UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II CICLO CELULAR Y ENFERMEDAD DE ALZHEIMER: ESTUDIOS EN CÉLULAS EXTRANEURONALES DE PACIENTES Y EN MODELOS MURINOS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Noemí Esteras Gallego Bajo la dirección de la doctora Ángeles Martín Requero Madrid, 2013 ©Noemí Esteras Gallego, 2012 UNIVERSIDAD  COMPLUTENSE  DE  MADRID   FACULTAD  DE  FARMACIA   Departamento  de  Bioquímica  y  Biología  Molecular  II                     CICLO  CELULAR  Y  ENFERMEDAD  DE  ALZHEIMER.   ESTUDIOS  EN  CÉLULAS  EXTRANEURALES  DE   PACIENTES  Y  EN  MODELOS  MURINOS.       MEMORIA  PARA  OPTAR  AL  GRADO  DE  DOCTOR   PRESENTADA  POR       Noemí  Esteras  Gallego       Bajo  la  dirección  de  la  doctora   Ángeles  Martín  Requero     Madrid,  2012     UNIVERSIDAD  COMPLUTENSE  DE  MADRID   FACULTAD  DE  FARMACIA   Departamento  de  Bioquímica  y  Biología  Molecular  II             CICLO  CELULAR  Y  ENFERMEDAD  DE  ALZHEIMER.   ESTUDIOS  EN  CÉLULAS  EXTRANEURALES  DE   PACIENTES  Y  EN  MODELOS  MURINOS.       Memoria  para  optar  al  grado  de  Doctor  presentada  por     NOEMÍ  ESTERAS  GALLEGO     Realizada  en  el  Centro  de  Investigaciones  Biológicas  (CSIC)  bajo  la   dirección  de  la  Doctora  Ángeles  Martín  Requero.           Madrid,  2012     VºBº  DIRECTORA  DE  TESIS        VºBº  INTERESADA         Dra.  Ángeles  Martín  Requero                          Noemí  Esteras  Gallego               Dª. ÁNGELES MARTÍN REQUERO, Investigadora Científica en el Centro de Investigaciones Biológicas, del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, CERTIFICA Que Dª NOEMÍ ESTERAS GALLEGO, licenciada en Farmacia por la Universidad Complutense de Madrid, ha realizado bajo mi dirección el proyecto correspondiente a su Tesis “Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células extraneurales de pacientes y en modelos murinos”, y que reúne los requisitos necesarios para su presentación como Tesis Doctoral en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II de la Universidad Complutense de Madrid. LA DIRECTORA, Fdo: Dª Ángeles Martín Requero     La   presente   tesis   se   presenta   en   Formato   Publicaciones,   como   una   colección   de   cinco   artículos,   cuatro   de   ellos   ya   publicados   en   revistas   internacionales   y   el   último   enviado   y   pendiente  de  publicación.             El   trabajo   aquí   presentado   ha   sido     realizado   con   cargo   a   los   proyectos   de   Investigación   siguientes:     SAF2007-­‐62405  Dirección  General  de  Investigación  Científica  y  Técnica.  Plan  Nacional   (2007-­‐2010).   “Interacciones   entre   Ca2+/Calmodulina   y   las   rutas   de   supervivencia/muerte   en   células  extraneurales  de    pacientes  de  Alzheimer  y  otras  demencias”       Fundación  Eugenio  Rodríguez  Pascual  (2009-­‐2010):  “Control  de  la  proliferación  celular   y   apoptosis   en   la   enfermedad   de   Alzheimer.   Estudios   en   células   extraneurales   y   ratones   transgénicos  APP/PS1”.         Y  gracias  a  la  beca  predoctoral:       JAEPRE2008  del  Programa  “Junta  de  Ampliación  de  Estudios”  del  CSIC.         A mi madre A veces podemos pasarnos años sin vivir en absoluto, y, de pronto, toda nuestra vida se concentra en un solo instante. Oscar Wilde Descubrí el secreto del mar meditando sobre una gota de rocío. Antonio Machado Agradecimientos Casi cinco años después de mi llegada al laboratorio finaliza una etapa, difícil en algunos aspectos, pero inmejorable en otros. A lo largo del camino me he encontrado con muchas personas a las que, por di- versas razones, me gustaría expresar mi gratitud. En primer lugar, quiero dar las gracias a la Dra. Ángeles Martín Requero, por haber confiado en mí y haberme dado la oportunidad de trabajar en su laboratorio. Por su generosidad, su cercanía, sus ense- ñanzas y su gran labor como directora de tesis. Muchas gracias por todo, Ángeles. A Úrsula, Fernando y Carol, porque además de haber sido tres compañeros maravillosos, son tres amigos y tres grandes personas. Úrsula, mi maestra y mi apoyo en aquellos primeros pasos en el laborato- rio. Fernando, nuestro chico para todo, siempre dispuesto para echar una mano en cualquier circunstancia. Carol, con quien he compartido tantas horas, tantas conversaciones, tantos pensamientos. Por todos los momentos inolvidables que he pasado junto a vosotros, gracias de corazón. Siempre os echaré de menos. Al Dr. Roberto Parrilla, la Dra. Matilde Sánchez Ayuso y la Dra. Consuelo González Manchón, por compartir su experiencia profesional a lo largo de estos años. A Tomás, por todo lo que me enseñó sobre el manejo de los ratones, al resto de las personas que han formado parte del grupo de trabajo a lo largo de estos años y también a los que han pasado de manera más fugaz por nuestro laboratorio, gracias por todo lo que ha aportado cada uno de ellos. Muy en especial a Miguel y a Asier, porque se han hecho querer y les tengo un cariño enorme. Quiero mostrar mi gratitud a todos los grupos con los que hemos colaborado. Al Dr. Sebastián Cer- dán, del Instituto de Investigaciones Biomédicas, por su inestimable ayuda en los trabajos de Resonancia. Un agradecimiento que se hace extensivo a todo el SIERMAC y especialmente a Teresa Navarro, por su pa- ciencia y sus valiosas recomendaciones en el análisis de los datos. A Laura Barrios, por su asesoramiento y por hacernos tan fácil la estadística. A la Dra. Eva Carro y a Desirée Antequera, del Hospital Doce de Octu- bre, por su colaboración, su ayuda y su interés en los trabajos con los ratones. Gracias a toda la gente que nos ha prestado su ayuda en algún momento. A los servicios técnicos del CIB, en especial a los de proteómica, confocal y citometría por la labor tan importante que hacen. Y en el sentido más artístico, gracias a Javier de Biomédicas por sus ilustraciones, y a Isabel, por su gran trabajo en la maquetación de esta tesis. Me gustaría igualmente expresar mi agradecimiento al Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid; a la Dra. Carmen de Juan Agradecimientos Noemí Esteras Gallego 13 por su interés y por aceptar la tutela de mi tesis y a la Dra. Pilar Iniesta por su gran ayuda con los trámites. En este Departamento fue donde empecé a tomar contacto con el mundo de la ciencia y por ello quiero agradecer también a Antonio, Cristina y Paloma todo lo que me enseñaron en aquella época. No me puedo olvidar del Departamento de Neurología del Weill Cornell Medical College de Nueva York, donde realicé mi estancia predoctoral, por lo bien que me trataron y por todo lo que aprendí allí. Gra- cias al Dr. Gunnar Gouras, por aceptarme en su laboratorio y a Davide, Fangmin y muy especialmente a Esti, por ponérmelo tan fácil y ser un apoyo tan importante en mi tiempo en Nueva York, mil gracias. El CIB ha sido mi casa, no podría haber elegido mejor lugar para hacer la tesis. Aquí he conocido a gente estupenda y he pasado, probablemente, los mejores años de mi vida en muchos sentidos. Las fies- tas de primavera, las casas rurales, las tardes de Lecumberri. Trabajar en un ambiente tan agradable ayuda, y mucho. Además de los que ya he nombrado, gracias a Lu, Eva, Ana Cris, Rubén, Maripaz, Carlos, Kike, Rodri, Virginia, Amaia... por tantos buenos momentos. Gracias en lo laboral y en lo personal. Gracias a mis amigas. A las farmacéuticas, por ser mi apoyo en Madrid, por el interés que muestran siempre y por su amistad. A Rocío, Clara, Miriam, Chirin, Patri, Cris y en especial a Irene y Piedad, por cada una de las conversaciones y confidencias a lo largo de estos años. Gracias por estar siempre tan cerca. Lo mismo puedo decir de mis sorianas. Patri, Rebe, Ana, Vane, que han estado siempre ahí desde hace muchos años. Por preguntarme, por apoyarme, por estar a mi lado. Tengo mucha suerte de estar rodeada de per- sonas como ellas. A toda mi familia, porque es lo mejor que tengo. A mi tía, porque le hubiese encantado estar aquí para verlo. A mi tío Felipe, mi hermano Iván y a mis padres, porque les quiero y porque sé cuánto me quie- ren. Porque gracias a su sacrificio he podido llegar aquí. Gracias por la confianza en mí y por todos los es- fuerzos durante tantos años. Y más que gracias a Mikel. Porque sin él no hubiera sido lo mismo. Porque es quien ha dado sentido a todo. Por ser tan bueno, tan generoso, tan amable, por sacarme una sonrisa en todos los momentos. Por alegrarme tantos días grises. Por todo lo que he aprendido de él. Por escucharme, por comprenderme, por estar siempre a mi lado. Por ser mi otra mitad. Gracias CIB por ponernos en el mismo camino. Agradecimientos 14 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Abreviaturas Aβ - β-amiloide Ach - Acetilcolina AchEI - Inhibidores de acetilcolinesterasa (AcetylcholinEsterase Inhibitors) ADC - Coeficiente de difusión aparente (Apparent Diffussion Coeficient) ADN - Ácido desoxirribonucleico AICD - Dominio Citoplasmático de la Proteína Precursora de Amiloide (Amyloid Precursor Protein Cytoplas- mic Domain) AINEs - AntiInflamatorios No Esteroideos APP - Proteína precursora de amiloide (Amyloid Precursor Protein) ATP - Adenosín trifosfato ARN - Ácido ribonucleico BACE 1 - Enzima de procesamiento de APP en el sitio β, β-secretasa (Beta-site APP Cleaving Enzyme 1) BDNF - Factor neurotrófico derivado del cerebro (Brain-Derived Neurotrophic Factor) BrdU - 5’-bromo-2’-deoxiuridina 11C-PiB - Compuesto B de Pittsburgh unido a carbono 11 (11C-labelled Pittsburgh compound B) CaM - Calmodulina CaMBP - Proteína de unión a CaM (CaM-Binding Protein) CaMKII - Ca 2+/Calmodulina proteína quinasa II (Calcium/calmodulin dependent protein Kinase II) CAT - ColinAcetilTransferasa Cdk - Quinasa dependiente de ciclina (Cyclin-dependent Kinase) Cdk5rap1 - (CDK5 Regulatory subunit-Associated Protein 1) Cdkn1a - Inhibidor de Cdk 1a o p21 (CDK inhibitor 1a) Cdkn2a - Inhibidor de Cdk 2a o p16 (CDK inhibitor 2a) Cip/Kip - Inhibidor de Cdk (Cdk Interacting Protein/Kinase Inhibitory Protein) Cho - Colina (Choline) Abreviaturas Noemí Esteras Gallego 17 CMSP - Células Mononucleares de Sangre Periférica Cr - Creatina CTF - Fragmento C terminal (C-terminal Fragment) DCL - Deterioro Cognitivo Leve DCX - Doblecortina (Doublecortin) DISC - Complejo de señalización inductor de muerte (Death-Inducing Signaling Complex) EA - Enfermedad de Alzheimer EMA - Agencia Europea del Medicamento (European Medicines Agency) ERK - Quinasa regulada por señales extracelulares (Extracellular-signal Regulated Kinase) FBS - Suero fetal bovino (Fetal Bovine Serum) FDA - Administración de Medicamentos y Alimentos de EEUU (Food and Drug Administration) FOXO3a - Factor de transcripción de la familia forkhead (Forkhead Box O 3a) FPP - Farnesilpirofosfato GFAP - Proteína Fibrilar Acídica Glial (Glial Fibrillary Acidic Protein) GGPP - Geranilgeranilpirofosfato Gpr132 - Receptor 132 acoplado a proteína G (G Protein-coupled Receptor 132) GSK3β - Glucógeno sintasa quinasa β HMG CoA - 3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A INK4 - Inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina 4 (Inhibitors of Cyclin D-dependent Kinase 4) iPSC - Célula madre con pluripotencialidad inducida (Induced Pluripotent Stem Cell) MAPK - Proteína quinasa activada por mitógeno (Mitogen-Activated Protein Kinase) MDM2 - Murine-Double Minute 2 mI - Mioinositol MMSE - Mini examen del estado mental (Mini-Mental State Examination) Abreviaturas 18 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer MRI - Imagen de Resonancia Magnética (Magnetic Resonance Imaging) MRS - Espectroscopía de Resonancia Magnética (Magnetic Resonance Spectroscopy) MT - Transferencia de magnetización (Magnetization Transfer) NAA - N-Acetilaspartato Nek2 - NIMA (Never In Mitosis gene A)-related Expressed Kinase 2 NGF - Factor de crecimiento nervioso (Nerve Growth Factor) NINCDS-ADRDA - Instituto Nacional para los Desórdenes Neurológicos, Comunicativos y Accidente Cere- bro Vascular - Asociación para la Enfermedad de Alzheimer y Desórdenes Asociados (National Institute of Neurologic, Communicative Disorders and Stroke - Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association) NMDA - N-Metil D-Aspartato PCNA - Antígeno nuclear de proliferación celular (Proliferating Cell Nuclear Antigen) PDGF - Factor de crecimiento derivado de plaquetas (Platelet-Derived Growth Factor) PET - Tomografía por emisión de positrones (Positron Emission Tomography) PHF - Filamentos Helicoidales Pareados (Paired Helical Filaments) PI3K - Fosfatidilinositol 3-quinasa (Phosphatidylinositol 3-kinase) PPAR - Receptor Activado por Proliferadores de Peroxisomas (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) PS, PSEN - Presenilina qRT-PCR - Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (Quantitative Real Time Poly- merase Chain Reaction) ROS - Especies Reactivas de Oxígeno (Reactive Oxygen Species) SERCA - Calcio ATPasa del retículo sarco/endoplásmico (Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) SNC - Sistema Nervioso Central TGF-β - Factor de crecimiento transformante β (Transforming Growth Factor β) TNF - Factor de necrosis tumoral (Tumor Necrosis Factor) Abreviaturas Noemí Esteras Gallego 19 Contenidos Índice Índice de Contenidos Noemí Esteras Gallego 23 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 31 1. Breve descripción de la enfermedad .................................................................................... 33 2. Patogénesis de la enfermedad............................................................................................. 37 2.1 Placas neuríticas ...................................................................................................... 37 2.1.1 Procesamiento de APP ............................................................................... 38 2.1.2 Funciones de APP ...................................................................................... 40 2.1.3 Formación de las placas de amiloide .......................................................... 40 2.1.4 Tipos de placas de amiloide........................................................................ 40 2.2 Ovillos neurofibrilares ............................................................................................. 41 2.3 Muerte neuronal ..................................................................................................... 43 2.3.1 Mecanismos moleculares de muerte neuronal............................................ 44 2.3.1.1 Apoptosis ...................................................................................... 44 2.3.1.2 Autofagia ...................................................................................... 46 2.4 Pérdida sináptica .................................................................................................... 48 3. Factores de riesgo de la EA .................................................................................................. 51 3.1 Factores genéticos .................................................................................................. 51 3.1.1 Genes asociados con alzhéimer familiar ..................................................... 52 3.1.2 Genes asociados con riesgo en alzhéimer esporádico ................................. 53 3.2 Factores de riesgo no genéticos.............................................................................. 54 4. Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis ...................................................................... 57 4.1 Cascada β-amiloide ................................................................................................ 57 4.2 Tau......................................................................................................................... 59 4.3 Inflamación ............................................................................................................ 60 4.4 Estrés oxidativo ..................................................................................................... 63 4.4.1 Fuentes de estrés oxidativo en la EA .......................................................... 64 4.5 Homeostasis del calcio............................................................................................ 66 4.6 Colesterol ............................................................................................................... 69 4.7 Déficit colinérgico.................................................................................................... 71 4.8 Degradación de proteínas: proteasoma y autofagia ................................................ 72 4.9 Ciclo celular ............................................................................................................. 73 4.9.1 Fases del ciclo celular ................................................................................. 73 4.9.2 Marcadores del ciclo celular en EA ............................................................. 75 4.9.3 Señales mitóticas....................................................................................... 78 5. Diagnóstico......................................................................................................................... 81 5.1 Criterios NINCDS-ADRDA ....................................................................................... 81 5.2 Resonancia magnética ............................................................................................ 81 5.2.1 Resonancia magnética de imagen (MRI)..................................................... 82 5.2.2 Resonancia magnética de espectroscopía (MRS)........................................ 84 5.2.3 MRI y MRS en la EA .................................................................................... 85 5.2.4 Técnicas de neuroimagen funcional ........................................................... 86 5.3 Marcadores en fluidos biológicos ............................................................................ 86 6. Tratamiento y perspectivas terapéuticas ............................................................................. 89 6.1 Tratamientos aprobados en la actualidad ................................................................ 89 6.2 Estrategias terapéuticas en estudio ........................................................................ 90 6.2.1 Estrategias para prevenir la producción de Aβ............................................ 90 6.2.2 Otras estrategias ....................................................................................... 92 7. Modelos de estudio de la enfermedad ................................................................................. 97 7.1 Modelos animales ................................................................................................... 97 Índice de Contenidos 24 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Índice de Contenidos Noemí Esteras Gallego 25 7.2 Tejidos periféricos de pacientes ............................................................................. 100 2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 103 3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 121 1. Modelos celulares y animales ............................................................................................. 111 1.1 Células periféricas de pacientes.............................................................................. 111 1.1.1 Obtención de las líneas linfoblásticas ........................................................ 111 1.1.2 Características, diagnóstico y selección de los pacientes ........................... 112 1.2 Modelo animal de la enfermedad: ratón APP/PS1 .................................................. 113 2. Técnicas de resonancia magnética ..................................................................................... 115 2.1 Resonancia Magnética de Imagen (MRI)................................................................. 117 2.1.1 Obtención de las imágenes ....................................................................... 117 2.1.2 Procesamiento de las imágenes................................................................ 118 2.2 Resonancia Magnética de Espectroscopía (MRS) .................................................. 119 4. RESULTADOS ....................................................................................................... 121 1. Presentación de los resultados........................................................................................... 123 2. Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales...................... 125 3. Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pa- cientes de alzhéimer.......................................................................................................... 137 4. La inactivación de ERK1/2 por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia de lin- focitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer.............................................................. 151 5. Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfo- citos de un modelo transgénico de EA (APP/PS1)............................................................... 175 6. Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectros- copía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1..................... 187 5. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 205 1. Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA........................................................................... 207 1.1 Regulación del contenido de calmodulina en linfocitos inmortalizados de pacien- tes de alzhéimer ................................................................................................... 208 1.2 Interacción de la vía Ca2+/CaM con la ruta PI3K/Akt en el control de la actividad proliferativa de los linfoblastos de EA................................................................... 212 1.3 Interacción de la vía Ca2+/CaM con la ruta de las MAPK para la regulación del con- tenido celular de p21 y el control de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero. 214 2. Estudio simultáneo de las alteraciones del ciclo celular en cerebro y células periféricas del modelo transgénico de EA APP/PS1 ............................................................................ 221 3. Caracterización por técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y de Espectroscopía del ratón APP/PS1............................................................................................................. 227 6. CONCLUSIONES ................................................................................................... 233 7. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 237 ANEXOS............................................................................................................... 269 Índice de Contenidos 26 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figuras y Tablas Índice Índice de Figuras y Tablas Noemí Esteras Gallego 29 I. INTRODUCCIÓN Figura 1. Dibujos originales de Alois Alzheimer..................................................................... 34 Figura 2. Placas neuríticas en el cerebro de un paciente de EA ............................................. 38 Figura 3. Esquema del procesamiento proteolítico de APP................................................... 39 Figura 4. Ovillos neurofibrilares en un paciente de enfermedad de Alzheimer ...................... 42 Figura 5. Oligomerización de tau y formación de ovillos neurofibrilares ............................... 43 Figura 6. Vías intrínseca y extrínseca de activación de caspasas ........................................... 45 Figura 7. Subtipos de autofagia que participan en la degradación de proteínas y compo- nentes citosólicos celulares .................................................................................................. 47 Figura 8. Esquema de las mutaciones en PS1 y APP en alzhéimer......................................... 53 Figura 9. Microglía, amiloide y tau ...................................................................................... 62 Figura 10. Relación entre activación de la microglía y muerte neuronal ................................ 63 Figura 11. Interrelación entre ROS y distintos mecanismos patogénicos implicados en la EA .... 66 Figura 12. Regulación de la homeostasis del calcio intracelular............................................. 67 Figura 13. Esquema de la síntesis de novo del colesterol en la ruta del mevalonato............... 70 Figura 14. Esquema de la síntesis y degradación de acetilcolina en las neuronas .................. 71 Figura 15. Esquema representativo de la progresión y la regulación del ciclo celular en eu- cariotas................................................................................................................ 74 Figura 16. Marcadores del ciclo celular en el cerebro de pacientes de EA.............................. 76 Figura 17. Alteraciones del ciclo celular en EA ...................................................................... 78 Figura 18. Esquema de la obtención de una señal de resonancia magnética......................... 82 Figura 19. Ejemplo de imágenes de resonancia magnética pesadas en T1 y T2 ..................... 84 Figura 20. Ejemplo de un espectro obtenido por MRS .......................................................... 85 Tabla 1. Diferentes modelos de ratones transgénicos empleados en el estudio de la EA....... 99 3. MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 2. Características demográficas de los sujetos implicados en la generación del pri- mer grupo de líneas celulares................................................................................. 113 Tabla 3. Características demográficas de todos los sujetos implicados en la generación del segundo grupo de líneas celulares. ................................................................... 113 Figura 21. Escáner de Resonancia Magnética ..................................................................... 116 Figura 22. Superposición de la imagen anatómica del atlas sobre la imagen pesada en T2.. 118 Figura 23. Ejemplos de mapas de ADC y MT en un ratón control ........................................ 119 5. DISCUSIÓN Figura 24. Esquema de las rutas implicadas en la mayor proliferación y supervivencia de los linfoblastos de EA ........................................................................................ 209 Figura 25. Esquema del papel de CaMKII/ERK1/2/FOXO3a en la regulación de los niveles de p21 y la supervivencia de linfocitos inmortalizados de pacientes de EA ......... 219 Índice de Figuras y Tablas 30 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Introducción 1 La demencia es un síndrome clínico que se caracteriza por un deterioro progresivo de las funciones cerebrales superiores como son la me- moria, el lenguaje, la orientación, el cálculo o la percepción espacial y que conlleva una pérdida de autonomía del enfermo, que se vuelve cada vez más dependiente a medida que avanza la enfer- medad. Aunque la demencia era conocida desde la antigüedad, no fue hasta 1906 cuando el médico alemán Alois Alzheimer sentó las bases biológicas de la enfermedad que ahora lleva su nombre y que constituye la principal causa de demencia a nivel mundial. Su paciente, Auguste D., de 51 años, pre- sentaba un cuadro clínico caracterizado por pér- dida progresiva de memoria, desorientación en el tiempo y el espacio, paranoia y trastornos en la conducta y el lenguaje. Tras su muerte, Alzheimer examinó su cerebro mediante tinción de plata y describió lo que a día de hoy suponen las dos prin- cipales características neuropatológicas de la en- fermedad: “depósitos de una sustancia peculiar en el córtex” (ahora conocidos como placas neuríti- cas o seniles) y “cambios peculiares en las neurofi- bras” (denominados en la actualidad ovillos neurofibrilares) (figura 1). Más de un siglo después, cuando la espe- ranza de vida al nacer ha aumentado de manera considerable, la enfermedad de Alzheimer (EA) se ha convertido en la principal causa de demencia en todo el mundo en personas mayores de 65 años. 1Breve descripción de la enfermedad de Alzheimer Noemí Esteras Gallego 33 Aunque los datos son difíciles de cuantificar, de- bido a la falta de estudios rigurosos en algunas re- giones, el estudio Delphi (Ferri y cols., 2005) estimaba que en 2001 el número de personas con demencia en todo el mundo llegaba a los 24 millo- nes, con una previsión de que ese número se doble cada 20 años, llegando a alcanzar los 80 millones de personas en 2040. Aunque en la actualidad la mayoría de los casos de demencia se describen en países desarrollados, se estima que en unos años el porcentaje de enfermos en países en desarrollo será 4 veces mayor que en países desarrollados. Además, la EA, por sus características, constituye un problema familiar, social y econó- mico de primera magnitud. A medida que pro- gresa la enfermedad, el enfermo se vuelve cada vez más dependiente y necesita de mayores cui- dados. En la mayoría de los casos, sobre todo en la sociedad española y en las latinas en general, los responsables del cuidado del paciente son los fa- miliares. A medida que la enfermedad progresa en el paciente, la presión sobre el cuidador se incre- menta. Debido a esta situación, los cuidadores también muestran un aumento en la frecuencia de enfermedades psicológicas y físicas (ansiedad, de- presión, aislamiento social, síntomas somáticos) y una importante reducción de su calidad de vida, li- gada invariablemente a la del paciente. En cuanto a los costes económicos aso- ciados a la EA, se pueden distinguir dos tipos: di- Breve descripción de la enfermedad de Alzheimer1 34 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 1. Dibujos originales de Alois Alzheimer. En primer lugar están representados los ovillos neurofibrilares y debajo las placas neuríticas. rectos e indirectos. Los directos son gastos cuan- tificables que derivan del cuidado del paciente y que engloban el gasto sanitario, los fármacos, la atención médica, la institucionalización, etc., y su- ponen alrededor del 20% del coste total. Por otro lado, los gastos indirectos o sociales, son difícil- mente cuantificables (tiempo dedicado al cuidado del paciente por parte del entorno, pérdida de pro- ductividad de sus cuidadores, etc.) y representan alrededor del 80% del total. Estos gastos indirec- tos son asumidos principalmente por las familias. En las fases finales, se produce un aumento en los costes directos que responde principalmente a la institucionalización del paciente. Un estudio re- ciente (Coduras y cols., 2010) calcula que el coste medio derivado del cuidado de una persona que sufre EA supone en España alrededor de 1400 euros mensuales, asumidos en un 88% por la pro- pia familia. El 12% restante corresponde a gastos directos que son asumidos por los fondos públicos. 1Breve descripción de la enfermedad de Alzheimer Noemí Esteras Gallego 35 Uno de los aspectos que merece la pena resaltar sobre la descripción que hizo Alzheimer de la enfermedad en 1906, fue el hecho de que reali- zase un estudio neuropatológico del cerebro y que propusiera que el comportamiento de la paciente era consecuencia de un depósito anormal en su ce- rebro, convirtiéndose así en un pionero en ligar es- tructura del cerebro y función. En la actualidad se reconocen dos principales características neuro- patológicas de la EA: las placas neuríticas y los ovi- llos neurofibrilares. Ambas han sido consideradas hasta ahora el “estándar de oro”, es decir, sola- mente la confirmación post-mortem de su pre- sencia en el cerebro del paciente, permite hacer un diagnóstico definitivo de la enfermedad. Otras ca- racterísticas bien definidas son la muerte neuronal y las alteraciones sinápticas. 2.1 Placas neuríticas Las placas neuríticas o seniles son depó- sitos proteicos extracelulares, de morfología más o menos esférica y con un tamaño de entre 10 y 200 µm de diámetro (figura 2). Durante la década de los ochenta tuvieron lugar dos importantes avances en el estudio de la EA. En primer lugar, la secuenciación del principal componente de las pla- cas, un péptido de 4,2 KDa, formado por entre 40 y 42 aminoácidos: el péptido β-amiloide (Aβ, Amy- loid β) (Glenner y Wong, 1984). Se postulaba que este péptido provenía del procesamiento de un 2Patogénesis de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 37 precursor de mayor tamaño, y en efecto, tres años más tarde, se clonó un receptor de superficie cuyo procesamiento aberrante parecía ser el responsa- ble de los depósitos de amiloide en el cerebro: la proteína precursora de amiloide (APP, Amyloid Precursor Protein) (Kang y cols., 1987) . El gen APP se localiza en el cromosoma 21 y da lugar a numerosas isoformas por splicing al- ternativo y modificaciones post-transcripcionales, siendo las más comunes la de 695 aminoácidos (que se expresa principalmente en el sistema ner- vioso) y las de 751 y 770, que se expresan de forma ubicua (Bayer y cols., 1999). La secuencia de APP ha sido altamente conservada durante la evolución en mamíferos, y la proteína pertenece a una fami- lia que incluye APLP1 y APLP2 (Amyloid Precursor- Like Proteins) en mamíferos y APPL en Drosophila (Amyloid Precursor Protein-Like) (O’Brien y Wong, 2011). Todas ellas son proteínas transmembrana con amplios dominios extracelulares y se procesan del mismo modo, pero sin embargo, sólo APP ge- nera el fragmento amiloidogénico. 2.1.1 Procesamiento de APP Existen diferentes rutas para el procesa- miento de APP, que pueden dar lugar o no a la for- mación del péptido Aβ, como se puede observar en la figura 3. La vía no amiloidogénica, la que no ge- nera Aβ, comienza con la acción de una α-secre- tasa, que realiza un corte en el dominio extracelular, a nivel del aminoácido 687, liberando el extremo extracelular soluble, sAPPα. A conti- nuación, el fragmento C-terminal α restante (CTF- α, Carboxyl-Terminal Fragment α) de 83 aminoácidos es procesado por una γ-secretasa que libera un pequeño fragmento extracelular (P3) y otro intracelular (AICD, Amyloid Precursor Protein Cytoplasmic/C-terminal Domain). Por su parte, la vía amiloidogénica, co- mienza con la acción de una β-secretasa, que rea- liza el primer corte a nivel del aminoácido 671, generando un fragmento extracelular soluble, sAPPβ y un fragmento C-terminal de 99 aminoá- cidos. A continuación, el fragmento CTF-β es pro- cesado por la γ-secretasa dando lugar a un fragmento extracelular, el β-amiloide, y a un frag- mento C-terminal intracelular, AICD, idéntico al Patogénesis de la enfermedad2 38 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 2. Placas neuríticas en el cerebro de un paciente de EA. La figura muestra la presencia de las placas en la corteza temporal de un paciente de enfermedad de Alzheimer. Inmunohistoquímica contra β-amiloide (4G8). Tomado de (Perl, 2010). generado por la vía no-amiloidogénica. La γ-se- cretasa corta APP en múltiples sitios en un proceso secuencial para generar péptidos de Aβ de dife- rente longitud. La mayoría son de 40 ó 42 amino- ácidos, pero el tamaño puede variar entre 38 y 43. El péptido de 40 aminoácidos es el más común, pero el de 42 es el más hidrofóbico y probable- mente el que favorece la oligomerización, la for- mación de fibras y finalmente de placas (Iwatsubo y cols., 1994). Las secretasas que forman parte de estas rutas de procesamiento han sido objeto de una ex- haustiva caracterización. Actualmente se atribuye 2Patogénesis de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 39 Figura 3. Esquema del procesamiento proteolitico de APP. El procesamiento a través de la β y la γ secretasas genera el fragmento Aβ amiloidogénico, mientras que la α y la γ secretasas dan lugar a una vía no amiloidogénica. Modificado de (Cole y Vassar, 2006). la actividad α-secretasa a la familia de metalopro- teasas ADAM (A Disintegrin And Metalloprotei- nase), siendo ADAM10 la que parece regular el proceso (Hooper y Turner, 2002). El procesamiento por la α-secretasa es además de un gran interés desde el punto de vista terapéutico. La activación preferente de esta ruta evitaría la producción de Aβ, ya que el corte por α-secretasa se produce dentro de su secuencia. La actividad β-secretasa, por su parte, es llevada a cabo por la proteasa transmembrana BACE1 (Beta-site APP Cleaving Enzyme 1) (Cai y cols., 2001). Se considera que la acción de BACE1 es el paso limitante para la producción de Aβ, con lo que el estudio de posibles inhibidores de su fun- ción parece prometedor como estrategia terapéu- tica. Sin embargo, entre otras dificultades de tipo estérico, se ha demostrado que BACE1 tiene mul- titud de sustratos fisiológicos, de modo que la in- hibición de esta enzima conlleva importantes efectos colaterales que están dificultando los es- tudios (Klaver y cols., 2010). La γ-secretasa es un amplio complejo pro- teasa formado por varias proteínas de membrana distintas: presenilina 1 (PS1), presenilina 2 (PS2), nicastrina, Aph-1 y Pen2, siendo las presenilinas las que poseen la actividad catalítica (De Strooper y cols., 2012). Además, este complejo es esencial para la proteólisis de otros muchos sustratos, entre ellos Notch, que tras el procesamiento por la γ-secretasa libera su dominio intracelular, NICD (Notch Intracellular Domain), una molécula que puede transactivar muchos genes críticos para el desarrollo (Schroeter y cols., 1998). Por este mo- tivo, los ratones knock-out para PS1 no son viables (Shen y cols., 1997). 2.1.2 Funciones de APP La función fisiológica de APP aún no se conoce con exactitud pero numerosos estudios han demostrado que el producto fisiológico del procesamiento de APP, el fragmento soluble sAPPα, está implicado en neuroprotección, plasti- cidad sináptica, crecimiento de las neuritas y si- naptogénesis (Kogel y cols., 2011). A pesar de ello, la deleción de APP en ratones apenas tiene conse- cuencias vitales, por lo tanto, no parece haber evi- dencia de que se produzca una pérdida de función celular de APP en pacientes de alzhéimer, sino que la proteína intervendría en la enfermedad por el incremento en la producción del fragmento Aβ ci- totóxico (Selkoe, 1998). 2.1.3 Formación de las placas de amiloide. Aβ se secreta de manera constitutiva en células normales en cultivo y se detecta como pép- tido circulante en plasma y en el líquido cefalorra- quídeo (Haass y cols., 1992; Seubert y cols., 1992). El modelo propuesto para la formación de las pla- cas de amiloide establece que, en condiciones fi- siológicas, la neurona produce y secreta Aβ en forma de monómeros y trímeros, que una vez en el fluido intersticial se expanden de forma contro- lada. Sin embargo, cuando por alguna razón el monómero se despliega, permite al péptido for- mar dímeros que darán lugar a las protofibrillas y a las placas de amiloide (Larson y Lesne, 2012). 2.1.4 Tipos de placas de amiloide m Depósitos difusos de Aβ Este tipo de depósitos son poco reactivos, de tamaño grande (entre 50-500 µm) y con una es- Patogénesis de la enfermedad2 40 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer tructura poco organizada (Duyckaerts y cols., 2009). Además de en pacientes, este tipo de placas se han encontrado en autopsias de personas que no tenían signos de demencia, a partir de los 40- 50 años (Arai y cols., 1999). En algunos casos, estos depósitos en la mediana edad podrían re- presentar una etapa preclínica de EA, pero no en todos ellos, ya que también se han encontrado pla- cas difusas en muchas personas de edad avanzada sin signos de demencia (Bennett y cols., 2006). Al- gunos estudios indican que en personas sanas, el depósito de Aβ aumenta con la edad y que la fre- cuencia del alelo Apoε4 es mayor que en personas sin los depósitos (Rodrigue y cols., 2012). m Depósitos focales Además de los depósitos difusos, estudios inmunohistoquímicos muestran acúmulos densos y esféricos de Aβ, denominados depósitos focales, que están formados mayoritariamente por el pép- tido Aβ42 (Guntert y cols., 2006). En estos casos, los depósitos están casi siempre acompañados de células de microglía activadas (Arends y cols., 2000). Los depósitos focales pueden estar rodea- dos de una corona neurítica, rodeada a su vez por procesos astrocíticos, constituyendo así las placas maduras, clásicas o neuríticas. El componente neurítico de la corona está formado por neuritas distróficas, principalmente axones, que contienen grandes cantidades de lipofuscina, cuerpos den- sos, mitocondrias, filamentos helicoidales parea- dos formados por tau y en algunos casos ubiqui- tina (Duyckaerts y cols., 2009). Se cree que los depósitos comienzan siendo difusos, después focales, y finalmente se rodean de la corona neurítica para formar las pla- cas neuríticas (Metsaars y cols., 2003). También hay que destacar que los depó- sitos de Aβ no se producen al azar, sino que se dis- tribuyen de manera jerárquica y secuencial en el cerebro. Se ha descrito que comienzan en el neo- córtex y luego se expanden a otras regiones en dis- tintas fases (hipocampo, córtex cingulado y entorrinal, amígdala, tálamo e hipotálamo, gan- glios basales y finalmente cerebelo) (Thal y cols., 2008a). m Depósitos vasculares En más del 80% de los pacientes de EA, y también en personas mayores sanas, la acumula- ción de Aβ también tiene lugar en las paredes de los vasos cerebrales, principalmente arterias, dando lugar a lo que se conoce como angiopatía amiloide cerebral (Thal y cols., 2008b). En casos severos, este tipo depósitos pueden estar asocia- dos con hemorragias intracerebrales 2.2 Ovillos neurofibrilares Los ovillos neurofibrilares, también des- critos por Alzheimer en 1906, son agregados pro- 2Patogénesis de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 41 teicos presentes en el interior de las neuronas, concretamente en el pericarion (citoplasma de la neurona) y en las dendritas proximales. En 1963, la microscopía electrónica permitió observar que los ovillos estaban formados por unas estructuras denominadas filamentos helicoidales pareados (Kidd, 1963). Pero no fue hasta 1986 cuando se describió por primera vez su principal compo- nente: la proteína asociada a los microtúbulos tau, (figura 4) (Grundke-Iqbal y cols., 1986). Tau es una molécula altamente soluble presente en todas las células nucleadas y su prin- cipal función es la estabilización de los microtúbu- los, principalmente en los axones. Tau tiene abundantes sitios potenciales de fosforilación, y el balance fosforilación/defosforilación regula sus funciones fisiológicas (Obulesu y cols., 2011). Las quinasas que pueden fosforilar in vivo esta prote- ína se dividen en dos grupos; por una parte las qui- nasas que fosforilan residuos serina o treonina seguidos de prolina (Ser-Pro o Thr-Pro) y por otro lado las que fosforilan serina o treonina no segui- das de prolina. Dentro del primer grupo encontra- mos la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3β) y la quinasa dependiente de ciclina 5 (Cdk5); y dentro del segundo la proteína quinasa A y la B (PKA y Akt respectivamente), la quinasa dependiente de cal- cio/calmodulina II (CaMKII, Calcium/calmodulin de- pendent protein Kinase II ) o la quinasa reguladora de afinidad de microtúbulos (MARK) (Johnson y Stoothoff, 2004; Mi y Johnson, 2006; Dolan y John- son, 2010). Por otro lado, la principal fosfatasa en- cargada de la defosforilación de tau es la proteína fosfatasa 2A (PP2A). Cuando tau es anormalmente hiperfosfo- rilada, principalmente en los residuos Ser-Pro o Thr-Pro, pierde su actividad biológica, se disocia de los microtúbulos, se hace resistente a la degra- dación, se inducen cambios conformacionales que la hacen insoluble y finalmente polimeriza hasta formar los filamentos helicoidales pareados (PHF, Paired Helical Filaments), que son el principal com- ponente de los ovillos neurofibrilares (Meraz-Rios y cols., 2010; Metcalfe y Figueiredo-Pereira, 2010). Además de la hiperfosforilación, el procesamiento de tau por caspasas o calpaína es otra modifica- ción que juega un papel importante en la forma- Patogénesis de la enfermedad2 42 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 4. Ovillos neurofibrilares en un paciente de en- fermedad de Alzheimer. La inmunohistoquímica muestra los ovillos neurofibrilares (flecha negra) y las placas neurí- ticas (flecha blanca). Tomado de (Binder y cols., 2005). ción de los PHF, ya que el truncamiento de la pro- teína favorece la formación de filamentos, ver fi- gura 5 (Gamblin y cols., 2003). La distribución de los ovillos sigue un pa- trón bien definido, que permitió establecer lo que se conoce como estadíos de Braak, que además se correlacionan con la evolución clínica de la enfer- medad. Los estadíos I y II son etapas preclínicas, aún no existe deterioro cognitivo y los ovillos apa- recen en la corteza entorrinal, la transentorrinal y el hipocampo. En los estadíos III y IV los ovillos aparecen también en el sistema límbico y la enfer- das taupatías, en las que por el contrario no apa- recen placas de amiloide. Ejemplos de taupatías son la parálisis supranuclear progresiva , la de- mencia frontotemporal con parkinsonismo aso- ciada al cromosoma 17, la degeneración corticobasal o la enfermedad de Pick (Robert y Mathuranath, 2007). 2.3 Muerte neuronal Otra característica principal de la enfer- medad es la muerte selectiva de poblaciones neu- 2Patogénesis de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 43 Figura 5. Oligomerización de tau y formación de ovillos neurofibrilares. Aunque en condiciones fisiológicas tau está fos- forilada, la hiperfosforilación o su truncamiento tras el procesamiento por caspasas, facilitan la agregación y aumentan su to- xicidad. Los monómeros patológicos forman oligómeros, que finalmente forman fibras, filamentos helicoidales pareados y ovillos neurofibrilares. Modificado de (Pritchard y cols., 2011). medad se ha hecho patente. Por último, los esta- díos V y VI se correlacionan con la fase más severa de la enfermedad, y los ovillos se observan tam- bién en el neocórtex (Braak y Braak, 1991). La proteína tau no solamente se acumula en la EA. También se observan acúmulos de tau en un grupo heterogéneo de demencias denomina- ronales en el cerebro. Esta alteración neuropato- lógica se caracteriza por la vulnerabilidad de de- terminadas neuronas en áreas concretas del cerebro. En la EA, el neocórtex y el hipocampo son las zonas principalmente afectadas, siendo las neuronas piramidales de la corteza entorrinal y de la región CA1 y el subículo del hipocampo las más vulnerables a la neurodegeneración (revisado en (Morrison y Hof, 1997). La corteza entorrinal recibe información altamente procesada de las áreas de asociación de la corteza (relacionadas con las fun- ciones cognitivas y afectivas) y la transmite al giro dentado del hipocampo a través de la denominada vía perforante, que juega así un papel muy impor- tante en la memoria. La capa II de la corteza ento- rrinal (de donde parte la vía perforante) sufre una extensa muerte neuronal ya en estadios iniciales de la EA, que puede llegar al 90% en EA avanzada (Gomez-Isla y cols., 1996; Price y cols., 2001). De esta manera, la disrupción de la vía perforante puede explicar algunos aspectos de la alteración de la memoria en la EA (Hyman y cols., 1986). Los tipos neuronales afectados en la EA son especial- mente sensibles a la deprivación energética, lo que unido al resto de estímulos estresantes que rodean la enfermedad, puede ser una de las causas de la vulnerabilidad selectiva de estas células (Saxena y Caroni, 2011). La muerte neuronal, junto con los ovillos neurofibrilares, es una característica fisio- patológica que se correlaciona muy bien con el dé- ficit cognitivo (Giannakopoulos y cols., 2003; Donev y cols., 2009). 2.3.1 Mecanismos moleculares de muerte neuronal Los tres principales mecanismos de muerte neuronal son la necrosis, la apoptosis y la autofagia. Mientras que la necrosis es un tipo de muerte aguda y no programada, caracterizada por la lisis celular y la inflamación causada por la libe- ración de los componentes celulares al medio ex- tracelular, la apoptosis y la autofagia son meca- nismos controlados y programados de muerte ce- lular. 2.3.1.1 Apoptosis Numerosas investigaciones apuntan a la apoptosis como el principal mecanismo de muerte neuronal en la EA. Morfológicamente, la apoptosis se caracteriza por la condensación de la cromatina, la disminución del tamaño nuclear, la compacta- ción del citoplasma y la fragmentación del ADN que da lugar a los cuerpos apoptóticos, fragmen- tos nucleares rodeados de membrana que son fi- nalmente fagocitados sin signos de lisis ni inflamación (Saraste y Pulkki, 2000). Bioquímicamente, la apoptosis está aso- ciada a la activación de las caspasas, una familia de proteasas capaces de procesar una gran varie- dad de sustratos para finalmente dar lugar a la muerte celular (Fischer y cols., 2003). La familia de las caspasas está formada en mamíferos por 13 miembros, de los cuales algunos tienen funciones relacionadas con la apoptosis, mientras que otras son caspasas pro-inflamatorias (Martinon y Tschopp, 2007). Dentro de las que tienen función apoptótica, se pueden clasificar en caspasas ini- ciadoras (caspasa-8, -9 y -10) o efectoras (caspa- sas -3, -6 y -7) (Pop y Salvesen, 2009). La activación de las caspasas está altamente regulada, por lo que se sintetizan como precursores en forma de pro-caspasas que necesitan ser activadas. Las cas- pasas iniciadoras se activan por dimerización (Bo- Patogénesis de la enfermedad2 44 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer atright y cols., 2003) y activan a su vez a las caspa- sas efectoras por proteólisis (Boatright y Salvesen, 2003). El proceso apoptótico se puede iniciar por dos vías bien definidas, la extrínseca y la intrínseca. La vía extrínseca está asociada a señales del medio extracelular recibidas a través de los receptores de muerte, mientras que la vía intrínseca actúa en res- puesta a estímulos como daño en el ADN, radia- ción UV o ausencia de suero (Wang y Youle, 2009) y se inicia cuando se producen cambios en la per- meabilidad de la membrana mitocondrial. Ésta se regula por la familia de proteínas Bcl-2, que incluye proteínas pro-apoptóticas (como Bax o Bak) o anti-apoptóticas (como Bcl-2 o Bcl-xL) que pro- mueven o inhiben la liberación de factores pro- apoptóticos al citosol (Shimizu y cols., 1999; Martinou y Youle, 2011). En la figura 6 se puede en- contrar un resumen detallado del proceso apop- tótico. 2Patogénesis de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 45 Figura 6. Vías intrínseca y extrínseca de activación de caspasas. La vía extrínseca (derecha) comienza con la unión de un ligando como FasL o TNF (Tumor Necrosis Factor) a un receptor de muerte, induciendo la formación del complejo DISC (Death- Inducing Signalling Complex), que recluta y activa la caspasa 8 iniciadora (Gonzalvez y Ashkenazi, 2010). La vía intrínseca (iz- quierda) comienza con la permeabilización de la mitocondria y la liberación al citosol de citocromo c, que permite el ensamblaje de Apaf1 (Apoptosis Protease-Activating Factor) y procaspasa 9, dando lugar al complejo activador de caspasas denominado apoptosoma y activando la caspasa 9 iniciadora (Li y cols., 1997; Gogvadze y cols., 2006). Junto con citocromo c, la mitocondria también libera las proteínas proapoptóticas Smac/Diablo, que actúan regulando negativamente la acción de un conjunto de proteínas inhibidoras de la apoptosis (Ekert y Vaux, 2005). La integridad de la membrana mitocondrial está regulada por la familia de proteínas Bcl-2, pero el complejo DISC de la vía extrínseca también puede potenciar la intrín- seca permeabilizando la mitocondria a través de la proteína Bid. Ambas vías finalizan con la activación proteolítica por parte de las caspasas 8 y 9 de las caspasas efectoras 3, 6 y 7. Basado en (Ribe y cols., 2008). Numerosos hallazgos apoyan el papel de la apoptosis en la muerte neuronal en la EA, entre ellos el incremento de caspasas activas en el cere- bro de pacientes, principalmente caspasa 3 (Arai y cols., 1999; Stadelmann y cols., 1999; Su y cols., 2001; Pompl y cols., 2003), caspasa 6 (Guo y cols., 2004; Graham y cols., 2011), caspasa 8 (Rohn y cols., 2001; Pompl y cols., 2003) y caspasa 9 (Rohn y cols., 2002; Pompl y cols., 2003). Además, las caspasas también están im- plicadas en el procesamiento de tau. La hidrólisis de la proteína por caspasas da lugar a una forma truncada capaz de formar agregados y ovillos neu- rofibrilares más rápidamente que la proteína com- pleta (Gamblin y cols., 2003; Rissman y cols., 2004). También APP puede ser sustrato de las cas- pasas y contribuir a la formación de Aβ (Gervais y cols., 1999), y en sentido contrario, el péptido Aβ es capaz de activar caspasas (Li y cols., 1996). Algunos autores han planteado que el proceso de muerte neuronal en alzhéimer no se corresponde con el proceso apoptótico tradicio- nal. La hipótesis se basa en que las células en cul- tivo emplean unas 24 horas en completar el proceso, algo que contrasta con una enfermedad crónica como el alzhéimer, lo que lleva a encontrar en un momento dado pocas neuronas que presen- ten signos morfológicos de apoptosis (Jellinger, 2006). Además, el hecho de que en las neuronas no se encuentren eventos terminales del proceso como condensación de cromatina o cuerpos apop- tóticos, pero sí aparezcan signos tempranos de apoptosis como caspasas iniciadoras o fragmen- tación de ADN (Nunomura y Chiba, 2000), podría sugerir que una vez iniciada, la apoptosis no se completa, sino que se evita o al menos retrasa, un proceso que Raina y cols. denominaron abortosis (Raina y cols., 2001; Raina y cols., 2003). Este sería un mecanismo de supervivencia de las neuronas ante el ambiente pro-apoptótico en el que se en- cuentran, favorecido por la elevada presencia de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 en las neuronas de EA (Zhu y cols., 2004c; Rohn y Head, 2008). 2.3.1.2 Autofagia El proceso de autofagia es un mecanismo por el cual algunas proteínas, agregados proteicos y orgánulos son degradados por la célula en los li- sosomas. Los objetivos son dos: emplear estos sustratos como fuente de energía para la síntesis de nuevas macromoléculas y deshacerse de es- tructuras perjudiciales para la célula (Mizushima y Klionsky, 2007). Existen tres subtipos de autofagia que se detallan en la figura 7: la macroautofagia, la microautofagia y la mediada por chaperonas (Funderburk y cols., 2010). Fisiológicamente, existe un nivel basal de autofagia responsable del correcto recambio de proteínas y orgánulos, que es muy importante Patogénesis de la enfermedad2 46 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer principalmente en células quiescentes como las neuronas, ya que les permite deshacerse de pro- teínas citosólicas aberrantes cuya acumulación po- dría conducir a la muerte neuronal (Hara y cols., 2006). Sin embargo, aunque la autofagia puede actuar como protector contra estímulos agresivos, también puede convertirse en un mecanismo de muerte neuronal en sí mismo. Morfológicamente, la muerte celular por autofagia se caracteriza por la ausencia de condensación de cromatina y la pre- sencia de numerosas vacuolas en el citoplasma (Amelio y cols., 2011). En ese sentido, se ha des- 2Patogénesis de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 47 Figura 7. Subtipos de autofagia que participan en la degradación de proteínas y componentes citosólicos celulares. En la macroautofagia, regiones enteras del citosol englobando orgánulos, agregados proteicos o proteínas mal plegadas entre otros, quedan secuestradas en una vacuola de doble membrana, denominada autofagosoma, que posteriormente se fusiona con el lisosoma (Yorimitsu y Klionsky, 2005). En la microautofagia también se procesan regiones enteras del citosol, pero es la propia membrana lisosomal la que se invagina para captar los componentes citosólicos (Li y cols., 2012). La autofagia me- diada por chaperonas degrada selectivamente proteínas que presentan una secuencia de aminoácidos concreta que éstas re- conocen (Kaushik y cols., 2011). Los objetivos de la autofagia son dos, por un lado constituir una fuente alternativa de energía, proveyendo a la célula de aminoácidos y ácidos grasos, y por otro lado permitir la eliminación de proteínas alteradas y orgá- nulos dañados. Modificado de (Cuervo, 2008). crito la acumulación de autofagosomas disfuncio- nales en neuronas y neuritas distróficas de pa- cientes de alzhéimer (Boland y cols., 2008), que se han relacionado con la presencia de Aβ42 y con el deterioro del sistema lisosomal con la edad (Ling y Salvaterra, 2011; Soura y cols., 2012). Este elevado número de vacuolas disfuncionales podrían con- ducir a la muerte neuronal porque la célula no po- dría hacer frente a la degradación de la gran cantidad de contenido citoplasmático acumulado en las mismas (Mizushima y cols., 2008; Amelio y cols., 2011) o por daños en la membrana de los au- tofagosomas que liberarían su contenido al cito- plasma (Ling y Salvaterra, 2009). 2.4 Pérdida sináptica La pérdida de las sinapsis, y, por lo tanto, la pérdida de comunicación entre las neuronas, es una de las principales causas de la disfunción cog- nitiva en la EA (Arendt, 2009). Además de la pér- dida sináptica producida por la muerte neuronal, existen evidencias de que las neuronas supervi- vientes también pierden sus sinapsis en la enfer- medad (Coleman y Yao, 2003). Las alteraciones de la integridad sináptica se detectan ya en pacientes con deterioro cogni- tivo leve (DCL), sugiriendo que puedan ser un evento temprano en la EA (Masliah y cols., 2001; Scheff y cols., 2006). La pérdida sináptica afecta fundamentalmente al hipocampo y a la corteza ce- rebral y se ha descrito un 18% de pérdida de las si- napsis en la región CA1 del hipocampo en DCL que puede llegar al 55% en las fases iniciales de EA (Scheff y cols., 2007). La función de las sinapsis es transmitir la señal eléctrica presináptica mediante la liberación de neurotransmisores al espacio sináptico, que pos- teriormente se convierten en una señal eléctrica en la neurona post-sináptica. Las vesículas sináp- ticas son orgánulos encargados de almacenar los neurotransmisores en las terminales nerviosas presinápticas y una compleja maquinaria celular se encarga de transportar los neurotransmisores hacia las vesículas, liberarlas y endocitar las vesí- culas de nuevo para su reciclaje. Las alteraciones en el tráfico de vesículas son una de las causas más importantes de la disfunción sináptica. Ejemplos de estas alteraciones son la reducción importante de los niveles de sinaptofisina, la principal prote- ína de dichas vesículas, en los cerebros de pacien- tes de EA (Callahan y cols., 1999; Callahan y cols., 2002), los defectos en la expresión de genes rela- cionados con el tráfico de vesículas sinápticas (Yao y cols., 2003) o en proteínas implicadas en su re- captación, como la clatrina (Yao, 2004). Otras pro- teínas que se ven alteradas en la enfermedad son las que componen las membranas pre y post-si- nápticas (Reddy y cols., 2005; Arendt, 2009). En las etapas iniciales de la enfermedad se ponen en marcha mecanismos que tratan de preservar las funciones cognitivas, se incrementa la expresión Patogénesis de la enfermedad2 48 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer de proteínas post-sinápticas como PSD-95 (Leuba y cols., 2008) o la densidad de los botones presi- nápticos glutamatérgicos (Bell y cols., 2007), lo que sugiere que tiene lugar una reorganización si- náptica compensatoria. Sin embargo, a medida que la enfermedad avanza, estos mecanismos se vuelven insuficientes y la pérdida sináptica se hace evidente (Arendt, 2009). De hecho, la disminución de la densidad sináptica es la alteración que mejor se correlaciona con el deterioro cognitivo en la en- fermedad (DeKosky y Scheff, 1990; Coleman y Yao, 2003; Scheff y Price, 2003). 2Patogénesis de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 49 3.1 Factores genéticos La EA es una enfermedad compleja en la que interactúan factores ambientales y genéticos. En general, se pueden distinguir dos formas prin- cipales de EA: - EA de aparición precoz. Supone entre el 1-6% de los casos y muestra su inicio entre los 30- 65 años. - EA de aparición tardía. Supone la gran mayoría de los casos y su edad de inicio ronda los 60-65 años. Aproximadamente en el 60% de las for- mas tempranas existe una historia familiar de en- fermedad, y en el 13% la agregación familiar sigue un patrón de herencia autosómico dominante. El estudio de dichas familias ha permitido describir 3 genes cuyas mutaciones causan EA, se trata de los genes que codifican la proteína precursora de ami- loide y las presenilinas: APP, PS1 y PS2. Por el con- trario, en el 95% de los pacientes, en los que la enfermedad aparece a partir de los 65 años, los genes implicados no son determinantes, aunque pueden conferir susceptibilidad al individuo, que a su vez puede ser modulada por factores ambien- tales. Estos factores, unidos a la complejidad y he- terogeneidad génica que existe en la EA, hacen que hasta la fecha sólo se haya relacionado un gen de manera consistente con la EA esporádica: el gen APOE que codifica la apolipoproteína E. Tam- bién se han presentado evidencias vinculando el 3Factores de riesgo de la EA Noemí Esteras Gallego 51 riesgo de padecer EA con polimorfismos en un buen número de genes. Estos hallazgos sugieren un modelo de dicotomía genética para explicar las bases hereditarias de la enfermedad, también apli- cable para otras enfermedades relacionadas con la edad como las cardiovasculares, la diabetes o el cáncer. Según este modelo, la enfermedad de apa- rición precoz estaría causada por una mutación rara, pero de alta penetrancia y gran impacto bio- lógico, mientras que la forma más común de la en- fermedad, de aparición tardía, está relacionada con factores genéticos de riesgo, en forma de po- limorfismos comunes en la población distribuidos por todo el genoma. 3.1.1 Genes asociados con alzhéimer familiar m Mutaciones en APP El gen APP se localiza en el cromosoma 21q21. A comienzos de 2012, aparecen descritas 32 mutaciones diferentes en este gen que son ca- paces de producir alzhéimer en 89 familias (www.molgen.ua.ac.be/ADMutations/). Una gran parte de las mutaciones en APP se encuentra en residuos involucrados en el procesamiento de la proteína por las secretasas. Entre ellas, las muta- ciones sin sentido “Swedish” (APPSW, APPK670N y M671L) o las mutaciones “London” (APPLON y APPV717I) son ejemplos de mutaciones que con- ducen a un aumento en la producción de Aβ y des- arrollo de EA (Bekris y cols., 2010). Otras mutaciones (como “Arctic” o “Iowa”) se encuen- tran en la región central de Aβ y provocan una mayor agregación del péptido (Brouwers y cols., 2008). (Ver figura 8). m Mutaciones en Presenilinas: PS1 Las mutaciones en PS1, localizado en el cromosoma 14q24.2, son la principal causa de EA familiar y también las que dan lugar a las formas más severas de la enfermedad y con un inicio más precoz, hacia los 30 años de edad. Existen 185 mu- taciones descritas hasta la actualidad en 405 fa- milias (www.molgen.ua.ac.be/ADMutations/). La mayoría de las mismas son mutaciones sin sentido y producen una reducción en la actividad γ-secre- tasa y un aumento en el cociente Aβ42/Aβ40 (Ci- tron y cols., 1997). Además, la reducción de la actividad γ-secretasa también puede contribuir a la patogénesis en estos pacientes por la alteración en la proteólisis de otros de sus sustratos como Notch (Shen y Kelleher, 2007), (figura 8). m Mutaciones en Presenilinas: PS2 Al contrario que las mutaciones en el gen PS1, las mutaciones sin sentido en PS2, localizado en el cromosoma 1q42.13, son una causa rara de EA. La edad de comienzo también es más tardía (alrededor de los 50 años) y más heterogénea entre individuos con el mismo tipo de mutación (Bekris y cols., 2010). En la actualidad, se han des- crito 13 mutaciones en PS2 en 22 familias Factores de riesgo de la EA3 52 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer (www.molgen.ua.ac.be/ADMutations/). 3.1.2 Genes asociados con riesgo en alzhéimer es- porádico m Gen APOE El gen APOE, situado en el cromosoma 19q13.2, tiene 3 alelos principales, APOE2, APOE3 y APOE4 que dan lugar a tres isoformas de la pro- teína: ε2, ε3 y ε4, que se diferencian entre sí por la presencia de un aminoácido cisteína o arginina en las posiciones 112 y 158, lo que afecta a la capaci- dad de la proteína para unir lípidos. La variante ε2 tiene una frecuencia aproximada del 6% en la po- blación caucásica, la ε3 del 78% y la ε4 del 16% (Seto-Salvia y Clarimon, 2010). Al comparar las fre- cuencias de cada una de las isoformas entre pa- 3Factores de riesgo de la EA Noemí Esteras Gallego 53 Figura 8. Esquema de las mutaciones en PS1 y APP en alzhéimer. Cada círculo representa un aminoácido. Los marcados en rojo simbolizan mutaciones sin sentido patogénicas. Los aminoácidos azules representan PS1, y los verdes APP. Se mues- tran también los puntos de corte de APP por las secretasas. Basado en ACS Divsion on Medicinal Chemistry (http://www.acsmedchem.org/module/AlzheimerFiles/alzheimer.html). Más información en Alzheimer Research Forum (http://www.alzforum.org). cientes y controles por edades, existe de forma consistente un incremento del alelo ε4 en pacien- tes con EA esporádica respecto a controles. Res- pecto al genotipo ε3/ε3, el más frecuente, los heterozigotos para ε4 presentan un riesgo aproxi- madamente 3 veces mayor de desarrollar alzhéi- mer, que se eleva hasta un riesgo 15 veces mayor para los homozigotos ε4/ε4 (Ashford, 2004), de modo que la dosis génica de APOε4 se considera un factor de riesgo para EA. Sin embargo, también hay que tener en cuenta que un 50% de las perso- nas con al menos un alelo ε4 no desarrollan EA, o, en el sentido contrario, aproximadamente el 42% de las personas con EA esporádica no tienen un alelo ε4, lo que da idea de la complejidad tanto ge- nética como ambiental que rodea a la enfermedad (Bekris y cols., 2010). Los mecanismos por los que la isoforma ε4 podría ser tóxica en cerebro no están del todo claros, pero se apunta a que pueda verse afectada la eliminación de β-amiloide a tra- vés de la barrera hematoencefálica (Jiang y cols., 2008). m Otros genes de riesgo Diversos estudios han mostrado hasta la fecha como polimorfismos en los genes que codi- fican algunas fosfoquinasas, como DYRK1A o GSK3β, capaces de fosforilar tau, están relaciona- dos con un aumento de riesgo en EA (Ballard y cols., 2011). Desde el 2007 ha cambiado el concepto del estu- dio genético de la EA gracias a nuevas técnicas de genotipado que están permitiendo realizar estu- dios de asociación del genoma entero, GWAS (Ge- nome-Wide Association Studies) en un elevado número de pacientes y controles. Entre los genes más destacados encontrados en estos estudios hasta la fecha, merece la pena resaltar genes aso- ciados con la inhibición del complemento y la in- flamación (como CLU, que codifica la lipoproteína clusterina; o CR1), genes asociados con rutas en- docíticas (como BIN1 o PICALM) o con el metabo- lismo lipídico y de colesterol (los ya mencionados APOE y CLU) (Guerreiro y Hardy, 2011). Aunque los riesgos asociados con estos genes son pequeños, este tipo de estudios pueden ser importantes para conocer las bases moleculares de la enfermedad y poder identificar posibles dianas terapéuticas. Para más información, la base de datos www.alz- gene.org proporciona un completo meta-análisis de cientos de estudios de asociación genética en alzhéimer. 3.2 Factores de riesgo no genéticos El principal factor de riesgo para la EA es la edad avanzada (Ferri y cols., 2005). Junto con éste, los traumatismos craneales han mostrado también estar relacionados con el desarrollo de la enfermedad (Luukinen y cols., 2008; Johnson y Factores de riesgo de la EA3 54 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer cols., 2010). Como ejemplo, la demencia pugilís- tica, asociada con traumatismos craneales cróni- cos, se desarrolla con una neuropatología similar a la del alzhéimer: placas de Aβ, ovillos neurofibri- lares, activación de la glía y neuroinflamación (Saing y cols., 2012). Una mayor reserva cognitiva (un con- cepto que combina niveles de educación, tipo de ocupación y realización de actividades mentales complejas) se asocia con menor incidencia de EA, especialmente en edades más avanzadas (Valen- zuela y Sachdev, 2006). Los cambios en los niveles de estrógenos tras la menopausia también se re- lacionan con la mayor incidencia de la enfermedad en mujeres, por la pérdida del efecto neuropro- tector de los mismos (Cholerton y cols., 2002; Ja- nicki y Schupf, 2010). Ejemplos de factores de riesgo relaciona- dos con el estilo de vida, y por lo tanto, modifica- bles, son la obesidad en la mediana edad (Beydoun y cols., 2008), la falta de actividad física (Hamer y Chida, 2009) y el consumo de tabaco (Lee y cols., 2010) y alcohol (Anstey y cols., 2009). Diversos meta-análisis de estudios obser- vacionales han mostrado que algunas enfermeda- des en la mediana edad como la hipertensión (Qiu y cols., 2005), la diabetes (Lu y cols., 2009), la hi- percolesterolemia (Anstey y cols., 2008) o la de- presión (Ownby y cols., 2006) incrementan el riesgo de padecer la enfermedad. Una revisión re- ciente, calcula que la intervención en algunos de estos factores de riesgo podría prevenir alrededor de un millón de casos de alzhéimer en todo el mundo (Barnes y Yaffe, 2011). 3Factores de riesgo de la EA Noemí Esteras Gallego 55 La patogénesis de la EA es un proceso aún no comprendido del todo. El número de hipótesis que tratan de explicar su origen es cada vez mayor, pero hasta ahora ninguna de ellas ha conseguido un consenso. Se detallan a continuación los prin- cipales mecanismos implicados. 4.1 Cascada β-Amiloide Propuesta a principios de los años 90, la hipótesis del amiloide establece que el depósito de Aβ es el evento inicial que conduce al resto de ma- nifestaciones de la enfermedad (Selkoe, 1991; Hardy y Higgins, 1992). La agregación de los frag- mentos hidrofóbicos Aβ40 y Aβ42 desencadena la formación de placas extracelulares insolubles, que según esta hipótesis son las responsables de la muerte neuronal (Selkoe, 2001). Algunas de las evidencias en las que se basa esta teoría son las si- guientes: - Aβ es el principal componente de las pla- cas de amiloide, que, junto con los ovillos neurofi- brilares, son las dos características histopatológicas diagnósticas de la enfermedad (Zhang y cols., 2012). - El depósito de Aβ ocurre antes que otros eventos patológicos como la formación de ovillos neurofibrilares o la muerte neuronal (Donev y cols., 2009). 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 57 - Las personas con síndrome de Down, ca- racterizado por la trisomía del cromosoma 21 y que por lo tanto poseen tres copias del gen APP, desarrollan a edad temprana signos clínicos y pa- tológicos de alzhéimer (Zigman y Lott, 2007; Mon- caster y cols., 2010). - Un gran porcentaje de los casos de EA de aparición precoz están producidos por muta- ciones en los genes APP, PS1 y PS2 (Bekris y cols., 2010). En general, estas mutaciones conducen a un aumento en la producción de Aβ y del cociente Aβ42/Aβ40, aunque es un tema de debate si se produce un aumento tóxico o una pérdida de las funciones fisiológicas de APP y las presenilinas (De Strooper, 2007; Wolfe, 2007). - Se han generado multitud de modelos animales de EA basados en las mutaciones de los genes APP y PSEN en el alzhéimer familiar, que desarrollan placas y muestran alteraciones en la memoria (Pimplikar, 2009). - Aβ ha demostrado in vitro ser neurotó- xico (Pimplikar, 2009) y producir muerte neuronal (Caughey y Lansbury, 2003). Además, induce dis- tintos efectos citotóxicos como estrés oxidativo o alteraciones en la homeostasis del calcio, que di- recta o indirectamente pueden conducir a la muerte neuronal (LaFerla, 2002; Abramov y cols., 2004). También es capaz de alterar la actividad de distintas quinasas como GSK3β o Cdk5, causando hiperfosforilación de tau y formación de ovillos neurofibrilares (Lopes y cols., 2010; Cai y cols., 2012). Aunque todas estas evidencias explican parte de los mecanismos que causan la patogéne- sis en alzhéimer, también existen evidencias en contra de esta hipótesis. - Se han encontrado placas de amiloide en autopsias de personas de elevada edad sin signos de demencia (Morishima-Kawashima y cols., 2000). Además, los avances en las técnicas de neu- roimagen in vivo (como la retención de 11C-PiB (11C- labelled Pittsburgh compound B), que se emplea para visualizar Aβ) también han mostrado depósi- tos en personas cognitivamente normales (Nord- berg, 2008; Villemagne y cols., 2008). - Algunos modelos de ratón muestran dé- ficits de memoria mucho antes de que las placas aparezcan en el cerebro (Lesne y cols., 2008). - Las mutaciones en PS1, que causan la gran mayoría de los casos de EA familiar, tienen efectos neurotóxicos que son independientes de la función γ-secretasa de la presenilina en el pro- cesamiento de APP y la producción de Aβ (Baki y cols., 2004; Shen y Kelleher, 2007; Kallhoff-Munoz y cols., 2008). - A pesar de ser una característica histo- patológica importante de la enfermedad, la canti- dad de depósitos de Aβ no se correlaciona con el grado de demencia (Terry y cols., 1991; Dickson y cols., 1995). Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 58 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer En este sentido, en los últimos años se ha descrito que son los niveles de las formas solubles de Aβ y no los insolubles los que mejor correlacio- nan con la severidad de la enfermedad (McLean y cols., 1999; Wang y cols., 1999), sugiriendo que las formas solubles podrían tener un papel más im- portante en la enfermedad que los depósitos. Estudios posteriores han mostrado los efectos neurotóxicos de estos oligómeros solubles (Selkoe, 2008; Lublin y Gandy, 2010; Larson y Lesne, 2012), lo que ha hecho pensar que quizá las placas insolubles no sean las que desencadenan las alteraciones patológicas, sino que sean benignas o incluso protectoras frente a la toxicidad de las formas solubles (Caughey y Lansbury, 2003). Aunque el papel de Aβ sea más limitado de lo que se creía en un principio, no hay duda de que es uno de los factores que influyen en la pato- génesis de la enfermedad. 4.2 Tau Aunque durante mucho tiempo la hipóte- sis de β-amiloide dominó la investigación sobre EA, la importancia de tau poco a poco ha empe- zado a ganar peso (Small y Duff, 2008). Los ovillos neurofibrilares, formados prin- cipalmente por tau, son también una caracterís- tica histopatológica diagnóstica de la enfermedad, pero, al contrario que las placas de amiloide, éstos sí que se correlacionan en número y localización con el grado de severidad de la EA (Giannakopou- los y cols., 2003), lo que ha hecho pensar que pue- dan contribuir a la muerte neuronal (Spires-Jones y cols., 2011). A pesar de ello, otros estudios seña- lan que la pérdida neuronal excede en número a los ovillos, y que en algunas regiones cerebrales ambas características no se correlacionan (Gomez- Isla y cols., 1997; van de Nes y cols., 2008). La función principal de tau es la estabili- zación de los microtúbulos, esenciales para el transporte de vesículas y orgánulos entre el soma y las neuritas (Caviston y Holzbaur, 2006). Cuando tau se hiperfosforila, se desliga de los microtúbu- los y se transloca al compartimento somatoden- drítico, donde sigue fosforilándose y termina formando los ovillos neurofibrilares (Honson y Kuret, 2008). La deslocalización de tau altera por lo tanto la función de los microtúbulos, afectando entre otras cosas al transporte de vesículas y or- gánulos del soma a los axones (Stamer y cols., 2002; Muresan y Muresan, 2009). Las mitocon- drias, encargadas del suministro de energía y la homeostasis del calcio, son las principales afecta- das, y su depleción en los axones puede ser clave en el proceso de neurodegeneración (Pritchard y cols., 2011). Tau también es un mediador de la toxici- dad inducida por Aβ (Ferrari y cols., 2003). Se ha descrito que las neuronas de ratones tau-/- son re- sistentes a la degeneración de las neuritas me- 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 59 diada por Aβ (Rapoport y cols., 2002), o que la re- ducción de los niveles endógenos de tau de un mo- delo APP de ratón al cruzarlo con un tau-/- , mejoraba el déficit cognitivo sin alterar los niveles de Aβ (Roberson y cols., 2007) . Aunque estos datos indican que tau actuaría por debajo de Aβ, las mutaciones en tau son la causa de enfermeda- des neurodegenerativas como la demencia frontotemporal con parkinsonismo asociada al cromosoma 17, en la que no hay patología me- diada por Aβ (Lee y cols., 2001). Paralelamente a lo que sucede con las pla- cas de amiloide, la toxicidad de tau estaría me- diada por las formas no-agregadas, no por los ovillos neurofibrilares (Hernandez y Avila, 2008). Recientemente se ha establecido un nuevo mo- delo en el que se observa activación de caspasas previa a los depósitos de tau. Al activarse, las cas- pasas procesan tau, y ésta polimeriza formando ovillos que también engloban a la proteína com- pleta, lo que indicaría que en lugar de ser una causa, los depósitos de tau son una consecuencia del proceso neurodegenerativo marcado por la ac- tivación de las caspasas. Los autores además indi- can que las neuronas no mueren inmediatamente tras la activación de las caspasas, ya que la apop- tosis no se completa, sugiriendo que los ovillos pueden ser un elemento protector (Avila, 2010; de Calignon y cols., 2010). 4.3 Inflamación Esta hipótesis establece que la inflama- ción contribuye significativamente a la patogéne- sis en alzhéimer (McGeer y cols., 2000). En la EA, la respuesta inflamatoria es local e innata, y aunque en un inicio puede ser beneficiosa, cuando es ex- cesiva o no termina de una manera correcta, se vuelve crónica y puede causar alteraciones neuro- nales (Hoozemans y cols., 2011). En el cerebro, los procesos inflamatorios están dirigidos por células de la glía: la microglía y los astrocitos. La microglía constituye el 10% de las cé- lulas en el sistema nervioso y representa la res- puesta inmune innata en el cerebro, la primera línea de defensa ante estímulos patogénicos (Ran- sohoff y Brown, 2012). En condiciones patológicas, estas células se activan, migran, rodean las células muertas o dañadas y fagocitan los restos, de ma- nera similar a los macrófagos (Heneka y cols., 2010). En pacientes de EA se ha observado activa- ción de la microglía desde etapas tempranas (Cag- nin y cols., 2001) y numerosos estudios apuntan a que su activación se produce en respuesta al de- pósito de Aβ (Barger y Harmon, 1997; DeGiorgio y cols., 2002). De hecho, las placas de amiloide se encuentran asociadas con astrocitos reactivos, mi- croglía activada y marcadores de neuroinflama- ción, revisado en (Hensley, 2010). Al mismo tiempo, los mediadores de la inflamación pueden incrementar la producción de Aβ, retroalimen- tando el ciclo (Sastre y cols., 2008). En sentido con- Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 60 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer trario, en etapas muy tempranas de la enferme- dad, la activación de la microglía puede reducir la acumulación de Aβ, aumentando su fagocitosis y favoreciendo su degradación (Frautschy y cols., 1998). Estudios recientes también apuntan a que caspasas implicadas en apoptosis como la 8 y 3/7, son capaces de activar la microglía en ausencia de muerte neuronal (Burguillos y cols., 2011; Venero y cols., 2011). La activación de la microglía se des- arrolla con un aumento en el número de células y cambios morfológicos, que suponen pasar de la morfología en reposo a una morfología activada caracterizada por presentar un pequeño soma y múltiples ramificaciones (Kettenmann y cols., 2011), (figura 9). Además, la activación de la mi- croglía supone la secreción de mediadores de la in- flamación como citoquinas, quimioquinas, prostaglandinas, derivados del óxido nítrico, ciclo- oxigenasa 2 (COX-2) o radicales libres (Ransohoff y Perry, 2009). Muchos de estos mediadores, como IL-1β, IL-6, TNF-α o TGF-β (Transforming Growth Factor β) aparecen elevados en EA (Sastre y cols., 2006b) y la producción sostenida de estas molé- culas resulta neurotóxica, revisado en (Block y cols., 2007). Por su parte, los astrocitos, las células más abundantes de la glía, son células no neuro- nales del sistema nervioso que proporcionan so- porte y protección a las neuronas, regulando su homeostasis (Li y cols., 2011). Los astrocitos se ac- tivan en respuesta a un daño en un proceso deno- minado astrogliosis reactiva, que se caracteriza por la proliferación de los astrocitos, cambios mor- fológicos en los que exitienden sus procesos y la elevada expresión de algunas proteínas, como la proteína fibrilar ácidica glial GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) que les permiten llegar a la zona da- ñada (Sofroniew y Vinters, 2010). En casos seve- ros, la astrogliosis reactiva puede acabar formando lo que se conoce como cicatriz glial, una acumulación de astrocitos reactivos rodeados de tejido conjuntivo, que separa las neuronas antes conectadas e impide el restablecimiento de nue- vas conexiones neuronales (Sofroniew, 2009). En respuesta a distintos estímulos, los as- trocitos reactivos secretan moléculas proinflama- torias y quimioquinas, como IL-1β, IL-6, TNFα o TGF, que pueden estar implicadas en los procesos neuroinflamatorios de EA (revisado en Li y cols., 2011). En la EA, los astrocitos suelen aparecer ro- deando las placas de amiloide, y formando pe- queñas cicatrices alrededor de las mismas que podrían actuar como barreras neuroprotectoras (Sofroniew y Vinters, 2010). Además, son cruciales para la degradación de los depósitos de Aβ (Wyss- Coray y cols., 2003) en un proceso mediado por ApoE, presente de forma muy importante en los astrocitos (Koistinaho y cols., 2004). También existen evidencias genéticas que 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 61 apoyan el papel de la inflamación en el desarrollo de la enfermedad. Dos recientes estudios de aso- ciación del genoma identificaron dos genes aso- ciados con un mayor riesgo de desarrollar EA: CLU y CR1, que codifican clusterina y el receptor 1 del complemento respectivamente, ambas implica- das en la inflamación (Guerreiro y Hardy, 2011). Por todos estos motivos, la inflamación se ha convertido en un importante objetivo de los es- tudios de tratamientos farmacológicos contra la EA. Entre las primeras observaciones que se tu- vieron en cuenta, está la baja prevalencia de EA en pacientes con artritis reumatoide, que algunos au- tores asociaron al tratamiento crónico de estos pa- cientes con antiinflamatorios (Hoozemans y cols., 2011). Desde entones, al menos 30 estudios epi- demiológicos han estudiado la relación entre los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), y el riesgo de desarrollar EA. Estos estudios observa- Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 62 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 9. Microglía, amiloide y tau. La activación de la microglía (detectada con MHC II) se relaciona con los depósitos de Aβ. Mientras en controles con presencia de placas difusas de Aβ la activación de la microglía es levemente superior a la de los controles sin placas, en pacientes con las típicas placas neuríticas, la activación de la microglía es claramente mayor. Ni las placas difusas ni la activación de la microglía parecen estar relacionadas con tau fosforilada. Tomada de (Hoozemans y cols., 2011). cionales apuntan a un retraso en la aparición de EA con el uso de AINEs (Breitner y cols., 2009) y a la disminución del riesgo de desarrollar la enferme- dad (int’ Veld y cols., 2001). Sin embargo, en ensa- yos clínicos randomizados los AINEs no se muestran efectivos en pacientes con EA estable- cida (Pasqualetti y cols., 2009), ni en la prevención de la aparición de la enfermedad en personas con DCL (Thal y cols., 2005). En individuos sanos se co- menzó un ensayo que terminó prematuramente por riesgos cardiovasculares relacionados con el antiinflamatorio, aunque los datos preliminares tampoco mostraban resultados positivos (Meinert y cols., 2009; Breitner y cols., 2011). Los ensayos clínicos realizados hasta la actualidad han sido re- visados por Szekely y Zandi, 2010. Los distintos re- sultados entre los estudios observacionales y los ensayos clínicos hacen pensar que los AINEs sólo sean eficaces en la EA cuando se comienzan a tomar varios años antes de su inicio (Zandi y cols., 2002), (figura 10). 4.4 Estrés oxidativo El estrés oxidativo se define como un des- equilibrio entre la producción de especies reacti- vas de oxígeno, ROS, (Reactive Oxygen Species) y su eliminación. En condiciones fisiológicas, la pro- ducción de ROS es un proceso altamente contro- lado por antioxidantes como glutation, α-tocoferol (vitamina E), carotenoides o ácido ascórbico y por enzimas como la catalasa o la glutation peroxi- dasa, que convierten el H2O2 en H2O y O2 (Yu y Chung, 2006). Sin embargo, cuando los niveles de ROS sobrepasan la capacidad antioxidante de la célula, el estrés oxidativo puede ocasionar daños celulares (Yu y Chung, 2006). 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 63 Figura 10. Relación entre activación de la microglía y muerte neuronal. El daño neuronal comienza con un estímulo que a su vez activa la microglía. Cuando la activación de la microglía supera un cierto límite, comienza a ser perjudicial para las células. Según este modelo, el diagnóstico y los tratamientos terapéu- ticos comienzan demasiado tarde, fuera de la ventana terapéutica óptima. El ré- gimen terapéutico ideal empleando AINEs, comenzaría con la prevención, reduciendo la activación de la microglía hasta niveles no perjudiciales. Adaptado de (Block y cols., 2007). Aunque representa solamente el 2% del peso corporal, el cerebro emplea alrededor del 20% del consumo total de oxígeno del cuerpo, y, por lo tanto, genera niveles elevados de ROS, que hacen que las neuronas estén más expuestas a los radicales libres que otros sistemas celulares (Shul- man y cols., 2004). Existen múltiples evidencias que indican que la sobreproducción de ROS tiene un papel muy importante en la neurodegeneración (Su y cols., 2008). Además, la presencia de daño oxidativo ya en individuos con DCL sugiere que el estrés oxidativo puede ser un acontecimiento tem- prano en la EA (Smith y cols., 2010). Entre otros marcadores, los pacientes con DCL muestran pe- roxidación lipídica y de ácidos nucleicos en cere- bro, líquido cefalorraquídeo, plasma y leucocitos periféricos (Keller y cols., 2005; Bonda y cols., 2010). Por su parte, en cerebros de pacientes se ha encontrado un elevado nivel de hierro y cobre junto con oxidación del ADN, peroxidación lipídica, alteraciones mitocondriales y producción de pro- ductos de glicosilación avanzada (de la Torre, 2011). La edad, algunas enfermedades (hiper- tensión, diabetes, hipercolesterolemia) o el estilo de vida (fumar, alta ingesta calórica, falta de ejer- cicio) contribuyen al aumento del estrés oxidativo (Maruszak y Zekanowski, 2011). El consumo de an- tioxidantes como la vitamina E y la C se ha aso- ciado en algunos estudios epidemiológicos con una reducida incidencia y prevalencia de la enfer- medad (Zandi y cols., 2004), aunque en otros en- sayos clínicos la administración de vitamina E en pacientes con la enfermedad no muestra efectos significativamente beneficiosos (Luchsinger y cols., 2003). 4.4.1 Fuentes de estrés oxidativo en la EA m Mitocondria Las mitocondrias son el principal centro de actividad metabólica celular, proporcionan ATP a la célula a través del proceso de fosforilación oxi- dativa, lo que las convierte en grandes productoras de estrés oxidativo, pero a su vez en dianas im- portantes de sus efectos. Por ejemplo, el daño oxi- dativo en la cadena de transporte de electrones puede hacer que este complejo no transfiera los electrones de manera eficaz en el proceso de fos- forilación oxidativa, generando de esta forma más ROS. El resultado es un círculo vicioso en el cual los ROS producen estrés oxidativo que a su vez produce más ROS (Bonda y cols., 2010). Múltiples evidencias apuntan a una disfunción mitocondrial con la edad y en enfermedades neurodegenerati- vas como el alzhéimer. Dichas alteraciones se han descrito en cerebro, fibroblastos y células sanguí- neas de pacientes, así como en modelos transgé- nicos de EA, revisado por Maruszak y Zekanowski, 2011. Las alteraciones mitocondriales más fre- cuentes en la enfermedad son las deficiencias en Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 64 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer enzimas clave para el metabolismo oxidativo como el complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa o el complejo piruvato deshidrogenasa, implica- dos en la reducción del oxígeno molecular (Su y cols., 2008). También se han descrito múltiples mutaciones en el ADN mitocondrial (algunas ex- clusivas de EA) en pacientes con la enfermedad, que tienen consecuencias funcionales importan- tes para la mitocondria (Coskun y cols., 2004). De- bido a la proximidad a la cadena de trasporte de electrones, el ADN mitocondrial es más suscepti- ble que el nuclear al daño oxidativo y su tasa de mutaciones es también mayor (Maruszak y Zeka- nowski, 2011). El incremento en los niveles de ROS también puede conducir a alteraciones en el nú- mero, la dinámica y la morfología de las mitocon- drias, lo que altera sus funciones, entre ellas las metabólicas, y daña las neuronas (Wang y cols., 2009a). Las alteraciones del metabolismo ener- gético como la depleción de ATP o la disminución del consumo de glucosa en regiones específicas, también son características importantes de la EA que se asocian a la disfunción mitocondrial (Fe- rreira y cols., 2010; Yao y Brinton, 2011). m Depósitos de β-amiloide Aβ ejerce parte de sus efectos neurotóxi- cos generando estrés oxidativo e induciendo la oxidación de distintas biomoléculas: produce pe- roxidación de las membranas lipídicas (Butterfield y cols., 2002), genera H2O2 (Manczak y cols., 2006) e hidroxinonenal (Tamagno y cols., 2003) en neuronas, además de dañar el ADN (Xu y cols., 2001) e inactivar enzimas transportadoras como la de glucosa (Guo y Mattson, 2000). La unión de metales de transición como el hierro y el cobre a Aβ favorecen la agregación de la proteína y sus efectos pro-oxidantes (Roberts y cols., 2012). De hecho, ambos metales aparecen acumulados en las placas de amiloide (Lovell y cols., 1998). Cuando las formas oxidadas de Fe o Cu se unen a Aβ, se reducen y producen H2O2, que, posteriormente, en presencia de hierro oxi- dado, da lugar a radicales hidroxilo en la reacción de Fenton (Tabner y cols., 2002). Los radicales li- bres tienen como principal diana los fosfolípidos de las membranas celulares, que, a su vez, cuando se oxidan pueden favorecer la agregación de Aβ (Koppaka y cols., 2003), ver figura 11. Algunos estudios apuntan a que el pép- tido Aβ secuestra los radicales libres en las neuro- nas vulnerables y se deposita como una medida para protegerse contra el daño oxidativo produ- cido por los ROS (Hayashi y cols., 2007). Sin em- bargo, además de neuroinflamación y daños mitocondriales, los depósitos producen más ge- neración de radicales libres (Bonda y cols., 2010). m Microglía y astrocitos activados Como se dijo anteriormente, tanto la mi- 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 65 croglía como los astrocitos activados característi- cos de la EA expresan numerosos mediadores de la inflamación entre los que se incluyen especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno que les permiten atacar a los patógenos. La más caracte- rística es el óxido nítrico (NO), que induce modifi- caciones post-traduccionales en proteínas, como la nitración de los residuos de tirosina, y que se ca- racteriza por la presencia de proteínas marcadas con nitrotirosina en la EA (Smith y cols., 1997). 4.5 Homeostasis del calcio El calcio está implicado en una enorme variedad de procesos fisiológicos, muchos de ellos neuronales, como el crecimiento y la diferencia- ción, la progresión del ciclo celular, la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria; y también en otros fisiopatológicos como la apoptosis y la degeneración (Bezprozvanny, 2009). Desde hace muchos años se ha observado el importante papel de la desregulación de la homeostasis del calcio en el envejecimiento y las enfermedades neurodege- Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 66 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 11. Interrelación entre ROS y distintos mecanismos patogénicos implicados en la EA. Basado en (Axelsen y cols., 2011). nerativas como la EA (Yu y cols., 2009a). La regu- lación de los niveles de calcio intracelular se pro- duce por distintos mecanismos representados en la figura 12. 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 67 Figura 12. Regulación de la homeostasis del calcio intracelular. La concentración de calcio intracelular es varios órdenes de magnitud menor a la extracelular y la regulación de su homeostasis se produce por distintos mecanismos. El calcio entra desde el medio extracelular al citosol a través de tres tipos de canales: i)los dependientes de voltaje, que permiten la en- trada de calcio tras una despolarización de la membrana; ii)los dependientes de ligando, como los asociados al receptor NMDA (N-Metil D-Aspartato) de glutamato; o iii) los dependientes de almacenamiento, que se activan por la depleción de los depósitos intracelulares. Además, el retículo endoplásmico, el principal almacén de calcio intracelular, puede liberar cal- cio al citosol a través de los receptores de rianodina (RyR) o de IP3, mensajero que se produce en respuesta a la activación de receptores metabotrópicos de la membrana plasmática. Las bombas de calcio Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática y SERCA (Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) del retículo endoplásmico retiran el calcio del citosol y lo transpor- tan en contra de gradiente hacia el exterior celular en el primer caso, y dentro del retículo en el segundo para mantener el equi- librio (Hermes y cols., 2010). Los canales de calcio de la mitocondria están menos caracterizados. Existe al menos un intercambiador de Na+/Ca2+ que libera Ca2+ al citosol y un uniportador y un receptor de rianodina que introducen calcio en la mitocondria (Hoppe, 2010). Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 68 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Los sistemas de regulación del calcio ex- perimentan alteraciones con el envejecimiento. Las consecuencias son un incremento en los nive- les de calcio intracelular, mayor entrada de calcio a través de los canales dependientes de voltaje tipo L, mayor liberación desde el retículo endo- plásmico a través de los receptores de IP3 y riano- dina, disminución de la capacidad tamponadora citosólica y activación de calcineurina y calpaínas (Raza y cols., 2007; Thibault y cols., 2007), protea- sas implicadas en la muerte neuronal por apopto- sis en la EA (Raynaud y Marcilhac, 2006). La mitocondria también participa en la homeostasis del calcio, ya que sirve de almacén temporal en respuesta a incrementos en la con- centración citosólica, por lo que las alteraciones mitocondriales relacionadas con el estrés oxida- tivo se relacionan también con una disfunción en la regulación del calcio (Yu y cols., 2009a). Además, si la concentración citosólica de calcio es muy ele- vada y la captación por la mitocondria es excesiva, se produce un aumento en la producción de ROS, se inhibe la síntesis de ATP y se libera citocromo c dando lugar a apoptosis y muerte celular (Supnet y Bezprozvanny, 2010; Rasola y Bernardi, 2011). El estrés oxidativo en la EA también se relaciona con la disfunción del calcio a través de la peroxidación de las membranas lipídicas. La generación de lípi- dos neurotóxicos como el 4-hidroxinonenal altera la función de proteínas de membrana implicadas en el transporte iónico como la Ca2+-ATPasa o los canales dependientes de voltaje (Lu y cols., 2002). Por su parte, las mutaciones en los genes de las presenilinas pueden alterar directamente la ho- meostasis del calcio, ya que interaccionan con tres componentes clave de su regulación: los recepto- res de IP3, los de rianodina y las bombas SERCA (Stutzmann y cols., 2006; Cheung y cols., 2008; Green y cols., 2008). Las propias presenilinas, in- dependientemente de su función γ-secretasa, pueden actuar como canales de calcio de goteo del retículo endoplasmático, (figura 12). Las mutacio- nes en PSEN hacen que la proteína pierda esa fun- ción y se produzca una sobrecarga de calcio en el retículo que puede desencadenar una respuesta apoptótica (Nelson y cols., 2007; Supnet y Bez- prozvanny, 2011). Los productos del metabolismo de APP y Aβ pueden aumentar la concentración in- tracelular de calcio actuando sobre los canales o formando poros en la membrana, entre otros me- canismos, revisado en (Yu y cols., 2009a). Además de los reservorios intracelulares como el retículo endoplásmico o la mitocondria, la célula cuenta con moléculas tamponadoras cito- sólicas que se unen al calcio intracelular, regulan sus niveles y están implicadas en una gran varie- dad de rutas de señalización (Gilabert, 2012). Entre ellas destacan la calmodulina y la calbindina, cuyas alteraciones también se han descrito en la enfer- medad (McLachlan y cols., 1987; O’Day y Myre, 2004; Riascos y cols., 2011). El calcio media el daño neuronal causado por exci- totoxicidad, cuando se produce una sobreactiva- ción de los receptores de glutamato, el principal neurotransmisor excitatorio del cerebro. La unión excesiva de glutamato al receptor NMDA conlleva un aumento extraordinario del contenido de cal- cio citosólico, que puede inducir apoptosis a tra- vés de calcineurina o las calpaínas, además de alterar otros orgánulos sensibles como las mito- condrias (Gazulla y Cavero-Nagore, 2006; Dong y cols., 2009). En este sentido, el antagonista de los receptores NMDA memantina, es un fármaco aprobado para el tratamiento de la EA (Lipton, 2005), ver figura 12. 4.6 Colesterol El colesterol es un componente esencial de las membranas lipídicas de las células animales que ayuda al mantenimiento de su permeabilidad y fluidez. Además, es el principal sustrato para la síntesis de una gran variedad de esteroides, inclu- yendo vitaminas, ácidos biliares y hormonas. El co- lesterol se obtiene a través de la dieta y también se sintetiza in vivo en la ruta del mevalonato, donde la reacción limitante del proceso es la for- mación de ácido mevalónico a partir de 3-hidroxi- 3-metilglutaril-Coenzima A (HMG CoA) catalizado por la HMG CoA reductasa (figura 13). Aunque el colesterol es vital para el funcionamiento celular, las alteraciones en su concentración o su homeos- tasis contribuyen a la aparición de enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas (Reiss y cols., 2004; Cui y cols., 2007). De hecho, la hiper- colesterolemia es un factor de riesgo no genético para el desarrollo de la EA (Kivipelto y cols., 2001). El tratamiento con estatinas, que actúan inhi- biendo la HMG CoA reductasa, se emplea para dis- minuir los niveles de colesterol, aunque también afecta a la síntesis de los productos derivados del mismo, como isoprenoides o ubiquinona (Na- warskas, 2005). En el cerebro, el colesterol es un compo- nente importante de las vainas de mielina, y de las membranas neuronales y gliales, y es fundamental para la formación de las sinapsis (Pfrieger, 2003). Las neuronas y las células gliales sintetizan su pro- pio colesterol por la vía de la HMG-CoA reductasa, y éste forma complejos con la lipoproteína ApoE, la más abundante en cerebro, para su transporte y la formación de nuevas membranas y sinapsis (Mathew y cols., 2011). La ApoE también es encar- gada de transportar el exceso de colesterol al plasma para su eliminación (Bjorkhem, 2006). En la EA, se ha descrito un exceso de eliminación de colesterol debido a la degeneración de las sinap- sis y también a la alteración del transporte por ApoE (Mathew y cols., 2011). Las mutaciones en ApoE se han relacionado además con un aumento del riesgo de desarrollar EA (Martin y cols., 2000; Namboori y cols., 2011). 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 69 Además, el colesterol también se ha rela- cionado con la formación de Aβ en la EA debido a que el procesamiento proteolítico de APP tiene lugar en dominios de la membrana ricos en coles- terol. Estudios in vitro muestran que cuando se trata a células humanas transfectadas con APP con inhibidores de la HMG CoA reductasa, el procesa- miento de APP por la vía amiloidogénica de la β- secretasa se reduce; mientras que el tratamiento de esas células con colesterol incrementa en cua- tro veces la producción de Aβ (Simons y cols., 1998). Otros estudios señalan que el colesterol se une a APP en el lugar de corte por la α-secretasa, favoreciendo el procesamiento por la β-secretasa y la formación de Aβ (Yao y Papadopoulos, 2002). Estos resultados se correlacionan con otros estu- dios in vivo usando modelos animales. Los ratones transgénicos que sobreexpresan APP humana mostraban un incremento en la deposición de Aβ en el cerebro cuando eran sometidos a una dieta con niveles elevados colesterol (Refolo y cols., 2000; Shie y cols., 2002). Los niveles de Aβ en estos casos se correlacionaban con los niveles de colesterol en plasma. Cuando se trataba a los ra- tones con un inhibidor de la HMG CoA reductasa, tanto el colesterol plasmático como los depósitos de Aβ disminuían (Refolo y cols., 2001). Resulta- dos similares se obtuvieron en conejos alimenta- dos con un exceso de colesterol en su dieta (Sparks y cols., 1994). Además, distintos estudios epidemiológi- cos muestran que los pacientes en tratamiento con estatinas presentan una menor prevalencia de EA (Jick y cols., 2000; Rockwood y cols., 2002; She- pardson y cols., 2011a). Las estatinas, además de reducir los niveles de colesterol, tienen otros efec- tos pleiotrópicos que no derivan de sus acciones sobre el metabolismo lipídico. Entre otras funcio- nes, inhiben la formación de isoprenoides como el farnesilpirofosfato (FPP) o el geranilgeranilpiro- fosfato (GGPP), derivados del metabolismo del mevalonato (figura 13) y encargados de la modifi- cación post-traduccional de proteínas, entre ellas pequeñas GTPasas como Rho, Rac, Rab o Ras Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 70 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 13. Esquema de la síntesis de novo del colesterol en la ruta del mevalonato. Otros productos de la ruta in- cluyen los isoprenoides farnesilpirofosfato (FPP) y geranil- geranilpirofosfato (GGPP). Adaptado de (Cole y Vassar, 2006) . (Liao y Laufs, 2005). Estas moléculas también se han visto relacionadas con la patogénesis en EA, regulando la actividad de las secretasas en el me- tabolismo de APP (Zhou y cols., 2003; Cole y cols., 2005), la activación de la glía (Cordle y Landreth, 2005), la generación de ROS (Lee y cols., 2002) o la plasticidad sináptica (Pilpel y Segal, 2004). Ade- más se han encontrado niveles más altos tanto de FPP como de GGPP en los cerebros de pacientes (Eckert y cols., 2009). Por lo tanto, junto con los niveles de co- lesterol, también hay que tener en cuenta que la homeostasis de estos intermediarios puede ser importante en la patogénesis de la enfermedad (Cole y Vassar, 2006; Hooff y cols., 2010). 4.7 Déficit Colinérgico La hipótesis del déficit colinérgico fue la primera que surgió para intentar explicar la pato- génesis de la EA. La acetilcolina (Ach) es uno de los principales neurotransmisores en el sistema nervioso central (SNC). Se sintetiza en algunas neuronas a partir colina (Cho) y de acetil-coenzima A derivada del metabolismo de la glucosa, me- diante la enzima colinacetiltransferasa (CAT). A continuación, se libera al espacio sináptico, donde se une a sus receptores, y rápidamente se degrada por medio de la acetilcolinesterasa. La colina es re- captada de nuevo por la neurona para volverse a emplear en la síntesis de Ach (Martorana y cols., 2010). La figura 14 recoge un esquema de este pro- ceso. A mediados de los años 70, esta hipótesis toma forma, cuando se encuentra que la actividad de la colinacetiltransferasa estaba disminuída en la corteza cerebral y el hipocampo de pacientes de alzhéimer (Perry y cols., 1977; Rossor y cols., 1982). Posteriormente se descubrió la degenera- ción selectiva en la EA de las neuronas del núcleo basal de Meynert (que proyecta fibras colinérgicas hacia la corteza y el hipocampo), lo que sirvió para explicar la menor actividad de CAT en el cerebro de los pacientes (Whitehouse y cols., 1982; Muf- son y cols., 2003). Éstos son eventos tempranos en 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 71 Figura 14. Esquema de la síntesis y degradación de ace- tilcolina en las neuronas. Basado en la página Anesthesia UK (http://www.frca.co.uk/) la enfermedad (Mesulam, 2004). La acetilcolina promueve la neurogénesis en el hipocampo y está implicada en el aprendizaje, por lo tanto, el déficit colinérgico puede contribuir a las alteraciones en la memoria de los enfermos (Mohapel y cols., 2005; Veena y cols., 2011). Estas evidencias lleva- ron al desarrollo de fármacos que incrementaran los niveles de Ach inhibiendo la acetilcolinesterasa responsable de su degradación. En la actualidad, existen cuatro fármacos aprobados para el trata- miento del alzhéimer basados en esta hipótesis: tacrina, donepezilo, rivastigmina y galantamina, (ver figura 14) (Pepeu y Giovannini, 2009). 4.8 Degradación de proteínas: Proteasoma y Autofagia El sistema ubiquitina-proteasoma y la au- tofagia son los dos principales mecanismos celu- lares para la degradación de proteínas. El proteasoma es un complejo enzimático por el cual las proteínas previamente marcadas con ubiqui- tina son procesadas y degradadas. El proteasoma tiene un papel fundamental en la eliminación de proteínas que ya no son funcionales, por ejemplo, por estar oxidadas o mal plegadas (Davies, 2001; Grune y cols., 2003; Kubota, 2009) y su inhibición conlleva la acumulación de proteínas ubiquitina- das causando muerte celular (Gorman, 2008). En la EA se han descrito alteraciones en la funcionalidad del proteasoma (Keller y cols., 2000; Keck y cols., 2003). En concreto, el trabajo de Ke- ller y cols. describe una disminución de su activi- dad en áreas afectadas selectivamente por la EA, como el hipocampo o la corteza. Las proteínas mal plegadas que escapan a la degradación suelen agregarse debido a que exponen una gran canti- dad de residuos hidrofóbicos (Gorman, 2008). De modo que las alteraciones en la actividad del pro- teasoma podrían relacionarse con la presencia ca- racterística de agregados proteicos y proteínas oxidadas en la EA. Éstos, además, pueden exacer- bar la disfunción del proteasoma (Bence y cols., 2001; Oddo, 2008). Otra evidencia de la alteración de este sistema en la EA es la acumulación de ubi- quitina en las placas y los ovillos neurofibrilares (Morishima-Kawashima y cols., 1993; van Leeu- wen y cols., 1998). Los propios ovillos y el péptido Aβ42 son también capaces de inhibir la actividad del proteasoma, dando lugar a un círculo vicioso que conduce a más acumulación de Aβ y tau (Keck y cols., 2003; Oh y cols., 2005). La autofagia, implicada en la eliminación de orgánulos y proteínas agregadas a través de los lisosomas, también juega un papel importante en la homeostasis celular y la neurodegeneración, Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 72 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer aunque el mecanismo que la relaciona con la EA no está del todo elucidado. Por un lado, como se dijo anteriormente, la acumulación de autofago- somas en las neuronas podría conducir a la muerte celular. Por otro lado, este sistema está implicado en la degradación de tau y Aβ (Wang y cols., 2009b; Jaeger y cols., 2010), por lo tanto la dismi- nución de la actividad autofágica puede conducir a la acumulación de dichas proteínas (Li y cols., 2010). 4.9 Ciclo celular La hipótesis del ciclo celular surgió hace relativamente pocos años, pero son cada vez más las evidencias que apoyan que las alteraciones en el control del ciclo celular en poblaciones neuro- nales vulnerables del cerebro son de gran impor- tancia en la patogénesis de la enfermedad. La teoría del ciclo celular establece que la reactiva- ción del ciclo en neuronas maduras conduce en úl- timo término a la muerte neuronal y al desarrollo de la EA (Nagy y cols., 1998; Arendt y cols., 2000; Copani y cols., 2001; Herrup y cols., 2004). El ciclo celular es un proceso altamente regulado que consta de cuatro fases necesarias para la división celular: G1, S, G2 y M. La mayoría de las células completan el ciclo entre 40 y 60 veces en su vida. Durante el desarrollo del sistema nervioso, los precursores neuronales también pro- liferan y las completan, sin embargo, cuando están totalmente diferenciadas, la gran mayoría de las neuronas salen del ciclo celular y permanecen en una etapa post-mitótica o quiescente, denomi- nada fase G0, en la que no se replican (Galderisi y cols., 2003; Politis y cols., 2008). Probablemente, las neuronas maduras tienen que mantenerse en esta fase porque una hipotética división celular conllevaría cambios en su citoesqueleto para pre- pararse para la mitosis y la citocinesis que altera- rían las conexiones sinápticas y la función neuronal (Currais y cols., 2009). Si por alguna razón son forzadas a entrar en ciclo, la incapacidad de las neuronas diferenciadas para completarlo desen- cadena un proceso apoptótico que termina con la muerte neuronal y que contribuye a la patogéne- sis en el alzhéimer (Yang y cols., 2003; McShea y cols., 2007; Lopes y cols., 2009b). 4.9.1 Fases del ciclo celular Para progresar a través de las distintas fases del ciclo, las células emplean ciclinas y qui- nasas dependientes de ciclinas (Cdks, Cyclin-De- pendent Kinase) que alternativamente se expresan o se suprimen en función de la etapa. Este meca- nismo está controlado por el sistema ubiquitina- proteasoma responsable de la proteólisis regulada de las ciclinas y de los inhibidores de las mismas (Udvardy, 1996). Durante la fase G1, del inglés Growth o Gap1, (ver figura 15), señales mitogénicas como factores de crecimiento, desencadenan la activa- ción de la ciclina D, cuya unión a Cdk4 o Cdk6 les permite fosforilar la proteína del retinoblastoma (Rb) impidiendo así su unión al factor de transcrip- ción E2F-1. Cuando éste es liberado, media la transcripción de genes que codifican proteínas que 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 73 Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 74 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 15. Esquema representativo de la progresión y la regulación del ciclo celular en eucariotas. 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 75 serán necesarias en la siguiente etapa. Al final de la fase G1, es necesario un incremento en la activi- dad ciclina E/Cdk2 para asegurar la progresión hacia la siguiente fase. Al final de G1 se encuentra el punto de restricción más importante del ciclo. Una vez que éste se supera, la entrada en ciclo es irreversible. A lo largo de la fase S, de Synthesis, el complejo ciclina A-Cdk2 fosforila sustratos que permiten la replicación del ADN, y, como resul- tado, cada cromosoma se duplica. A continuación, comienza la fase G2, Growth o Gap2. Este proceso, regulado por ciclina A/Cdk1 regula la fosforilación de proteínas esenciales en esta fase, en la que ge- neralmente la célula se asegura de que la replica- ción del ADN ha finalizado correctamente. El complejo ciclina B/Cdk1 se encarga de permitir la progresión a la fase M, de Mitosis, en la que las cé- lulas físicamente se dividen dando lugar a dos cé- lulas hijas (Murray, 2004; Currais y cols., 2009). La actividad de las Cdks que controlan el proceso se regula también con inhibidores específicos que se organizan en dos familias, INK4 y Cip/Kip. La fa- milia INK4 (Inhibitors of Cyclin D-dependent Kinase 4) está formada por p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c y p19INK4d. Por su parte, la familia Cip/Kip (Cdk Inter- acting Protein/Kinase Inhibitory Protein) está for- mada por p21Cip1, p27Kip1 y p57Kip2 (Currais y cols., 2009). Además, existen dos puntos importantes de control del ciclo en las transiciones G1/S y G2/M en los que la célula comprueba si la fase anterior se ha completado correctamente antes de pasar a la siguiente. En el primer punto de control, la célula decide si está preparada para comenzar la división celular o regresa a la fase G0 y se regula funda- mentalmente por el inhibidor de Cdk4, p16. En el segundo punto de control el principal problema suelen ser daños en el ADN. La célula debe decidir si continúa con la progresión del ciclo, si se pro- duce un arresto para poner en marcha mecanis- mos de reparación o si, en el caso de que no sea posible la reparación, se induce la apoptosis (Csi- kasz-Nagy y cols., 2011). 4.9.2 Marcadores del ciclo celular en EA Las neuronas de los pacientes de EA muestran un elevado número de marcadores del ciclo celular. En particular destaca la presencia de ciclina D, Cdk4 y Ki67, que indican que las neuronas han salido de la fase G0 y han entrado en la fase G1 (Smith y Lippa, 1995; McShea y cols., 1997; Nagy y cols., 1997b; Busser y cols., 1998; Smith y cols., 1999) (figura 16). Además, se han encon- trado elevados niveles de Rb hiperfosforilada y lo- calización citoplasmática de E2F-1 (Ranganathan y cols., 2001; Thakur y cols., 2008), así como de p130, una proteína relacionada con pRb (Previll y cols., 2007). Los inhibidores de Cdks como p16, p15, p18 y p19 también aparecen incrementados en la cor- teza temporal y las neuronas piramidales del hi- pocampo de los pacientes de EA (Arendt y cols., Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 76 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 16. Marcadores del ciclo celular en el cerebro de pacientes de EA. Los principales reguladores del ciclo celular se ex- presan en las neuronas piramidales de las zonas afectadas en la EA antes de la neurodegeneración. Adaptado de (Arendt, 2012) 1996; McShea y cols., 1997; Arendt y cols., 1998), así como los niveles citoplasmáticos de p27 (Ogawa y cols., 2003a). El incremento en los inhi- bidores de Cdks podría ser un mecanismo de de- fensa contra la activación de los iniciadores del ciclo (Currais y cols., 2009). También hay evidencias de transición a la fase S, como indica la presencia de proteínas de esa fase como pmcm2 (Bonda y cols., 2009), o más importante, evidencias de duplicación del ADN que demuestran que la neurona es capaz de com- pletar la fase S (ver figura 17). El laboratorio de He- rrup, empleando técnicas de hibridación in situ con sondas fluorescentes, demostró que una fracción importante de neuronas piramidales del hipo- campo en EA, había replicado cuatro loci genéti- cos en tres cromosomas diferentes (Yang y cols., 2001). El grupo de Arendt, (Mosch y cols., 2007; Arendt y cols., 2009), también cuantificó la canti- dad de ADN en neuronas corticales de la enferme- dad, encontrando una población de neuronas tetraploides, positivas para ciclina B1, que habían completado con éxito la replicación del ADN. Di- ferentes estudios han mostrado que, en condicio- nes fisiológicas, en el cerebro existe una pequeña tasa de neuronas aneuploides, aproximadamente del 10%, que son bien toleradas (Yurov y cols., 2005; Mosch y cols., 2007). Sin embargo, en la EA, esta frecuencia se duplica (Arendt, 2012) y el ex- ceso hace que las neuronas con un número de cromosomas superior al diploide mueran selecti- vamente en etapas tempranas de la enfermedad (Arendt y cols., 2010). La tetraploidía inducida por la reactivación del ciclo se correlaciona también con cambios morfológicos e hipertrofia neuronal que pueden ser responsables de las alteraciones funcionales y los cambios en los circuitos neuro- nales que conducen a la neurodegeneración (Frade y Lopez-Sanchez, 2010). Algunos autores defien- den que en lugar de un intento de entrada en ciclo de las neuronas maduras, la aneuploidía se debe a deficiencias en la segregación cromosómica du- rante el desarrollo embrionario, que dan lugar a progenitores aneuploides que no se eliminan por apoptosis como sucede en condiciones normales (Zekanowski y Wojda, 2009; Iourov y cols., 2011). Algunas de las neuronas de las zonas afec- tadas progresan y se detienen en la siguiente fase del ciclo, G2, como demuestra la presencia ciclina B en las neuronas del hipocampo (Nagy y cols., 1997a; Vincent y cols., 1997) o del regulador de la transición G2/M CARB (CIP-1-associated regulator of cyclin B) (Zhu y cols., 2004a). Sin embargo, nunca se ha visto progresión a la fase M (Ogawa y cols., 2003b). A pesar de que recientemente se han encontrado neuronas binucleadas (Zhu y cols., 2008), nunca se ha descrito condensación de cro- mosomas, presencia del huso mitótico o de citoci- nesis, lo que puede indicar que las neuronas susceptibles quedan arrestadas en la transición G2/M antes de morir. Por lo tanto, la activación de Cdk1 (Cdc2) en la fase G2 podría ser el paso limi- tante previo a la apoptosis, ya que esta quinasa puede iniciar el proceso fosforilando la proteína proapoptótica BAD (Konishi y cols., 2002; Konishi y Bonni, 2003). Cdk1 se encuentra sobreexpresado en EA (Vincent y cols., 1997) y se localiza en la glía y los ovillos neurofibrilares. Sería razonable pen- sar que la apoptosis neuronal en G2 puede ser el resultado de una incapacidad del citoesqueleto al- tamente especializado de las neuronas para for- mar el huso mitótico y la citocinesis (Currais y cols., 2009). La presencia de marcadores del ciclo ce- lular también se ha observado en personas con DCL (Sultana y Butterfield, 2007; Keeney y cols., 2011) y, en modelos animales, es previa a la apari- ción de otros signos neuropatológicos de la enfer- medad como las placas o la inflamación (Yang y cols., 2006; Varvel y cols., 2009), lo que hace pen- sar que las alteraciones en el ciclo celular son un evento temprano en la patogénesis de la enfer- medad. 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 77 4.9.3 Señales mitóticas Las señales mitóticas que inducen la en- trada de las neuronas en ciclo pueden ser de di- versos tipos. Existen numerosos compuestos con actividad neurotrófica y potencialmente mitogé- nicos que se encuentran elevados en EA. Entre ellos destacan el factor de crecimiento nervioso, NGF (Nerve Growth Factor), la hormona luteini- zante, el factor de crecimiento epidérmico, EGF (Epidermal Growth Factor), el factor de crecimiento derivado de plaquetas, PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) o el factor de crecimiento transfor- mante β1, TGF-β1, revisado en (Zhu y cols., 2004b). Algunos estudios en modelos celulares han mostrado que las neuronas pueden entrar en ciclo en respuesta a situaciones de estrés como la privación de factores tróficos, daños en el ADN o apoptosis mediada por estrés oxidativo con peró- xido de hidrógeno (Herrup y Busser, 1995; Shirvan y cols., 1998; Kruman y cols., 2004). La mayoría de estos factores median sus efectos celulares a través de la activación de la vía de las MAP (Mitogen Activated Protein) quinasas, una ruta dependiente de la proteína G Ras (Chang y cols., 2003). El incremento en fases muy tem- pranas de Ras en el cerebro de los pacientes (Gart- ner y cols., 1999; McShea y cols., 2007), puede ser una de las señales mitóticas que desencadena el proceso, ya que está implicada en la transición G0/G1 a través de su interacción con la ciclina D1 Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 78 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 17. Alteraciones del ciclo celular en EA. A) Neuro- nas del hipocampo de pacientes de EA positivas para ci- clina B. B) Ciclina A en nueronas corticales del modelo transgénico de EA R1.40. C) Análisis FISH en el que se muestran 4 puntos de hibridación de un único locus del ge- noma del ratón que indican que se ha producido la replica- ción del ADN en las neuronas del hipocampo del ratón R1.40. Adaptado de (Yang y Herrup, 2007) (Lavoie y cols., 1996). El resto de mediadores de la cascada de Ras (Raf, MEK1/2 y ERK1/2 (Extracellu- lar-signal Regulated Kinase)) también están acti- vados en neuronas de EA, pero no en controles sanos (Ferrer y cols., 2001; Pei y cols., 2002). Por otra parte, tanto APP como Aβ han mostrado ser capaces de inducir la entrada en ciclo, (Schubert y cols., 1989; Varvel y cols., 2008; Nizzari y cols., 2012). Aβ puede mediar la entrada en ciclo a través de Cdk5, una quinasa también im- plicada en la hiperfosforilación de tau (Lopes y cols., 2010). En cultivos neuronales se ha obser- vado como los niveles de Cdk4 (transición G0/G1) y PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) (fase S) se incrementaban en respuesta a inyecciones de Aβ (Moh y cols., 2011). En células HeLa, la sobreexpresión de pre- senilinas PS1 y PS2 induce el arresto de las células en G1 (Janicki y cols., 2000), mientras que su defi- ciencia acelera la transición de G1 a S (Soriano y cols., 2001), lo que puede ser un nexo entre las mu- taciones en PS1 en alzhéimer familiar y las altera- ciones del ciclo. La excitotoxicidad también está relacio- nada con la activación del ciclo. Se ha observado que tras una lesión excitotóxica en el hipocampo, se expresan de manera secuencial marcadores del ciclo celular en la corteza entorrinal y el giro den- tado (Hernandez-Ortega y cols., 2007). Ciclina D1 y Cdk6 (transición G0/G1) se expresan primero, se- guidas de PCNA (G1/S) que posteriormente dismi- nuye para dejar paso a Cdk2 (S) y finalmente a ci- clina B (G2). Estos cambios secuenciales en respuesta a la excitotoxicidad son representativos de una reentrada en ciclo intencionada (Hernan- dez-Ortega y cols., 2007). Las alteraciones en el ciclo celular tam- bién se relacionan con otros eventos patológicos de la enfermedad. Por ejemplo, el sistema ubiqui- tina-proteasoma media la proteólisis controlada de las ciclinas para permitir la progresión ade- cuada del ciclo, de modo que la alteración del sis- tema de ubiquitinación en EA puede influir en la regulación del ciclo celular en las neuronas (Tank y True, 2009). En diversos estudios se ha visto que la pa- tología neurofibrilar colocaliza con los regulado- res del ciclo celular y que tau puede ser fosforilada por quinasas del ciclo, como Cdk2, Cdk5, Cdk1 y Cdc2-like (Baumann y cols., 1993; Bennecib y cols., 2000; Sobue y cols., 2000; Thakur y cols., 2008). La hiperfosforilación de tau puede causar problemas para la neurona cuando entra en ciclo, ya que la desorganización de la red de microtúbulos inicia un proceso denominado división prematura de los centrómeros, por el cual los centrómeros se divi- den antes de tiempo, en la fase G2 del ciclo, inme- diatamente después de la replicación del ADN, lo que puede desencadenar la apoptosis. En la EA se ha encontrado que la incidencia de este proceso en la corteza es tres veces mayor que en controles 4Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis Noemí Esteras Gallego 79 (Spremo-Potparevic y cols., 2008). El estrés oxidativo también está en estre- cha relación con las alteraciones en el ciclo celular. El escaso número de neuronas que en un mo- mento dado sufren apoptosis en una enfermedad crónica como la EA, llevó a Raina y cols. a sugerir el término abortosis, un proceso por el cual las neuronas activan las caspasas reguladoras, pero no las efectoras, de modo que pueden sobrevivir durante un tiempo al no completar la apoptosis (Raina y cols., 2001; Raina y cols., 2003). El estrés oxidativo crónico puede inducir la abortosis, como sugieren algunos estudios en los que la exposición a concentraciones bajas de oxidantes pueden dar lugar a una respuesta adaptativa en lugar de pro- ducir muerte neuronal (Crawford y Davies, 1994; Wiese y cols., 1995; Cassina y cols., 2001). El estrés oxidativo crónico al que están sometidas las neu- ronas en la EA puede provocar cambios compen- satorios que permitan mantener la homeostasis, un estado en equilibrio en el que las neuronas so- breviven durante años (Zhu y cols., 2004b). Es en este estado de equilibrio cuando un “segundo im- pacto”, la entrada en ciclo de esas neuronas, pro- vocaría la muerte celular, según la teoría del doble impacto de Zhu y cols. (Zhu y cols., 2004b; Zhu y cols., 2007a). La situación también podría suceder al revés, pero sería necesaria la combinación de ambos factores para que tenga lugar la muerte neuronal. Las alteraciones en el ciclo celular se en- cuentran también en pacientes de alzhéimer fa- miliar (Malik y cols., 2008), en modelos animales (Yang y cols., 2006; Varvel y cols., 2009) y no sólo aparecen en neuronas, sino también en tejidos pe- riféricos como fibroblastos (Tatebayashi y cols., 1995; Cavazzin y cols., 2004) y linfocitos (Stieler y cols., 2001; Nagy y cols., 2002; de las Cuevas y cols., 2003; Zhang y cols., 2003; Zhou y Jia, 2010; Stieler y cols., 2012). Asimismo, se han relacionado con otras enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson, la demencia frontotemporal o la ataxia-telangectasia entre otras (Husseman y cols., 2000; Lee y cols., 2003; Yang y Herrup, 2005). Por todos estos motivos, la EA se podría considerar un proceso neoplásico abortivo. Mien- tras que en el cáncer la entrada anormal en ciclo produce proliferación incontrolada y escape de la apoptosis, conduciendo al desarrollo y la maligni- zación del tumor, en la EA la incapacidad para completar el ciclo celular desencadena la neuro- degeneración. Etiopatogénesis de la enfermedad: Hipótesis4 80 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 5.1 Criterios NINCDS-ADRDA En la actualidad, el diagnóstico de la EA se basa en los criterios del NINCDS-ADRDA (Na- tional Institute of Neurologic, Communicative Di- sorders and Stroke - Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association) (McKhann y cols., 1984). Según este protocolo, el diagnóstico defi- nitivo de la enfermedad solamente se puede rea- lizar con un análisis histopatológico post-mortem, y mientras tanto, se diagnostica como probable o posible EA. El diagnóstico clínico se realiza a través de los síntomas, la existencia de alteraciones cog- nitivas, sociales u ocupacionales y un análisis neu- ropsicológico. Entre las pruebas destaca el test mini-mental, MMSE (Mini-Mental State Examina- tion) que explora distintas áreas cognitivas (orien- tación, fijación, concentración, cálculo, memoria y lenguaje) y otorga una puntuación en función de la cual los resultados pueden ser sugerentes de de- mencia (Roselli y cols., 2009). Desde que se publi- caran estos criterios, se han descrito numerosas evidencias de que técnicas como la resonancia magnética, de imagen o de espectroscopía, la neu- roimagen funcional o la búsqueda de marcadores en fluidos biológicos permiten caracterizar mejor la enfermedad. 5.2 Resonancia magnética Esta técnica ha supuesto un avance tec- nológico muy importante en las últimas décadas. 5Diagnóstico Noemí Esteras Gallego 81 El fenómeno físico de la resonancia magnética nu- clear sienta sus bases en el magnetismo. Los ele- mentos con un número impar de electrones poseen una propiedad conocida como momento magnético o espín, que se caracteriza por presen- tar un campo magnético propio. Entre los átomos que presentan esta propiedad destaca el átomo de hidrógeno, que es el más abundante del cuerpo al formar parte de las moléculas de agua. En reposo, los campos magnéticos de cada átomo están orientados al azar. Sin embargo, cuando se so- mete la muestra a un campo magnético externo, semejante a un imán, los átomos se alinean con dicho campo magnético externo. Los campos magnéticos empleados en RM son de alta intensi- dad, medida en Teslas. La alineación es un proceso dinámico en el que cada átomo vibra con una fre- cuencia de giro característica. En el caso del átomo de hidrógeno, esta frecuencia es de 42.5 MHz/Tesla. Cuando se aplica una energía de la misma frecuencia que la del átomo de hidrógeno, es decir, cuando los átomos de hidrógeno y el campo magnético externo están en resonancia magnética, se produce un cambio en la orienta- ción de los átomos. Cuando se interrumpe el campo magnético externo, los átomos vuelven a su posición original en un proceso de relajación por el que liberan la energía aplicada en forma de señal de radiofrecuencia, de diferente intensidad según el entorno químico en el que se encuentren (figura 18). Las señales se captan y se transforman de dis- tintas formas. En el caso de la resonancia magné- tica de imagen, MRI (Magnetic Resonance Imaging) se transforman en funciones señal/tiempo, dando lugar a los tiempos de relajación T1/T2 para gene- rar una imagen. En el caso de la resonancia mag- nética de espectroscopía (MRS, Magnetic Resonance Spectroscopy) las señales son ordena- das según su frecuencia para dar lugar a un espec- tro de frecuencias. 5.2.1 Resonancia magnética de imagen (MRI) Las imágenes obtenidas pueden ser de distintos tipos. Diagnóstico5 82 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 18. Esquema de la obtención de una señal de resonancia magnética. m Imágenes pesadas en T1 y T2 Las señales de radiofrecuencia generadas se captan en funciones de señal-tiempo y se con- vierten en una escala de grises para formar una imagen. En ellas, se clasifica la señal como bri- llante o hipertensa cuando aparece blanca, o como hipotensa cuando aparece oscura. El proceso de relajación de los átomos de hidrógeno hasta su po- sición original se puede dividir en dos partes (im- posibles de distinguir en la práctica) que corresponden a los componentes vectoriales del eje de orientación de los átomos en cuestión. El componente vertical o longitudinal, depende de la interacción de los átomos con su entorno y, si se representa en función del tiempo, da lugar a una curva exponencial ascendente que se conoce como tiempo de relajación longitudinal o T1. El componente transversal depende de la interacción de los átomos entre sí, y su comportamiento en el tiempo es una curva exponencial descendiente que se corresponde con el tiempo de relajación transversal o T2. Las imágenes pesadas en T1 se caracterizan porque en ellas el líquido aparece os- curo, como una señal hipotensa. En el caso de las imágenes pesadas en T2, la materia grasa se muestra oscura y el agua brillante o hipertensa. Por lo tanto, debido a que en general el agua libre se asocia con la patología, esta técnica es muy útil en el estudio de diversas enfermedades cerebra- les. Las imágenes obtenidas de esta manera per- miten analizar las estructuras cerebrales y realizar estudios volumétricos. m Mapas de Coeficiente de Difusión Aparente Además, dentro de la imagen por reso- nancia, existen variantes cuantitativas, como la di- fusión en resonancia magnética, que permite detectar el grado de movimiento de las moléculas de agua en el medio extracelular, condicionado por la cantidad de células o la integridad de las membranas. El acúmulo regional de agua en el ce- rebro se puede producir por edema, inflamación, desmielinización u otras causas. Esta técnica mide la autodifusión, que es el movimiento de agua entre otras moléculas de agua. Es importante des- tacar que en los tejidos biológicos no existe una di- fusión libre, ya que las membranas se presentan como obstáculos a la difusión, de modo que la di- fusión del agua en los tejidos se mide como difu- sión aparente. La señal obtenida puede ser medida por medio del coeficiente de difusión apa- rente (ADC, Apparent Diffussion Coeficient). Cuando éste es calculado para cada píxel de la imagen se obtiene un mapa paramétrico, mapa de ADC, en el cual las áreas que no permiten la difu- sión aparecen en tonos azules, mientras que las que tienen difusión libre aparecen en tonos rojos (Vallejo Desviat y cols., 2011). m Mapas de Transferencia de Magnetización Por otro lado, la transferencia de magne- tización (MT, Magnetization Transfer), se basa en 5Diagnóstico Noemí Esteras Gallego 83 el intercambio de magnetización entre los proto- nes libres (representados por el agua) y los inmó- viles, es decir, ligados a macromoléculas. Las biomoléculas que más agua acoplan son los fosfo- lípidos. El agua acoplada a biomoléculas se considera “invisible” ya que no transfiere magne- tización a otras moléculas, mientras que el agua libre sí lo hace. La transferencia de magnetización entre ellos se produce al aplicar un pulso de presa- turación (pulso MT) que hace que los protones del agua ligada intercambien su magnetización con la población de protones del agua libre, haciendo que la intensidad de la señal del agua libre des- cienda. El porcentaje de transferencia de magne- tización (% MT) se usa como parámetro de medida del fenómeno. Las medidas de % MT dependen del entorno químico y biofísico que rodea las ma- cromoléculas y sirven por lo tanto para medir in- directamente la estructura macromolecular del tejido en cuestión, indicando posibles cambios es- tructurales, por ejemplo, en el parénquima cere- bral (Grossman y cols., 1994). 5.2.2 Resonancia Magnética de Espectroscopía (MRS) La espectroscopía de resonancia magné- tica se diferencia de la de imagen en la manera de analizar las señales. En lugar de una imagen ana- tómica, se obtiene un espectro de componentes bioquímicos correspondientes a los principales metabolitos cerebrales. El hardware empleado es el mismo que para la obtención de imágenes de RM, de manera que es una técnica ampliamente utilizada. Los espectros se representan como grá- ficos compuestos por múltiples picos en los que el área bajo cada pico constituye la concentración re- lativa de una especie química dada. Los metaboli- tos se diferencian por su posición en el espectro, ya que su diferente composición química hace que su resonancia sea también diferente. Entre los me- tabolitos que permite detectar esta técnica en un volumen cerebral concreto destacan el N-acetil- Diagnóstico5 84 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 19. Ejemplo de imágenes de re- sonancia magnética pesadas en T1 (iz- quierda) y en T2 (derecha). Imagen tomada de la página web de la Asocia- ción Holandesa de Neurocirugía http://www.nvvn.org/. aspartato (NAA), cuya disminución se considera un marcador de muerte neuronal; el mioInositol (mI), característico de las células gliales; la colina (Cho), marcador de la integridad y la síntesis de membranas, que indica la concentración de pre- cursores de membrana como colina y fosfocolina; o la creatina (Cr), que suele ser el pico más estable y se considera como control de los demás meta- bolitos (Alvarez-Linera Prado y cols., 2003). Un ejemplo de un espectro se puede observar en la fi- gura 20. 5.2.3 MRI Y MRS en la EA En la EA, la MRI se emplea en primer lugar para detectar posibles lesiones intracraneales como tumores o hematomas, que puedan contri- buir a la demencia (Waldemar y cols., 2007). Ade- más, se usa para medir la atrofia del lóbulo tem- poral medial, característica que permite diferen- ciar con una gran sensibilidad y especificidad los pacientes con EA de los controles, y en algunos casos identificar pacientes con DCL que pueden desarrollar la enfermedad (Chincarini y cols., 2011; Westman y cols., 2011). Esta técnica también es útil para medir el volumen cerebral y de estructu- ras cerebrales específicas. En ese sentido, la atro- fia del hipocampo y de la corteza entorrinal y el ensanchamiento de los ventrículos son caracterís- ticas de los pacientes de EA que se pueden medir por MRI (Fleisher y cols., 2008; Nestor y cols., 2008). En cuanto a los metabolitos cuantificados empleando espectroscopía de resonancia magné- tica, el hallazgo más consistente es la reducción del pico de N-acetil-aspartato observado en dis- tintas regiones del cerebro, que puede dar idea de 5Diagnóstico Noemí Esteras Gallego 85 Figura 20. Ejemplo de un espectro ob- tenido por MRS. Se pueden distinguir tres metabolitos característicos: NAA, Cr y Cho. la muerte neuronal (Kantarci, 2007). En relación a las técnicas cuantitativas, existen evidencias de que el coeficiente de difusión aparente se incre- menta en la enfermedad (Back y cols., 2003; Clerx y cols., 2012), mientras que la transferencia de magnetización es menor (Ginestroni y cols., 2009; Kiefer y cols., 2009). 5.2.4 Técnicas de neuroimagen funcional Las técnicas de neuroimagen funcional también son muy interesantes desde el punto de vista diagnóstico. Destaca la tomografía por emi- sión de positrones, PET (Positron Emission Tomo- graphy), que es capaz de medir la actividad metabólica de los tejidos tras detectar la distribu- ción que adopta en ellos un radiofármaco de vida media ultracorta tras ser administrado por vía in- travenosa. En el caso de la EA, la administración de fluorodeoxiglucosa permite medir el metabo- lismo de glucosa en el cerebro y distinguir indivi- duos control de pacientes, ya que éstos últimos presentan menor consumo de glucosa en la región temporal-parietal (Mosconi, 2005; Jagust y cols., 2007). Otro ligando que puede emplear el PET es el 11C-PiB, que se usa para visualizar Aβ in vivo. Una mayor retención de este ligando se relaciona con la EA (Forsberg y cols., 2010). 5.3 Marcadores en fluídos biológicos Por último, la búsqueda de marcadores en fluidos biológicos también es de gran interés. El lí- quido cefalorraquídeo, caracterizado por su com- posición constante y su estrecha relación con el sistema nervioso, ha centrado una buena parte de la búsqueda de marcadores diagnósticos. Los re- sultados destacan que la disminución en la con- centración de Aβ42 y el incremento de tau total o fosforilada en este fluido permiten diferenciar a los pacientes de los controles (Mattsson y cols., 2009; Tapiola y cols., 2009; Seppala y cols., 2012). Tam- bién se han encontrado potenciales marcadores periféricos en fluidos más fácilmente accesibles como el plasma, en el que además de Aβ se han encontrado otros marcadores, entre ellos algunos relacionados con estrés oxidativo e inflamación (Kim y cols., 2011; Song y cols., 2011; Torres y cols., 2011). La medición de los niveles de Aβ42 en saliva también puede considerarse un biomarcador pe- riférico potencial (Bermejo-Pareja y cols., 2010). Por estos motivos, algunos autores piden una revisión de los criterios del NINCDS-ADRDA para que, además del diagnóstico clínico, sea ne- cesaria la presencia al menos, de uno de los mar- cadores mencionados con anterioridad (cambios volumétricos medidos con MRI, alteraciones me- tabólicas medidas con PET o marcadores en el lí- quido cefalorraquídeo) (Dubois y cols., 2007). En los últimos años, la iniciativa ADNI (Alzheimer’s Di- sease Neuroimaging Initiative) está realizando un Diagnóstico5 86 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer estudio longitudinal multicéntrico a nivel mundial para la búsqueda de marcadores para el diagnós- tico precoz y seguimiento de la EA (Weiner y cols., 2012). 5Diagnóstico Noemí Esteras Gallego 87 6Tratamiento y perspectivas terapéuticas Noemí Esteras Gallego 89 El hallazgo de un tratamiento eficaz que detenga o ralentice la progresión de la EA sigue siendo uno de los objetivos más importantes de la investigación contra esta enfermedad. En la ac- tualidad, solamente existen cinco fármacos apro- bados por la FDA (Food and Drug Administration) y la Agencia Europea del Medicamento (EMA, Euro- pean Medicines Agency) para el tratamiento de la EA, aunque están en marcha numerosos ensayos clínicos con fármacos que actúan en distintos me- canismos implicados en su patogénesis. 6.1 Tratamientos aprobados en la actualidad m Inhibidores de la acetilcolinesterasa El objetivo de estos fármacos es comba- tir el déficit colinérgico impidiendo la degradación de la acetilcolina en el espacio sináptico. La tacrina fue el primer inhibidor de la acetilcolinestarasa (AchEI) aprobado por la FDA en 1993, sin em- bargo, está en desuso por su hepatotoxicidad (Watkins y cols., 1994). Posteriormente se apro- baron otros tres AchEI, cada uno de ellos con un mecanismo de acción diferente: donepezilo (1997), el más prescrito en la actualidad; rivastig- mina (2000) y galantamina (2001) (Fan y Chiu, 2010). En general, el análisis de numerosas revi- siones de la última década señala que estos fár- macos tienen un efecto positivo en la cognición, el comportamiento y las actividades de la vida diaria en pacientes con EA leve a moderada, mejorando su calidad de vida y la de sus cuidadores. En alguno de estos pacientes incluso se encontró una mejora en las funciones cognitivas tras 1 o 2 años de tera- pia, revisado en (Martorana y cols., 2010). En ge- neral, muchos estudios apuntan que estos tratamientos son altamente coste-efectivos (Get- sios y cols., 2010; Hartz y cols., 2012), aunque el coste-efectividad a largo plazo es un tema contro- vertido (Keller y cols., 2011; Versijpt, 2012). m Antagonistas de los receptores NMDA El último de los fármacos aprobados hasta el momento es la memantina. Es un anta- gonista de los receptores ionotrópicos NMDA de glutamato, que actúa impidiendo la sobreestimu- lación de los mismos y protegiendo a las neuronas de la excitotoxicidad mediada por calcio (Lipton, 2005; Blanchard y cols., 2008). El fármaco se aprobó en 2003 para el tra- tamiento de la EA moderada y severa, tanto en monoterapia como en combinación con donepe- zilo (Emre y cols., 2008). Numerosos estudios han mostrado su eficacia en la mejora de las funciones cognitivas y de comportamiento (Thomas y Gross- berg, 2009; Lo y Grossberg, 2011). Otras revisiones también consideran el fármaco coste-efectivo (An- tonanzas y cols., 2006; Rive y cols., 2010). 6.2 Estrategias terapéuticas en estudio 6.2.1 Estrategias para prevenir la producción de Aβ m Inhibidores de la β-secretasa La β-secretasa (BACE1) es la primera pro- teasa que participa en la vía amiloidogénica, de modo que su inhibición podría prevenir la forma- ción de Aβ y favorecer la vía no amiloidogénica. La inhibición directa de la enzima es problématica, debido a la gran cantidad de sustratos fisiológicos que tiene, incluído uno implicado en la mieliniza- ción (Klaver y cols., 2010). De momento, sólo un fármaco, CTS-21166, ha llegado a la fase I de los ensayos clínicos, revisado en (Ghosh y cols., 2012). La modulación indirecta de la β-secretasa podría ser una alternativa, y es posible a través de mecanismos que incluyen al receptor nuclear PPARγ (Peroxisome Proliferator-Activated Recep- tor). Cuando éste se estimula, se reduce la expre- sión de BACE1 y por lo tanto de APP (d’Abramo y cols., 2005; Sastre y cols., 2006a). Debido al im- portante papel de PPARγ en el metabolismo de lí- pidos y glucosa, es una importante diana en el tratamiento de la diabetes tipo II, y en ese sentido se han desarrollado fármacos como la rosiglita- zona. Experimentos con este fármaco en ratones muestran efectos beneficiosos en EA (Escribano y cols., 2010), pero no se ha demostrado la misma eficacia en ensayos clínicos en los que se emplea este fármaco sólo, o en combinación con AchEI (Gold y cols., 2010; Harrington y cols., 2011). Tratamiento y perspectivas terapéuticas6 90 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer m Inhibidores de la γ-secretasa En este caso, el objetivo es impedir la for- mación de β-amiloide inhibiendo la acción de la úl- tima enzima encargada de su procesamiento, la γ-secretasa. Esta enzima también es parte esen- cial de la ruta de señalización de Notch, implicada en procesos de diferenciación celular (Kopan y Ila- gan, 2009), por lo que el principal obstáculo es en- contrar inhibidores de γ-secretasa que no interfieran con Notch para evitar los efectos tóxi- cos que supone su inhibición (Searfoss y cols., 2003; Wong y cols., 2004). El ensayo clínico más reciente con un inhibidor de la γ-secretasa (sema- gacestat) completó con éxito la fase II, pero se detuvo en la fase III cuando se observó un empeo- ramiento de los pacientes, al parecer por toxicidad en las sinapsis (http://www.alzforum.org/). Algunas drogas, en concreto algunos an- tiinflamatorios no esteroideos, son capaces de modular la γ-secretasa y disminuir la producción de Aβ42 favoreciendo la producción de formas más cortas (Eriksen y cols., 2003). El primero de este tipo de fármacos en ensayo clínico fue taren- flurbil (R-flurbiprofeno), aunque no mostró efec- tos beneficiosos en fase III (Green y cols., 2009). En la actualidad, una amplia gama de este tipo de compuestos están en estudio, revisado en (Wolfe, 2012). m Inmunoterapia Inmunoterapia activa La inmunoterapia activa consiste en la ad- ministración del péptido Aβ sintético o un frag- mento del mismo para inducir la producción de anticuerpos anti-Aβ que eliminen Aβ del cerebro. La primera aproximación exitosa a este tipo de te- rapias se produjo en 1999, cuando la inmunización con Aβ de un ratón transgénico PDAPP produjo una disminución de las placas y de la distrofia de las neuritas (Schenk y cols., 1999). En humanos, el primer ensayo clínico con este tipo de vacunas (AN1792) mostró efectos adversos como menin- goencefalitis en un 6% de los pacientes, por lo que fue abandonado (Senior, 2002). Desde entonces, la segunda generación de vacunas intenta evitar estos efectos adversos y ha mostrado disminuir las placas y el amiloide insoluble en el cerebro, pero no el soluble o los oligómeros (Kim y cols., 2004). Inmunoterapia pasiva Consiste en la administración de un anti- cuerpo monoclonal que se une a Aβ y permite au- mentar su eliminación del cerebro. En general, los estudios en ratones transgénicos con este tipo de terapia muestran una disminución en el número de placas y una mejora en el déficit cognitivo (Bard y cols., 2000; Wilcock y cols., 2004). En humanos, la inmunoterapia pasiva con bapineuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado contra Aβ, ha 6Tratamiento y perspectivas terapéuticas Noemí Esteras Gallego 91 mostrado en fase II reducir la carga de Aβ en el ce- rebro, aunque algunos pacientes han desarrollado edemas vasculares y microhemorragias. De mo- mento, aún no ha mostrado beneficios cognitivos (Panza y cols., 2011; Panza y cols., 2012). Solane- zumab es otro anticuerpo monoclonal que actual- mente se encuentra en fase III. Los beneficios cognitivos que mostró en ratones, su capacidad para neutralizar selectivamente especies solubles de Aβ y la ausencia de efectos adversos en fase II, hacen de esta vacuna un fármaco prometedor (Sa- madi y Sultzer, 2011; Imbimbo y cols., 2012). En la actualidad, existen más de diez vacunas en diver- sas fases de los ensayos clínicos, revisado en (Del- rieu y cols., 2012). 6.2.2 Otras estrategias Además de los antiinflamatorios mencio- nados en el capítulo correspondiente, las siguien- tes dianas también son potenciales estrategias terapéuticas contra la EA. m Tau Se han diseñado estrategias dirigidas con- tra las quinasas responsables de la fosforilación de tau, entre ellas GSK3β y Cdk5 (Lopez-Tobon y cols., 2011). Aunque algunos compuestos como el ácido valproico (aintiepiléptico) y el litio mostraron inhi- bir la GSK3, los ensayos se abandonaron por los efectos colaterales en un caso y por no reducir la fosforilación de tau en el segundo caso (Hampel y cols., 2009; Tariot y Aisen, 2009). En la actualidad está en fase III el methylen blue (Fan y Chiu, 2010), un compuesto que en estudios preclínicos mostró una mejora de los niveles cognitivos y una reduc- ción de los niveles de Aβ y tau (Medina y cols., 2011; Congdon y cols., 2012). Las vacunas contra tau han mostrado re- sultados satisfactorios en ratones (Chai y cols., 2011). m Antioxidantes Algunos estudios epidemiológicos han mostrado que el consumo de antioxidantes como vitamina C o E, carotenos, flavonoides o polifeno- les en la dieta se asocia con un menor riesgo de desarrollar alzhéimer (Devore y cols., 2010; Craggs y Kalaria, 2011). Los primeros estudios con extractos de Ginkgo Biloba, un conocido antioxidante, mostra- ron efectos positivos sobre la cognición, el apren- dizaje y la memoria, sin embargo, ensayos clínicos recientes no han mostrado diferencias entre Ginkgo Biloba y placebo (Birks y cols., 2002; Snitz y cols., 2009). La curcumina, una especia del curry, ha mostrado en estudios con animales disminuir la patología de Aβ y el estrés oxidativo (Lim y cols., 2001). Sin embargo, los resultados de los ensayos clínicos no avalan estas observaciones (Hamagu- chi y cols., 2010). Lo mismo sucede con el ácido Tratamiento y perspectivas terapéuticas6 92 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer docosahexaenoico, un ácido graso poliinsaturado omega 3. Los estudios en animales mostraron re- ducir la inflamación, el estrés oxidativo y la pato- logía Aβ (Lim y cols., 2005), sin embargo, los ensayos clínicos no han mostrado esos beneficios (Jicha y Markesbery, 2010). El consumo moderado de vino tinto, también se asoció con un menor riesgo de alzhéimer. Este efecto podría estar me- diado por el resveratrol, un polifenol que ha mos- trado efectos neuroprotectores en modelos animales y celulares (Vingtdeux y cols., 2008; Ca- piralla y cols., 2012). m Calcio Además de la memantina, antagonista de los receptores NMDA, existen numerosos poten- ciales tratamientos que se dirigen al resto de ca- nales de calcio, revisado en (Yu y cols., 2009a). Entre otros, se ha estudiado la eficacia de los blo- queantes de canales de calcio dependientes de voltaje, que en la actualidad se emplean para el tratamiento de la hipertensión. El nimodipino pa- rece mejorar la función cognitiva en algunos estu- dios, aunque hasta la fecha no hay ensayos clínicos exhaustivos (Lopez-Arrieta y Birks, 2002). El isra- pidino es otro bloqueante que in vitro ha mostrado buenos resultados (Anekonda y Quinn, 2011). Dan- trolene, un antagonista del receptor de rianodina, mejora la cognición en un modelo murino de EA (Peng y cols., 2012). Otros fármacos como los an- tiinflamatorios indometacina, ibuprofeno o R-flur- biprofeno protegen a las neuronas de la toxicidad por Aβ inhibiendo la sobrecarga de calcio en la mi- tocondria (Sanz-Blasco y cols., 2008). m Estatinas A pesar de los buenos resultados de los estudios epidemiológicos, los ensayos clínicos con estatinas muestran resultados contradictorios (Shepardson y cols., 2011b; Shepardson y cols., 2011a). Aunque algunos ensayos clínicos han mos- trado beneficios en las funciones cognitivas tras el tratamiento con simvastatina o atorvastatina, (Sparks y cols., 2005; Carlsson y cols., 2008) otros ensayos recientes no lo hacen (Feldman y cols., 2010; Sano y cols., 2011). m Ciclo celular Los objetivos de este tipo de tratamiento serían evitar la transición G1/S o la replicación del ADN. En el primer caso se engloban los inhibidores de Cdks. Muchos de ellos ya existen para el trata- miento contra el cáncer. Hasta el momento, los ensayos con flavopiridol, olomucina y roscovitina han mostrado ser neuroprotectores en estudios in vitro, aunque ninguno de ellos se ha probado en modelos animales (Verdaguer y cols., 2003; Pallas y cols., 2005; Alvira y cols., 2007; Hilton y cols., 2008; de la Torre y cols., 2012). En el segundo caso, los inhibidores de la ADN polimerasa b como el ácido litocólico o la dedioxicitidina podrían ser una diana potencial específica de la inhibición del ciclo 6Tratamiento y perspectivas terapéuticas Noemí Esteras Gallego 93 neuronal, aunque son necesarios más estudios que confirmen esta hipótesis (Copani y cols., 2008). Por otro lado, existen numerosos compuestos farma- cológicos potencialmente útiles en el alzhéimer y que indirectamente pueden modular el ciclo celu- lar. Por ejemplo, algunos componentes de la dieta como los ya mencionados curcumina o resveratrol, pueden ejercer sus efectos beneficiosos contro- lando el ciclo celular a través de la regulación de las Cdks (Meeran y Katiyar, 2008). Entre otros ex- tractos naturales destaca la epigallocatethina-ga- llato, un componente del té verde que ha mostrado actuar en la fase G0/G1 del ciclo (Snape y cols., 2009). En la actualidad, se encuentra lis- tado como inhibidor del ciclo celular en un ensayo clínico en fase III contra el alzhéimer http://clini- caltrials.gov/ct2/show/NCT00951834. La rosiglitazona y la pioglitazona, agonis- tas de PPARγ que modulan indirectamente la β- secretasa, también causan arresto en G0/G1 (Heaney y cols., 2003), al igual que algunas estati- nas como la simvastatina (Chan y cols., 2008; Wali y cols., 2009; Relja y cols., 2010). Hay que señalar que las estatinas, al inhibir la ruta del mevalonato, afectan a la isoprenilación de proteínas como Ras, que puede ser una inductora del ciclo celular en neuronas (Chang y cols., 2003). Los antinflamato- rios no esteroideos también han sido capaces de prevenir las alteraciones del ciclo celular en un mo- delo de ratón (Varvel y cols., 2009). Otros com- puestos que se han mostrado neuroprotectores en modelos animales y que producen arresto en G0/G1 son la vitamina A (ácido retinoico), la vita- mina D (calcitriol), los glucocorticoides o la taurina, entre otros, revisado en (Woods y cols., 2007). m Estimulación de la neurogénesis y trata- miento con células madre La neurogénesis es el proceso que com- prende la proliferación, migración y diferenciación de las células progenitoras neuronales en un tipo específico de neurona y su integración en el cir- cuito neuronal adulto (Laplagne y cols., 2006). Las poblaciones de células progenitoras neurales están presentes en nichos especializados del cere- bro, como la zona subventricular, el bulbo olfato- rio y el giro dentado del hipocampo (Mu y Gage, 2011). El proceso de neurogénesis disminuye con la edad, y con algunos estímulos como el estrés o la depresión, y se incrementa con la presencia de factores de crecimiento como NGF o BDNF (Brain- Derived Neurotrophic Factor), y con el tratamiento con antidepresivos o estrógenos, entre otros, re- visado en (Abdel-Salam, 2011). Existe controver- sia respecto a la neurogénesis en EA; mientras que algunos autores describen una disminución de la neurogénesis en pacientes y modelos animales, y lo consideran un evento temprano de la enferme- dad (Ziabreva y cols., 2006; Mu y Gage, 2011), otros autores encuentran una elevada neurogéne- sis que se interpreta como un intento de estable- cer un mecanismo de compensación contra la pérdida neuronal (Jin y cols., 2004; Chen y cols., Tratamiento y perspectivas terapéuticas6 94 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 2008; Yu y cols., 2009b). El estímulo de la neurogénesis podría ser, por lo tanto, una estrategia atractiva para movili- zar los precursores neuronales y hacer que pro- duzcan neuronas que permitan sustituir a las dañadas, principalmente en el hipocampo. La ga- lantamina, tacrina y memantina aprobadas para el uso de la EA, estimulan la neurogénesis en mode- los de ratón (Jin y cols., 2006), un proceso que puede estar mediado por BDNF (Leyhe y cols., 2008). Otras drogas en estudio in vitro son FK-960, SGS-111, piracetam o quercetina revisado en (Abdel-Salam, 2011). El transplante de células madre humanas establecidas también se está estudiando en mo- delos murinos. Algunos modelos (Yamasaki y cols., 2007; Xuan y cols., 2009) han mostrado que estas células transplantadas pueden sobrevivir, migrar y diferenciarse a neuronas colinérgicas, mostrando una mejora de las funciones cognitivas. En otros casos, la implantación de células madre puede ac- tuar por otros mecanismos, como incrementar la proliferación de los progenitores neuronales en- dógenos (Mahmood y cols., 2004; Munoz y cols., 2005), modular la neuroinflamación (Taupin, 2009) o estimular la producción de factores neurotrófi- cos como NGF o BDNF (Luo y cols., 2009). En cual- quier caso, aunque se necesitan más estudios para ver los efectos a largo plazo de este tipo de técni- cas, como la posibilidad de formación de tumores, pueden ser una estrategia interesante contra la pérdida neuronal. 6Tratamiento y perspectivas terapéuticas Noemí Esteras Gallego 95 Muchos de los estudios que se han reali- zado hasta la actualidad sobre la EA emplean ma- terial de autopsia de pacientes. Además de los problemas vinculados al uso de tejidos post-mor- tem, este tipo de muestras están en general aso- ciadas a la patología terminal y no permiten estudiar la progresión de la enfermedad. En algu- nas ocasiones también se puede emplear tejido nervioso de pacientes vivos obtenido por cirugía, pero la difícil accesibilidad complica este tipo de experimentos. Otros modelos alternativos para el estudio de la enfermedad a nivel celular y molecu- lar son los animales y las células periféricas de pa- cientes. 7.1 Modelos animales Durante los últimos veinte años, se han desarrollado un gran número de ratones transgé- nicos que sobreexpresan APP y/o presenilina, prin- cipalmente PS1, basándose en las mutaciones encontradas en los casos de alzhéimer familiar. Los ratones transgénicos desarrollan progresiva- mente muchas de las principales características de EA, como elevados niveles de Aβ, depósitos de amiloide, neuroinflamación, estrés oxidativo, glio- sis, pérdida sináptica y déficit cognitivo; sin em- bargo, ni los ovillos neurofibrilares ni la muerte neuronal son patentes en la gran mayoría de los modelos (Balducci y Forloni, 2011). 7Modelos de estudio de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 97 Para generar las líneas transgénicas se emplean las tres isoformas de APP humana (695, 751 y 770 hAPP), y se introducen mutaciones en- contradas en la enfermedad familiar, nombradas según el área geográfica en la que se descubrie- ron. Destacan la doble mutación Swedish (K670N, M671L) que aumenta la producción de Aβ; la mu- tación London (V717I) e Indiana (V717F) que au- mentan preferentemente la forma Aβ42; la mutación Arctic (E693G) que disminuye el proce- samiento por la α-secretasa; y la mutación Dutch (E693Q) que aumenta el ratio Aβ40/Aβ42, revi- sado en (Chin, 2011). Los diferentes promotores empleados permiten la expresión preferencial o exclusiva de hAPP en el SNC. Una manera de ace- lerar la deposición de placas es la co-transfección de APP y PS1 mutados. Las mutaciones en PS1 son de distintos tipos, destacando PS1(A246E), PS1(M146L) y PS1(M146V), y se combinan con las mutaciones en APP para generar diferentes tipos de modelos doble transgénicos. Un resumen de las características de estos ratones se encuentra en la tabla 1. A pesar de que presentan tau hiperfosfori- lada, estos modelos no desarrollan ovillos neurofi- brilares, de modo que para investigar su papel, se escogen modelos basados en mutaciones en tau, entre los que destaca el triple transgénico (3xTg) con mutaciones en APP, PS1 y tau (Oddo y cols., 2003). Otro de los aspectos claves de EA, la muerte neuronal, tampoco es evidente en la gran mayoría de modelos murinos, aunque sí se ha observado en algunos, como en el APP23 cuando los ratones alcanzan 14 meses de edad (Calhoun y cols., 1998). Otros modelos más “agresivos”, ratones que com- binan dos o tres mutaciones en APP y dos en PS1, como el 5FAD, han mostrado pérdida neuronal en el hipocampo en etapas más tempranas (Casas y cols., 2004; Oakley y cols., 2006). Aunque ninguno de los modelos repro- duce totalmente las características de la enferme- dad en humanos (algunos autores consideran que la vida del ratón es demasiado corta para poder hacerlo) estos modelos permiten estudiar muchos de los aspectos relacionados con la EA, así como valorar posibles tratamientos terapéuticos. El es- tablecimiento de líneas celulares neuronales o ex- traneuronales, o los cultivos primarios de neuronas y astrocitos a partir de estos ratones son técnicas muy útiles para el estudio de la enfermedad. Modelos de estudio de la enfermedad7 98 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 7Modelos de estudio de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 99 Tabla 1. Diferentes modelos de ratones transgénicos empleados en el estudio de la EA. Adaptado de (Chin, 2011). 7.2 Tejidos periféricos de pacientes El empleo de tejidos periféricos de pa- cientes de alzhéimer es una estrategia alternativa y complementaria que tiene múltiples ventajas, entre ellas, la fácil accesibilidad de las células y la posibilidad de obtenerlas en cualquier momento del curso de la enfermedad. Los principales tejidos periféricos que se emplean para el estudio de la EA son células sanguíneas, como linfocitos o plaque- tas, y fibroblastos (Etcheberrigaray y Ibarreta, 2001; Casoli y cols., 2008). El uso de este tipo de células se basa en estudios que hacen pensar que la EA también tiene manifestaciones sistémicas, aunque con menores repercusiones clínicas que en el cerebro (Blass y Gibson, 1992; Scott, 1993; Gas- parini y cols., 1998). Las células periféricas son útiles para comprender los mecanismos implicados en la pa- togénesis de la enfermedad ya que muchas de las alteraciones encontradas en los cerebros de los pa- cientes y en modelos transgénicos aparecen tam- bién en células periféricas. En linfocitos, por ejemplo, se han mostrado alteraciones en el ciclo celular (Urcelay y cols., 2001; Zivkovic y cols., 2010; Stieler y cols., 2012), estrés oxidativo y alteracio- nes mitocondriales (Gibson y Huang, 2002; Leuner y cols., 2007; Sultana y cols., 2011), en la homeos- tasis del calcio (Eckert y cols., 1997; Ibarreta y cols., 1997; Nelson y cols., 2010) o alteraciones en genes relacionados con la producción de Aβ y el proce- samiento de tau (Maes y cols., 2007). Además, existe una estrecha relación entre el estado del sis- tema inmune (principalmente los linfocitos) y las enfermedades neurodegenerativas (Schwarz y cols., 2001; Pellicano y cols., 2012). Por estos mo- tivos, algunos autores afirman que existe una co- municación bidireccional entre el sistema nervioso central y el inmune a través de un complejo meca- nismo que engloba hormonas, citoquinas y neuro- transmisores (Gladkevich y cols., 2004). Por ejemplo, existen receptores de neurotransmisores y factores de crecimiento como BDNF o NGF, entre muchos otros, que se expresan tanto en neu- ronas como en linfocitos, revisado en (Gladkevich y cols., 2004). En cualquier caso, es necesario eva- luar adecuadamente los resultados obtenidos en estos tipos celulares, ya que los fenómenos obser- vados en estos tejidos no son siempre necesaria- mente extrapolables al sistema nervioso. Los fibroblastos, por su parte, también muestran alteraciones en la homeostasis del cal- cio (Palotas y cols., 2002), estrés oxidativo y alte- raciones mitocondriales (Wang y cols., 2008; Mendonsa y cols., 2009), secreción de Aβ en fibro- blastos de pacientes de EA familiar (Johnston y cols., 1994) y alteraciones en el ciclo celular (Tate- bayashi y cols., 1995). Además, son la base de un nuevo modelo para el estudio de la enfermedad, como son las células madre con pluripotencialidad inducida (iPSC, Induced Pluripotent Stem Cells). Modelos de estudio de la enfermedad7 100 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 7Modelos de estudio de la enfermedad Noemí Esteras Gallego 101 Estas células se consiguen reprogramando los fi- broblastos de pacientes hasta un estado indife- renciado por medio de la transfección mediada por retrovirus de distintos factores de transcripción. Posteriormente, las iPSC son diferenciadas a neu- ronas y, en el caso de la EA, han mostrado repro- ducir las características de la enfermedad (Yagi y cols., 2011; Israel y cols., 2012). También es posi- ble obtener iPSCs a partir de linfocitos inmortali- zados con el virus de Esptein-Barr (Choi y cols., 2011; Rajesh y cols., 2011). Aunque se ha conse- guido diferenciar estas células a tejido neuronal, de momento no existen estudios sobre la EA en iPSCs obtenidas de células sanguíneas (Rajesh y cols., 2011). El principal problema de la obtención de iPSCs es que es un proceso largo que se asocia con tumorogénesis e inestabilidad del ADN. Por ello, se está trabajando en la conversión directa de fi- broblastos a células neuronales sin necesidad de pasar primero por el estado pluripotente. Qiang y cols. han logrado generar las llamadas hiN (Human-Induced Neuronal Cells) a partir de fibro- blastos de pacientes de EA portadores de una mu- tación en presenilina, mediante co-transducción viral de distintos factores de transcripción en pre- sencia de factores de crecimiento neuronales. Las hiN obtenidas muestran el perfil de las neuronas glutaminérgicas de la corteza y un incremento en el cociente Aβ42/40 en consonancia con la patolo- gía de la EA (Qiang y cols., 2011). En conjunto, estos trabajos ponen de ma- nifiesto el gran potencial de la reprogramación ce- lular para obtener modelos neuronales para el estudio de la EA, así como para evaluar la eficacia de los tratamientos farmacológicos. Objetivos 2 El objetivo general de esta tesis ha sido profundizar en el estudio de los mecanismos que regulan los procesos de proliferación/superviven- cia/muerte celular en la enfermedad de Alzheimer. La muerte neuronal es una de las características más importantes de la EA, sin que hasta el mo- mento se conozcan por completo las causas que producen la pérdida selectiva de neuronas en zonas específicas del cerebro. En una enfermedad tan compleja como la EA, los síntomas y el diag- nóstico se producen cuando ya existe una pérdida neuronal significativa. Sin embargo, existen evi- dencias que indican que las características neuro- patológicas de la enfermedad comienzan a aparecer mucho antes en la vida del paciente y que en ellas influyen distintos factores tanto genéticos como ambientales. La respuesta celular a estos es- tímulos estresantes no es exclusiva de las neuro- nas, sino que, como indican numerosos trabajos, el SNC y el sistema inmune se ven afectados de forma similar por procesos dependientes de la EA. Este hecho ha llevado a emplear los linfocitos de pacientes, fácilmente accesibles, como modelo de estudio de las diferentes características fisiopato- lógicas de la EA. Entre otras, cobran cada vez más importancia las alteraciones en el control del ciclo celular como responsables de la muerte neuronal y del desarrollo de la enfermedad. Por este motivo, la hipótesis de trabajo de nuestro laboratorio se centra en estudiar los mecanismos de regulación del ciclo celular y de la apoptosis en la EA. Para Objetivos Noemí Esteras Gallego 105 este trabajo, uno de los modelos de la enfermedad que empleamos son linfocitos inmortalizados de pacientes con EA de aparición tardía y de indivi- duos no afectados de edades similares. Creemos que esta estrategia puede ser de gran interés, ade- más de por la fácil accesibilidad de las células, por- que conocer los factores responsables del fallo en los mecanismos de control del ciclo asociados a la enfermedad, puede ser útil para desarrollar posi- bles estrategias que impidan que las neuronas en- tren en ciclo, o provocar la detención del mismo en un punto en el que aún sea posible la rediferen- ciación. Por otro lado, es interesante conocer el proceso de apoptosis en estas células ya que puede ofrecer información que sirva para desarro- llar estrategias neuroprotectoras. Por último, sería de gran interés el hallazgo de alteraciones mole- culares que fuesen exclusivas de la EA y que pu- dieran servir de biomarcador para el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad. Además, otro de los modelos de la EA que hemos empleado para la realización de este tra- bajo son los ratones transgénicos APP/PS1, que expresan mutaciones basadas en la enfermedad familiar y que nos han permitido estudiar simultá- neamente las alteraciones del ciclo celular en cé- lulas periféricas como los linfocitos, y en tejido cerebral, en un intento de demostrar las manifes- taciones sistémicas en un modelo murino de la en- fermedad y validar el uso de células extraneurales para el estudio de la patología de la EA. La primera parte de esta tesis se enmarca dentro de trabajos previos del laboratorio, que mostraron alteraciones en la actividad prolifera- tiva y la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en linfocitos inmortalizados de pacientes de EA. En concreto, se había descrito una mayor res- puesta proliferativa y también una mayor resis- tencia a la muerte por apoptosis tras la privación de suero en las células de EA, que se relacionaron con alteraciones en los niveles de dos proteínas re- guladoras del ciclo celular: p27 en el primer caso y p21 en el segundo (Muñoz y cols., 2008; Bartolomé y cols., 2010). La vía Ca2+/calmodulina (CaM) apa- recía como la responsable de la regulación de ambas proteínas, a través de la interacción con otras vías de señalización celular, como la de fos- fatidilinositol 3-quinasa/Akt (PI3K/Akt) o la de MAPK. En esta tesis se ha profundizado en el es- tudio de los mecanismos moleculares que regulan estos procesos. Los objetivos concretos que se han perse- guido son los siguientes: 1.- Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en cé- lulas extraneurales de pacientes de EA, profundi- zando en los siguientes aspectos: 1.1.- Regulación del contenido celular de calmodulina. 1.2.- Interacción de la vía Ca2+/CaM con la ruta PI3K/Akt en el control de la actividad Objetivos 106 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer proliferativa. 1.3.- Interacción de la vía Ca2+/CaM con la ruta MAPK para la regulación del conte- nido celular de p21 en el control de la vul- nerabilidad frente a la retirada de suero. 2.- Estudio simultáneo de las alteraciones del ciclo celular en cerebro y células periféricas en el modelo transgénico de EA APP/PS1. 3.- Caracterización por técnicas de Reso- nancia Magnética de Imagen y de Espectroscopía del ratón APP/PS1. Objetivos Noemí Esteras Gallego 107 Materiales y Métodos 3 El grueso de los materiales y métodos emple- ados en la realización de este trabajo se exponen en los artículos correspondientes (1-5). En la pre- sente sección describimos con más detalle dos apartados. El primero de ellos se centra en los mo- delos celulares y animales que hemos empleado en los distintos artículos: por un lado, células peri- féricas de pacientes (linfocitos inmortalizados con el virus de Epstein-Barr) y por otro lado, un modelo transgénico murino, el APP/PS1. En el segundo apartado se detallan las técnicas empleadas en los estudios de resonancia magnética. 1.1 Células periféricas de pacientes 1.1.1 Obtención de las líneas linfoblásticas La obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de pacientes e indivi- duos control se realizó separando los componen- tes de la sangre total por medio de un gradiente de densidad en Ficoll (LymphoprepTM, Axis-Shield PoC AS, Oslo, Noruega). Este método permite se- parar las células mononucleares por la diferencia de densidad que existe entre éstas y los demás componentes sanguíneos. Las células obtenidas a partir de 10 mL de sangre de cada individuo se cul- tivaron en suspensión, a una concentración inicial de 1 x 106 células x mL-1 en frascos de cultivo de 25 cm2 en posición vertical. El medio de cultivo utili- zado, al que nos referiremos de ahora en adelante como medio de cultivo, fue RPMI-1640 (Invitro- 1Modelos celulares y animales Noemí Esteras Gallego 111 gen), suplementado con L-glutamina 2mM, 100 mg/mL de penicilina/estreptomicina (Invitrogen) y, a menos que se indique lo contrario, 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) (Invitrogen). Las líneas celulares linfoblásticas se establecieron infectando los linfocitos con el virus de Epstein-Barr, obtenido a partir de una línea celular de linfoma de Burkitt (B95-6) cedida por Longina Akhtar (NIH, Be- thesda, EEUU). La población de CMSP obtenida anteriormente se puso en cultivo con una alícuota del virus de Epstein-Barr, 5 mg/mL del mitógeno Pokeweed (Sigma), específico de células B, y 1 mg/mL de ciclosporina, para evitar la activación de los linfocitos T presentes en la población que pu- dieran impedir la proliferación inicial de los linfo- citos B infectados. En las siguientes 4 semanas se cambió el medio de cultivo de las células una o dos veces por semana hasta la aparición de los prime- ros clones linfoblásticos, y, una vez transformadas, las células se dividieron creciendo en suspensión, y cuando se obtuvo la cantidad suficiente se conge- laron en nitrógeno líquido, en 1 mL del medio de cultivo antes descrito con 7,5% de dimetilsulfóxido (DMSO). Para trabajar con las líneas linfoblásticas, las células se descongelaron, se retiró el medio con DMSO, se resuspendieron en aproximadamente 8 mL de medio de cultivo, en frascos de cultivo de 25 cm2 dispuestos en posición vertical y se mantu- vieron en un incubador húmedo, con 5% de CO2 y a 37º C, cambiando el medio de manera rutinaria dos veces por semana. 1.1.2 Características, diagnóstico y selección de los pacientes Las líneas linfoblásticas empleadas en este trabajo se han obtenido de personas sanas y de personas diagnosticadas de probable enferme- dad de Alzheimer de aparición tardía siguiendo los criterios NINCDS-ADRDA. El diagnóstico de los pacientes de EA y la selección de los individuos sanos los llevó a cabo el Dr. Félix Bermejo, del Ser- vicio de Neurología del Hospital Doce de Octubre de Madrid. La extracción de sangre de todos ellos se llevó a cabo en este Servicio, previa firma del consentimiento informado por parte de los do- nantes o de sus familiares cuando las circunstan- cias lo requirieron. Se establecieron aproximadamente 50 lí- neas linfoblásticas de pacientes de EA esporádica, o de aparición tardía y 50 líneas de individuos no dementes de edad aproximada. Un primer grupo de ellas, englobando 20 pacientes sanos y 20 pa- cientes de EA, de grado moderado-grave, se em- pleó para la realización de los experimentos de los artículos 1 y 2 y de los anexos 1 y 3. Posterior- mente, se obtuvo un segundo grupo de líneas ce- lulares, que han sido empleadas en los experimentos del artículo 3 y el anexo 2, englo- bando 23 sujetos sanos y 34 pacientes de EA. Las tablas 2 y 3 recogen las principales características de ambos grupos. La respuesta celular a la esti- mulación por suero o a la retirada del mismo no se vio afectada por la transformación celular reali- Modelos celulares y animales1 112 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer zada con preparaciones distintas del virus de Es- pein-Barr. 1.2 Modelo animal de la enfermedad: ratón APP/PS1 Los ratones empleados en la realización de esta tesis han sido proporcionados por la Dra. Eva Carro, del Laboratorio de Neurociencias del Instituto de Investigación del Hospital Doce de Oc- tubre de Madrid, grupo con el que hemos colabo- rado en la realización de los artículos 4 y 5. El modelo empleado, APP/PS1, es un cruce entre el ratón Tg2576, que sobreexpresa la APP humana 695 con la doble mutación sueca 1Modelos celulares y animales Noemí Esteras Gallego 113 Tabla 2. Características demográficas de los sujetos implicados en la generación del primer grupo de líneas celulares. La edad se expresa como media±error estándar. V:varón; M:mujer; n: número de sujetos. Tabla 3. Características demográficas de todos los sujetos implicados en la generación del segundo grupo de líneas celula- res. La edad se expresa como media±error estándar. V:varón; M:mujer; n: número de sujetos. Se consideró EA leve cuando la puntuación alcanzada en el test MMSE fue entre 18-24), EA moderada (MMSE entre 10-18) y EA grave (MMSE <10). (K670N, M671L) y el ratón PS1, que porta la muta- ción (M146L) en PS1, ambos basados en el feno- tipo C57BJ6. El ratón APP/PS1 resultante se emplea muy habitualmente como modelo trans- génico de la EA, ya que expresa suficientes niveles de APP humana y Aβ para garantizar el depósito de amiloide (Antequera y cols., 2009), que se pro- duce de forma progresiva en la corteza y el hipo- campo de estos ratones, comenzando a las 8 semanas de edad (Holcomb y cols., 1998; Kurt y cols., 2001). Además, a partir de los 6-9 meses, estos ratones muestran signos de muerte celular por apoptosis en el hipocampo y la corteza (Yang y cols., 2008; Spuch y cols., 2010). Los animales que hemos empleado tenían una edad de 12 meses, y, como control, hemos uti- lizado ratones C57BJ6 de la misma edad. Modelos celulares y animales1 114 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Los estudios de resonancia magnética en los ratones APP/PS1 se llevaron a cabo en el Servi- cio de Imagen y Espectroscopía por Resonancia Magnética de Alto Campo (SIERMAC), dirigido por el Profesor Sebastián Cerdán, en el Instituto de In- vestigaciones Biomédicas “Alberto Sols” (CSIC/UAM) de Madrid. Los experimentos se realizaron en un es- cáner de resonancia magnética de Alto Campo Bruker Pharmascan® (Burker Medical Gmbh, Et- tlingen, Alemania) con un imán horizontal de 7.0 Tesla y 16 cm de diámetro, equipado con un reso- nador de volumen selectivo para 1H de 23 mm de diámetro y un inserto de gradiente de 90 mm de diámetro (con una intensidad máxima de 30 G/cm). Todos los datos se adquirieron con una con- sola Hewlett-Packard mediante el programa Pa- ravision v 5.1 operando sobre una plataforma Linux. Los ratones fueron pre-anestesiados por inhalación empleando un porcentaje de 97%/3% de oxígeno/isofluorano con el animal situado en el interior de una cámara de plexiglass. Posterior- mente se introdujo el ratón en el resonador y se mantuvo anestesiado durante todo el ensayo ad- ministrando una mezcla de 98%/2% de oxígeno/isofluorano (1 mL/min) a través de una mascarilla nasal. La temperatura del animal se mantuvo constante a 37 ºC con una manta térmica de agua. La tasa respiratoria y la temperatura cor- poral se monitorizaron durante todo el proceso 2Técnicas de resonancia magnética Noemí Esteras Gallego 115 usando un monitor fisiológico Biotrig (Bruker, Me- dical Gmbh, Ettlingen, Alemania). La figura 21 muestra una foto del proceso. Para cada animal se tomaron diversos tipos de imágenes, mapas y datos que se enumeran a continuación. Técnicas de resonancia magnética2 116 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 21. Escáner de Resonancia Magnética. A la izquierda y arriba a la derecha se observa el escáner de Resonancia Mag- nética para pequeños animales que se ha empleado en nuestros estudios. En la imagen ampliada se muestra la disposición del ratón antes de introducirse en el aparato, y se aprecia la mascarilla nasal que le suministra la anestesia durante todo el pro- ceso. 2.1 RESONANCIA MAGNÉTICA DE IMAGEN (MRI) 2.1.1 Obtención de las imágenes m Imágenes pesadas en T2 Adquirimos para cada ratón un total de 16 imágenes pesadas en T2 que empleamos en los es- tudios estructurales y volumétricos. Las imágenes fueron adquiridas por secuencias de eco de espín rápido con los siguientes parámetros de adquisi- ción: TR = 2500 ms, TE=60 ms, factor RARE =8, FOV = 23mm, matriz de adquisición = 256 x 256, grosor de cada corte = 1 mm, número de cortes 16. Brevemente, cada secuencia se compone de dis- tintos estímulos o pulsos de radiofrecuencia que el tejido absorbe y emite cuando el impulso cesa. Es necesario realizar varios pulsos para poder carac- terizar los tejidos, de modo que el tejido emite tras cada pulso una radiofrecuencia que se denomina eco. El parámetro TR se corresponde con el tiempo de repetición, es decir el intervalo transcurrido entre cada pulso de radiofrecuencia mientras que TE es el tiempo de eco, es decir, el intervalo entre la aplicación de cada pulso de radiofrecuencia y la emisión del eco. Estos parámetros se modifican para conseguir contraste entre los tejidos. Valores altos de TR y TE permiten obtener información predominantemente sobre el T2. La matriz de ad- quisición representa la imagen completa de cada corte y está formada por un determinado número de filas de píxeles. El parámetro campo de visión (FOV, Field of View) se relaciona con el tamaño de la imagen, de manera que para obtener una reso- lución alta interesa que la relación FOV/matriz sea lo menor posible. En general, es necesario realizar una repetición para llenar una fila de píxeles de cada imagen, pero la Adquisición Rápida con Re- alce de la Relajación (RARE, Rapid Adquisition with Relaxation Enhancement) es un tipo de secuencia de eco de espín rápido que permite realizar menos repeticiones para conseguirlo. Un factor RARE de 8 significa que se llenan 8 filas por cada tiempo de repetición. m Mapas de ADC Los mapas de ADC se obtuvieron a partir de imágenes potenciadas en difusión de agua. Las se- cuencias de difusión se basan en la secuencia con- vencional de eco de espín pesada en T2 de Stejeskal-Tanner en la que se aplican gradientes de difusión. En los estudios de difusión se aplican varios valores de b (factor gradiente de secuencia de pulso) con los que se quiere ponderar la ima- gen, incluyendo un valor b=0, es decir, sin ponde- ración y se obtiene un grupo de imágenes para cada uno. Los parámetros empleados fueron TR = 3000 ms, TE=51 ms, duración del gradiente de di- fusión = 16 ms, dirección del gradiente de difusión : izquierda-derecha, FOV = 38 mm, matriz de ad- quisición = 128 x 128, valores de b = 100,200,300,500,800 y 1200 s/mm2. Después se obtienen los mapas de ADC, calculando el valor de ADC (expresado en mm2/s ) para cada vóxel, por 2Técnicas de resonancia magnética Noemí Esteras Gallego 117 medio de un ajuste lineal de la función Ib=Ioe-ADC·b, donde Ib es la intensidad de la señal para un valor b dado e I0 la intensidad de la señal cuando b=0. El mapa de ADC se representa como una imagen en una escala de colores que refleja la difusión de las moléculas de agua. Obtuvimos un total de 5 cortes para cada ratón. m Mapas de MT Los mapas de MT se obtuvieron a partir de dos secuencias idénticas de eco de espín, en las que se aplicaba, M(t) , o no ,M(0), un pulso de presatura- ción MT de 8.0 ppm. Los parámetros empleados fueron los siguientes: TR = 2500 ms, TE=9,8 ms, FOV = 20mm, matriz de adquisición 128x128. Los mapas M(t)/M(o) se prepararon dividiendo pixel a pixel las intensidades de las imágenes saturadas y no saturadas. Obtuvimos un total de 5 cortes para cada ratón. 2.1.2 Procesamiento de las imágenes Las imágenes pesadas en T2 se emplea- ron para examinar las diferentes estructuras cere- brales y realizar estudios volumétricos. Las regiones de interés se delinearon superponiendo sobre la imagen pesada en T2 la imagen anató- mica correspondiente obtenida del atlas del cere- bro del ratón “The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates” (Franklin y Paxinos, 1997). Como re- ferencia común entre el atlas y la imagen en T2, se seleccionó la marca anatómica del tercer ventrí- culo dorsal (Bregma -1.46 mm, Interaural 2.34 mm). En la figura 22 se puede ver un ejemplo del proceso. Una vez delimitadas las áreas de interés, se calculó para cada una de ellas su área y la in- tensidad de la señal de T2 correspondiente em- pleando el programa Image J (NIH, Bethesda, Maryland, EEUU). Técnicas de resonancia magnética2 118 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Figura 22. Superposición de la imagen del anatómica del atlas sobre la imagen pesada en T2 para la determinación de las áreas cerebrales de interés. El mismo proceso se siguió con los mapas paramétricos ADC y MT. En este caso, se emplea- ron las imágenes pesadas en T2 con la misma ge- ometría que los mapas ADC y MT para determinar la imagen correspondiente del atlas Paxinos, y posteriormente ésta se superpuso en los mapas ADC y MT para calcular los valores de ADC y %MT en cada región de interés. Se puede observar una imagen de ambos mapas en la figura 23. Como se explicó en la introducción, los mapas de ADC re- presentan la difusión del agua en el tejido cerebral. Una mayor difusión de agua aparece en tonos más rojos. Por su parte, en los mapas de MT se estudia la relación entre los protones libres y los unidos a macromoléculas. El %MT se usa como parámetro de medida del fenómeno y depende del entorno químico y biofísico que rodea las macromoléculas y sirve por lo tanto para detectar y cuantificar cam- bios histológicos que acompañan la enfermedad (Ridha y cols., 2007). En este caso, el agua aparece en tono azul. 2Técnicas de resonancia magnética Noemí Esteras Gallego 119 Figura 23. Ejemplos de mapa de ADC (izquierda) y MT (derecha) en un ratón control. En ambos casos se representa el mismo corte anatómico. En el caso de los mapas de ADC, las zonas con más di- fusión de agua se muestran rojas mien- tras que en los mapas de MT , las zonas de mayor contenido acuoso aparecen azules. 2.2 Resonancia magnética de espectroscopia Los ensayos de espectroscopía de hidró- geno en vivo se realizaron en el mismo aparato que la MRI y bajo las mismas condiciones. Se ad- quirieron en todos los casos espectros empleando una secuencia PRESS (Point Resolved SpectroS- copy) con una secuencia VAPOR para suprimir la señal de agua y se emplearon los siguientes pará- metros de adquisición: TR= 3000 ms, TE=35 ms, 128 adquisiciones, tamaño del vóxel = 3 mm3. Las regiones estudiadas fueron el área cortical y el área subcortical, y en cada una de ellas se analiza- ron los metabolitos NAA, Cr y Cho. Sus concentra- ciones se cuantificaron usando el programa LCModel (Provencher, 1993). En todos los casos, los valores de dichos metabolitos se encontraban por debajo del 20% de la cota inferior de Cramér- Rao (CRLB, Cramér-Rao Low Bound) un estimador de la desviación estándar del ajuste de cada me- tabolito. Para las comparaciones entre ratones control y APP/PS1, las concentraciones de NAA y Cho se normalizaron respecto a Cr. Aunque se in- vestigaron más parámetros como lactato, gluta- mato, glutamina, mioinositol o taurina con el pro- grama LCModel, no se tuvieron en cuenta por estar por encima del 20% de CRLB. Técnicas de resonancia magnética2 120 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Resultados 4 1Presentación de los resultados Noemí Esteras Gallego 123 Los resultados de esta tesis se presentan en Formato Publicaciones, y se encuentran des- critos en los siguientes artículos: Artículo #1: Natividad de las Cuevas, Úr- sula Muñoz, Fernando Bartolomé, Noemí Esteras, Carolina Alquézar, Ángeles Martín-Requero (2010). “Cell cycle and Alzheimer’s Disease. Studies in non-neuronal cells”. J Applied Biomed 8:121-130. Review. Artículo #2: Noemí Esteras, Úrsula Muñoz, Carolina Alquézar, Fernando Bartolomé, Félix Bermejo-Pareja , Ángeles Martín-Requero (2012). “Altered calmodulin degradation and sig- naling in non-neuronal cells from Alzheimer’s dis- ease patients.” Curr Alzheimer Res 9(3): 267-277. Artículo #3: Noemí Esteras, Carolina Al- quézar, Félix Bermejo-Pareja, Emilia Bialopiotro- wicz, Urszula Wojda, Ángeles Martín-Requero (2012). “Downregulation of ERK1/2 activity by CaMKII modulates p21 and survival of immortal- ized lymphocytes from Alzheimer’s disease pa- tients”. Submitted. Artículo #4: Noemí Esteras, Fernando Bartolomé, Carolina Alquézar, Desiré Antequera, Úrsula Muñoz, Eva Carro, Ángeles Martín-Requero (2012). “Altered cell cycle-related gene expression in brain and lymphocytes from a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease (APP/PS1)” Eur J Neurosci. doi:10.1111/j.1460.9568.2012.08178.x Artículo #5: Noemí Esteras, Carolina Al- quézar, Fernando Bartolomé, Desiré Antequera, Laura Barrios, Eva Carro, Sebastián Cerdán, Ánge- les Martín-Requero (2012). “Systematic Evaluation of Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy Techniques for Imaging a Transgenic Model of Alzheimer’s Disease (AbetaPP/PS1).” J Alzhei- mers Dis 30(2): 337-353. Presentación de los resultados1 124 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Artículo #1: Natividad de las Cuevas, Úrsula Muñoz, Fernando Bartolomé, Noemí Esteras, Carolina Al- quézar, Ángeles Martín-Requero (2010). “Cell cycle and Alzheimer’s Disease. Studies in non-neuronal cells”. J Applied Biomed 8:121-130. Review. Resumen Esta revisión recapitula el trabajo realizado en nuestro laboratorio centrado en el papel de las alteraciones del ciclo celular en la patogénesis de la EA en células periféricas de pacientes. La reactivación de la maquinaria del ciclo en neuronas postmitóticas es un evento temprano que se relaciona con la muerte neuronal y con el desarrollo de la enfermedad. Estas característi- cas también están presentes en células periféricas de pacientes, como linfocitos o fibroblas- tos. Por estos motivos, la hipótesis de trabajo de nuestro laboratorio se centra en estudiar los mecanismos moleculares que regulan los procesos de proliferación y supervivencia/muerte celular en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer de aparición tardía. Los resultados que aquí se exponen muestran que los linfocitos de pacientes de EA presentan, en presencia de suero, una mayor actividad proliferativa que las células control y, en ausen- cia de suero, una mayor resistencia a la apoptosis inducida por la ausencia de factores trófi- cos. Ambas características dependen en último lugar de dos proteínas reguladoras del ciclo celular, p27 en el primer caso y p21 en el segundo. La vía Ca2+/CaM interacciona con otras rutas para regular los niveles de ambas proteínas en estas células. En el primer caso, la ruta Ca2+/CaM sobreactiva la vía PI3K/Akt, lo que favorece la fosforilación de p27 y su degradación en el pro- teasoma. La degradación de p27, que actúa como inhibidor del ciclo, induce un aumento de la actividad del complejo Ciclina E/Cdk2, que aumenta la fosforilación del proteína del reti- noblastoma y libera el factor E2F favoreciendo la progresión del ciclo celular. En el segundo caso, la retirada de suero induce la activación dependiente de Ca2+/CaM de CaMKII. Este hecho se acompaña de una disminución de la actividad de la ruta de las MAPK (ERK1/2), de un aumento en los niveles de p21 y de una mayor resistencia a la apoptosis. Por estos motivos, las características neoplásicas que muestran las células de los pacientes de EA pueden ser consideradas manifestaciones sistémicas de la enfermedad. 2Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales. Noemí Esteras Gallego 125 2Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales. Noemí Esteras Gallego 127 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales.2 128 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 2Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales. Noemí Esteras Gallego 129 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales.2 130 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 2Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales. Noemí Esteras Gallego 131 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales.2 132 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 2Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales. Noemí Esteras Gallego 133 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales.2 134 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 2Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales. Noemí Esteras Gallego 135 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer. Estudios en células no neuronales.2 136 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Artículo #2 : Noemí Esteras, Úrsula Muñoz, Carolina Alquézar, Fernando Bartolomé, Félix Bermejo-Pareja , Ángeles Martín-Requero (2012). “Altered calmodulin degradation and signaling in non-neuronal cells from Alzheimer’s disease patients.” Curr Alzheimer Res 9(3): 267-277. Resumen Trabajos previos de nuestro laboratorio habían mostrado que el control de la proliferación y la supervivencia de los linfocitos inmortalizados de pacientes de EA dependían en último lugar de alteraciones en la vía de señalización dependiente de Ca2+/CaM. Por este motivo, en este trabajo se ha investigado la regulación de los niveles y la actividad de calmodulina en los lin- foblastos de pacientes de EA. En primer lugar, observamos un aumento en el contenido de CaM en las células de pacientes. El aumento en los niveles celulares de la proteína no se debe a una mayor expresión de ninguno de los tres genes que la codifican, como muestran las PCR cuantitativas en tiempo real (qRT -PCR) de los genes CALM1, 2 y 3. Sin embargo, la vida media de CaM es mayor en linfoblastos de pacientes de EA que en controles, sugiriendo que la de- gradación de la proteína está alterada en las células de pacientes. La tasa de degradación de calmodulina depende de los niveles intracelulares de calcio y de ROS, que aparecen elevados en los linfocitos de EA. Además, la degradación de calmodulina se produce a través del sistema ubiquitina-proteasoma. Los niveles elevados de CaM se asocian con una mayor actividad de la misma, como muestran la sobreactivación de la vías CaMKII y PI3K/Akt. En relación con esta última, nuestros resultados indican que el aumento en los niveles de CaM coopera con el suero para sobreestimular la vía PI3K/Akt, a través de la unión directa de CaM a la subunidad regu- ladora (α-p85) de la PI3K. Estos resultados sugieren que el fallo a nivel sistémico del control de la degradación de CaM, y por lo tanto, de la señalización celular que depende de la vía Ca2+/CaM, puede ser un mecanismo importante en la patogénesis de la EA. 3Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 137 3Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 139 Reprinted with permission from Bentham Science Publishers Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer3 140 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 3Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 141 Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer3 142 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 3Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 143 Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de Alzhéimer3 144 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 3Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 145 Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer3 146 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 3Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 147 Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer3 148 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 3Alteración de la degradación y señalización de calmodulina en células periféricas de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 149 Artículo #3 : Noemí Esteras, Carolina Alquézar, Félix Bermejo-Pareja, Emilia Bialopiotrowicz, Urszula Wojda, Ángeles Martín-Requero (2012). “Downregulation of ERK1/2 activity by CaMKII modulates p21 and survival of immortalized lymphocytes from Alzheimer’s disease patients”. Submitted. Resumen Con anterioridad, habíamos descrito que la mayor actividad de CaM/CaMKII de los linfoblas- tos de EA protege a estas células de la muerte inducida por la privación de suero. Este hecho se acompaña de una disminución acusada de la activación de la vía de las MAPK (ERK1/2) y un aumento en los niveles de p21. El objetivo de este trabajo ha sido investigar los mecanismos moleculares que están detrás de la regulación diferencial de p21 en las células de los pacien- tes de EA tras la retirada de suero. El análisis de la vida media de la proteína permite descar- tar que tenga lugar una alteración en la degradación de la misma. Sin embargo, el análisis por qRT-PCR muestra un aumento en los niveles de ARN mensajero de p21 tras la retirada de suero. El inhibidor de ERK1/2, PD98059, previene la muerte celular inducida por la privación de suero en los linfoblastos controles e induce un aumento en los niveles del mensajero y de proteína de p21. Por su parte, el inhibidor de PI3K/Akt, Ly29004, tiene escasa influencia en estos pro- cesos. El antagonista de CaM, CMZ, y el inhibidor de CaMKII, KN-62, revierten la mayor su- pervivencia mostrada por las células de EA y reducen los niveles de p21 al aumentar la actividad de ERK1/2. La regulación transcripcional de p21 en estas células no parece depender de p53, sino que nuestros resultados indican que ERK1/2 regula la expresión de p21 a través del factor de transcripción FOXO3a. Aparentemente, la menor actividad de ERK1/2 de linfoblastos de EA favorece la localización nuclear de FOXO3a, al impedir, al menos parcialmente, la fosforilación y la exportación del factor de transcripción al citosol para ser degradado por un mecanismo que parece estar mediado por MDM2. La retención de FOXO3a en el núcleo permite una mayor transcripción de p21. Por otra parte, observamos un aumento en el contenido de p21 en el ci- toplasma de los linfoblastos de EA que podría explicar los efectos antiapoptóticos de esta pro- teína en células derivadas de pacientes de EA. 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 151 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 153 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 154 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 155 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 156 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 157 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 158 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 159 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 160 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 161 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 162 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 163 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 164 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 165 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 166 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 167 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 168 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 169 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 170 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 171 La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer4 172 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 4La inactivación de ERK ½ por CaMKII regula los niveles de p21 y la supervivencia en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer Noemí Esteras Gallego 173 Artículo #4 : Noemí Esteras, Fernando Bartolomé, Carolina Alquézar, Desiré Antequera, Úrsula Muñoz, Eva Carro, Ángeles Martín-Requero (2012). “Altered cell cycle-related gene expression in brain and lym- phocytes from a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease (APP/PS1)” Eur J Neurosci. doi:10.1111/j.1460.9568.2012.08178.x Resumen La alteración del control del ciclo celular en neuronas maduras es un evento importante en la neuropatogénesis de la EA. El intento de reactivación del ciclo celular de las neuronas post-mi- tóticas, acompañado de la expresión aberrante de marcadores del ciclo, se ha observado en el cerebro de pacientes y también en muchos modelos animales de la enfermedad, a pesar de que la mayoría de éstos no desarrollan todas las características de la EA, como la muerte neu- ronal. También se ha observado en células periféricas de pacientes, como fibroblastos y linfo- citos. En este trabajo, hemos estudiado simultáneamente posibles alteraciones del ciclo celular en cerebro y linfocitos del modelo murino de EA APP/PS1 a los doce meses de edad. Para ello, hemos empleado la tecnología RT2ProfilerTM PCR Array, basada en arrays de PCR, para anali- zar la expresión de 84 genes diferentes relacionados con el ciclo celular. El estudio se ha rea- lizado en linfocitos y cerebro y nos ha permitido identificar un buen número de genes en los dos tejidos de los ratones transgénicos cuya expresión estaba alterada respecto a los ratones control. Además, hemos observado que los linfocitos de los ratones transgénicos muestran una mayor incorporación de 5’-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) en el ADN que los linfocitos de los ratones control cuando son estimulados con mitógenos, indicando una mayor respuesta proliferativa. Por último, las neuronas corticales de los ratones APP/PS1 exhiben una mayor ex- presión del marcador de proliferación PCNA y del inhibidor de Cdk Cdkn2a o p16, como mues- tra la inmunohistoquímica. Todos estos datos avalan las alteraciones en el control del ciclo celular como un mecanismo importante en la EA, además de validar el uso de células perifé- ricas como modelo de estudio de las bases moleculares de la enfermedad. 5Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1) Noemí Esteras Gallego 175 5Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1) Noemí Esteras Gallego 177 Reprinted with permission from John Wiley and Sons Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1)5 178 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 5Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1) Noemí Esteras Gallego 179 Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1)5 180 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 5Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1) Noemí Esteras Gallego 181 Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1)5 182 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 5Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1) Noemí Esteras Gallego 183 Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1)5 184 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 5Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1) Noemí Esteras Gallego 185 Alteraciones en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular en cerebro y linfocitos de un modelo de ratón transgénico de EA (APP/PS1)5 186 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Artículo #5 : Noemí Esteras, Carolina Alquézar, Fernando Bartolomé, Desiré Antequera, Laura Barrios, Eva Carro, Sebastián Cerdán, Ángeles Martín-Requero (2012). “Systematic Evaluation of Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy Techniques for Imaging a Transgenic Model of Alzheimer’s Disease (AbetaPP/PS1).” J Alzheimers Dis 30(2): 337-353. Resumen Los modelos murinos de la enfermedad de Alzheimer proporcionan una herramienta muy útil para la búsqueda y seguimiento de biomarcadores de la enfermedad similares a los que se ob- servan en humanos. Las técnicas no invasivas, como la Resonancia Magnética de Imagen (MRI) y de Espectroscopía (MRS) son muy convenientes para estos propósitos, ya que permiten es- tudiar in vivo la morfología y el metabolismo cerebral en cualquier momento del curso de la en- fermedad. En este trabajo hemos empleado ratones transgénicos APP/PS1 y ratones control de 12 meses de edad en los que hemos estudiado sistemáticamente los parámetros que estas técnicas nos proporcionan. En primer lugar, los estudios de MRI nos permitieron obtener una colección de imágenes pesadas en T2, en las que pudimos estudiar la morfología del cerebro y de las distintas estructuras que lo forman, así como imágenes de difusión y de transferencia de magnetización, que nos permitieron evaluar la integridad y la estructura macromolecular del tejido. Comparados con los ratones control, los ratones transgénicos muestran hiperin- tensidad en la corteza cerebral, un aumento del volumen ventricular, así como una disminución del volumen del hipocampo y de la transferencia de magnetización. Los estudios de MRS, por su parte, nos permitieron evaluar distintos metabolitos en las áreas cortical y subcortical del cerebro de los ratones. El análisis revela un incremento en el cociente colina (Cho) / creatina (Cr) en ambas áreas. El tratamiento estadístico de todos los parámetros por regresión logística nos permitió identificar aquellos que permitían clasificar con mayor sensibilidad y especificidad a los ratones en control o transgénico, encontrando que por sí solo, el cociente Cho/Cr en el área subcortical permite la identificación correcta del ratón. En resumen, estos resultados permi- ten evaluar los marcadores MRI/MRS óptimos para la caracterización de la EA en el modelo APP/PS1, que podrían aplicarse para el diagnóstico, el estudio de la progresión de la enfer- medad o el diseño de nuevos fármacos, dada la naturaleza no invasiva de la tecnología. 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 187 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 189 Reprinted from Journal of Alzheimer’s Disease 30 (2012) 337-353, copyright 2012, with permission from IOS Press Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS16 190 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 191 Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS16 192 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 193 Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS16 194 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 195 Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS16 196 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 197 Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS16 198 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 199 Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS16 200 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 201 Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS16 202 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 203 Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS16 202 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer 6Evaluación sistemática de las técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y Espectroscopía para la caracterización del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 203 Discusión 5 La primera parte del trabajo presentado en esta tesis se ha realizado en linfocitos obteni- dos a partir de sangre periférica de pacientes de EA y donantes controles de edad similar inmorta- lizados con el virus de Epstein-Barr. Este virus, aso- ciado con enfermedades como el linfoma de Burkitt, infecta selectivamente las células B e in- duce su proliferación, hecho que se transmite a la progenie, lo que permite inmortalizar los linfoci- tos y hacer que se dividan indefinidamente en cul- tivo (Zimber-Strobl y Strobl, 2001). Las líneas linfoblásticas resultantes expresan marcadores de activación y moléculas de adhesión similares a las células B activadas (Wang y cols., 1990), lo que ha permitido su uso como modelo experimental en diferentes estudios, entre ellos, diversos sobre la enfermedad de Alzheimer (Cecchi y Takahashi, 1999; Bojarski y cols., 2007; Chagnon y cols., 2008; Srimatkandada y cols., 2008; Zullo y cols., 2009; Zhang y cols., 2010). Es importante destacar que el proceso de transformación viral de las líneas linfo- blásticas no altera la respuesta celular, ya que las principales características que hemos descrito en las líneas inmortalizadas se han encontrado tam- bién en linfocitos B no transformados (Bartolomé y cols., 2007; Muñoz y cols., 2008). Empleando este modelo experimental hemos podido demostrar en nuestro laboratorio que los linfoblastos de EA muestran característi- cas neoplásicas, es decir, presentan una mayor ac- tividad proliferativa cuando son estimulados por 1Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA Noemí Esteras Gallego 207 suero (Urcelay y cols., 2001; de las Cuevas y cols., 2003; Muñoz y cols., 2008) y son más resistentes a la muerte celular inducida por la retirada del mismo (Bartolomé y cols., 2007; Bartolomé y cols., 2010). Esta alteración de la respuesta celular de los linfoblastos se puede interpretar como una mani- festación sistémica de la enfermedad y un reflejo de las alteraciones en el control del ciclo celular que se producen en neuronas postmitóticas y que están vinculadas a la muerte neuronal. Trabajos previos de nuestro laboratorio pusieron de mani- fiesto que el control del destino celular en presen- cia o ausencia de factores tróficos depende en último término de la regulación de los niveles de dos proteínas fundamentales para el control del ciclo celular como p27 y p21, respectivamente (Muñoz y cols., 2008; Bartolomé y cols., 2010). p27 y p21 son proteínas inhibidoras de las quinasas de- pendientes de ciclinas (Cdks) y juegan un papel fundamental en el control del tránsito G1/S del ciclo (Currais y cols., 2009). Las rutas de señaliza- ción implicadas en la regulación de ambas proteí- nas en nuestras células dependen de la vía calcio/calmodulina (Ca2+/CaM). En el caso de la res- puesta proliferativa, en presencia de suero, Ca2+/CaM interacciona con la vía PI3K/Akt, cuya so- breactivación se relaciona con un incremento en la degradación del inhibidor del ciclo p27. La dis- minución de los niveles de p27 se asocia, de esta forma, con un aumento en la proliferación (de las Cuevas y cols., 2003; Muñoz y cols., 2008). Por otro lado, en ausencia de suero, Ca2+/CaM interacciona con la vía MAPK. Ca2+/CaM, en un mecanismo me- diado por CaMKII, regula negativamente los nive- les de ERK1/2. La menor activación de ERK1/2 en las células de pacientes conduce en último término a un aumento en los niveles de p21 y a una mayor supervivencia frente a la retirada de suero (Barto- lomé y cols., 2007; Bartolomé y cols., 2010). Un re- sumen de estos resultados se puede encontrar en la figura 24. De acuerdo con estos resultados, el papel de Ca2+/CaM es fundamental para la regulación de la respuesta de los linfoblastos a la presencia o au- sencia de suero. Por ese motivo, el primer objetivo de esta tesis ha sido estudiar los mecanismos que regulan los niveles y la actividad de CaM en células de pacientes de EA e individuos control. En se- gundo lugar, se ha profundizado en el estudio de los mecanismos por los que la vía Ca2+/CaM inter- acciona con las rutas PI3K/Akt y MAPK para con- trolar los niveles celulares de p27 y, especialmente, de p21, asociados con el aumento en la actividad proliferativa y la resistencia a la muerte celular tras la retirada de suero respectivamente. 1.1 Regulación del contenido de calmodulina en linfocitos inmortalizados de pacientes de alzhéimer. La calmodulina es la principal proteína de unión a calcio de la célula. Es una proteína pe- Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA1 208 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer queña, de 17 kDa, compuesta por 148 aminoácidos y formada por una única cadena polipeptídica que presenta un dominio globular N-terminal y un do- minio globular C-terminal formados cada uno por dos motivos mano EF, una estructura formada por dos alfa hélices que permite la unión de un ión Ca2+ (Yamniuk y cols., 2007). Un incremento en los ni- veles de calcio intracelular produce la unión se- cuencial de hasta cuatro iones de Ca2+ en la prote- ína, lo que desencadena una serie de cambios con- formacionales, que conducen a la exhibición de residuos clave en una conformación conocida como “forma abierta” y que le permiten unir y ac- tivar sus múltiples proteínas diana, conocidas como CaMBP (CaM-Binding Proteins). Entre otras CaMBP destacan la fosfatasa calcineurina o diver- 1Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA Noemí Esteras Gallego 209 Figura 24. Esquema de las rutas implicadas en la mayor proliferación y supervivencia de los linfoblastos de EA. En las cé- lulas de EA, la presencia de suero promueve la sobreactivación dependiente de Ca2+/CaM de la vía PI3K/Akt que conduce a una mayor degradación de p27, a una mayor actividad de ciclina E/Cdk2/pRb/E2F y una mayor entrada en ciclo. En ausencia de suero, la ruta Ca2+/CaM, a través de CaMKII, disminuye la activación de NF-κB y ERK1/2 en comparación con controles, e in- crementa el contenido celular de p21, que parece proteger a los linfoblastos de EA de la apoptosis inducida por la ausencia de factores tróficos. sas quinasas, entre ellas la familia de quinasas de- pendientes de Ca2+/CaM, como CaMKII (Yamniuk y Vogel, 2004). CaM interviene de esta manera en numerosos procesos fisiológicos, como la progre- sión del ciclo celular. Se ha descrito que existe una relación entre los niveles celulares de CaM y la ca- pacidad proliferativa de la célula, de manera que un mayor contenido en CaM se asocia con mayor proliferación (Rasmussen y Means, 1987; Kahl y Means, 2003). Nuestros resultados indican, en primer lugar, que los linfocitos de pacientes de EA pre- sentan un mayor contenido en CaM que las células control y que este hecho no se debe a una mayor expresión de los genes que la codifican, sino a una disminución en su tasa de degradación. En el pri- mer caso, el estudio por PCR cuantitativa de los ni- veles de ARN mensajero de los tres genes que codifican CaM en mamíferos (CALM1, CALM2 y CALM3 (Berchtold y cols., 1993)) señala que el in- cremento en los niveles celulares de CaM en linfo- blastos de pacientes no se debe a un aumento en su expresión, ya que los niveles de ARN mensajero son similares a los de las células control. Sin em- bargo, el tratamiento de las células con ciclohexi- mida para inhibir la síntesis de proteínas de novo desvela que la tasa de degradación de CaM en cé- lulas de pacientes es mucho menor que en contro- les. Estimamos que la vida media de CaM en células de EA es de aproximadamente 22 horas, tres veces mayor que en individuos control. Este resultado es similar a otros descritos para la vida media de la proteína en cerebro de rata (Ferring- ton y cols., 1998). Además, es interesante señalar que tiene una vida media mucho menor que otras proteínas relacionadas con la homeostasis del cal- cio, como la Ca2+-ATPasa de la membrana plas- mática, para la que se ha descrito una vida media de 12 días en ese mismo tejido (Ferrington y cols., 1998). En cualquier caso, los valores son similares a los de la mayoría de proteínas celulares. Hemos descrito que la degradación de calmodu- lina en linfocitos inmortalizados se produce en el proteasoma. En efecto, se produce una acumula- ción de la proteína tanto en células control como en linfoblastos de pacientes, cuando inhibimos se- lectivamente el protesoma con lactacistina. Sin embargo, la inhibición de otros mecanismos de degradación de proteínas, como las caspasas o la autofagia, no afecta a los niveles de CaM. Los en- sayos de coinmunoprecipitación de CaM y ubiqui- tina muestran que la proteína se ubiquitina en estas líneas celulares. Aparentemente, se produce una ligera disminución de la poliubiquitinación de CaM en las células de pacientes de EA que quizá pueda contribuir a disminuir la velocidad de de- gradación de la molécula. Sin embargo, algunos autores han descrito que la proteína “envejecida” u oxidada se puede degradar en los proteasomas 20S y 26S sin necesidad de ubiquitinarse (Tarcsa y cols., 2000; Balog y cols., 2009), y que la ubiquiti- nación no aumenta su tasa de degradación (Bena- Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA1 210 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer roudj y cols., 2001). Es probable que ambos meca- nismos, tanto los dependientes de ubiquitina como los no dependientes, colaboren en la degra- dación de la proteína. Serían necesarios más estu- dios para evaluar la contribución potencial de ambos en el control de los niveles de CaM. Aunque se han descrito alteraciones en la funcionalidad del proteasoma en el cerebro de pa- cientes de EA (Keller y cols., 2000; Keck y cols., 2003), trabajos previos de nuestro y de otros labo- ratorios no han mostrado deficiencias en la activi- dad del mismo en linfocitos de afectados de EA (Blandini y cols., 2006; Muñoz y cols., 2008; Ullrich y cols., 2010). En nuestro laboratorio, además, se ha descrito un aumento en la tasa de degradación en el proteasoma de otro inhibidor del ciclo como p27 (Muñoz y cols., 2008). Por otra parte, nuestros resultados indican que la tasa de degradación de β-actina es similar en las células de controles y de pacientes. Por tanto, la disminución de la veloci- dad de degradación en linfoblastos de EA no se puede atribuir a alteraciones inespecíficas de los sistemas de degradación de proteínas. Dos características fisiopatológicas im- portantes de la enfermedad, como las alteracio- nes en los niveles de ROS o en la homeostasis del calcio (Zhu y cols., 2007b; Yu y cols., 2009), tam- bién se reflejan en los linfoblastos de los pacien- tes. Por un lado, nuestros resultados indican que las células de pacientes de EA presentan mayores niveles de ROS que las células control. Por otro lado, a pesar de presentar mayores niveles de CaM, los linfoblastos de EA muestran una mayor concentración intracelular de calcio. Este hecho estaría de acuerdo con resultados previos que muestran una menor capacidad de los linfoblastos de EA para tamponar los incrementos citosólicos de Ca2+ (Ibarreta y cols., 1997). También se ha des- crito una pérdida de la capacidad tamponadora de Ca2+ en cerebros de pacientes, que se relaciona con la vulnerabilidad neuronal selectiva y la neurode- generación (Palop y cols., 2003). De modo que los cambios en los flujos iónicos de Ca2+ y en la activi- dad de las proteínas tamponadoras de estos iones serían responsables del incremento en la concen- tración de Ca2+ citosólico característica de los pa- cientes de EA (Berridge, 2010). Tanto los niveles de ROS como los de cal- cio intracelular regulan en estas líneas linfoblásti- cas la tasa de degradación de CaM. El tratamiento de las células de EA con el quelante BAPTA para tamponar el calcio intracelular aumenta la tasa de degradación de CaM hasta niveles semejantes a los de las células control, mientras que el trata- miento de los controles con el ionóforo ionomi- cina, incrementa los niveles de calcio intracelular al mismo tiempo que aumenta la vida media de CaM. La reducción de la tasa de degradación de CaM po- dría interpretarse como una respuesta de las célu- las al aumento de la concentración de Ca2+ citosólico. En este sentido, se ha descrito que la molécula nativa de CaM, apo-CaM, se degrada 1Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA Noemí Esteras Gallego 211 más rápidamente que la unida a Ca2+ (Benaroudj y cols., 2001). Experimentos in vitro muestran tam- bién que el calcio regula de manera opuesta los procesos de ubiquitinación y degradación de CaM. Mientras que por un lado la adición de calcio su- pone una mayor ubiquitinación de la molécula, por otro lado produce una disminución en su velocidad de degradación (Tarcsa y cols., 2000). Es posible que la molécula de CaM ubiquitinada pueda rete- ner suficiente capacidad de unir Ca2+ para mante- ner una estructura demasiado rígida que impida su plegamiento y ser dirigida al proteasoma (Tarcsa y cols., 2000). Por otra parte, el tratamiento de los linfoblastos de pacientes con dos agentes antioxi- dantes como trolox y glutation reducido (GSH), disminuye los niveles de ROS y acelera la degra- dación de la proteína. Es sabido el efecto que tie- nen los niveles altos de ROS en los flujos de Ca2+ (Yu y cols., 2009a; Peng y Jou, 2010). Por tanto, cabe pensar que este efecto de los niveles de ROS alterando la degradación de CaM juegue un papel adicional en la influencia que éstos ejercen en la homeostasis del calcio. La ruta de señalización dependiente de Ca2+/CaM parece jugar un papel importante en la patología de la EA. Se ha descrito que numerosas proteínas implicadas en la enfermedad (muchas relacionadas con el procesamiento de APP y tau) presentan dominios de unión a CaM, con lo que pueden ser potenciales CaMBPs que actúen y se regulen dependiendo de la señalización de esta vía (O’Day y Myre, 2004). A pesar de ello, los meca- nismos que regulan los niveles de CaM no han sido estudiados en profundidad en la EA. El aumento en los niveles de CaM que encontramos en los lin- foblastos de pacientes contrasta con otros traba- jos en los que se observa una reducción de la proteína en la corteza cerebral de material de au- topsia de afectados de EA (Solomon y cols., 2001). Esta discrepancia quizá pueda atribuirse a que al- gunos anticuerpos contra CaM son capaces de re- conocer sólo la proteína en determinados estados conformacionales. 1.2 Interacción de la vía Ca2+/CaM con la ruta PI3K/Akt en el control de la actividad prolifera- tiva de los linfoblastos de EA Como se ha mencionado con anteriori- dad, la unión de hasta cuatro iones de Ca2+ a la mo- lécula de CaM induce una serie de cambios conformacionales que aumentan la exposición de residuos hidrofóbicos que sirven de sitios de unión para las distintas dianas proteicas de CaM. Tam- bién se ha descrito que tanto la saturación de Ca2+ como la localización de los iones Ca2+ unidos a CaM influyen en la capacidad de la proteína de unirse a sus dianas (Schumacher y cols., 2001). Nuestros resultados han permitido de- mostrar que el aumento de los niveles de CaM en linfoblastos de EA es el responsable de la mayor actividad de dos proteínas clave en los procesos Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA1 212 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer que regulan la proliferación/supervivencia/muerte celular, como PI3K y CaMKII. La primera de ellas, PI3K, media la señali- zación de diferentes procesos celulares y consta de dos subunidades, la reguladora o p85 y la cata- lítica o p110. La unión de la subunidad p85 a dis- tintas proteínas señal, libera p110 y permite activar la subunidad catalítica (Engelman y cols., 2006) que cataliza la reacción que da como productos fosfatidil inositol 3-4 bisfosfato (PIP2) e inositol 3,4,5 trifosfato (PIP3). PIP2 y PIP3 se unen a un subgrupo de proteínas entre las que se encuentra la serina-treonina quinasa Akt. Akt contiene do- minios de pleckstrina, que permiten su unión a los fosfolípidos y le sirven de anclaje, facilitando su translocación a la membrana plasmática donde es fosforilada y activada (Song y cols., 2005). Nuestros resultados demuestran que, en linfoblastos de pacientes de EA, la sobreactivación de la vía PI3K/Akt está asociada al aumento de la actividad proliferativa a través de un mecanismo que en último término induce la degradación del inhibidor de Cdks p27 y que es sensible a los anta- gonistas de CaM, en consonancia con el papel que juega CaM en la regulación del ciclo celular (Kahl y Means, 2003). Los resultados presentados en esta tesis muestran que CaM es capaz de unirse a la su- bunidad reguladora p85 de la PI3K, que esta unión se produce en mayor medida en los linfoblastos de EA que en los controles y que, además, es una interacción calcio-dependiente. Estos resultados están de acuerdo con estudios previos que de- mostraban que CaM interaccionaba con los domi- nios SH2 de la subunidad p85, aumentando su actividad in vitro y en cultivos celulares (Joyal y cols., 1997; Perez-Garcia y cols., 2004). Otros au- tores han descrito la capacidad de unión directa de CaM con Akt a través de los residuos pleckstrina (Dong y cols., 2007). La sobreactivación de la vía PI3K/Akt tam- bién se ha podido demostrar en cerebros de EA, asociada con un aumento en la fosforilación de GSK3β y mTOR y una disminución en los niveles de p27 (Griffin y cols., 2005). Se ha considerado que la sobreactivación de la vía PI3K/Akt, normal- mente asociada al control de la supervivencia ce- lular en cerebros de pacientes de EA, pudiera ser una respuesta de las neuronas para compensar los daños producidos por la enfermedad. Reciente- mente se ha descrito que la activación de Akt puede ser clave para las neuronas en el proceso de abortosis, por el cual no completan la cascada apoptótica (Liu y cols., 2012). Sin embargo, el in- cremento en la activación de esta vía en neuronas postmitóticas puede también inducir la entrada en ciclo y la muerte celular como consecuencia de sus efectos sobre proteínas reguladoras del ciclo celu- lar. 1Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA Noemí Esteras Gallego 213 1.3 Interacción de la vía Ca2+/CaM con la ruta MAPK para la regulación del contenido celular de p21 y el control de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero. Nuestros resultados también muestran que el aumento de los niveles de CaM en los linfo- blastos de EA se acompaña de una mayor activi- dad de CaMKII. CaMKII es una serina/treonina quinasa regulada por el complejo Ca2+/CaM que in- terviene en diversas rutas de señalización. En nuestro laboratorio se había descrito previamente que esta proteína juega un papel muy importante en el control de la respuesta celular a la apoptosis inducida por la retirada de suero en linfocitos in- mortalizados de pacientes de EA (Bartolomé y cols., 2007; Bartolomé y cols., 2010). Nuestros re- sultados muestran que la ruta Ca2+/CaM/CaMKII interacciona con la vía MAPK para regular los ni- veles de p21 y la vulnerabilidad celular frente a la privación de suero. La retirada de suero induce en los linfoblastos la activación sostenida de ERK1/2. Sin embargo, CaMKII regula negativamente este proceso, de manera que la activación de ERK1/2 es significativamente menor en los linfoblastos de EA 72 horas después de la retirada de suero. Los re- sultados presentados en esta tesis muestran que la regulación negativa de ERK1/2 por CaMKII au- menta los niveles de p21 y la resistencia frente a la muerte celular de los linfoblastos de EA al favore- cer la actividad del factor de transcripción FOXO3a (Forkhead Box O 3a). Estas afirmaciones se basan en las siguientes observaciones: 1) existe una rela- ción inversa entre la actividad de CaMKII y ERK1/2, de manera que la actividad de CaMKII es mayor en las células de pacientes de EA y se acompaña de una menor fosforilación de ERK1/2, de una mayor localización nuclear de FOXO3a y de una mayor expresión de p21. 2) La inhibición de CaMKII en los linfoblastos de pacientes restaura los niveles de fosforilación de ERK1/2 y disminuye los niveles nu- cleares de FOXO3a y la expresión de p21, sensibi- lizando a las células frente a los efectos apoptóticos que produce la retirada de suero. 3) El inhibidor de ERK1/2 PD98059 previene la muerte de los linfoblastos control en ausencia de suero al mismo tiempo que aumenta el contenido de FOXO3a en el núcleo e induce la expresión de p21. Como señalan nuestros resultados, el mayor contenido de p21 en las células de pacien- tes tras la retirada de suero se relaciona con el au- mento en los niveles de ARN mensajero en un proceso regulado negativamente por ERK1/2. De hecho, aunque los mecanismos post-transcripcio- nales y post-traduccionales son importantes en la regulación de p21, la regulación transcripcional es el principal punto de control de la expresión de la proteína y se puede producir por diversos meca- nismos dependientes e independientes del supre- sor tumoral p53 (Jung y cols., 2010). Nuestros resultados muestran que, a pesar del mayor con- tenido en p21, los linfoblastos de pacientes pre- sentan niveles semejantes de p53 total o Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA1 214 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer fosforilada en serina 15 que los controles y que el tratamiento con el inhibidor de p53, pifithrin α, tiene escaso efecto en los niveles de p21 y no afecta a la supervivencia de las células, descar- tando así la implicación de p53 en la regulación de la expresión de p21 en linfocitos inmortalizados. Entre los mecanismos independientes de p53, se había descrito que el factor de transcripción FOXO3a podía mediar la activación transcripcio- nal de p21 en algunos tipos de células (Hauck y cols., 2007) y que, además, este factor de trans- cripción se regula negativamente tras la activación de ERK1/2 (Yang y cols., 2008b). FOXO3a es un miembro de la clase O de la familia de factores de transcripción forkhead, que se expresa en diferen- tes tejidos y media los efectos de los factores de crecimiento en muchos procesos celulares como la progresión del ciclo, el metabolismo de glucosa y la apoptosis (Kops y cols., 2002; Accili y Arden, 2004; Greer y Brunet, 2008). Su actividad trans- cripcional depende mayoritariamente, aunque no exclusivamente, de su localización intracelular (Vogt y cols., 2005). En ausencia de factores trófi- cos, FOXO3a se localiza preferentemente en el nú- cleo celular, induciendo la transcripción de una gran variedad de genes (Modur y cols., 2002). Nuestros resultados indican que el contenido ce- lular de FOXO3a está aumentado en linfoblastos de EA privados de suero. En estas condiciones, FOXO3a se acumula en el núcleo y aumenta la transcripción de p21, favoreciendo la resistencia a la muerte celular inducida por la retirada de suero. Aparentemente, los niveles de FOXO3a son regu- lados por la vía CaM/CaMKII/ERK1/2 a través de la fosforilación de la molécula y su posterior degra- dación en el citosol en un mecanismo mediado por MDM2 (Murine-Double Minute 2). Numerosas evidencias experimentales apoyan la idea de que las llamadas quinasas onco- génicas, como PI3K/Akt, IKK y ERK1/2 están invo- lucradas en el control de la localización nuclear y la actividad de FOXO3a a través de la fosforilación de residuos específicos, lo que favorece la salida de la proteína del núcleo al citosol y su degrada- ción (Plas y Thompson, 2003; Hu y cols., 2004; Yang y cols., 2008b). En los linfoblastos de pacien- tes de EA, sin embargo, la inhibición de la vía PI3K/Akt no tiene consecuencias en la transcrip- ción de p21 ni en la supervivencia celular frente a la retirada de suero. Nuestros resultados indican que es la inhibición de ERK1/2 la que regula la localiza- ción nuclear de la proteína al parecer previniendo la fosforilación del factor e impidiendo su salida al citoplasma y su degradación. Al no poder encon- trar un anticuerpo adecuado contra FOXO3a fos- forilado en los residuos que fosforila ERK1/2 (Yang y cols., 2008b), estudiamos el efecto de la modu- lación de los niveles de ERK1/2 en el contenido nu- clear de FOXO3a. Encontramos que la inhibición de ERK con PD98059 favorece la acumulación de FOXO3a en el núcleo, mientras que la estimulación de ERK1/2, al inhibir CaMKII con CMZ y KN62, dis- 1Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA Noemí Esteras Gallego 215 minuye el contenido nuclear de FOXO3a. Se ha descrito, además, que ERK1/2 regula la proteína MDM2, que, entre otras funciones, puede actuar de ubiquitina ligasa E3, marcando diversas prote- ínas para su posterior degradación (Ries y cols., 2000; Phelps y cols., 2005). Entre otras, se ha des- crito que puede mediar la degradación de FOXO3a en el sistema ubiquitina-proteasoma (Yang y cols., 2008b). Nuestros resultados indican que las células de los individuos control presentan una mayor ac- tivación de ERK1/2 unida a un mayor contenido en MDM2, y que en los linfoblastos de pacientes, donde ERK1/2 está menos activada, o tras la inhi- bición de la misma en los controles con PD98059, los niveles de MDM2 son menores. Estos datos apoyan la teoría de que los niveles de FOXO3a se controlan en estas células modulando la fosforilación de la molécula por la ruta CaM/CaMKII/ERK1/2, y su posterior degradación, como consecuencia de alterar la salida de la pro- teína del núcleo al citosol y los niveles de MDM2. Además de observar un aumento en la transcripción de p21 en los linfoblastos de pacien- tes de EA, también hemos encontrado un incre- mento en los niveles citosólicos de la proteína tras la retirada de suero. p21 puede presentar distintas funciones dependiendo de su localización subce- lular. Además de su función clásica como proteína inhibidora de Cdks en el núcleo, se ha descrito que, en el citoplasma, p21 protege a la célula frente a la apoptosis (Blagosklonny, 2002; Coqueret, 2003). Por otro lado, no hemos observado cam- bios en la tasa de degradación de p21 tras la reti- rada de suero en nuestras células. Estos resultados contrastan con otros previos de nuestro laborato- rio, en los que se había observado una mayor de- gradación de p21 en condiciones proliferativas en presencia de suero (Sala y cols., 2008). Por lo tanto, parece que la adición o la retirada de suero producen efectos opuestos en los niveles celulares de p21 regulando la degradación o la transcripción y la localización respectivamente. La relación entre los niveles elevados de p21 y la mayor resistencia frente a la retirada de suero en los linfoblastos de EA está de acuerdo con otros resultados en los que se ha descrito que un incremento en la expresión de p21 bloquea la muerte inducida por estrés oxidativo en células de mieloma humano U266 (Kim y cols., 2001) o que la inducción de la expresión de p21 (Gareau y cols., 2011) o de su localización citoplasmática (Koster y cols., 2010; Xia y cols., 2011) se relaciona con la re- sistencia a los quimioterápicos en algunos tipos de cáncer. Por lo tanto, se puede asumir que el au- mento en los niveles de p21 proporciona a los lin- foblastos de EA una ventaja para la supervivencia, de forma similar a lo descrito para las células tu- morales (Weiss, 2003). p21 puede proteger a las células de la apoptosis a través de distintos mecanismos. Puede interaccionar e inhibir distintas caspasas (Suzuki y cols., 2000; Roninson, 2002), unirse a Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA1 216 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer E2F1 y MYC e impedir la transcripción de proteí- nas pro-apoptóticas (Abbas y Dutta, 2009) y tam- bién inducir la expresión de proteínas anti-apoptóticas (Dotto, 2000). También es inte- resante la observación de que el aumento del con- tenido de p21 en fibroblastos de pacientes de EA se ha asociado con la inhibición de la apoptosis in- ducida por estrés oxidativo (Naderi y cols., 2006). En este sentido, es importante destacar que exis- ten diferencias en la susceptibilidad de las células periféricas de los pacientes de EA y controles a la muerte celular inducida por diversos estímulos (Eckert y cols., 2001a; Morocz y cols., 2002; Uberti y cols., 2002; Naderi y cols., 2006), aunque existen discrepancias acerca de si las células de los pa- cientes son más resistentes o más vulnerables a los distintos inductores de muerte celular. Las dife- rencias pueden deberse a los distintos tipos celu- lares o inductores de muerte empleados. Mientras que en respuesta al suero la mayor proliferación de los linfoblastos de pacien- tes de EA se relaciona con la sobreactivación de la vía PI3K/Akt, el control de la supervivencia/muerte celular se relaciona con la actividad de CaMKII, ya que la inhibición selectiva de esta enzima aumenta la vulnerabilidad de las células de EA frente a la muerte celular inducida por la retirada de suero hasta los valores observados en las células control. Los efectos la inhibición directa de CaMKII con KN62 se acompañan de la activación de ERK1/2, y de un menor contenido nuclear de FOXO3a y de p21. La inactivación de CaMKII no tiene conse- cuencias en las células control, lo que sugiere que existe un umbral de CaM por encima del cual las células se protegen contra la apoptosis inducida por la retirada de suero. Estos resultados están en consonancia con publicaciones previas que indica- ban que los antagonistas de CaM bloqueaban la apoptosis en células de tumor de mama sin afectar a las células epiteliales normales de la glándula mamaria (Deb y cols., 2004). Los mecanismos por los cuales la activa- ción de CaMKII disminuye la actividad de ERK1/2 no se conocen con precisión. La cascada de las MAPK regula un gran número de procesos celula- res que en general se asocian a la activación de re- ceptores tirosina-quinasa y receptores acoplados a proteínas G. A grandes rasgos, la activación de la ruta de las MAPK comienza con la activación de Ras, una pequeña GTPasa unida a la membrana, que puede alternar entre la forma inactiva, unida a GDP y la forma activa unida a GTP. Una vez activa, recluta la quinasa Raf a la membrana, y ésta inicia una cascada de fosforilaciones, activando las qui- nasas MEK, que posteriormente fosforilan y acti- van ERK1/2. Se han descrito distintos mecanismos por los cuales CaMKII puede regular estas proteí- nas. Por un lado, se ha observado que en algunos tipos celulares, CaMKII fosforila la proteína Raf-1, favoreciendo la activación de ERK1/2 (Illario y cols., 2003; Salzano y cols., 2012). Por otro lado también se ha descrito que CaM puede unirse a K- 1Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA Noemí Esteras Gallego 217 Ras e inhibir la ruta Ras/Raf/MEK/ERK1/2 en fibro- blastos (Villalonga y cols., 2001). CaMKII también puede activar in vitro la proteína SynGAP (Synap- tic Ras GTPase activating protein 1) (Oh y cols., 2004) una proteína sináptica que activa la activi- dad GTPasa de Ras catalizando de esta forma su inactivación y la inhibición de ERK1/2 (Kim y cols., 1998). También en neuronas se ha propuesto un papel regulador de CaM de la actividad de K-Ras, mediante el cual CaM se puede unir a K-Ras, inhi- biendo su fosforilación por distintas quinasas. La inhibición de CaM en estos casos aumenta la acti- vación de K-Ras endógeno (Alvarez-Moya y cols., 2010). Aparentemente, CaM se une al extremo car- boxilo terminal que ancla K-Ras a la membrana en un mecanismo en el que es muy importante la far- nesilación de K-Ras (Wu y cols., 2011). Son nece- sarios más estudios para averiguar si estos mecanismos son operativos en linfocitos humanos y si están alterados en la EA. Recientemente se ha descrito la existen- cia de un pool de genes, importante en la res- puesta adaptativa y en la neuroprotección, cuya regulación es calcio-dependiente (Zhang y cols., 2009). Este sistema es extraordinariamente sensi- ble a cambios en la señalización nuclear de calcio, por lo que se debe también considerar la posibili- dad de que además del efecto indirecto de CaM/CaMKII en los niveles de FOXO3a y p21 a tra- vés de ERK1/2, estos genes pertenezcan al nom- brado pool. Los resultados obtenidos en células extra- neurales de pacientes de EA no son directamente extrapolables a lo que sucede en el cerebro. Sin embargo, es interesante destacar que alteraciones similares a las descritas en linfoblastos se han de- tectado en cerebros de pacientes de EA. Se han descrito cambios en la activación de CaMKII rela- cionados con una mayor fosforilación de tau y una mayor formación de ovillos neurofibrilares (McKee y cols., 1990). CaMKII también se ha relacionado con el aprendizaje y la memoria y se ha descrito una disfunción en la distribución celular de p-CaM- KII en las sinapsis que puede estar implicada en la disfunción cognitiva en los pacientes de EA (Reese y cols., 2011). De manera similar, se han encon- trado alteraciones en la actividad de ERK1/2, ge- neralmente asociadas a una mayor activación, en neuronas afectadas por EA (Zhu y cols., 2002). La ruta ERK1/2 parece estar implicada en la patogé- nesis de EA, por diversos mecanismos. Se ha des- crito que puede mediar la neurotoxicidad de Aβ (Chong y cols., 2006), de tau (Pei y cols., 2002) y alterar la plasticidad neuronal en el hipocampo, contribuyendo a la pérdida de memoria (Derkin- deren y cols., 1999). También se ha descrito un au- mento en la actividad de FOXO3a en el cerebro del modelo transgénico de EA Tg2576, comparado con la actividad de este factor en ratones control, que se relaciona con un aumento en los niveles de Aβ40 y Aβ42 (Qin y cols., 2008). De la misma ma- nera, se han encontrado elevados niveles de p21 Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA1 218 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer en la corteza cerebral de pacientes de EA (Engida- work y cols., 2001). Nuestros resultados sugieren que la alteración del eje Ca2+/CaM/CaMKII/ERK1/2 no es exclusiva de las neuronas, sino que también ocurre a nivel sistémico. En resumen, los datos aquí presentados muestran que, en ausencia de suero, la supervi- vencia de los linfoblastos de EA depende de la dis- minución de la actividad de ERK1/2 inducida por CaMKII. El resultado es una acumulación de FOXO3a en el núcleo, consecuencia de la inhibi- ción de la fosforilación y degradación del factor de transcripción y la posterior inducción transcripcio- nal de p21 como se observa en la figura 25. De ma- nera que la relación inversa entre CaMKII y ERK1/2 y entre ERK1/2 y FOXO3a controla el destino celu- lar de los linfoblastos de pacientes de EA en fun- ción de la disponibilidad de factores tróficos. 1Estudio de la actividad proliferativa y de la vulnerabilidad frente a la retirada de suero en células extraneurales de pacientes de EA Noemí Esteras Gallego 219 Figura 25. Esquema del papel de CaMKII/ERK1/2/FOXO3a en la regulación de los niveles de p21 y la supervivencia en lin- focitos inmortalizados de pacientes de EA. En los linfoblastos de pacientes control, la retirada de suero favorece la activa- ción de ERK1/2, que presumiblemente induce la degradación de FOXO3a, mediando su fosforilación y posterior salida al citoplasma y aumentando los niveles de MDM2. Estos procesos se revierten con el inhibidor de MEK PD98059. En linfoblas- tos de pacientes de EA, la retirada de suero regula negativamente ERK1/2 a través de una mayor activación de CaMKII. Este hecho previene la fosforilación y degradación de FOXO3a , favoreciendo su presencia en el núcleo, y aumentando de esta ma- nera la transcripción de p21. p21 se localiza mayoritariamente en el citoplasma de estas células y las protege frente a la apop- tosis. Estos efectos se revierten inhibiendo CaMKII con CMZ y KN62. La segunda parte de esta tesis se ha desarrollado empleando un modelo transgénico de la enfermedad, el ratón APP/PS1. A pesar de que ninguno de los modelos transgénicos existen- tes en la actualidad reproduce todas las caracte- rísticas neuropatológicas que presentan los pacientes de EA, como la muerte neuronal o el desarrollo de ovillos neurofibrilares, el empleo de estos animales está siendo muy útil para el estu- dio muchos aspectos relacionados con la enfer- medad y para valorar posibles tratamientos terapéuticos. En nuestro caso, el empleo de estos ratones nos ha permitido realizar un estudio com- parativo de la posible alteración simultánea en el control del ciclo celular en el SNC y en células pe- riféricas. El modelo que hemos empleado es el ratón APP/PS1, un modelo doble transgénico, re- sultado del cruce entre los ratones Tg2576, que so- breexpresan la APP humana con la doble mutación sueca (K670N, M671L) y el ratón PS1, que porta la mutación (M146L) en presenilina 1. El ratón APP/PS1 resultante se emplea habitualmente como modelo transgénico de la enfermedad. En nuestro caso, hemos usado ratones de 12 meses de edad, que garantizan el depósito de amiloide y los signos de muerte celular por apoptosis en la corteza y el hipocampo (Yang y cols., 2008a; An- tequera y cols., 2009; Spuch y cols., 2010). En primer lugar, empleamos la tecnología de arrays de PCR (RT2ProfilerTM-PCR Array) para 2Estudio simultáneo de las alteraciones del ciclo celular en cerebro y células periféricas del modelo transgénico de EA APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 221 cuantificar y comparar la expresión de 84 genes re- lacionados con el control del ciclo celular en el ce- rebro y células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de ratones APP/PS1 respecto a ratones control. Por el momento, hasta donde nosotros conocemos, es la primera demostración de la exis- tencia de alteraciones simultáneas en el control del ciclo celular en cerebro y células periféricas de un modelo murino de EA. Nuestros resultados in- dican que el genotipo APP/PS1 induce alteracio- nes en un amplio número de genes relacionados con el ciclo celular en ambos tejidos. El número de genes cuya expresión se ve alterada es mayor en CMSPs que en el cerebro (51% frente a 21%) y so- lamente 13 de ellos son comunes a los dos tejidos. Además, entre los genes comunes, algunos de ellos cambian en direcciones opuestas, lo que su- giere que su expresión puede estar regulada de forma dependiente del tejido en el que se encuen- tran. Los genes alterados no se relacionan con una fase concreta del ciclo celular, sino que están im- plicados en varias de ellas. En el cerebro, por ejem- plo, destacan los genes implicados en la fase G1 , en la transición G1/S y en los puntos de control del ciclo y arresto celular. Entre los genes que se expresan más tanto en cerebro como en CMSPs en APP/PS1 frente a controles encontramos Nek2 (NIMA(never in mitosis gene a)-related Expressed Kinase 2), Cdk5rap1 (CDK5 Regulatory subunit-Associated Protein 1) y Cdkn2a (CDK inhibitor 2a). Nek2 es un miembro de la familia de serina-treonina quinasas Nek, que se relaciona estructuralmente con el re- gulador de la mitosis NIMA (Fry y cols., 1998). Nek2 está implicada en la división celular y en la regulación mitótica a través de la separación del centrosoma (Fry, 2002; Fletcher y cols., 2004). Esta proteína también se ha encontrado elevada en di- versos tipos de cáncer (Hayward y cols., 2004) y se ha descrito que su sobreexpresión es capaz de pro- mover la aneuploidía en algunos tipos celulares (Liu y cols., 2010; Zeng y cols., 2010) . El gen Cdk5rap1 codifica una proteína asociada con la su- bunidad reguladora de Cdk5. En muchos modelos celulares se ha descrito la correlación entre la des- regulación de Cdk5 y la muerte neuronal. Además de ser una de las principales quinasas que inter- vienen en la hiperfosforilación de tau, Cdk5 tam- bién interviene en la muerte neuronal producida por la reentrada en ciclo ya que induce la fosfori- lación de la proteína del retinoblastoma (Hamdane y cols., 2005; Hamdane y Buee, 2007). Por su parte, los resultados del array de PCR muestran que el gen Cdkn2a, que codifica el inhibidor de Cdks p16, presenta una expresión más de tres veces superior en el cerebro de los ratones transgénicos que en el de los controles. Este resultado está de acuerdo con otros publicados con anterioridad, en los que se observaba una sobreexpresión de p16 en neu- ronas de pacientes de EA (Arendt y cols., 1996; McShea y cols., 1997). En cuanto a los genes que se expresan en menor medida en ratones transgéni- Estudio simultáneo de las alteraciones del ciclo celular en cerebro y células periféricas del modelo transgénico de EA APP/PS12 222 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer cos frente a controles en ambos tejidos, podemos destacar Cdkn1a, que codifica p21. En la corteza de pacientes de EA ya se habían descrito con an- terioridad alteraciones en la expresión de este in- hibidor del ciclo celular (Engidawork y cols., 2001; Zhu y cols., 2004a). Asimismo, de acuerdo con estos resultados, en nuestro laboratorio se había descrito una disminución de los niveles de p21 en linfoblastos de pacientes de EA respecto a contro- les en condiciones proliferativas (Sala y cols., 2008). La expresión de Gpr132 (G Protein-coupled Receptor 132), por su parte, está disminuida en el cerebro y aumentada en las CMSPs de los ratones APP/PS1 respecto a los controles, lo que puede tener distintas implicaciones funcionales. El receptor que codifica este gen se identificó en células linfoides B como el receptor de lisofosfati- dilcolina (Kabarowski y cols., 2001) debido a que su transcripción aumentaba en respuesta a la transformación oncogénica o tras el tratamiento con agentes que causan daños en el ADN (Weng y cols., 1998). En resumen, los resultados del array de PCR muestran que existe un buen número de genes relacionados con el ciclo celular cuya expre- sión está alterada tanto en el cerebro como en los linfocitos del modelo transgénico de alzhéimer APP/PS1. En consonancia con los cambios observa- dos en la expresión de genes que controlan el ciclo celular en los CMSPs del ratón transgénico, tam- bién observamos una mayor tasa de incorporación de BrdU en el ADN en los ratones APP/PS1 res- pecto a los controles. Este resultado refleja una mayor actividad proliferativa en respuesta a un es- tímulo mitogénico de los CMSPs de los ratones transgénicos respecto a los controles, y además está de acuerdo con los resultados previos de nuestro laboratorio, en los que mostrábamos una mayor proliferación tanto de CMSPs como de lin- focitos inmortalizados de pacientes de EA res- pecto a individuos sanos (de las Cuevas y cols., 2003; Bartolomé y cols., 2007; Muñoz y cols., 2008). Por otra parte, las alteraciones en genes del ciclo celular en el cerebro de ratones APP/PS1 se acompañan de la expresión de un marcador de proliferación como PCNA o de la proteína inhibi- dora de Cdks, p16, en neuronas postmitóticas. Estas observaciones sugieren que la sobreexpre- sión de APP y la mutación en PS1 pueden inducir a las neuronas diferenciadas a entrar en un ciclo de división no deseado. Nuestros resultados están de acuerdo con publicaciones previas en las que se describen aumentos en la expresión de distintas proteínas reguladoras del ciclo en el cerebro de pa- cientes de la enfermedad (Nagy y cols., 1997; Bus- ser y cols., 1998; Schmetsdorf y cols., 2007) o en el de varios modelos murinos de EA (Yang y cols., 2006; Ahn y cols., 2008; Malik y cols., 2008). Sin embargo, también hay que señalar que otros au- tores no han encontrado evidencias de reactiva- ción del ciclo celular en un modelo triple 2Estudio simultáneo de las alteraciones del ciclo celular en cerebro y células periféricas del modelo transgénico de EA APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 223 transgénico de la enfermedad (3xTg-AD) (Lopes y cols., 2009a). A pesar de que son numerosos los resul- tados que apuntan a la reactivación del ciclo celu- lar en las neuronas en varios modelos murinos de la EA y que también se han descrito característi- cas apoptóticas en el ratón APP/PS1 (Spuch y cols., 2010), este modelo, y, en general, la gran mayoría de los modelos de EA, no muestran una pérdida neuronal significativa (Oddo y cols., 2003; Yang y cols., 2006), lo que puede hacer pensar que la dis- función del ciclo no sea una causa inmediata de muerte neuronal. En ese sentido, la teoría del doble impacto sugiere que las neuronas afectadas puedan sobrevivir a pesar del intento de entrada de ciclo, pero en un estado que las hace más vul- nerables a otros factores nocivos (Zhu y cols., 2004b; Zhu y cols., 2007a). Además de nuestros resultados mos- trando alteraciones paralelas en cerebro y células periféricas, previamente se había descrito que tanto los linfocitos como los cultivos neuronales de ratones portadores de una o más mutaciones en el gen de PS1 mostraban una mayor vulnerabi- lidad celular frente al estrés (Eckert y cols., 2001b). Por lo tanto, nuestras observaciones suponen un apoyo adicional a la idea de que la EA induce tam- bién cambios significativos en la fisiología celular a nivel sistémico. Una limitación importante de nuestro es- tudio es la heterogeneidad de las muestras de ce- rebro. En este tipo de muestras, otras células ade- más de las neuronas, como las células de la glía o incluso los progenitores neurales, podrían contri- buir a la expresión diferencial de genes relaciona- dos con el ciclo celular en los ratones APP/PS1. Aunque hemos podido demostrar la expresión al- terada de PCNA y p16 específicamente en neuro- nas diferenciadas de la corteza de estos ratones, lo ideal sería confirmar los cambios en la expresión génica en poblaciones específicas de neuronas como las que se obtienen por microdisección me- diante captura con láser. En los ratones APP/PS1 hemos observado que, a pesar de presentar una mayor activación glial que los ratones control, la co-localización de p16 y el marcador de astrocitos GFAP es muy escasa. En resumen, los resultados presentados en este apartado muestran que la sobreexpresión de APP y la mutación de PS1 inducen en el ratón una serie de alteraciones en el control del ciclo ce- lular que se producen de manera paralela en el ce- rebro y en las CMSPs, apoyando la existencia de manifestaciones sistémicas de la enfermedad y va- lidando el empleo de tejidos periféricos para el es- tudio de las características fisiopatológicas de la EA y también para valorar la eficacia de trata- mientos contra la enfermedad. Algunos fármacos capaces de detener la progresión del ciclo celular han mostrado efectos neuroprotectores en mode- los animales de daños cerebrales o infarto (Woods Estudio simultáneo de las alteraciones del ciclo celular en cerebro y células periféricas del modelo transgénico de EA APP/PS12 224 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer y cols., 2007; Varvel y cols., 2009) y en la actuali- dad están en marcha diversos estudios basados en la hipótesis del ciclo celular. 2Estudio simultáneo de las alteraciones del ciclo celular en cerebro y células periféricas del modelo transgénico de EA APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 225 Además de lo expuesto anteriormente, los modelos animales de la EA también se em- plean en la actualidad para la búsqueda de bio- marcadores. Se entiende por biomarcador un parámetro molecular, bioquímico o anatómico que puede ser cuantificable y que es característico de un determinado estado de salud o enfermedad. En el caso de la EA, los biomarcadores pueden ser úti- les en el diagnóstico temprano de la enfermedad, en el estudio de la progresión de la misma o para evaluar la eficacia de potenciales tratamientos te- rapéuticos. Lo ideal en este tipo de indicadores es que sean de fácil obtención, y, dadas las caracte- rísticas de la EA, que se puedan obtener emple- ando técnicas no invasivas. En ese sentido, destacan la búsqueda de biomarcadores en fluidos corporales y el estudio anatómico, funcional y me- tabólico del cerebro mediante técnicas de reso- nancia magnética. Dentro de estas últimas, tanto la resonancia magnética de imagen (MRI) como de espectroscopía (MRS), son de especial interés y se están empleando en la actualidad tanto en huma- nos como en modelos animales (Bradley y cols., 2002; de Leon y cols., 2007; Leow y cols., 2009). Es importante hacer notar que los biomarcadores en- contrados en humanos no son necesariamente ex- trapolables a los que podemos encontrar en modelos animales (y viceversa) por lo que es inte- resante caracterizar los modelos animales en la búsqueda de los parámetros que mejor definan al 3Caracterización por técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y de Espectroscopía del ratón APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 227 modelo en cuestión. En general, el uso de MRI y MRS en los modelos de ratón se ha centrado en el estudio de la aparición de placas de amiloide (Lee y cols., 2004; Wengenack y cols., 2008), en los cambios vo- lumétricos (Lau y cols., 2008; Van Broeck y cols., 2008) y en la cuantificación de metabolitos por MRS (Marjanska y cols., 2005; von Kienlin y cols., 2005). En nuestro caso, el abordaje ha sido dife- rente, y hemos estudiado de manera general la to- talidad del cerebro del ratón, así como estructuras concretas (hipocampo y corteza, las zonas más afectadas por la enfermedad). El objetivo princi- pal de este bloque de la tesis ha sido caracterizar sistemáticamente por técnicas de MRI y MRS el modelo transgénico APP/PS1, evaluando una am- plia variedad de parámetros. Además, hemos apli- cado un modelo de regresión logística para determinar, entre todas las variables obtenidas, aquellas que mejor discriminan entre los ratones transgénicos y los controles. En primer lugar, en cuanto a las técnicas de resonancia magnética de imagen, hemos em- pleado imágenes pesadas en T2, junto con imáge- nes de resonancia magnética por difusión y por transferencia de magnetización (ver Material y Métodos). En humanos, las técnicas de MRI nor- malmente se emplean para el estudio estructural y volumétrico del cerebro, especialmente en la de- tección de la atrofia del lóbulo temporal-medial y también en los cambios concretos de determina- das estructuras, como el hipocampo y los ventrí- culos (Frisoni y cols., 2010). La inflamación, otra característica importante de la enfermedad, se re- laciona con un aumento en el contenido de agua del cerebro, y también se puede visualizar con este tipo de técnicas, reflejándose un aumento en la in- tensidad de las imágenes pesadas en T2 y en los valores de ADC junto con una disminución del por- centaje de MT. Los resultados presentados mues- tran que los ratones APP/PS1 presentan estas características, lo que es compatible con los sig- nos de neuroinflamación previamente descritos en este modelo de EA (Spuch y cols., 2010). El estudio volumétrico de las diferentes áreas del cerebro muestra que los ratones APP/PS1 presentan un mayor volumen ventricular que los ratones control. Este marcador estructural se ha observado también en pacientes de EA, se correlaciona fuertemente con los resultados en los test cognitivos y en algunos estudios longitudina- les los cambios se asocian con la progresión de DCL a EA (Thompson y cols., 2004; Nestor y cols., 2008; Ridha y cols., 2008; Evans y cols., 2010). Ade- más, algunos autores han descrito que los cambios volumétricos en los hemisferios cerebrales (como por ejemplo, la dilatación de los ventrículos) se co- rrelacionan mejor con el deterioro cognitivo que la atrofia del lóbulo temporal medial (Jack y cols., 2004). El incremento en el volumen ventricular también se asocia con las placas de amiloide y la Caracterización por técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y de Espectroscopía del ratón APP/PS13 228 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer presencia de ovillos neurofibrilares y puede consi- derarse un marcador adecuado para evaluar la progresión de la enfermedad (Silbert y cols., 2003). Nuestros resultados muestran un incremento sig- nificativo en el volumen de los ventrículos de los ratones APP/PS1 que afecta principalmente a los ventrículos laterales. Se han descrito resultados si- milares en otro modelo de ratón transgénico de EA con mutaciones en tau (Xie y cols., 2010). Tam- bién hay que mencionar que el patrón de expan- sión de los ventrículos a lo largo de la vida del ratón es diferente que en humanos, por lo que hay que tener en cuenta en los ratones la dilatación ventri- cular que ocurre fisiológicamente con el envejeci- miento (Chen y cols., 2011). El ensanchamiento de los ventrículos se acompaña de una disminución discreta del volu- men del hipocampo en los ratones APP/PS1. La atrofia del hipocampo, y especialmente la tasa de atrofia del hipocampo, es decir, los cambios de vo- lumen de esta estructura a lo largo del tiempo, son parámetros que se consideran predictores de la progresión de la EA también en personas con DCL (Henneman y cols., 2009; Mouiha y Duchesne, 2011). Sin embargo, los estudios en modelos trans- génicos de la enfermedad muestran resultados contradictorios. Mientras algunos modelos como el PDAPP, el APP/PS1 o el rTg4510 muestran un menor volumen del hipocampo (Redwine y cols., 2003; Oberg y cols., 2008; Yang y cols., 2011), otros resultados describen un mayor volumen en el mo- delo TASTPM (Maheswaran y cols., 2009). Cabe pensar que el trasfondo genético, los diferentes genes expresados en cada modelo, y otros facto- res como la edad del animal o incluso el método de medida puedan influir en las diferencias encon- tradas. En conjunto, parece que el estudio del au- mento del volumen ventricular, más que la disminución del volumen del hipocampo en los ra- tones transgénicos modelos de EA tenga poten- cialmente un interés mayor para el diagnóstico de la enfermedad. Los mapas de transferencia de magneti- zación nos ofrecen información sobre la microes- tructura del cerebro, reflejando posibles alteraciones histológicas. Nuestros resultados muestran una disminución en el porcentaje de transferencia de magnetización, tanto en el total del cerebro como en la corteza cerebral y el hipo- campo. Estos resultados están en consonancia con los encontrados en cerebros de pacientes de EA (Hanyu y cols., 2000; Hanyu y cols., 2001; Kabani y cols., 2002; Ropele y cols., 2012). Además, las al- teraciones localizadas en el % MT se han asociado con el estado cognitivo tanto en pacientes con DCL como con EA (van Buchem y Tofts, 2000; van der Flier y cols., 2002). La reducción del % MT en el cerebro se puede relacionar con situaciones de in- flamación o edema, y algunos autores han suge- rido que pueda reflejar cambios relacionados con la pérdida neuronal, la acumulación de placas y ovillos y la gliosis (Ridha y cols., 2007). 3Caracterización por técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y de Espectroscopía del ratón APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 229 Los valores de ADC, por su parte, nos dan una idea de la difusión del agua en los tejidos. En los cerebros de pacientes de EA y DCL se ha des- crito un aumento en los valores de ADC, que algu- nos autores han atribuido a la pérdida de cuerpos neuronales, axones o dendritas, que puede tener como consecuencia una expansión del espacio ex- tracelular donde el agua puede difundir de manera más rápida aumentando dichos valores (Sandson y cols., 1999; Kantarci y cols., 2005). Nuestros re- sultados muestran que los ratones APP/PS1 pre- sentan una tendencia a tener valores más altos de ADC tanto en el total del cerebro como en el hipo- campo respecto a los controles, sin embargo, este hallazgo no es estadísticamente significativo. Otro modelo transgénico de EA, el TgCRND8, muestra resultados similares (Thiessen y cols., 2010). Hemos combinado los estudios de MRI con MRS para analizar cuantitativamente cambios metabólicos en el cerebro del ratón in vivo. En ge- neral, la reducción del pico de NAA es el indicador metabólico más consistente de patología cerebral y de la progresión de la enfermedad en la EA, ya que está relacionado con la degeneración neuro- nal (Jessen y cols., 2005; Foy y cols., 2011; Silveira de Souza y cols., 2011). Aunque algunos modelos transgénicos de EA también muestran una dismi- nución del cociente NAA/Cr en el hipocampo de ratones entre 6,5 y 9 meses de edad (Oberg y cols., 2008), nosotros no hemos encontrado diferencias en este cociente ni en la corteza ni en el área sub- cortical de los ratones APP/PS1. Sin embargo, nuestros resultados podrían estar de acuerdo con otras publicaciones en las que se muestra una dis- minución de NAA/Cr en el cerebro de ratones APP/PS1 pero solamente en aquellos de más de doce meses de edad (Marjanska y cols., 2005). Asi- mismo, en el modelo transgénico PS2APP los cambios en los niveles de NAA también dependen de la edad y están relacionados con la amiloidosis (von Kienlin y cols., 2005). Nuestros resultados muestran que los es- tudios de MRS en el ratón APP/PS1 reflejan un in- cremento muy significativo en el cociente Cho/Cr en las áreas cortical y subcortical respecto a los ra- tones control. Otros modelos animales, sin em- bargo, no reflejan cambios en la concentración de Cho (Marjanska y cols., 2005). Las discrepancias pueden deberse a diferencias en la región cerebral estudiada o a diferencias intrínsecas al modelo transgénico o relativas a su edad. En humanos, hay también resultados conflictivos, mientras que algunos autores encuentran en pacientes de EA un mayor valor del cociente Cho/Cr (Kantarci y cols., 2004), otros no lo hacen (Valenzuela y Sachdev, 2001; Wang y cols., 2009c). Es importante destacar que este cociente permite diferenciar totalmente a los ratones APP/PS1 de los ratones control a los doce meses de edad. Por lo tanto este valor podría considerarse como un marcador muy sensible in vivo de la presencia de la enfermedad, al menos a los doce meses de edad. Un estudio longitudinal Caracterización por técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y de Espectroscopía del ratón APP/PS13 230 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer prospectivo realizado en 509 personas de edad avanzada mostraba que las personas con un co- ciente Cho/Cr elevado presentaban más riesgo de desarrollar demencia en los cuatro años siguien- tes (den Heijer y cols., 2006). Además, reciente- mente se ha descrito que la elevación de este cociente se asocia con procesos patológicos pre- clínicos de la EA, de forma que valores Cho/Cr ele- vados se correlacionan con puntuaciones más bajas en los test cognitivos, y que este proceso es independiente de la carga de Aβ (Kantarci y cols., 2011). Nuestras observaciones muestran que el incremento en el cociente Cho/Cr en los ratones APP/PS1 respecto a los controles se acompaña de un incremento en la neurogénesis como muestran la incorporación de BrdU y la co-localización del marcador de proliferación Ki-67 y del marcador de precursores neuronales DCX (Doublecortin). Algu- nos modelos de ratón han mostrado alteraciones en la neurogénesis, con resultados contradictorios, mientras unos muestran un aumento en la misma, otros apuntan a una disminución (Donovan y cols., 2006; Lopez-Toledano y Shelanski, 2007). El au- mento en la proliferación de los precursores neu- ronales que nosotros mostramos está de acuerdo con trabajos recientes que indican que la leptina induce una proliferación celular similar en el hipo- campo del ratón APP/PS1 adulto (Perez-Gonzalez y cols., 2011), y con resultados post-mortem en el cerebro de pacientes que muestran un aumento de la neurogénesis en el giro dentado y en el área CA1 del hipocampo (Jin y cols., 2004). El incre- mento en la neurogénesis puede representar una respuesta compensatoria al daño cerebral, aunque sería necesario estudiar si estos progenitores son capaces de diferenciarse en neuronas maduras funcionales que se integren satisfactoriamente en el circuito neuronal. Otra posible explicación para el incre- mento en la concentración de Cho tanto en pa- cientes de EA como en nuestro modelo de ratón es que la colina proceda del catabolismo de fosfa- tidilcolina de la membrana celular, cuyo objetivo sería proporcionar colina libre para intentar com- pensar la síntesis deficiente de acetilcolina que tiene lugar en la enfermedad (Wurtman y cols., 1985). Se ha descrito que el incremento de Cho/Cr en el estriado del ratón APP/PS1 se mitiga al tra- tar a los animales con el inhibidor de acetilcolines- terasa donepezilo (Westman y cols., 2009), un resultado que está de acuerdo con un estudio rea- lizado en pacientes, en los que el cociente Cho/Cr disminuía tras cuatro meses de tratamiento con el fármaco (Bartha y cols., 2008). Estos resultados hacen pensar que el cociente Cho/Cr pueda servir como marcador de la eficacia terapéutica en en- sayos clínicos. El análisis estadístico por regresión logís- tica indica que el parámetro más sensitivo y espe- cífico para discriminar entre ratones control y transgénicos a los doce meses de edad es la me- 3Caracterización por técnicas de Resonancia Magnética de Imagen y de Espectroscopía del ratón APP/PS1 Noemí Esteras Gallego 231 dida del cociente Cho/Cr en el área subcortical. La combinación de otros parámetros de MRI en la corteza cerebral (Intensidad T2 en el corte 10, % MT en el corte 4 y ADC en el corte 1) también dis- crimina totalmente ambos grupos. Otros marca- dores estructurales, como los cambios volumétricos en los ventrículos y el hipocampo nos dan información importante sobre el estado de en- fermedad, aunque con menores valores de espe- cificidad y sensibilidad. En conjunto, estas observaciones ponen de manifiesto la utilidad de los marcadores basados en MRI y MRS en la ca- racterización de los modelos transgénicos de la EA. Una importante limitación de nuestro es- tudio es que solamente se han empleado ratones de doce meses de edad, por lo que los resultados obtenidos de momento sólo se pueden considerar marcadores del estado de enfermedad, lo que los hace útiles para el diagnóstico. Sería muy intere- sante realizar estudios longitudinales, midiendo los parámetros a diferentes edades para compro- bar si estos indicadores pudieran también utili- zarse para monitorizar la progresión de la enfermedad. El modelo de ratón APP/PS1 se había ca- racterizado previamente en términos de depósito de amiloide, alteraciones del comportamiento, ca- racterísticas apoptóticas, y degeneración neuro- nal y sináptica (Holcomb y cols., 1998; Antequera y cols., 2009; Spuch y cols., 2010). Los estudios de MRI y MRS que hemos realizado añaden más in- formación sobre los parámetros estructurales y bioquímicos que caracterizan al ratón APP/PS1 a los doce meses de edad y pueden ser muy útiles para el estudio de la patología de la EA. Además, existe una gran correlación entre los resultados que presentamos y los que se observan en huma- nos, por lo que, a nivel translacional podrían ser observaciones muy interesantes en el desarrollo y validación de nuevas estrategias terapéuticas. Caracterización por técnicas de Resonancia Magnética de Imagen de Espectroscopía del ratón APP/PS13 232 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Conclusiones 6 1.- Los linfoblastos derivados de pacientes de EA muestran niveles elevados de CaM como conse- cuencia de alteraciones en la degradación de la molécula en el proteasoma, en un mecanismo dependiente de los niveles de ROS y de calcio intracelular. El aumento de CaM conlleva un incremento en la activación de PI3K y de CaMKII. 2.- Ca2+/CaM interacciona con las vías de señalización PI3K/Akt y ERK1/2 para el control de la pro- liferación y la supervivencia celular respectivamente, en función de la disponibilidad de factores tróficos. La regulación del destino celular se ejerce a través de cambios en los niveles de dos proteínas clave en el con- trol del ciclo celular: p27 y p21. 3.- Los linfoblastos de EA presentan niveles más elevados de p21 y son más resistentes que las cé- lulas control a la apoptosis inducida por la retirada de suero. La vulnerabilidad depende de la relación inversa que parece existir entre la actividad de CaMKII y ERK1/2 y entre ésta última y los niveles de p21. 4.- En ausencia de suero, los niveles de p21 parecen ser regulados a nivel transcripcional. En los lin- foblastos de EA, la menor activación de ERK1/2 se asocia con la retención nuclear y el aumento de la acti- vidad del factor de transcripción FOXO3a. 5.- Dado que las alteraciones en proteínas reguladoras del ciclo celular y moléculas señalizadoras encontradas en linfocitos de EA son similares a las descritas en neuronas vulnerables de pacientes, estos re- sultados sugieren que existe una huella molecular específica de la enfermedad a nivel sistémico. 6.- Los ratones APP/PS1 muestran una expresión diferencial de genes relacionados con el ciclo ce- lular en cerebro y en linfocitos, que se acompaña de una mayor actividad proliferativa de linfocitos y de la presencia de marcadores del ciclo celular en neuronas corticales. Estos resultados validan el uso de células periféricas para estudiar los fenómenos relacionados con la neurodegeneración asociada a la reactivación del ciclo celular en neuronas postmitóticas. 7.- La aplicación de técnicas de resonancia magnética de imagen y espectroscopia, MRI y MRS, para el estudio del cerebro de los ratones APP/PS1, ha permitido una caracterización exhaustiva de este modelo experimental, desvelando la potencialidad de algunos de los cambios observados como biomar- cadores para ayudar en el diagnóstico y en el desarrollo preclínico de nuevas estrategias terapéuticas. Conclusiones Noemí Esteras Gallego 235 Bibliografía 7 Abbas, T y Dutta, A (2009). “p21 in cancer: intri- cate networks and multiple activities.” Nat Rev Cancer 9(6): 400-414. Abdel-Salam, OM (2011). “Stem cell therapy for Alzheimer’s disease.” CNS Neurol Disord Drug Targets 10(4): 459-485. 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Anexos Noemí Esteras Gallego 271 Anexos Noemí Esteras Gallego 273 Noe Texto escrito a máquina Reprinted with kind permission from Springer Science and Business Media Anexos 274 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 275 Anexos 276 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 277 Anexos 278 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 279 Anexos 280 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 281 Anexos 282 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 283 Anexos 284 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 285 Anexos Noemí Esteras Gallego 287 Anexos 288 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 289 Anexos 290 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 291 Anexos 292 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 293 Anexos 294 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 295 Anexos Noemí Esteras Gallego 297 Noe Texto escrito a máquina Reprinted with kind permission from Springer Science and Business Media Anexos 298 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 299 Anexos 300 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 301 Anexos 302 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 303 Anexos 304 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 305 Anexos 306 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Anexos Noemí Esteras Gallego 307 Anexos 308 Ciclo celular y enfermedad de Alzheimer Tesis Noemí Esteras Gallego Portada Agradecimientos Abreviaturas Índice.Contenidos Índice. Figuras y Tablas Introducción Objetivos Materiales y Métodos Resultados Discusión Conclusiones Bibliografía Anexo