1 u jI .1. J .‘4I...ifl.dh t•.d ¿o Átc UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR * 5309658525* UNIVERSIDAD COMPLUTENSE INTERACCION DE LEUCOCITOS HUMANOS CON LA PROTEíNA DE MATRIZ EXTRACELULAR FIBRONECTINA. REGULACION Y FUNCION DE LA INTEGRINA a4f31 TESIS DOCTORAL PALOMA SÁNCHEZ APARICIO 1994 AUSUV La Dra. Angeles García Pardo, Investigadora Científica del InvestigacionesBiológicas,ConsejoSuperiorde InvestigacionesCientífkas, Centro de certifica: quePaloma SánchezAparicio, con DNI 50822313 y licenciadaen Ciencias Biológicaspor la UniversidadComplutensede Madrid, ha realizadobajomi direcciónel trabajo: “Interacciónde leucocitoshumanoscon la proteina de matriz extracelular fibronectina.Regulacióny función de la integrina ct4131”. Y paraqueasíconste,y a efectosde la presentacióndel mismo paraoptaral Titulo de Doctor, firmo la presente certificación. Madrid, 30 deSeptiembrede 1994 Fdo: Dra.AngelesGarcíaPardo InvestigadoraCientífica CentrodeInvestigacionesBiológicas ConsejoSuperiordeInvestigacionesCientificas A mi familia A todosmisamigos,por sucariño. A miscompañerospor suapoyo,ayuday comprensión. A mi buenaamigay compañeraCarmen,porsuayudaincondicionaL Al grupodeAntoniode la Hera, ellossabenporque. A JavierReypor escucharmesiemprey muchomás. A SantiagoRodríguezde Córdoba,por tendermesumano. A AngelesGarcíaPardoporenseñarmecómosedebenhacerlas cosasy cómonúnca sedebenhacerlas cosas. Yami buena amiga y compañeraCarmen, siempregracias. INDICE INDICE ABREVIATURAS 1.- INTRODUCCION 1-18 1. 1.- La matriz extracelular:composicióny funciónen adhesióncelular. 1-2 1.2.- Estructuray función de la fibronectina(En) 2-7 1.3.- Moléculas de adhesiónde superficiecelular 8 1.4.- Familia de las integrinas 8-12 1.5.- Integrina «4j31 13-15 1.6.- Regulaciónfuncional de las integrinas 16-17 1.7.- Transmisiónde señalesa travésde las integrinas 17-18 2.- OBJETIVOS 19 3.- MATERIALES Y METODOS 20-26 3.1.- Proteínasde matrizextracelular: 3.1.1.-Fibronectina,fragmentosde Fn y péptidossintéticos 20-21 3.1.2.- Laminina, colágenotipo 1 y vitronectina 21 3.2. - Anticuerpos 21-22 3.3.- Células y cultivos celulares 22-23 3.4. - Ensayosde adhesi6ncelular 24 3.5.- Ensayosde ELISA y Western Blot 24-25 3.6.- Estudios de inmunofluorescencia 25 3.7.- Inmunoprecipitacióny electroforesis 26 3.8.- Reactivos 26 4.- RESULTADOS 27-70 4.1.- Análisisde losfragmentosde fibronectina: 4.1.1.-Fragmentosquecontienenla región C-terminalde Fn 28-29 4.1.2.-Fragmentosquecontienenla región centralde En 29-30 4.1.3.- Otros fragmentosde Fn 30 4.2.- Estudiodela interacciónde leucocitosconla regióncarboxilo-terminalde Fn; estudiode nuevossitios adherentes,susreceptoresen leucocitoshumanosy suregulación: 4.2.1.-Obtenciónde dosnuevosAcms anti-fibronectina,PíFí1 y P3D4. Identificación de los sitios de unión 30-35 4.2.2.-Reconocimientodel dominioHep II por la integrina«4¡31 en distintas poblacionescelulares 35-38 4.2.3.-Efectode la diferenciacióny la activacióncelularenel reconocimientodel dominio Hep II 38-41 4.2.4.-Regulacióndel reconocimientodeldominioHep II atravésde la subunidad ¡31 42—46 4.2.5.-EfectodelcatióndivalenteMn2~en la interacciónconel dominio Hep II 47 4.3.- Estudiode la interaccióndeleucocitoshumanoscon la regióncentralde Fn.Análisisde nuevosligandosde bajaafinidad: 4.3.1.-Reconocimientodelfragmentode Fnde 80 kDaporalgunas células linfoides B negativaspara ctSIii 48-50 4.3.2.-Efectodel PMA enel reconocimientodelfragmentode Fnde 80 kDa en distintas células linfoides B 51-52 4.3.3.-Identificaciondelreceptorcelularimplicado en el reconocimiento delfragmento80 kDa.Análisis del sitio activode estefragmento. 52-57 4.3.4.-Análisisde la especificidadde la interaccióna4131-FN8O.58-59 4.4. - Estudiode las implicacionescelularesen leucocitossubsiguientesala interacción«4131—Fn: 4.4.1.-Análisisde la reorganizacióndel citoesqueletotrasla interacciónde células linfoides B con Fn 59-67 4.4.2.-Identificaciónde lossitios activosdentrode Fn implicadosen procesosdefosforilaci6n despuésde la interacci6nlinfocito-Fn... 67-70 5.- DISCUSION 71-81 6.- CONCLUSIONES 82-83 7.- BIBLIOGRAFíA 84-94 8.- ANEXO: Publicaciones 95 ABREVIATURAS Ac(s> anticuerpo(s) Acm(s) anticuerpo(s)monoclonal(es) B SA albúminaséricabovina CNBr bromuro decianógeno COL colágeno DMSO dimetilsulfóxido ECM matrizextracelular EDTA ácidoetilendiandnotetraacético FITC isotiocianatode fluoresceffia Fn fibronectina FN38 fragmentodefibronectinade 38 kDa FN58 fragmentodefibronectinade 58 kDa FN80 fragmentodefibronectinade 80kDa 1g(s) Inmunoglobulina(s) kDa kilodalton L N laminina OPD 1,2-phenylenediamine PBL linfocitosde sangreperiférica PB5 tampónsalinoconfosfato PG proteoglicanos PMA forbol miristatoacetato PMSF Phenylmethylsulfonylfluoride TCR receptordecélulasT TSP trombospondina VCAM-1 vascularcell-adhesionmolecule1 VLA very lateantigen VN vitronectina 1.- INTRODUCCION Introducción 1 INTRODUCCION 1.1.- La matriz extracelular:composicióny función en adhesióncelular La matriz extracelular(MEC) es un entramadode macromoléculasque junto al componentecelular constituyelos tejidos. La MEC estáformadapor unaserie de polisacáridosy proteínassecretadaslocalmente.La grandiversidadde formasquepuede presentarla MEC,cadaunatotalmenteadaptadaal requerimientofuncionalde cadatejido en particular, viene dadapor variacionesen las cantidadesrelativas y la forma de organizaciónde suscomponentes.Actualmente,seconsideraque la MEC no sóloactúa comosoportede la estructurafísica de los tejidossinoquetieneun papeldinámicoen la regulacióndelcomportamientodelas célulasqueinteraccionancon ella, influyendoen su desarrollo,migracióny proliferación. La MEC estáformadapor trestiposprincipalesdemacromoléculas: - Proteoglicanos(PG): sonun grupo heterogéneode macromoléculasconuna proteínacentralala queseasociancadenasde polisacáridosno ramificadosformadospor repeticionesde unidadesde disacáridosdenominadosglicosaminoglicanos(GAG). Los GAG sereúnenen cuatrogruposen basea suscaracterísticascomunes,estoes, ácido hialurónico,condroitinsulfatoy dermatánsulfato,heparánsulfatoy heparina, y queratán sulfato.Los proteoglicanoscontienenun 90%de carbohidratosy seclasificanen PGde superficiecelular,degránulosintracelularesy deMEC. - Colágenos:son unafamilia de proteínasfibrilaressecretadasfundamentalmente porcélulasdel tejido conjuntivo.Lasmoléculasde colágenosecaracterizanporpresentar unaestructurarígidade triple héliceformadapor trescadenasa. Se handescritohasta13 tipos de colágenosdiferentes(tipos I-XIII). En algunostejidos existeun componenteadicionalde MEC queesla elastina. Lasmoléculasde elastina(proteínasno glicosiladas)son secretadasa la MEC como filamentosinterconectadosentreellos que dan lugar a una matriz que escapazde contraersey relajarsedependiendode lasnecesidadesdel tejido. - Glicoproteinas:son un grupo de moléculascon función adhesiva,entrelas quedestacanla lamininay la fibronectinapor sermayoritarias.La laminina(LN) está formadapor tressubunidadesdiferentes,una de 400kDa (A) y dosde 200kDa (Rl y B2), y forma partede la membranabasal(Chunget al. 1979).La fibronectina(En) es unode los principalescomponentesde MEC capazde mediaradhesióncelulary se le dedicaun capitulo apartepor ser temacentral de estatesis. Ademásexistenotras glicoproteinasen la MEC y en el plasmacapacesde interaccionarconcélulas,comopor ejemplola vitronectina(VN), la trombospondina(TSP) y la tenascina(Haymanet al. 1985;Lawler, 1986) Introducción 2 En definitiva, enla MEC, las moléculasde proteoglicanosformaríanunaespecie degel en el quesesumergiríanlasglicoproteinas.Esteentramadomolecularpermitiría la difusiónde nutrientes,metabolitosy hormonasentrela sangrey las célulasde los tejidos. Las fibras decolágenodaríanrigidez y ayudaríana organizarla matriz extracelular, mientrasquemoléculascomo la fibronectinay la lamininamediaríanadhesióncelular. Porotraparte,los componentesde la MEC, atravésde las interaccionescelulares, jueganun importantepapelen morfogénesis,reparacióny regeneraciónde tejidos y metástasis.Duranteestosprocesos,las célulasalteranconstantementesumorfologíay su capacidadadhesivaa los componentesde MEC. La regulaciónespecíficade un tipo celular,dela expresiónde los muchoscomponentesde MEC, asícomodesusreceptores de membrana,proporcionanun poderosomecanismoparael apropiadocontrol del comportamientocelular duranteestosprocesos.Ademásde establecerunaserie de contactosdeterminadoscon la MEC, las célulaspodríanmodificarestoscontactosde una forma estrechamenteregulada;la regulaciónde lascantidadesde ligandosy receptores presentes,la alteraciónde la afinidad receptor-ligandoy la proteolisisde ligandos o receptorespodríanestarimplicadasen los procesosde migración,invasióny reparación de tejidos.Ademásde en estosprocesos,las interaccionescélula-MECtienenun papel fundamentalen las funcionesdel sistemainmune;sonespecialmenteimportantesparala migración,localizaciónentejidosy funcióngeneralde los leucocitos(Springer,1990). 1.2.- Estructuray función de la fibronectina Uno de los principalescomponentesde matrizextracelularquefuncionacomomediador de adhesióncelularesla glicoproteinaFn. La Fn no sóloestápresenteen la MEC, sino tambiénen la superficiede granvariedadde células,en el plasma(300gg ¡mí) y enotros fluidos biológicos.Existendistintasformasde Fn,al menossehandescrito20 variantes en humanos;todasellassondímeroso polimerosde doscadenaspolipeptídicas-A y B- unidaspordospuentesdisulfuroy contienenalrededordeun 5% decarbohidratos. La Fn secomponede dominiosestructuralesalineadosalo largodela molécula quecontienenlos sitiosdeuniónalas diferentesmacromoléculasqueinteraccionancon ella, asícomolos sitios de interacciónconcélulas(Fig.1). Engeneralexistenvariossitios de uniónparaun mismo ligando, queestánsituadosen diferentesdominiosde Fn. El dominioamino-terminalcontienesitios de uniónafibrina (Fib 1), aheparina(Hep1), así comoaotrasproteínas(StaphA, actina, factorXllIa). Estaregiónesademásresponsable de la polimerizaciónde moléculasde Fn quetiene lugaren la matriz extracelular.El siguientedominio contieneel sitio de unión a colágeno/gelatinay al componentedel complementoClq. La regióncentralquevieneacontinuacióncontieneun sitio un sitio de unión aheparinade bajaafinidad (HepIII) asícomoel sitio de interacciónconcélulas Introducción 3 tipificado por la secuenciaROD (arginina-glicina-aspártico).La regióncarboxilo-terminal contienesitios deunióna heparinade altaafinidad (HepII), de interacciónconcélulas (HepII y IIICS, vera continuación),asícomode uniónafibrina (Fib II) y al componente P del amiloide. Adyacenteal dominioFib II y en el extremoC.Éerminalestála región implicadaenla formacióndelosdospuentesdisulfuroque unenlas cadenasA y 13 deFn (Fig.1). Ab ¡ Hep ¡ Hop ¡IIIONA Células Hep II Fib II Fig.1.- Dominios estructurales de la molécula de Fn. Adaptado de Hynes,1990. Las regionespeptídicassituadasentrelos dominios globularesde Fn son muy sensiblesa la degradaciónproteolitica.Estoha permitidoobtenerfragmentosde Fn que contienenuno o varios dominios practicamenteintactos y que conservansu funcionalidad.Así la digestiónparcial de Fn plasmáticacon tripsina permiteobtener fragmentosde38, 58 y 80 kDa,entreotros,quesehanutilizadoalo largode estatesis. El análisisdela secuenciadela En muestrala existenciade regionesrepetidas,que son de tres tipos de homologíadiferentes:1, II, III (Fig.2). Los dominiosde unión a fibrina (Fib 1 y Fib II) estánformadospor repeticionesdesecuenciashomólogasde 45 aa (tipo 1) quese disponeformandoun par de lazos unidos por puentesdisulfuro. La secuenciade homologíatipo 1 serepite 12 vecesalo largode la moléculade Fn; 5 veces en el dominioN-terminal (Fib 1), 3 en el dominio C-terminal(Fib II) y 4 en el dominiode uniónagelatina(Fig.2). Esteúltimocontienetambiénrepeticionestipo II. La homología tipo II consisteen repeticionesde 60 aa y espor tantodiferentea la homologíatipo 1, aunquetambiéncontienedospuentesdisulfuro intracatenarios.Por último, el segmento centralde la moléculacontienerepeticionestipo III quecarecende puentesdisulfuro y poseenunalongitudaproximadade 90 residuos. Introducci6n 4 Lasecuenciadela Fnestáaltamenteconservadaentreespecies-hay menosdeun 10%de divergenciaentresecuenciasde diferentesmamíferosy la mayoríasoncambios conservativos-.El alto gradodeconservaciónindicaunafuertepresiónselectivasobrela función de granpartede la moléculade Fn. Es probableque cadatipo de homologíase correspondaconunafunciónespecífica:la homologíatipo 1 mediaríauniónafibrina , la II uniónacolagenoy la tipo III interaccionaríaconcélulasylu otros ligandos. III NH, —FjFJflfJfJ-fJ-CJOfJfjfJ1 OB op 1 iii I1~1 iii V120 + + OP 1 m V89 — + OP ] III ~lfl V64 —. + Fig. 2.- Esquema de la secuenciaprimaria de las diferentes formas deFn. La secuenciaestá formada por repeticionesde tres tipos (Hynes, 19%). Todasla formasde En conocidasestáncodificadaspor un sólo genqueen humanossesitúaen el cromosoma2. Todaslas unidadesestructuralesquese repitenen la moléculadeFnestáncodificadasa nivel génicopor unidadesgenómicasdiscretas(uno o dosexones);cadasecuenciade repeticiónestáseparadaporun intrón. El análisisdela estructuradel gende Fn permitió determinarquelas distintasfornasde Fn seoriginan pormecanismosde “splicing” alternativo. En la Figura2 sepuedever unarepresentación esquemáticade las distintasformas de Fn queaparecenpor talesmecanismos.Las regiones EIIIA (ED-A) y EIIIE (ED-B) pueden ser excluidas o no durante el procesamientodel RNA; mientrasque IIICS (typeIII connectingsegment)puedeser incluida total o parcialmente,o excluida totalmente.Las posiblescombinacionesson numerosas.El modelode ‘splicing” estásujetoa unacomplejaregulacióny esespecifico del tipo celular.La Fn plasmáticaessintetizadafundamentalmenteporhepatocitosy está 09 ¶195 + + Tipa i •{}- -‘k Tipa ji -0- -8 Tipaiii~~ ~ Introducción 5 compuestade doscadenaspolipeptídicasA y B unidaspordos puentesdisulfuro;ambas cadenascarecende los segmentosEIILA y EIIIB, y sólo la cadenaA contienela región IIICS. Por el contrario, la En celularpresentaEIIIA y/o EllE y el segmentoIIICS en ambascadenas(A y B). La Fn celularpuedeformar,apartir de estosdímeros,agregados o polímeros. Parecerazonablecuestionarseel porqué dela existenciadeestasvariantesde Fn. En principio cabríapensarque la presenciao ausenciade estossegmentosconfiere propiedadesfuncionalesespecificasalasdistintasisoformasde Fn;porejemplo,la región IIICS tienecapacidadde mediaradhesión(ver a continuación)y estápresenteen la Fn plasmática,pero sólo en la cadenaA, mientrasque en la En celular apareceen ambas cadenassugiriendounafuncionalidaddiferencial;porel contrario, los segmentosElIA y EIIR sóloestanpresentesen Fn celular,lo quesugieretambiénfuncionesespecificasde la En celular.Ademásdeestasdiferenciasensecuencia,entrelas distintasvariantesde Fn hay quesumarlas diferenciasquepresumiblementedebenexistir en los procesosde glicosilación,fosforilacióny sulfataciónposterioresala síntesisproteica. La multiplicidad desitios de unióny la existenciadevariasformasde Fnconfieren aestaproteínalassiquientesfunciones: 1.- Organizacióndel citoesgueleto:Hay evidenciasque correlacionanla organizaciónde microfilamentosconlos nivelesdeFn extracelular,parecequeexisteuna relaciónrecíprocaentreel gradode organizacióndelcitoesqueletoy el delas fibrillas de Fn en la MEC. Asimismo,seha demostradola colocalizaciónde filamentosde actinay fibras de Fn indicandoqueexisteun efectotransmembranade la Fn exógena;otras proteínascomovinculina, talmay «-actininatambiénseasocianconFn,estasproteínas selocalizanen los contactosfocales. 2.- MiÉración celular: Seha demostradoque la Fn purificada,tantoplasmática comocelular,promuevela migracióncelularde fibroblastos,célulasmusculareslisas, célulasde la crestaneural,queratinocitos,célulasde Schwann,astrocitos,célulasde melanoma,etc. En cambio,inhibe la migraciónde célulasdel epitelio del hígado,y no promuevemigraciónde neutrófilos.LaFn sepuedeconsiderarentrelasmoléculasque intervienenenfenómenosde haptotaxis,esdecir, fenómenosqueimplicanmigraciónen respuestaaun gradientede adhesividadenel sustrato;la regiónresponsablede esteefecto selocalizaen la zonacentraldela molécula. 3.- Desarrolloy diferenciación:La Fn participaen fenómenosde migración, adhesióny cambiosde morfologíacelular,asícomoen fenómenosde morfogénesis,es decir,de polarización,plegamientoy organizaciónde hojasembrionarias.Además,los procesosfinalesde la diferenciacióncelularpuedenestarafectadosporel tipo de matrizal queseencuentranexpuestaslas células;porejemplo,la Fnjuegaun papelimportanteen la diferenciacióndellinajeeritropoyético. In trndncci6n 4.- Transformación oncogénica:Existe correlación entre transformación, tumorigenicidady malignidadcon la disminución de los nivelesde Fn en superficie celular.Lapérdidade Fn tieneconsecuenciasen el cambiodel fenotipocelular;algunas célulastransformadasmuestranuna menorsíntesisde Fn y, otras, mayoresnivelesde enzimasproteolíticas,quepodríanactuarsobrela Fn o susreceptores,debilitandoasíla interacciónc¿lula-MEC.Estosfenómenosconduciríana un fenotipotransformadoquese caracterizaporunaadhesiónreducida,unamorfologíamasredondeaday un citoesqueleto desorganizado. 5.- Trombosisy hemostasis:La En reaccionaconfibrina quedandoincorporadaa los coágulos.Además,tambiénparticipaen la agregaciónplaquetariaqueseproduce durantela coagulación.De hecho,las plaquetasen reposono presentanEn ensuperficie, sóloaparecetrasla activación. 6.- Curaciónde heridasy fibrosis: Los depósitosde Fny fibrina son importantes durantelos fenómenosde curaciónde heridas,puessirvencomosustratoparala adhesión y migraciónde las célulasque reparanel dañotisular. En ocasiones,estamatriz es sustituidapor otra formadapor colágenoy Fn queno resultasiempreapropiada,casoen el queseorigina una fibrosis. Además,en las heridasseha detectadoFn cubriendo desechoscelularesque despuésson fagocitadospor los macrófagos.Así pues, la Fn participaríaen la reparacióndel daño tisular y en la eliminación de los desechos originadospor el mismo. 7.- Fagocitosiseinteracciónconmicroor2anismospatógenos:Existenevidencias que indican que la Fn aumentala fagocitosis,queestámediadapor otros receptores presentesen monocitos,macrófagoso neutrófilos.Los receptoresde factores del complementoy de la regiónFe de Ig parecenactivarseparala fagocitosiscuandoseocupa el receptorde En. Sehaespeculadocon la posibilidadde quela Fnpudierafuncionar ‘in vivo’ comounaopsoninano específica,capazde promoverla eliminaciónde diferentes materialesde la circulación.La Fnsepuedeunir adistintosmicroorganismos(bacteriasy levaduras>,y existenindicacionesde queestauniónpudieratenerimportanciafisiológica. 8.- Adh~si~n.~]ifla¡~La funciónprincipal de la Fnesmediaradhesióncelular.Se ha demostradoquela Enadheridaasustratomediamejor adhesiónquela Fn soluble;esto podríaserdebidoaun cambioconformacionalduranteel procesode adhesiónal sustrato, o bienseríaun reflejo dela bajaafinidadde lascélulaspor las moléculasdeFn aisladas, que se ve aumentadaal inmovilizarsela proteínasobre el sustrato(fenómenode polivalencia).La uniónaFninmovilizadarequierela presenciade cationesdivalentesy un metabolismoactivo,aunqueno serequierela síntesisde proteínas. Como se ha mencionadopreviamente,las secuenciasresponsablesde esta interacciónestánsituadasen las regionescentral y carboxilo-terminalde la Fn respectivamente.Enla regióncentralla secuenciamediadorade adhesiónesRGDaunque existensitiossinergísticosqueson necesariosparaunaadhesióncelularestable(Yamada, Introducción 7 1991). En la región carboxilo-terminalse han identificado secuenciasactivasen el dominio Hep 11(1, II, III, IV, V, Hí) y en la regiónIICS (Tabla1 y Fig.3). Dentro de IIICS se han identificado dos sitios mediadoresde adhesión:CS-1 (25 primeros aminoácidos)y CS-5(residuos90-109)(Humphrieset al. 1987).Ambasregionesestán reguladaspor “splicing” alternativo.CS-1 es el sitio de mayorafinidad.Los receptores celularesque reconocenalgunasde estassecuenciaspertenecena la familia de las Integrinas(ver acontinuación). IADL&J Sitiosactivosen HepII III IV Hl y 1 II Hep 1 lIb ¡ LEZI1-~ Col Ce! S~u~n~ia1~ YRVRVTPKEKTGPMKE SPPRRARVT JDAPS WQPPRARI YEKPGSPPREVVPRPRPGV KNNQKSEPLIGRKKT Hep ¡1 Ftb II *1 rzrzr¡o !IICs *¡ LEEZUUEEJOA DELPQLVn2HPNUiGPEILDVPSrVQICWFVrHPGVDTGNGIQLPGTSGQQpSVGQQMIF~HGFP 10 20 30 40 50 60 67 Cs.l CS-2—1 Fig.3.- Representaciónesquemáticade la Fn plasmática.La posición de la secuenciaROD apareceindicadaporel asterisco(*) dentrodel dominio de unión celular; los sitiossinergisticosno estánindicados.El dominio Hep II está presenteen ambascadenas.Sin embargo,la región IIICS sólo apareceen la cadenaA de Fn; la secuenciaCS-5 no figura porqueno se ha detectadoen cantidadesapreciablesen Fn plasmática. LZEJ-i Introducción 1.3.- Moléculas de adhesión de superficie celular Comoya sehamencionado,lasinteraccionescélula-MECo célula-célulason importantes en migracióny en el reconocimientocélula-célulay participanen numerososprocesos biológicos. Por ejemplo, las funcionesde los linfocitos T en la respuestainmune dependende sucontactodirectoconotrascélulas,y la extravasacióny migraciónalos tejidos de los leucocitosse hacemediantela adhesiónespecíficaa determinadostipos celulares.La transición rápida entreestadosadherentesy no adherentestiene una importanciacapitaldurantelos fenómenosde vigilanciainmunológica.Estosmecanismos de adhesiónsellevanacabopormoléculasaccesoriasdelsistemainmune. Principalmenteson treslas familiasde moléculasdesuperficiecelularqueregulan la migración de los leucocitosy las interaccionesentrecélulasactivadasdurantela respuestainmune: - La superfamiliade las Inmunoglobulinas.Susmiembrosposeenal menosun dominiode tipo inmunoglobulina,compuestopor 90-100aadispuestosen estructurade sandwichconstituidapor dos láminasformadasporcadenas13 antiparalelas,estabilizada porun puentedisulfuro.Estafamilia incluye las moléculassiguientes:LFA-2, LFA-3, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, VCAM-l, TCR, CD3,CD4,CDSy moléculasde clase1 y 1delcomplejomayorde histocompatibiidad(MHC). - La familia de las Selectinas.Son muy importantesen la interacciónde leucocitosconel endoteliovascular;tienenen suestructuraun dominio de tipo lectina (117-120aa)en posiciónN-terminal, un dominio similar al EGE (epidermalgrowth facior) de 30-40aay variosdominiosrepetidossimilaresa los queexistenen proteínas queregulanel complemento(SCR ó shortconsensusrepeat.).Estafamilia incluye la L- selectina(Mel- 14 o LAM- 1), la E-selectina(CD62E o ELAM- 1) y la P-selectina (PADGEM, CD2Po GMP-140); seexpresanen leucocitos,endotelio,y endotelioy plaquetas,respectivamente. - La familia de las Integrinas. Hastael momento se han identificado 22 moléculasdiferentescuyascaracterísticasmásrelevantesveremosen el siguientecapítulo. 1.4.- Familia de las Integrinas Los miembrosde estafamilia de moléculasde adhesión‘integran” el medioextracelular con el interior de la célula y estánimplicadosen procesosde adhesióncélula-célulay célula-MEC;jueganun importantepapelalo largodel desarrolloy la vidaadultay están ampliamentedistribuidas-la mayoríade las integrinasseexpresanen granvariedadde célulasy la mayoríadelas célulasexpresanvariasintegrinas-(Hynes,1992) Intrndiicci6n 9 Las integrinasson glicoproteinasde membrana;cadaunaes un heterodímero formadoporunasubunidada(120-180kDa) y unasubunidad[3(90-110kDa)unidasde forma no covalente.Presentanun dominioextracelularqueinteraccionaconsu ligando especifico,unaregión transmembranay unacolacitoplasmática(Fig.4). Subunidad a Taj ¡ n a Vinculina a-actinina Citoesqueleto de actina Fig. 4.- Modelo de la estructura de las integrinas. (Adaptado de McDonald,LA. andMechan,R.P. 1991). En la actualidadsehandescritohasta14 subunidadesa y 8 subunidades13 (Tabla II), y aunqueteóricamentesepodríanasociardandolugara másde 100 combinaciones «13, la diversidad pareceestarrestringida.Tradicionalmentese han definido tres subfamiliassegúnla cadena13 quecomparten(j31, 132 y 133), aunquealgunassubunidades apuedenasociarseconmásde unasubunidad13; ayesparticularmentepromiscuaeneste sentido.Además,la existenciade variantesreguladaspor “splicing alternativo”añadeun nivel másde complejidad;este tipo de regulaciónse ha descrito para el dominio cítoplasmáticode las subunidades131,133. ¡34, «3 y «6 (Sonnenberg,1993) y parael dominio extracelularde aM. La TablaII muestrael nombrecomúnde los distintos heterodimeros,asícomosusrespectivosligandos;puedeobservarsequeunaintegrina,a menudo,unemásde un ligando y cadaligando puedeserreconocidopor másde una integrina. LigandoS Introducción lo IA~L&J RECEPTORES DE LA FAMILIA DE LAS INTEGRINAS Subunidades Nombres Ligandos «1 «2 «3 «4 131 «5 «6 «7 «8 «9 aL ¡32 aM ocX 1~3 «lib 134 ¡35 136 «6 VLA-1, CD49a/CD29 VLA-2, CD49b/CD29 VLA-3, CD49c/CD29 VLA-4, CD49d/CD29 VLA-5, CD49e/0D29 VLA-6, CD49f/CD29 VLA-7 VLA-8 VLA-9 LN, COL LN, COL, FN LN, COL, FN, EPN FN, VCAM-1, TSP, ¡VN FN, TSP LN, FN LN FN, VN, COL, FG, vWF LFA-1, CD11a/CD18 MAC-1, CD11b/CD18 p150/95, CDllc/C018 gpllb/IIIa, CD41a VNR, CD51 VLA-6aIt VNRaIt aV ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 ICAM-1, FO, C3bi, F. X C3bi, FO FN, FB, vWF, VN VN, vWF, FB, FN, TSP LN VN FN LPAM-1 «1EL137 FN, VCAM-1, MadCAM-1 LN (laminina),COL (colágeno),FN (fibronectina),VCAM-1 (vascularcelí adhesion mnolecule1), TSP (trombospondina),FO (fibrinógeno),vWF (factor von Willebrand), ICAMs (intercellular adhesion molecules),C3bi (factor del Complemento),VN 137 «4 «E [38 ccV Introducción 11 (vitronectina),EPN(epilegrina),MadCAM-1 (mucosaladdressincelí adhesionmolecule 1)., INV (invasin). LassubfamiiasI3~ y ¡33 estánprincipalmenteimplicadasen el reconocimientode proteínasde matriz extracelular(LN, COL, VN, TSP,Fn). La snbfamilia(31 también seconocecomofamiliaVLA (very late afteractivationantigens)yaquelos dosprimeros miembrosdescritos,«1131 y «2131,aparecíanen la superficiede los linfocitos de 2 a 4 semanasdespuésde la activación “in vitro” con el antígeno.La Tabla II resumelos miembrosqueactualmenteforman estasubfamilia: «2131,«5131 y «6131 sonreceptores prototipo de colágeno,fibronectinay laminina respectivamente;otros,como «1131 y «3131,puedenunirmásde un componentede MEC; «4131 esun miembroexcepeionalya queestáimplicadoeninteraccionescélula-célulay célula-MEC.A estaintegrinasededica el apartadosiguienteporsertemacentralde estatesis.Los miembrosde la subfamilia ft3. tambiénseconocencomo citoadhesinas:«lIb133 se consideracomoel receptor prototipode estafamilia y seexpresasóloen plaquetasy megacariocitos;«433 esotro miembrodeestafamilia y apareceampliamentedistribuido. La subfamilia132 está implicada en procesosde interaccióncélula-célula fundamentalmente.Los miembrosde esta subfamiliase expresanexclusivamenteen leucocitos,aunqueel nivel de expresiónvaríasegúnel tipo celular,el nivel de activación y el gradodediferenciacióncelular;tienenun papelimportanteen la extravasaciónde los leucocitos.De hecho,la patologíaLAD (leucocyteadhesiondeficiency),enla cualexiste unaexpresióndefectuosade la cadena132,secaracterizapor la falta de extravasaciónde neutrófilosy monocitos. La regiónde uniónal ligandode las integrinasestáen la zonaextracelulary esta formadatantopor la cadenaacomopor la ¡3, la interacciónrequierecationesdivalentes en el medio. Por otrolado,las integrinasinteraccionanensuzonacitoplasmáticaconproteínas delcitoesqueleto(Fig.4)jugandoasíun importantepapelenla conexióndelcitoesqueleto con la membranaplasmática.Losfilamentosde actina estánancladosen la membrana plasmáticaen los llamadoscontactosfocaleso placasde adhesiónqueademásde las integrinascontienenvariasproteínascitoplasmáticascomoporejemplovinculina,talma,y «-actinina(Burridgeetal. 1988). Sesabequeel dominiocitoplasmáticodela subunidad 131 interaccionacontalmay «-actinina.La secuenciade unionessería:taiina-vinculina-«- actinina-actina,aunquetambiénpodríainteraccionarcon«-actininadirectamente(Oteyet al. 1990).Loscontactosfocalescondenenotrasproteínascomopaxilina, tensinay zyxin (Sonnenberg,1993).A pesarde quelas integrinas[31contienentodoslos sitiosparala interacciónconloscomponentesdel citoesqueleto,no selocalizanenlos contactosfocales a menosquesehayanunido asusligandosextracelulares.Así «5131 se localizaen los contactosfocalessobreFn mientrasque«2131 selocalizaenlos contactosfocalescuando IntrndnrriAn 12 lascélulascrecensobreCOL tipo 1. No existenevidenciasde la interaccióndirectade la cadena«conproteínasdecitoesqueleto.Pareceque hastaquela integrinasepiensaquela integrinano estáunidaa susligandos,la subunidad« previenela asociaciónde la subunidad¡31 con los componentesdel citoesqueleto.Sufunción podríaserregularlos tipos deinteracciónde la cadena131 conel citoesqueleto(Sonenberg,1993). Deestaforma, trasla unióna lasproteínasde MEC, las integrinasinteraccionan conel citoesqueletoe inducensureorganización.El patrón de citoesqueletogeneradoes funcióndela informaciónextracelulary delsistemade lecturaintracelularquecomienza conla interacciónespecíficaentrelos dominioscitoplasmáticosde las subunidades«y [3, u otrosreceptoresdeadhesión,y proteínasintracelulares.El procesode reorganizaciónde citoesqueletoqueseha estudiadomásextensivamenteesla formación de contactos focalesquetiene lugar trasla adhesiónde fibroblastosa fibronectinay vitronectinavia «5(31 (Sonenberg,1993). El patrónde citoesqueletoformadoinfluye en la adhesividad, en la forma celular y en la movilidad,y tambiénpodría influir en la propagaciónde señalesreguladorasmediadaspor integrinas(DamskyandWerb, 1992; Humprieset al. 1993) MP Fig. 5.- Representaciónesquemática de la interacción de las integrinascon las proteínasdel citoesqueleto. Actina TN Introducción 13 1.5.- Integrina «4131 El heterodúnero«4131estácompuestopor unacadenade 150 kDa («4) unidano covalentementea unacadenade 130 kDa (131). La asociaciónde ambascadenases necesariapara la expresióndel heterodimeroen la superficiecelular.La subunidad131, comúnparalas proteinasVLA, sehadonadoy secuenciado(Hemíeret al. 1987). De igual modo,la estructuraprimariade la subunidad«4, presumiblementeresponsablede determinarla especificidadde ligando del complejo«4131,tambiénseha determinado (Takadaet al. 1989). La subunidad«4 estácodificadapor un sólogen localizadoen el brazolargodel cromosoma2 y presentaun 17-24% de similitud con otrascadenas«. Constade 7 dominioshomólogosde 30-41 aa repetidosen el extremoN-terminal de la molécula. Dentro de los dominiosV, VI y VII aparecentressitiosdeunión decationesdivalentes. La subunidad«4 contiene 12 sitios de N-glicosilacióny 24 cisteinas.Además,no presentael dominio1, tancaracterísticode otrassubunidadesa, insertadoen la porción N-terminal de la molécula,ni cadenascortasasociadasen la porción C-terminal.Otra característicaquediferencia«4 de otrassubunidades« esla presenciade un punto de roturaaproximadamenteen la mitadde la secuencia,queese] responsablede la aparición de dosfragmentosde la cadenade «4. Las técnicasde marcajee inmunoprecipitación usandoAcm anti-cx4 o anti-131 sehanutilizado paraestudiarla estructuramolecularde «4131.Así sehan identificadolassiquientesformasdeestasubunidad:unaformaintacta de 150kDa y una formarotaconteniendodosfragmentosde 80 kDa (N-terminal) y 70 kDa (C-terminal) respectivamente(Fig.6). Además de estasdos formas, se ha identificadootraformade 180kDa. La cadena[31presentaun 44%de similitud conotrassubunidades[3y un 82-90% de identidadcon subunidades[31de otrasespecies.Estosdatosindicanque [31esuna moléculaaltamenteconservadaquepresumiblementeposeeimportantesfunciones.Es una proteínade 778 aa; su cola citoplasmáticaconstade 47 residuose interaccionacon proteínasde citoesqueletocomotalmay «-actinina.La colacitoplasmáticapuedesufrir fosforilación,lo cualpuedeafectarala asociaciónde la integrinaconel citoesqueletoasí comosu localizaciónen los contactosfocales.«4 ademásde asociarseconla subunidad [31,tambiénpuedehacerlocon la subunidad[37;«4137 se identificó como receptorde “homing” parala Placasde Peyer(Holzmanetal. 1989)y seexpresaencélulasT CD4+ en reposo,linfocitos T de sangreperiféricaactivadosconPMA, linfocitos B de sangre periférica, lineascelularesB y célulaspremonociticasU937 activadascon PMA. «4137 reconocecomo ligando principal MadCAM-l. Además,como muestrala Tabla II reconocetambiénla Fn (sitio CS-1)y VCAM-1. Introducción 14 Sitio A — cationes divalentes Transmembrana — ___ 41150 4/8c~ O,7O~ Fig.6.- Representaciónesquemáticade la integrina «4(31.(Adaptadode Teixido andSánchez-Madrid,1993). La integrina«4(31,seexpresaen la superficiede linfocitos B y T, monocitos basófilos,eosinófilos,mastocitosmadurosy precursoresde médulaósea(Teixido and Sánchez-Madrid,1993). De entrelas célulasoriginariasde la médulaósea,sólo los neutrófilos,plaquetasy eritrocitosno expresan«4131. Las poblacionesde linfocitos T (LT) vírgenes y de memoria difieren en la expresiónde «4131;en el primercasola expresióneshomogéneay bajay en el segundo casoesheterogéneay másalta(Pickeret al. 1990;Horganet al. 1992).La poblaciónde timocitos doblesnegativosexpresanmayoresniveles de «4131 que la población de timocitos doblespositivosy simplespositivos (Sawadaetet al. 1992). Asimismo,los linfocitos T activadospresentanmayoresnivelesdeexpresiónde «4131 y otrasintegrinas (Sánchez-Madridet aL 1986;Hemíeretal. 1990) En los linfocitos B la expresiónde «4 varíaen los procesosde diferenciacióny activación(Postigoet al. 1991).Las líneascelulareslinfoides y mieloidessonpositivas para«4131,mientrasquelos tiposcelularesadherentestalescomofibroblastosy células epitelialesexpresanmuy debilmenteo en absoluto«4131. Ciertaslíneascelularesde melanomay carcinomatambiénexpresan«4(31. Comoya seha mencionado,la integrina«4131 es un miembroexcepcionalde la subfamilia131 yaqueestáimplicadaeninteraccionescélula-célulay célula-MEC.Como muestrala TablaII los ligandosdescritosde «4131sonFn,VCAM-l, ISP,einvasin. 1.- En la TablaIII semuestranlas secuenciasactivasde la región carboxilo-terminaldeFn capacesde interacionarcon«4131 Introducción 15 ISMLAAII Sitios~xQs Secuencias Hl IDAPS YEKPGSPPREVVPRPRPGV II KNNQKSEPLIORKKT CS-1 DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST CS-5 GEEQIQIHIPREDVDYHLYP Las secuenciasHl. 1 y II, pertenecenal dominio HepII y se describieroncomo sitioscapacesde interaccionarcon«4131encélulasde melanoma(McCarthy etal., 1988; Mould andHumphries,1991b; lida et al., 1992). Los sitiosCS-l y CS-5 tambiénson ligandosde «4131 (Wayneret al. 1989; Ferreiraet al. 1990; García-Pardoet al. 1990; Mould et al 1990; Guanet al. 1990), pertenecena la región IIICS y las secuencias mínimascapacesde mediaradhesiónseindicanen negrita(Mould et al. 1991a;Komoriya et al., 1991; Wayner et al. 1992). Estudios recientes,incluyendolos de nuestro laboratorio,parecenindicarqueel reconocimientodeunasu otrassecuenciaspor partede «4131 dependeríadel tipo celular,estoes, linfocitos T, B y monocitos,así como del estadode activacióndel receptor. 2.- VCAM-1 (vascular ceil adhesionmolecule 1) (Elices et aL1990)es un miembrode la superfamiliadelas inmunoglobulinasy seexpresaencélulasendoteliales activadas(Polteet aL 1990;Cybulskyetal. 199la). Existendiferentesformasde VCAM- 1 reguladaspor “splicing” alternativo;varíanenel númerode dominiosde Ig. La forma predominanteen célulasendotelialescontiene7 dominiosde Ig (VCAM- 1 7D) (Cybulsky et al. 1991a, 1991b;Hessionet al. 1991),y difiere de la forma originalmentedescrita, VCAM-1 6D en un dominio de Ig adicionalentreel tercery el cuarto dominio. Tanto VCAM-l 7Dcomo6D medianadhesiónvia«4(31.Medianteexperimentosde adhesiónse ha demostradoque los dominioshomólogos1 y 4 de VCAM- 1 se requierenparala interaccióncon«4131. Además,«4131 esel receptorde trombospondina(TSP)queesunaglicoproteina presenteen plasma(Yabkwitzet al. 1993)y de la proteínabacterianainvasin(Ennisetal. 1993). Por otra parteseha descritotambiéncomomediadorade agregacióncelular homotípicaa travésde un mecanismoLFA- 1IICAM- 1 independiente,sugiriendosela existenciadeotro ligando celularpara«4(31aúnno identificado(Campaneroet al. 1990; Bednarczyk1990;Caixiaet al. 1991). Introducción 16 1.6.- Regulación funcional de las integrinas Lascélulaspuedenvariarsuspropiedadesadhesivaspormediode la expresiónselectiva de lasdistintasintegrinasqueexisten,einclusopuedenmodularla capacidadadhesivade los receptoresqueestánexpresando-unamismaintegrinaqueestépresenteen distintos tipos celularespuedeno reconocerlos mismosligandos-.La expresiónsuperficialdeuna integrinano implicasu funcionalidadcomomoléculacapazdemediaradhesión. La afinidad de las integrinaspor susligandosno essiempreconstante,estoes, las integrinasexistenen variosestadosde activación.Hay numerososejemplosdescritos que muestrancómo la avidezpuedeser moduladade forma rápida y reversible -fenómenosde activacióny desactivación-.La naturalezatransitoriadeestosfenómenos esprobablementeun importantemecanismoparaliberarlos linfocitos de otrascélulasy permitir de forma repetidala unión/liberacióncelular (Teixido and Sánchez-Madrid, 1993). La activaciónde plaquetas,neutrófilos y linfocitos por diferentesestímulos aumentanla avidezde las integrinas 33, (32 y (31 por sus ligandos (Springer, 1990; Hemíer,1990;Hynes,1992).Losmecanismosde adhesióndependientesde activaciónse handescritopara«4131 y «5131 en célulasT (Shimizuet al 1990).TambiénlascélulasB activadasseunenconmayor avideza VCAM-l y Fn, vía «4131,que lascélulasB en reposo(Freedmanet al. 1990; Postigoet al. 1991; Koopmanet al. 1991). Un efecto reguladorsimilar seha descritopara«4137 en célulasT y B activadas.Además,esta regulaciónocurre“in vivo”, comohandemostradoalgunosestudiossobrela funciónde «4(31 en célulasT aisladasde sinovio inflamadoen pacientesconartritis reumatoide (Laffónet al. 1991; Postigoetal. 1992).Los mecanismosmolecularesqueconducena los procesosde activaciónde integrinasno seconocentotalmente.Es posibleque la activaciónde integrinasdependade un cambioconformacionalen los sitiosde unión a ligandos.Estoscambiospodríanserseñalizadosporlos dominioscitoplasmáticosde las integrinas,quizadebidoa interaccionesconotrasproteínasdel citoesqueleto.Pareceque la actividadde uniónde unaintegrinadependedel dominio citoplasmáticode la subunidad (3 mientrassu funciónpodríaserreguladapor el dominio citoplasmáticodelassubunidad « (Sonnenberg,1993). Sehademostradola existenciade cambiosconformacionalesen integrinassolublescuyaafinidadpuedesermoduladapor Acm, asícomopor ligandos fisiológicos(OTooleet al. 1990; DuX etal. 1991;Arroyo etal. 1993).En estecontexto, la cadena(31 regula la afinidad de diferentesheterodimeros«[31, incluyendo«4131 (Arroyo etal. 1992;Kovach et al. 1992;Faulíet al. 1993;Masumotoer al. 1993).Todos estosdatosparecenindicarquela interaccióndelas integrinas131 consusligandospuede ser reguladapor el cambio entre conformacionesdiferencialmenteactivas de los receptores«¡31. Introducción 17 Paraalgunasintegrinasse ha sugeridounarelación entre fosforilación y su funcióncomoreceptordeadhesión(Sonnenberg,1993).Unacuestiónaresolveressi la fosforilación juega un papel importante en la interacción de las integrinas con componentescitoplasmáticos.Aunqueseha publicadola fosforilaciónde lasproteínas talma,vinculinay paxilinaencélulastratadasconPMA, no estáclarosi la asociaciónde integrinasrealmentedependede la fosforilación de talma u otros componentesdel citoesqueleto.Tambiénsetienen datos sobre ciertos lípidos que puedenregularla actividaddelas integrinas(Sonnenberg,1993). La estimulaciónconPMA, puedeproducirla activaciónde las integrinaspudiendo entoncesunirsea susligandos.Distintostrabajoshan documentadoque la uniónde las integrinasasusligandosconducea un cambioconformacionalen el dominioextracelular del receptor.Estoscambiosresultaríanen la expresiónde nuevosepítoposcapacesdeser detectadosporAcms. Sepodríapensarquela unión aligandostambiénpodríainducirun cambioconformacionalen el dominiocitoplasmáticode la subunidadII o inclusoen la subunidada. Otrasproteínascitoplasmáticaspodrían,de estaforma, interaccionarconla subunidad¡3 estableciendoseasíla uniónconel citoesqueleto. Tambiénsehandescritomecanismosde activaciónindependientesde PMA que incluyentratamientosde integrinasconciertoscationesdivalentecomo Mn2+, Ac contra distintassubunidades,o con péptidosquecontienensecuenciasactivasde los ligandos (Sonnenberg,1993).La activacióninducidapor estosagentespodríamimetizarel cambio conformacionalde lasintegrinas. 1.7.- Transmisiónde señalesa través de las integrinas. La adhesióna la MEC conducea cambiosen la morfologíacelulary la organizacióndel citoesqueletoy afectaafuncionescelularescomoproliferacióny diferenciación.Aunque duranteun tiempo seconsideróque las interaccionescelularescon la MEC eran puramentemecánicas,actualmenteexistenevidenciasde la implicaciónen la señalización desdeel exterioral interiorcelular. Lasprimerasevidenciasmostraronquela expresióngénicasemodificabatrasla adhesiónaproteínasdeMEC o tratamientoscelularesconAc anti-integrinas.(Eiermenet al. 1989;Werbet al. 1989;Haskill, 1991; Julianoand Haskill, 1993).Aunquelas rutas de señalizaciónqueconducenaestoseventosseestánestudiando,aúnsedesconocenlos mecanismosprecisospor losque setransmitenseñalesvía integrinas.Entre losejemplos descritosdecontroldela expresióngénicaatravésde interaccionesadhesivasconla MEC sepuedecitar la inducciónde expresiónde genesde metaloproteasassubsiguientea la adhesiónde célulasfibroblásticasa fragmentosde Fn y Acm anti-ct5.Sin embargo,el casomásdramáticode induccióngénicaatravésde interaccionesadhesivasconMEC sucedeen monocitos;estascélulassufren un cambiorápido en el patrónde expresión Intrnducción 18 génicatrasla adhesiónaproteínasdeMEC (JulianoandHaskill, 1993).La interacciónde «5¡31 con Fn en célulasT induceel factor de transcripciónAP-1 (Yamadaet al. 1991). «4131 en monocitosactuacomounaprimeramoléculaproduciendounaseñalcapazde regularla expresióndegenesde citoquinasinflamatorias(Yurochkoetal. 1992). Comoya seha mencionado,el dominiocitoplasmáticode la subunidad131 delas integrinasinteraccionaconelementosdel citoesqueletoen los contactosfocales.Otras proteínasconfuncionesreguladoraso enzimáticasselocalizantambiénen los contactos focalesy podríanser importantesen la transducciónde señalesmediadasporadhesión. Estasproteínasincluyenisoformasespecíficasde pKC, pp6Oscr,asícomootrastirosina quinasas.Estasprobablementeseanactivasen los contactosfocalesporel alto nivel de proteínasfosforiladasen tiwsinaquesedetectanenestossitios (Defilipi et al. 1994). Además,lasrutasde señalizaciónidentificadasmediadaspor integrinasincluyenla regulacióndela bombaNa~/H~,el flujo de Ca2testimulaciónde la síntesisdelípidosy fosforilación en tirosina de unaproteínade 130 kDa quesedenominó~~i 2sfak y se localizaespecialmenteen loscontactosfocales(Teixido andSánchez-Madrid,1993). 2.- OBJETIVOS Objetivos 19 QBJEflYOS Lasinteraccionesde los leucocitosconla matrizextracelular(MEC) sonfundamentales parasu migración y localizaciónen tejidos, asícomo parael desarrolloy la función generalde estascélulas. La interacción de los leucocitos con el componentede MEC Fn está principalmentemediadapor las integrinas«5131 y «4131,que reconocenla secuencia ROD en la regióncentraly lossitiosCSl/HepII en la regióncarboxilo-terminalde En respectivamente. Sin embargo,se desconocenotros muchos aspectossobre la interacción leucocitariacon Fn mediadapor «4131 y «5131, por ejemplo los sitios adherentes adicionalesimplicados, regulaciónfuncional de estos receptoresy consecuencias intracelularesdeestasinteracciones. Así, nos planteamosprofundizaren el estudiode la interacciónleucocito-Fnvía dichasintegrinasy en estecontextonuestrosobjetivosconcretosfueron: 1.- Estudiode la interacciónde los leucocitoshumanosconla regióncarboxilo- terminalde Fn: a.- Caracterizaciónde nuevosAcm anti-Fncomoinstrumentosde trabajoen el estudiode interaccionescelularesconFn. b.- Estudiodel reconocimientodel dominioHepII de Fn a travésde la integrina «4f31 expresadaen distintas poblacioneshematopoyéticas;análisis de la regulaciónfuncional. 2.- Estudiode la interacciónde los leucocitoshumanosconla regióncentralde fibronectina: a.- Identificacióndenuevosligandosenla moléculadeFn. b.- Análisisde los receptorescelularesimplicadosy suregulación. 3.- Estudiode las consecuenciasbiológicasde la interacciónde la integrina«4131 consusligandosen Fn: a.- Reorganizacióndelasproteínasdelcítoesqueletotrasla interaccióndel receptor condistintosligandosde Fn. b.- Análisisde los eventosde fosforilaciónposterioresalas interaccionescitadas. 3.- MATERIALES Y METODOS Materialesy Métodos 20 MATERIALES Y METODOS 3.1.- Proteínas de matriz extracelular (MEC) 3.1.1.- Fibronectina, fragmentos de fibronectina y péptidos sintéticos Lafibronectinaplasmáticahumana,donadapor los Drs. B. Horowitz y R. Shulman (New York Blood Center,New York, NY), sepurificó por cromatografíade afinidaden columnasde gelatina-Sepharosa(PharmaciaLKiB Biotechnology,Uppsala,Sweden).El eluido(fracciónUrea4 M) sedializó a 412 frente aunasoluciónTris 25 mM, CíNa50 mM, EDTANa2 0.5 mM pH 7,6 (en adelantesoluciónTris 25 mM) y se utilizó para obtenerdistintosfragmentosde Fnpordigestiónenzimática. Los fragmentosde 200, 190, 31 y 29 kDa seobtuvieronpor digestiónsuave de la Fn contripsina(1:1000w/w, 15 mm, temperaturaambiente)y posteriorpurificación con una columnade gelatina-Sepharosaequilibradaen unasoluciónTris 25 mM. Los fragmentosunidosa dichacolumna-200y 190 kDa- seeluyeronconunasoluciónTris 25 mM, Urea 4 1v! y sepurificaronposteriormentecon unacolumnadeSephacryl5-200 (Pharmacia);los fragmentosno unidosala columnade gelatina-Sepharosa-29y 31 kDa- sesepararon,a continuación,con unacolumnade heparina-Sepharosa(Pharmacia)(el fragmentode 31 kDa apareceen la fracción no uniday el fragmentode 29 KDa en la fraccióneluidaconCiNa0.15 M). Porúltimo, unacolumnade DEAE-Sephacelpermitió la purificaciónfinal delfragmentode 31 kDa. Losfragmentosde Fn de 80, 58 y 38 kDaseobtuvieronapartir de digestiones másexhaustivasde Fn con trípsina (1:200w/w, 90 mm, a 3712). La aplicacióndel digeridopor cromatografíadeafmidadencolumnasdeheparina-Sepharosapermitio eluir: - los fragmentosde 80 kDaenla fracciónde CINa 0.1 M. - losfragmentosde38 y 58 kDaenla fracciónde CíNa0.5 M. Posteriormente,el fragmentode 80 kDa se purificó utilizando unacolumnade gelatina-Sepharosay otracolumnade DEAE-Sephacelacontinuación(fracción de CíNa 0.2 M); los fragmentosde 38 y 58 kDa se separaronpor medio de unacolumnade DEAE-Sephacelqueretieneel fragmentode58 kDaperono el de38 kDa; el fragmentode 58 kDa seeluyóen la fracciónde CíNa0.08 M y se purificó posteriormenteporFPLC (Pharmacia).Finalmente,el fragmentode 38 kDa,presenteen la fracción no unidade DEAE-Sephacel,sepurificó conunamatrizdeCM-Sephacex(Pharmacia)equilibradaen unasoluciónTris 10 mM, Urea2 M, CíNa50 mM pH 7.0. Tras la eliminaciónde los materialesno unidos,el fragmentode 38 kDaseseparóde otros contaminantespor un gradientedeCINa (50-300mM) atravésdeestacolumna. Además,sehanutilizado los fragmentosde 15 y 45 kDa obtenidosa partirde la digestióndel fragmentode 80 kDa con pepsina(1:100w/w, 3712, lh) y posterior Materialesy Métodos 21 purificación por FPLC utilizando una columna de intercambio jónico Mono Q (Pharinacia)equilibradaen Tris 10 mM pH 7.0 (buffer A). Los fragmentosunidosse eluyeronapartir de un gradientede 45 mm desde100% A hasta40%A-60%B (Tris 10 mM,dNa0.5 M pH7.0). La concentraciónfinal de CINaera0.3 M. Finalmente, los fragmentospurificados se dializaron frente a PBS, se concentraronen algunoscasosy sealmacenaronen alicuotasa-7012.La caracterización y el controlde la purezade los fragmentosasíobtenidos,sellevó a cabopor técnicasde SDS-PAGE,Westernblots, ELISA, y secuenciaciónde la región N-terminal. Los términosFN38 /FNS8IFN8O o fragmentosde Fn de 38 kDa, 58 kDa y 80 kDa se utilizaránindistintamentealo largodeltexto. Los péptidos sintéticoscitadosa continuaciónse utilizaron a lo largo del desarrollode estatesisy seencargaronaBio-SynthesisD&I (Madrid,España): 1.- GRGDSPC 2.- GRGES 3.- DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPSTC(CS-1) 4.- PSTVQKTPFVTHPGYDTGNGIQLPG(CS-2) 5.- CIQLPGTSOQQPSVGQQMIFEEHGFR(CS-3) 6.- CGEEIQIGHIPREDVDYHLYP(CS-5) 7.- IDAPS(HJ) La secuenciaGRGDSPCestáincluidaen la regióncentralde Fn siendocapazde mediaradhesióncelular;la secuenciaGRGESesuna secuenciacontrol. Los péptidosCS- I,CS-2, CS-3 y CS-5 estáncontenidosen la región IIICS de Fn (ver figura) y la secuenciaIDAPSesun sitio activoincluidoen el dominio Hep II. 3.1.2.- Laminina, Colágeno tipo 1 y Vitronectina A lo largo del desarrollode estatesis se han utilizado otrasproteínasde MEC como lamininay colágenotipo 1 -enadelanteLM y COL respectivamente-de SigmaChemical Co. (Saint Louis, MO, USA). Además,seha utilizado la proteínavitronectina(VN), donacióndela Dra.Dejana(Instituto di RicercheFarmacologidie“Mario Negri”, Milán) 3.2.- Anticuerpos Los anticuerposmonoclonalesanti-Fn , PíFí1 y P3D4, fueron producidospor inmunización de ratones RBJ/DnJ con el péptido sintético CS-1 (DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST)(Humphrieset aL1987) acopladoahemocianina deKeyholeLiimpet - KLH -, o conel fragmentode 38 kDarespectivamente,utilizando Materialesy Métodos 22 técnicaspreviamentedescritas(Wayneretal. 1989). Los anticuerpospoliclonalesfrente al fragmentode 38 kDa seobtuvieronpor inyecciónsubcutáneade conejosNew Zealand Whiteconel fragmentopurificado. A continuación,la Tabla1 sumarizaotrosAcm anti-Fnutilizadosen estatesisasí comoAcm anti-integrinasy otrosno incluidosen los dos gruposanteriores. IABLAJ ANIJCUEREQiMQN=KLQNALES Anli~1ntPfnna*z 11F5 P1B5 HP1/1 HP1/2 HP2/l HP2/4 B5010 PlDó LM6O9 152/16 Alexl/4 HC1/1 AniF~ N-295 N-296 N-288 D3/9 ~~nprificAciad «3 «3 «4 (epitopoA) «4 (epitopoRl) «4 (epitopoBí) «4(epitopoB2) «4(epitopoO) «5 «vf33 ¡31 ¡31 CD1Ic fragmento15kDa (RGD+) regióncarboxi-terminal N-terminal CD4S flúg~n Dr, M. Hemíer Dra. E. Wayner Dr. F. Sánchez-Madrid Dr. F. Sánchez-Madrid Dr. F. Sánchez-Madrid Dr. F. Sánchez-Madrid Dr. M. Hemíer Dra. E.Wayner Dr. D. Cheresh Dr. F.Sánchez-Madrid Dr. F.Sánchez-Madrid Dr. O. Bemabeu Chemicony Dr.J.McDonald Chemicon Chemicon Dr. C. Bernabeu 3.3.- Células y cultivos celulares Se hanutilizado tanto lineascelularesestablecidascomocélulasobtenidasde sangre periféricade donantessanos.Todaslas líneascelulareshansido cultivadasen medio RPMI 1640, 10 % STF descomplementado(Gibco Life Technologies,Middlesex,UK),2 Materialesy Métodos 23 mM L-glutamina, 100 u/mlpenicilina(Antibióticos S.A., Madrid, España).y 24 mg/ml gentanúcina(Llorente,Madrid, España).LascélulasTHP-1 semantuvieronenel mismo mediosuplementadocon50 mM 2-ME. La TablaII muestralas líneascelularesutilizadas a lo largodel desarrollode estatesisindicandosu origen.Los experimentosde inducción de diferenciaciónconPMA serealizaronen frascosde Teflon (Pierce,Rockford,IL); 5 X l0~ células/mlseincubaroncon 10 ng/mlde PMA (SigmaChemicalCo., St.Louis, MO) durante48 h. Los cambiosmorfológicoscaracterísticos(formaciónde agregados)y la expresiónincrementadade la moléculaCD1lc seemplearoncomocontrolde la eficacia deltratamientoconPMA en la inducciónde diferenciacióncelular. Los linfocitos y monocitosde sangreperiféricaseobtuvieronde la sangrede donantessanos;despuésde la centrifugaciónen gradientede densidaden Lymphoprep (Nycomed),las célulasmononuclearesse depleccionaronde células adherentespor incubación(2 h a 3700)en frascosde plásticopreviamentetapizadoscon suero.Los linfocitos 1seobtuvierona partir delos linfocitos de sangreperiférica(PBL) utilizando columnasdelanade nylon. Iá&LLU lINFAS <‘FI ITT MW,S ~~nnminne44n Ramos HUT-78 U937 HL-60 THP-l Daudi JY RPM18866 A375 K562 Jurkat linfoide B linfoide 1 promonocítica promonocítica promonocítica linfoide B linfoide B linfoide B melanoma eritroleucemia linfoideT Materialesy Métodos 24 3.4.- Ensayos de adhesión celular Losensayosde adhesióncelularsellevaronacaboconcélulasdespuésde cuatrodíasdel último paseutilizando placasde 96 pocillos de fondo plano (ION BiomedicalsLtd, Bucks, UK en algunoscasos,y en otros CostarCo., Cambridge,MA, USA). Las placasde96 pocillos seincubaronconlas dilucionesapropiadas(100 ~tl/pocillo) de Eno susfragmentos,u otrasproteínasde MEO, durante2 h atemperaturaambiente.Después de treslavadosconPBS, las placasse incubaroncon 1% BSA en PBS al menos1 h a 3712, y selavaronnuevamenteconPBS-iones(Cl2Ca0.9 mM, CI2Mg 0.5 mM) antes de aifadir 100¡xl de la suspensióncelular apropiada- 0.5 x106 células/míenRPM!, 1% BSA, 10 mM Hepes-.Lasplacasseincubarondurante30 mm en estufaa3700y después de dos lavadoscon RPM!, 10 mM Hepes, las células adheridasse fijaron con glutaraldehido(1,25%)durantetoda la noche.La absorbanciade las células teñidas durante4 h con azul de toluidina - 0,1% - se midió a 492nm conun lector MRPA4 (Eurogenetics,Bélgica) en los primeros experimentosy a 620 nm con un lector Multiskan Bíochromatic(Labsystems,Helsinki, Fínland)en el restode los casos.La cuantificaciónde lascélulasadheridasserealizó a partir de la DO a 492 nm 6 620 nm, segúnlos casos,utilizando curvasde calibraciónparacadatipo celular. La relación “numerodecélulas1 DO” resultóserlineal en el rangocelularO.5X103-2.5X104paralas líneascelulares-con mínimoscambiosenteellas-yenel rango3.2X103-2X1($paralos linfocitosT de sangreperiférica.Todoslos ensayosserealizaronen triplicado. La activación de integrinasa travésde la subunidad¡31 sellevo a cabopor incubacióncelular previa con unadilución 1:10 de los sobrenadantesde hibridomas Acm(s) anti-13l, 15-20 mm a 3700, antesde los ensayosde adhesióncelular.Paralos experimentosde inhibición con Acm(s)anti-Fn, los pocillos previamentetapizadoscon Fn seincubaron30 mm atemperaturaambientecon50 gí de la dilución adecuadadelos Acm correspondientesantesde añadirlascélulas.Parael restodeensayosde inhibición lascélulasseincubaronpreviamentecon Acm anti-integrinas(15 mm, 3700),péptidos sintéticoso fragmentosde Fn (30 mm, temperaturaambiente)antesde afiadirsea los pocillostapizadosconlos distintossustratos. 3.5.- Ensayosde ELISA y WesternBlot Las placasde 96 pocillos (Corning tu e O B2 > A). uu~0 e e ee 40 Fig.4.1O.- Inhibición de la adhesión de células linfoides a fragmentos de Fn inmovilizados con Acms anti.a4 o fragmentos de Fn solubles.A: las células Ramos se preincubaron -1 h a 40C- con los Acms anti-epitopoA (HPI/l), Bló (HP2/1) y B2 (HP2/4) de la cadena«4, y se añadieronapocillos previamentetapizadosconlos fragmentosde 38 kDa (0,38 gg/cm2)(círculosblancos)6 58 kDa (5 gg/cm2)(círculosnegros).B: las células HUT-78 se preincubaron-30 mm. a temperaturaambiente- con las concentracionesindicadasdelos fragmentosde 38 y 58 kDa,y seañadierona los pocillos tapizadoscon el fragmento de 58 kDa (5 ~tg/cm2). En ambos experimentoslas célulasadheridassecuantificaronsegúnlo descrito en los materialesy métodos.Los valoresrepresentadosindicanel porcentajede células adheridasrespectoal control(sin inhibidores);el valormediodecélulasadheridas en loscontrolesfué 6.000(A) y 14.000(B). Estosúltimosresultados(fig.4.lOA) parecíanindicarquela secuenciaCS-1 (sólo en 38 kDa) y el dominioHep11(58kDa) interaccionabancon regionespróximasen la integrina«4131; además,fragmentossolublesde 38 kDa (contienenCS-1 y HepII) eran Resultados 38 capacesde inhibir la adhesióncelularal fragmentode 58 kDainmovilizado,confirmando así dicho supuesto.Como puedeapreciarseen la figura 4.lOB, la preincubaciónde célulasHUT-78 (y Ramos,aunqueno estárepresentado)confragmentossolublesde 38 kDa (contieneCS-1 y HepII) inhibenla adhesiónde estascélulasal fragmentode 58 kDa mientrasqueel fragmentosolublede 58 kDa (sólo contieneHep II) inhibeparcialmente (30%)la adhesión. Todosestosdatossugeríanquela integriina«4131estápresenteencélulaslinfoides comounaforma capazde reconocerla secuenciaCS-1 y el dominioHepLI, mientrasque «4131 seexpresaen célulasmonociticascomounaformacapazdereconocersóloel sitio CS-1.Además,comoseverámásadelante,nuestrosresultadosmostrabanquelascelulas linfoidesT extraídasde sangreperiféricade donantessanossecomportabanigual quelas célulasmonociticas;esdecir, no uníande forma constitutivael fragmentode 58 kDa aunquesi uníanel fragmentode 38 kDa vía «4131.Por tantose puedeconcluirqueel reconocimientodelos distintossitiosde adhesiónde Fnesdependientedel tipo celular. 4.2.3.- Efecto de la diferenciación y la activación celular en el reconocimiento del dominio Hep II Ferreiray col. (1991),habíanmostradoquela diferenciaciónde las célulasU937afectaba la expresiónsuperficialde las integrinas«5131y a4j31,asícomola unióndeestascélulas alos fragmentosdeFn de 80kDa -contienela secuenciaROD- y 38 kDa-contieneel sitio CS-1-. En baseaesto,decidimosestudiarsi eraposibleinducir el reconocimientodel dominio I-Iep II en célulasmonociticas,es decir, si eraposiblepromoveradhesiónal fragmentode 58 kDa -sólo contieneHep II-, y si estaunióntenía lugara travésde la integrina «4131.Utilizamos la líneacelular promonocíticaU937 paradeterminarsi los ésteresdeforbol (PMA) queinducendiferenciacióny/o activaciónde estascélulastenían algúnefectoen la induccióndel reconocimientodeldominio HepII. Comosemuestraen la Fig.4.11 el tratamientoconPMA (5 ng/mí,48h) indujo la adhesiónde las célulasU937al fragmentode 58 kDa deformadependientededosis.Está demostradoqueenestascondicionesel PMA inducela diferenciaciónde célulasU937a un estadode maduraciónsimilaral de los monocitos. Resultados 39 25 o> 20 1 .2 15 ~1 u .3 — 103 200 Fig.4.11.- Efecto del tratamiento con PMA sobre la adhesión de células U937 al fragmento de 58 kDa inmovilizado. Las células en reposo-cuadradosnegros-o las célulastratadasconPMA durante48h (10 ng/mí) -cuadradosblancos-o 20 mm.(50ng/mí) -círculosnegros-seañadierona pocillos tapizadospreviamentecon 100 jil de las concentracionesindicadasdel fragmento de 58 kDa.Tras 30 minutosde incubación,las célulasadheridassecuantificaron como ya se ha descrito.Las determinacionesse hicieron por duplicado y los valoresquesemuestransonla mediade tresexperimentosseparados.Los valores de lasordenadasrepresentanel porcentajedecélulasadheridasrespectoal total de célulasañadidasporpodilío (5x10~). Estos resultadossugeríanque la diferenciaciónde lascélulasU937 sepodría asociara la conversiónde «4131en unaforma másactivacapazde reconocerel dominio HepII. Sin embargo,teniendoen cuentael periodode tiempo transcurrido(48 h) y la gran cantidad de cambios que sufren las células U937 durante su procesode diferenciación(Minta et al. 1985) no resultabaposible, en principio, descartarla contribuciónde otrosfactoresque pudieranestarafectandoalas propiedadesde adhesión deestascélulas.Paraeludiresteinconvenienteseestudióel efectode tratamientoscortos conPMA (50 ng/mí,20 mm.) sobrela adhesiónde lascélulasU937al dominio Hep II. Enestascondicionesel PMA induceactivaciónperono diferenciacióncelular.Comose muestraen la Figura4.11,el efectodela activaciónen adhesióncelularfue aún mayor 0 50 100 150 Concentración de 58 kDa ~glml) Resultados 40 queel obtenidopor tratamientolargoconPMA, descartandoasíla contribuciónde otros factoresque sepodríaninducir en el procesode diferenciacióncelular.Tambiénse estudiaronlas lineascelularesmonocíticasHL-60 y THP-1, aunqueno semuestranenlas gráficas,obteniéndoseresultadossimilaresen adhesiónal fragmentode58 kDa. Paraconfirmarla implicaciónde la integrina«4131 enel reconocimientoinducido del dominioHepII, llevamosacaboensayosde adhesiónconcélulasU937tratadascon PMA en presenciade distintosAcms dirigidos contralos ya citadosepítoposde la subunidad«4. Los Acms anti-a4 inhibieron de forma eficientela adhesióncelular al fragmentode 58 kDa,obteniéndoseun patrónde inhibición para los epítoposA, Rl, y B2 de«4 equivalenteal observadoparala inhibición de la adhesiónde las célulasRamos alos fragmentosde 38 kDa(08-1 y Hep II) y 58 kDa(datosno mostrados). Por otraparteparaestablecersi el tratamientoconPMA afectabael patrónde la expresiónrelativa de los epitopos de «4 (A, BI,B2 y C). se analizaron por inmunofluorescencialas célulasU937en reposoy tratadasconPMA (48h),utilizandoel panelde Acms descritopreviamente.Comoseindicaen la tabla 1 no se observóningún cambioen la expresiónrelativadelos epitoposde «4 despuésdel tratamientocelularcon PMA, sólounadisminuciónde la expresiónde todosellos. Aunque no semuestraen la tabla, los tratamientosbrevescon PMA no produjeronningúncambioen la expresión superficialde «4131,lo quepodríaexplicarqueel aumentode la adhesiónal fragmentode 58 kDaesmayora tiemposcortosde tratamiento(ver Fig.4.11). TABLA] Expresiónde losepítoposde «4 en célulasU937en reposoo tratadasconPMA Anticuerpos IntensidadMediadeFluorescencia U937 PMA-U937 HP1/1 (A) 115,2 105,2 HP2/1 (Bí) 107,8 94,1 HP2/4(B2) 125,9 110,5 B-5G10(C) 128,9 95,8 HCl/l (CD11c) 34,2 63,0 Resultados 41 Estos resultados apoyan el concepto de que el reconocimiento del dominio Hep Il por ~~481 es dependiente del estado dc activación de esta integrina. Sin embargo, cs tambicn concehihle que la difcrentc funcionalidad de a4pl en células linfoides y monocíticas sea debido además a alguna difcrcncia bioquímica. Para estudiar esta posibilidad llevamos a cabo ensayos de inmunoprccipitación y análisis por SDS-PAGE. Como ya se ha mencionado, la intcgrina (~401 está compuesta por la cadena ct4 dc 150 kDa y la cadena pl dc 130 kD asociadas de forma no cavalente; sin embargo, “in vivo” la subunidad a4 pucdc degradarse proteoliticamentc lo que produce la aparición dc polipéptidos de 80 y 65 kDa en preparaciones puras de a4fil. La figura 4.12 muestra los resultados de las inmunoprccipitacioncs utilizando Acms anti-PI y ami-a4 para las cclulas Ramos, UY37 y UY37 tratadas con PMA (48h). Las subunidades a4 y pl de las células Ramos y UY37 mostraron una movilidad clcctroforética diferente. Los resultados aquí obtenidos muestran un patrón de rotura dc ~4 diferente para las distintas líricas cclularcs: a4 aparece cn la forma intacta de 150 kDa (Ramos, linea a) y como una mezcla de las formas 1x4/150 y a4/80,70 ( UY37, PMA-UY37; lineas h y c). Utilizando Acms anti- fil, ademas de la forma intxtza dc 1.50 kDa, la forma inîrecuentc dc 180 kDa SC dctcctó para UY37 (linea b) pero no para PMA-UY37 (linea c). La forma dc 180 kDa no SC observó al utilizar Acms anti-a4. Estos resultados podrían sugerir algunas difcrcncias cn a4l?il cntrc las distintas lineas cclulüres; sin embargo, resulta dificil interpretarlos puesto que no SC ha podido demostrar yuc estas formas estCn directamcntc relacionadas con cl rcconocimicnto diferencial dc distintos ligandos dc Fn. ab E Fig.4.12.- Inmunoprecipitación y análisis por SDS-PAGE de la integrina ct4pl en células Ramos (línea a), U937 (b) y PMA-UY37 (c). Las cC1ula.s marcadas con 1251 se lisaron en condiciones de asociación. Los inmunoprecipitados con el Acm ami-p1 TS2/16 se analizaron por SDS-PAGE. Resultados 42 4.2.4.- Regulación del reconocimiento del dominio Hep II a través de la subunidad 131 de las integrinas RecientementesehademostradoqueciertosAcm dirigidoscontrala subunidad¡31 soncapacesde regularla funcióndelas integrinasdeestafamilia (Arroyo et al. 1992;Van de Wiel-van Kemenadeet al. 1992; Kovachet al. 1992;Wayneret al. 1992).Por tanto decidimosevaluarel efectode talesAcms en el reconocimientodeldominio Hep JI por célulasmonocíticas.Paraello, estudiamosla adhesiónal fragmentode 58 kDa delíneas celularesmonocíticastratadaspreviamentecondichosAcms.Utilizamos los Acmsanti- ¡31 TS2/16y Alex 1/4 (Arroyo et al. 1992);TS2116 es un Acm activadorcapazde aumentarla afinidaddelas integrinas131 por susligandos,Alex 1/4 esun Acm neutroque no afectala funciónde las integrinas.La figura 4.13A muestrala adhesiónal fragmento de 58 kDa de las líneasmonocíticasTHP-1,U937,y HL-60. La cuantificaciónde este ensayoindicó queel 16-20%de las célulasinicialmenteañadidasseunenespecíficamente aesaconcentraciónde 58 kDatratandosede célulaspreincubadasconel Acm TS2/16.Es decir, el Acm TS2/16induce el reconocimientodel fragmentode 58 kDa que sólo contieneel dominioHepII. Al compararlas figuras 4.11 y 4.13B sepuedeobservarque los valoresde adhesiónobtenidosconel Acm TS2/16y trasel tratamientocelularcon PMA de U937sonsimilares. Fig.4.13.-(’ver página siguiente) A.- Efecto de los Acm(s) TS2/16 y Alex 114 sobre la adhesión de las células monocíticas U937, THP-1 y HL-60 al fragmentode58 kDa. Las célulasfijadas,se Uñeroncon azul de toluidina 0,1% y se fotografiaron.Las célulastratadascon TS2/16 seunen eficientementeal fragmentode 58 kDa (HepII) mientraslas célulastratadascon Alex 1/4 o en reposono se unen. B .- Inducción de adhesión celular al fragmento de En de 58 kDa por Acms y cationesdivalentesMn2 + para distintas células.Los pocillos seincubaron con 100 u~ del fragmentode 58 kDa (38 ~tg/ml,0,6 nmol). Las célulasmonociticas(THP-1, U937,HL-60) y LT de sangreperiféricaen reposo,pretratadoscon el Acm TS2/16,el Acm Alex 1/4 o Cl2Mn lmM seañadierona los pocillos y se incubarondurante30 mm a 370C. Las célulasadheridassecuantificaroncomoya seha mencionado.Los valoresrepresentadossonla mediade dosexperimentoscadauno deloscualesse realizóporduplicadoy correspondenal porcentajedeltotal de célulasañadidas. Resting +Ale arli u937 q Mn2+ q TS2/16 q Alexll4 THP-1 u937 HL-60 T cells Adhesión al fragmento de 58 kDa , THP-1 HL-60 Resultados 44 Siniultaneaniente,serealizaronensayosde adhesióncelularal fragmentode Fn de 38 kDa,conel fin de compararel nivel de adhesióninducidaal fragmentode 58 kDacon la adhesiónconstitutivaal fragmentode 38 kDa.La figura 4.14muestraquela adhesión constitutivade las lineascelularesTHP-1, U937 y I-IL-60 tambiénaumentacuandolas célulassepreincubanconel Acm TS2/16.El Acm Mex 1/4no tieneningúnefecto.Estos resultadosdenotanqueel Acm T52/16aumentala ahesiónconstitutivade estascélulas, afectandoasíla interacciónde «4131consusdos ligandosde Fn (HepUy CS-1).Resulta interesantecomprobarquea la mismaconcentraciónmolar -0,6 nmol y 0,5 nmol del fragmentode 58 kDa (fig.4.13) y de 38 kDa (fig.4. 14), respectivamente-el nivel de adhesióninducidaal fragmentode 58 kDaessimilar al nivel de adhesiónconstitutivaal fragmentode38 kDa paracadalíneacelular. 50 40 o> ‘~60 ‘O ‘E ‘O c~4O 4, .2 Fig .4.17.- Adhesión al fragmento de 80 kDa de las células linfoides Ramos (A) y Dandi (B). Las célulassepreincubaronconlos Acms Alexl/4 -círculos negros-o TS2/16-círculos blancos- y se añadierona los pocillos tapizadoscon las concentracionesindicadasdel fragmentode 80 kDa. La cuantificaciónde las célulasadheridasse indica en el capítulode materialesy métodos.Losvalorescorrespondena la mediade tresexperimentosdistintosque se hicieron porduplicado en cada caso. Estosresultadosmuestranclaramentequelas célulasRamosy Daudiadquierenla capacidaddereconocerel fragmentode 80 kDa despuésdel tratamientocelularcon el Acm T82/16. La mayor adhesiónal fragmentode 80 kDa observadapara las células Ramos respectoa Daudi probablementese justifica por la mayor expresiónde la subunidad¿11 en Ramos versusDaudi (Tabla II). La expresiónsuperficial de las integrinas131 no sevio afectadatrasel tratamientocelularconel Acm TS2/16,de acuerdo conlo observadopor otrosgrupos(Arroyo etal. 1992). Ademásseestudiaronlos fragmentosde 29 y 31 kDa queprocedende la región N- y C-terminalde Fn respectivamente(verfíg.4.l) y tambiéncarecende los ligandos descritosdea4131.Realizamosensayosde adhesióna los fragmentosde Fn de 29 y 31 kDacon célulasRamosy Daudi pretratadascon los AcmsTS2I16 y Alexl/4. La figura 4.18muestrael efectodetalesAcm enla adhesiónde las célulasRamosa los fragmentos de 29,31 y 80 kDa.Puedeapreciarsequeel Acm Alex 1/4no produceefectoen ninguno deloscasosy queel Acm TS2/16tampocolo haceen la adhesióna los fragmentosde 29 y 31 kDa mientras que induce efectivamentela adhesiónal fragmentodc 80 kDa, confirmándoseasíla especificidadde estainteracción. 0 20 40 60 800 20 40 60 80 Fragmento 80 kDa ~,Mg/mI) Restina +TSZi 6 Fig4.18.- Adhesión de las células Ramos a los fragmentos de Fn de X0, 29 y 31 kDa. Para conl’irmar la cspccificidad dc la activacií>n ;I 1fiLvAs dc 13 suhunidad PI. rcnlixunos ensayos dc ;ìdhcsión al l’ragmcn~o de 80 kDa con las lincas ~clularcs H. JY y RPMIX866. Eslas lincas celulares se eligieron porque no cxpresnn la suhunidad 81 (VCT tabla 1) (Chan et al. 1992; Stupnck ct al. 1991; Stupack c:t al. 1992); cn IU&W de l;r suhunidad PI cxprcsan la suhunidad p7 que también SC asocia con a4 (Chan et al. 1992; Postigo ct üI. 1993). Como pucdc obscrvarsi: cn In figura 4.19 el Acm anti-p 1 TS2/ 16 no IUVO ningún cl‘ecto cn la adhesií>n dc IU ct%~las JY y RPM18866 al fragmcntu dc X0 ~Du. micntlms que en el mismo cxpcrimcnto TS2/16 indu,jo itficientcmcntc la adhesión dc Ix cilulas Ramos y Dwdi il cstc fragmcn~o; ohs¿rvcse como la unión conslilutiva dc JY ;11 Iragmcnlo dc X0 kDn no SC vio afectada por el Azm TS2/ 16. El Acm control Alcx IN nu tuvo cfccto cn ninguno dr: los cusos. Resultados 51 4.3.2.- Efecto del PMA en el reconocimiento del fragmento de Fn de 80 kDa en distintas células linfoides B. Nuestrosresultadoshabíandemostradoqueel PMA, al igual queel Acm 152/16,inducIa el reconocimientodel dominioHep11 porpartedealgunascélulashematopoyéticas(ver fig.4.11). Paraestablecersi el tratamientocelularconPMA afectabaal reconocimientodel fragmentode 80 kDaporcélulaslinfoidesB, realizamosensayosde adhesióncelularcon célulastratadascon PMA. Comomuestrala figura 4.19, el tratamientocelularcon 50 ng/ml de PMA durante20 mm. no tuvo ningúnefectoen la adhesiónde lascélulasRamos y Daudi al fragmentode 80 kDa; en el mismo experimentoel Acm TS2/16produjo el efecto esperadoinduciendoadhesióncelular.El PMA tampocoafectóla unión de las célulasRamosy Daudial fragmentode 38 kDa (datosno mostrados).Porel contrario,el PMA resultóser un buen activadorde la adhesiónde lascélulasJY y RPMI 8866 al fragmento de 80 kDa (fig. 4.19); las células JY se unen al fragmento de 80 kDa constitutivamentey el PMA aumentaconsiderablementeestaadhesión.El PMA también induceadhesiónde las células RPMI 8866 al fragmentode 80 kDa. No seobservó ningúncambioen la expresiónsuperficialde las integrinastras dicho tratamientocon PMA (datosno mostrados). Estosresultadossugeríanla implicación de dos receptoresdiferentesparael fragmentode de 80 kDa,unode ellosreguladoporel Acm TS2/16y el otro por PMA. Stupackel al. (1992) handescritoquela integrina«v133actúacomoun receptorde Fn en célulasB. Paraestablecersi czv133 erael receptorparael fragmentode 80 kDa en las célulasJY y RPMI 8866,llevamosa caboensayosde adhesiónal fragmentode 80 kDa en presenciadel Acm anti-cxv133 LM6O9. NuestrosresultadosmostraronqueesteAcm inhibíacompletamente(100%) la adhesióndelas célulasJY en reposoy las célulasRPMI 8866 tratadasconPMA,y parcialmente(45%) la adhesiónde las célulasJY tratadascon PMA. Estosresultadosconfirmabanla implicaciónde «v¡33 enla adhesióndelas células B negativasparala subunidad131 al fragmentode 80 kDa,y sugeríanla existenciade un receptorde Fn todavíano identificadoen lascélulasJY estimuladasconPMA. El Acm LM609 no tuvo ningúnefectoenla adhesiónde las célulasRamosy Daudial fragmento de 80 kDa (fig.4.20), de acuerdocon la ausenciade expresióndeavll3 en estascélulas (verTablaII). Resultados 52 a— 60” u 1W 7s 1~ ~> 40~ “O 0 6, 0 .220- 0u 0--a — — - Ramos JY RPMI Adhesión al fragmento de 80 kDa Fig.4.19.. Efecto del PMA y el Acm TS2/16 en la adhesión al fragmento de 80 kDa para distintas líneas linfoides B. Las células se incubaronconmediodecultivo en el casode las célulascontrol (enreposo),con PMA (50 ng/mí, 20 mm.), o con unadilución 1:10del Acm TS2/16-15 mm. a 37~(2- y seañadieron5x ío4célulasporpocillo previamentetapizadoscon 100 ktl fragmentode 80 kDa (38 vg/ml). La cuantificaciónde las células adheridasse describeenel capítulodematerialesy métodos.Los valoresrepresentanla media de tresexperimentos. 4.3.3.- IdentIficación del receptor celular implicado en el reconocimiento del fragmento de En de 80 kDa. Análisis del sitio activo de este fragmento. Paraidentificarel receptorimplicado enel reconocimientodel fragmentode 80 kDa deFn por célulasRamosy Daudi tratadascon el Acm TS2116,llevamosa caboensayosde adhesióncelularen presenciade distintosAcmsanti-integrinas.LosAcms anti-a4HP1/l y HP1/2 dirigidoscontralos epitoposA y B 1 respectivamente,inhibieronla adhesiónal fragmentode 80 kDa de lascélulasRamos(fig.4.20) y Daudi preincubadasconel Acm TS2/16.LosAcms dirigidos contralas subunidades«5 (P1D6),«3 (11F5),asícomolos Acms anti-«v133(LM609) y anti-CD45(D3/9)no tuvieronningúnefectoen la adhesión • Control • 0 PMA Oaudi Resultados 53 celular al fragmentodc 80 kDa (fig.4.20), implicandoasía la integrina «4131 en el reconocimientode dichofragmento. 100 u 0 ‘O 1~ e ‘O 0 u 0 o a 80 60 40 20 o Adhesión al fragmento de 80 kfla Fig.4.20.- Efecto de distintos Acms en la adhesión de las células Ramos tratadas con el Acm TS2/16 al fragmento de 80 kDa. Las células setrataron-15 mm., 370C- con el Acm TS 2/16, y a continuaciónse incubaron con el Acm indicado durante 15 mm. Los sobrenadantesde hibridomas: D319, PlD6, HP2/l y HP1/1 se analizarona una concentración1:10, y los líquidosascíticosIIFS y LM609 a 1:500.Lascélulasseañadieren (5x 104/pocillo) a los pocillos previamentetapizadoscon 100 pi del fragmentode 80 kDa (38 gg/ml) y despuésde 30 mm. a37 0C, lascélulasadheridassecuantificaroncomo se indicaen los materialesy métodos.Los valoresrepresentanel porcentajede célulasadheridasrespectoal númerode células control,que en estecaso son células preincubadassólo con el Acm TS2/16 sin inhibidor. Los valores representanla mediade dos experimentosdiferentes. Para confirmar la implicación de «4131 en el reconocimiento del fragmento de 80 kDa, estudiamos el efectode distintospéptidossintéticosen adhesióncelular. Como muestrala figura 4.21 los péptidossintéticosCS-l e IDAPS inhibieronen un 100% la adhesióndecélulasRamostratadasconTS2/16al fragmentode 80 kDa,confirmandoasí la implicación de «4131 dadoqueambospéptidosson ligandosde estaintegrina.Los Resultados 54 péptidos control CS-2 (fig.4.21) y CS-3 (no mostrado)no tuvieron ningún efecto en estos experimentos mientras que CS-5 inhibió la adhesióncelular en un 65% (no mostrado).Sorprendentemente,el péptidoGRGDSPCinhibió completamentela adhesión al fragmentode 80 kDamientrasqueel controlRGES no tuvo ningún efecto(fig.4.21). La concentraciónde péptidorequeridaparaproducirun 50%de inhibición de la adhesión celularal fragmentode 80 kDafue: 5,45nM (15 gglml) paraCS-l, 104 nM (80 gg/ml) paraGRGDSPCy 400 (220 vg/ml) paraIDAPS. CS-1 resultóser el inhibidor más eficientey el péptidoGRGDSPCeramejor inhibidorquela secuenciaIDAPS. 100 <080 A) esparecido al obtenidopara los fragmentosde 58 y 38 kDa (ver fig. 4.10) sugiriendoque la interacciónde «4131 con estos fragmentosse produceen regionespróximasde la integrina. Esto se confirma, además, por el hecho de que las secuencias CS-l e IDAPS inhiben eficientemente la adhesión al fragmento de 80 kDa. Nuestrosresultadosindicabanque la activaciónde la integrina«4(31 por el Acm TS2/16 inducia el reconocimiento de la secuencia RGD. Sin embargo, estudios previos han demostradoquela adhesiónde las células Ramosal fragmentode 38 kDa es independientede ROD. Decidimoscomparar,por tanto, el efectodel péptido sintético RODen la adhesióndecélulasenreposoo tratadasconTS2/16al fragmentode Fn de 38 kDa. La figura4.22muestraestosresultados.Estepéptido,a 0,5 mg/ml no tuvo ningún efectocuando las células estabanen reposo,de acuerdocon los datospublicados previamente (García-Pardo et al. 1990)mientrasqueinhibió en un 50% la adhesiónal fragmento de 38 kDa, cuandolas célulasestabanpreviamenteincubadascon el Acm TS2/16. Como esperabamos, el péptido sintético CS-l. que se utilizó como control, resultóserun bueninhibidoren amboscasos. Todosestosresultadosindicanqueel péptidosintéticoRODescapazde inhibir el reconocimientodelos ligandosconstitutivosde la integrina«4131,cuandoéstaseactiva por el Acm 152/16,y por lo tanto la integrina«4131activada-perono en reposo-escapaz de reconocerla secuenciaRGD. loo u U ‘O 80 1~ 4> ‘O ‘O U u U cm> 80 60 40 20 en la incubación o Fig.4.23.- Efecto de Acms anti-Fn en la adhesión de células Ramos tratadas con TS2/16 al fragmento de 80 kDa. A los pocillos previamente incubadoscon 100 i.¡1 del fragmentode 80 kDa (38 gg/ml), se añadieronlas diluciones indicadas de los Acms: N-295 (anti-RGD), P3D4 (anti-Hep II), o el controlN-296 (anti-Fib II) y seincubaron30 mm. atemperaturaambiente.Tras estaincubaciónseañadieronlascélulaspreviamentetratadas-15 mm.,370C-con el Acm TS2116.Las células adheridasse cuantificaronsegún seindica en materialesy métodos.Los valoresseexpresancomoporcentajesrespectoal númerodecélulasen el pocillo control (sin inhibidor) y representanla mediade dosexperimentos. 5,7 ,O1 4 1 10 Dilución de anticuerpos (xlOO) 100 Resultados 58 4.3.4.- Análisis de la especificidad de la interacción a4(31-FN8O Teniendoen cuentaqueel Acm TS2/16escapazde inducirel reconocimientode nuevos ligandosde«4¡31 en la moléculade Fn,estudiamosel efectode esteAcm en la adhesióna otras proteinas de MEC no descritas previamente como mediadoras de adhesión celular a travésde la integrina «4131, como por ejemplo el colageno(COL) o la laminina (LM).Estasdos proteínasson ligandosconocidosde otras integrinas(31 incluyendo «2131,«3(31 y «6f31 (Hynes,1992) Cornomuestrala figura 4.24la preincubaciónde las célulasRamoscon el Acm TS2/16enensayosdeadhesiónalamininay colágenono produjoningúnefecto,mientras que las células se unieron eficientementeal fragmento de 80 kDa, en el mismo experimento.Teniendoen cuentaquela integrinamayoritariaen las célulasRamoses «4(31 (ver Tabla 1), estos resultadosindican que el Acm TS2/16 no induce el reconocimientode lamininay colágeno,apesarde queestasproteinasdela MEC también tienen la secuenciaROD. Por tanto, el reconocimientode la secuenciaRGD por la integrina«4j31 esespecíficodelentornode Fn.Paracomprobarquehabíamosutilizado una concentración suficiente de LM y COL para mediar adhesión celular, utilizamos como control la líneacelularde melanomaA375. LascélulasA375 expresandistintasintegrinas 131 (Tabla1), entreellasel receptorde laminina«6(31 (Arroyo et al. 1992).La figura 4.24 muestraque las célulasA375 se unen constitutivamenteal fragmentode 80 kDa, y a lamininay colágenoconmenoreficiencia;la preincubacióncelularconel Acm TS2/16 aumentóla adhesiónalos tressustratosde acuerdocon los datospublicados(Aroyo el al. 1992;Arroyo el al. 1993).Estaadhesiónno sedebióaun efectode ‘cross-linking” de las célulasa lasproteínasdeMEC víael Acm TS2/16 dadoqueen experimentoscontrol,el Acm TS2/16no seunió aFn,LM, o COL. Porel contrario,el incrementodela adhesión de lascélulasA375 aproteínasde MEC es debidoaunaregulaciónde la adhesióndelas integrinas«5(31,a2f31,y «6(31 queson receptoresdel fragmentode Fn de 80 kDa, COL, y LM respectivamente(Arroyoet al. 1992;Arroyo et al. 1993;Chanet al. 1993). Comoesperábamos,lascélulasRPMI 8866 y JY, quecarecende la subunidad131, no unenLM o COL en respuestaala preincubacióncelularconel Acm TS2/16. Conel fin de determinarsi el cambiode especificidaden el reconocimientode ligandosesunacaracterísticacomúnaotrasintegrinas,estudiamosel efectodeTS2/l6 sobrela adhesiónde la líneacelularK-562 al fragmentode 38 kDa. LascélulasK562 expresan«5131 pero no «4131 (Tabla1) y por tanto no seunenal fragmentode 38 kDa constitutivamente.El Acm TS2/16no produjoel reconocimientodelfragmentode38 kDa aunqueaumentóla unióndeestascélulasal fragmentode 80 kDaatravésde «5131 (datos no mostrados).Por tanto, se puedeconcluir que la capacidadde reconocernuevos Resultados 59 ligandos después de la activacióna travésde la subunidad131 podríaserunapropiedad intrínseca de la integrina a4JW u>u“o 1- O ‘0u u> u a t o o F¡g.4.24.-Efecto del Acm TS2/16 en adhesión celular a laminina y colágenotipo 1. Las células Ramosy el control A375 seincubaronconel Acm TS2/16y seañadieronapocillos tapizadoscon 100 pi del fragmentode Fnde 80 kDa (38 ~.tg/ml),laminina(LM, 150 ~xg/ml),o colágenotipo 1 (COL, 150 kg/ml). Las células secuantificaronsegúnseespecificaen materialesy métodos.Los valores representan el número de células adheridas respecto al total de células añadidasy correspondenala mediadedos experimentosdiferentes. 4.4.- Estudio de algunas implicaciones celulares en subsiguientesa la interacción «4(31-Fn. leucocitos Los datospresentadosanteriormentehabíandemostradoque «4131 estápresenteen distintaspoblacionescelularescomo diversasformascapacesde reconocerdistintos ligandosde Fn segúnel estadode activación,y quetalesestadospuedeninducirsepor diversosagentes.A continuaciónseestudianalgunasde las consecuenciascelularesque sobrelos leucocitostienela interacciónde «4131conestosdistintosligandosde Fn. 4.4.1.- Análisis de la reorganización del citoesqueleto tras la interacción de células linfoides B con Fn El hecho deque la integrina «4131 sea capaz de interaccionar con varios ligandos en Fn podrfaimplicar unareorganizacióndel citoesqueletoen lascélulasB Ramosestudiadas diferenteen cadacaso.Para analizar estahipótesisse llevaron a cabo ensayosde 80 SOkDa LM COL SOkDa LM COL 1~ Resultados 60 inmunofluorescencia utilizando los fragmentos de Fn de 80 y 38 kDa que proceden de la región centraly carboxilo-terminalde Fn respectivamente.De estaforma esposible estudiarlas consecuenciasintracelularesde la interaccióndecadaunode los los ligandos dc «4(31 en Fn: CSI/HepII contenidosen la regióncarboxilo-terminal(38kDa) y la secuencia RGD presente en la zona central (80 kDa). La Figura 4.25 muestra el análisis por inmunofluorescencia de la adhesión (3 h) a los fragmentosde 38 y 80 kDa de las célulasRamosen reposoy preincubadascon el Acm TS2/16;en estecasosepuedeobservarla distribución delcitoesqueletode actina(A) y dela tubulina(B). Comosepuedeobservaren la Figura4.25A,las célulasadheridasal fragmentode 38 kDa muestranabundantesextensionescitoplasmáticas,algunasde las cuáleslleganaconstituirauténticascolasde granlongitud, adquiriendoasíun fenotipo bastantedistinto al de lascélulaslinfoidesen general.Las célulastratadasconTS2/16 sobreel fragmentode 38 kDa adoptanunamorfologíamuy parecidaala anterioraunque con muchasmás ramificacionesy menoscolas largas.Por el contrario, las células adheridasal fragmentode 80 kDa carecende talesextensionesy presentanun aspecto bastantemásredondeado.En la Figura4.25B,las célulasunidasal fragmentode 80 kDa muestranunadistribuciónde tubulinahomogéneay polarizadamientrasquelascélulas unidasal fragmentode 38 kDamuestranun patrónheterogéneocon distribucióncentraly polarizada.Estosresultadosindicanquela adhesióncelulara los fragmentosde Fn que contienenlos distintosligandospara«4131 (CSl/HepII en la zonacarboxilo-terminal versus RGD en la zonacentral)no inducenla mismareorganizacióndel citoesqueletode actina.Sin embargo,la distribuciónde tubulinaparalascélulasunidasa los fragmentos de 38 u 80 kDamuestranun patrónno asociadoexclusivamenteacadafragmento. Fig.-4.25 (ver página siguiente).- Análisis por inmunofluorescencia de la adhesión a los fragmentos de 38 y 80 kDa de células Ramos en reposoo tratadascon el Acm TSZ/16. Las células Ramos en reposoo tratadasconTS2/16seañadieronsobrecubrescirculares(12 mm de diámetro) previamentetapizadoscon los fragmentosde38 kDa(3,5¡Ig/cm2)y 80 kDa(23 gg/cm2).Despuésde 3 h. de incubacióna 370(2,las célulasadheridassefijaron y setiñeronenprimerlugarcon un Acm anti-tubulina.En segundolugarlascélulas seincubaroncon IgG de conejoanti-ratónmarcadocon fluoresceínay Phaloidina- RITC. Las muestrasteñidasse observaronal microscopio de fluorescencia (objetivo de 40x)y sefotografiaron. RcSUltadoS 61 Para determinar si la interacción con el liqmcnto de 80 kDa quería un pcliodo de tiempo diferente al del fragmcnK dc 38 kDa para producir el mismo c1ccW las células Ramos se incubaron con ambos fragmentos a distintos tiempos. Las células se fi.jaron y SC tiñeron para ohscrvar la distribución de actina. En la Figura 4.26 se mucstm la cinbtica de la adhesión a los fragmentos de Fn dc 38 y 80 kDa de cClulas Ramos en reposo y tratadas con TS2/16 después dc 15 min. (A), 3 h. (B) , y toda la noche (C). A los 15 min. de incubación, para las cklulas Ramos cn reposo y tratadas con TS2/16, no SC observó la forma&% dc cxtcnsioncs citoplasmáticas, siendo su aspecto cl di: cClulas linfoides (redondeadas). Sin embargo, a los 30 min. (no mostrado en la figura) ya SC podían observar las cxtcnsiones celulares e incluso colas dc cierta longitud. A las 3 h. de incubación celular (panel B) se observaron colas dc gran longitud que sin cmhargo Ilcgaron a desaparcccr despu& de toda la noche (pancl C). Aunque las células Ramos cn reposo o tratadas con cl Acm TS2/16 mostraron un patrcin morfológico similar. la cin&ica rcsult6 mis Icnta para las células cn reposo. Dcspu~s dc toda la noche de incuhaci6n celular con el fragmento dc 38 kDa, las células (en reposo y activadas) mostraban un aspecto muy parecido a las ccilulas unidas a 80 kDa para cualquiera dc los tiempos de incubación; es decir, presentaban una morfología redondeada. Fig.4.26.- Ciní?tica de la adhesión a los fragmentos de Fn de 38 y 80 kDa de células Ramos en reposo y tratadas con TW16. Las células Ramos -4 x 105. en reposo (primera columna) o tratadas con TS2/ 16 15 min. a 37°C (segunda y tercera columnas) se añadieron a los cubres tapizados con cl l’ragmcnto dc 38 kDa -3.5 Fg/cm2- (primera y segunda columnas) o con el de X0 kDa -23 pg/cm2- (tercera columna) durante 15 min. (A), 3 h. (B) y toda la noche (C). Las células SC fijaron, SC tifícron con Phaloidina-RITC, y SC rotografiaron al microscopio (objetivo dc 40 x) Resultados 63 Nuestros resultadosindicabanque la formación de largas extensiones citoplasmáticascelulaieserael resultadodela interacciónde lascélulaslinfoides B Ramos conla regióncarboxilo-terminalde Fn (fragmentode 38 kDa) que,comoyahemoscitado anteriormente,contienedossitiosactivos,(28-1 y HepII. Paradeterminarla contribución de los sitiosCS-1 y Hep 11 en la formacióndeestasprolongaciones,sellevarona cabo ensayosde inmunofluorescenciaconlos fragmentosde Fn de 38 y 58 kDa,puestoque ésteúltimo fragmentocontieneexclusivamentela secuenciaHep II. Comosemuestraen la Figura4.27A, las célulasRamosincubadassobreel fragmentode 58 kDa no formaron largasprolongaciones,tancaracterísticasdelfragmentode 38 kDa. Por otraparte, seestudiaronlas interaccionescelularesconambosfragmentosde Fn por microscopiaconfocal(fig.4.27B). En estafigura semuestrandistintassecciones de un mismo campopara la adhesiónal fragmentode 38 kDa y 58 kDa. Comopuede apreciarseparael fragmentode 38 kDa, en el píanoinferiorseobservauna largacola totalmenteadheridaal sustrato,mientrasla célulasesitúaen un planosuperior,como confirmanlos distintosplanoscorrespondientesaseccionessuperiores,apareciendoen el extremosuperiorunaprotuberanciaque sobresaledel resto. Por el contrario, parael fragmentode 58 kDano seobservanprolongacionesen ningunade la secciones. Fig. 4.27 (ver página siguiente).- A. Análisis por inmunofluorescenciade la adhesióna los fragmentosde 38 y 58 kDa de las célulasRamos.LascélulasRamos(4 x104) seañadieronsobrecubres previamenteincubadoscon los fragmentosde 38 kDa (3,5 gg/cm2)y 58 kDa (Ixg/cm2). Despuésde 3 h. de incubacióna 370C,lascélulassefijaron y setiñeron conPhaloidina-RITC.Lascélulasseobservaronal microscopiode fluorescenciay sefotografiaron (objetivo de 40 x). B. Estudio por microscopiaconfocai de la adhesión a ambosfragmentos.Despuésde la incubacióncelular de 60 mm. conlos cubrespreincubadoscon los fragmentosde 38 (Bí) y 58 kDa (B2) las célulasse fijaron y se tiñeroncon Phaloidina-RITC.Se muestrandistintas seccionesde un mismocampo. 38 kC 58 kC Resultados 38 kDa Teniendo en cuenta que los fragmentos de de 38 y 58 kDa difieren respecto al contenido dc la secuencia CS-1, estos resultados sugerfw la implicación de la secuencia CS- en la formación de las colas citoplasmaticas tan características observadas tras la interacción con el fragmento de 38 kDa. Para confirmar esta hipótesis se realizaron ensayos de inhihicion utilizando Acms anti-Fn previamente descritos. La figura 4.28 muestra el resultado obtenido cuando los cubres previamcntc tapizados con fragmentos de Fn sc incubaron con Acms anti-Fn antes de añadir las células Ramos. Las cClutas incubadas sobre cubres tratados con cl Acm anti- Resultados 66 CSI PIFI 1 no muestran prolongaciones celulares, son de aspecto rcdondcado. Sin embargo el Acm anti-XOkDa, utilizado como control, no ejercio cfccto alguno, de forma que se pueden apreciar las prolongaciones cclularcs tan caractcristicas dc las cflulas Ramos sobre cl fragmento dc 38 kDa PlFll A80k. Fig.J.28.- Ensayo de inhibición con Acms anti-Fn. Los cuhrcs circulares prcincubados con ci fragmento de 38 kDa (3,5 pg/cm2) SC incubaron a continuación con Acms antiCS1 PlFll, anti- kDa A80k.l o RPM1 (no mostrado en la figura) y dcspues de lavar los cubres dos veces con PBS sc añadieron las cClulas Ramos. Tras una incubación de 3 h., las cdlulas se fijaron y sc tirieron con Phaloidina-RITC, se observaron al microscopio dc fluorescencia (objetivo 40 x) y SC fotografiaron. Todos estos resultados indican que la interacción celular con los difet-entes ligandos dc la integrina a4pl produce distinta reorganización del citoesqueleto Por un .1~ U u ¡.1 1’. U ¡lbS’ •éIi’rI,ih..S u. ql. ¡5111 Resultados 67 lado, la regióncentralno inducegrandescambiosen el fenotipocelular,al contrarioque la regióncarboxilo-terminal.De los dossitios activoscontenidosen estaregiónnuestros resultadosindicanque la secuenciaCS-1 seríala responsablede la formaciónde las prolongacionescelularesobservadas. 4.4.2.- Identificación de los sitios activos dentro de Fn implicados en procesos de fosforilación después de la interacción linfocito-Fn. Recientementeseha descrito la fosforilación de unaproteínade 110 kDa (Pp110) en célulaslinfoides B humanasdespuésde la interacciónconel fragmentode 38 kDade Fn (Freedmanet al. 1993). Sin embargo,como estefragmentocontienedos sitios activos (CS1IHepII), decidimosestudiarla contribuciónde cadauno de estossitios,comparando los procesosde fosforilaciónquetienenlugartrasla interaccióndelas célulasRamosvia «4131 alos fragmentos de 38 kDa o58kDa (contienesóloHep II). Paraello sellevarona cabo ensayosde inmunofluorescencia;como se muestraen la Figura 4.29A los fragmentosde 38 kDay 58 kDainducenfosforilaciónentirosinadespuésde 15 y 60 mm. de incubación.Comopuedeapreciarseen la figura 4.29B, la distribuciónmuestraun aspectodistinto. En el casode 38 kDa apareceunaventosacentral y para58 kDa un punteadoheterogeneocon algunasconcentracionesde morfologíairregular. La ventosa basalseapreciamejorenla composiciónde distintosplanos(Fig. 4.29C). Fig.4.29. A. Análisis por inmunofluorescencia de la fosforilación sobre los fragmentos de 38 y 58 kDa. Las células Ramos se añadieron sobrecubrescircularespreviamentetapizadoscon fragmentosde 38 kDa (3,5 gg/cm2)y 58 kDa (1 lpg/cm2). Despuésde 15 y 60 mm. de incubación,las célulasse fijaron y se incubaronconun Acm anti-fosfotirosinamarcadocon biotinadurante30 mm.Despuésseañadióstreptavidinamarcadaconfluoresceffia. Las células se observarony fotografiaron (objetivo 40x). B. Estudio por microscopia confocal. Las mismas muestrasse observaroncon un microscopio confocal y se fotografiaron. C. Estudio por microscopia confocal de la muestra de 38 kDa mostrando los diferentes planos. 38 58 69 - Resultados 70 . . 5.- DISCUSION Discusión 71 DISCUSION La interacciónde los leucocitoscon la proteínade MEC Fn resultaesencialen la migración,en la localizaciónen tejidosy en la funcióngeneralde estascélulas.A nivel molecularestainteracciónconstituyeun procesocomplejoqueimplica tantoa la región carboxio-terminalcomoala regióncentralde la moléculadeFn. Comoprimeraaproximaciónal estudiode la interaccióndelos leucocitoscon la regióncarboxio-terminalde Fn seobtuvierondosAcms, PiFí1 y P3D4,quereconocen los sitiosactivosCS-1y HepII respectivamente.EstosAcms hanresultadomuy útiles paradeterminarel origen exactode algunosfragmentosde Fn correspondientesa la regióncarboxilo-terminaly noshanpermitidoestudiarsuefectoenla interaccióncelular conFn,puestoqueambossitios ((25-1 y Hep II) soncapacesde mediaradhesióncelular. En baseal pesomolecularde los fragmentosobtenidosapartir de la digestiónde Fn contripsina, sehablaasumidoqueel fragmentode 58 kDa procedíade la cadenaB de Fn (McCarthyet al. 1988; Wayneret al. 1989;Ferreiraet al. 1990; García-Pardoet al. 1990).Los resultadosobtenidosen el presentetrabajoconel Acm PíFí1 nos permiten afirmar definitivamentequeel fragmentode 58 kDa procedede la cadenaB de la Fn plasmática.Además,teniendoen cuentaque la presenciade la secuencia(25-1 está reguladapormecanismosde “splicing” alternativoy, por tanto, no siempreestápresente en la Fn, el Acm PiFí1 resultamuy valiosoen el estudiode la existenciade lasdistintas formasdeEn (con o sin CS-l)en losdistintos tejidos. Por otraparte,la secuenciaexactaquereconoceel Acm P3D4dentrodel dominio Hep II de Fnaúnno seha determinado.No obstante,como esteAcm inhibe totalmentela adhesióncelulara los fragmentosde 38 y 58 kDa, se puedeconcluirqueel sitio que reconoceel Acm P3D4 estádirectamenteimplicado en adhesióncelular; de hecho, sorprendequeesteAcm seatanbueninhibidor de la adhesiónal fragmentode 38 kDa, puestoqueestefragmentocontienedos sitios activos(HepII y CS-l) y la secuenciaCS-1 es,en principio, un sitio de mayor afinidadque el dominioHepII (Wayneret al. 1989; García-Pardoetal. 1990a,1990b).Másinteresanteaúnesqueel Acm anti-CSl PíFí1 inhiba tanpoco la adhesiónal fragmentode 38 kDa.Una posibleexplicaciónparaeste resultadoesqueel Acm PíFí1 no seacapazde interaccionarconel fragmentode 38 kDa o con la Fn en forma nativacon suficienteafinidadparabloquearla adhesióncelular; PiFí 1 podríatenermenorafinidad por CS-l queel receptornatural.Por otra parte, PíFí1 podríaestarreconociendoun epítopode (25-1 queno estédirectamenteimplicado en adhesión.El sitio activode CS-1sehaidentificadocomo la secuenciaLDV, situadaen el extremocarboxilo-terminaldel péptido (Komoriyaet al. 1991; Wayneret al. 1992). Resultadosno publicadosparecenindicarque el epitoporeconocidopor esteAcm está situadoen la regióncentralde la secuenciaCS-l. Otra posibleexplicaciónparala baja inhibición obtenidacon PíFí1 esque, al contrariode lo quesucedecon P3D4, al Discusión 72 bloquear(28-1 conel Acm PíFí1 no se impidala uniónal dominio Hep II, suficiente paramediaradhesióncelular,sugiriendoun papelde “pivot” parael sitio Hep II. Como ya se ha citado, la interacciónde las células linfoides con la región carboxilo-terminalestáprincipalmentemediadapor los sitios activosCS-1 y Hep II a travésde la integrina«4131,estoes,dichascélulasreconocenlos fragmentosde Fn de 38 kDaquecontienenCS1 y Hep II y 58 kDaquecontienensóloHep II. El presenteestudio demuestraque lascélulasmonociticasno reconocenel fragmentode 58 kDa incluso a elevadasconcentraciones(>300¡.tg/ml),aunqueseuneneficientementeal fragmentode 38 kDaa travésdela secuenciaCS-1.Estosdatosconfirmanalgunosresultadospreliminares obtenidospor otros autoresutilizando lascélulaspremonocíticasU937 (Ferreiraet al. 1990) y podrían indicar que las células linfoides y monocíticaspresentanun comportamientodiferencialrespectoala utilización de las distintassecuenciasadhesivas dentrode Fn. Nuestrosresultadosmuestranquelas lineascelularesT y B unenlos fragmentos de 38 y 58 kDa,aunqueen concentraciónmolarel fragmentode 38 kDaresultatresveces másefectivoen la capacidadde mediaradhesióncelularqueel fragmentode 58 kDa. El hechode quelos linfocitos1de sangreperiférica,al igual quelas célulasmonocíticas,no seancapacesdereconocerel dominioHep II sugierequeel reconocimientodiferencialde estedominiopodríaestardeterminadopor la actividadde la integrina«4131 presenteen cadapoblación celular. La existenciade variosestadosde activaciónen «4131 está sugeridapor los distintospatronesde adhesiónobservados,inclusoentrecélulasque unenlos ligandos(28-1 y HepII; porejemploel númerode célulaslinfoidesT HUT-78 unidas a saturacióna los fragmentosde 38 y 58 kDa es similar (49% y 42%), respectivamente,mientrasque las célulaslinfoides B Ramosseunen a saturaciónal fragmento de 38 kDa 1,5 vecesmásque al fragmento de 58 kDa, a igualdad de concentraciónmolar. Por tanto, parecequeexiste lo quepodríamosdefinir comoun “gradientedeadhesión”al dominio HepII de Fn,queestadarepresentadoenprimer lugar por las líneas celularesT, seguidasde las líneascelularesB, y finalmentelas líneas celularesmonocíticasjuntoalos linfocitosT de sangreperiféricaparalas quela adhesión a Hep II esnula. La diferentecapacidadparareconocerel dominio HepII probablementeviene determinadapor la distinta avidez(alta-intermedia-baja)delreceptorpresenteenestas células.Así, mientrasque la forma deavidezintermedia/altade «4131 seríacapazdeunir los ligandosde alta((28-1)y baja(Hep II) afinidad,la forma de bajaavidezde «4131sólo seríacapazdeunirel ligandode altaafmidad(CS-l). Segúnesto,la eficienciadel proceso deadhesióndependerádelestadode activacióndel receptor,asícomode la disponibilidad y afinidaddel ligando.Enestesentido,recientementeseha publicadoun estudiosobrela existenciade dossubpoblacionesde timocitosquedifierenen los marcadoresde estados de diferenciacióny expresan«4131,pero en un caso «4131 es funcional, y por tanto Discusión 73 reconocesusligandosconstitutivos,mientrasqueenel otro no reconoceningúnligando (Salomonet al. 1994). Por otro lado sehan descritomuchosejemplosde cambiosque tienen lugar respectoa la adhesióna Fn trasprocesosde diferenciacióncelular(Bernardiet al. 1987; Shimizuet al. 1990; Verfaillie et al. 1991);paralas célulaspremonocíticasU937 seha publicadoqueel fenotipomonociticoafectaala adhesióncelularalas secuenciasRGD y (28-1 de Fn (Ferreiraet al. 1991).Nuestrosresultadosmuestranque las célulasU937 diferenciadastambiénadquierenla capacidadde unirel dominioHep II, y estoseasocia conunaligeradisminuciónde la expresiónsuperficialde «4131,lo queesconsistentecon el trabajocitado. La explicaciónmásprobableparael reconocimientodel dominioHep II por partede lascélulasU937tratadasconPMA esla estimulaciónfuncionalde «4131 tras la diferenciacióncelular,comoesel casode las integrinas131 en linfocitos (Shimizuet al. 1990).Estosresultadossehanintentadocomprobaranalizandola adhesiónde monocitos extraídosde sangreperiféricaal fragmentode 58 kDa; sin embargo,debidoa la elevada adhesiónno específicaquelos monocitosmostrabanen estosensayos,no resultóposible determinarla especificidadde la unión.Noobstante,el hechode quela activaciónde las célulasmonocíticasy los linfocitos T condosisaltasde PMA induzcala unióncelularal dominioHepII y, másaún, queseamásefectivaquelos tratamientoslargosconPMA, confirmala explicacióndela activaciónde «4131. Estáclaramentedemostradoque la actividadfuncional de las integrinassepuede modularpor distintosagentes,que incluyenno sólo los ésteresdeforbo], comoya seha mencionado(Shimizuet al. 1990;Wilkins et al. 1991;Postigoet al. 1991) sino también susligandosespecíficos(Du et al. 1991) y los cationesdivalentes(Gailit et al. 1988; Kirchhoferet al. 19%). AlgunostrabajoshanmostradoqueciertosAcms dirigidos contra la subunidad131 puedenincrementarla avidezde las integrinas131 por susligandos,y apuestanporun cambioconformacionalqueconducea unaforma activadadel receptor (Arroyoet al. 1992;vande Wiel-vanKemenadeetal. 1992;Kovachetal. 1992;Wayner et al. 1992).La uniónconstitutivade «4131 por susligandosCSl y VCAMI aumentaen estoscasos.También seha publicadoqueel reconocimientode la secuenciaLDV -secuenciaactiva contenidaen (28-1- tambiénrequierela activaciónprevia de «4131 (Wayner et al. 1992). Nosotrosencontramosque el Acm TS2/16 (anti-131) induce eficientementela unióndelas célulasmonociticasy los linfocitos 1de sangreperiféricaal dominioHep II de Fn,previamenteincapacesdeunirestedominio. Además,el reconocimientodel dominio Hep II tambiénsepuedeobservaren presenciadel catióndivalenteMn2+, aunqueel efectoesmenorsi secomparaconel obtenido utilizando el Acm TS2/16.Otros autoreshabíandescrito que estecatión aumentabala afinidad de las integrinas«5131 y «v133 por susligandos constitutivos (Gailit et al. 1988;Kirchhfer et al. 1990).Ennuestrosresultados,el efectoqueel catión Mn2+ tuvo enla adhesiónde los linfocitos1extraídosde sangreperiférica al fragmento u. 1 r 14 ., U I~flI~.l,,.’’I•~lI - .II•r...•iLIIII Ii Discusión 74 de 58 kDafue mínimocomparadoconel obtenidoparacélulasmonocíticas;estopodría indicarquelos linfocitos T de sangreperiféricaexpresan«4131en un estadoquerequiere estímulosmásfuertesparaalcanzarunatotal activación,como porejemploel PMA o los Acms anti-131. Esta explicaciónestá de acuerdocon la hipótesispropuestasobrela existenciade distintos estadosde activaciónpara «4131 entredistintaspoblaciones celulares.Pesealas diferenciasobservadasen el nivel de activación,sepodríapensarque tanto el Mn2+ comoel Acm TS2/16 inducenun cambioconformacionalen «4131,de maneraqueaumentarala avidezporsusligandosy permitierala uniónal dominioHep II. Losdatosexistenteshastaparecenconfirmarestemecanismocomoel másprobable. La existenciade dos regionesdiferentesHep II y CS-l, tan próximasen la moléculade Fn,capacesde mediaradhesión,asícomolos estudiosfuncionalesrealizados conlos Acms P3D4y PiFí1, sugierenunacooperaciónfuncionalde los distintossitios activosqueresultaríaen unaadhesióncelularestable.Paralas célulasde melanomaseha propuestoun modeloqueimplica la contribuciónde los sitiosactivosen Hep II y IIICS, la integrina «4131, y proteoglicanos(lida et al. 1992). Basándonosen la diferente capacidadinhibidorade los Acms P3D4y PiFí1 dirigidos contrael dominioHep II y la secuenciaCS-1respectivamente,podemospostularquela uniónde «4131 al dominioHep II podríaservirpararegulary estabilizarla uniónaCS-1.Si estofueraasí,seríanecesaria la activación de «4131 antesde que tuviera lugar la unión de algunascélulas hematopoyéticasal dominioHep II, proporcionandoasíun mecanismoparala regulación de la adhesiónde leucocitosa Fn en tejidos y sitios de inflamación. Por otra parte,la regulación(constitutivavenusinducida)de interaccionesfuerteso débilesde «4131con susligandosenFn podríatenerimportantesimplicacionesparala migracióny funciónde linfocitos y monocitos.Particularmente,porque el sitio (25-1 no está presente en todas las isoformasde Fn debidoamecanismosde “splicing” alternativo,proporcionandoasíotro nivel de regulación de adhesióncelular y migración,y reforzandoel papelde la matriz extracelularen estosprocesos. Los resultadosobtenidosrespecto al reconocimientodel dominioHep II por«4131 sugerianquela activacióndel receptorapropiadopodríaserunabuenaaproximaciónpara el estudiode las interaccionesde bajaafinidado de nuevosligandos,quedeotro modo nuncasedetectarían. Trabajos previos (García-Pardoet al. 1990) hablan mostrado de forma concluyentequealgunascélulas linfoides B no expresanla integrina «5131 y son incapacesdeunirseal fragmentode80 kDa.Estefragmentoprocedede la regióncentral de Fn y contienela secuenciaRGD, ligando descritode «5131. En el presenteestudio nosotrosencontramosque la incubaciónde las líneasB negativaspara«5131, como Ramosy Daudi, con el Acm anti-131TS2/16 induceel reconocimientodel fragmentode 80 kDa de formaespecíficay eficiente.Losdatospresentados muestranclaramentequela adhesiónde las célulasB al fragmentode 80 kDaestámediadapor la integrina«4131,esto Discusión 75 es, los Acms anti-a4y los péptidossintéticos(25-1 e IDAPS (ligandosdescritosde a4¡1l) inhibencompletamentela adhesióncelularal fragmentode 80 kDa. No obstante, másinteresanteaún resultóque el péptidosintéticoGRGDSPCtambiénfuesecapazde inhibir la adhesiónde células tratadascon el Acm TS2/16. Segúnotros trabajos publicadospreviamente,se hablaestablecidoque la interacciónde «4131 con los fragmentosde Fn de 38 kDa (CS1/HepII) y 58 kDa (Hep II) no seveíaafectadapor péptidosquecontuvieranla secuenciaRGD (Ferreiraet al. 1990; García-Pardoet al. 1990a,García-Pardoet al. 1990b;Wayneret al. 1989). Consistentecon estosdatos, nuestrosresultadosmuestranquela adhesiónal fragmentode 38 kDa de las células Ramos(no tratadaso tratadasconel Acm controlAlex 1/4) tampocoresultaafectadapor el péptidoGRGDSPC(verFig.4.22). Ademásobservamosque la secuenciaRGD no sólo inhibe la función de las célulastratadasen forma soluble,sino que resultaser el principal sitio quemedia adhesiónal fragmentode 80 kDa, como sepuedeconcluir de la buenainhibición observadapor el Acm N-295. Sin embargo,no se puededescartartotalmentela contribución de otras regiones dentro del fragmento de 80 kDa que pudieran actuar de forma sinergística con la secuencia RGD. Otros autoreshabíanmostradopreviamenteque el “spreading” de célulasde melanomasepodíainhibir porel péptidosintéticoGRGDSPCy quela integrina «4131 se podíaeluir de unacolumnade afinidadde CS-1condichospéptidos(Mould etal. 1991). En el presenteestudio,sin embargo,no seobservael reconocimientodel péptidosintético RGD sin incubaciónprevia de las células con el Acm T52/16. Aunqueno se puede explicar esta discrepancia,se debe teneren cuentaque resultadifícil comparar directamentelos resultadosobtenidosen amboscasos,por tratarsede distintos tipos celularesy estudiarun fenómenodiferente (“spreading” versus adhesión).Una explicaciónposibleesquelascélulasutilizadasen el trabajo de Mould et al. portenuna formaconstitutivamenteactivade «4131 capazde reconocerlos péptidosquecontienenla secuenciaRGD. Muy recientementesehapublicadoun trabajoenel quesemuestraqueel péptido RGD cíclico tambiéninhibe la adhesiónmediadapor «4131 indicandoque la manipulacióndelligandotambiéninduceel reconocimiento(Cardarelliet al. 1994). Nuestrosresultadosindicanquela activaciónde«4131 puederesultaren cambios respectoal reconocimientode susligandos.Para otrasintegrinasseha observadola capacidadde reconocermúltiplesligandosen estadoactivado.Porejemplo, la integrina «2131 essólo receptorde colágenoen plaquetasy fibroblastos,mientrasque funciona comoreceptorde colágenoy tambiénde lamininaen otros tiposcelulares(Elices et al. 1989; Languinoet al. 1989; Kirchhfer et al. 1990).Los trabajosde Chanet al. (1993) muestranqueen la mismacélula,el Acm T52/16puedeconvertirla forma parcialmente activade «2131 quereconocesólocolágenoenunaformatotalmenteactivaquetambién unelaminina.Los resultadosdeestatesismuestranque«4131 existeen diferentesestados Discusión 76 de activaciónen distintascélulashematopoyéticas.Lascélulasmonocíticasy los linfocitos T de sangreperiféricaexpresanunaformaparcialmenteactivade «4131 quereconoce(2S- 1 perono el dominioHepII, y el Acm 152/16convierte«4131 en unaforma másactiva -constitutivamentepresenteen célulaslinfoides-capazde reconocerambosligandosen Fn.En un trabajoreciente,Masumotoet al. (1993)comparanla unión de«4131 aCS-1y VCAiM- 1; la formamenosactivade la integrinaunesóloVCAM- 1, mientrasquela forma másactivadaune tanto VCAM-1 comoCS-l. Comosemuestraen estatesis,el PMA tambiénpuedeactivar«4131 expresadaen célulaspremonocíticasU937,de forma que reconocela secuencia(25-1 y el dominioHep II. Por otra parte,resultamuy interesante queel PMA no induzcaadhesiónal fragmentode 80 kDaenlascélulaslinfoidesRamosy Daudi, y que incluso tampocoafecte asu unión constitutivaal fragmentode 38 kDa, sugiriendoasíquela forma dea4f31 presenteen las célulasRamosy Daudino essensible a la activaciónpor ésteresde forbol. De hecho,otros autores(Masumotoet al. 1993) tambiénhanobservadounadiferenteregulaciónde la función de «4131 enestecasopor Acm(s)y Ca2+.Más aún, tambiénseha publicadoqueel PMA no tieneefecto,o éstees mínimo,en la uniónde«2131 a colágenoy laminina,mientrasqueel Acm 152/16resultó muy activo en la inducciónde dichaunión (Chanet al. 1993).El hecho de queotros autores(Arroyo et al. 1993; Chanet al. 1993) hayandemostradoqueel Acm 152/16 puedatambiénactivarlas integrinassolubilizadasestáde acuerdocon queno serequiera unaruta de activaciónintracelular.Todasestasobservacionesapoyanla existenciade mecanismosdiferentesderegulaciónde la funciónde lasintegrinas.Sin embargo,como el PMA aumentala función de «4131 en algunostipos celulares,esposible que la sensibilidada unestímuloparticularvengadeterminadao bien porel estadode activación de la integrina,o porel tipo celular,o por ambascosas. Todoslosestudiosanteriores han analizadoel efectode los Acms anti-131 o el PMA en la interaccionde «4131 conligandosya identificados,esdecir, (25-1,HepII y VCAM-1. Asimismo aunquelos estudiosde Chanet al. (1993)muestranclaramenteque existencambiosenla especificidadde acuerdoconel estadodeactivaciónde la integrina «2131,haypoblacionescelularesqueunen lamininay/o colágenode forma constitutiva. La novedadde nuestrosresultadosesqueel Acm TS2/16inducela uniónaunaregiónde Fn (fragmentode 80 kDa) no identificadapreviamentecomoun ligando de «4131. De hecho,el fragmentode 80 kDa esligando de la integrina«5131 y estáampliamente documentadoquela funciónde«4131en leucocitosesRGD-independiente(Wayneret al. 1989;Ferreiraet al. 1990;García-Pardoet al. 1990a,1990b). Aunque, en general,una integrinapuedeunir varios ligandos,«4131 destaca porquepuedeunir múltiples secuenciase incluso secuenciasaparentementedistintas dentrode la mismao diferentesmoléculas.Dentrode Fn las secuenciasmínimasquese han identificado como ligandos de «4131 son LDV, contenida en la secuencia CS-1 (Komoriyaet al. 1991, Wayneret al. 1992),REDV, contenidaen la secuencia(25-5 Discusión 77 (Mould et al. 1991a),e IDAPS, contenidaen Hl (Mould et al. 1991b).Seha propuesto que el aspartato,comúnen estassecuencias,puedeserun residuo fundamentalen el reconocimientpode «4131 (Mould et al. 199ib). Aunqueestahipótesispudierasercierta, parececlaroqueotrassecuenciaspodríansertambiénligandosespecíficosde a4f31.Hay evidenciasindirectasde quelos péptidosFNC/HI (YIKPGSPPREVVPRPRPGV,aquí llamadositio 1) y FNC/HII (KNNQKSEPLIGRKKT, llamadositio II), derivadosdel dominioHep II de Fn (McCarthyet al. 1988),podríantambiéninteraccionarcon «4131 (lida et al. 1992). Todasestassecuencias(CS-l,CS-5,H1, FNC/HI, FN(2/HII) están localizadasmuy próximasdentrodela moléculade Fn,en la repeticióntipo 111-14y en la región IIICS, queescontiguaa la anterior (ver fig.l). Como ya se ha mencionado, ademásde la Fn, «4131 estambiénel receptorde VCAM-1 (Elices et al. 1990),de la proteínabacterianainvasin(Enniset al. 1993),y de la trombospondina(Yabkowitzet al. 1993). Aunque los sitios de unióncelular paraalgunasde estasproteínasno se han identificado todavía, parece claro que la interacción de «4131 con V(2AM-l no implica al motivo LDV presente en esta proteína (Osborn et al. 1992, Vonderheide et al. 1992). Nuestros resultados muestran que el hipotéticocambioconformacionalinducidoen «4131 a través de la subunidad 131 permite el reconocimiento de la secuencia ROD de Fn que está localizada en la repetición111-10, de forma quedista bastantede los ligandos previamente descritos para «4131. En trabajos recientes (Koivunen et al. 1993, 1994) y a partir de unalibreríade fagos, se han identificado varios péptidos sintéticos cíclicos que carecende la secuenciaRGD y, sin embargo, son capacesde unir la integrina«5131;uno de estos péptidos correspondea la secuenciaSTSDVGG, que es homólogaa la TVSDVPRpresenteen la repetición111-10 de Fn. En estetrabajo semuestraqueesta secuenciaes tambiénhomólogaa EILDVPST, una secuenciapresenteen CS-1 que interaccionacon«4131 conaltaafinidad(Wayner et al. 1989; García-Pardo et al. 1990b; Guan et al. 1990; Mould et al. 1990). Aunque estos autores no demuestran que exista una interaccióndirectade «5131 con lasdossecuenciashomólogaspresentesenFn,sugieren que «5131 podríatenerla capacidad de reconocerotrosligandospresentesen Fn,además de RGD. Los resultadosquehemosobtenidoen este trabajoestánde acuerdocon la posibilidad de que existaun cierto grado de solapamientoen el reconocimientode ligandospor las integrinas«4131 y «5131.Esto tambiénestáapoyadopor otro trabajoque muestraqueun péptidosintéticocíclico,distinto de RGD, puedeinhibir la funciónde las integrinas«4131 y «5131 (Nowlin et al. 1993)y queel péptidocíclico RGD inhibe«4131 (Cardarelli et al., 1994). Aunque la ciclación de péptidospuedeproporcionaruna conformacióndel ligando óptima para interacciones de alta afinidadcon«4131 o «5131, parececlaropornuestrosresultadosqueel Acm TS2/16 no induceel reconocimientodela secuenciaCS-l de Fn vía«5131.Por lo tanto,la capacidadde reconocernuevosligandos bajo activaciónsupuestamenteconformacionalpodríaser intrínsecaala estructurade «4131. Discusión 78 Enestatesissedescribeun nuevopapelpara«4131 comoun receptorparael sitio RGDen Fn. Teniendoencuentaquela integrina«5131 esel receptorclásicoparae] sitio RGD, nosotroshemosintentadoestudiarla contribuciónde «4131en la adhesióncelular al fragmentode Fnde 80 kDacuandosambasintegrinasestánpresentessimultáneamente. En experimentosno mostrados,estudiamossi los Acm(s) anti-«4 podían inhibir parcialmentela unión de lascélulasU937 tratadasconTS2/16al fragmentode 80 kDa. Sin embargo,como el Acm T52/16 tambiénaumentala adhesiónmediadapor «Sf31 (Arroyo et al. 1992, 1993 y estetrabajo)no pudimosdetectarningunainhibición con Acm(s) anti-«4. Es posiblequecuando«Sf31 y «4131 seexpresanconjuntamente,la funciónde «5131 predominesobrelafunción de«4131 enla capacidadde mediaradhesión a Fn. Deacuerdoconesto,otrosautoreshan mostradoqueel fragmentode 80 kDa o el péptido sintéticoGRGDSPCinhiben completamentela adhesiónde célulasU937 aFn, mientrasel fragmentode 38 kflaoel péptidoCS-1 produceninhibición parcialo ausencia de inhibición (Ferreiraat al. 1990). Sin embargo,todosestosdatosno excluyenunacooperacióndeambosreceptores para lograr una adhesióneficientea Fn, como seha propuestopara los linfocitos T (García-Pardo and Ferreira, 1990). Los resultados de esta tesis resultan obviamente importantesparalas célulasque expresan«4131 comola integrinamayoritariade superficie;estoincluye las célulasB (García-Pardoet al. 1990b; Stupacket al. 1991), algunosprogenitoresde célulasB (Roldánet al. 1992) y probablementealgunascélulas tumorales.Incluso hay trabajosmostrandodiferentesinteraccionescon Fn duranteel desarrollode célulaspre-B (Bernardiet al. 1987;Verfaillie etal. 1991). Enlas célulasque expresan«5131junto a«4131,«4131 apropiadamenteactivadopodríaservirparacooperar con«5131 o parareemplazarlofuncionahnentecuando«5131 estéocupado. El hecho de que las integrinas se puedanencontraren distintas formas de activación“in vivo”, comoseha demostradopara«4131 (Laffón et al. 1991; Salomonet al. 1994),sugiere que los Acms anti-131 activadores (TS2/16y otros)estánmimetizando el efectodeligandosfisiológicosno identificadostodavía.Porotro lado,la multiplicidad de secuenciasreconocidaspor «4131debetenerrelevanciafisiológica;porejemplo,podría servir paraproporcionarlas interaccionessinergísticascon el receptorresultandoen unionesde altaafinidad.Tal sinergiayaseha mostradoparala interacciónde «5131 con la secuencia ROD en Fn (Yamada, 1991). De forma similar, la activación de la integrina cdllb133 en plaquetas con trombina resulta en el reconocimiento de una región adicional de En (junto a RGD), comprendiendo parte de la repetición 111-9 y 111-10 (Bowditch et al. 1991, ver fig.1). Una interesanteposibilidadesque algunasde las secuenciasque interaccionancon «4131 podríanregularla unión a otros ligandos,como ya se ha mostradopara«11b133(Du et al. 1991).Los ligandosde «4131,incluyendola secuencia ROD descritaen esta tesis, se unen aparentementea los mismossitios o a sitios solapantesen «4131,puestoqueseinhibenunosaotros. Sinembargo,pareceposibleque Discusión 79 otros ligandostodavíano identificadosseunan a «4131 conbajaafinidado inclusoa un sitio diferente,de forma queaumentenen vez de que inhiban la función de «4131. Apoyandoesto,seencuentrael hechode quedossecuenciasquemuestraninteracción con «4131, FNC/HI y FNCH/II, no interfieren o lo hacen ligeramente con la función adhesiva de «4131 (lida et al. 1992). La librería de fagos usada como aproximación para identificar los ligandosde «5131 (Koivunenet al. 1993, 1994) podríaser útil para identificar nuevosligandospotencialesde «4131.Esto tambiénabriríala posibilidadde usar estas secuencias moduladoras con fines terapéuticos. Otra consecuencia de este trabajoesque «4131fisiológicamenteestimuladopodríajugarun papel importanteen el reclutamientode linfocitos en los sitios de inflamacióny tejidosdondeseproducen distintosfragmentosde Fn conteniendo(25-1,Hep II y/o ROD. La integrina «4131 es, por tanto, un receptormuy versátil capazde reconocer múltiples ligandosen Fn.Dadoquesu avidezpor (25-1, Hep 11 y ROD esdiferente,la unióna cadauno de estossitios podríatenerdiferentesconsecuenciascelulares.En este sentido,sehaestudiadosi la interacciónde célulasB con las regionescentraly carboxilo- terminalde Fn afectaal citoesqueletocelularde la mismamanera.Nuestrosresultados demuestranquela interacciónde la líneacelularRamoscon la regióncarboxilo-terminal de Fn producela apariciónde extensionescelularesque, en ocasiones,sonauténticas colasde gran longitud. Por el contrario, la interacciónconla región centralde Fn no induce las prolongaciones citadas sino que el aspecto de las células es redondeado. En estesentidosepodríandistinguirun fenómenode adhesiónquepermitela inmovilización celulary no induceningúncambiomorfológicoaparentede un fenómenomáscomplejo queimplica inmovilizacióny subsiguientescambiosenel interior celular.Esteúltimo caso seríael quepromoveríala regióncarboxilo-terminalde Fn resaltando,en principio, su función biológica; sepodríaespecularsobreestefenotipo comoel de unacélula que estuvieraen movimientolo que resultaríamuy importanteparael desplazamientode las célulaslinfoidesen los distintostejidos.Por otra partela adhesióna travésde la región ROD podrríaserimportanteparala inmovilizacióndelas células,tannecesriaenprocesos de diferenciación,por ejemplo. Recientementese ha propuestoun modelo paralos timocitoshumanosenel quela integrina«4131 actúainmovilizandoestascélulasa Fn de forma transitoriapermitiendo el proceso de selección tímica en el que participan las moléculasdel MHC (Salomonet al. 1994),realzandoasíla importanciabiológica delos fenómenosde adhesiónperse. Comola interacciónde «4131 con la regióncarboxilo-terminalestámediadapor (25-1 y Hep II, resultabaimportantedeterminarla contribuciónde ambossitios en la formaciónde lasextensionescelularesque seproducentrasla interaccióncelularcon dicharegión,sobretodo si se tieneen cuentaquela presenciade CS-1 estasujetaa una estrecharegulaciónpormecanismosde “splicing” alternativoy queel reconocimientodel dominio Hep II tambiénestareguladopero a nivel del receptor.Nuestrosresultados Discusión 80 muestranquela secuencia(2S-l esnecesariaparaquetengalugar la apariciónde tales colas,comoasí lo demuestranlosensayosde inhibicióncon el Acmanti-CSI PiFJ1, los resultadosconel fragmentode 58 kDaquecarecede (25-1 y con los péptidossintéticos utilizados (datosno mostrados).Aunque las colascitoplasmáticasaparecentambién cuandoestáexclusivamentepresentela secuenciaCS-1, no sepuededescartaruna cooperaciónde ambossitios activosparala apariciónde talescambioscelulares.Estos resultadosparecenindicar que la interacciónde las células linfoides con la región carboxilo-terminalde Fn estásujeta aun rigurosocontrol queno debeser gratuito y sugierela importanciade lasconsecuenciascelularestrasla interaccióncelularatravésde «4131.Recientementesehapublicadoquelas célulasendotelialessintetizany depositan enla partecelularqueda ala luz vascularasícomo en la zonaintercelularla isoformade Fn quepresentala secuenciaCS-l en las dos cadenas(Elices et al 1994). Se podría especularcon la posibilidadde que la interacción«4131-Fn,en concreto(25-1, estaría implicadaen la extravasacióncelular;si estofueraasíun fenotipocelularcomoel que muestrannuestrosresultadosseríamuy apropiadoparala extravasaciónno sólopor su morfologíasinopor tratarseademásde un fenómenotransitorio. Nuestros resultadosademásmuestranotros eventosintracelularestras la interacciónde las célulaslinfoidesB con la regióncarboxilo-terminal,comoesel casode los fenómenosde fosforilación.Recientementese ha publicadoque la interacciónde célulasB con estaregión de Fn implica la fosforilación de unaproteinade 110 kDa (Freedmanet a]., 1993). Aunquenosotrosno hemosidentificadola proteinaquese fosforila cuandotiene lugar la interaccióncelularcon el fragmentode Fn de 38 kDa, mostramoslos resultadosobtenidospor inmunocitoquimica.Los resultadosobtenidosa distintos tiemposvarian desdelos 15 mm. de interaccióncelularcon dicho fragmento hastalos 60 mm. A los 15 mm. apareceunaespeciede ventosaen la parteinferior, como confirman los datos obtenidospor microscopiaconfocal, que corresponderíaa la distribuciónde las proteinasfosforiladas.Sinembargoalos 15 mm. de la interacciónde las células linfoides con el fragmentode 38 kDa las células mostrabanun aspecto redondeadocuandoseincubabanconPhaloidinamarcadaconrodamina.Tras60 mm. de interacciónla ventosatípicade proteinasfosforiladasdesaparececasien su totalidad, observandoseunadistribucióndifusao polarizadade estasproteinasmientrasqueen este tiempolas célulasmuestranextensionescitoplasmáticasperfectamentediferenciadas.A la vista de estosresultadossepodríaespecularque los fenomenosde fosforilación son previosalos fenómenosde reorganizaciónde proteinasdelcitoesqueleto. Por otra parte,dadoqueel fragmentode Fn de 38 kDa contienedossitios activos resultabainteresantedeterminarquésitio estabainvolucradoen la fosforilación o silo estabanambos.Los resultadosobtenidoscon el fragmentode 58 kDa nos permiten afirmarqueel dominioHep 11estáimplicado en la fosforilaciónde proteinassubsiguiente a la interacciónconestefragmentode Fn. Sin embargo,comomuestranlas fotografias Discusión 81 tomadasalos 15 min. de la interacción,la distribuciónde la zonafosforiladaesdistintaa la obtenidacon el fragmentode 38 kDa. En lugar de tenerel aspectode unaventosa, aparececomo unamanchaalargada.Aunque nosotrosno hemosidentificado si la secuenciaCS-1 inducefosforilación,lasdiferenciasobservadasparalos fragmentosde 38 kDa y 58 kDa sugierenqueCS-1 tambiénestáimplicado en fosforilación y quiza incluso fosforile otrasproteinasdistintas.En estesentido,hayquedecirque para los linfocitos T se ha publicadorecientementela implicación de la secuencia(2S-1 en los eventosde fosforilación posterioresa la interacciónde estascelulasconFn (Nojimaet al., 1992). En definitiva,y ala vistade nuestrosresultados,la integrina«4131 esun receptor muy flexible capazde reconocermultiplesligandosen Fn, dependiendodesuestadode activación,pudiendoimplicarestasinteraccioneseventosintracelularesdiferentesen cada caso.Todoello apoyala importanciade la matriz extracelular,particularmentela Fn enel desarrolloy funciónde los linfocitos. 6.- CONCLUSIONES Conclusiones 82 CONCLUSIONES Lasconclusionesde estatesisdoctoralsecitanacontinuación: 1.- El fragmentotríptico de 58 kDaprovienede la cadenaB de Fn y no contiene el sitio mediadorde adhesióncelularCS-1. 2.- El mecanismode adhesiónala regióncarboxilo-terminalde la Fn implica una cooperatividadde las regionesCS-l y Hep II; la interacciónde «4131 con Hep II probablementemodulala posteriorinteraccióncon(25-1. 3.- La integrina «4131 existeen diferentesestadosde activaciónen distintas poblacioneshematopoyéticas. 4.- Lascélulasmonociticasy los linfocitos T de sangreperiférica(LT) reconocen constitutivamenteen Fnla secuencia(2S-1perono el dominioHep 11, adiferenciadelas célulaslinfoidesen cultivo, quereconocenambossitios. La integrina«4131 presenteen las célulasmonocíticasy LT, por tanto representaunaformaparcialmenteactiva o de baja afmidadcapazde interaccionarsóloconel ligandomásactivoCS-l. 5.- La unión de«4131 al dominioHep II de Fnse puedeinducir porel tratamiento celularconPMA, el catióndivalenteMn2~ o el Acm TS2/16dirigido contrala subunidad 131. 6.- Las células linfoides B que no expresanla integrina«5131 y no seunen constitutivamenteal fragmentode Fn de 80 kDa, adquierenla capacidadde reconocer éstefragmentosi son previamentetratadascon el Acm TS2/16.El receptorcelular implicadoenla interacciónconel fragmentode 80kDaesla integrina«4131. 7.- La secuenciaRGDesun nuevoligandoparala integrina«4131 previamente activadaa travésde la subunidad131. Es decir,el cambioconformacionalinducido en «4131 porel Acm TS2/l16 resultaenla capacidadde reconocerRGD. 8.- La integrina «4131 activadapor el Acm TS2/16 reconocela secuenciaRGD de Fn. Por el contrario,«4131 asíactivadano reconoceestasecuenciaen otrasproteínasde MEC comolamininay colágenotipo 1. 9.- La región centraly carboxilo-terminalde Fn inducenuna reorganización distintadel citoesqueletode actinadespuésde la interacciónde célulaslinfoides B vía Conclusiones 83 «4131. La adhesióncelular a la región carboxilo-terminaltiene comoconsecuenciala aparicióndeextensionescelularesquepuedenllegaraserde gran longitud. Lasecuencia CS-1 es imprescindiblepero no suficienteparala formacióndetalesprolongaciones,es probablequeserequierala cooperacióndel dominioHep II. 10.- La región carboxilo-terminal de Fn induce fosforilación en tirosina después dela interacciónconcélulaslinfoidesB vía«4131.El dominioHep II y probablementela secuenciaCS-1 estánimplicadosen dichofenómeno. 7.- BIBLIOGRAFIA Bibliografía 84 BIBLIOGRAFÍA Alberts, B., Bray, D., Lewis, II., Raff, M., Roberts,K., Watson,JÁD. 1989. Molecular Biologyoftite Ceil? Ed. Gardland,New York. 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Mosher, editor.AcademicPress,New York.47- 121. Yamada,K. M. 1991. Adhesiverecognitionsequences.¿BioL Client. 266: 12809. Yurochko,A.D., Liu Dy, Eirmen D., Haskill, S. 1992. Integrins asa primary signal transductionmoleculeregulatingmonocyteimmediate-earlygeneindvction.Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 89: 9034. ANEXO ANEXQ El trabajode estatesisha dadolugaralas siguientespublicaciones: 1.- García-Pardo,A., Sánchez-Aparicio,2.,and Wayner, E.A. (1992). Two novel monoclonalantibodiesto fibronectin that recognizethe Hep II and CS-1 regions respectively.Their differential effect on lymphocyteadhesion.Riacliemica! and Biophysica!ResearcliCommunications,186:135-142. 2.- Sánchez-Aparicio. P., Ferreira, O.C.Jr., and García-Pardo, A. (1993). «4¡31 recognitionof the Hep II domainof fibronectin is constitutiveon sornehematopoietic celísbutrequiresactivationon others.Journal of Immuno!agy, 150: 3506-3514. 3.- Sánchez-Aparicio.P., Dominguez-Jiménez,C., and García-Pardo,A. (1994). Activation of the«4131 integrin throughthe¡31 subunitinducesrecognitionof theRGDS sequencein fibronectin.Tite Jaurna!ofCe!! Bio!ogy, 126: 27 1-279. 4.- Sánchez-Anaricio.P., Dominguez-Jiménez,(2., andGarcía-Pardo,A. The «4131 fibronectin ligandsHep II, (2S-1 andRGD inducedifferenteventsupon interactionon B lymphoidcelís. 1994. Manuscritoen preparaci[on. Vol. 186, No. 1. 1992 BIOCHEMICAt ANO BIOPHYSICAI. RESEARCI4 COMMUNICATIONS Ju¡y 15, 1992 Pages 135-142 TWO NOVEL MONOCLONAL ANTIBODIES 10 FIBRONECTIN THAI RECOGNIZE IHE tEl’ II AND 08-1 REGIONS RESPECTIVELY: IHEIR DIFPERENTIAL EFFECT ON LYMPHOCNTE ADHESION Angeles Garcla-Pardolt Paloma Sánchez-Apaddo1 and Elizabeth A. Wayner2 1Centro de lnvestigaciones Biológicas, 0810, Madtid, Spain 2Unlversity of Minnesota Medical Sohoal, Minneapalis, MN Received May 5, 1992 SUMMARY: We hayo 0btained two new mAbs to the carboxy-terminal reglan of fibronectin, namely P3Ó4 #nd Pl Fil, and hayo atudied their binding sites and their abllity to block lym~h#cyte adheslon to flbronectiri. ELISA and Western blot analyses showed that P~04 reacta with both fibronectin chaina and both Hep II- containing fragmenta <5~ ¡. Pl Fil, raised against the synthetic peptide OS-li reacted ik¿lth the 38 ¡.cad.,ic preás. Inc. We (1-3) and others (4) hayo previously shown that lymphocyte interaction with fibronectin (En> Involves multiple siles ¡ocated in the central and carboxy-terminal regians of Fn. Ihese sltds can be isotated within tryptlc fragmenta of 80 ¡. However the origen of this fragment has not buen clearly established yet. * Te whom correspandence shoold be addressed at Centro de Investigaciones Biolágtcas. VelAzquez 144, 28006 Madrid, Spain. Fax: 34—1-564 4567. Abbreviations: Fn, fibrorlectin; mAbs, monoclonal antibodies. 0006-291X/92 $400 copyrigh¡ C 1992 ¡‘y Acodcn,ic Press. Inc. 135 MI rights of reprodudilon in any fonn reser,’ed. 1. 186, No. 1. 1992 BIOCHEMICAt. ANO BIOPHYSICAL RESEARCH cOMMUNIcATIONS Ihe existence of twa adhesivo sites (Hep II and CS-1) in clase praxlmlty wtthin Fn, may suggest a lunctional coaperatian between both sites that resulta in an efficient ceIl attachment. Uslng a panel of monaclonal antibadies (mAba) solected lar thelr ability ta lnhibit lymphacyto adhesion to Fn, we have identifiod the a4~l integrin es the receptor lar both sites, Hup II and CS-l (1, 3>. In the prosont study we hayo obtained twa novel mAbs to Fn, which specifically recagnizo those adhesivo siles. Wo haw used theso mAbs to ciearly establish that tho 58 ¡. Far Inhibition experiments, coated wells were incubated at raom temperatura br 30 mm wtth 50 pl of appropriata dilutions of P3D4 ar Pl FIl mAbs prior to adding the colla. 136 Vol. 186, No. 1, 1992 BIOcHEMICAL AND BIOPHYSICAI. RESEARCH coMMuNIcATIoNs ELISA assays. 96-weB platos (Corning Gisas Works. New York, USA) were coatod wilh Fn (5 pg/well), 58 ¡ or 38 ¡ in 0.1 M cUrio acid-phosphate buffer, pH 5.). Afler 30 mm, the absorbance st 492 nm was determinad using a microplate reador. RESULTS Biochemical characterization of mAbs P3D4 and PIFI 1 binding sites in fibronectin lo determine the specilicity of the mAbs obtained using Ihe inimunization protocois duscribed aboye, we performed ELISA assays with equal molar quantities of Fn, 80 ¡; however, it was impartant to determine whether Uiis mAb recognized the CS-1 segment when present within Fn oc Fn fragments. As shown in Fig. 1 (right>, Pl Fil recagnized the 38 ¡, 58 kDa <2pg) oraS kDa (1 pg) and incubated with the indicated dilutions of mAb P304 (left panel> or Pl Fil . Quantitation of the reaction was done as described in Materlais and Methods. Each determination was done un duplicate and values represení the average of two dílferení experiments. 0,8 .1 1 10 P304 Dihition CX 100) ¡37 Vol. 186, No. 1, 1992 BIOCHEMIcAL AND BIOPHYSICAL RE5EARcH COMMUNIcATIONS Goomassue blue ~ 58k — 38k — P304 4 5 6 ge Fn — 200k - 190k — e 44 A fi coomassle blue 1 2. M k. e Coomassle blue •1,..v’1 a 80k— 9 e. e 58k— 0 381< — 4 PiFIl 466 Fn- 2001< — 1901< — a c coamasale blue piril -.4- Flauta 2. Western blot analysis of the reactivity of mAbs P304 and Pl Fil with Fn and fragrnerits. £nn~ja.A..and..Q: nitrocellulose membrana transfers of a 10% acrytamide gel contain¡ng 80 kOa (tanes 1 and 4>, 58 k0a (tanes 2 and 51, and 38 kfla (lanas 3 anó 6> fragments. Membranes were stained with Coomassie blue or incubated with either P304 <1:200 dilution. A> or Pl Fil (1:500 dilution, C> (right panel>; blots were developed with a peroxidase-labeled goat lgG ariti-mouse lgs. EanDIta.and..fl: nitrocellulose membrana transfars of a 5% acrylamide gol containing Fn (banes 1 and 3), and 200 koa+190 kDa fragmenis (lanas 2 and 4>. Membranas were stained with Coomassie blue (len> or incubated with mAba (right> P304 (6> or Pl Fil(O) and developed Rs aboye. The resulta obtained by ELISA were confirmad by Western blots analyses of Fn and ita fragmonts. As shown in Figure 2A, mAb P304 reacted with the 58 koa (lane 5) atid 38 koa (lane 6) fragments, but not with the 80 ¡ and to both Fn chains (A and B>. In contrast, mAb Pl Fí 1 (Fig. 20) reacted wilh Ihe 38 ¡, 58 koa (5 ¡ig/0m2>, or Fn (10 pg/cm2> atid incubated with P304 or Pl Fil supernatants for 30 mm, prior to adding the celis. Control wells (100% adhasion> are coated wells incubated with an irrelevant hybridoma supernatant. Attached celís wera quantitated as praviously dascribed. Values are the average of thrae separate experimanta. the 58 ¡ of Fn aupport celí adhasion. Wo hayo also shown that the 38 ¡ mapped the binding sites of mAba P3D4 and Pl Fil to Ihe Hep Ib domain atid the 08-1 site of Fn respoctively. lo further evabuatu the contribution of both sites to lymphocyte attachment to Fn, we studied the adhesion of the 6 calI Une Ramos to Fn and Fn fragmenta in fha presence of mAbs P3D4 and Pl Fil. As shown in Figure 3, mAb 139 Vol. 186, No. 1, 1992 BIOcHEMICAL ANO BIOPHYSICAL AESEARCH COMMUNICATIONS P3D4 elficiontIy Inhibited (>95%) celí attachment to Fn or Ihe 58 ¡. DISCIJSSION bn this study we haya obta¡ned two new mAba which recagnizo fha Hap II and 08-1 sites In the carbaxy-torminab rogion of Fn. We hayo usod theao mAba to clarify the origen of Fn lragments derivad lrom thia rogion; since Ihese two sites (Hep II and 08-1> are involyad in cali attachmant, we haya also studied the effect of thoao mAba on bymphocyte adhoaion to Fn. mAbs which spacilically racognize fha CS-i site in Fn hayo not been previouaby reponed. Two research groups haya succesatully obtained polycbonal antibodies to the 11108 region of Fn, using as imniunoguna a fusion protain containing a 95 amino acid residuo stratch of 11108 (8), or a synthot¡c poptido camprising the last 31 residues of 11105 (9). Both of theae segmenta (95 and 31 residuos> aro outsida the CS-l region atudied here which compílses the lirst 25 amino acid residues of 11108 (3, 5). The results obta¡ned with mAb PI Fil clearly show that the 58 koa lragment la darived from the E chain of Fn. Thia was previously aasumad (1-3,7) basad on fha molecular waight of fragmanta derivad lrom this rogion of Fn but can be dafinitely established now. Bocause the 05-1 segmant la regulatad by alternative splicing mechaniama, the availability of mAb PiFil may be very useful to study tho presenca of tho vartoua Fn isoforma (with and without 08-1) in diflerent tiasues, particubarly during devolopment. Although fha preciso site in Hep II recognizad by mAb P3D4 was not mapped. the lact that thia mAb olficiently inhibita cali adheaion to both 58 ¡ and OS-l ¡a apparantly of higher affinity than Hep 11(1-3). It a intereating 140 Vol. 186, No. 1, 1992 BIOcHEMICAL ANO BIOPHYSICAL RESEARcH COMMUNICATIONS that mAb Pl FIl . A more likely explanation lar the lac¡< of inhibition of mAb Pl Fi 1 is that, contrary lo Iho offect of PSD4, blocldng CS-1 does nol precItada ceil binding to Hep II. Ihe difleroní functionaí propertias of mAbs P304 and Pl Fi 1 suggest thaI the Hap II and CS-1 sites, may act in a cooperative marinar lo proniote Iymphocyte attachmont lo En. This suggostion is supported by tho fact thaI both regions internet with the sanie ceil receptor, the «4131 intogrin <1, 3). It is therefore possibla that interaction with Hep II is the lirat step in the procesa of cali adhusion to Ihe carboxy-terminal rogion of Fn, and thaI Ihis interaction regubatea (and sírongíhon) binding to 05-1. While Ihis mechanism awaits confirmation, Ihe availability of Iho twa noval mAba doscribed hero would be yery useful to fully understand thu molecular bases and rugulation of Iymphocyta interaction with Fn. ACKNOWLEDGMENTS We than¡< Ana Gutiérrez lar her axpert tochnical asaistanca. This work was supported by grant no. SAL91-0785 from Ihe Comisión interministoriai de Ciencia y Teonobogia, Madrid. P. Sánchez-Aparicio is the rucipient of a pro- doctoral leblowship lrom the Ministerio de Educacidn y Ciencia, Madrid, Spain. ‘1 REFERENCES 1. Wayner, E. A., García-Pardo, A., Humphrios, M. J., McDonald, J. A., and Carter, W. G. 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Chem. 266, 15075- 15079. 11. Wayner, E. A., atid Kovach, N. L. (1992) J. Coil Biol. 116, 489-497. 1 Reprinted from Biochemical sod Biophysical Research Communicat¡ons 186, 135—142 (¡992) Copyright 0 ¡992 Acadeniic Press, Inc. Printed ¡u U.S.A. 142 0022-1767/93/15O8-3506$02.OOAI Tite jocroal of In.n~unoJogy Copyright 0 1993 by Tite American Assoc¡ation o! In,nsuoologists Vol ¡50. 3506—3514. No. 8, Apdl 15, 1993 Prínted in U.S.A. a4f31 Recognition of the Hep II Domain of Fibronectin Is Constitutive on Sorne Hemopo¡etic Celis but Requires Activation on Others’ Paloma Sánchez-Aparicio, * Orlando C. Ferreira, Jr.,t and Angeles Garcia~Pardo2* *Unidad de Inmunobagía, Centro de bnvestigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, Spain; and the tServkio de Hematologia e k-iemoterapia, Hospital Israelita Albert Einstein, Sao Paulo, Brazil ABSTMcr. Leukocyte adhesion to the carboxyl-terminal reglan of fibronectin, a major camponent of extracellular matrices, invoives recognitian of (he CS-1 site and the Hep II domain. We have previously shown that cultural T and E lymphoid celis consthutively auach via the a4¡31 integrin to a 38-kDa fibronectin fragment that contains CS-1 and Hep II, and to a 58-kDa fragment that contains Hep II only. In his report we have studied the adhesion of other hemopoietic celís to the CS-1 and Hep II regions of fibronectin. Cultured manocytic celis and peripheral bload T ¡ymphocytes constitu’Ávely bound to the 38-kDa fragment indicating that a4131 was functiona¡. These celis, however, were unable to bind to the 58-kDa fragment. On Iymphoid celis both fragmens were shown to bind to veryclase regions of a4131 as indicated by the inhibition pattern of mAb to various a4 epitopes, and by the goad inhibitory capacity of soluble 38-kDa fragment vn ceil adhesion to 58-kDa fragmen!. These results suggested that a4f31 is present on certain cdl populations as a partiaíly active form able ta recognize the “high affinity” ligand CS-1 but not the “low affinity” ligand Hep II. Binding of monocytic celis and peripheral bload T lymphocytes to the Hep II domain couíd be induced by several agents: first, long (48-10 and shorwi (20-mm) treament with phorbol esters; second, celí incubatian with the divalent cation Mn2*; third, and most effective, celí incubation with the mAb TS2/16, which is directed to the ¡31 integrin subunit. Binding to the 58-kDa fragment in Ml three cases was com- pletely inhibited by mAb anti-a4, thus confirming the involvement of a4j31 in the recognition of the Hep II domain. No majar changes on a4¡31 surface expression were observed after these treaíments as determined by immunof- luorescence anaíyses. Our results indicate that hemopéietic celis may differentiaí¡y bind the CS-1 and Hep II ligands in fibronectin depending on the activation state of a4¡3l, a fact that may be relevant far ihe migraban and function of leukocytes. Jaurnal of lmmunology, 1993, 150: 3506. L yniphocyte interactions with extraceltular matrix components such as Fn3 are essentiab Co thcir proper migration and localization in lymphoid tis- sues and inflamrnatory sites as well as to Cheir function Received br publication Augusí 28. i992. Accepted ¡nr publication lanuary ¡9, ¡993. Tite cosí, of pubticatioo. of titis a,ticle were defrayed ¡o pan 1»,tite paymení of page citarges. Titis anide musí iherelore be itereby marked .,dvenisen,enf ¡o accordance edil, IR U.S.C. Section ¡734 sotely lo indicate Ibis fact. Thiswodc vas suppocted hy Graos SAI.91.0785 (90%CD3~ and <3% CD2l~ and CDllc~. Adherent celís were har- vested with HHSS containing 5 mM Na 2EDTA. Tite pite- notype of the aditerení population was >95% CDIUV~, CD3l~, and <1.9% CD3~. Ceil attachment assays These assays were performed exactly as described (6, 7) using fiat bottom, 96-weII Linbro pises (ICN Biomedicais, Higit Wycombe. Bucks, UR) coated with appropñate con- centrations of En or En fragments. me plates were washed with PBSandincubatedal 37 0Cwith heated (850C, 10 miii) ¡.5% BSA. After rinsing witit PBS containing 0.9 mM CaCI 2and 0.5 mM MgC¡2, lOO ji! of a 5ío6 >< 10 5/ml cdl suspensionwas added to each coatedwel¡ and aditesionwas assessed after 30 mm al 37’aC. For T lymphocytc experi- ments a 106/ml cdl suspension was used. Nonadherent celís were removed by two gentle washes witb RPMI ¡MO and attached celís were fixed ovemight with 1.25% glutaral- dchyde. washed, and sisined with 0.1% toluidine b¡uc. Af- ter 4 it at room temperature, tite absorbance al 492 nm was determined using an automatic microplate reader MRPA 4 (Eurogenetics Teffender¡o, Be¡gium). For inhibition exper- iments cel¡s were incubated with appropriate mAb for 1 it al 4’aC before adding Lo tite coated wells. Assays in tite presence of Mn24 were performed with celís previously washed twice witit 10 mM Tris, ¡50 mM NaCí, ¡ mM MnCI 2, 1 mM CaCI,, and tite piaLes were washed with tite same solution. For anti-¡31 mAb assays, celís were prein- cubatedwith a 1/10 dulution of tese mAb for 20 mlix aL 37 0C before tite aítachment assay. Quantitationof ccli attacitmentwas done based on tite 00 al492 nm usingcalibration curvesforeachcdl [inc or T celís as described<15). 00 was found to be a linear funclion of tite number of celis attacited in tite range 0.5 Y — 2.5 x io~ celís (witit minor citanges for eacit cdl ¡me) and 3.2 x ¡o~ — 2 X ¡o~ for peripiteral blood T lympito- cytes. AII assays werc perforrned iii triplicate. lmmunofluorescence analyses CelIs (5 x í05) were incubated for 30 mm at 40C with ¡00 pl of culture supernaíantscontainingtite appropriatemAb. Celis were washed twicewith coid PES containing1% BSA and resuspended in looitíofa l/l0Odulution offluorescein- conjugatedF(ab’) 2 fragmenis of rabbit antibodies Lo mause ¡gO (Dakopaus,Glostrop, Denmark).After 30 mm at 4 0C tite celís were wasited íwice, resuspended in PES, and an- alyzed by tiow cytomeíry on an FPICS-CS (Caulter Ci- entifica, Mósmíes, Spain>. Heplí — Fibll-~- ~Y~IIIt 58 kDa iii III III 3SkDa 12 13 14 III Hl U U 031 FIGURE 1. Schernatic drawing of the 58-kOa and 38-kDa Érypíic fragmenís of Fn used in Ihis study. rypes ¡ and III homology repears of Fn corresponding Lo ihese fragmenís are indicated and numbered (31). The S8-kDa fragmení is de- rived from Ihe E chain of Fn and contains Ihe Hep II and Fib II domains liniced by a type III homology unit that contains a free sulfhydryl group (13, 14). ¡he 38-kOa fragmení is de- rived from the A chain of Fn and contains the Hep II domain and part of the ¡IICS segment (13). The position of the known aditesive sequences within Hep II and IIICS is indicated (9, 10—12). CS-1 is only present on Ihe 38-lOa fragmení, whereas Hl, 1, II, and III are common to both fragmenís. Results Fn fragments that contain the Hep II domain The Fn fragmenís of 58-kDa and 38-kDa used in titis study (Fig. 1) itave been previously described (5—7). Botit frag- ments contain tite entire Hep 11 domain of En and itave identical N-terminal amino acid sequence. Tite 3&-kfla fragment also contains tite first 67-amino acid residues of te IIICS region, including tite CS- 1 site <¡3), and is derived from tite A citain of Fn. Tite 58-kDa fragment lacks tite entire IIICS region <¡4) and is titerefore derived from tite E citain of En. Consequently, íhe 38-kDa fragment contains two ccli binding regions: Hep ¡¡ and CS-l; tite 58-kDa fragmení contains only one: Hep II. Tite 58-kDa fragmcnt also comprises tite Fib 11 domain of Fn (A. Garcia-Pardo, unpublisited obscrvations) , tite T cdl Une HUT-78 (and Jurkat, noí sitown), (he B cdl une Ramos (and JY, CESS. not shown) 60 u u a 3 ‘o Fragmeuit ecocenlratlon (mMll) FIGURE 2. Attachment of lymphoid arid monocytic celís to the 38-lOa (open cirdes) ami 58-kDa (closed circíes) fibronectin fragments. A, HUT-78 (1 lymphoblastoid), 8 Ramos (B lymphoblasoid), and C, U937 (monocytic) celis. Microtiter weiiswere coated with 100 ¡.ul of tite indicated concentration of either fragment and 5 x 1 o~ celís were added. After 30 mm at 370C, attached celis were stamned and quanthated by 00 as described in Materia>s and Methods. Each determination was done in duplicate ami values represent tite means of titree different experiments. Values on tite ordinate indicate the percentage of celís that remained attached after washing relative La tite total input of cells (5 x 104/well) after subtracting bíanks. Maximal aditesion values of 40 lo 50010 in ah titree cases represení celí saturation of wells. and tite monocydc cdl lino U937 (and THP-l, HL-60, not sitown) efficiently aditered Lo dic 38-kDa fragment in a dose-dependent manner. Al! T and E ccli lunes studied also constitutive[y attacbed to dic58-kDa fragment, which ¡acks dic CS-l site (shown in Figs. 24 and 28 for HUT-78 atid Ramos, respective¡y). In contrast, U937 rnonocytic celís (and TI-lP- 1, HL-60, no’ shown), which constitutively al- tacited to tite 38-kfla fragment (47% of celis bound at sat- uration), were unable to bund to tite 58-lOa fragment (Fig. 2C). The total number of HUT-78 cefls attached at satu- ration represented 49% ami 42% of total ccli inpuí for 38- kDa and 58-kDa fragments, respectivoly (Fig. 24). In tite case of Ramos, these va¡ues were 42% ami 28%, respec- tively (Fig. 28). As shown iii these figures ami as previ- ous¡y reported (6. 7), tite 38-kDa fragment was a more efficient substrate for ccli aditesion titan tite 58-kDa frag- ment. Thisquantitative difference in diccapacity to support ccli attachment as well as te lack of adlxesion of monocytic celís to tite 58-lOa fragment (Fig. 2 Q were not caused by a poorer adsorption of 58-kDa Lo plastic surfaces because Wc have previously shown in quantitative experimcnts tis- ing 3H-labetedfragmentsthatequivalentamountsof 38- lOa and 58-kDa fragments bind to dieseplates(6, 7. 20). Using twa mAb directed Lo the a and 13 subunits, re- spectivcly, of tite a4¡31 uniegrin,we (5, 7> and others(18) prcvious¡y showed diaL a4¡31 could also function as tite receptor for tite 58-kDaEn fragment.To establishwitether tite samea4(31 epitopeswere invo¡ved in tite recognition of tite 38-kDa ami 58-lOa fragments, Wc performedat- tacitmentassays in Lite presenceola panel of anti-a4 mAb. As sitown iii Figure 3A, mAb HP¡/¡, HP2/1, and 8P2/4, previously mappedto epitopesA, Rl, and B2 of tite a4 subunit.respectively(¡9), inhibited Ramos cdl aditesion (andHUT-78, notsitown) Lo tite 58-kDaarid 38-koafrag- ments witb an identical patenn (El > B2 > A). Ibese resultaclear¡ysitow that tite CS- 1 site (38-kDa) and dic Hep II sites(58-kDa) interactwith veryclosercgionsin a4¡31. Thisconclusionwas further confirmedby tite capacityof soluble 38-kDafragmentLo inhibit ccl! aditesion to 58-kDa coaLed wells. As sitown in Figure 38, preincubation of HUT-7& celis(andRamos,nolshown)with soluble38-lOa fragmentresultedin 80%inhibition of attacitmentLo dic 58 lOa fragment. Cdl preincubationwith soluble 58-kDa fragmentitad limitod effect (30% unhibition) in agreement witb previousobservaíionsaix tite different binding affin- ides of botit fragments (5—7). Altogetiter diese results sug- gcst titat monocyticcelísbearapartial¡yfunctional form of a4¡31which differs from diaL presentinculturedIymphoid celís in tite abi!ity to inreract with Hep Hin Fn. Recognition of tite Hep II domain of Fn is induced after monocytic celí differentiation and activation Wc itave recently sitown diaL differentiation of U937 celis affects tite constitutive binding of titese celis to tite 80-kfla (RGD site) and 38-kDa (CS-t site) fragments of Fn (21). Wc now studied whetiter diffcrentiated U937 celís acquircd tite capacíty Lo recognize tite 58-ltDa fragment (Hep II sites). As shown in Figure 4, iJ937 celis thai had been cul- tured in Lite presence of low doses (¡0 ng/mí) of PMA for 48 h, specifically aditerod to tite 58-ltDa fragment in a dose- dependen manner. Titis result suggests timt diffcrenriation of U937 celis is accompanied by tite conversion of a4f~l Lo a fully active form capable of interacting widi Lite Hcp 1! domain. It can be argued hat given tite lengdi of time involved and tite overail changes undergone by U937 celis during diflerentiation (22), tite contribution of otiter factors diaL may affect tite aditesion properties of titese celís cannot 20 10 lOO 1000 •1 1 10 100 1000 1 ¶0 lOO 1000 :1 3510 DIFFERENTIAt CELL RECOGNITION OF THE HEP II DOMAIN OF FIBRONECTIN 1 a a e u o O 1 2 3 4 O 200 400 600 800 Antlbody dilution (x 100> Frsgment coneentratlon (jag/ml> FIGURE 3. irihibitian of cdl aditesion Lo tite 58-l.fla fragment by mAb to a4 (A) orby soluble 38-kDa and 58-kDa Iragments (8>. A, Ramos celis were incubated *ith anti-a4 mAb HP1/1 (epitope A), HP2/1 (epitope BU, or HP2/4 (epitope B2) lar 1 it at 4C and added to wells coated with 38-kDa (1.2 pg/mI) (open cirdes) or 58-lOa (19 as/mi) (closed circies) lragments. 8, HUT-78 celís were incubated witit tite indicated concentratians of 38-lOa or 58-kDa fragment lar 30 mm at room temperature; celis were acided to 58-kDa-coated wells (19 1jg/ml or 1.9 ag/well). Attached celís in bat experiments were quantitated as described. Values are expressed as percentage of tite number of celis attached a control wells (no inhibitor>. Tite average number of attached celis in control wells was: A, 6,000; B, 14,000. 25 20 1 o 1 e at 1 lo 0 50 100 150 200 58 kfla concentratlon (MaM1i) FIGURE 4. Effect of long (10 ng/mí, 48 hí (open squares> and shart (50 ng/mi, 20 mm) (dosed ch-cies) PMA treatment on tite aditesian of U937 celís Lo tite 58-lOa fragment. Rest- ng (closed squares> or PMA-treated U937 celis were added to wells coated with 100 jal of tite indicated concentrations of 58-kDa fragment. After 30-mm incuhation attached celis were quantitated as described. Determinations were done in duplicate and are tite average of Litree separate experiments. Values on tite ordinate represent tite percentage of auached celis relative La tite total ceil input (5 X 10 4/wefl). be completely ruled aut. lo overcgme titese problems, we studied Llie effect of acuLe activation of ¡1937 cells (without induction of differentiation) on adlliesion Lo Lhe Hep 1! do- main. As sitown in Figure 4, treatrnent of U937 celís witit 50 ng/ml of PMA for 20 mm resulLed in an even more efficient attacitmcnt Lo the 58-lOafragment.Similar paL- terns of adhesion Lo thc 58-lOa fragment were obtained for HL-60 andTHP-l celis (rcsults not shown>. Titese results are in agreement witit previous reports sitowing increased lympitocyte aditesion to Fn afrer sitort term activarion witit PMA (¡5, 16, 23, 24). U937 celí binding Lo tite 58-lOa fragment was mediated by tite a4¡3 1 integrinbecause it was initibited by mAb Lo tite a4 subunit (not sitown). To cstablish witether PMA treatment affected tite relative pattern of expression of o4 epitopes A, El, B2, and C, resting and PMA-treated U937 celis were analyzed by im- munofluorescence using tite panel of anti-a4 mAb men- tioned aboye. As sitown in Table 1, titere was a consisent decrease in tite expression of alí faur epitopes alffiough no majar relative citanges were observed among titem. No citanges in a4¡3 1 surface expression were derected afta short PMA treatment (not sitown). Recognition of the Hep II domain of Fn by monocytic celis is regulated through the ¡31 subunit It was recently reponed titat Lite function of severa! ¡31 integrins including a4¡31 and a5¡3l can be up-regulated titrougit certain mAb specific for tite (31 subunir (15—1 8). lo study witetiter sucit mAb affected tite irneracrion of a4¡3l witit its Hep II ligancis. we performed ccli auachment assays to Lhe 58-kDa fragment in Lhe presence of two anti-¡3¡ mAb,TS2/16 andAlex ¡/4. As shown ¡a Figure SA. preincubarion of ¡1937, THP-l. and HL-60 monocytic celís wiLh Lite activating mAb TS2/16 resulted ¡a specific aL- tachment to tite 58-kfla fragrnent. Tite level of ccli attach- ment to titis concentration of 58-kDa fragment reacited 16 to 20% of total cdl input and was similar ro tha obta¡ned after ccli treatmeat with PMA (compare Fig. SA wirh F¡g. 4) with sligitt variat¡ons among (he various ccli lines. Cdl preincubaLion with tite control mAb Alex 1/4 had no elTect (Fig. SA). L~5 1 1 jaurnal of lmmunoíogy Table E Expression of a4 ep¡topes vn celis 3511 resring and PMA-srimuíated ¡3937 Tite divalent cation Mn2~ induces celí binding Lo Lhe Hep II damain of Fn Antibody Mean Fluo.escence Inteosity U937 PMA-U937 l-IPI/1 (A4 115.2 105.2 HP2/1 (81) 107.8 94.1 HP2/4 (82) 125.9 110.5 8-5Gb (C) 128.9 95.8 HC1/1 (CDllc) 34.2 63.0 mAb TS2/16 also enhanced dic constitutivo bunding of monocytic celís to dic 38-kDa fragment and dius affccted Lhe interaction of a4¡3 1 widi lis twa Fn ligands (Hep II ami CS-l). As shown in Figure SR,restung THP-1, ¡1937,and HL-60celís bound efficiently (16 Lo 20% of total ccli input) to 38-kDa fragment-coatcd wells. mAb TS2/16 enhanced diis constitutive binding by more titan twofold Lo saturatian levels (40 to 50% of total ccli input), whcreas tite control mAb Alex 1/4 had no effect (Fig. SR). Intcrestingly. at tite equivalent molar concentrations shown in Figure 5 (0.6 nmol of 58-kDa and 0.5 nmo¡ of 38-kDa fragmenO. tite induced level of acihesion Lo dic 58-kfla fragment was sim- ilar to the constitutive binding of diccorrcsponding cdl ¡inc Lo the 38-kfla fragmení (Figs. SA and SR). Tite effect ex- caed by mAb TS2/16 involved tite a4¡3l integrin because preuncubation with anti-a4 mAb HP2/1 completely inhib- ited aditesion of alí celís Lo die 58-kfla fragmení (Fig. 6) and Lo Lite 38-kDa fragment (not shown) witereas tite anti-aS mAb PID6 used as control had no initibitory effecí. mAb TS2/1 6 induces recognit¡on of tite Hep II domain by peripheral bload T lymphocytes To establish whether tite differential aditesion Lo tite CS-1 and Hep 11 regionsof Fn also occurred on otiter itemopoietic celís besides titase of monocytic lineage. we studied tite aditesion of Tcelís Lo tite 38-kfla and 58-ltDa fragments. As shown in Figure SA, freshly isolated T lympitocytes were unable Lo attacit Lo tite 58-kfla fragment. Titese celís however constitutively bound Lo tite 38-kDa fragment (Fig. SR) althougit not as efficiently as cultured lympito¡d celís. Preincubation witit mAb TS2/16 unduced tite specific aL- tacitment of T lymphocytes to tite 58-kDa fragment . It is now well establishod titat integrin funetion can be mod- ulated by divalent cations (2). In particular Mn2~ has been sitown Lo enitance tite affínity of the aS(31 integrin for its ligand. Lite ROD sequence of Fn <25). In tite present study WC tested tite possibility titat Mn2~ could mimic tite effect of mAb TS2/l 6 and induce ccli binding Lo tite 58-kDa frag- ment. As sitown in Figure SA. inclusion of Mn2~ in tite attacitment assays and prewasiting tite celís in tite presenco of titis cation resulted in specifíc aditesion of tite titree monocytic cdl linos tested Lo Lite 58-kDa fragment. Mn2~, itowever, was not as efficicnt as mAb TS2/¡6 in inducing monocytic ccli binding lo tite Hep II sites and liad minima! effect anT celís (Fig. SA). As sitown in Figuro SB, M~9~ also increased tite constitutivo binding of ¡1937 celís to tite 38-kDa fragment but had no significant effect on THP- 1, HL-60, arT celís. Mn2~ cid notaffcct cdl hinding La BSA- coated surfaces titus confirming tite specificityoftiteeffect. Treatment witit Mn2~ cid not affect ccli surface expression of a4f31 as detennined by immunofluorescence using anti-a4 and anti-f31 mAb (daLa noÉ sitown). D¡scussion In titis repon we itave extended our previous studies on leukocyte aditesian to Fn and we shaw taL 1) monocytic celís and peripheral bloed T lympitocytcs constitutively recognize tite CS-1 site presentan tite 38-lOa fragment of Fn but are unable Lo bind to tite 58-kDa fragment titat con- tains only tite Hep II sites; 2) botit 38-kDa and58-kDa fragments bind Lo very clase regions of tite a4f31 untegrin; 3) a4¡3l on titese celís is titerefore presení as a partially active or low avidity form thai is able lo interaet witit the more active ligand CS-¡ but not witit tite less active ¡igand HcpII; 4> binding to Hep U can be induced by cdl treatment witit cititer ¡‘MA, tite divalenL cation Mn2~ or, most cf- fectively, witit mAb TS2/16 directed Lo tite ¡31 integrin sub- unít. Tite titree manocytic ccli lines used in tite present studies failed Lo aditere to the 58-kDa fragment of Fn even at itigh concenírations of >300 pg/ml, althougit íitey efficiently bound ta tite 38-kDa fragmení titroughtite CS- 1 site. Titis confirmsour preliminary results using ¡1937celís (20> and may indicate íhat lyrnphoid and monocytic celís beitave d¡fferently w¡tit respecí Lo the utilization of tite varlaus ad- hesive sites in Fn. As we have prev¡ously sitown, cultured T aud E lymphoid celis constitutively bind to bat 38-kfla and 58-kDa fragmenís of Fn alíitougit, on molar bases, ihe 38-kfla fragmení Was abaut threefold more effective titan tite 58-kDa fragmení in supportingcelí aditesion (5—7).The fact thai fresitly isolawd peripiteral bload T celís are also unable to bind lo tite Hep II domain of Fn (titis repofl) suggests titaL tite different¡al recognition of te Hcp 11 da- 50 50 -o ‘e o e e o t 40 30 20 10- A • • O AJsx¶/4 9 ¡JJJ 40 30 20 10 o-.—1, TNP-l 11937 HL-SO T caL THP-1 (ini HL4O T colis Adiuslon lo th. 58 IcDa fragm.nt AdMilon te Ihe 38 tO. fragmoní FIGURE 5. Induction of ccl! aditesion lo tite 58-kDa fragmení (A) and enitancement of cefi aditesion to ¡be 38-1<11» fragmení (8> by anti-(31 mAb TS2/16 and by tite divalent cation Mn2~. Wells were coated with 100 ji of 58-kDa (38 jag/ml, 0.6 nmoI~ 0< 38-kDa (19 jis/mí, 0.5 nmol> fragments as described. Monocytic celis (tJ937, THP-1, HL-60) and per¡pheral bload T celis either untreared , 0< mAb TS2/1 6 + Pl D6 (aníi-aS> were added to 58-lOa coated wells (38 jig/ml). After 30 mm at 370C attached celis were quantitated as described. Values are tite means of twa separate experiments and are expressed as percentage of total celí input. main may be determined by tite act¡vity of tite «4(31 in- tegrin receptarpresentan a panicular ce]! population. Tite existence of varjaus states of activation in «4(31 is cvi- denced by tite different patterns of acihesian observed even among celís titat constitutively bind both ligands. As sitown in tite prescnt repon, tite number of HUT-78 celis attacited aL saturation is similar faz- bo¡h 38- and 58-kDa fragments (49 and 42%, respectivcly). whcreas in tite case of Ramos more celís (1 5-fold) attacit at saturation lo the 38-kDa frag- mení titan to tite 58-kDa fragment when equivalent molar conccntrations are campared. Titerefore, it appears to be a “gradicnt of aditesion” Lo tite Hep ¡¡ domain of Fn repre- sented by cultured T celis, cultured B celís. ami monocytic/ peripheral bload T celis, respectiveiy. Tite different ability Lo recognize Hep II is probably determined by tite avidity (high-intermediate-low)of tite receptor present on titase celís.Conscquently, Lite high/intermediate avidity form of «4(31 would be able to bind high” (CS-I) aud “low” (Hep 11) affinity ligancis, witereas tite low avidity form of «4(31 would bind only tite stronger ligand CS- 1. In titis coritext, an efficient cdl aditesion will depend an tite state of ac- tivation of Lite receptor and on tite availability and affinitv of tite ligand. As we shaw in the present repon. several stimuli can convert Lite low avidity form of tite receptor to thc intermediate/I-iigh avidity form dms furtiter supporting tite aboye explanation on different activation faz-ms of &4J3 1. Changes in aditesion to En after cdl differentiation itave been reponed for several cdl typcs including lympitocytes (3, 23, 26). For U937 monocytic celis wc itave recently sitown titat induction of tite monocyte-like phenotype af- fects ce>] anachmens to tite ROD aud LS-> sites of Fn (21 Tite present resulis sitow titat differentiated U937 celís also acquirc tite ability Lo bind ro tite Hep 11 domain and titis coz-relates witit a slight down-regu¡ation of surface expres- sion of «4(3>, consiscnr wirh aur previous repon (21). Tite most likely explanation for the recognition of Hep 11 by PMA-treated U937 celís is tite functional up-regulation of «4(31 after differentiatíon. as previously reponed for ritis and otiter ¡31 integrins on lymphocytes (23). Wc itave at- tempted to furtiter confirrn titese results by resting tite al- hesion of freshly isolated peripiteral bload monocytes ro tite 58-kfla fragmení. However. because of tite high nanspe- cific aditerence of monocyres on thcse assays, it was nor possible to ascertain tite speciticiíy of tite binding. Tite fact titar sitort term activation of rnonocyt¡c and T celís ‘urh high ciases of ¡‘MA induces ccli binding lo tite Hep II do- main ami is even more effectivc titan long Éreatmerus. strongly suppons Lite explanatian of tite activation of «43k It is now wcll establisited Éitat tite funcrional activity oL 20 lo U937 HL-60 THP-1 Adhnlon to tite SSkOa tragmení integrins can be modulated by several agents including pitorbol esters (23, 24, 27), specitic ligancis (28), ami di- valcnt cations (25, 29). Receot rcports have shown Lhat certain mAb directed to tite ¡31 subunit can increase tite avidity of ¡31 integrins for their ligancis, presumably by inducing a confarmational change diaL leacis Loan activated form of tite receptor (15—18). The constitutive bindiixg of «413] Lo twa of its ligancis, CS-1, aud VCAM-¡ (vascular ccli aditesion molecule-l) has been shawn La be up- regulated in titis fasition. A recent repon itas shown titat tite recognitianof tite tripeptideLDV, aix activesequencede- rived fram CS- 1. also requires activation of «4131 (18). In tite present study, we sitow for tite first time titat anti-131 mAb TS2/16 effectively induces bunding of monocytic celís and peripiteral bload T lymphocytes Lo tite Hep II domain of En, witicit was nat previausly recognizedby resting celís. Titese results suggest titat activation of tite appropriate re- ceptor may be a useful way to study low affinity interac- Lions or novel ligancis otherwise noÉ deteeted. Asimilar atthaugit less dramatie effeet, was observed ¡ix tite presence of Lite divalent cation Mn2~. Titis cation itas beenshawn lo mercase tite affunity of «5131 anó «Vf33 integruns for Liteir respective ligancis <25, 29). Altitougit Mn2~ induced sorne binding of peripitera! bload 1 lym- phocytes Lo tite 58-kDa fragment, tite effect was minimal witen compared witit monocytic celis. Titis migitt indicate titat «413] on T lympitocytes requires a stronger stimulus (PMA, anti-131 mAb) for ful! activation. Sucit explanation wauld be in accordance witit tite praposed existence of sev- era! «4/3] activarion fornis among different ccl! popula- Lions. In spite of differences aix tite leve! of activation, it is likely thaIbat Mn2~ and 152/16 mAb induce a confor- mational citange in «4131 whicit increases tite avidity lar its ligancis and allows binding Yo tite Hep 11 domain. Hawever, until titis mechanism of «4131 activatian is contirmed, atiter alternative explanations sucit as intracellular signaling anWar receptor reorganization aL tite cdl sm-face should also be considered. As wc and otiters itave sitown, celí aditesion Lo tite car- boxyl terminal regian of En is a complcx process Éitat in- volves several aditesive sequences un tite ¡-lcp 11 damainand lix the [IICS region of Fn (5—7, 9—12). Sorne of titese sc- quences are ligancis for tite «413] integrin (5, 7, 10) and sorne Internet with proíeoglycans (II, 12, 30) ni tite ccli surface. A¡Lhough ¡ix tite present repon we did not idcntify tite spccific sequences invalved in ccli aítacitment ta tite Hcp 11 domain. tite finding titat mAb to «4/31 can com- pletely inhibit <100%) adhesion to tite 58-kDa (and 38-kfla) fragment indicates titat tite predominant interaction of leu- kocytes with Lhe Hep 1! and CSI sites in En is mediated by tite «4(31 integrin. Titis conclusion is furtiter supponed by tite results canccming tite regulation of aditesion to titese sites titrougit the (31 integrin subunit -and tite divalent carian Mn2~. Regard!ess of tite type of receptor invo¡vcd, tite ex- istence of twa aditesive regians ’ Lite activation statc of «4(3! supports tite notion titat ccli aditesian Lo tite CS-1 ar/and l-lep II rcgions may deliver different intracel¡ular signals. On tite otiter itand. tite reg- ulation (constitutive VS induced) of strang and weak inter- actians of «4(31 with its ligancis un Fn may itave impartant imp!ications far tite migration and function of lyrnpitacytes and monocytes, particularly because tite CS- 1 site is not present un alí Fn isoforms resulting from altemative splicing mccitanisms, titus providiug anather leve! of regulatingccli aditesion and migration and reinforcing tite role of tite extraccllu¡ar matrix en titese pracesscs. Acknowledgments Wc d,ank Dr Francisco Sánchez-Madrid for critical rcading of 111k nianu- scripí and for (he 5CixCtOUS supply of mAb: Drs. M. E. Herníer, E. A. Wayner. and C. Bernabee for rnAb; Ana Gutiénez for excellen; iechnical astistance; and Pedro Lasres for help with the flow cytomesry analyse& References 1. Springer, T. A. 1990. Adhesion reccptors of tite irnrnune sys- tem. A/ature 346:425. 2. Hyncs, R. 0. ¡992. lntegrins: versatility. madulation and sig- naling in cdl aditesion. CeIl 69:11. 3. Bernardi, PV. 1’. Patel, and H. Lodish. 1987. Lymphoid pre- cursor celís adherc to twa diflerení sites on fibronectin. i. Ceil fha). 105:489. 4. Liao. N. 5.. J. St. John, 1. E. McCarthy. L. T. Furchu and H. T. Cheung. 1989, Aditesion of lymphoid celis to ube carboxy- erminal heparin-b¡nding domains of fibronectin. Eu-p. Ce!! Res. 181:348. 5. Wayner, E. A., A. Garcia-Pardo, M. E. lisimpitries, A. A. McDonald, and W. 0. Carter. ¡989. ldeniification and char- acterization of the T lymphacytc aditesion receptor kw an altemative cdl attacitment domain (CS- 1) un plasma flbt-onec- tun. J. Cefi RieL ¡09:1321. 6. García-Pardo,A., andO.C. 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Springer-Verlag, New York. p.l 13 Activation of the a4tSl Integrin through the ¡31 Subunit Induces Recognitionof tite RGDSSequencein Fibronectin PalomaSánchez-Aparicio,Carmen Domingnez-Jiménez,andAngelesGarcia-Pardo Departamento de Inmunologfa, Cauto de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 28006 Madrid, Spain Abstnzct.L,ymphacyteattachmcntto fibronectin is mainlymediatcdby tite interactianof cr5aí ami a401 integriaswith dic ROD asid CS-4IHep II sites, respec- dvcly. Wc tuve rccently sbawndusdic anti-D1 mAb 132/16cancanvertdxc partly activea441 presentaix certainhemopoieticcelAs that recognizesCS-I bit not Hcp 11, tu a high avidity form thatbinds both ligancis. lix Uds repartwelave studicd whcdiermAb 132/16 also affccts a4~1ligand spccificity. Incubatianof tite B cefl Unes Ramasasid Daudi . Twa active sites hayo been identified within IIICS, namely CS-1 (residues 1—25) asid CS-5 (residuos 90—109) (19). Bat CS-1 asid CS-5 are regulated by alternative splicing asid are noÉ present in al! En ísafarms. While CS-1 asid dic entire Hep II domain clearly mediate lympbocyte aditesion Lo Fn (15, 16, 52) it is not knawn if tese ccl¡s recognize dic specific sequences contained in HI, FNC/H 1. PNC/H II, asid CS-5. Address .11 corresponden Lo Dr. Angeles Oarcia-Pania, Centro de Inves- Ligaciones Biológicas, Veitzqucz 144. 28006 Madrid, Spain. 1. Abba,tajions ¡¿sed in thts poper: ECM, extracellular matríx: Pu, fibra- nectin; ¡‘MA. phorbol myristate acetate; XCAM-I. ma,Iar ccli adhesian n,oiecule-i. O Tite Rockefciler Univcruiy Presa. 0021-9525/94107/27i/9 $200 ThelournalarcelíBiology Volume 126, Numter 1~ July 1994 271—279 Lyrnphocytcs intcract with En rnainly via twa main receptan which belong La dic integrin frmily: tite «5131integún is tite receptar fin dic ROO asid synergístic sites (42>. Thc «4131 integrin is tite receptor for Hl (35), Hep II, and CS-1 (16, 18, 33, 52) asid CS-S (34). Tite functional activity of rnast untcgrins can be regulated intracdllularly by pitorbol esters (45, 54) or lydic cytoplas- rnic domain of sorne a asid fi chains (22, 39) as well as ex- tracdllularly. Among diese extemal frctors certain mAb directed Lo tite 13 subunit huye been shown to upregulate tite funetian of most 131, 132, vid 133 integrins (reviewcd un 20). mese rnAb most likely induce a conforrixational change on tite receptar wlxich mercases tite affinity/avidity for its ligancis. Indeed, we and otbers itave been able La measure tus increase un dicaffinityof «5(31 for aix 80-kb Fn fragment containing dic ROD sequence (2) arfar intact Fn (11). Tite high avidity state can algo be induced aix sa¡ubi¡ized unte- grins and dius acquisition ofte activated form is an intrinsic property of dic receptor (2, 6, 38)- me existence of ¡ow asid itigit aflinity interactions witit tite extracelluiar matrix ma’ p¡ay a crucial ro¡e for tite migration and loca¡izatioix of lym- phocytes. Using one of diese activatíng anti-(31 mAb (TS2/16), we have recently shown diaL tite «4(31 integrin a¡so exíst on se’- eral states of activation amang different hemopoíetíc ceUs 271 (44). The more active form, prasent an cultured Iynxphoid calis, was able La bisid twa fragmenta of 38 lCD (contains CS-í asid Hep II) (13) asid 58 lcD (cantaba Ifep II) (15—17) derived from te A asid B chaíns of Fn, raspectively. Tite lesa active fórin, presesit on rnanacytic calis asid peripiteral bload T lymphacytes, bonsid only tite 38-kb ftagment asid dius recognized CS-1 but siaL Hep II. mAb 232/16 converted titís «4131 formLo a more active asic able La recognizebat sites. These prcvíous observations dierefore indicate taL diere are ccli populatiasis which canstitutivcly express a low ar ínter- mediate avidity «4131 forrn unable Lo recognize sorne of lis ligands. In view of diese results it ‘~s conceivable diaL acti- vaLían of Lito receptor wauld Icad Lo te recagnition of new low afilnity Iigands siaL previously identified. la dic prescnt repon we haya studied whedicr «4131 activa- fian via te fil subunit affects tite ligasid specific¡ty of diis receptor. Wc shaw that «5131-negativo B lymphaid calla diaL do not bisid cosisdtudvely to te SO-kb Fn fragment, efliciently attach latís fragment upan incubatian widi mAb 232/16 Wc bat ideotiticd dn404-íntegrin as tite receptor thai mediates aditesion ta tite 80-kb ftagment asid we shaw tal dic ROD sequence in Fn is a novel ligasid fór activated «4131. Materials asid Methods ECMPfleins, Fragments~ asid Synthedc Peptides Humanplisan Psi ns tite genaaus ¡u dUra, 8. Hozwaitz aid L Smlman ’ — previously deacuibed Q3-15). Purity of te ¡0-II) fragmeat sus .5- seasedby SUS-PASE, Western blots, ELISA. aid NH2-terminal amino acíd sequencing.Amino azid sequero analyscs werc performed by Mr. Javier Varela at te Proteja Chexrúsúy Laboratory, Centro de Invesaiga- ciones Bíold¡ucas (Madrid, Spain), usíng a 471A liquid-pbaso sequencer (Applied Biosystenis, Inc., Ibster City. CA). lite 80-U) fraguan wes cler.’ed with pepain WIOO ivt/wi, 31C, 1 iz) as described (40). Peptie digests utre resolved by Ist protein liquid chroinatography (Pitannacia 11<3 Bíotechxo]ogy, Uppsala, Swedcn) usíng a Mono Q ion esdiange colman (Phannacia tICE Eiotechwlagy) equilibrated la lO mM Tris pH 7A bu&r (A)- Bound fra¡ments nitre eluted~‘ applyíng a45-mm guadiext from 100% A La 40% A-60% E (10 mM fis, 500 mM NaCí, pH 20). Characterintion ofpeptác fragmcms wu acbimed by SDS4W3E,Western blota, ELISA, md NH2-terminal amino acíd sequencing. Purified frag- menta nitre dialyzed Venus PES aid atored st —70C. The folIowIng syn- tetie peptides viere purchased hesBio-Syathesis D&I (Madrid. Spain): <3RC}DSPC md GROES, containing sequenceshin te central ceJI-binding doniain; DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPS1C (CS-l), PST~flPF- VTHPGYD1I3NGIQLPO (CS-2), aid, CIQLPGISGQQPSNI3QQMIF- EEHGFR (CS-3>, containir.g sequencestraestite IIKS reglan, asid ¡DM5 containing un active sequence presentin tite Hep U domain (35)- Lmntinin sud collagen type 1 were purcitased fian, Sigma Chemical Co (Saínt Louis, MO). Monodonal Antibodies Pn-specific mAba PiPII (anÚ-CS-1) aid P3D4 (unti-Hep II doinain> nitre produced as reponed (17). niAba N-295 asid N-296 viere originafly pez-- chased traes Mallinckrvdt Specialty Chesnicats (Masytaad Hcisjts, Ma) aid un xcvi anilable thmugh Cheunicon International, Inc. (MABí 934 asid MAB1935, respectively; Tenzecula, CA). mAb N-295 reacts witit dic li-U) fragmeat taL contales te RSID sequence of fibronectun (40> asid ~stia1ly ínhibits celí aditesion <32). mAb N-296 rncts wíth acatboxy-Lerniinal frag- ment that contaixa tite Fib II donzain aid does not affect cdl adhesio. (32>- mAba Lo te a4 integrin subunit HN11 (epitope A), HP2/1 (epitope BI>. sud mAbs Mex 114 aid 132/16 specific for Lite fil subuxit nitre otnixed fram Dr. E Sánchez-Madrid (Hospital do la Princesa, Madrid, Spain). n,Abs PIDó (anti-a5> aid PIES (anti-a3> viere obtained fmm Dr. E. A. V.~yaer (Univenity ofMinnesota. Mumeapolis. MN). mnAb LM609 (¡tui- cA’0)v.usoétuined franz Dr, D. Cheresiz (SctippsClinic, San DIO% CA>- mAb lIF5 (anui-a3> susoltained fian, Dr. M. Hemier (Duna ftrber Can- cer Instituto, floto¡, MA). saAb D3I9 (ami-CD45) vas obtained franz Dr. C. Bernabea (Centro de InvestigacionesBióiogicas, Madrid, Spain>. Celis , and ¡<562 (erylhraleuhamia) viere obtained frani Dra. E Stndzez-Madrid vid C. Eec- subeo, lito melanonia ceIl líne A375 vas obtained fian, Dr. 1. ibixidó (Centro de Investigaciones Biológicas>. fle E ccli line Ramos and tite moaocytic celÉ lisie U93l viere ablained traes te American bp Culture Cailection (Rockville, MD>. Celia nre expanded ix RPMt ¡640,sup- plementedwith 10% heat-inactit-ated fetal bovme serma (Gíbco. Middle- su, ¡3K), 2 mM t-glutamine, 100 U/ml penicillin (Antibidticos, Madrid. Spain), aid 24 ¡¿guI gcntamycin (Horente, Madrid, Spain). lix general. three/faor-day cultures viere used for asaaya. Cd Attachment Assays fleje assaysviere perlarmed exacLIy Ss deactibed (44) uttng fiat ~ctxoia, high bísrdisig, Qó-vielí pIaLes (Costar Corp.. Cantridge, MA>. Quamititation of cdl attachmcnt vasdone by deaowining viere incubated faz- 30 ruin aL 4’C witb lOO ¡¿1 of supernatants (1:2 dilution> ar ascites (1:500 dilution) containing tite appro- priate mAb. Celta viere ~wstiedtwice wit coid PBS-1% resuspended ix 100 ¡tI of a 1/100 dilutian of fluoresoemn-coxjugated F(ab2z fragmenta of rubbit antibodiesLo incuse ¡¡O (Dakopatla, Glostrop, Den- mark>. Aher 30 mix aL 4’C colla viere vasbed twíce, resuspeadedix PES, aid analyzed t~’ tlow cytonietzy on an EPICS-CS (Caulter Cientifica, MdsLoles, Spain). ELISA Assays Titese assays viere perfornied u described (17> uit tite follewing modificaLions Lo improve b.ckgrcund: Fn fragmenta usad br coatissg wells vitre ix 0.1 M sodisuinborato, pH U (instead ofPES); platos viere vashed with 0.1% Theen 20 (instead el005%); isteubation wíth antibodies vas done at mcm temperare (instead of 37C). Absorbanco st 492 sim ‘las dotermined aher lO sud 30 mm using a microplate readeru Results blbmnectin Fragments Titar Contain the Central (RGD-dependent) or Carboxy-terrainat (RGD-independent) CeIl-binding Doma¿ns The Fn tryptic fragmenta of 38 asid 80 lcD use~1 in te pres- cnt study have bean prevíous¡y characterized and are scite- niaticail>’ shown in Fig. 1. Tite 38-kb fragmesit, deriva! from te carboxy-ternuínal regían of tite A citain of Fn, con- tains te Hcp II domain and pan of tite IIICS regían includ- ing Lite CS-1 site (13, 15, 17). Tite 80-lcD fragment, derived from te central region of botit chains of Fn, contaíns a ¡0W- affinity heparin and DNA-binding domain, tite ROD sequence and tite RGD-dependcnt syncrgistic siLes (56). Rotit fi-sg- menta are contiguous in tite En sequence. The ioun,al of Ceil Eiology, Volume 126, 1994 272 —.—-—ONM4ep —e- — —0011 E s u • u a Nl Nl 4 5 6 7 • , t0 t~ /.. Y — a. AOCI -~—— 4W45kO 16k0 —e.- -e.——— H.p II jlj jua 111131 sil 150$’ 001<0 l~4hdS4flSl 385tO Fo fragments sial previously shown Lo support ¡3 lymphaid cdl aditesion. Titese include dic 80- lcD fragmesit shown un Hg. 1 and twa fragmenta of 29 and 31 1W derivad frain te amino- and carbo,cy-Lormsnal regions of Fn, respectívely (riaL sitown un Hg. 1). Tite various cdl popu¡ations usa! un tese studíes and teir pattei-n of integrin expression are listed un lbble 1. As can be observa! none of the faur B cdl linos studied api-casad te ctS integrín subunít aix teir surfrce ¡ix agreement witit previous reparts (5, 16, 47). As sitown inFig. 3, resting Ramos or Daudí cel¡s orce¡ls incubated widi te control ami-fil rnAb A¡exlI4 did siaL aL- Ladi Lo tite 80-kb fragmerit. However, preincubatian of Ramas or Daudi celís with mAb TS2/16 resulta! in a dose- response auachment tate 80-kb fragment (Fíg. 3). incuba- Lían of Ramas cel¡s with mAb TS2/16 always resulta! in a more eflicient aditosion (60%) Lo tite 80-kb fragmont tan incubatian of Daudi cdlis (40%), a resuit consistent witit tite higiter fil cxprossiosi aix Ramos celis (‘Ibble 1). Tite surfáce expression of fil isitegrisis did siaL change upan treatment wit mAb TS2/16 (1, 2, and Litis repofl, not sitown). rnAb TS2/16 did not induce binding of Ramos or Daudi celís to a,eo e e 6O a, o Figure 2. ELISA analysis of Lite reactívity of mAb PIEl 1 (antí-CS- 1).P3D4(antí-Hepil), asid N-295 had no offcct en teseassays (Fig. 5). Tho effact of tite syndiotic papUdos CS-l aud Ifr~PS ox ‘132/16-treatad Ramos cdl aditesion ¡a te SO-kb fragmesit was alsa testad. As shown iii Fig. 6, CS-1 ar IDAPS peptides produced a dose-dapendesit inhibition of ccli attacitmesit Lo tite 80-kO fragment, while tite control peptides CS-2 (Pig. 6) sud CS-3 (siaL shawn) had no elfrct. Intarestingly, ¡be syn- titetic peptide ORGDSPC was alga complctely inbil’itary in diese assays while tite control GROES peptide had no cifeet (Fig. 6). mecalculated cosicantmation (siM) of peptide re- quired Lo produce50% inhibibon of ccli attachmen¡ ¡o tite SO-kb fragmesit was 5.45 (CS-1, 15 pg/mI), 104 (GRGDS- PC, SO pg/ml), asid 400 (IDAPS, no ~g/m1>.mus, cs-i ns tito most cifective inhibitor asid dio kGD-containing peptide was a better inhibitar tan dic reported «4(31 ligand IbAPS. The RGDSequenceix a Ligandfor TS2/16—activated a4fi1 Integrin Tite aboye resulta dierafore suggested diaL te canfurnia- Liosial change isiduced ix «4(31 ¡y mAl’ ‘¡‘82/16 resulta in te ability to recognize te ROO saquence. To pi-ove titis, we tested te capacity of te GRGDSPC syndietic pepLide La ix- hibit Che aditesion al resting asid 7S2/l6-actiwted Ramos celís Lo tite 38-kb fragmesit. As shown ix Hg. 7, resting Ramas ccli aditesion Lo te 38-kb fragmesit was siat affected (90% specific aditosion) ¡y ¡be ORGOSPC peptide «U mg/mi) in agreemesit wit aur previcus repon (16). However upan incubaban witb mAl’ 1S2/16, tite GRODSPC peptide (0.5 mg/mi) initibited celí aditesian Lo te 38-kb fragmesit ¡y 50% (Hg. 7). As expected, te CS-l peptide usa! as con- trol was a goad inhibitor ix bat cases. These resulta clearly shaw taL soluble RGD-coixtaixing peptides can efl’ectively o -eu u o Figure 7 Effect of ¡he GRGDSPC synthetic peptide ox Ramos cdl attaohmesi¡ Lo ¡he 38-kb fragment. Celís were e¡ther untreated (Resting) or treated with niAl’ TS2/16 (15 mix, 3~C) and incubated 30 mix st moni temperatura with (15 mg/ml of GRODSPC or CS-I peptides. Celís wera added Lo wells coated wíth OS pg/mI (Resting> or 0.6 ~g/rnl(TS2/16 activated> of 38-kb fragment. Tite numsiber of colís on control wells (no ixhibitar) were 35fl00 (Resting)and 29fl00 (TS2/16 tratad). Tite numbar of attached celIa relative ¡o control wells vas quantitated u described. Values are te mcans of t~v d¡fferent exparimnexta. inbil’iL te fusictian of activated «4(31 and taL activated «4(31 (tuL nat resting «4(31) acquires te capacity Lo recognize dio ROD sequence. As shown in lbble II, aditesion of TS2/16-troated Ramos celis Lo dic 80-kb fragment was alsa inhibited by soluble 80-, 38-, asid 15-kb (ROO sito) fragments. It was paorly ix- hibited ¡y te 40/45-Id) fragmesit (no ROO). Direct l’isiding ca cha 15-kb fragmcxt howavor could siaL be demonstrated probablydue Lo te lay affinity displayed ¡y tis fragment whesi usa! as substrate. To fui-ter confirm ¡bat diere vas a apecifie ligaud for «4(31 withix te 80-kb fragmení, we car- riad aut ccli attachmcnt assays in Lite presexce of a panel of anb-FnmAba. As shown ix Hg. & mAl’ N-295 which recog- nizes mi apitope near te ROD sequenca, ixhibited (80%) Ramos ceil aditosion Lo te SO-ko fragment while mAl’ N-296 (miLi-Fil’ II) asid P304(anti-Hep U) had no effect. These resulta togedier with te daLa showx ix Fig. 7, mdi- cace diaL «401 isiceracúan with tite SO-kO fragment ¡a pri- marily mediata! ¡y tite RGD sequesice. Because inhibition ¡y mAb N-295 was siaL complete (Hg. 8), a amail cantribu- Lían fi-am adier sites ix te SO-kb fragment cannot be cern- pletely miad cut. mAbliS2/76-induced Recagnition of NewLigcmnds May Be Specificlar Fn andfor tite «4(31Integrin Wc next testad whethei- mAb ¶132/16 cau¡d induce tite recog- Table II? Effec¡ ofFn Fragmeníscm Adhesionof TS2/16-treatedRomosCelis ¡o ¡he 80-kbFra g>nen¡ 80 lcD Coating concentration % Inhibition 80 lcD 38 lcD 15 ka 43 U) 35 lcD pg/ml 43’ 3 4.5 1.8 3 19 38 Nanomoles of Iragmenis 80 lOO 85 10 2 70 lOO 50 0 0 used ix ¡he incubañon micture. 80 80 40 20 0,4 0.8 1,2 Peptkle coneentratlon (mg/mi> Resling +TS2/16 Adh.sion ¡o ¡he 38 kO fragmení Sánchez Aparicio el nl, Ac~iva,ed a4$I Recognizes rhe ROn Fibronectin Site 275 loo EJ-eo u a, o , a, o a— 80 60 40 20 Figure & ¡hect of ami-Fn axtibodies ox 782/16-treated Ramos celí aditesion Lo ¡he 80-lcD fi-agment. Tba isidicated dílutíons of N-295 (antí-ROD), ¡‘311)4 (anti-Hep 11), or N-296 (anti-Fih 11 site, control> wei-e added Lo SO-kb fragment coated wells (38¡¿g/inl) axd ix- cubated far 30 mix at rooni temperatura. Celis previously incubated with ¡Mb 782/16(15 mix at 370C) were addad sd attachment was quantitated as described. Wlues are exprassed u percentage rela- tive La tite number of celIa ox control wells not previausly identified as mu «4/31 ligad. ¡si fact, ¡he SO-kb fragmeut is a t’eIl described ligad br ¡he «5(31 integrin sud we tuveextensiveiy documentad ¡bat te consti- tutiva function of «AI en leukocytes is ¡«3D independant (12, 15, 16, 52). ¡be activatad form of «4/31 described itere siaL osily bisida CS-1 asid Hep II widi higb avidity, bt¡t also racognaes ROO. AlLhough in general a single intagrin binds several ligands, a4$1 can bisid multiple asid appurextly quite disdnct se- quencas witisi te sama or d¡fferent molecules. Within En tite minimal sequences showx La be «4/31 ¡igands are LDV (contaisied in CS-1 [26, 531), RBDV (contaisiad in CS-5 [34]),asid IDAPS (contained ix Hl [35]). It has been pro- pasad thai iba common aspartate residue on tese sequences is isiiportaxt for «4j31 recogixition (35). While tía siiay be Lrue, it is clear diaL adiar sequences may alsa be specific «4(31 ligasids. mere is indirect evidenca tat te FNC/H 11 (YIKPOSPPREVVPRPRPOV) asid FNC/H 11 (KNHQKS- EPLIGRKKT) papLides derived fi-am te Hep II En domain (31) may also intaract wit «4/31 (21). Ah tese sequexces (CSI, CSS, HI, FNC/H 1, and FNC/H II) are lacatad ix clase praximity witbix te type 111-14 repeat asid te cositiguous IIICS rogion of En (sea Fig. 1). Resides Fn, «4/31 is alsa te receptor for VCAM-1 (9), ¡be bacterial pi-aLem invasin (10), and dirambaspondin (55). Altbaugit tite ca11-bindisig site(s) far sorne of tese prateins itas not baen idextified, it seems clear taL te intaraction of«4/31 with VCAM-1 daca not ix- valva ¡be LDV motif present ox ¡bis pi-aLem (37, 51). The presesit resulta sitaw ¡bat te conformatiaxal citange induced in cr4fil trougit tite /31 subunit ahlows recognition of te En ROb sequonce which is lacated ix repeat 111-10 and ¡bus distaxt fi-orn ¡be previously described «4131 ligands. In- terestingly, Raivuxen eL al. (24, 25), using a phage display librai-y, bave recesitly identified several cyclic syxtetic pep- tides which bisid te «5/31 integrin axd da not coxtain te RGD motif. One of titase peptides cori-espands Lo te se- quence STSDVOO witich is hamalogaus Lo te TVSDVPR saquence presení in repeat 11140 of En. As noticed in ¡bat repofl, dicte is algo sama degree of hamnology witb EILDVPST, a sequence present ix CS-l witich we axd otiters itave shawsi Lo be a high afflxity ligand for «4/31(16, 18, 33, 52). Altough tese au¡bors did not shaw di-ecL interaction of «5/31 with eiter of te twa hamologaus sequences pres- ant ix Ex, tau- woi-k suggests ¡bat «5(31 itas te patential to recognize otli& uganda ix En besides Rol). Our presetu resulta are ix agi-eemant wit a cerlain degíce ofaverlapping in ligasid racognitian by thc «4/31 and «5/31 integrisis. This is alsa supported l’y anotar repon titat sitows tat a syxtetic cyclic peptide, distinct fi-orn RGD, can irihil’it te function of «4/31 asid «5/31 isitegrins (36). While peptide cyclation may provide an optimal ligand conformatian for itigh aflinity ixteracíions wich cititer «4(31 or «5¡31, it is clear fi-orn nuz- pi-esent study ¡bat mAb TS2/16 does not induce «5131 bind- ixg Lo Lite CS-1 sequence of Fn. Titerefore te ability to recognize new Uganda upan confonnatioxal activation mav be intrinsic Lo Lite «4131 structure. The presesit repon titerefare describes a novel role for «4/31 as a recaptoi- far tite RGD site ix Fn. Hecause «501 Sánchez-Aparicio et al. Acá va~ed a4aI Recognizes ,he RGD Fíbronec,in Site 277 study ¡lic contribution of «4(31 Lo cali adhesion Lo dio 80-kb Fn fragmant whesi bat integrisis are expressed together. Ix exparirnonta siaL showsi, WC tested whether anti-«4 mAbs cauid partially isihibit te bindisig of T32/16-traated 13937 celís ta tite 80-kb fragmesit. Hawever. becausa mAl’ ‘¡‘82/16 also effectivaiy upi-agulates te aditasion mediata! ¡y «5/3 ¡ (1. 2. asid ¡bis study), wecauid mt datect any inhibition wi¡b mAbs asiti-a4. It is possibla diaL whesi a5¡31 and «4(31 are presant ¡agotar, «5(31 fusiction predominates ovar «4(31 fusiction in mediating adhasian Lo Fn. lii suppon of ¡lila, te 80-kb fragmesit ar te OROD sysitetic paptide compiataly isihibit U937 ccli aditasion Lo Fn whila tite 38-kD fragmesit or te CS-1 paptida produce pardal or no inhibitian (12). Titase resulta da siaL rule aut a coaparatian of bat receptora for an efficiosit attachmext La Fn as Wc itave praviously pro- posad far T lymphaid calla (15). Tite resulta reponed bara are obviously importasit far calis which expresa «4(31 as te majar surface isitegrin. Theseincludo B calís (16, 47), soma B cali progasiltara (43). asid pzababiy soma tumor celís. Fui-- ¡herniare, ¡hero are raparta sitowisig differont interactiasis wiÉh Fn duríng pra-B ccli devalapmesit (3, 50). Qn celis diaL oxpress «5(31 basides «4(31, proporly activated «4/31 may serve La coaperato with «5(31 or Lo functianally raplaca it whesi «5(3118 already angaged. It la siaw wail documentad ¡bat isitagrisis usidergo trasisí- dosis among differesit atatas of activation (20) asid ¡bat tese trasisitiosis aro isiduced ¡y savaral agonts includisig soma mAbs as shawn in te present rapan. Tite fact diaL te van- aus integrin activatian fbi-ms are alsa Ibusid ix vivo, as clearly shown fbi- «4(31 for exampio (28), suggests ¡bat ac- tiwting asid-fil mAba (132/16 asid aten) aro mimickisig te effect of physiological ligasida nat yet idesitified. Qn Lite atar hasid, te multiplicity of saquesicas recagnized ¡y ¿>4/31 muat haya physiological ralavanca. Far axample. it may serve Lo drive synorgistic interactiasis witli te receptor rasultisig in high affinity bisiding. Such sysiergy has aiready bean shawn tbr «5(31 interaction with te ROl) sequonce in Fn (56). Sirnilarly, activation of te platolot isitegrin «LIb(33 wit trombin mesuits in recognition of sin additianal Psi region (bosides ROl)) comprising pan of hamaiagy rapeata 111-9 asid 111-10 (4, sea Hg. 1). A¡ interestisig posaibility is taL sorne of te sequosices diaL intaraet wit «4/31 may regulate «4(31 bindisig to atar Uganda, as already shown for «Ilb(33 (7). Tito «4(31 uganda described so fsm, includiixg te ROD sito identified in ¡bis repon, apparentiy bisid Lo identical or averlapping sites on «4(31 becausa ¡bey are crass-inhibitory. Hawover, it seema poasibla taL odiar siaL yet identifled higanda bisid «4(31 wit law affisiity or at a different site, asid upregulate radiar tan irtibit te fusiction of «4/31. In sup- pon of ¡bis is te fact taL twa Fn sequesices ahawn Lo interact wit «4(31, FNC/H 1, asid FNC/H II, da siaL (or shightly) in- terfare wit «4/31 adhesiva functian (21, 31). Tite pitaga dis- piay library appwach usad for idasitification of ligands far «5(31(24, 25) may be a useful asia Lo idesitify new patantial uganda for «4/31. Titis would alsa open ¡be possibility of using diese madulatary sequencas far torapeutic purpases. Mareaver, bocause te avidity of «4(31 fo CS-1, Hep II, and ROl) is diffetext, bindisig Lo esch of tese sites may haya differant cellular casisequesices. Anotar implication of te prasasit study is taL physialogically stimulated «4/31 may play aix impanasit role for te recruitmesit of lympitocytes aL ing CS-í, Hap II, or/axd ROl) are produced.While diese pasaibilities require fui-ter study, ou¡- resulta highhigitt te rolo of«4(31 as a flexible receptorabla Lo recagnize niultiple liganda asid suppart te impartanca of te extraceilular ma- trix, panicularly Fn, ox lymphocyte develapmant and fusiction. We lhank Dre. C. Bernabeu, D. Cheresh. M. Hender, E. Sánchez-Madrid 1. Teixidó, asid E. A. Wayner, for praviding celia asid mAbs; Ana Outi¿z-- Tez faz- exoellext technical asaistance; asid Pedro Lastres faz- perfarming anuary 1994 asid in revised ¡orn, 25 March 1994. References 1. Arroyo. AG.,?. Sánchez-Mateas, M. It. Cwnpnero, 1. Manin-E’adura, E. Dejan., axd E. Sanchez-Madrid. 1992. Itegulation of the VLA ixtegrin-ligand inreraction Éhrough . E. Valinsky. asad C. 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REGULACIÓN Y FUNCIÓN DE LA INTEGRINA a AGRADECIMIENTOS ÍNDICE ABREVIATURAS 1.- INTRODUCCIÓN 1.1.- La matriz extracelular: composición y función en adhesión celular 1.2. - Estructura y función de la fibronectina (Fa) 1.3. - Moléculas de adhesión de superficie celular 1.4.- Familia de las integrinas 1.5.- Integrina alfa4beta1 1.6.- Regulación funcional de las integrinas 1.7.- Transmisión de señales a través de las integrinas 2.- OBJETIVOS 3.- MATERIALES Y MÉTODOS 3.1.- Proteínas de matriz extracelular 3.2.- Anticuerpos 3.3.- Células y cultivos celulares 3.4.- Ensayos de adhesión celular 3.5.- Ensayos de ELISA y Western Blot 3.6.- Estudios de inmunofluorescencia 3.7.- Inmunoprecipitación y electrofóresis 3.8.- Reactivos 4.- RESULTADOS 4.1.- Análisis de los fragmentos de fibronectina 4.2.- Estudio de la interacción de leucocitos con la región carboxilo-terminal de Fa; estudio de nuevos sitios adherentes, s 4.3.- Estudio de la interacción de leucocitos humanos con la región central de Fa. Análisis de nuevos ligandos de baja afinid 4.4.- Estudio de las implicaciones celulares en leucocitos subsiguientes a la interacción alfa4beta1-Fn 5.- DISCUSIÓN 6.- CONCLUSIONES 7.- BIBLIOGRAFÍA 8.- ANEXO: Publicaciones