3 2. ~

~iqcnv,

UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS QIJÍMICAS

Dpto. de BIOQUÍMICA

Y BIOLOGíA MOLECULAR

ESTUDIOSESTRUCTURALESDE LA PROTEÍNA

MAYORITARIA DE LA CÁPSIDA DE LENTIVIRUS

1H11III IllIhtIllIl III
1~V!~O9S44OSI.

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

Director: FranciscoGavilanesFranco

TESISDOCTORAL

M~ BELÉN YÉLAMOS LÓPEZ

Madrid,Mayo de 1998

A



>4rni/atnt¿a ~, a



<-./a jarcien/e ¿nuoí/¿ga¿¿¿n le ti ¡¿vado a ¿‘a/o en o¡~epar/amcn/o dc éLqu¿m&a ~c~ko¡og¿a 2fle¡cca/a,’ ~.9dc ¿
icen/taj do (Qoncíaí Qnún¿caí. tajo ti d¿.c¿c¡¿n ¿¿el 2>..

7’ancilco 6auí/atWl tJ’anco, al cual quiero cip.’clar

pPo/2UfltÍ> a¿Jb’adocun¡ento por Iii gran dtt’OCCLOC ~ la apoyo en t
0d0 monten/O. inclino, quiero agradccc.’ al ¿ti’. )ol¿ 6”

(tat~ liaren ol’/ater permitido ¡ni inco.’po.’acicin aí<~epa.’tamenlo

A t~d0 ¡ni grupo d0 ñwoí/igacicin. a/que/o ¿‘¿I/o crecer delio que te produjo mí en/ra
4 en e/cf?. A }¿1~~~0t

apoijo continuo Jal g.’ancLi eonie¡oí que ¿re permitieron deionvoter»te en o/campo de la S~olog¿a fljolocutir.A ‘ti/acto, por

tu ¿Icd¿eacíon en ¿ni primel’ año de Loiti ~ que ¿nc tn,c¡¿ en la ¿nro ítigacie=nde la el/rae/ura de pro/e¿naí.>I (armen
a &iQoa/,’íz,

ti Acn/(..flinai de/grupo a ¡al que ideo una ¡oiL chanda en cite latoratonio.

>4 ¿tena, fa que en ella no lote te encon/raclo una exceterio compañera dc trata/o lino /anitdn una gran amiga, que

La ¿‘italo corrugo en todo monten/o. ~a lAutin, ¡a cita tecencarnañón de l~a a/egría g a ¡a que ‘nc a/ogro marLo Ja Latee

¿Ot¿”flt¿IO.

¿¡¿crol¿¡pci’ iapueito, a/tel/o de/rL?, JiuiclkIo va en variol ¡alo,ato,’ioí, con que líe palado mw¿

ir o,,,¿‘itteí.

Á¡Sr. ~b.I./9eíe¡’íon por pet’miti.nte ¡ni el/anda en la ¡alotatorio y toda ¡a aytnti p¡’eitac/a en eí

¿‘.ílc¿cIio ¿le (u pro/chau que coní/ituyen ele/e cen/ral cte cita fl~1erno,.ia.

>1 mr.i /a¡ni¿4a, por la conilante apoyo en lodo níonlenio en elpecia/a ¡nl al neta a ¡a
cj¡lt’ Jiei>ipY’

i ‘ÚeOi ‘cuí ‘ú.

¡jj,/por último a )oíó j,o,. apoyasnie, anunarme, aco.¿íc¡arnze, en fin, por citar liempie a mí Lk.



iNDICE

INTRODUCCIÓN

RETROVIRUS

A. Morfología
B. Replicación y ensamblaje viral
C. Organización del genoma viral
D. Tipos de retrovirus

VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA

VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA FELINA

PROTEÍNAS DE LA CÁPSIDA LENTIVIRAL

OBJETIVOS

MÉTODOS EXPERIMENTALES

.3

3
5
7

12

16

1•7

19

24

1. Clonación, expresión y purificación de la proteína de la cépsida de EIAV

2. donación,

3. Obtención

expresión y purificación de la proteína de la cépsida de FIV

de las formas mutantes de la proteína de la cépsida de FIV

32

35

4. Técnicas de biología molecular

5. Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia

Transferencia e inmunodetección

Enzimoinmunoensayo

Determinación de la concentración de

Valoración de grupos tiólicos libres

Marcaje de cisteinas libres

Reducción y carboxiamidometilación

Oxidación y reducción de las proteínas

Dicroísmo circular

Predicción de estructura secundaria

Fluorescencia

Estudios de desnaturalización por urea

de SOS (PAGE-SOS)

39

40

41

41

prOteína 42

43

43

44

44

44

45

46

48

27

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.



RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DEL VIRUS
DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA (EIAV>. PAPEL DE LOS GRUPOS
SULEHIDRILO EN EL MANTENIMIENTO DE LA ESTRUCTURA

1 .A. CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA
EIAV-rp26

1 .8. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE EIAV-rp26

1 .C. PAPEL DE LOS RESIDUOS DE CISTEÍNA EN EL MANTENIMIENTO
DE LA ESTRUCTURA DE EIAV-rp26

1 .D. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA
PROTEÍNA rp26-HIS DE EIAV

2. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DEL VIRUS DE
LA INMUNODEFICIENCIA FELINA <FIV>. MECANISMO DE PLEGAMIENTO

2.A. CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE FIV-rp24 Y MUTANTES

2.8. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE FIV-rp24 Y MUTANTES

2.C. ESTUDIO DE DESNATURALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA rp24-FIV.
MECANISMO DE PLEGAMIENTO

CLONCLUSIONES

BIBLIOGRAFíA

65

91

95

• . . 96

• 104

.118

137

141

52

52

56

—II—



ABREVIATURAS

ESA:
CA:
CA PS:
CCA:
CD:
CEAV:
CypA:
DAR:
DTNB:
DTT:
EDTA:
EIAV:
env:
51V:
AG:
gag:

HcIGu:
HIV:
HPLC:
IN:
1 ETO:
LE:
LI:
LT R:
MA:
MHR:
NC:
Nef:
f’JTA:
ORF:
PAGE-SDS:
PCR:
pci:

PR:
Rey:
RMN:
RT:
SOS:
SIDA:
SIV:
SU:
TA E:
Tat:
TCEP:
TE:
TEMED:
TEA:
TM:

Albúmina de Suero Bovino
Proteína de la Cápsida
Ácido 3-(Ciclohexilamino>-1 -propano sultánico
Convex Constraint Analysis
Dicroísmo Circular
Virus de la Encefalomieíitis-Artritis Caprina
Ciclofilina A
3,3’-diaminabencimida
Ácido 5,5’-ditiobis<2-nitrobenzoico>
Ditiotreitol
Ácido etilendiamin-tetracético
Virus de la Anemia Infecciosa Equina
Gen de la Envuelta
Virus de la Inmunodeficiencia Felina
Variación de la energía libre de Gibbs
Gen Antígeno Específico de Grupo
Cloruro de guanidinio
Virus de la Inmunodeficiencia Humana
Cromatografía Liquida a Alta Presión
Integrasa
lsopropil-I3-D-tiogalactopiranásido
Luna Bertani
Proteína de Unión
Long Terminal Repeat
Proteína de la Matriz
Región de Máxima Homología
Proteína de la Nucleocápsida
Factor Negativo
Ácido nitrilotriacético
Marco de Lectura Abierto
Electroforesis en geles de
Reacción en Cadena de la
Gen de la Polimerasa
Proteasa viral
Proteína Reguladora de la expresión del gen
Resonancia Magnético Nuclear
Transcriptasa inversa
Dodecilsulfato sádico
Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
Virus de la Inmunodeficiencia Simia
Glicoproteina de la Superficie
Tris-acetato EDTA
Proteína Transactivante
Tris(2-carboxietil)fosfina
Tris-E DTA
N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina
Ácido trifluoroacético
Glicoproteina Transmembranal

poliacrilamida en presencia de SDS
Polinierasa

—1—



INTRODUCCIÓN





Introducción

Con la aparición del virus de la inmunodeficiencia humana, agente causante del

SIDA, los Lentivirus han pasado a ser uno de los grupos de virus más estudiados.

Esta familia se incluye dentro de los Retrovirus, caracterizados por la presencia de
moléculas de RNA en el interior de la cápsida viral. La gran relación existente entre

los lentivirus humanos y animales hace posible emplear estos últimos como modelos
para el estudio de la biología molecular, la patogénesis y el tropismo celular de esta
familia.

RETROVIRUS

El prefijo retro- <inverso) que antecede a la palabra virus deriva de la enzima
transcriptasa inversa o retrotranscriptasa, encargada de la síntesis del DNA vírico a
partir del RNA pregenómico y que se encuentra dentro de los viriones de todos los
miembros de esta familia. Los virus que pertenecen a esta familia guardan en común
una serie de características morfoLógicas y genómicas que se detallarán a
continuación. Dentro de esta familia hay tres subfamilias diferenciadas entre sí
principalmente por su morfología, siendo más importantes las de los Oncovirus y
Lentivirus, que engloban a una gran cantidad de virus de importancia veterinaria y
clínica.

A. MORFOLOGÍA

Los viriones de los retrovirus son esféricos, de 80-100 nm de diámetro, y
poseen una estructura única en tres capas (Narayan y Clements, 1990>. Están
constituidos por lípidos <30-35%>, proteínas <60%) y RNA <2%> (Gelderblom et al,
1991>. A modo de ejemplo, en la Figura 1 se recoge la estructura del virus de la
inmunodeficiencia humana <HIV-1). En esta figura se indican las diferentes proteínas
de las que consta el virión, como las que aparecen en su superficie, glicoproteinas
gpl 20 y gp4l, muy importantes en el proceso de entrada del virus en la célula (Freed
et aL, 1995>. En el interior se encuentra el complejo genoma-nucleoproteina, que
incluye alrededor de treinta moléculas de la enzima transcriptasa inversa transcriptasa
inversa, y supuestamente posee una estructura helicoidal. Esta estructura está situada
dentro de una cápsida icosaédrica, que a su vez se encuentra rodeada por una

-3-



Introducción

virus, y de cuya superficie emergen los peplómeros de glicoproteinas (Gelderblom
etat, 1989; Gelderblom eta!., 1991; Fukui eta!., 1993>. Debido a su contenido en
lípidos y proteínas, los retrovirus son inactivados por detergentes y disolventes de
lípidos, así como por calentamiento a 56 0C durante 30 minutos. Sin embargo, son
más resistentes que otros virus a la luz ultravioleta o a los Rayos X, lo que puede ser
debido a que su genoma es diploide.

Figura 1. Esquema de la organización del virus de la inmunadeficiencia humana (HIV) (Gelderblom
st aL. 1989~. La cápsida del viuián está constituido por la proteína CA (p241 y en su interior se
encuentra el RNA viral asociado a enzimas como la transcriptasa inversa, RT (p66>, la proteasa
viral, PR <pl 2> o la integrasa, IN (p32) y a la proteína NC <p7). Esta cápsida se encuentra
rodeada por una matriz formada por la proteína MA <p17). Una bicapa lipídica engloba a todos
estos componentes y en ella está embebida la glicoproteina transmembranal, TM (gp41), unida
a la glicoproteina de la superficie SU <gpl 20>. La cápsida en forma de cono suele estar unida a
la proteína MA a través de la proteína LI <p6) por su extremo más estrecho, mientras que el otro
aparece libre. Paralelos al eje longitudinal de la cápsida se encuentran los cuerpos laterales, que
pueden proceder de un exceso del precursor pr55 sin procesar o ser proteínas adicionales
codificadas por el virus.

SU (gpl2O)

TM

MA (p17)

LI (p6)

CA

IN (p32)

cÁPsíoA

CUERPO LATERAL

BICAPA LIPIDICA

-4-



Introducción

E. REPLICACIÓN Y ENSAMBLAJE VIRAL

En la Figura 2 se recoge el proceso de replicación viral. Después de la
adsorción del virus a la célula mediante la interacción con receptores de la superficie
celular (Fig. 2: 1,2), las glicoproteinas de la superficie fusionan la envuelta lipídica con
la membrana plasmática con lo que la nucleocápsida con el RNA viral es liberado en
el citoplasma (3>. El receptor celular para el virus HIV-1 mejor caracterizado es la
molécula CD4 (White y Littman, 1989; Robey y Axel, 1990; Capon y Ward, 1991;
Alían, 1993). Otros receptores retrovirales identificados incluyen aminoácidos y
transportadores, así como una molécula relacionada con el receptor de lipoproteinas
(Freed, 1997>. En el citoplasma el RNA es copiado a DNA por la transcriptasa inversa
asociada al virión actuando como una DNA-polimerasa dependiente de RNA. La copia
de DNAs de cadena sencilla es transformada en una de doble cadena por la misma
enzima, actuando ahora como una DNA-polimerasa dependiente de DNA. El DNA de
doble cadena entra en el núcleo de la célula infectada (4), donde se circulariza y se
integra en el DNA de la célula huésped. El DNA integrado <provirus> sirve como molde
para la producción tanto de mRNA (5> que es traducido a proteínas <6,7>, como de
RNA del virión, que es encapsulado en el virión progenie.

El virión se forma siguiendo dos procesos de ensamblaje, uno dirigido a la
formación de la cápsida <6) y otro a la formación de la envuelta viral <7>. La síntesis,
el procesamiento y la glicosilación de la poliproteina de la envuelta se produce en el
retículo endoplasmático. La poliproteina es transportada hacia la membrana
plasmática de la célula huésped mediante la vía secretora. Allí se asocia con la
membrana donde se hidroliza por la proteasa viral. Por otro lado, las proteínas
estructurales y las enzimas que se encuentran en la cápsida se sintetizan en el
citoplasma. La traducción y la miristoilación de las poliproteinas Gag y Gag-pol son
seguidas por el ensamblaje en el citoplasma o bien en el lado citoplasmático de la
membrana. Las poliproteinas Gag y Gag-pol, junto con el DNA del virión, se mueven
hacia una posición en la membrana celular, el lugar donde las proteínas de la envuelta
viral están ya presentes (Gelderblom et aL 1992; Hunter, 1994). La nucleocápsida se
ensambla mediante una serie de roturas proteolíticas de la proteína producidas por la
proteasa viral mientras tiene lugar el crecimiento de los virones.

La replicación de los retrovirus se produce con una alta velocidad de mutación
ya que la transcriptasa inversa carece de una función editora, y también a causa de
la alta frecuencia de recombinación con otros genes de retrovirus y con genes
celulares.

-5-



Introducción

Figura 2. Esquema del ciclo de vida de retrovirus (Freed, 1997>. Los pasos indicados son: <1>
unión con el receptor de la superficie de la membrana plasmática de la célula huésped, (2) fusión
con la membrana plasmática y liberación de la nucleocápaida, (3) transcripción inversa, (4)
transporte nuclear e integración en el núcleo de la célula huésped, (5) transcripción y transporte
del RNA viral, (6) traducción y transporte de las poliproteinas Gag y Gag-pol, (7> transporte de
las proteínas de la envuelta viral, (8) ensamblaje y crecimiento del virus, y (9) condensación y
maduración del virus.

1.

Virus

Receptor de la superficie celular

-6-



Introducción

C. ORGANIZACIÓN DEL GENOMA VIRAL

kb

o 1 2 3 4 5 6
¡ ¡ ¡ ¡ ¡

HIV-1

5’LTR pol
gag

ltpr

W L~Lzzzz~~
0)1V

EIAV

0)1V

mv ,,~

,

¡st

gag
LZ
5LTR

vil IA~ 3 LTR
0)1V ¡

mv

Figura 3. Organización del genama de los lentivirus EIAV. FIV y HIV-1. En la figura se muestra
la posición y el tamaño relativo de los marcos de lectura abierta de los tres virus. Flanqueando
el DNA de los lentivirus se encuentran los LTRs 5’ y 3’. En los tres genomas aparecen los
principales genes gag, env y poi. La organización del genoma más compleja la presenta el HIV,
donde hay hasta seis marcos de lectura abierta adicionales, vil, vpr, vpu, tat, mv y nel.

El genoma retroviral es diploide y comprende dos moléculas idénticas, unidas

no covalentemente en sus extremos 5’. A ambos lados del genoma retroviral están
los LTRs (Long Terminal Repeats). El LTR 5’ contiene los elementos promotores de
la transcripción y el LTR 3 proporciona la señal de poliadenilación (Clements y
Wong-Staal, 1992). El genoma está formado por unas 10.000 bases y contiene tres
genes principales que codifican las proteínas estructurales y enzimáticas. El gen gag
(antígeno especifico de grupo) codifica las proteínas del núcleo central del virión, el
gen pol (pof¡merasa>, codifica la transcriptasa inversa y el gen env <envuelta) codifica

78 9
¡ ¡ ¡

¡ a’ LTR

nof ¡

gag ¡ Vol

FIV

-7-



Introducción

las proteínas de los peplómeros del virién (Clements y Wong-Staal, 19921. Los
lentivirus tienen una organización genómica más compleja que el resto de los
retrovirus, pues además de los genes gag, po! y env, contienen marcos de lectura
abiertos (ORF) adicionales localizados entre el gen poi y el env, así como diferentes
exones tanto dentro como en el extremo 3’ del gen env (Cullen y Greene, 1990;
Carpenter y Alexander, 1992; Cullen, 1992; M¡yazawa et aL, 1994) (Fig. 3). Estos
genes actúan como reguladores modulando el ciclo viral “in vitro” y, probablemente,
“in vivo” contribuyen a los mecanismos tanto de latencia clínica como patogénicos.
Un ejemplo de este complejo genoma se encuentra en la Figura 3, en la que además
de los genomas de EIAV y FIV se representa el más complejo de los genomas
retrovirales, el del HIV-1, que posee hasta seis marcos extra de lectura abierta (v¡f,
vpu, vpr, tat, rey y nel) cuya función se comentará más adelante <Cullen y Greene,
1990; Schwartz et aL, 1990; Miyazawa eta!., 1994).

e El gen retroviral gag codifica las principales proteínas estructurales del virión
y es requerido para el ensamblaje y liberación de las partículas (Reicin et aL, 1996).
Las poliproteinas Gag pueden ser ensambladas y liberadas de las células como
partículas viricas en ausencia de otros genes virales, lo que sugiere que gag es el
único gen viral esencial para el proceso de ensamblaje (Karacostas et aL, 1989;
Mergener et aL, 1992; Royer et aL, 1992, McGuire et al, 1994; Klikova et aL, 1995;
Sakalian er aL, 19961.

El producto del gen gag se traduce en polirribosomas libres a partir de un
mANA inmaduro. El precursor gag sigue uno de los dos caminos de la morfogénesis
viral <Gelderblom et ah, 1990). En la mayoría de los retrovirus las poliproteinas Gag
son transportadas directamente a la membrana plasmática, donde se produce
simultáneamente el ensamblaje de la cápsida y la extrusión de la membrana. Entre los
virus que siguen este camino está el virus aviario de tipo C y los virus de
leucemia/sarcoma de mamíferos, así como los virus patogénicos de la leucemia
humana y el HIV. En el caso de la segunda clase de virus, los precursores parecen
dirigirse hacia un lugar intracitoplasmático donde se produce el ensamblaje de la
cápsida <Rhee y Hunter, 1991>. Estas partículas ensambladas inmaduras son entonces
transportadas hacia la membrana plasmática donde comienzan a crecer y envolverse.
Entre los virus que siguen este proceso están los virus del tumor mamario de ratón
de tipo B y los de mono Mason-Pfizer de tipo D, junto con los miembros de la familia
de espumavirus <Gelderbloom et al., 1990).

-8-



Introducción

La poliproteina precursora de 55-57 kDa codificada por el gen gag, Pr55Gag
es procesada proteolíticamente por la proteasa viral < Henderson et aL, 1987;
Kawakami et aL, 1987; Hussain et aL, 1988; Rushlow et aL, 1992; Tñzser et al,
1993; Schnñlzer er aL, 1996) originando la proteína de la matriz pl 7 (MA), de la
cápsida p24 <CA>, y la proteína piE de la nucleocápsida. La proteína pl 5, que está
localizada en el extremo carboxilo-terminal del precursor Pr5bGag, a su vez es
procesada dando lugar a la proteína p7 <NC), que forma realmente la nucleocápsida,
la proteína p6 rica en prolinas, y dos péptidos pequeños, pl <Dannulí etaí, 1994) y
p2. La proteína p7 es la que se une a las moléculas de RNA viral; posee motivos de
dedos de zinc <zinc fingers> constituidos por residuos de cisteina <Cys-X2-Cys-X9-Cys),
característicos de las proteínas que se unen a ácidos nucleicos (Green y Berg, 1989;
Narayan y Clements, 1990; Gorelick et aL, 1996). La proteína NC también cataliza
la formación del dímero de RNA genómico que se encuentra en las partículas víricas
<Darlix et aL, 1990>. La proteína p6 tiene como función unirse a la proteína Vpr,
dando como resultado la incorporación de esta proteína accesoria dentro del virión
<Kondo eta!., 1995). El papel de pl es todavía desconocido, mientras que p2 parece
participar en la regulación de la velocidad del procesamiento del precursor Gag (Pettit
e! al, 1994; Krausslich e! al, 1995>. La proteína mayoritaria es la que forma la
cápsida viral, que adquiere una estructura en forma de cono (Takasaki e! aL, 1997)
y es uno de los principales antígenos en la infección por estos virus <Gelderblom et

aL, 1989; Hñglund e! aL, 1992). Esta proteína induce anticuerpos que inactivan la
infectividad del virus (Ada, 1988> y por ello los estudios para conseguir una vacuna
contra el HIV se basan en la producción de anticuerpos frente a esta proteína. Otra
proteína importante codificada por este gen es pl?, proteína de la matriz, localizada
en el extremo amino-terminal del precursor PrE5Gag. La proteína pl 7 tiene múltiples
funciones estructurales y fisiológicas (Wills y Craven, 1991>. En los pasos iniciales
del ciclo viral, la proteína pi 7 puede estar implicada en la penetración del virión en
las células y en la infectividad viral <Crawford y Goff, 1984; Yu e! aL, 1 992a; Wang
y Barklis, 1993). En los últimos estados del ciclo viral la proteína pl 7 es un factor
importante en la morfogénesis del virión a través de su papel en el transporte
intracelular <F~cke e! aL, 1993; Yuan e! aL, 1993), en la señalización de la membrana
plasmática para el precursor del Gag, en el crecimiento extracelular de los viriones a
partir de la membrana celular <Bryant y Ratner, 1990; Gelderblom, 1991; Spearman
e! aL, 1994> y en la incorporación en el virión de glicoproteinas virales (Yu e! al,
1 992a; Yu e! aL, 1 992b; Dorfman e! al, 1 994a>. Esta proteína interacciona con la
membrana viral a través de su extremo amino-terminal, que sufre una modificación
post-trasduccional consistente en la incorporación de ácido miristico. Esta
miristoilación es requerida para la eficiente asociación a la membrana y la formación

-9-



Introducción

del virus (Gñttlinger e! aL, 1989; Pal e! aL, 1990). En el caso del virus HIV-1 se ha
identificado un dominio de unión a membranas dentro del extremo amino-terminal de
la proteína pl?. Este fragmento consiste en un conjunto de 14 aminoácidos del
extremo amino-terminal miristoilado y una región muy básica que se une a fosfolípidos
ácidos (Zhou e!aI., 1994>. Este último aspecto se ha comprobado mediante estudios
de unión del virión a membranas modelo (Ehrlich eta!., 1996>. La estructura cristalina
de la proteína MA ha sido ya determinada (Hill e! ah, 1996; Massiah e! ah, 1996).
Esta estructura revela que las moléculas individuales estén compuestas por cinco
hélices principales unidas por la parte superior por una lámina j3 mixta de tres
cadenas. La proteína trimeriza y es esta trimerización la que crea una superficie de
unión a la membrana, en la cual los residuos básicos expuestos podrían cooperar con
los grupos miristoilo del extremo amino-terminal para unir la proteína al interior ácido
de la membrana del virus.

• Los productos del gen pal son sintetizados inicialmente como una proteína
de fusión Gag-pol de 160 kDa <Jacks e! aL, 1988). Este precursor puede ser
autocataliticamente procesado dando lugar a las enzimas proteasa de 9 kDa <PR),
transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN), así como a proteínas maduras de la
cápsida. La proteasa viral, PR, se encarga de procesar, autocatalíticamente, las
proteínas precursoras codificadas por otros genes.

• El gen env codifica las proteínas glicosiladas que se encuentran insertadas
en la envoltura viral. Inicialmente se sintetizan en forma de un precursor que sufre una
proteolisis post-trasduccional por acción de una proteasa celular <Stein y Engleman,
1989; Gelderblom e! aL, 1991), lo que origina una proteína que atraviesa la
membrana viral, gp4O-50, y una proteína superficial, gpl 20-1 35. Esta rotura es
necesaria para dar lugar a la infectividad viral <McCune e! aL, 1988; Hunter y
Swanston, 1990). Las glicoproteinas transmembranales tienen una serie de
características en común: un fragmento de aminoácidos hidrofóbicos, una región rica
en residuos de treonina y serma, una serie de aminoácidos con una alta probabilidad
de formar una estructura en a-hélice, dos o tres residuos de cisteina próximos y los
sitios de N-glicosilación que están seguidos por el dominio de unión de la glicoproteina
a la membrana. El significado funcional de algunas de estas características
conservadas de esta proteína ha sido ampliamente estudiado. Así, mediante
mutaciones introducidas en las secuencias hidrofóbicas del extremo amino-terminal
de gp4l de HIV-1 se reduce enormemente la capacidad de formar agregados
<sincitios> de los virus mutantes <Kowalski e! aL, 1991). El dominio hidrofóbico que
se encuentra en el amino-terminal está implicado en el proceso de fusión entre la

-10-



Infroducción

membrana viral y la de la célula huésped, y es sólo activo después de la roture del
precursor (Fass er al., 1996). También la sustitución de dos residuos de cisteina
próximos entre sí altamente conservados por otros residuos de aminoácidos afectan
al procesamiento del precursor gpl 60, lo que sugiere que el puente disulfuro formado
entre estas dos cisteinas es importante para la maduración de la proteína de la
envuelta (Syu eta!., 1991). El segundo dominio hidrofóbico de la proteína se expande
en la membrana y se encarga de unir la glicoproteina a la membrana. La glicoproteina
superficial gpl 20 esté altamente glicosilada, aproximadamente la mitad de la masa
molecular de la proteína está compuesta por oligosacáridos <Alían eta!., 1985>. Forma
las protuberancias observadas en la superficie del virus y contiene las regiones que
interaccionan con el receptor celular así como los epitopos para la neutralización del
virus (Carpenter y Alexandersen, 1992>. En la Tabla 1 se resumen las diferentes
proteínas virales y la función que desempeñan.

Tabla 1. Proteínas retravirales resultantes de la expresión de las genes gag, pal e¡w y

función que desempeñan en el virus.

PROTEÍNA FUNCIÓN

Gag

Matriz <MA) Señalización de la membrana para Gag

Incorporación de Env en el virión

Cápsida (CA) Ensamblaje del virus

Nucleocápsida (WC> Unión a RNA

Proteasa (PR) Roture de los precursores Gag y Gag-po!

Pal

Transcriptasa inversa (RT) Transcripción inversa del genoma vire!

Integrase (IN) Integración del DNA viral en el genoma huésped

Env

Superficie (SU) Receptor de unión

¡ Transmembrana <TM) Fusión de la membrana

—11—



Introducción

D. TIPOS DE RETROVIRUS

La familia de los retrovirus comprende tres subfamilias, Oncovirus, Lentivirus
yEspumavirus. En la Tabla II se recogen algunos ejemplos representativos de las tres
subfamilias y en la Figura 4 se representan de manera esquemática algunos miembros
de estas subfamilias (Gelderblom e! aL, 1991). Sus características más importantes
se detallan a continuación:

• ONCOVIRUS: este grupo comprende virus tumorogénicos. Dentro de esta
subfamilia pueden distinguirse cuatro subtipos de virus, que se diferencian
principalmente en su morfología, y son denominados de tipo A, B, C y D. Las
partículas de tipa A se forman en el citoplasma de la célula infectada, migran hasta
la superficie celular y allí son envueltas por la membrana plasmática, formando los
virus de tipo B, como el virus del tumor mamario de ratón, que muestra una cápsida

excéntrica cuando ha madurado. Los virus de tipo C, tienen un cápsida simétrica y
central, formada a la vez que se produce la salida del virus de la célula. En su
superficie posee glicoproteinas. A este grupo pertenecen los oncovirus de importancia
veterinaria que causan sarcomas y linfomas en poííos, gatos y ratones. En las
partículas de tipa D el núcleo central ya se encuentra formado cuando se produce la
salida; al principio posee una forma esférica, pero cuando el virión ha madurado
adquiere una forma elongada.

El genoma de esta subfamilia posee, además de los tres genes principales, un
cuarto gen, el oncogen viral (v-onc). La presencia de este gen está normalmente
asociada a la supresión de algunas bases de la secuencia del gen env, por lo que la
mayoría de los oncovirus que lo contienen son incapaces de sintetizar una envuelta
completa y no son competentes en la replicación. Se encuentran asociados con virus
competentes que ayudan en la replicación de otrós virus.

• ESPUMAVIRUS: el potencial patogénico de los espumavirus aún no es
conocido. Se encuentran frecuentemente como contaminantes en cultivos celulares,
actuando como virus citopáticos. Estos virus se caracterizan por la formación de
vacuolas que se cree que son el resultado de un alto nivel de ensamblaje intracelular
y de la formación de agregados inducida por una expresión de la glicoproteina de la
envuelta viral (Freed, 1997>. Las partículas son esféricas <100-140 nm) y consisten
en una cápsida anular rodeada de una bicapa lipídica, cubierta de glicoproteinas. El
gen env codifica esta estructura que posee un dominio transmembranal y otro
superficial. Las cápsidas de estos virus se forman con anterioridad a la formación de
su envuelta, y tienen una forma esférica antes de la maduración.

-12-



Introducción

Figure 4. Representación esquemática de los componentes de la familia de los retrovirus
(Gelderblom et at.1991). Los oncovirus comprenden las partículas de tipo A, E, C y D. Las
partículas A son los núcleos centrales de las partículas de tipo E preformados en el citoplasma
de la célula huésped. Estos núcleos migran hacia la membrana de la célula y forman un virión
inmaduro. Este virión, después de una maduración morfológica, da lugar a una partícula con un
núcleo central isométrico excéntricamente localizado. En el caso de las partículas de tipo C, el
núcleo central se forma a la vez que se produce la salida del virión. Los viriones de tipo D se
forman por la envoltura de su núcleo central previamente formado en el citoplasma. El HTLV-1
y los virus relacionados (HTLV-l, HTLV-l¡, ELV y STLV-l) constituyen un grupo intermedio con
características comunes tanto a los oncovirus de tipo C como a los lentivirus. Los lentivirus tienen
un núcleo central que se forma a la vez que se produce la salida del virus de la célula. Este núcleo
central madura después hasta alcanzar una forma de cono. Los espumavirus presentan una
envoltura de los núcleos centrales formados en el citoplasma. Las abreviaturas empleadas son:
HTLV-1, virus de la leucemia T humana de tipo 1; HTLV-ll, virus de la leucemia T humana de tipo
2; ELy, virus de la leucemia bovina; STLV-l, virus de la leucemia simia de tipo 2; MVV. virus de
Maedi-visna, CEAV, virus de encefalomielitis-artritis caprina; EIAV, virus de la anemia infecciosa
equina; HIV, virus de la inmunodeficiencia humana; SIV, virus de la inmunodeficiencia simia; Fb/,
virus de la inmunodeficiencia felina; EIV, virus de la inmunodeficiencia bovina.

HTLv-L
F4TLv-v
BLV
STLV-I

1190 D

MW
CAEV
EIAV

LE>JflVIRUS

ONCeVIRUS

TIPO 6

ESPUMAVIRUS

MIV
MV
s[V
a¡v

-13-



Introducción

• LENTIVIRUS: constituyen una subfamilia cuyo nombre deriva del curso lento
de las infecciones que producen tanto en humanos como en animales <Haase, 1986).
Todas las infecciones causadas por lentivirus tienen una serie de características
clínicas en común: largos períodos de incubación, enfermedad multiorgánica, fuerte
respuesta inmune y un final invariablemente fatal (Clements y Zink, 1996>. En la
Tabla II se recogen algunos ejemplos de tentivirus. El primer lentivirus identificado fue
el EIAV, aislado por Vallee y Carree de un caballo con anemia hemolítica en 1904
(Vallee y Carree, 1904). A partir de entonces se han encontrado en una gran variedad

de especies, incluyendo primates y el hombre. En 1983 fue aislado el HIV por
Montaigner y Gallo (Gallo e! aL, 1984; Gallo y Montaigner, 1988). Difieren de los
oncovirus en detalles de su morfología, composición química así como en la aparición
de una nucleocápsida en los viriones maduros. Su membrana tiene mayor grosor y
sus cápsidas adquieren una forma de cono alargado que se puede observar mediante
estudios ultramicroscópicos (Gelderblom e! aL, 1989; Fukui e! aL, 1993; Nakai y
Soto, 1996; Takasaki e! aL, 1997>. En función de la manifestación de la enfermedad
que producen, los lentivirus pueden dividirse en virus que causan inmuodeficiencia y
virus que causan enfermedades específicas en órganos mediadas por respuesta
inmune. Entre los primeros se encuentran los virus de primates y humanos <HIV-1,
HIV-2, SIV mac) y el virus de inmunodeficiencia felina (FIV). Entre los segundos se
encuentran el virus de la encefalitis y artritis caprina (CAEV>, o el virus visna, que
inducen una enfermedad crónica inflamatoria, y el virus de la anemia infecciosa
equina (EIAV) que induce una anemia hemolítica seguida de una enfermedad crónica.

La expresión génica de lentivirus está caracterizada por dos fases, temprana
y tardía, aunque la transcripción del RNA viral siempre da lugar a la síntesis de un
mANA de cadena completa que sirve como el genoma viral así como el mRNA para
los genes gag y pol. El procesamiento del mRNA viral se produce en el núcleo de la
célula infectada, y los niveles de mRNA maduro e inmaduro que están en el
citoplasma de la célula estén controlados por las proteínas reguladoras Tat y Rey.
Durante la fase temprana de la expresión génica, las únicas transcripciones en el
citoplasma son de mRNAs que codifican a las proteínas Tat, Rey y Nef. Por el
contrario, en la fase tardía, mRNAs virales inmaduros y maduros están presentes en
el citoplasma. El gen !a! funciona incrementando la expresión del gen viral a niveles
transcripcionales y postranscripcionales <Cullen y Greene 1 990; Clements y
Wong-Staal, 1992>. La proteína Rey facilita el transporte de mRNAs virales inmaduros
desde el núcleo así como su asociación con poliribosomas (Ahmed e! aL, 1991;
Arrigo y Chen, 1991). Esta proteína funciona mediante la unión de su dominio básico
a elementos de RNA altamente estructurados presentes en los genes env (Cochrone
eta!, 1990; Olsen e! aL, 1990>. La expresión de RNA inmaduro que codifica las

-14-



Introducción

proteínas estructurales del núcleo central viral <proteínas Gag> y las enzimáticas del
gen pol, así como del mRNA maduro del gen rey, es dependiente de la proteína Rey.
La expresión génica tardía es iniciada cuando hay suficiente proteína Rey en la célula
para facilitar el transporte de mRNA viral para estas proteínas estructurales y
enzimáticas.

Subfamilia Huésped Virus Enfermedad

Oncovirus Pollo V. leucosis aviaria
<A LV)

Linfomas, leucemia,
anemia

V. leucemia bovina
(BLV)

V. leucemia felina
<FeLV)

Lentivirus Ovejas

Caballo

Vaca

Cabra

Mono

Gato

Hurna no

Espumavirus Vaca

y. maedi-visna <MLV>

V. anemia infecciosa
equina (EIAV)

Virus de la
inmunodeficiencia

bovina (BIV)

Virus de la encefalitis-
artitris caprina

(CA EV>

V. inmunodeficiencia
simia (51V>

y. inmunodeficiencia
felina <FIV)

V. inmunodeficiencia
humana (HIV)

V. bovino (BFV>

Encefalitis, neumonia
intersticial

Anemia hemolítica

Linfocitosis,
linfadenopatía

Artritis,
encefalomielitis

Inmunodeficiencia

Inmunodeficiencia

inmunodeficiencia,
SIDA

Infecciones
inaparentes

Tabla II. Ejemplos de virus pertenecientes e las tres subfamilias de los retrovirus.

Vaca

Gato

Leucemia

Leucemia

-15-



In!roducción

VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA

El virus de la anemia infecciosa equina (EIAV> tiene una gran importancia
veterinaria, ya que afecta a todos los integrantes de la especie equina y está
ampliamente difundido en todo el mundo <Montelaro, 1994>. El conocimiento de que
este virus estaba relacionado tanto genética como antigénicamente con el virus HIV-1
(Gonda, 1988), hizo que su estudio adquiriese mayor importancia, pues permitía
obtener información general acerca de la patogénesis causada por los lentivirus. El
EIAV, corno otros retrovirus, sufren una gran variación antigénica durante la infección
viral, fenómeno que únicamente ocurre en las infecciones donde el virus induce
anticuerpos neutralizantes. Este virus es transmitido por moscas y mosquitos y se
trata del único virus transmitido por esta vía (Narayan y Clements, 1990).

La infección viral clásica comprende tres fases de interacción entre el agente
viral y la célula huésped <Narayan y Clements, 1990): (a) el período de diseminación
del virus hacia las células diana y la infección en el hospedador, (b) el periodo de
replicación del virus, y (c) el período de eliminación del virus. La enfermedad se
origina o bien por efectos patológicos directos observados de la replicación viral en
células, o bien por las consecuencias inmunopatológicas asociadas con la eliminación
del virus. En muchos casos, estas fases se completan en días o semanas. El EIAV
difiere del resto de los lentivirus en el tiempo de inducción de la enfermedad. A
diferencia de otros lentivirus caracterizados por producir enfermedades de curso
progresivo, lento y crónico, la infección por EIAV tiene un curso rápido y variable.
Después de la exposición al virus, los caballos experimentan una enfermedad de curso
variable, pudiendo ser aguda, crónica o inaparente (Carpenter y Alexandersen, 1992>.
El estado agudo de la enfermedad se asocia a la exposición inicial al virus. En la forma
crónica tienen lugar tases de anemia, edema, pérdida de peso y depresión,
intercaladas con períodos de tranquilidad. Por último, en la tercera forma de la
enfermedad, clínicamente inaparente, los caballos no exhiben los signos clínicos
asociados con las formas aguda y crónica, pero son portadores del virus. La distinción
entre el estado crónico y agudo depende de la capacidad del animal infectado para
sobrevivir al inicio de la replicación del virus. La respuesta inmune, que normalmente
está asociada con la recuperación de una infección puede ser inducida por vacunas
que protejan frente a la enfermedad. La creación de una vacuna se puede llevar a
cabo mediante varios procedimientos, incluyendo el uso de virus activos con
virulencia atenuada <como en el caso del virus del sarampión), de virus inactivados
(como en el poliovirus) o subunidades virajes (como el antígeno de superficie del virus
de la hepatitis 6).

-16-



Introducción

El sistema de EIAV ha sido muy útil como modelo para examinar la eficacia de
diferentes estrategias de vacunas en la infección de lentivirus. Se han empleado
vacunas consistentes en la utilización del virus inactivado, vacunas compuestas de
glicoproteinas de la envuelta viral purificadas y una vacuna compuesta de
glicoproteinas de la superficie viral expresada en baculovirus <rgp90> (lssel e! aL,
1992; Wang e! aL, 1994; Montelaro y Bolognesi, 1995). Los resultados de estos
estudios revelan que hay un amplio intervalo de eficacia para prevenir la infección por
EIAV y la enfermedad. Por ejemplo, la vacuna del virus inactivado y la compuesta de
glicoproteinas de la envuelta viral purificadas proporcionan una protección del animal
frente a una infección homóloga por EIAV. Sin embargo, no previenen la infección
heteróloga por una variante antigénica de EIAV. La vacuna rgp9O es incapaz de
proteger al animal frente a una infección homóloga o heteróloga por EIAV. El gran
intervalo de eficacia observado se puede emplear para identificar las respuestas
inmunes características de protección.

VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA FELINA

El virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) fue aislado en 1986 de un gato
seronegativo frente al virus de la leucemia felina <FeLV) pero con infecciones
oportunistas (Pedersen e! aL, 1987>. Está clasificado como un lentivirus en función
de la morfología del virión, la actividad de la transcriptasa inversa dependiente de

y la tendencia a inducir una infección persistente en gatos (Pedersen e! al.,
1987; Yamamoto e! aL, 1988; Olmsted et aL, 1 989a>.

La infección por FIV está ampliamente difundida entre felinos tanto domésticos
como salvajes <Pedersen e!aL, 1987; Yamamoto eraL, 1989; Olmsted e! aL, 1992>
y actualmente se considera como un modelo de estudio para la infección inducida por
el virus de la inmunodeficiencia humana (Letvin, 1990; Johnson et aL, 1991;
Eendinelli e! aL, 1993; Willett e! al., 1997>. La imunopatogénesis y la enfermedad
clínica observadas en gatos infectados natural o experimentalmente son muy similares
a las del SIDA <Pedersen, 1993). Se caracteriza por una progresiva disminución en el
número de células CD4±circulantes y una inversión asociada de la relación CD4:CD8
<Pedersen e! aL, 1987; Yamamoto e! aL, 1988; Ackley e! aL, 1990; Novotney e! aL,
1990; Torten eraL, 1991>. Durante la fase aguda de la infección por FIV, la inversión
de la relación CD4:CD8 viene determinada por un incremento en las células T CD8+,
expresando bajos niveles de CD8 y de las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad de clase II <MHC> (Willet e! aL, 1993). Los datos sugieren que,

-¡7-



Introducción

como ocurre con la infección de HIV en humanos, el daño principal en los gatos
infectados por FIV es un impedimento de la función auxiliadora de las células T. La
observación de que humanos, monos y gatos pueden ser infectados por HIV, 51V y
por FIV, respectivamente, durante largo períodos de tiempo sin que experimenten una
enfermedad clínica, sugiere que los mecanismos inmunes naturales de los organismos
huéspedes son capaces de inhibir el desarrollo de la infección viral (Bolognesi, 1993;
Levy, 1993>.

En la infección por FIV se distinguen seis estados: <a) el primer estado está
asociado a grados variables de fiebre, leucopenia, neutropenia y en algunas ocasiones
diarrea. Una linfadenopatía generalizada aparece a menudo y puede persistir desde
unas cuantas semanas hasta varios meses antes de desaparecer. <b> En este estado
los niveles de células T CD4±bajan significativamente tras de la infección primaria
y después continúan bajando lentamente. (c) Este tercer estado es parecido al estado
de linfadenopatia progresiva que aparece en la infección por HIV. Se producen
pérdidas de peso, letargia, depresión, fiebres. (d) El cuarto estado coincide con el
fallo del sistema inmune. Está caracterizado por infecciones crónicas secundarias que
inicialmente responden a terapia pero esta respuesta disminuye cuando se alcanza el
quinto estado. <e> El quinto estado se asocia con pérdidas de peso mayores del 20%.
En la mayoría de los gatos infectados hay grados variables de anemia, neutropenia
o linfopenia e infecciones oportunistas. (F) Por último, el sexto estado lo presentan
aquellos gatos que desarrollan enfermedades neurológicas, inmunológicas o
neoplásticas sin signos aparentes de inmunodeficiencia adquirida.

Al igual que el EIAV, este lentivirus se ha empleado como modelo para
desarrollar una vacuna dirigida a prevenir la infección por FIV y los lentivirus
relacionados. Estas posibles vacunas incluyen el virus inactivado <Yamamoto e! al,
1991; Yamamoto e! aL, 1993; Hosie e! sI., 1995>, células infectadas pero
inactivadas, subunidades recombinantes y sintéticas. Estas últimas comprenden
proteínas de FIV recombinantes expresadas en células de mamíferos usando sistemas
de expresión del virus vaccinia o baculovirus <Lutz e!aI., 1995; Siebelink e!a/., 1995)
yen células procariotas como la bacteria E. coil (Hosie eraL, 1992; Lutz eta!., 1995;
Verschoor e! al., 1996>. Los resultados experimentales indican que la protección
frente a virus homólogos o cepas relacionadas se ha conseguido sólo con vacunas
que incluyen el virus inactivado o células infectadas inactivadas pero no con vacunas
de subunidades recombinantes. La protección frente a cepas de FIV antigénicamente
distintas aún no se ha conseguido.

-18-



Introducción

Como el HIV-1, HIV-2 y 51V <Steffan e!aL, 1986; Schmitt eta!., 1990; Schmitt
et al., 1991), FIV puede replicar en células Kuppfer de hígado después de la infección
de cultivos celulares lii vítro por el virus libre (Martin e! aL, 1 995>, lo que sugiere que
estas células pueden jugar un papel en la fisiopatología de la infección por FIV.

PROTEÍNAS DE LAS CÁPSIDA LENTIVIRAL

El principal producto del gen gag de lentivirus es una proteína <CA) de
24-26 kDa que constituye la cápsida del virus. Los estudios de microscopia
electrónica muestran que dicha proteína oligomeriza adoptando una forma tubular, en
forma de cono doblemente truncado, en cuyo interior aparece el material genético del
virus (Gelderblom etaL, 1989; Hñglund et aL, 1992; Fukui et al, 1993).

Como se ha dicho anteriormente, las proteínas estructurales y las enzimas que
se encuentran en la cápsida son sintetizadas en el citoplasma a partir de las
poliproteinas precursoras Gag y Gag-pol. Ambas poliproteinas son trasladadas a la
membrana plasmática, teniendo lugar el ensamblaje en el lado citoplasmático de la
membrana celular, a la vez que se produce el crecimiento y la liberación de las
partículas viricas. A la liberación de las partículas le sigue un proceso de maduración,
que supone la rotura proteolitica de las poliproteinas Gag y Gag-pol por la proteasa
viral, cuyo resultado es la formación del virus maduro infeccioso (Debrouck e! aL,
1987; Kohl e! aL, 1988). La fase de ensamblaje está dividida a su vez en dos estados
caracterizados por la diferente morfología de la estructura que se encuentra en el
interior de la envuelta viral. En las partículas inmaduras es esférica, mientras que en
las partículas maduras tiene forma de cono y está localizada excéntricamente
(Gelderblom e! aL, 1987; Chrystie y Almeida, 1988; Hockley e! aL, 1988). La
formación de la partícula inmadura y su maduración son muy sensibles a mutaciones
en los genes gag y pol, lo que indica que hay regiones en Gag y Gag-pol que
contienen información necesaria para varios aspectos del ensamblaje de los lentivirus.

Cuando se expresa el precursor Gag en ausencia de la proteasa viral se
producen partículas similares a las del virus. Este hecho ha convertido a este sistema
de expresión en la base para el análisis experimental de los factores requeridos para
el ensamblaje y la secreción <Gheysen e! aL, 1989; Hu e! aL, 1990; Royere! aL,
1991; Jowett e! aL, 1992). Así, la importancia de la proteína CA en el proceso de
ensamblaje se demostró por primera vez cuando se comprobó que moléculas de Gag
con deleciones en la CA son incapaces de ensamblarse (Trono e! aL, 1989).

-19-



In!roducción

Posteriores estudios han permitido definir una serie de regiones en CA
requeridas para el ensamblaje <Trono e! aL, 1989; Von Poblotzki e! a!., 1993; Wang
y Barklis, 1993; Mammano e! aL, 1994; Franke e! aL, 1 994a; Chazal e! aL, 1995;
Reicin et al., 1995>. Se sugiere que el extremo carboxilo-terminal, una región en la
cual la homología de secuencia entre las proteínas de las cápsidas de lentivirus es
máxima, es la región crucial para el ensamblaje <Wang y Barklis, 1 993; Chazal e! al,
1 994; Franke e! ah, 1 994a; Mammano e! aL, 1994 ). En otros estudios, utilizando
mutantes de deleción de la proteína CA se comprobó que dicha proteína está dividida
en dos regiones (Jowett e! aL, 1992; Von Poblotzki et aL, 1993; Dorfman e! st.,
1 994b; Reicin e!aL, 1996; Yoo e! aL, 1997>, el extremo amino-terminal y un dominio
carboxilo-terminal, siendo este último donde se producen los contactos entre las
moléculas de Gag, que resultan esenciales para el ensamblaje de la partícula (Zhang
e! aL, 1996). En el extremo carboxilo-terminal, que también ha sido implicado en la
dimerización de la proteína <Gitti etaL, 1996; Yoo e!aL, 1 997), en la oligomerización
del precursor Gag (Franke e! aL, 1 994a> y en la formación el virus, existe un
fragmento de unos 20 aminoácidos denominado MHR <‘Ma/or Homo/ogy Reg¡on’>,
que se encuentra en lodos los oncovirus y lentivirus conocidos, así como en el
trasposón inverso de levaduras <Patarca y Haseltine, 1985; Wills y Craven, 1991;
Orlinsky e! aL, 1996). Su función precisa no es conocida, ya que diferentes
mutaciones en esta región bloquean la replicación en diferentes fases, incluyendo el
ensamblaje (Mammano e! aL, 1994; Craven et aL, 1995; Orlinsky e! aL, 1996), la
maduración <Mammano e!aL, 1994; Craven e!aL, 1995> y las etapas más tempranas
de la infectividad (Strambio-de-Castillia y Hunter, 1992; Craven e! aL, 1995; Orlinsky
e! aL, 1996). En estudios realizados con el extremo amino-terminal, se observó que
deleciones e inserciones en dicho extremo no inhiben el proceso de ensamblaje, pero
si la formación de viriones maduros (Wang y Barklis, 1993; Reicin e! aL, 1995).
Según esto, distintas zonas del dominio amino-terminal de la proteína CA pueden ser
necesarias para el correcto procesamiento proteolitico del precursor Gag o para que
se produzcan los contactos CA-CA necesarios para la formación de la cápsida. Por
todo ello, la determinación de la estructura de esta proteína es esencial para conocer
las bases moleculares del proceso de ensamblaje y de formación de viriones maduros.
Por tanto, estos estudios podrían tener implicación en la terapia antiviral y conducir
al desarrollo de un posible método de inhibición de la infectividad de los lentivirus.

Las proteínas de la cápsida de los lentivirus guardan una gran homología de
secuencia entre sí (Stephens e! aL, 1986; Olmsted e! aL, 1 989b; Talbott e! aL, 1 989;
Willsy Craven, 1991; Matsuo eraL, 19921. En la Figura Sse representa la secuencia
de aminoácidos de las proteínas CA de EIAV (p26), HIV (p24) y FIV (p24>. De los 230

-20-



Introducción

aminoácidos de los que se compone p26 de EIAV, 58 de ellos son idénticos a
residuos de p24 de HIV, lo que supone un 25% de los residuos de la proteína de
EIAV; además hay un gran número de sustituciones conservativas, de manera que el
36% de los aminoácidos son homólogos. Lo mismo ocurre con la proteína p24 de FIV,
que guarda una identidad del 34% con EIAV, y del 29% con la proteína p24. de HIV.
Así mismo, el suero de caballos infectados por EIAV precipita las proteínas de la
cápsida de HIV <Montaigner e! aL, 1984) y FIV (Egberink e! aL, 1990; Steinmann et
aL, 1990). Estos resultados son indicativos de la presencia de determinantes
conservados entre las proteínas de las cápsidas lentivirales, sugiriendo que dichas
proteínas están organizadas en dominios antigénicos similares (Egberink eraL, 1990;

Chong e! aL, 1991>. Además, esta gran homología sugiere que todos los estudios
dirigidos a la caracterización estructural de la proteína p26 de EIAV y p24 de FIV sean
aplicables a la proteína p24 de HIV, lo que supondría un gran avance en los
conocimientos sobre el HIV en particular y sobre los lentivirus, en general.

HIV QNi QMVHQ»S TLN KVVEt-KAFSP$~IP 5 EG Q TV 593 URNFRP~T GYTFIV -~TVN PQYVALB SItME

F$TZNE L G~IT#GQMREERGSDIAGTTSTLQEQIGWMT 119
EIAV ~Q GQ LflAtUKIkf?. LPNA~LVAPPQGPIPMflRFZR L~PP3RaMUP 120
MV flca&uI~r DÉ5LKQLT, T PDflPRPLVYF Efl4I~

4TQ~Q~AEA 112

MIV NNP~IPVGEIYKRWIILELNKT¶~?MY, SSILD P YRD FYKTLPA~gASQ 179
EIAV ArDqF~QTY~Q%II#MtEGIKVMI (3 Ka-QN 3 9
11V R1J?AR4QC~AWYLEAL~KLAAIKAK, PA-VQ DYSSÉT ~FA~XDQ5~NTA 171

HIV *AWRT~E~*L
EIAV 5~SKF~DflT
FIV pZLYLKQqS uy’

Figura 5. Alineamiento de las secuencias de la proteína de la cápsida de HIV <p24), EIAV <p26)
y AV (p24>. Los números indican fas residuos de los que se compone cada proteína. (~‘) Residuos
conservados en las tres secuencias: (:) Residuos conservados en dos de las secuencias;

Cambio conservativo en la tercera secuencia. Las equivalencias empleadas son: H’-.R-K; N’-’O;
S’-’T; L’-’VV; F’Y”W; MG; M”C.

231
230
223

-21-



Introducción

Hasta hace unos años había pocos datos acerca de la estructura de la proteína
CA. De hecho, cuando se iniciaron los estudios que se recogen en esta memoria
únicamente había un modelo teórico (Rossmann, 1988; Argos, 1989) basado en la
analogía exitente entre estas proteínas y las de la cápsida de virus de plantas y
picornavirus. Según este modelo, la proteína podría adoptar una estructura de barril
13 compuesto de ocho cadenas. Sin embargo, estudios posteriores de dicroísmo
circular <Ehrlich e! aL, 1994; Hausdorf e! aL, 1994) y predicciones de estructura
secundaria (Coates e! aL, 1987; Ehrlich e! aL, 1994>, indican que la proteína adquiere
una estructura principalmente en a-hélice, lo que es incompatible con los modelos
anteriormente expuestos. La tendencia de la proteína CA a asociarse y formar
oligómeros (Ehrlich e! aL, 1992; Rosé et al., 1992) hace difícil realizar estudios
cristalográficos y de resonancia magnética nuclear <RMN>. Aún así, se ha conseguido
cristalizar la proteína p24 de HIV formando un complejo con un fragmento de un
anticuerpo (Prongay e! aL, 1990), aunque no se obtuvo ningún resultado sobre la
estructura. Posteriormente, se ha determinado la estructura tridimensional parcial
mediante técnicas de RMN y cristalógraficas. Hasta ahora, se ha resuelto la estructura
del extremo amino-terminal (residuos 1-151), tanto en disolución <Gitti e!aL, 1996)
como en estado cristalino (CambIe e! al., 1996; Momany et al., 1996). El extremo
amino-terminal de la proteína p24 de HIV está constituido por siete hélices. Cinco de
ellas, las de mayor extensión, forman una estructura superenrollada en la que las
caras hidrofóbicas de las hélices están dirigidas hacia el interior de la super-hélice
interaccionando entre ellas hidrofóbicamente. Estos residuos hidrofóbicos están
altamente conservados en las secuencias de las proteínas de la cápsida de otros
lentivirus, indicando la importancia de dichos residuos en el mantenimiento de la
estructura. Las hélices más extensas están separadas por un largo péptido antigénico
dentro del cual se encuentra el dominio de unión al fragmento de anticuerpo con el
que se han obtenido cristales. El resto se encuentra conectado por pequeños lazos.
En uno de ellos se encuentra el sitio de unión de la proteína a la ciclofilina A (CypA),
una peptidil-prolil isomerasa humana, que se empaqueta en el virión en el proceso de
replicación viral <Franke e! aL, 1 994b; Thali e! aL, 1994>. Tanto reactivos como
mutaciones que impiden la formación del complejo proteína-CypA in vítro, bloquean
el empaquetamiento de CypA y la replicación de HIV en cultivos, lo que indica que
esta interacción es esencial para la infectividad viral (Franke e! aL, 1 994b; Thali e!aL,

1994; Steinkaserer e! aL, 1995; Braaten e! aL, 1996). En la unión a CypA, la prolina
de la posición 90 tiene una gran importancia. Este residuo adopta conformaciones cis
y !rans que se encuentran en equilibrio, lo que puede sugerir que la ciclofilina A
cataliza la interconversión de dos estructuras del lazo en las que se encuentra la
Pro9O en cis o trans, lo que facilitaría diferentes interacciones intermoleculares
durante la morfogénesis del virión <Gamble e! aL, 1996; Gitti e! aL, 1996>.

-22-



Introducción

Recientemente, se ha determinado la estructura del extremo carboxilo-terminal
(residuos 151-231> de la proteína de la cápsida de HIV (Gamble e! aL, 1997>. Cada
molécula de CA <151-231) está compuesta de una lámina extendida seguida de cuatro
hélices a. Este dominio adopta una forma ovoide de dimensiones de 27 A x 29 A x
38 A. El fragmento MHR forma un motivo lámina-giro-hélice compacto que se
empaqueta frente al extremo carboxilo-terminal de la hélice 2. Los cuatro residuos
más conservados de este fragmento <GIní 55, Glyl 56, Glul 59 y Argí 67) forman una
red de puentes de hidrógeno que estabiliza esta estructura y la une a la hélice 2. Se
postula que los dos dominios de la proteína de la cápsida se encuentran conectados
por una secuencia de cinco aminoácidos que corresponden a los residuos 146 a 150,

que hace posible que haya una dimerización entre los dominios CA <151-231). A
estos dominios quedan unidos los extremos amino-terminales que no interaccionan
entre sí (Gamble e! aL, 1997). Sin embargo, esta es una modelización, ya que aun no
se ha resuelto la estructura de la proteína intacta. En este sentido, utilizando los
sistemas de expresión de la proteína CA que se describen en esta memoria, se puede
obtener cantidad suficiente de proteína como para llevar a cabo los estudios
estructurales de la proteína completa. Actualmente se está intentando poner a punto
un sistema de expresión para obtener la proteína a altas concentraciones y llevar a
cabo con ella estudios de RMN. Es necesario para ello expresar la proteína en un
medio mínimo, para obtener la proteína marcada uniformemente con isótopos estables
(13C y 15N> utilizando reactivos incluidos en el medio de cultivo (Cloruro de amonio,
fuente del ‘5N, y glucosa, fuente del 13C). La obtención de proteína marcada es

imprescindible para la resolución de los espectros de RMN, a la hora de asignar las

posiciones de determinados residuos como las prolinas, así como disminuir las señales

producidas por el disolvente, aumentando las señales propias de la proteína.

-23-



OBJETIVOS



Objetivos

Las proteínas de las cápsidas lentivirales guardan una gran homología de

secuencia entre sí. En concreto, en su secuencia hay dos residuos de cisteina en el
extremo carboxilo-terminal que se conservan en la mayoría de estas proteínas. La
posible formación de un puente disulfuro generalmente supone un aumento de
estabilidad de las proteínas. Por dicho motivo, en este trabajo se pretende hacer un
estudio estructural de las proteínas mayoritarias de la cápsida del virus de la anemia
infecciosa equina (EIAV> y así mismo, estudiar el papel que desempeñan los tres
residuos de cisteina presentes en estas proteínas en el mantenimiento de su
estructura, para lo cual se pretende:

O Clonación, expresió y purificación de la proteína mayoritaria de la cápsida de
EIAV para obtenerla en una cantidad tal que nos permita llevar a cabo estudios

estructurales.

@ Caracterización estructural y antigénica de esta proteína.

O Estudio del papel de los residuos de cisteina en el mantenimiento de la
estructura de la proteína.

Así mismo, ante la escasez de datos acerca del mecanismo de plegamiento de
todas estas proteínas, se pretende llevar a cabo un estudio del modo en que la
proteína de la cápsida del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) adquiere su

estructura tridimensional. Esta proteína posee en su secuencia dos residuos de

triptófano, cuyas propiedades espectroscópicas nos van a permitir seguir mediante

técnicas espectroscópicas como el dicroísmo circular o la fluorescencia los cambios
que ocurren en el entorno tridimensional de estos residuos cuando se producen
cambios que afectan a la polaridad de dichos entornos. Para ello se pretende:

OClonación, expresión y purificación de la proteína mayoritaria de la cápsida
de FIV (p24).
§ Obtención de proteínas mutantes en las que se cambie uno o los dos

residuos de triptófano por residuos de fenilalanina para disponer de dos
mutantes sencillos (W4OF y W1 26F> y un doble mutante (W40/1 26F>.
• Clonación, expresión y purificación de estas proteína mutantes.
O Caracterización estructural de la proteína rp24 de FIV y las proteínas
mutantes.

§ Estudio del mecanismo de plegamiento de esta proteína mediante la
obtención y comparación de las curvas de desnaturalización por urea de la
proteína original y de las proteínas mutantes.

-25-



MÉTODOS EXPERIMENTALES



Métodos Experimen!aíes

1. dONACIÓN EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA

DE EIAV

1.1. TRANSCRIPCIÓN INVERSA Y AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN DE

LA CÁPSIDA DE EIAV

El RNA vírico se obtuvo a partir de suero de caballo infectado por EIAV

mediante un método descrito previamente (Simmonds e! aL, 1990), con algunas
pequeñas modificaciones (Castillo e! aL, 1992>. Básicamente el método consiste en
incubar 200 pl de suero con 500 ~ulde una disolución que contiene tiocianato de

guanidinio 4.2 M, sarcosil al 0.5%, citrato sódico 25 mM, pH 7.0 y 5 pl de

3-mercaptoetanol. Una vez mezclada la disolución se añadieron 50 pl de acetato

sádico 50 mM, pH 4.0, 500 pl de fenol y 200 pl de cloroformo. Esta mezcla se incubó

durante 15 mm en hielo. Después de una centrifugación a 14000 g durante 15 mm
a 4 0C, la fase acuosa se extrajo dos veces con cloroformo. El RNA viral se precipitó

con isopropanol a -70 oc durante toda la noche. El RNA precipitado se recogió

centrifugando durante 30 mm a 14000 g, se lavó con etanol al 70% y se secó. El

precipitado se resuspendió en 3 pl de Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0. Este
RNA se usó como un molde para la reacción de transcripción inversa. Se preparó una

mezcla de reacción que contenía la enzima transcriptasa inversa, el RNA preparado

y se utilizaron hexámeros random para iniciar la reacción. Después de una incubación
de 10 mm a 25 0C, la mezcla se incubó a 42 0C durante 20 mm, 99 0C durante 5 mm
y finalmente, a 4 0C durante 5 mm. Al producto de la reacción de la transcripción

inversa, se le añadió la Taq polimerasa y el DNA viral sintetizado fue amplificado por

la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa <PCR), empleando las siguientes

condiciones:

1. 5 ciclos de 94 0C (1 mm), 42 0C (1 mm) y 72 0C <1 mm)
2. 35 ciclos de 94 0C (1 mm>, 55 0C (1 mm> y 72 0C (1 mm>
3. 1 ciclo de 72 0C <5 mm)

Los precursores utilizados para la PCR se diseñaron de tal forma que el

producto final tuviese un sitio de restricción Ncol en su extremo 5’ y un codón de

terminación seguido de un sitio de restricción Hindlll en su extremo 3’. Se

incorporaron dos nucleótidos adicionales después de los sitios de restricción para

facilitar la roture del producto de PCR por estas enzimas. Las secuencias de los
cebadores utilizados fueron:

-27-



Métodos Experimen!ales

p26-Ncol <+>: 5’ gc cCA TGcT TAG ATG GGG CTG GAA ACA G 3’
p26-Hindlll (-): 5’ cg aAG ct.t aAG TGC TTT TGC CAA. TAA CAT 3

En mayúscula aparecen los nucleótidos que coinciden con la secuencia

publicada mientras que las minúsculas representan aquellos que se han cambiado para
crear los sitios de restricción y los nucleótidos que se han añadido para facilitar la
rotura del producto de PCR. Los sitios de restricción de las enzimas Ncol (CCATGG)
y Hindlll (AAGCTT) se encuentran subrayados en la secuencia.

1.2. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE EIAV

El producto de la reacción de PCR, un fragmento de 712 pares de bases
correspondiente a los nucleótidos 839-1550 de la secuencia publicada del gen de

EIAV (Stephens e! aL, 1986), fue digerido con las enzimas de restricción Ncol y
Hindlll y donado en el vector pUC1 8N, cortado con las mismas enzimas,

obteniéndose el plásmido pUCí 8N/EIAVp26. El plásmido pUCí 8N es idéntico a
pUCí 8 excepto por el sitio de restricción Ncol del extremo 5’ del sitio de donación
múltiple. El residuo iniciador de metionina es codificado por el triplete ATG dentro del
sitio de restricción NcoI, asegurando que no se incorpora ningún aminoácido extraño
al producto final. Sin embargo, la incorporación de un sitio de restricción Ncol

requiere la alteración del cuarto nucleótido en el gen, de A a 6, lo que cambia el
segundo triplete de ATA (Ile> a 6TA <Val>. Ya que valina e isoleucina tienen cadenas
alifáticas e hidrofóbicas, no es esperable que esta alteración conservativa suponga
un cambio significativo en términos de la estructura global de la proteína. Como el

precursor Gag de EIAV se sintetiza como una poliproteina en la que p26 se encuentra
entre la proteína de la matriz (pl 5) y la de la nucleocápsida (pl 1), hubo que insertar
un codón de terminación en el extremo carboxilo-terminal. Esto se consigue con la
introducción del sitio de restricción Hindlll en el extremo 3’. El gen de la cápsida de

EIAV se clonó en el vector de expresión pKK223-3N. Este vector es una versión
modificada del vector de expresión pKK223-3 (Pharmacia) y utiliza el promotor !ac

para dirigir la expresión de los genes donados. La modificación consiste en la
introducción de un sitio de restricción Ncol a continuación del promotor !ac. El
fragmento Nco(IHindlll que incluye el gen de la cápsida se cortó de pUC1 8N/EIAVp26

y se ligó en los sitios Ncol/Hindlll del vector de expresión. Las características de los
dos vectores de expresión utilizados para obtener la proteína p26 se detallan en las
Figura 6. El gen donado tiene una longitud de 699 pares de bases y codifica una

proteína de 233 aminoácidos. La proteína p26 recombinante (rp26> difiere de la
verdadera proteína de la cápsida, que posee 230 aminoácidos, en que tiene dos

-28-



Métodos Experimentales

aminoácidos menos en el extremo amino-terminal, Pro e Ile, y el residuo Val en lugar
de Ile como segundo aminoácido, y en el extremo carboxilo-terminal una extensión de
cinco aminoácidos correspondientes a la secuencia que hay entre p26 y pl 1, la
proteína de la nucleocápsida (Henderson e! aL, 1987).

Figura 6. Construcción de los vectores de expresión pUC18N/EIAVp26 y pKK223-3N/EIAVp26.
(A> vector pUC1 SN¡EIAVp26. El gen de la cápsida de EIAV se clona entre los sitios Ncol y Hindlll

del vector pUC1 SN, que se encuentran dentro del sitio de múltiple donación . (E) vector
pKK223-3N. En este caso el gen de ElAvp2G también se clona entre los sitios Ncol y H¡ndlll que
se encuentran al lado del promotor tac (Ptac).

1.3. PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE EIAV

Células E. coil competentes <cepa TB1) se transformaron con 1 ~‘l de plásmido

pKK223-3N/EIAVp26 o pUCí 8N/EIAVp26 mediante el método del CaCI2 <Sambrook
e! aL, 1989> y se sembraron en una placa de medio LB (Luna Bertani) <10 gIL
bactotriptona, 5 gIL de extracto de levadura y 10 gIL de NaCí, pH 7.0), suplementado

con 5Opg/ml de ampicilina. Se seleccionó una colonia única que se usó para inocular
100 mIde medio TYN (10 gIL de bactotriptona, 10 gIL de extracto de levadura, 5 gIL
de NaCí, pH 7.4>, suplementado con 1 gIL de glucosa y SOpg/ml de ampicilina. Este
preinóculo se dejó crecer durante 8 h a 37

0C, usándose posteriormente para inocular

10 L de medio TYN; éste, a su vez, se dejó crecer 24 h a la misma temperatura, tras

A
flrnolII ¡Vocí

pBR332
cd

B
HindIII

pBR322
cd

-29-



Métodos Experimentales

las cuales se recogieron las células centrifugando durante 10 mm a 6000 rpm. El
sedimento celular se resuspendió en agua (30 ml/L de medio> y las células se
rompieron mediante 5 ciclos de sonicación de 30 s cada uno. El usado celular se

clarificó por centrifugación a 17000 rpm durante 30 mm, y el sobrenadante se
precipitó con sulfato amónico al 50% (313 gIL>. El precipitado se resuspendió en
fosfato sódico 10 mM, pH 6.8, antes de ser dializado frente al mismo tampón. La
mezcla de proteínas dializada se cargó en una columna de DEAE-celulosa DE-Sl
(Whatman) previamente equilibrada en fosfato sódico 10 mM, pH 6.8. En estas
condiciones la proteína rp26 no queda retenida en la columna, por lo que se recuperó
en el excluido. Las proteínas no retenidas se precipitaron con sulfato amónico al 60%
<390 gIL>. Una vez recogido el precipitado se resuspendió en un volumen mínimo de
Tris-HCI 10 mM, pH 8.0 y se dializó durante toda la noche frente a este mismo

tampón a 4 0C. Esta proteína se cargó en una columna de Sephacryl 5-1 00
equilibrada en Tris-HCI 10 mM, pH 8.0. La proteína se eluyó con este mismo tampón
recogiéndose el eluido en fracciones de 6 ml. A lo largo de toda la purificación la
presencia de rp26 fue seguida mediante geles de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato sódico <SDS). La presencia de rp26 se determinó también mediante

inmunodetección de geles de poliacrilamida transferidos a membranas de PVDF,
utilizando suero de caballo infectado por EIAV como se describe más adelante para
rp26. La pureza final de la proteína fue determinada mediante el densitometrado de
los geles de poliacrilamida-SDS teñidos.

1 .4. OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA MUTANTE rp26-C485

Para llevar a cabo la mutación del residuo de cisteina de la proteína EIAV-rp26
en la posición 48 por serma se ha utilizado la técnica de PCR. Para ello se utilizaron

los siguientes oligonucleótidos cebadores:

rp26-C48S(+>: W ac aGT ACT TCT GAA GAA ATG AAT CC 3’

rp26-C485(->: 5’ ga aCT ACT CTC TAC TGA TAA TAT Ccc 3’

En cursiva aparece el único nucleótido cambiado para producir simultáneamente
la mutación del residuo Cys48 (TGT> a 5er48 <AGT), a la vez que se introduce un
nuevo sitio de restricción, Scal <AGTACT>, que se encuentra subrayado. En minúscula
aparecen aquellos nucleótidos que se han introducido para facilitar e) corte de los
fragmentos originados en la reacción de PCR. Además se emplearon otros dos
oligonucleótidos, que son los cebadores utilizados en la donación del gen de la

-30-



Métodos Experimentales

cápsída de EIAV en el plásmido pUC18N descritos en el apartado 1.1, esto es,
p26-Ncol<+> y p26-Hindlll(-).

La reacción de PCR se realizó en las siguientes condiciones:

1. 5 ciclos de 94 0C <30 sI, 37 0C (12 s>, 72 oc (20 sI

2. 30 ciclos de 94 0C <30 s>, 55 0C (12 s), 72 0C <20 sI
3. 1 ciclo de 72 0C (7 minI

Se llevan a cabo dos reacciones de PCR utilizando los siguientes pares de
oligonucleótidos cebadores:p26-Ncol< + )/rp26-C485(-> y rp26-C48S< + >/p26-Hindlll(-).
La digestión de estos fragmentos con las enzima Scal y su posterior ligación dio lugar
al DNA de rp26-C48S completo. Este DNA se amplificó por PCR utilizando los

oligonucleótidos p26-Ncol(±)y p26-Hindlll(-), tras lo cual fue digerido por las enzimas
Ncol y Hindlll y donados en el plásmido pUC1BN digerido con las mismas enzimas.
La mutación introducida se confirmó mediante digestión con la enzima Scal y por

secuenciación automática del DNA de la proteína mutante.

La expresión y purificación de la proteína rnutante se llevó a cabo empleando
el mismo protocolo que el empleado para la proteína EIAV-rp26 salvaje.

1 .5. CLONACIÓN DE LA PROTEÍNA ro26-His

La proteína EIAV-rp26 se clonó en el vector de expresión pQE3O aplicando de
nuevo la técnica de PCR. En este caso, se llevó a cabo una reacción de PCR utilizando

unas condiciones idénticas a las indicadas en el apartado anterior, empleando el
siguiente par de oligonucleótidos cebadores:

rp26-His (+>: 5’ cc crna tcc ATO 000 OTO OAA ACA 0 3’

rp26-His <-): 5’ cg AAG CTT AAG TOC TTT TGC CAA TAA CAT 3’

En minúsculas aparecen los nucleótidos añadidos para crear el nuevo sitio de

restricción BamHl <G6ATCC> en el extremo amino-terminal de la proteína y los
nucleótidos añadidos para facilitar el corte de los fragmentos de DNA originados en
la reacción de PCR. El oligonucleótido rp26-His 1-> es idéntico al p26-Hindlllt->

empleado en la donación de EIAV-rp26 en el plásmido pUCí 8N e introduce el sitio
de restricción Hindlll junto con el codón de terminación de la proteína.

-31-



MÓ!odos Exper¡men!a/es

El fragmento originado fue digerido con las enzimas BamHl/Hindlll y donado
en el vector de expresión pQE3O, que añade una secuencia de seis residuos de
histidina en el extremo amino-terminal de la proteína, además de otros cuatros
residuos que se encuentran entre el sitio de unión a ribosoma y las seis His.

La proteína rp26-His se expresó y purificó empleando el protocolo utilizado en la
purificación de la proteína FIV-rp24, que se describe con más detalle en el siguiente
apartado.

2. CLONACIÓN. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA
DE FIV

2.1. CLONACIÓN DE LA PROTEíNA DE LA CÁPSIDA DE FIV

El aislamiento del RNA vírico a partir de suero infectado por FIV, la reacción de
transcripción inversa y la amplificación por PCR del gen que codifica la proteína p24
de la cápsida de FIV (Talbott et aL, 1989> se llevaron a cabo empleando las
condiciones indicadas anteriormente para el gen de EIAV-p26. Los precursores
utilizados para la PCR fueron diseñados de tal forma que el producto de la reacción
tuviese un sitio de restricción A/col en su extremo 5’ y un sitio de restricción Bg/ll en
su extremo 3’. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron:

p24-Ncol(+>: 5’ ge ecA TGG TAC CTA TTC AAA CAO TA 3’
p24-BgllI(-): 5’ gg a~a UcÉ nAO AOC TTC TOC CAA CAO 3’

En mayúscula aparecen los nucleótidos que coinciden con la secuencia
publicada mientras que las minúsculas representan aquellos que se han cambiado para
crear los sitios de restricción y los nucleótidos que se han añadido para facilitar la
digestión del producto de PCR. Los sitios de restricción de las enzimas Ncol

(CCATGG) y Sg/II <AGATCT) se encuentran subrayados en la secuencia.

El fragmento originado, de 699 pares de bases, fue digerido con las enzimas
de restricción NcolIBglll y donado en el vector de expresión pQE6O (Figura 7), que
añade una secuencie de seis histidinas en el extremo carboxilo-terminal de la proteína
FIVp24. Este vector de expresión contiene un elemento promotor/operador regulable,
constituido por el promotor TS de E. ccli, y dos secuencias del operador lac.

-32-



Métodos Experimen !ales

Figura 7. construcción del vector de expresión pQE6O/FIVp24. El gen que codifica la proteína
FIVp24 se doné entre los sitios Ncol ‘~ Sg ¡II del plásmido pOEfiO. Este último sitio de restricción
se encuentra justo antes del fragmento de DNA que codifica los seis residuos de histidina (6xHis).

La expresión de la región promotor/operador es muy eficiente, y sólo puede ser
impedida por la presencia de altos niveles del represor Iac. Las células donde se

expresan los plásmidos pQE contienen múltiples copias del plásmido pREP4, que porta
el gen /acl (Farabaugh, 1978), que codifica el represor /ac y confiere a la célula
resistencia a kanamicina.

La proteína que se obtiene en estas condiciones <rp24), que tiene 237
aminoácidos, difiere de la original, que posee 223 aminoácidos, en los siguientes
aspectos: al introducir el sitio de restricción Ncol se añaden dos aminoácidos, M y V,
en el extremo amino-terminal; posee los cuatro aminoácidos que en la poliproteina se
encuentran entre p24 y píO (Talbott e! aL, 1989); al generar el sitio de restricción

Bg/ll se añaden dos aminoácidos, R y 5, en el extremo carboxilo-terminal y, al estar
donado en pQE6O, posee el fragmento de seis histidinas que facilita su purificación.

NcoI BgJl 1

-33-



Métodos Experimentales

o

c

it

o Ml
% Z

o

c~, OFl, NH 011CM

ai, cii, cii, c¡l,—o—

o

o

Ml

R

2.2. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE FIV

La proteína p24 de la cápsida de FIV se expresó y purificó empleando el
sistema QlAexpress que utiliza un adsorbente quelante metálico, la resma Ni-NTA
(ácido nitrilotriacético) agarosa, que proporciona un método rápido de purificación en
un sólo paso (Hochuli et al., 1987>. La unión de la proteína a la resma se produce a
través de un fragmento de seis residuos de histidina que se añade a la proteína en su
extremo carboxilo-terminal. En la Figura 8 se observa la interacción que se produce
entre los anillos imidazólicos de los residuos de histidina y los iones Ni2~, así como
el resto de las posiciones de coordinación de dicho ión. El ácido nitrilotriacético es el
que queda unido a la resma.

Figura 8. Interacción entre los anillos imidazólicos de los residuos de histidina y los iones ~.

Los iones Ni2~ tienen dos de sus posiciones de coordinación ocupadas por dos átomos de
nitrógeno de los anillos imidazólicos de los residuos de histidina. El resto de las posiciones están
ocupadas por tres átomos de oxigeno y uno de nitrógeno del ácido nitrilotriacético. Este ácido
queda unido a la resma mediante un enlace éter.

Las células empleadas para la expresión de la proteína fueron células E. coil de
la cepa Ml 5[pREP4]. Una alícuota de estas células competentes se transformó
mediante el método del CaO

2 con 1 pl del plásmido pQE6O/FIVp24. Las células
transformadas se sembraron en una placa de medio LB suplementado con 100 pg¡ml
de ampicilina y 25 .ug/ml de kanamicina. Se crecieron las células durante 16 h y una
colonia de la placa se ernpleó para inocular un precultivo de 100 ml de medio LB
suplementado con 100 pg/ml de ampicilina y 25 pg/ml de kanamicina. Se crecieron

Ml

-34-



Métodos Experimentales

hasta saturación durante toda la noche y se inocularon entonces en 2 L de medio de
cultivo creciéndose a 37 0C hasta alcanzar una densidad óptica entre 0.5-0.6. La

expresión de la proteína se indujo con isopropil-13-D-tiogalactopiranósido (IPTO>
0.25 mM durante 4 h a 37 0C. Las células se recogieron centrifugando el medio 10
mm a 6000 rpm. El sedimento celular se resuspendió en PBS (NaCí 0.14 M, KCI 2.7

mM, KH
2PO41.5 mM, Na2HPO4 8.1 mM, pH 7.6> y las células se rompieron mediante

sonicación durante cinco ciclos de 30 s cada uno. El lisado celular se clarificó
centrifugando 30 mm a 26000 rpm. El sobrenadante resultante se llevó a Imidazol 10
mM y su pH se ajustó a 8.0, cargándose a continuación en una columna de

Ni-NTA-agarosa previamente equilibrada con PBS, Imidazol 10 mM, pH 8.0. Una vez
cargada la proteína se lavó con PBS, Imidazol 10 mM, pH 8.0 y posteriormente con
PBS, Imidazol 30 mM, pH 8.0 para eliminar todas las proteínas contaminantes. La
proteína se eluyó con PBS, Imidazol 200 mM, pH 8.0. La presencia de proteína en las
diferentes fracciones eluidas se siguió mediante la medida de la absorción a 280 nm
y se confirmó mediante PAGE-SDS.

3. OBTENCIÓN DE FORMAS MUTANTES DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE

FIV

La metodología empleada en la obtención de las formas mutantes es similar a
la utilizada en el caso de la obtención de la proteína mutante rp26-C485 descrita en

el apartado 1 .4. Se diseñaron oligonucleótidos cebadores que incluyen cambios
específicos de bases correspondientes a la mutación y que generan un nuevo sitio de
restricción, Mfel, en el caso del mutante W4OF y Xbal para el mutante W1 26F.

Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para cada mutante:

W4OF
W4OF <+): cgg CAA tTc¡ Ttc TTT ACT OCC TTC TCT OCA

W4OF <-1: AAA CCA Caa TTO AAC TTC CTC ACC T

W126F
W1261z(+): TGG TAT CTa GAG OCA TTA GGA

W126F <->: cgg CTC tAO ATA aaA TOC TCT ACA CTO CAT CCT

En cursiva aparecen los nucleótidos cambiados para producir la mutación del
residuo Trp4O <TGG) a Phe4O (TTC) y el Trpl 26 <TGG> a Phel 26 (TTT> y en
minúscula aquellos cambios, respecto de la secuencia original, que se introducen para

-35-



Métodos Experimen tales

generar los sitios de restricción o añadir bases que faciliten el corte por la enzima de
restricción correspondiente. Los sitios de restricción de las enzimas Mfel (CAATTG)
y Xbal <TCTAGA) se encuentran subrayados en la secuencia. Además se emplearon
otros dos oligonucleótidos, los mismos para los dos mutantes, que son los cebadores
utilizados en el donación del gen de la cápsida de FIV en el plásmido pQE6O descritos
en el apartado anterior, esto es, p24-Ncol (+1 y p24-Bglll 1->.

Para cada mutante se llevan a cabo dos reacciones de PCA en las mismas
condiciones empleadas en el caso de la obtención de la proteína rnutante rp26-C48S,
descritas en el apartado 1 .4.1 Se utilizó, en el caso de W4OF, los siguientes pares de
oligonucleótidos cebadores: p24-Ncol< +>/W4OF(-> y W4OF( + >/p24-Bglll(-) en el caso
de W4OF (Hg. 9) y p24-Ncol(+>/W126F(-J y W126E(+b’p24-Bglll(-J en el caso de
W1 26F, lo que genere dos fragmentos de DNA para cada mutante. La digestión de
estos fragmentos con las enzimas correspondientes a los sitios internos <Mfel o Xbal)

y su posterior ligación dio lugar a los DNAs de W4OF y W1 26F completos. Estos se
amplificaron con una reacción de PCA utilizando los oligonucleótidos p24-Ncol(±>y
p24-Bglll (-), tras lo cual fueron digeridos con las enzimas Ncol y Bglll y donados en
el plásmido pQE6O digerido con las mismas enzimas. De esta forma, también se
introduce una extensión de seis residuos de histidina en el extremo carboxilo-terminal
de las proteínas mutadas. Las mutaciones introducidas se confirmaron mediante
digestión con las enzimas Mfel <W4OF> o Xbal (W1 26F) y mediante la secuencie
complete del DNA de los rnutantes por secuenciación autornática.

El doble mutante se construyó mediante una las siguientes digestiones:

1. pQE6O/W4OF se digiere con las enzimas Ncol y Hindlll, obteniéndose un
fragmento de 216 bp que incluye la mutación W4OF.
2. pQE6O-W1 26F se digiere con Hindlll y Bg/ll y se obtiene un fragmento de
473 bp con la mutación W126F.
3. pQE6O-FIVp24 se digiere con Ncol y Bglll, recuperándose el fragmento de
3427 bp correspondiente a pQE6O.

La ligación de los tres fragmentos obtenidos permitió obtener un DNA que incluye
las dos mutaciones (Fig. 10>.

Una vez obtenidas las diferentes formas mutantes se transformaron células de
E. col/Ml 5[pREP4] con los plásmidos correspondientes, y se expresaron y purificaron
las proteínas mutantes empleando el mismo protocolo que el utilizado en la
purificación de la proteína FIV-rp24 salvaje.

-36-



Métodos Experimentales

Figura 9. Metodología empleada en la obtención del mutante W4OF. El gen de la proteína de la
cápsida de FIV que se encuentra donado en el plásmido pOEGO se emplea como molde en dos
reacciones de PCR (a y b) empleando los oligonucleótidos cebadores correspondientes. Tras estas
reacciones se obtienen dos fragmentos de DNA, en uno de los cuales (fragmento b) se introduce la
mutación del Trp4O por Phe. Tras digerir primero los dos fragmentos con la enzima de restricción
Mfel y posteriormente ligarlos se obtuvo el gen completo que codifica la proteína mutante. Para
introducirlo en el vector de expresión pQEGO se digiere éste y el gen de W4OF con las enzimas Ncol
y Sg/II, y los fragmentos del tamaño adecuado se ligan, obteniéndose el plásmido pOE6O-W4OF. La
misma metodología se emplea para la obtención del mutante W1 26, empleando en esta ocasión Xbal
como enzima de restricción correspondiente al sitio interno.

A.

-37-



Métodos Experimentales

W4OF H¡ndlll
Ncol Sg/II

pQE6Q/W4OF

Ncol

H¡ndl II

Ncol W4OF H¡ndlll

216 bp

Hindlll W126F Sg/II
tt.

473 bp

1

1
LIGACIÓN

Figura 10. Metodología empleada en la obtención del doble mutante W40/126F. Tras llevar a
cabo tres digestiones con las enzimas de restricción correspondientes y empleando los plásmidos
pOE6O/FIVp24, pOEGO/W4OF y pOE6O¡W12BF, se obtuvieron tres fragmentos, que ligados
originaron el plásmido pQE6O/W40/1 26F.

NcoI Ncol 2SF Sg/IISg/II

Neol

BgIl 1

H¡ndlll

Bgtll

r

-38-



Métodos Experimen tales

4. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

4.1 ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

Para comprobar los resultados obtenidos en reacciones de PCR, de digestión
de DNAs y ligaciones se prepararon geles de agarosa al 0.7-2% <p/v), según sea el
tamaño del DNA que se quiera detectar, en tampón TAE <Tris-acetato 0.045 mM.
EDTA 0.001 M, pH 8.0). A las muestras se les añade tampón de aplicación 6X (azul
de bromofenol 0.25% (p/v>, cianol de xileno 0.25% (p/v) y glicerol 30% <y/y>), que
contiene los marcadores azul de bromofenol y cianol de xileno, que nos permiten
seguir el desarrollo de la electroforesis. Para llevar a cabo la electroforesis se emplea
un voltaje constante entre 80-100 mV. Las bandas de DNA se detectaron tiñendo el
gel con una disolución de bromuro de etidio de 0.5 a 1 pg/ml durante unos 15 mm
y visualizando el gel bajo luz UV.

4.2. EXTRACCIÓN DE DNA DE GELES DE AGAROSA

La extracción de DNA de geles de agarosa se llevó a cabo con el sistema

QIAEX (QiaGen) siguiendo las condiciones indicadas por el fabricante. El proceso
consta de las siguientes etapas. Las bandas correspondientes al DNA que se quiere
extraer se cortan y se pesan. A continuación se solubilizan con 6 volúmenes del
tampón QX1 y se añaden 10 pl de resma QIAEX II, incubándose a 50 0C durante
10 mm. Se agíta cada 2 mm para que se una el DNA a la resma. Transcurrido este
tiempo, se centrifuga durante 30 s, lavándose el sedimento con 500 pl de tampón
QX1. El tampón se elimina centrifugando de nuevo 30 s. Posteriormente, se realizan
dos nuevos lavados con 500 pl de tampón PE, que contiene etanol al 80%, y el

sedimento se deja secar al aire. Para disolver el DNA se añaden 20 ¡A de agua estéril
o TE (10 mM Tris/HCI, 1 mM EDTA, pH 8.0) al sedimento y se incuba 10 mm a 50
0C, tras lo cual, la mezcla se centrifuga y se recupera el sobrenadante. El DNA así
extraído se puede almacenar a -20 0C.

4.3. PURIFICACION DE DNA

La purificación de DNA se llevó a cabo con el sistema de purificación de
QIAGEN. Una colonia de células transformadas con el plásmido apropiado se emplea
para inocular 3-5 ml de medio de cultivo, complementado con el agente selectivo
apropiado. El medio se crece hasta alcanzar saturación <12-16 h>. Las células se
recogen centrifugando 2-3 mm y se lisan en NaOH/SDS, en presencia de RNAasa A,
incubándose a temperatura ambiente durante 5 mm, con agitación continua. El SDS

-39-



Métodos Experimentales

desnaturaliza las proteínas, las condiciones alcalinas provocan la desnaturalización de
DNA cromosómico y plasmídico y la RNAasa digiere el RNA. El lisado se neutraliza
con acetato potásico 3.0 M, pH 5.5 durante 10 mm a 4 0C. La alta concentración
salina precipita las proteínas desnaturalizadas, el DNA cromosómico y el SDS,
mientras que el DNA plasmídico, más corto, se renaturaliza correctamente y
permanece en disolución. El sedimento precipitado se elimina centrifugando. El
sobrenadante se carga en la columna que contiene la resma a la que se unirá el DNA,
equilibrada con tampón QBT <NaCí 0.75 M, MOPS 50 mM, etanol 15%, pH 7.0,
Triton X-1 00 0-15%>. La columna se lava con el tampón OC <NaCí 1.0 M, MOPS 50
mM, etanol 1 5%, pH 7.0> para eliminar todos los contaminantes. El DNA se eluye con
tampón OF <NaCí 1.25 M, 50 mM Tris/HCI, etanol 15%, pH 8.5>. El DNA eluido se
desala y se concentra precipitándolo con isopropanol a temperatura ambiente y
centrifugando durante 30 mm a 10000 rpm. El sedimento se lava con etanol al 70%
para eliminar las posibles trazas de sales y reemplazar al isopropanol, pues el etanol
es más fácil de eliminar al ser más volátil. Después de secar el sedimento al aire, el
DNA se resuspende en un volumen pequeño de TE o de agua estéril.

5. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS

<PAG E-S DS

)

La preparación de los geles de poliacrilamida y el desarrollo de la electroforesis
se llevan a cabo en un aparato Mini-Protean II de Bio-Rad. Los geles tienen 0.75 mm
de espesor, 7 cm de alto y 8 cm de ancho.

En todos los casos se ha realizado la electroforesis a un 15% de acrilamida en
el gel de desarrollo y con bisacrilamida al 0.25%, tampón Tris 0.38 M, pH 8.8 y SDS
al 0.1% <p/v). El gel superior o concentrante, se prepara al 4% de acrilamida y 0.1 %
de bisacrilamida en tampón Tris 0.12 M, pH 6.8, conteniendo SDS al 0.1% <p/v). Para
la polimerización de los geles se añaden disoluciones de persulfato amónico al 0.02%
(p/v) como agente catalizador y N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina <TEMED) al 0.075%
(p/v) como propagador de la reacción.

Las muestras se disuelven en tampón de aplicación de electroforesis, que
contiene SDS al 3% (p/v), 13-mercaptoetanol al 1% (y/vI y azul de bromofenol al
0.02% (p/v> como indicador de la migración (Laemli, 1970>, y se calientan a ebullición
durante 10 mm. Se aplica en los pocillos entre 10 y 1 5 pl de disolución <generalmente
alrededor de 1 a 2 pg de proteína).

-40-



Métodos Experimentales

La electroforesis se desarrolla a temperatura ambiente en tampón Tris 0.025 M,
glicocola 0.192 M, pH 8.3, conteniendo SDS al 0.1% y a 25 mA/gel hasta que el
marcador llega al final del gel.

Los geles se tiñen empleando azul de Coomassie R-250 al 0.25% y se destiñen
con metanol al 20% y ácido acético al 7.5%.

6. TRANSFERENCIA E INMUNODETECCION

La inmunodetección se ha llevado a cabo mediante el método de Burnette
(Burnette, 1981>. Después de una electroforesis en geles de poliacrilamida, las
proteínas se transfirieron a membranas de PVDF. La transferencia se realizó en una
aparato de transferencia LKB, durante 1 h a 0.9 mA/cm2 de gel, en ácido
3-<Ciclohexilamino)-1 -propano sulfónico <CAPS>, metanol 20% <y/y> y SDS 0.033%,
pH 11. Posteriormente, la membrana se tapizó con albúmina de suero bovino IBSA>
al 4% en PES, pH 7.6 durante 2 h. A continuación, se incubó con suero de caballo
infectado por EIAV en un dilución 1:50 en PBS a temperatura ambiente durante toda
la noche. Tras un lavado con PBS-Tween al 0.05% durante 30 mm, la membrana se
incubó durante 1 h con una dilución 1:3000 de peroxidasa anti-lgG de caballo <Sigma)
en PBS-BSA al 0.1% (p/v>. El revelado se realizó por adición de la solución de
revelado que contiene tetrahidroclorato de 3,3’-diaminabencimida (DABI 0.033% (p/v)
y H

202 0.016% (y/y> en tampón PES.

7. ENZIMOINMUNOENSAVO

Placas de 96 pocillos (Costar> fueron tapizadas con 50 pl de una disolución de
rp26 a 5 pg/ml en tampón carbonato/bicarbonato sódico 20 mM, pH 9.0 durante toda
la noche a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después con PES y se
guardaron a 0

0C hasta el momento de utilizarlas. La proteína recombinante se acopló
con la peroxidasa de rábano activada con periodato en una relación molar 1:1,
siguiendo procedimientos previamente descritos <Harlow y Lane, 1988>. Se obtuvo
un lote de sueros negativos y positivos del Departamento de Agricultura
estadounidense (Ames, Iowa> y se analizó usando el siguiente procedimiento. Se
añadieron 50 u1 de suero sin diluir a dos pocillos, se incubaron a temperatura
ambiente durante 15 mm y se lavaron posteriormente con PBS. Se añadieron
entonces 50 pl de peroxidasa conjugada con rp26 diluida (0.5 pg/ml de peroxidasa>
a cada pocillo y se incubó durante 10 mm. Los pocillos se lavaron con PBS y se

-41-



Métodos Experimentales

añadió el sustrato 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina <TM Blue). El color se desarrolló
durante 10 mm y la reacción se paró con la adición de lOO pl de ácido fosfórico 1 M,
tras lo cual se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Titertek Uniskan
II (Flow Labs.).

8. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA

8.1. ANALISIS DE AMINOACIDOS

La hidrólisis de la proteína <entre 15 y 20 pg> se realiza a vacio, con 0.1 ml de
HCI tridestilado azeótropo, 5.9 N, conteniendo fenol al 0.1% <p/v), a 115 0C durante
24 horas. Finalizado el proceso, las muestras se llevan a sequedad en un desecador
a vacio añadiendo 2 veces un volumen de 0.1 ml de agua destilada y secando
después de cada adición. Las muestras se disuelven en 50 pl de tampón de
aplicación, que contiene 19.61 g de citrato sódico, 20.0 ml de tiodiglicol, 16.5 ml de
HCI concentrado y 1 .0 ml de fenol, en un volumen final de 1 L, a pH 2.2. La muestra
se pasa a un tubo cónico de teflón, analizándose, previa centrifugación, entre 10 y
30 pl. Los análisis de aminoácidos se llevan a cabo en una analizador automático
Beckman 6300. El número de nanomoles de cada aminoácido se calcula a partir del
área del pico correspondiente comparando con los valores obtenidos para una mezcla
estándar de aminoácidos. Para calcular las posibles pérdidas en el sistema de
inyección se utiliza NLeu como estándar interno. Los análisis se procesan con el
programa System GoId de Beckman.

8.2. ESPECTROS DE ABSORCIÓN

La concentración de las diferentes disoluciones de proteína empleadas se ha
determinado también a partir de los espectros de absorción en el ultravioleta. Para ello
se han determinado el coeficiente de extinción de las diferentes muestras
cuantificando la cantidad de proteína mediante análisis de aminoácidos. Los espectros
de absorción, realizados entre las longitudes de onda de 250 y 350 nm, se han
obtenido en un espectrofotómetro Beckman DU-7 de un solo haz. Se ha empleado una
cubeta de cuarzo de 1 cm de paso óptico. Cuando ha sido necesario, la contribución
de la dispersión a la absorbancia se ha calculado suponiendo una proporcionalidad
inversa entre la dispersión y la cuarta potencia de la longitud de onda a la que se mide
en el intervalo 320-350 nm. El cálculo de la concentración de la proteína se ha
realizado a partir de la ecuación [1]:

-42-



Métodos Experimentales

[1] C(mg/ml) = A280— D280
0.1%

8280

donde:

- A280 es la absorbancia de la muestra a 280 nm.
- D280 es la dispersión óptica a 280 nm.

- es la absorción a 280 nm de una disolución de proteína a 1 mg/ml.

9. VALORACIÓN DE GRUPOS TIÓLICOS LIBRES

La valoración del número de grupos tiólicos libres se llevó a cabo mediante el
método de Elíman (Elíman, 1959). Alrededor de 100 pg de proteína en condiciones
nativas (fosfato sódico 10 mM, pH 7.0) o en condiciones desnaturalizantes
(fosfato sódico 10 mM, cloruro de guanidinio <HCIGu> 6 M, pH 7.0> se incubaron con
ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico> <DINE) 0.7 mM, siguiéndose la cinética de la
reacción mediante medida de la absorbancia a 412 nm de forma continua. La
concentración de los grupos sulfhidrilos libres se determinó dividiendo la absorción
neta obtenida después de restar el valor de absorción de un blanco carente de
proteína, entre el coeficiente de extinción del ácido nitrobenzoico, en presencia o
ausencia de cloruro de guanidinio, 14200 y 13880 M’ cm<, respectivamente. Para
valorar el número de grupos tiólicos totales de la proteína, ésta se redujo previamente

con ditiotreitol <DTT) 100 mM durante 90 mm. El exceso de agente reductor se
eliminó cargando la muestra en una columna PD-1 O. Una alícuota de la fracción que
contiene la proteína se valoró con DTNB en condiciones desnaturalizantes.

10. MARCAJE DE CISTEiNAS LIBRES

Una disolución de 1 mg de la proteína rp26 de EIAV se marcó con 5 pl de14C-iodoacetamida <58 mCi/mmol, Amersham) en presencia de HCIGu 6 M durante
45 mm a 37 0C. El exceso de 14C-iodoacetamida se eliminó mediante una
cromatografía de filtración en gel usando una columna PD-10 <Pharmacia). A
continuación, la proteína se redujo con DTT 100 mM en HCIGu 6 M y se volvió a
alquilar con odoacetamida 1 50 mM sin marcar. La proteína así marcada se dializó
exhaustivamente frente a agua y se liofilizó. Posteriormente se disolvió en bicarbonato

-43-



Métodos Experimentales

amónico 0.1 M, pH 8.0 y fue digerida con tripsina a una relación enzima:sustrato de
1:150 en peso durante 4 horas a 37 0C. La proteína digerida se secó a vacío y se
redisolvió en ácido trifluoroacético <TFA> 0.1%. La separación de los péptidos
resultantes de la digestión se llevó a cabo mediante HPLC (Beckman) utilizando una
columna Ultrasphere-ODS y un gradiente lineal de acetonitrilo en TFA 0.1% (0-30%)
durante 80 mm. El flujo en la columna fue de 1 .0 mí/mm. Alícuotas de 50 pl de las
fracciones recogidas se contaron en un contador de centelleo liquido Beckman LS
3801 y aquéllas que poseían mayor radiactividad se hidrolizaron con HCI 6 N, 115 0C,
24 h y se analizaron en un analizador de aminoácidos Beckman 6300.

11. REDUCCIÓN Y CARBOXIAMIDOMETILACIÓN

Alrededor de 2 mg de proteína se incubaron durante 90 mm a 37 0C en
presencia de una disolución que contenía Tris 1 M, HCIGu 6 M, DTT 100 mM, EDTA
2 mM. Transcurrido este tiempo se añadió odoacetamida hasta alcanzar una
concentración final de 125 mM y se incubó de nuevo a 37 0C, en oscuridad, durante
70 mm. El exceso de odoacetamida y DTT se eliminó dializando frente a fosfato
sódico 10 mM, pH 8.0, durante toda la noche a 4 0C.

12. OXIDACIÓN Y REDUCCIÓN DE LAS PROTEiNAS

El estado de oxidación de los grupos SH en la estructura de la proteína se midió
comparando con las formas extremas totalmente oxidada y reducida. Para llevar a
cabo la oxidación se incubaron durante 90 mm 0.3 mg de proteína en presencia de
CuSO

4 2 mM. El sulfato de cobre se eliminó posteriormente de la disolución
dializándose frente a Tris-HCI 10 mM, pH 8.0 durante toda la noche a 4

0C.

La reducción se llevó a cabo incubando la proteína durante toda la noche a
temperatura ambiente con DTT 200 mM, empleándose posteriormente para hacer
estudios espectroscópicos. Parte de la proteína reducida se pasó a través de una
columna PD1 O para eliminar el exceso de DTT.

13. DICROíSMO CIRCULAR

Los espectros de dicroísmo circular se obtuvieron en un dicrógrafo Jasco
J-71 5. Se emplearon cubetas de cuarzo de 0.1 cm o 1 cm de paso óptico para las
regiones del ultravioleta lejano <185-250 nm> o próximo (250-330 nm),

-44-



Métodos Experimentales

respectivamente. El tampón empleado fue fosfato sódico 10 mM, pH 7.0. Los valores
de elipticidad molar rnedia por residuo se calculan tomando como masa molecular por
residuo el valor de 113. Estos datos se expresan en términos de [

0]MRW (grado x
cm2 x dmol<’>. La concentración de proteína empleada fue de 0.1-0.2 mg/ml (UV

lejano) y 1 mg/ml (UV próximo).

13.1. CÁLCULO DE ESTRUCTURA SECUNDARIA

La estructura secundaria de las proteínas se ha evaluado a partir de los
espectros de dicroísmo circular en el UV lejano por el método Convex Constraint
Analysis (CCA) (Perczel e! aL, 1991). Este método permite deducir la contribución
quiral de los elementos de estructura secundaria más comunes, directamente de los
espectros de CD experimentales y no hace uso de los datos de rayos X de proteínas
conocidas. El algoritmo descompone el espectro en sus componentes puras que
resultan ser muy parecidas a los que se obtienen utilizando polipéptidos modelo.

13.2. DESNATURALIZACIÓN TÉRMICA

Las curvas de desnaturalización térmica de las diferentes muestras de proteína
se obtuvieron midiendo de forma continua la elipticidad a 208 nm en un intervalo de
temperaturas de 25 a 70 0C. La temperatura de la cubeta se mantuvo mediante un
baño Neslab RT-1 11 y se incrementó a una velocidad de 30 0C/h.

14. PREDICCIÓN DE ESTRUCTURA SECUNDARIA

La predicción de estructura secundaria se ha llevado a cabo aplicando el
método de Chou y Fasman (Chou y Fasman, 1978), en el que se calcula la
probabilidad de que los distintos aminoácidos adopten un determinado tipo de
estructura secundaria, basándose en proteínas de estructura tridimensional conocida,
y mediante el programa ANTHEPROT (Geourjon y Déléage, 1993>.

-45-



Métodos Experimentales

15. FLUORESCENCIA

15.1. ESPECTROS DE EMISIÓN DE FLUORESCENCIA

Los estudios de fluorescencia se han realizado en un espectrofluorímetro SLM
AMINCO 8000C (SLM lnstruments), equipado con un arco de Xenon de 450 W. Se
emplearon cubetas de cuarzo de 0.2 ó 0.4 cm de paso óptico de excitación y de 1 cm
de paso óptico de emisión. La concentración de proteína se mantuvo entre 0.05-0.1
mg/ml. Los espectros de emisión de la proteína se midieron en un intervalo de
longitudes de onda entre 285 y 450 nm y entre 305 nm y 450 nm excitándose a 275
o 295 nm, respectivamente. Se emplea una rendija de 4 mm tanto en excitación como
en emisión, siendo la velocidad de barrido de 60 nm/min. La temperatura en la cubeta
se mantiene constante mediante un baño termostatizado de agua circulante Polystat
(Huber).

En general, es posible conocer la contribución de las tirosinas a la emisión de
fluorescencia en el espectro registrado excitando a 275 nm. Para ello es necesario
conocer un factor de normalización que se calcula midiendo la relación que existe
entre los espectros de emisión obtenidos excitando a 275 y 295 nm a partir de una
longitud de onda de 380 nm, en la que no existe contribución de las tirosinas. El
espectro obtenido excitando a 295 nm se multiplica por este factor y la contribución
de las tirosinas se obtiene como la diferencia entre el espectro de emisión con
excitación a 275 nm y este espectro normalizado.

15.2. ESTUDIOS DE APAGAMIENTO DE FLUORESCENCIA

Los estudios de apagamiento de fluorescencia se han realizado añadiendo, de
forma acumulativa, diversas cantidades de ioduro potásico 2 M a una disolución de
60 pg/ml de proteína, midiéndose el espectro de emisión a cada concentración del
agente para una longitud de excitación de 290 nm. La disolución de 1K contiene
Na2S2O3 1 o~ M para evitar la formación de 13¾que absorbe en la zona de los
triptófanos y que además podría reaccionar con la proteína. Se elige un valor de

= 295 nm porque a esa longitud de onda no absorbe el loduro y así se evitan los
posibles errores debidos al efecto de filtro interno. Paralelamente se han llevado a
cabo experimentos idénticos, sustituyendo las cantidades de agente de apagamiento
por volúmenes iguales de disolución de NaCí 2 M, con el fin de tener en cuenta tanto
el efecto de la dilución de la proteína como el posible efecto del aumento de fuerza
iónica en la intensidad de fluorescencía.

-46-



Métodos Experimentales

Las intensidades de fluorescencia se han medido en el máximo del espectro de
emisión de fluorescencia a 330 nm. El alto rendimiento cuántico del Trp relativo al de
la Tyr, junto con la longitud de onda escogida permite considerar que la fluorescencia
observada se debe, mayoritariamente, a los residuos de triptófano. Los cálculos de
la constante de apagamiento se han realizado a partir de la ecuación de Stern-Volmer:

12] FJF = 1+ K3[Q]

donde:
— F0 y F son las intensidades de fluorescencia en ausencia <obtenidas al

añadir NaCí 2 M a la muestra> y en presencia de agente de apagamiento,
respectivamente.

— [Ql es la concentración de agente de apagamiento.
— KD es la constante de apagamiento de Stern-Volmer: el inverso de su

valor representa la concentración de agente de apagamiento a la que
FQ/F = 2, es decir, a la que la intensidad de fluorescencia disminuye un
50%. El valor de K0 es la pendiente de la recta obtenida al representar
F0/F frente a [Q].

Si al realizar la representación de Stern-Volmer no se obtiene una recta, el
análisis de los experimentos de apagamiento debe realizarse por medio de una forma
modificada de la ecuación de Stern-Volmer <Lehrer, 1971):

[3] FQ/AF = 1/f0.K.[Q] + uf0

dondeAF = F0 -F, f0 es la fracción de fluorescencia inicial que es accesible al agente
de apagamiento y K es la constante de apagamiento de Stern-Volmer de la fracción
accesible de fluoróforos. Representando los valores de F0/AF frente a los de 1/[Q] se
obtiene una recta en la que se pueden calcular los valores de f0 y K a partir de la
ordenada en el origen (f;

1) y de la pendiente (f
3. KV

1.

-47-



Métodos Experimentales

16. ESTUDIOS DE DESNATURALIZACIÓN POR UREA

Para estudiar la desnaturalización de la proteína FIV-rp24 y las diferentes
formas mutantes, se prepararon disoluciones de las diferentes proteínas, a una
concentración entre 0.1-0.15 mg/mI, con diferentes cantidades de una disolución de
urea 10 M se incubaron durante 16 h a 40 C, condiciones en las que se alcanza una
situación de equilibrio. El tampón empleado en todas las disoluciones fue fosfato
sódico 10 mM, pH 7.0, conteniendo el agente reductor Tris(2-carboxietil)fosfina
(TCEP> 1 mM (Burns e! aL, 1991). A continuación se midieron los espectros de
dicroísmo en el UV lejano y los espectros de emisión de fluorescencia excitando a 275
nm y 295 nm de todas las disoluciones de proteína a 25 0C. La representación, bien
de la elipticidad a 220 nm, bien de la longitud de onda a la que aparece el máximo de
emisión, frente a la concentración de urea permite obtener las curvas de
desnaturalización. Con estos datos se calcula la fracción de proteína que se encuentra
desnaturalizada (Fap) a cada concentración de urea mediante la ecuación [4]
(Pace, 1986>:

[4]

donde:

Fap ~obs~n

~d~n

— ~obs es el valor del parámetro estructural <e
220 o Xmáx> de la proteína a cada

concentración de urea.
— Y, es el valor del parámetro de la proteína nativa a cada concentración de

urea.
— Yd es el valor del parámetro de la proteína desnaturalizada a cada

concentración de urea.

El efecto de la urea en el valor de los parámetros estructurales de las formas
nativa y desnaturalizada se evaluó midiendo los valores de Y, e Yd a cada
concentración de urea y extrapolando los tramos rectos obtenidos a baja y alta
concentración de urea respectivamente (Pace, 1986>.

La variación de energía libre de la desnaturalización en ausencia de agente
desnaturalizante, AGdH» puede determinarse mediante dos modelos:

-48-



Métodos Experimentales

A. EXTRAPOLACIÓN LINEAL <Pace, 1986

)

La manera más simple de estimar AGdH2O es asumir que existe una dependencia
lineal de AG con la concentración de agente desnaturalizante.

[51 AGd=AGdHP - m•[UJ

donde:
- AGd es la variación de energía libre de la desnaturalización
- m es la dependencia de AGd con la concentración de urea.

Sólo los valores de AGd del intervalo lineal de la región de transición se

emplearon para la extrapolación de AGdH2Oa [U] = O M.

8. MODELO DE UNIÓN DEL AGENTE DESNATURALIZANTE (Tanford. 1970

)

En este modelo se asume que la constante de equilibrio del proceso de
desnaturalización que implica dos estados, nativo y desnaturalizado, se ajusta al
modelo lineal de la unión de agente desnaturalizante:

[6] K~ =KH2O ~(1+k.a)tn

donde:
— K3~ es la constante de equilibrio aparente a una actividad de urea.
— KH2O es la constante de equilibrio en ausencia de urea.
— k es la constante de unión del agente desnaturalizante a la proteína.
— An es la diferencia en el número de sitios de unión de urea para la

proteína nativa y desnaturalizada
— a es la actividad de urea cuyo cálculo se hace con la siguiente expresión

<Bower y Robinson, 1963):

a (MI = 0.9815 x [U] - 0.02978 x [U]
2 + 0.00308 x [Uf

Cuando las curvas de desnaturalización no pueden ser ajustadas con un modelo
de dos estados, es necesario incluir otra especie más en el proceso de
desnaturalización:

-49-



Métodos Experimentales

K, K,

N~I~ u

donde 1 es la especie parcialmente desnaturalizada y K1 y K2 son las constantes de
equlibrio. Se utilizó un programa de ajuste no lineal (Sigma Plot> que emplea el
algoritmo de Marquardt-Levenberg <Marquardt, 1963; Press et aL, 1986) para estimar
el valor de los parámetros de la siguiente ecuación:

[7] Kap =
K1K2+ ZKi

1+ (1— Z>Ki

procesos de
urea según la

- K~eslaconstanteaparentedeequilibrio.
— K1 y K2 son las constantes de equilibrio de los

desnaturalización y dependen de la concentración de
ecuación [6].

— El parámetro Z es el cambio fraccional de las propiedades
espectroscópicas en la transición de N a 1 y está definido por
Z (Y~-Y~)/<Y&Y~), donde Y1 es el valor de la propiedad espectroscópica
de la especie intermedia.

donde:

-50-



RESULTADOS Y DISCUSIÓN



Resultados y Discusión

1. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DEL
VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA. PAPEL DE LOS GRUPOS

SULFHIDRILO EN EL MANTENIMIENTO DE LA ESTRUCTURA

1 .A. CLONACIÓN EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA EIAV-rp26 DE

EIAV

Siguiendo la estrategia comentada en el apartado Métodos Experimentales, el
gen que codifica la proteína mayoritaria de la cápsida de EIAV, p26, se transcribió a
partir de RNA viral. Este RNA, que había sido extraído de suero infectado, se amplificó
por PCR empleando los oligonucleótidos cebadores que aparecen en la Figura 11-A,
que introducen los sitios de restricción Ncol y Hindlll. El DNA resultante se clonó en
los sitios de restricción Ncol/Hindlll del plásmido pUCí 8N y, posteriormente, se clonó
también en otro vector de expresión diferente, el plásmido pKK223-3N. La secuencia
de DNA del gen p26 generado por PCR se comprobó mediante secuenciación
automática, siendo idéntica a la secuencia publicada del DNA proviral <Stephens
e! a/., 1986, Kawakami et al., 1987), excepto en el cambio del cuarto nucleótido de
adenina a guanina que cambia el segundo aminoácido de la proteína donada de líe a
Val (Figura 11-8).

La expresión del gen, donado en cualquiera de los dos plásmidos utilizados,
origina la aparición de una proteína con una masa molecular de 26 kDa. En (a
Figura 12, pocillo 1, se observa la expresión de dicha proteína utilizando el vector
pUCí 8N. La proteína se purificó mediante el método descrito anteriormente en
Métodos Experimentales. En la Figura 12 se recogen los resultados de PAGE-SDS de
algunas etapas de la purificación. El rendimiento obtenido fue de 1.2 a 1.5 mg/L de
medio de cultivo. La pureza de la proteína se determinó mediante el densitometrado
de geles de PAGE-SDS teñidos con azul de Coomassie, siendo ésta superior al 95%.
Tanto el rendimiento como la pureza de la preparación final de EIAV-rp26 que se
obtiene a partir del plásmido pUC1 8N/EIAVp26 (pUC/rp26> o pKK223-3N/EIAVp2G
(pKK/rp26> son comparables. Los resultados de PAGE-SDS en presencia y ausencia
de agente reductor (Fig. 12, pocillos 4 y 5) indican que la proteína EIAV-rp26 se
comporta como un monómero de 26 kDa. Esta naturaleza monomérica se confirmó
mediante cromatografía de penetrabilidad en Biogel P-1 00. El volumen de elución no
varía en el intervalo de concentraciones estudiado, de 1 a 20 mg/mí, e indica que la
proteína tiene 26 kDa. Además el volumen de elución no depende de la fuerza iónica
del tampón de elución <O.OSIJ.25 M NaCí) <resultados no mostrados).

-52-



Resultados i¡ Discusión

A

p26-Ncol <+>

p26-Hindlll (-)

5’ OCCCATOOTAOATOOGOCTOOAAACAG

5’ COAAOCTTAAAOTGCTTTTOCCAATAACAT

B

Original

Clonada

M

ATOOriginal

P 1 M 1 D O A O

CCA ATC ATO ATA OAT 000 OCT OOA

CC ATO OTA OAT 000 CGT OGA

M y fl O A O

C

L
TTA TTO OCA AAA OCA CTT CAO ACT OOT

Clonada ATO TTA TTO OCA A~A OCA CTT
M L L A K A L

TAA CGT TCO
*

Figura 11. Estrategia de donación de EIAV-rp26. (A) Secuencia de los oligonucleótidos
cebadores empleados en la reacción de PCR para amplificar el gen de p26. El cebador 5’ Ncol
introduce un sitio de restricción Ncol, mientras que el cebador 3’ Hindlil introduce un sitio de
restricción Hindlll y un codón de terminación (*)~ (B> Alineamiento de las secuencias original y
donada del extremo amino terminal de la proteína p26. (C) Alineamiento de secuencias original
y donada del extremo carboxilo-terminal de la proteína p26. Los nuevos sitios de restricción se
encuentran subrayados (Ncol - CCATGG; Hindlll - TTCGAA) y ‘TAA’ (*> es el codón de
terminación del gen donado. Como la proteasa de EIAV rompe el enlace L-L (Henderson et al.,
1987; Tñzser et al., 1993) la secuencia carboxilo-terminal de p26 es M-L. Sin embargo, EIAv-
rp2G contiene el pentapéptido L-A-K-A-L- que en el precursor Pr55gag se encuentra entre p26
y pl 1.

3’

3,

-53-



Resultados y Discusión

Figura 12. Electroforesis en gel de poliacrilarnida al 15% en presencia de SOS de los pasos de
purificación de EIAV-rp26. Pocillo 1, lisado celular; pocillo 2, precipitación con sulfato amónico
al 50%; pocilloS, conjunto de fracciones del DEAE OE-5l que contienen rp26; pocillo 4, conjunto
de fracciones del Sephacryl S-1 00 que contienen rp2G; pocillo 5, rp2G purificada en ausencia de
¡3-mercaptoetanol; M, marcadores de masa molecular.

La composición de aminoácidos de la proteína EIAV-rp26 aparece en la
Tabla III, donde se compara con la composición teórica determinada a partir de la

secuencia de DNA publicada <Stephens e! aL, 1986; Kawakami e! al., 1987>,
observándose que son prácticamente coincidentes. Además, la identidad de la
proteína se confirmó mediante el análisis de la secuencia amino-terminal. Los
resultados de cinco ciclos de secuencia automática indican que los primeros cinco
residuos de EIAV-rp26 son Val, Asp, Gly, Ala y Gly, los cuales coinciden con los
residuos 2 a 6 de la secuencia donada y los residuos 4 a 8 de la secuencia publicada
(Henderson eta!., 1987>. Es frecuente en proteínas que se expresan en E. coil, que
éstas pierdan el residuo iniciador de metionina a través de la rotura proteolítica del
residuo formil-metionina, catalizada por la desformilasa y la metionina amino-
peptidasa. Según las observaciones de Hirel et al. (Hirel e! al., 1 989), en el caso de
EIAV-rp26, ya que el segundo aminoácido es valina, la eliminación del amino-terminal
fMet sería esperable.

La proteína recombinante EIAV-rp26 posee 233 aminoácidos y difiere de la
proteína de la cápsida viral p26, de 230 aminoácidos, en que posee dos aminoácidos
menos en el extremo amino terminal, Pro e líe, en el cambio del segundo residuo de
Val a líe, (Fig. 11-8) y en que posee una extensión de cinco residuos en el extremo

-54-



Resultados y Discusión

carboxilo-terminal que en el precursor Pr55gag se encuentra entre las proteínas p26

y pl 1 <Henderson et aL 1987) (Figura 11 -C). Cabe esperar que estos cambios sean
poco significativos en lo que a estructura tridimensional de la proteína se refiere.

1AMINOÁCIDO COMP. TEÓRICA COMP. EXPER.

18

16

26

3

32

15

3

16

20

12

10

8

17

7
14

3

4
9

ALA

ARG

ASX

CYS1

GLX

GLY

HIS

ILE

LEU

LYS

MEV

PHE

PRO

SER

THR

TRP3

TYR

VAL

18

17

25

3

32

16

4

15

20

12

9

8

16

8

14

3

4.5

9

Tabla III. Composición teórica y experimental de la proteína EIAV-rp26 de EIAV. La composición
teórica se determinó a partir de la secuencia de DNA. (1) El número de residuos de cisteina se
determinó como cmcys en la proteína reducida con OTT y carboxiamidometilada. (2) En el
número de Met teóricas se incluye la correspondiente al extremo amino-terminal. (3) El número
de residuos de triptófano se calculó mediante el método de Edelhoch (Edelhoch, 1967).

-55-



Resultados y Discusión

1. 8. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE EIAV-rp26

Las cápsidas lentivirales están constituidas por varias copias de una o más
proteínas que interaccionan para formar una envoltura icosaédrica, la cual envuelve
al RNA viral. Estudios de microscopia electrónica (Gelderblom e! aL, 1989; Ozel
eral., 1990; Gelderblom eraL, 1991; Hóglund eta’,, 1992> indican que la proteína
adopta una estructura en forma de cono doblemente truncado. Ante la ausencia de
datos cristalográficos o estudios estructurales detallados, algunos autores han
postulado que la simetría cónica de la cépsida podría explicarse suponiendo una

simetría con un número de triangulación, T~3 <Rossmann, 1988>, mientras que la
proteína adoptaría una conformación de barril 13 con ocho cadenas <Argos, 1989>.
Esta estructura permitiría la existencia de un orificio hidrofóbico en cuyo interior
podrían alojarse sustancias antivirales tales como compuestos WIN encaminadas a la
eliminación del virus (Argos, 1989; Phelps y Post, 1995>. Sin embargo. la aplicación
de métodos predictivos o de análisis mediante dicroísmo circular indican una
estructura secundaria inconsistente con el modelo de barril j3, siendo la hélice a la
estructura mayoritaria.

MÉTODOS PREDICTIVOS

La predicción de estructura secundaria se realizó aplicando el programa
ANTHEPROT <Geourjon y Deléage, 1993>, que engloba diferentes métodos,
obteniéndose en todos los casos unos resultados muy parecidos, siendo el elemento
mayoritario de estructura secundaria la a-hélice. En la Figura 1 3 aparecen los
resultados de la predicción de la estructura secundaria de EIAV-rp26 por el método
de Chou-Fasman lChou y Fasman, 1978>. Este método emplea una serie de valores
correspondientes a la probabilidad que tiene cada aminoácido de ocupar una posición
en una hélice a, estructura j3 o giro 13; a esta última estructura es a la que se da
mayor importancia, pues la asignación de estructura secundaria para la proteína
comienza con la determinación de los giros j3 que hay en la secuencie. Prácticamente,
la mitad de la estructura es hélice a, estando los diferentes fragmentos helicoidales
diseminados por toda la secuencia de aminoácidos. La composición de estructura

secundaria de la proteína seria de un 46% de hélice a, 24% de estructura f3, 12% de

giro g y un 18% de estructura no ordenada.

El resto de los métodos empleados proporcionan unos resultados similares
(Tabla IV>, dando cuenta de la hélice a del 35-50% de la estructura secundaria,
mientras que la lámina 13 daría cuenta del 10-20%.

-56-



Resultados y Discusión

Figura 13. Predicción de estructura secundaria mediante el método de
Fasman. 1978). (~) a-hélice: (~‘~~v) estructura [3;( ) giro 13.
de EIAV-rp26 aparecen aquellas zonas que poseen estructura helicoidal
y 151-231 en la proteína p24 de HIV-1 () (Gamble etaL, 1997;

Chou-Fasman (Chou y
Debajo de la secuencia
en los dominios 1-151
Gitti et aL, 1996).

MÉTODO % estructura 13 % a-hélice % giro 13
¡

% estructura 1
no ordenada

48Garnier 11 33 8

Robsony 21 37 15 27

Garnier

Gibrat 15 49 - 36

Tabla IV. Predicción de estructura secundaria
diferentes métodos de predicción englobados en
1993.

de la proteína EIAV-rp26 de EIAV mediante
el programa ANTHEPROT (Geourjon y Deléage,

-57-



Resultados y Discusión

DICROíSMO CIRCULAR

La proteína EIAV-rp26 purificada presenta un espectro de absorción
característico de una proteína soluble, con un máximo de absorción alrededor de los
280 nm, sugiriendo que no contiene ácidos nucleicos. El coeficiente de extinción
molar para esta proteína calculado experimentalmente mediante análisis de
aminoácidos es 26974 M< cm’, es decir, una disolución de proteína a 1 mg/ml
tendría un valor de A280 de 1 .03.

Es ampliamente conocido que las diferentes formas de estructura secundaria

regular encontradas en péptidos y proteínas poseen diferentes espectros de dicroísmo
circular en el ultravioleta lejano. Las características de los espectros pueden depender
de la longitud y regularidad de los elementos estructurales en las proteínas (Hirst y
Brooks, 1 994). Para determinar la composición de estructura secundaria de la proteína
EIAV-rp26 de una forma experimental, se midió su espectro de dicroísmo circular en
el UV lejano (Figura 14-A). En él se observan dos mínimos bien diferenciados a 208
y 220 nm, característicos de la estructura a-hélice. El valor de elipticidad a 208 nm
es de -21400 grados x cm

2 x dmor1 y a 220 nm de -17960 grados x cm2 x dmor1.
A partir de los datos experimentales y utilizando el método Convex Constrain!
Analysis (CCA> (Perczel e! aL, 1991) se determinaron los siguientes porcentajes de
estructura secundaria: 50% de a-hélice, 1% de estructura 13, 1 5% de giros 13 y 34%
de estructura no ordenada. El espectro resultante del ajuste aparece representado en
la Figura 14-A, junto con el espectro obtenido experimentalmente. Como se puede
observar, ambos espectros son prácticamente coincidentes. Si el ajuste del espectro
se realiza mediante el método de Bolotina (Bolotina et al., 1980) se obtienen los
siguientes resultados: 33% de a-hélice, 17% de estructura 13, 20% de giro j3 y 30%
de estructura no ordenada, donde el componente mayoritario sigue siendo la hélice
a. Tanto los métodos predictivos como el dicroísmo circular indican que el elemento
mayoritario de estructura secundaria es la a-hélice, por lo que el modelo de barril 13
que se ha propuesto para la proteína de la cápsida viral de HIV-1 parece poco
probable <Argos, 1989). Por otro lado, la estructura propuesta por Argos no podría
explicar las observaciones de Langedijk et al. (Langedijk e! aL, 1990), quien asignó
los sitios de unión de varios anticuerpos monoclonales anti-p24 a regiones de p24 que
según el modelo de barril 13 resultarían inaccesibles.

-58-



Resultados y Discusión

Figura 14. Espectros de dicroísmo circular de la proteína EIAV-rp2G. (A) Espectro de CD en el uy
lejano. Junto al espectro de la proteína medido experimentalmente, que aparece en línea continua,
se representa el ajuste mediante el método OCA (e) (Perczel eta!., 1991). (B) Espectro de CD en
el uy próximo. La concentración de proteína utilizada fue de 0.1-0.2 mg/ml para los espectros
en el uy lejano y 1 mg/ml para los espectros en el U\J próximo. Los espectros corresponden a
la proteína obtenida cuando se utiliza el vector pUC1 SN/EIAVp2G.

El espectro de CD de EIAV-rp26 es similar al descrito para la proteína homóloga
p24 de HIV (Ehrlich e! aL, 1994; Hausdorf e! aL,

de una proteína que se obtiene donando un
procesamiento proteolítico cuando se expresa en
formar estructuras oligoméricas no random a
manteniendo un espectro de CD similar (Ehrlich et
trata de la proteína p24 recombinante, que se
cuerpos de inclusión <Hausdorf e! aL, 1994>. Por

estado de agregación de la proteína, la hélice a es
más abundante. En lo que a las características
formación de la cápsida respecta, los resultados

1994). En el primer caso se trata
precursor Gag-pol que sufre un
E. coil. Esta proteína es capaz de
alta concentración, 2-30 mg/mI,
aL, 1994). En el segundo caso se
obtiene renaturalizada a partir de

tanto, e independientemente del
el elemento de estructura ordenada

de la proteína responsables de la
son contradictorios. Así, en el caso

de EIAV se ha propuesto que es el precursor Pr5sgag, y no la proteína p26

,C’ 40 40
o

t 20
x

20 0
x ¿a
o 2% 10 -20 a

o
0>

q
0 ~

x
~ -10 -~ aa: 2

o
220 -80 2.

Longitud de onda (nm)

190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340

-59-



Resultados y Discusión

procesada, el responsable de la formación de partículas subvirales in vivo (McGuire
e! aL, 1994). Por otro lado, se ha descrito que p24 forma estructuras alargadas tipo

varilla (Ehrlich e! aL, 1992), lo que indicaría la capacidad inherente de la propia

proteína de formar estructuras oligoméricas estables. Si la formación in vitro de
estructuras oligoméricas fuese responsable de la formación de la cápsida in vivo, dada
la alta homología de secuencia entre todas estas proteínas, todas deberían ser

capaces de formar estructuras oligoméricas. Como se ha indicado anteriormente,
EIAV-rp26 permanece monomérica hasta una concentración de 20 mg/ml mientras
que, como se indicará más adelante la proteína rp24 de FIV forma agregados a una
concentración similar. Por tanto, parece claro que la secuencia de aminoácidos de
cada proteína determina la diferente capacidad de formación de oligómeros pero que
debe existir otro factor responsable de la formación de la cápsida.

El espectro de dicroísmo circular en el ultravioleta próximo de las proteínas
surge de los entornos asimétricos de las cadenas laterales de los residuos aromáticos,

así como de las posibles contribuciones de los puentes disulfuro, u otros cofactores
de naturaleza no proteica que puedan absorber en esta región. El espectro de CD de
la proteína EIAV-rp26 en el UV próximo <Fig. 14-B) presenta un mínimo alrededor de
los 300 nm, zona donde absorben los residuos de triptófano <Strickland, 1974). La
proteína EIAV-rp26 posee tres residuos de triptófano y cuatro residuos de tirosina,
pero mediante el espectro de dicroísmo circular no se puede asignar la contribución
de los residuos individualmente, ya sean residuos de triptófano, tirosina o fenilalanina.

ESPECTROS DE FLUORESCENCIA

El entorno tridimensional de los residuos aromáticos de una proteína puede
estudiarse también mediante espectroscopia de fluorescencia. En la Figura 1 5
aparecen los espectros de emisión de fluorescencia de la proteína EIAV-rp26
excitando a 275 nm y 295 nm. El espectro de emisión obtenido excitando a 275 nm
presenta un máximo de emisión entorno a los 324 nm. Como referencia, el triptófano
libre en disolución tiene un máximo de emisión a 348 nm, mientras que cuando este
residuo está en un entorno muy hidrofóbico el máximo de emisión se desplaza hacia
longitudes de onda entre los 310 y 320 nm (Lackowicz, 1983>. Por lo tanto, en la
proteína EIAV-rp26 los residuos de triptófano están bastante ocultos en la estructura.
En el espectro de emisión excitando a 295 nm se mide la fluorescencia emitida
únicamente por los residuos de triptófano, que son los únicos fluoróforos que pueden

excitarse a esta longitud de onda. Restando al espectro de emisión a 275 nm el de

emisión a 295 nm una vez normalizado determinado considerando que a partir de

-60-



Resultados y Discusión

380 nm toda la emisión de fluorescencia es debida a los residuos de triptófano, se
puede determinar la contribución de los cuatro residuos de tirosina al espectro de
emisión de la proteína (Fig. 15>. Se observa que esta contribución es muy pequeña;
El valor de la intensidad de fluorescencia en el máximo de la contribución es alrededor
de un 13% del valor en el máximo de emisión cuando se excita a 275 nm. Este valor
tan pequeño podría indicar la existencia de procesos de transferencia de energía
desde los residuos de tirosina a los de triptófano en la proteína o la mayor facilidad
para la desactivación que presentan los residuos de tirosina. Esta contribución tiene
un máximo cercano a los 300 nm, que es la longitud de onda a la que aparece el
máximo de emisión de la tirosina en disolución.

Figura lE. Espectros de emisión de fluorescencia de la proteína EIAV-rp26 de EIAV. Espectros
de emisión obtenidos con una longitud de excitación de 275 nm ( > y 295 nm normalizado

1; contribución de los residuos de tirosina al espectro de emisión de EIAv-rp26 calculado
a partir de los dos espectros anteriores < ). Los espectros corresponden a la proteína
obtenida cuando se utiliza el vector pUC1 SN/EIAVp2E.

Los diferentes parámetros espectroscópicos de EIAV-rp26 indican que ésta
posee una estructura tridimensional con un alto porcentaje de estructura ordenada.
Además, EIAV-rp26 se produce en forma soluble y se ha purificado utilizando una
metodología convencional no desnaturalizante. Por tanto, se puede pensar que

50

40ca
aa,
ciCo
ti,
i.- 30o

ci>

20
-D

a

a
lo

o

Longitud de onda (nm)
300 320 340 360 380 400 420 440

-61-



Resultados y Discusión

EIAV-rp26 posee estructura nativa. Como indica su espectro de CD, aproximadamente

el 50% de la estructura secundaria es hélice a, estando localizada dicha estructura
tanto en la mitad amino como carboxilo-terminal. Recientemente, se ha determinado
la estructura tridimensional del fragmento 1-151 de p24 de l-IIV-1 <Gitti eta!,, 1996>
y la del extremo carboxilo-terminal, residuos 151-232 (Gamble e! aL, 1997). El
extremo amino-terminal (residuos 1-1 51> adopta una estructura compuesta de siete

hélices a, dos horquillas 13 y un giro expuesto parcialmente ordenado, mientras que
en la región carboxilo-terminal hay otras cuatro hélices a que siguen a una lámina
extendida. La estructura tridimensional de estos fragmentos se ha determinado
suponiendo que ambos se comportan como unidades de plegamiento independientes
y que poseen, de manera aislada, la misma estructura que en la proteína completa.
Sin embargo, no existen datos de estructura tridimensional de la proteína entera y la
suposición podría no cumplirse. De hecho, el dominio carboxilo-terminal posee
estructura desordenada en cristales de dímeros de HIV-p24 <Momany et aL, 1996).
Ahora bien, la localización en la secuencia de los fragmentos de hélice a de los
fragmentos 1-151 y 151-232 de HIV-p24 coincide bastante bien con lo que se
predice para la proteína homóloga p26 de EIAV <Fig. 13). Por ello, parece probable
que dichos fragmentos se comporten como dominios y que posean la estructura
descrita, aunque, evidentemente, son necesarios los datos de estructura
tridimensional de la proteína completa.

ANÁLISIS ANTIGÉNICO DE EIAV-rp26

En la Figura 16 aparecen los resultados obtenidos en la inmunodetección de
ElAV-rp26 con suero de caballo infectado por EIAV. Se utilizaron cuatro muestras de
suero infectado por EIAV, elegidas al azar, <Hg. 16, pocillos 1-4), y dos muestras
control, las dos no infectadas por EIAV <Fig. 16, pocillos 5 y 6>. Como se puede
observar, sólo en el caso de las muestras infectadas se produce la reacción con
EIAV-rp26. Las líneas más débiles observadas en los pocillos 1 y 4 pueden deberse
a fragmentos de EIAV-rp26 que reacionaron con el suero correspondiente. Sin
embargo, estos fragmentos no son visibles cuando los geles de poliacrilamida se tiñen
con azul de Coomassíe.

La antigenicidad de EIAV-rp26 también se determinó en condiciones en las que
la proteína no se encuentra desnaturalizada. La Tabla V muestra los resultados
obtenidos en un enzimoinmunoensayo usando un lote de sueros positivos y negativos
proporcionados por el Departamento de Agricultura de EEUU. Los valores de
absorbancia de las muestras no infectadas fueron siempre inferiores a 0.04. Sin
embargo, la mayoría de las muestras positivas dieron una absorbancia mayor de 1 .0.

-62-



Resultados y Discusión

Las dos muestras positivas que dieron los valores más bajos de absorbancia, muestras
19 y 20, proceden de caballos que se consideran débilmente positivos.

Figura 16. Inmunodetección de EIAV-rp26 con suero infectado por EIAV. La inmunodetección se
llevó a cabo sobre membranas de PVDF como se describe en el apartado Métodos
Experimentales. Pocillos 1-4, suero infectado por EIAV; pocillos 5 y 6, suero normal de caballo.

Al igual que ocurre con la proteína p24 de HIV, p26 de EIAV es una proteína
muy inmunogénica que está altamente conservada entre diferentes cepas de virus

(Salinovich et al., 1986). Por ello, la respuesta de los anticuerpos anti-p26 constituye
la base de los inmunoensayos diagnósticos. El ensayo estándar para determinar la
infección por EIAV en caballos es el ‘Test Coggins, aprobado por la USDA en 1972
(Coggins y Norcross, 1970>. Este ensayo utiliza la inmunodifusión en geles de agar
para detectar anticuerpos frente a p26. La proteína p26 utilizada en estos ensayos se
obtiene a partir de cultivos de células infectadas por EIAV. La proteína recombinante
EIAV-rp26 que se obtiene mediante el método descrito en esta memoria proporciona
un método alternativo de obtención del antigeno para estudiar los aspectos
inmunológicos de esta proteína. Los datos de inmunoblotting claramente demuestran
que la proteína recombinante es reconocida por lo anticuerpos presentes en los sueros
de caballos infectados por EIAV, a pesar de que muchos epitopos dependientes de
la conformación son destruidos mediante esta técnica. Además, la proteína
recombinante se puede utilizar para detectar sueros positivos en un inmunoensayo
que no desnaturaliza la proteína. Por tanto, se puede pensar en la utilización de EIAV-

rp26 en el desarrollo de nuevos ensayos diagnósticos de la infección por EIAV.

1 2 3 4 56

1

sí ½

-63-



Resultados y Discusión

MUESTRA ESTADO

Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo

Positivo
Positivo

Positivo
Positivo
Positivo

Positivo
Positivo
Positivo
Positivo

1
2
3
4
5

6
.7
8
9
10
11

12
13

14
15
16
17

18
19
20

0.013
1 .060
0.009
0.032
0.002
0.004
0.013
0.015
0.003
0.010
>2.00
>2.00
>2.00
1.940
>2.00
1.962
1.787
>2.00
0.675
0.459

Tabla V. lnmunoensayo enzimático de EIAV-rp26. La
antigenicidad de EIAv-rp26 fue probada frente a un panel de
sueros positivos y negativos. Los valores de absorbancia
corresponden a la media de duplicados de cada muestra.

-64-



Resultados y Discusión

1.C. PAPEL DE LOS RESIDUOS DE CISTEINA EN EL MANTENIMIENTO DE LA
ESTRUCTURA DE EIAV-rp2B

El análisis de aminoácidos de la proteína EIAV-rp26 alquilada confirma la
existencia de tres residuos de cisteina. Según se deduce de la secuencia de DNA, los
tres residuos de cisteina ocupan las posiciones 48, 1 98 y 21 8 de la secuencia
donada. Las dos cisteinas que se encuentran en el extremo carboxilo-terminal están

muy conservadas en el resto de las proteínas de las cápsidas lentivirales (Stephens
et aL, 1986; Talbott e! aL. 1989; Gamble e! aL, 1997>. Además, en el caso de la
proteína p24 de HIV-1 se ha descrito que entre estas dos cisteinas se forma un
puente disulfuro intracatenario <Hausdorf eta!., 1994>, por lo que podría pensarse que
en el resto de las proteínas de las cápsidas ocurre lo mismo. Para determinar si en el
caso de EIAV-rp26 se forma un puente disulfuro intracatenario se han llevado a cabo
una serie de estudios encaminados a probar su existencia, y a determinar entre qué
residuos de cisteina se forma dicho puente.

Dada la implicación estructural de este tipo de interacciones se ha estudiado
el papel de los grupos SH en el mantenimiento de la estructura tridimensional de
EIAV-rp26. Los estudios que se describen en esta memoria se iniciaron con la
proteína EIAV-rp26 obtenida con el plásmido pKK223-3N/EIAVp26. Cuando esta
proteína purificada se analiza mediante PAGE-SDS en presencia o en ausencia de
agente reductor <13-mercaptoetanol al 5%>, la proteína, tanto en condiciones
reductoras <Fig. 12, pocillo 6) como no reductoras (Hg. 12, pocillo 7), migra como
un monómero de 26 kDa, lo que indica que no hay puentes disulfuros formados entre
dos moléculas de proteína. En algunas preparaciones, en ausencia de agente reductor
se observa la presencia de un pequeño porcentaje de forma dimérica <5-10%>.

El número de grupos SH libres de la proteína se puede determinar incubando
EIAV-rp26 con DTNB en presencia o ausencia de agentes desnaturalizantes como el
cloruro de guanidinio o el SDS, que hacen que todos los grupos SH libres de la
proteína queden totalmente accesibles al reactivo. Para las distintas preparaciones
estudiadas, el número promedio de grupos SH libres, aún en presencia de agente
desnaturalizante, es 1 .1. Este valor indica que la proteína pKK/rp26 se comporta,
mayoritariamente, como un monómero en el que existe un puente disulfuro entre dos
de las tres cisteinas de la molécula. Para determinar la posición de la cisteina libre, se
procedió a marcaría con ~C-iodoacetamida. Una vez marcada, la preparación se
dializó y la proteína se redujo con DTT y se volvió a alquilar, pero esta vez con
odoacetamida sin marcar. La proteína entonces se digiere con tripsina y los péptidos
resultantes de la digestión se separaron mediante cromatografía líquida de alta

-65-



Resultados y Discusión

presión (HPLC). El perfil de HPLC de los péptidos trípticos se recoge en la Figura 17.
En él aparecen tres picos mayoritarios, señalados con una flecha, que tienen una
radiactividad específica similar. Estos tres picos se analizaron y se comprobó que
correspondían a los péptidos donde se encuentran los residuos de cisteina. Por lo
tanto, ya que las tres cisteinas se marcan prácticamente en la misma proporción, no

parece que haya ningún puente disulfuro estable formado entre dos de los residuos
de cisteina, ya que de lo contrario se habría obtenido un único pico mayoritario
marcado, que correspondería a la cisteina libre, que debería haber sido la Cys48.
Estos datos podrían sugerir que las tres cisteinas se encuentran inicialmente en forma
libre en la estructura plegada, y que, durante el proceso de purificación, se produce
la oxidación de las tres Cys, formandose más de un puente disulfuro, implicando por
igual a las tres cisteinas.

Figura 17. Perfil de elución de HPLC de los péptidos resultantes de la digestión de EIAV-rp26
marcada con I1-14C1-iodoacetamida con tripsina. Las fracciones radiactivas se hidrolizaron con
HCI 6 N. La composición de los péptidos señalados como C48, C198 y C218, determinada
mediante análisis de aminoácidos, coincide con la deducida de la secuencia de aminoácidos de
los péptidos que contienen cisterna. Los péptidos que contienen residuos de cisterna.

-66-



Resultados y Discusión

En este mismo sentido apuntan los resultados que se obtienen cuando se utiliza
la proteína EIAV-rp26 purificada a partir del vector pUCí SN/EIAVp26. En este caso,

el número de grupos tiólicos libres varió, para las distintas preparaciones, entre 2 y
2.6, con un valor promedio de 2.2. También en este caso se observa mediante

PAGE-SDS en ausencia de agente reductor la existencia de un 5-10% de forma
dimérica. Estos datos indican, efectivamente, que no hay un puente disulfuro formado

entre dos de las tres cisteinas. Sin embargo, el hecho de que en ninguna preparación
se observen 3 grupos SF1 libres, indica que también en este caso existe una cierta
proporción de moléculas en las que sí se forma el puente disulfuro. Si se considera
que en estas preparaciones hay un 5-10% de dímeros y que éstos tienen un solo
puente disulfuro intercatenario, la preparación con 2.2 SH libres estaría formada por,
aproximadamente, un 55-58% de proteína reducida (con 3 SH libres> y un 35-37%
de forma monomérica con un puente disulfuro; si la forma dimérica tuviese todos los
SH oxidados, en la preparación con 2.2 SH libres la forma monomérica reducida
debería dar cuenta de un 60-61 % del total. De cualquier manera, estos datos
apuntarían hacia una gran proximidad de los residuos de cisteina en la estructura
tridimensional.

Figura 18. Espectros de CD en el UV lejano (A) y próximo (8) de las proteínas pUC/rp26 (e) y

pKK/rp26 (O). La concentración de proteína utilizada fue de 0.1-0.2 mg/ml para los espectros en
el UV lejano y 1 mg/ml para los espectros en el UV próximo.

-67-



Resultados y Discusión

Como indican los espectros de CD en el UV próximo y lejano (Fig. 18, A y B>

el diferente contenido en grupos SH libres se traduce en un cambio tanto a nivel de
estructura secundaria como tridimensional. Aunque en los dos casos la forma del
espectro en el UV lejano es la misma, con dos mínimos a 208 y 220 nm, hay un

cambio en la magnitud del espectro. Así, a 208 nm la elipticidad de la forma con 1.1
grupos SH libres es de -14940 grados x cm2 x dmol<’, mientras que la de la forma con
2.2 SH libres es -21400 grados x cm2 x dmol<. El ajuste del espectro de pKK/rp26
mediante el método OCA proporciona la siguiente estructura secundaria; 40% de
a-hélice, 26% de lámina 13, 12% de giro ¡3 y 22% de estructura no ordenada.
Comparando con la estructura de pUC/rp26 se observa una disminución de la
proporción de hélice a (del 50 al 40%> y un aumento considerable de la lámina 13 (de
1 a 26%). El entorno de los residuos aromáticos varía como consecuencia de la
formación del puente disulfuro. Este cambio afecta fundamentalmente a las bandas
dicroicas localizadas entre 270 y 290 nm.

De la comparación de los espectros de emisión de fluorescencia, tanto

excitando a 275 nm como a 295 nm, de ambas proteínas no se deduce ningún
cambio sustancial en la polaridad de los microentornos de los fluoróforos de EIAV-

rp26. Sin embargo, sí se observan diferencias entre ambas proteínas cuando se

estudia la desactivación (quenching) de fluorescencia por ioduro potásico.

La utilización de la técnica de desactivación de fluorescencia por agentes

solubles, como es el ioduro potásico, proporciona información acerca del diferente
grado de exposición de los distintos fluoróforos de la proteína. Como se ha
comentado anteriormente, la proteína EIAV-rp26 posee cuatro residuos de tirosina y
tres de triptófano, aunque a la vista de sus espectros de fluorescencia, la emisión se
debe principalmente a los residuos de triptófano. Por otro lado, los espectros de
emisión de fluorescencia que se han utilizado en estos estudios se han obtenido con
una longitud de onda de excitación de 295 nm, a la que sólo se excitan los residuos
de Trp. Por tanto, estos estudios de desactivación por 1K darán información acerca
de la exposición de los Trp de EIAV-rp26. El 1K ejerce su acción a través de un
mecanismo fundamentalmente colisional, por lo que la eficacia para desactivar la
fluorescencia de los triptófanos de EIAV-rp26 dependerá de si es capaz o no de
interaccionar con ellos y, probablemente, del diferente grado de exposición en la
molécula (Lehrer, 1971; Eftink y Chiron, 1976). Según esto, un cambio en las
características del apagamiento reflejará una variación en la accesibilidad al agente
de apagamiento, y, por tanto, un cambio conformacional.

El ioduro potásico, al ser un compuesto iónico, cargado y fuertemente
hidratado, únicamente va a actuar sobre los fluoróforos que estén en la superficie de

-68-



Resultados y Discusión

la proteína o cerca de ella (Lehrer, 1971>. La representación de Stern-Volmer para la
desactivación con ioduro de la proteína EIAV-rp26 nativa no es una línea recta, sino
que a partir de 0.3 M presenta una curvatura hacia el eje de abscisas en el intervalo

de concentraciones empleadas <datos no mostrados>, lo que indica que:

a> a una
desnaturalizada,
(Eftink y Ghiron,

concentración de 0.3 M de oduro potásico la proteína no está
ya que en ese caso se debería observar una curvatura hacia arriba
1976>.

b> hay das poblaciones de triptófanos, accesibles y no accesibles al agente de

apagamiento. Es más, la población de fluoróforos accesibles al ioduro es homogénea,
ya que cuando los datos obtenidos se representan siguiendo la ecuación de
Stern-Volmer modificada se obtiene una línea recta <Hg. 19> <Lebrer, 1971>.

Figura 19. Representación de Stern-Volmer modificada para la desactivación por ioduro potásico
de las proteínas pUC/rp26 (e), pKK/rp26 (O). A partir de los espectros de emisión de
fluorescencia para una excitación de 295 nm de pUC/rp26, pKK/rp26 se obtienen los valores de
intensidad de fluorescencia en el máximo de emisión. El valor de F0 se determina con una muestra
control a la que se añade Nací, según se describe en Métodos Expeámenta/es.

-69-



Resultados y Discusión

En la Figura 19 se recoge la representación de Stern-Volmer modificada para
la desactivación por ioduro potásico de las proteínas pUC/rp26 y pKK/rp26. A partir

de esta representación se calcula la fracción de residuos accesibles al agente
desactivador así como la constante de desactivación. Esta constante permite calcular
la facilidad para producir la desactivación de la fluorescencia, ya que el inverso de su
valor representa la concentración de agente de desactivación necesaria para reducir

un 50% la intensidad de fluorescencia. Así, cuanto menor sea el valor de K más difícil
será desactivar la fluorescencia y, por tanto, más internos deberán encontrarse los

fluor-óforos de la proteína. Estos valores aparecen en la Tabla VI.

K <lvi’)

pUC/rp26

pKK/rp26

_______________________

0.73 ±0.03

0.88 ± 0.05

5.5 ±1.0

5.4 ±0.9

Tabla VI. Parámetros de fluorescencia para la desactivación por joduro potásico de pUC/rp26 y
pKK/rp26. ~a, fracción de fluoróforos accesibles al agente de apagamiento; K, constante de
apagamiento obtenida a partir de la ecuación de Stern-Volmer modificada.

En la proteína pUC/rp26 el 73% de los triptófanos son accesibles al 1K, estando
el resto en el interior de la estructura tridimensional. Cuando se forma el puente
disulfuro en pKK/rp26 se produce un cambio conformacional que hace que aumente
significativamente el número de Trp accesibles al ioduro. El valor de la constante no
varía prácticamente de una proteína a otra. Además, este valor de 5.5 M<nos indica
que los Trp accesibles no están en la superficie, ya que el valor de la constante de
apagamiento de N-acetil-triptofanamida es de 17.5 M< <Eftink y Ghiron, 1976).

Otro de los parámetros estructurales empleados para comparar ambas proteínas
es la temperatura de desnaturalización térmica, determinada a partir de la variación
de la elipticidad a 208 nm con la temperatura (Fig. 20>. Estas curvas de

desnaturalización térmica se han medido siguiendo la variación continua de 0208 al
aumentar la temperatura a una velocidad de 30 0C/hora. Como se puede observar,
la proteína pKK/rp26, y a pesar de poseer una estructura más abierta en términos de
la fracción de residuos accesibles al 1K, posee una temperatura de desnaturalización
térmica ligeramente mayor que la de la proteína pUC/rp26 <55 0C y 53.8 0C
respectivamente>. Teniendo en cuenta que el cambio conformacional inducido por la

formación del puente disulfuro provoca un aumento en el porcentaje de lámina 13,
podría ser ésta la responsable de la ligera mayor estabilización de la estructura

tridimensional.

-70-



Resultados y Discusión

Figura 20. Curvas de desnaturalización térmica de las proteínas pUCIrp26 (A) y pKK/rp26 (6).
La elipticidad a 208 nm se midió de forma continua y se la temperatura se incrernentó a una
velocidad de 30 0C/hora. La concentración de la proteína empleada estuvo entre 0.1-0.2 mg/ml
y en todos los casos se empleó un tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7.0. En cada caso se indica
el valor de la Tm y la desviación estándar correspondiente.

REDUCCIÓN Y CARBOXIAMIOMETILACIÓN IDE EIAV-rp26

Con el objeto de determinar las características estructurales que tiene la
proteína cuando los tres residuos de cisteina son incapaces de formar puentes
disulfuros tanto intra- como intercatenarios, se modificaron los grupos SH con
odoacetamida después de que la proteína se hubiese reducido con DTT. El análisis
de aminoácidos de la proteína reducida y carboxiamidometilada pone de manifiesto

que las tres cisteinas se encuentran modificadas, pues se obtienen tres residuos de

carboximetilcisteinas por molécula de proteína. Aunque los resultados que se
presentan a continuación son los obtenidos con pUC/rp26, con la proteína pKK/rp26
se obtuvieron resultados similares.

El espectro de dicroísmo circular en el UV lejano de la proteína reducida y
carboxiamidometilada (rp26 CAM) se representa en la Figura 21, comparado con el
de la proteína pUC/rp26. Tanto la forma del espectro como el valor de la elipticidad

a 208 nm son prácticamente idénticos (-20250 para rp26 CAM frente a los -21400

-5 -5

oE t.
o CC

o -lo 8-
~-15 xo

2
o ‘o

a
~-20 2o

-15

30 40 50 50 30 40 50 80

Temperatura (tc)

-71-



Resultados y Discusión

de la proteína nativa), por lo que parece que la modificación de los grupos SH de la
proteína no supone prácticamente alteración de la estructura secundaria. Sin

embargo, los valores de la temperatura de transición térmica sí que son diferentes,
ya que para la proteína nativa se obtiene un valor de 53.8 0C mientras que para la
proteína reducida y carboxiamidometilada la temperatura de transición es de 48.3 0C
(Fig. 22). Además, el proceso de desnaturalización térmica en el caso de la proteína

rp26 CAM es menos cooperativo que el de la proteína nativa. La introducción del
grupo carboxiamidometilo, voluminoso, hace que sea más fácil desnaturalizar

térmicamente la proteína, a pesar de que la modificación química no altera
prácticamente la estructura global.

Figura 21. Espectros de dicroísmo de las proteínas pUC/rp26 (e) y rp26 CAM (•).

La concentración de proteína empleada estuvo entre 0.1-0.2 mg/ml.

40

o 30
E~0

x
N

E 20
(5

o
ca 10
O)

Co

o
st

-lo

0

-20

190 200 210 220 230 240 250

Longitud de onda (nm)

-72-



Resultados y Discusión

Figura 22. Curvas de desnaturalización térmica de las proteínas pUC/rp26 (A), rp2G CAIVI (E).
rp26 OXO (CI y rp26 REO (O). En todos los casos la proteína utilizada fue pUC/rp26. La
elipticidad a 208 nm se midió de forma continua y se la temperatura se incrementó a una
velocidad de 30 0C¡hora. La concentración de la proteína empleada estuvo entre 0.1-0.2 mg/ml
yen todos los casos se empleó un tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7.0. En cada caso se indica
el valor de la Tm y la desviación estándar correspondiente.

En la Figura 23 se encuentran representados los espectros de emisión de
fluorescencia de las proteínas nativa y carboxiamidometilada excitando a 275 y 295
nm. Como se observa, el máximo de emisión <324 nm> a las dos longitudes de onda

de excitación no varía como consecuencia de la alquilación. En la proteína rp26 CAM
hay una pequeña disminución de la intensidad de fluorescencia, que podría ser
indicativo de una diferente estructuración tridimensional y, por tanto, de una mayor

exposición al disolvente de los residuos de Trp que implicaría una mayor
desactivación de la fluorescencia de estos residuos en rp26 CAM. Sin embargo, los
espectros no experimentan ningún desplazamiento en el máximo de emisión. En el

A

T,,, =53.8±1.0OC

Tr,~ =49.1±1.00c

E

T 483±o5’C

Tm =54.0±o.5’c

C

-e -12

-9

12 -16

E
-D -15
st -18

01

E -18
<-5
st
o -21 -21 ¡
yca
O)

~ -12o
1~

st
- 12 -15

0 15- -18

-18 -21

-24
30 40 50 60 30

Temperatura (0C)

40 50 60

-73-



Resultados y Discusión

caso de que los residuos de triptófano estuviesen más expuestos habría un
desplazamiento del máximo hacia mayores longitudes de onda. Por tanto, esta
diferencia de intensidad de fluorescencia podría ser debida a una diferencia en el valor
de la concentración de la proteína. En relación a la contribución de los residuos de

tirosina, ésta es muy pequeña en ambos casos, siendo ligeramente en el caso de la
proteína rp26 CAM.

5 40a
a>
o
ci,a,
030 30
Z

a,
-c 20 20
r
(a
r

~ 10 10
e

o o

Figura 23. Espectros de emisión de fluorescencia de las proteínas pUC/rp26 (A> y rp26 CAM (B>.
Espectro de emisión obtenidos con una longitud de excitación de 275 (—j y 295 nm 1----);
contribución de los residuos de tirosina al espectro de emisión e - - ->. Los espectros de emisión
excitando a 295 nm están normalizados. La concentración de proteína utilizada fue de 40-60
Mg/ml.

El efecto de la reducción y alquilación de los grupos SH se ha medido
determinando la desactivación de fluorescencia por 1K. En este caso la población de
Trp accesibles al ioduro también es homogénea, como lo indica el hecho de que la
representación de Stern-Volmer modificada es una línea recta <Fig. 24>. A partir de
esta representación se calcula la fracción de residuos accesibles al agente de
apagamiento, ~a’ y la constante de apagamiento, K, valores que se recogen en la
Tabla VII. El valor de ~a sólo es ligeramente mayor que el que se obtiene para la
proteína pUC/rp26. Sin embargo, es menor que el que se obtiene en el caso de
pKK/rp26. Como se ha indicado anteriormente los resultados obtenidos al reducir y
carboxiamidometilar los grupos SH tanto en pUC/rp26 como de pKK/rp26 son muy
similares. Por tanto, al romper el puente disulfuro presente en pKK/rp26 se obtiene
una estructura en la que los triptófanos poseen un grado de exposición semejante al
que poseen en la proteína pUC/rp26. En lo que a la constante de desactivación
respecta no se observa variación alguna como consecuencia de la modificación
química.

300 320 340 360 380 400 420 440 300 320 340 360 350 400 420 440

Longitud de onda (nm)

-74-



Resultados y Discusión

Figura 24. Representación de Stern-Volmer modificada para la desactivación por ¡oduro potásico
de las proteínas rp26 CAM (•). rp2G OXD <A) y rp26 RED (U>. A partir de los espectros de
emisión de fluorescencia para una excitación de 295 nm de rp2G CAM, rp2G OXD y rp26 RED
se obtienen los valores de intensidad de fluorescencia en el máximo de emisión. El valor de F0 se
determina con una muestra control a la que se añade NaCí, según se describe en Métodos
Experimentales.

PROTEiNA K <M
1)

rp26 CAM

rp26 RED

rp26 OXD

0.77 ±0.11

0.64 ±0.10

0.89 ±0.11

5.8 ±ES

6.6 ±1.0

5.3 ±1.7

Tabla VII. Parámetros de fluorescencia para la desactivación por ioduro potásico para las
proteínas rp2G CAM, rp26 RED y rp26 OXO. f

8, fracción de residuos fluoróforos
accesibles al agente de apagamiento; K, constante de apagamiento obtenida a partir de
la ecuación de Stern-Volmer modificada.

F0/,íxF
5

4

3

1/[~] (M
1)

2

1

0 2 4 6 8 10 12 14

-75-



Resultados y Discusión

REDUCCIÓN Y OXIDACIÓN DE EIAV-rp26

A la vista de los resultados obtenidos con las proteínas pUC/rp26 y pKK/rp26
y con la proteína rp26 CAM, parece claro que el estado en el que se encuentren los
grupos SH en la molécula de proteína tiene mucha importancia en la estructura que
adopte EIAV-rp26. Por ello se procedió a estudiar la estructura cuando estos grupos
sulfhidrilo se encuentran en diferente estado de oxidación. Para ello, la proteína
pUC/rp26 nativa se redujo con DTT y se oxidó con CuSO4, midiéndose diferentes
parámetros estructurales de la proteína reducida <rp26 RED> y oxidada (rp26 OXD>.
Los datos que se presentan para rp26 RED son los obtenidos tanto con pUC/rp26
como con pKK/rp26. Sin embargo, los de rp26 OXO son sólo los que se obtienen con
pUC/rp26 puesto que en pKK/rp26 ya se encuentran parcialmente oxidados los
grupos sulfhidrilos.

La proteína reducida debería tener unas características semejantes, en cuanto
a su estructura, a las de la proteína pUC/rp26 puesto que esta proteína se encuentra
con parte de sus tres grupos tiólicos libres sin formar ningún puente disulfuro <2.0-2.6
SH libres/molécula de proteína>. Cuando la proteína se reduce con DTT y se mide su
espectro de CD en el UV lejano en ausencia de agente reductor se obtienen los
resultados que aparecen en la Figura 25. El exceso de DTT de la disolución se eliminó
pasando la muestra a través de una columna PD-1 O e inmediatamente se midió su
espectro de dicroísmo, para evitar que la proteína se oxidara por la acción del oxígeno
atmosférico. EJ valor de elipticidad a 208 nm disminuye significativamente respecto
del de la proteína original <-21440 grados x cm

2 x dmor1 para la proteína sin reducir
y -23970 grados x cm2 x dmol1 para la proteína reducida). Mayor es la diferencia
cuando se compara el espectro de CD de la proteína reducida con el de pKK/rp26
<Hg. 18). El valor de 0208 para esta proteína es de -14940 grados x cm2 x dmor1, por
lo que la reducción del puente disulfuro supone una disminución muy considerable,
1 .6 veces, del valor de elipticidad. El espectro de la proteína oxidada con CuSO

4 es
similar en forma al obtenido para la proteína sin reducir aunque la elipticidad a 208
nm es algo más baja, -19730 grados x cm

2 x dmor1. Para estas muestras se
determinó el número de SH libres mediante reacción con DTNB, obteniéndose 2.7
grupos SH/molécula para la proteína reducida en ausencia de DTT y 0.8 para la
proteína oxidada. Incluso después de reducir con DTT no llegan a observarse los tres
grupos SH. Teniendo en cuenta que en preparaciones reducidas no se observan
dímeros, el 85% de las moléculas deben tener todas las cisteinas reducidas y el 15%
restante debe tener un puente disulfuro intramolecular. El CuSO

4 actúa favoreciendo
la oxidación de los grupos SH libres de una proteína mediante la formación de puentes
disulfuros tanto intramoleculares como intermoleculares, éstos últimos originarían la

-76-



Resultados y Discusión

aparición de dimeros. Por ello, es importante determinar el tipo de interacciones que
se han producido por la oxidación de EIAV-rp26. Para ello, la proteína oxidada se
sometió a un análisis por PAGE-SDS en condiciones no reductoras, densitometrando
el gel teñido. Se observa que hay un aumento en la proporción de dímeros al tratar
la proteína con CuSO4, (20-30% de dímeros frente a 5-10% en la proteína sin
reducir), aunque el monómero sigue siendo la forma mayoritaria en la proteína
oxidada. Como el número de grupos tiólicos libres de la proteína oxidada es de 0.8
y el 70% de la proteína es monomérica, con un grupo SH libre y un puente disulfuro
intramolecular, los dimeros que se observan en la proteína oxidada con CuSO4 deben
tener prácticamente todas las cisteinas oxidadas, a diferencia de los dimeros que se
observan en el resto de preparaciones en los que podría ocurrir que sólo una cisteina
de cada molécula implicada en el dímero se encontrase oxidada.

Figura 25. Espectros de dicroísmo circular de las proteínas rp2G RED (U> y rp2O OXD (A>.
La concentración de proteína empleada estuvo entre 0.1-0.2 mg/ml.

A la vista de estos resultados parece claro que existe una relación entre el
número de grupos 51-4 libres y el espectro de CD. A partir del espectro de la

muestra reducida, con 2.7 SH libres, y de la composición de formas reducida y
oxidada que posee esta muestra, si suponemos que la forma monomérica oxidada
coincide con pKK/rp26, se podría determinar el espectro teórico de la muestra

40

t 30
E
0

20o

o 10
(a

o

,

t o

~ -10
0

-20

190 200 210 220 230 240 250

Longitud de onda (nm)

-77-



Resultados y Discusión

totalmente reducida. Así, la elipticidad a 208 nm para esta forma reducida con 3
grupos SH libres seria -25560 grados x cm2 x dmor1- Considerando ésta y la forma
pKK/rp26 como estructuras extremas se podría determinar la elipticidad de
cualquier forma intermedia. Por ejemplo, la proteína pUC/rp26, que posee 2.2
SH/molécLJla, con los porcentajes de formas monomérica oxidada y reducida y
formas diméricas señaladas anteriormente, 35-37%, 55-58% y 5-10%
respectivamente, tendría un valor de 0208 de -21600 a -21800 grados x cm2 x
dmol<’, valor próximo al experimental que es de -21440 grados x cm2 x dmol 1

Teniendo en cuenta los resultados de los ajustes de los espectros por el método
CCA, el cambio conformacional inducido por la formación del puente dísulfuro en
la proteína en su forma monomérica puede llevar consigo un aumento en la
proporción de lámina ¡3. En este sentido apunta la existencia de un punto
isodicrólco a 200 nm que se observa en la Figura 25. El espectro de rp26 OXD
debería ser similar en magnitud al de pKK/rp26 puesto que tienen un contenido
similar en grupos SH. La diferencia entre ambas formas radica en la diferente
proporción de dímeros, 30% en rp26 OXO, y pudiera ser ésta la responsable de la

diferencia observada en los espectros de CD.

Los espectros de emisión de fluorescencia de la proteína reducida y oxidada
(datos no mostrados>, excitando a 275 nm, no presentan ninguna variación ni en
la longitud de onda del máximo de emisión, ni en el valor de la intensidad en el
máximo. Éste sigue centrado a 324 nm. Sin embargo, sí se observan diferencia
cuando se llevan a cabo estudios de desactivación de fluorescencia por joduro
potásico. Las representaciones de la ecuación de Stern-Volmer modificada para
estas proteínas aparecen en la Figura 24. A partir de estas rectas se calculan la
fracción de residuos accesible al agente de desactivación y la constante de
desactivación, que se recogen en la Tabla VII. Se observa que la reducción de la
proteína EIAV-rp26 supone una disminución en el valor de ~ Como consecuencia
de la reducción parte de los residuos de Trp pasan a ocupar una localización más
interna, menos accesibles al agente de desactivación. Sin embargo, al oxidar la
proteína parte de los residuos que antes no eran accesibles pasan a serlo. El valor
de ~a de la proteína oxidada, 0.89, coincide con el de pKK/rp26, 0.88, que posee
un valor similar de grupos SH libres. El valor de la constante de desactivación no
varia prácticamente como consecuencia de la oxidación o la reducción. Si estos
resultados los relacionamos con el número de grupos sulfhidrilo libres en la
proteína, podemos observar que al aumentar el número de grupos SH libres se
produce una disminución en la fracción de residuos accesibles al ioduro, pues se
pasa de 0.64 para la proteína rp26 RED (2.7 SH libres> a 0.73 para pUC/rp2E (con
2.2 SH libres) y a 0.89 para rp26 OXID <0.8 SH libres). Esto supondría una mayor

-78-



Resultados y Discusión

estructuración de la proteína como consecuencia del aumento de grupos tiólicos
libres en la proteína. De nuevo se comprueba que el estado de oxidación en el que
se encuentran los residuos de cisteina en la proteína es importante en el
mantenimiento de la estructura tridimensional de la proteína.

Por último, se han utilizado las curvas de desnaturalización térmica de las

proteínas reducida y oxidada, obtenidas midiendo la elipticidad a 208 nm de forma
continua al aumentar la temperatura, para determinar el efecto del estado de
oxidación de los grupos SH en la estabilidad térmica de la estructura tridimensional
<Figura 22>. El proceso de desnaturalización térmica es cooperativo, aunque para

la proteína rp26 OXD esta cooperatividad es menor. Los valores de la temperatura
de transición térmica varian según sea el estado de oxidación de los grupos tiólicos
de la proteína. Como puede observarse la proteína reducida tiene una Tm

<54 ± 0.5 0C> muy similar a la de la proteína sin reducir <53.8 ± 1 .0 0C >. Sin
embargo, la oxidación de la proteína produce una disminución en la temperatura
de transición que pasa a ser de 49.1 ± 1.0. Es decir, la proteína se vuelve menos
estable térmicamente como consecuencia de la formación tanto de formas
diméricas como de un puente disulfuro intramolecular. La Tm de la proteína oxidada
<49.1 ±1.00C> es muy parecida a la de la proteína reducida y carboxiamidometilada
<48.3 ± 0.5 0C>, pero diferente a la de pKK/rp26 (55 ± 0.2 0C>, a pesar de tener

un contenido de grupos SH libres similar. Esta diferente facilidad para
desnaturalizar las proteínas pKK/rp26 y rp26 OXD será el reflejo de la diferente

estructura tridimensional que indican sus espectros de dicroísmo circular.

ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA MUTANTE rp26-C485

Empleando las mismas técnicas que las utilizadas para donar EIAV-rp26, se
ha donado el gen que codifica la proteína p26, cambiando el residuo de cisteina
de la posición 48 por un residuo de serma, en el vector de expresión pUCí 8N. A
esta proteína mutada la denominaremos rp2E-C48S. El residuo cambiado
corresponde a la cisteina que no se conserva en el resto de las proteínas
lentivirales, esto es, aquella que se ha descrito que no forma un puente disulfuro
intracatenario. Con el cambio de cisteina por serma se pretende influir lo menos
posible en el entorno tridimensional de la proteína. El residuo elegido posee
propiedades semejantes a la cisteina, pero sin la característica de poder formar
puentes disulfuros. La expresión en E. colí y la purificación de la proteína se ha
llevado a cabo empleando los protocolos utilizados para la proteína salvaje.

-79-



Resultados y Discusión

La mutación introducida se comprueba mediante secuenciación automática
del DNA que codifica rp26-C485. Además, por análisis de aminoácidos de la
proteína reducida y carboxiamidometilada se comprueba que hay un aumento del

número de residuos de serma en una unidad y una disminución en el número de
carboximetilcisteinas. Mediante PAGE-SDS se comprueba que el grado de pureza
de esta proteína es superior al 95%.

La reacción de la proteína rp26-C485 con DTNB indica que hay 1 .6 grupos
tiólicos libres. Si, como se ha descrito para otras proteínas de las cápsidas
lentivirales, las dos cisteinas que se conservan en la secuencia de la proteína se
encontrasen formando un puente disulfuro, el número de grupos SH libres de la
proteína mutante seria cero. Sin embargo, el resultado obtenido indica que el 80%
de las moléculas poseen los dos residuos de cisteina libres, sin formar ningún
puente disulfuro. Además el análisis de la proteína por PAGE-SDS en condiciones
no reductoras indica que el 20% restante de moléculas poseen un puente disulfuro
intracatenario puesto que no se observa la aparición de formas diméricas. Esta
proteína mutante sería, por tanto, similar a la pUC/rp26 en cuanto que las dos
poseen la mayor parte de sus cisteinas en forma libre.

Puede ocurrir que la mutación introducida en EIAV-rp26 origine un cambio
sustancial en la estructura tridimensional de la proteína, de manera que las dos
cisteinas queden tan lejos en el espacio que no puedan interaccionar entre sí y no
se forme el puente disulfuro. Para comprobar este aspecto, se han determinado
distintos parámetros estructurales de la proteína mutante y compararla con la
proteína original.

El espectro de CD de la proteína mutante en el UV lejano se recoge en la
Figura 26. Como puede observarse, la proteína rp26-C48S sigue presentando un
espectro con dos mínimos a 208 y 220 nm y una forma idéntica a la de la proteína
original. De la misma forma, ambas proteínas poseen un valor de elipticidad a 208
nm muy parecido (-21440 y -20650 grados x cm2 x dmol>’ para la proteína original
y mutante, respectivamente>. Por lo tanto, en relación a la estructura secundaria
de la proteína, la mutación introducida en rp26-C48S no la afecta
significativamente. El espectro de CD en el próximo indica una estructuración
tridimensional muy parecida a la de la proteína pUC/rp26 <Fig. 26).

-80-



Resultados y Discusión

Figura 26. (A) Espectros de CD en el UV lejano de la proteína mutante rp26-C48S IV). rp26-c48S
OXD (A) y rp2S-048S RED (Li) Y (B) en el UV próxima de la pr oteina rp26-C48S (81.
La concentración de la proteína empleada fue de 0.1-0.2 mg/ml para el UV lejano y 1 mg/ml para
el UV próximo.

En cuanto a la estabilidad térmica de la proteína, las curvas de
desnaturalización indican que la temperatura de transición de la proteína mutante es
ligeramente más baja que la de la proteína salvaje (53.8 0C para pUC/rp26 salvaje y
52.9 0C para rp26-C48S> <Tabla VII>. Por lo tanto, el cambio de cisteina por serma
afectar de manera poco significativa a la estabilidad térmica de EIAV-rp26. La

variación en la Ti,, podría deberse a cambios en las interacciones entre residuos que
se encuentran cercanos a la cisteina en la estructura tridimensional, pero no a un
cambio en la estructura global. Al fin y al cabo, se cambia un residuo que posee un
grupo SH por otro que tiene un grupo hidroxilo, que forma más fácilmente puentes
de hidrógeno con otros grupos cercanos.

Los espectros de emisión de fluorescencia, excitando a 275 y 295 nm de la
proteína mutante se representan en la Figura 27. El máximo de emisión, excitando a
275 nm, aparece a 324 nm, valor que coincide con el obtenido para la proteína
EIAV-rp26 {Fig. 231. Cuando se utiliza una longitud de onda de excitación de 295 nm,
el máximo aparece a 325 nm, prácticamente coincidente con el máximo del espectro

20
—40

r or
x

E
o 20 CC
X -20 ~
O aoi! 10
o,

—40 2
‘ux

a

-69 2tc-l0 O

-20

ia~ 209 210 220 230 249 250 250 269 270 280 ~: 339 310 320 332

Longitud de onda (nm)

-81-



Resultados y Discusión

medido a 275 nm. Para la proteína mutante la contribución de los residuos de tirosina
al espectro de emisión es pequeña, alrededor de un 13%, como ocurre en la proteína
EIAV-rp26 (Fig. 23>.

Figura 27. Espectros de emisión de fluorescencia de rp26-C48S. Espectros de emisión medidos
con una longitud de onda de excitación de 275 ( ) y 296 nm normalizado (- - -

contribución de los residuos de tirosina al espectro de emisión ( ), determinada como la
diferencia entre los dos anteriores.

Con objeto de determinar el papel que juega el estado de oxidación de los
residuos de cisteina de la proteína mutante, ésta se redujo con DTT y se oxidó con
CuSO4, estudiándose los mismos parámetros estructurales que en la proteína original.

El número de grupos sulfhidrilo libres de la proteína oxidada con sulfato de
cobre valorada con DTNB, es cero. Para comprobar si el puente disulfuro se forma
dentro de la cadena polipeptidica o bien entre diferentes moléculas de la proteína
mutante, dicha proteína se sometió a un análisis de PAGE-SDS <datos no mostrados>.

No se observa la formación de dímeros, por lo que la ausencia de grupos SH libres en
la proteína se debe íntegramente a la formación de un puente disulfuro intracatenario.
El número de grupos SH libres aumenta ligeramente cuando la proteína se reduce con
DTT, pasando de 1.6 a 1 .7. Este número indica que el 85% de las moléculas están
reducidas y el 1 5% restante poseen un puente disulfuro intramolecular puesto que no
se detecta la formación de dimeros. Esta preparación de proteína mutante reducida

tiene un contenido en grupos SH comparable a la proteína EIAV-rp26 reducida , en
la que también el 85% de las moléculas están totalmente reducidas.

0

a 40
a,
o
u,
o,
1.-o 30

a,
~ 20

0~05
a
a, 10
t
o

o
300 320 340 360 380 400 420 440

Longitud de onda (nm)

-82-



Resultados y Discusión

El espectro de CD en el ultravioleta lejano de la proteína rp26-C48S oxidada
<Figura 26) indica un aumento en valor absoluto en la elipticidad a 208 nm cuando se
compara con la proteína mutante nativa, aunque la forma del espectro sigue siendo
la misma. De un valor de -20650 se pasa a -18600 grados x cm2 x dmor1. Por el

contrario, la reducción con DTT origina una disminución en el valor de la elipticídad
a 208 nm <-21700 grados x cm2 x dmolt. Por lo tanto, los resultados de dicroísmo
circular de la proteína mutante son comparables a los que se obtienen con la proteína
pUC/rp26. Conforme aumenta el número de grupos tiólicos libres aumenta, en valor
absoluto, el valor de la elipticidad a 208 nm de la proteína, siendo máximo en el caso
de la proteína reducida donde el número de grupos SH libre de la proteína es de 1.7.
Los porcentajes de variación entre las diferentes formas de las dos proteínas son
semejantes. Cuando se oxidan los grupos SH hay un aumento del 8-10% en el valor
de 0208 en las dos proteínas. Cuando se reducen hay una disminución del 12% en el
valor de 0208 de pUC/rp26 y del 5% en rp26-C485, donde aumenta de 1.6 a 1 .7. Para
todas estas formas protéicas se midieron las curvas de desnaturalización térmica y
de ellas se obtuvieron las temperaturas de transición obtenidas que aparecen en la
Tabla VIII. Las diferencias entre las Tm de las diferentes formas son poco
significativas. Se produce una ligerísima inestabilización de la proteína como
consecuencia de su reducción, ya que la temperatura de transición es algo más baja
en el caso de la proteína reducida con DTT que en el caso de la proteína nativa. Sin
embargo la temperatura a la que se desnaturaliza la proteína oxidada es igual a la de
la proteína nativa. En el caso de pUC/rp26 se produce una inestabilización
considerable como consecuencia de la oxidación, aunque la proteína pKK/rp26 con
un contenido en grupos SH libres semejante al de la proteína oxidada posee una Tm

ligeramente mayor que la forma reducida.

rp26-C48S rp26-C48S RED rp26-C48S OXD

T <0C) 52.9 ±0.7 52.0 ±0.2 52.8 ±1.0

Tabla VIII. Temperaturas de desnaturalización térmica de la proteína mutante rp26-C48S y las
proteínas modificadas rp26-C48S RED y rp2G-C4SS OXO. La elipticidad a 208 nm se midió de
forma continua y se la temperatura se incrementé a una velocidad de 30 0C/hora. La concentración
de la proteína empleada estuvo entre 0.1-0.2 mg/ml y en todos los casos se empleó un tampón
fosfato sódico 10 mM, pH 7.0. En cada caso se indica el valor de la Tm y la desviación estándar
correspondiente.

-83-



Resultados y Discusión

En la Figura 28 aparecen los espectros de emisión de fluorescencia de la
proteína mutante en sus formas oxidadas y reducidas. A la vista de estos espectros

y comparándolos con los de la proteína mutante nativa (Fig. 27), no parece que haya
ningún cambio significativo en el entorno en el que se encuentran los residuos de
triptófano de la proteína mutante como consecuencia del cambio en el número de
grupos SH libres; el máximo de emisión del espectro medido tanto con una longitud
de onda de excitación de 275 nm como de 295 nm, coincide en todos los casos. La
contribución de los cuatro residuos de tirosina al espectro de fluorescencia disminuye
ligeramente como consecuencia de la reducción, que podría ser consecuencia de un
mayor acercamiento entre los residuos de Tyr y Trp, que hiciese que el proceso de
transferencia de energía fuese mayor. En el caso de la proteína oxidada la
contribución es comparable a la que se determina en el caso de la proteína nativa.

Figura 28. Espectros de emisión de fluorescencia de las proteínas rp2O-C4SS OXD (A) y rp26-
C4SS RED (B). (—) Espectro de emisión obtenido con una longitud de excitación de 275 nm;

1 espectro de emisión normalizado obtenido con una longitud de onda de excitación de
295 nm y ( ) contribución de los residuos de tirosina al espectro de emisión de rp26
calculado a partir de los dos espectros anteriores.

Los posibles cambios en la estructura tridimensional producidos como

consecuencia de la mutación C4BS y de la variación del estado de oxidación de las
cisteinas de la proteína mutante se ha seguido también mediante estudios de
desactivación de fluorescencia con oduro potásico. En todos los casos, la
representación de Stern-Volmer modificada es una línea recta, lo que indica el
carácter homogéneo de la población de Trp accesibles al agente de desactivación. Los
parámetros obtenidos se recogen en la Tabla IX. El valor de la fracción de Trp
accesibles al 1K es menor que el que se obtiene en el caso de pUC/rp26 (Tabla VI).
Sin embargo, y como indican los máximos de los espectros de fluorescencia <Fig. 27>,

estos residuos de triptófano ocupan una localización con un grado de polaridad
semejante. la diferencia entre los valores de ~a de la proteína mutante nativa y de

-84-



Resultados y Discusión

pUC/rp26 reducida <Tabla VII> es considerablemente menor y estas dos preparaciones
poseen un contenido en grupos SH semejante (85% de forma totalmente reducida en
el caso de pUC/rp26 y 80% en rp26-C48S). El aumento de 1.6 a 1.7 SH
libres/molécula, consecuencia de la reducción de la forma mutante, no origina una
variación en el valor de ~a• Por el contrario, la oxidación provoca que
aproximadamente, el 50% de los Trp accesibles al 1K en la forma nativa pasan a serlo
cuando se forma el puente disulfuro intracatenario de la proteína mutante (f8= 0.78>.
Estos Trp siguen ocupando una localización interna, el máximo de emisión está
centrado a alrededor de 324 nm, y como indica el valor de la constante de
desactivación, que no varía significativamente de una forma a otra, son fluoróforos
difíciles de desactivar. Los resultados obtenidos con la forma mutante rp26-C485
indican que, al igual que ocurre en el caso de pUC/rp26, las otras dos cisteinas,
Cysl 98 y Cys2l 8, no se encuentran formando un puente disulfuro en la proteína
purificada. Además, cuando se forma el puente disulfuro intracatenario mediante
oxidación con CuSO4 tiene lugar un cambio conformacional que se traduce en una
modificación del espectro de CD en el UV lejano (Fig. 26>, compatible, como ocurre
en el caso de EIAV-rp26, con una transformación de hélice a a lámina 13, y en un
aumento del número de residuos de triptófano accesibles a la desactivación por 1K.

PROTEiNA K<M
1)

rp26-048S

rp26-C48S OXD

rp26-C48S RED

0.56 ±0.07

0.78 ±0.03

0.53 ±0.08

5.9 ±0.5

4.1 ±1.5

6.0 ±1.6

Tabla IX. Parámetros de fluorescencia para la desactivacián por oduro potásico de las proteinas
rp2G-C4SS, rp26-C4SS OXO y rp26-C48S RED. f

0, fracción de residuos fluoróforos accesibles al
agente de apagamiento; 1<, constante de apagamiento obtenida a partir de la ecuación de
Stern-Volmer modificada.

Es bien conocido que el grupo tiólico de la cadena lateral de los residuos de
cisteina es uno de los más reactivos de los que aparecen en las cadenas laterales de
los aminoácidos naturales. Ya sea como grupo sulfhidrilo libre, ionizado como grupo
tiolato u oxidado en forma de enlace disulfuro, tioéter o tioéster, los residuos de
cisteina juegan un papel fundamental en las propiedades estructurales y funcionales
de las proteínas globulares (Doig y Williams, 1991; Creighton, 1992>. Normalmente,
desde un punto de vista estructural, las cisteinas forman puentes disulfuros que
estabilizan la estructura terciaria de un gran número de proteínas. Debido a la
inestabilidad relativa de los grupos tiólicos libres, en comparación con su forma

-85-



Resultados y Discusión

oxidada en presencia de oxígeno, los residuos de cisteina de las proteínas
extracelulares generalmente aparecen formando puentes disulfuro, siendo ésta una
de las modificaciones post-traduccionales más frecuentes, mientras que las proteínas
intracelulares presentan normalmente grupos tiólicos libres <Fahey et aL, 1977).
Además, es frecuente que en una proteína todos sus residuos de cisteína se
encuentren en el mismo estado de oxidación, siendo raro encontrar a la vez puentes
disulfuro y grupos tiólicos libres.

La formación de los puentes disulfuro requiere un entorno oxidante. En el caso
de E. col!, sistema empleado en la expresión de las proteínas estudiadas, los puentes
disulfuro se forman, generalmente, en proteínas extracitoplasmáticas, siendo más raro

en proteínas citoplasmáticas <Schultz y Schirmer, 1979; Thornton, 1981). Se ha

sugerido que el entorno redox del citoplasma es tan reductor que impide la formación
de los puentes disulfuro (Ziegler y Poulsen, 1977; Gilbert, 1990>. Como ocurre en las
células eucariotas, el principal sistema redox en el citoplasma de E. coli es el
glutation. E. coil contiene altos niveles de glutation (la concentración intracelular es
5 mM> que se mantiene prácticamente reducido <Kosower y Kosovver, 1978). La
relación de glutation reducido a oxidado varia entre 50:1 y 200:1 (Hwang et aL,
1992). Similares condiciones in vitro no permiten la formación de puentes disulfuro
en proteínas (Lyles y Gilbert, 1991; Hwang et al., 1992; Walker y Gilbert, 1994). De
hecho, cuando muchas proteínas que son exportadas fuera del citoplasma y que
forman puentes disulfuro, son expresadas en el citoplasma, no se forman los puentes
disulfuro. Esto ocurre con la ¡3-lactamasa, que es dirigida al periplasma por una
secuencia señal. Sin embargo, cuando el precursor de la proteína se acumula en el
citoplasma por inhibición de la secreción, el puente disulfuro no se forma (Pollit y
Zalkin, 1983). Otro ejemplo se encuentra en la fosfatasa alcalina, donde todas sus
cisteinas se encuentran reducidas durante largo tiempo cuando esta proteína es
expresada en el citoplasma. Sin embargo, cuando se permite la secreción de la
proteína al periplasma, la oxidación de los residuos de cisteina es inmediata <Derman
y Beckwith, 1991>. Son muy pocas las proteínas citoplasmáticas que pueden formar
puentes disulfuro estables en el citoplasma (Schultz y Schirmer, 1979). Una de las
excepciones se da con el inhibidor de la tripsina pancreática bovina <BPTI>, en el que
el plegamiento y la formación de los puentes disulfuro de la proteína bloquean su
secreción al periplasma <Nilsson et al., 1991>. Sin embargo, el caso del EPTI es
bastante raro porque es capaz de plegarse a su conformación nativa partir de un
estado reducido en condiciones redox similares a las que existen intracelularmente
<Harisch et al., 1979; Creighton y Goldenberg, 1984>.

-86-



Resultados y Discusión

La diferencia en el número de grupos SH libres de las proteínas obtenidas con
los dos plásmidos de expresión podría ser debida a la diferente localización de ambas-
Así, la proteína pUC¡rp26 se expresaría intracelularmente mientras que la proteína
pKK/rp26 seria exportada al periplasma de la célula. Es como si en el plásmido
pKK233-3N hubiera alguna secuencia señal que permitiera la secreción de la proteína.
El protocolo de purificación empleado es el mismo, sea cual sea el plásmido de
expresión empleado, por lo que no puede distinguir entre proteína intracelular y
periplásmica. Sin embargo, cuando se aplica un protocolo de purificación de fracción
de periplasma se comprueba que, independientemente del plásmido utilizado, la mayor
parte de la proteína se expresa intracelularmente. Por ello, el hecho de que en las
preparaciones de proteína pKK/rp26 posean 1 grupo tiólico libre podría indicar que la
proteína se puede oxidar durante el proceso de purificación ya que, al tratarse de una
proteína intracelular, debería tener todos sus grupos sulfhidrilos totalmente reducidos
por el entorno reductor en el que se encuentra.

Los puentes disulfuro juegan un papel importante en el mantenimiento de la
estructura nativa de un gran número de proteínas. Una posible explicación de la
contribución de los puentes disulfuro a la estabilidad de las proteínas residía en el
incremento de la energía libre de la forma desnaturalizada por una disminución de la

entropía <Cooper et al., 1992). Sin embargo, los detalles termodinámicos del aumento
de la estabilidad parecen ser más complejos e implican tanto efectos entrópicos como
entálpicos. Así, hay otros modelos (Doig y Williams, 1991; Kuroki etal., 1992; Tidor
y Karplus, 1 993) que sugieren que el efecto dominante de los puentes disulfuro es
entálpico, disminuyendo la exposición de residuos hidrofóbicos al disolvente y
modificando puentes de hidrógeno estables en el estado desnaturalizado. Sea cual sea
el efecto, mediante técnicas de mutagénesis dirigida es posible crear puentes disulfuro
que, en general, estabilizan la estructura de una proteína <Betz y Pielak, 1992; Clarke
y Fersht, 1993; Hinck et al., 1996), aunque algunas veces la creación de este tipo
de enlace llega a desestabilizar la estructura de la proteína <Matsumura eta!., 1989).

Los estudios que se han llevado a cabo con la proteína EIAV-rp26 de EIAV
indican claramente que los residuos de cisteina juegan un papel muy importante en
el mantenimiento de la estructura de la proteína. Ésta se purifica en dos estados de
oxidación diferentes: con casi sus tres grupos sulfhidrilo reducidos <pUC/rp26> o con
dos de ellos oxidados formando un puente disulfuro (pKK/rp26>. Este puente disulfuro
no tiene un patrón único, ya que cuando se marca la cisteina libre con
‘4C-iodoacetamida se observa que las tres cisteinas están marcadas en,
aproximadamente, la misma proporción. La formación del puente disulfuro lleva
consigo cambios en la estructura secundaria y terciaria. El espectro de CD en el

-87-



Resultados y Discusión

ultravioleta lejano indica que al estar dos de los tres grupos SH oxidados se produce
un aumento en la proporción de lámina 13 y una disminución en la proporción de hélice
a. Además, el entorno de los residuos de triptófano cambia, haciéndose más

accesibles, como indican los estudios de desativación de fluorescencia con ioduro
potásico.

Cuando la proteína pUC/rp26 se oxida, formándose fundamentalmente un
puente disulfuro intramolecular, se origina una estructura que posee menor estabilidad
térmica y una mayor proporción de residuos de triptófano accesibles a la
desactivación por 1K. Por otro lado, la mutación de la cisteina en la posición 48 no
produce grandes cambios en la estructura de EIAV-rp26. Los resultados obtenidos
con la proteína mutante están en la misma línea que los obtenidos con la proteína
original, en el sentido de que el estado de oxidación en el que se encuentran los dos
grupos tiólicos determina la estructura de la proteína. Cuanto mayor es el número de
grupos SH libres mayor es el contenido en hélice a, menos accesibles a la
desactivación por 1K son los residuos de triptófano y más estable es la estructura, en
términos de desnaturalización térmica. Estos resultados no permiten decidir cuál de
las dos conformaciones de la proteína es realmente la nativa: la proteína con sus tres
grupos SH libres, pUC/rp26, o la proteína en la que hay un puente disulfuro formado,
pKK/rp26. La proteína rp24 de HIV-1, en la que se describe que hay un puente
disulfuro formado entre las dos cisteinas que se conservan en todos los lentivirus
(Hausdorf et al., 1994) se expresa de manera intracelular, por lo que, en principio,
debería tener sus grupos sulfhidrilo reducidos. Además, esta proteína recombinante
se aísla de cuerpos de inclusión, lo que supone que para solubilizarla sea necesario

tratarla con urea para, posteriormente, renaturalizarla mediante dilución. En el caso
de la tirosina quinasa LCK humana <Yasukawa et al., 1995), y comparando con la
proteína nativa obtenida en forma soluble mediante un sistema en el que se
coproduce con la tioredoxina de E. col!., se concluye que sólo una pequeña
proporción de la proteína solubilizada a partir de urea tiene la conformación nativa.
Algo parecido podría entonces ocurrir con rp24 de HIV-1, de manera que el puente
disulfuro seria un artefacto del proceso de renaturalización. La falta de actividad
enzimática de estas proteínas hace más difícil distinguir la estructura nativa. Una
posibilidad consistiría en donar la proteína en algún plásmido que incluya una
secuencia señal que permita comprobar que realmente la proteína que es exportada
al periplasma tiene un puente disulfuro formado.

-88-



Resultados y Discusión

Como se conoce la estructura tridimensional de los dos posibles dominios de
la proteína rp24 de HIV determinada tanto cristalográficamente <Momany etaL, 1996;
Gamble et al., 1997>. como por RMN (Gitti et al., 1996>, se puede ver cuál es la
posición que ocupan los residuos de cisteina. En el caso de los residuos conservados
del extremo carboxilo-terminal de la proteína rp24, la cisteina de la posición 198 se
encuentra situada en un hélice a de corto tamaño y la cisteina 218 está en una zona
de la proteína que no presenta estructura ordenada. En la estructura cristalina del
fragmento 151-231 ambos residuos se encuentran formando el puente disulfuro
(Gamble et al., 1997). La proteína p24 no posee ningún otro residuo de cisteina
mientras que p26 de EIAV tiene otro situado e la posición 48. Si, como cabe esperar,
la estructura de estas proteínas es similar, este residuo Cys48 se encontrará en un

loop que une las hélices denominadas B y C en la estructura del fragmento 1-151 de
rp24. A partir de las estructuras tridimensionales de los dos fragmentos se ha
construido un modelo para el dímero de p24~ (Fig. 29> donde se unen las estructuras
de los dos fragmentos de rp24 a través de una secuencia de cinco aminoácidos. En
este modelo, la tercera cisteina quedaría muy alejada de las otras dos como para que
se produzca una interacción de este residuo con alguno de los otros dos del extremo
carboxilo-terminal. Es decir, no parece que pueda haber un equilibrio de interacción
entre los tres residuos de cisteina que haga que en ocasiones un grupo SH se
encuentre libre y en otras formando parte de un puente disulfuro. Sin embargo, no
hay que olvidar que la estructura de la proteína completa de la cápsida de lentivirus
no ha sido determinada y que la estructura que aparece en la Figura 29 es un modelo
siendo el extremo carboxilo-terminal el responsable de la formación del dímero, y que
exista otro modelo según el cual los fragmentos amino-terminales de dos moléculas
de proteína se encuentran interaccionando <Momany et aL, 1996>. Por tanto, es
necesario conocer la estructura tridimensional de la proteína completa para decidir
cual es el modelo correcto de formación de los dímeros de p24.

-89-





Resultados y Discusión

1 .D. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA rp26-His
DE EIAV

Está claro que a pesar de conocerse la estructura tridimensional de los dos
posibles dominios de p24 de HIV, es necesario disponer de datos estructurales de la
proteína completa. Un posible candidato sería la EIAV-rp26, dado que posee una
estructura globular que, en principio, se puede considerar nativa y, además, se
mantiene monomérica en disolución hasta una concentración de 20 mg/ml. Para
utilizar la resonancia magnética nuclear como método experimental de determinación
de la estructura, y al tratarse de una proteína relativamente grande, 26 kDa, seria
necesario disponer de 0.5 ml de una disolución 1 mM de proteína marcada con
y ‘3C. Como se obtienen 1.2-1.5 mg/L de medio, el precio de la preparación sería
excesivamente alto. Una de las formas de aumentar el rendimiento consistiría en
disminuir el número de etapas del proceso de purificación. Para ello se ha procedido

a donar la proteína p26 utilizando un vector de expresión que añade una extensión
de seis histidinas en un extremo de la proteína. También se podía utilizar la proteína
homóloga p24 de FIV que, como se indicará más adelante, se ha donado con la
extensión de seis histidinas. Sin embargo, esta proteína precipita a una concentración
cercana a los 15 mg/mí, haciendo imposible su utilización en estudios estructurales
que requieran una alta concentración.

CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA rp26-His

La proteína de la cápsida de EIAV, p26, se ha donado en el vector de
expresión, pQE3O, que tiene la característica de añadir en el extremo amino-terminal

de la proteína un fragmento de seis residuos de histidina, lo que va a permitir obtener
la proteína pura en un solo paso de purificación mediante una cromatografía de
afinidad. Con este nuevo método se mejora el rendimiento de la purificación y se
reduce de forma importante el tiempo que se emplea en obtener la proteína pura. La
proteína, a través de los seis residuos de histidina, interacciona con la resma
Ni-NTA-Agarosa, que posee iones níquel cargados, quedándose retenida en la
columna. Para eluirla es necesario un cambio de pH que protone a las seis histidinas,
un agente quelante de los iones Ni2~, como el EDTA, o bien un compuesto como el
Imidazol que compita con la histidina en su interación con el Ni2~ . En nuestro caso
se optó por eluir la proteína con Imidazol 200 mM. En la Figura 30 se muestra un gel
correspondiente a la purificación de rp26-His. Como puede observarse la incubación
de las células Ml 5 con IPTG durante 4 h induce la aparición de una banda alrededor
de 26 KDa correspondiente a la proteína rp26-His <Fig. 30, pocillos 1 y 2>. Esta

-91-



Resultados y Discusión

proteína es la mayoritaria de las que se cargan e la columna de NI-NTA-Agarosa y es,
además, la única que interacciona con el soporte cromatográfico, como se desprende
de la comparación de los pocillos 3 y 4 de la Figura 30. La proteína que se eluye con
Imidazol 200 mM posee una pureza superior al 95% <Fig. 30, pocillo 5). De esta
forma se obtienen alrededor de 4 mg/L de medio de cultivo, mientras que con el
anterior método de purificación se obtenían unos 1.2 a 1.5 mg/L de medio. Además,
el método anteriormente empleado comprendía etapas de precipitación con sulfato
amónico, diálisis y dos cromatografías. Por lo tanto, además de mejorar mucho el
rendimiento, se disminuye considerablemente el tiempo necesario para obtener la
proteína pura.

La identidad de la proteína se determinó por análisis de aminoácidos. La
composición de aminoácidos coincide con la composición teórica deducida a partir de
la secuencia (Stephens et aL, 1986; Kawakami et aL, 1987), y coincide con la de
EIAV-rp26 (Tabla III>, excepto en el número de histidinas y en la existencia de cinco
residuos adicionales que se introducen como consecuencia de la donación en el
plásmido pQE3O.

1 2 34 5
97.4
66.2 -— -

45.0 — - ——

21.5

14.4

Figura 30. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS de los pasos de purificación
de rp26-His. Pocillo 1, células Ml 5 sin inducir; pocillo 2, células Ml 5 inducidas con IPTG durante
4 horas; pocillo 3, muestra que se carga en la columna de Ni-NTA-Agarosa; pocillo 4, proteínas
no retenidas en la columna; pocillo 5, proteína rp2G eluida de la columna con Imidazol 200 mM.

-92-



Resultados y Discusión

ESTUDIO ESTRUCTURAL DE rp26-His

Una vez comprobado que este método de purificación permite obtener la
proteína p26 con mayor rendimiento, es necesario caracterizar estructuralmente esta
proteína, para comprobar si la introducción de seis residuos de histidina afecta a su
estructura tridimensional. Es de suponer que no habrá ningún gran cambio por la
adición de seis residuos ya que la proteína consta de 233 aminoácidos y el cambio
supone un aumento de un 3% en el número de residuos.

Figura 31. Espectros de dicroísmo circular de las proteínas pUC/rp26 <e> y rp26-His (•) de EIAV.
(A> Espectros de dicroísmo en el UV lejano. (B) Espectros de dicroísmo en el UV próximo. La
concentración de proteína utilizada se encontraba entre 0.1-0.2 mg/ml para los espectros de uy
lejano y 1 mg/ml para los espectros de Uy próximo.

En la Figura 31 se representan los espectros de dicroísmo circular en el UV
lejano y próximo de la proteína rp26-His, donde se comparan con los de la proteína
pUC/rp26. Como puede observarse, los espectros en el ultravioleta lejano coinciden
totalmente, tanto en la forma como en el valor de la elipticidad. La adición del
fragmento de seis residuos de histidina no modifica el porcentaje de a-hélice que
sigue siendo la estructura secundaria mayoritaria. En cuanto a los espectros en el UV
próximo, la forma del espectro de las dos proteínas es muy parecida siendo los
valores de elipticidad prácticamente coincidentes. El resultado de la valoración con
DTNB de la proteína con los seis residuos de histidina fue de 2.9 SH libres/molécula
de proteína, valor que es ligeramente mayor que el que se obtiene con pUC/rp26. Al

‘JO

-~ 20r

o
x fi>
Vi ao o
-v •20 <~E
o> o

<7> 3
o -40

x
o.

-w _

o
0

-so

Longitud de onda (nm)

1~L) 2(X) 210 220 230 240 250 280 270 280 2~) XX) 310 320

-93-



Resultados y Discusión

igual que ocurre con la proteína pUC/rp26, no parece que en esta proteína haya un
puente disulfuro formado entre dos de sus tres residuos de cisteina.

En lo que a la estabilidad térmica respecta, la proteína rp26-His posee una
temperatura de desnaturalización ligeramente menor que pUC/rp26 (53.8 ± 1.0
frente a 52.9 ± 1.0 0C). La cooperatividad del proceso es la misma en los dos casos.

Los espectros de emisión de fluorescencia, excitando a 275 y 295 nm, de la
proteína rp26-His, presentan un máximo a 322 y 325 nm, respectivamente (datos no
mostrados). El espectro obtenido excitando a 275 nm está algo desplazado hacia una
menor longitud de onda con respecto al obtenido para la proteína pUC/rp26

<Vax = 324 nm). Sin embargo, a 295 nm, longitud de onda a la que sólo se excitan
los triptófanos, el máximo coincide. Por tanto, la extensión de 6 His provoca una
pequeña modificación del entorno de los fluoróforos de la proteína.

En resumen, los parámetros estructurales de la proteína rp26-His de EIAV
indican que la introducción de los seis residuos de histidina no influye
significativamente en la estructura de la proteína. Por ello y teniendo en cuenta el
ahorro tanto de tiempo como económico que supone la purificación, esta proteína
puede ser empleada en estudios posteriores encaminados a determinar su estructura
tridimensional.

-94-



Resultados y Discusión

2. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEiNA o24 DE LA CÁPSIDA

DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA FELINA <FIV). MECANISMO
DE PLEGAMIENTO

La proteína p24 de FIV, al igual que la proteína p26 de EIAV, posee una gran
homología de secuencia con el resto de las proteínas que forman la cápsida de los
lentivirus. Un alineamiento de secuencia indica que la proteína p24 de MV tiene un
34% de identidad con p26 de EIAV, un 43% con la del virus visna y un 29% con la
proteína p24 de HIV-1. Por ello, los datos estructurales que se obtengan para esta
proteína serán representativos del resto de proteínas de esta familia. Además, y ante
la escasez de datos al respecto, se han llevado a cabo diferentes estudios
encaminados a conocer el mecanismo de plegamiento de la proteína. Por ello, se ha
recurrido a la obtención de formas mutantes de la proteína en los que se ha cambiado
los residuos de triptófano que aparecen en la secuencia de p24 (Fig. 32). Los datos
obtenidos serán, igualmente, representativos de este grupo de proteínas.

Figura 32. Secuencia de aminoácidos de la proteína EIV-p24. En negrita se encuentran señalados
los residuos de triptófano de la proteína.

Los aminoácidos aromáticos, especialmente los triptófanos, han sido utilizados
a menudo como sondas intrínsecas de las proteínas para estudiar la estabilidad de las

proteínas así como el proceso de desnaturalización-renaturalización (Loewenthal et
aL, 1991; Royer etaL, 1993; Martensson etal., 1995; Cai y Schirch, 1996; Nath y
Udgaonkar, 1997). En la secuencia de p24 hay dos residuos de triptófano en las
posiciones 38 y 124 que pueden ser cambiados por uno o dos residuos de fenilalanina
y así obtener dos mutantes sencillos y uno doble. Aunque los dos residuos de

triptófano de la proteína FIV-p24 no se encuentran conservados en el resto de las
proteínas de las cápsidas lentivirales los estudios llevados a cabo con las proteínas

salvaje y mutantes permitirán obtener información de cómo la proteína alcanza su
estructura tridimensional y del modo de plegamiento de los dos posibles dominios de
estas proteínas <residuos 1-151 y 152-231, en el caso de la proteína p24 de HIV-1).

1 PIQTVNGVPQ YVALDPKMVS IFMEKAREGL GGEEVQLWFT AFSANLTPTD
51 MATLIMAAPG CAADKETLDE SLKQLTAEYD RTHPPDAPRP LPYFTAAEIM
101 GIGLTQEQQA. EARFAPARMQ CRAWYLEALG KLAAIKAKSP RAVQLRQGAK
151 EDYSSFTDRL FAQIDQEQNT AEVKLYLKQS LSIANANADC KKANSHrJKPE
201 STLEEKLPAC QEIGSPGYKM QLL

-95-



Resultados y Discusión

2.A. CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE FIV-rp24 Y MUTANTES

Aplicando la estrategia descrita en el apartado Métodos Experimentales, se
consiguió obtener el fragmento de DNA que codifica la proteína p24 de FIV y clonarlo
en el plásmido pQE6O (Fig. 33>, obteniéndose el plásmido pQE6O/FIVp24. Este
plásmido añade un fragmento de seis residuos de histidina en el extremo carboxilo-
terminal de la proteína. Como se ha indicado anteriormente en el caso de p26 de
EIAV, la introducción de los seis residuos de histidina no modifica prácticamente la
estructura de la proteína y, sin embargo, facilita su purificación.

La secuencia de DNA del gen de p24 generado por PCR se comprobó mediante
secuenciación automática, siendo idéntica a la secuencia publicada <Talbott et aL,
1989>. La proteína p24 original tiene 223 aminoácidos mientras que la proteína
FIV-rp24 posee 237. Los aspectos que diferencian a ambas proteínas son las
siguientes: la introducción del sitio de restricción Ncol hace que se añadan dos
aminoácidos, Met y Val, en el extremo amino-terminal de FIV-rp24. Por otro lado, en
el extremo carboxilo-terminal, FIV-rp24 tiene el tetrapéptido AEAL que en el precursor

se encuentra entre p24 y píO <Talbott et aL, 1989). Además, el sitio de restricción
Bglll añade otros dos aminoácidos, Arg y Ser, en el extremo carboxilo-terminal. Por
último, FIV-rp24 contiene los seis residuos de histidina procedentes del plásmido
pQE6O. Es de esperar que esta diferencia en tamaño, FIV-rp24 tiene un 6% más de
aminoácidos que p24, no tenga un efecto apreciable en la estructura global de la
proteína, máxime si se tiene en cuenta que las diferencias tienen lugar en los
extremos de la cadena polipéptidica. Por otro lado, ahora los residuos de Trp aparecen
en las posiciones 40 y 126.

Una vez donada la proteína salvaje se procedió a la obtención de los dos
mutantes sencillos aplicando la técnica de PCR. Para ello se utilizó el plásmido
pQE6O/FIVp24 como molde junto con los oligonucleótidos apropiados para cada
mutante <Fig. 34>. En el caso del mutante W4OF se utilizaron los siguientes pares de
oligonucleótidos cebadores: p24-Ncol< +>/W4OF(-) y W4OF< + )/p24-Bgll 1<-); en el caso
del mutante W1 26F los pares fueron p24-Ncol< +>/W1 26F<-> y W1 26F< +>/p24-Bglll(-).
Por tanto, para cada mutante se obtienen dos fragmentos de DNA. Tal y como puede
observarse en la Figura 35, los fragmentos obtenidos en los dos mutantes tienen los
tamaños esperados, esto es, 127 y 587 bp para el mutante W4OF y 394 y 320 para
el mutante W1 26F, utilizando los pares de cebadores indicados anteriormente.
Además de la banda correspondiente al fragmento de DNA del tamaño apropiado, en
algunas de las reacciones de PCR se obtienen bandas de otros tamaños que pueden

-96-



Resultados y Discusión

resultar de uniones inespecíficas de oligonucleótidos al molde como ocurre con el
fragmento W126F (+) o W4OF (-) (Fig. 35>. En este último caso la banda inespecífica
es la mayoritaria.

p24-Bglll<-) 5’ COAGATCTAAGACCTTCTQCCAACAG 3

B

P 1 Q T y

CGT ATT CAA AGA CTAOriginal

CC ATO CTA

M y

CGT ATT CAA ACA CTA

F 1 Q T V

C

L

CTC TTC

Figura 33. Estrategia de donación de FIV-rp24. (A> Secuencia de los oligonucleótidos cebadores
empleados en la reacción de PCR para amplificar el gen de p24. El cebador p24-Ncol( i-) introduce
un sitio de restricción Ncol, mientras que el cebador p24-Bglll(-) introduce un sitio de restricción
Sg/II y un codón de terminación (fl. (R> Alineamiento de las secuencias original y donada del
extremo amino-terminal de la proteína p24. (C> Alineamiento de secuencias original y donada del
extremo carboxilo-terminal de la proteína p24. Los nuevos sitios de restricción se encuentran
subrayados (Ncol - CCATTG; Hindlll - AGATCT> y ‘TAA’ es el codón de terminación del gen
donado. La secuencia amino-terminal de p24 es PIQ y la de FIV-rp24 es MVPIQ. La secuencia
carboxilo-terminal de p24 es L-L. La proteína FIV-rp24 contiene, además, el tetrapéptido AEAL,
que en el precursor se encuentra entre p24 y pl O (Talbott, 1989), los residuos R y 5, incluidos
al crear el sitio de restricción BgIll y las seis histidinas que facilitan la purificación de la proteína
FIV-rp 24.

p24-Ncol(+>

A

5’ CCCCATCOTACCTATTCAAACAGTA 3’

Clonado

Original

donado CTC TTG OCA CAA CGT CTT ACA TCT (CAT GAG)
3 TAA

L L A E A L R S (H H>3

-97-



Resultados y Discusión

Q L W F O A E S A

CAA CTA TOO TTT ACT CCC TTC TCT SCA

GAA

Q L

TTC TTT ACT CCC TTC TCT OCA

E E O A E S A

O E E V Q L IV

CGT CAO GAA CTT CAA CTA TOS

E

TTT

OOT OAO OAA OTT CAA TTO TOS TTT

O E E V Q L IV E

B

W126F<+>

IV Y L E

100 TAT CTC CAO

A L O

CCA TTA OGA

TOG TAT CTA GAG OCA TTA OSA
IV Y L E A L O

R Nl Q

ACO ATO CAO

C R A IV Y L E

TOT ASA OCA TOO TAT CTC SAO

AGO ATO CAO TOT ACA OCA TTT TAT CTA SAO
R Nl Q C R A E Y L E

Figura 34. Secuencia de oligonucleátidos
mutantes sencillos W4OF (A) y W126F (B).

de las cebadores utilizados en la obtención de los
Se recoge la secuencia de la zona donde se produce

la mutación. En todos los casos la secuencia del cebador (mutado) se compara con la del DNA
de FIV-rp24 en la zona donde se produce la mutación (original>. (A) La mutación de W <TGG> a
F <TTC> se introduce en la reacción de PCR en la que se utiliza el oligonucleátido cebador
W4OF( +). (R) La mutación de W (TGG) a F (TTT) se introduce en la reacción de PCR en la que
se utiliza el oligonucleótido cebad& W126F(-). Los sitios de restricción Mfel (CAA TTG> y Xbal
(TCT AGA) se encuentran subrayados. Puede comprobarse como los cambios introducidos para
crear los nuevos sitios de restricción no afectan al resto de la secuencia de aminoácidos de las
proteínas mutantes.

W4OF(+>
A

Original

Mutado

W4OF(->

Original

Mutado

O ri gi nal

Mutado

W1 26F(-)

Original

Mutado

-98-



Resultados y Discusión

Figura 35. Electroforesis en geles de agarosa de los productos de las reacciones de POR utilizadas
para obtener los mutantes W4OF y W126F. Se empleó como molde en todos los casos el
plásmido pQEGO/FIVp24, junto con los oligonucleótidos que se indican en cada uno de los
pocillos, como control se empleó el producto de PCA obtenido en una reacción en la que se
emplea como molde el DNA de la proteína p24 de FIV y los oligonucleótidos p24-Ncol( +> y

p24-Bglll(-).

Las bandas de tamaño adecuado del gel de agarosa se extrajeron obteniéndose
los fragmentos puros. A continuación estos fragmentos se cortaron con las enzimas

correspondientes a los nuevos sitios internos (MfeI en el caso de W4OF y Xbal en el
de W1 26F) y se ligaron. El producto de ligación se amplificó mediante otra reacción
de PCA. Como puede verse en la Figura 36, en ambos casos se obtiene un fragmento

de unos 700 bp que aparece a la misma altura que el control utilizado y que
corresponde al fragmento de DNA de la proteína salvaje. Este DNA se clonó en el
vector de expresión pQE6O, que, como en el caso de la proteína p24 salvaje, añade

seis histidinas en el extremo carboxilo-terminal de las proteínas mutantes.

Figura 36. Electroforesis en geles de agarosa de los productos de POR correspondientes a los
mutantes W4OF y W126F. Como control se empleó el producto de PCA obtenido en una reacción
en la que se emplea como molde el plásmido pQEGO/FIVp24 y los oligonucleótidos cebadores
p24-Ncol(+) y p24-Bglll(-).

Para la obtención del doble mutante en el que los dos residuos de triptófano se

cambian por fenilalanina, se llevaron a cabo una serie de digestiones empleando los
plásmidos pQE6O/FIVp24, pQE6O/W4OF y pQE6O/W126F (Fig. 10>. De esta forma,
y ligando tres de los fragmentos obtenidos en las digestiones, se obtuvo el plásmido

C W4OF WI2GF— .— 699 bp

-99-



Resultados y Discusión

pQE6O/W40/1 26F, que lleva el inserto correspondiente a la secuencia del doble
mutante.

Las mutaciones introducidas se comprobaron mediante digestión de los
plásmidos pQE6O/W4OF, pQE6O/W1 26F y pQE6O/W40/1 26F con las enzimas de
restricción Miel o Xbal, obteniendose los fragmentos con los tamaños esperados.
Además, la identidad de las secuencias de DNA mutadas se llevó a cabo mediante
secuenciación automática observándose el cambio del triplete TGG a TTC, que
produce la mutación en W4OF, y el cambio TGG a TTT para el mutante W1 26F. Estos
dos cambios se observaron simultáneamente en el caso del doble mutante W40/1 26F.

El método de purificación de la proteína salvaje y los mutantes es el empleado
en el caso de la proteína rp2B-His de EIAV, ya que en todos los casos se incorporan
seis residuos de histidina, lo que permite purificarías mediante una cromatografía de
afinidad con una columna de Ni-NTA-Agarosa. En la Figura 37 se muestra un gel de
la purificación de FIV-rp24 salvaje, siendo los resultados que se obtienen en el caso
de los mutantes totalmente comparables. La proteína FIV-rp24 es una de las
mayoritarias de las que se cargan en la columna. La proteína que se eluye con
Imidazol 200 mM tiene una pureza superior al 99% (Fig. 37, pocillo 5). La masa
molecular calculada para FIV-rp24 (27.5 KDaI es superior a la esperada para su
composición de aminoácidos (26 KDa>. Esta diferencia se observa con otras proteínas
que contienen la extensión de seis histidinas en uno de los extremos de la cadena
polipeptídica.

El rendimiento de la purificación varia según sea la proteína que se purifica. A
partir de 1 L de medio de cultivo se obtienen las cantidades recogidas en la Tabla X.
Como puede observarse la mutación del triptófano 40 no afecta apenas a la
expresión de proteína. Se obtiene, prácticamente, la misma cantidad de proteína que
en el caso de la proteína salvaje. Sin embargo, la mutación del triptófano 126 produce
una disminución en la expresión y, por tanto, en la posterior purificación de la
proteína; esto se mantiene en el caso del doble mutante. En todos los casos la
cantidad de proteína purificada permite llevar a cabo perfectamente los estudios
estructurales y de desnaturalización-renaturalización.

-100-



Resultados y Discusión

1 2 3 4 5

97.4
66.2

45.0

31.0

21.5

14.4

e FIV-rp24

eu
Figura 37. ElectoToresls en geí ae po¡iacruam¡aa en presencia ue gua ae uos pascs de purificación
de FIV-rp24 salvaje. Pocillo 1, marcadores de masa molecular; pocillo 2, células MiS sin inducir;
pocillo 3, células Ml 5 inducidas con PTO durante 4 horas; pocillo 4, muestra que se carga en
la columna de Ni-NTA-Agarosa; pocillo 5, proteína Flv-rp24 eluida de la columna con Imidazol
200 mM. La masa molecular de los patrones se indica al margen de cada banda.

Tabla X. Rendimiento de
Las cantidades recogidas
de medio de cultivo.

la purificación de FIV-rp24 y mutantes.
en la tabla se obtuvieron a partir de 1 L

Mediante análisis de aminoácidos se determinó la identidad de la proteínas
purificadas. En la Tabla Xl se compara la composición de aminoácidos de las cuatro
proteínas con la composición teórica de p24 obtenida a partir de la secuencia de DNA
publicada, teniendo en cuenta los aminoácidos que se añaden al donar la proteína
<Talbott et al., 1989). Como puede observarse, la coincidencia entre la composición
teórica y la experimental es prácticamente total. La no coincidencia en el número de
Met puede se debido a la eliminación de la metionina amino-terminal por la acción de
la metionina amino-peptidasa, al igual que ocurre en el caso de EIAV-rp26 en la que

el segundo aminoácido es también Val. En el número de histidinas teóricas se incluyen

PROTEINA CANTIDAD (mg)

FIV-rp24 4.5

W4OF 4.0

W126F 2.0

W40/126F 2.0

-101-



Resultados y Discusión

las seis His que añade el plásmido pQE6O. Para todas las proteínas obtenidas el
número de residuos de histidina es de 9, ligeramente mayor que el valor teórico. Se
puede observar el aumento en el número de residuos de fenilalanina que pasa de 7
residuos en la proteína salvaje a 8 en los mutantes sencillos y a 9 en el mutante
doble. Por el contrario, el número de residuos de triptófano, que ha sido calculado
mediante el método de Edelhoch (Edelhoch, 1967; Gilí y von Hippel, 1989), disminuye
de 1.5 residuos para FIV-rp24 a 0.7 y 1.0 para los mutantes W4OF y W1 26F,
respectivamente, y O para W40/1 26F. La proteína FIV-rp24 tiene 4 Cys que podrían
encontrarse en diferentes estados de oxidación. Dado que en el caso de EIAV-rp26
la formación de un puente disulfuro lleva consigo una modificación en la estructura
proteica, se determinó el contenido en grupos SH libres de las diferentes proteínas
utilizadas. Para las diferentes proteínas y en las diferentes preparaciones utilizadas,
el número de grupos Sí libres varió entre 2.0 y 3.0. El hecho de que en algunas
preparaciones se obtengan 3 grupos tiólicos libres implica que no siempre se forma
el puente disulfuro entre las dos Cys homólogas y que, al igual que ocurre en el caso
de EIAV-rp26, el puente dísulfuro se puede formar durante el proceso de purificación
de la proteína.

-102-



Resultados y Discusión

~1 ~1AMINOÁCIDO TEÓRICA EXPER. W4OF W126F W40/126F

32

11

16

4

35

12

9

11

24

14

8

7

15

11

11

1.5

7

8

33

11

15

N.D

35

12

9

11

24

15

8

8

15

11

11

0.7

7

7

ALA

ARG

ASX

CYS1

GLX

GLY

H 15

ILE

LEU

LyS

MET2

PHE

PRO

SER

TH R

TRP3

TYR

VAL

33

11

15

4

35

11

8

11

24

15

9

7

14

12

11

2

7

8

32

11

16

N.D.

35

12

9

11

24

15

8

8

15

11

10

1

7

8

32

11

16

N.D.

35

12

9

11

24

14

8

9

15

11

10

7

8

Tabla Xl. composición de aminoácidos de la proteína FIV-rp24 salvaje y de las proteínas mutantes
W4OF. W126F y W40/126F. Se recoge la composición teórica y experimental de FIV-rp24 y la
experimenta de los mutantes (1) El número de residuos de cisteina se determinó como Cmcys en la
proteína reducida con DTT y carboxiamidometilada. (2) En el número de Met teóricas se incluye la
correspondiente al extremo amino-terminal. (3) El número de residuos de triptófano se calculó
espectrofotométricamente (Edelhoch, 1967).

-103-



Resultados y Discusión

2.8. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE FIV-rp24 Y MUTANTES

ESPECTROS DE ABSORCIÓN

En la Figura 38 aparecen representados los espectros de absorción en la región
de ultravioleta de la proteína salvaje y de (os mutantes. El espectro de absorción de
la proteína salvaje, característico de una proteína, posee un máximo a 277 nm y dos
hombros a 281 y 292 nm, con residuos de tirosina y triptófano, observándose una
serie de hombros alrededor de 260-270 nm que representan la estructura fina de los
siete residuos de fenilalanina. En el caso de los mutantes sencillos, el hombro a 292
nm se ve menos acentuado y en el espectro del doble mutante llega a desaparecer
como consecuencia de la desaparición de los dos residuos de triptófano. Los
espectros de los dos mutantes sencillos son prácticamente coincidentes, aunque el
mutante W4OF tiene una menor absorción y el máximo a 277 nm está algo más
diferenciado. En estos espectros es más apreciable la contribución de los resiudos de
fenilalanina. El espectro del mutante W40/1 26F coincide con el espectro de la tirosina
en disolución, aunque su máximo está desplazado hacia mayor longitud de onda,
indicando que los residuos de tirosina en la proteína se encuentran en un entorno más
hidrofóbico. Además, en este espectro se puede apreciar claramente la contribución
de los residuos de fenilalanina en la región entre los 255 y 275 nm.

Figura 38. Espectros de absorción de la proteína FIV-rp24. de los mutantes sencillos W4OF.
W126F y del doble mutante W401126F. En todos los casos la concentración de proteína es de
1 mg/ml.

A1=

1.0

0-e

0.8

0.4

0.2

0.0

Longitud de onda (nm)

260 280 300 320 340

-104-



Resultados y Discusión

Mediante el análisis de aminoácidos de alícuotas de disoluciones de proteína
de absorción conocida, se calcula el coeficiente de extinción molar de las proteínas
salvaje y mutantes. Estos valores quedan reflejados en la Tabla XII, donde se
comparan con los valores teóricos calculados a partir de la expresión que permite
calcular el valor del coeficiente de extinción molar de una proteína en disoluión acuosa
<Pace et al., 1995>:

E
280 (M

1 cm’>— n0 Trp x 5500+ n0 Tyr x 1490 + n0 cistina x 125

PROTEINA E,
80 tear. E280 exp.

1

FIV-rp24 21430 <0.81) 23120 (0.88)

W4OF 15930 (0.60> 17110 (0.65)

W126F 15930 (0.60> 17365 (0.67)

W40/126F 10430 <0.40) 11565 (0.44>

Tabla XII. Coeficiente de extinción malar a 280 nm teórico y experimentai de la proteina FIV-rp24
y de los mutantes W4OF, W126F y W40/126F. El valor teórico, con unidades M’ cm’, se a
calculado utilizando el método de Pace et al. (Pace et al., 1995>. El valor experimental se ha
determinado mediante análisis de aminoácidos. Entre paréntesis se recoge ~0 1% , esto es, el valor
de la absorbancia a 280 nm de una disolución de proteína a una concentración de 1 mg/ml medida
con un paso óptico de 1cm.

Los valores experimentales obtenidos son, aproximadamente, un 10% mayores

que los teóricos en las cuatro proteínas. A partir de los valores indicados en la
Tabla XII se puede calcular la contribución individual de los distintos componentes de
los diferentes cromóforos al coeficiente de extinción. Así, expresado en términos de

absorbancia de una disolución a una concentración de 1 mg/mI, el valor de E0~~ del
Trp4O sería de 0.23 (mg/mW’ cm’ (6055 M1 cm1>, el del Trp12G sería
0.25 <mg/mI) cm< (5530 M< cm1> y el valor de las siete tirosinas sería
0.44 (mg/mlf’cm’ (1650 M1 cm’) por residuo. Estos valores indican el carácter
aditivo de este parámetro, pues la suma de las contribuciones individuales de los dos

residuos de triptófano y de las tirosinas nos da el valor del coeficiente de extinción
de la proteína salvaje. La diferencia entre los valores del coeficiente de extinción de
los dos triptófanos podría reflejar una diferencia en hidrofobicidad del entorno de

ambos. Por ejemplo, se ha descrito que el valor de E
280 del ester etílico del N-Ac-Trp

es de 5630 M
1 cm< en agua y 6075 M1 cm’ en propanol (Pace eta,’., 1995). El valor

calculado de 1650 M1 cm</residuo de Tyr coincide bastante bien con el descrito para

el ester etílico de N-Ac-Tyr en propanol <Pace et aL, 1995).

-105-



Resultados y Discusión

ESPECTROS DE DICROÍSMO CIRCULAR

Los espectros de dicroísmo circular en el ultravioleta lejano se representan en
la Figura 39-A. Las cuatro proteínas tienen un espectro que indica que la estructura
secundaria mayoritaria sigue siendo la a-hélice, como ocurre en el caso de la proteína
EIAV-rp26. En el espectro aparecen dos mínimos bien diferenciados a 208 y 220 nm,
así como un máximo a 200 nm. Se puede observar que las mutaciones introducidas
en las posiciones 40 y 126, bien por separado o de una manera conjunta, no tienen
prácticamente ningún efecto sobre la forma y magnitud del espectro de dicroísmo
circular. El valor promedio de elipticidad a 208 nm para la proteína salvaje y los
mutantes W4OF, W126F y W40/126F es -19110, -19050, -18330 y -18130
grados x cm’ x dmoL1, respectivamente.

o
E

o
ci)
o
tu
o>

o

30

20

10

o

-10

-20

20

10

0

-10

-20

-30

-40

-50

-60

-70

-60

o

ca
o>
ao
x
o
2

Ñ
a
2o

Figura 39. Espectros de dicroísmo de la proteína FIV-rp24 y de los mutantes. Espectros de CD
el uy lejano (A) y en el UV próximo (E) de FIV-rp24 (o); W4OF Cv); W12GF (E> y W40/126F(O).
La concentración de proteína utilizada fue de 0.1 mg/ml para el uy lejano y 1 mg/ml en el uy
próximo. Los espectros son representativos de los obtenidos con cuatro preparaciones diferentes.

A partir de los espectros de CD y mediante el método CCA (Perczel et aL,
1981) se determinaron los porcentajes de estructura secundaria que aparecen en la

Tabla XIII.

190 200 210 220 230 240 250 250 260 270 280 290 300 310 320 330

Longitud de onda (nm)

-106-



Resultados y Discusión

PROTEÍNA % a-hélice % estructura j3 % giro ~3 % estructura no
ordenada

FIV-rp24

W4OF

W126F

W40/126F

48

52

51

49

5

5

5

5

20

18

20

14

32

30

29

32

Tabla XIII. Porcentajes de estructura secundaria de la proteína FIV-rp24 salvaje y las proteínas
mutantes. Estos valores se han calculado a partir de los espectros de dicroísmo circular en el UV
lejano mediante el método OCA (Perczel et al., 1991).

Como reflejan los datos del ajuste del espectro de dicroísmo, el componente
mayoritario de estructura secundaria en todas estas proteínas es la a-hélice, dando
cuenta del 48-52% del total. La estructura 13 no aparece prácticamente en ninguna,
salvo un pequeño porcentaje en el caso del doble mutante. El resto de estructura
secundaria se reparte entre giro j3, 20%, y estructura no ordenada, 30%. Por tanto,
ninguna de las mutaciones introducidas modifican sustancialmente la estructura

secundaria. Esta estructura es prácticamente coincidente con la obtenida para
EIAV-rp26.

Los espectros de CD en el UV próximo se recogen en la Figura 39 (6). Como
ya se ha indicado en esta región surgen de los entornos asimétricos de los residuos
aromáticos, esto es, de un determinado ordenamiento tridimensional de las cadenas
laterales. Normalmente la contribución de los residuos de Phe es considerablemente
menor que la de los residuos de Tyr y Trp, por lo que suelen ser éstos los que

determinan el espectro de CD en el UV próximo de una proteína. En el caso de
FIV-rp24 salvaje se observan cuatro mínimos centrados a 262, 269, 284 y 296 nm
así como un máximo a 290 nm. Alrededor de los 260 nm empieza a ser significativa
la contribución de los enlaces peptídicos, por lo que alguna de las bandas observadas

cerca de esta longitud de onda pueden no ser debidas a residuos aromáticos. Es difícil
asignar estas bandas a residuos concretos debido a que pueden ser composición de
otras bandas diferentes. La banda a 296 nm podría ser debida a un residuo de

triptófano porque la tirosina no absorbe a esta longitud de onda; el resto pueden ser
debidas tanto a tirosinas como a triptófanos. Analizando los espectros de CD de las
formas mutantes se podría determinar a qué residuos de Trp se deben las distintas
bandas, siempre y cuando los cambios de Trp por Phe no modifiquen la estructura
tridimensional de la proteína. Los espectros de los mutantes W4OF y W1 26F indican

-107-



Resultados y Discusión

que el residuo Trp4O es responsable de la banda positiva a 290 nm y que el residuo
Trpl 26 lo es de la banda negativa centrada a 296 nm. Además, el espectro del doble
mutante indica una contribución importante de los siete residuos de Tyr (Fig. 39-B),
con bandas negativas a 262, 269, 278 y 284 nm. Sí suponemos que las fenialaninas
que se han introducido por las mutaciones no influyen apenas en el espectro, la
contribución de cada residuo de triptófano se puede calcular restando al espectro de
la proteína salvaje el espectro del mutante sencillo correspondiente o restando el
espectro del otro mutante al del doble mutante.

En la Figura 40 aparecen las contribuciones de los residuos de Trp4O (A) y
Trpl26 (8>. Como se puede observar, independientemente del modo de cálculo
utilizado, a partir de 265 nm, los resultados son prácticamente coincidentes. El
espectro de cualquiera de los dos Trp es una combinación compleja de bandas. Así,
la contribución del Trp4O al espectro es toda positiva y se puede observar que es el
responsable de la banda del espectro de la proteína salvaje a 290 nm. Aparecen,
además, otros dos máximos a 283 y 273 nm. En el espectro del Trpl26 aparecen,
fundamentalmente, dos bandas negativas, una a 272 nm, que coincide y anula la
correspondiente positiva del Trp4O y otra situada a los 295 nm. Esta banda es la que
aparece en la proteína salvaje a 296 nm. Las diferentes posiciones de los máximos
de los triptófanos podrían indicar una diferente localización de ambos, estando el
Trpl 26 algo menos expuesto al disolvente que el Trp4O.

Figura 40. Contribuciones de los residuos de Trp4O <A) y Trp 126 <6) al espectro de dicroísmo
circular en el UV próximo de la proteína FIV-rp24. Estas contribuciones se han calculado restando
al espectro de la proteína salvaje el espectro del mutante sencillo correspondiente ($> o restando
el espectro del otro mutante el correspondiente al doble mutante (O).

80 20

o
E
r

0
E
o 0)

o-
o 40 0

-Y,
(U o
Cl -20 3

x
~ 20 o.2

0 0

-40

0
260 280 300 320 260 280 300 320

Longitud de onda (nm)

-108-



Resultados y Discusión

A partir de las contribuciones individuales de los dos residuos de triptófano de
la Figura 40 y la contribución de las Tyr que proporciona el espectro del doble
mutante, se puede recomponer el espectro de la proteína salvaje (Figura 411. Como
se puede observar, esta composición exhibe todas las características del espectro de
la proteína salvaje, Independientemente de los espectros utilizados para recomponer
el original, exceptuando en la zona entre los 250 y 265 nm, donde hay mayores
diferencias en el resto del espectro, la coincidencia es prácticamente total. La no
coincidencia en la zona de los 250-265 nm es debida a la alta contribución del enlace
peptídico a los valores de elipticidad en esta zona del espectro; de manera que
pequeñas variaciones en la determinación de la concentración de proteína se traducen
en diferencias significativas entre los diferentes espectros. El hecho de que coincida
el espectro experimental con los teóricos indica que no hay cambios conformacionales
debido a las mutaciones introducidas, o más concretamente, que no ha habido
distorsiones estructurales en los entornos de los residuos de triptófano como
consecuencia de las mutaciones.

Figura 41. Espectro de CD en el UV próximo obtenido como la suma de las contribuciones de los
triptófanos y de las tirosinas. Se compara el espectro experimental de FIV-rp24 (e) con los
obtenidos a partir de la suma del espectro del doble mutante con los de los Trp obtenidos como
diferencia entre el espectro de la proteína salvaje y el mutante correspondiente (U) o como
diferencia entre el espectro del otro mutante y el doble mutante Chi.

40

o 20
E
-D

Eo
x
<1> -20o-ocg
5-40

tE
~ -60

-80

Longitud de onda (nm>

260 280 300 320

-109-



Resultados y Discusión

ESPECTROS DE FLUORESCENCIA

Como se ha comentado anteriormente, mediante esta técnica espectroscópica
es posible estudiar el entorno tridimensional de los residuos aromáticos de una
proteína. Generalmente, la mayor contribución al espectro de emisión de una proteína
procede de los residuos de triptófano, debido a la mayor facilidad para la
desactivación colisional o por transferencia de energía de los residuos de tirosina. Sin
embargo, también los residuos de triptófano pueden estar afectados por procesos de
apagamiento local o de transferencia. Así, la fluorescencia de un residuo de triptófano
puede ser desactivada por distintas cadenas laterales, como los grupos sulfhidrilo
libres y los puentes disulfuro (Hennecke etal., 1997> o los grupos carboxilo, histidina,
metionina, etc <Loewenthal etal., 1991>. Por otro lado, los procesos de transferencia
de energía de un triptófano a otro en una proteína pueden hacer que la fluorescencia
del triptófano donador desaparezca (Wu y Brand, 1994). Por ello, es difícil predecir
la propiedades de fluorescencia de una proteína cuando contiene más de un residuo
de triptófano, incluso cuando la estructura de la proteína es conocida o cuando se
poseen los espectros de fluorescencia de mutantes sencillos de triptófano. En la
Figura 42 se representan los espectros de fluorescencia, medidos con una longitud
de onda de excitación de 275 y 295 nm, de la proteína FIV-rp24 salvaje, de los
mutantes sencillos y del doble mutante. El espectro de emisión de la proteína salvaje
al excitar a 275 nm presenta un único máximo a 321 nm, lo que indica que la
fluorescencia está dominada por los residuos de triptófano y que éstos ocupan una
localización bastante hidrofóbica. Como a esta longitud de onda contribuyen tanto los
residuos de tirosina como los de triptófano, para aislar la fluorescencia de los de Trp
se emplea una longitud de onda mayor, 295 nm. Como se observa <Fig. 42-A), el
espectro de la proteína salvaje sigue presentando un máximo centrado a,
prácticamente, la misma longitud de onda, 323 nm. El pequeño desplazamiento,
desde 321 a 323 nm, puede ser debido a la ausencia de fluorescencia de tirosina, que
tiene un máximo de emisión a 300 nm, en el espectro a 295 nm. A partir de estos
espectros, y mediante la diferencia entre ambos, se calcula la contribución de los
siete residuos de tirosina, que en el máximo de emisión resulta ser alrededor del 40%.
Claramente, la contribución promedio de cada Tyr, 6%, es considerablemente menor
que la de cada Trp, 31%.

A partir de los espectros de los mutantes se puede determinar la contribución
de los diferentes residuos aromáticos al espectro de fluorescencia. Cuando se
comparan los espectros obtenidos a 275 nm se observa que al pasar de la proteína
salvaje <321 nm) al mutante sencillo W4OF (320 nm> no hay desplazamiento en la

-110-



Resultados y Discusión

longitud de onda a la que aparece el máximo de emisión. Sin embargo, en el caso del
mutante W126F <303 nm> sí hay un desplazamiento hacia menores longitudes de
onda del máximo de emisión, lo que indica una menor contribución de las tirosinas en
la proteína mutante. Además, la contribución de los dos triptófanos al espectro es
diferente ya que la intensidad a 321 nm del mutante W4OF representa el 70% del
valor de la proteína salvaje mientras que la del mutante W1 26F sólo representa el
50%. En el caso del doble mutante, que carece de residuos de triptófano, el espectro
representa la contribución de los residuos de Tyr, apareciendo el máximo de emisión
a una longitud de onda característica de un espectro de tirosina, alrededor de los 300
nm. En ninguno de los espectros de los dos mutantes sencillos se observa un pico o
un hombro a esta longitud de onda de una intensidad similar a la del doble mutante,
lo que indica que puede existir una transferencia de energía de radiación desde los
residuos de Tyr a los de Trp, más acentuada en el cso de la proteína salvaje y del
mutante W4OF que en el del mutante W1 26F, donde el máximo de emisión aparece
a 305 nm.

La contribución de los residuos de tirosina al espectro se determina como la
diferencia entre los espectros obtenidos al excitar a 275 nm y 295 nm, estando este
último normalizado a partir de los 390 nm, longitud de onda a la que sólo emiten los
residuos de Trp. En la Figura 42 se representa también la contribución de las tirosinas
al espectro. Tanto para la proteína salvaje como para el mutante W4OF, el valor de
la intensidad de fluorescencia a 305 nm, cercano al máximo de 300 nm característico
de la Tyr, es el 40% de la intensidad en el máximo del espectro obtenido al excitar
a 275 nm. Sin embargo, en el caso del mutante W1 26F dicho valor aumenta hasta
un 75%. Estas diferencias pueden reflejar, como se ha indicado anteriormente, la
existencia de transferencia de energía de Tyr a Trp que será considerablemente mayor
desde las Tyr al Trpl 26 que el Trp4O. Sin embargo, también podría ocurrir que la
disminución de la fluorescencia de las Tyr en la proteína salvaje o en los mutantes
sencillos respecto del doble mutante reflejase una menor desactivación colicional en
los primeros. Esto significaría la existencia de diferentes entornos en las diferentes
proteínas, consecuencia de cambios conformacionales ocurridos al mutar los residuos
de triptófano, aunque, como se indicara más adelante, esta posibilidad es más
improbable.

La diferente contribución de los dos residuos de Trp al espectro de
fluorescencia se pone claramente de manifiesto cuando se comparan los espectros
obtenidos al excitar a 295 nm. En lo que a la longitud del máximo de emisión
respecta, se observa que al pasar de la proteína salvaje (322 nm) a los mutantes

—111—



Resultados y Discusión

sencillos <321 nm) no hay desplazamiento del máximo de emisión, lo que indica que
los residuos de triptófano que permanecen tras la mutación se encuentran en un
entorno hidrofóbico similar al que tenían en la proteína salvaje. Sí hay en cambio,
diferencias en la intensidad de fluorescencia; los mutantes sencillos presentan una
menor intensidad de fluorescencia con respecto a la proteína salvaje, como es natural,
ya que poseen un solo residuo de Trp. Esta diferencia de intensidad se acentúa en el
caso del mutante W1 26F con respecto a la del otro mutante sencillo, W4OF. La
intensidad de fluorescencia del mutante W4Of en el máximo es el 68% del valor de
la proteína salvaje mientras que la del mutante W126F es el 63%. Por tanto, la
contribución del Trpl 26 al espectro es el doble que la del trp4O. Como se trata de
intensidad al excitar a 295 nm, la diferencia entre ambos triptófanos debe reflejar una
diferente desactivación colisional mayor en el caso del Trp4O que en el Trp’126. En
el caso del doble mutante no debería observarse fluorescencia al excitar a 295 nm
puesto que esta proteína no tiene triptófanos; sin embargo, la intensidad a 321 nm
es un 7~/~ del valor de la proteína salvaje. Esta fluorescencia podría ser debida a los
residuos de rirosina que, como indica el espectro de absorción del doble mutante <Fig.
38>, absorben a 295 nm. Sin embargo, si fuese fluorescencia de Tyr, el espectro a
295 nm normalizado debería coincidir con el de 275 nm, cosa que no ocurre. Otra
posibilidad es que esa fluorescencia sea debida a tirosinato, como se ha descrito en
otras proteína <Szabo et aL, 1994). Aunque el valor de pKa de Tyr en el estado
fundamental es de 10.3, en el estado excitado dicho valor es 4 o menos; por ello,
puede ocurrir una ionización favorecida por la presencia de grupos aceptores
próximos si bien, el tirosinato posee un máximo a 345 nm y en este caso hay un
máximo poco definido entre 320 y 330 nm.

A partir de las contribuciones individuales de los Trp a 295 nm se puede
reconstruir el espectro de la proteína salvaje (Fig. 43>. Como el doble mutante posee
una cierta intensidad de fluorescencia, es posible que ésta también se manifieste en
los dos mutantes sencillos. Por ello, a los espectros de los mutantes individuales se
ha restado la intensidad residual del doble mutante y, a la hora de reconstruir el
espectro de la proteína salvaje, se ha sumado a las contribuciones de los triptófanos
el espectro del doble mutante. Como se puede observar el espectro de la proteína
salvaje coincide bastante bien con el espectro suma. La intensidad de fluorescencia
del último es el 95% del de la proteína salvaje, pudiendo reflejar el 5% restante
errores en la determinación de la concentración de proteína de las diferentes muestras
utilizadas. El hecho de que el espectro combinado sea muy similar al de la proteína
salvaje indica que los residuos de triptófano en los mutantes están en un entorno
tridimensional muy parecido al que ocupan en la proteína salvaje. Por tanto, parece

-112-



Resultados y Discusión

claro que no hay cambios conformacionales como consecuencia de las mutaciones
introducidas, al menos, cambios que tengan un reflejo en los espectros de
fluorescencia y, como se ha indicado anteriormente, de dicroísmo circular.

Figura 42. Espectros de emisión de fluorescencia de las proteinas FIV-rp24 salvaje (A>, W4OF
(B), WI2EF (C) y W40/126F (D). Espectros de emisión obtenidos con una longitud de onda de
excitación de 275 nm (—) y 295 nm ( ); contribución de los residuos de tirosina al espectro
de emisión de la proteína ( ). Los espectros a 295 nm se encuentran normalizados. La
contribución de tirosinas se calcula como la resta de los dos espectros anteriores.

800

600

400

~ 200
u
r
o>
u
Eo
~ 800
o>

~ 600
tu

u>
~ 4000>
e

200

300 320 340 360 380 400 420 440

Longitud de onda (nm)

—, ¾>-

300 320 340 360 380 400 420 440

-11 3-



Resultados y Discusión

Figura 43. Espectro de fluorescencia obtenido como suma de las contribuciones individuales de
los triptófanos medido con una longitud de onda de excitación de 295 nm. A los espectro de
emisión se ha restado el espectro del doble mutante. Suma de los espectros de emisión excitando
a 295 nm de los mutantes W4OF, W126F y W40/126F (. - - -1; espectro de la proteína FIV-rp24
salvaje (t.

ESTABILIDAD TÉRMICA

Mediante la técnica de dicroísmo circular se obtuvieron las curvas de

desnaturalización térmica de las proteínas salvaje y mutantes, midiendo la señal de
dicroísmo a 208 nm al aumentar la temperatura de forma continua. Estas curvas se
encuentran representadas en la Figura 44. En primer lugar, lo que se observa es que
el proceso de desnaturalización es cooperativo en las cuatro proteínas. Sin embargo,
la temperatura de transición térmica varia entre las diferentes proteínas. En el caso

de la proteína salvaje y el mutante W4OF se obtiene parecido valor de Tm <64 0C para

600

O 500a
ci,>
O
Co
E 400
o

ci,
300

-y;,

i5 200
a
U>
a

100

o

Longitud de onda (nm)
320 340 360 350 400 420 440

-114-



Resultados y Discusión

la proteína salvaje y 61 0C para el mutante W4OF>, mientras que esta temperatura es
algo menor en el caso del mutante W126F (53 0C> y el doble mutante <54%>. Por lo

tanto, parece que la mutación del Trpl 26 si parece afectar algo a la estabilidad
térmica de la proteína y esta inestabilidad se sigue manteniendo para el doble
mutante.

Figura 44. curvas de desnaturalización térmica de las proteínas FIV-rp24, W4OF, W126F y
W40/126F. La temperatura se incrementó a una velocidad de 30 0C/hora. La concentración de
la proteína empleada estuvo entre 0.1-0.2 mg/ml y todas ellas se encuentran en un tampón
fosfato sódico 10 mM, pH 7.0.

-8 .4

-10 -6

-12 -8

__ -14 -10

-16 -12
-14

~ -18
E -16
o
,< -20 -18
o
tu

-4o> -8
o -6
1~

>< -10
-8

...~ -12
-10

-14
-12

-16
-14

-18 -16

Temperatura <0C)

30 35 40 45 50 55 60 65 30 35 40 45 50 55 60 65

-115-



Resultados y Discusión

Ya que la estructura tridimensional de la proteína p24 de HIV-1 es conocida,
y hay una gran homología de secuencia entre esta proteína y p24 de FIV, podemos
hacer una comparación entre ambas y observar qué posiciones ocuparían los residuos
de triptófano de p24. de FIV en la estructura de p24. de HIV-1. Uno de los residuos,
el que se encuentra en la posición 126 en la secuencia de p24 de FIV, se encuentra
conservado en la secuencia de p26 de EIAV y hay un residuo de triptófano muy
próximo en la secuencia de p24 de HIV. Ambos residuos se encuentran en dos hélices
alfa, las denominadas E y G, que aparecen en el extremo amino-terminal de p24 de
HIV-1 (Momany et al., 1996>. Estas dos hélices junto con otras tres hélices alfa más

<A, C, y D> forman una estructura superenrrollada <colled col!). Las secuencias de
aminoácidos de las hélices tienden a una repetición en heptadas (a, b, c, d, e, f, g)
presentes en las secuencias de estructuras superenrrolladas <Cohen y Parry, 1990>.
En la estructura de la proteína p24 de HIV, las posiciones a, d y e tienen tendencia
a estar ocupadas por aminoácidos hidrofóbicos, mientras que las posiciones b, c, f
y g son más hidrofílicas y se encuentran en el exterior de la estructura. Una vista
desde el interior de la proteína de la cápsida de HIV-1 de la estructura superenrrollada
aparece en la Figura 45 (Momany et aL, 1996). En esta figura se han sustituido los
aminoácidos de la proteína p24 de HIV-1 por los correspondientes de la proteína p24
de FIV. Según el alineamiento de secuencia de esta proteína con la proteína p24 de
FIV, el Trp4O ocuparía la posición g en la heptada de la hélice E, mientras que el
Trpl 26 estaría en la posición g de la hélice G.

A la vista de la Figura 45, puede observarse que el triptófano 126 se encuentra

en un entorno más hidrofílico que el triptófano 40. En el espectro de dicroísmo que
correspondía a la contribución del Trpl 26 al espectro de dicroísmo de la proteína
salvaje, había una banda a que sufría un desplazamiento hacia el azul, que indicaba
que este residuo podría encontrarse en un entorno más hidrofflico que el Trp4O. Este
resultado coincide con lo comentado anteriormente en relación a la posición que
ocupa este triptófano en la estructura de p24 de HIV-1.

Una de las diferencias entre el mutante sencillo W4OF y el mutante W1 26F es
la diferente contribución de los residuos de tirosina al espectro de emisión de la
proteína excitando a 275 nm. Esta contribución resultó ser menor en el caso de
W4OF, mientras que al mutar el Trpl 26 por fenilalanina aumentaba la emisión de los
residuos de tirosina. Según la Figura 45, en la hélice O hay un residuo de tirosina en
la posición d de la heptada. Este residuo se encuentra justo al lado del Trpl 26 en la
secuencia, mientras que en la estructura tridimensional está algo más alejada. Sin
embargo, puede que estén lo suficientemente cerca como para que haya un proceso

-116-



Resultados y Discusión

de transferencia de energía de la tirosina al triptófano. Por ello, al mutar el Trpl 26

desaparece este proceso de transferencia y la tirosina es capaz de emitir, aumentando
así su contribución al espectro de emisión de

E

SI

TM

AEA

la proteína.

EA

F

a oC
VF

d B b ET
Abojo

9 f L
¡ MK W o

EA

Héptada
Hélice c 49

Hélice A 17

Hélice B 43
Hélice 0 126

Hélice D 83

Héptada

abcdefgabcdefgabcdefg

STDMATLIMSA

PKMVS 1 FMEKAR

FATFULQVEE

ARMQCRAWYLEALGKLAAI

TRDYEATMQKLTEDLIEKDAA

dcbagf edcb a q fe dcbagfed

Héptada
59
29

4— 34

144

— 63
Héptada

Figura 45. (A) Estructura superenrrollada de la proteína de la cápsida de FIV compuesta por las
hélices A, B. C. O y G vista desde el interior de la cápsida viral. ‘Abajo’ significa que el extremo
carboxilo-terminal de la hélice es lo que está más alejado de la vista, mientras que ‘arriba’ implica
que los extremos amino-terminales de las hélices se encuentran enfrentados a la vista y están en
el interior del núcleo central. Las héptadas a, b, c, d, e, f y g a lo largo de las hélices se muestran
con sus aminoácidos en código de una letra. En negrita están señalados los dos residuos de
triptófano de la proteína p24 de FIV. (B) Alineamiento cíe las héptadas a lo largo de las cinco
hélices que forman la estructura superenrrollada del extremo amino-terminal de la proteína p24
de FIV. Las héptadas [a, b, c, d, e, f, gJ se muestran en la línea superior par las hélices que van
desde el exterior hacia el interior de la cápsida y en la línea de abajo para las hélices que van
desde el interior hacia el interior. Los núemros de la secuencia corresponden al primero y último
residuo de cada hélice. (Momany et al., 1996)

KLY

lCR

E

Al

AWK

AG

M LA

-117-



Resultados y Discusión

2.C. ESTUDIOS DE DESNATURALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA FIV-ro24

.

MECANISMO DE PLEGAMIENTO

El mecanismo mediante el cual las proteínas se pliegan hasta alcanzar su
conformación nativa desde una forma totalmente desorganizada es uno de los
problemas fundamentales en la biología molecular que aún está sin resolver. El
resolver el problema del plegamiento de las proteínas implica conocer como se alcanza
la estructura tridimensional partiendo de la estructura totalmente desplegada. La
mayoría de las proteínas purificadas pueden replegarse espontáneamente in vitro
después de haber sido completamente desnaturalizadas, de tal forma que la estructura
tridimensional de una proteína debe estar determinada por su estructura primaria
<Creighton, 1990). Para resolver este problema, se han hecho muchos intentos
dirigidos a comprender cuáles son los principios que gobiernan las interacciones entre
los aminoácidos que llevan a la formación de la estructura secundaria y terciaria de
una proteína. Estos intentos han sido tanto teóricos (Thomas, 1992; Bryngelson et
al., 1995; Dilí et aL, 1995; Hao y Scheraga, 1995). como experimentales (Kim y
Baldwin, 1990; Matthevvs, 1993; Fersht, 1993; Baldvvin, 1995; Creighton et a!.,
1996>. Sin embargo, el proceso a nivel molecular no está ni mucho menos resuelto.

Como se ha comentado anteriormente, los aminoácidos aromáticos se han
utilizado a menudo como sondas intrínsecas de las proteínas para seguir su
desnaturalización, renaturalización y su estabilidad. La elección de la proteína p24 de
FIV para llevar a cabo el estudio de su mecanismo de plegamiento se debe a que en
su secuencia posee dos residuos de triptófano. El resto de proteínas de las cápsidas
lentivirales también poseen residuos de triptófano en su secuencia: la proteína p26
de EIAV tiene tres y la proteína p24. de HIV-1 posee hasta cuatro triptófanos. Sin
embargo, para reducir el número de proteínas mutantes en construir y estudiar se
eligió p24 de liv. El cambio introducido para crear las proteínas mutantes es el de los
residuos de triptófano por fenilalanina. Se ha elegido este residuo debido a que emite
muy poca fluorescencia en relación a la tirosina y el triptófano, debido a su menor
rendimiento cuántico. Así mismo, en estudios de varias proteínas se ha observado que
las sustituciones de Trp por Phe son bien toleradas por las proteínas que siguen
manteniendo su conformación <Rule et aL, 1987; Loewenthal et al,, 1991; Locke et
aL, 1992).

En este caso se ha intentado estudiar este mecanismo a partir de las curvas de
desnaturalización de la proteína FIV-rp24 y sus formas mutantes. A partir de dichas
curvas puede estimarse la estabilidad de la proteína, es decir, cuál es la disminución
de la energía libre de Gibbs de una cadena polipeptídica sin estructura cuando se
pliega para formar la molécula de proteína en agua <Gupta et aL, 1996). También
estas curvas son muy útiles para ver la diferencia en estabilidad de proteínas que
difieren muy poco en su estructura química debido a diferencias en la secuencia de
aminoácidos o a alteraciones resultantes de modificaciones químicas, como ocurre
con la proteínas mutantes. Por último, las curvas de desnaturalización pueden
informarnos acerca del mecanismo mediante el cual la proteína alcanza su estructura
tridimensional. Por ejemplo, si el proceso de desnaturalización transcurre a través de

-118-



Resultados y Discusión

estados intermedios o se produce en un solo paso. El agente desnaturalizante elegido
ha sido la urea. La urea, junto con el cloruro de guanidinio, es uno de los agentes
desnaturalizantes más fuertes. La incubación de una proteína con urea o cloruro de
guanidinio la conduce a una completa desnaturalización <Miller eta!., 1967; Tanford,
1968; Flory, 1969> adoptando las propiedades de una estructura desordenada
(random col!>. No ocurre así con la desnaturalización de la proteína con cambios
extremos de pH o por variación de la temperatura (Dobson et al., 1984; Howarth y
Lian, 1984; Griko et al., 1988; Privalov et al., 1989>.

Las técnicas empleadas en el estudio de la desnaturalización de FIV-rp24 son
el dicroísmo circular y la fluorescencia. En el caso del dicroísmo, se ha medido la
elipticidad de la proteína a 220 nm a diferentes concentraciones de urea, mientras que
por fluorescencia se ha medido el desplazamiento de la longitud de onda del máximo
de emisión al ir aumentando la concentración de urea. Para obtener estas curvas, la
proteína se incubó en presencia de urea durante 16 horas a 4 oc para asegurarnos
que la reacción de desnaturalización alcanzaba el equilibrio. El intervalo de
concentraciones en el que se ha llevado a cabo los estudios de desnaturalización varia
entre O y 8 M urea. Entre estas dos concentraciones se produce la total
desnaturalización de la proteína. Cuando la proteína se ha incubado con urea 8 M
presenta un espectro de dicroísmo característico de una proteína con una estructura
desordenada. Por fluorescencia, el espectro de emisión obtenido de la proteína
desnaturalizada presenta su máximo de emisión desplazado hacia mayores longitudes
de onda, pues sus residuos aromáticos están ahora en un entorno más hidrofílico, en
contacto con las moléculas de disolvente. También puede observarse la aparición de
un hombro en la zona donde emiten las tirosinas, pues al estar la proteína
desnaturalizada, su fluorescencia no se ve apagado por los residuos próximos de
triptófano.

Una vez que se ha medido el cambio de las propiedades espectroscópicas de
las cuatro proteínas en función de la concentración de urea, se pueden manejar los
datos para calcular la fracción de proteína desnaturalizada, Fap, a cada concentración
de urea, empleando la ecuación reseñada en Métodos Experimentales.

-119-



Resultados y Discusión

CURVAS DE DESNATURALIZACIÓN OBTENIDAS POR DICROÍSMO CIRCULAR

En la Figura 46-A aparece la representación del valor de elipticidad molar media
por residuo a cada concentración de urea para la proteína FIV-rp24 salvaje. Con los
valores del parámetro estructural obtenidos se calcula la fracción de proteína
desnaturalizada <Fap) que hay a cada concentración de urea, cuya representación nos
permite obtener la curva de desnaturalización de la proteínas.

2 8

Figura 46. (A) Variación de la elipticidad molar por residuo a 220 nm con la concentración de urea
para la proteína FIV-rp24. (B> Representación de la fracción de proteína desnaturalizada (Fap)
frente a la concentración de urea para la proteína FIV-rp24. La desnaturalización de la proteína
se llevó a cabo incubando disoluciones de proteína con diferentes concentaciones de urea en
fosfato sádico 10 mM, TCEP 1 mM, pH 7.0. Las líneas continuas muestran la dependencia de
los coeficientes de la proteína nativa y desnaturalizada con la concentración de urea.

Con el resto de las proteínas, los dos mutantes sencillos y el doble mutante
puede seguirse el mismo procedimiento. En la Figura 47 aparecen representadas las
curvas de desnaturalización de las cuatro proteínas. En primer lugar lo que puede
observarse es que en todas las proteínas el proceso de desnaturalización es
cooperativo. La aparición de un hombro en las curvas de desnaturalización de la
proteína salvaje y los mutantes W4OF y W1 26F, nos permite pensar que el proceso
de desnaturalización de estas proteínas no se produce en un sólo paso, sino que
parece implicar, aparentemente, al menos un estado intermedio. La amplitud de la
primera transición es diferente en las tres proteínas, siendo más acentuada en el caso
de la proteína salvaje, mientras que para W1 26F apenas si se distingue. Así mismo,
para una misma proteína, las dos transiciones que se producen no son de igual

Fa p
lo

C’ -2
0.8

0
x
E 0.6

-8

o 04
D -10
c0

9-12
o 0.2

® -14

0.0

4

[UI<M)

o 6 8 10 0 2 4 lo

[U](M)

6

-120-



Resultados y Discusión

amplitud, sino que la primera transición resulta siempre ser de menor amplitud que la
segunda. Otra característica importante que reflejan las curvas de desnaturalización
de estas proteínas es que la primera transición se produce a una concentración
similar, alrededor de 4.0 M de urea, en todas las proteínas. Sin embargo, las mayores
variaciones se producen en la segunda transición. Este cambio ocurre en la proteína
salvaje y el mutante W4OF a una concentración de 6.25 M de urea, mientras que en
el mutante W1 26F y el doble mutante la concentración de urea se reduce a 5.25 M.
Es decir, las proteínas presentan una diferente estabilidad frente a la acción del
agente desnaturalizante, resultando ser menos estables W126F y W40/126F. Esta
variación en la concentración de urea a la cual se desnaturaliza la proteína parece
indicar que los residuos de triptófano, Trp4O y Trpl 26, se encuentran en diferentes
zonas de la proteína que no se pliegan de la misma forma.

Figura 47. Curvas de desnaturalización de la proteína FIV-rp24 (e) y los mutantes W4OF (vi.
W126F (U) y W40/126F (4) obtenidas por dicroísmo circular. El cálculo de la fracción aparente
se realizó midiendo la variación de la elipticidad molar media por residuo con la concentración de
urea. La desnaturalización de la proteína se llevó a a cabo incubando disoluciones de proteína con
diferentes concentaciones de urea en fosfato sódico 10 mM, TCEP 1 mM, pH 7.0.

CURVAS DE DESNATURALIZACIÓN OBTENIDAS POR FLUORESCENCIA

Aparentemente, en las curvas de desnaturalización obtenidas por fluorescencia
midiendo con una longitud de onda de excitación de 275 <Fig. 48), no se observa la
existencia de hombros, exceptuando el caso de la proteína W1 26F, donde hay un
hombro que aparece a altas concentraciones de urea. Lo que sí se puede observar,

F ap

1 .0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0 2 4 6 8

U] (M)

-121-



Resultados y Discusión

como ocurría con las curvas de desnaturalización obtenidas por dicroísmo, es que hay
una diferente estabilidad de las proteínas frente a la urea, pues el mutante sencillo

W1 26F y el doble mutante se desnaturalizan a una concentración de urea menor. Esta
concentración pasa de alrededor de 6.5 M para la proteína salvaje y W4OF, a 5.8 M
para W126F y 4.5 M para el doble mutante. Si se comparan estas concentraciones
con las concentraciones de urea a las cuales se producía la segunda transición
recogida en las curvas por dicroísmo, se observa que resultan ser algo diferentes a
las obtenidas en las curvas por fluorescencia. Esta diferencia entre los resultados
obtenidos mediante dos técnicas diferentes indican, una vez más, que el proceso de
desnaturalización de la proteína p24 y sus formas mutantes transcurre a través de
estados intermedios.

Figura 48. curvas de desnaturalización de la proteína FIV-rp24 (e) y los mutantes W4OF CV).
W16F (u) y W40/126F (•) obtenidas por fluorescencia. El cálculo de la fracción aparente se
realizó midiendo la variación de la longitud de onda del máximo del espectro de emisión medido
con una longitud de onda de excitación de 275 nm con la concentración de urea. La
desnaturalización de la proteína se llevó a a cabo incubando disoluciones de proteína con
diferentes concentraciones de urea en fosfato sódico 10 mM, TCEP 1 mM, pH 7.0.

Midiendo la fluorescencia a 295 nm seguir los procesos de desnaturalización

de la proteína salvaje y los mutantes sencillos, ya que el doble mutante, al carecer de
residuos de triptófano, no emite fluorescencia. En las curvas de desnaturalización de
la proteína salvaje y el mutante W1 26F (Fig. 49) hay unos pequeños hombros que
podrían ser indicativos de diferentes transiciones. No ocurre así con el otro mutante
sencillo, W4OF, que claramente presenta una curva correspondiente a un proceso de
desnaturalización en el que hay presentes dos especies.

Fap i.o

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

[U M)....

0 2 4 6 8

-122-



Resultados y Discusión

Figura 49. Curvas de desnaturalización de la proteína FIV-rp24 (e) y los mutantes W4OF (Y).

W126F (U). El cálculo de la fracción aparente se realizó midiendo la variación de la longitud de
onda del máximo del espectro de emisión medido con una longitud de onda de excitación de 295
nm con la concentración de urea. La desnaturalización de la proteína se llevóa a cabo incubando
disoluciones de proteína con diferentes concentaciones de urea en fosfato sódico 10 mM, TCEP
1 mM, pH 7.0.

ANÁLISIS DE LAS CURVAS DE DESNATURALIZACIÓN

Hay varios modelos para analizar las curvas de desnaturalización por agentes
desnaturalizantes como el cloruro de guanidinio o la urea y obtener información
termodinámica a partir de ellas, como puede ser la variación de la energía libre del
proceso. La obtención de esta información termodinámica siempre es posible si el
proceso de desnaturalización de las proteínas es un proceso reversible. Así ocurre con
la proteína FIV-rp24 salvaje y las proteínas mutantes, pues cuando la concentración
de urea de una disolución de proteína en presencia de urea 8 M se diluye a la mitad,
la proteína recupera las propiedades espectroscópicas de dicroísmo y de fluorescencia
que tenía a esa concentración de urea.

Fap 1.0

0.8 -

0.6 -

0.4 -

0.2 -

0.0

0 2 4 6 6

[U] (M)

-123-



Resultados y Discusión

Los modelos que se han empleado para analizar las curvas de desnaturalización
de FIV-rp24 salvaje y las proteínas mutantes son el modelo de la extrapolación lineal
(Pace, 1986> y el modelo de unión del agente desnaturalizante (Tanford, 1970), que
se describiren a continuación.

A. MODELO DE EXTRAPOLACIÓN LINEAL

Considerando un modelo de dos estados, en el que únicamente están presentes
dos especies en el equilibrio, nativa y desnaturalizada, se puede calcular la variación
de energía libre para cada concentración de urea mediante la ecuación:

AG = -R T~LnK~,

donde:
- A es la constante de los gases, cuyo valor es 1.987 cal’mol-1
- T es la temperatura en K, 298 K en todos los casos
- Kap es la constante del proceso de desnaturalización a cada
concentración de urea.

El método de extrapolación lineal (Pace, 1986> se asume que hay una
dependencia lineal de AG con la concentración de urea en la zona de la transición.
Ajustando los datos a la ecuación [E], que aparece en Métodos Experimentales, y
extrapolando a concentración de urea cero se puede estimar el valor de ~Gn,o, la
variación de energía libre en ausencia del agente desnaturalizante.

En la Tabla XIV aparecen los valores de AGH,o obtenidos mediante el ajuste
lineal de los datos de AG representados frente a la concentración de urea, junto con
los valores de la dependencia con la concentración, m, y la concentración de urea a
la que la hay un 50% de proteína desnaturalizada. Estos valores se comparan para
las dos técnicas empleadas para seguir la desnaturalización de FIV-rp24 y las
proteínas mutantes.

-124-



u,
o

(O
CD

o.)CDO
to

o
r-.

e
-o

to

r~
Co

L
o

co
Lo

eCDe

4

st
CO

‘—
o

<N
aj

iD
e

e
e

r
(D

O
O)

—
O

—
O

(D
r-C

O
r~

o->
Co

C
N

O
)

CD
(OCo

C
O

0
0

)
CD

s
t

l
O

~tu
-

u
-

5
-

u-

0>
.5

4

>

4-’
u>

E
E

=
o

o
e>

Ca

e
e

LO
LO

u>
r—

O
)

O
N

CN
~0<0

~>
4>

ca
D

~tj
e

e
E

2
0

‘1>
o

ua,
u>

—
2

~
E

4>
0>

0
.

4>
a>

u>
-D

~
D

o
<~

<e
-
J

.
D

~
D

•
C

E
£

0>
4>

a
,

.r
fl

r
<

e
D

~D

D
0>

<e
c
a

e
e

~
~~o

o
—

E
tu

‘0
4

>
<~

~
e

<e
—

.~
c

e
C

o
e

c
o

o
~or~o

Oo
5

=
~

r
.:2-D4>

~
Eoo4>au>a,

~W
>C

Q
>

-~
4
>
~
D

0oE

5
~

C
N

E
E

~
.~<e

<e
a

W
9

0
-D

0
D

O
C

Co0>
C

5
j3

J
D

D

~cn
a

,4
>

—
1~

u
>

4
>

ca
0

o
o

-D
Co

—
_<e

¡
C

r—
0

0
4

>
0

>
4>

.E
N

.D
r

t
o

a
,c

e
E

-‘o
-g

~
a

<e
~

<e
~<e

.c
n

E
—

>
>

4
>

>
c
>

<
e

—

C
C

—
C

~
C

o.
a,

a,
Q>

‘o
4>

‘
0

•
-D

D
:2

.~
:2

=
5

~
E

~
E

~
—

—
><

o.
a,

~
e

4>
e

L
O

E
<

e
co

ko
O

U
LI..

Ca
L

S

<Oe,
u-LOr-.

u
-

ou

<Oo,04
u

-u,04
u

-

o(~1Loe,04
u

-LO0404
u

-

ou

caoE(aoEoE<aoo

it)C’J



Resultados y Discusión

En el caso de la proteína FIV-rp24 se obtienen valores parecidos de AGH,o y de

la dependencia de este parámetro con la concentración de urea, m, exceptuando
cuando se mide el desplazamiento de la longitud de onda del máximo del espectro de

emisión excitando a 275 nm. En este caso, el valor de AGÑ,o resulta ser prácticamente
el doble. No ocurre así con la concentración de urea a la que la mitad de la proteína
se encuentra desnaturalizada, Q12. Este valor es diferente según se siga la
desnaturalización mediante dicroísmo circular o fluorescencia, lo que nos indicaría la
existencia de especies intermedias en el proceso de desnaturalización. Para el resto
de las proteínas ocurre algo parecido, los valores de los parámetros obtenidos
mediante este ajuste difieren según sea la técnica empleada. Esta diferencia puede
achacarse en parte, primero, al número de puntos utilizados en el ajuste lineal, pues
han de emplearse únicamente fas concentraciones de urea a la que se produce la
transición. Así mismo, en las curvas de desnaturalización puede observarse
claramente, que algunas proteínas presentan diferentes transiciones, lo que indicaría
que hay estados intermedios. Este modelo supone en todo momento que el estado de
equilibrio implica únicamente dos especies, la nativa y la desnaturalizada.

Si comparamos los valores de C112 de la proteína salvaje y de las proteínas
mutantes, observamos la diferente estabilidad de estas proteínas frente a la
desnaturalización por urea, tal y como podíamos apreciar en las curvas de
desnaturalización. Es decir, el mutante W1 26F y el doble mutante son menos estables
que la proteína salvaje y W4OF, pues su C~12 es menor siempre, sea cual sea la
técnica de medida. El doble mutante es el que tiene una C112 más pequeña, es decir,
es el que primero se desnaturaliza en presencia de urea.

6. MODELO DE UNIÓN DEL AGENTE DESNATURALIZANTE

En este modelo se asume que durante el proceso de desnaturalización las
moléculas del agente desnaturalizante se unen a grupos peptidicos o a una cadena
lateral de un aminoácido. Se pueden calcular la transferencia de energía libre desde
una disolución acuosa a una disolución de urea o cloruro de guanidinio para un grupo
peptídico o para las cadenas laterales de distintos aminoácidos y a partir de ellas las
constantes de unión, k (Pace, 1986>. Cuando una proteína se desnaturaliza en
presencia de urea, la mayoría de los grupos peptídicos están más expuestos al
disolvente que las cadenas laterales. Por ello el valor de la constante de unión de la
urea a un dipéptido puede representar el valor medio más razonable para utilizarla en

-126-



Resultados y Discusión

la ecuación [6,7] (Métodos Experimentales) y analizar las curvas de desnaturalización.
El valor empleado en todos los análisis de las curvas de desnaturalización de las
proteínas ha sido k=0.1, que es el valor medio anteriormente mencionado (Pace,
1986).

Para cada curva de desnaturalización de las diferentes proteínas, y para cada
técnica, se ha intentado ajustar los datos experimentales a un modelo de dos estados
(ecuación [6]) o a un modelo de tres estados (ecuación [7]) y estos ajustes se
representan en las Figuras 50, 52 y 53.

En la Figura 50 se representan las curvas de desnaturalización obtenidas
mediante la técnica de dicroísmo para la proteína salvaje, los mutantes sencillo y el
doble mutante. Junto a los datos experimentales se representan los ajustes de dichos
puntos por el modelo de unión de las moléculas del agente desnaturalizante. Este
ajuste puede ser según un modelo que implique dos o tres especies en el proceso de
desnaturalización.

Figura 50. Ajuste de las curvas de desnaturalización de las proteínas FIV-rp24 (A). W4OF (EL
W12OF (C) y W40/126F (D) a un modelo de dos (~) o tres estados (— — — —). Para el doble
mutante únicamente se representa el ajuste realizado con el modelo de dos estados porque el
correspondiente al modelo de tres estados es prácticamente coincidente. Los parámetros de todos
los ajustes se recogen en la Tabla xv.

1.0 10

0.6 08

0.6 06

04 04

0.2 02

00 00F Fap 1.0 10 •P

0.6 08

0.6 06

0.4 04

0.2 02

0.0 00

2 4 6 8 0 2 4 6 8

[UI (M)

-127-



Resultados y Discusión

En dos de las cuatro proteínas claramente el modelo de tres estados ajusta
mejor los datos experimentales. Esto ocurre con la proteína salvaje y el mutante
sencillo W4OF. No ocurre así con el mutante W126F y el doble mutante, donde el
ajuste según el modelo de dos estados es prácticamente coincidente con el de tres
estados. De estos ajustes se obtienen una serie de parámetros cuyos valores
aparecen en la Tabla XV.

AG1H
2o

(kcal~ mor
1)

AG2H,O

<kcal~ mo[1)

AGTH,O

<kcal~ mo[’)

Aa, An
2 Z

SE SE 28 SE 2E’ SE SE 38

FIV- rp24 12.2 9.7 5.4 21.9 21.2 61.4 35.4 0.3

W4OF 12.2 11 .0 6.6 23.2 26.6 66.5 42.4 0.2

W1 26F 5.0 6.06 7.3 11.0 30.8 20.8 26.1 0.5

W40/126F 7.9 4.1 8.2 11.9 37.5 35.5 17.1 0.9

Tabla XV. Parámetros de ajuste de las curvas de desnaturalización obtenidas por dicroísmo a un modelo
de dos (2E1 o tres estados (3E1. AG’H,o,variación de energía libre correspondiente a la transición del
estado nativo al estado intermedio; AG%o, variación de energía libre correspondiente a la transición
del estado intermedio al estado desnaturalizado; An1, diferencia en el número de sitios de unión para
la urea de las conformaciones nativa e intermedia; An2, diferencia en el número de sitios de unión para
la urea de las conformaciones intermedia y desnaturalizada; Z, cambio fraccional de la señal de
dicroísmo en la transición del estado nativo al intermedio. la) diferencia en el número de sitios de unión
para la urea para la proteína nativa y desnaturalizada.

Como puede observarse en la columna correspondiente a la variación de

energía libre total del proceso de desnaturalización, ésta es siempre mayor en el caso
de considerar un modelo de tres estados que en el del modelo de dos estados. Así
mismo, para tres de las cuatro proteínas, la primera transición, de la forma nativa a
la intermedia, parece estar ligeramente menos favorecida que la segunda transición

de la forma intermedia a la desnaturalizada. Únicamente en el caso de W1 26F, la
primera transición está algo más favorecida, pues la variación de energía libre es
menor. Si comparamos la estabilidad de la proteína salvaje con la de los mutantes,

resulta que tanto la proteína salvaje como el mutante W4OF tienen una estabilidad
parecida, mientras que el mutante W126F y el doble mutante son menos estables.

Una vez calculadas las constantes de los equilibrios de desnaturalización, en

el caso de las proteínas cuyas curvas se ajustan mejor con un modelo de tres

-128-



Resultados y Discusión

estados, se pueden calcular las fracciones de las formas nativa (fa), intermedia <f1> y

desnaturalizada (fd> a diferentes concentraciones de urea. Las ecuaciones empleadas
para ello son:

exp[-AG’/RT] — = ti h

exp[-AG
2/RT] = = ~d ¡ f

f~ + f~ + ~d = 1

La representación de las fracciones frente a la concentración de urea aparece
en la Figura 51 para las proteínas FIV-rp24, W4OF, W126F y W40/126F.

Figura 51. Representación de la fracción de las formas nativa, intermedia y desnaturalizada a cada
concentración de urea para las proteínas FIV-rp24. W4OF, W126F y W40/126F obtenidas con
los parámetros termodinámicos resultantes del ajuste de los datos experimentales de las curvas
de desnaturalización a un modelo de tres estados. Forma nativa (O), forma intermedia (u) y forma
desnaturalizada (Y) . Las curvas de desnaturalización se obtuvieron midiendo la variación de la
elipticida molar media por residuo a 220 nm con la concentración de urea.

Como puede observarse en la gráfica correspondiente a la proteína FIV-rp24
salvaje, la forma intermedia es la forma predominante a una concentración de urea
5.2 M, alcanzando un valor F

8p igual a 0.9. Si analizamos las curva de
desnaturalización de FIV-rp24 (Fig. 50), podemos ver cómo a esta concentración es
donde aparece el hombro correspondiente a la primera transición. Así mismo, también

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

—.—-- f o.o

st

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

[U](M)

0 2 4 6 6 0 2 4 6 8

-129-



Resultados y Discusión

coincide el valor de F0,, a esta concentración de urea con el valor del parámetro Z que

se obtiene en el ajuste con el modelo de tres estados (Tabla XV>. La forma
desnaturalizada comienza a aparecer a partir de una concentración ligeramente menor,
siendo la forma predominante cuando la concentración es 6.5 M. De la misma forma
se pueden analizar los resultados obtenidos con las formas mutantes. En el caso del
mutante W4OF, claramente hay una presencia de un estado intermedio en el proceso
de desnaturalización. Esta forma predomina a una concentración 4.8 M de urea, que
es la misma concentración a la que se produce la primera transición. Para el mutante
W12GF y el doble mutante, los resultados son algo diferentes. A ninguna
concentración de urea la forma intermedia es predominante, aunque alcanza su
máximo a una concentración 5.3 M, concentración que coincide con la C112 obtenida
en el ajuste mediante el método de extrapolación lineal.

De la misma forma que se hace con las curvas de desnaturalización obtenidas
por dicroísmo circular, se pueden ajustar las curvas obtenidas siguiendo el proceso
de desnaturalización por fluorescencia excitando a 275 y 295 nm. Los ajustes
obtenidos empleando el modelo de dos o el de tres estados aparecen en las Figuras
52 (longitud de onda de excitación de 275 nm) y 53 (longitud de onda de excitación
de 295 nm> y los valores de los parámetros termodinámicos obtenidos a partir de

estos ajustes se recogen en la Tabla XV.

En el caso de las curvas de desnaturalización de la Figura 52, sólo en el caso
de la proteína FIV-rp24 salvaje y el mutante W1 26F el ajuste de los datos
experimentales se mejora con el modelo de tres estados. Según los datos recogidos
en la Tabla XV, las dos transiciones presentan una variación de energía libre muy
similar, así como también es muy parecida si comparamos las variaciones de la
proteína salvaje con la proteína mutante. Para la proteína W4OF y el doble mutante,
sólo se representa el ajuste conseguido con el modelo de dos estados, pues el otro
es coincidente. El valor de la variación de energía libre total del proceso es muy
parecido para todas las proteínas si tenemos únicamente en cuenta el ajuste con el
modelo de dos estados.

-130-



Resultados y Discusión

Figura 52. Ajuste de las curvas de desnaturalización obtenidas por fluorescencia de las proteínas
FIV-rp24 (A), W4OF (6), W126F (C) y W40/126F (D) a un modelo de dos (—) o tres estados

— — -1. En el caso del mutante sencillo y el doble mutante únicamente se representa el ajuste
realizado con el modelo de dos estados porque el correspondiente al modelo de tres estados es
prácticamente coincidente. Los parámetros de todos los ajustes se recogen en la Tabla XV.

La representación de las fracciones de las distintas formas presentes en el
proceso de desnaturalización coincide con lo que se puede observar a simple vista en

la curva de desnaturalización de la proteína FIV-rp24 salvaje y el mutante W1 26F.
Para la proteína FIV-rp24, la forma intermedia es muy minoritaria, alcanzando su
máximo a una concentración 6.4 M de urea, que coincide con la concentración de

urea a la que la mitad de la proteína se encuentra desnaturalizada <C112>. Sin embargo,
en el mutante W1 26F hay una segunda transición, a concentraciones altas de urea,
que no se apreciaba en el caso de las curvas de desnaturalización obtenidas por
dicroísmo, y es donde la forma intermedia es mayoritaria (6.5 M). Esta forma
intermedia incluso está presente cuando la concentración de urea es 8 M.

2 6 8

1.0 1.0

0.8 0.5

0.5 0.6

0.4 0.4

0.2 0.2

0.0 0.0

F ~.o 1.0ap

0.5 0.8

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 0.2

0.0 0.0

4 6 8

[U](M)

0 2 4 6 8 10 0 2

-131-



Resultados y Discusión

Figura 53. Representación de la fracción de las formas nativa. intermedia y desnaturalizada a cada
concentración de urea para las proteínas FIV-rp24 salvaje y W126F obtenidas con los parámetros
termodinárnicos resultantes del ajuste de los datos experimentales de las curvas de
desnaturalización a un modelo de tres estados. (e> forma nativa, (Y) forma intermedia y (U) forma
desnaturalizada. Las curvas de desnaturalización se obtuvieron midiendo la variación de la
longitud de onda del máximo del espectro de emisión de fluorescencia excitando a 275 nm con
la concentración de urea.

Por último, hay que analizar los resultados obtenidos con las curvas de

desnaturalización de la Figura 54. Como ocurría con el ajuste de las curvas de
desnaturalización de la Figura 52, sólo en el caso de la proteína FIV-rp24 salvaje y el
mutante W1 26F, el modelo de tres estados ajusta mejor los datos experimentales. Los

resultados obtenidos de los ajustes de las tres curvas se recogen en la Tabla XV. Para
FIV-rp24 y W1 26F se hace la representación de las fracciones de las formas nativa,
intermedia y desnaturalizada frente a la concentración de urea que aparecen en la

Figura 55.

-132-



Resultados y Discusión

Figura 54. Ajuste de las curvas de desnaturalización obtenidas por fluarescencia de las proteínas
FIV-rp24 (A). W4OF (EL W126F (O) a un modelo dedos () o tres estados (— — — —). En el
caso del mutante sencillo y el doble rnutante únicamente se representa el ajuste realizado con el
modelo de dos estados porque el correspondiente al modelo de tres estados es prácticamente
coincidente. Los parámetros de todos los ajustes se recogen en la Tabla XVI.

De nuevo hay una práctica coincidencia entre la concentración a la que la
forma intermedia es predominante (5.5 M para la proteína FIV-rp24 y 4.4 M para
W1 26F> con la concentración a la que aparece un hombro en las curvas de
desnaturalización (5.2 M para FIV-rp24 y 4.2 M para W1 26F). En el caso del mutante
W4OF, la concentración Q12 coincide también con la C112 obtenida en el ajuste
mediante el modelo de extrapolación lineal (Q12 = 6.4 Ml.

-133-



Resultados y Discusión

-r

— fi

0 2 4 6 8 0 2 4 6 8

u~ (M)
Figura 5o. iepresentacion de ia ~racc¡onpelas formas nativa. untermedía y desnaturalizada a cada
concentración de urea para las proteínas FIV-rp24 y W126F obtenidas con los parámetros
termodinámicas resultantes del ajuste de los datos experimentales de las curvas de
desnaturalización a un modelo de tres estados. (e) forma nativa, (Y) forma intermedia y (U) forma
desnaturalizada. Las curvas de desnaturalización se obtuvieron midiendo la variación de la
longitud de onda del máximo del espectro de emisión de fluorescencia excitando a 295 nm con
la concentración de urea.

AG’i~o
(kcaI~ mol~’l

AG2wo Ikcal~
maL1)

AGTH,o
(kcal- mol~1l

An
1 A,,2 Z

SE SE 2E SE 2E SE SE SE

A275

FIV-rp24 11.7 10.5 11.7 22.3 42.1 41.2 39.9 0.1

W40F

W 1 26P 9.9 21.2 42.9 SF2 29.8 0.8

W40/1 26F

A295

FIV-rp24 3.2 10.2

W4OF

W126F 8.43 12.1 6.8 28.4 31.4 50.0 52.8 0.3

Tabla XVí. Parámetros de ajuste de las curvas de desnaturalización obtenidas por fluorescencia a un
modelo de dos <2E) a tres estados (3E). AG’H2o,variación de energía libre correspondiente a la transición
del estado nativo al estado intermedio; AG%o, variación de energía libre correspondiente a la transición
del estado intermedio al estado desnaturalizado; An,, diferencia en el número de sitios de unión para
la urea de las conformaciones nativa e intermedia; An2, diferencia en el número de sitios de unión para
la urea de las conformaciones intermedia y desnaturalizada; 7, cambio fraccional de la señal de
dicroísmo en la transición del estado nativo al intermedio. la) diferencia en el número de sitios de unión
para la urea para la proteína nativa y desnaturalizada.

-134-



Resultados y Discusión

Con todos los datos obtenidos mediante el análisis de las curvas de

desnaturalización seguidas mediante dos técnicas espectroscópicas diferentes
podemos aventurar un modelo para explicar el mecanismo de plegamiento de la
proteína FIV-rp24. Cuando el proceso de desnaturalización se sigue por dicroísmo
circular, se aprecian dos transiciones en el caso de la proteína salvaje y el mutante

W4OF, que se producen a unas concentraciones de urea similares. Una primera
transición a una concentración 5.2 M para FIV-rp24 y algo menor en el mutante
W4OF, 4.7 M, y una segunda transición a 6.2 M (FIV-rp24> y 6.0 M (W4OF>. Con el
mutante W1 26F y el doble mutante, por dicroísmo circular, sólo se puede apreciar la
primera transición a concentraciones 5.3 M (W126F> y 4.9 M (W40/126F). Hay
también una pequeña transición en el mutante W126F a una concentración 4.0 M,
que es de una amplitud muy baja, por lo que podríamos considerarla una pre-
transición. Si el proceso de desnaturalización se estudia mediante la técnica de
fluorescencia, volvemos a distinguir dos transiciones en la proteína salvaje, a
concentraciones algo superiores a las obtenidas por dicroísmo circular en el caso de
las curvas obtenidas midiendo con una longitud de excitación de 275 nm, pero muy
similares cuando la longitud de excitación es de 295 nm. Si embargo, por esta técnica
sólo una transición se puede apreciar en el mutante W4OF, la correspondiente a
concentraciones más altas de urea. En el mutante W1 26F los resultados son
diferentes según la longitud de onda de excitación; mientras que se distinguen dos
transiciones cuando la longitud de onda de excitación empleada es de 275 nm, sólo
una se observa excitado a 295 nm a una concentración 5.1 M, aunque también se
vuelve a distinguir la pre-transición observada mediante dicroísmo a una
concentración algo superior, 4.2 M. Por último, para el doble mutante solamente se
aprecia la primera transición, a una concentración 4.6 M.

Los resultados sugieren que, con respecto a la estructura secundaria, hay una

diferencia entre la proteína salvaje y el mutante W4OF en relación al mutante W126F
y el doble mutante. Parece ser que el Trp4O en la proteína FIV-rp24 se encuentra en
un entorno en el que la pérdida de estructura secundaria se produce a
concentraciones de urea menores, mientras que el Trpl 26, que es el que está
presente tanto en la proteína salvaje como en el mutante W4OF, está en un entorno
diferente, menos expuesto a la acción del agente desnaturalizante. En cuanto al
estudio del entorno tridimensional de estos dos residuos de triptófano en la proteína,
los resultados obtenidos midiendo la fluorescencia emitida por las proteínas excitando
a 295 nm, longitud a la cual sólo se mide la fluorescencia emitida por los residuos de

triptófano, vuelven a obtenerse parecidas conclusiones. Es decir, el Trpl 26 se
encuentra en un entorno, ya que la desnaturalización del mutante W126F refleja

-135-



Resultados y Discusión

únicamente la transición a bajas concentraciones de urea, mientras que para el

mutante W4OF se observa la segunda transición. Si nos fijamos en la Figura 45,
ambos residuos de triptófano ocupan posiciones correspondientes a dos hélices de
la estructura superenrrollada del extremo amino-terminal. El Trpl 26 parece estar algo
más expuesto al disolvente que el Trp4O, como también se puede apreciar en los

espectros de discroísmo circular en el UV próximo, sin embargo, la desnaturalización
con urea afecta más al entorno del Trp4O, lo que hace que el mutante donde sólo este
residuo de triptófano está presente se desnaturalice a más bajas concentraciones de
urea.

-136-



CONCLUSIONES



Conclusiones

PAPEL DE LOS GRUPOS SULFHIDRILO EN EL MANTENIMIENTO DE LA
ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA p26 DE EIAV

O La proteína p26 se obtiene en condiciones nativas. El elemento de
estructura secundaria mayoritario es la hélice a, en claro contraste con
el modelo propuesto de barril !3 para la proteína p24 de HIV-1.

• La proteína rp26 se comporta como un monómero de 26 kDa, tanto en
PAGE-SDS, en ausencia o presencia de agentes reductores, como en
cromatografía de penetrabilidad hasta una concentración de 20 mg/ml.

• La proteína rp26 es reconocida por anticuerpos presentes en suero de
caballo infectado por EIAV, tanto en condiciones nativas (ELISA) como
desnaturalizantes (inmunodetección).

O Las proteínas pUC/rp26 y pKK/rp26 tienen distinto contenido en grupos
SH libres, 2.2 frente a 1.1, y diferente estructura secundaria:

[pUC/rp26 (pKK/rp26 1

Estructura a 40 50

Estructura 1~ 26 1

Giro ¡3 12 15

Estr. no ordenada 22 34

§ La diferente estructura de pUC/rp26 y pKK/rp26 se refleja en los
parámetros ~a’ fracción de fluoróforos accesibles, siendo mayor cuanto
menor es el número de SH libres, y en el valor de la elipticidad A pesar
de que la proteína pKK/rp26 tiene una estructura más accesible, la
temperatura de desnaturalización térmica es ligeramente mayor (55.0
frente a 53.8 0C>.

§ Existe una relación entre el contenido de SH y el espectro de dicroísmo
circular. El cambio confromacional al formarse el puente disulfuro podría
implicar un aumento en el porcentaje de lámina 13 de la proteína
pKK/rp26.

O El cambio del residuos de Cys48 por Ser provoca cambios poco
importantes en la estructura tridimensional de la proteína rp26, según
sus espectros de CD en el UV lejano y de fluorescenci y su estabilidad
térmica.

-138-



Conclusiones

O El mutante tiene 1 .6 grupos SH, lo que indica que el 80% de las
moléculas están totalmente reducidas. Al igual que ocurre en rp26, en
el caso del mutante es importante el estado de oxidación. En este caso
al reducir la proteína, el cambio es menos significativo puesto que se
pasa de 1.6 a 1 .7 grupos SH libres. Sin embargo, la oxidación modifica
el espectro de CD en el UV lejano y provoca un aumento del parámetro

~a Este cambio no tiene ningún reflejo en los espectros de fluorescencai
ni en la temperatura de desnaturalización térmica.

§ La proteína rp26-His posee las mismas características estructurales que
rp26. Se obtiene mayor cantidad y, en principio, se puede utilizar en
estudios estructurales (RMN).

ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA p24 DE LA CÁPSIDA DEL VIRUS DE
LA INMUNODEFICIENCIA FELINA (FIV). MECANISMO DE PLEGAMIENTO

O Se ha donado la proteína p24 de FIV y se han obtenido dos mutantes
sencillos de Trp y un mutante doble. La hélice a es mayoritaria en todas
(da cuenta de un 50%) y no hay estructura 13. Las mutaciones no
afectan la estructura secundaria.

§ A partir de los espectros de CD en el Uy próximo de las formas
mutantes se ha podido determinar la contribución individual de los dos
triptófanos. Ef espectro original se puede recomponer a partir de las
mencionadas contribuciones y del espectro del doble mutante que
proporciona la contribución de las siete tirosinas que hay en la proteína.
Excepto en la zona de 250-265 nm, los espectros son peácticamente
coincidentes, lo que indica que el ordenamiento tridimensional en los
alrededores de los Trp no se modifica como consecuencia de las
mutaciones.

• El espectro de fluorescencia, obtenido a 275 nm, tanto de la proteína
salvaje como de los mutantes sencillos presenta una contribución menor
de los residuos de tirosina que la que se determina con el doble mutante.
Esta disminución refleja la existencia de transferencia de energía sin
radiación de Tyr a Trp. La contribución del Trpl 26 al espectro es el
doble que la del Trp4O. El espectro de fluorescencia obtenido como
suma de las contribuciones individuales de los Trp coincide bastante bien
con el de la proteína salvaje, lo que indica una estructuración
tridimensional similar en las cuatro proteínas.

O Los estudios de desnaturalización-renaturalización seguidos por

-139-



Conclusiones

dicroísmo circular sugieren que el Trp4O se encuentra en un entorno en
el que la pérdida de estructura secundaria como consecuencia de la
desnaturalización con urea se produce a concentraciones de urea
menores, mientras que el Trpl 26 se encuentra menos expuesto a la
acción del agente desnaturalizante.

§ Los estudios de desnaturalización-renaturalización seguidos por
fluorescencia vuelven a dar resultados similares a los de CD. El Trpl 26
se encuentra en un entorno tridimensional diferente que el Trp4O, pues
el W126F tiene una curva de desnaturalización en la que únicamente se
observa una transición a bajas concentraciones de urea. La
desnaturalización con urea parece afectar más al entorno del Trp4O, lo
que hace que el mutante donde sólo esta presente este residuo de
triptófano se desnaturalice a más bajas concentraciones de urea.

-140-



BIBLIOGRAFÍA



Bibliografía

• Ackley, C.D., Yamamoto, J.K., Levy, (‘4., Pedersen, NC., cooper, MD. (1990) J. Virol., 64,

5652-5655.

• Ada, G.L. (1988> J. Acquin ¡inmune Def¡c. Syndr.1, 295-303.

• Ahmed, Y.F., Hanly, S.M., Malirn, M.H., Cullen, BR., Green, W.C. (1991) Genes. Dey., 4,
10 14-1022.

• Alían, J.S., Coligan, dE., Barin, F., MeLane, M.F., Sodroski, J.G., Rosen, CA., Haseltine,
W.A., Lee, T.H., Essex, M. (1985> Science, 228, 1091-1094.

• Argos, P. (1989) EMBO J., 8,779-785.

• Arrigo, S.J., Chen, l.S.Y. (1991> Genes Dei’., 5,808-819

• Ealdwin, RL. ¿1995>J Biomol. RMN, 5, 103-109.

e Eendineli, M., Pistello, M., Matteuci, 0., Lobardi, 5., Ealdinotti, E., Bandecchi, P., Ghilarducci,
R., Ceccherini-nelli, L., Garzelli,C., Poli, A., Esposito, F., Malvaldi, G., Tozzini, F. (1993) Adv.
Exp. Med. 8/oh, 335, 189-202.

• Eetz, S.F., Pielak, G.J. (1992) BiocIiemistry 31, 12337-1 2344.

• Eolognesi, D.F. (1993) Seniin. Iminunoí, 5, 203-214.

• Bolotina, lA., Chekhov, \l.Q., Lugauscas, V.Y., Ptitsyn, 0.6. (1980) Mol. BioL, (USSR) 14,
902-908.

• Bower, vE., Robinson, n.A. (1963) J. Phys. Chem. 67, 1524-

• Braaten, D., Franke, E.K., Luban, J. (1996) J. ViroL, 70, 3551-3560.

• Bryant, M., Ratner, L. (1990) Proc. NatL Acad. Sci. USA, 87, 523-527.

• Bryngelson, J.D., Onuchic, J.N., Socci, NO., Wolynes, P.G. (1995> Proteins: Struct., Funct.,

Genet, 21, 167-1 95.

• Burnette, W.N. (1981) Anal. Biochem. 112, 195-203

• Burns, JA., Butíer, J.C., Moran, J., Whitesides, G.M. (1991) J. Oip. Chem. 56, 2648-2650.

• Cai, 1<., Schirch, V. (1996) J. Rio!? Chein., 271, 2987-2994.

• Capon, D.J., Ward, R.H.R (1991) ,4nnu. Rey. Imniunoí, 9, 649-678.

• Carpenter, 5. Alexander, 5. (1992) Sem¡nars in Viro/ogy, 3, 157-166.

• Castillo, 1., Bartolome, J., Quiroga, J.A., Carreño, V. (1992) J. Virol Methods, 38, 71-80.

• Chazal, N., Carriére, HE., Gv, E., Boulanger, P. (1994) J. ViroL, 68, 111-122.

• Chazal, N., Gay, E., Carriére, C., Tournier, .1., Boulanger, P. (1995> J. Virol., 69, 365-375.

• Chong, Y.-H., Payne, S.L., lssel, C.d., Montelaro, R.C., Rushlow, K. (1991) J. Virol, 65,
1007-10 12.

-142-



Bibliografía

• Chou, P.Y, Fasman, GIl (1978) Annu. Rey. 8/oc/mm., 47, 251-276.

• Chrystie, IL., Almeida, J.D. (1988> AIDS, 2, 459-464.

• Clarke, J., Fersht, AB. (1993> Biochemistry 32, 4322-4329.

• Clements,J.E.,Wong-Staal, F. <1992> Molecular Riologyof lentiviruses. Seminarsin Virology,
3, 137-146.

• Clements, JE., Zink, MC. (1996) Clinical Microbio!? Rey., 9, 100-107.

• Coates, A.R.M., Cookson, J., Barton, G.J., Zvelebil, M.J., Sternberg, M.JE, <1987> Nature,

326, 549-550.

• Cochrone,A.W., Chen, CH., Rosen, CA. tl990>Prnc. A/att Acad. Sci. LISA, 87, 1198-1202.

• Cohen, C., Parry, DAD. (1990) Proteins, 7, 1-15.

• Coggins, L., Norcross, NL., (1970) Cornell Ve!? 60, 330-335

• Cooper, A., Eyles, S.J., Radford, SE., Dobson, CM. <1992> J. Mo!? Rio! 225, 939-943.

• Craven, R.C., Leure-duPree, A.E., Weldon, Jr., RA., Wills, J.W. (1995) J. Viro!? , 69, 4213-

4227.

• Crawford, 5., Goff, SP. (1984) J. Viro!? , 49, 909-91 7.

• Creighton, TE., Goldenberg, OP. (1984) J. Mo!? Rio!?, 179, 497-526.

• Creighton, TE. (1990> Bloc/mm J., 270, 1-16.

• Creighton, TE. (1992) Protein Fo/ding, W.H. Freeman and Co., New York.

• Creigthon, TE., Darby, N.J., Kemmink, J. (1996) FASEBJ., 10, 110-118.

• Cullen, BR. y Greene, WC. (1990> V¡ro/ogy, 17, 1-5.

• Cullen, BR. (1992) Microbio!? Rey., 56, 375-394.

• Dannulí, J., Surovoy, A., Jung, G., Molling, 1<. (1994) EMBOJ., 13, 1525-1 533.

• Darlix, J.L., Gabus, C., Nugeyre, MT., Clavel, F., Earre-Sinoussi F. (1990) J. Mo!? Rio!? 216,
689-699.

• Debouck,C., Gorniak, J.G., Strickler, JE., Meek, T.D., Metcalf, B.W., Rosenberg, M. (1987)
Proc. Nací Atad, Sci. USA, 84, 8903-8906.

• Derman, Al., Beckwith, J. (1991) J. Racteriot, 173, 771 9-7722.

• Dilí, KA., Eromberg, 5., Yue, K., Fiebig, KM., Yee, D.p., Thomas, PO., Chan, H.S. (1995>
Procein Sci., 4, 561-602.

• Dobson, CM., Evans, PA., Williamson, KL. (1984) FF85 Lete., 168, 331-334.

• Doig, A.J., Williams, O.k. (1991) J. Mo!? Rio!? 217, 389-398.

-143-



B¡bI¡ogra fía

• Oorfman, T., Mammano, F., Haseltine, W.A., Gáttlinger, H.G. (1994a> J.ViroL, 68, 1689-
1696.

• Dorfman, T., Eukovsky, A., Ohagen, A, Hóglund, 5., Góttlinger, HAZ. (1994b) J. Viro!?, 68,

8180-8187.

• Edelhoch, H. (1967) Riochemistry 6, 1948-1954.

• Eftink MR., Ghiron C.A. (1976> Biochem¡stry, 15, 672-680

• Egberink, H.F., Ederveen, J., Montelaro, R.C., Pederson, NC., Horzinek. MC,, Koolen,
M.J.M. (1990)1 Gen. ViroL, 71, 739-743.

• Ehrlich, L.S., Agresta, BE., Carter, CA. (1992> J. ViroL, 66, 4874-4883

• Ehrlich, LS., Agresta, BE., Gelfand, CA., Jentoft, J., Carter, CA. (1994> Viro/vg>’3 204,
515-525.

• Ehrlich, LS., Fong, 5., Scarlata, 5., Zybarth, O., Carter, C. (1996) Biochemistry, 35, 3933-

3943.

• Eliman, OL. (1959> Arch. Eiochem. Eiphys. 82, 70-77.

• Fácke, M., Janetzko, A., Sohoeman, RL., Kráusslich, H.-G. (1993> J. Viro!?, 67, 4972-4980.

• Fahey, R.C., Hunt, J.S., Windham, OC. (1977> J. Mo!? EvoL 10, 155-160.

• Farabaugh, P.J. <1978> Nature, 274, 765-769.

• Fass, O., Harrison, SC., Kim, PS. (1996) Nat Struct. Rio!?, 3, 465-469.

• Fauci, AS. (1993) Science, 262, 1011-1018.

• Fersht, AR. (1993> FF85 Lett., 325, 5-16.

• Flory, P.J. (1969> StatisticalMechanics of Chain Mo/ecu/es. Wiley, New York.

• Franke, E.K., En, H., Yuan, H., Bossolt, KL., 00ff, SP., Luban, J. (1994a) J. Viro!?, 66,
5 330-5334.

• Franke, E.K., Yuan, H., Luban, J. (1994b), Natura, 372, 359-362.

• Freed, Ea., Martin, MA. (1995) J.Bio/.Chem., 270, 41, 23883-23886

• Freed, E.0. <199?> Encyc/opedia of Cantar Vol. III, Ecl. Academic Press, PP. 1585-1590.

• Fulcui, T., Imura, 5., Goto, T., Nakai, M. <1993) Microse. Ras. Tech., 26, 335-340.

• Gallo, FI.C., Salahuddin, 5.7., Popovie, M., Shearer, CM., Kaplan, M., Haynes, B.F., Palker,
T.J., Redfield, R., Oleske, J., Safai, B., White, 0., Foster, P., Markham, PO. (1984) Science,
224, 500-503.

• Gallo, R.C., Montaigner, L. El SIOA hoy. Libros de Investigación y Ciencia (1988). Pp 6-15.

-144-



Bibliografía

• Gamble, T.R., Vaidos, F.F., Yoo, 8., Worthylake, ¡2K., Houseweart, M., Sundquist, W.l., Hill,
C.P. (1996) Ce!!, 87, 1285-1294.

• Gamble, T.R., Yoo, 5., Vadios, F.F., von Schwedler, U.K., Worthylake, D.K.,Wang, H.,
McCutcheon, J,P., Sundquist, W.l., Hill, Ci’. (1997) Science, 278, 849-852.

• Gelderblom, H.R., Hausmann, E,H.S., Ozel, M., Pauli, G., Koch, M.A. (1987> Virologv, 156,
171-176.

• Gelderblom, H.R., Ozel, M., Pauli, G. Morphogenesis and morphology of HIV. Structure-
functions relations. (1989> Arch. Viro!?, 106, 1-13.

• Gelderblom, H.R., Marx, PA., Ozel, M.,Gheysen, D., Munn, R.J., doy, Kl., Pauli, G. (1990>
Retroviral pi-oteases: control of maturation and morphogenesis. L.H. Pearl (ed.>. Stockton
Press, N.Y., Pp. 159-180.

• Gelderblom, HA. Ozel, M., Winkel, T., Morath, 8., Grund, C., Pauli, 6. <1991> Accesory Ce/ls
in HIV and Other retro vii-al Infections. Ed. Easel, Karger. pp 50-68.

• Gelderblom, H.R. (1991) AIDS, 5, 617-638

• GeLderblom, H.R., Bauer, P.G., Ozel, M., Hóglund, 5., Niedrig, M., Renz,H., Morath, 8.,
Lundquist, 1’., Nilsson, A., Mattow,J. etal. (1992>. Morphogenesisandmorphologyofhuman
immunodeficiency virus. Membrane lnteractions of HIV. R.C. Aloia and C.C. Curtain, eds.
(New York: Wiley-Liss, Inc.>, Pp. 33-54.

• Geourjon, C., Déléage, G. (1993> Comput App/. Bioscí, 9, 87-91

• Gheysen, O., Jacobs, E., De Foresta, F., Thiriart, C., Francotte, M.,Thines, D., Wilde, MD.

<1989) Ceil, 59, 103-112.
• Gilbert, H.F. (1990) Adv. Enzyrnot Re/att Areas Mo!? Rio!?, 63, 69-172.

• Gilí, SC., von HippeL, PH. (1989> AnaL Riochein. 182, 319-326.

• Gitti, R.K., Lee, EM., Walker, J., Summers, MF., Yoo, S., Sunquist, W.l. (1996) Science,

273, 231-235.
• Gonda, MA. (1988) J. Electron Microsc. Tech., 8, 17-40

• Gorelick, R.J., Nigida, SM., Eess, J.W., Arthur, LO., Henderson, LE., Rem, A. (1996> J.
Viro!?, 64, 3207-3211.

• Gáttlinger, HG., Sodroski, dG., Haseltine, W.A. (1989) Proc. Nat!? Acad. Sci. USA, 86,

5781 -5785.

• Green, L.M., Berg, J.M. (1989> Proc. NatL AcarÉ Sc!? USA, 66, 4047-4051.

• (3riko, Yu, y., Privalov, PL., Venyaminov, S. Yu., Kutyshenko, ‘IP. (1988>J. Mo!? Rio!? 202,
127-138.

• Gupta, A., Yadav, 5., Ahmad, E. <1996> Biochemístry 35, 11925-11930.

• Haase, A.T. <1986> Nature, 322, 130-136

-145-



Bibliografía

• Hao, M.-H., Scheraga, H.A. (1995) J. Chem. Phys., 102, 1334-1 348.

• Harisch, G., Eikemeyer, J., Schole, J. (1979> Experientia, 35, 719-720.

• Harlow, E., Lane, 0. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, p. 348, CoId Spring Harbor
Laboratory, CoId Spring Harbor, NY.

• Hausdorf, G., GewieB, A., Wray, V., Porstmann, T. (1994> J. Viro!? Methods., 50, 1-10.

• Henderson, LE., Sowder, R.C., Smythers, 6W., Oroszlan, 5. (1987> J. ViroL, 61, 1116-
1124.

• Hennecke, J., Sillen, A., Huber-Wunderlich, M., Engelborghs, Y., Glockshuber, A. (1997)
Biochemistry 36, 6391-6400.

• Hill, C.P., Worthylake, O., Rancroft, OP., Christensen, AM., Sundquist, W.l. (1996> Proc.
Natí Acad. Sci. USA, 93, 3099-3104.

• Hinck, AP., Truckses, DM., Markley, J.L. (1996) Riochemistry 35, 10328-10338.

• [jirel, PH., Schmitter, M.J., Oessen, P., Fayat, 6., Blanquet, 5. (1989) Proc. Natí Acad. Sc>?
86, 8247-8261.

• Hirst, J.D., Rrooks, C.L.,lll (1994), J. Mo!? Rio!? 243, 173-178.

• Hochuli, E., D&beli, H., Schacher, A. (1987>.! Chromatography 411, 177-184.

• Hockley, O.J., Wood, RO., Jacobs,J.P., Garren, A.J. <1988> J. Gen. ViroL, 69, 2455-2469.

• Hñglund, 5., Ofverstedt, L., Nilseon, A., Lundquist, P., Gelderblom, H.P., Ozel, M., Skoglund,
U. (1992> A/OS Res. Huin. Retro y., 8, 1-7

• Hosie, M.J., Osborne, R., Yamamoto, J.K., Neil, J.C., Jarrett, 0. (1995> J. Viro!?, 69, 1253-
1255.

• Howarth, 0W., Lian, L.Y. (1984> Biochemisrry 23, 351 5-3521 -

• Hu, S.-L., Travis, B., Garrigues, J., Zarling, J.M., Sridhar, P., Oykers, T., Eichberg, JE.,
Alpers, C. (1990> Viro/ogy, 179, 321-329

• Hunter, E., Swanston, R.(1990) Curr. Top. Microbio!? Iminun., 157, 187-253.

• Hunter, E. (1994> Sem. Virol., 5, 71-83.

• Hussain, K.A., lssel, C.J., Rwambo, P,M., Arnizaut, AB., Rail, J.M., Schnorr, KL., Montelaro,
R.C. (1988> J. Gen. ViroL, 69, 1719-1724.

• Hwang, C., Sinskey, A.J., Lodish, H.F. (1992> Sejence 257, 1496-1 502.

• lssel, C.J., Horohov, O.W., Lea, D.F., Adams,W.V., Hagius, WA/., McManus,J.M., Allison,

A.C., Montelaro, P.C. (1992> J. Virol., 66, 3398-3408.

• Jacks, T., Madhani, HO., Masiarz, F.R., \/armus, HE. (1988) Ce!!, 55, 447-458.

-146-



Bibliografía

• Johnson, AP., Trocha, A., Yang, L., Mazzara, GP., Panicali, O.L., Ruchanan, T.M., Walker,
8.0. (1991> J. Iminunot, 147, 1512-1 521.

• Jowett, J.B.M., Hockney, O.J., Nermut, M., dones, J.M. (1992> J. Gen. Viro!?, 73, 3079-
3086.

• Karacostas, V., Nagashima, K., Gonda, MA., Moss, 8. (1989) Proc. NatL Acad. ScA USA,
86, 8964-8967.

• Kawakami, T., Sherman, L., Dahlberg, J., Gazit, A., Yaniv, A., Tronick, SR., Aaronson, SA.
<19871 Virology, 168, 300-31 2.

• Kim, PS., Baldwin, RL. (1990) Anna. Rey. Biochem., 59, 631-660.

• Klikova, M., Ahee, 5., Hunter, E., Rumí, T. (1995).! ViroL, 69, 1093-1098.

• Kohl, NE., Emini, EA., Schleif, W.A., Davis, L.J., Heimbach, J.C., Dixon, A.F., Scolnick,
EM., Sigal, lS. (1988) Proc. NatL Acad. Sci. USA, 85, 4686-4690.

• Kondo, E., Mammano, F., Cohen, EA., Gottlinger, HG. (1995) J. Viro!? 69, 2759-2764.

• Kosower, NS., Kosower, E.M. (1978> ¿‘it. Rey. Cytoh, 54, 109-160.

• Kowalski, M., Rergeron, T., Oorfman, W., Haseltine, W., Sodroski, J. (1991) J. Viro!?, 65,
281-291.

• Krausslich, HG., Facke, M., Heuser, AM., Konvalinka, J., Zentgraf, H. (1995) J. Viro!? 69,
3407-3419.

• Kuroki, A., lnaka, K., Taniyama, Y., Kidokoro, 5., Mateushima, M., Kikuchi, M., Yutani, K.
(1992> Rioc/iemistry 31, 8323-8328.

• Lackowicz, J.R. (1983) en Principies of Fluorescence spectroscopy, Pp. 341-379, Plenum
Press, New York.

• Laemli, V,K. (1970> Nature, 227, 680-685.

• Langedijk, J.P., Schalken, J.J., Tersmette, M., l-luismari, JO., Meloen, R.H. (1990) J. Gen.

ViroL, 71, 2609-2614

• Lebrer, 5.5. (1971> Biochemistry, 10, 3254-3263.

• Letvin, NL. (1990) /mmuno!? Toda>’, 11, 322-326.

• Levy, JA. (1993> A/OS, 7, 1401-1410.

• Locke, SC., Macinnis, J.M., Qian, S.J., Gordon, JI., Li, E., Fleming, GR., Yang, NC. (1992)
Biochemistry, 31, 2376-2383.

• Loewenthal, R., Sancho, J., Fersht, AR. (1991) Riochemistry 30, 6775-6779.

• Lutz, H., Hoffmann-Lehmann, A., Rauerpham, K., Holznagel, E., Tozzini, F., Rendinelli, M.,
Reubel, O., Aubert, A., Davis, O., Cox, O., eta!? (1995) Vet. linmunoh /mmunopathot, 46,
103-113.

• Lyles, MM., Gilbert, H.F. (1991> Rio chemistry, 30, 613-61 9.

-147-



Bibliografía

• Mammano, F., OHagen, A., Hoglund, 5., Gottlinger, H.G. (1994).! Virol., 68, 4927-4936.

• Marquardt, 0W. (1963) An Algorithm for Least Squares Estimation of Parameters. Joamal
of t/ie Society of /ndustria/andApplled Mathematics, 11, 431-441.

• Martensson, L.-G., Jonasson, P., Freskgard, P.-0., Svensson, M., Carlsson, U., Jonsson, B.-
1-1. (1995) Biochem¡stry 34, 1011-1021.

• Martin, J.-P., Ringen, A., Braunwald, d., Nonnemacher, H., Valle, M., Gut, J.-P., Koehren, F.,
de Monte, M., Kirn, A. (1995> A/OS, 9, 447-453.

• Massiah, MA., Worthylake, D., Christensen, A.M., Sundquist, W.l., Hill, C.P., Summers, M.F.
(1996) Protein Science, 5, 2391-2398.

• Matthews, CFi. <1993> Annu. Rey. Biochent, 62, 653-683.

• Matsuo, 1<., Nishino, Y., Kimura, T., Yamaguchi, R., Yamazaki, A., Mikami, T., lkuta, K.
¿1992>]. Gen. ViroL, 73, 2445-2450.

• Matsumura, M., Signor, O., Matthews, 8W. (1989> Nature 342, 291-293.

• McCune JM., Rabin, LB., Feinberg, MB., Liebermann, M., Kosek, J.C., Reyes, GR.,
Weissmann, IL. (1988> CeIl, 53, 55-67.

• McGuire, T.C., 0’Rourke, Kl., Baszler, TV., Leib, SR., Brassfield, AL., Davis, WC. <1994>
J. Gen. ViroL, 75, 895-900.

• Mergener, K., Facke, M., Welker, R., Rrinkmann, V., Gelderblom, H.R., Krauslich, HO. (1992>
Virology, 186, 25-39.

• Miller, W.O., Brant, O.A., Flory, P.J. (1967> J. Mo!? Rio!?, 23, 67-80.

• Miyazawa, T., Tomonaga, K., Kawaguchi, Y., Mikami, T. (1994>Arch. ViroL, 134, 221-234.

• Momany, C., Kovari, L.C., Prongay, A.J., Keller, W., Gitti, R.K., Lee, B.M.,Gorbalenya, A.E.,
Tong, L., McClure, J., Ehrlich, LS., Summers, MF., Carter, C., Rossmann, MO. (1996>
Nature Struct. Rio!?, 3, 763-770.

• Montaigner, L., Oauguet, C., Axíer, 5., Chambaret, 5., Gruest, J., Nugeyret, M.T., Rey, F.,
Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C. (1984) Ann. Inst. Pasteur Viro!?, 135E, 119-134.

• Montelaro, R.C. <1994) Equine lnfectious Anemia Virus. Encyclopedia of Virology. Ecl.
Webster, RO. and Granoff, A. Academio Press. Harcout Brace & Co., Publishers. PP. 430-
437.

• Nakai, M., Goto, T. (1996> J. Electron. Microsc., 45, 247-257.

• Narayan, O., Clements, J. <1990) Lentiviruses. Virology, 2 Edición, Ed. Rayen Press, Ltd.,
PP 1571-1 589.

• Nath, U., Udgaonkar, dR. (1997> Biochemistry, 36, 8602-8610.

• Nilsson, E., Berman.Marks, C., Kuntz, 1.0., Anderson, 5. (1991> J. Rio!? Chem., 266, 2970-
2977.

-148-



Bibliografía

• Novotney, C., English, R.V., Housman, J., Oavidson, MG., Nasisse, Mi’., jeng, C.R., Oavis,
WC., Tompkins, ME. (1990> A/OS, 4, 121 3-1218.

• Olmsted, RA., Barnes, A.K., Yamamoto, J.K., Hirsch,V.M., Purcelí, R.H., Johnson, PR.
(1989a) Proc. Nar!? AcarÉ Science USA, 86, 2448-2452.

• Olmsted, RA., Hisch, VM., Purcelí, R.H., Johnson, P.R. (1 989b> Proc. Nar!? Acad. Sc!?, 86,
8088-8092

• Olmsted, R.A., Langley, R., Roelke, ME., Goeken, R.M., Adger-Johnson, O., Goff, J.P.,
Albert, J.P., packer, C., Laurenson, M.K., Caro, T.M., Scheepers,L., Wildt, DE., Bush, M.,
Martenson,J.S., OBrien, S.J. (1992> J. ViroL, 66, 6008-6018.

• Olsen, H.A.W., Cochrone, P.J., Dillo, P.J., Nalin, C,M., Rosen, CA. (1990) Genes Dei’., 4,
1357-1364

• Orlinsky, K.J., Gu, J., Hoyt, M., Sandmeyer, 5., Menees, T.M. (1996> J. ViroL, 70, 3440-

3448.

• Ozel, M., Pauii, G., Gelderblom, H.R.(1 990> Ultramicroscopy, 32, 35-41.

• Pace, C.N. <1986) Methods Enzymo!? 131, 266-280.

• Pace, C.N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, 6., Gray, T. (1995) Protein Science 4, 2411-2423.

• Pal, A., Aeitz, MS., Jr., Tschachier, E., Gallo, R.C., Sarngadharan, MG., Veronese, F.D.M.
(1990) A/OS Res. 1-/am. f9etroviruses, 6, 721-730.

• Patarca, Fi., l-4aseltine, W.A. (1985> A/ature, 318, 390.

• Pedersen, NC., Ho, E.W., Brown, M.L., Yamamoto, J.K. (1987> Science, 235, 790-793.

• Pedersen, NC. (1993> The Retro virases, vol. 2, JA. Levy (ed.), Plenum Press, New York.

• Perczel, A., Hollósi, M., Tusnády, 6., Fasman, GO. (1991) Pror. Eng., 4, 669-679.

• Pettit, SC., Moody, MO., Wehbie, RS., Kaplan, AH., Nantermet, PV., Klein, CA.,
Swanstroní, R. <1994).! 1/fro/. 68, 8017-8027.

• Phelps, O.K. y Post, CE. (1995)]. Mo!? Rio!? 254, 544-551.

• PolLit, 5., Zalkin, H. (1983>]. Bacteriot, 153, 27-32.

• Press, W.H., Flannery, SP., Teukolsky, SA., Vetterling, W.T. (1986) Numerical Recipes.
Cambridge: Cambridge university Press.

• Privalov, PL., Tiktopulo, El., Venyaminov, 5. Yu., Griko, Yu. V., Makhatadze, Gí.,
Khechinashvili, N.N. (1989> J. Mo!? Rio!? 205, 737-750.

• Prongay, A.J., Smith, T.J., Rossmann, M.G., Ehrlich, LS., Carter, CA., McClure, J. (1990)
Proc. Nar!? Acad. Sci. USA, 87, 9980-9984.

• Reicin, AS., Paik, 5., Berkowitz, R.D., Luban,J.,Lowy, 1., Goff, SP. (1995>, J. Viro!?, 69,
642-650.

-149-



Bibliografía

• Reicin, AS., Ohagen, A., Yin, L., Héglund, 5., Goff, S.P. (1996)]. ViroL, 70, 8645-8652.

• Rhee, S.S., Hunter, E. (1991) EMBO]., 10, 535-546.

• Robey, E., Axel, R. (1990> Ce!!, 60, 697-700.

• Rosé, 5., Hensley, P., 0’Shannessy, 0.3., Culp, J., Oebouck, C., Chaiken, 1. (1992> Proteins:
Stractare, Fanction, aM Genetics, 13, 112-119.

• Rossmann, M.G.(1988) Proc. NaO? Acad. Sci. USA, 85, 4625-4627.

• Royer, M., Cerutti, M., Gav, 6., Hong, 5-5., Devauchelle, G., Eoulanger, P. (1991) Virology,
184, 41 7-422.

• Boyer, M., Hong, S.S., Gay, 6., Cerutti, M., Boulanger, P. (1992)]. ViroL, 66, 3230-3235.

• Boyer, CA., Mann, C.d., Matthews, C.R. (1993) Protein. Sc!? 2, 1844-1852

• Rule, G.S., Pratt, E.A., Simplacenau, y., Ho, C. (1987> Biochemistry, 26, 549-556.

• Rushlow, K., Peng, X.-X., Montelaro, R.C., Shih, OS. (1992) Virology, 188, 396-401.

• Sakalian, M., Parker, S.O., Weldon Jr., RA., Hunter, E. (1996)]. ViroL, 70, 3706-3715.

• Salinovich, 0., Payne, S.L., Montelaro, R.C., Hussain, KA., sse?, C.J., Schnorr, KL. (1986)

.1. Virol 57, 71-80.

• Sambrook, J., Fritsch, EF., !vlaniatis, T. (1989> “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”.

Segunda Edición. Co/d SpringHarbortaboratoryPress, N. York.

• Schmitt, MP., Gendrault, dL., Schweitzer, C. et al. <1990) A/OS Res. Hain. Retroviruses, 6,

987-991.

• Schmitt, MP., Gendrault, dL., Steffan, AM., eta?. (1991) CelIs of the Hepatic Sinusoid, vol.
3. Edited by Knook, DL., Wisse, E. ,McCuskey, RS.. Rijswick: Kupffer Ce?? Foundation, PP.
410-413.

• Schnólzer, M., Rackwitz, H.-R., Gustchina, A., Laco, G.S., Wlodawer, A., Elder, J.H., Kent,
S.B.H. (1996> Viro/ogy, 224, 268-275.

• Schultz, G.E., Schirmer, R.H. (1979) PrincipIes of Protein Stractare. Springer-Verlag, New
York. Pp. 54.

• Schwartz, 5., Felber, 6K., Benko, DM., Fenyo, EM., Paulakis, ON. (1990) ]. ViroL, 64,
251 9-2529.

• Siebelink, K.H.J., Tijhaar, E., Huisnian, R.C., Huisnian, W., de Ronde, A., Darby, l.H.,
Francis, M.J., Rimmelzwaan, G.F., Osterhaus, A.O. <1995)]. ViroL, 69, 3704-3711

• Simmonds, P., Zhang, L.Q., Watson, HG., Rebus, 5., Ferguson, ED., Balfe, P., Leadbetter,
G.H., Yap, PL., Peutherer, d.F., Ludlam. C. (1990) Lancet, 336, 1469-1472.

• Smith, J.C., Clarke, AR., Chia, W.., lrons, LI., Atkinson, T., Holbrook, J.J. (1991)
Biochemistry 30, 1028-1036.

-150-



Bibliografía

• Spearman, P., Wang, J.-J., Vander Heyden, N., Ratner, L. (1994)]. Viro!?, 68, 3233-3242.

• Steffan, AM., Gendarult, J.L., McCuskey, RS., McCuskey, PA., Kirn, A. (1986) Hepato/ogy,
6, 830-836

• Stein, RS., Engelman, E.G. <1989) J? Rio!? Chem., 265, 2640-2649.

• Steinkasserer, A., Harrison, R., Billich, A., Hammerschmid, F., Werner, G., Wolff, 6., Peichí,

P,, Palfi, O., Schnitzel, W., Mlynar, E. et al. (1995> .i? ViroL, 69, 814-824.

• Steinmann, R., Oombrowski, J., O’Conner, T., Montelaro, R.C., Tonelli, O., Lawrence, K.,

Seymor, C., Goodness, d., Pederson, N., Anderson, PR. <1990>]. Gen. ViroL, 71, 701-706.
• Stephens, R.M., Casey, J.W., Rice, NR. (1986) Science, 231, 589-594.

• Strambio-de-Castillia, 5K., Hunter, E. (1992>]. ViroL, 66, 7021-7032.

• Strickland, EH. (1974) Cnt ¡9ev. Biochem. 2, 113-175.

• Syu, W.J., Lee, W.R., Ou, B., Yu, OC., Essex, M., Lee, T.H. (1991> ]. ViroL, 65, 6349-

6352.
• Takasaki, T., Kurane, 1., Aihara, H., Ohkawa, N., Yamaguchi, J. (1997) Aro!,. ViroL, 142,

375-382.

• Talbott, RL., Sparger, E.E., Lovelace, K.M.,Fitch, W.M., Pedersen, NC., Luciw, PA., Elder,
d.H. (1989> Proc. NatL AcarÉ Sc!? USA, 86, 5743-5747.

• Tanford, C. (1968> Adv. Protein C/íiem., 23, 121-282.

• Tanford, C. (1970) Adv. Protein, Chem., 24,1-95.

• Thali, M., Bukovsky. A., Kondo, E., Rosenwirth, 8., Walsh, C.T., Sodroski, J., Gñttlinger,

HG. (1994) Natare, 372, 363-365.

• Thomas, O.J.(1992> FF8S Lett., 307,10-13.

• Thornton, dM. <1981>]. Mo!? Rio!?, 151, 261-287.

• Tidor, 8., Karplus, M. (1993> Proteins: Stract., Fanct., Genet., 15, 71-79.

• Torten, M., Franchini, M., Barlough, dE., George, J.W., Mozes, E., Lutz, H., Pedersen, NC.
(1991>]. Viro!?, 65, 2225-2230.

• Tñzser, d., Friedman, O., Weber, IT., Rláha, 1., Oroszlan, 5. (1993> Biochemistry, 32, 3347-
3353.

• Trono, O., Feinberg, MB., Baltimore, D. (1989) Ce!!, 59, 113-120.

• Vallee, H., Carree, H. (1904) CRuebdSeavcAcadSc¿ 139, 331-333.

• Verschoor, EJ., Willemse, Md., Stam, JO., van Vliet, AL., Pouwels, H., Chalmers, 5K.,
Horzinek, MC., Sondermeijer, P.J., Hesselink, W., de Ronde, A. (1996) Vaccine, 14,
285-289.

-151-



Bibliografía

• Von Poblotzki, AV., Wagner, R., Niedrig, M., Wagner, O., Wolf, H., Hodrow, 5. (1993)
Viro/ogy, 193, 981-986.

• Walker, KW., Oilbert, H.F. (1994)]. BioL Chein., 269, 28487-28493.

• Wang, C.T., Barklis, E. (1993) ].ViroL, 67, 4264-4273.

• Wang, 5.7-5., Rushlow, CE., lssel, .J., Cook, RE., Cook, S.J., Raabe, ML., Chong, Y.-H.,
Costa, L., Montelaro, R.C. (1994) Virology, 199, 247-251.

• Wetzel, R. (1987) TrendRiochein. Sc!? 12, 478-482.

• White, dM., Littman, DR. (1989) Ce!!, 56, 725-728.

• Wills,J.W., Craven, R.C. <1991> A/OS, 5, 639-654.

• Willet, B.J., Hosie, Md., Callanan, J.J., Neil, J.C., Jarrett, 0. (1993) /mmuno/ogy, 78, 1-6.

• Wu, P., Brand, L. (1994> Ana!? Biochem. 218, 1-13

• Yamamoto, J.K., Spager, E., Ho, E.W., Andersen, PR., O’Connor, T.P., Mandelí, C.P.,
Lowenstine, L., Munn, R., Pedersen, NC. (1988) Am. J. Vet. Res., 48, 1246-1258.

• Yamamoto, J.K., Hansen, H., Ho, E.W., Morishita, T.Y., Okuda, T., Sawa, T.R., Nakamura,
R.M., Pedersen, NC. (1989).! Am. Vett Med. Assoc., 194, 213-220.

• Yamamoto, d.K., Okuda, T., Ackley, C.D., Louie, H., Pembroke, E., Zochlinski, H., Munn,
Rd., Oardner, MB. (1991> A/OS Res. Hain. Retro virases 7.911-922

• Yamamoto, J.K., Hohdatsu, T., Olmsted, RA., Pu, R., Louie, H., Zochlinski, HA., Acevedo,
V., Johnson, HM., Soulds, GA., Oardner, MB. <1993)]. Viro!? 67, 601-605.

• Yasukawa, T., Kanei-lshii, C., Makawa, T., Fujimoto, J., Yamamoto, T., ¡shii, 5. (1995> J.
Rio!? Chein., 270, 25329-25331.

• Yoo, 5., Myszka, DG., Yeh, C., McMurray, M., Hill, C.P., Sundquist, W.l. (1997)]. Mo!? Rio!?
269, 780-795

• Yu, x., Yuan, X., Matsuda, 7., Lee, T.H., Essex, M. (1 992a) ]. ViroL, 66, 4966-4971

• Yu, X., Yu, Q.-C., Lee, T.H., Essex, M. <1992b)]. ViroL, 66, 5667-5670

• Yuan, X., Yu, X.F,, Lee, T.H., Essex, M. (1993)1 ViroL, 67, 6387-6394.

• Zhang, W.-H., Hockley, D.d., Nermut, MV., Morikawa, Y., dones, l.M. (1996).! Gen. Viro!?,
77, 743-751.

• Zhou, W., Parent, L.J., WiIls, J.W., Resh, MD. (1994> ]. ViroL, 68, 2556-2569.

• Ziegler, DM., Poulsen, L.L. (1977) Trends Biochein. ScA, 2, 79-81.

-152-


	AYUDA DE ACROBAT READER
	SALIR DE LA TESIS
	ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE LA PROTEÍNA MAYORITARIA DE LA CÁPSIDA DE LENTIVIRUS
	ÍNDICE
	ABREVIATURAS
	INTRODUCCIÓN
	RETROVIRUS
	VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA
	VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA FELINA
	PROTEÍNAS DE LAS CÁPSIDA LENTIVIRAL

	OBJETIVOS
	MÉTODOS EXPERIMENTALES
	1. CLONACIÓN EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE EIAV
	2. CLONACIÓN. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE FIV
	3. OBTENCIÓN DE FORMAS MUTANTES DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE FIV
	4. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
	5. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS (PAGE-SDS
	6. TRANSFERENCIA E INMUNODETECCIÓN
	7. ENZIMOINMUNOENSAYO
	8. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA
	9. VALORACIÓN DE GRUPOS TIÓLICOS LIBRES
	10. MARCAJE DE CISTEÍNAS LIBRES
	11. REDUCCIÓN Y CARBOXIAMIDOMETILACIÓN
	12. OXIDACIÓN Y REDUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS
	13. DICROÍSMO CIRCULAR
	14. PREDICCIÓN DE ESTRUCTURA SECUNDARIA
	15. FLUORESCENCIA
	16. ESTUDIOS DE DESNATURALIZACIÓN POR UREA

	RESULTADOS Y DISCUSIÓN
	1. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DEL VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA. PAPEL DE LOS GRUPOS SULFHIDRILO EN EL MANTENIMIENTO DE LA ESTRUCTURA
	2. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEiNA o24 DE LA CÁPSIDA DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA FELINA <FIV). MECANISMO DE PLEGAMIENTO

	CONCLUSIONES
	PAPEL DE LOS GRUPOS SULFHIDRILO EN EL MANTENIMIENTO DE LA ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA p26 DE EIAV
	ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA p24 DE LA CÁPSIDA DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA FELINA (FIV). MECANISMO DE PLEGAMIENTO

	BIBLIOGRAFÍA

	DD: