UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR ESTUDIOS MOLECULARES DEL SISTEMA REGULADOR DE LA DEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE BENZOATO EN Azoarcus sp. CIB TESIS DOCTORAL DE: GONZALO DURANTE RODRÍGUEZ BAJO LA DIRECCIÓN DE: EDUARDO DÍAZ MANUEL CARMONA Madrid ©Gonzalo Durante Rodríguez, 2009 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR ESTUDIOS MOLECULARES DEL SISTEMA REGULADOR DE LA DEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE BENZOATO EN Azoarcus sp. CIB TESIS DOCTORAL GONZALO DURANTE RODRÍGUEZ Madrid, 2009 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR ESTUDIOS MOLECULARES DEL SISTEMA REGULADOR DE LA DEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE BENZOATO EN Azoarcus sp. CIB TESIS DOCTORAL GONZALO DURANTE RODRÍGUEZ DIRECTORES: Dr. EDUARDO DÍAZ Dr. MANUEL CARMONA CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS Madrid, 2009 “No estoy en absoluto de acuerdo con lo que usted dice, pero lucharé hasta la muerte para que nadie le impida decirlo” Voltaire (1694-1778). A mis padres A Gaëlle A aquella tan deseada que viene en camino, a ti Noa Agradecimientos Quisiera expresar mi agradecimiento a todas las personas que han colaborado en la realización de esta Tesis. Abreviaturas i AABBRREEVVIIAATTUURRAASS A: adenina A600: densidad óptica medida a 600 nm aa: aminoácido(s) ADN: ácido desoxirribonucleico Apr: resistencia a ampicilina ARN: ácido ribonucleico ATP: adenosina trifosfato BSA: seroalbúmina bovina C: citosina ºC: grado centígrado C-terminal: carboxilo terminal cAMP: adenosina monofosfato cíclico CD: dicroísmo circular (Circular Dichroism) cDNA: ADN complementario Ci: curio Cmr: resistencia a cloranfenicol CoA: Coenzima A cpm: cuentas por minuto CRP: proteína receptora de cAMP (cAMP receptor protein) CTP: citidina trifosfato Da: Dalton dATP: desoxiadenosina 5’-trifosfato dCTP: desoxicitidina 5’-trifosfato DEPC : dietilpirocarbonato dGTP: desoxiguanosina 5’-trifosfato DMSO: dimetilsulfóxido dNTP: desoxinucleótido trifosfato DTT: ditiotreitol dTTP: desoxitimidina 5’-trifosfato EDTA: ácido etilendiaminotetraacético F: fluorescencia Abreviaturas ii Fmin: fluorescencia mínima G: guanina GTP: guanosina trifosfato h: hora His6: secuencia de aminoácidos compuesta por 6 histidinas HTH: motivo hélice-giro-hélice IPTG: isopropil-β-D-tiogalatopiranósido kb: 1000 pares de bases Kb: constante de asociación Kd: constante de disociación aparente kDa: 1000 Dalton Kmr: resistencia a kanamicina [L]F: concentración de ligando libre LB: medio Luria-Bertani M63: medio mínimo M63 min: minuto ml: mililitro mM: milimolar n: nucleótido N-terminal: amino terminal NAD: nicotinamida-adenina-dinucleótido NADH: nicotinamida-adenina-dinucleótido reducido NCBI: National Center for Biotechnology Information nm: nanómetro p/v: relación peso/volumen PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida pb: pares de bases PCR: reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente PDB: Protein Data Bank RBS: secuencia de unión a ribosoma rpm: revoluciones por minuto RT-PCR: reacción de retrotranscripción acoplada a PCR σ: factor sigma de la ARN polimerasa SDS: dodecilsulfato sódico Abreviaturas iii SKI: siquimato quinasa I de E. coli T: timina Tm: temperatura de fusión o desnaturalización TBE: tampón Tris-borato-EDTA TE: tampón Tris-EDTA Tris: tri(hidroximetil)aminometano U: unidad de actividad enzimática UTP: uridina trifosfato UV: ultravioleta v/v: relación volumen-volumen X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido iv Índice v ÍÍNNDDIICCEE IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN 11 11.. BBiiooddeeggrraaddaacciióónn ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. 33 22.. CCaattaabboolliissmmoo aannaaeerróóbbiiccoo ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. 66 22..11 RRuuttaass ppeerriifféérriiccaass ddeell ccaattaabboolliissmmoo aannaaeerróóbbiiccoo ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. 77 22..22 RRuuttaass cceennttrraalleess ddeell ccaattaabboolliissmmoo aannaaeerróóbbiiccoo ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. 1100 22..22..11 RRuuttaa cceennttrraall ddeell ccaattaabboolliissmmoo ddeell bbeennzzooiill--CCooAA.. 1100 22..22..22 RRuuttaa aallttaa ddeell bbeennzzooiill--CCooAA.. 1111 22..22..33 RRuuttaa bbaajjaa ddeell bbeennzzooiill--CCooAA.. 1122 22..33 OOrrggaanniizzaacciióónn ggéénniiccaa ddee llaa rruuttaa ddee ddeeggrraaddaacciióónn ddeell bbeennzzooiill--CCooAA.. 1155 33.. RReegguullaacciióónn ddee llaa eexxpprreessiióónn ggéénniiccaa eenn rruuttaass ddee ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. 1199 33..11 RReegguullaacciióónn eessppeeccííffiiccaa ddee eeffeeccttoorr.. 2222 33..11..11 RReegguullaacciióónn eenn RR.. ppaalluussttrriiss.. 2222 33..11..22 RReegguullaacciióónn eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. 2255 33..22 RReegguullaacciióónn ddee llaa rruuttaa bbaajjaa ddeell bbeennzzooiill--CCooAA.. 3300 33..33 RReegguullaacciióónn ddee llaa rruuttaa ppeerriifféérriiccaa ddeell 44--hhiiddrrooxxiibbeennzzooaattoo ((44--HHBBAA)) eenn RR.. ppaalluussttrriiss.. 3322 33..44 RReegguullaacciióónn ddee llaass rruuttaass ppeerriifféérriiccaass ddee ddeeggrraaddaacciióónn ddee ttoolluueennoo yy eettiillbbeenncceennoo.. 3333 33..55 RReegguullaacciióónn ssoobbrreeiimmppuueessttaa.. 3388 33..55..11 RReegguullaacciióónn ddeeppeennddiieennttee ddee ooxxííggeennoo.. 3388 33..55..22 RReegguullaacciióónn ddee llaa rreepprreessiióónn ccaattaabbóólliiccaa.. 4400 OOBBJJEETTIIVVOOSS.. 4433 MMAATTEERRIIAALLEESS YY MMÉÉTTOODDOOSS.. 4477 11 CCeeppaass bbaacctteerriiaannaass yy pplláássmmiiddooss.. 4499 22 MMeeddiiooss yy ccoonnddiicciioonneess ddee ccuullttiivvoo.. 5522 22..11 MMeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo eemmpplleeaaddooss ppaarraa EE.. ccoollii.. 5522 22..22 MMeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo eemmpplleeaaddooss ppaarraa AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. 5533 Índice vi 22..33 AAnnttiibbiióóttiiccooss.. 5544 22..44 OObbtteenncciióónn ddee ccoonnddiicciioonneess aannaaeerróóbbiiccaass eenn llooss mmeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo.. 5544 22..55 CCoonnddiicciioonneess ddee ccuullttiivvoo.. 5555 22..66 CCoonnsseerrvvaacciióónn ddee llaass cceeppaass bbaacctteerriiaannaass.. 5555 33 TTééccnniiccaass ddee mmaanniippuullaacciióónn ddee AADDNN yy AARRNN.. 5566 33..11 AAiissllaammiieennttoo ddee AADDNN.. 5566 33..22 RReeaacccciióónn ddee aammpplliiffiiccaacciióónn eenn ccaaddeennaa ccoonn AADDNN ppoolliimmeerraassaa tteerrmmoorrrreessiisstteennttee ((PPCCRR)).. 5566 33..33 SSeeccuueenncciiaacciióónn ddee AADDNN.. 5599 33..44 DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddeell ssiittiioo ddee iinniicciioo ddee llaa ttrraannssccrriippcciióónn.. 5599 33..44..11 EExxttrraacccciióónn ddee AARRNN.. 5599 33..44..22 EExxtteennssiióónn ppoorr cceebbaaddoorr ((pprriimmeerr--eexxtteennssiioonn)).. 6600 33..55 EEnnssaayyooss ddee rreettrroottrraannssccrriippcciióónn--PPCCRR ((RRTT--PPCCRR)) eenn ttiieemmppoo rreeaall.. 6600 33..66 MMuuttaaggéénneessiiss ddiirriiggiiddaa ddeell ggeenn bbzzddRR.. 6611 33..77 CCoonnssttrruucccciióónn ddee llaa qquuiimmeerraa QQ11.. 6622 33..88 MMuuttaaggéénneessiiss ddiirriiggiiddaa ddeell ggeenn HHiiss66QQ11.. 6622 44 PPrroocceeddiimmiieennttooss ddee ttrraannssffeerreenncciiaa ggeennééttiiccaa.. 6633 44..11 TTrraannssffoorrmmaacciióónn ddee ccéélluullaass ddee EE.. ccoollii.. 6633 44..22 TTrraannssffeerreenncciiaa ddee pplláássmmiiddooss ppoorr ccoonnjjuuggaacciióónn.. 6633 44..33 CCoonnssttrruucccciióónn ddeell mmuuttaannttee AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBBddaaccppRR.. 6633 55 TTééccnniiccaass ddee mmaanniippuullaacciióónn ddee pprrootteeíínnaass.. 6644 55..11 EElleeccttrrooffoorreessiiss eenn ggeelleess ddee ppoolliiaaccrriillaammiiddaa--SSDDSS ((SSDDSS--PPAAGGEE)).. 6644 55..22 OObbtteenncciióónn ddee aannttiiccuueerrppooss aannttii--BBzzddRR.. 6644 55..33 TTééccnniiccaa ddee WWeesstteerrnn BBlloott.. 6655 55..44 SSoobbrreepprroodduucccciióónn yy ppuurriiffiiccaacciióónn ddee llaass pprrootteeíínnaass eexxpprreessaaddaass ddeessddee eell vveeccttoorr ddee eexxpprreessiióónn ppQQEE3322 óó ppQQEE6600.. 6655 55..55 EEnnssaayyooss ddee ccrroosssslliinnkkiinngg.. 6666 55..66 EEnnssaayyooss ddee ttrriippssiinniizzaacciióónn.. 6677 55..77 EEnnssaayyooss ddee fflluuoorreesscceenncciiaa.. 6677 55..88 DDiiccrrooííssmmoo cciirrccuullaarr ((CCDD)).. 6688 66 EEnnssaayyooss ddee eexxpprreessiióónn.. 6688 66..11 EEnnssaayyooss ddee aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa.. 6688 66..11..11 EEnnssaayyoo ddee aaccttiivviiddaadd ββ--ggaallaaccttoossiiddaassaa.. 6688 Índice vii 66..11..22 EEnnssaayyoo ddee aaccttiivviiddaadd ssiiqquuiimmaattoo qquuiinnaassaa.. 6699 66..22 EEnnssaayyooss ddee ttrraannssccrriippcciióónn iinn vviittrroo.. 7700 66..33 EEnnssaayyooss ddee mmoonnoo--hhííbbrriiddoo.. 7700 66..44 IInnmmuunniiddaadd ffrreennttee aa llaa iinndduucccciióónn ddeell cciicclloo llííttiiccoo ddeell ffaaggoo λλ.. 7711 77 EEnnssaayyooss ddee uunniióónn ddee pprrootteeíínnaa aa AADDNN.. 7711 77..11 MMaarrccaajjee ddee ssoonnddaass rraaddiiaaccttiivvaass.. 7711 77..22 EEnnssaayyooss ddee rreettaarrddoo eenn ggeell.. 7722 77..33 EEnnssaayyooss ddee pprrootteecccciióónn ffrreennttee aa llaa ddiiggeessttiióónn ccoonn DDNNaassaa II ((ffoooottpprriinnttiinngg)).. 7722 77..44 EEnnssaayyoo ddee ffoooottpprriinnttiinngg ccoonn ppeerrmmaannggaannaattoo ppoottáássiiccoo ((KKMMnnOO44)).. 7733 77..55 EEnnssaayyooss ddee uullttrraacceennttrriiffuuggaacciióónn aannaallííttiiccaa.. 7744 77..66 CCrriissttaalliizzaacciióónn ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 7744 77..77 AAnnáálliissiiss ddee llaa eessttrruuccttuurraa ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR mmeeddiiaannttee mmiiccrroossccooppííaa eelleeccttrróónniiccaa yy rreeccoonnssttrruucccciióónn ddee ppaarrttííccuullaass iinnddiivviidduuaalleess.. 7755 77..88 AAnnáálliissiiss ddee llaa iinntteerraacccciióónn pprrootteeíínnaa--AADDNN mmeeddiiaannttee mmiiccrroossccooppííaa ddee ffuueerrzzaass aattóómmiiccaass ((AAFFMM)).. 7766 77..88..11 FFoorrmmaacciióónn ddee llooss ccoommpplleejjooss pprrootteeíínnaa--AADDNN.. 7777 77..88..22 PPrreeppaarraacciióónn yy vviissuuaalliizzaacciióónn ddee llaa mmuueessttrraa ddee AAFFMM.. 7777 88 AAnnáálliissiiss ddee sseeccuueenncciiaa yy eessttrruuccttuurraa.. 7777 88..11 AAnnáálliissiiss ddee llooss ddaattooss ddee sseeccuueenncciiaa.. 7777 88..22 MMooddeelloo ddee AAccppRR.. 7788 88..33 NNúúmmeerroo ddee aacccceessoo ddee llaa sseeccuueenncciiaa ddee nnuucclleeóóttiiddooss ddeell ggeenn aaccppRR.. 7788 RREESSUULLTTAADDOOSS.. 7799 OObbjjeettiivvoo 11.. EEssttuuddiioo ddee llaa rreegguullaacciióónn ddeeppeennddiieennttee ddee ooxxííggeennoo ddee llaa rruuttaa ddee ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. 8811 11..11 PPaappeell ddeell ooxxííggeennoo eenn llaa eexxpprreessiióónn ddee llooss ggeenneess ddeell cclluusstteerr bbzzdd.. 8811 11..22 PPaappeell ddee llaa pprrootteeíínnaa FFnnrr eenn llaa aaccttiivviiddaadd ddeell pprroommoottoorr PPNN.. 8822 11..33 UUnniióónn ddee llaa pprrootteeíínnaa FFnnrr** aall pprroommoottoorr PPNN.. 8844 11..44 AAccttiivvaacciióónn ttrraannssccrriippcciioonnaall ddeell pprroommoottoorr PPNN mmeeddiiaaddaa ppoorr llaa pprrootteeíínnaa FFnnrr.. 8866 11..55 LLaa pprrootteeíínnaa AAccppRR eessttáá iinnvvoolluuccrraaddaa eenn llaa aaccttiivvaacciióónn ddeell pprroommoottoorr PPNN eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. 9911 11..66 LLaa pprrootteeíínnaa FFnnrr ddee EE.. ccoollii ssee ccoommppoorrttaa ccoommoo uunn rreegguullaaddoorr ddee llaa rruuttaa cceennttrraall ddee ddeeggrraaddaacciióónn ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. 9955 Índice viii OObbjjeettiivvoo 22.. EEssttuuddiioo ddeell pprroommoottoorr PPRR ddeell ggeenn bbzzddRR yy ssuu iimmpplliiccaacciióónn eenn llaa rreegguullaacciióónn ddee llaa ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. 9977 22..11 BBzzddRR aauuttoorrrreegguullaa ssuu pprrooppiiaa eexxpprreessiióónn.. 9977 22..22 CCaarraacctteerriizzaacciióónn ddee llaa iinntteerraacccciióónn BBzzddRR--PPRR.. 9999 22..33 PPaappeell ddeell ooxxííggeennoo eenn llaa eexxpprreessiióónn ddeell ggeenn bbzzddRR.. 110011 22..44 PPaappeell ddee ffuueenntteess ddee ccaarrbboonnoo aaddiicciioonnaalleess eenn llaa eexxpprreessiióónn ddeell ggeenn bbzzddRR.. 110022 OObbjjeettiivvoo 33.. EEssttuuddiioo ffuunncciioonnaall yy eessttrruuccttuurraall ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 110044 33..11 EEssttuuddiiooss ssoobbrree llaa eessttrruuccttuurraa ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 110044 33..11..11 HHiippeerrpprroodduucccciióónn ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 110044 33..11..22 DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee llaa eessttrruuccttuurraa nnaattiivvaa ddee BBzzddRR mmeeddiiaannttee mmiiccrroossccooppííaa eelleeccttrróónniiccaa.. 110055 33..22 LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR eessttáá ccoonnssttiittuuiiddaa ppoorr ddooss ddoommiinniiooss ffuunncciioonnaalleess.. 110066 33..22..11 EEssttuuddiioo ddeell ddoommiinniioo NNBBzzddRR.. 110088 33..22..11..11 EEll ddoommiinniioo NNBBzzddRR ssee uunnee yy rreepprriimmee aall pprroommoottoorr PPNN.. 110088 33..22..11..22 EEssttaaddoo ddee oolliiggoommeerriizzaacciióónn ddee BBzzddRR yy ddeell ddoommiinniioo NNBBzzddRR.. 111111 33..22..22 EEssttuuddiioo ddeell ddoommiinniioo CCBBzzddRR.. 111133 33..22..33 EEssttuuddiioo ddeell lliinnkkeerr ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR ((LLBBzzddRR)).. 111177 33..22..33..11 AAnnáálliissiiss eessttrruuccttuurraall ddee llaa rreeggiióónn LLBBzzddRR.. 111177 33..22..33..22 AAnnáálliissiiss ffuunncciioonnaall ddee llaa rreeggiióónn LLBBzzddRR.. 112200 33..33 AAnnáálliissiiss ddeell ccaammbbiioo ccoonnffoorrmmaacciioonnaall ssuuffrriiddoo ppoorr llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR eenn pprreesseenncciiaa ddeell iinndduuccttoorr.. 112244 OObbjjeettiivvoo 44.. LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR ccoommoo mmooddeelloo ppaarraa llaa ssíínntteessiiss ddee nnuueevvooss rreegguullaaddoorreess ffuunncciioonnaalleess.. 112277 44..11 LLaa pprrootteeíínnaa qquuiimméérriiccaa QQλλ ccoonnttrroollaa eell cciicclloo llííttiiccoo ddeell ffaaggoo llaammbbddaa.. 112277 44..22 LLaa pprrootteeíínnaa qquuiimméérriiccaa QQ11:: uunn nnuueevvoo rreepprreessoorr ttrraannssccrriippcciioonnaall ccoonn aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa.. 112299 44..22..11 FFuunncciioonnaalliiddaadd ddeell ddoommiinniioo NN--tteerrmmiinnaall ((NNBBzzddRRLL)) ddee llaa qquuiimmeerraa QQ11.. 112299 44..22..22 FFuunncciioonnaalliiddaadd ddeell ddoommiinniioo CC--tteerrmmiinnaall ((SSKKII)) ddee llaa qquuiimmeerraa QQ11.. 113311 44..22..33 LLaa qquuiimmeerraa QQ11 aaddqquuiieerree uunnaa nnuueevvaa ffuunncciióónn.. 113333 44..22..44 PPaappeell ddeell lliinnkkeerr eenn llaa qquuiimmeerraa QQ11.. 113399 Índice ix OObbjjeettiivvoo 55.. EEssttuuddiioo ddee llaa iinntteerraacccciióónn eennttrree llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR yy eell pprroommoottoorr PPNN.. 114433 55..11 EEll pprroommoottoorr PPNN ssee ddiivviiddee eenn ttrreess rreeggiioonneess ddee iinntteerraacccciióónn ccoonn llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 114433 55..22 TTiippoo ddee iinntteerraacccciióónn yy nnúúmmeerroo ddee mmoollééccuullaass iimmpplliiccaaddaass.. 114477 55..22..11 EExxppeerriimmeennttooss ddee uullttrraacceennttrriiffuuggaacciióónn aannaallííttiiccaa.. 114477 55..22..22 EExxppeerriimmeennttooss ddee mmiiccrroossccooppííaa ddee ffuueerrzzaass aattóómmiiccaass ((AAFFMM)).. 114499 DDIISSCCUUSSIIÓÓNN.. 115577 DDiissccuussiióónn 11.. EEssttuuddiioo ddee llaa rreegguullaacciióónn ddeeppeennddiieennttee ddee ooxxííggeennoo ddee llaa rruuttaa ddee ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. 115599 11..11 PPaappeell ddeell ooxxííggeennoo eenn llaa eexxpprreessiióónn ddee ggeenneess ddeell ccaattaabboolliissmmoo aannaaeerróóbbiiccoo ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. 115599 11..22 LLaa pprrootteeíínnaa FFnnrr ssee uunnee aall pprroommoottoorr PPNN yy eess nneecceessaarriiaa eenn ssuu aaccttiivvaacciióónn ttrraannssccrriippcciioonnaall.. 116600 11..33 EEll oorrttóóllooggoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB ddee FFnnrr ddee EE.. ccoollii eessttáá iinnvvoolluuccrraaddoo eenn llaa aaccttiivvaacciióónn ddeell pprroommoottoorr PPNN.. 116622 DDiissccuussiióónn 22.. EEssttuuddiioo ddeell pprroommoottoorr PPRR ddeell ggeenn bbzzddRR yy ssuu iimmpplliiccaacciióónn eenn llaa rreegguullaacciióónn ddee llaa ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. 116688 22..11 BBzzddRR ssee uunnee aa ssuu pprrooppiioo pprroommoottoorr PPRR yy aauuttoorrrreegguullaa ssuu pprrooppiiaa eexxpprreessiióónn.. 116688 22..22 PPaappeell ddeell ooxxííggeennoo eenn llaa eexxpprreessiióónn ddeell ggeenn bbzzddRR.. 116699 DDiissccuussiióónn 33.. EEssttuuddiioo ffuunncciioonnaall yy eessttrruuccttuurraall ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 117711 33..11 LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR eessttáá ccoonnssttiittuuiiddaa ppoorr ddooss ddoommiinniiooss ffuunncciioonnaalleess.. 117711 33..22 EEll ddoommiinniioo NNBBzzddRR eess uunn ssuuppeerr--rreepprreessoorr ddeell pprroommoottoorr PPNN.. 117722 33..33 EEll lliinnkkeerr ddee BBzzddRR eess nneecceessaarriioo,, ppeerroo nnoo ssuuffiicciieennttee eenn eell pprroocceessoo ddee ddiimmeerriizzaacciióónn.. 117733 33..44 EEll ddoommiinniioo CCBBzzddRR mmooddiiffiiccaa ssuu ccoonnffoorrmmaacciióónn aall uunniirrssee eell iinndduuccttoorr,, bbeennzzooiill--CCooAA.. 117777 33..55 AAnnáálliissiiss ddee llooss ddaattooss ddee eessttrruuccttuurraa oobbtteenniiddooss ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 118800 33..66 UUnn mmooddeelloo ddee aacccciióónn ppaarraa llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 118833 Índice x DDiissccuussiióónn 44.. LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR ccoommoo mmooddeelloo ppaarraa llaa ggeenneerraacciióónn ddee nnuueevvooss rreegguullaaddoorreess ffuunncciioonnaalleess.. 118888 44..11 LLaa pprrootteeíínnaa qquuiimméérriiccaa QQλλ eess ccaappaazz ddee ccoonnttrroollaarr eell cciicclloo llííttiiccoo ddeell ffaaggoo llaammbbddaa uuttiilliizzaannddoo bbeennzzooiill--CCooAA ccoommoo iinndduuccttoorr.. 118888 44..22 LLaa pprrootteeíínnaa qquuiimméérriiccaa QQ11:: uunn rreepprreessoorr ttrraannssccrriippcciioonnaall ccoonn aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa.. 119900 44..33 PPaappeell ddeell lliinnkkeerr eenn llaass qquuiimmeerraass QQ11 yy QQ22.. 220011 44..44 MMooddeelloo ssoobbrree eell oorriiggeenn eevvoolluuttiivvoo ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 220022 DDiissccuussiióónn 55.. EEssttuuddiioo ddee llaa iinntteerraacccciióónn eennttrree llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR yy eell pprroommoottoorr PPNN.. 220099 55..11 EEll pprroommoottoorr PPNN ssee ddiivviiddee eenn ttrreess rreeggiioonneess ddee iinntteerraacccciióónn ccoonn llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. 220099 55..22 TTiippoo ddee iinntteerraacccciióónn yy nnúúmmeerroo ddee mmoollééccuullaass iimmpplliiccaaddaass.. 221122 55..33 MMooddeelloo ddee iinntteerraacccciióónn ddeell ccoommpplleejjoo BBzzddRR--PPNN.. 221155 CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS.. 221199 BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA.. 222255 1 IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN 2 Introducción 3 IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN 11.. BBiiooddeeggrraaddaacciióónn ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. Los compuestos aromáticos, como los componentes de la lignina, los flavonoides, las quinonas, los aminoácidos aromáticos, los componentes de los combustibles fósiles, son los compuestos orgánicos más extendidos en la naturaleza después de los carbohidratos. De hecho, se estima que la lignina conforma aproximadamente el 25% de la biomasa terrestre, siendo el segundo polímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa (Alder, 1977). Además, a lo largo del último siglo se han incrementado de forma considerable la liberación de compuestos aromáticos a la biosfera como consecuencia de la revolución industrial. Muchos de estos compuestos aromáticos pertenecen al grupo de los xenobióticos, compuestos creados por el hombre que contienen sustituyentes que no existen o se encuentran raramente en la naturaleza, lo que impide que puedan ser degradados o lo hagan muy lentamente (Pieper & Reineke, 2000). La gran estabilidad termodinámica del anillo de benceno, debida a su estructura resonante, es la responsable de su persistencia en el medio ambiente. Además, la elevada hidrofobicidad de estos compuestos los convierte en una fuente importante de contaminación ambiental por su elevada toxicidad. De estos contaminantes, cabe destacar especialmente a los que conforman el grupo denominado BTEX, benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos, debido a que son producidos en grandes cantidades y actúan como contaminantes de acuíferos y de sedimentos procedentes de filtraciones o vertidos de petróleo o derivados de este (Lin et al., 2002). De igual forma, existen otros compuestos aromáticos muy contaminantes como los derivados polihalogenados de las dioxinas y los bifenilos (PCBs), compuestos nitroaromáticos y derivados fenólicos halogenados (Abraham et al., 2002; Haggblom et al., 2000). Todos estos compuestos poseen diversos índices de toxicidad que pueden llegar a provocar desde leves daños dermatológicos hasta graves afecciones del sistema nervioso central o leucemias (Chee-Sanford et al., 1996). Los microorganismos juegan un papel crucial en el reciclaje del carbono y el mantenimiento de la biosfera (Dagley, 1978), desarrollando diversas estrategias para conseguir degradar la mayor parte de los compuestos orgánicos que se encuentran en la naturaleza, incluyendo a los aromáticos más recalcitrantes. Además, la promiscuidad Introducción 4 que muestran las enzimas catabólicas codificadas por genes implicados en el catabolismo, permite a las bacterias degradar, al menos en ciertos casos, los compuestos xenobióticos cuyas estructuras se asemejan a la de compuestos aromáticos naturales (Diaz, 2004; McLeod, 2008). Con el fin de degradar los compuestos aromáticos, el catabolismo bacteriano ha evolucionado hasta dar lugar a una amplia variedad de rutas periféricas que engloban todas aquellas reacciones enzimáticas que convierten los compuestos aromáticos en unos pocos intermediarios centrales (rutas centrales) con menor estabilidad termodinámica (Heider & Fuchs, 1997). Existen dos estrategias principales para degradar compuestos aromáticos dependiendo de la presencia o ausencia de oxígeno. En el catabolismo aeróbico de aromáticos, el cual ha sido ampliamente estudiado a lo largo de varias décadas, el oxígeno es la única molécula que puede actuar como aceptor final de electrones, y además es clave como co-sustrato en dos procesos esenciales, como son la hidroxilación y la rotura del anillo aromático llevadas a cabo por oxigenasas (Parales, 2006; Vaillancourt et al., 2006). En el catabolismo anaeróbico, estudiado desde hace solamente unos pocos años, los compuestos aromáticos utilizan una estrategia totalmente diferente, basada en reacciones de reducción capaces de hidrolizar el anillo aromático (Fuchs, 2008; Gibson & C, 2002), utilizando como aceptor final de electrones compuestos inorgánicos como el NO3¯ (que es reducido a NO2¯ o a N2) (Spormann & Widdel, 2000), el Fe3+ (que es reducido a Fe2+) (Coates et al., 2001) o el SO4 2¯ (que es reducido a SO3 2¯ o a SO2¯) (Morasch et al., 2004; Peters et al., 2004), u otros menos comunes como el Mn4+, el ClO4¯, el Cr4+, el V4+, el óxido de trimetilamina, e incluso algunos compuestos orgánicos como el dimetil sulfóxido (DMSO), el fumarato, etc. (Coates et al., 2002; Chakraborty & Coates, 2004; Gibson & C, 2002; Lovley, 2003). Por último, cabría hacer mención de un tercer tipo de catabolismo, la fermentación, donde la fuente de carbono es degradada anaeróbicamente por medio de una serie de reacciones en las cuales ciertos compuestos orgánicos actúan como aceptores de electrones, generando ATP mediante fosforilación a nivel de sustrato, razón por la cual no se requiere una cadena de transporte de electrones. Sin embargo, la fermentación no permite la mineralización de compuestos aromáticos, sino que los transforma en ácidos orgánicos de cadena corta que serán posteriormente mineralizados por microorganismos metanógenos que establecen una asociación simbiótica con aquellos microorganismos fermentadores (Elshahed et al., 2001; Evans & Fuchs, 1988). Introducción 5 Los procesos de degradación aeróbica han adquirido gran importancia a nivel ecológico por su capacidad para eliminar y mineralizar compuestos aromáticos presentes en determinados ambientes. Sin embargo, su relevancia se ha visto sobrestimada con respecto a los procesos de degradación anaeróbica, ya que muchos de los ambientes susceptibles de sufrir contaminación de compuestos aromáticos suelen ser ambientes anóxicos, como es el caso de acuíferos, sedimentos acuáticos, zonas del subsuelo, lumen intestinal, o ambientes con elevadas concentraciones de carbono, donde el oxígeno se consume más rápidamente que el tiempo que tarda en reponerse (Lovley, 2003). Por ejemplo, en los acuíferos contaminados con hidrocarburos se puede apreciar la formación de compartimentos con diferentes potenciales redox, donde diversas comunidades microbianas son capaces de utilizar localmente los donadores y aceptores de electrones disponibles para llevar a cabo el proceso de biodegradación posible por los parámetros redox de su entorno (Lovley, 2001; Lovley, 2003). Además, debido a la baja reactividad química de los compuestos aromáticos, su biodegradación anaeróbica requiere reacciones bioquímicas muy atípicas, lo cual es de gran interés, tanto desde el punto de vista bioquímico o evolutivo, como desde el punto de vista biotecnológico. Entre estas novedosas reacciones enzimáticas, cabría destacar aquellas implicadas en la reducción anaeróbicas del anillo del benceno (reducción de Birch) o en la carboxilación anaeróbica del fenol (carboxilación de Kolbe-Schmitt), las cuales sólo habían sido descritas en el campo de la química orgánica (Fuchs, 2008). No obstante, aunque se han estudiado con cierta profundidad determinadas rutas periféricas y centrales de la degradación anaeróbica de compuestos aromáticos, aún no han sido bien establecidas las bases genéticas y los mecanismo de regulación subyacentes de la degradación anaeróbica de compuestos aromáticos, debido, principalmente, a las dificultades que entraña tanto el trabajo en condiciones anaeróbicas, como el crecimiento y la manipulación genética de los microorganismos degradadores de compuestos aromáticos. Los últimos avances en la secuenciación de genomas han aportado el primer perfil genético completo de cinco diferentes especies bacterianas capaces de degradar anaeróbicamente compuestos aromáticos, utilizando diferentes aceptores de electrones, que pertenecen a diferentes subgrupos de proteobacterias: la α-proteobacteria fototrofa Rhodopseudomonas palustris CGA009 (Larimer et al., 2004), la α-proteobacteria desnitrificante Magnetospirillum magnetotacticum AMB-1 (Matsunaga et al., 2005), la β-proteobacteria desnitrificante Introducción 6 Azoarcus sp. EbN1 (propuesta para ser rebautizada con el nombre de “Aromatoleum aromaticum” EbN1) (Rabus et al., 2005), y dos anaerobios estrictos, la δ-proteobacteria reductora de hierro Geobacter metallireducens GS-15 (Butler et al., 2007) y la δ- proteobacteria fermentadora Syntrophus aciditrophicus SB (McInerney et al., 2007) (Tabla 1). Tabla 1. Comparación de las características más relevantes de los biodegradadores anaeróbicos cuyo genoma ha sido totalmente secuenciado. Características R. palustris CGA009 M. magnetotacticum AMB-1 Azoarcus sp. EbN1 G. metallireducens GS-15 S. aciditrophicus SB Clasificación taxonómica α-Proteobacteria α-Proteobacteria β-Proteo- bacteria δ-Proteobacteria δ-Proteobacteria Hábitat Acuático Acuático Sedimentos acuáticos Múltiples Múltiples Principales aceptores de electrones O2, fototrófico O2 (microaerófilo), NO3 O2, NO3¯, NO2¯ Fe(III), Mn(IV), NO3¯, NO2, Co(III), U(VI), Cr(VI) Fermentador Tª óptima de crecimiento 25-30 30 31 30 35 Morfología Barra Espiral Barra Barra Barra Motilidad Sí Sí No Sí No Fuentes de carbono aromáticas en condiciones anaeróbicas p-coumarato, cinamato, ferulato, cafeico, 3- fenilpropionato, 5-fenilvalerato, mandelato, 4- hidroxibenzoato, 3- hidroxibenzoato, benzoato Benzoato, fenilacetato Tolueno, etilbenceno, fenilacetato, antranilato, fenol, p- cresol, p- etilfenol, fenilalanina, benzil alcohol, 3- hidroxi- benzoato, 4- hidroxi- benzoato, benzoato Tolueno, fenol, p- cresol, bencil alcohol, benzaldehido, 4- hidroxibenzoato, benzoato Benzoato Tamaño del cromosoma (pb) 5.459.213 4.967.148 4.296.230 3.997.420 3.179.300 Plásmidos (kb) 8.4 --- 207/223 13.7 --- Contenido en G+C (%) 65.0 65.1 65.1 59.5 51.4 ORFs 4.836 4.559 4.603 3.532 3.169 Elementos IS 16 33 237 --- 37 22.. CCaattaabboolliissmmoo aannaaeerróóbbiiccoo ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. Como se ha señalado anteriormente, un ecosistema cuyo consumo de oxígeno exceda respecto del aporte de esta molécula al medio, constituirá un ecosistema anóxico. Estos ecosistemas han demostrado estar ampliamente distribuidos en la Introducción 7 naturaleza, lo cual ha revestido de gran importancia a los organismos capaces de degradar compuestos aromáticos en estos ambientes anaeróbicos. Sin embargo, la degradación anaeróbica de compuestos aromáticos ha sido estudiada tan solo en unos pocos microorganismos como R. palustris, T. aromatica o Azoarcus evansii, además de algunas otras bacterias reductoras de hierro o azufre. Entre los organismos encontrados en los ambientes anóxicos, cabe destacar la frecuente presencia de miembros del género Azoarcus, aislados por primera vez en la rizosfera de zonas tropicales y subtropicales, y catalogados inicialmente como organismos no desnitrificantes (Reinhold-Hurek et al., 1993) y con actividad nitrogenasa (Fries et al., 1994). Diversos estudios posteriores ampliaron el número de especies aisladas, revelando algunos microorganismos del género Azoarcus que también eran capaces de crecer anaeróbicamente en condiciones desnitrificantes en presencia de diversos compuestos aromáticos como única fuente de carbono. Entre las nuevas especies se pudieron encontrar anaerobios estrictos, como A. anaerobius (Springer et al., 1998), y anaerobios facultativos, como A. evansii (Anders et al., 1995), A. tolulyticus (Zhou et al., 1995), A. toluvorans (Fries et al., 1994; Song et al., 1999), A. toluclasticus (Song et al., 1999) y A. buckelii (Mechichi et al., 2002). Todos los miembros del género Azoarcus son móviles gracias, en la mayoría de los casos, a la presencia de un único flagelo polar (Anders et al., 1995; Song et al., 1999), y casi todos ellos, presentan una morfología de diplobacilo, con algunas excepciones de cepas crecidas en m-xileno en condiciones desnitrificantes, donde la morfología observada fue de tipo coco (Hess et al., 1997). A lo largo de este trabajo, se ha trabajado con una de las últimas especies caracterizadas de éste género, Azoarcus sp. CIB, aislada por López- Barragán y col. (2004), la cual es capaz de degradar anaeróbicamente diversos compuestos aromáticos como m-xileno, tolueno, benzoato, etc. A continuación, se mostrará un breve repaso de los principales clusters génicos que codifican las rutas periféricas y centrales de degradación de compuestos aromáticos, centrando la atención en la ruta de degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB. 22..11 RRuuttaass ppeerriifféérriiccaass ddeell ccaattaabboolliissmmoo aannaaeerróóbbiiccoo ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. Tal y como se señaló anteriormente, las rutas periféricas son aquellas responsables de eliminar los grupos funcionales, promoviendo la pérdida de estabilidad termodinámica, de los distintos compuestos aromáticos para dar lugar a la formación de Introducción 8 unos pocos intermediarios centrales que prosigan posteriormente su biodegradación a través de las rutas centrales. En el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos, la mayoría de las rutas periféricas convergen en el intermediario central benzoil-CoA (Figura 1) (Harwood, 1999; Heider & Fuchs, 1997), si bien se han descrito otros intermediarios. Aunque en algunos casos las rutas periféricas implican una única reacción, como es el caso de la activación de ciertos ácidos aromáticos (benzoato, 3- hidroxibenzoato, 3-metilbenzoato, 2-aminobenzoato) a sus correspondientes ésteres de aril-CoA, existen otros muchos compuestos aromáticos que son convertidos en benzoil- CoA a través de rutas periféricas con múltiples pasos, cuyos genes no suelen estar ligados al cluster de degradación de benzoil-CoA. En cualquier caso, se ha podido establecer que todo aquel compuesto que sea metabolizado por medio de la ruta del benzoil-CoA debe poseer un grupo carboxilo, o bien un grupo alquilo capaz de oxidarse a su correspondiente carboxilo. Si no fuera así, el compuesto ha de ser carboxilado específicamente para generar el correspondiente ácido aromático al inicio del metabolismo (Gibson & C, 2002; Schuhle & Fuchs, 2004). De igual forma, los compuestos aromáticos que confluyen en el benzoil-CoA deben sufrir una conversión a tioésteres de CoA mediante la acción de diversas enzimas CoA ligasas. El grupo CoA juega un papel desestabilizador del anillo aromático equivalente al que ejercen los grupos hidroxilo en el catabolismo aeróbico (Heider & Fuchs, 1997). Se han identificado y estudiado diversas CoA ligasas implicadas en el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos en diversos microorganismos, de las cuales las benzoato- CoA ligasas (Egland et al., 1995; Schuhle et al., 2003), las 4-hidroxibenzoato-CoA ligasas de R. palustris y T. aromatica (Biegert et al., 1993; Gibson et al., 1994), la p- hidroxibenzoato-CoA ligasa de G. metallireducens (Peters et al., 2007) y la fenilacetato-CoA ligasa de A. evansii (Mohamed, 1993) han sido las mejor caracterizadas. Introducción 9 Figura 1. Rutas periféricas del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos. Muestra de un amplio rango de compuestos aromáticos que son degradados a través de diferentes rutas periféricas a un limitado número de intermediarios centrales (recuadrados en color transparente), como el benzoil-CoA (BzCoA), el 2-aminobenzoil-CoA (2-AminoBzCoA), el 3-hidroxibenzoil-CoA (3-HidroxiBzCoA), el 3- metilbenzoil-CoA (3-MetilBzCoA), el 6-hidroxinicotinato, el resorcinol, el floroglucinol, la hidroxihidroquinona, que son desaromatizados y enviados por medio de las rutas centrales al metabolismo central de la célula. La desaromatización de estos intermediarios centrales puede implicar el uso de ferredoxina (Fd) y energía (flechas marrones), de únicamente de ferredoxina (flechas azules) o de NAD(P)H (flechas verdes), como donadores de electrones. También se indica la desaromatización oxidativa descrita en el caso de la hidroxihidroquinona (flecha amarilla). Tal y como se puede apreciar, algunos de los compuestos aromáticos pueden ser degradados a través de diferentes rutas periféricas y centrales, dependiendo del potencial redox del aceptor final de electrones de la célula hospedadora. COO-COO- Benzoato COO-COO- Fenilacetato COSCoACOSCoA CH2OHCH2OH Bencilalcohol COO- NH2 COO- NH2 L-fenilalanina CH3 OH CH3 OH p-cresol COO- OH COO- OH 4-Hidroxibenzoato p-coumarato OH CHO OCH3 OH CHO OCH3 Vanilina COO- NH2 COO- NH2 4-Aminobenzoato OH OH OH OH Hidroquinona COO-COO- Fenilpropionato NH2NH2 Anilina CH3CH3 Etilbenceno CH3CH3 Tolueno OH COO- OH COO- OH COO- OH COO- 2-Hidroxibenzoato COO- Cl COO- Cl 3-Clorobenzoato HO COO- OH HO COO- OH Gentisato COO- COO- COO- COO- o-ftalato OH COO- OH COO- p-hidroxifenilacetato OH CH3 OH CH3 p-etilfenol Metabolismo Metabolismo centralcentral BzCoA NH2 COO- NH2 COO- 2-Aminobenzoato Triptófano N H N H N H CH2 CH NH2 COO- N H CH2 CH NH2 COO- Indol NH2 COSCoA NH2 COSCoA 2-AminoBzCoA OHOH Fenol CH3 OH CH3 OH CH3 COO- CH3 COO- o-cresol 3-Metilbenzoato CH3 CH3 CH3 CH3 m-xileno COSCoA CH3 COSCoA CH3 3-MetilBzCoA COO- OH COO- OH 3-Hidroxi benzoato OH OH OH OH Catecol OH OH COO- OH OH COO- Protocatecuato CH3 OH CH3 OH m-cresol OH OH COO- OH OH COO- 2,3-Dihidroxi benzoato COSCoA OH COSCoA OH 3-Hidroxi BzCoA OH COO- OH COO- HO OHHO OH Resorcinol 3-Hidroxibenzoato HO OH COO- HO OH COO- α-resorcilato OH OH OH OH Hidroquinona Hidroxihidro quinona HO OH OH HO OH OHOH OHHO OH OHHO Pirogalol OH OHHO COO- OH OHHO COO- Galato OH OH OH OH OH OH OH HO OH OH HO OH Floroglucinol Hidroxihidro quinona Resorcinol HO OHHO OH N COO- HO N COO- HO 6-Hidroxi nicotinato N COO- N COO- Nicotinato HO OH COO- HO OH COO- γ-resorcilato OH OH COO- OH OH COO- β-resorcilato Fd, energía Fd NAD(P)H Introducción 10 Las CoA ligasas precisan de un cofactor, el Mg2+, así como de dos sustratos, CoA y ATP, para llevar a cabo su actividad enzimática correspondiente. El CoA es incorporado al compuesto aromático y el ATP se hidroliza a AMP + 2Pi. No obstante, aparte de la esterificación con CoA como mecanismo de degradación anaeróbica de compuestos aromáticos, también existen otra serie de mecanismos implicados en las reacciones de algunos compuestos que derivan en floroglucinol, resorcinol o hidroxihidroquinona, los cuales no requieren activación mediada por CoA para poder ser degradados (Schink et al., 2000). 22..22 RRuuttaass cceennttrraalleess ddeell ccaattaabboolliissmmoo aannaaeerróóbbiiccoo ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. Después de la conversión de un compuesto aromático en un intermediario de la ruta central por medio de la ruta periférica de degradación, el intermediario entrará en la ruta central correspondiente para ser catabolizado hasta intermediarios del metabolismo central. Como se ha visto en el apartado anterior, los principales intermediarios del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos son homocíclicos, es decir, presentan una estructura basada en un anillo de benceno: benzoil-CoA (y sus derivados 2-amino, 3-hidroxi y 3-metil), floroglucinol, hidroxihidroquinona y resorcinol (Figura 1) (Fuchs, 2008; Gibson & C, 2002; Harwood, 1999; Heider & Fuchs, 1997). Basándose en el intermediario formado a partir de un determinado compuesto aromático, así como en el potencial redox del aceptor de electrones, los microorganismos han desarrollado diversas rutas centrales que transforman dichos intermediarios en compuestos susceptibles de entrar en el metabolismo energético central de la célula. De todas las rutas centrales estudiadas, a continuación se tratará una de las mejor caracterizadas, debido a que algunos aspectos de su regulación han sido objeto de esta tesis. 2.2.1 Ruta central del catabolismo del benzoil-CoA. El benzoato, al ser el compuesto aromático más comúnmente degradado por los microorganismos, ha sido utilizado como compuesto modelo para el estudio de la principal ruta anaeróbica de degradación de compuestos aromáticos, la ruta central del benzoil-CoA. El catabolismo anaeróbico de benzoato vía benzoil-CoA ha sido estudiado a nivel molecular en algunos microorganismos anaerobios facultativos como T. aromatica (Breese et al., 1998), Azoarcus spp. (Fuchs, 2008; Harwood, 1999; López Barragán et al., 2004a), Magnetospirillum spp. (López Introducción 11 Barragán et al., 2004b; Shinoda et al., 2005b), R. palustris (Egland et al., 1997), G. metallireducens (Wischgoll et al., 2005) y S. aciditrophicus (McInerney et al., 2007). En todos ellos, la degradación de benzoato tiene lugar a través de una ruta periférica que consiste en una única reacción que activa el benzoato a benzoil-CoA mediante la acción de una benzoato-CoA ligasa dependiente de ATP (Figura 2). De esta forma, el benzoil-CoA puede ser degradado a acetil-CoA y CO2 a través de una serie de reacciones que constituyen la ruta central del benzoil-CoA, la cual se divide en dos partes: la ruta alta, que convierte el benzoil-CoA en un compuesto alifático C7-dicarboxil-CoA, y la ruta baja, que convierte el éster C7-dicarboxílico de CoA en acetil-CoA y CO2 (Figura 2) (Blazquez et al., 2008; Carmona & Diaz, 2005). 2.2.2 Ruta alta del benzoil-CoA. La ruta alta del benzoil-CoA se divide a su vez en dos pasos metabólicos principales, la reducción del anillo aromático del benzoil-CoA y la β-oxidación que dará lugar al éster de CoA que entrará en la ruta baja (Figura 2). a) Reducción del anillo aromático: este paso es clave en el proceso de degradación anaeróbica de benzoil-CoA, ya que elimina el carácter aromático del anillo. Esta reacción es catalizada por la benzoil-CoA reductasa (BCR), la única enzima sensible a la presencia de oxígeno de la ruta del benzoil-CoA. La reducción de benzoil-CoA parece tener lugar mediante un mecanismo semejante a la reacción de Birch, en la cual se produce una transferencia secuencial de electrones y protones a potenciales redox extremadamente bajos (Boll et al., 2002; Boll, 2005a; Boll, 2005b). Esta reducción es facilitada por el grupo tioéster, lo cual explica por qué las rutas anaeróbicas suelen utilizar tioésteres de CoA en el proceso de degradación (Fuchs, 2008). Se han descrito dos variantes del proceso de reducción del benzoil-CoA: en T. aromatica, Azoarcus spp., G. metallireducens y S. aciditrophicus el benzoil-CoA es reducido a ciclohex-1,5-dieno-1-carbonil-CoA, mientras que en R. palustris, el dienoil-CoA sufre una reducción adicional dando lugar a ciclohex-1-eno-1- carbonil-CoA (Figura 2) (Boll, 2005a; Boll, 2005b; Carmona & Diaz, 2005; Egland et al., 1997). b) β-oxidación modificada: tras la formación del correspondiente (di)enoil-CoA cíclico por la acción de la BCR, se producen una serie de reacciones similares Introducción 12 a las de la β-oxidación, en la cual se incorpora una molécula de agua al doble enlace mediante la acción de una acil-CoA hidratasa, una deshidrogenación mediada por una hidroxiacil-CoA deshidrogenasa y, finalmente, la hidrólisis del anillo por medio de una oxoacil-CoA hidrolasa, que genera un compuesto alifático C7-dicarboxil-CoA. Hasta ahora se han descrito dos variantes de la β- oxidación en dos organismos diferentes (Figura 2): • Tipo Thauera: fue descrita por primera vez en T. aromatica y utiliza como sustrato el dienoil-CoA cíclico producto de la reacción llevada a cabo por la BCR, generando como producto final 3-hidroxipimelil-CoA (Harwood, 1999; Laempe et al., 1998; Laempe et al., 1999). • Tipo Rhodopseudomonas: fue descrita en R. palustris y utiliza como sustrato el monoenoil-CoA cíclico producto de la reacción llevada a cabo por la BCR, generando como producto final pimelil-CoA (Harwood, 1999; Pelletier & Harwood, 1998; Pelletier & Harwood, 2000). Al comparar las enzimas responsables de la degradación de ambas variantes se pueden observar ciertas diferencias en las especificidades de sustrato, lo que da lugar a la existencia de dos diferentes tipos de genes catabólicos. Mientras que los genes del tipo Rhodopseudomonas únicamente se encuentran en R. palustris CGA009 (y algunas otras cepas de Rhodopseudomonas) (Egland et al., 1997), se han hallado ortólogos de los genes del tipo Thauera (Breese et al., 1998) en otras bacterias reductoras de nitrato (Azoarcus spp. y Magnetospirillum spp.) (López Barragán et al., 2004a; López Barragán et al., 2004b; Rabus, 2005; Shinoda et al., 2005b) y reductoras de Fe(III) (Geobacter spp.) (Butler et al., 2007). 2.2.3 Ruta baja del benzoil-CoA. La ruta baja del benzoil-CoA es la responsable de la degradación de los derivados alifáticos C7-dicarboxil-CoA, que generará tres moléculas de acetil-CoA y CO2 (Figura 2) (Gallus & Schink, 1994; Harrison & Harwood, 2005). Las bacterias contienen multitud de genes cuyos productos génicos podrían participar en el catabolismo de los intermediarios dicarboxil-CoA formados en el metabolismo anaeróbico de ácidos aromáticos o en el catabolismo de ácidos dicarboxílicos. Introducción 13 Figura 2. Reacciones enzimáticas de la ruta del catabolismo anaeróbico del benzoato en diversas bacterias. A la derecha se indican las diferentes fases de la degradación: (I) Activación del benzoato a benzoil-CoA por medio de la benzoato-CoA ligasa (flecha roja); (II) Ruta alta del benzoil-CoA (flecha amarilla) donde tiene lugar la reducción del anillo aromático por medio de la benzoil-CoA reductasa (flechas azul oscuro) y la β-oxidación modificada (flecha verde oscuro) mediante hidratación (flechas verde claro), deshidrogenación (flechas azul claro) e hidrólisis del anillo (flechas naranja); (III) Ruta baja del benzoil-CoA (flechas grises) que genera 3 moléculas de acetil-CoA y 1 de CO2. También se muestra la ruta convergente del ciclohexano carboxilato, que es activado por una CoA ligasa (AliA) y seguidamente deshidrogenada por una ciclohexanocaroxil-CoA deshidrogenasa (AliB) (flecha rosa). Los metabolizados representados en la figura se indican a continuación: ciclohex-1,5-dieno-1-carbonil-CoA (1), ciclohex-1- eno-1-carbonil-CoA (2), 2-hidroxiciclohexano-1-carbonil-CoA (3), 6-hidroxiciclohex-1-eno-1-carbonil- CoA (4), 2-cetociclohexano-1-carbonil-CoA (5), 6-cetociclohex-1-eno-1-carbonil-CoA (6), pimelil-CoA (7) y 3-hidroxipimelil-CoA (8). Las enzimas implicadas también han sido indicadas correspondiéndose sus nombres con el de sus respectivos genes, los cuales pueden encontrarse ordenados en sus respectivos clusters y asociados a sus respectivos organismos en la Figura 3. 3Acetil-CoA + CO2 CoA+ATP AMP+PPi BadA, BclA, BzdA, BamY 2ATP, 4[H] 2ADP, 2Pi 2ATP, 2[H] 2ADP, 2Pi BadDEFGBadBBcrCBADFdx BzdNOPQBzdM H2O BadK Dch BzdW BamR NAD+ NADH+H+ 2H2O BadH Had BzdX BamQ BadI Oah BzdY BamA BamB-I? 5 COS CoA O 5 COS CoACOS CoA O 8 COS CoA COO-HO 8 COS CoACOS CoA COO-COO-HOHO 2 COS CoA 2 COS CoACOS CoA 1 COS CoA 1 COS CoACOS CoA 3 COS CoA OH 3 COS CoACOS CoA OHOHOH 4 COS CoA OHOH 4 COS CoA 4 COS CoACOS CoA 6 COS CoA O 6 COS CoACOS CoA O 7 COS CoA COO- 7 COS CoACOS CoA COO-COO- COS CoA Benzoil-CoA COS CoA Benzoil-CoA AliAB COO- Ciclohexano carboxilato COO-COO-COO- Ciclohexano carboxilato COO- Benzoato COO-COO-COO- Benzoato H2O NAD+ NADH+H+ 2H2O 2[H] Reducción del anillo aromático β-oxidación modificada Activación (I) Ruta alta (II) Ruta baja (III) Introducción 14 Los genes pimFABCDE constituyen un operón inducido específicamente en R. palustris cuando las células crecen anaeróbicamente en benzoato (o pimelato). Los genes de este operón codifican todas las enzimas necesarias para llevar a cabo la β- oxidación de los ácidos dicarboxílicos a glutaril-CoA (Harrison & Harwood, 2005; Larimer et al., 2004; VerBerkmoes et al., 2006). No obstante, las proteínas Pim no son las únicas de R. palustris capaces de catalizar la degradación de ácidos dicarboxílicos, siendo probable que actúen en combinación con otras enzimas cuyos niveles se ven incrementados cuando las células crecen en presencia de benzoato (VerBerkmoes et al., 2006). En el genoma de Azoarcus sp. EbN1 se han identificado in silico diversos clusters que codifican posibles rutas de β-oxidación de ácidos dicarboxílicos (Rabus, 2005). Azoarcus spp. bz dM Magnetospirillum spp. T. aromatica α -P ro te ob ac te ri as β- Pr ot eo ba ct er ia s R. palustris ba dK al iA al iB ba dI ba dH ba dR ba dC ba dD ba dE ba dF ba dG ba dA ba dB γ β α ha d oa h bc rC bc rB bc rA bc rD fd x or f3 or f4 dc h ko rB ko rA γ β α δ bz dS bz dT bz dN bz dO bz dP bz dQ bz dV bz dW bz dX bz dY bz dZ bz dA bz dR γ β δ α ko rB oa h ha d ko rA dc h bc rC bc rB bc rA bc rD fd x γ β α δ ba dM bz dK bz dB 1 bz dB 2 bz dB 3 bz dB 4 bz dB 5 ba dL hb aH bc lA G en es bo x bz dU (rpa0650) (rpa0665) (amb2146) (amb2137) bc lA (amb2869) (ebA5278) (ebA5311) G en es bo x δ Figura 3. Organización génica de la ruta de degradación del benzoil-CoA en α y β-proteobacterias: Rhodopseudomonas palustris CGA009 (NC_005296), Magnetospirillum spp. [M. magneticum AMB-1 (NC_007626); M. magnetotacticum MS-1 (AAAP00000000) y Magnetospirillum sp. TS-6 (AB-167726 y AB243675)], Thauera aromatica (AJ224959) y Azoarcus spp. [Azoarcus sp. CIB (AF515816), A. evansii (AJ428529) y Azoarcus sp. EbN1 (NC_006513)]. Los nombres de los genes han sido detallados en la Tabla 2. Los genes han sido representados con flechas de diversos colores: rojas, los genes que codifican benzoato-CoA ligasas; azul oscuro, los genes que codifican las subunidades α-β-δ-γ de la benzoil-CoA reductasa; rayas azules, los genes que codifican las ferredoxinas asociadas a las benzoil-CoA reductasas; amarillas, los genes KGOR; rayas negras, los genes que codifican posibles oxidorreductasas dependientes de NADPH y ferredoxina; verde claro, los genes que codifican enoil-CoA hidratasas; azul claro, los genes que codifican hidroxiacil-CoA deshidrogenasas dependientes de NAD; naranjas, los genes que codifican oxoacil-CoA hidrolasas; negras, genes reguladores; verde oscuro, genes que codifican posibles acil-transferasas; marrones, posibles genes transportadores; rosas, genes que codifican la ciclohexanocarboxilato-CoA ligasa (aliA) y la ciclohexanocarboxil-CoA deshidrogenasa (aliB); moradas, genes pertenecientes a otras rutas catabólicas de compuestos aromáticos; blancas, genes de función desconocida. Dos rayas verticales separan los genes no adyacentes en el genoma. Introducción 15 En la mayoría de los microorganismos, la oxidación y descarboxilación del glutaril-CoA es catalizada por una glutaril-CoA deshidrogenasa bifuncional que sintetiza glutaconil-CoA en forma de intermediario unido a la enzima (Fu et al., 2004; Gomes et al., 1981). De hecho, se ha identificado y caracterizado recientemente el gen gcdH en Azoarcus sp. CIB, que codifica una glutaril-CoA deshidrogenasa bifuncional (Blazquez et al., 2008). El gen gcdH suele aparecer en forma de una única copia en el cromosoma, al contrario de lo que sucede con los genes que implicados en la β-oxidación de ácidos dicarboxílicos. La mutación del gen gcdH impide el crecimiento anaeróbico de Azoarcus sp. CIB en benzoato, en otros compuestos aromáticos y alicíclicos, y en determinados ácidos dicarboxílicos como pimelato o glutarato, lo que indica que el gen gcdH es el único que codifica una glutaril-CoA deshidrogenasa en Azoarcus sp. CIB (Blazquez et al., 2008). En algunos organismos que presentan ciertas limitaciones en la obtención de energía, como las bacterias fermentadoras, el glutaril-CoA es oxidado por una glutaril-CoA deshidrogenasa dependiente de NAD y posteriormente descarboxilado por una glutaconil-CoA descarboxilasa anclada a membrana, que es dependiente de sodio y acopla la descarboxilación con la traslocación de iones de sodio a través de la membrana, dando lugar a la síntesis de ATP (Dimroth & Schink, 1998). La conversión de glutaril-CoA a crotonil-CoA acoplada a la síntesis de ATP puede ser considerada como una medida adicional para la conservación de energía, impuesta por las estrictas restricciones energéticas del metabolismo fermentador (Elshahed & McInerney, 2001). Las actividades enzimáticas responsables del metabolismo que transforma el crotonil-CoA en acetil-CoA, como por ejemplo 3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa o acetoacetil-CoA tiolasa, han sido descritas en diversas bacterias (Auburger & Winter, 1996; Elshahed et al., 2001; Elshahed & McInerney, 2001; Gallus & Schink, 1994), pudiéndose encontrar los supuestos genes codificantes de dichas enzimas mediante análisis in silico de los genomas de algunos biodegradadotes anaeróbicos (Harrison & Harwood, 2005; Rabus, 2005). 22..33 OOrrggaanniizzaacciióónn ggéénniiccaa ddee llaa rruuttaa ddee ddeeggrraaddaacciióónn ddeell bbeennzzooiill--CCooAA.. Los genes responsables de la degradación anaeróbica de benzoato han sido estudiados ampliamente tanto en T. aromatica (Breese et al., 1998) como en R. palustris (Egland et al., 1997). En R. palustris, los genes implicados en la degradación Introducción 16 anaeróbica de compuestos aromáticos se organizan en un cluster de 25.4 kb que incluye los genes bad, responsables de la degradación de benzoato, los genes ali, responsables de la degradación de ácidos alicíclicos, y los genes hba, responsables de la degradación 4-hidroxibenzoato (Figura 3 y Tabla 2). Los genes badDEFG codifican las cuatro subunidades de la benzoil-CoA reductasa de R. palustris, constituyendo una unidad transcripcional cuya expresión se induce por benzoato (Egland et al., 1997). El gen badA codifica la enzima benzoil-CoA ligasa, responsable de la activación de benzoato a benzoil-CoA. El producto génico del gen badB posee una identidad significativa (50%) con proteínas del tipo ferredoxina, cuya función consiste en la transferencia de los electrones necesarios para la reducción del anillo aromático. Ambos genes, badA y badB, constituyen una unidad transcripcional. El gen badC codifica una proteína cuya función se desconoce, si bien se ha propuesto una posible función relacionada con el transporte de electrones (Egland et al., 1997). Los genes badH y badK codifican proteínas del tipo flavín-deshidrogenasa y enoil-CoA hidratasa, respectivamente, implicadas ambas en las reacciones que oxidan el ciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA a 2- cetociclohexano-1-carbonil-CoA (Figura 3). La enzima codificada en gen badI es responsable de la actividad 2-cetociclohexano-1-carbonil-CoA hidrolasa, que da lugar a la apertura del anillo alicíclico. Los genes badH, badK y badI constituyen, junto con los genes aliA y aliB, otra unidad transcripcional cuya orientación es divergente respecto de los demás genes del cluster bad. En T. aromatica, los genes implicados en la ruta de degradación anaeróbica de compuestos aromáticos se agrupan en un cluster de 7.9 kb (cluster bcr), en el cual se disponen ocho genes transcritos en la misma dirección (Figura 3 y Tabla 2). En una posición upstream respecto del primer gen del cluster, el gen had, se ha identificado una zona rica en AT, donde podría existir un promotor. El gen had codifica una 6- hidroxiciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA deshidrogenasa. El siguiente gen, oah, codifica la enzima responsable de la apertura del anillo alicíclico, denominada 2-cetociclohex-1- eno-1-carbonil-CoA hidrolasa. El tercer gen del operón, dch, codifica la enzima ciclohex-1,5-dieno-1-carbonil-CoA hidratasa. Los siguientes cuatro genes, bcrCBAD, codifican las subunidades γ, β, α y δ, respectivamente, de la benzoil-CoA reductasa. Finalmente, el último gen, fdx, codifica una ferredoxina encargada de transferir los electrones a la benzoil-CoA reductasa. En una posición downstream respecto del gen fdx se localiza una estructura palindrómica adyacente a una cola de poli-T, la cual podría ser una señal de terminación de la transcripción rho independiente, lo que Introducción 17 sugeriría que los ocho genes constituyen un operón catabólico. En una posición downstream respecto de dicha estructura palindrómica se localizan dos genes de función desconocida, orf1 y orf2, que, en caso de pertenecer al cluster bcr, no se co- transcribirían con el resto de los genes de dicho cluster (Breese et al., 1998). El gen que codifica la benzoato-CoA ligasa en T. aromatica (bclA) no forma parte del cluster bcr, sino que se encuentra localizado en el cluster génico implicado en la degradación aeróbica de benzoato (Schuhle et al., 2003), con lo que su expresión es inducida cuando las células crecen aeróbicamente en benzoato. Por otro lado, en una posición upstream respecto del gen had, se han localizado dos genes, korA y korB, orientados en sentido divergente al cluster bcr, que codifican las subunidades α y β, respectivamente, de la enzima KGOR, cuya función consiste en regenerar el estado reducido de la ferredoxina (Dorner & Boll, 2002). Tabla 2. Nombres de los genes que codifican la benzoato-CoA ligasa y la ruta alta del benzoil-CoA en α y β-proteobacterias. Nombre del gen Enzima Rhodopseudomonas palustris Magnetospirillum ssp. Thauera aromatica Azoarcus spp. Benzoato-CoA ligasa badA bclA bclA bzdA Subunidad α de la BCRa badF bcrA bcrA bzdQ Subunidad β de la BCRa badE bcrB bcrB bzdO Subunidad γ de la BCRa badD bcrC bcrC bzdN Subunidad δ de la BCRa badG bcrD bcrD bzdP Ferredoxina badB fdx fdx bzdM Enoil-CoA hidratasa badK dch dch bzdW Hidroxiacil-CoA deshidrogenasa badH had had bzdX Oxoacil-CoA hidrolasa badI oah oah bzdY a Benzoil-CoA reductasa de anaerobios facultativos. También han sido identificados los genes responsables de la degradación anaeróbica de benzoato en M. magnetotacticum MS-1 (Figura 3 y Tabla 2) (López Barragán et al., 2004b), cuyo cluster bcr presenta una disposición semejante a la del cluster bcr de T. aromatica en dos operones divergentes, de forma que se han identificado la hipotética Introducción 18 benzoil-CoA reductasa (bcrCBAD), la ferredoxina (fdx), la hidratasa (dch), la deshidrogenasa (had), la hidrolasa (oah) y la enzima KGOR (korAB). Estos genes también poseen una elevada similitud con los genes de T. aromatica. Además, el gen que codifica la benzoato-CoA ligasa en M. magnetotacticum (bclA) también se localiza fuera del cluster bcr, como en el caso de T. aromatica, por lo que es probable que también esté implicado en la ruta de degradación aeróbica de benzoato (López Barragán et al., 2004b)). En el género Azoarcus han sido identificados los genes bzd como los responsables de la degradación anaeróbica de benzoato (Figura 3 y Tabla 2). El cluster bzd se divide en dos operones, bzdR y bzdNOPQMSTUVWXYZA, ambos orientados en la misma dirección. El gen bzdR codifica el regulador transcripcional BzdR, responsable de la regulación de la expresión del promotor PN (Barragán et al., 2005). Los genes bzdNOPQ y bzdM codifican las cuatro subunidades de la benzoil-CoA reductasa y su correspondiente ferredoxina, respectivamente. El gen bzdV codifica la oxirreductasa implicada en la regeneración del estado reducido de la ferredoxina. Los productos génicos de bzdW, bzdX y bzdY muestran una mayor similitud con las correspondientes hidratasa, deshidrogenasa e hidrolasa implicadas en la ruta de β-oxidación modificada de T. aromatica, que con las enzimas correspondientes de R. palustris, lo que sugiere que Azoarcus podría llevar a cabo la β-oxidación del intermediario alicíclico del mismo modo que T. aromatica, generando 3-hidroxipimelil-CoA como producto final. El gen bzdA codifica la benzoato-CoA ligasa responsable de la activación del benzoato a benzoil-CoA. Este gen se localiza al final del cluster bzd, al contrario que su ortólogo en T. aromatica (bcrA), que se sitúa fuera del cluster de degradación anaeróbica. Los genes bzdS, bzdU y bzdZ codifican proteínas de función desconocida hasta el momento. Por último, en una posición downstream respecto del gen bzdA, se han podido localizar seis genes cuyos productos génicos presentan una elevada identidad con las cinco subunidades de transportadores tipo ABC (bzdB1B2B3B4B5) y con un transportador monocompetente (bzdK), respectivamente, de la familia MFS (Rabus et al., 2005), lo que sugiere que el cluster bzd podría incluir los transportadores de benzoato. Introducción 19 33.. RReegguullaacciióónn ddee llaa eexxpprreessiióónn ggéénniiccaa eenn rruuttaass ddee ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. La capacidad de las células bacterianas de degradar compuestos aromáticos es dependiente no sólo de la presencia del cluster de genes catabólicos adecuado que codifique las enzimas necesarias para la degradación de estos compuestos, sino también de ser capaz de expresar estas proteínas en el momento y lugar adecuado. De igual manera, el control de la expresión de estos genes no depende únicamente de la presencia o ausencia de compuestos aromáticos, sino también de una amplia variedad de estímulos ambientales (Cases & de Lorenzo, 2005). La regulación puede ser llevada a cabo en diferentes niveles, como pueden ser la transcripción, la traducción o la post- traducción, siendo la mejor caracterizada, la que tiene lugar a nivel transcripcional (Carmona et al., 2008; Cases & de Lorenzo, 2005; Diaz & Prieto, 2000; Shingler, 2003; Tropel & van der Meer, 2004). Si se realiza un análisis global de las proteínas reguladoras específicas que controlan el catabolismo de compuestos aromáticos se puede encontrar una gran divergencia en sus correspondientes orígenes evolutivos, lo que sugiere que genes catabólicos y reguladores podrían haber evolucionado independientemente (Cases & de Lorenzo, 2005; de Lorenzo & Perez-Martin, 1996). Uno de los posibles mecanismos evolutivos para obtener reguladores capaces de responder a señales semejantes de diferentes formas podría ser la combinación de dominios reguladores similares (que presenten determinados motivos de unión a determinadas moléculas) con diferentes dominios de unión a ADN. Otra de las estrategias establecería la diferencia a nivel del promotor, de forma que, aunque los reguladores muestren una arquitectura muy similar, podrían ser responsables de diferentes efectos en la célula dependiendo de la localización de los sitios de unión (regiones operadoras) en un determinado promotor. Esto permitiría que el mismo regulador pueda activar ciertos genes cuando se une en una posición upstream respecto de la región de unión de la ARN polimerasa, a la vez que reprimir otros genes cuando se une downstream respecto de dicha región. Todas estas posibilidades son las responsables del extraordinario grado de plasticidad y adaptabilidad que presenta la evolución de las redes de regulación (Carmona, 2008; Cases & de Lorenzo, 2005; Diaz & Prieto, 2000; Tropel & van der Meer, 2004). Si bien la mayor parte de la información existente sobre regulación proviene de las rutas de degradación aeróbicas, en los últimos años se ha producido un progreso notable Introducción 20 en el estudio y determinación de reguladores en rutas anaeróbicas, obteniéndose múltiples evidencias de que los mismos principios establecidos para la regulación aeróbica pueden ser aplicables a la regulación de rutas anaeróbicas de degradación de compuestos aromáticos. No obstante, aún se desconocen multitud de elementos reguladores responsables del control de dichas rutas metabólicas, y sólo unos pocos han sido caracterizados y relacionados con la regulación transcripcional de este tipo de rutas. En la Tabla 3 se pueden apreciar algunos reguladores específicos de efector ya caracterizados, y otra serie, más amplia, de proteínas potencialmente reguladoras, que pertenecen a diversas familias de reguladores transcripcionales y podrían controlar la expresión de genes implicados en catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos. Además, cuando las bacterias se encuentran en su medio natural, se enfrentan a multitud de señales químicas, físicas y biológicas que necesitan procesar con el fin de dar una respuesta fisiológica de un tipo u otro. Entre estas señales, cabe destacar las múltiples fuentes de carbono que una bacteria puede encontrar, por lo que necesita decidir cuál de ellas debe consumir preferentemente, en detrimento de las demás, con el fin de optimizar su metabolismo. Por ello, las bacterias han desarrollado una serie de mecanismos fisiológicos de control que establecen una regulación específica de los operones catabólicos en base al estado fisiológico y metabólico de la célula (Carmona, 2008; Cases & de Lorenzo, 2001; Prieto et al., 2004; Shingler, 2003). Este tipo de regulación sobreimpuesta es llevada a cabo por reguladores globales que actúan sobre varios promotores, cada uno de ellos con su respectivo regulador específico. El concepto de regulación sobreimpuesta encaja con la idea de conectividad e integración de la señal en una red de regulación transcripcional global, lo que explica el hecho de que muchos reguladores puedan afectar tan sólo a un escaso número de genes y al contrario, que unos pocos reguladores puedan influir en un elevado número de genes (Cases & de Lorenzo, 2005). La mayoría de reguladores involucrados en la regulación sobreimpuesta del catabolismo de compuestos aromáticos se ha descrito para rutas aeróbicas (Carmona, 2008; Diaz & Prieto, 2000; Marques et al., 2006; Moreno & Rojo, 2008; Prieto et al., 2004; Rojo, 2004; Shingler, 2003), pero, no obstante, también se han descrito un par de reguladores cuya actividad ha sido relacionada con reguladores específicos de rutas de degradación anaeróbicas, como es el caso de AadR (Tabla 3) y de AcpR, descrita en este trabajo y tratada en profundidad en el Objetivo 1 de “Resultados”. Introducción 21 Tabla 3. Proteínas reguladoras implicadas en la regulación del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos de ciertos microorganismos. Regulador Familia Microorganismo Actividad Ruta Acceso GenBank Específico de efector BzdR BzdR Azoarcus sp. CIB Represor Benzoato AAQ08805 ORF11a XylR/DmpR T. aromatica K172 Desconocido Fenol CAC12685 PdeRa XylR/DmpR Azoarcus sp. EbN1 Desconocido Fenol Q5P474 Gmet1542a XylR/DmpR G. metallireducens GS-15 Desconocido Tolueno ABB31776 EbA324 XylR/DmpR Azoarcus sp. EbN1 Desconocido p-etilfenol AAD12187/ AAD12186 TutC1/B1 TCR b T. aromatica T1 Activador Tolueno CAA05048/ CAA05049 Tdis/Ra TCR b T. aromatica K172 Activador Tolueno CAI07156/ CAI07155 Tdis/Ra TCR b Azoarcus sp. EbN1 Activador Tolueno AAK50369/ AAK50368 Tdis/Ra TCR b Azoarcus sp. T Activador Tolueno CAI07438/ CAI07439 Tcs2/Tcr2a TCR b Azoarcus sp. EbN1 Desconocido Etilbenceno CAI07436/ CAI07437 Tcs1/Tcr1a TCR b Azoarcus sp. EbN1 Desconocido Acetofenona ABB32375/ ABB32374 BamV/Wa TCR b G. metallireducens GS-15 Desconocido Benzoato AAF04013 HbaR Fnr/Crp R. palustris CGA009 Activador 4-Hidroxi benzoato AAL87770 CprK Fnr/Crp D. hafniese Activador o-clorofenol ABM69269 GcdR LysR Azoarcus sp. CIB Activador Ruta baja benzoil-CoA ABC88392 NicRa LysR E. barkeri Desconocido Nicotinato CAI09182 PadRa GntR Azoarcus sp. EbN1 Desconocido Fenilacetato ABE38758 Rpd1521a GntR R. palustris BisB5 Desconocido Fenilacetato O33817 ORF1a MarR T. aromatica K172 Desconocido 4-Hidroxi benzoato ABB32362 PcmQa MarR G. metallireducens GS-15 Desconocido 4-Hidroxi benzoato AAC23923 BadR MarR R. palustris CGA009 Activador Benzoato Q6N8V9 Rpa1794a MarR R. palustris CGA009 Desconocido p-coumarato CAI06487 EbA715a TetR Azoarcus sp. EbN1 Desconocido 3-Hidroxi benzoato ABB31754 Gmet1520a TetR G. metallireducens AMB-1 Desconocido Tolueno O07465 BadM Rrf2 R. palustris CGA009 Represor Benzoato AAQ08805 Dependiente de oxígeno AadR Fnr/Crp R. palustris CGA009 Activador Benzoato/4- Hidroxi benzoato B43334 a Predicha. b Sistema regulador de dos componentes. Introducción 22 33..11 RReegguullaacciióónn eessppeeccííffiiccaa ddee eeffeeccttoorr.. Las rutas catabólicas de compuestos aromáticos, tanto aeróbicas como anaeróbicas, están sometidas a una estricta regulación dependiente de sus respectivos sustratos (Tropel & van der Meer, 2004; Wohlbrand et al., 2007). Aunque los sistemas de regulación mejor estudiados son de rutas de degradación aeróbicas, también se han descrito diversos circuitos reguladores de rutas de degradación anaeróbicas, de los cuales, el mejor estudiado es el responsable de la regulación de la expresión de los genes del catabolismo anaeróbico de benzoato, mediante dos organismos modelo: la bacteria fototrófica Rhodopseudomonas palustris y Azoarcus sp. CIB. 3.1.1 Regulación en R. palustris. La bacteria R. palustris presenta un cluster de degradación anaeróbica de benzoato denominado bad (benzoic acid degradation) cuya inducción dependiente de benzoato, así como los productos génicos del cluster, han sido confirmados tanto por experimentos clásicos de expresión génica (Egland et al., 1997; Egland & Harwood, 1999; Pelletier & Harwood, 2000; Peres & Harwood, 2006) como por ensayos de proteómica (Pan et al., 2008; VerBerkmoes et al., 2006). El cluster bad se divide en 5 operones diferentes (Figura 4) (Egland et al., 1997; Egland & Harwood, 1999; Pelletier & Harwood, 2000; Peres & Harwood, 2006): badDEFGAB, badHIaliBAbadK, badC, badR y badM. Los genes que constituyen el operón badDEFG codifican las cuatro subunidades de la proteína BCRRp, el gen badA codifica la benzoato-CoA ligasa y el gen badB codifica la ferredoxina. El sitio de inicio de la transcripción se localiza 71 nucleótidos upstream respecto del codón de iniciación predicho para el gen badD (Egland et al., 1997; Peres & Harwood, 2006). El producto génico del gen badR actúa como activador transcripcional del promotor de este operón (Figura 4), aunque aún no se ha demostrado que la proteína BadR se una directamente a dicha región promotora (Egland & Harwood, 1999). El operón badR codifica únicamente la proteína BadR, que pertenece a la familia MarR de reguladores transcripcionales bacterianos. No obstante, BadR se comporta como un activador, al contrario de lo que sucede con otros miembros de esta familia (Tabla 3), entre los que cabe destacar al mejor caracterizado hasta el momento, la proteína MarR, que reprime la expresión de los genes de resistencia a antibióticos marAB, siendo el 2-hidroxibenzoato (salicilato) la molécula inductora (Martin & Introducción 23 Rosner, 1995). Posteriormente, se han descrito otros reguladores semejantes a MarR, como HpaR y CbaR, que también responden a compuestos aromáticos (Carmona et al., 2008; Carmona et al., 2009; Prieto et al., 2004; Tropel & van der Meer, 2004). En el caso de BadR se han sugerido como posibles activadores el benzoato o el benzoil-CoA. Este último parece ser el candidato más probable debido a las diversas evidencias obtenidas hasta el momento: el benzoil-CoA se acumula hasta niveles considerables en la cepa reportera badE::lacZ utilizada para detectar la actividad del promotor badD; diversos compuestos como el 4-hidroxibenzoato, que inducen la expresión de badE, son metabolizados para formar benzoil-CoA en lugar de benzoato libre como intermediario de la ruta, mientras que determinados compuestos aromáticos como el 3-clorobenzoato, que son estructuralmente semejantes al benzoato y no son metabolizados a benzoil- CoA, no inducen la expresión de badE (Egland & Harwood, 1999). Figura 4. Organización y regulación del cluster ali-bad-hba de R. palustris. Los genes ali, bad y hba se muestran en rosa, azul y verde, respectivamente. Las enzimas codificadas por estos genes, así como las reacciones que catalizan estas enzimas han sido recuadradas en los mismos colores, rosa, azul y verde, respectivamente. Los genes reguladores badR, badM y hbaR y sus correspondientes reguladores BadR, BadM y HbaR se muestran en color rojo (regulación específica de sustrato). El regulador AadR, que se encuentra codificado fuera de este cluster, se muestra en violeta (regulación dependiente de oxígeno). Las flechas negras situadas encima del cluster indican que los genes que abarcan constituyen un operón (flechas sólidas) o un posible operón (flechas de puntos). Los promotores badD, hbaA y hbaR han sido representados detrás de los genes en forma de flechas curvas de color rojo. Los símbolos (-) y (+) indican represión y activación transcripcional, respectivamente. aliABK RH C badDEFG A B M L hbaHGFE A RhbaBCDI BadR AadR (-O2) COO- COO- OH HbaR COSCoA ? ? RegulaciRegulacióón n especespecíífica fica de sustratode sustrato RegulaciRegulacióón n sobreimpuestasobreimpuesta (dependiente de O(dependiente de O22)) (+)(+) (+) (+) COSCoACOSCoA DEFGB COO- AB COO- OH COSCoA OH ABCD COSCoA COO- IHK Ciclohexano carboxilato Pimelil-CoA COO- A Benzoato Benzoil-CoA 4-Hidroxi- benzoato AadR (-O2) (-) BadM COO- COO- badD hbaA hbaR aliABK RH C badDEFG A B M L hbaHGFE A RhbaBCDI BadR AadR (-O2) COO-COO- COO- OH COO- OH HbaR COSCoACOSCoA ? ? RegulaciRegulacióón n especespecíífica fica de sustratode sustrato RegulaciRegulacióón n sobreimpuestasobreimpuesta (dependiente de O(dependiente de O22)) (+)(+) (+) (+) COSCoACOSCoACOSCoA DEFGB COO-COO- AB COO- OH COO- OH COSCoA OH ABCD COSCoA COO- COSCoA COO- IHK Ciclohexano carboxilato Pimelil-CoA COO-COO- A Benzoato Benzoil-CoA 4-Hidroxi- benzoato AadR (-O2) (-) BadM COO-COO- COO-COO- badD hbaA hbaR Introducción 24 Además de la regulación dependiente de BadR, el promotor badD también es controlado por la proteína AadR en respuesta a anaerobiosis (regulación sobreimpuesta) (Tabla 3). El producto génico del gen aadR fue el primero cuya función fue relacionada con la regulación del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos (Dispensa et al., 1992; Egland & Harwood, 1999). Los estudios iniciales realizados con cepas de R. palustris defectivas en el gen aadR demostraron la implicación de su producto génico en la regulación de la síntesis de benzoato-CoA ligasa y 4-hidroxibenzoato-CoA ligasa, dos enzimas responsables de la degradación anaeróbica de benzoato y 4- hidroxibenzoato, respectivamente (Dispensa et al., 1992). Estudios posteriores sugirieron que la proteína AadR podría estar involucrada en la regulación de la expresión de rutas del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos en respuesta a la presencia o ausencia de oxígeno (Egland & Harwood, 1999), debido al elevado grado de identidad existente entre su secuencia de aminoácidos y la del regulador transcripcional Fnr de E. coli (Unden & Schirawski, 1997; Unden et al., 2002). La proteína Fnr da nombre a la familia en la que se encuentra englobada, en la cual, la mayoría de sus miembros, entre ellos AadR, poseen cuatro residuos de cisteína altamente conservados y coordinados con un grupo ferrosulfurado (4Fe-4S) que mantiene a la proteína en una conformación inactiva en presencia de oxígeno (Khoroshilova et al., 1997; Mazoch & Kucera, 2002). Los reguladores BadR y AadR actuando conjuntamente son capaces de incrementar unas 100 veces la inducción de expresión de la fusión badE::lacZ que tiene lugar cuando un cultivo de R. palustris crecido aeróbicamente en succinato se pasa a condiciones anaeróbicas con benzoato. El gen aadR aumenta dicha expresión unas 20 veces en respuesta a la anaerobiosis, mientras que el gen badR sería el responsable de un incremento de 5 veces más en respuesta a la presencia de benzoato. Por ello, el doble mutante badR- aadR- de R. palustris no presenta expresión de la fusión badE::lacZ cuando es crecido anaeróbicamente en benzoato, al contrario de lo que sucede con los mutantes sencillos badR- o aadR- (Egland & Harwood, 1999). Además, existe un tercer regulador transcripcional implicado en el control de la actividad del promotor badD, la proteína BadM, que actúa como represor del mismo (Figura 4) (Peres & Harwood, 2006). Los datos obtenidos hasta el momento sugieren que BadM podría estar reprimiendo la expresión del cluster de degradación de benzoato mediante su unión al promotor badD, siendo posiblemente el benzoato el inductor de la ruta al unirse a la proteína BadM, lo que daría lugar a su desunión del ADN. Sin Introducción 25 embargo, esta hipótesis aún no ha sido demostrada (Peres & Harwood, 2006). La proteína BadM pertenece a la familia Rrf2 de reguladores transcripcionales (Tabla 3), en la cual se incluyen diversos represores implicados en los metabolismos del nitrito, del óxido nítrico o del hierro (Giel et al., 2006), y conserva la región HTH de esta familia, que presumiblemente se une al ADN, pero no conserva las cisteínas que conforman el cluster ferrosulfurado (Fe-S) presente en muchos de los miembros de esta familia (Peres & Harwood, 2006). El análisis del transcriptoma del mutante en badM de R. palustris ha revelado que, además del operón badDEFGAB, existen una serie de genes cuya expresión varía alrededor de 5 veces con respecto a la cepa silvestre, entre los que cabe destacar un gen que codifica un posible transportador de ácidos dicarboxílicos (RPA2448), un gen que codifica una proteína hipotética conservada (RPA3401), un gen que codifica un posible citocromo P450 (RPA1009) y un operón con una serie de genes conservados que codifican proteínas conservadas de función desconocida (desde RPA1209 a RPA1212). Sin embargo, ninguno de estos genes codifica proteínas que presenten un cluster Fe-S involucradas en procesos de respiración anaeróbica o en metabolismo del hierro, por lo que el papel de BadM como regulador de carácter general aún no ha sido establecido (Peres & Harwood, 2006). A pesar de todos los estudios mencionados, la regulación del catabolismo anaeróbico del benzoato en R. palustris aún no ha sido elucidada completamente, como pone de manifiesto el hecho de que no se conoce la regulación del operón badHI- aliBAbadK. Este operón es responsable de la oxidación del benzoato/ciclohexano, siendo inducida por carboxilato tras la activación de éste a benzoil-CoA (Figura 4). No parece que intervengan ni BadR ni BadM en la regulación de estas reacciones (Egland & Harwood, 1999; Peres & Harwood, 2006). Dado que los genes del cluster bad no parecen incluir otros genes cuyos productos génicos posean funciones reguladoras, la regulación del operón badHI-aliBAbadK queda así como una cuestión aún no resuelta. 3.1.2 Regulación en Azoarcus sp. CIB. La bacteria Azoarcus sp. CIB presenta los genes del cluster bzd, responsables del catabolismo anaeróbico de benzoato (López Barragán et al., 2004). Los genes catabólicos bzdNOPQMSTUVWXYZA constituyen un operón que se encuentra regulado por el promotor PN (Figura 5) (López Barragán et al., 2004). En una posición upstream respecto de este operón catabólico, se localiza otro operón constituido por un único gen denominado bzdR, cuyo producto génico controla la expresión de los genes catabólicos Introducción 26 mediante su interacción con el promotor PN (Figura 5) (Barragán et al., 2005). La proteína BzdR reprime la expresión del promotor PN cuando las células de Azoarcus sp. CIB crecen en un medio cuya fuente de carbono no sea aromática. Sin embargo, el inductor de la ruta no es el benzoato, sino el benzoil-CoA, tal y como han demostrado los resultados de los ensayos in vivo e in vitro llevados a cabo (Barragán et al., 2005). Estos resultados sugerían que la proteína BzdR se encontraba específicamente adaptada para controlar la ruta de degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus, mediante la capacidad de reconocer al primer intermediario de esta ruta, el benzoil-CoA (Barragán et al., 2005). El promotor PN del cluster bzd ha sido caracterizado, localizándose el sitio de inicio de la transcripción 75 nucleótidos upstream respecto del codón ATG de inicio de la traducción del gen bzdN, así como las cajas –10 y –35 consenso de los promotores σ70-dependientes. De igual forma, se han determinado mediante ensayos de footprinting con DNasa I la tres cajas operadoras del promotor PN a los que se une BzdR: región I (– 32 a +31), región II (–83 a –63) y región III (–146 a –126). Las tres regiones poseen repeticiones de la secuencia TGCA incluidas en palíndromos más largos, dos en la región I y uno en cada una de las regiones II y III (Barragán et al., 2005). Aquellos reguladores transcripcionales similares a BzdR, como el regulador SinR de B. subtilis o Figura 5. Organización y regulación del cluster bzd de Azoarcus sp. CIB. Los genes se encuentran agrupados en dos operones, el operón regulador bzdR (rojo) y el operón catabólico bzdNOPQMSTUVWXYZ (azul), controlados por los promotores PR y PN, respectivamente. El promotor PN es reprimido por la proteína BzdR (elipse roja). La activación del promotor PN se produce por medio de la molécula inductora, el benzoil-CoA, que se une a BzdR. Algunas fuentes de carbono, tales como ácidos orgánicos, causan represión catabólica del promotor PN por medio de un factor aún desconocido (cilindro amarillo). Los símbolos (-) y (+) indican represión y activación transcripcional, respectivamente. BzdR BzdA 3-hidroxi pimelil-CoA BzdNOPQMSTUVWXYZ bzdNOPQMSTUVWXYZ bzdA (+) COSCoACOSCoACOO-COO- Benzoato Benzoil-CoA (-) PR PNbzdR COSCoA COO-HO COSCoACOSCoA COO-COO-HOHO COSCoACOSCoA (-) Represión catabólicaÁcidos orgánicos ? (+) Introducción 27 el represor Cro del fago λ, también se unen a repeticiones cortas que, en la mayoría de los casos, se sitúan en el interior de regiones palindrómicas (Cervin et al., 1998; Koudelka & Lam, 1993; Mandic-Mulec et al., 1995). Además, se ha podido observar que la unión de BzdR al ADN induce cambios en la estructura del promotor PN, tal y como ponen de manifiesto los enlaces fosfodiéster que se vuelven hipersensibles a la digestión con DNasa I en el ensayo de footprinting (Barragán et al., 2005). La región I del promotor PN que reconoce BzdR solapa tanto con el sitio de inicio de la transcripción, como con la caja –10 que reconoce la subunidad σ70 de la RNAP, lo cual se mantiene en concordancia con el papel represor de BzdR sobre el promotor PN (Barragán et al., 2005). El análisis de la estructura primaria del regulador BzdR (298 aa) reveló una arquitectura molecular única, no descrita en ninguna de las proteínas reguladoras caracterizadas hasta ahora, lo que convierte a BzdR en un prototipo de una nueva subfamilia de reguladores transcripcionales (Barragán et al., 2005). Dicho análisis sobre BzdR reveló la existencia de dos diferentes dominios, el N-terminal o NBzdR (residuos 1-90) y el C-terminal o CBzdR (residuos 131-298), ambos conectados por una región linker o LBzdR (residuos 91-130) (Figura 6A). El dominio NBzdR muestra una significativa similitud a nivel de secuencia con los miembros de la familia de reguladores transcripcionales HTH-XRE, en la cual se incluyen más de 1300 proteínas de eucariotas, bacterias, arqueas y bacteriófagos. Esta familia se caracteriza por la presencia de un motivo HTH de unión a ADN similar a uno muy bien caracterizado, como es el de la proteína Cro del fago λ (Sauer et al., 1982). De todas los miembros de esta familia, el dominio NBzdR mostró una elevada identidad (34%) con la proteína SinR (14 kDa), un regulador transcripcional implicado en la esporulación de B. subtilis (Cervin et al., 1998), cuya estructura tridimensional fue utilizada con el fin de generar un modelo tridimensional de NBzdR (Figura 6B). Dicho modelo predecía la presencia de un motivo HTH (residuos 38-76) en el dominio NBzdR de la proteína BzdR, responsable de la interacción con el ADN. Por otro lado, el dominio CBzdR (Figura 6C) muestra una significativa similitud (23%) con las siquimato quinasas, unas enzimas encargadas de catalizar la conversión de siquimato a 3P-siquimato usando ATP como co-sustrato, en rutas de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (Vogels & Van der Drift, 1976). Introducción 28 Figura 6. Arquitectura modular de la proteína BzdR. (A) Representación esquemática de los dominios de la proteína BzdR. También se señalan el motivo HTH y el motivo Walker en color rojo y amarillo, respectivamente. (B) Modelo tridimensional del dominio NBzdR. Diagrama de cintas del dominio NBzdR donde se pueden apreciar las 5 hélices α (cintas verdes y naranjas). Las hélices y el loop que conforman el clásico motivo HTH de los reguladores tipo XRE han sido representados en color naranja. (C) Modelo tridimensional del dominio CBzdR. Diagrama de cintas del dominio CBzdR unido al benzoil-CoA. El dominio CBzdR contiene 5 láminas β (flechas azules) y 8 hélices α (cintas rosadas). El sitio de unión del fosfato (P-loop) se puede apreciar en color amarillo. La molécula de benzoil-CoA se muestra en color rojo, con los extremos benzoil y ADP sombreados de color azul y amarillo, respectivamente. Los correspondientes extremos N- y C-terminal de ambos dominios han sido marcados como NH2 y COOH, respectivamente. (D) Secuencia de la proteína BzdR. Los aminoácidos se indican mediante el código de una letra y los cuatro colores en que se muestran representan el grupo de aminoácidos al que pertenecen: rojo = apolares; verde = polares sin carga; azul = ácidos; rosa = básicos. Se han remarcado con un rectángulo azul los residuos que constituyen el motivo Walker A; en verde el motivo Walker B; en rojo el motivo de unión a adenina; y en negro, los residuos que pertenecen al motivo HTH. Las hélices α (α1-α13) y las láminas β (β1-β5) se representan con cilindros y flechas, respectivamente, cuyos colores se corresponden con los de las figuras B y C. MSNDENSSRLKRPDLSLEENNYLLMLGDRIRDLRAQRGMTRKMLAQQSGVSERYLAQLET 60 GHGNISIILLRQIAQGLGFPIVDLVREEAEQSPELTLLIQYLSRFPPKTHEWARRLLQNE 120 LESSGRSARRQRIAFIGLRGAGKTTLGTMLAEHLGVPFLELAKVIEQEAGADLSEIFSLY 180 GQTAYRRYERRGLESVVASNEAFVLIAGGSIVSEPANFDLLLSSCFTIWLCASPEEHMAR 240 VMEQGDYRPMHGNQEAMDDLKRILAGRTTMYSKADAIIDTSGRTVEQSFLDILEVLAR 298 COOH NH2 COOH NH2 CB 381 90 NBzdR HTH Walker 131 298 LBzdR CBzdRA D αα11 αα22 αα33 αα44 αα55 αα66 αα77 αα88 αα99 αα1010 αα1111 αα1212 αα1313 αα88 ββ11 ββ22 ββ33 ββ44 ββ55 Introducción 29 Dicho modelo predecía la presencia de un motivo HTH (residuos 38-76), el cual sugería que era el dominio NBzdR de la proteína BzdR el responsable de la interacción con el ADN. Por otro lado, el dominio CBzdR muestra una significativa similitud con las siquimato quinasas, unas enzimas encargadas de catalizar la conversión de siquimato a 3P-siquimato usando ATP como co-sustrato, en rutas de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (Vogels & Van der Drift, 1976). Con el fin de obtener un modelo tridimensional de la estructura de CBzdR, se utilizó la estructura de la tridimensional de la siquimato quinasa I (AroK) de E. coli (Gu et al., 2002; Romanowski & Burley, 2002), con la cual comparte un 23% de identidad. Este modelo estructural del dominio CBzdR presenta un motivo de unión de mononucleótidos característico y altamente conservado en determinadas proteínas (Krell et al., 1998), que se constituye de cinco láminas β paralelas flanqueadas por ocho hélices α (Figura 6C). Igualmente, cabe destacar en esta estructura la presencia de un motivo Walker-A o P-loop de unión de fosfato, así como una serie de residuos de glicina conservados en un motivo Walker-B de unión de purinas (Saraste et al., 1990; Walker et al., 1982). El modelo tridimensional del dominio CBzdR permitió la generación de un hipotético modelo de unión entre CBzdR y la molécula inductora de benzoil-CoA (Figura 6C). La fiabilidad de este modelo de unión se vio incrementada debido a la similitud estructural del grupo ADP y benzoilo de la molécula de benzoil-CoA con los dos sustratos de la siquimato quinasa, ATP y siquimato, respectivamente. En el modelo de unión se pudo encajar el motivo ADP del benzoil-CoA en el sitio de unión de nucleótidos, así como las unidades de pantotenato y β-mercaptoetilamina pudieron encajarse en un surco conformado por los loops existentes entre los residuos 163-158 y 231-271. Dicho surco desemboca en una cavidad equivalente al sitio de unión del siquimato descrito para las siquimato quinasas (Gu et al., 2002; Krell et al., 1998), donde se ajusta perfectamente el grupo benzoilo del benzoil-CoA (Figura 6C) (Barragán et al., 2005). En relación a la actividad enzimática de la siquimato quinasa se ha propuesto un mecanismo de adaptación inducida donde los loops que constituyen el surco de interacción con los sustratos deben sufrir importantes cambios conformacionales tras producirse la unión de dichos sustratos (Gu et al., 2002). La unión del benzoil-CoA a BzdR podría dar lugar a una serie de cambios conformacionales semejantes a nivel del dominio CBzdR, el cual, a través de la región linker, sería capaz de transmitir dicha información al dominio NBzdR con la consecuente inhibición de la represión del promotor PN mediada por BzdR. No obstante, Introducción 30 aún no se ha logrado cristalizar ni BzdR ni el complejo BzdR:benzoil-CoA, lo cual permitiría elucidar la base estructural que determina la actividad biológica de este regulador transcripcional. La proteína BzdR ha constituido una nueva subfamilia de reguladores transcripcionales cuyo número de miembros aumenta de forma constante, tal y como revelan las bases de datos, donde además se han podido identificar diversos ortólogos de BzdR asociados a clusters de degradación de benzoato en más de 30 proteobacterias desnitrificantes de los subgrupos α y β. En la mayoría de casos, estos genes reguladores se encuentran relacionados con la ruta aeróbica de degradación de benzoato vía benzoil- CoA (Denef et al., 2006; Gescher et al., 2002; Gescher et al., 2006; McLeod, 2008), por lo que probablemente sus productos génicos sean los encargados de regular la expresión de dichas rutas aeróbicas. Hasta ahora sólo se han descrito dos genes del tipo bzdR, uno de ellos en la cepa Azoarcus sp. CIB y el otro en la cepa Azoarcus sp. EbN1, que están asociados a la ruta anaeróbica de degradación de benzoato. No obstante, cabría destacar que en ciertas bacterias no desnitrificantes, como R. palustris, G. metallireducens y S. aciditrophicus, los genes responsables de la degradación anaeróbica de benzoato parecen estar regulados mediante estrategias diferentes no dependientes de BzdR. 33..22 RReegguullaacciióónn ddee llaa rruuttaa bbaajjaa ddeell bbeennzzooiill--CCooAA.. Existen diversos genes implicados en la ruta baja responsable del metabolismo de productos alifáticos generados en la ruta central del benzoil-CoA. En R. palustris, los genes pimFABCDE constituyen un operón inducido de forma específica cuando las células crecen anaeróbicamente en benzoato o pimelato (Harrison & Harwood, 2005; VerBerkmoes et al., 2006). Desde el operón pim se transcriben en sentido divergente un gen regulador tipo IclR y un posible transportador tipo ABC (Harrison & Harwood, 2005). No obstante, además del operón pim, se ha descrito el aumento de la expresión de otra serie de genes relacionados con el metabolismo de la β-oxidación, cuando R. palustris es crecida en benzoato (VerBerkmoes et al., 2006). En el organismo G. metallireducens, el cluster IB que contiene la mayoría de los genes implicados en la ruta baja de degradación de benzoato, también ve aumentados sus niveles de expresión en presencia de benzoato (Butler et al., 2007; Wischgoll et al., 2005). Sin embargo, el único gen de la ruta baja cuya expresión ha sido estudiada hasta cierto punto es el gen gcdH que codifica la proteína glutaril-CoA deshidrogenasa en Azoarcus sp. CIB Introducción 31 (Blazquez et al., 2008). La expresión de este gen es inducida cuando la bacteria es crecida en presencia de compuestos, como benzoato o pimelato, cuya degradación genera glutaril-CoA. Además, se ha demostrado mediante experimentos de RT-PCR que su expresión se encuentra bajo control transcripcional (Blazquez et al., 2008). El análisis de la región del genoma que incluye al gen gcdH reveló la existencia de otro gen dispuesto en sentido divergente y denominado gcdR, que codifica un activador transcripcional de tipo LysR (Tabla 3), responsable de la expresión del promotor Pg del gen gcdH. El glutarato y el glutaconato (2,3-dihidroglutarato) demostraron ser los inductores específicos de la proteína GcdR, mientras que otros probados, por ser análogos estructurales de estas moléculas, como valerato, crotonato, succinato, α- cetoglutarato, glutamato, glutamina, adipato, cis-cis-muconato o pimelato, no lo son. Estos datos indicaban que el activador transcripcional GcdR era capaz de reconocer con un alto nivel de especificidad ácidos dicarboxílicos de cinco carbonos (Blazquez et al., 2008). Debido a que los derivados de CoA del glutarato y del glutaconato son los sustratos de dos reacciones catalizadas por la enzima GcdH, no puede descartarse la posibilidad de que el glutaril-CoA y el glutaconil-CoA puedan ser también inductores de la activación del promotor Pg mediada por GcdR, lo cual facilitaría la expresión del gen gcdH cuando las células crecen en fuentes de carbono, como compuestos aromáticos o pimelato, que producen glutaril-CoA más que ácido glutárico (Blazquez et al., 2008). El sitio de inicio de la transcripción del promotor Pg fue localizado 59 nucleótidos upstream del codón ATG de inicio de la traducción del gen gcdH. Igualmente, se localizaron dos posibles cajas –10 y –35, separadas por una distancia consenso de 17 pb, típicas de los promotores σ70-dependientes. En la secuencia del promotor también pudo identificarse, entre las posiciones –71 y –57, una repetición invertida, 5’- GTGCGT-N3-ACGCAC-3’, que incluía el motivo consenso de unión a ADN típico de los reguladores LysR, T-N11-A ( Schell, 1993; Tropel & van der Meer, 2004), y que podría corresponderse con el sitio de reconocimiento (RBS) de GcdR (Blazquez et al., 2008). Por otro lado, se localizó una segunda repetición invertida, 5’- ACGAAATTTTCGT-3’, en una posición inmediatamente upstream respecto de la caja –35, que podría funcionar como el sitio de activación (ABS) de GcdR (Blazquez et al., 2008). Esta hipótesis se vio reforzada tras llevar a cabo un alineamiento de la secuencia de nucleótidos de la región correspondiente a los posibles promotores del gen gcdH entre diversos microorganismos, ya que se pudo comprobar que las regiones más Introducción 32 conservadas se correspondían con los sitios RBS, ABS y con la caja –35 del promotor Pg (Blazquez et al., 2008). Además, también se pudo encontrar un gen gcdR, cuyo producto génico se correspondía con un posible regulador transcripcional tipo LysR, en sentido divergente con respecto al gen gcdH en diversas proteobacterias, incluyendo aquellas capaces de degradar ácidos dicarboxílicos, pero no compuestos aromáticos, en condiciones anaeróbicas. Por otro lado, el hecho de que el gen gcdR de Azoarcus sp. CIB sea capaz de regular eficientemente la expresión del gen gcdH de P. putida cuando éste último era expresado en una cepa de Azoarcus sp. CIB cuyo gen gcdH había sido previamente inactivado por interrupción del mismo, ponía de manifiesto la existencia de una regulación cruzada entre los reguladores tipo GcdR y los promotores gcdH provenientes de diferentes subgrupos filogenéticos de proteobacterias (Blazquez et al., 2008), lo que sugiere que la regulación transcripcional del gen gcdH ha sido fuertemente conservada en muchas bacterias. 33..33 RReegguullaacciióónn ddee llaa rruuttaa ppeerriifféérriiccaa ddeell 44--hhiiddrrooxxiibbeennzzooaattoo ((44--HHBBAA)) eenn RR.. ppaalluussttrriiss.. El cluster hba codifica las enzimas responsables de la ruta periférica que convierte el 4-HBA en benzoil-CoA en el microorganismo R. palustris. A pesar de no poseer datos acerca de la transcripción del cluster hba, un análisis de su estructura ha determinado su división en cuatro unidades transcripcionales diferentes (Figura 4) (Egland et al., 1997), hbaR, que codifica el regulador HbaR, hbaA, que codifica la enzima 4-HBA-CoA ligasa, hbaBCD, que codifica la 4-hidroxibenzoil-CoA reductasa, y hbaEFGH, que codifica un posible transportador tipo ABC. El producto génico del gen hbaR es un activador transcripcional capaz de reconocer y unir 4-HBA como molécula efectora y así inducir la expresión del gen hbaA, si bien no parece ser capaz de controlar los genes responsables de la degradación aeróbica de 4- HBA en R. palustris (Egland & Harwood, 2000). No obstante, a pesar de los experimentos con el gen hbaR expresado en P. aeruginosa que indican que HbaR activa la expresión del promotor del gen hbaA (Figura 4), aún no ha sido demostrada in vitro dicha unión. La proteína HbaR pertenece a la superfamilia de reguladores transcripcionales Fnr/Crp, concretamente, al grupo Dnr, como han revelado las comparaciones de secuencia llevadas a cabo con miembros de dicho grupo, en el cual se incluyen proteínas que no poseen residuos de cisteína imprescindibles en la coordinación de los clusters Fe-S para la detección de oxígeno (Korner et al., 2003). Con la excepción de HbaR, todos los miembros del grupo Dnr son reguladores globales Introducción 33 que controlan la expresión de genes implicados en procesos de desnitrificación (Egland & Harwood, 2000). Por otro lado, también se ha demostrado en P. aeruginosa que HbaR puede activar la expresión del promotor hbaA en presencia de oxígeno. Por el contrario, en R. palustris la expresión de hbaA no es activada en condiciones aeróbicas de crecimiento, lo que sugiere la participación de un segundo regulador capaz de responder a la anaerobiosis (Egland & Harwood, 2000). Curiosamente, la proteína Fnr de E. coli era capaz de afectar la expresión de la fusión hbaR:lacZ en ausencia de oxígeno, lo cual, unido al hallazgo de una posible caja consenso de unión de Fnr situada a –42.5 nucleótidos respecto del sitio de inicio de la transcripción del gen hbaR, sugería que la expresión de hbaR en R. palustris era activada en respuesta a la ausencia de oxígeno por un ortólogo de la proteína Fnr (Egland & Harwood, 2000). El principal candidato homólogo de la proteína Fnr en R. palustris es posiblemente AadR, ya que, además de pertenecer a la superfamilia de reguladores transcripcionales Fnr/Crp, es necesario para la expresión de hbaA (Figura 4) (Dispensa et al., 1992). Sin embargo, la expresión de la fusión hbaA:lacZ en E. coli no se vio afectada por la mutación del gen fnr, con lo que el control dependiente de AadR del gen hbaA podría deberse a un efecto indirecto del control transcripcional que ejerce AadR sobre el gen hbaR, responsable de la activación de la expresión de hbaA en respuesta a 4-HBA (Figura 4) (Egland & Harwood, 2000). De esta forma, la expresión del gen hbaA tendría lugar mediante una cascada de regulación en la cual una proteína, AadR, actuaría como sensor de oxígeno, activando la expresión de un regulador, HbaR, específico de sustrato. Este sistema jerárquico de dos proteínas sería una efectiva estrategia para prevenir fenómenos de regulación cruzada y lograr una regulación más específica, como en el caso de la degradación de 4-HBA, bajo condiciones de ausencia de oxígeno (Egland & Harwood, 2000). El control de la expresión de los demás genes del cluster hba, como son los operones hbaBCD y hbaEFGH, precisa ser estudiado aún con el fin de completar la comprensión de la regulación de la ruta periférica de degradación del 4-HBA. 33..44 RReegguullaacciióónn ddee llaass rruuttaass ppeerriifféérriiccaass ddee ddeeggrraaddaacciióónn ddee ttoolluueennoo yy eettiillbbeenncceennoo.. La inducción mediada por sustrato de las enzimas implicadas en el catabolismo del tolueno tiene lugar a nivel transcripcional (Coschigano et al., 1998; Coschigano & Bishop, 2004; Leuthner et al., 1998). En determinados microorganismos como Azoarcus sp. T, el operón bss también puede ser inducido por m-xileno (Achong et al., Introducción 34 2001). El posible sitio de inicio de la transcripción tanto del operón bss ha sido determinado en diversos organismos: Azoarcus sp. T (Achong et al., 2001), T. aromatica K172 (Hermuth et al., 2002) y T. aromatica T1 (Coschigano, 2000), así como el posible sitio de inicio de la transcripción del operón bbs en la cepa T. aromatica K172 (Leuthner & Heider, 2000). Tanto en T. aromatica K172 como en Azoarcus sp. EbN1 los genes bss parecen transcribirse más eficientemente que los genes bbs (Hermuth et al., 2002; Kühner et al., 2005). Después de realizar un análisis de comparación de la secuencia de nucleótidos entre bacterias desnitrificantes, pudieron encontrarse una serie de regiones conservadas situadas en una posición upstream respecto de los genes bssD y bbsA, de las cuales se identificaron dos de ellas como típicas cajas –10 y –35 de los promotores σ70-dependientes. Las demás regiones conservadas se localizaron entre las posiciones –40 y –50, y alrededor de la posición – 65 respecto del sitio estimado de inicio de la transcripción. Estas regiones podrían representar los posibles sitios de unión y reconocimiento de un regulador transcripcional específico (proteínas TdiR) o bien de otras proteínas reguladoras capaces de responder a diversas condiciones como la anaerobiosis o la disponibilidad de tolueno en el medio (Kube et al., 2004). En la mayoría de bacterias desnitrificantes, la inducción de la expresión de genes por tolueno utilizado como fuente de carbono parece estar mediada por los productos de los genes tdiSR, los cuales se localizan en una posición upstream respecto de los genes bss y codifican un posible sistema regulador de dos componentes. Estos dos genes constituyen un operón en Azoarcus sp. T y se transcriben divergentemente respecto del operón bss en todas las cepas del género Azoarcus estudiadas hasta ahora (Achong et al., 2001). Por el contrario, en T. aromatica K172, los genes tdiSR se transcriben en el mismo sentido que los genes bss. En esta cepa, el producto génico del gen tdiR ha demostrado ser capaz de unirse in vitro a una sonda de ADN que incluye la región 5’ del operón bss (Leuthner et al., 1998). En la cepa T. aromatica T1, una mutación puntual en el gen tutB1 impedía tanto el crecimiento anaeróbico en tolueno, como la expresión del gen tutE, lo cual estaba en concordancia con el papel de este regulador como activador de promotores catabólicos (Coschigano & Young, 1997; Coschigano & Bishop, 2004). Esta bacteria, capaz de crecer en tolueno tanto aeróbica como anaeróbicamente, presenta dos sistemas reguladores de dos componentes, el constituido por los genes tutCB, localizado inmediatamente upstream y en sentido divergente respecto del operón de degradación anaeróbica tut, y el constituido por los genes Introducción 35 tutC1B1, localizado inmediatamente upstream y en sentido divergente respecto de los genes tutCB (Leuthner et al., 1998). Se llevaron a cabo análisis de comparación de secuencia que revelaron una significativa similitud entre las proteínas TutCB y los sistemas reguladores de dos componentes aeróbicos, al igual que las proteínas TutC1B1, que mostraron ser homólogas de los sistemas anaeróbicos TdiSR (Leuthner et al., 1998). En el sistema regulador TdiSR, el componente sensor TdiS se compone de tres dominios que ocupan cada uno de ellos un tercio de la proteína: dos dominios PAS y un dominio C-terminal histidín-quinasa que contiene el residuo de histidina predicho para el proceso de autofosforilación (Leuthner et al., 1998). Los dominios PAS están implicados en detección de estímulos luminosos, reacciones redox o presencia de hidrocarburos en diversas proteínas sensoras (Mascher et al., 2006), por lo que probablemente estén implicados en la detección de la molécula(s) inductora que interactúa con la proteína TdiS. Por otro lado, el componente regulador TdiR se compone de un dominio regulador en el extremo N-terminal, que contiene un residuo de aspártico predicho para el proceso de fosforilación, y un motivo HTH en el extremo C- terminal que permitiría su unión a los promotores correspondientes, y que además incluye a esa proteína como un miembro más de la familia de reguladores FixJ/NarL (Leuthner et al., 1998). Ambos componentes, el sensor TdiS y el regulador TdiR, muestran una significativa similitud con sus correspondientes homólogos de la ruta aeróbica implicados en el catabolismo del tolueno (proteínas TodS y TodT) (Lau et al., 1997) y del estireno (proteínas StyS y StyR) (Velasco et al., 1998), constituyendo todos ellos una nueva subfamilia de los sistemas reguladores de dos componentes implicados en el control de rutas catabólicas para la degradación de solventes orgánicos (Busch et al., 2007). El dominio PAS del extremo N-terminal de la proteína TodS de P. putida DOT-T1E es capaz de unir tolueno con una alta afinidad, lo que incrementa notablemente su tasa de autofosforilación basal y permite así la transfosforilación de la proteína TodT, la cual dará lugar a la activación de la transcripción de los promotores correspondientes (Busch et al., 2007; Lacal et al., 2006). En el sistema regulador anaeróbico TdiSR, se pudo comprobar que la molécula inductora que permite la expresión de los operones tutE y tutFDGH en T. aromatica T1 parecía ser, en lugar del tolueno, el bencilsuccinato (o cualquiera de los metabolitos posteriores de la ruta catabólica del tolueno), incluso a pesar de que esta bacteria no es capaz de utilizar el bencilsuccinato como fuente de Introducción 36 carbono (Coschigano & Bishop, 2004). Por el contrario, parece improbable que ocurra algo semejante en Azoarcus sp. EbN1, tal y como indican los ensayos llevados a cabo con esta cepa en presencia de una mezcla de piruvato y bencilsuccinato como fuente de carbono, donde no se pudo apreciar en ningún caso ni activación de la expresión del gen bssA, ni síntesis de las proteínas Bss/Bbs (Kühner et al., 2005). Por lo tanto, parece que, en la cepa EbN1, el sistema TdiSR es específico de tolueno, ya que ni siquiera el análogo etilbenceno fue capaz de inducir la expresión de los genes bss/bbs (Kühner et al., 2005). En la cepa Azoarcus sp. T, el m-xileno también demostró ser capaz de inducir el operón bss (Achong et al., 2001). No obstante, aún se desconocen muchos detalles del mecanismo de acción de TdiS y TdiR sobre los promotores catabólicos de la ruta anaeróbica de degradación de tolueno. Al contrario de lo descrito hasta el momento en relación con las bacterias desnitrificantes capaces de catabolizar tolueno, no se han hallado ortólogos de tdiSR en organismos reductores de hierro como G. metallireducens, donde podría existir un sistema de regulación diferente. De hecho, se ha podido observar que los clusters bss y bbs de este organismo se encuentran flanqueados por dos genes con una secuencia muy semejante a los reguladores XylR y TetR. Puesto que XylR es una proteína reguladora que detecta tolueno (y determinados análogos) y controla la expresión σ54-dependiente de los genes xyl implicados en el catabolismo aeróbico de tolueno en diversas cepas de Pseudomonas (Cases et al., 2003; Ramos et al., 1997), cabría la posibilidad de especular que el sistema regulador σ54-dependiente también está controlando la expresión del cluster de degradación anaeróbica de tolueno en G. metallireducens. En T. aromatica K172 se ha sugerido un posible control post-transcripcional de la expresión del operón bss (Hermuth et al., 2002). Basándose en esta hipótesis, se ha podido observar que, además del transcrito del operón bssDCABE originado desde el promotor inducido por tolueno localizado upstream del gen bssD, también existe una segunda especie de ARNm más abundante, cuyo extremo 5’ se sitúa enfrente del gen bssC. El ARNm de mayor tamaño que contiene el gen bssD tiene una vida media corta, y genera, probablemente por procesamiento mediado por una ARNasa, un transcrito más estable que comprende los genes bssCABE. La secuencia de ARN que rodea el extremo 5’ situado enfrente del gen bssC podría formar una estructura de bucle, semejante a los sitios de procesamiento ya conocidos para la RNasa III de E. coli (Hermuth et al., 2002). Este control post-transcripcional permitiría que la expresión de la benzilsuccinato sintasa (BssABC) y su correspondiente enzima activadora (BssD) Introducción 37 fueran inducidas de forma coordinada, de forma que los niveles de enzima podrían ser ajustados en la célula para explicar la disminución observada de enzima activadora hasta concentraciones 14 veces inferiores (Hermuth et al., 2002). Según esto, podría esperarse que las proteínas activadoras fueran necesarias en cantidades menores que las proteínas activadas. De hecho, en T. aromatica T1, las diferentes cantidades de activador y de benzilsuccinato sintasa parecerían estar controladas a nivel transcripcional por la existencia de dos operones diferentes, tutE (bssD) y tutFDGE (bssCABE) (Coschigano, 2000). En Azoarcus sp. EbN1, los genes tcs1/tcr1 y tcs2/tcr2 situados entre los operones de las rutas alta y baja del etilbenceno codifican unas proteínas que se asemejan al típico sistema regulador de dos componentes responsable del control del metabolismo de compuestos aromáticos, donde Tcs1 y Tcs2 serían los componentes sensores, y Tcr1 y Tcr2 los componentes reguladores, respectivamente (Rabus et al., 2002). Después de llevar a cabo un análisis de la secuencia de la proteína Tcs1 se pudo predecir un dominio histidín-quinasa del cual cabía sugerir su implicación en el reconocimiento de un intermediario, la acetofenona, debido a su elevada similitud con sistemas detectores de p-hidroxiacetofenona descritos previamente, que regulan la transcripción de los genes de virulencia en bacterias patogénicas de plantas. En relación al regulador Tcr1 cabría sugerir su implicación en el control de la expresión de los genes apc/bal, responsables del catabolismo anaeróbico de la acetofenona (Rabus et al., 2002). Por otro lado, aunque las proteínas Tcs2 y TdiS presentan una elevada similitud tanto en el primer dominio PAS como en el dominio histidín-quinasa (41-43% de identidad), no sucede lo mismo con el segundo dominio PAS, el cual difiere de forma notable entre ambas proteínas (16% de identidad). Este hecho sugiere que las proteínas TdiS y Tcs2 podrían ser capaces de discriminar entre tolueno y etilbenceno, respectivamente, por medio del segundo dominio PAS (Kube et al., 2004). Por último, el regulador Tcr2 podría ser el responsable del control de la expresión de los genes ebd/ped (Rabus et al., 2002). De esta forma, las rutas alta y baja de la degradación anaeróbica de etilbenceno podrían ser inducidas de forma secuencial por sus respectivos sustratos, etilbenceno y acetofenona, los cuales podrían ser utilizados como fuente de carbono (Kube et al., 2004; Rabus et al., 2002; Rabus, 2005). Introducción 38 33..55 RReegguullaacciióónn ssoobbrreeiimmppuueessttaa.. De todas las posibles señales ambientales existentes capaces de afectar la expresión génica de los microorganismos, cabría destacar dos de ellas que lo hacen de forma especialmente notable: el oxígeno y la disponibilidad de fuentes de carbono. Estos factores muestran la capacidad de modificar la expresión de diversos clusters del catabolismo anaeróbico por medio de proteínas reguladoras que actúan sobre promotores catabólicos, que además poseen sus propios reguladores específicos. 3.5.1 Regulación dependiente de oxígeno. El oxígeno es uno de los factores ambientales de mayor importancia en el control de la expresión de genes implicados en rutas anaeróbicas del catabolismo de compuestos aromáticos. Por ejemplo, en el caso de R. palustris, los genes badDEFG y badA que codifican las cuatro subunidades de la enzima BCRRp y la benzoato-CoA ligasa respectivamente, ven disminuida su expresión en condiciones aeróbicas (Egland et al., 1997; Peres & Harwood, 2006). En el caso de T. aromatica, se pudo observar una fuerte disminución de la expresión de la enzima BCRTa cuando las células crecían en un medio aeróbico (Heider et al., 1998). En M. magnetotacticum sp. TS-6, los genes bss que codifican la bencilsuccinato sintasa implicada en la degradación de tolueno únicamente se transcriben si las células crecen anaeróbicamente en presencia de tolueno (Shinoda et al., 2005a). En Azoarcus sp. EbN1, se ha podido observar que muy pocas proteínas implicadas en la degradación aeróbica de benzoato se expresan cuando las células son crecidas anaeróbicamente en presencia de benzoato (Wohlbrand et al., 2007). Sin embargo, también se han descrito casos en los que los genes de determinadas enzimas sensibles a la presencia de oxígeno se transcriben tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, como la enzima BCR (genes bcr) de M. magnetotacticum TS-6 (Shinoda et al., 2005a) o la bencilsuccinato sintasa (genes bss) de Thauera sp. DNT-1 (Shinoda et al., 2004). Por ello, todo parece indicar que cada organismo ha desarrollado una estrategia reguladora particular para la expresión dependiente de oxígeno de los genes implicados en el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos. Cabría la posibilidad de que, tanto la expresión de genes anaeróbicos en condiciones aeróbicas, como la de genes aeróbicos en condiciones anaeróbicas, pudiera ser el resultado del escape sufrido por la regulación específica, pero también podría ser explicado como un mecanismo de los organismos anaerobios facultativos para mantener un nivel basal de enzimas con el fin de facilitar una respuesta inmediata en ambientes Introducción 39 sujetos a fuertes fluctuaciones de los niveles de oxígeno (Fuchs, 2008). Una explicación adicional podría basarse en el hecho de que exista una única benzoato-CoA ligasa para iniciar el catabolismo aeróbico o anaeróbico de benzoato, como sucede en determinadas cepas de T. aromatica y de Magnetospirillum spp. (Kawaguchi et al., 2006; Schuhle et al., 2003). Tal y como se indicó anteriormente, en R. palustris, el promotor del gen badD es controlado por los reguladores BadR y BadM y, además, por la proteína reguladora AadR (Tabla 3) en respuesta a condiciones de anaerobiosis (Figura 4) (Egland & Harwood, 1999). La proteína AadR, cuyo gen se localiza fuera de los clusters ali-bad- hba, pertenece a la superfamilia de reguladores transcripcionales Fnr/Crp, con lo que conserva aquellas regiones características de esta superfamilia, entre las que cabe destacar cuatro residuos de cisteína altamente conservados que coordinan un grupo 4Fe- 4S, responsable de la inactivación de la proteína en presencia de oxígeno. Este hecho, unido al hallazgo en la región promotora del operón badDEFG de una secuencia consenso de unión a Fnr (TTGAT-N4-ATCAA) centrada en la posición –39.5 respecto del inicio de la transcripción, apoya la hipótesis de que AadR actúa probablemente en respuesta a condiciones anaeróbicas, momento en el que adopta una conformación activa que le permite unirse al promotor badD y así activar su transcripción (Egland & Harwood, 1999). No obstante, no puede descartarse la posibilidad de que el efecto positivo de AadR sobre el promotor badD pudiera producirse de forma indirecta por medio de la activación de otra proteína reguladora (Egland & Harwood, 1999), como, de hecho, parece ocurrir en el caso del control de la expresión del gen hbaA a través de la expresión del activador HbaR dependiente de AadR (Figura 4). También se ha podido identificar una posible caja de unión a Fnr en la región promotora del gen aadR, lo que sugiere que, probablemente, AadR también sea capaz de unirse a este sitio y así autorregular su propia expresión (Dispensa et al., 1992). A pesar de la similitud predicha entre las estructuras de Fnr y AadR, todo parece indicar que ambas proteínas no juegan el mismo papel regulador en sus respectivos organismos, E. coli y R. palustris, respectivamente. La ausencia de Fnr en E. coli tiene un efecto pleiotrópico en la expresión de un cierto número de genes, que da lugar, por ejemplo, a la incapacidad de la cepa mutante de crecer utilizando nitrato o fumarato como aceptor final de electrones (Unden et al., 1995). Por el contrario, la ausencia de AadR en R. palustris, no da lugar a ningún efecto aparente cuando la cepa mutante crece en fuentes de carbono no aromáticas. Esto parece indicar que AadR es un Introducción 40 regulador dependiente de oxígeno especializado en el control de genes responsables del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos, en lugar de un regulador global que controle la expresión de diferentes circuitos génicos, como es el caso de otros miembros del grupo Fnr (Korner et al., 2003). Este tipo de especialización podría ser una norma general en organismos capaces de degradar compuestos aromáticos como Azoarcus y R. palustris, en cuyos genomas pueden identificarse un significativo número de reguladores de la superfamilia Fnr/Crp, al contrario de lo que sucede en E. coli, en cuyo genoma sólo se ha identificado el gen fnr. Por ejemplo, en el caso de Azoarcus sp. EbN1, se han identificado hasta siete posibles reguladores transcripcionales de la superfamilia Fnr/Crp: un homólogo de Fnr, un homólogo de Crp, tres homólogos de Dnr y dos homólogos de Nnr (Rabus et al., 2005). 3.5.2 Regulación de la represión catabólica. El control del catabolismo dependiente de la disponibilidad de fuentes de carbono es uno de los mecanismos fundamentales en bacterias, confiriendo una competencia ventajosa al establecer prioridades en el metabolismo del carbono. El término represión catabólica pretende englobar toda una serie de procesos reguladores que aseguren la máxima eficiencia cuando la bacteria crezca en un medio con diversas fuentes de carbono, de forma que, en presencia de una fuente de carbono preferente, no se induzcan rutas de degradación de fuentes de carbono no preferentes, incluso estando sus correspondientes inductores presentes en el medio (Carmona, 2008; Cases & de Lorenzo, 2005; Diaz & Prieto, 2000; Rojo, 2004b). Se ha descrito una amplia cantidad de casos de represión catabólica en el catabolismo aeróbico de los compuestos aromáticos, además de lograrse caracterizar algunos de los reguladores implicados en estos procesos en diversas bacterias (Carmona, 2008; Collier et al., 1996; Marques et al., 2006; Moreno & Rojo, 2008; Ohtsubo et al., 2006a; Prieto et al., 2004; Rojo, 2004b; Shingler, 2003). No obstante, el control mediado por represión catabólica también parece ser una característica típica de los organismos que crecen en condiciones anaeróbicas, habiéndose descrito un par de ejemplos en rutas anaeróbicas de degradación de compuestos aromáticos en T. aromatica (Heider et al., 1998) y Azoarcus sp. CIB (López Barragán et al., 2004a). En estos organismos, la represión catabólica de la ruta anaeróbica de degradación de benzoato es llevada a cabo por determinados ácidos orgánicos como succinato, malato y acetato. Como cabría esperar, aquellos compuestos que no pueden ser utilizados como únicas fuentes de carbono en Introducción 41 condiciones anaeróbicas, como citrato, glicerol, fructosa o maltosa, no causan represión catabólica de la ruta anaeróbica del catabolismo del benzoato (López Barragán et al., 2004a). Los mecanismos moleculares responsables del control de la represión catabólica de las rutas aeróbicas de degradación de compuestos aromáticos han sido estudiados en algunos organismos, entre los que cabe destacar a E. coli, cuyo principal responsable del control de la represión catabólica es la proteína receptora de AMPc (CRP), la cual actúa como un activador transcripcional global en presencia de AMPc (Prieto et al., 2004). Si bien E. coli y muchos otros microorganismos utilizan de forma preferente la glucosa como fuente de carbono, las bacterias del género Pseudomonas degradan preferentemente ácidos orgánicos o aminoácidos antes que azúcares (Collier et al., 1996). Sin embargo, no todos los ácidos orgánicos presentan la capacidad de ejercer como efectores de la represión catabólica e incluso algunos de ellos muestran dicho efecto en unos casos, pero no en otros (Rojo, 2004b). La represión catabólica no suele producirse únicamente por la presencia de un determinado compuesto en el medio, sino que suele ser el resultado de la integración de diversas señales ambientales. Curiosamente, la proteína CRP responsable del control de la represión catabólica en E. coli, presenta un homólogo muy similar codificado en el cromosoma de diversas cepas de Pseudomonas y, sin embargo, en este caso no parece mediar en el control de la represión catabólica (Morales et al., 2004b; Rojo, 2004b; Suh et al., 2002). Por el contrario, se han identificado otra serie de proteínas implicadas en la represión catabólica de diversas rutas de degradación de aromáticos en bacterias no entéricas, como Crc (catabolite repression control) (Morales et al., 2004b; Moreno & Rojo, 2008; Rojo, 2004b), PtsN y PtsO (sistema de transporte nitrógeno fosfotransferasa) (Marques et al., 2006; Pflüger & de Lorenzo, 2008), ciertas oxidasas terminales tipo o (CyoB) capaces de sensar el estado redox de la célula (Morales et al., 2006; Petruschka et al., 2001b) y el regulador BphQ (Ohtsubo et al., 2006a). No obstante, si bien se tiene abundante información acerca de la represión catabólica de las rutas aeróbicas de degradación de aromáticos, aún no se conocen mecanismos moleculares responsables del control de la represión catabólica en rutas anaeróbicas del catabolismo de compuestos aromáticos, salvo estudios preliminares llevados a cabo sobre la represión catabólica de la ruta anaeróbica de degradación de benzoato en Azoarcus sp. CIB. En este microorganismo, el efecto represor de ciertas fuentes de carbono, como succinato, malato, piruvato, etc., tiene lugar a nivel de la Introducción 42 transcripción del promotor PN (Figura 5) (López Barragán et al., 2004a). También se han descrito diversos promotores de rutas catabólicas en otros organismos, cuya expresión se ve disminuida cuando las células crecen en presencia de determinados sustratos y una fuente de carbono preferente, siendo mediada dicha disminución por una variación de los niveles de los reguladores transcripcionales correspondientes. Por ejemplo, a medida que aumenta la represión catabólica de la ruta de degradación de alcanos (genes alk) codificada en el plásmido OCT de P. putida Gpo1, decrece la expresión del activador AlkS (Canosa et al., 2000). De forma similar, la represión catabólica de la degradación de fenol (genes phl) en P. putida H se produce por interferencia con la función activadora del regulador transcripcional PhlR (Muller et al., 1996). Basándose en esta información, se ha sugerido la existencia de factores adicionales que pudieran estar implicados en la represión catabólica de la ruta de degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB. Uno de estos factores podría ser la existencia de un regulador transcripcional adicional capaz de unirse al promotor PN en respuesta a ácidos orgánicos, como succinato, de forma que impediría la expresión de los niveles basales del cluster bzd responsables de la síntesis de la molécula efectora, el benzoil-CoA (Figura 5). Por otro lado, aunque la regulación sobreimpuesta del catabolismo anaeróbico del tolueno no ha sido estudiada aún en suficiente detalle, sí se ha podido observar que los genes bss/bbs, responsables de la degradación anaeróbica del tolueno, se encuentran sometidos a represión catabólica cuando las células son crecidas simultáneamente en tolueno y en un ácido orgánico no aromático, como succinato o piruvato (B. Blázquez, datos no publicados). De igual forma, también se han descrito sistemas de represión catabólica semejantes en rutas de degradación aeróbica de tolueno (Duetz et al., 1996; Ruíz et al., 2004). En cualquier caso, la base molecular subyacente al control de la represión catabólica de la ruta de degradación anaeróbica de tolueno en Azoarcus sp. CIB y en otros degradadores de tolueno permanece pendiente de ser caracterizada. 43 OOBBJJEETTIIVVOOSS 44 Objetivos 45 OOBBJJEETTIIVVOOSS En base a lo expuesto en el apartado de “Introducción” se puede extraer que la información existente acerca de la regulación de rutas de degradación anaeróbica de compuestos aromáticos es bastante escasa, en comparación con la información existente sobre regulación del catabolismo aeróbico. Concretamente, en el caso de la regulación del catabolismo anaeróbico del benzoato en la β-proteobacteria Azoarcus sp. CIB, se había logrado, al inicio de esta tesis, determinar parcialmente el mecanismo de regulación del cluster bzd. De igual forma, desde el primer gen, aadR, cuyo producto génico fue relacionado con el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos, no se han descrito una gran cantidad de este tipo de reguladores de rutas anaeróbicas. En relación con el catabolismo anaeróbico de benzoato en Azoarcus sp. CIB únicamente se había descrito el represor BzdR, que había sido parcialmente caracterizado. Por todo lo anteriormente expuesto, en este tesis se propusieron una serie de objetivos dirigidos a profundizar tanto en el conocimiento del mecanismo molecular responsable de la regulación del catabolismo anaeróbico de benzoato en Azoarcus sp. CIB, como en la caracterización estructural y modular de la proteína BzdR. De esta forma, se propusieron esencialmente 5 objetivos que se enumeran a continuación: OObbjjeettiivvoo 11:: EEssttuuddiioo ddee llaa rreegguullaacciióónn ddeeppeennddiieennttee ddee ooxxííggeennoo ddee llaa rruuttaa ddee ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. OObbjjeettiivvoo 22:: EEssttuuddiioo ddeell pprroommoottoorr PPRR ddeell ggeenn bbzzddRR yy ssuu iimmpplliiccaacciióónn eenn llaa rreegguullaacciióónn ddee llaa ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. OObbjjeettiivvoo 33:: EEssttuuddiioo ffuunncciioonnaall yy eessttrruuccttuurraall ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. OObbjjeettiivvoo 44:: LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR ccoommoo mmooddeelloo ppaarraa llaa ssíínntteessiiss ddee nnuueevvooss rreegguullaaddoorreess ffuunncciioonnaalleess.. OObbjjeettiivvoo 55:: EEssttuuddiioo ddee llaa iinntteerraacccciióónn eennttrree llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR yy eell pprroommoottoorr PPNN.. 46 47 MMAATTEERRIIAALLEESS YY MMÉÉTTOODDOOSS 48 Materiales y Métodos 49 MMAATTEERRIIAALLEESS YY MMÉÉTTOODDOOSS 11.. CCeeppaass bbaacctteerriiaannaass yy pplláássmmiiddooss.. A continuación se muestra una tabla con las diferentes cepas de E. coli y Azoarcus sp. CIB y otra tabla con los plásmidos utilizados en esta tesis, junto a sus características más relevantes. Tabla 4. Cepas bacterianas utilizadas. Cepa Genotipo/Fenotipo Referencia E. coli K12 CC118 Rfr, Spr; Δ(ara-leu) araD, ΔlacX74, galE, galK, phoA20, thi-1, rpsE, rpoB, argE (Am), recA1 (Herrero et al., 1990) DH10B F´, mcrA, Δ(mrr, hsdRMS-mcrBC), φ80dlacΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK λ rpsL, endA1, nupG Life Technologies DH5α endA1, hsdR17, supE44 thi-1, recA1, gyrA(Nalr), relA1, Δ(argF-lac)U169, depR, (φ80dlacΔ(lacZ) M15) (Sambrook & Rusell, 2001) M15 Cepa de expresión de vectores pQE Qiagen MC4100 araD139, Δ(argF-lac)U169, rpsL150, relA1, flbB5301, deoC1, ptsF25, rbsR (Casadaban, 1976) AFMC MC4100 resistente a rifampicina (Ferrández et al., 2000) AFMCPN Kmr; AFMC portadora en el cromosoma de la fusión traduccional PN::lacZ (Barragán et al., 2005) AFMCRPN Kmr; AFMC portadora en el cromosoma de la fusión traduccional PR-bzdR/PN::lacZ (Barragán et al., 2005) M182 Smr; (ΔlacIOPZYA)X74, galU, galK, rpsL. Δ(ara- leu) (Spiro & Guest, 1988) MV1190 Δ(lac-pro), thi, supE, Δ(srl-recA)306::Tn10, (F’ traD36, lacIqZΔM15, proAB) Bio-Rad S17-1λpir Tpr, Smr; recA, thi, hsdRM+, RP4::2-Tc::Mu::Km, Tn7, λpir lisogénico (de Lorenzo & Timmis, 1994a) JRG1728 Cmr, Smr; Δ(tyrR, fnr, rac, trg)17, zdd-30::Tn9; derivado de M182 (Spiro & Guest, 1988) RZ7350 lacZΔ145, narG234::Mudl1734 (Kiley & Reznikoff, 1991) PK330 Cmr; Ptrp-rpoD derivado de RZ7350 (Lonetto et al., 1998) XL1-Blue MRA (P2) Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, gyrA96, supE44, relA1, thi-1, lac, P2 lisogénico Stratagene Azoarcus sp. CIB CIB Cepa silvestre degradadora de compuestos aromáticos (López Barragán et al., 2004a) CIBdbzdR Cepa CIB con disrupción insercional del gen bzdR (López Barragán et al., 2004a) CIBdbzdN Cepa CIB con disrupción insercional del gen bzdN (Barragán et al., 2005) CIBdacpR Cepa CIB con disrupción insercional del gen acpR Este trabajo CIBlacZ Cepa CIB portadora en cromosoma de la fusión traduccional PN::lacZ (López Barragán et al., 2004a) Fago λ EMBL-4 ? Materiales y Métodos 50 Tabla 5. Plásmidos utilizados. Plásmido Genotipo/Fenotipo Referencia pK18mob Kmr, oriColE1, Mob+, lacZα, vector suicida utilizado para las disrupciones insercionales mediante recombinación homóloga (Schäfer et al., 1994) pK18mobacpR Kmr; derivado de pK18mob que incluye un fragmento BamHI/HindIII de 410 pb del gen acpR Este trabajo pSJ3 Apr, oriColE1, ´lacZ, vector para búsqueda de promotores con el gen reportero lacZ flanqueado con dianas de restricción NotI (Ferrández et al., 1998) pSJ3PN Apr, derivado de pSJ3 que contiene la fusión traduccional PN::lacZ (López Barragán et al., 2004a) pSJ3RPN Apr, derivado de pSJ3 que contiene la fusión traduccional bzdR/PN::lacZ (Barragán et al., 2005) pSJ3PR Apr, derivado de pSJ3 que contiene la fusión traduccional PR::lacZ Este trabajo pECOR7 Apr, pUC19 que contiene un fragmento EcoRI de 7.1 kb procedente del fago λBzd1 (López Barragán et al., 2004a) pHW1 Kmr; gen fnr clonado en el plásmido pLG339 (Bell et al., 1990) pET29a(+) Kmr; oriColE1, vector de clonación e hiperexpresión Novagen pET29-BzdR Kmr; derivado de pET29a(+) que expresa la proteína BzdR Este trabajo pQE32 Apr, oriColE1, promotor T5, operador lac, terminadores λ to/E. coli rrnB T1, N-terminal His6 Qiagen pQE32-His6BzdR Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-bzdR (Barragán et al., 2005) pQE32-His6NBzdR Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-NbzdR Este trabajo pQE32-His6N2BzdR Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-N2bzdR Este trabajo pQE32-His6CBzdR Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-CbzdR Este trabajo pQE32-His6Q1BzdR Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-Q1bzdR (fusión N2BzdR-aroK) Este trabajo pQE32-His6Q2BzdR Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-Q2bzdR (fusión N2BzdR-aroK mutante) Este trabajo pQE32-His6Q4BzdR Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-Q4bzdR (fusión NBzdR-aroK) Este trabajo pQE32-His6Q5BzdR Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-Q5bzdR (fusión NBzdR-aroK mutante) Este trabajo pQE32-His6SKI Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-aroK Este trabajo pQE32-His6mut3 Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-bzdRmut3 Este trabajo pQE32-His6mut4 Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-bzdRmut4 Este trabajo pQE32-His6mut5 Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-bzdRmut5 Este trabajo pQE60-His6Fnr* Apr, derivado de pQE32 que incluye la fusión génica His6-fnr* Este trabajo pSJ6 Kmr; vector de clonación y expresión de amplio espectro de huésped que incluye la fusión Pr::tnp’::’lacZ en una casete NotI de 4.0 kb (Jaenecke et al., 1996) pcI-cat Apr; derivado de pC132 que expresa la proteína de fusión cI-CAT (dominio N-terminal del represor cI del fago λ y gen de la cloramfenicol aminotransferasa) (Di Lallo et al., 1999) Materiales y Métodos 51 Plásmido Genotipo/Fenotipo Referencia pcI-LBzdR Apr; derivado de pCI que expresa la proteína de fusión cI-LBzdR Este trabajo pcI-Qλ (cI-C2) Apr; derivado de pCI que expresa la proteína de fusión Qλ Este trabajo pcI-Qλ2 (cI-C1) Apr; derivado de pCI que expresa la proteína de fusión Qλ2 Este trabajo pcI Apr; derivado de pcI-cat que expresa el dominio N- terminal del represor cI del fago λ Este trabajo pCK01 Cmr, oripSC101, vector de clonación de bajo número de copias con polylinker flanqueado por dianas NotI (Fernandez et al., 1995) pCK01-BzdR Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/HindIII procedente de pQE32-His6BzdR que incluye el gen bzdR bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-NBzdR Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/HindIII procedente de pQE32-His6NBzdR que incluye el gen bzdR bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-N2BzdR Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/HindIII procedente de pQE32-His6N2BzdR que incluye el gen bzdR bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-Q1 Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/PstI procedente de pQE32-His6Q1 que incluye la fusión N2bzdR-aroK bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-Q2 Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/PstI procedente de pQE32-His6Q2 que incluye la fusión N2bzdR-aroK mutante bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-Q4 Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/PstI procedente de pQE32-His6Q4 que incluye la fusión NbzdR-aroK bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-Q5 Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/PstI procedente de pQE32-His6Q5 que incluye la fusión NbzdR-aroK mutante bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-BzdRmut3 Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/HindIII procedente de pQE32-His6BzdRmut3 que incluye el gen bzdRmut3 bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-BzdRmut4 Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/HindIII procedente de pQE32-His6BzdRmut4 que incluye el gen bzdRmut4 bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-BzdRmut5 Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/HindIII procedente de pQE32-His6BzdRmut5 que incluye el gen bzdRmut5 bajo el control del promotor T5 Este trabajo pCK01-BzdA Cmr; derivado de pCK01 que contiene un fragmento EcoRI/ScaI de 2.2 kb que incluye el gen bzdA bajo el control del promotor Plac (Barragán et al., 2005) pBBR1MCS-5 Gmr, oripBBR1MCS Mob+ lacZα, vector de clonación y expresión de amplio espectro de huésped (Kovach et al., 1995) pGEM-T Easy Apr, oriColE1, lacZα; vector para la clonación de fragmentos de PCR Promega pGEM-T EasyacpR Apr, derivado de pGEM-T Easy que contiene un fragmento de PCR de 1.2 kb que incluye el gen acpR Este trabajo Materiales y Métodos 52 Plásmido Genotipo/Fenotipo Referencia pBBR5PN Gmr, derivado de pBBR1MCS-5 que contiene un fragmento EcoRI/HindIII de 4.2 kb que contiene la fusión traduccional PN::lacZ procedente de pSJ3PN (Barragán et al., 2005) pBBR5PR Gmr, derivado de pBBR1MCS-5 que contiene un fragmento EcoRI/HindIII de 4.2 kb que contiene la fusión traduccional PR::lacZ procedente de pSJ3PR Este trabajo pBBR1MCS-5acpR Gmr, derivado de pBBR1MCS-5 que contiene un fragmento KpnI/ApaI de 1.2 kb que incluye el gen acpR Este trabajo pREP4 Kmr, orip15A; plásmido que expresa el represor lacI Qiagen pJCD01 Apr oriColE1; polylinker de pUC19 flanqueado por los terminadores rpoC y rrnBT1T2 (Marschall et al., 1998) pJCD-PN Apr; derivado de pJCD01 que contiene un fragmento EcoRI de 585 pb que incluye el promotor PN Este trabajo pJCD-PR Apr; derivado de pJCD01 que contiene un fragmento SmaI/EcoRI de 298 pb que incluye el promotor PR Este trabajo pGEX-2T Apr; plásmido para la construcción de proteínas fusionadas a GST (Smith & Johnson, 1988) pGEX-2Tσ70 Apr; derivado de pGEX-2T que contiene el gen rpoD (Lonetto et al., 1998) pGEX-2Tσ70(EA591) Apr; derivado de pGEX-2T que contiene el gen rpoD-EA591 (Lonetto et al., 1998) pGEX-2Tσ70(KA593) Apr; derivado de pGEX-2T que contiene el gen rpoD-KA593 (Lonetto et al., 1998) pGEX-2Tσ70(KA597) Apr; derivado de pGEX-2T que contiene el gen rpoD-KA597 (Lonetto et al., 1998) pIZ1016 Gmr, derivado del vector de clonación y expresión de amplio espectro de huésped pBBR1MCS-5 con el promotor tac y el gen lacIq de pMM40 (Moreno-Ruiz et al., 2003) pIZ-FNR* Gmr; derivado de pIZ1016 que contiene el gen fnr* bajo el control del promotor Ptac Este trabajo 22.. MMeeddiiooss yy ccoonnddiicciioonneess ddee ccuullttiivvoo.. Todas las soluciones y medios de cultivo utilizados en este trabajo se esterilizaron por calor húmedo en autoclave a 121ºC y 1 atmósfera de presión, o mediante filtración utilizando filtros estériles Millipore de 0.2 micras de diámetro. Para los crecimientos de E. coli y Azoarcus sp. CIB se utilizaron diferentes medios de cultivo cuya composición se detallará a continuación. 22..11 MMeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo eemmpplleeaaddooss ppaarraa EE.. ccoollii.. El medio rico empleado fue Luria-Bertani (LB) (Sambrook & Rusell, 2001). Los cultivos de E. coli en medio sólido se realizaron con medio LB suplementado con agar al 1.5% (p/v). Cuando fue necesario, se añadió 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- galactopiranósido (X-gal) a una concentración de 0.08 mM, así como isopropil-1-tio-β- D-galactopiranósido (IPTG) a una concentración de 0.2 mM. Materiales y Métodos 53 El medio mínimo empleado para E. coli fue M63 (Miller, 1972), al que se añadió agar al 1.5% (p/v) para los crecimientos en medio sólido. El medio mínimo se suplementó con glicerol (20 mM) como fuente de carbono, así como con las vitaminas y aminoácidos necesarios para cada cepa a las concentraciones recomendadas por Gerhardt et al. (Gerhardt et al., 1994). Cuando fue necesaria la anaerobiosis, se añadió KNO3 10 mM como aceptor final de electrones. Cuando fueron requeridos, los antibióticos se utilizaron a las concentraciones que se indican en el apartado 2.3. 22..22 MMeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo eemmpplleeaaddooss ppaarraa AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. El medio mínimo empleado en este trabajo para cultivar las cepas de Azoarcus sp. CIB fue el medio denominado MA (pH 7.5), cuya composición se detalla a continuación: KH2PO4 0.33 g Na2HPO4 1.2 g NH4Cl 0.11 g MgSO4⋅7H2O 0.1 g CaCl2 0.04 g H2O destilada hasta 1 l Este medio basal fue suplementado con una solución de elementos traza (pH 6.5), cuya composición (1000x) se detalla a continuación: Ácido nitrilotriacético (NTA) 1.5 g ZnSO4⋅7H2O 0.18 g MgSO4⋅7H2O 3.0 g CuSO4⋅5H2O 0.01 g MnSO4⋅2H2O 0.5 g KAl(SO4)2⋅12H2O 0.02 g NaCl 1.0 g H3BO3 0.01 g FeSO4⋅7H2O 0.1 g Na2MoO⋅2H2O 0.01 g CoSO4⋅7H2O 0.18 g NiCl2⋅6H2O 0.025 g NaSeO3 ·5H2O 0.3 g H2O destilada hasta 1 l También se suplementó el medio MA con una solución de vitaminas cuya composición (1000x) es la siguiente: Materiales y Métodos 54 Biotina 20 mg Ácido fólico 20 mg Piridoxina-HCl 10 mg Tiamina-HCl ⋅ 2H2O 50 mg Riboflavina 50 mg Ácido nicotínico 50 mg D-pantotenato cálcico 50 mg Vitamina B12 50 mg Ácido p-aminobenzoico 50 mg H2O destilada hasta 1 l Para el crecimiento anaeróbico de Azoarcus sp. CIB se añadió, como aceptor final de electrones, KNO3 10 mM al medio MC (medio basal suplementado con vitaminas y elementos traza). Además, para asegurar el ambiente reductor, también se añadió al medio MC una solución de sulfuro ferroso a una concentración final de 0.044 mg/ml. 22..33 AAnnttiibbiióóttiiccooss.. Los antibióticos se prepararon en soluciones 1000 veces concentradas en agua, excepto el cloranfenicol y la rifampicina que se disolvieron en etanol 100% y en DMSO 100%, respectivamente. Estas soluciones se esterilizaron por filtración y se almacenaron a –20ºC. Los antibióticos se utilizaron a las concentraciones finales que se indican: Ampicilina (Ap) 100 μg/ml Cloranfenicol (Cm) 34 μg/ml Kanamicina (Km) 50 μg/ml Gentamicina (Gm) 7.5 μg/ml 22..44 OObbtteenncciióónn ddee ccoonnddiicciioonneess aannaaeerróóbbiiccaass eenn llooss mmeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo.. Para obtener condiciones de anaerobiosis, tanto el medio de cultivo como las soluciones de elementos traza, el nitrato potásico, el sulfuro ferroso, las fuentes de carbono y el resto de compuestos utilizados, se dispensaron en frascos de vidrio, los cuales se sellaron con tapones de goma y arandelas de aluminio. A través del tapón de goma se inyectó una aguja conectada a un depósito de nitrógeno (Alpha Gas), permitiendo pasar un flujo de este gas al medio líquido durante varios minutos con el objeto de eliminar el oxígeno. Finalmente, todos los frascos fueron autoclavados. Para obtener una solución anaeróbica y estéril de vitaminas (las cuales son sensibles al calor) se realizó la misma operación descrita anteriormente pero con frascos de vidrio Materiales y Métodos 55 vacíos en los que, después de ser esterilizados por autoclave, se inyectó la solución de vitaminas mediante una jeringa conectada a un filtro estéril Millipore (de 0.2 micras de diámetro). Una vez preparadas estas soluciones, fueron añadidas al medio basal MA para obtener así el medio MC suplementado con las correspondientes fuentes de carbono. Tanto la filtración de las soluciones de vitaminas como la inoculación de los medios de cultivo con las distintas cepas bacterianas, se realizaron en una cámara de anaerobiosis (Forma Scientific). 22..55 CCoonnddiicciioonneess ddee ccuullttiivvoo.. Para los crecimientos aeróbicos, las cepas de E. coli fueron cultivadas a 37ºC y en agitación a 250 rpm, mientras que Azoarcus sp. CIB fue incubado a 30ºC y en agitación brusca. En el caso de los crecimientos anaeróbicos, ambas estirpes bacterianas fueron incubadas a 30ºC sin agitación. Cuando se utilizaron compuestos aromáticos como fuente de carbono, éstos fueron añadidos al medio MC a una concentración de 3 mM. El crecimiento de los cultivos fue monitorizado midiendo la densidad óptica a 600 nm (A600) empleando un espectrofotómetro Shimadzu UV-260. La morfología celular se analizó con un microscopio de contraste de fase Nikon OPTIPHOT-2. La desnitrificación en cultivos anaeróbicos fue monitorizada midiendo los niveles de NO3 y NO2 con el Test Nitrates (Merck). El consumo de benzoato en el medio de cultivo fue monitorizado espectrofotométricamente a 273 nm tras la acidificación del medio con HCl. 22..66 CCoonnsseerrvvaacciióónn ddee llaass cceeppaass bbaacctteerriiaannaass.. Durante cortos períodos de tiempo (menos de un mes) E. coli se conservó a 4ºC en placas de medio LB o de medio mínimo. Los cultivos anaeróbicos de Azoarcus sp. CIB se conservaron adecuadamente durante un período aproximado de un mes a 4ºC en frascos de vidrio. Para su conservación a largo plazo, las bacterias se congelaron en el medio de cultivo correspondiente con glicerol al 15% (v/v) y se mantuvieron a -80° C. Materiales y Métodos 56 33 TTééccnniiccaass ddee mmaanniippuullaacciióónn ddee AADDNN yy AARRNN.. La manipulación del ADN así como la mayor parte de las técnicas de biología molecular utilizadas en este trabajo fueron aplicadas esencialmente tal y como describen Sambrook y Rusell (Sambrook & Rusell, 2001). Las endonucleasas de restricción fueron suministradas por Amersham Biosciences, New England Biolabs y Takara. La ADN ligasa T4 y el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli se adquirieron de Amershan Biosciences, y la ADN polimerasa T4 de Applied Biosystems. La ARN polimerasa utilizada en los ensayos de transcripción in vitro fue suministrada por USB (E. coli RNA Polymerase Holoenzyme 1 U/μl). Todas las enzimas se utilizaron siguiendo las indicaciones de las respectivas casas comerciales. 33..11 AAiissllaammiieennttoo ddee AADDNN.. La purificación de ADN plasmídico se realizó mediante el uso de High Pure™ Plasmid Purification Kit (Roche). Para obtener mayores volúmenes de preparaciones plasmídicas, se utilizó el Plasmid Midi kit (QIAGEN). El ADN cromosómico se extrajo empleando el procedimiento descrito por Wilson (Wilson, 1997). 33..22 RReeaacccciióónn ddee aammpplliiffiiccaacciióónn eenn ccaaddeennaa ccoonn AADDNN ppoolliimmeerraassaa tteerrmmoorrrreessiisstteennttee ((PPCCRR)).. Para llevar a cabo la amplificación de fragmentos de ADN se empleó un termociclador Gene ATAQ Controller (Pharmacia-LKB) y las enzimas AmpliTaq® DNA polimerasa (Applied Biosystem) o la DNA polimerasa PFU (Biotools) de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Los productos amplificados se purificaron utilizando el Gene-Clean Turbo kit (Q-BIOgene) o el High Pure™ PCR Product Purification Kit (Roche). Los distintos oligonucleótidos empleados en las reacciones de PCR se indican en la Tabla 6. Los oligonucleótidos fueron sintetizados empleando un equipo Oligo-1000M (Beckman Instruments, Inc.) en el servicio de Química de Proteínas del Centro de Investigaciones Biológicas, o bien fueron proporcionados por Sigma-Genosys. En la Tabla 6 se detalla la secuencia y ubicación de cada uno de ellos, así como la presencia de las dianas de restricción correspondientes en cada caso. Materiales y Métodos 57 Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados. Las regiones subrayadas pertenecen a la diana de restricción que se indica al final de la secuencia. Nombre Secuencia (5’-3’)/Diana de restricción Localización relativa y utilización REG GTGCCAGGACTTCGAGGATGTC Región interna de bzdR (313 pb) RT-PCR RetI CCGAGCCTCGCGTTTTACTGC Extremo 3´ del gen bzdR 5HISReg CGGGATCCTTTCCAACGATGAGAACTCATCAC/BamHI Extremo 5´ de bzdR (plásmido pQE32- His6BzdR) 3HISReg GGGAAGCTTTCAGCGTGCCAGGACTTCGAGG/HindIII Extremo 3´ de bzdR (plásmido pQE32- His6BzdR) C1BzdR CGGGATCCTTCAGCGCATCGCCTTCATCGGC/BamHI Extremo 5’ del dominio CBzdR (plásmido pQE32- His6CBzdR) N2BzdR GGGAAGCTTTCACCTGCGCGCGCTTCGCCCC/HindIII Extremo 3’ del dominio N2BzdR (plásmido pQE32- His6N2BzdR) N1BzdR GGGAAGCTTTCACTCCGCCTCCTCGCGCACG/HindIII Extremo 3’ del dominio NBzdR (plásmido pQE32- His6NBzdR) N0BzdR GGGAAGCTTTCAGAGCCCCTGCGCGATCTG/HindIII Extremo 3’ del dominio N0BzdR (plásmido pQE32- His6N0BzdR) 5’Glu111Arg CAAGACGCATAGATGGGCGCGCCGG Región intergénica de bzdR para la obtención del mutante bzdRmut3 3’Glu111Arg CCGGCGCGCCCATCTATGCGTCTTG Región intergénica de bzdR para la obtención del mutante bzdRmut3 5’Arg114Glu CATGAATGGGCGGAACGGCTGCTCCAG Región intergénica de bzdR para la obtención del mutante bzdRmut4 3’Arg114Glu CTGGAGCAGCCGTTCCGCCCATTCATG Región intergénica de bzdR para la obtención del mutante bzdRmut4 5’Glu111Arg/ Arg114Glu AAGACGCATAGATGGGCGGAACGGCTGCTCCAG Región intergénica de bzdR para la obtención del mutante bzdRmut5 3’Glu111Arg/ Arg114Glu CTGGAGCAGCCGTTCCGCCCATCTATGCGTCTT Región intergénica de bzdR para la obtención del mutante bzdRmut5 5’ HIS-aroK CGGGATCCTTGCAGAGAAACGCAATATCTTTC/BamHI Extremo 5’ del gen aroK (plásmido pQE32-His6SKI) 3’aroKquim *** GGGGTACCATGGCAGAGAAACGCAATATCTTT/KpnI Extremo 5’ del gen aroK (plásmido pQE32-His6Q1) 5’aroKquim AACTGCAGTTAGTTGCTTTCCAGCATGTGAATA/PstI Extremo 3’ del gen aroK (plásmido pQE32-His6Q1) 5’N2quim GGGGTACCCCTGCGCGCGCTTCG/KpnI Extremo 3’ del dominio N2BzdR (plásmido pQE32- His6Q1) new-N1kim GGGGTACCCTCCGCCTCCTCGCGCACG/KpnI Extremo 3’ del dominio NBzdR (plásmido pQE32- His6Q4) 5’ D36A GAATTTTACGATTCCGCTCAAGAGATT Región intergénica de la quimera Q1 para la obtención del mutante Q2 Materiales y Métodos 58 Nombre Secuencia (5’-3’)/Diana de restricción Localización relativa y utilización 3’ D36A AATCTCTTGAGCGGAATCGTAAAATTC Región intergénica de la quimera Q1 para la obtención del mutante Q2 3’ C1-CI GAAGGCCTCCAGCGCATCGCCTTCATCGG/StuI Extremo 5’ del dominio CBzdR (plásmido pCI-Qλ) 5’ C2 CGGGATCCTCAGCGTGCCAGGACTTCGAGG/BamHI Extremo 3’ del dominio CBzdR (plásmido pCI-Qλ) 3’-NiuBzdR GGAATTCCATATGTCCAACGATGAGAACTCATCA/NdeI Extremo 5’ del gen bzdR (plásmido pET29-BzdR) 5’-NiuBzdR CGGAATTCTCAGCGTGCCAGGACTTCGA/EcoRI Extremo 3’ del gen bzdR (plásmido pET29-BzdR) 3REG GGGGTACCCGTGCATCAATGATCCGGCAAG/KpnI Región intergénica bzdR/bzdN (490 pb) (RT- PCR). Fragmento de 598 pb bzdR/bzdN (PN) clonado en pSJ3PN 5IVTPN CGGAATTCCGTGCATCAATGATCCGGCAAG/EcoRI Fragmento que incluye el promotor PN (sonda FP) 3IVTPN CGGAATTCCATCGAACTATCTCCTCTGATG/EcoRI Fragmento que incluye el promotor PN (sonda FP) 5BZN GCTCTAGACCCATCGAACTATCTCCTCTGATG/XbaI Extremo 3’ del fragmento de 598 pb bzdR/bzdN (PN) clonado en pSJ3PN BLINE CGTGCCTGACATTTGACTTAGATC Extremo 5’ del fragmento que incluye la región I del promotor PN BKIN GGGGTACCCGTGCCTGACATTTGACTTAGATC/KpnI Extremo 5’ del fragmento que incluye la región I del promotor PN PN-II CAAGAAAGATTGCAGTTTTCCATG Extremo 5’ del fragmento que incluye la región II del promotor PN NIU PN-II GGGGTACCCAAGAAAGATTGCAGTTTTCCATG/KpnI Extremo 5’ del fragmento que incluye la región II del promotor PN NIK CGGAATTCGATCTAAGTCAAATGTCAGGCACG/EcoRI Extremo 3’ del fragmento que incluye la región II del promotor PN RET1 CCGAGCCTCGCGTTTTACTGC Extremo 5’ del fragmento que incluye la región III del promotor PN NIU PN-III CGGAATTCCAATCTTTCTTGCCGCAACGC/EcoRI Extremo 3’ del fragmento que incluye la región III del promotor PN 3’PR-ScaI AAAAGTACTCGCGGTTCATGACGTTCATCTG/ScaI Extremo 5’ del fragmento que incluye el promotor PR (plásmido pJCD-PR) 5’PR-EcoRI CGGAATTCCGCCCAACATCAGCAGGTAGTTG/EcoRI Extremo 3’ del fragmento que incluye el promotor PR (plásmido pJCD-PR) 3’-newlynk GAAGGCCTGCGCGAGGAGGCGGAGCAGTC/StuI Extremo 5’ de la región LBzdR (plásmido pCI- LBzdR) 5’-lynk CGGGATCCTCACTGCCTGCGCGCGCTTC/BamHI Extremo 3’ de la región LBzdR (plásmido pCI- LBzdR) Lac57 CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG Inicio del gen lacZ Materiales y Métodos 59 Nombre Secuencia (5’-3’)/Diana de restricción Localización relativa y utilización 5AcpRcib GGGATCCGTTGAGCAGGAAGGCCG/BamHI Región interna del gen acpR 3AcpRcib CAAGCTTCCGCCTCGACGAACTCGTC/HindIII Región interna del gen acpR 3RTpR2 GAGGATGTCCAGGAAGGATTG Extremo 3’ del promotor PR 5RTpR1 GCTGTCATCGTGCTTCACG Extremo 5’ del promotor PR 3RTpN2 GTGTAGGTACACATCGTTGC Extremo 3’ del promotor PN 5RTpN1 GCAACACATCAGAGGAGATAG Extremo 5’ del promotor PN N3’ TTCAGCATCTCGTTGTGCTC Región interna del gen bzdN utilizado para sintetizar la sonda de ADN utilizada en AFM 33..33 SSeeccuueenncciiaacciióónn ddee AADDNN.. La secuenciación se llevó a cabo utilizando un secuenciador automático modelo ABI Prism 377™ automated DNA sequencer (Applied Biosystems Inc), en el Servicio de Secuenciación Automática de ADN dirigido por la empresa Sequgen en el Centro de Investigaciones Biológicas. Para la reacción de secuenciación se utilizó el Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), y la ADN polimerasa AmpliTaq FS, siguiendo las recomendaciones de los proveedores. Las reacciones se llevaron a cabo con un termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Perkin-Elmer) en el servicio de Secuenciación Automática de ADN del Centro de Investigaciones Biológicas. En el caso concreto de los experimentos de extensión por cebador (primer extension), la secuenciación del ADN patrón se llevó a cabo según el método de terminación de la polimerización por dideoxinucleótidos (Sanger et al., 1977) utilizando el T7 Sequencing™ Kit (Amersham Pharmacia Biotech), y [α-32P]dCTP (14.8 × 1012 Bq/mmol, 3.7 × 105 Bq/μl) (Amersham Biosciences) como deoxinucleósido trifosfato marcado radiactivamente, siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. 33..44 DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddeell ssiittiioo ddee iinniicciioo ddee llaa ttrraannssccrriippcciióónn.. 3.4.1 Extracción de ARN. Se procedió al análisis del sitio de inicio de la transcripción (+1) del promotor PR mediante la técnica de extensión por cebador o primer-extension. La extensión se realiza mediante un cebador que hibrida con el ARNm en una posición cercana al Materiales y Métodos 60 supuesto sitio de iniciación de la transcripción. Para ello, se utilizó una cepa de Azoarcus sp. CIB que incorporaba el plásmido pBBR5PR (PR::lacZ) (Tabla 5), que fue crecida anaeróbicamente en medio MC y con benzoato 3 mM como fuente de carbono, hasta que la A600 alcanzó un valor de 0.3. Las células fueron lavadas, resuspendidas en tampón TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) con lisozima (50 mg/ml; Sigma) y posteriormente lisadas mediante varios ciclos de congelación-descongelación. A continuación se aisló el ARN total del cultivo mediante el RNeasy Mini kit (Qiagen), siguiendo las indicaciones del proveedor. 3.4.2 Extensión por cebador (primer-extension). Las reacciones de extensión fueron llevadas a cabo con la transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar (Promega) y 10 μg de ARN total, tal y como se ha descrito previamente (Martín et al., 1995), usando el oligonucleótido Lac57 (Tabla 6) marcado previamente en su extremo 5´ con la polinucleótido quinasa del fago T4 en presencia de [γ-32P]ATP (3000 Ci, 111 TBq mmol-1; Amersham Biosciences). Con el fin de determinar el tamaño de los productos obtenidos en la reacción de extensión, se llevaron a cabo en paralelo reacciones de secuenciación del plásmido pBBR5PR con el oligonucleótido Lac57 utilizando el T7 sequencing kit en presencia de [γ-32P]dCTP (Amersham Biosciences), siguiendo las indicaciones del proveedor. Los productos obtenidos en las reacciones fueron analizados por electroforesis en geles de poliacrilamida 6%-urea 8M. Los geles se secaron al vacío sobre papel Whatman 3MM y se expusieron en películas Hyperfilm™ MP (Amersham Pharmacia Biotech) con pantallas amplificadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). 33..55 EEnnssaayyooss ddee rreettrroottrraannssccrriippcciióónn--PPCCRR ((RRTT--PPCCRR)) eenn ttiieemmppoo rreeaall.. Azoarcus sp. CIB fue cultivado anaeróbicamente en medio MC con benzoato, succinato o benzoato más succinato hasta alcanzar una A600 de 0.2 (fase exponencial). Las células fueron obtenidas por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos y resuspendidas en tampón de lisis TE (Tris-HCl 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM). La lisis celular se produjo por ciclos de congelación-descongelación y el ARN total de Azoarcus sp. CIB fue posteriormente extraído con el High Pure RNA isolation kit (Roche). La contaminación de ADN en las preparaciones de ARN se eliminó mediante un tratamiento con el DNase treatment and removal kit (Ambion). La concentración y pureza de las muestras de ARN fue medida con un espectrofotómetro ND1000 Materiales y Métodos 61 (Nanodrop Technologies), siguiendo las indicaciones del fabricante. El análisis de los niveles de transcripción de los promotores PN o PR fue llevado a cabo en 20 μl de reacción que contenía 2 μg de ARN, 0.5 mM de cada uno de los desoxinucleótidos (dNTPs), 200 U de la transcriptasa reversa SuperScript II (Invitrogen) y 0.5 μM del oligonucleótido 3RTpN2 ó 3RTpR2 (Tabla 6), respectivamente, en el tampón recomendado por el proveedor. Las reacciones fueron incubadas a 42ºC durante 2 horas, seguido de una incubación a 70ºC durante 15 minutos, para eliminar finalmente el ARN molde mediante una incubación a 37ºC en presencia de 20 U de RNasa H (Amersham Biosciences) durante 20 minutos. El ADNc obtenido fue almacenado a -20ºC. A continuación, se llevó a cabo la PCR en tiempo real en un termociclador IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Las mezclas de reacción contenían 10 μl de ADNc diluido, oligonucleótido 3RTpR2 0.2 μM, oligonucleótido 5RTpR1 0.2 μM (Tabla 6), para el promotor PR, u oligonucleótido 3RTpN2 0.2 μM, oligonucleótido 5RTpN1 0.2 μM (Tabla 6), para el promotor PN, y 12.5 μl de la mezcla SYBR Green (Applied Biosystems). Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo de la siguiente forma: 1 ciclo inicial de desnaturalización (95ºC, 3 minutos), seguido de 44 ciclos de amplificación (95ºC, 30 segundos; hibridación, 57ºC, 30 segundos; elongación y medida de la señal, 72ºC, 30 segundos). Para la cuantificación relativa de los valores de fluorescencia obtenidos, se realizó una curva de calibrado con diluciones seriadas de ADN genómico. 33..66 MMuuttaaggéénneessiiss ddiirriiggiiddaa ddeell ggeenn bbzzddRR.. La construcción de los genes bzdR mutantes (bzdRmut3, bzdRmut4 y bzdRmut5) se llevó a cabo mediante mutagénesis dirigida en dos etapas sucesivas de PCR. En una primera etapa, se amplificó el gen dividido en dos fragmentos utilizando como molde el plásmido pCOR7 (Tabla 5). El primero de ellos comprende desde la secuencia que hibrida con el oligonucleótido 5HISReg (Tabla 6) hasta la secuencia que contiene el codón donde se inserta la mutación, y es reconocida por los oligonucleótidos 3’Glu111Arg (bzdRmut3), 3’Arg114Glu (bzdRmut4) y 3’Glu11Arg/Arg114Glu (bzdRmut5) (Tabla 6). El segundo fragmento comprende el resto del gen, desde la mutación, donde hibridan los oligonucleótidos 5’Glu111Arg (bzdRmut3), 5’Arg114Glu (bzdRmut4) y 5’Glu11Arg/Arg114Glu (bzdRmut5) (Tabla 6), hasta el codón stop, que hibrida con el oligonucleótido 3HISReg (Tabla 6). En la segunda etapa de PCR se Materiales y Métodos 62 emplearon como molde los dos fragmentos obtenidos anteriormente, que solapan en la región de la mutación, para ser amplificados con los oligonucleótidos 5HISReg y 3HISReg, que hibridan al inicio y al final del gen bzdR, regenerando así un gen completo que incluye la mutación deseada. Los productos de PCR así obtenidos fueron purificados y se clonaron en el vector pQE32 (Tabla 5) empleando las dianas de restricción BamHI y HindIII, para su posterior sobreproducción y purificación. Los plásmidos obtenidos se denominaron pQE32-His6mut3, pQE32-His6mut4 y pQE32- His6mut5 (Tabla 5). La incorporación de la mutación en cada uno de los genes resultantes fue comprobada mediante secuenciación. 33..77 CCoonnssttrruucccciióónn ddee llaa qquuiimmeerraa QQ11.. La construcción de la proteína de fusión NBzdRL-SKI (Q1) se llevó a cabo mediante amplificación por PCR de ambas secuencias, NBzdRL y SKI, con los oligonucleótidos 5HisReg/5’N2quim y 3’aroKquim***/5’aroKquim (Tabla 5), y usando como molde el plásmido pCOR7 (Tabla 4) y ADN genómico de E. coli CC118 (Tabla 3), respectivamente. Ambas secuencias fueron clonadas en el plásmido pGEMt y se fusionaron con el dominio NBzdRL en el extremo N-terminal y la SKI en el extremo C- terminal, dejando en medio 6 nucleótidos correspondientes a la diana de la enzima de restricción KpnI. Posteriormente, esta construcción fue subclonada en el plásmido pQE32 dando lugar a la secuencia His6-NBzdRL-SKI, denominada His6-Q1. 33..88 MMuuttaaggéénneessiiss ddiirriiggiiddaa ddeell ggeenn HHiiss66QQ11.. La construcción del gen His6-Q1 mutante (fusión NBzdRL-aroK), denominado His6-Q2 (D36A), se llevó a cabo, como en el caso explicado anteriormente, mediante mutagénesis dirigida en dos etapas sucesivas de PCR. En una primera etapa, se amplificó el gen dividido en dos fragmentos utilizando como molde el plásmido pQE32-Q1 (Tabla 5). El primero de ellos comprende desde la secuencia que hibrida con el oligonucleótido 5HISReg (Tabla 6) hasta la secuencia que contiene el codón donde se inserta la mutación, y es reconocida por el oligonucleótido 3’D36A (Tabla 6). El segundo fragmento comprende el resto del gen, desde la mutación, donde hibrida el oligonucleótido 5’D36A (Tabla 6), hasta el codón stop, que hibrida con el oligonucleótido 5’aroKquim (Tabla 6). En la segunda etapa de PCR se emplearon como molde los dos fragmentos obtenidos anteriormente, que solapan en la región de la mutación, para ser amplificados con los oligonucleótidos 5HISReg y 5’aroKquim, que Materiales y Métodos 63 hibridan al inicio y al final del gen His6Q1, regenerando así un gen completo que incluye la mutación deseada. El producto de PCR así obtenido fue purificado y se clonó en el vector pQE32 (Tabla 5) empleando las dianas de restricción BamHI y PstI, para su posterior sobreproducción y purificación. El plásmido obtenido se denominó pQE32-Q2 (Tabla 5). La incorporación de la mutación en el gen resultante fue comprobada mediante secuenciación. 44 PPrroocceeddiimmiieennttooss ddee ttrraannssffeerreenncciiaa ggeennééttiiccaa.. 44..11 TTrraannssffoorrmmaacciióónn ddee ccéélluullaass ddee EE.. ccoollii.. Las células de E. coli se transformaron utilizando dos procedimientos distintos: choque térmico y electroporación. La transformación por choque térmico requiere la preparación previa de células competentes con RbCl (Sambrook & Rusell, 2001). La transformación por electroporación (Wirth et al., 1989) se llevó a cabo en un equipo Gene Pulser/Pulse Controller (Bio-Rad). 44..22 TTrraannssffeerreenncciiaa ddee pplláássmmiiddooss ppoorr ccoonnjjuuggaacciióónn.. En la mayoría de los casos, los procesos de conjugación se realizaron como detallan De Lorenzo y Timmis (de Lorenzo & Timmis, 1994a). Sin embargo, en aquellos casos en los que Azoarcus sp. CIB participó como cepa receptora, se realizaron una serie de modificaciones tales como el uso de medio mínimo MC con succinato 0.4% (p/v) como fuente de carbono y la utilización de una elevada densidad de células en el proceso de conjugación (109-1010 células/ml). La cepa donadora en los procesos de conjugación fue E. coli S17-1λpir, la cual fue contra-seleccionada tras el proceso de conjugación en medio MC suplementado con citrato (compuesto que E. coli no puede utilizar como sustrato de crecimiento). 44..33 CCoonnssttrruucccciióónn ddeell mmuuttaannttee AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBBddaaccppRR.. Para la construcción del mutante Azoarcus sp. CIBdacpR se procedió a la disrupción insercional del gen acpR por recombinación homóloga. Para ello, se amplificó un fragmento interno del gen acpR de 410 pb utilizando los oligonucleótidos 5AcpRcib y 3AcpRcib (Tabla 6), y se clonó entre las dianas BamHI/HindIII del polylinker de Materiales y Métodos 64 pK18mob (plásmido movilizable que no replica en Azoarcus). La construcción resultante, pK18mobacpR (Tabla 5), fue transferida de la cepa donadora E. coli S17- 1(λpir) a la cepa receptora Azoarcus sp. CIB, mediante conjugación biparental. Los transconjugantes presentaban una disrupción génica por inserción, mediante recombinación homóloga, derivados del plásmido suicida pK18mob, y fueron seleccionados aeróbicamente en medio MC sin nitrato y suplementado con kanamicina (50 μg/ml) y con citrato 0.4% (p/v) como fuente de carbono para la contra-selección de la cepa donadora. El mutante Azoarcus sp. CIBdacpR fue analizado por PCR para confirmar la disrupción del gen truncado. 55 TTééccnniiccaass ddee mmaanniippuullaacciióónn ddee pprrootteeíínnaass.. 55..11 EElleeccttrrooffoorreessiiss eenn ggeelleess ddee ppoolliiaaccrriillaammiiddaa--SSDDSS ((SSDDSS--PPAAGGEE)).. Las electroforesis analíticas de proteínas se realizaron en todos los casos en condiciones desnaturalizantes y en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS). La técnica utilizada fue la descrita por Laemmli (Laemmli, 1970) utilizando geles de poliacrilamida en placa (PAGE) a una concentración del 10-15%. Las muestras se hirvieron a 100ºC durante 10 minutos en presencia del tampón de ruptura (Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8; SDS 2%, β-mercaptoetanol 5%, glicerol 10% y azul de bromofenol 0.005%). Las electroforesis se realizaron a temperatura ambiente y a 50 mA (corriente constante), utilizando un electrolito que contenía Tris-HCl 25 mM pH 8.8, glicina 192 mM y SDS 0.1%. Las proteínas de los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 (Swank & Munkres, 1971). Las proteínas empleadas como marcadores de tamaño molecular [fosforilasa B (97.4 kDa), seroalbúmina bovina (BSA) (66.2 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (31 kDa) e inhibidor de tripsina (21.5 kDa)] se adquirieron en Bio-Rad. 55..22 OObbtteenncciióónn ddee aannttiiccuueerrppooss aannttii--BBzzddRR.. Los anticuerpos frente a BzdR de Azoarcus sp. CIB se obtuvieron mediante inmunización de un conejo con la proteína BzdR. La inmunización del animal se realizó en tres pasos, en cada uno de los cuales se inyectaron 0.1 g de proteína en tampón PBS por vía intramuscular. La primera dosis se preparó en adyuvante de Freund completo, y Materiales y Métodos 65 la segunda y tercera en adyuvante de Freund incompleto, dejando transcurrir 15 días entre cada una de dichas dosis. Pasado este tiempo se extrajo el antisuero, se limpiaron los restos celulares y se eliminó el coágulo sanguíneo por centrifugación del suero a 5000 rpm, 5 minutos a 4ºC. Posteriormente, se inactivaron las proteínas del complemento incubando el extracto a 56ºC durante 15 minutos. Tras este tratamiento se alicuotaron las muestras y se congelaron a –20ºC. La especificidad del antisuero obtenido se ensayó mediante Western Blot. 55..33 TTééccnniiccaa ddee WWeesstteerrnn BBlloott.. Después de llevar a cabo una electroforesis SDS-PAGE (12.5%) con 2.25 μg de proteína total de extractos celulares, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Sambrook & Rusell, 2001). La membrana se saturó con leche en polvo desnatada al 5% (p/v) en tampón PBS (fosfato sódico 10 mM, pH 7.4 conteniendo NaCl 140 mM) mediante incubación a 4ºC durante 12 horas. Tras 3 lavados de 10 minutos con PBS que contenía Tween 20 al 0.1% (v/v), se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 hora en presencia de suero anti-BzdR en dilución 1/1000. Posteriormente, se repitieron los tres lavados con PBS-Tween y la membrana se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y agitación suave en presencia de una dilución 1/10.000 de anticuerpos ECLTM Anti-rabbit IgG (GE Healthcare). Finalmente, tras cuatro lavados con PBS-Tween, las bandas se revelaron con el sistema ECLTM Western Blotting Detection (GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las membranas se expusieron en películas Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Biotech) durante 1 minuto. La cuantificación de la proteína BzdR se realizó utilizando el programa Quantity-One (Bio-Rad). 55..44 SSoobbrreepprroodduucccciióónn yy ppuurriiffiiccaacciióónn ddee llaass pprrootteeíínnaass eexxpprreessaaddaass ddeessddee eell vveeccttoorr ddee eexxpprreessiióónn ppQQEE3322 óó ppQQEE6600.. A continuación se explicará el proceso empleado para la sobreproducción y purificación de la proteína BzdR, cuyo protocolo, basado en el que describe el proveedor Qiagen, será ampliable a todas las demás proteínas sobreproducidas y purificadas mediante este método: His6-BzdR, His6-Fnr*, His6-NBzdR, His6-N2BzdR, His6-CBzdR, His6-SKI, His6-BzdR3, His6-BzdR4, His6-BzdR5, His6-Q1, His6-Q2, His6- Q4 e His6-Q5. Materiales y Métodos 66 El plásmido recombinante pQE32-His6BzdR (Tabla 5) contiene el gen bzdR desprovisto de su codón de inicio de la traducción, que fue sustituido por una secuencia de 6 histidinas más otros 6 aminoácidos en su extremo 5´. La sobreproducción de esta proteína His6BzdR se realizó en una cepa de E. coli M15 portadora del plásmido pREP4, que expresa el gen lacI (Tabla 5) para el estricto control de la expresión del gen His6-bzdR clonado bajo el control del promotor PT5 (que incorpora operadores lac) en el plásmido pQE32-His6BzdR. Las células de E. coli M15 (pREP4, pQE32-His6BzdR) fueron incubadas a 37ºC en 100 ml de LB en presencia de ampicilina y kanamicina hasta que el cultivo alcanzó una A600 de 0.5 (aproximadamente 2 horas), momento en el cual se indujo la hiperexpresión de la fusión His6-BzdR mediante la adición de IPTG a una concentración de 0.5 mM. Las células fueron incubadas a 37ºC durante 5 horas más y posteriormente se centrifugaron a 10.000 rpm durante 15 minutos. El sedimento celular fue resuspendido en 10 ml de tampón de lisis (NaH2PO4 50 mM, KCl 300 mM, imidazol 100 mM, pH 8) y se procedió a la rotura de las células mediante tratamiento en la prensa de French (Aminco Corp.) a una presión de 20.000 psi. El lisado celular fue centrifugado a 26.000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue cuidadosamente decantado y se hizo pasar a través de columnas de agarosa-níquel-ácido nitrilotriacético, Ni-NTA, (QIAGEN). Las columnas se lavaron con 50 volúmenes de tampón de lisis y finalmente la proteína His6BzdR fue eluida con un tampón de elución de composición idéntica al tampón de lisis, pero con imidazol a una concentración de 1 M. Dependiendo de la utilización que se le fuera a dar a la proteína, ésta podía ser dializada. En dicho caso, la muestra eluida era dializada a 4ºC en tampón FP (Tris-HCl 20 mM pH 7.5, glicerol 10%, β-mercaptoetanol 2 mM y KCl 50 mM), repartida en alícuotas y almacenada a –20ºC. Si la muestra no era dializada, se almacenaba a 4ºC. 55..55 EEnnssaayyooss ddee ccrroosssslliinnkkiinngg.. Las proteínas purificadas His6-BzdR, His6-NBzdR, His6-N2BzdR e His6-CBzdR (todas ellas a concentraciones entre 2 y 10 μM)) fueron incubadas con diferentes concentraciones de glutaraldehído (5-50 mM) a temperatura ambiente durante 20 minutos en el mismo tampón de lisis utilizado en el proceso de purificación de las proteínas (NaH2PO4 50 mM, KCl 300 mM, imidazol 100 mM, pH 8). Las reacciones se pararon mediante la adición de tampón de ruptura Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8; SDS 2%, β-mercaptoetanol 5%, glicerol 10% y azul de bromofenol 0.005%). Las muestras fueron hervidas durante 10 minutos a 100ºC y analizadas mediante PAGE-SDS. En paralelo, Materiales y Métodos 67 fue llevado un ensayo control con lisozima, una proteína cuyo estado natural es monomérico, que fue tratada a las mismas concentraciones de glutaraldehído, pero en ningún caso se observaron bandas de posibles oligómeros (dato no mostrado). 55..66 EEnnssaayyooss ddee ttrriippssiinniizzaacciióónn.. Las proteínas purificadas His6-BzdR e His6-CBzdR (ambas a una concentración de 5 μM) fueron incubadas con tripsina en 20 μl del tampón de reacción Tris-HCl 25 mM pH 7.5, CaCl2 10 mM, en ausencia y presencia de 2 mM del ligando benzoil-CoA durante diversos tiempos entre 2 y 60 minutos a 37ºC (Schujman et al., 2006). Las reacciones se pararon mediante la adición de tampón de ruptura Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8; SDS 2%, β-mercaptoetanol 5%, glicerol 10% y azul de bromofenol 0.005%). Las muestras fueron hervidas durante 10 minutos a 100ºC y analizadas mediante PAGE- SDS. 55..77 EEnnssaayyooss ddee fflluuoorreesscceenncciiaa.. La intensidad de fluorescencia de His6BzdR e His6CBzdR fue determinada a 25°C utilizando un espectrofluorímetro SML-Aminco 8000 empleando una cubeta de cuarzo de 0.2 cm de paso óptico de excitación y 1 cm el de emisión. La longitud de onda de excitación fue 275 nm, a la que absorben tanto los residuos de triptófano como los de tirosina. El espectro de emisión de fluorescencia se llevó a cabo en el intervalo de longitudes de onda entre los 300 a 400 nm utilizando una anchura de rendija de excitación y de emisión de 1 nm y 5 nm, respectivamente. La concentración final de proteína fue 1 μM en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, KCl 100 mM. Los ligandos benzoil-CoA, fenilacetil-CoA, CoA, ATP, benzoato y succinato (preparados en el mismo tampón) se añadieron a la muestra de proteína (volumen total de 400 μl) de 1 en 1 μl, hasta una concentración final de 50 μM. La absorbancia de la muestra a la longitud de onda de excitación siempre fue menor de 0.01, evitándose por ello efectos de filtro interno. Todos los espectros fueron corregidos con su correspondiente línea base así como por efecto de la dilución de la muestra. La desactivación de la emisión de fluorescencia de la proteína causada por la unión del ligando fue analizada con un modelo de unión a un único sitio, empleando la siguiente función: F = 1 – (1-Fmin) (Kb[L]libre)/(1+Kb[L]libre Materiales y Métodos 68 En esta expresión, Fmin representa el valor de fluorescencia mínima, Kb representa la constante de asociación y [L]libre representa la concentración de ligando libre. Los datos experimentales se ajustaron a esta función utilizando el programa Sigma Plot, lo que permitió la determinación de los valores de las constantes de asociación y desactivación máxima para los diferentes ligandos. 55..88 DDiiccrrooííssmmoo cciirrccuullaarr ((CCDD)).. Las medidas de dicroísmo circular en la región del UV-lejano se realizaron en un espectropolarímetro Jasco J-715. En los ensayos se utilizó una cubeta de cuarzo de 0.1 cm de paso óptico en la que se introdujo 0.3 ml de muestra. La concentración de proteína His6CBzdR utilizada en los ensayos fue 10 μM, siendo diluida en un tampón Tris-HCl 20 mM pH 8.0, KCl 100 mM. Los espectros fueron obtenidos a 25ºC en el intervalo de longitudes de onda entre los 200 y 250 nm utilizando una anchura de rendija de 1 nm y una velocidad de barrido de 20 nm/min. El espectro final de cada muestra es el promedio de una acumulación de cinco espectros individuales. El espectro inicialmente obtenido se corrige por la línea base y se normaliza por la concentración de residuos, para calcular así la señal de CD en unidades de elipticidad molar por residuo. Todos los cálculos se realizaron empleando el software del fabricante. Los espectros se analizaron mediante el paquete CDPro que contiene las siguientes aplicaciones: CONTIN (Provencher & Glockner, 1981), SELCON (Sreerama & Woody, 2000) y CDNN (Bohm et al., 1992). 66 EEnnssaayyooss ddee eexxpprreessiióónn.. 66..11 EEnnssaayyooss ddee aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa.. 6.1.1 Ensayo de actividad β-galactosidasa. Para el ensayo de actividad β-galactosidasa se emplearon células de E. coli portadoras de la fusión PN::lacZ o PR::lacZ, crecidas en medio rico LB o cultivadas anaeróbicamente en medio mínimo M63 con glicerol (20 mM) como fuente de carbono y en presencia de distintos compuestos aromáticos, según se detalla en cada caso, o bien células de Azoarcus sp. CIBlacZ cultivadas anaeróbicamente en medio MC con kanamicina y en presencia de benzoato 3 mM y/u otra fuente de carbono no aromática Materiales y Métodos 69 (0.4% p/v). Los cultivos se incubaron a 30ºC, tanto en el caso de E. coli como de Azoarcus sp. CIB, hasta alcanzar la densidad óptica deseada en cada caso. La actividad β-galactosidasa se analizó permeabilizando las células, y las unidades de actividad enzimática (Unidades Miller) se determinaron según el método descrito por Miller (Miller, 1972). 6.1.2 Ensayo de actividad siquimato quinasa. Para el ensayo de actividad siquimato quinasa se emplearon diversas proteínas purificadas como His6SKI, His6BzdR, His6CBzdR, His6Q1, His6Q2, His6Q4 e His6Q5. El tampón de reacción utilizado se componía de Tris-HCl 100 mM pH 7.5, KCl 50 mM y MgCl2 5 mM, tal y como se describe en (Oliveira et al., 2001). La actividad siquimato quinasa fue determinada de forma indirecta, midiendo la formación de ADP mediante su acoplamiento al sistema enzimático formado por la piruvato quinasa y la lactato deshidrogenasa, y la consecuente monitorización espectrofotométrica de la desaparición de NADH a 340 nm (Ziegler, 1989) (Figura 7). La mezcla de reacción (800 μl) contenía tampón de reacción, ATP 2 mM, fosfoenolpiruvato 2 mM, NADH 0.5 mM, 2 μl de una mezcla de piruvato quinasa (1 U) y lactato deshidrogenasa (1 U) de músculo de ratón (Roche) y 10 μl (a diversas concentraciones) de la proteína a ensayar. COO¯ Siquimato 3P-siquimato OH OH HO COO¯ OH OH PO Siquimato quinasa ATP ADP Fosfoenolpiruvato Piruvato Lactato ADP ATP NADH NAD+ A340Piruvato quinasa Lactato deshidrogenasa MgMg2+2+COO¯ Siquimato 3P-siquimato OH OH HO COO¯ OH OH PO Siquimato quinasa ATP ADP Fosfoenolpiruvato Piruvato Lactato ADP ATP NADH NAD+ A340Piruvato quinasa Lactato deshidrogenasa MgMg2+2+ Figura 7. Reacciones implicadas en el ensayo acoplado para detectar la actividad siquimato quinasa. La actividad siquimato quinasa (indicada en rojo) fue detectada por medio de la monitorización de la desaparición de NADH (medida espectrofoto- métricamente a 340 nm, indicado en morado). Las enzimas que constituyen el sistema enzimático al que se acopla la actividad siquimato quinasa han sido marcadas en verde (piruvato quinasa) y azul (lactato deshidrogenasa). Materiales y Métodos 70 66..22 EEnnssaayyooss ddee ttrraannssccrriippcciióónn iinn vviittrroo.. Todas las soluciones se prepararon con agua destilada que contenía el inhibidor de RNasa dietilpirocarbonato (DEPC) (Sigma) y fueron filtradas antes de su uso. El tampón utilizado para la reacción contenía Tris-HCl pH 7.5 40 mM, MgCl2 10 mM y KCl 100 mM. El ADN molde utilizado correspondía al plásmido pJCD-PN o pJCD-PR en cada caso (Tabla 5). El volumen final de la mezcla de reacción fue de 50 μl que contenían ADN plasmídico 5 nM y BSA a 500 μg/ml. Se añadieron 3 μl de E. coli RNA Polymerase Holoenzyme 50 nM (1 U/μl; USB), incubándose esta mezcla a 37ºC durante 10 minutos. A continuación, se añadieron las proteínas de interés en cada caso (His6BzdR, His6Fnr*, His6N2BzdR, His6Q1, His6Q2, His6Q4, His6Q5), diluidas previamente en el tampón anteriormente mencionado que contenía además ditiotreitol 2 mM y BSA a 500 μg/ml, a diversas concentraciones finales. Además, se añadieron en diversas ocasiones diferentes ligandos (benzoil-CoA, siquimato, ATP, benzoato) a concentraciones de 0.5-5 mM. Esta mezcla fue incubada a 37ºC durante 10 minutos para permitir la formación de los complejos abiertos. La elongación de la cadena de ARN naciente comenzó al añadir 5 μl de una mezcla que contenía ATP, CTP y GTP 1 mM, y 1 μCi de [α-32P] UTP (Amersham Biosciences). Se paró la reacción al cabo de 15 minutos con 50 μl de una solución STOP que contenía NaCl 350 mM, EDTA 50 mM y ARN transferente 100 µg/ml. El ARN fue precipitado en 3 volúmenes de etanol absoluto y mantenido durante a 1 hora a -80ºC. Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a 14.000 rpm a -4ºC y se llevó a cabo un segundo lavado con etanol al 70%. Las muestras se secaron y se resuspendieron en 25 μl de tampón de carga que contenía formamida al 80% (v/v), EDTA 20 mM, azul de bromofenol y azul de xilencianol, antes de ser calentadas a 90ºC y cargadas en un gel desnaturalizante de poliacrilamida 4% (v/v)-urea 8 M. La electroforesis se desarrolló a 300 V. Los geles se secaron al vacío sobre papel Whatman 3MM y se expusieron en películas Hyperfilm™ MP (Amersham Pharmacia Biotech) con pantallas amplificadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). 66..33 EEnnssaayyooss ddee mmoonnoo--hhííbbrriiddoo.. Este método permitió ensayar la dimerización de diversas proteínas midiendo actividad β-galactosidasa. Para ello, se creció la cepa MV1190 pSJ6 y sus variantes que incorporan también el plásmido pcI-cat, pcI-NcI, pcI-Qλ, pcI-Qλ2, en medio rico LB Materiales y Métodos 71 hasta una A600 de 0.6. El plásmido pSJ6 incluye la fusión λPR::lacZ que expresará β- galactosidasa si el promotor PR no se encuentra reprimido por ninguna proteína. Los demás plásmidos expresarán la proteína correspondiente, que reprimirá al promotor PR si presentan la capacidad de dimerizar. Finalmente, se midió la actividad β- galactosidasa tal y como es descrito por Miller (Miller, 1972). 66..44 IInnmmuunniiddaadd ffrreennttee aa llaa iinndduucccciióónn ddeell cciicclloo llííttiiccoo ddeell ffaaggoo λλ.. En este caso, las mismas células utilizadas en el ensayo anterior, fueron crecidas a 37ºC y en agitación, en medio rico LB al cual se añadió MgSO4 10 mM y maltosa 0.2%, con el fin de favorecer la posterior infección con el fago λgt10, hasta una densidad óptica de 2 (A600). Las células fueron centrifugadas y resuspendidas en MgSO4 10 mM. A continuación, se separaron 200 µl de células, a las cuales se añadieron 50 µl del fago λgt10 a diferentes concentraciones y se incubó la mezcla 30 minutos a 37ºC. Las diferentes diluciones eran mezcladas con 4 ml de agar blando y se vertían en placas de LB, algunas de las cuales incorporaban benzoato 5 mM, según el ensayo en cuestión. Dichas placas eran incubadas a 37ºC durante 16 horas. La eficiencia de lisis fue determinada contando el número de calvas de lisis obtenidas en cada uno de los ensayos y comparando con los niveles obtenidos en la cepa control MV1190 pSJ6, que no expresaba ningún represor del fago λ. 77 EEnnssaayyooss ddee uunniióónn ddee pprrootteeíínnaa aa AADDNN.. 77..11 MMaarrccaajjee ddee ssoonnddaass rraaddiiaaccttiivvaass.. La obtención de las sondas radiactivas utilizadas en los experimentos que se explicarán a continuación se llevó a cabo mediante amplificación por PCR a partir del plásmido pECOR7 (Tabla 5), tal y como describen Barragán y col. (Barragán et al., 2005). Para la obtención de la sonda PN se utilizaron los oligonucleótidos 5IVTPN y 3IVTPN (Tabla 6), cuyo producto de PCR fue digerido con las enzimas de restricción PvuII y EcoRI obteniendo un fragmento resultante de 376 pb. Para la obtención de las sondas miniI (145 pb), miniII (80 pb) y miniIII (79 pb), se utilizaron los oligonucleótidos BLINE y 3IVTPN, PN-II y NIK, y RET1 y NIU PN-III (Tabla 6), respectivamente. En todos los casos, los productos obtenidos fueron marcados en el Materiales y Métodos 72 extremo 3´ cohesivo generado por la enzima EcoRI, mediante la acción del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli en presencia de [α-32P]dATP, como se ha descrito en el anterior apartado. Los fragmentos marcados radiactivamente fueron purificados con el kit Gene-Clean Turbo (Q-BIOgene). 77..22 EEnnssaayyooss ddee rreettaarrddoo eenn ggeell.. Para los ensayos de retardo en gel se utilizaron las sondas radiactivas obtenidas tal y como se detalla en el apartado anterior. Las mezclas de reacción contenían la proteína purificada correspondiente (His6BzdR, His6Fnr*, His6NBzdR, His6N2BzdR, His6BzdRmut3, His6BzdRmut4, His6BzdRmut5, His6Q1, His6Q2, His6Q4, His6Q5) a diversas concentraciones, así como la sonda correspondiente (PN, mI, mII o mIII) marcada radiactivamente a una concentración de 0.5 nM en un volumen final de reacción de 9 µl. El tampón de retardo utilizado contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, glicerol 10%, β-mercaptoetanol 2 mM, KCl 50 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 250 µg/ml y, en determinados casos, ADN inespecífico de esperma de salmón a una concentración de 50 μg/ml. El resultado de la reacción se analizó por electroforesis en geles de poliacrilamida al 5-7% con tampón TBE 0.5x (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM). El gel se secó sobre papel Whatman 3MM y los productos de la reacción se detectaron por autorradiografía con películas Hyperfilm MP (Amersham Biosciences) con pantallas amplificadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). 77..33 EEnnssaayyooss ddee pprrootteecccciióónn ffrreennttee aa llaa ddiiggeessttiióónn ccoonn DDNNaassaa II ((ffoooottpprriinnttiinngg)).. Las mezclas de reacción para el ensayo de footprinting se realizaron en tampón FP (Tris-HCl 20 mM pH 7.5, glicerol 10%, β-mercaptoetanol 2 mM y KCl 50 mM), al que se añadió BSA (500 µg/ml) en presencia de la sonda correspondiente (PN, mI, mII o mIII) a una concentración de 2 nM y 10 µl de la proteína purificada correspondiente (His6BzdR, His6Fnr*, His6NBzdR, His6N2BzdR, His6Q1, His6Q2) a diversas concentraciones. Las muestras (en un volumen final de reacción de 15 µl) se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, transcurridos los cuales se añadieron 3 µl (0.05 U) de DNasa I (Amersham Biosciences) diluida en un tampón Tris-HCl 10 mM pH 7.5, CaCl2 10 mM, MgCl2 10 mM y KCl 125 mM. La digestión con DNasa I se realizó a 37ºC durante 25 segundos y la reacción fue detenida por la adición de 180 µl de solución DNasa STOP (acetato sódico 0.4 M, EDTA 2.5 mM, 50 µg/ml de ADN de esperma de salmón y 0.3 µl/ml de glicógeno). Las muestras fueron sometidas a una Materiales y Métodos 73 extracción con fenol y el ADN fue precipitado en 3 volúmenes de etanol absoluto tras una centrifugación a 14.000 rpm a 4ºC y posteriormente lavado con etanol al 70%. Las muestras se secaron y se resuspendieron en tampón de carga [Tris-HCl 10 mM pH 8.0, formamida 80%, EDTA 20%, azul de bromofenol 0.05% (p/v) y azul de xilencianol 0.05% (p/v)] y fueron desnaturalizadas por incubación a 95ºC durante tres minutos. En paralelo, las correspondientes sondas fueron secuenciadas por el método A+G de Maxam y Gilbert (Maxam & Gilbert, 1980), siendo analizadas junto a las reacciones de footprinting en geles desnaturalizantes de poliacrilamida 6% (v/v)-urea 8 M, los cuales se secaron al vacío sobre papel Whatman 3 MM y, por último, se expusieron en películas Hyperfilm MP (Amersham Biosciences) con pantallas amplificadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). 77..44 EEnnssaayyoo ddee ffoooottpprriinnttiinngg ccoonn ppeerrmmaannggaannaattoo ppoottáássiiccoo ((KKMMnnOO44)).. Mediante estos ensayos se puede observar el complejo abierto formado por la ARN polimerasa en estadios muy tempranos del inicio de la transcripción (Sasse-Dwight & Gralla, 1989). Se trata de un ensayo de footprinting en el cual el permanganato potásico reacciona con residuos de timina en regiones de ADN monocatenario, es decir, aquellas regiones en las que se está produciendo el complejo abierto debido al inicio de la transcripción. Para realizar el footprinting de permanganato se obtuvieron los complejos ADN-proteína de la misma forma que en el apartado anterior, utilizando la sonda PN a una concentración de 2 nM. En este caso se utilizaron las proteínas His6Fnr* (25-250 nM) y E. coli RNA Polymerase Holoenzyme (1 U/μl; USB) (50-200 nM). La reacción se inició al añadir 2.5 μl de KMnO4 40 mM a los 15 μl de complejo ADN-proteína, incubándose durante 30 segundos a 37ºC. A continuación, se paró la reacción añadiendo 2 μl de β-mercaptoetanol 2 M. El tratamiento posterior de la muestra fue idéntico al protocolo utilizado para el footprinting de DNasa I, detallado en el apartado anterior. Una vez precipitadas las muestras con etanol se resuspendieron en 150 μl de piperidina 10% (v/v) y se incubaron durante 30 minutos a 90ºC. La piperidina fue evaporada en una Speed Vac (Pacisa) y se lavó la muestra dos veces con 20 μl de agua destilada. Finalmente, las muestras fueron analizadas en geles desnaturalizantes de poliacrilamida 6% (v/v)-urea 8 M, los cuales se secaron al vacío sobre papel Whatman 3 MM y, por último, se expusieron en películas Hyperfilm MP (Amersham Biosciences) con pantallas amplificadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). Materiales y Métodos 74 77..55 EEnnssaayyooss ddee uullttrraacceennttrriiffuuggaacciióónn aannaallííttiiccaa.. Los ensayos se llevaron a cabo en una ultracentrífuga analítica modelo Optima XL- A (Beckman) equipada con un espectrofotómetro UV-visible y con un rotor An50Ti. Para la detección del gradiente de concentración de proteína, las medidas fueron llevadas a cabo utilizando una longitud de onda de absorción de 280 nm. En los diversos ensayos se utilizaron diferentes concentraciones de proteína (His6BzdR, His6NBzdR, His6N2BzdR, His6CBzdR, His6BzdRmut3, His6BzdRmut4, His6BzdRmut5, His6Q1) que variaban entre 1 y 30 μM. En todos los casos, las proteínas se encontraban disueltas en un tampón NaH2PO4 50 mM, KCl 300 mM, imidazol 300 mM pH 8.0. La velocidad a la que se sometieron las muestras fue de 50.000 rpm y el volumen de muestra fue de 400 μl. La distribución de coeficientes de sedimentación se calculó mediante el programa SEDFIT (Schuck & Rossmanith, 2000; Schuck et al., 2002). Los coeficientes de sedimentación fueron corregidos por la composición del tampón utilizando el programa SEDNTERP (Laue, 1992) para obtener los valores estándares correspondientes (en agua y a 20ºC). También se llevaron a cabo ensayos de interferencia con la proteína His6BzdR en ausencia y presencia de benzoil-CoA (0.5, 1 y 2 mM). Para la realización de los experimentos de velocidad de sedimentación de las proteínas His6BzdR, His6NBzdR e His6NBzdRL unidas al ADN, se incubaron diferentes concentraciones de dichas proteínas (0.5 - 10 μM) junto con el fragmento de ADN (0.05 - 0.2 μM). Las dos sondas de ADN utilizadas en el ensayo se correspondían con el promotor PN completo (261 pb) y con la región I del promotor PN (145 pb), respectivamente, y fueron obtenidas mediante PCR, utilizando los oligonucleótidos RET1 y 3IVTPN (Tabla 6) para la obtención de la sonda PN, y los oligonucleótidos BLINE y 3IVTPN (Tabla 6) para la obtención de la región I. Estos experimentos se llevaron a cabo en el mismo tampón descrito anteriormente (NaH2PO4 50 mM, KCl 300 mM, imidazol 100 mM, pH 8). En esto caso, se detectó la presencia de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm. Las masas moleculares de las diferentes especies obtenidas en los experimentos de velocidad de sedimentación fueron determinadas utilizando el programa SEDPHAT. 77..66 CCrriissttaalliizzaacciióónn ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR yy ssuuss ddoommiinniiooss NN22BBzzddRR yy CCBBzzddRR.. Los experimentos de cristalización llevados a cabo con la proteína BzdR y con sus dominios N2BzdR y CBzdR se realizaron en colaboración con el Dr. José Miguel Materiales y Métodos 75 Mancheño del Grupo de Cristalografía Macrocolecular y Biología Estructural del Instituto “Rocasolano” de Química-Física (CSIC) de Madrid. La determinación de la estructura tridimensional de proteínas mediante difracción de rayos X requiere el empleo de monocristales de tamaño adecuado (McPherson, 1982). Así, con objeto de determinar la estructura tridimensional de BzdR o de sus dominios a alta resolución, se procedió a la producción de monocristales de estas proteínas mediante la técnica de difusión de vapor en gota colgante. Sobre un cubre-objetos siliconizado se añadió una alícuota de una disolución de la proteína correspondiente a diversas concentraciones: en el caso de BzdR a concentraciones entre 5-11 mg/ml, y en el caso de CBzdR a concentraciones entre 10 y 30 mg/ml. Esta alícuota, de 1-2 µl, era mezclada con un volumen idéntico de diferentes disoluciones de cristalización. Estas disoluciones de cristalización contenían un agente precipitante (sales, polietilenglicol de distinta masa molecular promedio, compuestos orgánicos no volátiles, etc.), un tampón y diferentes aditivos. Como una primera aproximación, la búsqueda de condiciones de cristalización de BzdR y CBzdR se llevó a cabo mediante el empleo de disoluciones de las siguientes casas comerciales: Crystal Screens I y II (Hampton Research), Structure Screens I y II (Molecular Dimensions), y los sistemas de Jena Bioscience (http://www.jenabioscience.com/). El cubre-objetos se dispuso sobre un pocillo de la caja empleada (Linbro) que contenía 500 µl de la misma disolución de cristalización. Todos los experimentos de cristalización se llevaron a cabo a una temperatura constante de 19ºC. 77..77 AAnnáálliissiiss ddee llaa eessttrruuccttuurraa ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR mmeeddiiaannttee mmiiccrroossccooppííaa eelleeccttrróónniiccaa yy rreeccoonnssttrruucccciióónn ddee ppaarrttííccuullaass iinnddiivviidduuaalleess.. Los ensayos de microscopía electrónica fueron realizados mediante la técnica de tinción negativa. Para ello, se dispuso proteína His6-BzdR purificada sobre rejillas cubiertas de carbón previamente sometidas a 1 minuto de descarga iónica. Las rejillas fueron lavadas con agua y teñidas con acetato de uranilo al 2% durante 40 segundos. A continuación, las muestras se analizaron en un microscopio electrónico JEOL 1230, operando a 100 kV. Las micrografías se tomaron a una magnificación nominal de 50.000 aumentos en condiciones de mínima dosis. Las imágenes fueron digitalizadas usando un escáner Minolta Dimage Scan Multi Pro. La función de transferencia de contraste de cada micrografía fue estimada con el programa CTFFIND3 (Mindell & Grigorieff, 2003) y corregida con el programa Bsoft Materiales y Métodos 76 (Heymann & Belnap, 2007). Se seleccionaron 5.741 partículas individuales mediante el programa ‘boxer’ del paquete de análisis de imagen EMAN (Ludtke et al., 1999) y promediadas a una resolución final de 4.1 Å/píxel. Todas las imágenes de BzdR seleccionadas fueron normalizadas, centradas y sometidas a un refinamiento 3D, tal y como está implementado en el programa EMAN (Ludtke et al., 1999). Se generaron varios modelos iniciales que, refinados de manera independiente y sin asumir ningún tipo de simetría, convergieron en la misma estructura. Ésta poseía una clara simetría C2 por lo que los últimos ciclos de refinamiento se realizaron imponiendo dicha simetría. El umbral de visualización engloba una masa correspondiente a una proteína asumiendo que la densidad media de las proteínas es de 1.35 g/ml. Los volúmenes fueron visualizados con el programa Chimera (Pettersen et al., 2004). 77..88 AAnnáálliissiiss ddee llaa iinntteerraacccciióónn pprrootteeíínnaa--AADDNN mmeeddiiaannttee mmiiccrroossccooppííaa ddee ffuueerrzzaass aattóómmiiccaass ((AAFFMM)).. Para la realización de estos experimentos se utilizaron diversas sondas de ADN, que fueron obtenidas mediante PCR usando como molde el plásmido pCOR7 (Tabla 5): • PNL: sonda de 1.225 pb que incluía toda la región intergénica entre los genes bzdR y bzdN, y por tanto todo el promotor PN, así como parte del gen bzdN (desde la posición -505 hasta la +720, respecto del sitio de inicio de la transcripción). Para su amplificación mediante PCR se utilizaron los oligonucleótidos 3REG y N3’ (Tabla 6). • mI: sonda de 782 pb que incluía la región I del promotor PN, así como parte del gen bzdN (desde la posición -61 hasta la +720, respecto del sitio de inicio de la transcripción). Para su amplificación mediante PCR se utilizaron los oligonucleótidos BLINE y N3’ (Tabla 6). • mI+II: sonda de 834 pb que incluía las regiones I y II del promotor PN, así como parte del gen bzdN (desde la posición -112 hasta la +720, respecto del sitio de inicio de la transcripción). Para su amplificación mediante PCR se utilizaron los oligonucleótidos PN-II y N3’ (Tabla 6). Por otro lado, se utilizó proteína His6-BzdR purificada tal y como se detalla en el apartado 5.4. Materiales y Métodos 77 7.8.1 Formación de los complejos proteína-ADN. Las reacciones de unión fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente, durante 15 minutos, en tampón de transcripción in vitro (Tris-HCl pH 7.5 40 mM, KCl 100 mM, MgCl2 10 mM) o en tampón de retardo (Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, glicerol 10%, β- mercaptoetanol 2 mM, KCl 50 mM). Las concentraciones de proteína y ADN utilizadas fueron las adecuadas para que los complejos de unión pudieran ser caracterizados con el AFM, es decir, a una concentración final de proteína controlada para que el exceso no unido al ADN y sí adsorbido a la superficie no perturbara la toma de imagen. De esta forma, la incubación de los complejos se realizó a una concentración final de sonda PNL 2 nM, y a una relación [PNL]:[BzdR] variable entre 1:28 y 1:70 (partiendo de proteína purificada His6-BzdR 100 nM). 7.8.2 Preparación y visualización de la muestra de AFM. Cada mezcla de reacción fue depositada en una superficie de mica recién exfoliada (lo que proporciona un sustrato limpio y atómicamente plano), en presencia de Mg2+ ó Ni2+, cuyo objetivo es dirigir la adsorción de los complejos sobre la mica. Para ello, las muestras de complejos se diluyeron 10 veces en el tampón de adsorción correspondiente, tampón de transcripción in vitro o de retardo, en presencia de MgCl2 ó NiCl2 a una concentración variable entre 3 y 10 mM. Después de 1 minuto de incubación sobre la mica se eliminó el material no adsorbido mediante sucesivos lavados con el mismo tampón de adsorción. Finalmente, las muestras pudieron ser visualizadas con un microscopio de fuerzas atómicas de Nanotec Electrónica S.L y las imágenes fueron procesadas con el programa WSxM (Horcas et al., 2007). 88 AAnnáálliissiiss ddee sseeccuueenncciiaass.. 88..11 AAnnáálliissiiss ddee llooss ddaattooss ddee sseeccuueenncciiaa.. El análisis de las secuencias nucleotídicas fue realizado con el programa Bioedit Sequence Alignment Editor v7.0.3 (Hall, 1999) y con las aplicaciones del servidor de Biosupport (http://bioinfo.hku.hk/). Las secuencias de nucleótidos y las secuencias deducidas de aminoácidos fueron comparadas con las existentes en las bases de datos mediante el uso de los algoritmos BLASTN y TBLASTN, respectivamente (Altschul et Materiales y Métodos 78 al., 1990) a través del servidor del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/BLAST.cgi). La comparación de parejas de secuencias proteicas se realizó con el programa ALIGN (Wilbur & Lipman, 1983) y los alineamientos múltiples de secuencias, con el programa CLUSTALW (Thompson et al., 1994), por medio del servidor de EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Para los análisis filogenéticos de las proteínas semejantes a Fnr se empleó el método “del vecino más próximo” y fueron llevados a cabo con el programa PHYLIP (Brodsky, 1995; Felsenstein, 1993) a través del servidor de TreeTop-GeneBee (http://www.genebee.msu.su/genebee.html). 88..22 MMooddeelloo ddee AAccppRR.. El modelo tridimensional de AcpR fue generado con el programa LOOPP (Teodorescu et al., 2004b), utilizando la proteína CRP como modelo (entrada 1I5Z de la base de datos Protein Data Bank), y fue visualizada con el programa PyMol (http://pymol.sourceforge.net/). 88..33 NNúúmmeerroo ddee aacccceessoo ddee llaa sseeccuueenncciiaa ddee nnuucclleeóóttiiddooss ddeell ggeenn aaccppRR.. La secuencia de nucleótidos del gen acpR de Azoarcus sp. CIB fue enviada a la base de datos de GeneBank, donde le fue asignado el número de acceso AY996130. 79 RREESSUULLTTAADDOOSS 80 Resultados 81 OObbjjeettiivvoo 11.. EEssttuuddiioo ddee llaa rreegguullaacciióónn ddeeppeennddiieennttee ddee ooxxííggeennoo ddee llaa rruuttaa ddee ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. El cluster bzd de la β-proteobacteria Azoarcus sp. CIB ha demostrado estar involucrado en la degradación anaeróbica de benzoato (López Barragán et al., 2004a). Dicho cluster se encuentra organizado en dos operones, uno catabólico, que contiene los genes bzdNOPQMSTUVWXYZA, y otro regulador, que contiene el gen bzdR. La expresión del operón catabólico es mediada por el promotor PN, el cual se encuentra controlado por el regulador transcripcional BzdR que reprime su expresión, siendo el benzoil-CoA la molécula inductora (Barragán et al., 2005). No obstante, el cluster bzd también demostró ser incapaz de expresarse en presencia de oxígeno, incluso en presencia de benzoato, y por tanto de la molécula inductora benzoil-CoA en el medio, lo cual sugería que existía algún tipo de regulación adicional relacionada con la disponibilidad de oxígeno. 11..11 PPaappeell ddeell ooxxííggeennoo eenn llaa eexxpprreessiióónn ddee llooss ggeenneess ddeell cclluusstteerr bbzzdd.. Con el fin de determinar si el oxígeno controlaba la expresión de los genes involucrados en la ruta central del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos en Azoarcus sp. CIB, se estudió la actividad del promotor PN, que controla la expresión del cluster bzd, cultivando células en presencia o ausencia de oxígeno. Para ello, se determinó la actividad β-galactosidasa de la cepa Azoarcus sp. CIBlacZ, que incluye una fusión traduccional estable (PN::lacZ) insertada en su cromosoma, tras 48 horas de crecimiento en medio MC y condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas, utilizando como fuente de carbono benzoato 3 mM. Como se puede apreciar en la Figura 8A, los niveles de actividad β-galactosidasa fueron cerca de dos órdenes de magnitud más elevados en ausencia de oxígeno que cuando éste estaba presente en el medio de cultivo. Se obtuvieron resultados similares a lo largo de toda la curva de crecimiento (datos no mostrados). Estos resultados sugerían que el oxígeno jugaba un papel crucial en la expresión de los genes bzd, inhibiendo la actividad del promotor PN. El efecto del oxígeno en la actividad del promotor PN fue también analizado en un hospedador heterólogo, como es E. coli. Para ello, se transformó la cepa E. coli M182 con el plásmido pSJ3PN (PN::lacZ) y fue crecida en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Se determinó la actividad β-galactosidasa a lo largo de la curva de Resultados 82 crecimiento, obteniendo niveles significativamente inferiores en el caso del crecimiento aeróbico (Figura 8B). Estos niveles fueron similares a los obtenidos con la cepa M182 transformada con el plásmido pSJ3RPN (PR-bzdR/PN::lacZ) y crecida en condiciones anaeróbicas, la cual expresa la proteína BzdR que reprime la actividad del promotor PN (Barragán et al., 2005), tal y como se puede apreciar en la Figura 8B. Así, estos datos confirman el efecto negativo del oxígeno en la transcripción de los genes catabólicos del cluster bzd. 11..22 PPaappeell ddee llaa pprrootteeíínnaa FFnnrr eenn llaa aaccttiivviiddaadd ddeell pprroommoottoorr PPNN.. Un detallado análisis de la secuencia de nucleótidos del promotor PN reveló la presencia de la siguiente secuencia: 5’-TTGACTTAGATCAA-3’, la cual se extendía desde la posición -36 a la posición -49, con el centro en -42.5 desde el punto de inicio de la transcripción (+1), tal y como se representa en la Figura 9. Esta secuencia es prácticamente idéntica a la secuencia consenso que reconoce la proteína Fnr en E. coli (Spiro & Guest, 1990): 5’-TTGAT-N4-ATCAA-3’ (donde N corresponde a cualquiera de las cuatro bases nitrogenadas). Esta observación sugería la implicación de una Figura 8. Actividad β-galactosidasa de E. coli y Azoarcus sp. CIB con la fusión traducional PN::lacZ. (A) La cepa Azoarcus sp. CIBlacZ (PN::lacZ) (CIBlacZ) fue crecida durante 48 h en medio MC suplementado con benzoato como fuente de carbono y en condiciones aeróbicas (barra blanca) o en condiciones anaeróbicas en presencia de nitrato 10 mM (barra gris). (B) La cepa E. coli M182 (fnr+) con el plásmido pSJ3PN (PN::lacZ) (fnr+-PN) o con el plásmido pSJ3RPN (bzdR-PN::lacZ) (fnr+-RPN) y la cepa E. coli JRG1728 (fnr) con los plásmidos pSJ3PN (fnr-PN), pHW1 (fnr-PN pHW1) o pQE60-His6-Fnr* (fnr- PN pFnr*), fueron crecidas anaeróbicamente (barras grises) o aeróbicamente (barras blancas) en medio LB con glucosa hasta que alcanzaron la fase estacionaria. La actividad β-galactosidasa fue medida como se describe en el apartado de Materiales y Métodos. Los datos mostrados son resultados de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. 4000 3000 2000 1000 0 CIBlacZ A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) 2000 1500 1000 500 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) fnr+-PN fnr+-RPN fnr-PN fnr-PN pHW1 fnr-PN pFnr* A B 4000 3000 2000 1000 0 CIBlacZ A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) 2000 1500 1000 500 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) fnr+-PN fnr+-RPN fnr-PN fnr-PN pHW1 fnr-PN pFnr* A B Resultados 83 proteína de la superfamilia Fnr/Crp en la regulación del promotor PN, mediante su unión a esta secuencia consenso únicamente en ausencia de oxígeno. Por ello, con el fin de confirmar el papel de la proteína Fnr de E. coli en la actividad del promotor PN, se midió la actividad β-galactosidasa de E. coli JRG1728 (cepa fnr- derivada de la M182) transformada con el plásmido pSJ3PN (PN::lacZ). CCGAGCCTCGCGTTTTACTGCGTGTTGCAATGCAACAAAATGCATTTCAT GCTGCGTTGCGGCAAGAAAGATTGCAGTTTTCCATGCAAAAAATGCAATC AAGTGCATGCAAACGTGCCTGACAT TTAG CATCGCCTGCA CTGCAGTGCGTAACATGCGACATCATGCATTAACGGCAAAATAATGCAGC AAAGGCGGACTCAGGGACGGGATCCGCAACACATCAGAGGAGATAGTTCG ATG Como se puede observar en la Figura 8B, las cepas fnr- crecidas tanto en presencia como en ausencia de oxígeno apenas muestran actividad del promotor PN. Sin embargo, cuando esta misma cepa JRG1728 (pSJ3PN) se transforma con el plásmido pHW1, capaz de expresar constitutivamente el gen fnr de E. coli en trans, se recuperan unos niveles de actividad β-galactosidasa muy similares a los obtenidos con la cepa de E. coli fnr+ M182 (pSJ3PN) crecida en ausencia de oxígeno. Estos datos parecen indicar que la proteína Fnr es necesaria para la inducción anaeróbica del promotor PN en E. coli. Con el fin de confirmar esta aseveración, se estudió la expresión de la fusión PN::lacZ en presencia de Fnr*, un mutante de la proteína Fnr que se encuentra activo de forma constitutiva, debido a la sustitución D154A, lo que le permite dimerizar en presencia de oxígeno y así unirse al ADN, además de mantener todas las propiedades de Fnr (Kiley Región III Región II Región I -35 -10 +1 RBS bzdN Caja Fnr -174 +79 Figura 9. Secuencia de nucleótidos del promotor PN. Secuencia del promotor PN desde la posición -174 a la +79. La posición +1 ha sido marcada en amarillo, las cajas -10 y -35 de reconocimiento de la ARN polimerasa han sido subrayadas, la región de unión del ribosoma (RBS) figura en cursiva y subrayada, y el codón de iniciación (ATG) del gen bzdN también ha sido subrayado. Por otro lado, han sido recuadradas las 3 regiones de unión de la proteína BzdR (Barragán et al., 2005) y han sido marcadas con flechas negras las secuencias palindrómicas de cada una de ellas. Por último, se ha recuadrado en un trazo más grueso y de color verde la secuencia que es probablemente reconocida por una proteína de la familia Fnr y se han marcado con flechas rojas y letras blancas las secuencias palindrómicas de la misma. Resultados 84 & Reznikoff, 1991; Lazazzera et al., 1993; Ziegelhoffer & Kiley, 1995). Como se observa en la Figura 1B, cuando la cepa fnr- JRG1728 (pSJ3PN) era transformada con el plásmido pQE60-His6-Fnr* (Wing et al., 2000) se obtenían elevados niveles de actividad β-galactosidasa, al crecer las células tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. Todos estos datos tomados en conjunto señalan de forma inequívoca a Fnr como factor transcripcional imprescindible para la actividad del promotor PN en E. coli. Además, se ha demostrado que la represión dependiente de oxígeno del cluster bzd puede ser evitada mediante la expresión de la proteína Fnr*, que posee capacidad activadora de forma independiente a la presencia/ausencia de oxígeno. 11..33 UUnniióónn ddee llaa pprrootteeíínnaa FFnnrr** aall pprroommoottoorr PPNN.. Con el fin de estudiar la interacción in vitro de la proteína Fnr* con el promotor PN, y poder realizar todos los experimentos in vitro en condiciones aeróbicas, se purificó la proteína Fnr* de E. coli, capaz de mantener la actividad en presencia de oxígeno (Kiley & Reznikoff, 1991; Ziegelhoffer & Kiley, 1995). La purificación se llevó a cabo mediante la adición de una secuencia de 6 histidinas en el extremo N-terminal de la proteína Fnr*, lo que permitió purificarla mediante una cromatografía de afinidad de níquel (Wing et al., 2000), tal y como se describe en la sección Materiales y Métodos. Tras la purificación de la proteína His6-Fnr*, se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel, utilizando como sonda de ADN un fragmento del promotor PN de 376 pb que se extiende desde la posición -293 a la +83 (sonda PN). Como se aprecia en el retardo de la Figura 10A, la proteína His6-Fnr* mostró la capacidad de unirse a la sonda PN, retardando su migración de forma progresiva al ir aumentando la concentración de His6- Fnr*. Esta unión demostró ser específica al ser inhibida mediante la adición de sonda PN no marcada al ensayo de retardo y, sin embargo, no verse afectada dicha unión cuando lo que se añadía era una sonda no marcada heróloga (Figura 10B). Una vez demostrada la unión de His6-Fnr* a la sonda PN, se pasó a identificar la región del promotor PN a la que se unía mediante ensayos de protección frente a digestión con DNasa I o footprinting (véase Materiales y Métodos). Como se puede observar en la Figura 10C la protección de la proteína His6-Fnr* sobre la sonda PN se extiende desde la posición -26 a la -57, con respecto a la posición +1 del inicio de la transcripción del promotor PN. En esta región podemos encontrar la secuencia Resultados 85 palindrómica anteriormente mencionada y predicha como región de unión de Fnr: TTGACTTAGATCAA. Figura 10. Ensayos in vitro de la unión de la proteína His6-Fnr* al promotor PN. (A) Ensayo de retardo en gel. En la calle 1 se cargó sonda PN en ausencia de proteína. En las calles 2-5 se añadieron concentraciones crecientes de la proteína purificada His6-Fnr* de la siguiente forma: 1, 2.5, 5 y 10 nM, respectivamente. (B) Ensayo de especificidad. En la calle 1 se cargó sonda PN en ausencia de proteína. En las calles 2-5 se añadió una concentración de 5 nM de la proteína purificada His6-Fnr*. En la calle 3 se añadió sonda PN no marcada radiactivamente a una concentración de 100 nM, y en la calle 5 se añadió ADN inespecífico de esperma de salmón a una concentración de 100 μg/ml. (C) Ensayo de protección frente a la digestión por DNasa I de la interacción de la proteína His6-Fnr* y la RNAP con el promotor PN. En la calle 1 se cargó sonda PN en ausencia de proteína. Las calles 2-4 incorporaban 50, 100 y 150 nM de proteína purificada His6-Fnr*, respectivamente. Las calles 5-7 incorporaban 50, 100 y 150 nM de RNAP purificada de E. coli, respectivamente. Las calles 8-10 incorporaban, 50 nM de His6-Fnr*, y 50, 100 y 150 nM de RNAP, respectivamente. En la calle señalada como AG fue cargada la reacción de secuenciación A+G de Maxam and Gilbert. A la derecha, se puede apreciar una vista expandida de la región protegida por la proteína His6-Fnr*, así como los nucleótidos cuyos enlaces fosfodiéster resultaron ser hipersensibles a la digestión por DNasa I, los cuales han sido señalados con asteriscos. Las flechas grises indican la secuencia consenso reconocida por Fnr*. También han sido marcadas con llaves las dos regiones que flanquean el operador Fnr y son protegidas por la RNAP. Igualmente, se indican las regiones -35, -10 y +1 del promotor PN. 1 2 3 4 5 His6-Fnr* Sonda PN Complejo PN::His6-Fnr* 1 2 3 4 5 His6-Fnr* Sonda PN Complejo PN::His6-Fnr* A 1 2 3 4 5 His6-Fnr* Complejo PN::His6-Fnr* Sonda PN B C (-57) C* T G A C A T T T G A C* T T A G A T C A A C* A T C G C C T G C* (-26) AG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 His6-Fnr* -35 -10 +1 RNAP RNAP His6-Fnr* C Resultados 86 Esta secuencia es prácticamente idéntica a la secuencia consenso que reconoce la proteína Fnr (Spiro & Guest, 1990), confirmándose así que el promotor PN presenta un operador Fnr en esta región. La región donde se une la proteína Fnr queda centrada en la posición -42.5 desde el inicio de la transcripción y se solapa con la caja -35, lo que caracteriza al promotor PN como un promotor dependiente de activador de clase II (Rhodius & Busby, 1998), por lo que Fnr se puede considerar un activador de PN de la clase II en ausencia de oxígeno. 11..44 AAccttiivvaacciióónn ttrraannssccrriippcciioonnaall ddeell pprroommoottoorr PPNN mmeeddiiaaddaa ppoorr llaa pprrootteeíínnaa FFnnrr.. La activación de la transcripción en los promotores de clase II suele darse por medio de interacción proteína-proteína entre el activador y la ARN-polimerasa (Busby & Ebright, 1999; Rhodius & Busby, 1998). Con el fin de estudiar si este tipo de interacción tenía lugar en el promotor PN, entre Fnr y la ARN polimerasa, se llevaron a cabo ensayos de protección frente a digestión con DNasa I sobre la sonda PN en presencia de ambas proteínas. Los resultados, mostrados en la Figura 10C, pusieron de manifiesto que la unión de la ARN-polimerasa al promotor PN se ve incrementada cuando está en presencia de la proteína His6-Fnr*, lo que sugiere un posible reclutamiento de la ARN polimerasa por parte de la proteína Fnr. Es más, en la huella generada por la ARN-polimerasa en presencia de Fnr, se puede apreciar un aumento de la protección en las regiones que flanquean el sitio de unión de Fnr. La protección de la región upstream podría atribuirse al dominio α-CTD de la ARN-polimerasa, tal y como ya se ha descrito en otros casos (Attey et al., 1994; Busby & Ebright, 1999; Kolb et al., 1993; Wing et al., 2000). La protección de la región downstream del sitio Fnr podría ser debida a la subunidad σ70 de la ARN-polimerasa, como también ha sido demostrado en otros casos en los que se ha identificado una pequeña región en el dominio C-terminal de la subunidad σ70 (aminoácidos 590-603) que es indispensable en la activación de algunos promotores dependientes de Fnr (Lonetto et al., 1998). Esta región contiene en su secuencia un residuo ácido (E591) y seis residuos básicos (K593, R596, K597, R599, H600 y R603), los cuales, al ser sustituidos, dan lugar a una disminución de la activación de la transcripción dependiente de Fnr (Bell & Busby, 1994; West et al., 1993). En base a estos antecedentes y con el fin de determinar la posible interacción entre el dominio C-terminal de la subunidad σ70 y la proteína Fnr, se midió la expresión de PN::lacZ en cultivos anaeróbicos de 4 cepas diferentes de E. coli PK330, una Resultados 87 silvestre y las otras 3 mutantes en la subunidad σ70, previamente caracterizadas: [σ70(EA591)], [σ70(KA593)] y [σ70(KA597)] (Lonetto et al., 1998). La cepa PK330 contiene el gen rpoD, que codifica la subunidad σ70 de la ARN polimerasa, bajo el control del promotor Ptrp, responsable de la regulación del operón trp que codifica la ruta de síntesis del triptófano. Esta modificación impide que la bacteria pueda crecer en presencia de triptófano (Lonetto et al., 1998), salvo si el gen de la subunidad σ70 es suministrado por medio de un plásmido como pGEX-2Tσ70 o sus variantes mutadas mencionadas anteriormente (Lonetto et al., 1998). Todas las cepas mutantes presentaron una tasa de crecimiento en líquido semejante a la cepa salvaje y formaron colonias de igual tamaño al ser crecidas en medio sólido, tal y como ya se había descrito (Lonetto et al., 1998). Sin embargo, al medir la actividad del promotor PN se pudo observar que los mutantes que habían sufrido la sustitución de una alanina por una lisina, KA593 y KA597, mostraban una actividad significativamente menor que la mostrada por la cepa salvaje. El otro mutante, EA591, no mostró diferencias significativas respecto de los niveles de la cepa salvaje (Figura 11). Estos resultados sugerían que, efectivamente, la interacción entre la proteína Fnr y la subunidad σ70 de la ARN polimerasa juegan un papel crucial en la activación del promotor PN. Con el fin de demostrar el papel directo como activador de la proteína Fnr en la regulación del promotor PN se llevaron a cabo ensayos de transcripción in vitro, utilizando para ello proteína purificada His6-Fnr*, ARN-polimerasa (RNAP) de E. coli y el plásmido pJCD-PN, en el cual se ha clonado el promotor PN, tal y como se detalla Figura 11. Efecto de los mutantes en σ70 en la expresión de la fusión PN::lacZ en E. coli mediada por Fnr. La cepa E. coli PK330 con el plásmido pBBR5PN (PN::lacZ) fue transformada además con diversos plásmidos: pGEX-2Tσ70 (WT), pGEX- 2Tσ70 [EA591] (EA591), pGEX-2Tσ70 [KA593] (KA593) ó pGEX-2Tσ70 [KA597] (KA597). Posteriormente, todas ellas fueron crecidas anaeróbicamente durante 10 horas, en medio mínimo M63 con 20 mM de glicerol y 20μg/ml de triptófano, hasta una A600 de 0.4. La actividad β-galactosidasa es representada en porcentaje con respecto a la actividad medida en la cepa silvestre (WT = 370 U. Miller). Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. 100 75 50 25 0 A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (% ) WT EA591 KA593 KA597 100 75 50 25 0 A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (% ) WT EA591 KA593 KA597 Resultados 88 en el apartado Materiales y Métodos. Como se puede apreciar en la Figura 12, la presencia de la proteína His6-Fnr* en la mezcla de reacción es imprescindible para que tenga lugar la transcripción del promotor PN, apareciendo el transcrito esperado de 184 nt, cuyo nivel de transcripción va aumentando a medida que se incrementa la concentración de His6-Fnr*. Por el contrario, en ausencia de la proteína His6-Fnr* únicamente se puede apreciar el transcrito control de 105 nt, incluso a concentraciones de RNAP que mostraban unión de ésta a la sonda PN en los ensayos de protección frente a digestión con DNasa I (Figura 10C). Así, los ensayos de transcripción in vitro demostraron que, aunque la RNAP es capaz de unirse al promotor PN, la proteína Fnr es esencial durante el inicio de la transcripción, tras la formación del complejo cerrado RNAP/PN. Dado que ambas proteínas parecían solapar en sus regiones de unión al ADN, se decidió estudiar cuál de las proteínas, Fnr ó la RNAP, se unía al promotor PN en primer lugar, mediante ensayos de competencia por retardo en gel. El objetivo final era comprobar si la proteína Fnr ayudaba a la RNAP durante la unión de ésta al promotor PN. En la Figura 13 se puede apreciar la notable diferencia existente entre la calle 3, que incorpora una concentración 4 nM de RNAP, y la calle 11, con idéntica concentración de RNAP y además 10 nM de la proteína His6-Fnr*, ya que sólo en esta última se puede observar la formación del complejo PN::RNAP (C2), desapareciendo tanto la banda de sonda libre (PN), como la banda del complejo PN::His6-Fnr* (C1), lo cual sugiere que Fnr* está implicada en el reclutamiento de la RNAP. 1 2 3 4 5 6 His6-Fnr* PN C 1 2 3 4 5 6 His6-Fnr* PN C Figura 12. Efecto de la proteína His6-Fnr* en la transcripción in vitro del promotor PN. Se llevaron a cabo reacciones de transcripción in vitro de múltiples rondas utilizando como molde el plásmido pJCD-PN, que incorpora, en sentidos divergentes, un promotor control, que expresa un ARNm de 105 nucleótidos (C), y el promotor PN, que expresa un ARNm de 184 nucleótidos (PN). En la calle 1 se cargó mezcla de reacción sin RNAP. En las calles 2-6 se cargaron reacciones con RNAP de E. coli 50 nM y proteína purificada His6-Fnr* a una concentración creciente de 0, 1, 2.5, 5 y 10 nM, respectivamente. Resultados 89 Finalmente, se llevaron a cabo ensayos de footprinting con KMnO4, tal y como se detalla en el apartado Materiales y Métodos, para establecer la influencia de Fnr en la formación del complejo abierto. Para ello, se realizaron mezclas de reacción con RNAP y KMnO4, el cual es capaz de romper fragmentos de ADN de una sola hebra, tanto en presencia como en ausencia de la proteína purificada His6-Fnr*. Como se aprecia en la Figura 14, cuando la concentración de RNAP es de 100 nM, únicamente en presencia de la proteína His6-Fnr* se logra formar el complejo abierto, que se pone de manifiesto por el bandeado observado, que abarca un fragmento de 9 pares de bases, desde la posición +1 hasta la posición +9, e implica a las bases subrayadas de la secuencia: 3’- A T G C A T T A A -5’. Al aumentar la concentración de RNAP a 200 y 400 nM se pueden observar un par de bandas difusas en ausencia de la proteína His6-Fnr*, pero no se aprecia el bandeado observado típico de los complejos abiertos. Estos datos sugieren que la proteína His6-Fnr* es necesaria para la formación del complejo abierto. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 His6-Fnr*RNAP RNAP His6-Fnr* C1 C2 PN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 His6-Fnr*RNAP RNAP His6-Fnr* C1 C2 PN Figura 13. Ensayo de competencia de la proteína His6-Fnr* y la RNAP en su unión al promotor PN. Se llevó a cabo un ensayo de retardo en gel en el cual se cargaron diversas muestras. En la calle 1 se cargó sonda PN libre. En las calles 2-6 se cargaron concentraciones crecientes de RNAP: 2, 4, 10, 20 y 40 nM, respectivamente. En las calles 7-9 se cargaron concentraciones crecientes de proteína purificada His6-Fnr*: 5, 10 y 25 nM, respectivamente. Por último, en las calles 10-14 se cargaron concentraciones 10 nM de proteína purificada His6-Fnr*, así como concentraciones crecientes de RNAP: 2, 4, 10, 20 y 40 nM, respectivamente. A la derecha han sido señaladas las bandas correspondientes a la sonda libre (PN), así como las formadas por los complejos de unión con la proteína His6-Fnr* (C1), o con la RNAP (C2). Resultados 90 G C G A C A T C AA T G C A T T A A C G G C AG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -35 -10 +1 DNasa I——+——+——+— + + His6-Fnr*——+——+——— KMnO4+—++—++—— RNAP 400RNAP 200RNAP 100S G C G A C A T C AA T G C A T T A A C G G C AG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -35 -10 +1 DNasa I——+——+——+— + + His6-Fnr*——+——+——— KMnO4+—++—++—— RNAP 400RNAP 200RNAP 100S Figura 14. Ensayo de footprinting con KMnO4 de la interacción de la proteína His6-Fnr* y la RNAP con el promotor PN. En la calle 1 se cargó sonda (S) PN en ausencia de proteínas. Las calles 2-4, 5-7 y 8-10 incorporaban 100 (RNAP100), 200 (RNAP200) y 400 (RNAP400) nM de RNAP, respectivamente. En las calles 2, 5 y 8 se llevó a cabo un ensayo de protección frente a DNasa I. En las calles 3, 4, 6, 7, 9 y 10 se añadió KMnO4 a la mezcla de reacción. En las calles 4, 7 y 10 se añadió proteína purificada His6-Fnr* a una concentración 100 nM. En la calle AG fue cargada la reacción de secuenciación A+G de Maxam and Gilbert. A la derecha, se puede apreciar una vista expandida de la región donde tiene lugar la formación del complejo abierto, donde ha sido subrayada la posición +1. Tanto en el interior de la imagen como en la secuencia de la derecha han sido señaladas aquellas bases del complejo abierto que han sido modificadas por el KMnO4. También han sido señaladas las regiones -35, -10 y +1 del promotor PN a la izquierda de la figura. Resultados 91 11..55 LLaa pprrootteeíínnaa AAccppRR eessttáá iinnvvoolluuccrraaddaa eenn llaa aaccttiivvaacciióónn ddeell pprroommoottoorr PPNN eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. Tras haber demostrado de forma inequívoca el papel de la proteína Fnr de E. coli como activador transcripcional del promotor heterólogo PN, pasamos a la identificación del ortólogo de Fnr que controla realmente la expresión de los genes del cluster bzd en el microorganismo Azoarcus sp. CIB. Para ello, se llevó cabo una comparación de la secuencia de aminoácidos contra la base de datos PDB, usando como molde la secuencia de la proteína Fnr de E. coli, obteniéndose, entre otros, la secuencia de un supuesto gen fnr ortólogo (ebA5149) en el genoma de Azoarcus sp. EbN1, situado entre el gen hemN (ebA5151), que codifica la enzima coproporfirinógeno III oxidasa independiente de oxígeno y regulada por Fnr en Pseudomonas, y el gen ebA5146, que codifica una proteína de función desconocida (Figura 15) (Rabus et al., 2005). Basándose en el genoma de Azoarcus sp. EbN1, se diseñaron dos oligonucleótidos: uno de ellos en el extremo 5’ del gen hemN y otro en el extremo 3’ del gen ebA5146, para amplificar mediante PCR una secuencia de 1220 pb utilizando como molde el genoma de Azoarcus sp. CIB. Dicha secuencia contenía los extremos 5’ y 3’ predichos, es decir, los ortólogos de los genes hemN y ebA5146, respectivamente, flanqueando al correspondiente ortólogo de fnr de Azoarcus sp. CIB, el cual fue bautizado con el nombre de acpR (aromatic central pathway Regulator), cuyo significado será explicado más adelante. El gen acpR codifica una proteína de 248 aminoácidos, cuya secuencia 5AcpRext 3AcpRint 5AcpRext 3AcpRint Figura 15. Gen fnr del organismo Azoarcus sp. EbN1. El gen fnr de Azoarcus sp. EbN1 se extiende a lo largo de 747 pares de bases, concretamente, desde la base 3.053.049 hasta la base 3.053.795, y flanqueado por dos genes: hemN, que codifica una coproporfirinógeno III oxidasa, y ebA5146, gen huérfano de función desconocida. Los oligonucleótidos 5AcpRext y 3AcpRint fueron utilizados para amplificar una secuencia de 1220 pares de bases del genoma de Azoarcus sp. CIB, que incluía el gen ortólogo a fnr de E. coli. Resultados 92 presenta una significativa similitud con los miembros de la superfamilia de reguladores transcripcionales Fnr/Crp, como se puede apreciar en la siguiente tabla: Tabla 7. Porcentaje de identidad entre la proteína AcpR de Azoarcus sp. CIB y las proteínas de la superfamilia Fnr/Crp de diversos organismos. Organismo Nº de acceso Porcentaje de identidad Azoarcus sp. EbN1 CAI09052 94% Dechloromonas aromatica RCB ZP_00150505 75% Rubrivirax gelatinosus PM1 AAW66138 68% Polaromonas sp. JS666 ZP_00364405 58% Ralstonia solanacearum CAD14985 54% Escherichia coli AY629341 43% Una vez obtenida la secuencia del gen acpR se procedió al estudio del papel de la proteína en la expresión del cluster bzd en Azoarcus sp. CIB. Para ello, se construyó la cepa mutante Azoarcus sp. CIBdacpR, cuyo gen acpR fue interrumpido, como se detalla en la sección Materiales y Métodos. Si bien esta cepa mutante fue incapaz de crecer en condiciones anaeróbicas utilizando como fuente de carbono diversos compuestos aromáticos, tales como el benzoato, el fenilacetato o el 4-hidroxibenzoato, todos ellos metabolizados a través de la ruta central codificada en el cluster bzd, no presentó ningún problema cuando dicho crecimiento se llevó a cabo en condiciones aeróbicas en los mismos compuestos. Cuando la cepa mutante fue complementada con el gen acpR por medio del plásmido pBBR1MCS-5acpR, que expresa el gen acpR bajo el control del promotor Plac, se pudo restablecer el crecimiento en condiciones anaeróbicas utilizando compuestos aromáticos como fuente de carbono, lo que sugiere que la proteína AcpR es imprescindible para que tenga lugar la expresión del cluster bzd (Figura 16A). Sin embargo, aún quedaba por confirmar que el producto del gen acpR estuviera directamente implicado en la actividad del promotor PN. Para ello, tanto la cepa Azoarcus sp. CIB como el mutante Azoarcus sp. CIBdacpR fueron transformados con el plásmido pBBR5PN, el cual incluye la fusión traducional PN::lacZ. Cuando la cepa Azoarcus sp. CIB(pBBR5PN) fue crecida en condiciones anaeróbicas con benzoato y piruvato se obtuvo una actividad β-galactosidasa muy significativa, como se aprecia en la Figura 16B. Por el contrario, cuando el mutante Azoarcus sp. CIBdacpR(pBBR5PN) fue crecido en estas mismas condiciones, la actividad β-galactosidasa no superó el nivel Resultados 93 basal que alcanza la cepa Azoarcus sp. CIB(pBBR5PN) cuando crece usando como única fuente de carbono compuestos no aromáticos como el piruvato. Estos datos señalan al gen acpR como el responsable de la regulación sobreimpuesta dependiente de oxígeno del promotor PN. Por último, se llevó a cabo un análisis filogenético de la proteína AcpR basado en el alineamiento múltiple de su secuencia de aminoácidos con la de otros miembros de la superfamilia Fnr/Crp. Dicho análisis puso de manifiesto que la proteína AcpR pertenece al grupo Fnr, en el cual destaca la proteína Fnr de E. coli, ampliamente caracterizada, con la que guarda un 43% de identidad a nivel de la secuencia de aminoácidos, o la proteína AadR de R. palustris, con la que guarda un 34% de identidad, además de jugar papeles muy semejantes en el metabolismo celular. La comparación y el modelo tridimensional de AcpR usando como modelo la proteína CRP de E. coli se llevó a cabo con el programa LOOPP (Teodorescu et al., 2004a) (Figura 17). Dicha comparación nos Figura 16. Control de las proteínas AcpR y Fnr* sobre la expresión del cluster bzd en Azoarcus sp. CIB. (A) Curvas de crecimiento de Azoarcus sp. CIB (cuadrados □), Azoarcus sp. CIBdacpR (círculos ), Azoarcus sp. CIBdacpR con el plásmido pBBR1MCS-5acpR (triángulos ∆), y Azoarcus sp. CIBdacpR con el plásmido pIZ-Fnr* (pentágonos ), crecidos todos ellos en condiciones anaeróbicas, en medio MC y utilizando como fuente de carbono succinato (símbolos blancos) o benzoato (símbolos negros). (B) Las cepas Azoarcus sp. CIB (barras negras), Azoarcus sp. CIBdacpR (barras grises), ambas con el plásmido pBBR5PN (PN::lacZ), y la cepa Azoarcus sp. CIB lacZ pIZ-Fnr* (barras blancas), fueron crecidas todas ellas anaeróbicamente durante 48 horas en medio MC utilizando como fuente de carbono piruvato al 0.4% (Pyr) o piruvato al 0.4% más benzoato 3 mM (Pyr+Bz). La actividad β-galactosidasa fue medida como se describe en el apartado Materiales y Métodos. Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. A Tiempo (h) C re ci m ie nt o (A 60 0 nm ) 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0 20 40 60 80 0 10000 20000 30000 Pyr Pyr+Bz B A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) A Tiempo (h) C re ci m ie nt o (A 60 0 nm ) 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0 20 40 60 80 0 10000 20000 30000 Pyr Pyr+Bz B A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) Resultados 94 permite establecer la posición de las posibles regiones AR-1, AR-2 y AR-3 de la proteína AcpR, así como del motivo HTH, cuya secuencia presenta un alto grado de conservación con respecto a las demás proteínas. NH2 COOH NH2 COOH Fnr de E. coli AcpR de Azoarcus sp. CIB B NH2 COOH NH2 COOH Fnr de E. coli AcpR de Azoarcus sp. CIB NH2 COOH NH2 COOH NH2 COOH NH2 COOH Fnr de E. coli AcpR de Azoarcus sp. CIB B -MQMKATVP-ITVASLKVACSQCNLVELCLPFGMSESEIDRLDELVGARRKIKRQQNLYR 58 -MQMKATVP-ITVASLKVACSQCNLVELCLPFGMSENEIDRLDELVGARRKIKRQHHLYR 58 MIPEKRIIRRIQSGGCAIHCQDCSISQLCIPFTLNEHELDQLDNIIERKKPIQKGQTLFK 60 ---MPHLAYPTTTCEGFRCETHCAVRGLAICGELGPADHEEFERLAQHVR-YGPKEALFS 56 .* : *.: :. : :.::.: : . *: AGDPFEAIYAIRAGSFKTDVLLEDGREQVTGFQMTGEMLGLDGISTETHSCNAIALEDSE 118 AGDPFEAIYAIRAGSFKTNVLLEDGREQVTGFQMTGEMLGLDGISTELHSCNAIALEDSE 118 AGDELKSLYAIRSGTIKSYTITEQGDEQITGFHLAGDLVGFDAIGSGHHPSFAQALETSM 120 EDEVADSVYSLIEGIARLYKLLPDGRRQIIGFALPGDFLGMAPG--NRYSFSADSIGGVT 114 .: .::*:: * : : :* .*: ** :.*:::*: :. * :: VCVIAYSKLEELSRVVEGLQLQFHKVMSREIVRDHGVMTLLGSMRAEERLAAFLLNMSQR 178 VCVIAYGKLEELSRVVEGLQHQFHKVMSREIVRDHGVMTLLGSMRAEERLAAFLLNMSQR 178 VCEIPFETLDDLSGKMPNLRQQMMRLMSGEIKGDQDMILLLSKKNAEERLAAFIYNLSRR 180 VCKFFRGPFLRFIENRPQMLLRMNDFATRELSLAQDQMLLLGRRSAEEKVAAFLVGWRDR 174 ** : : : : :: . : *: :. : **. ***::***: . * FTARGFSPAEFHLRMTREEIGSYLGLKLETVSRAFSKFQDDGLIAVQQKHIRILDIIGLK 238 FTARGFSAAEFHLRMTREEIGSYLGLKLETVSRAFSKFQEEGLIAVQQKHIRILNICGLK 238 FAQRGFSPREFRLTMTRGDIGNYLGLTVETISRLLGRFQKSGMLAVKGKYITIENNDALA 240 LARLEGVTKTVSLPMGRQDIADFLGLTIETVSRTFTKLEREKLIVIVPDGVRVLDPKRFD 234 :: . . * * * :*..:***.:**:** : ::: . ::.: . : : : : RLIQHPSPRP 248 KLIHHPSPRG 248 QLAGHTRNVA 250 ALAAA----- 239 * ARAR--22 ARAR--11 ARAR--33 ARAR--11 ARAR--11 αα11 ββ11 ββ22 ββ33 ββ44 ββ55 ββ66 ββ77 ββ77 ββ88 ββ99 αα22 αα33 αα44 αα55 αα66 AcpRAcpR Fnr (EbN1)Fnr (EbN1) Fnr (Fnr (E. E. colicoli)) AadRAadR AcpRAcpR Fnr (EbN1)Fnr (EbN1) Fnr (Fnr (E. E. colicoli)) AadRAadR AcpRAcpR Fnr (EbN1)Fnr (EbN1) Fnr (Fnr (E. E. colicoli)) AadRAadR AcpRAcpR Fnr (EbN1)Fnr (EbN1) Fnr (Fnr (E. E. colicoli)) AadRAadR AcpRAcpR Fnr (EbN1)Fnr (EbN1) Fnr (Fnr (E. E. colicoli)) AadRAadR A Resultados 95 11..66 LLaa pprrootteeíínnaa FFnnrr ddee EE.. ccoollii ssee ccoommppoorrttaa ccoommoo uunn rreegguullaaddoorr ddee llaa rruuttaa cceennttrraall ddee ddeeggrraaddaacciióónn ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. Debido a la notable similitud entre la proteína Fnr de E. coli y la proteína AcpR de Azoarcus sp. CIB y tras haber demostrado que la proteína Fnr* es capaz de actuar como un activador transcripcional del cluster bzd cuando es expresada en E. coli, se llevó a cabo otro estudio con el fin de comprobar si Fnr* podría sustituir el papel de AcpR en el organismo original, es decir, en Azoarcus sp. CIB. Para ello, se expresó la proteína Fnr*, clonada bajo el promotor Ptac en el plásmido pIZ-Fnr*, en la cepa Azoarcus sp. CIBdacpR. Mientras la cepa Azoarcus sp. CIBdacpR no fue capaz de crecer en condiciones anaeróbicas utilizando benzoato como fuente de carbono, la cepa Azoarcus sp. CIBdacpR(pIZ-Fnr*) mostró una curva de crecimiento similar a la obtenida con la cepa Azoarcus sp. CIB crecida en iguales condiciones (Figura 16A). No obstante, con el fin de confirmar el resultado y demostrar la acción directa de Fnr* sobre el promotor PN, se expresó la proteína Fnr* desde el plásmido pIZ-Fnr* en la cepa Azoarcus sp. CIB lacZ y se midieron los niveles de actividad β-galactosidasa en cultivos aeróbicos crecidos en piruvato, donde no se obtuvieron valores significativos de actividad, y en piruvato más benzoato, donde se alcanzaron valores notables de actividad (Figura 16B). De esta forma, se demostraba que la proteína Fnr* era capaz de complementar la ausencia de la proteína AcpR, adquiriendo así la actividad de regulador transcripcional Figura 17. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos entre AcpR, Fnr (EbN1), Fnr (E. coli) y AadR, y modelo tridimensional de AcpR. (A) Los números de acceso de las secuencias mostradas son los siguientes: AcpR de Azoarcus sp. CIB, AAY81959.1; Fnr de Azoarcus sp. EbN1, YP_159953.1; Fnr de E. coli, YP_001730333.1; y AadR de Rhodopseudomonas palustris, CAE29675.1. Los residuos de cada una de las secuencias están numerados a la derecha. Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa de alineamiento múltiple ClustalW2. Los aminoácidos han sido representados mediante el código de una letra y los cuatro colores en que se muestran representan el grupo de aminoácidos al que pertenecen: rojo = apolares; verde = polares sin carga; azul = ácidos; rosa = básicos. En la zona inferior del alineamiento, un asterisco (*) significa que los residuos de esa posición son idénticos en todas las secuencias; dos puntos (:) significan que existen sustituciones conservadas, acordes con el código de colores mencionado anteriormente; un punto (.) significa que existen sustituciones semi-conservadas. Las regiones AR-1, AR-2 y AR-3 se muestran recuadradas en verde, rojo y amarillo, respectivamente. Los elementos de estructura secundaria predichos por el modelo tridimensional de AcpR han sido representados en forma de cilindros morados (hélices α) y flechas rosadas (láminas β) debajo de las secuencias. De igual forma, se han resaltado en color naranja las dos hélices α del motivo HTH implicadas en la interacción con el ADN. (B) Modelos tridimensionales de las proteínas Fnr de E. coli y AcpR de Azoarcus sp. CIB, donde son representadas mediante un diagrama de cintas en el que se aprecian las 6 hélices α y las 9 láminas β. Las regiones AR-1, AR-2 y AR-3 se muestran coloreadas de verde, rojo y amarillo, respectivamente. Las dos hélices α que conforman el motivo hélice-giro-hélice (HTH) se muestran en color naranja. También han sido indicados los extremos N- y C-terminal como NH2 y COOH, respectivamente. Resultados 96 de los genes bzd cuando Azoarcus sp. CIB crece tanto aeróbica como anaeróbicamente en presencia de benzoato. Resultados 97 OObbjjeettiivvoo 22.. EEssttuuddiioo ddeell pprroommoottoorr PPRR ddeell ggeenn bbzzddRR yy ssuu iimmpplliiccaacciióónn eenn llaa rreegguullaacciióónn ddee llaa ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. La expresión de los genes bzd involucrados en la degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB es controlada por el represor transcripcional específico BzdR mediante su unión al promotor PN, el cual también está sujeto a represión catabólica mediada por diversos ácidos orgánicos (López Barragán et al., 2004a). Con el fin de ampliar el conocimiento acerca de la regulación del cluster bzd, se decidió estudiar la regulación del gen bzdR, controlado por el promotor PR. 22..11 BBzzddRR aauuttoorrrreegguullaa ssuu pprrooppiiaa eexxpprreessiióónn.. Con el fin de ampliar la caracterización de la regulación de la ruta de degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB, se llevó a cabo un estudio sobre la posible regulación de PR, el promotor del gen bzdR, por su propio producto de expresión, la proteína BzdR. Para ello, se estudió la expresión del promotor PR en un fondo genético en el que BzdR estuviera ausente. Esto se realizó mediante la fusión del promotor PR al gen lacZ, en el plásmido pBBR5PR (PR::lacZ), con el que fueron transformadas las cepas Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. CIBdbzdR, una cepa mutante cuyo gen bzdR se encuentra interrumpido. A continuación, se midió la actividad β-galactosidasa tras crecer ambas cepas en benzoato, en succinato o en benzoato más succinato. Como se puede observar en la Figura 18, la expresión de la fusión PR::lacZ en la cepa silvestre Azoarcus sp. CIB fue notablemente inferior con respecto a la expresión obtenida en la cepa mutante Azoarcus sp. CIBdbzdR, que no expresa la proteína BzdR, lo que sugería que BzdR estaba implicada en la represión de su propio promotor PR. Por otro lado, puesto que el benzoil-CoA fue descrito como la molécula inductora de la expresión del promotor PN mediante su unión a la proteína BzdR (Barragán et al., 2005), se estudió la relación del benzoil-CoA con la regulación del promotor PR. Para ello, se midió la expresión de la fusión PR::lacZ en la cepa Azoarcus sp. CIBdbzdN, un mutante incapaz tanto de crecer anaeróbicamente en benzoato, como de sintetizar benzoil-CoA, ya que todo el cluster bzd queda interrumpido por una mutación polar en el gen bzdN (López Barragán et al., 2004a). Como se observa en la Figura 18, la cepa Azoarcus sp. CIBdbzdN(pBBR5PR) crecida en succinato o en succinato más benzoato, muestra los mismos niveles de expresión del promotor PR que los niveles mostrados por Resultados 98 la cepa salvaje crecida en presencia de succinato. Sin embargo, dichos niveles fueron unas dos veces más bajos que los niveles de PR obtenidos en la cepa salvaje crecida en benzoato o en benzoato más succinato, lo que indica que el represor BzdR deja de ejercer su papel represor sobre el promotor PR cuando las células crecen en presencia de benzoato y se sintetiza benzoil-CoA. Finalmente, se llevaron a cabo una serie de ensayos in vitro con el fin de confirmar los resultados obtenidos in vivo. En primer lugar, se estableció el sitio de iniciación de la transcripción del promotor PR mediante la técnica de extensión del cebador, a partir de ARN mensajero aislado de células de la cepa Azoarcus sp. CIB(pBBR5PR) crecidas en benzoato, tal y como se describe en el apartado Materiales y Métodos. El inicio de la transcripción fue localizado 39 nucleótidos upstream respecto del codón ATG de iniciación de la traducción del gen bzdR (Figura 19). Se establecieron como posibles cajas promotoras del promotor PR la secuencia -10 (CACTAT) y -35 (TTGCAA), ambas separadas por 17 pares de bases entre sí. Con el fin de determinar la capacidad represora de BzdR sobre el promotor PR, se llevaron a cabo ensayos de transcripción in vitro con la proteína His6-BzdR purificada y RNAP, usando como molde de transcripción el plásmido pJCD-PR, cuya secuencia contiene al promotor PR. Como se observa en la Figura 20, la actividad del promotor PR, medida en base a la formación del transcrito esperado de 242 nt, fue inhibida con concentraciones crecientes de proteína His6-BzdR. Sin embargo, al añadir cantidades crecientes de benzoil-CoA a la mezcla de reacción, la actividad del promotor PR se recuperaba, indicando así su acción inductora sobre este promotor. Figura 18. Expresión del gen bzdR bajo diferentes condiciones de crecimiento. Actividad β-galactosidasa de las cepas Azoarcus sp. CIB (barras blancas), Azoarcus sp. CIBdbzdR (barras grises) y Azoarcus sp. CIBdbzdN (barras negras) con el plásmido pBBR5PR (PR::lacZ). Las células fueron crecidas anaeróbicamente hasta la mitad de la fase exponencial en medio MC y utilizando como fuente de carbono benzoato 3 mM (Bz), succinato 7.5 mM (Sc) o benzoato 3 mM más succinato 7.5 mM (Bz+Sc). Las barras de error indican las correspondientes desviaciones estándar (n = 3). 0 250 500 Bz Sc Bz+Sc A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PR lacZ 0 250 500 Bz Sc Bz+Sc A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PR lacZ Resultados 99 22..22 CCaarraacctteerriizzaacciióónn ddee llaa iinntteerraacccciióónn BBzzddRR--PPRR.. Con el fin de caracterizar la interacción entre BzdR y el promotor PR, se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel y de protección frente a la digestión con DNasa I. Para ello, se purificó la proteína His6-BzdR y un fragmento del promotor PR, concretamente desde la posición -169 a la posición +120. Como se aprecia en el ensayo de retardo de la Figura 21A, la proteína His6-BzdR es capaz de unirse al promotor PR dependiendo de la concentración de proteína. Esta interacción demostró ser específica ya que se veía PR 242 nt 1 2 3 4 5 6 7 8 His6-BzdR His6-BzdR Bz-CoA A C G T PR A T A T T A A G* T A G C C PR 242 nt 1 2 3 4 5 6 7 8 His6-BzdR His6-BzdR Bz-CoA PR 242 nt 1 2 3 4 5 6 7 8 His6-BzdR His6-BzdR Bz-CoA A C G T PR A T A T T A A G* T A G C C A C G T PR A T A T T A A G* T A G C C Figura 19. Identificación del sitio de iniciación de la transcripción (+1) en el promotor PR. El ARNm total fue aislado de la cepa Azoarcus sp. CIB portadora del plásmido pBBR5PR (PR::lacZ), crecida anaeróbicamente en benzoato, tal y como se detalla en la sección Materiales y Métodos. El tamaño del fragmento que se aprecia en la calle PR fue determinado mediante su comparación con la reacción de secuencia del promotor PR, llevada a cabo en las calles A, C, G y T. La extensión por cebador y las reacciones de secuenciación fueron realizadas con el oligonucleótido Lac57, como se describe en la sección Materiales y Métodos. A la derecha del gel se muestra la secuencia de los nucleótidos que rodean la posición +1 (asterisco), de la hebra no codificante del promotor PR. Figura 20. Actividad in vitro del promotor PR. Se llevaron a cabo reacciones de transcripción in vitro utilizando como molde el plásmido pJCD-PR, que incorpora el promotor PR, el cual expresa un ARNm de 242 nucleótidos (PR). Las reacciones se llevaron a cabo con RNAP 50 nM de E. coli en ausencia de la proteína His6-BzdR (calle 2) o en presencia de ésta a diversas concentraciones: 50 nM (calle 3), 100 nM (calle 4) ó 200 nM (calle 5). En las calles 6-8 se mantuvo la proteína His6-BzdR a una concentración de 200 nM y además se añadió benzoil-CoA (Bz-CoA) en concentraciones crecientes: 0.5 mM, 1 mM y 2 mM, respectivamente. En la calle 1 se añadió, a modo de control, proteína His6-BzdR inactivada por calor. Resultados 100 inhibida al añadir sonda PR no marcada a la mezcla de reacción (dato no mostrado). De igual forma, al añadir una sonda inespecífica no marcada, la interacción BzdR-PR no se vio afectada (dato no mostrado). -10 -35 B AG 1 2 3 4 5 6 +1 * * * His6-BzdR * 1 2 3 4 5 Sonda PR Complejo PR::His6-BzdR A His6-BzdR 1 2 3 4 5 Sonda PR Complejo PR::His6-BzdR A His6-BzdR * Figura 21. Análisis in vitro de la interacción de BzdR con el promotor PR. (A) Ensayo de retardo en gel de la unión de la proteína His6- BzdR al promotor PR, llevado a cabo como se detalla en la sección Materiales y Métodos. En la calle 1 se añadió sonda PR libre y en las calles 2-5 se añadieron concentraciones crecientes de la proteína purificada His6-BzdR de la siguiente forma: 0.05, 0.1, 0.5 y 1 μM, respectivamente. La sonda PR y el complejo PR::His6-BzdR han sido indicados con flechas. (B) Ensayo de protección frente a la digestión por DNasa I de la interacción de la proteína His6-BzdR con el promotor PR, llevado a cabo como se detalla en la sección Materiales y Métodos. En la calle 1 se cargó sonda PR en ausencia de proteína. Las calles 2-6 incorporaban 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 y 1 μM de proteína purificada His6-BzdR, respectivamente. En la calle AG fue cargada la reacción de secuenciación A+G de Maxam and Gilbert. La región protegida por la proteína His6-BzdR se muestra acotada por una llave y los enlaces fosfodiéster hipersensibles a la digestión por DNasa I han sido señalados con asteriscos. Igualmente, han sido señaladas la región -35, -10 y +1 del promotor PR. Resultados 101 Posteriormente, se identificó la región operadora reconocida por BzdR en el promotor PR mediante ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I. En la Figura 21B se puede apreciar la región protegida por la proteína His6-BzdR, que se extiende desde la posición -33 hasta la +25 del promotor PR. En dicha región se pueden apreciar tres repeticiones GCAC, lo que apoya el hecho de que BzdR actúa como represor del promotor PR al coincidir esta región que protege con las cajas -10 y -35. En la Figura 21B también se pueden apreciar los cambios originados en la estructura del ADN debidos a la interacción de la proteína BzdR con el promotor PR, como se pone de manifiesto en las regiones de hipersensibilidad a la digestión con DNasa I. En la Figura 22 se ha esquematizado la estructura del promotor PR, indicando aquellos de sus elementos relacionados con su expresión y su regulación. CATTATCCGGCGTCTCCTGCTTAGGCGTGAGAGCGCTCGCGGGCAATTTT GCGGTTACTACGGATGCCCGACAACTCATCCGCATGTTGCAATCGCGCCC AACCTTGAGCACTATAATTCATCGGCACTTTATTGCCGCACAAATAGGGG TAGCCCCGATG 22..33 PPaappeell ddeell ooxxííggeennoo eenn llaa eexxpprreessiióónn ddeell ggeenn bbzzddRR.. Tras haber establecido previamente el papel del oxígeno como represor en la regulación del promotor PN (Durante-Rodríguez et al., 2006), era necesario ampliar dicho estudio al promotor PR, con el fin de determinar qué papel jugaba el oxígeno en la expresión del gen bzdR. En primer lugar, se midió la actividad del promotor PR en la cepa Azoarcus sp. CIB(pBBR5PR) crecida en condiciones aeróbicas y anaeróbicas en medio mínimo con benzoato, y cuando el cultivo se encontraba en mitad de la fase exponencial. Tal y como se puede observar en la Figura 23A, el oxígeno no parece jugar un papel especialmente relevante en la expresión del promotor PR. Para confirmar este resultado, se midió la expresión del promotor PR en la cepa Azoarcus sp. CIBdacpR(pBBR5PR), cuyo gen acpR se encuentra interrumpido impidiendo así que Figura 22. Secuencia de nucleótidos del promotor PR. Secuencia del promotor PR desde la posición -119 a la +42. Ha sido subrayada la posición +1, las cajas -10 y -35 de reconocimiento de la ARN polimerasa, la región de unión del ribosoma (RBS) y el codón de iniciación (ATG) del gen bzdR. Por otro lado, ha sido recuadrada la región del promotor protegida por la proteína BzdR, que se extiende desde la posición -33 a la posición +25, resaltando en gris claro las tres repeticiones GCAC. bzdR RBS +1 -10 -35 +42 -119 Resultados 102 pueda crecer anaeróbicamente en benzoato (Durante-Rodríguez et al., 2006). Cuando dicha cepa fue crecida anaeróbicamente en medio mínimo utilizando succinato como fuente de carbono, los valores de actividad β-galactosidasa asociados a PR::lacZ fueron muy similares a los obtenidos en la cepa Azoarcus sp. CIB(pBBR5PR) crecida en las mismas condiciones (Figura 23A). Posteriormente, y con el fin de determinar la cantidad de represor BzdR presente en las células, se llevaron a cabo ensayos de Western-blotting utilizando anticuerpos anti-BzdR con extractos crudos de Azoarcus sp. CIB crecido en diferentes fuentes de carbono, benzoato, succinato, piruvato y combinaciones de estos, donde se pusieron de manifiesto unos niveles de la proteína BzdR muy similares en todos los casos (Figura 23B). Atendiendo a estos resultados, todo parece indicar que el promotor PR no se encuentra sujeto a ningún tipo de regulación mediada por oxígeno ni por la proteína AcpR. 22..44 PPaappeell ddee ffuueenntteess ddee ccaarrbboonnoo aaddiicciioonnaalleess eenn llaa eexxpprreessiióónn ddeell ggeenn bbzzddRR.. Con el fin de estudiar la posible regulación del promotor PR mediada por otras fuentes de carbono, se midió su actividad en la cepa Azoarcus sp. CIB(pBBR5PR) crecida en diversas condiciones. La actividad del promotor PR observada cuando la cepa Figura 23. (A) Expresión del promotor PR en diversas condiciones. Actividad β-galactosidasa de la fusión PR::lacZ en las cepas Azoarcus sp. CIB (barras blancas) o Azoarcus sp. CIBdacpR (barra rayada) crecidas aeróbicamente (fondo azul) o anaeróbicamente (fondo rosa) hasta la mitad de la fase exponencial en medio MC y utilizando como fuente de carbono benzoato 3 mM (Bz) o succinato 7.5 mM (Sc). Las barras de error indican las correspondientes desviaciones estándar (n = 3). (B) Ensayo de Western-blotting con anticuerpos anti-BzdR. La cepa Azoarcus sp. CIB fue crecida anaeróbicamente en las fuentes de carbono indicadas en la figura: benzoato (Bz), succinato (Sc), piruvato (Pyr), benzoato + succinato (Bz+Sc) y benzoato más piruvato (Bz+Pyr). Se recogieron las células a una densidad óptica de 0.2, y se obtuvieron extractos celulares, tal y como se detalla en el apartado de Materiales y Métodos. El diagrama de barras indica la intensidad de cada una de las bandas obtenidas en el Western-blotting. 100 75 50 25 0 C on ce nt ra ci ón d e B zd R (U ni da de s ar bi tr ar ia s) Bz Sc Pyr Bz+Sc Bz+Pyr + O2 0 Bz Sc - O2 Sc 250 500 Bz Sc A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PR lacZ A B 100 75 50 25 0 C on ce nt ra ci ón d e B zd R (U ni da de s ar bi tr ar ia s) Bz Sc Pyr Bz+Sc Bz+Pyr + O2 0 Bz Sc - O2 Sc 250 500 Bz Sc A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PR lacZPR lacZ A B Resultados 103 fue crecida en benzoato o en benzoato más succinato fue muy similar, y casi dos veces superior a la actividad obtenida cuando la cepa fue crecida en succinato como única fuente de carbono. Como se puede apreciar en la Figura 18, la expresión del gen bzdR no disminuye cuando la cepa es crecida en benzoato y una fuente de carbono adicional como el succinato, al contrario de lo que sucedía con la expresión de los genes bzd dependientes del promotor PN, cuya expresión se veía significativamente reducida cuando las células crecían en benzoato más succinato (López Barragán et al., 2004a). Con el fin de confirmar este resultado y descartar que la actividad del promotor PR no era debida a algún tipo de regulación post-transcripcional del gen lacZ, se llevó a cabo un ensayo de RT-PCR en tiempo real para poder controlar directamente los niveles transcripcionales del promotor PR. Para ello, se aisló ARNm de la cepa Azoarcus sp. CIB crecida en succinato, benzoato o succinato más benzoato. Como se observa en la Figura 24, los datos obtenidos mediante RT-PCR confirmaron los resultados obtenidos previamente mediante ensayos in vivo, lo que indica claramente que la expresión del gen bzdR no está sujeta a represión catabólica mediada por un ácido orgánico como el succinato. Figura 24. Actividad del promotor PR medida por RT-PCR en tiempo real. El ensayo de RT-PCR en tiempo real fue llevado a cabo tal y como se detalla en la sección de Materiales y Métodos. Las diferencias observadas en los niveles obtenidos del tránscrito de PR se indican como un porcentaje del valor obtenido en las células crecidas en benzoato más succinato (Bz+Sc). Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. 0 25 50 75 100 Bz Sc Bz+Sc Tr an sc rip ci ón d e P R (U ni da de s ar bi tr ar ia s) 0 25 50 75 100 Bz Sc Bz+Sc Tr an sc rip ci ón d e P R (U ni da de s ar bi tr ar ia s) Resultados 104 OObbjjeettiivvoo 33.. EEssttuuddiioo ffuunncciioonnaall yy eessttrruuccttuurraall ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. La proteína BzdR constituye el primer represor transcripcional descrito entre los reguladores transcripcionales de rutas de degradación anaeróbica de compuestos aromáticos, cuyo inductor es un derivado CoA aromático, el benzoil-CoA, y representa el prototipo de una nueva subfamilia de reguladores transcripcionales en procariotas que no se ha estudiado hasta la fecha (Barragán et al., 2005). Con el fin de profundizar en el estudio de las relaciones estructura/función del nuevo regulador BzdR, se llevaron a cabo una serie de abordajes experimentales que se exponen a continuación. 33..11 EEssttuuddiiooss ssoobbrree llaa eessttrruuccttuurraa ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. Como se ha indicado en el apartado 3.1.2 de Introducción, la proteína BzdR posee una arquitectura modular consistente en un dominio N-terminal (NBzdR) probablemente implicado en la unión a ADN y un dominio C-terminal (CBzdR) que podría mediar la interacción con la molécula efectora, benzoil-CoA. La significativa similitud de secuencia entre el dominio NBzdR y la proteína reguladora SinR de Bacillus subtilis (34%), y entre el dominio CBzdR y la siquimato quinasa I de E. coli (23%), respectivamente, permitió proponer un modelo de la estructura tridimensional de BzdR (Barragán et al., 2005). Con el fin de confirmar experimentalmente el modelo propuesto, se llevaron a cabo distintos estudios estructurales de la proteína BzdR. 33..11..11 HHiippeerrpprroodduucccciióónn ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. Para determinar la estructura tridimensional de la proteína BzdR mediante cristalización y difracción de rayos X, se estableció una colaboración con el Dr. Mancheño, del Instituto de Química-Física “Rocasolano” (CSIC). Para ello, se procedió a la hiperproducción de la proteína His6-BzdR en la cepa E. coli M15 pREP4 (Tabla 4) y a su purificación mediante cromatografía de afinidad en columnas de Ni-NTA, tal y como se detalla en el apartado 5.4 de Materiales y Métodos. De esta manera, se logró obtener proteína His6-BzdR purificada a concentraciones de 5-11 mg/ml. Sin embargo, estas muestras de proteína eran obtenidas tras la elución de la columna cromatográfica con imidazol 1 M, por lo cual fue necesario dializar las muestras para eliminar el exceso de imidazol y reducir la concentración salina, condición indispensable para llevar a cabo el posterior proceso de cristalización. Aunque se probaron hasta 20 tampones de diálisis Resultados 105 diferentes y variaciones en el protocolo de diálisis, retirando el imidazol de forma progresiva en 10 pases sucesivos desde 1 M hasta 10 mM, en todos los casos, cuando la concentración de imidazol descendía de 300 mM, se producía la precipitación de la proteína His6-BzdR. Con el fin de descartar que la tendencia a precipitar de la proteína His6-BzdR fuera debida a los 6 residuos de histidina fusionados en su extremo N-terminal, se clonó el gen bzdR en el plásmido pET29-BzdR (Tabla 5), bajo el control del promotor T7 y se hiperexpresó en la cepa E. coli BL21. Si bien la producción de BzdR fue notable en los extractos celulares, la proteína mostró ser aún más insoluble que la variante His6-BzdR, ya que prácticamente toda la proteína estaba precipitada en la fracción insoluble (datos no mostrados). 33..11..22 DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee llaa eessttrruuccttuurraa nnaattiivvaa ddee BBzzddRR mmeeddiiaannttee mmiiccrroossccooppííaa eelleeccttrróónniiccaa.. Con objeto de obtener información acerca de la estructura nativa de BzdR, se procedió a su observación en el microscopio electrónico (ME). Como se puede apreciar en la Figura 25, la proteína BzdR pudo ser claramente detectada, llegando a obtenerse de las micrografías 5.741 imágenes de moléculas individuales, que fueron analizadas tal y como se detalla en el apartado 7.7 de Materiales y Métodos. Un primer análisis bidimensional de las imágenes mostró una posible simetría bilateral. Posteriormente, se llevó a cabo un análisis tridimensional mediante métodos de refinamiento angular sin asumir previamente ninguna simetría. La estructura así obtenida reveló que la proteína BzdR estaba compuesta por dos dominios, uno mayor que otro, y presentaba una aparente simetría bilateral, a pesar de no haber asumido esta condición durante el método de refinamiento. En base a estos datos, se llevó a cabo un nuevo refinamiento de la estructura, pero en este caso imponiendo la condición de simetría bilateral, obteniendo así una estructura con una resolución de 25 Å. Además, el cálculo de la masa molecular realizado durante el proceso, asumiendo como densidad el valor medio de las proteínas (1.35 g/ml), indicó que la estructura de BzdR era compatible con un oligómero, muy probablemente con un dímero. De esta forma, se pudo reconstruir una estructura dimérica para BzdR, donde cada monómero está constituido por un dominio grande y un dominio pequeño (Figura 25F). Mientras que el dominio grande es probable que se corresponda con el dominio C-terminal de BzdR, Resultados 106 debido a su mayor volumen, el dominio pequeño es probable que se corresponda con el dominio N-terminal de BzdR. 33..22 LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR eessttáá ccoonnssttiittuuiiddaa ppoorr ddooss ddoommiinniiooss ffuunncciioonnaalleess.. Con el fin de confirmar experimentalmente la estructura modular propuesta para la proteína BzdR, se procedió a la clonación, hiperexpresión y purificación por separado de los dominios NBzdR, CBzdR y del dominio NBzdR con la región linker, denominado NBzdRL. Para ello, dichos motivos se expresaron como proteínas de fusión con un tag de 6 histidinas en su extremo N-terminal, utilizando el vector de Figura 25. Estructura tridimensional de la proteína BzdR obtenida por microscopía electrónica. (A) Micrografía donde se pueden apreciar dímeros de la proteína BzdR. (B) Galería de micrografías con 12 de las 5.741 imágenes recogidas de la proteína BzdR. (C) Imágenes obtenidas tras realizar una media libre de patrón entre aquellas imágenes con formas semejantes, sin asumir ningún tipo de simetría en la molécula. (D) Imágenes obtenidas tras realizar una media utilizando un método de refinamiento angular, sin asumir ningún tipo de simetría. En la fila superior se muestran diversas proyecciones de la proteína y en la fila inferior se muestran las medias obtenidas para cada una de las proyecciones superiores (E) Estructura tridimensional frontal y lateral de un dímero de BzdR obtenida sin asumir previamente ningún tipo de simetría en la reconstrucción. (F) Estructura tridimensional de un dímero de BzdR obtenida tras imponer simetría bilateral en el proceso de reconstrucción. La resolución obtenida fue de 25 Å. Se pueden observar 4 imágenes: frontal, lateral, superior e inferior (de izquierda a derecha y de arriba a abajo). El dominio de mayor tamaño (presunto CBzdR) se muestra en color morado, mientras que el de menor tamaño (presunto NBzdR) aparece en color amarillo. 30 Å 50 Å 50 Å FrontalFrontal FrontalFrontal SuperiorSuperior InferiorInferior LateralLateral LateralLateral 5 nm Resultados 107 hiperexpresión pQE32, de forma similar al método utilizado con la proteína BzdR. Las proteínas fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad en columnas de Ni- NTA, tal y como se describe en el apartado 5.4 de Materiales y Métodos. De este modo, se obtuvieron estas tres proteínas: His6-NBzdR (residuos 1-90), His6-NBzdRL (residuos 1-130) e His6-CBzdR (residuos 131-298). 1 180 393 894 LBzdR CBzdRNBzdR bzdRbzdR His6-NBzdR His6-NBzdRL His6-CBzdRHis6-BzdR pQE32-BzdR pQE32-NBzdR pQE32-NBzdRL pQE32-CBzdR AmplificaciAmplificacióón por PCR y clonacin por PCR y clonacióón en n en plpláásmidosmido de de hiperexpresihiperexpresióónn pQE32pQE32 Figura 26. Esquema del gen bzdR y sus dominios expresados y purificados. Los dominios NBzdR, NBzdRL y CBzdR son indicados con los colores naranja, naranja + verde y azul, respectivamente. Todos ellos fueron clonados en el plásmido de hiperexpresión pQE32, bajo el control del promotor T5 (flecha violeta) y con un tag de 6 histidinas (rectángulo rojo) al inicio del extremo N-terminal. Resultados 108 33..22..11 EEssttuuddiioo ddeell ddoommiinniioo NNBBzzddRR.. 3.2.1.1 El dominio NBzdR se une y reprime al promotor PN. Para verificar si la proteína NBzdR es un verdadero dominio funcional y mantiene su capacidad de reprimir la transcripción del promotor PN se realizaron abordajes in vitro e in vivo de interacción con PN utilizando las dos variantes representadas en la Figura 26, NBzdR y NBzdRL. La utilización de estas dos variantes tuvo como objetivo determinar la influencia del linker tanto en el proceso de dimerización como en la interacción con el ADN. Los ensayos in vitro de retardo en gel demostraron la capacidad de ambas proteínas NBzdR y NBzdRL de unirse al promotor PN (Figura 27A) Sin embargo, también se pueden apreciar ciertas diferencias en relación a la afinidad por la sonda PN, ya que con la proteína NBzdR es necesario alcanzar una concentración de 100 nM para retardar totalmente la sonda PN, mientras que con NBzdRL o con BzdR se observa un retardo casi total de la sonda a una concentración de 50 nM. Otra notable diferencia entre la proteína nativa BzdR y el dominio NBzdR es el número de complejos proteína-ADN formados. Mientras que la proteína BzdR da lugar a un único complejo, tanto NBzdR como NBzdRL dan lugar a al menos tres complejos, lo que podría reflejar diferencias en la cooperatividad de la unión de las proteínas a las tres cajas operadoras del promotor PN. Con el fin de profundizar en el estudio de la unión de NBzdR al promotor PN se llevaron a cabo ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I. Tal y como se puede observar en la Figura 27B, la proteína NBzdR protege las mismas tres cajas operadoras descritas para BzdR, si bien la región en la caja operadora I no es protegida por NBzdR a las concentraciones de proteína usadas en el ensayo. Este resultado no puede ser explicado por la diferencia volumétrica entre BzdR y NBzdR, ya que la proteína NBzdRL, de volumen similar a NBzdR, fue capaz de proteger totalmente la caja operadora I, al igual que sucede con BzdR, con lo que la causa de la menor protección del operador I de PN por NBzdR parece deberse a la ausencia de linker, el cual podría estar implicado en la correcta formación de los dímeros de proteína, lo que incrementaría la afinidad por el ADN y permitiría una protección más extensa de las cajas operadoras. Resultados 109 Los ensayos de expresión in vivo demostraron la capacidad de ambas proteínas NBzdR y NBzdRL de unirse y reprimir la actividad del promotor PN con una efectividad similar a la obtenida con BzdR. Dichos ensayos se llevaron a Figura 27. Unión de las proteínas purificadas NBzdR, NBzdRL y BzdR al promotor PN. (A) Unión de las proteínas al promotor PN mediante ensayos de retardo en gel. En todos los casos, en la calle 1 se cargó sonda PN y en las calles 2-8 se añadieron concentraciones crecientes 1, 2, 5, 10, 25, 50 y 100 nM, respectivamente, de las proteínas purificadas. PN representa la sonda libre y C representa el complejo, o complejos, formados entre la proteína y el promotor PN. (B) Ensayo de protección frente a la digestión por DNasa I. En la calle 0 se cargó sonda PN en ausencia de proteínas. En las calles 1-3, 4-6 y 7-9 se añadieron 50, 100 y 200 nM de las proteínas NBzdR, NBzdRL y BzdR purificadas, respectivamente. Calle AG: reacción de secuenciación del promotor PN mediante el método de Maxam y Gilbert. A la izquierda se indican con corchetes las tres regiones operadoras (I, II y III) protegidas por las proteínas y a la derecha las cajas -35, -10 y el +1 del promotor PN. BzdR 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 NBzdRL NBzdR PN PN PN C C C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 AG BzdRNBzdRLNBzdR -35 -10 +1 A B I II III Resultados 110 cabo midiendo la actividad β-galactosidasa de la fusión traduccional PN::lacZ en E. coli (Figura 28A). Los ensayos de transcripción in vitro también apoyaron estos resultados, como se puede observar en la Figura 28B, donde NBzdRL muestra un nivel de represión del promotor PN semejante al obtenido con la proteína nativa BzdR. Además, se pudo demostrar que únicamente la proteína BzdR presenta la capacidad de responder al inductor, el benzoil-CoA, al contrario de lo que sucede con NBzdRL, que mantiene reprimido el promotor PN constitutivamente al no poseer el dominio efector CBzdR que une benzoil-CoA. Con la proteína NBzdR se obtuvieron exactamente los mismos resultados que con NBzdRL, tal y como se puede apreciar en la Figura 28B. Estos datos demuestran la funcionalidad del dominio NBzdR y su independencia respecto del dominio CBzdR, siendo capaz de unirse eficazmente al promotor PN y reprimir constitutivamente su actividad. Figura 28. Represión ejercida por las proteínas NBzdR, NBzdRL y BzdR sobre el promotor PN. (A) Ensayos in vivo. La cepa E. coli MC4100-T1, que incorpora en cromosoma la fusión PN::lacZ (Tabla 4), fue transformada con los plásmidos pCK01-BzdR, pCK01-NBzdR, pCK01-NBzdRL, que expresan las proteínas His6-BzdR, His6-NBzdR e His6-NBzdRL, respectivamente (Tabla 5). Todas ellas fueron cultivadas en condiciones anaeróbicas y en medio LB a 30ºC, hasta que alcanzaron una A600 de 0.5. Posteriormente, se ensayó su actividad β-galactosidasa, tal y como se detalla en el apartado 6.1.1 de Materiales y Métodos. Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. (B) Ensayos de transcripción in vitro. Reacciones de transcripción in vitro de múltiples rondas utilizando como molde el plásmido pJCD-PN (Tabla 5). Todas las reacciones fueron llevadas a cabo en presencia de RNAP de E. coli 50 nM y proteína purificada His6-Fnr* 20 nM. Además, se añadió proteína purificada His6-BzdR, His6-NBzdR ó His6-NBzdRL 40 nM, en ausencia o presencia de benzoil- CoA 2 mM, según se indica. 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 4000 3000 2000 1000 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PN BzdR PN NBzdR PN PN NBzdRL PN lacZPN lacZ 0 50 100 – BzdR Tr an sc rip ci ón in v itr o (U ni da de s ar bi tr ar ia s) NBzdR 75 25 NBzdRL NBzdRL + Benzoil+ Benzoil--CoACoA A B NBzdR BzdR Resultados 111 3.2.1.2 Estado de oligomerización de BzdR y del dominio NBzdR. Con objeto de estudiar el estado de oligomerización de las proteínas BzdR, NBzdR y NBzdRL, se llevaron a cabo, como primera aproximación, ensayos de crosslinking, incubando cada una de las proteínas purificadas con un agente de entrecruzamiento, el glutaraldehído. Como se muestra en la Figura 29, en ausencia de glutaraldehído las tres proteínas mostraron un tamaño compatible con su forma monomérica: BzdR = 34.9 kDa, NBzdR = 11.5 kDa, NBzdRL = 16.3 kDa, en SDS-PAGE. Sin embargo, cuando las proteínas son tratadas previamente con glutaraldehído se puede apreciar en el gel SDS-PAGE una banda adicional que coincide con el tamaño esperado para la forma dimérica de cada una de ellas. Cabe destacar que las proteínas BzdR y NBzdRL eran capaces de dimerizar a concentraciones de glutaraldehído inferiores a las necesarias para obtener la misma proporción de dímero con la proteína NBzdR, lo que sugiere que ésta última presenta una menor capacidad de dimerización. Con el fin de confirmar de una manera más precisa el estado de oligomerización de la proteína BzdR y su dominio N-terminal, se realizaron Figura 29. Ensayo de crosslinking con las proteínas purificadas BzdR, NBzdR y NBzdRL. El ensayo fue realizado tal y como se detalla en el apartado 5.5 Materiales y Métodos, utilizando 5 μM de las proteínas purificadas His6-BzdR, His6-NBzdR e His6-NBzdRL. Las calles 0, 1, 2 y 3 se corresponden con muestras en presencia de glutaraldehído 0, 0.1, 0.2 y 0.5 μM, respectivamente. En el gel se indican las masas moleculares de las formas monoméricas y diméricas de cada proteína. En la calle M se cargó un marcador de pesos moleculares, cuyos valores se indican a la izquierda. Las muestras se cargaron en geles SDS-PAGE al 15% (panel izquierdo) y al 12.5% (panel derecho). 321032103210 BzdR M NBzdRLNBzdR M 16 kDa 11 kDa 34 kDa 68 kDa 32 kDa 200 116 97 66 45 31 21 14 200 116 97 66 45 31 21 14 22 kDa kDa kDa Resultados 112 ensayos de velocidad y equilibrio de sedimentación mediante ultracentrifugación analítica, tal y como se detalla en el apartado 7.5 de Materiales y Métodos. Los resultados obtenidos (Tabla 8) mostraron especies compatibles con un dímero tanto en el caso de la proteína BzdR, como en el caso de NBzdR y NBzdRL (Figura 30). En los tres casos, los dímeros fueron homogéneos y presentaron una forma esencialmente globular, con unos índices de fricción f/f0 de 1.4 para BzdR, 1.5 para NBzdR y 1.6 para NBzdRL en las condiciones experimentales empleadas (véase el apartado 7.5 de Materiales y Métodos). Todos estos datos sugieren que tanto la proteína BzdR como el dominio NBzdR y la proteína NBzdRL, son dímeros en solución. Tabla 8. Datos obtenidos en los experimentos de ultracentrifugación analítica. Proteína Mm teórica (Da) f/f0 Coeficiente de sedimentación (s) Estado de asociación compatible BzdR 34.895 1.4 4 ± 0.2 Dímero NBzdR 11.510 1.5 1.8 ± 0.2 Dímero NBzdRL 16.394 1.6 2.3 ± 0.2 Dímero CBzdR 20.057 1.5 1.8 ± 0.3 Monómero Figura 30. Ensayo de velocidad de sedimentación mediante ultracentrifugación analítica de las proteínas purificadas BzdR, NBzdR, NBzdRL y CBzdR. Se representa el valor c(s), proporcional a la medida realizada por el espectrofotómetro a 280 nm, frente al coeficiente de sedimentación. El valor del coeficiente de sedimentación obtenido para las proteínas purificadas His6-BzdR, His6-NBzdR, His6-NBzdRL e His6-CBzdR se ha representado mediante líneas de rayas y puntos, continua, de rayas y de puntos, respectivamente. 1 0.75 0.5 0.25 0 c (s ) 1.25 1.5 10 2 3 4 5 Coeficiente de sedimentación BzdRBzdR NBzdRNBzdR NBzdRLNBzdRL CBzdRCBzdR Resultados 113 33..22..22 EEssttuuddiioo ddeell ddoommiinniioo CCBBzzddRR.. Como se ha descrito en el apartado 3.1.2 de Introducción, el dominio CBzdR se ha supuesto implicado en la interacción con la molécula inductora benzoil-CoA (Barragán et al., 2005). Este dominio presenta una significativa similitud en su secuencia de aminoácidos con enzimas que presentan actividad siquimato quinasa. Con el fin de obtener información acerca del contenido en estructura secundaria del dominio CBzdR, se llevaron a cabo medidas de dicroísmo circular. Para ello, se utilizó la proteína His6-CBzdR purificada, tal y como se describe en el apartado 5.4 de Materiales y Métodos. El análisis fue realizado en el intervalo de longitudes de onda entre 200-250 nm, que permite estimar el contenido de estructura secundaria de la proteína. El análisis de los espectros mediante el conjunto de programas CDPro indica que la proteína His6- CBzdR posee un 40% de estructura en α-hélice, un 13.5% en lámina β y un 46.5% en estructura no ordenada o irregular (Figura 31). Además, se realizaron ensayos de velocidad y equilibrio de sedimentación mediante ultracentrifugación analítica con el dominio CBzdR, tal y como se detalla en el apartado 7.5 de Materiales y Métodos. Los resultados obtenidos mostraron una especie única compatible con un monómero (Figura 30 y Tabla 8) [θ ] M R W (e lip tic id ad m ol ar p or re si du o ) 0 Longitud de onda (nm) -5000 -15000 -10000 200 210 220 230 240 250 [θ ] M R W (e lip tic id ad m ol ar p or re si du o ) 0 Longitud de onda (nm) -5000 -15000 -10000 200 210 220 230 240 250 Figura 31. Espectro de dicroísmo circular en el UV lejano de la proteína His6-CBzdR. En la gráfica se representa la elipticidad molar promedio por residuo (MRW) de la proteína His6-CBzdR en la región del UV lejano (λ<250 nm). La muestra fue preparada en tampón Tris-HCl 20 mM pH 8.0 y KCl 100 mM, en el cual la proteína se encontraba a una concentración de 10 μM. El espectro de dicroísmo circular se obtuvo tal y como se detalla en el apartado 5.8 de Materiales y Métodos. Resultados 114 Con el fin de establecer si CBzdR presenta actividad siquimato quinasa, se ensayó dicha actividad con la proteína CBzdR y con la proteína nativa BzdR purificadas, tal y como se detalla en el apartado 6.1.2 de Materiales y Métodos. En estos ensayos se utilizó la proteína siquimato quinasa I (SKI) purificada de E. coli, His6-SKI, como control positivo (ver detalles sobre su hiperexpresión y purificación en el apartado 5.4 de Materiales y Métodos). Como se puede apreciar en la Figura 32, mientras que la proteína SKI mostró unos valores de actividad enzimática significativos, ni la proteína CBzdR, ni la proteína nativa BzdR mostraron actividad siquimato quinasa. Por otro lado, con el fin de demostrar la interacción de la proteína CBzdR con el benzoil-CoA, el inductor de la ruta de degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB (Barragán et al., 2005), se llevaron a cabo ensayos de espectroscopía de fluorescencia en la región UV-visible del espectro. Para ello, se realizaron espectros de emisión de fluorescencia de CBzdR en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de varios ligandos, excitando las muestras a una longitud de onda de 275 nm (a la cual absorben tanto los triptófanos como las tirosinas de las proteínas). Figura 32. Actividad siquimato quinasa de las proteínas purificadas SKI, CBzdR y BzdR. El ensayo de actividad siquimato quinasa se llevó a cabo tal y como se detalla en el apartado 6.1.2 de Materiales y Métodos. Se utilizaron 12 medidas para la obtención de la curva logarítmica. En el interior de la gráfica se muestra el valor de Km para la proteína His6-SKI. Cada uno de los 12 puntos utilizados fue el resultado de realizar la media de tres medidas independientes, cuya desviación estándar fue menor del 10%. 100 75 50 25 0 A ct iv id ad (μ m ol es · m in -1 ·m g pr ot eí na -1 ) 125 150 175 0.50 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 [Siquimato] (mM) BzdR SKI → Km = 0.22 mM CBzdR Resultados 115 Figura 33. Interacción de la proteína CBzdR con diversos ligandos. Ensayo de espectroscopía de fluorescencia de la proteína His6-CBzdR en ausencia y presencia de diferentes concentraciones de benzoil- CoA, fenilacetil-CoA, CoA, ATP, benzoato y succinato. En todos los casos se parte de una concentración fija de proteína (5 μM) y se va incrementando la cantidad de ligando desde 0 hasta una concentración de 30 μM. En el interior de cada una de las gráficas ha sido incluido el valor obtenido para la constante de disociación (Kd), excepto en el caso del benzoato y del succinato, que no poseían afinidad. En la gráfica de interacción entre His6-CBzdR y benzoil-CoA también se ha incluido una curva de unión que representa la variación de la fluorescencia (Fo-Fi, donde Fo es la fluorescencia inicial y Fi es la fluorescencia a una determinada concentración de ligando) en relación a la concentración de ligando libre en el medio, cuya curva representa el buen ajuste de los resultados experimentales al modelo de unión considerado. 280 300 320 340 360 380 400 0,0 0,4 0,8 1,2 Longitud de onda (nm) In te ns id ad d e flu or es ce nc ia CBzdR + CoA Kd = 456 μM CBzdR + Fenilacetil-CoA Longitud de onda (nm) In te ns id ad d e flu or es ce nc ia 280 300 320 340 360 380 400 0,0 0,4 0,8 1,2 Kd = 441 μM CBzdR + ATP Longitud de onda (nm) In te ns id ad d e flu or es ce nc ia 0,0 0,4 0,8 1,2 Kd = 520 μM 280 300 320 340 360 380 400 CBzdR + Benzoil-CoA Longitud de onda (nm) In te ns id ad d e flu or es ce nc ia 280 300 320 340 360 380 400 0,4 0,8 1,2 40 80 1200 0.15 0.30 [Bz-CoA] libre (mM) Kd = 203 μM 0,0 Fo -F i 300 320 340 360 380 400 Longitud de onda (nm) In te ns id ad d e flu or es ce nc ia CBzdR + Benzoato 280 0,0 0,4 0,8 1,2 280 CBzdR + Succinato In te ns id ad d e flu or es ce nc ia Longitud de onda (nm) 300 320 340 360 380 400 0,0 0,4 0,8 1,2 Resultados 116 Como se observa en la Figura 33, el espectro de emisión obtenido para la proteína CBzdR se vio reducido unas 5 veces cuando las medidas se realizaron en presencia de benzoil-CoA, utilizando una relación de [proteína]:[ligando] 1:30. Además, la reducción de fluorescencia iba acompañada de un desplazamiento del máximo de emisión, que pasa de 312 nm en ausencia de ligando, a 322 nm en presencia de benzoil-CoA. Cuando se emplearon otros ligandos tales como fenilacetil-CoA, CoA, ATP, benzoato y succinato, sólo se obtuvieron diferencias en el espectro de emisión en el caso del fenilacetil-CoA, CoA y ATP, y con todos ellos, la intensidad de fluorescencia se vio reducida a la mitad con respecto al espectro de la proteína en ausencia de ligandos (Figura 33). Además, a diferencia de lo observado previamente con benzoil-CoA, en este caso no se pudo apreciar desplazamiento alguno en la longitud de onda del máximo de emisión. El ajuste de estos resultados a un modelo que supone la existencia de un único sitio de unión del ligando en la proteína, permitió calcular las constantes de disociación (Kd), para cada uno de los ligandos (Figura 33). Estos datos sugerían la existencia de una variación notable en el entorno del triptófano 99 (el único existente en CBzdR), como resultado del cambio conformacional inducido por la interacción del benzoil-CoA con el dominio C-terminal de BzdR. No obstante, dado que los ligandos fenilacetil-CoA, CoA y ATP también interaccionaron de forma específica con CBzdR y el benzoato no es capaz de inducir ningún tipo de cambio conformacional, se puede concluir que CBzdR reconoce principalmente el CoA, concretamente el grupo ADP de éste último, en la molécula de benzoil-CoA. Con el fin de confirmar el cambio conformacional sugerido en los experimentos anteriores, se realizaron ensayos de proteolisis con tripsina (ver apartado 5.6 de Materiales y Métodos). Como se puede apreciar en la Figura 34, CBzdR mostró ser más sensible a la digestión por tripsina en ausencia de benzoil-CoA que en presencia de este inductor, lo que sugiere un cambio conformacional en CBzdR tras su interacción con el benzoil-CoA, como consecuencia del cual los aminoácidos reconocidos por la tripsina, principalmente residuos de lisina y arginina, han adquirido una nueva disposición espacial en la que son menos accesibles a la enzima proteolítica. Todos estos resultados tomados en conjunto demostraban que el dominio CBzdR sufre un cambio conformacional como consecuencia de la unión de la molécula inductora benzoil-CoA. Resultados 117 33..22..33 EEssttuuddiioo ddeell lliinnkkeerr ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR ((LLBBzzddRR)).. 3.2.3.1 Análisis estructural de la región LBzdR. Con el fin de determinar el papel del linker en la conformación nativa y en la función de la proteína BzdR se analizó, inicialmente, la secuencia de aminoácidos y la posible estructura de esta región (LBzdR). La secuencia de aminoácidos de LBzdR fue comparada con las estructuras tridimensionales depositadas en la base de datos PDB y se detectó una región de la formato deshidrogenasa dependiente de NAD+ de Pseudomonas sp. 101 (PDB: 2GUG), que presentaba una identidad significativa (42%) con parte de la secuencia de LBzdR (Lamzin et al., 1992; Tishkov et al., 1991). Esta región de la formato deshidrogenasa, denominada αA, permitió modelar la estructura tridimensional de la región central del linker de la proteína BzdR. Dado que αA interviene en la dimerización de la formato deshidrogenasa, se propuso una función similar para LBzdR y se estableció un modelo del presunto dímero LBzdR con dos hélices α paralelas (Figura 35). Después de un minucioso análisis de este modelo, se propusieron dos aminoácidos, Glu111 y Arg114, que podían estar formando parte de un par de puentes salinos esenciales para la dimerización. Figura 34. Ensayo de digestión con tripsina de la proteína purificada CBzdR. El ensayo fue realizado con CBzdR 10 μM y tripsina 0.02 mg/ml, tal y como se detalla en el apartado 5.6 de Materiales y Métodos. Calles 0: muestras incubadas a 37ºC (condiciones óptimas de la tripsina) durante 2, 5, 10, 20, 30 y 60 minutos, respectivamente. Las reacciones se realizaron en ausencia (panel A) o presencia (panel B) de benzoil-CoA 2 mM. Calles M: marcadores de pesos moleculares, indicados a la izquierda en kDa. M 0 2 5 10 20 30 60 M 0 2 5 10 20 30 60 200 116 97 66 45 31 21 14 TiempoTiempo kDa A B Resultados 118 En base a esta hipótesis, se diseñaron mediante mutagénesis dirigida las proteínas mutantes BzdR3 y BzdR4, que poseen las sustituciones Glu-111-Arg y Arg-114-Glu (ver apartado 3.6 de Materiales y Métodos), las cuales deberían ocasionar la ruptura de los supuestos puentes salinos en el dímero LBzdR de las proteínas mutantes. Por otro lado, se construyó el doble mutante BzdR5 (Glu- 111-Arg y Arg-114-Glu) que, teóricamente, debería haber reconstituido los puentes salinos en el dímero LBzdR, aunque en orientación invertida respecto de la proteína nativa BzdR. La hiperproducción y purificación de las proteínas mutantes de realizó de un modo similar a como se ha descrito anteriormente para la proteína BzdR (ver apartado 5.4 de Materiales y Métodos) y se observó que éstos presentaban una solubilidad similar a la de la proteína nativa. Cuando se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel con el promotor PN, la proteína BzdR4 mostró una significativa reducción en su capacidad de unión al promotor PN (Figura 36). Leu100Leu100 Tyr106Tyr106 Leu107Leu107 His110His110 Glu111Glu111 Arg114Arg114 Leu100Leu100 Tyr106Tyr106 Leu107Leu107 His110His110 Glu111Glu111 Arg114Arg114 LBzdRLBzdR FDHFDH A B 5 LTLLIQYLSRFPPKTHEWARR 25 159 LSLVRNYLP-----SHEWARK 174 *:* ** :*****: Figura 35. (A) Alineamiento de la secuencia del linker de BzdR (LBzdR) con la formato deshidrogenasa de Pseudomonas sp. 101 (FDH). Los aminoácidos han sido representados mediante el código de una letra y los cuatro colores en que se muestran representan el grupo de aminoácidos al que pertenecen: rojo = apolares; verde = polares sin carga; azul = ácidos; rosa = básicos. En la zona inferior del alineamiento, un asterisco (*) significa que los residuos de esa posición son idénticos en todas las secuencias; dos puntos (:) significan que existen sustituciones conservadas, acordes con el código de colores mencionado anteriormente. (B) Modelo de interacción entre las regiones linker de dos monómeros de BzdR. Modelo de estructura secundaria del linker de BzdR donde se muestran los aminoácidos enfrentados entre las dos hélices α. Resultados 119 Para confirmar el estado oligomérico de las proteínas BzdR3, BzdR4 y BzdR5, se realizaron ensayos de velocidad de sedimentación mediante ultracentrifugación analítica, tal y como se describe en el apartado 7.5 de Materiales y Métodos. Como se muestra en la Tabla 9, el mutante BzdR4 mostró varios estados oligoméricos, encontrándose el 52% de la proteína en estado de monómero, una tercera parte en estado de dímero (37%) y un pequeño porcentaje (11%) como multímeros. Además, la proteína BzdR5 tenía significativamente reducida su capacidad de unión a PN con respecto a la mostrada por la proteína nativa BzdR (Figura 36). Tabla 9. Datos obtenidos en los experimentos de ultracentrifugación analítica. Proteína Mm teórica (Da) f/f0 Coeficiente de sedimentación (s) Estado de asociación compatible BzdR 34895 1.4 4 ± 0.21 Dímero = 100% BzdR3 34922 1.6 3.9 ± 0.15 --- Dímero = 91% Otros = 9% BzdR4 34868 2.3 3.5 ± 0.23 2.2 ± 0.18 --- Dímero = 37% Monómero = 52% Otros = 11% BzdR5 34895 2.3 2.3 ± 0.32 --- Monómero = 88% Otros = 12% Todos estos resultados sugerían que si bien la sustitución del residuo Arg114 por Glu impedía la dimerización de BzdR, este estado oligomérico no dependía de la formación de puentes salinos entre los residuos Arg114 y Glu111 Figura 36. Ensayos in vitro de unión de las proteínas mutantes BzdR3, BzdR4 y BzdR5 al promotor PN. Los 3 ensayos de retardo en gel fueron llevados a cabo en las mismas condiciones. Calles 1: sonda PN. En las calles 2-5 se añadieron concentraciones crecientes de las proteínas purificadas His6- BzdR3, His6-BzdR4 e His6-BzdR5 (25, 50 100 y 200 nM, respectivamente), tal y como se indica en la figura. BzdR3 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 BzdR4 BzdR5BzdR3 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 BzdR4 BzdR5 Resultados 120 de la región del linker. Además, los resultados obtenidos revelaban que la proteína BzdR no es capaz de interaccionar eficazmente con el promotor PN en estado monomérico, requiriéndose un dímero del regulador para la unión al ADN diana. 3.2.3.2 Análisis funcional de la región LBzdR. Con el fin de confirmar si la región LBzdR influye en la dimerización de la proteína BzdR y/o interviene en la transmisión de la señal entre los dominios NBzdR y CBzdR, se utilizó un abordaje genético de mono-híbrido desarrollado con el fin de caracterizar interacciones proteína-proteína en organismos procariotas (Di Lallo et al., 1999). Este sistema aprovecha la estructura y las propiedades de la proteína represora dimérica codificada por el gen cI del fago lambda (Figura 25B) (Di Lallo et al., 1999; Hu et al., 1990; Longo et al., 1995). El represor cI del fago lambda (λcI) presenta dos dominios, N-terminal (λNcI) y C-terminal, conectados por una secuencia linker (λLcI) de unos 40 residuos aproximadamente (Pabo et al., 1979). Aunque la región λNcI + λLcI (dominio NTDcI) es capaz de dimerizar débilmente en solución (Pabo et al., 1979), es el dominio C-terminal (CTDcI) el principal responsable del proceso de dimerización de la proteína reguladora, así como de la unión cooperativa de los dímeros de λcI a las regiones operadoras del promotor PR (Pabo & Lewis, 1982). Por ello, el dominio NTDcI es una útil herramienta para detectar dominios de dimerización heterólogos que al fusionarse con el primero, permiten al regulador quimérico resultante interaccionar con el promotor PR. El sistema genético desarrollado en esta tesis está basado en el plásmido que expresa el dominio NTDcI solo o fusionado a diversos dominios heterólogos, incluyendo el gen cat (Di Lallo et al., 1999) que codifica la enzima dimérica cloramfenicol acetiltransferasa tipo III de E. coli (control positivo de dimerización; Figura 37) (Leslie, 1990), y en el plásmido compatible pSJ6 que expresa la fusión PR::lacZ (Jaenecke et al., 1996), la cual permite monitorizar la capacidad de unión al ADN de los distintos reguladores quiméricos. Como se aprecia en la Figura 37B, cuando se expresa el dominio NTDcI, el promotor PR muestra unos niveles de expresión significativos (∼ 400 U. Miller), mientras que Resultados 121 cuando se expresa la quimera control NTD-Cat, la actividad β-galactosidasa se reduce en más de un orden magnitud. La quimera NTD-LBzdR, si bien mostró una actividad represora sobre el promotor PR ligeramente menor que la proteína NTDcI (Figura 37B), no redujo los niveles de actividad β-galactosidasa tan drásticamente como lo hacía la Figura 37. (A) Representación esquemática de las fusiones llevadas a cabo con el dominio NTD del represor λcI. Amarillo: dominio NTD del represor λcI (NTDcI). Verde: región linker LBzdR de la proteína BzdR (L). Rosa: cloranfenicol acetiltransferasa (Cat). Azul: dominio C-terminal de la proteína BzdR (CBzdR). (B) Actividad β-galactosidasa del ensayo de mono-híbrido con la fusión PR::lacZ. La cepa E. coli MV1190 pSJ6(PR::lacZ) fue transformada con los plásmidos pcI, pcI-cat, pcI-LBzdR, pcI-Qλ y pcI-Qλ2 que expresan las fusiones NTDcI, NTD-Cat, NTD-LBzdR, Qλ y Qλ2, respectivamente. Las distintas cepas se cultivaron en medio LB y se midió la actividad β-galactosidasa tal y como se detalla en el apartado 6.1.1 de Materiales y Métodos. Los datos mostrados son el resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes, y presentaron una desviación estándar menor del 10%. NTDcI NTD-Cat NTD-LBzdR Qλ Qλ2 λNcI λLcI λNcI λLcI λNcI λLcI L λNcI λLcI L λNcI λLcI Cat CBzdR CBzdR 500 300 200 100 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) NTDcI NTD-Cat NTD- LBzdR Qλ Qλ2 B A 400 PR (λ) lacZ PR (λ) lacZ Resultados 122 quimera control NTD-Cat, lo que parecía indicar que la capacidad de dimerización inducida por la región LBzdR era nula o, al menos, muy reducida. Asumiendo que el resultado observado podía haberse producido por un mal plegamiento del linker al quedar en el extremo de la proteína NTD-LBzdR, se construyó una nueva quimera (Qλ) donde se fusionó el dominio NTDcI a la región LBzdR y CBzdR. En este caso, la quimera Qλ mostró los mismos niveles de represión ejercidos por la quimera control NTD-Cat (Figura 37B), lo que indicaba que la quimera Qλ se encontraba en forma dimérica. Con el fin de determinar si el linker de BzdR era el responsable directo de la dimerización de la quimera Qλ, se diseñó una nueva quimera denominada Qλ2, que contiene el dominio CBzdR sin linker fusionado al dominio NTDcI. Como se aprecia en la Figura 37B, los niveles de represión causados por Qλ2 fueron similares a los niveles obtenidos con la quimera Qλ. En conclusión, todos estos datos sugerían que la región LBzdR no es imprescindible en la dimerización de las proteínas quiméricas y, por ende, en la dimerización de BzdR. Por otro lado, los resultados del experimento de mono-híbrido con la quimera Qλ2 revelaron que, si bien el dominio CBzdR aislado es un monómero homogéneo en solución, como se ha demostrado anteriormente (Tabla 8), dicho dominio CBzdR debe presentar motivos implicados en el proceso de dimerización suficientes para estabilizar el dímero de NTDcI. Una vez descartado un papel esencial del linker de BzdR en la dimerización del regulador, se exploró su posible función en la transmisión de información entre los dos dominios de la proteína BzdR en presencia del inductor benzoil-CoA. Con el fin de abordar esta cuestión, se construyeron las cepas E. coli MV1190 portadoras de los plásmidos pcI-Qλ (que expresa la proteína Qλ) ó pcI- Qλ2 (que expresa la proteína Qλ2), y los plásmidos compatibles pCK01-BzdA (que expresa la enzima benzoato-CoA ligasa, cuya actividad enzimática da lugar al inductor benzoil-CoA a partir de benzoato y CoA) y pSJ6 (que incluye la fusión PR::lacZ). Cuando estas células fueron cultivadas en presencia o en ausencia de benzoato se pudo observar que, si bien tanto Qλ como Qλ2 eran capaces de reprimir eficazmente la expresión de la fusión PR::lacZ en ausencia de benzoato, sólo la quimera Qλ permitía la actividad del promotor PR en presencia Resultados 123 de benzoato y, por tanto, cuando existía el inductor benzoil-CoA en la célula (Figura 38). Estos resultados revelaban que la quimera Qλ es capaz de reconocer eficazmente benzoil-CoA y transmitir el cambio conformacional sufrido por el dominio CBzdR al dominio NTDcI induciendo la desrepresión del promotor PR. Sin embargo, este fenómeno de desrepresión no se observa con la quimera Qλ2, lo que indica que en este caso no se produce de forma eficaz la transmisión de información desde el dominio CBzdR al NTDcI en presencia de benzoil-CoA. Todos estos datos tomados en conjunto sugieren que el papel del linker (LBzdR), si bien no parece ser fundamental en el proceso de dimerización de BzdR, es crucial en el proceso de transmisión de la información desde el dominio CbzdR al NBzdR, resultante del cambio conformacional sufrido por el dominio CBzdR al unirse al inductor benzoil-CoA. Figura 38. Ensayo de mono-híbrido con las proteínas Qλ y Qλ2 en presencia o ausencia de benzoato. Las cepas E. coli MV1190 pSJ6(PR::lacZ) fue transformada con los plásmidos pcI, pcI-Qλ y pcI-Qλ2 que expresan las fusiones NTDcI, Qλ y Qλ2, respectivamente, y con el plásmido pCK01- BzdA que expresa la enzima benzoato-CoA ligasa (BzdA). Tras ser cultivadas en medio LB en presencia (+Bz) o ausencia (-Bz) de benzoato 3 mM, se midió su actividad β-galactosidasa tal y como se detalla en el apartado 6.1.1 de Materiales y Métodos. Los datos mostrados son el resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes, y presentaron una desviación estándar menor del 10%. NTDcI Qλ BzdA +Bz Qλ2 BzdA +Bz PR (λ) lacZ PR (λ) lacZ 500 300 200 100 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) 400 Qλ BzdA -Bz Qλ2 BzdA -Bz Resultados 124 33..33 AAnnáálliissiiss ddeell ccaammbbiioo ccoonnffoorrmmaacciioonnaall ssuuffrriiddoo ppoorr llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR eenn pprreesseenncciiaa ddeell iinndduuccttoorr.. El cambio conformacional sufrido por la proteína BzdR al unirse a su inductor, el benzoil-CoA, se analizó mediante distintas técnicas. Los resultados obtenidos mediante espectroscopía de fluorescencia en la región UV-visible del espectro excitando las muestras a una longitud de onda de 275 nm revelaron un cambio conformacional como resultado de la interacción entre BzdR y el benzoil-CoA (Figura 39). Al igual que sucedía con la proteína CBzdR, cuando la proteína BzdR se encuentra en presencia del inductor benzoil-CoA, no sólo se detecta un descenso de la emisión de fluorescencia, sino que además se puede observar un desplazamiento del máximo de emisión de 312 nm en ausencia de ligando, a 322 nm en presencia de benzoil-CoA. Dado que esta variación del espectro era muy semejante a la sufrida por la proteína CBzdR en presencia de benzoil-CoA, cabía sugerir que era el triptófano 229 de BzdR (que se corresponde con el triptófano 99 de CBzdR) y no el triptófano 112 (que no está presente en CBzdR), el que sufría una variación notable de su entorno, como resultado del cambio conformacional inducido por la interacción del benzoil-CoA con el dominio C- terminal de BzdR. Por otro lado, los experimentos de proteolisis con tripsina llevados a cabo con la proteína BzdR también revelaron un cambio conformacional como resultado de la interacción entre BzdR y el benzoil-CoA (Figura 40). Figura 39. Interacción de la proteína BzdR con benzoil-CoA. Ensayo de espectroscopía de fluorescencia de la proteína His6-BzdR en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de benzoil- CoA. Se parte de una concentración fija de proteína (5 μM) y se va incrementando la cantidad de ligando desde 0 hasta una concentración de 30 μM. En el interior de la gráfica ha sido incluido el valor obtenido para la constante de disociación (Kd). En la zona superior derecha se ha incluido una curva de unión que representa la variación de la fluorescencia (Fo-Fi, donde Fo es la fluorescencia inicial y Fi es la fluorescencia a una determinada concentración de ligando) en relación a la concentración de ligando libre en el medio, cuya curva representa el buen ajuste de los resultados experimentales al modelo de unión considerado. Longitud de onda (nm) In te ns id ad d e flu or es ce nc ia 280 300 320 340 360 380 400 0.5 1.0 1.5 40 80 1200 0.15 0.30 [Bz-CoA] libre (mM) Kd = 192 μM 0.0 Fo -F i Resultados 125 Se llevaron a cabo experimentos de interferencia mediante ultracentrifugación analítica con la proteína purificada BzdR en presencia o ausencia de benzoil-CoA. Los resultados obtenidos mostraron una pequeña diferencia en el valor del coeficiente de sedimentación (s) de la proteína, siendo ligeramente mayor este valor en presencia de benzoil-CoA (Tabla 10). Este resultado sugiere un cambio en la forma de la proteína tras su interacción con el benzoil-CoA. Tabla 10. Datos obtenidos en el ensayo de interferencia llevado a cabo mediante ultracentrifugación analítica. Proteína Mm teórica (Da) f/f0 Coeficiente de sedimentación (s) Estado de asociación compatible BzdR 34.895 1.37 3.62 ± 0.41 Dímero Bz-CoA 860 - - - BzdR + Bz-CoA 35.755 1.07 3.82 ± 0.14 Dímero Todos estos datos tomados en conjunto sugieren que BzdR sufre un cambio conformacional al unirse el benzoil-CoA a su dominio C-terminal. Este cambio conformacional será transmitido al dominio N-terminal por medio del linker, dando así lugar a las modificaciones estructurales que se producen en la región HTH y que Figura 40. Ensayo de digestión con tripsina de la proteína purificada BzdR. El ensayo fue realizado con BzdR 10 μM y tripsina 0.02 mg/ml, tal y como se detalla en el apartado 5.6 de Materiales y Métodos. Calles 0: muestras incubadas a 37ºC (condiciones óptimas de la tripsina) durante 2, 5, 10, 20, 30 y 60 minutos, respectivamente. Las reacciones se realizaron en ausencia (panel A) o presencia (panel B) de benzoil-CoA 2 mM. Calles M: marcadores de pesos moleculares, indicados a la izquierda en kDa. Tiempo Tiempo M 0 2 5 10 20 30 60 M 0 2 5 10 20 30 60 200 116 97 66 45 31 21 14 kDa A B Resultados 126 conllevan a la disociación entre el regulador transcripcional y el promotor PN (Barragán et al., 2005), y finalmente a la activación de dicho promotor. La activación específica del benzoil-CoA sobre la represión ejercida por BzdR en el promotor PN se ha demostrado en ensayos de transcripción in vitro (Figura 41). En estos ensayos también se confirmó que el benzoato no actuaba como inductor y que el fenilacetil-CoA era capaz de causar una ligera activación de PN. Además, también se pudo apreciar una ligera activación en presencia de ATP, lo que sugería que era este grupo de la molécula de benzoil-CoA el que interaccionaba con la proteína BzdR. Figura 41. Efecto de distintos ligandos en la represión de la proteína BzdR sobre el promotor PN. Se llevaron a cabo reacciones de transcripción in vitro de múltiples rondas utilizando como molde el plásmido pJCD-PN, que incorpora, en sentidos divergentes, un promotor propio, que expresa un ARNm de 105 nucleótidos (C), y el promotor PN, que expresa un ARNm de 184 nucleótidos (PN). Todas las reacciones incorporaban RNAP, según se detalla en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos. Las reacciones de las calles 2-6 llevaban además el activador His6-Fnr* 20 nM. Las calles 3-6 también incorporaban proteína purificada His6-BzdR 50 nM. Las calles 4, 5, 6 y 7 incluían benzoil-CoA (BzCoA) 1 mM, benzoato (Bz) 1 mM, fenilacetil-CoA (PACoA) 1 mM y ATP (ATP) 1 mM. Fnr* 1 2 3 4 5 6 7 PN C BzdR BzCoA Bz PACoA⎯ ⎯ ⎯ ATP Represor Activador Ligando Resultados 127 OObbjjeettiivvoo 44.. LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR ccoommoo mmooddeelloo ppaarraa llaa ssíínntteessiiss ddee nnuueevvooss rreegguullaaddoorreess ffuunncciioonnaalleess.. Como se ha demostrado anteriormente, la proteína BzdR posee una arquitectura modular con dos dominios, NBzdR y CBzdR, estructural y funcionalmente independientes, conectados entre sí por una región linker, LBzdR, que actúa como transmisor de la información entre ambos en presencia de la molécula inductora benzoil-CoA. La naturaleza modular de BzdR permite su utilización para el diseño de nuevos reguladores artificiales que permitan profundizar en el estudio de las relaciones estructura/función de los dominios de BzdR, en el origen evolutivo de los reguladores de la subfamilia BzdR, así como en el desarrollo de nuevos circuitos reguladores de interés en el campo de la biología sintética. 44..11 LLaa pprrootteeíínnaa qquuiimméérriiccaa QQλλ ccoonnttrroollaa eell cciicclloo llííttiiccoo ddeell ffaaggoo llaammbbddaa.. La proteína quimérica Qλ es una proteína capaz de reprimir el promotor PR del fago lambda (Figura 37). Este promotor está directamente implicado en la activación del ciclo lítico tras la infección fágica (Herskowitz, 1973; Reichardt, 1975a; Reichardt, 1975b), por lo que la proteína Qλ debería ser capaz, en principio, de proteger de la lisis a células de E. coli portadoras de dicha quimera e infectadas por el fago λ. Con el fin de comprobar esta hipótesis, se diseñó un experimento de infección con fago λ de la cepa E. coli MV1190 expresando distintas proteínas. La cepa parental E. coli MV1190 generó 6.4x106 calvas de lisis tras la infección con la preparación de fago λ (Figura 42). Como cabría esperar, el control negativo llevado a cabo con la cepa E. coli MV1190 expresando el dominio NTD del represor cI de λ que no puede reprimir de forma eficaz al promotor PR del fago (Figura 37), no mostró una reducción significativa del número de placas de lisis tras la infección con dicho fago λ. Por el contrario, el control positivo E. coli MV1190 expresando la proteína NTD-Cat que es capaz de reprimir eficazmente al promotor PR (Figura 37), sí mostró una clara reducción en el número de placas de lisis observadas (Figura 42), lo que revela el papel de este regulador quimérico como represor efectivo del ciclo lítico del fago λ. Cuando la cepa E. coli MV1190 expresa la quimera Qλ, se observa también una significativa reducción (más de dos órdenes de magnitud) en el número de calvas de lisis respecto a la cepa parental tras la infección con el fago λ (Figura 42), lo que está de Resultados 128 acuerdo con la represión del promotor PR por parte de la quimera Qλ observada previamente (Figura 37). Además, la represión del ciclo lítico fue revertida con benzoato en la cepa E. coli MV1190 expresando la quimera Qλ y la benzoato-CoA ligasa. Por el contrario, el benzoato no causó ningún efecto en la infección del fago λ sobre la cepa E. coli MV1190 expresando la quimera Qλ2 y la benzoato-CoA ligasa, lo cual está de acuerdo con el papel del linker de BzdR como transmisor de la información entre los dominios NBzdR y CBzdR tras la unión del inductor benzoil-CoA. En su conjunto, todos estos resultados confirman los obtenidos previamente con la fusión traduccional PR::lacZ (Figura 37), revelando que la quimera Qλ es capaz de Figura 42. Ensayo de infección y lisis mediada por el fago lambda en la cepa E. coli MV1190. La cepa E. coli MV1190 () fue transformada con los plásmidos pcI, pcI-cat, pcI-Qλ y pcI-Qλ2 que expresan las fusiones NTDcI, NTD-Cat, Qλ y Qλ2, respectivamente, representadas en las figuras en color. Las cepas con las fusiones Qλ ó Qλ2 fueron transformadas posteriormente con el plásmido pCK01-BzdA (BzdA), que expresa la enzima benzoato-CoA ligasa, y fueron cultivadas en presencia (+Bz) o ausencia (-Bz) de benzoato 3 mM. La infección con el fago λ fue llevada a cabo tal y como se describe en el apartado 6.4 de Materiales y Métodos. Código de las construcciones: Amarillo: dominio NTD del represor λcI (NTDcI). Verde: región linker LBzdR de la proteína BzdR (L). Rosa: cloranfenicol acetiltransferasa (Cat). Azul: dominio C-terminal de la proteína BzdR (CBzdR).Los datos mostrados son el resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes, y presentaron una desviación estándar menor del 10%. 4 0 Li si s (L og n º d e ca lv as )  NTDNTD-- CatCat QQλλ +Bz+Bz 5 6 7 QQλλ BzdABzdA +Bz+Bz 6.81 6.08 3.95 4.184.20 4.15 5.96 QQλλ22 +Bz+Bz QQλλ22 BzdABzdA +Bz+Bz 4.27 4.35 4.04 4.09 NTDcI NTD-Cat Qλ Qλ2 λNcI λLcI λNcI λLcI λNcI λLcI L λNcI λLcI Cat CBzdR CBzdR QQλλ --BzBz QQλλ BzdABzdA --BzBz QQλλ22 --BzBz QQλλ22 BzdABzdA --BzBz NTDcINTDcI Resultados 129 reprimir eficazmente al promotor PR en el genoma del fago λ (inhibición del ciclo lítico), y de reconocer benzoil-CoA como molécula inductora que permite la activación del promotor fágico (activación del ciclo lítico) (Figura 42). En resumen, la quimera Qλ constituye un nuevo regulador artificial capaz de controlar el ciclo vital del fago λ en respuesta a la presencia/ausencia de benzoato (benzoil-CoA) en la célula. 44..22 LLaa pprrootteeíínnaa qquuiimméérriiccaa QQ11:: uunn nnuueevvoo rreepprreessoorr ttrraannssccrriippcciioonnaall ccoonn aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa.. Para confirmar la capacidad del dominio NBzdR de unirse al promotor PN y de la región linker de BzdR de transmitir la información desde el dominio receptor de ligando al dominio NBzdR, se fusionó NBzdRL con la enzima SKI (producto del gen aroK de E. coli) (Figura 43), tal y como se detalla en el apartado 3.7 de Materiales y Métodos. La proteína quimérica Q1 fue hiperproducida desde el plásmido pQE32-Q1 y posteriormente purificada tal y como se detalla en el apartado 5.4 de Materiales y Métodos. 44..22..11 FFuunncciioonnaalliiddaadd ddeell ddoommiinniioo NN--tteerrmmiinnaall ((NNBBzzddRRLL)) ddee llaa qquuiimmeerraa QQ11.. Con el fin de confirmar la función predicha para el dominio NBzdRL en la quimera Q1, se llevaron a cabo una serie de ensayos de interacción con el promotor PN in vitro e in vivo. En primer lugar, se realizaron ensayos de retardo en gel que demostraron la capacidad de la quimera Q1 para unirse eficientemente al promotor PN, tal y como puede apreciarse en la Figura 44A. Esta interacción era específica ya que se inhibía en presencia de sonda PN no marcada radiactivamente (Figura 44A). En segundo lugar, se llevaron a cabo ensayos in vivo, transformando la cepa E. coli MC4100-T1 (que incluye la fusión PN::lacZ en cromosoma; Tabla 4) con el plásmido pCK01-Q1 (Tabla 5), que Figura 43. Arquitectura modular de la proteína quimérica Q1. Representación esquemática de los dominios que componen la quimera Q1. En naranja se muestra el dominio N-terminal de BzdR (NBzdR), en rojo la región HTH, en verde la región del linker de BzdR (LBzdR) y en morado la proteína siquimato quinasa I de E. coli (SKI). 381 90 NBzdR HTH 131 304 LBzdR SKI NBzdRL Resultados 130 expresa la proteína Q1. Como se puede apreciar en la Figura 44B, la proteína Q1 mostró una capacidad represora del promotor PN tan eficiente como la mostrada por la proteína nativa BzdR. Figura 44. Ensayos in vitro e in vivo de la unión de la proteína quimérica Q1 al promotor PN. (A) Ensayo de retardo en gel. Calles 1 y 6, sonda PN libre. En las calles 2-5 y 7-10 se añadieron concentraciones crecientes, 5, 10, 25 y 50 nM, respectivamente, de la proteína purificada His6-Q1. Además, en las calles 6-10 se añadió sonda PN no marcada radiactivamente a una concentración de 100 nM. Los tres complejos PN::His6-Q1 formados se indican como C1, C2 y C3. Los ensayos fueron realizados tal y como se indica en el apartado 7.2 de Materiales y Métodos. (B) Actividad β- galactosidasa de la cepa E. coli MC4100-T1, que incorpora la fusión PN::lacZ (PN). Dicha cepa fue transformada con el plásmido pCK01-BzdR (PN BzdR) o pCK01-Q1 (PN Q1), que expresan las proteínas His6-BzdR e His6-Q1, respectivamente. Todas las cepas fueron cultivadas anaeróbicamente en medio LB y posteriormente se midió su actividad β-galactosidasa tal y como se detalla en el apartado 6.1.1 de Materiales y Métodos. Los datos mostrados son el resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes, y presentaron una desviación estándar menor del 10%. 400 300 200 100 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PN PN BzdR PN Q1 A B Q1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Q1 PN C1 C2 C3 PN lacZ 400 300 200 100 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PN PN BzdR PN Q1 A B Q1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Q1 PN C1 C2 C3 PN lacZPN lacZ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Siquimato Q1 Q1 Siquimato + ATPATP PPNN Figura 45. Efecto del siquimato y el ATP en el control de la actividad del promotor PN por la quimera Q1. Se llevaron a cabo reacciones de transcripción in vitro de múltiples rondas utilizando como molde el plásmido pJCD-PN (Tabla 5), que incorpora el promotor PN, transcribiendo un ARNm de 184 nucleótidos (PN), y añadiendo RNAP 50 nM y proteína Fnr* 20 nM, ambas necesarias para la actividad del promotor PN. En las calles 1-4 se añadieron concentraciones crecientes 0, 25, 50 y 100 nM, respectivamente, de la quimera His6-Q1. En las calles 5-13 se fijó la concentración de His6-Q1 en 50 nM. En las calles 5-7 se añadió siquimato 1, 2 y 4 mM, respectivamente, en las calles 8-10 se añadió ATP 1, 2 y 4 mM, respectivamente, y en las calles 11-13 se añadió siquimato + ATP 1, 2 y 4 mM, respectivamente. Resultados 131 También se ensayó la capacidad de represión de la quimera Q1 sobre el promotor PN, mediante experimentos de transcripción in vitro. Al igual que en los ensayos in vivo, la proteína Q1 demostró ser capaz de reprimir la actividad del promotor PN tan eficientemente como lo hacía la proteína nativa BzdR, tal y como se puede apreciar en la Figura 45. Por último, se realizaron experimentos de velocidad de sedimentación con el fin de comprobar la homogeneidad y el estado oligomérico de la quimera Q1. Se ensayaron diferentes concentraciones de proteína Q1 entre 1 y 20 μM, obteniendo en todos los casos una especie única compatible con una masa molecular de una forma dimérica de la proteína (Tabla 11). Tabla 11. Datos obtenidos en los experimentos de ultracentrifugación analítica con Q1. Proteína Mm teórica (Da) f/f0 Coeficiente de sedimentación (s) Estado de asociación compatible Q1 36.072 1.4 3.68 ± 0.2 Dímero Todos estos resultados, en su conjunto, indicaban claramente que el dominio NBzdRL de la quimera Q1 mantenía su integridad estructural y funcional, lo que permitía el reconocimiento y represión del promotor PN, así como la dimerización de la quimera Q1. 44..22..22 FFuunncciioonnaalliiddaadd ddeell ddoommiinniioo CC--tteerrmmiinnaall ((SSKKII)) ddee llaa qquuiimmeerraa QQ11.. Dado que la enzima siquimato quinasa I (SKI) fue integrada como dominio en la quimera Q1, se decidió comprobar si ésta mantenía aún su funcionalidad. Se realizó un ensayo para medir la posible actividad siquimato quinasa de la proteína His6-Q1 purificada. Como control positivo se utilizó la proteína nativa SKI de E. coli purificada a partir de las células que sobreexpresan el gen aroK desde el plásmido pQE32, tal y como se detalla en el apartado de Materiales y Métodos, con el fin de obtenerla en forma de His6-SKI. En la Figura 46 se puede apreciar que la quimera His6-Q1 posee actividad siquimato quinasa con una afinidad ligeramente inferior que la obtenida para la SKI. El valor de Km obtenido para la quimera His6-Q1 fue de 0.38 mM, mientras que para la quimera His6-SKI fue de 0.22 mM, valor muy semejante al obtenido por otros autores (De Feyter, 1987). Resultados 132 Con el fin de corroborar la actividad siquimato quinasa de Q1, se utilizó una cepa mutante de E. coli defectiva en los genes aroK y aroL, que codifican las dos isoformas de la siquimato quinasa en E. coli: SKI y SKII. Esta cepa, denominada E. coli ALO807 (aroK-, aroL-), no es capaz de crecer en medio mínimo con glicerol como única fuente de carbono (Lobner-Olesen & Marinus, 1992), al no ser capaz de sintetizar aminoácidos aromáticos, aunque sí puede hacerlo en presencia de aminoácidos aromáticos suplementados como los presentes en los casaminoácidos (CAA) (Lobner-Olesen & Marinus, 1992). Cuando la cepa E. coli ALO807 fue complementada con la actividad siquimato quinasa generada por la quimera His6-Q1 al ser transformada con el plásmido pQE32-Q1, fue capaz de crecer en medio mínimo con glicerol como única fuente de carbono y sin necesidad de ser suplementada con CAA, lo que demostró la capacidad de Q1 para compensar el déficit de las siquimato quinasas aroK y aroL (Figura 47). Figura 46. Actividad siquimato quinasa de las proteínas purificadas His6-SKI e His6-Q1. El ensayo de actividad siquimato quinasa se llevó a cabo tal y como se detalla en la sección Materiales y Métodos. Se obtuvieron 10 medidas a lo largo de la curva, que fue posteriormente ajustada a una curva logarítmica. En el interior de la gráfica se muestran los valores de Km para cada una de las proteínas. Cada uno de los 10 puntos obtenidos fue el resultado de realizar la media de tres medidas separadas e independientes, cuya desviación estándar fue menor del 10%. 100 75 50 25 0 V (U /m g pr ot eí na ) 125 150 175 0.50 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 [Siquimato] (mM) Q1 → Km = 0.38 mM SKI → Km = 0.22 mM 100 75 50 25 0 V (U /m g pr ot eí na ) 125 150 175 0.50 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 [Siquimato] (mM) Q1 → Km = 0.38 mM SKI → Km = 0.22 mM Resultados 133 Estos resultados parecen mostrar que el dominio C-terminal de la quimera His6- Q1 también mantiene su función, lo que sugiere que la enzima SKI se encuentra correctamente plegada. 44..22..33 LLaa qquuiimmeerraa QQ11 aaddqquuiieerree uunnaa nnuueevvaa ffuunncciióónn.. Puesto que ambos dominios de la quimera Q1, NBzdRL y SKI, mantenían sus respectivas funciones, cabía la posibilidad de que el cambio conformacional producido en el dominio C-terminal (SKI) tras la unión de sus sustratos, se transmitiera al dominio N-terminal (NBzdRL) y fuera capaz de modificar su afinidad por el ADN. De ser así, la quimera Q1 se habría convertido en un nuevo regulador transcripcional, capaz de responder a un nuevo estímulo, el siquimato, el cual daría lugar a la desrepresión del promotor PN de forma análoga a como lo hace el benzoil-CoA al unirse a BzdR. Con objeto de comprobar esta hipótesis, se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel añadiendo los sustratos naturales de la SKI, siquimato y ATP, y usando como sonda de ADN el promotor PN. Como se puede observar en la Figura 48, la proteína His6-Q1 se despega de la sonda PN cuando se añade siquimato, ATP o ambos en la mezcla de reacción, pero no al añadir ligandos control como benzoato o glucosa (moléculas semejantes al siquimato), lo que sugería que el cambio conformacional producido en el dominio SKI es específico de sustrato y podría transmitirse al dominio NBzdRL. Figura 47. Curvas de crecimiento de las cepas de E. coli defectivas en los genes aroK y aroL. La cepa de E. coli ALO807 (aroK-, aroL-) fue crecida en medio mínimo M63, utilizando como fuente de carbono glicerol. Además fueron crecidas en presencia (línea discontinua morada) o ausencia (línea discontinua verde) de casaminoácidos. También fue crecida en idénticas condiciones la cepa ALO807 pQE32-Q1, que expresa la proteína His6-Q1. La curva obtenida tanto en presencia (línea morada) como en ausencia (línea verde) de casaminoácidos fue aproximadamente la misma. Cada uno de los puntos obtenidos fue el resultado de realizar la media de tres medidas separadas e independientes, cuya desviación estándar fue menor del 10%. 0.4 0.3 0.2 0.1 0 A 60 0 0.5 0.6 0.7 40 8 12 16 20 24 28 32 Tiempo (h) ALO807 ALO807 pQE32-Q1 + CAA + CAA - CAA - CAA 0.4 0.3 0.2 0.1 0 A 60 0 0.5 0.6 0.7 40 8 12 16 20 24 28 32 Tiempo (h) ALO807 ALO807 pQE32-Q1 + CAA + CAA - CAA - CAA Resultados 134 Con el fin de confirmar este resultado, se llevaron a cabo ensayos de transcripción in vitro con los sustratos empleados anteriormente, tal y como puede apreciarse en la Figura 45. La represión ejercida por la quimera His6-Q1 sobre el promotor PN dejaba de producirse al añadir siquimato a la mezcla de reacción. Sin embargo, cuando se añadían ambos sustratos, ATP y siquimato, los niveles de transcripción observados eran extremadamente bajos. En vista de estos resultados, se realizaron ensayos in vivo, en los cuales se creció en LB y en presencia de siquimato la cepa de E. coli MC4100-T1 (pCK01-His6-Q1), portadora de la fusión PN::lacZ y capaz de producir la quimera His6-Q1. En ningún caso se logró detectar expresión del promotor PN al realizar los correspondientes ensayos de actividad β-galactosidasa, lo que indicaba que no se estaba produciendo la supuesta activación inducida por el siquimato (Figura 49). Estas aparentes discrepancias surgidas entre los resultados obtenidos en los ensayos de retardo en gel y los resultados obtenidos tanto en los ensayos de transcripción in vitro como en los ensayos de actividad in vivo, podían explicarse mediante la hipótesis detallada a continuación. Figura 48. Ensayos de retardo en gel de la unión y despegue de la proteína His6-Q1 al promotor PN. (A) En la calle 1 se cargó sonda PN libre. En las calles 2-10 se añadió proteína His6-Q1 a una concentración fija de 50 nM. En las calles 2-4, 5-7 y 8-10 se añadieron tres concentraciones crecientes (0, 2 y 4 mM) de siquimato, ATP y benzoato (control negativo), respectivamente. (B) En la calle 1 se cargó sonda PN libre. En las calles 2-10 se añadió proteína His6-Q1 a una concentración fija de 50 nM. En las calles 2-6 se añadieron concentraciones crecientes de siquimato + ATP de la siguiente forma: 0, 0.2, 0.5, 1 y 2 mM, respectivamente (y de cada uno de los compuestos). En las calles 7-10 se añadieron concentraciones crecientes de glucosa (control negativo) de la siguiente forma: 0, 1, 2, y 4 mM, respectivamente. En ambos casos se indican los tres complejos PN::His6-Q1 (C1, C2 y C3), así como la sonda PN libre. Siquimato 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PN C1 C2 C3 ATP Benzoato Siquimato + ATP Glucosa A B His6-Q1 Siquimato 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PN C1 C2 C3 ATP Benzoato Siquimato + ATP Glucosa A B His6-Q1 Resultados 135 La SKI sufre un cambio de conformación cuando une alguno de sus dos sustratos (siquimato y ATP) o ambos (Hartmann et al., 2006), lo cual posibilita que se catalice la reacción enzimática, generándose 3P-siquimato y ADP (De Feyter, 1987; Pittard, 1987). Esta reacción precisa de un cofactor, el catión Mg2+, para que tenga lugar la actividad enzimática (DeFeyter & Pittard, 1986). En ausencia de Mg2+, los sustratos de la SKI son capaces de unirse al centro activo de la enzima generándose el cambio de conformación correspondiente, pero no se puede producir la reacción enzimática. Figura 49. Ensayo in vivo del efecto del siquimato en la represión por la quimera Q1 del promotor PN. La cepa MC4100-T1, que incorpora la fusión PN::lacZ (PN), fue transformada con el plásmido pCK01-Q1. El crecimiento se llevó a cabo en LB y en condiciones anaeróbicas. La cepa que expresaban la proteína His6-Q1 fue crecida, además, en ausencia (PN Q1) y en presencia (PN Q1 + sk) de siquimato. Posteriormente, se midió su actividad β-galactosidasa tal y como se detalla en el apartado Materiales y Métodos. Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. Figura 50. Actividad siquimato quinasa de las proteínas purificadas His6-SKI e His6-Q1 en el tampón de retardo (A) y de transcripción in vitro (B). Los ensayos de actividad siquimato quinasa se llevaron a cabo tal y como se detalla en la sección Materiales y Métodos. Se obtuvieron 10 medidas a lo largo de la curva, que fue posteriormente ajustada a una curva logarítmica. En el interior de ambas gráficas se muestra una leyenda que indica el tipo de línea al que corresponde cada una de las proteínas. Cada uno de los 10 puntos obtenidos fue el resultado de realizar la media de tres medidas separadas e independientes, cuya desviación estándar fue menor del 10%. 400 300 200 100 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PN PN Q1 PN Q1 + sk 400 300 200 100 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PN PN Q1 PN Q1 + sk V (U /m g pr ot eí na ) [Siquimato] (mM) 100 75 50 25 0 125 150 175 0.50 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Tampón de retardoTampón de retardo ((––MgMg2+2+)) A B V (U /m g pr ot eí na ) [Siquimato] (mM) 100 75 50 25 0 125 150 175 0.50 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Tampón de transcripción Tampón de transcripción in vitroin vitro ((+Mg+Mg22++)) His6-Q1: His6-SKI: His6-Q1: His6-SKI: V (U /m g pr ot eí na ) [Siquimato] (mM) 100 75 50 25 0 125 150 175 0.50 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Tampón de retardoTampón de retardo ((––MgMg2+2+)) A B V (U /m g pr ot eí na ) [Siquimato] (mM) 100 75 50 25 0 125 150 175 0.50 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Tampón de transcripción Tampón de transcripción in vitroin vitro ((+Mg+Mg22++)) His6-Q1: His6-SKI: His6-Q1: His6-SKI: Resultados 136 Teniendo en cuenta esta información, se pudo comprobar que el tampón utilizado en las reacciones de unión con Q1 de los ensayos de retardo en gel no llevaba Mg2+, al contrario del tampón utilizado en las reacciones de los ensayos de transcripción in vitro, que sí llevaba Mg2+ (véase Materiales y Métodos). Con objeto de determinar si Q1 mostraba actividad enzimática en estos tampones, se llevaron a cabo los ensayos mostrados en la Figura 50, donde se puede apreciar que ni la quimera Q1, ni la SKI original mostraron actividad siquimato quinasa en el tampón de retardo, al contrario de lo que sucedía en el tampón de transcripción in vitro, donde sí existía actividad. De esta forma, los resultados obtenidos podían ser explicados de la siguiente manera: en los ensayos de retardo en gel, a pesar de añadir siquimato y/o ATP a la mezcla de reacción, no podía producirse la actividad enzimática, pero sí podía mantenerse el cambio conformacional que era transmitido al dominio NBzdRL de Q1, con el consecuente despegue del ADN (Figura 48). En los ensayos de transcripción in vitro, al añadir siquimato y ATP a la mezcla de reacción sí podía tener lugar la actividad enzimática del dominio SKI, con lo que se producía la reacción enzimática y Q1 volvía rápidamente a su conformación original (Hartmann et al., 2006), sin posibilidad de transmitir al dominio NBzdRL el cambio conformacional generado por la unión de los sustratos, con lo que se mantenía la represión del promotor PN (Figura 45). Únicamente cuando se añadía sólo siquimato a la reacción de transcripción, podía detectarse la desrepresión del promotor PN, ya que en este caso tampoco podía producirse la reacción enzimática pero sí se produce un cambio de conformación. Finalmente, en los ensayos in vivo, puesto que la presencia tanto de ATP como de cationes Mg2+ es constante y no puede ser controlada, la quimera Q1 siempre podrá catalizar la reacción enzimática cuando se encuentre en presencia de siquimato, con lo que no será capaz de mantener el cambio conformacional el tiempo necesario para que sea transmitido al dominio NBzdRL y así éste pueda desreprimir al promotor PN (Figura 49). Dado que el magnesio parecía ser imprescindible para que tuviera lugar la reacción enzimática de la siquimato quinasa, se planteó la posibilidad de mutar en la quimera Q1 aquel residuo o residuos implicados en la unión del catión de Mg2+. En la siquimato quinasa de Mycobacterium tuberculosis se ha podido determinar que los residuos Thr16 y Asp32 están implicados en la coordinación de un átomo de Mg2+, así como el residuo Asp34, el cual forma un puente de hidrógeno con una molécula de agua que se coordina a su vez con el átomo de Mg2+ (Gu et al., 2002). La SKI de E. coli que Resultados 137 forma parte de la quimera Q1 posee dos residuos de aspártico en las posiciones 34 y 36 que, por semejanza con la siquimato quinasa de M. tuberculosis, parecen ser los implicados en la unión del catión de Mg2+. De esta forma, con el fin de mantener la quimera Q1 en una conformación “cargada” e impedir que tuviera lugar la reacción enzimática, se construyó un mutante de esta quimera, en el cual se alteró la región de la proteína que parece ser la responsable de la interacción con el catión Mg2. Para ello, se llevó a cabo una mutagénesis dirigida, tal y como se describe en el apartado de Materiales y Métodos, mediante la cual se cambió el residuo de aspártico 36 (Asp36) por un residuo de alanina (Ala), dando lugar así a la quimera mutante: Q1D36A (Q2 de aquí en adelante) (Figura 51A). Tras la purificación de la quimera Q2 en forma de His6- Q2, se llevó a cabo un ensayo de actividad siquimato quinasa, con el cual se demostró, tal y como se esperaba, que esta mutación daba lugar a una proteína sin dicha actividad (Figura 51B). Sin embargo, la quimera His6-Q2 mantuvo su capacidad de unirse al promotor PN, como se puede observar en los ensayos de retardo mostrados en la Figura 51C. A su vez, también era capaz de despegarse del promotor PN cuando la reacción tenía lugar en presencia de siquimato y/o ATP. Siquimato 1 2 3 4 5 6 7 8 PN C1 C2 C3 C V (U /m g pr ot eí na ) [Siquimato] (mM) 100 75 50 25 0 125 150 175 0.50 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 B His6-Q1: His6-SKI: His6-Q2 His6-Q2 His6-Q2: 381 90 NBzdR HTH 131 304 LBzdR SKI (E. coli) N2BzdR D36A A Resultados 138 A diferencia de lo que sucedía con la quimera Q1, los ensayos de transcripción in vitro demostraron que, en este caso, la quimera His6-Q2 permitía la transcripción del promotor PN en presencia de siquimato y ATP (Figura 52). Por otro lado, se llevaron a cabo experimentos in vivo con la cepa E. coli MC4100 pSJ3PN, que expresa la fusión PN::lacZ en multicopia, transformada con el plásmido pQE32-Q1 y pQE32-Q2, que expresan las proteínas His6-Q1 e His6-Q2, respectivamente. Como se puede apreciar en la Figura 53, ambas proteínas eran capaces de reprimir la expresión del promotor PN con igual eficiencia. Sin embargo, al añadir siquimato al medio, únicamente la cepa que expresa la quimera His6-Q2 mostró niveles significativamente altos de actividad β-galactosidasa, lo que indicaba que el promotor PN era activo y por tanto His6-Q2 no era capaz de reprimirlo. Figura 52. Efecto del siquimato y del ATP en la represión por la quimera mutante Q2 de la transcripción in vitro del promotor PN. Se llevaron a cabo reacciones de transcripción in vitro de múltiples rondas utilizando como molde el plásmido pJCD-PN, que incorpora el promotor PN, desde el cual se expresa un ARNm de 184 nucleótidos. En todas las calles se cargó RNAP 50 nM y proteína His6-Fnr* 20 nM. En las calles 1-4 se añadieron concentraciones crecientes de la quimera His6-Q2 de la siguiente forma: 0, 25, 50 y 100 nM, respectivamente. En las calles 5-10 se fijó la concentración de His6-Q2 en 50 nM. En las calles 5-7 se añadió siquimato 1, 2 y 4 mM, respectivamente, y en las calles 8-10 se añadió siquimato y ATP 1, 2 y 4 mM, respectivamente. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Siquimato His6-Q2 His6-Q2 Siquimato + ATP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Siquimato His6-Q2 His6-Q2 Siquimato + ATP Figura 51. (A) Dominios de la proteína quimérica Q2. Representación esquemática de los dominios que componen la quimera Q2 y su posición en la secuencia. En naranja y rojo (región HTH) se muestra el dominio N-terminal de BzdR (NBzdR) y en azul la región del linker de BzdR (LBzdR). Ambos conforman el dominio NBzdRL. En morado se muestra la proteína siquimato quinasa I de E. coli (SKI), en la cual se señala el aminoácido mutado mediante mutagénesis dirigida (D36A). (B) Actividad siquimato quinasa de las proteínas purificadas His6-SKI, His6-Q1 e His6-Q2. Los ensayos de actividad siquimato quinasa se llevaron a cabo tal y como se detalla en la sección Materiales y Métodos. Se obtuvieron 10 medidas a lo largo de la curva, que fue posteriormente ajustada a una curva logarítmica. En el interior de ambas gráficas se muestra una leyenda que indica el tipo de línea al que corresponde cada una de las proteínas. Cada uno de los 10 puntos obtenidos fue el resultado de realizar la media de tres medidas separadas e independientes, cuya desviación estándar fue menor del 10%. (C) Ensayos de retardo en gel de la unión y despegue de la proteína His6-Q2 al promotor PN. En la calle 1 se cargó sonda PN libre. En las calles 2-5 se añadió proteína His6-Q2 a una concentración creciente de la siguiente forma: 5, 10, 25 y 50 nM, respectivamente. En las calles 6-8 se añadió proteína His6-Q2 a una concentración fija de 25 nM, así como concentraciones crecientes de siquimato de la siguiente forma: 0, 2 y 4 mM, respectivamente. Resultados 139 Estos resultados sugerían que la quimera mutante Q2 era capaz de interactuar con el siquimato y mantener el cambio conformacional que éste induce en la estructura del dominio SKI, lo que permitiría la transmisión de esta información al dominio NBzdR, y así su despegue del ADN. De esta forma, la pérdida de la actividad siquimato quinasa del dominio SKI ha transformado a la quimera Q1 en un nuevo regulador transcripcional, capaz de responder a una señal ambiental, en este caso, al siquimato. En vista de estos resultados, cabría plantear la posibilidad de establecer una relación evolutiva entre el dominio CBzdR del regulador BzdR, que reconoce benzoil-CoA, y la enzima SKI, que reconoce siquimato y ATP. Este planteamiento será comentado en el apartado de Discusión. 44..22..44 PPaappeell ddeell lliinnkkeerr eenn llaa qquuiimmeerraa QQ11.. Con el fin de determinar la importancia del linker en el proceso de transmisión de información desde el dominio SKI al dominio NBzdR cuando se unen los ligandos correspondientes, ATP y siquimato, se construyó una nueva quimera semejante a Q1, en las cual se eliminó la región linker de BzdR (LBzdR), dando lugar a la quimera Q4 (Figura 54). Además, también se construyó el equivalente de la quimera Q2, es decir, la quimera mutante sin linker, denominada quimera Q5 (Figura 54). Ambas quimeras, Q4 y Q5, fueron expresadas y purificadas, tal y como se describe en el apartado de Materiales y Métodos, en forma de His6-Q4 e His6-Q5. Figura 53. Ensayo in vivo del efecto del siquimato en la represión por la quimera Q2 del promotor PN. La cepa de E. coli MC4100 pSJ3-PN, que incorpora la fusión PN::lacZ (pSJ3PN) en multicopia, fue transformada con el plásmido pCK01-Q1 y pCK01-Q2. El crecimiento se llevó a cabo en LB y en condiciones anaeróbicas. Las cepas que expresaban la proteína His6-Q1e His6-Q2 fueron crecidas, además, en ausencia (pSJ3PN Q1 y pSJ3PN Q2) y en presencia (pSJ3PN Q1 + sk y pSJ3PN Q2 + sk) de siquimato. Posteriormente, se midió su actividad β-galactosidasa tal y como se detalla en el apartado Materiales y Métodos. Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. 10000 7500 5000 2500 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) pSJ3PN pSJ3PN Q1 pSJ3PN Q1 + sk pSJ3PN Q2 pSJ3PN Q2 + sk 10000 7500 5000 2500 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) pSJ3PN pSJ3PN Q1 pSJ3PN Q1 + sk pSJ3PN Q2 pSJ3PN Q2 + sk Resultados 140 381 90 NBzdR HTH 266 SKI (E. coli) 381 90 NBzdR HTH 266 SKI (E. coli) D34A Q4 Q5 381 90 NBzdR HTH 266 SKI (E. coli) 381 90 NBzdR HTH 266 SKI (E. coli) D34A Q4 Q5 Figura 54. Dominios de las proteínas quiméricas Q4 y Q5. Representación esquemática de los dominios que componen las quimeras Q4 y Q5, y su posición en la secuencia. En naranja y rojo (región HTH) se muestra el dominio N-terminal de BzdR (NBzdR) y en morado se muestra la proteína siquimato quinasa I de E. coli (SKI). En la quimera Q5 se señala además el aminoácido mutado mediante mutagénesis dirigida (D34A). C A+G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 His6-BzdR His6-Q1 His6-Q4 -35 -10 +1 ** ** ** ** ** Siquimato 1 2 3 4 5 6 7 8 His6-Q4 His6-Q4 B PN C1 C2 C3 A Siquimato 1 2 3 4 5 6 7 8 His6-Q1 His6-Q1 PN C1 C2 C3 Resultados 141 En primer lugar, se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel con la quimera Q4 sobre el promotor PN, en presencia y ausencia de siquimato y ATP. La quimera Q4 demostró que, si bien era capaz de unirse al promotor PN con una afinidad ligeramente menor a la de la quimera Q1 en ausencia de ligandos, no fue capaz de despegarse del promotor PN cuando las reacciones se realizaron en presencia de siquimato o ATP (Figura 55A y 55B). Por otro lado, con el fin de determinar si las proteínas BzdR, Q1 y Q4 protegían las mismas regiones operadoras del promotor PN, se llevó a cabo un ensayo de footprinting. Como se puede observar en la Figura 55C, las tres proteínas mostraron huellas de protección similares, lo que sugería que la interacción ADN-proteína se producía del mismo modo en los tres casos. Posteriormente, se llevaron a cabo ensayos de transcripción in vitro con la quimera Q5 usando como molde el plásmido pJCD-PN (Tabla 5). En este caso, la quimera Q5 demostró ser capaz de reprimir la expresión del promotor PN a una concentración de proteína ligeramente superior a la concentración necesaria de Q2 en ausencia de ligandos, lo que indicaba una menor afinidad. Sin embargo, cuando las mezclas de reacción se realizaron en presencia de siquimato, de ATP o de ambos, la quimera Q5 mantuvo la represión sobre el promotor PN, a diferencia de los resultados obtenidos con la quimera Q2, que sí permitía la transcripción de PN en estos casos (Figura 56A). Por último, el gen de la quimera Q5 fue clonado en el plásmido pCK01, y expresado en la cepa MC4100 pSJ3-PN, creciendo las células en medio rico LB, en presencia y ausencia de siquimato 5mM. Este ensayo se llevó en paralelo con la cepa que expresa la quimera Q2. Como se puede observar en la gráfica de la Figura 56B, no se pudieron apreciar diferencias entre las células crecidas en presencia y ausencia de Figura 55. A) y B) Ensayos de retardo en gel de la unión y despegue de las proteínas His6-Q2 e His6-Q4 al promotor PN. Tanto en A como en B, en la calle 1 se cargó sonda PN libre. En las calles 2-5 se añadió proteína His6-Q1 (A) ó His6-Q4 (B) a una concentración creciente de la siguiente forma: 5, 10, 25 y 50 nM, respectivamente. En las calles 6-8 se añadió proteína His6-Q1 (A) ó His6-Q4 (B) a una concentración fija de 10 nM, así como concentraciones crecientes de siquimato de la siguiente forma: 0.5, 2 y 4 mM, respectivamente. (C) Ensayo de protección frente a la digestión por DNasa I de la interacción de la proteína His6-BzdR, His6-Q1 e His6-Q4 con el promotor PN. En la calle 1 se cargó sonda PN en ausencia de proteína. Las calles 2-5, 6-9 y 10-13 incorporaban 25, 50, 100 y 200 nM de las proteínas purificadas His6-BzdR, His6-Q1 e His6-Q4, respectivamente. En la calle señalada como A+G fue cargada la reacción de secuenciación A+G de Maxam and Gilbert. A la derecha, se puede apreciar las 3 regiones protegidas por las proteínas, así como los nucleótidos cuyos enlaces fosfodiéster resultaron ser hipersensibles a la digestión por DNasa I, señalados con asteriscos. También se indican a la izquierda las regiones -35, -10 y +1 del promotor PN. Resultados 142 siquimato, lo que indicaba que la quimera Q5 no era capaz de responder a siquimato, tal y como sí lo hacía la quimera Q2. Todos estos resultados tomados en conjunto sugerían que el linker parecía ser imprescindible en la transmisión de la información desde el dominio siquimato quinasa hasta el dominio NBzdR, ya que su ausencia daba lugar a quimeras no funcionales incapaces de responder al inductor, el siquimato. Figura 56. (A) Efecto comparado del siquimato en la represión de las quimeras His6-Q2 e His6-Q5 sobre el promotor PN. Se llevaron a cabo reacciones de transcripción in vitro de múltiples rondas utilizando como molde el plásmido pJCD-PN, que incorpora el promotor PN, desde el cual se expresa un ARNm de 184 nucleótidos. En todas las calles se cargó RNAP 50 nM y proteína His6-Fnr* 20 nM. En las calles 2 y 3 se añadió proteína purificada His6-Q2 50 nM. En las calles 4 y 5 se añadió proteína purificada His6-Q5 50 nM. En las calles 3 y 5 se añadió siquimato 2 mM. (B) Efecto comparado del siquimato en la represión de las quimeras His6-Q2 e His6-Q5 sobre el promotor PN in vivo. La cepa de E. coli MC4100 pSJ3-PN, que incorpora la fusión PN::lacZ (pSJ3PN) en multicopia, fue transformada con el plásmido pCK01-Q2 y pCK01-Q5. El crecimiento se llevó a cabo en LB y en condiciones anaeróbicas. Las cepas que expresaban la proteína His6-Q2 e His6-Q5 fueron crecidas, además, en ausencia (pSJ3PN Q2 y pSJ3PN Q5) y en presencia (pSJ3PN Q2 + sk y pSJ3PN Q5 + sk) de siquimato. Posteriormente, se midió su actividad β-galactosidasa tal y como se detalla en el apartado Materiales y Métodos. Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. 10000 7500 5000 2500 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) pSJ3PN pSJ3PN Q2 pSJ3PN Q2 + sk pSJ3PN Q5 pSJ3PN Q5 + sk 10000 7500 5000 2500 0A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) pSJ3PN pSJ3PN Q2 pSJ3PN Q2 + sk pSJ3PN Q5 pSJ3PN Q5 + sk Siquimato 1 2 3 4 5 His6-Q2 His6-Q5 B Siquimato A Resultados 143 OObbjjeettiivvoo 55.. EEssttuuddiioo ddee llaa iinntteerraacccciióónn eennttrree llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR yy eell pprroommoottoorr PPNN.. La proteína BzdR interacciona con el promotor PN, reprimiendo su expresión en ausencia de benzoil-CoA. A lo largo de este capítulo se mostrarán una serie de experimentos preliminares que tuvieron como objetivo elucidar tanto la estructura del promotor PN, como el mecanismo mediante el cual se produce la interacción entre éste y BzdR. 55..11 EEll pprroommoottoorr PPNN ssee ddiivviiddee eenn ttrreess rreeggiioonneess ddee iinntteerraacccciióónn ccoonn llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. La región de interacción entre el promotor PN y la proteína BzdR se extiende desde la posición -144 a la posición +30 respecto de la posición +1 (Barragán et al., 2005) del gen bzdN de Azoarcus sp. CIB. A lo largo de esta región se pueden distinguir 3 zonas diferenciadas de interacción, tal y como ha sido demostrado previamente (Barragán et al., 2005). En la Figura 57 se puede observar la secuencia que abarca cada una de estas regiones: Región I: desde +31 a -32. Región II: desde -63 a -83. Región III: desde -126 a -146. CCGAGCCTCGCGTTTTACTGCGTGTTGCAATGCAACAAAATGCATTTCAT GCTGCGTTGCGGCAAGAAAGATTGCAGTTTTCCATGCAAAAAATGCAATC AAGTGCATGCAAACGTGCCTGACATTTGACTTAGATCAACATCGCCTGCA CTGCAGTGCGTAACATGCGACATCATGCATTAACGGCAAAATAATGCAGC AAAGGCGGACTCAGGGACGGGATCCGCAACACATCAGAGGAGATAGTTCG ATG Región III Región II Región I -35 -10 +1 RBS bzdN -174 +79 -146 -126 -83 -63 -32 +31 Figura 57. Vista en detalle del promotor PN. Secuencia del promotor PN desde la posición -174 a la +79. Se han señalado todas las posiciones que acotan cada una de las regiones I, II y III, recuadradas en verde, que protege la proteína BzdR en su unión al promotor PN, así como las posiciones que acotan las sondas construidas mI (en amarillo), mII (en verde) y mIII (en azul claro). Las flechas azules indican las secuencias palindrómicas presentes en cada una de ellas. Igualmente, se ha señalado la posición +1 en color rojo, las cajas -10 y -35 subrayadas en color naranja, la región de unión del ribosoma (RBS) subrayada en negro y en cursiva, y el codón de iniciación (ATG) del gen bzdN, subrayado en color rojo. -61 -38 -112 -101 Resultados 144 Con el fin de profundizar en el mecanismo de interacción entre BzdR y el promotor PN se purificaron por separado y de forma independiente 3 secuencias que incluían, en cada caso, cada una de estas 3 regiones para estudiar específicamente su interacción con BzdR en ensayos in vitro. También fueron clonadas en el plásmido pSJ3 dando lugar a las fusiones mI::lacZ, mII::lacZ, mIII::lacZ y mI+II::lacZ, para llevar a cabo ensayos de interacción in vivo. En la Figura 57 pueden apreciarse estas secuencias que, a partir de ahora, serán denominadas de la siguiente forma: mI (que incluye la región I): de +79 a -61. mII (que incluye la región II): de -38 a -112. mIII (que incluye la región III): de -101 a -174. mI+II (que incluye las regiones I y II): de +79 a -112. En primer lugar, se purificaron las secuencias mI, mII y mIII y se marcaron con [α- 32P]dATP, tal y como se detalla en el apartado de Materiales y Métodos. Una vez obtenidas, se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel con estas sondas y la proteína His6-BzdR. Como se puede observar en la Figura 58, la proteína His6-BzdR mostró ser capaz de unirse a cualquiera de las 3 sondas indistintamente, si bien mostró mayor afinidad por la sonda mI, la cual era totalmente retardada a una concentración de 250 nM de BzdR, algo que no sucedía con las sondas mII y mIII. 0 5 10 25 50 100 250 500 nM His6-BzdR His6-BzdR His6-BzdR C mI C mII C mIII A B C 0 5 10 25 50 100 250 500 nM 0 5 10 25 50 100 250 500 nM0 5 10 25 50 100 250 500 nM His6-BzdR His6-BzdR His6-BzdR C mI C mII C mIII A B C 0 5 10 25 50 100 250 500 nM 0 5 10 25 50 100 250 500 nM Figura 58. Ensayos de retardo en gel de la proteína purificada His6-BzdR sobre las 3 regiones I, II y III del promotor PN. En cada uno de los geles se cargó la sonda marcada correspondiente, mI en A, mII en B y mIII en C, y una concentración creciente de His6- BzdR, tal y como se indica. A la izquierda de cada figura se han señalado mediante flechas las bandas que corresponden a la sonda libre (mI, mII y mIII) y a los complejos C::His6- BzdR (C). Resultados 145 También se llevaron a cabo ensayos de footprinting con las 3 sondas y la proteína His6-BzdR, donde pudieron apreciarse las regiones protegidas en cada caso (Figura 59). En los tres casos, las regiones protegidas por la proteína His6-BzdR en cada una de las sondas, coincidieron con las regiones protegidas por His6-BzdR en el promotor PN al realizar un ensayo de footprinting con el promotor PN completo. Todos estos resultados tomados en conjunto parecían indicar que tanto las regiones de las 3 sondas reconocidas y protegidas por BzdR como las afinidades que mostraba por cada una de ellas, no variaban de forma significativa con respecto a los datos de interacción obtenidos con el promotor PN. Figura 59. Ensayo de protección frente a la digestión por DNasa I de la interacción de la proteína His6-BzdR con las 3 regiones I (A), II (B) y III (C) del promotor PN. En cada uno de los ensayos se cargó la sonda marcada correspondiente, mI en A, mII en B y mIII en C, y una concentración creciente de His6-BzdR, tal y como se indica. En la calle AG fue cargada la reacción de secuenciación A+G de Maxam and Gilbert, llevada cabo con cada una de las sondas, tal y como se detalla en el apartado de Materiales y Métodos. A la derecha de cada figura se ha señalado mediante corchetes la región protegida por la proteína His6-BzdR en cada caso. AG 0 100 200 nM His6-BzdR A B mI mII mIII His6-BzdR His6-BzdR C AG 0 50 100 200 nM AG 0 50 100 200 nM * * * * * AG 0 100 200 nM His6-BzdR A B mI mII mIII His6-BzdR His6-BzdR C AG 0 50 100 200 nM AG 0 50 100 200 nM * * * * * Resultados 146 En segundo lugar, se llevaron a cabo ensayos in vivo con la región I y la región I+II, con el fin de observar posibles diferencias con respecto al promotor PN completo. Para ello, se clonaron las sondas mI y mI+II en el plásmido pSJ3, dando lugar a las fusiones mI::lacZ y mI+II::lacZ. Estas construcciones fueron transformadas en la cepa E. coli MC4100 en presencia y en ausencia del plásmido pCK01-BzdR, que expresa la proteína BzdR. Mediante ensayos de actividad β-galactosidasa, se pudo comprobar que tanto la región I como la I+II daban niveles de actividad semejantes a los obtenidos con el promotor PN completo. De igual forma, la proteína BzdR era capaz de reprimir la expresión de la región I ó I+II tan eficientemente como lo hacía con el promotor PN (Figura 60). Estos resultados sugerían que la sonda mI que incorpora la región I del promotor PN era suficiente para llevar a cabo el proceso de regulación, ya que tanto su capacidad de expresión como su capacidad de ser reprimido por BzdR podían emular el comportamiento del promotor PN en un ensayo in vivo. Figura 60. Ensayo in vivo de la acción de la proteína BzdR sobre las regiones I y I+II del promotor PN. Las cepas de E. coli MC4100 (pSJ3-PN), E. coli MC4100 (pSJ3-mI) y E. coli MC4100 (pSJ3-mI+II), que incorporan las fusiones PN::lacZ (PN) mI::lacZ (mI) y mI+II::lacZ (mI+II), respectivamente, fueron transformadas con el plásmido pCK01-BzdR (PN BzdR, mI BzdR y mI+II BzdR). El crecimiento se llevó a cabo en LB y en condiciones anaeróbicas durante 16 horas. Posteriormente, se midió su actividad β-galactosidasa tal y como se detalla en el apartado Materiales y Métodos. Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. 10000 7500 5000 2500 0 A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PN mI mI BzdR mI+II mI+II BzdR 12500 PN BzdR 10000 7500 5000 2500 0 A ct iv id ad β -g al ac to si da sa (U ni da de s M ill er ) PN mI mI BzdR mI+II mI+II BzdR 12500 PN BzdR Resultados 147 55..22 TTiippoo ddee iinntteerraacccciióónn yy nnúúmmeerroo ddee mmoollééccuullaass iimmpplliiccaaddaass.. 55..22..11 EExxppeerriimmeennttooss ddee uullttrraacceennttrriiffuuggaacciióónn aannaallííttiiccaa.. Los ensayos de ultracentrifugación analítica fueron llevados a cabo contando con la colaboración del Dr. Germán Rivas y del Dr. Carlos Alfonso, del Departamento Ciencia de Proteínas del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB). Con el fin de elucidar el número de moléculas del represor BzdR que interactúan con el promotor PN, se llevaron a cabo diversos experimentos de unión [ADN]:[proteína] mediante ultracentrifugación analítica. Esta técnica permite calcular la masa molecular de una determinada molécula en base a su coeficiente de sedimentación (s), el cual puede ser medido al ser centrifugada la muestra a una determinada velocidad. Estableciendo los diferentes valores del coeficiente de sedimentación de una sonda de ADN en presencia y en ausencia de proteína, y sabiendo la masa molecular de la proteína, se podría determinarse el número de moléculas unidas a dicho ADN. En primer lugar, se seleccionó una secuencia del promotor PN de tamaño óptimo para realizar el ensayo. Se purificó una sonda de 253 pares de bases (desde la posición - 174 hasta la posición +79) que incluye las tres regiones (I, II y III) reconocidas por BzdR. Por otro lado, se utilizó proteína His6-BzdR, purificada tal y como se detalla en el apartado Materiales y Métodos. Se llevaron en paralelo diversas mezclas de reacción fijando una concentración de ADN óptima para su medida, que en este caso fue de 0.2 μM, a una longitud de onda de 260 nm y variando la concentración de proteína desde 0.2 μM hasta 10 μM. Estos ensayos fueron repetidos varias veces, y en ningún caso fue posible obtener información cuando la concentración de proteína se incrementaba por encima de 2 μM, ya que agregaba y la muestra migraba rápidamente al fondo del tubo de ensayo. En este caso, la unión comenzaba a producirse cuando la concentración de His6-BzdR se encontraba en torno a 1 μM. En estas condiciones, la masa molecular del promotor PN indicaba que se encontraban unidas 2 moléculas de His6-BzdR. Cuando la concentración de BzdR era de 2 μM, el número de moléculas es estimó entre 8 y 10, pero la calidad de los datos no permitió afinar más en esta estimación (Figura 61). A concentraciones superiores, como ya se ha comentado, se formaban agregados. Además, los datos obtenidos sugerían que el tipo de unión entre BzdR y el promotor PN era cooperativa, ya que al pasar de 1 μM al doble de concentración, 2 μM, la unión parecía Resultados 148 saturarse, razón por la cual era probable que se estuvieran formando los agregados observados a concentraciones superiores. A continuación, se llevó a cabo el mismo tipo de ensayo con el dominio N- terminal de BzdR, usando para ello las proteínas His6-NBzdR e His6-NBzdRL, con el fin de intentar evitar problemas de agregación, puesto que estas proteínas eran más solubles que BzdR, y obtener así datos de mayor calidad. Cuando el ensayo se llevó a cabo con la proteína His6-NBzdRL, la estequiometría de unión con el promotor PN fue semejante inicialmente a la obtenida con BzdR. Sin embargo, en este caso, la calidad de los datos obtenidos fue mejor, debido tanto a la menor variación obtenida en las desviaciones estándar de los puntos tomados, como a la mayor estabilidad de la proteína, que permitió incrementar su concentración hasta 8 μM, dando lugar a unos valores más afinados. En aquellos casos en los que se utilizó una concentración de His6- NBzdRL de 1 μM, la masa molecular del promotor PN sugería que se encontraban unidas 2 moléculas de proteína. Si tan solo se aumentaba la concentración de proteína al doble, 2 μM, se obtenía un valor de 8 moléculas unidas. Al aumentar la concentración a 4 μM y a 8 μM el sistema quedaba saturado y no se superaban las 8 moléculas de His6- NBzdRL por molécula de PN (Figura 61). Además, en este caso, se pudo establecer que el tipo de unión era cooperativa, ya que se pasaban de dos moléculas a ocho (correspondiente al nivel de saturación) en un rango inferior a un orden de magnitud (de 1 μM a 2 μM). En base a estos últimos datos y extrapolándolos a la proteína BzdR completa, cabe especular que al promotor se unen también 8 moléculas de BzdR. Puesto que, por Figura 61. Espectro de ultracentrifugación analítica de la unión entre las proteínas His6-BzdR e His6-NBzdRL y el promotor PN. N2 BzdR N2 BzdR Coeficiente de sedimentación (s)Coeficiente de sedimentación (s) C (s ) C (s ) N2 BzdR N2 BzdR Coeficiente de sedimentación (s)Coeficiente de sedimentación (s) C (s ) C (s ) Resultados 149 un lado, BzdR es un dímero y, por otro lado, a lo largo de la estructura del promotor PN se distribuyen 4 regiones palindrómicas, cabría plantear la posibilidad de que se una un dímero de BzdR por cada una de estas secuencias palindrómicas (véase Figura 57): dos dímeros en cada uno de los dos palíndromos de la región I y dos más en los palíndromos de cada una de las regiones II y III. 55..22..22 EExxppeerriimmeennttooss ddee mmiiccrroossccooppííaa ddee ffuueerrzzaass aattóómmiiccaass ((AAFFMM)).. Los ensayos de AFM se realizaron con la colaboración de Paloma Gutiérrez del Centro de Biología Molecular (CBM), proponiéndose una serie de objetivos que se exponen a continuación: Determinar la estructura del complejo PN:BzdR y, en tal caso, si existe más de un tipo de estructura para este complejo. Determinar qué regiones operadoras del promotor PN son necesarias para formar dicha estructura. Determinar la estequiometría del complejo, ya que mediante ultracentrifugación analítica sólo se obtuvo esta información con las proteínas His6-NBzdRL e His6-NBzdR, pero no con la proteína completa, His6-BzdR, con la que sólo se pudo estimar un número aproximado. Determinar el efecto del benzoil-CoA a nivel de la estructura del complejo. Esta técnica, detallada en el apartado 7.8 de Materiales y Métodos, permite observar directamente las moléculas de ADN y proteína dispuestas en la superficie de un sustrato de mica recién exfoliada, lo que implica que dicha superficie sea atómicamente plana. De esta forma, permite caracterizar las muestras en medio líquido, que es más cercano a las condiciones fisiológicas (Binnig et al., 1986). La dinámica de este tipo de microscopios consiste en deslizar una punta situada en el extremo de una micropalanca sobre la superficie de la mica, de forma que avance barriendo línea a línea a una fuerza de interacción punta-muestra constante, definiendo su topografía, lo que permitirá reconstruir un mapa tridimensional de la superficie en el que se verán incluidas las estructuras tridimensionales de las moléculas con las que la punta vaya interactuando. Esta punta actúa de sensor de estas interacciones y las transmite a la micropalanca, que hace de transductora de las fuerzas oscilando en el eje vertical (jumping-mode). Estas oscilaciones son detectadas por un fotodiodo que registra los cambios de deflexión de un láser enfocado en el envés de la punta, transformándolos en Resultados 150 impulsos eléctricos de una intensidad proporcional a la fuerza de dicha oscilación. Estos impulsos eléctrico son transformados a su vez en los volúmenes de aquellas moléculas con las que se haya encontrado el cabezal, lo que permite establecer el tamaño del ADN, el de las proteínas y, con ellos, el número de moléculas que interactúan entre sí. Figura 62. Esquema de las sondas PNL, mI+II y mI utilizadas en los ensayos de AFM. Las sondas de ADN utilizadas en los ensayos de AFM PNL, mI+II y mI poseían 1225 pb (416 nm), 834 pb (281 nm) y 782 pb (264 nm), respectivamente. Las tres sondas se extienden desde las posiciones -505, -112 y -61, respectivamente, hasta la +720, respecto del sitio de inicio de la transcripción del promotor PN (+1, indicado en la figura). Las tres sondas incluyen parte del gen bzdN, representado con una flecha verde. Las regiones operadoras reconocidas por BzdR han sido representadas mediante cajas moradas con su correspondiente número en el interior (I, II ó III), y ampliadas en la zona superior. Tanto en la secuencia completa, como en el detalle de las regiones reconocidas por BzdR (zona superior), han sido indicadas las distancias que separan cada una de las zonas y entre paréntesis el número de pares de bases correspondientes. 416 nm (1225 pb) 59 nm (177 pb) 121 nm (359 pb) 233 nm (689 pb) 14 nm (42 pb) 10 nm (30 pb) 7 nm (21 pb) 21 nm (63 pb) IIIIIIIIIIII bzdN PN 7 nm (21 pb) -505 +720+1 IIIIIIIIIIII SondaSonda PPNNLL 233 nm (689 pb) bzdN +720+1 II 31 nm (93 pb) 264 nm (782 pb) SondaSonda mImI -61 233 nm (689 pb) bzdN +720+1 II 48 nm (145 pb) IIII 281 nm (834 pb) SondaSonda mI+IImI+II -112 416 nm (1225 pb) 59 nm (177 pb) 121 nm (359 pb) 233 nm (689 pb) 14 nm (42 pb) 10 nm (30 pb) 7 nm (21 pb) 21 nm (63 pb) IIIIIIIIIIII bzdN PN 7 nm (21 pb) -505 +720+1 IIIIIIIIIIII SondaSonda PPNNLL 233 nm (689 pb) bzdN +720+1 II 31 nm (93 pb) 264 nm (782 pb) SondaSonda mImI -61 233 nm (689 pb) bzdN +720+1 II 31 nm (93 pb) 264 nm (782 pb) SondaSonda mImI -61 233 nm (689 pb) bzdN +720+1 II 48 nm (145 pb) IIII 281 nm (834 pb) SondaSonda mI+IImI+II -112 233 nm (689 pb) bzdN +720+1 II 48 nm (145 pb) IIII 281 nm (834 pb) SondaSonda mI+IImI+II -112 Resultados 151 En el presente trabajo, se utilizaron tres diferentes sondas de ADN, con diferentes tamaños, denominadas PNL, mI+II y mI, que incluían el promotor PN completo, la región I+II y la región I, respectivamente (Figura 62). Todas las sondas se diseñaron con extremos de distinto tamaño a ambos lados de las respectivas regiones de unión, con el fin de poder identificar dichas regiones con la proteína unida en las fotografías tomadas (Figura 62). En primer lugar se tomaron una serie de imágenes de ADN desnudo, con el fin de determinar el aspecto que presentaban estas sondas bajo el microscopio de fuerzas atómicas, pudiéndose observar que los tamaños observados coincidían con los tamaños esperados: 416 nm, en el caso de la sonda PNL, y 264 nm, en el caso de la sonda mI. A continuación, se llevó a cabo un ensayo de unión semejante al que tiene lugar en un ensayo de retardo en gel, tal y como se detalla en el apartado Materiales y Métodos, con la sonda PNL (que presenta las tres regiones de unión) y con la proteína purificada His6-BzdR. Inicialmente se utilizó un rango de relación de concentraciones de [ADN]:[proteína] que variaba desde 1:28 hasta 1:70, hasta que se logró optimizar esta relación en torno a 1:50. Como se puede apreciar en la Figura 63, se obtuvo un conjunto de complejos heterogéneo, en el cual se podían encontrar diversas combinaciones de unión, donde BzdR ocupaba los siguientes sitios: I, III, I+II, I+III, II+III. Las distintas regiones fueron identificadas y diferenciadas unas de otras mediante las mediciones llevadas a cabo con el programa WSxM (Horcas et al., 2007), con el cual se obtuvieron las distancias desde los sitios de unión de las proteínas hasta los extremos del ADN o la longitud total del complejo en sí. De igual forma, se pudo obtener la altura tanto del ADN como de los complejos, tal y como se puede apreciar en la Figura 63C. A modo de ejemplo, la imagen de la Figura 63B fue analizada con mayor detalle. En esta imagen, se pueden ver dos complejos que, dada la distancia de ambos extremos, coinciden con las regiones operadoras III y I. Al trazar el perfil de toda la hebra de ADN, se pudieron obtener altura y longitud tanto del ADN como de los complejos, que coincide con los dos picos en la gráfica de la Figura 63C. Como se puede apreciar, la longitud medida en ambos extremos desde la región III y la región I, 109 y 229 nm, se aproximaba bastante a las distancias esperadas, 121 y 233 nm, respectivamente. Igualmente, los complejos de las regiones III y I midieron 9 y 18 nm, aproximándose también bastante a las distancias esperadas, 7 y 21 nm, respectivamente. Resultados 152 Figura 63. (A) Colección de imágenes de diversos complejos de unión PNL:BzdR. Las cinco imágenes muestran la sonda PNL con proteína BzdR unida en diversas regiones, tal y como se indica en la figura. (B) Sonda PNL protegida en los sitios I y III. (C) Perfil de la hebra de ADN y del complejo. En el eje X se representa la longitud de la hebra y en el eje Z, la altura, ambos en nm. Los dos picos muestran la altura de los sitios I y III de la imagen de la izquierda. Las distancias de los extremos se representan mediante una línea punteada naranja y la distancia que cubre cada uno de los complejos mediante líneas azules. Sitio ISitio I A Sitios III y I 0 415 2 1.5 1 0.5 0 Sitio III Sitio I X (nm) Z (n m ) 229 nm109 nm 9 nm 18 nm B C 401 Sitios III y ISitios III y I 0 415 2 1.5 1 0.5 0 Sitio III Sitio I X (nm) Z (n m ) 229 nm109 nm 9 nm 18 nm 0 415 2 1.5 1 0.5 0 Sitio III Sitio I X (nm) Z (n m ) 229 nm109 nm 9 nm 18 nm B C 401 Resultados 153 No obstante, en esta muestra, el ruido de fondo impedía establecer unas medidas fiables de la altura (eje Z). Para ello, era necesario obtener una muestra con poco ruido de fondo, como en el caso de la Figura 64A. En esta imagen se puede observar la sonda PNL protegida por BzdR en la región I, sobre un fondo bastante homogéneo. Por ello, al hacer el perfil indicado con una línea azul, se pudo determinar una altura más homogénea, la cual se encontraba en torno a 3 nm en el caso de los complejos del sitio I, y en torno a 1.7 nm en el caso del ADN desnudo (Figura 64B). Además, este complejo parece dividirse en dos porciones en la imagen, lo que se traduce en dos picos en la gráfica, sugiriendo que, en este caso, en el sitio I se encuentran unidos dos dímeros de BzdR. Además, a lo largo de todos los análisis realizados, se pudo encontrar una estructura más compacta que el resto, que se repetía con cierta frecuencia, por lo que se llevó a cabo un análisis más detallado de su estructura y de las regiones protegidas por BzdR. Mientras la altura promedio de la proteína en los complejos lineales era de 1.2 ± 0.2 nm (N = 12, siendo “N” el número de imágenes analizadas) sobre la altura de la hebra de ADN, la de estas superestructuras era de 2.3 ± 1.1 nm (N = 14). De esta forma, cabía la posibilidad de que el ADN rodeara a la proteína en forma de horquilla o en forma de lazo. Para tratar de elucidar este punto, se midió la longitud de los brazos emergentes de estas superestructuras obteniendo unos valores de 108.9 ± 20 nm y 199.9 ± 44.2 nm (N = 16). Estos valores fueron menores que los esperados para las distancias Figura 64. (A) Imagen de la sonda PNL siendo protegida por BzdR en el sitio I. La línea azul muestra el perfil llevado a cabo en la gráfica de la derecha. (B) Perfil de la hebra de ADN y del complejo. En el eje X se representa la longitud de la hebra y en el eje Z, la altura, ambos en nm. La línea azul representa la sección perfilada de la imagen de la izquierda. Los dos primeros picos indican la altura en el sitio I (∼3 nm) donde se encuentra unida la proteína BzdR. El tercer pico indica la altura del ADN (∼1.7 nm). Sitio I X (nm) 900 Z (n m ) A B Sitio I Sitio I X (nm) 900 Z (n m ) A B Sitio I Resultados 154 desde la región III (121 nm) y la región I (233 nm), pero la diferencia fue más notable en el caso del extremo de la región I. Si se asume que la unión [proteína]:[ADN] sigue un modelo de horquilla (Figura 65A), la longitud total de la sonda PNL se reduce en un promedio de un 18%. Sin embargo, si la longitud del perfil es trazada en forma de lazo alrededor del complejo de proteína (Figura 65B), la longitud total de la sonda PNL se reduce sólo en un 4%, con un valor promedio de 398.6 ± 28.9 nm (N = 14), que es más aproximado a la distancia esperada de la sonda PNL (416 nm). La longitud del lazo trazado en el exterior de la superestructura, asumiendo que el ADN rodea a la proteína, es de 99.4 ± 14 nm (N = 14), lo que indica que, dada su localización con respecto a los extremos, contiene las tres regiones de unión I, II y III. Figura 65. Imagen de un complejo con superestructura. (A) Modelo de unión tipo horquilla. (B) Modelo de unión tipo lazo. En ambas imágenes se han detallado las distancias tanto de los brazos, como del lazo u horquilla. .. Figura 66. Imagen de un complejo con superestructura y su correspondiente perfil de altura. La línea verde de la imagen se corresponde con el perfil trazado en la gráfica inferior. En dicha gráfica, en el eje X se representa la longitud de la hebra y en el eje Z, la altura, ambos en nm. El primer pico se corresponde con la superestructura y el segundo pico, con el ADN. 86 nm 206 nm 104 nm B 86 nm 206 nm 104 nm B 86 nm 206 nm 74 nm A 86 nm 206 nm 74 nm A Resultados 155 Adicionalmente, se midió la anchura de estas superestructuras a la mitad de su altura, tal y como se muestra en la Figura 66, obteniéndose un valor de 26.9 ± 6 nm (N = 10). Esta anchura, dado que la altura del dímero de BzdR está en torno a los 5 nm, según la estructura obtenida por microscopía electrónica, sería compatible con 5 dímeros de BzdR. Finalmente, se trató de determinar el efecto del benzoil-CoA, inductor de la transcripción, en la formación de los complejos sobre la sonda PNL. Para ello, se llevaron a cabo ensayos de unión con la sonda PNL y BzdR a una relación 1:42, en presencia de benzoil-CoA 2 mM y en presencia de benzoato 2 mM (utilizado como control negativo). Figura 67. (A) Sonda PNL + BzdR. (B) Sonda PNL + BzdR + benzoato. (C) Sonda PNL + BzdR + benzoil-CoA. En todos los casos, las flechas blancas señalan los complejos de las diversas hebras visibles en cada uno de los campos. AA BB CC PPNNL + BzdRL + BzdR PPNNL + BzdR + L + BzdR + BzBz PPNNL + BzdR + L + BzdR + BzBz--CoACoA Resultados 156 Como se puede observar en la Figura 67, al añadir benzoil-CoA se apreciaba una disminución del número de complejos, mientras que en presencia de benzoato, esto no sucedía. Aunque este experimento no pudo realizarse de forma cuantitativa con un número representativo de imágenes, los datos obtenidos son consistentes con los datos obtenidos mediante ensayos bioquímicos, y apoyan el modelo de interacción [ADN]:[proteína] que será discutido en el apartado de Discusión. 157 DDIISSCCUUSSIIÓÓNN 158 Discusión 159 DDIISSCCUUSSIIÓÓNN DDiissccuussiióónn 11.. EEssttuuddiioo ddee llaa rreegguullaacciióónn ddeeppeennddiieennttee ddee ooxxííggeennoo ddee llaa rruuttaa ddee ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. Uno de los primeros objetivos de esta tesis fue el estudio de la regulación sobreimpuesta del cluster de degradación anaeróbica de benzoato (bzd) mediada por oxígeno en la β-proteobacteria Azoarcus sp. CIB. Previamente, ya había sido descrita la regulación de este cluster mediada por la proteína BzdR (Barragán et al., 2005), pero posteriormente se pudo comprobar y demostrar la existencia de una regulación adicional mediada por oxígeno. 11..11 PPaappeell ddeell ooxxííggeennoo eenn llaa eexxpprreessiióónn ddee ggeenneess ddeell ccaattaabboolliissmmoo aannaaeerróóbbiiccoo ddee ccoommppuueessttooss aarroommááttiiccooss.. El papel del oxígeno en la represión de la expresión de los genes involucrados en rutas de degradación de compuestos aromáticos ya ha sido estudiado previamente. Por ejemplo, cabe destacar el operón badDEFG de la α-proteobacteria Rhodopseudomonas palustris, que codifica las 4 subunidades de la benzoil-CoA reductasa, cuya expresión se ve drásticamente reprimida en condiciones de crecimiento aeróbicas (Egland & Harwood, 1999). De igual forma, la síntesis de benzoil-CoA reductasa de la β- proteobacteria Thauera aromatica se encuentra totalmente reprimida en presencia de oxígeno (Boll & Fuchs, 1995), al igual que ocurre con los genes bss que codifican la enzima benzilsuccinato sintasa, implicada en la degradación de tolueno del microorganismo Magnetospirillum magnetotacticum TS-6, cuya transcripción únicamente tiene lugar en cultivos anaeróbicos. Sin embargo, en la literatura existen algunos casos en los que los genes que codifican enzimas sensibles a oxígeno, como es el caso de la benzoil-CoA reductasa de M. magnetotacticum TS-6 (genes bcr) (Shinoda et al., 2005b) y de la benzilsuccinato sintasa de T. aromatica DNT-1 (genes bss) (Shinoda et al., 2005b), son transcritos no solo bajo condiciones anaeróbicas, sino también en cultivos de células creciendo aeróbicamente en presencia de benzoato y tolueno, respectivamente. Discusión 160 Por lo tanto, parece que cada organismo ha desarrollado una particular estrategia de regulación para controlar la expresión de aquellos genes implicados en el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos. En el caso del cluster bzd de Azoarcus sp. CIB serían imprescindibles dos condiciones, al menos, para que tenga lugar la transcripción de los genes de la ruta de degradación anaeróbica de benzoato: la presencia de benzoato y la ausencia de oxígeno. En cualquier otra situación, dicha expresión no tendrá lugar, como se verá más adelante. 11..22 LLaa pprrootteeíínnaa FFnnrr ssee uunnee aall pprroommoottoorr PPNN yy eess nneecceessaarriiaa eenn ssuu aaccttiivvaacciióónn ttrraannssccrriippcciioonnaall.. Tal y como ha quedado demostrado en el apartado de “Resultados”, la proteína Fnr es capaz de unirse al promotor PN, siendo imprescindible su unión para que tenga lugar la activación del promotor y así la consecuente transcripción del cluster bzd. Igualmente, se ha podido establecer que la región donde se une la proteína Fnr queda centrada en la posición -41.5 desde el inicio de la transcripción y se solapa con la caja - 35, lo que caracteriza al promotor PN como el típico promotor dependiente de Fnr de clase II (Guest, 1996; Rhodius & Busby, 1998). Inicialmente las secuencias de unión consenso de Fnr centradas entre las posiciones -39.5 y -42.5 fueron postuladas como las responsables de que tuviera lugar la expresión del operón badDEFG (Egland & Harwood, 1999) y del gen hbaR (Egland & Harwood, 2000) en R. palustris. Sin embargo, los resultados obtenidos en esta tesis ofrecen la primera evidencia experimental de que dicha secuencia consenso de unión a Fnr está involucrada también en la activación de un promotor (PN) responsable de la expresión de los genes que codifican proteínas del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos en Azoarcus sp. CIB. Los mecanismos mediante los cuales operan este tipo de promotores de clase II parecen indicar que actúan por medio de interacciones proteína-proteína con la RNAP (Busby & Ebright, 1999; Rhodius & Busby, 1998). Y así parece que sucede en los resultados obtenidos en los ensayos de protección frente a digestión con DNasa I sobre la sonda PN en presencia de ambas proteínas, Fnr y RNAP. En este sentido, tanto la distancia de 19 pares de bases que separan las secuencias -10 (TAACAT) y -35 (TCAACA) del promotor PN, ligeramente superior a los 17 pares de bases esperados en una secuencia consenso típica de los promotores σ70, como el hecho de que la caja -35 sea parcialmente diferente respecto de la secuencia consenso, podrían explicar la Discusión 161 necesidad de la proteína Fnr en la correcta formación del complejo cerrado RNAP::PN, imprescindible para que dé comienzo el proceso de transcripción (Figura 68). En los resultados in vitro obtenidos mediante retardo en gel y footprinting se pudo apreciar como el aumento de la concentración de RNAP derivaba en una mayor protección a ambos lados del lugar de unión de la proteína Fnr, lo que sugería que existía la posibilidad de interacción entre ambas proteínas. La protección upstream respecto del sitio Fnr podría atribuirse al dominio αCTD de la RNAP, tal y como se ha sugerido en los estudios de este tipo de promotores de clase II dependientes de Fnr, donde la subunidad αCTD de la RNAP se une al surco menor del ADN, en torno a la posición -61, inmediatamente upstream de la región protegida por el dímero de Fnr, dando lugar a una interacción que contribuye a la activación del promotor (Attey et al., 1994; Busby & Ebright, 1999; Kolb et al., 1993; Wing et al., 2000). Por otro lado, la protección downstream respecto del sitio Fnr podría deberse a la subunidad σ70 de la RNAP, tal y como se desprende de estudios previos en los que se ha identificado una pequeña región el dominio C-terminal de la subunidad σ70 de la RNAP (residuos de los aminoácidos 590-603) que es necesario para que tenga lugar la activación dependiente de Fnr en determinados promotores (Lonetto et al., 1998). Esta región contiene en su secuencia un residuo ácido (E591) y seis residuos básicos (K593, R596, K597, R599, H600 y R603), los cuales, al ser sustituidos, dan lugar a una disminución drástica de la activación de la transcripción dependiente de Fnr (Bell & Busby, 1994; West et al., 1993). Los resultados obtenidos en este caso mostraron que, en dos de los tres mutantes Figura 68. Modelo de los promotores de clase II dependientes de Fnr. Los promotores dependientes de Fnr presentan un sitio de reconocimiento para la proteína Fnr centrada en la posición -41.5 respecto del punto de inicio de la transcripción (+1). La superficie AR-1 de Fnr (cuadrado negro) hace contacto con el dominio αCTD de la RNAP. La superficie AR-2 de Fnr (triángulo negro) hace contacto con el dominio αNTD de la RNAP. La superficie AR-3 de Fnr (círculo negro) hace contacto con la subunidad σ70 de la RNAP. También se muestran las subunidades β y β’ de la RNAP, así como las cajas -10 y -35 del promotor dependiente de σ70. -41.5 σ70 β/β´FnrαCTD αNTD -35 -10 +1-41.5 σ70 β/β´FnrαCTD αNTD -35 -10 +1 Discusión 162 ensayados, las sustituciones de lisina por alanina de las posiciones 593 (KA593) y 597 (KA597) de la subunidad σ70, redujeron la actividad del promotor PN in vivo (Figura 11). Estos resultados, sumados a los ya obtenidos previamente en los estudios realizados con promotores dependientes de Fnr pnarG y pdmsA en E. coli (Lonetto et al., 1998), sugieren que el contacto Fnr-σ70 juega un papel crucial en la activación del promotor PN de clase II dependiente de Fnr. Por otro lado, los ensayos de transcripción in vitro demostraron que Fnr es totalmente imprescindible en el inicio de la transcripción del promotor PN, en algún paso posterior a la formación del complejo cerrado RNAP::PN, así como en la formación del complejo abierto, como se puede apreciar en los ensayos de footprinting con KMnO4. En este aspecto, ya ha sido demostrado que Fnr, al igual que otros miembros de la superfamilia Fnr/Crp como el propio Crp, es el responsable de activar la transcripción en determinados promotores de clase II dependientes de Fnr, promoviendo el paso de un complejo cerrado transcripcionalmente inactivo a un complejo abierto transcripcionalmente activo (Tagami & Aiba, 1998; Wing et al., 2000). Estos resultados in vitro fueron totalmente congruentes con los experimentos de transcripción realizados in vivo, demostrando que Fnr es crucial e imprescindible para que tenga lugar la activación del promotor PN y sugiriendo que la ausencia de expresión del promotor PN en condiciones aeróbicas es debida a la incapacidad de la proteína Fnr de dimerizar y por tanto de unirse a su sitio de reconocimiento en el promotor. Con el fin de profundizar en el estudio de la regulación sobreimpuesta, se procedió a identificar el gen ortólogo de Fnr en Azoarcus sp. CIB, así como su función en relación al promotor PN. 11..33 EEll oorrttóóllooggoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB ddee FFnnrr ddee EE.. ccoollii eessttáá iinnvvoolluuccrraaddoo eenn llaa aaccttiivvaacciióónn ddeell pprroommoottoorr PPNN.. Puesto que el genoma de Azoarcus sp. EbN1 está secuenciado (Rabus et al., 2005), se procedió a la búsqueda del gen ortólogo de fnr (ebA5149) en el genoma de esta bacteria. De esta forma, se consiguió localizar un gen ortólogo entre los genes hemN (ebA5151), que codifica una coproporfirinógeno III oxidasa, y ebA5146, gen huérfano de función desconocida (Figura 15). Con esta información se pudo obtener por medio de PCR el gen ortólogo de fnr en Azoarcus sp. CIB, bautizado con el nombre de acpR. La asociación de los genes fnr y hemN ya ha sido descrita previamente en otros organismos (Korner et al., 2003). Discusión 163 El gen acpR codifica una proteína de 248 aminoácidos que debe ser incluida en la superfamilia de reguladores transcripcionales Fnr/Crp, debido a la elevada similitud que presenta con determinadas proteínas pertenecientes a dicha superfamilia, tal y como se muestra en la Tabla 7. La construcción de una cepa mutante portadora de una interrupción por inserción en el gen acpR (Azoarcus sp. CIBdacpR), incapaz de crecer anaeróbicamente en diversos compuestos aromáticos, como benzoato, fenilacetato o 4- hidroxibenzoato, pero sí aeróbicamente, parece indicar que el gen acpR está efectivamente implicado de alguna forma en la regulación de la degradación de benzoato en Azoarcus sp. CIB. Cuando dicha cepa mutante fue complementada con el gen acpR y fue capaz de crecer anaeróbicamente en diversos compuestos aromáticos, quedó confirmada la implicación de AcpR en el proceso de regulación de la degradación de benzoato. Posteriormente, se logró establecer una relación directa entre la proteína AcpR y la actividad del promotor PN, mediante la construcción de una cepa que incluyera la mutación en acpR y la fusión traducional PN::lacZ (Azoarcus sp. CIBdacpR (pBBR5PN)), la cual nunca mostró niveles significativos de actividad β-galactosidasa tras ser crecida tanto aeróbica como anaeróbicamente en benzoato, a diferencia de lo observado con la cepa no mutada (Azoarcus sp. CIB (pBBR5PN)) que sí mostró unos niveles significativos de actividad β-galactosidasa al ser crecida anaeróbicamente en benzoato (Figura 16B). Todos estos datos señalan a AcpR como un activador transcripcional imprescindible en la actividad del promotor PN, cuando Azoarcus sp. CIB es crecido en benzoato bajo condiciones anaeróbicas (Figura 69). En este sentido, el papel fisiológico de AcpR en la regulación en respuesta a oxígeno de la degradación de compuestos aromáticos en Azoarcus sp. CIB parece ser equivalente a la función llevada a cabo por el regulador AadR, otro miembro de la superfamilia Fnr/Crp, en el microorganismo R. palustris (Dispensa et al., 1992; Egland & Harwood, 1999; Egland & Harwood, 2000). Finalmente, un análisis filogenético de la proteína AcpR obtenido por medio de alineamiento múltiple de la secuencia de aminoácidos reveló hasta un 43% de identidad con la proteína Fnr de E. coli. Curiosamente, si bien AcpR y AadR juegan papeles muy similares a nivel fisiológico en la célula, tan solo muestran una identidad del 34% en su secuencia de aminoácidos, e incluso, la proteína AadR ha sido clasificada en el grupo FnrN, el cual no pertenece a la superfamilia Fnr/Crp (Korner et al., 2003). Discusión 164 La proteína Fnr de E. coli presenta cuatro residuos de cisteína (Cys-20, -23, -29 y - 122) que contribuyen a la formación de un complejo ferro-sulfuroso [4Fe-4S]2+ esencial en la dimerización (y consecuente activación) de Fnr en ausencia de oxígeno (Green et al., 1996). Estos cuatro residuos de cisteína se encuentran perfectamente conservados en la proteína AcpR de Azoarcus sp. CIB (Cys-18, -21, -27 y -120), pero no en AadR de R. palustris, en la cual únicamente se conservan dos de estos residuos (Cys-20 y -116) (Figura 17A). Por otro lado, las regiones de activación AR-1, AR-2 y AR-3 involucradas en la interacción de la proteína Fnr con las subunidades αCTD, αNTD y σ70-CTD de la RNAP, respectivamente (de Lorenzo & Timmis, 1994b; Lamberg et al., 2002; Weber et al., 2005; Williams et al., 1997), se encuentran conservadas en AcpR y esta vez, también en AadR, si bien en esta última existe una escasa conservación en la secuencia de aminoácidos de la región AR-1. Posteriormente, se generó un modelo tridimensional de la proteína AcpR de Azoarcus sp. CIB utilizando como molde la estructura tridimensional de la proteína CRP de E. coli (Figura 17B). Tras comparar este modelo obtenido de la proteína AcpR con el modelo previamente obtenido para la proteína Fnr de E. coli (Lamberg & Kiley, 2000), se pudo determinar la localización exacta de las regiones AR-1, AR-2 y AR-3 de AcpR, así como del motivo hélice-giro- BzdR BzdA 3-hidroxi pimelil-CoA BzdNOPQMSTUVWXYZ bzdNOPQMSTUVWXYZ bzdA (+) COSCoACOO- Benzoato Benzoil-CoA (-) PR PNbzdR COSCoA COO-HO COSCoA AcpR (-O2) (+) O2 AcpR (+O2) BzdR BzdA 3-hidroxi pimelil-CoA BzdNOPQMSTUVWXYZ bzdNOPQMSTUVWXYZ bzdA (+) COSCoACOSCoACOO-COO- Benzoato Benzoil-CoA (-) PR PNbzdR COSCoA COO-HO COSCoACOSCoA COO-COO-HOHO COSCoACOSCoA AcpR (-O2) (+) O2 AcpR (+O2) Figura 69. Organización y regulación del cluster bzd de Azoarcus sp. CIB. Los genes se encuentran agrupados en dos operones, el operón regulador bzdR (rojo) y el operón catabólico bzdNOPQMSTUVWXYZ (azul), controlados por los promotores PR y PN, respectivamente. El promotor PN es reprimido por la proteína BzdR (elipse roja). La activación del promotor PN se produce por medio de la molécula inductora, el benzoil-CoA, que se une a BzdR. En la zona inferior se muestra la regulación sobreimpuesta mediada por la proteína AcpR, que activa al promotor PN cuando se encuentra en ausencia de oxígeno. Los símbolos (-) y (+) indican represión y activación transcripcional, respectivamente. Discusión 165 hélice (HTH) (Aravind et al., 2005) implicado en el reconocimiento de ADN (Figura 17B). No obstante, a pesar de la elevada similitud entre Fnr y AcpR, ambas proteínas no presentan las mismas funciones reguladoras en el interior de la célula. Por ejemplo, un mutante de E. coli incapaz de expresar la proteína Fnr da lugar a un efecto pleiotrópico en la expresión de más de 100 genes (Korner et al., 2003), entre los que cabe destacar aquellos que codifican proteínas necesarias para crecer utilizando nitrato o fumarato como aceptor final de electrones (Unden et al., 1995). De hecho, la proteína Fnr* fue capaz de suplir la actividad de la proteína AcpR sobre el promotor PN, no solo en E. coli como ya ha sido demostrado, sino también en la cepa mutante Azoarcus sp. CIBdacpR (pIZ-Fnr*), la cual mostró una curva de crecimiento similar a la cepa silvestre al ser crecida en condiciones anaeróbicas, utilizando benzoato como fuente de carbono. Además, cuando el plásmido pIZ-Fnr* fue expresado en la cepa Azoarcus sp. CIB lacZ en condiciones aeróbicas y se midió su actividad β-galactosidasa, los niveles de expresión de la fusión PN::lacZ no mostraron diferencias significativas en las células crecidas en piruvato, pero mostraron una expresión 5 veces superior en las células crecidas en piruvato más benzoato. Este hecho constituye el primer ejemplo de cómo la expresión de una ruta anaeróbica de degradación de compuestos aromáticos puede ser transformada en una ruta aeróbica únicamente mediante el cambio de una proteína clave a nivel de regulación. Al contrario de lo sucedido con la proteína Fnr, cuando un mutante de Azoarcus sp. CIB era incapaz de expresar la proteína AcpR, no veía afectada su capacidad de crecimiento anaeróbico al utilizar nitrato como aceptor final de electrones o al utilizar fuentes de carbono no aromáticas tales como succinato, acetato o malato, pero sí veía alterada su capacidad de metabolizar compuestos aromáticos que implicaran la ruta del benzoil-CoA. Por lo tanto, parece que el papel fisiológico de AcpR se centra exclusivamente en la regulación a nivel transcripcional del cluster bzd, en lugar de intervenir en procesos globales de regulación, tal y como hacen otros miembros del grupo Fnr (Korner et al., 2003), por lo que la proteína AcpR puede ser considerada como un regulador de la ruta central del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos en Azoarcus (aromatic central pathway Regulator). Discusión 166 Figura 70. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de 7 proteínas de la superfamilia Fnr/Crp cuyos genes están presentes en el genoma de Azoarcus sp. EbN1. A la izquierda se indica en nombre del gen que codifica cada una de las proteínas alineadas. Los números de acceso de las secuencias alineadas son los siguientes: dnrD1 YP_157133.1, nnr YP_157619.1, dnrE YP_159000.1, nnrR YP_159618.1, dnr YP_159949.1, fnr YP_159953.1, crp YP_161022.1. Los residuos de cada una de las secuencias están numerados a la derecha. Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa de alineamiento múltiple ClustalW2. Los aminoácidos han sido representados mediante el código de una letra y los cuatro colores en que se muestran representan el grupo de aminoácidos al que pertenecen: rojo = apolares; verde = polares sin carga; azul = ácidos; rosa = básicos. En la zona inferior del alineamiento, un asterisco (*) significa que los residuos de esa posición son idénticos en todas las secuencias; dos puntos (:) significan que existen sustituciones conservadas, acordes con el código de colores mencionado anteriormente; un punto (.) significa que existen sustituciones semi- conservadas. Por último, se ha sombreado en color gris la región que incluye el motivo HTH en cada una de las secuencias. MPRIACSPGTRGETLSSTACPAIGQEHAETERLCRLLVHVPLLSGFSPAEIARFAHGVRE 60 MP----NP---------------------TADIPTLLRQISFFSELSADDIDRVARYTRE 35 MATAIHPP------------------------AFQSLSCLEPFSSLDPATLQRLSRGVRV 36 MTQP-------------------------TAVSTTALKTFSLFQGLSDDTLATVSRLAMM 35 MTTP------------------------HTPELARLAHRYPVIATLPESARHRLFETARW 36 --------------------------------MADRMAGLELFSTLGSSDLACLARGARH 28 MQMKATVP--------------ITVASLKVACSQCNLVELCLPFGMSENEIDRLDELVGA 46 : . . . Q-NVDRGCVVFHKGDPCHGFHLVLAGQVKLAFTSAEGHEKVIEIILPGQ--TFGEAVMFM 117 R-TLEKGEVLFQRGDPVHGFFFVVSGQMKLAVSSAQGNEKVVEIISPMN--SFGEAVMFL 92 C-RASRGEMLMHRGARPAGMYAVVEGEVKLFLISSAGAEKIVRLAGRGE--SFCEENILS 93 R-RIPRGQSVVHAGERCDFVYLVLTGSLKVVVSDEDGREVILTILGQGE--LFGEMSMFG 92 A-RVPAGALLFDDHQACEGFPFVVEGSVRVVKCAPNGRELPLYRVAAGETCIISSSCLLG 95 R-HLGPGKPLWRAGERAAHFAVIESGIIEIRQTTLTGDGVVVGLFRTGE--AVGLAAVLE 85 RRKIKRQHHLYRAGDPFEAIYAIRAGSFKTNVLLEDGREQVTGFQMTGE--MLGLDGIS- 103 : . : * .. * : . : DKPYVVMAQALT-DCKLLHISKSVVFDEMDRDPVFCRKIIAGLSHRLHHLIADVETYSLR 176 NRPYPVFAEGLV-ATRLLHIGQAVVSDLIDQDSSFARKLLAGMAIRLHSMIQDVEIYSLR 151 DTPQTLAAQATR-DSVVLHLQRPALQTAMAAHPSLTQALMARLSQRMGELVEGMEQCIQR 152 EQPRSATVVAVM-PSDLVMIAKNDFRTILQGNFEVAWRIMANLADRLRSADRKIESLALM 151 HEDYNARGIAES-DTVLMLLPKAEFDALLG-EPAFRNFVFHLFAERIADLMQLIEEVAFH 153 HGLFPADAIAIGGAVDVLSIRADALQEALETSVTVGFAINRALLQHTAALRAKIDIVSAG 145 TELHSCNAIALE-DSEVCVIAYGKLEELSRVVEGLQHQFHKVMSREIVRDHGVMTLLGSM 162 . : : . . . : . : SGRERIVGYLLRQEEIDGEPRTNGYVSVRLPTSKGTIASRLNLTQEHFSRILHELIEAGL 236 SSTQRVIGYLLQQVEQDG---ATGARDIQLPTSKQVIASRLNLTPETLSRIFHDLVNAGL 208 SSTQRVAHYLVQHADCSAP-----HAEVRLSCDKQTIASQLNLTPETFSRVLNRLTRDGI 207 DVYGRVARLLLEMSEEVNG-----AVVVVRKITKQDIAKMIGASREMVSRVMKDLAAQGL 206 RLDQRLAGQLLGKG-------------RVLHVTHQQLADELGSVREFISRLLKGFAAQGL 200 SVPRRLAALMIYLIERFGRPTGAEAVVVEVNLSREEISQLVSARAETVIRILSRWQKAGW 205 RAEERLAAFLLNMSQRFTAR-GFSAAEFHLRMTREEIGSYLGLKLETVSRAFSKFQEEGL 221 *: :: : :.. :. * . * : * ICVEG-RTIHIPDIEKLRTTQGQF---- 259 ITVHG-KHIALHDPVGLAHYQG------ 229 IVPRGRRSITLTDLRSLQSIAA------ 229 IEETG-AGIVLRDRLQSV---------- 223 VKLSR-EQIEILDPAGLRRMASEGRHE- 226 LTSRP-GGMEITRADMLRRILDT----- 227 IAVQQ-KHIRILNICGLKKLIHHPSPRG 248 : : : dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr MPRIACSPGTRGETLSSTACPAIGQEHAETERLCRLLVHVPLLSGFSPAEIARFAHGVRE 60 MP----NP---------------------TADIPTLLRQISFFSELSADDIDRVARYTRE 35 MATAIHPP------------------------AFQSLSCLEPFSSLDPATLQRLSRGVRV 36 MTQP-------------------------TAVSTTALKTFSLFQGLSDDTLATVSRLAMM 35 MTTP------------------------HTPELARLAHRYPVIATLPESARHRLFETARW 36 --------------------------------MADRMAGLELFSTLGSSDLACLARGARH 28 MQMKATVP--------------ITVASLKVACSQCNLVELCLPFGMSENEIDRLDELVGA 46 : . . . Q-NVDRGCVVFHKGDPCHGFHLVLAGQVKLAFTSAEGHEKVIEIILPGQ--TFGEAVMFM 117 R-TLEKGEVLFQRGDPVHGFFFVVSGQMKLAVSSAQGNEKVVEIISPMN--SFGEAVMFL 92 C-RASRGEMLMHRGARPAGMYAVVEGEVKLFLISSAGAEKIVRLAGRGE--SFCEENILS 93 R-RIPRGQSVVHAGERCDFVYLVLTGSLKVVVSDEDGREVILTILGQGE--LFGEMSMFG 92 A-RVPAGALLFDDHQACEGFPFVVEGSVRVVKCAPNGRELPLYRVAAGETCIISSSCLLG 95 R-HLGPGKPLWRAGERAAHFAVIESGIIEIRQTTLTGDGVVVGLFRTGE--AVGLAAVLE 85 RRKIKRQHHLYRAGDPFEAIYAIRAGSFKTNVLLEDGREQVTGFQMTGE--MLGLDGIS- 103 : . : * .. * : . : DKPYVVMAQALT-DCKLLHISKSVVFDEMDRDPVFCRKIIAGLSHRLHHLIADVETYSLR 176 NRPYPVFAEGLV-ATRLLHIGQAVVSDLIDQDSSFARKLLAGMAIRLHSMIQDVEIYSLR 151 DTPQTLAAQATR-DSVVLHLQRPALQTAMAAHPSLTQALMARLSQRMGELVEGMEQCIQR 152 EQPRSATVVAVM-PSDLVMIAKNDFRTILQGNFEVAWRIMANLADRLRSADRKIESLALM 151 HEDYNARGIAES-DTVLMLLPKAEFDALLG-EPAFRNFVFHLFAERIADLMQLIEEVAFH 153 HGLFPADAIAIGGAVDVLSIRADALQEALETSVTVGFAINRALLQHTAALRAKIDIVSAG 145 TELHSCNAIALE-DSEVCVIAYGKLEELSRVVEGLQHQFHKVMSREIVRDHGVMTLLGSM 162 . : : . . . : . : SGRERIVGYLLRQEEIDGEPRTNGYVSVRLPTSKGTIASRLNLTQEHFSRILHELIEAGL 236 SSTQRVIGYLLQQVEQDG---ATGARDIQLPTSKQVIASRLNLTPETLSRIFHDLVNAGL 208 SSTQRVAHYLVQHADCSAP-----HAEVRLSCDKQTIASQLNLTPETFSRVLNRLTRDGI 207 DVYGRVARLLLEMSEEVNG-----AVVVVRKITKQDIAKMIGASREMVSRVMKDLAAQGL 206 RLDQRLAGQLLGKG-------------RVLHVTHQQLADELGSVREFISRLLKGFAAQGL 200 SVPRRLAALMIYLIERFGRPTGAEAVVVEVNLSREEISQLVSARAETVIRILSRWQKAGW 205 RAEERLAAFLLNMSQRFTAR-GFSAAEFHLRMTREEIGSYLGLKLETVSRAFSKFQEEGL 221 *: :: : :.. :. * . * : * ICVEG-RTIHIPDIEKLRTTQGQF---- 259 ITVHG-KHIALHDPVGLAHYQG------ 229 IVPRGRRSITLTDLRSLQSIAA------ 229 IEETG-AGIVLRDRLQSV---------- 223 VKLSR-EQIEILDPAGLRRMASEGRHE- 226 LTSRP-GGMEITRADMLRRILDT----- 227 IAVQQ-KHIRILNICGLKKLIHHPSPRG 248 : : : dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr dnrD1 dnr dnrE crp nnr nnrR fnr Discusión 167 Este análisis sumado a los datos ofrecidos por la proteína AadR de R. palustris, la cual juega un papel similar en la regulación de la expresión de los genes involucrados en el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos (Dispensa et al., 1992; Egland & Harwood, 1999; Egland & Harwood, 2000), sugiere que este tipo de especialización está presente en diferentes grupos de la superfamilia Fnr/Crp, lo cual podría establecerse como un principio general de aquellos organismos capaces de degradar compuestos aromáticos tales como Azoarcus (Rabus et al., 2005) y R. palustris (Larimer et al., 2004), ambos poseedores de un significativo número de reguladores Fnr/Crp. A modo de ejemplo, cabe destacar el organismo Azoarcus sp. EbN1, en cuyo genoma se han encontrado hasta siete genes que codifican posibles reguladores transcripcionales pertenecientes a la superfamilia Fnr/Crp, entre los que se encuentran: una proteína Fnr-like (AcpR), una proteína Crp-like, tres proteínas Dnr-like y dos proteínas Nnr-like (Rabus et al., 2005). Estos siete reguladores fueron sometidos a un alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos correspondientes a los motivos HTH, obteniéndose diferencias significativas entre todos ellos (Figura 70), las cuales eran congruentes con la afirmación de que cada uno de los miembros de esta superfamilia se ha adaptado de forma más o menos específica para cumplir un papel muy concreto a nivel fisiológico. Discusión 168 DDiissccuussiióónn 22.. EEssttuuddiioo ddeell pprroommoottoorr PPRR ddeell ggeenn bbzzddRR yy ssuu iimmpplliiccaacciióónn eenn llaa rreegguullaacciióónn ddee llaa ddeeggrraaddaacciióónn aannaaeerróóbbiiccaa ddee bbeennzzooaattoo eenn AAzzooaarrccuuss sspp.. CCIIBB.. Los reguladores transcripcionales que controlan la expresión de promotores catabólicos de rutas de degradación de compuestos aromáticos suelen controlar también su propia expresión (Diaz & Prieto, 2000; Tropel & van der Meer, 2004) (Carmona, 2008). Sin embargo, no parecen existir estudios sobre la autorregulación de reguladores transcripcionales que controlen la expresión de rutas anaeróbicas de degradación de compuestos aromáticos. Con objeto de profundizar en el estudio de estos procesos de autorregulación en rutas de catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos, se procedió al estudio de la regulación del promotor PR del gen bzdR en Azoarcus sp. CIB. 22..11 BBzzddRR ssee uunnee aa ssuu pprrooppiioo pprroommoottoorr PPRR yy aauuttoorrrreegguullaa ssuu pprrooppiiaa eexxpprreessiióónn.. En el apartado “Resultados” se ha podido demostrar, tanto in vivo como in vitro, como la proteína BzdR era capaz de unirse a su propio promotor PR y reprimir así su expresión, revelando incluso un patrón de inducción dependiente de benzoil-CoA muy similar a la regulación previamente estudiada entre BzdR y el promotor PN en Azoarcus sp. CIB (Barragán et al., 2005). Además, se localizó la posición +1 del inicio de la transcripción del gen bzdR a 39 pb upstream del codón ATG de iniciación, así como las cajas -10 (CACTAT) y -35 (TTGCAA) separadas por 17 pb, que difieren de las cajas consenso en 3 y 2 pb respecto de las cajas consenso (-10 = TATAAT, -35 = TTGACA) reconocidas por la subunidad σ70 de la RNAP de E. coli. Los ensayos de footprinting pusieron de manifiesto la región protegida por BzdR en el promotor PR, que se extendía desde la posición -33 a la +25 e incluía 3 repeticiones GCAC (Figura 22). De esta forma, parece que BzdR protege tanto el sitio de inicio de la transcripción (+1) como la caja -10 del promotor PR, de un modo muy similar a la protección que ejerce sobre el promotor PN (Barragán et al., 2005), lo que sugiere que ambos promotores, PN y PR, utilizan el mismo mecanismo de represión. Por otro lado, la unión de BzdR al promotor PR parece que induce cambios en la estructura del ADN, tal y como ponen de manifiesto los enlaces fosfodiéster que dan lugar a las bandas de hipersensibilidad a la digestión por DNasa I en los ensayos de footprinting. Este mismo efecto también ha sido observado en la interacción BzdR-PN (Barragán et al., 2005) y quizá esté relacionado Discusión 169 con una distorsión provocada en el ADN por BzdR. No obstante, también se han podido apreciar ciertas diferencias en ambas interacciones, como es el caso de la afinidad de unión de BzdR por cada uno de los promotores. Si bien en los ensayos de footprinting fue necesaria una concentración de 50 nM de proteína purificada His6-BzdR para proteger a la sonda PN (Barragán et al., 2005), en el caso del promotor PR fue necesaria una concentración de 0.5-1 μM de His6-BzdR para obtener niveles semejantes de protección (Figura 21). Estos resultados parecen ser congruentes con la represión moderada (Figura 21) y fuerte (Barragán et al., 2005) ejercida por BzdR sobre los promotores PR y PN, respectivamente. Atendiendo a la estructura del promotor, cabe destacar en primer lugar las tres regiones de unión descritas en el promotor PN, en las que repeticiones de la secuencia TGCA forman parte de los palíndromos de las cajas operadoras (Barragán et al., 2005). Esta arquitectura del promotor PN se asemeja a otra serie de promotores regulados por miembros pertenecientes a la familia de reguladores transcripcionales HTH-XRE, tales como los represores Cro y 434 de los bacteriófagos λ y 434, respectivamente, los cuales también se unen a cortas secuencias repetidas que, en la mayoría de los casos, se localizan dentro de regiones palindrómicas incluidas en los promotores (Cervin et al., 1998; Koudelka & Lam, 1993; Mandic-Mulec et al., 1995; Weickert & Adhya, 1992). Por el contrario, en el promotor PR existe únicamente un operador reconocido por BzdR con una única secuencia TGCA situada entre las posiciones -32 y -29 de la región protegida. Esta diferente estructura a nivel de arquitectura entre los promotores PR y PN podría ser la responsable de la baja eficiencia de unión entre el promotor PR y la proteína BzdR. 22..22 PPaappeell ddeell ooxxííggeennoo eenn llaa eexxpprreessiióónn ddeell ggeenn bbzzddRR.. La presencia o ausencia de oxígeno podría jugar un papel esencial en la expresión del gen bzdR, tal y como sucede con la expresión de los genes del cluster bzd, cuyo promotor PN es inhibido por la presencia de oxígeno (véase sección 1 de la “Discusión”) (Durante-Rodríguez et al., 2006). Sin embargo, los resultados obtenidos al respecto parecían indicar que el promotor PR presentaba semejantes niveles de expresión (o diferencias no muy significativas) tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, por lo que parecía no estar sujeto a una regulación dependiente de oxígeno, indicando que la proteína AcpR no juega ningún papel en la regulación del promotor PR. La expresión aeróbica del gen bzdR podría ser responsable en cierta medida de la ausencia de expresión del operón catabólico bzd cuando las células crecen en presencia de oxígeno, Discusión 170 evitando así expresiones basales que pudieran dar lugar a la producción de determinadas enzimas sensibles a oxígeno tales como la benzoil-CoA reductasa (BzdNOPQ) (López Barragán et al., 2004a). Por otro lado, la presencia simultánea de diferentes fuentes de carbono parece jugar un papel de mayor envergadura en la regulación sobreimpuesta de los clusters de genes que codifican rutas de degradación de compuestos aromáticos (Carmona & Diaz, 2005; Cases & de Lorenzo, 2005; Diaz & Prieto, 2000). Si bien la represión catabólica de genes reguladores ha sido estudiada en rutas de degradación aeróbicas (Canosa et al., 2000; Muller et al., 1996), no ha sido así en los genes reguladores encargados de controlar la expresión de rutas de degradación anaeróbicas de compuestos aromáticos. En este sentido, los resultados obtenidos, tanto por ensayos de β-galactosidasa como por ensayo de RT-PCR en tiempo real, parecen indicar que la expresión del gen bzdR no está sujeta a represión catabólica mediada por ácidos orgánicos, tales como succinato, en Azoarcus sp. CIB. Discusión 171 DDiissccuussiióónn 33.. EEssttuuddiioo ffuunncciioonnaall yy eessttrruuccttuurraall ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. Los reguladores transcripcionales encargados de controlar la expresión de promotores catabólicos de rutas de degradación de compuestos aromáticos han sido ampliamente estudiados tanto a nivel de función como de estructura. Han sido descritos diversos reguladores transcripcionales pertenecientes a distintas familias: LysR, IclR, AraC/XylS, del tipo GntR, etc. (Tropel & van der Meer, 2004). Además, también se han descrito algunos reguladores transcripcionales de tipo activador implicados en el control de rutas de degradación anaeróbica de compuestos aromáticos, como BadR o TdiSR (Tropel & van der Meer, 2004). Sin embargo, no parecen existir estudios a este nivel de ningún regulador transcripcional de tipo represor que controle una ruta de degradación anaeróbica de compuestos aromáticos. En este punto, se profundizará sobre el estudio de la proteína BzdR, el primer represor descrito hasta el momento del catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos (Barragán et al., 2005). 33..11 LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR eessttáá ccoonnssttiittuuiiddaa ppoorr ddooss ddoommiinniiooss ffuunncciioonnaalleess.. Como previamente se ha demostrado, la proteína BzdR presenta una secuencia de 298 aminoácidos y dos dominios, el dominio N-terminal capaz de reconocer y unir ADN por medio de un motivo HTH (residuos 1-90) y el dominio C-terminal capaz de reconocer a la molécula inductora benzoil-CoA (residuos 131-298), ambos unidos por una secuencia linker (residuos 91-130) (Figura 6) (Barragán et al., 2005). Este tipo de arquitectura modular en dos dominios, uno que reconoce y une ADN y otro que reconoce a la molécula inductora unidos por un linker flexible, ya ha sido descrito para diversos reguladores transcripcionales como aquellos pertenecientes a las familias LysR (Schell, 1993), IclR (Molina-Henares et al., 2006) o AraC/XylS (Gallegos et al., 1993; Gallegos et al., 1997). En el caso de la proteína BzdR se ha podido demostrar que ambos dominios, NBzdR y CBzdR, son funcionales tras ser expresados como proteínas independientes, siendo capaces de unir ADN y benzoil-CoA, respectivamente, tal y como se ha demostrado en el apartado de “Resultados”. De esta forma, se pudo establecer que la proteína BzdR poseía una arquitectura modular. Discusión 172 33..22 EEll ddoommiinniioo NNBBzzddRR eess uunn ssuuppeerr--rreepprreessoorr ddeell pprroommoottoorr PPNN.. En el caso del dominio N-terminal de BzdR (NBzdR), los resultados demostraron su capacidad de unirse al promotor PN en los ensayos in vitro con una afinidad algo menor que la obtenida por la proteína BzdR (Figura 27). Cuando los ensayos se realizaron con el dominio N-terminal más el linker (N2BzdR) se pudo observar que la afinidad por la sonda PN en los ensayos in vitro fue superior a la obtenida por NBzdR pero inferior a la obtenida por BzdR (Figura 27). Por otro lado, tanto los ensayos de expresión in vivo como los de transcripción in vitro, indicaron que ambas proteínas, NBzdR y N2BzdR, eran capaces de reprimir la expresión del promotor PN tan eficazmente como lo hacía BzdR (Figura 28). Además, los ensayos de transcripción in vitro en presencia de benzoil-CoA mostraron la incapacidad de la proteína N2BzdR para responder a la presencia del inductor (como cabría esperar al no estar presente el dominio CBzdR que reconoce el benzoil-CoA) (Figura 28B), lo que convierte a este dominio en un super- represor que, una vez unido al promotor PN, es incapaz de permitir su expresión. Posteriormente, y debido a que los reguladores transcripcionales suelen formar multímeros (Gicquel-Sanzey & Cossart, 1982), se llevaron a cabo ensayos para determinar el estado de oligomerización tanto de BzdR como de NBzdR y N2BzdR. Los resultados obtenidos por medio de ultracentrifugación analítica indicaron que las tres proteínas se encontraban en forma dimérica en solución, pero los resultados obtenidos mediante el ensayo de crosslinking parecían indicar una capacidad de dimerización menor en el caso de NBzdR, lo cual sugería un posible papel del linker en la dimerización de BzdR. Estos resultados sugerían que NBzdR era efectivamente un dominio funcional e independiente del dominio C-terminal de BzdR (CBzdR). No obstante, atendiendo a la estructura secundaria con 5 α-hélices del dominio NBzdR (Barragán et al., 2005), no pudo determinarse con mayor precisión la región implicada en la dimerización, ya que al eliminar la quinta α-hélice y obtener la proteína N0 (residuos 1-76), ésta resultó ser totalmente inestable. Este tipo de comportamiento ya ha sido descrito previamente en el represor cI del fago λ, cuyo dominio N-terminal también presenta una estructura con 5 hélices α. Este dominio es estable y funcional por sí solo, salvo si se elimina la quinta hélice α, en cuyo caso la proteína pasa a ser totalmente inestable. Parece por tanto, que NBzdR y el represor cI del fago λ comparten similitudes estructurales. Este tipo de estructura también es compartida con el represor Cro del fago λ (Anderson et al., 1981), el represor Cro del fago 434 (Mondragon et al., 1989a; Discusión 173 Mondragon et al., 1989b), el represor Cro del fago P22 (Sauer et al., 1982) y la proteína Ner del fago Mu (Strzelecka et al., 1995), ya que todos ellos poseen una estructura secundaria conformada por 5 α-hélices. Sin embargo, algunos de ellos son monómeros en solución, como en el caso de las proteínas Cro del fago P22 (Newlove et al., 2004) y Ner del fago Mu (Kukolj et al., 1989), al contrario de lo que sucede con NBzdR. 33..33 EEll lliinnkkeerr ddee BBzzddRR eess nneecceessaarriioo,, ppeerroo nnoo ssuuffiicciieennttee eenn eell pprroocceessoo ddee ddiimmeerriizzaacciióónn.. En el caso de la región linker de BzdR (LBzdR en la Figura 6), y con objeto de determinar su papel en la dimerización y función de la proteína BzdR se analizó, inicialmente, su secuencia de aminoácidos con el fin de hallar aminoácidos clave en el proceso de dimerización. Tal y como se expuso en el apartado 3.2.2.1 de “Resultados”, se llevó a cabo un análisis de la secuencia del linker de BzdR, la cual fue comparada con la base de datos PDB, hallándose una significativa similitud con una región de la enzima formato deshidrogenasa dependiente de NAD+ (Nº de acceso: 2GUG) de Pseudomonas sp. 101, cuya estructura tridimensional ya había sido resuelta (Lamzin et al., 1992). Esta enzima está implicada en la obtención de poder reductor en la célula mediante síntesis de NADH acoplada a la oxidación de formato (Egorov et al., 1979). Además, ha demostrado ser un dímero formado por dos subunidades idénticas que poseen actividad de forma independiente (Popov et al., 1978). Cuando esta enzima fue alineada con el linker de BzdR, se pudieron establecer aquellos residuos conservados entre ambas secuencias (Figura 71). Curiosamente, la región de la formato deshidrogenasa (residuos 159-174) que alineaba con el linker de BzdR, formaba parte de una hélice α (αA) que parecía estar implicada en la dimerización de la enzima (Lamzin et al., 1992). La estructura de esta enzima permitió generar un modelo tridimensional del linker, en el cual se apreciaba una estructura secundaria en hélice α. Asumiendo esta como una posible estructura del linker de BzdR, y teniendo en cuenta que la estructura de la cual se ha obtenido parece estar implicada en procesos de dimerización, cabía especular que el dímero de BzdR se formase a partir de dos monómeros que interactuasen por medio de esta región del linker, de forma que ambas regiones quedasen enfrentadas paralelamente, tal y como se ilustra en el modelo de la Figura 71. De este modo, se hallaron dos residuos que podían estar formando algún tipo Discusión 174 de puente salino clave en el proceso de dimerización de la proteína, el glutámico 111 y la arginina 114. Por ello, se decidieron llevar a cabo 3 mutantes, dos sencillos, que deberían impedir el proceso de dimerización, denominados BzdR3 (E111R) y BzdR4 (R114E), y un tercero con una doble mutación que le permitiera recuperar dicha capacidad de dimerización al establecer el puente salino de forma inversa, denominado BzdR5 (E111R + R114E). En un principio, los resultados obtenidos con el mutante BzdR4 parecían sugerir un papel ciertamente importante del linker en el proceso de dimerización de BzdR, concretamente, del residuo de arginina 114. Cuando dicho residuo era sustituido por otro residuo de glutámico la proteína parecía disminuir drásticamente su capacidad de dimerización, tal y como mostraron los ensayos de crosslinking (Figura 29), donde no se apreciaron formas diméricas, y los ensayos de ultracentrifugación analítica (Tabla 9), donde se observaron mezclas heterogéneas de monómero/dímero con un mayor porcentaje de formas monoméricas (52%). El mutante BzdR5, al contrario de lo esperado, mostró una incapacidad de dimerizar mayor que el Figura 71. (A) Alineamiento de la secuencia del linker de BzdR (LBzdR) con la formato deshidrogenasa de Pseudomonas sp. 101 (FDH). Los aminoácidos han sido representados mediante el código de una letra y los cuatro colores en que se muestran representan el grupo de aminoácidos al que pertenecen: rojo = apolares; verde = polares sin carga; azul = ácidos; rosa = básicos. En la zona inferior del alineamiento, un asterisco (*) significa que los residuos de esa posición son idénticos en todas las secuencias; dos puntos (:) significan que existen sustituciones conservadas, acordes con el código de colores mencionado anteriormente. (B) Modelo de interacción entre las regiones linker de dos monómeros de BzdR. Modelo de estructura secundaria del linker de BzdR donde se muestran los aminoácidos enfrentados entre las dos hélices α. Leu100Leu100 Tyr106Tyr106 Leu107Leu107 His110His110 Glu111Glu111 Arg114Arg114 Leu100Leu100 Tyr106Tyr106 Leu107Leu107 His110His110 Glu111Glu111 Arg114Arg114 LBzdRLBzdR FDHFDH A B 5 LTLLIQYLSRFPPKTHEWARR 25 159 LSLVRNYLP-----SHEWARK 174 *:* ** :*****: Discusión 175 mutante BzdR4, hasta el punto de que no es capaz de formar dímeros en solución, manteniéndose casi en su totalidad en forma de monómero (88%). Teniendo en cuenta que la mutación de BzdR3 (E111R) no parece tener un gran efecto en la dimerización, y que BzdR5 lleva tanto la mutación de BzdR3, como la de BzdR4 (E111R + R114E), se puede inducir que la doble mutación es sinérgica y que ambos residuos probablemente presenten algún tipo de interacción entre sí. Estos datos unidos a la incapacidad de dicho mutante para unirse a la sonda PN en ensayos de retardo en gel (Figura 36), parecían indicar que el estado oligomérico de BzdR era crucial en el reconocimiento y unión del ADN. Estos resultados obtenidos in vivo, aparentemente contradictorios con los resultados obtenidos in vitro, podrían explicarse asumiendo que la población dimérica de moléculas de BzdR4 era, si bien menor que la población monomérica, suficiente para reprimir al promotor PN in vivo, donde existen un limitado número de copias, a diferencia de los ensayos de retardo en gel, donde la sonda de ADN que incluye el promotor PN se encuentra en millones de copias. La represión por parte del mutante BzdR5, puesto que ha demostrado no formar dímeros en solución, podría explicarse por la presencia de ese pequeño porcentaje de forma oligoméricas (12%), las cuales podrían reconocer el promotor PN y reprimirlo, asumiendo el mismo argumento explicado con el mutante BzdR4. No obstante, y debido a la escasa solidez del conjunto de los datos anteriores, se utilizó otro tipo de ensayo, un sistema genético de mono-híbrido desarrollado con el fin de caracterizar interacciones proteína-proteína en procariotas aprovechando la estructura y las propiedades del represor cI del fago lambda (λcI) (Di Lallo et al., 1999; Hu et al., 1990; Longo et al., 1995), tal y como se explicó en el apartado 3.2.2.2 de “Resultados”, con el fin de determinar desde otra perspectiva el papel del linker en la dimerización de BzdR. Inicialmente, los resultados parecían sugerir que efectivamente la región linker era crucial en el proceso de dimerización. Por un lado, la quimera Qλ (Figura 37), que incorpora el dominio N-terminal de la proteína λcI fusionado al dominio CBzdR con el linker (LBzdR) incluido, mostró su capacidad de dimerizar en el ensayo de mono- híbrido, ya que era capaz de reprimir al promotor PR del fago λ, al igual que la proteína de fusión NcI-CAT (Di Lallo et al., 1999). La proteína Cat es una cloramfenicol acetiltransferasa, cuya capacidad de dimerización ya había sido descrita previamente (Leslie, 1990), con lo que podía ser utilizada como control positivo. Por otro lado, la proteína His6-CBzdR (sin linker) purificada se mostraba como un monómero en Discusión 176 solución en los ensayos de ultracentrifugación analítica. Sin embargo, contrariamente a lo que cabía esperar, la quimera Qλ2 (Figura 37), que incorpora el dominio N-terminal de la proteína λcI fusionado al dominio CBzdR sin el linker, resultó ser capaz de dimerizar en el ensayo de mono-híbrido. Este dato contradictorio podría ser explicado mediante la siguiente hipótesis: tanto la región linker de BzdR, como determinadas regiones del dominio CBzdR, serían necesarias para que tuviera lugar el proceso de dimerización. Por ello, cuando el ensayo de mono-híbrido fue realizado con la proteína de fusión NcI-LBzdR, que solo incluía la región linker de BzdR, apenas se obtuvieron niveles significativos de dimerización, al contrario de los resultados obtenidos con la quimera Qλ, que incluía tanto el linker como el dominio CBzdR. Además, el hecho de que el linker quede en un extremo de la proteína, como sucede en la quimera NcI- LBzdR, probablemente no le permite adquirir la conformación adecuada para establecer un dímero. De esta forma, el dominio CBzdR estaría aportando algún tipo de interacción necesaria para formar un dímero estable. Este tipo de interacciones podrían también ser establecidas en el caso de la quimera Qλ2, reforzando así la dimerización propia del dominio NcI, el cual, como ya se ha explicado en el apartado 3.2.2.2 de “Resultados”, es capaz de dimerizar aunque con una afinidad mucho menor respecto de la proteína λcI completa (Di Lallo et al., 1999). En este punto, cabe destacar que el dominio NcI incorpora, además del motivo HTH de unión a ADN, la región linker de la proteína (residuos 93-131), la cual ha demostrado, mediante experimentos de RMN, poseer una gran flexibilidad que permite a ambos dominios, N- y C-terminal, rotar independientemente uno de otro (Weiss et al., 1983). Esta flexibilidad sería la responsable de que el dominio CBzdR pudiera adoptar una estructura adecuada para establecer las interacciones necesarias en el proceso de dimerización y reforzar así la dimerización ejercida per se por el dominio NcI, lo que daría explicación al resultado obtenido en el ensayo de mono-híbrido. Sin embargo, estas interacciones no deben ser suficientes para dar lugar al proceso de dimerización, razón por la cual el dominio CBzdR sin linker purificado se comporta como un monómero en solución en los ensayos de ultracentrifugación analítica. No obstante, el resultado obtenido por la quimera Qλ2 en el ensayo de mono-híbrido (debido a que mantiene su capacidad de dimerización) permitió diseñar y llevar a cabo una serie de experimentos con el objetivo de comprobar la hipótesis de la transmisión Discusión 177 de información por medio del linker en proteínas quiméricas. Dichos experimentos serán discutidos en el apartado 3.6 y 4.3 de la “Discusión”. 33..44 EEll ddoommiinniioo CCBBzzddRR mmooddiiffiiccaa ssuu ccoonnffoorrmmaacciióónn aall uunniirrssee eell iinndduuccttoorr,, bbeennzzooiill-- CCooAA.. Por último, en el caso del dominio C-terminal de BzdR (CBzdR en la Figura 6), los resultados demostraron que mantenía su capacidad de unir benzoil-CoA y dicha unión daba lugar a un cambio conformacional. El benzoil-CoA es la molécula ya establecida como inductora de la ruta de degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB (Barragán et al., 2005) y se ha postulado que interacciona con una determinada región del dominio CBzdR (Barragán et al., 2005), lo que permitiría a la proteína BzdR despegarse del promotor PN (Barragán et al., 2005). En primer lugar, y dada la homología de este dominio con las enzimas con actividad siquimato quinasa, se llevaron a cabo ensayos de actividad siquimato quinasa, tanto con el dominio CBzdR como con la proteína completa BzdR, donde se determinó su ausencia de actividad. No obstante, este ensayo no descartaba la posibilidad de que el dominio CBzdR pudiera mantener la capacidad de liberar fosfato de una molécula de ATP ó GTP. Sin embargo, los ensayos de actividad ATPásica ó GTPásica llevados a cabo tanto con CBzdR como con BzdR arrojaron resultados negativos. En segundo lugar, se llevaron a cabo estudios del espectro de emisión de fluorescencia de CBzdR y BzdR, tanto en presencia como en ausencia de benzoil-CoA. La proteína BzdR posee en su secuencia dos residuos de triptófano, en las posiciones 112 y 229, y ocho residuos de tirosina, en las posiciones 22, 54, 101, 180, 185, 188, 247 y 271. La proteína CBzdR posee únicamente un residuo de triptófano (99) y cinco de tirosina (50, 55, 58, 117 y 141) en su secuencia, que se corresponden con los residuos de BzdR subrayados anteriormente. Los espectros de emisión de fluorescencia se llevaron a cabo a dos longitudes de onda: a 275 nm, a la cual absorben tanto tirosinas como triptófanos, y a 295 nm, a la cual absorbe únicamente el triptófano. Debido a que la emisión debida a los triptófanos (λexcitación = 295 nm) era muy baja, las curvas de fluorescencia se llevaron a cabo excitando únicamente a 275 nm. En este caso, la emisión de fluorescencia tanto de CBzdR como de BzdR disminuía drásticamente y de forma muy similar a medida que se incrementaba la concentración de benzoil-CoA en la mezcla de reacción (Figura 33), lo que sugería un notable cambio de conformación en el entorno del triptófano 229 de BzdR (ó 99 de CBzdR), que está presente en ambas proteínas. De esta forma, se pudieron medir las Discusión 178 constantes de afinidad (Kd), cuyos valores fueron 203 ± 35 μM y 157 ± 58 μM, respectivamente, e indicaban que la afinidad por el benzoil-CoA era moderada-baja. Además, se pudo observar, también en ambas proteínas, que el espectro se desplazaba hacia mayores longitudes de onda de emisión (de 312 nm a 322 nm) a medida que se aumentaba la concentración de ligando añadida al medio de reacción, lo que indica un cambio en la polaridad del entorno de las tirosinas y, sobretodo, de los triptófanos. En este caso, el espectro de emisión es desplazado hacia el rojo lo que indica un incremento en la polaridad y sugiere que, probablemente, el triptófano 229 de BzdR (ó 99 de CBzdR) se encuentre en una nueva posición más cercana a la superficie de la proteína donde la polaridad es mayor que en el interior de la proteína. De hecho, en el modelo de CBzdR se puede apreciar que la mayoría de residuos que rodean al triptófano 99 son de carácter apolar: Leu8, Tyr141, Ala144 e Ile147 (Figura 72), con lo que cualquier variación en la conformación del triptófano tenderá hacia entornos más polares, tal y como se ha podido observar en el espectro de emisión en presencia de benzoil-CoA. Por otro lado, se pudo determinar las afinidades de CBzdR por moléculas con estructuras semejantes, tales como el fenilacetil-CoA, el CoA o el ATP, cuyos valores de Kd resultaron mayores que el obtenido para el benzoil-CoA: 441 μM, 456 μM y 520 μM, respectivamente, además de ir acompañados de unas mayores desviaciones estadísticas, que indicaban que la unión con el benzoil-CoA era específica. Este tipo de interacciones con diversas moléculas con estructuras similares ya ha sido descrito Figura 72. Entorno del triptófano 99 en el modelo estructural de CBzdR. La secuencia de aminoácidos ha sido representada mediante diagrama de cintas. Únicamente se muestran las cadenas laterales de los aminoácidos apolares que rodean al triptófano 99. Discusión 179 previamente, como en el caso de la glicoproteína PEB3 de Campylobacter jejuni, implicada en procesos de adhesión, que reconoce con diferente afinidad tres ligandos semejantes en estructura, como son el fosfato, el 3-fosfoglicerato y el fosfoenolpiruvato (Min et al., 2009). No obstante, en ninguno de estos casos, se pudo apreciar un desplazamiento del espectro de emisión, que siempre se mantuvo constante en 312 nm. En este punto, cabe mencionar que los cálculos realizados al respecto se hicieron asumiendo que cada monómero de la proteína BzdR posee únicamente un sitio de unión para el benzoil-CoA, premisa que fue asumida en base al modelo estructural que se posee actualmente de la proteína BzdR (Barragán et al., 2005). Además, los ensayos de dicroísmo circular mostraron que el contenido en estructura secundaria del dominio CBzdR (α-hélice 40%, lámina β 13.5%, estructura no ordenada 46.5%) se aproxima bastante al contenido en estructura secundaria de la SKI (α-hélice 46.5%, lámina β 10%, estructura no ordenada 44%) obtenido a partir de su estructura terciaria, lo que apoya las similitudes ya observadas a nivel de alineamiento de secuencia entre ambas proteínas, y que servirá para reforzar la hipótesis del origen evolutivo de BzdR, como se verá más adelante. En tercer y último lugar, se llevaron a cabo una serie de ensayos de proteolisis con tripsina con el fin de aportar más evidencias sobre el cambio de conformación producido en la proteína BzdR o en su dominio CBzdR tras unirse al benzoil-CoA. Este tipo de ensayos ya han demostrado previamente su eficacia, como en el caso de la proteína FapR (Schujman et al., 2006), cuyo patrón de digestión en ausencia del inductor (malonil-CoA) es totalmente diferente respecto del patrón de digestión en presencia del inductor. En el caso de CBzdR y BzdR, aunque el patrón de bandas de digestión obtenido en presencia y ausencia de benzoil-CoA es aproximadamente igual (Figura 34), no es así con el porcentaje de proteína digerida. En presencia de benzoil- CoA las proteínas se encuentran claramente más protegidas frente a la acción de la tripsina, lo cual sugiere un cambio de conformación en la estructura molecular que dé lugar a una menor exposición de aquellos residuos diana para la tripsina (lisina y arginina). 33..55 AAnnáálliissiiss ddee llooss ddaattooss ddee eessttrruuccttuurraa oobbtteenniiddooss ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. El modelo tridimensional de la proteína BzdR obtenido previamente (Barragán et al., 2005), permitió idear un modelo tridimensional del complejo formado entre el dominio CBzdR y la molécula efectora benzoil-CoA (Barragán et al., 2005). Sin Discusión 180 embargo, en este trabajo, y debido a las evidentes limitaciones que presenta un modelo, se intentó obtener la estructura tridimensional de BzdR. Debido al tamaño del dímero en solución (70 kDa), demasiado pequeño para obtener una buena resolución mediante microscopía electrónica y, en principio, demasiado grande para analizarse mediante RMN, se optó por intentar cristalizar la proteína, someterla a difracción de rayos X y obtener su estructura mediante reemplazamiento molecular, usando como modelos la estructura de la siquimato quinasa de E. coli para el dominio CBzdR y la estructura de la proteína SinR de B. subtilis para el dominio NBzdR. Han sido descritos multitud de reguladores transcripcionales cuya estructura ha podido ser resuelta mediante cristalografía de rayos X, como en el caso de algunos miembros de la familia MarR (reguladores de resistencia múltiple a antibióticos), entre los que cabe destacar el activador transcripcional BldR de Sulfolobus solfataricus, que actúa en respuesta al estrés generado por la presencia de compuestos aromáticos en el medio (Di Fiore et al., 2009), o el represor transcripcional MTH313 de Methanobacterium thermoautotrophicum, cuyo papel en la regulación aún no ha sido totalmente elucidado, pero se ha determinado el cambio estructural que sufre al unirse al salicilato, el cual inactiva a MTH313 impidiendo su unión al ADN (Saridakis et al., 2008). De igual forma, se ha logrado determinar la estructura tridimensional de algún miembro de la familia LysR, como el activador transcripcional CbnR de Ralstonia eutropha NH9, que controla la expresión de los genes implicados en el metabolismo del clorocatecol (Muraoka et al., 2003; Ogawa et al., 1999), o el regulador transcripcional CrgA de Neisseria meningitidis MC58, que controla los genes implicados en la adhesión del patógeno a las células epiteliales humanas (Deghmane et al., 2000; Sainsbury et al., 2008). Sin embargo, otros muchos reguladores transcripcionales parecen presentar una baja capacidad de cristalización por su elevada inestabilidad y su gran capacidad para formar agregados y precipitar a elevadas concentraciones, como de hecho ocurre con la gran mayoría de los miembros pertenecientes a la familia LysR (revisado por Maddocks & Oyston, 2008), lo que impide la obtención de su estructura mediante esta técnica. Únicamente las proteínas muy estables cristalizan de forma ordenada y, sin embargo, la proteína BzdR demostró ser altamente insoluble e inestable y, si bien se lograron concentraciones elevadas de la proteína (hasta 11 mg/ml), no se consiguió establecer unas condiciones óptimas de cristalización, las cuales requieren bajas concentraciones de sales. No obstante, se lograron obtener algunos cristales cuya estructura, al ser desordenada, impidió que difractaran adecuadamente al ser sometidos a rayos X, razón Discusión 181 por la cual no se pudo obtener el conjunto de datos que habría permitido la resolución de la estructura tridimensional de BzdR. En determinados reguladores, ante la imposibilidad de obtener el cristal de la proteína debido a este tipo de problemas, se opta por intentar cristalizar por separado y de forma independiente cada uno de los dominios que conforman la proteína completa. Así se han logrado obtener ciertas estructuras tridimensionales parciales que aportan, sino toda, bastante información estructural y funcional. Un ejemplo que ilustra bastante bien esta situación es el caso del represor cI del fago λ, del que se hablará más adelante, cuya estructura no pudo ser resuelta inicialmente con la proteína completa, razón por la cual se intentó y se logró cristalizar por separado el dominio N-terminal implicado en la unión al ADN (Pabo & Lewis, 1982). Años más tarde, se logró cristalizar por separado el dominio C-terminal, responsable de la cooperatividad de la unión al ADN y de la dimerización de cI (Bell et al., 2000). Sin embargo, la estructura de la proteína cI completa no se obtuvo hasta el año 2008 (Stayrook et al., 2008). En cualquier caso, las estructuras de los dominios N- y C-terminal dieron una información muy valiosa y útil en su momento. En el caso de la proteína BzdR, y debido a su arquitectura modular en dos dominios, se intentaron cristalizar tanto el dominio N-terminal (con y sin linker) como el C- terminal de forma independiente. Tal y como ha quedado plasmado en el apartado de “Resultados” no se logró en ninguno de los casos, a pesar de las mejores condiciones de cristalización, la mayor concentración y la mayor solubilidad obtenidas en el caso del dominio CBzdR. Debido a la ausencia de resultados obtenidos en el campo de la cristalografía, se optó por llevar en paralelo alguna otra técnica que pudiera aportar algún tipo de información acerca de la estructura tridimensional de BzdR, por lo que se recurrió a la microscopía electrónica (ME). El hecho de poseer un tamaño tan pequeño (35 kDa) disminuía las posibilidades de que pudiera ser detectada mediante el método de tinción negativa con acetato de uranilo en el microscopio electrónico. Sin embargo, estas posibilidades se veían incrementadas por el hecho de que BzdR es un dímero en solución, lo que aumenta el tamaño al doble (70 kDa). En la literatura se pueden encontrar algunos casos de estructuras tridimensionales de proteínas inferiores a 100 kDa resueltas mediante ME, entre las que cabe destacar la geminina humana, que sólo presenta una masa de 23.5 kDa pero en solución adquiere una conformación de tetrámero de dímeros (~100 kDa), cuya estructura fue resuelta a 17.5 Å de resolución (Okorokov et al., 2004), o el complejo GINS humano, compuesto por un Discusión 182 heterotetrámero de 98 kDa, cuya estructura fue resuelta a 33 Å de resolución (Boskovic et al., 2007). De esta forma, si bien no se obtienen resoluciones tan elevadas como las obtenidas por difracción de rayos X, sí se puede obtener información muy valiosa a nivel de estructura secundaria. Tal y como se describe en el apartado “Resultados”, la proteína BzdR pudo ser detectada con una resolución aceptable, lo que permitió, tras un exhaustivo estudio de las 5.741 micrografías, llevar a cabo un análisis bidimensional el cual sugería una posible simetría bilateral. El análisis tridimensional posterior llevado a cabo con el paquete de programas EMAN (Ludtke et al., 1999), también sugirió que BzdR poseía una simetría bilateral, a pesar de no asumir dicha simetría en el análisis. Al imponer dicha simetría bilateral, se pudo obtener una estructura tridimensional con una resolución final de 4.1 Å/píxel, en la cual se podían apreciar dos dominios, uno mayor que otro, en cada uno de los monómeros, tal y como se muestra en la Figura 25. Además, con objeto de determinar de forma aproximada cómo se ajustaba el modelo de BzdR a esta estructura obtenida mediante microscopía electrónica, se llevó a cabo una superposición de dicho modelo sobre la estructura 3D, en la cual se puede observar un ajuste moderadamente bueno entre ambas figuras (Figura 73). NBzdR CBzdR NBzdR CBzdR Figura 73. Ajuste del modelo de CBzdR y NBzdR sobre la estructura de BzdR obtenida mediante microscopía electrónica. La estructura del dímero de BzdR obtenida mediante microscopía electrónica se representa mediante un volumen azul claro semi- transparente. La zona que divide cada uno de los monómeros ha sido indicada mediante una línea roja de puntos. El dominio CBzdR se muestra en un modelo de cintas de color amarillo, coincidente con la región superior de la estructura de BzdR. El dominio NBzdR se muestra en un modelo de cintas de color azul oscuro, coincidente con la región inferior de la estructura de BzdR. Discusión 183 La estructura obtenida sugería la posibilidad de que las interacciones existentes entre ambos dominios en cada uno de los monómeros pudieran estar involucradas en el proceso de oligomerización. 33..66 UUnn mmooddeelloo ddee aacccciióónn ppaarraa llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. Por otro lado, se llevó a cabo un modelo de acción de la proteína BzdR en base al cambio conformacional sugerido por los experimentos de fluorescencia y de proteolisis realizados con el dominio CBzdR y las semejanzas estructurales de dicho dominio con la estructura de la enzima siquimato quinasa I de E. coli. La actividad enzimática de la siquimato quinasa tiene lugar a través de un preciso mecanismo inducido por la unión del sustrato, que genera un importante cambio conformacional en las regiones que constituyen la superficie del surco donde se ubica dicho sustrato (Gu et al., 2002). Las siquimato quinasas se componen de 3 regiones: núcleo, LID (= tapa) y NMPB (Nucleotide Mono Phosphate Binding). El núcleo presenta una secuencia altamente conservada de regiones de unión a fosfato (P-loop). La región LID actúa como una tapa que se cierra y cubre la molécula de ATP cuando ésta se une a la siquimato quinasa por medio de una serie de residuos esenciales (Figura 74). La región NMPB es la responsable del reconocimiento y la unión de moléculas específicas de NMP, en este caso, una molécula de ATP. La región LID de las NMP quinasas es muy flexible y es capaz de sufrir cambios conformacionales drásticos tras la unión de la molécula de sustrato. Normalmente, suele adoptar una conformación “cerrada” cuando el nucleótido trifosfato se encuentra unido al centro activo de la enzima, para evitar la hidrólisis del grupo fosfato (Gu et al., 2002) (Figura 74). Tal y como se ha mostrado en el apartado de “Resultados”, se han obtenido una serie de evidencias que apoyan la hipótesis del cambio conformacional de BzdR cuando se encuentra unido al benzoil-CoA. En primer lugar, los experimentos de fluorescencia, donde se pudo observar una disminución del espectro de emisión cuando BzdR se encontraba en presencia de benzoil-CoA. En segundo lugar, los experimentos de interferencia en ultracentrifugación analítica, donde se detectaron pequeñas diferencias entre los valores del coeficiente de sedimentación (s) de BzdR en presencia y ausencia de benzoil-CoA, lo que podría estar indicando un posible cambio conformacional hacia una estructura más compacta cuando la molécula inductora se encuentra unida. En tercer lugar, los experimentos de proteolisis parcial con tripsina, donde se pudo Discusión 184 constatar la mayor sensibilidad a ser digerida de la proteína BzdR libre respecto de la proteína en presencia de benzoil-CoA. Todos estos resultados tomados en conjunto sumados a la comparación llevada a cabo con la siquimato quinasa, sugieren que el dominio CBzdR también podría presentar una región LID contigua al motivo Walker A implicado en la unión de fosfato (Walker et al., 1982), que presenta una secuencia altamente conservada (GXXXXGKT/S). Este motivo se encuentra entre la lámina β1 y la hélice α1 en la siquimato quinasa, formando un lazo característico de unión a fosfato (Saraste et al., 1990). En el caso de BzdR, este motivo Walker A presenta una secuencia compatible con la consenso (GLRGAGKT) y se sitúa entre la lámina β1 y la hélice α6, concretamente, entre las posiciones 137 y 143 de su secuencia. De esta forma, la región LID sería capaz de mantenerse en una conformación “abierta” cuando la molécula Figura 74: Modelo de la estructura de la siquimato quinasa de E. coli en presencia y ausencia de sus sustratos siquimato y ATP. La figura de la izquierda representa la estructura de la SKI en presencia de siquimato y ATP, donde el LID (azul) queda cerrado. La figura de la derecha representa esta misma estructura en ausencia de sustratos, donde el LID queda abierto. En la zona superior se indica el código de colores necesario para identificar cada una de las regiones o motivos en la estructura de la SKI. El modelo fue obtenido a partir de la estructura de la siquimato quinasa de M. tuberculosis en ausencia (Nº de acceso: 2iyt) y presencia de siquimato + ADP (Nº de acceso: 2iyq), depositada en la base de datos PDB. Siquimato quinasa + siquimato + ATP Siquimato quinasa Dominio de unión a ATP (NMPB) LID Motivo A Motivo BDominio de unión a siquimato ATP Siquimato LID abiertoLID cerrado Siquimato quinasa + siquimato + ATP Siquimato quinasa Dominio de unión a ATP (NMPB) LID Motivo A Motivo BDominio de unión a siquimato ATP Siquimato LID abiertoLID cerrado Discusión 185 inductora, el benzoil-CoA, no estuviera presente, y adquirir una conformación “cerrada” cuando el benzoil-CoA se encontrara unido al dominio CBzdR, de una forma semejante a cómo sucede en el caso de la siquimato quinasa (Figura 74). Esta interacción entre proteína e inductor sería la responsable de un cambio conformacional que sería transmitido al dominio NBzdR, logrando así que la proteína BzdR sea incapaz de unirse al ADN. Esta transmisión de la información desde el dominio CBzdR al dominio NBzdR podría estar teniendo lugar a través del linker de BzdR. Los resultados mostrados en el apartado 3.2.2.3 de “Resultados”, sugieren que el linker es imprescindible en este proceso de transmisión del cambio conformacional, ya que, mientras la quimera Qλ, que incluye el linker de BzdR, es capaz de responder a la presencia de benzoil-CoA en el medio, permitiendo la expresión del promotor PR, no sucede así con la quimera Qλ2, que no incluye el linker de BzdR, incapaz de responder a la presencia de benzoil-CoA en el medio (Figura 38). Las regiones linker de los diversos reguladores transcripcionales descritos en la literatura no parecen presentar una elevada homología, aunque sí parecen ser ricos en residuos de glutamina, arginina, glutámico, serina y prolina (Argos, 1990; Wootton & Drummond, 1989). Estas regiones linker no suelen presentar secuencias que predigan posibles estructuras secundarias, siendo denominadas Q-linkers, por el elevado número de residuos de glutamina (Q) que suelen presentar (Wootton & Drummond, 1989). Además, se ha sugerido que su papel en estos reguladores consiste en unir los dos dominios de la proteína, de forma que puedan producirse las interacciones funcionales necesarias entre ambos, pero sin actuar de forma directa en la transmisión de información (Wootton & Drummond, 1989). Este tipo de Q-linkers han sido encontrados, por ejemplo, en las proteínas implicadas en la regulación del nitrógeno NtrB, NtrC, NifA y NifL (Drummond et al., 1986; Drummond & Wootton, 1987), en las cuales, si se llevaban a cabo mutaciones de sus respectivos Q-linkers por adición, deleción o sustitución de residuos, no se veían afectadas sus respectivas actividades reguladoras, y sólo si el Q-linker era eliminado por completo se podían observar efectos negativos en dicha actividad (Wootton & Drummond, 1989). Sin embargo, también se han descrito ciertos reguladores transcripcionales cuyos linkers no se ajustan a este modelo, como es el caso de OmpR ó DmsR. La proteína OmpR es un regulador efector, perteneciente a un sistema de dos componentes, que controla la expresión de los genes ompF y ompC, encargados de codificar porinas en E. coli, en respuesta a las variaciones Discusión 186 en la osmolaridad del medio. Consta de dos dominios de los que el N-terminal es susceptible de ser fosforilado y el C-terminal se une al ADN por medio de un dominio HTH (Kanamaru et al., 1990). La proteína DmsR pertenece a la familia OmpR y controla la expresión del operón dmsCBA en Rhodobacter sphaeroides, responsable de la utilización de DMSO como fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. También presenta dos dominios, de los cuales el N-terminal es el regulador (susceptible de ser fosforilado) y el C-terminal el que se une al ADN por medio de un dominio HTH (Ujiiye et al., 1997). Ambos reguladores poseen regiones linker semejantes a los Q- linkers que, sin embargo, parecen poseer un papel más relevante en la interacción entre ambos dominios. Cuando estos linkers incorporaban determinadas mutaciones puntuales, la funcionalidad de los reguladores se veía totalmente truncada, lo que sugería que ambas regiones linker estaban implicadas de forma directa en la transmisión de información de un dominio a otro (Aiba et al., 1994; Mattison et al., 2002; Yamamoto et al., 1999). El linker de BzdR presenta 3 residuos de glutamina, 6 de arginina, 4 de glutámico, 5 de serina y 3 de prolina, es decir, 21 residuos de 40 que componen el linker, por lo que, si bien puede decirse que su composición es rica en estos aminoácidos, como suele suceder en los Q-linkers, no posee un elevado número de glutaminas. Además, su papel se asemejaría más al linker del regulador OmpR, ya que, aunque no se posean mutantes puntuales que demuestren la acción directa del linker en la transmisión de información o estructuras que ofrezcan esta información, el hecho de que las quimeras construidas, Qλ y, Q1 y Q2, como se verá más adelante en el apartado 4.3, consigan transmitir la información entre dominios de diferentes proteínas o dominios (incluida una enzima no relacionada en absoluto con la regulación) nos dan un indicio de que dicha transmisión se está produciendo de forma directa. Por otro lado, cuando el linker de BzdR fue enfrentado con la base de datos PDB, se encontró una enzima, la formato deshidrogenasa dependiente de NAD+, que poseía una secuencia semejante, aparentemente implicada en dimerización, tal y como se expuso anteriormente. Sin embargo, no se detectaron semejanzas con otros linkers de proteínas implicadas en la regulación transcripcional. No obstante, el modelo de la región conservada del linker generado a partir de la estructura de la formato deshidrogenasa, mostró una estructura en hélice α (Figura 71). Por otro lado, se llevó a cabo una predicción de estructura secundaria con el programa JPred 3 (Cole et al., 2008), cuyo resultado mostraba una Discusión 187 predicción de dos hélices α, como se puede apreciar en la Figura 75. Como se puede observar, la segunda hélice predicha coincide con la hélice modelada a partir de la formato deshidrogenasa. Además, el programa JPred 3 predijo aquellos residuos cuya probabilidad de encontrarse en superficie era inferior al 25%. Por tanto, parece que la primera hélice α presenta una elevada probabilidad de no encontrarse en superficie, así como algunos de los residuos de la segunda hélice α, lo que sugiere que una de las hélices se encuentra expuesta en la superficie de la proteína y unida a través de una secuencia de siete residuos a la otra hélice, que permanecería en el interior de la proteína. Esta información y los resultados previamente expuestos, sugieren que esta estructura del linker con dos hélices α podría ser la responsable de la transmisión de la información mediante un mecanismo de bisagra que modificara la estructura del dominio N-terminal cuando el C-terminal sufriera un cambio de conformación. Todos estos datos tomados en conjunto, sugieren que el linker de BzdR presenta un papel crucial en la funcionalidad del regulador, que, lejos de ser una simple secuencia que une dos dominios, interactúa de forma activa, transmitiendo información desde el dominio regulador al dominio efector. ((AA)) 11------------------1111----------------2211----------------3311---------------- ((BB)) QQSSPPEELLTTLLLLIIQQYYLLSSRRFFPPPPKKTTHHEEWWAARRRRLLLLQQNNEELLEESSSSGGRRSSAARRRR ((CC)) --------HHHHHHHHHHHHHHHH--------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-------------- ((DD)) --------BBBBBBBBBBBBBBBB----BB--------BB--BBBB----BBBB------BB------------------ Figura 75. Secuencia del linker de BzdR. La fila (A) indica el número de residuo. La fila (B) indica la secuencia de aminoácidos. La fila (C) indica con la letra “H” aquellos aminoácidos para los cuales el programa JPred 3 predice estructura secundaria de tipo hélice α. La fila (D) indica con la letra “B” aquellos aminoácidos que, según el programa JPred 3, presentan una probabilidad inferior al 25% de hallarse en superficie. Discusión 188 DDiissccuussiióónn 44.. LLaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR ccoommoo mmooddeelloo ppaarraa llaa ggeenneerraacciióónn ddee nnuueevvooss rreegguullaaddoorreess ffuunncciioonnaalleess.. La proteína BzdR ha demostrado poseer una arquitectura modular consistente en dos dominios, NBzdR y CBzdR, unidos por una secuencia que actúa como linker y parece ser capaz de transmitir cambios de conformación del dominio CBzdR al NBzdR. Si bien ya se han descrito diversas proteínas con este tipo de estructura como los reguladores transcripcionales de la familia LysR e IclR entre otros (Tropel & van der Meer, 2004), ninguno de ellos ha demostrado poseer dominios funcionales independientes capaces de generar nuevos reguladores transcripcionales (quimeras) al ser fusionados a otras proteínas o dominios. A continuación se discutirán los resultados obtenidos al respecto con los dominios de BzdR. 44..11 LLaa pprrootteeíínnaa qquuiimméérriiccaa QQλλ eess ccaappaazz ddee ccoonnttrroollaarr eell cciicclloo llííttiiccoo ddeell ffaaggoo llaammbbddaa uuttiilliizzaannddoo bbeennzzooiill--CCooAA ccoommoo iinndduuccttoorr.. Los resultados obtenidos han demostrado que la proteína quimérica Qλ, construida a partir de una fusión entre el dominio N-terminal del represor cI del fago λ (λNcI) y el dominio CBzdR, es una proteína capaz de reprimir el promotor PR del fago λ (Figura 37), implicado en la entrada en ciclo lítico del fago tras la infección celular (Meyer et al., 1975; Ptashne & Hopkins, 1968). Por ello, si la proteína Qλ era expresada en la bacteria E. coli, era capaz de conferir protección frente a la lisis inducida por el fago λ, ya que se une y reprime al promotor PR. No obstante, ya se han descrito proteínas quiméricas capaces de reprimir el promotor PR, como es el caso de la fusión llevada a cabo entre el dominio λNcI y la proteína cloramfenicol acetiltransferasa o CAT (que confiere resistencia al cloramfenicol) (Di Lallo et al., 1999), o la fusión entre λNcI y el dominio C-terminal de la proteína transmembranal ToxR de Vibrio cholerae (que regula la expresión de la toxina colérica) (Dziejman & Mekalanos, 1994). Sin embargo, la quimera Qλ también demostró mantener su capacidad de reconocer el benzoil-CoA mediante su dominio CBzdR y, lo que es más importante, adquirió la nueva capacidad de regular al promotor PR y por tanto la entrada del fago λ en ciclo lítico. Inicialmente, esto quedó demostrado al realizar los ensayos de mono-híbrido con la cepa de E. coli MV1190 (pSJ6, pcI-Qλ, pCK01-BzdA) en presencia y ausencia de benzoato. La presencia de actividad β-galactosidasa (debida a la expresión de la fusión PR-lacZ Discusión 189 localizada en el plásmido pSJ6) al crecer las células en presencia de benzoato sugería que, efectivamente, la proteína Qλ se despegaba del promotor PR en presencia de benzoil-CoA (sintetizado por medio de la benzoil-CoA ligasa expresada por el plásmido pCK01-BzdA). Posteriormente, estos resultados se pudieron corroborar de forma directa, mediante ensayos de lisis con el fago λ, tal y como se muestra en el apartado 1 del Objetivo 4 de “Resultados”. Aquellos cultivos de la cepa de E. coli MV1190 (pcI- Qλ, pCK01-BzdA) que eran crecidos en presencia de benzoato y eran posteriormente infectados con el fago λ mostraban un número de placas de lisis significativamente superior al número de placas de lisis observado en la misma cepa crecida en ausencia de benzoato (Figura 42). Parecía por tanto, que la quimera Qλ se había convertido en un nuevo regulador transcripcional del ciclo lítico del fago λ, el cual pasaba a ser controlado por una nueva molécula inductora, el benzoil-CoA: en ausencia de este inductor la quimera Qλ se une al promotor PR, impide la entrada en ciclo lítico, y cabe suponer que se promueve la entrada en el ciclo lisogénico; en presencia del inductor, la quimera Qλ lo une en su dominio CBzdR y se despega del promotor PR, lo que induce la entrada en ciclo lítico del fago λ. Este resultado también sugiere que el cambio de conformación sufrido por el dominio CBzdR al unir el benzoil-CoA se transmite al dominio λNcI, probablemente, por medio de la región linker de BzdR (LBzdR), tal y como puso de manifiesto el resultado obtenido con la quimera Qλ2, que, al no poseer la región linker de BzdR, fue incapaz de despegarse del promotor PR en presencia de benzoil-CoA, como se puede apreciar en la Figura 42. Todo indicaba que el linker de BzdR se encuentra directamente implicado en la transmisión de información del cambio conformacional del dominio regulador (CBzdR) al dominio efector (NcI). Los resultados obtenidos convierten a la quimera Qλ en un excelente ejemplo de regulador transcripcional diseñado artificialmente, capaz de gobernar la regulación del ciclo vital del fago λ mediante la presencia o ausencia de benzoato en el medio de cultivo, tal y como se esquematiza en la Figura 76, donde se puede apreciar cómo la quimera Qλ podrá controlar la entrada del fago λ en el ciclo lítico dependiendo de la presencia de benzoil-CoA en el medio. No obstante, la proteína BzdR mostró poseer, como se discutirá a continuación, una capacidad excepcional a la hora de crear nuevas quimeras funcionales con ambos dominios. Discusión 190 44..22 LLaa pprrootteeíínnaa qquuiimméérriiccaa QQ11:: uunn rreepprreessoorr ttrraannssccrriippcciioonnaall ccoonn aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa.. La proteína quimérica Q1, construida por medio de la fusión del dominio N2 de BzdR (que incluye la región linker) con la enzima siquimato quinasa I (SKI) de E. coli (producto del gen aroK), demostró ser capaz de mantener la función de ambos dominios: el dominio N2 de BzdR mantuvo su capacidad de unirse al promotor PN a concentraciones similares a las que BzdR precisa, tanto in vivo como in vitro, y el dominio SKI mantuvo su capacidad enzimática de fosforilar siquimato a 3P-siquimato con una afinidad ligeramente inferior a la enzima silvestre. La siquimato quinasa I (SK; EC 2.7.1.71) es la quinta enzima de la ruta biosintética de aminoácidos aromáticos, determinados cofactores, ubiquinona y algunos otros metabolitos secundarios (Bentley, Figura 76. Modelo de acción de la quimera Qλ sobre el ciclo vital del fago λ. En el esquema superior se muestra a la quimera Qλ (CBzdR en azul oscuro, LBzdR en azul claro, linker NcI en verde y NcI en amarillo) reprimiendo al promotor PR (verde oscuro) del fago λ, impidiendo la expresión de los genes líticos (rojo) y manteniendo así al fago λ en lisogenia. En el esquema inferior se muestra a la quimera Qλ unida al benzoil-CoA (triángulo naranja) y despegada del promotor PR, lo que permite la expresión de los genes líticos y, por tanto, la inducción del ciclo lítico del fago λ. Genes del ciclo lítico QQλλ PR PR BenzoilBenzoil--CoACoA QQλλ Genes del ciclo lítico Lisogenia Lisis Discusión 191 1990; Haslam, 1993). Es una ruta esencial en algas, plantas superiores, bacterias, hongos y parásitos, pero se encuentra ausente en mamíferos (Haslam, 1993; Kishore & Shah, 1988), lo que la convierte en diana potencial para el desarrollo de agentes bactericidas (Davies et al., 1994), herbicidas (Coggins, 1989) y drogas antiparasitarias (Ridley, 1998), no tóxicos para los mamíferos. La SKI cataliza específicamente la reacción de fosforilación del grupo 3-OH del siquimato utilizando ATP como co- sustrato. En E. coli, la actividad siquimato quinasa puede ser llevada a cabo por dos isoformas que comparten un 30% de identidad en su secuencia (Whipp & Pittard, 1995): la siquimato quinasa I (SKI), codificada en el gen aroK, y la siquimato quinasa II (SKII), codificada en el gen aroL. La expresión del gen aroK parece ser constitutiva, a diferencia del gen aroL, que es controlado por los represores TyrR y TrpR (Ely & Pittard, 1979). La diferencia más destacable entre ambas enzimas es su afinidad por el siquimato: mientras la SKI posee una Km de 20 mM, la SKII posee una Km de 0.2 mM (DeFeyter & Pittard, 1986). No obstante, la SKI es suficiente para que la célula pueda sintetizar aminoácidos aromáticos, al contrario de lo que sucede en el doble mutante (aroK- aroL-), que se convierte en auxótrofo de aminoácidos aromáticos (Lobner-Olesen & Marinus, 1992). Esta información tomada en conjunto, sugiere que la SKII es la enzima principal en esta ruta de biosíntesis, mientras que la SKI estaría jugando un papel secundario en esta ruta a la vez que podría estar implicada en algún otro proceso celular aún no descrito (DeFeyter et al., 1986). De hecho, se ha descrito que la pérdida de actividad de la SKI en E. coli confiere resistencia al mecillinam (Romanowski & Burley, 2002; Vinella et al., 1996), un antibiótico β-lactámico que se une a la proteína PBP2 (Penillin-Binding Protein 2) de E. coli (Sougakoff & Jarlier, 2000). No obstante, la mayoría de las bacterias poseen únicamente una enzima siquimato quinasa que, si bien suele ser la codificada en el gen aroL (SKII), en algunos organismos como Haemophilus influenzae y Mycobacterium tuberculosis es la SKI codificada en el gen aroK. Tal y como muestran los resultados, la quimera Q1 demostró ser capaz de unirse al promotor PN en ensayos de retardo en gel (Figura 44A). Sin embargo, dicha unión daba lugar a la aparición de tres bandas de retardo, dos de las cuales (las inferiores) iban desapareciendo a medida que se aumentaba la concentración. Parecía que la proteína fuera ocupando de forma paulatina las tres regiones (I, II y III) que reconoce en el promotor PN. Este tipo de unión no ha podido ser detectado con la proteína BzdR, donde aparece una única banda de retardo, o dos en determinadas ocasiones. En el ensayo de Discusión 192 footprinting llevado a cabo más adelante, se puede observar que tanto BzdR como la quimera Q1 reconocen las mismas regiones del promotor PN con una afinidad similar (Figura 55C). En cualquier caso, la quimera Q1 también demostró ser capaz de reprimir in vivo la expresión del promotor PN (Figura 44B) de forma tan eficiente como BzdR, lo que indicaba que el dominio N2BzdR era funcional y por tanto se debía encontrar correctamente plegado. Estos datos sugerían que la quimera Q1 se debía encontrar en forma de dímero, ya que BzdR se encuentra en dicho estado de oligomerización en solución. Los resultados obtenidos mediante la ultracentrifugación analítica confirmaron este dato y demostraron que Q1 era un dímero en solución, al contrario de lo que sucede con la enzima SKI de la cual se ha constatado que se encuentra en forma de monómero (Krell et al., 1997; Millar et al., 1986). Por otro lado, también pudo ser demostrada la funcionalidad del dominio SKI, el cual mantuvo, aunque con un valor de Km algo superior, su actividad enzimática siquimato quinasa. En este punto, cabe destacar que el valor de Km obtenido con la SKI purificada (0.2 mM) fue mucho menor que el valor obtenido previamente en la literatura (20 mM) (DeFeyter & Pittard, 1986), con una diferencia de dos órdenes de magnitud. La quimera Q1 fue capaz incluso de complementar en trans un doble mutante en E. coli de los dos genes responsables de dicha actividad, aroK y aroL, compensando su actividad y permitiendo el crecimiento de este mutante en medio mínimo sin aminoácidos aromáticos, lo que demostraba que Q1 podía sustituir el papel de la siquimato quinasa en la célula. Una vez quedó demostrado que ambos dominios de la quimera Q1 mantenían sus respectivas actividades, se diseñaron una serie de experimentos con el fin de establecer si Q1 era capaz de actuar como un nuevo regulador transcripcional cuyas moléculas inductoras fueran, en este caso, el siquimato y/o el ATP. Tal y como se muestra en el apartado 4.2.3 de “Resultados”, los primeros datos obtenidos al respecto mostraron que, en ensayos de retardo en gel, la quimera Q1 se despegaba del promotor PN en presencia de siquimato, de ATP o de ambos (Figura 48). Los ensayos de transcripción in vitro mostraron una primera discrepancia con lo anterior, al no poderse apreciar expresión del promotor PN cuando la reacción de transcripción era llevada a cabo en presencia de siquimato y ATP. Sin embargo, si la reacción se llevaba a cabo únicamente en presencia de siquimato se observaba el despegue de Q1 de forma inequívoca (Figura 45). Los resultados de los ensayos in vivo tampoco fueron congruentes, al no poderse apreciar la desrepresión del promotor PN tras crecer los cultivos en presencia de siquimato 5 mM (Figura 49). Discusión 193 Una posible explicación para este resultado podría ser que el siquimato no fuera capaz de atravesar la membrana celular y así entrar en la célula. En la literatura se ha descrito un gen (shiA) que codifica la proteína ShiA, un transportador de siquimato (Whipp et al., 1998). El gen shiA es activado por RyhB, un sRNA de 90 nucleótidos cuya expresión se ve incrementada en ausencia de hierro en el medio (Prevost et al., 2007). Dado que todos los cultivos fueron crecidos en medio rico LB el cual, al ser un extracto de levadura, probablemente presente trazas de hierro en su composición, cabría pensar que los niveles de RyhB en estas condiciones sean inexistentes o al menos insuficientes para activar la expresión del gen shiA, con lo que la célula no presentaría transportadores de siquimato en su superficie, impidiendo así la entrada del siquimato al citoplasma. Sin embargo, esta hipótesis fue desechada al asumir que el siquimato debería poder entrar por difusión simple gracias a la elevada concentración (5 mM) que fue añadida a los cultivos correspondientes. Con el fin de encontrar otra explicación a estos resultados aparentemente incongruentes, se estableció una nueva hipótesis detallada a continuación: La SKI sufre un cambio de conformación cuando une alguno de sus dos sustratos (siquimato y ATP) o ambos, tal y como está descrito en la literatura (Hartmann et al., 2006). El dominio de unión a siquimato es el que define el cambio conformacional que se produce tras la unión de dicho siquimato, dando lugar a una bajada y cierre de la región LID sobre el siquimato unido (Gan et al., 2006). Este cambio de conformación está directamente relacionado con la actividad enzimática que lleva a cabo, de forma que, una vez se han unido tanto el siquimato como el ATP, se produce el cambio conformacional que posibilita la reacción enzimática. Esta reacción genera dos productos, 3P-siquimato y ADP (De Feyter, 1987; Pittard, 1987), que son liberados al medio a la vez que la SKI adquiere de nuevo la conformación inicial (Figura 77). Tratando de profundizar en esta cuestión se pudo constatar en la literatura que la siquimato quinasa posee una región LID (tapa), de unos 15 aminoácidos tanto en el caso de Erwinia chrysanthemi (Krell et al., 1998) como en el de Helicobacter pylori (Cheng et al., 2005), que en ausencia de sustratos se encuentra en una conformación “descargada” o abierta (Figura 77A), capaz de unir siquimato (Figura 77B1), ATP (Figura 77B2) o ambos sustratos (Figura 77C). Tras la unión de alguno de los sustratos al bolsillo de unión se produce un cambio de conformación que da lugar a una bajada de la región LID. La unión posterior del otro sustrato, ATP o siquimato según el caso, no genera cambios conformacionales Discusión 194 importantes en la estructura de la SK (Hartmann et al., 2006). La región LID adquiere así una conformación “cargada” o cerrada, que únicamente durará el tiempo necesario para que tenga lugar la reacción de hidrólisis del ATP, la transferencia del grupo fosfato al siquimato y la síntesis de los productos correspondientes, ADP y 3P-siquimato, que serán liberados al medio, a la vez que la región LID adquiere de nuevo una conformación desplegada. Estas dos diferentes conformaciones de la región LID indican una elevada flexibilidad en su estructura (Hartmann et al., 2006). Figura 77. Esquema del cambio conformacional sufrido por la SKI de M. tuberculosis en presencia de sus sustratos. (A) Estructura de la SKI en ausencia de sustratos. En negro se representa la región LID; en verde se representa el dominio NB, responsable del reconocimiento de nucleótidos; en azul se representa el dominio ESB, responsable del reconocimiento del siquimato; en rojo se representa el dominio RC, que se correspondería con el resto de la estructura de la SKI. (B1) Estructura de la SKI en presencia de siquimato. (B2) Estructura de la SKI en presencia de ATP. (C) Estructura de la SKI en presencia de siquimato y ATP. La flecha negra central representa la catálisis enzimática de la SKI, que precisa la presencia del catión Mg2+ y libera dos productos, ADP y 3P-siquimato. Adaptado de (Hartmann et al., 2006). BB11 + Siquimato+ Siquimato + ATP+ ATP + Siquimato+ Siquimato+ ATP+ ATP LIDLID ESBESB RCRC NBNB 3P3P--siquimatosiquimatoADPADP Mg2+ AA CC BB22BB11 + Siquimato+ Siquimato + ATP+ ATP + Siquimato+ Siquimato+ ATP+ ATP LIDLID ESBESB RCRC NBNB 3P3P--siquimatosiquimatoADPADP Mg2+ AA CC BB22 Discusión 195 Por otro lado, es preciso mencionar que el catión Mg2+ actúa como cofactor en la catálisis llevada a cabo por la siquimato quinasa y es necesario para que tenga lugar la actividad enzimática de la enzima (DeFeyter & Pittard, 1986). La ausencia de cationes Mg2+ en el medio de reacción parece tener un papel significativo tanto en la posición a adoptar por el siquimato en la enzima, como en la transferencia del grupo γ-fosfato desde la molécula de ATP al grupo 3-OH nucleofílico del siquimato mediante un mecanismo de reacción asociativa (Bellinzoni et al., 2006; Schlichting & Reinstein, 1997). En el caso de la siquimato quinasa de Mycobacterium tuberculosis se ha demostrado que los residuos Thr16 y Asp32 de la SKI están coordinados con un catión de Mg2+, y el residuo Asp34 forma un puente de hidrógeno con una molécula de agua, la cual se coordina también con el catión de Mg2+ (Gu et al., 2002). Siguiendo con la hipótesis propuesta, cuando la SKI se encuentra en ausencia de Mg2+, los sustratos mantendrían la capacidad de unirse al centro activo de la enzima, dando lugar al cambio de conformación correspondiente, el cual se mantendría al no poderse catalizar la reacción enzimática. En base a la hipótesis desarrollada hasta este punto, los resultados obtenidos pueden ser explicados y reinterpretados de la siguiente forma: En las reacciones de unión de los ensayos de retardo en gel se utiliza un tampón que no lleva Mg2+ (véase “Materiales y Métodos”). Por ello, en las reacciones llevadas a cabo en presencia de siquimato y ATP, no podría catalizarse la reacción enzimática, con lo que ambos sustratos podrían permanecer unidos al dominio SKI (LID “cargado”) de la quimera Q1, manteniéndose así el cambio conformacional que podría ser transmitido al dominio N2BzdR con el consecuente despegue del ADN. Esta hipótesis daría explicación a los resultados obtenidos en los ensayos de retardo en gel (Figura 48), donde se puede apreciar que Q1 se despega del promotor PN tanto en presencia de ATP o siquimato como en presencia de ambos sustratos. Posteriormente, pudo demostrarse que ni la quimera Q1 ni la SKI silvestre mantenían la actividad enzimática en el tampón de retardo (carente de Mg2+) (Figura 50A), lo que apoyaba la hipótesis propuesta. En las reacciones de los ensayos de transcripción in vitro el tampón utilizado sí lleva Mg2+ (véase “Materiales y Métodos”). Por ello, en este caso, en las reacciones llevadas a cabo en presencia de siquimato y ATP, sí podría catalizarse la reacción Discusión 196 enzimática del dominio SKI, con lo que, aparte de liberarse 3P-siquimato y ADP al medio, no se mantendría el cambio conformacional, sino que la SKI volvería rápidamente a su conformación inicial (LID “descargado”) (Hartmann et al., 2006). De esta forma, no habría transmisión del cambio conformacional del dominio SKI al dominio N2BzdR, el cual se mantendría unido al promotor PN. Esto explicaría los resultados obtenidos en los ensayos de transcripción in vitro (Figura 45), donde se puede apreciar que, al contrario de lo que sucede en los ensayos de retardo en gel, la quimera Q1 mantiene la represión del promotor PN cuando las reacciones son llevadas a cabo en presencia de ATP y siquimato, ya que mantiene su actividad enzimática, impidiendo que la proteína transmita el cambio de conformación al dominio N2BzdR con el consecuente despegue del ADN. Sin embargo, cuando en la reacción se añadía únicamente siquimato, sí se recuperaba la expresión del promotor PN, ya que la actividad enzimática no podía tener lugar sin ATP, con lo que el cambio conformacional provocado por el siquimato (LID “cargado”) se mantiene y, por tanto, podía ser transmitido al dominio N2BzdR, permitiendo la expresión del promotor PN. Posteriormente, pudo demostrarse que tanto la quimera Q1 como la SKI silvestre mantenían la actividad enzimática en el tampón de transcripción in vitro (provisto de Mg2+) (Figura 50B), lo que apoyaba la hipótesis propuesta. En los ensayos in vivo, al no poder controlar los componentes del medio de cultivo, la presencia tanto de ATP como de cationes Mg2+ está garantizada en el citoplasma celular. Esto explicaría los resultados obtenidos en los experimentos de expresión in vivo (Figura 49), donde se puede apreciar que la cepa que expresa la quimera Q1 crecida en presencia de siquimato mantiene los mismos niveles de represión del promotor PN que ésta misma cepa crecida en ausencia del inductor, debido probablemente a que está teniendo lugar la actividad enzimática del dominio SKI, con lo que la enzima adquiere rápidamente su conformación original (LID “descargado”) (Figura 77A) y no permite la transmisión del cambio conformacional al dominio N2BzdR, manteniéndose la quimera Q1 unida al promotor PN. Desde este nuevo punto de vista, todo parecía indicar que la quimera Q1 es capaz de actuar como un regulador transcripcional únicamente cuando se encuentra en su conformación “cargada” y mantiene esa estructura en el tiempo, sin que tenga lugar la reacción enzimática. En ese estado en el que alguno de los sustratos (siquimato, Discusión 197 ATP o ambos) permanece unido y la región LID “cargada”, el dominio SKI mantiene un cambio conformacional que es transmitido al dominio N2BzdR de forma permanente, pudiendo tener lugar así la desrepresión del promotor PN. Una vez desarrollada esta hipótesis que explicaba por qué la quimera Q1 se comportaba como un regulador transcripcional solo en determinadas condiciones, se estudió la forma de diseñar y construir una segunda quimera que fuera capaz de permanecer en su conformación “cargada”, en detrimento de su actividad enzimática siquimato quinasa. Para ello, se procedió de la siguiente forma: Debido a que el Mg2+ ha demostrado ser imprescindible en la reacción enzimática, coordinándose con los residuos Thr16, Asp32 y Asp34 de la SKI de M. tuberculosis (Gu et al., 2002), se buscaron estos residuos en la secuencia de la SKI de E. coli, encontrándose dos residuos de aspártico en las posiciones 34 y 36 (Figura 78A), así como un residuo de treonina en la posición 19. Estos residuos de la SKI se corresponden con las posiciones Asp166, Asp168 y Thr151 de la quimera Q1. Asumiendo que estos residuos, Asp34 y Asp36, estaban implicados en la coordinación con Mg2+ en la SKI de E. coli, se construyó, tal y como se explica en el apartado 4.2.3 de “Resultados”, una quimera mutante mediante mutagénesis dirigida donde fue sustituido el residuo Asp36 por alanina (Figura 78B), generando D34 A32 BcoA SK D34 A32 D34 A36ATP SK D34 A32 D34 A32 BcoA SK D34 A32 D34 A36ATP SK D34 D32 Mg2+ BcoA SK D34 D32 Mg2+ D34 D36 Mg2+ ATP SK D34 D32 Mg2+ D34 D32 Mg2+ BcoA SK D34 D32 Mg2+ D34 D36 Mg2+ ATP SK A B Figura D11: (A) Estructura de la SKI de E. coli unida a sus sustratos (siquimato y ATP) y a su cofactor Mg2+. (B) Modelo de la estructura de la SKI mutante de E. coli unida a sus sustratos (siquimato y ATP). En ambas estructuras se han representado en amarillo las estructuras moleculares de los sustratos, siquimato (SK) y ATP; en rojo los residuos de aspártico D34 y D36 en la figura (A) y los residuos de aspártico D34 y alanina A36 en la figura (B); en verde el catión de Mg2+; en azul el resto de la estructura de la SKI. Discusión 198 así la quimera Q2 (Q1D36A; Figura 51A), con el fin de tener una nueva proteína incapaz de unir cationes Mg2+ y por tanto incapaz de efectuar la reacción enzimática propia de la SKI. La quimera Q2 demostró no poseer ningún tipo de actividad siquimato quinasa, como se puede apreciar en la Figura 51B. Con el fin de determinar si esta ausencia de actividad se debía a la incapacidad de unir Mg2+ o a algún cambio conformacional drástico causado por la mutación efectuada, se realizó una comparación entre el modelo tridimensional de la estructura de una SKI con dicha mutación, obtenido mediante el programa LOOP (Teodorescu et al., 2004b), y la SKI silvestre cristalizada de E. coli (Eco1SKI, código de acceso PDB: 1kag; (Romanowski & Burley, 2002)). Dicha comparación puso de manifiesto que la variación estructural entre ambas proteínas era mínima, lo cual sugería que la pérdida de actividad enzimática no se debía a variaciones estructurales importantes, sino a la pérdida de la capacidad del dominio SKI de unir cationes Mg2+ (Figura 78). A continuación, se determinó la capacidad de unión de la quimera Q2 al promotor PN mediante ensayos de retardo en gel, comprobándose que apenas difería de la obtenida para la quimera Q1 ó BzdR. De igual forma se pudo constatar su capacidad de desrepresión en presencia de siquimato, de ATP o de ambos, similar a la obtenida con la quimera Q1 (Figura 51C). En los ensayos de transcripción in vitro se puso de manifiesto la primera de las diferencias con respecto a la quimera Q1, ya que la quimera Q2 demostró poder ser desreprimida, no únicamente en presencia de siquimato, sino también con la adición de ambos sustratos, siquimato y ATP (Figura 52). Estos resultados parecían indicar que, efectivamente, el hecho de impedir que se produzca la reacción enzimática del dominio SKI permite que el ATP y el siquimato permanezcan unidos y así, el cambio conformacional sufrido en este dominio, puede ser transmitido al dominio N2BzdR, permitiendo la transcripción del promotor PN. Discusión 199 En los ensayos de expresión in vivo llevados a cabo en la cepa E. coli MC4100 pSJ3-PN demostraron que la represión ejercida por la quimera Q2 sobre el promotor PN, podía ser revertida añadiendo siquimato 5 mM al medio de cultivo, tal y como muestran los resultados de la Figura 53. Todos estos resultados tomados en conjunto sugieren que la nueva quimera Q2, al haber perdido su actividad enzimática y por tanto, ser capaz de mantener unidos sus sustratos, ATP y siquimato, de forma permanente, se ha transformado en un regulador transcripcional estable, capaz de responder a las señales ambientales del medio. De este modo, la quimera Q2 podría definirse como un regulador artificial similar a BzdR, capaz de controlar la regulación del promotor PN mediante una nueva molécula inductora, siquimato, en lugar de benzoil-CoA. De este modo, se han logrado construir dos reguladores transcripcionales artificiales, Q1 y Q2, capaces de controlar la expresión del promotor PN por medio de un nuevo inductor, el siquimato. En el caso de la quimera Q1, se ha obtenido un regulador bi-funcional, capaz de regular la expresión del promotor PN in vitro a la vez que mantenía su actividad enzimática siquimato quinasa. Hasta ahora no se ha descrito en la literatura la construcción de ninguna proteína artificial bi-funcional de este tipo, pero, no obstante, sí se han descrito algunas proteínas naturales capaces de aunar estas dos funciones: regulador transcripcional + enzima. Entre este tipo de proteínas cabría destacar la flavoproteína PutA (Proline utilization A), involucrada en el metabolismo de la prolina, que presenta la capacidad de asociarse a membrana y catalizar la reacción de oxidación que transforma la prolina en glutamato, mediante dos actividades enzimáticas diferentes, lo que le permite a la bacteria utilizar a la prolina como única fuente de nitrógeno y energía (Becker & Thomas, 2001; Brown & Wood, 1993; Menzel & Roth, 1981b; Surber & Maloy, 1998; Vinod et al., 2002; Zhu & Becker, 2003). Primeramente, la prolina es oxidada a Δ-pirrolin-5-carboxilato (P5C) por el dominio prolina deshidrogenasa (PRODH) dependiente de FAD de la proteína PutA (Scarpulla & Soffer, 1978). A continuación, el P5C se hidroliza espontáneamente (sin que medie ninguna enzima) a glutámico. Finalmente, el glutámico es oxidado a glutamato por el dominio P5C-deshidrogenasa (P5CDH) dependiente de NAD+ de la proteína PutA (Abrahamson et al., 1983; Menzel & Roth, 1981b). Este tipo de proteínas sólo han sido encontradas Discusión 200 en organismos procariotas, ya que en eucariotas ambas actividades enzimáticas son llevadas a cabo por proteínas independientes (Phang, 1985), y únicamente en algunos organismos se ha descrito una función relacionada con la regulación transcripcional, como es el caso de E. coli, S. typhimurium y P. putida. En estos microorganismos, la proteína PutA, además de catalizar la reacción enzimática anteriormente descrita, es capaz de regular la transcripción del operón put, que incluye los genes putA (que codifica la proteína PutA) y putP (que codifica un transportador de Na+/prolina) (Brown & Wood, 1992; Maloy & Roth, 1983; Menzel & Roth, 1981a; Ostrovsky de Spicer et al., 1991; Ostrovsky de Spicer & Maloy, 1993; Wood, 1981). Estos genes se transcriben en direcciones opuestas y la proteína PutA es capaz de reprimir su expresión uniéndose a la región intergénica del operón put que separa a ambos (Brown & Wood, 1992; Nakao et al., 1987). En ausencia de prolina, la proteína PutA se encuentra en citoplasma, reprimiendo la expresión de los genes put. En presencia de prolina, ésta se une a la proteína PutA dando lugar a la reducción del cofactor FAD, lo que genera un cambio de conformación que favorece la asociación de PutA con la membrana. De esta forma, se produce la disociación del complejo ADN-PutA, activándose la expresión de los genes put (Brown & Wood, 1993; Ostrovsky de Spicer & Maloy, 1993; Zhang et al., 2004b; Zhu & Becker, 2003). En el caso de la proteína PutA de E. coli, que posee 1320 aa y se encuentra en solución como un dímero de 293 kDa (Brown & Wood, 1992), se han podido delimitar cada uno de los dominios responsables de las actividades previamente descritas. El dominio de unión a ADN se extiende entre los residuos 1 y 47, y pertenece a la familia RHH (ribbon-helix-helix) (Gu et al., 2004; Larson et al., 2006). Este dominio parece estar implicado también en el proceso de dimerización de PutA, una característica típica de esta familia de dominios (Gu et al., 2004). El dominio con actividad prolina deshidrogenasa (PRODH) se extiende entre los residuos 86 y 669, y ha sido caracterizado estructuralmente (Lee et al., 2003; Zhang et al., 2004a). El dominio con actividad P5C-deshidrogenasa (P5CDH) no ha sido caracterizado estructuralmente, pero el modelo de PutA predice que se extiende entre los residuos 650 y 1130 (Ling et al., 1994). Por último, el dominio de unión a membrana aún no ha sido localizado. No obstante, en el caso de la proteína PutA, ambas funciones están relacionadas entre sí, es decir, hay una relación directa entre el catabolismo de la prolina y la regulación de los genes que codifican los transportadores de prolina. Sin embargo, en el caso de la quimera Q1, se han logrado aunar dos funciones que no tienen relación entre Discusión 201 sí: actividad siquimato quinasa, relacionada con la biosíntesis de corismato, y regulación transcripcional del promotor PN, relacionado con la degradación anaeróbica de benzoato. Este tipo de proteínas que aúnan dos funciones tan dispares como son catalizar una reacción enzimática y regular la transcripción génica, es muy probable que no sean favorecidas desde el punto de vista evolutivo, ya que una mutación de su secuencia podría dar lugar a la pérdida de dos funciones en lugar de una sola, como sucede con el resto de proteínas. De hecho, esa podría ser la razón por la que se han descrito tan pocos casos. Estas proteínas podrían ser consideradas como intermediarios evolutivos que en algún momento perderán alguna de sus funciones para especializarse en una de ellas, incrementando su efectividad. En el caso de la quimera Q1, así se ha considerado, como se verá en el apartado 4.4 de esta “Discusión”. En el caso de la quimera Q2, se ha obtenido un regulador transcripcional artificial similar al represor BzdR, capaz de regular la expresión del promotor PN tanto in vivo como in vitro, de un modo semejante a BzdR, pero utilizando como inductor siquimato en lugar de benzoil-CoA. Esta quimera ya no posee actividad siquimato quinasa, pero, gracias a ello, permite regular la transcripción del promotor PN de un modo más efectivo. Esta quimera también podría ser considerada un intermediario evolutivo, más especializado que la quimera Q1, como se verá en el apartado 4.4 de esta “Discusión”. 44..33 PPaappeell ddeell lliinnkkeerr eenn llaass qquuiimmeerraass QQ11 yy QQ22.. Por último, cabe mencionar los experimentos llevados a cabo con las quimeras sin linker (LBzdR) Q4 y Q5 (Figura 54). Estas quimeras demostraron, tanto en los ensayos in vitro como en los ensayos in vivo, ser incapaces de transmitir el cambio conformacional desde el dominio SKI hasta el dominio NBzdR, lo que sugería que el papel del linker de BzdR era crucial en el proceso de transmisión de la información. De hecho, estos resultados son coherentes con los resultados obtenidos con la quimera Qλ2, la cual tampoco poseía el linker de BzdR, demostrando ser incapaz de transmitir el cambio conformacional desde el dominio CBzdR hasta el dominio NcI, lo que sugería un papel crucial del linker en este proceso, tal y como se discutió en el apartado 3.6. Estos resultados tienen un valor añadido debido a que en todas las quimeras construidas el linker está transmitiendo la información de un cambio conformacional entre dominios nuevos, diferentes de los originales. En el caso de la quimera Qλ (NcI + LBzdR + Discusión 202 CBzdR), cuando el benzoil-CoA se une al dominio CBzdR, el cambio conformacional que recibe y transmite el linker probablemente no difiera de cómo lo hace en la proteína BzdR, residiendo la novedad en que el linker es capaz de hacer llegar esa información de cambio conformacional a un dominio NcI, similar pero diferente de NBzdR, de forma efectiva, ya que NcI deja de reprimir al promotor PR. En el caso de la quimera Q1 ó Q2 (NBzdR + LBzdR + SKI), cuando el siquimato se une al dominio SKI, se genera un cambio conformacional cuyo objetivo, al ser una enzima, es catalizar una reacción enzimática y, en ningún caso, transmitir un cambio conformacional. Sin embargo, y he ahí la novedad, el linker de BzdR es capaz de recibir la información del cambio conformacional sufrido por la SKI y transmitirla al dominio NBzdR de forma efectiva, ya que NBzdR deja de reprimir al promotor PN. Todas las quimeras construidas que no poseen el linker de BzdR (Qλ2, Q4 y Q5), si bien no demuestran cómo se produce esta transmisión de información para lo cual sería necesario poseer datos de estructura, sí han demostrado que el linker es necesario en este proceso, y probablemente intervenga en el proceso de forma directa. De hecho, esta información, unida a los datos previamente obtenidos y discutidos acerca del linker, refuerzan la hipótesis de que el linker de BzdR se encuentre implicado de forma directa y activa en la transmisión de la información del cambio conformacional desde el dominio regulador al dominio efector. 44..44 MMooddeelloo ssoobbrree eell oorriiggeenn eevvoolluuttiivvoo ddee llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. Dada la similitud estructural previamente establecida entre la SKI de E. coli y el dominio CBzdR, tanto a nivel de secuencia (Barragán et al., 2005), como a nivel de estructura secundaria (apartado 3.4 de “Discusión”), cabe la posibilidad de establecer una relación evolutiva entre ambos. Esta hipótesis permite especular bien con un dominio ancestral común que dio origen tanto a la SKI como al dominio CBzdR, o bien con una posible evolución directa en la cual la proteína SKI habría dado lugar al dominio CBzdR por pérdida de su actividad enzimática y adaptación del bolsillo de reconocimiento a la estructura de un nuevo inductor, el benzoil-CoA. La fusión de este nuevo dominio CBzdR a un dominio capaz de reconocer ADN, probablemente de la familia Cro/cI, con una región linker capaz de transmitir los cambios conformacionales en respuesta a la presencia de inductor en el medio, habrían dado lugar a un intermediario evolutivo semejante a la quimera Q1, previamente descrita en este trabajo. Este intermediario mantendría su actividad enzimática, pero ya poseería la capacidad de unirse al ADN y actuar como regulador transcripcional del promotor PN. A Discusión 203 continuación, este intermediario semejante a Q1 sufriría una mutación que le convertiría en un nuevo intermediario evolutivo semejante a la quimera Q2, previamente descrita. Este intermediario habría perdido totalmente la actividad enzimática, con lo que podría actuar de forma más eficiente como regulador transcripcional. En la quimera Q2 se mutó un residuo de aspártico que se corresponde con el Asp36 de la SKI, implicado en la unión de Mg2+ e imprescindible para que tenga lugar la actividad enzimática. Si se realiza un alineamiento entre BzdR y la SKI (Figura 79) se puede apreciar que, de los dos residuos de aspártico, Asp34 y Asp36, implicados en la unión de Mg2+ en la SKI (Gu et al., 2002), la proteína BzdR no conserva ninguno de ellos, siendo sustituidos por glutámico, el Asp34, y por alanina, el Asp36. De hecho, la mutación llevada a cabo en la quimera Q2 fue la sustitución del Asp36 por alanina. Esta mutación pudo ser la que dio lugar a la pérdida de actividad enzimática en este intermediario evolutivo propuesto. Finalmente, diversas mutaciones sobre este intermediario semejante a Q2, generarían una serie de cambios en el sitio de reconocimiento de sustrato, que perdería la capacidad de reconocer siquimato y ATP para reconocer de forma específica benzoil- CoA, dando lugar a la proteína BzdR (Figura 80). Figura 79. Alineamiento de secuencias del dominio CBzdR y la siquimato quinasa I de E. coli (SKI). Los residuos de cada una de las secuencias están numerados a la derecha. Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa de alineamiento múltiple ClustalW2. Los aminoácidos han sido representados mediante el código de una letra y los cuatro colores en que se muestran representan el grupo de aminoácidos al que pertenecen: rojo = apolares; verde = polares sin carga; azul = ácidos; rosa = básicos. En la zona inferior del alineamiento, un asterisco (*) significa que los residuos de esa posición son idénticos en todas las secuencias; dos puntos (:) significan que existen sustituciones conservadas, acordes con el código de colores mencionado anteriormente; un punto (.) significa que existen sustituciones semi- conservadas. Por último, se han sombreado en color gris los dos aspárticos de la SKI (34 y 36) implicados en la unión del catión Mg2+, así como los residuos correspondientes de CBzdR, glutámico (34) y alanina (36). CBzdRCBzdR SKISKI CBzdRCBzdR SKISKI CBzdRCBzdR SKISKI ----QRIAFIGLRGAGKTTLGTMLAEHLGVPFLELAKVIEQEAGADLSEIFSLYGQTAYR 56 MAEKRNIFLVGPMGAGKSTIGRQLAQQLNMEFYDSDQEIEKRTGADVGWVFDLEGEEGFR 60 :.* ::* ****:*:* **::*.: * : : **:.:***:. :*.* *: .:* RYERRGLESVVASNEAFVLIAGGSIVSEPANFDLLLSSCFTIWLCASPEEHMARVMEQGD 116 DREEKVINELTEK-QGIVLATGGGSVKSRETRNRLSARGVVVYLETTIEKQLARTQRDKK 119 *.: ::.:. . :.:** :**. *.. . : * : ..::* :: *:::**. .: . YRPMHGNQEAMDDLKRILAGRTTMYSK-ADAIIDTSGRTVEQSFLDILEVLAR- 168 RPLLHVETPPREVLEALANERNPLYEEIADVTIRTDDQSAKVVANQIIHMLESN 173 :* : . : *: : *..:*.: **. * *..::.: :*:.:* 34 36 CBzdRCBzdR SKISKI CBzdRCBzdR SKISKI CBzdRCBzdR SKISKI ----QRIAFIGLRGAGKTTLGTMLAEHLGVPFLELAKVIEQEAGADLSEIFSLYGQTAYR 56 MAEKRNIFLVGPMGAGKSTIGRQLAQQLNMEFYDSDQEIEKRTGADVGWVFDLEGEEGFR 60 :.* ::* ****:*:* **::*.: * : : **:.:***:. :*.* *: .:* RYERRGLESVVASNEAFVLIAGGSIVSEPANFDLLLSSCFTIWLCASPEEHMARVMEQGD 116 DREEKVINELTEK-QGIVLATGGGSVKSRETRNRLSARGVVVYLETTIEKQLARTQRDKK 119 *.: ::.:. . :.:** :**. *.. . : * : ..::* :: *:::**. .: . YRPMHGNQEAMDDLKRILAGRTTMYSK-ADAIIDTSGRTVEQSFLDILEVLAR- 168 RPLLHVETPPREVLEALANERNPLYEEIADVTIRTDDQSAKVVANQIIHMLESN 173 :* : . : *: : *..:*.: **. * *..::.: :*:.:* 34 36 Discusión 204 Figura 80. Modelo del origen evolutivo de la proteína BzdR. Las flechas moradas indican la fusión de la enzima SKI con un miembro de la familia Cro/cI. Las flechas verdes indican mutaciones sufridas en el proceso evolutivo. Todas las proteínas han sido representadas mediante modelos estructurales obtenidos de la base de datos PDB. Siquimato Siquimato quinasaquinasa Pérdida de Pérdida de actividad actividad enzimáticaenzimática Motivo HTHMotivo HTH (Familia (Familia CroCro//cIcI)) FusiónFusión CBzdRCBzdR NBzdRNBzdR Q2Q2 Q1Q1 Cambio del sitio Cambio del sitio de reconocimiento de reconocimiento de sustratode sustrato αα--BzdRBzdR BzdRBzdR Cambio del sitio Cambio del sitio de reconocimiento de reconocimiento de sustratode sustrato ???? Discusión 205 En base a esta hipótesis, cabría especular que la proteína BzdR sea también un intermediario de este proceso evolutivo. De esta forma, sería posible que BzdR sufriera una serie de mutaciones que generaran una nueva proteína capaz de reconocer benzoato y utilizarlo como inductor de la expresión del promotor PN, lo que facilitaría y mejoraría la regulación del cluster bzd, ya que su expresión dependería directamente del benzoato, y no precisaría de ser transformado a benzoil-CoA. Por otro lado, cabe mencionar el hecho de que en ciertos organismos, como E. coli, existan dos genes que codifiquen dos siquimato quinasas (Whipp & Pittard, 1995), y una de ellas, aroK, presente una actividad enzimática con una Km muy elevada. Se podría especular con la posibilidad de que inicialmente existiese un único gen que codificara una siquimato quinasa y dicha enzima comenzara a ejercer algún papel adicional en la célula. Esta presión selectiva daría lugar a la duplicación y mutación del gen, de forma que se expresarían dos siquimato quinasas, la original, que mantiene su papel original, y la mutada, cuya actividad, al poseer una elevada Km, se centraría en el papel adicional antes mencionado. De hecho, actualmente se sospecha que la SKI de E. coli, codificada por el gen aroK, aparte de desempeñar un papel secundario como enzima siquimato quinasa, debe desempeñar algún otro papel que aún no se ha conseguido identificar (DeFeyter et al., 1986; Romanowski & Burley, 2002; Vinella et al., 1996). Extrapolando este razonamiento al microorganismo Azoarcus sp. CIB, donde únicamente se ha descrito un gen que codifica una siquimato quinasa, cabría especular con la posibilidad de que el dominio CBzdR haya evolucionado a partir de una duplicación de dicho gen de la siquimato quinasa. Posteriormente, este gen pudo fusionarse a un dominio de la familia Cro/cI y, tras sufrir una serie de mutaciones, tal y como se ha esquematizado en la Figura 80, esta proteína de fusión terminó convirtiéndose en la proteína BzdR. En la literatura se han descrito algunos casos de reguladores transcripcionales cuyo origen evolutivo podría residir en dominios enzimáticos que ya han perdido su actividad enzimática y únicamente poseen una actividad reguladora. La mayoría de estos casos han sido reportados en proteínas de organismos eucariotas. Uno de estos reguladores transcripcionales es Gal80, un represor de Gal4, que es el activador transcripcional de los genes del catabolismo de la galactosa (GAL) en Saccharomyces cerevisiae y en Kluyveromyces lactis (Lohr & Lopez, 1995; Zenke et al., 1996). Si las células crecen en ausencia de galactosa, la proteína Gal80 permanece unida a Gal4 e impide que active la Discusión 206 transcripción de los genes GAL. Por el contrario, en presencia de galactosa como única fuente de carbono, la proteína Gal80 forma un complejo con otra proteína, Gal3, mediante una reacción dependiente de galactosa y ATP (Zenke et al., 1996), de forma que la proteína Gal4 adquiere una conformación que le permite activar la transcripción de los genes GAL, aunque el mecanismo molecular implicado en este proceso aún no se conoce en profundidad. La secuencia del represor Gal80 indica que posee un elevado grado de identidad con la familia de oxidorreductasas GFOR (Glucose Fructose OxidoReductases) (Aravind & Koonin, 1998). De hecho, la proteína Gal80 conserva un motivo Rossmann (Rossmann fold) típico de la familia GFOR, implicado en la unión de dinucleótidos. Sin embargo, la familia GFOR posee un motivo Glu-Lys-Pro típico de su centro catalítico, que ya no aparece en la secuencia de Gal80, lo que sugiere que Gal80 no posee actividad enzimática oxidorreductasa (Aravind & Koonin, 1998), aunque sí mantiene su capacidad de unir nucleótidos, lo cual probablemente esté relacionado con que la reacción de activación dependa, además de galactosa, de ATP (Yano & Fukasawa, 1997). No obstante, si bien Gal80 es un represor de la transcripción, no lo hace directamente uniéndose al ADN, ni ha adquirido la capacidad de reconocer un nuevo sustrato, por lo que las modificaciones que haya sufrido suponiendo que provenga de un miembro de la familia GFOR no han sido tan drásticas. Otro caso destacable es el de la proteína TAFII150 de Drosophila melanogaster. TAFII150 es uno de los componentes del complejo TFIID, que se une al ADN en regiones cercanas a los promotores (Verrijzer et al., 1995), controlando la activación de la transcripción mediada por la RNAP-II en células eucariotas (Verrijzer et al., 1994). La secuencia de la proteína TAFII150 ha demostrado poseer una elevada similitud con la familia de aminopeptidasas N (AMPN) (Aravind & Koonin, 1998), que incluye diversas enzimas implicadas en la degradación de gran variedad de péptidos y leucotrienos. La proteína TAFII150 posee cuatro regiones típicas de la familia AMPN, conservando prácticamente todos los residuos excepto las dos histidinas encargadas de quelar metales (Aravind & Koonin, 1998), fundamentales en la actividad enzimática de esta familia (normalmente actividad hidrolasa). De esta forma, la proteína TAFII150 probablemente no posea actividad enzimática, aunque podría mantener la capacidad de unir alguno de los sustratos reconocidos por las aminopeptidasas (Aravind & Koonin, 1998). En este caso, TAFII150 sí está directamente involucrada en la unión al ADN, pero no parece que reconozca nuevos sustratos, y, de ser así, nada indica que pudiera tener relación con su actividad de regulador transcripcional. Cabría mencionar un caso más, el del regulador Discusión 207 Cdc68/Spt16, una proteína asociada a cromatina que actúa como activadora de la transcripción, cuyo caso es muy semejante al de TAFII150, por lo que no se profundizará más en ello (Aravind & Koonin, 1998). Por último, cabe mencionar un caso descrito en procariotas, el de los factores de transcripción de la subfamilia HutC (familia GntR). Entre las proteínas de esta subfamilia se encuentran la proteína HutC de P. putida, implicada en la represión de los genes de utilización de histidina e inactivada por la unión de uroconato (Allison & Phillips, 1990), o la proteína FarR de E. coli, que controla la expresión de los genes del ciclo del ácido cítrico y responde a ácidos grasos de cadena larga (Quail et al., 1994). Todos los miembros de esta subfamilia poseen dos dominios, el N-terminal implicado en el reconocimiento de ADN y el C-terminal implicado en el reconocimiento de la molécula efectora (Gorelik et al., 2006; Haydon & Guest, 1991). Mediante análisis de secuencia se ha podido determinar que los miembros de la subfamilia HutC contienen un dominio de unión a ligando conservado, el cual posee el mismo motivo que posee la enzima corismato liasa, implicada en la ruta de biosíntesis de ubiquinona (Aravind & Anantharaman, 2003). Esta relación sugiere que el dominio C-terminal de la subfamilia HutC une moléculas de pequeño tamaño en un motivo similar al sitio de unión de sustrato de la corismato liasa. De hecho, los miembros de la subfamilia HutC unen diversos efectores como uroconato (HutC) (Allison & Phillips, 1990), ácidos grasos (FarR) (Quail et al., 1994), azúcares (TreR) (Schock & Dahl, 1996) o alquilfosfonato (PhnF) (Metcalf & Wanner, 1993). Sin embargo, ninguno de estos reguladores transcripcionales ha conservado los residuos catalíticos de la corismato liasa (Aravind & Anantharaman, 2003). Además, se ha podido comprobar que la corismato liasa se encuentra tanto en organismos procariotas como eucariotas y arqueas, a diferencia de la familia GntR, que sólo han sido descritas en bacterias. De esta forma, se sugiere la existencia de un dominio ancestral de reconocimiento de moléculas pequeñas que evolucionó dando lugar a una variante enzimática (corismato liasa) y a otra variante no enzimática (subfamilia HutC) del mismo motivo de reconocimiento de moléculas pequeñas, por medio de diferentes presiones selectivas a lo largo de la evolución (Aravind & Anantharaman, 2003). Este es el único caso que realmente se asemeja al propuesto para el origen evolutivo de BzdR, si bien en este caso proponen que el motivo ancestral no poseía actividad enzimática y desde este evolucionaron la actividad enzimática por un lado y el motivo de unión de ligandos por otro. Aparentemente, con la información disponible, no parece Discusión 208 ser posible identificar si el motivo ancestral poseía actividad enzimática y la perdió, como ha sido propuesto en el caso de BzdR, o si dicho motivo no poseía actividad enzimática y la ganó posteriormente, como ha sido propuesto para HutC. Sin embargo, en el caso de BzdR, dado que la siquimato quinasa actúa en la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (entre otros compuestos) (Bentley, 1990; Haslam, 1993), que son moléculas básicas y elementales en el desarrollo de la vida desde su inicio (hace alrededor de 3.800 millones de años), cabría pensar que esta enzima, o algún ancestro de la misma, tiene un origen muy antiguo. En cualquier caso, dicho origen sería anterior a la aparición de reguladores de la transcripción como BzdR, implicado en la regulación de una ruta de degradación sumamente compleja como la del benzoil-CoA, cuya origen evolutivo sea, muy probablemente, mucho más moderno que el de la siquimato quinasa. En vista de estos resultados, serán necesarios estudios más profundos y afinados que permitan elucidar estas cuestiones. Discusión 209 DDiissccuussiióónn 55.. EEssttuuddiioo ddee llaa iinntteerraacccciióónn eennttrree llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR yy eell pprroommoottoorr PPNN.. La proteína BzdR ha demostrado ser capaz de reconocer tres determinadas regiones del promotor PN. Dichas regiones presentan secuencias palindrómicas del tipo TGCA (Barragán et al., 2005). Con el fin de profundizar en la caracterización de esta interacción se llevaron a cabo estudios para intentar determinar tanto la afinidad de BzdR por cada una de las regiones que reconoce, como el número de moléculas de proteína que se encuentran unidas al promotor PN cuando tiene lugar la represión del mismo. 55..11 EEll pprroommoottoorr PPNN ssee ddiivviiddee eenn ttrreess rreeggiioonneess ddee iinntteerraacccciióónn ccoonn llaa pprrootteeíínnaa BBzzddRR.. El dominio NBzdR (residuos 1-90) de la proteína BzdR muestra un elevado porcentaje de similitud con los reguladores transcripcionales pertenecientes a la familia HTH-XRE (Barragán et al., 2005), que incluyen más de 1300 proteínas de diversos organismos eucariotas, procariotas, arqueas y bacteriófagos, debido a que posee un motivo HTH de unión a ADN muy similar al que poseen la proteína Cro y el represor cI del fago λ, dos de los mejor caracterizados hasta el momento (Pabo & Lewis, 1982; Roberts et al., 1977; Sauer et al., 1982). La secuencia reconocida por estos dos represores consta de 3 regiones denominadas OR3, OR2 y OR1 de 17 pb cada una, dispuestas entre los genes divergentes que codifican el represor cI y la proteína Cro. Las secuencias de cada uno de los operadores OR son similares, pero no idénticas, y poseen secuencias palindrómicas hacia los extremos de la secuencia (Ptashne & Hopkins, 1968; Ptashne et al., 1976). Este tipo de estructuras palindrómicas es muy común en promotores no constitutivos que se ven sometidos a algún tipo de regulación mediada tanto por activadores como por represores. En el caso de reguladores transcripcionales que responden específicamente a determinados compuestos aromáticos, se han descrito algunas de estas estructuras palindrómicas que son reconocidas tanto por activadores como por represores. Por ejemplo, la proteína MarR es un represor del operón marRAB de resistencia múltiple a antibióticos, que responde a compuestos fenólicos (Cohen et al., 1993; Sulavik et al., 1995), y reconoce una región del operador marO en la cual se han localizado dos palíndromos como posibles secuencias de reconocimiento (Cohen et al., 1993). También cabe destacar otros reguladores transcripcionales tales como el Discusión 210 represor HpaR, involucrado en la regulación del cluster hpa que codifica las proteínas encargadas de la ruta de degradación del ácido 4-hidroxifenilacético (Prieto et al., 1996), y es capaz de reconocer dos secuencias palindrómicas (OPR1 y OPR2) en la región promotora del meta-operón hpaGEDFHI (Galan et al., 2003). El activador CbaR de la familia MarR, involucrado en la regulación del cluster cbaABC que codifica las proteínas encargadas de la ruta de degradación del clorobenzoato (Peel & Wyndham, 1999), también reconoce dos secuencias palindrómicas en la región promotora del operón cba (Providenti & Wyndham, 2001). Por último, cabe destacar el represor TtgR de P. putida, implicado en la regulación del operón ttgABC que codifica los transportadores responsables de la resistencia a antibióticos (Orth et al., 2000), el cual también reconoce una región palindrómica consistente en una repetición invertida de 12 pb separadas por 4 pb, sobre las cajas -10 y -35 de los promotores divergentes responsables de la expresión del operón ttgABC y del gen ttgR (Teran et al., 2003). La proteína BzdR, de forma semejante a los casos anteriormente expuestos, reconoce cuatro secuencias palindrómicas, las cuales dividen la zona del promotor PN protegida por BzdR en tres regiones denominadas región I (correspondiente a la sonda mI), que se extiende a lo largo de 63 pb, región II (correspondiente a la sonda mII), que se extiende a lo largo de 21 pb, y región III (correspondiente a la sonda mIII), que se extiende también a lo largo de 21 pb. En la región I se localizan dos de las secuencias palindrómicas, y una más en cada una de las regiones II y III (Barragán et al., 2005). Tal y como se puede apreciar en la Figura 57, los palíndromos del promotor PN se caracterizan en todos los casos por mantener la secuencia común TGCA, a partir de la cual pueden poseer más bases por ambos extremos, y por situarse aproximadamente en el centro de cada una de las tres regiones protegidas por la proteína BzdR. Aunque la región I parece ser la principal responsable de la represión, ya que solapa con la caja -10 de la RNAP y con el sitio de inicio de la transcripción del gen bzdN, la región II también podría tener algún tipo de papel en el mecanismo de represión, ya que podría interferir con la subunidad α-NTD de la RNAP, pero parece más probable que su papel principal sea otro. En cuanto a la región III, no es sencillo especular acerca de su papel en la regulación sin más datos acerca del mecanismo de regulación BzdR-PN. Con el fin de profundizar en la estructura del promotor PN y su relación con la función del represor BzdR, se purificaron por separado las tres regiones I, II y III y se llevaron a cabo los ensayos in vivo e in vitro mostrados en el apartado 5.1 de “Resultados”. Los ensayos de retardo en gel pusieron de manifiesto una mayor afinidad Discusión 211 de BzdR por la región I, ya que prácticamente toda la sonda mI era retardada a una concentración de BzdR 100 nM, mientras que las sondas mII y mIII aún no habían sido completamente retardadas a una concentración de BzdR 500 nM (Figura 58). Desde el punto de vista mecanístico, este dato es consistente con la hipótesis planteada inicialmente, ya que la región I, que se extiende desde la posición -32 a la +31, es la que coincide directamente con la región promotora propiamente dicha del promotor PN, es decir, solapa con parte de la región de reconocimiento de la RNAP (caja -10) y con la región de inicio de la transcripción (+1). De este modo, el represor BzdR estaría ocupando una región de reconocimiento clave para la RNAP, la cual, al no poder acceder a dicha región, es incapaz de iniciar la transcripción del promotor PN. Los ensayos de footprinting mostraron las respectivas secuencias de reconocimiento de las regiones I, II y III (Figura 59), que coincidieron con las regiones ya previamente establecidas en los ensayos de footprinting con la sonda PN, que incluye las tres regiones (Barragán et al., 2005). Por otro lado, se llevaron a cabo una serie de ensayos in vivo en los que se comparó la actividad promotora de PN, que incluye las tres regiones I, II y III, con la actividad promotora de la región I y de la región I+II, clonando las respectivas regiones en el promotor pSJ3 delante del gen reportero lacZ. Tal y como muestran los resultados de la Figura 60, la actividad en todos los casos fue prácticamente la misma. Además, la proteína BzdR mantuvo intacta su capacidad represora, tanto con la región I, como con la región I+II. Estos datos parecían indicar que la región I era suficiente para que tuviera lugar la regulación del promotor PN, ya que el ensayo realizado, al mostrar niveles de expresión similares a los obtenidos con el promotor PN, sugería que la RNAP era capaz de unirse e iniciar la transcripción desde la región I, lo que implicaba la unión de la proteína Fnr, sin la cual la RNAP es incapaz de dar lugar a dicha transcripción (Durante-Rodríguez et al., 2006). Igualmente, debido a que la represión mediada por BzdR de la región I mostró niveles similares a los obtenidos con el promotor PN, este resultado sugería, por un lado, que las regiones II y III no son necesarias para que tenga lugar la represión y, probablemente, no estén implicadas en el proceso, y, por otro lado, que la interacción entre la región I y el represor BzdR es lo suficientemente estable para impedir el acceso de la RNAP a su zona de reconocimiento en el promotor PN. Por lo tanto, si bien parece haber quedado claro el proceso en el que no están implicadas las regiones II y III, aún no se ha elucidado cuál podría ser su función. No obstante, con los datos obtenidos mediante los ensayos de ultracentrifugación analítica y AFM, se pudo Discusión 212 establecer un modelo de interacción que involucra a las tres regiones del promotor PN, como se verá a continuación. 55..22 TTiippoo ddee iinntteerraacccciióónn yy nnúúmmeerroo ddee mmoollééccuullaass iimmpplliiccaaddaass.. Los resultados mostrados hasta el momento han puesto de manifiesto, entre otras cosas, que la proteína BzdR es un dímero en solución. Sin embargo, las tres regiones protegidas por BzdR, al encontrarse separadas entre sí y abarcar una región bastante amplia (177 pb), sugieren que el número de moléculas de represor que protegen dichas regiones del promotor PN es superior a un único dímero. Con el fin de elucidar esta cuestión, y determinar de la manera más aproximada posible el número de moléculas de BzdR que se unen al promotor PN en solución, se llevaron a cabo los ensayos de ultracentrifugación analítica y microscopía de fuerzas atómicas, cuyos resultados han sido expuestos en el apartado 5.2 de “Resultados”. Los ensayos de unión [ADN]:[proteína] llevados a cabo mediante ultracentrifugación analítica demostraron que el dominio N2BzdR se unía al promotor PN en una relación 8:1, cuando la concentración de proteína era 10 veces superior a la de ADN (2 μM:0.2 μM). Es decir, se unían 8 moléculas de proteína N2BzdR por cada molécula de PN. Puesto que ya había sido demostrado que el dominio N2BzdR era un dímero en solución, todo indicaba que la proteína se había unido en forma de 4 dímeros al promotor PN. Además, los datos indicaban que esta unión se producía de un modo cooperativo, ya que al incrementar la concentración de N2BzdR de 1 a 2 μM, la unión pasaba de 1 a 4 dímeros, que no aumentaban más, aunque se incrementase la concentración de N2BzdR hasta 8 μM. Los ensayos realizados con el dominio NBzdR (sin linker) arrojaron los mismos resultados que N2BzdR. Sin embargo, este ensayo no pudo llevarse a cabo con tanta precisión con la proteína completa BzdR, debido a su tendencia a agregar. En este caso, si bien se pudo comprobar la cooperatividad de la unión, no se pudo establecer con exactitud el número de moléculas de BzdR que se unían al promotor PN. Este tipo de unión cooperativa es coherente con la respuesta fisiológica controlada por BzdR, de forma que, en ausencia de benzoato en el medio, BzdR debe ser capaz de reprimir eficiente y rápidamente la expresión de los genes bzd, ya que supondría un gasto energético inútil, lo cual muestra la sutileza y la precisión de este sistema de regulación. No obstante, los datos obtenidos permitieron estimar que a una concentración de 1 μM se unía un dímero, como en el caso de N2BzdR, y que a una Discusión 213 concentración de 2 μM se unían entre 8 y 10 moléculas, es decir, probablemente, entre 4 y 5 dímeros de BzdR. El hecho de que la proteína N2BzdR se una al promotor PN en forma de 4 dímeros, sugiere que en el caso de BzdR suceda lo mismo y se unan también 4 dímeros a una relación [ADN]:[proteína] de 1:10 o superior. Se han descrito reguladores transcripcionales que se unen también en forma de dímeros a sus correspondientes promotores. El represor TtgR, antes mencionado, es un dímero en solución y se ha demostrado mediante ensayos de ultracentrifugación analítica que se une a las regiones operadoras de los promotores ttgR/ttgA en forma de dos dímeros. Además, mediante ensayos de calorimetría isoterma de titulación se pudo determinar que la unión de los dímeros de TtgR presentaba un comportamiento bifásico y era de tipo cooperativo (Krell et al., 2007). Otro ejemplo es el de la proteína CggR, que controla la expresión de las enzimas implicadas en la parte central de la glucolisis codificadas en el operón gapA (Doan & Aymerich, 2003). Mediante ensayos de fluorescencia anisotrópica y de ultracentrifugación analítica se ha podido demostrar que CggR se une de un modo cooperativo al promotor de gapA, en forma de dos dímeros que cubren cada una de las dos repeticiones inversas presentes en el promotor. Además, se ha podido determinar que su ligando, la fructosa-1,6-bifosfato, presenta un efecto bimodal sobre CggR. Si el ligando se encuentra a concentraciones del rango μM, la proteína CggR se mantiene en forma de tetrámero unido al ADN y sólo se puede apreciar un cambio conformacional en la estructura del complejo, con lo que se propone que el ligando podría estar actuando como cofactor. Si el ligando se encuentra a concentraciones del rango mM, se produce una disminución drástica de la afinidad y la cooperatividad del complejo CggR-ADN. Con estos datos, los autores sugieren que la proteína CggR podría presentar dos sitios de unión para la fructosa-1,6-bifosfato, uno de alta afinidad, mediante el cual el ligando actuaría como cofactor de CggR, y otro de baja afinidad, a través del cual el ligando actuaría como inductor de la expresión de los genes gapA (Zorrilla et al., 2007). Por último, cabría destacar el caso del represor transcripcional TtgV, implicado en la regulación de la expresión del operón ttgGHI, que codifica la más importante de las tres bombas de extrusión que confieren resistencia a multitud de compuestos tóxicos en P. putida DOT-T1E (Rojas et al., 2001) y es capaz de reconocer diversos compuestos aromáticos tóxicos para la célula (Guazzaroni et al., 2005). Mediante ensayos de ultracentrifugación analítica se pudo determinar que la proteína TtgV es un tetrámero en Discusión 214 solución, cuyo estado oligomérico no varía en presencia de los efectores. También se pudo establecer que la unión al ADN se produce en forma de tetrámero y que la unión de diversos efectores dan lugar a la disociación del complejo TtgV-ADN, pero manteniéndose TtgV siempre como un tetrámero (Guazzaroni et al., 2007). Como se puede apreciar, este tipo de ensayos permiten la obtención de una valiosa información a la hora de estudiar el mecanismo por el cual se produce la regulación de un promotor a nivel molecular. En el caso de BzdR, se intentó ampliar este conocimiento sobre la interacción BzdR-PN mediante el uso de una técnica que permitiría la observación directa de esta interacción, la microscopía de fuerzas atómicas (AFM). Esta técnica permitió la obtención de una serie de imágenes que, si bien no permitieron determinar el número exacto de moléculas de BzdR que se unen al promotor PN, sí permitieron caracterizar qué tipo de complejos se forman entre la proteína BzdR y las regiones operadoras I, II y III del promotor PN. Entre la diversidad de complejos observados, con interacciones entre BzdR y diversas combinaciones de las regiones operadoras (I, III, I+II, I+III, II+III), cabe destacar la existencia de una superestructura en la que el ADN quedaba plegado e implicaba a las tres regiones operadoras. Dado que esta superestructura ocupaba todas las regiones del promotor PN, de igual modo que revelaban los ensayos de footprinting (Barragán et al., 2005), probablemente fuera la más relevante, aunque la proporción de estos complejos no estuviera en consonancia con esta afirmación. De hecho, esta baja proporción de superestructuras podía deberse a que las condiciones en las que se llevaba a cabo el ensayo no fueran óptimas en cuanto a la concentración de proteína usada. Sin embargo, dicha concentración no pudo ser incrementada porque se perdía resolución en las imágenes de AFM. Además, el porcentaje de complejos observables por esta técnica (adsorción sobre una superficie de mica), no siempre coincide con el porcentaje que se da en solución, sino que suele ser muy inferior (Sorel et al., 2006). Por tanto, cabía la posibilidad de asumir que esta superestructura era el complejo más relevante de todos los observados. El análisis de varias superestructuras permitió establecer un modelo de unión tipo lazo, en el cual el ADN abrazaba a las moléculas de proteína dando un giro sobre sí mismo (Figura 65B). Este tipo de unión también ha sido descrito en el complejo formado por la proteína MutS con el ADN (Jia et al., 2008). Esta proteína reconoce errores en la secuencia de ADN, uniéndose a estas regiones específicamente y estimulando el reclutamiento de las proteínas implicadas en la corrección del error. Mediante AFM se ha caracterizado este tipo de unión y se ha Discusión 215 podido observar que sigue un modelo tipo lazo, semejante al formado por la proteína BzdR con sus regiones operadoras del promotor PN. No obstante, inicialmente se consideró la posibilidad de que la unión siguiera un modelo tipo horquilla, descrito previamente en la unión del regulador TodT a su promotor PtodX (Lacal et al., 2008). Este regulador pertenece al sistema de dos componentes TodS/TodT (Lacal et al., 2006) y controla la expresión de los genes tod implicados en la degradación de tolueno en Pseudomonas putida (Mosqueda et al., 1999). La proteína TodT reconoce dos pseudopalíndromos y la mitad de un palíndromo del promotor PtodX, plegando el ADN en forma de horquilla (Lacal et al., 2008). En cualquier caso, a pesar de la mayor semejanza de la proteína BzdR con la proteína TodT desde el punto de vista funcional y fisiológico, el tipo de unión al ADN fue diferente. Todos estos datos, unidos a los datos bioquímicos previamente obtenidos, permitieron elaborar un modelo que será discutido a continuación. 55..33 MMooddeelloo ddee iinntteerraacccciióónn ddeell ccoommpplleejjoo BBzzddRR--PPNN.. La proteína BzdR ha demostrado ser capaz de unirse a las tres regiones operadoras del promotor PN en diversos experimentos. Los resultados obtenidos mediante ultracentrifugación analítica y AFM, si bien no lo han demostrado, sugieren que la proteína se une en forma de 4 dímeros, lo cual es bastante consistente dado que el promotor PN presenta 4 palíndromos dispuestos en tres regiones operadoras: dos en la región I y uno en cada una de las regiones II y III. Por tanto, era posible asumir que la interacción se daba mediante un modelo de lazo, propuesto anteriormente, en el cual la hebra de ADN rodearía a los cuatro dímeros de BzdR, que permanecerían en el interior de esta superestructura, protegiendo las regiones operadoras, tal y como se esquematiza en la Figura 81. Esta estructura mantendría las cajas -10 y -35 totalmente inaccesibles para la RNAP, pues no sólo solapan con la región I donde está unida BzdR, si que además se encuentran en el interior de un bucle o lazo de ADN plegado sobre sí mismo, razón por la cual, en esta conformación, el promotor se mantendría reprimido, como de hecho ocurre. Por otro lado, se encuentra el activador de la transcripción del promotor PN, la proteína AcpR. Esta proteína, o su ortólogo Fnr*, ha demostrado ser imprescindible en la expresión del promotor PN, tanto en ensayos in vivo como in vitro (Durante- Rodríguez et al., 2006), probablemente por la estabilización de la interacción ADN- RNAP. En el modelo propuesto, la proteína AcpR podría estar unida también en ese Discusión 216 complejo, ya que su región de reconocimiento no solapa con ninguna región operadora de BzdR y su región de unión solapa sólo parcialmente con la región I. De esta forma, la proteína AcpR quedaría confinada entre el dímero de BzdR unido en la región II y uno de los dímeros unidos en la región I. En cualquier caso, esto no ha sido demostrado, y la proteína AcpR podría unirse a su región operadora en alguna fase posterior de la activación del promotor. Por último, es necesario mencionar el papel de la molécula inductora, el benzoil- CoA. Los ensayos de expresión in vivo han demostrado de forma inequívoca su papel como inductor del promotor PN (Barragán et al., 2005). Los ensayos de transcripción in vitro confirmaron este dato, como se puede observar en el apartado 3.3 de “Resultados”. Los ensayos de retardo en gel parecían indicar que el benzoil-CoA despegaba a la proteína BzdR del promotor PN, al menos, parcialmente (Barragán et al., 2005). Sin embargo, aunque el benzoil-CoA modificaba la conformación de la proteína, BzdR se mantenía en forma de dímero, como quedó demostrado en el ensayo de ultracentrifugación analítica expuesto en la Tabla 10. Los experimentos de AFM también sugerían que la proteína BzdR se despegaba del promotor PN, al menos parcialmente, en presencia de benzoil-CoA (Figura 67C). En base a estos datos, el benzoil-CoA parecía ser el principal candidato implicado en la disolución de la superestructura formada por BzdR y sus regiones operadoras. Finalmente, tomando todos estos datos en conjunto, se propuso el siguiente modelo, que implica la participación de la superestructura en el mecanismo molecular de regulación del promotor PN. Cuando el sistema se encuentra en ausencia de inductor, la proteína BzdR forma la superestructura ya comentada en forma de lazo (Figura 81). La unión posterior del inductor, el benzoil-CoA, genera un cambio de conformación en la estructura de BzdR, que probablemente reduzca la afinidad de las proteínas por el ADN, y provoca el despliegue de la superestructura, pudiendo mantenerse las moléculas de BzdR unidas a la hebra de ADN lineal. En ausencia de AcpR, la RNAP no podría unirse a al promotor PN y se mantendría la represión. Por el contrario, cuando AcpR esté disponible en el medio, podrá unirse a su región operadora, o, si ya estaba unida, afianzar dicha unión. En cualquier caso, el activador AcpR ya sería accesible a la RNAP, la cual ya estaría en condiciones de competir con BzdR, desplazándola de la región I y comenzando la transcripción. Discusión 217 Por lo tanto, la función de la superestructura parece ser, bien impedir el acceso del activador AcpR a su región operadora, bien impedir el reconocimiento de AcpR por parte de la RNAP. En cualquiera de los dos casos, el objetivo de esta superestructura en forma de lazo, sería impedir totalmente la expresión del promotor PN hasta que sea Figura 81. Esquema del modelo de interacción y mecanismo molecular del promotor PN. (A) Esquema de la superestructura del complejo [BzdR]:[PN] en forma de lazo, en ausencia de inductor. (B) Esquema de la disposición del promotor PN desplegado en presencia de inductor, con AcpR unido y la RNAP compitiendo por unirse a la región I. (C) Esquema del promotor PN en disposición de comenzar la transcripción, tras haber sido desplazada la proteína BzdR de la región I por la RNAP. bzdRbzdR bzdNbzdN Región I Región II Región III ?? BzdRBzdR AcpRAcpR bzdRbzdR bzdNbzdN Región IRegión IIRegión III BenzoilBenzoil--CoACoA RNAPRNAP bzdRbzdR bzdNbzdN Región IRegión IIRegión III σ70 ?? ?? A B C Discusión 218 necesaria la expresión de los genes de la ruta catabólica de benzoato que controla. Dado que el complejo [BzdR]:[ADN] parece ser constitutivo, únicamente cuando la bacteria se encuentre en presencia de una fuente de carbono como el benzoato, que da lugar a la síntesis de benzoil-CoA (el intermediario de la ruta central), se desplegará el complejo y, en caso de estar en condiciones anaeróbicas (lo que induce la dimerización de la AcpR y su unión al ADN), la RNAP podrá ser estabilizada por AcpR, desplazar a BzdR, y comenzar la transcripción del cluster bzd, que codifica las enzimas de la ruta catabólica. De esta forma, queda modelada la interacción y el mecanismo molecular subyacente entre el promotor PN, las proteínas implicadas en su regulación y el inductor, mostrando un sistema complejo, sutil y robusto, dada la eficacia de la represión y la eficiente respuesta ante la aparición del efector. No obstante, se han obtenido datos adicionales no mostrados en este trabajo, que sugieren la implicación de más factores en la regulación de este promotor. 219 CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS 220 Conclusiones 221 CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS A continuación se exponen las conclusiones extraídas a lo largo de este trabajo: 1. Se ha caracterizado la regulación sobreimpuesta mediada por oxígeno del cluster de degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB, pudiéndose comprobar que la proteína Fnr* de E. coli, implicada en procesos globales de regulación mediada por el nivel de oxígeno, es necesaria en la activación del promotor PN. 2. Se ha caracterizado la región operadora de Fnr* en el promotor PN, la cual se centra en la posición -41.5, lo que incluye a PN dentro de los promotores de clase II. 3. La proteína Fnr ha demostrado estar implicada en el reclutamiento de la RNAP, así como poseer regiones de interacción con los residuos de lisina 593 y 597 de la subunidad σ70 de la RNAP. 4. Se ha identificado un nuevo regulador denominado AcpR en Azoarcus sp. CIB, ortólogo de la proteína Fnr de E. coli, cuyo papel es crucial en la activación del promotor PN del operón bzd, al cual sólo activará en ausencia de oxígeno en el medio. 5. Se ha caracterizado la regulación del promotor PR del gen bzdR, que es regulado por su propio producto génico, el represor BzdR, mediante un sistema de feedback negativo que autorregula su propia expresión. Además, se ha podido establecer que la represión ejercida por BzdR sobre el promotor PR es en torno a un orden de magnitud inferior que la represión ejercida sobre el promotor PN. 6. Se ha demostrado que el promotor PR no se encuentra sometido a represión catabólica mediada por ácidos orgánicos, tales como succinato. 7. Los estudios llevados a cabo con la proteína BzdR han demostrado que posee una arquitectura modular constituida por dos dominios, el efector y el regulador, conectados por una región linker. El dominio N-terminal, tanto con linker Conclusiones 222 (NBzdRL) como sin linker (NBzdR), ha demostrado ser funcional cuando es purificado de forma aislada, convirtiéndose en un super-represor del promotor PN. El dominio C-terminal (CBzdR) también ha demostrado mantener la capacidad de reconocer a la molécula efectora, benzoil-CoA, y sufrir un cambio conformacional cuando es purificado de forma aislada. 8. La región linker de BzdR (LBzdR) está implicada en la transmisión de información desde el dominio CBzdR, que sufre un cambio de conformación al unir el benzoil- CoA, al dominio NBzdR, que detecta dicho cambio conformacional y permite la inducción del promotor PN. El linker también parece ser capaz de disponer el dominio NBzdR en una conformación que permite la dimerización de BzdR, si bien no parece estar implicado directamente en este proceso de dimerización. 9. Se ha podido establecer un modelo de acción de la proteína BzdR basado en la estructura de la enzima SKI, con la cual, el dominio CBzdR, comparte un 30% de identidad. Dicho modelo predice el cambio de conformación que sufriría CBzdR al reconocer al benzoil-CoA, que consistiría en una bajada de la región LID, dando lugar a un cambio conformacional que sería transmitido al dominio NBzdR a través del linker. 10. Los dominios de la proteína BzdR demostraron ser tan flexibles a nivel funcional que permitieron la construcción de quimeras artificiales con nuevas funciones reguladoras. El dominio LCBzdR fusionado al dominio N-terminal del represor del fago λ dio lugar a una quimera (Qλ) capaz de controlar el ciclo de vida del fago, que mantenía al fago en lisogenia e inducía el ciclo lítico en presencia del inductor, benzoil-CoA. El dominio NBzdRL fusionado a la enzima SKI de E. coli dio lugar a una quimera (Q1) bi-funcional, capaz de catalizar la reacción de la siquimato quinasa y de controlar la expresión del promotor PN in vitro, utilizando siquimato como inductor. Cuando la actividad siquimato quinasa de esta quimera fue eliminada mediante una mutación que impedía la unión de su cofactor, el Mg2+, se obtuvo una nueva quimera, Q2, que actuaba igual que BzdR tanto in vivo como in vitro, pero utilizando siquimato, en lugar de benzoil-CoA, como inductor de la expresión del promotor PN. Conclusiones 223 11. Las similitudes existentes entre las secuencias del dominio CBzdR y de la SKI, así como los resultados obtenidos con las quimeras Q1 y Q2, permitieron la elaboración de un modelo sobre el origen evolutivo de la proteína BzdR. 12. Se llevó a cabo una caracterización de cada una de las regiones operadoras del promotor PN, I, II y III, que reconoce la proteína BzdR, pudiéndose demostrar que la región I es suficiente para que la regulación ejercida por BzdR tenga lugar. De esta forma, quedó demostrado que el papel de las regiones II y III no está relacionado con el mecanismo de represión. 13. Se pudo establecer que el tipo de unión de BzdR al promotor PN era cooperativa. Además, se pudo demostrar que el dominio NBzdRL se unía al promotor PN en forma de 4 dímeros a concentraciones saturantes de proteína. La proteína BzdR completa parecía unirse en forma de 4 ó 5 dímeros. Si bien no pudo demostrarse de un modo concluyente, los resultados obtenidos con NBzdRL sugerían que también se uniría en forma de 4 dímeros. 14. Se pudo establecer un modelo de interacción del complejo BzdR-PN, basado en los resultados anteriores y en las imágenes obtenidas mediante AFM, que establece la formación de un lazo en donde se incluyen todas las regiones operadoras del promotor PN, cada una de las cuales tendría unido un dímero de BzdR por cada uno de los palíndromos presentes (4 palíndromos = 4 dímeros). En este modelo, el benzoil-CoA sería el responsable de disgregar la superestructura del lazo, pero sería la proteína Fnr la cual, al reclutar a la RNAP, desplazaría a los dímeros de BzdR de la región I. Las regiones II y III sólo participarían en la formación de la superestructura en lazo, siendo irrelevante, aparentemente, si se mantienen unidas o no cuando el ADN se encuentra desplegado. 224 225 BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA 226 Bibliografía 227 BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA Abrahamson, J. L., Baker, L. G., Stephenson, J. T. & Wood, J. M. (1983). Proline dehydrogenase from Escherichia coli K12. Properties of the membrane-associated enzyme. European journal of biochemistry / FEBS 134, 77-82. Achong, G. R., Rodriguez, A. M. & Spormann, A. M. (2001). Benzylsuccinate synthase of Azoarcus sp. strain T: cloning, sequencing, transcriptional organization, and its role in anaerobic toluene and m-mylene mineralization. J Bacteriol 183, 6763-6770. Aiba, H., Kato, N., Tsuzuki, M. & Mizuno, T. (1994). Mechanism of gene activation by the Escherichia coli positive regulator, OmpR: a mutant defective in transcriptional activation. FEBS Lett 351, 303-307. Alder, E. (1977). 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