UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de posinfarto MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Alejandro Carta Bergaz Directores Francisco Javier Bermejo Thomas Pablo Martínez-Legazpi Aguiló Francisco Jesús Fernández-Avilés Díaz Madrid © Alejandro Carta Bergaz, 2023 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL EFECTO DE LAS CÉLULAS MADRE CARDIACAS SOBRE EL SUSTRATO ARRÍTMICO EPICÁRDICO EN UN MODELO DE POSTINFARTO MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Alejandro Carta Bergaz DIRECTORES Dr. Ángel Arenal Maíz Dr. Francisco Javier Bermejo Thomas Dr. Francisco Jesús Fernández-Avilés Díaz Madrid, 2022 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS MÉDICO-QUIRÚRGICAS TESIS DOCTORAL EFECTO DE LAS CÉLULAS MADRE CARDIACAS SOBRE EL SUSTRATO ARRÍTMICO EPICÁRDICO EN UN MODELO DE POSTINFARTO MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Alejandro Carta Bergaz DIRECTORES Dr. Ángel Arenal Maíz Dr. Francisco Javier Bermejo Thomas Dr. Francisco Jesús Fernández-Avilés Díaz Madrid, junio de 2022 ii iii v Agradecimientos Con las palabras que siguen, seguramente insuficientes para mostrar la magnitud de mi sentimiento, quiero agradecer a todas aquellas personas que han hecho posible la culminación de esta tesis. Quiero agradecer en primer lugar a mis directores de tesis por haberme permitido embarcarme en un proyecto tan apasionante como el de la terapia celular en el tratamiento de las arritmias. Sin sombra de duda, esto ha sido un punto de inflexión en mi formación en cardiología. Al Dr. Ángel Arenal le estoy infinitamente agradecido por su mentoría, por acrecentar mi curiosidad por la Electrofisiología y, muy por encima de todo, por la confianza que ha depositado en mí desde el principio. Desde que me embarqué en este proyecto no ha cejado en su empeño por enseñarme que la excelencia se encuentra en los detalles. Al Dr. Javier Bermejo le doy las gracias por su confianza y por cartografiarme el camino para llegar a donde yo quería. Sin sus valiosísimos consejos esto no habría sido posible. Al Prof. Dr. Francisco Fernández-Avilés le agradezco que aceptase la tarea de dirigir esta tesis y el permitir que todo la “magia” que uno encuentra en el Servicio de Cardiología del Hospital General Universitario Gregorio Marañón sea posible. Gracias por haber sembrado la semilla del interés por la terapia celular en los que hemos tenido la suerte de formarnos bajo su dirección. En este agradecimiento debo incluir a todos los miembros del Servicio de Cardiología del Hospital General Universitario Gregorio Marañón por todo lo enseñado durante mis años de residencia. De entre este maravilloso elenco me siento en la obligación de agradecer en especial a las siguientes personas: AGRADECIMIENTOS vi A la Dra. Esther Pérez-David, no sólo por su invaluable ayuda con los estudios de cardiorresonancia de esta tesis, sino porque siempre encontró tiempo para ilustrarme con su infinito saber. Gracias por la confianza. A la que fuese mi tutora durante los años de Residencia, y ahora amiga, la Dra. Ana González Mansilla; a ella me faltará tiempo para compensarle por tantos y tan buenos consejos. Su arrope y su infatigable apoyo han sido vertebrales para culminar este proyecto. Al Dr. Ricardo Sanz que, a pesar de su ajetreada labor asistencial, encontró tiempo para revisar las partes de esta tesis relativas a la terapia celular. Sus comentarios y su amplísimo conocimiento al respecto seguro han contribuido a enriquecer este trabajo. A todo el departamento de Electrofisiología Cardiaca (Dr. Ángel Arenal, Dr. Esteban González-Torrecilla, Dr. Felipe Atienza, Dr. Tomás Datino, Dr. Pablo Ávila, a nuestra enfermera senior María Fé y a nuestro técnico Antonio Moratalla) por confirmarme que un día con un buen maestro es mejor que mil días de estudio concienzudo. Este proyecto tampoco hubiese sido posible sin todo el personal del Laboratorio de Investigación Traslacional en Cardiología del Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Les debo un especial agradecimiento a la Dra. María Eugenia Fernández-Santos, a Dª. Miriam Pareja y a Dª. Alejandra Acosta, por la ingente labor de aislar las células madre. Por su puesto, merecen el mayor de mis reconocimientos el personal del Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón, donde realizamos las intervenciones con catéter. En especial debo mencionar a la Dra. Verónica Crisóstomos, por su colaboración y su constante disposición a ayudarme. Por último, y no por ello menos importante, tengo que acordarme de Cristina, por su dulce amor y su constante apoyo; y, por encima de todo, a mis padres, a quienes todo debo. En mis padres se encuentran y encontrarán siempre mis méritos, no así mis fracasos que son sólo míos. A ellos les debo su apoyo, su amor incondicional y el hacerme valedor de la mejor herencia que pueden entregarle unos padres a su hijo: la educación. Sin mis padres nada hubiese sido posible. vii Índice general Índice Figuras, ix Índice de Tablas, xiii Abreviaturas, xv Resumen, xix Abstract, xxi Capítulo 1 Introducción General, 1 1.1 Introducción, 1 1.2 Muerte súbita cardiaca y arritmias ventriculares, 2 1.3 Papel del desfibrilador implantable en la prevención de la muerte súbita cardiaca. La paradoja de las descargas, 3 1.4 Ablación con catéter del sustrato arrítmico, 4 1.5 ¿Fármacos antiarrítmicos o ablación?, 11 1.6 La importancia de las cardiomiopatías no isquémicas en términos arrítmicos, 12 1.7 Mecanismos de recurrencias arrítmicas tras la ablación con catéter, 13 1.8 Recurrencias arrítmicas tras la ablación con catéter: el sustrato inaccesible, 17 1.9 ¿Cómo sospechar la presencia de sustrato arrítmico “no endocárdico”?, 21 1.10 Técnicas para abordar el sustrato “no-endocárdico”, 35 1.11 Necesidad de estrategias novedosa, 47 1.12 Células madre en cardiología, 48 1.13 Nicho de oportunidad de este trabajo, 58 INDICE DE GENERAL viii Capítulo 2 Hipótesis y Objetivos, 59 2.1 Hipótesis, 59 2.2 Objetivos, 60 Capítulo 3 Materiales y Método, 61 3.1 Introducción, 61 3.2 Materiales, 61 3.3 Método,63 Capítulo 4 Resultados, 91 4.1 Introducción, 91 4.2 Resonancia magnética,92 4.3 Efecto de las CDC en el mapa electroanatómico obtenido mediante estudio endocárdico (Fase V),101 4.4 Efecto de las CDC en la electrofisiología epicárdica evaluada con cartografía óptica (Fase VII),102 4.5 Efecto de las CDC en el tejido heterogéneo a nivel endo- y epicárdico (Fase VIII),105 Capítulo 5 Discusión, 107 5.1 Efecto de las CDCs sobre los volúmenes y función ventricular en la evolución, 107 5.2 Efecto de las CDCs sobre el remodelado de la escara,108 5.3 Impacto de las CDCs sobre las características electrofisiológicas endo- y epicárdica, 112 5.4 Efectos antiarrítmicos de las CDCs: conjunción del efecto sobre el remodelado eléctrico y anatómico de la escara, 113 5.5 Limitaciones del estudio y líneas futuras de investigación, 117 Capítulo 6 Conclusiones, 119 Bibliografía,121 ix Índice de Figuras CAPITULO 1 Fig.1 Curvas Kaplan-Meier para la supervivencia libre de descargas del DAI del estudio SMASH-VT, 6 Fig.2 Curvas Kaplan-Meier para la supervivencia libre de TV o VF del estudio VTACH,7 Fig.3 Resultados de la ablación con catéter en la miocardiopatía no isquémica en el estudio de Soejima et al.8 Fig.4 Resultados de ablación con catéter de TV en miocardiopatías dilatadas idiopáticas del estudio de Muser et al.,9 Fig.5 Curva Kaplan-Meier de supervivencia libre de trasplante entre pacientes con y sin recurrencia de TV tras un procedimiento de ablación, 10 Fig.6 Alcance de las lesiones de radiofrecuencia desde el endocardio, 13 Fig.7 Tasa de recurrencia de arritmias ventricular en función del éxito agudo de la ablación en pacientes con cardiopatía estructural,14 Fig.8 Ejemplos de escaras típicas en la miocardiopatía dilatada no isquémica que reconstrucciones formadas a partir de imágenes de cardiorresonancia,15 Fig.9 Hallazgos histopatológicos en la miocardiopatía no isquémica con mutaciones patogénicas,16 Fig.10 La eliminación de completa de los LAVA se asocia a menor recurrencia de TV,18 Fig.11 Cicatriz miocárdica y sustrato reentrante de TVs,19 INDICE DE FIGURAS x Fig.12 Comparación de la ablación de TV convencional del istmo de la conducción frente a la ablación de sustrato,20 Fig.13 Criterios morfológicos que sugieren origen epicárdico de una TV,25 Fig.14 Algoritmo propuesto por Vallés et al. para la detección de TVs con origen epicárdico,25 Fig.15 Ejemplos de patrones de realce tardío con gadolíneo,27 Fig.16 Relación de mapa de voltaje y el mapa de intensidad de señal,29 Fig.17 Resultados de la elección del abordaje anatómico según la transmuralidad del infarto,32 Fig.18 Algoritmo del servicio de cardiología del Hospital General Universitario Gregorio Marañón de Madrid para la selección del abordaje en la ablación de TV según la localización de la escara,32 Fig.19 Características de los mapas de activación endocárdicos que sugieren origen epicárdico de la TV,34 Fig.20 Empleo de mapas endocárdicos unipolares para predecir bajos voltajes epicárdicos,35 Fig.21 Acceso epicárdico percutáneo,37 Fig.22 Mapa electroanatómico epicárdico y correlación anatomopatológica,38 Fig.23 Procedimiento de ablación con etanol transcoronario,41 Fig.24 Protocolo de radioablación estandarizado por el grupo de Cuculich et al.,43 Fig.25 Tipos de configuración de la ablación de radiofrecuencia,45 Fig.26 Sistema de ablación con aguja de radiofrecuencia intramiocárdica,46 Fig.27 Productos celulares estudiados en medicina regenerativa cardiaca junto con las teorías mecanísticas de su efecto,50 Fig.28 Retos de la teoría paracrina en la terapia regenerativa cardiaca,53 Fig.29 Resultados del estudio SCIPIO,56 CAPITULO 3 Fig.30 Fases del estudio,63. Fig.31 Disposición de los animales en la sala de hemodinámica,65 Fig.32 Imagen angiográfica del sondaje del tronco coronario izquierdo del corazón del cerdo; en proyección postero-anterior,66 Fig.33 Software para medida de volúmenes ventriculares en la RMC,69 INDICE DE FIGURAS xi Fig.34 Software para medida de la masa de escara total,70 Fig.35 Mapa de intensidad de señal del endo- y epicardio,71 Fig.36 Técnica de punción subxifoidea para acceso al espacio epicárdico y administración de las CDCs o el placebo,75 Fig.37 Mapa electroanatómico endocárdico con voltajes bipolares,78 Fig.38 Mapa electroanatómico endocárdico con voltajes unipolares,78 Fig.39 Conexión del corazón explantado al sistema de perfusión de Langendorff,80 Fig.40 Sistema de perfusión de Langendorff,81 Fig.41 Sistemática de empleo del software para medida de las propiedades electrofisiológicas del epicardio con la cartografía óptica, 82 Fig.42 Estimulación ventricular programada desde el epicardio del ventrículo derecho,84 Fig.43 Secciones transversales del ventrículo izquierdo,85 Fig.44 Secciones de la escara incluidos en los moldes de inclusión en parafina,85 Fig.45 Compartimentación de la escara transmural en una mitad interna y otra mitad externa, 87 Fig.46 Tinción inmunohistoquímica para la detección de conexina 43,88 CAPITULO 4 Fig.47 Efecto de las CDCs en la composición de la EDEN,95 Fig.48 Efecto de las CDCs en la composición del THEN,96 Fig.49 Efecto de las CDCs en las variables -THEN y -EDEN,97 Fig.50 Efecto de las CDCs en la composición de la EDEP,98 Fig.51 Efecto de las CDCs en la composición del THEP,99 Fig.52 Efecto de las CDCs en las variables -THEP y -EDEP, 100 Fig.53 Efecto de las CDCs en la homogenización de la electrofisiología del epicardio,104 CAPITULO 5 Fig.54 Se muestra la carcasa 3D del mapa de intensidad de señal de la mitad endocárdica del miocardio para un cerdo placebo y un cerdo tratado con CDCs intrapericárdicas,108 Fig.55 Se muestra la carcasa 3D del mapa de intensidad de señal de la mitad epicárdica del miocardio obtenido para un cerdo placebo y un cerdo tratado con CDCs intrapericárdicas,109 Fig.56 Las CDCs bloquean el paso de tejido heterogéneo a escara densa,110 INDICE DE FIGURAS xii Fig.57 Mecanismos por los que el epicardio puede contribuir en la reparación cardíaca,111 Fig.58 Mecanismo arritmogénico por reentrada. Modelo teórico,114 Fig.59 Modelo de la importancia de un “núcleo” crítico de tejido in-excitable,115 Fig.60 Gradiente de voltaje entre regiones con distintas duraciones del potencial de acción,117 xiii Índice de Tablas CAPITULO 1 Tabla 1 Estudios observacionales sobre los resultados agudos y a largo plazo de la ablación, 5 Tabla 2 Localización del sustrato arrítmico (escara) y su profundidad en la pared miocárdica en función del tipo de cardiopatía, 22 Tabla 3 Estrategia de ablación según el tipo de cardiopatía junto con algunas de las referencias que refrendan la recomendación. La fecha () implica que se realizan 2 procedimientos en dos tiempos, 23 Tabla 4 Criterios electrocardiográficos que sugieren origen epicárdico de la TV, 24 Tabla 5 Comparación de las distintas técnicas de RMC para la identificación de fibrosis,28 Tabla 6 Algunas series de casos de ablación con etanol transcoronario. BAV= bloqueo auriculoventricular completo, 40 CAPITULO 3 Tabla 7 Muestra de estudio,62 CAPITULO 4 Tabla 8 Características basales de los grupos de tratamiento para las variables evaluadas en la RMC primera, 92 Tabla 9 Evolución en los grupos de tratamiento de las variables evaluadas por RMC para función ventricular, volúmenes ventriculares, escara y tejido miocárdico sano, 93 INDICE DE TABLAS xiv Tabla 10 Características de los grupos de tratamiento para las variables evaluadas en la RMC segunda, 94 Tabla 11 Características de la escara isquémica de los grupos de tratamiento evaluada con mapeo electroanatómico endocárdico, 101 Tabla 12 Propiedades electrofisiológicas epicárdicas de los grupos de tratamiento evaluadas con cartografía óptica: comparación intragrupos, 102 Tabla 13 Propiedades electrofisiológicas epicárdicas de los grupos de tratamiento evaluadas con cartografía óptica: comparación intergrupos, 106 Tabla 14 Efecto de las CDCs en tejido heterogéneo endo- y epicárdico, 108 xv Abreviaturas -DPAHS6 Porcentaje de cambio relativo de la duración del potencial de acción determinada mediante estimulación ventricular derecha con trenes a 800 ms. -DPAHS8 Porcentaje de cambio relativo de la duración del potencial de acción determinada mediante estimulación ventricular derecha con trenes a 800 ms. -EDEN Porcentaje de cambio relativo de la escara densa endocárdica. -EDEP Porcentaje de cambio relativo de la escara densa epicárdica. -THEN Porcentaje de cambio relativo del tejido heterogéneo endocárdico. -THEP Porcentaje de cambio relativo del tejido heterogéneo epicárdico. -VCHS6 Porcentaje de cambio relativo de la velocidad de conducción determinada mediante estimulación ventricular derecha con trenes a 800 ms. -VCHS8 Porcentaje de cambio relativo de la velocidad de conducción determinada mediante estimulación ventricular derecha con trenes a 800 ms. ACENB Área de cicatriz endocárdica en el mapa electroanatómico bipolar ACT Tiempo de activación de la coagulación. ACU Área de cicatriz definida en el mapa electroanatómico unipolar. APD Duración del potencial de acción. ATP Terapia antitaquicardia. AVMA Asociación Americana de Medicina Veterinaria (siglas en inglés). ABREVIATURAS xvi BMCs Células derivadas de la médula ósea adulta. BRD Bloqueo de rama derecha. CC43C Cantidad de conexina 43 en los cardiomiocitos. CCL Canal de conducción lenta. CDCs Células Derivadas de Cardioesferas. CF Cantidad de fibroblastos. RMC Cardiorresonancia magnética. CS Cardioesferas. CSCs Células madre cardiacas. DAI Desfibrilador automático implantable. DPAMS Duración del potencial de acción del miocardio sano. DPATH Duración del potencial de acción del tejido heterogéneo. EAM Mapa electroanatómico (siglas en inglés de electroanatomic map). ECG Electrocardiograma. eCSC Células madre cardiacas endógenas (siglas en inglés de endogeneous cardiac stem cells). EDEN Escara densa endocárdica. EDEP Escara densa epicárdica. EEF Estudio electrofisiológico. EPS Estudio electrofisiológico (siglas en inglés de: electrophysiological study). ESCs Células madre embrionarias (siglas en inglés de: embriological stem cells). FAAs Fármacos antiarrítmicos. FEVI Fracción de eyección del ventrículo izquierdo. FITC Isotiocianato de fluoresceína. FV Fibrilación ventricular. FWHM Full width at half máximum. HT Heterogeneous tissue. iPSCs Células madre pluripotenciales inducidas (siglas en inglés de: induced pluripotential stem cells). IV Intravenoso. LAVA Actividad ventricular local anormal (siglas en inglés de: Local abnormal ventricular activities). MCI Miocardiopatía isquémica. ABREVIATURAS xvii MCNI Miocardiopatía no isquémica. MET Masa de escara total. MFI Intensidad de fluorescencia media (siglas en inglés de: mean fluorescence intensity). MMT Masa miocárdica total. MSC Muerte súbita cardiaca. NCBI Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos (siglas en inglés de: National Centre por Biotechnology Information). PC43C Polaridad de la conexina 43 en los cardiomiocitos. PF Porcentaje de fibrosis. PMN Porcentaje de masa necrótica. PRDR Reexcitación dependiente de una repolarización prolongada (siglas en inglés de: prolonged repolarization-dependent reexitation). RI Respuesta inflamatoria. RNA Ácido ribonucleico. TC Tomografía computarizada. TE Tamaño del efecto. TH Tejido heterogéneo. THEN Tejido heterogéneo endocárdico. THEP Tejido heterogéneo epicárdico. TIMI Thrombolysis In Myocardial Infarction. TV Taquicardia ventricular. TVMS Taquicardia ventricular monomórfica sostenida. VAS Vascularización. VC Viabilidad de los cardiomiocitos. VCMS Velocidad de conducción del miocardio sano. VCTH Velocidad de conducción del tejido heterogéneo. VTDVI Volumen telediastólico de ventrículo izquierdo. VTSVI Volumen telesistólico de ventrículo izquierdo. xviii xix Resumen Introducción. El sustrato arrítmico de las taquicardias ventriculares de muchas cardiopatías estructurales se encuentra en el epicardio, condicionando peores resultados con las terapias actualmente disponibles. Las células derivadas de cardioesferas (CDCs) pueden modificar la escara miocárdica, aunque para que ejerzan su efecto en el epicardio es clave la vía de administración. La hipótesis de este trabajo es que la administración intrapericárdica de CDCs (punción subxifoidea) puede modificar la anatomía y funcionalidad del sustrato arrítmico epicárdico. Método. Se incluyeron 19 cerdos (Large White) a los que se les provocó un infarto por oclusión de la arteria descendente anterior media durante 120 minutos (día 0). Se obtuvo una cardiorresonancia (RMC) basal con secuencias de realce tardío 4 semanas postinfarto y se aleatorizaron a los cerdos a un grupo tratamiento (300.000 CDCs alogénicas/kg intrapericárdicas), (n=10), y a un grupo control (administración del vehículo de las CDCs) (n=9). Se realizó una segunda RMC y un mapa electroanatómico endocárdico (CARTO-3) de alta densidad y resolución a las 16 semanas postinfarto. Se realizó post-procesado de las imágenes de RMC para proyectar la intensidad de señal promedio de la mitad interna y externa del miocardio en una reconstrucción tridimensional del endocardio y el epicardio. La escara total se segmentó en escara densa (ED) y el tejido heterogéneo (TH) atendiendo a la intensidad de señal con respecto al miocardio sano remoto (> 3 y entre 2 y 3 desviaciones estándar, respectivamente). RESUMEN xx Inmediatamente después de realizar el mapa electroanatómico, se sacrificaron a los cerdos y se realizó una cartografía óptica epicárdica (sistema Langendorff) y un estudio histológico del tejido heterogéneo (TH) de la escara endo- y epicárdica. Resultados. 1) RMC: No se detectaron diferencias estadísticamente significativas en la masa miocárdica ni tampoco en los volúmenes o la función ventricular entre los grupos de tratamiento. Las CDCs no produjeron diferencias en la evolución de la escara endocárdica. A nivel epicárdico, en el grupo tratado, aunque la escara total creció, no se observó un cambio significativo en la extensión de la ED entre la primera y la segunda RMC, sin embargo, sí se produjo un aumento estadísticamente significativo en la cantidad de TH. La escara epicárdica del grupo control presentó una evolución opuesta: la ED creció, pero la extensión del TH no cambió. 2) Mapa electroanatómico: No se documentaron diferencias estadísticamente significativas en la extensión de la ED y del TH. 3) Cartografía óptica: La tasa de variación relativa de la velocidad de conducción y de la duración del potencial de acción entre el TH y el miocardio sano fueron significativamente menores en el grupo tratado. 4) Estudio histológico: No se documentaron diferencias en las características del TH endocárdico de los grupos. A nivel epicárdico, el TH del grupo tratado presentó menor porcentaje de fibrosis, mayor cantidad y mejor polaridad de las conexina-43 y mayor viabilidad de los cardiomiocitos. Conclusiones. Las CDCs intrapericárdicas producen cambios anatómicos (detienen el crecimiento de la escara densa) y funcionales (homogenización de las propiedades electrofisiológicas del epicardio) del sustrato arrítmico epicárdico, lo que podría tener un efecto antiarrítmico. La detención del proceso fibrótico con mejor vascularización y viabilidad de los cardiomiocitos del TH epicárdico junto con la mayor cantidad y mejorar polarización de la conexina 43 podrían explicar los cambios anatomofuncionales. xxi Abstract Introduction. The arrhythmic substrate of ventricular tachycardias in many structural heart diseases is located in the epicardium, often resulting in poor outcomes with currently available therapies. Cardiosphere-derived cells (CDCs) can modify myocardial scarring, although the route of administration is key to their effect on the epicardium. The hypothesis of this work is that the intrapericardial administration of CDCs (subxiphoid puncture) can modify the anatomy and functionality of the epicardial arrhythmic substrate. Method. A total of 19 Large White pigs were infarcted by occlusion of the mid-left anterior descending coronary artery for 120 min. (day 0). Baseline cardiac magnetic resonance (CMR) imaging with late enhancement sequences was obtained 4 weeks post-infarction and pigs were randomised to a treatment group (intrapericardial administration of 300,000 allogeneic CDCs/kg), (n=10) and a control group (administration of CDC vehicle) (n=9). A second CMR and high-density, high-resolution endocardial electroanatomical mapping (CARTO-3) was performed at 16 weeks post-infarction. Post-processing of the CMR images was performed to project the average signal intensity of the inner and outer half of the myocardium onto a three-dimensional reconstruction of the endocardium and epicardium. Total scar mass (TSM) was separated into dense scar (DS) and heterogeneous tissue (HT) based on signal intensity relative to remote healthy myocardium (≥ 3 and ≥ 2 but < 3 standard deviations, respectively). Immediately after the electrophysiological study, the pigs were sacrificed and epicardial optical mapping (Langendorff ABSTRACT xxii system) and histological studies of the HT of the endocardial and epicardial scar were performed. Results. 1) CMR: No statistically significant differences in myocardial mass, ventricular volume or ventricular function were detected between groups. CDCs did not produce differences in endocardial scar evolution. At the epicardial level, although there was an increase in TSM in the treatment group, no significant changes were found in the extent of DS between the first and second CMR. However, there was a statistically significant increase in the amount of HT. In the control group, epicardial scarring evolved in an opposing direction, with an increase in DS while HT remained constant. 2) Electroanatomical mapping: No statistically significant differences in the extent of DS and HT were observed. 3) Optical mapping: The relative rates of variation of conduction velocity and action potential duration between HT and healthy myocardium were significantly lower in the treatment group. 4) Histological study: No differences in the endocardial HT characteristics of the two groups were found. At the epicardial level, the HT of the treatment group showed a lower percentage of fibrosis, a higher quantity and polarity of connexin-43 and better cardiomyocyte viability. Conclusions. Intrapericardial CDCs produce anatomical (impeding DS growth) and functional (homogenisation of the electrophysiological properties of the epicardium) changes of the epicardial arrhythmic substrate, which could have an anti-arrhythmic effect. The arrest of the fibrotic process with improved vascularisation and viability of epicardial HT cardiomyocytes, together with the increased amount and improved polarisation of connexin 43, could explain the anatomo-functional changes. 1 CAPÍTULO 1 Introducción general 1.1. Introducción Las arritmias ventriculares justifican más de la mitad de las muertes súbitas en los países desarrollados y estas suelen aparecer frecuentemente en el seno de una cardiopatía estructural. Aunque el desfibrilador automático implantable (DAI) ha disminuido la muerte arrítmica, no elimina el sustrato arrítmico. En el presente capítulo se realizará una revisión a las distintas técnicas disponibles en el ámbito clínico para el tratamiento de las arritmias ventricular. Se revisará en detalle el papel deletéreo que presentan las recurrencias de las taquiarritmias ventriculares tras la aplicación de las terapias establecidas y se comentarán las técnicas no invasivas para la detección del sustrato profundo que suele estar detrás de las recurrencias. Se pretende ofrecer al lector un Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 2 estado del arte del tratamiento de las arritmias para posteriormente dar pie a las teorías que fundamentan el empleo de células madre para combatir las arritmias ventriculares. 1.2. Muerte súbita cardiaca y arritmias ventriculares La muerte súbita cardiaca (MSC), entendida como la muerte inesperada por causas cardiológicas que sobreviene tras 1 hora del inicio de los síntomas (o tras 24 horas de haber visto al paciente vivo y asintomático), representa un reto médico de primer orden, estando detrás de más del 50% de las muertes de causa cardiovascular.1–4 Los estudios prospectivos basados en datos del siglo XXI estiman una incidencia anual de MSC de entre 42 y 95 casos por 100,000 personas.5–7 Debe tenerse presente que estas estimaciones son imprecisas y que el impacto poblacional de la MSC está definido de forma incompleta e incluso sometida a debate.8 Pese a lo anterior, la mayoría de los estudios coinciden en que existe una tendencia descendente en la incidencia de MSC probablemente por una mejora en la prevención y manejo de la cardiopatía isquémica que, no obstante, se acepta es responsable de hasta el 80% de los casos en los países anglosajones y, tal vez, de un porcentaje menor en España.3,9,10 En los casos de MSC característicos, el pacientes pierde el conocimiento súbitamente sin (o con escasos) pródromos, por lo que, aunque rara vez se documenta el ritmo cardiaco en el momento del colapso, la causa inmediata de la muerte suele obedecer a taquiarritmias ventriculares.11 En la MSC asociada a infartos de miocardio crónicos frecuentemente ocurre una taquicardia ventricular (TV) monomórfica sostenida (TVMS) que degenera en fibrilación ventricular (FV) o bien genera inestabilidad hemodinámica con hipoperfusión e isquemia miocárdica y FV secundaria.12,13 Si bien la cardiopatía isquémica puede desencadenar arritmias ventriculares por cualquiera de los tres mecanismos arritmogénicos conocidos (estos incluyen el automatismo anormal, la actividad desencadenada por pospotenciales y la reentrada), la reentrada es el mecanismo arritmogénico de la mayoría de las arritmias clínicas en humanos.14,15 Aunque la causa de las arritmias en las cardiopatías estructurales no isquémicas no está tan bien estudiada, se considera igualmente que la causa se encuentra en el establecimiento de CAPÍTULO 1 | Introducción general 3 reentradas, siguiendo el principio de “no scar, no ventricular tachycardia” (sin escara no hay TV).16 A diferencia de las TVs que ocurren en pacientes con ausencia de cardiopatía estructural (con excepción de las canalopatías hereditarias asociadas a MSC), las taquiarritmias ventriculares que se presentan en el seno de una cardiopatía subyacente deben abordarse de forma agresiva por el elevado riesgo de MSC asociado.17,18 1.3. Papel del desfibrilador implantable en la prevención de la muerte súbita cardiaca. La paradoja de las descargas Los paciente supervivientes de una TVMS tienen un alto riesgo de presentar una nueva MSC por recurrencia de una taquiarritmia ventricular.19,20 Los DAI han logrado disminuir la mortalidad en este escenario y se han convertido en un pilar en el tratamiento de estos pacientes, presentando una indicación con máximo nivel de recomendación en las guías de práctica clínica.19,21–24 Sin embargo, los DAI no son una cura para las TVs porque no eliminan el sustrato arritmogénico 25. En un estudio realizado en Estados Unidos, se estima que en un seguimiento a 5 años, hasta el 38% de los pacientes que habían recibido un implante de DAI en prevención secundaria presentaba una descarga apropiada por una arritmia ventricular26. Sin embargo, el DAI es un “red de rescate” y todos los esfuerzos terapéuticos deben destinarse a utilizarlo lo menos posible porque las descargas son dolorosas, no evitan el síncope por la TV antes de la descarga (y, con ello, el riesgo de traumatismo), no ofrecen reducción completa de la muerte arrítmica (hasta un 5% de pacientes portadores de DAI fallecen por una arritmia ventricular) 27–30, se asocian con progresión de la insuficiencia cardiaca 31, acarrean un impacto psicológico notorio (afecta a más del 50% de los portadores de DAI) 27,32,33, reducen la vida útil del dispositivo y, por encima de todo, se asocian a un riesgo aumentado de muerte. 34,35 Existen estudios que han sugerido que las descargas del DAI producen daño micro y macroscópico en las proximidades del electrodo de desfibrilación.36 De lo anterior surge la hipótesis de que, tal vez, aquellos pacientes que reciben una descarga del DAI en el seguimiento puedan tener un pronóstico distinto a la de aquellos sujetos que no reciben choques. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 4 Un sub-estudio de los pacientes incluidos en el ensayo clínico MADIT II fue el primero en describir una asociación entre las terapias del DAI - descargas y/o terapia antitaquicardia (ATP) - y un peor curso clínico en el seguimiento.35,37,38 En este trabajo se evidenció un riesgo de muerte 3 veces mayor entre los pacientes que sobrevivieron a las terapias apropiadas del DAI con respeto a los que no recibieron terapias 35,37. De forma parecida, un sub-análisis del estudio SCD-HeFT demostró que el riesgo de muerte por cualquier causa era mayor, tanto entre los que recibieron una descarga apropiada (hazard ratio, 5.68; intervalo de confianza 95%: 3.97 - 8.12) como entre los que recibieron una descarga inapropiada del DAI (hazard ratio, 1.98; 95% CI, 1.29 to 3.05) con respecto a los que no recibieron ninguna descarga.39,40 Pese a los trabajos anteriores, aún queda por dilucidar si la mayor mortalidad asociada a las descargas del DAI es consecuencia de estas o simplemente las descargas actúan de marcador de una cohorte de pacientes más enfermos. Si bien existe acuerdo entre los estudios publicados de la asociación entre descargas y mortalidad, también parece existir acuerdo en relación con la terapia antitaquicardia, que no se asocia a una mayor mortalidad. 41–43. Teniendo en cuenta lo anterior y sabiendo que, a diferencia de los choques, la ATP no son dolorosas y tienen un consumo de batería del DAI despreciable, varios estudios han intentado dilucidar qué programación del DAI (tiempos de detección largos, programación dual, ATPs antes de las descargas y durante la carga de los condensadores, activación de los discriminadores de taquicardias supraventriculares en pacientes con indicación de DAI bicameral por indicación de estimulación) es la óptima para evitar descargas sin comprometer la seguridad del paciente. 44–47 Sin embargo, además de una adecuada programación del DAI, también son necesarias estrategias terapéuticas que disminuyan la carga arrítmica y las cuales se expondrán en los siguientes apartados. 1.4. Ablación con catéter del sustrato arrítmico Las descargas apropiadas del DAI no curan las TV y se asocian a un aumento de la mortalidad. 34,35 Puesto que ningún dispositivo confiere protección total contra las TV, cabe adoptar CAPÍTULO 1 | Introducción general 5 estrategias que reduzcan la incidencia de estas arritmias. La ablación con catéter y los fármacos antiarrítmicos son dos estrategias que, por si solas o combinadas, tienen la capacidad para disminuir la incidencia de las descargas del DAI 1,2. ▪ Virtudes de la ablación con catéter de radiofrecuencia La ablación con catéter que disminuye la tasa de recurrencia de las taquicardias ventriculares y, por ende, las descargas del DAI. 27,32,48–51 Sin embargo aún no se ha demostrado de forma prospectiva y aleatorizada que la ablación de TV con catéter disminuya la mortalidad.52 En pacientes con infarto de miocardio crónico, los ensayos clínicos SMASH-VT y VTACH han venido a ratificar los hallazgos de estudios no aleatorizados previos que concluían que la ablación con catéter disminuye las descargas del DAI (ver Tabla 1). 25,53–58 Tabla 1. Estudios observacionales sobre los resultados agudos y a largo plazo de la ablación. Estudio Número de pacientes FEVI promedio (%) Cardiopatía Tratamiento Tipo de TV Mapeo Éxito agudo (%) Seguimiento (meses) Éxito largo plazo (%) Mortalidad seguimiento (%) Tanner, 2009 54 63 30 MCI Ablación de TV Cualquier TV Mapeo en TV y mapeo de sustrato 81 12 51 9 Stevenson, 2008 56 231 25 MCI 49 6 53 18 Calkins, 2000 55 146 31 MCI y MCNI 59 8 46 25 Niwano, 2008 58 58 37 MCI y MCNI 43 31 75 16 Carbucicchio, 2008 57 95 36 MCI y MCNI Tormenta arrítmica 85 22 66 16 MCI= miocardiopatía isquémica. MCNI= miocardiopatía no isquémica. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 6 Tormenta arrítmica se define como 3 ó más episodios de TV en un plazo de 24 horas. El estudio SMASH-VT aleatorizó de forma homogénea a 128 pacientes con historia de infarto de miocardio (>1 mes previo a la aleatorización) e implante de DAI (en prevención primaria y con descarga en el seguimiento, así como en prevención secundaria o síncope con inducción de TVs en un estudio electrofisiológico) a un grupo de ablación de sustrato o un grupo control.25 Tras un seguimiento promedio de 22.5 meses los pacientes en el grupo de ablación mostraron una reducción del 65% en el riesgo de presentar una terapia del DAI (descargas y terapia ATP). Considerando exclusivamente las descargas del DAI persistía el beneficio de la ablación con una reducción significativa del riesgo de sufrir una descarga del 73% (Fig.1). Cabe destacar la baja tasa de complicaciones de la ablación. Fig. 1. Curvas Kaplan-Meier para la supervivencia libre de descargas del DAI del estudio SMASH-VT. (Reproducido de 25). Por su parte, el estudio VTACH aleatorizó a 107 pacientes con antecedente de infarto de miocardio y fracción de eyección de ventrículo izquierdo (FEVI) <50% que hubiesen presentado una TV bien tolerada y que se iban a someter al implante de un DAI a un grupo control (n=56) o de ablación (n=54).53 Tras un seguimiento promedio de 22.5 meses, la supervivencia libre de TV/FV fue significativa mayor en el grupo de ablación (hazard ratio 0.61; intervalo confianza 95%: 0.37- 0.99) (Fig.2). Además, la ablación con catéter redujo significativamente la incidencia de descargas apropiadas del DAI en un 43% y el número de intervenciones del DAI promedio al año y por paciente en un 93%. Al igual que en el SMASH-VT, las complicaciones del procedimiento y la mortalidad a 30 CAPÍTULO 1 | Introducción general 7 días son bajas. Los dos ensayos comentados no detectaron diferencias en mortalidad entre los pacientes sometidos a ablación y sus comparadores, aunque no estaban diseñados para tal fin. Sin embargo, en el estudio SMASH-VT se identificó una tendencia hacia una menor mortalidad entre los pacientes sometidos a ablación (9% vs. 17%; p= 0.29).25,53 Un meta-análisis que incluyó, además del SMASH-VT y el VTACH, otros estudios no aleatorizados tampoco encontró diferencias en mortalidad.59 Fig. 2. Curvas Kaplan-Meier para la supervivencia libre de TV o VF del estudio VTACH (Reproducido de 53). En línea con lo anterior, en el estudio SMS (Substrate Modification Study) se aleatorizaron 111 pacientes con infarto crónico de miocardio y FEVI ≤ 40% que habían presentado una TV mal tolerada a 1) ablación con catéter e implante de DAI (n=54) ó 2) implante de DAI sin ablación 60. Aunque la ablación con catéter no prolongó el tiempo hasta la recurrencia de la primera arritmia ventricular, sí se asoció con una reducción >50% en el número total de terapias del DAI durante el seguimiento. A partir de los estudios anteriores se publicó el estudio multicéntrico BERLIN-VT 61,62. El BERLIN-VT es el primer ensayo clínico que evalúa el momento óptimo para realizar la ablación con catéter de la TV respecto al implante de DAI en prevención secundaria 62. En este estudio se Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 8 aleatorizaron 159 pacientes con cardiopatía isquémica y FEVI 30-50% que habían presentado una TV a un grupo de ablación preventiva (n=76) realizada antes del implante del DAI o a un grupo de ablación diferida realizada tras el tercer choque apropiado del DAI. La metodología de la ablación recomendaba la inducción de las TV. El estudio se terminó precozmente por evidencia futilidad en un análisis intermedio. Así, tras un seguimiento promedio de 396 días, el endpoint primario (mortalidad por cualquier causa y hospitalización por TV o descompensación de insuficiencia cardiaca) no fue significativamente diferente según los grupos de ablación. A pesar de lo anterior, y si bien son endpoints secundarios que deben analizarse con cautela, el ensayo BERLIN-VT ratificó los resultados de los ensayos SMASH-VT y VTACH, demostrando que la proporción de pacientes con TVs sostenidas (39.7% vs. 48.2%; p= 0.050) y terapias apropiadas del DAI (34.2% vs. 47.0%; p=0.020) fue menor en el grupo de ablación preventiva. En las miocardiopatías no isquémica no existen estudios aleatorizados como en la cardiopatía isquémica, pero en estudios observacionales prospectivos – aunque con resultados discordantes por la heterogeneidad de los diseños de los estudios y de la población de pacientes – se evidencia que la ablación disminuye las terapias del DAI 63–66. Fig. 3. Resultados de la ablación con catéte en la miocardiopatía no isquémica en el estudio de Soejima et al. Se muestra la frecuencia mensual promedio de episodios de TV para cada uno de los 28 pacientes con miocadiopatía dilatada idiopática sometidos a ablación. (Reproducido de16). Un estudio que incluyó a 28 pacientes con miocardiopatía dilatada no isquémica remitidos para ablación por TVMS con FEVI severamente deprimida evidenció que, tras un seguimiento CAPÍTULO 1 | Introducción general 9 promedio de 334 días, el 54% de los pacientes con TVs sometidos a ablación endocárdica (y epicárdica en caso de fallo del abordaje endocárdico), fundamentalmente por mapeo de activación y encarrilamiento, permanecían libre de recurrencias pese a documentar episodios frecuentes previos a la misma (Fig.3).16 Otro estudio en miocardiopatía dilatada idiopática y FEVI moderada-severamente deprimida con TV refractaria a tratamiento antiarrítmico remitidos para ablación (abordaje combinado endo- epicárdico en un 32 % de los pacientes) evidenció una supervivencia libre de TV del 69% tras 60 meses de seguimiento. Adicionalmente, cuando se producía una recurrencia existía una reducción en la carga de TV (el 53% de las recurrencias se producían a expensas de episodios aislados de TV) (Fig. 4).67 Fig. 4. Resultados de ablación con catéter de TV en miocardiopatías dilatadas idiopáticas del estudio de Muser et al.67 (A) Curvas Kaplan-Meier de supervivencia libre de TV tras la ablación con catéter. (B) Comparación de la presentación clínica de los episodios de TV antes y después del procedimiento de ablación en los pacientes con recurrencias. (Reproducido de la fuente: 67). ▪ Recurrencias arrítmicas: el punto débil de la ablación con catéter de radiofrecuencia A pesar de lo expuesto en el apartado anterior, la ablación con catéter de las TV tiene su punto débil en la tasa de recurrencias. Globalmente, los tratados de electrofisiología asumen que aproximadamente el 40-50% de los pacientes sometidos a ablación tendrán una recurrencia Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 10 arrítmica tras un periodo de unos 12 meses aproximadamente.68 Fig. 5. Curva Kaplan-Meier de supervivencia libre de trasplante entre pacientes con y sin recurrencia de TV tras un procedimiento de ablación. (Reproducido de: 52). Las recurrencias arrítmicas tras un procedimiento de ablación con catéter se asocian a un aumento de la mortalidad.69–73 En un estudio retrospectivo multicéntrico que analizó los datos de 2061 pacientes con cardiopatía estructural sometidos a ablación de sustrato de TVMS observó que la recurrencia de TVs tras la ablación se asoció a un mayor riesgo de muerte y/o necesidad de un trasplante cardiaco (hazard ratio: 6.9; intervalo de confianza al 95%: 5.3-9.0) (Fig. 5).52 La tasa de recurrencias es distinta según el tipo de cardiopatía. Así, un estudio prospectivo evidenció que, entre pacientes con cardiopatía isquémica y no isquémica, tras un año de la ablación con catéter, sólo el 57% y el 41% de los pacientes, respectivamente, seguían libres de TV.68. A diferencia de este estudio, en el que más de la mitad de los pacientes se sometieron a un procedimiento de ablación con mapeo de activación, un estudio posterior en el que los pacientes se sometieron exclusivamente a ablación de sustrato concluyó que las recurrencias son más frecuentes en las cardiopatías no isquémicas (51 vs 26 %).74 Resultados similares a estos ya se habían descrito en estudios previos donde, de forma análoga, casi siempre se agrupaban bajo la definición de “cardiopatía no isquémica” todas aquellas cardiopatías en las que la dilatación y/o disfunción ventricular no estuviese asociada a lesiones coronarias o alteraciones en la pre- y postcarga.16,75–77 Si bien varios de los estudios que se han comentado comparan la cardiopatía CAPÍTULO 1 | Introducción general 11 isquémica con las “no isquémicas”, cabe recordar que este es un grupo heterogéneo que incluye cardiomiopatías de origen variado (genético, inflamatorio, post-infeccioso e idiopático) con fenotipos morfológicos y funcionales distintos.78 Así, cabe destacar que las recurrencias tras la ablación son muy dependientes de la cardiomiopatía específica.79 Las recurrencias arrítmicas no deben considerarse una variable dicotómica de sí o no, también existe un cierto “efecto de carga”. Varios estudios demostraron que a mayor número de episodios de TVs mayor mortalidad.80,81 Además del efecto de dosis, el riesgo de muerte es mayor cuanto más precoz se produce la recurrencia arrítmica tras la ablación. 73 72 1.5. ¿Fármacos antiarrítmicos o ablación? Las descargas apropiadas - y por ende, la recurrencia de TVs - son menores (hasta un 15- 44%) en pacientes tratados con sotalol frente a los que sólo recibían betabloqueantes o placebo. La amiodarona reduce aún más las recurrencias (hasta un 71% durante 1 año de tratamiento), sin embargo, asocia efectos adversos considerables a largo plazo.82–84 Un meta-análisis de 8 ensayos clínicos evidencia que los fármacos antiarrítmicos (FAAs) disminuyen el número de terapias apropiadas e inapropiadas del DAI, principalmente gracias a la efectividad de la amiodarona. Sin embargo, esta disminución significativa en las recurrencias de TV no se traduce en un descenso de la mortalidad y, de hecho, la amiodarona se asocia a un incremento en la misma (odds ratio 3.36; intervalo de confianza al 95%: 1.36-8.30; p= 0.009).85 En los episodios recurrentes de TV a pesar de tratamiento con FAAs cabe preguntarse cuál es la mejor opción terapéutica, bien proceder con una ablación con catéter o escalar en el tratamiento farmacológico. La respuesta a esta pregunta se encuentra en el estudio VANISH que aleatorizó a pacientes con cardiopatía isquémica y portadores de un DAI que presentaban TVs recurrentes pese a FAAs, bien a la ablación con catéter (n=132) o bien a escalar en el tratamiento antiarrítmico (n=127).31 Durante un seguimiento promedio de casi 28 meses, la variable principal (muerte, tormenta arrítmica o descarga apropiada del DAI) ocurrió significativamente menos veces en el grupo de ablación (59.1% vs. 68.5%; p= 0.04).31 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 12 1.6. La importancia de la miocardiopatía dilatada no isquémica en términos arrítmicos La presencia de TVs en las cardiopatías no isquémicas es un marcador de riesgo de muerte arrítmica que mejora con la implantación de un DAI. Las guías de práctica clínica europeas y americanas recomiendan el implante de DAI en prevención primaria para la muerte súbita en pacientes con insuficiencia cardiaca y FEVI reducida. Esta indicación tiene el máximo grado de recomendación para pacientes con cardiopatías isquémicas (recomendación I-A), y se generaliza a las miocardiopatías no isquémicas (recomendación II-A) en base a los estudios SCD-HeFT, COMPANION, DEFINITE y DANISH.1,2,40,86–88 Los pacientes con miocardiopatía dilatada no isquémica y escara miocárdica frecuentemente fallecen de forma súbita, a pesar de las mejoras en supervivencia que han introducido los avances en los tratamientos médicos. Con respecto a la población sana, el 90% de los pacientes con miocardiopatía dilatada no isquémicas tienen ectopia ventricular frecuente, y más del 40% tienen TVs no sostenidas.89,90 En pacientes con miocardiopatía dilatada y FEVI  35% , el ensayo DANISH, evidenció que un 17 y un 12 % de los pacientes sometido a implante de DAI-resincronizador presentaron ATP o descargas apropiadas, respectivamente en un seguimiento promedio de 69 meses86. Un estudio observacional con similar tipo de pacientes evidenció que, tras un seguimiento promedio de 50 meses, el 32 % de los pacientes sufrían TVs y un 7% tenían una tormenta arrítmica.91 Aunque en mucha de la evidencia científica se trata a las “miocardiopatías dilatadas no isquémica” como una suerte de cajón de sastre, cabe no olvidar que bajo esta etiquetan se recogen varias entidades muy heterogéneas entre sí. De hecho, la carga arrítmica de cada una de estas entidades es muy variable; por ejemplo, la tasa de terapias apropiadas del DAI en pacientes con miocardiopatías por mutaciones en lamina A/C (3-7% anual) es superior al de otras entidades de este grupo (aproximadamente 2% anual) 92,93. CAPÍTULO 1 | Introducción general 13 1.7. Mecanismos de recurrencias arrítmicas tras la ablación con catéter Las teorías para explicar la diferencia en el éxito del procedimiento de ablación según la cardiopatía son múltiples y se encuentran en las peculiaridades del sustrato arrítmico de cada enfermedad. Así, las recurrencias se pueden justificar por alguno de estos mecanismos: i) incapacidad para aplicar suficiente energía de radiofrecuencia, ii) formación de nuevos circuitos de reentrada en el seguimiento – en probable relación con progresión del sustrato reentrante en una cardiopatía de base en evolución – y, especialmente, iii) la presencia de sustrato inaccesible (o profundo) al abordaje convencional con catéter de radiofrecuencia desde el endocardio.94 Fig. 6. Alcance de las lesiones de radiofrecuencia desde el endocardio. El sustrato profundo (flecha azul) queda lejos de las lesiones producidas por el catéter de radiofrecuencia (RF) desde el endocardio. El trayecto representado por las flechas amarillas pretende simular un circuito reentrante en torno a una zona de escara mesocárdica. El círculo negro muestra la profunidad de una lesión producida con un catéter de radiofrecuencia desde el endocardio. Reproducido de 95. Si bien la formación de nuevos circuitos es una causa de recurrencias, la presencia de sustrato inaccesible parece ser el mecanismo más habitual (Fig. 6). Lo anterior lo apoya un estudio prospectivo que relaciona las recurrencias con el éxito agudo. Así, los pacientes con miocardiopatía dilatada isquémica y no isquémica que alcanzan un éxito agudo de la ablación (ausencia de inducibilidad de cualquier TV) experimentan un 4 y un 7 % de recurrencias de TV, respectivamente, en un seguimiento promedio de 21 meses. Sin embargo, cuando el procedimiento tuvo un éxito parcial (eliminación de la TV clínica, pero no de otras TV) la tasa de recurrencias fue del 54 y 75%, Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 14 respectivamente. Por tanto, el éxito agudo (mayor en la cardiopatía isquémica que en las no isquémica [69% vs. 53%, p= 0.03]) se relacionó directamente la tasa de recurrencias (Fig. 7). Parece pues que es el fallo para eliminar el sustrato presente inicialmente explica las recurrencias.74 Fig. 7. Tasa de recurrencia de arritmias ventricular en función del éxito agudo de la ablación en pacientes con cardiopatía estructural. Reproducido de 74. Otro estudio publicado previamente que clasificó la ablación con TV en función del resultado de la estimulación ventricular tras el procedimiento en: clase A, ausencia de inducibilidad de cualquier TV; clase B, inducibilidad de TVs no-clínicas; o clase C, inducibilidad de la TV clínica llegó a similares conclusiones. Tras un seguimiento promedio de 26 meses, la TV clínica recurrió en 29, 40 y 67 % de los pacientes según el resultado de la ablación fuese clase A, B o C, respectivamente (log-rank p< 0.001). Un estudio posterior, primer multicéntrico al respecto, analiza específicamente si las recurrencias tras la ablación de TV en la miocardiopatía dilatada idiopática y en la miocardiopatía arritmogénica se deben a la ablación incompleta o a la progresión de la enfermedad.72 Se concluye que, a pesar de que la cardiopatía progresa en el 75% de los pacientes incluidos (es decir, se produce remodelado ventricular, deterioro de la FEVI o aumento del tamaño de la escara), en los segundos procedimientos de ablación el 70% de los pacientes reciben aplicaciones en áreas CAPÍTULO 1 | Introducción general 15 existentes en la escara índice que no se sometieron a ablación en un primer abordaje. Así, aunque el sustrato inaccesible (o no abordado) se encuentren tras la mayoría de las recurrencias tampoco puede olvidarse que las cardiopatías son dinámicas y, con ello, el sustrato arritmogénico.94 ▪ Características del sustrato según la cardiopatía En la cardiopatía isquémica, la escara suele estar constituida por fibrosis compacta que se extiende desde el endocardio hasta el epicardio con una localización ventricular que depende de la anatomía coronaria.96 En la miocardiopatía dilatada no isquémica, el sustrato arrítmico consiste fundamentalmente de fibrosis parcheada (55%), seguido en frecuencia por una arquitectura de la fibrosis difusa (34%) o intersticial (9%); la identificación de fibrosis compacta – que es la característica de la cardiopatía isquémica - es lo menos frecuente (3%).97 Fig. 8. Ejemplos de escaras típicas en la miocardiopatía dilatada no isquémica sobre reconstrucciones formadas a partir de imágenes de cardiorresonancia. OAD, OAI y PA= proyecciones oblicua anterior derecha, izquierda y posterior-anterior, respectivamente. (Reproducido de 98). Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 16 Aunque clásicamente se describía una localización preferente de la escara a nivel mesoventricular y epicárdico, otros autores encontraron un patrón menos restringido, pudiéndose identificar hasta un 30% de biopsias con fibrosis subendocárdica.97 99,100. Además, en base a estudios electroanatómicos y necropsias, se han identificado 2 localizaciones preferenciales de la fibrosis en la miocardiopatía dilatada no isquémica: i) anteroseptal, localizándose la escara a nivel del septo anterior basal, en torno al tracto de salida del ventrículo izquierdo y la unión mitroaórtica; y ii) inferolateral, donde suele ser subepicárdica (Fig. 8).98,101 La fibrosis en estas cardiopatías destaca por su naturaleza dinámica, lo que unido a su habitual predilección por localizaciones profundas explica la dificultad para la ablación convencional desde el endocardio en las miocardiopatías no isquémicas.94 Fig. 9. Hallazgos histopatológicos en la miocardiopatía no isquémica con mutaciones patogénicas. Tinción tricrómica de Masson con fibrosis en azul, cardiomiocitos en rojo y adipocitos en blanco. A: Corazón sano. Las mutaciones en desmina (B), fosfolambano (C) y desmosómicos (D) con fibrosis en epicardio. Corazones con una mutación en los genes que codifican lamina A / C (E) y proteínas sarcoméricas (F) con fibrosis en el endocardio. Reproducido de102. CAPÍTULO 1 | Introducción general 17 En contraposición con las generalizaciones anteriores, la entidad nosológica específica dentro de las miocardiopatías no isquémicas es la responsable última de las características del sustrato. Así, en las miocardiopatías genéticas, las mutaciones en fosfolambano y desmina suelen presentarse con abundante escara epicárdica, mientras que las mutaciones en lamina A/C o en proteínas sarcoméricas suelen presentar fibrosis endocárdica o intramural (Fig. 9).102 Por su parte, en la miocardiopatía arritmogénica la sustitución fibrograsa se localiza en el triángulo de la displasia y progresa desde el epi- hacia el endocardio; y en el 80% de las miocardiopatías hipertróficas existe escara a nivel epicárdico.78 Entre las miocardiopatías adquiridas, las escaras post-miocarditis víricas suelen ser exclusivamente epicárdicas a nivel inferolateral; en la sarcoidosis suele existir escara parcheada endocárdica y extensión epicárdica en el septo basal y la cara inferior e inferolateral; y en la miocardiopatía chagásica la escara casi siempre tiene afectación epicárdica y suele afectar a los segmentos inferolaterales y apicales.102 1.8. Recurrencias arrítmicas tras la ablación con catéter: el sustrato inaccesible En línea con lo expuesto de que el sustrato inaccesible a la energía de radiofrecuencia es una causa de recurrencias establecida, se ha demostrado que la ablación que persigue la eliminación completa del sustrato comporta mejor pronóstico. Un estudio que incluyó pacientes con cardiopatía estructural (isquémica o no isquémica) y TVs evidenció que la eliminación completa de los electrogramas de actividad ventricular local anormal (LAVA, de sus siglas en inglés: local abnormal ventricular activities) era el único factor que se asociaba a una reducción significativa de la incidencia de un endpoint combinado de muerte o recurrencia de TVs a los 22 meses (hazard ratio: 0.48; intervalo de confianza 95%: 0.25-0.92; p= 0.022) (Fig. 10).103 Los modelos animales indican que los LAVA son miocitos supervivientes rodeados de fibrosis que tiene pobres conexiones con el resto de miocardio y que son responsables de la conducción lenta necesaria para establecer una reentrada.103 De forma parecida, un estudio observacional prospectivo multicéntrico con pacientes con cardiopatía isquémica que se encontraban en situación de tormenta arrítmica estudió si una ablación más extensa de todas las zonas con registro de potenciales patológicos se asociaba a Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 18 mejores resultados en el seguimiento. 104 Se comparó una cohorte 1ª de pacientes sometidos a ablación endocárdica con radiofrecuencia mediante técnicas de mapeo convencional (topoestimulación, mapeo de activación, encarrilamiento) para identificar istmos de conducción y una cohorte 2ª donde se realizó abordaje combinado endocárdico y epicárdico para realizar homogenización de las escaras – esto es, eliminación de todos los electrogramas fraccionados o retrasados (Fig. 11) que, al igual que los LAVA identifican miocitos supervivientes embebidos en la cicatriz. Fig. 10. La eliminación de completa de los LAVA se asocia a menor recurrencia de TV. Las curvas de supervivencia representan la ausencia de TV recurrente o la muerte en pacientes con y sin eliminación completa de los electrogramas de actividad ventricular anormal local (LAVA). Reproducido de 103. Tras un seguimiento promedio de 25 meses, la tasa de recurrencia de TVs fue menor en la cohorte 2ª de ablación extensa endo-epicárdica frente a la cohorte 1ª de ablación limitada endocárdica (19% vs. 47%; log-rank p= 0.006). Estos datos deben interpretarse con cautela. Aunque en la cohorte 2ª se realizó acceso epicárdico percutáneo a todos los pacientes, sólo se realizó ablación a un 33% de los casos. Puesto que se consiguió un éxito agudo del 100% en ambas cohortes, la explicación para las diferencias en la tasa de recurrencia se asume que se encuentra CAPÍTULO 1 | Introducción general 19 en la técnica de ablación. La principal limitación de este estudio radica en que la técnica de ablación difirió entre las cohortes, realizándose homogenización de la escara en la cohorte 2ª vs. ablación de sustrato limitado en la cohorte 1ª, de tal forma que no fue posible conocer la contribución que el abordaje anatómico o la técnica de ablación tenían sobre los resultados. Para aclarar esta cuestión se publicaron dos estudios posteriores.105,106 Fig. 11. Cicatriz miocárdica y sustrato reentrante de TVs. (Izquierda) La activación eléctrica desde el miocardio normal a través del tejido de la zona fronteriza es lenta y retrasada (flechas rojas). Hay múltiples canales miocárdicos presentes y pueden identificarse mediante electrogramas característicos que pueden clasificarse como electrogramas fraccionados (arriba a la derecha, asterisco), potenciales tardíos (en medio a la derecha, asterisco) o LAVAs (abajo, flecha). En este caso, la LAVA se aprecia mejor con estimulación ventricular, que separa el electrograma anormal local del electrograma de campo lejano con demostración de bloqueo de entrada local al sitio en el tercer complejo QRS. Todos estos canales miocárdicos pueden servir como vías potenciales para diferentes taquicardias ventriculares. Reproducido de 96. En el ensayo clínico VISTA se comparó exclusivamente la técnica de ablación (homogenización de la escara vs. ablación de istmos de la conducción).105 En este estudio, se aleatorizaron pacientes con cardiopatía isquémica y TV bien tolerada a un grupo de ablación de la TV clínica o a un grupo de ablación de sustrato; en la ablación de TV clínica se eliminaba exclusivamente el istmos de conducción crítico, mientras que en la ablación de sustrato se eliminaban todos estos electrogramas patológicos.96,105 Tras un seguimiento promedio de 1 año, el grupo de ablación de sustrato experimentó menos recurrencias que el grupo de TV clínica (15.5% Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 20 vs. 48.3%; log-rank p < 0.001) (Fig.12).105 Fig. 12. Comparación de la ablación de TV convencional del istmo de la conducción frente a la ablación de sustrato. La gráfica compara la probabilidad acumulada de recurrencia de la TV (con o sin FAA) entre pacientes sometidos a ablación de sustrato y ablación de TV convencional. Los pacientes con ablación de sustrato mostraron una tasa de recurrencia significativamente menor a los 12 meses de seguimiento. Reproducido de 105. CAPÍTULO 1 | Introducción general 21 Por su parte, otro estudio de cohortes comparó la realización de una ablación de sustrato mediante un abordaje exclusivamente endocárdico con una ablación con un abordaje combinado endo-epicárdico en pacientes con cardiopatía isquémica remitidos para un primer procedimiento de ablación por TVMS.106 Este trabajo es novedoso porque, si bien se conocía que la ablación epicárdica mejoraban el pronóstico de los pacientes con cardiopatía isquémica que presentaban TVMS recurrente, no se había valorado previamente el abordaje combinado endo-epicárdico en un primer procedimiento – aunque se reconocía la existencia de circuitos epicárdico e intramurales.107–109 Tras un seguimiento de un año se demostró que la necesidad de ingreso por TV y/o de nuevo procedimiento de ablación era significativamente menor entre los pacientes sometidos de entrada a un abordaje endo-epicárdico.106 Los estudios comentados ponen en relieve la importancia pronóstica que tiene perseguir la ablación de todo el sustrato arrítmico (no sólo de los istmos de las TV clínicas, sino todo el sustrato que incluiría también los circuitos de TV no clínicas que en el seguimiento pueden hacerse inducibles). Este sustrato muchas veces es inaccesible por encontrarse profundo en la pared miocárdica, más próximo al epicardio que a la fuente de energía aplicada sobre el endocardio. De forma más llamativa que en la cardiopatía isquémica, el abordaje combinado endo- epicárdico había demostrado menor tasa de recurrencias de TV en la miocardiopatía dilatada no isquémica 77,110 (aunque en muchos de estos estudios los pacientes ya se habían sometido a ablación endocárdica), la miocardiopatía arritmogénica 111–113, la cardiomiopatía chagásica 114, la sarcoidosis cardiaca 115 y la miocardiopatía hipertrófica con aneurisma apical 64. Por todo lo expuesto, se justifican alternativas a la ablación endocárdica estándar para abordar la totalidad del sustrato arrítmico. 1.9. ¿Cómo sospechar la presencia de sustrato arrítmico “no endocárdico”? La necesidad de realizar un abordaje del sustrato profundo suele considerarse habitualmente tras un primer abordaje de ablación convencional con catéter desde el endocardio que es fallido. Sin embargo, también puede plantearse esta necesidad en base a: i) la cardiopatía subyacente, ii) los criterios electrocardiográficos, iii) las técnicas de imagen no invasiva y iv) los hallazgos de un mapeo endocárdico previo. A continuación, se comentan estos puntos en detalle. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 22 ▪ El papel de la información clínica Antes de someter a un paciente a ablación con catéter de TV, el conocimiento sobre el tipo de cardiopatía estructural es probablemente la información disponible más relevante. Partiendo del axioma que afirma que sin escara no hay reentrada, cabría plantear una estrategia de ablación sobre el epicardio cuando se estime que la probabilidad a priori de afectación meso- o epicárdica sea alta. Así, la necesidad realizar un abordaje epicárdico varía según el tipo de cardiopatía y la localización preferencial del sustrato arrítmico en estas (Tabla 2). Tabla 2. Localización del sustrato arrítmico (escara) y su profundidad en la pared miocárdica en función del tipo de cardiopatía. Cardiopatía Localización Profundidad Cardiopatía isquémica Distribución coronaria Endocardio Miocardiopatía dilatada idiopática Anteroseptal e inferolateral basal Meso- y epicardio Cardiomiopatía arritmogénica Triángulo displasia Epicardio Miocardiopatía hipertrófica Aneurisma / septo interventricular Mesocardio Sarcoidosis cardiaca Variable (sobre todo septo interventricular) Meso- y epicardio Enfermedad de Chagas Segmento lateral basal Endo- y epicardio En el último documento de consenso de expertos de la Sociedad Europea de Cardiología sobre la ablación con catéter de arritmias ventriculares, sólo se recoge con una clase de recomendación formal, el abordaje epicárdico para la cardiopatía isquémica – como terapia de rescate cuando ha fallado el abordaje endocárdico; nivel de evidencia IIa – y la miocardiopatía dilatada isquémica – bien como técnica de rescate cuando ha fallado el abordaje endocárdico o como tratamiento de primera línea cuando se sospecha un abordaje epicárdico –.116 Pese a lo anterior, como se ha señalado en el apartado anterior 1.8. se acumula la evidencia en relación con otras cardiopatías que se beneficiarían de un abordaje combinado inicial sobre el epicardico (Tabla 3). CAPÍTULO 1 | Introducción general 23 Tabla 3. Estrategia de ablación según el tipo de cardiopatía junto con algunas de las referencias que refrendan la recomendación. La fecha () implica que se realizan 2 procedimientos en dos tiempos. Cardiopatía Estrategia Referencias Cardiopatía isquémica Endocárdica  epicárdica (rescate) 116 Miocardiopatía dilatada idiopática Endocárdica  epicárdica (rescate) 116 Combinado endoepicárdica de primera línea Cardiomiopatía arritmogénica Combinado endoepicárdica de primera línea 111–113,117 Endocárdica  epicárdica (rescate) Miocardiopatía hipertrófica Endocárdica  epicárdica (rescate) 118 Sarcoidosis cardiaca Combinado endoepicárdica de primera línea 115 Endocárdica  epicárdica (rescate) Enfermedad de Chagas Combinado endoepicárdica de primera línea 114,119 Pese a lo expuesto, algunas cardiomiopatías con afectación preferencial del epicardio en ocasiones presentan escaras exclusivamente en el endocardio, por lo que el empleo de criterios adicionales a la clínica son muy valiosos.120 Sin embargo, se reconoce que el abordaje fallido de una ablación endocárdica es motivo suficiente para plantear un abordaje epicárdico.109 La necesidad de realizar mapeo epicárdico es más frecuente en unas cardiopatías que en otras. Un registro multicéntrico de ablación revela que es preciso un acceso epicárdico en un 16% de la cardiopatía isquémica, en un 35% de las miocardiopatías dilatadas idiopáticas, en un 41% de las miocardiopatías arritmogénicas y en un 18% en otras cardiomiopatías no isquémicas.120 ▪ Características electrocardiográficas de las TV con sustrato profundo Los criterios electrocardiográficos que sugieren un foco no endocárdico de las TV se basan en que la activación miocárdica progresa lentamente desde el foco reentrante profundo hasta el endocardio, lugar donde la activación miocárdica se sigue por el sistema de conducción específico Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 24 del corazón. Basándose en lo anterior, tras comprobarse que la estimulación epicárdica prolonga la parte inicial del complejo QRS con respecto a la estimulación endocárdica, se intentaron identificar criterios electrocardiográficos que predijeran un origen epicárdico de las TVs. 121 Se compararon los ECG de 14 TVs con morfología de bloqueo de rama derecha (BRD) que se habían logrado ablacionar con un abordaje epicárdico (tras un intento fallido de ablación endocárdico) con los de 27 TVs que se habían logrado ablacionar desde el endocardio. El 72% de las TV tenían un sustrato isquémico. Se evaluaron 3 intervalos electrocardiográficos (la onda pseudodelta, el tiempo de la deflexión intrinsicoide en V2, y la duración del complejo RS) y se buscaron cuáles fueron los valores con mayor sensibilidad y especificada (Tabla 4) 120,121. Tabla 4. Criterios electrocardiográficos que sugieren origen epicárdico de la TV. Valores de los distintos intervalos electrocardiográficos que presentan mejor sensibilidad y especificada para la detección de TVs con puntos de salida del circuito reentrante en el epicardio.121 Criterio Sensibilidad Especificidad Pseudodelta wave ≥34 ms 83 95 Deflexión intrinsicoide (V2) ≥85 ms 87 90 Complejo RS más corto ≥121 ms 76 85 Un estudio posterior evaluó estos criterios en pacientes con cardiomiopatías no isquémicas y evidenció que la sensibilidad y especificidad de los intervalos propuesto eran dependientes de la región miocárdica de origen de la TV.122 Además, estos autores propusieron una serie de criterios morfológicos según el vector inicial del complejo QRS. En resumen, los siguientes criterios sugieren un origen epicárdico: i) la presencia de onda Q en la derivación I en las TVs con origen basal superior y apical superior, ii) la ausencia de onda Q en las derivaciones II, III y aVF en las TV con origen basal superior, iii) la presencia de onda Q en las derivaciones II, III y aVF en las TV con origen basal inferior y apical inferior, y iv) la presencia de onda Q en la derivación V2 en TV con origen apical (Fig. 13).122,123 Globalmente, estos criterios identificaban el origen epicárdico en el 84% de los casos. Puesto que la mayoría de las TV en la miocardiopatía dilatada no isquémica se origen en la región superior y lateral perivalvular aórtica y mitral, se ha propuesto un algoritmo validado en una CAPÍTULO 1 | Introducción general 25 cohorte de TVs con origen a nivel basal superior/lateral (Fig. 14) donde se identificada correctamente el origen epicárdico en el 90% de los casos.123 Fig. 13. Criterios morfológicos que sugieren origen epicárdico de una TV. Representación esquemática que muestra las diferencias morfológicas en el QRS en la derivación I y aVF según la región inicial (flecha azul pequeña) seguida de la activación global del VI (flechas grandes) desde el origen de la VT endocárdica versus epicárdica desde el VI superior lateral. (A) Las TV con origen en el endocardio muestran pequeñas ondas q en las derivaciones inferiores y una pequeña onda R en la derivación I que representa el segmento pequeño de miocardio que se despolariza con una activación desde el endocardio al epicardio. (B) Las TV con origen en el epicardio no mostrará una onda q inicial en las derivaciones inferiores y mostrará consistentemente una onda q en la derivación I. Reproducido de 122. Fig. 14. Algoritmo propuesto para la detección de TVs con origen epicárdico. Cuatro pasos para identificar el origen de la epicárdico de TVs con origen en el segmento basal superior y lateral de las miocardiopatías no isquémicas. Los 3 pasos primeros tienen una alta especificidad y el último paso es el más preciso. La sensibilidad y especificidad total del algoritmo en la población de estudio para la localización del mapa de ritmo alcanza el 96 y el 93%, respectivamente. Reproducido de 123. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 26 Un trabajo posterior estudió la idoneidad de los criterios morfológicos y de intervalos propuestos para las cardiomiopatías no isquémicas (o en el mejor de los escenarios, testados en poblaciones mixtas de pacientes isquémicos y no isquémicos) en TVs con sustrato isquémico.124 Concluyen que ninguna de las características electrocardiográficas estudiadas predice de forma consistente el origen epicárdico de las TV en la cardiopatía isquémica y consideran que la presencia de ondas Q patológicas distorsionan los intervalos y, estando presentes también en TV, hacen que los criterios morfológicos sean equívocos. ▪ Caracterización mediante resonancia magnética cardiaca del sustrato La resonancia magnética cardiaca (RMC) con secuencias de realce tardío con gadolinio (LGE) se considera la técnica no invasiva gold standard para identificar y delinear la presencia de escara miocárdica.125 ▪ Definición de la escara con la RMC La técnica más frecuentemente empleada con RMC para la identificación de zonas de escara (con independencia de si está relacionada con un infarto o con fibrosis de sustitución) se basa en el estudio del relace tardío de gadolinio, habiéndose demostrado una excelente correlación con estudios anatomopatológicos.125–127 La presencia de contraste retenido se detectará mediante un aumento de la señal, de tal forma que las zonas en negro corresponden a tejido sano y las zonas blancas a escara; las zonas con tonalidades grises corresponderán a tejido heterogéneo (Fig. 15). Si bien a nivel clínico suele describirse la localización y composición de la escara de forma narrativa, el volumen y la composición de la escara puede cuantificarse empleando alguno de varios algoritmos basados en la intensidad de la señal (SI, de sus siglas en inglés de signal intensity).127 Así, existen programas que de forma semi-automática definen la escara densa y heterogénea según distintos métodos (por ejemplo, el método de la desviación estándar, identifica como escara densa y tejido heterogéneo en función de la desviación estándar de la intensidad de señal de cada vóxel con respecto al miocardio sano; el método de full width at half máximum (FWHM) identifica como escara densa aquellos vóxeles con valores de intensidad > 50% del pico de intensidad en la región CAPÍTULO 1 | Introducción general 27 identificada como escara e identifica como tejido heterogéneo aquellos vóxeles con valores entre 35-50%), no existiendo aún un consenso sobre cuál es el método óptimo.128,129 Fig. 15. Ejemplos de patrones de realce tardío con gadolinio. El daño isquémico (infarto, lado izquierdo) siempre implica realce endocárdico, mientras que el realce epicárdico o mesocárdico sugiere una etiología no isquémica (lado derecho). Reproducido de 130. La técnica del realce tardío se basa en la falta de heterogeneidad del miocardio, pues se compara una zona de escara circunscrita con una zona sana, por lo que en las cardiopatías con fibrosis difusa puede ser más difícil detectar la fibrosis si no hay segmentos miocárdicos sanos.131 En estos casos puede optarse bien por la realización de mapas de relajación longitudinal T1 nativos, bien por valorar la expansión del tejido extracelular comparando los valores de relajación Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 28 longitudinal T1 antes y después de la administración de gadolinio (Tabla 5).132–135 Estas técnicas, si bien son cuantitativas, aún no tienen evidencia sólida que respalde su uso en la toma de decisiones o en la valoración del riesgo arrítmico 127,136,137 Tabla 5. Comparación de las distintas técnicas de RMC para la identificación de fibrosis. Adaptado de 127. Técnica Medida Identificación de escara Cuantificación de tejido heterogéneo Identificación de fibrosis difusa Evidencia para su empleo clínico Realce tardío con gadolinio Semi- cuantitativa +++ ++ - ++ (cardiopatía isquémica) +++ (cardiopatía no isquémica) Mapas de T1 nativo Cuantitativa + - + + Mapas de volumen extracelular Cuantitativa ++ + +++ +/- Así, aunque las guías de práctica clínica de la ESC recomiendan la realización de un ecocardiograma como primera técnica de imagen (recomendación clase I con nivel de evidencia A), la RMC cada vez cobra mayor importancia por su capacidad para caracterizar el tejido miocárdico (“biopsia no invasiva”) (recomendación clase IIa con nivel de evidencia B).2 Prueba de esto se encuentra en una serie de casos de pacientes con TVMS o recuperados de MSC, donde la realización de una RMC identifica enfermedad miocárdica en un porcentaje mayor de pacientes que las técnicas de imagen convencionales (ecocardiografía transtorácica y/o coronariografía invasiva) y permite reclasificar a la mitad de los pacientes a un diagnóstico nuevo o alternativo.138 ▪ Comparación de la RMC y de la cartografía de voltaje. Identificación de canales de conducción lenta El examen histológico de los corazones con infarto crónico y TVMS refractaria evidencia haces de miocitos supervivientes en el interior de la escara que se sabe son el sustrato anatómico de los CCL que sostiene los istmos de conducción críticos de los circuitos de TV.139,140 CAPÍTULO 1 | Introducción general 29 Fig. 16. Relación de mapa de voltaje y el mapa de intensidad de señal. Los CCL observados en el mapa de voltaje (izquierda, flechas blancas y negras) (rango de voltaje de 0.4 a 0.41 mV) también se identifican en los mapas de intensidad de señal (derecha). Reproducido de 141. En este punto, cabe recordar que, si bien la ablación de TVMS inicialmente consistía exclusivamente en la eliminación de los istmos de conducción identificados con mapeo de activación y encarrilamiento, en la mayoría de los casos esto no era posible porque exigía la tolerancia hemodinámica de la TV.142 Una solución a esta limitación fue la identificación del sustrato de las TV durante el ritmo sinusal (o con estimulación ventricular). Esta técnica se basa en la identificación de la zona de tejido heterogéneo, donde se localizan miocitos supervivientes dispersos en una red de fibrosis que forman los canales de conducción lenta (CCL) necesarios para el mantenimiento de las reentradas.64,142,143 Esta zona de tejido heterogéneo es el objetivo habitual de la ablación y se identifica de forma invasiva por las características y propiedades de los electrogramas (Fig. 11).144,145 Esta técnica tiene como limitaciones la deficiente identificación de la escara, el pobre contacto del catéter y el efecto de los electrogramas a distancia.144,145 Por tanto, la capacidad de la RMC para identificar este tejido heterogéneo e incluso delinear los CCL, como se verá a continuación, la convierten en una herramienta clave pues: i) define la localización y composición cicatriz mejor que la cartografía electroanatómica, ii) permite identificar los CCL, y iii) sus imágenes se pueden fusionar con los sistemas de navegación electroanatómicos. La capacidad de identificar los CCL de forma no invasiva mediante RMC fue demostrado de forma seminal por nuestro grupo.141 En este trabajo se compararon 18 pacientes con infarto crónico remitidos para ablación de TVMS con 18 controles emparejados. A todos los pacientes se les realizó un RMC basal para identificar los canales de tejido heterogéneo en la mitad interna del Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 30 miocardio y un mapa de voltaje endocárdico para identificar los CCL como un “pasillo” de electrogramas consecutivos diferenciados del área circundante por su mayor amplitud. Se compararon los mapas de intensidad de señal de la mitad interna del miocardio con los de voltajes mediante el software CARTO Merge (Fig. 16). Entre las conclusiones de este trabajo destaca: i) que los canales de TH son más frecuentes entre los pacientes con TVMS (88% vs. 33%; p >0.001); ii) que todos los canales identificados con RMC se correspondían con canales en los mapas de voltaje, y iii) que 15 de 18 de las TV ablacionadas con éxito tenían relación con un canal.141 Partiendo de esta idea, trabajos posteriores han segmentado la pared miocárdica en hasta 5 capas de endo a epicardio.146 ▪ Impacto clínico de la RMC Predicción de mortalidad y eventos arrítmicos. Tanto en la cardiopatía isquémica como en las miocardiopatías no isquémicas, la presencia de realce tardío en la RMC se asocia a mayor mortalidad y a eventos arrítmicos (incluyendo descargas del DAI), con independencia de la presencia o no de disfunción sistólica de ventrículo izquierdo.147–151 Otras características más concretas de la escara, como la extensión, la transmuralidad, la cantidad de tejido heterogéneo o la presencia de canales de conducción lenta se han implicado como moduladores del riesgo tanto en la cardiopatía isquémica como en las miocardiopatías no isquémicas. Sin embargo, la variación en las técnicas empleadas para definir la escara y la inconsistencia que se deriva de esto, así como la ausencia de estudios aleatorizados, han frenado la aplicación clínica de estas técnicas. En relación al valor del tejido heterogéneo para estratificar el riesgo arrítmico cabe mencionar el estudio observacional prospectivo GUADI-CRT por ser el que mayor número de pacientes incluyó.152 Este trabajo evaluó la posibilidad de que ciertas características de la escara mejorasen la estratificación del riesgo de MSC o TVs en pacientes con indicación de CRT por insuficiencia cardiaca. Este estudio concluyó que, además del tamaño de la escara y la identificación de CCL, la masa de tejido heterogéneo se asoció al endpoint primario (terapias apropiadas del DAI y/o MSC). Además, encuentran que sólo se documentan eventos en el seguimiento cuando existe una masa mínima de escara densas (>10 g) y de tejido heterogéneo (>5.3 g). Guía de los procedimientos de ablación con catéter. Aún a falta de grandes ensayos clínicos que lo avalen, se reconoce que la información que aporta la RMC en relación con la CAPÍTULO 1 | Introducción general 31 localización y las características de la escara permiten planear la técnica de ablación.125 Así, por ejemplo, la presencia de escara meso- y epicárdica se asocia a mayor fracaso de la ablación con catéter desde el endocardio; por el contrario, el abordaje epicárdico de estos sustratos aumenta el éxito del procedimiento.125 En referencia a lo expuesto, en una serie de pacientes con miocardiopatía no isquémica remitidos para ablación de TV con catéter de radiofrecuencia se demuestra que en la totalidad de pacientes con escara en el estudio de realce tardío de la RMC, el componente crítico de la arritmias (máxima precocidad en los casos de EV o encarrilamiento con fusión oculta en los casos de TVMS) se encontraa en dicha región. 153 En este mismo trabajo se concluye que todos los pacientes con escara predominantemente endocárdica o epicárdica pudieron ablacionarse con aplicaciones desde el endo- o epicardio, respectivamente. Añadido a lo anterior, otro trabajo demuestra que la presencia de un patrón de realce tardío predominantemente epicárdico (esto es, un número de segmentos con realce epicárdico  el número de segmentos con otros patrones de realce) tiene un valor predictivo positivo para el origen epicárdico de la TV del 90.9% con un valor predictivo negativo del 92.4%; además, cuando el realce es exclusivamente epicárdico, el origen de la TV se encuentra en la totalidad de los casos en el epicardio.154 En el campo de la cardiopatía isquémica, existe ya evidencia que avala la selección del procedimiento de ablación de TV en función de la extensión de la escara. Un trabajo estudió a los pacientes con RMC de tal forma que, aquellos con escara transmural se sometieron a un procedimiento de ablación endo-epicárdica (cohorte 1ª) y aquellos con escara exclusivamente endocárdica sólo a un abordaje endocárdico (cohorte 2ª). 155 Estas dos cohortes de compararon con un grupo de pacientes con escara transmural que se realizaron exclusivamente ablación endocárdica (cohorte 3ª) bien porque tenían el antecedente de una cirugía cardiaca previa o porque se habían sometido a ablación fuera del contexto del estudio. Se identificó un sustrato epicárdico en el 88% de los pacientes con infarto transmural sometidos a un abordaje combinado endo-epicárdico. Tras un seguimiento promedio de 22.5 meses, la cohorte 3ª de pacientes presentó una supervivencia libre de TV significativamente menor que las cohortes 1ª y 2ª (40.6% vs. 14.7% y 12.5%, respectivamente; p= 0.011), entre las cuales no existían diferencias significativas (Fig. 17). Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 32 Fig. 17. Resultados de la elección del abordaje anatómico según la transmuralidad del infarto. Curva de Kaplan-Meier para la recurrencia de TV según la transmuralidad del infarto y el tipo de abordaje anatómico. Grupo 1: pacientes con infarto subendocárdico y abordaje endocárdico. Grupo 2: pacientes con infarto transmural y abordaje endo-epicárdico. Grupo 3: pacientes con infarto transmural y abordaje endocárdico. Reproducido de 155. Fig. 18. Algoritmo del servicio de cardiología del Hospital General Universitario Gregorio Marañón de Madrid para la selección del abordaje en la ablación de TV según la localización de la escara. EEF ENDO = estudio electrofisiológico endocárdico; EEF EPI = estudio electrofisiológico epicárdico. CAPÍTULO 1 | Introducción general 33 El proceder del servicio de Cardiología del Hospital General Universitario Gregorio Marañón de Madrid con respecto a este punto se resume en la Figura 18. La RMC no sólo permite anticipar el abordaje más conveniente para la ablación de las TV, si no que permite optimizar los resultados de la ablación de sustrato cuando las reconstrucciones tridimensionales de los mapas de intensidad de señal se integran en los sistemas de electronavegación. Un trabajo del grupo del Hospital Clinic de Barcelona demuestra que, comparado con la ablación de sustrato mediante dechanneling convencional, la ablación guiada por mapas de intensidad de señal fusionados en el mapa electroanatómico mejora las resultados de la ablación.146 ▪ Mapas de voltaje endocárdicos unipolares para la detección de sustrato profundo A pesar de la gran resolución de la RMC, esta técnica tiene potenciales limitaciones en pacientes portadores de DAI.125 Si bien existen series de casos que apuntan a que la realización de estudios de RMC es segura en portadores de DAI convencionales, existen aún dudas sobre la seguridad (calentamiento del electrodo, disfunción del hardware y/o software, inducción de arritmias, etc.).156 Además, una limitación adicional de la RMC en pacientes con DAI es la presencia de artefactos que afecta a la adquisición de secuencias de realce tardío.156 Para salvar las dudas en seguridad y el artefacto de las imágenes de resonancia puede emplearse la información que aporta el mapeo de la cavidad ventricular desde el endocardio: i) características de los electrogramas bipolares endocárdicos; y ii) mapas de voltaje endocárdicos en unipolar. Se han identificado una una serie de características de los electrogramas endocárdicos bipolares en los mapas de activación que sugieren a un origen epicárdico de las TVMS (Fig. 19): i) área de activación endocárdico amplia (>2 cm2 de puntos con precocidades en un rango de aprox. 10 ms), ii) identificación en el área de mayor precocidad endocárdica de electrogramas far-field seguidos por electrogramas near-field; y iii) incapacidad para lograr buena concordancia estimulando el área de máxima precocidad endocárdica.157 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 34 Fig. 19. Características de los mapas de activación endocárdicos que sugieren origen epicárdico de la TV. Endo mapa de activación endocárdico; Epi= mapa de activación epicárdico. Adaptado de 157. Los mapas de voltaje endocárdicos unipolares mínimamente filtrados tienen un “campo de visión” mayor que los mapas bipolares, de tal forma que, la presencia de electrogramas de bajo voltaje permite identificar con razonable confianza áreas de bajo voltaje epicárdico.158,159 El umbral para considerar baja la amplitud de voltaje en los mapas en unipolares desde el endocardio varía según los estudios (entre 5.1 y 8.27 mV). 160 Cuando se considera una amplitud de voltajes endocárdicos unipolares normales >8.3 mV se evidencia que las áreas de bajo voltaje predice la presencia de bajo voltaje epicárdico en el 82% de los casos con un área de solapamiento promedio entre los mapas endocárdicos unipolares y epicárdicos bipolares del 60% (Fig. 20).159 Un punto a tener en cuenta de los estudios que evalúan el rol de los mapas endocárdicos unipolares comparándolos con mapas epicárdicos bipolares es que la grasa epicárdica puede sobreestimar la escara epicárdica. Un apunte importante es que la correlación entre los mapas endocárdicos unipolares y epicárdicos bipolares es peor en las miocardiopatías no isquémica.160,161 De esta forma, la presencia de mapas endocárdicos unipolares normales no permite descartar la presencia de escara profunda de forma categórica. CAPÍTULO 1 | Introducción general 35 Fig. 20. Empleo de mapas endocárdicos unipolares para predecir bajos voltajes epicárdicos. Se muestran dos ejemplos (A y B) que presentan voltajes endocárdicos bipolares, ENDO BIP, de amplitud normal; los mapas endocárdicos unipolares, ENDO UNIO, (umbral de tejido sano > 8.3 mV) presentan buena concordancia con los bajos voltajes epicárdicos, EPI BIP, (umbra de tejido sano > 1.0 mv). Reproducido de 159. 1.10. Técnicas para abordar el sustrato “no-endocárdico”0F * Como se ha comentado, las recurrencias tras los procedimientos de ablación de TV obedecen mayoritariamente a un fracaso del procedimiento inicial derivado de la existencia de sustrato inaccesible a la energía de radiofrecuencia aplicada desde el endocardio. A sabiendas de que las recurrencias de TVMS conllevan mayor mortalidad, se hace capital la búsqueda de * Dado que el presente trabajo se enfoca al abordaje de los sustratos arrítmicos profundos, particularmente aquellos presentes a nivel epicárdico, serán las técnicas que aborden el sustrato epicárdico las que se aborden con mayor profundidad. Las técnicas más dirigidas hacia el mesocardio como la ablación con aguja de radiofrecuencia o la ablación con radiofrecuencia bipolar se comentará más someramente y en último lugar. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 36 tratamientos que aborden este sustrato. A continuación, se detallan de forma somera algunos de los procedimientos desarrollados hasta la fecha, si bien, muchos de ellos aún no se han instaurado todavía en la práctica clínica. De todos estas técnicas, la ablación epicárdica percutánea es la más extensamente empleada en la práctica clínica presente.116 Incluso cuando las técnicas convencionales de ablación endo-epicárdicas con radiofrecuencia fracasan es importante no desistir y tratar de eliminar todo el sustrato arritmico.162 Un trabajo que incluyó pacientes sometidos a técnicas de ablación alternativas tras una recurrencia de TV tras 2 ó más procedimientos de ablación con catéter endo/epicárdica demostró controlar la TV en casi el 70% de los casos. ▪ Ablación epicárdica percutánea o mediante mini-toracotomía Una parte muy limitada del epicardio se puede explorar mediante un acceso transvenoso a través del seno coronario, lo cual no está exento de riesgos. Por esto y motivado por el hecho de que muchas TV tenían su sustrato a nivel epicárdico, en 1996 se publica la primera serie de 3 casos de miocardiopatía chagásica sometidos a ablación desde el epicardio, al cual se accedía mediante una punción a nivel subxifoidea empleando la técnica de Seldinger.163 Si bien inicialmente el acceso epicárdico se empleaba de forma anecdótica como rescate tras procedimientos de ablación de TV endocárdicos fallidos, cada vez es más habitual en los casos de ablación de TV (hasta el 19%).164 Con el conocimiento actual, tal vez lo difícil sea identificar a los pacientes que se benefician de un primer abordaje epicárdico o endo-epicárdico. El acceso subxifoideo consiste en la punción a nivel el ángulo esternocostal izquierdo y avance de una aguja de Tuohy (o de una microaguja dentro de otra aguja) hasta el espacio pericárdico, a través del espacio avascular de Larrey, guiado por fluoroscopia (Fig. 21).163,165–167 Aunque este abordaje del epicardio percutáneo es el más extendido, en casos donde se sospeche la presencia de adherencias (por ejemplo, por un antecedente de pericarditis purulenta o de cirugía cardiaca con esternotomía) se puede realizar un acceso quirúrgico (bien con minitoracotomía anterior o mediante la creación de una ventana de Marfan subxifoidea, en función de la región donde se sospeche tiene origen la TV).168–170 La presencia de adherencias no se CAPÍTULO 1 | Introducción general 37 considera una contraindicación absoluta al acceso percutáneo pues si son de escasa entidad pueden disecarse con un catéter deflectable, pero se sabe que se asocia a mayores complicaciones.165 En casos muy excepcionales donde los abordajes anteriores fracasan existe la opción de cirugía abierta y ablación del epicardio mediante crioablación, hasta alcanzar temperaturas de -140 º C.168–170 Cualquiera de estos accesos debe realizarse con anestesia general para el control del dolor y la seguridad del paciente. Fig. 21. Acceso epicárdico percutáneo. Imagen de tomografía computarizada (superior izquierda) que muestra los accesos pericárdicos anterior (flecha roja) y posterior (flecha verde), e imágenes fluoroscópicas que muestran la punción pericárdica (parte superior derecha): (A) tenting del diafragma, (B) punción a través del diafragma , (C) tenting en el pericardio, (D) contraste inyectado en el espacio pericárdico) y guías (puntas de flecha) en el espacio pericárdico (izquierda y media inferior) e inadvertidamente introducidas en el tracto de salida del ventrículo derecho (derecha inferior). AP, anteroposterior; CS, seno coronario; HB, registro de hisiograma; LAO, proyecciómn oblicua anterior izquierda; RV, ventrículo derecho. Reproducido de 167. La ablación epicárdica percutánea se ha demostrado eficaz en el tratamiento de las TVs en distintas cardiopatías (Tabla 3), incluyendo la cardiopatía isquémica, chagásica, dilatada idiopática, la cardiomiopatía por miocarditis y la cardiomiopatía arritmogénica. El éxito agudo publicado de la ablación epicárdica oscila de forma importante, desde un 50% hasta más del 90%, probablemente relacionado con el tipo de cardiopatía, el tipo de catéter empleado y los parámetros de Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 38 radiofrecuencias utilizados, así como la técnica de ablación empleada (ablación de sustrato vs. ablación convencional con mapeo de topoestimulación y activación).16,63,77,110,114,117,171–174 Cabe señalar que los estudios que persiguen definir el éxito de los procedimientos de ablación epicárdico están sesgados porque la mayoría de los pacientes han sido sometidos a un procedimiento endocárdico (fallido) previo. Fig. 22. Mapa electroanatómico epicárdico y correlación anatomopatológica. Correlación de áreas de bajo voltaje en CARTO (A) con el examen patológico macroscópico (B) que demuestra grasa epicárdica (epicardial fat) en el surco auriculoventricular posterior (línea discontinua roja) e infarto lateral lineal que se extiende desde la base hasta el ápex (línea discontinua negra). Los potenciales tardíos (late potentials) fueron específicos de las áreas de escara (epicardial scar). Obsérvese la contusión miocárdica a la derecha de la escara por punción epicárdica durante el acceso pericárdico. Confirmación histopatológica (x 100) de la escara epicárdica (C) por infarto transmural y tejido adiposo que recubre el miocardio normal (D). Reproducido de 161. Las técnicas de mapeo del epicardio son las mismas que las empleadas a nivel endocárdico.163,165–167. Sin embargo, la presencia de grasa en el epicardio - más frecuente en mujeres, pacientes añosos y con cardiopatía isquémica - puede dificultar el mapeo y la creación de lesiones profundas con radiofrecuencia. Aunque varios estudios han demostrado que un espesor de grasa epicárdica < 5 mm no afecta a la amplitud de los electrogramas o el umbral de estimulación, espesores mayores sí parecen disminuirlos, haciendo que se registren como zonas CAPÍTULO 1 | Introducción general 39 de bajo voltaje zonas de miocardio completamente sano bajo la grasa.175 La duda en estos casos es si el bajo voltaje se debe a la grasa o a la presencia de escara. En este sentido, si bien la grasa puede atenuar la amplitud de los electrogramas, no afecta a la duración de estos, de tal forma que los electrogramas de baja amplitud pero prolongados, fraccionados o con potenciales tardíos implican que el catéter de mapeo se encuentra sobre un área de bajo voltaje por escara (Fig. 22).161 Las aplicaciones de radiofrecuencia en zonas con espesores de grasa epicárdica > 10 mm no producen lesiones significativas.176 De hecho, al comparar la eficacia de la ablación de un catéter de ablación estándar de 4 mm contra la de un catéter de ablación con irrigación externa se observa que en áreas con espesores de grasa > 3 mm sólo el catéter con irrigación externa logra producir lesiones profundas.176 En relación a la valoración del contacto del catéter, cabe señalar que en el epicardio pueden registrarse fuerzas de contacto adecuadas que no implican adecuado contacto, siendo la orientación del catéter lo más importante.177 Aunque el empleo de energía de radiofrecuencia es lo más habitual para la ablación epicárdica – pudiéndose emplear parámetros más liberales por el menor impacto que tienen el charing y los pops – , también se han ensayado otras fuentes de energía como la criotermia, láser, etc. que, no obstante, no han tenido tanto éxito. Las complicaciones mayores de la ablación epicárdica se estiman entre un 4.5 y un 5%.164,178 Entre estas destacan especialmente la punción del ventrículo derecho y la lesión del nervio frénico o de las arterias coronarias. La complicación más frecuente, sin embargo, es la pericarditis “seca” (20-30%) y, anecdóticas, la laceración hepática, el pseudoaneurisma de ventrículo derecho, la fístula del ventrículo derecho al abdomen, etc. Aunque no existen ensayos clínicos que las avalen, existen descritas varias técnicas para prevenir el daño al nervio frénico tales como comprobar la ausencia de captura con salidas altas (estímulos de hasta 10mA) antes de la ablación, interposición de un balón de angioplastia periférico relleno de agua y aire en las zonas donde se aplique radiofrecuencia y se haya documentado captura frénica, entre otras.166 Para evitar el daño a las arterias coronarias, se aconseja la realización de una coronariografía o de la fusión de imágenes de angioCT con el mapa electroanatómico para garantizar que no se realicen aplicaciones de radiofrecuencia a una distancia menor de 5 mm de las arterias coronarias (aunque algunos grupos toman hasta un 1 cm de distancia, particularmente en la vecindad de arterias de diámetro < 0.5mm que son las más vulnerables).179,180 La instilación de glucocorticoides en el pericardio reduce la incidencia de pericarditis en un modelo porcino.181 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 40 ▪ Ablación con etanol transcoronario o transvenoso La ablación con alcohol transcoronario consiste en la administración intracoronaria de etanol para inducir daño celular y eliminar el sustrato arrítmico.182,183 La elección entre una ablación anterógrada por arterias coronarias o retrógrada por el sistema venoso deberá supeditarse a la facilidad de alcanzar el foco arrítmico, si bien con esta segunda modalidad existe menos experiencia.184 En modelos animales se ha ensayado la inyección directa en el miocardio del alcohol, aunque sin extensión a la práctica en humanos.185,186 Tabla 6. Algunas series de casos de ablación con etanol transcoronario. BAV= bloqueo auriculoventricular completo. Adaptada de Gianni et al. 187 Serie N Edad (años) Isquémicos (%) Éxito (%) Complicaciones (%) Seguimiento Recurrencia (%) Brugada 1989 188 3 56 100 100 33 (BAV) 1-6 meses 33 Dailey 1992 189 4 - 100 100 25 (BAV) 4-25 meses 50 Kay 1992 190 10 100 100 90 40 (BAV) 4 meses 25 Segal 2007 191 5 70 80 100 0 19 meses 0 Sacher 2008 192 9 55 67 89 33 29 meses 33 Tokuda 2011 193 22 63 52 82 38 (BAV) 16 días 64 El éxito de la ablación con alcohol transcoronario está íntimamente relacionado con la capacidad de relacionar el tejido arritmogénico con una rama arterial que lo irrigue; esto puede realizarse por la proximidad anatómica entre electrocatéter de mapeo y la angiografía. Otra forma de detectar el ramo arterial diana consistiría en la fusión de imágenes de angioTC con imágenes de RMC.194 Si bien la mayoría de series de casos publicados son en TV en cardiopatía isquémica, también ha sido de utilidad en la miocardiopatía chagásica, la miocardiopatía hipertrófica y dilatada primarias y en la miocardiopatía valvular (Tabla 6).193,195,196 Una vez identificada la arteria que irriga el tejido arrítmico, esta debe poderse canular selectivamente para avanzar un balón coaxial que se inflará para administrar contraste yodado a su través (Fig. 23).197 Esto permitirá descartar la presencia de reflujo hacia vasos proximales, así CAPÍTULO 1 | Introducción general 41 como la existencia de circulación colateral, evitando así un daño miocárdico descontrolado. Previa a la administración de etanol debe comprobarse que se trata de la rama arterial que efectivamente irriga el sustrato arrítmico; la comprobación consiste en el cese transitorio de la TV (si se lograse inducir) tras la infusión de suero frío por el balón coaxial.198 Si elimina la inducibilidad, se administrarán 1-2 ml de etanol absoluto por el balón coaxial, que se mantendrá inflado durante unos 10 minutos para posteriormente comprobar si existe permeabilidad del vaso.199 La selección de pacientes adecuados para la ablación con alcohol transcoronario es clave pues no está exenta de riesgos (bloqueo auriculoventricular, rotura cardiaca, infarto masivo, disección coronaria, etc.). La creación de un nuevo sustrato arrítmico secundario a la infusión de alcohol no se ha estudiado bien, pero puede especularse a partir de la experiencia con la ablación alcohólica septal en la miocardiopatía hipertrófica que es poco probable. Sin embargo, no existen seguimientos prolongados para ser categóricos al respecto.200 Fig. 23. Procedimiento de ablación con etanol transcoronario. A) Se avanza una guía coronaria de 0.014’’ (flecha) hacia el ramo bisectriz. B) Se avanza balón coaxial (flecha que señala la marca radioopaca del balón) y se infla hasta ocluir el ramo bisectriz para retirar posteriormente la guía coronaria de 0.014’’ y conectar la luz del balón a una jeringuilla (con suero frío primero y con etanol después). C) Tras 10 minutos se desinfla el balón y se evidencia oclusión del ramo bisectriz. Reproducido de A Carta y A Arenal 201. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 42 ▪ Ablación con radioterapia estereotáctica La radioterapia estereotáctica (o radioablación) consiste en la aplicación de radioterapia externa sobre aquellas áreas del miocardio donde se sospecha se encuentra el circuito reentrante de la TV. La radioablación surge del maridaje entre la cardiología y la oncología radioterápica, donde la radioterapia ya se utiliza para el tratamiento de algunos tumores (incluyendo tumores cardiacos) con gran tasa de éxito y escasos efectos adversos.202 Tras varios estudios preclínicos en modelos animales que demuestran que la radioablación con varios tipos de radiación induce cambios electrofisiológicos (entre ellos, disminuir la inducibilidad de TV en modelos post-infarto) con escasa afectación de la función ventricular o de efectos adversos serios, en 2015 se realiza el primer caso de radioablación en un humanos.203,204 Se administró una dosis única de 25 Gy sin fraccionar con el sistema CyberKnife sobre el área que hubiese correspondido a la zona de ablación de sustrato con catéter y se observó que el número de episodios de TV disminuyó de forma notoria (de 562 los 2 meses previo a 52 entre los 2 y 9 meses que siguieron al procedimiento). A partir del caso anterior, se estudia la realización de radioablación a pacientes con más de 3 episodios de TV en los 3 meses previo, pese a tratamiento con 2 FAAs, y con fallo o contraindicación para la ablación con catéter.205 La primera serie de casos publicados seleccionó el área objetivo de la radioterapia a partir de un mapa electrocardiográfico no invasivo (mediante un chaleco de 256 electrodos) durante la inducción de la TV con el DAI; esta información se combina con la imagen del TC (o bien de la RMC, si se disponía de esta) para radiar el miocardio activado en los primero 10 ms de la TV (Fig. 24) – sólo en 1 caso no se logró inducción de la TV y se empleó la información del estudio electrofisiológico invasivo previo para identificar el área objetivo. Esta primera serie incluyó un total de 5 pacientes; tenían una edad media de 66 años, 2 tenían diagnóstico de cardiopatía isquémica, la FEVI promedio era de 23 % y la clase funcional era NYHA III-IV en todos los casos. Todos los pacientes presentaron descenso de la carga arrítmica; en conjunto, se consiguió pasar de 6577 episodios de TV en los 15 pacientes-meses previos al tratamiento a 4 episodios de TV en los siguiente 46 pacientes-meses. Tras 12 meses de seguimiento 4 de los 5 pacientes seguían vivos, y 3 de ellos habían dejado el tratamiento con FAAs. No se documentaron efectos adversos, aunque en los TC de seguimiento se evidenciaban datos de neumonitis rádica que se resolvió espontáneamente. CAPÍTULO 1 | Introducción general 43 Fig. 24. Protocolo de radioablación estandarizado.205 Empleando los mismos criterios de selección de pacientes y el mismo esquema de Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 44 tratamiento el mismo grupo que publicó la primera serie de casos de radioablación publicó un ensayo clínico fase I/II (ENCORE-VT) que incluyó a un total de 19 pacientes con un perfil clínico similar.206 En los primeros 90 días tras la radioablación sólo 2 pacientes desarrollaron efectos adversos serios posiblemente relacionados con el tratamiento (descompensación de insuficiencia cardiaca; pericarditis). Además, se produjo una disminución significativa en la mediana del número de episodios de VT (119 vs 3; p <0.001). Pese a los datos esperanzadores, aún quedan muchas dudas por resolver (¿cuáles son los efectos adversos a largo plazo?, ¿cómo logra su efecto antiarrítmico la radioterapia?, ¿un esquema no fraccionado de 25 Gy es el óptimo?, ¿es precisa la información del mapeo electrocardiográfico no invasivo?, etc.) que exigen cautela a la hora de hacer su uso más extensivo.206 ▪ Ablación con radiofrecuencia bipolar o unipolar simultánea En la aplicación convencional con radiofrecuencia unipolar, se administra una corriente desde la punta del catéter de ablación hasta un parche dispersor de corriente adherido a la piel, produciéndose la mayor densidad de corriente en la punta del catéter, lo que produce calentamiento resistivo del tejido adyacente. Con idea de ampliar la profundidad de las lesiones se estudiaron 2 posibilidades: i) ablación unipolar simultánea, es decir realizar aplicaciones a la vez a cada lado del foco, y ii) ablación de radiofrecuencia bipolar, que consiste en el paso de la corriente entre la punta de 2 catéteres enfrentados con el tejido que se desea ablacionar en medio (Fig. 25).187 Estudios con modelos experimentales animales han demostrado que tanto la ablación unipolar simultánea como la ablación con radiofrecuencia bipolar producen lesiones mayores que aquellas producidas por ablación unipolar secuencial; sin embargo, estas 2 formas de ablación no han sido comparadas entre sí en un contexto clínico.202 Si bien la mayor parte de la literatura que aborda estos tipos de ablación se centra en el sustrato arrítmico intramural a nivel del septo interventricular también se han empleado para el tratamiento de sustrato profundo en las paredes miocárdicas.207,208 Con respecto a la ablación unipolar simultánea, una serie de 14 casos de TV idiopáticas en el tracto de salida de ventrículo izquierdo refractarias a un primer abordaje desde el endo- o CAPÍTULO 1 | Introducción general 45 epicardio, pudieron tratarse con éxito mediante ablación unipolar secuencial o simultánea.209 El beneficio de la ablación unipolar simultánea sobre la secuencial radica en la aumentar la temperatura en el miocardio profundo por aumento del calor conductivo. Con respecto a la ablación bipolar, que se comentará a continuación, tiene la ventaja de no precisar de material distinto al habitualmente presente en una sala de electofisiología y de permitir controlar la potencia de radiofrecuencia y registrar la impedancia en los 2 catéteres. Fig. 25. Tipos de configuración de la ablación de radiofrecuencia. En relación con la ablación con radiofrecuencia bipolar, una serie de 6 pacientes refractarios a una ablación unipolar secuencial (4 pacientes con TV septales y 2 con TV de pared libre de ventrículo izquierdo) documentó la eliminación del 78% de las TV inducibles con la ablación bipolar. Tras un seguimiento promedio de 12 meses, el 50% de los pacientes permanecía libre de recurrencias (2 de los 4 pacientes con TV septal y 1 con TV de pared libre).210 El inconveniente fundamental de esta técnica es la incapacidad para regular la potencia y temperatura del catéter conectado a la toma de tierra y la incapacidad para detectar la posición exacta de este catéter con el sistema de navegación. No se produjeron muertes peri-procedimentales. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 46 ▪ Ablación con empleo de aguja intramiocárdica En 2019 se publica la mayor serie de casos de pacientes con TV o taquicardiomiopatía por ectopia ventricular sometidos sometidos a ablación con aguja intramiocárdica.202,211 En todos los casos había fracasado el tratamiento antiarrítmico y las ablaciones convencionales con catéter de radiofrecuencia. Así, para sustratos profundos no abordables desde el endocardio o para aquellos casos donde el acceso epicárdico no es posible o es limitado (por ejemplo, adherencias pericárdicas) surge la ablación con aguja intramiocárdica. El catéter de ablación con aguja consiste en un par de electrodos distales (electrodo de anillo y de punta) junto con un orificio en su extremo que permite la salida de una aguja retráctil de 26-G y hasta 10 mm de longitud (Fig. 26). La aguja está aislada eléctricamente de los otros 2 electrodos, y permite sensar y estimular (bien en unipolar o bien en bipolar con el electrodo de la punta). El principal reto de esta técnica consiste en la identificación de los objetivos de ablación, que se realiza con mapeo desde el endocardio bien en sinusal o con estimulación ventricular continua, o bien en TV cuando esta se inducía y se toleraba hemodinámicamente. Las áreas sospechosas de encontrarse próxima al circuito reentrante por mapeo de activación o encarrilamiento (TV bien toleradas) o con mapeo de topoestimulación y de voltaje (TV mal toleradas o no inducibles) se marcaban para la punción.202,211 Fig. 26. Sistema de ablación con aguja de radiofrecuencia intramiocárdica. Reproducido de 202 CAPÍTULO 1 | Introducción general 47 En la serie de casos referida la edad media de los pacientes era de 62 años, el 71% presentaba una cardiopatía no isquémica y 71% habían sido sometidos a  2 procedimientos de ablación con radiofrecuencia convencional (39% con acceso epicárdico).202 Se identificaron los objetivos de ablación y en esos puntos se realizó punción con aguja; si se lograba captura miocárdica (pulsos de 10 mA x 2 ms) se infundía una dilución de contraste yodado y salino por la aguja y se procedía con la ablación (máximo 50W y 60ºC); si no se lograba captura se realizaba punción en otra localización. Tras una media de 15 punciones por paciente y 6 meses de seguimiento, 48% de los pacientes permanecían libres de TV y un 19% experimentaron una disminución en la carga arrítmica (es decir, globalmente, el 68% de los pacientes experimentaron algún grado de mejoría). En los 30 días que siguieron al procedimiento, un 12% de los pacientes presentaron complicaciones no mortales potencialmente relacionadas con la ablación (1 pericarditis, 1 hematoma femoral, 1 bloqueo auriculoventricular y 1 desplazamiento de electrodo de resincronizador).162 1.11. Necesidad de estrategias novedosas La erradicación total de las taquicardias ventriculares se ve frustrada, como se ha visto anteriormente, por la presencia de sustrato arrítmico difícilmente accesible con el catéter de radiofrecuencia. Así, se han desarrollado nuevos abordajes y energías ablativas para la eliminación de este sustrato. Sin embargo, estas nuevas técnicas no son perfectas y todas ellas, con la posible excepción de la radiocirugía esterotáxica, exigen unos conocimientos muy avanzados de electrofisiología para identificar el sustrato arrítmico. Además, estas técnicas tienen en común que combaten un sustrato que ya ha demostrado sostener taquicardias ventriculares. Para salvar los retos de las distintas técnicas de abordaje de sustrato no-endocárdico que se han comentado, cabe pensar en terapias que frenen la aparición del sustrato arrítmico (prevención primaria) y no persigan eliminarlo cuando ya ha demostrado su suficiencia para el sostenimiento de taquicardias ventriculares (prevención secundaria). Idealmente estas nuevas técnicas deben poder ser sencillas y no requerir de unos conocimientos avanzados de electrofisiología para que puedan ser implantadas en el máximo número posible de centros. En vista del papel prometedor, que se comentará a continuación, de la terapia celular regenerativa en el ámbito de la medicina cardiovascular, donde nuestro centro tiene una amplia trayectoria investigadora, consideramos Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 48 estudiar el empleo de células madre cardiacas para el abordaje del sustrato arrítmico epicárdico.212– 219 1.12. Células madre en cardiología La mayoría de las células del cuerpo humano adulto están completamente diferenciadas y no poseen capacidad de división celular. Si estas células se pierden son reemplazadas por la proliferación de células menos diferenciadas derivadas de células madre autorrenovables, las cuales están presentes en la mayoría de los tejidos adultos.220 La propiedad clave de las células madre es que se dividen para producir una célula hija que sigue siendo una célula madre y otra que se divide y diferencia.221 Clásicamente, el corazón de los mamíferos se consideró un órgano post-mitótico sin capacidad para regenerarse, siendo sustituido su tejido por escara ante una agresión. Sin embargo, partiendo del descubrimiento de que el corazón de algunos vertebrados como la salamandra o el pez cebra tenía capacidad endógena para regenerarse, se demostró que el corazón adulto murino presentaba una renovación celular (turnover) de un 1% anual.222,223 Posteriormente, aprovechando el incremento en los tejidos de los niveles de carbono-14 en los tejidos derivados de la prueba de armas nucleares durante la Guerra Fría, se demostró que el corazón humano también presenta un recambio celular de aproximadamente un 1 % anual. Aunque esta tasa de recambio es claramente insuficiente para poder regenerarse las regiones dañadas en la gran mayoría de las enfermedades cardíacas, sí demuestra que el corazón tiene cierto poder de recuperación.224 La terapia celular cardiaca surge con la hipótesis de poder reparar o reemplazar el tejido miocárdico dañado mediante el empleo de distintos tipos de células madre o de sustancias derivadas de ellas.224 La mayoría de los productos celulares ensayados se han empleado en el seno de la cardiopatía isquémica o la insuficiencia cardiaca con el objetivo principal de mejorar la función ventricular.225 Sin embargo, la modesta mejoría de la función y las dimensiones ventriculares que se ha demostrado hasta la fecha, como se verá a continuación, no es óbice para plantear su uso para un objetivo menos “ambicioso” que la generación de nuevo tejido miocárdico como es la modificación de la escara que constituye el sustrato de las arritmias ventriculares. CAPÍTULO 1 | Introducción general 49 ▪ Lecciones aprendidas de la terapia celular 1F † A principios de los años 2000, varios estudios preclínicos defendieron que las células derivadas de la médula ósea adulta (“bone marrow cells” o BMCs 2F ‡; que incluyen células mononucleares de la médula ósea, progenitores hematopoyéticos y células mesénquimales de la médica ósea) eran capaces de transdiferenciarse en cardiomiocitos cuando se implantaban en el corazón.226,227 Aunque posteriormente se demostró que las BMCs no se transdiferenciaban en otros tejidos que no fuesen células hematopoyéticas, los estudios anteriormente referidos dieron paso a una pléyade de ensayos clínicos, fundamentalmente en pacientes con infarto agudo de miocardio o insuficiencia cardiaca, con el objetivo final de reemplazar el tejido dañado por tejido contráctil (teoría de “remuscularización”).228–230 A pesar de los resultados inconsistentes de los distintos ensayos clínicos, un metaanálisis que incluyó 38 ensayos aleatorizados con BMCs demostró la seguridad de esta terapia y un robusto efecto positivo sobre la FEVI, aunque sin encontrar diferencias en mortalidad entre los grupos tratado y control.231 Para justificar aquellos trabajos que demostraron mejoría de ciertas variables surrogadas (FEVI, volúmenes ventriculares, etc.) surgió la teoría paracrina que proponía que los efectos beneficiosos de la terapia celular derivaban de la liberación de una variedad de proteínas (factores de crecimiento, citoquinas, etc.) que modularían positivamente procesos endógenos como la angiogénesis, la inflamación o la fibrosis, además de “activar” a células madres residentes en el corazón.232,233 La teoría paracrina ha ido ganando terreno a la teoría de la remuscularización durante la última década al demostrarse la existencia en el miocardio de células madre bona fide cardíacas y ante la evidencia clara de que las células extracardiacas infundidas no se injertaban y aun así se producían efectos positivos (Fig. 27).227 † Tal como se verá en el apartado de Materiales y método (capítulo 3), dado que el producto celular empleado en este trabajo son las células madre cardiacas derivadas de cardioesferas (CDC), sólo se provee un resumen somero de las teorías de la terapia celular y de los otros productos celulares ensayados para comprender por qué la elección de las CDC. ‡ Aunque en muchos artículos de revisión se habla de células madre derivadas de médula ósea, algunas de las células estudiadas no se consideran estrictamente células madre, por lo que nos referimos a ellas exclusivamente como células derivadas de médula ósea. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 50 Fig. 27. Productos celulares estudiados en medicina regenerativa cardiaca junto con los mecanismos de acción propuestos de cada una de ellas. Reproducido de 234. Antes del empleo de BMCs, se estudió el empleo de mioblastos esqueléticos autólogos, sin embargo, las dudas sobre el riesgo aumentado de arritmogenicidad y los resultados neutros del primer ensayo en humanos hicieron abandonar esta vía de investigación.235,236 Conforme se sucedían los estudios neutrales sobre las BMCs, surgió el interés por una “segunda generación” de productos celulares, entre los que destacaron las mencionadas células madres cardiacas endógenas (eCSC, de las siglas en inglés endogeneous cardiac stem cells).232 El fundamento principal para el estudio de las eCSC era que la reparación o reemplazo sería más fácil si se empleaban células fenotípicamente cercanas a los cardiomiocitos. Como se comentó con anterioridad, se acepta que existen eCSC que se encargan que la lenta generación de nuevos cardiomiocitos a lo largo de la vida; se autorenuevan, son clonogénicas y tienen capacidad de diferenciación trilineal.224,237 Tras la descripción iniciales de las eCSC se han descrito hasta 8 poblaciones identificadas en base a la presencia de ciertos marcadores de superficie, CAPÍTULO 1 | Introducción general 51 frecuentemente compartidos entre estas poblaciones; la creencia más extendida actualmente es que se trata de variaciones fenotípicas de una misma células madre cardiaca.238,239 Entre las distintas poblaciones de eCSC descritas, sólo las eCSC c-kit + (sin marcadores del linaje hematopoyético), las cardioesferas (CS) y las células derivadas de cardioesferas (CDC) se han estudiado en ensayos clínicos.239 3F § A pesar de resultados preclínicos contradictorios en relación a la capacidad de diferenciación de las eCSC, estudios de localización celular tras la administración demostraron que la diferenciación a cardiomiocitos era lo suficientemente escasa como para no lograr una remuscularización significativas tras una agresión.230,238,240–243 Añadido a lo anterior, varios estudios han demostrado que las eCSC rápidamente envejecen en los cultivos y sólo se injertan transitoriamente en el corazón.244 Así, los efectos positivos que demuestran las eCSC en los ensayos clínicos, también parecen explicarse por la teoría paracrina (ver más adelante).227 Con respecto a las BMCs, las eCSC parecen tener mayor potencial paracrino.245 Dentro de las células de “segunda generación” se encuentran también las células madre embrionarias (ESCs) y las células madre pluripotenciales inducidas (iPSCs) 4F **, cuyo efecto sí parece producirse parcialmente mediante la remuscularización. Inicialmente, guiados por la creencia de que el medio ambiente cardiaco (millieu) podría favorecer la diferenciación de ESCs hacia cardiomiocitos, se probó a inyectar ESCs en el miocardio de ratones, donde dieron lugar a teratomas.246 Para salvar esta complicación, se probó a realizar el implante de cardiomiocitos derivados de ESCs (CM-ESCs). Tras comprobar que las CM-ESCs humanas se injertaban y mejoraban la función de corazones murinos infartados, varios estudios posteriores en primates inmunosuprimidos ratificaron los resultados positivos.247–249 Como se verá más adelante, aunque prometedor, el empleo de CM-ESCs aún tiene muchos retos por delante, entre los que destacan la arritmogenicidad, la histocompatibilidad y los dilemas éticos.250 § Las eCSC pueden migrar al depositar una biopsia cardiaca en un medio de cultivo y formar conglomerados celulares esferoides de 20-500 m de diámetro, de donde surge la denominación de CS. Las CS contienen en su núcleo eCSC indiferenciadas que se rodean de células con un mayor grado de diferenciación en su periferia. Las CDC han demostrado producir mayor efecto paracrino que las CS.364,432 ** Las ESCs son células obtenidos de la capa celular del blastocisto que, mediante protocolos de diferenciación pueden diferenciaren en cualquier tipo celular (por ejemplo, en cardiomiocitos). Las iPSC son células somáticas adultas que pueden reprogramarse a un estado de pluripotencialidad similar a la de las ESCs bajo la influencia de ciertos factores de transcripción.234 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 52 Para salvar la problemática ética de las ESCs y las CM-ESCs, surgen las iPSCs, que han demostrado poderse diferenciar a distintos tipos celulares, incluyendo los cardiomiocitos, y mejorar la función ventricular y reducir el tamaño de la escara.251,252 ▪ Retos de la teoría de la remuscularización Como se ha comentado, la remuscularización cardiaca se encuentra aún en estadios de investigación incipientes, aunque con gran optimismo dado los trabajos con ESCs y las iPSCs.227 Sin embargo, el camino hasta su prueba en humanos tiene que salvar varios retos: • Lograr una producción a gran escala. Para reemplazar los cardiomiocitos perdidos por ejemplo tras un infarto de miocardio (del orden de billones) son necesarias un gran número de células. Si bien las BMCs son óptimas en este sentido, su incapacidad para transdiferenciarse hacia cardiomiocitos las rechaza para la estrategia de remuscularización. Las CSCs, aunque tienen cierto potencial limitado para transdiferenciarse se encuentran en un número muy bajo en el corazón y no pueden conseguirse en grandes cantidades fácilmente.224,228,239 Así, y aún a falta de estudios consistentes en animales grandes, las CM- ESCs y las iPSCs parecen las mejores candidatas a lograr la remuscularización.227 • Incrementar la supervivencia de las células trasplantadas. Tras la administración de cualquier tipo de célula al miocardio isquémico o sano, se evidencia una rápida e importante pérdida del número células.250 Se han ensayado varias estrategias para aumentar la supervivencia celular (preacondicionamiento de las células, tratamiento farmacológico, etc.), pero ninguna de ellas ha alcanzado el ámbito de la clínica.253,254 Otro punto clave es cómo evitar o paliar la respuesta inmune de rechazo a las células alogénicas trasplantadas.234 • Optimizar el acoplamiento mecánico. Aún resulta un reto lograr que las células se injerten y se acoplen eléctricamente con el resto del sincitio ventricular para evitar el potencial proarrítmico.255 ▪ Retos de la teoría de la paracrina Los efectos paracrinos son aún poco entendidos pero son reproducibles, se han demostrado CAPÍTULO 1 | Introducción general 53 con todos los productos celulares estudiados y son hasta la fecha el objetivo de la terapia celular que goza de más refrendo.234 Pese a esto, los productos celulares que ejercen su efecto fundamentalmente por vía paracrina no están libres de retos, entre los que destacan (Fig. 28): Fig. 28. Retos de la teoría paracrina en la terapia regenerativa cardiaca. Adaptado de 227. • Selección de células con alto perfil secretor. Aún quedan dudas respecto a cuál el producto celular óptimo, aunque algunos estudios destacan a las CSCs y a las células mesenquimales en este sentido.247,256 • Lograr una fuente consistente de células. Si bien para el efecto paracrino no es imprescindible la administración de un número de células tan elevado como para la remuscularización, el empleo de células autólogas implica un proceso de extracción más o menos cruento (bien de la médula ósea o de la sangre periférica con aféresis para las BMCs o de biopsias cardiacas en el caso de las CSCs). Además, para asegurar la funcionalidad de las células es imprescindible una estandarización de los procedimientos de obtención, aislamiento y cultivo. Se sabe además que la edad y las comorbilidades de los pacientes impactan negativamente en la funcionalidad de las CSCs.257 Una solución a este inconveniente ha sido el empleo de fuentes alogénicas (células de donantes no emparentados) que permitan estandarizar la calidad y las propiedades de un producto celular que podría disponerse off-the-shelf.239 Las células alogénicas que actúan fundamentalmente por vía paracrina no se integran en el tejido cardiaco y actúan mediante Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 54 respuestas inmunitarias moduladores, desapareciendo en 24-48 horas sin provocar respuestas de rechazo inmune humoral o celular ya que no expresan moléculas de histocompatibilidad.239,258 259–262 • Optimizar la retención de las células. Los productos celulares deben retenerse un tiempo suficiente en el corazón para poder ejercer su efecto paracrino.250 Las BMCs administradas de forma intramiocárdica, comparado con las que son administradas por vía intracoronaria, se retienen un mayor tiempo y se asocian a mejoría de la FEVI y de parámetros funcionales en pacientes con miocardiopatía dilatada idiopática.263 Adicionalmente, la administración conjunta de BMCs y alginato mejoran la retención celular y los efectos paracrinos.264 ▪ Vías de administración celular Aunque en menor medida que con la teoría de la remuscularización, uno de los principales retos de la teoría paracrina es lograr la administración de un número suficiente de células en el lugar deseado, por ejemplo, la región miocárdica adyacente a la escara del infarto.265. Además, es preciso que las células se retengan un tiempo suficiente para poder liberar las sustancias y poder así modular los procesos endógenos de reparación (fibrosis, angiogénesis, reclutamiento de células madre cardiacas endógenas, etc.). La mayoría de las vías de administración de la terapia celular estudiadas hasta la fecha o bien no consiguen una retención de las células en el corazón suficientemente prolongada para lograr su efecto, o bien implican procedimientos invasivos.227 Entre las vías de administración estudiadas hasta la fecha se encuentra las inyecciones intramiocárdicas, la vía intracoronaria, los depósitos epicárdicos en cirugías cardiacas o la administración sistémica intravenosa.250,266 Las inyecciones intramiocárdicas (desde el epicardio en cirugías cardíacas o desde el endocardio con catéteres específicos) han mostrado grados de retención celular adecuados y mejores que los de la vía intracoronaria, evitando además el riesgo de embolias en la microcirculación con la administración de cantidades elevadas de células en el segundo supuesto.266–270 Como es obvio, la administración (trans)epicárdica en quirófano durante procedimientos de cirugía cardiaca es invasiva y esto limita su aplicabilidad.266,271 Así, surgió la necesidad de estudiar abordajes mínimamente invasivos para la administración de células en el corazón, entre ellos el abordaje epicárdico percutáneo.272–274 El espacio pericárdico que, en condiciones fisiológicas unos 15-25 ml de líquido pericárdico (de CAPÍTULO 1 | Introducción general 55 composición similar al ultrafiltrado de plasma) con un turnover estimado de unas 7h, se ha postulado como un candidato más idóneo para la administración de medicamentos.275–278 A partir de varios estudios con animales que demuestran que la administración intrapericárdica de fármacos es segura, eficaz e incluso carece de algunos efectos adversos atribuidos a la administración sistémica, se extiende la idea al campo de la terapia celular cardiovascular.279–283 Además, trabajos que han estudiado el implante de catéteres de larga duración intrapericárdicos para la administración de fármacos demostraron que no se producían daños en el punto de entrada o en el epicardio.284 Teóricamente, la administración intrapericárdica percutánea goza de varias ventajas: i) es relativamente poco invasiva, ii) permite la administración de cantidades elevadas de células, iii) garantiza un tiempo de retención de las células prolongado en el corazón, y iv) no depende del estado de la circulación sistémica para poderse administrar.267 La administración de BMCs intrapericárdica con punción subxifoidea se ha demostrado segura.272 Además, se ha comprobado que el líquido pericárdico no compromete la viabilidad y el perfil fenotípico de las células, las cuales persisten, al menos, hasta 7 días en el espacio pericárdico.272 Por su parte, la administración de CS en el espacio pericárdico porcino también ha demostrado ser segura e inducir cambios positivos en parámetros bioquímicos e inmunológicos en el postinfarto.285,286 Un estudio aleatorizado con administración de CS en ratas postinfarto demostró la persistencia del producto celular en el espacio pericárdico tras 4 semanas, documentándose una mejoría de la FEVI y del volumen ventricular, junto con una disminución en el tamaño de la escara en las ratas tratadas con CS.287 ▪ Células madre cardiacas en ensayos clínicos En consonancia con lo expuesto, las CSCs han sido hasta la fecha el producto celular que mayores resultados ha tenido en los ensayos clínicos.239 Sin embargo, la comunidad científica coincide en la escasez de estudios preclínicos que investiguen el mecanismo de acción de las CSCs que, hasta la fecha, parece depender predominantemente del efecto paracrino.227 El ensayo clínico aleatorizado fase I SCIPIO evaluó la seguridad y eficacia de la administración intracoronaria de CSC c-kit+ autólogas en pacientes con cardiopatía isquémica crónica sometidas a cirugía de revascularización.288 En este trabajo no se registran eventos Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 56 adversos atribuibles a las CSCs y se evidenció una mejoría de la FEVI (evaluada con ecocardiografía), de la calidad de vida y de la capacidad funcional entre los pacientes que recibieron las CSCs, que era evidente a 4 meses del tratamiento y se mantenía hasta 1 año después. Fig. 29. Resultados del estudio SCIPIO. A) Tamaño del infarto (en gramos, g) a los 4 y 12 meses después de la infusión de CSCs medido en la RMC mediante delineación manual. B) Reducción del tamaño del infarto a los 4 y 12 meses después de la infusión de CSCs. C) tamaño del infarto “central” a los 4 y 12 meses después de la infusión de CSCs medido en la RMC mediante la técnica de FWHM. D) Reducción del tamaño del infarto central a los 4 y 12 meses después de la infusión de CSCs. Reproducido de 289. Un estudio de la cohorte de pacientes que recibieron CDCs en el estudio SCIPIO, valoró el impacto de las CDCs sobre el tamaño de la escara.289 Tras un año se demostró un incremento de la FEVI (de 27.5 a 41.2%, p= 0.013). Además, evaluado mediante 3 técnicas distintas (FWHW, delineación manual de la escara y delineación semiautomática) observan una reducción CAPÍTULO 1 | Introducción general 57 significativa del tamaño de la escara tras un 1 año de seguimiento, siendo en el peor caso de un – 30.2% (Fig. 29). Además, también evidencian una reducción de la masa de miocardio no viable (entendiendo con esto aquellas áreas donde la escara se extiende >50% del grosor miocárdico) y un aumento de la masa viable. La eficacia de las CDCs se evaluó en el ensayo clínico fase I CADUCEUS, que aleatorizó a 25 pacientes tras 2-4 semanas de un infarto agudo de miocardio y FEVI 25-45% a CDCs autólogas intracoronarias o a placebo.290 Tras 6 meses de seguimiento, la terapia celular se mostró segura y sugiere ser eficaz con disminución del tamaño de la escara y aumento de la masa fiable evaluadas mediante RMC, aunque sin cambios en la FEVI o los volúmenes ventriculares. Estos cambios persistieron tras 1 año de seguimiento.291 Más tarde, el ensayo ALLSTAR, aleatorizó 2:1 a 134 pacientes a la administración intracoronaria de CDCs alogénicas o placebo tras 4-12 meses de un infarto de miocardio. El estudio fue detenido prematuramente por futilidad en un análisis intermedio.291 Sin embargo, el estudio ratificó la seguridad de la terapia y evidenció que el grupo tratado con CDCs mantuvo volúmenes ventriculares estables, mientras que el grupo control presentó un aumento tras 6 meses de seguimiento; sin embargo, no se detectaron diferencias en el tamaño de la escara. Estas diferencias con respecto al estudio CADECEUS podrían deberse a la distinta naturaleza de las CDCs empleadas o al tiempo de administración de las células tras el infarto.290–292 Estos resultados están en consonancia con el ensayo clínico no controlado DYNAMIC que emplea CDCs alogénicas intracoronarias en pacientes con insuficiencia cardiaca y FEVI deprimida. En el estudio DYNAMIC se cumplió el endpoint de seguridad y se evidenció mejoría de la FEVI y los volúmenes ventriculares tras 6 meses de seguimiento.293 El ensayo clínico fase I/II CAREMI aleatorizó a 49 pacientes tras 5-7 días de un infarto agudo de miocardio y FEVI 45% a la administración intracoronaria de CDCs alogénicas o a placebo 258. La terapia se mostró segura, pero en este trabajo no se evidenciaron datos de eficacia, si bien el estudio carecía de potencia estadística para este análisis. Los pacientes con anticuerpos citotóxicos anti-HLA antes de recibir las CDCs o que los desarrollaban posteriormente no presentaron eventos adversos, y no se observaron reacciones de hipersensibilidad al producto celular administrado. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 58 1.13. Nicho y oportunidad de este trabajo Como se ha comentado, los sustratos arrítmicos epicárdicos condicionan peores resultados con las terapias actualmente disponibles en clínica para el tratamiento de las arritmias ventriculares.166 Existen estudios clínicos y preclínicos que demuestran que las CS y las CDCs alogénicas, a través de su efecto paracrino, pueden reducir el tamaño de la escara y mejorar parámetros de función ventricular – esto último de forma menos consistente.239 Así, en contraposición con el objetivo más ambicioso de la remuscularización, la posibilidad de modular la formación de una escara en el miocardio con el efecto paracrino de las células madre cardiaca abre una nueva puerta al tratamiento de las arritmias ventriculares maligna. Para este fin, la vía de administración de las células madre cardiaca es clave y parece que el espacio pericárdico oferta, en comparación las vías clásicamente empleadas para la distribución de la terapia celular, poder administrar mayor número de células con una distribución más homogénea y duradera. 59 CAPÍTULO 2 Hipótesis y objetivos 2.1. Hipótesis Los desarrollos en las técnicas de imagen y de mapeo electrofisiológico han puesto de manifiesto que el sustrato arrítmico de muchas cardiopatías estructurales se encuentra en el epicardio. Los sustratos arrítmicos epicárdicos condicionan peores resultados con las terapias actualmente disponibles en clínica para el tratamiento de las arritmias ventriculares. Una posibilidad para intervenir sobre este sustrato sería el empleo de células madre cardiacas por su potencial para modificar la escara. El trabajo de la presente Tesis Doctoral se sustenta sobre las siguientes hipótesis: Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 60 • Las CDCs alogénicas puede ejercer efectos positivos en la anatomía (escara) y funcionalidad (propiedades electrofisiológicas) del sustrato arrítmico epicardio difícil de alcanzar con los tratamientos convencionales. • La administración de las CDCs en el espacio pericárdico es clave para que el producto celular ejerza su efecto atribuido a la liberación de factores paracrinos. La administración intrapericárdica permite la retención durante más tiempo del producto celular y permite un efecto más homogéneo sobre todo el epicardio. 2.2. Objetivos ▪ Objetivo general El objetivo general es investigar si, en un modelo de infarto porcino, la administración de CDCs en el espacio pericárdico mediante una punción subxifoidea produce cambios en la anatomía de la escara o en las propiedades electrofisiológicas del epicardio. ▪ Objetivos específicos • Valorar el efecto de las CDCs en la función y el tamaño del ventrículo izquierdo y en la escara total. • Valorar el efecto de las CDCs en el tamaño y la composición de la escara endocárdica y epicárdica. • Valorar el efecto de las CDCs en las propiedades eléctricas del endocardio. • Valorar el efecto de las CDCs en las propiedades electrofisiológicas del epicardio. • Valorar el efecto de las CDCs en la histología del tejido heterogéneo. 61 CAPÍTULO 3 Materiales y Método 3.1. Introducción Se realizó un estudio aleatorizado controlado con placebo a doble ciego empleando un modelo experimental de postinfarto porcino para valorar el efecto de la administración intrapericárdica de CDCs alogénicas sobre el sustrato arrítmico epicárdico. 3.2. Materiales Se dispuso inicialmente de una muestra de 20 cerdos 5F †† hembra, de la raza Large White de 10 semanas de edad. La elección de esta especie animal se fundamenta en la similitud que comparte el corazón †† Uno de los cerdos falleció durante la inducción del infarto, por lo que la muestra final se redujo a 19. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 62 del cerdo con el humano en términos de anatomía cardiovascular, función ventricular, metabolismo cardiaco, electrofisiología, distribución del sistema arterias coronarias y la colateralización tras un evento agudo.294–296 Además, los animales que sobreviven al infarto desarrollan infartos transmurales de similar tamaño y localización.297 Específicamente desde el punto de vista electrofisiológico, estudio previos han documentado similitudes entre corrientes iónicas, morfología del potencial de acción y respuesta farmacológico entre los corazones de cerdo y humano.298–301 Por su parte, el motivo de seleccionar el sexo hembra se fundamenta en la mayor mortalidad de los cerdos macho tras la inducción de un infarto.302–309 Tabla 7. Muestra de estudio Clase Clave ID animal Peso (kg) T C1 P17-585 35 T C2 P17-588 34 T C3 P17-590 31 T C4 P17-758 32 T C5 P17-778 35 T C6 P18-099 31 T C7 P18-093 21 T C8 P18-095 30 T C9 P18-057 41 T C10 P18-079 36 P C11 P17-586 33 P C12 P17-595 34 P C13 P17-761 33 P C14 P18-076 32 P C15 P17-690 28 P C16 P17-717 36 P C17 P17-721 28 P C18 P17-724 36 P C19 P17-718 46 Los cerdos se obtuvieron de la instalación de alojamiento de animales (Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón; Cáceres; Extremadura; España), que ha sido certificada para tal fin de acuerdo con la Legislación Española y Europea. Los ID de los animales y sus pesos se muestran en la Tabla 7. Dado que los ensayos que se llevarán a cabo son de tipo experimental con un modelo CAPITULO 3 | Materiales y Método 63 porcino, aleatorizado y controlado con placebo, en la Tabla se señala la clase (T:tratado, P:placebo) asignada a cada animal como resultado de la aleatorización mediante sobres sellados y numerados. 3.3. Método El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado Animal (Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón; Cáceres; Extremadura; España), en pleno cumplimiento de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/EU y conforme al Real Decreto 53/2013 de la legislación española para la protección de los animales utilizados para fines científicos. Antes de la inclusión en el protocolo, todos los animales se sometieron a un examen físico completo y análisis bioquímicos del suero para comprobar que se encontraban sanos. ▪ Fases del estudio En la Figura 30 se muestra un esquema de las fases del estudio realizado. Como puede observarse en la Figura 30, el procedimiento consta de 8 fases. Fig. 30. Fases del estudio. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 64 ▪ FASE I. Creación del infarto. El modelo experimental de infarto que se describe ya ha sido previamente empleado en otros trabajos y está extensamente validado. 308,310–315 Los animales recibieron una dosis diaria de 500 mg de aspirina y 300 mg de clopidogrel, empezando el día antes de la creación del infarto y manteniendo este tratamiento hasta su sacrificio. Para reducir las arritmias agudas relacionadas con la isquemia los animales recibieron 400 mg de amiodarona oral desde 5 días antes de la inducción del infarto hasta 3 días después. El procedimiento de inducción del infarto se realizó bajo anestesia general inhalada; este mismo protocolo se empleó durante las fases de estudio de resonancia y de estudio electrofisiológico. Después de estar en ayunas durante 24 horas, se premedicó a los animales con una combinación de diazepam (0,4 mg kg) y ketamina (15 mg/kg) inyectada por vía intramuscular. Diez minutos después de la premedicación, se obtuvo acceso a una vena marginal de la oreja y se indujo la anestesia con propofol intravenoso (IV) al 1% (3 mg/kg). Se realizó control ventilatorio asistido por volumen a través de un tubo orotraqueal con balón (tamaños 6,5-9 mm de diámetro, dependiendo del peso del animal). La anestesia general se mantuvo utilizando sevoflurano en oxígeno al 100% hasta una concentración de sevoflurano al final de la espiración de 1-8-2%. Los tubos endotraqueales se conectaron a un circuito anestésico circular semicerrado unido a un ventilador con un caudal de gas fresco de 3 L/min. Una vez que se alcanzó la profundidad anestésica correcta, se ajustó el flujo de gas fresco a 0,5 L/min. Se mantuvo ventilación controlada con un volumen corriente de 8-10 mL / kg para obtener normocapnia (presión parcial de CO2 en sangre arterial de 35-40 mmHg). La analgesia intraoperatoria se aseguró mediante la administración intravenosa al inicio del estudio de un bolus IV de 1 mg/kg de ketorolaco y 2 mg/kg de tramadol, seguido de la misma combinación administrada en perfusión continua a 1 mg/kg/h y 2 mg/kg/h, respectivamente. Durante la anestesia, se administró solución salina fisiológica a través de la vena marginal de la oreja a una velocidad de 5-10 ml/kg/h. La monitorización anestésica incluyó los siguientes parámetros cardiovasculares y hemodinámicos: frecuencia cardíaca, electrocardiografía, pulsioximetría y monitorización invasiva CAPITULO 3 | Materiales y Método 65 de la presión arterial. Por su parte los parámetros ventilatorios controlados fueron los siguientes: frecuencia respiratoria, oximetría, presión de las vías respiratorias, concentración de CO2 inspirado y al final de la espiración, capnografía y sevoflurano inspirado y al final de la espiración. Al final del procedimiento, se apagó el vaporizador y se aumentó el caudal de gas fresco a 4-5 L/min de oxígeno al 100%. Durante la recuperación, se observó que los animales presentaban recuperación de reflejos, ventilación espontánea y realizaban movimientos espontáneos. Fig.31. Disposición de los animales en la sala de hemodinámica. Se visualiza la disposición del ventilador y de carro de parada. Para la creación del infarto, los animales se sujetaron en la mesa del angiógrafo en posición de decúbito supino con extensión caudal de las extremidades traseras (Fig.31). Se preparó el área de la ingle derecha pintando con povidona yodada y se realizó el acceso vascular percutáneo mediante punción estéril de la arteria femoral común derecha utilizando la técnica de Seldinger y Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 66 colocando un introductor vascular de 7 Fr (Terumo, Inc. Tokio, Japón). En el momento de la colocación del introductor vascular femoral se administró heparina sódica por vía IV (150 UI/kg). Bajo guía fluoroscópica (Philips Mobile Digital Angiographic System-BV Pulsera, Philips Medical Systems, Best, Países Bajos) se introdujo un catéter guía de palo de hockey de 6 Fr (Mach 1 ®, Boston Scientific Corporation, Natick, MA, EE. UU.) hasta lograr el sondaje del troco coronario izquierdo (Fig.32). Fig.32. Imagen angiográfica del sondaje del tronco coronario izquierdo del corazón del cerdo; en proyección postero-anterior. Se obtuvieron angiografías coronarias en la proyección oblicua anterior izquierda a 40 para valorar la longitud de la arteria coronaria descendente anterior izquierda e introducir una guía de angioplastia de 0.014” (Hi-torque. Abbott Vascular, Santa Clara, CA, EE. UU.) hasta su extremo más distal. Después de medir el diámetro de la arteria coronaria descendente anterior izquierda inmediatamente distal al origen del primer ramo diagonal, se avanzó un balón de angioplastia no compliante de diámetro apropiado (típicamente de 3 mm de diámetro) hasta esta localización. Antes de ocluir la arteria, se administró un bolo IV de lidocaína al 2% (1 mg/kg) para prevenir las arritmias ventriculares inducidas por isquemia, para posteriormente proceder con el inflado del balón de angioplastia hasta la oclusión de la arteria. La oclusión correcta se evaluó mediante la inyección de contraste yodado intracoronario a través del catéter guía inmediatamente después del inflado del balón; se consideró que el balón estaba correctamente inflado cuando el flujo distal CAPITULO 3 | Materiales y Método 67 era Thrombolysis In Myocardial Infarction (TIMI) 0. La oclusión se mantuvo durante 150 minutos. Si los animales presentaban parada cardiorrespiratoria por taquiarritmias ventriculares durante la oclusión, se iniciaban maniobras de reanimación cardiopulmonar avanzada siguiendo las guías de resucitación establecidas en ese momento. Después de desinflar y retirar el balón de angioplastia, se realizó una coronariografía postprocedimiento para evaluar la permeabilidad del árbol coronario y evaluar el flujo TIMI. Los animales recibieron infusión IV continua de lidocaína a una velocidad de 1 mg/kg/h durante la hora posterior al procedimiento. Posteriormente se realizó despertar anestésico y se enviaron de regreso al animalario para observación posoperatoria. La analgesia postoperatoria se aseguró con 10 μg/kg/12 horas de buprenorfina intramuscular durante las 24 h siguientes a la creación del infarto. Se utilizó un parche de liberación transdérmica de fentanilo (25 μg/h) para asegurar una analgesia correcta en el postoperatorio inmediato. Se administró antibioterapia con profilácticos clorhidrato de ceftiofur durante los 5 días después de la inducción del infarto. ▪ FASE II. Realización del primer estudio de resonancia magnética cardiaca. • Adquisición de imágenes de RMC Tras 4 semanas de la inducción del infarto se sometió a los cerdos a un primer estudio de RMC con un escáner de 1,5 T (Intera, Philips Medical Systems, Best, Países Bajos) con sistema de gradientes Nova (33 mT/m; 160 mT/m/m2) que empleaba una antena multicanal específica para estudios cardiacos. Se realizó el mismo protocolo de anestesia general que el empleado durante la inducción del infarto (ver fase 1), aunque en este caso se mantuvo la anestesia mediante la infusión IV continua de propofol (8-12 mg/kg/h) y no con sevoflurano. Los animales se conectaron a un ventilador compatible con la RMC (TransPAC T200, Smiths Industries Medical Systems, Reino Unido), realizándose control ventilatorio asistido por volumen con los mismos objetivos ya descritos en la FASE I. Siguiendo el mismo protocolo que ya había empleado nuestro grupo en trabajos previos, se obtuvieron las siguientes adquisiciones. 141 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 68 i) Secuencias modo cine para analizar la función y las dimensiones de ventrículo izquierdo (SENSE X2, tiempo de repetición 2.4 ms, tiempo de eco 1.2 ms, resolución espacial 1.6 x 2.0 mm, corte de 8 mm de grosor – sin separación, 30 fases por ciclo). ii) Secuencias de realce tardío con secuencia tridimensional de eco de gradiente potenciado en T1, inversión-recuperación (SENSE X2, ángulo de inclinación 15 grados, tiempo de repetición 3.4 ms, tiempo de eco 1.3 ms, resolución espacial 1.4 x 1.7mm, corte de 5 mm de grosor, tiempo de inversión 200-300 ms, ventana de adquisición establecida a 150-170 ms y apnea de 13-14 s). La adquisición se realizó tras 10-15 minutos de la inyección IV de 0.2 mmol/kg godobutrol (Gadovist, Bayer Shering Pharma AG, Berlin, Germany); el retraso del pulso de radiofrecuencia se optimizó para conseguir la máxima supresión de la señal del miocardio sano evaluado con la secuencia Look-locker. Para ambas secuencias, se obtuvieron imágenes en los planos del eje corto (unos 10-12 cortes seriados, en función del tamaño del corazón), plano de 4 cámaras, 2 cámaras y 3 cámaras. • Postprocesado de las imágenes de RMC Las imágenes de cine y realce tardío se analizaron en una estación de trabajo off-line en formato Digital Imaging and Communciations in Medicine (DICOM) con la versión 7.6 del software de análisis cuantitativo QMass MR (MEDIS; Países Bajos). Las secuencias de cine se emplearon para valorar la función y los volúmenes ventriculares. Se seleccionaron las fases telediastólica y telesistólica como las fases en las que la cavidad ventricular evaluada en el eje corto a nivel de los músculos papilares era más pequeña y más grande, respectivamente. En las imágenes en eje corto, tanto en telediástole como en telesístole, se seleccionó el corte más basal para el ventrículo izquierdo cuando al menos un 50% de la sangre quedaba rodeada por miocardio ventricular. Con esto, se cuantificaron las siguientes variables: • Volumen telediastólico de ventrículo izquierdo (VTDVI): Se trazaron manualmente el borde endocárdico en la fase telediastólica en las imágenes de cada uno de los cortes en eje corte para calcular el volumen telediastólico mediante el método de Simpson. Los músculos papilares se incluyeron como parte del volumen telesistólico (Fig.33). CAPITULO 3 | Materiales y Método 69 • Volumen telesistólico de ventrículo izquierdo (VTSVI): Se trazaron manualmente el borde endocárdico en la fase telesistólica en las imágenes de cada uno de los cortes en eje corte para calcular el volumen telesistólico mediante el método de Simpson. Los músculos papilares se incluyeron como parte del volumen telesistólico (Fig.33). • FEVI: Se calculó mediante la diferencia del VTDVI con el VTSVI dividido por el VTDVI. Fig.33. Software para medida de volúmenes ventriculares en la RMC. La línea roja delinea el contorno endocárdico en fase telesistólica para calcular el volumen telesistólico. Cuando la fase empleada para la medida era telediastóle se obtenida el volumen telediastólico. Las secuencias de realce tardío con gadolinio se emplearon para la caracterización de la escara. Las escara se analizó empleando la técnicas previamente validadas de intensidad de señal n-standard deviation, descritas detalladamente en otros trabajos.316 En la técnica n-standard deviation se define la intensidad de señal promedio y la desviación estándar en el área de miocardio remoto (como se definió para el FWHM). Se define como escara densa aquellos con vóxeles con intensidad de señal  3 desviaciones estándar por encima del valor promedio; aquellos vóxeles con intensidad de señal entre 2 y 3 desviaciones estándar por encima del valor promedio se definen como tejido heterogéneo (border zone). Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 70 De forma semiautomática y con corrección manual de los bordes trazados por el software se definió la siguiente variable: • Masa de escara total (MET): Empleando la técnica de n-standard deviation, en cada uno de los cortes en el eje corte, se delineó la escara como aquellas áreas con vóxeles valores de intensidad  2 desviaciones estándar. Se calculó la masa de la escara con la siguiente fórmula: área de escara x grosor de corte x 1.05 g/cm3 (Fig.34) Fig.34. Software para medida de la masa de escara total. El área marcada en rojo identifica la escara transmural a nivel de la cara anterior del corazón. • Masa miocárdica total (MMT): Se trazó manualmente el borde epicárdico del ventrículo izquierdo en la fase telediastólica en las imágenes de cada uno de los cortes en eje corte. A este volumen se le sustrajo el VTDVI y se multiplicó por 1.05 g/cm3 • Porcentaje de masa necrótica (PMN): Se calculó dividiendo la MET por la MMT y multiplicándola por 100 A partir de las secuencias de realce tardío se obtuvieron mapas de intensidad del endocardio y del epicardio mediante una aplicación informática propietaria desarrollada en el entorno MATLAB (Mathworks, Massachusetts, USA) siguiendo la misma estrategia que publicó nuestro grupo en su trabajo seminal de 2011.141 Se definieron manualmente los contornos endocárdicos y epicárdicos CAPITULO 3 | Materiales y Método 71 del ventrículo izquierdo en los cortes en eje corto en la aplicación QMass MR y se importaron a la aplicación proprietaria, dividiendo la pared miocárdica en 2 mitades de idéntico grosor: endocardio (mitad interna) y epicardio (mitad externa). La intensidad de señal promedio de la mitad interna y externa se proyectó en una reconstrucción tridimensional del endocardio y el epicardio, respectivamente, para caracterizar la escara a estos niveles. Estas reconstrucciones del endocardio y el epicardio se visualizaron en una interfaz de visualización tridimensional implementado en Java (Sun Microsystems, California, USA) mediante el empleo de algoritmos de visualización VTK (Kitware, New York, USA) (Fig. 35). La intensidad de señal se codificó mediante una escala de colores, de forma que aquellas zonas con señales  3 desviaciones estándar por encima del valor promedio se representaban en rojo (escara densa) y las zonas con una intensidad de señal menor a 2 se representaban en magenta (miocardio sano). Fig.35. Mapa de intensidad de señal del endo- y epicardio. En la imagen de la izquierda se visualiza la intensidad de señal promedio de la mitad interna del grosor miocárdico proyectada sobre una carcasa 3D del endocardio. En la imagen de la derecha se visualiza la intensidad de señal promedio de la mitad externa del grosor miocárdico proyectada sobre una carcasa 3D del epicardio. Las intensidades de señal comprendidas entre 2 y <3 se representaron en otros colores (gradiente azul-verde-amarillo; de menor a mayor intensidad dentro de este rango) e identificaban al tejido heterogéneo. Esta caracterización de la escara ha sido validada en trabajos previos, incluyendo algunos de nuestro grupo, si bien algunos grupos prefieren referirse al tejido heterogéneo como zona borde del infarto (border zone) o zona gris.317–322 A partir de lo anterior se midieron las siguientes variables: Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 72 • Escara densa endocárdica (EDEN). • Escara densa epicárdica (EDEP). • Tejido heterogéneo endocárdico (THEN). • Tejido heterogéneo epicárdico (THEP). ▪ FASE III. Aislamiento de CDCs alogénicas y administración intrapericárdica en los cerdos aleatorizados a este tratamiento. ▪ Aislamiento de las CDCs El aislamiento de las CDCs se realizó como se ha descrito en trabajos previos.323 Se obtuvieron CDCs a partir de corazones de cerdos Large White sacrificados de otros experimentos. Los explantes auriculares (1-2 g) se lavaron y se disgregaron mecánicamente en fragmentos (aproximadamente 1-2 mm3). Se eliminaron los restos celulares de estos fragmentos mediante lavados repetidos en tampón fosfato salino para posteriormente someterlo a un proceso de digestión enzimáticas con una solución de tripsina 0,2% (Lonza; Gampel-Bratsch; Suiza) y colagenasa IV 0,2% (Sigma-Aldrich; Misuri; EEUU) durante 5 min a 37ºC. El tejido digerido se lavó con tampón fosfato salino y se dispusieron en un cultivó de explante compuesto [suero bovino fetal 10% (Sigma-Aldrich; Misuri; EEUU), penicilina-estreptomicina 1% (Lonza; Gampel-Bratsch; Suiza), L-glutamina 2 mM (Lonza; Gampel-Bratsch; Suiza) y 2-mercaptoetanol 0,2 mM (Sigma-Aldrich; Misuri; EEUU) en un medio de Dulbecco modificado de Iscové (Hyclone; Philadelphia; EEUU)] a 37ºC de temperatura y 5% de CO2. Tras 3 semanas de cultivo, los fragmentos de tejido se descartaron y las células fusiformes similares a fibroblastos que migraron de los explantes se tripsinizaron y sembraron en placas recubiertas de poli-D-lisina con un medio de cultivo de cardioesferas [suero bovino fetal al 10% (Sigma), penicilina-estreptomicina 1% (Lonza), glutamina 2 mM (Lonza) y 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma) en 35% de en un medio de Dulbecco modificado de Iscové (Hyclone) y 65% de medio de Eagle modificado por Dulbecco / mezcla de nutrientes F-12 (Hyclone)]. En estas condiciones, se forman agrupaciones de células suspendidas que constituyen las CS y las células que migran radialmente desde estas son las CDCs. Se seleccionaron las CDCs y expandieron a 37ºC y 5% de CO2. CAPITULO 3 | Materiales y Método 73 ▪ Caracterización fenotípica y molecular de CDCs Se realizó una caracterización fenotípica y molecular de las CDCs mediante citometría de flujo y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), respectivamente.323 Para la caracterización fenotípica, las CDCs se tiñeron con anticuerpos monoclonales porcinos conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) contra el antígeno humano CD90 y anticuerpos monoclonales porcinos conjugados con FITC contra CD29, CD31, CD44, CD45, CD61, CD105, CD117, Sca-1, SLA- I (antígeno leucocitario porcino clase I) y SLA-II (antígeno leucocitario porcino clase II) (Bio-Rad; California; EEUU). Se cultivaron 2x105 células durante 30 minutos a 4ºC con el “pool” de anticuerpos monoclonales a concentraciones apropiadas, tras lo cual se lavaron y resuspendieron con tampón fosfato salino. El análisis de citometría de flujo se realizó en un citómetro FACScalibur (BD Biosciences; New Jersey; EEUU) tras la adquisición de 105 eventos. Las células se seleccionaron en base a la dispersión (frontal y lateral) y la fluorescencia se analizó usando el software CellQuest (BD Biosciences New Jersey; EEUU). En todos los experimentos se utilizaron anticuerpos de control emparejados por isotipo para determinar la contribución de un fondo no específico a la tinción. Así, la intensidad de fluorescencia relativa media se calculó dividiendo la intensidad de fluorescencia media (MFI, siglas en inglés de Mean Fluorescence Intensity) por el MFI de su control negativo. Para la caracterización molecular se estudió la expresión génica de diferentes marcadores mediante la RT-PCR se aisló to el ácido ribonucleico (RNA) de las CDCs. Las células se transfirieron a un tubo de microcentrífuga con 200 μL de cloroformo para incubarse durante 5-10 min a temperatura ambiente. Después de una centrifugación de 15 min a 4ºC con una fuerza centrífuga relativa de 12000 x g, el sobrenadante se mezcló con 500 μL de isopropanol y se incubó a -80ºC durante 20 min para precipitar el RNA. Se realizaron centrifugaciones y lavados con etanol consecutivos para finalmente resuspender el precipitante con el RNA en agua tratada con dietil pirocarbonato (Sigma; Misuri; EEUU). El RNA copia se sintetizó a partir de 1 μg de RNA mediante una reacción de transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen; California; EEUU) durante 1 h a 37 ° C. La secuencia de los cebadores específicos para el objetivo de la PCR-RT se diseñaron Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 74 empleando la herramienta Primer-Blast del Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos (NCBI, de sus siglas en inglés). Se evaluó la expresión de genes relacionados con células madre (Hardy-Zuckerman 4 homólogo del oncogén viral del sarcoma felino, NANOG, OCT4), diferenciación cardiaca temprana (MEF2C, GATA-4), diferenciación cardiaca tardía (CX43, TNNI3, ACTC1), factores de crecimiento (VEGFA, IGF-1, IGF-1R, HGFL, FGFR2, TGFB1), además de genes de mantenimiento (ACTB). La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa convencional se realizó usando el kit Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen) en un termociclador PXE 0.2 (ThermoFisher; Massachusetts; EEUU). Los niveles de expresión génica se analizaron y normalizaron con el software Gene Tools (Synoptic; Texas; EEUU) utilizando beta-actina como gen de mantenimiento. La cuantificación relativa se realizó midiendo la intensidad de brillo de cada banda utilizando el software GeneSnap (Syngene; Bangladesh; India). ▪ Administración intrapericárdica de CDCs o placebo Tras 4 semanas de la creación del infarto de miocardio, y habiendo realizado el primer estudio de RMC, se realizó la punción pericárdica percutánea para la administración, bien de CDCs o de placebo, atendiendo al grupo de aleatorización del cerdo. Estos procedimientos se realizaron bajo anestesia general de los animales siguiendo el mismo protocolo anestésico que en la fase 1 para la creación del infarto. Se realizó lavado quirúrgico con povidona yodada del tórax inferior y abdomen superior del cerdo. Se identificó la zona de punción mediante palpación de las referencias anatómicas; el punto óptimo se punción quedó representado por el vértice formado por el borde inferior de la parrilla costal izquierda y la apófisis xifoides del esternón del animal. Se realizó una punción subxifoidea con una aguja de Tuohy orientada hacia la raíz del miembro anterior izquierdo del cerdo (Fig.36), procurando mantener una angulación de < 45ºC con respecto al tórax para acceder a la cara anterior del ventrículo derecho. CAPITULO 3 | Materiales y Método 75 Fig.36. Técnica de punción subxifoidea para acceso al espacio epicárdico y administración de las CDCs o el placebo. Bajo guía fluoroscopia se avanzó la aguja con una gota de suero fisiológico en su extremo más proximal. El momento de acceder al pericardio se evidenciaba por aspiración de la gota y la percepción táctil del operador. En el momento en el que el operador percibía de forma intensa los latidos cardiacos se dejaba al animal en apnea para evitar los desplazamientos diafragmáticos y el riesgo de punción del ventrículo derecho. Si se aspiraba líquido con sangre se introducía una guía de angioplastia en el pericardio y se comprobaba en proyección radiológica oblicua anterior izquierda que atravesase varias cámaras cardiacas para confirmar su localización en el epicardio. Tras lo anterior se realizaba la administración de una dosis total de 300.000 CDCs/kg suspendidos en 5 mL de solución HypoThermosol (BioLife Solutions; Washington; EEUU) a aquellos cerdos aleatorizados a la rama de tratamiento con CDCs. Los cerdos aleatorizados a la rama de placebo sólo se les administraron 5 mL de solución HypoThermosol sin CDCs. ▪ FASE IV. Realización de segundo estudio de resonancia magnética cardiaca. Tras 16 semanas de la inducción del infarto se repitió el mismo estudio de RMC al realizado en la fase 2 (idéntico protocolo anestésico y mismo protocolo de adquisición de imágenes). Se realizaron medidas de las mismas variables ya definidas en la fase 2. Se obtuvieron 4 nuevas variables de porcentaje de cambio: Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 76 • Porcentaje de escara densa endocárdica (-EDEN): Se calculó el porcentaje de cambio de la extensión de la escara densa endocárdica (esto es, se dividió la diferencia de la extensión de la escara densa endocárdica entre la primera y la segunda RMC por la extensión en la primera RMC). • Porcentaje de escara densa epicárdica (-EDEP): Se calculó el porcentaje de cambio de la extensión de la escara densa epicárdica (esto es, se dividió la diferencia de la extensión de la escara densa epicárdica entre la primera y la segunda RMC por la extensión en la primera RMC). • Porcentaje de tejido heterogéneo endocárdico (-THEN): Se calculó el porcentaje de cambio de la extensión del tejido heterogéneo endocárdico (esto es, se dividió la diferencia de la extensión del tejido heterogéneo endocárdico entre la primera y la segunda RMC por la extensión en la primera RMC). • Porcentaje de tejido heterogéneo epicárdico (-THEP): Se calculó el porcentaje de cambio de la extensión del tejido heterogéneo epicárdico (esto es, se dividió la diferencia de la extensión del tejido heterogéneo epicárdico entre la primera y la segunda RMC por la extensión en la primera RMC). Los porcentajes de cambio de la escara ofrecen una descripción más precisa de cómo las variables cambian con el tiempo, obviando la magnitud absoluta del cambio. El porcentaje de cambio permite comparar 2 variaciones sin dar ninguna “ventaja injusta”, con independencia del valorar de la variable basal.324 El empleo del porcentaje de cambio ha sido empleado en trabajos previos que estudian el efecto de células madre sobre la escara isquémica miocárdica.325–328 Además, esta valoración de los cambios en el tamaño de la escara también se ha empleado en otros campos de la medicina.329,330 ▪ FASE V. Realización de mapeo electroanatómico endocárdico del ventrículo izquierdo. Tras 16 semanas de la inducción del infarto se realizó un mapeo electroanatómico (EAM, de sus siglas en inglés) en ritmo sinusal del ventrículo izquierdo. Se realizó el mismo protocolo de anestesia general que el empleado durante la inducción del infarto en la FASE I. CAPITULO 3 | Materiales y Método 77 Para la creación del EAM, los animales se sujetaron en la mesa del angiografo en posición de decúbito supino con extensión caudal de las extremidades traseras. Se preparó el área de la ingle derecha pintando con povidona yodada y se realizó el acceso vascular percutáneo mediante punción estéril de la arteria femoral común derecha utilizando la técnica de Seldinger y colocando un introductor vascular de 8 Fr (Terumo, Tokio, Japón). En el momento de la colocación del introductor vascular femoral se administró heparina sódica por vía IV (150 UI/kg). Se realizaron controles de tiempo de activación de la coagulación (ACT) para mantener valores > 250 s. Mediante un acceso retrógrado transvalvular aórtico, se realizó una reconstrucción electroanatómica de alta densidad del ventrículo con el sistema de navegación Carto-3 (Biosense Webster, California, Estados Unidos). Se empleó un catéter de mapeo deflectable con 20 electrodos dispuestos en 5 splines6F ‡‡ radiantes flexibles (Pentaray, Biosense Webster; distancia interelectrodo 2-6-2 mm). Para la compleción del EAM se estableció un umbral de densidad de llenado ≤ 5 mm en las regiones con baja amplitud de voltaje (esto es, ≤ 1.5 mV) y ≤ 10 mm en el resto de la cavidad ventricular. Los electrogramas bipolares se registraron entre pares de electrodos distales y se filtraron entre 30 y 500 Hz; los electrogramas unipolares se registraron entre los electrodos y la central terminal de Wilson y se filtraron entre 1 y 500 Hz. Esta misma sistemática de mapeo, así como los rangos de voltaje seleccionados y el filtrado de las señales ya se ha empleado en trabajos previos.331 Todos los electrogramas se reviraron visualmente para descargar la presencia de ruido y se empleó la herramienta de filtrado de puntos del software del sistema de mapeo para la adquisición de puntos. Empleando la herramienta de medida incluida en el software de mapeo Carto-3 se calcularon las siguientes variables: • Extensión del área de cicatriz endocárdica en el EAM bipolar (ACENB): Empleando el EAM bipolar filtrado se calculó la extensión de la escara densa (definida como aquellos puntos con amplitudes de electrogramas ≤ 0.5 mV) y del tejido heterogéneo (definido como aquellos puntos con amplitudes de electrogramas > 0.5 mV y ≤ 1.5 mV) (Fig.37). ‡‡ Splines es la forma con la que en el argot de la electrofisiología se hace referencia a las 5 “ramitas” del catéter Pentarray. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 78 • Área de cicatriz definida en el EAM unipolar (ACU): Empleando el EAM unipolar mínimamente filtrado se calculó la extensión de la escara total (definida como aquellos puntos con amplitudes de electrogramas ≤ 8.3 mV) (Fig.38). Fig.37. Mapa electroanatómico endocárdico con voltajes bipolares. Se ha configurado un rango de voltaje para detección de escara densa (0 – 0.5 mV). A la izquierda: proyección oblicua anterior derecha; a la derecha: proyección oblicua anterior izquierda. Fig.38. Mapa electroanatómico endocárdico con voltajes unipolares. Se ha configurado un rango de voltaje para detección de escara total (0 – 8.3 mV). A la izquierda: proyección oblicua anterior derecha; a la derecha: proyección oblicua anterior izquierda. CAPITULO 3 | Materiales y Método 79 ▪ FASE VI. Sacrificio de los animales y explante del corazón. Siguiendo las directrices de Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA, de las siglas en inglés), una vez completó el estudio electrofisiológico, los cerdos fueron sacrificados mediante la administración intravenosa de una dosis letal de cloruro de potasio (1-2 mmol/kg) mientras estaban bajo anestesia profunda. Se administró heparina sódica IV (1 mg/kg) para minimizar la formación de coágulos y, posteriormente, mediante esternotomía se realizó la extracción de los corazones. ▪ FASE VII. Realización de cartografía óptica. Para la realización de la cartografía óptica del epicardio se empleó un sistema de perfusión de corazón aislado (conocido como sistema de Langendorff), descrito a finales del siglo XIX por Oscar Langendorff y desde entonces empleado para el estudio con un modelo de corazón funcionante en ausencia de influencias autonómicas.332 El sistema de Langendorff permite el mantenimiento del órgano ex vivo gracias a la perfusión de una solución oxigenada rica en nutrientes. 333,334 Por su parte, el fundamento básico de la cartografía óptica consiste en el empleo de un tinte sensible al voltaje que se une al sarcolema del cardiomiocito. Con la iluminación del corazón con una fuente de luz de longitud de onda específica se excita el tinte que emite fotones en función del estado de despolarización/hiperpolarización del cardiomiocito.301,335–341 Tanto el sistema de Langendorff como el protocolo para la realización de la cartografía óptica han sido empleados con anterioridad por otros grupos de trabajo y se encuentra ampliamente validado.301,332–340 Tras el explante del corazón se deslizó una cánula en el interior de la aorta ascendente y a su través se infundió una solución cardiopléjica a 4C (composición de la solución de pH 7.4 en mM: 140 NaCl; 5.4 KCl; 1 MgCl2; 5 tampón HEPES 7F §§; 11 glucosa; 1.8 CaCl2) a una presión de 70 mmHg dejando que el líquido desbordase la cánula para evitar la entrada de burbujas en la circulación §§ Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-iletanosulfónico. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 80 coronaria 8F ***. El corazón quedó sumergido en cuadriplejia fría hasta que estaba listo para transferirse al sistema de perfusión caliente de Langendorff (no más de 10 minutos). En el momento de inicio de la cartografía óptica se extrajo el corazón de la solución cardiopléjica fría para dejarlo suspendido de la cánula de perfusión aórtica (Fig.39). La perfusión retrógrada a través de la aorta canulada cierra la válvula aórtica y permite el flujo de la solución cardiopléjica hacia las arterias coronarias, su paso al lecho vascular y su drenaje en las venas coronarias. En este sistema las cámaras cardiacas no están perfundidas. Fig.39. Conexión del corazón explantado al sistema de perfusión de Langendorff. Se realizó un lavado sin recirculación con 1L de solución modificada de Krebs a 36. 5C (composición de la solución de pH 7.4 en mM: 120 NaCl; 25 NaHCO3; 1.8 CaCl2; 5.4 KCl; 1 MgCl2; 5.5 glucosa; 1.2 H2PO2H2O) 9F ††† hasta eliminar toda la sangre de la vasculatura del corazón. Una vez que la solución de Krebs fluía sin sangre, se cerraba el circuito para que se produjese la recirculación de la solución. La solución de Krebs se oxigenó mediante burbujeo constante de gas carbógeno *** Todos los compuestos se adquirieron de Sigma-Aldrich (Dorset, Reino Unido). ††† Todos los compuestos se adquirieron de Sigma-Aldrich (Dorset, Reino Unido). CAPITULO 3 | Materiales y Método 81 (Fig.40). En caso de que el corazón no recuperase el ritmo sinusal al transferirlo al sistema de Langendorff porque presentaba taquiarritmias ventriculares se administraban choques de 5 J con palas externas dispuestas en el ápex y la base del corazón. En caso de refractariedad a la desfibrilación se incrementaba la energía de los choques en saltos de + 5 J hasta alcanzar una energía máxima de 50 J. Si tras lo anterior no se lograba la cardioversión se desechaba el órgano. Se administraron 10 mM de 2,3-butanodiona monoxima (Biotium, Inc. Hayward, California, EE. UU.) para lograr la disociación electromecánica y evitar la hipoxia y los artefactos de movimientos durante la cartografía óptica. Se administró un bolo de 100 L de di-4-ANEPPS (Biotium), el tinte potenciométrico (de voltaje). En aquellos casos en los que la distribución no fue homogénea se realizaron administraciones repetidas del mismo, según fuese necesario, durante el experimento. Para excitar el di-4- ANEPPS se iluminaron los corazones con una fuente de luz LED verde filtrada (salida de potencia máxima 58 W; longitud de onda máxima 524 nm; Luminus Devices, Billerica, EE. UU.) a través de una lente plano-convexa (LA1951; distancia focal = 25,4 mm; Thorlabs, Nueva Jersey, EE. UU.) y un filtro de excitación verde (D540 / 25X; Chroma Technology, Bellows Falls, EE. UU.). Se utilizaron tres fuentes de luz para lograr una iluminación homogénea. Fig.40. Sistema de perfusión de Langendorff. A la izquierda se visualiza la disposición del aparataje; a la derecha se visualiza cómo se suspendió el corazón. VD: ventrículo derecho; VI: ventrículo izquierdo. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 82 Fig.41. Sistemática de empleo del software para medida de las propiedades electrofisiológicas del epicardio con la cartografía óptica. Arriba se visualiza la interfaz del software propietario. 1) Calibrar imagen de cartografía. Se carga la imagen anatómica (“Load file”) con una regla para calibración y, tras seleccionar 2 puntos a una distancia conocida (“Select pixels”), se pulsa el comando “Calibrate”. 2) Calcular velocidad. Se carga el vídeo (“Load file”) con estimulación desde ventrículo derecho a la velocidad deseada (bien trenes con S1S1 a 600 o 800 ms), se seleccionan 2 puntos (“Select pixeles”) en el área de interés (bien en el borde de la escara con tejido heterogéneo, bien una zona de miocardio sano remoto) y se selecciona el comando “Calculate velocity”. Se puede reproducir el video (“Play”) para visualizar el avance del frente de activación epicárdico. Las líneas paralelas rojas denotan el surco interventricular anterior. Las líneas negras denotan el borde de la cicatriz densa (ED) y del tejido heterogéneo (TH) periférico. El par de puntos (a) se seleccionan para calcular la velocidad de conducción a nivel del TH; el par de puntos (b) se seleccionan para calcular la velocidad de conducción a nivel del tejido miocárdico sano. Se visualizan maximizadas las señales registradas en entre los pares de puntos en el TH y el miocardio sano. 3) Calcular duración del potencial de acción. Se selección uno único punto en el vídeo (bien en la zona de TH o en el miocardio sano, según se quiera calcular la duración del potencial de acción en una zona y otro) y aparecen las señales de intensidad de luminosidad, que representan los potenciales de acción (a). Se amplifican estas señales (icono con la lupa) y se marca (icono con una curva y una cruz) el punto en el 80% de la repolarización (b) y el punto al inicio (c) y se anotan los valores del eje de abscisas. La resta del valor (b) menos el valor (c) nos da la duración del potencial de acción. CAPITULO 3 | Materiales y Método 83 Se utilizó un software personalizado escrito en MATLAB y basado en el software de código abierto -Manager para realizar la grabación y el procesamiento de imágenes de mapeo óptico (Fig.41).342 El protocolo de estimulación ventricular consistió en la aplicación en el epicardio del ventrículo derecho de trenes de estimulación a 800 y 600 ms con pulsos rectangulares (amplitud 10 V y duración 2 ms). Se realizó estimulación desde la superficie epicárdica de la pared anterior del ventrículo derecho (Fig.42) de modo que la propagación fuera longitudinal a la orientación de las fibras epicárdicas. Se realizaron medidas de las siguientes variables (Fig. 41): • Velocidad de conducción del tejido heterogéneo (VCTH); donde corresponda se especifica si se determinó con estimulación ventricular derecha con trenes a 600 ó a 800 ms. • Velocidad de conducción del miocardio sano (VCMS); donde corresponda se especifica si se determinó con estimulación ventricular derecha con trenes a 600 ó a 800 ms. • Duración del potencial de acción del tejido heterogéneo (DPATH); donde corresponda se especifica si se determinó con estimulación ventricular derecha con trenes a 600 ó a 800 ms. • Duración del potencial de acción del miocardio sano (DPAMS); donde corresponda se especifica si se determinó con estimulación ventricular derecha con trenes a 600 ó a 800 ms. • Porcentaje de cambio relativo de la velocidad de conducción (-VCHS6 ó -VCHS8, según se estimulase con trenes a 600 o 800 ms). Esta variable se calculó dividendo la diferencia de VCTH-VCMS por VCMS. • Porcentaje de cambio relativo de la duración del potencial de acción (-DPAHS6 ó - DPAHS8, según se estimulase con trenes a 600 o 800 ms). Esta variable se calculó dividendo la diferencia de DPATH-DPAMS por DPAMS. Se calcularon los porcentajes de cambio de la velocidad de conducción y del potencial de acción entre el miocardio sano y el tejido heterogéneo de la zona de transición con la intención de evaluar la heterogeneidad de estas propiedades eléctricas del epicardio. El empleo del porcentaje de cambio ha sido empleado en trabajos previos de mapeo óptico, así como en neurofisiología.343,344 La duración del potencial de acción de las señales de voltaje óptico se calculó con una repolarización del 80%. La velocidad de conducción se calculó dividendo la distancia entre 2 pixeles por el tiempo transcurrido entre la activación máxima de ambos pixeles. El tejido heterogéneo se identificó de forma macroscópica como el área que rodeaba a la cicatriz densa que presentaba hebras fibróticas. Por su parte, el tejido sano se identificó como una zona de miocardio remoto a la cicatriz macroscópicamente normal. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 84 Fig.42. Estimulación ventricular programada desde el epicardio del ventrículo derecho. ▪ FASE VIII. Estudio histológico de los corazones. Los corazones explantados se fijaron almacenándolos en cubetas con formalina al 10% tamponada con fosfato (2mL de formalina por 100 g de corazón) a temperatura ambiente durante varios días. ▪ Preparación de muestras en parafina La preparación de las muestras en parafina ha sido ampliamente descrita con anterioridad.345,346 Tras lavar el corazón completo con agua destilada para retirar los restos de formalina, se diseccionó el ventrículo izquierdo mediante exéresis de la aurícula izquierda, las inserciones del ventrículo derecho en el septo interventricular y la raíz aórtica. Posteriormente, se identificó la escara macroscópicamente y se realizaron secciones transversales al eje largo del ventrículo izquierdo (obteniendo unas 3-4 secciones en promedio, sin contar con el ápex estricto) (Fig.43). CAPITULO 3 | Materiales y Método 85 Fig.43. Secciones transversales del ventrículo izquierdo. Se descartaron las secciones que no incluían escara macroscópica y aquellos en los que se identificaba se cortaron en fragmentos de tamaño adecuado para los moldes de inclusión (Fig.44). Fig.44. Secciones de la escara incluidos en los moldes de inclusión en parafina. Los fragmentos de ventrículo izquierdo se deshidrataron con lavados sucesivos a concentraciones crecientes de etanol (1 lavado de 20 minutos en etanol al 70%; 2 lavados de 20 minutos en etanol al 95% y 2 lavados de 20 minutos en etanol puro). Se finalizó con 2 lavados de 20 minutos en xileno (Sigma) a temperatura ambiente. Se calentó la parafina a 65C y con un dispensador de parafina se encastraron los fragmentos de ventrículo izquierdo. Procurando escurrir al máximo los fragmentos de xileno, estos se introdujeron los fragmentos en los moldes y se dejaron enfriar para endurecer la parafina. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 86 Con el micrótomo se obtuvieron secciones de 6 m de espesor de cada uno de los fragmentos que se transfirieron a un baño de agua destilada a 37ºC y posteriormente se montaron en los portaobjetos donde se derritió la parafina. ▪ Tinciones de las muestras Las técnicas de tinción se han descrito previamente en otros trabajos.345,346 Para la tinción con hematoxilina-eosina, tricrómica de Masson y la inmunohistoquímica se mantuvieron las secciones en una incubadora a 70ºC durante 10 minutos. Se introdujeron los portaobjetos con las secciones en una cubeta para desparafinado con xileno durante 20 minutos. Posteriormente se realizó rehidratación con etanol (proceso exactamente inverso a lo descrito para la deshidratación). Se realizaron 2 lavados sucesivos con agua destilada. Los procesos siguientes dependieron de la tinción específica que se realizó: Tinción de hematoxilina-eosina Se realizó inmersión de las secciones, primero en una cubeta con hematoxilina durante 11 minutos, y posteriormente, en una con eosina durante 15 segundos. Se realizó deshidratación de las secciones con etanol (procedimiento idéntico al descrito con anterioridad) para luego mantenerlos en una cubeta con xileno durante 10 minutos. Se colocó el cubreobjetos sobre las secciones con medio de montaje DPX (Sigma). Tinción tricrómica de Masson Se realizó inmersión de las secciones en hematoxilina férrica de Weigert (Sigma) durante 5 minutos. Tras lavar en agua destilada (3 minutos) se realizó inmersión en fucsina-escarlata (Sigma) durante 5 minutos. Tras esto, se repitió lavado en agua destilada (12 minutos) y se realizó inmersión en ácido fosfomolíbdico 5% (Sigma) durante 15 minutos seguido de 10 minutos en verde luz 2%. Se realizó diferenciación con ácido acético 1% (Sigma) para luego deshidratar (procedimiento idéntico al descrito con anterioridad) y mantener inmerso en xileno durante 10 minutos. Se realizó deshidratación de las secciones con etanol (procedimiento idéntico al descrito con anterioridad) para luego mantenerlos en una cubeta con xileno durante 10 minutos. Se colocó cubreobjeto sobre las secciones con medio de montaje DPX (Sigma). CAPITULO 3 | Materiales y Método 87 Inmunohistoquímica Se realizó bloqueo de la actividad peroxidasa endógena incubando las secciones en peróxido de hidrógeno 0.3% (Sigma) en metanol durante 10 minutos. Para lograr la fijación posterior de los anticuerpos monoclonales se realizó calentamiento de las secciones en cubetas con citrato de sodio 10mM (Sigma). Para bloquear la unión no específica de los anticuerpos se realizó incubación con tampón bloqueante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se incubó la sección con los distintos anticuerpos primarios contra los distintos antígenos previstos (factor de von-Willebrand, vWF; CD31; y conexina 43, Cx43) (Bio-rad) a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavados en solución tamponada con fosfato se incubó la sección con el anticuerpo secundario. Se incubaron las secciones en di-amino-benzidina 0.5mg/ml (Sigma) en solución tamponada con fosfato durante 5 minutos para posteriormente incubar peróxido de hidrógeno 0.3%. Se deshidrataron las secciones como se ha descrito con anterioridad y se cubrieron las secciones con un cubreobjetos sobre medio DPX (Sigma). ▪ Análisis de las muestras Para la realización de un estudio comparativo, la escara se dividió en 2 compartimentos que se analizaron de forma independiente: 1) tejido heterogéneo de la escara endocárdica y 2) tejido heterogéneo de la escara epicárdica (Fig.45). Para el análisis semicuantativo se empleó una plantilla cuadrilla de 20x40 mm dividida en 1250 cuadrados de análisis (0.64 mm2 de área por cuadrado de análisis). Fig.45. Compartimentación de la escara transmural en una mitad endocárdica y epicárdica. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 88 Los distintos tipos celulares (miocitos, fibroblastos, células endoteliales y células inflamatorias) se identificaron con la inmunohistoquímica. Los miocitos sanos se definieron por la ausencia de hipertrofia, miocitolisis, degeneración vacuolar o edema. La conectividad de los miocitos se evaluó mediante inmunohistoquímica contra la conexina 43 (Fig.46). Fig.46. Tinción inmunohistoquímica para la detección de conexina 43. Este es un ejemplo con buena cantidad y polaridad de la conexina 43. La presencia de tejido heterogéneo se evaluó en los cortes histológicos teñidos con la técnica de Tricrómica de Mason y hematoxilina-eosina y se evaluaron bajo un microscopio con luz polarizada para cuantifiar la fibrosis. A partir de lo expuesto se cuantificaron las siguientes variables semicuantitativas en cada uno de los cortes histológicos realizados para cada cerdo: • Porcentaje de fibrosis (PF): se valoró el porcentaje del tejido heterogéneo ocupado por fibras de colágeno. • Cantidad de conexina 43 en los cardiomiocitos (CC43C): se estimó la cantidad de conexinas en los miocitos localizados en el tejido heterogéneo. Se empleó una escala semicuantitativa de 0 (nula cantidad) a +++++ (>80% de la cantidad esperable comparada con miocitos sanos). • Polaridad de la conexina 43 en los cardiomiocitos (PC43C): se estimó la polarización de las conexinas en el sarcolema. Se empleó una escala semicuantitativa de 0 (dispersas en el citoplasma) a +++++ (adecuada polarización hacia los extremos de los cardiomiocitos). CAPITULO 3 | Materiales y Método 89 • Viabilidad de los cardiomiocitos (VC): se calculó como el % se cardiomiocitos miocitos sanos (esto es, definidos por la ausencia de hipertrofia, miocitolisis, degeneración vacuolar o edema) en el tejido heterogéneo. La presencia de células inflamatorias, células endoteliales y fibroblastos se evaluó de forma semi-cuantitativa empleando una escala de cruces de 0 (ausencia de la célula de interés) a +++++ (>80% de células de los cuadrados de análisis). • Respuesta inflamatoria (RI): se estimó partir del número de linfocitos en el tejido heterogéneo. • Vascularización (VAS): se estimó a partir del número de células endoteliales presentes en el tejido heterogéneo. • Cantidad de fibroblastos (CF): se estimó a partir del número de fibroblastos presentes en el tejido heterogéneo. Para cada una de las variables semi-cuantitativas se obtuvo un valor numérico de tal forma que +, ++, +++, ++++ y +++++ se convertían en 20, 40, 60, 80 y 100 %. Puesto que de cada uno de los animales se examinaba la escara en distintos cortes histológicos, se realizó una medida de la extensión del tejido heterogéneo de cada uno de ellos. En función de la superficie, posteriormente se ponderó cada una de las variables para obtener un valor promedio de cada variable por animales. ▪ Análisis estadístico Los datos recopilados de los estudios realizados se volcaron en una base de datos específica y se realizó la explotación estadística mediante el uso de paquetes estadísticos libremente disponibles en lenguaje de programación R. En el análisis se aborda el problema de contraste de hipótesis y se evalúa, a partir de las muestras consideradas, si las hipótesis iniciales expresadas son aceptadas o no. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 90 En principio, se contrastó la hipótesis de normalidad de los datos, la cual suele ser supuesta en la mayoría de los métodos estadísticos. Para llevar a cabo dicho contraste de normalidad se hizo uso del test de ajuste de Shapiro-Wilk.347 En el caso de rechazo de la hipótesis nula de normalidad se recurrió al empleo de pruebas no paramétricas que contrastan las medianas de dos grupos con libre función de distribución, en el caso de que las poblaciones comparadas difieran únicamente es su localización.10F ‡‡‡ Concretamente, se ha empleado el test no paramétrico de Mann-Whitney, para el caso de muestras independientes, y al test no paramétrico de Wilcoxon para el caso de muestras pareadas, ambos test aplicables a muestras pequeñas.348,349 Para ello se utilizó la función ‘wilcox.exact()’ del paquete ‘exactRankTests’ §§§(versión 4.2.0) de R.350 La significación estadística que se utilizó fue de 5%. ‡‡‡ El test de Mann–Whitney contrasta que la probabilidad de que una observación de la población que denominamos A sea mayor que una observación de la población que denominamos B es igual a la probabilidad de que una observación de la población B supere a una observación de la población A. §§§ Adecuado cuando no es posible determinar el p-valor de forma exacta debido a la presencia de ties. 91 CAPÍTULO 4 Resultados 4.1. Introducción En este trabajo se incluyeron un total de 19 cerdos que se aleatorizaron a un grupo tratamiento (n=10), al que se administró CDCs en el espacio pericárdico mediante punción subxifoidea, y a un grupo control (n=9), al que sólo se administró el vehículo de las CDCs. A continuación, se muestran los resultados obtenidos con las diferentes técnicas empleadas (RMC, cartografía óptica epicárdica, estudio electrofisiológico endocárdico y estudio histológico). Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 92 4.2. Resonancia magnética • Características basales de los grupos evaluados mediante RMC (fase II) Las características de los cerdos al inicio del estudio estaban equilibradas entre los dos grupos de tratamiento con respecto a las variables analizadas mediante RMC. No se detectaron diferencias estadísticamente significativas en la función (FEVI) y volúmenes ventriculares (VTDVI, VTSVI). Tampoco se detectaron diferencias en la masa de tejido sano y de escara (MMS, MET) ni en la extensión de la escara densa (EDEN, EDEP) y tejido heterogéneo (THEN, THEP) a nivel endo- y epicárdico (Tabla 8). Tabla 8. Características basales de los grupos de tratamiento para las variables evaluadas en la RMC primera. Se muestran los valores de las medianas de las variables y el p-valor del contaste de hipótesis realizado con test de Mann-Whitney. EDEN: Escara densa endocárdica. EDEP: Escara densa epicárdica. MET: Masa de escara total. MMT: Masa miocárdica total. PMN: Porcentaje de masa necrótica. THEN: Tejido heterogéneo endocárdico. THEP: Tejido heterogéneo epicárdico. VTDVI: Volumen telediastólico del ventrículo izquierdo. VTSVI: Volumen telesistólico del ventrículo izquierdo. Variables Grupo de control (n=9) Grupo tratado (n=10) P VTDVI (ml) 121 (120 - 138) 131 (122 – 145) 0.414 VTSVI (ml) 95 (81 – 97) 93 (72 –101) 0.968 FEVI (%) 30 (23 – 33) 29 (28 - 31) 0.549 MET (g) 9.7 (8.9 – 10.6) 8.5 (6.8 – 9.0) 0.095 MMT (g) 64.4 (56.2 – 66.6) 58.3 (50.5 – 60.9) 0.438 PMN (%) 17.2 (14.6 – 18.4) 13.0 (11.9 – 17.5) 0.236 EDEN (cm2) 18.9 (16.6 – 19.9) 14.9 (11.3 – 20.3) 0.278 EDEP (cm2) 13.4 (11.0 – 14.4) 15.8 (9.8 – 21.4) 0.549 THEN (cm2) 3.7 (2.7 – 4.5) 3.1 (2.5 - 3.8) 0.500 THEP (cm2) 8.8 (8.3 – 10.6) 6.6 (5.1 – 8.8) 0.113 CAPÍTULO 4 | Resultados 93 • Efecto de las CDC evaluado mediante RMC (Fase IV) ▪ Efecto de las CDC sobre los volúmenes y función ventricular, y escara total Entre la primera y segunda RMC, en ambos grupos de tratamiento, se evidenció un aumento significativo de los volúmenes ventriculares (VTDVI, VTSVI) y de la masa de tejido sano y escara total (MMS, MET). No se produjeron diferencias significativas en la FEVI para el grupo control, aunque sí para el grupo tratado, si bien con un p-valor próximo a 0.05 (Tabla 9). Tabla 9. Evolución en los grupos de tratamiento de las variables evaluadas por RMC para función ventricular, volúmenes ventriculares, escara y tejido miocárdico sano. Se muestran los valores de las medianas de las variables y el p-valor del contaste de hipótesis realizado con test de Wilcoxon. EDEN: Escara densa endocárdica. EDEP: Escara densa epicárdica. MET: Masa de escara total. MMT: Masa miocárdica tiotal sano. PMN: Porcentaje de masa necrótica. THEN: Tejido heterogéneo endocárdico. THEP: Tejido heterogéneo epicárdico. VTDVI: Volumen telediastólico del ventrículo izquierdo. VTSVI: Volumen telesistólico del ventrículo izquierdo. Grupo de control (n = 9) Variables Pretratamiento Postratamiento P VTDVI (ml) 121 (120 - 138) 195 (171 – 209) 0.002 VTSVI (ml) 95 (81 – 97) 124 (120 – 137) 0.002 FEVI (%) 30 (23 – 33) 31 (30 – 34) 0.125 MET (g) 9.7 (8.9 – 10.6) 11.8 (9.5 – 12.6) 0.014 MMT (g) 64.4 (56.2 – 66.6) 85.4 (82.5 – 90.1) 0.002 PMN (%) 17.2 (14.6 – 18.4) 13.7 (11.2 – 13.9) 0.004 Grupo tratado (n = 10) Variables Pretratamiento Postratamiento P VTDVI (ml) 131 (122 – 145) 196 (180 – 201) 0.001 VTSVI (ml) 93 (72 –101) 138 (116 – 146) 0.001 FEVI (%) 29 (28 - 31) 26 (23 – 32) 0.042 MET (g) 8.5 (6.8 – 9.0) 10.0 (8.4 – 11.3) 0.001 MMT (g) 58.3 (50.5 – 60.9) 88.7 (72.7 – 95.5) 0.001 PMN (%) 13.0 (11.9 – 17.5) 10.8 (10.0 – 14.9) 0.001 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 94 No existieron diferencias estadísticamente significativas en los volúmenes ventriculares, función sistólica o tamaño y composición de la escara (escara densa y tejido heterogéneo) endo- y epicárdico al comparar los grupos de tratamiento tras la intervención (Tabla 10). Tabla 10. Características de los grupos de tratamiento para las variables evaluadas en la RMC segunda. Se muestran los valores de las medianas de las variables y el p-valor del contaste de hipótesis realizado con el test de Mann-Whitney. VTDVI: Volumen telediastólico del ventrículo izquierdo. EDEN: Escara densa endocárdica. EDEP: Escara densa epicárdica. MET: Masa de escara total. MMT: Masa miocárdica total. PMN: Porcentaje de masa necrótica. THEN: Tejido heterogéneo endocárdico. THEP: Tejido heterogéneo epicárdico. VTDVI: Volumen telediastólico del ventrículo izquierdo. VTSVI: Volumen telesistólico del ventrículo izquierdo. Variables Grupo de control (n=9) Grupo tratado (n=10) P VTDVI (ml) 195 (171 – 209) 196 (180 – 201) 0.968 VTSVI (ml) 124 (120 – 137) 138 (116 – 146) 0.683 FEVI (%) 31 (30 – 34) 26 (23 – 32) 0.156 MET (g) 11.8 (9.5 – 12.6) 10.0 (8.4 – 11.3) 0.278 MMT (g) 85.4 (82.5 – 90.1) 88.7 (72.7 – 95.5) 0.999 PMN (%) 13.7 (11.2 – 13.9) 10.8 (10.0 – 14.9) 0.549 EDEN (cm2) 22.7 (19.5 – 31.7) 22.4 (13.4 – 24.3) 0.500 EDEP (cm2) 20.0 (15.8 – 28.5) 12.5 (9.2 – 23.7) 0.211 THEN (cm2) 5.6 (4.5 – 5.7) 5.7 (3.2 – 7.0) 0.619 THEP (cm2) 9.5 (8.4 – 12.6) 8.8 (6.8 – 10.6) 0.661 ▪ Efecto de las CDC en la escara endocárdica A nivel endocárdico, en ambos grupos de tratamiento, se observó un aumento de la escara CAPÍTULO 4 | Resultados 95 total a expensas de un aumento significativo tanto del tejido heterogéneo (THEN) como de la escara densa (EDEN) (Fig. 47 y Fig.48). Fig. 47. Efecto de las CDCs en la composición de la EDEN. Diagrama de caja y bigotes para la EDEP en ambos grupos antes y después de la intervención. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 96 Fig. 48. Efecto de las CDCs en la composición del THEN. Diagrama de caja y bigotes para el THEN en ambos grupos antes y después de la intervención. . En cuanto a los cambios relativos en la extensión del THEN y de la EDEN no existían diferencias significativas entre los grupos tratado y control (Fig. 49). En la Fig.49, además de los diagramas de caja y bigotes utilizados se han incluido los mapas de intensidad de señal obtenidos por el post-procesado de las imágenes de RMC. CAPÍTULO 4 | Resultados 97 Fig. 49. Efecto de las CDCs en las variables -THEN y -EDEN. Se muestran los diagramas de caja y bigotes de la variable −THEN (A) y −EDEN (B) de los grupo tratado y control antes y después de la intervención. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 98 ▪ Efecto de las CDC en la escara epicárdica A nivel epicárdico la modificación de la composición de la escara fue opuesta en el grupo tratado y control. Fig. 50. Efecto de las CDCs en la composición de la EDEP. Diagrama de caja y bigotes para la EDEP en ambos grupos antes y después de la intervención. En el grupo tratado no se observó un cambio estadísticamente significativo en la extensión de CAPÍTULO 4 | Resultados 99 la escara densa epicárdica (EDEP) entre la primera y la segunda RMC (Fig.50). Sin embargo, sí se produjo un aumento significativo en la cantidad de tejido heterogéneo epicárdico (THEP) (Fig.51). Fig. 51. Efecto de las CDCs en la composición del THEP. Diagrama de caja y bigotes para la THEP en ambos grupos antes y después de la intervención. En el grupo placebo, por su parte, entre la primera y la segunda RMC sí se documentó un aumento significativo en la extensión de la EDEP (Fig.50). Sin embargo, no se produjo un cambio estadísticamente significativo en la extensión del THEP (Fig.51). Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 100 Fig. 52. Efecto de las CDCs en las variables -THEP y -EDEP. Se muestran los diagramas de caja y bigotes de la variable −THEP (A) y −EDEP (B) de los grupo tratado y control antes y después de la intervención. CAPÍTULO 4 | Resultados 101 Además de estas diferencias antes-después en cada uno de los grupos de tratamiento, el porcentaje de cambio relativo de la EDEP y del THEP fue estadísticamente diferente al comparar el grupo tratado y placebo (Fig.52). Se observó que el porcentaje de incremento relativo del THEP del grupo tratado fue significativamente mayor que aquel del grupo control. Por su parte, el cambio relativo de la EDEP del grupo control fue significativamente mayor que el del grupo tratado. 4.3. Efecto de las CDC en el mapa electroanatómico obtenido mediante estudio endocárdico (Fase V) En el mapeo electroanatómico de alta densidad y resolución del endocardio del ventrículo izquierdo no se detectaron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. La extensión de la superficie endocárdica que presentaba electrogramas bipolares con amplitudes comprendida entre 0 y 0.5 mV (ACENB 0-0.5; escara densa) y entre 0.5 y 1.5 mV (ACENB 0.5-1.5; tejido heterogéneo) no fue diferente entre los grupos de tratamiento. Igualmente, al comparar la extensión de la superficie con electrogramas unipolares con amplitudes comprendidas entre 0 y 8.3 mV no se detectaron diferentes significativas entre grupos (Tabla 11). Tabla 11. Características de la escara isquémica de los grupos de tratamiento evaluada con mapeo electroanatómico endocárdico. Se muestran los valores de las medianas de las variables y el p-valor del contaste de hipótesis realizado con test de Wilcoxon. ACENB: Área de cicatriz endocárdica en el mapa electroanatómico bipolar. ACU: Extensión del área de cicatriz definida en el mapa electroanatómico unipolar. Bipolar Variables Grupo de control Grupo tratado P ACENB (cm2) 0.0-0.5 mV 4.6 (2.3 – 9.5) 3.0 (1.7 – 6.9) 0.369 0.5-1.5 mV 23.7 (20.1 – 24.9) 19.7 (17.3 – 23.7) 0.391 Unipolar Variables Grupo de control Grupo tratado P ACU (cm2) 0.0-8.3 mV 44.9 (20.7 – 53.6) 50.0 (26.5 – 56.3) 0.391 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 102 4.4. Efecto de las CDC en la electrofisiología epicárdica evaluada con cartografía óptica (Fase VII) En la Tabla 12 se observa como, tanto en el grupo tratado como en el grupo control, las medidas de VC y APD fueron significativamente diferentes entre la zona borde de la escara (tejido heterogéneo) y el miocardio remoto sano. Tabla 12. Propiedades electrofisiológicas epicárdicas de los grupos de tratamiento evaluadas con cartografía óptica: comparación intragrupos. Se muestran los valores de las medianas de las variables y el p-valor del contaste de hipótesis realizado con test de Wilcoxon. DPAMS: Duración del potencial de acción del miocardio sano. DPATH: Duración del potencial de acción del tejido heterogéneo. VCMS: Velocidad de conducción del miocardio sano. VCTH: Velocidad de conducción del tejido heterogéneo. Grupo de control Variables Tejido heterogéneo Miocardio sano P VCTH-600 (cm/s) 35 (26.7 – 35.6) 63.5 (53.7 – 64.9) 0.031 DPAMS-600 (ms) 210 (185 – 201) 150 (130 – 160) 0.003 VCMS-800 (cm/s) 34 (33.4 – 34.2) 63.2 (59.8 – 66.1) 0.031 DPAMS-800 (ms) 230 (220 – 240) 170 (150 – 180) 0.031 Grupo tratado Variables Tejido heterogéneo Miocardio sano P VCTH-600 (cm/s) 38.1 (32.4 – 48.3) 54.4 (48.2 – 64.3) 0.008 DPAMS-600 (ms) 200 (72 –101) 180 (165 – 185) 0.016 VCMS-800 (cm/s) 32.4 (28.2 – 40.3) 53.3 (48.8 – 58.1) 0.008 DPAMS-800 (ms) 200 (185 – 225) 180 (175 – 200) 0.018 En la Tabla 13 se muestran los contrastes de hipótesis entre los grupos de tratamiento para la VC y la APD medida en la zona borde de la escara densa (tejido heterogéneo) y en el miocardio remoto sano. Se evidencia que, tanto para las medidas de VC como de APD realizadas bajo estimulación a 600 y 800 ms, no existieron diferencias significativas entre los grupos tratado y control. CAPÍTULO 4 | Resultados 103 Tabla 13. Propiedades electrofisiológicas epicárdicas de los grupos de tratamiento evaluadas con cartografía óptica: comparación intergrupos. Se muestran los valores de las medianas de las variables y el p-valor del contaste de hipótesis realizado con test de Wilcoxon. DPAMS: Duración del potencial de acción del miocardio sano. DPATH: Duración del potencial de acción del tejido heterogéneo. VCMS: Velocidad de conducción del miocardio sano. VCTH: Velocidad de conducción del tejido heterogéneo . Tejido heterogéneo Variables Grupo de control (n=9) Grupo tratado (n=10) P VCTH-600 (cm/s) 35.0 (26.7 – 35.6) 38.1 (32.4 – 48.3) 0.292 DPATH-600 (ms) 210 (190 –230) 200 (185 –201) 0.390 VCTH-800 (cm/s) 34.0 (33.4 – 34.2) 32.4 (28.2 – 40.3) 0.876 DPATH-800 (ms) 230 (220 – 240) 200 (185 – 225) 0.369 Miocardio sano Variables Grupo de control (n=9) Grupo tratado (n=10) P VCMS-600 (cm/s) 63.5 (53.7 – 64.9) 54.4 (48.2 – 64.3) 0.431 DPAMS-600 (ms) 150 (130 – 160) 180 (165 – 185) 0.139 VCMS-800 (cm/s) 63.2 (59.8 –66.1) 53.3 (48.8 – 58.1) 0.073 DPAMS-800 (ms) 170 (150 – 180) 180 (175 – 200) 0.333 Entre los grupos de tratamiento se encontraron diferencias estadísticamente significativas al comparar las diferencias relativas en la VC y la APD entre la zona borde de la escara (tejido heterogéneo) y el miocardio remoto sano (Fig. 53). Tanto para la VC como para la APD las tasas de variación fueron significativamente menores en el grupo de tratamiento. Se observó que en el grupo tratamiento existía menor heterogeneidad en las propiedades electrofisiológicas epicárdicas estudiadas en comparación con el grupo control. En la Fig. 53, además de los diagramas de caja y bigotes se han incluido las señales obtenidas durante el mapeo óptico. Visualmente se percibe como, con respecto al grupo tratado, en el grupo control la morfología del potencial de acción del Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 104 tejido heterogéneo y el miocardio sano presentan mayor diferencia en su duración. Fig. 53. Efecto de las CDCs en la homogenización de la electrofisiología del epicardio. Arriba: se muestran las señales obtenidas durante la cartografía óptica del epicardio. Se ha marcado la APD entre flechas. Abajo: Se muestran los diagramas de caja y bigotes de los porcentajes de cambio relativo de la VC (A) y la APD (B) entre el tejido heterogéneo y el miocardio sano evaluados con estimulación continua desde el epicardio de ventrículo derecho con trenes a 600 y 800 ms. Se muestran los p-valores para los contrastes de hipótesis realizados con el test de Mann-Whitney. CV: velocidad de conducción. APD: duración del potencial de acción. CAPÍTULO 4 | Resultados 105 4.5. Efecto de las CDC en el tejido heterogéneo a nivel endo- y epicárdico (Fase VIII) Con la administración en el espacio epicárdico de CDCs no se documentaron diferencias estadísticamente significativas la composición del tejido heterogéneo del endocardio entre los grupos de tratamiento (Tabla 14). Tabla 14. Efecto de las CDCs en tejido heterogéneo endo- y epicárdico. Se muestran los valores de las medianas de las variables y el p-valor del contaste de hipótesis realizado con el test de Mann-Whitney. PF: porcentaje de fibrosis, CC43C: cantidad de la conexina 43; PC43C: polaridad de la conexina 43; VC: viabilidad de los cardiomiocitos; RI: respuesta inflamatoria; VAS: vascularización; CF: cantidad de fibrosis. Endocardio Variables Grupo de control Grupo tratado P PF (%) 40(30 - 40) 35 (30-40) 0.266 CC43C (%) 80 (70 – 80) 80 (60 –85) 0.560 PC43C (%) 60 (40 – 60) 40 (40 - 60) 0.179 VC (%) 60 (23 – 33) 60 (23 – 33) 0.579 RI (%) 40 (20 – 60) 40 (20 – 40) 0.433 VAS (%) 60 (60 – 60) 60 (40 – 80) 0.219 CF (%) 40 (20 – 40) 40 (20 – 40) 0.479 Epicardio Variables Grupo de control Grupo tratado P PF (%) 40 (20 – 55) 12.5 (5 – 30) 0.011 CC43C (%) 70 (65 – 80) 82.5 (72.5 – 90) 0.025 PC43C(%) 40 (20 – 40) 40 (40 – 60) 0.024 VC (%) 60 (50 – 70) 80 (60 – 80) 0.021 RI (%) 20 (20 – 20) 20 (20 – 20) 0.083 VAS (/%) 60 (50 – 60) 60 (60 – 65) 0.049 CF (%) 20 (20 – 20) 20 (20 – 20) 0.155 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 106 Por su parte, a nivel epicárdico, el tejido heterogéneo del grupo tratado presentó menor porcentaje de fibrosis, mejor viabilidad de los cardiomiocitos y mayor cantidad con mejor polaridad de la conexina 43 que el grupo control. El tejido heterogéneo del grupo tratado también estaba mejor vascularizado. 107 CAPÍTULO 5 Discusión 5.1. Efecto de las CDCs sobre los volúmenes y función ventricular en la evolución Evolutivamente, los volúmenes ventriculares y la masa de la escara total crecieron en ambos grupos de cerdos, sin que existieran diferencias significativas entre ellos. La pérdida aguda de cardiomiocitos en el infarto provoca un incremento súbito en las condiciones de carga del miocardio que inducen al remodelo ventricular, inicialmente marcado por la expansión del área del infarto y posteriormente, asociado con dilatación ventricular con distorsión de su arquitectura e hipertrofia de los segmentos supervivientes.351–353 Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 108 Los resultados de este trabajo están en consonancia con algunos estudios preclínicos y, sobre todo, estudios clínicos previos donde la terapia celular con CDCs no demostró mejorar la fracción de eyección ni los volúmenes ventriculares.290–292,323,354,355 No obstante, la ausencia de efecto de las CDCs sobre los volúmenes y la función ventricular no implica una ausencia de efecto de la terapia celular en el sustrato arrítmico.356 5.2. Efecto de las CDCs sobre el remodelado de la escara La administración epicárdica de las CDCs no tuvo efecto a nivel de la escara endocárdica. En ambos grupos se produjo un crecimiento de la escara densa y del tejido heterogéneo endocárdico, sin embargo, no hubo diferencias finales ni en los cambios relativos entre ellos. En este sentido, los hallazgos del mapeo electroanatómico endocavitario y de la RMC fueron consistentes (Fig. 54). Fig. 54. Se muestra la carcasa 3D del mapa de intensidad de señal de la mitad endocárdica del miocardio para un cerdo placebo y un cerdo tratado con CDCs intrapericárdicas. Visualmente no se identifican cambios relevantes en el tamaño o la composición de la escara entre grupos. En rojo se marca la escara densa y en el espectro de colores amarillo-verde-naranja se marca la zona de transición (tejido heterogéneo). En contraste con el efecto a nivel endocárdico, a nivel epicárdico, la modificación de la CAPÍTULO 5 | Discusión 109 escara fue radicalmente opuesta para los 2 grupos. En los animales que recibieron CDCs, aunque la escara total creció, no se observó un cambio significativo en la extensión de la escara densa epicárdica entre los estudios de CRM, mientras que sí se produjo un aumento significativo en la extensión del tejido heterogéneo. Por el contrario, en los animales que recibieron placebo se observó el efecto contrario. Aunque la escara total creció, no se produjo un cambio significativo en la extensión del tejido heterogéneo, pero sí un aumento significativo en la extensión de la escara densa (Fig. 55). Todo lo anterior sugiere que, la escara total crece a expensas de la escara densa en el grupo control y a expensas del tejido heterogéneo en el grupo placebo. Fig. 55. Se muestra la carcasa 3D del mapa de intensidad de señal promediada de la mitad epicárdica del miocardio obtenido para un cerdo que recibió placebo y otro cerdo que recibió CDCs intrapericárdicas. Se observa como en el ejemplo de animal que recibió un placebo la extensión de la escara densa (coloreada de rojo) aumenta y, en cambio, la extensión del tejido heterogéneo (espectro de colores verde-amarillo- naranja) no cambia apreciablemente. Por su parte, en el ejemplo de animal que recibió CDCs se observa como la extensión de la escara densa no parece cambiar apreciablemente pero sí se observa mayor tejido heterogéneo. Los resultados anteriores pueden entenderse mecanísticamente al imaginar la escara como se muestra en la Fig. 56. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 110 Fig. 56. Las CDCs bloquean el paso de tejido heterogéneo a escara densa. En este esquema se muestra la evolución de la escara en función del grupo. Tanto en placebos como en tratados, la escara total aumenta entre los 2 estudios de RMC. Se representan esquemas de la escara epicárdica. En los placebos la escara crece a expensas de un aumento de la escara densa, quedando el tejido heterogéneo con una extensión similar. Esto se explica por el paso de tejido heterogéneo a escara densa, y el paso de tejido sano a tejido heterogéneo. En los tratados la escara crece a expensas del tejido heterogéneo, quedando la extensión de la escara densa similar. Esto sólo se explica por el paso de tejido sano a tejido heterogéneo, de forma que el paso de tejido heterogéneo a escara densa queda bloqueado. En el grupo control la escara total crece a expensa del aumento de la escara densa, lo que obedece al paso de tejido heterogéneo a escara densa. El tejido heterogéneo queda inalterado por el paso de tejido normal a tejido heterogéneo. En el grupo tratado, las CDCs bloquean el paso de heterogéneo hacia escara densa por lo que la escara total crece a expensas de un aumento del tejido heterogéneo. De esta forma, el crecimiento de la escara total sólo puede explicarse por la conversión de tejido sano en tejido heterogéneo. • Efecto histológico de las CDCs con impacto sobre el remodelado de la escara El efecto de las CDCs sobre el tamaño de la escara isquémica total ya se había demostrado en varios trabajos previos.290,357–361 El efecto limitado al epicardio (y la ausencia de efecto sobre el endocardio) que se observa en este trabajo puede especularse que se debe a: i) el contacto íntimo de las CDCs con el epicardio y/o CAPÍTULO 5 | Discusión 111 ii) la promoción por las CDCs de vías de regeneración que se encuentran principalmente en el epicardio y cuyos efectos se confinan a nivel meso y epicárdico.362–364 En este último sentido, se sabe que las agresiones al corazón adulto activan al epicardio y provocan una respuesta regenerativa que se activa en el epicardio. 365–370 Esta respuesta presenta una contribución celular (transición epitelio-mesénquima y la diferenciación de las células derivadas del epicardio en varios tipos de células cardíacas) y con una contribución paracrina, la cual se cree es la principal mediadora del efecto reparador (Fig. 57).370–374 Fig. 57. Mecanismos por los que el epicardio puede contribuir en la reparación cardíaca. Las células epicárdicas activadas pueden tener una contribución celular directa a medida que las células epicárdicas se someten a la transformación epitelial-mesénquima (TEM) y migran al miocardio y se diferencian hacia células cardíacas (fibroblastos cardíacos, células de músculo liso y potencialmente otros tipos de células). Una segunda contribución epicárdica a la reparación cardíaca actúa a través de la señalización paracrina, induciendo (1) proliferación de cardiomiocitos, (2) angiogénesis y (3) supervivencia de cardiomiocitos en el área infartada. Modificada de 370. Con independencia del mecanismo fisiopatológico responsable de la producción de fibrosis, la pérdida de los cardiomiocitos inicia la cascada de fibrosis que, con participación de distintas células y moléculas, termina en la activación de miofibroblastos (Fig. 57).375–377 La respuesta de cómo las CDCs bloquea la transformación del tejido heterogéneo en cicatriz densa puede inferirse a partir del estudio histológico donde se evidencia que el tejido heterogéneo de la zona borde de la escara de los cerdos tratados muestra: i) menor porcentaje de fibrosis, ii) está mejor vascularizado y iii) contiene cardiomiocitos mejor preservados. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 112 Estos resultados concuerdan con trabajos preclínicos previos donde se evidenciaba que la administración de CDCs alogénicas se disponían en la zona borde de la escara donde “amplificarían” las vías de reparación endógenas. Así, las CDCs regularían al alza los cardiomiocitos en ciclo, favorecerían la angiogénesis y suprimirían la apoptosis postisquémica mejorando la viabilidad de los cardiomiocitos.359,364,378–380 Puede especularse que la mejor viabilidad de los cardiomiocitos y la mejor vascularización están causalmente relacionadas con el efecto antifibrótico. Ya se ha sugerido que el aumento de densidad de vasos en la zona borde de la escara anula en parte la expansión de la escara densa.380,381 Las CDCs también podrían tener un efecto antifibrótico directo como se ha demostrado con la expresión de grandes cantidades de metaloproteasas de la matriz.380,382,383 5.3. Impacto de las CDCs sobre las características electrofisiológicas endo- y epicárdica La cartografía óptica permite el análisis en exclusiva de las propiedades electrofisiológicas del epicardio.384,385 En este trabajo se evidencia que el grupo de cerdos tratados presenta menos dispersión de la duración del potencial de acción (APD) y de la velocidad de conducción (VC) entre la zona borde del infarto de tejido heterogéneo y el miocardio sano. Es decir, los cerdos tratados presentan una mayor homogeneidad de las propiedades electrofisiológicas en la zona borda del infarto en el epicardio. • Efecto histología de las CDCs con impacto en la electrofisiología La presencia de mayor cantidad y mejor polaridad de conexina 43 (que justifica el acoplamiento eléctrico de los cardiomiocitos) en el tejido heterogéneo epicárdico de los cerdos tratados podría, junto con el menor porcentaje de fibrosis, explicar la mayor homogeneidad en la APD a nivel epicárdico. Estos cambios a nivel histológico también justificarían la menor heterogeneidad del epicardio.386 En trabajo previos se ha observado que en el corazón intacto las diferencias en la APD fisiológicas presentes en los cardiomiocitos se ven reducidas, fundamentalmente por el CAPÍTULO 5 | Discusión 113 acoplamiento eléctrico de los cardiomiocitos en un sincitio funcional mediante uniones “gap”.387,388 De esta forma, se comprende que el “desacoplamiento” celular exacerbaría dichas diferencias en la APD dando lugar a heterogeneidad en la repolarización que propiciaría la reentrada.389,390 En un trabajo donde se estudia el efecto de la expresión de conexina 43 sobre la electrofisiología de corazones de ratón perfundido ex vivo se evidenció que la heterogeneidad de la refractariedad estaba determinada por un desacoplamiento eléctrico heterogéneo.391 Esta heterogeneidad de la refractariedad se asoció a una mayor inducibilidad de arritmias.392,393 En esta misma línea, existen trabajos que han demostrado que una mayor expresión de conexina 43 reducen in vivo la incidencia de arritmias ventriculares postinfarto.394–396 5.4. Efectos antiarrítmicos de las CDCs: conjunción del efecto sobre el remodelado eléctrico y anatómico de la escara La cicatriz arrítmica debe tener las siguientes características (Fig. 58): 397–399 1. Islotes de escara densa inexcitables con una “masa crítica” que permitan que la longitud de onda se adapte a la longitud del circuito. 2. Tejido heterogéneo que facilite la aparición de conducción lenta y bloqueo unidireccional (heterogeneidad electrofisiológica). 3. Detonante El área de tejido inexcitable constituye un obstáculo que obliga al frente de despolarización a dividirse y propagarse de forma independiente por los dos lados de este. Si en un momento determinado el frente de propagación se bloquea unidireccionalmente en una de las vías y avanza únicamente por la otra, podrá rodear el área inexcitable y alcanzar el punto donde se había bloqueado inicialmente, pero en sentido contrario. Si el frente de despolarización tarda el tiempo suficiente (conducción lenta) para que este punto y el tejido inicialmente despolarizado hayan superado su periodo refractario, los despolarizará y conducirá nuevamente en el circuito (reentrada). El efecto de la administración intrapericárdica de CDCs sobre cada una de las características Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 114 de la cicatriz arrítmica se comentan de forma separada a continuación. Estos efectos hacen prever un efecto antiarrítmico en relación con las TV de mecanismo reentrante. Fig. 58. Mecanismo arritmogénico por reentrada. Modelo teórico. ▪ Efecto de las CDCs sobre la escara densa inexcitable En este trabajo se evidencia que las CDCs bloquea la transformación del tejido heterogéneo en cicatriz densa. Varios trabajos previos habían demostrado la relación entre la extensión de la escara densa con las arritmias ventriculares.318,400–402 En este sentido, un trabajo de nuestro grupo que estudió el sustrato arrítmico en un modelo de postinfarto en cerdos concluyó que aquellos CAPÍTULO 5 | Discusión 115 animales donde la extensión de la escara densa epicárdica era menor de 19 cm2 tenían una menor inducibilidad, sugiriendo la necesidad de una extensión “crítica” de tejido inexcitable para el establecimiento de una TV estable.403 Esta misma idea de la necesidad de una masa “crítica” de escara densa es compartida por otros grupos y tiene un refrendo fisiopatológico.402,404,405 La longitud de tejido despolarizado (esto es, la longitud de onda, que se calcula como el producto de la VC por el periodo refractario) del circuito que va quedando con el avance del frente de despolarización es el producto de la velocidad de conducción del frente y el periódo refractario del tejido por el que se ha propagado. El mantenimiento de las TVs reentrantes precisa que la longitud de onda sea más corta que la longitud total del circuito para que el frente de despolarización pueda encontrar tejido excitable en su camino por el circuito. Así, la menor zona inexitable, permitiría que el frente de onda de excitación alcanzase el sitio donde se originó cuando este aún está refractario y no permitiría el establecimiento de una reentrada (esto es, la longitud de onda es mayor que la longitud del circuito) (Fig. 59). Fig. 59. Modelo de la importancia de un “núcleo” crítico de tejido inexcitable. En el grupo control la escara densa inexcitable es mayor que en los tratados (x= pequeño; x’= grande). En el grupo tratado, la longitud del circuito es más pequeña que la longitud de onda (línea azul y roja; la cola roja representa la cola de refractariedad), la cual representa el periodo refractario. Para que exista una reentrada la longitud del circuito tiene que ser mayor que la longitud de onda. La diferencia temporal entre la longitud del circuito y la longitud de onda es el” gap” excitable que permite que la reentrada sea estable. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 116 ▪ Heterogeneidad electrofisiológica que permite la conducción lenta y el bloqueo unidireccional. Junto con la presencia de un tejido inexcitable y dos vías de conducción, el inicio de la reentrada precisa de la existencia de bloqueo unidireccional de la conducción. En los casos donde los circuitos sean pequeños, adicionalmente, sería necesaria la presencia de conducción lenta para el mantenimiento de la reentrada, de forma que la longitud de ciclo sea menor que la longitud del circuito.388,406 En este trabajo las CDCs provocan una mayor homogeneidad de la APD y de la VC. La dispersión de la repolarización aumenta la probabilidad de que, ante un extrasístole precoz, se establezca un bloqueo unidireccional de la conducción y que el extraestímulo se conduzca por la vía de conducción lenta.407–409 Lo expuesto apoya que la homogeneidad de las propiedades electrofisiológicas a nivel epicárdico sea un factor protector frente a la inducción de arritmias ventriculares malignas. ▪ Desencadenante El desencadenante del establecimiento de una reentrada (habitualmente una extrasístole ventricular precoz) puede originarse, al igual que ocurría con la conducción lenta y el bloqueo unidireccional, por heterogeneidades en la velocidad de conducción y en la refractariedad. De esta forma, la homogenización eléctrica del epicardio que provocan las CDCs, de nuevo, se muestra tiene un efecto antiarrítmico. La dispersión de la repolarización en regiones epicárdicas adyacentes puede dar lugar a corrientes electrotónicas que induzcan una TV mediante una reentrada fase 2.410,411 La presencia de regiones con diferencias marcadas en la APD provoca que la región con la APD y refractariedad de menor duración pueda despolarizarse dos veces por un solo estímulo (Fig. 60). Como se observa en la Fig. 60, la mayor APD de la estructura 1 con respecto a la 2, permite el establecimiento de una segunda ola de despolarización hacia la estructura 2. En ausencia de cambios en la APD, la sola presencia de trastornos de la conducción, puede ser la responsable de generar un gradiente eléctrico cuando la zona sana se haya repolarizado totalmente. Este gradiente CAPÍTULO 5 | Discusión 117 sería el encargado de producir una despolarización electrotónica del tejido sano y con ello originar un extrasístole que podría precipitar el establecimiento de una TV reentrante.412 Fig. 60. Gradiente de voltaje entre regiones con distintas duraciones del potencial de acción. En el esquema existe un gradiente de voltaje entre el área 1 y 2 debido a una repolarización prolongada en 1. El gradiente de voltaje podría resultar en la despolarización electrónica del área 2 recuperado. 5.5. Limitaciones del estudio y líneas futuras de investigación Una de las limitaciones de esta tesis es el bajo número de animales incluidos, reducido siguiendo las guías internacionales para la investigación biomédica con animales.413 En humanos, el tamaño del infarto crónico (evaluado mediante RMC y estudio histológico) presenta un tamaño pico en los primeros días postinfarto para posteriormente presentar una disminución progresiva en las 4-6 semanas postinfarto, tras lo cual el tamaño del infarto se considera relativamente estable.414 Incluso existen trabajos donde se evidencia que a los 6 meses y a los 7 años, la masa de escara disminuye significativamente.415 En contraste con esto, en este trabajo se emplean cerdos Large White jóvenes de forma, aun ejerciendo las CDCs un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de la escara, es posible que la escara total crezca por el mayor efecto que tiene el crecimiento del propio animal. El número de CDCs administradas intrapericárdica se ha extrapolado de trabajos donde se evidencia efecto de las CDCs sobre la cicatriz.416,417 Así, cabe plantearse si a nivel epicárdico, donde no existe el problema de la obstrucción microvascular, sería mejor una dosis mayor de CDCs. Asimismo, aunque la administración epicárdica logra tiempos de retención de las CDCs en el Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 118 corazón mayores que la administración intracoronaria, estas no están exentas del recambio del líquido pericárdico, por lo que la necesidad de administraciones repetidas también es una duda razonable.276,418 En este trabajo se ha empleado un modelo de postinfarto de miocardio anterior, sin embargo, es conocido que tanto la localización, como el tamaño y la geometría del infarto influyen sobre el remodelo ventricular.419,420 En este sentido, existen trabajos donde se evidenciaba mayor eficacia regenerativa en los pacientes con escaras más grandes.361,421–424 Así, es posible que el efecto de las CDCs fuese distinto según la localización del infarto y sus interacciones mecánicas con el resto del miocardio. En el estudio histológico sería interesante valorar no sólo la cantidad de fibrosis sino también su composición molecular, su grado de entrecruzamiento, así como su orientación y alineamiento, pues pueden influir en la conducción eléctrica y el grado de anisotropía.425,426 También cabría valorar el acoplamiento celular heterotípico (entre fibroblastos/miofibroblastos y cardiomiocitos) que se sabe puede modular el potencial de acción e incrementar la susceptibilidad arrítmica.427–429 Por último, cabe señalar que al comparar técnicas se ha equiparado el tejido heterogéneo del estudio histológico con la región peri-infarto de la RM y con la extensión de la superficie endocárdica con electrogramas. Sin embargo, esta correspondencia entre técnicas, aunque asumida por muchos grupos, rigurosamente, exigiría de estudios experimentales adicionales para comparar si la imagen heterogénea de la RMC efectivamente se corresponde con el tejido heterogéneo en el estudio histológico, el cual contiene tanto fibrosis como miocitos viables. En las imágenes de RMC con realce tardío, el miocardio normal aparece negro y el infarto blanco. Así, se ha postulado que los píxeles con intensidad intermedia (gris; de ahí la denominación de gray zone) identifican una zona heterogénea, mezcla de tejido cicatricial y fibras miocárdicas viables; sin embargo, esto no ha sido confirmado anatomopatológicamente y explica la existencia de distintos métodos para definir la escara densa y la zona peri-infarto en la RMC.320,321,430,431 119 CAPÍTULO 6 Conclusiones En este ensayo donde se realiza administración de CDCs en el espacio pericárdico en un modelo de postinfarto en cerdo se alcanzaron las siguientes conclusiones: 1. Las CDCs no influyeron sobre la función y el tamaño del ventrículo izquierdo. 2. Las CDCs modificaron el sustrato arrítmico epicárdico deteniendo el crecimiento y la confluencia de la escara densa. La diminución del área de escara densa podría disminuir el establecimiento de reentradas estables al no existir una masa crítica de tejido inexcitable sobre el que rotar el frente de onda de excitación. 3. Las CDCs no produjeron efecto sobre el sustrato arrítmico a nivel endocárdico. 4. Las CDCs lograron homogeneizar la duración del potencial de acción y la velocidad de conducción en el epicardio, lo cual tendría un efecto antiarrítmico. Efecto de las células madre cardiacas sobre el sustrato arrítmico epicárdico en un modelo de postinfarto 120 5. Las CDCs detuvieron la progresión de la fibrosis en el tejido heterogéneo epicárdico y, por tanto, su evolución a escara densa. Además, las CDCs mejoraron la vascularización y la viabilidad de los cardiomiocitos del tejido heterogéneo epicárdico lo que podría estar relacionado causalmente con el efecto antifibrótico. 6. Las CDCs aumentaron la cantidad y mejoraron la polarización de la conexina 43 en el tejido heterogéneo epicárdico. Lo anterior podría justificar la homogenización en la duración del potencial de acción y la velocidad de conducción en el epicardio. 7. Las CDCs intrapericárdicas abren la esperanza a la terapia celular como tratamiento antiarrítmico en cardiopatías con afectación predominantemente epicárdica. A pesar de las múltiples preguntas aún por resolver, este trabajo constituye un generador de hipótesis para estudios de investigación futuros que empleen las CDCs como tratamientos antiarrítmicos. 121 Bibliografía 1. Al-Khatib SM, Stevenson WG, Ackerman MJ, et al. 2017 AHA/ACC/HRS Guideline for Management of Patients With Ventricular Arrhythmias and the Prevention of Sudden Cardiac Death: Executive Summary. Vol 138.; 2018. doi:10.1161/CIR.0000000000000548 2. Priori SG, Blomström-Lundqvist C, Mazzanti A, et al. 2015 ESC Guidelines for the management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death the Task Force for the Management of Patients with Ventricular Arrhythmias and the Prevention of Sudden Cardiac Death of the Europea. 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