UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS © Carolina González de Figueras, 2020 TESIS DOCTORAL Construcción de una planta transgénica de Arabidopsis thaliana que expresa una declorinasa bacteriana y que elimina, y degrada el pesticida lindano MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Carolina González de Figueras DIRECTOR Jose Eduardo González Pastor Madrid UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS TESIS DOCTORAL Construcción de una planta transgénica de Arabidopsis thaliana que expresa una declorinasa bacteriana y que elimina, y degrada el pesticida lindano MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Carolina González de Figueras DIRECTOR Jose Eduardo González Pastor UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR TESIS DOCTORAL CONSTRUCCIÓN DE UNA PLANTA TRANSGÉNICA DE ARABIDOPSIS THALIANA QUE EXPRESA UNA DECLORINASA BACTERIANA, Y QUE ELIMINA Y DEGRADA EL PESTICIDA LINDANO MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Carolina González de Figueras DIRECTOR José Eduardo González Pastor Madrid, 2020 Memoria presentada por Dª Carolina González de Figueras, licenciada en Biología, para optar al grado de Doctor por la Universidad Complutense de Madrid Madrid, 2020 Director Dr. José Eduardo González Pastor Tutor Dr. Miguel Arroyo Sánchez Agradecimientos AGRADECIMIENTOS Quiero dedicar y agradecer esta tesis a mi familia por todo su apoyo y comprensión con este tema y en resto de mi vida, vuestra ayuda, vuestra confianza, vuestra guía y vuestra paciencia. Gracias por demostrarme vuestro orgullo siempre. Siento que papá no pueda estar aquí para verlo pero sé mamá que disfrutarás por los dos y que él nos acompaña de otra manera. Muchas gracias Vladi por todo, pero en especial por cuidar tan bien de todos y dejarte los sesos en planes para llevarte a los peques lejos cuando tenía que trabajar, eres un padrazo, lo sabes, te quiero. Gracias por tu amor y tu compañía todos estos años, el camino es más fácil contigo al lado. Gracias a Rodrigo y a Alejandro por su amor incondicional, sus dibujos en los artículos, sus besos y risas y su comprensión, siento el tiempo no compartido. Nuestra vida no ha sido más sencilla desde que llegasteis, pero sí más completa. Maitongui, mamá sé que estáis y siempre estaréis ahí cuando os necesite, gracias por toda vuestra ayuda. Muchas gracias Maite en especial por tu ayuda con la portada, ha quedado estupenda por supuesto. Os quiero y estoy orgullosa de todos vosotros. Por supuesto quiero darte gracias Eduardo por todo, son ya muchos años juntos y sé que este trabajo ha sido una apuesta personal y un gran esfuerzo para ti. Soy consciente de tus desmanes y tus dolores de cabeza. Gracias por tu confianza, tu guía desde que llegué y montamos el laboratorio juntos, tu apoyo constante, por tu paciencia, por tu forma de decir las cosas, por tu cariño y tu amistad. Gracias a las “niñas” del laboratorio, las que estáis y las que, aunque ya no estéis in situ seguís apoyando y sosteniendo desde fuera. Es un placer trabajar y/o haber trabajado con vosotras. La vida es más agradable cuando se trabaja a gusto con buena compañía, y “buena” música. María gracias por tu sonrisa y tu forma de ver la vida, Ale gracias por tu madurez y alegría, Patricia gracias por pensar siempre en los demás y ayudarme siempre, Vero sabes que eres todo un ejemplo, Olga admiro tu forma de explicar las cosas y tu paz y Virginia gracias por tu comprensión y por escucharme en las clases de pintura y tu ayuda siempre. Sara, tu apoyo tecnológico siempre es indispensable muchas gracias. Salvador, trabajar a tu lado ha sido muy motivador antes de que nos abandonaras por el despacho. Gracias al resto del laboratorio también. Muchas gracias a la Dr. Laura Barrios por su tiempo y su ayuda con la estadística, es un “mundo” complicado en el que es mucho más sencillo adentrarse acompañado. Gracias por tu paciencia y disponibilidad. Agradecimientos Y por supuesto gracias a Antonio Leyva y su equipo por iniciarnos y guiarnos en el aprendizaje de trabajar con plantas. Gracias a todos los que de alguna manera habéis hecho posible esta tesis, gracias Silvia por convencerme y ayudarme, gracias a Piti por tu ayuda y consejos. Olga por todo tu esfuerzo con los geles, siento que al final no salieran. A César y Susana por sus análisis y su tiempo. Y a Pedro, Alejandro y Jesús por la ayuda en la “búsqueda arqueológica”. A Pilar por tenernos las cosas siempre a punto. Y a Juan Pérez Mercader que apostó por mi en su momento y me dio la oportunidad de entrar en el Centro de Astrobiología. Gracias a Rogelio y a Juan Ángel de la Unidad de Divulgación del CAB por sus estupendas fotos para las contraportadas. Gracias a los amigos de siempre y al grupo por crear estabilidad y felicidad en mi vida. Muchas gracias a todos, de esto, como de muchas otras cosas, tenéis parte de “culpa”. Índice Índice ABREVIATURAS ................................................................................................................... I ÍNDICE DE FIGURAS: ............................................................................................................III ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................. IV ABSTRACT ........................................................................................................................... 1 RESUMEN ............................................................................................................................ 3 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 5 1 LINDANO .......................................................................................................................... 7 1.1 CARACTERÍSTICAS E HISTORIA DE LA PROBLEMÁTICA DERIVADA DE SU EMPLEO COMO PESTICIDA............. 7 1.2 EFECTOS DEL LINDANO Y DEMÁS ISÓMEROS DEL HCH EN LOS DISTINTOS ORGANISMOS. ...................... 10 1.3 NORMATIVA. ......................................................................................................................... 11 2 DEGRADACIÓN BIOLÓGICA NATURAL DEL LINDANO. .................................................................. 12 2.1 DEGRADACIÓN DEL LINDANO POR LA BACTERIA SPHINGOBIUM JAPONICUM (ANTES CONOCIDA COMO SPHINGOMONAS PAUCIMOBILIS) UT26. .............................................................................................. 12 2.2 OTROS MICROORGANISMOS CAPACES DE DEGRADAR EL LINDANO.................................................... 18 3 TRATAMIENTOS PARA LA DESCONTAMINACIÓN DE SUELOS CON PESTICIDAS. ................................... 19 3.1 EVOLUCIÓN DE LOS PESTICIDAS EN SUELOS .................................................................................. 19 3.2 TECNOLOGÍAS PARA LA DESCONTAMINACIÓN DE PESTICIDAS .......................................................... 20 4 ANTECEDENTES DEL EMPLEO DE S. JAPONICUM Y DE LOS GENES LIN PARA LA DESCONTAMINACIÓN DE SUELOS CON LINDANO. ............................................................................................................ 26 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 29 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................. 33 MATERIALES ...................................................................................................................... 35 Índice 1 MATERIAL BIOLÓGICO ....................................................................................................... 35 1.1 ESTIRPES BACTERIANAS ............................................................................................................ 35 1.2 PLÁSMIDOS ............................................................................................................................ 35 1.3 MATERIAL VEGETAL ................................................................................................................. 36 2 CEBADORES .................................................................................................................... 37 3 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN ................................................................................................... 37 4 ANTIBIÓTICOS ................................................................................................................. 38 5 FOSFINOTRICINA (HERBICIDA) Y LINDANO (PESTICIDA) ............................................................... 38 6 MEDIOS DE CULTIVO ......................................................................................................... 38 6.1 MEDIO PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS......................................................................... 39 6.2 MEDIOS PARA EL CRECIMIENTO DE PLANTAS ................................................................................ 39 MÉTODOS ......................................................................................................................... 40 1 MANIPULACIÓN Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS Y DE PLANTAS ............................... 40 1.1 CRECIMIENTO BACTERIANO ...................................................................................................... 40 1.2 CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS BACTERIANAS ................................................................................ 41 1.3 CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE PLANTAS ................................................................................ 41 1.4 CONSERVACIÓN DE LAS SEMILLAS .............................................................................................. 43 2 MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN ......................................................................................... 43 2.1 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA ................................................................................................ 43 2.2 TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS .................................................................................. 43 3 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ...................................................................................... 45 3.1 MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS BACTERIANOS ................................................................... 45 3.2 MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE PLANTAS ..................................................................... 49 4 ANÁLISIS FENOTÍPICO ........................................................................................................ 53 4.1 ESTUDIO DE LA PARTE AÉREA DE LA PLANTA ................................................................................. 53 4.2 ESTUDIO DE RAÍCES ................................................................................................................. 54 5 ANÁLISIS DE LA DEGRADACIÓN DE LINDANO POR LAS PLANTAS MODIFICADAS .................................. 55 5.1 CROMATOGRAFÍA DE GASES CON ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC/MS-ECD) ................................. 55 5.2 IDENTIFICACIÓN DE LINDANO Y SUS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN MEDIANTE CROMATOGRAFÍA CON MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA DE ALTA EFICACIA (HP-SPME) ....................................................... 58 5.3 TRATAMIENTOS ESTADÍSTICOS ................................................................................................... 59 6 FOTOGRAFÍA ................................................................................................................... 62 Índice RESULTADOS ..................................................................................................................... 63 1 CONSTRUCCIÓN DE PLANTAS QUE EXPRESAN EL GEN LINA DE LA BACTERIA SPHINGOBIUM JAPONICUM UT26S................................................................................................................................ 65 1.1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LINDANO TÓXICA PARA A. THALIANA ............................. 65 1.2 TRANSFORMACIÓN DE A. THALIANA CON EL GEN LINA ................................................................... 66 1.3 TOLERANCIA A LINDANO DE LAS PLANTAS HOMOCIGOTAS DE LA GENERACIÓN T2 ............................... 70 1.4 DETECCIÓN DE LA PRESENCIA DEL GEN LINA Y DE SU EXPRESIÓN EN LAS PLANTAS TRANSFORMADAS ...... 70 1.5 ANÁLISIS FENOTÍPICO DE LAS PLANTAS TRANSFORMADAS CON EL GEN LINA....................................... 74 2 ELIMINACIÓN Y DEGRADACIÓN DE LINDANO MEDIADA POR LAS PLANTAS MODIFICADAS QUE EXPRESAN EL GEN LINA ............................................................................................................................. 85 2.1 ELIMINACIÓN DE LINDANO DEL MEDIO POR LAS PLANTAS MODIFICADAS ........................................... 85 2.2 IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN DE LINDANO EN LOS TEJIDOS DE LAS PLANTAS MODIFICADAS, EN EL MEDIO Y EN LA FASE GASEOSA ............................................................................... 87 3 TOLERANCIA DE LAS PLANTAS MODIFICADAS AL LINDANO PRESENTE EN SUELOS CONTAMINADOS ......... 93 DISCUSIÓN ........................................................................................................................ 97 1 LAS PLANTAS QUE EXPRESAN LINA SON RESISTENTES AL LINDANO. .............................................. 100 2 LAS PLANTAS QUE EXPRESAN LINA ELIMINAN Y DEGRADAN EL LINDANO DEL MEDIO......................... 104 2.1 MODELO DE LA RUTA DE DEGRADACIÓN DE LINDANO EN PLANTAS QUE EXPRESAN LINA .................... 111 3 FITORREMEDIACIÓN ........................................................................................................ 113 3.1 LIBERACIÓN DE 1,4-DCB, 1,2,4-TCB Y -PCCH POR LAS PLANTAS MODIFICADAS QUE DEGRADAN LINDANO Y SU EFECTO TÓXICO. ......................................................................................................... 114 3.2 PROBLEMA DEL EMPLEO DE PLANTAS QUE EXPRESEN LINA EN EL MEDIO AMBIENTE .......................... 117 3.3 ESTRATEGIAS PARA OPTIMIZAR LA DEGRADACIÓN DE LINDANO EN SUELOS MEDIANTE PLANTAS QUE EXPRESEN EL GEN LINA. ................................................................................................................... 118 CONCLUSIONES ............................................................................................................... 121 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 125 ANEXO ............................................................................................................................ 147 Abreviaturas I ABREVIATURAS 1,2,4- TCB 1,2,4-triclorobenceno 1,4- TCDN 1,3,4,6-tetracloro-1,4- ciclohexadiano 2,5- DCHQ 2,5-diclorohidroquinona 2,5-DCP 2,5-diclorofenol 2,5- DDOL 2,5-dicloro-2,5-ciclohexadieno- 1,4-diol A.I.C. Criterios de Información Akaike (selección modelos estadísticos) A600nm Absorbancia a 600nm ACAT Alaska Community Action on Toxics ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc ADN complementario Basta 4-(hidroxi-(metil)-fosfinol)-DL- Homoalanina /glufosinato de amonio BHC Hexaclorobenceno (~ HCH) BSA Albúmina de Suero Bobino CaMV Virus del mosaico de la coliflor CAS Servicio de Resúmenes Químicos (Chemicals Abstract Service) CB Clorobenceno CCM Colección de Microorganismos (República Checa) Chr Cromosoma CNB Centro Nacional de Biotecnología Col-0 Columbia-0 (ecotipo) CT Ciclo umbral Ct Extremo de una proteína carboxilo terminal DCB Diclorobenceno DMSO Dimetil sulfoxido dNTPs 2'-desoxinucleósido trifosfatos (solución con mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) EDTA Ácido Etilen Diamin Tetracético EEA Agencia Europea de Medio Ambiente (European Environmental Agency) EF-1α Factor de elongación 1α F (test F) Test F de Levene (paramétrico de homogeneidad de varianza) FAM-490 Fluoresceína FW Forward (oligo dirección lectura de 5' a 3') G+C Guanina+Citosina GC/MS Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (gas chromatgraphy-mass spectrometry) GC/MS- ECD (GC- ECD) Cromatografía de Gases Masas y espectrometría de masas acopladas con Detector de Captura de Electrón (Electron Capture Detector) GFP Green Fluorescente Protein PCCH -pentaclorociclohexano HCH Hexaclorociclohexano His Histidina HP-SPME (SPME- GC-MS) Microextracción en Fase Sólida de Alta Eficacia sin espacios vacíos (High Performance Solid-Pphase Microextraction ) IARC Agencia del Investigación del Cáncer/Agency for Research on Cancer ID Diámetro Abreviaturas II IHPA Asociación de Profesionales de la Salud Independientes/ Independent Health Professionals Association IS6100 Secuencia de Inserción 6100 kDa kiloDalton (unidad de masa atómica) Km Kanamicina LB Luria-Bertani m/z Relación masa carga (m/Q) mRNA ARN mensajero MS Murashige and Skoog MTCC Colección de Cultivos Microbianos Tipo y banco de genes (India) Nt Extremo de una proteína amino- terminal, NH2-terminal, extremo amina OCPs Pesticidas organoclorados OGM Organismos Genéticamente Modificados (o GEMs) ORFs Marco de lectura abierta o marco abierto de lectura (Open Reading Frame) p/v peso/volumen (p/v) PANNA Pesticide Action Network North America pb pares de bases PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction) PDMS Polydimethylsiloxane Pfu Polimerasa encontrada en la arqueobacteria hipertermófila Pyrococcus furiosus pH Grado de acidez o basicidad de una solución acuosa Pm Peso molecular POPs Pesticidas Orgánicos Persistentes PPT DL-fosfinotricina qPCR PCR cuantitativa o a tiempo real r.p.m Revoluciones por minuto rev (RV) Reverse (oligo con direccion de lectura inverso 3' a 5') Rif Rifampicina RLe Raíces Laterales emergidas sp.nov. especie nueva (nova) t tonelada Taq Polimerasa producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-aq) TBE Tampón cuya composición contiene Tris-Borato-EDTA TCB 1,2,4-triclorobenceno T-DNA ADN de Transferencia (ADN transferido de plásmido inductor de tumores Ti de A. tumefaciens) TIFF Formato de archivo informático para almacenar imágenes (Tagged Image File Format) Tris Tris(hidroximetil)aminometano (HOCH2)3CNH2 tRNAs ARNs de transferencia Tween Monolaurato de polioxietilen- sorbitan/ mmonolaurato de polietilenglicol sorbitano (CAS9005-64-5) US EPA (USEPA) Agendia de Protección del Medio Ambiente de EEUU/United States Environmental Protection Agency UT26T "T" cepa tipo (type strain) v/v volumen/volumen WHO Organización Mundial de la Salud WT Cepa control (Wild Type) III ÍNDICE DE FIGURAS: FIGURA 1. Estructura de los isómeros de HCH. FIGURA 2. Localizaciones de zonas de alta contaminación con HCH. FIGURA 3. Ruta de degradación del γ-HCH en S. japonicum UT26. FIGURA 4. Esquema de los procesos que sufren los pesticidas en el medio ambiente. FIGURA 5. Esquema de las distintas técnicas de descontaminación de suelos con pesticidas. FIGURA 6. Técnicas de fitorremediación. FIGURA 7. Esquema del vector p-CAMBIA 3500. FIGURA 8. Resultados de calibración del termociclador para qPCR para nuestro ensayo (curva de fusión, curva estándar y del de agarosa). FIGURA 9. Crecimiento de las plantas WT en medio MS suplementado con distintas concentraciones de lindano. FIGURA 10. Diagrama de la región T-DNA de los distintos vectores utilizados. FIGURA 11. Selección de plánulas en MS con lindano. FIGURA 12. Crecimiento de plantas WT, LIN-A5.1, LIN-C2.1, LIN-C10.1 en MS suplementado con distintas concentraciones de lindano. FIGURA 13. Electroforesis de gel de agarosa PCR del ADN de las plantas. FIGURA 14. Electroforesis en gel de agarosa de RT-PCR del gen linA FIGURA 15. Niveles de expresión del gen linA en las plantas transformadas. qPCR. FIGURA 16. Gráfico de diagrama de caja del análisis estadístico del área de las rosetas. FIGURA 17. Detalle de las hojas de las rosetas de cada línea de plantas en cada concentración de lindano probada. FIGURA 18. Gráfico de diagrama de caja del análisis estadístico de la densidad radicular. FIGURA 19. Gráfico de diagrama de caja del análisis estadístico del área radicular. IV FIGURA 20. Resultados del crecimiento vertical de plantas tras una semana después de trasplantar plántulas crecidas durante otra semana sin lindano y en horizontal. FIGURA 21. ANOVA one-way de los valores obtenidos de pesticida en las placas contaminadas con HCH tras dos semanas de crecimiento de las distintas líneas de plantas modificadas y WT. FIGURA 22. HP SPME junto con GC/MS de tejidos de plantas. FIGURA 23. HP SPME combinada con GC/MS de parte gaseosa o volátil. FIGURA 24. HP SMPE combinada con GC/MS de agar contaminado con lindano. FIGURA 25. Crecimiento en tierra wt vs LIN- A5.1. FIGURA 26. Crecimiento en tierra wt vs LIN- C2.1. FIGURA 27. Esquema de las posibles degradaciones del lindano. FIGURA 28. Ruta de degradación propuesta por Quintero y colaboradores (2005) en condiciones de anaerobiosis. ÍNDICE DE TABLAS TABLA 1. Antecedentes de la situación actual del lindano. TABLA 2. Genoma de S. japonicum UT26 TABLA 3. Estirpes bacterianas utilizadas en este trabajo TABLA 4. Lista de oligonucleótidos TABLA 5. Enzimas de restricción. TABLA 6. Antibióticos de selección empleados. TABLA 7. Soluciones de fosfinotricina y lindano. TABLA 8. Secuencia del gen linA. TABLA 9. Condiciones de PCR para la obtención del gen linA. V TABLA 10. Condiciones de la PCR para amplificación del gen linA a partir del ADN genómico de las plantas modificadas. TABLA 11. Condiciones de PCR para amplificar el gen linA a partir de cDNA. TABLA 12. Condiciones para qPCR. TABLA 13. Parámetros de las curvas estándar para las dos líneas de investigación de este trabajo. TABLA 14. Eficiencia de transformación de A.thaliana. TABLA 15. Pruebas con las distintas líneas seleccionadas de la generación T1. TABLA 16. Valores de inducción de la expresión del gen linA. TABLA 17. Tabla de efectos fijos lll de los valores de la roseta. TABLA 18. Tabla de estadístico descriptivo de los valores de densidad radicular. TABLA 19. Tabla de estadístico descriptivo de los valores del área radicular. TABLA 20. Resultados medios finales de cantidad de lindano en medio MS suplementado con HCH técnico. VI Abstract 1 ABSTRACT Hexachlorocyclohexane (HCH) is an organochlorine compound produced synthetically by reacting benzene with chlorine in the presence of ultraviolet light. Of the 8 possible isomers, only the γ-HCH has insecticidal activity and was named lindane, which is purified by a very inneficient process. Before the end of the 1940s, it was already produced and used on a large scale due to its low price and broad spectrum of action. Lindane has been used as an agricultural pesticide, for seed cleaning, treatment of livestock parasites, in human health (for treatment of lice and scabies), and also for the control of pest and insects that transmit diseases such as malaria. This pesticide was used massive scale between the years 1950-1970, despite the fact that it is harmful effects on human health and the environment were already being studied. From the 1970s, restrictions started and its use gradually decreased until it was banned in at least 52 countries after the Stockholm convention in 2010 (nowadays 184 countries had been united it). Japan was the first country to ban it in 1973, followed by others such as the United States, China and the European Union, although it is still being produced in India. At first, it was thought to be an effective and harmless pesticide but now it has become one of the largest ecological and human health problems. It had been included in Group 1 where the most dangerous pollutants are because of this carcinogenesis to human an animals (IARC, 2019). The isomers that were discarded in the lindane production process and the stored pesticide (all toxic, persistent and bioaccumulative), were stockpiled under very low security conditions in what is known as white mountains, which favors their release into the environment, contaminating soils, rivers and aquifers and therefore, entering the food chain. The volatilization of the compound has produced a dispersion from the warm areas where it was manufactured to the colder ones, producing global contamination (from the areas of production and use to the poles, high mountains and oceans). Due to its extension and toxicity, it is urgent to find a definitive, economic and sustainable solution. This doctoral thesis work focuses on the construction of a plant capable of helping to decontaminate soils contaminated with this pesticide, through the insertion and expression into the plant genome of the bacterial gene linA, which is at the beginning of the lindane degradation pathway in the Sphingobium japonicum UT26 strain isolated soils contaminated with this compound in Japan. Thanks to molecular biology, we can design and create an organism that contains and expresses genes from another species in order to improve the initial organism to Abstract 2 use it as a decontamination tool. It is therefore proposed to use a phytodegradation strategy to remove lindane from contaminated soils by using a modified plant that degrades this compound. For this, the following objectives were proposed: i) insertion and expression of the S. japonicum UT26 linA gene in the model plant Arabidopsis thaliana. Construction of three different variants of the plant, one with the wild-type gene and the other two with a sequence that encodes a tail of six histidines at the Ct and Nt ends of LinA (these labels have a biochemical application and could allow the detection of the LinA protein in the modified plants); ii) evaluation of the resistance to lindane of plants expressing linA (in artificial media and in contaminated soils); iii) phenotypic characterization of plants modified in response to the pesticide; iv) analysis of compounds resulting from the degradation of lindane by the modified plants, those accumulated in their tissues and those released in the growing medium and in the atmosphere. The results obtained have shown that the introduction and expression of the linA gene and its linA-Ct6xHis variant in A. thaliana (LIN-A and LIN-C plants), allow them to grow correctly both in artificial medium and in soil, under conditions of lethal lindane concentration for the wild plant. Furthermore, it was found that the modified LIN-A and LIN-C plants could effectively remove lindane from the artificial medium in which they were grown, and transform it into compounds less harmful to the environment and human health, pentachlorohexene and mainly dichlorobenzene, which were detected by the HP-SPME (High Performance-Solid Phase MicroExtraction) technique coupled with CG-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) in the plant tissues, in the culture medium and in the air surrounding the plants. In summary, this modification of the plant confers resistance to lindane, making possible the in situ degradation of this compound, so it could be used as a tool to eliminate the diffuse contamination of lindane in soils in which other classic methods are unthinkable due to their high cost. The A. thaliana plant that expresses the linA gene constitutes a proof of concept or prototype, and to use this phytoremediation strategy in soil decontamination effectively, this gene would have to be expressed in other more robust plant species, long-lived and with a greater root system, which are also capable of stimulating the diversity and abundance of microbial communities to cooperate in the lindane mineralization. 3 RESUMEN El hexaclorociclohexano (HCH) es un compuesto organoclorado producido de forma sintética al reaccionar el benceno con el cloro en presencia de luz ultravioleta. De los 8 posibles isómeros sólo el -HCH tiene actividad insecticida y se denominó lindano, que es purificado mediante un proceso muy ineficiente. Antes de que acabara la década de los 40 ya se producía y utilizaba a gran escala por su bajo precio, eficacia y amplio espectro de actuación. El lindano se ha utilizado como pesticida agrícola, para la limpieza de semillas, tratamiento de los parásitos del ganado, en salud humana (para tratamiento de piojos y sarna), y también para el control plagas y de insectos transmisores de enfermedades como la malaria. Este pesticida se empleó de forma masiva entre los años 1950-1970, a pesar de que ya se empezaban a estudiar sus efectos nocivos en la salud humana y en el medio ambiente. A partir de la década de los 70 empezaron las restricciones y su uso fue disminuyendo paulatinamente hasta que se prohibió en, al menos 52 países tras la convención de Estocolmo en el 2010 (a la que en la actualidad se han adscrito 184 países). El primer país que lo prohibió fue Japón en el 1973, seguido por otros como EEUU, China y la UE, aunque todavía en India se sigue produciendo. Lo que un principio parecía un pesticida efectivo que no suponía ningún riesgo para la salud, ha pasado a convertirse en uno de los problemas ecológicos y de salud humana de mayor envergadura. El IARC lo ha incluido en el Grupo 1, donde se encuentran los contaminantes más peligrosos, por ser cancerígeno para el hombre y para los animales (IARC, 2019). Los isómeros que se descartaban en el proceso de producción de lindano, junto con los depósitos del pesticida, (todos tóxicos, permanentes y bioacumulativos) se almacenaron en condiciones de ínfima seguridad en lo que se conoce como “montañas blancas” favoreciendo su liberación al medio ambiente, contaminando suelos, ríos y acuíferos y por tanto introduciéndose en la cadena trófica. La volatilización del compuesto ha producido una dispersión de zonas cálidas donde se producía hacia las más frías, lo que ha conllevado una contaminación global (desde las zonas de producción y uso hasta los polos, altas montañas y océanos). Debido a su extensión y toxicidad resulta urgente encontrar una solución definitiva, económica y sostenible. Este trabajo de tesis doctoral se centra en la construcción de una planta capaz de ayudar a descontaminar los suelos contaminados con este pesticida mediante la inserción y expresión en el genoma de la planta modelo Arabidopsis thaliana del gen bacteriano linA que está en el inicio de la ruta degradativa del lindano en la cepa Sphingobium japonicum UT26 aislada de suelos contaminados con este compuesto en Japón. Gracias a la biología molecular podemos diseñar y crear un organismo que contenga y exprese genes de otra especie con el fin de conseguir 4 mejorar el organismo inicial para usarlo como herramienta de descontaminación. Se propone por tanto explorar la estrategia de fitodegradación para eliminar el lindano de suelos contaminados, empleando una planta modificada que degrade este compuesto. Para ello se plantearon los siguientes objetivos: i) inserción y expresión del gen linA de S. japonicum UT26 en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Construcción de tres variantes diferentes de la planta, una con el gen silvestre y otras dos etiquetadas con una secuencia que codifica para una cola de seis histidinas en los extremos Ct y Nt de LinA (estas etiquetas tienen una aplicación bioquímica pues podrían permitir la detección de la proteína LinA en las plantas); ii) evaluación de la resistencia a lindano de las plantas que expresan linA (en medios artificiales y en suelos contaminados), y de su capacidad de eliminar lindano del medio; iii) caracterización fenotípica de las plantas modificadas en respuesta al pesticida; iv) análisis de los compuestos resultantes de la degradación del lindano por las plantas modificadas, las acumuladas en sus tejidos y las liberadas al sustrato de cultivo y a la atmósfera. Los resultados obtenidos demuestran que la introducción y expresión del gen linA y de su variante linA-Ct6xHis en A. thaliana (construcciones LIN-A y LIN-C, respectivamente), le permiten crecer correctamente tanto en medio artificial como en suelo, en condiciones de concentración de lindano letales para la planta sin modificar. Además, se pudo comprobar que las plantas modificadas LIN-A y LIN-C podían eliminar eficazmente el lindano del medio artificial en el que se cultivaban, y lo transformaban en compuestos menos nocivos para el ambiente y la salud humana (pentaclorociclohexano y diclorobenceno principalmente) que se detectaron mediante la técnica de HP-SPME (microextracción en fase sólida de alta eficacia) combinada con GC-MS (cromatografía de gases- espectrometría de masas) en los tejidos de la planta y en el medio de cultivo y el aire circundante a las plantas. En resumen, esta modificación de la planta le confiere resistencia a lindano, posibilitando la degradación in situ de este compuesto, por lo que podría utilizarse como herramienta para eliminar la contaminación difusa de lindano en suelos en los que otros métodos clásicos resultan impensables debido a su alto coste. La planta de A. thaliana que expresa el gen linA constituye una prueba de concepto o prototipo, y para el empleo de esta estrategia de fitorremediación en la descontaminación de suelos de forma efectiva, habría que expresar este gen en otras especies de plantas más robustas, longevas y con mayor sistema radicular, que además sean capaces de estimular la diversidad y abundancia de comunidades microbianas que cooperen en la mineralización del lindano. 5 INTRODUCCIÓN 6 Introducción 7 1 Lindano 1.1 Características e historia de la problemática derivada de su empleo como pesticida De acuerdo con la agencia de protección del medio ambiente estadounidense (U.S. Environmental Protection Agency 2019) un pesticida se define como “cualquier sustancia o mezcla de ellas ideada para prevenir, destruir, repeler o mitigar cualquier plaga” (insectos, ratones u otros animales, malas hierbas o microorganismos). El hexaclorociclohexano (HCH), también conocido como hexaclorobenceno (BHC), es un hidrocarburo organoclorado, un compuesto orgánico sintético, que pertenece al grupo de los pesticidas no iónicos y aparece en la lista prioritaria de contaminantes de la USEPA (U.S. Environmental Protection Agency, 2013). Fue sintetizado por primera vez en 1825 por M. Faraday al hacer reaccionar benceno (producto que acababa de descubrir) con cloro en presencia de luz (Smith, 1991). En esta primera reacción se obtiene una mezcla conocida como “hexaclorociclohexano técnico” (Nº de Registro CAS 608-73-1) compuesta por 8 isómeros (α (+,-), β, , δ, ε, , -HCH) según la orientación de los átomos de Cl en cada molécula (Fig. 1), 4 de los cuales (α, β, δ y -HCH) son tóxicos y contaminantes recalcitrantes. Van der Linden aisló el isómero -HCH varios años después (1912), pero hasta mediados de los años 30 no sería identificado como el único “principio activo” del HCH y nombrado como “lindano” en honor a su descubridor (Matolcsy et al, 1988). Figura 1: Estructura de los isómeros de HCH. Se diferencian por la posición axial o ecuatorial de los átomos de Cl (α, β, , δ y ε son los más importantes, mientras que eta y theta son menos comunes). Fuente (Lal et al, 2010). Introducción 8 La producción del lindano resulta muy ineficiente ya que ese isómero supone tan solo entre un 10-12% del HCH comercial (Li et al, 2003), para ser comercializado debe purificarse hasta conseguir -HCH con un 99% de pureza (Nº de Registro CAS. 58-89-9), desechando el resto que no muestra actividad insecticida (Langenhoff et al, 2002) y produce un olor y sabor desagradable que impiden su uso agrícola (Vijgen et al, 2019). Se ha estimado que de cada tonelada (t) de lindano producida se generan de 8-12 t de desechos compuestos por los otros isómeros de HCH. El lindano una vez purificado es un sólido cristalino de gran densidad (Pm 290,83 g/mol), tiene baja solubilidad en agua, alta solubilidad en grasas, es bastante hidrofóbico y posee un olor muy característico. Al igual que el resto de isómeros de HCH presenta un punto de fusión alto (112- 113ºC) y tiene baja presión de vapor de saturación (Willett et al, 1998). Es muy estable a la luz, al agua caliente, al calor o la oxidación y a los ácidos, debido a los enlaces C-C, C-H y C-Cl. Todo ello hace que, dentro de los distintos grupos de pesticidas, los organoclorados (OCPs) (en los que se incluye el lindano) sean los más tóxicos y tengan una gran persistencia en el medio ambiente (Abhilash et al, 2013a; Köhler & Triebskorn, 2013), con una vida media estimada de 708 días en suelo y 2292 días en agua (Beyer & Matthies, 2001). Los pesticidas tuvieron un gran auge después de la 2º Guerra Mundial (Gavrilescu & Chisti, 2005), en el caso del lindano su eficiencia, rápido efecto, fácil producción y bajo coste, extendieron su uso y fabricación por todo el mundo durante décadas entre 1950 y 2000 llegándose a producir más de 10.000.000 t (Li, 1999) (incluyendo el pico de producción de los años 60 y principios de los 70). Principalmente utilizado en agricultura, siendo Europa (con España entre los mayores consumidores) y América responsables del 69% del consumo total (Ali et al, 2014), también se usó para el control de plagas, ganadería y en la industria farmacéutica contra ectoparásitos (tratamiento de sarna, piojos y malaria entre otros) (Li et al, 1998; Vijgen, 2006). China e India se encuentran en la cabeza de producción (WHO, 1994), aunque también se obtuvieron grandes cantidades en EEUU, Europa y la antigua Unión Soviética (Breivik et al, 1999). El consumo de lindano, con distintos nombres y formatos, ha ido fluctuando a lo largo del tiempo. Paradójicamente los picos de producción han coincidido con la prohibición del uso del compuesto en algunas regiones. La cantidad del compuesto liberado al medio empezó a disminuir a partir de 1983 debido al descenso mantenido de la producción, alcanzando niveles muy bajos a partir de 1995. A pesar de ello ha sido el pesticida más empleado durante décadas (Navarro et al, 2019; Vijgen et al., 2019) y, pese al descenso en el consumo, el problema no ha desaparecido en la actualidad. Ya en el 2011 se consideraba que globalmente sólo para Introducción 9 agricultura se habían destinado 450 kilotoneladas (Kt) de lindano (Vijgen et al, 2011) y se estimaba que si se incluyeran también lo utilizado en ganadería, salud humana y uso doméstico se añadirían otros 150 kt más, lo que supondría una cantidad de desechos del resto de isómeros de HCH que rondaría los 4 -7 millones de t (Weber & Varbelow, 2013). Sólo en Europa, la Agencia Europea de Medio Ambiente (EEA) estima que hay 3 millones de sitios contaminados, de los cuales 250.000 estarían altamente contaminados y necesitarían una solución inmediata (European Environment Agency, 2007; Gillespie & Philp, 2013) y que en el 2050 el número de sitios contaminados que necesitarán tratamiento ascenderán a más del 50 %. Hay que tener en cuenta que encontramos dos focos claros de contaminación (Lal et al., 2010):  En las zonas de producción. El desconocimiento de su toxicidad llevó a depositar los deshechos de manera incontrolada alrededor de las fábricas por todo el mundo en pilas o vertederos abiertos (muchos ilegales) conocidos como “montañas blancas”, o enterrados (PANNA, 2008; Vijgen, 2006; Weber et al, 2008). Los derrames y operaciones de desecho rutinarias también contribuyeron a aumentar la contaminación de fábricas y del suelo limítrofe a ellas más contaminado que el resto de áreas (Fang et al, 2016). Se estima que hay entre 1,6 y 4,8 millones de toneladas de residuos globales de HCH (Fig. 2). Figura 2: localizaciones de zonas de alta contaminación con HCH basada en mapa de (Lal et al., 2010) y datos de PE 571.398, 2016. Introducción 10  Contaminación difusa en el medio ambiente con bajas concentraciones de HCH debido a su uso como insecticida y a la dispersión de los vertederos. Su uso directo contra plagas ha contaminado los suelos de uso agrícola o ganadero y sus alrededores. Además, el almacenamiento abierto al aire libre ha facilitado la dispersión y volatilización del compuesto por el aire (Ukalska-Jaruga & Smreczak, 2020; Vijgen et al., 2011; Weber et al., 2008) debida al Efecto de Destilación Global que implica un movimiento de contaminantes desde regiones cálido-templadas hacia latitudes altas, donde el descenso de la temperatura provoca el depósito del compuesto volatilizado (Walker et al, 1999). Desde los años 1980 se han detectado rastros en muestras de aire, suelo, vegetación, y agua en la Antártida, el Océano Pacífico, en el Ártico, alta montaña…etc (Lal et al, 2008; U.S. Environmental Protection Agency, 1980; Willett et al., 1998). El calentamiento global agrava esta situación al aumentar la disipación del lindano del suelo de forma directa al aumento de la temperatura (Tripathi et al, 2015a). 1.2 Efectos del lindano y demás isómeros del HCH en los distintos organismos. Los distintos isómeros del HCH se pueden acumular en microorganismos, invertebrados, peces, pájaros y mamíferos, suponiendo un peligro para todos ellos y para el ser humano (Abd Al- Rahman, 2012; Hussain et al, 2015; Vega et al., 2016). La mayor difusión del pesticida viene por la exposición derivada del consumo de alimentos contaminados, especialmente pescado, carne y leche, o incluso, agua (IHPA, 2016; Vega et al., 2016; Vijgen et al, 2018; Wycisk et al, 2013). El lindano se ha clasificado como carcinogénico y disruptor endocrino, con efectos mutagénicos, genotóxicos y teratogénicos (Luo et al, 2016; Muñiz et al, 2017). El reglamento europeo (CE) 1272/2008 clasifica al lindano con toxicidad aguda oral (categoría 3), de inhalación y cutánea (categoría 4) y en órganos determinados por exposición repetida (categoría 2), con efectos a través de lactancia y con toxicidad acuática aguda y crónica (categoría 1). En humanos se ha observado que produce ataxia, desorientación, temblores, ataques y muerte; además, exposiciones crónicas al compuesto pueden afectar al corazón e hígado y ocasionar problemas neurológicos (sistema nervioso central), de inmunosupresión y cáncer (Nolan et al, 2012). Su exposición se relaciona con cáncer de mama, próstata, colon recto, estómago, pulmón y vejiga (Abolhassani et al, 2019; Jayaraj et al, 2016; Mortazavi et al, 2019) y con el linfoma no hodgkiniano (IARC, 2015). Se puede acumular en el cerebro y otros órganos por su lipofilidad, al igual que en la placenta (Luo et al., 2016); estudios recientes señalan también una relación entre la exposición a productos químicos clorados en el desarrollo de sobrepeso y riesgo de diabetes Introducción 11 por una desregulación del mecanismo de la glucosa y disrupción de homeostasis lipídica (Henriquez-Hernandez et al, 2017). Sabemos que este compuesto además afecta al medio ambiente: el HCH inhibe las reacciones de oxidorreducción en microorganismos del suelo, así como en bacterias amino- y metano- oxidantes (Singh & Kuhad, 1999), puede inhibir la actividad enzimática y afecta directamente a la riqueza, estructura y diversidad bacteriana según su concentración (Sun et al, 2019). Inhibe el crecimiento de la fauna del suelo (Mohamed et al, 2011; Shi et al, 2007) y excita el sistema nervioso central de los insectos diana (Agrahari et al, 2019) hasta matarlos. En las plantas tiene una toxicidad moderada con efectos negativos en la germinación, crecimiento y desarrollo inicial de diferentes especies (Calvelo Pereira, 2008; Kostoff, 1948); además de desestabilizar los principios vitales de la planta afectando a su desarrollo y fisiología, y alterando así la distribución de la biomasa, la fotosíntesis, los procesos celulares…etc (Audus, 1976). 1.3 Normativa. Desde que se confirmó la toxicidad del lindano (y se descartó que el resto de isómeros fueran inertes) se ha restringido paulatinamente su uso de forma irregular en los distintos países productores y consumidores (tabla 1). Tabla 1. Antecedentes de la situación actual del lindano Año Hitos relacionados con el empleo de lindano Fuente Evidencias de impacto negativo en el medio ambiente Efectos negativos en el hombre Restricciones de consumo Prohibición en Japón Li, 1999 Prohibición general en EEUU (no como pesticida ni uso farmaceútico) USEPA 2006 U.S. Food and Drug Administration, 2009 Prohibición en China Li, 1999 2007 Prohibición en EEUU para uso agrícola U.S.EPA, 2006 2008 Phohibición integral en UE Vega et al., 2016 2009 Prohibición de lindano para uso agrícola y producción. UNEP, 2009 α-HCH, β-HCH y γ-HCH se añadieron con los “nuevos POPs” Vijgen et al., 2011, 2013 Prohibición de todo uso, a excepción farmaceútico, en al menos 52 países además de Europa. C.N.524.2009.treaties-4, Stockholm Convention, 22/05/2011 179 naciones ratifican este acuerdo Secretariat of the Stockholm Convencion, 2014b India único productor continuando contaminación Vijgen et al., 2011; Tripathi, 2014 Sigue permitido en algunos estados de USA U.S. Food and Drug Administration, 2009 Sigue permitido en China (para gestión de bosques y control de plagas domésticas) Yang, Yu et al. 2016 Uso en África e India (para uso local, control de malaria y para exportar) Bajaj and Singh, 2015 2017 WHO incluye el compuesto en la lista de carcinogénicos. Grupo 1 Singh and Singh, 2019 Actualización europea de sito contaminados con HCH y depósitos (1,8- 3 millones de t) Nueva acción denominada Acción 15 donde “se deberían identificar los sitios contaminados por POPs para su remediación ” Falta de objetivos claros con fechas límites para la eliminación de HCH Vijgen et al., 2019 Asamblea 1 marzo, UN declara 2021-2030 "Decada de restauración de ecosistemas" http://www.unenvironment.org/ China prohibe su producción, circulación, apliacación y exportación e importación Wang, 2019 2020 Ratificación del convenio de Estocolmo por 184 países http://chm.pops.Int/Countries/StatusofRatifications /PartiesandSignatoires/tabld/4500/ European Commission, 2019 2014 2016 Década 50 Década 70 1979-82 2019 Calvo Pereira, 2008 2010 Introducción 12 La mayoría de las regulaciones se desarrollan considerando el riesgo en la salud humana en zonas residenciales, comerciales o industriales, siendo en las primeras las más restrictivas (Jennings & Li, 2015), y además, teniendo en cuenta la exposición del hombre al suelo contaminado por contacto, inhalación o ingestión. A pesar de esto sólo un cuarto de los países han definido unos valores críticos a partir de los cuales se necesita una acción correctora (o valores guía de regulación) para los cuales no hay consenso en la jurisdicción internacional, promulgando cada país sus leyes (Li, 2018) con una variación de hasta 10 órdenes de magnitud entre unos países y otros. Los países firmantes de la Convención de Estocolmo establecen como prioritario el desarrollo de un método efectivo también desde el punto de vista económico que los elimine de forma global (Dubey et al, 2014). Los esfuerzos por remediar el problema del lindano son progresivos, pero en los últimos 30 años los datos europeos apuntan a una eliminación de tan sólo 80.000 zonas contaminadas (Gillespie & Philp, 2013). Todavía no se ha establecido un tiempo límite para eliminar el lindano, en gran parte debido al alto coste que conlleva su destrucción que, ni industria ni gobiernos, están dispuestos a asumir. Por el momento la solución más utilizada es el aislamiento en vertederos controlados que supone entre un 1-10 % tan sólo de los gastos de excavación y destrucción, una solución que no es tal pues tan solo pospone el problema (Vijgen et al., 2019), que puede seguir aumentado por el uso ilegal de estos plaguicidas en varios países (Kafaei et al, 2020; Khuman et al, 2020). El cambio climático que conlleva un aumento de las inundaciones contribuirá también a aumentar la difusión de este pesticida a los ríos cercanos a las plantas de producción (Plan Estratégico de las Tecnologías de la Información, 2016) lo que hace acuciante afrontar el problema. 2 Degradación biológica natural del lindano. 2.1 Degradación del lindano por la bacteria Sphingobium japonicum (antes conocida como Sphingomonas paucimobilis) UT26. Tan sólo 60 años después de la primera liberación de lindano al medio (Li et al., 2003; Walker et al., 1999), se aislaron numerosas cepas bacterianas en distintos lugares geográficos, capaces de degradar el compuesto de manera aerobia (Lal et al., 2010). Ya en 1989, se identificaron más de sesenta aislados en suelos contaminados de diferentes partes de mundo capaces de degradarlo (Senoo & Wada, 1989; Yamamoto et al, 2009). Estas cepas pertenecían en su mayoría a la familia Sphingomonadaceae (con casi la mitad del total de representantes degradadoras del compuesto provenientes de Japón, India, Francia, Alemania, España, China…), aunque también se han Introducción 13 caracterizado otras de géneros tan distantes como Microbacterium, Bacillus (Lal et al., 2010), Pseudomonas o Pandoraea (Sun et al, 2015) y filos como Cyanobacteria. La química refractaria de la molécula de HCH llevó a la necesidad evolutiva de conseguir una ruta degradativa uniendo enzimas individuales de forma coordinada, esto es posible gracias a que los distintos genes están localizados en plásmidos y/o elementos móviles como secuencias de inserción (Davison, 1999). La complejidad de los isómeros del lindano añade otro punto de dificultad encontrando diferencias entre las reacciones que catalizan su eliminación, sobretodo en condiciones aerobias (Lal et al., 2010). De los 8 isómeros de HCH, sólo los isómeros α y γ-HCH pueden ser mineralizados completamente por las cepas degradadoras, los demás se transformarán en otros metabolitos menos tóxicos pero todavía recalcitrantes (Bala et al, 2012; Geueke et al, 2013). En la actualidad, sólo se ha encontrado una ruta de degradación de HCH, mediada por los genes lin, con ejemplos tanto en la familia Sphingomonadaceae como fuera de ella (Lal et al., 2010). La reacción clave de esta ruta es la deshalogenación de compuestos halogenados que consiste en la eliminación de átomos de cloro, responsables de la toxicidad y el carácter xenobiótico del compuesto, reemplazándolos por un hidrógeno o un grupo hidroxilo. Con esto se consigue reducir tanto el carácter recalcitrante del compuesto como el riesgo de la formación de intermediarios tóxicos como consecuencia de los pasos metabólicos (Camacho- Perez et al, 2012). La ruta degradativa se identificó inicialmente en la cepa UT26T, también denominada MTCC 6362T o CCM 7287T (Lal et al., 2010; Nagata et al, 2007). Designada en un principio con el nombre de Sphingomonas paucimobilis, tras un cambio taxonómico, basado en los resultados obtenidos de la secuenciación de genes 16S ARNr, hibridación ADN-ADN y electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), esta cepa se dividía en tres especies distintas reclasificándolas como Sphingobium japonicum sp. nov. UT26, S. francense Sp+ y S. indicum B90A en relación con el lugar del aislamiento (Pal et al, 2005). Todas ellas han sido caracterizadas en términos genéticos y de bioquímica de la degradación de HCH (Bala et al., 2012; Lal et al., 2010; Nagata et al., 2007). S. japonicum sp. nov. UT26 fue descubierta a finales de los años 80 en Japón (Senoo & Wada, 1989), en suelo contaminado anualmente con γ-HCH durante 15 años. Es una bacteria Gram- negativa, de color amarillo, con forma bacilar, aerobia, mesofílica, no formadora de esporas y sin motilidad. Es capaz de utilizar α-, γ- y δ-HCH (no β-HCH) como única fuente de carbono y energía en aerobiosis (Imai et al, 1989; Pal et al., 2005; Senoo & Wada, 1989). UT26 es una bacteria “especialista” para la degradación de un determinado número de compuestos (Stolz, 2009) como el lindano y otros compuestos recalcitrantes extremos (dioxinas, herbicidas Introducción 14 clorados, compuestos de lignina, hidrocarbonos poliaromáticos y polietilenglicol). No obstante la capacidad de Sphingomonas para adaptarse a degradar tantos compuestos recalcitrantes puede estar favorecida por dos características:  su inusual composición de la membrana externa, que contiene glucoesfingolípidos en lugar de lipopolisacáridos (White et al, 1996), lo que le proporciona una superficie altamente hidrofóbica que facilita la asimilación de compuestos de estas características tales como HCH y otros hidrocarbonos (Kawahara et al, 1999)  la transferencia génica horizontal: los genes de degradación están asociados a secuencias de inserción como la IS6100 (Lal et al, 2006; Nagata et al, 2011) que pertenece a la familia IS6, capaz de movilizar genes replicándose y dejando una copia en el sitio original (Mahillon & Chandler, 1998). El genoma de S. japonicum UT26 consiste en 5 replicones circulares y aparece en la tabla 2. Tabla 2: genoma de S. japonicum UT26 Replicón Nombre pb G+C (%) ORFs Observaciones Cromosoma Chr1 31514.822 64,8 3.529 Principal por contener el mayor número de genes esenciales. Cromosoma Chr2 681.892 65,9 589 Plásmido pCHQ1 190.974 63 224 Plásmido pUT1 31.776 63,7 44 Plásmido pUT2 5.398 61 8 (Gil et al, 2004; Nagata et al, 2010). La ruta degradativa de lindano esta mediada por los genes lin (15 genes lin en total) que se encuentran dispersos en los dos cromosomas y en el plásmido pCHQ1 (Nagata et al, 2006). Los genes específicos de la ruta de conversión en sí (hasta β-cetoadipato, Fig. 3) están localizados en regiones únicas del genoma de UT26 (linA se encuentra en Chr1), mientras que el resto de genes lin se localizan en otras regiones conservadas de Sphingomonas. Todos los genes lin parecen necesarios para degradar el lindano. Por una parte linA, linB, linC, linRED y linF son específicos de conversión de -HCH a β-cetoadipato (Nagata et al., 2011). Por otra, linGHIJ son responsables de la vía β-cetoadipato. Y por último, los genes linK, linL, linM y linN forman parte del sistema de transporte y se sospechan implicados en la integridad de la membrana exterior de la bacteria y en la utilización del lindano por la misma [confiriéndole mayor tolerancia frente a los metabolitos tóxicos resultantes de la degradación, como el 2,5-DCP (Endo et al, 2005; Introducción 15 Nagata et al, 1993b)]. Esta cepa cuenta con una copia de estos genes lin y con 5 copias de IS6100 (Pal et al., 2005). La ruta de los genes lin es claramente la más accesible (y quizá la única) para la degradación aerobia de HCH. En presencia de oxígeno, la enzima LinA (-hexaclorociclohexano deshidroclorinasa) de S. japonicum UT26 cataliza la eliminación de átomos de cloro de la molécula -HCH (Mencía et al, 2006) formando un doble enlace en su lugar (van Pée & Unversucht, 2003). La degradación se realiza en dos fases (Fig. 3): en la fase inicial de la ruta (up stream) se encuentran las deshalogenasas LinA, LinB y LinC que catalizan las reacciones de declorinación produciendo 2,5-diclorohidroquinona, y en la fase posterior (down stream), con la ayuda de las enzimas LinD, LinE, LinF, LinG, LinH y LinJ, este compuesto se metaboliza formando intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos conduciendo a la mineralización completa del lindano (Nagata et al., 2007). Los genes implicados en la fase posterior están combinados en dos grupos o clusters (Endo et al., 2005), los de la fase inicial se encuentran agrupados en uno. No todos los grupos aúnan los mismos genes sino que el contenido del clúster depende de la cepa, por ejemplo en B90A el clúster contiene los genes linA1-linF-linC. La agrupación de estos genes en clusters facilita y simplifica su transferencia a otros microorganismos (Pearce et al, 2015). La enzima LinA inicia la ruta de degradación y cataliza, mediante dos reacciones de deshidrocloración, la transformación de lindano a 1,4-TCDN vía -PCCH (Imai et al, 1991; Nagata et al, 1999b). El paso de este compuesto a 1,2,4-TCB se supone mediado por una reacción no enzimática debido a los enlaces inestables de la molécula inicial en contraposición con la estabilidad de anillo aromático de la última (Nagata et al, 1999a; Nagata et al, 1993a). LinA y LinB forman un complejo que convierte -PCCH en 2,5-DDOL de forma eficiente porque el sustrato de LinB es químicamente inestable, curiosamente ambos genes se encuentran a gran distancia en el genoma de UT26 porque no se ha logrado aislar ningún cósmido con ambos genes. Como 1,2,4-TCB y 2,5-DCP no se degradan por ninguna enzima se consideran productos finales del proceso, quizá estén relacionados con el lento crecimiento de UT26 cuando el lindano es la única fuente de carbono y energía. 2,5-DDOL se degrada hasta 2,5-DCHQ sugiriendo una mayor ruta de asimilación del -HCH (Nagasawa et al, 1993a; Nagata et al., 1993a) Introducción 16 Figura 3: Ruta de degradación del -HCH en S. japonicum UT26. Compuestos: 1, -hexaclorociclohexano (-HCH); 2, - pentaclorociclohexeno (-PCCH); 3, 1,3,4,6-tetracloro-1,4-ciclohexadieno (1,4-TCDN); 4, 1,2,4-triclorobenceno (1,2,4- TCB); 5, 2,4,5-tricloro-2,5-ciclohexadieno-1-ol (2,4,5-DNOL); 6, 2,5-diclorofenol (2,5-DCP); 7, 2,5-dicloro-2,5- ciclohexadieno-1,4-diol (2,5-DDOL); 8, 2,5-diclorohidroquinona (2,5-DCHQ); 9,clorohidroquinona (CHQ); 10, acilclorido; 11, hidroquinona (HQ); 12, ácido-6-hidroxi-4-oxohexa-2,5-dienoico (-hidroximucónico-semialdehido); 13, maleilacetato (MA); 14, -cetoadipato; 15, 3-oxoadipil-CoA; 16, succinil-CoA;17, acetyl-CoA. TCA, citrato/ ciclo ácido tricarboxílico. Basado en (Nagata et al., 2011) y (Camacho-Perez et al., 2012). El gen linA es especialmente único ya que sólo tiene similitud con secuencias de idénticos genes linA de otras cepas bacterianas (>90 %) (Lal et al., 2010; Nagata et al., 2007), no se han encontrado homólogos en la base de datos GenBank (Böltner et al, 2005). Este gen codifica para la proteína LinA, homotetramérica con masa molecular de 16,5KDa (Nagasawa et al, 1993b; Nagata et al., 1993b), la primera enzima en la ruta degradativa del lindano y que es el único miembro de una superfamilia de proteínas estructurales sin homología con otras proteínas conocidas (Nagata et al, 2001). En base a comparaciones estructurales se ha propuesto que la enzima LinA evolucionara de una enzima deshidratasa. Se sabe que su expresión es constitutiva (Nagata et al., 2011). Estudios empleando mutaciones que conducen a la sustitución de aminoácidos sugieren que el gen linA todavía puede evolucionar a alta velocidad bajo condiciones de presión lo que indicaría que su introducción en la ruta debe ser reciente (Nagata et al., 2007). Introducción 17 La enzima LinA no necesita cofactores (Nagata et al., 2001) para catalizar los dos pasos de la fase inicial de la degradación del lindano, es específica de sustrato (Nagata et al., 1993b). Está localizada en el espacio periplásmico (junto con LinB) como otras enzimas encargadas de la detoxificación de antibióticos [como la β-lactamasa (Oliver & Cantón, 1996)], y no se secreta extracelularmente. Parece por tanto, que la degradación de compuestos halogenados xenobióticos es otra de las funciones realizadas en el espacio periplásmico, donde las enzimas entran desde el interior de forma inespecífica en vez de ser secretadas al medio de cultivo. Será en este mismo espacio donde se ataque a los contaminantes que entran desde el exterior a través de poros inespecíficos de membrana (Nagata et al., 1999b). LinA es capaz de usar como sustrato los isómeros α, γ y δ-HCH y sus correspondientes productos, ya que elimina los átomos de cloros de forma estereoselectiva al par 1,2-biaxial de hidrógeno y cloro presente en estos isómeros (que están en las posiciones 2, 6 y 1 del anillo respectivamente) (Lal et al., 2006). La evolución de la ruta degradativa se iniciaría con una primera fase de reclutamiento de los genes de la fase inicial, cuya expresión constitutiva confirma su reciente incorporación (Nagata et al., 2007; Nagata et al., 2011). Una vez reclutados se introducirían mediante transferencia horizontal en el interior de una cepa ancestral portadora de los genes de la fase posterior, cuyas funciones son esenciales para Sphingomonas localizándose en su mayor parte (linGHIJ y linKLMN) en regiones conservadas de la cepa (Nagata et al., 2007; Nagata et al, 2014). linA además presenta un contenido en G+C (53,9%) muy diferente al de los otros genes lin analizados (Dogra et al, 2004; Nagata et al., 1999a), a excepción de linX (Ceremonie et al, 2006), lo que sugiere que es un gen endógeno que fue reclutado accidentalmente de un microorganismo con ADN genómico con bajo contenido de estas bases y con origen evolutivo desconocido. El hecho de que los 15 genes estén dispersos en los dos cromosomas y en el plásmido pCHQ1 refuerza la idea de que no se incorporaron de forma simultánea, aunque el alto nivel de conservación y la integridad de las secuencias de estos genes (excepto los del sistema de trasporte ABC) sugieren que derivan de una única fuente original. La siguiente fase en la evolución supone la consolidación de la ruta, donde se observa un incremento de la actividad IS6100 que se asocia con los genes transferidos, con especial afinidad por los genes lin con muchos sitios de inserción a su alrededor, en especial con los específicos de UT26 localizados en regiones únicas de esta cepa (linA, linC, LinRED y LinF) como se comentó antes (Nagata et al., 2011). La naturaleza dinámica de IS6100 obtenida tras secuenciar ADN de muestras de cepas de distintos orígenes naturales recogidas en varios puntos de curvas de crecimiento en medio con lindano demostró la gran cantidad de inserción de IS6100 a la largo de los genes lin lo que sugiere que la ruta está todavía evolucionando con el sistema de inserción como pieza activa (Pearce et al., 2015). Introducción 18 No conocemos la función de esta ruta en el ecosistema natural de la bacteria ni sabemos si la evolución de los organismos degradadores del compuesto en los sitios contaminados está acelerando la velocidad de reducción de HCH (Lal et al., 2010). Resulta curioso constatar no obstante que los genes lin se pierden rápidamente cuando no hay exposición al HCH (Pearce et al., 2015) mientras que se adquieren cuando la concentración aumenta (Sangwan et al, 2012). De hecho, se ha encontrado una relación directa entre cantidad de linA y la velocidad de degradación de HCH (Sun et al., 2015). Se sabe que las cepas de Sphingomonas son más diversas de lo que se pensaba en un principio y el hecho de que aparezcan nuevas cepas degradadoras subraya el papel dominante de este género en la degradación del compuesto (Böltner et al., 2005; Mohn et al, 2006), su adaptabilidad y su eficiencia degradativa (Nagata et al., 2007). Es el predominio de Sphingomonas frente a otros microorganismo en las zonas contaminadas lo que llevó a proponerla como posible biomarcador de las HCH total, β y la fracción enantiomérica de α-HCH (Xu et al, 2018). 2.2 Otros microorganismos capaces de degradar el lindano El número de especies degradadoras del lindano aisladas del suelo contaminando aumenta constantemente (Phillips et al, 2005). Se han identificado microorganismos de diferentes géneros bacterianos como Bacillus (Lal et al., 2010; Pannu & Kumar, 2017), Staphylococcus sp y Kokuria (Kumar et al, 2016), Chromohalobacter sp capaz de degradarlo en condiciones salinas (Bajaj et al, 2017), Paracoccus (Sahoo et al, 2019), Streptomyces (Simón Solá et al, 2019), Amycolatopsis (Aparicio et al, 2018) , Micobacterium sp. (Singh & Singh, 2019) y Burkholderia spp. (Kumar, 2018), capaces de metabolizar dicho compuesto. También se ha descrito la degradación anaerobia de lindano por especies de los géneros Clostridium, Desulfovibrio, Citrobacter y Dehalobacter (Boyle et al, 1999; Heritage & Rae, 1977; van Doesburg et al, 2005), que finaliza con la formación de clorobencenos pues no se puede mineralizar el lindano de esta manera (Phillips et al., 2005). Todavía no se conocen ni enzimas ni genes involucrados en esta degradación (Lal et al., 2010), pero se ha descubierto que son capaces de degradar también los diferentes isómeros de HCH de forma selectiva ya que varía la comunidad bacteriana encontrada según el isómero del medio, no así la de arqueas (Qiao et al, 2020). Los hongos también son capaces de degradar lindano, toleran mayores concentraciones de contaminantes, colonizan grandes zonas gracias a sus redes micelares, resisten en ambientes adversos como esporas y cuentan con enzimas degradadoras extracelulares (Maqbool et al, 2016; Saez et al, 2018). Introducción 19 3 Tratamientos para la descontaminación de suelos con pesticidas. 3.1 Evolución de los pesticidas en suelos Tras el vertido de pesticidas, éstos pueden sufrir diferentes procesos químicos, físicos o biológicos en el medio (Fig. 4). El suelo en gran medida es el sumidero de los pesticidas, la evolución definitiva vendrá mediada por factores como la topografía del lugar, la humedad, la radiación solar, la climatología, las características de la biosfera, las características estructurales y fisicoquímicas del suelo, y la estructura y características del compuesto (presión de vapor, solubilidad en agua y el coeficiente de adsorción) (Bedos et al, 2002; Tejedor et al, 1974). Muy importante es tener en cuenta la biodisponibilidad (fracción del compuesto accesible para los organismos vivos y que determina su toxicidad). La relación entre movilidad y biodisponibilidad es directa mientras que entre la degradación y la biodisponibilidad es inversa, ya que al aumentar la degradación del compuesto, disminuye su disponibilidad para la asimilación por organismos vivos (Xing et al, 1996). Tampoco se debe obviar el “Efecto de envejecimiento (o aging)” que afirma que la biodisponibilidad disminuye según aumenta el tiempo de contacto entre los contaminantes orgánicos y el suelo (Alexander, 2000), disminuye por tanto la fracción biodegradable y aumentan las fracciones recalcitrante y no extraíble (Semple et al, 2003). Figura 4: Procesos que sufren los pesticidas en el medio ambiente [basada en (Weber & Miller, 1989)] Introducción 20 3.2 Tecnologías para la descontaminación de pesticidas Uno de los mayores causantes de la degradación edáfica es el uso de pesticidas (Rodríguez- Eugenio et al, 2018; Wall et al, 2015). Un alto porcentaje de los pesticidas aplicados en agricultura nunca alcanzaron la plaga que querían destruir (Niti et al, 2013) y se encuentran dispersos en el suelo, aire y agua, acumulándose en la cadena trófica hasta llegar al ser humano. Por lo tanto, para proteger la salud humana y el medio ambiente es imprescindible conseguir remediar la contaminación edáfica, que en la mayoría de los casos será mixta (pesticidas orgánicos e inorgánicos) (Diez, 2010; Gerhardt et al, 2009) y no estará disponible por el efecto de la erosión natural (Cheng et al, 2016). Por otro lado, la prohibición del uso y fabricación de dichos pesticidas de manera global ha sido indispensable para conseguir controlar la contaminación contribuyendo así a la mejora de la salud edáfica y previniendo la aparición de nuevos focos. La contaminación ambiental de los plaguicidas y residuos generados, principalmente en el suelo, se da por su elevada adsorción a la materia orgánica, su baja volatilidad y estabilidad química, que les confiere un bajo grado de movilidad y una elevada persistencia. Para reducir, eliminar, aislar o estabilizar un pesticida, las técnicas de remediación utilizadas contendrán procesos físicos, químicos o biológicos que pueden ser usados de forma independiente, conjunta o consecutiva. Dependiendo de la tecnología usada, los tratamientos se pueden aplicar de tres maneras diferentes (Caliman et al, 2010): i) in situ, la remediación tendrá lugar en el mismo lugar donde se encuentra la contaminación y no se excavará el suelo; ii) ad situ u on site, el suelo se excava pero no se transporta, y una vez tratado en el mismo terreno se devuelve a su lugar; o iii) ex situ u off site, el suelo es excavado, transportado y tratado en otro lugar. En la figura 5, se enumeran las diferentes tecnologías existentes para descontaminar los suelos. Se añaden algunas características para dar una idea lo más concisa posible de la situación actual. Muchas de ellas siguen en constante evolución y su investigación está aportando mejoras, aunque todavía se deben desarrollar más para poder usarlas de forma efectiva. Introducción 21 Figura 5: Esquema de las distintas técnicas de descontaminación de suelos contaminados con pesticidas. (Basado en (Morillo & Villaverde, 2017) 3.2.1 Métodos convencionales. En general la remediación química cuenta con unas limitaciones que debe ser consideradas: los disolventes orgánicos usados muchas veces son complejos y se deben eliminar de forma controlada para no poner en riesgo el medio ambiente. Son tratamientos difíciles y peligrosos que pueden dar lugar a reacciones violentas o subproductos tóxicos, el resultado final normalmente conlleva un mayor volumen de desechos menos tóxicos que los iniciales, pero que también deben ser eliminados de forma inocua (con tratamientos biológicos, solidificando los subproductos o almacenándolos en vertederos) (Dominguez et al, 2018; Huang et al, 2019; Jung et al, 2018; Morillo & Villaverde, 2017; Mrozik & Piotrowska-Seget, 2010). Los métodos físico-químicos y térmicos convencionales han demostrado su eficacia, pero requieren mucha energía y gran inversión en infraestructuras (Liu et al, 2015; Zhang et al, 2020). Al ser, en su mayoría, tratamientos ex situ incluyen excavación y transporte de los materiales contaminantes, lo que aumenta la posibilidad de contaminaciones en las zonas de paso y conlleva la destrucción del recurso edáfico (Rodríguez Garrido, 2009). Ambas cosas encarecen tanto estos tratamientos que resultan inviables para volúmenes grandes como los sedimentos Introducción 22 de vertederos (Förstner & Apitz, 2007). El alto coste de la descontaminación hace que en gran medida sea más rentable abandonar los campos contaminados que limpiarlos. Ninguno de los tratamientos convencionales está resultando totalmente satisfactorio y su aceptación pública es baja, lo que abre la puerta al uso de nuevas tecnologías que den soluciones capaces de eliminar, remediar y limpiar de forma global y segura esta contaminación, reduciendo los riesgos para la salud humana y el medio ambiente. 3.2.2 Métodos de biorremediación (o biocorrección). Estos métodos “verdes” más saludables para el medio ambiente están experimentando un gran auge intentándose implementar cada vez en mayor medida e invirtiendo mucho esfuerzo en conseguir que sean igualmente eficaces. Para poder optimizar estos métodos se tendrá que estudiar en cada caso la disponibilidad de los contaminantes, las características del suelo (Afzal et al, 2011), y los factores abióticos y bióticos (Nedunuri et al, 2000) de la zona a tratar, ya que afectarán directamente a la supervivencia y actividad de las plantas y microorganismos utilizados. Son técnicas mucho más baratas por lo que constituyen la única solución cuando el área a tratar es muy extensa (Angelucci & Tomei, 2016; Bini, 2010). Si bien presentan un riesgo ecológico por el posible desplazamiento o hibridación de las especies endémicas por las introducidas (planta o microorganismos) en las zonas de tratamiento (Gressel & Al-Ahmad, 2006; Pilon-Smits, 2005) y por la liberación de metabolitos incluso más contaminantes que los originales surgidos de la degradación (Salt et al, 1998) cuando se alcanza un bajo porcentaje de mineralización completa del compuesto inicial. 3.2.2.1 Mediada por microorganismos La degradación microbiana de pesticidas, tanto en suelos como en medios acuáticos, se presentó por primera vez en 1930 (Tausz & Donath, 1930) y en la actualidad es uno de los métodos más prometedores (Bhatt et al, 2020; Egorova et al, 2017; Zhang et al, 2018). De hecho el uso de biotecnología microbiana para la eliminación de pesticidas tiene grandes ventajas incluida la gran variedad de microorganismos disponibles, alta velocidad de mutación, comodidad del cultivo (Yin & Lian, 2012) y su capacidad de usar plaguicidas como fuentes de nutrientes (Díaz, 2011). Los métodos biológicos mediados por microorganismos suelen ser in situ lo que supone una gran ventaja frente a los tradicionales, aunque deben solventar problemas como la supervivencia de las cepas introducidas, la disminución de eficacia derivada del estrés biótico o abiótico y el Introducción 23 reparto de los microorganismos una vez inoculados, lo que hace que todavía los intentos por ponerlo a punto a gran escala resulten infructuosos (Sun et al., 2015). Estos métodos implican distinto nivel de actuación humana yendo desde “confiar” la degradación de los contaminantes del suelo a los microorganismos endógenos con sus propias rutas degradativas (bioatenuación), hasta la introducción de un refuerzo de microorganismos autóctonos reinoculados tras ser preadaptados en el laboratorio, “supermicrobios” foráneos seleccionados de lugares contaminados, OGMs construidos para degradar contaminantes, o introducción de enzimas con capacidades degradativas en el medio probadas para solucionar una contaminación particular (bioaumentación). Entre ambos extremos se encuentra la bioestimulación que consiste en añadir nutrientes y oxígeno para favorecer la microflora autóctona. En general se tiende a utilizar los tres métodos de forma consecutiva de menos intervención a más. El método de bioaumentación se ha comprobado que resulta más efectivo con la utilización de consorcios bacterianos (Aparicio et al., 2018; Camacho-Pérez et al, 2010a; Camacho-Pérez et al, 2010b; Elcey & Kunhi, 2010; Garg et al, 2016) donde las bacterias se comunican por quorum sensing repartiendo el trabajo de la degradación del compuesto (Ye et al, 2019; Ye et al, 2020), consorcios de hongos (Knudsen et al, 2013; Kulshrestha & Kumari, 2011; Nyakundi et al, 2011), o incluso consorcios entre bacterias y hongos (Maqbool et al., 2016), u hongos con plantas (Asemoloye et al, 2017). 3.2.2.2 Fitorremediación Técnica de degradación in situ sostenible con el medio ambiente, basada en el crecimiento de plantas capaces de eliminar, transformar o degradar los contaminantes en los distintos ambientes (Bell et al, 2014; Passatore et al, 2014). Este término se acuñó en los años 80, pero la técnica no se expandió hasta una década después (Willey, 2007). Reconocida como un método efectivo (Schnoor et al, 1995; Weyens et al, 2013) está ganando cada vez más adeptos por su bajo coste, 10 veces menos que las técnicas tradicionales (Pilon-Smits & Freeman, 2006), su fácil manejo y su potencial para eliminar contaminantes orgánicos e inorgánicos en grandes áreas (se emplea en un 80% de contaminantes orgánicos y un 20% de inorgánicos). Las plantas son capaces de metabolizar pesticidas orgánicos persistentes (POPs) (Luo & Lei, 2014) entre otras cosas gracias al uso de rutas y enzimas similares a las de los mamíferos, lo que llevó al concepto de “hígado verde” (Cobbett & Meagher, 2002; Sandermann, 1994). Introducción 24 Los contaminantes orgánicos (artificiales) se introducirán en la planta mediante difusión (según sus características hidrofílicas o hidrofóbicas) ya que no hay trasportadores específicos para ellos como para los inorgánicos (Batty & Dolan, 2013). Dependiendo de cómo procesen la degradación o eliminación del compuesto podemos encontrar diferentes tipos de fitorremediación (Megharaj et al, 2011), englobadas en 2 grandes técnicas según se comporten con el contaminante (Fig. 6). Todos los métodos que aparecen a continuación se pueden usar simultáneamente, no siendo excluyentes unos de otros. Clasificación de fitorremediación según su comportamiento frente al contaminante: I. Técnicas que facilitan la estabilización del contaminante en el suelo (tienen como objetivo reducir la biodisponibilidad del contaminante, la lixiviación y su toxicidad): A. Fitoestabilización: la planta retiene el suelo y disminuye la accesibilidad de los contaminantes inmovilizándolos en la superficie radicular sin transportarlos a otros tejidos. II. Técnicas que induzcan la descontaminación (para que sean eficaces necesitan que el contaminante esté lo más disponible posible): A. Fitoestimulación: para compuestos orgánicos hidrofóbicos que no se pueden introducir en la planta, pero que pueden ser degradados por microorganismos de la rizosfera. B. Fitovolatilización: los compuestos solubles en agua y de bajo Pm son transportados a través de las membranas de las plantas y liberados a través de los estomas de las hojas como gas vía evapotranspiración (Minorsky, 2003). C. Fitoextracción: los compuestos son extraídos (por la raíces, o por los estomas y cutícula foliar), transportados y acumulados en los tejidos de las plantas (ligados a sustancias quelantes o formando conjugados (Pilon-Smits, 2005) y aislados en zonas donde hagan el menor daño posible (vacuolas, pared celular, epidermis o tricomas). D. Fitodegradación: los compuestos orgánicos tras ser “secuestrados” son degradados por procesos enzimáticos hasta mineralizarlos a compuestos inorgánicos o a compuestos parciales estables acumulables en la planta. El proceso tiene 3 fases: Introducción 25  Fase I. Activación o transformación: en esta fase los compuestos hidrofóbicos se convierten en otros menos hidrofóbicos una vez están en el interior celular.  Fase ll. Conjugación: los compontes orgánicos o los metabolitos de fase l se conjugan directamente con glutatión, azúcares o aminoácidos para producir compuestos hidrofílicos.  Fase lll. Secuestro: Se puede dividir en dos procesos (Sandermann, 1992):  transporte y almacenamiento en vacuolas para los conjugados solubles (lo que es esencial para la fitorremediación) (Hatzios, 1997).  las reacciones finales:  unión a la pared celular o a la lignina [para los conjugados insolubles (Macek et al, 2000)]  la excreción (Theodoulou, 2000) de los solubles en las vacuolas. E. Rizofiltración: uso de las raíces de las plantas para absorber y adsorber contaminantes (especialmente metales) del agua o sistemas de desechos acuosos (Salt et al., 1998). F. Fitorremediación mediada por endófitos: los compuestos son degradados por la acción de microorganismos endófitos (a través de sus rutas degradativas) que viven en los tejidos de la planta sin producirle daños al hospedador (Schulz & Boyle, 2006). G. Rizodegradación (rizoremediación, fitoestimulación o bioaumentación asistida por plantas): implica a las plantas y a los microorganismos asociados a la rizosfera en un proceso de mutualismo donde ambos ven potenciado su crecimiento mejorando sus condiciones para degradar los contaminantes que les rodean. Si los compuestos contaminantes están en agua se pueden degradar mediante plantas acuáticas tales como la cola de loro (Myriophyllum aquaticum) y Elodea (Gao et al, 2000) o mediante algas (Anacleto et al, 2017). Introducción 26 Figura 6: Técnicas de fitorremediación. En el caso de compuestos xenobióticos pueden ser estabilizados o degradados en la rizosfera, adsobidos o acumulados en las raíces y transportados a las partes aéreas, volatilizados o degradados en el interior de las plantas siguiendo las 3 fases de forma consecutiva. Las flechas verdes corresponden a transporte activo (GST: glutatión S-transferasas; GT: glucosiltransferasas; Mt: maloniltransferasas; OA: ácidos orgánicos). En el caso de los contaminantes inorgánicos la introducción en la célula vegetal se haría por transporte activo al igual que el secuestro al interior vacuolar tras la conjugación, o paso alternativo del secuestro al interior de la pared celular (estos compuestos no serían degradados enzimáticamente ni pasarían por la fase I) (Abhilash et al, 2009; Newman & Reynolds, 2004; Pilon-Smits, 2005) 4 Antecedentes del empleo de S. japonicum y de los genes lin para la descontaminación de suelos con lindano. Las primeras aproximaciones en biodegradación de lindano han consistido en trabajos de laboratorio empleando cultivos microbianos en medio líquido contaminado:  Estudios con cultivos líquidos de las tres cepas procedentes del aislado original Sphingomonas paucimobilis mostraron que sólo dos de ellas S. indicum B90A y S. japonicum UT26 fueron capaces de degradar el compuesto en menos de dos meses a 4°C, produciendo pequeñas cantidades de 1,2,4-TCB y 2,5-DPC como deshechos, demostrando ser buenos candidatos tanto para el tratamiento de suelos como de agua contaminados (Zheng et al, 2011) .  También se han probado cultivos de consorcios microbianos provenientes de una zona contaminada (S. japonicum, S. spiritivorum, Ochrobactrum anthopi y Bosea thiooxidans) y, tras ser aclimatados durante 30 días en medio mínimo con lindano Introducción 27 como fuente de carbono, en laboratorio fueron capaces de aumentar su velocidad de degradación de 15 a 2 días. Haciendo cultivos puros de cada cepa se descubrió que sólo B. thiooxidans y S. paucimobilis fueron capaces de degradarlo en 3 días (Pesce & Wunderlin, 2004)  Por otro lado, se han modificado microorganismos como E. coli y la cianobacteria Anabaena en los que se ha introducido el gen linA2 de S. paucimobilis B90 (idéntico al 98 % a linA de UT26) con resultados igualmente positivos siendo Anabaena capaz de degradar más del 98 % de lindano a una concentración de 10 ppm en 6-10 días (prefecto para lugares poco contaminados). Por su parte, E. coli pudo degradar la misma concentración del pesticida en 1 h, y en una placa con 2000 ppm (2 mg/ml) de lindano este fue degradado en tan solo 12 h, pudiendo servir respectivamente para las zonas con trazas de lindano y las zonas muy contaminadas (Chaurasia et al, 2013). Mediante las estrategias mencionadas a continuación, se pudo conseguir las degradaciones simultáneas de lindano y otros contaminantes simulando la contaminación mixta existente en los suelos:  Con ingeniería genética se consiguió degradar simultáneamente pesticidas y eliminar metales pesados introduciendo en la superficie celular de S. japonicum UT26 una fitoquelatina sintética y una proteína de fusión metil parationion hidrolasa. Con esta construcción se consiguió una cepa mejorada genéticamente (S. japonicum con pVINPEM) capaz de degradar no sólo el lindano a una concentración de 10 μg/ml en tan solo 32 h tras su inoculación en el medio líquido contaminado sino que además era capaz de acumular 3,61 nmol Cd2+/mg en 42 h y degradar el insecticida clorpirifós 50 µg/ml en 24 h (Yang et al, 2016).  En un trabajo parecido se expresó el gen mpd en la bacteria Sphingomonas paucimobilis (S. japonicum) para conseguir una bacteria mejorada capaz de degradar simultáneamente lindano (5 µg/ml) y metil-paration (50 µg/ml) a distintas temperaturas y pHs (Lan et al, 2014). Para solucionar los posibles problemas de seguridad e impedir la transferencia génica horizontal se le añadió el sistema dual letal ABC que se induce con 3-metilbenzoato rompiendo la membrana celular y el ADN introducido. Introducción 28  En esta línea, se construyó una cepa de Sphingobium japonicum que expresaba una organofosfato hidrolasa fusionada con GFP en su superficie celular. Con ello se consiguió una cepa capaz de degradar por completo una mezcla del plaguicida organofosforado “Paratión” (100 mg/kg) con lindano (10 mg/kg) en tan solo 15 días tanto en suelos esterilizados como sin esterilizar (Yang et al, 2013). Por último, en una investigación más reciente el gen linA de la cepa UT26 se expresó en las raíces de la planta Cucurbita moschata con la ayuda de Agrobacterium rhizogenes, dejando el resto de la planta sin modificar. Las raíces se crecieron en medio líquido que fue posteriormente suplementado con -HCH y β-HCH, ambos a 5 mg/ml. Se comprobó que eran capaces de degradar más del 90 % del lindano en unas 16 h, produciendo 1,2,4-TCB como producto de degradación que, finalmente, era liberado al medio a una concentración no tóxica para la planta (Nanasato et al, 2016) . Teniendo en cuenta los antecedentes expuestos anteriormente, en este trabajo se planteó expresar el gen linA de S. japonicum en la planta Arabidopsis thaliana para probar la capacidad de la planta resultante de degradar el lindano del medio en el que se cultive e incrementar, por tanto, su resistencia al pesticida. Teóricamente, esto permitiría mejorar la capacidad degradativa endógena de las plantas con una nueva enzima catabólica determinada, y las plantas modificadas resultantes podrían constituir una herramienta eficaz para la remediación de suelos contaminados. 29 OBJETIVOS 30 Objetivos 31 Este trabajo tiene como objetivo general estudiar si plantas de Arabidopsis thaliana que expresen el gen linA de la bacteria Sphingobium japonicum, el primer gen de la ruta de degradación del pesticida lindano, pueden eliminar este compuesto del suelo y degradarlo a otros menos tóxicos y si con ello se incrementa la resistencia de la planta al pesticida. Para lograrlo se han abordado los siguientes objetivos específicos: I. Construcción de una planta transgénica que exprese el gen linA. Se construirán 3 variaciones diferentes de la planta, una con el gen silvestre y otras dos etiquetadas con una secuencia que codifica para una cola de histidinas en 5’ y en 3’ (para demostrar la expresión de la proteína LinA en los tejidos de la planta). a. Selección de líneas homocigotas para el gen linA (dos o tres), independientes entre sí, que sean resistentes al lindano. b. Comprobar la presencia y expresión del gen linA introducido en dichas plantas. c. Caracterización fenotípica de la respuesta a lindano de las plantas transformadas frente a las plantas control en medio suplementado con distintas concentraciones del pesticida II. Estudio de la capacidad de eliminación y degradación de lindano de las plantas modificadas. Análisis cuantitativo de la capacidad de eliminación de lindano de medio con agar en el que crezcan plantas que expresen el gen linA. Estudio de los compuestos de degradación encontrados en el sustrato, en los tejidos de las plantas y en el aire circundante de plantas cultivadas en medio con lindano. III. Probar el crecimiento de las plantas modificadas en suelos contaminados en el laboratorio con lindano. 32 33 MATERIALES Y MÉTODOS 34 Materiales y Métodos 35 MATERIALES 1 Material biológico 1.1 Estirpes bacterianas Las estirpes bacterianas empleadas en este trabajo se describen en la tabla 3. Tabla 3. Estirpes bacterianas utilizadas en este trabajo Estirpes microbianas Referencia Escherichia coli DH5 Woodcock et al. 1989 Escherichia coli DH5(pLINA) * Thomas et al. 1996 Agrobacterium tumefaciens C58C1 Yanofsky & Nester, 1986 *pLINA es un vector pBuescript que contienen el gen linA de S. paucimobilis (Sphingobium japonicum) cuyo código (de gen) en GeneBank es S63514 1.2 Plásmidos Para integrar y expresar el gen bacteriano linA en la planta Arabidopsis thaliana se ha empleado el plásmido pCAMBIA3500 que fue donado por el laboratorio de Carlos Alonso-Blanco del CNB (Ausín Pascua, 2004). Es un plásmido binario con un origen de replicación para E. coli y otro para Agrobacterium tumefaciens, ya que esta última bacteria permite la transferencia del llamado ADN de transferencia (T-DNA) a la planta. En el pCAMBIA3500 (Fig. 7) se encuentran las secuencias que flanquean el T-DNA (T-Border) que proceden del plásmido inductor de tumores Ti de A. tumefaciens, éste se transfiere de forma natural al genoma de las células vegetales en el proceso de infección de la bacteria, siendo integrado en el genoma vegetal y pudiendo ser expresado por ésta. Se ha demostrado que para que la transferencia del T-DNA tenga lugar sólo son necesarias las secuencias que lo flanquean. Por ello, las secuencias T-Border se colocan a ambos extremos de la construcción de interés (que contendrá el gen que se quiere clonar junto con sus elementos reguladores y la resistencia necesaria para su selección), con ello cuando se infecte la planta con la bacteria A. tumefaciens que contiene el plásmido modificado, se introducirá el pequeño fragmento de ADN flanqueado por los bordes T-DNA en el interior de la planta insertándose directamente en su genoma, obteniéndose una planta transformada capaz de expresar el gen introducido. Esta técnica permite obtener inserciones al azar del gen de interés en el genoma de la planta. El vector pCAMBIA3500 es una modificación del pCAMBIA3300 (CAMBIA, Canberra, Australia, (p-Cambia 3300)) en el que se introdujo una secuencia polyA del CaMV35S en el extremo 3’ del Materiales y Métodos 36 gen clonado para la terminación de la transcripción y en su extremo 5’ dos promotores CaMV35S. El resto del plásmido es igual al pCAMBIA3300, caracterizado por tener un tamaño pequeño (8428 pb). En E. coli tiene un gran número de copias, ya que cuenta con el origen de replicación del plásmido pBR322, para la transmobilización del vector de E. coli a A. tumefaciens posee la base de movilidad pBR322 bom, y es muy estable en esta última bacteria gracias al replicón pVS1 (pVS1 rep y sta). Por otra parte, confiere resistencia a Km en bacterias (gracias al gen que codifica la enzima neomicina fosfotransferasa (NPT) y resistencia a fosfinotricina (glufosinato amónico) en plantas (conferida por el gen bacteriano de resistencia al bialafos (BAR) que codifica la enzima fosfinotricina acetil transferasa (PAT). El gen que se clone en este vector pCAMBIA3500, como se menciona al principio, se transcribirá bajo el control de dos copias del promotor constitutivo del CaMV35S (virus del mosaico de la coliflor, para aumentar la transcripción del gen clonado) y contará con una cola de polyA como terminador. Para insertar el gen, existe un MCS (Multiple Cloning Site o sitio de clonación múltiple) con diversas dianas únicas de restricción (entre ellas EcoRl y BamHI). Figura 7. Esquema del vector pCAMBIA3500 empleado en la generación de las plantas transgénicas de este trabajo. 1.3 Material vegetal Se utilizaron semillas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia-0 (Col-0) que se reprodujeron en las condiciones de cultivo indicadas en el apartado 1.3 de métodos. Materiales y Métodos 37 2 Cebadores Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo se reflejan en la tabla 4. Tabla 4. Lista de oligonucleótidos Nombre Secuencia 5´a 3’ Clonaje del gen linA en pCAMBIA3500 LINABAM (forward) 5´-TGAGGATCCATGAGTGATCTAGACAGACTT-3´ LINAECO (reverse) 5´-TGAGAATTCCTATTATGCGCCGGACGGTG-3´ LINABAMHIS (forward) 5´-TGAGGATCCATGCATCATCATCATCATCATAGTGATCTAGACAGACTT GCA-3´ LINAECOHIS (reverse) 5´-TGAGAATTCCTATTAATGATGATGATGATGATGTGCGCCGGACGGTG CGA-3´ Secuenciación de plásmido pCAMBIA3500-linA amplificado en DH5α (antes de introducirlo en A. tumefaciens) CAM357-F 5’-ATTTGGAGAGGACAGCCC-3’ CAM357-R 5’-TTATTATGGAGAAAATAGAGAGAGA-3’ Amplificación del Factor de elongación 1 α de A. thaliana para normalización en qPCR AT5T60390F 5´-TGAGCACGCTCTTCTTGCTTTCA-3´ AT5G60390R 5´-GGTGGTGGCATCCATCTTGTTACA-3´ 3 Enzimas de restricción Las enzimas de restricción usadas en este trabajo aparecen en la tabla 5. Tabla 5. Enzimas de restricción usadas en este trabajo Enzima Secuencia marca Ref. Catálogo Origen BamHI G/GATCC Roche 10 656 275 001 Bacillus amyloliquefaciens H EcoRl G/AATTC Roche 11 175 084 001 E. coli RY13 *Para facilitar la digestión se añade BSA final 100 µg/ml Materiales y Métodos 38 4 Antibióticos Tabla 6: Antibióticos de selección empleados en este trabajo Nombre Casa comercial Abreviatura Concentración final Diluido en Kanamicina Sigma Km 50 g/ml Agua estéril Rifampicina* Sigma Rif 50 g/ml DMSO *al ser fotosensible se conserva y se manipula en oscuridad. 5 Fosfinotricina (herbicida) y lindano (pesticida) Las soluciones de fosfinotricina y de lindano para seleccionar las plantas transgénicas tanto en tierra como en medio con agar se muestran en la tabla 7. Tabla 7: Soluciones de fosfinotricina y lindano Nombre Casa comercial Abreviatura Concentraci ón final Diluido en uso Glufosinato de amonio * (o fosfinotricina) ARGOS Basta 15% (p/v) Agua Selección de plantas resistentes a Basta en tierra DL- fosfinotricina Duchefa PPT o Basta 10 g/ml Agua estéril Selección de plantas resistentes a PPT en MS-agar 1,2,3,4,5,6- hexaclorociclo hexano Sigma Lindano Variable según experimento DMSO Resistencia en medio MS agar 1,2,3,4,5,6- hexaclorociclo hexano Sigma Lindano Variable según experimento metanol Resistencia en suelo *Para pulverizar sobre plantas diluido en agua con Tween-20 al 0,02% (v/v) (Merck) 6 Medios de cultivo Todos los medios tras ser preparados se esterilizan en autoclave vertical (Mediclave, Selecta) durante 20 minutos a 121°C y 1 atmósfera de presión, los medios líquidos se guardaron a temperatura ambiente (en el caso de los suplementados con antibióticos se guardan a 4°C); los medios sólidos se atemperaron a 55°C y se distribuyeron en placas Petri en condiciones de esterilidad. Las placas destinadas a cultivo bacteriano se conservaron a 4°C dentro de una bolsa para evitar desecación de las mismas, las placas cuyo uso era el cultivo in vitro de las plantas se prepararon el día antes en campana de bioseguridad y se dejaron toda la noche a temperatura ambiente. Materiales y Métodos 39 6.1 Medio para el cultivo de microorganismos Para el crecimiento de las estirpes bacterianas se utilizó el medio Luria-Bertani (LB) con pH ajustado a 7 ±0,2 (Laboratorios Conda). Este medio contiene: 1 % (p/v) Bactotriptona, 0,5 % (p/v) extracto de levadura, 1 % (p/v) NaCl; y el medio sólido contiene un 15 % (p/v) de agar. 6.2 Medios para el crecimiento de plantas Las plantas se crecieron en placas con el medio MS (Murashige & Skoog, 1962) con vitaminas/MES incluido (Duchefa): 0,025 mg/l CoCl2·6H2O; 0,025 mg/l CuSO4·5H2O; 36,7 mg/l FeNaEDTA; 6,2 mg/l H3BO3; 0,83 mg/l Kl; 16,9 mg/l MnSO4·H2O; 0,25 mg/l Na2MoO4·2H2O; 8,6 mg/l ZnSO4·7H2O; 332,02 mg/l CaCl2; 170 mg/l KH2PO4, 1900 mg/l KNO3; 180,54 mg/l MgSO4; 1650 mg/lNH4NO3, 500 mg/l MES; 2 mg/l glicina; 100 mg/l myo-inositol; 0,5 mg/l ácido nicotínico, 0,5 mg/l piroxina HCl y 0,1 mg/l tiamina HCl. Este medio se suplementa con 1 % (p/v) de sacarosa (Sigma). Se llevó a pH 5,6-5,7 y para el crecimiento normal en medio sólido se añadió 0,6 % (p/v) agar de plantas (Duchefa). Para los experimentos de crecimiento de raíces en horizontal se empleó el medio MS pero con 0,8-1 % (p/v) del mismo agar. Las placas Petri utilizadas para todos los experimentos “in vitro”, salvo algunos de crecimiento de raíces, son circulares estándar de 92x16 mm. Las placas cuadradas utilizadas para los experimentos iniciales de crecimiento de raíces fueron de 120x120x16 mm. Para el crecimiento en tierra se utilizó sustrato universal (mezcla de turba rubia y de transición; pH (CaCl2) 5,0-6,0; concentración salina 2000-2500 mg/l; Blumenerde) y vermiculita tipo 3 (Projar). La mezcla se hizo con una parte de sustrato y otra de vermiculita a partes iguales (1:1) y se distribuyó en alveolos (5 x 4,8 x 6,1cm; volumen 153 cc, Projar) o macetas (14 HC U/D; 14 x 11,9 cm Projar). 6.2.1 Preparación de placas con MS contaminado con lindano El lindano stock para uso in vitro, al ser poco soluble en agua, se preparó en DMSO a una concentración de 100 mg/ml. Filtrado con filtro de 0,45 µm y almacenado en alícuotas a -20°C. De este stock se cogió la cantidad necesaria en cada caso para conseguir la concentración final requerida para el experimento (normalmente 2,5 - 5 - 10 - 12,5 y 15 µg/ml), se añadió en condiciones de esterilidad en el MS autoclavado, se homogenizó mediante agitación para ser seguidamente dispensado en las placas correspondientes. En concentraciones mayores de 30 µg/ml de lindano se observaron precipitados en el medio (que aumentan de tamaño directamente con el aumento de concentración del pesticida llegando a dejar las placas más concentradas con un aspecto blanquecino y translucido). Materiales y Métodos 40 6.2.2 Preparación de tierra contaminada con lindano El lindano para contaminar la tierra (referencia en apartado 5 de materiales) se diluyó en metanol (Merck) y se mezcló con sustrato universal (tamizado con tamiz de 0,45 mm de red y autoclavado) para obtener las concentraciones finales de lindano con las que se trabajó: de 1000 750 g/ml -500 g/ml y 250 g/ml. Posteriormente se secaron en el liofilizador (Labconco 2,5) mínimo 1,5 h (hasta 24 h) con el fin de evaporar cualquier traza de metanol del suelo que pudiera afectar al crecimiento de la planta. La tierra contaminada con lindano se distribuyó en tubos Falcon de 50 ml (los cultivos con 8 ml de tierra por tubo, se realizan con la tapa superpuesta sujeta con papel poroso para facilitar la transpiración y mantener la esterilidad). 6.2.3 Solución para esterilización de semillas durante estratificación Las semillas antes de estratificarse fueron esterilizadas con la ayuda de un preparado que contenía hipoclorito sódico comercial al 70 % (p/v) (de uso doméstico), Tween-20 al 0,01 % (p/v) (MercK) y agua MiliQ. Esta mezcla se autoclavó y se dejó enfriar antes de ser usada. Con el tiempo se observaban precipitados por lo que es necesario resuspenderlo antes de cada uso. 6.2.4 Medio para transformación por infiltración por vacío en plantas La parte aérea de las plantas a transformar se sumerge en un recipiente con una suspensión de A. tumefaciens portadora de la construcción de interés en medio ½ MS suplementado con sacarosa (Sigma) 5 % (p/v), hormona de virulencia bacteria 6-bencilaminopurina (BAP) (Duchefa) 11 ng/ml y agente surfactante Silwet-L77 (Lehle seeds) 0,02 % (v/v). (Clough & Bent, 1998). MÉTODOS 1 Manipulación y condiciones de crecimiento de bacterias y de plantas 1.1 Crecimiento bacteriano 1.1.1 Escherichia coli El crecimiento de E. coli (DH5) se realizó en medio LB, tanto líquido como sólido. El medio sólido contenía agar al 1,6 % (p/v), se distribuyó en placas Petri donde se inocularon las bacterias y se incubaron a 37°C en una estufa de cultivo (Heraeus Kendro) durante al menos 12 h. Los cultivos líquidos se realizaron en tubos de vidrio de un solo uso (16x150 mm) con 5 ml de medio que se inocularon a partir de colonias bacterianas crecidas en medio sólido y se incubaron durante toda la noche en una cámara caliente a 37°C en un agitador rotativo para tubos (Fisher). Materiales y Métodos 41 Los antibióticos añadidos para la posterior selección se prepararon a una concentración 1000 veces mayor a la final, se esterilizaron por filtración (usando membranas Millex-GV (Millipore) de 0,22 μm de tamaño de poro), se distribuyeron en alícuotas de 1ml y se conservaron a -20°C. 1.1.2 Agrobacterium tumefaciens Para transformar las plantas se utilizó A. tumefaciens C58C1 por ser la cepa más eficiente para el método de infiltración por vacío. Esta bacteria es resistente a rifampicina, por lo que el crecimiento de la bacteria transformada con el plásmido pCAMBIA3500 se hizo en medio LB con Km 50 g/ml y Rif 50 g/ml. Para infectar las plantas se hicieron cultivos líquidos de esta bacteria en matraces estériles con 400 ml de LB a los que se añadieron 3 ml de un precultivo (crecido 36 h en tubos a 250 r.p.m. en un incubador orbital), y se incubaron 24 h a 150 r.p.m. en incubador orbital (RF1-150x Infors AG) a 28°C, que se corresponde con la temperatura óptima de crecimiento de esta cepa (25-28°C). 1.2 Conservación de las cepas bacterianas La conservación a corto plazo se realizó mediante estrías de las bacterias en placas de LB con antibiótico de selección guardadas a 4°C. Para la conservación a largo plazo se prepararon cultivos líquidos a partir de preinóculos crecidos durante la noche en medio líquido y cuando éstos llegaron al final de fase exponencial (crecidos durante 6 h a 37°C), se hicieron alícuotas en glicerol 10,5 % (v/v) (Merck) que se congelaron a -80°C. 1.3 Condiciones de crecimiento de plantas Se realizaron los experimentos en Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia-0 por ser este ecotipo el más eficaz para el método de transformación empleado (Clough & Bent, 1998). Las condiciones de fotoperiodo tanto en los experimentos in vitro como en los de tierra fueron las mismas, programando días largos de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, con temperatura regulada de 22°C para acelerar el ciclo reproductivo de las plantas. El crecimiento se realizó en una cámara de cultivo Snijders Scientific B.V. Las semillas de A. thaliana necesitan pasar por un periodo de estratificación en frío para germinar, por esta razón, independientemente de que se esterilicen o no según el sustrato donde vayan a ser sembradas, se guardaron embebidas en agua Milli-Q estéril (para cultivo in vitro), o sobre la superficie de tierra (para cultivo in vivo) tapando el alveolo o la maceta con plástico, durante 2 ó 3 días en oscuridad y a 4°C. Materiales y Métodos 42 1.3.1 Crecimiento de plantas en medio sólido artificial Para crecerlas in vitro se esterilizó la superficie de las semillas con la mezcla indicada en el apartado 6.2.3 de materiales en agitación continua en vórtex a máxima velocidad durante 4 minutos, seguido de 3 lavados con agua Milli-Q estéril agitando con ayuda de un vórtex o una punta de pipeta, tras esto se dejaron a 4°C como se comentó en las condiciones generales (métodos 1.3). Las semillas entonces se sembraron con pipeta en placas Petri (92 x 16 mm) de medio MS agar descrito en el apartado de materiales 6.2. Una vez sembradas se sellaron con cinta quirúrgica de microporo de 25 mm (3M) y se crecieron en cámara de cultivo in vitro. El medio MS se suplementó en algunos experimentos con fosfinotricina (PPT) a una concentración de 10 g/ml para seleccionar las plantas modificadas o con lindano. 1.3.2 Crecimiento de plantas en tierra Para el crecimiento en tierra, las semillas se sembraron en alveolos o macetas directamente en una mezcla de sustrato universal para plantas y vermiculita (1:1). Las semillas se sembraron en la parte superior del sustrato sin enterrar para que germinasen. Se cubrieron con plástico (sin que entrase en contacto con la tierra) y se estratificaron en frio (4°C), esta vez sin esterilizar previamente, como se apunta en el apartado de métodos 1.3. Tras la estratificación pasaron a la cámara de cultivo donde se les quitó el plástico de forma paulatina y se mantuvieron las mismas condiciones de cultivo expuestos en el mismo apartado. Se regaron 2 veces por semana (el agua de riego debe tener un pH ácido de alrededor de 5,7; de no ser así las plantas no son capaces de desarrollarse adecuadamente, por tanto, se midió el pH del agua, y se ajustó cuando fue necesario). 1.3.3 Crecimiento de plantas en tierra contaminada con lindano Para el crecimiento en tierra, las semillas se sembraron en tubos de plástico de fondo cónico de 50 ml con 20 ml de tierra preparada como se refleja en el apartado 6.2.2 de materiales. Se prepararon 2 tubos estériles por muestra que se regaron con agua estéril. En cada tubo se añadieron 10 ml de agua y se sembraron las semillas (12 semillas por tubo), por goteo o con ayuda de un papel (separándolas con pinzas cuando quedaban demasiado juntas) y se estratificaron tapando los envases y dejándolos a 4ºC en oscuridad durante 2 días. A continuación, se pasaron a la cámara de cultivo (en las mismas condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo que el resto de los cultivos). En este caso las plantas se crecieron durante 15-30 días (los resultados eran más evidentes creciéndolas hasta un mes) regándolas con agua estéril. Materiales y Métodos 43 1.4 Conservación de las semillas Tras terminar el ciclo de vida de las plantas, éstas se dejaron secar y las vainas con las semillas se recolectaron en sobres de papel. Posteriormente, las semillas se separaron del resto de la planta con un tamiz de 0,45 mm de red y se guardaron en tubos de 1,5 ml conservados a temperatura ambiente. 2 Métodos de transformación 2.1 Transformación bacteriana Para producir células competentes de E. coli DH5 y A. tumefaciens se sigue el método de CaCl2 (Sambrook, 2001). Para ello, estas bacterias se cultivaron en 100 ml de LB, con el antibiótico de selección, a partir de un preinóculo de un cultivo líquido de 5 ml crecido a 30°C o 28°C durante toda la noche, para empezar con una A600nm= 0,05 (se midió con espectrofotómetro biowave S2100 Diode Array S. de la marca WPA) y se incubaron a 37°C (E. coli) o a 28°C (A. tumefaciens) y a 220 r.p.m. de agitación hasta que el cultivo llegó a la fase exponencial (aproximadamente una A600nm= 0,6). A continuación, se enfriaron en hielo durante 30 minutos, se centrifugaron a 4000 r.p.m. a 4°C durante 10 minutos (en una centrífuga Eppendorf modelo 5415D) para separar las células del sobrenadante, el pellet de células se lavó mediante resuspensión en 25 ml de CaCl2 100 mM (Merck) previamente enfriado a 4°C, se volvió a centrifugar en las mismas condiciones y se resuspendió en 1 ml de CaCl2 100 mM a 4°C. Finalmente, las células competentes se guardaron en glicerol 10 % (v/v), en alícuotas de 150 l a -80°C. Las transformaciones se realizaron mediante el tratamiento térmico de la cepa bacteriana (E. coli DH5 o de A. tumefaciens) siguiendo el método de choque térmico (Sambrook, 2001). Las células competentes se descongelaron en frío, se les añadió el ADN (plásmido o ligación) entre 10 y 100 ng. Se incubaron 30 minutos en hielo y a continuación se sometieron a un choque térmico a 42°C durante 90 segundos seguido de 2 minutos en hielo. Posteriormente, se les añadió 1 ml de LB y se transfirieron a un tubo de cristal donde se incubaron inclinados en gradilla en un agitador orbital durante 1 h a 37°C a 200 r.p.m. (RF1-150x Infors AG). Como control negativo se emplearon células competentes sin ADN añadido y como control positivo células competentes con 100 ng del plásmido control (sin inserto clonado). Seguidamente se extendieron las células transformadas en placas de LB con el antibiótico de selección y se incubaron a 37°C (28°C si es A. tumefaciens). 2.2 Transformación genética de plantas La transformación de A. thaliana ecotipo Col-0 con los plásmidos portadores de las construcciones de interés mediante la bacteria A. tumefaciens se realizó a través de las Materiales y Métodos 44 inflorescencias de plantas cultivadas en tierra durante cinco semanas en el momento en el que presentaban el mayor número posible de meristemos apicales (botones florales). Cinco días antes de la transformación se cortó el ápice de la inflorescencia primaria para promover la aparición de inflorescencias secundarias. Las plantas se seleccionaron cuando se observó un número elevado de flores, habiendo aún primordios florales, y se sometieron a transformación mediante el método de infiltración por vacío sumergiendo la parte aérea de dichas plantas en un recipiente con una suspensión de A. tumefaciens portadora de la construcción de interés en el medio (descrito en el apartado 6.2.4 de materiales) durante 10 minutos en cámara de vacío (para potenciar la infección) por dos veces consecutivas separadas por una apertura de válvula de la cámara (la cámara estaba asociada a una bomba de vacío de agua Unijet l) (Clough & Bent, 1998). Tras este proceso las inflorescencias se enjuagaron con agua y posteriormente se cubrieron con bolsas independientes por maceta para mantener la humedad y aumentar la eficacia de transformación. Se retiraron las bolsas a partir de las 24 h de forma paulatina (primero se abrieron por abajo para dejar entrar el aire, para al día siguiente quitarlas del todo) y se dejaron crecer las plantas, ya transformadas, en cámara de cultivo con condiciones controladas de fotoperiodo y temperatura. Las plantas se regaron cada dos días por inundación y cada 2 riegos el agua se implementó con abono (½ de sales MS) hasta que las hojas de la roseta comenzaron a amarillear, entonces, transcurrido el tiempo de fructificación y de secado de las semillas, se recogieron las semillas que conformarían la generación T0. 2.2.1 Obtención de líneas transgénicas homocigotas Tras la obtención de la T0, unas 2.000 semillas se sembraron en tierra (sustrato: vermiculita en una proporción 1:1) y en cámara de cultivo controlada para conseguir individuos de la generación T1, seleccionando las plantas transformadas mediante resistencia a DL-fosfinotricina (PPT), ya que sólo aquellas plantas en las que se hubiera integrado el plásmido crecerían en este herbicida. Las plantas se pulverizaron con Basta® suplementado con Tween 0,02 % (p/v) cada 2 días desde su germinación hasta que las plantas no transformadas murieran. Las plantas supervivientes fueron trasplantadas a alveolos individuales y se crecieron por separado para poder recoger las líneas de forma independiente tras su tiempo de fructificación y secado de semillas. Posteriormente las semillas provenientes de una única planta, se sembraron de nuevo en placa con el herbicida. En total se sembraron diez líneas independientes de cada transformación, ya que el gen clonado entre los extremos del T-DNA (linA) se podría haber integrado en diferentes posiciones del genoma (como se explica en el punto 1.2 de materiales), y por tanto podría haber variabilidad en la expresión del gen. Tras 15 días de crecimiento, se contó el número de semillas que germinaron en medio con fosfinotricina, si esta segregación se Materiales y Métodos 45 correspondía con la mendeliana 3:1 (resistentes:sensibles) se podría atribuir a una sola integración de T-DNA en el genoma de la planta, pero si el porcentaje era mayor se supondría que la integración tuvo lugar en múltiples sitios en el genoma. De las líneas seleccionadas por su segregación en PPT se escogieron las líneas cuya segregación indicaba que tenían un solo gen insertado en el genoma. En las subsecuentes generaciones con segregación mendeliana y 100 % de resistencia a PPT se asumía entonces que las plantas no sólo eran portadoras de una sola copia del gen insertado, sino que eran homocigotas para el gen de resistencia a lindano. Por lo tanto, dichas plantas fueron usadas a lo largo de esta tesis para caracterizar la respuesta a lindano en A. thaliana. Las semillas transgénicas T1 de las líneas seleccionadas, además de sembrarse en las placas suplementadas con PPT, se sembraron en paralelo en placas Petri con medio MS agar suplementado con lindano en una concentración subletal para el ecotipo Col-0. Después de dos semanas de crecimiento, las plántulas resistentes al lindano (T1) fueron rescatadas y trasplantadas a placas MS agar sin contaminante durante unos días para favorecer la recuperación de las plantas y su crecimiento radicular, y después se trasplantaron a alveolos con tierra de manera individual para conseguir la generación T2. Las semillas T2 se crecieron otra vez en medio MS sólido suplementado con lindano para comprobar su respuesta. Como las líneas ya eran homocigotas, se esperaba una respuesta homogénea (sin segregación). De las líneas homocigotas obtenidas se eligieron las que presentaban mayor resistencia a lindano para trasplantarlas a tierra de forma individual y obtener semillas. 3 Técnicas de biología molecular 3.1 Manipulación de ácidos nucleicos bacterianos 3.1.1 Aislamiento y cuantificación de ADN plasmídico El ADN plasmídico se aisló empleando el “Qiaprep® spin miniprep kit” (Qiagen), partiendo de 1,5 ml de cultivo bacteriano crecido en LB más el antibiótico de selección y siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y la calidad del ADN plasmídico se determinó con un equipo Nanodrop (Nanodrop® ND-1000). Este ADN se utilizó para reacciones de secuenciación y clonaje. 3.1.2 Reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR). Amplificación del gen linA El gen linA (GeneBank no.S63514) de Sphingobium japonicum (S. paucimobilis) UT26S, con la secuencia contenida en la tabla 8, se amplificó mediante PCR con la enzima ADN polimerasa de Materiales y Métodos 46 alta fidelidad de copia Pfu (Stratagene) usando como molde el plásmido pLinA extraído como se indica en el apartado anterior de la cepa de DH5α que lo contenía (tabla 3). Tabla 8: secuencia del gen linA Gen Tamaño (pb) Secuencia linA 468 1 atgagtgatc tagacagact tgcaagccgg gccgcgattc aggacctcta ctctgacaag 61 ctcattgccg tagacaagcg ccaagagggc cgtctcgctt ctatttggtg ggatgatgca 121 gagtggacca ttgagggaat cggcacctac aagggcccgg aagcgctcga tttggccaat 181 aacgtactct ggccaatgtt tcacgaatgt attcattatg gaaccaatct gcgcttggaa 241 tttgtgagcg cggacaaggt aaatggtatt ggcgacgtcc ttctccttgg aaatctcgtc 301 gaaggtaatc agtcgattct tatcgctgcg gtcttcacgg atgagtatga gcgccgtgac 361 ggggtgtgga agttctctaa gcgcaacgca tgcacgaact atttcacccc gctggccggc 421 attcatttcg caccgcccgg cattcatttc gcaccgtccg gcgcataa Las condiciones que se aplicaron a las reacciones de PCR se reflejan a continuación: 1 unidad de enzima ADN polimerasa Pfu turbo® (Stratagene); 0,1 volúmenes de tampón Pfu 10x (suministrado con la enzima); 0,125 mM de una mezcla equimolecular de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) (Sigma), 20 pmol de cada oligonucleótido (forward y reverse) y una cantidad de ADN molde que varía entre 20 y 70 ng; todo ello en un volumen final de 50 μl. Las condiciones de PCR fueron optimizadas siguiendo las recomendaciones descritas por Ausubel y colaboradores (Ausubel et al, 1994), usando 4ºC por debajo de la temperatura de desnaturalización de los cebadores para la fase de hibridación y se calculó un tiempo de síntesis de un minuto por cada kb. La fórmula para calcular la temperatura de desnaturalización de cada oligonucleótido fue: Tm=2(A+T)+4(G+C) Donde Tm era la temperatura de desnaturalización y A, T, G y C hacía referencia al número de bases nitrogenadas que tenía la secuencia del oligonucleótido de adenina, timina, guanina y citosina respectivamente. Para amplificar el gen linA y clonarlo en el vector pCAMBIA3500, se diseñaron dos cebadores, uno con la secuencia de una diana de restricción BamHI en el extremo 5’ (LINABAM-forward- 5´- TGAGGATCCATGAGTGATCTAGACAGACTT-3´, y otro con la diana EcoRI y un codón stop adicional en el extremo 5’ (LINAECO-reverse- 5´-TGAGAATTCCTATTATGCGCCGGACGGTG-3´) (los sitios de restricción se indican en verde y las bases adicionales introducidas para crear el codón stop adicional están subrayadas). Materiales y Métodos 47 Por otra parte, se diseñaron dos cebadores distintos para generar dos versiones del gen linA que codificasen 6 histidinas unidas en el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína (se etiquetan en ambos extremos de forma independiente): i) LINABAMHIS-forward-,5´-GAGGATCCATGCATCATCATCATCATCATAGTGATCTAGACAG ACTTGCA-3´ (en combinación con LINAECO) ii) LINAECOHIS-reverse-, 5´-TGAGAATTCCTATTAATGATGATGATGATGATGTGCGCCGGAC GGTGCGA-3´ (en combinación con LINABAM) (los codones de histidina están indicados en negrita). El programa empleado para amplificar el gen linA por PCR aparece descrito en la tabla 9. Tabla 9. Condiciones de PCR para la amplificación del gen linA Etapa Temperatura Tiempo Nº ciclos Desnaturalización inicial 94ºC 3 minutos 1 Desnaturalización 94ºC 30 segundos Anillamiento 50ºC 30 segundos 30 Extensión 72ºC 5 minutos Extensión final 72ºC 10 minutos 1 3.1.3 Electroforesis de ADN y ARN La separación electroforética de fragmentos de ADN se realizó rutinariamente en geles de agarosa 0,8-1 % (p/v) (Pronadisa), preparados en tampón TBE 1x (Tris-Borato 45 mM, 1 mM EDTA) (laboratorios Conda). Como patrón de peso molecular se utilizó el Marcador λ ADN/HindIII (Roche) o HyperLadder I (DNA del fago lambda cortado con las enzimas EcoRI y HindIII (Bioline)). Para cada muestra a analizar se añadió 1/5 de tampón de carga 5x que venía con el marcador (EDTA 10x, 30 % glicerol, 0,25 % azul de bromofenol y 0,25 % xileno-cianol). Los geles se prepararon con 1 µg/ml final de bromuro de etidio (invitrogen). Se resolvieron durante 1 h a 100 V. Las bandas de ADN se revelaron mediante exposición a la luz ultravioleta en un transiluminador Vilber Lourmat, las imágenes de los geles se captaron con el programa Gel Logic 100 de Kodak. Para comprobar la integridad del ARN extraído de plantas, se analizó en geles con las mismas características que los utilizados para ADN. Debido a la fragilidad de estas muestras se Materiales y Métodos 48 resolvieron durante tan solo 30 minutos a 100 V. Las bandas se revelaron y captaron de la misma manera que con el ADN. 3.1.4 Purificación de fragmentos de ADN en geles de agarosa Para separar y purificar los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR, se emplearon geles de agarosa 1 % (p/v) en buffer TBE 1x (laboratorios Conda). Las muestras de ADN se concentraron empleando un concentrador de vacío (SPD SpeedVac, ThermoSavant) asociado a un liofilizador (FREEZONE Plus 2.5, Labconco) para cargarse en un solo pocillo. El gel se resolvió a 100 V, las bandas con los fragmentos de ADN se extrajeron con un bisturí y se purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), siguiendo las recomendaciones del fabricante. 3.1.5 Digestión del ADN con enzimas de restricción Las digestiones del ADN con enzimas de restricción se realizaron siguiendo las instrucciones indicadas por el fabricante (Roche). Generalmente las reacciones contenían 3-10 g de ADN; 0,1 volúmenes de la solución tampón 10x recomendada para cada corte simultáneo con dos enzimas (suministrado con las enzimas); 0,5-4 unidades de cada enzima de restricción y BSA con una concentración final de 100 μg/ml. El volumen final de la reacción era de 10 l. Tanto las muestras del inserto como las del vector se digirieron 2 h (para evitar corte en estrella). Las temperaturas de incubación y de inactivación también fueron las indicadas por el fabricante. 3.1.6 Ligación de fragmentos de ADN La ligación entre el vector linealizado y el inserto, obtenidos mediante las digestiones anteriores se incubaron en proporción molecular 1:5. Se utilizó 0,1 volúmenes de tampón 10x (incluido con la enzima) y 1 unidad de ADN ligasa T4 (Roche) en un volumen final de 10 l, siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezcla se incubó a 16ºC durante al menos 12 h en termobloque (ThermoStart plus de Eppendorf). 3.1.7 Precipitación de la ligación Antes de transformar las células competentes de E. coli, se precipitaron las muestras de ligación con 0,1 volúmenes de acetato sódico (Sigma) 3 M pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol absoluto (PanReac Applichem) (Sambrook, 2001). Se incubó durante 1 hora a una temperatura de -80ºC, seguido de una centrifugación a unos 13000 r.p.m. durante 20 minutos a 4°C (centrífuga 5415R de Eppendorf) para precipitar las células, y se eliminó sobrenadante, posteriormente se añadió 1 ml de etanol 70 % (v/v) (PanReac Applichem), se centrifugó 5 minutos en las mismas condiciones que la centrifugación anterior, se eliminó el sobrenadante y se dejó abierto para Materiales y Métodos 49 que se evaporase el etanol restante durante unos minutos, una vez que estuvo totalmente seco el pellet se resuspendió en 4 l de agua estéril. 3.1.8 Secuenciación de ADN Los fragmentos de ADN con las distintas versiones del gen linA clonados en el plásmido pCAMBIA3500 (amplificado en E. coli DH5 se secuenciaron antes de transformar A. tumefaciens. Los plásmidos se extrajeron como se indicó en apartado 3.1.1 de métodos y se secuenciaron mediante electroforesis capilar mediante una variante del método de terminación por didesoxinucleótidos (Sanger et al, 1977) en la Unidad de Secuenciación del Centro de Astrobiología (Madrid). Los oligonucleótidos utilizados fueron CAM357 R y CAM357 F (tabla 4). Las secuencias obtenidas se analizaron con el programa DNASTAR Lasergene. 3.2 Manipulación de ácidos nucleicos de plantas 3.2.1 ADN 3.2.1.1 Extracción de ADN de plantas Para la extracción de ADN de plantas se sembraron semillas de todas las plantas en estudio (incluidas las plantas control) en medio MS agar, tras ser vernalizadas 48 h a 4°C en oscuridad, y se crecieron en condiciones controladas de fotoperiodo a 22°C durante 15 días en cámara de cultivo. Se aisló el ADN a partir de hojas de las plantas crecidas por cada línea y de las WT, empleando el kit REDExtract-N-Amp Plant PCR (Sigma-Aldrich). Se hicieron dos replicas biológicas de cada una. 3.2.1.2 Reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR) Las reacciones de PCR se realizaron con la mezcla “REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix”, del kit empleado para la extracción del ADN, que contiene el anticuerpo JumPStart Taq específico para amplificación “hot start”, el tampón para la ADN polimerasa, los dNTPs y REDTaqTM polimerasa. En las reacciones, se empleó la cantidad recomendada por el fabricante de ADN molde extraído en la primera fase del kit (4 μl). El programa de PCR (tabla 10) también se basó en lo indicado en el protocolo del kit y adaptado a los oligonucleótidos empleados. Los cebadores usados para la amplificación del gen linA fueron: LINABAM (FW) y LINAECO (RV) (tabla 4). Materiales y Métodos 50 Tabla 10. Condiciones de la PCR para la amplificación del gen linA a partir del ADN genómico de las plantas modificadas. Etapa Temperatura Tiempo Nº ciclos Desnaturalización inicial 94ºC 3 minutos 1 Desnaturalización 94ºC 52 segundos Anillamiento 52ºC 45 segundos 35 Extensión 72ºC 2 minutos Extensión final 72ºC 10 minutos 1 3.2.2 ARN 3.2.2.1 Extracción de ARN de plantas Para obtener las muestras de plantas a las que extraer el ARN se sembraron semillas de todas las construcciones de estudio y también de la planta control, tras ser vernalizadas, en medio MS suplementado con lindano a una concentración de 5 µg/ml que permite también el crecimiento de las plantas silvestres, y se incubaron durante 15 días con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, y 22°C de temperatura constante. Una vez crecidas se separó la parte aérea de las raíces (se eliminó al máximo el medio adherido a la superficie de las raíces) para extraer el ARN por separado. A partir de aproximadamente 0,1 g de la parte aérea y de las raíces, se extrajo el ARN mediante el kit FastRNA®Pro-Green (Qbiogene) siguiendo el protocolo adjuntado por el fabricante. Para comprobar su integridad se hizo una electroforesis en agarosa y se comprobó que no estaba degradado (se observaron íntegras las bandas de ARN ribosomal). 3.2.2.2 PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Este método ha ido sustituyendo al método alternativo Northern Blot como medio de cuantificar la expresión de un gen ya que posee una mayor sensibilidad, permitiendo distinguir homólogos y ortólogos de genes. Mediante esta técnica se puede comprobar si un determinado gen se está expresando. Partiendo de 3 g de ARN total de cada muestra, se eliminó el ADN de la misma mediante tratamiento con RNAsa-free DNAsa I (Sigma-Aldrich), añadiendo 6 unidades a la muestra de ARN e incubando durante 1 hora a 37°C. Después se trataron con fenol, fenol-cloroformo y cloroformo para eliminar la enzima. Se sintetizó el ADN complementario (ADNc) a partir del ARN Materiales y Métodos 51 con transcriptasa inversa SuperScript TM II (Invitrogen), en este caso, para eliminar el ARN se trató con 1 µl (2 unidades) RNAsa H (Invitrogen) a 37°C durante 20 minutos. A continuación, se realizó una PCR con la enzima ADN polimerasa Taq (obtenida de la bacteria termófila Thermus aquaticus) (Invitrogen) usando como molde el ADNc resultante del tratamiento anterior. Los cebadores usados para la amplificación del gen linA fueron: LINABAM (FW) y LINAECO (RV) (tabla 4). Las condiciones del programa fueron las que refleja la tabla 11. Tabla 11. Condiciones de PCR para amplificar el gen linA a partir de cDNA Etapa Temperatura Tiempo Nº ciclos Desnaturalización inicial 95ºC 2 minutos 1 Desnaturalización 95ºC 45 segundos Anillamiento 50ºC 45 segundos 30 Extensión 72ºC 2 minutos Extensión final 72ºC 10 minutos 1 3.2.2.3 PCR en tiempo real (qPCR) y su análisis Mediante esta técnica se determinó la expresión relativa del gen linA en las distintas líneas transgénicas. Para ello se usó como molde el ADNc obtenido en el apartado anterior (RT-PCR). La especificidad de los cebadores se comprobó de dos formas diferentes. Por una parte, se evaluó el resultado final de la PCR cuantitativa en un gel de electroforesis 1 % (p/v) agarosa) y se confirmó la presencia de bandas únicas y la ausencia de artefactos (como son la amplificación inespecífica y cebador dímero) (Fig. 8 D). Por otro parte, se construyó una curva de fusión para esta pareja de cebadores mostrando un único pico sin detectarse otros productos inespecíficos (Fig. 8 A). El factor de elongación 1se usó como control interno para normalizar los resultados AT5G60390F y AT5G60390R (tabla 4)]. El termociclador utilizado fue el iCycler iQTM con Real- time PCR Detection System (Bio-Rad) con el programa fue el que aparece en la tabla 12. Se usó fluoresceína (FAM-490) para normalizar la intensidad de la fluorescencia, el agente intercalante SYBR ®Green para monitorizar la síntesis de ADN de doble cadena (concentración 1:10000) y la enzima Taq Platinium (Sigma-Aldrich). Materiales y Métodos 52 Figura 8. Resultados de calibración del termociclador para qPCR para nuestro ensayo. A: Curva de fusión: con los cebadores LINAECO y LINABAM utilizados para qPCR. B: Curva estándar realizada para LINA5.1 con FAM-490, representa logaritmo de concentraciones frente a CT. C: Curva estándar realizada para LINA-C2.1 con FAM-490, representa logaritmo (base 10) de concentraciones frente a CT. D: Electroforesis en gel de agarosa 1,2 % (p/v) de las muestras de la PCR a tiempo real. Se aprecia la banda de 30 pb correspondiente a lo esperado para los cebadores control usados [AT5(F) y AT5(R) (tabla 4)]. Tabla 12. Condiciones para qPCR. Etapa Temperatura Tiempo Nº ciclos Medida de fluorescencia Desnaturalización inicial 95ºC 3 minutos 1 Desnaturalización 95ºC 45 segundos Anillamiento 50ºC 45 segundos 40 Extensión 72ºC 2 minutos Al final Extensión final 72ºC 10 minutos 1 Desnaturalización 95ºC 1 minuto 1 Enfriamiento 50ºC 1 minuto 1 Curva de fusión 50ºC a 95ºC (0,5ºC por 10 segundos) 100 Medida continua Los resultados se obtuvieron de dos réplicas biológicas (en cada una de ellas poniendo dos muestras correspondientes al molde sin diluir y su dilución 10-1) de cada planta modificada y de Materiales y Métodos 53 la WT en cada réplica), se analizaron según el método de cuantificación relativa de la curva estándar (Larionov et al, 2005). Dicho método calcula la cantidad de ADN amplificado de cada gen en las diferentes muestras (plantas silvestres y transformadas con linA) interpolando los valores CT obtenidos en su curva estándar. Se construyeron curvas estándar utilizando diluciones decimales seriadas (0, 10-1 y 10-2). Estas curvas se obtuvieron al representar los valores CT frente al logaritmo de la cantidad de ADN molde de cada dilución (Fig. 8 B y C). El valor CT (ciclo umbral) representaba el número de ciclos de PCR necesarios para alcanzar el nivel mínimo de detección (umbral). Con una relación inversa donde al crecer el nivel de expresión disminuye el valor CT. Se calculó usando el acercamiento por coeficiente máximo de correlación. La eficacia de amplificación de los cebadores utilizados se calculó a partir de la pendiente de su curva estándar según la fórmula: Eficacia=10(-1/pendiente) Los parámetros de las curvas estándar construidas para dos de las líneas de estudio (LINA5.1 y LINA-C2.1) se recogieron en la tabla 13. Tabla 13. Parámetros de las curvas estándar para dos de las líneas de investigación de este trabajo. LINA5.1 LINA-C2.1 coeficiente de correlación 0,997 0,997 pendiente -3,975 -3,909 punto de intercepción 9,542 11,952 Eficiencia de PCR (%) 78,50 80,20 4 Análisis fenotípico Las plantas expuestas a condiciones de estrés abiótico subletales exhiben respuestas morfogenéticas comunes, que pueden ser consideradas como una respuesta genérica al estrés (Potters et al, 2009). Para poder determinar en profundidad esa respuesta al estrés producido por el lindano en las plantas silvestres y si ésta mejoraba en las plantas transformadas se realizaron experimentos para evaluar el desarrollo de la parte aérea y radicular. 4.1 Estudio de la parte aérea de la planta Como parámetro de resistencia, desarrollo y crecimiento se evaluó el área de la roseta foliar característica de A. thaliana. La caracterización fenotípica de este parámetro se llevó a cabo en plantas crecidas en medio sólido con distintas concentraciones del pesticida y sin suplementar como control. Se sembraron 10 semillas de cada construcción, las semillas se dejaron crecer Materiales y Métodos 54 durante dos semanas en las condiciones reflejadas en el apartado 1.3 de esta sección, tras lo cual se obtuvieron imágenes de alta resolución que se guardaron en formato TIFF para su posterior análisis informático con el programa Fiji (ImageJ). De esta prueba se realizaron tres replicas biológicas, y, además, sólo para las concentraciones elegidas y control sin lindano se realizó una cuarta réplica con 22 plantas de cada línea de plantas. El área foliar de cada planta se midió de forma individual en las distintas placas con el mismo programa para procesamiento de imágenes digitales y con todos estos datos se efectuó un análisis estadístico con el programa IBM ssps. 4.2 Estudio de raíces En A. thaliana, como otras dicotiledóneas, todo el sistema radicular procede de la ramificación de la raíz principal o seminal, llamada así por su formación en la embriogénesis (Nibau et al, 2008). La respuesta al estrés abiótico, como el producido por el lindano en este caso, se podría ver tanto en el desarrollo de la raíz como en su arquitectura (Muthusamy et al, 2020). 4.2.1 Estudio de morfología de las raíces. Densidad radicular En A. thaliana, las raíces laterales se forman y se distribuyen a lo largo de la raíz principal de acuerdo con un patrón regular que se conoce como distribución acrópeta (Charlton, 1983) alternando izquierda-derecha (De Smet et al, 2007) donde las raíces más jóvenes estén en la parte apical y las más antiguas en la zona proximal, de la misma manera su número se correlaciona de forma positiva con la longitud de la raíz principal. Ambos valores obtenidos permitieron calcular la densidad de las raíces lo que nos dio una idea más precisa de la salud radicular en cada una de las concentraciones de lindano probadas. Para evaluar la sensibilidad de la planta a este compuesto se estudió primero el crecimiento de las raíces y posteriormente se contó el número de raíces laterales de la raíz principal de las plantas en placas con medio MS agar, sin lindano, para obtener los valores de cada una de las medidas para las plantas en “condiciones normales” sin estrés, seguidamente se estudió el efecto en ambas medidas para las concentraciones elegidas del pesticida. Para ello se sembraron las semillas, una vez estratificadas y estériles, alineadas en un sector de placas cuadradas (15 x 15 cm) con medio MS con 0,8 % (p/v) de agar para plantas que proporcionaba suficiente consistencia para disponer las placas verticalmente y así facilitar el crecimiento de las raíces sobre la superficie del medio de cultivo y su monitorización. En cada placa se dispusieron 5 semillas de cada línea y otras tantas de WT alineadas y separadas unas de otras 1 cm, lo suficiente para evitar el solapamiento de sus raíces, y a una distancia de 2,5 cm de la parte superior de la placa. Tras pasar dos semanas creciendo en las condiciones descritas en el Materiales y Métodos 55 apartado 1.3 de métodos, se obtuvieron imágenes de alta resolución de las placas (se guardaron en formato TIFF) para, posteriormente realizar las medidas de longitud final de las raíces y obtener los datos del número de raíces laterales de la raíz principal en cada una de ellas (número total de raíces laterales emergidas (RLe)) con la ayuda del programa Fiji (ImageJ). A continuación, se calculó la densidad radicular dividiendo el valor de RLe entre la longitud de cada raíz (mm) para representarla posteriormente, hacer la estadística pertinente con el programa IBM SSPS (n=5 por construcción y placa y al menos 3 réplicas distintas) y estudiar así su comportamiento en los distintos medios. Para la obtención de estos datos se realizaron tres réplicas biológicas y, en el caso de la concentración de 5 μg/ml de lindano incluso se hizo una réplica más. 4.2.2 Estudio del área radicular Con el objetivo de estudiar el área que ocupaban las plantas transformadas y la planta silvestre en los medios con distintas concentraciones de lindano se hicieron medidas de este parámetro en las mismas placas en las que se realizaron las medidas de longitud y número de raíces laterales (para el cálculo de la densidad radicular). Por lo tanto, contamos con tres réplicas biológicas y, en el caso de la concentración de 5 μg/ml de lindano incluso se añadió una réplica más. Se realizaron las medidas con la ayuda del programa Fiji (ImageJ). 4.2.3 Estudio de la tasa de crecimiento de las raíces Para poder medir mejor las diferencias de crecimiento respecto al tiempo entre las raíces se empleó el protocolo descrito por Peter Doerner dentro del maunal de Arabidopsis (Weigel & Glazebrook, 2002). Las semillas se sembraron previamente en medio MS con 0,6 % (p/v) agar sin lindano y se dejaron crecer en horizontal durante una semana en condiciones de fitocultivo descritas en el apartado 1.3 de métodos. Después las plántulas se trasplantaron en condiciones de esterilidad a otras placas con medio MS 0,8 % (p/v) agar en ausencia y presencia de lindano, y se crecieron en vertical en las mismas condiciones de fotoperiodo y temperatura de la semana anterior. En este caso, como las plantas ya habían germinado y tenían raíz, se marcó en la placa el extremo apical de las raíces como posición inicial para las mediciones sucesivas de elongación que se realizaron cada 24-48 h. Se analizó el crecimiento respecto al tiempo de cada construcción. Cada experimento contaba con 4 repeticiones de cada línea seleccionada, y se hicieron dos réplicas biológicas. 5 Análisis de la degradación de lindano por las plantas modificadas 5.1 Cromatografía de gases con espectrometría de masas (GC/MS-ECD) Esta técnica cromatográfica permite evaluar la capacidad de degradación de lindano de las plantas modificadas, frente a la planta control, y determinar los compuestos resultantes de la Materiales y Métodos 56 degradación de este pesticida (realizado en colaboración con la empresa Gaiker, España). El empleo de lindano comercial, permitió determinar además la respuesta de las plantas no sólo al lindano (γ-HCH) sino a algunos de los otros isómeros del HCH que no tenían actividad insecticida, pero eran recalcitrantes y tóxicos (α, β, y, δ y ε) y corresponsables del problema de contaminación del compuesto (aunque se incluyeron el análisis de ε-HCH sus valores fueron casi imperceptibles). Para las muestras de medio sólido y tejido de plantas el medio MS se suplementó con lindano comercial. Para los experimentos con plantas crecidas en tierra, se utilizaron diferentes mezclas de tierra obtenida de zonas contaminadas y sin contaminar. 5.1.1 Cuantificación de degradación de lindano en medio MS agar Las concentraciones de HCH, como marcador de la presencia de lindano, fueron determinadas usando un método estadístico estandarizado basado en el método de extracción 3550B y el método analítico para pesticidas organoclorados 8081B, ambos de la USEPA. La concentración de HCH restante en el medio MS agar tras la germinación y el crecimiento de las plantas en él se determinó usando un protocolo modificado de extracción en el que 1 g de la muestra de MS agar se colocó en viales de vidrio de 20 ml y se extrajo dos veces con 10 ml de hexano durante 1 h, seguida de sonicación durante 10 minutos. Los sobrenadantes se mezclaron y concentraron bajo corriente de nitrógeno hasta un volumen final de 1 ml, después se analizaron por cromatografía de gases con cromatógrafo 6890N de la marca Agilent Technologies con detector de captura de electrón (GC-ECD) (límite de detección de este método=0,1 μg/l). Durante el proceso de extracción se usó un sustituto de Standard Mix 9 de Dr. Ehrenstorfer XA08080900AC o uno similar. Se prepararon una serie de estándares (controles) usando agar inoculado con concentraciones de HCH conocidas, para determinar la fiabilidad y precisión del método de extracción (que resultó del 100 % en recuperación de la muestra). Las concentraciones de lindano en agar fueron 1 M, 5 M and 10 M usadas y extraídas por triplicado. Para los cálculos, la densidad de agar se estimó igual a la densidad del agua. Para ver diferencias entre el control y el resto de plantas transformadas se sembraron 20 semillas por placa en las placas de MS suplementadas con lindano 5 µg/ml o unos 50 µg de semillas resuspendidas en 1 ml de agar al 0,15 % (p/v) (300 µl en el caso de los tubos de plástico de fondo cónico de 50 ml que contenían 15 ml de medio) y se movieron circularmente para distribuirlas de la forma más homogénea posible en la superficie del medio. Cada línea de plantas modificadas, se sembró de forma independiente en placas (y también en tubos de 50 Materiales y Métodos 57 ml) con repeticiones técnicas de ambas (2 placas o tubos de cada línea), se crecieron simultáneamente en condiciones estándar de fotoperiodo durante al menos 15 días y, para analizar el medio MS agar, se eliminaron las plantas del mismo antes de enviar las muestras. Como control se empleó una placa con el mismo medio, pero en el que no crecieron plantas, también por duplicado y expuesta a las mismas condiciones que las demás placas con semillas de las líneas de plantas modificadas y de la planta control. De este experimento, se realizaron dos replicas biológicas. 5.1.2 Cuantificación de la degradación de lindano en cultivos en tierra La empresa Gaiker nos suministró una muestra “real” de tierra contaminada con lindano con una concentración de 3.500 mg/kg, se realizaron pruebas haciendo diluciones de esta tierra tamizada con tamiz de 0,45 mm de red (tras romperla con mortero) y el sustrato nuestro comercial (Projar). Se realizaron las diluciones de 1/5, 1/10 y 1/50 y se sembraron, por duplicado, 20 semillas de cada línea (las 3 líneas transformadas y la WT) por bote estéril de crecimiento con ayuda de unas pinzas. Se estratificaron a 4°C durante 48 h y luego se dejaron crecer en condiciones controladas de fotoperiodo. La tierra se analizó tras quitar las plantas crecidas en ella (como se hizo en el caso del análisis de las muestras de agar) empleando el método analítico estandarizado CG/MS-ECD y el método de extracción basado directamente en el método de extracción 3550B de USEPA. 5.1.3 Cuantificación de la degradación de triclorobenceno El triclorobenceno (TCB) es un producto volátil de degradación del lindano que se encuentra normalmente tras la degradación mediada por el gen linA. Para analizar la cantidad de este subproducto en la muestra se usó un método estandarizado de la USEPA basado en el 5021A y el 8260A para hidrocarburos, que analizó la muestra mediante GC/MS/HS. No se introdujeron pasos de extracción, ya que la prueba de extracción con metanol realizada como paso anterior no supuso una mejora del proceso de detección. Se empleó 1 g de agar fresco que se introdujo en un vial de vidrio de 20 ml y se calentó a 70°C durante 15 minutos. Se realizó una recta de calibración previa con agar puro inoculado con concentraciones crecientes de 1,2,4-TCB. Para analizar el 1,2,4-TCB presente en el medio se prepararon placas MS agar con la misma concentración de 1,2,4-TCB estimada para hacer los experimentos con lindano (5 µg/ml) para hacer los controles. La detección de este compuesto se llevó a cabo a partir del medio sólido de las placas de lindano usadas en el apartado de materiales 6.2.1 Materiales y Métodos 58 5.2 Identificación de lindano y sus productos de degradación mediante Cromatografía con Microextracción en Fase Sólida de Alta Eficacia (HP-SPME) Para identificar el lindano y sus productos de degradación se empleó la técnica de Cromatografía con Microextracción en Fase Sólida de Alta Eficacia (HP-SPME) asociado a detectores de espectrometría de masas que se utilizan para resolver metabolitos de γ-HCH (Camacho-Pérez et al., 2010b; Manickam et al, 2006; Manickam et al, 2008; Quintero et al, 2007) y que se utilizó en este caso para ver la degradación del lindano. Con esta combinación de técnicas se llevaron a cabo mediciones de muestras recogidas por separado de los tejidos de la planta (modificada y control), la fase gaseosa y el sustrato (agar contaminado) en el departamento de Química Prebiótica del Centro de Astrobiología (Madrid). Las plantas crecidas, el medio donde crecieron y el aire que las rodeaba se separaron para ser analizados como muestras independientes. Todas ellas, pertenecían a los mismos cultivos con 20 semillas crecidas en tubos de fondo cónico de 50 ml con 15 ml de MS-agar (cerrados para poder analizar la fase gaseosa) crecidos en condiciones controladas de fotoperiodo y temperatura durante una semana en cámara de cultivo. Se debe tener en cuenta que los resultados obtenidos de esta manera no son cuantitativos, pero aportan información cualitativa de los compuestos que se encuentran en cada muestra lo que permite determinar la existencia o ausencia de los productos de degradación del lindano. 5.2.1 Mediciones del medio MS agar y de los tejidos de plantas La extracción de los compuestos del medio MS contaminado con lindano y los tejidos de la planta se hicieron usando 100 µm de fibra de sílice recubierta con polidimetilsiloxano (PDMS) de la casa Supelco. Las plantas y el medio MS agar con lindano (5 µg/ml) donde se crecieron durante 15 días en cámara de cultivo (además de un medio control sin sembrar) se congelaron con nitrógeno líquido y se pulverizaron. Las muestras pulverizadas se introdujeron en viales de vidrio de 10 ml sellados con la fibra de SPME colocada por encima. El vial se calentó a 70°C durante 30 minutos en baño de arena. Después de esto, los analitos retenidos en el PDMS se desorbieron en el puerto GC a 250°C durante 4 minutos en modo de inyección continua y se analizan con columnas Elite-5 (5 % difenil-95 %, dimetil polisiloxano, 30 m, 0,25 mm ID) proporcionado por Perkin-Elmer. El espectro del impacto de la masa de electrón (EI+) de los analitos se grabó monitorizando los iones totales y las características de masa de los fragmentos. Se eligió para el diagnóstico de los fragmentos, masa con relación carga-masa (m/z) 180 para HCH e isómeros de pentaclorocyclohexano y triclorobenceno, m/z 146 para dicloro-benceno y Materiales y Métodos 59 m/z 109 para clorobenceno. Todos los compuestos se identificaron por su espectro masa y se contrastaron con los estándares comparando los espectros y el tiempo de retención. 5.2.2 Mediciones de la fase gaseosa Para la monitorización de los compuestos de degradación emitidos por la planta a la fase gaseosa, se introdujo un filtro SPME durante 2 h a temperatura ambiente en el tubo que contenía las plantas cultivadas y que permaneció cerrado durante la semana de incubación. Los analitos se desorbieron y se analizaron usando el mismo protocolo GC/MS. 5.3 Tratamientos estadísticos 5.3.1 Excel 2010 Los estudios estadísticos básicos con descriptivos univariantes (medias, desviaciones estándar), las sumas, los porcentajes y los gráficos de estas operaciones se realizaron con Microsoft Excel 2010, al igual que las tablas complejas. 5.3.2 GraphPad Prism 6 Los estudios realizados para obtener las gráficas de cinética del crecimiento de raíces se hicieron con el programa estadístico GraphPad Prism 6 en el que se introducen los datos obtenidos sin realizar ningún análisis específico en este caso, también se realizaron las pruebas de ANOVA para ver la significación de los resultados de los valores recogidos en ECD-CGMS. 5.3.3 IBM SPSS Statistics 24 Con la intención de comprobar si los resultados obtenidos en la caracterización fenotípica de las plantas expuestas a las distintas concentraciones de lindano seleccionado tenían una base estadística sólida y consistente se usó el programa “IBM SPSS Statistics 24”. En los experimentos llevados a cabo en esta tesis la unidad experimental se corresponde con cada planta independiente crecida en placa. La muestra de cada experimento comprende las plantas cultivadas en las placas con medio MS agar en el mismo día (normalmente incluye como mínimo dos repeticiones de cada condición), cómo mínimo se realizaron 3 réplicas biológicas, y en cada placa se sembraron un número de semillas determinado por el tipo de experimento. Las variables con las que se trabajó son: las distintas líneas de las plantas y la concentración de lindano con la que se implementó el medio de cultivo. Para intentar minimizar factores externos que puedan condicionar el resultado final, todas las placas se crecieron en condiciones de fotoperiodo y temperatura controladas descritas en el apartado 1.3 de métodos. El total de datos analizados para el estudio del área de roseta analizados fueron en total 769 plantas, para Materiales y Métodos 60 el de la longitud de raíces se analizaron un total de 89 plantas y las mismas para el número de raíces secundarias y el área radicular. Con este programa también se elaboraron los gráficos ilustrativos del análisis de los modelos seleccionados. El primer paso del análisis en todos los casos conllevó la realización de un estudio preliminar de normalidad de las variables construyendo histogramas para evaluar el grado de ajuste de las observaciones con una distribución teórica normal, transformando la variable dependiente para mejorar la normalidad en los casos necesarios. A continuación, debido a la complejidad de los datos experimentales en los que se cuenta con efectos fijos y aleatorios se probaron varios modelos estadísticos paramétricos (Barrios, 2018). La selección del modelo en cada caso se realizó considerando los Criterios de Información de Akaike (A.I.C) (Akaike, 1974) con los que se estimó la pérdida de información cuando la distribución de probabilidad f (asociada con el modelo verdadero), era aproximada mediante la distribución de probabilidad g (asociada con el modelo evaluado). En base al criterio se seleccionó el modelo en el que A.I.C. alcance el valor mínimo de entre los modelos factoriales candidatos. (Caballero Díaz, 2011). El modelo que mejor se ajusta a los datos obtenidos en cada experimento fue un lineal mixto (MIXED), que permitía mejorar la calidad del análisis de los factores fijos (niveles predeterminados interesantes para el investigador) y de los factores aleatorios (no se controlaban) (Barrios, 2018), y analizar datos correlacionados (Evelyn Bandera-Fernández, 2018) reduciendo los sesgos producidos por los datos incompletos (no crecía siempre el 100 % de las plantas sembradas). La nomenclatura utilizada en el programa se unificó de la siguiente manera siendo: ”línea” que se correspondía con la construcción de la planta, “tratamiento” que se correspondía con la concentración de lindano en el medio sólido y “réplica” que se correspondía con el día en el que se realizaron los experimentos. Los distintos modelos se construyeron con las variables “línea” y “tratamiento” como factores fijos del experimento, al igual que la interacción de ambos. Se añadió además la variable “réplica” como factor aleatorio. 5.3.4 Estudio del área de la roseta Las variables que se analizaron en este caso son las distintas construcciones de plantas (se midió el área de la roseta de cada planta de forma independiente) y las concentraciones seleccionadas de lindano que se añade al medio MS agar en las placas (sin lindano, 5 µg/ml y 10 µg/ml). El experimento consistía en la comparación de cada línea con las otras crecidas en cada concentración de lindano por separado (como mínimo habrá 3 réplicas). Materiales y Métodos 61 Para contraste paramétrico, caracterización del grupo y vista de las diferencias entre grupos se representó con gráfico de diagrama de caja o Box plot (Barrios, 2018) que sirvió para visualizar si las varianzas de los diferentes grupos eran constantes (Correa & Salazar, 2016). Para medir la heterogeneidad inobservable y cómo estaba contribuyendo cada factor fijo (no el aleatorio) al resultado final del área se efectuó un modelo de efectos fijos que se corresponde con la tabla 17 donde se podían ver los grados de libertad (gl) del numerador y denominador, el test F (que nos permitió distinguir como afectaba cada factor a la respuesta total, la significación estadística de F era mejor cuanto mayor fuera su valor) y los datos de significación para la hipótesis nula donde las variaciones del área no se ven afectadas por los parámetros fijos (tomando como valores significativos aquellos valores p <0,05). En la tabla además se podía ver cada factor de forma independiente y la interacción entre ambos que nos daba una idea de la evolución de ambos factores en el tiempo (tomando como hipótesis nula la igualdad de factores). Para ver la relación de cada línea con el tratamiento se hicieron comparaciones múltiples a las que se les aplicó un test a posteriori (post hoc) para establecer de dónde venían las diferencias. De los posibles test se eligió el de Bonferroni (por observar una varianza homogénea y tener un bajo número de grupos). 5.3.5 Estudio de densidad radicular Las variables que se analizaron en este caso son las distintas construcciones de plantas (se obtuvo el valor de la medida de longitud de las raíces principales en plantas crecidas en vertical y su número de raíces laterales) y las concentraciones de lindano que se añadieron al medio MS en las placas seleccionadas. En este caso el estudio estadístico mixto realizado permitió estudiar la evolución de las distintas líneas probadas mediante la representación gráfica de diagrama de cajas, pero no permitió obtener datos de significación, para obtener estos datos se necesitó hacer un contraste no paramétrico para cada cepa (debido a que los histogramas de normalidad presentan una distribución mala alejada de la normal en el caso de las plantas control). Se obtuvo una tabla descriptiva (tabla 18) y se hizo el estudio no paramétrico Mann-Whitney U para muestras independientes de las medianas, que se adjuntó a dicha tabla. Materiales y Métodos 62 5.3.6 Estudio del área radicular En este caso las variables analizadas fueron las distintas construcciones de plantas (se obtuvo el área de las raíces en el medio de las plantas crecidas en vertical de las plantas seleccionadas) y las distintas concentraciones de lindano seleccionadas. El modelo mixto volvió a ser el del mejor A.I.C. Como en el caso anterior el estudio de la normalidad no permitió trabajar con los datos salvo para representarlos y ver la evolución de cada línea en las distintas concentraciones de lindano. Del mismo modo para poder analizar los resultados se necesitó hacer un contraste no paramétrico para cada cepa. Se obtuvo una tabla descriptiva (tabla 19) y se hizo el estudio no paramétrico Mann-Whitney U para muestras independientes de las medianas, que se adjuntó a dicha tabla. 5.3.7 Estudio de los resultados de qPCR Del mismo modo se realiza análisis no paramétrico de Mann-Whitney U para muestras independientes para obtener la estadística con los datos resultantes de la qPCR, con ello se consiguió ver la significación entre unas líneas y otras frente la expresión del gen linA. Los resultados obtenidos tuvieron un intervalo de confianza del 95 %. 6 Fotografía Todas las imágenes de este trabajo (de las plantas y de las raíces) fueron realizadas con una cámara Olympus DP70 sobre soporte Karner RT1. La adquisición de imágenes se realizó con el software asociado DP Controller (2001-2004 Olympus Corporation) y con el sistema de iluminación directa HFB 5656 (Karner). 63 RESULTADOS 64 Resultados 65 1 Construcción de plantas que expresan el gen linA de la bacteria Sphingobium japonicum UT26S 1.1 Determinación de la concentración de lindano tóxica para A. thaliana Previamente a los experimentos para introducir el gen linA en A. thaliana, se determinó la concentración de lindano que debería ser empleada para probar las plantas transgénicas resultantes. Se buscó la concentración mínima de lindano que permitiese la germinación de la semilla, pero que, al mismo tiempo, impidiese el crecimiento de la planta silvestre (WT). Para ello, se sembraron semillas de A. thaliana ecotipo Col-0 en placas con medio MS suplementado con concentraciones crecientes de lindano entre 2,5 y 500 µg/ml (Fig. 9). Figura 9. Plantas WT sembradas en MS-agar con distintas concentraciones de lindano y cultivadas a 22°C durante 15 días en condiciones estándares de fotoperiodo. Resultados 66 Estos ensayos permitieron observar que tras 15 días de crecimiento las semillas habían germinado en todas las concentraciones, pero sólo se observaron hojas verdes y plantas desarrolladas en concentraciones menores de 10 µg/ml. A partir de la concentración de 15 µg/ml y concentraciones superiores las plantas presentaron un fenotipo alterado con una disminución de la elongación de su raíz principal tan acusada que las raíces secundarias no fueron capaces de desarrollarse y mostraban hojas pequeñas y cloróticas. Motivo por el cual en los experimentos posteriores a esta prueba se usó una concentración máxima de 10-15 μg/ml. 1.2 Transformación de A. thaliana con el gen linA El gen linA de Sphingobium japonicum UT26 codifica una enzima con actividad deshidroclorinasa que realiza el primer paso de la ruta degradativa del lindano. Esta enzima transforma el -HCH en 1,3,4,6-tetracloro-1,4-ciclohexadieno (1,4-TCDN), un compuesto inestable que sufre una deshidrocloración de forma espontánea produciendo 1,2,4-triclorobenceno (1,2,4-TCB) con tres cloros. Con el propósito de generar una planta resistente a lindano y capaz de degradarlo, se introdujo este gen en el genoma de la planta A. thaliana, mediante el método de infiltración por vacío. Para ello, se clonó el gen linA en el plásmido pCAMBIA3500 (Fig. 10 A). El plásmido pCAMBIA3500 tiene dos copias del promotor CaMV35S que permite la sobreexpresión en la planta del gen clonado. Además, con el propósito de facilitar la detección de la proteína LinA mediante western blot usando anticuerpos anti-histidina, se clonaron en pCAMBIA3500 otras dos versiones del mismo gen etiquetado con una secuencia que codifica seis histidinas en el extremo 5´ del gen (Fig. 10 C) o con la misma secuencia en el extremo 3´ del gen (Fig. 10 B). Los plásmidos generados se introdujeron en la bacteria Agrobacterium tumefaciens C58C1 Rifr. El método de transformación de plantas con Agrobacterium tiene varias ventajas a tener en cuenta, como la reducción del número de copias de los transgenes y la integración estable de los genes con mucha eficiencia (Jones et al, 2005). Figura 10. Diagrama de la región T-DNA de los distintos vectores usados en esta tesis. A: LIN.A, B: LIN.B, C: LIN.C. T-BL: T-border left; T-BR: T-border right; 35S: promotor CaMV 35S; 6-HIS: etiqueta de secuencia de 6 histidinas; polyA: secuencia de terminación de CaMV; fosfinotricina: gen de resistencia a herbicida de selección; linA: gen de S. japonicum. Resultados 67 Para seleccionar las plantas que hayan sido transformadas y en las que se haya integrado el gen linA silvestre y sus dos versiones etiquetadas, las semillas obtenidas a partir de las plantas infiltradas en vacío se sembraron en tierra, aproximadamente 2.000 semillas por construcción. Tras la salida de los primeros cotiledones y las primeras hojas, se pulverizaron las plántulas con una solución del herbicida Basta (fosfinotricina) y Tween 20 durante días alternos hasta que la diferencia entre las resistentes y no resistentes se hizo evidente. Sólo aquellas plantas en las que se hubiera insertado en el genoma el fragmento de DNA que porta el gen de resistencia a fosfinotricina (y además el gen linA) serían capaces de sobrevivir (tabla 14). Tabla 14. Eficiencia de transformación de A. thaliana Construcción Nº de semillas Nº plantas transformadas Eficiencia linA 2000 37 1,8% linA Nt-6xHis 2000 43 2,2% linA Ct-6xHis 2000 42 2,1% De las plantas resistentes a fosfinotricina se seleccionaron al azar 10 de cada construcción, generación T0, se cultivaron en macetas individuales y las semillas que produjeron por autofecundación se recogieron, obteniendo así la generación T1. Una vez obtenida dicha generación se sembraron 20 semillas de cada línea en medio MS suplementado con PPT 10 µg/ml con el objetivo de analizar la segregación de las distintas líneas (10 de cada construcción) y su genotipo, (tabla 15), y, en paralelo, se sembraron otras 20 semillas de cada línea en placas con medio sólido MS suplementado con lindano (10 µg/ml). De las líneas con el gen linA silvestre, cuatro tenían plantas lo suficientemente desarrolladas para ser trasplantadas, lo mismo ocurrió con la construcción etiquetada con la cola de histidina en el C-terminal (otras cuatro líneas fueron seleccionadas), mientras que sólo se pudo recuperar una plántula de una línea con la etiqueta de cola de histidina en el N terminal. Resultados 68 Tabla 15. Pruebas con las distintas líneas seleccionadas de la generación T1. Las líneas “A” se corresponden con ellas que han integrado el gen linA silvestre, las “B” con las del gen que codifica LinA Nt-His, la “C” con las del gen que codifica LinA Ct-His y la control es la planta WT sin transformar. Las plántulas que pudieron desarrollar cotiledones y crecer verdes después de 15 días de incubación (Fig. 11) en presencia de lindano, se trasplantaron a un medio MS sin lindano durante una semana, para su recuperación, después de lo cual fueron trasplantadas a tierra y se crecieron en condiciones controladas para obtener las semillas correspondientes a la generación T2 de plantas. Resultados 69 Figura 11. Selección de plántulas en MS con lindano. A: WT, B: plantas transformadas con el gen linA. Se comprobó posteriormente la segregación de la generación T2 de las plantas en medio suplementado con PPT igual que se había realizado con la generación anterior. Los resultados obtenidos mostraron líneas homocigotas con respuesta homogénea de crecimiento del 100 % en medio de selección con PPT. Por otro lado se sembraron las plantas de dicha generación en medio MS suplementado con lindano (10 µg/ml) para seleccionar de entre las líneas homocigotas aquellas que mostraban un fenotipo de resistencia al compuesto. Al final, se obtuvieron cuatro líneas de plantas que cumplían los dos requisitos expuestos anteriormente: dos líneas que contenía el gen linA silvestre (LIN-A5.1 y LIN-A1.5, aunque esta última era heterocigota para linA, al contar en ese momento con otras líneas de la otra construcción que no segregaban además de LIN-A5.1 se decidió no llevar a LIN-A1.5 hasta homocigosis para no retrasar la obtención de resultado) y otras dos con el gen que codificaba la proteína que etiquetaba LinA en Ct (LIN-C2.1 y LIN-C10.1). Además, estas líneas transgénicas crecían igual o ligeramente mejor que las plantas WT en medio MS sin lindano, por lo que la inserción del gen bacteriano linA no tenía un efecto deletéreo en la planta. Por otra parte, finalmente no se obtuvo ninguna línea de plantas resistentes a lindano en la generación T2 de la versión del gen que codificaba la proteína LinA Nt-His (que en la tabla se corresponden con la nomenclatura de línea “B”), es decir, con la etiqueta de cola de histidina en N-terminal. Esto podría estar indicando una interferencia de esta modificación en el correcto plegamiento/funcionamiento de la proteína, o de la presencia de alguna secuencia o péptido señalizador en N-terminal de la proteína que dirigía la localización de la misma a algún compartimento celular específico y que era procesado al sintetizarse la proteína. Resultados 70 1.3 Tolerancia a lindano de las plantas homocigotas de la generación T2 Para comprobar la tolerancia que el gen linA proporcionaba a las plantas, se sembraron semillas de la generación T2 de las líneas homocigotas seleccionadas LIN-A5.1, LIN-C2.1 y LIN-C10.1, usando como control la WT, directamente en placas de MS suplementadas con las distintas concentraciones de lindano que se habían probado previamente con el genotipo silvestre. A una concentración de 10 μg/ml las plantas silvestres estaban muy afectadas en su crecimiento, pero las plantas que contenían el gen linA eran aun resistentes al lindano. Las plantas transformadas no empezaron a mostrar un crecimiento afectado hasta la concentración de 15 μg/ml (Fig. 12). Figura 12. Crecimiento de plantas WT, LIN-A5.1, LIN-C2.1 y LIN-C10.1 en medio MS suplementado con distintas concentraciones de lindano y crecidas en las condiciones de fotocultivo estándar a 22°C durante 15 días. 1.4 Detección de la presencia del gen linA y de su expresión en las plantas transformadas 1.4.1 Presencia del gen linA en las plantas transformadas Con el objetivo de confirmar la presencia del gen linA en el genoma de las líneas transgénicas seleccionadas de la generación T2 se extrajo ADN cromosómico de las hojas de cada línea, así como de plantas WT y se usó como molde para amplificar mediante PCR el gen linA. Como Resultados 71 resultado, se consiguió amplificar el gen linA de S. japonicum a partir del ADN cromosómico de todas las líneas transgénicas seleccionadas, pero no a partir del de las plantas WT (Fig. 13). Por tanto, se corroboró la presencia del gen linA en el genoma de las plantas transformadas. Figura 13. Electroforesis en gel de agarosa (0.8 % de concentración de agar) de los productos resultantes de la amplificación mediante PCR del gen linA (empleando los cebadores LINA_BAM_Forward y LINA_BAM_Reverse) en muestras de ADN extraídas de plantas WT y modificadas con linA. 1: Marcador de peso molecular III (DNA del fago lambda cortado con las enzimas EcoRI y HindIII, Roche), 2: control negativo, muestra que contiene todos los tampones de la reacción y agua en substitución del ADN cromosomal, 3: Plantas WT, 4: Plantas LIN-A5.1, 5: Plantas LIN- C2.1, 6: Plantas LIN-C10.1. La banda que aparece tiene un tamaño aproximado a 500 pares de bases, lo que coincide con el tamaño esperado del fragmento de ADN que contiene el gen linA (498 pb). 1.4.2 Estudio de la expresión del gen linA en las plantas transformadas mediante RT-PCR Para comprobar si el gen linA introducido en el genoma de las plantas se estaba transcribiendo, se hizo un análisis de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa). Para ello, se extrajo ARN total por separado de las raíces y de la parte aérea de plantas transformadas y WT crecidas en medio MS suplementado con una concentración de lindano de 5 µg/ml que permitiese también el desarrollo de las plantas WT. Se eliminó el ADN y mediante la enzima transcriptasa inversa el ARN se retrotranscribió a ADN complementario y se usó como molde para amplificar mediante PCR el gen linA con los cebadores específicos del gen entero que permiten identificar también las dos variantes del gen etiquetado con colas de histidina. Al analizar las muestras resultantes de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa (Fig. 14) se observó la presencia de una banda única de DNA con el tamaño esperado de amplificación del gen linA en las líneas LIN-A5.1, LIN-C2.1 y LIN-C10.1, tanto en las muestras de raíces como Resultados 72 en las de las partes aéreas. No se observó la presencia de esta banda de ADN en las muestras procedentes de la planta WT. Por tanto, se concluye que las plantas transformadas con el gen linA son capaces de expresar el gen tanto en la parte aérea como en la raíz. Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa (1 % concentración de agar) de los productos resultantes de la amplificación mediante RT-PCR del gen linA (empleando los cebadores LINA_for y LINA_rev) a partir de muestras de ARN total extraídas de plantas transformadas y WT. Las muestras de cada carril son las siguientes: M, marcador de peso molecular HyperLadder 1Kb (Bioline), y a continuación las muestras de RT-PCR de la parte aérea y de las raíces de plantas WT y transformadas con linA: A5.1, C2.1 y C10.1, y C, el control negativo, realizado con todos los tampones de la reacción y agua en substitución del cDNA. En el lado derecho de la figura se indica la posición de un único producto de PCR, que sólo aparece en las muestras de las plantas transformadas (LIN-A5.1, LIN-C2.1 y LIN-C10.1), pero no en los controles (C y WT) y que tiene un tamaño aproximado de 500 pares de bases, lo que coincide con el tamaño esperado del fragmento de ADN amplificado que contiene el gen linA. Se intentó detectar mediante western la presencia de las proteínas LinA y LinA con la etiqueta de cola de histidinas en extremo Ct con anticuerpos anti-LinA y anti-His pero no se observaron (resultados no mostrados). También se intentó detectar la proteína y su ubicación mediante técnicas inmunocitoquímicas, por el método de inmunofluorescencia in toto (en las raíces) y observación con microscopía de fluorescencia (resultados no mostrados). Resultados 73 1.4.3 Estudio cuantitativo de la expresión del gen linA en las plantas transformadas mediante PCR a tiempo real (qPCR) Para cuantificar la variación de la expresión del gen linA en las distintas líneas transgénicas construidas, se realizó un análisis de PCR a tiempo real o cuantitativa (en inglés qPCR) usando como control de expresión cebadores que amplifican la secuencia génica que codifica el factor de elongación 1α (EF-1α). Este gen se considera constitutivo (housekeeping o gen de referencia), es decir, un gen que se mantenía invariable frente a distintas condiciones, y por lo tanto, se podía usar como control interno de expresión génica para normalizar los resultados obtenidos para el gen linA. Al representar sus niveles de expresión relativa se observó que, a pesar de que todas presentan unos valores de CT similares, había una mayor expresión de linA en las plantas en las que se había introducido el gen linA silvestre (LIN-A5.1) en comparación con las que portaban etiquetas de cola de histidinas en el extremo Ct del gen (LIN-C2.1 y LIN-C10.1) (Fig. 15). La tendencia se reproducía al comparar cualquiera de las construcciones con la planta WT donde no se apreciaba inducción. Los valores de inducción de la expresión de gen linA obtenidos de la qPCR comparando los recogidos de las plantas transformadas con los de la WT, siendo esta 1, aparecían en la tabla 16. Los resultados del análisis no necesitaban prueba estadística extra ya que al representarse frente a la WT, donde no se apreciaba inducción, cualquier valor resultaba significativo, no obstante con los valores obtenidos en la qPCR se hizo la prueba no paramétrica de Mann-Whitney (o prueba Wilcoxon para muestras independientes) y su resultado se reflejó en el gráfico de la figura 15, donde cada línea fue comparada con la línea control dando en los tres casos valores de P muy por debajo de 0,05. Esto se tradujo estadísticamente en que la diferencia entre cada línea trasformada y la control era muy significativa lo que conllevaba el rechazo de la hipótesis nula (donde la inducción del gen de estudio en ambas líneas era igual) con un intervalo de confianza del 95,0 %. Resultados 74 Figura 15. Niveles de expresión relativa del gen linA en las plantas transformadas mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Las columnas muestran los niveles de expresión de cada planta transformada frente a la expresión de la planta WT. Se empleó ARN total aislado de la parte aérea de plantas crecidas durante 15 días en medio sólido en presencia de lindano. Se probaron dos diluciones seriadas de 1/10 de cada muestra de ARN en cada experimento. Todo el proceso se repitió dos veces (dos réplicas biológicas). *** (P<0,001) significación de los valores recogidos de CT al hacer prueba no paramétrica Mann-Whitney para cada línea respecto a la control. Tabla 16. Valores de inducción de la expresión del gen linA en las plantas transformadas respecto a las plantas control (WT). PCR cuantitativa en tiempo real. 1.5 Análisis fenotípico de las plantas transformadas con el gen linA 1.5.1 Fenotipo de la parte aérea: cuantificación del tamaño de la roseta Con el fin de analizar en profundidad el fenotipo de la parte aérea de las distintas construcciones, se usaron los valores del área de la roseta de las distintas plantas transgénicas correspondientes a las distintas construcciones en medios suplementados con distintas concentraciones de lindano (Fig. 11). Se realizó un estudio estadístico de estos valores para poder extraer conclusiones. En el primer paso, en el estudio de normalidad de los datos de “línea” y “tratamiento” se consigue la “cuasi-normalidad” corrigiendo con logaritmo en base 10. línea Inducción Desviación estándar wt 1 0,09 LIN-A5.1 13.194,7 1.211,46 LIN-C2.1 4.729,3 826,71 LIN-C10.1 3.088,0 852,45 Resultados 75 Al contar con los parámetros fijos de “línea” y “tratamiento” y además con el factor aleatorio “réplica” (que se corresponde con el día en el que se hicieron y la placa a la que corresponden), lo más correcto era analizarlo mediante un modelo lineal mixto (MIXED) donde se analizó la interacción de todos ellos. Para evitar la variación producida en los valores de la roseta obtenidos debidas al día en que se recogieron (“réplica”) se aplicó el factor aleatorio como factor de corrección, pero se comprobó que una parte de su interacción no se podía evitar ya que las estimaciones de la covarianza daban valores de significación (Sig.) por debajo de 0,05, y por lo tanto eran muy significativas (tabla anexo 1). Para visualizar las varianzas de los distintos grupos y cómo se comportaban en las distintas réplicas en conjunto se representaron los valores obtenidos en un diagrama de cajas (Fig. 16). Figura 16: Gráfico de diagrama de cajas (box plot) que refleja la diferencia del tamaño de la roseta en respuesta a lindano. Parámetros fijos “tratamiento” unido a “línea”. Representación del análisis estadístico mediante modelo lineal mixto de área de las rosetas de todas las líneas de plantas modificadas seleccionadas y de las plantas WT sembradas en medio MS suplementado con distintas concentraciones de lindano. o: casos extremos, admisibles. *: valores atípicos (outliers) muy improbables. Los números que los acompañan corresponden a la placa en la que aparecen. Resultados 76 Se observó que en general las cajas eran de pequeño tamaño, lo que mostraba la reducción de las varianzas de los errores de los diferentes grupos, las cajas sólo aumentaban su tamaño mucho en las plantas WT a 5 µg/ml, y en LIN-C2.1 y LIN-C10.1 en la máxima concentración aumentando por tanto sus varianzas de errores para los 3 grupos. De cualquier manera, se observó que las cajas tenían tamaño semejante en cada caso lo que evidenciaba que los tratamientos eran comparables entre sí. La comprobación de lo observado se realizó con test de homogeneidad de varianzas de Levene’s, donde los tratamientos con lindano de 0; 2,5; 10 y 12,5 µg/ml salieron homogéneos y los restantes (que se correspondían con 5 y 15 µg/ml de lindano) no homogéneos. Al seguir la evolución de cada línea se vio que todas las plantas transformadas seguían una tendencia similar, mientras que las WT se comportaban de forma muy diferente al resto de ellas. Para estudiar cómo afectaban los factores fijos (“tratamiento” y “línea”) al resultado final y como se comportaban en el tiempo se realizó una prueba de efectos fijos cuyos resultados aparecían en la tabla 17. Tabla 17. Tabla de efectos fijos lll. (siendo gl=grados de libertad, F=test F y Sig. =Significación donde los valores de p<0,05 se suponen significativos) Pruebas de efectos fijos de tipo IIIa Origen gl de numerador gl de denominador F Sig. Intersección 1 18,993 16879,247 0,000 línea 3 18,987 27,004 0,000 tratamiento 5 727,861 165,129 0,000 línea * tratamiento 15 727,594 22,036 0,000 Se esperaba que los efectos debidos al tratamiento y los propios de cada línea afectaran al resultado final, por tanto, debían ser significativos. Y eso fue lo obtenido, los tres efectos fijos eran significativos (principales e interacción) con una P (<0.05) en Sig. Por tanto, las variaciones en el área foliar, medida en su logaritmo, estaban afectadas tanto por la línea como sobre todo por el tratamiento y también por la interacción de este con la línea según se observaba en el valor del test F (ya que tenía un valor mayor, teniendo en cuenta que la significación de todas era igual). A priori no se sabía si ambas variables afectaban de la misma manera, y esto se respondió con la observación de la interacción entre ellos, donde se pudo inferir que el área de las rosetas de las distintas líneas seguía una progresión diferente con el aumento del Resultados 77 tratamiento (evolucionando cada una de forma diferente con los distintos tratamientos). Con esto se podía afirmar que pese a que el factor aleatorio “réplica” daba significativo (p<0.05) (tabla 1 anexo) no invalidaba la significancia de los fijos (tabla 17). El resultado, por tanto, de hacer la estimación de los efectos fijos (línea y tratamiento) con la variable dependiente larea (área foliar corregida con logaritmo en base 10 para conseguir mejor distribución de normalidad) hizo que se rechazara la hipótesis de igualdad de varianzas y se infiriera que presentaban diferencias significativas entre ellos, tanto el tratamiento como la línea afectaban de manera muy significativa al tamaño del área de la roseta. En la figura 17 se mostraban en detalle las hojas de las rosetas, aunque, en las plantas WT a partir de la concentración 10 μg/ml ya no eran hojas como tal, sino que sólo se desarrollaban los cotiledones. Figura 17. Detalle de las hojas de las rosetas de cada línea de plantas en cada concentración de lindano probada. Como todos los valores F salieron significativos se realizaron estudios a posteriori (post hoc). Se hizo una comparación por parejas de cada tratamiento (cada concentración) del medio para todas las líneas ajustado por Bonferroni para las que tenían homogeneidad de varianza y por Tamhane los que no la tenían, se comprobó numéricamente la información extraída de la gráfica. En ausencia de lindano la planta WT presentaba diferencias significativas sólo con la construcción LIN-A5.1 que crecía un poco mejor que las demás y el resto de las construcciones Resultados 78 respondían de forma similar al control. En presencia de 2,5 μg/ml de lindano sólo aparecían diferencias muy significativas entre la planta WT y el resto de las construcciones, que entre sí se comportaban de manera similar. Esto ocurría también en presencia de 5 μg/ml y 10 μg/ml de lindano, en este último las diferencias en fenotipo eran muy evidentes, ya que por ejemplo el WT presenta síntomas de clorosis (Fig. 11) y en muchos casos le costaba desarrollar hojas verdes tras los cotiledones. Sin embargo, el fenotipo del resto de construcciones se presentaba similar al obtenido en la placa control sin lindano. En el tratamiento con 12,5 μg/ml de lindano las diferencias eran significativas no sólo con el control WT sino con la construcción LIN-C2.1, mientras que LIN-A5.1 y LIN-C10.1 se comportaban igual entre ellas (ambas, en general, presentaban menos clorosis que la LIN-C2.1). En el tratamiento con 15 μg/ml de lindano todas las comparaciones entre las distintas líneas entre sí y con la planta control presentaron diferencias significativas reflejando lo que se apreciaba en la gráfica (Fig. 16). En esta última concentración se observaba un crecimiento más consistente y mejor en LIN-A5.1 pero en todas se observaba cierta clorosis. El control presentaba una coloración típica de acumulación de antocianinas (tonos marrones) a partir de la concentración de 12,5 µg/ml, y sólo era capaz de producir los cotiledones, en ningún caso hojas verdaderas. Haciendo un test de Bonferroni y comparando esta vez cada línea con las distintas concentraciones de forma independiente para cada línea se observaba que en la planta LIN-A5.1 los tratamientos no presentaban diferencias significativas entre ellos hasta 10 µg/ml, y ocurría lo mismo en la planta LIN-C2.1 y en la planta LIN-C10.1, las diferencias significativas en WT se encontraron a partir de la concentración de lindano de 5 μg/ml (tabla 2 anexo). 1.5.2 Morfología y crecimiento de las raíces en presencia de lindano Con el objetivo de analizar la respuesta de las plantas que expresaban el gen linA, en comparación con las WT, a las distintas concentraciones de lindano a las que se expusieron, se analizaron los posibles cambios registrados en la raíz (Doerner et al, 1996). Se evaluaron diversos parámetros tales como la densidad radicular, el área radicular y la tasa de crecimiento de las raíces. 1.5.2.1 Estudio de la densidad radicular La arquitectura del sistema radicular cuenta como factor principal la formación de raíces laterales y su crecimiento (Nibau et al., 2008). El desarrollo de las raíces laterales proporciona un modelo sencillo para estudiar el efecto de los factores abióticos y bióticos exógenos. Las raíces laterales son aquellas que se originan a partir de cualquier otra raíz, ya sea una raíz seminal o principal y, constituyen el sistema radicular. Resultados 79 Para reforzar el estudio de la respuesta de las plantas transformadas con el gen linA a las concentraciones de lindano seleccionadas, se obtuvieron los valores de densidad de las raíces, para ello se realizó la medición de la raíz principal en todos los experimentos y, paralelamente, se contabilizó el número de raíces laterales. Ambos valores se obtuvieron en las concentraciones de lindano seleccionadas de 5 y 10 µg/ml. Y sólo en esta ocasión se seleccionaron para hacer las pruebas, además de las plantas WT, las plantas que contenían el gen silvestre (LIN-A5.1) y no las otras dos (LIN-C2.1 y LIN-C10.1), ya que, a tenor de los resultados en el área de la roseta, se supuso que los resultados de las distintas construcciones sería el mismo. Como control positivo se usaron placas sin lindano de forma independiente para LIN-A5.1 y WT. El valor de la densidad radicular se obtuvo dividiendo el número de raíces laterales entre la longitud de la raíz principal. Se observó que en ausencia de lindano, la densidad de raíces laterales era similar entre las plantas WT y LIN-A5.1 (Fig. 18). Sin embargo, la diferencia entre ambos grupos de plantas se ampliaba cuando la concentración del pesticida era de 5 µg/ml y era aún mayor a 10 µg/ml, donde las plantas WT no eran capaces de formar raíces laterales. Por otra parte, en las plantas LIN-A5.1 los valores de densidad de raíces laterales entre lindano 5 y 10 µg/ml no eran muy diferentes. Para estudiar el resultado global, se intentó analizar mediante un modelo similar al utilizado con el área de las rosetas (modelo mixto) con los valores obtenidos, pero había problemas para conseguir la normalidad, ya que la planta transformada sí se podía ajustar a esta distribución mientras que la silvestre, al tener valores 0 (debidos a que en la concentración máxima de lindano no se observaban raíces laterales), no lo conseguía y su histograma estaba muy concentrado en pocas barras del mismo tamaño. Forzando el modelo, sin embargo, obtuvimos una gráfica en la que podemos observar la progresión de las plantas LIN-A5.1 frente a las WT al aumentar la concentración de lindano en las placas de crecimiento (Fig. 18). Esta gráfica, coincidía con el fenotipo obtenido y nos permitió de algún modo comparar los resultados obtenidos con el área de la roseta, cualquier otro análisis paramétrico como t-student o ANOVA hubieran sido inadecuados al descartar su normalidad. Se pudo concluir que los días en los que se hizo cada réplica (“réplica”) no afectaban al resultado final, mientras que la interacción entre la cepa y la concentración sí lo hacían, al igual que ambas de forma independiente. Según lo observado en la figura 18, se infería que las plantas WT y las LIN-A5.1 se comportaban de forma muy diferente, la densidad radicular de las plantas WT llegaba a un valor de 0 a una concentración de lindano de 10 μg/ml, desapareciendo de la gráfica al no producir raíces Resultados 80 secundarias, en el caso de la planta transformada esto no ocurría ya que en ambas concentraciones de lindano la respuesta era muy similar. Dada la mala distribución de los datos, lo más correcto en este caso era hacer un contraste no paramétrico para cada cepa por separado y medir la mediana. Los resultados obtenidos con este análisis aparecen en la tabla 18. Se incluyeron los valores de la prueba no paramétrica para muestras independientes Mann-Whitney U en la que se compararon las medias de las dos líneas para cada punto en la tabla en el apartado de “sig.”, se podía ver la significación de la comparación de las medias obtenidas para cada línea enfrentadas en cada punto de concentración de lindano (dando por significativos aquellos valores de P< 0,05) por lo que, a partir de la concentración de lindano de 5 µg/ml la hipótesis nula se desecharía (ambas cepas no se comportan igual), lo mismo ocurría en la concentración de 10 µg/ml pero la diferencia entre ambas líneas era aún mayor. Por lo tanto, sólo se mantenía la hipótesis nula de igualdad de líneas en el punto en que no se habían implementado las placas con lindano (control positivo), sólo en “condiciones normales” (sin estrés) las dos líneas se comportaban de manera similar. Figura 18. Gráfico de diagrama de cajas (box plot) de la densidad radicular en las distintas concentraciones de lindano. Parámetros fijos “tratamiento” unido a “línea”. Representación del análisis estadístico mediante modelo lineal mixto de densidad radicular (nº raíces/longitud) de la línea de plantas modificadas LIN-A5.1 (azul) y de las plantas WT (rojo) sembradas en medio MS suplementado con distintas concentraciones de lindano. o: casos extremos, admisibles, el número que lo acompaña se corresponde con la placa en la que aparecen. Tabla 18: tabla de estadístico descriptivo de los valores de densidad radicular. En significación (sig.) se introdujeron los datos obtenidos en la prueba no paramétrica para muestras independientes Mann-Whitney U en la que se Resultados 81 compararon las medias de las dos líneas para cada punto, se considera significativo todo valor (p<0,05). P<0,05 se corresponde con *, p<0,001 con**, p<0,0001 con*** 1.5.2.2 Estudio del área radicular Este estudio permitía analizar el valor real que podía tener una planta para usarse en fitorremediación, ya que las plantas darían mejores resultados cuánto mayor área fueran capaces de alcanzar con sus raíces ya que esto les permitiría descontaminar zonas más amplias. A pesar de que A. thaliana era sólo una planta modelo y no una planta apropiada para utilizar en fitorremediación, analizamos los resultados de su área radicular para ver si las plantas modificadas tenían afectada esta característica en presencia y ausencia de lindano. Se intentaron analizar los valores con un modelo mixto, e igual que en el caso anterior la planta WT tenía una mala distribución que le impedía asemejarse a una normal. Forzando el modelo, como en el caso anterior, se obtuvo una gráfica que resumía su comportamiento incluyendo todas las réplicas y las repeticiones obtenidas (Fig. 19) A5.1 wt nºraíces/longitud nºraíces/longitud sig. (*) N Válido 14 11 Media 0,236 0,205 Mediana 0,215 0,277 0,727 Deviación estándar 0,168 0,118 N Válido 19 18 Media 0,346 0,218 Mediana 0,303 0,177 0,024 * Deviación estándar 0,202 0,270 N Válido 13 12 Media 0,324 0,000 Mediana 0,285 0,000 0,000 *** Deviación estándar 0,222 0,000 línea tratamiento 1 2 3 Resultados 82 Figura 19. Gráfico de diagrama de caja (box plot) del área que ocupan las raíces en medio con distintas concentraciones de lindano. Parámetros fijos “tratamiento” unido a “línea”. Representación del análisis estadístico mediante modelo lineal mixto de área radicular de la línea de plantas modificada LIN-A5.1 (azul) y de las plantas WT (rojo) sembradas en medio MS suplementado con distintas concentraciones de lindano. o: casos extremos, admisibles, acompañados por el número correspondiente con la placa en la que aparecen. Como en el caso anterior al no seguir una distribución normal (aunque los datos estaban más centrados en el histograma), lo correcto fue analizar los resultados obtenidos mediante un análisis no-paramétrico, otra vez se usó el test de muestras independientes Mann-Whitney U, los resultados se unieron a los de la tabla descriptiva obtenida (tabla 19) donde una vez más sólo se pudo aceptar la hipótesis nula de variables iguales en el caso del control positivo, siendo significativa la diferencia entre medianas en las dos concentraciones de lindano usadas, lo que significaba que en ambos casos las plantas WT y LIN-A5.1 no seguían la hipótesis nula y diferían en el área que eran capaces de ocupar para una misma concentración de lindano utilizada. Resultados 83 Tabla 19. Tabla de estadístico descriptivo de los valores del área radicular. En significación “sig.” se incluyeron los datos obtenidos en la prueba no paramétrica para muestras independientes Mann-Whitney U en la que se compararon las medias de las dos líneas para cada punto. Se supone significativo para P<0,05. P<0,05 se corresponde con *, p<0,001 con**, p<0,0001 con*** Por lo observado en los resultados de las plantas utilizadas para la cinética, podríamos decir que estas diferencias en el área se potenciaban mucho cuando las plantas se sembraban en medio contaminado tras haber germinado en medio sin contaminar ya que eran capaces de desarrollar mucho más tanto sus raíces laterales como las principales, independientemente del día en que realizó el experimento. 1.5.2.3 Tasa de crecimiento de las raíces Con el fin de medir el crecimiento de las raíces de las plantas en función del tiempo se utilizó un método que incorporaba un paso previo en el que las semillas se sembraban en placas con MS sin suplemento alguno y 0,6 % agar y se dejaban crecer en horizontal durante una semana en condiciones de fitocultivo controladas, tras esto, las plántulas se trasplantaban a un medio con lindano donde se cultivaban en posición vertical con las mismas condiciones de fotoperiodo y temperatura de la semana anterior. Las plantas LIN-A5.1 sometidas a este tratamiento previo fueron capaces de resistir mejor al incremento de concentración de lindano (Fig. 20 A) mostrando un crecimiento mayor de la parte aérea y unas raíces mucho más desarrolladas que las de las plantas WT que sí fueron capaces de mejorar su respuesta al pesticida en la concentración intermedia de 5 µg/ml, pero no en la siguiente de 10 μg/ml donde su desarrollo se detuvo poco después de germinar. A5.1 wt area area sig. (*) N Válido 15 13 Media 562 375 Mediana 471 381 0,108 Deviación estándar 324 201 N Válido 14 15 Media 438 280 Mediana 542 345 0,046 * Deviación estándar 226 156 N Válido 13 12 Media 173 68 Mediana 181 60 0,000 *** Deviación estándar 77 42 línea tratamiento 1 2 3 Resultados 84 Figura 20. Resultados de crecimiento en vertical de plantas sembradas tras 7 días de crecimiento en horizontal en placas con MS A: Crecimiento vertical de plantas WT y LIN-A5.1 en medio MS 0.8 % suplementado o no con distintas concentraciones de lindano (5 μg/ml y 10 μg/ml). Plántulas crecidas durante una semana en placas horizontales con medio MS sin lindano se trasplantaron en las placas de crecimiento vertical y se incubaron durante otra semana. B: Comparación de la cinética de crecimiento de las raíces entre las plantas WT y LIN-A5.1 (n=16). Medidas realizadas cada 24-48 h durante una semana. Las semillas se crecieron durante una semana en placas con MS 0,6 % agar sin lindano en condiciones de día largo estándares y después se trasplantaron a medio MS con 0,8 % agar suplementado o no con lindano para crecerlas durante otra semana en vertical con las mismas condiciones de fitocultivo. El valor inicial de cada una corresponde con la medida de la raíz en el momento de ser trasplantada al medio con o sin lindano. a: placas de MS sin lindano, b: placas de MS suplementadas con 5 µg/ml, c: placas de MS suplementadas con 10 µg/ml Se tomaron medidas de las raíces durante una semana cada 24-48 horas a partir del tiempo 0 establecido al trasplantar las plántulas a las placas para crecimiento vertical. Se compararon entonces los resultados de las plantas WT y LIN-A5.1 crecidas en medio contaminado y sin contaminar, obteniendo los resultados que aparecen la figura 20 B. En la concentración de 5 µg/ml ambas líneas presentaban gran variabilidad en la velocidad de crecimiento debida a que algunas raíces eran capaces de crecer mucho más que otras dentro de cada construcción. Esto producía unas desviaciones elevadas en la representación que conllevaba que las diferencias no fueran significativas entre ambos grupos a pesar de que el fenotipo fuera diferente por el alto grado de raíces secundarias de las plantas LIN-A5.1 que no presentaban las WT. Las desviaciones Resultados 85 encontradas en 10 µg/ml de lindano son mucho menores, el resultado era más constante y consistente, sobre todo debido a que las plantas WT no reflejaban casi ningún crecimiento y en LIN-A5.1 las variaciones eran también más discretas aunque el crecimiento era mucho mayor en comparación. En la placa sin lindano se observaba también gran variabilidad, es posible que sea debida a la variación natural que genera distintos genotipos (quizá por ello sea mayor en la planta WT que en la línea transformada que ha sufrido dos selecciones antes), unida a los distintos patrones de desarrollo o fenotipos que se observarían igual en ambos. En cualquier caso, los resultados obtenidos apuntaban a que la introducción del gen linA en la planta favorecía la velocidad de crecimiento y la longitud final de las raíces en presencia de lindano (Fig. 20 B). 2 Eliminación y degradación de lindano mediada por las plantas modificadas que expresan el gen linA 2.1 Eliminación de lindano del medio por las plantas modificadas Para determinar la capacidad de las plantas modificadas de eliminar lindano se cultivaron plantas desde semillas en medio MS-agar suplementado con lindano 5 µg/ml en condiciones estándar de día largo y la concentración de lindano en el medio después de cuatro semanas se cuantificó mediante cromatografía de gases (las plantas se retiraron del medio antes del análisis). Este experimento se realizó con lindano comercial con lo que además de γ-HCH encontramos trazas de los otros isómeros que quedaban tras la purificación del HCH técnico que contenía todos los isómeros del compuesto. Se demostró que las plantas modificadas eliminaban un porcentaje muy elevado de lindano del medio, superior al 90 % después de ser cultivadas durante cuatro semanas (tabla 20). Para este experimento se pusieron dos controles uno de medio solo (sin plantas) y el otro con las plantas WT (en el que el desarrollo de las plantas era muy limitado, similar al encontrado en los demás experimentos). Resultados 86 Tabla 20. Resultados de la cantidad de lindano en medio MS (obtenidos por cromatografía de gases) en el que se cultivaron plantas desde semillas de plantas WT y modificadas durante 4 semanas con fotoperiodo controlado a 22°C y que inicialmente estaba suplementado con HCH técnico 5 µg/ml inicial. Se muestran valores medios de dos experimentos independientes. Los valores de HCH están en mg/kg (mg/l, considerando la densidad=1). Con los resultados de cantidad de pesticida obtenidos se procedió al estudio estadístico mediante la realización de una ANOVA one-way para establecer si había diferencias significativas entre las medias de las distintas líneas (incluida la WT) de forma independiente y la placa control de medio MS con lindano en la que no se habían sembrado semillas de ninguna línea (Fig. 21). Se analizaron los resultados de todos los isómeros juntos (Fig. 21 A) y de lindano (Fig. 21 B) por separado. Se observó que las diferencias eran altamente significativas para todas las líneas transformadas que eran capaces de reducir la cantidad de lindano o de HCH total en el medio, mientras que en el caso de las plantas WT las diferencias no eran significativas para ninguno de ellos. Por tanto, sólo las plantas transformadas eran capaces de eliminar el lindano (y alguno de los otros isómeros de HCH) obteniendo unas cantidades significativamente diferentes a la placa control donde no se habían sembrado semillas (e incluso a WT). Muestras α-HCH β-HCH -HCH (lindano) δ-HCH ε-HCH Total (HCH) SD (%) HCH eliminado Control sin plantas 0,016 <0,01 3,187 0,027 <0,01 3,23 0,349 <0 WT 0,025 <0,01 2,91 0,028 <0,01 2,963 0,168 <0 LIN-A5.1 0,167 0,053 0,038 <0,01 <0,01 0,258 0,059 92,01 LIN-C2.1 0,151 0,021 0,044 <0,01 <0,01 0,216 0,061 93,3 LIN-C10.1 0,17 0,061 0,041 <0,01 <0,01 0,272 0,072 91,57 Resultados 87 Figura 21. ANOVA one-way de los valores obtenidos de pesticida en las placas contaminadas con HCH tras dos semanas de crecimiento de las distintas líneas de plantas modificadas y WT. Comparación de cada línea con la placa control donde no se crecieron plantas. A: valores totales de HCH (todos los isómeros medidos) y B: Valores sólo de - HCH. *P<0,05, **P<0,001, ***P<0,0001 y ****p<0,00001 Este experimento también se llevó a cabo con tierra contaminada en el laboratorio con el pesticida en las que se sembraron 20 semillas. En el análisis posterior la variabilidad de resultados fue mucho mayor que en las muestras de agar y los errores hicieron imposible llegar a una conclusión fiable. Tampoco se consiguieron resultados coherentes con este método tras el análisis de los extractos de los tejidos de plantas extraídos de medios contaminados. Por otra parte, se realizaron pruebas para medir el triclorobenceno (TCB) que se liberaba por la degradación del lindano, pero fueron desestimadas ya que este compuesto no se detectó en ninguna de las muestras de agar analizadas, quizá porque en las cuatro semanas, debido a su alta volatilidad, el TCB liberado se había disipado. 2.2 Identificación de los productos de degradación de lindano en los tejidos de las plantas modificadas, en el medio y en la fase gaseosa Con el propósito de estudiar si las plantas que expresan linA eran capaces de degradar lindano, se procedió a identificar los diferentes productos de degradación mediante la técnica de microextracción en fase sólida de alta eficacia (HP-SPME) combinada con cromatografía de gases masas (GC/MS). Para ello, se crecieron plantas WT, LIN-A5.1 y LIN-C2.1 en MS-agar con lindano 5 µg/ml en tubos cerrados, durante 7 días en condiciones controladas de día largo y 22°C, a partir de estos cultivos se analizaron muestras de los tejidos de las plantas, del sustrato (MS- agar con lindano) y de la fase gaseosa. Resultados 88 La extracción de los compuestos en los tejidos de las plantas WT, LIN-A5.1 y LIN-C2.1 se realizó separando la parte aérea de las plantas, se trituraron tras ser congeladas y se metieron en viales de vidrio donde se realizó una primera etapa de extracción de los analitos mediante adsorción con fibra con recubrimiento bipolar Carboxen-polidimetilsiloxano (CAR/PDMS) (para SPME) seguida de una desorción de los mismos mediante temperatura (en equipo asociado GC-MS) para medir los volátiles emitidos recogidos en la fibra. Como el calentamiento de las plantas presentaba la desventaja de que el tejido de la planta emitía gran cantidad de volátiles, sobre todo aldehídos como hexadecanal y otros con alta afinidad por la fibra de extracción, al final se midieron los volátiles emitidos por los extractos sin calentar. Los resultados aparecen en la figura 22. La planta WT se observó un gran pico de lindano y otro mucho más pequeño que eluyó a los 16 minutos lo que se corresponde con C6H6Cl5 (-PCCH) en muy poca cantidad. La gráfica resultante no presentaba casi ruido de fondo debido a la gran cantidad de lindano presente, por tanto, no se puede afirmar que no haya algún derivado más que pueda provenir de las plantas ya que aparecen en los otros fragmentogramas y podrían estar enmascarados, pero, de haberlos, su cantidad sería bastante despreciable. De hecho, la intensidad del pico de lindano en las plantas WT nos permitió representarlo en 105, que era un orden de magnitud mayor que el observado en los dos fragmentogramas de las plantas que expresaban linA (por tener mucha menor cantidad). Como la abundancia relativa en las distintas muestras representadas no era la misma, la altura de los picos en las gráficas de la figura 22 no se podía comparar. A pesar de todo sí se apreciaba que el pico de lindano era mayor en las plantas WT (de hecho esta gran cantidad era lo que fuerza el cambio de medida) que en las plantas transgénicas, siendo mayor la diferencia en las plantas LIN-C2.1. En esta construcción no se apreciaba casi lindano ya que seguramente se había degradado casi en su totalidad. En las plantas transformadas se podían apreciar otros productos de degradación como eran el C6H6Cl2 (1,4-DCB) y el C6H6Cl3 (1,2,4-TCB), este último era tan débil que podría deberse a una cuestión de cinética enzimática, o quizá se había perdido por su elevada volatilidad (también esto podría explicar la poca cantidad de 1,4-DCB). Además, se encontraba un pico en el tiempo de elución del C6H6Cl5 (-PCCH), mucho mayor en LIN-A5.1 que en LIN-C2.1. Este compuesto era el primero que aparecía en la ruta de degradación de lindano, ya que la enzima LinA eliminaba el primer cloro de la molécula, y esta primera escisión iba acompañada de otras produciendo el resto de productos de degradación observados en la gráfica. A partir de los datos obtenidos podíamos decir que las plantas transformadas estaban degradando el lindano por la menor abundancia relativa que se registraba de este compuesto en los tejidos de las plantas y por los productos de degradación que aparecían. En las plantas Resultados 89 LIN-C2.1 se habría reducido aún mucho más el lindano en los tejidos, pareciendo más eficiente que las plantas LIN-A5.1. Por otra parte, la baja intensidad del resto de picos hacía muy evidente el pico que aparece a los 14 minutos en las plantas LIN-C2.1, que se correspondía con contaminación de plástico (m-diterbutil-fenol), que no se había observado en el fragmentograma de la planta LIN-A5.1. En los gráficos obtenidos con el análisis de los compuestos volátiles en la fase gaseosa (Fig. 23), tras analizar el filtro SPME introducido durante 2 h a temperatura ambiente en un tubo cerrado donde previamente se cultivaron las plantas a analizar. En este caso la escala de intensidad era la misma para las tres muestras por lo que eran comparables. Se observó en la planta silvestre un pico correspondiente al lindano y otro que se correspondía con m-diterbutil-fenol, un compuesto proveniente del plástico del tubo, que en este experimento apareció en las fases gaseosas de todas las plantas probadas. En las plantas transformadas, por el contrario, no se encontraron casi trazas del pesticida, pero sí de los productos de degradación del mismo, un pico intermedio de C6H6Cl5 (1,2,3,3,4-PCCH; -PCCH) (menor en LIN-A5.1) y uno mayor correspondiente al tiempo de retención de C6H6Cl2 (1,4-DCB), que era algo mayor en LIN-A5.1. La cantidad del C6H6Cl3 (1,2,4-TCB) era muy pequeña como en los otros casos. Por último, también se analizó el medio MS-agar con lindano en el que se cultivaron las plantas WT y modificadas (Fig. 24). El medio fue precalentado para que emitiera los volátiles, lo que conlleva el inconveniente del pico de derivado fenólico (m-diterbutil-fenol) que procedía del plástico del tubo que los contenía y que estaba presente en las tres muestras. Todas las gráficas presentan la misma escala de intensidad. En la planta WT se detectó principalmente lindano, por lo que no se podía decir que hubiera un metabolismo activo que degradara el compuesto (el valor del pentaclorociclohexano es residual). En el caso de las dos plantas transformadas el lindano aparecía en cantidades mucho menores y en su lugar se apreciaban picos altos en los tiempos de retención correspondientes con los productos de degradación del compuesto, siendo los de mayor intensidad los pertenecientes a C6H6Cl2 (1,4-DCB) y C6H6Cl5 (-PCCH), y los de menor intensidad en ambos casos corresponden con C6H6Cl3 (1,2,4-TCB), que eran similares en abundancia relativa de lindano. Resultados 90 Figura 22. Resultados de GC/MS combinado con HP-SPME (fragmentograma a m/z 146). Análisis de los tejidos de plantas WT, LIN-C2.1 y LIN-A5.1 cultivadas en MS-agar con lindano 5 µg/ml y crecidas durante una semana. En el fragmentograma superior se representa la planta WT, en los dos inferiores las plantas transformadas con el gen linA. (Cada ensayo se llevó a cabo a partir de 20 plantas de cada línea crecidas de forma independiente y se realizó por duplicado con resultados similares) Resultados 91 Figura 23. Resultados de GC/ combinado con HP-SPME (fragmentograma a m/z 146). Análisis de la fase aérea o volátil del cultivo de plantas WT, LIN-C2.1 y LIN-A5.1 cultivadas en MS-agar con lindano 5 µg/ml y crecidas durante una semana. En el gráfico superior se representa la planta silvestre, en los inferiores las plantas transformadas con el gen linA. (Cada ensayo se llevó a cabo a partir de 20 plantas de cada línea crecidas de forma independiente y se realizó por duplicado con resultados similares) Resultados 92 Figura 24. Resultados de GC/ combinado con HP-SPME (fragmentograma a m/z 146). Análisis del medio MS-agar con lindano 5 µg/ml tras el cultivo de plantas WT, LIN-C2.1 y LIN-A5.1 durante una semana. En el gráfico superior se representa la planta WT y en los inferiores las plantas transformadas con el gen linA. (Cada ensayo se llevó a cabo a partir de 20 plantas de cada línea crecidas de forma independiente y se realizó por duplicado con resultados similares). Resultados 93 3 Tolerancia de las plantas modificadas al lindano presente en suelos contaminados Tras realizar estudios “in vitro” empleando sustratos artificiales de cultivo (MS agar) para comprobar que las plantas modificadas que expresaban el gen linA degradaban y eliminaban lindano en medio suplementados con este compuesto, se decidió estudiar la capacidad de estas plantas para crecer en suelos reales contaminados con lindano. Esto nos permitiría valorar la aplicabilidad de las plantas capaces de expresar dicho gen para fitorremediación (ya que en esta tesis se ha trabajado con Arabidopsis sólo como modelo de esta construcción). El sustrato utilizado, por tanto, fue suelo rico en materia orgánica esterilizado en autoclave al que se añadió lindano para obtener las distintas concentraciones finales, se liofilizó para eliminar el metanol en el que estaba disuelto el pesticida. El sustrato así preparado se distribuyó en tubos de plástico de 50 ml con fondo cónico, aproximadamente un volumen de unos 15 ml por tubo. A partir de ese momento el sustrato se humedeció con agua estéril y se sembraron semillas de plantas WT y LIN-A5.1. Los tubos se mantuvieron cerrados, pero permitiendo el intercambio gaseoso durante un mes expuestos a condiciones controladas de luz y temperatura estándares de fitocultivo. En el experimento se sembraron 12-20 semillas de las plantas WT, LIN-A5.1 o LIN- C2.1 transformadas por cada tubo. En la figura 25 se observa de nuevo una clara diferencia de crecimiento de las plantas WT y LIN- A5.1 en el suelo con lindano contaminado, pues las plantas transgénicas eran capaces de crecer en presencia de 500 µg/ml, con un fenotipo similar al que presentan en concentraciones más bajas del compuesto. Incluso algunas plantas parecían resistir a una concentración de 750 µg/ml, aunque ya con un tamaño de roseta mucho menor. A concentraciones de 1000 µg/ml todas las plantas se mostraban muy afectadas por el compuesto, pero se apreciaba una supervivencia algo mayor en la transformada que además presentaba menor clorosis. El mismo experimento también se realizó de manera similar con la línea LIN-C2.1, que expresaba la proteína LinA etiquetada con una cola de histidinas en el Ct, obteniendo resultados similares en las concentraciones elegidas, ya que se eliminaron las concentraciones intermedias que no aportaban información extra al resultado final en las comparaciones entre la línea modificada y la WT (Fig. 26). Resultados 94 Figura 25. Plantas WT y LIN-A5.1 crecidas en tubos de plástico con suelo rico inoculado con concentraciones crecientes de lindano. El sustrato se esterilizó antes de ser inoculado con lindano y liofilizó para eliminar el metano en el que está diluido el pesticida. El cultivo se mantuvo durante un mes con fotoperiodo controlado a 22°C. Resultados 95 Figura 26. Plantas WT y LIN-C2.1 crecidas en tubos de plástico con suelo rico inoculado con concentraciones crecientes de lindano. El sustrato se esterilizó antes de ser inoculado con lindano y se liofilizó para eliminar el metano en el que está diluido el pesticida. El cultivo se mantuvo durante un mes con fotoperiodo controlado a 22°C. 96 97 DISCUSIÓN 98 Discusión 99 La contaminación de suelos con lindano es un problema global, encontrándose contaminaciones severas en las zonas de producción y uso, y contaminaciones difusas en el resto. En estas amplias áreas donde la contaminación no es muy grande es impensable utilizar métodos tradicionales para eliminar el lindano por su alto coste (Vijgen et al., 2019), y se podrían descontaminar mediante fitorremediación empleando plantas modificadas que degraden este compuesto, como se propone en esta tesis. Los estudios obtenidos en diferentes ambientes en los últimos años muestran además que los suelos suelen tener una contaminación mixta de compuestos orgánicos e inorgánicos (Alvarez et al, 2017) y que esto supone un problema para los métodos convencionales (no biológicos) al tener que adecuarse a las características físico químicas de cada tipo de componente (Aparicio et al, 2015; Dong et al, 2013). El coste y el tipo de contaminación por tanto nos lleva a pensar que la biorremediación puede ser una solución más adecuada para muchos suelos contaminados ya que los organismos vivos son capaces de degradar los contaminantes orgánicos en otros menos tóxicos a la vez que transforman los inorgánicos (Chen et al, 2015a; Chen et al, 2015b; Jie Liu et al, 2015). La biorremediación convencional a su vez presenta otras limitaciones tales como la competencia de los microorganismos introducidos con las especies nativas, la baja actividad microbiana en el subsuelo, la dependencia de nutrientes limitantes, la humedad (Xu et al, 2020), la heterogeneidad y disponibilidad de los contaminantes y la toxicidad o inhibición de algunos de los componentes de las mezclas contaminantes haciendo poco prometedor el uso de los microorganismos aislados, especialmente con los pesticidas orgánicos que pueden ser mineralizados por muy pocas cepas (Glick, 2003). El uso de la fitorremediación, tecnología prometedora para ambos tipos de contaminantes, puede ser una alternativa o un método suplementario ya que las plantas son más robustas, fuentes renovables, se pueden usar in situ (Parameswaran et al, 2007), sobreviven a mayores concentraciones de contaminantes que los microorganismos y no son desplazadas con tanta facilidad por los organismos autóctonos (normalmente estas zonas contaminadas cuentan de por sí con poca vegetación), además suponen una mejora de calidad y reestructuración de la zona en tratamiento y contribuyen a la fijación de CO2, mejora de la calidad y la reestructuración del suelo (Bell et al., 2014; Philippot et al, 2013) y pueden ser usadas como biocombustibles tras ser utilizadas (Tripathi et al, 2016). Recientemente se ha demostrado que los exudados de las raíces de las plantas ayudan a la biodisponibilidad y desorción del HCH especialmente con los isómeros más hidrofóbicos (como ocurre con α, β, -HCH) en la zona de la rizosfera, favoreciendo la degradación de suelos contaminados hace 50 años, lo que minimiza el efecto aging del que ya hemos hablado (Rodríguez-Garrido et al, 2020). Discusión 100 La OMS en 2014 reconoció que los casos de intoxicación aguda por plaguicidas causan gran morbilidad y mortalidad a nivel global, siendo los países en desarrollo los más vulnerables (Anguiano & Montagna, 2012; Organización Mundial de la Salud, 2014). Se ha demostrado por otro lado que hay una relación directa entre la calidad y seguridad de los alimentos que ingerimos y el nivel de contaminación de los suelos (Weber et al, 2018). Se estima que la exposición directa o indirecta a plaguicidas intoxica unos dos millones de personas al año (Aguirre Arias, 2015). Por ello, la restauración de los sitios contaminados debe ser prioritaria aunque todavía no se haya establecido un tiempo límite para la eliminación de este pesticida en concreto (Vijgen et al., 2019). Buscando nuevas alternativas a este problema, para este trabajo se seleccionó el gen bacteriano linA de la bacteria S. japonicum UT26S, localizada en suelos contaminados con lindano, para ser introducido en plantas de A. thaliana. Nuestra hipótesis es que este gen proporcionará las herramientas necesarias a la planta para empezar con los primeros pasos de la degradación del lindano lo que contribuirá positivamente en la capacidad de las plantas para tolerar y crecer en tierras contaminadas con este compuesto (HCH ha demostrado ser fitotóxico para el crecimiento de diversas especies de plantas, incluyendo a monocotiledóneas y dicotiledóneas (Calvelo Pereira et al, 2010). Los resultados presentados en este trabajo parecen confirmar dicha hipótesis ya que las plantas modificadas que expresan linA fueron capaces de resistir y crecer en presencia de concentraciones elevadas de lindano y además lo degradaban, a diferencia de las plantas silvestres donde el pesticida permanece inalterado. 1 Las plantas que expresan linA son resistentes al lindano. En el trabajo realizado en esta tesis se clonó el gen linA silvestre en el vector pCAMBIA3500 y la construcción resultante, previa amplificación en E. coli, se introdujo en A. tumefaciens que fue la herramienta que nos permitió introducir el gen en el genoma de la planta A. thaliana mediante el método de inmersión por vacío (floral dipping). Paralelamente, y de forma independiente, se prepararon otros dos plásmidos con el gen linA etiquetado en ambos extremos de forma independiente generando dos versiones distintas: i) con una secuencia que codificaba 6 histidinas unidas en el extremo N-terminal de la proteína y ii) con la misma secuencia codificadora de histidinas pero en el extremo C-terminal. Con estos dos plásmidos recombinantes se siguieron los mismos pasos que con el plásmido con el gen silvestre para obtener plantas transgénicas que expresaran las variantes con el gen linA etiquetado con cola de histidinas Discusión 101 De las tres construcciones realizadas en A. thaliana, tras analizar su fenotipo de resistencia al compuesto en la primera generación en medio artificial contaminado con lindano, además de las plantas transformadas con el gen silvestre (LIN-A) sólo seleccionamos una de las otras dos con etiquetas introducidas, la que expresaba LinA con una cola de histidina en el Ct (LIN-C), ya que la otra construcción no presentaba un fenotipo de resistencia al lindano significativo. En la siguiente generación de plantas seleccionamos para su estudio una línea con el gen silvestre LIN-A5.1 y dos líneas distintas con la etiqueta de histidina en Ct, LIN-C2.1 y LIN-C10.1, todas ellas eran capaces de germinar y crecer en una concentración de lindano de 10 μg/ml sin diferencias significativas en su respuesta a esta concentración (en concentraciones mayores del compuesto este comportamiento variaba y las diferencias entre las plantas transformadas se hacían significativas, respondiendo mejor la que tenía introducido el gen linA silvestre). En esta concentración el área de la roseta era significativamente mayor en las plantas con el gen linA que en las no modificadas (WT), que eran capaces de germinar pero su crecimiento se veía severamente inhibido, siendo casi incapaces de desarrollar más hojas que los dos cotiledones iniciales, y sufriendo clorosis lo que indicaba que además de la reducción del desarrollo se estaba dando una reducción de la clorofila, lo que afectaba directamente a su viabilidad. También se observaron diferencias significativas entre las plantas WT y las que expresan linA (LIN-A y LIN-C) en la concentración intermedia de 5 μg/ml, el área de la roseta de las plantas WT volvía a ser significativamente menor con respecto a las transformadas, aunque en este caso todavía eran capaces de sobrevivir y desarrollarse. Ambos fenómenos fueron observados por Pereira et al, 2010 y por Dubey et al en 2014. Los primeros ponían de manifiesto que en las etapas iniciales del crecimiento vegetal la germinación total no era una variable suficientemente sensible para detectar los efectos fitotóxicos del HCH porque estaba menos afectada que el vigor de las plántulas y el crecimiento de los tejidos. Los segundos observaban disminución en la clorofila de sus plantas y esto lo atribuían a la toxicidad propia del lindano. Otros estudios descubrieron variación en la morfología de los cloroplastos y una disminución de su número por célula con una relación directa afectando a ambos tipos de fotosistemas de forma drástica tras la exposición al lindano (Zhang et al, 2013). Tras la obtención de un fenotipo tan claro y gracias al uso de RT-PCR se pudo confirmar la expresión del gen linA de forma independiente tanto en los tejidos aéreos de las plantas transformadas como en sus raíces mientras que en la planta control (WT) no se detectó dicho gen en ninguno de sus tejidos. Este resultado era conforme a lo esperado al haber usado el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor que induce la expresión del gen introducido en la planta en la mayoría de los tejidos del organismo, independientemente de Discusión 102 factores ambientales o del estadio de desarrollo, promoviendo altos niveles de expresión transgénica en dicotiledóneas como A. thaliana (Dutt et al, 2014; Park et al, 2010). Mediante PCR cuantitativa en tiempo real se apreció una mayor transcripción del gen linA en la planta que posee el gen silvestre (LIN-A) respecto a las construcciones que cuentan con una etiqueta de cola de histidinas (LIN-C). La diferencia en los valores de CT no era muy grande ya que la variación estaba entre 12 y 15 (ambos los valores extremos), sin embargo, las diferencias en los valores obtenidos de inducción se amplificaban enormemente debido al método utilizado para calcularlo que conllevaba una gran variación en los resultados pudiendo ampliar las diferencias biológicas existentes. En cualquier caso la línea LIN-A5.1 (que contenía el gen silvestre) presentaba mayor inducción que las otras dos construcciones, es posible que la adición de la secuencia de poli-His utilizada para etiquetarlas estuviera afectando a la expresión del gen introducido, disminuyéndola, pero no se podría afirmar tajantemente pues el número de datos obtenidos no nos permitía hacer una estadística mínima para contrastarlo. Por otro lado, el número de datos era el adecuado para nuestro objetivo ya que permitía apreciar la inducción o no inducción del gen linA de forma contundente, existiendo una clara relación entre las plantas transformadas entre sí frente a sus diferencias con la planta WT. En las plantas WT los valores CT (29-30) las colocaban fuera de la fase exponencial de inducción, en la parte superior de la gráfica donde no hay inducción, justo como era de esperar al no contar con el gen linA en su genoma mientras que en el resto de construcciones analizadas, con un CT en plena fase exponencial, sí que se reflejaba una inducción de expresión que confirmaba la incorporación y expresión de dicho gen en las plantas modificadas. Las diferencias de inducción observadas entre las plantas LIN-A y LIN-C podrían estar relacionadas con el fenotipo obtenido, según algunos estudios que mostraron una relación entre la abundancia de linA y la degradación de lindano (LIN-A5.1 era la que mayor expresión tenía y era la que mejor resistía al lindano incluso en las concentraciones más altas) dicha relación llevó a concluir que la degradación del compuesto podía medirse por la abundancia del gen linA y de bacterias degradadoras de OCPs (Sun et al., 2015). Posteriormente, el crecimiento de las raíces principales y su capacidad para formar raíces laterales se evaluó también para investigar la sensibilidad al estrés de nuestras líneas transgénicas en presencia de lindano a concentraciones de 5 y 10 μg/ml. Este estudio se realizó mediante el análisis de la densidad de las raíces uniendo los valores obtenidos de longitud radicular y desarrollo de raíces laterales (la densidad se consiguió dividiendo el número de raíces laterales frente a la longitud de la raíz). A la máxima concentración testada la longitud decrecía en las raíces de la planta transformada observada y el número de raíces laterales disminuía pero Discusión 103 en ningún momento estos valores llegaban a anularse como ocurría en las plantas WT cuya densidad era igual a 0 (debido a su incapacidad de desarrollar raíces laterales), las diferencias entre ambas líneas eran estadísticamente muy significativas al realizar los análisis no paramétricos comparando sus medianas. Esto concordaba con los trabajos en los que se observó como el pesticida afectaba de manera drástica a las raíces, tanto a su elongación como a la aparición de raíces laterales (siendo el isómero  el segundo que más afecta a esta zona de la planta superado sólo por isómero δ) (Zhang et al., 2013) . Con otros herbicidas orgánicos xenobióticos se observaron resultados similares tanto en los tamaños de la raíz principal como en las raíces laterales (Azab et al, 2016; Benimeli et al, 2008). Por otra parte, al estudiar los resultados de la concentración intermedia 5 μg/ml se apreciaba que el fenotipo de la planta WT estaba bastante menos afectado a pesar de que las diferencias de medianas de los valores de densidad radicular eran significativas respecto a las transformadas (el valor de significación era bajo en comparación con el de la concentración anterior). Un punto importante a tener en consideración dentro de los datos recogidos en la densidad radicular, y que se pudo observar en la gráfica donde se representaba esta frente a las distintas concentraciones de lindano (Fig. 16), era que en las plantas transformadas, y levemente en las WT, crecidas en medio MS suplementado con 5 μg/ml de lindano (una concentración intermedia) la densidad radicular parecía mejorar respecto a su crecimiento en el mismo medio sin lindano. Esta observación podría deberse en parte a que la longitud de las raíces era menor, pero a la vez implicaba que mantenían el número de raíces laterales desarrolladas o disminuía muy poco. Por otra parte, esta mejora del fenotipo podría ser una respuesta de la planta a la estimulación producida por la contaminación, lo que se conoce como hormesis, fenómeno caracterizado por una estimulación por bajas dosis e inhibición por dosis altas (Calabrese, 2005; Calabrese & Baldwin, 2003; Calvelo Pereira et al., 2010). Este fenómeno es común en los estudios de contaminación ambiental donde la actividad adicional de la planta refleja una recuperación del estrés producido por el compuesto de estudio al principio para disminuir al aumentar la concentración. En nuestro caso esta segunda parte de la hormesis la podíamos observar especialmente en las plantas WT ya que en la concentración de 10 μg/ml de lindano la inhibición de su crecimiento era casi total, por el contrario, para las plantas transformadas esta concentración parecía estar todavía estimulándolas pues su media de densidad seguía siendo mayor que la obtenida en el medio sin pesticida (aunque la variación de las plantas en este punto era mucho mayor). Los resultados de los análisis del área radicular obtenidos fueron similares a los de densidad radicular en cuanto a su evolución general, aunque en este caso ningún valor era igual a 0, el Discusión 104 área radicular de las plantas transformadas era mayor que la de las WT para todas las concentraciones probadas. A pesar de que la última concentración de lindano utilizada parecía afectar bastante más a su distribución, en ambas concentraciones de pesticida las raíces de las plantas transformadas eran capaces de extenderse por una superficie mayor de medio lo que resultaría muy interesante en fitorremediación, ya que presentarían una zona de acción superior para degradar el compuesto. Con los métodos utilizados para analizar el crecimiento de las raíces (midiendo la longitud radicular tras 7 días de crecimiento y midiendo cada 24h-48h hasta llegar a la semana para analizar la cinética) en medio con lindano obtuvimos siempre los mismos resultados en la concentración máxima utilizada, donde las plantas WT (tanto su parte aérea como las raíces) no podían casi desarrollarse, sin embargo, sí se veía diferencia en la concentración intermedia de 5 µg/ml donde al trasplantar las plántulas crecidas en MS sin aditivos al medio contaminado su fenotipo era mejor que crecidas directamente desde semilla. En el caso de la planta transformada LIN-A5.1, esta mejora en la longitud radicular y el desarrollo aparecía en todas las concentraciones de lindano. En diversos estudios se ha observado que la respuesta de la raíz a medios contaminados dependía del estadío de la misma cuando entraba en contacto con estos medios (Afzal et al., 2011; Martinez-Trujillo et al, 2013; Wenzel, 2008). Por otra parte, se podía concluir que la introducción y expresión del gen linA en A. thaliana no afectaba a su correcto crecimiento, ya que en ausencia de lindano, tanto la parte aérea como la radicular se desarrollaban de forma similar a la de las plantas no modificadas. Este resultado era relevante porque la expresión de este gen en plantas, al menos en A. thaliana, no debilitaba su crecimiento y no supondría un problema para que las plantas modificadas se emplearan en fitorremediación. 2 Las plantas que expresan linA eliminan y degradan el lindano del medio Con el objetivo de estudiar la eficiencia de las plantas modificadas para eliminar el lindano en el sustrato donde se crecieron in vitro, se analizó mediante GC-ECD el medio artificial MS con lindano en el que habían crecido plantas transformadas y WT (de forma independiente) durante cuatro semanas, y se observó que las plantas transformadas fueron capaces de eliminar más del 90% del HCH, lo que supondría una ventaja en fitodegradación (Pilon-Smits, 2005). Las plantas WT durante este periodo no fueron capaces de desarrollarse correctamente y los valores de porcentaje de degradación del medio en el que crecieron fueron cercanos a cero (similares a los del control con el medio sólo sin plantas). El utilizar HCH y no sólo lindano permitió analizar con este método lo que ocurría además con otros isómeros presentes en la muestra. Normalmente Discusión 105 el HCH contiene mayoritariamente los isómeros , α, δ y β (Vijgen et al., 2011) que influyen en la planta con distinto grado de toxicidad dependiendo de qué zona se estudie (Zhang et al., 2013) y, en mucha menor medida el isómero ε-HCH que es prácticamente imperceptible en el medio de todas las muestras. Por ello la poca representación de este último isómero, aunque esperado por suponer entre el 3 y el 5 % del HCH técnico total, no nos permitió sacar ninguna conclusión respecto a la capacidad de degradación de linA (Weber & Varbelow, 2013; Wycisk et al., 2013). El γ-HCH en el medio en el que crecen las plantas LIN-A se eliminaba casi un 90 % respecto a los controles y δ-HCH también disminuyó hasta hacerse casi imperceptible; esto era muy interesante por ser este isómero el más toxico de los analizados (Zhang et al., 2013), pero estaba dentro de lo razonable pues, se sabe que este isómero también es sustrato de LinA, pudiendo ser degradado por ella (Lal et al., 2010). Por otro lado, esta tendencia se invirtió en los valores obtenidos con β-HCH y α-HCH en el medio con las plantas transformadas. El resultado de β-HCH no coincidía con lo esperado, teniendo en cuenta que LinA no es capaz de hidrolizar este isómero ni usarlo como fuente de carbono, ni para la obtención de energía en la naturaleza por ser un isómero muy difícil de mineralizar (Bachmann et al, 1988) [siendo el más estable y persistente en el medio (Bidlan et al, 2004; Kumar et al, 2005)] y que se ha demostrado que es necesaria la intervención de la enzima LinB para degradarlo, lo esperado hubiera sido que se mantuviera similar al encontrado en el medio control donde no se crecieron plantas no que aumentara respecto a este. Con los valores de α-HCH ocurría lo contrario, en este caso lo razonable sería que la cantidad disminuyera respecto al control ya este isómero se ha demostrado experimentalmente que sí puede ser degradado por LinA (Lal et al., 2010; Wu et al, 2007), lo que es importante ya que este isómero supone como un 55-80 % del HCH técnico y un 30 % de los residuos; a pesar de que se sabe que en el medio ambiente el HCH se transforma en gran parte en este isómero debido a su gran estabilidad (Manna & Dybala-Defratyka, 2014) no parece que esto sea lo ocurrido en cuanto al aumento en su cantidad porque de ser un proceso espontáneo también se daría en el medio control y eso no ocurría, es posible que las plantas al disminuir drásticamente los niveles de -HCH en el medio no enmascarasen los valores del resto de isómeros y esto afectara a la variabilidad observada, después de todo los valores que obtuvimos en cualquier caso eran menores de 0,25 mg/kg (±0,2) y de 0,1 mg/kg (±0,1) para los isómeros α y β respectivamente. Además, podría no degradarse porque encontrarse en forma enantiomérica (- o +) diferente a la que el gen linA podría degradar (Xu et al., 2020). Nanasato y sus colaboradores en 2016 transformaron sólo las raíces de Cucurbita moschata con la ayuda de A. rhizogenes para estudiar si la introducción del gen linA confería a la planta la capacidad de degradar lindano de medio líquido. Fueron capaces de obtener también un Discusión 106 porcentaje de degradación del 90 % tras introducir las raíces modificadas en el medio de cultivo contaminado durante sólo una noche, una degradación rápida que podía deberse a que sus pruebas se realizaron en medio líquido, evitando la limitación de transferencia de masa que se da en el suelo (Rijnaarts et al, 1990). Es importante tener en cuenta que los resultados de degradación de lindano presentados en este trabajo se hicieron en medio ácido con un pH de 5,6-5,7. Se ha demostrado que el pH del medio es uno de los factores que más afecta a la degradación del lindano en la naturaleza ya que la degradación estará supeditada a la supervivencia de los microorganismos causantes de la misma, de hecho, la acidificación del medio puede impedir que tenga lugar (Salam, 2012). A pHs muy ácidos (de 4) la degradación no es posible, mejorando en valores neutros (Elcey & Kunhi, 2010). Se ha demostrado además que el pH óptimo de degradación para asegurar la supervivencia de los microorganismos es de 7 (Kumar et al, 2017) como se observó en Staphyloccus sp. y Kocuria (Kumar et al., 2016) o en consorcios de bacterias de suelos contaminados que degradaban mejor a pH 6-8 (Elcey & Kunhi, 2010). Otras enzimas deshalogenasas que hidrolizan compuestos aromáticos como 4-clorobenzoil deshalogenasa necesitan un pH de 8,0-8,2 (Arora & Bae, 2014), y en especies de Pandoraea la degradación era óptima a pH 9 (Okeke et al, 2002). Del mismo modo se ha demostrado que la degradación de HCH tanto enzimática como no enzimática (en estudios teóricos en agua) es mucho más rápida en aguas alcalinas (5 veces más que en las neutras y la diferencia es aún mayor respecto a las aguas ácidas) (Ngabe et al, 1993) ya que parece comprobado que para la eliminación de los Cl- y la formación del doble enlace posterior es necesario un ambiente alcalino y esto debe ser similar con LinA por la correspondencia entre los valores teóricos y prácticos obtenidos (Kannath et al, 2019). El expresar el gen linA en un organismo diferente al inicial permitiría agilizar la catálisis enzimática necesaria para la degradación del lindano en ambientes contaminados que difieran de las condiciones óptimas para la enzima (o para la supervivencia del microorganismo que la produce). Esto podría ser muy importante ya que no sólo el pH sino la temperatura resulta clave para la degradación del compuesto, los microorganismos degradadores son más eficientes en condiciones de 25-30°C (Kumar & Pannu, 2018), aunque se ha llegado a observar degradación con S. japonicum a 4°C en algunos experimentos (Zheng et al., 2011). Para corroborar los resultados de γ-HCH y obtener más datos sobre la degradación de este compuesto por la planta, se analizaron mediante la técnica SPME-GC-MS muestras de tejidos de plantas, medio de cultivo y la fase gaseosa alrededor de las plantas, tanto de dos construcciones de las plantas transformadas como de plantas WT. Elegimos hacer un análisis cualitativo Discusión 107 mediante la comparación relativa de la altura/área de los picos obtenidos para cada tiempo de retención en una relación masa/carga fija de las plantas transformadas frente a la WT para poder analizar las diferencias entre ellas, habiendo sido procesadas de la misma forma. De esta manera podríamos seguir extrayendo los analitos con SMPE (y concentrando simultánea), técnica especialmente indicada para determinar pesticidas en muestras medioambientales (Koel & Kaljurand, 2006), ya que permite analizar directamente los semivolátiles sin mucha manipulación (o incluso en vivo), sin alterar la muestra, ni arrastrar interferencias, y de forma rápida y limpia (por no necesitar disolventes orgánicos) (Martínez Mejía, 2010). Una vez extraídos los analitos de la matriz se analizaron con cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, técnica que permite analizar mezclas complejas ya que tras la separación cromatográfica de los componentes estos se ionizan para ser fragmentados en iones moleculares que, mediante corrientes iónicas darán un espectro tan específico como una “huella digital”. Según la relación carga/masa de los iones se realizan fragmentogramas en los que podemos identificar los analitos similares en carga/masa por su tiempo de retención específico con una abundancia relativa dada por el área de los picos obtenidos. En este trabajo realizamos fragmentogramas a 180 m/z, 146 m/z y 109 m/z para conseguir analizar los distintos compuestos de la ruta degradativa obtenida (1,2,4-TCB, 1,4-DCB y CB respectivamente). Los resultados obtenidos indicaban que todas las plantas acumularon lindano en los tejidos, aunque la elevada cantidad de este compuesto que se encontraba en la planta WT hacía que se tuviera que representar con un orden de magnitud más que en las plantas transformadas, lo que hacía más difícil una comparación directa de la altura de los picos entre los distintos fragmentogramas, que a simple vista podía llevar a confusión. Sin embargo, en las plantas LIN-A se detectó la presencia de otros productos de degradación del lindano, principalmente 1,3,4,5,6- pentaclorociclohexano (-PCCH), 1,4-diclorobenceno (1,4-DCB) y algo de triclorobenceno (1,2,4- TCB). El lindano encontrado se observó que tendía a depositarse en la parte aérea de la planta, especialmente en las hojas, al igual que el resto de isómeros de HCH y otros compuestos hidrofóbicos volátiles, y llegaban allí mediante sorción del suelo por las raíces (por procesos abióticos principalmente) o siendo atrapado por las hojas si el compuesto se volatiliza del suelo por lo que parecía razonable encontrar este pico de lindano en todas las plantas (Calvelo Pereira et al, 2006; Lin et al, 2007; Simonich & Hites, 1994; Whitfield Aslund et al, 2007). Se sabe que esta bioacumulación depende directamente de la concentración del contaminante, de las propiedades fisicoquímicas de cada isómero, de la especie de la planta y del tipo de tejido (Calvelo Pereira et al., 2006). Esto último estaba directamente relacionado con que observáramos mucha menos cantidad de lindano en las plantas transgénicas, muy Discusión 108 probablemente debido a que su degradación por la planta disminuía su concentración en el suelo y en el aire lo que hacía que se pudiera acumular menos en el tejido de las muestras de las plantas transformadas y por eso en ambos casos se detectaba con una intensidad de un orden de magnitud menor al resto de fragmentogramas (incluido por supuesto el de tejido de WT). Siguiendo con este razonamiento la planta LIN-C2.1 parecía ser más eficiente en la degradación por los pequeños picos encontrados de lindano y -PCCH (aunque esta diferencia de eficiencia sólo se hacía visible en los tejidos, en el resto de muestras analizadas las dos plantas transgénicas se comportaban de forma similar). Además, parecía razonable pensar que la combinación de otros compuestos fruto de la degradación del lindano en la muestra de tejidos vegetales encontrada en las plantas transformadas confirmaba la hipótesis inicial de que estas plantas son capaces de degradar el compuesto. El 1,4- DCB también es relativamente volátil pero el ser químicamente estable le permitía acumularse en los organismos (Malcolm et al, 2004), aunque en los tejidos no es donde se encuentra en mayor cantidad. La detección del pequeño pico correspondiente al compuesto -PCCH encontrado en el fragmentograma de la planta silvestre en los tejidos, así como del resto de productos de degradación encontrados tanto en el agar como en la fase gaseosa, serían debidos a alguno de los múltiples factores de los que depende la disipación de este compuesto por ser un proceso dinámico (Simon Sola et al, 2017). En las muestras de agar en las que crecieron las plantas y en el aire circundante, sólo se detectaban grandes picos de lindano en las de la planta silvestre, y concretamente en la muestra de aire circundante a la planta el pico fue mucho mayor que el encontrado en el agar. El agar había sido contaminado con lindano para hacer los experimentos, por lo que encontrarlo ahí era lo esperado, al igual que en la fase gaseosa pues el lindano también es volátil y sabemos que se ha encontrado en diversas muestras de aire recogidas del medio ambiente (Olisah et al, 2020). Sobre la base de la constante de Henry (medida del equilibrio entre la fase líquida y la gaseosa) la evaporación del suelo húmedo y del agua es el proceso más importante en la distribución de este compuesto (U.S. Environmental Protection Agency, 2006b), en un medio húmedo como se supone un cultivo in vitro es alta (Phillips et al., 2005), la evaporación se sumaba a la difusión que estaba relacionada directamente con la temperatura (a más temperatura, más difusión). Nuestras plantas se crecieron a 23°C, temperatura que, pese a ser la óptima para estas plantas, objetivamente era suficientemente alta para favorecer la difusión del lindano que se observa y que también provocaba que se encontraran picos de contaminación del plástico que contenía las muestras no sólo en el aire circundante, sino también en el medio en el que crecieron las Discusión 109 plantas, e incluso en una de las muestras de tejido. La presencia de estos contaminantes se podría haber evitado creciendo las plantas en recipientes de vidrio. Las muestras de las plantas que expresaban el gen linA (las dos construcciones analizadas) contenían unos valores ínfimos de lindano tanto en el agar como en el aire circundante (aunque en el agar era ligeramente superior). Dos picos altos lideraban los fragmentogramas, dos metabolitos intermedios en los tiempos de retención correspondientes al 1,4-DCB (en ambos) y al -PCCH, ambos productos de degradación del lindano, lo que volvía a apoyar la hipótesis de que la expresión del gen linA en la planta le permitía iniciar y avanzar varias etapas en la ruta degradativa del lindano. Los compuestos observados en las muestras gaseosas se suelen encontrar en el aire en los sitios contaminados, por ser volátiles, siendo un foco de contaminación propio en la atmósfera de estas localizaciones (Fang et al, 2017). Es muy probable que al tener más cantidad de cloros el -PCCH sea menos volátil y por eso se encontrara en mucha mayor proporción en la muestra de agar que en la del aire circundante donde se obtenían grandes cantidades de 1,4-DCB. Curiosamente, si se sigue la ruta degradativa del γ-HCH de la bacteria UT26 en condiciones aerobias desde los primeros pasos de deshidroclorinación enzimática (los ejecutados por la enzima LinA) esperaríamos observar la conversión de γ-HCH a γ-PCCH, que se transforma en 1,2,4-TCB (Nagata et al., 1993a; Nagata et al., 1993b) de forma espontánea y es expulsado como producto de desecho. Sin embargo, el 1,2,4-TCB no se observó en cantidades significativas en los fragmentogramas de ninguna de las muestras estudiadas, siempre en cantidades mucho menores que 1,4-DCB, incluso en algunas podríamos decir que son residuales, lo que nos llevaba a pensar que el 1,2,4-TCB se estaba degradando en ese último compuesto. Si se continúa con la degradación, en los pasos inmediatamente posteriores de la ruta realizados por la enzima LinB, se libera como producto de desecho 2,5-DCB (Lal et al., 2010; Ricking & Schwarzbauer, 2008), que es el que se observaba en nuestros experimentos sin haber introducido esta segunda enzima a las plantas. La degradación del lindano mediada por la planta parecía capaz de eliminar átomos de cloro responsables de la toxicidad y el carácter xenobiótico de estos compuestos, consiguiendo así que fuera menos recalcitrante y reduciendo también el riesgo de formar intermediarios tóxicos en los siguientes pasos metabólicos (Camacho-Perez et al., 2012). Hay evidencias de que las plantas son capaces de captar TCB y TCE del ambiente y transportarlo a la rizosfera donde aumenta según lo hace el nivel de contaminación en el aire (Su & Liang, 2013). Muy probablemente esto ocurra con productos similares como el DCB y el resto de compuestos encontrados en ambas muestras, en nuestro caso no se apreció que la aparición de 1,2,4-TCB aumentaba en las muestras del agar frente a las del aire circundante, quizá esto se debía a la poca cantidad de este producto que éramos capaces de detectar a pesar Discusión 110 de que los fragmentogramas representan la ratio de 180 de carga masa que es donde se esperaba encontrar este compuesto. La presencia de 1,2,4-TCB sí ha sido observada en plantas de Cucurbita moschata cuyas raíces se han transformado con el gen linA, en este caso se recogieron medidas de hasta un 30 % del rendimiento potencial de este compuesto (lo que les llevaba a la conclusión de que parte se estaba degradando y convirtiendo en otro compuesto en la planta pero que no lo llegaron a analizar, podría ser 1,4-DCB pero no se midió) (Nanasato et al., 2016). Normalmente las plantas que captan los volátiles a través de los estomas de las hojas los transportan a las raíces concentrando este tipo de compuestos en el horizonte superficial del suelo (Horstmann & McLachlan, 1996). En la planta WT no se detectaron los productos de degradación en ninguno de los análisis (ni en el agar ni en la fase gaseosa) al igual que no aparecían de forma significativa en el análisis del tejido vegetal, con lo que parecía confirmarse que la planta por sí misma no tenía la capacidad de degradar el lindano. A pesar de los muchos intentos para localizar la enzima LinA en las células de las plantas mediante western el resultado fue infructuoso, probablemente se debiera a un problema técnico independiente del revelado que es lo que más se modificó, quizá con un paso previo de enriquecimiento de la proteína se hubiera podido demostrar su presencia en las muestras. En el trabajo de Nanasato y sus colaboradores también se describen problemas con la identificación de esta enzima por western, y lo atribuyen a que la eficacia de traducción de la proteína era baja y que esta enzima (que normalmente se encuentra en el espacio periplásmico como hemos visto) se degrada rápidamente en el citosol. Es posible también que el etiquetado con cola de His elegido (normalmente utilizado en bacterias) no fuera lo más conveniente para su uso en plantas por los problemas de detección derivados de las mayores modificaciones de dichas etiquetas en estos organismos. Nanasato y su grupo etiquetaron la proteína con los genes codificantes del péptido ascorbato oxidasa en Nt que finalmente sí les permitió la detección de la enzima (Nanasato et al., 2016). Tampoco los resultados obtenidos con citoinmunodetección in toto para analizar la posición del gen en las raíces de la planta arrojaron resultados positivos, en este caso probablemente el problema mayor se debía a que el anticuerpo utilizado estaba en suero y necesitábamos purificarlo para conseguir respuestas más claras y específicas. No obstante, pese a que no se pudo detectar la presencia de LinA ni localizarlo en las plantas transformadas, se puede concluir que esta enzima se estaba expresando correctamente y era funcional, ya que se identificaron de forma cualitativa los compuestos resultantes de la degradación de lindano que no se observaron en las plantas WT. En un futuro se podría hacer un análisis cuantitativo empleando la técnica HP-SPME estableciendo una recta patrón con Discusión 111 estándares externos, para comparar las concentraciones de cada producto de degradación resultante respecto a los demás. 2.1 Modelo de la ruta de degradación de lindano en plantas que expresan linA Puesto que el 1,4-DCB era un compuesto detectado en grandes cantidades en los fragmentogramas de las muestras del aire circundante y del agar de plantas que expresaban linA, a pesar de no aparecer en las rutas degradativas descritas en la literatura existente, era razonable pensar que en el interior de las plantas ocurrían otras reacciones que no se habían observado en bacterias. Por eso proponemos una ruta alternativa a la previamente descrita que se muestra en la figura 27 y que explicaría la degradación del lindano en las plantas LIN generadas en este trabajo. Con los resultados obtenidos proponemos que el 1,2,4-TCB se degrada a 1,4-DCB en las plantas. Este compuesto, usando como referencia la base de datos “KEGG pathways” con la bioquímica de la degradación del lindano, se podía transformar en CB y MA pero experimentalmente no se han detectado estos compuestos más simples que el 1,4- DCB. El primero de ellos es el clorobenceno (CB o MCB) que sería el compuesto de degradación más esperable a partir del 1,4-DCB, pero, a pesar de que las fibras usadas en SPME presentan buena afinidad para este compuesto no conseguimos detectarlo en el fragmentograma correspondiente. Se requeriría hacer una serie de experimentos de control con cantidades conocidas para poder afirmar o desmentir si realmente la planta es capaz de producirlo, ya que se ha visto que la sensibilidad y selectividad de este método permiten detectar plaguicidas organoclorados a nivel de trazas (Maritza et al, 2008). El segundo compuesto sería el MA (Maleil- acetato), que se obtendría tras varios pasos intermedios y que sería similar al que se produce en la ruta degradativa de S. japonicum tras la acción de LinE (ya comentada en la figura 3 de la introducción). Lo esperable en los siguientes pasos de degradación sería que siguiera la ruta de degradación establecida transformándose en 3-oxodipato y de ahí en succinil-CoA o acetil-CoA que se incorporaría en el ciclo de Krebs para terminar la degradación del anillo bencénico liberando CO2 y ATP. Discusión 112 Figura 27. Esquema de las posibles rutas de degradación del lindano en las plantas LIN. Con flechas rojas se indica la ruta propuesta en las plantas que expresan linA (los compuestos 5 y 6 de la misma son hipotéticos pues no se han encontrado en los fragmentogramas realizados). Con flechas azules continuación de la ruta de degradación según la base de datos “KEGG pathways” (sin confirmación experimental). 3: 1,2,4-TCB; 4; 1,4-DCB; 5:CB (clorobenceno); 6: MA (maleilacetato/ácido maleil-acético). En la naturaleza los microorganismos son capaces de realizar la primera deshalogenación de los pesticidas organoclorados (POPs) haciendo accesible el esqueleto de carbono residual para las enzimas oxidativas de las plantas (Kurashvili et al, 2016). La expresión del gen linA en A. thaliana permitió que esta primera etapa se realizara en las células de la planta y posiblemente otras enzimas propias estuvieran actuando sobre los compuestos formados. Parece razonable pensar que las plantas son capaces de metabolizar un gran número de xenobióticos, incluidos los clorinados, ya que poseen dos grandes sistemas de enzimas degradadoras iguales a las existentes en el hígado de los animales (el encargado de la degradación de compuestos tóxicos), por lo que reciben el nombre de “hígados verdes”. Estos sistemas enzimáticos son por un lado los del citocromo monooxigenasa P450, peroxidasas y peroxigenasas (implicadas en la oxidación de los compuestos tóxicos) y por otro lado glutatión S-transferasas, carboxilesterasas, O-glucosiltransferasas, O-maloniltransferasas, N- glucosiltransferasas y N-maloniltransferasas (asociadas con el metabolismo xenobiótico en células vegetales, transporte de intermediarios y procesos de compartimentalización). Además, se encuentran otras enzimas de detoxificación como la polifenol antioxidante, catalasa, superóxido dismutasa, esterasa, amidasa, hidrolasa, lacasas, nitrorreductasas, nitrilasas y Discusión 113 catecol-2,3-dioxigenasa (las nitrorreductasas por ejemplo contribuyen a la degradación de TNT, o mononitrodiaminotolueno y las nitrilasas degradan 4-clorobenzonitrilo) (Alkorta & Garbisu, 2001; Macek et al., 2000). Se ha comprobado que S. japonicum UT26 no es capaz de degradar 1,2,4-TCB (Nagata et al., 1993a) sino que es uno de los productos de deshecho de la ruta metabólica y, sin embargo, en nuestros resultados aparecían el 1,4-DCB como producto mayoritario de degradación y el 1,2,4-TCB en menor cantidad. Esto podríamos interpretarlo como un paso más en la mineralización del HCH llevado a cabo por la “maquinaria enzimática” propia de la planta inducida, o no, por la exposición al lindano (la mayoría de las enzimas son constitutivas (Sandermann, 1992). En estudios recientes se ha visto que se pueden utilizar plantas para realizar una degradación oxidativa de los productos deshalogenados provenientes de la degradación bacteriana de pesticidas usando las enzimas detoxificadoras (peroxidasas, fenoloxidasas, citocromo P450 y glutatión transferasas) de las plantas estudiadas (soja, maíz, y alfalfa) (Kurashvili et al., 2016). Es interesante que estos resultados coincidían con los obtenidos en degradación de lindano en pruebas con biorreactores en condiciones de anaerobiosis (Fig. 28), aunque resultaría aventurado hacer cualquier comparación con nuestro experimento. Figura 28. Ruta de degradación propuesta en condiciones de anaerobiosis ((Quintero et al, 2005). HCH:hexaciclorohexano, PCCH:pentaclorociclohexano; DCB:diclorobenceno, CB:clorobenceno. 3 Fitorremediación Para poder utilizar estas plantas para fitorremediación se debía tener en cuenta que fueran capaces de mantener estas características de resistencia en un suelo real contaminado. Se ha comprobado que las plantas que expresan linA construidas en este trabajo mantenían este fenotipo incluso a concentraciones de lindano mucho mayores que in vitro, lo que reforzaba la idea de la importante influencia que ejercen las propiedades del suelo en los procesos de fitorremediación (Vangronsveld et al, 2009). Este aumento en la resistencia de las plantas podía ser debido a las características hidrofóbicas del lindano que al ser adsorbido por la materia Discusión 114 orgánica del suelo no afectaba de la misma manera al crecimiento vegetativo consiguiendo ese “efecto protector” que observábamos (Alexander, 2000; Reid et al, 2000; Weber & Miller, 1989). En este caso las plantas eran capaces de crecer en cantidades de lindano que ya muestran toxicidad en animales (Fuentes et al, 2011; Polti et al, 2011). Los experimentos en el sustrato contaminado y estéril, para evitar posibles interferencias de microorganismos, demostraron que las plantas transformadas con el gen linA fueron capaces de crecer a una concentración de 500 μg/ml, mientras que la planta silvestre en las mismas condiciones sólo resistió la mitad de dicha contaminación. En otros estudios con tierra contaminada con lindano estéril se observó que, sin la ayuda de los microorganismos edáficos, este no se degrada, su concentración se mantenía constante a lo largo del tiempo (Kidd et al, 2008), esto refuerza nuestra hipótesis de que la expresión del gen linA permitiría a la planta de A. thaliana degradar la contaminación del suelo sin necesidad de la colaboración de microorganismos. Que la planta transformada fuera capaz de crecer y transformar el medio contaminado donde crece en ausencia de microorganismos era un punto muy positivo de este trabajo ya que se ha demostrado que al introducir este pesticida en el suelo el número de bacterias de la zona se ven muy afectadas (al igual que otros organismos edáficos como las lombrices) (Muñiz et al., 2017). A esto se suman algunos estudios donde se asegura que el cambio climático reduce la eficiencia de los microorganismos en la degradación de los compuestos recalcitrantes (Frey et al, 2013) y altera la biomasa microbiana y las enzimas en el suelo (Tripathi et al., 2015a) disminuyendo la medida de la actividad deshidrogenasa del medio (indicador de la actividad de los microorganismos del suelo e implicado en la degradación de pesticidas clorados y otros compuestos aromáticos (Quilchano & Marañón, 2002; Salazar et al, 2011). 3.1 Liberación de 1,4-DCB, 1,2,4-TCB y -PCCH por las plantas modificadas que degradan lindano y su efecto tóxico. En la planta WT no se encontraron (o lo hicieron en muy pequeñas cantidades) compuestos de degradación del lindano mientras que en las plantas transformadas el 1,4-DCB parecía ser uno de los mayores productos de degradación de lindano en el agar y el medio en el que crecían, el 1,2,4-TCB y también el -PCCH, este último, al no ser volátil se encontró también en el medio de cultivo y en mayor medida en el tejido de las plantas. Dependiendo de la volatilidad e hidrofobicidad de los clorobencenos liberados al medio, la materia orgánica existente en el mismo puede incrementar o inhibir los efectos en los organismos existentes, incrementando dicha toxicidad cuanto más baja hidrofobicidad y mayor volatilidad tenga el compuesto (Zhang et al, 2016). El 1,4-DCB puede ser acumulado en la cadena trófica y afectar a los vegetales presentes causando una inhibición del crecimiento significativa (se ha observado una reducción Discusión 115 de la biomasa de entre 40-90 % para concentraciones mayores de 10 μg/ml), afectando a la proliferación celular en las raíces, causando trastornos en el crecimiento de las hojas e inhibiendo la división celular (Miguel et al, 2012). Se ha observado además que 1,4-DCB tiene efectos tóxicos en la fotosíntesis de algas como Chorella pyrenoidosa donde el fotosistema II se daña de forma irreversible y la eficacia del transporte de electrones fotosintéticos disminuye en concentraciones del compuesto mayores o iguales a 10 mg/l (Zhang et al., 2016). Es posible que este efecto del 1,4-DCB, el 1,2,4-TCB y el -PCCH se sumaran a la toxicidad propia del lindano en las plantas transformadas (donde al aumentar las cantidades del pesticida en el medio se observaba una tendencia decreciente de elongación radicular y del desarrollo de la parte aérea, características producidas por ambos compuestos). El -PCCH también se puede acumular en la cadena trófica siendo tóxico para el medio ambiente y para el hombre por inhalación y contacto (PRTREspaña, 2007). Parece demostrado que los átomos de cloro inducen estrés oxidativo lo que afecta directamente a varios procesos ya que hay correlación entre el grado de clorinación y la exposición a clorobencenos (Kong et al, 1998). De hecho, se ha calculado que el incremento del daño producido por el compuesto aumenta un orden de magnitud por cada grado de clorinación (Miguel et al., 2012), con una relación, a menos cantidad de cloros en la molécula menor daño. El orden de toxicidad establecido para el protozoo Tetrahymena reflejado en la bibliografía es 1,2,4-TCB>o-DCB>p-DCB>m-DCB>CB (Zhang et al, 2012). Por lo tanto, suponía una ventaja que las plantas modificadas liberasen más 1,4-DCB que 1,2,4-TCB [regulados como contaminante prioritario en la UE y por la Convención de Estocolmo respectivamente (Fliedner et al, 2016)] e incluso que haya -PCCH en vez de -HCH [ambos introducidos en la lista de sustancias reguladas prohibidas en la Convención de Estocolmo del 2009 (Convention, 2020; U.N. Environment Programe, 2009)]. La volatilización del 1,4-DCB al ambiente, aunque sea mucho menos tóxico que el lindano y que el 1,2,4-TCB, sigue siendo un problema a tener en cuenta, ya que podría suponer una fuente de contaminación importante en el aire circundante a los sitios contaminados que acaba siendo inhalado por la población o ingerido en los vegetales de consumo (Fang et al., 2017). El 1,4-DCB, el 1,2,4-TCB y el -PCCH acumulado en el medio por la degradación del lindano mediada por las plantas que expresan linA podría ser eliminado mediante las técnicas de lavado de suelo, más concretamente con la depuración mediada con biosurfactantes añadidos al sustrato. Estos compuestos naturales se han demostrado eficaces para el tratamiento de suelos contaminados con DCBs, específicamente al aumentar su remediación (Pei et al, 2017). Es posible que los Discusión 116 surfactantes sintetizados directamente por la propia planta en su exudado (dependientes de la especie de a planta y del tipo de suelos) podrían facilitar la desorción y la disponibilidad de los pesticidas clorados en el suelo (Rodríguez-Garrido et al., 2020). La biodegradación también es una buena estrategia para eliminar DCB (Zhang et al, 2011), por ejemplo, cepas aisladas de Acidovorax sp. sk40 y Ralstonia sp. sk41 podrían ser empleadas en esta estrategia, ya que degradan este compuesto (Cui et al, 2017). El uso conjunto de biorremediación y fitorremediación ha sido recomendado como solución en varios trabajos (Afzal et al., 2011; Gerhardt et al., 2009) ya que se ha demostrado que el cultivo de plantas asociado a tratamientos de biorremediación tiene ventajas para los microorganismos de la rizosfera (Rodríguez-Garrido et al., 2020) e, indirectamente, a otros presentes en el mismo suelo, y también se ha demostrado que el cultivo de plantas y la adición de nutrientes para reforzar a los microorganismos de los suelos permite una mayor degradación de HCH (Sun et al., 2015). Otra estrategia consistiría en la inoculación en las plantas que expresan linA de bacterias endófitas que tuvieran rutas degradadoras específicas para 1,4-DCB, 1,2,4-TCB y -PCCH. De esta forma se reduciría su acumulación en el medio de crecimiento y en el aire circundante o en la planta respectivamente, degradándolo en el proceso de transporte de un lugar a otro dentro de la planta, y por tanto su fitotoxicidad disminuiría, incrementando el efecto de tolerancia de la planta a lindano, y evitando la acumulación en planta y agar de -PCCH y la emisión de 1,2,4-TCB y 1,4-DCB al aire por transpiración, como se ha hecho por ejemplo para la degradación de hidrocarburos, compuestos aromáticos y tolueno (Andria et al, 2009; Wang et al, 2011; Yousaf et al, 2011). Este método no presenta efectos negativos para la planta hospedadora y le permite equiparse con nuevas rutas de degradación que mejoren las suyas propias y reduzcan la contaminación tisular (Zhu et al, 2014). Los compuestos que ya se han liberado al ambiente se podrían tratar utilizado la capacidad de las plantas de absorber dichos compuestos directamente del aire, mediante las hojas o los tallos, y llevarlos a las raíces, esto ya se ha observado con plantas de maíz (Su & Liang, 2013). Otra posibilidad para atenuar la liberación de los 1,4-DCB y 1,2,4-TCB observados en el aire circundante de las plantas transformadas sería utilizar bacterias que puedan proliferar en la superficie vegetal (filosfera) y que sean capaces de degradar contaminantes orgánicos liberados en el aire (de Lorenzo, 2008); estas bacterias epífitas ya se han observado capaces de degradar otras sustancias como el fenol (Sandhu et al, 2007), los hidrocarburos aromáticos policíclicos (Yutthammo et al, 2010) o el clorometano (Nadalig et al, 2014). Introducir más genes en el genoma de la planta que permitan completar la mineralización del lindano sería otra opción, incluso se podrían expresar genes que degradasen otros Discusión 117 contaminantes, como ya hemos comentado anteriormente, y así utilizar un solo organismo para degradar diferentes compuestos (Hong-Bo et al, 2010; Lan et al., 2014). Otro método que se podría estudiar para eliminar los compuestos acumulados en el sustrato es el uso de nanopartículas que contengan enzimas de biorremediación que se combinen con el tratamiento de fitorremediación (Singh, 2009; Singh, 2010) para la degradación de compuestos organoclorados. Tras la degradación obtenida por las plantas transformadas se podrían introducir enzimas nanoencapsuladas en el medio (para evitar la acción de proteasas) capaces de degradar los compuestos de desecho “vertidos” por la planta (1,4-DCB, 1,2,4-TCB y -PCCH); este método requeriría un estudio la posible toxicidad de las nanopartículas y de su evolución en el medio ambiente para asegurar su inocuidad (Abhilash et al, 2012). También se podrían unir nanopartículas inertes a microorganismos como muestran los estudios de degradación de lindano con n_ZnO+Candida VITJzNO4 o con Pd/Fe(0)+Sphingomonas spp NM05 (Salam & Das, 2015; Singh et al, 2013) respectivamente. Estudios más recientes en suelo contaminado muestran una reducción del 60% del lindano tras el uso de oxidación química seguido de tratamientos a pH neutro con H2O2, H2O2/Fell, Na2S2O8, Na2S2O8/Fell y KMnO4 (Usman et al, 2017). También se podrían aprovechar las bacterias de la rizosfera para finalizar la degradación de los compuestos que se están liberando al suelo por la planta transformada y llegar así a la mineralización del lindano. Si se sembraran distintas especies de plantas también favorecería la variedad bacteriana y el incremento del número de copias del gen (Ito et al, 2012; Khan et al, 2013b) ya que la composición de los exudados viene determinado por la combinación de las condiciones del suelo y la especie vegetal que lo genere (Rodríguez-Garrido et al., 2020). 3.2 Problema del empleo de plantas que expresen linA en el medio ambiente El uso de plantas transgénicas en el medio ambiente siempre plantea un problema legislativo, al menos en los países de la Unión Europea. En nuestro caso, el gen linA que se ha introducido en las plantas se ha detectado de forma natural en microorganismos que sobreviven en zonas contaminadas por lindano (de hecho, en tierras contaminadas es donde se aisló por primera vez la cepa portadora del gen), por tanto no estaríamos introduciendo un material genético ajeno al presente en el ecosistema, sino potenciando la respuesta existente. En trabajos realizados en experimentos de mesocosmos, contaminando el medio de forma controlada para ver el resultado, se observó que en los suelos que contienen plantas la eliminación de contaminantes orgánicos es mucho mayor que en los suelos desnudos y que el linA aparecía tras la contaminación (Ito et al., 2012; Khan et al, 2013a). Discusión 118 Para evitar posibles problemas de transmisión del gen, si fuera posible, se podría insertar el gen en el genoma de los plastos o las mitocondrias ya que de esta manera no se transmitiría en el polen o lo hará de forma mínima (Maliga, 2002; Maliga, 2004), introducirlo en plantas macho que no formarán semillas o en líneas estériles también reduciría sensiblemente su propagación (Abhilash et al., 2009; Wang et al, 2004). Las tecnologías que refuerzan el sistema de contención uniendo al transgen primario genes mitigadores o suicidas (que confieren unas características inocuas para la planta usada para fitorremediación pero resultan perjudiciales para las especies diferentes a las que se transfiera el gen) podrían ser también adecuadas. Un ejemplo de esto último sería clonar el sistema dual letal ABC (Lan et al., 2014). Por otra parte, se podrían construir híbridos estériles que no sólo fueran respetuosos con el medio ambiente sino que permitieran alargar la longevidad de las plantas (Beltrán et al, 2007). 3.3 Estrategias para optimizar la degradación de lindano en suelos mediante plantas que expresen el gen linA. A. thaliana es uno de los organismos modelo más importante para el estudio de biología de plantas ya que permite trabajar de forma rápida y controlada gracias a su reducido tamaño, su pequeño genoma y su fácil manipulación genética (Dolan et al, 1993; Koornneef & Meinke, 2010). La introducción y expresión del gen linA en esta planta nos ha servido como prueba de concepto, ya que ha permitido demostrar que le confiere un fenotipo más robusto frente al lindano, posibilitando su crecimiento en sustratos (tanto artificiales como naturales) cuya contaminación no resiste la planta silvestre y además es capaz de degradar el lindano directamente del sustrato en el que crece. La bibliografía muestra que el éxito de la fitorremediación está condicionado por las propiedades físico-químicas del contaminante, por los microorganismos del suelo y de forma directa por la especie de planta que se use (Tripathi et al, 2015b). Se ha demostrado que las plantas no son capaces de absorber grandes cantidades de compuestos hidrofóbicos como HCH (Nanasato et al., 2016), siendo el HCH fitotóxico para la mayoría de las especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Calvelo Pereira et al., 2010). La introducción de linA en las raíces de Cucurbita moschata (planta capaz de incorporar cantidades significativas del pesticida (Namiki et al, 2013) permitió degradar durante 12h una cantidad de lindano en medio líquido de 5 mg/ml, confirmando lo importante que puede ser la elección de la planta donde se introduzca el gen. Teniendo esto en consideración y con el objetivo de mejorar los resultados obtenidos para poder ser considerado un método de fitorremediación eficaz, sería más conveniente expresar el gen linA en plantas más robustas, longevas (Arabidopsis no sobrevive Discusión 119 más que 6-7 semanas), con un sistema radicular más desarrollado y más resistente de por si al lindano. En la bibliografía se confirman estas características en las siguientes plantas: Solanum nigrum (Macek et al., 2000), Cucurbita moschata, Solanu torvum, Withania somnífera, Lantana camera, Achyranthes asera, Dalbergia sisso, Calotropis procera y Erithus munja (Abhilash et al, 2008), Jatropha curcas L. ((Abhilash et al, 2013b), Cytisus striatus (Becerra-Castro et al, 2013; Calvelo Pereira et al., 2006), Sesamum indicum L. (Abhilash & Singh, 2010), Hardeum vulgare L., Brassica sp., Phaseolus vulgaris L. (Calvelo Pereira et al., 2010), Withania somnífera (Solanaceae) (Abhilash & Singh, 2010), Spinacia oleracea L (Dubey et al., 2014), Zea mays (Álvarez et al, 2015) o Solanum torvum (Solanaceae), o, posteriormente plantas que crecen ya en zonas contaminadas con el pesticida como Lotus tenuis, Artemisia vulgaris o Tanacetum vulgare (Balázs et al, 2018). Otros trabajos aconsejan la selección de la vegetación autóctona en cada ambiente a tratar, para minimizar el impacto ecológico evitando los posibles riesgos de la introducción de especies foráneas (Nurzhanova et al, 2013; Ramirez-Sandoval et al, 2011; Singh & Singh, 2014), lo que además permite aprovechar el hecho de que las especies nativas ya están adaptadas a las condiciones del sitio (Mousavi Kouhi & Moudi, 2020). Los trabajos realizados en esta tesis, por tanto, sirven para confirmar las hipótesis iniciales de que la introducción del gen linA y su expresión en plantas puede hacer que éstas degraden el compuesto y sean más resistentes que las plantas sin tranformar. Del mismo modo, contando con la amplia bibliografía existente, recomendaríamos que el gen linA se exprese en plantas más robustas y resistentes al compuesto para que estos resultados preliminares se potencien y la construcción resultante responda frente al lindano de manera mucho más eficaz, duradera e incluso ecológicamente más segura (si elegimos especies autóctonas de la zona a tratar). La aplicación de este nuevo conocimiento permitiría conseguir plantas óptimas para la detoxificación de suelos con contaminación difusa de lindano que de otra manera serían imposibles de recuperar. Según los resultados obtenidos en este trabajo, la transformación de las plantas con el gen linA supondría un método eficaz de fitorremediación que permitiría una “revitalización ecológica” (United States Environmental Protection Agency, 2013) que conllevaría la recuperación de estas amplias zonas para poder ser reutilizadas, de una forma económicamente razonable, sin el impacto visual y ecológico de las técnicas tradicionales. Por otra parte, habría que considerar optimizar la expresión del gen linA en plantas modificando su secuencia para adaptarla al uso de codones de plantas. Quizá de esta manera se acumularía menos cantidad de PCB, acelerando su degradación a 1,4-DCB (y 1,2,4-TCB). La modificación de los parámetros de codones óptimos y abundancia de tRNAs permite incrementar la expresión, regular la velocidad de la traducción ribosomal (Andersson & Kurland, 1990; Tuller et al, 2010), Discusión 120 la eficiencia en el plegamiento de las proteínas y la coordinación de la expresión funcional de familias de genes relacionadas (Novoa & Ribas de Pouplana, 2012). Este paso que proponemos podría mejorar los resultados obtenidos ya que la secuencia del gen linA es de origen bacteriano y puede no ser la más óptima para su expresión en la planta transformada. El código genético es degenerado, lo que significa que varias combinaciones de codones pueden servir para codificar el mismo péptido, la naturaleza de la proteína sintetizada no parece verse afectada, pero se modifica el nivel de la expresión del gen. Esto se traduce en que al modificar los codones para utilizar los óptimos en plantas podremos influir directamente aumentando la expresión del gen, facilitando la traducción de la proteína y aumentando la cantidad de enzima resultante. No ocurre en todas las especies, pero se ha demostrado que los codones óptimos son los más reconocidos (Kimura, 1968) por los tRNAs más abundantes, la disponibilidad de los tRNAs parece clave, de forma que los genes que más se expresan son aquellos que tienen una frecuencia alta de codones óptimos, mientras que los que se expresan menos usan mayor variedad de codones (Ikemura, 1981) y esto puede variar entre las especies y entre los distintos tejidos. Por otra parte, para introducir estos cambios en la secuencia del gen linA habría que tener en consideración la estructura secundaria del mRNA para que no se viera afectada y no se perdiera la funcionalidad (Iserentant & Fiers, 1980), ya que tanto el codón como la secuencia de mRNA están íntimamente ligados a la estructura definitiva de la proteína resultante (Cortazzo et al, 2002). 121 CONCLUSIONES 122 Conclusiones 123 Los datos presentados en este trabajo permiten extraer las siguientes conclusiones: 1. La introducción y expresión del gen linA de Sphingobium japonicum UT26 en Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia-0 produce plantas (LIN-A) capaces de resistir concentraciones de lindano letales para la planta no modificada, tanto en medio artificial de laboratorio como en suelos contaminados con lindano. Se obtuvo el mismo resultado en las plantas que expresan el gen linA etiquetado con una cola de 6 histidinas en el extremo Ct de LinA (LIN-C). 2. La expresión del gen linA o de su variante en A. thaliana no afecta al correcto desarrollo de las plantas. En ausencia de lindano, la parte aérea y el sistema radicular son similares a los de las plantas no modificadas. 3. Las plantas modificadas LIN-A y LIN-C pueden eliminar eficazmente lindano del medio artificial en el que crecen (hasta un 90% en 4 semanas). 4. Las plantas LIN-A y LIN-C degradan el lindano produciendo principalmente pentaclorociclohexano (-PCCB), triclorobenceno (1,2,4-TCB) y diclobenceno (1,4-DCB). Este último compuesto de degradación tiene un cloro menos que el triclorobenceno, que es uno de los productos residuales esperados tras la actuación de la enzima LinA en la ruta degradativa bacteriana. Con lo que es posible que una vez comenzada la degradación del compuesto por LinA, la planta modificada podría estar empleando sus propias enzimas favoreciendo otro paso adicional en la degradación del compuesto. 5. La planta modificada en este trabajo, Arabidopsis thaliana, es una crucífera de pequeño tamaño y anual, que ha constituido una prueba de concepto para validar esta estrategia de fitorremediación de suelos contaminados con lindano. Sin embargo, la introducción del gen linA en otras especies de plantas más robustas, o más resistente al lindano proporcionaría herramientas más eficaces para limpiar grandes extensiones de suelos con contaminación difusa de este pesticida. 124 125 BIBLIOGRAFÍA 126 Bibliografía 127 Abd Al-Rahman, SH (2012) Persistent organochlorines in human breast milk from Al- Sharkia Governorate, Egypt. International Journal of Environmental Analytical Chemistry 92: 1215-1225 Abhilash, P, Jamil, S, Singh, N (2009) Transgenic plants for enhanced biodegradation and phytoremediation of organic xenobiotics. 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Tratamientos:1=0ug/ml, 2=2,5ug/l, 3=5ug/ml, 4=10ug/ml, 5=12,5ug/ml y 6=15mg/ml Anexo 150 Anexo 151 Portada AGRADECIMIENTOS Índice ABREVIATURAS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS ABSTRACT RESUMEN INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXO