UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Sanidad Animal CARACTERIZACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES PARA LA DETECCIÓN DE TÉNIDOS DE INTERÉS HUMANO Y VETERINARIO MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Ada Nelly Martínez Villalobos Bajo la dirección de los doctores Teresa Gárate Ormaechea y Luis Miguel González Martínez Madrid, 2008 • ISBN: 978-84-692-1088-8 ©Ada Nelly Martínez Villalobos, 2008 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE SANIDAD ANIMAL CARACTERIZACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES PARA LA DETECCIÓN DE TÉNIDOS DE INTERÉS HUMANO Y VETERINARIO ADA NELLY MARTÍNEZ VILLALOBOS MADRID 2007 Dña. Teresa Gárate Ormaechea, Jefa del Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salus Carlos III y Don Luis Miguel González Martínez Investigador Titular del Instituto de Salud Carlos III. CERTIFICAN: Que la Tesis Doctoral titulada “CARACTERIZACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES PARA LA DETECCIÓN DE TÉNIDOS DE INTERÉS HUMANO Y VETERINARIO” de la que es autora la Licenciada en Medicina Veterinaria Doña Ada Nelly Mar tínez Villalobos , ha sido realizada en el Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III, bajo nuestra dirección y cumple las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor en Veterinaria. De acuerdo con la normativa vigente , firmamos el presente certificado, autorizando su presentación como Co-directores de la mencionada Tesis Doctoral, en Madrid a 18 de diciembre de 2007. Fdo: Teresa Gárate Ormaechea Fdo: Luis Miguel González Martínez Esta memoria fue financiada por: Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) Instituto de Salud Carlos III, MPY1274 RD06/002/0019 RETIC-RICET MEC AGL2006-13936-CO2-02/GAN Índice pág. Abreviaturas y siglas..................................................................................................vii Resumen........................................................................................................................ix INTRODUCCIÓN........................................................................................................1 REVISIÓN BILIOGRÁFICA......................................................................................5 1.1. Clasificación taxonómica del género Taenia...........................................................9 1.2. Morfología de las tenias..........................................................................................10 1.2.1. Estado adulto........................................................................................................10 1.2.2. Huevos..................................................................................................................13 1.2.3. Cisticerco o metacestodo......................................................................................14 1.3. Ciclo biológico........................................................................................................16 1.4. Epidemiología de teniasis/cisticercosis...................................................................18 1.5. Aspectos clínicos ....................................................................................................22 1.5.1. Teniasis ................................................................................................................22 1.5.2. Cisticercosis .........................................................................................................22 1.5.2.1 Cisticercosis en el humano.................................................................................22 A) Cisticercosis de tipo quístico ........................................................................25 B) Cisticercosis de tipo racemoso.......................................................................26 C) Cisticercosis de tipo mixto (quística y racemosa)..........................................26 D) Cisticercosis medular ....................................................................................26 1.5.2.2 Cisticercosis en el cerdo......................................................................................28 1.6. Respuesta inmunitaria..............................................................................................29 A) Respuesta inmune humoral ...........................................................................30 B) Respuesta inmune celular ..............................................................................30 1.7. Diagnóstico de teniasis ...........................................................................................31 1.7.1. Diagnóstico parasitológico ..................................................................................31 1.7.2. Diagnóstico inmunológico ...................................................................................32 1.7.3. Diagnóstico molecular .........................................................................................33 1.8 Diagnóstico de cisticercosis humana .......................................................................34 1.8.1. Diagnóstico inmunológico ...................................................................................36 1.8.2 Diagnóstico de cisticercosis porcina .....................................................................38 1.9. Tratamiento .............................................................................................................39 1.9.1. Tratamiento para teniasis .....................................................................................39 1.9.2. Tratamiento de la cisticercosis humana ...............................................................39 1.9.3. Tratamiento de la cisticercosis porcina.................................................................41 1.10. Medidas de control de teniasis/cisticercosis .........................................................41 i Índice 2. Echinococcus granulosus ..........................................................................................43 2.1. Clasificación taxonómica ........................................................................................45 2.2. Morfología de E. granulosus ..................................................................................46 2.2.1. Estado adulto .......................................................................................................46 2.2.2. Huevos .................................................................................................................47 2.2.3. Quiste hidatídico ..................................................................................................47 2.3. Ciclo biológico y mecanismos de transmisión .......................................................48 2.3.1. Hospedador definitivo..........................................................................................49 2.3.2. Hospedador intermediario ...................................................................................50 2.4. Epidemiología .........................................................................................................51 2.5. Aspectos clínicos: Patología y Síntomas ................................................................54 2.6. Diagnóstico .............................................................................................................55 2.7. Tratamiento .............................................................................................................58 2.8. Prevención ..............................................................................................................59 OBJETIVOS ................................................................................................................61 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................63 1. MATERIAL BIOLÓGICO .......................................................................................63 1.1. Genotecas de expresión de adulto de T. solium ......................................................63 1.2. Vectores de Clonación ............................................................................................63 1.2.1. Fagos ....................................................................................................................63 1.2.2. Plásmidos .............................................................................................................63 1.3. Cepas bacterianas ....................................................................................................64 1.3.1. E. coli XL1-Blue MRF´ ........................................................................................64 1.3.2. E. coli SOLR ………………………………………………………………….....64 1.3.3. E. coli BL-21 ………………………………………………………………...….65 1.3.4. E. coli TOPO ………………………………………………………………...….65 1.4. Material parasitario .................................................................................................65 1.4.1. Proglótides de T. solium .......................................................................................65 1.4.2. Quistes hidatídicos ...............................................................................................65 1.4.3. Metacestodos de T. solium ...................................................................................65 1.4.4. Otros quistes .........................................................................................................65 1.5. Sueros ......................................................................................................................66 1.5.1. Sueros empleados en el inmunocribado de las genotecas ....................................66 2. MEDIOS DE CULTIVO ............................................................................................68 2.1. Medios de cultivo de bacterias. Crecimiento y mantenimiento de bacterias............68 ii Índice 3. MÉTODOS ................................................................................................................69 3.1. Manipulación de genotecas de expresión. Técnicas básicas....................................69 3.1.1. Preparación de cepas bacterianas para el crecimiento de los fagos......................69 3.1.2. Mantenimiento de fagos........................................................................................70 3.1.3. Titulación de genoteca de expresión.....................................................................70 3.2. Cribado “al azar” de genotecas de expresión del adulto de T. solium para aislar cDNAs característicos del ténido y, en paralelo, evaluar las propiedades de las genotecas. ................................................70 3.2.1. Aislamiento de los fagos “al azar”.......................................................................71 3.2.2. Determinación de los tamaños de cDNAs clonados............................................71 3.2.3. Electroforesis de DNA en geles de agarosa.........................................................72 3.2.4. Purificación de los cDNAs a partir de geles de agarosa......................................72 3.2.5. Secuenciación de los cDNAs de los fagos purificados........................................73 3.2.6. Análisis de las secuencias....................................................................................73 3.2.7. Preparación de células competentes.....................................................................74 3.2.8. Transformación de células competentes con plásmidos......................................74 3.2.9. Clonación en el vector pGEM®-T Easy...............................................................75 3.2.10. Extracción de DNA plasmídico de los fragmentos clonados.............................75 3.2.11. Medición de la concentración y pureza de ácidos nucleicos.............................75 3.2.12. Digestión del DNA plasmídico..........................................................................76 3.2.13. Diseño de PCR anidada......................................................................................76 3.3. Cribado dirigido o inmunocribado de genotecas de expresión del adulto de T. solium para aislar y caracterizar antígenos marcadores de teniasis...........................................................................................77 3.3.1. Preabsorción de los sueros con lisados de E. coli.................................................77 3.3.2. Infección de células E. coli XL1-Blue con fagos recombinantes.........................78 3.3.3. Inmunodetección...................................................................................................78 3.3.4. Aislamiento y purificación de fagos recombinantes.............................................79 3.3.5. Escisión in vivo en pBluescript de los fagos recombinantes.................................79 3.3.6. Lisis en mancha (“Spot-lysis”)..............................................................................80 3.3.7. Clonación en vector de expresión..........................................................................80 3.3.8. PCR de colonias....................................................................................................81 3.3.9. Inducción y expresión de proteínas de fusión.......................................................82 3.3.10. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE)....................................................................82 3.3.11. Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa y revelado inmunoenzimático (“Western blot”)..................................................83 3.3.12. Preparación de extractos proteicos a partir de material parasitario.....................84 3.4. Obtención de cDNAs de interés diagnóstico utilizando otras alternativas..............84 3.4.1. Extracción de RNA total a partir de material parasitario......................................84 3.4.2. RT-PCR. Amplificación por Transcripción Reversa............................................85 3.4.3. Clonación en el vector pCR 2.1 TOPO®.............................................................86 3.4.4. Construcción de un DNA quimérico.....................................................................87 3.5. Desarrollo de protocolos de PCR y PCR-RFLP, como marcadores para el diagnóstico diferencial de ténidos. iii Índice Aplicación a la identificación específica de quistes tisulares de interés veterinario................................................................................................89 3.5.1. Extracción de DNA genómico de quistes ............................................................90 3.5.2. Diagnóstico por PCR ...........................................................................................90 3.5.2.1. Multiplex-PCR derivada de los fragmentos de HDP2 ......................................91 3.5.2.2. PCRs y PCR-RFLPs derivadas de los espaciadores transcritos internos del DNA ribosomal (ITS-1 e ITS-2)..................................91 3.5.2.3. PCR Eg 9 y Eg 16 .............................................................................................92 3.5.2.4. PCR de genes mitocondriales (COI y ND1)......................................................93 3.5.2.5. PCR optimizada a partir del gen 18S rRNA......................................................93 3.6. Tablas con los cebadores utilizados en este trabajo.................................................94 RESULTADOS.............................................................................................................97 1. Antecedentes...............................................................................................................97 2. Cribado de genotecas de expresión de adulto de T. solium........................................98 2.1. Cribado “al azar”.....................................................................................................98 2.1.1. Determinación de los tamaños de cDNAs clonados ............................................99 2.1.2. Secuenciación de los cDNAs y análisis de las secuencias .................................100 2.1.3. Clonación en vectores de las secuencias HDP2 de T. solium ............................102 2.1.4 Optimización de una multiplex PCR semi-anidada de valor diagnóstico a partir de los fragmentos HDP2 de T. solium ................................104 2.1.5 Análisis de la reactividad de sueros de pacientes para el cribado de genotecas.............................................................................................107 2.1.6 Estudio de antigenicidad de clones purificados “al azar” por lisis en mancha (“Spot-lysis”) .......................................................................109 2.2. Inmunocribado de las genotecas de expresión de adulto de T. solium y selección de clones positivos...............................................................109 2.2.1. Transformación de los fagos recombinantes en fagémidos: “Escisión in vivo”...................................................................................................110 2.2.2. Secuenciación de los fragmentos clonados y análisis de las secuencias ......................................................................................................110 2.2.2.1 Análisis de las secuencias del clon #5 ..............................................................113 2.2.2.2 Análisis de las secuencia del clon #11...............................................................114 2.2.2.3 Análisis de las secuencias del clon #16 ............................................................115 2.2.2.4 Análisis de las secuencia del clon #63 ..............................................................116 2.2.3 Expresión de las proteínas recombinantes a partir de los cDNA seleccionados.......................................................................................118 2.2.4 Estudio primario de la inmunorreactividad de las proteínas de fusión mediante, “Western blot”, con sueros de pacientes con teniasis.........................120 3. Subclonación de la molécula TSES38 ......................................................................121 3.1. Expresión de la proteína recombinante TSES38 en pGEX-4T..............................124 3.2 Estudio de la inmunorreactividad de la proteína de fusión recombinante iv Índice TSES38 mediante “Western blot” con sueros de pacientes con teniasis................124 4. Construcción de un cDNA Quimérico......................................................................125 4.1 Estudio de la inmunorreactividad de las proteínas de fusión recombinantes TSES33 truncada y completa mediante “Western blot” con sueros de pacientes con teniasis..............................................................................................133 5. Definición de marcadores moleculares para el diagnóstico de ténidos. Aplicación a la identificación de quistes aislados s de hospedadores Intermediarios..........................................................................................................134 5.1. Extracción de DNA genómico de quistes..............................................................135 5.2. Diagnóstico por PCR.............................................................................................137 5.2.1. Multiplex-PCR derivada de los fragmentos de HDP2........................................137 5.2.2. PCRs y PCR-RFLPs derivadas de los espaciadores transcritos internos del DNA ribosomal (ITS-1 e ITS-2)....................................................138 5.2.3. PCR Eg 9 y Eg 16...............................................................................................141 5.2.4. PCR de genes mitocondriales (COI y ND1) ......................................................143 5.2.5. PCR optimizada a partir del gen 18S rRNA ......................................................143 6 DISCUSIÓN.............................................................................................................149 1. Cribado “al azar” de las genotecas de expresión de adulto de T. solium.................149 2. Inmunocribado de las genotecas de expresión de adulto de T. solium.....................153 3. Molécula TSES 33 y 38 de T. solium.......................................................................156 4. Diagnóstico de quistes aislados de hospedadores intermediarios ...........................158 CONCLUSIONES......................................................................................................165 BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................167 ANEXO v Abreviaturas ABREVIATURAS aa aminoácido (s) Ac anticuerpo Ag antígeno BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato β-gal β-galactosidasa BSA albúmina sérica bovina (del inglés “bovine serum albumin”) CDC Centro de Control de Enfermedades (del inglés “Centers for Disease Control”) CO1 citocromo oxidasa 1 DAB diaminobencidina DMSO dimetilsulfóxido DNA ácido desoxirribonucleico cDNA ácido desoxirribonucleico complementario gDNA ácido desoxirribonucleico genómico dNTP desoxinucleótido trifosfato DO densidad óptica EDTA ácido etilendiamino tetraacético EITB inmunoelectrotransferencia (del inglés “enzime immunotransfer blot”) ELISA ensayo inmunoenzimático (del inglés “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”) E/S antígeno de excreción secreción EtBr bromuro de etidio FV fluido vesicular G gramos Gp glicoproteína GST glutatión S-transferasa HIC hipertensión intracraneal IFN-γ interferon gamma Ig inmunoglobulina IL interleucina IPTG isopropil-β-D-tiogalactopiranósido ITS espaciador transcrito interno (del inglés “internal transcribed spacers”) vii Abreviaturas Kb kilobase (103 pb) kDa kilodalton Kg kilogramos LB medio Luria-Bertani LCR líquido cefalorraquídeo mg miligramos NBT nitroazul de tetrazolio NCC neurocisticercosis ND1 NADH deshidrogenasa 1 ng nanogramos nt nucleótido (s) OIE Oficina Internacional de Epizootias OMS Organización Mundial de la Salud OPS Organización Panamericana de la Salud ORF marco abierto de lectura (del inglés “open reading frame”) pb pares de bases PBS tampón fosfato salino PCR “Polymerase Chain Reaction” o reacción en cadena de la polimerasa. PMSF fenil metil sulfonil fluoruro RFLP polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (del inglés “restriction fragment length polymorphism”) RM Resonancia Magnética RNA ácido ribonucleico mRNA ácido ribonucleico mensajero rpm revoluciones por minuto RT Transcripción Reversa SDS dodecil sulfato sódico SDS- PAGE electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico sHSP Proteína de choque térmico de bajo peso molecular (del inglés “small heat shock protein”) SNC Sistema Nervioso Central TAC tomografía axial computarizada TAE tampón tris-acetato-edta Taq pol polimerasa de Thermus aquaticus viii Abreviaturas TG transportadores de glucosa (tipo 1 y 2) (TGTP1 y TGTP2) TSES antígenos de T. solium excretores y secretores Tris tri-hidroximetil amino metano ufp unidad formadora de placa de lisis X-gal 5 bromo-4 cloro-3 indolil- β-D galactopiranósido WB Western Blot ix Resumen Resumen Las cestodiosis continúan produciendo serios problemas en salud humana y animal, causan patologías muy serias, no sólo por el grado de discapacidad que producen sino también por la gravedad de las lesiones que generan y que en ocasiones pueden provocar la muerte de los individuos. Su amplia distribución geográfica, con prevalencias más elevadas en regiones menos desarrolladas, la importancia de las lesiones y su repercusión en salud y economía de las áreas afectadas, han despertado el interés de organizaciones internacionales, como la Organización Mundial de la Salud, y en este momento teniasis/cisticercosis están incluidas en el grupo de “enfermedades tropicales olvidadas”, con prioridad para su estudio en vías a conseguir su eliminación. Taenia solium es un parásito de importancia médica y veterinaria, ya que es el responsable de la teniosis humana y la cisticercosis porcina y humana. Pocos estudios se han realizado sobre las relaciones parásito-hospedador en el estado adulto de T. solium y la identificación de moléculas que pudiesen utilizarse como dianas en diagnóstico o protección. Por lo que los objetivos del presente trabajo fueron: (i) aislamiento y caracterización de los genes que se expresan en el cuello-escólex y proglótides del adulto, (ii) el análisis de la posible utilidad de algunas moléculas como marcadores en el diagnóstico precoz de la teniasis, (iii) así como la identificación diferencial de ténidos obtenidos de hospedadores intermediarios, mediante el empleo de distintos protocolos moleculares. Para este estudio se utilizaron cuatro genotecas de expresión de adulto de T. solium. Se aislaron mediante cribado al “azar” una variedad de genes con posible interés diagnóstico; de ellos, una molécula con similitud con el fragmento HDP2, descrito en T. saginata, se empleó para poner a punto una PCR semi-anidada. Por otra parte mediante el inmunocribado se aislaron cuatro moléculas que no fueron reconocidas por los sueros de pacientes portadores de ténidos (T. saginata). La utilización de diferentes marcadores moleculares para el diagnóstico de los quistes aislados de hospedadores intermediarios, permitió la identificación de Sarcocystis suihominis y S. hominis en muestras que previamente fueron diagnosticadas como cisticercos calcificados, además de la detección especie–especifica de T. saginata, T. solium, T. hydatigena, E. granulosus y sus genotipos. Introducción INTRODUCCIÓN En los últimos años la situación sanitaria mundial ha estado influenciada por la prevalencia de las enfermedades transmisibles, las cuales representan una pesada carga de morbilidad y mortalidad para muchos países, especialmente aquéllos en vías de desarrollo. Así, las enfermedades infecciosas son responsables de un porcentaje elevado de toda la atención médica que se registra en el mundo, amenazando la salud pública y contribuyendo a aumentar los costes de la atención sanitaria. En ese panorama las llamadas enfermedades infecciosas emergentes y re-emergentes ocupan un lugar relevante (Sciutto et al., 2000; Rodríguez, 2001). Las enfermedades infecciosas emergentes son las que surgen en lugares y momentos específicos y se convierten, o amenazan en convertirse, en nuevas epidemias. Se caracterizan porque pueden causar serios problemas de salud local o internacional. En los últimos 20 años se han descubierto más de 30 nuevos gérmenes productores de otras tantas enfermedades o síndromes, con resultados devastadores en algunos casos (Rodríguez, 2001; Mesa et al., 2004). Con respecto a las enfermedades re-emergentes son aquéllas supuestamente controladas, en franco descenso, o prácticamente desaparecidas, que vuelven a constituir una amenaza sanitaria y que frecuentemente reaparecen en proporciones epidémicas. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha instado a los estados miembros a fortalecer la vigilancia con vistas a la rápida detección de las enfermedades re- emergentes y a la pronta identificación de las nuevas emergentes. En este sentido, parasitosis consideradas exóticas para muchos países desarrollados han emergido, o re-emergido, como es el caso de la teniosis/cisticercosis en Estados Unidos de América, Francia, y otros países Europeos, libres de las patologías y ahora elegidos como destino por muchos inmigrantes portadores de ténidos (Schantz et al., 1998; Chatel et al., 1999; Giménez-Roldán et al., 2003; Schantz y Tsang, 2003; Phiri et al., 2003; De Giorgio et al., 2005). En relación con hidatidosis, el problema todavía es más serio ya que los fenómenos migratorios también están influyendo en su mantenimiento (Warnnissorn et al., 2006). Estas cestodiosis pueden ser muy serias, no sólo por el grado de discapacidad que provocan sino también por la gravedad de las lesiones que generan 1 Introducción y que en ocasiones pueden determinar la muerte de los individuos. Su amplia distribución geográfica, con prevalencias más elevadas en regiones menos desarrolladas, la importancia de las lesiones y su repercusión en salud y economía de las áreas afectadas, han despertado el interés de organizaciones internacionales y en este momento teniosis/cisticercosis están incluidas en el grupo de “enfermedades tropicales olvidadas”, con prioridad para su estudio en vías a conseguir su eliminación (WHO 2003, Willingham y Engels, 2006). Si bien las zoonosis mencionadas han tomado mayor notoriedad en los últimos años, ya en 1983, uno de los principales objetivos de la OMS fue la identificación correcta de los portadores de los dos ténidos más importantes del hombre, Taenia solium y T. saginata, ya que son la clave para el control de estas enfermedades. En este sentido, la teniosis humana se produce como consecuencia de la infección intestinal por especies del género Taenia. Las especies más comunes son las ya mencionadas, Taenia solium y T. saginata, pero recientemente se ha descrito otra, T. saginata asiatica, con características propias y diferenciales de las dos primeras. Mientras que T. solium y T. saginata tienen una distribución cosmopolita, T. saginata asiatica se circunscribe a países del Sudeste Asiático (Eom y Rim, 1993; Hoberg et al., 2000, 2001; Hoberg, 2002). La ingestión de huevos de T. saginata y T. solium deriva en cisticercosis bovina y porcina, respectivamente. Los huevos de T. solium también pueden infectar al hombre dando lugar a la cisticercosis humana. No está claro que los huevos de T. saginata asiatica invadan al hombre, aunque se piensa que dicha especie podría ser responsable de algunos casos de cisticercosis humana descritos en Asia (Ito et al., 2003, 2005). La parasitosis en estudio es una zoonosis cuyas tasas de prevalencia varían en función de diversos factores socio-económicos y culturales. El comportamiento humano resulta fundamental para su persistencia, ya que la contaminación con heces humanas de los terrenos posibilita la infección de los animales, y el hábito de ingerir carne cruda o poco cocinada de estos últimos cierra el ciclo, permitiendo la infección humana por tenias adultas. A pesar de que parte de los comportamientos comentados han desaparecido en las sociedades más desarrolladas, el complejo teniosis/cisticercosis humana continúa siendo un problema de salud pública que, como ya se ha comentado, no afecta solo a áreas endémicas, sino que en la actualidad se ha extendido a otras regiones, especialmente con la inmigración (Schantz, et al., 1998). 2 Introducción Por otra parte y en relación con zoonosis en general, se debe destacar que la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), ahora denominada Organización Mundial de Sanidad Animal, presentó en la reunión de mayo de 2005 la nueva lista de enfermedades de notificación obligatoria, aprobada por los países miembros, con la idea de propiciar que los países cuenten con la posibilidad de monitorear y notificar todas las patologías que tienen importancia en el comercio de animales y sus productos. Los criterios que se consideraron para la inclusión de cada una de las enfermedades en la nueva lista fueron: 1) La situación de la enfermedad en el mundo, 2) El riesgo de propagación en poblaciones inmunológicamente desprotegidas y que la enfermedad pueda producir morbilidad o mortalidad significativa y 3) El potencial zoonótico de la enfermedad y considerarse una patología emergente. De acuerdo con los criterios establecidos, la lista final aprobada por los países miembros, se encuentra publicada en el Artículo 2.1.1.3 del Código Sanitario para los Animales Terrestres. Incluye a la cisticercosis porcina y a otras cestodiosis tisulares, como la hidatidosis, en posiciones de gran relevancia veterinaria. (http://www.oie.int/esp/normes/mcode/E_summry.htm). A pesar de las llamadas de la OMS sobre la identificación correcta de los individuos teniásicos y las recomendaciones de la OIE, el diagnóstico de los ténidos sigue presentando importantes limitaciones que se tienen que superar para alcanzar una detección específica y sensible de los mismos. Dicha detección orientaría correctamente al clínico y al veterinario sobre las patologías que sufren los enfermos, hombres y animales, ayudaría al epidemiólogo a determinar las vías de contagio y permitiría la interrupción de su transmisión. Teniendo en cuenta la pobre sensibilidad de los métodos microscópicos, la escasa especificidad y oferta limitada de los ensayos serológicos, los problemas de determinación de coproantígenos y estudio molecular del DNA de los ténidos (Pawlowski y Schultz, 1972; Allan et al., 1990, 1993; Wilkins et al., 1999; Mayta et al., 2000; González et al., 2000), con el presente trabajo se persigue llevar a cabo la caracterización de marcadores moleculares de estos parásitos a través de diferentes aproximaciones genómicas que permitan mejorar el diagnóstico de las especies de interés humano y veterinario, aspecto de las parasitosis muy descuidado y que precisa de una mejoría o cambio urgente. 3 http://www.oie.int/esp/normes/mcode/E_summry.htm Revisión Bibliográfica REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Las enfermedades humanas debidas a cestodos son generalmente poco patógenas, salvo casos de cestodiosis larvaria, como la cisticercosis producida por Taenia solium y la hidatidosis ocasionada por Echinococcus granulosus. En el presente capítulo se revisarán aspectos de interés de estos parásitos con especial mención a las características de T. solium. T. solium es un cestodo que parasita al hombre y al cerdo, conocido desde las culturas griega y egipcia. Hipócrates, Aristóteles y Teofrasto los llamaron “gusanos planos” por su parecido con las cintas o listones, mientras que los romanos, Celso, Plinio el Viejo y Galeno, los denominaban Lumbricus latus, que significa gusano ancho. En el siglo IV A.C., Aristóteles en su tratado de “Historia de los Animales” describe con precisión la presencia del estadio larvario del parásito en la lengua y musculatura del cerdo y los compara morfológicamente con el granizo. Al principio de la era cristiana, algunos autores, como Serapio, consideraban que cada proglótide era un gusano diferente y lo llamaban “cucurbitineos”, no solamente por su parecido con las semillas de calabaza, sino porque estas semillas fueron uno de los remedios más antiguos contra la teniosis, que se sigue utilizando en la actualidad (Pawlowski y Schultz, 1972; Cox, 2002; Flisser, 2006). Las religiones monoteístas, como la judaica y posteriormente la musulmana, en sus normas prohibieron la ingesta de carne de cerdo; estas prohibiciones posiblemente guarden relación con la enfermedad en estudio y otras parasitosis musculares. Algunas normas del Corán son claras indicaciones higiénicas orientadas a su prevención (Corán 6, 145). En la Torá y en la Biblia también se hace referencia a medidas alimentarias que pueden ser tomadas como normas de prevención para diferentes tipos de zoonosis, entre ellas la cisticercosis (Levítico 11.3-7). Paranoli, en 1550, y Rumler, en 1558, mencionaron por primera vez la presencia del estadio larvario en el sistema nervioso central y la duramadre en el hombre (cisticercosis). Paracelso, en 1650, sospechó que la epilepsia de un sacerdote enfermo derivaba de la presencia de quistes cerebrales. Tyson, en 1683, descubrió y describió con gran detalle el escólex de las tenias y Redi publicó ilustraciones de dicha porción 5 Revisión Bibliográfica cefálica de tenias de perros y gatos. La enfermedad no se reconoció como parasitaria hasta que Malpighi, en 1697, descubrió la naturaleza animal de los cisticercos y Goeze, en 1784, su condición helmíntica. (Pawlowski y Schultz, 1972; Cox, 2002). Se necesitaron dos siglos más para entender la anatomía completa de estos helmintos, así como su organización e individualidad. Carlos Linneo, en 1758, incluyó la especie T. solium en la décima edición de su Sistema Naturae. Fischer, en 1789, describe Taenia hydatigena en el plexo coroideo de un sujeto. En 1818, se le otorga el nombre de “cisticerco fisherianus”, atribuido a Laenec, basándose en los nombres griegos “Kistis” vejiga, “kestus” cola, y “fisherianus” en honor a su descubridor. Fue Laenec quien introdujo por primera vez el término “cellulosae”. La clasificación específica de Cysticercus cellulosae fue realizada por Zeder y Rudolphi (1800 y 1819, respectivamente), pero se desechó al demostrarse que los cisticercos son estadios larvarios de T. solium. El término de cisticerco celuloso se sigue empleando para describir a los organismos encontrados en humanos y cerdos, aunque no se debe escribir como nombre científico, pues no corresponde a una especie parasitaria. En la actualidad, la denominación más utilizada es el de cisticerco o metacestodo de T. solium (Yoshino, 1934; Grove, 1990; Flisser et al., 1998). En 1860, Virchow describe otro tipo de cisticerco, el cisticerco racemoso. Schott y Sommering, en 1829, observaron la presencia del parásito en la cámara anterior del ojo. Van Beneden demostró, en 1853, el desarrollo de cisticercos en cerdo cuando alimentó un animal con huevos de T. solium y encontró numerosos cisticercos en los músculos en la necropsia, enunciando así el mecanismo de transmisión del ténido. Küchenmeister, en 1855, y Leuckart, en 1879, fueron los primeros en investigar su ciclo biológico y ambos demostraron que el verme vesicular de los tejidos del cerdo era el estadio larvario infestante para el hombre. Küchenmeister comprobó que las tenias adultas se desarrollaban a partir de cisticercos, para lo cual colocó estos parásitos, extraídos de la carne de cerdo, en los alimentos de algunos convictos, sentenciados a muerte, en quienes posteriormente les descubrió tenias en sus intestinos durante la autopsia (teniosis). Las primeras medidas profilácticas basadas en la inspección obligatoria de la carne de cerdo se practican en Alemania, en el año 1900. Se inicia así, la lucha efectiva contra la 6 Revisión Bibliográfica enfermedad, constatándose, un descenso de la frecuencia de cisticercosis del 2% al 0.1% (García-Albea, 1991). El primer estudio documentado en México data de 1889, cuando José de la Luz Gómez, primer veterinario mexicano, publicó en la Gaceta Médica un trabajo sobre la cisticercosis porcina en la ciudad de México, en donde informa la frecuencia de esta parasitosis en los años 1887 y 1888, 2.4 y 2.9 % respectivamente (Aluja y Villalobos 2000). También en México, Gómez Izquierdo, en 1901, describe el primer caso de cisticercosis humana en una paciente de un asilo psiquiátrico con diagnóstico de alcoholismo o tuberculosis, sin embargo en la autopsia se encontraron múltiples cisticercos en su cerebro. En los años 1933-1934, McArthur, Dixon y Smithiers aportaron casuísticas en soldados con cisticercosis que habían contraído la enfermedad sirviendo al ejército inglés en las colonias del sur de África y la India. En España, López de Albo, en 1926 y 1936, encontró cisticercosis en el 6% de todos los casos de “sospecha de tumor cerebral”. Yoshino, en 1933, describió con gran detalle histológico el desarrollo temprano de los cisticercos en los cerdos y también informó que se expulsaba diariamente de uno a cinco proglótides, después de que él mismo ingiriera cisticercos para seguir el curso de su propia infección durante dos años. Para finales del siglo XIX la cisticercosis constituía un problema importante en Europa, especialmente en Alemania, donde la infraestructura sanitaria, el decomiso de canales de cerdo con cisticercosis y los inicios de la educación para la salud permitieron posteriormente erradicarla (Gemmell et al., 1983). En el periodo comprendido entre 1930 a 1980 aparecen numerosos reportes científicos sobre la frecuencia, incidencia y prevalencia de la cisticercosis en hospitales y estudios en autopsias, en varios países de Europa y también en América Latina. En el año 1973 aparece la tomografía axial computarizada (TAC) que es el pilar fundamental en el diagnóstico de la cisticercosis, aumentándose así el número de publicaciones con respecto al tema. La Organización Mundial de la Salud, en 1983, publica una guía para el manejo, la prevención y el control del complejo Teniosis/Cisticercosis, además en el siguiente año, 1984, indica que la población mundial era 5.000 millones de habitantes y que de estos, los casos de teniosis ascendían al 1.5%. Sotelo et al. en 1985, proponen una clasificación de Neurocisticercosis (NCC) basado en la presencia de formas activas e inactivas. Por otra parte, unos años después Madrazo y Sandoval, 1989, publican una nueva clasificación de la neurocisticercosis. En la 7 Revisión Bibliográfica década de los 80, se dió mucho énfasis al diagnóstico inmunológico de la NC, destacando los estudios sobre el ensayo inmunoenzimático (ELISA) y la inmunoelectrotransferencia (EITB) (Tsang et al., 1989). Finalmente, en 1993 la Organización Mundial de la Salud, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) y entidades afines financiaron la realización de programas de prevención para el control del complejo Teniosis/Cisticercosis y como resultado de ello se publicaron diversos tipos de manuales, guías y normas sobre el control de esta zoonosis. A pesar de las medidas mencionadas, este binomio está muy lejos de ser erradicado, debido al aumento creciente en el turismo, la inmigración masiva de individuos provenientes de áreas endémicas y los grandes movimientos de refugiados, migración debida a las guerras en las que poblaciones enteras tienen que migrar con todo y sus animales, desplazándose a áreas libres de la enfermedad (Chatel et al., 1999; Giménez-Roldán et al., 2003; Schantz y Tsang, 2003; Schantz et al., 1998; DeGiorgio et al., 2005; Sorvillo et al., 2007). Todo ello ha condicionado un aumento en la frecuencia de la neurocisticercosis diagnosticada en países desarrollados, donde la enfermedad se consideraba una rareza en las ultimas décadas, situándola como una enfermedad reemergente (Craig y Pawlowski, 2002; Carpio, 2002; Phiri et al., 2003; Wallin y Kurtzke, 2004; Imirizaldu et al., 2004). La prevalencia exacta de la teniosis y la cisticercosis es muy difícil de determinar en vista de la escasez de servicios médicos en las zonas marginadas, inespecificidad de sus manifestaciones clínicas, y de la falta de una prueba de laboratorio completamente confiable y segura que pueda utilizarse en estudios epidemiológicos a gran escala, etc. La teniosis humana es una infección intestinal producida por la fase adulta de T. solium o T. saginata en el hombre, único hospedador definitivo. La cisticercosis ocurre como consecuencia de la infección por el estado larvario del parásito (cisticerco o metacestodo) en los hospedadores intermediarios. El cisticerco de T. saginata (Cysticercus bovis) provoca la cisticercosis bovina y el cisticerco de T. solium (Cysticercus cellulosae) causa la cisticercosis porcina y humana, ya que el hombre también puede convertirse en su hospedador intermediario. El cisticerco de T. solium parasita también otros animales domésticos y silvestres entre los que podemos destacar al perro, gato, zorro y otros. (Okolo, 1986a; Okolo, 1986b; Buback et al., 1996; Schwan et al., 2002; Suja et al., 2003). Recientemente, se ha descrito otra tenia que afecta a 8 Revisión Bibliográfica humanos, T. saginata asiatica, (Fan, 1988; Fan et al., 1995), la cual utiliza como hospedadores intermediarios al cerdo, ganado vacuno, cerdos salvajes y monos, además de otros animales domésticos y silvestres típicos del Sudeste Asiático (Eom y Rim, 1993; Hoberg et al., 2000, 2001; Hoberg, 2002). La presencia de esta enfermedad en países desarrollados y en vías de desarrollo, es digna de consideración debido a la creciente demanda de carne de cerdo en estos países (Phiri et al., 2003; Delgado, 2003). 1.1. Clasificación taxonómica del género Taenia Los Cestodos constituyen un importante grupo dentro del tronco de los Platelmintos. Son los metazoos parásitos con mayor grado de especialización. Todos los miembros adultos de esta subclase son endoparásitos del aparato digestivo y conductos biliares de sus hospedadores definitivos. Durante su ciclo biológico, requieren uno, dos o más hospedadores intermediarios, en cada uno de los cuales experimentan una fase de su desarrollo. Además, se caracterizan por ser vermes alargados y acintados, simétricos bilateralmente y aplastados dorsoventralmente. Carecen de sistema circulatorio, sistema respiratorio y aparato digestivo, por lo que su alimentación la realizan por intercambio de nutrientes a través del tegumento o envoltura externa. La clasificación taxonómica según Cheng (1978) es la siguiente: -Reino: Animal -Phylum: Platyhelminthes, metazoos planos con cavidad general que está rellena de parénquima. El cuerpo está recubierto por el tegumento, en el que se distinguen pequeñas microvellosidades, llamadas microtriquias o “microvilli”. Incluye además de la clase Cestoidea a la clase Trematoda con importantes parásitos en el hombre. -Clase: Cestoidea, con cuerpo cintiforme y segmentado, carecen de tubo digestivo y su nutrición se realiza a través del tegumento, se alimenta del contenido intestinal del hospedador, carece de aparato digestivo propio y la captación y asimilación del alimento se lleva a cabo en el sincitio celular del tegumento, el cual absorbe por difusión o transporte activo, y probablemente también por endocitosis, moléculas orgánicas de bajo peso molecular (Noble et al., 1989). Son hermafroditas, por lo tanto cada proglótide tiene sistema reproductor femenino (ovarios, útero, vagina) y masculino (testículos, vaso deferente, vesícula seminal y cirro). Las proglótides pueden fecundarse así mismas o cuando se adosan dos entre sí. 9 Revisión Bibliográfica -Subclase: Eucestoda, cuerpo dividido en proglótides, con uno o más pares de órganos reproductores por segmento, parasitismo entérico. -Orden: Cyclophyllidea, tienen como órgano de fijación en la porción cefálica del parásito, o escólex, cuatro estructuras de naturaleza muscular denominadas ventosas y un rostelo muscular, generalmente armado con ganchos. Los huevos no contienen larvas ciliadas. -Familia: Taeniidae, son cestodos de tamaño mediano o grande; las proglótides poseen poros genitales irregularmente alternos. -Género: Taenia Linnaeus, 1758. -Especies: T. solium, T. saginata. -Sub-especie: T. saginata asiatica. Con respecto a T. saginata asiatica, se debe indicar que hay autores que la definen como especie, T. asiatica, si bien su situación taxonómica sigue siendo tema de controversia (Eom y Rim, 1993; Fan et al., 1995; Simanjuntak et al., 1997; Eom, 2006; Jeon y Eom, 2006; Kim et al., 2007; Jeon et al., 2007). 1.2. Morfología de las tenias Con respecto a la morfología de los grandes ténidos del hombre, en el ciclo biológico se distinguen tres fases o estadios: el adulto, que vive adherido a la pared del intestino delgado, el huevo y el cisticerco o metacestodo, que se encuentra usualmente en la musculatura del ganado (porcino y bovino). 1.2.1. Estado adulto Presenta forma aplanada dorsoventralmente y de color blanquecino, de aproximadamente 2-4 metros de longitud para T. solium y para T. saginata presenta un tamaño medio de 5 -8 metros (Quiroz, 1999). Comprende tres partes: el escólex u órgano de fijación, el cuello o zona germinal y el estróbilo formado por una serie de segmentos o proglótides inmaduras, maduras y grávidas, las cuales están repletas de huevos (Quiroz, 1999), son hermafroditas por lo que en sus segmentos maduros se encuentran órganos masculinos y femeninos bien diferenciados (Schantz, 1996a). -Escólex: Porción anterior del cuerpo. Su morfología es esencial para la identificación del verme adulto, de forma piriforme y globular, mide de 1.5 a 2 mm de diámetro. En el 10 Revisión Bibliográfica caso de T. solium, el escólex posee un rostelo con una doble corona de ganchos (de 22 a 32) con 4 ventosas musculares que son semiesféricas con un diámetro de 0,7 a 0,8 mm. Están situadas en sus cuatro ángulos y actúan como órganos de fijación (Beaver et al., 1986; Quiroz, 1999). T. saginata presenta un rostelo cuadrado en sección transversal no armado, con un diámetro de 1,5 a 2 mm, también con 4 ventosas (Figura RB.1). El adulto está perfectamente adaptado para unirse a la mucosa del intestino delgado del hombre, y normalmente se encuentran localizados en el yeyuno (Beaver et al., 1986). uello: Situado inmediatamente detrás del escólex, es corto y delgado, mide de 5–10 uerpo o estróbilo: Es la porción más grande del parásito. Está formada por una serie roglótides inmaduras R V V C C Figura RB.1. (A) Escólex de Taenia solium, (B) de T. saginata, observados con el microscopio electrónico de barrido. C: cuello, V: ventosas, R: rostelo. (Tomado de Willms, 2006) A B R V V C C Figura RB.1. (A) Escólex de Taenia solium, (B) de T. saginata, observados con el microscopio electrónico de barrido. C: cuello, V: ventosas, R: rostelo. (Tomado de Willms, 2006) A B -C mm de largo. Es un área no segmentada y poco diferenciada, más estrecha que el estróbilo. Es la región germinal de más alta actividad, ya que es la zona que da lugar a las proglótides por un proceso conocido como estrobilación (Pawlowski 1989). -C de segmentos o anillos, llamados proglótides, que son segmentos independientes pero unidos entre si formando el adulto. Las proglótides conforme se van alejando del escólex cambian de tamaño y presentan nuevas estructuras, por lo que se clasifican de la siguiente manera: P : Son las más cercanas al cuello y no tienen órganos sexuales diferenciados, son más anchas que largas y en ellas se puede observar un aparato genital rudimentario. 11 Revisión Bibliográfica Proglótides maduras: De forma casi cuadrada, sexualmente maduros, donde se aprecian los órganos sexuales diferenciados. Cada proglótide puede considerarse como una unidad independiente puesto que posee órganos reproductores funcionales, tanto aso deferente penetra n el cirro, que se encuentra en el interior de la bolsa del cirro. En algunas especies la ucto. El viducto se dirige a una pequeña cámara, llamada ootipo, donde los distintos femeninos como masculinos. El ovario, situado en el tercio posterior de la proglótide, es bilobulado en T. saginata y trilobulado en T. solium. Los testículos aparecen situados en el parénquima medular, están constituidos por folículos cuyo número varía entre 300 y 400 para T. saginata, mientras que T. solium posee la mitad. El resto de las partes del aparato reproductor de ambos ténidos son prácticamente iguales. El sistema reproductor masculino consta de varios testículos y de cada uno surge un vaso eferente que se unen formando un vaso deferente común. El v e vesícula seminal se encuentra dentro de los límites de la bolsa del cirro y se conoce con el nombre de vesícula seminal interna. En el interior de la bolsa del cirro hay células glandulares conocidas como glándulas prostáticas, que desembocan en el cirro por medio de conductos citoplasmáticos. El cirro es protusible y en la mayoría de los cestodos desemboca en una abertura externa común al macho y a la hembra, o poro genital, situado en la abertura superficial del atrio. Durante la copula, el cirro se introduce en la vagina, las células espermáticas se almacenan en el receptáculo seminal, desde donde penetran al ootipo para llevar a cabo la fecundación (Cheng, 1978) El sistema reproductor femenino esta formado por un único ovario lobulado, situado en la base del útero en el extremo posterior de la proglótide, del que parte el ovid o componentes del huevo son ensamblados. Otras estructuras que se dirigen al ootipo son: las glándulas de Mehlis, el conducto vitelino común. Sobre la porción inferior de los vasos deferentes se encuentra el tubo vaginal, el cual se dirige hacia la porción media y luego hacia la parte posterior del poro genital, para terminar dentro del ootipo. La glándula vitelógena está constituida por un conjunto elíptico y adelgazado de folículos situados en posición media por detrás del ovario. El útero se origina en la cara anterior del ootipo y se dirige hacia el borde anterior de la proglótide, como un órgano ciego (Beaver et al., 1986; Quiroz, 1999). 12 Revisión Bibliográfica Proglótides grávidas: Son más largas que anchas, presentan el útero con 14 – 32 ramas uterinas laterales para T. saginata y de 8 – 14 ramas para T. solium. Se encuentran enos de huevos dentro de las ramificaciones uterinas, la mayoría de los órganos s proglótides grávidas se encuentran en distintos grados de maduración; alrededor del oncosferas infectivas totalmente desarrolladas. Los huevos inmaduros ámbar y miden de 30 a 0 µm de diámetro. Poseen varias envolturas que le permiten al embrión sobrevivir en ll genitales se atrofian por la presión que ejerce el útero lleno de huevos. Cada proglótide grávida contiene aproximadamente 50.000 huevos en distintos grados de madurez (Heath, 1982). Se desprenden periódicamente del resto del cuerpo por apólisis, permitiendo así la salida de los huevos del hospedador en las heces. Las proglótides grávidas de T. saginata pueden salir solas, ya que presentan movimientos de contracción y alargamiento, lo que les permite desplazarse lentamente y salir por el ano. Los adultos de T. saginata tienen generalmente 1.000 a 2.000 proglótides, mientras que T. solium presenta un promedio de 1.000 proglótides. (Figura RB. 2). 4 3 2 1 Fig. RB.2. Adulto de Taenia sp, 1. escólex, 2. segmentos inmaduros, 3. segmentos maduros, 4. segmentos grávidos. Tomado de DPDx-image library-CDC 4 3 2 1 Fig. RB.2. Adulto de Taenia sp, 1. escólex, 2. segmentos inmaduros, 3. segmentos maduros, 4. segmentos grávidos. Tomado de DPDx-image library-CDC 1.2.2. Huevos El ootipo es el lugar de formación del huevo (Cheng, 1978). Los huevos contenidos en la 50% contienen pueden madurar fuera del hospedador y permanecer viables en agua, ríos o pastizales por semanas, susceptibles a la desecación (Willms et al., 2006). Los huevos salen del útero a través del poro genital o por ruptura de la proglótide que fue expulsada con la materia fecal. Son semiesféricos, de color 4 el ambiente. La envoltura más externa es una membrana delgada hialina conocida como vitelo que usualmente se pierde en las heces (Quiroz, 1999; Willms et al., 2006). La 13 Revisión Bibliográfica siguiente capa es el embrióforo denso formado por pequeños bloques de queratina, unidos entre sí por un cemento que les da su aspecto radiado característico y la resistencia en el ambiente externo. Finalmente, se encuentra la membrana oncosferal que rodea directamente a la oncosfera o embrión hexacanto. La oncosfera está formada por un epitelio delgado con extensiones citoplásmicas, un complejo sistema muscular que opera los tres pares de ganchos, un par de glándulas que le ayudan a atravesar las paredes intestinales, células germinativas a partir de las cuales se desarrollará el siguiente estadio larvario y un sistema nervioso primitivo (Quiroz, 1999; Willms et al., 2006) (Figura RB.3). La oncosfera llega por vía linfática o sanguínea a todos los músculos y órganos. Por razones desconocidas, tiene preferencia para alojarse además de en el tejido muscular striado, en el Sistema Nervioso Central (SNC), ojo, hígado y en otras vísceras donde, El cisticerco T. solium ide de 0.5 x 1.5 cm y está formado por una vesícula ovalada blanca o amarillenta, con e al cabo de 60 a 70 días, se transforma en el estadio larvario maduro denominado cisticerco o metacestodo (Smith y McManus, 1989). Los huevos de T. solium son morfológicamente indistinguibles de los de T. saginata y otros ténidos. Estos huevos al principio no son infectantes, y requieren de dos eventos previos para que tengan capacidad de invadir al hospedador intermediario, la desintegración del embrióforo y la activación de la oncosfera (Topley y Wilson´s, 1999). Figura RB.3. Huevos de T. solium, (A) microscopía electrónica de barrido y (B) microscopia óptica. Tomado de Laclette (1982). BA Figura RB.3. Huevos de T. solium, (A) microscopía electrónica de barrido y (B) microscopia óptica. Tomado de Laclette (1982). BA 1.2.3. Cisticerco o metacestodo o metacestodo es la fase larvaria de las tenias. El cisticerco de m 14 Revisión Bibliográfica una pared translúcida y llena de líquido, a través de la cual se puede observar el escólex que tienden a agruparse en racimos ickerstaff et al., 1952; Escobar, 1983). Dichos cisticercos se localizan principalmente invaginado como un gránulo sólido blanquecino (Figura RB.4). La pared de la vesícula es una estructura membranosa compuesta de tres capas, cuticular o externa, celular o media y reticular o interna (Del Brutto et al., 1993). Puesto que los cestodos carecen de tracto digestivo, obtienen sus nutrientes y excretan sus desechos a través de la superficie tegumentaria. En relación con su función de absorción, la superficie externa del tegumento aparece aumentada por proyecciones digitiformes, designadas también microtriquias (Willms et al., 2006). Los cisticercos utilizan rutas metabólicas aeróbicas y anaeróbicas, dependiendo de la disponibilidad de oxígeno en el medio, y obtienen sus nutrientes por difusión facilitada a través de la pared vesicular. Se han identificado dos transportadores de glucosa (TGTP1 y TGTP2), TGTP1 es abundante en estructuras de la pared vesicular del cisticerco así como del parásito adulto, mientras que TGTP2 se localiza en la superficie tegumentaria del cisticerco (Rodríguez-Contreras et al., 1998). Estos cisticercos, frecuentemente, están separados del tejido del hospedador por una cápsula fina de colágeno (Aluja et al., 1987). El escólex presenta una estructura similar a la del adulto de T. solium, con rostelo con ventosas y ganchos y un cuerpo rudimentario, que incluye al canal espiral. Algunas de las proteínas de los cisticercos tienen propiedades antigénicas y estimulan la producción de anticuerpos específicos (Sotelo, 1989). Sin embargo, estos anticuerpos tienen poco efecto en la protección contra la enfermedad ya que los cisticercos desarrollan una serie de mecanismos evasores que les permiten defenderse del ataque inmunológico del hospedador (Flisser, 1980, Del Brutto, 1999a). Entre estos mecanismos destacan el mimetismo molecular y la depresión de la inmunidad celular, la cual puede condicionar una serie de complicaciones al enfermo (Flisser et al., 1980). En algunos cisticercos el escólex no puede ser identificado. Estas últimas larvas están formadas por membranas adheridas entre si, las (B en las cisternas del líquido cefalorraquídeo (LCR) en la base del cráneo y, en ellas, se sugiere que el escólex ha desaparecido como consecuencia de un proceso de degeneración hidrópica, condicionada por la entrada continua de LCR a la vesícula (Escobar, 1983). Solamente en el cerebro del hombre se habían descrito dos tipos de cisticercos, que son: el celuloso y el racemoso, pero en 1989, Rabiela et al., describen 15 Revisión Bibliográfica un tercer tipo, el que cree que es un estadio intermedio entre el cisticerco cellulosae y el racemoso. Se suele denominar Cysticercus cellulosae a aquellos parásitos que presentan escólex y Cysticercus racemosus a aquellos que no lo tienen. Sin embargo, dicha terminología es .3. Ciclo biológico l humano se infecta al ingerir carne de cerdo cruda, o insuficientemente cocida, con l estómago, el efecto de las enzimas digestivas como la pepsina, y inadecuada y crea confusión ya que se puede pensar que se trata de dos especies distintas de tenias (Rabiela et al., 1989). En la actualidad se prefiere la terminología de “forma celulosa” y “forma racemosa” de cisticercos, respectivamente. Cysticercus bovis (T. saginata) exhibe las mismas características que las descritas para T. solium, pero sin la corona de ganchos (Náquira, 1999). A B Figura RB.4. (A) cisticercos vesiculares, (B) corte histológico de un cisticerco de T. solium, teñido con hematoxilina-eosina (V) ventosas, (G) ganchos, (CE) canal de entrada (CEs) canal espiral. Fotos cedidas amablemente por la Dra. Aluja. V G CE CEs V A B Figura RB.4. (A) cisticercos vesiculares, (B) corte histológico de un cisticerco de T. solium, teñido con hematoxilina-eosina (V) ventosas, (G) ganchos, (CE) canal de entrada (CEs) canal espiral. Fotos cedidas amablemente por la Dra. Aluja. V G CE CEs V 1 E cisticercos vivos. En e después en el intestino, la tripsina, inducen la evaginación de la larva. En el primer tercio del intestino delgado, el escólex sale de la vejiga parasitaria y se fija a la pared intestinal ayudándose de las ventosas y ganchos, y se convierte en un verme maduro al cabo de 5 a 12 semanas, liberándose proglótides grávidas por apólisis, llenos de huevos infectantes. Después de ser ingeridos por los cerdos, los huevos son sometidos a la acción de los jugos gástricos en el tubo digestivo del animal, con la consiguiente liberación de los embriones hexacantos u oncosferas que se adhieren a la mucosa intestinal y luego penetran en la pared para alcanzar los vasos sanguíneos y linfáticos (Yoshino 1934; Garrido et al., 2007). Cuando llegan a la circulación sanguínea y 16 Revisión Bibliográfica linfática, se distribuyen por diversos órganos y tejidos, localizándose en la musculatura con más irrigación sanguínea como son músculos maseteros, diafragma y corazón (Cheng, 1978). El hombre es el único hospedador definitivo de la tenia adulta, y el cerdo el hospedador intermediario. Ocasionalmente, la cisticercosis humana puede ser el resultado de una auto-infección externa, a través de la contaminación directa ano-mano- boca en un individuo con teniosis, o de autoinfección interna como consecuencia de movimientos antiperistálticos del intestino (Náquira, 1999). T. saginata presenta una biología similar, con el hombre como hospedador definitivo y los bovinos como intermediarios exclusivos (Figura RB.5). (1) Tenia (2) Huevos (4) Cisticerco (3) Medio Ambiente Fig. RB.5 Ciclo biológico de T. solium. (1) El hombre alberga en su intestino al adulto, (2) cuando elimina proglótides y/o huevos en sus heces, contamina el (3) medio ambiente (4) los cerdos tienen acceso a la materia fecal, adquiriendo la cisticercosis. Finalmente, el hombre adquiere (1) la teniasis consumiendo carne poco cocinada infectada con cisticercos. (4) El hombre también puede padecer la cisticercosis al consumir alimentos contaminados con los huevos del ténido. (1) Tenia (2) Huevos (4) Cisticerco (3) Medio Ambiente (1) Tenia (2) Huevos (4) Cisticerco (3) Medio Ambiente Fig. RB.5 Ciclo biológico de T. solium. (1) El hombre alberga en su intestino al adulto, (2) cuando elimina proglótides y/o huevos en sus heces, contamina el (3) medio ambiente (4) los cerdos tienen acceso a la materia fecal, adquiriendo la cisticercosis. Finalmente, el hombre adquiere (1) la teniasis consumiendo carne poco cocinada infectada con cisticercos. (4) El hombre también puede padecer la cisticercosis al consumir alimentos contaminados con los huevos del ténido. 17 Revisión Bibliográfica 1.4. Epidemiología de teniosis/cisticercosis La teniosis/cisticercosis representa quizá el parámetro más seguro de todo el espectro de patologías humanas para medir el grado de desarrollo de una comunidad. Su presencia es índice confiable de subdesarrollo sociocultural y deficiente infraestructura higiénico- sanitaria y educativa (Sotelo, 2006). Esta enfermedad cobra mucho interés debido a que el hombre, además de ser el hospedador definitivo de la tenia, ha pasado a formar parte del ciclo cuando se infecta con el huevo de T. solium, desarrollándose en él la cisticercosis. La cisticercosis es una de las enfermedades de las que se conoce con precisión su etiología, sus mecanismos fisiopatológicos y sus vías de propagación. Además, de ser una infección milenaria ampliamente conocida y estudiada, se han documentado evidencias de acciones no médicas, sino socioculturales, efectivas para erradicarla de algunos países de Europa a principios del siglo XIX (Gemmell et al., 1983; Sotelo, 2006). Es una parasitosis ampliamente distribuida en países en vías de desarrollo, donde se consume carne de cerdo y predominan las malas condiciones higiénicas, además de una deficiente educación sanitaria. Es endémica en el sureste de Asia no islámica, la parte central y sur de África y en América Latina (Schenone et al., 1982) (Figura RB.6). México y Brasil son los países más afectados en el continente americano (Sarti et al., 1992). Sin embargo, en las últimas décadas han aparecido casos de cisticercosis humana en Estados Unidos, como resultado de los crecientes movimientos migratorios de trabajadores de países en vías de desarrollo (Rosenfeld et al., 1996; Schantz y Tsang, 2003; Wallin y Kurtzke, 2004; DeGiorgio et al., 2005; orvillo et al., 2007). El problema se está extendiendo a otras regiones del mundo ebido a la globalización o el turismo, también como consecuencia de la emigración y wski, 2002; Willingham y Engels, 2006). S d los viajes (Chatel et al., 1999; Craig y Pawlo Las características propias de esta enfermedad hacen que se considere un problema severo de salud pública, ya que los gastos de hospitalización, diagnóstico, atención médica, cirugía y la pérdida de la productividad laboral son muy elevados (Velasco- Suárez et al., 1982; Zoli et al., 2003). También afecta a la economía ganadera de los países endémicos, provocando importantes pérdidas en la industria porcina y bovina de estas regiones (Acevedo, 1989; Aluja et al., 1996). La transmisión de esta parasitosis está asociada con los métodos primitivos de producción de cerdos, la pobre o nula inspección y control sanitario de canales, todo ello asociado a las nulas condiciones higiénico-sanitarias de las zonas endémicas. Sin embargo, la información que se tiene sobre la prevalencia de la infección en el hombre y los animales es escasa. Los estudios 18 Revisión Bibliográfica realizados sobre poblaciones de zonas endémicas podrían ser una fuente confiable (Keilbach et al., 1989; Díaz-Camacho et al., 1990, 1991; Sarti et al., 1992, 1997). Para T. saginata existe una clasificación de la incidencia que reconoce tres grupos: países altamente endémicos, con una incidencia de más del 10% en el centro y este de África (Kenia, Sudán, Eritrea, y otros), países con moderada incidencia (entre 10 y 0.1%) en algunos países de América Latina, y países o regiones de baja incidencia (0.1%), como Estados Unidos, Canadá y centro de Europa (Pawlowski y Schultz, 1972). En América Latina, entre 1949 y 1970, se publicaron informes sobre la presencia de cisticercosis en el sistema nervioso central en autopsias, aunque las autopsias no representan fielmente la población de un país. En cambio, las encuestas serológicas sí pueden diseñarse para que sean representativas, pero sólo permiten identificar personas que han tenido contacto con T. solium aunque no necesariamente se haya establecido la infección. Estudios de seroprevalencia basados en la detección de anticuerpos con la técnica de “Western blot” (WB) demostraron las siguientes valores: 2-9% en Bolivia (Jafri et al., 1998), 5-11% en México (Díaz-Camacho et al., 1990; Sarti et al., 1994), 7-24% en Perú (García et al., 1995), 10-17% en Guatemala (Allan et al., 1996b; García-Noval et al., 1996) y 34% en Honduras (Sánchez et al., 1997), siendo los datos en general, significativamente más altos que los obtenidos con la prueba de ELISA. En Brasil, Colombia, Ecuador y Perú la neurocisticercosis es causa importante de epilepsia de inicio tardío (Carpio, 2002; Imirizaldu et al., 2004). En México, el 12% de las intervenciones de neurocirugía las motiva la NCC y hasta el 4% de las autopsias revelan la presencia de parásitos en el SNC (Del Brutto, 1999b). En África, la teniosis y la cisticercosis se encuentran principalmente en países del este y sudeste del continente (Pammenter et al., 1987; Shasha y Pammenter, 1991; Geerts, 1995; Vilhena et al., 1999; Phiri et al., 2003; Mafojane et al., 2003). En el centro de África se ha descrito cisticercosis en casi todas las regiones a excepción de las áreas musulmanas, donde no se consume cerdo por razones religiosas (Zoli et al., 2003; Nguekam et al., 2003). Además durante la pasada década, se ha indicado que la enfermedad es un serio problema emergente en varios países de África, como Mozambique, Tanzania, Zambia, Zimbabwe, Uganda y Sudáfrica, en los que si se compara la población de cerdos en los años 1960, 1980 y 2000, se observa un incremento creciente de estos animales, especialmente en las áreas rurales, de 1.500.000 a 4.500.000 y con ello el aumento de casos de cisticercosis porcina con una prevalencia 19 Revisión Bibliográfica que puede ir de 0.12 % hasta el 45%. La enfermedad en estas áreas es el resultado de la adquisición (por importación o como regalo) de cerdos de áreas endémicas (Phiri et al., 2003). En Asia, la prevalencia de la Teniosis/Cisticercosis varía dependiendo de diversos factores de riesgo. Así, está casi ausente en países económicamente prósperos como Japón y Singapur, con altos estándares de vida, y en países islámicos (Rajshekhar et al., 2003), mientras que es endémica en otros países con estándares bajos de vida, con mucha pobreza como India (Prasad et al., 2002), China (Ito et al., 2003), Indonesia (Simanjuntak et al., 1997; Sutisna et al., 1999; Subahar et al., 2001; Margono et al., 2003), Tailandia (Yodnopaklow y Mahuntussangapong, 2000) y Vietnam (Erhart et al., 2002), en los que se registran prevalencias de 0.8 al 23% para teniosis y de 1.7 hasta 3% para cisticercosis (Rajshekhar et al., 2003). La información más impresionante ordero del Campillo, 1994). 1 sobre la epidemiología de esta enfermedad surgió en 1978 en Nueva Guinea occidental, donde se convirtió en un desastre entre la población Ekari, para quienes la enfermedad era totalmente desconocida, tras la introducción de cerdos con cisticercosis como regalo del gobierno de Java. Entre el 18 y 20 % de la población adquirió cisticercosis (Flisser, 2006). Aunque el ciclo de vida de T. solium, está considerado sólo entre el humano y el cerdo, los perros también juegan un papel importante, debido a que ellos pueden desarrollar la cisticercosis, y teniendo en cuenta que en algunos países del mundo se consume su carne (Okolo, 1986a; Okolo, 1986b; Buback et al., 1996; Suja et al., 2003). La distribución concreta para ambos ténidos en España es la siguiente: T. solium se ha descrito en Aragón, Badajoz, Cáceres, Cádiz, Cataluña, Córdoba, Granada, León, Lugo, Madrid, Murcia, Pontevedra, Salamanca, Tenerife, Toledo y Vizcaya. T. saginata aparece distribuida por Asturias, Barcelona, Córdoba, Galicia, Granada, León, Madrid, Salamanca y Vizcaya (C Como se ha comentado anteriormente, es difícil obtener cifras claras sobre los casos de teniosis en el mundo; algunos autores (Piédrola et al., 1988) indican que ésta podría alcanzar los 70 millones de portadores, otros estiman (Bern et al., 1999) que, para el caso de T. solium la cifra podría ser de 2.5 millones de afectados. En el caso concreto de España, se han encontrado porcentajes de infectados de hasta 0,1% (Arenas et al., 1992). Se llegó a esta conclusión tras realizar un estudio en el Hospital Clínico Universitario de Salamanca en el que tras el análisis de 692 muestras de heces fecales se encontraron 5 positivas infectadas probablemente por T. saginata. Un estudio similar 20 Revisión Bibliográfica fue llevado a cabo por Roca et al. (1995) en el que se examinó el historial de 68 pacientes correspondientes a los casos de teniosis atendidos, durante 1984-1994, en la Clínica de Viajeros de la Sección de Medicina Tropical (Servicio de Enfermedades Infecciosas), Hospital Clínico Provincial de Barcelona. El 72% de los pacientes no presentaban antecedentes de viajes al trópico (teniosis autóctona) y coincidieron con los autores anteriores en que el porcentaje de casos en España alcanza el 0,1%. La cisticercosis era frecuente en Europa a principios del siglo XX, sin embargo, mejoras generales en los sistemas de salud pública produjeron una reducción considerable de su prevalencia (Mitchell y Crawford, 1988; Engels et al., 2003), aunque aún se pueden encontrar algunos casos autóctonos en Francia, Portugal, España y países de Europa del dura, Galicia, Castilla y León y T. solium, Este (Pittella, 1997; Anton et al., 2002; Duong, et al., 2006). Hoy en día en España, la mayoría de las personas con cisticercosis son inmigrantes de países endémicos, motivando el aumento en el diagnóstico de esta enfermedad (Font et al., 1999; Terraza et al., 2001; Roca et al., 2003); sin embargo, todavía ocurren algunos casos autóctonos aislados de T. solium en áreas rurales de Extrema Castilla la Mancha (Castellanos et al., 2000; Rodríguez-Sánchez et al., 2002). La OMS estima que se producen 50.000 muertes al año como consecuencia de la neurocisticercosis (Schantz, 1996b; Willingham y Engels, 2006), aunque es posible que esta cifra sea mayor. La epidemiología de T. solium y cisticercosis humana se debe considerar como el complejo teniosis/cisticercosis, en el cual hay que tener en cuenta 3 aspectos: a. Los factores que hacen posible la infección de los cerdos a partir de personas infectadas con la tenia adulta. b. Las condiciones que permiten la adquisición de la tenia intestinal por el hombre al ingerir cisticercos en la carne de cerdo. c. Las situaciones que determinan que el hombre ingiera huevos del parásito a partir de su propia tenia o de la que albergan otras personas. La distribución de T. saginata es cosmopolita, solapada en muchas áreas con y, al no ser causa de cisticercosis humana, no tiene las implicaciones en salud pública ya comentadas para la tenia del cerdo (Hoberg, 2002; Willingham y Engels, 2006). 21 Revisión Bibliográfica 1.5. Aspectos clínicos 1.5.1. Teniosis atología clara. Puede presentarse irritación en el lugar donde se adhiere a la ón de hambre y diarrea persistente, o alternada con estreñimiento, dolor de cabeza, aumento de apetito, dolor abdominal, náusea, debilidad, pérdida de peso, vértigos y excitación, prurito anal en el caso de T. saginata. Se puede detectar una eosinofília moderada. Este cuadro leve hace difícil el diagnóstico y puede pasar desapercibida la presencia de la tenia por muchos años (Chester et al., 1986). Cabe destacar, por último, que los enfermos con teniosis son el origen de la cisticercosis bovina (T. saginata) y porcina y humana (T. solium) (Topley y Wilson’s, 1999). 1.5.2. Cisticercosis 1.5.2.1. Cisticercosis en humanos El estado larvario o cisticerco se encuentra más frecuentemente en tejidos subcutáneos, intermusculares, en el ojo y como se ha comentado, en el cerebro. Los síntomas que ráfica de teniasis/cisticercosis (Del Brutto 1999).Figura I.7. Distribución geogFigura I.7. Distribución geográfica de teniasis/cisticercosis (Del Brutto 1999). El ser humano es el único hospedador conocido del estadio adulto de la tenia; el escólex se encuentra adherido a la pared del intestino delgado provocando así la enfermedad denominada teniosis. En esta localización, no se producen serios daños de salud ni una sintom mucosa, o bien oclusión intestinal, sensaci 22 Revisión Bibliográfica produce varían de acuerdo con el número de parásitos y el tejido invadido (Beaver, 1986; Fleury et al., 2004). También se ha descrito que la larva produce cambios metabólicos del tejido que la rodea (Martínez, 1996; Aluja, 2006). Los tipos de cisticercosis más perjudiciales para el hombre son la forma ocular y la neurocisticercosis. La neurocisticercosis es una enfermedad de distribución mundial, su expresión clínica en los enfermos varía de manera radical; por ejemplo, en pacientes de Asia (China, Corea, India) es común la cisticercosis muscular y subcutánea y rara la hidrocefalia secundaria debida a aracnoiditis cisticercosa; mientras que la neurocisticercosis en Latinoamérica esporádicamente se acompaña de cisticercosis muscular, en cambio la hidrocefalia por aracnoiditis cisticercosa es frecuente. Igualmente, la infección masiva por parásitos en el sistema muscular, que no encuentran resistencia inmunológica del hospedador, parece ser más común en Asia que en América (Sotelo, 2006; Willingham y Engels, 2006). La cisticercosis es más habitual en el sistema nervioso central (Sotelo y Del Brutto la India esta aumentando (Sekhar et al., 1996; Nainiwal et al., 2005; Kaliaperumal et al., 2005; Mohan et al., 2005). La el ojo puede ser subcoroidea, subretiniana, subhialoidea, handra et al., 2007). La infección intraocular puede 2002; Fleury et al., 2006; Willingham y Engels, 2006). Es una enfermedad muy heterogénea, cuyo curso clínico es impredecible, muchas veces autolimitado, y probablemente relacionado con la historia natural del parásito, localización del quiste y la respuesta inmune del hospedador. Existe una aceptación unánime en relación al criterio de que las crisis epilépticas son la manifestación clínica secundaria más frecuente y muchas veces la única, (Del Brutto et al., 1992; Fleury et al., 2006), que ocurre hasta en el 70% de los pacientes con neurocisticercosis (Carpio et al., 1998; Carpio, 2002; Sotelo y Del Brutto 2002). Se notificó como hallazgo ocasional la cisticercosis ocular en India, este de Europa y Latinoamérica (Guillory y Zinn, 1980); sin embargo, en los últimos años el número de casos de cisticercosis ocular en et al., 2003; Chadha localización del cisticerco en intravitrea o en la cámara anterior (C ser bilateral y multifocal (Topilow et al., 1981; Sekhar y Lemke, 1997; Chadha et al., 2005). Los cisticercos también se localizan en el párpado y debajo de la conjuntiva 23 Revisión Bibliográfica (Perry y Font, 1978; Sekhar y Lemke, 1997). En el humor vítreo y en la cámara anterior, las larvas se encapsulan y son capaces de alterar activamente su forma, con eversión e introversión periódicas del escólex. Aunque los síntomas se limiten a la incomodidad causada por las sombras formadas por la larva delante de la retina, si no se extrae llega a producir uveítis, iritis, retinitis, atrofia coroidea, conjuntivitis palpebral o rmación de un quiste según el tipo de localización. Cuando muere el parásito, surge condiciona cambios en el interior del parásito y en el tejido nervioso dyacente (Del Brutto et al., 1988). Esta reacción inflamatoria propicia que el cisticerco el líquido vesicular es transparente, el escólex vaginado es de aspecto normal y no se observan cambios inflamatorios en el tejido fo una reacción inflamatoria intensa que puede poner en grave peligro al ojo afectado (Beaver, 1986; Sekhar y Lemke, 1997; Kaliaperumal et al., 2005; Chadha et al., 2005). En cuanto a la neurocisticercosis, una vez que los cisticercos se han establecido en el sistema nervioso central pueden permanecer viables por décadas y no presentarse ningún tipo de respuesta inflamatoria a su alrededor, cursando de forma asintomática y constituir un hallazgo de necropsia (Rabiela et al., 1982). En algunos casos, sin embargo, el sistema inmunológico del hospedador puede desencadenar una reacción inflamatoria que a entre en un proceso degenerativo que va a terminar con su muerte y posterior transformación en un nódulo calcificado (Del Brutto et al., 1996; Fleury et al., 2006). Desde que se identificó esta enfermedad parasitaria, fue evidente que los estudios anatomopatológicos eran la base indispensable para comprender las variantes clínicas y la historia natural de la enfermedad, dado que no existían las modernas técnicas diagnósticas de neuroimagen (Escobar y Nieto 1972). Escobar, en 1983, describió con detalle los estadios o fases por los que atraviesa el cisticerco desde que llega al sistema nervioso central hasta su calcificación. Estas fases son: (1) Fase vesicular: El parásito es viable, la membrana vesicular es delgada, in cerebral que le rodea. (2) Fase coloidal: La pared del quiste se engrosa rodeándose de una densa capa de colágeno y el escólex muestra signos de degeneración hialina. El parénquima cerebral circundante se encuentra edematoso y muestra un intenso infiltrado inflamatorio compuesto por linfocitos, eosinófilos y células plasmáticas. (3) Fase granular: La reacción inflamatoria abarca al parásito propiamente dicho, el cual ya no es viable. (4) Fase calcificada: Finalmente el cisticerco llega a esta fase transformándose en un nódulo calcificado e inerte y los cambios inflamatorios perilesionales suelen ser intensos y persisten así durante años. 24 Revisión Bibliográfica La localización de los cisticercos en el sistema nervioso central es uno de los elementos más importantes en la determinación de la patología y patogénesis de la cisticercosis cerebral. Casi todos los autores coinciden en distinguir cuatro formas básicas que se correlacionan con las manifestaciones clínicas de la enfermedad: 1. Forma intraparenquimatosa. 2. Forma ventricular. 3. Forma meníngea 4. Forma mixta. isticercos en las cavidades ventriculares pueden Sotelo et al., (1985) han propuesto una clasificación basada en la viabilidad del parásito, formas activas e inactivas. Las formas inactivas serían la hidrocefalia secundaria a fibrosis meníngea, y las formas calcificadas intraparenquimatosas; las formas activas corresponderían al resto. La neurocisticercosis presenta un gran pleomorfismo clínico. Los principales signos y síntomas son, junto a las crisis convulsivas ya comentadas (epilepsia), el aumento de la presión endocraneal, el dolor de cabeza y la alteración del estado mental (Barry y Kaldjian 1993; Del Brutto et al., 2001; Sotelo y Del Brutto 2002). La sintomatología depende del tipo anatómico del cisticerco (quístico, racemoso, mixto o medular), de la localización y del daño que ocasiona en el parénquima cerebral y meninges (Escalante, 1996; Sotelo y Del Brutto 2002). A continuación se detallan cuatro tipos de neurocisticercosis en función de la morfología del cisticerco que la ocasiona. A) Cisticercosis de tipo quístico El cuadro clínico está en relación con la localización preferente del quiste, la corteza cerebral, pero sobre todo depende del grado de infestación. Un cisticerco puede ser el origen de un foco epileptógeno, y si se trata de un cisticerco gigante, de tres a cinco centímetros, puede dar manifestaciones de tipo expansivo. En los casos con moderada y severa infestación, además de crisis de tipo epiléptico se puede encontrar paresias. La hipertensión intracraneal (HIC) y los cuadros psíquicos se ven con menos frecuencia que en la cisticercosis racemosa. Cuando hay cisticercos en el parénquima cerebral y en los ventrículos pueden destacar las manifestaciones de un hidrocéfalo interno con intermitencia de los síntomas. Los c 25 Revisión Bibliográfica estar debajo del epéndimo o libres, cuya movilización puede obstruir la válvula, dando lugar a crisis agudas de HIC. Dentro de la cisticercosis ventricular, el compromiso del IV ventrículo es el más frecuente. Se trata por lo general de un cisticerco único, lo que le da un interés práctico ya que es posible su extirpación quirúrgica (Carpio et al., 998). B) Cisticercosis de tipo racemoso La se localiza en la base del encéfalo. A este nivel las vesículas son ón y están aglomeradas, conformando una estructura que recuerda un racimo de uvas. Este complejo meninge-parásito altera la libre circulación del LCR, rmente, los mecanismos de memoria se deterioran hasta llegar un estado demencial, la marcha se hace insegura, oscilante y se asocian signos a mayoría de los casos corresponde a una cisticercosis racemosa de la base craneal, sis quística medular es rara. Los casos comunicados 1 cisticercosis racemosa de mayor dimensi dando lugar a la dilatación de las cavidades ventriculares (Costero, 1946; Sotelo y Del Brutto, 2002). El cuadro clínico predominante es el de una hidrocefalia de tipo crónico y trastornos psíquicos como confusión, desorientación, indiferencia, apatía, falsos reconocimientos. Posterio a piramidales leves en extremidades inferiores y trastornos de esfínteres (Escalante, 1996). C) Cisticercosis de tipo mixto (quística y racemosa) Predominan las manifestaciones clínicas relacionadas con el componente racemoso (Escalante, 1996). D) Cisticercosis medular L con extensión espinal. La cisticerco como cisticercosis medular pura corresponden a casos quirúrgicos y en ellos no se tiene la seguridad de la no existencia de una cisticercosis encefálica. De dos casos examinados (Escalante, 1996), que fueron operados, uno de ellos presentó después de un año convulsiones generalizadas. Tras revisar los tipos de neurocisticercosis se comentan las alteraciones clínicas más características dentro de esta enfermedad. El síndrome psíquico como manifestación única es raro, en cambio puede ser el primer síntoma de la enfermedad y dominar claramente sobre los otros en los casos de larga evolución. En la cisticercosis cerebral se 26 Revisión Bibliográfica puede encontrar sintomatología psíquica sumamente variada, desde manifestaciones de tipo banal como cefalea, irritabilidad y alteraciones del ritmo del sueño, hasta reacciones de tipo neurótico y verdadera psicosis. Pero sobre todo, destacan una bradipsiquia (es un síntoma neurológico caracterizado por favorecer la lentitud psíquica, mental o del pensamiento) y un estado confusional que evoluciona hasta la demencia, lo ue se ve principalmente en los casos de cisticercosis racemosa o de tipo mixto 61, señala que los trastornos mentales son más en frecuencia, intensidad y semiología dependiendo del número y de la calización de las lesiones en el sistema nervioso central (Del Brutto et al., 1996; as anatomo-patológicas de la ística). Tanto los quistes viables como aquéllos que se encuentran en se coloidal, granular o calcificada, pueden cursar con crisis convulsivas, si es que se corticales y condicionan irritación neuronal (Sotelo, 1989). a et al., 1991; Del Brutto, 1999b). Es importante estacar que un paciente puede presentar uno o varios signos o síntomas desde el inicio q (Escalante, 1996). Fuentes, en 19 constantes y se acentúan en la medida en que están dilatadas las cavidades ventriculares. La epilepsia es la manifestación clínica más común de la neurocisticercosis observándose en el 50% a 80% de los casos y, con frecuencia, representa el único síntoma de la enfermedad (Barry y Kaldjian 1993; Del Brutto, 1999b; Carpio, 2002; Sotelo y Del Brutto 2002). Los trabajos realizados sobre este tema en diferentes países son muy numerosos (Escalante, 1996; Sotelo y Del Brutto 2002). En muchos de ellos se ha demostrado que entre un 50% y 70% de los pacientes con neurocisticercosis tienen crisis convulsivas (Monteiro et al., 1992; Sotelo y Del Brutto 2002), las cuales pueden variar lo Sotelo y Del Brutto 2002). De todas las form neurocisticercosis, la que con mayor frecuencia se asocia con epilepsia es la parenquimatosa (qu fa localizan cerca de regiones Dicha irritación puede deberse a la presencia del parásito propiamente dicho, a los cambios inflamatorios agudos que se presentan alrededor de cisticercos en vías de degeneración, o a los granulomas y calcificaciones que se forman (Sotelo, 1989; Del Brutto et al., 1992). De esta manera, los cisticercos se comportan como focos epileptógenos de forma similar a lo que ocurre con otros tipos de lesiones estructurales del sistema nervioso central (Medin d de la enfermedad. Así, la cefalea y las convulsiones son los dos más frecuentes, y también las convulsiones por la preferente ubicación menigocortical de los quistes o cisticercos (Martínez, 1996; Sotelo y Del Brutto 2002). De igual manera es interesante el estudio de la afectación de los nervios craneanos. Se ha descrito, ya desde 1960, que 27 Revisión Bibliográfica el nervio óptico se altera con frecuencia como manifestación secundaria de la hipertensión intracraneana (Rocca y Mendoza 1967; Asenjo 1967). La disminución de la agudeza visual se ha detectado en cerca del 50% de los casos con hipertensión endocraneana y, aunque con menor frecuencia, se han descrito alteraciones auditivas como hipoacusia o desórdenes del equilibrio (Martínez, 1996). Por último, García y Del Brutto, en 2003, proponen una clasificación usando las técnicas de neuroimagen y de acuerdo al estado evolutivo de las lesiones, distinguiendo cuatro estadios de los cisticercos: 1. Viable o forma vesicular. 2. Coloidal 3. Nodular-granular 4. Calcificado o forma quística. 1.5.2.2. Cisticercosis en el cerdo En el cerdo los cisticercos se distribuyen prácticamente en todo el tejido muscular. Vargas et al. en 1986, estudió los lugares de predilección en el cuerpo de los cerdos, encontrando en orden decreciente de infección los siguientes músculos: maseteros, pterigoideos, tríceps, lengua, espaldilla, corazón, pierna, lomo, falda e intercostales. Además pueden localizarse en el SNC, en corazón, ojo, útero, ganglios linfáticos y otras vísceras (Figura RB.7) (Aluja et al., 1987; Vargas et al., 1986; Prakash et al., 2007). Por lo general no se observan alteraciones clínicas en los cerdos parasitados, y existen muy pocos informes de convulsiones en los animales infectados (Zürn, 1882). Royo, en 1996, estudió el hemograma de animales infectados de forma experimental, sin apreciar cambios significativos. La presencia de la larva provoca una secuencia típica de reacciones celulares locales incluida la infiltración de neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, células plasmáticas y macrófagos, seguidas por fibrosis y necrosis de la cápsula, con desintegración o calcificación eventual de la larva. Estas etapas fueron descritas con detalle por Aluja y Vargas, en 1988, que, realizaron una clasificación de la reacción inflamatoria en los cisticercos. 28 Revisión Bibliográfica Figura RB.7. (A) Pulmón de cerdo, la flecha señala un cisticerco vesicular en la superficie. (B) Cisticercos vesiculares en un corazón de cerdo. Figura RB.7. (A) Pulmón de cerdo, la flecha señala un cisticerco vesicular en la superficie. (B) Cisticercos vesiculares en un corazón de cerdo. 1.6. Respuesta inmunitaria El con o de su ciclo, con el hospedador determina una compleja respuesta inmune. El fenómeno inmunológico se ha investigado con s y de tratamiento. Ya, en 1936, se fraccionaron por murinos (ratón- T. crassiceps), porcinos y humanos orrea y Medina, 1999). Además el cisticerco expresa antígenos de origen proteico (Plancarte et al., 1994), glicoproteico (Prabhakaran et al., 2004) y lipídico (López- Marín et al., 2002). Esta heterogeneidad antigénica ha sido parcialmente descrita tact de T. solium, en los estadios propósitos preventivos, diagnóstico diversos métodos los componentes del adulto y del cisticerco, obteniéndose diferentes fracciones proteicas, nucleoproteínas y polisacáridos con actividad inmunogénica (Campbell, 1936). Existen pocos estudios de la respuesta inmune en teniosis, la mayoría de ellos han sido enfocados hacia la detección de anticuerpos; sin embargo, como los individuos con teniosis pueden a su vez padecer cisticercosis oculta, es difícil determinar si los anticuerpos detectados se deben al verme adulto o al cisticerco (Correa y Medina, 1999). Por otra parte, se han tratado de desarrollar algunos modelos animales para reproducir dicha cestodiosis intestinal, pero han fallado en la obtención de adultos grávidos, y no se debe olvidar que la mayoría de los modelos, principalmente los que emplean cricetos, están basados en el uso de corticosteroides que también afectan la respuesta inmune, haciendo difícil la evaluación de los resultados (Correa y Medina, 1999, García et al., 2003). En cisticercosis, en cambio, se han realizado múltiples investigaciones para descifrar los mecanismos de respuesta inmune, tanto humoral como celular, dirigidos contra el cisticerco de T. solium (Restrepo et al. 2001). Esta respuesta ha sido evaluada en (C 29 Revisión Bibliográfica mediante el uso de diferentes metodologías como la inmunoelectrotransferencia (Ramos-Kuri et al., 1992). Se ha reportado que existen algunos componentes antigénicos que son los más frecuentemente reconocidos por el suero de pacientes con cisticercosis (Handali et al., 2004). Respecto a la respuesta inmunológica, a continuación, se revisan las aportaciones más interesantes: A) Respuesta inmune humoral Hoy en día existe un conocimiento parcial referente a la respuesta inmune humana respecto al parásito. Así, la respuesta inmune humoral se ha estudiado en enfermos co neurocisticercosis, principalmente debido a la necesidad de estandarizar métodos n munológicos para su diagnóstico (Baily et al., 1988). La mayoría de los pacientes 0%-90%) desarrollan una gran variedad de anticuerpos frente al estado larvario, s de la clase IgG (inmunoglobulina), cuya presencia in (8 siendo los más frecuentes lo corrobora que la enfermedad generalmente es un proceso crónico y de larga evolución (Flisser, 1996). Dichos anticuerpos presentes en el suero y líquido cefalorraquídeo son capaces de detectar, tras electroforesis y posterior “Western-Blot”, al menos 50 bandas proteicas diferentes, algunas de ellas específicas de T. solium, usando un extracto antigénico completo del parásito (Larralde et al., 1989; Tsang, et al., 1983; García et al., 1995). Sin embargo, existe un porcentaje de pacientes con neurocisticercosis confirmada que no tienen anticuerpos (Larralde et al, 1992). Estos pacientes, negativos serológicamente, por lo general exhiben un único quiste, pocos quistes o formas calcificadas (Larralde et al., 1989; White et al., 1997). En este último caso, relacionado con la neurocisticercosis inactiva, se sabe que los anticuerpos desaparecen de forma natural tras la calcificación del cisticerco (García et al., 1997). B) Respuesta inmune celular Por otro lado, existen pocos estudios de la respuesta inmune celular en cisticercosis. Así, se ha podido observar un incremento en linfocitos CD8+, una disminución de IFN- γ y una activación policlonal de los linfocitos B. Recientemente, también se ha observado un aumento de interleuquina 12 (IL-12) (Restrepo et al., 1998; Grewal et al., 2000), así como el predominio de IL-5 e IL-10 en líquido cefalorraquídeo de pacientes con neurocisticercosis activa (Rodríguez et al., 2000). Hay que destacar, que también se hace necesario profundizar en los mecanismos que permiten la supervivencia de la larva en un ambiente adverso ante la reacción inflamatoria desencadenada por el humano. 30 Revisión Bibliográfica Con relación a este punto se han planteado diferentes teorías relacionadas con las posibles estrategias desarrolladas por el parásito para evitar dicha reacción inmune local. Así, la actividad de la respuesta inmune estaría contrarrestada por la producción de proteínas semejantes a las del hospedador, por parte del parásito (White et al., 1992), o bien la respuesta celular y humoral del hospedador podría controlarse a través de roductos secretados por el parásito (Arechavaleta et al., 1998). Además, la inmunidad ue manifiestan los pacientes es susceptible a la étodo de Graham o por ncuentro casual de proglótides en las heces del paciente, o por su presencia en ropa e T. saginata (movimiento activo). En relación con la p celular y humoral periférica q modulación por el parásito causando efectos inmunosupresores que mantienen o aseguran la persistencia crónica de los cisticercos viables (Restrepo et al., 2001, Chavarría et al., 2006). Finalmente, hay que mencionar que son pocos los estudios realizados para determinar cuales son los factores que regulan la susceptibilidad a la infección, aunque se sabe que la edad, sexo y estado fisiológico del hospedador tienen marcadas influencias en la resistencia innata a la infección (Flisser et al., 1979, 1980; Flisser, 1980; Fleury et al., 2004; Morales-Montor y Larralde, 2005; Morales et al., 2006). 1.7. Diagnóstico de teniosis Debido a la baja sensibilidad de los métodos de detección de teniosis que se emplean habitualmente, se deben utilizar varios criterios diagnósticos conjuntamente para tratar de conseguir un diagnóstico certero. 1.7.1. Diagnóstico parasitológico Se basa en el hallazgo y diferenciación de proglótides grávidas. Con respecto al hallazgo, éste se puede hacer mediante tamizaje de heces, m e interior o de cama en el caso d diferenciación de los dos grandes ténidos del hombre, las proglótides con menos de 15 ramas uterinas corresponden a T. solium, mientras que las de T. saginata presentan más de 15 ramas. Se han empleado diferentes métodos de tinción, tinta china, hematoxilina- eosina y otros, pero muchas veces las proglótides están en mal estado por lo que la identificación morfológica específica es difícil (Mayta et al., 2000; González et al., 2000). En ocasiones, tras el tratamiento, los pacientes eliminan el escólex del adulto, fácilmente identificable por la presencia o ausencia de ganchos, además, las propiedades distintas de las proglótides maduras pueden ayudar al diagnóstico especie-específico, en 31 Revisión Bibliográfica caso de que se aíslen. Por otra parte, la observación microscópica de huevos, tras examen directo de heces, Kato o previa concentración, ya sea por sedimentación o flotación, para separar las formas parasitarias de la materia fecal por medio de sus densidades específicas, sólo puede indicar teniosis, pero no sirve para determinar si la enfermedad está producida por T. solium o T. saginata, dado que morfológicamente los huevos son indistinguibles. Todos estos métodos parasitológicos que solamente detectan huevos se caracterizan por exhibir baja sensibilidad y especificidad (Allan et al., 2003). 1.7.2. Diagnóstico inmunológico Se han desarrollado técnicas de detección de coproantígenos utilizando para su captura anticuerpos policlonales de conejos inmunizados con extractos crudos de proglótides del verme adulto. Esta técnica presenta 100% de sensibilidad y 94% de especificidad ya que permite detectar a los portadores de Taenia spp, pero no consigue distinguir entre T. solium y T. saginata (Allan, 1999). Cuando la determinación se realiza en tira reactiva “dipsticks”, la sensibilidad disminuye al 85%, pero permite analizar un mayor número e muestras y no se necesita de equipo costoso (Allan et al., 1990, 1993, 1996a). Este rabajos epidemiológicos y demostró ser una técnica muy desarrollado métodos de etección de coproantígenos similares, donde los sueros policlonales de conejos están creción/secreción o antígenos de superficie de T. d ensayo ha sido empleado en t sensible en la determinación de la prevalencia de teniosis (Allan et al., 1996a), además de su gran utilidad en la evaluación de la eficacia de tratamiento en masa de poblaciones de las áreas endémicas (Allan et al., 1997). Otros grupos han d preparados contra antígenos de ex saginata (Deplazes et al., 1991; Machnicka et al., 1996), pero presentan el mismo inconveniente que la técnica descrita por Allan et al. (1990). También existen variantes diagnósticas que utilizan anticuerpos monoclonales para la identificación de extractos de huevos de T. solium, que empleados con la técnica de EITB, rinden 100% de sensibilidad y especificidad (Montenegro et al., 1996). Las ventajas de los ensayos de detección de coproantígenos son que se trata de pruebas género-específicas, no dan reactividad cruzada con cestodos próximos como Hymenolepis spp. y otras especies, poseen sensibilidad y especificidad elevadas, logran una detección temprana antes de la patencia y los antígenos desaparecen una semana después del tratamiento, por lo que permite el seguimiento de los pacientes. Las desventajas son que no consiguen distinguir entre las diferentes especies de tenias, y la sensibilidad depende del formato 32 Revisión Bibliográfica del ensayo, así como de la calidad del suero de conejo hiperinmune utilizado (Allan et al, 2003). Por otro lado se han desarrollado diversos ensayos para la detección de anticuerpos en sueros de individuos con teniosis, la mayoría con pobre sensibilidad y especificidad. Sin embargo, en 1999, Wilkins et al. estandarizaron un ensayo de detección de anticuerpos mediante “EITB”, utilizando dos antígenos de excreción/secreción de T. solium, con los que lograron obtener 95% de sensibilidad y 100% de especificidad en la identificación de portadores del ténido. Dicho ensayo logró detectar pacientes con teniosis en ueros de pacientes con otras helmintiasis no dieron solium, a partir de la secuencia de la sonda HDP2 (Harrison et al., 1990), se diseñó una Guatemala, Perú e Indonesia. Los s reactividad cruzada (Wilkins et al., 1999). Recientemente, Levine et al. han clonado los antígenos nativos TSES (antígenos de T. solium excretores y secretores) mediante proteómica y han expresado las proteínas recombinantes en el sistema baculovirus (Levine et al., 2004). Con dichas proteínas han desarrollado un método utilizando el formato de “EITB” (Levine et al., 2007). La detección de anticuerpos para el diagnóstico de teniosis tiene como ventajas que evita el peligro para el analista de la exposición a huevos en las muestras de heces, permite la detección de teniosis y cisticercosis (en combinación con otras técnicas como el ELISA o WB) en una misma muestra, pero presenta la desventaja de que después del tratamiento del paciente los anticuerpos permanecen y podrían rendir falsos positivos (Allan et al. 2003). 1.7.3. Diagnóstico molecular Para el diagnóstico diferencial de T solium y T. saginata se han utilizado técnicas de biología molecular, tales como sondas de DNA (ácido desoxirribonucleico) y PCR (“Polymerase Chain Reaction” o reacción en cadena de la polimerasa). En 1990, Harrison et al. clonaron 2 sondas de DNA no codificante, HDP1 y HDP2, a partir de una genoteca genómica de T. saginata que permitieron, mediante hibridación, la identificación diferencial de los dos grandes ténidos del hombre. Igualmente, en 1995, Chapman et al. clonaron a partir de genotecas genómicas de T. solium y T. saginata dos sondas, pTsol-9 y pTsag-16, especificas de T. solium y T. saginata respectivamente y que lograron distinguir los dos ténidos. La primera PCR en Taenia fue desarrollada por Gottstein et al., en 1991, la que identificaba específicamente a T. saginata. Posteriormente otros grupos optimizaron PCRs que diferenciaban T. saginata de T. saginata asiatica (Zarlenga et al., 1991; Bowles y McManus, 1994). En cuanto a T. 33 Revisión Bibliográfica “multiplex PCR” que permitió la realización de un diagnóstico diferencial especie- específico de T. solium y T. saginata. (González et al., 2000; González et al., 2002a). T. solium, uando se emplearon los marcadores moleculares CO1 y Ts14. También fueron das con el marcador ITS1; además, estás variaciones se Esta PCR fue utilizada para la identificación de aislados de los ténidos procedentes de distintas zonas geográficas (González et al., 2002b). Paralelamente, Mayta et al. en el año 2000, propusieron la detección diferencial de T. solium y T. saginata mediante una PCR-RFLP (“PCR-restriction fragment length polymorphism”), basada en la amplificación del gen 5.8S ribosomal, además de los espaciadores intergénicos ITS1 e ITS2, y posterior digestión con las enzimas Alu I, Dde I y Mbo I. En ese período se desarrolló una PCR-RFLP que amplifica la secuencia 12S ribosomal del DNA mitocondrial, seguido por digestión con la enzima Dde I, que distingue a T. solium de T. saginata (Rodríguez-Hidalgo et al., 2002). Finalmente, en los últimos años la técnica PCR no sólo ha sido empleada en la detección de infecciones producidas por T. saginata y T. solium sino también en el estudio de la variabilidad génica inter- e intra- especie en diferentes aislados geográficos de ambos parásitos. Así, Hancock et al. (2001) amplificaron y secuenciaron, de forma parcial, el gen CO1, el espaciador trascrito interno (ITS1) y el gen que codifica el antígeno diagnóstico Ts14 (Tsang et al., 1989; Greene et al., 1999, 2000), a partir de DNAg de cisticercos extraídos de cerdos originarios de Perú, Colombia, México, India, China y Filipinas. La variación encontrada, a nivel nucleotídico, fue mínima entre aislados geográficos de c mínimas las diferencias obteni establecieron entre los cisticercos de un mismo país y no entre los diferentes aislados geográficos empleados. En este sentido, se han realizado estudios filogenéticos utilizando distintas técnicas moleculares que, además de identificar los ténidos en estudio, han demostrado, con base en análisis de los genes mitocondriales, que T. solium forma dos grupos filogenéticos, uno constituido por los aislados americanos y africanos y otro por los asiáticos (Nakao et al., 2002; Ito et al., 2003; Yamasaki et al., 2004). 1.8 Diagnóstico de cisticercosis humana El diagnóstico de la neurocisticercosis resulta en general problemático, ya que habitualmente es imposible demostrar la infección por tomografía simple. Del Brutto, en 2005, a partir de datos globales del paciente relacionados con información epidemiológica, clínica, inmunodiagnóstico y estudios de neuroimagen (Figura RB.8) (White, 2000; Del Brutto et al., 2001; Pérez-López et al., 2003), estableció distintos 34 Revisión Bibliográfica criterios y grados de certeza diagnósticos, que pueden resultar de gran utilidad en la detección y seguimiento de la neurocisticercosis. En la tabla RB.1 se incluyen los criterios diagnósticos propuestos por Del Brutto (2005). Tabla RB.1. Criterios diagnósticos de neurocisticercosis (Del Brutto, 2005) Criterios Absolutos Criterios Mayores Criterios Menores: Criterios Epidemiológicos -Demostración histológica del parásito en material de biopsia de lesión cerebral o espinal. -Tomografía computarizada o Resonancia magnética con lesiones quísticas e imágenes de escólex en el interior. -Visualización directa del parásito por oftalmoscopia -Neuroimagen con lesiones altamente sugestivas de neurocisticercosis. -“Western blot” positivo para detección de anticuerpos específicos en suero. - Resolución de lesiones quísticas con albendazol o prazicuantel. -Resolución espontánea de pequeñas lesiones anulares únicas, captadoras de contraste. -Neuroimagen con lesión compatible con neurocisticercosis. -Clínica sugestiva de neurocisticercosis -ELISA positivo para detección de anticuerpos o antígenos de cisticerco en el líquido cefalorraquídeo - Presencia de cisticercosis fuera del Sistema Nervioso Central. -Teniosis (T. solium) pres pasada, personal o de un contacto doméstico. - Individuos que residan o provengan de áreas endémicas. -Haber residido en países donde la neurocisticercosi endémica o viajado frecuentemente a dichos ente o s es países. Figura RB.8. Aspecto de cisticercos parenquimatosos en estudios de neuroimagen. (A) Resonancia Magnética (RM) Cerebral (proyección axial): quistes vesiculares. (B) RM cerebral (proyección axial): quistes coloidales. (C) Tomografía cerebral: calcificaciones. (Del Brutto, 2005) 35 Revisión Bibliográfica 1.8.1. Diagnostico inmunológico Las técnicas de inmunodiagnóstico incluyen la detección de antígenos circulantes del parásito y de anticuerpos anti-cisticerco tanto en suero como en LCR, resultando de ran utilidad para la identificación de cisticercosis (Del Brutto et al., 1996). Así, sirven de a son en instalac radiológico son inasequibles (Chung et al., 1999; Sako et al., 2000; Dorny et al., 2003; 2 o y me técnicas i m nto de la im a enferm e et al., ). p por rm co que p ifiest lita la evaluación del it g culante y quistes viables (García et arrollado múltiples ensayos para la detección de antígenos circulantes tanto en suero como en LCR pero los mejores son los basados en el uso de nticuerpos monoclonales. Harrison et al., en 1989, diseñaron un sistema de munodiagnóstico por captura de antígeno utilizando un anticuerpo monoclonal HP10. En 1992, Wang et al. produjeron otro monoclonal contra antígenos de cisticerco de T. e han desarrollado varios ensayos de inmunodiagnóstico para detectar anticuerpos ontra el parásito, en suero, saliva y LCR, empleando diferentes técnicas tales como aglutinación en latex (Rocha et al., 2002) y EITB (Tsang et al., g poyo al diagnóstico por imágenes y al clínico-epidemiológico, y imprescindibles áreas endémicas, en las que las grandes iones del examen Prado-Jean et al., contribuido a un otras cosas a encuestas s 007). El desarroll ayor conocimie jora de estas portancia de l nmunológicas han edad, debido entr eroepidemiológicas más fiables (Dorny 2003; Prado-Jean et al., 2007 -Detección de antígeno circulante del parásito La detección de inmunológi roductos secretados ermite poner de man e la correlación entre antí el parásito es una fo o su presencia, posibi eno cir a de diagnóstico tratamiento, perm al., 2000). Se han des a in solium que también lo utilizaron en un sistema de captura para la detección de antígeno circulante en LCR de pacientes con cisticercosis. También, en ese año, Brandt y colaboradores (Brandt et al., 1992) desarrollaron un método similar, con los anticuerpos 12G5 y 2H8 que reconocían antígenos de excreción/secreción de cisticercos. Todos los métodos mencionados se han empleado en estudios diagnósticos y epidemiológicos de la enfermedad (Fleury et al., 2007, Prado-Jean et al., 2007). -Detección de anticuerpos S c fijación de complemento (Feldman et al., 1990; García y Sotelo, 1991), hemaglutinación indirecta (Ferreira et al., 1997), radioinmunoensayo, ELISA, “dipstick”-ELISA, 36 Revisión Bibliográfica 1989). Durante años, la mayoría de los ensayos para la detección de anticuerpos han crudos o fluido vesicular del parásito (Diwan et al., al., 2002), que pueden sustituir a los de T. solium en la detección serológ ticercosis. También, en las últimas décadas se han realizado que se puedan utilizar en ensayos de cidad que el EITB clásico y ue se ha utilizado con buenos resultados en el diagnóstico de cisticercosis humana. ificados de los que hemos hablado requieren gran cantidad utilizado como antígeno extractos 1982; Larralde et al., 1986; Escalante, 1999), pero estas pruebas carecen de la adecuada sensibilidad y especificidad debido a la gran reactividad cruzada con otras parasitosis, tales como hidatidosis, esquistosomosis, himenolepiosis, y otras helmintosis (Gottstein et al., 1986, 1987; Pammenter et al., 1992; Fleury et al., 2001). Debido a la dificultad en la obtención de material parasitario específico se ha recurrido al empleo de antígenos heterólogos. Así, se ha utilizado en el diagnóstico de cisticercosis humana, antígenos de T. saginata, especie que presenta mucha similitud antigénica con T. solium (Harrison y Parkhouse, 1989), antígenos de T. crassiceps y otros (Larralde et al., 1990; García et al., 1995; Vaz et al., 1997; Barcelos et al., 2001; Espíndola et ica de la cis esfuerzos para caracterizar antígenos específicos rutina en los países endémicos. Las moléculas más estudiadas han sido el antígeno B, las glicoproteínas, los antígenos de excreción/secreción del parásito y los antígenos de bajo peso molecular (Flisser et al., 1979, 1986; Tsang et al., 1991; Ko y Ng, 1998; Nascimento et al., 1987). En este sentido, en 1989, Tsang et al. lograron purificar por cromatografía de afinidad con lectina de lenteja, 7 glicoproteínas (GP13, GP14, GP18, GP21, GP24, GP39-42, GP50) de metacestodos de T. solium, que exhibían un 98% de sensibilidad y 100% de especificidad en el diagnóstico de cisticercosis, empleándolas en la técnica de EITB. Dicho ensayo es reconocido por la Organización Panamericana de la Salud (OPS) como el método inmunológico de elección para el diagnóstico de la neurocisticercosis (Greene et al., 1999). Estas glicoproteínas también han sido utilizadas en estudios epidemiológicos en humanos y cerdos (Tsang et al., 1991; Rodríguez-Canul et al., 1997). Ito et al. en 1998, desarrollaron un método de purificación de glicoproteínas por iso-electroenfoque en un solo paso, extracto aplicable en ELISA y “Western blot” que presenta la misma sensibilidad y especifi q Pero como los antígenos pur de material parasitario para su aislamiento, además de equipos sofisticados y técnicas laboriosas, se ha recurrido a la tecnología del DNA recombinante para la clonación de las moléculas de interés (Greene et al., 2000; Levine et al., 2004; Scheel et al., 2005; Sako et al., 2006; Ferrer et al., 2007). Entre estos últimos caben destacar la familia de 37 Revisión Bibliográfica genes que codifica las proteínas (glicoproteínas) de bajo peso molecular, 8 kDa, como Ag1, Ag1V1, Ag2 y Ag2V1, descritos por el grupo del Prof. Ito (Sako et al., 2000; Bueno et al., 2005; Sako et al., 2006) y los clonados por Ferrer et al. (2007), Ts8B1, Ts8B2 y Ts8B3. También, Tsang et al. 1989, han aislado, y purificado, algunos genes (Hancock et al., 2004; Hancock et al., 2006) que expresan las glicoproteínas que en estado nativo se utilizan en la prueba de referencia EITB, ya mencionada en esta sección. Todos los antígenos indicados muestran muy buena sensibilidad y una especificidad superior a los antígenos convencionales en la detección de cisticercosis. Para terminar, y aunque fuera de la temática del inmunodiagnóstico, hay que destacar que en los últimos años la introducción de la PCR (González et al., 2000) para el diagnóstico de NC está tomando una mayor relevancia. En este sentido, queremos citar el trabajo de Almeida et al. (2006), así como el de Hernández et al. (2007), quienes han desarrollado PCRs, de gran sensibilidad para la detección de DNA parasitario en el líquido cefalorraquídeo de los pacientes con la enfermedad. 1.8.2 Diagnóstico de cisticercosis porcina El diagnóstico se puede realizar antemortem (en pie) en el campo, o posmortem (en la canal) en mataderos o en matanzas caseras. El diagnóstico antemortem se lleva a cabo con un examen visual y con la palpación de la lengua, en su parte ventral, en búsqueda de cisticercos (Sato et al., 2003; Aluja, 2006). Con este método sólo puede ser detectado un pequeño número de animales afectados desestimando la verdadera prevalencia de esta enfermedad, además de ser violento y traumático para los cerdos, es muy cansado para la persona que realiza la inspección; además, la sensibilidad de este método es baja e inespecífica, sin embargo, para estudios en los que se necesita una valoración rápida puede ser útil, sobre todo en aquellas áreas en las que no se conoce la endemicidad de esta enfermedad (Willingham y Engles, 2006). Se han realizado estudios con las pruebas utilizadas para el diagnóstico en humanos como el ELISA y la EITB, y se ha encontrado que esta última tiene una sensibilidad y especificidad buena (Sciutto et al., 1998; Sato et al., 2003); además, estos métodos no son aplicables por ser costosos y laboriosos. Se sugiere el uso de la ultrasonografía como un método preciso y confiable, que facilita la detección de los cisticercos en la musculatura de los cerdos (Herrera García et al., 2007), el problema es el traslado del equipo al campo y su costo muy elevado, por lo que no se considera un método viable. El diagnóstico postmortem se 38 Revisión Bibliográfica realiza generalmente en mataderos de acuerdo a las pautas oficiales en cada ciudad, en algunas solo se realiza el diagnostico visual de las canales, y en otras se realizan cortes en los músculos (tríceps y ancóneo derecho) y se revisan las vísceras en búsqueda de cisticercos; aún cuando se realiza la inspección en forma esmerada, algunas infecciones leves llegan a pasar desapercibidas, generalmente cuando hay menos de 10 cisticercos (Aluja, 2006). Sin embargo, en muchos lugares estas normas no se respetan. 1.9. Tratamiento 1.9.1. Tratamiento para teniosis Como fármacos de elección se utilizan la niclosamida (2',5-dicloro-4'- nitrosalicilanilida), el praziquantel (pirazino-isoquinolina) y el albendazol (carbamato de imidazol). La niclosamida es insoluble en agua y se absorbe poco por el intestino, actúa directamente sobre el tegumento del verme adulto, haciéndole susceptible a la acción de las enzimas proteolíticas del hospedador. Es un fármaco bien tolerado y no se conocen efectos tóxicos. La dosis recomendada es de 4 tabletas (2 g) para adultos en na sola toma en ayunas. Para menores de 14 años se utiliza la dosis de 1 g, puede de haber ingerido el medicamento. Con u emplearse un laxante salino a las 2 horas respecto al praziquantel, este fármaco se absorbe rápidamente por el intestino, alcanza sus niveles mayores a las dos horas de administrado, se metaboliza en el hígado y se elimina totalmente a las 24 horas. No se conoce completamente el mecanismo de acción, pero se sugiere que lesiona el tegumento del parásito y produce su parálisis debido a cambios en la permeabilidad de la membrana. La dosis recomendada es 10 mg/Kg en una sola toma, no se requiere laxante, ni dieta especial. El albendazol es el tercer fármaco de elección, sobre todo en menores de cinco años de edad. Se tolera bien y produce efectos secundarios mínimos. La ventaja de este medicamento es que no sólo actúa contra Taenia sino también sobre la mayor parte de otros helmintos y nematodos frecuentes. Su desventaja es que debe administrarse durante tres días consecutivos. (Vermund et al., 1986). 1.9.2. Tratamiento de la cisticercosis humana El tratamiento específico de la cisticercosis del parénquima cerebral con resultados satisfactorios comenzó en América Latina en 1980 con el uso de praziquantel y posteriormente, en 1987, con albendazol, antihelmíntico del grupo de los 39 Revisión Bibliográfica benzimidazoles. Durante la administración de estos fármacos, los pacientes pueden presentar trastornos neurológicos, incluyendo cefalea, vómitos, vértigos, convulsiones, dificultad motora o hipertensión endocraneana. Son reacciones colaterales que se manifiestan en los primeros días del tratamiento y que están relacionadas con la intensa inflamación desarrollada por el hospedador en respuesta a la destrucción aguda de los cisticercos en el cerebro (Escobedo et al., 1987; Takayanagui y Jardim, 1992). A continuación se detallan las pautas de utilización del praziquantel y albendazol en nción del tipo de cisticercosis. ercosis tratados con praziquantel en forma exitosa, do et al., 1987; Botero, 1993). Por ello es conveniente ospitalizar a los pacientes, al menos la primera semana del tratamiento, porque es sentan con mayor frecuencia. El uso de buenos resultados, ya que este fármaco es un potente antihistamínico con buena fu Los primeros casos de neurocistic fueron realizados por Robles y Chavarría, en 1980 y Spina-Franca y Nobraga, en 1981, ya que la cirugía hasta esas fechas era la única alternativa terapéutica en la cisticercosis. Se observó mejoría clínica y desaparición de la mayoría de los parásitos (Botero y Castaño, 1982). A partir de entonces, han sido numerosísimos los estudios de investigación realizados sobre pacientes a los que se ha suministrado praziquantel (Botero y Castaño, 1982; Sotelo et al., 1984). Actualmente, la dosis estándar es de 50 mg/Kg/día (dividida en tres dosis diarias), durante 15 días y administración paralela de esteroides. La conclusión general es que el praziquantel determina la desaparición del 60% al 70% de los quistes intraparenquimatosos, lo que supone una mejoría o curación clínica del paciente (Sotelo et al., 1984). Estudios realizados con albendazol (Escobedo et al., 1987; Botero et al., 1993) demostraron que los índices de curación de neurocisticercosis superan a los obtenidos con praziquantel, y siendo el albendazol de menor costo y de más fácil obtención. Por estas razones, para algunos autores, la droga de elección es el albendazol, cuya dosis es 15 mg/kg/día durante 15 días. Los efectos secundarios, anteriormente comentados con praziquantel, también se presentan con albendazol y dependen de la inflamación cerebral originada en la destrucción de los quistes y no de un efecto directo de los antihelmínticos (Escobe h cuando los efectos secundarios colaterales se pre esteroides está indicado para contrarrestar dichos efectos (Botero, 1993). También se ha comprobado que el albendazol, administrado junto con dextroclorofeniramina da muy 40 Revisión Bibliográfica penetración en el sistema nervioso central. Parece que este medicamento, actuando sobre los receptores histamínicos cerebrales por un mecanismo competitivo, suprimiría o atenuaría dichos efectos colaterales (Escobedo et al., 1987; Sotelo et al., 1990). Finalmente López-Vélez y Gárate (2006) mencionan que el tratamiento de la neurocisticercosis debe dirigirse a los siguientes objetivos: 1. Identificar y tratar los quistes que entrañen un grave riesgo para la salud del enfermo. 2. Prevenir las secuelas neurológicas graves y 3. Minimizar la necesidad de terapias muy prolongadas y de sus efectos secundarios. 1.9.3. Tratamiento de la cisticercosis porcina ucho tiempo parte de las nfermedades tropicales olvidadas, pero últimamente se han producido varias iniciativas Con la finalidad de destruir los cisticercos en cerdos vivos, se han empleado varios compuestos como el fluobendazol (Téllez Giron, 1989), praziquantel (Torres et al., 1992), sulfóxido de albendazol (Peniche Cardenas et al., 2002) utilizados por diferentes vías de administración y con varias dosis, informando del tratamiento exitoso en los animales de estudio. La desventaja para los productores es el elevado precio de dichos medicamentos, el tiempo que tienen que esperar para que estos parásitos desaparezcan en los tejidos y sus animales puedan salir al mercado, aumentando así los costes de producción. 1.10. Medidas de control de teniosis/cisticercosis El binomio teniosis/cisticercosis ha sido durante m e importantes para paliar dicha situación. Se les considera enfermedades potencialmente erradicables y en el caso de la cisticercosis se le está dando la importancia que merece, ya que es una parasitosis que afecta a 50 millones de personas en todo el mundo y causa más de 50.000 muertes anuales (Schantz et al., 1993; Román et al., 2000; Schantz y Tsang, 2003). La cisticercosis es una parasitosis relacionada con la pobreza y típica de comunidades con bajos niveles socio-económicos. Puede prevenirse a través de mejoras en las condiciones sanitarias y la educación, y del tratamiento de los portadores de T. solium. Evitar el fecalismo al aire libre, promoviendo la construcción de letrinas o implementando los servicios de drenaje y alcantarillado en las áreas rurales. También, con prácticas adecuadas en la inspección de la carne de cerdo; así, en México la inspección sanitaria de las carnes se lleva acabo mediante el corte transversal profundo de los músculos tríceps y ancóneo derechos, y los reglamentos respectivos disponen que 41 Revisión Bibliográfica una canal con cisticercosis deba decomisarse. Otra medida preventiva es la adecuada cocción de la carne; Nava et al., 2007 han realizado un estudio al respecto con la finalidad de poder ofrecer al ama de casa de las comunidades rurales métodos sencillos que destruyen las larva y, por lo tanto, vuelven la carne inocua. Además, las mejoras en la crianza del ganado porcino, evitando su acceso a las heces humanas, guardando a los animales en corrales para impedir que estos deambulen por los pueblos, son una manera de ayudar al control de las parasitosis. Como otro método de control varios autores han ensayado tratamientos con el fin de destruir los cisticercos en los animales vivos infectados (Torres et al., 1992; Engels et al., 2003; Flisser et al., 2003; Sarti y ajshekhar, 2003) reportando buenos resultados en sus ensayos, pero este producción. Por otra parte, otra medida una eficiente inspección sanitaria de carnes. En todos los países esarrollados, esta zoonosis ha sido prácticamente erradicada desde los inicios del siglo ntivas relativamente sencillas como R procedimiento también aumentaría los costes de para evitar la teniosis se consigue mediante la irradiación de la carne con rayos gama a bajas dosis (0.3kGy) (Aluja et al., 1993; Flores-Pérez et al., 2003; Flores-Pérez et al., 2006), pero la instalación del equipo necesario no es factible en el medio rural. Además, se ha propuesto la posible vacunación de los animales susceptibles (Molinari et al., 1997; Plancarte et al., 1999; Huerta et al., 2001; Bonay et al., 2002; Sciutto et al., 2002, Lightowlers, 2003, 2006a; Harrison et al., 2005; Lightowlers, 2006b; Sciutto et al., 2007). Cualquier programa de control debe incluir la educación, higiene (Keilbach et al., 1989) y d XIX por medio de la introducción de medidas preve la educación y la higiene. 42 Revisión Bibliográfica 2. Echinococcus granulosus La hidatidosis es una zoonosis de distribución cosmopolita. Ocurre en ambos hemisferios y de acuerdo a las especies involucradas se distinguen ciclos biológicos domésticos y silvestres con sus respectivos hospedadores intermediarios y definitivos. Está causada por las especies del género Echinococcus, pequeños cestodos que en su fase larvaria pueden desarrollarse en una gran cantidad de herbívoros y omnívoros, incluyendo al hombre. Los quistes hidatídicos producidos por Echinococcus granulosus son conocidos, tanto en animales como en el hombre, desde la antigüedad. Hipócrates los consideraba tumores llenos de agua en pulmones de vacas, ovejas y cerdos, y también en humanos. A finales del siglo XVII se empezó a considerar estas vesículas como animales. En 1766, Pallas diferenció las formas quísticas de los helmintos de otros quistes tisulares. Goeze, en 1782, describió los protoescólices de los quistes hidatídicos, denominándolos Taenia visceralis sociales granulosus. Poco después Batsch, en 1786, renombró al parásito como Hydatigena granulosa. Zeder, en 1800, estableció una clasificación en la que separaba en distintos grupos cestodos y formas quísticas. A los quistes hidatídicos los denominó inicialmente Polycephalus hominis, renombrándolos en 1803 como Polycephalus echinococcus. Laennec, en 1804, investigando quistes hidatídicos humanos no pudo encontrar las “cabezas del verme” (los protoescólices) observados en los quistes de ovejas y vacas, por lo que supuso que deberían pertenecer a otro género. A estos quistes los llamó acefaloquistes. Este punto de vista fue aceptado hasta 1843, en que Livois demostró que los acefaloquistes son quistes hidatídicos normales en los cuales todavía no se han desarrollado los protoescólices. udolphi, en 1801, describió el género Echinococcus (al que situó en el Orden ysticorum); posteriormente este género se dividió en tres especies: E. hominis, E. miae y E. veterinorum, según el hospedador al que afectaban (hombre, primates y miantes). Durante las décadas posteriores no hubo discrepancia entre los elmintólogos respecto al número de especies que formaban el género; sin embargo, remser y Diesing supusieron que los protoescólices recuperados de quistes humanos ran del mismo tipo que los de quistes animales, denominando al cestodo como chinococcus polymorphus. La práctica más común era considerar dos especies: una E. ominis que afectaba al hombre, con una corona de ganchos en el rostelo de los rotoescólices, y la otra, presente en animales y con una doble corona de ganchos, enominada E. veterinorum. Küchenmeister y Leuckart a mediados del siglo XIX R C si ru h B e E h p d 43 Revisión Bibliográfica propusieron otra clasificación en función del contenido de la arena hidatídica. 3, demostró que los adultos obtenidos a partir de los cas que tiene en muchas partes del mundo. En España, está a explicar, al menos en parte, Finalmente, Naunyn, en 186 protoescólices de ambas especies eran idénticos. Con el reconocimiento de que tanto la forma quística como el verme adulto pertenecían a una misma especie, le designaron como Echinococcus granulosus. La importancia de esta parasitosis es indiscutible, debido a las repercusiones sanitarias, veterinarias y económi incluida desde 1982 dentro del grupo de las Enfermedades de Declaración Obligatoria (EDOs) (BOE del 15 de enero 1982). Sin embargo, en el Real Decreto 2210/1995 que deroga el decreto de 1982. Quedó incluida en el Anexo III, dentro de las enfermedades endémicas de ámbito regional. Su control es un objetivo prioritario, llevándose a cabo a través de los programas de lucha antihidatídica implementados en distintas Comunidades Autónomas en la década de los 80 y primeros años de los 90. A nivel científico, son numerosos los estudios epidemiológicos, inmunológicos y quimioterápeuticos llevados a cabo. A pesar de todos esos esfuerzos, sólo se han conseguido éxitos parciales. Los aspectos socioculturales y educacionales de la población son algunos de los principales factores que contribuyen a la falta de éxito total en los distintos programas de control puestos en marcha. A esta situación debe añadirse un importante factor: la variabilidad intraespecífica presente en E. granulosus. La constatación en diferentes países, de la existencia de variantes o cepas del parasito, con características epidemiológicas, biológicas, bioquímicas, inmunológicas y genéticas diferentes, podrí los resultados no muy satisfactorios obtenidos en apartados como el diagnóstico, el tratamiento o la profilaxis de la enfermedad. Ante la nueva situación planteada por este hecho, la OMS (Organización Mundial de la Salud) en 1986, indicó como una de las líneas prioritarias de la lucha contra la hidatidosis, el estudio de este fenómeno de variabilidad intraespecífica, principalmente en zonas donde esta zoonosis era endémica (caso del sur de Europa, incluyendo a España). 44 Revisión Bibliográfica 2.1. Clasificación taxonómica La clasificación sistemática de los cestodos ha sufrido muchas modificaciones desde 1758, en que Linneo establece el Phylium Vermes agrupando a todos los “gusanos” de vida libre y parásita. Dentro del género Echinococcus se han descrito numerosas especies y subespecies, muchas de ellas posteriormente invalidadas. En este trabajo se sigue la clasificación de Yamaguti (1959) y Schmidt (1986) para el género y la de hompson para las especies. De todas maneras destacar que, en el año 2002, se publicó s secuencias del DNA itocondrial. De esta forma se identificaron los nueve genotipos detallados en la tabla reúne a endoparásitos carentes de tubo igestivo. Orden Cyclophyllidea, presentan escólex con cuatro ventosas musculares. T una revisión taxonómica del género basada en estudios epidemiológicos recientes que utilizaron técnicas de biología molecular (Thompson, 2002) (Tabla RB.2). En este sentido, en el año 2001 se introdujo el concepto de cepas, definidas como “variantes que difieren estadísticamente de otros grupos de la misma especie en frecuencias génicas y en una, o más características, con real o potencial interés para el control y la epidemiología de la Echinococcosis” (Thompson, 2002). El estudio de estas variantes está basado en cambios en las secuencias de los ácidos nucleicos que se reflejan en caracteres fenotípicos que afectan los patrones del ciclo de vida del parásito, la especificidad de hospedador, la velocidad de desarrollo, patogenicidad, antigenicidad, sensibilidad a agentes quimioterapéuticos, dinámica de transmisión y la epidemiología de Echinococcus. Para ello se están utilizando análisis por PCR ligados a RFLPs (polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricción) sobre las regiones espaciadoras del DNA ribosomal, así como, estudios en la m I.1 para E. granulosus. Si bien inicialmente sólo cuatro especies fueron reconocidas taxonómicamante dentro del género Echinococcus, hoy en día este hecho está en discusión. De esta manera, E. granulosus es un helminto parásito perteneciente al phylum Platyhelmintes y a la clase Cestoda, que d Familia Taeniidae, adultos en el intestino delgado de carnívoros y humanos. Género Echinococcus, que comprende a E. granulosus, E. multilocularis, E. oligarthrus y E. vogeli. En este trabajo solamente nos referiremos a la primera especie. 45 Revisión Bibliográfica Tabla RB.2. Características de la especie y cepas reconocidas y propuestas en el género Echinococcus. fectiva Hospedadores Probable distribución Designación Especie/ Cepa o Hospedadores In aislamiento (genotipo) intermediarios conocidos humanos? definitivos conocidos geográfica taxonómica propuesta E. granulosus Cepa Ovina G1 Oveja, ganado, cerdos, cabras, camellos Sí Perros, zorros, chacales, hienas Australia, Europa, USA, Rusia, Nueva Zelanda, Tasmania, Argentina, África, Sudáfrica, China E. granulosus Cepa Ovina de Tasmania (G2) Oveja, ganado Sí Perros, zorros Tasmania, Argentina E. granulosus Cepa de búfalo (G3) Búfalo, ganado ? Perros, zorros? Asia E. granulosus Cepa equina (G4) Equinos No Perros Europa, Sudamérica, USA? E. equinus Cepa vacuna (G5) Ganado vacuno Sí Perros Europa, Sudamérica E. ortleppi Cepa camello (G6) Camellos, vacas, cabras? Sí Perros África, India, Rusia E. granulosus? Cepa porcina (G7) Cerdos Sí Perros África, Argentina, China E. granulosus? Cepa cérvidos (G8) Cérvidos Sí Perros, lobos Europa, Sudamérica, Rusia E. granulosus? Cepa leones (G9) Búfalos, jirafas? antílopes, cebras. ? Leones Asia, Norteamérica, África E. granulosus? E. multilocularis Aislamiento Europeo Roedores, cerdos, perros, monos Sí Zorros, perros, gatos, lobos Europa, China E. multilocularis Aislamiento en Alaska Roedores Sí Zorros, perros, gatos Alaska E. multilocularis Aislamiento en Norteamérica Roedores Sí Zorros, perros, gatos, coyotes Norteamérica E. multilocularis E. vogeli Roedores Sí Perros Centro y Sudamérica E. vogeli E. oligarthus. Roedores Sí Felinos Centro y Sudamérica E. oligarthus ? Incierto, se necesitan más datos y/o investigación Tomado de Thompson (2002) 2.2. Morfología de E. granulosus 2.2.1. Estado adulto Es un verme, alargado, con simetría bilateral que mide 2 a 7 mm de longitud (Ecker y Deplazes, 2004). Está recubierto por un tegumento, o cubierta protectiva, a través del cual absorbe nutrientes y excreta desechos (Figura RB.9). Posee un escólex dotado de cuatro ventosas y ganchos dispuestos en doble hilera, que le permiten anclarse sobre la ared del intestino del hospedador definitivo. En el extremo posterior del escólex hay n cuello corto y delgado (región proliferativa), en el que se generan asexualmente los p u 46 Revisión Bibliográfica segmentos del cuerpo o proglótides, que son de 3 a 6 y forman el estróbilo. Cada er s p e m ual n x. La corpor e ilar a la otros helm 2.2.2. Huevos Se producen gener entre los 34 y 58 cción y hay entre 100 ogló den se lips ricos y diámetr a bri osfera tá r el que a res al huevo. La envoltura xterior sta por la ca a vitelógena y la cápsula se pie den durante su liberación uiroz W . Es nte destacar qu su m a es i tica a rita de l . .2.3. Quiste hidatídico larva de E. granulosus. Es una esfera o vesícula arente, constituida por tres membranas: adventicia, laminar y F .9. Morfolog d (Tomado de Bogitsh y Cheng, 199 proglótide contiene órganos para la reproducción sexual tanto testículos como ovarios, ya que son h adurez sex mafroditas. E a medida qu tos segm e se aleja entos van ad del escóle quiriendo un grado superficie rogresivo d al del verm adulto es sim de intos (ver apartado 1.2.1.1.) (Botero, 2005). almente días después de la infe a 1500 por pr tide. Pue r e oides o esfé poseer os desde 25 50 µm. El em ón u onc se protegido po compue embrioforo le otorga alt istencia e p r (Q , 1999; illms et al., 2006) importa e orfologí dén la desc para los dos gran s ténidos de igura RB ía del adulto e E. granulosus. 8). a a atrio a a atrio hombre, T. solium y T. saginata (apartado 1.2.2) 2 También conocido como hidátide o llena de líquido transp germinal. La membrana adventicia es de naturaleza fibrosa, formada por tres capas que se desarrollan como consecuencia de la reacción del órgano afectado del hospedador en las fases iniciales del desarrollo de la oncosfera (Figura RB.10). 47 Revisión Bibliográfica A BA B A partir de la m indirectamente todos los elem del quiste es lento, crecen de 1 . En su interior rotoescólices y (3) quistes hijos. Las vesículas prolígeras son crecimientos de la capa erminativa hacia el interior del quiste, que quedan unidos por pedúnculos a dicha su interior se desarrollan los protoescólices; el proceso de formación de nismos de transmisión cestodo incluye como hospedador definitivo al perro, pero ser humano es un ental (Figura RB.11). Cuando los huevos alcanzan el intestino Figura RB.10. (A) Esquema de una hidátide. (B) Corte histológico de un quiste hidatídico, teñido con hematoxilina-eosina. embrana germinal o prolígera, se desarrollan directa o entos de la hidátide. El desarrollo y crecimiento a 5 cm por año y pueden alcanzar tamaños de más de 20 cm se encuentra una gran cantidad de líquido, junto con (1) vesículas proligeras, (2) p g membrana. En éstos en las cápsulas proliferas es asincrónico, pudiendo observarse varios estadios de desarrollo en la misma cápsula. Por rotura del pedúnculo, las vesículas pueden quedar libres en el líquido de la hidátide, y a su vez, si esta última se rompe los escólices se liberan. Las vesículas hijas presentan la misma estructura de la hidátide madre. La hidátide tiene la capacidad de producir durante 6 años protoescólices (Quiroz, 1999; Ecker y Deplazes, 2004). 2.3. Ciclo biológico y meca El ciclo biológico de este también puede vivir en otros canidos como, zorros, lobos o chacales. En su estadio larvario se desarrolla en numerosos herbívoros (ovejas, vacas, búfalos, cerdos, équidos), pero también puede desarrollarse en otros mamíferos, como marsupiales, conejos, roedores, primates no humanos y humanos. Estos y otros hospedadores juegan un papel importante en la transmisión del ciclo (Eckert y Deplazes, 2004). El hospedador accid 48 Revisión Bibliográfica eclosionan y se activan las oncosferas que son capaces de adherirse y atravesar la pared intestinal con el fin de alcanzar el torrente sanguíneo y linfático, desde donde llegan hasta los órganos pulmones e hígado, principalmente en los que se desarrolla la larva. Por otra parte, una alta proporción de quistes no producen protoescólex, estos quistes reciben el nombre de acefaloquistes o estériles (Pawlowski et al., 2001). 2.3.1. Hospedador Definitivo El adulto de E. granulosus se encuentra en el intestino del hospedador definitivo, siendo frecuentes las infecciones múltiples, que en general son bien toleradas por animales, tales como perros, zorros, chacales, lobos, etc. El perro se infecta cuando ingiere quistes con protoescólices viables; generalmente, esto ocurre durante las matanzas del ganado cuando se alimenta a los canes con vísceras de animales que son hospedadores intermediarios del parásito (vacas, ovejas, etc.). En el intestino se inicia el desarrollo de los protoescólices (escólices o escólex inmaduros), los cuales se fijan en el epitelio intestinal, anclados en las criptas de Lieberkühn (Thompson et al., 1979), y evolucionan Hidátide Hospedador intermediario Adulto Hospedador definitivo Hospedador accidental Huevo Hidátide Hospedador intermediario Adulto Hospedador definitivo Hospedador accidental Huevo Figura RB. 11. Ciclo biológico de E. granulosus 49 Revisión Bibliográfica hasta llegar al estado adulto, formando las proglótides que posteriormente maduran. En ellas se desarrollan los huevos que son eliminados finalmente junto con las heces. No obstante, aproximadamente un 70% de los huevos se liberan en el intestino antes de que las proglótides grávidas salgan al exterior (Quiroz, 1999). Cuando un quiste es ingerido por el hospedador definitivo, los protoescólices viables inal y una rca su sitio. , entras que ya se ente se o se abre paso a s comunes jidos (músculos, huesos, riñones, bazo, tiroides, SNC) (Eckert y Deplazes, 2004). uando los embriones llegan a los capilares intrahepáticos o intrapulmonares son ando un nódulo de aproximadamente 200 µm emergen en su tracto gastrointestinal y se activa la evaginación de la región apical del protoescólice y su desarrollo se inicia, que consta de una diferenciación germ diferenciación somática. Inicialmente aparece un rudimento genital que denota la formación del primer segmento y una constricción debajo del cuerpo que ma Aproximadamente a los 20 días, el verme se encuentra bisegmentado con órganos genitales masculinos diferenciados y los femeninos en desarrollo. Entre los 28 y 33 días ambos genitales están maduros dentro de la proglótide terminal, mi formó la penúltima proglótide que contiene genitales en desarrollo. Posteriorm produce la ovulación y fertilización en la proglótide terminal, y los órganos genitales degeneran. Alrededor de los 50 días, la proglótide terminal es grávida y posee huevos embrionados en su interior. 2.3.2. Hospedador Intermediario El huevo de E. granulosus ingerido llega a la primera porción del intestino delgado, donde pierde su cubierta protectora y libera al embrión. Este últim través de la pared intestinal para llegar a los vasos sanguíneos y vías linfáticas. Una vez en la circulación es transportado pasivamente hasta distintos órganos. Los má son: el hígado y los pulmones; pero también pueden llegar al corazón y otras vísceras o te C rodeados por leucocitos y terminan form de diámetro. Al cabo de 4 días, el nódulo comienza a vacuolizarse para finalmente dar lugar a la formación parasitaria, llamada hidátide o larva, que será recubierta por una capa de tejido conjuntivo del órgano en el que se alojó. El ciclo se cierra cuando los quistes maduros son ingeridos por los hospedadores definitivos. Se han reconocido dos formas biológicas o biotipos del parásito en base a la especificidad del estadio larvario por el hospedador, así como sus características de desarrollo, patogenicidad y respuesta inmune (ciclos epidemiológicos) (Rausch, 1994). 50 Revisión Bibliográfica El biotipo norteño afecta exclusivamente a ungulados de la familia Cervidae, no desarrollándose en ungulados domésticos (salvo renos domesticados) (Rausch, 1994) en este caso el hospedador definitivo suelen ser lobos y, ocasionalmente perros. El biotipo europeo presenta varios tipos de ciclo epidemiológicos, según los hospedadores implicados. En España son las ovejas, vacas, cerdos, cabras y equinos los ue actúan como hospedadores intermediarios, siendo las ovejas, como en otras partes r intermediario accidental, en el que el ciclo se interrumpe, n embargo, existen lugares del mundo, como Kenia, en los que el hombre puede ico, debido a las costumbres de algunas tribus de s en zonas endémicas q del mundo, las más importantes para el mantenimiento del ciclo, junto con los perros como hospedadores definitivos. En América del Sur, el ciclo más importante es el de ovinos – perros; el hombre está involucrado accidentalmente y a pesar de que no posee un papel relevante en el ciclo biológico para perpetuar la infección. Esto se da principalmente por contacto con perros o con objetos y alimentos contaminados (Schantz et al., 1995). En humanos y algunos animales domésticos la formación del quiste puede marcar el fin del ciclo de vida del parásito. Sin embargo, algunos animales salvajes, como ardillas y conejos, hospedadores intermediarios potenciales representarían otra situación ya que sus quistes pueden ser ingeridos cuando los predadores se alimentan de dichos animales. El hombre es un hospedado si formar parte del ciclo epidemiológ enterrar a poca profundidad, o no enterrar los cadáveres, siendo éstos accesibles para gran variedad de carnívoros (Macpherson, 1983) 2.4. Epidemiología Como se mencionó anteriormente, la hidatidosis es una zoonosis que afecta principalmente a las regiones agrícolas y ganaderas de todo el mundo. La incidencia en humanos es alta en Grecia, Rumania, China, España, Argelia, Yugoslavia, y en América Latina. En esta última región los índices de infección más elevados se dan en Argentina, Chile, Uruguay, Brasil, Perú, y en menor escala, Colombia, Bolivia, Paraguay y México. La incidencia en otros países es menor debido a programas de prevención bien organizados: Australia, Nueva Zelanda y Tasmania (Craig et al., 1996; Ecker y Deplazes, 2004). La prevalencia de la enfermedad en humano oscila entre 0.2% en China, hasta valores del 9.1% en los Andes Peruanos (Craig et al., 1996; Moro y Schantz 2006) (Figura RB.12). 51 Revisión Bibliográfica El ser humano, por ignorancia, favorece el contacto entre el hospedador definitivo y otros mamíferos susceptibles de ser hospedadores intermediarios, entre los que se incluye el mismo hombre. Algunas de las causas que favorecen la difusión de esta parasitosis son: el desconocimiento del problema por la población, la participación del pson, 2002), los que se Scott et al., 1997, revisaron muestras rocedentes de humanos y cerdos provenientes de Polonia, en sus resultados uestras de humanos no estaban infectadas con el genotipo G1, biología molecular, aislamientos de E. granulosus procedentes de Suiza y España. hombre en la creación de condiciones favorables al desarrollo del ciclo biológico (alimentar perros con vísceras crudas, matanza clandestina de animales y abundancia de cánidos) y costumbres étnicas como en Kenia en donde se propicia el contacto de los niños con los perros (nurse-dogs) y se alcanzan los valores de incidencia más altos del mundo. E. granulosus, se caracteriza por presentar una gran variación en relación a la especificidad del hospedador, epidemiología, morfología, biología del desarrollo, bioquímica, fisiología y genética, se han identificado variantes o cepas hasta el momento se han descrito 9 genotipos distintos (G1-G9) (Thom han asociado a diferentes animales, como ovejas, cerdos, caballos, bovinos, cabras, etc. (Bowles et al., 1992, Scott et al., 1997). El genotipo comúnmente encontrado en ovejas es el G1, pero también ha sido reportado en muestras colectadas de ganado bovino y porcino, este genotipo esta reportado en la mayoría de los casos de humanos con hidatidosis, considerándose el mas patógeno (Bart et al., 2006). El genotipo G7 encontrado en cerdos ha sido reportado en diferentes países de Europa (Kedra et al., 1999; Scott et al., 1997; Ŝnabel et al., 2000) el número de casos reportados en humanos esta restringido para este genotipo, aunque si existe reportes (Pawlowski y Stefaniak 2003; Turcekova et al., 2003). Posteriormente, p encontraron que las m aislándose en dichas muestras un genotipo similar al G7, al que denominaron G9. Estudios previos realizados en España sobre la identificación y caracterización de cepas de E. granulosus, muestran la existencia de tres genotipos el de “oveja”, “cerdo” y “caballo” (Cuesta-Bandera et al., 1988; Siles-Lucas et al., 1993, 1994, Siles-Lucas y Cuesta-Bandera, 1996; Ponce Gordo y Cuesta-Bandera, 1998). Pocos estudios fueron realizados en cerdos, cabras y ninguno en animales de vida libre, hasta ese momento. Por su parte Siles-Lucas et al., (1996), estudiaron mediante diferentes técnicas de 52 Revisión Bibliográfica Encontrando que las muestras exhibían patrones de bandas características de caballo y burro, en aquellos aislamientos provenientes de Suiza y España, de bovino en los ibles hospedadores de E. granulosus y clasificar los genotipos encontrados en stos animales, analizaron muestras de quistes obtenidos de ovejas, cabras, vacas, ndez- rzac et al., 2002; Palacios-Ruiz et al., 2003). La frecuencia de quistes hidatídicos en aislamientos provenientes de Suiza, de ovino en aislamientos provenientes de España, de cerdo en aislamientos provenientes de los dos países y finalmente de caprino en aislamientos provenientes de España. González et al., (2002a), analizaron 53 muestras de la región central de España, reportando el aislamiento de 2 diferentes genotipos de las muestras procedentes de cerdos, genotipos G1 y G7, estos resultados son de gran importancia en la salud publica Española debido a la posibilidad de que los cerdos infecten a los humanos, como se ha informado de casos en Europa Oriental y Central. Por otra parte, Mwambete et al. (2004), realizaron un estudio en España para identificar a los pos e cerdos y caballos sacrificados en mataderos de la región central de España, también se incluyeron quistes provenientes de humanos, así como, de jabalíes cazados en la zona central de este país. Los 248 aislamientos provenientes de hígados y pulmones de las especies antes mencionadas, fueron catalogados en fértiles e infértiles. En sus resultados reportaron 3 diferentes genotipos, el G1 en aquellas muestras procedentes de ovejas, cabras, bovinos, cerdos, jabalíes y en el hombre, G4 en caballos y G7 en cabras, cerdos y jabalíes. Sin embargo, no mencionan cuantas de las muestras que fueron positivas al genotipo G1 pertenecían a los quistes obtenidos de pulmón. Piergili et al. (2004), en Italia realizó un estudio sobre la distribución de la hidatidosis en mataderos de Umbria situada en la región centro norte de Italia, encontrando el 100 % de los quistes de cerdo en hígado, no realizó la caracterización de estas muestras, por lo tanto se desconoce el genotipo al que pertenecen. En México, existe poca información sobre la distribución, incidencia y genotipos que afectan tanto al hombre como a los animales (Barroeta et al., 1962; Sarina Natera et al., 1976; Herrera Merino et al., 1991; Villarreal et al., 1994; Suárez et al., 1995; Mé A cerdos y bovinos sacrificados en mataderos, fue de 0,27-6,5% y 0,1% respectivamente (Martínez et al., 1994: Vargas-Rivera et al., 1995), mientras que la prevalencia de E. granulosus en perros está estimada en un 0,49% (Fernández y Canto, 2002). Maravilla et al. (2004), informan sobre un quiste obtenido del hígado de un cerdo correspondiente al genotipo G7, y el hallazgo de otro quiste hepático en un paciente, correspondiente al 53 Revisión Bibliográfica genotipo G5. Villalobos et al. (2007), reportan por primera vez el hallazgo del genotipo G1 en pulmón de cerdo, y confirman la presencia del genotipo G7 en este país. 2.5. Aspectos clínicos: Patología y Síntomas La hidatidosis es una cestodiosis larvaria presente, por lo tanto, sólo en los hospedadores intermediarios. En el caso de los hospedadores definitivos, como los perros, no se observan síntomas clínicos, aunque un número grande de parásitos puede ocasionarles una enteritis. En los hospedadores intermediarios, no se ha podido precisar una sintomatología definida. A pesar de ello, la enfermedad produce grandes pérdidas económicas debidas, en su mayor parte, a la descomposición de órganos infectados y a alteraciones en la calidad de la carne de animales altamente parasitados (Acha, 1987). En el hombre la fase inicial de la infección es siempre asintomática, en algunos casos quistes pequeños encapsulados no continúan su desarrollo y se quedan calcificados no produciendo mayor patología durante m Figura RB. 12. La Hidatidosis esta presente en países de América Latina, Europa, Asia y África. (Tomado de Bogitsh and Cheng, 1998 y Moro and Schantz. 2006) uchos años o permanentemente (Eckert y 004). La sintomatología depende de la localización del quiste y su tamaño; Deplazes, 2 los quistes se asemejan a cualquier tumoración del órgano afectado, y generalmente los problemas son ocasionados por fenómenos mecánicos de compresión y atrofia de los tejidos que lo rodean. Es una afección de crecimiento lento, grave y destructora, la morbilidad dependerá del número, tamaño y desarrollo de los quistes, así como del órgano al que este presionando (Eckert y Deplazes, 2004). Requiere tratamiento quirúrgico y, con cierta frecuencia, presenta complicaciones que incluso pueden llevar a la muerte. La presencia del quiste provoca una reacción inflamatoria del hospedador que 54 Revisión Bibliográfica termina dando lugar a la encapsulación del quiste. Se observa con frecuencia pasaje de sustancias de la hidátide al hospedador, que provocan alteraciones inmunológicas. Las localizaciones más frecuentes son el hígado y los pulmones, pero también puede desarrollarse en bazo, riñón, corazón, músculos, mamas, páncreas, genitales, parótidas y tiroides en los que el parásito tiene la estructura habitual. En cambio en el hueso y en el ortalidad durante las cirugías es alta. encéfalo adquiere características morfológicas especiales. Los quistes pueden romperse de forma aparentemente espontánea, o por algún traumatismo o esfuerzo y también durante una cirugía. El contenido derramado en la cavidad peritoneal puede originar un accidente inmediato, el shock anafiláctico; o tardío, la hidatidosis secundaria, dada por la liberación de los escólices en la cavidad abdominal o pleural con la subsiguiente formación de nuevos quistes. La importancia médico-social deriva del daño que produce al enfermo y a la comunidad. Es una afección crónica de larga evolución que compromete la capacidad de trabajo de la persona ya que deberá ser alejada de su núcleo familiar y entorno laboral, al requerir hospitalización prolongada. El tratamiento es primordialmente quirúrgico, con operaciones complejas, en general requiriéndose más de una. La tasa de m 2.6. Diagnóstico Recientemente la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2003) ha impulsado una clasificación internacional estandarizada ecográfica de los quistes hepáticos primarios (Tabla RB.3) que hace la diferencia entre los quistes activos (CE1, CE2), quistes transicionales (CE3, algunas CE4 pueden reactivarse) e inactivos (CE4, CE5). El adulto de E. granulosus ocasiona problemas de escasa importancia en el hospedador definitivo, limitados a la zona de fijación del escólex. El hospedador permanece en muchos casos asintomático, aún cuando el número de vermes sea elevado. Debido a que los huevos de los ténidos son morfológicamente similares, los análisis coprológicos no son válidos para realizar un diagnóstico fiable de equinococosis, por lo que en diversos estudios epidemiológicos, se recurre al análisis después de la administración de purgas realizadas con bromohidrato de arecolina (Schantz, 1973). En relación con el inmunodiagnóstico se han desarrollado dos metodologías: la primera supone la detección de anticuerpos en el hospedador, y la segunda implica la detección de componentes parasitarios en las heces del mismo. Así, se ha puesto a punto un 55 Revisión Bibliográfica ensayo serológico para la detección de anticuerpos en el hospedador definitivo; sin embargo, la sensibilidad del mismo es baja, ya que algunos perros con una gran cantidad de parásitos han sido negativos en la prueba, y su especificidad no está todavía comprobada. La detección de componentes parasitarios en las heces se basa en identificación de antígenos parasitarios mediante técnicas inmunológicas. Craig et al., (1986, 1988), Allan, et al. (1992) y Deplazes et al. (1992) descubrieron coproantígenos de Echinococcus, siendo esta técnica más sensible que la detección serológica de anticuerpos. Respecto a la fase larvaria, debido al lento crecimiento de los quistes y su baja patogenicidad, éstos pueden permanecer en el hospedador durante mucho tiempo, siendo detectados sólo cuando la larva ejerce efecto mecánico sobre alguna función corporal. Se produce una reacción alérgica aguda como consecuencia de una rotura accidental de los mismos, o bien se determina su presencia en análisis realizados por l diagnóstico etiológico de la hidatidosis es normalmente difícil de realizar, los ración no invasivos se basan en un grupo de criterios que incluyen ratorio: acciones serológicas, intradermorreacciones, hemogramas y ELISA. Si bien todas otros motivos clínicos o en algunos casos solo se ha diagnosticado en estudios post mortem. En el caso de algunos quistes pulmonares, o quistes abiertos a las vías biliares o urinarias, pueden detectarse restos del parásito (fragmentos de membranas, protoescólices o ganchos) en el esputo, el contenido duodenal o el sedimento urinario, respectivamente (Bilbao, 1985). E métodos de explo síntomas, estudios de residencia en zonas endémicas y contacto cercano con perros. Se pueden realizar estudios radiológicos, ecografías, ultrasonografía, tomografía axial computada, resonancia magnética o laparoscopias en los que solamente se pude observar una masa tumoral, por lo que se tiene que recurrir a ensayos de labo re estas metodologías han sido mejoradas en los últimos años, es necesario el desarrollo de pruebas inmunodiagnósticas con antígenos recombinantes especie-específicos para abaratar costos, estandarizar, facilitar y aumentar la especificidad de los exámenes (Craig et al., 1991; McManus, 2006). 56 Revisión Bibliográfica Tabla RB.3. Clasificación internacional estandarizada ecográfica de los quistes hepáticos primarios de la OMS Tipo Morfología CE1 Quistes simples con vesículas hijas y que contienen en su interior ecos que corresponden a la arena hidatídica CE2 Quistes simples con pared bien definida y con vesículas hijas en su interior que pueden ocuparlo parcial o totalmente, produciendo una imagen en rueda de carro o en panal de abeja CE3 Quiste con morfología alterada, encogidos, con la membrana germinativa flotando en el interior (signo del nenúfar) y algunos de ellos con vesículas hijas, dando la apariencia de una masa compleja CE4 Quiste de aspecto semisólido, con imágenes hiperecoicas o contenido degenerativo heterogéneo y sin vesículas hijas o con las membranas colapsadas y degeneradas (imagen en madeja de lana) CE5 Quiste calcificado total o parcialmente, con una gruesa pared en forma de arco e interior con distintos grados de calcificación Una lesión quística única indiferenciada (CL) puede ser, además de hidatidosis, una lesión congénita, postraumática, biliar o neoplásica. Además, por su tamaño se clasifican en pequeños (< 5 cm), medianos (5-10 cm) y grandes (> 10 cm). Los métodos invasivos (punciones, aspirados, biopsias) son peligrosos, debido al riesgo de ruptura del quiste, con el consecuente choque anafiláctico y/o diseminación de protoescólices, así como riesgo de infecciones bacteriana asociadas a dichas prácticas. Por lo tanto, para evitar estos peligros se recurre al diagnóstico serológico ya comentado. Para el estudio, caracterización e identificación de las especies y cepas de E. granulosus se han desarrollado varios protocolos moleculares, en los que se utilizan como dianas secuencias parciales de la citocromo C oxidasa I mitocondrial (CO I) y la NADH deshidrogenada I (NAD I), así como los espaciadores transcritos internos del DNA ribosomal (ITS1, ITS2) acoplados al análisis del polimorfismo del tamaño de fragmentos de restricción (PCR-RFLPs), (Bowles et al., 1992; Bowles et al, 1993a; Bowles et al., 1995; Gasser y Chilton 1995). Además, González et al., en 2002a, desarrollaron tres protocolos moleculares (Eg9-PCR, Eg9-PCR-RFLP y Eg16-PCR) para diferenciar algunos genotipos de E. granulosus y E. multilocularis. 57 Revisión Bibliográfica 2.7. Tratamiento a extirpación quirúrgica de un quiste permanece como tratamiento de elección, qu , 20 as c r complicaciones y evitar la rup del inyección-reaspiración con el o guía durante la realización de esta técnica, disminuir el peritoneal en caso de rotura accidental del quiste durante la enc quiste y po momento un fár ocasiones suele emplearse conjuntamen Los fármaco más efectividad en el tratamiento de la dos administrad e no está indicada la cirugía se n el plazo medio de 2 años después de la extirpación quirúrgica del quiste. El L edando la quimioterapia para los casos total o parcialmente inoperables (WHO ealizarse precozmente para evitar 03). L irugías deben tura quiste. La técnica que se utiliza es llamada PAIR por pinchazo-aspiración- uso de un ultrasonido com más una terapia con albendazol antes de la cirugía y después de ésta, para riesgo de siembra interv ión. En principio se saca con una aguja fina por aspiración el fluido del steriormente se introduce un agente protoescolicida. No existe hasta el maco 100% eficaz contra la hidatidosis, en te con la cirugía, como tratamiento pre-o post-operatorio complementario. s que hasta el momento han mostrado hidati is son derivados bencimidazólicos (albendazol, mebendazol) en ocasiones os conjuntamente. En los pacientes en qu emplea el albendazol a la dosis de 10-15 mg/kg/d, en 3 o más ciclos de 4 semanas, con períodos de descanso de 2 semanas. Las pruebas serológicas suelen reportarse negativas e porcentaje de curación completa es inferior a 20 % (Craig et al., 2003). En la tabla RB.4 se muestran las recomendaciones terapéuticas de la hidatidosis hepática propuestas por la Organización Mundial de la Salud, en base a su clasificación ecográfica (López- Vélez y Gárate, 2006). 58 Revisión Bibliográfica Tabla RB.4 Recomendaciones del quiste hidatídico hepático basadas en la clasificación ecográfica de la OMS CE1 CE2 CE3 CE4 CE5 Abstención Generalmente Inactivos, stá invasivos, no esta recomendado el tratamiento. no e indicado tratamiento Quimioterapia 1ª Elección Menos eficaz, puede probarse como 1ª elección 1ª Elección PAIR 2ª Elección si fracasa la quimioterapia 1ª Elección 2ª Elección si fracasa la quimioterapia Si se sospecha actividad o infección Cirugía Si quimioterapia y PAIR contraindicadas , o si fracasa la quimioterapia + PAIR Si hay muchas vesículas hijas y fracasa la quimioterapia Si la quimioterapia y la PAIR están contraindicadas, o si fracasa la quimioterapia + PAIR Si la PAIR está contraindicada Si complicacio hay nes Quimioterapia con albendazol, con praziquantel o sin éste. CE1, CE3: pueden tratarse con quimioterapia. Si la quimioterapia no induce cambios degenerativos se procede a la PAIR. Los C3 multivesiculados deben pincharse en cada vesícula hija. Cirugía si contraindicada quimioterapia o PAIR. C2: pueden tratarse inicialmente con quimioterapia, pero es menos eficaz que en CE1 y CE3, PAIR es también una primera opción, a no ser que existan tal cantidad de vesículas hijas que sea imposible la punción. Cirugía si no hay cambios degenerativos tras la quimioterapia o si PAIR de todas las vesículas hijas es difícil. CE4: los quistes casi siempre inactivos, por lo que no requieren ningún tratamiento. PAIR si cierto grado de fertilidad o sobreinfectados. Cirugía si PAIR imposible. CE5: no requiere tratamiento, a no ser que se compliquen, en tal caso la cirugía es el procedimiento de elección. 2.8. Prevención Se deberían promover campañas de concienciación de las personas con el objetivo de que se conozca el problema y se estimulen cambios de hábitos: evitar el contacto entre erros y hospedadores intermediarios, educar a la gente sobre el riesgo del contacto strecho con estos animales domésticos, especialmente en áreas endémicas y tratar gularmente a los perros con antihelmínticos. Otra medida importante sería la onstrucción de mataderos adecuados con controles veterinarios durante todo el rocesamiento de las reses y borregos, decomiso total de las vísceras contaminadas. xisten ejemplos de control exitoso del parásito: en Islandia hace más de 100 años uno e cada seis habitantes estaba afectado por la hidatidosis; hoy la echinococcosis se onsidera erradicada gracias a una campaña de educación efectiva que permitió nsibilizar a la población frente a la enfermedad para luego poder implementar edidas que eliminaron la sacrificio domiciliario de animales. En España se inició en el p e re c p E d c se m 59 Revisión Bibliográfica año 1980 un programa de control que logró disminuir la prevalencia de la enfermedad n animales domésticos y en humanos, hasta niveles aceptables en comparación con la idatidosis, en e se incl iquante rros, edu a ue manejan ganado y estudio de acientes en hos rtá descenso en el número de casos durante 13 años de estudio (Jim e situación de partida. En 1987, La Rioja inició un programa de control y prevención de atamiento prazh el qu uye tr con l a pe cación personas q , p pitales, repo énez et al., 2002 ndose un ). 60 Objetivos OBJETIVOS En el presente trabajo se pretende definir marcadores moleculares para el diagnóstico diferencial de los ténidos de interés, mediante los siguientes objetivos específicos. 1.- Cribado al azar de genotecas de expresión del adulto de T. solium para aislar cDNAs característicos del ténido y, en paralelo, evaluar las propiedades de las genotecas. 2.- Cribado dirigido o inmunocribado, de genotecas de expresión del adulto de T. solium para aislar y caracterizar antígenos marcadores de teniasis. 3.- Obtención de cDNAs de interés diagnóstico utilizando otras alternativas. 4.- Desarrollo de protocolos de PCR y PCR-RFLP, que sirvan de marcadores para el diagnóstico diferencial de ténidos. Aplicación a la identificación específica de quistes tisulares de interés veterinario. 61 Materiales y Métodos MATERIALES Y MÉTODOS 1. MATERIAL BIOLÓGICO 1.1. Genotecas de expresión de adulto de Taenia solium. Para la realización de los objetivos propuestos, se utilizaron cuatro genotecas de expresión (según los tamaños de los cDNA) a partir de un adulto de T. solium, construidas en el vector Uni-ZAP XR® (Stratagene), mediante la clonación dirigida Eco RI (extremo 5´) y Xho I (extremo 3´): -Dos genotecas de cDNA “High” (cDNA grandes): una de cuello-escólex, y una de proglótides. -Dos genotecas de cDNA “Médium” (cDNA medios): una de cuello-escólex, y una de proglótides. Las genotecas fueron preparadas por los Drs. González y Ferrer, quienes amablemente me las suministraron. 1.2. Vectores de Clonación. 1.2.1. Fagos. -λZAP® XR (Stratagene): Este vector fue empleado en la construcción de las genotecas de expresión de adulto de T. solium. Con él se pueden clonar fragmentos comprendidos entre 0,1 a 10 Kb. El fago λZAP® XR se utilizó para la clonación dirigida Eco RI / Xho I de los cDNA de adulto de T. solium, así como para la subclonación directa de los insertos en pBluescript mediante escisión in vivo. - Fago de ayuda (helper) ExAssist T (Stratagene): Este es un fago monocatenario de 5 Kb necesario para la escisión in vivo del fago λ-ZAP® XR. 1.2.2. Plásmidos. - pBluescript® SK (Stratagene): Es un fagémido de 2,9 Kb, derivado de pUC 19. Se obtiene tras la escisión in vivo de λ-ZAP XR, utilizando el fago de ayuda ExAssist. Permite la expresión in vivo de proteínas de fusión con β-galactosidasa, ya que presenta el promotor inducible Lac del gen Lac Z. Tiene como marcador el gen de resistencia a ampicilina. La región de policlonaje está flanqueada por los cebadores universales T3 y T7. 63 Materiales y Métodos - pGEM®-T Easy (Promega): Es un vector diseñado para el clonaje directo de productos de PCR. Permite la selección de los clones recombinantes mediante la actividad de la proteína β–galactosidasa. Contiene los cebadores universales D y SP6, flanqueando la región de policlonaje. Presenta un peso de 3,0 Kb y como marcador el gen de resistencia a ampicilina. -TOPO pCR® 4 (Invitrogen): Vector de clonación. Es un vector de alto número de copias, seleccionable en cepas autotróficas para uracilo, sirve para subclonar productos de PCR. Contiene los cebadores universales T3 y T7, flanqueando la región de policlonaje. Tiene como marcador el gen de resistencia a ampicilina y kanamicina y presenta un peso de 3,9 Kb. - pGEX-4T-1 (Amersham): Plásmidos utilizados en la expresión de los genes de interés. Rinden una proteína de fusión con la enzima glutation S-transferasa (GST) de Schistosoma japonicum, que posibilita su purificación por cromatografía de afinidad mediante columnas de glutation agarosa, así como también la detección de la proteína mediante el anticuerpo policlonal anti-GST (Amersham). Contienen el promotor T7 y presentan un tamaño de 4,9 Kb. Tienen como marcador el gen de resistencia a ampicilina. 1.3. Cepas bacterianas. Se utilizaron las siguientes cepas de Escherichia coli: 1.3.1 E. coli XL1-Blue MRF (Stratagene): ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F´proAB laclq Z∆M15Tn10 (tetr)]. Cepa de alta eficiencia para la transformación de DNA metilado y no metilado y para la selección de clones recombinantes mediante la detección de actividad β–galactosidasa. Esta cepa se utilizó para la propagación y mantenimiento de todos los plásmidos recombinantes. 1.3.2. E. coli SOLR (Stratagene): e14- (McrA-) ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171sbcC recB recj uvrC umuC::Tn5 (Kanr) lac gyrA96 relA1 thi-1 endA1 λr [F´proAB laclq Z∆M15] 64 Materiales y Métodos Su- (nonsuppressing). Esta cepa se empleó para la clonación directa de los plásmidos pBluescript recombinantes mediante escisión in vivo. 1.3.3. E. coli BL-21 (Stratagene): F-, ompT, rB-, mB-. Se utilizó para la expresión de los genes subclonados en los vectores de expresión pGEX-4T. 1.3.4. E. coli TOPO10. F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG. Esta cepa bacteriana fue empleada para la subclonación de los plásmidos TOPO pCR® 4 recombinantes. 1.4. Material parasitario. 1.4.1. Verme adulto de T. solium: Para la obtención de ácidos nucleicos se utilizó cuello-escólex y fragmentos maduros y grávidos de un adulto de T. solium, mantenidos en congelación a -80ºC en el Servicio de Parasitología, del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III. El ténido fue aislado en Venezuela y transportado en nieve carbónica a nuestro país. 1.4.2. Quistes hidatídicos (Echinococcus granulosus): Para la obtención de DNA genómico de E. granulosus se emplearon quistes hidatídicos, obtenidos de cerdos infectados de forma natural y sacrificados en el matadero de Zacatepec, Estado de Morelos, México. 1.4.3. Metacestodos de T. solium: Para la obtención de DNA genómico del parásito, se usaron cisticercos obtenidos de cerdos infectados de forma natural y sacrificados en el matadero de Zacatepec, Estado de Morelos, México. 1.4.4. Otros quistes, de etiología desconocida y con morfología no identificativa encontrados en muestras musculares procedentes de bovinos y porcinos, fueron enviados por diferentes mataderos de la Comunidad de Castilla y León al Servicio de Parasitología, del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III. 65 Materiales y Métodos Cada quiste fue diseccionado con un bisturí, lavado con PBS y guardado en etanol al 70% hasta su procesamiento. En el caso de las muestras procedentes de músculo, una parte fueron diseccionadas y congeladas. En la tabla M.1 se incluyen las características de los quistes y cisticercos, aislados de las muestras de porcino y bovino, examinados en el presente trabajo. 1.5. Sueros. 1.5.1. Sueros empleados en el inmunocribado de las genotecas. Sueros humanos - Sueros de pacientes con teniasis (T. saginata) confirmada mediante el diagnóstico por PCR de las proglótides aisladas (González et al., 2000), enviadas al Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III. - Sueros de individuos sanos sin contacto con áreas endémicas de la enfermedad y que provenían del banco de sueros del Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III. Sueros de conejo - Mezcla de sueros de 3 conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55), obtenidas por cromatografía de afinidad con lectinas de acuerdo a Tsang et al. (1989). Todos los sueros fueron preabsorbidos con lisados de E. coli (Sambrook y Russell, 2001). En la tabla M.2 se muestran algunos aspectos clínicos de los sueros empleados en este trabajo. 66 Materiales y Métodos Tabla M.1. Características de los quistes y cisticercos aislados de porcino y bovino. ND= no hay datos Número Hospedador Sexo Edad Muestra Número de *Cistic/quistes Morfología** #1 Porcinoa ND ND Músculo 15 Calcificados 0.5 X 0.2 cm #2 Porcinoa Macho 6 meses Hígado 1 Vesicular 1.0 cm #3 Bovinoa Macho 12 meses Corazón 3 Calcificados 0.5 X0.2 cm #4 NDa ND ND ND 1 Vesicular 1.0 cm #5 Porcinoa Macho 16 meses Hígado 6 Calcificados 0.5 X0.2 cm #6 Porcinoa Macho 6 meses Hígado 1 Coloidal 0.5 X 0.2 cm #7 Porcinoa ND ND Diafragma 10 Calcificados 0.5 X0.2 cm #8 Bovinoa Macho 12 meses Músculo 1 Coloidal 0.5 X 0.2 cm #9 Bovinoa Hembra 15 meses Músculo 1 Vesicular 0.5 cm #10 Bovinoa ND 13 meses Corazón 1 Coloidal 0.5 X 0.2 cm #11 #12 #13 #14 Bovinoa Macho 7.5 meses Corazón Masetero Diafragma Lengua 5 3 2 2 Caseosos 2.0 X 1.5 cm Vesiculares 0.5 X 0.5 cm Vesiculares 0.5 X 0.5 cm Vesiculares 0.5 X 0.5 cm #15 Porcinob ND ND Hígado 1 Vesicular de 3.5 x 4.0 #16 Porcinob ND ND Hígado 1 ND #17 Porcinob ND ND Músculo 10 Vesiculares 0.5 cm #18 Porcinob ND ND Hígado 8 Vesiculares 1.5 X 2.5 cm #19 Porcinob ND ND Hígado 1 Vesicular 1.5 X 2.5 cm #20 Porcinob ND ND ND 1 Vesicular 2.0 X 2.5 cm #21 Porcinob ND ND ND 1 ND #22 Porcinob ND ND Hígado 1 Vesicular 1.5 X 2.5 cm #23 Porcinob ND ND Hígado 1 ND #24 Porcinob ND ND Hígado 1 ND #25 Porcinob ND ND Pulmón 3 Vesiculares 2.5 X 2.0 cm #26 Porcinob ND ND Hígado 1 Vesicular 4.0 X 3.0 cm #27 Porcinob ND ND Hígado 2 Vesiculares 2.0 X 1.3 cm #28 Porcinob ND ND Epiplón 1 Vesicular 1.5 X 1.0 cm #29 Porcinob ND ND Hígado 1 Vesicular 0.3 X 0.2 cm #30 Porcinob ND ND Hígado 2 Vesiculares 0.5 X 1.0 cm #31 Porcinob ND ND Hígado 1 Vesicular 2.0 X 1.5 cm #32 Porcinob ND ND Hígado 1 Vesicular 3.0 X 2.0 cm #33 Porcinob ND ND Hígado 2 Vesiculares 0.3 X 0.2 cm #34 Porcinob ND ND Hígado 2 Muy pequeños #35 Porcinob ND ND Hígado 1 Vesicular 1.5 X 1.5 cm a Muestras procedentes de la Comunidad de Castilla y León, España. b Muestras procedentes del matadero de Zacatepec, Estado de Morelos, México. * Cisticercos ** En aquellos casos en los que se encontró más de 1 quiste se anota la medida promedio. 67 Materiales y Métodos Tabla M.2. Características de los sueros humanos usados en el inmunocribado de las genotecas. Número Registro Muestra Multiplex HDP2 Observaciones 1 5474 P/98 Suero T. saginata ELISA + 2 3193 P/99 Suero T. saginata Negativo 3 4013P/99 Suero T. saginata Negativo 4 4320 P/00 Suero T. saginata Negativo 5 0916 P/01 Suero T. saginata Negativo 6 5701 P/02 Suero T. saginata Negativo 7 2250 P/03 Suero T. saginata ELISA + 8 772 P/05 Suero T. saginata Negativo 9 3337 P/05 Suero T. saginata Negativo 10 4273 P/05 Suero T. saginata Negativo 11 3118 P/06 Suero T. saginata ELISA + 12 3518 P/06 Suero T. saginata ELISA + 13 7792P/06 Suero T. saginata ELISA + 14 9625 P06 Suero T. saginata Negativo 15 9674 P/06 Suero T. saginata ELISA + Observaciones: En paralelo al diagnóstico de teniasis, se estudió la presencia de posibles metacestodos para descartar la cisticercosis, en caso de que el diagnóstico de teniasis fuera positivo para T. solium. ELISA: Se realizó la determinación de anticuerpos mediante ELISA, utilizando un ensayo comercial (“Ridascreen® Taenia solium IgG K7721”, R-Biopharm AG, Germany) y un ensayo “in house” con fluido vesicular de cisticerco. También se llevó a cabo la detección del antígeno HP10 mediante ELISA de captura con un anticuerpo monoclonal específico (Harrison et al., 1989). Registro: número de muestra, P/XX (Parasitología y los dos últimos dígitos del año de obtención de la muestra). 2. MEDIOS DE CULTIVO 2.1. Medios de cultivo de bacterias. Crecimiento y mantenimiento de bacterias. Para el crecimiento y conservación de las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo, se usó el medio de cultivo Luria-Bertani (LB), líquido o sólido (Sambrook y Russell, 2001). Se empleó una temperatura de 37ºC con agitación para su crecimiento en medio líquido. En los casos en los que fue necesario se incluyó en los medios el antibiótico de selección adecuado. Para la infección con fagos se utilizó el medio LB suplementado con 20% de maltosa y sulfato de magnesio (MgS04) 10 mM. El crecimiento de los cultivos se siguió midiendo la densidad óptica a 600nm en un espectrofotómetro Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech), hasta alcanzar valores comprendidos entre 0,6 y1,0. 68 Materiales y Métodos Para el crecimiento y mantenimiento de células transformadas con plásmidos, las bacterias se cultivaron en medio LB líquido o sólido, con antibióticos, dependiendo del marcador de resistencia de los plásmidos. Para la conservación de las diferentes cepas bacterianas utilizadas y células transformadas, se prepararon alícuotas de 80% de cultivo bacteriano y 20% de glicerol y se almacenaron a –80ºC hasta su uso. La composición de los medios de cultivo utilizados se describe a continuación. - Medio LB líquido: 10 g/l triptona, 5 g/l extracto de levadura, 5 g/l NaCl, pH 7,5 (Sambrook y Russell, 2001). - Medio LB sólido: La misma composición del medio LB líquido a la que se añade 15 g/l de agar (Sambrook y Russell, 2001). - Medio LB-agar cobertura: La misma composición del medio LB líquido a la que se añade 8 g/l de agar (Sambrook y Russell, 2001). 3. MÉTODOS A continuación se detallan los métodos básicos de manipulación de genotecas de expresión , así como los métodos concretos de acuerdo con los objetivos propuestos. 3.1. Manipulación de genotecas de expresión. Técnicas básicas. Para trabajar con genotecas de expresión resultan imprescindibles los protocolos que se describen a continuación. 3.1.1. Preparación de cepas bacterianas para el crecimiento de los fagos. Se tomó una muestra de las células E. coli XL1B MRF´ de su envase comercial original y se mantuvieron en una placa de agar LB/tetraciclina (12,5 µg/ml). Para su crecimiento, y posterior infección con los fagos, se cultivaron en LB suplementado con MgSO4 10 mM y maltosa 20 %, a 37ºC y 200 rpm, hasta obtener una DO600 nm entre 0,6- 1,0. A continuación, se centrifugaron a 2000 rpm, durante 10 minutos a 4ºC, y se resuspendieron en 50 ml de MgSO4 10 mM hasta su uso. 69 Materiales y Métodos Las células E. coli SOLR se mantuvieron en placas de agar LB/kanamicina (50 µg/ ml). Para su crecimiento e infección con fagos, se procedió como se describe anteriormente. 3.1.2. Mantenimiento de fagos. Medio SM NaCl 0,1 M Tris-HCl 50 mM pH 7,4 MgSO4 10 mM gelatina 0,01% Los fagos utilizados en el cribado se conservaron en medio SM, con 5% de cloroformo y se guardaron a 4ºC. Para su propagación se utilizó el protocolo de infección descrito por Sambrook y Russell (2001). En caso de los fagos empleados para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se mantuvieron en agua, debido a que el SM inhibe la PCR, y se conservaron a 4ºC hasta la realización de la técnica. 3.1.3. Titulación de genoteca de expresión. Para la titulación de las genotecas de expresión, se incubaron las bacterias mantenidas en MgSO4 10 mM (DO600 nm 0,5) con diferentes diluciones de las genotecas de fagos en SM, durante 20 minutos a 37ºC. Después se añadió a la mezcla el agar cobertura, y el conjunto se dispuso sobre placas de petri de 90 mm. Las placas se incubaron a 37ºC toda la noche, se contaron las ufp (unidades formadoras de placa) encontradas y, considerando la dilución empleada, se estimó el título de la genoteca. 3.2. Cribado al az ar de genotecas de expresión del adulto de T. solium para aislar cDNAs característicos del ténido y, en pa ralelo, evaluar las propiedades de las genotecas. Con la finalidad de conocer los tamaños, la calidad y la naturaleza de los cDNAs clonados de las genotecas amplificadas de cuello-escólex y proglótides, “Medium” y “High”, de adultos de T. solium, y como no se contaba con sueros específicos al inicio de este trabajo, se decidió hacer el cribado de dichas genotecas aislando los fagos recombinantes al azar, amplificando los correspondientes cDNAs por PCR y secuenciando el producto de amplificación. Antes de utilizar las placas de LB, se les añadió a cada una 250 µl de LB con 100 µl de X-gal 20 mg/ml (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactósido) (Sigma) para seleccionar recombinantes por su actividad β-galactosidasa. Además, se les agregó 10 µl de IPTG 70 Materiales y Métodos 1M (Isopropil tio-β-D-galactósido) (Sigma) para la inducción del promotor Lac. Se dejó secar para su posterior utilización. Para la infección, se colocaron en un tubo universal de 50 ml, las células XL1-Blue de E. coli con los fagos recombinantes. Se usaron a razón de 50000 ufp y 600 µl de bacteria XL1-Blue en MgSO4 10 mM, para cada placa de 150 mm de diámetro. Se incubó a 37ºC durante 15 minutos. Pasado ese tiempo se añadieron 9 ml de agar de cobertura precalentado, se depositó la mezcla sobre placas de agar sólido y se incubaron a 37ºC durante toda la noche. 3.2.1. Aislamiento de los fagos “al azar”. Se aislaron “al azar” los fagos recombinantes (calvas o placas de lisis incoloras) con la punta de una pipeta Pasteur y se colocaron en tubos de 0,5 ml que contenían 100 µl de agua destilada y guardados a 4°C. Para determinar los tamaños de los cDNAs aislados, y poder secuenciarlos, se realizó la PCR de las muestras obtenidas, según pautas que se describen a continuación. 3.2.2. Determinación de los tamaños de cDNAs clonados. Tampón de la Taq polimerasa 10X Tris-HCl 10 mM pH 8,3 KCl 50 mM, MgCl2 6 mM, 0,01% gelatina (Perkin-Elmer) Para determinar los tamaños de los cDNAs clonados en λZAP® XR, y aislados al azar, se utilizó la técnica de PCR (Mullis y Faloona, 1987). Se emplearon los cebadores específicos del fago lambda, próximos al lugar de clonación de los insertos: T3 (5´ATTAACCCTCACTAAAG 3´), situado 66 pb a la izquierda del lugar de restricción Eco RI, y T7 (5´AATACGACTCACTATAG 3´), situado 24 pb a la derecha del lugar de restricción Xho I. Para la preparación del DNA molde se añadió una calva del fago recombinante a 100 µl de agua destilada, se hirvió la mezcla 10 minutos, se centrifugó a 14000 rpm, durante 1 minuto, y se tomó 40 µl del sobrenadante. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en tubos de 0,2 ml, en un volumen final de reacción de 100 µl, con 10 µl de tampón de la Taq polimerasa 10X, 2 µl de cada desoxinucleótido trifosfato 0,2 mM (dNTP) (Pharmacia), 1 µl del cebador directo T3 (10 µM), 1 µl del cebador reverso T7 (10 µM), 1 µl de Taq Polimerasa 5 U/µl (Perkin-Elmer), 45 µl de 71 Materiales y Métodos agua destilada estéril y 40 µl de los diferentes fagos aislados. Como control negativo se utilizó una calva azul no recombinante. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador automático (“Gene Amp PCR, System 2400, Perkin-Elmer”) empleando las siguientes condiciones de reacción: Inicio 94°C / 1 minutos. Desnaturalización 94°C / 30 segundos 35 ciclos Anillamiento 54°C / 30 segundos Extensión 72°C / 3 minutos Extensión final 72°C / 7 minutos 4°C / 3.2.3. Electroforesis de DNA en geles de agarosa. Los productos obtenidos por PCR se fraccionaron en geles de agarosa al 1-3%, (agarosa D1, D5 y MS8) (Pronadisa) dependiendo del tamaño de las moléculas estudiadas y según el procedimiento descrito por Sambrook y Russell (2001). Los geles se prepararon con TAE 1X y Bromuro de Etidio (BrEt) a una concentración de 0,5 µg/ml. Los fragmentos de DNA fueron visualizados con luz ultravioleta y se empleó el sistema Gel Doc TM 1000 system (Bio-Rad Laboratories). Se usó como marcador el DNA de fago lambda digerido con Hind III o Bst EII y PCR Markers (Sigma), de alto y bajo peso molecular. El fraccionamiento se llevó a cabo en una cubeta de electroforesis horizontal con TAE 1X (Sambrook y Russell, 2001). El gel se procesó con un voltaje de 80 a 100 volts con una fuente de electroforesis “EC 105”, “Apparatus Corporation”. TAE 1X Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM 3.2.4. Purificación de los cDNAs a partir de geles de agarosa. Se llevaron a cabo dos métodos de purificación dependiendo de los cDNAs amplificados de los fagos recombinantes. Cuando se amplificaba más de una banda por halo de lisis procesado, se utilizó el kit “QIAquick gel extraction” (QIAGEN) para purificar los productos obtenidos del fraccionamiento en gel de agarosa al 1%. Las bandas se cortan, se depositan en un tubo de 1,5 ml, se pesan y se les añaden 3 72 Materiales y Métodos volúmenes de tampón QG. Después, se incuban durante 10 minutos a 50°C. Pasado ese tiempo, se les añade un volumen de isopropanol 100% y se mezcla con el vortex; el líquido se transfiere al tubo que contiene la columna, se centrifuga por un minuto a 12000 rpm, se añaden 750 µl de tampón de lavado PE y se centrifuga por un minuto a 12000 rpm. A continuación, se centrifuga un minuto más para quitar el exceso de tampón de lavado. La columna con el DNA se coloca sobre un tubo limpio de 1,5 ml y se agregan 50 µl de agua, se espera un minuto para que se moje bien la resina con el DNA y se centrifuga otro minuto a 12000 rpm, para recoger el DNA que se guarda a 4°C. Por otro lado, cuando se obtenía una única banda de amplificación por placa de lisis procesada, parte del volumen del producto amplificado se purificó con el “kit QIAquick PCR purification” (QIAGen), como a continuación se describe. En un tubo de 1,5 ml se colocaron 50 µl del producto de PCR, se añadieron 5 volúmenes de tampón PB. El contenido del tubo se transfirió a la columna, y se centrifugó a 12000 rpm durante un minuto. Después se lavó con 750 µl de tampón PE y se centrifugó a 12000 rpm, un minuto. Nuevamente se centrifugó durante un minuto para eliminar el exceso de tampón y el tubo de la columna se colocó sobre otro tubo de 1,5 ml, bien identificado, y se agregaron 50 µl de agua, se esperó un minuto y se centrifugó, un minuto a 12000 rpm, para favorecer el paso del DNA disuelto en el agua, y la muestra así recogida se guardó en el refrigerador a 4°C. 3.2.5. Secuenciación de los cDNAs de los fagos purificados. La secuenciación se realizó mediante el método de Sanger et al, (1977), a partir del producto purificado y utilizando los cebadores universales correspondientes a cada vector. Se empleó el protocolo de reacción Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI-PRISM, PE Biosystems). La secuenciación se llevó a cabo en el Servicio de Secuenciación del Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, con el sistema 373 A, modelo 377 de Applied Biosystem. 3.2.6. Análisis de las secuencias. Para manipular, editar, analizar y caracterizar las diferentes secuencias resultantes de los fragmentos obtenidos se utilizó el paquete bioinformático Lasergene: Ediseq, Seqman, Mapdraw, Primerselect (DNASTAR Inc. Madison. WI. USA). Las secuencias 73 Materiales y Métodos nucleotídicas y aminoacídicas deducidas fueron comparadas frente a las bases de datos GenBank/algoritmo BLAST (Altschul et al., 1997). La alineación múltiple de secuencias se llevó a cabo con el programa Clustal W (Thompson et al., 1994) y la edición de los mismos con el programa Bioedit 5.0.9 (Hall, 1999). 3.2.7. Preparación de células competentes. Los plásmidos son vectores de más fácil manipulación que los fagos utilizados para la clonación de los cDNAs en las genotecas de expresión. Para subclonar un cDNA de un fago a un plásmido se requiere que las dos unidades sean compatibles. Una vez ligadas, para la propagación del plásmido recombinante se necesita que dicho plásmido infecte células específicas competentes cuya preparación a continuación se resume. En nuestro caso, la preparación de células competentes se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito por Hanahan (1986). A partir de las placas de LB agar/tetraciclina (12,5 µg/ml) de E. coli XL1-Blue MRF`, se tomó una colonia y se cultivó en 50 ml de LB, a 37ºC y 200 rpm, hasta una DO600nm de 0,5-1,0. Después, las células se incubaron durante 10 minutos en hielo, se centrifugaron 15 minutos a 2000 rpm a 4ºC, y el sedimento se resuspendió en 16 ml de solución RF1. Posteriormente, se mantuvieron 15 minutos en hielo, se centrifugaron 15 minutos a 1800 rpm a 4ºC, y se resuspendieron en frío en 4 ml de solución RF2. Nuevamente se incubaron durante una hora en hielo y se hicieron alícuotas de 200 µl. Los tubos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su uso. Procedimiento idéntico se empleó para preparar células competentes de E. coli BL21. Solución RF1 RbCl 100 mM, MnCl2. 4H20 50 mM, KAc 30 mM, CaCl2 2H20 10 mM, Glicerol 15% pH 5,8 Solución RF2 MOPS 0,5 M, pH 6,8 RbCl 10 mM, CaCl2 2H20 75 mM, Glicerol 15% 3.2.8. Transformación de células competentes con plásmidos. A 100 µl de células competentes se añadió de 10-50 ng de DNA plasmídico y se mantuvieron en hielo 30 minutos. Después se realizó el choque térmico a 42ºC durante 45 segundos y con hielo durante 2 minutos. Posteriormente, se añadieron 900 µl de medio LB precalentado a 37ºC y se incubaron 1 hora a 37ºC con agitación (200 rpm). Se sembró 100 µl de cada tubo en placas de agar LB con el antibiótico marcador y se 74 Materiales y Métodos mantuvo a 37ºC toda la noche. Al día siguiente, se llevó a cabo el recuento del número de colonias obtenidas. 3.2.9. Clonación en el vector pGEM®-T Easy. El vector pGEM®-T Easy (Promega) permitió la subclonación directa de los productos de PCR más interesantes, obtenidos en el cribado al azar de la genoteca de expresión de adulto de T. solium. Se purificó el fragmento de DNA amplificado y se ligó con el vector en la proporción molar 1:3 (vector:inserto), en un volumen final de 10 µl, empleando 1 µl de T4 ligasa (Promega) y el tampón suministrado por la casa comercial. La reacción de ligación se llevó a cabo a 4ºC durante toda la noche. Después, las células XL1-Blue competentes fueron transformadas con la mitad de la mezcla de ligación, como se indica en el apartado 3.2, en placas de LB con ampicilina (100µg/ml) y X-gal (40 µl; 20 mg/ml) e IPTG (4 µl; 1M). Al día siguiente, se seleccionaron las colonias blancas y se sembraron en el medio de cultivo adecuado, incubando a 37ºC y 200 rpm toda la noche. 3.2.10. Extracción de DNA plasmídico de los fragmentos clonados. Para la extracción de DNA plasmídico se utilizó “Ultra clean mini plasmid prep Kit” (Mo Bio). Se sigue el protocolo de la casa comercial partiendo de 3 ml de medio de cultivo bacteriano. Los protocolos se basan en el método de lisis alcalina (Sambrook y Russell, 2001) y la utilización de columnas cromatográficas que permiten la obtención del DNA plasmídico de buena calidad. El DNA extraído se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa (apartado 3.2.3.) y se cuantificó por espectrofotometría como se indica en el siguiente apartado. 3.2.11. Medición de la concentración y pureza de ácidos nucleicos. Los métodos utilizados en este trabajo para estimar la concentración y pureza de ácidos nucleicos aparecen descritos por Sambrook y Russell (2001). La concentración de DNA fue determinada midiendo la absorbancia a 260 nm y empleando la fórmula: [DNA] = A 260 x D x 50 µg/ml D = factor de dilución 75 Materiales y Métodos La concentración se estimó en un espectrofotómetro modelo UV-120-02. La pureza del DNA analizado se obtuvo mediante el cociente de las lecturas a 260 nm y 280 nm. Cuando el valor de dicho cociente estuvo comprendido entre 1,6 y 2,0, se consideró que el DNA en estudio era adecuado para su posterior manipulación. También, se determinó la concentración utilizando el NanoDrop (Spectrophotometer ND-1000, Technologies, INC Wilmington, DE, USA). Para ello, se empleó 2 µl de la muestra total de DNA obtenido, siguiendo las normas de la casa comercial. 3.2.12. Digestión del DNA plasmídico. En la digestión de las diferentes muestras de DNA plasmídico se utilizaron endonucleasas de restricción compatibles con la zona de clonaje múltiple de los diferentes vectores empleados, siguiendo las instrucciones de la casa comercial y de acuerdo a Sambrook y Russell, 2001. Los productos de las digestiones se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 0,8%. La cantidad de DNA utilizada para cada digestión fue de 0,2-1 µg. La cantidad de enzima empleada fue de 10 unidades. Las digestiones fueron incubadas de 2 a 3 horas a 37ºC, a excepción de las enzimas que requieren otra temperatura para su actividad. Las enzimas y tampones para llevar a cabo las diferentes digestiones fueron suministrados por las casas comerciales Roche®, Amersham Biosciences® y New England Biolabs®. El DNA digerido se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa como se describe en el apartado 3.2.3. 3.2.13. Diseño de PCR anidada. Técnica muy sensible de PCR que consta de dos amplificaciones consecutivas, en la que el producto de la primera amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. El diseño de los cebadores se realizó de forma manual, aprovechando las diferencias que existen entre las dos secuencias HDP2 de T. saginata y T. solium. Estos cebadores están recogidos en la tabla M.3. Primera amplificación. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en tubos de 0,2 ml, con un volumen final de reacción de 50 µl, con 5 µl de tampón de Taq polimerasa 10X, 1 µl de cada 76 Materiales y Métodos dNTP (0,2 mM), 1 µl del cebador directo (10 µM), 1 µl del cebador reverso (10 µM), 1 µl de enzima Taq Polimerasa 2,5 U/µl, 39 µl de agua destilada estéril. Se utilizó 1 ng de DNA molde de T. saginata y T. solium como controles positivos, y 1 µl de agua destilada como control negativo. Se llevaron a cabo varios ensayos variando el número de ciclos, la temperatura de anillamiento, así como la extensión final para las dos PCRs diseñadas. Segunda amplificación. La segunda reacción de amplificación consecutiva a la anterior, se llevó a cabo en tubos de 0,2 ml, con un volumen final de reacción de 25 µl, con 2,5 µl de tampón de Taq polimerasa 10X, 0,5 µl de cada dNTP (0,2 mM), 0,5 µl del cebador directo (10 µM), 0,5 µl del cebador reverso (10 µM), 1 µl de enzima Taq Polimerasa 2,5 U/µl, 18,5 µl de agua destilada estéril. El producto a amplificar en esta reacción fue el obtenido de la primera amplificación pero en este caso se usaron 2 µl de una dilución (4/1000). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador automático (“Gene Amp PCR, System 2400, Perkin-Elmer”). Los productos amplificados fueron visualizados tras electroforesis en geles de agarosa al 2%. 3.3. Cribado dirigido o inmunocriba do de genotecas de expresión del adulto de T. solium para aislar y caracterizar antígenos marcadores de teniasis. Para el inmunocribado de las genotecas de expresión de cuello-escólex y proglótides, de adulto de T. solium, se utilizó el protocolo descrito por Huynh et al. (1985). Se empleó una mezcla de sueros de pacientes con teniasis diluidos a la 1/100 en el lisado de E. coli. Como controles negativos se usaron sueros de individuos sanos libres de la parasitosis en estudio, preabsorbidos y a la misma dilución que la mezcla anterior (Apartado 3.3.1). 3.3.1. Preabsorción de los sueros con lisados de E. coli. Los sueros utilizados en el cribado de las genotecas se preabsorbieron con lisados de E. coli, para bloquear los anticuerpos anti-E. coli presentes en los sueros y que pudiesen interferir en los resultados. Los lisados bacterianos se prepararon según el protocolo descrito por Sambrook y Russell (2001). Primero, se dejó crecer hasta saturación una colonia de E. coli XL1-Blue MRF´ en 100 ml de LB. Se centrifugó el cultivo y el sedimento se resuspendió en 3 ml de tampón de lisis. A continuación, se sometió a la 77 Materiales y Métodos Tri ED S suspensión a congelación/descongelación (-80ºC / 37ºC) y sonicación con el sistema “Sonifier Cell Disruptor B-30”, “Smithkline and Company”, empleando el siguiente protocolo: 5 ciclos de 20 segundos, durante 3 minutos. Después se añadió 50 ml de solución de bloqueo. Los sueros se diluyeron 1/100 en el lisado y se incubaron en agitación, a 4ºC, durante toda la noche. Siguiendo este protocolo se preabsorbieron los sueros utilizados en el inmunocribado y descritos en el apartado 1.5 de este capítu 3.3.2. Infección de células E. coli XL1-Blue con fagos recomb En primer lugar, se realizó la infección de la cepa XL1-Blue recombinantes, a razón de 50000 ufp y 600 µl de bacterias XL1 para cada placa de petri de 150 mm. Se incubó a 37ºC durante ml de agar cobertura, se depositó la mezcla sobre placas de aga 42ºC durante 4 horas. A continuación, los halos de lisis obten capilaridad a filtros de nitrocelulosa (poro de 0,1 µm S previamente impregnados con IPTG 10 mM, se colocaron sobr nuevamente a 37ºC durante 4 horas. Posteriormente se obteniéndose así una réplica de las placas de lisis. 3.3.3. Inmunodetección. Para la inmunodetección, los filtros fueron sumergidos en so mantuvieron a 37ºC durante 1 hora. Pasado este tiempo, se inc mezcla de sueros durante toda la noche. Después, se realizaron 3 lavados con PBS-Tween®20 (0,05%) (Monolaurato de polioxietilensorbitano) (Sigma) y se procedió al tratamiento con el conjugado de cabra anti IgG H+L humana marcado con fosfatasa alcalina (BioRad), diluido a 1/2000 en PBS-BSA (0,1%), durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación se hicieron 3 l 20® al 0,05%, de 10 minutos cada uno. Se equilibraron las mem fosfatasa alcalina y finalmente se incubaron con el sustrato NB T 78 Tampón de lisis s-HCl 50 mM pH 8,0 TA 10 mM pH 8,0 olución de Bloqueo PBS 1X BSA 3% NaN3 0,01% lo. inantes. de E. coli con los fagos -Blue en MgSO4 10 mM 15 minutos. Se añadió 9 r sólido y se incubaron a idos se transfirieron por chleicher & Schuell®), e la placa y se incubaron separaron los filtros, lución de bloqueo y se ubaron los filtros con la avados, con PBS-Tween branas en tampón de la T/BCIP (2.2 – di – p – ampón de la fosfatasa alcalina Tris-HCl 0,1M, NaCl 0,1M, MgCl2 50 mM pH 9,5 Materiales y Métodos nitrofenil – 5.5 – difenil – 3.3´ - [3.3´- dimetoxi – 4.4´- difenilén] – ditetrazolio cloruro) / (5–bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) (Sigma), 0,33 mg/ml de NBT y 0,16 mg/ml de BCIP en tampón de la fosfatasa alcalina hasta la aparición de las señales. 3.3.4. Aislamiento y purificación de fagos recombinantes. Las posibles señales positivas obtenidas en las distintas rondas de inmunocribado fueron aisladas con pipeta Pasteur y colocadas en tubos de 1,5 ml con 1 ml de SM (Sambrook y Russell, 2001) y 50 µl de cloroformo, y se almacenaron a 4ºC. Posteriormente, se titularon según se describió con anterioridad y se hicieron las rondas de purificación oportunas, a razón de 1000, 100 y 50 ufp/placa, hasta la obtención de los clones puros. .3.5. Escisión in vivo en pBluescript de los fagos recombinantes. tor λZAP® XR y Fagos Placa original membrana de Nitrocelulosa Placa con filtro de nitrocelulosa Fagos transferidos al filtro Hibridación con sonda y revelado Figura M.1. Esquema del inmunocribado de la genoteca de expresión. Fago recombinante positivo Fagos Placa original membrana de Nitrocelulosa Placa con filtro de nitrocelulosa Fagos transferidos al filtro Hibridación con sonda y revelado Figura M.1. Esquema del inmunocribado de la genoteca de expresión. Fago recombinante positivo 3 Los clones seleccionados y purificados fueron escindidos del vec recircularizados como pBluescrip SK+ (Stratagene®), de acuerdo a las recomendaciones de la casa comercial (Hay y Short, 1992). La infección simultánea de células de XL1- Blue MRF´ con un fago recombinante y el bacteriófago de ayuda “Fago Helper ExAssist” permite que las proteínas sintetizadas por el bacteriófago reconozcan las señales de origen y fin de transcripción incluidas en el vector ZAP. Comienza así la 79 Materiales y Métodos síntesis de una nueva cadena de DNA desde el origen de replicación hasta la señal de terminación. Cada molécula nueva de DNA, que incluye el inserto clonado, se recirculariza dando lugar a una molécula de DNA circular en forma de fagémido. Se tomaron 250 µl de la suspensión del fago en SM, 200 µl de células XL1-Blue MRF´ en MgSO4 10 mM, a una DO600 nm 0,5-1,0, y 1 µl de fago de ayuda “ExAssist T”. Se agitó suavemente y los tubos se incubaron a 37ºC durante 15 minutos. Tras la incubación se añadió a cada tubo 3 ml de LB, precalentado a 37ºC, y se incubó 3 horas a 200 rpm y 37ºC y posteriormente 20 minutos a 65ºC. Después se centrifugó a 2000 rpm, 15 minutos. A continuación se pasó el sobrenadante con el fagémido pBluescript a otro tubo y se mezcló con células SOLR (100 µl sobrenadante por 200 µl células SORL, DO600 nm 0,5-1,0). Los tubos se incubaron a 37ºC durante 15 minutos. Se sembraron 200 µl de cada mezcla en placas LB/ampicilina y se mantuvieron a 37ºC toda la noche. La obtención de los DNA plasmídicos a partir de las colonias crecidas y la digestión de .3.6. Lisis en mancha (“Spot-lysis”). cción de las proteínas de fusión de los clones .3.7. Clonación en vector de expresión. ombinantes más interesantes en sistemas los mismos se realizó siguiendo los procedimientos descritos en los apartados 3.2.10 y 3.2.12, respectivamente. La secuenciación y análisis de los cDNAs seleccionados fueron llevados a cabo como se describe en los apartados 3.2.5 y 3.2.6. 3 En este método se lleva a cabo la indu purificados con el fin de analizar de una forma rápida su inmunogenicidad. Se siguió el protocolo descrito por Maizels et al. (1991). Para ello, sobre una placa de LB-agar cobertura con células E. coli XL1-Blue MRF´ (600 µl de células DO600 nm 0,5-1,0), se colocó 2 µl de cada clon purificado, se incubó 4-5 horas a 42ºC hasta que los halos de lisis fueron patentes. A continuación, se dispuso un filtro de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) previamente impregnado con IPTG 10 mM y se incubó nuevamente durante 4 horas a 37ºC. Posteriormente, los filtros fueron bloqueados, incubados con el primer y segundo anticuerpo y revelados como se describe en el apartado 3.3.3. 3 Para la expresión de los antígenos rec procariotas, se realizó la subclonación de los diferentes cDNAs en el vector de expresión pGEX-4T-1. Dichos cDNAs se amplificaron por PCR con cebadores 80 Materiales y Métodos específicos. Posteriormente, se digirieron tanto los cDNAs amplificados como el vector de expresión con las enzimas de restricción adecuadas. Finalmente, se llevó a cabo la ligación, como se indica en el apartado 3.2.9, pero con la excepción de que las incubaciones se realizaron a 16ºC toda la noche. A continuación, las células BL21 fueron transformadas (según el apartado 3.2.8) con la mezcla de ligación con el vector pGEX-4T-1. Al día siguiente, se empleó el protocolo PCR de colonias para aislar las posibles recombinantes mediante el método 3.3.8. Finalmente, los DNAs plasmídicos recombinantes obtenidos (como se indica en el apartado 3.2.10) se secuenciaron según el apartado 3.2.5. 3.3.8. PCR de colonias. robar si las colonias obtenidas un volumen final de reacción Inicio 94°C / 5 minutos. alizac n 35 clos Con la finalidad de comp en la transformación de células competentes eran recombinantes, se utilizó la técnica de PCR, empleando los cebadores universales que flanquean el lugar de clonación. Para ello, se tomaron colonias y se resuspendieron en 10 µl de agua destilada. Como molde se utilizó 1 µl de la mezcla anterior. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en tubos de 200 µl, con de 50 µl, con 5 µl de tampón de Taq polimerasa 10X, 1 µl de dNTP (0,2 mM), 1 µl del cebador directo (10 µM), 1 µl del cebador reverso (10 µM), 1 µl de enzima Taq Polimerasa 5 U/µl (Perkin-Elmer), 40 µl de agua destilada estéril. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador automático (“Gene Amp PCR, System 2400, Perkin- Elmer”), empleando las siguientes condiciones de reacción: Desnatur ió 94°C / 30 segundos ci Anillamiento 50°C / 30 segundos Extensión 72°C / 2 minutos Tampón de Taq Tri ,3 0,01% gelatina polimerasa 10X s-HCl 10 mM pH 8 KCl 50 mM MgCl 2 6 mM (Biotools) Extensión final 72°C / 7 minutos 4°C / 81 Materiales y Métodos 3.3.9. Inducción y expresión de proteínas de fusión. las concentración 0,5-1 mM. espués de haber confirmado la expresión de las proteínas recombinantes .3.10. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida co n dodecilsulfato Para as proteínas se siguió el método de electroforesis en geles Las colonias de células BL21 transformadas con construcciones en los vectores de expresión (pGEX-4T-1) se cultivaron en medio LB líquido con el antibiótico correspondiente y se dejaron crecer a 37ºC, 200 rpm, hasta alcanzar una DO600 nm 0,6-1,0. Se tomaron como control alícuotas de los cultivos no inducidos y, a continuación, se añadió el agente inductor IPTG a una Después, se incubó 3-4 horas a 37ºC y 200 rpm. Nuevamente, y como control de la inducción, se tomaron alícuotas de los cultivos inducidos y el resto de las muestras se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos y a 4°C. Los sedimentos se guardaron a – 70ºC hasta su uso. Finalmente, las alícuotas control de los cultivos antes y después de inducirse se centrifugaron a 13000 rpm durante 1 minuto. Los sedimentos se resuspendieron en tampón de carga, se calentaron a 100ºC durante 5 minutos, y se fraccionaron en geles de poliacrilamida para comprobar la expresión. Tampón de carga Tri ,8 0,01% s-HCl 62,5 mM pH 6 25% glicerol 2% SDS az mofenol ul de bro (BIO-RAD) D seleccionadas, los sedimentos celulares de 1 ml de cultivo bacteriano se resuspendieron en 300 µl de tampón de lisis “B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent” (Pierce), se centrifugaron 5 minutos a 14000 rpm, a temperatura ambiente, y el sobrenadante se depositó en un tubo nuevo obteniéndose así la fase soluble. La fase insoluble se resuspendió nuevamente en 300 µl del tampón de lisis antes mencionado. De éstos, se tomaron 15 µl y se les añadió 15 µl de tampón de carga. Todos ellos se desnaturalizaron a 100ºC durante 5 minutos y se fraccionaron en geles de poliacrilamida para comprobar la solubilidad de las proteínas recombinantes expresadas. 3 sódico (SDS-PAGE). el fraccionamiento de l de poliacrilamida (SDS-PAGE), en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico (SDS) según Laemmli (1970). Este tipo de electroforesis permite separar las proteínas en función de su peso molecular, independientemente de su carga eléctrica intrínseca. Las electroforesis se llevaron a cabo en condiciones desnaturalizantes, en geles de poliacrilamida entre el 10%-12,5%, dependiendo del tamaño de las moléculas 82 Materiales y Métodos Tampón de electroforesis en estudio. Se utilizó tampón de electroforesis, empleándose un sistema de electroforesis vertical “mini-ATTO” (ATTO Corporation). Como patrones de tamaño molecular se usaron los marcadores preteñidos de Sigma con un rango de 180-26,6 kDa. Las muestras se desnaturalizaron antes de ser aplicadas al gel, hirviéndolas durante 5 minutos, y se centrifugaron 3 minutos. Se depositaron 10 µl/pocillo para el patrón de pesos moleculares y 15 µl/pocillo para los diferentes extractos proteicos analizados. La migración electroforética se realizó a 15 mA/g separativa, y entonces se incrementó a 30 mA/gel. Se utilizó la fuente de electroforesis “EC 3000-90 E-C”, Apparatus Corporation. Finalizado el fraccionamiento, los geles se fijaron y tiñeron con Azul de Coomassie durante 15 minutos. A continuación se destiñeron hasta la observación de las bandas nítidas. Los geles se conservaron en papel celofán “Precut cellophan sheet” (Amersham Biociences), y se secaron utilizando un desecador (DRYER Hoefer Easy Breeze gel dryer without frames & loading platform). Tris 15 g/l G l licina 72 g/ SDS 5 g/l pH 8,3 A Coo 5% Solución de desteñido el hasta que el frente alcanzó la fase .3.11. Transferencia de proteínas a memb ranas de nitrocelu losa y revelado Una electroforesis, éstas se transfirieron a espués de la transferencia de las proteínas separadas en el gel, la membrana de zul de C omassieo massie blue tipo R 0,0 ácido acético 10% metanol 45% Ácido acético 7,5% Metanol 25% 3 inmunoenzimático (“Western blot”). vez separadas las proteínas mediante membranas de nitrocelulosa según Towbin et al. (1979), utilizando el sistema semiseco descrito por Maizels et al. (1991) y el aparato SartoBlot (Sartorious). Para ello se colocaron 3 papeles de filtro del tamaño del gel, humedecidos en tampón de transferencia. Después, se dispuso la membrana de nitrocelulosa empapada en este mismo tampón y encima el gel. Se colocó sobre el gel 3 papeles de filtro igualmente humedecidos, y se transfirió a 80 mA durante 1 hora. Se utilizó la fuente de poder “EC 3000-90 E-C”, Apparatus Corporation. D nitrocelulosa se bloqueó con PBS-BSA 3% toda la noche, y se incubó con los diferentes sueros (pacientes con teniasis confirmada, individuos sanos) durante 2 horas, a 83 Materiales y Métodos temperatura ambiente. Se lavó 3 veces con PBS- Tween20® 0,05%, 10 minutos cada lavado, y se incubó 2 horas, a temperatura ambiente, con el conjugado de anti- IgG (H-L) humana marcado con peroxidasa (Pierce), diluido a 1/5000 en PBS-BSA 3%. Se lavó 3 veces nuevamente y, a continuación, se revelaron los complejos antígeno-anticuerpo con el sustrato “Metal Enhanced DAB Substrate Kit” (Pierce). Tampón de transferencia glicina 192 mM Tris 25 mM SDS 0,1% metanol 20% pH 8,3 Solución de Bloqueo PBS 1X BSA 3% 3.3.12. Preparación de extractos proteicos a partir de material parasitario. Se preparó un extracto proteico de proglótides maduros y grávidos de T. solium mediante pulverización del material parasitario congelado en un mortero, mantenido en congelación con nitrógeno líquido. El polvo obtenido, aproximadamente 1 mg, fue resuspendido en 6 ml de PBS frío y 60 µl de cada uno de los siguientes inhibidores de proteasas PI-A: EDTA (Etilén-diamino ácido tetracético) 0,2 M, EGTA (Etilén-glicol bis (2-amino-etil-éter)- N,N,N´, N´-ácido tetracético) 0,2 M, NEM (N-Etilmaleimida) 0,2 M y PI-B: PMSF (Fenil-metil- sulfonil fluoruro) 0,2 M, TPCK (N-Tosilamida-L- fenilalanina clorometil ketona) 0,02 M, Pepstatina 0,2 M (Sigma-Aldrich). La mezcla se trató en un homogenizador hasta que quedó clara y se conservó a –70º C. La valoración del extracto proteico obtenido se realizó empleando el kit comercial “BCA Protein Assay” (Pierce). 3.4. Obtención de cDNAs de interés diagnóstico utilizando otras alternativas. 3.4.1. Extracción de RNA total a partir de material parasitario. La extracción del RNA total se realizó con el kit “SV-Total RNA Isolation System” (Promega), siguiendo el protocolo recomendado por la casa comercial. Se procesó un extracto total parasitario, de la misma manera como se preparó en el apartado anterior, a partir de cuello-escólex y una mezcla de proglótides maduros y grávidos de un adulto de T. solium. Se añadió el tampón de lisis al extracto pulverizado. Después, se transfirieron 175 µl de la muestra parasitaria preparada a un tubo de 1,5 ml, se le añadieron 300 µl de tampón de lisis, se mezcló e incubó a 70ºC durante 3 minutos. Para eliminar las trazas celulares se centrifugó a velocidad máxima durante 10 minutos, recogiendo el 84 Materiales y Métodos Tampón de lisis tiocianato de guanidinio 4 M Tris-HCl 10 mM pH 7,5 0,9% β-mercaptoetanol Solución de lavado acetato potásico 60 mM Tris-HCl 10 mM pH 7,5 60% etanol Tampón de DNAsa Tris-HCl 22,5 mM pH 7,5 NaCl 1,125 M MnCl2 9 mM 0,0025% colorante amarillo sobrenadante con el RNA total. A continuación, el sobrenadante se mezcló con 200 µl de etanol al 95 %, la mezcla se pasó por una columna absorbente de ácidos nucleicos. Los lavados se realizaron añadiendo 600 µl de solución de lavado, y se centrifugó nuevamente. A continuación, se agregó el tampón de DNAsa, incubando durante 15 minutos a temperatura ambiente. Pasado ese tiempo, se añadió 200 µl de SV DNAsa I, se centrifugó a velocidad máxima, y se lavó dos veces con la solución SV RNA. El RNA total se eluyó de la columna con 200 µl de agua libre de nucleasas, que contenía inhibidor de RNAsas (1 UI/µl) (Rnasin, Promega®), y se guardó a –80°C hasta su uso. El RNA total obtenido se cuantificó por espectrofotometría como se indica en el apartado 3.2.11. 3.4.2. RT-PCR. Amplificación por Transcripción Reversa. El proceso de la RT-PCR consta de dos reacciones consecutivas, en la primera se transcribe el RNA en DNA complementario (cDNA), y éste se utiliza como molde para una posterior reacción de amplificación. La reacción se llevó a cabo con los tampones y soluciones del kit “Retrotools DNA-cDNA Polymerase, Biotools®”. La primera reacción se dispuso en un tubo de 0,2 ml, con un volumen final de reacción de 20 µl, con 4 µl de tampón 10X RT, 4 µl de MnCl2 5 mM, 1 µl de mezcla de dNTPs (10 mM), 1 µl del cebador reverso TSES 38 R1 (10 µM), 1,5 µl de enzima DNA polimerasa-RNA dependiente (actividad transcriptasa inversa), 2 µl de la suspensión de RNA total y 6,5 µ l de agua destilada estéril. Los componentes de la segunda reacción de PCR se prepararon en un volumen final de 30 µl, con 6 µl de tampón 10X de PCR, 1 µl de dNTPs, 1 µl de cebador directo TSES 38 F1 (10 µM), más 22 µl de agua destilada. Este volumen de 30 µl se añadió al volumen anterior (20 µl) durante la pausa del termociclador (85°C). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador automático (“Gene Amp PCR, System 2400, Perkin-Elmer”) utilizando las siguientes condiciones de reacción: 85 Materiales y Métodos Inicio 60°C / 30 minutos. 85°C / pausa 94°C / 3 minutos Desnaturalización 94°C / 10 segundos 45 ciclos Anillamiento 55°C / 20 segundos Extensión 72°C / 1 minuto Extensión final 72°C / 7 minutos 4°C / Los cebadores utilizados en la RT-PCR (Tabla M.4) fueron diseñados utilizando la secuencia citada en el EMBL con número de acceso AY128681. Los productos obtenidos en esta reacción de amplificación se visualizaron en geles de agarosa y se purificaron como se describe en el apartado 3.2.3 y 3.2.4, respectivamente. Posteriormente, se llevó a cabo la subclonación de dichos fragmentos en el vector pCR 2.1 TOPO. 3.4.3. Clonación en el vector pCR 2.1 TOPO®. El plásmido pCR 2.1 TOPO® (Invitrogen) utiliza el método denominado “TA Cloning”, que permite una ligación directa entre el plásmido, con extremos cohesivos con una dexositimidina libre (3´-T), y los productos de la amplificación, a los cuales la enzima Taq polimerasa les ha adicionado una dexosiadenosina (3´-A). La ligación se lleva a cabo cuando una topoisomerasa, que se encuentra unida al vector, liga a este último con los productos amplificados por PCR. La ligación se realizó en un volumen final de 6 µl siguiendo las recomendaciones de la casa comercial, 4 µl de DNA amplificado, 1 µl de vector, 1 µl de solución salina. La mezcla se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente. Después las E. coli TOPO10 competentes fueron transformadas con la mitad de la mezcla de ligación, como se indica en el apartado 3.2.8, en placas de LB con ampicilina (100 µg/ml). Al día siguiente, se aislaron las colonias recombinantes, según el apartado 3.3.8. A continuación, se purificaron los DNAs recombinantes y se secuenciaron como se indica en los apartados 3.2.5 y 3.2.6. Finalmente, se realizó la subclonación en el vector de expresión pGEX-4T-1, según se 86 Materiales y Métodos describe en el apartado 3.3.7. Para ello se diseñaron cebadores con sitios de restricción adecuados (Tabla M.5). 3.4.4. Construcción de un DNA quimérico. Para la construcción de un DNA quimérico, primero se procedió a buscar la secuencia de interés con número de acceso AY183761, incluida en el EMBL / GenBank. La molécula presentaba un marco de lectura abierto “ORF” de 804 pb, por lo que se decidió dividirla en dos partes, utilizando el programa “Mapdraw” del paquete informático Lasergene, y se buscó una enzima que cortara la molécula en dos. Después se diseñaron manualmente los cebadores directos y reversos solapantes, para cada una de las partes adecuadas, recogidos en la tabla M.6 y se emplearon para conseguir su síntesis por PCR, metodología empleada por Jado et al. en 2006. La construcción se realizó mediante amplificaciones seriadas, en las que el producto obtenido de la primera reacción, se utilizó como molde para la segunda y así sucesivamente. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en tubos de 0,2 ml, con un volumen final de reacción de 50 µl, con 5 µl de tampón 10X, 8 µl Cl2Mg 4mM, 2 µl de dNTPs, 2 µl de cada cebador F1 y R1 (en la primera PCR y en las siguientes se utilizó solo 1 µl del cebador específico) y como enzima 0,5 µl Taq Gold (Roche), 30,5 µl de agua, con las siguientes condiciones de reacción Inicio 94°C / 2 minutos. Desnaturalización 94°C / 30 segundos 40 ciclos Anillamiento 55°C / 1 minuto Extensión 72°C / 30 segundos Extensión final 72°C / 5 minutos 4°C / infinito Los productos obtenidos en estas reacciones se visualizaron en geles de agarosa, la banda identificada se cortaba y se purificaron como se describe en el apartado 3.2.3 y 3.2.4. El DNA purificado se utilizo para la siguiente reacción de PCR, respectivamente. Posteriormente, se llevó a cabo la subclonación de los productos finales, en el vector pCR2.1 TOPO como se indica en el apartado 3.4.3. Con la finalidad de comprobar si las colonias obtenidas en la transformación de células E. coli TOPO10 competentes eran 87 Materiales y Métodos recombinantes, se utilizó la técnica PCR como se describe en el apartado 3.3.8. Los DNAs plasmídicos obtenidos de estas colonias se utilizaron para secuenciar como se indica en el apartado 3.2.5. Además, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, se procedió a la inserción de sitios de restricción a cada extremo de la molécula. Para ello se empleó 1 µl del plásmido recombinante diluido 1:10, 5 µl de tampón de la enzima Biotools, 3 µl de DMSO (dimetilsulfóxido), 1 µl de cada dNTP 0,2 mM (Pharmacia), 1 µl del cebador directo (10 µM), 1 µl del cebador reverso (10 µM), 1 µl de enzima Taq 2,5 U/µl (Biotools), 37 µl de agua destilada estéril. Los cebadores utilizados están recogidos en la tabla M.7. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador automático (“Gene Amp PCR, System 2400, Perkin-Elmer”) utilizando las siguientes condiciones de reacción: Inicio 94°C / 4 minutos. Desnaturalización 94°C / 70 segundos 15 ciclos Anillamiento 65°C / 70 segundos Extensión 72°C / 70 segundos Extensión final 72°C / 4 minutos 4°C / Los productos obtenidos de estas amplificaciones fueron visualizados en geles de agarosa como se describe en el apartado 3.2.3 y 3.2.4. Estos productos fueron nuevamente subclonadas en el vector pCR2.1 TOPO como se indica en el apartado 3.4.3. Con la finalidad de comprobar si las colonias obtenidas en la transformación de células E. coli TOPO10 competentes eran recombinantes, se utilizó la técnica PCR como se describe en el apartado 3.3.8. Los DNAs plasmídicos fueron secuenciados para corroborar si las moléculas presentaban los sitios de restricción. Acto seguido, se realizó la digestión para la liberación de los insertos, como se describe en el apartado 3.2.10. y posterior ligación, con el vector de expresión pGEXT-4T-1, previamente digerido con las enzimas de restricción de interés. La transformación se llevó a cabo utilizando las células XL1Blue competentes. Después, tras la transformación se tomaron algunas colonias para su siembra en LB líquido y se realizó 88 Materiales y Métodos una “miniprep” de los cultivos, para comprobar mediante secuenciación la correcta subclonación. También, con el DNA obtenido se llevó a cabo la transformación de células BL21 competentes de E. coli, para inducir la expresión de las correspondientes proteínas de fusión como se indica en el apartado 3.3.9. Para el fraccionamiento de la proteína obtenida, se siguió el método de electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) como se describe en el apartado 3.3.10. Por último, la transferencia de esta proteína a membranas de nitrocelulosa y revelado inmunoenzimático (“Western blot”) se realizó de acuerdo con el apartado 3.3.11. 3.5. Desarrollo de protocolos de PCR y PCR-RFLP, c omo marcadores para el diagnóstico diferencia l de ténidos. Aplicac ión a la identificac ión específica de quistes tisulares de interés veterinario. Para el estudio de las muestras obtenidas de los hospederos intermediarios bovinos y porcinos, se diseñó el algoritmo de trabajo de la figura M.3. MUESTRA Extracción de DNA PCR PCR PCR PCR y secuenciación MULTIPLEX HDP2 ITS 2 ITS 1 18S rRNA Sarcocystis hominis T. saginata (650 pb) S. suihominis T. solium (600 pb) T. saginata T. hydatigena (550 pb) Ténidos Echinococcus sp (170 y 600 pb) ( ≅ 800 pb) (> 1000 pb ) T. solium (170 pb) PCR-RFLP PCR y secuenciación PCR-RFLP PCR ITS 1 genes mitocondriales ITS 1 Eg 9 y Eg 16 (COI y ND1) PCR-RFLP Eg 9 T. saginata T. solium T. hydatigena GENOTIPO Figura M.3. Algoritmo de trabajo utilizado en el procesamiento de muestras quísticas procedentes de bovinos y porcinos. 89 Materiales y Métodos 3.5.1. Extracción de DNA genómico de quistes. La extracción de DNA genómico (gDNA) de quistes se llevó a cabo según el método descrito por Sambrook y Russell. (2001). Los quistes, conservados en etanol al 70%, se lavaron con PBS y se congelaron a -70ºC. La muestra que se tomó, compacta y congelada, fue homogeneizada en un mortero de porcelana previamente enfriado y mantenido en baño de nitrógeno líquido durante todo el proceso. El polvo resultante de la homogeneización fue transferido a un tubo de 50 ml y resuspendido en 1,8 ml de tampón de lisis, agitando la muestra durante 3-5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 0,2 ml de SDS 10% y 100 µl de proteinasa K, a una concentración de 20 mg/ml, incubándose la mezcla a 37ºC durante 2 horas con ligera agitación. Seguidamente, se realizaron tres extracciones. La primera con igual volumen de fenol que el de la fase acuosa, la segunda con el mismo volumen de fenol-cloroformo (1:1) y la tercera con el mismo volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). A fin de eliminar el RNA, la fase acuosa se digirió con RNAsa a una concentración de 150 µg/ml, durante 1 hora a 37ºC. A continuación, se hicieron dos extracciones, la primera con fenol-cloroformo (1:1) y la segunda con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). La fase acuosa fue precipitada con 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M, pH 7,0 y 2,5 volúmenes de etanol 100% frío. Se incubó como mínimo una hora a -20ºC. Para separar el DNA precipitado, se realizó una centrifugación de 1 hora a 12000 rpm y a 4ºC, en una centrifuga Sorvall con rotor SS-34. Después, tras retirar el sobrenadante, el precipitado se lavó con etanol al 70% y el DNA seco se resuspendió en 50 µl de agua estéril. Una vez resuspendidas las muestras de DNA, se cuantificaron según se describe en el apartado 3.2.11, y se almacenaron a 4ºC. Tampón de lisis Tris-HCl 50mM pH 8 EDTA 50mM NaCl 100 mM 3.5.2. Diagnóstico por PCR. La aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnóstico especie-específico de las diferentes muestras se realizó empleando 50 ng de gDNA de cada una de ellas, usando cinco protocolos diferentes. Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de 0,2 ml, con un volumen final de reacción de 25 µl, los cuales contenían 2,5 µl de tampón de la Taq polimerasa 10X, 1µl de glicerol, 1 µl de cada dNTP 0,2 mM 90 Materiales y Métodos (Pharmacia), 1 µl del cebador directo (10 µM), 1 µl del cebador reverso (10 µM) (ver tabla M.7), 1 µl de Taq polimerasa 1 U/µl (Biotools), 10 µl de agua destilada estéril y 1 a 5 µl de DNA obtenido de los quistes aislados. Se utilizaron como controles positivos el DNA extraído y purificado de ténidos diagnosticados en el laboratorio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología, del Instituto de Salud Carlos III. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador automático (“Gene Amp PCR, System 2400, Perkin-Elmer”) y los amplicones obtenidos en estas PCRs fueron fraccionados en geles de agarosa según se describe en el apartado 3.2.2. A continuación se siguió el procedimiento descrito en el algoritmo de trabajo propuesto en la Figura M.4, empezando por la Multiplex –PCR HDP2. 3.5.2.1. Multiplex-PCR derivada de los fragmentos de HDP2. Se utilizaron los cebadores descritos por González et al. (2000) (PTs7S35F1, PTs7S35F2 y PTs7S35R1, tabla M.7) y el programa que a continuación se describe. Inicio 94°C / 5 minutos. Desnaturalización 94°C / 1 minuto 35 ciclos Anillamiento 56.5°C / 30 segundos Extensión 72°C / 30 segundos Extensión final 72°C / 10 minutos 4°C / 3.5.2.2. PCRs y PCR-RFLPs derivadas de los es paciadores transcritos internos del DNA ribosomal (ITS-1 e ITS-2). Se utilizaron los cebadores descritos por Bowles et al. (1993b), y Gasser y Chilton. (1995) (BD1 F - 4S R y NC6 F – NC2 R, tabla M7). Para la realización de las PCRs se empleó el siguiente programa: Inicio 95° C / 5 minutos. Desnaturalización 95° C / 1 minuto 30 ciclos Anillamiento 55° C / 30 segundos Extensión 72° C / 30 segundos Extensión final 72° C / 10 minutos 4° C / 91 Materiales y Métodos Los productos amplificados de la PCR ITS-1 fueron digeridos con las enzimas de restricción Cfo I, Msp I y Rsa I (Bowles y McManus, 1993b) en el caso de las muestras positivas a E. granulosus. Para diferenciar los tenidos, T. solium, T. saginata. y T. hydatigena se utilizó Alu I y Cfo I según se describe en el apartado 3.2.12. 3.5.2.3. PCR Eg 9 y Eg 16. Se utilizaron los cebadores descritos por González et al. (2002a) (Eg9 F1-Eg9 R1 y Eg16 F1-Eg16 R1, tabla M.7), empleándose los siguientes programas: PCR Eg9 Inicio 94°C / 5 minutos. Desnaturalización 94°C / 1 minuto 35 ciclos Anillamiento 60°C / 30 segundos Extensión 72°C / 30 segundos Extensión final 72°C / 10 minutos 4°C / Los productos amplificados de la PCR Eg9 fueron digeridos con las enzimas de restricción Cfo I y Rsa I, según se describe en el apartado 3.2.12. PCR Eg16 Inicio 94°C / 5 minutos. Desnaturalización 94°C / 1 minuto 35 ciclos Anillamiento 65°C / 30 segundos Extensión 72°C / 30 segundos Extensión final 72°C / 10 minutos 4°C / 92 Materiales y Métodos 3.5.2.4. PCR de genes mitocondriales (COI y ND1) . Se emplearon los cebadores descritos por Bowles et al. (1992 y 1993a) (JB11F-JB12R y JB3F-JB4R, tabla M.7), así como los siguientes programas: PCR COI Inicio 94°C / 5 minutos. Desnaturalización 94°C / 30 segundos 35ciclos Anillamiento 50°C / 30 segundos Extensión 72°C / 30 segundos Extensión final 72°C / 7 minutos 4°C / PCR ND1 Inicio 94°C / 5 minutos. Desnaturalización 94°C / 30 segundos 35ciclos Anillamiento 55°C / 30 segundos Extensión 72°C / 30 segundos Extensión final 72°C / 7 minutos 4°C / Los productos amplificados de estas PCRs se procesaron para su secuenciación y análisis según se comenta en los apartados 3.7.4, 3.7.5 y 3.7.6. 3.5.2.5. PCR optimiz ada a partir del gen 18S rRNA. Se utilizaron las condiciones descritas por Yang et al. (2001) (3L F y 3H R, tabla M.8), con modificaciones, empleando el siguiente programa: Inicio 94°C / 5 minutos. Desnaturalización 94°C / 1 minuto 35 ciclos Anillamiento 60°C / 30 segundos Extensión 72°C / 30 segundos Extensión final 72°C / 10 minutos 4°C / 93 Materiales y Métodos Los productos amplificados de esta PCR se procesaron para su secuenciación y análisis según se describe en los apartados 3.2.4, 3.2.5 y 3.2.6. Los cebadores empleados en el diagnóstico de cisticercos y quistes, obtenidos de hospedadores intermediarios bovinos y porcinos, se recogen en la tabla M.8. 3.6. Tablas con los cebadores utilizados en este trabajo. Tabla M.3 Cebadores para la realización de PCR anidada Cebador Secuencia Tamaño NHDP2 F1 5´AGTTCGAACAAACAAAGTATTACACAGCC 3´ 29 nt NHDP2 F2 5´ACGCTCTCCTTGGTCAGCCTCCC 3´ 23 nt NHDP2 F2D 5´CCRACGCTCYCCTTGGTCAGCCTCCC 3´ 26 nt NHDP2 F3 5´GCATGCGATCCAAGTGTGCAAAGC 3´ 24 nt NHDP2 F4 5´TCATAGGAACAAAATGCATGCGATCC 3´ 26 nt NHDP2 R1 5´CACGGCTAGCGTCGCTTCAGTTG 3´ 23 nt NHDP2 R2 5´GGAGTTCACGGCTAGCGTCGCTTCAG 3´ 26 nt NHDP2 R3 5´GGAGAGGTGAGTTGTCCAATAACAGGAG 3´ 28 nt NHDP2 R4 5´CCAATAACAGGAGAGAGAGAGCTTACGG 3´ 28 nt NHDP2 R5 5´CTGCAACAGGAGAGAGAGCTTACGGAGGA 3´ 29 nt nt = nucleotides Tabla M.4. Cebadores diseñados para RT-PCR Cebador Secuencia Tamaño TSES 38 F1 5´CGGCTGAGAATGATGAGAATTATTGTGG3´ 28 nt TSES 38 R1 5´TTACTTCCACAAAAGTATCACCATC 3´ 25 nt TSES 38 R2 5´GGTCCCCCAACCATTTACTTCCAC 3´ 24 nt TSES 38 R3 5´GGCAATAATTGAGGGGTATTATAGTGTAG 3´ 29 nt nt = nucleótidos Tabla M.5. Cebadores utilizados para introducir los sitios de restricción en la molécula aislada por RT-PCR. Cebador Secuencia Tamaño TSES38EcoRI F 5´GAGAGAGAATTCATGTTGAACATCATTCAGTC 3´ 32 nt TSES38XhoI R 5´GAGAGACTCGAGTCAAACTGCAAAGAGTGGC 3´ 31 nt nt = nucleótidos 94 Materiales y Métodos Tabla M.6. Cebadores empleados para la construcción de un cDNA quimérico. Cebador Secuencia Tamaño F1 5´GGATATCAATTGAAGCTGGCAAGTGTGTCGACAGTGAGAATCGGACTTGGGG CAGTCCGTGCAGGGTG 3´ 68 nt F2 5´ TTAATGGCGGGGTTGAAGCGAGTGTCATACATGGTTCGGAATTGAGTCGGATA TCAATTGAAGCTGGC 3´ 68 nt F3 5´GTAGCAAAGGCGTCGGGACCGTCTGACACCATGAAATATCAATTTA ATGGCGGGGTTGAAGCG 3´ 63 nt F4 5´GCTCAGGCACAAACACTCCAACGTTATGGGGGTCGCGAGTCGTAGCAAAGGC GTCGGGACCGTCTGACACCATG 3´ 74 nt F5 5´ATGATGAGAATTATTGTGGTTTTAATTCTTGTGACCTATTGCTCAGGCACAAA CACTCCAACGTTATGG 3´ 69 nt R1 5´GCCTTCACATCGGCCATGGTGATGTAAACATCATTTCCAGTCACCCTGCAC GGACTGCCCCAAGTCCG 3´ 68 nt R2 5´GCCATTCCTCTTGTGAGCTGTGCATCACTTAATAGAAGGATGTCTTGTGC CTTCACATCGGCCATGG 3´ 67 nt R3 5´GCAGGCTTTGGAAATTTGCAATGTGGCACGAAGAATGTTGTTGAAGCCATTC CTCTTGTGAGCTGTGC 3´ 68 nt R4 5´CCTTGACAAATCGTGAGAACGGAAACGACGTATTCAGATCGACTCCATCTTTAGC AGGCTTTGGAAATTTGCAA 3´ 74 nt R5 5´CGTTTGATGTACTCTCTGCCCCTTGAACGGCGAAGTCAACGTTGAACGAAT CCATGTCCTTGACAAATCG 3´ 70 nt FQ1 5´GGTGAAGAGACGATTATAGCCGTGTCCATCGACTACACGCAAAGTGGAATA TCACCGGAAGTGGCTGAATGC 3´ 72 nt FQ2 5´GGCGTTTTTCCAAAGAAAAGCGGGGTTTCTCGCGAAAGCTTTATTTTCGATGGT GAAGAGACGATTATAGCCGTGT3´ 76 nt FQ3 5´GTGTTAACTTGGTTAAGGATGTGAAAGCTGATTTGCGGGTATTCCAT GGCGTTTTTCCAAAGAAAAGC 3´ 68 nt FQ4 5´GATCATTGTTCATGGTCGGGAACTCAACTTCAGATGAATAGAAGCA GCTTTTGTGTTAACTTGGTTAAGG 3´ 70 nt FQ5 5´GGCAGAGAGTACATCAAACGTCACATTTAGCATTAACGGAGACGATCAT TGTTCATGGTCGGGAACTCAACT 3´ 72 nt RQ1 5´CAAAAGTGAGATGATGATGCCGGTGAATGAGAAAGTCGTTGCAGATCGG TTGCATTCAGCCACTTCCGGTGAT 3´ 73 nt RQ2 5´CATTTGTTGTGTCTGGTCCCCCAACCATTTACTTCCACAAAAGTATCACCAT CAAAAGTGAGATGATGATGCCGG 3´ 75 nt RQ3 5´CTATAAAGGTATAGATCGCGTTTGGTTTCACACATTTGTTGT GTCTGGTCCCCCAACCA 3´ 59 nt RQ4 5´CGAATTTGTGGAAAGGTTATTTTGCATTTGAAGTGCGGCAAA ACACTATAAAGGTATAGATCGCGTTTGG 3´ 70 nt RQ5 5´TCAATGTGGAATGCATTTCAACATATCAAGTGTTCAATCGAATTT GTGGAAAGGTTATTTTGC 3´ 63 nt TSES33MRc1 5´ GCAAATCAGCTTTCACATCCTTAACCAAGTTAACACAAAAGCTGCTTC 3´ 48 nt TSES33MRc2 5´ GAAAAACGCCATGGAATACCCGCAAATCAGCTTTCACATCC 3´ 41 nt TSES33MRc3 5´ TCGCGAGAAACCCCGCTTTTCTTTGGAAAAACGCCATGGAATAC 3´ 44 nt nt = nucleótidos 95 Materiales y Métodos Tabla M.7. Cebadores empleados para introducir sitios de restricción en los fragmentos de la molécula quimera. Cebador Secuencia Tamaño TSES33 Rsa I F 5´ GAGAGAGTACTCTCTGCCCCTTGAACG 3´ 27 nt TSES33 Rsa I R 5´ GAGAGAGTACATCAAACGTCACATTTAGC 3´ 29 nt TSES33 Eco RI F 5´ GAGAGAGAATTCATGAGAATTATTGTGG 3´ 28 nt TSES33 Xho I R 5´ GAGAGACTCGAGTCAATGTGGAATGCATTTC 3´ 31 nt TSES33 Hind III 5´ GAGAGAGAAAGCTTTCGCGAGAAACCCCG 3´ 29 nt nt = nucleótidos Tabla M.8. Características de los cebadores empleados en el diagnóstico de cisticercos y quistes obtenidos de hospedadores intermediarios bovinos y porcinos. Cebador Secuencia Tamaño PTs7S35F1 5`-CAGTGGCATAGCAGAGGAGGAA-3` 22 nt PTs7S35F2 5`-CTTCTCAATTCTAGTCGCTGTGGT-3´ 24 nt PTs7S35R1 5´-GGACGAAAGAATGGAGTTGAAG-GT-3` 25 nt BD1 F 5´ GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA 3´ 20 nt 4S R 5´TCT AGA TGC GTT CGA A(G/A)TGT CGA TG 3´ (G/A)= R 25 nt NC6 F 5’-ATCGACATCTTGAACGCACATTGC-3’ 24 nt NC2 R 5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’ 20 nt Eg9 F1 5´ATG GCA TGG GTA GCA CGA CGG AGA G 3´ 25 nt Eg9 R1 5´ GGT TTG GGA ATG GCG ATG TTG A 3´ 22 nt Eg 16 F1 5´- CGC-GCT-ATC-GAC-CCA-CCA-ACA-G- 3´ 29 nt Eg 16 R1 5´- ACT-CCG-TCC-CGC-TAC-TCC-ACT-CC –3´ 29 nt JB11 F 5´ AGA-TTC-GTA-AGG-GGC-CTA-ATA 3´ 27 nt JB12 R 5´ ACC-ACT-AAC-TAA-TTC-ACT-TTC 3´ 27 nt JB 3 F 5´ TTT-TTT-GGG-CAT-CCT-GAG-GTT-TAT 3´ 31 nt JB 4. R 5´ TAA-AGA-AAG-AAC-ATA-ATG-AAA-ATG 3´ 31 nt 3L F 5’ CTAGTGATTGGAATGATGGG 3’ 20 nt 3H R 5’ GGCAAATGCTTTCGAGTAG 3’ 19 nt nt = nucleotidos 96 Materiales y Métodos Tabla M.9. Cebadores empleados en las PCR de colonias y secuenciación realizadas en este trabajo Cebadores Secuencias Tamaño T3 5’– ATTAACCCTCACTAAAGGG – 3’ 19 nt T7 5’– GTAATACGACTCACTATAGGGC – 3’ 22 nt pGEX F 5’– GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG – 3’ 23 nt pGEX R 5’– CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG – 3’ 23 nt D 5’– GTAAAACGACGGCCAGT – 3’ 17 nt SP6 5’– TATTTAGGTGACACTATAG – 3’ 19 nt Todos los cebadores empleados en este trabajo fueron suministrados por la Unidad de Biopolímeros del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III. 97 Resultados RESULTADOS 1. Antecedentes. En la actualidad, los métodos de diagnóstico de rutina de teniasis, generalmente métodos coprológicos, presentan graves limitaciones, especificidad limitada a la forma parasitaria disponible, pobre sensibilidad, o no están estandarizados convenientemente. Para mejorar esta situación, en los laboratorios de diagnóstico, durante los últimos años, se han diseñado distintos protocolos de PCR de manera exitosa permitiendo la identificación inequívoca de T. solium, T. saginata y otros ténidos, pasando a ser evaluados a través de copro-PCR. Otra alternativa que queda por estudiar, y que complementaría las herramientas moleculares diagnósticas hasta ahora desarrolladas, es la puesta a punto de ensayos que detecten los antígenos específicos secretados por los ténidos intestinales y eliminados en las heces de los pacientes (copro-antígenos), aproximación ya empleada por algunos autores que consiguen la identificación género específica de los parásitos. Además, los métodos serológicos podrían tener gran utilidad en el diagnóstico de estas patologías intestinales. En este sentido, los ensayos de detección actuales, emplean generalmente extractos crudos de los ténidos, con graves limitaciones por su escasa especificidad. Se ha realizado un gran esfuerzo en la caracterización de moléculas únicas de los patógenos. Con respecto a la cisticercosis, las moléculas más estudiadas de los metacestodos por sus interesantes propiedades han sido las glicoproteínas. También se han evaluado los antígenos de excreción/secreción, mostrando sensibilidad y especificidad excelentes. Sin embargo, queda un gran vacío en la detección serológica prepatente y patente de las teniasis. Por lo tanto, nos hemos propuesto superar las limitaciones actuales, mediante la búsqueda de moléculas antigénicas de las tenias a través de su clonación en genotecas de expresión de adulto de T. solium, RT-PCR o construcción de moléculas quiméricas. Así como el diseño de protocolos de PCR muy sensibles para llevar a cabo la identificación copro-DNA en pacientes con teniasis asintómatica. Por último, como se comentó en los objetivos del trabajo, la identificación de marcadores basados en el polimorfismo del DNA de los cestodos en estudio, complementarán los esfuerzos por mejorar la correcta identificación de los mismos. 97 Resultados 2. Cribado de genotecas de expresión de adulto de T. solium Para el cribado de las genotecas de expresión preparadas con cDNAs de adulto de T. solium se emplearon dos abordajes: cribado “al azar” y cribado dirigido o inmunocribado. Así, mediante cribado “al azar” se aislaron cDNAs de las cuatro genotecas preparadas de adulto de T. solium. Se seleccionaron aquellos clones que por su secuencia pudiesen tener valor diagnóstico potencial y después se caracterizaron molecularmente. Para el inmunocribado de las genotecas de proglótides se utilizó una mezcla de sueros de pacientes bien caracterizados clínicamente, y previamente confirmados como teniásicos mediante la técnica de Multiplex HDP2-PCR aplicada a material parasitario eliminado por los mismos. De esta manera se aislaron y purificaron fagos recombinantes que se estudiaron y caracterizaron con los sueros de pacientes anteriormente comentados. 2.1. Cribado “al azar” Se realizó el cribado “al azar” de cuatro genotecas de expresión, dos de cuello-escólex y dos de proglótides de adulto de T. solium, construidas en el vector λ-ZAP XR® (Stratagene). El título obtenido de las genotecas anteriores amplificadas está mostrado en la tabla R.1. Teniendo en cuenta dicha titulación, la librería se cribó a una densidad de 50000 ufp por placa, en 10 placas de petri de 150 mm de diámetro. Las placas fueron tratadas previamente por el método de selección blanco-azul. En el cribado se seleccionó “al azar” las unidades formadoras de placa blancas descartando las azules. A modo de ejemplo, en la figura R. 1 se incluye una placa de petri obtenida durante el muestro “al azar” de las genotecas utilizadas en este estudio. Tabla R.1. Resultado de la titulación de las cuatro genotecas de expresión de adulto de T. solium utilizadas en este trabajo. Genoteca Nº ufp Dilución ufp/100µl Título (ufp/ml) % N. R.*. Proglótides “High” 1304 10-6 1.304 x 109 1.304 x 1010 4.9% Proglótides “Medium” 1048 10-6 1.048 x 109 1.048 x 1010 4% Cuello y escólex “High” 1792 10-6 1.792 x 109 1.792 x 1010 6.7% Cuello y escólex “Medium” 1008 10-6 1.008 x 109 1.008 x 1010 7.1% * N. R.= No recombinantes 98 Resultados ufp recombinantes . . . . . . . . Figura R.1. Placa de petri LB agar tratada con IPTG y X-GAL, para poder distinguir las ufp de las genotecas de expresión, recombinantes (blancas) y no recombinantes (azules). . . . ufp recombinantes . . . . . . . . Figura R.1. Placa de petri LB agar tratada con IPTG y X-GAL, para poder distinguir las ufp de las genotecas de expresión, recombinantes (blancas) y no recombinantes (azules). . . . Se llevaron a cabo 5 rondas de aislamiento, obteniendo un total de 918 clones. Estos aislamientos se realizaron con las cuatro genotecas y los resultados de los mismos están clasificados en la tabla R.2. Tabla R.2. Fagos aislados de las 5 rondas de cribado en las genotecas de expresión de adulto de T. solium. Aislamiento Identificación Genoteca CLONES AISLADOS 1 1 Cuello y escólex “High” 44 2 N Cuello y escólex “Medium” 104 3 A Proglótides “High” 412 4 B Proglótides “Medium” 200 5 C Cuello y escólex “H” y “M” 158 2.1.1 Determinación de los tamaños de los cDNAs clonados Se realizó la técnica de PCR para la amplificación de los insertos de los clones seleccionados y así poder conocer su tamaño, utilizando los cebadores universales T3 y T7 del vector de clonación empleado en la construcción de las genotecas. Tras llevarse a cabo las reacciones, se obtuvieron insertos con tamaños comprendidos entre 150 y 4000 pb. Como ejemplo, se muestra en la figura R.2 algunos de los resultados obtenidos de las diferentes PCRs. Además, en la misma figura podemos observar que existe una gran heterogeneidad en el tamaño amplificado de los clones recombinantes aislados. 99 Resultados .1.2 Secuenciación de los cDNAs y análisis de las secuencias. s y tras su aislamiento e obtuvieron 240 cDNAs, de los cuales 29 mostraron similitud significativa con las n la tabla R.3 se muestran las secuencias conocidas con posible interés; se Figura R.2. Electroforesis en gel de agarosa al 1% para la determinación del tamaño de los cDNAs clonados “al azar” de las genotecas de adultos de T. solium. Identificación de productos de amplificación obtenidos con los cebadores universales T3 y T7. Calles 1, 2, 5, 6 y 7 productos con un tamaño entre 700 y 3000 pb, calles 3, 4, 9, 10 y 11 productos con tamaño menor a 700 pb. (M) marcador λ BstE II (Sigma). Tinción con bromuro de etidio. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 8454- 4822- 3675- 1929- 702- pb Figura R.2. Electroforesis en gel de agarosa al 1% para la determinación del tamaño de los cDNAs clonados “al azar” de las genotecas de adultos de T. solium. Identificación de productos de amplificación obtenidos con los cebadores universales T3 y T7. Calles 1, 2, 5, 6 y 7 productos con un tamaño entre 700 y 3000 pb, calles 3, 4, 9, 10 y 11 productos con tamaño menor a 700 pb. (M) marcador λ BstE II (Sigma). Tinción con bromuro de etidio. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 8454- 4822- 3675- 1929- 702- 8454- 4822- 3675- 1929- 702- pb 2 Después de estimar el tamaño aproximado de los insertos clonado y purificación, éstos fueron secuenciados mediante el método de Sanger (1977), utilizando los cebadores universales T3 y T7. La secuenciación se realizó con el sistema automático ABI 377, empleando el Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI-PRISM, PE Biosystems). Se llevó a cabo el análisis de las secuencias nucleotídicas parciales de los clones y la comparación entre ellas con el paquete informático Lasergene. Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas fueron comparadas con las de las bases de datos GenBank mediante el algoritmo Blastn y Blastp. S secuencias depositadas en los bancos de datos (tabla R.3), 121 con secuencias bacterianas y 90 no presentaron similitud alguna con moléculas ya descritas. E identificaron genes, o parte de genes, que codifican enzimas típicas del metabolismo de organismos vivos tales como, nucleósido difosfato quinasa, diacilglicerol quinasa, glutation reductasa, fucosil transferasa, aminotransferasas, glutamato racemasa y tirosin-quinasas. Además, se clonaron secuencias de algunos transportadores de 100 Resultados membrana como por ejemplo: proteína transportadora de fosfato, transportador de nitrato NRT1, transportadores de ATP, transportador de ribosa, etc. Así como otros genes que expresan proteínas estructurales como la actina y proteínas que se unen a ácidos nucleicos y también DNAs ribosomales, como los genes 12S y 28S ribosomales. Tabla R.3. Clones purificados “al azar” en las genotecas de cuello-escólex de T. solium, con similitudes significativas con secuencias ya descritas obtenidas con blastn / blastp Nº Fago Tamaño aproximado Similitud (pb) 1 2 #A2 #A99 #A318 Fragmento HDP2 de Taenia saginata 3 172 966 417 4 #8 150 Nucleósido difosfato quinasa +/- 5 #11 150 Proteína de unión a RNA 6 #14 150 Diacilgl legans icerol quinasa de Caenorhabditis e 7 #16 2500 Dominios F- B Humana box WD-40 de la proteína 1 8 9 #33 #41 500 150 Transportador de nitrato NRt1 10 #N1 400 DAPA de Bacteria E. coli 11 #N9 750 DNA Genómico Bacterias, Proteasa 47 humana 12 #N10 1900 Metilasa kinasa H ratón, Nucleósido difosfato 13 #N18 1800 Proteína de rata 14 #N22 1900 Proteína P humano 15 16 #N28 #N41 300 202 No significativa, región va a pesada de la Ig humana riable de la caden 17 18 #2.8 #2.11 238 290 DNA de la subunidad 12 S ribosomal de ténidos Proteína de unión a RNA 19 #2.10 500 RNA binding protein, DNA mitocondrial ténido 20 #A1 150 Glutation reductasa O. ns, Fucosil transferasa volvulus, Colágeno C. elega humana, proteína homóloga BTF 3 humana 21 22 #A107 #A156 150 23 24 25 #A261 #A377 #A388 2300 150 750 750 Proteína hipotética de T. solium 26 #A138 150 Actina de T. solium 27 #A155 1200 Insulina Gorila 28 #A273 725 Receptor de Rianodina de c da a canales de Ca+ de rata erdo y proteína asocia 29 #A321 1000 Subunidad 28S ribosomal de Railletina australis, de Hymenolepis, pb ar ase ambién, el cribado “al azar” de las genotecas de expresión de adulto de T. solium = p es de b s T reportó el aislamiento de algunos genes que podían tener valor diagnóstico; así tres fragmentos que presentaron similitud con la secuencia HDP2 de T. saginata y 90 cDNAs sin similitud con las moléculas ya descritas. 101 Resultados Tras examinar los resultados y atendiendo a los objetivos fijados en el presente trabajo, se decidió continuar con la caracterización de estos clones similares a HDP2 de T. saginata, #A2, #A99 y #A318. 2.1.3 Clonación en vectores de las secuencias HDP2 de T. solium Los tres fragmentos correspondientes a HDP2 de T. solium fueron subclonados en el vector pGEM®-T Easy como se describe en materiales y métodos. Las colonias blancas analizadas fueron sometidas a la extracción del DNA plasmídico y su posterior digestión enzimática con Eco RI para liberar los insertos de los 3 clones diferentes (Figura R.3). Dichos clones fueron secuenciados varias veces y los resultados de la secuenciación nos pusieron de manifiesto la naturaleza nucleotídica total de dichos fragmentos. Así, tenemos que el fragmento #A2 presentó un tamaño de 172 pb, el fragmento #A99 de 966 pb y, finalmente, el fragmento #A318 mostró 417 pb. l realizar la comparación de estas moléculas con las depositadas en el banco de datos 1 2 3 -3000 -1000 -500 -100 Figura R.3 Electroforesis en gel de agarosa al 1% en el que se observan los tres clones digeridos con la enzima Eco RI. Calle 1 clon #2, Calle 2 clon #318, Calle 3 clon # 99. Tinción con bromuro de etidio. pb 1 2 3 -3000 -1000 -500 -100 Figura R.3 Electroforesis en gel de agarosa al 1% en el que se observan los tres clones digeridos con la enzima Eco RI. Calle 1 clon #2, Calle 2 clon #318, Calle 3 clon # 99. Tinción con bromuro de etidio. pb A (GenBank, EMBL), nuevamente, se puso de manifiesto similitud entre estas tres secuencias con el fragmento HDP2 de T. saginata, con número de acceso AJ133740. Después se procedió al análisis de dichas secuencias junto con la descrita de HDP2 de T. saginata mediante el paquete informático Lasergene. Se realizaron alineamientos 102 Resultados entre ellas, y se confirmó que eran solapantes, y la mayor parte de las tres coincidían con algunas regiones de HDP2 de T. saginata. Así, se observó que la secuencia #A2 está comprendida entre el nucleótido (nt) 3509 al 3681, el fragmento #A99 desde el nt 2179 al 3145 y el clon #A318 desde el nt 2754 al 3171 de HDP2 de T. saginata, como se muestra en la figura R.4. Además, dichas secuencias mostraban zonas con mutaciones y delecciones entre ellas y también con respecto al fragmento HDP2 de T. saginata previamente caracterizado (González et al., 2000) (Figura R.4). Estos resultados determinaron que continuásemos con el estudio de los tres fragmentos Figura R.4. Representación esquemática de la localización y comparación de los tres fragmentos de DNA HDP2 de T. solium (línea color azul) con respecto a la secuencia homóloga de HDP2 de T. saginata (caja color fucsia). Las líneas discontinuas representan “gaps”. Los números en los fragmentos de los clones indican la posición donde se encuentra la homología con respecto a la secuencia de HDP2 de T. saginata. de HDP2 de T. solium, atendiendo a las propiedades de HDP2 de T. saginata como molécula de interés diagnóstico, con el objetivo de optimizar una PCR muy sensible para el diagnóstico de la teniasis prepatente. 3954pb HDP2 T. saginata 5’ 3’ HDP2 T. solium 31452179 2650 2702 5’ 3’Fragmento #A99 966pb 36813509 5’ 3’ Fragmento #A2 172pb 2754 3171 3’ 3102 3124 Fragmento #A318 417pb 1 5’ Figura R.4. Representación esquemática de la localización y comparación de los tres fragmentos de DNA HDP2 de T. solium (línea color azul) con respecto a la secuencia homóloga de HDP2 de T. saginata (caja color fucsia). Las líneas discontinuas representan “gaps”. Los números en los fragmentos de los clones indican la posición donde se encuentra la homología con respecto a la secuencia de HDP2 de T. saginata. 3954pb HDP2 T. saginata 5’ 3’ HDP2 T. solium 31452179 2650 2702 5’ 3’ 2179 2650 2702 5’ 3’Fragmento #A99 966pb 36813509 5’ 3’ Fragmento #A2 172pb 2754 3171 3’ 3102 3124 Fragmento #A318 417pb 1 5’ 103 Resu ltados 104 de como se muestra en el esquema de la figura R.5. 2.1.4 Optimización de una multiplex PCR semi-anidada de valor diagnóstico a s fragmentos HDP2 de T. solium. T. saginata, se procedió a alineamiento entre la molécula #A99 y HDP2 T. saginata. Como se muestra en la figura R.6, entre dichas secuencias se apreciaron directos y reversos con el fin de conseguir una multiplex PCR semi-anidada diseñados zonas con mutaciones puntuales y delecciones importantes que nos permitió proyectar una serie de cebadores directos (F1, F2, F3, F4) y cebadores reversos (R1, R3, R4, R5). El diseño de estos cebadores se realizó manualmente. Para la primera y segunda PCR, se diseñaron cuatro cebadores directos, válidos para ambos ténidos, con la diferencia entre ellos de que el producto resultante de amplificación sería diferente en su tamaño. Por otro lado, se sintetizó un cebador reverso común (R1) para utilizarlo en la primera reacción de PCR. Para la segunda PCR, los cebadores reversos R3 y R4 fueron diseñados para amplificar exclusivamente DNA de T. solium, y el cebador R5 para amplificar sólo DNA de T. saginata (Ver Figura R6) Con esta premisa, realizamos las diferentes combinaciones entre todos los cebadores ensayar una PCR semi-anidada. En primer lugar, se estudió con detalle el Para cumplir con los objetivos propuestos y aprovechando el tamaño, diferencias y similitudes de las molécula #A99 con la molécula HDP2 de partir de lo T. solium 1ª PCR Taenia spp. T. saginata T. solium Multiplex-semianidada HDP2 T. saginata Figura R.5 : Esquema del diseño de una multiplex PCR semianidada. En la primera PCR con cebadores comunes se amplificará un fragmento común a ambas especies. La segunda PCR con cebadores reversos específicos amplificará fragmentos especie- específicos de diferente tamaño. R5 Resultados 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 2250 2260 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HDP2 T. saginata -AACCGGTAGTTCGAACAAACAAAGTATTACACAGCCCCTCTCTTCTTTCGAGCGTCGTCCCCGACGCTCCCCTTGGTCAGCCTCCCGTG #A99 HDP2 T. solium AAACCGGCAGTTCGAACAAACAAAGTATTACACAGCCGCTCTCTTCTTTCGAGCGTAGCTTCCAACGCTCTCCTTGGTCAGCCTCCCATG 2270 2280 2290 2300 2310 2320 2330 2340 2350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HDP2 T. saginata TCAGCCATCACAACGTAATCTGTGCTGCGAGAAGCACCCACGAGCTAACCATCCCAGTTGTCGAGATTCGAACGCATGTGTTCCTGTAGT #A99 HDP2 T. solium TCAGCCATCGCAACGTAATCAGTGCTACGAGAAGCACCCATGAGTTAACCGTGCCAGTCATCGGGATTCGAGCGCATGTGTTCTTGTAAT 2360 2370 2380 2390 2400 2410 2420 2430 2440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HDP2 T. saginata GCTATCAATTCCGCGTAGCACTCAGTGCAGCAAATGC-GCGCTCCTTGGCCGTCCTCTCCCACGACACTGTGGTCCCATGAAAGATGGAG #A99 HDP2 T. solium GCCATCAATTCCGCGCAGCACTCGGTGCAGCAAATGCATATTTCCCAGTCC-TCCTCTCTCACGATAAGG-CGTCTAGAGAAAGATGGAG 2450 2460 2470 2480 2490 2500 2510 2520 2530 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HDP2 T. saginata GTACGAATCCAAGCTTTCGAATGAGTCGAGCCTCACACAACACATATTGCGATTCCAGGCTTAATTGATACCGTGGAAGAAACGCAAGGG #A99 HDP2 T. solium GCATGAGTCCAATTTTTCGAATGGATTGGGACGCACGCAATGCATATTGTGAGTTCAGGCTT-TTCGATGCCATAGGATAAACCCAAGGG 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 2610 2620 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HDP2 T. saginata CATCGTAGAAACCTGAGCAAATGTGGCGGTCGGGCGTCATAGGAACAAAATGCATGCGATCCAAGTGTGCAAAGCATAAAACGATGTTAT #A99 HDP2 T. solium TACCGTAGAACTCTGAGCAAATGGAGCGATCGGGCCTCATAGGAACAAAATGCATGCGATCCAAGTGTGCAAAGCATAAAACGATGCTAT 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 2710 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HDP2 T. saginata CCAATGGCATCCTGCACATTCTACATCTG-----------------------------------GCAACA-G-GAGAGAGAGCTTACGGA #A99 HDP2 T. solium CGAATGGCGTCCTGCACATTC TGTTGATACGCATTTTGGAGGAGAGGTGAGTTGTCCAATAACAGGAGAGAGAGAGCTTACGG- 2720 273 ....|....|....|....|. HDP2 T. saginata GGATGCTTGACCACAACGTCG #A99 HDP2 T. solium -GTTGCTTGATCACAATGTCG Figura R.6. Secuencia nucleotídica parcial de HDP2 T. diferencias entre ambos fragmentos. Las secuencias som F2 F1 F3 F4 a los cebadores reversos. Los “gaps” están representados CACATC R4 105 0 2740 2750 2760 2770 2780 2790 ...|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|. CAGGTCTCTCTTGGCAGTTCCACTGCACTTGGAGTTCACGGCTAGTGTCGCTTCAGTTGTT-- CTGATCCCTCTTGGTAGTTCTACTGGACATGGAGTTCACGGCTAGCGTCGCTTCAGTTGCTAA saginata y el fragmento #A 99 HDP2 T. solium, en las que se pueden observar en rojo las breadas en azul corresponden a los cebadores directos y las sombreadas en amarillo corresponden R3 R1 con guiones. Resultados Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µl, con una cantidad constante de DNA genómico de 10 ng, con la enzima Taq (1U) y tampón de PCR (2 mM de Mg++) de “Biotools”, así como los cebadores diseñados anteriormente a la concentración de 125 µM (Tabla M.2 de “Métodos”). Se probaron diferentes temperaturas de anillamiento así como tiempo de extensión. Los resultados de las diferentes PCRs para T. solium y T. saginata con las temperaturas de anillamiento y combinaciones de cebadores directos y reversos se recogen en las tablas R.4 y R.5. Como podemos observar, después de hacer dichas combinaciones, las mezclas de los cebadores directos con los reversos R3 y R4 amplificaron una banda para T. saginata cuando no deberían amplificar nada, y la combinación F3-R5 amplificó el DNA de T. saginata como se esperaba, pero no del tamaño teórico calculado. Además, existen otras combinaciones de cebadores, no incluidas en las tablas, que resultaron inexplicablemente negativas, teniendo en cuenta la comparación de las secuencias HDP2 de T. saginata y T. solium. Tabla R. 4. Resultados obtenidos en las diferentes PCRs, combinando los cebadores y la temperatura de anillamiento para amplificación de DNA de T. solium. Temperatura Cebador 68°C 65°C 63°C 60°C 58°C 55°C F1 - R4 + + + + + + F2 - R1 + + + + + - F2 - R4 + - - + +* + F3 - R1 + + + + + + F3 - R3 - - - + + +* F3 - R4 + + + + + + F4 - R1 - - - - + + F4 - R3 - - - - - + F4 - R4 + + + + + + * Tamaño no esperado 106 Resultados Tabla R. 5. Resultados obtenidos en las diferentes PCRs, combinando los cebadores y la temperatura de anillamiento para amplificación de DNA de T. saginata Temperatura Cebador 68°C 65°C 63°C 60°C 58°C 55°C F1 - R4 +۩ +*۩ +*۩ +*۩ +*۩ +*۩ F2 - R1 + + + + + - F2 - R4 +*۩ +*۩ - +*۩ +*۩ +*۩ F3 - R1 + + + + + + F3 - R3 - - - - - +*۩ F3 - R4 +۩ +۩ +۩ +۩ - - F3 - R5 - - - - - +* F4 - R1 - - - - + + F4 - R3 - - - - - - F4 - R4 +۩ +۩ +۩ +۩ +۩ +۩ * Tamaño no esperado ۩ No debería presentar amplificación con estos cebadores reversos Nota: Las otras combinaciones no se incluyen en las tablas por ser los resultados negativos, aunque sí se llevaron a cabo. Tras realizar las PCRs indicadas, con la combinación entre los cebadores diseñados, así como variando las temperaturas de anillamiento, los resultados obtenidos fueron complejos de interpretar. Las PCRs desarrolladas con el cebador R1 (común) y algunos de los cebadores directos podrían ser útiles para realizar la primera PCR, aunque los productos obtenidos no coincidieron con el tamaño esperado. Sin embargo, fue imposible seleccionar algún cebador reverso adecuado para poder aplicar la segunda PCR (multiplex PCR semi-anidada). A la vista de los resultados obtenidos y no esperados, se decidió purificar y secuenciar la mayoría de las bandas de amplificación. Los resultados obtenidos en la secuenciación de dichos amplicones mostraron una alta variabilidad y complejidad entre ellos y las secuencias de HDP2 de T. saginata y T. solium (dato no mostrado). Por tanto, con el conocimiento actual que disponemos de dichas secuencias no se ha podido realizar un diagnóstico diferencial y simultáneo de las dos especies de ténidos que mejorase las propiedades de especificidad y sensibilidad de los protocolos en uso. 2.1.5 Análisis de la reactividad de sueros de pacientes para el cribado de genotecas. Para seleccionar los sueros de pacientes portadores de T. saginata, que pudieran tener interés para llevar a cabo un inmunocribado de genotecas de expresión, se realizaron los 107 Resultados siguientes pasos. En primer lugar, se obtuvo antígeno total a partir de extracto proteico de proglótides maduras y grávidas de T. solium. Después, se fraccionaron 108 µg de proteína en un gel preparativo SDS-PAGE al 10% y transferido a membranas de nitrocelulosa mediante “Western blot” (Towbin, 1979). Finalmente, se analizaron dichos filtros mediante ensayo inmunoenzimático con 15 sueros de pacientes portadores de T. saginata, una mezcla de sueros de pacientes sanos y una mezcla de sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55) (Figura R.7.). El análisis de los sueros mostró un comportamiento variable en número, intensidad de reacción y rango de pesos molecular de los antígenos reconocidos; la mezcla de sueros de conejo presentó un ligero reconocimiento con bandas de alto peso molecular y otra de cerca de 24 kDa. La mezcla de sueros de individuos sanos no mostró ningún patrón de bandas. Figura. R.7. (A) Electroforesis en gel SDS-PAGE, de extracto proteico obtenido de proglótides de T. solium. Calle 1 (10 µg), Calle 2, (40 µg), M. Marcador de peso molecular (Prestained SDS-PAGE Molecular weight markers de Sigma). (B) Análisis inmunoenzimático mediante “Western blot” de sueros de pacientes con teniasis. (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker Wide Range MW” de Sigma). Membranas del 1 al 14 incubadas con sueros de pacientes con teniasis (T. saginata), Membrana 15 incubada con mezcla de sueros positivos a teniasis, Membrana 16 incubada con una mezcla de sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55), Membrana 17 incubada con una mezcla de sueros de pacientes sanos M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 116 94 84 66 55 45 36 29 24 B M 1 2 A kDakDa 180 116 84 58 48 36 26 Figura. R.7. (A) Electroforesis en gel SDS-PAGE, de extracto proteico obtenido de proglótides de T. solium. Calle 1 (10 µg), Calle 2, (40 µg), M. Marcador de peso molecular (Prestained SDS-PAGE Molecular weight markers de Sigma). (B) Análisis inmunoenzimático mediante “Western blot” de sueros de pacientes con teniasis. (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker Wide Range MW” de Sigma). Membranas del 1 al 14 incubadas con sueros de pacientes con teniasis (T. saginata), Membrana 15 incubada con mezcla de sueros positivos a teniasis, Membrana 16 incubada con una mezcla de sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55), Membrana 17 incubada con una mezcla de sueros de pacientes sanos M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 116 94 84 66 55 45 36 29 24 B M 1 2 A kDakDa 180 116 84 58 48 36 26 108 Resultados 2.1.6 Estudio de antigenicidad de clones purificados “al azar” por lisis en mancha (“Spot-lysis”) Con este método se lleva a cabo la inducción de las proteínas de fusión de los clones seleccionados. Se siguió el protocolo descrito por Maizels et al. (1991) como se indicó en el apartado de materiales y métodos. Para su realización se utilizaron 120 fagos purificados y aislados en el cribado “al azar”, de los cuales 90 clones no tenían similitud alguna y 29 clones presentaban similitud con moléculas descritas en los bancos de secuencias (GenBank y EMBL). En total, se realizaron tres rondas de inmunodetección (Figura R.8.), incubados con una mezcla de sueros de pacientes teniásicos (T. saginata), para comprobar si los halos de lisis se mantenían, resultando positivos sólo tres de ellos (#A63, #B73, #C81). Figura R.8. Purificación de los fagos recombinantes obtenidos. (1) Primera ronda de cribado, (2) segunda ronda de cribado y (3) tercera ronda de cribado. 2.2 Inmunocribado de las genotecas de expresión de adulto de T. solium y selección de clones positivos Una vez realizada la titulación de las cuatro genotecas de cDNA de adulto de T. solium construidas en el vector λ-ZAP XR® (Stratagene) (tabla R.1), se llevó a cabo el cribado de 1.0 x 109 clones, utilizando como sonda una mezcla de sueros de pacientes portadores de tenias (T. saginata). En el ensayo se incluyó una mezcla de sueros humanos sanos como controles negativos de la reacción. El cribado primario de 1.0 x 109 clones rindió un total de 20 señales positivas que posteriormente se sometieron a varias rondas de purificación para obtener los clones puros. Estos se denominaron con las letras correspondientes a cada genoteca (Cm, Ch, 109 Resultados Pm, Ph) y un número (#4, #5, #6, #7, #8, #9, #10, #11, #12, #16, #17, #21, #28, #33, #34, #35, #37, #38, #39 y #43, #A63, #B73, #C81) (Tabla R.6). Los clones #A63, #B73 y #C81 procedían del cribado “al azar” y posterior inmunopurificación mediante lisis en mancha (“spot lysis”). 2.2.1 Transformación de los fagos recombinantes en fagémidos: “Escisión in vivo” Con los veinte fagos inmunopurificados, más los tres fagos obtenidos mediante lisis en mancha, se realizó el proceso de “Escisión in vivo”, según el protocolo descrito en el apartado 3.3.5 de “Métodos”, con el fin de obtener los correspondientes fagémidos, vectores de más fácil manejo. De esta forma, se extrajeron los DNA plasmídicos recombinantes de los 23 clones seleccionados, a partir de cultivos de las células E. coli SOLR transformadas con los fagémidos obtenidos. 2.2.2 Secuenciación de los fragmentos clonados y análisis de las secuencias Después de obtener los DNAs plasmídicos recombinantes, se procedió a su secuenciación. Se utilizó 200 ng de DNA molde, y se emplearon los cebadores universales T3 y T7, siguiendo la metodología descrita en el apartado 3.2.5 de “Métodos”. El análisis de las secuencias nucleotídicas, correspondientes a los extremos 5´ y 3´ de los insertos obtenidos, se llevó a cabo mediante el programa “Seqman” del paquete informático Lasergene. Además, el alineamiento de las secuencias de los clones entre sí no se pudo realizar, al no existir similitud entre ellas. La comparación de dichas secuencias con aquellas encontradas en las bases de datos de nucleótidos GenBank/EMBL, mediante el algoritmo BLASTn, nos reportó los siguientes resultados: 20 clones no presentaron homología significativa con las secuencias incluidas en los bancos de datos, 1 clon mostró homología con una proteína hipotética de T. solium, descrita por González y Manoutcharian en 2004 (Banco de datos GenBank AY699706), otro con DNA mitocondrial con T. solium, y el restante con dineina. 110 Resultados Tabla R.6. Características de los 23 clones aislados por inmunocribado en las genotecas de expresión de adulto T. solium. Nº Fago Genoteca Homología con genes del banco de datos Tamaño (pb) 1 #4 *Ph No significativa 746 2 #5 *Pm No significativa 713 3 #6 Pm No significativa 451 4 #7 Ph No significativa 732 5 #8 *Ch No significativa 1709 6 #9 Pm No significativa 1200 7 #10 Ph No significativa 300 8 #11 Ph No significativa 701 9 #12 Ph No significativa 701 10 #16 Pm Dineina 321 11 #17 Ph Proteína hipotética de T. solium 1300 12 #21 Pm No significativa 1552 13 #28 *Cm No significativa 1560 14 #33 Ch No significativa 500 15 #34 Ch No significativa 180 16 #35 Pm T. solium mitocondrial 500 17 #37 Pm No significativa 700 18 #38 Pm No significativa 800 19 #39 Pm No significativa 729 20 #43 Cm No significativa 150 21 #A63 Cm No significativa 3247 22 #B73 Pm No significativa 1300 23 #C81 Ph No significativa 500 *Ph= Proglótides “High” *Pm= Proglótides “Medium” *Ch= Cuello y escólex “High” *Cm= Cuello y escólex “Medium” Finalmente, cuando se llevó a cabo la traducción a proteínas, utilizando los programas “Editseq y Protean” ambos del paquete informático Lasergene, nos llamó la atención que la mayor parte de las moléculas carecían de un marco de lectura abierto (ORF) consistente, siguiendo el ORF que dicta la beta-galactosidasa, proteína de fusión que aporta el vector λ-ZAP XR®. Además, se observaron múltiples codones de parada “no razonables” y ausencia de cola poli-A. Ante esta situación de cDNAs complejos y, para cumplir con los objetivos propuestos en este trabajo, se decidió continuar con 4 de los clones que presentaron una señal más intensa en el inmunocribado, ya que expresaban proteínas recombinantes reconocidas por la mezcla de sueros de pacientes con teniasis. 111 Resultados En primer lugar, se llevó a cabo la repetición de secuenciaciones de cada uno de ellos, y la revisión de las secuencias con el paquete informático Lasergene para asegurarnos de la correcta composición de los clones. En segundo lugar, se analizaron dichas secuencias con el servidor EXPASY, una herramienta bioinformática especializada en el análisis de proteínas, para estudiar los tres posibles marcos de lectura de traducción que se obtienen a partir de las secuencias nucleotídicas de los cuatro clones seleccionados. Los resultados de dicho estudio están resumidos en la tabla R.7. Tabla R.7 . Tamaños hipotéticos de las 4 proteínas expresadas por las moléculas seleccionadas. La traducción a proteína fue realizada en los tres marcos de lectura abierto (ORF). Se muestran las posibles proteínas encontradas en dichos marcos de lectura. Los ORF, con sus pesos moleculares y subrayados en amarillo, son los seleccionados para el trabajo. Clon cDNA (nt) 1er marco de lectura (ORF) 2do marco de lectura * (ORF) 3er marco de lectura (ORF) Peso kDa #5 713 5aa 48aa 36aa 18aa 26aa 25aa 6aa 51aa 21aa 6aa 6aa 20aa 6.0 #11 701 48aa 36aa 18aa 26aa 62aa 11aa 2aa 10aa 28aa 5aa 5aa 33aa 7.0 #16 321 76aa 90aa 2aa 30aa 9.8 #63 3247 27aa 19aa 20aa 57aa 31aa 8aa 17 112 13aa 30aa 15 56aa 26aa 15aa 80aa 46aa 28aa 30aa 42aa 15aa 7aa 15aa 7aa 15aa 17aa 8aa 36aa 10aa 12.4 nt = nucleótidos aa = aminoácidos ORF = marco de lectura abierto (“open reading frame”). * = Este marco de lectura es el que dicta la beta-galactosidasa, proteína de fusión que aporta el vector λ-ZAP XR®. 112 Resultados 2.2.2.1 Análisis de la secuencia del clon #5 El clon #5 presenta una secuencia de 713 nucleótidos. El análisis de la traducción de la secuencia nucleotídica de este clon, en los tres posibles marcos de lectura, encontró un ORF consistente en el segundo marco, un fragmento de 156 pb, con un posible codón de inicio (ATG), en la posición 449, y un posible codón de parada (TGA) en la posición 604 (Figura R.9). La secuencia aminoacídica deducida está formada por 51 aminoácidos con un peso molecular teórico de 6.0 kDa y un punto isoeléctrico de 10.0. El programa “Protean” del paquete informático Lasergene nos muestra las regiones alfa hélice y beta plegada de la secuencia, que es hidrofílica y altamente antigénica. No se observa la presencia de posible péptido señal (Figura R.10). Tras llevar a cabo las correspondientes búsquedas en los bancos de datos (GenBank, EMBL) no se encontró similitud con los genes descritos previamente en ténidos. igura R.9 Secuencia nucleotídica (nt) y aminoacídica (aa) deducida de la molécula #5. F La parte sombreada en verde corresponde al ATG de inicio y al codón de parada, la secuencia nucleotídica está formada por 712 (nt) y la aminoacídica por 52 (aa), no presenta cola de poli-A. GTTTTTCA CA AATT TTT TGGCAAAACG A ACACACAT T CACTTGTCT T TACACGAAGA CAAAAAG CTCTTCAAAAG AAA AAA 90 nT T TGGTGGT t ATT T T T TG TTTTG T TGT TTG TG T TTG T TGG TT TTG TG T T T TT TTG TTTTT T TGG TGTT TTTG T T TTG T T TG TGT T T TG TT TT TT T TG TT CAGCG C AAAG C CCAAC AAA C CGGAC A ACA CCCCACCCAG ACGAGGG CAAAGAG CGGAC 180 CAG AAAAGA CACA C AA AAAACC CAG CCAAG CA CGCAAAG A CAAAACACACA ACC CAAG 270 GGCA A C ACCG ACAGCACAC A CG CAGA AGAGCA A CACC CGAAG AAGCGACCCGGG CAACCGCC CAC 360 AACCGG A AACGGACA C C CAAAGAG AGGGAGAA AAAAC ACAACAC ACCGA AGCA A AAA 450 M TGG T TTTT TTG TTTT TGGT T TTTTG TG T TT T TG 1 aa CCA A AAACC CC CC AAAACCGGAAAGC C ACGC CC AGGCC AACGCAC CAGAACC CG A AGCA CCACG 540 P Y K P F F L L K T G K L Y A S F R P N A L R T S Y S I S T 31 T T TTTTTT T TT T T TT TTT T T T T T TTT CC CAGGAGACA CAC A C CGGG AGA AAGAA AACAC CAAGAAACGGAGGA AGCCA CCG AA AGGC AAAGAC 630 P V R R H H Y L R V K N N T Q T 51 GGCGC CGGG CCCAAAACAGCG AA ACGAGCCGAG CA CAACCACCAG CAG C ACC AAAGCA CA 712 TGT T T T TT T T T T TT TT T TTT TTT D E E D * T T T TT TT TTTTGT T TGTT T T TT 113 Resultados igura R.10. Estructura secundaria de la molécula #5 donde se observan las regiones .2.2.2 Análisis de las secuencia del clon #11 ia nucleotídica de 701 nucleótidos. Al 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 AA Regiones Alfa Regiones beta Regiones flexibles Regiones enrrolladas Hidrofilicidad Índice antigénico Superficie BB TT CC 0 4.5 -4.5 A0 1.7 -1.7 S1 6 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 AA Regiones Alfa Regiones beta Regiones flexibles Regiones enrrolladas Hidrofilicidad Índice antigénico Superficie BB TT CC 0 4.5 -4.5 A0 1.7 -1.7 S1 6 F α- hélice, β plegada, las regiones flexibles, así como también la hidrofilicidad, el índice antigénico (Jameson-Wolf) y la probabilidad de estar en superficie. Programa Protean (Lasergene). 2 El clon #11 está constituido de una secuenc realizar la traducción en los distintos marcos de lectura, el servidor EXPASY encontró un ORF apropiado de 190 pb en el segundo marco (Figura R.11). La secuencia aminoacídica deducida está compuesta por 63 aminoácidos, con un posible codón de inicio (ATG) en la posición 29 y un posible codón de parada (TGA) en la posición 217, con un peso molecular teórico de 7.0 kDa y un punto isoeléctrico de 7.3. Dicha proteína se analizó con el programa “Protean” del paquete informático Lasergene, encontrándose que presenta principalmente regiones alfa hélice. Es poco hidrofílica y exhibe un buen índice antigénico en su zona terminal (Figura R.12). 114 Resultados CGCCAACAGCATT T T TGGTG T T TGT TGT TGTTG TT TGG T TTTGGG E D C A ACCGAGCACACA CACGCCCA CACGAAAGCC ACCAGC A CCA C CAAAGCAA A AC C 100 nt M V H A H H S L P A V P F K A M T L G C C C 24 aa ATG T TG T TGG TT TGTT T TTTT TTTGT TGTTTGTT TGTTG TT TTA AC CAGCA CAAAAAGG GAAAA CAAAGG A AG C CACACCCACC AA ACGAAGGC AAC CAA 200 M I L Q H Q K G G K I Q R Y S F L H T H L F V N V G L T S C C D E 57 ATTG TG T TG TGT TGTG T TTT TT TTT TT T T T TTT TTG T TTCGAAAACAGA AAAACCA AC AA CCCG CGA C AC CGAGAGA AACCCAC C A C CAC A AAGCACA A A 300 N N R * C E Figura R11 . Secuencia nucleotídica y aminoacídica deducida del clon #11. La parte sombreada en verde corresponde al ATG de inicio y al codón de parada, está formada por 701 nucleótidos y la posible proteína con 57 aminoácidos, no presenta cola de poli- A. 62 C CAACA ACAGAGCC CCG AG ACGC AC CA AA C AAG C AACAACG CGAGGGAAC AAACGGCAC A CG C CA 400 A AA CGAGC A C CA C AA AACAAA AACCAA CA A AAG CAGACAAACCGGGC CGC 500 G AGCACA CAC C CG CA C CCGCA AG AC ACCGC ACC CAACAAG AA CC ACAGA AGAAA CCC CAA A 600 G C AG GACC C A AGGCA C AGCACAC A CCA G AA CGCGC ACCACCCAA CAAA AAA CGA C ACAACA 700 C 701 T T TT T T TTTT TG TGG TG TTTG TG T T TG T T TTT TGT TTTT TTTTGGT T T T TT TTGGT TTTT TG TGTTTG TG TTGG TG TGTG TTTGT T T T TT T TTTT T TTT TGTTGG T TT T T TT T TGT TT T TTTT T TG TT TTGG T TGG TGG T T TTTT T TGG TTTT T T TTT T TG T T 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 AA BB TT TT CC 0 4.5 -4.5 A0 -1.7 Figura R.12 Estructura secundaria de la molécula #11 donde se observan las regiones α- hélice, β plegada, las regiones flexibles, así como también la hidrofilicidad, el índice antigénico (Jameson-Wolf) y la probabilidad de estar en superficie. Programa Protean (Lasergene). 2.2.2.3 Análisis de las secuencias del clon #16 El clon #16 presenta una secuencia de 321 nucleótidos con un marco de lectura abierto de 273 pb, un codón de inicio (ATG) en la posición 32 y un codón de parada (TGA) en la posición 304, no tiene señal de poliadenilación ni cola de poli-A (Figura R.13). La secuencia aminoacídica deducida en el segundo marco de lectura está formada por 91 aminoácidos, con un peso molecular teórico de 9.0 kDa y un punto isoeléctrico de 9.0. El programa “Protean” del paquete informático Lasergene indica que la secuencia deducida presenta regiones alfa hélice, beta, flexibles y enrolladas intercaladas, que es 1.7 S1 6 Regiones alfa Regiones beta Regiones flexibles Regiones errolladas Hidrofilicidad Índice antigénico Superficie 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 AA BB TT TT CC 0 -4.5 4.5 A0 -1.7 1.7 S1 6 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 AA BB TT TT CC 0 -4.5 4.5 A0 -1.7 1.7 S1 6 Regiones alfa Regiones beta Regiones flexibles Regiones errolladas Hidrofilicidad Índice antigénico Superficie Regiones alfa Regiones beta Regiones flexibles Regiones errolladas Hidrofilicidad Índice antigénico Superficie 115 Resultados poco hidrofílica y antigénica. No se distingue la presencia de posible péptido señal (Figura R.14). igura R.13 Secuencia nucleotídica y aminoacídica deducida del clon #16, que está igura R.14 Estructura secundaria de la molécula #16 donde se observan las regiones - hélice, β plegada, las regiones flexibles, así como también la hidrofilicidad, el índice ntigénico (Jameson-Wolf) y la probabilidad de estar en superficie. Programa Protean .2.2.4 Análisis de las secuencia del clon #63 inalmente, el clon #63 presentó una secuencia nucleotídica de 3247 pb. Al examinar la do marco de lectura se distingue una isoeléctrico de 11.42 (Figura R15). Dicha proteína se analizó con el programa ACAGACGAAGGCGATTG TGG TG TTT TG T TT TT T T TGG TTG T T TT E A ACA A A A C C AGCGAAAGAGAAAAC A AAG CCACAAAACC C AGGCG A A 90 nt M I F L A K K T I S G H K T L L G V L 20 aa AGGAA C A AAGAG CAAAGGCACC AA CCA G CCCAGC AAG CC CCCA ACGAG CCAACACC 180 R N A V M K S S K A P G I A M W V P A L V P S H T S P T P TG TGTG TG TT TGG TTG TGTGG T TTTGG TT TT T T T E 50 AC CGGC AA AAGA C CAGCA CC ACAAA CCAA AAA ACGA CAAGCAAA A A C AC CA 270 T S A V N L K I S A S W T N S N M W Q A N I M L L H TT TGTG TTTG T T T TGGTGT TT TG TGTGGG T T TT TG T TT T E D D C 80 CACA AC CG C CG C AAA A ACC CAA 320 H I T V V V L R L TT TGTTGTTTG TG TT T TTT TGT TGG T TT C F formada por 320 nucleótidos y 90 aminoácidos. La parte sombreada en verde, pertenece al ATG de inicio y al codón de parada, no presenta cola de poli A. * 90 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 A B T C 0 4.5 -4.5 0 1.7 -1.7 1 6 Regiones alfa Regiones beta Regiones flexibles Regiones enrrolladas Hidrofilicidad Índice antigénico Superficie 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 A B T C 0 4.5 -4.5 0 1.7 -1.7 1 6 Regiones alfa Regiones beta Regiones flexibles Regiones enrrolladas Hidrofilicidad Índice antigénico Superficie F α a (Lasergene). 2 F traducción aminoacídica deducida en el segun posible proteína de 113 aminoácidos, correspondientes a una secuencia de 349 pb, que presenta un posible codón de inicio (ATG) en la posición 90, y un posible codón de parada (TGA) en la posición 428, con un peso molecular teórico de 12.4 kDa y un punto 116 Resultados “Protean”, en el que observamos las regiones alfa, flexibles y enrolladas, pero no tiene regiones beta. Es hidrofílica y exhibe un buen índice antigénico en la totalidad de la molécula (Figura R.16). Figura R.15 . Secuencia nucleotídica (nt) y aminoacídica (aa) de la molécula #63, está formada por 3247 nucleótidos y la proteína deducida por 142 aa. Las partes sombreadas en verde, se corresponden con el ATG de inicio y al codón de parada, no presenta cola de poli-A. CTCACATGCAAAACCCAGGTTGTAGCATTTGCATCTTTGTTAGGCTTATAAAGTAAGGCAATTCTCTCCATTCCTTAGGGGCTATAGATATGATCACTGC 100 n M I T A 4 TTCTAATACTGCAAAAGCCCACACCTCTGG S N T A K A H T S G t aa CTCCACTACTGCGAGGCGACACTTGGAAATTCGGAACTACTTGTGGAAAATGGAAGTGTTGGCAGAGGTG 200 S T T A R R H L E I R N Y L W K M E V L A E V 37 CAAAAGTGCGTTGAGAAGTAAAAATCCTAAAGTGGCAGCAAAATCATCTGGCAAAATGGATGCAAAGGCGCGGCTTAAATCCCCATCAAGCACCAACA 300 K S A L R S K N P K V A A K S S G K M D A K A R L K S P S S T N 70 CC P AACCACTTGCAAATAACAAGCAAACAATTAGGATAAAATGTAGGCATGATAAAGCTCACCAGGTGAGCGTGCGAAAACTATGGAGACTACTCGTAAATTT 400 K P L A N N K Q T I R I K C R H D K A H Q V S V R K L W R L L V N L 104 AGCTCATCTAGGGGCAACTCAGACTTAAGCGAGTAACCACTTGCAAATCCAAGCACACGTATCCATACCATTCCTTCGTCACTACGATAAAAAGCCCACA 500 A H L G A T Q T * 112 ATTCCCATCTGATTTCCATGCAACACCTCCAGAATAACAAAGGTCACGCAAGGAGCATATGCTCTGTTATCTTATTTGCAAAGAACTGTAATTTGATCCA 600 ATAGAAGTTTCCGTGTTGCACCTTGGTTTGTCGTTAGGCTGTGTGTTCAACTACATAATAAATTGGAATTTCTGGAAGCCGTACTTTCGCTCCGTGGCAT 700 TCCATTCGACCTGCATCAACAGCCTCCTAGACTCCACGCATATCCGATGCTAGTGTTCTTCCACGTCGCTTCAGGTTACTGTGGCATAAATAAGAACTCA 800 GAGTGCAATGCTAATGAGCCCCTCTTAGGAACAAGCTAGCAATGGTCAGTTTGATGGGTGAGCAGGTAACCAGCATCCAATGAATCACTCTCAGGTTATT 900 GAAATGTCCAGGTAGCATGCTGCCCATGCCGGTTGGCTAAGACTAAATCGGCAGCTAAATCTGCGTCCCATTTAAATTAAGAGCAATGGAACAATGTGAG 1000 GGATCGCAAGAAATGATGGCGAGTATTGTAAGTACACGAAACTTGTTACTTGCGCCATCAGAAATCACGAAGGTGCCCGCAAATTAGTCATGTTATCCGT 1100 GCATCCACCACGCGCCAAGCCAATTCTGAGGATGCTGAACCGCCTCAAAGGCACTTTCTTAAGGACACGTGTGAGCTGAAGTTTTGCTTTTTGATAAACT 1200 TGACTGGCGAGCGCACGTAAAATTGCCATATCAACGCAGTAATCAGCTCAAATGCCCTAAATCTTTGTTTCTCCCAAATGTCTTAAAGATTTATTAATTT 1300 TTGATAACGTTGTTCAACTTTTGCCGGCATTCTATTTCGCGTGGTTGTCAGCTTCCTGTTTTCCTCGATGAATTGTGGTGCGCCTGCGATTCGGCCTTAA 1400 TTAGCTAATATTGGTTGCAAAATGCGGACGTGGGGAGATAATGTTGATGTTTCTTCTACGAGAATTATGTGAAAATAATTCACGCAAAAGGTTATGCACC 1500 TTCAAACGACAACAGCGTTGTGCATCCCAGATGCTACTTCTGGGAAAATTGATTGTTTGCGTGGACATGTCCGACACGATAACAATGGAAGTAATTGTTA 1600 CGTGGCGTCAAAGCGTGAGATTAAGACGGATGTATTCTGCAACATGAACGATGTGCTGCATTAGAGGTTATTCGCTAGTCGCCAGAAACTGAATGGATTC 1700 CTTCTGATTTTACCACGCATTGATTCAGTAGTGCCTTGGAAAATAAATGTTTTGCAAACAAATGTTGCTTTACAAAAGTGATTTGCCATCGCATTTTAGC 1800 AACTTAATTGCATTAACTGAATTCGGGATTTCATGAGGCACATGCGAGTAAGGAATAAAAAGGAGACTTCGTGATGTCTAATGCTCATTTGAACAGTGGC 1900 CCATTTATTGTGGTTTTAAGAAAGAATGCTATTTCAAGCGGATTGCAATTAACTTAAAGTTCATCATGCCATGGCCTTTATAGATTCCGTCAGTGACAAA 2000 ACGCCGCTAGCCTTCGATTGGCCCTACCTTCGAGTGAATTGCCGCTTCGACGAAGGGGACTTGAATGGTCCACGCTGGTGATGGAGCCACCTAGTGGCCT 2100 CGTGCTTGTAGGTTCGTGGAGTGTGTCGCTGGTATGTTAAATACACTTCTATGTTATCTACCCGAGTATGATGTCTCTTGTCGCCTTCGGGGATTGGAAG 2200 ATCTGGGAGAACTGCAGCACTTATGTGTGAATTGGCGATGGGGATGTTCTAATGCGAAGACGTGGTGCATTTGCATGGCCTGGTGATGGCTGCGGCATAT 2300 TTTGTCTCAGCAGATGTGGATATGTTTTTATTTTGTTGGGTGGCAGTATGTCGTCACAGGTGGTGAGTGCATTTTATAGTATAGTTTCAACTTGTTTCTC 2400 CATTCCACTGTTGAGTGTGTCGTGATTTATTGGAGGGTGAATTGCTACTGCACAGCCTTGAGAACGGCTTTAGAGTGTGAAGAATGTGCGACTTATAGAT 2500 AGTTGGGGAGATAGGATTGAAGGGATGAGTTGTGCTTGGGCAAAGACGAGATATTTCCACGCACTTTGTGCAGAAGCGTTAATACCCAGAAGGCGGGAAT 2600 TCCGAGCGCAGCTTGAGTAAATTCGTTGTGCCTTTCCCCTTGTAGGAACGGCTCCAGAATGCTGTCATGTTGTTATGTCAGAACGTGCTACTTTTAAGTA 2700 GATGTGATGGCTAGTATTACCATCGGGCAACTACGTGAAAGTTAGTTTGTTGAATTGCTTTAATAGCATCTGCTATTGGTATAAATTCTCACGTATTACC 2800 TGCACCTCTACAATTTAATTTGTTCTCCGGAGGTTGCAGACCTTTCTGTAGTATTTTGAGAGGAAGTGAGGGCATGGCGTTTCAAGTTGTTGGCTATAAA 2900 TTGATGCACATGCAAGGTTCCCTTCCAACTGCCTTAGCAAGCATCCCGCAAGCGATTTCCCCCCACCTACTTTTTTTCAAAAAGCTGAAGTGCCTTCTCA 3000 GTGCCCACGTAGTCCCTTTTAGCTTGACAAAGCGCAAGATGCACGAATTGTGCGTCTCTAGGCGCCTTCTACAGGATCTACGTATGCTAGTGACGTTGAC 3100 TTCCCAGGCATGGTGAGTGAATCATCTAATTACCGCTTCACATCACACAGTGCCTTCCAGGGCTGGCTCTCCCTTTCTGCTTTGTCTCTAACATGCTGGT 3200 TAACAGCCTCAAAGACGACCTAGTTCCTATTTCAAGCTGGCTCCTTG 3247 117 Resultados 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Figura R.16. Estructura secundaria de la molé u # do d e o la r io -hé ce, n enrrolladas, así como tamb ín ice ntigénico (Ja e n ) a a e ta en s p r cie. g te n (Laser 2. .3 e ó de las p te s r ombi a part de s NA e c do on l ob to d r ali ar a s e d tic lóg co s u t xp lo n sel cc #1 y # orr s l s a e d s lis com jo lle a a c bo junt co ser EXPASY, se tiliza o ro f ad diagn s ic a a a), suero d du s a Para ello, se ro u r n pr na c in te r de s ORFs selec n os en e o e ión p E T . e c la 63 n e s bservan s eg nes α li las regiones flexibles, regio es ién la hidrofilicidad, el d a m so -Wolf y l prob bilidad de s r u e fi Pro rama Pro a gene). 2 Expr si n ro ína ec n ntes a ir lo cD s le ciona s. C e je e e z ens yo d iagnós o sero ico n lo prod c os de e resión de s clo es e ionados (#5, 1, #16 63), c e pondientes a os ORFs má d cua o tras el aná is ple v do a o n el vidor u r n sue s de pacientes con teniasis con irm a ( o t ados mediante PCR de la forma p rasitari eliminad así como s de in ivi o s nos. p d je o oteí s re omb an s a pa tir lo cio ad l vect r de expr s G X-4 -1 S diseñaron cebadores para subclonar el marco de os 4 insertos amplificados (#5, #11, #16 y #63) fueron ligados en el vector de expresión pGEX 4T-1 (#5pGEX 4T-1, #11pGEX 4T-1, #16pGEX 4T-1 y #63pGEX 4T-1), con la consiguiente infección de células XL1-Blue. Después, tras la transformación, se tomaron algunas colonias para llevar a cabo “minipreps” a fin de lectura abierto (ORF) de dichas moléculas y se amplificaron sus secuencias mediante el uso de la PCR. L 1 00 110 AA BB TT CC H0 -4 4.5 .5 A0 1. -1.7 7 S1 6 Re a Reg o io s le les ie rof ida nic giones alf Regiones beta i nes enrrolladas Reg ne f xib Superfic Hid ilic d Índice antigé o 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 00 110 AA BB TT CC H0 -4 4.5 .5 A0 1. -1.7 7 S1 6 Re a Reg o io s le les ie rof ida nic giones alf Regiones beta i nes enrrolladas Reg ne f xib Superfic Hid ilic d Índice antigé o 118 Resultados comprobar mediante secuenciación la correcta subclonación. Una vez confirmada la clonación, el DNA obtenido se transformó en células competentes BL21 de E. coli, para inducir la expresión de las correspondiente proteínas de fusión. Los extractos proteicos de E. coli BL21 inducidos con IPTG fueron fraccionados en geles SDS-PAGE al 10- 12.5 % por el método de Laemmli (1970), con marcadores de peso molecular (Biorad y Sigma). Previamente, las muestras fueron desnaturalizadas con B-PER, que rompe las bacterias y separa las proteínas solubles e insolubles; además, confiere estabilidad a dichas proteínas. Como podemos observar en la figura R.17, en todos los casos, excepto en el plásmido #11pGEX 4T, la proteína mayoritaria presente en los extractos de E. coli inducida con IPTG corresponde con las proteínas de fusión codificada por los plásmidos #5pGEX 4T, 16pGEX 4T y #63pGEX 4T. Las proteínas de fusión inducidas por dichos plásmidos kDa (26 kDa + 9.8 kDa); 63 pGEX 4T-1 = 38.4 kDa (26 kDa + 12.4 kDa); # presentan los siguientes pesos moleculares en gel de poliacrimada con SDS: #5 pGEX 4T-1 = 32.0 kDa (26 kDa + 6.0 kDa); 16 pGEX 4T-1 = 35.8# # Para el plásmido #11pGEX 4T, no se observó la presencia de la proteína recombinante esperada, bien porque no se pudo inducir en cantidad suficiente para su identificación entre las moléculas de E. coli, o bien por la formación de cuerpos de inclusión. Desafortunadamente, todas las proteínas recombinantes expresadas se encontraban en la fracción insoluble, dificultando su purificación. No obstante, antes de llevar a cabo estrategias para ello, comprobamos la especificidad de dichas proteínas recombinantes con los sueros de los pacientes con teniasis. 119 Resultados 1 2 3 4 5 6 7 8 9 180 116 84 58 48 36 26 kDa tudió de manera preliminar mediante “Western blot”, empleando como antígeno el extracto e de las células BL21 transformadas. Las ra R.18). Tras repetir en varias ocasiones s ensayos descritos, las proteínas recombinantes obtenidas de los clones aislados y seleccionados de la genoteca de adulto de T. solium no fueron reconocidas por los sueros de los pacientes teniásicos, resultando moléculas no antigénicas en nuestras condiciones de trabajo. 2.2.4 Estudio primario de la inmunorreactiv idad de las proteínas de fusión mediante, “Western blot”, con sueros de pacientes con teniasis. La reactividad de las proteínas recombinantes expresadas con anterioridad se es crudo correspondiente de la fracción insolubl proteínas separadas por SDS-PAGE fueron electrotransferidas a membranas de nitrocelulosa (Towbin, 1979) e incubadas con la mezcla de sueros humanos de pacientes con teniasis confirmada, así como la mezcla de sueros humanos control. El resultado fue totalmente negativo en todos los casos (Figu lo Figura R . 17 . Electroforesis en gel SDS-PAGE al 12.5% teñido con azul de Coomassie. Expresión de las proteínas recombinantes de los clones #5, #11, #16 y #63 en pGEX-4T-1. (1) marcador de peso molecular teñido (Sigma marker proteico insoluble del clon #5, (4) extracto proteico soluble del clon #11, (5) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 180 116 84 58 48 36 26 kDa wide range MW de Sigma), (2) extracto proteico soluble del clon #5, (3) extracto to proteico soluble del clon tracto proteico soluble del extracto proteico insoluble del clon #11, (6) extrac #16, (7) extracto proteico insoluble del clon #16, (8) ex Figura R . 17 . Electroforesis en gel SDS-PAGE al 12.5% teñido con azul de Coomassie. Expresión de las proteínas recombinantes de los clones #5, #11, #16 y #63 en pGEX-4T-1. (1) marcador de peso molecular teñido (Sigma marker proteico insoluble del clon #5, (4) extracto proteico soluble del clon #11, (5) clon #63, (9) extracto proteico insoluble del clon #63. wide range MW de Sigma), (2) extracto proteico soluble del clon #5, (3) extracto to proteico soluble del clon tracto proteico soluble del extracto proteico insoluble del clon #11, (6) extrac #16, (7) extracto proteico insoluble del clon #16, (8) ex clon #63, (9) extracto proteico insoluble del clon #63. 120 Resultados M 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura R.18 Análisis inmunoenzimático mediante “Western blot” de las proteínas recombinantes expresadas correspondientes a los clones purificados de las genotecas de expresión de adulto de T. solium. Membrana incubada con una mezcla de sueros de pacientes portadores de T. saginata (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker wide range MW” de Sigma), (1) fracción soluble del clon #5 inducido, (2) fracción insoluble del clon #5 inducido, (3) fracción soluble del clon #11 inducido, (4) fracción insoluble del clon #11 inducido, (5) fracción soluble del clon #16 inducido (6) fracción insoluble del clon #16 inducido, (7) fracción soluble del clon 116 94 84 66 55 45 36 29 24 kDa . , #63 inducido, (8) fracción insoluble del clon #63 inducido. M 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura R.18 Análisis inmunoenzimático mediante “Western blot” de las proteínas recombinantes expresadas correspondientes a los clones purificados de las genotecas de expresión de adulto de T. solium. Membrana incubada con una mezcla de sueros de pacientes portadores de T. saginata (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker wide range MW” de Sigma), (1) fracción soluble del clon #5 inducido, (2) fracción insoluble del clon #5 inducido, (3) fracción soluble del clon #11 inducido, (4) fracción insoluble del clon #11 inducido, (5) fracción soluble del clon #16 inducido (6) fracción insoluble del clon #16 inducido, (7) fracción soluble del clon 116 94 84 66 55 45 36 29 24 kDa . , #63 inducido, (8) fracción insoluble del clon #63 inducido. Ante esta situación, se recurrió a otros abordajes para asegurar los objetivos de está formada por 278 aminoácidos, con un peso molecular órico de 30.58 kDa y un punto isoeléctrico de 4.53 (Figura R.19). Además, la proteína deducida está provista de un posible péptido señal (primeros 20 aminoácidos). Esta secuencia posee 4 sitios potenciales de N-glicosilación (Figura R.19). diagnóstico propuestos, y se procedió al aislamiento de genes ya definidos por su interés diagnóstico, como TSES 33 y TSES 38 de T. solium (Levine et al., 2004). 3. Subclonación de la molécula TSES38. Primero se procedió a la búsqueda de la molécula TSES 38, ya que su potencial como herramienta diagnóstica había sido previamente descrito por Levine et al.(2004). Para ello, se buscó su secuencia en el GenBank (No. de acceso AY128681). La secuencia mencionada presenta las siguientes características: está compuesta por una secuencia de 1089 nucleótidos, con un marco de lectura abierto de 837 pb con un codón de inicio (ATG) en la posición 13 y un codón de parada (TGA) en la posición 849. La secuencia aminoacídica deducida te 121 Resultados cggatacacaccatgttgaacatcattacagtcttattttgcgtggcatattgcacaggcgaaacgagtccaaagatgtggggttc M L N I I T V L F C V A Y C T G E T S P K M W G S gttgtctcaaagccgacgggaccatcggacacaatgagctatcgggtcggtgactatgccggcgtatttatttacaatggaacaaaa V V S K P T G P S D T M S Y R V G D Y A G V F I Y N G T K gatagaatcacgttcgacaatggcagctgcatagtaaatcaggcaatttggggcaatccttgtcaaataggcgaaggcactgttaa D R I T F D N G S C I V N Q A I W G N P C Q I G E G T V N acagtaaatgacgtgaacatgcaaaacgagatcaggatttacgcaggttccggcgatgacccctaccatctatcaacatattttct T V N D V N M Q N E I R I Y A G S G D D P Y H L S T Y F L aattgcaaatttcccccactcgcaatagaggaagctgacccgaagacgtcgtttccactctcccgatttgtcaaaggccagcagt N C K F P P L A I E E A D P K T S F P L S R F V K G Q Q S caacttgactttgctgttaaaggagcagacagcgaggattcggttatgctcagaagaaccgcagaaacactctgcgattggatagg Q L D F A V K G A D S E D S V M L R R T A E T L C D W I G aaagtcaggttcaattacagcgacgcttgcgttgatttggagaaggacgaagcatcagacttgagggttttccatggagtattcac K V R F N Y S D A C V D L E K D E A S D L R V F H G V F T cgatcggacgtccaatgggacacctatacgtttttaacgtccaaatcggagctggcaataagcgtcgactatacgcaaagtggga R S D V Q W D T Y T F L T S K S E L A I S V D Y T Q S G I ccagaagtggcggaatgcaaccagtacgggggagtgcaatttccgacaacatcctcgggatctgcgttgacctacacgatcagtg P E V A E C N Q Y G G V Q F P T T S S G S A L T Y T I S tcgc 90 nt R 26 aa cgg 180 R 30 catc 270 I 30 gccg 360 P 30 ccttc 450 F 30 cgtg 540 V 30 tccc 630 P 30 tttca 720 S 30 ttatg 810 V M 30 ctcgggacagcaataatgctgacgtattcgggaggctgacgaattagccaatggatgcgactgatgttagacgactgcaccgatac L G T A I M L T Y S G G * gtcacttgctccactcttttaagagttctacattttctttctcaccaacaagccactctttgcagtttgaaactctaatcgctcgt aaac 900 12 gctc 990 tcaagcactcacatctactctattaatgaacaaggcaagtgtgccattttgcgtcaataaagtttcattaacatttctcaaaaaaaaaaa 1080 aaaaaaa 1088 F1 R2 R1 R3 a Figura R.19. Secuencia nucleotídica en minúsculas (nt) y aminoacídica en mayúsculas (aa) deducida de la molécula TSES38. Las cajas sombreadas en color verde corresponden al ATG de inicio y al codón de parada; las puntas de flecha indican los posibles sitios de N-glicosilación. La caja sombreada de color azul se corresponde con l cebador directo, las cajas sombreadas de color amarillo se corresponde con los tres ebadores reversos, diseñados para su clonación. e c Teniendo en cuenta las características de la molécula en estudio, se planteó una RT- PCR para conseguir la molécula TSES38 completa. Para ello, se diseñaron un cebador directo (TSES38 F1) y tres cebadores reversos (TSES38 R1, R2 y R3) (tabla M.3 de “Métodos”), que abarcan el ORF de dicho cDNA (ver figura R.19). También, se preparó RNA total a partir de extractos de cuello/escólex y proglótides maduras/grávidas de adulto de T. solium, como se describe en el apartado de “Métodos”. A continuación se determinó la concentración de ácidos nucleicos como se indica en el apartado 3.2.11 de “Métodos”. 122 Resultados La RT-PCR se realizó empleando diferentes cantidades de RNA total de cuello/escólex (13,5 n l 1-R , n un am ño e 8 ue pod c T. soliu os g e u ada qu ómico 800 p que las nte ores s tra a la es D o. Fi 0) A con pu en ó s n c tran e c pe s. í, se procedió a re e é o ” El r tado la ecue c nfi ó q a í c on d molécula TSES 8 ng) y proglótides maduras/grá as (22,9 g) co a combinación de cebadores F 1 obteniéndose u a banda con a t a d 00 pb q ría orresponderse con la molécula TSES 38 de m. Además, en la reacción añadimos como control p itivo DNA enómico e T. solium (200 ng), am ficándos n fragmento de aproxim mente 1,5 kb e podría ser el gen gen (intrones + exones). También se eció otra banda de b posiblemente coincide con el fragmento obtenido en a ri muestras, gracia a z s de RNA total en mu tra de NA genómic ( gura R.2 . tinuación se procedió a cortar las bandas de amplificación para rificarlas con el Kit de “Qiag gel extraction”, y después se realiz u ligació on el vector TOPO, y la sformación d élulas E. coli TOPO10 com tente último, se llevó a cabo PCRs de colonias para evaluar el producto obtenido. As alizar el cultivo para la Miniprep y con el DNA obtenido se desarrolló la reacción de secuenciación, como se indica en los apartados 3.2.5 y 3.2.6 d “M t dos . esul de s nciación nos o rm ue h b amos l a o la 3 . tivo. Tinción con bromuro de etidio. vid 5 n d pli apr Por Figura R.20. Electroforesis en gel de agarosa al 1 % en el que se observa el cDNA de la molécula TSES 38 aislada mediante RT- PCR. Muestra 1 RNA de cuello-escólex de adulto de T. solium (13,5 ng), Muestra 2, RNA de proglótides de adulto (22,95 ng), Muestra 3 y 4, controles negativos. (M) marcador de 100 pb “ladder” (B control posi M 5 1 2 3 4 Pb 1000 M 5 1 2 3 4 iotools). Muestra 5 DNA genómico de T. solium como 500 100 Figura R.20. Electroforesis en gel de agarosa al 1 % en el que se observa el cDNA de la molécula TSES 38 aislada mediante RT- PCR. Muestra 1 RNA de cuello-escólex de adulto de T. solium (13,5 ng), Muestra 2, RNA de proglótides de adulto (22,95 ng), Muestra 3 y 4, controles negativos. (M) marcador de 100 pb “ladder” (B control posi iotools). Muestra 5 DNA genómico de T. solium como tivo. Tinción con bromuro de etidio. Pb 1000 500 100 123 Resultados 3.1. Expresión de la proteína recombinante TSES38 en pGEX-4T. Para llevar a cabo la subclonación en el vector de expresión pGEX-4T, en primer lugar se introdujeron sitios de restricción en cada extremo de la molécula TSES 38. Para ello, se utilizó la técnica de PCR y los cebadores diseñados para este fin están descritos en la tabla M. 5 de “Métodos”. El DNA molde empleado fue 1 µl del plásmido recombinante diluido 1:10. Tras realizar la PCR, los productos obtenidos fueron visualizados en gel de agarosa, y purificados como se describe en “Métodos”. Estos productos fueron nuevamente subclonadas en el vector pCR2.1 TOPO, con el fin de comprobar si las colonias obtenidas eran recombinantes y con las modificaciones diseñadas. Los DNA plasmídicos fueron secuenciados y se confirmó la presencia de los sitios de restricción indicados (Eco RI y Xho I). Después, se realizó la digestión con dichas enzimas de restricción, Eco RI y Xho I, para la liberación del inserto y su posterior purificación, como se describe en el apartado de “Métodos”. Con el producto obtenido se llevó a cabo la subclonación en el vector de expresión pGEX-4T previamente linearizado con las mismas enzimas. Después de la transformación de células competentes, se tomaron algunas colonias para comprobar la correcta subclonación mediante secuenciación. A ontinuación, con el DNA plasmídico se transformaron células BL21 de E. coli, para inducir la expresión de la correspondiente proteína de fusión. Para visualizar dicha expresión, se realizó el fraccionamiento de los extractos proteicos de E. coli, previamente tratados con B-PER, en un gel al 10% SDS-PAGE (Figura R.21A). Observamos que la proteína mayoritaria presente en el extracto de E. coli inducido se corresponde con la proteína de fusión de GST (26 kDa) más la proteína TSES38 (30.58 kDa), con un peso de 56.58 kDa. Además, los resultados obtenidos nos mostraron que esta molécula se expresa como producto insoluble. 3.2 Estudio de la in munorreactividad de la proteína de fusión reco mbinante TSES38 mediante “Western blot” con sueros de pacientes con teniasis. Por último, la transferencia de esta proteína a membranas de nitrocelulosa y revelado inmunoenzimático (“Western blot”) se desarrolló de acuerdo con el apartado 3.3.11 de “Métodos”. En la Figura R.21B, se muestra el resultado del “inmuno-blot” incubado con sueros de pacientes portadores de T. saginata, una mezcla de sueros de pacientes sanos, una mezcla de sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de etacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55). Desafortunadamente, ninguno e los sueros probados en este estudio ha reconocido el antígeno recombinante. c m d 124 Resultados A BA BA B 4. Construcción de un cDNA Quimérico La molécula TSES 33 no se pudo aislar mediante RT-PCR a partir del RNA total de T. solium, como se pensó al inicio de esta parte del trabajo. Por ello, se optó por la construcción de un cDNA quimérico. Con este objetivo, se buscó en el banco de datos GenBank la secuencia de interés TSES 33 (No. de acceso AY183761). La m 180 84 58 48 36 26 olécula pleta está formada por 1047 pb. Con un ATG de inicio en la posición 13, y un olécula en 116 M 1 2 3 4 Figura R .21 (A) Electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% con el fraccionamiento de los productos de expresión pGEXT de la molécula TSES38, teñido con azul de Coomassie. (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker wide range MW” de Sigma), (1) extracto proteico no inducido, (2) extracto proteico soluble, (3) extracto proteico insoluble (la flecha señala el tamaño de la proteína), (4) inducido. (B) Análisis inmunoenzimático “Western blot” de la proteína recombinante inducida del clon TSES 38, (1-12) cada tira de nitrocelulosa fue incubada con un suero de paciente con T. saginata, (13) tira incubada con suero de paciente sano, (14) tira incubada con una mezcla de sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55)., 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 kDa 180 84 58 48 36 26 116 M 1 2 3 4 Figura R .21 (A) Electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% con el fraccionamiento de los productos de expresión pGEXT de la molécula TSES38, teñido con azul de Coomassie. (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker wide range MW” de Sigma), (1) extracto proteico no inducido, (2) extracto proteico soluble, (3) extracto proteico insoluble (la flecha señala el tamaño de la proteína), (4) inducido. (B) Análisis inmunoenzimático “Western blot” de la proteína recombinante inducida del clon TSES 38, (1-12) cada tira de nitrocelulosa fue incubada con un suero de paciente con T. saginata, (13) tira incubada con suero de paciente sano, (14) tira incubada con una mezcla de sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55)., 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 180 84 58 48 36 26 116 M 1 2 3 4 Figura R .21 (A) Electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% con el fraccionamiento de los productos de expresión pGEXT de la molécula TSES38, teñido con azul de Coomassie. (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker wide range MW” de Sigma), (1) extracto proteico no inducido, (2) extracto proteico soluble, (3) extracto proteico insoluble (la flecha señala el tamaño de la proteína), (4) inducido. (B) Análisis inmunoenzimático “Western blot” de la proteína recombinante inducida del clon TSES 38, (1-12) cada tira de nitrocelulosa fue incubada con un suero de paciente con T. saginata, (13) tira incubada con suero de paciente sano, (14) tira incubada con una mezcla de sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55)., 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 kDa com codón de parada TAA en la posición 816; el marco de lectura abierto presenta 804 pb. Utilizando el programa “Mapdraw”, se buscó una enzima que cortara la m dos fragmentos de tamaño parecido, encontrándose un sitio de restricción para la endonucleasa Rsa I (esta enzima corta produciendo fragmentos con extremos romos), ubicado en el nucleótido 475, quedando dos partes, una de 475 pb y otra de 329 pb. Tras este estudio preliminar, se procedió al diseño de cebadores directos y reversos solapantes para cada una de las partes que están recogidos en la Tabla M.6 de “Métodos”. Como podemos observar en las figuras 22A y 22B, la construcción se 125 Resultados realizó mediante 5 amplificaciones seriadas por cada fragmento, en las que el producto obtenido de cada reacción se utilizó como molde para la siguiente reacción de amplificación. Por tanto, fuimos obteniendo amplicones de 106 pb, 202 pb, 286 pb, 384 pb y 475 pb para el fragmento inicial y, 108pb, 188 pb, 265 pb, 285 pb y 318 pb para el fragmento terminal. 1° amplicón (106 pb) F1 R1 2° amplicón (202 pb) F2 R2 3° amplicón (286 pb) F3 R3 4° amplicón (384 pb) F4 R4 500- 200- 417- 200- 500- 5° amplicón (475 pb) F5 R5 Figura R.22A. Esquema de la construcción del fragmento inicial de la molécula quimérica TSES33. 300- 500- 300- 500- 300- 1° amplicón (106 pb) F1 R1 1° amplicón (106 pb) F1 R1 2° amplicón (202 pb) F2 R2 2° amplicón (202 pb) F2 R2 3° amplicón (286 pb) F3 R3 3° amplicón (286 pb) F3 R3 4° amplicón (384 pb) F4 R4 4° amplicón (384 pb) F4 R4 500- 200- 500- 200- 417- 200- 417- 200- 417- 200- 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- 5° amplicón (475 pb) F5 R5 5° amplicón (475 pb) F5 R5 Figura R.22A. Esquema de la construcción del fragmento inicial de la molécula quimérica TSES33. 500- 300- 500- 300- 500- 300- 126 Resultados Con los amplicones finales obtenidos en la quinta PCR con los cebadores F5-R5 (fragmento inicial) y con los cebadores Fq5-Rq5 (fragmento terminal), se realizó la ligación de cada uno en el vector pCR2.1 TOPO (Figura R.23). Después, una vez comprobadas las secuencias de los clones obtenidos, se procedió a introducir los sitios de restricción adecuados, en el fragmento inicial (Eco R I en el extremo 5’ y Rsa I en el extremo 3´) y en el fragmento final (Rsa I en el extremo 5´ y Xho I en el extremo 3´), para permitir su posterior ligación, mediante PCR utilizando los cebadores diseñados para este fin (tabla M.4. “Métodos”) (Figura R.23). Estos últimos fragmentos fueron purificados y subclonados de nuevo en pCR2.1 TOPO, siguiendo los protocolos ya indicados (Figura R.23). 4º amplicón (285pb) Fq4 Rq4 3º amplicón (265pb) Fq3 Rq3 2° amplicón (188 pb) Fq2 Rq2 1° amplicón (108) pb) Fq1 Rq1 5º amplicón (318pb) Rq5Fq5 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- -500 -300 Figura R.22B. Esquema de la construcción del fragmento terminal de la molécula quimérica TSES33. 4º amplicón (285pb) Fq4 Rq4 3º amplicón (265pb) Fq3 Rq3 2° amplicón (188 pb) Fq2 Rq2 2° amplicón (188 pb) Fq2 Rq2 1° amplicón (108) pb) Fq1 Rq1 1° amplicón (108) pb) Fq1 Rq1 5º amplicón (318pb) Rq5Fq5 5º amplicón (318pb) Rq5Fq5 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- 500- 300- -500 -300 -500 -300 Figura R.22B. Esquema de la construcción del fragmento terminal de la molécula quimérica TSES33. 127 Resultados Figura R.23. Representación esquemática de la construcción del cDNA quimérico de la molécula TSES33. Eco Rsa I Rsa I Xho I RI Fragmento inicial (475pb) Fragmento terminal (318 pb) Subclonación Topo pCR4 Topo pCR4 Sitios de restricción añadidos mediante PCR Subclonación Topo pCR4 Topo pCR4 Vector pGEX-4T-1 Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina co RI Rsa I Rsa I Xho I Digestión DigestiónEco RI + Rsa I Xho I + Rsa I Eco RI + Xho I Eco RI Xho I Ligación Vector pGEX-4T-1 Eco RI Rsa I Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Xho I EEco Rsa I RI E co Rsa I Rsa I Xho I RI Rsa I Xho I Fragmento inicial (475pb)Fragmento inicial (475pb) Fragmento terminal (318 pb) Subclonación Topo pCR4Topo pCR4 Topo pCR4Topo pCR4 Sitios de restricción añadidos mediante PCR Subclonación Topo pCR4Topo pCR4 Topo pCR4Topo pCR4 Vector pGEX-4T-1 Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Eco RI Rsa IEco RI Rsa I Rsa I Xho IRsa I Xho I Digestión DigestiónEco RI + Rsa I Xho I + Rsa I Eco RI + Xho I Eco RI Xho I Ligación Vector pGEX-4T-1 Eco RI Rsa I Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Xho I 128 Resultados A continuación, se realizó la digestión de los fragmentos modificados para la liberación bservan además de las bandas de interés (475 pb y 318pb), dos bandas mayores de mil ares de bases, una de 200 pb y otra de 600 pb, debido a que la enzima Rsa I corta en uatro sitios (504, 564, 1594 y 2757) y Eco RI corta en 2 sitios (284 y 304) dentro de la cuencia del vector TOPO. ras purificarlos, se llevó a cabo la subclonación en el vector de expresión pGEX-4T-1, reviamente digerido con Eco RI y Xho I (Figura R.24). El plásmido recombinante se élulas de E. coli BL21 competentes, para inducir la expresión e ducción de las correspondiente proteínas de fusión, como se indica en el apartado .3.9 de “Métodos”. Sin embargo, cuando revisamos el tamaño de la proteína combinante en un gel de SDS-PAGE al 10%, nos percatamos de que presentaba un eso molecular de 45 kDa, diferente al esperado, de 54.8 kDa (26 kDa de GST más 28.8 Da de la molécula TSES33 completa) (Figura R.25 A). Además, la proteína combinante estaba presente en la fracción insoluble del extracto de E. coli. Figura R.24 Electroforesis en geles de agarosa al 1%. (A) Calle 1, 2, 3, productos del fragmento inicial de la molécula TSES 33 después de ser digeridos con las enzimas Eco RI y Rsa I. Calle 4, 5, 6, productos del fragmento terminal de la molécula TSES 33, y digeridos con las enzimas Xho I y Rsa I. (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools) Círculos amarillos destacan mentos de interés. Tinción con bromuro de etidio. de los insertos, como se describe en el apartado 3.2.10 de “Métodos”. En la figura 24 se o p c se T p secuenció para determinar su correcta subclonación y posteriormente se llevó a cabo la transformación de c in 3 re p k re los frag 1 2 3 4 5 6 M A B 1000 500 100 pb Figura R.24 Electroforesis en geles de agarosa al 1%. (A) Calle 1, 2, 3, productos del fragmento inicial de la molécula TSES 33 después de ser digeridos con las enzimas Eco RI y Rsa I. Calle 4, 5, 6, productos del fragmento terminal de la molécula TSES 33, y digeridos con las enzimas Xho I y Rsa I. (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools) Círculos amarillos destacan mentos de interés. Tinción con bromuro de etidio. los frag 1 2 3 4 5 6 M A B 1000 500 100 Figura R.24 Electroforesis en geles de agarosa al 1%. (A) Calle 1, 2, 3, productos del fragmento inicial de la molécula TSES 33 después de ser digeridos con las enzimas Eco RI y Rsa I. Calle 4, 5, 6, productos del fragmento terminal de la molécula TSES 33, y digeridos con las enzimas Xho I y Rsa I. (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools) Círculos amarillos destacan mentos de interés. Tinción con bromuro de etidio. 1 2 3 4 5 6 M A B 1000 500 100 pb los frag 129 Resultados Por esta razón tuvimos que enviar a secuenciar totalmente el clon de la quimera obtenida, confirmándose que se había perdido un nucleótido inexplicamente en la zona donde se ligaron los extremos romos (obtenidos con la enzima Rsa I) (Figura R.25 B), cambiándonos el marco de lectura y rindiendo una proteína de 181 aminoácidos, con un peso molecular teórico de 19.9 kDa diferente al esperado. Después de varios intentos fallidos para realizar dicha estrategia, se decidió desarrollar otro abordaje para conseguir la molécula completa TSES33. introducir los sitios de restricción adecuados, siguiendo la misma estrategia empleada T Figura R.25 (A) . Electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% teñido con azul de Coomassie. Expresión de la molécula TSES33 (truncada) (1) extracto proteico no inducido, (2) extracto proteico inducido, (3) extracto proteico inducido soluble, (4) extracto proteico inducido insoluble, (M) marcador de peso molecular (“Prestained SDS-PAGE molecular weight markers) (Sigma). La flecha muestra el tamaño obtenido de la molécula truncada TSES33. (B) Secuencia parcial de la molécula TSES 33, donde se observa la ausencia del nucleótido timina (T) en la 1 2 3 4 M En la segunda estrategia, utilizamos nuevamente el programa “Mapdraw” para buscar una enzima que cortara únicamente en la segunda parte de la molécula y que rindiera extremos cohesivos, encontrando un sitio para Hind III en el nucleótido 169 (Figura R.26). Después, nuevamente se diseñaron 3 cebadores reversos solapantes, y mediante tres reacciones de PCR, utilizando como molde el fragmento inicial de la molécula, se amplificó una secuencia de 642 pb que se subclonó en el vector pCR2.1 TOPO (Figura R.26). Una vez comprobada la secuencia de los clones obtenidos, se procedió a parte que indica la flecha en la quimera preparada. B A kDa TT Figura R.25 (A) . Electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% teñido con azul de Coomassie. Expresión de la molécula TSES33 (truncada) (1) extracto proteico no inducido, (2) extracto proteico inducido, (3) extracto proteico inducido soluble, (4) extracto proteico inducido insoluble, (M) marcador de peso molecular (“Prestained SDS-PAGE molecular weight markers) (Sigma). La flecha muestra el tamaño obtenido de la molécula truncada TSES33. (B) Secuencia parcial de la molécula TSES 33, donde se observa la ausencia del nucleótido timina (T) en la 1 2 3 4 M B A kDa parte que indica la flecha en la quimera preparada. 130 Resultados en el fragmento mutado; se introdujo el sitio de restricción Hind III en el extremo 3’ de la parte inicial de la molécula (Eco RI en el extremo 5’ y Hind III en el extremo 3’), y en la parte terminal (Hind III extremo 5’ y Xho I en el extremo 3’) mediante PCR. Después, se realizó la digestión del cDNA TSES 33 completo para su posterior ligación en pGEX-4T -1 (Figura R.26). Fragmento inicial (475pb)Topo pCR4 Sitios de restricción añadidos mediante PCR Subclonación Topo pCR4 Topo pCR4 Vector pGEX-4T-1 Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Hind III Xho I Digestión DigestiónEco RI + Hind III Xho I + Hind III Eco RI + Xho I Eco RI Xho I Ligación Vector pGEX-4T-1 Eco RI Hind III Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Xho I Eco RI Hind III Eco RI Hind III Subclonación Topo pCR4 3º amplic ón (265pb)3º amplic ón (642pb) 2° amplic ón (188 pb )2° amplic ón (588 pb ) Rq2 1° amplic ón (108) pb )1° amplic ón (475) pb ) Fq1 Rq1 Fq1 Fq1 Rq2 PCRs Fragmento terminal 642 pb 162 pb Fragmento inicial (475pb)Topo pCR4 Sitios de restricción añadidos mediante PCR Subclonación Topo pCR4 Topo pCR4 Vector pGEX-4T-1 Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Hind III Xho I Digestión DigestiónEco RI + Hind III Xho I + Hind III Eco RI + Xho I Eco RI Xho I Ligación Vector pGEX-4T-1 Eco RI Hind III Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Xho I Eco RI Hind III Eco RI Hind III Subclonación Topo pCR4 3º amplic ón (265pb)3º amplic ón (642pb) 2° amplic ón (188 pb )2° amplic ón (588 pb ) Rq2 1° amplic ón (108) pb )1° amplic ón (475) pb ) Fq1 Rq1 Fq1 Fq1 Rq2 PCRs Fragmento inicial (475pb)Fragmento inicial (475pb)Topo pCR4Topo pCR4 Sitios de restricción añadidos mediante PCR Subclonación Topo pCR4Topo pCR4 Topo pCR4Topo pCR4 Vector pGEX-4T-1 Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Vector Resistencia ampicilina Hind III Xho I Digestión DigestiónEco RI + Hind III Xho I + Hind III Eco RI + Xho I Eco RI Xho I Ligación Resistencia Vector pGEX-4T-1 Eco RI Hind III ampicilina Resistencia ampicilina Vector Xho I Eco RI Hind IIIEco RI Hind III Eco RI Hind IIIEco RI Hind III Subclonación Topo pCR4Topo pCR4 3º amplic ón (265pb)3º amplic ón (642pb) 2° amplic ón (188 pb )2° amplic ón (588 pb ) Rq2 1° amplic ón (108) pb )1° amplic ón (475) pb ) Fq1 Rq1 Fq1 Fq1 Rq2 PCRs Fragmento terminal 642 pb 162 pb 131 Resultados Figura R. 26 . Representación esquemática de la segunda estrategia empleada para la correcta construcción del cDNA quimérico TSES 33. El plásmido recombinante fue secuenciado para confirmar su correcta subclonación, así como su composición. Más tarde, se llevó a cabo la transformación de células de E. coli BL21 competentes, para inducir la expresión de la correspondiente proteína de fusión. El fraccionamiento de las proteínas totales se realizó en un gel SDS-PAGE al 10% ndiendo una proteína mayoritaria con un peso molecular de 54.8 kDa (26 kDa de GST xtracto (Figura R.27). ri más 28.8 kDa de la molécula TSES33 completa) en la fracción insoluble y soluble del e 180 116 84 58 48 36 26 M 1 2 3 Figura R. 27. Electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% teñido con azul de Coomassie. Expresión de la molécula TSES33. (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker Wide Range MW” de Sigma), (1) extracto proteico no inducido, (2) extracto proteico inducido soluble, (3 )extracto proteico inducido insoluble. La flecha destaca la proteína recombinante TSES 33. kDa 180 116 84 58 48 36 26 M 1 2 3 Figura R. 27. Electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% teñido con azul de Coomassie. Expresión de la molécula TSES33. (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker Wide Range MW” de Sigma), (1) extracto proteico no inducido, (2) extracto proteico inducido soluble, (3 )extracto proteico inducido insoluble. La flecha destaca la proteína recombinante TSES 33. 180 116 84 58 48 36 26 M 1 2 3 Figura R. 27. Electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% teñido con azul de Coomassie. Expresión de la molécula TSES33. (M) marcador de peso molecular (“Sigma marker Wide Range MW” de Sigma), (1) extracto proteico no inducido, (2) extracto proteico inducido soluble, (3 )extracto proteico inducido insoluble. La flecha destaca la proteína recombinante TSES 33. kDa 132 Resultados 4.1 Estudio de la inmunorreactiv idad de las proteínas de fusión recombinantes TSES33 truncada y completa mediante “Western blot” con sueros de pacientes con stra que los sueros de los pacientes con teniasis, sueros de dividuos sanos y suero de conejo inmunizado no reconocen a la proteína combinante TSES33, tanto truncada como entera. teniasis. Para finalizar, se llevó a cabo la transferencia de los productos recombinantes expresados a membranas de nitrocelulosa; se incubó las membranas con sueros de pacientes, sueros de individuos sanos y una mezcla de sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55); para el revelado inmunoenzimático se siguió la metodología descrita en el apartado 3.3.11. En la figura R.28, se mue in re Figura R. 28. Análisis inmunoenzimático mediante “Western blot de pacientes con teniasis. (M) marcador de peso molecular (“Sig Wide Range MW” de Sigma). Membranas del 1 al 13 incubada pacientes con teniasis (T. saginata), Membrana 14 incubada con m sueros positivos a teniasis, Membrana 15 incubada con una mezcl de pacientes sanos. Membrana 16 incubada con una mezcla de 116 94 84 66 55 45 36 29 24 ” de sueros ma marker s con sueros de ezcla de a de sueros sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55), Figura R. 28. Análisis inmunoenzimático mediante “Western blot de pacientes con teniasis. (M) marcador de peso molecular (“Sig Wide Range MW” de Sigma). Membranas del 1 al 13 incubada pacientes con teniasis (T. saginata), Membrana 14 incubada con m sueros positivos a teniasis, Membrana 15 incubada con una mezcl de pacientes sanos. Membrana 16 incubada con una mezcla de 116 94 84 66 55 45 36 29 24 ” de sueros ma marker s con sueros de ezcla de a de sueros sueros de conejos inmunizados con glicoproteínas de metacestodos de T. solium (TEW53, TEW54, TEW55), 133 Resultados 5. Definición de marcadores moleculares para el diagnóstico de ténidos. Aplicación a la identificación de quistes aislados de hospedadores intermediarios De acuerdo a los objetivos de trabajo indicados, nos propusimos realizar una arlos III y, además, se realizaron arias visitas a un matadero de la región central de México, en los meses de diciembre e 2004 y 2005, en los que se obtuvieron 21 muestras encontradas en la cavidad bdo aracterísticas de los quistes estudiados se describen en “Materiales y Métodos” (tabla .1). Todas las muestras se examinaron mediante el uso de varios protocolos de PCR omo herramientas para la identificación molecular diagnóstica, siguiendo el algoritmo escrito en la figura 1 de “Materiales y Métodos”. En las figuras R.29 y R.30 se pueden preciar las propiedades macroscópicas de algunos de los quistes estudiados. identificación específica de los cisticercos obtenidos a partir de ganado bovino y porcino, hospedadores intermediarios de cestodos, mediante la definición de marcadores moleculares únicos de ténidos y parásitos relacionados. Nuestra meta no sólo era el diagnóstico de estos cestodos, si no también llevar a cabo un reconocimiento diferencial de otros quistes parasitarios de morfología similar que se localizan en músculo esquelético, cavidad abdominal y otros órganos de los animales mencionados. Para ello, se trabajó con 14 muestras quísticas enviadas al Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud C v d a minal y torácica de 350 canales de cerdo revisadas en ese periodo. Las c M c d a Figura. R.29 Hígados de cerdos con cisticercos de Taenia spp. (A) Se observa el quiste sobre la superficie del parénquima hepático. (B) Se observa el quiste dentro del parénquima. Las flechas señalan los quistes mencionados. A B Figura. R.29 Hígados de cerdos con cisticercos de Taenia spp. (A) Se observa el quiste sobre la superficie del parénquima hepático. (B) Se observa el quiste dentro del parénquima. Las flechas señalan los quistes mencionados. A B 134 Resultados A BA B Figura. R.30 . (A) Músculo de bovino que presenta lesiones no clasificadas; la flecha señala una de estas lesiones que se asemejan a granos de arroz. (B) Corazón de bovino, la flecha señala un cisticerco caseoso. Figura. R.30 . (A) Músculo de bovino que presenta lesiones no clasificadas; la flecha señala una de estas lesiones que se asemejan a granos de arroz. (B) Corazón de bovino, la flecha señala un cisticerco caseoso. 5.1 Extracción de DNA genómico de quistes La extracción de DNA genómico (gDNA) de quistes se llevó a cabo según el método descrito por Sambrook y Russell, 2001. El DNA obtenido se resuspendió en 50 µl de agua estéril Milli-Q (millipore). Una vez resuspendidas las muestras de DNA, se realizó roductos liofilizados. la valoración espectrofotométrica a 260/280 nm. En la tabla R.8 se incluyen los resultados estimados en la medición de la concentración del DNA de 20 muestras (#15- #34) de las 34 estudiadas, así como el cociente 260/280 para cada una de ellas. Además se preparó un gel de agarosa al 0.7% para observar la calidad del DNA obtenido (Figura R.31). Las muestras extraídas de los de los quistes #14, #15, #16 y #20, se trataron con RNAsa; además, fueron sometidas a extracción con fenol-cloroformo y, finalmente, purificadas en columnas de “Qiaqen”. Todas las muestras se liofilizaron con el fin de poder trabajar con la misma cantidad de DNA, a partir de diluciones adecuadas de los diferentes p 135 Resultados Tabla R.8. Concentración y cociente (260/280) para el DNA de 20 de las 35 muestras; mediciones realizadas con el Nanodrop. Muestra Concentración µg/ml Razón 260/280 #15 25.65 1.83 #16 128.75 1.09 #17 10.75 1.48 #18 133.30 1.55 #19 121.90 0.983 #20 46.35 1.34 #21 54.0 1.65 #22 11.20 1.52 #23 56.85 1.81 #24 131.65 1.17 # 25 39.05 1.43 # 26 27.00 1.28 # 27 7.85 1.14 # 28 6.70 2.80 # 29 11.85 1.17 # 30 14.75 1.16 # 31 19.45 1.54 # 32 9.05 1.06 # 33 9.55 1.22 # 34 11.75 1.05 M #2 #14 #15 #16 #17 #18 #19 #20 #21#22 #23 #24#25#27#29#30 #32 #34 #35 M Figura R .31. Electroforesis en gel de agarosa al 0.7%, para la observación de la calidad del gDNA extraído. 19 de las 34 quistes estudiados. Tinción con bromuro de etidio. (M) marcador λ BstE II (sigma). 8454- 4822- 3675- 1929- pb M #2 #14 #15 #16 #17 #18 #19 #20 #21#22 #23 #24#25#27#29#30 #32 #34 #35 M 1264- 702- Figura R .31. Electroforesis en gel de agarosa al 0.7%, para la observación de la calidad del gDNA extraído. 19 de las 34 quistes estudiados. Tinción con bromuro de etidio. (M) marcador λ BstE II (sigma). 8454- 4822- 3675- 1929- 8454- 4822- 3675- 1929- pb 1264- 702- 1264- 702- 136 Resultados 5.2 Diagnóstico por PCR 5.2.1. Multiplex-PCR derivada de los fragmentos de HDP2 E HDP2 (F1, F2, R1) inada la reacción de amplificación, se proce suali o o es de agarosa al 1%, con los siguientes resultados: una banda de 170 pb para las muestras de T. solium (#17, #19 y #27), y dos bandas, 170 y 600 pb, para las de T. saginata (#4, #9, #10, #11, #12, #13 y #14) (Figura R.32). onfirmándose que las muestras quísticas de masetero, diafragma, corazón, lengua y músculo, estaban infectadas con metacestodos de T. saginata, pero también se apreció que dos muestras de hígado (#19 y #27) estaban parasitadas por la fase larvaria de T. solium. Las otras muestras no rindieron patrón alguno, por lo que se recurrió a otros protocolos de amplificación para conseguir su identificación. Figura R.32 . Elect sis en gel d osa al 2 % d muestras amplificadas según el protocolo Multiplex -PCR, en la se observan la uestras amplificadas con los cebadores específic , F2 y R1. L estra #4, #9, 11, #12, #13 y #14, amplifican una banda de 600 p ra de 170 pb. Cabe destacar qu muestras 19 y 27 positivas para T. solium solo amp una banda de 170 pb, que se sponden con cisticercos que se encontraron en híga e incluyen ontroles positi e gDNA de T. hydatigena (T. hyd), T. solium (T. T. saginata g) y control n vo (-) Tinción con bromuro de etidio. T. hy d T. so l. T. sa g. C - n primer lugar, todas las muestras fueron examinadas con el protocolo Múltiplex PCR (González et al., 2000). Una vez term dió a vi zar el product btenido en gel Este protocolo presentó un patrón diferencial inequívoco entre ambos ténidos, c rofore HDP2 e agar que e las s 17 m os F1 as mu #10, # b y ot e las lifican dos. S corre vos dlos c sol), (T. sa evati 1000 pb 500 300 150 50 #1 #2 #3 #4 6 #7 #8 0 #11 #12 #1 #17 #19 #27 Figura R.32 . Elect sis en gel d osa al 2 % d muestras amplificadas según el protocolo Multiplex -PCR, en la se observan la uestras amplificadas con los cebadores específic , F2 y R1. L estra #4, #9, 11, #12, #13 y #14, amplifican una banda de 600 p ra de 170 pb. Cabe destacar qu muestras 19 y 27 positivas para T. solium solo amp una banda de 170 pb, que se sponden con cisticercos que se encontraron en híga e incluyen ontroles positi e gDNA de T. hydatigena (T. hyd), T. solium (T. T. saginata g) y control n vo (-) Tinción con bromuro de etidio. T. hy d T. so l. T. sa g. T. hy d T. so l. T. sa g. C - #5 # #9 #1 3 #14 rofore HDP2 e agar que e las s 17 m os F1 as mu #10, # b y ot e las lifican dos. S corre vos dlos c sol), (T. sa evati 1000 pb 500 300 150 50 #1 #2 #3 #4 6 #7 #8 0 #11 #12 #1 #17 #19 #27#5 # #9 #1 3 #14 137 Resultados 5.2.2 PCRs y PCR-RFLPs derivadas de los es paciadores transcri tos internos del DNA ribosomal (ITS1 e ITS2). Se realizó la caracterización de las muestras negativas por Multiplex PCR HDP2, utilizando las técnicas de PCR ITS 1 y 2. Los amplicones obtenidos con el protocolo PCR-ITS 1 presentaron el siguiente patrón: una banda de 700 pb para T. solium y T. saginata, una de 800 pb para T. hydatigena (#2, #6, #20, #26, #28, #29, #31, #33 y #35) (Figura R.34-A) y una banda mayor de 1000 pb que por descripción realizada por otros autores se correspondería con DNA de Echinococcus spp (#15, #16, #21, #22, #32). Sin embargo, en este estudio nos llamo la atención, que se apreció una doble banda menor de 1000 pb para la muestra #25, también patrón característico de Echinococcus spp un genotipo diferente) (Figura R.33). La para #6, # #15, Figura R.33 Electroforesis en gel de agarosa al 1 % de los productos de amplificación obtenidos a partir de la ITS1-PCR, en la que se observan las 6 muestras positivas a Echinococcus spp (#15, #16, #21, #22, #25 y #32). La muestra #25 presenta un doblete con tamaño inferior a 1000 pb. Se incluye el control positivo de gDNA de E. granulosus y control negativo (-) marcadores de 100 pb “ladder” (Biotools) Tinción con bromuro de etidio. 100- (como veremos más adelante corresponde a pb 1000- 500- #25#15 #16 #21 #22 #32 C- E. granulosuspb 1000- 500- #25#15 #16 #21 #22 #32 Figura R.33 Electroforesis en gel de agarosa al 1 % de los productos de amplificación obtenidos a partir de la ITS1-PCR, en la que se observan las 6 muestras positivas a Echinococcus spp (#15, #16, #21, #22, #25 y #32). La muestra #25 presenta un doblete con tamaño inferior a 1000 pb. Se incluye el control positivo de gDNA de E. granulosus y control negativo (-) marcadores de 100 pb “ladder” (Biotools) Tinción con bromuro de etidio. 100- C- E. granulosus PCR IT S2 (Figura R.34-B) mostró el siguiente patrón de bandas: una de 650 pb T. saginata, una de 600 pb para T. solium y una de 550 pb para T. hydatigena (#2, 20, #26, #28, #29, #31, #33 y #35), el resto de las muestras (#1, #3, #5, #7, #8, #16, #18, #21, #22, #23, #24, #25, #32 y #34) fueron negativas. Atendiendo a estos resultados, sólo a las muestras amplificadas con el protocolo PCR ITS 1 se les realizó un estudio de polimorfismo de DNA (RFLP). 138 Resultados r PCR-RFLP, el amplicón obtenido para el fragmento ITS1 fue uestras de T. hydatigena (#2, #6, Figura R.34 . Electroforesis en geles de agarosa al 1.5% de los productos de ión, A B pb 1000 750 500 300 150 50 En la caracterización po digerido con las enzimas Cfo I y Alu I. Los productos de las digestiones se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 2,5%. Las m #20, #26, #28, #29, #31, #33, y #35), digeridas con la enzima Cfo I, mostraron dos bandas, una de 500 pb y otra de 200 pb, y sólo una banda de 800 pb que no se digirió con la enzima Alu I (Figura R.34). amplificación obtenidos a partir de la PCR-ITS1 (A). En la que se observa que las muestras #2 y #6 rinden sólo una banda de 800 pb. (B) PCR-ITS 2 las mismas muestras #2 y #6 que amplifican una banda de 500pb, ambos resultados corresponde a muestras positivas para T. hydatigena. Las muestras #1, #3, #5, #7 y #8 no presentaron amplificac resultando negativas con estas técnicas. Se incluyen controles positivos de gDNA de T. hydatigena (T. hyd) T. solium (T. sol) y T. saginata (T. sag) y control negativo (-) marcadores de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. T. hy d. - ITS1-PCR T. so l. T. sa g. #1 #2 #3 #5 #6 #7 #8 T. hy d. - ITS2-PCR T. so l. T. sa g. #1 #2 #3 #5 #6 #7 #8 Figura R.34 . Electroforesis en geles de agarosa al 1.5% de los productos de ión, A B pb 1000 750 500 300 150 50 1000 750 500 300 150 50 T. hy d. - ITS1-PCR T. so l. T. sa g. #1 #2 #3 #5 #6 #7 #8 T. hy d. - ITS2-PCR T. so l. T. sa g. #1 #2 #3 #5 #6 #7 #8 amplificación obtenidos a partir de la PCR-ITS1 (A). En la que se observa que las muestras #2 y #6 rinden sólo una banda de 800 pb. (B) PCR-ITS 2 las mismas muestras #2 y #6 que amplifican una banda de 500pb, ambos resultados corresponde a muestras positivas para T. hydatigena. Las muestras #1, #3, #5, #7 y #8 no presentaron amplificac resultando negativas con estas técnicas. Se incluyen controles positivos de gDNA de T. hydatigena (T. hyd) T. solium (T. sol) y T. saginata (T. sag) y control negativo (-) marcadores de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. 139 Resultados Además, los productos de amplificación correspondientes a las muestras #15, #16, #21, #25 y #32, también fueron digeridos con las enzimas Cfo I, Rsa I y Msp I. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que todos los quistes identificados como E. granulosus presentaron un patrón de bandas similar con las enzimas Msp I y Rsa I, ayudándonos a confirmar que las 6 muestras se correspondían con DNA de E. ranulosus y no con el de E. multilocularis; sin embargo, la muestra # 25 presentó un patrón diferente, que si bien es característico de E. granulosus, pertenece a un genotipo diferente del resto de las muestras estudiada, genotipo G1 (oveja) (Figura R.36) (Bowles y McManus, 1993b). g pb 1000 750 500 300 150 #2 T . s #6 T. T. s #2 T. s #6 T . T . s Figura R.35 Electroforesis en geles de agarosa al 2.5 % en los que se ana digestión enzimática de los productos amplificados mediante la ITS 1-RFL Los amplicones procesados con la enzima Alu I que no digiere las muestras obteniendo sólo una banda aproximadamente 800 pb. (B) Las mismas m digeridos con la enzima Cfo I nos presentan 2 bandas una de 200 pb y otra d pb y que se corresponden a T. hydatigena. Se incluyen los controles positivos de gDNA de T. saginata (T. sag), T. hydatigena (T. hyd) y T. solium (T. sol). Ti a g . hy d . ol . ag . h y d. o l . liza la P. (A) #2 y #6 uestras e 500 nción con bromuro de etidio. pb A B 1000 750 500 300 150 #2 T . sa g. #6 T. h yd . T. so l. #2 T. sa g . #6 T . h yd . T . so l. Figura R.35 Electroforesis en geles de agarosa al 2.5 % en los que se analiza la digestión enzimática de los productos amplificados mediante la ITS 1-RFLP. (A) Los amplicones procesados con la enzima Alu I que no digiere las muestras #2 y #6 obteniendo sólo una banda aproximadamente 800 pb. (B) Las mismas muestras digeridos con la enzima Cfo I nos presentan 2 bandas una de 200 pb y otra de 500 pb y que se corresponden a T. hydatigena. Se incluyen los controles positivos de gDNA de T. saginata (T. sag), T. hydatigena (T. hyd) y T. solium (T. sol). Tinción con bromuro de etidio. A B 140 Resultados M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura R .36. Electroforesis en geles de agarosa al 3 % de los productos amplificados mediante PCR-ITS-1, y digeridos con las enzimas de restricción Rsa I, Msp I y Cfo I . Las calles 1, 4 y 7 pertenecen a la muestra #15, las calles 2, 5 y 8, a la muestra #21 y las calles 3, 6 y 9 a la muestra #25. (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. Rsa I Msp I Cfo I 1000 500 100- pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura R .36. Electroforesis en geles de agarosa al 3 % de los productos amplificados mediante PCR-ITS-1, y digeridos con las enzimas de restricción Rsa I, Msp I y Cfo I . Las calles 1, 4 y 7 pertenecen a la muestra #15, las calles 2, 5 y 8, a la muestra #21 y las calles 3, 6 y 9 a la muestra #25. (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. Rsa I Msp I Cfo I 1000 500 100- M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura R .36. Electroforesis en geles de agarosa al 3 % de los productos amplificados mediante PCR-ITS-1, y digeridos con las enzimas de restricción Rsa I, Msp I y Cfo I . Las calles 1, 4 y 7 pertenecen a la muestra #15, las calles 2, 5 y 8, a la muestra #21 y las calles 3, 6 y 9 a la muestra #25. (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. Rsa I Msp I Cfo I 1000 500 100- pb 5.2.3. PCR Eg 9 y Eg 16 Estas técnicas permiten diferenciar las especies del género Echinococcus. Por otro lado, la caracterización mediante PCR-Eg 9-RFLP de las seis muestras de Echinococcus sp (#15, #16, #21, #22, #25 y #32) supuso la digestión de los amplicones obtenidos con la PCR Eg9 con las enzimas Cfo I y Rsa I y su visualización en gel de agarosa al 3%. Los resultados mostraron una banda de aproximadamente 500 pb, que no se digirió con la a Cfo I (Figura R.37 A). Por el contrario, las muestras amplificadas con el nclusión, el protocolo PCR Eg9-RFLP nos ayudó a entificar la especie de Echinococcus mediante el uso de la enzima Cfo I, ya que si los roductos de amplificación se hubiesen cortado se tratarían de quistes de E. ultilocularis. Además, el uso de la enzima Rsa I nos ayudó a diferenciar los genotipos e E. granulosus. enzim protocolo Eg9 y que se digirieron con la enzima Rsa I, rindieron un patrón molecular de dos bandas de 400 y 100 pb en el caso de las muestras de E. granulosus genotipo G-1 (humano, oveja, cerdo). Sin embargo, se apreció una digestión parcial del amplicon para las muestras del genotipo G-7 (cerdos), obteniéndose el amplicon de 500 pb sin digerir, más dos bandas de 450 pb y una banda de 50 pb difícil de visualizarse (señalada en un circulo en la figura R.37 B). En co id p m d 141 Resultados Figura R.37. Electroforesis en geles de agarosa al 2.5 % en los que se observa la digestión enzimática (RFLP) de los productos amplificados mediante Eg9 PCR. (A). Las muestras digeridas con la enzima Cfo I no fueron digeridas rindieron sólo una banda de 500 pb. (B). Las muestras digeridas con la enzima Rsa I presentan una digestión parcial y nos muestran una banda doble de 500 y 450 pb y una muy tenue de 100 pb para el genotipo G7, y dos bandas, una de 400 y otra de 100 pb para el genotipo G1. (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. pb 1000 500 100 #15 #16 #21 #22 #25 #32 A B #15 #16 #21 #22 #25 #32 Figura R.37. Electroforesis en geles de agarosa al 2.5 % en los que se observa la digestión enzimática (RFLP) de los productos amplificados mediante Eg9 PCR. (A). Las muestras digeridas con la enzima Cfo I no fueron digeridas rindieron sólo una banda de 500 pb. (B). Las muestras digeridas con la enzima Rsa I presentan una digestión parcial y nos muestran una banda doble de 500 y 450 pb y una muy tenue de 100 pb para el genotipo G7, y dos bandas, una de 400 y otra de 100 pb para el genotipo G1. (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. pb 1000 500500 100100 #15 #16 #21 #22 #25 #32 A B #15 #16 #21 #22 #25 #32 Así, los productos amplificados para el genotipo G1 de E. granulosus con el protocolo CR Eg 16, y visualizados en geles de agarosa al 3 %, contenían tres bandas. Las andas presenta un patrón de 400, 450 y 500 pb. Los productos amplificados P b correspondientes al genotipo G7 tienen 450 y 500 pb y no se obtiene la banda de 400 pb. Así tenemos que los resultados observados se corresponden con el patrón típico de E. granulosos y que las muestras #15, #16, #21, #22, #25 y #32 exhibían el patrón característico de dicha especie. De esta manera se volvió a comprobar que en nuestro estudio no se presentó ningún caso producido por E. multilocularis (Figura R.38). 142 Resultados 5.2.4. PCR de genes mitocondriales (CO1 y ND1) ta que la familia Sarcocystidae parasita una amplia variedad de ertebrados, entre ellos porcinos y bovinos, y que las muestras #1, #3, #5, #7, #8, #18, #23, #24 y #34 eran negativas en todos los protocolos de amplificación utilizados, se driales (CO1 y ND1) ta que la familia Sarcocystidae parasita una amplia variedad de ertebrados, entre ellos porcinos y bovinos, y que las muestras #1, #3, #5, #7, #8, #18, #23, #24 y #34 eran negativas en todos los protocolos de amplificación utilizados, se pb 1000- 500 - 400 - pb 1000- 500 - 400 - Figura. R.38 . Electroforesis en gel de agarosa al 3 % de los productos de amplificación obtenidos a partir de la PCR Eg-16, en la que se observan que las 6 muestras de E granulosus (#15, #16, #21, #22, #25 y #32) presentaron un patrón de 450 y 500 para las muestras positivas al genotipo G7 (muestras #15, #16, #21, #22 y #32). La muestra #25 presenta además una banda de 400 pb que se corresponde al Genotipo G1. El control positivo H+ (DNA de quiste hidatídico del genotipo G1) el control S+ (DNA de quiste hidatídico de cerdo del genotipo G7), (-) control negativo, (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. M #15 # 16 #21 # 22 # 25 #32 H+ S+ C-pb 1000- 500 - 400 - Figura. R.38 . Electroforesis en gel de agarosa al 3 % de los productos de amplificación obtenidos a partir de la PCR Eg-16, en la que se observan que las 6 muestras de E granulosus (#15, #16, #21, #22, #25 y #32) presentaron un patrón de 450 y 500 para las muestras positivas al genotipo G7 (muestras #15, #16, #21, #22 y #32). La muestra #25 presenta además una banda de 400 pb que se corresponde al Genotipo G1. El control positivo H+ (DNA de quiste hidatídico del genotipo G1) el control S+ (DNA de quiste hidatídico de cerdo del genotipo G7), (-) control negativo, (M) marcador de 100 pb “ladder” (Biotools). Tinción con bromuro de etidio. M #15 # 16 #21 # 22 # 25 #32 H+ S+ C- Las seis muestras de E. granulosus (#15, #16, #21, #22, #25 y #32), también fueron Las seis muestras de E. granulosus (#15, #16, #21, #22, #25 y #32), también fueron procesadas mediante PCR de los genes mitocondriales y su secuenciación, citocromo oxidasa 1 (CO1) y NADH deshidrogenasa 1 (ND1), utilizando los cebadores descritos en la tabla M 7 de “Métodos”. Los productos amplificados se secuenciaron y las secuencias se compararon con las descritas en las bases de datos. No se encontraron diferencias entre las seis muestras cuando se realizó la alineación con la secuencia de E. granulosus (No de acceso AB235847 GenBank). Sin embargo, con CO1 (No de acceso EF367277 GenBank), cinco presentaron idéntica secuencia a la descrita como genotipo G7 (Figuras R. 39 y R.40), y sólo una fue similar al genotipo G1. Así, confirmamos que los resultados que nos aportaron los protocolos PCR Eg9-RFLP y PCR Eg 16 coincidían con los obtenidos mediante secuenciación de los genes mitocondriales (COI y ND1), ya que los quistes #15, #16, #21, #22 y #32 tenían secuencias idénticas del genotipo G7 y el #25 del genotipo G1. 5.2.5. PCR optimizada a partir del gen 18S de RNA ribosomal (RNAr) Teniendo en cuen procesadas mediante PCR de los genes mitocondriales y su secuenciación, citocromo oxidasa 1 (CO1) y NADH deshidrogenasa 1 (ND1), utilizando los cebadores descritos en la tabla M 7 de “Métodos”. Los productos amplificados se secuenciaron y las secuencias se compararon con las descritas en las bases de datos. No se encontraron diferencias entre las seis muestras cuando se realizó la alineación con la secuencia de E. granulosus (No de acceso AB235847 GenBank). Sin embargo, con CO1 (No de acceso EF367277 GenBank), cinco presentaron idéntica secuencia a la descrita como genotipo G7 (Figuras R. 39 y R.40), y sólo una fue similar al genotipo G1. Así, confirmamos que los resultados que nos aportaron los protocolos PCR Eg9-RFLP y PCR Eg 16 coincidían con los obtenidos mediante secuenciación de los genes mitocondriales (COI y ND1), ya que los quistes #15, #16, #21, #22 y #32 tenían secuencias idénticas del genotipo G7 y el #25 del genotipo G1. 5.2.5. PCR optimizada a partir del gen 18S de RNA ribosomal (RNAr) Teniendo en cuen vv 143 Resultados decidió el empleo de una PCR optimiz ada para el gen 18S rRNA, previamente descrita como específica para protozoos Sarcocystidae: Los amplicones obtenidos se visualizaron en un gel de agarosa al 1%. El producto amplificado consistió en una banda de 500 pb, confirmándose la presencia de casos de Sarcocystis spp. Los amplicones fueron cortados y purificados con el kit “Qiagen gel extraction” y el DNA obtenido fue secuenciado. Las secuencias se compararon con aquellas ya descritas en las base de datos (GenBank). Confirmándose que las muestras #1, #5 y #7 se trataban de quistes de S. suihominis (No de acceso AF176936 GenBank), y las muestras #3 y #8 de S. hominis (No. de acceso AF176943 GenBank) (Figura R.41) De las 35 muestras estudiadas con las diferentes técnicas de PCR no fuimos capaces llegar al diagnóstico final con cinco de ellas. Al estudiar la ITS 1 de las muestras #18 y #23 se observó una banda débil de 750 pb, que se corresponde con T. solium. Sin embargo, no se pudieron reproducir nuevamente estos resultados, por lo que se optó por de onsiderarlas como negativas. Sin embargo, las muestras #24, #30 y #34 nunca se mplificaron con las técnicas de PCR utilizadas. En la tabla R.9 se muestran los c a resultados finales obtenidos con los diferentes protocolos empleados. 144 Resultados 145 Tabla R.9. Resultados obtenidos con los diferentes protocolos de PCR y PCR-RFLPs al examinar las 35 muestras estudiadas. Número de muestra multiplex PCR HDP2 PCR-RFLP ITS1 Eg 9 PCR- RFLP Eg 16 PCR CO1 y ND1 PCRs Secuenciación 18S RNAr PCR Secuenciación #1 Negativo - - - S. suihominis #2 Negativo T. hydatigena - - - #3 Negativo - - - S. hominis #4 T. saginata - - - - #5 Negativo - - - S. suihominis #6 Negativo T. hydatigena - - - #7 Negativo - - - S. suihominis #8 Negativo - - - S. hominis #9 T. saginata - - - - #10 T. saginata - - - - #11 T. saginata - - - - #12 T. saginata - - - - #13 T. saginata - - - - #14 T. saginata - - - - #15 Negativo E.granulosus (G7) E.granulosus (G7) E.granulosus (G7) - #16 Negativo E.granulosus E.granulosus E.granulosus (G7) - (G7) (G7) #17 T. solium - - - - #18 Negativo Negativo - - Negativo #19 T. solium - - - - #20 Negativo T. hydatigena - - - #21 Negativo E.granulosus (G7) E.granulosus (G7) E.granulosus (G7) - #22 Negativo E.granulosus (G7) E.granulosus (G7) E.granulosus (G7) - #23 Negativo Negativo - - Negativo #24 Negativo Negativo - - Negativo #25 Negativo E.granulosus (G1) E.granulosus (G1) E.granulosus (G1) - #26 Negativo T. hydatigena - - - #27 T. solium - - - - #28 Negativo T. hydatigena - - - #29 Negativo T. hydatigena - - - #30 Negativo Negativo - - Negativo #31 Negativo T. hydatigena - - - #32 Negativo E.granulosus (G7) E.granulosus (G7) E.granulosus (G7) - #33 Negativo T. hydatigena - - - #34 Negativo Negativos - - Negativo #35 Negativo T. hydatigena - - - Resultados Comparación de las secuencias nucleotídicas de 6 quiste identificados omo E. granulosus con la secuencia de CO 1 de E. granulosus (EF367277 GenBank). e puede observar las muestras #15, #16, #21, #22 y #32, se alinean igual que la que orresponde al genotipo G7, mientras que la muestra #25 se alinea con la del genotipo 1. Las líneas corresponden a “gaps”, los puntos representan el mismo nucleótido, con specto a la secuencia del Genotipo G1. Figura R.39. c S c G re 146 Resultados Figura R.40. ció encias cleotídicas de 6 quistes ident das com . gran n la D1 ulos 47 GenBa k). Se puede observar que todas las m ras (#15, #21, #22, #32), se alinean por igual con la que corresponde al genotipo G . Los puntos epresentan nuc ido, co o a l el Gen po G1. Compara n de las secu nu ifica o E ulosus co secuencia N uest de E. gran #16, us (AB2358 #25 y n 7 r el ismo m leót n respect a secuencia d oti 147 Resultados igura R.41. Comparación de las secuencias nucleotídicas 18S rRNA de 5 quistes de entificados como Sarcocystis sp. Las muestras #1, #5 y #7 corresponden a S. uihominis (No. de acceso AF176936 GenBank) y las muestras #3 y #8 a S. hominis o. de acceso AF176943 GenBank). Las líneas corresponden a “gaps”, los puntos representan el mismo nucleótido con respecto a la secuencia AF176936. AF176936 CTAGTGATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTGTTCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAG 70 AF176943 .................................-.................................... 69 Muestra#1 ...................................................................... 70 Muestra#3 .................................-.................................... 69 Muestra#5 ...................................................................... 70 Muestra#7 ...................................................................... 70 Muestra#8 .................................-.................................... 69 AF176936 CAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATG 140 AF176943 .....................................................................A 139 Muestra#1 ...................................................................... 140 Muestra#3 .....................................................................A 139 Muestra#5 ...................................................................... 140 Muestra#7 ...................................................................... 140 Muestra#8 .....................................................................A 139 AF176936 TCTGTTGGAAGCAATCATCAGTCCGCCCTATTTGATTAGGGTGTGAATATGATGAATTCCGGCATAATTG 210 AF176943 ....C............---.............---.........C.CT..........T.....----- 198 Muestra#1 ...................................................................... 210 Muestra#3 ....C............---.............---.........C.CT..........T.....----- 198 Muestra#5 ...................................................................... 210 Muestra#7 ...................................................................... 210 Muestra#8 ....C............---.............---.........C.CT..........T.....----- 198 AF176936 TCTCCCTGTTATTAATAAGACGATTATTATTAGATTCATTTCTAATAATAATACGTCTATATTGATAATG 280 AF176943 -----..A.....CT...T.TA..G......GA.A.G....TC......-------.A.....AGG...- 255 Muestra#1 ...................................................................... 280 Muestra#3 -----..A.....CT...T.TA..G......GA.A.G....TC......-------.A.....AGG...- 255 Muestra#5 ...................................................................... 280 Muestra#7 ...................................................................... 280 Muestra#8 -----..A.....CT...T.TA..G......GA.A.G....TC......-------.A.....AGG...- 255 AF176936 TGGGAGAAATGTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTGAAGCAGGCTTTTGTTGCCTTGAATACTGCAGCA 350 AF176943 ----.AT.CA....................................--.A.................... 319 Muestra#1 ...................................................................... 350 Muestra#3 ----.AT.CA....................................--.A.................... 319 Muestra#5 ...................................................................... 350 Muestra#7 ...................................................................... 350 Muestra#8 ----.AT.CA....................................--.A.................... 319 AF176936 TGGAATAACAATATAGGATTTCGGTTCTATTTTGTTGGTTCTTTTTTTAGGACTGAAATAATGATTAATA 420 AF176943 ...............................A.T...--.TGG...G....................... 387 Muestra#1 ...................................................................... 420 Muestra#3 ...............................A.T...--.TGG...G....................... 387 Muestra#5 ...................................................................... 420 Muestra#7 ...................................................................... 420 Muestra#8 ...............................A.T...--.TGG...G....................... 387 AF176936 GGGACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAG-CGAACTACT 489 F176943 ............................................................A......... 457 uestra#5 ............... 504 uestra#7 ............... 504 uestra#8 ............... 472 A Muestra#1 ............................................................-......... 489 Muestra#3 ............................................................A......... 457 Muestra#5 ............................................................-......... 489 Muestra#7 ............................................................-......... 489 Muestra#8 ............................................................A......... 457 AF176936 GCGAAAGCATTTGCC 504 AF176943 ............... 472 Muestra#1 ............... 504 uestra#3 ............... 472 M M M M F id s (N 148 Discusión DISCUSIÓN Con el presente trabajo se ha intentado llevar a cabo la caracterización de marcadores moleculares de ténidos a través de diferentes aproximaciones genómicas que permitan mejorar el diagnóstico de estos parásitos de interés humano y veterinario, aspecto de las parasitosis muy descuidado y que precisa de una mejoría o cambio urgente. Con este fin, se propusieron los objetivos concretos ya indicados, y a continuación se discutirán los resultados de acuerdo a los grandes bloques de trabajo diseñados. 1. Cribado “al azar” de las genotecas de expresión de adulto de T. solium Para la búsqueda de genes expresados por el ténido adulto, en primer lugar se construyeron genotecas con el cDNA del cestodo. Para ello, se contactó con el Biomed, unidad de investigación asociada a la Universidad de Carabobo, Maracay, Venezuela. Allí, localizaron a un portador del ténido, quien donó el verme completo, expulsado tras la toma de praziquantel. Del adulto se separó cuello y escólex del estróbilo, y de este último se tomaron las proglótides grávidas, manteniéndose todo el material a –70ºC hasta su uso. Para el aislamiento del RNA de ambas porciones, se empleó el método de Trisol (Hummon et al., 2007), menos laborioso que los otros habitualmente usados por nosotros (Benítez et al., 1996), debido a las limitaciones logísticas existentes. Los ácidos nucleicos y el resto del adulto fueron trasladados al Centro Nacional de Microbiología, del Instituto de Salud Carlos III, en nieve carbónica, para su posterior manipulación. Si bien el método de Trisol es muy empleado en la purificación de ácidos nucleicos, en nuestro caso apreciamos contaminación por DNA genómico y otros RNAs en el producto final empleado para la preparación de la genoteca de expresión, como más adelante discutiremos. Con respecto a las genotecas, propiamente dichas, cabe resaltar que ha sido uno de los primeros intentos para conseguir una colección de cDNAs de la fase adulta de T. solium, objetivo difícil de conseguir teniendo en cuenta el pequeño número de portadores del ténido que se detectan, aunque diversas campañas para mejorar dicha situación parece que van a aliviarse la carencia indicada en el futuro próximo (Flisser et al., 2007). 149 Discusión Como se ha detallado se construyeron cuatro genotecas de adulto de T. solium, dos por cada una de las porciones indicadas. Dicha estrategia se diseñó teniendo en cuenta la complejidad de los adultos de los ténidos, en los que en un mismo individuo se distinguen porciones muy distintas desde el punto de vista de desarrollo y funcional (Wilms et al., 2006). En el cribado al “azar” de las genotecas, se examinaron 500000 ufp, de los que se aislaron 918 clones, que presentaron cDNAs con un tamaño medio de 150 a 4000 pb, al amplificarlos mediante PCR estándar. Los tamaños encontrados estuvieron en concordancia con los previamente obtenidos en otras genotecas preparadas (Benítez et al., 1996, Montero et al., 2003, Ferrer et al., 2007). En cuanto a la naturaleza de los fragmentos de DNA amplificados, se identificaron genes, o parte de genes, que codifican enzimas típicas del metabolismo de organismos vivos tales como nucleósido difosfato quinasa, diacilglicerol quinasa, glutation reductasa, fucosil transferasa, aminotransferasas, glutamato racemasa y tirosin-quinasas. Además, se clonaron secuencias de algunos transportadores de membrana, como por ejemplo: proteína transportadora de fosfato, transportador de nitrato NRT1, transportadores de ATP, transportador de ribosa y otros. Como se aprecia, se trata de secuencias de DNA codificante de proteínas que desempeñan la misma función en organismos vivos diversos, proteínas con dominios conservados y que se expresan en prácticamente todos ellos (Wilson, 2002). Así, las enzimas de la vía glucolítica se presentan desde bacterias hasta el humano, y permiten establecer relaciones entre los diferentes organismos (Sheehan et al., 2001; Torres-Rivera y Landa, 2007). También, el cribado “al azar” de las genotecas de expresión de adulto de T. solium reportó el aislamiento de genes que expresan proteínas estructurales, con similitud con actina (Campos et al., 1990, Ambrosio et al., 2003), dineina (Kim et al., 2007), DNAs ribosomales como los genes 12S y 28S ribosomales (Jiménez et al., 2000, 2004; Rodríguez-Hidalgo et al., 2002) y diversas glutation S-tansferasas, (Vibanco-Perez et al., 1999, 2002; Plancarte et al., 2004). Estos resultados podrían sugerir la alta actividad metabólica que puede tener lugar en el escólex y cuello del parásito, principalmente en este último tramo, que es el origen del proceso de estrobilación que da lugar al gusano adulto (Willms et al., 2001), aunque la clonación de moléculas idénticas en la genoteca de proglótides no permite realizar dicha 150 Discusión afirmación. Probablemente, un estudio de niveles de expresión de estos genes en las dos fracciones del verme ayudarían a confirmar la hipótesis propuesta. Por otra parte, el cribado permitió la purificación de tres fragmentos que exhibían similitud con el fragmento HDP2 de T. saginata (Harrison et al., 1990; González et al., 2000). Como ya se ha mencionado en la introducción del presente trabajo, las sondas HDP1 y HDP2 fueron aisladas a partir de una genoteca genómica de T. saginata (Harrison et al., 1990). La sonda HDP1 se caracterizó por hibridar específicamente con DNA de T. saginata y la sonda HDP2 reconoció tanto el DNA de T. saginata como el de T. solium, aunque con distinta intensidad. Ninguna de las sondas presentó reacciones cruzadas con DNA de otras especies próximas (T. taeniaeformis y E. granulosus) o DNA humano, porcino o bovino. Debido al interés de estos fragmentos (González et al., 2000; González et al., 2002a, 2002b; Montero et al., 2003; González et al., 2004), se decidió el estudio de las 3 secuencias de T. solium (#A2, #A99 y #A318). Después de analizar bien su composición y comprobar las similitudes que compartían con el DNA homólogo de T. saginata, previa subclonación de las moléculas en el vector pGEM®-T Easy, se pensó en emplear estas sondas como base para el diseño de una PCR que permitiera el diagnóstico especie-específico de T. solium, de aplicación inmediata en la detección de teniasis intestinal. Así, a partir del fragmento #A99, se sintetizaron cebadores para poner a punto una PCR “semi-anidada”, para el diagnóstico diferencial entre ambos ténidos, y a ser posible en el periodo prepatente de la parasitosis. A pesar de todos los intentos llevados a cabo, no se consiguió este objetivo, ya que la combinación de los cebadores directos y reversos empleados, que habían sido diseñados, rendían productos de amplificación que no correspondían al tamaño esperado. Además, al secuenciarlos y comparar su composición con la molécula HDP2 de T. saginata, así como con el fragmento previamente clonado de T. solium, se confirmó que los amplicones eran diferentes de los fragmentos HDP2 estudiados (datos no mostrados). Actualmente, en el laboratorio se está llevando a cabo la caracterización genómica del fragmento HDP2 en los dos ténidos T. saginata como T. asiatica (González et al., datos 151 Discusión no publicados). En dichas investigaciones se ha encontrado que: (i) HDP2 se presenta de forma repetida en el genoma de ambos parásitos pero estas repeticiones no contienen toda la longitud del fragmento HDP2 (3954 pb); es decir, existen repeticiones truncadas de dicha secuencia. (ii) HDP2 es una secuencia del DNA ribosomal ya que tiene una alta similitud con la secuencia pTTr 3.1 y pTSgr 3.1 de T. saginata asiatica y T. saginata, respectivamente (Zarlenga et al., 1991). Estos autores clonaron un fragmento de 1 Kb presente en ambos ténidos, y la misma secuencia truncada de 0,3 Kb (pTSgr 2.4) que solamente existe en T. saginata. Por tanto, estos resultados podrían sugerir que la secuencia de clon #A99 se presenta de forma repetida en algunas porciones del fragmento de DNA de T. solium. En este sentido, Rosenzvit et al. (1997) clonaron y caracterizaron una sonda de DNA que se repite en tándem en el genoma de E. granulosus. Además, hay que destacar que el DNA repetido tiene una extensa aplicabilidad para determinar relaciones filogenéticas (Hamilton et al., 1990), proporcionar información sobre la organización del genoma (Porter, 1994) y para el diagnóstico molecular de algunas enfermedades (Chandrasekharan et al., 1994), entre otras aplicaciones. En relación con el diagnóstico parasitario, como ya se ha mencionado, las sondas han sido utilizadas con muy buenos resultados por González et al. en 2000, para el diagnóstico diferencial de T. solium y T. saginata, a través de la puesta a punto de una multiplex PCR, así como en la caracterización de muchos parásitos por otros autores (Nicolas y Scoles, 1997; Rubio et al., 1999; Le et al., 2006 ). Los resultados negativos obtenidos en el intento de definir marcadores moleculares específicos de T. solium, a partir de los fragmentos similares de HDP2 de T. saginata, sugieren que la estructura de esta molécula podría ser distinta a la descrita previamente en T. saginata (González et al., 2000). Así, es importante recordar que esta última molécula está formada por 3954 pb, mientras que el fragmento #A99 de T. solium, utilizada para el diseño de los cebadores y usados para la puesta a punto de una PCR “semi-anidada”, sólo tiene 966 pb, desconociéndose de momento el tamaño real de la molécula entera, ya que los fragmentos restantes también son fragmentos truncados y no solapantes en comparación con HDP2 de T. saginata. 152 Discusión Para un futuro próximo pensamos estudiar con otras aproximaciones el marcador HDP2 seleccionado, empresa en la que resultará de gran utilidad la información que se obtenga de la secuenciación del genoma completo de T. solium, proyecto de investigación ya iniciado (Aguilar-Díaz et al., 2006). La secuenciación de genomas es trabajo de gran envergadura, que necesita de tiempo para llegar a su finalización. La obtención del genoma completo de un organismo, como en el caso de T. solium, resultará una herramienta fundamental para el estudio del mismo a varios niveles, desde aspectos evolutivos básicos hasta el entendimiento de la regulación fina de su metabolismo, además contribuirá a profundizar en el estudio de la relación hospedador-parásito. 2. Inmunocribado de las genotecas de expresión de adulto de Taenia solium. Como se ha descrito en el capítulo de resultados, en este apartado se ha englobado el trabajo realizado, desde la selección y purificación hasta la secuenciación de diferentes moléculas del adulto de Taenia solium obtenidas tanto en el estudio de la antigenicidad de los clones purificados “al azar” (“spot-lysis”), como en el inmunocribado de la genoteca de expresión correspondiente. Para el cribado dirigido o inmunocribado se empleó un cóctel de sueros de pacientes con teniasis por T. saginata. Estos sueros fueron previamente analizados frente a un extracto proteico de proglótides de T. solium. Si bien, los resultados del mismo mostraron un reconocimiento variable de antígenos, hay que remarcar que la intensidad de la reacción fue débil. Estas observaciones coincidieron con las señales tenues obtenidas en el inmunocribado de las genotecas, resultados semejantes a los previamente registrados en el experimento con genotecas y sueros de pacientes con estas parasitosis (Ferrer, 2003). Además, hay que señalar la dificultad para conseguir más sueros de pacientes con teniasis, y sobre todo portadores de T. solium, como se menciona en el anterior apartado de esta discusión. Aunque este último problema, no es ningún impedimento para llevar a cabo el estudio debido a la similitud antigénica que presentan ambos ténidos (Harrison y Parkhouse,1989) propiedad que posibilita utilizar sueros de pacientes portadores de T. saginata en el cribado de una genoteca de expresión de T. solium. Así, fue posible la selección de 23 fagos recombinantes. Tras experimentos de “excisión in vivo”, secuenciación de los cDNAs correspondientes y análisis de secuencia, se 153 Discusión comprobó que 3 de los 23 clones aislados presentaban similitud con las siguientes moléculas: dineina (cadena ligera Banco de Datos GenBank EAN99751.1), proteína mitocondrial de T. solium (Banco de Datos GenBank AB086256.1) y una proteína hipotética de T. solium (Banco de Datos GenBank AY699706.1). Además, las otras 20 señales positivas contenían cDNAs que no exhibían similitud significativa con otras moléculas ya descritas. Con objeto de predecir la posible estructura primaria de dichos cDNAs, la secuencia aminoacídica de todos ellos fue estudiada utilizando el programa bioinformático Lasergene (DNASTAR Inc. Madison. WI. USA), así como con el servidor EXPASY (http://expasy.org/tools/#translate). El resultado fue inesperado porque las moléculas carecían de un ORF coherente en los tres marcos posibles de lectura. También, se observaron múltiples codones de parada a lo largo de la secuencia y ausencia de la cola poli-A, secuencia fundamental para construir una genoteca de expresión. Ante esta situación de cDNAs “complejos”, o cDNAs incompletos, que presentaban un ORF bastante pequeño y que las proteínas expresadas en sistema procariota eran reconocidas por la mezcla de sueros de pacientes con teniasis, se decidió continuar con la caracterización de cuatro de estos antígenos, aquéllos que presentaron una señal más intensa en el inmunocribado, y con la evaluación de sus propiedades diagnósticas. Tras el análisis concienzudo y la repetición de las secuenciaciones de cada uno de ellos, se seleccionó los ORFs más amplios y se llevó a cabo de una forma preeliminar la expresión de las proteínas recombinantes en el vector pGEX-4T. Desafortunadamente, todas las proteínas expresadas se encontraban en la fracción insoluble, y no fueron reconocidas por los sueros de los pacientes teniásicos. Estos datos pusieron de manifiesto que las moléculas no eran antigénicas en las condiciones de trabajo utilizadas. En definitiva, los resultados obtenidos al ser inesperados, nos hicieron reflexionar sobre varias cuestiones. En primer lugar, se duda sobre la calidad de las genotecas de expresión de adulto de T. solium empleada en este trabajo. Los cDNAs obtenidos durante el immunocribado no presentaron cola de poli-A, ni un marco de lectura abierto consistente. Concretamente de las cuatro moléculas más estudiadas, solamente se 154 Discusión encontró homología con la dineina. Dicha proteína ha sido descrita como una proteína de alto peso molecular asociada a los microtúbulos y con una función estructural (Porter, 1989) y ha sido reportada en los microtúbulos de las células que forman las glándulas del escólex en los cestodos (Koonce, et al. en 1992; Moreno et al., 2001). Por tanto, en este caso sabemos con seguridad que el clon obtenido está truncado. Evidentemente se seleccionó el ORF real de todos los posibles cuando se llevó a cabo su expresión como proteínas recombinantes en los vectores pGEX-4T. En segundo lugar, y en relación con las otras moléculas con las que no se han encontrado similitud con otras descritas en el banco de datos, no se sabe si en este caso los cDNAs son quimeras, o entidades reales, ya que actualmente es imposible averiguar con programas bioinformáticos los ORFs correctos para estos cDNAs tan particulares. Pero se debe recordar que estas moléculas mostraron las señales más intensas tras varios cribados con los sueros de pacientes con teniasis. Por ello, se procedió con el estudio y se seleccionó los ORFs de mayor longitud ante la imposibilidad de averiguar cuáles de ellos, de todos los posibles (ver tabla R.7), eran los reales. En tercer lugar, y teniendo en cuenta la reactividad de los sueros utilizados en el inmunocribado de una genoteca de expresión, en nuestro laboratorio se han empleado diferentes sondas de anticuerpos en el cribado de otras librerías de cDNAs de distintos estadios del verme, como por ejemplo: anticuerpos monoclonales, suero de cerdos infectados con cisticercosis y de conejos inmunizados contra diferentes extractos proteicos de la oncosfera y metacestodo de T. solium y T. saginata (Benítez et al., 1996, Montero et al., 2003, Ferrer et al., 2003, 2005, 2007). Dichas sondas presentaron una reactividad mayor comparada con los sueros de los individuos con teniasis usados en este estudio. Hay que subrayar que en los inmunocribados anteriores, debido a la gran reactividad de los sueros, las intensidades más débiles pasaron desapercibidas, por lo que no se llevó a cabo la caracterización de los mismos; por tanto, se desconoce la naturaleza de dichos cDNAs. Si bien, en el trabajo realizado por Montero, 2003, caracterizó dos moléculas cuyos cDNAs fueron un tanto peculiares, con cierta similitud con los del estudio actual. Quizás debido a la pobre sensibilidad presentada por los sueros de pacientes con teniasis, no fue posible la subclonación de los cDNAs más adecuados e interesantes, a pesar del gran número de unidades formadores de placa cribado. 155 Discusión Por tanto, en un futuro próximo será interesante llevar a cabo otras aproximaciones de cribado, como inmunizar conejos con diferentes extractos proteicos de la fase adulto del verme y de esta manera obtener reactivos más potentes que permitan la subclonación de los cDNAs más característicos. No obstante, como se ha indicado con anterioridad, se podrá confirmar o descartar el interés de los cDNAs clonados en este estudio con la información que se obtendrá de la secuenciación del genoma completo de T. solium. 3. Moléculas TSE33 y TSES38 de T. solium. Durante el desarrollo de este trabajo, se identificaron en la literatura 2 antígenos del adulto de T. solium, TSES33 y TSES38, mediante abordajes de proteómica. Dichos antígenos fueron reconocidos por sueros de teniásicos y algunos sueros de pacientes con cisticercosis, demostrando que son prácticamente estadio-específicos (Levine et al., 2004, 2007). Ante esta situación y, para cumplir con los objetivos propuestos en este trabajo, se procedió al aislamiento de dichos genes. Para ello, se llevaron a cabo dos estrategias. Un primer abordaje que consistió en la subclonación completa de la molécula TSES38 mediante RT-PCR a partir de RNA total de cuello-escólex y proglótides maduras- grávidas del ténido, demostrándose que dicha proteína se expresa a lo largo del verme. Aunque no se sabe en qué tramo se produce la exhibición de la proteína al sistema inmune del hospedador, probablemente, y teniendo en cuenta la posible naturaleza de secreción y excreción de dicho antígeno (Levine et al., 2004), quizás este suceso ocurre durante las fases iniciales de la infección es decir, cuando el cisticerco evagina da lugar al verme en el aparato digestivo del hospedador. Es importante recordar que en el estudio de Levine et al., 2007, mostraron que hasta el 46% de los pacientes con cisticercosis reconocieron dicho antígeno. Por otro lado, los resultados obtenidos en la RT-PCR utilizando el mismo material de partida que para la construcción de la genoteca (RNA total de cuello-escólex y proglótides maduras-grávidas) nos conducen a afirmar que al menos en dicho RNA existen mRNAs en buenas condiciones. 156 Discusión Por el contrario, la molécula TSES33 no se pudo aislar mediante RT-PCR a partir del RNA total de T. solium. Posiblemente, se necesitará más RNA total en la reacción, ya que dicho mRNA podría expresarse en menor cantidad. O bien, esta molécula se expresa solamente en proglótides inmaduras. Sería interesante, en el futuro, averiguar si se produce una expresión diferencial de las dos moléculas entre las diferentes porciones del verme de T. solium. El segundo abordaje para clonar la molécula TSES33 consistió en la síntesis del ORF mediante ingeniería genética, utilizando como herramienta la PCR. Esta metodología ha sido empleada por otros autores para la construcción de varios fragmentos de DNA no codificantes de Rickettsia prowazekii, R. bellii y R. Aeschlimannii (Jado et al., 2006). Con dichos fragmentos se llevó a cabo la optimización de una multiplex-PCR que fue capaz de identificar de manera especie-específica dichos patógenos bacterianos en muestras de pacientes (Jado et al., 2006). Sin embargo, en nuestro trabajo, y a diferencia del estudio anterior, el fragmento quimérico sintetizado se corresponde con el ORF de la molécula TSES33. Por tanto, hubo que trabajar de manera precisa en su síntesis para que no existiera ningún error en la secuencia del DNA debido a mutaciones puntuales o “gaps”, errores comunes que se pueden producir como consecuencia del uso de la enzima Taq polimerasa de forma continuada (Kim et al., 1997; Patel et al., 2001; Strerath et al., 2007). De hecho, tuvimos que diseñar una segunda estrategia para obtener el ORF correcto y de esta manera la proteína TSES33, ya que en la primera se perdió un nucleótido que varió el marco de lectura encontrándonos con un codon de parada antes de tiempo. Después de la subclonación de los 3 cDNAs (TSES38 y TSES33) en el vector de expresión pGEX-4T, se indujo la expresión de las proteínas recombinantes fusionadas a GST. Desafortunadamente, estas proteínas expresadas no fueron reconocidas por los sueros de los pacientes teniásicos, resultando moléculas no antigénicas en nuestras condiciones de trabajo. Creemos que este resultado puede deberse a varias razones. Posiblemente, la inmunogenicidad de estas proteínas nativas residan exclusivamente en epitopos glucosídicos ya que estos cDNAs contienen sitios hipotéticos de glucosilación. Levine et al. (2004) aislaron dichas proteínas nativas por la tecnología de proteómica. Además, expresaron las proteínas recombinantes en un sistema eucariota (baculovirus), 157 Discusión con modificaciones postraduccionales. Ellos obtuvieron unos resultados excelentes de especificidad y sensibilidad frente a un panel de sueros humanos con teniasis por T. solium y cisticercosis. Más tarde, Levine et al. (2007) han llevado a cabo un trabajo con un panel más amplio de sueros de paciente con teniasis y cisticercosis frente las proteínas recombinantes TSES33 y TSES38, expresada en el mismo sistema anterior. Los autores observaron falsos positivos con la proteína TSES38, con 17 de los 26 sueros peruanos de individuos portadores de T. saginata. Sin embargo, no observaron ningún falso positivo con dichos sueros frente a la proteína TSES33. En nuestro caso, no se han obtenido los resultados esperados expresando dichas proteínas recombinantes en un sistema procariota (sin modificaciones postraduccionales) y frente a un panel reducido de sueros con teniasis por T. saginata. Por tanto, otra razón por la que no hayan sido reconocidas las proteínas recombinantes podría ser la naturaleza y el número de sueros humanos empleados en nuestros estudio. Hasta el momento, en el Servicio de Parasitología del ISCIII no se ha registrado ningún suero humano de teniasis por T. solium para descartar que la inmunogenecidad de dichas proteínas sea exclusivamente glucídica. No obstante, se harán estudios futuros en México, donde la enfermedad es endémica y se dispone de dichos sueros tan preciados. 4. Diagnóstico de quistes aislados de hospedadores intermediarios Para cumplir con los objetivos propuestos en el presente trabajo nos propusimos realizar la caracterización molecular específica (definición de marcadores) de los quistes obtenidos a partir de ganado bovino y porcino procedentes de mataderos de España y México. Nuestra meta, además de conseguir la identificación de estos cestodos, fue llevar a cabo el diagnóstico diferencial con otros quistes de morfología similar, que se localizan en músculo esquelético, cavidad abdominal y otros órganos de los animales mencionados y que en ocasiones llevan a conclusiones erróneas (Gracey et al., 1999; Ogunremi et al., 2004). Siguiendo la metodología propuesta en el algoritmo de trabajo (Figura M.3 de materiales), en primer lugar las muestras fueron examinadas por el protocolo Multiplex PCR HDP2 (González et al., 2000). Siete de las treinta y cinco muestras de DNA de quistes analizadas rindieron dos bandas de amplificación, de 170 pb y de 600 pb, para T. saginata y tres de las treinta y cinco amplificaron sólo una banda, de 170 pb, para T. solium. Estos resultados concuerdan con los descritos por González et al. (2000, 2002b) 158 Discusión utilizando las cantidades de 10 ng de DNA para todas las muestras analizadas, obteniendo el diagnóstico especie-específico de ambos ténidos. Dichos datos resaltan aún más la sensibilidad de la prueba si la comparamos con los ensayos de amplificación propuestos por otros autores para diferenciar a T. saginata de T. solium y/o de T. saginata asiatica. Zarlenga et al. (1991), para diferenciar T. saginata de T. saginata asiatica, emplearon como mínimo 0,5 µg del gDNA de ambos ténidos. Bowles y McManus (1994) usaron 100 ng de DNA total para identificar específicamente T. saginata asiatica, T. saginata y T. solium con el protocolo PCR-RFLP, al igual que Mayta et al. (2000) para distinguir T. saginata y T. solium. Yamasaki et al. (2004) reportaron el uso de una Multiplex PCR que diferencia las muestras de T. solium, T. saginata y T. asiatica, con una sensibilidad desconocida, pero mencionaron que se pueden detectar 5 huevos (T. saginata) en un gramo de heces, e incluso 1 huevo (T. solium), pero concluyeron que para tener un diagnóstico más certero las heces deben de tener 50 huevos, o más por gramo. Sin embargo, en los anteriores estudios no se han empleado muestras de los hospedadores intermediarios mencionados. En este sentido, únicamente los protocolos moleculares derivados de las sondas HDP1 y HDP2 han sido utilizados para este fin (Abuseir et al., 2006; Gonzalez et al., 2002; Harrison et al., 2005). Además, el trabajo realizado por Abuseir et al. (2006) con dichos protocolos moleculares demuestran una alta sensibilidad detectando DNA de T. saginata y DNA de C. Bovis, hasta 200 fg y 100 pg respectivamente. Por otra parte, en el estudio que se presenta cabe resaltar que dos de las muestras de hígado, que macroscópicamente estaban diagnosticadas como quistes hidatídicos, se confirmó que eran cisticercos de T. solium mediante resultados obtenidos con el protocolo de PCR desarrollado; hecho muy importante debido a que la infección es una zoonosis y sería otra forma de transmisión para el humano, si no se tiene cuidado y no se decomisan las muestras infectadas en los mataderos. Es de todos conocido que el control efectivo del binomio cisticercosis/teniasis depende, en parte, de una identificación segura del adulto y de la larva en los diferentes hospedadores, así como de la eliminación controlada de esta muestras. Con los quistes que no presentaron amplificación mediante multiplex PCR HDP2, se procedió a su análisis con los protocolos PCRs ITS1/ITS2. Los resultados obtenidos con PCR ITS 1 consistieron en un producto de amplificación de 750 pb aproximadamente 159 Discusión para las muestras correspondientes a los ténidos T. solium y T. saginata, y de una banda de 800 pb para las muestras correspondientes a T. hydatigena. Estas mismas muestras amplificaron un producto entre 550 y 650 pb con la PCR ITS 2. Sin embargo, las muestras de E. granulosus rindieron un amplicon entre 0.9-1.1 kb con el protocolo PCR ITS1. Además, los productos obtenidos con las muestras del género Taenia se sometieron a un protocolo PCR-ITS1-RFLP que confirmó la presencia de T. hydatigena en 9 de las 25 muestras negativas con la técnica multiplex PCR HDP2. Resultados similares fueron obtenidos por Gasser y Chilton en 1995, al usar esta técnica PCR- RFLP para el diagnostico de 7 especies de ténidos aislados de hospedadores definitivos e intermediarios de diferentes regiones del mundo. Con respecto a las 6 muestras de E. granulosus, 5 procedentes de hígados y 1 de pulmón, los resultados registrados mediante PCR ITS1, pusieron de manifiesto que las muestras #15, #16, #21, #22 y #32 presentaron un tamaño de amplificación de 1 a 1.1 kb y el producto de amplificación de la muestra #25 fue de 0.9 a 1 kb; estos resultados preliminares pusieron de manifiesto que las muestras de E. granulosus pertenecían a genotipos diferentes. Dichos datos también coinciden con los obtenidos por otros autores (Bowles et al., 1992; Bowles y McManus 1993a; Bowles y McManus 1993b). Para corroborar esta última observación, se procedió a utilizar diferentes protocolos moleculares: PCR-ITS1-RFLP, PCR-Eg9-RFLP y PCR-Eg16. Los resultados obtenidos mostraron que las 6 muestras correspondían a E. granulosus y no a E. multilocularis. Además, 5 quistes (#15, #16, #21, #22 y #32) se identificaron como genotipo G7 y el #25 como el genotipo G1. Finalmente, los resultados anteriores se confirmaron con la información conseguida con la secuenciación de los genes mitocondriales ND1 y CO1, que fue comparada con la descrita en los bancos de datos (GeneBank) y los datos obtenidos por Bowles et al. (1992). En general las secuencias eran altamente homólogas, con pocas diferencias puntuales entre las conseguidas en nuestro estudio y las que se encuentran depositadas en los bancos de datos, resultando que las 5 muestras de hígado pertenecían al genotipo G7 y la de pulmón al genotipo G1. 160 Discusión Hasta el momento, para la identificación concluyente en el diagnóstico y genotipado de los quistes hidatídicos, los protocolos más empleados son PCR-ITS1-RFLP y secuenciación de los genes mitocondriales ND1 y CO1 (Bowles et al., 1992; Bowles y McManus 1993a; Bowles y McManus 1993b). También, este trabajo ha empleado otros ensayos moleculares complementarios (PCR-Eg9-RFLP y PCR-Eg16), igualmente efectivos para la identificación de E. granulosus/E. multilocularis y los genotipos G1/G7, ensayos que están siendo utilizados cada vez más por grupos de investigación. (González et al., 2002; Varcasia et al., 2006, 2007; Sobrino et al., 2006; Moks et al., 2005; Manterola et al., 2006) Por otro lado, buscando en las diferentes revistas de difusión científica, no se encontraron datos que confirmaran el tropismo de estos quistes con genotipo G1 por el pulmón; pensamos que se deben de realizar más estudios en este sentido sobre los quistes hidatídicos encontrados en cerdo. En México, la información sobre la hidatidosis es incompleta; son pocos los estudios que se han realizado sobre la distribución y los genotipos que pueden encontrarse en humanos y en animales. Maravilla et al. (2004) informaron sobre un quiste obtenido del hígado de un cerdo correspondiente al genotipo G7, y el hallazgo de otro quiste hepático en un paciente, correspondiente al genotipo G5. Los resultados obtenidos en el presente estudio nos confirmaron la presencia del genotipo G7, ya reportado previamente en México (Maravilla et al., 2004); sin embargo, es la primera vez que se reporta el genotipo G1 en este país. Estos resultados podrían tener consecuencias epidemiológicas importantes y un impacto directo en la salud pública mexicana, debido a la posibilidad de que los quistes de cerdos infecten al hombre. Es bien sabido que la mayoría de los quistes aislados de humanos, y caracterizados, corresponden al genotipo G1 (oveja), pero también se tienen reportes de que el genotipo G7 infecta y afecta a los seres humanos (Kedra et al., 1999). Por lo tanto es importante definir el papel de estos genotipo de E. granulosus para el control adecuado de la zoonosis, sobre todo en aquellas áreas en donde los servicios veterinarios son escasos, o nulos, y no se realiza una adecuada inspección de las matanzas y un decomiso de las vísceras contaminadas, siendo estas una fuente de contaminación para el hombre y los animales. Por otra parte, todas aquellas muestras que fueron negativas por los protocolos antes descritos, se sometieron al estudio por PCR optimizada a partir del gen 18 rRNA (Yang et al., 2001), pensando en que la familia Sarcocystidae parasita a una amplia variedad 161 Discusión de vertebrados, incluyendo cerdos y bovinos (Soulsby, 1983). Cinco de las muestras sometidas a esta PCR rindieron un producto de amplificación de 500 pb, confirmándose la presencia de Sarcocystis spp. Después al realizar la secuenciación de estos productos y comparar las secuencias parciales con las publicadas por Yang et al. (2001), del rRNA 18S para Sarcocystes hominis y S. suihominis (Número de acceso, GenBank. AM261237- AM261241), los resultados demostraron que las 5 muestras negativas para ténidos, 3 presentaban secuencias iguales a las de S. suihominis y las 2 restantes a las de S. hominis. Por lo tanto, las herramientas moleculares nos permitieron la identificación de aquellos quistes con diagnóstico dudoso, como son estas 5 muestras, que tras la realización de las diferentes técnicas de PCR para el diagnóstico de los diferentes ténidos, como son T. saginata, T. solium, T. hidatigena y E. granulosus rendían resultados no concluyentes. Estas observaciones nos ayudaron a comprobar que aquellas lesiones de músculo, descritas como miositis sarcosporídica, Actinobacillus o con otras alteraciones locales (Cordero del Campillo, 1980, Ogunremi et al., 2004, Gracey et al., 1999), pueden confundirse con cisticercos calcificados en los que solamente se observa un granuloma (Aluja, 2006). Dichos protocolos moleculares tienen una utilidad práctica en mataderos de zonas geográficas en las que estas enfermedades son endémicas, como España y México, en donde las muestras procedentes de hospedadores intermediarios como bovinos y cerdos pueden dar pie a confusión durante el diagnóstico macroscópico y, por tanto, puede conducir a una infraestimación de la prevalencia de la cisticercosis porcina y bovina (Abuseir et al., 2006) . Hay que mencionar que todas estas técnicas de biología molecular, en especial la PCR, son un gran avance en el diagnóstico especie- específico de los ténidos. Finalmente, en las 5 muestras en que no fue posible llegar a un diagnóstico, pensamos que estos resultados podrían deberse a una mala calidad del DNA extraído, o a una degradación del mismo, o a posibles inhibiciones en las PCRs. Kamenetzky et al. (2000) y Bart et al. (2006) reportaron buenos resultados con su protocolo de extracción de ácidos nucleicos de E. granulosus. Con algunas modificaciones realizadas por el grupo de Kamenetzky, estos protocolos fueron utilizados por otros autores (Boom et al., 1990; Reichardt y Rogers, 1994), con muestras procedentes de quistes fértiles e infértiles de ovejas, bovinos, cerdos y humanos. De esta manera se consiguió la caracterización de quistes infértiles, que anteriormente no se había podido realizar. 162 Discusión Kamenetzky sugirió que la inhibición de la PCR se debe a la presencia de la capa laminar del quiste. Para terminar, sería interesante la utilización en los mataderos de otros métodos complementarios, además del diagnóstico visual y molecular, que ayuden a combatir la cisticercosis bovina y porcina. Actualmente, existen ensayos serológicos que permiten distinguir entre quistes viables y degenerados (SCVPH 2000, 2003; Wanzala et al., 2002; Onyango-Abuge 1996; Hughes et al., 1993) 163 Conclusiones CONCLUSIONES 1. El cribado “al azar” de las genotecas de expresión de adulto de T. solium reportó una variedad de genes con posible interés como marcadores diagnósticos. De ellos, el clon #A99, con similitud a HDP2 de T. saginata, no fue idóneo en la puesta a punto de una PCR semi-anidada, lo que sugiere que la estructura de HDP2 en T. solium es distinta a la descrita previamente en la secuencia homóloga de T. saginata. 2. Las cuatro moléculas más estudiadas y obtenidas en el inmunocribado de las genotecas de expresión de adulto de T. solium no fueron reconocidas por los sueros de los pacientes teniásicos, resultando marcadores no antigénicos en nuestras condiciones de trabajo, a pesar de exhibir una antigenicidad apropiada en los diferentes inmunocribados realizados en el transcurso de su selección. 3. La clonación de las moléculas diagnósticas, TSES33 y TSES38 mediante las técnicas de RT-PCR y construcción de un cDNA quimérico, permitió comprobar las ventajas de otras metodologías de biología molecular más económicas cuando se conoce información sobre la secuencia a clonar. Además, las moléculas recombinantes no fueron reconocidas por sueros de pacientes con teniasis producida por T. saginata . 4. El diagnóstico molecular de cisticercos y quistes aislados de hospedadores intermediarios típicos de ténidos posibilitó comprobar que quistes del músculo de ganado bovino, diagnosticados macroscópicamente como cisticercos calcificados, se correspondían en realidad con quistes de Sarcocystis suihominis y S. hominis. Por otra parte, quistes aislados de hígados de cerdos, identificados macroscópicamente como hidátides, se confirmó mediante caracterización molecular que se trataban de cisticercos de T. solium. 5. Los protocolos de PCRs ITS (1 y 2) y Eg (9 y 16), así como la técnica PCR-RFLP, aplicados al DNA purificado de quistes hidatídicos, obtenidos de cerdos en México, confirmaron la presencia de E. granulosus y descartaron la de E. multilocularis en el país latinoamericano. Al mismo tiempo los ensayos moleculares corroboraron la existencia del genotipo G7, ya reportada por otros autores, y descubrieron la presencia 165 Conclusiones del genotipo G1 en México, hallazgo de gran relevancia en salud pública y veterinaria mexicana. 166 Bibliografía BIBLIOGRAFÍA Abuseir S, Epe C, Schnieder T, Klein G, Kuhne M. (2006). Visual diagnosis of Taenia saginata cysticercosis during meat inspection: is it unequivocal?. Parasitol Res. 99(4):405-9 Acevedo H. (1989). Epidemiología de la cisticercosis porcina. En: Cisticercosis Humana y Porcina, pp 251-253. (Editor. Flisser A, Malagón F) Limusa, Noriega. México, D.F. Acha, N.P. y Szyfres, B. (1987). 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Cisticercosis en humanos A) Cisticercosis de tipo quístico B) Cisticercosis de tipo racemoso C) Cisticercosis de tipo mixto (quística y racemosa) D) Cisticercosis medular 1.5.2.2. Cisticercosis en el cerdo 1.6. Respuesta inmunitaria A) Respuesta inmune humoral B) Respuesta inmune celular 1.7. Diagnóstico de teniosis 1.7.1. Diagnóstico parasitológico 1.7.2. Diagnóstico inmunológico 1.7.3. Diagnóstico molecular 1.8 Diagnóstico de cisticercosis humana 1.8.1. Diagnostico inmunológico 1.8.2 Diagnóstico de cisticercosis porcina 1.9. Tratamiento 1.9.1. Tratamiento para teniosis 1.9.2. Tratamiento de la cisticercosis humana 1.9.3. Tratamiento de la cisticercosis porcina 1.10. Medidas de control de teniosis/cisticercosis 2. Echinococcus granulosus 2.1. Clasificación taxonómica 2.2. Morfología de E. granulosus 2.2.1. Estado adulto 2.2.2. Huevos 2.2.3 Quiste hidatídico 2.3. Ciclo biológico y mecanismos de transmisión 2.3.1. Hospedador Definitivo 2.3.2. Hospedador Intermediario 2.4. Epidemiología 2.5. Aspectos clínicos: Patología y Síntomas 2.6. Diagnóstico 2.7. Tratamiento 2.8. Prevención OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS 1. MATERIAL BIOLÓGICO 1.1. Genotecas de expresión de adulto de Taenia solium. 1.2. Vectores de Clonación. 1.2.1. Fagos. 1.2.2. Plásmidos. 1.3. Cepas bacterianas. 1.3.1 E. coli XL1-Blue MRF 1.3.2. E. coli SOLR 1.3.3. E. coli BL-21 1.3.4. E. coli TOPO10. 1.4. Material parasitario. 1.4.1. Verme adulto de T. solium 1.4.2. Quistes hidatídicos 1.4.3. Metacestodos de T. solium 1.4.4. Otros quistes 1.5. Sueros. 1.5.1. Sueros empleados en el inmunocribado de las genotecas. 2. MEDIOS DE CULTIVO 2.1. Medios de cultivo de bacterias. Crecimiento y mantenimiento de bacterias. 3. MÉTODOS 3.1. Manipulación de genotecas de expresión. Técnicas básicas. 3.1.1. Preparación de cepas bacterianas para el crecimiento de los fagos. 3.1.2. Mantenimiento de fagos. 3.1.3. Titulación de genoteca de expresión. 3.2. Cribado al azar de genotecas de expresión del adulto de T. solium para aislar cDNAs característicos del ténido y, en paralelo, evaluar las propiedades de las genotecas. 3.2.1. Aislamiento de los fagos “al azar”. 3.2.2. Determinación de los tamaños de cDNAs clonados. 3.2.3. Electroforesis de DNA en geles de agarosa. 3.2.4. Purificación de los cDNAs a partir de geles de agarosa. 3.2.5. Secuenciación de los cDNAs de los fagos purificados. 3.2.6. Análisis de las secuencias. 3.2.7. Preparación de células competentes. 3.2.8. Transformación de células competentes con plásmidos. 3.2.9. Clonación en el vector pGEM®-T Easy. 3.2.10. Extracción de DNA plasmídico de los fragmentos clonados. 3.2.11. Medición de la concentración y pureza de ácidos nucleicos. 3.2.12. Digestión del DNA plasmídico. 3.2.13. Diseño de PCR anidada. 3.3. Cribado dirigido o inmunocribado de genotecas de expresión del adulto de T.solium para aislar y caracterizar antígenos marcadores de teniasis. 3.3.1. Preabsorción de los sueros con lisados de E. coli. 3.3.2. Infección de células E. coli XL1-Blue con fagos recombinantes. 3.3.3. Inmunodetección. 3.3.4. Aislamiento y purificación de fagos recombinantes. 3.3.5. Escisión in vivo en pBluescript de los fagos recombinantes. 3.3.6. Lisis en mancha (“Spot-lysis”).3 3.3.7. Clonación en vector de expresión. 3.3.8. PCR de colonias. 3.3.9. Inducción y expresión de proteínas de fusión 3.3.10. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). 3.3.11. Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa y revelado inmunoenzimático (“Western blot”). 3.3.12. Preparación de extractos proteicos a partir de material parasitario. 3.4. Obtención de cDNAs de interés diagnóstico utilizando otras alternativas. 3.4.1. Extracción de RNA total a partir de material parasitario. 3.4.2. RT-PCR. Amplificación por Transcripción Reversa 3.4.3. Clonación en el vector pCR 2.1 TOPO®. 3.4.4. Construcción de un DNA quimérico. 3.5. Desarrollo de protocolos de PCR y PCR-RFLP, como marcadores para el diagnóstico diferencial de ténidos. Aplicación a la identificación específica de quistes tisulares de interés veterinario. 3.5.1. Extracción de DNA genómico de quistes. 3.5.2. Diagnóstico por PCR 3.5.2.1. Multiplex-PCR derivada de los fragmentos de HDP2. 3.5.2.2. PCRs y PCR-RFLPs derivadas de los espaciadores transcritos internos del DNA ribosomal (ITS-1 e ITS-2). 3.5.2.3. PCR Eg 9 y Eg 16. 3.5.2.4. PCR de genes mitocondriales (COI y ND1). 3.5.2.5. PCR optimizada a partir del gen 18S rRNA. 3.6. Tablas con los cebadores utilizados en este trabajo. RESULTADOS 1. Antecedentes. 2. Cribado de genotecas de expresión de adulto de T. solium 2.1. Cribado “al azar” 2.1.1 Determinación de los tamaños de los cDNAs clonados 2.1.2 Secuenciación de los cDNAs y análisis de las secuencias. 2.1.3 Clonación en vectores de las secuencias HDP2 de T. solium 2.1.4 Optimización de una multiplex PCR semi-anidada de valor diagnóstico a partir de los fragmentos HDP2 de T. solium. 2.1.5 Análisis de la reactividad de sueros de pacientes para el cribado de genotecas. 2.1.6 Estudio de antigenicidad de clones purificados “al azar” por lisis en mancha (“Spot-lysis”) 2.2 Inmunocribado de las genotecas de expresión de adulto de T. solium y selección de clones positivos 2.2.1 Transformación de los fagos recombinantes en fagémidos: “Escisión in vivo” 2.2.2 Secuenciación de los fragmentos clonados y análisis de las secuencias 2.2.2.1 Análisis de la secuencia del clon #5 2.2.2.2 Análisis de las secuencia del clon #11 2.2.2.3 Análisis de las secuencias del clon #16 2.2.2.4 Análisis de las secuencia del clon #63 2.2.3 Expresión de las proteinas recombinantes a partir de los cDNA seleccionados 2.2.4 Estudio primario de la inmunorreactividad de las proteínas de fusión mediante, “Western blot”, con sueros de pacientes con teniasis. 3. Subclonación de la molécula TSES38. 3.1. Expresión de la proteína recombinante TSES38 en pGEX-4T. 3.2 Estudio de la inmunorreactividad de la proteína de fusión recombinante TSES38 mediante “Western blot” con sueros de pacientes con teniasis. 4. Construcción de un cDNA Quimérico 4.1 Estudio de la inmunorreactividad de las proteínas de fusión recombinantes TSES33 truncada y completa mediante “Western blot” con sueros de pacientes con teniasis 5. Definición de marcadores moleculares para el diagnóstico de ténidos. Aplicación a la identificación de quistes aislados de hospedadores intermediarios 5.1 Extracción de DNA genómico de quistes 5.2 Diagnóstico por PCR 5.2.1. Multiplex-PCR derivada de los fragmentos de HDP2 5.2.2 PCRs y PCR-RFLPs derivadas de los espaciadores transcritos internos del DNA ribosomal (ITS1 e ITS2). 5.2.3. PCR Eg 9 y Eg 16 5.2.4. PCR de genes mitocondriales (CO1 y ND1) 5.2.5. PCR optimizada a partir del gen 18S de RNA ribosomal (RNAr) DISCUSIÓN 1. Cribado “al azar” de las genotecas de expresión de adulto de T. solium 2. Inmunocribado de las genotecas de expresión de adulto de Taenia solium. 3. Moléculas TSE33 y TSES38 de T. solium. 4. Diagnóstico de quistes aislados de hospedadores intermediarios CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXO