UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 
FACULTAD DE FARMACIA 

 

 
 
 

TESIS DOCTORAL 
 

Nanopartículas de Morin funcionalizadas con fenilanina para 
el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer 

 
 

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR 
 

PRESENTADA POR 
 

Mario Alonso González 
 

Directoras 
 

Ana María Fernández Carballido 
Emilia María Barcia Hernández 

 
 

Madrid 
 
 
 

© Mario Alonso González, 2021 



UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 

FACULTAD DE FARMACIA 

 

 

 

 

 

 

 

TESIS DOCTORAL 

 

NANOPARTÍCULAS DE MORIN FUNCIONALIZADAS CON FENILALANINA PARA EL 

TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 

 

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR 

PRESENTADA POR 

 

Mario Alonso González 

 

DIRECTOR 

 

Ana María Fernández Carballido y Emilia María Barcia Hernádez 



 

 

  



 

 

  



NPs de morin funcionalizadas con fenilalanina para el tratamiento de la EA 

 

  

A mis padres y a mi hermana, 

por su apoyo y cariño. 

  



 

 

  



NPs de morin funcionalizadas con fenilalanina para el tratamiento de la EA 

 

Han ocurrido muchas cosas desde que comencé el largo camino que finaliza con la 

firma de esta memoria hace ya 5 años. Durante este tiempo, el número de personas que 

me han mostrado su apoyo o han participado activamente en algún punto de esta tesis es 

enorme. A todas ellas me gustaría darles las gracias. 

En primer lugar, quiero agradecer a mis directoras de tesis, las Dras. Ana M. 

Fernández Carballido y Emilia M. Barcia Hernández, el apoyo que me han brindado desde 

el primer instante que puse un pie en este departamento, antes incluso de haber terminado 

la licenciatura. Durante estos años me habéis permitido organizarme como prefiriese y 

siempre habéis estado allí para aconsejarme o sacarme de un apuro; al igual que para 

darme ánimos cuando mi motivación ha estado más baja y me han ayudado a superar el 

escollo (recordemos aquella sucesión de incidentes con el HPLC, que ahora parecen tan 

lejanos).  

A Ana no puedo si no agradecerle su buen humor y disposición siempre positiva. 

Ha sido capaz de ver los puntos fuertes del mayor de los contratiempos, no puedo olvidar 

tampoco que fue ella quien me animó a emprender este camino. A Emilia, su buena 

disposición e infinita paciencia; siempre ha aportado un punto de coherencia a un 

doctorando algo caótico en sus qué haceres. 

Me resulta imposible no mencionar a continuación a Mónica C. Villa, compañera 

de laboratorio que ha estado trabajando conmigo, codo con codo, a las buenas y a las 

malas, desde el máster del departamento y con quien he fraguado una gran amistad. Los 

“grandes momentos de la tesis” quedan en el recuerdo para demostrarlo. 

Quisiera, también, agradecer a todos los profesores del departamento que me han 

apoyado de distintas formas a lo largo del camino. Me gustaría hacer hincapié en el apoyo 

recibido por la Dra. Sofia Negro durante estos años. Tampoco me puedo olvidar de la 

Dra. Ana I. Torres, quien me ha brindado la oportunidad de probar otros aspectos de la 

investigación en este departamento. A los Drs. Manuel y Damián Córdoba, que siempre 

me han acogido con cariño y aconsejado como si fuese uno de sus propios doctorandos y 

a los que debo muchas de las costumbres que he adquirido con el HPLC. Si hablamos de 

profesores del departamento es imposible olvidarse de la Dra. Ana I. Fraguas, quien desde 

siempre se ha mostrado dispuesta a echarme una mano, no importaba lo ocupada que 

estuviese. Y por supuesto, debo agradecer al Dr. Santiago Torrado, que siempre me recibe 

del mejor humor y está dispuesto a ayudarme con cualquier traba que se me presente (sin 

olvidar que en no pocas ocasiones me ha ahorrado el trayecto en metro). 

Igualmente me gustaría agradecer a la Dra. Consuelo Montejo del CEU, siempre 

dispuesta a ayudar, aun después de finalizar mi estancia en esa universidad. Gracias a 

ella, en la San Pablo CEU me he sentido como en mi alma mater.  

También he de agradecer al Dr. Luis García, por la paciencia y el apoyo que ha 

mostrado tanto durante los ensayos en animales como durante mis estudios en el edificio 

pluridisciplinar. En ese sentido he de agradecer también a Rubén, sin cuya habilidad para  



 

 

  



NPs de morin funcionalizadas con fenilalanina para el tratamiento de la EA 

 

la manipulación de los animales muchos de los estudios realizados en esta tesis hubiesen 

sido imposibles. 

Igualmente he de agradecer al Dr. Juan F. González. Siempre ha estado dispuesto a 

echarme un cable, pese a lo ocupado que pudiese estar. Además, su ayuda ha sido 

indispensable para la elaboración de una de las formulaciones que se proponen en esta 

tesis. 

A mis compañeros y amigos del laboratorio: 

Somos muchos los miembros de este departamento y a la mayor parte de vosotros 

os tendría que agradecer muchas cosas, pero permitidme que reduzca un poco el texto. 

Desde el máster de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, he tenido el privilegio de 

contar con la amistad Carlos Torrado y de Víctor Guarnizo (aunque haya emigrado al otro 

lado del charco), al igual que con Nicola Paccione., Verónica García, Yvonne Del Val y 

Teresa Gallego o con nuestro técnico de laboratorio Pablo Notivoli. Con todos ellos las 

risas, cafés cervezas y comidas han sido continuas. Vuestro apoyo y presencia ha sido 

indispensable para sobrellevar los más y los menos del periodo predoctoral. 

No puedo olvidarme de Patricia quien me ayudó a dar mis primeros pasos en este 

departamento y me facilitó el contacto con la farmacia que me permitiría mantener mis 

estudios sin preocuparme por el trabajo. En esta farmacia tuve el placer además de 

coincidir con María, antigua compañera de unidad y con Nuria quienes me han apoyado 

y brindado su amistad desde entonces. 

Aunque nuestro contacto haya sido más corto, también debo agradecer a todos los 

que cariñosamente he puesto el apodo de “Minion” pues me habéis dado la oportunidad 

participar en vuestro aprendizaje y a su vez habéis aportado algo a mi propia formación: 

Rafa, Patri, Jenny y Ana.  

Aunque nuestra interacción ha sido breve también me gustaría mencionar a aquellas 

personas que habéis aportado algo de alegría al día a día de mi tesis: Kim, nuestra alumna 

belga, con quien mantengo aún contacto a pesar de la distancia y los años. Natalia, 

decidida a sacar tanto el doctorado como un trabajo en industria. A Carmen y a Teresa, a 

quienes siempre liamos para un café o una cerveza y me han alegrado el día con su 

compañía. O a Sara, que siempre tenía una frase de ánimo. A nuestra compañera de 

laboratorio Mahdieh quien, aunque debido a la pandemia hemos interaccionado menos, 

siempre ha sido amable y presta a ayudar. 

A mis queridos vecinos de laboratorio: Sergio, David, Javier, Alba, Miriam, Marco, 

y Alicia. Debo dedicaros un par de palaras de agradecimiento por añadir un poco de 

emoción a las mañanas en el laboratorio. Haré hincapié en que los datos de pZ. se han 

podido obtener gracias a Javier.  

 



 

 

  



NPs de morin funcionalizadas con fenilalanina para el tratamiento de la EA 

 

No todas las personas que me han apoyado o han intervenido en esta tesis están 

relacionadas con el mundo académico o de la farmacia. 

A mis amigos de toda la vida: Sergio, Dani, Carlos y Jaime; a los que he visto menos 

de lo que debería estos años, pero que sé que siempre estáis ahí para apoyarme. De igual 

manera agradezco la amistad que Rubén y Javi me han mostrado, aguantándome en los 

peores y en los mejores días. A Cristina, Jessica y Rebeca también he de hacerles un 

hueco en estos agradecimientos, pues siempre que hemos coincidido me han animado, no 

importa si las cosas fueran bien o mal. 

De mis amigos de la carrera no puedo olvidarme, pues han estado atentos al 

progreso de esta tesis, aunque no siempre nos hayamos visto. Entre ellos, a Miguel, a 

Julia C. a Alberto y a Isa les agradezco haberme ayudado a seguir a flote en los momentos 

más bajos de estos años. Igualmente agradezco a Alejandro y Estéfano. su amistad, espero 

poder seguir visitándolos allí donde continúen su carrera en investigación. No obviaré a 

Jorge J., que ha sido un buen amigo y ha ejercido de válvula de escape en los momentos 

de tensión. Por supuesto también incluiré a Ana Belén P., quien me ha alegrado los días 

con sus visitas.  

Bajo ningún concepto puedo olvidarme de Irene Ortiz, compañera y amiga desde 

primero de carrera, que me ha apoyado en los más y los menos de la carrera académica 

durante más de 11 años. Como futura phD en veterinaria le deseo lo mejor y sabe que 

siempre puede contar conmigo y con mi apoyo. 

A Carlos Corral, Álvaro Pérez y Gema Díaz, los “tres mosqueteros” de mis años de 

carrera, su apoyo aun después de tantos años. 

No me quiero olvidar tampoco de Julia. ni de Alicia., pues han sido importantes 

durante gran parte del tiempo que ha ocupado esta memoria, siempre os desearé lo mejor. 

Por último, pero no menos importante me gustaría agradecer a toda mi familia. 

Especialmente a mi hermana por recordarme la importancia de lo que hago, sobre todo 

cuando yo la pierdo de vista. A mi padre, por aportar la calma y la lucidez a la hora de 

afrontar un contratiempo, de los que han sido más que frecuentes durante este periodo. Y 

a mi madre, por aguantarme con infinita paciencia, sobre todo en los momentos en los 

que paciencia es justo lo que a mí me ha faltado.  

A todos mis tíos y a mis primos, muchas gracias por vuestro apoyo e interés durante 

estos años. 

La lista de agradecimientos podría seguir casi hasta igualar el número de páginas 

de esta memoria. Muy a mi pesar, debo terminarla aquí. A todas las personas que han 

intervenido en ella, de verdad, muchas gracias. 

 



 

 

 

 

 

 

 

  



NPs de morin funcionalizadas con fenilalanina para el tratamiento de la EA 

 

ABREVIATURAS: 

Aa Aminoácido 
ABC ATP-binding cassette 
Acetil-CoA Acetil coenzima-A 
ACN Acetonitrilo 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
AINEs Antinflamatorios no esteroideos 
AJs Uniones adherentes 
APP Proteína precursora de amiloide 
Aα α-amiloide 
Aβ β-amiloide. 
BACE-1 β-site-APP-cleaving enzyme-1 
BHE Barrera hematoencefálica 
BSLCR Barrera sangre-líquido cefalorraquídeo 
CAMKII Calmodulin-quinasa II 
CV Coeficiente de variación 
DCM Diclorometano. 
DIPEA N,N-diisopropiletilamina 
DMSO Dimetilsulfóxido 
DV Diámetro volume 
EA Enfermedad de Alzheimer 
EAAT Transportadores de glutamato 
EDC 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida hidroclorato 
EE Eficacia de encapsulación 
EP enfermedad de Parkinson. 
ER error relativo 
FDA Administración de Medicamentos y Alimentos, EE.UU. 
GJs Uniones Gap 
Glut-1 Transportador de glucosa de tipo 1 
Glut-3 Transportador de glucosa de tipo 3 
Glut-5 Transportador de glucosa de tipo 5 
Gly Glicina 
Gp-P Glicoproteína-P 
GSK3β Glicógeno-sintasa quinasa 3β 
HPLC cromatografía líquida de alta resolución 
IC50 Concentración inhibitoria 
ICH International Conference on Harmonization 
IP Indice de polidispersión 
JAM Junctional adhesion molecules.  
LAT-1 Transportador de aminoácidos largos-1 
LC Límite de cuantificación 
LCR Líquido cefalorraquídeo 
LD Límite de detección 
LDL Lipoproteínas de baja densidad 
LRP Low density lipoprotein receptor related protein 



 

 

MES Ácido 2-(4-morfolino)-etanosulfónico 
MetOH Metanol 
MH Morin hidrato 
NHS N-hidroxisuccinimida 
NMDA N-metil-D-aspartato 
NPs Nanopartículas 
NT Neurotransmisor 
OMS Organización Mundial de la Salud 
PAL fenilalanina-amonio liasa. 
PBS Tampón fosfato 
Phe Fenilalanina 
Phe-phe Dipéptido de fenilalanina 
PLGA:  Ácido poliláctico co-glicólico 
PLGA-phe-phe PLGA unido al dipéptido de fenilalanina 
p-Tau Proteína Tau 
PVA:  alcohol polivinílico. 
PVDF Fluoruro de polivinilideno 
pZ Potencial Z 
RAGE Receptor for advanced glycation end producst 
RI Receptor de insulina 
RMN Resonancia magnética nuclear 
ROS Especies reactivas de oxígeno 
rpm Revoluciones por minuto. 
RTf Receptor de transferrina 
SEM Microscopía electrónica de barrido 
SI Sistema Inmune 
SNC Sistema nervioso central 
T1/2: Semivida plasmática. 
Tf Transferrina 
TJs Uniones estrechas 
TNF-α Factor de necrosis tumoral α 
tr Tiempo de retención 
UV Ultravioleta 
VIS visible 

 

 

 

  



NPs de morin funcionalizadas con fenilalanina para el tratamiento de la EA 

 

ÍNDICE 
Resumen ............................................................................................................................. 1 

Summary ............................................................................................................................. 9 

I- Introducción ................................................................................................................... 17 

1. Enfermedad de Alzheimer ....................................................................................... 19 

1.1. Anatomía patológica ............................................................................................... 20 

1.2. Diagnóstico de la EA ................................................................................................ 24 

1.3. Tratamiento de la EA ............................................................................................... 25 

2. Barrera Hematoencefálica ...................................................................................... 31 

2.1. Componentes de la BHE .......................................................................................... 32 

2.2. Transporte a través de la barrera ............................................................................ 35 

2.3. Alteraciones en la BHE en la EA ............................................................................... 44 

3. Flavonoide Morin ................................................................................................... 45 

3.1. Características físico-químicas: ............................................................................... 49 

3.2. Características farmacocinéticas ............................................................................. 50 

3.3. Actividad frente a la Enfermedad de Alzheimer ..................................................... 52 

3.4. Morin y barrera ....................................................................................................... 56 

3.5. Morin como hepatoprotector ................................................................................. 57 

II- Objetivos ....................................................................................................................... 59 

III- Determinación analítica de morin ................................................................................. 63 

1. Introducción ........................................................................................................... 65 

2. Objetivos ................................................................................................................ 66 

3. Materiales y métodos ............................................................................................. 67 

3.1. Determinación analítica de morin por HPLC ........................................................... 67 

3.2. Determinación analítica de morin por espectrofotometría UV .............................. 75 

4. Resultados y Discusión ............................................................................................ 77 

4.1. Determinación analítica de Morin por HPLC ........................................................... 77 

4.2. Resultados de la cuantificación de morin hidrato en tampón PBS por 

espectrofotometría UV. ................................................................................................. 91 

IV Nanopartículas de PLGA funcionalizadas con un dipéptido de fenilalanina ...................... 95 

1. Introducción ........................................................................................................... 97 

2. Objetivos ................................................................................................................ 98 

  



 

 

  



NPs de morin funcionalizadas con fenilalanina para el tratamiento de la EA 

 

3. Material y métodos ................................................................................................ 99 

3.1. Elaboración de nanopartículas de Rodamina B....................................................... 99 

3.2. Caracterización de las formulaciones .................................................................... 105 

3.3. Estudios de biodistribución ................................................................................... 110 

4. Resultados y discusión .......................................................................................... 114 

4.1. Caracterización de las NPs..................................................................................... 114 

4.2. Estudios de biodistribución ................................................................................... 126 

V-Nanopartículas de Morin Hidrato .................................................................................. 147 

1. Introducción ......................................................................................................... 149 

2. Objetivo ............................................................................................................... 150 

3. Material y métodos .............................................................................................. 151 

3.1. Estudios previos .................................................................................................... 151 

3.2. Elaboración de nanopartículas funcionalizadas con fenilalanina ............................. 156 

3.3. Caracterización de las formulaciones .................................................................... 157 

4. Resultados y discusión .......................................................................................... 161 

4.1. Estudios previos .................................................................................................... 161 

4.2. Caracterización de las nanopartículas de morin hidrato ...................................... 165 

VI- Conclusiones .............................................................................................................. 177 

VII-Bibliografía ................................................................................................................ 183 

 

 



 

 



 

1 

 

RESUMEN 

  



Mario Alonso 

2 

  



Resumen 

3 

Introducción 

Morin hidrato (MH) es un flavonoide de origen vegetal, que ha 

demostrado in vitro tener actividad frente a mecanismos de 

neurodegeneración asociados a la enfermedad de Alzheimer (EA), evitando 

la hiperfosforilación de la proteína Tau, disolviendo los agregados de 

péptido β-amiloide que forman las placas seniles y reduciendo el estrés 

oxidativo producido por las especies reactivas de oxígeno. Su potencial uso 

en clínica está muy limitado debido a su baja biodisponibilidad, rápido 

metabolismo hepático y escasa capacidad de atravesar la barrera 

hematoencefálica (BHE). 

Objetivo 

El objetivo principal de esta tesis doctoral es incrementar la capacidad 

de paso de MH a través de la BHE, potenciando así su potencial interés en 

el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas; como el Alzheimer. 

Para ello, se desarrollan y caracterizan nanopartículas (NPs) biodegradables 

de PLGA, cargadas con MH y funcionalizadas con el dipéptido fenilalanina-

fenilalanina, empleado para favorecer la vectorización al lugar de acción en 

sistema nervioso central. La funcionalización se realiza, en primer lugar, 

sobre las nanopartículas ya elaboradas y, en segundo lugar, sobre el 

polímero antes de la formación de los nanosistemas. Una vez caracterizados 

in vitro las NPs, se estudia su biodistribución in vivo. Para la cuantificación 

de MH se han puesto a punto y validado métodos por HPLC y por 

espectrofotometría UV. 

  



Mario Alonso 

4 

Parte experimental 

▪ Desarrollo y validación de métodos analíticos para la 

cuantificación de MH: HPLC y espectrofotometría UV.  

▪ Desarrollo y caracterización de nanopartículas sin funcionalizar y 

funcionalizadas con el péptido phe-phe, y cargadas con el 

marcador de fluorescencia (rodamina-B).  

▪ Desarrollo y caracterización in vitro de nanopartículas de PLGA 

cargadas con morin hidrato. 

▪ Evaluación in vivo de la biodistribución de las nanopartículas en 

hígado, riñón, pulmón y bazo. 

▪ Evaluación in vivo del paso de las nanopartículas a través de la 

BHE. 

Resultados y discusión 

Desarrollo y validación de métodos analíticos para la cuantificación 

de MH: HPLC y espectrofotometría UV: 

Por HPLC se han puesto a punto y validado dos métodos tratando y sin 

tratar las muestras con ácido clorhídrico, y un método por 

espectrofotometría UV. Todos los métodos son lineales, exactos, precisos y 

selectivos; permitiendo cuantificar el MH encapsulado en las NPs, y el 

liberado en los estudios de cesión in vitro. 



Resumen 

5 

Desarrollo y caracterización de nanopartículas funcionalizadas con el 

péptido phe-phe y sin funcionalizar, cargadas con el marcador de 

fluorescencia (rodamina-B): 

La elaboración de las nanopartículas se ha realizado mediante 

extracción-evaporación del solvente. La funcionalización sobre las NPs ya 

elaboradas se realiza por activación con NHS (N-hidroxisuccinimida)/EDC 

(1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodimida hidroclorato) en tampón MES 

pH 4,7 (2(N-morfolino)etanosulfónico) y tampón PBS pH 7,4. La 

funcionalización del polímero PLGA, antes de formar las NPs, se realiza 

mediante activación con NHS en ausencia de oxígeno. Todas las 

formulaciones de NPs presentan tamaños de partícula de unos 190 nm y 

una encapsulación suficiente del marcador fluorescente rodamina-B, como 

para poder evaluar su comportamiento in vivo. 

Desarrollo y caracterización in vitro de nanopartículas de PLGA 

cargadas con morin hidrato: 

Se han preparado NPs por nanoprecipitación y extracción-evaporación 

del solvente, siendo esta última la más adecuada para la encapsulación del 

MH, y en la que la proporción óptima MH:PLGA es de 1:10. Las 

formulaciones de NPs presentan un tamaño medio partícula de unos 190 

nm, con un perfil de cesión de MH durante al menos 9 días. La eficacia de 

encapsulación (EE) se ha visto influenciada por el proceso de 

funcionalización. Así, en la funcionalización PLGA-phe-phe, la EE aumentó 

del 80% al 96% (antes y después), debido probablemente a la interacción 

entre el MH y el dipéptido. En la funcionalización realizada sobre las NPs ya 

formadas, hay una pérdida del 40-50% de MH, que puede ser atribuida a la 

cantidad presente en la superficie de las NPs. 



Mario Alonso 

6 

Evaluación in vivo de la biodistribución de las nanopartículas en 

hígado, riñón, pulmón y bazo: 

Se han preparado tres formulaciones de NPs para su evaluación in 

vivo: NPs sin funcionalizar, NPs funcionalizadas con phe-phe después de su 

elaboración y NPs elaboradas con péptido unido al polímero PLGA. Todas 

las formulaciones están cargadas con el marcador de fluorescencia 

rodamina-B. El estudio de biodistribución se realiza en ratas macho Wistar 

a las que se administra una dosis de 50 mg/Kg en suspensión de las NPs en 

la vena de la cola. El sacrificio de los animales se realiza a tiempos 1 hora y 

2 horas después de la administración. Al evaluar la fluorescencia del 

marcador rodamina-B en los órganos, se obtiene que la funcionalización 

incrementa la presencia de las NPs en bazo, cuando se realiza sobre la NPs 

ya elaboradas. La tendencia de las formulaciones es a aumentar su 

presencia en los órganos a las 2 horas, a excepción del bazo, donde tiende 

a disminuir. En el caso de las NPs con PLGA unido a phe-phe, los niveles en 

bazo, aun siendo bajos, aumentan con el tiempo. 

Evaluación in vivo del paso de las nanopartículas a través de la BHE: 

Al medir la fluorescencia de la rodamina-B, tanto en cortes de cerebro 

por microscopía como mediante fluorimetría, se obtiene que la unión de 

phe-phe incrementa su paso a través de la BHE, si bien el procedimiento de 

funcionalización afecta de diferente manera a los perfiles de distribución 

cerebral del marcador. 

  



Resumen 

7 

Conclusiones 

1. Los dos métodos de cuantificación de morin hidrato desarrollados por 

HPLC resultaron ser lineales, selectivos y precisos. El método que emplea 

HCl en la preparación de las muestras resultó ser más exacto y sensible, 

disminuyendo los límites de detección y cuantificación del flavonoide.  

2. La unión del péptido phe-phe a las NPs es capaz de aumentar su paso a 

través de la barrera hematoencefálica, condicionando su biodistribución 

en otros órganos. 

3. La unión del péptido phe-phe a la superficie de las NPs supone la pérdida 

de morin hidrato/rodamina-B en las capas superficiales de las NPs. 

4.- La interacción del péptido phe-phe unido al polímero con los grupos 

aromáticos de morin hidrato/rodamina-B forma un complejo altamente 

lipófilo que se internaliza en el núcleo de las NPs, incrementando 

significativamente la eficacia de encapsulación. 

 

  



Mario Alonso 

8 

 



 

9 

SUMMARY 

  



Mario Alonso 

10 

  



Summary 

11 

Introduction 

Morin hydrate (MH) is a flavonoid of plant origin, which has been 

shown in vitro to have activity against neurodegeneration mechanisms 

associated with Alzheimer's disease (AD), avoiding hyperphosphorylation of 

the Tau protein, dissolving β-amyloid peptide aggregates that form senile 

plaques and reducing oxidative stress produced by reactive oxygen species. 

Its potential clinical use is very limited due to its low bioavailability, rapid 

liver metabolism, and poor ability to cross the blood-brain barrier (BBB). 

Objective 

The main objective of this doctoral thesis is to increase the ability of 

MH to cross the BBB, thus enhancing its potential interest in the treatment 

of neurodegenerative diseases; like Alzheimer's. For this, biodegradable 

PLGA nanoparticles (NPs) are developed and characterized, loaded with MH 

and functionalized with the phenylalanine-phenylalanine dipeptide, used to 

promote targeting to the site of action in the CNS. The functionalization is 

carried out, firstly, on the NPs already prepared and, secondly, on the 

polymer before the formation of the nanosystems. Once the NPs have been 

characterized in vitro, their in vivo biodistribution is studied. For the 

quantification of MH, methods have been developed and validated by HPLC 

and UV spectrophotometry. 

  



Mario Alonso 

12 

Experimental 

▪ Development and validation of analytical methods for the 

quantification of MH: HPLC and UV spectrophotometry. 

▪ Development and characterization of non-functionalized and phe-

phe functionalized nanoparticles, loaded with the fluorescence 

marker (rhodamine-B). 

▪ Development and in vitro characterization of PLGA nanoparticles 

loaded with morin hydrate. 

▪ In vivo evaluation of the biodistribution of nanoparticles in liver, 

kidney, lung and spleen. 

▪ In vivo evaluation of the passage of nanoparticles through the 

BBB. 

Results and discussion 

Development and validation of analytical methods for the 

quantification of MH: HPLC and UV spectrophotometry: 

Two methods have been developed and validated by HPLC treating 

and without treating the samples with hydrochloric acid, and one method 

by UV spectrophotometry. All methods are linear, exact, precise and 

selective; allowing to quantify the MH encapsulated within the NPs, and 

that released in vitro. 



Summary 

13 

Development and characterization of non-functionalized phe-phe 

peptide functionalized nanoparticles, loaded with the fluorescence 

marker (rhodamine-B): 

The elaboration of nanoparticles has been carried out by solvent 

extraction-evaporation. The functionalization on the NPs already prepared 

is carried out by activation with NHS (N-hydroxysuccinimide) / EDC (1-Ethyl-

3- [3-dimethylaminopropyl] carbodimide hydrochloride) in MES buffer pH 

4.7 (2 (N-morpholino) ethanesulfonic acid) and PBS buffer pH 7.4. The 

functionalization of the PLGA polymer, before forming the NPs, is carried 

out by activation with NHS in the absence of oxygen. All NPs formulations 

have particle sizes of about 190 nm and enough encapsulation of 

rhodamine-B to allow for evaluating their behaviour in vivo. 

Development and in vitro characterization of PLGA nanoparticles 

loaded with morin hydrate: 

NPs have been prepared by nanoprecipitation and solvent extraction-

evaporation methods, the latter being the most suitable for encapsulation 

of MH, and in which the optimal MH: PLGA ratio is 1:10. All NPs 

formulations have mean particle sizes around 190 nm, with an MH release 

profile for at least 9 days. Encapsulation efficiency (EE) is influenced by the 

functionalization process. In PLGA-phe-phe functionalization, EE increased 

from 80% to 96% (before and after), probably due to the interaction 

between MH and the dipeptide. In the functionalization carried out on the 

NPs already formed, there is a loss of 40-50% of MH, which can be 

attributed to the amount present on the surface of the NPs. 

  



Mario Alonso 

14 

In vivo evaluation of the biodistribution of nanoparticles in liver, 

kidney, lung and spleen: 

Three NPs formulations have been prepared for in vivo evaluation: 

non-functionalized NPs, phe-phe functionalized NPs after processing, and 

NPs made with peptide bound to the PLGA polymer. All formulations are 

loaded with the fluorescence marker rhodamine-B. The biodistribution 

study is carried out in male Wistar rats to which a dose of 50 mg/Kg in 

suspension of the NPs is administered in the tail vein. The animals are 

sacrificed at times 1 hour and 2 hours after the administration. When 

evaluating the fluorescence of the marker rhodamine-B in the organs, it is 

found that functionalization increases the presence of the NPs in spleen, 

when performed on the NPs already formed. The tendency of the 

formulations is to increase its presence in the organs at 2 hours, with the 

exception of the spleen, where it tends to decrease. In the case of NPs with 

PLGA bound to phe-phe, the levels in the spleen, although low, increase 

with time. 

In vivo evaluation of the passage of nanoparticles through the BBB: 

The fluorescence of rhodamine-B is measured in brain sections by 

microscopy and fluorimetry- It is obtained that the binding of phe-phe 

increases its passage through the BBB, although the functionalization 

procedure affects differently the cerebral distribution profiles of the 

fluorescence marker. 

  



Summary 

15 

Conclusions 

1. The two methods of quantification of morin hydrate by HPLC are 

linear, selective and precise. Treatment of samples with HCl lowers the 

limits of detection and quantification and increase the accuracy. The 

quantification method by UV spectrophotometry is linear, exact, 

selective and precise. 

2. Binding of the phe-phe peptide to NPs is able of increasing its passage 

through the blood-brain barrier, conditioning its biodistribution in 

other organs. 

3. Binding of the phe-phe peptide to the surface of the NPs leads the loss 

of morin hydrate/rhodamine-B in the surface layers of the NPs. 

4. The interaction of phe-phe peptide bound to the polymer with the 

aromatic groups of morin hydrate/rhodamine-B forms a highly 

lipophilic complex that is internalized in the nucleus of the NPs, 

significantly increasing the encapsulation efficiency. 

 

  



Mario Alonso 

16 

 

  



 

17 

 

I- INTRODUCCIÓN 

  



Mario Alonso 

18 

  



Introducción: Enfermedad de Alzheimer 

19 

1. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 

La OMS define las demencias como “un síndrome, generalmente de 

naturaleza crónica o progresiva, que se caracteriza por un deterioro de la 

función cognitiva más allá de lo que podría considerarse consecuencia de 

un envejecimiento normal” (OMS, 2013). En 1908, Alois Alzheimer 

identificó una serie de afecciones en el tejido cerebral de sus pacientes que 

le permitieron describir lo que hoy conocemos como Enfermedad de 

Alzheimer (EA). 

La EA es hoy en día la patología neurodegenerativa más común  

(OMS, 2013). Representa entre el 50 y el 75% de los casos de demencia en 

el mundo (Niu, et al., 2017; Alzheimer’s Association, 2019),  

ya que afecta a más de 50 millones de personas sólo en 2019  

(Alzheimer’s Association, 2019). La incidencia de esta enfermedad se 

duplica cada 5 años a partir de los 65 años y se estima que más del 30% de 

las personas mayores de 85 años la padecen. 

La gradual pérdida de neuronas asociada a esta enfermedad supone 

una progresiva reducción de la calidad de vida para el paciente y su familia. 

Debido al deterioro de las áreas cognitivas del cerebro, responsables del 

aprendizaje y la memoria, el paciente experimenta dificultades a la hora de 

expresarse, organizar sus pensamientos o recordar eventos de su vida 

diaria. A medida que la enfermedad progresa, los pacientes van requiriendo 

cada vez de más ayuda, incluso en las tareas más sencillas, como pueden 

ser atarse los cordones, vestirse, o ya en las últimas etapas, comer. Debido 

a este fenómeno de dependencia que llega a ser completa, esta 

enfermedad supone un importante impacto económico y social. A menudo 



Mario Alonso 

20 

a las familias les supone un gran esfuerzo verse obligadas a requerir de 

ayudas externas para poder ocuparse de un pariente que padece la 

enfermedad y poder pagar, al mismo tiempo, los costes de una medicación 

crónica. A todo ello hay que sumarle el nada despreciable impacto 

emocional que genera el deterioro cognitivo de un ser querido. 

1.1. Anatomía patológica 

Actualmente la EA se considera una enfermedad multifactorial y, si 

bien sus causas no están del todo esclarecidas, su desarrollo sí parece tener 

una serie de factores comunes (Varma, et al., 2018). Entre las características 

propias de esta patología neurodegenerativa podemos destacar la 

acumulación de péptido β-amiloide (Aβ) en el medio extracelular, la 

formación de ovillos de proteína Tau (p-Tau) en el citoplasma celular, el 

incremento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y la presencia 

neuroinflamación (O’Brien y Wong, 2011). 

- Acumulación de placas de péptido Aβ 

La hipótesis amiloide sugiere que el proceso de 

neurodegeneración se produce debido a la acumulación del péptido 

β-amiloide, que es insoluble en el medio extracelular. Este péptido 

procede del metabolismo de la proteína precursora de amiloide 

(APP), presente en la membrana de la célula. 

APP presenta dos vías de metabolización: la vía no 

amiloidogénica, en la cual interviene una α-secretasa y da lugar a α-

amiloide (Aα) que es interiorizado y degradado por la propia  

célula y la vía amiloidogénica, en la cual intervienen  



Introducción: Enfermedad de Alzheimer 

21 

BACE-1 (β-site-APP-cleaving enzime-1), una β y una γ-secretasa, en la 

cual se genera Aβ (Folch, 2015) (figura 1.1). 

 

Figura 1.1. Rutas de degradación de APP y formación de Aβ. 

En condiciones fisiológicas, el metabolismo se produce 

principalmente por la α-secretasa, mientras que la producción de Aβ 

se encuentra muy disminuida. Aβ es un fragmento soluble y puede 

ser retirado por los astrocitos (O’Brien y Wong, 2011; Rajsekhar, et 

al., 2015). El problema surge cuando durante la EA, BACE-1 se 

encuentra sobreestimulada así, el proceso se desplaza hacia la 

formación de Aβ. Grandes concentraciones de este péptido amiloide 

dan lugar a agregados insolubles, que originan las conocidas como 

“placas seniles”, responsables del daño y muerte celular de las 

neuronas colindantes (Rajsekhar, et al., 2015). 

  



Mario Alonso 

22 

- Ovillos neurofibrilares de proteína Tau  

La p-Tau es, en ausencia de patología, una proteína que 

contribuye al normal mantenimiento de la estructura de las 

neuronas. No obstante, durante la EA se produce un incremento en 

la actividad de la glicógeno-sintasa quinasa 3β (GSK3β) y la 

calmodulin-quinasa II (CAMKII), que introducen gran número de 

grupos fosfato en los residuos de serina de la proteína p-Tau 

(Ebrahipour, et al., 2018; Varma, et al., 2018). Esta hiperfosforilación 

de la proteína genera un cambio en su conformación hacia una β-

hélice insoluble (Tang, et al., 2013; Fitzpatrick, et al., 2017). La 

acumulación en el citoplasma de fibras de p-Tau insoluble altera y 

daña la membrana celular; se produce así la activación en la neurona 

una vía apoptótica (Varma, et al., 2018). 

- Especies reactivas de oxígeno (ROS) 

La presencia de precipitados de proteína p-Tau en el citosol 

produce al mismo tiempo una disfunción en las mitocondrias y altera 

la cadena de transporte de electrones, por ello incrementa la 

producción de especies reactivas de oxígeno en el medio intracelular 

(Chen y Zhong, 2014). El crecimiento intracelular de ROS aumenta a 

su vez la actividad de la BACE-1 y de GSK3β, así los niveles de Aβ y  

p-Tau se incrementan también. Esto, unido a la peroxidación de los 

fosfolípidos de las membranas celulares, consecuencia de la 

presencia de ROS, produce un mayor daño en la mitocondria y se 

genera un bucle positivo en la formación de especies reactivas 

(Tönnies, et al., 2017) (figura 1.2). Este ciclo de acumulación de ROS 



Introducción: Enfermedad de Alzheimer 

23 

termina por producir daño en el ADN celular e induce la apoptosis 

celular por la vía de la caspasa-3 (Tavakkoli, et al., 2019). 

 

Figura 1.2: Esquema de distintas rutas que llevan a la muerte neuronal en el Alzheimer. 

- Neuroinflamación  

La neuroinflamación es una respuesta en el SNC caracterizada 

por la acumulación de células de la glía, evento que aparenta tener 

gran importancia durante la EA. Tradicionalmente, el cerebro se ha 

considerado como un órgano con “privilegios inmunes”, es decir, 

debido a la existencia de la barrera hematoencefálica (BHE) el 

cerebro parecía estar aislado de una respuesta inmune convencional 

(Carson, et al., 2006). No obstante, en la década de 1990 se observó 

que los fármacos antiinflamatorios podían tener un efecto protector 

frente a la progresión de la EA (McGeer, et al., 1996). 



Mario Alonso 

24 

Como se ha podido ver, ninguno de los procesos destacados en la 

EA sucede de manera aislada, sino que todos ellos se ven entrelazados y 

son a la vez causa y consecuencia de los demás (figura 1.2). 

1.2. Diagnóstico de la EA 

La EA se caracteriza por ser un proceso que, en general, tiene una 

progresión bastante lenta y pueden pasar años hasta que se manifiestan los 

primeros síntomas. Esto se debe a que al principio del proceso el cerebro 

es capaz de suplir la pérdida de algunas de sus neuronas mediante la 

actividad de las supervivientes. Este dato, que aparenta ser positivo, tiene 

sin embargo un lado muy negativo: cuando los síntomas de la EA son 

evidentes el daño cerebral es ya muy avanzado. 

Actualmente el diagnóstico de la EA se basa principalmente en la 

aplicación de criterios clínicos, ya que hasta la fecha no se han establecido 

marcadores biológicos que permitan su identificación con la fiabilidad y 

especificidad necesarias (Valls-Pedret, et al., 2010). Esto conlleva dos 

importantes problemas: el primero, la enfermedad no se puede 

diagnosticar hasta la aparición de los primeros síntomas, de modo que se 

presenta un periodo subclínico durante el cual el paciente permanece sin 

tratamiento; y el segundo, la posibilidad de diagnosticar erróneamente otro 

tipo de demencia u afección que se corresponda con los síntomas iniciales 

de la EA (Valls-Pedret, et al., 2010). 

  



Introducción: Enfermedad de Alzheimer 

25 

1.3. Tratamiento de la EA 

La EA carece hoy de un tratamiento eficaz que permita su curación, 

razón por la cual los que se emplean están orientados a reducir su 

progresión, disminuir sus síntomas y mantener en lo posible la calidad de 

vida los pacientes. El tratamiento de la EA puede abarcar desde una terapia 

de rehabilitación y fisioterapia hasta un tratamiento farmacológico. Dada la 

temática de esta memoria, abordaremos los tratamientos farmacológicos 

más habituales. 

▪ Inhibidores de la acetilcolinesterasa 

Los inhibidores de la colinesterasa son en la actualidad los agentes 

terapéuticos más utilizados en el tratamiento sintomático de la 

enfermedad. La acetilcolina es sintetizada en las neuronas presinápticas 

a partir de sus precursores; colina y acetil-coenzima A que, por acción del 

enzima acetilcolinesterasa, dan lugar a la acetilcolina. Durante la EA la 

disfunción neuronal, al igual que la reducción del número de estas 

células, da lugar a una disminución de este neurotransmisor (NT), ello 

origina gran parte de los síntomas asociados a la enfermedad. 

El uso de inhibidores de la acetilcolinesterasa busca aumentar los 

niveles sinápticos de este NT, al disminuir su eliminación mediante la 

acetilcolinesterasa y la butilcolinesterasa. 

Este tipo de terapia, si bien obtiene unos buenos resultados 

iniciales, presenta dos problemas de gran importancia: en primer lugar, 

se produce un fenómeno de tolerancia y requiere un incremento 

progresivo de la dosis. En segundo lugar, presenta un elevado índice de 



Mario Alonso 

26 

abandono, ya que son muy numerosos los efectos adversos que ocasiona 

su administración crónica, principalmente efectos extrapiramidales 

(Sicras, et al., 2004). 

Los inhibidores de la acetilcolinesterasa están principalmente 

indicados para los primeros estadios de la EA, cuando su actividad 

permite la reducción de los síntomas. A medida que el daño neuronal 

progresa, los beneficios de este tipo de terapia se van reduciendo. A este 

grupo de fármacos pertenecen la tacrina, el donepezilo, la rivastigmina y 

la galantamina. 

Tacrina 

Tacrina es un inhibidor de la colinesterasa a nivel del SNC capaz de 

actuar como agonista colinérgico indirecto al incrementar, también, la 

producción de acetilcolina. Fue el primer inhibidor de la colinesterasa 

aprobado para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, bajo el 

nombre comercial COGNEX® (Jarrot, 2017). Aunque presenta cierta 

selectividad por la colinesterasa a nivel central, este fármaco también 

inhibe la butilcolinesterasa y da lugar a bastantes efectos adversos. 

El clorhidrato de tacrina sufre en el organismo un importante efecto 

de primer paso después de su administración lo que supone una 

biodisponibilidad del 5-30%, que aumenta de forma lineal con la dosis. 

Su semivida de eliminación oscila de 1,5 a 4 horas, y se metaboliza por la 

enzima CYP1A2 del citocromo P-450 (Samuels y Davis, 1997). 

Junto con sus efectos adversos, el principal inconveniente de este 

fármaco ha resultado ser su toxicidad hepática y la sospecha de poder 

resultar carcinogénico. Aunque no hay muertes registradas por daño 



Introducción: Enfermedad de Alzheimer 

27 

hepático asociado a tacrina, sí se ha observado que incrementa los 

niveles de enzimas hepáticas entre un 60 a un 90% en tratamientos 

prolongados. De hecho, la biopsia del hígado de un paciente de 76 años 

sin antecedentes de hepatitis B o C en tratamiento de 8 semanas con este 

fármaco mostró hepatitis lobular (Samuels y Davies, 1997). 

Actualmente la tacrina está aprobada para su uso por la FDA, pero 

no se comercializa en España. 

Donepezilo 

Es un derivado de piperidina que actúa como inhibidor reversible de 

la colinesterasa. A diferencia de otros inhibidores, donepezilo actúa 

principalmente sobre la colinesterasa presente en el SNC y su afinidad es 

1.000 veces más potente por esta enzima que por la butilcolinesterasa, 

que está presente en el sistema nervioso periférico. 

A diferencia de lo que ocurre con la tacrina, el donepezilo no presenta 

toxicidad hepática. Este fármaco ha demostrado la misma eficacia clínica 

que otros inhibidores de la colinesterasa y no es capaz de frenar el avance 

de la enfermedad, aunque sí retrasa la progresión de sus síntomas 

(LiverTox, 2012).  

La absorción oral del donepezilo permite alcanzar los niveles 

plasmáticos máximos a las 3-4 horas de su administración (Rogers y 

Friedhoff, 1998). En su distribución circula unida en un 95% a proteínas 

plasmáticas, y presenta una semivida plasmática de eliminación 

prolongada, de unas 70 horas. Se excreta en parte inalterado en orina y 

también metabolizado por el citocromo P-450 (Tiseo, et al. 1998). 



Mario Alonso 

28 

La toxicidad del donepezilo se encuentra principalmente asociada a 

la sobredosificación y da lugar a crisis colinérgicas que cursan con 

nauseas violentas, vómitos, salivación, sudores, bradicardia, hipotensión, 

insuficiencia respiratoria, convulsiones y colapso. 

Rivastigmina: 

La rivastigmina es un carbamato con actividad inhibidora de la 

colinesterasa.  

Desde su introducción al uso clínico se ha notificado al menos un 

caso clínicamente relevante de daño hepático con ictericia leve. Por ello 

se ha establecido que es un fármaco con potencial de causar daños en el 

hígado. En la actualidad se desconoce el mecanismo por el cual se 

produce el daño hepático: se ha descartado la posibilidad de que se deba 

a un incremento en la actividad metabólica y podría estar relacionado 

con causas inmunes (LiverTox, 2012). 

Galantamina: 

La galantamina es un alcaloide que actúa como inhibidor selectivo y 

reversible de la colinesterasa y, además, como agonista indirecto al 

estimular la acción de la acetilcolina sobre los receptores nicotínicos, al 

unirse a un lugar alostérico. 

La absorción de la galantamina es relativamente rápida pues 

permite alcanzar las concentraciones plasmáticas máximas pasada una 

hora de su administración oral, con una biodisponibilidad del 88,6%. Su 

semivida es de 7-8 horas y se metaboliza en un porcentaje elevado 



Introducción: Enfermedad de Alzheimer 

29 

(alrededor del 75%) por el CYP2D6 del citocromo P-450; otra parte se 

excreta inalterada por orina. 

En pacientes con insuficiencia hepática moderada y grave su 

semivida plasmática de eliminación se ve incrementada 

significativamente. Puede presentar toxicidad hepática, que en 

ocasiones conduce a hepatitis, al igual que se puede observar un 

incremento en las enzimas hepáticas (LiverTox, 2012). 

▪ Memantina 

La memantina es un antagonista no competitivo de los receptores 

NMDA (N-metil-D-aspartato), con afinidad moderada. Su actividad se 

centra en modular el efecto causado por el incremento de los niveles de 

glutamato durante la patología, responsables de causar disfunción 

neuronal. 

Es un fármaco que está indicado para el tratamiento de la 

enfermedad en sus fases moderadas y avanzadas. Los efectos adversos 

de la memantina son poco frecuentes y de carácter leve; entre los que se 

incluyen confusión, mareos, dolor de cabeza y fatiga (Tariot, et al., 2004). 

La biodisponibilidad oral de la memantina es prácticamente del 

100% y alcanza las concentraciones plasmáticas máximas entre las 3-8 

horas. La semivida de eliminación de este fármaco oscila entre las 60-100 

horas y es excretada prácticamente en su totalidad por vía renal de forma 

inalterada.  

Está descrito al menos un caso de hepatotoxicidad clínicamente 

relevante. En él, un paciente en tratamiento con memantina durante 3 



Mario Alonso 

30 

semanas sufrió una hepatitis colestásica aguda de gravedad moderada. 

La afección hepática revertió rápidamente al suspender el tratamiento. 

Dado que no hubo indicios de afectación inmune y que el fármaco no 

presenta prácticamente metabolismo hepático, se desconocen las causas 

del daño en este órgano (LiverTox, 2012). 

▪ Antiinflamatorios 

Tras aceptarse la posibilidad de que el sistema inmune (SI) tenga un 

importante papel mediador en el desarrollo de la EA, hay cada vez más 

estudios en los que se propone el uso de antiinflamatorios no 

esteroideos (AINEs) para disminuir la neuroinflamación durante la 

patología y también, para disminuir el riesgo de padecer la enfermedad 

(Deardorff, et al., 2017). Se ha postulado también que ciertos AINEs son 

capaces de reducir la producción del péptido Aβ y consigue disminuir la 

formación de las placas seniles (Prade, et al., 2015). No obstante, 

estudios realizados con metaanálisis no mostraron mejoras significativas 

entre los pacientes tratados con AINES (ácido acetilsalicílico y otros) y los 

pacientes que recibieron un placebo (Jaturapatporn, et al., 2012). 

▪ Neuroprotectores 

Actualmente el tratamiento con neuroprotectores, el cual busca 

reducir la progresión de la enfermedad al disminuir la muerte neuronal, 

es uno de los objetivos diana en la investigación para la EA. Está 

orientado principalmente a buscar moléculas con actividad contra la 

producción del péptido Aβ, antioxidantes que puedan reducir el estrés 

oxidativo en las neuronas o disminuir la hiperfosforilación de p-Tau; de 

forma que aumenta la supervivencia neuronal.



Introducción: Barrera Hematoencefálica 

31 

2. BARRERA HEMATOENCEFÁLICA 

El sistema nervioso central lo componen algunos los órganos más 

importantes del cuerpo humano, pero también de los más delicados y 

sensibles a los xenobióticos. Pequeños cambios en las concentraciones de 

iones Na+, K+ o aminoácidos, pueden impedir el correcto funcionamiento de 

las neuronas. Es por ello que el organismo ha desarrollado una serie de 

barreras que impiden el acceso de sustancias potencialmente dañinas a 

estos tejidos y el paso de organismos patógenos. Estas barreras únicamente 

permiten el acceso de los nutrientes esenciales en las cantidades necesarias 

para el funcionamiento del sistema. La barrera hematoencefálica y la 

barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BSLCR) son las estructuras que se 

encargan del mantenimiento de la homeostasis en el SNC y presentan 

distintos grados de permeabilidad; la BHE es la más restrictiva y la que 

presenta una mayor superficie (Cipolla, 2009). 

La principal característica de la BHE, su selectividad al paso de 

sustancias, es responsable de la dificultad y baja eficacia del tratamiento de 

las patologías del SNC (Bhowmik, et al., 2017), ya sean procesos 

neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, 

otras tautopatías), oncológicos o infecciosos. 

  



Mario Alonso 

32 

2.1. Componentes de la BHE 

Las principales funciones de la BHE son el mantenimiento de la 

homeostasis en el SNC y la prevención del acceso de sustancias tóxicas para 

el mismo (Farokhazad y Langer, 2006). Para entender cómo se realizan estás 

funciones, se debe prestar atención a los componentes que constituyen la 

BHE. En los capilares cerebrales (figura 1.3) se puede encontrar una capa de 

células endoteliales rodeada de una membrana basal con pericitos; 

además, la presencia de astrocitos que recubren aproximadamente el 99% 

de su superficie, la existencia de células de la microglía y algunas 

terminaciones neuronales (Helms, et al., 2016). 

 

Figura 1.3: Esquema de un capilar cerebral 

  



Introducción: Barrera Hematoencefálica 

33 

2.1.1. Células endoteliales 

Las endoteliales son las células que componen la primera capa de la 

BHE y están en contacto directo con la circulación sistémica. A diferencia de 

las células endoteliales del resto de capilares del organismo, éstas 

presentan un mayor contenido mitocondrial, ausencia de fenestraciones y 

una actividad pinocítica mínima (Takakura et al., 1991; Oldendorf et al., 

1977), aunque la principal diferencia respecto a otros capilares es que estas 

células se encuentran íntimamente unidas por la presencia de uniones 

adherentes (AJs), uniones estrechas (TJs) y uniones Gap (GJs) (Huber, et al., 

2001). Las TJs están formadas por múltiples proteínas de adhesión 

transmembrana, dispuestas en paralelo, en forma de múltiples barreras. 

(Abbott, et al., 2010). Se pueden encontrar ocludinas y claudinas, proteínas 

tipo IgG, JAMs (Junctional adhesion molecules), entre otras, y es la  

Claudina-5 el componente mayoritario en la TJs (Martìn-Padura, et al., 

1998) Las TJs son las que tienen mayor importancia de cara a limitar el paso 

de sustancias entre las células endoteliales (transporte paracelular), al 

formar uniones fuertes proteína-proteína con las células adyacentes. Estas 

uniones generan un gran impedimento al paso de sustancias por tamaño y 

polaridad y una alta resistencia eléctrica, que restringe el paso libre de iones 

y moléculas cargadas (Butt, et al., 1990; Abbot, et al., 2006). Por su parte, 

las AJs presentan una organización similar a las TJs pero se encuentran 

formadas principalmente por proteínas transmembrana Ca2+ dependientes, 

las Cadherinas, que establecen uniones célula-célula por medio de 

interacciones homotrópicas (Bazzoni y Dejana, 2004). El último tipo de 

uniones entre células endoteliales son las GJs, que están formadas por 

proteínas de la familia de las conexinas. Estas GJs están implicadas en la 



Mario Alonso 

34 

comunicación entre células adyacentes y permiten el paso de iones 

(Langrée, et al., 2003). 

▪ Pericitos 

Los pericitos son células contráctiles de tejido conectivo, planas y no 

diferenciadas. No está totalmente esclarecido, pero se postula que su 

función en la BHE es la de ayudar a regular la proliferación y supervivencia 

de las células endoteliales (Lai y Kuo, 2005). Se ha observado que en 

condiciones de hipoxia o trauma cerebral los pericitos migran de su posición 

natural en la BHE (Gonul, et al., 2002; Dore-Duffy, et al., 2000), lo que puede 

estar relacionado con el aumento de la permeabilidad de la BHE en estas 

situaciones.  

▪ Astrocitos 

Los astrocitos son el tipo de célula más abundante en el SNC pues 

componen la mayor parte de la sustancia gris. Además, presentan 

morfología distinta en función de su localización en el SNC (Abbot, et al., 

2006). En la BHE, los astrocitos recubren cerca del 99% la superficie luminal 

de las células endoteliales (Helms, et al., 2016). En la superficie de estas 

células se encuentran distintos transportadores, como la glicoproteína P 

(gp-P) que les permite secuestrar sustancias potencialmente dañinas, que 

pudiesen haber atravesado la capa de células endoteliales (Ronaldson y 

Davis, 2012). También pueden disminuir la concentración de 

neurotransmisores u otras sustancias producidas en el SNC que, en altas 

concentraciones, pudiesen suponer un riesgo para el mismo, como puede 

ser el caso del glutamato. Los astrocitos expresan en su membrana 

transportadores de glutamato EAAT1 y EAAT2 que permiten secuestrar este 



Introducción: Barrera Hematoencefálica 

35 

aminoácido (aa) si se encuentra en exceso, lo que previene que cause 

excito-toxicidad en el tejido nervioso (Yi y Hazell, 2006). 

▪ Microglía 

Las células de la microglía son las células inmunitarias encargadas de 

la respuesta inmune primaria en el SNC. Se encuentran distribuidas por 

todo el tejido y se activan en respuesta a traumatismos, inflamaciones 

sistémicas y distintas patologías del SNC. La activación de estas células, en 

respuesta a una situación de estrés, altera su morfología y adoptan un 

aspecto ameboide con ramificaciones (Kattenmann, et al., 2011). Está 

activación genera una respuesta por parte de las células de la microglía en 

la que se liberan gran cantidad de mediadores proinflamatorios, como TNF-

α y distintas interleuquinas (Ronaldson y Davis, 2012). Estos mediadores 

pueden a su vez generar daño celular y muerte neuronal y por ello se 

asocian a la neuroinflamación en distintas patologías como la EA  

(Labus, et al., 2014). 

2.2. Transporte a través de la barrera 

La BHE supone un impedimento excelente al paso de sustancias al SNC 

aunque, debido a su elevada demanda metabólica, ya que consume 

alrededor del 20% de las necesidades de oxígeno del organismo (Rolfe y 

Brown, 1997), debe incorporar mecanismos selectivos que permitan el 

acceso de los nutrientes esenciales. 

Las células endoteliales de la BHE, a diferencia de las periféricas 

presentan un elevado número de uniones estrechas, escaso transporte por 

pinocitosis o vesículas y muchas menos fenestraciones. El transporte de 



Mario Alonso 

36 

sustancias desde el torrente sanguíneo al tejido cerebral depende 

principalmente del tamaño de la molécula, su liposolubilidad, carga 

eléctrica o la presencia de transportadores específicos (Moody, 2006). A 

diferencia de lo que ocurre en la circulación periférica, las características 

uniones entre las células endoteliales de la BHE dificultan enormemente el 

paso de sustancias hidrofílicas a través de los espacios intercelulares. Por 

ello, tradicionalmente se ha empleado el coeficiente de reparto 

octanol/agua para predecir el comportamiento de una sustancia frente a la 

BHE. Por ejemplo, la dihidramina, con un elevado coeficiente de reparto, 

pasa fácilmente la barrera, mientras que la loratadina, con un coeficiente 

bajo, prácticamente no accede al SNC (Kay, 2000). No obstante, a medida 

que se ha avanzado en el estudio de la BHE, se ha podido observar que esta 

aproximación es inexacta, ya que no se ha tenido en cuenta la presencia de 

transportadores específicos y bombas de eliminación. 

Así podemos diferenciar distintos mecanismos de paso a través de la 

BHE (Figura 1.4): transporte paracelular, difusión pasiva, transporte a través 

de proteínas transmembrana o canales de transporte, transcitosis, y 

transcitosis mediada por receptores o a través de bombas de eliminación.  



Introducción: Barrera Hematoencefálica 

37 

 

Figura 1.4: Resumen de los tipos de transporte a través de la BHE. 

2.2.1. Transporte paracelular 

Esta vía de paso implica el acceso al líquido cefalorraquídeo (LCR) a 

través de los espacios entre células epiteliales de la BHE. Como ya se ha 

comentado, esta barrera se caracteriza por presentar espacios 

intercelulares muy reducidos, y la presencia de TJs en ellos le confiere una 

elevada resistencia eléctrica al paso de moléculas cargadas, e impide el 

acceso a moléculas de gran tamaño (Butt, et al., 1990). Por ello, esta vía la 

pueden emplear sólo sustancias de muy bajo peso molecular y elevada 

liposolubilidad. 

  



Mario Alonso 

38 

2.2.2. Transporte transcelular 

▪ Transporte por difusión pasiva 

El acceso al SNC por difusión pasiva está casi exclusivamente reservado 

a gases, como O2 o CO2, que son capaces de atravesar la membrana celular 

por simple diferencia de gradientes, o a fármacos muy específicos, como la 

morfina (Abbott et al., 2010; De Gragori, et al., 2012). 

▪ Transportadores específicos 

La mayor parte de las moléculas cargadas, de tamaño elevado o 

hidrofílicas que son capaces de alcanzar el tejido cerebral, emplean 

proteínas transmembrana específicas para lograrlo. Es el caso de la glucosa, 

que emplea el canal GLUT-1, ya que su elevada hidrofilia y tamaño impiden 

que pueda acceder de cualquier otra forma, pese a su elevada demanda por 

parte del SNC (Persidsky et al., 2006). Otros elementos esenciales emplean 

también canales similares. Así, aminoácidos como la fenilalanina, la tirosina 

o la isoleucina emplean el transportador de aminoácidos largos de tipo 1 

(LAT-1) para atravesar la BHE. Los aminoácidos ácidos, como el ácido 

glutámico o el aspártico, así como los precursores de ácidos nucleicos, 

emplean canales diferentes, menos expresados. Los aminoácidos neutros 

de pequeño tamaño utilizan canales en el polo abluminal de estas células 

que solamente permiten la circulación de salida. 

  



Introducción: Barrera Hematoencefálica 

39 

- GLUT-1 

La glucosa es esencial para el correcto funcionamiento de las 

neuronas, ya que es casi su única forma de obtener energía. En el tejido 

cerebral se pueden encontrar al menos 3 isoformas del canal de transporte 

de glucosa, GLUT: GLUT-5, presente en la microglía; GLUT-3, expresado en 

las neuronas; y GLUT-1, muy expresado en las células epiteliales de la BHE 

(Mooradian et al., 1997). GLUT-1 es una proteína codificada por el gen 

SLC2A1, con 12 segmentos α-hélice transmembrana, agrupadas para 

formar un canal polar a través del cual puede difundir la glucosa. 

Durante el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, se ha podido 

observar que la expresión de estos transportadores se reduce 

significativamente (Mooradian et al., 1997; Keaney y Campbell, 2015). Esto 

parece estar relacionado también con una disminución en el aclaramiento 

de Aβ en el SNC (Keaney y Campbell, 2015). 

- LAT-1 

El transportador de aminoácidos de tipo 1, es un complejo proteico 

transmembrana que consta de dos subunidades: una cadena ligera 

(SLC7A5) y una cadena pesada CD98. Se trata de un transportador 

independiente de NA+ y pH, el cual permite el paso de L-aminoácidos 

grandes, neutros, aromáticos o ramificados (leucina, fenilalanina, 

isoleucina, triptófano, tirosina, metionina o histidina) de la circulación 

sistémica al SNC a través de la BHE. Este canal no sólo es capaz de permitir 

el paso de estos aminoácidos, sino también de fármacos como la L-DOPA o 

la gabapentina (Huttunen, et al., 2019). 



Mario Alonso 

40 

Este transportador se expresa tanto en la superficie luminal como 

abluminal de las células epiteliales de la BHE y en las células que componen 

su segunda capa (astrocitos, células de la glía y neuronas primarias) 

(Huttunen, et al., 2019; Boado, et al., 1999). Dado que esta proteína, a 

diferencia de otros transportadores, no ve reducida su expresión como 

consecuencia de los procesos inflamatorios en la EA e incluso se puede ver 

sobreexpresada en otras patologías, como algunos tumores, resulta una 

diana atractiva para conseguir que distintos profármacos puedan, no sólo 

atravesar la BHE, sino también acceder al interior de las células  

cerebrales o emplearse para facilitar la llegada de nanosistemas al  

SNC (Ong, et al., 2017; Gynther, et al., 2019). 

▪ Transcitosis y transcitosis mediada por receptores 

Son vías reservadas a aquellas moléculas de mayor tamaño 

imprescindibles para el correcto funcionamiento de las neuronas, como 

pueden ser la insulina, la transferrina, el colesterol y algunas proteínas 

sanguíneas (Fu, 2018). Su mecanismo se puede emplear tanto como medio 

de ingreso al SNC o como sistema de expulsión de este. La transcitosis no 

mediada por receptores o transcitosis por adsorción se produce cuando una 

proteína de carga positiva de adhiere a la superficie de la célula epitelial 

(con carga negativa). A continuación, se produce la invaginación de esta 

membrana y el proceso de transcitosis. La transcitosis mediada por 

receptores es un proceso similar pero que involucra la unión previa de la 

sustancia a un receptor específico: la figura 1.5 esquematiza el proceso. El 

inicio se produce cuando un ligando proteico o una molécula vectorizada se 

une a un receptor específico de la membrana apical de las células epiteliales 

de la barrera (figura 1.5-1). Como consecuencia de esta unión se produce 



Introducción: Barrera Hematoencefálica 

41 

una invaginación de la membrana (figura 1.5-2), que forma una vesícula y 

completa el mecanismo de endocitosis. Esta vesícula con el complejo 

ligando-receptor en su interior puede dirigirse hacia distintos destinos: en 

algunos casos la vesícula se reincorpora a la membrana apical, el ligando se 

expulsa así de nuevo a circulación sistémica (figura 1.5-3). En otros casos, la 

vesícula será transportada a la membrana basolateral de forma que permite 

el acceso del ligando al SNC, proceso conocido como transcitosis (figura 1.5-

4). La última posibilidad radica en la migración de la vesícula al lisosoma, 

donde su contenido será degradado por la célula (figura 1.5-5). (Lajoie y 

Shusta, 2015; Tashima, 2020). Actualmente esta es una prometedora vía de 

vectorización de fármacos al SNC, bien sea mediante moléculas como la 

transferrina o al emplear anticuerpos anti-RTf (receptor de transferrina) 

para mejorar este proceso de transcitosis (Lajoie y Shusta, 2015). 

 

Figura 1.5: Esquema del proceso de transcitosis mediada por receptores  



Mario Alonso 

42 

Los receptores más importantes que median esta vía son el receptor 

de transferrina, el receptor de insulina y el receptor de lipoproteínas de baja 

densidad (LDL): 

 Receptor de transferrina (RTf) 

El receptor de transferrina fue uno de los primeros receptores 

estudiados para la vectorización a través de la BHE. Se trata de un receptor 

expresado ampliamente en la superficie de las células epiteliales de la 

barrera y su función es la de modular el acceso de los iones de hierro al 

cerebro, al unirse a la proteína de transporte de hierro, transferrina (Tf) 

(Moos y Morgan, 2000).  

Actualmente es una de las dianas más empleadas para la vectorización 

de fármacos y nanosistemas al tejido cerebral. Un estudio realizado por 

Sharma, emplea liposomas pegilados con un péptido de transferrina y  

poly-L-arginina unido como ligando para este receptor; consiguió 

incrementar el acceso de estos sistemas al SNC (Sharma et al., 2013). No 

obstante, se ha podido observar que en contra de lo que se podría pensar, 

la Tf no es un ligando óptimo para este receptor. Esto se debe a que esta 

proteína se encuentra en altas cantidades en la circulación sistémica y sólo 

accede al tejido cerebral la cantidad necesaria, por ello su afinidad por su 

receptor es baja. Para suplir este inconveniente, actualmente los ligandos 

por elección para la vectorización a este receptor son los anticuerpos anti-

RTf, ya que resultan mucho más específicos y con alta afinidad por la diana. 

Un ejemplo de estos estudios son los realizados por Ulbrich, que emplea 

nanopartículas de albumina con anticuerpos monoclonales anti-RTf (OX26 

y R17217) (Ulbrich, et al. 2009).  



Introducción: Barrera Hematoencefálica 

43 

 Receptor de insulina (RI) 

El receptor de insulina de la BHE es el encargado de permitir la llegada 

de esta hormona hasta el tejido cerebral. El transporte de la insulina hasta 

el SNC se lleva estudiando desde mediados del siglo pasado. Y, a pesar de 

ser un receptor similar al RTf, no se trata de una buena diana de 

vectorización por dos razones principalmente: la insulina no es un buen 

ligando, ya que su administración puede dar lugar a una situación de 

hipoglucemia (Lajoie y Shusta, 2015) y a que es un receptor cuya actividad 

es saturable (Rhea, et al., 2018). A pesar de esto hay diversos estudios que 

han empleado ligandos, principalmente anticuerpos, de este receptor para 

vectorizar distintos sistemas a través de la BHE (Lajoie y Shusta, 2015). 

Bombas de eliminación: 

Desde que la BHE es objeto de estudio, se ha podido comprobar cómo 

sustancias que, por su pequeño tamaño y elevado coeficiente de reparto 

octanol/agua deberían ser capaces de atravesarla sin problemas, en la 

práctica apenas lo hacen. Este fenómeno hoy en día se asocia a ciertas 

proteínas que actúan como bombas de eliminación. El caso más 

representativo y relevante desde un punto de vista terapéutico es el de la 

gp-P. Esta proteína se expresa en varios tejidos del organismo, como puede 

ser el hígado, el páncreas, los túbulos proximales del riñón, la placenta 

(Juliano y Ling, 1976), así como en las células endoteliales y astrocitos de la 

BHE (Schinkel et al., 1996). Es una proteína transmembrana de la 

superfamilia de las ABC (ATP-binding cassette), que presenta una longitud 

de 1280 aa, distribuidos en dos secciones homólogas de 6 dominios 

transmembrana cada una, formado entre ellas un canal. La función de la  

gp-P en el SNC es de protección frente a sustancias potencialmente 



Mario Alonso 

44 

neurotóxicas, ya que actúa como bomba de salida y expulsa dichas 

sustancias del SNC (Gottesman, et al., 1955). 

A consecuencia de esta actividad se han descrito numerosos 

inhibidores de esta proteína (Boesch, et al., 1991; de Gooijer, et al., 2018), 

con los que se logra aumentar la permeabilidad de fármacos, como la 

domperidona o el haloperidol al SNC, pero se incrementa de forma 

sustancial los efectos tóxicos sobre estos tejidos (Schinkel, et al., 1996). 

Debido a ello, una estrategia interesante podría ser vectorizar con 

sustancias que no sean sustrato de esta gp-P o emplear inhibidores 

reversibles. 

2.3. Alteraciones en la BHE en la EA 

Muchos estudios sugieren que la acumulación de péptido Aβ en el 

cerebro produce alteraciones cerebrovasculares (Kawarabayashi, et al., 

2001; Hardy, 2009). En condiciones fisiológicas, la proteína P y el LRP (low-

density lipoprotein receptor-related protein) son responsables de la 

disminución de las cantidades de Aβ, mientras que RAGE (receptor for 

advanced glycation end products) es el encargado de permitir su acceso al 

cerebro (Zolezzi e Inestrosa, 2013). En la EA, las altas cantidades de Aβ 

producen a su vez una hiperexpresión de RAGE y se genera de esta manera 

un bucle positivo, que incrementa aún más los niveles de Aβ y al mismo 

tiempo genera una respuesta inflamatoria (Deane, et al., 2003). En la EA 

además, se produce una disminución de la actividad de la gp-P (van Assema, 

et al., 2012), como se ha podido comprobar en modelos animales, esto 

favorece el bucle positivo. El proceso inflamatorio resultante produce 



Introducción: Flavonoide morin 

45 

alteraciones que dañan las TJs. En este sentido, los modelos en ratón 

muestran atrofia cerebrovascular y elevados niveles de RAGE que 

claramente alteran la BHE y modifican su permeabilidad (Hafezi-

Moghadam, et al., 2006). 

3. FLAVONOIDE MORIN 

En los últimos años los flavonoides están siendo objeto de un 

importante número de investigaciones biomédicas por su potencialidad en 

el tratamiento de diversas patologías, debido a sus propiedades 

farmacológicas.  

Los flavonoides son compuestos fenólicos que se originan durante los 

procesos del metabolismo secundario de los vegetales; en concreto a través 

de la ruta del ácido shikímico (Ávalos García y Pérez-Urria Carril, 2009). En 

esta ruta, la fenilalanina (Phe) sufre una reacción de desaminación 

catalizada por la enzima fenilalanina-amonio-liasa (PAL)y da lugar al ácido 

cinámico. A partir de esta molécula, por adición de grupos hidroxilo y otros 

sustituyentes, y mediante la acción de varias enzimas; se generan los ácidos 

trans-cinámico y para-cumárico. Este último, se conjuga con el acetil 

coenzima A (acetil-CoA) y genera a su vez cumaril-CoA. Es aquí donde 

comienza la primera etapa de la síntesis de los flavonoides: una molécula 

de cumaril-CoA se condensa con 3 moléculas de malonil-CoA, en una 

reacción mediada por la calcona-sintasa, esto da lugar a la naringenina-

calcona (figura 1.6), que es la molécula precursora de los flavonoides. La 

acción de una isomerasa sobre esta calcona origina las flavonas y a partir 

de estas, los distintos flavonoides (Ávalos García y Pérez-Urria Carril, 2009).  



Mario Alonso 

46 

 

 

Figura 1.6: Resumen de las primeras etapas de la síntesis de flavonoides. 

En función del grado de oxidación, así como de los sustituyentes del 

anillo C pirano, los flavonoides pueden clasificarse en antocianidinas, 

flavanoles, flavonas, isoflavonas y flavonoles: 

Las antocianidinas se caracterizan por presentar un hidroxilo en 

posición c3 y dos insaturaciones entre c3-c4 y entre el oxígeno del pirano y 

el c2. Esto confiere a dichas moléculas una carga positiva, debido a estas 

insaturaciones. Cuando las antocianidinas presentan un azúcar conjugado 

con el hidroxilo en c3, se les denomina antocianinas. Los flavanoles, como 

la catequina, se caracterizan por presentar el c3 hidroxilado, pero carecen 

de insaturaciones en el anillo C. Las flavonas, por su parte, se presentan un 



Introducción: Flavonoide morin 

47 

carbonilo en c4 y no presentan hidroxilaciones en el pirano. Esta 

característica es común a las isoflavonas, que se distinguen de las anteriores 

por la posición del anillo B, el cual está unido por c3 en lugar de c2. Por 

último, los flavonoles representados por la quercetina, entre los que se 

encuentra el morin, presentan tanto un grupo carbonilo en c4 como una 

hidroxilación en c3. En muchos casos presentan además, un doble enlace 

entre c2=c3 (figura 1.7) (Martínez-Flórez, et al., 2002). 

 

Figura 1.7: Estructura general y tipos de flavonoides. 

El morín, que normalmente encontramos como morin hidrato (MH) se 

clasifica como flavonol y presenta una estructura base común con el resto 

de flavonoides: 15 carbonos ordenados en un difenilpirano (c6-c3-c6). Esta 

estructura se compone de dos anillos fenilo (A y B) unidos a través de uno 

pirano (C) conjugado (figura 1.7). El anillo B suele estar unido al carbono 2 

(c2) del heterociclo, salvo en el caso de las isoflavonas, que se encuentra 

unido al c3. En esta estructura, los carbonos del heterociclo (A-C) se 

numeran del 2 al 8; mientras que los carbonos del anillo B se numeran del 

2’ al 6’ (figura 1.7) (Kühnau, 1976).  



Mario Alonso 

48 

El MH (3,5,7,2’,4’-pentahidroxiflavona) (figura 1.8) es un flavonoide de 

origen natural que se encuentra presente en un gran número de plantas, 

principalmente pertenecientes a la familia moraceae (Abbad, et al., 2015). 

Normalmente se obtiene en forma de morin hidrato (MH) por extracción 

hidroalcohólica de las especies Maclura pomifera, Maclura tinctoria y 

Psidium guajava. Su estructura química permite formar quelatos con iones 

metálicos di y trivalentes (Panhwar y Memon, 2014) y origina compuestos 

fluorescentes (Song, et al., 2000). A demás de ello, recientemente se ha 

comprobado que presenta numerosas actividades farmacológicas. 

 

Figura 1.8: Estructura del flavonoide Morin. 

Este compuesto presenta una elevada capacidad antioxidante. 

Además, ha demostrado en diferentes estudios tener actividad 

antiinflamatoria, antineoplásica (Francis, et al., 1989), neuroprotectora, 

nefroprotectora y hepatoprotectora (Fang, et al., 2003; Zhang, et al., 2010; 

Hannasaki, et al., 1994; Ola, et al., 2014; Abbad, et al., 2015). Algunas de 

estas características han convertido al MH en un candidato interesante con 

potencialidad para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, 

tales como la enfermedad de Parkinson (Zhang, et al., 2010; Waddad, et al., 

2013) o distintas tautopatías (Gong, et al., 2011), entre las cuales se 

encuentra la EA. 

  



Introducción: Flavonoide morin 

49 

3.1. Características físico-químicas: 

Morin se presenta como un sólido de color amarillento con punto de 

fusión de 303,5 °C y peso molecular de 302,23 g/mol. Presenta una baja 

solubilidad en agua (28,7 μg/mL) a valores de pH inferiores a 7. Para valores 

de pH superiores a 7,4, aumenta ligeramente (54,86 μg/mL), y a partir de 

un pH de 9 la solubilidad aumenta acusadamente, hasta valores en torno a 

500 μg/mL. A valores de pH de 11, la solubilidad de morin se incrementa 

hasta los 3 mg/mL (Li, et al., 2019). Este incremento de la solubilidad a pH 

elevado puede explicarse por la ionización de morin, al producirse la 

desprotonación de c7-OH del anillo de benzoílo en medio básico (Kumar, et 

al, 2018). 

Al igual que ocurre con otros bioflavonoides, la solubilidad y 

reactividad de morin aumenta con el pH de la solución, debido a una mayor 

desprotonación de grupos hidroxilo en el anillo de benzoilo. Sin embargo, 

el flavonoide, en medio básico (pH 9), se hidroliza con facilidad, 

degradación que es mínima a pHs ácidos y neutro. Por otra parte, la 

estabilidad de morin se ve también afectada por la luz (Zhang et al, 2011; 

Abbad et al, 2015; Bark et al, 2015; Ghosh et al, 2017; Jangid et al, 2018; 

Kumar et al, 2018; Li et al, 2019; Alonso et al, 2020). 

  



Mario Alonso 

50 

3.2. Características farmacocinéticas 

Pese a las prometedoras características farmacológicas de morin, su 

uso como agente terapéutico se ve condicionado por su baja solubilidad en 

agua y sus características biofarmacéuticas. La solubilidad es un parámetro 

muy importante en el desarrollo de nuevos medicamentos, ya que puede 

condicionar la vía de administración y la forma farmacéutica más adecuada.  

En el caso de morin, en estudios realizados en cultivos celulares se ha 

demostrado que la concentración necesaria obtener un efecto 

antiinflamatorio, anticancerígeno o antioxidante es de aproximadamente 

10-100 μM, por lo que necesitan ser más elevadas en plasma y tejidos para 

obtener dichos efectos in vivo (Jin et al, 2014; Kuo et al 2007).  

Sin embargo, la escasa solubilidad en agua de morin es un factor que 

condiciona su biodisponibilidad por vía oral. Así, la biodisponibilidad por vía 

oral de MH es muy baja, con valores que oscilan entre el 0,45% y el 5,28%, 

debido fundamentalmente a esa limitada solubilidad en fluidos acuosos y 

escasa permeabilidad a través de membranas biológicas y además, sufre un 

acusado efecto de primer paso intestinal (Li et al 2019). 

La escasa permeabilidad intestinal de morin está condicionada por la 

acción de transportadores de salida como es el caso de la gp-P, hecho que 

se ha puesto de manifiesto tanto en estudios realizados en cultivos 

celulares como en animales de experimentación (Li et al., 2019; Yeon et al, 

2015).  



Introducción: Flavonoide morin 

51 

La glicoproteína P es un sistema de transporte activo celular 

perteneciente a la superfamilia de ATPasas tipo ABC, que es capaz de 

transportar metabolitos endógenos y fármacos al exterior celular mediante 

un mecanismo de transporte dependiente de ATP. Se localiza en la 

membrana apical de hepatocitos, células de la corteza adrenal, en la 

superficie luminal de las células del túbulo proximal renal, en el páncreas 

riñones y enterocitos, y constituye una barrera frente a la entrada de 

fármacos y toxinas, por ello puede condicionar la absorción intestinal de 

compuestos como ocurre con morin (Choi, et al., 2015).  

Por otra parte, como les ocurre a todos los flavonoides, morin sufre un 

extenso metabolismo hepático (Singh, et al., 2018), mediante reacciones de 

Fase I en las que incorporan más grupos polares y de Fase II, en las cuales 

se conjuga con glucurónico, sulfatos o glicina; se generan de esta manera 

metabolitos más polares que son fácilmente excretados en orina (Martínez-

Flórez, et al., 2002). La semivida plasmática (t1/2) tanto de morin como de 

sus metabolitos es corta, con valores descritos que oscilan entre 30 minutos 

(Li, et al., 2018; Li et al., 2019) y 2 horas (Jangid et al, 2019). 

Todas estas características dificultan de manera significativa la 

posibilidad de su uso como agente activo en administración por vía oral, y 

limita su potencial terapéutico. (Ikeuchi-Takahashi, Ishihara y Onishia, 

2016)  

  



Mario Alonso 

52 

3.3. Actividad frente a la Enfermedad de Alzheimer 

Aunque el morin ha demostrado tener potencial actividad terapéutica 

frente a diversas patologías, resulta especialmente interesante su posible 

utilización para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, ya que 

puede actuar sobre distintos factores característicos de esta enfermedad: 

▪ Disminución de las placas Aβ 

La acumulación y formación de depósitos extracelulares o placas del 

péptido β-amiloide es una de las lesiones características de la EA 

(Hooper, et al., 2008; Igbal y Grundke-Igbal, 2008). Pues bien, 

estudios realizados in vitro han puesto de manifiesto que morin es 

capaz de reducir la formación de estas placas (Hirohata, et al., 2007). 

Por otra parte, este flavonoide es capaz de desestructurar las placas 

Aβ ya formadas, debido a que se interpone en el núcleo hidrofóbico 

de la lámina y la desestabiliza y favorece que se solubilice en el medio 

(Lemkul y Bevan, 2010). El tratamiento de cortes cerebrales de 

ratones APPswe/PS1dE9 (modelo de ratón que genera placas Aβ de 

forma acelerada) con anti-Aβ ha demostrado que los ratones 

tratados con este flavonoide presentaban una cantidad 

significativamente menor de Aβ tanto en córtex cerebral como en 

hipocampo (Du, et al., 2016).  

  



Introducción: Flavonoide morin 

53 

▪ Inhibición de BACE-1 

BACE-1 es una β-secretasa cuya importancia en la EA radica en ser la 

principal responsable de la escisión del APP y la formación a partir del 

mismo de Aβ, el cual sale al medio extracelular y precipita; se forman 

de esta manera las placas amiloides. Estudios realizados en cultivos 

celulares con MH han puesto de manifieste que es capaz inhibir esta 

enzima e impide su acción sobre el péptido APP (Shimmyo, et al., 

2008). 

▪ Inhibición de α-sinucleína  

La proteína α-sinucleína es el componente principal de las inclusiones 

filamentosas que constituye una de las características de diversos 

procesos neurodegenerativos, como la EA. Esta proteína se 

encuentra muy expresada en cerebro, fundamentalmente en 

terminaciones nerviosas presinápticas. Pues bien, la conversión de 

una pequeña cantidad de esta proteína en filamentos insolubles se 

cree que es el principal evento en la patogenia de las enfermedades 

neurodegenerativas más comunes (Goddert, et al., 1998; Prusiner, 

2001). Varios estudios han demostrado que morin presenta 

concentraciones inhibitorias (IC50) de la agregación de los filamentos 

de, entre otras, la proteína α-sinucleína en el rango de 

concentraciones de 1 a 2 µM (Masuda, et al., 2006). 

  



Mario Alonso 

54 

▪ Disminución de los depósitos de Tau hiperfosforilada  

La proteína Tau, en su forma fosforilada, contribuye a la estabilidad 

estructural de las neuronas. No obstante, en la EA, la 

hiperfosforilación de esta proteína causa agregados insolubles de la 

misma, que conducen finalmente a muerte celular (Karran, et al., 

2011). El enzima responsable de este proceso de hiperfosforilación 

es principalmente la GSK3β. Así, Kim y col. (Kim, et al., 2005) han 

demostrado que MH es capaz de inhibir de forma competitiva la 

actividad de este enzima en cultivos celulares (células HT22 de 

neuroblastoma murino), a consecuencia disminuye la formación de 

los ovillos de p-Tau.   

Entre las quinasas que fosforilan la proteína Tau, GSK3β por tanto 

está fuertemente implicada en la patogénesis de la EA. Pues bien, 

estudios realizados tanto in vitro (Kim, et al., 2018) como in vivo 

(Gong, et al., 2011), han puesto de manifiesto que morin es capaz de 

inhibir esta enzima, mediante la unión del flavonoide al bucle rico en 

glicina (Gly) de la proteína. 

Por otra parte, MH al igual que otros polifenoles con estructura 

similar, como la miricetina, presenta IC50 de la agregación de los 

filamentos de la proteína Tau en el rango de concentraciones 1-2 µM 

(Masuda, et al., 2006; Alberdi, et al., 2018). Otros estudios realizados 

en animales de experimentación (ratones JNPL3 que expresan la 

proteína tau humana mutada P301L), han demostrado que morin es 

capaz de disminuir las cantidades de p-Tau hiperfosforilada insoluble, 

con un incremento en los niveles de la fracción soluble de esta 

proteína, debido posiblemente, a que MH se une a p-Tau 



Introducción: Flavonoide morin 

55 

hiperfosforilada, la estabiliza y previene su agregación y precipitación 

en forma de ovillos (Yu, et al., 2018). 

▪ Protección frente a las especies reactivas de oxígeno (ROS): 

En la EA las neuronas se ven sometidas a un incremento del estrés 

oxidativo causado por una mayor presencia de ROS (Chen y Zhong, 

2014). Numerosos estudios han demostrado que MH es capaz de 

incrementar la supervivencia de los cultivos celulares sometidos a 

estrés oxidativo causado por ROS (Zhang, et al., 2010; Alberdi, et al., 

2018; Hannasaki, et al., 1994). Además, es capaz de estabilizar la 

membrana mitocondrial de la célula dañada y dar lugar a una 

reducción en los niveles de ROS (Campos-Esparza, et al., 2009). 

▪ Reducción de la neuroinflamación: 

Otro de los factores responsables de la muerte neuronal durante la 

EA es la inflamación. MH es un flavonoide que ha demostrado en 

estudios realizados en cultivos celulares un efecto antinflamatorio 

(Fang, et al., 2003), que en el caso de su potencial uso en el 

tratamiento de la EA, puede estar basado en su actuación a nivel de 

varias vías:  

• Modula los niveles de los mediadores de la inflamación a 

través de la vía de NF-kβ (Heeba y Mahmound, 2014; Sinha, et 

al., 2015). 

• Reduce de manera indirecta la activación de los astrocitos de 

la glía al reducir la presencia de Aβ soluble en el medio 

extracelular (Du, et al., 2016). 



Mario Alonso 

56 

3.4. Morin y barrera 

La capacidad de paso a través de la BHE del MH resulta controvertida. 

Muchos ensayos, principalmente en modelos celulares, defienden que este 

flavonoide si es capaz de alcanzar la barrera hematoencefálica. Por 

ejemplo, Youdim et al (Youdim, et al., 2004) defienden que los metabolitos 

conjugados con glucurónico de este flavonoide son perfectamente capaces 

de alcanzar el SNC, así son capaces de ejercer su acción neuroprotectora. 

Efectivamente, el morin es un flavonoide que puede acceder a través de los 

transportadores de aniones orgánicos, presentes en la BHE. No obstante, 

este tipo de transportador es mucho más frecuente en los riñones por ello 

este es el destino principal de los metabolitos del MH (Sekine, et al., 2006). 

Este hecho explicaría por qué estos metabolitos no exhiben una mejora de 

las condiciones farmacocinéticas respecto al compuesto original, puesto 

que prensentan una t1/2 de 2h 30min (Hou, et al., 2003). Al igual que explica 

que para alcanzar concentraciones cuantificables y farmacológicamente 

activas, sea necesario el administrar dosis de 30mg o 50mg/Kg de animal 

(Singht, et al., 2018). Esto resultaría en que el morin es un flavonoide que 

en la práctica no es capaz de atravesar la BHE por si mismo  

(Waddad, et al. 2013) o por lo menos no en cantidades terapéuticamente 

relevantes (Singht, et al., 2018). 

  



Introducción: Flavonoide morin 

57 

3.5. Morin como hepatoprotector 

En este capítulo se ha hablado del papel que presenta el flavonoide 

morin en el tratamiento de la EA. No obstante, el tratamiento directo de la 

enfermedad no es el único beneficio que este compuesto puede ofrecer. 

Como se ha mencionado en el apartado anterior de la EA, la mayor parte 

de los tratamientos actuales para esta patología presentan un metabolismo 

hepático. Al tratarse de tratamientos crónicos, pueden suponer un estrés 

para este hígado a largo plazo. Es más, algunos de estos tratamientos han 

demostrado presentar posibles complicaciones por hepatotoxicidad. 

En este sentido, el MH podría ser capaz de mitigar los problemas 

asociados. Ya se ha visto que el MH tiene un efecto antioxidante que es de 

por sí una característica hepatoprotectora. Esto ha sido confirmado con 

estudios in vivo, en los cuales tratamientos con este flavonoide fueron 

capaces de disminuir el daño por estrés oxidativo en el hígado de ratas 

diabéticas (Pandey, et al., 2019).  

Pese a este hecho, el rápido metabolismo del MH vuelve a jugar en su 

contra. Debido a este factor, resulta necesario el uso de tratamientos 

prolongados para comenzar a observar un aumento en la supervivencia de 

los hepatocitos (Jayaraj, et al., 2007). 

 

 

  



Mario Alonso 

58 

 



  

59 

 

II- OBJETIVOS 

  



Mario Alonso 

60 

  



Determinación analítica del morin 

61 

El flavonoide morin es un compuesto polifenólico que ha 

demostrado in vitro ser capaz de actuar frente a los principales 

mecanismos de una la enfermedad de Alzheimer. Esta enfermedad 

supone un importante problema de salud y es la principal causa de 

demencia en la población de mayores de 65 años. No obstante, su 

potencial uso en la práctica clínica se ve condicionado por su escasa 

biodisponibilidad, elevado metabolismo hepático y muy baja capacidad 

para atravesar la BHE. 

El objetivo general de esta memoria experimental es favorecer el 

acceso del morin hidrato al SNC mediante el uso de nanopartículas 

funcionalizadas para su vectorización. Para ello, se han planteado los 

siguientes objetivos parciales: 

▪ Desarrollo y validación de dos métodos para la determinación de 

morin hidrato por HPLC que permitan la cuantificación de la 

cantidad de flavonoide encapsulada en las nanopartículas. 

▪ Desarrollo y validación de un método por espectrofotometría UV, 

para la cuantificación de las cantidades de morin hidrato liberadas 

por las nanopartículas en los ensayos de cesión in vitro.  

▪ Elaboración de nanopartículas de PLGA cargadas con rodamina-B 

sin funcionalizar, funcionalizadas con el dipéptido fenilalanina-

fenilalanina en superficie, y mediante la funcionalización del 

polímero PLGA con el dipéptido antes de su formación. 



Mario Alonso 

62 

▪ Evaluación in vivo de la biodistribución de las formulaciones de 

nanopartículas cargadas con rodamina-B en hígado, riñón, 

pulmón y bazo. 

▪ Evaluación in vivo del paso a través de la barrera 

hematoencefálica de las diferentes formulaciones de 

nanopartículas cargadas con rodamina-B  

▪ Desarrollo y caracterización de nanopartículas de PLGA cargadas 

con morin hidrato sin funcionalizar, funcionalizadas con el péptido 

fenilalanina-fenilalanina en superficie y mediante la 

funcionalización del polímero PLGA antes de su formación. 

 



  

63 

 

III- DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE MORIN 



Mario Alonso 

64 

  



Determinación analítica del morin 

65 

1. INTRODUCCIÓN 

La determinación y cuantificación de las cantidades de principio activo 

es un punto crítico en el desarrollo y preparación de formas farmacéuticas. 

Por tanto, es necesario disponer de métodos analíticos rápidos, sencillos y 

precisos para poder garantizar la calidad del producto. No obstante, los 

métodos empleados para la detección y cuantificación de los flavonoides, 

en especial del morin hidrato, puede presentar dificultades asociadas a su 

falta de especificidad y/o selectividad.  

 Existen pocos estudios que se han centrado en el desarrollo de una 

metodología por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la 

detección y cuantificación de este compuesto. Ikeuchi-Takahashi  

(Ikeuchi-Takahashi, et al., 2016) en un trabajo en el que se realiza la 

encapsulación de morin en nanopartículas lipídicas, describen una 

metodología para su cuantificación mediante HPLC, para ello se ha 

empleado una fase móvil de acetonitrilo:agua acidificada con ácido 

ortofosfórico 0,2% en proporción 27:73 (v/v), no obstante no especifican el 

rango de concentraciones en el cual trabajan (Ikeuchi-Takahashi, et al., 

2016). Otros autores desarrollan también un método por HPLC, pero en un 

rango de concentraciones elevado, y comprendido entre 50-75 µg/mL  

(El-Haddad, et al., 2018). 

En este capítulo se describe la puesta a punto y validación de los 

métodos analíticos empleados para la cuantificación del morin. No existe 

un único modelo para la puesta a punto de métodos analítico, por tanto, se 

pueden determinar diferentes parámetros en función de los objetivos 

buscados. En la presente memoria se han puesto a punto dos métodos de 



Mario Alonso 

66 

cuantificación por HPLC y un método de detección por espectrofotometría 

ultravioleta directa (UV). 

2. OBJETIVOS 

El objetivo principal de este estudio es el desarrollo y validación de 

métodos analíticos rápidos, sencillos y precisos para la cuantificación del 

morin solo o encapsulado en nanosistemas, así como para cuantificar el 

compuesto en los ensayos de velocidad de liberación in vitro. Para alcanzar 

este objetivo se proponen los siguientes objetivos parciales: 

▪ Desarrollo y puesta a punto de una metodología para la 

determinación de MH por HPLC que nos permita la cuantificación 

de la cantidad de flavonoide encapsulada en las nanopartículas 

(NPs). 

▪ Desarrollo y puesta a punto de un método para la determinación 

de morin hidrato por espectrofotometría UV, para la 

cuantificación de las cantidades de flavonoide cedidas por las NPs 

en los ensayos de cesión in vitro.  

  



Determinación analítica del morin 

67 

3. MATERIALES Y MÉTODOS 

3.1. Determinación analítica de morin por HPLC 

Para poder realizar la detección y cuantificación de MH encapsulado 

en las nanopartículas, se ha puesto a punto y validado un nuevo método 

analítico por HPLC. 

Para la validación del método analítico, así como para el posterior 

análisis, se ha utilizado un HPLC Jasco (Jasco International Co Ltd, Tokio, 

Japón) equipado con una unidad de gradiente cuaternario LG-2080-04, una 

bomba PU-2080, un desgasificador DG-2080-54, un inyector automático AS-

2050-plus y un detector UV-2070 de ultravioleta/visible. Para este método 

se optó por utilizar una columna de fase reversa Gemini® 5 µm NX-C18 110 

Å con una longitud de 250 x 4,6 mm (Phenomenex®, Torrance, USA). 

Durante los análisis la columna se mantuvo a una temperatura de 40ºC.  

Se seleccionó un volumen de inyección de 50 µl y una longitud de onda 

(λ) de 256 nm. La fase móvil utilizada para la cuantificación de morin 

consistió en una mezcla de agua:acetonitrilo (73:27) (Fisher Scientific, 

Madrid, España) la cual se acidificó con ácido fosfórico (Acros Organic, EE. 

UU.).  

  



Mario Alonso 

68 

3.1.1. Selección de las condiciones cromatográficas para la 

determinación de MH 

Para la selección de las condiciones cromatográficas finales se 

analizaron diferentes variables: proporciones de agua:acetonitrilo, pH de la 

fase móvil, flujo y temperatura de la columna (tabla 3.1). Las fases móviles 

fueron filtradas a través de membranas de nylon de 0,45 µm de diámetro 

de poro (Millipore, Madrid, España) y desgasificadas mediante un baño de 

ultrasonidos, durante 20 minutos, antes de su uso. 

Variables Valor 

pH 

2,3 

2,5 

2,6 

Flujo (mL/min) 
1,2 

1,4 

Fase móvil 

(% acetonitrilo) 

20 

27 

30 

Temperatura columna (± 0,5ºC) 
30 

40 

Tabla 3.1: Relación de las variables seleccionadas para establecer las condiciones del 
método de análisis de morin mediante HPLC.   

  



Determinación analítica del morin 

69 

3.1.2. Estudios de Estabilidad  

Con el objetivo de detectar si los productos de degradación de morin 

pueden interferir en la cuantificación del principio activo con el método de 

HPLC desarrollado, se realizaron estudios de estabilidad MH en las 

condiciones que se indican en la tabla 3.2. Dado que esta metodología se 

puso a punto orientada para la determinación de la eficacia de 

encapsulación del MH en las NPs, ensayo que requiere, como se explica más 

adelante en esta memoria, del contacto del principio activo con metanol, 

los estudios de estabilidad se realizaron en todos los casos con el 

compuesto disuelto en dicho alcohol. Las condiciones ensayadas se recogen 

en la tabla 3.2. Todas las muestras fueron preparadas por triplicado. 

Condiciones de estabilidad 

25ºC, 24 h  

4ºC, 24 h  

HCl 0,1N, 60ºC, 24 h 

NaOH 1N, 105ºC, 20 min 

3% H2O2, 24 h 

Tabla 3.1: Condiciones experimentales de los estudios de estabilidad.  

  



Mario Alonso 

70 

3.1.3. Preparación de las muestras patrón 

Las muestras empleadas para la elaboración de las curvas de 

calibración se prepararon de acuerdo a dos protocolos: 

Protocolo A: se preparó una solución madre en metanol con una 

concentración de 100 µg/mL; a partir de la cual se realizaron diferentes 

diluciones para obtener la curva de calibración en un rango entre 5 y  

30 µg/mL de MH en metanol  

Protocolo B: Se preparó una solución madre con una mezcla de 

metanol:HCl 0,1N (50:50 v/v) a igual concentración (100 µg/mL), bajo 

agitación magnética constante durante dos horas, para asegurar que se 

formaba el clorhidrato. Esta solución madre fue diluida en metanol para 

obtener las concentraciones correspondientes para la curva de calibración 

en un rango entre 1 a 30 µg/mL de MH en metanol:HCl (50:50 v/v). 

Análisis estadístico de los resultados 

Se han puesto a punto dos métodos analíticos a partir de las muestras 

patrón obtenidas con ambos protocolos (A y B). En el protocolo A, las 

muestras del flavonoide morin fueron disueltas en metanol; en el protocolo 

B, fueron disueltas en una mezcla de metanol y ácido clorhídrico (HCl) en 

proporción 50:50 (v/v). Las condiciones empleadas, en ambos casos, 

fueron: fase móvil ACN:H2O 27:73 (v/v); pH 2,5 ± 0,05; flujo 1,4 mL/min y 

temperatura de la columna40ºC.  

Los resultados obtenidos por ambos métodos se analizaron mediante 

un análisis de la varianza ANOVA para comprobar la validez de los métodos. 

Además, se comprobó la linealidad, precisión y exactitud de ambos 



Determinación analítica del morin 

71 

protocolos; y se determinaron los límites de cuantificación (LC) y de 

detección (LD). 

Linealidad 

La ICH define la linealidad como la capacidad de un procedimiento 

analítico para obtener, en un rango determinado, resultados directamente 

proporcionales a la concentración de la muestra de analito (ICH, 2005).  

Para el estudio de linealidad, el rango de concentraciones utilizadas 

fue de 5, 10, 15, 20 y 30 µg/mL para el protocolo A, que emplea sólo 

metanol, y de 1, 5, 10, 15, 20 y 30 µg/mL para el protocolo B, con 

metanol:HCl. Para realizar el estudio de la linealidad se prepararon 3 curvas 

para cada método en 3 días distintos.  

Análisis de la varianza de la regresión 

Los resultados fueron analizados mediante un ANOVA de regresión, en 

el cual se comparan las variaciones debidas a la regresión frente a aquellas 

debidas a los errores residuales (experimentales y de ajuste), para 

comprobar si los datos se ajustan a un modelo lineal. 

- H0
 (hipótesis nula): El modelo no es lineal (p > 0,05). 

- H1 (hipótesis alternativa): El modelo es lineal (p < 0,05). 

Test de proporcionalidad 

Mediante la prueba estadística de la t de Student se demuestra, por 

medio de contraste de hipótesis, si la ordenada pasa o no por el origen: 

- H0
 (hipótesis nula): La ordenada en el origen no difiere 

significativamente de cero (p > 0,05). 



Mario Alonso 

72 

- H1 (hipótesis alternativa): La ordenada en el origen difiere 

significativamente de cero (p < 0,05). 

Test de regresión 

Por medio del mismo estadístico, t de Student, se demuestra que la 

pendiente es distinta de 0 para un nivel de significación del 95%. 

- H0: La pendiente no difiere significativamente de cero (p > 0,05). 

- H1: La pendiente difiere significativamente de cero (p < 0,05). 

Resolución de los picos 

La resolución de los picos (R), es una medida cuantitativa del grado de 

separación de dos picos y por tanto, de su capacidad para separar dos 

analitos (1 y 2). Este parámetro se puede calcular a partir de la siguiente 

ecuación: 

R = (Δt /WB1 + W B2) 

Siendo Δt la distancia entre el máximo de los dos picos, WB1 y WB2 la 

medida de las bases de los picos 1 y 2, respectivamente. Cuando el valor de 

R es de 1,5, permite una separación esencialmente completa de los dos 

componentes. Un valor de 1,0 representa una resolución del 90%. Valores 

de R inferiores a 1 indican solapamiento de los picos. 

Idoneidad del sistema cromatográfico 

Se evaluó la idoneidad del método analítico, a partir del cálculo del 

factor de asimetría (T) y del número de platos teóricos (N). 



Determinación analítica del morin 

73 

- Factor de asimetría (T): proporciona una medida de la simetría del 

pico cromatográfico, y se puede calcular mediante la siguiente 

ecuación: 

T = (W0,05/2f) 

Donde, f es la distancia entre el máximo del pico y el borde inicial del 

mismo, y W 0,05 es la anchura del pico correspondiente al 5% de su 

altura. Cuanto más próximo se encuentre el valor de T a 1, mayor será 

la simetría del pico.  

- Número de platos teóricos (N): medida de la eficacia de la columna, 

que se puede calcular empleando la siguiente ecuación: 

N= 16 (tr/W)2 

Siendo tr el tiempo de retención del analito y W la anchura del pico 

en su base. El valor de N indica la eficacia de la columna utilizada y 

está directamente relacionada con el sistema cromatográfico. 

Precisión 

La precisión de un método expresa la capacidad de este para obtener 

resultados lo más semejante posible de múltiples muestreos, cuando se 

emplean muestras homogéneas o muestras preparadas a la misma 

concentración. Para ello se emplea a desviación estándar relativa y el 

coeficiente de variación (CV).  

Puede considerarse la precisión a tres niveles: repetibilidad, precisión 

intermedia y reproducibilidad. Debe determinarse mediante el uso de 

muestras originales y homogéneas.  



Mario Alonso 

74 

- Repetibilidad: Expresa la precisión bajo las mismas condiciones de 

trabajo en un corto intervalo de tiempo con un mismo analista, el 

mismo aparato y los mismos reactivos. Se puede expresar también 

como precisión intradía. 

- Precisión intermedia o interdía: Expresa la capacidad de obtener 

idénticos resultados al analizar las mismas concentraciones en días 

distintos. 

- Reproducibilidad o precisión instrumental: Expresa la precisión al 

emplear distintos equipos. 

Para los estudios de precisión se seleccionaron 3 concentraciones 

distintas (5, 15 y 30 µg/mL) y se prepararon 5 muestras de cada una. La 

repetibilidad (precisión intradía), tanto para el método A como del método 

B, se realizó al analizar tres concentraciones (5, 15 y 30 µg/mL), cinco veces 

cada una y bajo las mismas condiciones. La precisión intermedia (interdía) 

se determinó al analizar estas tres concentraciones en 3 días distintos, cada 

muestra se repitió cinco vece. Por último, la precisión instrumental se 

evaluó a través de la comparación de 5 inyecciones sucesivas del flavonoide 

a una concentración de 15 µg/mL. Los resultados se expresaron como CV.  

Exactitud 

Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado como verdadero 

(material de referencia interno, certificado o estándar de una farmacopea) 

y el valor encontrado. La exactitud se expresa como porcentaje de 

recuperación de una cantidad conocida de analito (MH)(USPNF,2020). Se 

prepararon, para cada uno de los métodos, soluciones a tres 

concentraciones conocidas del flavonoide (5, 15 y 30 µg/mL). Todas las 

muestras se prepararon por triplicado. La exactitud del método se 



Determinación analítica del morin 

75 

determinó al comparar los resultados obtenidos frente a la concentración 

real y se expresó como CV. 

Límites de detección: 

Tanto el LD como el límite de cuantificación LC fueron calculados bajo 

los criterios establecidos por las guías ICH (ICH, 2005). El cálculo de ambos 

límites se realizó en base a la desviación estándar de la curva de calibración 

(σ) y a la pendiente de la misma (S), para ello se emplearon a las siguientes 

ecuaciones: 

𝐿𝐷 = 3,3 × 𝜎/𝑆 

𝐿𝐶 = 10 × 𝜎/𝑆 

3.2. Determinación analítica de morin por 

espectrofotometría UV 

Para cuantificar de forma sencilla las cantidades del flavonoide 

disueltas en tampón fosfato (PBS) a pH 7,4 en los ensayos de cesión, se puso 

a punto un método analítico por espectrofotometría UV. 

En la preparación del tampón PBS se empleó hidrógeno fosfato de di-

sodio (Na2HPO4) (Fisher Scientific, Madrid, España) y di-hidrógenofosfato 

monopotasio (KH2PO4) (Fisher Scientific, Madrid, España) en las cantidades 

indicadas por Farmacopea, y el pH fue ajustado a 7,4. El analito fue morin 

hidrato (Sigma Aldrich, Madrid, España). El espectrofotómetro empleado 

fue un Jasco V-730 con detector UV/VIS (Jasco International Co Ltd, Tokio, 

Japón). Cubetas de cuarzo High Precision Cell de H0Q310H (Hellma 

Analytics, Paris, Francia.). Para el ajuste de pH se empleó un medidor de pH 

Accumet® AE150 (Fisher Scientific, Madrid, España). 



Mario Alonso 

76 

Se llevó a cabo un barrido de absorción del morin disuelto en PBS a un 

pH de 7,4 y se seleccionó un máximo de absorción a una longitud de onda 

λ= 261nm. Se evaluó la linealidad y exactitud del método 

espectrofotométrico de acuerdo con los criterios ICH previamente 

descritos. 

Para los estudios de linealidad se prepararon 5 rectas de calibrado en 

tampón PBS a pH 7,4, cada una de las cuales se realizaron en diferentes 

días. Las concentraciones seleccionadas fueron: 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5 y 15 

µg/mL, las cuales se prepararon a partir de una solución patrón de morin 

hidrato con una concentración de 100 µg/mL.  

La exactitud del método se determinó a las concentraciones de 5, 10 y 

15 µg/mL. Estas diluciones se prepararon con la incorporación de PLGA a 

una concentración de 50 μg/mL de polímero para 5 μg/mL de morin en PBS 

a pH 7,4. 

  



Determinación analítica del morin 

77 

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

4.1. Determinación analítica de Morin por HPLC 

4.1.1. Selección de las condiciones cromatográficas para la 

determinación de MH 

Para la selección de las mejores condiciones cromatográficas se 

modificaron diferentes variables. Los valores obtenidos de porcentaje de 

recuperación y tiempo de retención quedan recogidos en la tabla 3.3: 

Parámetros  Valor Recuperación (%) Tr (min) 

pH 

 2,3 109,24 8,02 

 2,5 100,56 7,45 

 2,6 95,54 7,11 

Flujo (mL/min) 
 1,2 102,56 8,14 

 1,4 100,56 7,45 

Fase móvil 

(% acetonitrilo) 

 20 91,46 18,66 

 27 100,56 7,45 

 30 115,85 6,10 

Temperatura de 

la columna (± 

0,5ºC) 

 30 90,77 7,29 

 40 99,66 7,45 

Tabla 3.3: Relación de los parámetros ensayados para establecer las condiciones del cromatograma. Tr. 
se corresponde con el tiempo de retención del pico.  

Cuando se analizó el efecto del pH, se pudo observar que muy 

pequeñas variaciones dan lugar a modificaciones en el pico cromatográfico, 

por ejemplo, a un pH de 2,6 aparece un pico ancho y poco definido, con una 

cola muy marcada. También valores de 2,3 dan lugar a picos menos 

simétricos y de menor tamaño. Así, se optó por emplear un valor pH de 2,5, 



Mario Alonso 

78 

al cual se obtuvieron los picos más adecuados (figura 3.1A). Esta variable 

resultó fundamental para obtener un pico bien definido (Alonso, et al., 

2020), tal y como se observa en la figura 3.1B. 

 

Figura 3.1: (A) Cromatograma correspondiente a una concentración de 30 µg/mL de morin por 
el método A. (B) Cromatograma correspondiente a la misma concentración de morin por el 
método B. 

Al analizar la proporción de acetonitrilo (ACN) en la composición de la 

fase móvil, los resultados obtenidos indican que un menor porcentaje del 

componente orgánico daba como resultado picos con un tiempo de 

retención muy largo, 18.66 min; mientras que con una proporción superior 

al 30%, los tiempos podrían ser excesivamente cortos y se acercaban al 

frente de solvente, se limita así la posible aplicación del método en la 

detección del compuesto en fluidos biológicos (figura 3.2) 



Determinación analítica del morin 

79 

Figura 3.2: Cromatogramas correspondientes al análisis de una 

solución de morin (concentración 10 µg/mL) en una fase móvil 

preparada: (A) con un 20% ACN y (B) con un 30% de ACN. 

 

En función de estos resultados se optó por emplear una fase móvil 

preparada con ACN: H2O de 27:73 v/v, ajustada a un pH de 2,5±0,05 con 

ácido fosfórico. 

Al analizar las condiciones de flujo se llegó a la conclusión de que entre 

un flujo de 1,2 mL/min y 1,4 mL/min, el segundo presentaba mejores 

resultados (tabla 3.3). Por lo que se refiere a la variable temperatura, y dado 

que el tiempo de retención obtenido fue similar a las dos temperaturas 

ensayadas (30ºC y 40ºC), se optó por emplear la más elevada, ya que 

resultaba más sencillo mantenerla constante independientemente de los 

factores ambientales a los que se realizase el ensayo. 

Por tanto, podemos indicar que las condiciones cromatográficas más 

adecuadas para la cuantificación de morin mediante HPLC son las 

A 



Mario Alonso 

80 

siguientes: Fase móvil ACN:H2O 27:73 (v/v) a pH de 2,5 ± 0,05; flujo  

1,4 mL/min; temperatura de 40ºC para la columna, y longitud de onda de 

256 nm.  

4.1.2. Estudios de estabilidad 

Para descartar que los productos de degradación de morin puedan 

interferir en la cuantificación del mismo, cuando se emplea este método de 

HPLC, se llevaron a cabo estudios de estabilidad forzados y estudios de 

estabilidad en condiciones de almacenamiento de la materia prima a 

tiempos cortos. En la tabla 3.4 se recogen los resultados obtenidos, 

expresados como porcentajes de recuperación del morin, en los estudios 

de estabilidad bajo las condiciones ensayadas. 

 

Condiciones de estabilidad 

Porcentaje de 

recuperación±DE 

25ºC, 24 h 103,42 ± 0,57 

4ºC, 24 h 106,19 ± 8,03 

HCl 0,1N, 60ºC, 24 h 214,05 ± 8,14 

NaOH 1N, 105ºC, 20 min 2,85 ± 0,86 

3% H2O2, 24 h 73,77 ± 7,29 

Tabla 3.4: Resultados de los ensayos de estabilidad del morin.  

  



Determinación analítica del morin 

81 

En la figura 3.3 se muestran los cromatogramas correspondientes a una 

muestra patrón de morin (30 µg/mL). B corresponde a los 4ºC en 24h. C 

corresponde a 25ºC y 24h. D es el cromatograma correspondiente a las 

condiciones ácidas (HCl 0,1N; 60ºC). E se corresponde al medio oxidativo 

(H2O2 3%; 25ºC). F: condiciones básicas (NaOH 1N; 60ºC): 

  

 

Figura 3. 3: Cromatogramas correspondientes a los estudios de estabilidad. (A) muestra de una solución de morin de 

30 µg/mL. (B) cromatograma obtenido en condiciones de 4ºC durante 24h. (C) Cromatograma obtenido a 25 ºC durante 

24h. (D) cromatograma obtenido en condiciones ácidas (HCl 0,1N; 60ºC). (E) cromatograma obtenido en medio 

oxidativo (H2O2 3%; 25ºC). (F) cromatograma obtenido en condiciones básicas (NaOH 1N; 60ºC) 

En todos los casos se observa un pico que aparece a un Tr de  

18 ± 0,3 min y que se trata de una impureza habitual en el morin. Este pico 

sale a un tiempo muy posterior a del morin y no interfiere para su 

cuantificación. 



Mario Alonso 

82 

Para asegurar que los tiempos de contacto con el metanol empleados 

en la extracción de las NPs no afectan a la estabilidad del morin, se llevaron 

a cabo estudios de estabilidad a corto plazo, en las mismas condiciones que 

se utilizan para la determinación de la eficacia de encapsulación de las 

nanopartículas. Los cromatogramas correspondientes a las muestras 

conservadas a 25ºC y 4ºC no presentaron diferencias significativas en los 

porcentajes de recuperación respecto a los obtenidos con la concentración 

del patrón preparado en el momento: 103,42±0,57% y 106,19±8,03%, 

respectivamente (figura 3.3 A; 3.3 B y 3.3 C) (tabla 3.4).  

Los ensayos de estabilidad forzados realizados permiten indicar que 

tanto las condiciones oxidativas como el medio básico producen una 

degradación significativa del compuesto y se obtuvieron porcentajes 

remanentes de morin de73,77 ± 7,29% en el caso del medio H2O2 3% a 25ºC 

(figura 3.3 E) y 2,85±0,86% en NaOH 1N a 60ºC (figura 3.3 F) (tabla 3.2), de 

esta manera se originan dos compuestos (una dicetona y un ácido  

o,p-dihidroxibencilico) con un Tr que no interfiere con el tiempo de 

retención del morin. Estos resultados se corresponden con los observados 

por otros autores (Bark et al., 2015) quienes demostraron la inestabilidad 

del morin en condiciones de pH 8,8 a 10,2 (figura 3.4).  

En un estudio de estabilidad de morin realizado en diferentes medios, 

se observó que un pH de 9,0 conduce a una mayor inestabilidad de morin, 

siendo más estable en medios ácido y neutro. En este estudio, los autores 

concluyen que el pH básico y la luz son los principales factores que afectan 

a la estabilidad de morin (Jangid, et al., 2018). 



Determinación analítica del morin 

83 

 

Figura 3.4: Posible reacción de degradación del morin en medio básico (Bark et al. 2015). 

Por el contrario, en nuestro caso, en medio ácido en presencia de HCl 

se observó un pico mucho mayor al esperado (214,05±8,14%) (figura 3.3 D; 

tabla 3.4), lo que nos indica que en presencia de HCl podría formarse un 

clorhidrato, de forma que aumenta la sensibilidad de la muestra.  

Por este motivo y para incrementar la sensibilidad del método, se pone 

a punto un segundo método analítico en el cual se emplea una disolución 

de morin en etanol, a la cual se añade HCl para formar el clorhidrato 

(método B) (Alonso, et al., 2020).  

Protocolo A: Morin disuelto en metanol (100 µg/mL).  

Protocolo B: Morin (100 µg/mL) disuelto en una mezcla de 

metanol:HCl 0,1N (50:50 v/v), bajo agitación magnética constante durante 

dos horas.  

En la figura 3.1 se muestran los cromatogramas obtenidos para ambos 

métodos para una concentración de morin 30 µg/mL. El área bajo la curva 

correspondiente al pico obtenido con el método B es mayor y muestra 

además mayor simetría y una mejor definición. 



Mario Alonso 

84 

4.1.2. Análisis estadístico de los resultados 

A partir de las condiciones de trabajo previamente seleccionadas se 

lleva a cabo la puesta a punto de ambos métodos analíticos: El método A, 

el cual emplea muestras disueltas solamente en metanol y el método B, 

cuyas muestras se disuelven en una solución de metanol:HCl 50:50 (v/v).  

En la tabla 3.5 se muestra el rango de concentraciones empleado para 

el método A (5-30 µg/mL) y para el método B (1-30 µg/mL) con sus 

correspondientes valores medios de áreas de los picos del cromatograma.  

Concentración (µg/mL) Método A (área del pico) Método B (área del pico) 

1 - 57548,4 

5 164684,3 277847,5 

10 308038,0 605429,0 

15 432403,5 911907,5 

20 601203,0 1225692,0 

30 860565,8 1819582,0 

Tabla 3.5: Áreas de los picos cromatográficos obtenidos por los métodos A y B de análisis de morin.  

 

  



Determinación analítica del morin 

85 

Las curvas de calibración obtenidas mediante los métodos A y B se 

representan en la figura 3.5. 

 

 

Figura 3.5: Curvas de calibración obtenidas por los métodos A y B de análisis de morin.  

 

  

R² = 0,9985

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

0 5 10 15 20 25 30 35

A
re

a 
d

el
 p

ic
o

Concentración (µg/mL)

Recta calibrado método A

R² = 0,9997

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

0 5 10 15 20 25 30 35

A
re

a 
d

el
 p

ic
o

Concentración (µg/mL)

Recta calibrado método B



Mario Alonso 

86 

Linealidad 

La tabla 3.6 muestra los resultados de linealidad correspondientes a 

los métodos A y B. 

 Método A Método B 

Rango (µl/mL) 5-30 1-30 

Coeficiente de correlación (r) 0,9970 0,9993 

Coeficiente de determinación (r2) 0,9940 0,9987 

Pendiente 28026,95 61986,31 

Error típico de la pendiente 602,689 544,691 

Estadístico-t pendiente (valor-p) 46,5031 (0,0000) 113,8008 (0,0000) 

Ordenada al origen 9515,80 -4625,74 

Error típico de la intercepción 10948,40 9035,41 

Estadístico-t intercepción (valor-p) 0,8691 (0,4005) -0,5119 (0,6157) 

F-ANOVA test de regresión (valor-p) 2162,54 (0,0000) 12950,63 (0,0000) 

Tabla 3.6: Resultados del análisis de la linealidad obtenidos por los métodos A y B. 

El ANOVA de la regresión permite evaluar la correlación existente 

entre la absorbancia y la concentración. Existe una correlación 

estadísticamente significativa entre ambas variables (p=0,0000) para 

ambos métodos, que presentan coeficientes de correlación de 0,9970 para 

el método A y de 0,9993 para el B. Esta correlación significativa entre la 

absorbancia y la concentración se confirma a partir de las pendientes de las 

rectas de calibración, con una probabilidad asociada al estadístico “t” de 

Student inferior a 0,05, que no difiere significativamente de cero (p= 0,000) 

en ninguno de los dos métodos. Los valores de “t” de Student obtenidos 

para las ordenadas al origen, son significativamente distintos de cero y 

permiten demostrar que el método es proporcional (p > 0,05). Por tanto, 



Determinación analítica del morin 

87 

en ambos métodos la ordenada al origen no difiere significativamente de 

cero, para un nivel de probabilidad del 95%. 

Resolución de los picos e idoneidad del sistema cromatográfico 

La tabla 3.7 muestra los tiempos de retención, el factor de simetría y 

el número de platos teóricos obtenidos para ambos métodos A y B  

(tabla 3.7). 

 R N Tr (min) T (±DE) 

Método A 7,71 2936 6,79 0,77±0,005 

Método B 13,91 4032 6,81 1,09±0,01 

Límites requeridos R > 2 N > 2,000  T < 2 

Tabla 3.7: Resultados de la idoneidad de los métodos A y B. 

  



Mario Alonso 

88 

Exactitud 

Los resultados del ensayo para determinar la exactitud de ambos 

métodos se resumen en las tablas 3.8 y 3.9  

Concentración de Método A 

morin 
(µg/mL) 

Recuperación 
(µg/mL) 

Recuperación (%) 
Media ± DE 

CV % 

1 - - 
- 1 - - 

1 - - 

5 5,34 106,91 
102,44 ± 5,08 

4,96% 
5 5,17 103,48 
5 4,84 96.91 

10 10,28 102,84 
92.90 ± 9.99 

10,72% 
10 8,28 82,85 
10 9,30 93,02 

15 14,57 97,13 
97,40 ± 1,21 

1,24% 
15 14,45 96,36 
15 14,81 98,73 

20 20,38 101,92 
95,58 ± 5,49 

5,74% 
20 18,50 92,50 
20 18,46 92,31 

30 29,32 97,73 
97,02 ± 2,01 

2,07% 
30 28,42 94,75 
30 29,57 98,58 

Tabla 3.8: Resultados de la determinación de la exactitud del método A. 

  



Determinación analítica del morin 

89 

Concentración de Método B 

morin 
(µg /mL) 

Recuperación 
(µg/mL) 

Recuperación (%) 
Media ± DE 

%CV 

1 1,03 103,28 
100,3± 2,98 

2,97% 
1 1,00 100,30 
1 0,97 97,32 

5 4,86 97,26 
99,94 ± 2,37 

2,38% 
5 5,04 100,8 
5 5,09 101,8 

10 10,22 102,21 
101,46 ± 2,74 

2,70% 
10 9,84 98,42 
10 10,37 103,74 

15 15,50 103,37 
100,83 ± 2,41 

2,38% 
15 14,79 98,57 
15 15,08 100,55 

20 20,61 103,04 
100,67 ± 2,07 

2,06% 
20 19,85 99,24 
20 19,94 99,72 

30 29,51 98,37 
99,47 ± 2,15 

2,16% 
30 29,43 98,10 

30 30,58 101,94 

Tabla 3.9: Resultados de la exactitud del método B. 

El porcentaje de recuperación de las muestras preparadas oscila entre 

el 82,85% y el 106,91% para el método A, pero con valores del CV de hasta 

10,7%; mientras que el método B, presenta valores de recuperación 

comprendidos entre 97,27% y 103,74%, con valores CV de un 2,9%. 

Los CV obtenidos con el método A son excesivamente elevados. 

Además, de acuerdo a la USP, los porcentajes de recuperación deberían 

encontrarse entre 97% y el 103% (USPNF, 2020), algo que no se cumple con 

el método A. Por ello, el método A no cumple con el criterio de exactitud 

para la determinación de MH en el rango de concentraciones estudiadas.  

  



Mario Alonso 

90 

Precisión 

Las medidas intradía e interdía de precisión se expresaron en forma de 

CV (%). Los resultados obtenidos se muestran en las tablas 3.10 y 3.11.  

Concentración 

de morin  

(µg/mL) 

Intradía Interdía 

Recuperación 

media (%) 
CV(%) ER(%) 

Recuperación 

media (%) 
CV(%) ER(%) 

5 99,71 6,20 -0,28 95,95 6,77 -4,09 

15 104,20 3,66 4,20 102,55 5,50 2,55 

30 104,60 2,10 4,60 105,49 5,63 5,48 

Tabla 3.10: Resultados del estudio de precisión del método A. CV (coeficiente de variación) y ER (error 
relativo). 

 

Concentración 

de morin 

(µg/mL) 

Intradía Interdía 

Recuperación 

media (%) 
CV(%) ER(%) 

Recuperación 

media (%) 
CV(%) ER(%) 

5 98,11 3,54 -1,89 97,12 3,13 -2,87 

15 100,30 0,92 0,30 100,08 2,18 0,08 

30 100,90 2,47 0,90 97,34 3,38 -2,65 

Tabla 3.11: Resultados del estudio de precisión del método B. CV (coeficiente de variación) y ER (Error 
relativo) 

  



Determinación analítica del morin 

91 

Con el método A, la precisión interdía presentó valores de CV 

comprendidos entre 5,50% y 6,77% y de 2,10-6,20% para la precisión 

intradía. Por lo que se refiere al método B, los CV obtenidos para la 

precisión interdía e intradía fueron inferiores, con valores de 2,18-3,38% y 

0,92-3,54% respectivamente. En ambos casos, los valores obtenidos 

pueden considerarse aceptables, no obstante, el método B presenta 

coeficientes de variación más bajos y por tanto, más adecuados. 

4.2. Resultados de la cuantificación de morin hidrato 

en tampón PBS por espectrofotometría UV.  

En la tabla 3.12 se recogen los valores medios de la absorbancia 

obtenidos a las distintas concentraciones de la recta de calibración de morin 

preparada en tampón PBS a pH 7,4 y analizada por espectrofotometría UV. 

Las rectas de calibrado se representan en la figura 3.6 

Concentración (µg/mL) Absorbancia media ± DE 

1 0,0265 ± 0,0088 

2,5 0,1082 ± 0,0049 

5 0,2492 ± 0,0039 

7,5 0,3764 ± 0,0033 

10 0,5207 ± 0,0046 

12,5 0,6628 ± 0,0119 

15 0,8072 ± 0,0164 

Tabla 3.12: Absorbancias medias correspondientes a las 3 rectas de calibrado. 



Mario Alonso 

92 

 

Figura 3.6: Representación conjunta de las 3 rectas de calibrado del método espectrofotométrico. 

Linealidad 

En la tabla 3.13 se resumen los resultados del tratamiento estadístico 

realizado para evaluar la linealidad del método espectrofotométrico. 

 Valores 

Rango (µl/mL) 1-15 

Coeficiente de correlación (r) 0,99949 

Coeficiente de determinación (r2) 0,99898 

Pendiente 0,055 

Error típico de la pendiente 0,000408 

Estadístico-t pendiente (valor-p) 136,1383 (0,0000) 

Ordenada al origen -0,03 

Error típico de la intercepción 0,003683 

Estadístico-t intercepción (valor-p) -8,6347 (0,0000) 

F-ANOVA test de regresión (valor-p) 1,49087 (0,0000) 

Tabla 3.13: Resumen de los resultados obtenidos en el análisis de la regresión para el método de 

cuantificación por espectrofotometría UV.  

y = 0,0556x - 0,0318
R² = 0,9997

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

U
n

id
ad

es
 d

e 
A

B
S

Concentración µg/mL



Determinación analítica del morin 

93 

Los resultados obtenidos del análisis de la varianza de la regresión 

permitieron confirmar la correlación existente entre la absorbancia y la 

concentración. La probabilidad asociada a los estadísticos F de Snédecor y t 

de Student, indicaron la existencia de una correlación estadísticamente 

significativa entre ambas variables. Por tanto, con el estadístico F, se puede 

afirmar que los datos se ajustan al modelo lineal propuesto, al obtenerse 

un valor p < 0,05 (p = 0,0000) para un nivel de probabilidad del 95%.  Al 

mismo tiempo, el estadístico t-Student de la pendiente indica que difiere 

significativamente de cero con un valor p < 0,05 (0,0000) para el mismo 

nivel de probabilidad. No obstante, la ordenada en el origen difiere 

significativamente de cero pues presenta un valor p < 0,05 (0,0000) para un 

nivel de confianza del 95%, por tanto el método no es proporcional y la 

ordenada al origen difiere significativamente de cero. 

Los resultados obtenidos nos permiten indicar que el método es lineal 

y puede ser empleado para la cuantificación de morin liberado a partir de 

las nanopartículas en los estudios de cesión in vitro. 

Exactitud 

El estudio de la exactitud del método espectofotométrico, se llevó a 

cabo empleando PLGA y MH Para ello, se calcularon los porcentajes de 

recuperación del analito en cada muestra y los coeficientes de variación. 

Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 3.14 

  



Mario Alonso 

94 

Concentración 

teórica  

(µg/mL) 

Concentración 

real (µg/mL) 

Porcentaje 

recuperación 

(%) 

Recuperación 

media (%) 

Desviación 

típica 

CV 

(%) 

5 5,04 100,72 

101,17 1,42 1,40 5 5,00 100,04 

5 5,14 102,77 

10 9,90 99,03 

99,42 0,83 0,84 10 10,08 100,38 

10 9,88 98,85 

15 14,90 99,36 

100,63 1,97 1,96 15 15,44 102,91 

15 14,95 99,64 

Tabla 3.14: Resultados del estudio de la exactitud del método de cuantificación de morin por 

espectrofotometría UV. 

Los resultados obtenidos demuestran que se trata de un método de 

detección exacto para concentraciones de morin iguales o superiores a  

2,5 µg/mL (CV< 5%). 

A la luz de estos resultados se puede afirmar que se trata de un 

método analítico adecuado para la detección y cuantificación de morin 

liberado a partir de las nanopartículas en los ensayos de cesión in vitro. 

  



  

95 

IV NANOPARTÍCULAS DE PLGA 

FUNCIONALIZADAS CON UN DIPÉPTIDO DE 

FENILALANINA 

  



Mario Alonso 

96 

  



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

97 

1. INTRODUCCIÓN 

En la BHE la permeabilidad de las sustancias es muy limitada. Los 

capilares del endotelio cerebral presentan uniones estrechas de tamaños 

cercanos a los 200 nm; esto unido a la inexistencia de canales paracelulares 

y a los escasos y restrictivos tipos de canales transcelulares, impide el paso 

de la mayor parte de las sustancias. Únicamente agua, gases, sustancias 

liposolubles de pequeño tamaño (400-600 Da) y los nutrientes esenciales, 

como glucosa y algunos aminoácidos, son capaces de atravesar la barrera. 

Este estricto control del paso se complementa con un mecanismo de eflujo 

constituido por la gp-P. La acción de esta bomba está destinada a la 

eliminación de sustancias tóxicas y desechos metabólicos, pero restringe la 

posibilidad de acción de muchos fármacos con interesantes acciones 

terapéuticas. 

En este aspecto las nanopartículas poliméricas elaboradas con 

polímeros biodegradables y biocompatibles, como el PLGA, suponen una 

estrategia interesante para conseguir el acceso de sustancias que no 

pueden atravesar la BHE y acceder al SNC. Sin embargo, las cantidades de 

nanopartículas que logran alcanzar el SNC son reducidas, dado que se 

distribuyen por todos los tejidos del organismo.  

La BHE presenta en su superficie canales LAT-1 con elevada afinidad 

por la fenilalanina o tirosina, aa precursores de numerosos 

neurotransmisores (Gardiner, 1990). Algunos estudios han indicado que la 

presencia de estos aminoácidos puede suponer una mejora a través de la 

barrera para los nanosistemas que incorporan en su superficie péptidos 

(Vyas, et al., 2015). 



Mario Alonso 

98 

La rodamina B (Rh) es una sustancia fluorescente que no atraviesa la 

BHE. Su estructura es de gran tamaño y la presencia de dos aminos ternarios 

(figura 4.1) impiden a esta molécula pasar los obstáculos que genera la BHE 

(Chen, et al., 2017). Es por esto, que se puede emplear como un marcador 

fluorescente para determinar la capacidad de paso de BHE de las NPs que 

contienen esta sustancia. 

 

Figura 4.3: Estructura química del marcador de fluorescencia Rodamina-B. 

2. OBJETIVOS 

El objetivo de este trabajo es elaborar nanopartículas de PLGA 

cargadas con rodamina B y funcionalizadas con un dipéptido de 

fenilalanina, para favorecer el paso a través de la BHE y el acceso de la 

rodamina B al SNC. 

Objetivos parciales: 

▪ Elaborar nanopartículas de PLGA cargadas con rodamina B. 

▪ Elaborar nanopartículas de PLGA cargadas con rodamina B y, 

posteriormente, funcionalizar. con el péptido fenilalanina-

fenilalanina, la superficie de las mismas. 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

99 

▪ Elaborar nanopartículas de PLGA-fenilalanina-fenilalanina y PLGA 

cargadas con rodamina B. 

▪ Realizar estudios de biodistribución de las nanopartículas en 

diferentes órganos: hígado, pulmón, riñón y bazo. 

▪ Evaluar el paso a través de la barrera hematoencefálica de las 

diferentes formulaciones en un modelo animal. 

3. MATERIAL Y MÉTODOS 

3.1. Elaboración de nanopartículas de Rodamina B 

3.1.1. Nanopartículas de PLGA  

Para la elaboración de NPs por el método de extracción-evaporación 

del solvente se pesan 50 mg de PLGA que se disuelven en 1,5 mL de 

diclorometano (Fisher Scientific®, España). A esta solución se adicionan  

2,5 mg de Rh (Fisher Scientific®, España) disueltos en 0,5 mL de DCM; y 

mediante agitación en vórtex se asegura una mezcla homogénea. La 

solución resultante se incorpora sobre 6 mL de una disolución acuosa de 

PVA al 1,5%. La mezcla resultante (fases orgánica y acuosa) se somete a 

agitación en sonicador (Accumet® AE150, Fisher Scientific, España) en 

pulsos de 10/15 segundos on/off durante 10 minutos, el vial debe 

mantenerse en un baño de hielo para prevenir el aumento de la 

temperatura. Pasado ese tiempo, la dispersión resultante se mantiene en 



Mario Alonso 

100 

agitación magnética moderada durante 2,5 horas, para permitir la 

evaporación del disolvente orgánico y la formación de las NPs. 

Una vez eliminado el disolvente orgánico las NPs se centrifugan a 

13.000 rpm (Sorvall ST8R Thermo Fisher®, España), el sobrenadante se 

retira, las NPs se resuspenden en agua destilada y se centrifugan 3 veces 

para asegurar la total eliminación del PVA. Tras el último centrifugado, las 

NPs se suspenden en 1 mL de sacarosa al 1,5%, precongeladas y liofilizadas 

durante 24 horas (Lyo Quest®, Azbil Telstar® S.A., España). Se han 

preparado también lotes de NPs de esta formulación sin rodamina B. 

La figura 4.2 refleja un esquema del proceso de elaboración seguido 

en este método. 

 

Figura 4.4: Esquema de elaboración de NPs por el método de la extracción-evaporación del solvente. 

  



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

101 

3.1.2. Nanopartículas de PLGA funcionalizadas en superficie con 

fenilalanina. 

Las NPs funcionalizadas en superficie con un dipéptido de fenilalanina 

(phe-phe) se elaboran con 50 mg de PLGA 502 y 2,5 mg de Rh  

(NPpheA-Rh) por el método de extracción-evaporación del solvente 

previamente descrito. La unión del péptido se realiza sobre la superficie de 

las NPs elaboradas, al activar los grupos carboxilo del PLGA.  

Para la unión del dipéptido a la superficie, las NPs cargadas con Rh se 

mantienen en 1 mL de H2O destilada durante 24 horas refrigeradas a 4ºC. 

Para realizar el proceso de funcionalización se adaptó el protocolo descrito 

por Constantino et al. (Constantino, et al., 2005). A 55 mg de NPs 

suspendidas en 1 mL de H2O destilada, se adicionan 0,5 mL de una solución 

tamponada de MES 0,1M (ácido 2-(4-morfolino)-etano sulfónico) (Fisher 

Scientific, España) con pH ajustado a 4,7. A esta solución se le añaden 50 

mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Acros Organics, Bélgica). Seguidamente 

se incorporan 150 mg de 1-etil-3(3-dimetilamino-propil) carbodiimida 

hidroclorato (EDC) disueltos en 2,5 mL de tampón MES. La suspensión de 

NPs se mantiene en agitación magnética durante 1 hora. Pasado este 

tiempo, se centrifugan las NPs a 13.000 rpm durante 25 minutos, para 

retirar el tampón MES junto con los reactivos que no hayan reaccionado. A 

continuación, se resuspenden las NPs en 2,5 mL de tampón fosfato (PBS) 

ajustado a pH 7,4. Sobre esta segunda suspensión se incorporan 2 mg de 

phe-phe disueltos en 2,5 mL de PBS a pH 7,4; manteniéndose en agitación 

magnética durante 2 horas para asegurar la reacción. Finalmente, se 

procede a centrifugar las NPs a 13.000 rpm durante 30 min, antes de añadir 

el crioprotector (sacarosa 1,5%) y liofilizarlas. El PBS sobrenadante se 



Mario Alonso 

102 

recoge y se cuantifica la cantidad de phe-phe que no se ha unido a la 

superficie. También se han preparado lotes de NPs de esta formulación sin 

rodamina B (NPpheA ). 

La figura 4.3 muestra las reacciones que tienen lugar durante el 

proceso de funcionalización con phe-phe: 

 

Figura 4.3: Esquema de las reacciones de unión del péptido phe-phe a las NPs.  

3.1.3. Nanopartículas elaboradas con PLGA-phe-phe y PLGA 

Para la elaboración de esta formulación (NPpheB-Rh), se emplea PLGA 

502 al que previamente se ha unido el phe-phe. En este caso, la fenilalanina 

se une por un enlace covalente peptídico al PLGA antes de la formación de 

las nanopartículas.  

En la unión del péptido y el polímero podemos distinguir dos etapas: 

activación del polímero y síntesis del PLGA-phe-phe. 

Durante la etapa de activación del polímero 2,5 g de PLGA se disuelven 

en DMC anhidro (7 mL) que se hacen reaccionar con un exceso de  



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

103 

NHS (68 mg) en presencia de EDC (115 mg), manteniéndose en agitación 

durante 22 horas en atmosfera de argón. La solución resultante se 

incorpora por goteo sobre 10 mL de una mezcla de éter etílico y metanol 

(1:1) enfriada en hielo, procurando así que el producto precipite. En esta 

etapa se obtiene un residuo sólido, que se separa por decantación y lavado 

con una mezcla de éter-metanol, para eliminar los subproductos 

resultantes de la reacción. El precipitado restante se diluye nuevamente 

con 15 mL de DCM y la solución se deshidrata con sulfato de sodio anhidro. 

A continuación, el disolvente se elimina mediante vacío en un baño 

termostatizado, obteniéndose 2,2 g de un polvo blanco. El sólido resultante 

se liofiliza para obtener PLGA-NHS en forma de polvo blanco. 

La figura 4.4 resume la reacción. 

 

Figura.4.4: Esquema de la reacción de activación del PLGA con NHS/EDC. 

En la etapa de síntesis del PLGA-phe-phe, 502 mg de PLGA-NHS se 

hacen reaccionar con 200 mg de péptido phe-phe en 12 mL de DCM anhidro 

y 0,1 mL de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA). La reacción se lleva a cabo 

durante 40 horas, manteniendo una agitación intensa y una atmósfera de 

argón. La mezcla resultante fue concentrada mediante vacío en baño 

termostatizado y posteriormente lavada con 15 mL de una mezcla de éter 

de petróleo-metanol (10:90). El precipitado resultante se separa por 

decantación y se lava repetidas veces con idéntica mezcla, con el fin de 



Mario Alonso 

104 

eliminar las impurezas de la reacción. El sólido recuperado se liofiliza para 

obtener de esta manera 120 g de un polvo blanco-amarillento de  

PLGA-phe-phe. 

 

Figura 4.5: Síntesis del PLGA-phe-phe mediante la unión del péptido phe-phe al PLGA activado.  

Para la elaboración de las NPs se emplea una mezcla de 50 mg de 

PLGA-phe-phe y PLGA en una proporción 40:60. Las NPs se elaboran por el 

método de extracción-evaporación del solvente que se ha explicado 

anteriormente, empleando 2,5 mg de Rh como activo. Siguiendo el mismo 

protocolo se elaboran nanopartículas blancas de esta formulación 

(NPpheB). 

La tabla 4.1 muestra las formulaciones de nanopartículas de morin 

elaboradas: 

Formulación PLGA 502 PLGA -PhePhe Phe-Phe Rh 

NP-Rh 50 mg - - 2,5 mg 

NPpheA-Rh 50 mg - 2 mg 2,5 mg 

NPpheB-Rh 30 mg 20 mg - 2,5 mg 

Tabla 4.1: Resumen de la composición de las formulaciones elaboradas 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

105 

3.2. Caracterización de las formulaciones 

3.2.1. Determinación de la cantidad de péptido unido a las 

formulaciones NPpheA 

La cuantificación del péptido phe-phe unido a la formulación NPpheA, 

se realiza mediante un método de cuantificación de fenilalanina por 

fluorescencia, adaptado a nuestras condiciones (Neurauter, et al., 2013). 

Este método emplea como fase móvil una solución acuosa de KH2PO4 a una 

concentración 15 mM, y con un flujo de 0,9 mL/min. El detector de 

fluorescencia se configura para una longitud de onda de excitación de  

210 nm y una lectura de emisión a 302 nm. Se han realizado cinco rectas de 

calibrado a concentraciones de 50, 100, 150, 200, 300, 400 y 500 µg/mL.  

La cuantificación de la cantidad del péptido unido a las NPs después de 

su formación, se ha realizado de manera indirecta. Una muestra diluida del 

sobrenadante de la reacción de funcionalización se ha analizado mediante 

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC Jasco, Jasco International Co 

Ltd, Japón) con un detector de fluorescencia acoplado (Jasco FP-4025 

fluorescence detector, Jasco International Co Ltd, Japón). Los ensayos de 

realizan por duplicado. 

3.2.2. Determinación de la unión del péptido al PLGA en las 

formulaciones NPpheB 

El proceso de unión del péptido phe-phe al PLGA es una reacción 

compleja. Para poder asegurar que el producto obtenido en cada una de las 

etapas del proceso de síntesis es el esperado, los subproductos resultantes 

se han analizado mediante resonancia magnética nuclear (RMN). 



Mario Alonso 

106 

El RMN es una técnica espectroscópica que puede emplearse para 

estudiar núcleos atómicos con un número impar de protones, neutrones o 

de ambos. En condiciones normales los espines de estos átomos se orientan 

al azar. Sin embargo, cuando se someten a la influencia de un campo 

magnético, adquieren una conformación ordenada: los espines positivos se 

orientan en la misma dirección del campo (estado conocido como espín-α) 

mientras que los espines negativos se orientan en dirección contraria al 

campo (espín-β). La diferencia de energía entre los dos estados α y β 

depende de la fuerza del campo magnético aplicado. 

En una muestra con compuestos orgánicos que es irradiada 

brevemente con un pulso intenso de radiación, los núcleos en estado α son 

promovidos al estado β. Cuando los núcleos vuelven a su estado original, 

emiten una señal que es detectada por el espectrómetro RMN y registrada 

en forma de una gráfica de frecuencias frente a intensidad.  

El análisis de las muestras se lleva a cabo disolviendo 5 mg de muestra, 

procedente de cada una de las etapas, en 10 mL de cloroformo deuterado 

(CDCl3). De la solución resultante se toma una alicuota de 

aproximadamente 1mL en un tubo de resonancia magnética, que se analiza 

mediante los espectrofotómetros del CAI de resonancia magnética, en unas 

condiciones de trabajo de 250 MHz para resonancia 1H. Sobre los espectros 

obtenidos se identifica la señal correspondiente a los sustituyentes de 

interés. 

  



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

107 

3.2.3. Determinación del tamaño de partícula 

Con el objetivo de determinar el tamaño medio y la distribución de 

tamaños de todas las formulaciones elaboradas se ha empleado la técnica 

de difracción de rayos láser, para ello se empleó un equipo Zetatrac® Ultra 

(Microtac, Inc., EE.UU.). Se determina el diámetro medio de las NPs como 

diámetro volumen (DV) y la distribución de tamaños, mediante curvas 

distributivas de volumen. 

Alteraciones en la metodología pueden dar lugar a cambios en el 

tamaño final de las NPs. Para evaluar si la técnica empleada es adecuada 

conviene determinar la dispersión de la distribución de tamaños de las 

formulaciones, por ello se calcula el valor de span y el índice de 

polidispersión (IP). 

Para calcular los valores de span de cada una de las distribuciones 

obtenidas se ha empleado la siguiente ecuación: 

𝑠𝑝𝑎𝑛 =
𝑃𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑖𝑙 90 − 𝑃𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑖𝑙 10

𝑃𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑖𝑙 50
 

Valores de span elevados indican una distribución heterogénea; un 

valor de span se considera adecuado cuando es inferior a 1, lo que significa 

que la población es monodispersa. 

El IP nos indica la anchura y distribución de tamaños moleculares, y es 

la relación entre el promedio en peso y en número. Para el cálculo del IP se 

emplea la siguiente ecuación: 

𝐼𝑃 =  
𝑆𝐷

𝑇𝑎𝑚𝑎ñ𝑜 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜
 



Mario Alonso 

108 

Valores de IP comprendidos entre 0,1-0,5 indican una población 

monodispersa, mientras que valores superiores a 0,7 reflejan una amplia 

distribución de tamaños y por tanto, una muestra polidispersa. 

3.2.4. Estudios morfológicos 

El análisis morfológico de las formulaciones se ha realizado por 

microscopía electrónica de barrido (SEM, Jeol, JSM 7600F, Japón). Este 

estudio permite determinar la forma, homogeneidad de tamaños, estado 

de agregación de las partículas y presencia de alteraciones en la superficie, 

que son aspectos que pueden tener una influencia en el perfil de liberación 

del principio activo desde la NPs. 

Para la realización del análisis, las muestras se fijan mediante cinta 

adhesiva de fibra de carbono a portamuestras, que se recubren con oro 

coloidal como agente conductor. 

3.2.5. Propiedades superficiales 

La determinación del potencial zeta de las distintas formulaciones de 

NPs se ha realizado mediante la técnica de dispersión de luz; se utiliza para 

ello el equipo Zetasizer Nano S® (Malvern Instrument’s, Reino Unido), que 

emplea una célula capilar Capillary cell enhances® (Malvern Instrument’s, 

Reino Unido) para la lectura de muestras. Para ello se prepara una 

suspensión de las formulaciones en agua destilada a una concentración de 

100 µg/mL. Las muestras se agitan en vórtex a velocidad moderada durante 

1 minuto, para asegurar la dispersión de las NPs. 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

109 

El potencial Z (pZ) se ha determinado en las formulaciones NP-Rh; 

NPpheA-Rh y NPpheB-Rh, y se ha comparado con el obtenido para las 

formulaciones que no incorporan principio activo. 

3.2.6. Determinación de la cantidad de Rh encapsulada 

Para la determinación del contenido en Rh de las NPs cargadas con el 

flavonoide se pesan 10 mg de la formulación y se disuelven en 1 mL de DCM 

bajo agitación en vórtex. A continuación, se adicionan 4 mL de metanol 

(Fisher Scientific, España). Al ser el PLGA insoluble en MetOH, este 

precipita. Seguidamente, se cuantifica por espectrofotometría la cantidad 

de principio activo encapsulado, que se expresa como microgramos de Rh 

en 100 mg de NPs. 

Para la cuantificación de Rh en metanol, se ha puesto a punto un 

método por espectrofotometría, para ello se emplean concentraciones de 

0,5; 1; 2; 3; 4 y 5 µg/mL de Rh en MetOH. La recta de calibrado se ha 

repetido 5 veces y se obtuvo como resultado la siguiente ecuación media: 

𝑦 = 0,1992𝑥 + 0,0098 

El valor de R2 obtenido es de 0,9998; el cual resulta adecuado para el 

análisis. 

3.2.7. Ensayos de cesión 

Para la realización de los ensayos de cesión, se pesan 20 mg de NPs, 

que se introducen en tubos eppendorf y se suspenden en 4 mL de una 

solución de PBS a pH 7,4. Las muestras se sumergen en un baño 

termostatizado Memmert WNB 45 (Memmert®, Alemania) a 37±0,1ºC, bajo 



Mario Alonso 

110 

una agitación magnética constante de 100 rpm. La toma de muestras se 

realiza a los siguientes tiempos: 1, 2 y 6 horas. El volumen de muestra 

extraído se filtra a través de filtros de PVDF de 0,45 µm (Teknokroma 

Analítica SA, España) y se procede al análisis de las muestreas mediante 

espectrofotometría a una longitud de onda de 261 nm 

Para la cuantificación de Rh en PBS, se ha puesto a punto un método 

por espectrofotometría, empleando para ello las concentraciones de 0,5; 1; 

2; 3; 4 y 5 µg/mL de Rh en MetOH. La recta de calibrado se ha repetido 5 

veces, obteniéndose como resultado la siguiente ecuación media: 

𝑦 = 0,227𝑥 − 0,0021 

El valor R2 de la ecuación es de 0,9997; el cual resulta adecuado para 

el análisis en ese rango de concentraciones. 

3.3. Estudios de biodistribución 

Los estudios de biodistribución se han realizado en ratas Wistar macho 

de 220-270 g de peso. Las ratas se dividen en 4 grupos experimentales a los 

que se administran las formulaciones. El número de animales es de 6 ratas 

en todos los grupos, excepto en el grupo que recibe la formulación de NPs 

sin funcionalizar (NP-Rh) que está formado por 8 ratas (tabla 4.2). En todos 

los grupos las ratas se han sacrificado a las 1 hora y 2 horas después de la 

administración de las formulaciones. 

La dosis seleccionada fue de 12,5 mg de NPs, administrada en un 

volumen de 0,5 mL de suero salino, para un peso medio de 250 g. El 

volumen administrado a cada rata se ha ajustado en función del peso 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

111 

exacto de cada animal. La administración se realiza con una jeringuilla de 

insulina y con agujas de 30 G en la vena lateral de la cola. 

El grupo 1 de animales se ha establecido como control y se le 

administra solamente suero salino. A los demás grupos experimentales (2, 

3 y 4) se les administran las formulaciones de NPs correspondientes, tal y 

como se muestra en la tabla 4.2 (formulaciones NP-Rh, NPpheA-Rh y 

NPpheB-Rh):  

Grupos Formulación Número de animales 
Tiempo de 

sacrificio (h) 

1 Suero salino 

3 1 

3 2 

2 NP-Rh 

4 1 

4 2 

3 NPpheA-Rh 

3 1 

3 2 

4 NPpheB-Rh 

3 1 

3 2 

Tabla 4.2: Resumen de las condiciones de administración y sacrificio de los animales durante el 
estudio de biodistribución. 

Tras el sacrificio, se procede a extraer el cerebro, que se divide en los 

dos hemisferios, los pulmones, el hígado, los riñones y el bazo. Los órganos 

extraídos se congelan con nieve carbónica y se mantienen a -80°C hasta su 

posterior análisis. 

  



Mario Alonso 

112 

3.3.1. Biodistribución en tejidos 

El análisis de biodistribución de las formulaciones de NPs se ha 

realizado midiendo la fluorescencia de la Rh contenida en los diferentes 

órganos estudiados, de acuerdo al método descrito previamente por 

nuestro equipo de investigación (Marcianes, et al., 2017). Para ello, se pesa 

en primer lugar cada órgano, del que se toma una porción. A continuación, 

esta porción se homogeniza en 5 mL de DCM mediante turbina. 

Seguidamente, las muestras ya homogenizadas se mantienen en 

maceración protegidas de la luz durante 1 hora, el sobrenadante se 

centrifuga a 8.000 rpm durante 10 minutos, y se realiza la lectura en un 

fluorímetro Varian Cary Eclipse, (Agilent Technologies, España). La Rh 

presenta una longitud de onda de excitación de 553 nm y una longitud de 

onda de emisión de 627 nm.  

Debido a las diferencias en las cantidades de Rh encapsulada entre las 

distintas formulaciones. Ha sido necesario normalizar los resultados en 

función de la cantidad existente en la formulación NP-Rh. Los resultados se 

expresan como ng de Rh por gramo de órgano. 

3.3.2. Evaluación del paso de las NPs a través de barrera 

hematoencefálica 

Los estudios de paso a través de la BHE se han realizado por dos 

métodos distintos: en primer lugar, se realizó un estudio de biodistribución 

siguiendo el protocolo previamente descrito, con uno de los hemisferios 

cerebrales. Con el otro hemisferio se han realizado cortes de 30 µm con un 

micrótomo. Los cortes cerebrales se montan en portamuestras para ser 

analizados en un microscopio de fluorescencia. 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

113 

Para ello, las muestras se fijan con formaldehido a los portamuestras 

y son tratados con DAPI, colorante que se une al material genético de las 

células intactas y proporciona una fluorescencia azul. Para evaluar la 

intensidad de Rh en los cortes cerebrales se emplea una longitud de onda 

de excitación 540 nm y de emisión de 570 nm. Las imágenes se adquieren 

en un microscopio Leica, modelo DM2000 LED (Leica Microsystems, 

España) acoplado a una cámara digital Leica DFC3000G (Leica 

Microsystems, España) para capturar las imágenes con 

inmunofluorescencia. Las imágenes se obtienen mediante el software Leica 

LAS, que posteriormente se exportan en formato jpeg 

Una vez hecha la tinción, los cortes se observan a 10 aumentos en el 

microscopio de fluorescencia. Las imágenes obtenidas han sido analizadas 

y tratadas mediante el programa ImageJ (National Institute of Health, EE. 

UU.). Los datos se expresan como promedio de la intensidad de 

fluorescencia de las muestras. Para ello se han empleado 8 cortes del área 

del hipocampo de cada uno de los animales estudiados. 

3.3.3. Integridad del tejido cerebral 

Con el fin de saber si la administración de las NPs genera algún tipo de 

daño en tejido cerebral, se ha realizado una tinción de NISSL. La tinción 

NISSL se lleva a cabo sumergiendo la muestra fijada a un portamuestras en 

una solución de violeta de cresilo. La muestra se mantiene durante 30 

minutos en esta solución. Posteriormente se procede a su lavado, 

empleando para ello concentraciones crecientes de etanol durante 2 

minutos. Finalmente, para asegurar que la muestra queda deshidratada, se 

realizan dos lavados de 5 minutos en xileno. 



Mario Alonso 

114 

Las imágenes se adquirieron en un microscopio Leica, modelo DM2000 

LED acoplado a una cámara digital (Leica DFC425 para las capturas a color 

de las tinciones de violeta de cresilo). Las imágenes se han capturado 

usando el software Leica LAS y posteriormente son exportadas en formato 

jpeg. 

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

4.1. Caracterización de las NPs 

4.1.1. Determinación de la cantidad de péptido unido a las 

formulaciones NPpheA-Rh 

El método de detección del phe-phe por fluorescencia puesto a punto 

se ajusta a la siguiente recta de calibración: 

𝑦 = 35447 + 638,32𝑥    

(𝑅2 =  0,9991) 

Para la cuantificación de la cantidad de phe-phe unida a la superficie 

de las NPs (NPpheA-Rh), se cuantifica la cantidad remanente de péptido 

presente en el tampón, resultante del proceso de funcionalización. A partir 

de estos datos se han obtenido las cantidades de péptido unido a las NPs. 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

115 

La figura 4.6 muestra, a modo de ejemplo, uno de los picos de fluorescencia 

obtenidos durante el análisis. 

 

Figura 4.6: Ejemplo del pico obtenido al analizar el sobrenadante con phe-phe.  

Los resultados del análisis se muestran en la tabla 4.3. 

Formulación 
phe-phe añadido 

(µg) 
phe-phe 

sobrenadante (µg) 
phe-phe unido a 

NPs (µg) 

NPpheA-Rh 2000 1568,67 ± 53,28 431,33 ± 53,28 

Tabla 4.3: Cantidad de péptido phe-phe en el líquido sobrenadante y unido a la formulación  

NPpheA-Rh. 

Como se puede observar en la tabla 4.6, la metodología empleada para 

la unión del péptido phe-phe a las NPs ya elaboradas resultó ser viable, pero 

altamente ineficiente, debido a que el rendimiento del proceso es bajo. De 

los 2 mg añadidos (en exceso), solamente se unieron 431±53 µg, lo que 

supone que solamente un 21,57% de la cantidad inicial ha conseguido 

unirse a la superficie de las NPs.  

Este método de funcionalización se empleará para la elaboración de la 

formulación de NPs que denominamos NPpheA-Rh. 



Mario Alonso 

116 

4.1.2. Determinación de la unión de péptido al PLGA en las 

formulaciones NPpheB 

Para analizar la unión de phe-phe al PLGA, polímero que se va a 

emplear para la elaboración de las formulaciones de nanopartículas 

NPpheB, se ha llevado a cabo un análisis de RMN de elucidación de la 

estructura. La figura 4.7 muestra el espectro de H-RMN correspondiente al 

PLGA en su etapa de activación, y en la figura 8 se muestra el espectro de 

RMN del PLGA-phe-phe sintetizado y obtenido tras la unión del péptido.   

 

Figura 4.7: Espectro H-RMN del polímero PLGA activado con NHS.  



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

117 

 

Figura.4.8: Espectro H-RMN del PLGA-phe-phe.  

En la figura 4.8 se muestran los cambios en el espectro del PLGA 

debido a la presencia de fenilalanina. En ella se pude observar un pico a  

t= 7,17, que es característico de los anillos aromáticos presentes en el 

péptido phe-phe, así como la desaparición del doblete correspondiente a la 

NHS que debería aparecer a t= 3,26 (figura 4.7). 

El método de unión del péptido phe-phe al polímero, previo a la 

elaboración de las NPs de las formulaciones NPpheB, tiene la ventaja de 

poder controlar la proporción de ligando presente en la formulación. Esta 

síntesis ha permitido obtener un porcentaje de unión de phe-phe al PLGA 

del 100%. Por tanto, este nuevo polímero (PLGA-phe-phe) se puede 

emplear en diferentes proporciones, junto con el polímero PLGA, que no 

tiene el péptido unido. En nuestro caso, hemos seleccionado una 



Mario Alonso 

118 

proporción de 40% de PLGA-phe-phe y 60% de PLGA para la elaboración de 

las formulaciones de NPs que denominamos NPpheB. 

4.1.3. Determinación del tamaño de partícula 

En la tabla 4.4 se resumen los resultados medios correspondientes al 

tamaño de partícula, índice de polidispersión (IP) y span de las 

formulaciones de rodamina elaboradas. 

Formulación 
Diámetro medio (nm) 

± DE IP span 

NP 176,4 ± 13,45 0,22 0,68 

NPpheA 195,47 ± 12,99 0,18 0,63 

NPpheB 192,77 ± 1,44 0,19 0,67 

NP-Rh 187,67 ± 6,92 0,25 0,71 

NPpheA-Rh 190,66 ± 4,67 0,31 0,83 

NPpheB-Rh 191,03 ± 6,51 0,25 0,67 

Tabla 4.4: Resultados medios obtenidos para el tamaño de partícula (±DE), índice de 
polidispersión y span de las formulaciones de NPs elaboradas. 

Como se puede observar, todas las formulaciones presentan tamaños de 

partícula comprendidos entre 180-198 nm. Dado que ninguno de los valores 

de IP fue superior a 0,5 ni los valores de span fueron superiores a 1,0, se 

puede afirmar que se trata de poblaciones de partículas homogéneas y 

monodispersas. A la vista de los datos obtenidos podemos indicar que el 

método de elaboración empleado para las NPs resulta apropiado para 

nuestros objetivos, ya que el tamaño de partícula obtenido fue inferior a 

250 nm; este tamaño resulta adecuado para poder atravesar la BHE 

(Kasinatham, et al., 2015).  



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

119 

 

Figura 4.9: Dispersión de tamaños de las distintas formulaciones. A:NP-Rh; B: NPpheA-Rh; C: NPpheB-
Rh 

 

  



Mario Alonso 

120 

4.1.4. Estudios morfológicos (SEM) 

 

Figura 4.10: Imagen por microscopía electrónica de barrido (SEM) de la formulación NP. A: cargadas con 
Rh; B: blancas. 

 

Figura 4¡Error! No hay texto con el estilo especificado en el documento..11: Imagen por microscopía 
electrónica de barrido (SEM) de la formulación NPphA. A: cargada con Rh; B: blancas. 

 

Figura 4.12: Imagen por microscopía electrónica de barrido (SEM) de la formulación NPpheB. A: cargada 
con Rh; B: blancas. 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

121 

Las microfotografías obtenidas mediante microscopia electrónica de 

barrido (SEM) nos permiten comprobar que todas las formulaciones de NPs 

presentan una superficie lisa, rígida y con un tamaño homogéneo. No se 

observaron agregados que podrían dificultar la administración de las 

formulaciones por vía intravenosa. Estos resultados concuerdan con los 

obtenidos en el análisis por difracción de rayos láser. 

4.1.5. Propiedades superficiales 

Formulación 
Potencial Z NPs Rh ± DE  

(mV) 
Potencial Z NPs blancas ± DE 

(mV) 

NP -22,63 ± 0,42 -25,4 ± 1,38 

NPpheA -18,46 ± 0,74 -20,03 ± 0,21 

NPpheB -7,88 ± 0,23 -18,27 ± 2,15 

Tabla 4.5: Potenzial Z medio (±DE) de las formulaciones NP-Rh, NPpheA-Rh, NPpheB-Rh (columna 1) y 

NP, NPpheA, NPpheB sin cargar (columna 2).  

El potencial Z de las NPs de PLGA blancas es similar al obtenido por 

otros autores (Vera, et al., 2015; Marcianes, et al., 2017). Este potencial 

disminuye de forma significativa con la presencia de phe-phe, aunque esta 

disminución no resulta suficientemente relevante para modificar las 

características de las partículas. Como se puede observar en la tabla 4.5, se 

produce un cambio en el potencial Z de todas las formulaciones al 

incorporar la Rh, en las cuales disminuye su carga negativa. Esto es 

especialmente marcado en el caso de la formulación NPpheB-Rh, la cual 

alcanza una carga que podríamos considerar neutra (valores de Pz ±10,0). 

Si se tiene en cuenta que la Rh tiene carga positiva, las diferencias 

encontradas podrían ser debidas a la mayor encapsulación que se produce 

al elaborar la formulación NPpheB-Rh.  



Mario Alonso 

122 

Hoyos-Ceballos et al. (Hoyos-Ceballos, et al., 2020) obtienen similares 

resultados cuando elaboran NPs de PLGA que son funcionalizadas, antes o 

después de su elaboración, mediante otros péptidos. Estos autores 

encuentran que el valor de potencial Z de las NPs pre-funcionalizadas es 

mucho más parecido al de las NPs de PLGA que el obtenido para las NPs 

post-funcionalizadas con los mismos péptidos.   

Es sabido que valores de potencial Z positivos (>+10,0) facilitan el paso 

de las partículas a través de barreras biológicas, ya que tienen 

principalmente carga negativa, aunque esto significa también que provocan 

una mayor activación del sistema inmune (S.I.) y son fagocitadas por 

macrófagos (Salvador-Morales, et al., 2009). Es por este motivo que, en 

principio, las cargas neutras o negativas son más adecuadas para que las 

NPs puedan circular libremente y llegar a su lugar de acción, sin ser 

eliminadas. 

4.1.6. Determinación de la cantidad de Rh encapsulada 

La tabla 4.6 muestra los resultados medios obtenidos para la cantidad 

de rodamina encapsulada y la eficacia de encapsulación (EE) de las distintas 

formulaciones elaboradas. 

Formulación 
Cantidad encapsulada media 

(µg)/100 mg de NPs ± DE 
EE% ± DE 

NP-Rh 362,8± 17,3 7,6 ± 0,4 

NPpheA-Rh 108,9 ± 11,4 2,3 ± 0,2 

NPpheB-Rh 715,3 ± 8,6 15,0 ± 0,2 

Tabla 4.6: Cantidad media de Rh encapsulada y eficacia de encapsulación (EE%) ± DE de las 

formulaciones de NPs elaboradas.  



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

123 

Los resultados obtenidos muestran una baja cantidad de Rh 

encapsulada y, por tanto, una eficacia de encapsulación muy baja. En este 

sentido, cuando se aumentó la cantidad de Rh inicial para la elaboración de 

las NPs se observó una interacción entre la rodamina y el polímero, que 

modificaba las características del PLGA. Por ello, se emplea una cantidad 

inicial de Rh del 2,5%, que resulta suficiente para llevar a cabo los estudios 

de biodistribución. La formulación NPpheA-Rh presenta los valores más 

bajos de encapsulación, que probablemente es debido al proceso de 

funcionalización que requiere de tiempos largos de contacto de las NPs con 

los medios tamponados MES y PBS y, por tanto, se puede producir la 

liberación del agente fluorescente durante el proceso. 

Por otro lado, la formulación NPpheB-Rh presenta porcentajes de 

encapsulación muy superiores a los obtenidos para las otras dos 

formulaciones. Estas diferencias solo pueden atribuirse a la presencia de 

fenilalanina previa a la formación de las NPs. Aunque la presencia de este 

dipéptido está avalada por los espectros de RMN obtenidos tras su unión al 

PLGA y por las modificaciones del potencial Z, no es posible saber si la 

fenilalanina se orienta hacia el interior o hacia el exterior de las NPs. Una 

orientación hacia el interior de una parte o de toda la fenilalanina, podría 

explicar esta elevada diferencia en la cantidad de Rh encapsulada, que se 

puede observar a simple vista por el color que adquieren de las NPs 

elaboradas para esta formulación.   

  



Mario Alonso 

124 

4.1.7. Ensayos de cesión 

Las tablas 4.7 a 4.9, junto con las figuras que las acompañan, muestran 

los resultados del ensayo de cesión de Rh a partir de las tres formulaciones.  

Tiempo (h) 
Cantidad media cedida acumulada 

(µg)/100 mg NPs ± DE 
Porcentaje medio cedido 

acumulado ± DE 

1 159,64 ± 1,28 44,00 ± 0,35 

2 223,76 ± 1,79 61,68 ± 0,49 

6 256,05 ± 2,04 70,58 ± 0,56 

Tabla 4.7: Resultados medios (±DE) obtenidos en los ensayos de cesión de la formulación NP-Rh.  

Tiempo (h) 
Cantidad media cedida acumulada 

(µg)/100 mg NPs ± DE 
Porcentaje medio cedido 

acumulado ± DE 

1 30,96 ± 0,30 28,42 ± 0,28 

2 43,45 ± 0,43 39,89 ± 0,39 

6 49,80 ± 0,49 45,72 ± 0,45 

Tabla 4.8: Resultados medios (±DE) obtenidos en los ensayos de cesión de la formulación NPpheA-Rh.  

Tiempo (h) 
Cantidad media cedida acumulada 

(µg)/100 mg NPs ± DE 
Porcentaje medio cedido 

acumulado ± DE 

1 393,65 ± 3,13 55,04 ± 0,44 

2 552,40 ± 4,349 77,23 ± 0,61 

6 579,77 ± 4,60 81,05 ± 0,64 

Tabla 4.9: Resultados medios (±DE) obtenidos en los ensayos de cesión de la formulación NPpheB-Rh.  

Los estudios de cesión de estas formulaciones se llevan a cabo, 

únicamente para conocer de forma aproximada la liberación de Rh y así 

poder relacionar estos resultados con el comportamiento de la formulación 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

125 

in vivo. Hay que tener en cuenta, que antes de atravesar la BHE se puede 

producir la liberación de Rh en el organismo. Es necesario indicar que la 

rodamina B no consigue atravesar la barrera hematoencefálica, sin 

embargo, la rodamina cedida previamente reducirá la cantidad de la misma 

que acceda al SNC y las Nps llegarían al cerebro con menos carga. Por otro 

lado, en estudios de biodistribución llevados a cabo previamente por el 

grupo de Investigación, el mayor paso de NPs de PLGA al cerebro se produce 

en los primeros de los 30 minutos después de la administración (Marcianes, 

et al., 2017). 

Como se observa en los resultados obtenidos para la formulación 

NPpheA-Rh (tabla 4.8), el proceso de funcionalización mediante la reacción 

de la carbodihimida condujo a una disminución de la velocidad de la cesión. 

Este hecho puede deberse a que el proceso de funcionalización retire la 

rodamina presente en las capas superficiales de las NPs y por ello disminuye 

el burst inicial. Sin embargo, otros autores que han trabajado con NPs 

funcionalizadas por este mismo método, achacan este cambio en la 

liberación a la formación de una capa extra en la superficie de los 

nanosistemas, que modificaría la velocidad de liberación debida a la 

presencia del péptido en la formulación (Zhu, et al., 2017; Cayero-Otero, et 

al., 2019).  

  



Mario Alonso 

126 

4.2. Estudios de biodistribución  

4.2.1. Biodistribución en tejidos 

Los estudios de biodistribución se llevan a cabo después de 1 y 2 horas 

de la administración de las NPs mediante la cuantificación de la Rh presente 

en los distintos órganos: hígado, bazo, riñón y pulmón. Para poder 

comparar los resultados, previamente fue necesario normalizar las dosis de 

NPs administradas en función de la carga de Rh en cada formulación. 

En primer lugar, se ha comparado la biodistribución en los órganos de 

cada una de las formulaciones, para así poder evaluar la mayor o menor 

afinidad de cada formulación. En las tablas 10 a 12 se recoge la cantidad de 

Rh presente en los distintos órganos analizados, a los dos tiempos 

ensayados, y para cada una de las formulaciones elaboradas. Las figuras 13 

a 15, que acompañan a las tablas, muestran en forma de gráfico estos 

mismos valores. 

Órgano 
Cantidad media de Rh  

(ng/g órgano) ± DE a t=1h 
Cantidad media de Rh  

(ng/g órgano) ± DE a t=2h 

Hígado 15,73 ± 1,52 19,31± 3,95 

Riñón 3,02 ± 0,21 5,01 ± 0,30 

Bazo 28,61 ± 3,71 18,98 ± 2,60 

Pulmón 14,42 ± 1,40 15,76 ± 3,85 

Tabla 4.10: Resultados de los ensayos de biodistribución correspondientes a la formulación NP-Rh 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

127 

 

 

Figura 4.13: Resultados de los ensayos de biodistribución correspondientes a la formulación NP-Rh. 

En la tabla 10 se puede observar cómo, durante la primera hora, la 

formulación NP-Rh presentó un mayor tropismo hacia el bazo, mientras que 

el riñón es el órgano en el cual se detectan menores niveles de Rh. Por lo 

que se refiere al hígado y pulmón, presentan una acumulación similar del 

marcador fluorescente. A las 2 horas de la administración, se detectó una 

brusca bajada de la fluorescencia en la Rh presente en el bazo, la cual llega 

a alcanzar valores similares a los de pulmón e hígado, mientras que, en el 

resto de órganos, las cantidades de rodamina aumentan ligeramente. Los 

resultados obtenidos solo muestran un incremento significativo en las 

concentraciones de Rh en riñón, si bien los niveles encontrados en este 

órgano siguen siendo muy bajos e inferiores a los de los otros órganos.   

  

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Higado Riñon Bazo Pulmón

R
h

 (
µ

g/
g 

O
rg

)



Mario Alonso 

128 

Órgano 
Cantidad media de Rh  
(ng/g Org) ± DE a t=1h 

Cantidad media de Rh  
(ng/g Org) ± DE a t=2h 

Hígado 47,79 ± 14,12 109,96 ± 3,89 

Riñón 11,39 ± 2,01 6,99 ± 1,08 

Bazo 283,45 ± 38,65 203,84 ± 25,15 

Pulmón 21,86 ± 2,98 96,84 ± 4,22 

Tabla 4.11: Resultados de los ensayos de biodistribución correspondientes a la formulación  
NPpheA-Rh. 

 

Figura 4.14: Resultados de los ensayos de biodistribución correspondientes a la formulación NPpheA-
Rh 

Al estudiar la biodistribución de la formulación NPpheA-Rh se observa 

que, durante la primera hora, el bazo es claramente el órgano por el que 

existe un mayor tropismo, en el que se alcanzan cantidades de Rh casi 6 

veces superiores a las presentes en el hígado, que representa el segundo 

órgano con un mayor acceso de Rh, con niveles cercanos a los 50 µg/g de 

órgano. A continuación, y en cantidad, se encuentra el pulmón, pero con 

valores significativamente inferiores a los encontrados en hígado. Los 

niveles más bajos se alcanzan en riñón. Al estudiar el comportamiento de 

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

Higado Riñon Bazo Pulmón

R
h

 (
µ

g/
g 

O
rg

)



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

129 

esta formulación después de 2 horas de la administración, se puede 

observar como las cantidades de Rh en bazo disminuyeron, aunque 

continúa siendo el órgano con una mayor presencia de Rh. En hígado y 

pulmón se produjo, sin embargo, un aumento muy significativo de la 

presencia de este compuesto y llega a doblar y a triplicar, respectivamente, 

sus valores para ambos órganos. En cambio, su presencia en riñón se redujo 

a la mitad. Otros autores han encontrado resultados similares con NPs 

funcionalizadas en superficie con péptidos que incluyen fenilalanina, las 

cuales incrementan su presencia, respecto a las NPs no funcionalizadas, en 

la mayor parte de los órganos estudiados (hígado, bazo y riñón) durante la 

primera hora, reduciéndose en el siguiente tiempo de estudio en el caso de 

los riñones (Tosi, et al. 2010). En dicho estudio, sin embargo, las 

nanopartículas funcionalizadas con el péptido no se acumularon en 

pulmones hasta tiempos superiores a las 3 horas, obteniendo las mayores 

acumulaciones en hígado y riñones; esto hecho es contrario a lo obtenido 

en nuestro estudio. Es verdad, no obstante, que el péptido empleado por 

Tosi et al., para funcionalizar no es exactamente el mismo, el cual es más 

largo y con otros aminoácidos además de phe, lo que puede afectar a este 

perfil de distribución.  

  



Mario Alonso 

130 

Órgano 
Cantidad media de Rh  

(ng/g órgano) ± DE a t=1h 
Cantidad media de Rh  

(ng/g órgano) ± DE a t=2h 

Hígado 29,40 ± 3,28 42,61 ± 0,64 

Riñón 11,08 ± 1,34 12,22 ± 0,14 

Bazo 11,65 ± 1,74 10,01 ± 0,89 

Pulmón 24,64 ± 5,05 18,83 ± 2,18 

Tabla 4.12: Resultados de los ensayos de biodistribución correspondientes a la formulación  
NPpheB-Rh 

 

Figura 4.15: Resultados de los ensayos de biodistribución correspondientes a la formulación  
NPpheB-Rh 

Por último, en relación a la formulación NPpheB-Rh, los resultados 

obtenidos a la hora muestran claramente un tropismo diferente, en este 

caso es el tejido hepático el que presenta la mayor acumulación de Rh. Por 

otra parte, tanto en riñón como en bazo se obtienen cantidades 

significativamente menores y muy similares entre ellas (tabla 4.12). Al 

analizar los resultados correspondientes a las 2 horas, se observa un 

aumento significativo en la presencia de rodamina en hígado, mientras que 

los cambios en los otros órganos no fueron significativos: aumentaron muy 

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00

Higado Riñon Bazo Pulmón

R
h

 (
µ

g/
g 

O
rg

)



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

131 

ligeramente en riñón y disminuyeron su presencia en bazo y pulmón (figura 

15). Con esta formulación se reduce claramente la tendencia de las NPs de 

acumularse en bazo, por lo que el hígado y el pulmón fueron los órganos 

con mayor presencia de Rh.   

A la vista de los resultados obtenidos, hemos comparado el 

comportamiento de las formulaciones entre ellas respecto a su afinidad por 

los diferentes órganos.  

La figura 4.16 muestra las concentraciones de Rh en los distintos 

órganos, 1 hora después de la administración, y para las tres formulaciones 

estudiadas. 

 

Figura 4.16: Comparación de las concentraciones de Rh en los distintos órganos ensayados, 1 hora 
después de la administración, y para las tras formulaciones de NPs estudiadas. 

La figura 4.17 muestra las concentraciones de Rh en los distintos 

órganos, 2 horas después de la administración, y para las tres formulaciones 

estudiadas. 

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

Higado Riñon Bazo Pulmón

R
h

 (
µ

g/
g 

O
rg

)

NP NPpheA NPpheB



Mario Alonso 

132 

 

Figura 4.17: Comparación de las concentraciones de Rh en los distintos órganos ensayados, 2 horas 
después de la administración, y para las tras formulaciones de NPs estudiadas. 

En el tejido hepático se pudo observar que durante la primera hora las 

formulaciones que se encuentran presentes en mayor medida son la 

formulación NPpheA-Rh y la formulación NPpheB-Rh, especialmente la 

primera. Estas diferencias se incrementaron a las 2 horas, aunque el 

aumento es ligeramente menor en el caso de la formulación NP-Rh. 

La comparativa de los valores de Rh en bazo no deja lugar a dudas. A 

ambos tiempos, los valores correspondientes a la formulación NPpheA-Rh 

son muy superiores a los encontradas con las otras formulaciones y llegan 

a ser 10 veces mayores a los de NP-Rh, durante la primera hora (tabla 4.12).  

En pulmón se obtienen valores muy similares entre las formulaciones 

durante la primera hora, que se incrementan exponencialmente para 

NPpheA-Rh al tiempo de sacrificio de 2 horas, mientras que no se observan 

grandes diferencias entre los otros dos grupos de NPs. 

Por último, las cantidades de Rh en riñón son muy bajas para todas las 

formulaciones, en comparación con las cantidades encontradas en otros 

órganos. Aun así, durante la primera hora, se observa que la formulación 

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

Higado Riñon Bazo Pulmón

R
h

 (
µ

g/
g 

O
rg

)

NP NPpheA NPpheB



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

133 

NP-Rh presenta los valores más bajos, mientras que las dos formulaciones 

funcionalizadas tienen niveles más elevados y similares entre sí. El cambio 

en el comportamiento de las NPs en este órgano se observa a las 2 horas, 

tiempo al cual las cantidades correspondientes a la formulación NP-Rh son 

del doble de las existentes a la hora, mientras que con la formulación 

NPpheA-Rh disminuyen casi hasta la mitad de los valores observados 

previamente (figura 4.17). Con la formulación NPpheB-Rh, sin embargo, se 

mantuvieron unos niveles constantes. 

Las diferencias de concentración de Rh encontradas en los distintos 

órganos nos indican que la presencia de fenilalanina modifica la 

biodistribución de las NPs.  Además, la presencia de NPpheA-Rh es 

predominante en casi todos los órganos, con la excepción del riñón. Este 

hecho se podría explicar si tenemos en cuenta la existencia de células 

fagocíticas en los tejidos. Algunos nanosistemas tienen tendencia a dirigirse 

a órganos para ser captados por células fagocíticas; especialmente por las 

células de Kupffer del hígado, por macrófagos del bazo y macrófagos 

alveolares del pulmón. Los resultados de biodistribución obtenidos parecen 

indicar que el proceso de funcionalización con el péptido phe-phe, 

especialmente cuando se produce en superficie (formulación NPpheA), 

podría estimular el fenómeno de fagocitosis y la migración de las NPs hacia 

estos órganos. Este hecho explicaría la mayor presencia de estas 

formulaciones en órganos fagocíticamente activos, mientras que la 

formulación NP-Rh podría permanecer en circulación sanguínea. Este no es 

un fenómeno único para en estas formulaciones. Así, Rafiei y Haddadi, 

(Rafiei y Haddadi; 2017) compararon la biodistribución de NPs de PLGA y 

NPs de PLGA-PEG y observaron una mayor presencia de las segundas en 

circulación sanguínea, aunque considerablemente menor en la mayor parte 



Mario Alonso 

134 

de los órganos estudiados. Por otra parte, estudios realizados por Semete 

et al. (Semete, et al., 2010) con NPs de PLGA cargadas con rodamina 

mostraron una elevada presencia de este marcador en suero sanguíneo y 

corazón, durante todo el ensayo. 

En nuestro caso, al tratarse de formulaciones funcionalizadas con el 

mismo péptido, cabría esperar que tanto NPpheB como NPpheA 

presentasen perfiles de biodistribución similares. Sin embargo, NPpheB 

exhibe un perfil híbrido entre las formulaciones NP-Rh y NPpheA-Rh. Este 

hecho, unido al marcado incremento de la eficacia de encapsulación (tabla 

4.6), podría avalar la teoría de una interacción entre los grupos aromáticos 

de la Rh y el péptido phe-phe, que diese lugar a un complejo más lipófilo, 

con un menor porcentaje de fenilalanina hacia el exterior. Por tanto, al 

presentar una menor cantidad del dipéptido en la superficie de las NPs, 

podría traducirse en una menor afinidad de esta formulación por los tejidos, 

ya que ésta permanecería más tiempo en circulación que la formulación 

NPpheA.   

4.2.2. Evaluación del paso de las NPs a través de la barrera 

hematoencefálica 

La mayoría de los autores indican que tras la administración por vía 

intravenosa de NPs, el paso mayoritario de las mismas a través de la BHE se 

produce a tiempos cortos (Marcianes, et al. 2017), por este motivo en 

nuestro estudio hemos seleccionado tiempos más largos para analizar la 

biodistribución de las NPs y su permanencia en SNC. Para evaluar las 

cantidades de Rh en cerebro de las tres formulaciones, se ha usado el 

mismo método de cuantificación previamente descrito (sección 3.3.1). Los 

resultados de concentración de Rh obtenidos quedan recogidos en la tabla 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

135 

4.13. Para la comparación de los resultados fue necesario normalizar las 

dosis de NPs administradas en función de la carga de Rh.  

Formulación 

Niveles medios de Rh (ng/g cerebro) ± DE 

t= 1 h t=2 h 

Control 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 

NP-Rh 2,23 ± 0,84 2,12 ± 0,01 

NPpheA-Rh 8,76 ± 0,76 3,90 ± 0,76 

NPpheB-Rh 1,88 ± 0,62 1,90 ± 0,10 

Tabla 4.13: Niveles medios (±DE) de Rh obtenidos en cerebro para las formulaciones de NPs 

ensayadas. 

En la figura 4.18 se representan los niveles Rh obtenidos en cerebro 

tras la administración de las tres formulaciones y a los dos tiempos 

ensayados (1 y 2 horas). 

  



Mario Alonso 

136 

 

Figura 4.18: Representación gráfica de los niveles de Rh encontrados en cerebro (µg/g de cerebro) para 
cada una de las formulaciones de NPs a tiempo 1 hora (oscuro) y 2 horas (claro). 

Como se puede observar en la tabla 4.13 y en la figura 4.18, la 

formulación NPpheA-Rh consigue alcanzar niveles de Rh en cerebro 

claramente superiores a los obtenidos con las otras dos formulaciones, 

especialmente en la primera hora. No obstante, mientras que las 

formulaciones NP-Rh y NPpheB-Rh mantienen unos niveles prácticamente 

constantes a las 2 horas, las concentraciones de Rh obtenidas a partir de la 

formulación NPpheA-Rh disminuyeron en más de un 50% a ese mismo 

tiempo.  

Es necesario indicar que las cantidades de Rh que se encuentran en 

cerebro son muy bajas, y por tanto el método de cuantificación podría no 

ser lo suficientemente sensible como para detectar las variaciones 

asociadas a errores residuales. Por este motivo, el hemisferio cerebral de 

los animales que no fue empleado para la cuantificación de la Rh por 

fluorimetría, fue seccionado con un micrótomo en más de 8 cortes. Estas 

muestras se procesan y son observadas en un microscopio de fluorescencia, 

para la cuantificación de la intensidad de fluorescencia. Las figuras 4.19 a 

-2,00

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

control NP-Rh NPPA-Rh NPPB-Rh

R
h

 (
µ

g/
g 

O
rg

)

1h 2h



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

137 

4.26 muestran imágenes de los cortes de cerebro de hipocampo obtenidas 

con el microscopio de fluorescencia.  

 

Figura 4.19: Microfotografía del hipocampo, correspondiente al grupo control y a tiempo 1 hora. Células 
marcadas con DAPI (azul), células con fluorescencia (rojo).  

 

 

Figura 4.20: Microfotografía del hipocampo, correspondiente al grupo control y a tiempo 2 horas. 
Células marcadas con DAPI (azul), células con fluorescencia (rojo). 

 



Mario Alonso 

138 

 

Figura 4.21: Microfotografía de hipocampo correspondiente al grupo tratado con la formulación NP-Rh 
y a tiempo 1 hora. Células marcadas con DAPI (azul), células con fluorescencia debida a Rh (rojo). 

 

 

Figura 4.22: Microfotografía de hipocampo correspondiente al grupo tratado con la formulación NP-
Rh y a tiempo 2 horas. Células marcadas con DAPI (azul), células con fluorescencia debida a Rh (rojo). 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

139 

 

Figura 4.23: Microfotografía de hipocampo correspondiente al grupo tratado con la formulación 
NPpheA-Rh y a tiempo 1 hora. Células marcadas con DAPI (azul), células con fluorescencia debida a Rh 
(rojo). 

 

Figura 4.24: Microfotografía de hipocampo correspondiente al grupo tratado con la formulación 
NPpheA-Rh y a tiempo 2 horas. Células marcadas con DAPI (azul), células con fluorescencia debida a Rh 
(rojo). 



Mario Alonso 

140 

 

Figura 4.25: Microfotografía de hipocampo correspondiente al grupo tratado con la formulación 
NPpheB-Rh y a tiempo 1 hora. Células marcadas con DAPI (azul), células con fluorescencia debida a Rh 
(rojo).  

 

Figura 4.26: Microfotografía de hipocampo correspondiente al grupo tratado con la formulación 
NPpheB-Rh y a tiempo 2 horas. Células marcadas con DAPI (azul), células con fluorescencia debida a Rh 
(rojo).   

  



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

141 

El DAPI se encuentra unido al ADN de las células y proporciona una 

fluorescencia de color azul, que nos permite diferenciar las células del 

hipocampo. Por otra parte, en las microfotografías se puede observar la 

fluorescencia debida a la Rh, que aparece en color rojo. Al emplear el 

programa ImageJ se puede cuantificar la fluorescencia obtenida en cada 

caso. La tabla 4.14 y la figura 4.27 muestran los datos de intensidad de 

fluorescencia correspondientes a las tres formulaciones ensayadas. 

Formulación 

Intensidad de fluorescencia media ± DE en cerebro 

t= 1 h t=2 h 

Control 0,00 ± 107,04 0 ± 17,04 

NP-Rh 1166,98 ± 204,15 933,87 ± 124,77 

NPpheA-Rh 2810,00 ± 314,85 1598,45 ± 133,32 

NPpheB-Rh 1402,40 ± 104,23 1818,77 ± 108,82 

Tabla 4.14: Cuantificación de intensidad de la fluorescencia procedente de Rh en cerebro a 1 hora y 2 

horas después de la administración de las formulaciones de NPs.  



Mario Alonso 

142 

 

Figura 4.27: Intensidad de fluorescencia de Rh obtenida en cerebro 1 hora y 2 horas después de la 

administración de las formulaciones de NPs.  

Como se puede observar en la figura 4.27, los valores obtenidos a la 

hora corroboran los resultados obtenidos al realizar la cuantificación de Rh 

en cerebro mediante fluorimetría. Este hecho se mantiene también a las 2 

horas.   

Al comparar el comportamiento de la formulación NP-Rh a los dos 

tiempos estudiados se observa que la formulación NP-Rh reduce su 

presencia en cerebro a las 2 horas, aunque las diferencias son significativas 

con respecto al tiempo 1 hora. En este sentido, en otros estudios realizados 

por nuestro equipo, tampoco se observaron diferencias en la intensidad de 

fluorescencia correspondiente a NPs poliméricas entre los tiempos 30 min 

y 1 hora (Marcianes, et al., 2017).  

Los resultados obtenidos por la formulación NPpheA-Rh (NPs 

funcionalizadas en superficie con el péptido phe-phe), ponen de manifiesto 

un incremento en la intensidad de la fluorescencia en la primera hora, 

seguida de una marcada reducción, de casi el 50%, de las cantidades de Rh 

-500,00

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

3500,00

G1 NP-Rh NPheA-Rh NPheB-Rh

In
te

n
si

d
ad

 d
e 

fl
u

o
re

sc
en

ci
a 

1h 2h



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

143 

a las 2 horas. Estos resultados concuerdan con los obtenidos mediante 

análisis por fluorimetría para esta formulación.   

Por último, la formulación NPpheB-Rh, fue la única con la que se ha 

conseguido un aumento significativo en los valores de intensidad de 

fluorescencia a las 2 horas en comparación con el tiempo 1 hora. Sin 

embargo, esta diferencia apenas se puede apreciar en el análisis de 

cuantificación de Rh realizado por fluorimetría, aunque podría deberse a 

que las cantidades en cerebro son muy pequeñas y el método, como ya se 

ha comentado, puede no ser lo suficientemente sensible como para 

cuantificar las diferencias.    

Por otro lado, es necesario indicar que, cuando los cortes cerebrales 

son observados por el microscopio de fluorescencia, no se realiza ninguna 

normalización relacionada con la carga de Rh en cada formulación, ya que 

se trabaja directamente con los cortes de cerebro. En estas circunstancias, 

la formulación NP-Rh, que tiene una carga intermedia, es de las tres 

formulaciones de NPs la que presenta la menor intensidad de fluorescencia 

a ambos tiempos (1 y 2 horas).   

Sin embargo, la formulación NPpheA-Rh, que tiene una carga de Rh 

muy inferior a la formulación NP-Rh y, siete veces menor que la de  

NPpheB-Rh, es la que presenta en la primera hora los valores más elevados 

de intensidad de fluorescencia. Sin embargo, al cabo de 2 horas, los valores 

de intensidad de fluorescencia se reducen de forma significativa. Es sabido 

que la rodamina es sustrato de la P-gp, que la elimina del tejido cerebral, 

por tanto, cabe esperar que tras ser liberada de las NPs que se encuentran 

en el cerebro, sea expulsada por dicha bomba de e-flujo. Por otro lado, si 

además tenemos en cuenta la baja encapsulación de esta formulación, a las 



Mario Alonso 

144 

2 horas de la administración, sería posible encontrar niveles muy bajos de 

Rh en cerebro, sin que ello implique que las NPs han sido eliminadas. En 

este sentido, hay que tener en cuenta que la fenilalanina tiene la 

característica de ser un aminoácido con un gradiente favorable a la entrada 

en tejido cerebral, pero no a la salida, hecho que pudiera favorecer la 

permanencia de las NPs en dicho órgano (Puris, et al., 2020). 

Por último, la formulación NPpheB-Rh presenta una intensidad de 

fluorescencia en el hipocampo ligeramente superior a la formulación NP-Rh 

durante la primera hora, aunque hay que resaltar que la carga de rodamina 

de esta formulación es prácticamente el doble que la que hay en la 

formulación sin funcionalizar. Sin embargo, a las 2 horas, este valor se 

incrementa de forma significativa, siendo la única formulación que presenta 

este aumento significativo en el valor de intensidad fluorescencia.  

Uno de los mayores problemas asociados al paso de NPs al SNC es la 

actuación de la bomba de e-flujo, que tiende a expulsar las NPs hacia el 

exterior. Por este motivo, es especialmente interesante que se produzca un 

incremento en la fluorescencia a tiempos más largos, ya que podría 

indicarnos; o bien que continúa produciéndose el paso de las NPs a través 

de la BHE o bien, que las Nps continúan en el interior liberando Rh. En este 

sentido, algunos autores indican que el acceso a tejido cerebral mediante 

transcitosis mediada por receptores, mecanismo que hemos intentado 

favorecer mediante la incorporación del péptido phe-phe a las NPs, puede 

resultar ser más lenta que la difusión pasiva (Cayero-Otero, et al., 2019). 

Esto podría explicar el comportamiento de la formulación NPpheB-Rh, con 

la que se logran mejores resultados a las 2 horas de la administración, 

especialmente si tenemos en cuenta que a tiempos cortos (30 minutos), es 



NPs de PLGA funcionalizadas con phe-phe 

145 

cuando se produce el mayor paso a través de BHE, y que la Rh es eliminada 

del cerebro por la P-gp, lo que dificultaría su presencia en cerebro a tiempos 

largos, si no es por la que se libera a partir de las NPs.  

4.2.3. Integridad del tejido cerebral 

Para observar si la presencia de las NPs puede dañar el tejido cerebral, 

se ha realizado una tinción de NISSL sobre los cortes realizados. La figura 

4.28 muestra las imágenes de hipocampo obtenidas por microscopía óptica.  

 

Figura 4.28: Microfotografías del área del hipocampo. A: grupo control tiempo 1 hora. B: grupo control 
tiempo 2 horas. C: Grupo tratado con la formulación NP-Rh, tiempo 1 hora. D: Grupo tratado con la 
formulación NP-Rh, tiempo 2 horas. E: Grupo tratado con la formulación NPpheA-Rh, tiempo1 hora. F: 
Grupo tratado con la formulación NPpheA-Rh, tiempo 2 horas. G: Grupo tratado con la formulación 
NPpheB-Rh, tiempo 1 hora. H: Grupo tratado con la formulación NPpheB-Rh, tiempo 2 horas. 



Mario Alonso 

146 

Cuando las NPs se administran por vía intravenosa, pueden 

interaccionar con proteínas y otras sustancias presentes en sangre y tejidos 

y dar lugar a una estructura cuya composición y espesor varía en función de 

las propiedades químicas superficiales del nanosistema  

(Casals, et al., 2010; Monopoli, et al., 2012). Varios estudios sugieren la 

implicación de estos sistemas en la producción de especies reactivas de 

oxígeno y en el desencadenamiento de procesos inflamatorios, los cuales 

afectan a la BHE y a la microglía presentes en parénquima cerebral (Sharma 

y Sharma, 2012). 

En la figura 30 se puede observar un corte de hipocampo de un animal 

procedente de cada grupo experimental. Los resultados obtenidos tras la 

tinción de NISSL nos permiten observar que no existe daño estructural 

ocasionado por la administración de las formulaciones de Nps. 

A la vista de los resultados obtenidos podemos indicar que, ambas 

formulaciones funcionalizadas con fenilalanina pueden ser adecuadas para 

favorecer el paso de las NPs a través de la BHE. Los resultados parecen 

señalar que la formulación NPpheA-Rh consigue atravesar la BHE más 

rápidamente y en mayor proporción. Por otro lado, con la formulación 

NPpheB-Rh se obtiene una mayor intensidad de fluorescencia a las 2 horas, 

que podría deberse; o bien a un paso más lento a través de la BHE o bien a 

la presencia de las NPs en cerebro, que se mantiene al menos durante 2 

horas.  

 

 



  

147 

 

V-NANOPARTÍCULAS DE MORIN HIDRATO 

  



Mario Alonso 

148 

  



NPs de morin hidrato 

149 

1. INTRODUCCIÓN 

La Enfermedad de Alzheimer es una de las principales causas de 

demencia en el mundo. Actualmente el tratamiento de esta patología se 

basa en el uso de fármacos que actúan fundamentalmente sobre los 

síntomas, pero no curan la enfermedad. La posibilidad de emplear algunos 

agentes con actividad terapéutica para esta patología se ve dificultada por 

la acción de la BHE, que impide su acceso al SNC.  

El MH presenta distintas acciones que resultan prometedoras para el 

tratamiento de esta enfermedad: capacidad para inhibir la 

hiperfosforilación de la proteína Tau (Gong, et al., 2011), capacidad de 

solubilizar los agregados Aβ amiloide (Lemkul y Bevan, 2010) y capacidad 

para reducir el estrés oxidativo (Jayaraj, et al. 2007). No obstante, su 

capacidad de paso a través de la BHE es prácticamente nulo, especialmente 

cuando se administra por vía oral. La biodisponibilidad oral del MH es, 

además, extremadamente baja, de un 0,45% debido a una baja absorción 

intestinal y un elevado efecto de primer paso hepático (Zhang, et al., 2015). 

Al ser administrado por vía parenteral, el MH sufre un rápido metabolismo, 

lo que se traduce en una semivida plasmática de tan solo 30 min. (Li, et al. 

2019). Numerosos autores han llevado a cabo ensayos in vivo con el 

flavonoide y han llegado a la conclusión que el MH no es capaz de alcanzar 

el tejido cerebral, salvo si se administran altas dosis del mismo (Sight, et al., 

2018). En este sentido, Waddad et al. (Waddad, et al., 2013) en un estudio 

realizado en ratas Wistar no pudieron detectar concentraciones de morin 

en cerebro. Sin embargo, estudios in vitro llevados a cabo por algunos 

autores con modelos celulares de BHE, indicaron que el flavonoide si podría 



Mario Alonso 

150 

llegar a atravesar la BHE (Youdim, et al., 2004). Por tanto, si bien no se 

puede descartar totalmente que no sea capaz de atravesar la BHE, el 

porcentaje en que se produciría este paso resultaría terapéuticamente 

insuficiente (Singht, et al., 2018).  

Por todo ello, la encapsulación del morin en nanopartículas elaboradas 

con PLGA, polímero biocompatible y biodegradable, puede facilitar su 

acceso al SNC. Por otra parte, la unión de fenilalanina, con una elevada 

afinidad por los transportadores de aminoácidos largos (LAT-1), podrá 

ayudar a su transporte a través de la BHE.   

2. OBJETIVO 

El objetivo de este trabajo es desarrollar y caracterizar nanopartículas 

de PLGA cargadas con morin hidrato y funcionalizadas con un dipéptido de 

fenilalanina, para favorecer su acceso al SNC, y poder ser empleadas en el 

tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. 

Objetivos parciales: 

▪ Desarrollar y caracterizar nanopartículas elaboradas con PLGA y 

cargadas con morin hidrato. 

▪ Elaborar y caracterizar nanopartículas de PLGA cargadas con 

morin hidrato y, posteriormente funcionalizadas en superficie con 

el dipéptido fenilalanina-fenilalanina. 

▪ Elaborar y caracterizar nanopartículas elaboradas con PLGA-

fenilalanina-fenilalanina/PLGA y cargadas con morin hidrato. 



NPs de morin hidrato 

151 

3. MATERIAL Y MÉTODOS 

3.1. Estudios previos 

3.1.1. Elaboración de NPs por el método de nanoprecipitación 

El protocolo desarrollado para la elaboración de nanopartículas 

mediante el método de nanoprecipitación consiste en disolver 50 mg de 

polímero PLGA Resomer RG 502 (Evonik®, Alemania) en 3,9 mL de acetona 

(Fisher Scientific®, España). A esta solución se le añaden 0,1 mL de una 

solución de morin hidrato (Sigma Aldrich®, España) en etanol (Fisher 

Scientific®, España), previamente preparada a una concentración de 10 

mg/mL. Todo ello se mezcla por agitación en vórtex durante 1 min. Esta 

solución se adiciona con una pipeta pasteur, gota a gota, sobre 12 mL de 

una solución acuosa de alcohol polivinílico (PVA) al 0,5% (Acros Organic®, 

EE.UU.); manteniendo una agitación magnética moderada. La suspensión 

resultante se mantiene en agitación a la misma velocidad durante 30 

minutos. Para eliminar la acetona presente en el medio, la suspensión se 

lleva a un rotavapor (IKA Laborteehnik, Alemania; Bomba Buchi Copp., 

Suiza) durante 2,5 horas, a temperatura ambiente y a una presión de 70 

mbar.  

Una vez eliminado el disolvente orgánico, la suspensión de NPs se 

centrifuga durante 30 minutos a 13.000 rpm (Sorvall ST8R Thermo Fisher®, 

España), se lava hasta 3 veces con agua destilada, repitiendo idéntico 

protocolo de centrifugado. Finalmente, se incorpora 1 mL de una solución 

al 1,5% de sacarosa como crioprotector (Panreac Química S.A, España y se 

liofiliza durante 24 horas (Lyo Quest®, Azbil Telstar® S.A., España)  



Mario Alonso 

152 

Siguiendo el mismo método, también se elaboraron formulaciones 

que incorporan en la fase orgánica 10 µl de un excipiente, labrafil® M 

1944CS (Gattefossé, Francia), con el fin de modificar las características de 

cesión de las nanopartículas.  

La figura 5.1 muestra esquemáticamente el proceso de elaboración de 

las NPs mediante este método de nanoprecipitación. 

 

Figura 5.5: Esquema de elaboración de las NPs de PLGA y morin hidrato por nanoprecipitación. 

  



NPs de morin hidrato 

153 

3.1.2. Elaboración de NPs por el método de extracción-evaporación 

del solvente 

Para la elaboración de NPs por el método de extracción-evaporación 

del solvente se parte de 50 mg de PLGA 502 que se disuelven en 2 mL de 

diclorometano (DCM) (Fisher Scientific®, España) y a esta solución se le 

adiciona 0,1 mL de MH disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) (Fisher 

Scientific®, España) a la concentración deseada, asegurando una mezcla 

homogénea mediante agitación en vórtex. La solución resultante se 

adiciona sobre 6 mL de una disolución acuosa de PVA al 1,5%. La mezcla 

resultante de fases orgánica y acuosa se somete a agitación en sonicador 

(Accumet® AE150, Fisher Scientific, España) en pulsos de 10/15 segundos 

on/off durante 10 minutos, manteniendo el vial en un baño de hielo para 

prevenir el aumento de la temperatura. Pasado ese tiempo, la dispersión 

obtenida se deja en agitación magnética moderada durante 2,5 horas, para 

permitir la evaporación del disolvente orgánico y la formación de las NPs. 

Una vez eliminado el disolvente orgánico se sigue idéntico protocolo 

de recuperación, lavado y liofilización que en el caso previamente descrito 

para el método de nanoprecipitación. 

La formulación (NPMH-4) se elabora medinate el mismo método, pero 

con la incorporación en la fase orgánica 10 µL de labrafac® Lipophile WL 

1349 (Gatefossé, Francia), con el fin de modificar las características de 

cesión del MH a partir de las nanopartículas.  

  



Mario Alonso 

154 

La figura 5.2 refleja un esquema del proceso de elaboración mediante este 

método. 

 

Figura 5.6: Esquema de elaboración de NPs de PLGA y morin hidrato por extracción-evaporación del 

solvente. 

  



NPs de morin hidrato 

155 

En la tabla 5.1 se muestran las diferentes formulaciones de NPs 

cargadas con MH desarrolladas y se indica en cada caso el método de 

elaboración empleado. 

Formulación 
Método de 
elaboración 

PLGA MH Labrafil Labrafac 

NPMH-1 Nanoprecipitación 50 mg 1 mg - - 

NPMH-2 Nanoprecipitación 50 mg 1 mg 10 µL - 

NPMH-3 
Extracción-
evaporación del 
solvente 

50 mg 1 mg - - 

NPMH-4 
Extracción-
evaporación del 
solvente 

50 mg 1 mg - 10 µL 

NPMH-5 
Extracción-
evaporación del 
solvente 

50 mg 5 mg - - 

NPMH-6 
Extracción-
evaporación del 
solvente 

50 mg 10 mg - - 

Tabla 5.1: Formulaciones de NPs de morin hidrato elaboradas en los estudios previos. 

Se han preparado también NPs no cargadas con MH. Para los estudios 

previos, la caracterización de las formulaciones se realiza atendiendo, 

exclusivamente, al tamaño de partícula, la eficacia de encapsulación (EE%) 

y la cesión in vitro (efecto burst) inicial.  

  



Mario Alonso 

156 

3.2. Elaboración de nanopartículas funcionalizadas 

con fenilalanina 

3.2.1. Nanopatículas de PLGA cargadas con morin hidrato 

Las NPs seleccionadas (NPMH-5), fueron elaboradas por medio del 

método de extracción-evaporación del solvente descrito anteriormente. 

Para la elaboración se emplean 50 mg de PLGA 502 y 5 mg de MH. 

3.2.2. Nanopartículas de PLGA funcionalizadas en superficie con 

fenilalanina (NPpheA-MH) 

Para la unión del dipéptido fenilalanina-fenilalanina (phe-phe) a la 

superficie de las NPs seleccionadas (NPMH-5), ha sido necesario activar los 

grupos carboxilo del PLGA. Por este motivo, las NPs previamente 

elaboradas y cargadas con MH, pero sin liofilizar, se mantuvieron en 1 mL 

de H2O destilada durante 24 horas a una temperatura de 4ºC. El proceso de 

funcionalización se realizó adaptando el protocolo desarrollado por 

Constantino et al. (Constantino, et al., 2005) descrito en el capítulo anterior 

de esta memoria.  

3.2.3. Nanopartículas elaboradas con PLGA-phe-phe (NPpheB-MH) 

Para la elaboración de esta formulación (NPpheB-MH), se emplea 

PLGA 502 al que se une por un enlace covalente peptídico el dipéptido (phe-

phe) hasta obtener un polímero: PLGA-phe-phe.  El protocolo para la unión 

del péptido de fenilalanina al PLGA queda recogido en el capítulo anterior 

de esta memoria.  



NPs de morin hidrato 

157 

Para la elaboración de esta formulación de NPs (NPpheB-MH) se 

emplea una mezcla de 50 mg de PLGA-phe-phe y PLGA 502 en una 

proporción 40:60. Las NPs se elaboran por el método de extracción-

evaporación del solvente que se ha explicado anteriormente, empleando 5 

mg de MH.  

Se han preparado también NPs no cargadas con MH. 

La tabla 5.4 muera las diferentes formulaciones de nanopartículas de morin 

hidrato elaboradas. 

Formulación PLGA 502  PLGA -PhePhe Phe-Phe MH 

NPMH-5 50 mg - - 5 mg 

NPpheA-MH 50 mg - 2 mg 5 mg 

NPpheB-MH 30 mg 20 mg - 5 mg 

Tabla 5.4: Composición de las formulaciones NPMH-5, NPpheA-MH y NPpheB-MH.  

3.3. Caracterización de las formulaciones 

3.3.1. Determinación del tamaño de partícula 

Con el objetivo de determinar el tamaño de partícula medio y la 

distribución de tamaños de todas las formulaciones elaboradas, antes y 

después de la liofilización, se ha empleado la técnica de difracción de rayos 

láser, utilizando para ello un equipo Zetatrac® Ultra (Microtac, Inc., EE.UU.). 

Se determina el diámetro medio de las NPs como DV y la distribución de 

tamaños mediante curvas distributivas de volumen. 



Mario Alonso 

158 

Para calcular el span y el índice de polidispersión (IP) se emplean las 

ecuaciones y los criterios explicados en el capítulo anterior de esta 

memoria. 

3.3.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM) 

El análisis morfológico de las NPs se ha realizado por SEM (Jeol, JEM-

7600F, Japón). Estos estudios se han llevado a cabo con las formulaciones 

NPMH-5, NPpheA-MH y NPpheB-MH. Este estudio permite determinar la 

forma, homogeneidad de tamaño, estado de agregación de las partículas y 

la presencia de alteraciones en su superficie, aspectos que pueden afectar 

al perfil de liberación del MH. 

Para la realización del análisis, las muestras se recubren con una fina 

capa de oro coloidal aplicada en un evaporador de vacío catódico antes de 

la observación por SEM a 20 KV. 

3.3.3. Propiedades superficiales 

La determinación del potencial Z de las distintas formulaciones de NPS 

se ha realizado mediante la técnica de dispersión de luz, se utiliza para ello 

un equipo Zetasizer Nano S® (Malvern Instrument’s, UK), y empleando una 

célula capilar Capillary cell enhances® (Malvern Instrument’s, UK) para la 

lectura de las muestras. Para el análisis, se prepara una suspensión con las 

formulaciones de NPs liofilizadas, en agua destilada, a una concentración 

de 100 µg/mL. Las muestras se agitan en vórtex a velocidad moderada 

durante 1 minuto, para asegurar la dispersión de las NPs. 



NPs de morin hidrato 

159 

El potencial Z se ha determinado en las formulaciones NPMH-5, 

NPpheA-MH y NPpheB-MH, comparado los resultados con las mismas 

formulaciones no cargadas con el principio activo MH.  

3.3.4. Determinación de la eficacia de encapsulación y de la cantidad 

de morin encapsulado 

Para la determinación del contenido en MH de las NPs se pesan 10 mg 

de cada formulación y se disuelven en 1 mL de DCM bajo agitación en 

vórtex. A continuación, se adicionan 4 mL de metanol (MeOH) (Fisher 

Scientific, España). Al ser el PLGA insoluble en MeOH, este precipita, pero 

como el MH es muy soluble en el alcohol, se solubiliza. Seguidamente, se 

centrifugan a 13.000 rpm durante 5 minutos, para separar el polímero del 

sobrenadante. Este proceso se repite 3 veces, para así asegurar la máxima 

extracción del flavonoide. A continuación, se determina el contenido en MH 

por cromatografía líquida de alta resolución, de acuerdo al procedimiento 

que se describe en el capítulo de métodos analíticos de esta memoria. La 

cuantificación del contenido en MH se ha realizado por triplicado para cada 

formulación. 

La eficacia de encapsulación (EE%) se expresa como porcentaje de 

principio activo que ha sido retenido en el interior de las NPs, respecto al 

total empleado para su elaboración. Para ello, se utiliza la siguiente 

ecuación: 

𝐸𝐸(%) =
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝. 𝑎.  𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒

𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝. 𝑎.  𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜
 × 100 

La cantidad de principio activo encapsulado se expresa como 

microgramos de morin en 100 mg de NPs.  



Mario Alonso 

160 

3.3.5. Ensayo de cesión in vitro 

Para la realización de los ensayos de cesión in vitro de MH, se pesan 

20 mg de la formulación de NPs, que se introducen en tubos eppendorff y 

se suspenden en 4 mL de una solución PBS a pH 7,4. Este volumen permite 

mantener condiciones “sink” durante todo el ensayo de cesión. Las 

muestras se mantienen en un baño termostatizado Memmert WNB 45 

(Memmert®, Alemania) a 37 ± 0,1ºC con una agitación constante de 100 

rpm. 

La toma de muestras se realiza a los siguientes tiempos: 1, 6, 24, 48, 

72, 96, 168, 192 y 216 horas. Previo a la toma de muestras, y con el fin de 

evitar arrastrar NPs, se centrifugan las mismas a 5.000 rpm durante 5 

minutos empleando, para retirar el medio, una aguja de 30 G acoplada a 

una jeringa de 5 mL. El volumen extraído se repone nuevamente con una 

solución de tampón PBS recién preparada. 

La muestra extraída se filtra a través de filtros PVDF (fluoruro de 

polivinildeno) de 0,45 µm (Teknokroma Analítica, SA, España) y la 

cuantificación de MH se realiza mediante espectrofotometría empleando el 

método descrito en el capítulo de técnicas analíticas de esta memoria. 

Todos los ensayos de cesión in vitro del MH a partir de las NPs se han 

realizado por triplicado. 

  



NPs de morin hidrato 

161 

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

4.1. Estudios previos 

La tabla 5.5 recoge los resultados de tamaño medio de partícula, índice de 

polidispersión (IP) y span de las formulaciones de NPs desarrolladas en los 

estudios previos.  

Formulación Tamaño medio ± DE (nm) IP span 

NPMH-1 178,8±10,50 0,26 0,78 

NPMH-2 249,8±3,60 0,34 0,86 

NPMH-3 187,7±15,16 0,29 0,83 

NPMH-4 212,9± 10,5 0,46 0,77 

NPMHi-5 188,6±10,7 0,32 0,90 

NPMH-6 200±7,32 0,43 0,94 

Tabla.5.5: Resultados de tamaño de partícula, índice de polidispersión (IP), y span de las 

formulaciones de NPs elaboradas en los estudios previos.  

  



Mario Alonso 

162 

La tabla 5.6 recoge los resultados de eficacia de encapsulación (EE), burst o 

cesión en la primera hora, y duración de la cesión de MH a partir de las 

formulaciones de NPs desarrolladas en los estudios previos. 

Formulación EE (%)±DE 

Cantidad media 
encapsulada ± 
DE (µg/100 mg 

NPs) 

Burst inicial 
(%) 

Duración de la 
cesión (h) 

NPMH-1 56,24±0,57 1071,24 ± 10,86 53,6 ± 3,25 144 

NPMH-2 71,82±2,81 1368,00 ± 51,92 43,68 ± 2,89 144 

NPMH-3 60,13±2,72 1145,33 ± 51,81 40,1 ± 1,11 192 

NPMH-4 57,57±1,38 1096,57 ± 26,28 73,42 ± 3,55 144 

NPMH-5 82,54±1,42 7860,95 ± 135,24 45,5± 1,84 216 

NPMH-6 62,16±0,36 11840,00 ± 68,57 57,8± 2,93 192 

Tabla 5.6: Resultados de eficacia de encapsulación (±DE), cantidad de MH encapsulado (±DE), burst 

inicial (cesión en la primera hora), y duración de la cesión de MH a partir de las formulaciones de NPs 

elaboradas en los estudios previos.  

Para la selección del método más adecuado, en primer lugar, se 

compararon los resultados obtenidos por las formulaciones base NPMH-1 y 

NPMH-3, elaboradas cada una por dos métodos distintos: 

nanoprecipitación y extracción-evaporación del solvente, respectivamente. 

Como podemos observar en las tablas 5 y 6, los resultados obtenidos por 

ambos métodos fueron bastante similares. Si bien el tamaño de partícula 

de NPMH-1 fue ligeramente inferior, las diferencias entre ambas 

formulaciones no fueron estadísticamente significativas. En lo referente a 

la EE y la cantidad de MH encapsulada, los valores obtenidos fueron, en 

todos los casos, relativamente bajos y se obtuvieron resultados ligeramente 

mejores con el método de extracción-evaporación del solvente que con el 



NPs de morin hidrato 

163 

de nanoprecipitación. Sin embargo, fue en los ensayos de cesión donde se 

observaron mayores diferencias entre ambos métodos de elaboración; así, 

la cesión inicial de MH a la hora (efecto burst) fue de más del 50% para la 

formulación de NPs preparadas por nanoprecipitación (NPMH-1) y del 40% 

en el caso de la formulación NPMH-3. El tiempo que permanecieron 

cediendo ambas formulaciones también supuso una diferencia, ya que a los 

7 días la velocidad de cesión era muy lenta, de manera que la cantidad 

cedida de MH no era cuantificable en el caso de la formulación NPMH-1.  

Para intentar reducir el burst inicial y aumentar la cantidad de MH 

encapsulada en las NPs obtenidas por nanoprecipitación, se procedió a 

incorpora a la fase orgánica una pequeña cantidad de labrafil®. Como se 

puede observar en la tabla 6, el burst inicial de la formulación así 

desarrollada (NPMH-2) fue ligeramente menor (43,68%), aunque el tiempo 

en que la formulación continuó liberando el MH fue el mismo (144 horas). 

No obstante, el tamaño de partícula obtenido en este caso se incrementó 

de forma significativa y alcanzaron un tamaño medio de 250 nm, tamaño 

excesivamente elevado para nuestros objetivos. 

A la luz de estos resultados, y teniendo en cuenta que el método de 

extracción-evaporación del solvente es más sencillo y rápido, se ha 

seleccionado este último para la elaboración de las NPs de MH y continuar 

con sus estudios y ensayos. 

En este mismo sentido y, para intentar mejorar la eficacia de 

encapsulación y el burst inicial de la formulación NPMH-3, se incorporó a la 

formulación otro tensioactivo biocompatible, labrafac®. Los resultados 

obtenidos mostraron que el compuesto no modifica significativamente la 



Mario Alonso 

164 

EE y sí incrementa ligeramente el tamaño de partícula, hasta los 212 nm. 

Sin embargo, el efecto burst aumenta de forma significativa, liberándose 

más del 70% del contenido de MH en la primera hora del ensayo de cesión 

in vitro. Esto puede ser debido a que el carácter más hidrófobo de este 

excipiente (labrafac®) favorece la liberación del MH al reducir su afinidad 

por la matriz polimérica.  

Para incrementar la cantidad de MH encapsulado, utilizando el 

método de extracción-evaporación del solvente, se procedió a aumentar la 

cantidad inicial del principio activo en la formulación, empleando para ello 

5 mg y 10 mg disueltos en DMSO (formulaciones NPMH-5 y NPMH-6). Los 

resultados demuestran que al añadir 5 mg de MH el tamaño medio de 

partícula no cambia de forma significativa respecto a las NPs elaboradas con 

1 mg. Sin embargo, al trabajar con 10 mg, los tamaños medios obtenidos 

son ligeramente superiores a 200 nm. Por otro lado, la formulación  

NPMH-5 presenta una mejor eficacia de encapsulación (82,54±1,4%) 

respecto a la NPMH-6 (62,16±0,36%), que fue elaborada con una cantidad 

inicial de activo de 10 mg. Se puede suponer que la capacidad de las NPs 

para encapsular MH por este método es limitada, esto resulta evidente al 

aumentar los porcentajes iniciales de activo utilizado. Sin embargo, cuando 

hemos empleado cantidades de principio activo de 1 mg (NPMH-3), en 

contra de lo que cabría esperar, la EE obtenida es muy baja. Este hecho 

podría estar relacionado con la solubilidad del morin en la fase acuosa, que 

solo se manifiesta a concentraciones bajas del flavonoide.  

  



NPs de morin hidrato 

165 

Por último, al comparar efecto burst inicial para ambas formulaciones, 

se observa un claro incremento para la formulación NPMH-6 (57,8 ± 2,93%). 

Hay que tener en cuenta que las NPs tienen que ser funcionalizadas en 

superficie con un dipéptido (phe-phe), y que durante este proceso se puede 

liberar principio activo, por ello, interesa seleccionar aquellas 

formulaciones que presenten una menor cesión inicial.  

Por todo lo indicado, teniendo en cuenta la disminución en la eficacia 

de encapsulación y el incremento en el burst de la formulación NPMH-6 en 

la primera hora del ensayo, se selecciona la formulación NPMH-5 como la 

más adecuada para los objetivos. 

4.2. Caracterización de las nanopartículas de morin 

hidrato 

Las formulaciones de NPs de morin hidrato NPMH-5 y NPpheA-MH 

funcionalizadas en superficie, y la NPpheB-MH, elaboradas con el polímero 

PLGA-phe-phe (40%) y PLGA (60%), se han caracterizado empleando 

diferentes técnicas.  

  



Mario Alonso 

166 

4.2.1. Estudios morfológicos y determinación del tamaño de partícula  

En la tabla 5.7 se recogen los resultados de tamaño medio de partícula, 

índice de polidispersión (IP) y span obtenidos.  

Formulación Tamaño medio±DE 
(nm) 

    IP span 

NPMH-5 188,60±16,70   0,32 0,90 

NPpheA-MH 196,40±3,81   0,24 0,66 

NPpheB-MH 189,10±8,27    0,33 0,94 

Tabla 5.7: Resultados de tamaño de partícula, índice de polidispersión (IP), y span de las formulaciones 

de NPs elaboradas. 

En la figura 5.3 se muestra la distribución del tamaño de partícula de 

nanopartículas correspondientes a las formulaciones NPMH-5, NPpheA-MH 

y NPpheB-MH. 

 

Figura 5.7: Distribución de tamaños partícula de un lote correspondiente a las formulaciones. A:  

NPMH-5. B: NPpheA-MH. C: NPpheB-MH. 



NPs de morin hidrato 

167 

El análisis del tamaño de partícula medio y la distribución de tamaños 

de las distintas formulaciones revelaron que en todos los casos se han 

obtenido poblaciones con una dispersión homogénea y un tamaño similar. 

La similitud entre los tamaños de los lotes NPMH-5 y NPpheA-MH es algo 

que se podría esperar, dado que no existe variación en el proceso de 

elaboración de estas nanopartículas y la diferencia entre unas y las otras 

reside únicamente en el proceso de funcionalización adicional sobre la 

superficie. Sin embargo, la formulación NPpheB-MH, que incorpora tanto 

PLGA previamente unido al dipéptido de fenilalanina (PLGA-phe-phe) como 

PLGA, tampoco presenta diferencias significativas en el tamaño y forma 

respecto de formulaciones anteriores, tal y como podemos observar en la 

tabla 5.7. Esto indica que la incorporación del péptido al polímero PLGA no 

modifica el tamaño de las NPs elaboradas en las mismas condiciones, 

mediante el método de extracción-evaporación del solvente. 

Las figuras 5.4, 5.5 y 5.6 muestran imágenes obtenidas por SEM de las 

nanopartículas correspondientes a las formulaciones NPMH-5, NPpheA-MH 

y NPpheB-MH. 

 

Figura 5.8: Imágenes de SEM correspondientes a la formulación NPMH-5: A. cargada con MH; B: blancas. 



Mario Alonso 

168 

 

Figura 5.9: Imágenes de SEM correspondientes a la formulación NPpheA: A. cargada con MH; B: blancas. 

 

Figura.5.10: Imágenes de SEM correspondientes a la formulación NPpheB: A. cargada con MH; B: 
blancas. 

En las figuras se observa que las tres formulaciones presentan 

superficies lisas y una distribución homogénea en el tamaño de las 

partículas, tal y como ha quedado demostrado en los análisis realizados 

mediante difracción de rayos láser. 

Las imágenes del SEM también evidenciaron que morfológicamente 

no existen diferencias en el tamaño de partícula en las tres formulaciones 

(cargadas con MH y no cargadas). 

  



NPs de morin hidrato 

169 

4.2.2. Potencial Zeta 

Los resultados del análisis de potencial zeta de las formulaciones 

elaboradas se recogen en la tabla 5.8.  

 
Potencial Z Nps MH ± DE  

(mV) 
Potencial Z Nps blancas ± DE 

(mV) 

NP -20,77 ± 0,45 -25,4 ± 1,38 

NPpheA -20,53 ± 0,40 -20,03 ± 0,21 

NPpheB -23,27 ± 0,86 -18,27 ± 2,15 

Tabla 5.8. Valores medios (±DE) de potencial zeta de las formulaciones elaboradas con MH y sin cargar 

(blancas).  

Como pudimos observar en las NPs cargadas con rodamina 

desarrolladas para los estudios de biodistribución, ambos procesos de 

funcionalización han supuesto una modificación de la carga superficial de 

las NPs y existe una pequeña tendencia a la neutralización de la misma. 

Todas las NPs que incorporan el dipéptido en su formulación dan lugar a 

una reducción en el potencial Z, que resulta más evidente en la formulación 

elaborada con PLGA-phe-phe.  

Al encapsular el flavonoide MH en las NPs se observan variaciones en 

el potencial Z de las tres formulaciones (NPMH-5, NPpheA-MH y NPpheB-

MH). En primer lugar, la formulación NPMH-5 presenta una disminución de 

la carga superficial (-20,77 ± 0,45mV) con respecto a las mismas partículas 

no cargadas (-25,4 ± 1,38 mV). Esto se puede deber a que parte del MH 

quede en la superficie de las NPs, no siendo internalizado en la matriz 

polimérica. La formulación NPpheA-MH no presenta diferencias 

significativas en el potencial Z al comparar las NPs blancas y las cargadas 



Mario Alonso 

170 

con MH. Este comportamiento se podría atribuir al largo tiempo de 

contacto de las NPs con medios acuosos durante el proceso de 

funcionalización, responsable de la pérdida del MH en las capas 

superficiales de la formulación. Sin embargo, la formulación NPpheB-MH, 

muestra un aumento de la carga negativa en la superficie de las NPs cuando 

se incorpora el Morin, probablemente debido a la elevada cantidad de 

morin encapsulada.  

4.2.3. Eficacia de encapsulación y cantidad de morin encapsulada 

La tabla 5.9 muestra los valores medios obtenidos de cantidad de MH 

encapsulado y de eficacia de encapsulación obtenidos para las distintas 

formulaciones. 

Formulación 
Cantidad media de MH 

encapsulado (µg/100 mg NPs)±DE 
EE (%) media ± DE 

NPMH-5 7.503,63 ± 88,05 82,54 ±1 ,42 

NPpheA-MH 3.710,60 ± 217,05 42,44 ± 2,65 

NPpheB-MH 9.023,83 ± 204,44 96,26 ± 3,16 

Tabla 5.9: Cantidad media de MH encapsulado (±DE) y eficacia de encapsulación media (EE) (±DE) en las 

formulaciones de NPs elaboradas. 

La eficacia de encapsulación media entre las formulaciones elaboradas 

resultó muy dispar. Si se toma la formulación NPMH-5 como referencia, que 

presenta una eficacia de encapsulación algo superior al 80%; se observa que 

la formulación NPpheB-MH presenta un valor bastante más elevado, 

cercano al 100%. Esta elevada eficacia de encapsulación se podría 

relacionar con la presencia de la fenilalanina en la formulación. 

Probablemente, la presencia de este dipéptido modifica las características 



NPs de morin hidrato 

171 

de la matriz polimérica y  aumenta la afinidad del morin hacia la misma. 

Este hecho se podría explicar debido a que los anillos aromáticos de la 

fenilalanina pueden establecer enlaces electrónicos tipo π con los anillos 

del flavonoide, hecho que también se manifiesta en el caso de la rodamina 

(como hemos podido ver en el capítulo anterior de esta memoria). El 

péptido phe-phe es bastante lipófilo, y si a eso se suma la presencia de los 

anillos del morin, se puede obtener una estructura altamente lipófila que 

se orientaría hacía el núcleo de las NPs, dejando en superficie las 

terminaciones carboxílicas del PLGA, mucho más hidrófilas. 

Por otra parte, la pérdida de MH a partir de la formulación NPpheA-

MH tras su funcionalización, reduce de forma significativa la EE a valores de 

alrededor el 42,44%. Esto es probablemente debido a que la unión de  

phe-phe a la superficie de las NPs requiere tiempos elevados de agitación 

en distintos medios (tampón MES y tampón PBS) y se produce la pérdida 

de, prácticamente, la mitad del flavonoide encapsulado. 

4.2.4. Ensayos de cesión 

Las tablas 5.10 a 5.12 y las figuras 5.7, 5.8 y 5.9 recogen y muestran los 

resultados del ensayo de cesión in vitro de MH a partir de las formulaciones 

de NPs (NPMH-5, NPpheA-MH y NPpheB-MH).  

  



Mario Alonso 

172 

Tiempo (h) 
Cantidad media cedida acumulada de 

MH (µg/100 mg NPs)(±DE) 
Porcentaje medio 

cedido acumulado (±DE) 

1 3189,43 ± 138,01 45,51 ± 1,84 

6 4317,37 ± 86,50 57,54 ± 1,15 

24 5035,33 ± 264,31 67,11 ± 3,52 

48 5251,24 ± 177,12 69,98 ± 2,36 

72 5425,29 ± 113,08 72,30 ± 1,51 

96 5636,57 ± 271,70 75,12 ± 3,62 

168 6314,52 ± 300,81 84,15 ± 4,01 

192 6682,19 ± 247,08 89,05 ± 3,29 

216 6890,69 ± 328,22 91,83 ± 4,37 

Tabla 5.10: Resultados de los ensayos de cesión in vitro realizados con la formulación NPMH-5. 

 

Figura 5 7: Porcentajes medios de MH cedidos (±DE) en los ensayos realizados con la formulación  

NPMH-5.   

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

C
am

ti
d

ad
 c

ed
id

a 
(%

)

Tiempo (h)



NPs de morin hidrato 

173 

Tiempo (h) 
Cantidad media cedida acumulada de 

MH (µg/100 mg NPs)(±DE) 

Porcentaje medio 
cedido acumulado 

(±DE) 

1 910,60 ± 24,67 23,85 ± 0,65 

6 997,20 ± 96,66 26,12 ± 2,53 

24 1435,47 ± 96,01 37,60 ± 2,51 

48 1804,36 ± 97,28 47,26 ± 2,55 

72 2156,60 ± 135,62 56,48 ± 3,55 

96 2256,40 ± 146,03 59,10 ± 3,82 

168 2965,95 ± 170,99 77,68 ± 4,48 

192 3198,32 ± 67,38 83,77 ± 1,76 

216 3326,34 ± 80,46 87,12 ± 2,11 

240 3364,27 ± 145,26 88,11 ± 3,80 

Tabla 5.11: Resultados de los ensayos de cesión in vitro realizados con la formulación NPpheA-MH. 

 

Figura 5.8: Porcentajes medios de MH cedidos (±DE) en los ensayos realizados con la formulación 

NPpheA-MH. 

  

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264

%
 c

ed
id

o

Tiempo (h)



Mario Alonso 

174 

Tiempo de 
muestreo (h) 

Cantidad media cedida acumulada 
de MH (µg/100 mg NPs)(±DE) 

Porcentaje medio 
cedido acumulado (±DE) 

1 4256,09 ± 279,43 47,17± 3,15 

6 5535,33 ± 437,56 61,34 ± 4,93 

24 6262,00 ± 151,99 69,39 ± 1,71 

48 6843,71 ± 261,58 75,84 ± 2,95 

72 7505,36 ± 227,54 83,17 ± 2,57 

96 8109,43 ± 158,64 89,87 ± 1,79 

168 8663,54 ± 224,34 96,01 ± 2,53 

192 8800,18 ± 173,22 97,52 ± 1,95 

216 8870,56 ± 201,98 98,30 ± 2,28 

Tabla 12: Resultados de los ensayos de cesión in vitro realizados con la formulación NPPheB-MH. 

 

 Figura 9: Porcentajes medios de MH cedidos (±DE) en los ensayos realizados con la formulación 

NPPheB-MH. 

Como se puede observar en la figura 5.7 la formulación NPMH-5 

presenta una velocidad de cesión rápida durante las primeras 24 horas y 

llega a alcanzar una cesión del 67,11% del MH en ese tiempo. A partir del 

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

%
 C

ed
id

o

Tiempo (h)



NPs de morin hidrato 

175 

primer día, la velocidad de liberación se hace más lenta y se mantiene 

constante durante 9 días, al cabo de los cuales se ha cedido el 91,83% de 

MH.  

Por lo que se refiere a la formulación NPpheA-MH (figura 5.8, tabla 

5.11), funcionalizada después de la elaboración de las NPs de MH, presenta 

una liberación más lenta y controlada durante todo el tiempo del ensayo. 

En las primeras 24 horas el porcentaje de MH liberado es un 23,85%. Esta 

disminución del burst inicial, en comparación con la formulación NPMH-5, 

puede ser debida a la pérdida del MH situado en las capas superficiales de 

las NPs durante el proceso de funcionalización. Estos resultados 

concuerdan con los obtenidos al determinar el potencial Z. Sin embargo, al 

tratarse de una formulación con una eficacia de encapsulación mucho 

menor (tabla 9), se puede considerar que la cantidad que se libera a lo largo 

del tiempo es la que se encuentra encapsulada en el interior de la NPs.  En 

este caso, al cabo de 9 días se ha liberado el contenido de MH por difusión, 

quedando en el interior una pequeña cantidad del flavonoide (12%) que, 

probablemente, se libera cuando comience el proceso de erosión.  

La formulación NPpheB-MH (figura 5.9, tabla 5.12), elaborada con 

PLGA-phe-phe y PLGA, presenta un perfil de liberación similar a la 

formulación NPMH-5, con un elevado burst en las 24 primeras horas, que 

supone casi el 50% de la cantidad de MH encapsulada. Sin embargo, a partir 

de este tiempo, la velocidad de liberación se mantiene constante durante 9 

días, a una velocidad adecuada para obtener niveles terapéuticos.  

Otros autores también obtienen liberaciones muy rápidas del morin a 

partir de nanopartículas. Así, Ghosh et al. (Ghosh, et al.,2017) elabora NPs 



Mario Alonso 

176 

de albumina que liberan el 80% de MH durante las primeras 12-20 horas. 

Similares resultados obtienen Song et al. con NPs de otro flavonoide como 

es la curcumina (Song, et al., 2016). Esta formulación presenta también un 

perfil bifásico y llega a liberar prácticamente la totalidad del principio activo 

antes de las 16 primeras horas.  

Al comparar las cantidades liberadas de MH a partir de las 

formulaciones NPpheA-MH y NPpheB-MH podrían ser suficientes para 

obtener niveles terapéuticos durante 9 días. Por otro lado, y en función de 

los resultados de los estudios de biodistribución realizados en esta tesis, 

que se comentan en el capítulo correspondiente, la formulación  

NPpheA-MH presenta un mejor acceso o más rápido al SNC que la 

formulación NPpheB-MH. Sin embargo, como indican Cayero-Otero et al. el 

acceso al tejido cerebral mediante transcitosis mediada por receptores, 

mecanismo que se ha buscado con la funcionalización de las nanopartículas, 

puede resultar más lento que la difusión pasiva (Cayero-Otero, et al., 2019). 

Por otro lado, los estudios de biodistribución realizados por Marcianes et 

al. con NPs cargadas con rodamina indican que, aunque la rodamina es 

expulsada del tejido cerebral durante la primera hora, no se puede afirmar 

que las NPs también lo sean (Marcianes, et al., 2017), por lo que en nuestro 

caso, se puede considerar que ambas formulaciones podrían ser 

interesantes para conseguir niveles terapéuticos de MH en SNC, para la 

formulación NPpheA-MH, debido a su  más rápido y/o mayor paso a través 

de BHE, y para la formulación NPpheB-MH debido a su permanencia a 

tiempos más prolongados en el SNC, mayor carga de MH y mejor control en 

su liberación.  

  



  

177 

VI- CONCLUSIONES 

  



Mario Alonso 

178 

  



Conclusiones 

179 

1- Los dos métodos de cuantificación de morin hidrato desarrollados 

por HPLC resultaron ser lineales, selectivos y precisos. El método que 

emplea HCl en la preparación de las muestras resultó ser más exacto 

y sensible, disminuyendo los límites de detección y cuantificación del 

flavonoide.  

2- El método de cuantificación de morin hidrato por espectrofotometría 

UV resultó ser lineal, exacto, selectivo y preciso, siendo adecuado 

para la cuantificación de las cantidades cedidas de flavonoide a partir 

de las nanopartículas.  

3- La unión del dipéptido de fenilalanina a las nanopartículas consigue 

modificar su biodistribución. La formulación NPpheA-Rh, 

funcionalizada con el dipéptido en superficie, presenta marcada 

afinidad hacia bazo y, únicamente a las dos horas de su 

administración, aumenta su presencia en hígado y pulmón. La 

formulación NPpheB-Rh, elaborada con PLGA y PLGA-phe-phe, 

presenta una mayor distribución en hígado y pulmón, aunque en 

todos los órganos estudiados, las cantidades de rodamina-B son 

inferiores a las encontradas con la formulación NPpheA-Rh. 

  



Mario Alonso 

180 

4- La unión del péptido phe-phe a las nanopartículas de PLGA consigue 

favorecer su paso a través de la barrera hematoencefálica. La 

formulación NPpheA-Rh alcanza los mejores resultados, con 

cantidades de rodamina-B en sistema nervioso central, a tiempos 

cortos, superiores a las obtenidas por las nanopartículas elaboradas 

con PLGA y PLGA-phe-phe. Esta formulación (NPpheB-Rh), mantiene 

niveles de rodamina-B prácticamente constantes en cerebro dos 

horas después de su administración, lo que podría ser atribuido a un 

retardo en su paso a través de la BHE.  

5- El método de extracción-evaporación del solvente, en una 

proporción MH:PLGA de 1:10 resultó el más adecuado para la 

obtención de nanopartículas, con un tamaño medio de partícula de 

unos 190 nm, adecuado para atravesar la barrera hematoencefálica, 

y con un perfil de cesión de morin hidrato que se mantiene durante 

al menos 9 días.  

6- El método de funcionalización empleado para la unión del dipéptido 

de fenilalanina a la superficie de las nanopartículas elaboradas con 

un 10% inicial de morin hidrato, supone la pérdida de casi el 50% del 

P.A. encapsulado, así como una reducción en la eficacia de 

encapsulación, con respecto a las mismas nanopartículas sin 

funcionalizar. 

  



Conclusiones 

181 

7- Las nanopartículas elaboradas con los polímeros PLGA (60%) y PLGA 

unido al dipéptido fenilamina (40%) y un 10% inicial de morin hidrato, 

incrementan en un 20% la cantidad de activo encapsulado, 

probablemente debido a que una parte de la fenilalanina se dispone 

hacia el interior, modificando la matriz polimérica y la afinidad del 

flavonoide hacia la misma.  

  



Mario Alonso 

182 

 

 



  

183 

 

VII-BIBLIOGRAFÍA 

  



Mario Alonso 

184 

  



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211 

 


	Tesis Mario Alonso González
	PORTADA
	ABREVIATURAS
	ÍNDICE
	RESUMEN
	SUMMARY
	I- INTRODUCCIÓN
	1. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
	2. BARRERA HEMATOENCEFÁLICA
	3. FLAVONOIDE MORIN

	II- OBJETIVOS
	III- DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE MORIN
	1. INTRODUCCIÓN
	2. OBJETIVOS
	3. MATERIALES Y MÉTODOS
	4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

	IV NANOPARTÍCULAS DE PLGA FUNCIONALIZADAS CON UN DIPÉPTIDO DE FENILALANINA
	1. INTRODUCCIÓN
	2. OBJETIVOS
	3. MATERIAL Y MÉTODOS
	4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

	V-NANOPARTÍCULAS DE MORIN HIDRATO
	1. INTRODUCCIÓN
	2. OBJETIVO
	3. MATERIAL Y MÉTODOS
	4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

	VI- CONCLUSIONES
	VII-BIBLIOGRAFÍA