co1_-I— ' co (D 3E _cO C jO Q . (D "O CO Co CD U O g 2 _ ■§ o « “ S ' - S ë Q - ■Q CO co CD O ) O O C - I C co Iü (D < OLU O < O OtrQ CD l O co 0 00 CD 0 00 CD 0 0 0 00 CO CO OLU O < CL O ÇO C Û < C 0 < û_LL O Q_ 0 %N 0 0 ^ O o CL 0 0 g O c§ ü 013 C - O ü3J3 b D)C O 03C c8&_ 0 03E g y 8 g CÛ I i < 03c 'cdo ü çg lûCdc §ü oCD g ■q -O oco oLO o 00 oCM 0 LUz LUh-1Og üg[g Id < % cCDoCDCD k _D)Co m3C Ü N CM. o o> CM oo" 0 0 N (OCDCD 3 E CM■4CM mCOCD L _ J D Eo 0LU ZLUI-10 g üg[g < CD "Dg 1V.o -û 3 LLÎ LU3 LL in0ü 1 (D Œ LUO (fi Tj- co < < 0 _ OCD 3 ^ ÇÛ CD< LU UJ W ai 5 o o û -DC Z O O< g < ^ > oc CD Z O OCL ü i o o ÿ CD LU LU ce3 Z CD Q >■ OC g oü < QLUü > < 0 _ u_ Q OCQ< OCDLUOCCDZ O>LU3Z LUQ (O CD (Si1< LOZ G)G)OC T—o coCJ)00 ÜUo Q _ O ) I-ÎI ^ -g J O c 0 *— >0 c0 0 0 3 o0 3E ■ D C 0 ^ ^ CL 0 ZZ 0 0 ^ TD % C O 0 O) O03 TD C Ü ^3 (0 ID 0 b T 3 oo oo oo 1 1 CO 1 Ü CO 1 1 CD CO CO CO CM lO lO lO CO N CM CO s 1- COo OL -M- CO lO G) 0 c0 00 .1=: c 0 0 0 0 o Q. 0 0 0 13 O OCM 05 CM O 13■g m C - O O O) ïii (D 50 .Ç co o 0 0) E œ CD 2 tD 0 0 ■ D g ü T- 3 -r- D 0 • - - O CD Q 0 2 Iü 0 0i H en OCL <0 Oceû T ' " -7-- oo s h-CM CD CO CDCM D)CM CDaË CL O CD en< '0 OQ. 0 O0 0 ü CO 0 " O C g ü 3 ; 9 -t— ' 0 b c0 co o O oCL c g U0E co ü 30 < CLLL OQ. O0 3_Q0 sg fcb CD o> i l Oœ ■jo L_ "O0 C0 004— »C0 io c0CL0"OOD)O U O o oCO inCM OCM LO LO O LUZ LU Og üg a> 16 < CD“D O b 13 0 1 LU LU3LL O0 1 CD LUCÛ ̂ CO ■ “ s I ? 0 ) T 3 0) CD a 5 5 5 5 55 0 O LUZHI H IoÜ 'c Ü g]g IB < 0 “D _g o 13 b :§ ÛJ ëLU 3LJL 00 O t Ü 13.- CONCLUSIONES Concluaionea_________________________________________ 210___ 13.- CONCLUSIONES 15.- MEMOS ENCONTRADO EN POBLACION LABORAL DE PLANTILLA, DE NUEVO INGRESO Y REHABILITACION DE DROGODEPENDIENTES UNAS FRECUENCIAS DE POSITIVIDADES POR INMUNOENSAYOS A LA EXPOSICION DE DROGAS DE ABUSO PARTICULARMENTE A CANNABIS DE 1,1%, 8,77% Y 12,6% RESPECTIVAMENTE. A OPIACEOS DE 1,18%, 1,27% Y 3,6% RESPECTIVAMENTE. A COCAINA DE 0,16%, 0,95% Y 5,4% RESPECTIVAMENTE, RATIFICADAS POR LA TECNICA DE REFERENCIA GASES MASAS. 25.- PROPONEMOS COMO PUNTOS DE CORTE EN VIRTUD DE SU MAXIMA PROBABILIDAD PARA SER CONFIRMADOS POR GASES MASAS LOS SIGUIENTES: OPIACEOS 300 ng/mL, COCAINA 300 ng/mL, CANNABIS 50 ng/mL. SIENDO EL METODO DE ENZIMOINMUNOENSAYO CON ANTICUERPOS MONOCLONALES (CEDIA) EL MAS UTIL PARA EL SCREENING DE DROGAS EN VIRTUD DE SU CAPACIDAD PARA SER AUTOMATIZABLE EN AUTOANALIZADORES CONVENCIONALES. 35.- DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS SE DESPRENDE QUE LAS FRECUENCIAS DE EXPOSICION A DROGAS DE ABUSO EN POBLACION LABORAL DE PLANTILLA Y DE NUEVO INGRESO ES RESPECTIVAMENTE DE 2.44% Y 10.99%, LO QUE PERMITE CUESTIONAR LA UTILIDAD DE INVESTIGAR METABOLITOS DE DROGAS DE ABUSO IN SITU EN LUGAR DE UTILIZAR LOS RECONOCIMIENTOS MEDICO LABORALES, EN FUNCION DE ESTABLECER UNA MEJOR PRESUNCION DE RIESGO ACORDE CON LOS PLANTEAMIENTOS DE LA LEY DE PREVENCION DE RIESGOS LABORALES. Conclusiones________________________________________ 211___ 45.- AUNQUE LA OBTENCION DE MUESTRAS EN NUESTRO TRABAJO A TENIDO QUE SER VOLUNTARIA Y ANONIMA PROPONEMOS QUE CON UN INTERES MEDICO LEGAL LA INVESTIGACION DE METABOLITOS DE DROGAS DE ABUSO EN POBLACION LABORAL EXIGE A NUESTRO JUICIO COMPLIMENTAR LOS SIGUIENTES REQUISITOS:-DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO POR ESCRITO,-ELABORACION DE UNA CADENA DE CUSTODIA ACREDITADA DOCUMENTALMENTE,-CONFIRMAR MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE GASES MASAS TODAS LAS PRUEBAS POSITIVAS POR METODOS DE SCREENING,-REALIZAR INFORME TOXICOLOGICO CON LA INTERPRETACION DE RESULTADOS CORRESPONDIENTE FUNDAMENTALMENTE EN LOS CASOS DE POSITIVOS A OPIACEOS Y CANNABIS. 55.- LAS FRECUENCIAS DE RESULTADOS POSITIVOS PARA ANFETAMINAS OBTENIDAS MEDIANTE TECNICAS DE SCREENING EN LAS POBLACIONES LABORAL DE PLANTILLA, NUEVO INGRESO Y DROGODEPENDIENTES HA SIDO RESPECTIVAMENTE DE 0,16%, 0,31% Y 2,7%, LO QUE JUSTIFICA A NUESTRO JUICIO SU INVESTIGACION EN LOS PROTOCOLOS DE ANALISIS MEDICO LABORALES, PROPONEMOS SE REALICEN TRABAJOS MAS AMPLIOS DONDE MEDIANTE LA CONFIRMACION POR GASES MASAS JUSTIFIQUE UNA INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS EN RELACION CON LA PRESUNCION DE RIESGOS LABORALES. 65.- LAS FRECUENCIAS A EXPOSICION A BENZODIACEPINAS OBTENIDAS EN LAS POBLACIONES LABORALES DE PLANTILLA Y NUEVO INGRESO ASI COMO DROGODEPENDIENTES HA SIDO RESPECTIVAMENTE DE 2,26%, 0,31% Y 67,5%. PROPONEMOS LA INVESTIGACION MAS AMPLIA Y Conclusionea_____________________________________ 212. DETALLADA DE ESTA CASUISTICA Y SU CONFIRMACION POR GASES MASAS POR CUANTO PUEDIERAN INFLUIR EN LA ACTITUD EN EL TRABAJO DE PERSONAS SOMETIDAS A AUTOMEDICACION Y EN LA INVESTIGACION DE LA TRANSGRESION DEL CONTRATO TERAPEUTICO EN POBLACION DROGODEPENDIENTE SOMETIDA A REHABILITACION. 14.- BIBLIOGRAFIA B ib lio a ia fia____________________________________________ 2 J J l _ 1.- COLE,M.D.;CADDY,B. Forensic Science Unit, University of Strathelyde. Ed. Ellis Horwwod Series in Forensic Science 1995. 2.- FULLER,R.K. Alchohol e Alcohol, suppl 2. p p . 103-106, 1993. 3.- WIELL,J.;SCHELLENBER.F. Alcohol e Alcholism, suppl 2. p p 107-110, 1993. 4.- AUBÂ,J.;SERRANO,M.;FRUTOS,D.;MIRA,M. Medicina Clinica 100(1), pp. 5-8, 1993. 5.- C0RR0NS,V.L.J. Medicina Clinica 91, p p . 264-266, 1988. 6 .- PLA,A. ;HERNÂNDEZ,F,A, ;VILLANTJEVA,E. 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