UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS © Lidia Nazaret Gómez Arribas, 2021 TESIS DOCTORAL Diseño, síntesis, caracterización y aplicaciones analíticas de elementos de reconocimiento biomiméticos MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Lidia Nazaret Gómez Arribas DIRECTORES María Cruz Moreno Bondi Javier Lucas Urraca Ruiz María Elena Benito Peña Madrid UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS TESIS DOCTORAL DISEÑO, SÍNTESIS, CARACTERIZACIÓN Y APLICACIONES ANALÍTICAS DE ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO BIOMIMÉTICOS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR LIDIA NAZARET GÓMEZ ARRIBAS DIRECTOR MARÍA CRUZ MORENO BONDI JAVIER LUCAS URRACA RUIZ MARÍA ELENA BENITO PEÑA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA DISEÑO, SÍNTESIS, CARACTERIZACIÓN Y APLICACIONES ANALÍTICAS DE ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO BIOMIMÉTICOS TESIS DOCTORAL LIDIA NAZARET GÓMEZ ARRIBAS Directores: María Cruz Moreno Bondi Javier Lucas Urraca Ruiz María Elena Benito Peña Madrid, 2021 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Departamento de Química Analítica TESIS DOCTORAL DISEÑO, SÍNTESIS, CARACTERIZACIÓN Y APLICACIONES ANALÍTICAS DE ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO BIOMIMÉTICOS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Lidia Nazaret Gómez Arribas Directores María Cruz Moreno Bondi Javier Lucas Urraca Ruiz María Elena Benito Peña Madrid, 2021 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Departamento de Química Analítica DISEÑO, SÍNTESIS, CARACTERIZACIÓN Y APLICACIONES ANALÍTICAS DE ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO BIOMIMÉTICOS TESIS DOCTORAL QUE PRESENTA Lidia Nazaret Gómez Arribas Madrid, 2021 AGRADECIMIENTOS “Si quieres ir rápido, ve solo; si quieres llegar lejos, ve acompañado”. Este proverbio africano describe a la perfección lo que la etapa de doctorado representa, ya que la Tesis no es solo de quien la lleva a cabo, sino también de todo el conjunto de personas que comparten el camino. En primer lugar quisiera agradecer a mis directores de Tesis su ayuda y apoyo incondicional a lo largo de esta etapa. A la Prof. María Cruz Moreno Bondi, gracias por enseñarme a ser tan crítica, a no ser conformista y a buscar siempre la excelencia. Gracias también por brindarme mi primera oportunidad laboral, por todas las discusiones exhaustivas de los resultados, por empujarme a buscar siempre una explicación y a construir la científica en la que me he convertido. Al Prof. Javier Urraca Ruiz, gracias por acompañarme en este largo camino, desde que empecé el TFG en el año 2013 hasta hoy. Gracias por ser siempre tan positivo y tan pragmático, por soportar todos mis problemas, por tener siempre una solución para todo y por transmitir que “de todo se sale”. Gracias por animarme tantas veces cuando estaba decaída y por dejar que cometa errores aun sabiendo que llevabas razón desde el principio. A la Prof. Elena Benito Peña, gracias por transmitirme tu pasión por la ciencia, por tener siempre ganas de descubrir e innovar y por dejar que te aburriese tanto con las bandas misteriosas de los geles. Gracias por animarme a tomar decisiones y por tu apoyo constante, especialmente en aquella época de estudio e incertidumbre. En esencia, gracias a los tres por hacerme sentir en todo momento valorada y escuchada. También agradecer al Ministerio de Economía y Competitividad y al Ministerio de Ciencia e Innovación por haber hecho posible el desarrollo de las investigaciones incluidas en la presente Tesis Doctoral a través de la financiación aportada en los proyectos CTQ2015-69278-C2-1-R/AIE y RTI2018‐096410‐B‐C21. Agradecer a todas las personas con las que he tenido la oportunidad de colaborar en las diferentes publicaciones: la Gda. Mª del Mar Darder Amengual, el Dr. Alberto Rico Yuste, la Dra. Rahma Abou Hany, la Dra. Mª Carmen Hurtado, la Prof. Ana Belén Descalzo, el Prof. Guillermo Orellana, la Prof. Concepción Pérez Conde, (UCM), la Prof. Nuria García (ICTP-CSIC), el Prof. Yoel Rodríguez (Universidad Hostos), la Prof. Carmen Cuadrado (INIA), el Dr. Augusto Juste-Dolz, el Prof. Sergi Morais, el Prof. Ángel Maquieira (IDM- UPV-UV), el Prof. David Giménez-Romero (UV) y el Prof. Rodrigo Barderas (ISCIII). Agradecer también a la Facultad de Ciencias Químicas, al Dpto. de Química Analítica y a todos sus integrantes por su ayuda y apoyo, así como a los Centros de Asistencia a la Investigación (CAI) de Microanálisis Elemental, el Centro Nacional de Microscopia Electrónica y las Unidades de Genómica y Proteómica de la UCM. Asimismo, quisiera agradecer al grupo de investigación en Sensores Químicos Ópticos y Fotoquímica Aplicada (GSOLFA) y al director del mismo, el Prof. Guillermo Orellana, por abrirme las puertas del grupo desde mis comienzos, por estar siempre disponible para resolver cualquier duda y por las reuniones de grupo, siempre tan constructivas. Agradecer también a la Prof. Ana Belén Descalzo, al Prof. Fernando Navarro, a la Prof. Concepción Pérez y a la Prof. Ana Mª Gutiérrez su ayuda y disponibilidad en todo momento. Gracias a todos mis compañeros por su inestimable apoyo, ayuda y compañía a lo largo de estos años. A Beatriz Díez por compartir los inicios y por sacarme una sonrisa cada vez que recibo una postal. A Alberto Rico por compartir tantísimas horas codo con codo, por los “buenos” momentos junto al ASE, por mantener el buen humor, ayudarme siempre de forma incondicional, ser mi asesor musical y diseñar la portada de esta Tesis. A Idoia Urriza por alegrarme los días grises, por enterarte siempre de todo, por todas las cervezas y soportar mis quejas monotemáticas, especialmente en este último año. A Riikka Peltomaa, por ser un referente y enseñarme a no desanimarme nunca. Gracias por tu infinita paciencia y por tu inestimable ayuda, especialmente con los fagos. A Jose Ángel de la Torre, por aportar el punto de locura al grupo y ser siempre tan auténtico. A José Quilez, por ser el mejor organizador de eventos y estar dispuesto a echar una mano con cualquier cosa. A Guido Ielasi, por tu particular visión de la vida y por el gran viaje a Israel. A Mar Darder, por ser una “alumna” ejemplar, gracias por enseñarme tanto durante los meses que pasamos trabajando juntas. A Laura Figuerola, por tu optimismo y tus ánimos. A Bettina Glahn y a Álvaro Luque por vuestro gran compañerismo y ayudarme siempre con cualquier cuestión “bio”. A Nieves Fresno, gracias por enseñarme a perder el miedo a equivocarme y por tu gran ayuda con las funcionalizaciones. A Francisco Amaro, por ser nuestro biólogo favorito y estar dispuesto a resolver cualquier duda. A Virginia Huerta, Irene Agudo, Irene Núñez y Raquel Chamorro, gracias por vuestra alegría y por aguantar las aventuras y desventuras de nuestras tesis. A Francesca Salis, por tu resiliencia con los muy habituales “¡¡vaffanculo!!”. A Silvia Vaghini, por tu alegría y locura. También a nuestra querida Nuria, por ser nuestro nexo de unión y por todos los buenos ratos en el Lecumberri. A Maximino Bedoya, por ser tan manitas y estar siempre de tan buen humor. A Luis Serrano y Miguel Mendoza, por vuestro apoyo dentro y fuera del laboratorio. También quisiera agradecer a Sergio Carrasco, Keurison Figueredo, Alen Baeza, Markel Luaces, Jesús Gracia, Victoria Vallejo, Cris de la Hera, Beatriz Bedoya, Pramiti Hui, Javier Tejera, Tuğçe Kutlusoy y a todos los alumnos de TFG y TFM que han pasado por el laboratorio (Elsa, Andrea, Beatriz L., Miguel, Álex, Guille, Felipe y Paloma), así como a las nuevas incorporaciones por aportar aire fresco y alegría al grupo, a Cristina Monterde, David Martín, Fernando Pradanas y especialmente a Luis Calahorra por echarme una mano con los métodos cromatográficos. Gracias también a algunos de mis compañeros de piso, presentes y pasados, por soportar los malos momentos, servir de desahogo después de un mal día y escuchar los ensayos de las presentaciones: Fran, Inés, Rocío, Ana y, especialmente a Alba. Agradecer también a Marta de la Torre, compañera incansable de las clases de tenis por hacer aquellos dos años un poco más llevaderos en medio del caos. Gracias a mis amigas “las químicas”, por ser tan transparentes, por vuestra energía, por las vacaciones, por las clases de Psicología I, los viajes y todos los momentos que me han servido de desconexión. Noe, Inma, María, Emma, Cris, Sarita y especialmente Bea y Mari Carmen. Gracias Bea por tu locura y apoyo a lo largo de todos estos años. Gracias Mari por acompañarme tan de cerca todo este largo camino, por darme tantos ánimos y por estar siempre tan pendiente. También agradecer a Sara, Yolanda, Ana, Laura Pérez, Elena y, en especial, a Estefi y Laura Fernández por entender tan bien este proceso y compartir tantos años entre tuppers y cafés. También agradecer a mis amigas de Segovia por su indudable convicción de que lo conseguiría: Ainhoa, Bea, Keka, Martita, Martu, Rosado, Salomé, Sandra, Sonia, Laura, Raquel, Rocío y especialmente a Marina I., Alba, Silvia, Natalia, Clara, Marina L. y Paula. Gracias por vuestro apoyo incondicional durante todos estos años, por ser testigos de las luces y de las sombras de esta etapa y por la tan necesitada desconexión a través de los viajes, las cervezas y las tostas. A mis amigos de Adrada, Edurne, Cris, Laura y Javi, gracias por todos los veranos y por vuestros ánimos. A mis compañeros de la AEMPS, agradecer vuestro apoyo, ánimo e interés diario, prometo no aburriros más con este tema. Manoli, Inés, Montse, Antonio, Javi N., Javi B., Luz María, Mª Carmen, María A., María V., Pablo, Olga y Rubén. En especial a Ana Asenjo, Jing, Lara, Ana García y Jaime, por vuestra constante preocupación, interés y optimismo. Gracias por confiar siempre en que lo conseguiría. Y por supuesto, gracias a toda mi familia. A Juan, por ser mi compañero de vida, por comprender mejor que nadie toda esta etapa, por entenderme, por tu paciencia infinita y por no dejar que me rindiera nunca. Ojalá sigamos alcanzando metas juntos. A mis tíos, por todos sus mensajes de ánimo e interés. A mis abuelas, por su esfuerzo en comprender “eso de la universidad”, por preocuparse siempre tantísimo por mi y por su apoyo constante. Y, sobre todo, gracias a mis padres y a mi hermana. Gracias por haberme dado la fuerza necesaria para acabar esta Tesis, por todos vuestros sacrificios y por ser ejemplo de trabajo, esfuerzo, respeto y constancia. Gracias por transmitirme la calma que necesitaba en todo momento y ser mi refugio y soporte vital. Gracias por vuestras ganas, apoyo y alegría, sin duda habéis sido el motor que necesitaba para no abandonar. En definitiva, gracias por quererme tanto. Os debo todo lo que soy. Lidia "Y una vez que la tormenta termine, no recordarás cómo lo lograste, cómo sobreviviste. Ni siquiera estarás seguro si la tormenta ha terminado realmente. Aunque una cosa sí es segura, cuando salgas de esa tormenta, no serás la misma persona que entró en ella. De eso se trata esta tormenta." Haruki Murakami Índice 3 ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS .................................................................................. 7 RESUMEN .................................................................................................................. 15 SUMMARY ................................................................................................................. 23 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 31 1.1. Elementos de reconocimiento biomiméticos ................................................. 33 1.1.1. Aptámeros ............................................................................................. 34 1.1.2. Péptidos ................................................................................................ 36 1.1.3. Anticuerpos recombinantes ................................................................... 38 Clasificación de los anticuerpos recombinantes .............................. 39 Obtención de anticuerpos recombinantes empleando la tecnología de presentación de anticuerpos en la superficie de fagos ..................................... 42 1.1.4. Polímeros de impronta molecular .......................................................... 48 Composición ................................................................................... 50 Aproximaciones en la preparación de polímeros de impronta molecular… ...................................................................................................... 53 Preparación de polímeros de impronta molecular ........................... 57 Estrategias para la síntesis de MIPs en función de la naturaleza de la molécula plantilla .............................................................................................. 66 Aplicaciones de los MIPs ................................................................ 86 1.2. Seguridad alimentaria y reacciones adversas a los alimentos ...................... 90 1.2.1. Reacciones adversas a los alimentos .................................................... 91 1.2.2. Micotoxinas ........................................................................................... 93 Clasificación de las micotoxinas ..................................................... 94 Legislación sobre micotoxinas en la Unión Europea ..................... 103 Métodos de muestreo y análisis empleados para la determinación de micotoxinas .................................................................................................... 104 1.2.3. Lectinas ............................................................................................... 110 Lectinas de leguminosas .............................................................. 114 Significado nutricional y toxicidad de las lectinas de leguminosas 115 Métodos de análisis de lectinas .................................................... 118 2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 119 3. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS ...................................................................... 123 3.1. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de péptidos y proteínas mediante la aproximación del epítopo .................................................... 127 3.1.1. Publicación I: Tag-specific affinity purification of recombinant proteins by using molecularly imprinted polymers ................................................................ 129 Introduction ................................................................................... 129 Índice 4 Experimental section .................................................................... 131 Results and discussion ................................................................. 134 Conclusions .................................................................................. 142 Acknowledgments ........................................................................ 143 References ................................................................................... 143 Supporting information .................................................................. 146 3.1.2. Publicación II: Hierarchically imprinted polymer for peptide tag recognition based on an oriented surface epitope approach ................................................ 165 Introduction ................................................................................... 166 Results and discussion ................................................................. 168 Conclusions .................................................................................. 183 Experimental section .................................................................... 184 Acknowledgments ........................................................................ 187 References ................................................................................... 187 Supporting information .................................................................. 192 3.2. Polímeros de impronta molecular para el análisis de micotoxinas en alimentos… ............................................................................................................... 213 3.2.1. Publicación III: Tailoring molecularly imprinted polymer beads for alternariol recognition and analysis by a screening with mycotoxin surrogates .. 215 Introduction ................................................................................... 216 Materials and methods ................................................................. 217 Results and discussion ................................................................. 223 Conclusions .................................................................................. 232 Acknowledgments ........................................................................ 233 References ................................................................................... 233 Supporting information .................................................................. 237 3.3. Descubrimiento de fragmentos de anticuerpo VH mediante tecnología phage display selectivos a la fitohemaglutinina y su clasificación acorde a una estrategia multiparamétrica ....................................................................................................... 247 3.3.1. Publicación IV: Multi-parameter evaluation of phage-displayed VH fragments using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring ........... 249 Introduction ................................................................................... 250 Materials and methods ................................................................. 251 Results and discussion ................................................................. 253 Conclusions .................................................................................. 264 Acknowledgments ........................................................................ 265 References ................................................................................... 265 Índice 5 Supporting information .................................................................. 269 4. DISCUSIÓN INTEGRADORA ........................................................................... 279 4.1. Polímeros de impronta molecular como elementos de reconocimiento biomiméticos ............................................................................................................. 281 4.1.1. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de péptidos y proteínas recombinantes sintetizados mediante la aproximación del epítopo… ........................................................................................................... 281 Síntesis de MIPs mediante impronta no jerarquizada ................... 283 Síntesis de MIPs mediante impronta jerarquizada ........................ 293 4.1.2. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaria ................................................................................... 313 4.1.3. Optimización de la composición polimérica ......................................... 314 Evaluación de la selectividad y afinidad de los MIPs .................... 316 Optimización del método MISPE .................................................. 317 Optimización del método de extracción de micotoxinas de Alternaria en muestras de tomate ................................................................................... 319 4.2. Selección de fragmentos de anticuerpo VH selectivos a la fitohemaglutinina mediante la tecnología de presentación de proteínas en la superficie de fagos (phage display) y posterior caracterización empleando la microbalanza de cristal de cuarzo 325 4.2.1. Selección de la biblioteca de fagos ...................................................... 326 4.2.2. Enriquecimiento de fagos e identificación de clones selectivos ........... 328 4.2.3. Evaluación de los clones seleccionados .............................................. 329 4.2.4. Análisis de los clones empleando inmunoensayos ELISA ................... 330 4.2.5. Estrategias para el diseño de un ensayo de detección de PHA ........... 332 5. CONCLUSIONES .............................................................................................. 335 5.1. Síntesis de polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de péptidos y proteínas recombinantes mediante la aproximación del epítopo ......... 337 5.1.1. Síntesis de MIPs mediante impronta no jerarquizada (Publicación I) ....... 337 5.1.2. Síntesis de MIPs mediante impronta jerarquizada (Publicación II) ........... 338 5.2. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaria (Publicación III) ................................................................ 339 5.3. Descubrimiento de fragmentos de anticuerpo VH mediante tecnología phage display selectivos a la fitohemaglutinina y su clasificación acorde a una estrategia multiparamétrica (Publicación IV).............................................................................. 340 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 343 7. ANEXOS………………………………………………………………….………..……391 7.1. Anexo I ………………………………………………………….…………...……393 7.2. Anexo II ……………………………………………………………...…………….395 Abreviaturas y símbolos 9 ABREVIATURAS AA Ácido acrílico ABDV 2,2’-Azobis-(2,4-dimetilvaleronitrilo) ADN Ácido desoxirribonucleico ACN Acetonitrilo AEAPMS 3-(2-Aminoetilamino)propildimetoximetilsilano AETAZS N-(2-aminoetil)-2,2,4-trimetill-1-aza-2- silaciclopentano AFM Microscopio de fuerza atómica AIBN 2,2’-Azobis-(isobutironitrilo) 1-ALLP 1-Alilpiperazina ALT Altenueno AM Acrilamida AME Alternariol monometiléter AOH Alternariol APTES 3-aminopropiltrietoxisilano APTMS N'-[2-(3-trimetoxisililpropilamino)etil]etano-1,2- diamina ARN Ácido ribonucleico ATRP Polimerización por transferencia atómica ATX Altertoxina BSA Albúmina de suero bovino C Cisteína CCα Límite de decisión CCβ Capacidad de detección CDR Región determinante de la complementariedad CH Dominio constante de la cadena pesada CIT Citrinina CL Dominio constante de la cadena ligera CL Entrecruzante CRP Polimerización radicalaria controlada/viviente CSBF Tampón de bloqueo de caseína CV Coeficiente de variación, expresado como desviación estándar relativa D Ácido aspártico dAb Dominio de anticuerpo Abreviaturas y símbolos 10 DAD Detector de hilera de diodos DAEM Metacrilato de 2-dietilaminoetilo DMAP 4-Dimetilaminopiridina DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DON Deoxinivanelol DVB Divinilbenceno EAMA N-(2-aminoetil)metacrilamida ECL Quimioluminiscencia mejorada EDMA Dimetacrilato de etilenglicol EFSA Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria ELISA Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima ESI Ionización por electroespray ESIPT Transferencia de protón intramolecular en estado excitado Fab Fragmento de unión a antígeno Fc Región cristalizable FDA Administración de Medicamentos y Alimentos FLD Detector de fluorescencia FM Monómero funcional FP Cebador directo FR Región marco FRET Transferencia de energía de resonancia de Förster FRP Polimerización por radicales libres Fv Región variable hcAbs Anticuerpos exclusivos de cadena pesada HEMA Metacrilato de 2-hidroxietilo HEPES Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2- etanosulfónico HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia HRP Peroxidasa de rábano IF Factor de impronta Ig Inmunoglobulina IMAC Cromatografía de afinidad con metal inmovilizado Abreviaturas y símbolos 11 IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido K Tirosina LC Cromatografía líquida LLE Extracción líquido-líquido LMR Límite máximo de residuo LOD Límite de detección LOQ Límite de cuantificación MAA Ácido metacrílico MAM Metacrilamida mAb Anticuerpo monoclonal MAE Extracción asistida por microondas MALDI Desorción/ionización mediante láser asistida por matriz MBA N,N´-metilenbisacrilamida MBP Polímero de impronta molecular en bloque MeOH Metanol MD Dinámica molecular MIP Polímero de impronta molecular MISPE Extracción en fase sólida mediante polímeros de impronta molecular MS Espectrometría de masas MSP Polímero de impronta molecular en partículas esféricas MS/MS Espectrometría de masas en tándem NAR Nuevo receptor de antígeno NIP Polímero sin impronta NIPAm N-isopropilacrilamida NMP Polimerización mediada por nitróxidos NTA Ácido nitrilotriacético QCM-D Microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de disipación OD Densidad óptica OT Ocratoxina OPA o-ftaldehído PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida PB Tampón fosfato Abreviaturas y símbolos 12 PBS Tampón fosfato salino PCA Análisis de componentes principales PCR Reacción en cadena de la polimerasa PDMS Polidimetilsiloxano PEGDA Diacrilato de polietilenglicol PEGDMA Dimetacrilato de polietilenglicol PETRA Triacrilato de pentaeritritol PFBF Tampón de bloqueo libre de proteínas PHA Fitohemaglutinina pIII Proteína menor de la cápsida III PLE Extracción con líquidos presurizados PMF Huella peptídica PTSA Ácido p-toluensulfónico PVDF Fluoruro de polivinilideno QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe R Recuperación RAFT Polimerización por adición, fragmentación y transferencia reversible RRLC Cromatografía líquida de resolución rápida RP Cebador reverso RMN CP/MAS Resonancia magnética nuclear con polarización cruzada/giro al ángulo mágico RMSD Raíz de la desviación cuadrática media RSD Desviación estándar relativa S2 3,8,9-trihidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona SAM Monocapa autoensamblada scFv Fragmento de cadena sencilla variable scFab Fragmento de cadena sencilla de unión a antígeno sdAb Anticuerpo de dominio único SDS Dodecilsufato de sodio SELEX Evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial SEM Microscopia electrónica de barrido SLE Extracción sólido-líquido SFRP Polimerización vía radicales libres estables Abreviaturas y símbolos 13 SPE Extracción en fase sólida SPME Microextracción en fase sólida SPR Resonancia de plasmón superficial T Molécula plantilla TBA Hidrogenosulfato de tetrabutilamonio TBAOH Hidróxido de tetrabutilamonio TBS Tampón Tris salino TeA Ácido tenuazónico TEM Microscopia electrónica de transmisión TEN Tentoxina TEOS Tetraetilortosilicato TFA Ácido trifluoroacético TFMAA Acido trifluorometacrílico TMB 3,3',5,5'-tetrametilbencidina TOF Tiempo de vuelo TRIM Trimetacrilato de trimetilolpropano TTC Umbral de preocupación toxicológica UAE Extracción asistida por ultrasonidos ufc Unidad formadora de colonias ufp Unidad formadora de placas UPLC Cromatografía de líquidos de ultra eficacia VBA Ácido p-vinilbenzoico VH Dominio variable de la cadena pesada VL Dominio variable de la cadena ligera VIPY Vinilpiridina WB Western Blot Y Tirosina ZEA Zearalenona ZON Zearalenol SÍMBOLOS a Factor preexponencial que indica el número de sitios de unión y la afinidad media de la red C0 Concentración inicial de analito B Fracción de analito unida a un polímero D Factor de disipación Abreviaturas y símbolos 14 Df Grado de funcionalización F Fracción libre de analito en disolución f Frecuencia k Factor de retención kon Constante de velocidad de asociación koff Constante de velocidad de disociación K Constante de asociación KK1−K2 Afinidad media ponderada aparente Ka Constante de afinidad m Parámetro de heterogeneidad N Número de sitios de unión NK1−K2 Número aparente de sitios de unión Q Capacidad de unión tR Tiempo de retención f Rendimiento cuántico de fluorescencia f Tiempo de vida de fluorescencia λexc Longitud de onda de excitación λem Longitud de onda de emisión obs Cambio en el desplazamiento químico SA Área superficial específica Vp Volumen de poro específico NOTAS DE ESTILO 1. Con objeto de homogenizar el criterio de nomenclatura a lo largo de la presente Tesis Doctoral, los decimales no serán indicados con comas, sino con puntos. 2. Aunque los artículos han sido adaptados al formato de texto de la Tesis Doctoral, la numeración de Figuras, Tablas y Ecuaciones, así como las referencias bibliográficas es exclusiva de cada publicación de forma individual. Resumen 17 Diseño, síntesis, caracterización y aplicaciones analíticas de elementos de reconocimiento biomiméticos Los procesos de reconocimiento molecular constituyen la base para el establecimiento de uniones específicas entre un sistema receptor y su ligando, y representan el principio regidor de muchas de las interacciones que se producen en la naturaleza. En los procesos biológicos, los elementos de reconocimiento pueden ser, anticuerpos, enzimas, receptores celulares, etc. No obstante, a pesar de la demostrada selectividad que presentan los receptores de origen natural, su elevado coste de preparación y limitada estabilidad han conducido al desarrollo de alternativas de origen sintético y semisintético que permitan emular su comportamiento, evitando los inconvenientes asociados a su empleo para el desarrollo de métodos analíticos. Dentro de estas alternativas se encuentran los elementos de reconocimiento biomimético, tales como, aptámeros, péptidos, anticuerpos recombinantes o polímeros de impronta molecular (MIPs, del inglés molecularly imprinted polymers), ampliamente utilizados en diferentes aplicaciones bioanalíticas. Los anticuerpos recombinantes surgen como consecuencia de los avances producidos en el campo de la ingeniería genética y la biotecnología al facilitarse el diseño y la expresión de receptores derivados de los anticuerpos tradicionales. Al contrario que sus análogos biológicos, los anticuerpos recombinantes pueden presentarse en diferentes formatos dependiendo de la aplicación final, siendo uno de los más populares los denominados anticuerpos de dominio único. Estos anticuerpos recombinantes, especialmente los de origen humano correspondientes al dominio variable de la cadena pesada (VH), se posicionan como competidores frente a los anticuerpos tradicionales de origen biológico. Debido a su pequeño tamaño pueden acceder más fácilmente a un mayor número de epítopos presentes en el antígeno que una inmunoglobulina completa, además de presentar mayor estabilidad frente a procesos de desnaturalización, agregación o degradación. Asimismo, presentan mayor capacidad de penetración en los tejidos y menor coste de producción. La generación de estos anticuerpos recombinantes no requiere el empleo de animales de experimentación, ya que se lleva a cabo empleando métodos in vitro como las técnicas de presentación en superficie. Estas técnicas están basadas en el despliegue de los anticuerpos sobre diferentes plataformas, como levaduras, bacterias o fagos, siendo esta última (phage display) una de las más empleadas. Una de las etapas determinantes de esta técnica es el cribado de los anticuerpos recombinantes afines al analito diana. Tradicionalmente se emplean métodos ELISA, ya que cumplen la mayoría de los criterios necesarios para su selección eficaz como, por Resumen 18 ejemplo, su capacidad de analizar cientos de muestras de forma rápida y poco costosa. Sin embargo, una vez reducido el número de candidatos a niveles más manejables, es imprescindible introducir nuevas alternativas de cribado más específicas y que aporten suficiente información sobre las interacciones que se producen entre el fragmento desplegado y el antígeno. En este sentido, las técnicas de análisis que no emplean marcadores (label-free), como por ejemplo la resonancia de plasmón superficial (SPR) o la microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de disipación (QCM-D), permiten obtener dicha información de forma precisa y robusta. Los MIPs son materiales sintéticos que se preparan en presencia de la molécula plantilla, o un análogo estructural de la misma, de forma que, tras su eliminación, se generan en el polímero cavidades complementarias que facilitan su reconocimiento selectivo. Los MIPs son elementos de reconocimiento robustos, con una gran estabilidad química, térmica y mecánica, presentan bajo coste de preparación y gran versatilidad en cuanto a condiciones operativas. Debido a sus excelentes características, en la actualidad es posible encontrar MIPs para prácticamente cualquier compuesto y una gran variedad de aplicaciones, destacando su uso especialmente en procesos de extracción y separación. A pesar de la relativa facilidad de síntesis de estos elementos de reconocimiento, la impronta de macromoléculas conlleva limitaciones asociadas a su propia naturaleza, tales como la heterogeneidad de los sitios de unión generados en el material, o la desnaturalización y el atrapamiento permanente de la molécula plantilla en la red polimérica. Una alternativa a la impronta íntegra de macromoléculas es la denominada impronta subestructurada o “impronta de epítopo”. En esta aproximación, un fragmento representativo y presente en la macromolécula, denominado epítopo, se emplea como plantilla para la síntesis del MIP. De este modo, el material polimérico final será capaz de reconocer al epítopo empleado en su síntesis y, por ende, a la macromolécula completa. Esta aproximación es de suma relevancia en el campo de purificación de proteínas recombinantes, donde, a pesar del éxito de la impronta parcial de péptidos, el desarrollo de materiales poliméricos capaces de competir con las resinas comerciales se encuentra aún en desarrollo. Otro de los campos donde es necesario disponer de elementos de reconocimiento específicos y robustos que permitan el desarrollo de métodos de detección fiables es el de la seguridad alimentaria. Las reacciones adversas a los alimentos constituyen un importante problema de salud pública a nivel mundial debido a su creciente incidencia, estimándose que en países occidentales la prevalencia de estas patologías puede superar el 20%. De entre todas ellas, las reacciones tóxicas, por su carácter general, son las que suscitan mayor interés a nivel global. A diferencia de la hipersensibilidad alimentaria (alergias e Resumen 19 intolerancias), las reacciones tóxicas no dependen de la susceptibilidad individual y pueden aparecer en cualquier individuo que esté en contacto con el alimento. Estas sustancias tóxicas pueden aparecer como resultado de procesos físicos, químicos o biológicos durante el almacenaje o fabricación del producto, como es el caso de las micotoxinas. También pueden estar presentes de forma natural en el alimento e interferir en la biodisponibilidad de algún nutriente, denominándose agentes o factores antinutricionales, como las lectinas o los inhibidores de proteasas presentes en las legumbres. De este modo, el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral es la síntesis y caracterización de elementos de reconocimiento biomiméticos, específicamente polímeros de impronta molecular y anticuerpos recombinantes y su aplicación en la purificación de biomoléculas y el control de la seguridad alimentaria. Uno de los marcadores de fusión más versátiles que existen actualmente para la purificación de proteínas recombinantes es el polipéptido DYKDDDDK, conocido como FLAG. Como prueba de concepto, en la presente Tesis Doctoral se han desarrollado MIPs basados en la aproximación de epítopo para el reconocimiento selectivo del FLAG tanto en su forma de péptido libre como fusionado a una proteína fluorescente recombinante (mCherry). La Publicación I (Anal. Chem. 91 (2019) 4100−4106) describe la síntesis de MIPs empleando como molécula plantilla el extremo N-terminal del FLAG en su forma de cuatro aminoácidos (DYKD) y gel de sílice como molde sacrificable para la polimerización. Se diseñó una biblioteca de polímeros utilizando diferentes combinaciones de monómeros funcionales y entrecruzantes. Los mejores resultados se obtuvieron con el polímero MSP8 sintetizado empleando el péptido DYKD como molécula plantilla, hidrocloruro de N-(2-aminoetil)metacrilamida (EAMA•HCl) como monómero funcional y dimetacrilato de etilenglicol (EDMA) como entrecruzante. Además, se optimizó un método de extracción en fase sólida empleando el MIP (MISPE) para la extracción simultánea de los péptidos libres DYKD y DYKDDDDK, obteniéndose recuperaciones satisfactorias para ambos compuestos (RMSP8-DYKD = 64%, RMSP8-FLAG = 89%, CV < 7%). Posteriormente, se llevó a cabo la purificación de proteínas fluorescentes recombinantes marcadas con los péptidos DYKD y FLAG de un lisado celular (mCherry-DYKD y mCherry-FLAG, respectivamente) empleando el método MISPE optimizado. En ambos casos se consiguió obtener una limpieza y una recuperación excelente para ambas proteínas (RMSP8-mCherry-DYKD = 95%, RMSP8-mCherry-FLAG = 103%, CV < 15%), muy superior a la obtenida empleando una resina de inmunoafinidad comercial (ANTI-FLAG M2 Affinity Gel; RANTI-FLAG M2 = 58%, CV < 12%). Resumen 20 Continuando con esta línea de investigación, en la Publicación II (ACS Appl. Mater. Interfaces 12 (2020) 49111−49121) se describe la preparación de MIPs selectivos al péptido FLAG libre sintetizados mediante impronta jerarquizada a fin de disminuir las uniones no específicas obtenidas para este marcador en la publicación anterior. El empleo de esta estrategia, requiere inmovilizar la molécula plantilla sobre un soporte poroso, que actúa como molde sacrificable para la polimerización. De este modo, los sitios improntados se encuentran más accesibles al situarse orientados hacia la superficie del MIP tras la polimerización. Se ha optimizado una ruta completa de derivatización de partículas de sílice porosas para la inmovilización orientada del epítopo del FLAG, con una cisteína en su extremo C-terminal (DYKDC), sobre la superficie de la misma. El proceso completo consta de tres etapas: 1) aminación con dos organosilanos: difuncional AEAPMS (3-(2-aminoetilamino)propildimetoximetilsilano) o monofuncional AETAZS (N-(2-aminoetil)-2,2,4-trimetill-1-aza-2-silaciclopentano); 2) yodoacetilación con anhídrido yodoacético como etapa intermedia y, 3) derivatización covalente del péptido DYKDC. Las partículas silanizadas se caracterizaron extensamente mediante resonancia magnética nuclear de sólidos (29Si CP/MAS RMN), en colaboración con la Prof. N. García, del Instituto de Ciencia y Tecnología de Polímeros del CSIC (Madrid), con objeto de conocer la distribución de las cadenas de silano injertadas. Los MIPs se sintetizaron empleando EAMA•HCl como monómero funcional, EDMA como entrecruzante y las sílices derivatizadas con el péptido DYKDC como soporte y plantilla correspondiente. El MIP sintetizado empleando el silano monofuncional (MIP-AZA) fue el que permitió obtener el mejor reconocimiento selectivo del FLAG. Además, el empleo de polímero jerarquizado (MIP-AZA) mejoró sustancialmente los resultados obtenidos con el MIP no jerarquizado sintetizado en la Publicación I, disminuyendo drásticamente las interacciones no específicas (factor de impronta 21.3 vs. 3.3). Complementariamente, empleando estudios de modelización molecular de los péptidos, realizados en colaboración con el Prof. Y. Rodríguez del Department of Natural Sciences, Hostos Community College of CUNY (Nueva York), se ha justificado la mayor retención en el MIP del péptido FLAG, en comparación con el péptido DYKDC empleado como plantilla, debido a la rápida interconversión de las conformaciones del octapéptido. La Publicación III (J. Chromatogr. A 1425 (2015) 231−239), describe la síntesis de un MIP selectivo a la micotoxina alternariol (AOH) y la optimización de un método de extracción de la misma en muestras de tomate troceado. Para ello se preparó una biblioteca de MIPs empleando diferentes combinaciones de análogos sintéticos del alternariol como moléculas plantilla (designados como S1−S4), varios monómeros Resumen 21 funcionales y entrecruzantes de diferente polaridad. El polímero que mejores resultados ofreció fue aquel sintetizado con el análogo 3,8,9-trihidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona (S2) como molécula plantilla, EAMA como monómero funcional, metacrilamida (MAM) como monómero diluyente y EDMA como entrecruzante, empleando gel de sílice como molde sacrificable para la polimerización. Además, se evaluó la selectividad de este material en términos de factor de impronta (IF), así como las constantes de afinidad del MIP y del polímero sin impronta (NIP) a partir de las isotermas de adsorción. Se optimizó un método de extracción MISPE para la determinación de alternariol empleando 100 mg de polímero y las siguientes condiciones de extracción: 1) acondicionamiento (5 mL MeOH, 10 mL tampón fosfato (PB, 100 mM, pH 8.5); 2) carga (15 mL de muestra en PB); 3) lavado (3 mL H2O/AcN (80:20, v/v)); 4) elución (1 mL MeOH/TFA 1% (v/v)). Además, se optimizó un método de análisis completo para la determinación de alternariol en muestras de tomate troceado empleando ultrasonidos en la etapa de extracción, seguido de la extracción MISPE y detección por cromatografía de líquidos de alta eficacia con detección por fluorescencia (HPLC-FLD), obteniendo recuperaciones cuantitativas en todo el intervalo de concentraciones estudiado. La Publicación IV (artículo en preparación) detalla el proceso de selección y producción de anticuerpos recombinantes VH desplegados en fagos selectivos a la lectina fitohemaglutinina (PHA), empleando la tecnología phage display. En colaboración con el grupo del Prof. Á. Maquieira de la Universidad Politécnica de Valencia, se realizó una profunda caracterización de los mismos mediante la evaluación de los parámetros cinéticos y termodinámicos de la interacción VH-PHA empleando QCM-D y su clasificación mediante el análisis de componentes principales (PCA). Para ello, se llevó a cabo el proceso de selección de fagos recombinantes, aplicando cuatro rondas de enriquecimiento, a partir de una biblioteca sintética que presentaba fragmentos de anticuerpo VH de forma monovalente. Posteriormente, se aislaron e identificaron clones (fagos que presentan el mismo fragmento VH) procedentes de las diferentes rondas de selección, obteniendo un total de ocho secuencias diferentes. Se establecieron los valores de hidropaticidad de las regiones CDR de los distintos fragmentos VH y, a partir de las medidas realizadas con la QCM-D, se calcularon las constantes de velocidad de asociación (kon), disociación (koff) y afinidad (Ka) de cada uno de los clones por la lectina PHA. Con objeto de clasificar los ocho clones y combinar toda la información recabada, se llevó a cabo un análisis PCA, estableciéndose como representativos el factor de disipación (D), la hidropaticidad del CDR3 y la kon. A partir de estos resultados los clones se clasificaron en tres grupos: grupo A y B agrupados estructuralmente en función del factor de disipación (D) y la hidropaticidad del CDR3, Resumen 22 respectivamente, y el grupo C agrupados termodinámicamente según el valor de kon. Además, los análisis estructurales de las secuencias, así como la modelización molecular de los complejos formados entre la PHA (E2L2) y los fragmentos VH, permitieron establecer las zonas de interacción con los epítopos de la PHA. La información obtenida aplicando esta metodología resulta de gran utilidad tanto para el desarrollo de sensores para la determinación de PHA de manera directa sin emplear marcadores, como para el desarrollo de inmunosensores basados en ensayos de tipo sándwich, ya que es posible identificar el par de fragmentos de anticuerpos más apropiado para interaccionar con diferentes epítopos en la proteína. Summary 25 Design, synthesis, characterization and analytical applications of biomimetic recognition elements Molecular recognition is the basis for the interaction between a receptor system and its ligand in a specific geometry, and it represents the main principle of many interactions that occur in nature. In biological processes, the recognition elements can be antibodies, enzymes, cell receptors, etc. However, despite the demonstrated selectivity of receptors of natural origin, their high preparation cost and limited stability have led to the development of synthetic and semi-synthetic alternatives that emulate their behaviour, avoiding the inconveniences associated to their application in the development of analytical methods. Biomimetic recognition elements, such as aptamers, peptides, recombinant antibodies or molecularly imprinted polymers (MIPs), are included in this group and nowadays they are widely used in bioanalytical applications. The application of recombinant antibodies has increased significantly in the last decades thanks to the advances in the fields of genetic engineering and biotechnology that have facilitated the design and expression of receptors derived from traditional antibodies. In contrast to their biological counterparts, recombinant antibodies can be obtained in different formats depending on their final application, one of the most popular being the so-called single domain antibodies. These recombinant antibodies, especially those of human origin corresponding to the variable domain of the heavy chain (VH), are especially suitable for analytical applications and compete favorably with traditional antibodies of biological origin. Due to their small size, they can easily access to a higher number of epitopes present in the antigen than a complete immunoglobulin, in addition they are more stable against denaturation, aggregation, or degradation processes. Likewise, they have a greater capacity for tissue penetration and lower production costs. Production of recombinant antibodies does not require animal experimentation, since it is carried out using in vitro methods, such as surface display techniques. These techniques are based on the display of antibodies on different platforms, such as yeast, bacteria or phages, the latter being one of the most widely used (“phage display”). One of the key steps of this technique is the screening of the recombinant antibodies that interact with the target analyte. ELISA methods are traditionally used to this aim, as they meet most of the criteria required for the efficient selection of the best antibody candidates, including the ability to analyze hundreds of samples within short times and relatively low cost. However, once the number of candidates has been reduced to a manageable size, it is essential to introduce new, more specific screening methods that allow the detailed characterization of the interactions taking place between the antibody fragment and the analyte. In this regard, the use of label-free analysis Summary 26 techniques, such as surface plasmon resonance (SPR) or the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), is an excellent alternative for gathering accurate and reliable information. Molecularly imprinted polymers (MIPs) are synthetic materials prepared in the presence of a template molecule, or a structural analogue. After template extraction the resulting polymer will contain cavities complementary in size, shape and functional group distribution to the template molecule that will facilitate its selective recognition. MIPs are robust materials, with great chemical, thermal and mechanical stability, low preparation costs and great versatility in terms of operational conditions. Due to their excellent properties, it is possible to prepare MIPs for practically any compound and a wide variety of applications, highlighting their use, especially in analytical extraction and separation processes. Despite the relatively simple synthesis of these recognition elements, the imprinting of macromolecules has certain limitations due to their intrinsic nature, resulting in the synthesis of MIPs with a heterogeneous distribution of binding sites generated, or to the denaturation and permanent entrapment of the template molecule in the polymeric network. An alternative to the imprinting of the whole macromolecule is the so-called substructured imprinting or "epitope imprinting". In this approach, a representative fragment of the macromolecule, known as the epitope, is used as template for the MIP synthesis. In this way, the final polymeric material will be able to recognize the epitope used in its synthesis and, in principle, the whole macromolecule. This approach is of especial interest in the field of recombinant protein purification, where, despite the success of peptide imprinting, the development of polymeric materials capable of competing with commercial resins is still in its infancy. Food safety is another field demanding the availability of specific and robust recognition elements that allow the development of reliable detection methods. Adverse reactions to food constitute a major public health problem worldwide due to their increasing incidence, and it is estimated that in western countries the prevalence of these pathologies may exceed 20%. Among all of them, and due to their general nature, toxic reactions are the ones that attract the main interest globally. Unlike food hypersensitivity (allergies and intolerances), toxic reactions do not depend on individual susceptibility and may appear in any consumer in contact with food. These toxic substances can appear as a result of physical, chemical or biological processes during the storage or manufacture of the product, as in the case of mycotoxins. They can also be naturally present in food and interfere with the bioavailability of some nutrients, receiving the name of antinutritional agents or factors, as is the case of lectins or the protease inhibitors present in legumes. Summary 27 The main aim of this PhD thesis is the synthesis and characterization of biomimetic recognition elements, specifically molecularly imprinted polymers and recombinant antibodies and their application in the purification of biomolecules and in the control of food safety. One of the most versatile fusion markers currently available for the purification of recombinant proteins is the DYKDDDDK polypeptide, known as FLAG. As proof of concept, the present PhD thesis describes the development of MIPs, based on the epitope approach, for the selective recognition of the FLAG tag both as a free peptide and fused to a recombinant fluorescent protein (mCherry). Publication I (Anal. Chem. 91 (2019) 4100−4106) describes the synthesis of MIPs using the four aminoacids at the N-terminal end of FLAG (DYKD) as template molecule and silica gel as a sacrificial scaffold for the polymerization. A polymer library was designed using different combinations of functional and cross-linking monomers. The best results were obtained with the MSP8 polymer synthesized using the DYKD peptide as the template molecule, N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (EAMA•HCl) as the functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) as the cross-linker. Furthermore, a solid phase extraction method was optimized using MIPs (MISPE) for the simultaneous extraction of the free peptides DYKD and DYKDDDDK, obtaining satisfactory recoveries for both compounds (RMSP8-DYKD = 64%, RMSP8-FLAG = 89%, RSD < 7%). The optimized MISPE method was applied to the purification of recombinant fluorescent proteins, labelled with DYKD and the FLAG peptides, from a cell lysate (mCherry-DYKD and mCherry-FLAG, respectively). In both cases, it was possible to obtain excellent purifications and recoveries for both proteins (RMSP8-mCherry-DYKD = 95%, RMSP8-mCherry-FLAG = 103%, RSD < 15%), significantly higher than that obtained using a commercial immunoaffinity resin (ANTI-FLAG M2 Affinity Gel; RANTI-FLAG M2 = 58%, RSD < 12%). Continuing with this line of research, Publication II (ACS Appl. Mater. Interfaces 12 (2020) 49111−49121) describes the synthesis of MIPs selective to the free FLAG tag by hierarchical imprinting, to reduce the non-specific interactions obtained for this marker in the previous work. The use of this strategy requires the immobilization of the template molecule on a porous support, which acts as a sacrificial scaffold for polymerization. In this way, the imprinted sites are more accessible as they are oriented to the surface of the MIP after polymerization. A complete route of derivatization of porous silica particles has been optimized for the targeted immobilization of the FLAG epitope on the surface of the particles, using a five aminoacid peptide with a cysteine at its C-terminal end (DYKDC) as template molecule. The immobilization process consists of three steps: 1) amination with an organosilane: the difunctional 3- (2-aminoethylamino) Summary 28 propyldimethoxymethylsilane (AEAPMS) or the monofunctional N-(2-aminoethyl)-2,2,4- trimethyl-1-aza-2-silacyclopentane (AETAZS); 2) iodoacetylation with iodoacetic anhydride as an intermediate step and, 3) covalent binding of the DYKDC peptide. The silanized particles were extensively characterized by solid-state nuclear magnetic resonance (29Si CP/MAS NMR), in collaboration with Prof. N. García, from the Instituto de Ciencia y Tecnología de Polímeros del CSIC (Madrid), to determine the distribution of the grafted silane chains. The MIPs were synthesized using EAMA•HCl as functional monomer, EDMA as cross-linker, and the derivatized silicas with the DYKDC peptide as template and sacrificial mold. The highest selective recognition of the FLAG tag was obtained with the polymer synthesized using the monofunctional silane (MIP-AZA). Furthermore, the use of the hierarchically imprinted polymer (MIP-AZA) substantially improved the results obtained with the non-hierarchical MIP synthesized in Publication I, due to the drastic reduction of the non-specific interactions (imprinting factor 21.3 vs 3.3). In parallel, molecular modeling studies, developed in collaboration with Prof. Y. Rodriguez from the Department of Natural Sciences, Hostos Community College of CUNY (New York), were carried out to understand why the hierarchically MIP templated with the peptide DYKDC recognizes better the FLAG tag than the shorter DYKD peptide. Both peptides share the same number of conformations (i.e., 3) and the same most populated conformation. However, the FLAG tag shows quick conformational changes that could allow a better fitting into the MIP cavities than the DYKD. Publication III (J. Chromatogr. A 1425 (2015) 231−239), describes the synthesis of a selective MIP to alternariol mycotoxin (AOH) and the optimization of an extraction method for the analysis of this analyte in tomato samples. For this purpose, a MIP library was prepared using different combinations of synthetic AOH analogues as template molecules (designated as S1-S4), several functional and cross-linking monomers of different polarity. The best results were obtained with the polymer that was synthesized with the analogue 3,8,9-trihydroxy-6H-dibenzo[b,d]pyran-6-one (S2) as template molecule, EAMA as functional monomer, methacrylamide (MAM) as diluent monomer and EDMA as cross-linker and using silica gel as a sacrificial scaffold for polymerization. The selectivity of the material was evaluated in terms of the imprinting factor (IF), and the affinity constants of AOH for the MIP and the non-imprinted polymer (NIP) were calculated from the adsorption isotherms. A MISPE method was optimized for the determination of AOH using 100 mg of polymer and the following extraction conditions: 1) conditioning (5 mL MeOH, 10 mL phosphate buffer (PB, 100 mM, pH 8.5)); 2) loading (15 mL of sample in PB); 3) washing (3 mL H2O/ACN (80:20, v/v)) and 4) elution (1 mL MeOH/TFA 1% (v/v)). The analysis of AOH in tomato samples was carried out using Summary 29 ultrasounds in the extraction step, followed by MISPE extraction and detection by HPLC- FLD, obtaining quantitative recoveries in the whole concentration range. Publication IV (manuscript in preparation) describes the process of selection and production of recombinant phage-displayed VH antibodies for phytohaemagglutinin lectin (PHA). For this purpose, the phage selection process was accomplished in four rounds of enrichment, from a synthetic library that presented VH antibody fragments in a monovalent form. Subsequently, clones (phages displaying the same VH fragment) from different rounds of selection were isolated and their sequences were identified, obtaining a total of eight different sequences. A extense characterization of the VH-PHA interaction was performed by evaluating the kinetic and thermodynamic parameters using a quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D). The hydropathicity values of the CDR regions of the different VH fragments were determined as well as the association rate (kon), dissociation rate (koff) and affinity (Ka) constants of each one of the clones for the PHA lectin. The data generated from the eight clones was analyzed by principal component analysis (PCA), finding that the dissipation factor (D), the hydropathicity values of the CDR3 region and the kon were the most representative parameters. Based on these results, the clones were classified into three groups: group A and B grouped structurally according to the dissipation factor (D) and hydropathicity of CDR3, respectively, and group C grouped thermodynamically according to the value of kon. Furthermore, the structural analysis of the sequences, as well as the molecular modeling of the complexes formed between the PHA (E2L2) and the VH fragments, allowed to identify the areas of interaction with the PHA epitopes. The information obtained by this methodology is very useful both, for the development of label-free sensors for the direct analysis of PHA, and for the development of immunosensors based on sandwich-type assays, since it allows the selection of the most appropriate pair of antibody fragments interacting with different epitopes on the same protein. This work was developed in collaboration with the group of Prof. Á. Maquieira from the Polytechnic University of Valencia. Introducción 33 1.1. Elementos de reconocimiento biomiméticos Los elementos de reconocimiento molecular desempeñan un papel clave en el desarrollo de aplicaciones analíticas en diversos campos como la detección de enfermedades, seguridad alimentaria, catálisis, administración de fármacos o monitorización ambiental. El reconocimiento molecular es el proceso en el que se produce la interacción específica entre dos o más moléculas, que exhiben complementariedad molecular, a través de enlaces no covalentes incluyendo fuerzas hidrofóbicas, fuerzas de Van der Waals, el enlace de hidrógeno, la coordinación ligando- metal, las interacciones π-π, y/o los efectos electrostáticos.1 Este proceso se produce espontáneamente en la naturaleza y va a ser el punto de partida de numerosos procesos biológicos incluyendo, por ejemplo, las hormonas, los sistemas enzima-sustrato y antígeno-anticuerpo o los mecanismos de acción de los fármacos, entre otros. El elemento de reconocimiento o sistema receptor, puede ser de origen natural como los anticuerpos, enzimas o células, o sintético y/o semisintético como es el caso de los aptámeros, péptidos, anticuerpos recombinantes o los polímeros de impronta molecular (MIPs, del inglés molecularly imprinted polymers). Mientras que los primeros hacen referencia a aquellas construcciones biológicas que presentan una alta especificidad hacia el analito y que pueden encontrarse en la naturaleza sin necesidad de modificaciones, los elementos de reconocimiento sintéticos son estructuras diseñadas y construídas artificialmente para emular las interacciones naturales específicas. Por todo ello a estos sistemas de reconocimiento sintético y/o semisintético también se les conoce como elementos de reconocimiento biomiméticos. El término “biomimético” deriva de la palabra griega biomimesis que combina los términos “bio” (vida) y “mimesis” (imitación) y fue acuñado en 1957 por Otto Schmitt para designar aquello que está inspirado, adaptado o deriva de la naturaleza.2 La palabra “biomimética” se introdujo por primera vez en el diccionario en 1974 y se define como “el estudio de la formación, estructura o función de sustancias y materiales producidos biológicamente (como enzimas o seda) y mecanismos y procesos biológicos (como síntesis de proteínas o fotosíntesis) con el propósito de sintetizar especialmente, por mecanismos artificiales, productos similares que imitan a los naturales”. Como su propia definición implica, y según recoge The Royal Society, el campo de la biomimética es altamente interdisciplinar e “implica la comprensión de las funciones biológicas, estructuras y principios de diversos objetos encontrados en la naturaleza por biólogos, físicos, químicos y científicos de materiales, así como el diseño y fabricación de diversos materiales y dispositivos de interés comercial por ingenieros, científicos de materiales, químicos y otros”.3 Introducción 34 Aunque los receptores biológicos presentan una elevada especificidad y afinidad, su uso para aplicaciones analíticas habitualmente se ve limitado por su escasa estabilidad en medios no fisiológicos, elevado coste, bajo rendimiento de producción y su poca o nula reutilización.4 Es por ello que en las últimas décadas se han producido notables avances en la búsqueda de elementos de reconocimiento biomiméticos diseñados “a la carta”, a fin de solventar los problemas que presentan los receptores biológicos. Para el descubrimiento o desarrollo de estos nuevos elementos se pueden emplear diversas metodologías entre las que se incluyen, la química computacional, la química combinatoria y la técnica de presentación en superficie de fagos (phage display), entre otras.5 A continuación, se describen las características más relevantes de los receptores biomiméticos más utilizados en aplicaciones analíticas. 1.1.1. Aptámeros Los aptámeros son ácidos nucleicos monocatenarios de tipo ADN (ssADN, del inglés single stranded) o ARN utilizados ampliamente en bioensayos y biosensores. El término aptámero deriva del latín aptus que significa “ajustar” o “unir” y de la palabra griega meros que significa “partícula”. Los aptámeros presentan una forma tridimensional específica y son más pequeños que los anticuerpos tradicionales, oscilando entre 20 y 120 nucleótidos (5-20 kDa).6 Presentan una baja inmunogenicidad, bajo coste de fabricación, versatilidad en cuanto a modificaciones químicas, buena reproducibilidad entre diferentes lotes y un amplio espectro de moléculas diana, desde pequeñas moléculas orgánicas, iones, péptidos hasta complejos proteicos y células.7 Los aptámeros se aislan de genotecas de oligonucleótidos empleando el método SELEX (del inglés, systematic evolution of ligands by exponential enrichment), descrito por primera vez en 1990.8,9 Los sensores basados en aptámeros, denominados aptasensores, se han desarrollado en diferentes formatos y normalmente asociados al empleo de nanomateriales, no solo para generar una señal analítica sino también para amplificarla, aumentando así la sensibilidad del aptasensor. Además, la inmovilización de los aptámeros permite la construcción de dispositivos de multiplexado, facilitando la detección simultánea de varios analitos y la integración de estos receptores en dispositivos portátiles y miniaturizados.10 Existen numerosas estrategias para el desarrollo de aptasensores, pero las más extendidas están basadas en medidas de fluorescencia. Por ejemplo, el aptámero modifica su conformación de forma notable en presencia del analito, lo que ha facilitado el desarrollo de aptasensores basados en Introducción 35 transferencia de energía de resonancia de Förster (del inglés, Förster resonance energy transfer, FRET). El fenómeno FRET hace referencia al proceso de transferencia de energía entre dos grupos (donador y aceptor) separados entre sí por una corta distancia (1 − 10 nm) y depende, entre otros factores, del solapamiento espectral entre el espectro de absorción del aceptor y el espectro de fluorescencia del donador. Así, cuando el analito se une al aptámero, al modificarse la conformación tridimensional de este se puede producir el acercamiento del par donador/aceptor y con ello la transferencia energética (Figura 1A), con la consiguiente variación en la señal analítica.11 Otra variante, que se muestra en la Figura 1B, consiste en la hibridación inicial entre el aptámero conjugado a un grupo fluoróforo y la hebra de ADN complementaria conjugada a un grupo desactivante. Así, en presencia de la molécula diana, se libera el aptámero con el correspondiente incremento de la señal de fluorescencia. En combinación con esta hibridación inicial, es común el uso de superficies inorgánicas, tales como el óxido de grafeno, para inmovilizar temporalmente el aptámero marcado. Este material además sirve como desactivador de la fluorescencia. En presencia del analito, el aptámero se desorbe del nanomaterial, uniéndose a este y provocando un incremento de la señal analítica.12 También es posible la escisión de un mismo aptámero en dos partes y su posterior autoensamblaje. Así, si los fragmentos poseen en sus extremos un fluoróforo y un agente desactivante respectivamente, en presencia del analito se autoensamblarán dando lugar a una disminución de la señal (Figura 1C). En lugar de los agentes tradicionales, diversos nanomateriales se han empleado como agentes desactivantes, como por ejemplo puntos cuánticos, nanopartículas de oro, óxido de grafeno o nanotubos de carbono.13 Figura 1. Estrategias empleadas en la construcción de un aptasensor (Q = agente desactivante, F = fluoróforo). (A) Basado en el fenómeno FRET con cambio inducido de conformación. (B) Basado en cambio de estructura. (C) Basado en autoensamblaje. Adaptado de la referencia [14]. A B C Introducción 36 Además de la fluorescencia para el desarrollo de aptasensores, pueden emplearse otras técnicas de detección, tanto ópticas (colorimetría, quimioluminiscencia) como electroquímicas.15 1.1.2. Péptidos Los péptidos son moléculas que contienen dos o más aminoácidos unidos mediante un enlace amida, denominado enlace peptídico, formado entre el grupo carboxilo terminal de un aminoácido y el grupo amino terminal del siguiente. Algunos péptidos se encuentran de forma natural en los organismos y cumplen importantes funciones vitales ya que están implicados en numerosos procesos bioquímicos. Los péptidos sintéticos constituyen herramientas muy valiosas en diferentes campos analíticos, por ejemplo para el desarrollo de nuevos fármacos, como agentes terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades o para el diagnóstico clínico.16,17 Su potencial analítico radica en la similitud que presentan con la zona de reconocimiento de los anticuerpos. Son muy estables en gran variedad de condiciones, incluso en presencia de agentes desnaturalizantes. Esto se debe a la menor longitud de su cadena peptídica, en comparación con las proteínas, con tamaño molecular < 100 kDa. Existen diversas técnicas de cribado para la selección de péptidos con alta afinidad por la molécula diana basadas en el empleo de bibliotecas tanto de origen químico como recombinante, que se pueden modelizar fácilmente mediante herramientas informáticas. Estos compuestos se pueden modificar químicamente de forma relativamente fácil, incluyendo las modificaciones postraduccionales, lo cual los hace muy versátiles para su aplicación como elementos de reconocimiento. No obstante, por sí mismos no proporcionan una señal medible en respuesta a su interacción con la molécula diana, por ello, es necesaria su conjugación con un grupo que sí la produzca.18 Entre las estrategias más utilizadas cabe destacar su conjugación, tras la etapa de síntesis, con un grupo fluoróforo o bien con nanopartículas,19 puntos cuánticos20 o grafeno21 como marcadores. Alternativamente, pueden obtenerse péptidos artificiales mediante procedimientos estándar de síntesis en fase sólida (SPSS, del inglés solid-phase peptide synthesis), empleando una resina sobre la que se va construyendo la cadena peptídica.22 Otra de las técnicas para la obtención de péptidos artificiales es la tecnología de presentación en superficie de fagos (phage display). Como se comentará más adelante, se trata de una técnica muy utilizada para la selección in vitro tanto de fragmentos de anticuerpos como de péptidos selectivos a un analito concreto. Introducción 37 Se han desarrollado diferentes estrategias para el desarrollo de biosensores empleando péptidos como elementos de reconocimiento para la detección de diversos analitos (proteínas, iones metálicos y ácidos nucleicos): A) La estrategia más simple consiste en el empleo de péptidos funcionalizados con un fluoróforo. En presencia del analito se produce un cambio en las condiciones del medio que origina una variación en la señal del fluoróforo (variación de la longitud de onda de emisión, desactivación de la fluorescencia). Esta estrategia se ha utilizado para el desarrollo de sensores para la detección de biomarcadores proteicos del cáncer, polisacáridos e incluso iones metálicos.23,24,25 B) Otra de las estrategias empleada se basa en la formación de excímeros entre dos fluoróforos idénticos que se encuentran anclados a los extremos finales del péptido. En presencia del analito, la interacción entre este y el péptido fuerza a los fluoróforos a separarse, originándose un cambio en el espectro de emisión.26 Esta estrategia se ha empleado, por ejemplo, para la detección de anticuerpos anti-VIH,27 como en el desarrollo de sensores para la detección de ADN28 o iones metálicos. 29 C) Los sensores basados en el fenómeno FRET se componen de un par donador/aceptor y la secuencia peptídica. Cuando el analito se une al péptido, cambia la conformación tridimensional del mismo y al disminuir la distancia entre el donador y el aceptor se produce la transferencia energética. Esta aproximación se ha empleado, por ejemplo, para la detección de enzimas o metales como se muestra en la Figura 2:30,31 Figura 2. Biosensor empleado para la detección de mercurio empleando un péptido modificado con un grupo fluoróforo donador y un grupo aceptor. Adaptado de la referencia [31]. P E T I D O P h P E T I D O P h Hg2+ h Introducción 38 Alternativamente, los péptidos pueden utilizarse también como mímicos de un epítopo, o mimotopos, de un antígeno. Es decir, pueden unirse al mismo paratopo del anticuerpo que la molécula diana, y por tanto, provocar una respuesta idéntica o muy similar a la del epítopo original.32 Esta particularidad les convierte en elementos muy útiles para su aplicación en inmunoensayos de tipo competitivo, en los que se necesita reemplazar el conjugado de la molécula diana-marcador por el mimotopo, ya sea debido a la toxicidad de dicha molécula como por su coste, disponibilidad o dificultad de conjugación.33 La selección de los mimotopos se lleva a cabo empleando la técnica de phage display y diferentes bibliotecas de fagos. Después de la identificación del mejor candidato, el mimotopo se sintetiza químicamente34 o por ejemplo, se expresa fusionado a una proteína fluorescente, para servir de marcador sin la necesidad de emplear anticuerpos secundarios en el inmunoensayo.35 1.1.3. Anticuerpos recombinantes Los anticuerpos, también denominados inmunoglobulinas, son glicoproteínas producidas por el sistema inmune en respuesta a la presencia de un estímulo extraño.36 Debido a su alta especificidad frente a un analito concreto, los anticuerpos son los elementos de reconocimiento más utilizados en el campo de los biosensores, biomedicina y biotecnología.37 Los anticuerpos que se emplean en el campo de investigación y diagnóstico se obtienen tras la inmunización de animales de laboratorio (conejos, ratones, cabras o caballos) con un determinado antígeno. Así, el sistema inmune del animal produce anticuerpos específicos que son recogidos en el suero total (denominado antisuero). Estos anticuerpos no son todos idénticos, puesto que pueden reconocer diferentes epítopos de un mismo antígeno debido a la respuesta de múltiples células B, y se denominan anticuerpos policlonales. Reconocen al antígeno con distinta especificidad y afinidad, pudiendo presentar un alto grado de variabilidad entre lotes, alta reactividad cruzada y uniones no específicas.38 Cuando los anticuerpos se producen en un único clon de células B presentarán idéntica afinidad por el mismo epítopo del antígeno, denominándose anticuerpos monoclonales.39 A diferencia de los anticuerpos policlonales, estos muestran mayor especificidad y afinidad por su antígeno, además de mayor homogeneidad entre lotes, lo que permite obtener una mayor reproducibilidad entre ensayos. La demanda de métodos alternativos para la generación de anticuerpos que permitan reemplazar el uso de animales vivos por otros modelos in vitro es cada vez mayor. Gracias a ello, en los últimos años se han producido notables avances biotecnológicos que han facilitado la producción de diferentes tipos de anticuerpos recombinantes con mejores propiedades bioanalíticas que los anticuerpos clásicos. Introducción 39 Clasificación de los anticuerpos recombinantes Existen 5 clases de inmunoglobulinas, IgA, IgD, IgE, IgM e IgG, siendo esta última la más utilizada para el desarrollo de inmunoensayos. Las inmunoglobulinas IgG constan de cuatro cadenas polipeptídicas, distinguiéndose dos cadenas pesadas H (del inglés, heavy) y dos cadenas ligeras L (del inglés, light) unidas entre sí por enlaces disulfuro y adoptando una estructura característica en forma de Y (Figura 3). Tanto la cadena H como la cadena L constan de dos dominios variables denominados VH y VL respectivamente. Este dúo (VH y VL) constituye el denominado fragmento o región variable Fv (del inglés, variable fragment), mientras que la región constante está conformada por los tres dominios constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3) y el dominio constante (CL) de la cadena ligera. Además de diferenciar entre región variable y constante, es posible distinguir dos tipos de fragmentos acorde a su funcionalidad. De este modo, la molécula de IgG posee un fragmento de región cristalizable (Fc, del inglés crystalizable fragment), responsable de la interacción, con los receptores de la superficie celular y el fragmento de unión a antígeno (Fab, del inglés antigen binding fragment) unidos entre sí mediante un enlace disulfuro. La región Fab es la responsable de la unión a los antígenos y está compuesta por los dominios VL y CL de la cadena ligera y los dominios VH y CH de la cadena pesada.40 Figura 3. Estructura típica de la inmunoglobulina IgG. En la ampliación se muestra la región variable (Fv) con las regiones CDR en rojo. Adaptado de la referencia [41]. La especificidad de los anticuerpos recae en la región variable (Fv) bivalente y monoespecífica, formada por el tándem VH y VL. Cada uno de estos dominios posee tres regiones hipervariables no contiguas, denominadas regiones determinantes de la complementariedad CDR (del inglés complementarity determining region), encargadas de la interacción con el antígeno (CDR1, CDR2 y CDR3). La superficie o cavidad donde se localiza la región del anticuerpo que reconoce al epítopo del antígeno se denomina paratopo. Las regiones CDR se encuentran separadas entre sí por regiones muy VH VH VL VL CL CL CH1 CH1 CH2 CH2 CH3 CH3 Región constante Región variable (Fv) Zona de reconocimiento de antígeno Cadena ligera (L) Cadena pesada (H) Fc Fab CDR H2 CDR L3 CDR L1 CDR H1 CDR H3 CDR L2 VH VL Introducción 40 conservadas que no presentan interacción con el antígeno (FR del inglés, framework regions).42 Como se ha comentado anteriormente, aunque los anticuerpos del tipo IgG se han utilizado profusamente en bioanálisis, presentan ciertas limitaciones asociadas a su coste y limitada estabilidad en medios no fisiológicos o frente a altas temperaturas. Los avances en el campo de la ingeniería genética y la biotecnología han hecho posible el diseño y la expresión de entidades más pequeñas derivadas de los anticuerpos tradicionales, denominadas anticuerpos recombinantes, que son menos susceptibles de desnaturalizarse, agregarse o degradarse.43 Se trata de fragmentos que mantienen la misma selectividad por el analito que el anticuerpo completo, con la ventaja de que son más pequeños y fáciles de producir. La generación de anticuerpos recombinantes se realiza empleando metodologías in vitro, gracias a las denominadas tecnologías de presentación en superficie (display), basadas en la construcción de bibliotecas con una amplia variedad genotípica y el posterior cribado y selección de las secuencias más afines al analito. Entre las tecnologías de presentación disponibles para este fin cabe destacar las basadas en el empleo de levaduras (yeast display), bacterias (bacterial display), células de mamífero, retrovirus (retrovirus display) o fagos (phage display), siendo esta última, como se comentará más adelante, una de las más empleadas en la actualidad. También pueden emplearse otras tecnologías basadas en la formación de un complejo covalente entre el anticuerpo y el ARN mensajero (mRNA display), entre el anticuerpo y el ADN (DNA display) o con el propio ribosoma (ribosome display).44 Los anticuerpos recombinantes pueden presentarse en diferentes formatos dependiendo de la aplicación final.45 Los más utilizados son los fragmentos Fab, formados por un dominio variable y un dominio constante de cada cadena (VL-CL+VH- CH1) y los fragmentos variables de cadena sencilla (scFv, del inglés single chain variable fragment) formados por los dominios VH y VL unidos desde el extremo C-terminal de uno de los dominios, al extremo N-terminal del otro mediante un espaciador polipeptídico flexible (VH-VL o VL-VH). También es posible encontrar otros formatos como la variante ds-scFv (del inglés disulfide-bond stabilized scFv) donde los dominios VH y VL están unidos de forma covalente mediante un enlace disulfuro46, fragmentos scFab (del inglés single chain Fab fragments) que combinan las propiedades de los scFv y Fab, anticuerpos multiméricos (dia-, tria- y tetrabodies) formados por fragmentos scFv unidos mediante espaciadores o minibodies (miniAbs) que combinan fragmentos scFv con dominios CH3.47,48 Otra opción posible consiste en combinar dos sitios diferentes de unión al antígeno en la misma construcción del anticuerpo recombinante, denominándose Introducción 41 anticuerpos biespecíficos (bsAb, del inglés bispecific antibodies), que puede variar desde, IgG-IgG, scFv-IgG, Fab-scFv-Fc, etc.49,50 Por último, es importante mencionar un formato cada vez más en auge debido a las propiedades extraordinarias que presenta. Se trata de los fragmentos de anticuerpo más pequeños existentes, denominados anticuerpos de dominio único (sdAb, del inglés single-domain antibody) compuestos por un único dominio variable monomérico. Los primeros sdAb se diseñaron a partir del descubrimiento en camélidos (camellos, dromedarios, alpacas o llamas) de anticuerpos que carecían de cadena ligera (hcAbs, del inglés heavy chain antibodies), denominándose fragmentos VHH o nanobodies.51 También pueden obtenerse a partir de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas presentes en algunos peces cartilaginosos, como los tiburones (IgNAR, del inglés immunoglobulin new antigen receptor), denominándose fragmentos VNAR. 52 Por el contrario, si su origen es humano se denominan simplemente dAb (del inglés domain antibody) pudiendo corresponder tanto al dominio variable de la cadena pesada (VH), como ligera (VL). La Figura 4 muestra las estructuras de algunos de los anticuerpos recombinantes más empleados en la actualidad. Figura 4. Principales tipos de anticuerpos recombinantes: región variable de la cadena pesada (VH), región variable de la cadena ligera (VL), dominio variable del nuevo receptor de antígeno de tiburón (VNAR), anticuerpo de dominio único de camélidos (VHH), fragmento variable de cadena sencilla (scFv), fragmento de unión al antígeno (Fab), anticuerpo bivalente (minibody), anticuerpo tetravalente (tetrabody) y anticuerpo biespecífico (bis-scFv) compuesto por dos fragmentos scFv. Aunque el empleo de los fragmentos scFv es una opción muy extendida, los fragmentos VHH, VNAR y dAb poseen características únicas que les confiere un gran potencial para su empleo en diferentes aplicaciones, especialmente como elementos de reconocimiento en el ámbito de sensores y su uso como agentes terapéuticos.53,54 Estos fragmentos son las entidades más pequeñas con identidad propia capaces de mostrar unión por un antígeno. Su peso molecular oscila entre 11 y 15 kDa, casi la mitad que los VH VL VNAR VHH Fab Minibody Tetrabody Bis-scFv scFv (~ 15 kDa) (~ 15 kDa) (~ 15 kDa) (~ 15 kDa) (~ 28 kDa) (~ 50 kDa) (~ 100 kDa)(~ 75 kDa) (~ 55 kDa) Introducción 42 scFv y casi 10 veces menos que una inmunoglobulina completa. Precisamente de este hecho deriva que puedan acceder más fácilmente a un mayor número de epítopos presentes en el antígeno, además de presentar una mayor estabilidad tanto térmica como química, mayor capacidad de penetración en los tejidos y menor coste de producción.55 A pesar de poseer solo tres regiones CDR, en contra de las seis que presentan los anticuerpos convencionales, han demostrado ser unos dignos competidores frente al resto de formatos comentados anteriormente. Especialmente en el ámbito terapéutico cabe destacar la relevancia que poseen los fragmentos dAb humanos, tanto VH como VL, ya que, debido a su naturaleza, poseen una menor inmunogenicidad en comparación con los VHH de camélidos o los VNAR de tiburones.56,57 Obtención de anticuerpos recombinantes empleando la tecnología de presentación de anticuerpos en la superficie de fagos La tecnología de presentación de péptidos y proteínas en la superficie de bacteriófagos, más conocida como phage display, es una de las metodologías más potentes que existen en la actualidad para la obtención de anticuerpos recombinantes. Descrita por primera vez por George P. Smith en 1985, básicamente consiste en la modificación del material genético de un fago para permitir la expresión de péptidos y proteínas de fusión en su superficie.58 La característica principal de esta tecnología es la relación directa que existe entre el genotipo, es decir, la secuencia de ADN que codifica el péptido o proteína y el fenotipo, esto es, el propio polipéptido expresado en la superficie del fago. Para ello se pueden emplear diferentes tipos de fagos como el fago T7, el fago λ o la familia de los fagos filamentosos (Ff) entre los que se incluyen los fagos fd, f1 y M13, siendo este último uno de los más empleados.59 Tal ha sido el impacto de esta tecnología, que en el año 2018 George P. Smith y Sir Gregory P. Winter fueron galardonados con el Premio Nobel de Química por su contribución en este campo.60 Como se comentará más adelante, para la obtención de anticuerpos recombinantes mediante phage display, es necesaria la construcción de bibliotecas con una gran variedad genotípica, denominadas genotecas. Tras generar los miles de millones de partículas fágicas que expresan en su superficie las diferentes combinaciones de anticuerpos, la biblioteca se enfrenta a la molécula diana y, mediante rondas de enriquecimiento, se seleccionan los clones más afines a la misma. Esta tecnología permite obtener anticuerpos frente a una gran variedad de analitos tanto de naturaleza biológica como no biológica, entre los que se incluyen toxinas o autoantígenos.61 Introducción 43 A) Fago filamentoso M13 El fago M13 es un bacteriófago perteneciente al genéro Inovirus y al grupo de los fagos filamentosos (Ff). Estos fagos infectan específicamente células E. coli portadoras del factor F a través del pilus de la bacteria mediante la interacción con la proteína pIII de su cubierta.62 La infección por este tipo de fagos no produce la lisis de las células, sino que las bacterias infectadas continúan creciendo, aunque lo hacen a menor velocidad. El fago M13 posee una morfología cilíndrica con un tamaño de aproximadamente 900 nm de largo por 7 nm de diámetro y un peso de 16.3 MDa (Figura 5). Figura 5. Micrografía de transmisión electrónica (TEM), obtenida en el Centro Nacional de Microscopia Electrónica de la UCM (CNME), de un conjunto de fagos M13 que despliegan en su superficie un péptido que mimetiza el comportamiento de fumonisina B1. Su material genético está formado por una molécula de ADN circular monocatenaria, de aproximadamente 6400 nucleótidos, y su genoma se agrupa en diferentes genes según la proteína que codifiquen.63 Además, también posee una región intergénica que contiene la señal de empaquetamiento de la partícula viral, así como el origen de replicación de las hebras (+) y (-) del ADN viral. Estructuralmente, el fago M13 presenta forma tubular compuesta, principalmente, por unas 2700 copias de la proteína mayoritaria pVIII. Las proteínas denominadas menores se localizan en los extremos, en uno se encuentran 5 copias de las proteínas pIII y pVI y en el otro, 5 copias de las proteínas pVII y pIX. Las seis proteínas restantes (II, V, X, I, IX y IV) están involucradas en la replicación del material genético y en el ensamblaje del fago (Figura 6). Normalmente, los anticuerpos recombinantes suelen expresarse fusionados al extremo de la proteína pIII o junto a la proteína pVIII de la cubierta del fago. No obstante, esta opción presenta más restricciones en cuanto al tamaño del fragmento que se quiere clonar, ya que puede interferir en el proceso de replicación del fago. Por este motivo, la Introducción 44 fusión a la pVIII suele ser la opción elegida, casi en exclusiva, en las bibliotecas de péptidos.61 Figura 6. Estructura del fago M13 con un fragmento de anticuerpo fusionado a la pIII. El ciclo infectivo del fago M13 comienza cuando la proteína pIII del fago entra en contacto con el pilus de la bacteria. Tras esta primera interacción, algunas proteínas de la cubierta viral del fago se eliminan, permitiendo la penetración del ADN vírico en el interior de la bacteria mediante translocación al citoplasma celular. El ADN monocatenario del fago se transforma en su forma replicativa de doble hebra actuando de molde, tanto para la formación de nuevas cadenas monocatenarias hijas, como para la transcripción de las proteínas necesarias para la síntesis de las nuevas partículas fágicas. Posteriormente, las hebras de ADN monocatenarias (+) junto con dímeros de la proteína pV, se dirigen a la membrana celular donde tiene lugar el ensamblaje de nuevas partículas víricas, sustituyéndose las proteínas pV del complejo formado por las proteínas de la cubierta. Las nuevas partículas víricas son expulsadas al exterior celular sin provocar la lisis de la bacteria.64 B) Fagémidos La tecnología de presentación en superficie de fagos se basa en el empleo de dos tipos de vectores.65 El primer sistema incluye aquellos vectores que derivan directamente del genoma del fago y constan de un solo gen. Esta secuencia contiene todos los genes que codifican las proteínas necesarias para la replicación y el ensamblaje de la partícula fágica. Así, el fragmento de anticuerpo se expresa como proteína de fusión en todas las proteínas correspondientes de la cubierta del fago, dando lugar a un sistema multivalente. En cambio, en el segundo sistema el fago resultante presenta tanto las proteínas naturales de la cubierta sin modificar, como un número limitado de copias de las proteínas de fusión, resultando en una expresión monovalente. Para ello, este sistema de dos genes emplea vectores denominados fagémidos que necesitan de fagos auxiliares (del inglés, helper phage).66 Los fagémidos son un tipo especial de plásmidos híbridos más pequeños que el genoma del fago y, por tanto, más fáciles de manipular genéticamente. Estos vectores contienen en su estructura el origen pIX pVII pVIII pVI pIII Anticuerpo recombinante Introducción 45 de replicación propio del plásmido, un marcador de selección, el promotor, sitios de restricción donde se inserta tanto la proteína de interés como un marcador de fusión, la región intergénica y los genes que codifican la proteína de la cubierta del fago y el péptido señal. Las nuevas partículas fágicas filamentosas se forman gracias a la intervención del fago auxiliar mediante un proceso de superinfección. Este fago proporciona los genes necesarios para la síntesis de proteínas y enzimas virales involucradas en la replicación del fagémido y en el empaquetamiento de los nuevos fagos. Así, las nuevas partículas víricas resultantes presentan una composición mixta, ya que combinan las proteínas naturales del fago auxiliar con las proteínas de fusión codificadas en el fagémido. Además, el fago auxiliar posee su propio origen de replicación defectivo, lo que favorece la síntesis de las partículas que contienen el genoma del fagémido. Por lo tanto, aunque la maquinaria de replicación y ensamblaje actúen tanto sobre el genoma del fagémido como del fago auxiliar, el ADN monocatenario del fago ayudante se produce en mucha menor proporción a la del fagémido.67 C) Genotecas La versatilidad de la técnica de phage display ha permitido la obtención de anticuerpos recombinantes en sus diferentes formatos, desde scFV, Fab, scFab, dAbs, VHH o VNAR, frente a una gran diversidad de antígenos. Todos ellos requieren de una biblioteca con gran variedad genotípica, la cual, dependiendo del origen de los genes, puede ser inmune o no inmune. Las bibliotecas de tipo inmune, como su nombre indica, se construyen a partir del material genético extraído de los linfocitos B de animales previamente inmunizados con el antígeno, como pollos, ratones, conejos, ovejas, tiburones o camellos.68 También se pueden construir bibliotecas inmunes de origen humano a partir de pacientes infectados de forma natural con virus o parásitos.69 Las de tipo no inmune tienen un carácter más universal, ya que una única biblioteca puede emplearse para la obtención de anticuerpos frente a diferentes antígenos. La principal ventaja de estas aproximaciones es que no es necesario llevar a cabo una inmunización para generar una biblioteca nueva para cada analito. Las bibliotecas de tipo no inmune pueden dividirse a su vez en tres tipos: naturales (o naïve), sintéticas y semisintéticas.70 La bilbiotecas naïve se obtienen a partir de los linfocitos B procedentes de donantes no inmunizados. Posteriormente, mediante RT-PCR se obtienen los genes de las diferentes cadenas y se subclonan en el fagémido correspondiente para llevar a cabo el proceso de selección.71 En este tipo de bilbiotecas, al no existir una exposición previa Introducción 46 del paciente sano al antígeno, la respuesta inmune no está sesgada y el abanico de secuencias obtenidas es muy variado. No obstante, se necesita un número relativamente alto de donantes para alcanzar una gran diversidad de combinaciones. Las bibliotecas sintéticas se construyen a partir de la inserción de ADN sintético degenerado en las regiones codificantes de los CDR de los dominios variables, lo que permite controlar la diversidad de las cadenas.72 Aunque la variedad de los anticuerpos generados mediante esta estrategia es muy elevada, debido al diseño racional de las secuencias, pueden producirse plegamientos incorrectos o formación de agregados.73 Las bibliotecas semisintéticas combinan las características de las dos bibliotecas no inmunes descritas anteriormente, en donde algunas regiones de los CDR presentan diversidad natural, mientras que otras se han generado de manera sintética.74,75 Al igual que para el resto de bibliotecas no inmunes, el tamaño de la biblioteca determina la afinidad mostrada por los anticuerpos resultantes. La Tabla 1 muestra un ejemplo de algunas de las genotecas disponibles para la generación de anticuerpos recombinantes. Tabla 1. Tipos de genotecas empleadas en la tecnología phage display para la generación de anticuerpos recombinantes. Tipo Biblioteca Tamaño* Formato Ref. Inmune Chassagne, 2004 5 x 105 Fab 76 Andris-Widhopf, 2000 3.8 x 107 Fab 77 Naïve Sheets, 1998 6.7 x 109 scFv 78 XFab1 3.1 x 1011 Fab 79 KNU-Fab 3.0 x 1010 Fab 80 Sintética ETH-2-Gold 3 x 109 scFv 81 Predator 6.2 x 107 VH 82 PHILODiamond 4.1 x 1010 scFv 83 Christ, 2007 3 x 109 VH 84 Tomlinson I+J 1.47 x 108 1.37 x 108 scFv 85 Semisintética n-CoDeR 1 x 1010 scFv 86 ALTHEA Gold Libraries 2.1 × 1010 scFv 87 *El tamaño de la biblioteca se expresa como unidades formadoras de colonias (ufc) tras la transformación de células E. coli con la biblioteca de ADN. Introducción 47 D) Enriquecimiento de fagos mediante biopanning El proceso de selección de anticuerpos recombinantes presentados en la superficie de los bacteriófagos se realiza mediante un proceso conocido como panning o biopanning, ilustrado en la Figura 7.88 Este proceso in vitro se basa en la exposición repetida de la biblioteca de fagos recombinantes frente al antígeno inmovilizado en una superficie sólida, por ejemplo los pocillos de una placa ELISA, tubos de poliestireno o partículas magnéticas. Inicialmente, la genoteca se incuba frente a la molécula diana y, tras una serie de lavados en los que se eliminan los fagos unidos de forma no específica, se eluyen los clones más afines al analito empleando un medio ácido, una alta concentración de sales, o mediante digestión con proteasas como la tripsina. De esta forma, se consigue aislar una fracción enriquecida de aquellos fagos que presentan mayor afinidad por la molécula diana, amplificándose posteriormente mediante la infección de un cultivo de E. coli. Las bacterias infectadas producen una nueva población de fagos recombinantes que se someten a rondas sucesivas de selección, generalmente entre 3 y 5, hasta obtener el grado de enriquecimiento deseado.89 Tras finalizar este proceso, se procede al aislamiento de los clones individuales mediante la siembra en placa de las bacterias infectadas procedentes de las últimas rondas de biopanning. Figura 7. Tecnología phage display. (A) Construcción de bibliotecas de fagos mediante clonaje del repertorio genético. (B) Proceso de enriquecimiento de clones mediante el proceso de biopanning. (C) Selección de los monoclones mediante aislamiento en placa, evaluación de su afinidad mediante ensayo ELISA y posterior secuenciación del ADN de los clones positivos. Adaptado de las referencias [90,91]. Superinfección fago auxiliar Repertorio ADN Transformación E.coli Clonaje Fagémidos Biblioteca de fagos Biopanning (3-5 rondas) 1. Incubación 2. Lavado 3. Elución 4. Amplificación A B ELISASecuenciación ADN Aislamiento monoclones C Introducción 48 Así, se seleccionan diferentes colonias individuales y se evalúa su afinidad frente a la molécula diana mediante Western-blot, citometría de flujo o ELISA. Los clones que muestren mayor afinidad por el analito se secuencian, para determinar la composición del fragmento de anticuerpo desplegado ya que, como se comentó anteriormente, existe una relación directa genotipo-fenotipo. Como alternativa al ELISA de fagos para el cribado y selección de los clones más afines, es posible realizar un ELISA de fracción soluble, esto es, mediante la expresión de los fragmentos de anticuerpo en su forma soluble fusionados a la proteína pIII.92 1.1.4. Polímeros de impronta molecular La idea primitiva de impronta molecular se inspira en la teoría de Pauling para la formación de los anticuerpos en el sistema inmune. Esta teoría postulaba la adopción de una estructura tridimensional por parte del anticuerpo en contacto con el antígeno.93,94 La impronta molecular es una técnica que permite la preparación de materiales sintéticos, conocidos como polímeros de impronta molecular o MIPs. Estos materiales poliméricos se preparan en presencia de la molécula plantilla, o un análogo estructural de la misma, de forma que, tras su eliminación, se generan en el polímero cavidades complementarias que facilitan su reconocimiento selectivo. Así pues, los MIPs son materiales robustos capaces de imitar o replicar a los elementos de reconocimiento natural y se proponen como alternativas sintéticas al empleo de anticuerpos debido a su gran capacidad de reconocimiento molecular. Los MIPs presentan algunas ventajas en comparación con los receptores biológicos, como son su elevada estabilidad química, térmica y mecánica, reconocimiento molecular en medio orgánico, bajo coste debido a su reutilizabilidad y facilidad de síntesis y elevada versatilidad en cuanto a condiciones operativas y espectro analítico. No obstante, presentan también algunas limitaciones, como la distribución heterogénea de sitios de unión, cinética más lenta que los receptores biológicos debido a la dificultad de acceso a las cavidades específicas y limitada aplicabilidad a moléculas de elevado peso molecular. La tecnología de impronta molecular ha evolucionado en la última década en el desarrollo de receptores sintéticos para su uso en diferentes áreas (separación analítica, sensores químicos, liberación controlada de fármacos, etc.). 95,96,97 La Tabla 2 muestra una comparación de algunas características relevantes de los MIPs y los anticuerpos. Introducción 49 Tabla 2. Comparación de las características de los MIPs y los anticuerpos.98 MIPs Anticuerpos Vida útil Años 6−12 meses Almacenamiento Desde 6 ºC hasta temperatura ambiente Refrigerado -20 ºC Regeneración Sencilla Compleja Esterilización UV, autoclave Compleja (irradiación γ) Estabilidad térmica Resistentes hasta 140 ºC Desnaturalización a ciertas temperaturas Espectro analítico Prácticamente ilimitada Limitada Precio 0.25−5 $/mg 1−1000 $/mg En términos generales, la síntesis de MIPs implica en primer lugar la formación de un complejo de prepolimerización entre la molécula plantilla y los monómeros funcionales, mediante interaciones de tipo covalente o no covalente, disuelto en un disolvente adecuado denominado porógeno. A continuación, se añade un exceso de entrecruzante a fin de crear una red polimérica tridimensional en presencia de un iniciador. Después de la síntesis, la molécula plantilla se extrae del polímero creando unas cavidades complementarias a la misma en términos de tamaño, forma y disposición de grupos funcionales. El reconocimiento puede basarse en interacciones de tipo covalente o, más generalmente, no covalentes como enlaces de hidrógeno, hidrofóbicas, Van der Waals, electrostáticas, o coordinación metálica.99 El proceso de preparación de MIPs se ilustra en la Figura 8. Figura 8. Representación esquemática del proceso de impronta molecular. (1) Formación del complejo de prepolimeración entre la molécula plantilla y los monómeros funcionales. (2) Copolimerización en presencia de un exceso de entrecruzante. (3) Extracción de la molécula plantilla. (4) Reconocimiento selectivo. Adaptado de la referencia [100]. Para evaluar las interacciones no específicas del analito con el polímero sintetizado, es necesaria la síntesis de un polímero que actúe como control. Este polímero puede prepararse empleando la misma composición que el MIP pero en 1 2 3 4 Introducción 50 ausencia de la molécula plantilla, denominado polímero sin impronta o NIP (del inglés, non-imprinted polymer), o empleando otra molécula plantilla diferente a la del MIP, denominándose entonces polímero control o CIP (del inglés, control imprinted polymer). Composición La selectividad del MIP sintetizado viene determinada por la selección adecuada de los componentes de la mezcla de polimerización. La naturaleza de la molécula plantilla y las condiciones de síntesis influyen en la elección de los precursores de la polimerización. Además, deben tenerse en cuenta las condiciones de reacción, la composición y tipo de monómeros empleados en la síntesis, el tiempo y temperatura de reacción y la aplicación final del polímero.101 A) Molécula plantilla La molécula plantilla es la responsable de la formación de los sitios de unión específicos en el material improntado. La molécula plantilla seleccionada para la polimerización puede ser el propio analito o un análogo con estructura similar a la molécula objetivo. Esta opción se emplea cuando la molécula diana presenta alta toxicidad, una disponibilidad limitada o un elevado coste. La molécula plantilla debe reunir una serie de características específicas tales como no contener grupos polimerizables, no afectar a la cinética de polimerización o ser soluble en la mezcla de prepolimerización. Alternativamente, para evitar problemas de insolubilidad, la molécula plantilla puede inmovilizarse en un soporte sólido. Dependiendo del tipo de iniciación seleccionada para la preparación del MIP, la molécula plantilla debe estable térmica y/o fotoquímicamente. Después de la polimerización, la molécula plantilla debe eliminarse de las cavidades del polímero, para dejar disponibles los huecos improntados. Esta etapa supone un paso crucial en la preparación del MIP ya que, si no se elimina completamente, disminuye la eficacia en el reconocimiento posterior y su liberación durante el análisis puede originar lo que se conoce como sangrado del analito derivando este en falsos positivos.102,103 Las técnicas para la eliminación de la molécula plantilla incluyen la incubación discontinua del polímero en disolventes orgánicos o disoluciones salinas, la extracción continua en Soxhlet, extracción con líquidos presurizados, extracción asistida con microondas, extracción asistida con ultrasonidos o extracción con fluidos supercríticos.104 B) Monómeros funcionales Los monómeros funcionales deben seleccionarse en función de las características de la molécula plantilla, ya que proveen de los grupos funcionales responsables de la formación de un complejo estable con la misma.105 Este proceso es Introducción 51 fundamental para el correcto reconocimiento molecular del analito en las cavidades generadas tras la formación del polímero.106 Dependiendo del tipo de interacción que da lugar a la formación del complejo plantilla-monómero funcional se pueden distinguir tres modelos principales de polimerización: covalente, semicovalente y no covalente.107 Existe una gran variedad de monómeros funcionales disponibles comercialmente, clasificándose en función de su carácter ácido, como el ácido acrílico (AA), ácido metacrílico (MAA), ácido trifluorometacrílico (TFMAA) o el ácido p- vinilbenzoico (VBA); básico como la 4-vinilpiridina (4-VIPY) o la 1-alilpiperazina (1- ALLP); o neutro como el metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA). En la Figura 9 se recogen algunos de los monómeros funcionales más empleados en la síntesis de MIPs. Figura 9. Estructuras químicas de los monómeros funcionales más empleados para la síntesis de MIPs: ácido acrílico (AA), ácido metacrílico (MAA), ácido trifluorometacrílico (TFMAA), ácido p-vinilbenzoico (VBA), metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), acrilamida (AM), metacrilamida (MAM), 4-vinilpiridina (4-VIPY) y 1-alilpiperazina (1-ALLP). C) Entrecruzantes Los monómeros entrecruzantes son los encargados de la formación de una red alrededor del complejo de prepolimerización, creando una estructura tridimensional rígida.106 De este modo el tipo, tamaño y cantidad de entrecruzante influye en la morfología, la estabilidad mecánica y la flexibilidad de la red polimérica.105 Un incremento en la relación molar entre el entrecruzante y los monómeros funcionales resulta en materiales más rígidos, con menor capacidad de hinchamiento y tamaño de poro más pequeño. Así pues, la red no se puede expandir, dificultando la difusión del analito a los sitios de unión. Por el contrario, un bajo nivel de entrecruzamiento (< 5%) resulta en una red polimérica muy flexible, pero con una configuración de la cavidad poco estable.108 Los entrecruzantes más empleados en la síntesis de MIPs se recogen en la Figura 10, siendo el dimetacrilato de etilenglicol (EDMA) y el divinilbenceno (DVB) los más comunes. AA 4-VIPYMAMAM MAA TFMAA VBA HEMA 1-ALLP Introducción 52 Figura 10. Estructuras químicas de monómeros entrecruzantes empleados en la síntesis de MIPs: dimetacrilato de etilenglicol (EDMA), N,N´-metilenbisacrilamida (MBA), divinilbenceno (DVB), trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM) y triacrilato de pentaeritritol (PETRA). D) Disolvente El disolvente, conocido como porógeno, es el responsable de solubilizar a todos los componentes de la mezcla de prepolimerización y su naturaleza condiciona el tipo de interacciones no covalentes que se producen entre los monómeros funcionales y la molécula plantilla, además de influir de forma significativa en la textura y la morfología del polímero final.109 En el proceso de polimerización, el disolvente ocupa espacio en la red de polimerización creando los poros necesarios para permitir la difusión de la molécula plantilla, tanto para su extracción tras la síntesis como para su posterior reconocimiento, favorecido debido al “efecto memoria”. Casi todos los MIPs se sintetizan en disolventes orgánicos para preservar las interacciones electrostáticas y los enlaces de hidrógeno formados entre la molécula plantilla y los monómeros funcionales, base para la construcción de complejos estables de tipo no covalente.107 De este modo, es frecuente emplear disolventes apróticos y de baja polaridad, como el tolueno, acetonitrilo o cloroformo.108 E) Iniciador Los MIPs se sintetizan habitualmente vía polimerización por radicales libres (FRP, del inglés free radical polymerization) inducida térmica o fotoquímicamente. El mecanismo de polimerización FRP consiste en tres etapas: iniciación, propagación y terminación. La iniciación empieza con la ruptura homolítica del iniciador, generando radicales que reaccionan con monómeros que portan dobles enlaces en su estructura molecular, para producir radicales intermedios. La segunda etapa es la propagación, donde los radicales reaccionan sucesivamente con nuevas moléculas por adición repetitiva al EDMA MBA DVB TRIM PETRA Introducción 53 doble enlace creando macroradicales. La última etapa, terminación, transcurre con la propagación de la cadena hasta que los radicales libres reaccionan para formar un enlace covalente inactivo. Este proceso puede ocurrir por diferentes vías, ya sea por combinación, desproporción o transferencia de cadena.106 Este proceso requiere del empleo de un iniciador radicalario, normalmente de tipo azo, como el 2,2’-azobis- (isobutironitrilo) (AIBN) o 2,2’-azobis-(2,4-dimetilvaleronitrilo) (ABDV), compuestos de tipo peróxido (APS, persulfato amónico), sistemas rédox o fotoiniciadores. La Figura 11 muestra las estructuras químicas de los dos iniciadores más empleados en la polimerización FRP inducida térmicamente. Figura 11. Estructuras químicas de los iniciadores más empleados en polimerización FRP: AIBN (2,2’-azobis-(isobutironitrilo)) y ABDV (2,2’-azobis-(2,4-dimetilvaleronitrilo)). No obstante, la polimerización por radicales libres presenta algunas desventajas como la falta de control del peso molecular o la polidispersidad de las partículas poliméricas obtenidas. Con objeto de solventar estas limitaciones, en los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas de polimerización englobadas en la denominada polimerización radicalaria controlada/viviente (CRP, del inglés controlled/living radical polymerization). En este tipo de polimerizaciones se diseñan polímeros con estructuras definidas basadas en el establecimiento de un equilibrio dinámico entre una concentración baja de cadenas de propagación activas y una cantidad alta de cadenas inactivas que no pueden propagar o terminar. Los tres métodos más populares son: 1) la polimerización vía radicales libres estables (SFRP, del inglés stable free radical polymerization) comúnmente mediada por nitróxidos (NMP, del inglés nitroxide- mediated radical polymerization) o por iniferter, 2) polimerización por transferencia atómica (ATRP, del inglés atom transfer radical polymerization) y 3) la polimerización por adición, fragmentación y transferencia reversible (RAFT, del inglés reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization). 110,111 Aproximaciones en la preparación de polímeros de impronta molecular Los métodos para la síntesis de MIPs pueden clasificarse en dos grupos principales en función del tipo de interacciones entre la molécula plantilla y los monómeros en la etapa de prepolimerización: impronta covalente y no covalente. Otras AIBN ABDV Introducción 54 aproximaciones que derivan de estos procedimientos son la impronta semicovalente o mediada por metales, pero estos métodos no están tan extendidos. A) Impronta covalente La impronta covalente se basa en la formación de un enlace covalente reversible entre la molécula plantilla y el monómero funcional previo a la polimerización, obteniéndose así un complejo polimerizable.112 Posteriormente se añade el entrecruzante para formar una red tridimensional sólida. El enlace plantilla-monómero funcional debe ser estable en las condiciones de reacción, pero de fácil ruptura, generalmente mediante hidrólisis, para permitir la extracción de la molécula plantilla una vez creada la red polimérica sin afectar negativamente al posterior reconocimiento.113 Esta aproximación para la síntesis de polímeros orgánicos fue descrita por el Prof. G. Wulff para la preparación de MIPs selectivos al ácido D-glicérico.114 Esta técnica permite preparar polímeros con una distribución más homogénea de los sitios de unión, controlar la estequiometría de la mezcla de prepolimerización y obtener una mayor selectividad que los MIPs preparados de forma no covalente. Un ejemplo de esta aproximación se ilustra en la Figura 12. Figura 12. Preparación de un polímero de impronta molecular selectivo a bisfenol A mediante impronta covalente. (1) Polimerización. (2) Hidrólisis. (3) Adsorción específica. Adaptado de la referencia [115]. 1 3 2 Introducción 55 Sin embargo, la impronta covalente está limitada a un grupo restringido de monómeros funcionales, la eliminación de la molécula plantilla es más difícil y se obtienen cinéticas de unión más lentas en comparación con la impronta no covalente.107 B) Impronta no covalente La impronta no covalente fue introducida por Mosbach en el año 1985 y, desde entonces, es la opción más empleada para la preparación de MIPs.116 Esta aproximación consiste en la formación de un complejo de prepolimerización entre la molécula plantilla y los monómeros funcionales basado en interacciones débiles (electrostáticas, dipolo- dipolo, fuerzas de dispersión de London o enlaces de hidrógeno) responsables del proceso de reconocimiento posterior. El proceso de síntesis en la impronta no covalente es más simple que la covalente resultando en una extracción más eficaz de la molécula plantilla y cinéticas de unión más rápidas. El abanico de moléculas plantilla y monómeros funcionales que se pueden aplicar en esta estrategia es más mucho amplio que en el caso anterior. No obstante, los MIPs preparados por esta vía suelen reconocer tanto a la molécula plantilla, como a otros compuestos estructuralmente similares. Esta reactividad cruzada se considera una limitación cuando se necesita un reconocimiento selectivo de la molécula diana. Sin embargo, es bastante útil en aquellas aplicaciones donde se requiere la detección de una familia de compuestos.117 El disolvente seleccionado para la impronta no covalente no debe interferir en la formación del complejo molécula plantilla-monómero. Así, los disolventes orgánicos apróticos favorecen la formación de complejos plantilla-monómero mediante interacciones no covalentes polares, como los enlaces de hidrógeno.118,119 Alternativamente, cuando el complejo está estabilizado por interacciones hidrofóbicas, se emplean disolventes polares como porógenos.120 Otra opción para la síntesis de MIPs en medios acuosos empleando moléculas plantilla poco polares, e impronta no covalente, se basa en la incorporación de ciclodextrinas en la síntesis del polímero. Estos compuestos de forma toroidal están compuestos por unidades de glucopiranosas y se caracterizan por presentar carácter hidrofílico en su superficie, compatible con el medio acuoso, y carácter hidrofóbico en su cavidad central, de forma que las interacciones con moléculas de baja polaridad están favorecidas.121 Algunos ejemplos de esta aproximación incluyen la preparación de MIPs selectivos a lisozima122 o los MIPs selectivos a baicaleína (Figura 13),123 entre otros. Introducción 56 Figura 13. Preparación de un MIP empleando β-ciclodextrinas como comonómeros funcionales responsables de establecer interacciones hidrofóbicas con la molécula plantilla. (1) Extracción de la molécula plantilla. (2) Reconocimiento selectivo del analito. Adaptado de la referencia [123]. C) Impronta semicovalente La impronta semicovalente se puede considerar como una fusión entre las dos estrategias citadas anteriormente.124 Este modelo se basa en la unión covalente previa al proceso de polimerización entre la molécula plantilla y el monómero funcional. Tras la polimerización, la plantilla se extrae por hidrólisis o tratamiento térmico y el reconocimiento posterior en el polímero tiene lugar mediante interacciones no covalentes.125,126 D) Impronta mediada por metales Las interacciones metálicas también pueden servir de base para la preparación de MIPs. Los iones metálicos pueden actuar como plantilla,127,128,129 o participar en la interacción plantilla-monómero funcional, siendo necesaria su presencia para el posterior reconocimiento del analito. Este último caso se conoce como impronta mediada por iones metálicos, generalmente de transición.130 Este tipo de impronta se ha utilizado para la determinación de metales en matrices biológicas131, en muestras medioambientales132,133 o para la determinación de compuestos organofosforados.134 1 2 Introducción 57 Preparación de polímeros de impronta molecular Los polímeros de impronta molecular pueden prepararse en diferentes formatos físicos cuyo tamaño varía desde varias micras a nanómetros dependiendo del proceso de síntesis y su aplicación final.135 Entre los formatos más empleados destacan la síntesis en formato bloque, partículas esféricas, membranas, síntesis por moldeo, hidrogeles y nanogeles. A) Síntesis en forma de bloque La síntesis de monolitos ha sido ampliamente utilizada para la preparación de MIPs. En este caso, el polímero se prepara mezclando los componentes de la reacción (molécula plantilla, monómero funcional, entrecruzante, porógeno e iniciador) en un vial y procediento a su polimerización por vía térmica o fotoquímica. A continuación, el monolito obtenido se muele y se tamiza hasta obtener partículas de polímero del tamaño deseado. Se trata de un método muy simple y sencillo de aplicar, sin embargo, la etapa de triturado supone la destrucción de un número importante de sitios de unión selectivos, además de conducir a tamaños y formas de partícula irregulares, lo que dificulta su empaquetamiento para su aplicación en separaciones analiticas.136,137 B) Síntesis en forma de partículas esféricas Dadas las limitaciones que presenta la síntesis de MIPs en forma de bloque, una de las estrategias de síntesis que más se utiliza es la que conduce a la obtención de polímeros en forma de partículas esféricas. Estos materiales se caracterizan por presentar una distribución de tamaño más uniforme y homogénea, así como una mejor transferencia másica y un área superficial más elevada que la de los monolitos una vez triturados. La preparación de MIPs con este formato y en diferentes tamaños (nano y micrométrico) se realiza aplicando diferentes técnicas, tales como la polimerización por precipitación, polimerización mediante suspensión, polimerización mediante emulsión, polimerización mediante hinchamiento multipasos o polimerización con molde de sílice sacrificable. Polimerización por precipitación/dispersión Este tipo de polimerización es uno de los más empleados para la obtención de MIPs con diámetros en el intervalo de nano a micrómetros. Es un procedimiento sencillo y rápido en el que la polimerización se lleva a cabo empleando disoluciones diluidas de los monómeros (relación monómeros/disolvente < 5% p/v), produciéndose una dispersión de las partículas que, al alcanzar un determinado tamaño, precipitan (Figura 14). Los polímeros preparados mediante esta técnica presentan elevada capacidad de carga y una distribución de los sitios de unión más uniforme que los preparados en Introducción 58 formato bloque.138 No obstante, el tamaño máximo de las partículas suele estar limitado unos pocos micrométros. Figura 14. Micrografías SEM correspondiente a MIPs sintetizados mediante polimerización por (A) precipitación y (B) dispersión. Adaptado de las referencias [139,140]. Polimerización mediante suspensión La polimerización mediante suspensión se basa en la formación de microgotas generadas mediante agitación al poner en contacto una fase dispersante (o fase continua), que está presente en mayor proporción, con una fase orgánica inmiscible (fase discontinua) que contiene la mezcla de prepolimerización.141 Las fases dispersantes suelen ser agua, disolventes perfluorados o aceites minerales.142,143 Las microesferas generadas se pueden estabilizar adicionando estabilizantes (polivinil alcohol o líquidos iónicos), aunque la dispersión de tamaño de las partículas generadas suele ser bastante amplia. La polimerización por suspensión se ha empleado con éxito para la preparación de MIPs especialmente en combinación con partículas magnéticas.144 Polimerización mediante emulsión Al igual que en la polimerización mediante suspensión, la polimerización mediante emulsión se basa en la formación de gotas de monómeros dispersadas en una fase continua inmiscible, generalmente acuosa.145 La diferencia con el método anterior radica en que las gotas se encuentran estabilizadas en el interior de micelas, formadas empleando un agente tensioactivo, a lo largo de toda la fase continua, lo que permite la obtención de partículas de tamaño más uniforme.146 Una alternativa a la polimerización clásica mediante emulsión es la denominada emulsión Pickering. En esta estrategia, las gotas se estabilizan mediante partículas sólidas en lugar de emplear surfactantes.147 A B Introducción 59 Polimerización mediante hinchamiento multipasos Este tipo de polimerización tiene lugar en varias etapas. En primer lugar, se sintetizan partículas esféricas de látex o poliestireno en una disolución acuosa y, posteriormente, se hinchan formándose microemulsiones gracias a la adición de un compuesto orgánico hidrofóbico de bajo peso molecular, como el ftalato de dibutilo. Posteriormente se añade la mezcla de prepolimerización que es absorbida por las partículas y se lleva a cabo la polimerización.148 Este procedimiento se puede repetir tantas veces como sea necesario hasta lograr el tamaño de polímero deseado, obteniéndose partículas monodispersas de 0.5 a 50 µm de diámetro.149 No obstante, como principales limitaciones a esta técnica cabe destacar que se requieren largos tiempos de síntesis y la pérdida de control de la monodispersidad del tamaño de partícula al aumentar el número de etapas de hinchamiento. C) Síntesis en formato membranas Los primeros polímeros de impronta molecular en formato membranas preparados mediante un proceso de impronta convencional (MIM, del inglés molecularly imprinted membranes) fueron sintetizados inicialmente en 1990 por Pilestsky y col.150 A partir de ese momento y hasta la actualidad, han surgido variedad de técnicas para sintitezar MIMs. El interés por este tipo de formato radica en la mayor permeabilidad que suelen presentar las membranas frente a otro tipo de formatos, con la consiguiente mejora en la difusión de los analitos.151 Precisamente de esta particularidad deriva su uso en el campo del sensado al facilitar la integración del elemento biomimético con el transductor, consiguiendo incrementar la sensibilidad del análisis en comparación con otros formatos de MIPs.152 Las MIMs se pueden preparar depositando directamente la mezcla de prepolimerización en forma de lámina delgada entre dos soportes no porosos que se eliminan tras la polimerización. Alternativamente, la mezcla de prepolimerización se puede depositar aplicando spin-coating, lo que facilita la obtención de membranas de espesor nanométrico.153 Otra de las aproximaciones consiste en el empleo de soportes porosos en los cuales la capa de MIP se genera bien mediante técnicas de injerto (denominadas grafting), o a partir de la absorción de la mezcla de prepolimerización en los poros del material y su posterior polimerización. Un ejemplo de esta aproximación es la descrita por Xie y col. para la preparación de MIMs selectivos a albúmina de suero bovino y lisozima (Figura 15).154 Introducción 60 Figura 15. Micrografías SEM correspondientes a secciones transversales (A, B) y superficial (C) de un MIP sintetizado en formato criogel selectivo a la lisina. Adaptado de la referencia [154]. Las técnicas de injerto pueden clasificarse en dos grupos: crecimiento “hacia la superficie” (del inglés, grafting to) y crecimiento “desde la superficie” (del inglés, grafting from). La primera aproximación consiste en funcionalizar la superficie con grupos polimerizables y añadir el resto de componentes en disolución para generar la capa de MIP correspondiente. En la segunda estrategia, el iniciador se inmoviliza en la superficie del sustrato antes de la polimerización, permitiendo un mayor control del espesor y composición de la capa de MIP formada. Los iniciadores empleados pueden ser azoderivados, tipo iniferter o de tipo RAFT.155,156,157 Una técnica muy popular para la preparación de membranas es la denominada litografía blanda (soft lithography), en concreto la impresión por microcontacto. Esta técnica consiste en la creación de estructuras a escala micro o nanométrica mediante la estampación de un determinado motivo (denominado sello) en un sustrato polimérico. En este caso el sello sería la molécula plantilla inmovilizada en un soporte y se estampa sobre la mezcla de prepolimerización (Figura 16).158 Esta aproximación se ha empleado para el reconocimiento de diferentes tipos de moléculas, especialmente macromoléculas.159 A B C C Introducción 61 Figura 16. (A) Esquema de preparación de un MIP por microcontacto: (1) la molécula plantilla inmovilizada en un sello es estampada por microcontacto sobre la mezcla de prepolimerización depositada sobre un soporte y (2) eliminación del sello tras la polimerización y creación de los sitios de unión en la superficie. (B) Micrografía AFM de las cavidades obtenidas tras la polimerización y estampación de de células S. cerevisiae. Adaptado de la referencia [160]. D) Síntesis por moldeo La síntesis por moldeo consiste en el empleo de un molde que reúna ciertas características de interés para la preparación del MIP. El molde se impregna con la mezcla de prepolimerización y tras su eliminación se obtiene la imagen negativa de los motivos presentes en el mismo. Existen diferentes aproximaciones para la síntesis por moldeo en función del tipo de sustrato. Polimerización empleando moldes de sílice sacrificable Esta técnica se basa en el uso de esferas de sílice mesoporosas como molde para la síntesis del MIP. Es un proceso bastante sencillo en el cual los poros de las partículas de sílice se rellenan con la mezcla de prepolimerización, procurando que toda la mezcla penetre dentro del molde para evitar la polimerización en la superficie exterior de las partículas de sílice. Tras la polimerización, la sílice se disuelve empleando una disolución concentrada de ácido fluorhídrico o de hidrogenofluoruro de amonio, por lo que se conoce como molde sacrificable (Figura 17). Esta aproximación permite la preparación de partículas de MIP esféricas y porosas normalmente con diámetros del orden de micras, dependiendo del tamaño de la sílice empleada como molde. Los MIPs sintetizados mediante esta técnica se emplean habitualmente como sorbentes en cromatografía o extracción en fase sólida (SPE, del inglés solid-phase extraction) para el reconocimiento selectivo de una gran variedad de analitos.161 1 2 Sello Soporte Polímero Molécula plantilla inmovilizada +A MIP B Introducción 62 Figura 17. (A) Esquema de síntesis de un MIP empleando micropartículas esféricas de sílice como molde sacrificable para la polimerización: (1) adición de la mezcla de prepolimerización sobre las partículas de sílice para generar el composite silica-MIP y (2) disolución del molde de sílice para obtener partículas esféricas de MIP. (B) Micrografías SEM de las partículas de sílice, composite silica-MIP y partículas de MIP porosas. Adaptado de la referencia [162]. Una variante de esta aproximación es la denominada impronta jerarquizada, en la que la molécula plantilla se inmoviliza previamente sobre la superficie de la partícula de sílice, disolviéndose también el molde tras la polimerización. La orientación adecuada de la molécula plantilla, facilita la generación de sitios de unión más homogéneos que se encontrarán localizados en la superficie del polímero, mejorando así la accesibilidad del analito a las cavidades. También se evitan los posibles problemas de sangrado de la molécula plantilla. Los polímeros sintetizados mediante esta técnica presentan una elevada área superficial, lo que les hace idóneos para su aplicación como materiales funcionales en procesos de separación, empleándose principalmente para la impronta de péptidos y para la separación y purificación de proteínas, como se discutirá más adelante en la sección 1.1.4.5. Nanofilamentos Los nanofilamentos se obtienen empleando sustratos nanoestructurados sacrificables, generalmente de óxido de aluminio, sobre los cuales se inmoviliza previamente la molécula plantilla. El molde funcionalizado se rellena con la mezcla de prepolimerización y, tras finalizar el proceso, los nanofilamentos se separan disolviendo el molde. De este modo se obtienen nanoestructuras cilíndricas de MIP con las cavidades selectivas localizadas en la superficie del polímero, lo cual permite obtener cinéticas de unión más rápidas al mejorar la transferencia de masa, por lo que han encontrado aplicación para el desarrollo de biochips y sensores.163 Esta aproximación se ha empleado para la síntesis de MIPs selectivos a antibióticos como enrofloxacino164 o proteínas como la mioglobina.165 1A B Partículas de sílice Composite silica-MIP 2 MIP poroso Introducción 63 Cristales fotónicos Los cristales fotónicos son materiales nanoestructurados con unas propiedades ópticas especiales, ya que permiten la propagación controlada de la luz en un medio periódico. Pueden encontrarse de forma natural en los ópalos, las alas de las mariposas o en la piel de los camaleones.166 Artificialmente, se pueden construir mediante el autoensamblaje de partículas para crear estructuras tridimensionales porosas.167 Combinando las propiedades de los cristales fotónicos junto con la capacidad de reconocimiento selectivo que presentan los MIPs, es posible emplear estos materiales como sensores ópticos para la detección de diferentes analitos.168 Así, los polímeros de impronta fotónicos (IPP, del inglés, imprinted photonic polymer) consisten en una estructura tridimensional, altamente ordenada e interconectada como se ilustra en la Figura 18.169 Figura 18. Micrografías SEM correspondientes a la síntesis de un polímero de impronta fotónico. (A) Molde sacrificable de cristales de sílice coloidal. (B) Nanocavidades formadas en el polímero de impronta fotónico tras la disolución del molde. Adaptado de la referencia [169]. Partículas núcleo-recubrimiento Las partículas núcleo-recubrimiento (del inglés core-shell) han suscitado mucho interés en los últimos años como alternativa para la preparación de MIPs, pudiéndose considerar como materiales compuestos híbridos. Estas partículas están compuestas por un núcleo (core) que puede presentar diferentes propiedades, eléctricas, magnéticas u ópticas, dependiendo del tipo de material empleado para su síntesis (partículas magnéticas,170 partículas de oro,171 puntos cuánticos,172 termoplásticos,173 sílice dopada con ligandos fluorescentes,174 entre otros) y recubierto posteriormente con una fina capa de MIP (shell). Así, los sitios de unión están localizados cerca de la superficie, lo que favorece la difusión del analito, mejora la cinética de transferencia másica y reduce la adsorción inespecífica.175 La combinación de las propiedades del núcleo con la selectividad de la capa de MIP, convierte estos materiales híbridos en elementos muy versátiles para una gran variedad de aplicaciones analíticas. A B Introducción 64 El éxito de estos materiales radica en el control minucioso del espesor de la capa de MIP inmovilizado sobre el núcleo. Un sobrecrecimiento de la capa de polímero puede conducir al atrapamiento permanente de la molécula plantilla, dificultado su completa extracción y posterior reconocimiento del analito. Para evitarlo, se emplean polimerizaciones controladas tipo ATRP o tipo RAFT.176 La síntesis de estas partículas puede llevarse a cabo mediante diferentes técnicas, siendo las más empleadas la polimerización mediante emulsión, precipitación, procesos sol-gel o por técnicas de injerto (grafting). En algunos casos se requiere una etapa previa de recubrimiento del núcleo, normalmente con sílice, para mejorar el anclaje de la capa de polímero. Los MIPs tipo núcleo-recubrimiento pueden clasificarse en función del material del que está compuesto el núcleo, siendo los más comunes los de núcleo silíceo, magnéticos, puntos cuánticos y metálicos. En la Figura 19 se muestra el proceso general de síntesis de una partícula núcleo-recubrimiento. Figura 19. Esquema de síntesis de un MIP de tipo núcleo-recubrimiento. (1) El núcleo se recubre opcionalmente de una primera capa de SiO2. (2) Polimerización tras la adición de la molécula plantilla y los componentes de prepolimerización. (3) Eliminación de la molécula plantilla y creación de las cavidades complementarias. E) Síntesis de hidrogeles y nanogeles Los hidrogeles son materiales poliméricos poco entrecruzados que se hinchan en contacto con disolventes acuosos. Son blandos, elásticos y capaces de retener una cantidad significativa de disolvente.177 Este formato es ideal para su aplicación en la detección, enriquecimiento o separación de biomoléculas de alto peso molecular, al tratarse de materiales menos entrecruzados y más flexibles que los obtenidos empleando otros formatos, lo que facilita la difusión de los analitos. También se emplean en la liberación controlada de sustancias, tales como fármacos178 o antioxidantes.179 Mediante la combinación de diferentes monómeros y entrecruzantes se obtienen polímeros en formato hidrogel con diferentes características, como en el caso de los polímeros semi-interpenetrados (semi-IPN)180 o los hidrogeles sensibles al pH o la temperatura.181 Núcleo Recubrimiento opcional MIP 1 2 Molécula plantilla 3 Introducción 65 Manteniendo las mismas propiedades físicas que los hidrogeles en cuanto a bajo grado de entrecruzamiento y alta flexibilidad, han surgido en los últimos años los denominados nanogeles o nanoMIPs. Este nuevo formato permite disminuir el tamaño de los polímeros sintetizados a la escala nanométrica. Los nanoMIPs presentan características muy similares a los anticuerpos y han demostrado ser unas buenas alternativas para el diagnóstico clínico y aplicaciones in vivo debido a su pequeño tamaño (entre 10 y 300 nm) y gran estabilidad.182 Se sintetizan normalmente mediante precipitación en presencia de una gran cantidad de disolvente o mediante polimerización controlada empleando agentes tipo RAFT o iniferters.183,184 No obstante, es frecuente la obtención de sitios de unión heterogéneos y la presencia residual de la molécula plantilla. Con el fin de solventar estos problemas, Canfarotta y col. desarrollaron un nuevo método para la síntesis de nanoMIPs en estado sólido.185 Este procedimiento se basa en la inmovilización covalente de la molécula plantilla en un soporte sólido que posteriormente se pone en contacto con la mezcla de prepolimerización. Una vez finalizado el proceso, las partículas de nanoMIPs se eluyen del soporte en función de su diferente afinidad con respecto a la molécula plantilla (Figura 20). Figura 20. Esquema de síntesis de nanoMIPs empleando el péptido EGFR como molécula plantilla inmovilizada en bolas de vidrio. (1) Formación de los polímeros tras la adición del iniciador. (2) Elución de los monómeros sin reaccionar y los polímeros de baja afinidad a 20 ºC. (3) Elución de los nanoMIPs de alta afinidad a 70 ºC. Adaptado de la referencia [186]. Mediante este procedimiento se pueden obtener polímeros de alta afinidad, y descartar los oligómeros y polímeros de baja afinidad. Debido a las características de estos materiales, los nanoMIPs se han empleado en catálisis y para el desarrollo de sensores para diversos compuestos como micotoxinas,187 drogas,188 endotoxinas189 o plaguicidas.190 Molécula plantilla inmovilizada en bolas de vidrio + Mezcla de prepolimerización 1 20 ºC 70 ºC 2 3 Introducción 66 Estrategias para la síntesis de MIPs en función de la naturaleza de la molécula plantilla Los MIPs pueden sintetizarse para una paleta casi ilimitada de compuestos, incluyendo iones, moléculas orgánicas, proteínas, o incluso microorganismos.191 No obstante, la impronta de estructuras complejas y macromoléculas presenta una serie de limitaciones asociadas a su gran tamaño, su compleja estructura y su limitada solubilidad y estabilidad, que precisan de un control exhaustivo de las condiciones de síntesis para lograr el reconocimiento selectivo.137,105 A) Impronta de células La preparación de MIPs para el reconocimiento selectivo de entidades celulares ha experimentado un gran progreso en la última decada, empleándose tanto para investigación básica como para aplicaciones médicas basadas en células. En un primer momento la síntesis de MIPs para células se centró en procesos simples de separación, sensado y catálisis, pero gracias al desarrollo tecnológico y al potencial que presentan estos receptores artificiales, es posible encontrar MIPs para aplicaciones avanzadas como, la modulación de la adhesión celular,192 la indución de la diferenciación celular,193 o el desencadenamiento de la apoptosis celular.194 No obstante, el campo emergente con más aplicación de estos receptores es el reconocimiento celular mediado por MIPs. Aunque existe una gran diversidad de entidades celulares, no solo a nivel molecular sino también morfológico, el diseño de MIPs selectivos a células se basa en dos estrategias principales, ilustradas en la Figura 21: 1) la impronta de la entidad celular completa y, 2) la impronta de ciertas moléculas presentes en el exterior de la membrana celular. Figura 21. Estrategias para la impronta de células en función de la unidad estructural. (A) Empleo de la entidad celular completa como molécula plantilla. (B) Empleo de moléculas presentes en la superficie celular como plantilla. Adaptado de la referencia [195]. A Células mamíferas Bacterias Glicoproteína Proteína α-hélice Receptor Membrana plasmática B MIP MIP Glicoproteína Introducción 67 La primera estrategia se basa en el empleo de la célula completa, en su mayoría microorganismos, como molécula plantilla dada la rigidez que presentan sus estructuras en comparación con las células de mamífero. La impronta no se dirige específicamente a ciertas moléculas de la superficie celular sino que se basa en múltiples interacciones no covalentes entre la membrana celular y el MIP, y en la complementariedad en términos de forma física de la cavidad formada con la célula.195 Debido al gran tamaño de estas entidades empleadas como plantilla, los sitios de unión deben localizarse en la superficie para asegurar una buena accesibilidad a las cavidades, así como su eliminación completa tras la síntesis. De este modo, se han preparado MIPs selectivos a células mediante procesos de estampación,196 sol-gel,197 coloides,198 o diferentes procesos litográficos.199 Un ejemplo de ello se ilustra en la Figura 22, que muestra el empleo de bacterias (E. coli y M. luteus) como plantilla para la preparación de MIPs.200 Figura 22. Micrografías SEM de los MIPs sintetizados empleando bacterias como plantilla. MIP antes (A, B) y después (C, D) de eliminar la molécula plantilla. Adaptado de la referencia [200]. Debido a la simplicidad de este método de síntesis, existen en la literatura diversos ejemplos que emplean la emulsión Pickering para la preparación de MIPs selectivos a diferentes microorganismos, como el estudio publicado recientemente por Zhao y col. para la determinación de L. monocytogenes en combinación con puntos cuánticos.145 Otra aproximación muy utilizada se basa en la técnica de microcontacto que se ha empleado para la impronta de diversas entidades celulares como, eritrocitos,201 levaduras (S. cerevisiae)160 o diferentes tipos de bacterias (S. epidermidis, S.aureus, E. coli o K. pneumoniae). 202 Introducción 68 Alternativamente, los MIPs selectivos a células se pueden preparar en formato hidrogel. Los materiales obtenidos presentan un menor grado de entrecruzamiento y son más flexibles que los MIPs clásicos, resultando en una mejor difusión de los analitos. Empleando este método se han preparado MIPs de poliacrilamida utilizando como plantilla células HeLa, células embrionarias de riñón humano (HEK-293T) y células embrionarias del pulmón (MRC-9).203 Una variante del formato clásico del hidrogel es su combinación junto con nanomateriales, como el estudio publicado por Lv y col.204 en el que se combinan los nanofilamentos de oro con un sustrato de hidrogel termosensible para la captura y liberación de células tumorales circulantes (CTC). La segunda estrategia, también denominada impronta subestructurada, se refiere al empleo de ciertas partes expuestas en la membrana celular (proteínas, péptidos, lípidos o glicanos) como moléculas plantilla. En este tipo de impronta es de vital importancia seleccionar adecuadamente el fragmento que se va a improntar para conseguir un buen reconocimiento celular posterior. Esta estrategia, cada vez más en auge en el campo del diagnóstico, se emplea para la detección de biomarcadores tumorales al tratarse de moléculas específicas de la membrana celular, normalmente glicoproteínas, como el antígeno carcinoembrionario.205 Además, los MIPs sintetizados en tamaño nanométrico se pueden emplear como herramientas en técnicas de imagen de células, especialmente el formato núcleo-recubrimiento, al tratarse de polímeros estables de pequeño tamaño fácilmente funcionalizables con moléculas fluorescentes compatibles con esta técnica. Estos MIPs se basan principalmente en la impronta de glicanos de la superficie celular, como el ácido glucurónido, ácido siálico, ácido N- acetilneuramínico (NANA), fucosa o manosa, entre otros.206,207 ,208 También es posible la impronta de péptidos presentes en la célula, en una estrategia denominada “impronta de epítopo”, la cual se discutirá más a fondo en la sección 1.1.4.4.209 B) Impronta de virus Los virus son agentes patógenos causantes de la contaminación del medioambiente, alimentos o agua, así como de numerosas y graves enfermedades. Por ello, su rápida detección y eliminación es de vital importancia para la salud pública, requiriendo de técnicas analíticas muy sensibles. 210 Los virus se pueden agrupar en función de diferentes aspectos tales como, el tipo de ácido nucleico, su tamaño, forma, simetría de la cápside, presencia o ausencia de la envoltura externa o, la estructura de su genoma. La impronta de virus supone un reto en el campo de la síntesis de MIPs debido a las particularidades de estos microorganismos, como su variedad estructural y escasa estabilidad en disolventes Introducción 69 orgánicos. Por ello, la impronta se suele llevar a cabo en medios acuosos, a fin de evitar la destrucción prematura y asegurar la integridad conformacional de la entidad vírica.108 Además, dada su flexibilidad tridimensional, se producen constantemente variaciones de la estructura del virus a nivel molecular, dificultando el proceso de impronta en comparación con los procesos tradicionales. Al tratarse de entidades grandes, con tamaños de hasta 1000 nm, los virus pueden improntarse mediante diferentes métodos, desde la impronta en superficie bidimensional en forma de lámina delgada o membrana (2D) a la impronta tridimensional (3D, formato bloque) permitiendo una mayor capacidad de carga de la muestra. Además, para evitar el uso de la entidad vírica completa como molécula plantilla, al igual que se describía en el apartado anterior, es frecuente el uso de la denominada impronta subestructurada. En esta aproximación, se emplea como molécula plantilla solo una fracción representativa del virus, tratándose normalmente de proteínas o péptidos presentes en su cápside.211 Los epítopos de algunos virus, en términos de aquella secuencia vírica que es capaz de desencadenar la respuesta inmune, son ampliamente conocidos y se encuentran recogidos en una base de datos en línea (ViPR, Virus Pathogen Resource).212 La forma más simple de preparación de MIPs empleando virus como plantilla es el formato bloque. Esta aproximación, como se ha descrito previamente en la sección 1.1.4.3., presenta ventajas en cuanto a la escasa manipulación que se requiere del virus al añadir directamente la molécula plantilla a la mezcla de prepolimerización, sin necesidad de modificarlo previamente para su anclaje a un soporte. No obstante, a pesar de su simplicidad, los huecos improntados pueden localizarse en el interior del monolito, suponiendo un problema no solo en cuanto a accesibilidad en procesos posteriores de reconocimiento, sino que pueden conducir al atrapamiento permanente del virus plantilla en el interior de la matriz polimérica. Para evitar estos problemas es necesario el uso de materiales menos entrecruzados y más flexibles que los formatos clásicos que permitan la difusión de analitos de alto peso molecular, como los hidrogeles y nanogeles. Una alternativa al formato bloque es la impronta superficial en forma de lámina delgada o membrana, muy empleada en combinación con biomacromoléculas al localizarse los sitios de unión en zonas más accesibles. De esta manera, se consigue mejorar la extracción de la molécula plantilla, derivando en cinéticas de unión más rápidas y la disminución de la resistencia a la transferencia de masa.213 En el marco de esta impronta superficial existen diferentes aproximaciones, desde la inmovilización de la molécula plantilla a un sustrato y la posterior síntesis de la capa polimérica a su alrededor, hasta la síntesis de láminas delgadas normalmente mediante procesos de Introducción 70 estampación.214 Otra alternativa en la impronta superficial de partículas víricas consiste en sustituir la capa de polímero clásica, formada por monómeros acrílicos o vinílicos, por una capa de organosilano. Esta estrategia se basa en el empleo de partículas de sílice o partículas magnéticas sobre las que se inmoviliza previamente el virus y sobre la cual se deposita posteriormente una mezcla de organosilanos (Figura 23). Tal y como describen Sykora y col.,215 al emplear silanos en vez de los monómeros acrílicos o metacrílicos tradicionales, el virus inmovilizado tiene la capacidad de organizar los organosilanos alrededor de la superficie de su cápside antes de la polimerización. Figura 23. Preparación de un MIP empleando un virus como molécula plantilla. (1) Inmovilización de las partículas víricas sobre la superficie del soporte. (2) Formación de la capa de MIP. (3) Extracción de la molécula plantilla. Adaptado de la referencia [215]. La preparación de MIPs en formato membranas es también una estrategia muy generalizada dados los problemas asociados al empleo de virus como plantillas. Como ya se comentó en la sección 1.1.4.3, una de estas aproximaciones es la litografía blanda como técnica de estampación. Normalmente, y para facilitar la detección del virus, la membrana polimérica se crea sobre un soporte o sustrato transductor, en su mayoría para su detección emplendo una microbalanza de cuarzo (QCM). Dickert y col. fueron pioneros en aplicar esta técnica para la preparación de MIPs selectivos al virus del mosaico de tabaco.216 En la Tabla 3 se recogen algunos ejemplos de impronta de virus y de los formatos empleados para su síntesis. C) Impronta de proteínas Las proteínas están compuestas por secuencias de aminoácidos enlazados entre sí mediante enlaces peptídicos. Están involucradas en miles de procesos celulares, actuando muchas de ellas como biomarcadores en diferentes enfermedades. Debido a la relevancia que presentan estas macromoléculas en los campos de la genómica y proteómica, es necesario el desarrollo de materiales selectivos que permitan avanzar en su detección y monitorización. La impronta de proteínas supone un reto dentro del campo de MIPs, dado su elevado tamaño y su sensibilidad a las condiciones ambientales (temperatura, pH, la fuerza iónica del medio, etc). Por otra parte, el elevado precio de las proteínas purificadas para su empleo como plantillas supone una dificultad añadida para la preparación de este tipo de materiales. Una alternativa, es emplear parte SiO2 1 3 SiO2 SiO2 MIP SiO2 2 3 MIP 7 1 In tro d u c c ió n Tabla 3. Ejemplos de MIPs selectivos a virus y tipos de impronta utilizada. Molécula plantilla Tipo de impronta Composición polimérica Propiedades más relevantes * Ref. TMV Bloque (hidrogel) PAA/Epiclorhidrina Q: 8.8 mg g-1 217 TMV Bloque (hidrogel) PAA/EGDE IF: 2.3 218 Adenovirus Superficial (nanogeles) NIPAm/AA/MBA/TBAm/N3APM LOD: 0.02 pM; KD: 3.10 x 10-11 M 213 Bacteriófago MS2 Superficial (nanogeles) NIPAm/AA/MBA/TBAm/N3APM LOD: 5 x 106 pfu mL-1; KD: 3 x 10-9 M 219 Adenovirus Superficial (núcleo SiO2) TEOS/APTES/APTMS RMIP: 97% 220 Norovirus VLP Superficial (núcleo SiO2) TEOS/APTES/ácido cítrico RMIP: 80% 215 TYMV Superficial (núcleo SiO2) TEOS/APTES LOD: 65 pM 221 JEV Superficial (núcleo SiO2) TEOS/APTES LOD: 9.6 pM, IF: 2.12 222 Virus hepatitis A Superficial (núcleo SiO2) Dopamina LOD: 8.6 pM; RMIP: 90%−96% 223 Virus hepatitis A Superficial (núcleo SiO2) NIPAAm/MBA LOD: 1.1 pM; RMIP: 90.8%−108.3% 224 Virus hepatitis A Superficial (núcleo SiO2) Dopamina KD: 526.3 ufp mL-1; Bmax: 96.3x103 ufp g-1 225 JEV Superficial (núcleo SiO2) TEOS/APTES LOD: 0.11 pM, IF: 1.7 226 JEV Superficial (núcleo Fe3O4) TEOS/APTES LOD: 0.32 nM, IF: 2.98 227 JEV Superficial (núcleo Fe3O4) TEOS/APTES LOD: 1.3 pM 228 7 2 In tro d u c c ió n Tabla 3. (Continuación). *Resultados expresados en términos de: Q: capacidad de unión, Bmax: capacidad de absorción máxima; KD: constante de disociación; LOD: límite de detección; LOQ: límite de cuantificación R: recuperación; IF: factor de impronta. Abreviaturas: AA: ácido acrílico; AM: acrilamida; APTES: 3-aminopropiltrietoxisilano; APTMS: 3-aminopropiltrimetoxisilano; DHEBA: N,N-(1,2-dihidroxietilen)bisacrilamida; DPDI: diisocianato de difenilmetano; EGDE: etilenglicol diglicidil; EV: virus de la encefalitis japonesa; FMDV: virus de la fiebre aftosa (foot-and-mouth disease virus); MAA: ácido metacrílico; MBA: N,N´-metilenbisacrilamida; NIPAm: N-isopropilacrilamida; N3APM: hidrocloruro de N-(3-aminopropil)metacrilamida; PAA: hidrocloruro de poli(alilamina); PDMS: polidimetilsiloxano; TBAm: N-tertbutilacrilamida; TEOS: tetraetilortosilicato; TMV: virus del mosaico de tabaco; VLP: Virus-like particle; VP: vinilpirrolidona. Molécula plantilla Tipo de impronta Composición polimérica Resultados* Ref. TMV Superficial (membrana QCM) AA/EDMA Cualitativo 216 Rinovirus humano Superficial (membrana QCM) Bisfenol A/Floroglucinol/ DPDI 100 µg mL-1 229 Virus de la gripe A Superficial (membrana QCM) AAM/MMA/VP/DHEBA LOD: 105 ufp mL-1 230 Virus del dengue Superficial (membrana QCM) MAA/VP/EDMA IF: 3 231 FMDV Superficial (membrana electrodo) o-aminofenol LOD: 1.98 ng mL-1; LOQ: 3 ng mL-1 232 Virus Zika Superficial (membrana electrodo) AM/MAA/VP/DHEBA LOD: 2 x 10-2 ufp mL-1 233 TMV Superficial (membrana) MAA/VP/DHEBA LOD: 8 µg mL-1 234 Virus de la gripe A Superficial (membrana) PDMS LOD: 8 fmol L-1 235 Introducción 73 parte de la proteína, i.e., unos pocos aminoácidos, como plantilla, lo que se conoce como impronta de epítopo. El primer material improntado utilizando una proteína como molécula plantilla fue sintetizado por Glad y col. en 1985,236 aunque no ha sido hasta esta última decada cuando la impronta de estas macromoléculas ha empezado a tener un peso significativo en el campo de los MIPs. Como sucedía con otras plantillas biomacromoleculares ya comentadas, la impronta de proteínas lleva asociada una serie de limitaciones para la preparación de MIPs, debido al tamaño, complejidad, flexibilidad conformacional y solubilidad de las mismas. Las proteínas presentan gran variedad de grupos funcionales y, por lo tanto, la selección de los monómeros debe realizarse cuidadosamente para evitar interacciones no específicas.237 Además, a diferencia de las moléculas orgánicas de bajo peso molecular, las proteínas presentan el factor añadido del impedimento estérico, dificultando aun más la síntesis de estos polímeros.238 La preparación de MIPs en formato bloque no está recomendada en este caso, dado que los sitios de unión se encuentran distribuidos heterogéneamente a lo largo de todo el monolito pudiendo quedar la proteína permanentemente atrapada en la matriz polimérica. Además, para maximizar las interacciones no covalentes, la síntesis tradicional de MIPs suele llevarse a cabo en disolventes orgánicos, que favorecen la precipitación, formación de agregados o los cambios conformacionales de estas biomoléculas. Así, para favorecer la difusión de las proteínas en el MIP, pueden prepararse materiales menos entrecruzados como los hidrogeles. Estos polímeros suelen emplear entrecruzantes como N,N´-metilenbisacrilamida (MBA), N,N`- etilenbisacrilamida (EBA) o HEMA, compatibles con medios acuosos. Además, es necesario un control íntegro de las condiciones de polimerización a fin de mantener la biomolécula en su estructura nativa, lo cual es poco factible si el proceso de polimerización requiere calor. Un ejemplo de ello es el estudio publicado por Andaç y col. (Figura 24),239 los cuales desarrollaron un MIP en formato criogel macroporoso con base HEMA para la extracción de albúmina de suero humano (HSA). Como sucedía para otras macromoléculas, la alternativa preferida en el campo de los MIPs para proteínas es la impronta en superficie, mediante el anclaje de la proteína de interés a la superficie de un sustrato y la síntesis posterior del polímero alrededor de la misma. En esta aproximación, los sitios de unión se encuentran más accesibles y orientados al estar localizados en la superficie, permitiendo una extracción más eficiente de la proteína plantilla y favoreciendo cinéticas de unión más rápidas.240,241 Se han utilizado diferentes sustratos para este fin, pudiendo ser eliminados o no (como Introducción 74 en el caso de las partículas núcleo-recubrimiento) tras la síntesis, tales como sílica, partículas magnéticas o puntos cuánticos. Figura 24. (A) Micrografía SEM de un MIP en formato criogel empleando la proteína HSA como molécula plantilla. (B) MIP empaquetado en una columna: (1) extracción de la proteína HSA y (2) reconocimiento selectivo de la HSA en los huecos improntados. Adaptado de la referencia [239]. Además de la inmovilización de la proteína como etapa previa a la polimerización, es posible realizar este proceso en el sentido inverso, es decir, en lugar de inmovilizar la molécula plantilla sobre el soporte, se emplean técnicas de injerto (grafting from/to) inmovilizando los monómeros funcionales o el bien el iniciador, como se ha descrito anteriormente en la sección 1.1.4.3.242,243 Un formato en auge es la síntesis de nanogeles mediante el método clásico según se comentó en la sección 1.1.4.3., o mediante un procedimiento modificado denominado “impronta en fase sólida dispersiva” en el que la molécula plantilla se inmoviliza en partículas magnéticas en vez de en bolas de vidrio.244 Aplicando este protocolo, Sellergren y col.245 han descrito la síntesis de dos nanogeles selectivos a tripsina y pepsina, obteniendo constantes de disociación (KD) del orden de 10 pM para ambas proteínas diana. También se han preparado MIPs para diferentes proteínas mediante la generación de láminas delgadas de polímero sobre la superficie de un sustrato vidrio mediante técnicas litográficas,246 o mediante el uso de emulsiones.247 Actualmente, la tendencia se dirige hacia la integración del MIP con nanomateriales, como describe Zhou y col.,248 para la detección de la hemoglobina empleando puntos cuánticos de carbono con un límite de detección de 0.77 nM. La Tabla 4 recoge algunos ejemplos de MIPs sintetizados empleando proteínas como plantilla. A 10 µm B 1 2 In tro d u c c ió n 7 5 Tabla 4. Ejemplos de MIPs sintetizados en diferentes formados empleando proteínas como plantilla. Molécula plantilla Tipo de impronta Composición polimérica Propiedades más relevantes* Ref. BSA Bloque DMAPMA/AM/NIPAm/MBA Ka: 9.6 x 104 L mol-1 ; Qmax: 4.7 µmol g-1 249 Lisozima Bloque (Hidrogel) NIPAm/MAA/MBA K: 3.9 x 105 M-1 250 BSA Superficial (núcleo SiO2) AM/MAA/MBA/DMAEMA IF: 2.89; QMIP: 23.3 mg g-1 251 HSA Superficial (núcleo SiO2) MAA/AM/DMAEMA/MBA QMIP: 86.7 mg g-1 252 PSA Superficial (núcleo SiO2) MAA/HEMA IF: 2.6; QMIP: 7.7 mg g-1 253 BHb Superficial (núcleo SiO2@CdTe) APTES/TEOS LOD: 9.4 nM 254 BHb Superficial (nanohilos de Al2O3) AM/MBA QMIP: 27.2 mg g-1 255 Mioglobina Superficial (lámina óxido de grafito) SSA/AEHM/EDMA RMIP: 102−110.2% 256 Troponina T Superficial (núcleo MWCNT) AM/MBA LOD: 0.16 µg mL-1 257 BSA Superficial (núcleo Fe3O4) APTES/TEOS/Dopamina IF: 5.45; QMIP: 266.99 mg g-1 258 BHb Superficial (núcleo Fe3O4) APTES/OTMS IF: 2.60; QMIP: 210 mg g-1 259 HSA Superficial (núcleo Fe3O4 + MWCNT) Dopamina QMIP: 66.23 mg g-1; RMIP: 91.95−97.8% 260 Hemoglobina Superficial (CQDs) AM/MAA/EDMA LOD: 0.77 nM, RMIP: 86.8−93.9% 261 In tro d u c c ió n 7 6 Tabla 5. (Continuación). Molécula plantilla Tipo de impronta Composición polimérica Resultados* Ref. Tripsina y pepsina Nanogel NIPAm/MBA/TBAm/AA/APMA KD < 10 pM 262 Hemoglobina Superficial (láminas) AM/MBA LOD: 0.00035 mg mL-1 263 BSA Superficial (Fe3O4@SiO2) NIPAm/MAA/MBA IF: 1.70; QMIP: 71.85 mg g-1 264 Lisozima Superficial (Fe3O4@SiO2) Dopamina IF: 2.04; QMIP: 202.02 mg g-1 265 α-Caseína NanoMIP NIPAm/MBA/TBAm/APM LOD: 127 ng mL-1; KD ~ 10 x 10-9 M; RMIP: 87−120% 266 Tripsina Miniemulsión MAA/EDMA LOD: 0.07 µg mL-1; RMIP: 94−104% 267 *Resultados expresados en términos de: Ka: constante de asociación; Qmax: capacidad máxima de unión; IF: factor de impronta; QMIP: capacidad de unión; LOD: límite de detección; RMIP: recuperación; KD: constante de disociación. Abreviaturas: AEHM: hidrocloruro de 2-aminoetilmetacrilato; AM: acrilamida; APM: N-(3-aminopropil)metacrilamida; APMA: aminopropilmetacrilamida; APTES: 3- aminopropiltrietoxisilano; BHb: hemoglobina bovina; BSA: albúmina de suero bovino; CQDs: puntos cuánticos de carbono; DMAEMA: metacrilato de 2-(dimetilamino)etilo; DMAPMA: N-[3-(dimetilamino)propil] metacrilamida; EDMA: dimetacrilato de etilenglicol; HEMA: metacrilato de 2-hidroxietilo; HSA: albúmina de suero humano; MAA: ácido metacrílico; MBA: N,N´-metilenbisacrilamida; NIPAm: N-isopropilacrilamida; MWCNT: nanotubos de carbono de pared múltiple; OTMS: octiltrimetoxisilano; PSA: albúmina de suero porcino; SSA: ácido 4-estirenosulfónico; TEOS: tetraetilortosilicato. Introducción 77 D) Impronta de péptidos Una alternativa a la impronta íntegra de proteínas es la denominada “impronta de epítopo”, mencionada anteriormente. Esta técnica consiste en seleccionar un fragmento polipeptídico de tamaño molecular pequeño (300−5000 Da) que forme parte de la proteína o péptido que se pretende aislar y emplearlo como plantilla para la síntesis del MIP (Figura 25). Esta aproximación está basada directamente en la descripción del término “epítopo”, que se define como la parte de un antígeno que interacciona con una parte específica del receptor o del anticuerpo (denominada paratopo).268 Esta aproximación evita los problemas inherentes al empleo de proteínas como plantilla en la preparación de MIPs, tales como la desnaturalización de la biomolécula, su atrapamiento permanente en la red polimérica, una pobre transferencia másica, o la heterogeneidad en los sitios de unión generados en el material.269 Los MIPs preparados mediante impronta de epítopo se han aplicado en diferentes campos, especialmente en biotecnología para el reconocimiento celular, detección de biomarcadores, purificación de proteínas o liberación controlada de fármacos.186,192 Figura 25. Representación esquemática de la síntesis de un MIP mediante la aproximación de la impronta de un epítopo. (1) Polimerización. (2) Extracción de la molécula plantilla y creación de los sitios de unión. (3) Reconocimiento selectivo de un polipéptido a través de su epítopo. E P I T O O P + Monómeros funcionales Entrecruzante Porógeno Iniciador 1 E P I T O O P 2 3 E P I T O O P E P I T O O P MIP MIP MIP Introducción 78 Como sucedía con las otras moléculas plantilla comentadas anteriormente, en el caso de la impronta de un epítopo, es posible llevar a cabo una polimerización en bloque o en superficie. La impronta de epítopo surge en el año 2000 de la mano de Rachkov y Minoura,270 los cuales prepararon un MIP en formato bloque mediante polimerización radicálica empleando el tetrapéptido YPLG como molécula plantilla, MAA como monómero funcional, EDMA como entrecruzante y acetonitrilo como porógeno. El polímero resultante reconocía tanto al tetrapéptido empleado como molécula plantilla, como al tripéptido PLG del extremo C-terminal y también al nonapéptido oxitocina (CYIQNCPLG). Este trabajo permitió demostrar la posibilidad de emplear un péptido pequeño como molécula plantilla para el reconocimiento de un péptido más largo. No obstante, como ya se ha comentado anteriormente, la impronta en bloque clásica presenta limitaciones importantes, por lo que la síntesis de MIPs mediante la aproximación de epítopo avanzó a una síntesis en formato esferas. No obstante, aunque esta aproximación permite obtener partículas con un tamaño más uniforme y de forma regular, la mayoría de los sitios de unión generados se suelen localizar en el interior de la partícula lo que puede dificultar la extracción y el acceso del analito a la cavidad. Por ello, con objeto de mejorar la accesibilidad de los sitios de unión, se han desarrollado nuevas aproximaciones mediante impronta de epítopo en superficie. Como se ha mencionado anteriormente, uno de los principales problemas asociados a la preparación de MIPs para el reconocimiento de biomoléculas es la solubilidad de la molécula plantilla en la mezcla de prepolimerización. Por otra parte, los péptidos pueden adoptar diferentes conformaciones durante la etapa de polimerización, originando cavidades con diferentes geometrías que pueden estar cerca de la superficie del MIP, facilitando el reconocimiento de la proteína, o encapsuladas en el interior del mismo sin acceso al analito.113 La inmovilización de la molécula plantilla sobre un sustrato permite reducir el número de grados de libertad de la misma, favoreciendo la creación de sitios de unión homogéneos y orientados en la superficie del material. De esta forma se consigue una mayor accesibilidad de las cavidades, una mejor eliminación de la molécula plantilla y cinéticas de unión más rápidas.271 Además, la inmovilización de la molécula plantilla sobre la superficie de un sustrato permite la impronta de moléculas que no son solubles en la mezcla de prepolimerización, ampliando así el abanico de disolventes que se pueden emplear en la preparación de MIPs. También se potencia la interacción entre la plantilla y los monómeros funcionales al evitar el uso de surfactantes que puedan interferir en la misma. La base de esta aproximación es el empleo de un soporte sobre Introducción 79 el que se sintetiza el polímero de impronta molecular, que puede ser mantenido (Figura 26A), o eliminado (Figura 26B) tras la síntesis del MIP. Figura 26. Estrategias seguidas para la impronta de epítopos inmovilizados sobre un soporte que se elimina (A), o no (B) tras la síntesis del MIP. Etapas seguidas en la preparación de los MIPs: (1) polimerización, (2) extracción de la molécula plantilla y generación de los sitios de unión y (3) reconocimiento selectivo de una proteína modelo a través de su epítopo. Adaptado de las referencias [272,273]. En el primer caso, el epítopo se inmoviliza en un soporte sólido y se añade posteriomente el cóctel de prepolimerización formándose una película de espesor controlado sobre la superficie del sustrato. Después se extrae la molécula plantilla creándose cavidades selectivas en la superficie del polímero. La interacción entre el epítopo y el soporte debe ser estable y reversible para poder eliminar de forma fácil y completa la molécula plantilla tras la polimerización. En esta aproximación es vital el control del espesor de la película polimérica para evitar el atrapamiento de la molécula plantilla. Se han abordado diferentes estrategias para la inmovilización de los epítopos, desde la adición de un aminoácido tiolado en uno de los extremos del péptido, por ejemplo para unirlo a una superficie de oro,274 hasta la interacción entre el ácido borónico y los compuestos tipo cis-diol (1,2 ó 1,3).275 Un ejemplo de ello es el MIP desarrollado por Liu y col.276 para la detección de la mioglobina empleando como molécula plantilla un péptido con una secuencia equivalente a su extremo C-terminal modificado con una lisina (NYKELGFQGK) y con fructosa. Como soporte emplearon partículas magnéticas Soporte Soporte SoporteSoporte Epítopo Proteína 321 SoporteSoporte Epítopo Proteína 321 A B MIP MIP MIP MIP MIP MIP Introducción 80 funcionalizadas con ácido borónico, a fin de aprovechar la interacción entre este grupo y los grupos dioles de la fructosa, consiguiendo así una inmovilización orientada de la molécula plantilla. En el segundo caso, se sigue el mismo protocolo de síntesis pero, tras la extracción de la molécula plantilla, se disuelve el soporte, creándose cavidades orientadas en la superficie del MIP. En el caso de emplear soportes porosos, esta estrategia se denomina impronta jerarquizada.273 Aunque en la actualidad esta estrategia se emplea principalmente para la impronta de péptidos, los primeros estudios que utilizaron la impronta jerarquizada fueron desarrollados en el año 2000 de la mano de Mosbach y col.277 para la preparación de MIPs selectivos a teofilina mediante la derivatización previa de micropartículas de sílice porosas. Tras sus excelentes resultados, el concepto de impronta jerarquizada siguió desarrollándose por otros investigadores. A partir del año 2002, uno de los grupos propulsores de la impronta jerarquizada fue el liderado por Sellergren que desarrolló MIPs para nucleótidos,278 péptidos279 y proteínas280 aplicando esta técnica. Un ejemplo de ello fue el estudio publicado por Titiricci y col.281 que preparó un MIP selectivo al péptido nociceptina (FGGFTGARKSARKLANQ) derivatizando partículas de sílice con el dipéptido FG (fenilalanina-glicina) empleando MAA como monómero funcional y EDMA como entrecruzante. Como se ilustra en la Figura 27, tras la disolución del molde, los huecos improntados quedan orientados hacia el exterior lo que facilita el reconocimiento del analito. Figura 27. Síntesis de un MIP mediante impronta jerarquizada empleando sílice derivatizada con el dipéptido FG. (1) Polimerización alrededor del péptido inmovilizado (60 ºC, 24 h). (2) Eliminación de la molécula plantilla con NH4HF2. Adaptado de la referencia [282]. La impronta de epítopo, en cualquiera de sus variantes, supuso una revolución en la síntesis de MIPs epecialmente para la detección y separación de péptidos y proteínas, como queda reflejado en la Tabla 6. Las combinaciones son casi infinitas, 1 Sílice derivatizada Composite sílice-MIP MIP SiO2 2 SiO2 In tro d u c c ió n 8 1 Tabla 6. Ejemplos de MIPs sintetizados mediante la aproximación del epítopo en diferentes formados empleando aminoácidos o péptidos como moléculas plantilla para el reconocimiento de péptidos y proteínas. Molécula plantilla Analito Tipo de impronta Composición polimérica Propiedades más relevantes * Ref. Histidina Lisozima Criogel MAH/HEMA/MBA Qmax: 54.2 mg g-1 283 QKSLSLSPGK IgG NanoMIP NIPAm/MBA/TBAm/AA KD: 27.4 nM 284 YGGF Péptidos encefalinas Bloque MAA/EDMA RMIP: 85.1−95.7%; IF ≥ 32.2 285 Péptidos C- y N-terminales Citocromo C Superficial (núcleo QD) APTES/PTESMIC/TEOS RMIP: 95.0−103.0%; LOD: 0.15 nM 286 Péptido NSE Proteína NSE Superficial (sustrato QCM) Escopoletina LOD: 0.5 ng mL-1; KD: 5.3 x 10-11 M 287 Péptidos C- y N-terminales PSA Superficial (núcleo MCNTs) Acrilato de zinc/EDMA QMIP: 45.05 mg g-1 ; IF:4.50 288 VVSTQTALA BSA Superficial (lámina Au) o-fenilendiamina LOD: 0.02 ng mL-1; RMIP: 98.3−102.5% 289 MIQRTPKIQ β2-microglobulina Superficial jerarquizada (SiO2) MAA/EBA LOD: 0.058 mg L-1; LOQ: 0.195 mg L-1; RMIP ˃ 83% 290 Péptidos C-terminales HSA Trf Superficial (núcleo MCNTs) Acrilato de zinc/EDMA QMIP: 103.67 mg g-1; IF: 2.57 QMIP: 68.48 mg g-1; IF: 2.17 291 KSWDTGSPSSANAGYCAS Proteína REG1B Superficial (lámina Au) EVAL KD: 1.73 pg mL-1; LOD: 0.1 pg mL-1 292 CNCKAPETADCAFVCFLS Proteína p32 Microemulsión AM/MBA IC50: 340 nM 293 AASQAALGL HSA Superficial (lámina Au) Acrilato de zinc/EDMA RMIP: 99−103%; LOD: 0.026 µg mL-1 294 AYLKKATNE GDVEKGKKI Citocromo C Superficial (núcleo QD@SiO2) Acrilato de zinc/EDMA RMIP: 99.3−114%; IF: 3.06 295 https://scifinder.cas.org/scifinder/references/answers/58559E38X86F35093X7A84E2B31FACC8BA76:5855D4E1X86F35093X218F362626900DAB10/30.html?nav=eNpb85aBtYSBMbGEQcXUwtTUxcTVMMLCzM3Y1MDSOMLI0MLN2MwICC0NDFwcnQwNgEqTiosYBLMSyxL1chLz0vU880pS01OLhB4tWPK9sd2CiYHRk4G1LDGnNLWiiEEAoc6vNDcptahtzVRZ7ikPupkYGCoKGBgYmIEGZpQwSDuGhnj4B8V7-oW5-oUAGX7-8e5B_qEBnn7uJQycmbkF-UUlQBOKCxnqGJiB-hiAotm5BUGphSiiABMROxM&key=caplus_2018:834860&title=TWV0YWwgY2hlbGF0aW9uIGR1YWwtdGVtcGxhdGUgZXBpdG9wZSBpbXByaW50aW5nIHBvbHltZXIgdmlhIGRpc3RpbGxhdGlvbi1wcmVjaXBpdGF0aW9uIHBvbHltZXJpemF0aW9uIGZvciByZWNvZ25pdGlvbiBvZiBwb3JjaW5lIHNlcnVtIGFsYnVtaW4&launchSrc=reflist&pageNum=2&sortKey=ACCESSION_NUMBER&sortOrder=DESCENDING In tro d u c c ió n 8 2 Tabla 6. (Continuación). Molécula plantilla Analito Tipo de impronta Composición polimérica Resultados* Ref. AASQAALGLHHHHHH HSA Superficial (núcleo MCNTs) AA/NIPAm/DMAPMA QMIP: 46.6 mg g-1; IF: 4.0 296 KGLVDDADI Proteína Por B (N. meningitidis) Superficial (lámina Au) MAA/EDMA Semicuantitativo 297 VVSTQTALA BSA Superficial (núcleo Fe3O4@SiO2) APTES/TEOS QMIP: 20.25 mg g-1; IF: 3.21 298 QKSLSLSPGK IgG Membrana MAA/MAM/EDMA QMIP: 3.7 mg mL-1; IF: 4.0 299 AYLKKATNE GDVEKGKKI Citocromo C Superficial (núcleo SiO2) Acrilato de zinc/EDMA RMIP: 94−107.5%; IF: 2.43 300 VVSTQTALA BSA Superficial (núcleo QD) TEOS/APTES RMIP: 96.56−103.51%; IF: 4.8 301 WMDF Neuropéptidos de colecistoquinina Bloque MAA/EDMA RMIP: 85.1−94.2%: IF ≥ 22.3 302 SWSNKS Glicoproteína 41 NanoMIP NIPAm/TFMAA/PAA/TBAm/ MAA IC50: 85.4 nM 303 AYLKKATNE Citocromo C Superficial (núcleo MCNTs) Acrilato de zinc/EDMA QMIP: 780 mg g-1; IF: 11.7 304 *Resultados expresados en términos de: Qmax: capacidad de unión máxima del MIP; RMIP: recuperación; IF: factor de impronta; KD: constante de disociación; IC50: concentración inhibitoria media máxima; LOD: límite de detección; QMIP: capacidad de unión; LOQ: límite de cuantificación. Abreviaturas: AA: ácido acrílico; AM: acrilamida; APTES: 3-aminopropiltrietoxisilano; BSA: albúmina de suero bovino; DMAPMA: N-[3-(dimetilamino)propil] metacrilamida; EBA: N,N´-etilenbisacrilamida; EDMA: dimetacrilato de etilenglicol; EVAL: poli(etilen-covinilalcohol); HEMA: metacrilato de 2-hidroxietilo; HSA: albúmina de suero humano; MAA: ácido metacrílico; MAH: N-metacriloil-(l)-histidina metiléster; MAM: metacrilamida; MBA: N,N´-metilenbisacrilamida; MCNTs: nanotubos de carbono magnéticos; NIPAm: N- isopropilacrilamida; NSE: proteína enolasa específica de neurona; PAA: N-fenilacrilamida; PSA: albúmina de suero porcino; PTESMIC: cloruro de 1-propiltrimetoxisilano- 3- metilimidazolio; QD: punto cuántico; QCM: microbalanza de cristal de cuarzo; TBAm: N-terc-butilacrilamida; TEOS: tetraetilortosilicato; TFMAA: ácido trifluorometacrílico;. Trf: transferrina. Introducción 83 desde la incorporación de nanomateriales,305 en forma de láminas,306 hidrogeles,299 nanogeles,284,307 o incluso es posible el empleo de dos péptidos plantilla simultáneamente, opción muy popular en los últimos años.308,309,310 Como se ha discutido en este apartado, la impronta de un epítopo tiene como objetivo el reconocimiento de una secuencia contenida de forma natural en la proteína de interés, es decir, que no ha sido añadida ni modificada de forma artificial mediante técnicas recombinantes. No obstante, los grandes avances que se han experimentado en las últimas décadas en el campo de la ingeniería genética, hacen necesario el desarrollo de materiales poliméricos selectivos que puedan competir con las resinas comerciales, normalmente basadas en el uso de anticuerpos, para la purificación de proteínas recombinantes. La tecnología de ADN recombinante permite modificar proteínas “a la carta” introduciendo péptidos o proteínas como marcadores, denominados marcadores de afinidad o de fusión, para facilitar su purificación. La presencia de un marcador puede influir en determinadas propiedades de la proteína, mejorando su solubilidad y estabilidad.311 Las proteínas marcadas de forma recombinante se purifican habitualmente empleando cromatografía de afinidad a través de la interacción del marcador con el ligando unido a la matriz de la columna de purificación, normalmente un anticuerpo. Este proceso permite la purificación de diferentes proteínas fusionadas al mismo marcador. Existe un amplio abanico de marcadores de afinidad cuya selección dependerá principalmente del sistema de expresión de proteínas utilizado, del vector de expresión deseado y la localización N-terminal o C-terminal del marcador. Algunos de los marcadores de fusión más utilizados, así como las condiciones de purificación empleadas en cada caso se recogen en la Tabla 7. Uno de los marcadores de fusión más empleados es el conocido como His-tag o His6. Este polipéptido está compuesto por 6 histidinas y su tamaño es de 0.84 kDa, lo que le confiere una baja inmunogenicidad.312 La purificación de proteínas marcadas con His-tag se enmarca dentro de lo que se conoce como proceso IMAC (del inglés, immobilized metal affinity chromatography). Mediante la cromatografía IMAC, ciertos iones metálicos (como Ni2+ y Co2+), inmovilizados en una resina mediante un agente quelatante (como el ácido nitriloacético, NTA), se coordinan con los átomos de las cadenas laterales de las histidinas. Este protocolo tiene el inconveniente de que se pueden copurificar otras proteínas presentes en el medio que contengan en su estructura histidinas y cisteínas, o bien la coelución de otras proteínas cargadas negativamente al unirse de forma inespecífica a la resina IMAC, originando la contaminación y disminución de la pureza de la proteína recombinante obtenida.313 In tro d u c c ió n 8 4 Tabla 7. Marcadores de fusión empleados para la purificación de proteínas recombinantes. Marcador Tamaño (Da/aa) Secuencia aminoacídica Localización terminal Origen Sistema de expresión Ligando/ Matriz Comentarios Ref. His-tag 840.9 Da/ 6 aa HHHHHH N- o C- terminal Sintético Bacterias Resina Ni2+- NTA (ácido nitriloacético) Elución con imidazol 314, 315 Strep II Tag 1058 Da/ 8 aa WSHPQFEK N- o C- terminal Bacterias Bacterias, levaduras, insectos, células mamíferas Proteína Strep- Tactin (estreptavidina modificada) Elución competitiva con destiobiotina 316 HA 1102 Da/ 9 aa YPYDVPDYA N- o C- terminal Virus de la gripe humana Bacterias, células mamíferas Anticuerpo monoclonal anti-HA Elución con glicina (0.1 M, pH 2-2.8), 3M NaSCN, 50 mM NaOH o elución competitiva con el péptido HA libre 317, 318 c-Myc 1203 Da/ 10 aa EQKLISEEDL N- o C- terminal H. sapiens Bacterias, células mamíferas Anticuerpo monoclonal anti-c-Myc 9E10 Elución en medio ácido (glicina 200 mM/150 mM NaCl, pH 2.2) o elución competitiva con el péptido libre c-Myc 319 FLAG 1013 Da/ 8 aa DYKDDDDK N- o C- terminal Sintético Bacterias, levaduras, insectos, células mamíferos Anticuerpo monoclonal anti-FLAG (M1, M2 o M5) Elución en medio ácido (tampón glicina 0.1 M, pH 2.5-3.5) o elución competitiva con el péptido FLAG libre 320 T7 1098 Da/ 11 aa MASMTGGQQ MG N- o C- terminal Bacteriófa go T7 Bacterias, células mamíferos Anticuerpo monoclonal anti-T7 Elución con ácido cítrico 0.1 M pH 2.2 321 Péptido S 1678 Da/ 15 aa KETAAAKFERG HMDS N- o C- terminal Bovino Bacterias Proteína S Elución en condiciones desnaturalizantes (3 M guanidina tiocianato, 0.2 M citrato potásico, pH 2, 3 M MgCl2) 322 Introducción 85 La preparación de MIPs para la purificación de proteínas recombinantes marcadas con péptidos es una aplicación de gran interés a escala comercial dadas las indudables ventajas de estos materiales frente a los soportes de inmunoafinidad (Tabla 6). No obstante, se trata de una aplicación que, hasta la fecha de realización de la presente Tesis Doctoral, prácticamente no se había abordado en la bibliografía. Tan solo se había descrito la síntesis de MIPs selectivos a His-tag, por ejemplo Li y col.323 sintetizaron un MIP selectivo a la proteína verde fluorescente marcada con His-tag (His6-GFP). Para ello modificaron nanopartículas de sílice con metacrilato de 3-trimetoxisililpropilo (MPS), para introducir los grupos vinílicos, y con ácido iminodiacético (IDA) para inmovilizar los iones Ni2+, adicionados en forma de disolución de NiSO4. Posteriormente, se añadió la molécula plantilla (His-tag, HHHHHH) y la polimerización se llevó a cabo empleando acrilamida, N,N´-metilenbisacrilamida y un derivado del ácido propiónico en acetonitrilo. Tras la extracción de la molécula plantilla, los autores emplearon el MIP sintetizado para la purificación de la proteína His6-GFP presente en el extracto de lisis celular obteniendo una recuperación del 78% y una pureza de 52.9% para dicha proteína. El esquema de síntesis, así como los resultados de la elución analizados por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) se ilustran en la Figura 28. Figura 28. Estrategia para la síntesis de un MIP mediante la aproximación del epítopo para la purificación de proteínas marcadas con His-tag. (1) Inmovilización del péptido His-tag. (2) Polimerización. (3) Eliminación de la molécula plantilla. (4) Reconocimiento selectivo de proteínas de fusión con His-tag. Evaluación mediante SDS-PAGE de la proteína purificada señalada en color rojo: canal (L): lisado celular, canal (E): elución procedente del MIP. Adaptado de la referencia [323]. E) Impronta de moléculas orgánicas de bajo peso molecular La síntesis de MIPs para moléculas de pequeño tamaño molecular (< 1500 Da), es más extendida y mucho más simple de abordar que las descritas en las secciones anteriores. Normalmente estas moléculas son bastante estables frente a diferentes condiciones, L 1 2 3 4SDS-PAGE E Introducción 86 pudiendo realizar la polimerización en disolventes orgánicos o bajo temperaturas relativamente altas. Además, al presentar menos grupos funcionales se consigue una mayor selectividad pudiendo realizar la impronta de manera más dirigida. Actualmente existen MIPs para un amplio espectro de moléculas pequeñas, desde antibióticos, micotoxinas, endotoxinas, insecticidas o explosivos y en una gran variedad de formatos, ya mencionados anteriormente (en bloque, en láminas delgadas, partículas núcleo-recubrimiento, partículas esféricas, etc). En la Tabla 8 se recogen algunos ejemplos. Aplicaciones de los MIPs Los MIPs son materiales muy versátiles que ofrecen gran selectividad hacia el analito de interés y, como se ha comentado, es posible preparar MIPs para casi cualquier compuesto. Este hecho unido a la robustez y bajo coste de producción que presentan, ha incentivado que en la última decada se haya extendido su empleo en diferentes campos. A) Separaciones analíticas Una de las aplicaciones más extendidas de los MIPs es su empleo en separaciones analíticas, más concretamente en cromatografía y electroforesis. Son varias las estrategias que se han puesto a punto para este fin, desde los tradicionales monolitos completos o fraccionados tras la molturación y tamizado hasta la síntesis de MIPs directamente en el interior de la columna cromatográfica.324 No obstante, con objeto de permitir una mejor difusión del analito y facilitar la eliminación de la molécula plantilla, se avanzó hacia el uso de polímeros en forma de partículas esféricas para conseguir distribuciones de tamaños más homogéneas y solventar las limitaciones asociadas al empleo de partículas sintetizadas en bloque. El uso de partículas esféricas y monodispersas como sorbentes en cromatografía evita la generación de sobrepresiones en la columna, permite mejorar la transferencia másica y reducir la asimetría de los picos cromatográficos obtenidos.325 Los MIPs se han empleado en separaciones cromatográficas para una gran variedad de analitos, desde moléculas pequeñas como fármacos o plaguicidas a macromoléculas complejas como proteínas. Posiblemente la aplicación más popular de los MIPs es su empleo como sorbentes en procesos de extracción en fase sólida, MISPE (del inglés molecularly imprinted solid-phase extraction). Debido a su simplicidad y efectividad, la extracción en fase sólida es la técnica de preparación de muestra más empleada tanto para muestras medioambientales como biológicas y alimentarias. En el proceso tradicional, el polímero se empaqueta en un cartucho y se acondiciona con el disolvente adecuado. A continuación, se realiza la carga de la muestra, se aplica una etapa de lavado para elimi- In tro d u c c ió n 8 7 Tabla 8. Ejemplos de MIPs sintetizados empleando moléculas de bajo peso molecular como plantilla. Molécula plantilla Tipo de impronta Composición polimérica Propiedades más relevantes * Ref. Ciprofloxacino Superficial (núcleo PSD) 1-alil-3-vinilimidazol/HEMA/MDA QMIP: 19.96 mg g-1; RMIP: 87.33−102.50% 326 Ácido quenodesoxicólico Suspensión DMAEMA/PEGDA QMIP: 49.86 mg g-1; IF: 2.72; RMIP: 94.2−96.1% 327 Fumonisina B1 NanoMIP EGMP/NIPAM/MBA/NAPMA/TBAm LOD: 0.001 ng mL-1; RMIP: 108−113% 328 Actinomicina Superficial (núcleo magnético) TEOS/MPS/EDMA QMIP: 23.5 µg g-1 329 Histamina Precipitación MAA/EDMA LOD: 1 µM 330 Cocaína Superficial (núcleo QD) EDMA/DVB LOD: 0.0042 mg L-1; RMIP: 96−106% 331 Eritromicina Superficial (núcleo Au@SiO2) 3-APTES/TEOS LOD: 12 nM; IF 4; RMIP: 104.6−108% 332 Ácido clorogénico Superficial (núcleo magnético) Polietilenimina/glutaraldehído QMIP: 58.5 mg g-1; IF: 5.90; LOD: 0.01 µg mL-1; RMIP: 92.8−101.7% 333 Fenoprofeno Bloque 2-VIPY/EDMA QMIP: 38.8 mg g-1; LOD: 0.64 ng mL-1; RMIP: 99.6% 334 Malatión Superficial (núcleo TiO2) 3-APTES/TEOS LOQ: 0.01 mg L-1; RMIP: 62.1−76.7% 335 *Resultados expresados como: QMIP: capacidad de unión del MIP; RMIP: recuperación obtenida en el MIP, IF: factor de impronta, LOD: límite de detección, LOQ: límite de cuantificación. Abreviaturas: 3-APTES: 3-aminopropiltrietoxisilano; DMAEMA: metacrilato de dimetilaminoetilo; DVB: divinilbenceno; EDMA: dimetacrilato de etilenglicol; EGMP: dimetacrilato de etilenglicol fosfato; HEMA: metacrilato de 2-hidroxietilo; MAA: ácido metacrílico; MBA: N,N'-metilenbisacrilamida; MDA: N,N-metilendiacrilamida; MPS: metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo; NAPMA: hidrocloruro de N-(3-aminopropil)metacrilamida; NIPAM: N-isopropilacrilamida; PEGDA: Diacrilato de polietilenglicol; PSD: poliestireno divinilbenceno; QD: punto cuántico; TBAm: N-terc-butilacrilamida; TEOS: tetraortosilano; 2-VIPY: 2-vinilpiridina. Introducción 88 nar compuestos interferentes y favorecer las interacciones específicas y, por último, se eluye el analito del cartucho (Figura 29). Existen varias empresas que comercializan polímeros de impronta molecular para su uso específico en procesos MISPE como SupelMIP® (Merck) o AffiniluteTM MIP (Biotage). Figura 29. Esquema del proceso de extracción en fase sólida empleando MIPs como sorbente (MISPE). Adaptado de la referencia [336]. Una variante del MISPE es la denominada microextracción en fase sólida (SPME, del inglés solid-phase microextraction). Este proceso se basa en el reparto de los analitos entre la muestra y una fase estacionaria formada por el MIP depositado sobre una fibra. Los analitos son desorbidos posteriomente en el portal de inyección de un cromatógrafo de gases, o eluidos con un disolvente para su análisis por cromatografía líquida.337 Otros formatos alternativos del MISPE incluyen el empaquetamiento del polímero en puntas de pipeta o su inmovilización en membranas de extracción.285,338,339 Los MIPs empleados como sorbentes pueden utilizarse en modo continuo (on- line), cuando el material polimérico está directamente acoplado a un sistema HPLC, o en modo discontinuo (off-line), cuando la extracción del analito se realiza de forma independiente. Aunque el modo on-line proporciona una mayor automatización, la mayoría de las extracciones se realizan en modo off-line debido a la complejidad y el coste de la instrumentación requerida.340 Otra variante del proceso MISPE es el uso de MIPs en combinación con nanomateriales magnéticos en un proceso denominado MMISPE (magnetic molecularly imprinted solid-phase extraction). Esta aproximación está ganando terreno a la SPE convencional al conseguir una extracción de los analitos más rápida y sencilla al emplear un imán para separar las partículas magnéticas del Acondicionamiento Carga Lavado Elución Analito Interferentes MIP Introducción 89 medio. Según se comentó en la sección 1.1.4.3, este tipo de materiales constan de un núcleo magnético recubierto de una capa de polímero donde se localizan los sitios de unión. Debido a la versatilidad de estos materiales, los MIPs se han empleado en procesos MISPE para la detección de analitos en una gran variedad de muestras, desde el ámbito medioambiental,341 biológico,342 o alimentario.343 B) Sensores Los sensores y biosensores se han convertido en elementos imprescindibles, desde hace algunos años, en diferentes ámbitos analíticos debido a la necesidad que existe en la detección rápida, sensible y selectiva del analito de interés. Básicamente, un sensor es un dispositivo que consta de un elemento de reconocimiento, denominándose biosensor si este es de naturaleza biológica, un transductor que convierte el evento de reconocimiento en una señal medible y un sistema electrónico de amplificación y procesamiento de dicha señal.344 Debido a las propiedades particulares que presentan los MIPs, cada vez es más común su aplicación para el desarrollo de sensores, al ser reutilizables, muy estables a largo plazo y con bajo coste de producción. No obstante, la integración del MIP con el transductor y los tiempos de respuesta son algunas de las limitaciones encontradas hasta la fecha para la fabricación de estos dispositivos. Para solventar estos problemas, cada vez es más frecuente sintetizar MIPs nanoestructurados, o en combinación con nanomateriales, tales como puntos cuánticos, nanotubos de carbono o grafeno. Mediante estas aproximaciones se consigue una mayor área superficial y mejor accesibilidad a los sitios de unión al ofrecer menor resistencia a la transferencia de masa. Esto se traduce en una mejor sensibilidad y en una reducción de los tiempos de análisis.345 Los sensores se clasifican principalmente en función del tipo de transducción que empleen, distinguiéndose entre sensores ópticos, electroquímicos, piezoeléctricos o térmicos. Debido a su fácil miniaturización, posibilidad de detección multianalito y monitorización in situ, uno de los tipos principales de sensores empleados son los sensores ópticos. En estos sensores se mide el cambio en la señal óptica al interaccionar el analito con el elemento de reconocimiento de forma directa o indirecta.346 Los principales tipos son los basados en absorbancia, luminiscencencia y resonancia de plasmón superficial (SPR, del inglés surface plasmon resonance). En la literatura científica están descritos diferentes sensores ópticos basados en MIPs para la detección de multitud de analitos, tales como hemoglobina,347 antibióticos348,171 o incluso explosivos.349 Introducción 90 C) Catálisis El proceso de impronta molecular permite crear sitios de unión catalíticamente activos, orientados y estereoselectivos asemejándose en cierto modo a los dominios presentes en las enzimas biológicas. Así, una de las aplicaciones de los MIPs es su uso como catalizadores biomiméticos pudiendo emplear como molécula plantilla análogos del sustrato, del estado de transición, el producto final o intermedios de reacción.350 En los últimos años se han aplicado MIPs con éxito en reacciones de hidrólisis, oxidación, reducción o eliminación, mimetizando así a diferentes tipos de enzimas naturales.351 D) Liberación controlada de compuestos de interés Los MIPs también se pueden emplear en procesos de liberación controlada de fármacos dada a su capacidad para retener de forma reversible y selectiva un determinado analito en las cavidades formadas. Esta propiedad los convierte en alternativas muy interesantes para su aplicación en este campo, ya que muchos fármacos presentan baja solubilidad o se degradan antes de llegar al órgano o zona de destino. Por ello, para la liberación controlada se necesitan materiales que puedan incorporar el fármaco en la dosis adecuada, transportarlo y liberarlo correctamente en términos de cantidad y tiempo.352 Los materiales poliméricos empleados en este tipo de procesos, normalmente hidrogeles, deben ser biodegradables y biocompatibles con los fluidos y tejidos biológicos. Aunque se han empleado con éxito en liberación de fármacos por vía oral, ocular o transdérmica, su uso en este campo se encuentra aún en desarrollo.353,354,355 Alternativamente, también se ha descrito su aplicación para la liberación controlada de otros compuestos de interés, por ejemplo, en la industria alimentaria.179,356 1.2. Seguridad alimentaria y reacciones adversas a los alimentos La tecnología de alimentos ha experimentado un gran desarrollo en los últimos años a nivel mundial, aunque siguen existiendo muchos problemas relacionados con la calidad y el fraude de los alimentos. Los nuevos estilos de vida adoptados por la sociedad aumentan la probabilidad de aparición de toxiinfecciones alimentarias, debido a la producción y el consumo masivo de alimentos y a la elevada frecuencia de uso de la restauración colectiva.357 Los avances experimentados en distintas áreas científico-técnicas han permitido disponer de mayor información acerca de las reacciones que provocan sobre la salud determinados compuestos presentes en los alimentos, diferenciando a grandes rasgos entre intoxicaciones alimentarias, alergias e intolerancias. Dependiendo de la situación será necesario controlar la presencia o la ausencia de la sustancia en cuestión, como Introducción 91 por ejemplo en el caso de los alérgenos, o determinar de forma cuantitativa su nivel de concentración, como en el caso de las micotoxinas. Por tanto, es necesario disponer de métodos analíticos robustos y fiables que aseguren resultados válidos para garantizar la seguridad de los productos alimenticios. 1.2.1. Reacciones adversas a los alimentos Las reacciones adversas a los alimentos constituyen un importante problema de salud pública a nivel mundial debido a su creciente incidencia. A lo largo de las últimas décadas su prevalencia ha aumentado hasta situarse en el 20% en países occidentales. 358 Estas reacciones hacen referencia a una respuesta clínicamente anormal producida después de la ingesta, el contacto o la inhalación de un alimento o un aditivo presente en el mismo. La clasificación general (Figura 30) divide a las reacciones adversas a los alimentos en dos grandes grupos, en función de si los individuos afectados están predispuestos (reacciones no tóxicas) o no (reacciones tóxicas) a experimentarlas. Mientras que las primeras se engloban bajo el término general de hipersensibilidad alimentaria, distinguiendo entre alergias alimentarias e intolerancias alimentarias, las reacciones tóxicas no dependen de la susceptibilidad individual y pueden aparecer en cualquier individuo que esté en contacto con el alimento contaminado, por este motivo también se denominan genéricas. Este tipo de reacciones suceden cuando las toxinas alimentarias se consumen en grandes cantidades o bien en bajas dosis, pero de forma continuada. Pueden estar producidas por compuestos naturales presentes en los alimentos, inducidas por el procesamiento de los mismos, o incorporarse posteriormente al producto como contaminante o aditivo. 359 Figura 30. Tipos de reacciones adversas según EAACI y WAO. Adaptado de la referencia [360]. Reacciones adversas a los alimentos Tóxicas No tóxicas  Toxinas  Contaminantes microbianos  Sustancias con actividad farmacológica Alergia alimentaria (Hipersensibilidad alimentaria alérgica) Intolerancia alimentaria (Hipersensibilidad alimentaria no alérgica) Mediada por IgE No mediada por IgE  Hipersensibilidad tipo I  Hipersensibilidad tipo II, III y IV  Metabólica  Farmacológica  Idiopática Introducción 92 Las reacciones adversas tóxicas a los alimentos, denominadas intoxicaciones alimentarias, engloban aquellas reacciones que se producen cuando un individuo sin predisposición reacciona de forma adversa a un alimento. Los alimentos pueden resultar tóxicos para la salud por diferentes motivos, bien porque los compuestos dañinos se encuentren de forma natural en el alimento, porque aparezcan como resultado del almacenamiento y/o procesamiento del mismo, o debido a la presencia remanente de ciertas sustancias al final de la cadena de producción. También puede deberse a la aparición de contaminantes agrícolas procedentes de los residuos ambientales generados por la industria y que son esparcidos por tierra, aire o agua contaminando así los alimentos. Como consecuencia de ello, su toxicidad puede ser aguda, si el compuesto se ingiere en una única administración en dosis muy elevadas, crónica si la administración se produce durante un periodo de tiempo prolongado a dosis menores, y subaguda o subcrónica cuando se administran varias dosis no demasiado elevadas pero prolongadas en el tiempo (máximo 90 días).361 No obstante, no todas las toxinas provocan los mismos efectos, abarcando desde náuseas o vómitos hasta parálisis o la muerte. Las toxinas alimentarias naturales pueden ser producidas por plantas, como en el caso de la solanina o la saponina, resultantes de la contaminación fúngica como las micotoxinas o producidas por determinadas algas marinas como es el caso de las biotoxinas marinas. Es conveniente destacar también, dentro de las toxinas alimentarias, aquellas que interfieren con la biodisponibilidad de algún nutriente, denominados agentes o factores antinutricionales, como las lectinas o los inhibidores de proteasas presentes en las legumbres.362 Las toxinas alimentarias naturales también pueden estar presentes en los animales para consumo humano, como en el caso de la tetrodoxina en el pez globo o la histamina en pescados escombroides en mal estado. Las sustancias tóxicas alimentarias no naturales o exógenas (también denominadas xenobióticas), incluyen aquellas sustancias que provocan efectos adversos tóxicos y no están presentes de forma natural en el alimento.363 En este grupo se incluyen los contaminantes orgánicos persistentes como las dioxinas y los bifenilos policlorados, los hidrocarburos aromáticos policíclicos o los metales pesados. Además, la contaminación alimentaria también puede venir asociada con la presencia de microorganismos responsables de provocar diferentes toxiinfecciones alimentarias como Listeria monocytogenes o Clostridium botulinum, entre otros. 364 Por tanto, teniendo en cuenta todo lo comentado, queda patente la relevancia de la seguridad alimentaria a nivel global, siendo imprescindible un buen control de los alimentos con el fin de proteger y garantizar la salud de los consumidores. Introducción 93 1.2.2. Micotoxinas Las micotoxinas son toxinas fúngicas de bajo peso molecular producidas por ciertas especies de hongos filamentosos, de forma natural, como resultado de su metabolismo secundario.365 La palabra micotoxina proviene de la palabra griega mykos que significa “hongo” y toxicum que significa “veneno”. Estos compuestos químicos se producen a partir de hongos capaces de contaminar alimentos, generados especialmente durante la cosecha y el almacenado de los mismos, representando un gran riesgo para la salud tanto humana como animal al consumir alimentos o piensos elaborados a partir de materias primas contaminadas. Según datos de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, del inglés Food and Agriculture Organization) alrededor del 25% de los cultivos a nivel mundial están contaminados por micotoxinas.366 Las enfermedades o trastornos causados por micotoxinas se conocen por el término micotoxicosis y son el resultado de la ingestión, inhalación o absorción cutánea de estas sustancias por animales y humanos provocando enfermedades graves o incluso la muerte. Un ejemplo bien conocido tuvo lugar entre los años 837 y 1347 en Europa Central al producirse brotes de la enfermedad denominada “Fuego de San Antonio”, o ergotismo, causada por ingerir centeno contaminado por alcaloides producidos por el hongo Claviceps purpurea. Las personas afectadas sufrían alucinaciones, convulsiones o picores intensos en las extremidades. Más recientemente, en el año 1960, se produjo la muerte masiva de 100.000 pavos en Reino Unido debido al consumo de piensos elaborados a partir de harina de cacahuete contaminada con aflatoxinas.367 La contaminación fúngica se puede considerar como un proceso aditivo, ya que las micotoxinas que se generan durante el cultivo, se pueden extender después a la recolección, almacenamiento y transporte, causando así grandes pérdidas económicas al sector alimentario. Los diferentes factores que influyen en la contaminación de los alimentos por micotoxinas pueden clasificarse en varios grupos: a) físicos, como la humedad, la actividad del agua o la temperatura; b) químicos, como el pH, la composición del sustrato, el oxígeno o los nutrientes presentes en el alimento y, c) biológicos, como la presencia de invertebrados, la composición de la microflora o el tipo de cepa fúngica.368 Además, el abanico de productos susceptibles de contaminación por micotoxinas es muy variado, incluyendo cereales, frutos secos, hortalizas, frutas, semillas, cacao, café, huevos, leche o incluso cerveza.369 El principal problema de la contaminación por micotoxinas es la gran estabilidad térmica y química que poseen estos compuestos, siendo capaces de resistir procesos de degradación a altas Introducción 94 temperaturas, así como procesos de secado y molienda. Además, las micotoxinas pueden introducirse en la cadena alimentaria animal tras alimentar al ganado con piensos contaminados. Este hecho, sumado al proceso aditivo mencionado anteriormente, hace que resulte necesario el control de la presencia de micotoxinas tanto en productos iniciales e intermedios como en los productos finales previos a su consumo. Las micotoxinas, en general, son compuestos tóxicos que pueden afectar al sistema nervioso central, el sistema cardiovascular, digestivo y pulmonar.369 Esta toxicidad puede ser aguda, cuando las micotoxinas se encuentran en niveles muy superables a los permitidos, o crónica, cuando existe una exposición continuada a bajas dosis, siendo esta última la más peligrosa para la salud pública debido al efecto acumulativo. Además, ciertas micotoxinas están catalogadas como agentes cancerígenos, teratógenos, mutágenos o inmunodepresores. No obstante, el efecto final depende de la concentración de la micotoxina en el alimento, el tiempo de exposición a la misma, el efecto sinérgico que presenta junto con otras micotoxinas y diferentes factores ambientales asociados.370 Clasificación de las micotoxinas Las micotoxinas pueden clasificarse en función de su estructura química, su origen biosintético, los efectos que producen y del hongo micotoxigénico que las origina. Una determinada especie de hongo puede producir más de un tipo de micotoxina, y también es posible que géneros filogenéticamente diferentes produzcan la misma micotoxina. Los hongos productores de micotoxinas se clasifican en hongos de campo, como las especies de Fusarium y Alternaria, que requieren de bastante humedad para crecer, y hongos de almacenamiento, como las especies de Aspergillus y Penicillium, que se desarrollan en condiciones de menos humedad.371 La Tabla 9 recoge las principales micotoxinas, sus hongos productores, los principales alimentos que se ven afectados y algunos de los efectos tóxicos asociados a su consumo. A) Aflatoxinas Las aflatoxinas son una familia de 20 compuestos producidos por determinadas especies del género Aspergillus, principalmente A. flavus, A. parasiticus y A.nominus que aparecen principalmente en productos como cereales, semillas, frutos secos y cacahuetes, especialmente a niveles altos de temperatura y humedad.372 Estos compuestos se clasifican como difuranocumarinas, y su toxicidad y presencia en los alimentos es variable, siendo las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2, denominadas así por la fluorescencia azul (B) y verde (G) que presentan tras excitación a 365 nm, las Introducción 95 Tabla 9. Principales micotoxinas, hongos productores, alimentos más afectados y efectos tóxicos que provocan. Micotoxina Hongo productor Alimentos afectados Efectos tóxicos Aflatoxinas AFB1, AFB2 AFG1, AFG2 AFM1 Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aspergillus nominus Cereales, frutos secos, maíz, arroz, leche Altamente hepatotóxico y carcinogénico, inmunosupresor, mutagénico, genotóxico, teratogénico Citrinina Penicillium citrinum Penicillium camemberti Aspergillus terreus Aspergillus niveus Cereales, frutas, trigo, avena, centeno, arroz Nefrotóxico, inmunosupresor Fumonisinas FB1 FB2 Fusarium verticillioides Fusarium proliferatum Aspergillus niger Maíz y sorgo Hepatotóxico y carcinogénico Ocratoxinas OTA Aspergillus ochraceus Aspergillus carbonarius Penicillium verrucosum Cereales, granos de café, legumbres Nefrotóxico, carcinogénico, inmunosupresor, teratogénico Patulina Penicillium patulum Penicillium expansum Aspergillus spp Byssochlamys Cereales, fruta, queso Neurotóxico, inmunosupresor, genotóxico, teratogénico Zearalenona Fusarium graminearum Fusarium culmorum Trigo, arroz, cebada, sorgo, centeno, maíz, avena Estrogénico Toxina T2 Toxina HT-2 Fusarium sporotrichioides Fusarium poae Maíz, trigo, avena, cebada, arroz Citotóxico, inmunosupresor, inhibidor de la síntesis de proteínas Deoxinivanelol (DON) Fusarium graminearum Fusarium culmorum Maíz, trigo, avena, cebada, arroz Inmunotóxico, inhibidor de la síntesis de proteínas Toxinas de Alternaria Alternariol (AOH) Alternariol monometiléter (AME) Ácido tenuazónico (TeA) Alternaria alternata Alternaria tenuissima A. arborecens Frutas, zumos, cereales, semillas, cerveza Genotóxico, carcinogénico, mutagénico, citotóxico Introducción 96 mayoritarias. Los efectos adversos que producen se engloban en el término aflatoxicosis y diferentes estudios las otorgan características tóxicas, carcinogénicas, mutagénicas, teratogénicas y con efecto inmunosupresor en humanos y animales, siendo el hígado el órgano principalmente afectado.373 La aflatoxina B1 (AFB1) es la micotoxina más tóxica, sobre todo a nivel hepático, clasificada como sustancia carcinogénica de grupo 1 por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC, del inglés International Agency for Research on Cancer). Las otras aflatoxinas son menos tóxicas (B1>G1>B2>G2), aunque no por ello requieren un menor control.374 El principal metabolito hidroxilado de la AFB1 es la aflatoxina M1 (AFM1), encontrándose en la leche de los mamíferos que han consumido alimentos contaminados con AFB1.375 De hecho, la aflatoxina M1 es la única micotoxina para la que se han establecido límites máximos de residuo (LMR) en leche en la Unión Europea. En términos de seguridad alimentaria, se limita el contenido total en aflatoxinas en alimentos (expresado como la suma de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2) y, en particular, es necesario especificar el contenido individual de la AFB1 para algunos productos. La Figura 31 muestra las estructuras químicas de las principales aflatoxinas. Figura 31. Estructura química de las principales aflatoxinas. B) Ocratoxinas Las ocratoxinas (abreviadas como OT) son producidas principalmente por algunas especies de los géneros Aspergillus y Penicillium. Las ocratoxinas se clasifican en ocratoxina A (OTA), B (OTB) y C (OTC), y están formadas por una isocumarina y una fenilalanina unidas mediante un enlace amida (Figura 32). La OTA es la micotoxina más habitual y más tóxica pudiéndose encontrar en diferentes productos naturales como Aflatoxina B1 Aflatoxina G1 Aflatoxina M1 Aflatoxina B2 Aflatoxina G2 Introducción 97 cereales, frutas, legumbres o frutos secos, así como en productos derivados de estas materias primas, como el vino o la cerveza.376 Esta micotoxina está clasificada como sustancia 2B por la IARC como posible sustancia carcinógena humana, según estudios llevados a cabo en animales, siendo el riñón su órgano diana. Varios estudios han relacionado la exposición a la OTA con enfermedades humanas como la nefropatía endémica de los Balcanes y la nefropatía intersticial crónica, así como con otras enfermedades renales.377,378 Figura 32. Estructura química de las ocratoxinas. C) Fumonisinas Las fumonisinas se aislaron por primera vez en 1988 de la especie Fusarium verticillioides, uno de los principales hongos contaminantes del maíz.379 Son una familia de al menos 15 compuestos estructuralmente relacionados al poseer una amina primaria, un ácido tricarboxílico, un grupo hidroxilo y una cadena alifática, distinguiéndose cuatro series: A, B, C y P. De todas ellas, las fumonisinas más frecuentes son la B1 y B2 (Figura 33), asociándose a diversas micotoxicosis tanto animales como humanas. Están producidas por varias especies del género Fusarium (principalmente por F. verticilloides y F. proliferatum) y se ven afectadas tanto por factores abióticos como bióticos. Aunque el producto más susceptible a la contaminación por fumonisinas es el maíz, y por ende sus derivados, también se han detectado en arroz y judías.380 Frecuentemente se presentan junto a otras micotoxinas como las aflatoxinas, el deoxinivalenol (DON) o la zearalenona (ZEA). De entre todas las fumonisinas destaca especialmente la fumonisina B1 (FB1) por ser la más tóxica y predominante. Su estructura es muy parecida a la esfingosina, por lo que el mecanismo de acción se atribuye a la inhibición de la biosíntesis de los esfingolípidos, compuestos esenciales de las membranas celulares.381 El efecto que provocan las fumonisinas depende del organismo, provocando una enfermedad mortal en caballos denominada leucoencefalomalacia equina, edema pulmonar en cerdos o carcinomas hepatocelulares en ratas. En humanos se ha vinculado con el desarrollo de cáncer de esófago.382 Ocratoxina A (OTA) Ocratoxina B (OTB) Ocratoxina C (OTC) Introducción 98 Figura 33. (A) Estructura química de las fumonisinas B1 y B2. (B) Maíz infectado con hongo Fusarium. Adaptado de la referencia [383]. D) Tricotecenos Los tricotecenos engloban una familia de más de 200 compuestos caracterizados por compartir un núcleo tricíclico común basado en una estructura sesquiterpenoide.384 Se clasifican en cuatro grupos (tipos A-D) en función de su similitud estructural. Están producidos por diferentes géneros de hongos como Fusarium, Cephalosporium, Giberella, Myrothecium, Stachybotrys, Trichothecum y Trichoderma. Entre los tricotecenos más relevantes producidas por Fusarium spp. destacan el 4- deoxinivalenol (DON) y las toxinas T-2 y HT-2 (Figura 34).385 Figura 34. Estructura química de la micotoxina deoxinivalenol y las toxinas T-2 y HT-2. El deoxivalenol, conocido también como vomitoxina, es producido principalmente por F. graminearum y F. culmorum y pertenece a los tricotecenos de tipo B. Suele presentarse con gran facilidad en cultivos de cereales (trigo, maíz, cebada, avena y centeno) y en granos procesados (malta, cerveza y pan). Su principal característica físico-química es la gran estabilidad que presenta a altas temperaturas. El DON inhibe Fumonisina B1 (FB1) A B Fumonisina B2 (FB2) Deoxinivalenol (DON) Toxina T-2 Toxina HT-2 Introducción 99 la síntesis de proteínas y ADN y su ingesta tiene efectos adversos sobre el sistema gastrointestinal provocando vómitos, diarrea y fiebre.386 No obstante, ha sido clasificado como sustancia del grupo 3 por la IARC, al no presentar efectos cancerígenos demostrados. La toxina T2 y su metabolito, la toxina HT-2, pertenecen a los tricotecenos de tipo A, producidos por varias especies de Fusarium. Aunque la toxina T2 se considera uno de los tricotecenos más tóxicos, la toxicidad de la HT-2 es similar, dado que ambas contienen una estructura epoxi-sesquiterpenoide, actuando principalmente como inhibidores de la síntesis de proteínas y presentando efecto inmunosupresor y citotóxico.387,388 Estas toxinas se pueden encontrar en los granos de trigo, avena, cebada, maíz y arroz.389 E) Zearalenona La zearalenona, abreviada como ZEA, es una micotoxina producida por diferentes especies de Fusarium (F. graminearum y F. culmorum) principalmente en cultivos de maíz, aunque también puede presentarse en granos de cebada, trigo, avena, arroz y sorgo. Es estable a altas temperaturas, lo que impide su completa eliminación mediante procesos térmicos convencionales (hasta 160 ºC).390 La ZEA y sus derivados (α-zearalenol y β-zearalenol, α-ZON y β-ZON, respectivamente) presentan una estructura similar al 17-β-estradiol, actuando como inhibidores de la secreción y liberación de hormonas esteroides (Figura 35). Su actividad estrogénica causa trastornos reproductivos en animales, así como síndromes hiperestrogénicos en humanos.391 Figura 35. Estructura química de la zearalenona y sus derivados α-zearalenol y β-zearalenol. F) Patulina La patulina es un compuesto que se encuentra de forma natural en diferentes frutas, especialmente en la manzana, y afecta principalmente a bebidas y productos derivados no fermentados cuando en su preparación se emplea fruta en malas condiciones.392 Inicialmente fue identificada como un compuesto antimicrobiano, pero Zearalenona (ZEA) α-zearalenol (α-ZON) β-zearalenol (β-ZON) Introducción 100 en la década de 1960, tras varios estudios de toxicidad, fue recatalogada como micotoxina.393 La patulina (Figura 36) se produce en varias especies de Penicillium, Aspergillus y Byssochlamys, principalmente P. patulum y P. expasum. La IARC la clasifica dentro del grupo 3 al no presentar suficientes evidencias de provocar efectos cancerígenos en humanos. Sin embargo, presenta gran afinidad por los grupos sulfhidrilo y por las bases del ADN, siendo un agente genotóxico, inmunotóxico, neurotóxico y teratogénico.394 Figura 36. Estructura química de la patulina. G) Citrinina La citrinina (abreviada como CIT) es una micotoxina producida por algunas especies de Penicillium (P. citrinum, P. camenberti), Aspergillus (A. terreus, A. niveus y A. oryzae) y Monascus (M. ruber y M. purpureus).395 Su estructura química se muestra en la Figura 37. Se encuentra normalmente en cultivos de maíz, trigo, centeno, cebada, avena y arroz.396 Aunque la IARC la clasifica dentro del grupo 3, es popular por su nefrotoxicidad y suele aparecer junto con otras micotoxinas como la OTA.397 Figura 37. Estructura química de la citrinina. H) Micotoxinas de Alternaria Los hongos del género Alternaria están ampliamente distribuidos en el medio ambiente, pudiendo encontrarse tanto en la atmósfera como en el suelo o los cultivos. Sin embargo, la mayoría son patógenos de plantas que pueden infectar productos como cereales, frutas y verduras, antes y después de la cosecha, suponiendo grandes pérdidas económicas al sector de la agricultura.398 Las patologías asociadas a este hongo se denominan alternariosis y alternariatoxicosis y provocan en humanos y Patulina (PAT) Citrinina (CIT) Introducción 101 animales diferentes infecciones cutáneas y subcutáneas, asma, rinosinusitis o alergias.399 Además, la presencia de esporas de Alternaria spp. se ha relacionado con el síndrome del edificio enfermo, manifestándose en los habitantes del mismo en forma de irritaciones, fatiga o dolores de cabeza.400,401 Dentro de este género, la principal especie productora de micotoxinas es la Alternaria alternata, aunque también pueden ser producidas por A. tenuissima, A. dauci, A. brassicae o A. arborecens.398 Actualmente, no existe una legislación en la que se establezcan los límites máximos permitidos de estos compuestos en alimentos. Por ello, se las considera como micotoxinas emergentes. Las micotoxinas producidas por el género Alternaria engloban una serie de compuestos de diferentes estructuras y propiedades, siendo 8 las consideradas más importantes (Figura 38). Figura 38. Estructura química de las principales toxinas de Alternaria: alternariol, alternariol monometiléter, altenueno, altertoxinas (I, II y III), ácido tenuazónico y tentoxina. Alternariol (AOH) Alternariol monometiléter (AME) Altenueno (ALT) Altertoxina I (ATX-I) Altertoxina II (ATX-II) Altertoxina III (ATX-III) Ácido tenuazónico (TeA) Tentoxina (TEN) Introducción 102 Estas micotoxinas se clasifican en diferentes grupos en función de su estructura química:402  Derivados de dibenzopironas: alternariol (AOH), alternariol monometiléter (AME) y altenueno (ALT).  Derivados de perilenos: altertoxinas I, II y III (ATX-I, -II, -III).  Derivados de ácidos tetrámicos: ácido tenuazónico (TeA).  Derivados peptídicos: tentoxina (TEN). Estas micotoxinas han suscitado interés en los últimos años en temas de salud pública, principalmente desde la asociación entre la contaminación de granos de cereales por A. alternata con los altos niveles de cáncer de esófago encontrados en China.403,404 Como se ha comentado, aunque no se han establecido aún los LMR permitidos para estos compuestos, en el año 2011 la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, del inglés European Food Safety Authority) publicó una opinión científica sobre los riesgos para la salud animal y pública relacionados con la presencia de toxinas de Alternaria en piensos y alimentos.405 En esta evaluación, se empleó el criterio del umbral de preocupación toxicológica (TTC, del inglés threshold of toxicological concern) debido a los datos limitados que existían de la toxicidad de las toxinas de Alternaria. Para las toxinas genotóxicas (AOH y AME), la exposición dietética crónica excedía los valores de TTC (fijados en 2.5 nanogramos por kilogramo de peso corporal por día), resultando en un nivel de exposición dietética (percentil 95) de 5.9 a 82 ng/kg p.c./d para el AOH y de 3.1 a 15 ng/kg p.c./d para el AME. Estos resultados pusieron de manifiesto la necesidad de disponer de más datos toxicológicos para estas micotoxinas. En el caso del TeA y TEN no superaron el valor umbral, ya que, al no presentar una genotoxicidad demostrada, el TTC se fijó en 1500 ng/kg p.c./d, resultando en un nivel de exposición dietética (percentil 95) de 86 a 362 ng/kg p.c./d para el TEN y en menos de 13 ng/kg p.c./d para el TeA. Más tarde, en 2016, la EFSA realizó una evaluación de la exposición alimentaria de estas mismas micotoxinas estimándose unos resultados similares para el AOH o superiores para AME, TEN y TeA. El origen principal de los productos contaminados fueron los cereales y los productos a base de tomate.406 Debido a los estudios llevados a cabo, la Comisión Europea está considerando la posibilidad de establecer LMR para ciertas toxinas de Alternaria en alimentos. La Figura 39 muestra una imagen de varias frutas infectadas con Alternaria. De todas ellas, el alternariol (AOH) y el alternariol monometiléter (AME) son las micotoxinas de Alternaria más estudiadas.407 Se han detectado en diferentes frutas y hortalizas, así como en sus productos derivados (zumos, salsas, conservas), cereales, semillas de girasol, aceites o nueces.408 Aunque es necesario un estudio más profundo Introducción 103 de la toxicidad que provocan estas micotoxinas sobre la salud humana y animal, se ha demostrado que poseen capacidad genotóxica, carcinogénica, mutagénica y citotóxica en diferentes modelos in vivo e in vitro.409,410,411,412 Figura 39. Frutas infectadas con Alternaria spp. (A) tomate, (B) manzana y (C) mandarina. Adaptado de la referencia [413]. Legislación sobre micotoxinas en la Unión Europea Desde el descubrimiento de la toxicidad de las aflatoxinas a raíz de la enfermedad de los pavos en los años 60, la preocupación por la seguridad alimentaria asociada a la presencia de estas toxinas ha ido ganando terreno, tanto en la Unión Europea como en otros países del mundo, materializándose en forma de normativas con el fin de proteger la salud de los consumidores. Diversas instituciones y organizaciones internacionales, tales como la EFSA, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, del inglés Food and Drug Administration), la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la FAO, han reconocido los riesgos para la salud animal y humana que supone la contaminación de los alimentos por micotoxinas. La legislación europea vigente general en materia de control de los niveles de micotoxinas en alimentos se basa en una normativa armonizada por la Comisión Europea: el Reglamento (CE) nº 1881/2006, de 19 de diciembre de 2006, por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios. Desde entonces, este reglamento ha sufrido diferentes modificaciones en las que se han ido introduciendo nuevos límites y especificaciones. De forma complementaria a este reglamento se encuentran las recomendaciones europeas emitidas por la Comisión Europea, así como informes y opiniones emitidas por la EFSA. En cuanto a los piensos, la legislación por la que se rige es la directiva 2002/32/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 7 de mayo de 2002 sobre sustancias indeseables en la alimentación animal. Los LMR establecidos se revisan periódicamente basándose en los datos científicos recogidos. La Tabla 10 recoge los LMR de las micotoxinas legisladas A B C Introducción 104 (aflatoxinas, ocratoxina A, toxinas de Fusarium, patulina y citrinina) y su legislación correspondiente. Aunque estos valores dependen del tipo de micotoxina y del alimento en particular, la regulación más estricta recae sobre las aflatoxinas en los productos destinados a la alimentación infantil, en concreto para la aflatoxina M1 en leche (0.050 µg kg-1) y en alimentos para lactantes y niños de corta edad (0.025 µg kg-1). No obstante, la Comisión Europea incluye también el contenido máximo en piensos y materias primas destinadas a la alimentación animal. Diferentes organismos están implicados en el establecimiento de los LMR de micotoxinas en las diferentes matrices, como son como IARC, la OMS o la Organización de Naciones Unidas (ONU), y a nivel europeo la EFSA, así como comités de expertos y grupos de trabajo de los distintos Estados miembros de la UE. Además, para minimizar la presencia de micotoxinas en los alimentos que llegan en última instancia al consumidor, es necesaria la aplicación de códigos de buenas prácticas de higiene que garanticen que se toman todas las medidas necesarias durante las fases de cultivo, recolección y almacenamiento de la materia prima o del alimento procesado para prevenir la contaminación. Métodos de muestreo y análisis empleados para la determinación de micotoxinas La distribución heterogénea de las micotoxinas en las diferentes matrices alimentarias hace que el muestreo y el análisis sean etapas críticas para su determinación, ya que, la ausencia visual de la especie fúngica no garantiza la desaparición de la micotoxina. El plan de muestreo debe contar con las garantías suficientes para poder obtener una muestra representativa del lote. Así, la Comisión Europea establece en el Reglamento (CE) nº 401/2006, de 23 de febrero de 2006, los métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios. Además, debido a la toxicidad que presentan estas sustancias, es necesario contar con métodos analíticos robustos y sensibles que permitan alcanzar los límites de detección establecidos. La legislación europea no establece un método específico para la determinación del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios, sino que fija unos criterios generales y específicos a los que deberá ajustarse el método de análisis seleccionado. Los controles oficiales de micotoxinas se llevan a cabo en laboratorios de control oficial que, según el Reglamento (UE) 625/2017 relativo a los controles y otras actividades oficiales realizadas para garantizar la aplicación de la legislación sobre alimentos y piensos, y de las normas sobre salud y bienestar de los animales, sanidad vegetal y productos fitosanitarios, deben estar obligatoriamente acreditados por la norma ISO/IEC 17025. Los ensayos se In tro d u c c ió n 1 0 5 Tabla 10. Recomendaciones y regulaciones de las micotoxinas por la Comisión Europea. Micotoxina Límites máximos de residuo Matriz alimentaria Legislación Aflatoxinas B1 Suma B1+B2+G1+G2 M1 0.10−12 µg kg-1 4−15 µg kg-1 0.025−0.050 µg kg-1 Cacahuetes, avellanas, nueces, almendras, pistachos, frutos de cáscara, higos secos, frutos secos, huesos de albaricoque, arroz, cereales y productos, procesados, maíz, especias, semillas oleaginosas, alimentos infantiles y cereales procesados, leche CE no 1881/2006 Citrinina 2000 µg kg-1 Complementos alimenticios a base de arroz fermentado con levadura roja Monascus purpureus CE no 212/2014 Fumonisinas Suma FB1+FB2 200−4000 µg kg-1 Maíz, cereales y productos procesados del maíz, alimentos infantiles para lactantes y niños de corta edad CE no 1881/2006 CE no 1126/2007 Ocratoxinas OTA 0.5−10 µg kg-1 Cereales, productos derivados de cereales, uvas pasas, café, especias, vino, vinos de fruta y zumo de uva, alimentos dietéticos, regaliz CE no 1881/2006 CE no 105/2010 In tro d u c c ió n 1 0 6 Tabla 10. (Continuación). Micotoxina Límites máximos de residuo Matriz alimentaria Legislación Patulina 10−50 µg kg-1 Zumos de fruta, productos sólidos y bebidas elaboradas con manzana, alimentos infantiles para lactantes y niños de corta edad CE no 1881/2006 Zearalenona 20−350 µg kg-1 Cereales, maíz, productos elaborados a base de maíz y cereales, pan, galletas, alimentos infantiles para lactantes y niños de corta edad CE no 1881/2006 CE no 1126/2007 Deoxinivanelol (DON) 200−1750 µg kg-1 Maíz, cereales, pasta, pan, alimentos elaborados a base de cereales, alimentos infantiles para lactantes y niños de corta edad CE no 1881/2006 CE no 1126/2007 Toxinas T2 y HT2 Suma T2+HT2 15−1000 µg kg-1 Cereales no procesados y productos a base de cereales CE no 165/2013 Introducción 107 llevan a cabo siguiendo la estructura piramidal de recomendaciones y pautas de los Laboratorios Nacionales de Referencia (en España, el Centro Nacional de Alimentación) y de los Laboratorios Europeos de Referencia para asegurar un control homogéneo en todo el territorio de la UE. Actualmente en la bibliografía científica existe una gran diversidad de métodos para la detección de prácticamente la totalidad de micotoxinas conocidas en diferentes matrices alimentarias. Generalmente todos se basan en una etapa previa de extracción y limpieza, combinada con una etapa de preconcentración para la posterior determinación de la micotoxina por técnicas cromatográficas o no cromatográficas. Además, existen diferentes métodos de análisis recomendados para la determinación de micotoxinas en matrices alimentarias, como los métodos oficiales de Análisis de la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC) o los métodos normalizados propuestos por la Organización Internacional para la Normalización (ISO) y el Comité Europeo de Normalización (CEN), traspuestos a la legislación nacional mediante normas UNE a través de la Asociación Española de Normalización y Certificación (AENOR). A) Tratamiento de muestra El primer paso para la determinación de micotoxinas es su extracción de la matriz donde están contenidas. En general, este proceso se suele llevar a cabo empleando técnicas clásicas como la extracción líquido-líquido (LLE, del inglés liquid-liquid extraction) o sólido-líquido (SLE, del inglés solid-liquid extraction) empleando en su mayoría una mezcla de disolventes orgánicos y acuosos, como acetonitrilo y/o metanol con agua debido a la solubilidad de las micotoxinas en los mismos. A pesar de la simplicidad operacional de estos procedimientos, muchas veces son poco efectivos debido a la complejidad de la matriz y la solubilidad de las micotoxinas en la fase extractante. También es posible emplear otras técnicas, tales como la extracción asistida por microondas (MAE, del inglés microwave-assisted extraction), la extracción asistida por ultrasonidos (UAE, del inglés ultrasound-assisted extraction) o la extracción con líquidos presurizados (PLE, pressurized liquid extraction) que, aunque requieren una instrumentación más compleja permiten mejorar la eficiencia del proceso.414 Si bien la UAE no está muy extendida, el PLE se ha empleado para la extracción de algunas micotoxinas como las fumonisinas en productos derivados de maíz415 o la zearalenona en harinas y cereales.416,417 El éxito de esta técnica automatizable radica en la extracción a presión elevada utilizando temperatura moderada, lo que evita en buena parte la degradación del analito pudiéndose aplicar a muestras sólidas o semisólidas.418 Introducción 108 Uno de los métodos alternativos al uso de métodos clásicos más empleados en la actualidad debido a su sencillez, flexibilidad y bajo coste es el denominado método QuEChERS (acrónimo de Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe).419 Este método consta de dos fases: una primera etapa de extracción que consigue transferir los analitos a la fase orgánica y una segunda etapa de limpieza mediante extracción dispersiva de los analitos en una fase sólida (d-SPE, del inglés dispersive solid-phase extraction). No obstante, para obtener unos buenos rendimientos es necesaria la optimización de diferentes parámetros en función del analito y la matriz. En los últimos años se han publicado varios trabajos en los que se emplea el método QuEChERS para la extracción de micotoxinas en su versión más original, o con alguna modificación para incrementar la eficiencia del proceso.420,421 Para la determinación de esta clase de analitos es frecuente utilizar la extracción en fase sólida (SPE) como etapa previa al análisis instrumental. Esta técnica se emplea comúnmente para llevar a cabo una limpieza de la muestra y una preconcentración de los analitos antes de su análisis. Pueden emplearse sorbentes SPE disponibles comercialmente de diferente naturaleza en función de las interacciones entre la resina y la micotoxina, casi todas basadas en C18 (Strata C18, Strata XL)422 o compuestos poliméricos (Oais HLB).423 Específicamente para micotoxinas, se han desarrollado resinas de intercambio iónico (Bond Elut Mycotoxin) para tricotecenos y zearalenona.424 En el caso de las resinas MycoSep® y MultiSep® la estrategia empleada es la inversa a una SPE normal, ya que son las interferencias las que quedan retenidas en la columna.425 Otra opción son las columnas de inmunoafinidad, donde los anticuerpos se encuentran inmovilizados en la matriz. A pesar de su selectividad, estas columnas son muy caras, de un solo uso y presentan poca compatibilidad con disolventes orgánicos debido a la desnaturalización de los anticuerpos en medios no fisiológicos.426 Tal y como se ha citado anteriormente, un tipo de materiales prometedores son los MIPs, basados en el reconocimiento a nivel molecular sintetizados mediante un proceso de impronta.427 Según se comentó en la sección 1.1.4, estos materiales presentan buena selectividad, robustez y facilidad de síntesis. B) Métodos de análisis Métodos cromatográficos El análisis de micotoxinas en matrices alimentarias se lleva a cabo principalmente por técnicas cromatográficas en cualquiera de sus modalidades, especialmente por cromatografía de líquidos. Su acoplamiento con diferentes detectores ha permitido el desarrollo de una instrumentación de gran precisión y sensibilidad capaz Introducción 109 de detectar compuestos a nivel de traza, especialmente en el caso de su combinación con la espectrometría de masas (LC-MS) y en su versión más actual con la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El empleo de estas técnicas permite llevar a cabo la detección, identificación y cuantificación inequívoca de las micotoxinas de forma individual en mezclas complejas, empleándose casi siempre como técnicas de confirmación. Además, su empleo permite el análisis multianalito en muestras que contienen más de una micotoxina.428 Si la micotoxina presenta fluorescencia nativa, o bien mediante derivatización de la micotoxina en fase pre- o post-columna, es posible emplear la cromatografía de líquidos acoplada a un detector de fluorescencia (HPLC-FLD) alcanzándose en algunos casos límites de detección comparables a los obtenidos mediante espectrometría de masas. Aunque la instrumentación empleada tanto para detección fluorescente como para absorción UV-vis (HPLC-DAD) es más sencilla y menos costosa que para LC-MS y LC-MS/MS, normalmente los métodos se suelen optimizar para la detección de una sola micotoxina, como en el caso de la OTA429 o bien para grupos de analitos, como en el caso de las fumonisinas.430 En menor medida también se puede llevar a cabo el análisis de micotoxinas por cromatografía de gases (GC), principalmente en una única dimensión acoplado a un detector de espectrometría de masas (GC-MS) o incluso en dos dimensiones (GCxGC).431 No obstante, debido a la baja volatilidad y alta polaridad que presentan la mayoría de las micotoxinas, es necesario realizar casi siempre una etapa previa de derivatización mediante sililación o acetilación, por lo que no es la técnica de elección preferente para el análisis de estos compuestos.432 Métodos no cromatográficos Los métodos de análisis no cromatográficos se basan principalmente en inmunoensayos aplicados en diferentes formatos, proporcionando resultados cualitativos, semicuantitativos o, en algunos casos, cuantitativos. Muchos de ellos se enmarcan dentro de lo que se conoce como métodos de barrido o screening y se emplean cuando simplemente es necesario demostrar la presencia o la ausencia de una micotoxina de forma rápida y sencilla. Los inmunoensayos se basan en la interacción entre la micotoxina y un anticuerpo específico. Tras la formación del complejo, se adiciona un sustrato para facilitar la detección, que puede ser radiactivo (RIA, del inglés radioinmunoassay), fluorogénico (FIA, del inglés fluorescence immunoassay) o cromogénico (ELISA, del inglés enzyme-linked immunosorbent assay). De todos los tipos de inmunoensayos existentes, los ensayos tipo ELISA son probablemente los más empleados para la Introducción 110 detección de micotoxinas en sus diferentes formatos, ofreciendo resultados cuantitativos y semicuantitativos. No obstante, debido a la similitud estructural dentro de cada familia de micotoxinas, no todos los anticuerpos disponibles en el mercado son capaces de discriminar individualmente entre cada una de ellas, mostrando en algunos casos cierta reactividad cruzada.433 Otro tipo de inmunoensayo son los denominados ensayos de flujo lateral (LFIA, del inglés lateral flow immunoassay), donde se los anticuerpos se inmovilizan en una membrana y la muestra fluye por capilaridad ofreciendo una respuesta visual colorimétrica. Este formato se emplea principalmente en ensayos de campo, donde se necesita conocer de una forma rápida si una muestra está contaminada o no.434 Actualmente se encuentran comercializados diferentes kits basados en los ensayos comentados anteriormente para la determinación de diferentes micotoxinas.435 Un área de gran potencial para la detección cuantitativa de micotoxinas son los sensores y biosensores. Los (bio)sensores proporcionan una respuesta rápida, sensible, de bajo coste y en tiempo real de la muestra a analizar, y se han aplicado en diferentes formatos para la detección de diferentes micotoxinas, como la zearalenona en cereales,436 fumonisina B1 en maíz437 o aflatoxina M1 en leche.438 Dado el interés que tienen para la salud pública las micotoxinas en general, y en particular para la presente Tesis Doctoral las producidas por Alternaria alternata, en la Tabla 11 se recogen algunos de los métodos analíticos publicados recientemente en la literatura científica para la determinación de alternariol (AOH) en diferentes matrices. 1.2.3. Lectinas Las lectinas son proteínas de origen no inmune que presentan gran afinidad por carbohidratos y glucoconjugados.439 Se encuentran de forma ubicua en multitud de seres vivos, como bacterias, virus, algas, plantas y animales vertebrados e invertebrados, lo que lleva a pensar que poseen un papel importante en gran variedad de procesos celulares.440 Las lectinas, especialmente las presentes en plantas, han suscitado mucho interés desde su descubrimiento hasta la actualidad. En 1888, P. Hermann Stillmark descubrió en extractos de semilla de ricino (Ricinus communis) un compuesto tóxico que podía aglutinar eritrocitos, al que denominó ricina. Posteriormente, se descubrieron proteínas similares en otros vegetales como la abrina, altamente tóxica, en extractos de regaliz americano (Abrus precatorius) y otras hemaglutininas en leguminosas y euforbiáceas.441 El término hemaglutinina fue introducido por M. Elfstand en 1898 para In tro d u c c ió n 1 1 1 Tabla 11. Métodos analíticos para la determinación de alternariol (AOH) en diferentes matrices. Matriz Tratamiento de muestra Método analítico Recuperación (R, %) Nivel medio encontrado (𝒙) LOD/LOQ/IC50 Ref. Salsa de tomate Semillas de girasol Harina de trigo LLE + agitación LC-MS/MS 𝑥: 6.7 ng g-1 𝑥: 1.4 ng g-1 𝑥: 3.5 ng g-1 LOQ: 1 ng g-1 LOQ: 0.2 ng g-1 LOQ: 1.2 ng g-1 442 Cereales Productos a base de cerales QuEChERS UPLC-ESI- MS/MS R: 92.9−99.0%; 𝑥: 3.52 µg kg-1 R:92.6−101.1%; 𝑥: 1.43 µg kg-1 LOD: 1.71 µg k-1g; LOQ: 5.19 µg kg-1 LOD: 0.10 µg k-1g; LOQ: 0.31 µg kg-1 443 Maíz Arroz Harina Zumo de manzana Zumo de uva Trituración + dilución ó dilución ciCLEIA R: 72.67−114.30% R: 76.60−94.00% R: 82.00−103.40% R: 84.00−113.60% R: 78.67−115.80% LOD: 0.068 ng mL-1 IC50: 0.37 ng mL-1 444 Nutracéuticos LLE + SPE UHPLC-ESI- Q/Orbitrap R: 93% LOQ: 0.1 µg kg-1 445 Cerezas Mermelada de cerezas Cerezas deshidratadas Cerezas en almíbar LLE/UAE + SPE LC-ESI-MS/MS R: 90.8−95.4% R: 98.7−105.8% R: 87.1−105.4% R: 72.7−79.2% LOD: 0.017 µg kg-1; LOQ: 0.055 µg kg-1 LOD: 0.011 µg kg-1; LOQ: 0.038 µg kg-1 LOD: 0.020 µg kg-1; LOQ: 0.066 µg kg-1 LOD: 0.013 µg kg-1; LOQ: 0.042 µg kg-1 446 Jujube QuEChERS UPLC-MS/MS R: 84.8−91.3% LOD:0.26 µg kg-1 LOQ: 0.87 µg kg-1 447 In tro d u c c ió n 1 1 2 Tabla 11. (Continuación). Matriz Tratamiento de muestra Método analítico Recuperación (R, %) Nivel medio encontrado (𝒙) LOD/LOQ/IC50 Ref. Tomates Fresas Tomates cherry Lechuga Pak choi SPE UHPLC-MS/MS R: 81.1−94.7% LOD: 0.3 µg L-1; LOQ: 1 µg L-1 448 Trigo LLE ciCLEIA R: 84.5−107.6% LOD:0.7 ng mL-1; IC50: 9.4 ng mL-1 449 Salsa de tomate Aceite de girasol Harina de trigo LLE + agitación LC-MS/MS R: 87% R: 95% R: 94% LOD: 0.5 ng g-1; LOQ: 1.0 ng g-1 LOD: 0.1 ng g-1; LOQ: 0.2 ng g-1 LOD: 0.6 ng g-1; LOQ: 1.2 ng g-1 450 12 matrices alimentarias SPE UPLC-MS/MS R: 85.98−102.98% LOQ: 0.4~0.9 µg kg-1 LOD: 0.1~0.3 µg kg-1 451 Uva verde Uva roja QuEChERS UPLC-MS/MS R:79.8−100.4% R: 81.4−95.6% LOD: 0.08 µg kg-1; LOQ:0.12 µg kg-1 LOD: 0.18 µg kg-1; LOQ: 0.29 µg kg-1 452 Agua de bebida SPE UPLC-MS/MS R: 76.1−94.8% LOD: 0.05 ng L-1 LOQ: 0.1 ng L-1 453 Abreviaturas: AOH: alternariol; ciCLEIA: competitive indirect chemiluminescence enzyme immunoassay; ESI: ionización por electroespray; FLD: detector de fluorescencia; HPLC: high performance liquid chromatography; LC: cromatografía de líquidos; LLE: extracción líquido-líquido; LOD: límite de detección; LOQ: límite de cuantificación; MISPE: molecularly imprinted polymer solid-phase extraction; MS: espetrometría de masas; PLE: extracción con líquidos presurizados; Q: cuadrupolo; QuEChERS: Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe; UAE: extacción asistida por ultrasonidos; UPLC: ultra performance liquid chromatography. Introducción 113 designar a este grupo de proteínas que resultaban tóxicas y tenían poder hemaglutinante. No obstante, en 1907 se demostró que no todas las hemaglutininas resultaban tóxicas. Sin embargo, el porqué de esta hemaglutinación no fue descrito hasta 1936 cuando se correlacionó la presencia de sacarosa con la inhibición de la capacidad aglutinante de la concanavalina A.439 Finalmente, en 1952 se demostró la relación que existía entre la capacidad de aglutinación de las lectinas y el reconocimiento de los carbohidratos presentes en la superficie de los eritrocitos. Este descubrimiento fue de suma importancia, ya que se demostraba la capacidad de reconocimiento hacia los carbohidratos que poseían las lectinas.454 El término “lectina”, acuñado en 1956 por William Boyd, proviene de la palabra en latín legere que significa “seleccionar”.455 Este término se adoptó tras observar la capacidad que presentan estas proteínas, denominadas también hemaglutininas o simplemente aglutininas, para aglutinar selectivamente eritrocitos en función del tipo sanguíneo (A, B ó 0). Estas proteínas reaccionan específicamente con ciertos azúcares presentes en la membrana celular y su unión a los carbohidratos es reversible, provocando la aglutinación celular y la precipitación de glucoconjugados. Además, a diferencia de otras proteínas similares, las lectinas no modifican químicamente los carbohidratos a los que se unen. Aunque todas las lectinas poseen al menos un dominio de unión a carbohidrato (CBD, del inglés carbohydrate-binding domain), no todas son capaces de aglutinar células.456 Las lectinas vegetales se definen como “todas aquellas proteínas vegetales que poseen al menos un dominio no catalítico que presenta unión reversible a un mono- u oligosacárido”.457 Se acumulan principalmente en raíces, hojas y tallos, y se sintetizan durante la formación de las semillas, en la germinación y el crecimiento de la planta. Aunque estas proteínas están involucradas en el almacenamiento y transporte de los carbohidratos en las semillas, en la unión de bacterias fijadoras de nitrógeno a las raíces de las plantas, así como en la inhibición del crecimiento de hongos y en los mecanismos de defensa contra insectos fitófagos, originan efectos adversos para la salud tras su consumo.458 Debido a la gran afinidad que presentan por los carbohidratos, tras su ingesta interaccionan con las glicoproteínas presentes en las células epiteliales del intestino provocando cambios drásticos en la morfología celular y en el metabolismo. Las lectinas, por tanto, se engloban dentro del grupo de los denominados factores antinutricionales, al interferir en la correcta digestión y absorción de los nutrientes, aumentar la permeabilidad del intestino y estimular cambios en la flora bacteriana.362,459 Como su propio nombre indica, estos compuestos tienen un efecto antagónico al nutriente y al Introducción 114 consumirlos reducen el valor nutritivo del alimento. La exposición a largo plazo puede causar trastornos crónicos que, en la mayoría de los casos, son irreversibles. No obstante, la toxicidad depende del tipo de lectina consumida y de la concentración de la misma presente en el alimento. Además de las lectinas, otros factores antinutricionales que se pueden encontrar en las plantas como resultado de la adaptación evolutiva son las sustancias que inhiben la acción de enzimas digestivas, como las amilasas y los inhibidores de proteasas, o las que interfieren con la asimilación de minerales, como el ácido fítico o el ácido oxálico entre otros.460 Debido a los avances en el campo de la lectinología, una de las últimas clasificaciones más completas de las lectinas vegetales es la propuesta en 2008 por Van Damme. Este investigador sugería reagrupar las lectinas de plantas en doce familias teniendo en cuenta su secuencia y homología estructural, a saber, 1) aglutininas con dominio Agaricus bisporus, 2) amarantinas, 3) homólogos de quitinasa de clase V, 4) dominios cianovirina, 5) aglutininas con dominio Euonymus europaeus, 6) aglutininas con dominio Galanthus nivalis, 7) con dominios de heveína, 8) jacalinas, 9) lectinas de leguminosas, 10) con dominio LysM, 11) aglutinina con dominio Nicotiana tabacum y 12) lectinas con dominio ricina-B.461 Lectinas de leguminosas Las lectinas de leguminosas representan la familia de proteínas de unión a carbohidratos más extensa conocida a día de hoy. Por ello, sus propiedades biológicas y físico-químicas se han estudiado extensamente desde su descubrimiento.462 Entre ellas se incluyen la concanavalina A, lectina de la soja (SBA, del inglés soybean agglutinin), fitohemaglutinina (PHA, del inglés phytohaemagglutinin) o la lectina del cacahuete (PNA, del inglés peanut agglutinin). Las lectinas de leguminosas presentan una gran homología en su estructura, caracterizándose por incluir el denominado “dominio de leguminosas”. Este monómero posee entre 25 y 30 kDa de peso y está formado principalmente por láminas β antiparalelas. Se caracteriza por albergar un dominio de unión a carbohidratos con ciertos aminoácidos fuertemente conservados y sitios de unión a iones metálicos divalentes (Ca2+, Mn2+ y Mg2+).463 Los monómeros se combinan para formar dímeros o, en su mayoría, tetrámeros. No obstante, a pesar de sus similitudes, las lectinas de leguminosas muestran variaciones importantes en su estructura cuaternaria y en sus patrones de glicosilación, afectando a sus propiedades físico-químicas y derivando en una afinidad diferente por los azúcares. Introducción 115 Una de las lectinas de leguminosas más tóxicas, como se comentará más adelante, es la PHA presente en distintas variedades de judía o alubia (Phaseolus vulgaris). La PHA consta de dos tipos de cadenas polipeptídicas, denominadas E y L debido a su capacidad para aglutinar eritrocitos o leucocitos, respectivamente. Estos polipéptidos poseen secuencias aminoacídicas similares, diferenciándose solo en ciertos aminoácidos. Así, la PHA puede presentarse en 5 isolectinas tetraméricas de aproximadamente 120 kDa en función de la combinación de los polipéptidos (E4, E3L1, E2L2, E1L3, L4).464 Todas ellas se caracterizan por no contener aminoácidos azufrados en su estructura. Ambas formas (PHA-E y PHA-L) presentan un 90% de homología a nivel nucleotídico y un 82% en su secuencia aminoacídica (Figura 40).465 Aunque muestran una composición similar, se diferencian en la especificidad de unión a los N- glicanos de tipo complejo debido a la existencia de diferentes aminoácidos en el bucle B.466 Figura 40. Estructura de las isolectinas de PHA. (A) PHA-E4. (B) PHA-L4. Adaptado de las referencias [467,468]. Significado nutricional y toxicidad de las lectinas de leguminosas Las leguminosas representan una de las principales fuentes de proteínas vegetales en la dieta humana. Además de aportar nutrientes, vitaminas, fibra y antioxidantes, tienen un bajo contenido en grasas, lo que las convierte en un alimento muy interesante. No obstante, presentan los ya mencionados factores antinutricionales, como las lectinas, que pueden afectar negativamente a la salud del consumidor. Las lectinas de leguminosas se encuentran principalmente en las semillas y son el resultado A B PHA-E4 PHA-L4 Introducción 116 de una adaptación evolutiva de la planta a las condiciones medioambientales. Su presencia en las semillas oscila entre un 8 y un 10% del contenido proteico total.469 La toxicidad de las lectinas para los consumidores radica en la extraordinaria resistencia que poseen a la degradación proteolítica y a la afinidad que presentan por los carbohidratos. La Figura 41 muestra un esquema de los posibles escenarios que pueden presentarse cuando las lectinas ingeridas son digeridas o no. En el segundo caso, cuando las lectinas no son digeridas pueden interaccionar con las enzimas digestivas, inducir efectos mucoatractivos o unirse a los receptores glicosilados de las células del intestino provocando una inflamación de la mucosa intestinal, además de destruir irreversiblemente el epitelio. Todo ello implica una malabsorción de los nutrientes, digestiones incompletas, retraso en el crecimiento y formación de edemas al inhibir la reparación de las células dañadas.470 Figura 41. Mecanismos de toxicidad inducidos por las lectinas. Adaptado de la referencia [471]. Como se ha comentado, una de las lectinas más tóxicas es la PHA. Su concentración varía en función del tipo y variedad de judía, encontrándose normalmente entre 1–10 g kg-1 en judías crudas. Las concentraciones más altas se han detectado en las judías pintas o alubias rojas, seguido de las judías blancas y las habas (Vicia faba). Lectina Lectina Lectina digerida Lectina no digerida Lectina Lectina Sin efecto toxicológico Interacción con enzimas digestivas Efectos mucoatractivos Unión a receptores celulares intestinales Lectina Daño irreversible al epitelio intestinal Malabsorción de nutrientes Digestión incompleta Retraso en el crecimiento Intestino Introducción 117 La toxicidad de la PHA se ha demostrado en ensayos con diferentes animales. Por ejemplo, en ensayos con ratas se ha observado que tras la unión de la lectina a la mucosa intestinal aparecen lesiones en las microvellosidades del intestino.472 Además, al añadir PHA a la dieta de ratas de experimentación, se inhibía la absorción de nutrientes en la pared intestinal aumentando el crecimiento bacteriano.473 También se ha demostrado que determinadas lectinas, incluida la PHA, están involucradas en el desarrollo de ciertas enfermedades como la artritis reumatoide, la nefropatía por IgA o la úlcera péptica.474 En humanos, la intoxicación suele manifestarse con náuseas, dolores abdominales y vómitos entre 1−3 horas tras el consumo del producto y con episodios de diarrea.475 Además, según la FDA, hacen falta solo 4 ó 5 alubias crudas o mal cocinadas para desencadenar los síntomas.476 La recuperación de los pacientes suele ser rápida, requiriendo de hospitalización solo en casos severos. El efecto tóxico de las lectinas se reduce mediante tratamientos térmicos empleando temperaturas elevadas, ya que las bajas temperaturas y el poco tiempo de cocinado no eliminan sus efectos tóxicos. Aunque este tipo de intoxicaciones se producen más frecuentemente en Reino Unido debido a su alto consumo de alubia roja, en el año 2003 se produjo una intoxicación alimentaria por PHA en un colegio del País Vasco tras el consumo de alubias que no estaban completamente cocinadas.477 Ninguna autoridad alimentaria ha establecido aún los contenidos máximos diarios permitidos para la PHA, sin embargo, el laboratorio de Salud Pública de Londres (PHLS) recomienda aplicar una serie de medidas para que el producto sea seguro para su consumo, a saber, poner las judías a remojo al menos 5 h, desechar el agua utilizada y hervirlas a fuego vivo en agua fresca durante al menos 10 min.476 Por tanto, algunas de las tendencias culinarias de la actualidad no son aptas para el cocinado de este tipo de legumbres, tales como la cocción en olla lenta (crockpot). Aunque el tiempo de cocinado en esta técnica es extenso (10 h), la temperatura aplicada (~80 ºC) no es suficiente para inactivar las lectinas presentes. Por último, mencionar que, debido a que las lectinas contribuyen a la disminución de la absorción de nutrientes, en muchos casos se toman como suplemento en dietas de adelgazamiento poniendo en riesgo la salud de los pacientes.478 A pesar de su demostrada toxicidad, diversos estudios han confirmado que los factores antinutricionales presentes en las leguminosas, especialmente las lectinas, a bajas dosis pueden ser beneficiosos sobre la salud. Por ejemplo, disminuyendo los niveles de glucosa en sangre o actuando como prebióticos al aumentar la materia fermentable en el colon.462 Introducción 118 Métodos de análisis de lectinas El análisis de las lectinas en alimentos, especialmente la PHA, se lleva a cabo mediante inmunoensayos, mediante la medida de la actividad hemaglutinante o empleando espectrometría de masas.479,480 No obstante, debido a la gran complejidad que presentan las muestras, tanto la materia prima como los productos derivados, es necesario introducir una etapa de purificación previa. Así, normalmente las lectinas se extraen de la muestra empleando medios tamponados y precipitándolas con sales o ácidos y, posteriormente, se realizan diferentes etapas de purificación mediante cromatografía de afinidad empleando columnas funcionalizadas con azúcares.481 La PHA también se puede determinar mediante ensayos ELISA competitivo indirecto empleando anticuerpos policlonales.482 Objetivos 121 El objetivo general de la presente Tesis Doctoral es la síntesis y caracterización de elementos de reconocimiento biomiméticos y su correspondiente aplicación bioanalítica. A pesar de su gran afinidad y selectividad, los receptores naturales suelen presentar problemas asociados con su limitada estabilidad, reutilizabilidad y elevado coste. Es por ello que, en las últimas décadas, se ha trabajado extensamente en la búsqueda de nuevos receptores sintéticos o semisintéticos que puedan reemplazar a sus homólogos de origen biológico para diferentes aplicaciones. En la presente Tesis Doctoral se ha abordado la aplicación de los MIPs y de los anticuerpos recombinantes como alternativas a los anticuerpos para su aplicación en la purificación de biomoléculas o para el control de la seguridad alimentaria. Los objetivos específicos del presente trabajo, desglosados en función del tipo de elemento de reconocimiento biomimético utilizado y de su aplicación, se describen a continuación: 1) Síntesis de MIPs para el reconocimiento selectivo de péptidos y proteínas recombinantes mediante la aproximación del epítopo basada en dos estrategias: 1.1. Impronta no jerarquizada: empleando el péptido DYKD como molécula plantilla. 1.2. Improntada jerarquizada: empleando el péptido DYKDC inmovilizado sobre gel de sílice como plantilla. 2) Síntesis de MIPs selectivos a micotoxinas de Alternaria y su aplicación a la determinación de estas en alimentos empleando un método basado en extracción en fase sólida y detección mediante HPLC con detección fluorescente (MISPE-HPLC-FLD). 3) Descubrimiento de fragmentos de anticuerpo VH empleando la tecnología de despliegue de anticuerpos sobre la superficie de fagos (phage display) selectivos a la fitohemaglutinina (PHA), evaluación de los parámetros cinéticos y termodinámicos de la interacción antígeno-anticuerpo empleando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de disipación (QCM-D), y su clasificación en función a una estrategia multiparámetrica basada en el análisis de componentes principales (PCA). Publicaciones científicas 125 La presente Tesis Doctoral está basada en los siguientes artículos de investigación: I. L. N. Gómez-Arribas, J. L. Urraca, E. Benito-Peña, M.C. Moreno-Bondi, Tag- specific affinity purification of recombinant proteins by using molecularly imprinted polymers, Anal. Chem. 91 (2019) 4100−4106. II. L. N. Gómez-Arribas, M. Darder, N. García, Y. Rodriguez, J. L. Urraca, M. C. Moreno-Bondi, Hierarchically imprinted polymer for peptide tag recognition based on an oriented surface epitope approach, ACS Appl. Mater. Interfaces 12 (2020) 49111−49121. III. R. A.G. Abou-Hany, J. L. Urraca, A. B. Descalzo, L. N. Gómez-Arribas, M. C. Moreno-Bondi, G. Orellana, Tailoring molecularly imprinted polymer beads for alternariol recognition and analysis by a screening with mycotoxin surrogates, J. Chromatogr. A 1425 (2015) 231−239. IV. L. N. Gómez-Arribas, A. Juste-Dolz, R. Peltomaa, D. Giménez-Romero, S. Morais, R. Barderas, C. Cuadrado, Á. Maquieira, E. Benito-Peña, M. C. Moreno-Bondi, Multi-parameter evaluation strategy of phage-displayed VH fragments based on quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, (artículo en preparación). Publicaciones científicas 127 3.1. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de péptidos y proteínas mediante la aproximación del epítopo Los marcadores de fusión son pequeños polipéptidos que se expresan, junto con la proteína de interés, mediante tecnología de ADN recombinante, con el fin de facilitar la purificación de la misma. Debido a los grandes avances que se han producido en el campo de la biotecnología, actualmente existe un gran abanico de marcadores de afinidad disponibles en el mercado que pueden emplearse para esta aplicación. Uno de los más populares es el péptido denominado FLAG (DYKDDDDK), que permite mejorar los niveles de expresión y de solubilidad de la proteína recombinante, y alcanzar un grado de pureza muy superior al obtenido empleando otros marcadores. A pesar de la gran selectividad que ofrecen las resinas de inmunoafinidad disponibles comercialmente para la purificación de proteínas marcadas con FLAG, su elevado coste y escasa reutilización ha promovido la búsqueda de materiales alternativos basados en el empleo de elementos de reconocimiento biomiméticos. Como se ha comentado en la sección 1.1.4., los MIPs son una alternativa sintética a los elementos de reconocimiento de origen biológico. Como prueba de concepto, en la presente Tesis Doctoral se han desarrollado MIPs, sintetizados mediante la aproximación del epítopo, para el reconocimiento selectivo del FLAG (DYKDDDDK) de forma no jerarquizada (Publicación I) y jerarquizada (Publicación II). La Publicación I describe la síntesis de MIPs empleando el tetrapéptido DYKD como molécula plantilla. Se diseñó una biblioteca de MIPs variando la naturaleza de los monómeros funcionales y entrecruzantes empleados para la síntesis del polímero. La combinación óptima se seleccionó para la síntesis de MIPs en forma de partículas esféricas que se aplicaron, tanto para la extracción de los péptidos libres DYKD y FLAG, como para la purificación de dos proteínas recombinantes obtenidas a partir de la fusión de la proteína fluorescente mCherry con cada uno de dichos péptidos. Las etapas de las que consta este trabajo se pueden resumir en: 1. Síntesis de una biblioteca combinatoria de mini-MIPs, en formato de partículas esféricas, utilizando como moléculas plantilla el péptido DYKD, el péptido FLAG y ácido aspártico, a fin de confirmar la adecuación del epítopo seleccionado para el posterior reconocimiento selectivo tanto de los péptidos libres como de las proteínas marcadas. 2. Optimización de un método MISPE empleando el polímero de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de los péptidos DYKD y FLAG. Publicaciones científicas 128 3. Diseño, síntesis y expresión de las proteínas recombinantes fluorescentes mCherry- DYKD y mCherry-FLAG en células de E. coli. 4. Purificación de las proteínas recombinantes fluorescentes procedentes del lisado celular mediante MISPE. En el caso de la Publicación II los MIPs se sintetizaron de forma jerarquizada inmovilizando covalentemente el pentapéptido DYKDC, empleado como molécula plantilla, sobre partículas de sílice que se eliminan tras la polimerización. Uno de los objetivos de esta aproximación era reducir las interacciones no específicas del FLAG con el NIP que se habían observado en el trabajo anterior. Para ello, se optimizó la ruta de funcionalización de la sílice, incluyendo las etapas de silanización, yodoacetilación y posterior anclaje del péptido DYKDC a través de la cisteína del extremo C-terminal. El MIP resultante se aplicó con éxito a la extracción del péptido libre FLAG evaluándose su interacción con el polímero mediante estudios de modelización molecular. Las etapas de las que consta el trabajo presentado a continuación se pueden resumir en: 1. Evaluación y optimización de la silanización de micropartículas de sílice empleando un silano monofuncional (AETAZS, N-(2-aminoetil)-2,2,4-trimetill-1-aza-2- silaciclopentano) y un silano difuncional (AEAPMS, 3-(2- aminoetilamino)propildimetoximetilsilano). 2. Caracterización de las partículas silanizadas mediante análisis elemental y resonancia magnética nuclear en estado sólido (29Si CP/MAS RMN). 3. Derivatización de las partículas de sílice con el péptido DYKDC. 4. Síntesis de MIPs, mediante impronta jerarquizada, utilizando las micropartículas de sílice derivatizadas con el péptido como molécula plantilla y soporte para la polimerización. 5. Evaluación de la retención de los péptidos libres DYKD y FLAG aplicando el método MISPE optimizado. 6. Estudios de modelización molecular de los péptidos utilizados para justificar su reconocimiento selectivo en el MIP. Publicaciones científicas 129 3.1.1. Publicación I: Tag-specific affinity purification of recombinant proteins by using molecularly imprinted polymers Reproduced from: Analytical Chemistry 91 (2019) 4100−4106 Copyright © 2019, with permission from American Chemical Society Abstract Epitope tagging is widely used to fuse a known epitope to proteins for which no affinity receptor is available by using recombinant DNA technology. One example is FLAG epitope (DYKDDDDK), which provides better purity and recoveries than the favourite poly-histidine tag. However, purification requires using anti-FLAG antibody resins, the high cost and nonreusability of which restrict widespread use. One cost- effective solution is provided by the use of bioinspired anti-FLAG molecularly imprinted polymers (MIPs). This work describes the development of MIPs, based on the epitope approach, synthesized from the tetrapeptide DYKD as template that affords purification of FLAG-derived recombinant proteins. Polymer was optimized by using a combinatorial approach to select the functional monomer(s) and cross-linker(s) resulting in the best specific affinity towards FLAG and the peptide DYKD. The imprinted resin obtained was used to purify mCherry proteins tagged with either FLAG or DYKD epitopes from crude cell lysates. Both mCherry variants were highly efficiently purified (R ≥ 95%, RSD ≤ 15%, n = 3) and impurities were removed. Unlike existing antibody-based resins, the proposed tag-imprinting strategy provides a general method for meeting the growing demand for efficient, inexpensive, versatile materials for tagged proteins purification. Introduction Recombinant DNA technology is one of the most powerful techniques among those that have supported salient advances in life science and industrial research.1 Thus, the production of therapeutic protein-based vaccines, industrial enzymes, and new Publicaciones científicas 130 biomaterials has benefited from advances in the expression of recombinant proteins in various systems including bacteria, yeasts, and mammalian cells. However, this technique is rather expensive to implement owing to the high cost of downstream processing, which includes isolation and purification of proteins. One effective alternative is provided by genetic coding of proteins with universal epitope tags, which enables selective extraction by use of tag-specific affinity resins, tag-dependent aggregation, or precipitation reactions.2 In fact, epitope tags are also useful tools for structural and functional proteomics initiatives.2 No universal tag for the expression of proteins in any host has so far been identified; however, one of the most versatile and cost-effective protein purification methods uses poly-histidine (His-) tags.3 The capture step relies on the affinity of four or more histidine residues for immobilized nickel ion via coordinated bonds. This approach, however, is subject to a number of limitations, such as copurification of proteins with external HIS residues, metal leaching from the sorbent, or interference with proper target protein folding and activity,3,4 that can be partially circumvented by replacing the His-tag with a smaller epitope tag such as FLAG, c-Myc or hemagglutinin (HA). These alternative tags typically consist of 8–12 amino acids and allow the simple, expeditious purification of recombinant proteins by using immunoaffinity resins, all with a high yield and purity.3,5 FLAG-tag, which is a DYKDDDDK peptide, provides superior purity and recoveries of fused proteins by virtue of its being more hydrophilic than other common epitope tags and thus less likely to denature or inactivate the proteins to which it is fused.3 FLAG-tag can be easily purified by using immunoaffinity resins functionalized with anti- FLAG tag M1 or M2 monoclonal antibodies.6 However, the high cost of these sorbents, and their limited reusability, have so far hindered widespread use. One alternative strategy is provided by Molecularly Imprinted Polymers (MIPs). These synthetic materials have emerged as effective substitutes for biological recognition elements such as antibodies and enzymes. MIPs contain well-defined molecularly engineered receptor sites that enable the selective binding of target molecules even in complex mixtures.7,8 These polymers are intrinsically more stable and robust than its natural counterparts and, in principle, can be reused several times without altering its selective recognition properties, which results in decreased costs.9 By analogy with the recognition of antigens by the immune system, where a small part of the entire molecule may by itself be responsible for the whole interaction, epitope imprinting10-20 is the most viable alternative to well-established antibody-based resins in terms of affinity and capacity. In the proposed approach, a small peptide fragment (the epitope) rather than the whole protein is templated and subsequently added to a protein Publicaciones científicas 131 by using recombinant DNA technology. To date, the His-tag label has only been used for protein purification with MIPs21 (see Section S1, Table S1, Supporting Information). Herein we report the first molecularly imprinted polymer based on the epitope approach and synthesized from the tetrapeptide DYKD as template that affords purification of FLAG-derived recombinant proteins. Using a combinatorial screening design for polymer synthesis allowed the best template, functional monomer(s) and cross-linker(s) for the formulation to be identified. The optimum composition was used to prepare microparticles from porous silica beads acting as sacrificial scaffolds in the polymerization process.22 For the proof of concept study, two different N-terminus tagged fluorescence proteins (mCherry-DYKD and mCherry-FLAG) were designed and expressed in E. coli cells in order to assess the ability of the resulting MIP as an immune- like affinity resin for purifying crude cell extracts of both mCherry variants by using molecularly imprinted solid-phase extraction (MISPE). Experimental section Combinatorial MIP library Silica microspheres (SiliaSphere™ PC, 40–75 μm diameter, 500 Å pore size, SiliCycle, www.silicycle.com) were used as sacrificial scaffolds for polymerization. Methacrylic acid (MAA, Sigma-Aldrich), 2- (trifluoromethyl)acrylic acid (TFMAA, Sigma- Aldrich), 1-allylpiperazine (1-ALLP, Sigma-Aldrich), N,N-diethylaminoethylmethacrylate (2-DAEM, Sigma-Aldrich), N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (EAMA•HCl, Polysciences) and 2-hydroxyethylmethacrylate (HEMA, Acros) were used as functional monomers. Ethyleneglycol dimethacrylate (EDMA), trimethylolpropane dimethacrylate (TRIM), divinylbenzene (DVB), N,N-methylenebisacrylamide (MBA) and poly(ethyleneglycol) dimethacrylate (PEGDMA) were purchased from Sigma-Aldrich and used as cross-linkers. Dimethylformamide (DMF, GPR Rectapur) was used as porogen. The initiator, 2-2′-azo-bis-(2,4-dimethylvaleronitrile) (ABDV), was obtained from Wako Pure Chemicals, Ltd. The structures of the monomers and cross-linkers are shown in Figure S1. The MIP/NIP libraries were developed by using the compositions shown in Tables S2 and S3 in the Supporting Information. The peptide DYKD (aspartic acid- tyrosine-lysine-aspartic acid from Peptide Sciences) was used as template. The volume of porogen (DMF) used in each polymer synthesis was that need for a VDMF/(VDMF + Vtotal monomers) ratio of about 0.57. The prepolymerization solutions were transferred to 27 mL borosilicate glass vials containing silica microspheres that were used as sacrificial scaffolds to synthesize the polymers. The mixture was mixed under stirring until the silica Publicaciones científicas 132 beads were freely flowing and then purged with argon for 10 min. Copolymerization was carried out at 70 ºC for 24 h. The silica was dissolved by adding 3 x 150 mL of a 3 M aqueous solution of ammonium hydrogen difluoride (NH4HF2, Alfa Aesar) and shaking the mixture for 24 h after each addition. Nonimprinted polymers (NIPs) were prepared under identical conditions but using no template. The polymers were thoroughly washed to pH ~ 7 with water on a shaking table, and then with 1 L of a methanol (MeOH, Fisher Scientific)/trifluoroacetic acid (TFA, HPLC grade Alfa Aesar; 1%, v/v) mixture and 0.5 L of methanol. The resulting polymer beads were dried in a vacuum oven at 50 ºC for 24 h prior characterization and use. Then, the powders were allowed to settle in methanol/water (80:20, v/v) to remove fine particles. The peptide DYKDDDDK (FLAG, Peptide Sciences) and aspartic acid (D, Acros Organic) were used as alternative templates for MIP synthesis (Table S3, polymers MSP9 and MSP10, respectively), using EAMA as functional monomer and EDMA as cross-linker. Molecularly imprinted solid-phase extraction (MISPE) for peptide analysis Solid-phase extraction cartridges (1 mL, Varian, Palo Alto, CA, USA) were packed with 25 mg of MIP or the corresponding NIP. The cartridges were equilibrated with 10 mL of MeOH and 10 mL of HEPES buffer (100 mM, pH 7.5). The peptide solution, containing 1 mL of DYKD and 5 mg L-1 FLAG, was percolated at a constant flow rate of 0.4 mL min-1 with the aid of an 8-channel Ismatec ISM936D peristaltic pump (Oak Harbor, WA, US). Then, the cartridges were rinsed with 3 mL of water to remove nonspecifically retained compounds and the peptides were eluted with 1 mL H2O/tetrabutylammonium hydrogensulfate (TBA, Sigma-Aldrich) 1% (w/v). The eluates from the MISPE column were injected into the RRLC system for analysis. All analyses were done in triplicate. The imprinting factor (IF) for each peptide was calculated as the ratio of its recovery from the MIP (MSP8) to that from the NIP (NSP8) as described in section S8 of the Supporting Information. Construction and expression of mCherry fusion proteins For the expression of mCherry-tagged DYKD and mCherry-tagged FLAG, plasmids pQE-T7-2-(mCherry-DYKD) and pQE-T7-2-(mCherry-FLAG) were constructed. The mCherry gene was polymerase chain reaction (PCR)-amplified from vector pmCherry by KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase (Merck Millipore) with oligonucleotides depicted in Table S5. The sense primers FP-mCherry-SacI-M-DYKD (5´-GCG AGCTCATGG ATT ACA AGG ATG TGA GCA AGG GCG AGG AGG AT-3´) and FP-mCherry-SacI-M-FLAG (5´- GCG AGC TCA TGG ATT ACA AGG ATG ACG ACG ATA AGG TGA GCA AGG GCG AGG AGG AT -3´) contained a 5´-overhang Publicaciones científicas 133 composed of the DNA sequence encoding for either DYKD or FLAG tags (underlined) to generate the translational fusions DYKD-mCherry and FLAG-mCherry. The PCR products were subcloned at the SacI and KpnI sites of the pQE-T7-2 to generate pQE- T7-2-(mCherry-DYKD) and pQE-T7-2-(mCherry-FLAG). Successful cloning was confirmed by DNA sequence analysis. For the overexpression of the mCherry tagged proteins, E. coli One Shot BL21 Star (DE3) cells were transformed with the corresponding plasmids pQE-T7-2-(mCherry- DYKD) and pQET7-2-(mCherry-FLAG) as described elsewhere.23 The mixtures were plated on LB agar plates, supplemented with a 50 mg L-1 kanamycin and incubated at 37 ºC for 20 h. Then, manually screened single colonies were grown in LB agar plates containing 15 μL of spread isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) at 37 ºC for 20 h to induce protein expression. Selected single colonies were inoculated in TB supplemented with 50 mg L–1 kanamycin at 37 ºC under stirring at 230 rpm for 16 h to an optical density at 600 nm (OD600) ranging from 0.6 to 1. Then, IPTG was added to the culture to a final concentration of 1 mM in order to induce protein expression, and cell growth was continued for 4 h. Finally, transformed cells were harvested by centrifugation at 5000 rpm at 4 ºC for 10 min, resuspended in lysis buffer (5 mL g–1 cell pellet) and incubated on a rotating mixer at room temperature for 1 h. Insoluble cell debris was removed by centrifugation at 11000 rpm at 4 ºC for 15 min. Lysis extracts were filtered through SPE frits (20 μm pore size, Agilent) and stored at –80 ºC until use. More details on the construction and expression of mCherry fusion proteins are provided in the Supporting Information. Molecularly imprinted solid-phase extraction (MISPE) for mCherry fusion protein purification Solid-phase extraction cartridges (1 mL, Varian, Palo Alto, CA, USA) were packed with 25 mg of MIP (MSP8) or the corresponding NIP (NSP8) and equilibrated with 10 mL of Tris buffer (20 mM, pH 7.5) (TRIZMA hydrochloride, Sigma Aldrich). Then, a volume of 500 μL of sample (50 μL of cell lysate diluted to 500 μL with Tris buffer, 20 mM, pH 7.5) was percolated through each cartridge at a flow rate of 0.1 mL min–1 with the aid of a 8-channel Ismatec ISM936D peristaltic pump (Oak Harbor, WA, US). The cartridges were rinsed with 3 mL of water to remove nonspecifically retained proteins. Finally, bound proteins were eluted with 3 x 0.5 mL of glycine buffer (0.1 M, pH 3; Scharlau) and immediately neutralized with 20 μL of Tris buffer (1 M, pH 9; BioRad). The cartridges were then thoroughly washed with glycine-HCl buffer (0.1 M, pH 3) and water before a new analysis. Eluate samples from the MISPE column were transferred to the wells of 96-microtiter plates (Greiner) and directly measured with a CLARIOstar Publicaciones científicas 134 microplate reader from BMG LabTech (Ortenberg, Germany). Fluorescence signals were recorded at the typical wavelengths for mCherry (λexc = 587 nm, λem = 610 nm). For quantification in terms of recovery (%), the emission intensity of eluted sample was compared with the signal for the mixture of 50 μL of cell lysate diluted with 450 μL of glycine buffer (0.1 M, pH 3) and neutralized with 20 μL Tris buffer (1 M, pH 9). Results and discussion Preparation of a combinatorial MIP library In order to ensure a high epitope affinity in the resulting MIPs for FLAG and DYKD tag rebinding, we considered mimicking the pocket of the anti-FLAG M2 monoclonal antibody, which has proved specific for the first four amino acids in the FLAG epitope (i.e., DYKD).24-26 From the molecular imprinting perspective, the motifs of both FLAG and the DYKD (Scheme 1) meet the essential requirements for an ideal template, namely: stability, compatibility with radical polymerization27 and presence of charged basic and acidic groups capable of engaging in multiple ionic interactions with a broad palette of functional monomers.28 A combinatorial library was designed by screening functional monomers of different polarity in order to ensure the best possible MIP composition. The candidates included the acidic monomers methacrylic acid (MAA), trifluormethacrylic acid (TFMAA), N-(2-aminoethyl)methacrylamide hydrochloride (EAMA), the neutral monomer 2- hydroxyethylmethacrylate (HEMA) and the basic monomers 1-allylpiperazine (1-ALLP) and 2-diethylaminoethylmethacrylate (2-DAEM) in combination with the cross-linkers trimethylolpropane dimethacrylate (TRIM), ethyleneglycol dimethacrylate (EDMA), divinylbenzene (DVB), N,N-methylenebis(acrylamide) (MBA) and poly(ethyleneglycol) dimethacrylate (PEGDMA). Polymerization was accomplished by using ABDV as initiator and dimethylformamide (DMF) as porogen. Nonimprinted polymers (NIPs) were also prepared under identical conditions except that no template was used. Figure 1 shows the ingredients of the synthetic process and Table 1 the composition of the combinatorial library (for details, see section 2, Figure S1, and Tables S2 and S3, Supporting Information). Silica microbeads 40–75 µm in size were used as sacrificial scaffolds for the polymerization reaction in order to improve mass transfer of the recombinant proteins to the MIP recognition sites.29 Organic polymer microspheres were only obtained for the MIPs prepared from MAA+TFMAA as functional monomers and TRIM (MSP1) or PEGDMA (MSP3) as cross-linkers, or EAMA as functional monomer and EDMA cross- Publicaciones científicas 135 linker (MSP8). The scanning electron micrographs of MSP8 microparticles in Figure 2 confirm the porosity and structural fidelity of the resulting materials. Scheme 1. Simplified scheme of recombinant plasmid pQE-T7-2-mCherry-tag construction (tag = DYKD or FLAG, respectively). pQE-T7-2 pQE-T7-2- mCherry- tag mCherry Kan Digestion: KpnI SacI NotI DNA ligase T4 a) PCR: FP-mCherry-SacI-M-tag RP-mCherry-KpnI-ST pQE-T7-2 b) Digestion: KpnI SacI Kan mCherry pmCherry Amp Transfection of E. coli BL21 with pQE-T7-2-mCherry-FLAG® pQE-T7-2-mCherry-DYKD Lysis of E.Coli for the purification of mCherry-FLAG and mCherry-DYKD E. coli extract P u b lic a c io n e s c ie n tífic a s 1 3 6 Figure 1. Workflow of the production of DYKD and FLAG tag-imprinted resins, and purification of tagged mCherry- FLAG by MISPE. D Y K D D D D K FLAG® tag DYKD tag HEMA TFMAA EAMA 1-ALPP TRIM 2-DAEM MAA DVB MBA PEGDMA EDMA Epitope templatesCross-linkersMonomers Prepolymerization mixture Polymerization (1) Silica beads Combinatorial MIP library Removal of silica beads (2) Removal of template (3) Crude cell lysis extract (4) Selective binding of tagged proteins D Y K D × 40 EDMA EAMA ABDV Publicaciones científicas 137 Table 1. Composition of the combinatorial MIP library. Polymer Template (T) Functional monomers (FM) Cross-linker (CL) T:FM:CL MSP1 DYKD MAA/ TFMAA TRIM 0.5:2:2:30 MSP2 DYKD MAA/ TFMAA DVB 0.5:2:2:30 MSP3 DYKD MAA/ TFMAA PEGDMA 0.5:2:2:30 MSP4 DYKD MAA/ TFMAA MBA 0.5:2:2:30 MSP5 DYKD MAA/ TFMAA/ HEMA EDMA 0.5:2:2:4:30 MSP6 DYKD 1-ALLP EDMA 0.5:4:20 MSP7 DYKD 2-DAEM EDMA 0.5:4:20 MSP8 DYKD EAMA EDMA 0.5:3:20 MSP9 FLAG EAMA EDMA 0.5:3:20 MSP10 D EAMA EDMA 0.5:3:20 Figure 2. Scanning electron micrographs of MIPs obtained as spherical polymers after silica etching. The micrographs correspond to MSP8, which was obtained by using DYKD, EAMA and EDMA in a 0.5:3:20 mole proportion. Evaluation of the synthetized MIP/NIP polymers by MISPE The retention performance of DYKD and FLAG peptides in imprinted microspheres was assessed by packing an amount of 25 mg of MIP or NIP in a 1 mL gravity flow cartridge. All cartridges were conditioned with HEPES buffer (100 mM, pH 7.5) and then loaded with 1 mL of an aqueous solution containing 5 mg L–1 DYKD and FLAG in the buffer. Peptides were eluted with 1 mL of 1% (w/v) TBA to disrupt Publicaciones científicas 138 electrostatic interactions between the polymer and peptides by ion-pairing. Eluted fractions were analysed by HPLC-DAD at λabs = 220 nm (sections S3 and S7, Supporting Information). Figure 3A shows the recoveries of the two peptides. As can be seen, MSP1 and MSP3 exhibited weak affinity toward the peptides, with retention < 20% (RSD < 5%). MSP8 microparticles (Figure 3B) exhibited effective rebinding of both peptides (RMSP8- DYKD = 65.5%, RSD < 2%; RMSP8-FLAG = 92%, RSD < 2%). However, differences between the MIP and NIP were only significant with the DYKD peptide (RNSP8-DYKD = 16.5%, RSD < 5%; RNSP8-FLAG = 87.5%, RSD < 2%), possibly because of the hydrophobicity of the FLAG tag (log PFLAG = 6.47) relative to the DYKD peptide (log PDYKD = –2.22) favoring nonspecific interactions with the polymer matrix. Figure 3. Extraction recoveries (%) from MIPs (MSP1, MSP3, MSP8) and NIPs (NSP1, NSP3, NSP8) of variable composition for DYKD and FLAG (A, B) and from MIPs (MSP8,9,10) and the corresponding NIP (NSP8), after percolation of 1 mL of 5 mg L–1 DYKD (C) or FLAG (D). Using an appropriate template molecule in MIP syntheses is crucial. This led us to examine the influence of the template used in the imprinting reaction on peptide capture in MIPs prepared with the templates DYKD (MSP8), FLAG (MSP9) and aspartic acid (MSP10). Extractions were performed as described above and washing with water used before elution to minimize nonspecific interactions between the peptides and imprinted materials. As can be seen from Figures 3C and 3D, recovery of the target epitopes from the polymers based on aspartic acid (MSP10) were negligible (RMSP10-DYKD = 3%, RSD < 2 %) or very low (RMSP10-FLAG = 30%, RSD< 1%), and so was that from the DYKD DYKDDDDK0 20 40 60 80 100 MSP1 NSP1 MSP3 NSP3 R e c o v e ry (% ) DYKD DYKDDDDK 0 20 40 60 80 100 MSP8 NSP8 R e c o v e ry ( % ) Wash 3 mL Wash 1 mL Wash 0 mL 0 20 40 60 80 100 MSP8 MSP9 MSP10 NSP8 R e c o v e ry ( % ) Wash 3 mL Wash 1 mL Wash 0 mL 0 20 40 60 80 100 MSP8 MSP9 MSP10 NSP8 R e c o v e ry ( % ) A B C D mailto:lihuazhang@dicp.ac.cn mailto:lihuazhang@dicp.ac.cn mailto:lihuazhang@dicp.ac.cn mailto:lihuazhang@dicp.ac.cn mailto:lihuazhang@dicp.ac.cn mailto:lihuazhang@dicp.ac.cn mailto:lihuazhang@dicp.ac.cn mailto:lihuazhang@dicp.ac.cn Publicaciones científicas 139 NIP (RNSP8-DYKD = 5%, RSD < 1%). Interestingly, the polymers obtained with FLAG as template (MSP9) exhibited lower affinity for DYKD (RMSP9-DYKD < 25%, RSD < 2%) than those synthesized with the shorter peptide (RMSP8-DYKD = 64%, RSD < 7%). This result can be ascribed to DYKD not fitting accurately in the larger binding sites produced by the FLAG motif.30 In contrast, the polymers prepared with DYKD (MSP8) or FLAG (MSP9) as template exhibited extraction recoveries exceeding 89% for the FLAG tag (RMSP8-FLAG= 89%, RSD < 6%; RMSP9-FLAG= 94%, RSD < 6%) and minimal adsorption in the NIP (RNSP8-FLAG= 27%, RSD < 4%). These results are consistent with those reported by Minoura31 and Sellergren32 according to which polymers imprinted with a short peptide efficiently recognize both the template itself and a larger peptide. Uptake and selectivity were greatest with MSP8- imprinted polymer microspheres for both tags; thus, the imprinting factor (IF) was 12.8 for DYKD and 3.3 for FLAG (see section 8, Supporting Information). The promising results obtained encouraged us to check whether MSP8 was in fact a suitable resin for improved downstream purification of FLAG and DYKD tagged proteins captured from E. coli cell lysis extracts. Construction of the mCherry-tagged proteins We used the synthesis of a genetically modified fluorescent protein labelled with either FLAG or DYKD tag as a benchmark method. For this purpose, we selected mCherry, a monomeric far-red fluorescent protein that expresses itself efficiently in E. coli; also, it is nontoxic to the bacterial system and possesses a high photostability.33 Both epitopes were fused to the N-terminus instead of a C-terminal in order to ensure efficient translation initiation and facilitate tag removal.34 Two different vectors were constructed by using plasmid pmCherry as DNA template and plasmid pQE-T7-2 as host for the final plasmid constructions [pQE-T7-2-(mCherry-DYKD) and pQE-T7-2- (mCherry-FLAG), respectively]. The bacterial strains and constructed primers are shown in Tables S4 and S5 (see sections S4 and S5, Supporting Information). The recombinant process workflow is illustrated in Scheme 1. For overexpression of the mCherry variants, the plasmids pQE-T7-2-(mCherry- DYKD) and pQE-T7-2-(mCherry-FLAG) were transformed into E. coli One Shot cells.35,36 Experimental details on the molecular cloning and protein expression are described in sections S5 and S6 of the Supporting Information. The target proteins were identified by using SDS-PAGE electrophoresis to compare induced and non-induced cell cultures (Figure S3A, section S9, Supporting Information). A mismatch between the theoretical molecular weight values (27.7 kDa for mCherry-FLAG and 27.2 kDa for mCherry-DYKD Publicaciones científicas 140 proteins, Table S7) and the experimental SDS-PAGE values was observed. However, this is a frequent occurrence and has been ascribed to aberrant migration of some proteins during the electrophoretic process.37 Fluorescent mCherry proteins were easily detected by measuring fluorescence emission under ambient conditions. Figures S3B and S3C (section S9, Supporting Information) show an extract of the lysis of each protein and the corresponding emission spectrum. As can be seen, no difference in fluorescence profile between the proteins was observed irrespective of the particular N-terminus tag.38 The amount of mCherry-tagged protein present in each lysis extract was quantified by native PAGE electrophoresis under the conditions described in section S9 (Supporting Information). Fluorescence bands were directly viewed (Figure S4) and manually excised to determine the protein content with the bicinchoninic acid assay (BCA). The concentrations of mCherry-DYKD and mCherry-FLAG in the corresponding cell lysis extracts were 0.94 and 0.50 mg mL-1, respectively. Purification of the mCherry-tagged proteins by MISPE The crude cell lysis extracts (1/10, v/v) of BL21 E. coli cells transformed with either mCherry-DYKD or mCherry-FLAG were processed in MSP8 and NSP8 cartridges previously equilibrated with binding buffer. After washing with 3 mL of water, the mCherry variants were eluted with 3 x 0.5 mL of eluent buffer (EB) (viz., 0.1 M glycine-HCl buffer, pH 3), which is commonly used to purify FLAG-tagged proteins.39 The cartridges were thoroughly washed with EB and water for further reuse. Eluates were immediately neutralized with 20 μL of Tris buffer (1 M, pH 9), transferred to 96-well plates and measured with a microplate reader (λexc = 587 nm; λem = 610 nm). Robust recoveries (%) were obtained (> 4 cycles) before harsher cleaning was required.32 For quantification in terms of recovery (%), the emission intensity of each eluate was compared with that of an extract of the corresponding cell lysate (50 μL) that was diluted with 450 μL of EB and neutralized with 20 μL of Tris buffer (1 M, pH 9). Figures 4A and 4B show the extraction recoveries obtained for the mCherry- DYKD and mCherry-FLAG lysate extracts, respectively. Total recoveries of up to 95% (RSD < 15%) were obtained for mCherry-DYKD in MSP8 (n = 4, 25 mg MIP); by contrast, recoveries from NSP8 were negligible (R = 1.5%, RSD < 13%). The results were similar for mCherry-FLAG (n = 3, 25 mg MIP), with total recoveries of 103% (RSD < 9%) in MSP8 and 1.5% (RSD < 8%) in NSP8. Whereas most mCherry-DYKD was recovered in the first elution with 0.5 mL of EB, extracting mCherry-FLAG required using larger volumes (2 x 0.5 mL) of disrupting solvent. As also previously found by Schwark et al.,32 MISPE purification not only afforded high, specific capture, but also facilitated gentle, quantitative release of the protein in its functional form. Publicaciones científicas 141 Figure 4. Recoveries (%) obtained after each elution by percolating 500 μL of diluted lysis extract of mCherry-DYKD (A) or mCherry-FLAG (B) (1:10, v/v) and following the whole MISPE process. SDS-PAGE confirmed that MISPE enabled the selective extraction of the tagged proteins from cell lysis extracts. Figures 5A and 5B (lanes 1) show the profile of the diluted lysate. MISPE provided substantial sample cleanup. Analysis of the elution solutions confirmed the presence of either mCherry-DYKD (Figure 5A, lane 3) or mCherry-FLAG (Figure 5B, lane 3) depending on the particular lysate. No signals for the eluates from NSP8 (Figure 5A and 5B, lanes 5) were observed, however. These results confirm that the MIP allowed the interfering matrix components to be removed during the loading and washing steps without compromising retention of the target protein. Also, both proteins were actively retained by the MIP but not by the NIP, which testifies to the usefulness of the epitope imprinting approach for the selective extraction of proteins labelled with DYKD or FLAG tags. The mCherry-FLAG cell lysates were also purified using ANTI-FLAG M2 affinity gel (section 10, Supporting Information), which provided much lower recoveries (R = 58%, RSD < 12%) than with the MIP column. The binding capacity (Q, mg protein g–1 polymer) of the imprinted polymers for both mCherry-tagged proteins was estimated with the BCA assay (section 10, Supporting Information) and found to be 1.78 mg g–1 for mCherry-DYKD and 1.03 mg g–1 for mCherry-FLAG. A Western blot test (see Figure 5C) was carried out with anti-FLAG M2 monoclonal antibodies to confirm the identity of mCherry-FLAG in the different solutions. The analysis of the lysate (lane 1), and of the washing and eluted fractions from the MIP (lanes 2 and 3) and NIP cartridges (lanes 4 and 5), confirmed the presence of mCherry- FLAG in the cell lysis extract and MIP eluate only. The fractions eluted from the MIP column assessed with SDS-PAGE gels (Figure 5A, lane 3 and Figure 5B, lane 3) were analysed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry following “in-gel” trypsin digestion. The MASCOT search details are described in section S10 of the Supporting Information (Figures S6 and S7). Peptide Mass Fingerprint (PMF) analysis of the mCherry-tagged protein bands revealed a total A B 3rd elution 2nd elution 1st elution 0 20 40 60 80 100 MSP8 NSP8 R e c o v e ry ( % ) 3rd elution 2nd elution 1st elution 0 20 40 60 80 100 MSP8 NSP8 R e c o v e ry ( % ) Publicaciones científicas 142 of 25 peptides matched for mCherry-DYKD protein (MASCOT score 203; sequence coverage 85%). Peptide LSFPEGFKWER was confirmed with high confidence (p < 0.05; ion score = 76) by MS/MS analysis. A total of 28 peptides were matched in mCherry- FLAG protein (MASCOT score = 302; sequence coverage = 73%). Peptides LSFPEGFKWER (ion score = 62) and GEEDNMAIIKEFMR (methionine oxidation, ion score = 80) were confirmed with a high confidence by MS/MS analysis. These analyses unraveled the identity of the lower bands coeluting with the mCherry-tagged proteins (denoted by asterisks in Figures 5A and 5B, Lanes 3). An E. coli protein known as superoxide dismutase [Fe] (SODF_ECO57, UniProt accession number P0AGD5, 21.3 kDa) was obtained in both cases and potential protein degradation discarded. Also, PMF analysis allowed a sequence coverage of 94% to be calculated. Selected peptides were subjected to MS/MS analysis and confirmed as described in section 10, Figures S8 and S9 (Supporting Information). The presence of this protein was also observed with the ANTI-FLAG M2 affinity gel (section 10, Supporting Information). In fact, it was described previously by Britton et al.,40 who found coelution of an E.coli protein together with mCherry but did not attempt identification. Figure 5. SDS-PAGE electrophoresis gel of a diluted cell lysis extract from mCherry-DYKD (A), mCherry-FLAG (B) and Western blot analysis of mCherry-FLAG (C): before MISPE (lane 1), washing solution (MISPE lane 2, NISPE lane 4) and elution solution (MISPE lane 3, NISPE lane 5). Purified mCherry-tagged proteins are denoted by an arrowhead (►) and coeluted proteins (superoxide dismutase [Fe]) with an asterisk. Conclusions In conclusion, a novel MIP for the highly selective purification of FLAG or DYKD tagged recombinant proteins based on the epitope imprinting approach was developed. Using MIPs instead of immunoaffinity columns3 considerably reduces assay costs while 1 2 3 4 5 18.5 26 32 44 48 66 96 Marker (kDa) * 1 2 3 4 5 18.5 26 32 44 48 66 96 Marker (kDa) * 1 2 3 4 5 A B C Publicaciones científicas 143 increasing the recovery yields and purity. Also, our results show that the joint use of MIPs and a new fusion tag (DYKD) provides a cost-effective protein purification method requiring no large fusion tags. This antibody-like material fills the existing gap between polymers and antibodies. Acknowledgments This work was funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (Grant CTQ2015-69278-C2-1-R/AIE). The authors are grateful to the Proteomics Unit of the Complutense University of Madrid, which is a member of ProteoRed, PRB3-ISCIII. References [1] L.A. Palomares, S. Estrada-Mondaca, O.T. Ramírez (2014), Production of recombinant proteins, in P. Balbás, A, Lorence (Eds.), Recombinant gene expression: reviews and protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 15–51. [2] A.S. Pina, C.R. Lowe, A.C.A. Roque, Challenges and opportunities in the purification of recombinant tagged proteins, Biotechnol. Adv. 32 (2014) 366–381. [3] D.W. Wood, New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification, Curr. Opin. Struct. Biol. 26 (2014) 54–61. [4] K. Yoshimatsu, T. Yamazaki, Y. Hoshino, P.E. Rose, L.F. Epstein, L.P. Miranda, P. Tagari, J.M. Beierle, Y. Yonamine, K.J. Shea, Epitope discovery for a synthetic polymer nanoparticle: A new strategy for developing a peptide tag, J. Am. Chem. Soc. 136 (2014) 1194–1197. [5] B. Brizzard, Epitope tagging, Biotechniques 44 (2008) 693–695. [6] A. Einhauer, A. Jungbauer, The FLAGTM peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins, J. Biochem. Biophys. Methods. 49 (2001) 455–465. [7] L. Chen, S. Xu, J. Li, Recent advances in molecular imprinting technology: current status, challenges and highlighted applications, Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 2922–2942. [8] N.M. Bergmann, N.A. Peppas, Molecularly imprinted polymers with specific recognition for macromolecules and proteins, Prog. Polym. Sci. 33 (2008) 271–288. [9] A. Poma, A. Guerreiro, M.J. Whitcombe, E. V. Piletska, A.P.F. Turner, S.A. Piletsky, Solid-phase synthesis of molecularly imprinted polymer nanoparticles with a reusable template-"plastic antibodies", Adv. Funct. Mater. 23 (2013) 2821–2827. [10] Y.P. Qin, H.Y. Wang, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Metal chelation dual-template epitope imprinting polymer via distillation-precipitation polymerization for recognition of porcine serum albumin, Talanta 185 (2018) 620–627. Publicaciones científicas 144 [11] P. Palladino, M. Minunni, S. Scarano, Cardiac Troponin T capture and detection in real-time via epitope-imprinted polymer and optical biosensing, Biosens. Bioelectron. 106 (2018) 93–98. [12] L. Liu, T. Zhong, Q. Xu, Y. Chen, Efficient molecular imprinting strategy for quantitative targeted proteomics of human transferrin receptor in depleted human serum, Anal. Chem. 87 (2015) 10910–10919. [13] D.F. Tai, C.Y. Lin, T.Z. Wu, L.K. Chen, Recognition of dengue virus protein using epitope-mediated molecularly imprinted film, Anal. Chem. 77 (2005) 5140–5143. [14] D.F. Tai, M.H. Jhang, G.Y. Chen, S.C. Wang, K.H. Lu, Y. Der Lee, H.T. Liu, Epitope- cavities generated by molecularly imprinted films measure the coincident response to anthrax protective antigen and its segments, Anal. Chem. 82 (2010) 2290–2293. [15] A.M. Bossi, P.S. Sharma, L. Montana, G. Zoccatelli, O. Laub, R. Levi, Fingerprint- imprinted polymer: Rational selection of peptide epitope templates for the determination of proteins by molecularly imprinted polymers, Anal. Chem. 84 (2012) 4036–4041. [16] H. Nishino, C.S. Huang, K.J. Shea, Selective protein capture by epitope imprinting, Angew. Chemie Int. Ed. 45 (2006) 2393–2396. [17] D.Y. Li, X.M. Zhang, Y.J. Yan, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Thermo-sensitive imprinted polymer embedded carbon dots using epitope approach, Biosens. Bioelectron. 79 (2016) 187–192. [18] Y.Q. Yang, X.W. He, Y.Z. Wang, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Epitope imprinted polymer coating CdTe quantum dots for specific recognition and direct fluorescent quantification of the target protein bovine serum albumin, Biosens. Bioelectron. 54 (2014) 266–272. [19] K. Yang, J. Liu, S. Li, Q. Li, Q. Wu, Y. Zhou, Q. Zhao, N. Deng, Z. Liang, L. Zhang, Y. Zhang, Epitope imprinted polyethersulfone beads by self-assembly for target protein capture from the plasma proteome, Chem. Commun. 50 (2014) 9521–9524. [20] Y. Zhang, C. Deng, S. Liu, J. Wu, Z. Chen, C. Li, W. Lu, Active targeting of tumors through conformational epitope imprinting, Angew. Chem. Int. Ed. 54 (2015) 5157–5160. [21] S. Li, K. Yang, B. Zhao, X. Li, L. Liu, Y. Chen, L. Zhang, Y. Zhang, Epitope imprinting enhanced IMAC (EI-IMAC) for highly selective purification of His-tagged protein, J. Mater. Chem. B 4 (2016) 1960–1967. [22] M. M. Titirici, A. J. Hall, B. Sellergren, Hierarchically imprinted stationary phases:  mesoporous polymer beads containing surface-confined binding sites for adenine, Chem. Mat. 14 (2002) 21–23. Publicaciones científicas 145 [23] https://tools.thermofisher. com/content/sfs/manuals/oneshotbl21_man.pdf (accesed July 31st, 2018) [24] T.P. Roosild, S. Castronovo, S. Choe, Structure of anti-FLAG M2 Fab domain and its use in the stabilization of engineered membrane proteins, Acta Crystallogr. 62 (2006) 835–839. [25] S.L. Li, S.J. Liang, N. Guo, A.M. Wu, Y. Fujita-Yamaguchi, Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243–252. [26] A. Knappik, A. Pluckthun, An improved affinity tag based on the FLAG® peptide for the detection and purification of recombinant antibody fragments, Biotechniques, 17 (1994) 754–761. [27] L. Chen, X. Wang, W. Lu, X. Wu, J. Li, Molecular imprinting: perspectives and applications, Chem. Soc. Rev. 45 (2016) 2137–2211. [28] G. Pan, S. Shinde, S.Y. Yeung, M. Jakštaitė, Q. Li, A.G. Wingren, B. Sellergren, An epitope-imprinted biointerface with dynamic bioactivity for modulating cell–biomaterial interactions, Angew. Chem. Int. Ed. 56 (2017) 15959–15963. [29] M.M. Titirici, A.J. Hall, B. Sellergren, Hierarchical imprinting using crude solid phase peptide synthesis products as templates, Chem. Mater. 15 (2003) 822–824. [30] J.L. Urraca, M.D. Marazuela, E.R. Merino, G. Orellana, M.C. Moreno-Bondi, Molecularly imprinted polymers with a streamlined mimic for zearalenone analysis, J. Chromatogr. A 1116 (2006) 127–134. [31] A. Rachkov, N. Minoura, Towards molecularly imprinted polymers selective to peptides and proteins. The epitope approach., Biochim. Biophys. Acta 1544 (2001) 255– 266. [32] S. Schwark, W. Sun, J. Stute, D. Lütkemeyer, M. Ulbricht, B. Sellergren, Monoclonal antibody capture from cell culture supernatants using epitope imprinted macroporous membranes, RSC Adv. 6 (2016) 53162–53169. [33] N.C. Shaner, P.A. Steinbach, R.Y. Tsien, A guide to choosing fluorescent proteins, Nat. Methods 2 (2005) 905–909. [34] S. Costa, A. Almeida, A. Castro, L. Domingues, Fusion tags for protein solubility, purification, and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system, Front. Microbiol. 5 (2014) 1–20. Publicaciones científicas 146 [35] M.A. Palacios, E. Benito-Peña, M. Manesse, A.D. Mazzeo, C.N. LaFratta, G.M. Whitesides, D.R. Walt, InfoBiology by printed arrays of microorganism colonies for timed and on-demand release of messages, Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (2011) 16510–16514. [36] O. Stepanenko, V. Verkhusha, I. Kuznetsova, V. Uversky, K. Turoverov, Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes, Curr. Protein Pept. Sci. 9 (2008) 338–369. [37] A. Rath, M. Glibowicka, V.G. Nadeau, G. Chen, C.M. Deber, Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2009) 1760–1765. [38] N.C. Shaner, R.E. Campbell, P.A. Steinbach, B.N.G. Giepmans, A.E. Palmer, R.Y. Tsien, Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein, Nat. Biotechnol. 22 (2004) 1567–1572. [39] ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Catalog Number A2220 Sigma Aldrich (accesed July 31th, 2018). [40] J. Britton, R.P. Dyer, S. Majumdar, C.L. Raston, G.A. Weiss, Ten-minute protein purification and surface tethering for continuous-flow biocatalysis, Angew. Chem. Int. Ed. 56 (2017) 2296–2301. Supporting information Introduction S1. Histidine imprinted polymer review Table S1. Epitope histidine imprinted polymer (Q, adsorption capacity in mg analyte g-1 polymer; IF, imprinting factor). Template Target Composition Results Ref. His-Ala N-Terminal histidine peptides AAm/EBA/NTA ligand/Ni2+ Kobs = (5.88 ± 0.5) × 10-3 s-1 1 L-histidine Lysozyme MAH/HEMA/Cu2+/ MBA Q = 54.2 mg g-1 2 AASQAALGL- HHHHHH HSA Fe3O4/SiO2/IDA/Ni2+/ dopamine IFepitope = 4.26 IFHSA= 2.12 3 AASQAALGL- HHHHHH HSA SiO2/IDA/MAPS/Ni2+/AA/ DMAPMA /NIPAAm/MBA QHSA = 46.6 mg g-1 IFHSA = 4.0 4 HHHHHH His-tagged GFP SiO2/IDA/MAPS/Ni2+/AA m/MBA/DMP QHis-GFP = 25.7 mg g-1 IFHis-GFP = 7.1 5 Publicaciones científicas 147 Table S1. Cont. HHHHHH His-tagged GFP SiO2/MAPS/NTA/Ni2+ AAm/MBA/DMP QHis-GFP = 35.2 mg g-1 6 AAm: acrylamide; EBA: N,N′-ethylenebis(acrylamide); NTA: nitrilotriacetic acid; Kobs: observed rate constant; MAH: [N-methacryloyl-(l)-histidinemethyl ester]; HEMA: 2- hydroxyethylmethacrylate; MBA: methylenebis(acrylamide); HSA: human serum albumin; IDA: iminodiacetic acid; MAPS: 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate; AA: acrylic acid; DMAPMA: N- [3-(dimethylamino)propyl]methacrylamide; NIPAAm: N-isopropylacrylamide; GFP: green fluorescent protein; DMP: 2-(dodecylthiocarbonothio)-2-methylpropionic acid. Experimental procedures S2. Combinatorial MIP library Figure S1. Chemical structures of the functional monomers and cross-linkers used to develop the combinatorial MIP library. N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride MONOMERS (MAA)(TFMAA)(EAMA HCl) (1-ALLP) (2-DAEM) (HEMA) 2- (trifluoromethyl) acrylic acid Methacrylic acid 1-allylpiperazine N,N-diethylaminoethyl methacrylate 2-hydroxyethyl methacrylate (TRIM) (EDMA)(DVB) (PEGDMA) (MBA) CROSSLINKERS Divinylbenzene Ethyleneglycol dimethacrylate N,N-methylenebisacrylamide Poly(ethyleneglycol) dimethacrylate Trimethylolpropane dimethacrylate Publicaciones científicas 148 Table S2. Composition of the spherical polymers obtained by using silica gel as sacrificial scaffold (MSP1–MSP5). Polymer MSP1 MSP2 MSP3 MSP4 MSP5 DYKD (mmol) 0.0125 0.0125 0.0125 0.0125 0.0125 MAA (mmol) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 TFMAA (mmol) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 HEMA (mmol) 0.1 TRIM (mmol) 0.75 DVB (mmol) 0.75 PEGDMA (mmol) 0.75 MBA (mmol) 0.75 EDMA (mmol) 0.75 ABDV (mmol) 0.068 0.068 0.068 0.068 0.076 DMF (µL) 332 157 385 168 220 Silica (g) 1.5 0.8 2.4 0.8 1 T:FM:CL 0.5:2:2:30 0.5:2:2:4:30 Table S3. Composition of the spherical polymers obtained by using silica gel as sacrificial scaffold (MSP6–MSP10). Polymer MSP6 MSP7 MSP8 MSP9 MSP10 DYKD (mmol) 0.0125 0.0125 0.0125 FLAG (DYKDDDDK) (mmol) 0.0125 Aspartic acid (mmol) 0.0125 1-ALLP (mmol) 0.1 2-DAEM (mmol) 0.1 EAMA·HCl (mmol) 0.075 0.075 0.075 EDMA(mmol) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 ABDV (mmol) 0.048 0.048 0.048 0.048 0.048 DMF (µL) 144 152 142 142 142 Silica (g) 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 T:FM:CL 0.5:4:20 0.5:3:20 Publicaciones científicas 149 S3. Chromatographic analysis of DYKD and FLAG peptides by rapid resolution liquid chromatography (RRLC) Chromatographic analyses were performed on an Agilent 1200 series Rapid Resolution Liquid Chromatography (RRLC) system (Palo Alto, CA, USA) equipped with a binary pump, online degasser, high-performance autosampler, column thermostat and 1260 Infinity diode array detector (DAD) detector system. Chromatographic separation was done with an ACE Excel 2 C18-PFP analytical column (100 mm × 2.1 mm, 2 μm) from Advanced Chromatography Technologies Ltd. (Aberdeen, Scotland) at 45 ºC. The mobile phase a mixture of solvent A (water/trifluoroacetic acid, TFA) 0.1% (v/v) and solvent B (acetonitrile, ACN), and used according to the following gradient programme: 98–92% A (0–9 min), 92–30% A (9–9.1 min), 30–98% A (9.1–17 min) and 98% A (17– 29 min). The flow rate was 0.4 mL min–1 and the injected volume 30 μL. All peptides were quantified at λ = 220 nm. S4. Bacterial strains, plasmids and growth conditions Two different strains of E. coli (One Shot TOP10 and BL21 Star (DE3) One Shot, Invitrogen) were cultured in LB Broth with agar (Lennox) (LB, Sigma-Aldrich) at 37 ºC for 20 h and Terrific Broth (TB, Conda) at 37 ºC with aeration and vigorous shaking (230 rpm) for 16 h. For colony selection, kanamycin (Sigma-Aldrich) was added to each medium to a final concentration of 50 mg L–1. One Shot BL21 (DE3) E. coli strain (Invitrogen) contains the DE3 lysogen, which carries the gene for T7 RNA polymerase under control of lacUV5 promoter; this required isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, Sigma-Aldrich) to induce polymerase expression. By contrast, One Shot TOP10 E. coli strain (Invitrogen) required no IPTG to induce expression from the lacZ promoter. The bacterial strains used for expression of recombinant mCherry proteins in E. coli are summarized in Table S4. For genomic DNA extraction, bacteria were grown overnight (16 h) and strains kept as frozen stock at -80 ºC in TB containing a 50 mg L–1 concentration of antibiotic plus 50 % (v/v) glycerol (Fisher Scientific) until use. Table S4. Bacterial strains (Invitrogen) used. E. coli strain Genotype One Shot TOP10 F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG BL21 Star (DE3) One Shot F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) Publicaciones científicas 150 Plasmid pmCherry (Clontech Laboratories) was used as DNA source for cloning and expression, and plasmid pQE-T7-2 (Qiagen) as host to construct the transformed E. coli strains containing the gen templates of the new recombinant plasmids mCherry- DYKD and mCherry-FLAG. S5. Construction of the pQE-T7-2 (mCherry-DYKD) and pQE-T7-2 (mCherry-FLAG) plasmids Recombinant DNA techniques were performed according to the protocols described by Sambrook and Russell.7 The polymerase chain reaction (PCR) mixtures contained 5 μL of each primer (Table S5, Integrated DNA Technologies) from a 10 μM stock solution, 5 μL of 10X Pfu Ultra II reaction buffer (Agilent), 0.5 μL of dNTPs mix (100 mM each, Millipore), 10 μL of betaine 1 M (Sigma-Aldrich) and 2 μL of KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase (Merck Millipore). The mixtures were supplied with 1.5 μL of DNA template (30 ng) and the total volume was made to 50 μL with autoclaved distilled water. Table S5 shows the composition of the oligonucleotide primers (forward and reverse) used to prepare the recombinant proteins. The PCR was conducted in an SureCycler 8800 Thermal Cycler from Agilent. The process started with 3 min of denaturation at 94 ºC, followed by 30 cycles of 1 min of denaturation (94 ºC), 1 min of annealing at the primer specific temperature (60 ºC) and 1 min of elongation (72 ºC). An additional time of 7 min at 72 ºC was used to allow the reaction to complete. A negative control containing no DNA template and a positive control [purified λ DNA (Invitrogen)] were included in all PCR batches. Chimeric DNA recombinant products from PCR (cDNAs), encoding either FLAG tagged mCherry or DYKD tagged mCherry genes (designated “mCherry-tag” here), were isolated by using a GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare) and quantified spectrophotometrically on a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific) according to the manufacturer’s instructions. An amount of 1 μg of amplified mCherry-tag cDNA fragments was double digested with FastDigest KpnI High Fidelity (HF)/SacI HF FastDigest and host plasmid pQE-T7-2 was triple digested, also using NotI HF FastDigest (Thermo Scientific) to avoid plasmid religation. The inserts mCherry-DYKD and mCherry-FLAG were ligated into the host digested plasmid pQE-T7-2 (plasmid:cDNA mole ratio 1:2, 100:200 fmol) with T4 DNA ligase (DNA Ligation kit, Agilent) to obtain pQE-T7-2-(mCherry-DYKD) and pQE- T7-2-(mCherry-FLAG), respectively. The ligation reaction was conducted on an Agilent SureCycler 8800 Thermal Cycler (Agilent) at 16 ºC for 18 h and was followed by a heat- shock at 65 ºC for 10 min. Publicaciones científicas 151 The plasmids were propagated in chemically competent E.coli cells (One Shot TOP10 E. coli strains) as described elsewhere.8 The mixture was plated on LB agar plates at 37 ºC for 20 h, and the selected target colonies were manually screened as also described elsewhere.9 Single colonies were grown in TB containing 50 mg L–1 kanamycin at 37 ºC under stirring at 230 rpm for 16 h. Bacterial cells were harvested from the TB medium by centrifugation at 5000 rpm at 4 ºC for 15 min and pellets treated to extract the plasmids and purified by using a GenElute Plasmid MiniPrep Kit (Sigma- Aldrich). Finally, the plasmids were subjected to electrophoresis on 0.8 % (w/v) agarose precast gels stained with a proprietary stain using an E-Gel Go! System (Invitrogen) and sequenced to confirm the correct gene composition at the Genomics and Proteomics Research Support Center of Complutense University. Table S5. Primer libraries used for the expression of mCherry proteins tagged with the peptides DYKD and FLAG.a Fluorescent protein Primer Sequence Acronym mCherry- DYKD Forward 5´- GCG AGCTCATGG ATT ACA AGG ATG TGA GCA AGG GCG AGG AGG AT-3´ FP-mCherry -SacI- M-DYKD Reverse 5'- GTG GTA CCT CAC TTG TAC AGC TCG TCC ATG CC-3' RP-mCherry-KpnI- ST mCherry- FLAG Forward 5´- GCG AGC TCA TGG ATT ACA AGG ATG ACG ACG ATA AGG TGA GCA AGG GCG AGG AGG AT -3´ FP-mCherry -SacI- M-FLAG Reverse 5'- GTG GTA CCT CAC TTG TAC AGC TCG TCC ATG CC-3' RP-mCherry-KpnI- ST aBold type: restriction enzyme sequence; Underlined: nucleotides codifying peptides DYKD and FLAG. S6. Protein Expression in BL21(DE3) Competent E. coli One Shot BL21 Chemically competent E. coli strains were transformed with the corresponding plasmids pQE-T7-2-(mCherry-DYKD) and pQE-T7-2-(mCherry-FLAG) as described elsewhere.10 The mixtures were plated on LB agar plates, supplemented with a 50 mg L–1 concentration of kanamycin and incubated at 37 ºC for 20 h. Then, manually screened single colonies were grown in LB agar plates containing 15 μL of spread IPTG at 37 ºC for 20 h to induce protein expression. Selected single colonies were inoculated in TB supplemented with 50 mg L–1 kanamycin at 37 ºC under stirring at 230 rpm for 16 h until OD600 was 0.6–1. Then, IPTG was added to the culture to a final concentration of 1 mM in order to induce protein expression, and cell growth was continued for 4 h. Finally, Publicaciones científicas 152 transformed cells were harvested by centrifugation at 5000 rpm at 4 ºC for 10 min and the resulting pellets were frozen at -80 ºC for 2 days to facilitate protein extraction. Proteins were extracted by using lysis buffer (Bacterial Cell Lysis Buffer, NYZ Tech.) supplemented with DNase I and lysozyme to facilitate the process. Pellets were resuspended in lysis buffer (5 mL g–1 cell pellet) and incubated on a rotating mixer at room temperature for 1 h. Insoluble cell debris was removed by centrifugation at 11 000 rpm at 4 ºC for 15 min. Lysis extracts were filtered through SPE frits (20 μm pore size, Agilent) and stored at -80 ºC until use. Results and discussion S7. Chromatographic analysis of DYKD and FLAG peptides by RRLC Figure S2 shows the chromatogram for a mixture of peptides DYKD and DYKDDDDK. Calibration graphs were linear over the 0-15 mg L–1 range for all peptides (r2 > 0.9991). Recoveries (%) were calculated from external calibration peak area measurements. Figure S2. Typical HPLC-DAD chromatogram for a mixture of peptides DYKD and DYKDDDDK (5 mg L–1) in water/TBA (1%, w/v). Chromatographic conditions are described in Section S3. S8. Imprinting factor (IF) calculations for optimal MIP/NIP tandem The imprinting factor (IF) for each peptide was calculated as the ratio of its recovery from the MIP (MSP8) to that from the NIP (NSP8). Time (min) 0 2 4 6 8 m A U 0 50 100 150 200 DYKD DYKDDDDK Publicaciones científicas 153 Table S6. Imprinting factors (IF) for the peptides DYKD and FLAG (DYKDDDDK) under optimum conditions (MIP, MSP8; NIP, NPS8). Analyte Recovery (MSP8) Recovery (NSP8) IF DYKD 64% 5% 12.8 FLAG (DYKDDDDK) 89% 27% 3.3 S9. Identification and quantification of mCherry variants SDS-PAGE electrophoresis Target proteins were identified by using SDS-PAGE electrophoresis to compare non-induced and induced cultures containing the overexpressed proteins (Figure S3). Figure S3. (A) Identification of mCherry-FLAG and mCherry-DYKD by SDS-PAGE under non- reducing conditions. Samples obtained from induced (+) and non-induced (–) cultures were mixed in a 1:1 (v/v) ratio with sample buffer [62.5 mM Tris-HCl, 2% SDS (w/v), 25% glycerol (v/v) and 0.01% bromophenol blue (w/v), pH 6.8] and heated at 95 ºC for 5 min. The samples were loaded in 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel from BioRad (10-well, 30 μL). Precision Plus Protein Dual Color Standards from BioRad were used as protein molecular weight markers. (B) Cell lysis extracts obtained from mCherry-FLAG and mCherry-DYKD induced cultures. (C) Fluorescence emission spectra for mCherry-FLAG and mCherry-DYKD diluted cell lysis extracts in Tris buffer (20 mM, pH 7.5) as recorded on a Varian Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer. 100 25 20 15 10 37 50 75 150 - + Marker (kDa) - + mCherry- FLAG mCherry- DYKD nm 450 500 550 600 650 700 F lu o re s c e n c e / n o rm . 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mCherry-DYKD mCherry-FLAG mCherry- FLAG mCherry- DYKDA B C Publicaciones científicas 154 Table S7. Amino acid sequences and molecular weights (MW) of the recombinant engineered mCherry tagged proteins as calculated by using ProtParam in Expasy web tool. Fluorescent protein Amino acid sequence MW (kDa) mCherry- DYKD MDYKDVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGE GEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYV KHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQ DGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPED GALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNV NIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK 27.24 mCherry- FLAG MDYKDDDDKVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEF EIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYG SKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQ DSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSER MYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLP GAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK 27.71 Native PAGE electrophoresis Native PAGE electrophoresis was performed on a BioRad MiniProtean Cell electrophoresis apparatus using a PowerPac power supply set at constant voltage of 100 V in native SDS-free running buffer (3.03 g L–1 Tris base, 14.41 g L–1 glycine, pH 8.3). Cell lysis extracts (5 μL) from mCherry-DYKD and mCherry-FLAG were mixed separately 1:1 (v/v) with native non-reducing, non-denaturing sample buffer [50 mM Tris- HCl, 30% glycerol (v/v) and 0.01% Bromophenol Blue (w/v), pH 6.8] and loaded directly in native hand-casted gels. Resolving native gels (10%) and stacking native gels (4%) were prepared without SDS. After electrophoresis, two red bands were directly seen in the gel (Figure S4) with fluorescence emission (Irradiation with UV light of 312 nm from a Spectroline 312A UV table; band-pass filter 475 nm) corresponding to mCherry-tagged proteins. No staining was required. Isoelectric points (pI) were calculated by using ProtParam in Expasy web tool. The bicinchoninic acid assay (BCA assay) For quantification purposes, fluorescence bands were manually excised from the gel and completely immersed in elution buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl and 0.1 mM EDTA, pH 7.5). Gel pieces were crushed, incubated in a rotatory shaker at 30 ºC overnight and centrifuged at 10000 g for 10 min. The supernatant was carefully transferred to a new tube and protein content was determined with the BCA test (Pierce Publicaciones científicas 155 BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher) as per the manufacturer’s instructions. The total protein content of each cell lysis extract was determined in parallel with the BCA assay. Figure S4. Native PAGE gel of cell lysis extracts of proteins mCherry-FLAG (lane A, pI 5.29) and mCherry-DYKD (lane B, pI 5.5). Table S8. Protein content (expressed as mCherry-tagged protein and total protein) in mCherry- tag cell lysis extracts as calculated with the BCA assay. Protein mCherry-tagged protein content Total protein content mCherry-DYKD 0.94 mg mL-1 5.35 mg mL-1 mCherry-FLAG 0.50 mg mL-1 5.38 mg mL-1 S10. Purification of mCherry proteins Protein binding capacity (Q) of imprinted polymer MSP8 and non-imprinted polymer NSP8 The binding capacity of the synthesized polymers (MSP8 and NSP8) was calculated from the total recovery of mCherry-tagged proteins obtained in the three consecutive elutions (Main Text, Figure 4) with provision for the total amount of mCherry-tagged protein contained in the cell lysis extracts loaded onto the polymer columns (50 μL of cell lysate, 25 mg of polymer). The protein concentrations of the cell lysates as determined with the BCA test assay (Section 9, Table S8, Supporting Information) were 0.94 mg mL-1 for mCherry-DYKD and 0.50 mg mL-1 for mCherry-FLAG. The imprinting factor was calculated as the ratio of the recovery obtained with the MIP (MSP8) to that obtained with the NIP (NSP8) for each protein. A B Publicaciones científicas 156 SDS PAGE electrophoresis Selective binding of the target proteins to the MIP/NIP cartridges was examined by SDS-PAGE electrophoresis. All cell lysate samples were passed through a centrifugal filtration device (Amicon Ultra 0.5 mL Filters MWCO 3K, Merck Millipore), diluted 1:1 (v/v) with “sample buffer” (SDS Gel Preparation Kit, content not specified, Sigma) and heated at 95 ºC for 5 min before analysis by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) according to Laemmli.11 Gels were hand-casted (10% resolving gel, 3% stacking gel) according to the manufacturer’s instructions (SDS Gel Preparation Kit, Sigma). Electrophoresis was performed on a BioRad MiniProtean Cell apparatus using a PowerPac power supply at constant voltage of 200 V. After washing with de-ionized water, gels were stained by incubation with Coomassie Brilliant Blue R250 from BioRad (0.3 % w/v, methanol, water and acetic acid 45:45:10, v/v) for 1 h and then destained with a mixture of methanol, water and acetic acid (45:45:10, v/v) under shaking at room temperature. A protein marker of low molecular weight (18.5–96 kDa) from NZY Tech was used to assess the relative molecular sizes of the proteins separated by electrophoresis. Enhanced chemiluminescence-Western Blot (ECL-WB) test The eluted solutions from MIP/NIP cartridges were subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis and the protein profile from the gel was electrophoretically transferred to a PVDF membrane (BioRad). Transfer was accomplished by using a Mini Trans-Blot Cell system from BioRad in a BioRad MiniProtean Cell electrophoresis apparatus equipped with a PowerPac power supply operated at 100 V and 160 mA for 90 min. The membrane was incubated in blocking buffer [PBS 1X, Tween-20 (0.1% v/v)] and non-fat milk (3% w/v) at room temperature with gentle agitation for 1 h. The blocking agent was removed and the membrane was washed with TBS (1X) at pH 8. PBS was obtained from Sigma-Aldrich and Tween-20 from Thermo Fisher. The monoclonal antibody ANTI-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) was added to a final concentration of 1 µg mL-1 (1:1000 dilution of the antibody as supplied) in 10 mL of TBS (1X) containing 3% non-fat milk. The membrane was incubated at 4ºC with gentle agitation overnight. After the monoclonal ANTI-FLAG M2 solution was decanted off, the blot was washed with TBS(1X)–Tween (0.1% v/v). The secondary antibody was added as a mixture of goat anti-mouse antibody (dilution 1:2500, Pierce) and goat antirabbit (dilution 1:3000, BioRad). After incubation at room temperature for 1 h, the antibody mixture was decanted off and the membrane washed with TBS(1X)-Tween (0.1% v/v). Publicaciones científicas 157 Finally, the membrane was reacted with the ECL substrate solution (PierceTM ECL Western Blotting Substrate, Thermo Fisher). Immunoblots were scanned and processed by using a FluorChem SP enhanced chemiluminescence imaging system (Alpha Innotech). Purification of mCherry-FLAG recombinant protein using ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Purification of mCherry-FLAG fusion protein from cell lysate was performed using ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma Aldrich) according to the manufacturer’s instructions.12 Briefly, a volume of 250 μL of resin slurry was transferred to a 1 mL solid- phase extraction cartridge. After conditioning with glycine (0.1 M, pH 3.5) and TBS buffers (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), 500 μL of sample (50 μL of mCherry- FLAG cell lysate diluted to 500 μL with TBS) was percolated through the column by gravity flow. The column was rinsed with 10 mL of TBS and the proteins were eluted with 6 x 1 mL of glycine buffer (0.1 M, pH 3.5) at a flow rate of 0.4 mL min–1 with the aid of an 8-channel Ismatec ISM936D peristaltic pump and immediately neutralized with 20 μL of Tris buffer (1 M, pH 8). Flow-through and eluate samples were transferred to the wells of 96-microtiter plates (Greiner) and directly measured with a CLARIOstar microplate reader from BMG LabTech (Ortenberg, Germany). Fluorescence signals were recorded at the characteristic wavelengths for mCherry (λexc = 587 nm, λem = 610 nm). For quantification purposes in terms of recovery (%), the emission intensity of the eluted sample was compared with the fluorescence signal obtained for a solution containing 50 μL of cell lysate diluted with 950 μL of glycine buffer (0.1 M, pH 3.5) and 20 μL Tris buffer (1 M, pH 8). Purification of mCherry-FLAG protein was done in triplicate. Protein separation was carried out by SDS-PAGE using the conditions described in Section S10 of the Supporting Information. Precision Plus Protein Dual Color Standards (10–250 kDa) from BioRad was used as protein molecular weight marker. After destained, the gel was imaged using ImageJ Software and further analyzed by ImageLab Software (Version 6.0, Bio-Rad). Bands were manually selected and individual purity values (%) were obtained. We observed an incomplete retention of the mCherry fusion protein in the ANTI- FLAG M2 Affinity Gel during the loading step (Rloading = 16%, RSD ≤ 33%). Elution of mCherry-FLAG was achieved in the first aliquot in all cases (Relution = 58%, RSD ≤ 12%), being negligible (Relution ≤ 1%) in the next five aliquots. As shown in Figure S5, the mCherry-FLAG protein appears in the flow-through (lane 2) and in the eluate samples (lane 3) (denoted by an arrowhead, ►). A protein of lower molecular weight, suspected Publicaciones científicas 158 to be superoxide dismutase [Fe] (denoted by an asterisk, *), as described previously, coeluted with mCherry-FLAG in the elution solution. Figure S5. SDS-PAGE gel of mCherry-FLAG protein purification using ANTIFLAG M2 Affinity Gel from a cell lysate (lane 1): flow-through sample (lane 2) and elution solution (lane 3). Purified mCherry-FLAG protein is denoted by an arrowhead (►) and coeluted protein with an asterisk. Purity evaluation was carried out using the protocol described by Li et al.13 for both the MIP (Figure 5A and Figure 5B, lane 3) and the ANTI-FLAG M2 affinity gel (Figure S5, lane 3) eluates. The purity values for mCherry-FLAG were 31% and 38% in the affinity gel and the MIP cartridge, respectively. While for the mCherry-DYKD protein purity reached a value of 53% in the polymer cartridge. Therefore, the MIP provides slightly higher purities than the ANTIFLAG M2 Affinity Gel. In comparison with the antibody-based extraction, the use of the synthesized imprinted polymer MSP8 allows the complete recovery (RMSP8 = 103%) of the mCherry-FLAG protein in the elution step, whereas the maximum recovery value using the ANTI-FLAG M2 gel was 65%. Protein identification by MALDI-TOF mass spectrometry Electrophoretically resolved proteins obtained from MISPE eluate samples (Manuscript, Figure 5) were excised from the gel and subsequently in-gel reduced, alkylated and digested with trypsin according to Sechi et al.14 Briefly, electrophoresis bands were washed twice with water, shrunk with 100% acetonitrile for 15 min and dried in a Savant SpeedVac concentrator for 30 min. Then, the samples were reduced with 10 mM dithioerytritol in 25 mM ammonium bicarbonate at 56 ºC for 30 min and subsequently alkylated with 55 mM iodoacetamide in 25 mM ammonium bicarbonate for 15 min in the dark. Finally, samples were digested with 12.5 ng μL-1 sequencing grade trypsin (Roche 1 2 3 M (kDa) 25 20 15 37 50 75 100 150 250 * Publicaciones científicas 159 Molecular Biochemicals) in 25 mM ammonium bicarbonate (pH 8.5) at 37 ºC overnight. After digestion, a volume of 1 μL was spotted onto a MALDI target plate and allowed to air-dry at room temperature. Then, 0.6 μL of a 3 mg mL-1 solution of α-cyano-4-hydroxy- transcinnamic acid matrix (Sigma) in 50% acetonitrile was added to the dried peptide digest spots, which were again allowed to air-dry at room temperature. MALDI-TOF MS analyses were performed on a 4800 Plus Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Applied Biosystems, MDS Sciex, Toronto, Canada) at the Proteomics Unit of the Complutensian University of Madrid. The spectrometer was operated in the positive reflector mode, using an accelerating voltage of 20 000 V. All mass spectra were calibrated internally against peptides from trypsin autodigestion. The MALDI-TOF/TOF MS technique provides peptide mass fingerprints (PMFs), and peptides with a signal-to-noise ratio greater than 10 can be collated and represented as a list of monoisotopic molecular weights that can be compared with the masses of theoretical trypsin digestion of sequences annotated in a protein database. Those proteins that were ambiguously identified from the PMFs were subjected to MS/MS sequencing analysis. Thus, MS spectra were used to select suitable precursors for MS/MS analysis by Collision Induced Dissociation (CID), using atmospheric gas and the MS/MS-1 Kv operating mode with a precursor mass windows of ± 4 Da. The plate model and default calibration were optimized for processing of MS/MS spectra. Proteins were identified by using the Swissprot database (date 2017/01/16; 553231 sequences) without taxonomic restriction and the custom-made Database mCherry with the two sequences of recombinant proteins (mCherry-DYKD and mCherry-FLAG). The databases were searched by using a local license of MASCOT engine v. 2.3 (Matrix Science, London; http://www.matrixscience.com) through the software Global Protein Server v.3.6 from ABSciex. The search parameters were as follows:  Trypsin  2 missed trypsin cleavage site allowed  Carbamidomethyl cystein as fixed modification  Oxidized methionine; Acetyl (Protein N-term); Met-loss (Protein N-term M); Met- loss+Acetyl (Protein N-term M) as variable modifications  Peptide mass tolerance 50 ppm for PMF and 80 ppm for MS/MS or combined searches  Peptide charge state +1  MS–MS fragment tolerance 0.3 Da The parameters for the combined search (Peptide mass fingerprint plus MS–MS spectra) were identical with the previous ones. The probability scores for all protein identifications were greater than that set as significant (p < 0.05) by MASCOT. Publicaciones científicas 160 Figure S6. (A) MALDI-TOF mass spectrum of mCherry-DYKD eluted protein (band ► in Figure 5A, Lane 3), peaks displayed in red are matched peptides, peaks in black were excluded of peak list (peptides of trypsin, internal standards, and other typical contaminants, etc.), and blue peaks are unmatched peptides. (B) Sequence coverage of matched peptides (bold red) in mCherry- DYKD. Underlined peptide confirmed by MS/MS analysis. Figure S7. (A) MALDI-TOF mass spectrum of mCherry-FLAG eluted protein (band ► in Figure 5B, Lane 3), peaks displayed in red are matched peptides, peaks in black were excluded (peptides of trypsin, internal standards, and other typical contaminants, etc.) of peak list used in searching, and blue peaks are unmatched peptides. (B) Sequence coverage of matched peptides (bold red) in mCherry-FLAG. Underlined peptides confirmed by MS/MS analysis. 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Mass 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 C l u s t e r A r e a 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Mass 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 C l u s t e r A r e a MS - INTERNAL CALIBRATION Plate: 1 Spot: A1 MS - INTERNAL CALIBRATION Plate: 1 Spot: A1 3747.75 3607.58 3565.48 3550.51 3532.533274.40 3212.37 3153.35 3121.52 3106.44 2928.26 2894.31 2878.28 2612.08 2574.17 2550.17 2545.29 2465.22 2397.20 2329.10 2299.05 2273.15 2240.01 2225.03 2192.08 2163.07 2144.08 2093.151856.97 1783.90 1775.84 1740.05 1646.87 1629.90 1583.88 1570.72 1540.92 1505.78 1490.78 1450.77 1427.75 1395.76 1377.72 1331.70 1296.75 1225.68 1201.58 1168.67 1153.57 1113.60 1090.54 1063.61 1023.64 1007.64 904.54 854.13 A B 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Mass 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 C lu s t e r A r e a 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Mass 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 C lu s t e r A r e a MS - INTERNAL CALIBRATION Plate: 1 Spot: A3 MS - INTERNAL CALIBRATION Plate: 1 Spot: A3 3736.64 3610.19 3566.22 3550.20 3521.173292.88 3274.91 3249.95 3211.85 3121.87 3105.81 3006.77 2916.52 2878.53 2831.72 2691.40 2638.33 2573.24 2545.35 2498.29 2383.972337.07 2289.15 2273.16 2225.03 2191.04 2163.05 2020.00 1996.94 1851.881795.83 1776.29 1734.86 1698.76 1682.77 1646.81 1611.81 1553.74 1540.87 1505.74 1450.73 1427.71 1395.72 1347.67 1331.68 1297.62 1232.61 1169.61 1153.57 1113.11 1090.57 1023.60 972.69 855.23 852.48 A B Publicaciones científicas 161 Figure S8. (A) MALDI-TOF mass spectrum for mCherry-DYKD co-eluted protein (band * in Figures 5A, Lane 3, Main Text). The red peaks correspond to matched peptides, the blue peaks to unmatched peptides and the black peaks to substances excluded from the peak list (trypsin peptides, internal standards, other typical contaminants, etc.). (B) Sequence coverage of matched peptides (bold red) in superoxide dismutase. Underlined peptides confirmed by MS/MS analysis: SFELPALPYAK (ion score 88), SLEEIIR (ion score = 53), AQFTDAAIK (ion score = 79) and NFGSGWTWLVK (ion score = 107). Figure S9. (A) MALDI-TOF mass spectrum for mCherry-FLAG co-eluted protein (band * in Figures 5B, Lane 3, Main Text). The red peaks correspond to matched peptides, the blue peaks to unmatched peptides and the black peaks to substances excluded from the peak list (trypsin peptides, internal standards, other typical contaminants, etc.). (B) Sequence coverage of matched peptides (bold red) in superoxide dismutase. Underlined peptide confirmed by MS/MS analysis: NFGSGWTWLVK (ion score 95). 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Mass 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 C l u s t e r A r e a 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Mass 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 C l u s t e r A r e a MS - INTERNAL CALIBRATION Plate: 1 Spot: A2 MS - INTERNAL CALIBRATION Plate: 1 Spot: A2 3900.04 3867.07 3853.67 3759.72 3721.98 3690.97 3680.78 3647.96 3590.77 3284.70 3154.54 3088.63 3054.47 2995.44 2881.44 2872.51 2681.29 2674.25 2642.30 2598.30 2576.31 2548.31 2518.22 2506.172411.17 2356.21 2289.14 2273.16 2240.18 2193.06 2163.05 2115.93 2036.92 2014.97 1999.89 1934.94 1876.85 1846.91 1828.84 1786.86 1740.67 1694.85 1668.75 1652.76 1630.77 1581.63 1573.75 1549.78 1490.72 1465.72 1389.62 1362.64 1326.60 1316.59 1294.61 1257.60 1235.61 1203.56 1131.54 1111.56 1034.07 1007.95 964.46 906.46 884.40 859.42 A B 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Mass 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 C l u s t e r A r e a 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Mass 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 C l u s t e r A r e a MS - INTERNAL CALIBRATION Plate: 1 Spot: A4 MS - INTERNAL CALIBRATION Plate: 1 Spot: A4 3924.19 3899.17 3867.21 3822.25 3748.11 3713.99 3691.08 3680.88 3624.81 3520.70 3384.76 3283.71 3195.67 3153.56 3081.66 3010.62 2983.40 2882.44 2879.52 2681.27 2658.30 2642.31 2597.25 2576.33 2547.32 2519.292428.13 2417.22 2325.14 2289.14 2273.16 2229.06 2193.04 2163.05 2036.95 2014.98 1983.90 1934.441886.88 1846.43 1784.851750.85 1716.84 1694.88 1652.77 1630.79 1612.78 1573.78 1549.81 1490.72 1443.66 1395.70 1389.65 1348.57 1326.63 1294.65 1257.62 1235.66 1203.60 1180.59 1111.56 1073.61 1021.53 992.52 964.51 918.49 887.01 859.50 A B Publicaciones científicas 162 References [1] B.R. Hart, K.J. Shea, Molecular imprinting for the recognition of N-terminal histidine peptides in aqueous solution, Macromolecules 35 (2002) 6192–6201. [2] N. Bereli, Y. Saylan, L. Uzun, R. Say, A. Denizli, L-histidine imprinted supermacroporous cryogels for protein recognition, Sep. Purif. Technol. 82 (2011) 28– 35. [3] J. Liu, B. Jiang, L. Zhang, Y. Zhang, Surface-imprinted nanoparticles prepared with a his-tag-anchored epitope as the template, Anal. Chem. 87 (2015) 4617–4620. [4] S. Li, K. Yang, N. Deng, Y. Min, L. Liu, L. Zhang, Y. Zhang, Thermoresponsive epitope surface-imprinted nanoparticles for specific capture and release of target protein from human plasma, ACS Appl. Mater. Interfaces 8 (2016) 5747–5751. [5] S. Li, K. Yang, B. Zhao, X. Li, L. Liu, Y. Chen, L. Zhang, Y. Zhang, Epitope imprinting enhanced IMAC (EI-IMAC) for highly selective purification of His-tagged protein. J. Mater. Chem. B 4 (2016) 1960–1967. [6] S. Li, K. Yang, L. Liu, B. Zhao, Y. Chen, X. Li, L. Zhang, Y. Zhang, Surface sieving coordinated IMAC material for purification of His-tagged proteins. Anal. Chim. Acta 997 (2018) 9–15. [7] J. Sambrook, D. W. Russell (Eds.) (2001), Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; New York. [8] https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/oneshottop10_man.pdf (accesed July 31st, 2018). [9] M.A. Palacios, E. Benito-Peña, M. Manesse, A.D. Mazzeo, C.N. LaFratta, G.M. Whitesides, D.R. Walt, InfoBiology by printed arrays of microorganism colonies for timed and on-demand release of messages, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2011) 16510– 16514. [10] https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/oneshotbl21_man.pdf (accesed July 31st, 2018) [11] U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680–685. [12] ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Catalog Number A2220 Sigma Aldrich (accesed February 5th, 2019). Publicaciones científicas 163 [13] S. Li, K. Yang, L. Liu, B. Zhao, Y. Chen, X. Li, L. Zhang, Y. Zhang, Surface sieving coordinated IMAC material for purification of His-tagged proteins, Anal. Chim. Acta 997 (2018) 9–15. [14] S. Sechi, B. T. Chait, Modification of cysteine residues by alkylation. a tool in peptide mapping and protein identification, Anal. Chem. 70 (1998) 5150–5158. Publicaciones científicas 165 3.1.2. Publicación II: Hierarchically imprinted polymer for peptide tag recognition based on an oriented surface epitope approach Reproduced from: ACS Applied Materials and Interfaces 12 (2020) 49111−49121 Copyright © 2020, with permission from American Chemical Society Abstract FLAG tag (DYKDDDDK) is a short peptide commonly used for the purification of recombinant proteins. The high price of the affinity columns and their limited reusability are a shortcoming for their widespread use in biotechnology applications. Molecularly imprinted polymers (MIPs) can circumvent some of the limitations of bioaffinity columns for such application, including long-term stability, reusability and cost. We report herein the synthesis of MIPs selective to the FLAG tag by hierarchical imprinting. Using the epitope imprinting approach, a 5-aminoacid peptide DYKDC was selected as template and was covalently immobilized on the surface of microporous silica beads, previously functionalized with different aminosilanes namely, 3-(2- aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane, AEAPMS, and N-(2-aminoethyl)-2,2,4- trimethyl-1-aza-2-silacyclopentane, AETAZS. We investigated the effect of the type of silane on the production of homogeneous silane-grafted layers with the highest extent of silanol condensation as possible using 29Si CP/MAS NMR. We observed that the right orientation of the imprinted cavities can substantially improve analyte recoveries from the MIP. After template and silica removal, the DYKDC-MIPs were used as sorbents for solid-phase extraction (molecularly imprinted solid-phase extraction) of the FLAG peptide showing that the polymer prepared with AETAZS-bound silica beads contained binding sites more selective to the tag (RMIP-AZA = 87.4% vs RNIP-AZA = 4.1%, n = 3, RSD ≤ 4.2%) than those prepared using AEAPMS (RMIP-DM = 73.4% vs RNIP-DM = 23.2%, n = 3, RSD ≤ 4.0%) as a functionalization agent. An extensive computational molecular Publicaciones científicas 166 modeling study was also conducted, shedding some light on the interaction mechanism between the FLAG peptide and the imprinted template in the binding cavities. Introduction The advent of fusion tags marked a milestone in biotechnology, allowing protein purification on demand. These affinity tags are short polypeptides expressed together with the target protein by recombinant DNA technology. Its further purification is based mainly on the interaction between specific antibodies and the fused peptidic sequence. Despite the commercial availability of immunoaffinity resins and their variety, the production of antibody receptors is time-consuming and expensive. Therefore, a broad palette of peptide tags has emerged, resulting in a wide diversity of different sequences, sizes and features of application in different fields.1 FLAG tag is a versatile purification peptide composed of eight aminoacids (DYKDDDDK) specifically designed by Hopp et al.2 for immunopurification chromatography. Because of its hydrophilic nature, the tag is located on the surface of the recombinant protein, increasing the solubility of the fusion partner to achieve higher purity values. Moreover, this polypeptide does not interfere with the structure and function of the fused protein and can be used in different expression systems.3 It can be applied as a single peptide or in a combination of three consecutive repetitions (3 x FLAG).4 FLAG-tagged proteins are purified using anti-FLAG monoclonal antibodies (M1 or M2) immobilized on agarose resins or on magnetic nanoparticles.5 Although this immunopurification procedure is highly selective, the limited binding capacity, reusability, and high cost of these materials have prompted the search of new purification alterna- tives.6 Molecularly imprinted polymers (MIPs) are biomimetic synthetic receptors intrinsically more stable and robust than antibodies with significantly higher reusability (see Table S1, Supporting Information).7 These polymeric materials display selective cavities generated during polymerization because of the formation of prepolymerization complexes between the template molecule and the selected functional monomers. A three-dimensional polymer network is built around this complex by the addition of a cross-linking agent. Subsequent template removal leaves specific binding sites comple mentary in terms of size, shape, and geometry of functional groups with the template molecule, displaying a “memory effect”.8,9 Their synthesis has been extended to almost any kind of template, but macromolecular templating still remains a challenge because of the large size, complexity, conformational flexibility, and limited solubility of these biomolecules.10 Epitope imprinting appears to be a suitable alternative to circumvent Publicaciones científicas 167 these drawbacks.11,12 This approach is based on the use of a short peptide (known as epitope) that represents a larger peptide or protein, so the final MIP will be able to recognize both structures.13,14 Nevertheless, to ensure high selectivity of the imprinted material to the target molecule, the epitope must be carefully selected as the polymer selectivity will depend of the uniqueness of its sequence.15,16 Despite the epitope imprinting popularity,17–19 the use of commercial affinity tags as template molecules for the preparation of imprinted materials able to compete with commercial resins is still challenging. Ideal imprinted materials should display controlled particle size, shape, and porosity, and consequently, spherical particles are preferred to bulk materials. Imprinted polymers prepared by the hierarchically imprinting strategy combine all of these features by using porous silica beads as sacrificial supports.20 The template molecule is immobilized in the pores of the particles and subsequently filled with the prepolymerization mixture. After polymerization, the template-grafted silica beads are dissolved, leaving the “negative image” of the templated scaffold.21 The imprinted material will contain binding sites oriented and located at the surface, exhibiting more accessible open-entrance cavities for analyte recognition and faster adsorption kinetics.22,23 In a previous work, we developed a nonhierarchically imprinted polymer also based on the epitope approach by using the peptide DYKD as template molecule.24 Despite the good results obtained with the former MIP, the recognition of the FLAG peptide showed significant nonspecific binding when compared with the nonimprinted polymer (NIP). Thus, in order to suppress this effect, we aim to prove in this work the known effectiveness of the hierarchically imprinting strategy by using the template orientation. Herein, we report the synthesis of a hierarchically imprinted polymer combined with the aforementioned epitope approach for the recognition of the FLAG tag using the peptide DYKDC as template molecule. This pentapeptide was immobilized into the pores of iodoacetylated silica microbeads through the thiol group of the C-terminus cysteine, preceded by an initial amino modification step. The functionalization process involves a thorough control of the synthetic conditions to avoid the formation of multiple silane layers that would lead to a possible clogging of the silica pores and thus an incomplete filling of these pores with the prepolymerization mixture. In this regard, two types of aminosilane agents were evaluated to achieve a homogeneous monolayer surface coverage of the inorganic support. Derivatized silane-grafted particles were thoroughly investigated by solid state NMR to elucidate the silane moiety distribution on the silica beads. Based on our previous work,24 hierarchically imprinted polymers were also Publicaciones científicas 168 prepared using EAMA as the functional monomer in combination with EDMA as the cross-linking agent (Table S2, Supporting Information). Interestingly, the hierarchically imprinted beads prepared with AETAZS as coupling agent in the initial derivatization step show an enhanced binding behavior towards the FLAG peptide. To further understand this outstanding and specific recognition performance of the FLAG peptide toward the imprinted cavities, we performed an extensive computational molecular modeling study of the free peptides (DYKD and FLAG) and the complex between the immobilized template DYKDC and the functional monomer EAMA. Results and discussion Derivatization of silica beads Functionalization of silica particles with the peptide DYKDC has been ac- complished in several steps. A general overview of the strategy is depicted in Figure 1. Amino groups were introduced by using two different silanization agents: AEAPMS or AETAZS, see Figure S2, Supporting Information. These aminated beads were then modified by introducing iodoacetamide groups, able to react in the subsequent step with the thiol group of the C-terminus cysteine in the template peptide DYKDC. The amount of immobilized ligand (expressed as degree of functionalization in mmol g-1, Df) on the silica surface was estimated by elemental microanalysis data, more precisely from the change in carbon content (∆%C) compared by measuring the preceding step (Equation S1, Supporting Information).25 As silanization of silica beads is the most crucial step in the functionalization procedure, amino-functionalized particles were subjected to additional analysis to elucidate the coupled ligand distribution. An uncontrol grafting reaction and/or an inappropriate choice of the silane will lead to a complete or partial pore blockage by multilayer formation, avoiding the proper polymer synthesis. Thus, different reaction conditions were investigated in order to achieve a homogeneous surface silane coverage. Silica bead functionalization using AEAPMS The ideal scenario for further functionalization of the silica particles would be a monolayer grafting of the silane along the silica surface with the highest extent of silanol condensation as possible. With this purpose, different AEAPMS concentration were tested (3.75 mmol, 7.5 mmol or 11.25 mmol g–1). As described previously by García et al.,26 the use of p-toluensulfonic acid (PTSA) accelerates the silane hydrolysis reaction close to the silica surface and then the condensation with surface silanols, acting this P u b lic a c io n e s c ie n tífic a s 1 6 9 Figure 1. (A) Derivatization of silica particles: (1) silanization of rehydroxilated silica beads by using two types of silane agents: AEAPMS (3-(2-aminoethylamino) propyldimethoxymethylsilane) and AETAZS (N-(2-aminoethyl)-2,2,4-trimethyl-1-aza-2-silacyclopentane), (2) iodoacetylation of amino-modified silica particles, (3) peptide DYKDC coupling through the thiol group of the C-terminus cysteine. (B) Hierarchically imprinted polymer synthesis: (1) polymerization using EAMA (N-(2-aminoethyl)methacrylamide hydrochloride) as functional monomer and EDMA (ethyleneglycol dimethacrylate) as cross-linker, (2) template and silica removal and (3) FLAG recognition by epitope imprinted cavities. (C) Chemical structures of FLAG (DYKDDDDK), DYKDC and DYKD peptides, where D= aspartic acid, Y= tyrosine, K= lysine and C= cysteine. AEAPMS AETAZS 1 2 A 3 D Y DK C SH D Y DKC B EDMA C FLAG (DYKDDDDK) DYKDC DYKD D Y DK C D Y DK EAMA 1 2 3 SiO2-DYKDC Composite silica-MIP MIP MIP Publicaciones científicas 170 compound as a catalyst. As shown in Table S3 (Supporting Information), as silane AEAPMS concentration increases, the functionalization degree (Df) also increases slightly, rendering 0.24 (Si-DMPTSA1), 0.27 (Si-DMPTSA2) and 0.28 mmol g–1 (Si- DMPTSA3) immobilized on the surface. However, an increase in silane concentration did not produce a significant improvement in their Df. The 29Si CP/MAS NMR spectra of samples Si-DMPTSA1, Si-DMPTSA2, and Si- DMPTSA3 are included in Figure 2. The spectra show the presence of two groups of signals assigned to the inorganic (Q region) at the highest field and the organic D region assigned to the silane grafted moieties.27 These regions are, in their turn, decomposed into different signals accounting for the condensation degree of the silyl species involved. The main difference between the spectra is the lower intensity of the Q3 signal (≈ –102 ppm), assigned to free silanols onto the silica surface, in sample Si-DMPTSA1 compared to the other two samples. This suggests a higher surface coverage by silane grafting in this former sample. This means that, although the silane content in the derivatization products increases with the silane concentration, the extent of silanol condensation on the surface does not change or it is even lower when the concentration of the silanization agent increases. This is probably due to an increase in the self-condensation of amino silanes in the concentrated media before grafting on the surface. Within the scope of this work, the grafting of condensed silanes species (brushes as the silane agent is difunctional) is not desirable because they can block the silica pores. Thus, 3.75 mmol g-1 of AEAPMS was selected as optimum concentration for further steps. Figure 2. 29Si CP/MAS NMR spectra of silica particles functionalized with silane AEAPMS using different conditions: Si-DMPTSA1 (3.75 mmol g-1, 110 0C, PTSA, and 2 h), Si-DMPTSA2 (7.5 mmol g-1, 110 0C, PTSA, and 2 h) and Si-DMPTSA3 (11.25 mmol g-1, 110 0C, PTSA, and 2 h). D Q3 Q4 Publicaciones científicas 171 For a complete optimization method, the reaction time and temperature were also investigated under the optimum AEAPMS concentration. Longer reaction times (up to 16 h as in Si-DMPTSA4 sample) yield a higher functionalization degree (Table S3, Supporting Information). However, the absence of catalyst (Si-DMRT) results in a decrease of the grafting content. Figure S3 (Supporting Information) shows the 29Si CP/MAS NMR spectra of the samples Si-DMPTSA4 and Si-DMRT. The Si-DMPTSA1 spectrum was included for the sake of comparison. This latter sample is, again, the one with the lowest intensity of the Q3 signal, which indicates a higher extent in the silanol condensation under these reaction conditions. On the other hand, the sample Si- DMPTSA4 shows the highest intensity of the D signal according to its higher content of grafted silane. It seems that as the reaction is prolonged in time, the self-silane condensation is favored instead of increasing the surface silanol reaction. Actually, Si- DMPTSA4 sample exhibits a D signal sharper and located closer to –22 ppm, where siloxane units in the liquid state (i.e., far from the silica surface) appear.27 Therefore, the Si-DMPTSA4 spectrum is consistent with long silane brushes grafted to the silica surface, whereas Si-DMPTSA1 would have a grafting coverage close to a monolayer structure onto the silica surface. From these results, the reaction conditions of sample Si-DMPTSA1 were chosen as the most suitable for within the scope of this work. These results are consistent with a study published by Smith and Chen,28 which proves by using different silanization experiments that silane layers prepared in anhy- drous medium at elevated temperatures possessed higher functional group density and exhibited greater hydrolytic stability than those prepared in vapor phase or at room temperature. Reproducibility of the procedure at optimum reaction conditions (Si- DMPTSA1) was evaluated by synthesizing three different batches obtaining a mean Df of 0.26 mmol g–1 (RSD ≤ 12%) proving a good replicability of the synthesis procedure (see Table S4, Supporting Information). These data rely also on porosity studies evaluated from N2 adsorption/desorption analysis. Figure S4 (Supporting Information) shows a comparison of the isotherms measured using commercial silica particles and sample Si-DMPTSA1 showing a type IV curve, indicating that the pore size of the derivatized silica is located in the mesopore range, according to the IUPAC classification.29 Results revealed a decrease in the specific surface area (SA) and the specific pore volume (Vp) for the amino-modified beads (Si-DMPTSA1) obtaining a SA of 40 m2 g–1 and Vp of 0.64 cm3 g–1 compared with the commercial silica particles (SA of 56 m2 g–1 and Vp of 0.71 cm3 g–1). These results support the presence of the silane moieties attached to the surface of the bead, as well as the suitability of the synthesis procedure as the pore volume is reduced less than 10%. Publicaciones científicas 172 Silica bead functionalization using AETAZS For comparison, AETAZS was also used as silanization agent. This silane cannot self-condense, so the reaction produces a monolayer onto the silica surface. The optimization of the reaction conditions pursued the highest extent of silanol condensation. Optimization of AETAZS cyclic azasilane route was evaluated at three concentration levels (3.75 mmol, 7.5 mmol or 11.25 mmol g–1), showing a mild increase in carbon content as the AETAZS concentration increases (see Supporting Information, Table S5). Nevertheless, there are not significant differences in the Df between samples, as described previously for AEAPMS, rendering 0.12 (Si-AZA1), 0.13 (Si-AZA2) and 0.13 mmol g–1 (Si-AZA3), respectively. Surface analysis by 29Si CP/MAS NMR reveals almost an identical structure pattern for the three samples (see Figure S5, Supporting Information). Because there are no significant differences in silane content and surface silanol condensation extent, the lowest silane concentration in the reaction medium was preferred. Three different batches were synthesized at an optimum silane concentration (Si-AZA1) obtaining a mean Df of 0.14 mmol g–1 (RSD ≤ 8%), showing an excellent synthesis reproducibility (see Table S6, Supporting Information). Nitrogen sorption analysis (Figure S6, type IV curve) revealed the same specific surface area as for Si-DMPTSA1 (40 m2 g–1) but a higher specific pore volume (0.69 cm3 g–1) that would explain the lower functionalization degree and a better adsorbability.30 The pore size distribution curves obtained from N2 adsorption and desorption isotherms for the Si-AZA1, Si-DMPTSA1, and rehydroxylated silica (SiOH) samples are shown in Figures S7A and S7B (see Supporting Information). Although at a glance there are no substantial changes in the surface of both amino-functionalized particles under the microscope (see Figure S8, Supporting Infor- mation), the main differences can be observed between them after the coupling of the silane agent used in the derivatization process. The AEAPMS silane includes two methoxy groups that could condense with one or two groups in the silanol moieties, while the AETAZS silane can only be attached by one arm by performing a ring-opening reaction (see Figure S2, Supporting Information). This fact leads to a more targeted reaction, where AETAZS acts as a monovalent reagent avoiding self-condensation processes. Moreover, the synthesis of three different batches revealed the use of the cyclic azasilane as a more reproducible method (RSD ≤ 8%) compared with the dimethoxy silanization (RSD ≤ 12%). The use of the aza-compound is not very popular31– 33 because most of the published studies report the application of di- or trimethoxy/ethoxy silanes (i.e., APTES, 3-aminopropyltrimethoxysilane).34 However, our results prove that Publicaciones científicas 173 this coupling agent is an excellent selection when the formation of a monolayer and high grafting yields are sought. In peptide DYKDC coupling, amino-modified silica particles were iodoacetylated in order to introduce an iodine atom for further substitution by the thiol group of the peptide (Figure S9, Supporting Information). In the case of the iodoacetylated Si- DMPTSA1 particles (Si-DM-IAc), the obtained Df was 0.15 mmol g–1 (RSD ≤ 18%), whereas in the case of the Si-AZA1 derivatized particles (Si-AZA-IAc), Df was 0.10 mmol g–1 (RSD ≤ 16%) (see Tables S7 and S8, Supporting Information). By applying Equation S2 (Supporting Information), the coupling yield can be evaluated toward the preceding step, rendering 58% for Si-DM-IAc and 71% for Si-AZA-IAc. This higher yield obtained for the aza-silane beads can be associated with the lower steric hindrance of the azasilane moeities grafted onto the silica surface. Template immobilization is a critical step in the hierarchically imprinting strategy for the proper performance of the final imprinted polymer. A high constrained surface coverage may lead to a template aggregation and consequently an inefficient formation of binding sites. On the contrary, a low template coverage will render insufficient binding sites and therefore the material will lose the ability of the selective recognition. Peptide DYKDC was coupled to the corresponding iodoacetylated silica beads (Si-DM-IAc or Si- AZA-IAc) through the C-terminus cysteine thiol taking advantage of the selectivity of this mercapto group (see Figure S10, Supporting Information).35 Similar results were obtained for both functionalization reactions in terms of reaction yield (~35%) and a close mean functionalization degree of 0.05 mmol g–1 (RSD ≤ 8%) for Si-DM-Pept and 0.035 mmol g–1 (RSD ≤ 9%) for Si-AZA-Pept (Tables S9 and S10, Supporting Information). These functionalization results are in agreement with those obtained by other authors using the silica templating strategy. For example, Wierzbicka et al.36 reported the immobilization of phosphotyrosine using amino-functionalized silica beads (30 µm particle size, 45 m2 g-1 surface area, and 47.5 nm pore diameter) as well. They obtained a maximum template functionalization of 0.055 mmol g-1 comparable to the peptide immobilization reported in this work. Synthesis of the hierarchically imprinted polymer The epitope imprinting approach has been recognized as an effective strategy for the synthesis of imprinted polymers selective to proteins.37 In a previous study, we demonstrated the use of the N-terminus four-amino acid epitope of the FLAG tag (DYKD) as a template molecule for the preparation of MIPs useful for the purification of FLAG- tagged proteins.24 The resulting MIP (denoted as MSP8, 0.5:3:20 mole ratio Publicaciones científicas 174 DYKD:EAMA:EDMA) aimed to mimic the binding pocket of the ANTI-FLAG M2 monoclonal antibody,38,39 and showed a good performance in the extraction of both the FLAG and DYKD-tagged proteins. However, the nonspecific binding of the FLAG tag in the MSP8 polymer was relatively high with an IF in the order of 3.3. In order to improve the MIP performance and reduce the nonspecific binding for FLAG tag purification, we decided to explore the hierarchically imprinting approach. The peptide DYKDC was covalently immobilized on the iodoacetylated silica beads, as described previously, and EAMA and EDMA were used as functional and cross-linking monomers, respectively for polymer synthesis. Dimethyl sulfoxide (DMSO) was used as porogen. In contrast to traditional imprinting strategies (i.e., bulk imprinting), the preparation of spherical polymer particles allows the preparation of MIPs with a better mass transfer properties and higher superficial areas. The use of the functionalized silica microbeads (40–75 µm diameter, 500 Ȧ pore size) as sacrificial scaffolds in combination with the hierarchically imprinting strategy should lead, in principle, to the preparation of MIPs with improved recognition properties. After silica etching and template removal, the binding sites of the resulting MIP particles should be on the surface of the material favoring the diffusion of the analytes into the binding sites in the rebinding step.20 These materials can be considered as “mirror image” structures of the silica used as support (Figure 1B).40 To maintain the desired spherical structure in the MIP, the prepolymerization mixture should fully penetrate into the pores of silica. Nonetheless, the use of an excess of the prepolymerization solution will lead to a complete pore blockage in the resulting composite, causing low efficiencies for the targeted application.41 The volume of the prepolymerization mixture used for filling each silica sample was calculated considering 95% of the pore volume obtained in the nitrogen sorption analysis for the corresponding silanized silica.42 Peptide-functionalized silica beads play a double role in polymer synthesis because they serve simultaneously as a template and as a sacrificial scaffold in the hierarchically imprinting approach. Imprinted polymers were synthesized using the functionalized supports Si-DM-Pept and Si-AZA-Pept, designating the imprinted organic networks as MIP-DM and MIP-AZA, respectively. The molar ratios between immobilized template (T), functional monomer (FM) and cross-linking agent (CL) were of 0.6:4:20 for MIP-DM and 0.4:4:24 in the case of the MIP-AZA (detailed composition in Table S2, Supporting Information). In order to evaluate nonspecific interactions, a nonimprinted material (NIP) was synthesized with all the cocktail components but in the absence of the template molecule. The iodoacetylated silica beads (Si-DM-IAc and Si-AZA-IAc) Publicaciones científicas 175 were selected as scaffolds for NIP preparation, designated as NIP-DM and NIP-AZA, respectively. Figure 3 shows the SEM micrographs of the peptide-functionalized silica beads and the corresponding hierarchically imprinted polymers. The sphericity of the particles is maintained after the polymerization step (Figure S11, Supporting Information), which is critical to achieve an efficient packing in the solid-phase extraction (SPE) cartridges. The MIP particles exhibit a more irregular surface than the silica molds with a porous structure that facilitates the access of the analyte to the binding sites in the polymer. Figure 3. Scanning electron micrographs of the peptide-derivatized silica beads Si-DM-Pept (A) and Si-AZA-Pept (B) and the corresponding hierarchically imprinted polymers MIP-DM (C) and MIP-AZA (D) and NIP-DM (E) and NIP-AZA (F). A BSI-DM-PEPT SI-AZA-PEPT MIP-AZAC DMIP-DM E FNIP-DM NIP-AZA Publicaciones científicas 176 Evaluation of the retention of the DYKD and FLAG peptides by molecularly imprinted SPE The MIP-DM and MIP-AZA particles (25 mg), and their corresponding NIPs, were packed in 1 mL SPE cartridges. After conditioning with HEPES buffer (100 mM, pH 7.5), 1 mL of aqueous solutions of DYKD and FLAG peptides at 5 mg L-1 were percolated through the cartridges. A washing step using water (0, 1, or 3 mL) was introduced in order to remove the nonspecific interactions. Finally, the peptides were eluted with 1 mL of TBA 1% (w/v) to disrupt the interactions between the polymer and peptides. Recoveries obtained for the DYKD epitope decreased in both imprinted and NIPs with increasing water washing volumes, revealing a nonspecific binding behavior of the imprinted cavities (Figure 4A). Recoveries from the hierarchically imprinted polymers, without washing step (RMIP-DM/DYKD = 52.6%, RSD ≤ 6.1%; RMIP-AZA/DYKD = 64.7%, RSD ≤ 5.4%), are comparable to those obtained using nonhierarchically DYKD-imprinted MIPs (designated as MSP8) and 3 mL of water as a washing solvent (RMSP8/DYKD = 64%; RSD ≤ 7%). However, the recoveries from the hierarchically NIPs (RNIP-DM/DYKD = 22.9%, RSD ≤ 6.3%; RNIP-AZA/DYKD = 37.1%, RSD ≤ 5.3%) are considerable higher than for the NSP8 (RNSP8/DYKD = 5%; RSD ≤ 1%). It can be noticed that the retention of DYKD in the MIPs dramatically decreases as the washing volume increases, indicating a low retention in the polymer. Regarding the retention of FLAG, differences between the MIP and the NIP are larger in all cases than those observed with DYKD (Figure 4B). As the washing volume increases (0–3 mL water), the recoveries for the FLAG in MIP-DM decrease from 97.2% (RMIP-DM/FLAG/0mL; RSD ≤ 6.8%) to 73.4% (RMIP-DM/FLAG/3mL; RSD ≤ 3.8%). Whereas in NIP- DM, the recoveries decreased from 36.5% (RNIP-DM/FLAG/0mL; RSD ≤ 5.4%) to 23.2% (RNIP- DM/FLAG/3mL; RSD ≤ 4%). These recovery values were similar to those obtained using the MSP8 polymer and 3 mL of washing solvent volume (RMSP8/FLAG = 89%; RSD ≤ 6%; RNSP8/FLAG = 27%; RSD ≤ 4%). Recoveries of FLAG are higher from the MIP-AZA particles, and the differences between the MIP and the NIP were also higher. Without washing step, FLAG recovery is almost quantitative in the MIP (RMIP-AZA/FLAG/0mL = 99.8%; RSD ≤ 3.2%) and relatively low in the NIP (RNIP-AZA/FLAG/0mL = 19.6%; RSD ≤ 5.4%). By using 3 mL of washing volume, differences between MIP and NIP are even more noticeable (RMIP-AZA/FLAG/3mL = 87.4%; RSD ≤ 4% vs RNIP-AZA/FLAG/3mL = 4.1%; RSD ≤ 4.2%), obtaining an imprinting factor (IF) value of 21.3 (calculated as RMIP/RNIP, see Table S11). This data is considerably higher than the value reported previously (IF of 3.3),24 highlighting the success of the epitope imprinting effect. Publicaciones científicas 177 Figure 4. MISPE recoveries (%, n = 3, RSD = 2–8%) from imprinted (MIP-DM and MIP-AZA) and NIPs (NIP-DM and NIP-AZA) after percolating 1 mL of: (A) DYKD and, (B) FLAG at 5 mg L-1 each, HEPES buffer (100 mM, pH 7.5) applying different washing volumes of water (0, 1 and 3 mL), and elution with 1 mL water/TBA (1%, w/v). The differences between MIP-DM and MIP-AZA resemble a typical monoclonal antibody performance in immunoassays, where an excess of antibody leads to a higher nonspecific binding. As the amount of peptide immobilized in Si-AZA-Pept (0.035 mmol g –1) is lower than that for Si-DM-Pept (0.05 mmol g –1), it is expected that the peptide binding sites in the MIP-AZA polymer are less and more homogeneously distributed than in MIP-DM, resulting in better defined cavities. In view of these results, MIP-AZA was used in molecularly imprinted solid-phase extraction (MISPE) and loaded with different concentrations (1, 10 and 25 mg L–1) of DYKD and FLAG peptides in order to evaluate their retention performance (Figure 5). In the case of the DYKD peptide, retention in both the MIP and the NIP decreases significantly with the loading concentration and the washing volume. However, the retention of the FLAG in MIP-AZA is always significantly higher in MIP compared to NIP (Figure 5B), and slightly decreases as both concentrations of peptide and washing volumes increase. It is worth mentioning that the IFs in the tested conditions are always significantly higher to those reported previously.24 These results strongly confirm the recognition ability of MIP-AZA for the effective retention of FLAG peptide, reinforcing the Wash 3 mL Wash 1 mL Wash 0 mL 0 20 40 60 80 100 MIP- DM NIP-DM MIP-AZA NIP-AZA R e c o v e ry ( % ) Wash 3 mL Wash 1 mL Wash 0 mL 0 20 40 60 80 100 MIP- DM NIP-DM MIP-AZA NIP-AZA R e c o v e ry ( % ) A B Publicaciones científicas 178 usefulness of the epitope imprinting approach as a synthetic strategy for MIP synthesis.43 These results are in agreement with those reported by Rachkov and Minoura,13 showing that a polymer synthesized using a tetrapeptide as template molecule (YPLG) exhibited a stronger retention for the longer nonapeptide oxytocine (CYIQNCPLG) under certain conditions. Figure 5. MISPE recoveries (%, n = 3, RSD = 1–7%) from MIP-AZA (●) and NIP-AZA polymers (▲) after percolating 1 mL of peptide solutions of (A) DYKD and (B) FLAG at different concentration levels (1, 5, 10 and 25 mg L-1) applying various washing volumes of water (0, 1 and 3 mL) and elution with 1 mL water/TBA (1% w/v). Cross-reactivity assays The affinity of the MIP-AZA to other peptides GRGDNP and YPYDVPDYA was evaluated using the optimized MISPE procedure (see Supporting Information, Section S5). Peptide GRGDNP includes an aspartic acid in same position as DYKD and FLAG (DYKDDDDK). Recoveries obtained for this peptide were negligible and similar for both MIP and NIP (RMIP-AZA/GRGDNP = 7.6%, RSD ≤ 2.1%; RNIP-AZA/GRGDNP = 7.5%, RSD ≤ 7.4%). The second peptide (YPYDVPDYA, known as HA peptide) was chosen by virtue of its usefulness as fusion tag in protein purification processes. This nine-amino acid polypeptide derives from the human influenza hemagglutinin (HA) protein and is commonly used as a protein purification partner by using HA-tag specific antibodies. The peptide contains several aspartic acids and tyrosine amino acids in its structure. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 R e c o v e ry (% ) [DYKD] (mg L-1) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 0 5 10 15 20 25 R e c o v e ry ( % ) [FLAG] (mg L-1) A B MIP-AZA NIP-AZA Wash 0 mL Wash 1 mL Wash 3 mL MIP-AZA NIP-AZA Wash 0 mL Wash 1 mL Wash 3 mL Publicaciones científicas 179 Recoveries obtained were also negligible (RMIP-AZA/HA = 8.6%, RSD ≤ 10.5%; RNIP-AZA/HA = 2.3%, RSD ≤ 10.2%). The selectivity achieved in this approach can be attributed to the high quality of the binding sites generated on the surface of the hierarchically imprinted polymer. Whereas in other methods (i.e., bulk imprinting), the binding cavities can be occluded, generating a random distribution of binding sites with different affinities as it happens with polyclonal antibodies.44 Template-forced orientation leads to more accessible open-access cages for analyte recognition.45 This fact has a direct effect on the recognition properties of the material as we have demonstrated for the FLAG peptide using the MIP-AZA polymer. This behavior is well known for monoclonal antibodies, where affinity increases with a decrease in the conformational flexibility of the antigen binding site of the antibody.46 Molecular dynamics simulations To gain better understanding of why the hierarchically MIP templated with the peptide DYKDC recognizes better the FLAG peptide (DYKDDDDK) than the shorter DYKD peptide, we performed extensive molecular dynamics (MD) simulations of: 1) DYKD peptide (1 µs), 2) DYKDDDDK peptide (1 µs); and 3) DYKDC peptide in complex with EAMA (1.2 µs and the analysis was conducted on the last 1 µs MD simulation). We analyzed each of the three simulations using root–mean–square deviation (RMSD) and two-dimensional RMSD (2D-RMSD). The MD simulation of DYKDC peptide in complex with EAMA exhibits mainly two different conformations for the peptide: 1) one semi-extended (linear) forming an S-like shape with a population of ~60% (average ~0.8 ± 0.3 Å all peptide residues RMSD with respect to equilibrated structure backbone atoms; see Figure 6); and 2) the other one forms a turn starting at Y2 towards the C-terminus with a population of ~40% (average ~2.0 ± 0.2 Å RMSD; see Figure 6 depicting the last 1 µs MD simulation). The analysis of the 2D-RMSD shown in Figures 6B and S12A (Supporting Information) confirms the formation of the two above-mentioned conformations. There is no difference between the RMSD and 2D-RMSD graphs since the conformational changes occurred in block during the MD simulation (see Figures 6B-6C) contrary to DYKDDDDK peptide behavior as described below. EAMA stabilized after 22 ns MD simulation displaying two main populations (average ~3.7 ± 1.9 Å and average ~6.8 ± 1.2 Å) with an overall all ligand heavy atoms´ average RMSD of ~5.5 ± 2.2 Å with respect to the equilibrated structure backbone atoms (see Figure 6A and S13, Supporting Information). As shown in Figure 6C, the main interactions for cluster 1’s and cluster 2’s representative structures, respectively, are mainly through three hydrogen bonds between the hydrogen of –NH3 + (i.e., two salt bridges) and -NH groups of EAMA and oxygen of -COO- group of D4 and Publicaciones científicas 180 Figure 6. Computational study of DYKDC peptide/EAMA complex in DMSO. (A) RMSD with respect to equilibrated structure backbone atoms; last 1 µs MD simulation. (B) Left panel: two- dimensional-RMSD; right panel: cluster analysis: the two main representative conformations are depicted – cluster 1 (blue, ~40%), and cluster 2 (orange, ~60%). (C) Main interactions for cluster 1’s (left panel) and cluster 2’s (right panel) representative structures, respectively. Hydrogen bonds between the –NH3 + (i.e., two salt bridges) and –NH groups of EAMA and –COO- groups of D4 and C5 respectively are shown in dashed lines. 45 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nanoseconds D1 D4 Y2 K3 EAMAC5 D1 D4 Y2 K3 EAMA C5 Time (ns) R M S D ( Ȧ ) 0 200 400 600 800 1000 DYKDC EAMA 12 10 8 6 4 2 0 A B C 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 Publicaciones científicas 181 C5 highlighted with dashed lines (see Tables S12–S14, Supporting Information). On the other hand, as shown in Figure 7 and S12B (Supporting Information), the DYKD peptide MD simulation predicts three different conformations: 1) the semi- extended (linear) one forms an S-like shape with a population of ~50% (average ~0.7 ± 0.1 Å all peptide residues RMSD with respect to the minimized initial structure backbone atoms); 2) the other one forms a turn starting at Y2 towards the C-terminus with a population of ~37% (average ~1.1 ± 0.2 Å RMSD); and 3) the remaining one forms a horseshoe-like shape with a population of ~13% (~2.2 ± 0.3 Å RMSD). The all-residues peptide average RMSD including the three clusters is ~1.1 0± 0.5 Å along the MD simulation. Figure 7. Computational study of DYKD peptide in water. (A) RMSD of DYKD peptide with respect to minimized initial structure backbone atoms. (B) Left panel: two-dimensional RMSD; right panel: cluster analysis: three representative conformations are depicted – cluster 1 (orange, ~50%), cluster 2 (blue, ~37%), and cluster 3 (red, ~13%). Time (ns) R M S D ( Ȧ ) 0 200 400 600 800 1000 DYKD Peptide3.5 3 2.5 2 1 0.5 0 1.5 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nanoseconds 45 A B Publicaciones científicas 182 Analogously, the MD simulation of the FLAG peptide (DYKDDDDK) also shows three different conformations as the DYKD peptide when aligned with respect to resi- dues 1–4 (DYKD): 1) the semiextended (linear) one forms an S-like shape including the DYKD motif; then at D5, the peptide is bent forming a turn toward the C-terminus with a population of ~52% (~0.8 ± 0.3 Å all ligand atoms RMSD with respect to the minimized initial structure backbone atoms); 2) the other one forms a clamp-like shape including the DYKDD motif; then the peptide is turn toward the C-terminal with a population of ~28% (~1.8 ± 0.2 Å all ligand atoms RMSD with respect to minimized initial structure backbone atoms); and 3) the remaining one folds into a helix secondary structure which is better defined toward the C-terminus with a population of 20% (~2.4 ± 0.3 Å all ligand atoms RMSD with respect to the minimized initial structure backbone atoms) (see Figure 8). The all-residue RMSD of the FLAG peptide, as aligned with respect to all residues 1– 8 (DYKDDDDK), is on an average ~3.5 ± 0.8 Å showing the peptide´s high flexibility (see Figure S14A, Supporting Information). As the alignment is done with respect to the N- terminus residues 1–4 (DYKD) the average RMSD is reduced to ~1.4 ± 0.7 Å, showing less flexibility of these four residues which are the ones to recognize the MIP template made by DYKDC peptide (see Figure 8A). In the remaining portion of FLAG, the C-terminus residues 5–8 (DDDK) also show a lower average RMSD of ~1.6 ± 0.4 Å (see Figure S14B, Supporting Information). The two portions of the peptide aligned well with respect to themselves, but not overall. They seem to move independently from each other. All RMSDs were calculated with respect to the minimized initial structure backbone atoms. All in all, the DYKDDDDK (FLAG) and DYKD peptides share the same number of conformations (i.e., 3) and the same most populated conformation, which is similar to one of the conformations exhibited by the template molecule DYKDC peptide used to make the MIP. However, the conformations of the FLAG peptide interconvert back and forth from one kind to another opposite to what happens to the DYKD peptide confor- mations, which occur more like in blocks, along the MD simulation (see Figures 7 and 8). This behavior of the FLAG peptide, favored by its longer extension of 8 residues and hence its flexibility, could explain why the DYKDDDDK (FLAG) peptide compared to the DYKD peptide recognizes better the MIP formed by the template DYKDC peptide. The quick conformational changes of DYKDDDDK (FLAG) peptide could localize and fit into the MIP surface faster than the DYKD, thus displaying a higher selectivity toward the aforementioned hierarchically MIPs. Publicaciones científicas 183 Figure 8. Computational study of DYKDDDDK (FLAG) peptide in water. (A) RMSD of the FLAG peptide with respect to minimized initial structure backbone atoms aligned with respect to residues 1–4 (DYKD). (B) Left panel: two-dimensional RMSD including residues 1–4 (DYKD); right panel: cluster analysis: the three main representative conformations are depicted – cluster 1 (orange, ~52%), cluster 2 (blue, ~28%) and cluster 3 (red, ~20%). Conclusions We have demonstrated that it is possible to circumvent one of the major drawbacks for the preparation of peptide-selective MIPs by an optimization of the polymer synthesis from the very first step: the grafting of the silane moieties. A rational chose of the reaction conditions leads to a well-distributed silane units onto the silica surface. This fact has been faithfully proved in this comprehensive study by the synthesis of an epitope hierarchically imprinted polymer for the recognition of the FLAG tag by an 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nanoseconds 45 Time (ns) R M S D ( Ȧ ) 0 200 400 600 800 1000 3 2.5 2 1 0.5 0 1.5 FLAG Peptide 1-4 aa A B Publicaciones científicas 184 initial immobilization of the pentapeptide DYKDC in porous silica beads. The optimized hierarchically EAMA-based imprinted polymer (MIP-AZA) shows unprecedented selectivity for FLAG peptide recognition, highlighting the importance of properly selecting the silane coupling agent and the template molecule orientation. Computational molecular modeling has also shown to be a suitable tool to explain the molecular recognition properties of the imprinted material for the FLAG peptide. Moreover, it could be of help for the selection of epitopes for protein imprinting. The developed imprinted material can be considered as an excellent candidate for a future universal successful FLAG-tagged protein purification. Experimental section Rehydroxilation of silica beads Silica beads (20 g, 40–75 µm diameter, 500 Ȧ pore size, SiliCycle) were suspended in 120 mL of 20% HCl (v/v) in a 500 mL round-bottomed flask and heated at reflux at 110 ºC for 6 h. Then, the silica was filtered through a filter funnel and washed with water until pH of washing solution was around 7. Finally, the silica was dried in a vacuum oven at 70 ºC for 24 h. Optimization of derivatization process using AEAPMS Concentration optimization Rehydroxilated silica beads (1 g) were suspended in 20 mL of dry toluene in a three-necked round-bottomed flask connected to an automatic rotator system equipped with an overhead paddle stirring rod. This system was connected to a Dean-Stark collector coupled to a refrigerator. The mixture was then heated at 50 ºC for 30 min. The appropriate amount of AEAPMS (3.75 mmol, 7.5 mmol or 11.25 mmol) was added to the suspended beads together with p-toluenesulfonic acid (PTSA, 0.04 mmol). Products were designated as Si-DMPTSA1, Si-DMPTSA2 and Si-DMPTSA3 in ascending order of AEAPMS amount in the feed. Temperature was then raised to 110 ºC and maintained for 2 h. The product was poured through a filter funnel and washed with 50 mL of toluene and 3 x 50 mL aliquots of ethanol. The functionalized silica particles were first dried in an oven at 100 ºC for 24 h and finally dried in a vacuum oven at 45 ºC for 24 h. Temperature optimization Rehydroxilated silica beads (1 g) were suspended in 20 mL of dry toluene and heated at 50 ºC for 30 min. Silane AEAPMS (3.75 mmol) together with PTSA (0.04 mmol) were added to the reaction mixture. Temperature was then raised to 110 ºC and Publicaciones científicas 185 maintained for 16 h. The product was designated as Si-DMPTSA4. The downstream procedure is analogous as described previously. For comparison purposes, the rehydroxilated silica beads (1 g) were suspended in 20 mL of dry toluene and stirred in an orbital shaker (KS 4000i, IKA) for 30 min at room temperature. Then, the silane AEAPMS (3.75 mmol) was added to the reaction and the mixture was continuously stirred for 24 h under an inert atmosphere. The product was filtered through a filter funnel and washed with 50 mL of toluene and 3 x 50 mL aliquots of ethanol. The functionalized silica particles were first dried in an oven at 100 ºC for 16 h and finally dried in a vacuum oven at 45 ºC for 24 h. Obtained product was designed as Si-DMRT. Optimization of derivatization process using AETAZS Rehydroxilated silica beads (2 g) were purged under nitrogen stream for 5 min, suspended in 20 mL of dry toluene at room temperature, and additionally purged for 5 min. The appropriate amount of AETAZS (3.75 mmol, 7.5 mmol or 11.25 mmol per gram of silica) was added to the suspended beads under an inert atmosphere in an orbital shaker and the mixture was continuously stirred for 24 h. Products were designated as Si-AZA1, Si-AZA2, and Si-AZA3 in ascending order of AETAZS amount in the feed. The products were filtered through a filter funnel and washed with 20 mL of toluene and 3 x 50 mL aliquots of ethanol. The functionalized silica particles were first dried in an oven at 70 ºC for 24 h and then dried in a vacuum oven at 45 ºC for 24 h. Iodoacetylation of silica particles Dry dimethylformamide (DMF, 3 mL), iodoacetic anhydride (0.18 mmol), and 4- dimethylaminopyridine (DMAP, 0.18 mmol) were introduced into a 5 mL vial protected from light in the case of AEAPMS-silica. Dry DMF (3 mL), iodoacetic anhydride (0.09 mmol) and DMAP (0.09 mmol) were introduced into a 5 mL vial protected from light in the case of AETAZS-silica. After 15 min of stirring, 500 mg of aminosilica particles were added to the corresponding mixture (Si-DMPTSA1 or Si-AZA1). The products were de- signated as Si-DM-IAc and Si-AZA-IAc, respectively. The reaction mixtures were shaking at room temperature for 72 h in an orbital shaker. Then, the obtained products were filtered through a filter funnel and washed with 3 x 100 mL aliquots of DMF. Finally, the particles were first dried in an oven at 45 ºC for 72 h and then dried in a vacuum oven for 48 h. Peptide DYKDC coupling to iodoacetylated silica particles Dry DMF (4 mL), peptide DYKDC (0.04 mmol), and triethylamine (350 µL) were introduced into a 5 mL vial protected from light in the case of the dimethoxysilane route. Publicaciones científicas 186 Dry DMF (4 mL), peptide DYKDC (0.02 mmol), and triethylamine (175 µL) were introduced into a 5 mL vial in the case of the azasilane route. After 15 min of stirring, 500 mg of iodoacetylated silica particles was added to the corresponding mixture (Si-DM-IAc or Si-AZA-IAc). The reaction mixtures were shaking at room temperature for 72 h in an orbital shaker. Then, the obtained products were filtered through a filter funnel and washed with 2 x 100 mL aliquots of DMF. Finally, the particles were first dried in an oven at 45 ºC for 72 h and then dried in a vacuum oven for 48 h. The obtained products were designated as Si-DM-Pept and Si-AZA-Pept. Polymer synthesis by hierarchical imprinting The MIPs were synthesized using the corresponding peptide-derivatized silica particles as template and a scaffold for polymerization (Si-DM-Pept or Si-AZA-Pept). NIPs were prepared with the corresponding preceding iodoacetylated silica particles (Si- DM-IAc or Si-AZA-IAc). MIPs and NIPs were synthesized under the same experimental conditions. For polymerization, silica particles were packed in SPE cartridges (5 mL, ICO plus3) equipped with a bottom SPE frit (20 µm pore size, Agilent). The cartridge was then sealed with a rubber septum and purged under a nitrogen stream. Prepolymerization mixture was prepared in a 1 mL vial, taking into consideration the pore volume of the corresponding silica. The mixture was composed by a solution of EAMA as functional monomer, EDMA as a cross-linker, DMSO a as porogen, and, 2,2-azobis(2,4- dimethylvaleronitrile) as an initiator (see Table S2 in the Supporting Information for a detailed polymer composition). After purging the mixture under a nitrogen flow, the cocktail was injected into the corresponding cartridge. In order to force the mixture to completely fill the silica pores, a nitrogen stream was flow through the cartridges by closing the outlet of the SPE column. This process was repeated several times. The cartridges were checked to contain freely flowing silica particles to avoid bulk polymerization. Polymerization was done at 70 ºC in an oven for 24 h. The final template/functional monomer/cross-linker (T/FM/CL) molar ratios were 0.6:4:20 for MIP- DM (using Si-DM-Pept as a support) and 0.4:4:24 for MIP-AZA (using Si-AZA-Pept). After polymerization, the silica beads were dissolved by adding 3 x 250 mL of 3 M aqueous solution of ammonium hydrogen difluoride and shaking the mixture for 24 h after each addition. The obtained polymers were thoroughly washed with water (until pH ∼7), 3 x 100 mL of MeOH/TFA (1%, v/v), and, finally, 3 x 100 mL of MeOH. The resulting polymer beads were dried in a vacuum oven at 50 ºC for 24 h prior characterization and use. Before packing in SPE cartridges, the polymers were allowed to settle in methanol/water (80:20, v/v) to remove fine particles. NIPs were prepared under the same experimental conditions. Publicaciones científicas 187 MISPE procedure for peptide recognition SPE cartridges (1 mL, Varian, Palo Alto, CA, USA) were packed with 25 mg of hierarchically imprinted MIP or the corresponding NIP. The cartridges were equilibrated with 10 mL of MeOH and 10 mL of HEPES buffer (100 mM, pH 7.5). The peptide solution, containing 1 mL of DYKD and FLAG at 5 mg L–1 was percolated at a constant flow rate of 0.4 mL min–1 with the aid of an eight-channel Ismatec ISM936D peristaltic pump (Oak Harbor, WA, US). Then, the cartridges were rinsed with 0, 1, or 3 mL of water to remove nonspecifically retained compounds and the peptides were eluted with 1 mL water/TBA 1% (w/v). The eluates from the MISPE column were injected into the HPLC system for analysis. Aza-polymers (MIP-AZA and NIP-AZA) were subjected to a further MISPE procedure at different concentrations levels (1, 10, and 25 mg L–1) of DYKD and FLAG peptides in order to evaluate their retention performance. The cartridges were reused at least 25 times without lowing its binding properties. Acknowledgments This work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (Grant RTI2018-096410-B-C21). We thank Prof. M. J. Torralvo for assistance with the N2 adsorption experiments and National Centre for Electron Microscopy and Centre for Elemental Microanalysis (UCM, Madrid) for the technical support. N. G. thanks the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MAT2016- 81001-P project) and Dr. Leví López (Characterization Service of ICTP-CSIC) for performing solid state NMR spectra. Y. R. thanks Dr. Mihaly Mezei (Department of Pharmacological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai) for critically reading the computational part of this manuscript and suggesting improvements. Computations were supported in part through the computational resources and staff expertise provided by the Scientific Computing Facility at the Icahn School of Medicine at Mount Sinai. References [1] D.W. Wood, New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification, Curr. Opin. Struct. Biol. 26 (2014) 54–61. [2] T.P. Hopp, K.S. Prickett, V.L. Price, R.T. Libby, C.J. March, D.P. Cerretti, D.L. Urdal, P.J. Conlon, A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification, Nat. Biotechnol. 6 (1988) 1204–1210. [3] J. Prentoe, J. Bukh, Hepatitis C virus expressing Flag-tagged envelope protein 2 has unaltered infectivity and density, is specifically neutralized by Flag antibodies and can be purified by affinity chromatography, Virology 409 (2013) 148–155. Publicaciones científicas 188 [4]. R. Hernan, K. Heuermann, B. Brizzard, Multiple epitope tagging of expressed proteins for enhanced detection, BioTechniques 28 (2000) 789–793. [5] A. Einhauer, A. Jungbauer, The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins, J. Biochem. Biophys. Methods 49 (2001) 455–465. [6] J. J. Lichty, J. L. Malecki, H.D. Agnew, D.J. Michelson-Horowitz, S. Tan, Comparison of affinity tags for protein purification, Protein Expr. Purif. 41 (2005) 98–105. [7] A. Poma, A. Guerreiro, M.J. Whitcombe, E. V. Piletska, A.P.F. Turner, S.A. Piletsky, Solid-phase synthesis of molecularly imprinted polymer nanoparticles with a reusable template-"plastic antibodies", Adv. Funct. Mater. 23 (2013) 2821–2827. [8] L. Chen, S. Xu, J. Li, Recent advances in molecular imprinting technology: current status, challenges and highlighted applications, Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 2922–2942. [9] G. Vasapollo, R. Del Sole, L. Mergola, M. R. Lazzoi, A. Scardino, S. Scorrano, G. Mele, Molecularly imprinted polymers: present and future prospective, Int. J. Mol. Sci. 12 (2011) 5908–5945. [10] N.M. Bergmann, N.A. Peppas, Molecularly imprinted polymers with specific recognition for macromolecules and proteins, Prog. Polym. Sci. 33 (2008) 271–288. [11] L. Jiang, H. Liu; C. Huang, X. Shen, Blood group antigen shielding facilitated by selective cell surface engineering, ACS Appl. Mater. Interfaces 12 (2020) 22426–22432. [12] H. Nishino, C. S. Huang, K. J. Shea, Selective protein capture by epitope imprinting, Angew. Chem. Int. Ed. 45 (2006) 2392–2396. [13] A. Rachkov, N. Minoura, Recognition of oxytocin and oxytocin-related peptides in aqueous media using a molecularly imprinted polymer synthesized by the epitope approach., J. Chromatogr. A 889 (2000) 111–118. [14] H. Peng, Y. T. Qin, X. W. He, W. Y. Li, Y. K. Zhang, Epitope molecularly imprinted polymer nanoparticles for chemo-/photodynamic synergistic cancer therapy guided by targeted fluorescence imaging, ACS Appl. Mater. Interfaces 12 (2020) 13360–13370. [15] Y. Hoshino, H. Koide, T. Urakami, H. Kanazawa, T. Kodama, N. Oku, K.J. Shea, Recognition, Neutralization, and clearance of target peptides in the bloodstream of living mice by molecularly imprinted polymer nanoparticles: a plastic antibody, J. Am. Chem. Soc. 132 (2010) 6644–6645. [16] A. Kushwaha, J. Srivastava, A.K. Singh, R. Anand, R. Raghuwanshi, T. Rai, M. Singh, Epitope imprinting of Mycobacterium leprae bacteria via molecularly imprinted Publicaciones científicas 189 nanoparticles using multiple monomers approach, Biosens. Bioelectron. 145 (2019) 111698. [17] J. Drzazgowska, B. Schmid, R.D. Süssmuth, Z. Altintas, Self-assembled monolayer epitope bridges for molecular imprinting and cancer biomarker sensing, Anal. Chem. 92 (2020) 4798–4806. [18] P. X. Medina Rangel, E. Moroni, F. Merlier, L. A. Gheber, R. Vago, B. Tse Sum Bui, K. Haupt, Chemical antibody mimics inhibit cadherin-mediated cell-cell adhesion: a promising strategy for cancer therapy, Angew. Chem. Int. Ed. 59 (2020) 2816–2822. [19] R. Xing, Y. Ma, Y. Wang, Y. Wen, Z. Liu, Specific recognition of proteins and peptides via controllable oriented surface imprinting of boronate affinity-anchored epitopes, Chem. Sci. 10 (2019) 1831–1835. [20] E. Yilmaz, K. Haupt, K. Mosbach, The use of immobilized templates—a new approach in molecular imprinting, Angew. Chem. Int. Ed. 39 (2000) 2115–2118. [21] C. Baggiani, P. Baravalle, C. Giovannoli, L. Anfossi, C. Passini, G. Giraudi, Binding behaviour of molecularly imprinted polymers prepared by a hierarchical approach in mesoporous silica beads of varying porosity, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 1828–1834. [22] M.M. Titirici, A.J. Hall, B. Sellergren, Hierarchical imprinting using crude solid phase peptide synthesis products as templates, Chem. Mater. 15 (2003) 822–824. [23] I.A. Nicholls, Thermodynamic considerations for the design of and ligand recognition by molecularly imprinted polymers, Chem. Lett. 24 (1995) 1035–1036. [24] L. N. Gómez-Arribas, J. L. Urraca, E. Benito-Peña, M.C. Moreno-Bondi, Tag-specific affinity purification of recombinant proteins by using molecularly imprinted polymers, Anal. Chem. 91 (2019) 4100–4106. [25] Y. H. Liu, H. P. Lin, C. Y. Mou, Direct method for surface silyl functionalization of mesoporous silica, Langmuir 208 (2004) 3231–3239. [26] N. García, E. Benito, J. Guzmán, P. Tiemblo, Use of p-toluenesulfonic acid for the controlled grafting of alkoxysilanes onto silanol containing surfaces: preparation of tunable hydrophilic, hydrophobic, and super-hydrophobic silica, J. Am. Chem. Soc. 129 (2007) 5052–5060. [27] N. García, E. Benito, P. Tiemblo, M.M.B. Hasan, A. Synytska, M. Stamm, Chemically guided topography in alkylsilane- and oligosiloxane-modified silica nanoparticle coatings: From very hydrophobic surfaces to “pearl” bouncing droplets, Soft Matter 6 (2010) 4768– 4776. https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.8b05731 https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.8b05731 https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/la0358421 https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/la0358421 Publicaciones científicas 190 [28] E. A. Smith, W. Chen, How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes, Langmuir 24 (2008) 12405–12409. [29] M. Thommes, K. Kaneko, A. V. Neimark, J.P. Olivier, F. Rodriguez-Reinoso, J. Rouquerol, K.S.W. Sing, Physisorption of gases, with special reference to the evaluation of surface area and pore size distribution (IUPAC Technical Report), Pure Appl. Chem. 87 (2015) 1051–1069. [30] W. Cheng, H. Ma, L. Zhang, Y. Wang, Hierarchically imprinted mesoporous silica polymer: an efficient solid-phase extractant for bisphenol A, Talanta 120 (2014) 255–261. [31] J. Ĉulić-Viskota, W. P. Dempsey, S. E. Fraser, P. Pantazis, Surface functionalization of barium titanate SHG nanoprobes for in vivo imaging in zebrafish, Nature Protocols 7 (2012) 1618–1633. [32] L. Ju, N. C. Strandwitz, Cyclic azasilanes as volatile and reactive precursors for atomic layer deposition of silicon dioxide, J. Mater. Chem. C 4 (2016) 4034–4039. [33] K. Khadka, G. K. Carpenter, G. S. Ferguson, Byproduct‐free synthesis, characterization and reactivity of 1, 2‐diaminosiloxane monolayers on silicon/silicon dioxide, Chem. Select 4 (2019) 11801–11807. [34] M. Zhu, M. Z. Lerum, W. Chen, How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica, Langmuir 28 (2012) 416–423. [35] E. Moczko, A. Guerreiro, C. Cáceres, E. Piletska, B. Sellergren, S. A. Piletsky, Epitope approach in molecular imprinting of antibodies, J. Chromatogr. B 1124 (2019) 1– 6. [36] C. Wierzbicka, S. B. Torsetnes, O. N. Jensen, S. Shinde, B. Sellergren, Hierarchically templated beads with tailored pore structure for phospho-peptide capture and phosphoproteomics, RSC Adv. 7 (2017) 17154–17163. [37] H. Bagán, T. Zhou, N. L. Eriksson, L. Bülow, L. Ye, Synthesis and characterization of epitope-imprinted polymers for purification of human hemoglobin, RSC Adv. 7 (2017) 41705–41712. [38] T.P. Roosild, S. Castronovo, S. Choe, Structure of anti-FLAG M2 Fab domain and its use in the stabilization of engineered membrane proteins, Acta Crystallogr. 62 (2006) 835–839. [39] A. Knappik, A. Pluckthun, An improved affinity tag based on the FLAG peptide for the detection and purification of recombinant antibody fragments, Biotechniques 17 (1994) 754–761. Publicaciones científicas 191 [40] M.M. Titirici, A.J. Hall, B. Sellergren, Hierarchically imprinted stationary phases: mesoporous polymer beads containing surface-confined binding sites for adenine, Chem. Mater. 14 (2002) 21–23. [41] M. R. Halhalli, C. S. A. Aureliano, E. Schillinger, C. Sulitzky, M. M. Titirici, B. Sellergren, An improved grafting technique for producing imprinted thin film composite beads, Polym. Chem. 3 (2012) 1033–1042. [42] M.M. Titirici, B. Sellergren, Peptide recognition via hierarchical imprinting, Anal. Bioanal. Chem. 378 (2004) 1913–1921. [43] D. Dechtrirat, K. J. Jetzschmann, W. F. M. Stöcklein, F. W. Scheller, N. Gajovic- Eichelmann, Protein rebinding to a surface-confined imprint, Adv. Funct. Mater. 22 (2012) 5231–5237. [44] R. Reverberi, L. Reverberi, Factors affecting the antigen-antibody reaction, Blood Transfus. 5 (2007) 227–240. [45] S. Ambrosini, S. Beyazit, K. Haupt, B. Tse Sum Bui, Solid-phase synthesis of molecularly imprinted nanoparticles for protein recognition, Chem. Comm. 49 (2013) 6746–6748. [46] V. Manivel, N. C. Sahoo, D. M. Salunke, K. V. S. Rao, Maturation of an antibody response is governed by modulations in flexibility of the antigen combining site, Immunity 13 (2000) 611–620. Publicaciones científicas 192 Supporting information List of acronyms AEAPMS: (3-(2-aminoethylamino) propyldimethoxymethylsilane. AETAZS: N-(2-aminoethyl)-2,2,4-trimethyl-1-aza-2-silacyclopentane. PTSA: p-toluensulfonic acid. DMAP: 4- dimethylaminopyridine. EAMA: N-(2-aminoethyl)methacrylamide hydrochloride. EDMA: ethyleneglycol dimethacrylate. ABDV: 2,2 -azobis(2,4-dimethylvaleronitrile). Si-DMPTSA1, Si-DMPTSA2, Si-DMPTSA3, Si-DMPTSA4: silica particles functionalized with difunctional silane AEAPMS at 110 ºC using PTSA as catalyst. Si-DMRT: silica particles functionalized with difunctional silane AEAPMS at room temperature in absence of catalyst. Si-DM-IAc: iodoacetylated Si-DMPTSA1 particles. Si-DM-Pept: Si-DM-IAc particles derivatized with DYKDC peptide. MIP-DM: molecularly imprinted polymer synthesized using Si-DM-Pept as scaffold. NIP-DM: molecularly non imprinted polymer synthesized using Si-DM-IAc as scaffold. Si-AZA1, Si-AZA2, Si-AZA3: silica particles functionalized with monofunctional silane AETAZS. Si-AZA-IAc: iodoacetylated Si-AZA1 silica particles. Si-AZA-Pept: Si-AZA-IAc particles derivatized with DYKDC peptide. MIP-AZA: molecularly imprinted polymer synthesized using Si-AZA-Pept particles as scaffold. NIP-AZA: molecularly non imprinted polymer synthesized using Si-AZA-IAc particles as scaffold. MISPE: molecularly imprinted solid phase extraction. Publicaciones científicas 193 Introduction Table S1. Comparison between MIPs and antibodies for their application in analytical separations.1,2,3,4 MIPs Antibodies Lifetime Years 6-12 months Storage From 4 ºC to room temperature Freezer Reusability Extended Limited Solvent compatibility Compatible with most organic and aqueous solvents Compatible with aqueous- based media Sterilization UV, autoclaving Problematic, typically using γ-irradiation Stability Robust, resistant to extreme conditions Unstable in extreme conditions, easy denaturation Selectivity Medium-high High Binding capacity Variable (~ 1 mg g-1)(b) Variable (~ 0.6 mg mL-1)(c) Price (a) 0.25-5 $/mg 1-1000 $/mg (a) A. Poma, A. Guerreiro, M.J. Whitcombe, E. V. Piletska, A.P.F. Turner, S.A. Piletsky, Solid-phase synthesis of molecularly imprinted polymer nanoparticles with a reusable template-"plastic antibodies", Adv. Funct. Mater. 23 (2013) 2821–2827. (b) Binding capacity for FLAG peptide obtained in the present work (MIP-AZA polymer). (c) Binding capacity of FLAG-BAP Fusion Protein (Sigma-Aldrich). Experimental section S1. Reagents and chemicals Hydrochloric acid (36.5–38%), toluene (˃ 99.9%) and triethylamine (˃ 99%) were from Scharlau. Silica microspheres (SiliaSphereTM PC, 40–75 m diameter, 500Ȧ pore size, SiliCycle, www.silicycle.com). 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane (AEAPMS, ≥ 95%), p-toluenesulfonic acid (PTSA, 98.5%), anhydrous toluene (99.8%), acetonitrile (ACN), methanol (MeOH, HPLC grade), ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) and tetrabutylammonium hydrogensulfate (TBA) were from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Water was purified with a Millipore Direct-Q system (Bedford, MA, USA). N-(2- aminoethyl)-2,2,4-trimethyl-1-aza-2-silacyclopentane (AETAZS, >95%) was from Gelest. Absolute ethanol, dimethylsulfoxide and dimethylformamide (DMF, > 98%) were from VWR chemicals. Iodoacetic anhydride and anhydrous dimethylformamide (> Publicaciones científicas 194 99.8%) were from Acros Organic. N-(2-aminoethyl)methacrylamide hydrochloride (EAMA) was from Polysciences. 2,2 -azobis(2,4-dimethylvaleronitrile) (ABDV) was from Wako Pure Chemicals (Neuss, Germany). 4-Dimethylaminopyridine (DMAP, > 98%) was from Fluorochem. Peptides DYKD and DYKDDDDK were from Peptide Sciences. Peptide DYKDC was from China Peptides. Ammonium hydrogen difluoride was from Fischer Scientific. Peptides GRGDNP and YPYDVPDYA were from GenScript. Trifluoroacetic acid (TFA) was purchased to Alfa Aesar. S2. Techniques for particle characterization Derivatized silica particles and imprinted polymers were subjected to several characterization techniques. Functionalization degree of silica particles was estimated from elemental microanalysis obtained by using a CHNS-932 microanalyzer in Centre for Elemental Microanalysis (UCM, Madrid). Scope of validation for each element was %C (0.53–82.42); %H (2.75–6.71), %N (0.45–20.13) and %S (0.57–26.69). Established uncertainty for each element is ± 0.35% for carbon content, ± 0.30% for hydrogen and nitrogen content and ± 0.35% for sulfur content. Specific surface area and specific pore volume of functionalized silica particles were evaluated from N2 adsorption/desorption analysis recorded at -196 ºC on a Micromeritics ASAP 2020 Surface Area and Porosity Analyzer. Before measurements, samples were outgassed at 50 ºC for 2 h and 30 ºC for 8 h under high vacuum (10-3 Torr). The specific surface areas (SA) were evaluated using the BET method and the specific pore volumes (Vp) were determined using the Barret-Joyner-Halenda method (BJH). Particle morphology and size distribution were determined by Scanning Electron Microscopy (SEM) using JEOL JSM 6335F electron microscope in the Spanish National Centre for Electron Microscopy (UCM, Madrid) and further processed by ImageJ software. The NMR spectra of the silica were performed in a Bruker Avance 400 spectrometer (Bruker Analytik GmbH Karlsrube, Germany) equipped with a Bruker Ultrashield 9.4 T, 8.9 cm vertical-bore superconducting magnet. 29Si CP/MAS NMR spectra were acquired at ambient temperature by using a standard Bruker broad-band MAS probe. Representative samples were ground and packed in 4 mm zirconia rotors, sealed with Kel-F caps and spun at 5 kHz. The 90-pulse width was 3.5–4.5 ms and, in all cases, highpower proton decoupling was used. All free-induction decays were subjected to standard Fourier transformation and phasing. The chemical shifts were externally referenced to TMS. The spectra were obtained with 4 ms CP contact time, 4 s recycle delay, 16 000 averages, and 80 Hz line broadening. Publicaciones científicas 195 S3. HPLC methods Chromatographic analyses were done on an Agilent 1200 series (Palo Alto, CA, USA) equipped with a binary pump, online degasser, high-performance autosampler, column thermostat and 1260 Infinity diode array detector (DAD) system. Recoveries (%) were calculated from external calibration peak area measurements. All peptides were quantified at  = 220 nm. DYKD and FLAG peptides Chromatographic separation was done with an ACE Excel 2 C18-PFP analytical column (100 mm × 2.1 mm, 2 µm) from ACE at 30 ºC. The mobile phase was a mixture of solvent A (water/trifluoroacetic acid, TFA 0.1% (v/v)) and solvent B (acetonitrile, ACN), and used according to the following gradient programme: 97% A (0–10 min), 97–20% A (10–10.1 min), 20% A (10.1-11-1 min), 20–97% A (11.1–11.2 min) and 97% A (11.2–25 min). The flow rate was 0.4 mL min–1 and the injected volume 5 μL. Figure S1. HPLC-DAD chromatogram for a mixture of peptides DYKD and DYKDDDDK (5 mg L–1) in water/TBA (1%, w/v). Peptide GRGDNP Chromatographic separation was done with an ZORBAX SB-C18 analytical column (4.6 x 150 mm, 3.5 µm) from Agilent at 30 ºC. The mobile phase was a mixture of solvent A (water/trifluoroacetic acid, TFA 0.1% (v/v)) and solvent B (methanol/trifluoroacetic acid, TFA 0.1% (v/v)) and used according to the following gradient programme: 90% A (0–8 min), 90–10 % A (8–8.5 min), 10% A (8.5–10 min), 10–90 % A (10–10.5 min) and 90% A (10.5–20 min). The flow rate was 1 mL min–1 and the injected volume 50 μL. DYKD FLAG Publicaciones científicas 196 Peptide YPYDVPDYA Chromatographic separation was done with an ACE Excel 2 C18-PFP analytical column (100 mm × 2.1 mm, 2 µm) from ACE at 30 ºC. The mobile phase was a mixture of solvent A (water/trifluoroacetic acid, TFA 0.1% (v/v)) and solvent B (acetonitrile trifluoroacetic acid, TFA 0.1% (v/v)) and used according to the following gradient programme: 80-65% A (0–10 min). The flow rate was 0.25 mL min–1 and the injected volume 5 μL. S4. Hierarchically molecularly imprinted polymer synthesis Hierarchically molecularly imprinted polymers (MIPs) were synthesized using functionalized silica beads with the peptide DYKDC (Si-DM-Pept in the case of MIP-DM and Si-AZA-Pept in the case of MIP-AZA) as sacrificial scaffolds. In the case of the non- imprinted polymers (NIP), functionalized iodoacetylated silica beads Si-DM-IAc (NIP- DM) and Si-AZA-Iac (NIP-AZA) were chosen as sacrificial supports. Table S2. Optimized composition of hierarchically imprinted polymer using different template:functional monomer:cross-linker ratios (T:FM:CL, molar ratio). Polymer MIP-DM NIP-DM MIP-AZA NIP-AZA Silica support Si-DM-Pept Si-DM-IAc Si-AZA-Pept Si-AZA-IAc 346 mg 352 mg EAMA 0.117 mmol 0.117 mmol EDMA 0.59 mmol 0.71 mmol DMSO 80 µL 80 µL ABDV 0.04 mmol 0.04 mmol T:FM:CL 0.6:4:20 - 0.4:4:24 - S5. Molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) for cross-reactivity studies Solid-phase extraction cartridges (1 mL, Varian, Palo Alto, CA, USA) were packed with 25 mg of hierarchically imprinted MIP-AZA or the corresponding NIP-AZA. The cartridges were equilibrated with 10 mL of MeOH and 10 mL of HEPES buffer (100 mM, pH 7.5). The peptide solution, containing 1 mL of peptide GRGDNP or peptide YPYDVPDYA at 5 mg L–1 in HEPES buffer was percolated at a constant flow rate of 0.4 mL min–1 with the aid of an 8-channel Ismatec ISM936D peristaltic pump (Oak Harbor, WA, US). Then, the cartridges were rinsed with 3 mL of water to remove non-specifically Publicaciones científicas 197 retained compounds and the peptides were eluted with 1 mL H2O/tetrabutylammonium hydrogensulfate (TBA) 1% (w/v). The eluates from the MISPE column were injected into the HPLC system for analysis. S6. Methods and models of computational study of DYKDC peptide/EAMA complex, and DYKD and DYKDDDDK peptides Molecular systems We performed extensive computational molecular modeling of three systems formed by peptides comprising residues 1) DYKD in water, 2) DYKDDDDK (FLAG) in water, and 3) DYKDC bound to N-(2-aminoethyl)methacrylamide hydrochloride (EAMA) in dimethyl sulfoxide (DMSO). Each peptide chain was built using the LEaP module within the Amber 14.0 program.5 Molecular induced fit docking (IFD) with standard precision (SP) A representative DYKD peptide structure, obtained from the molecular dynamics (MD) simulation as described in Molecular Dynamics Simulations (see Manuscript), was used to generate a model of DYKDC bound to EAMA using the Induced Fit Docking (IFD) module through Glide and Prime of Schrödinger-Maestro 2018-3.6 First, LigPrep in Schrödinger-Maestro 2018-36 was used to prepare the EAMA ligand using the default parameters. EAMA initial structure was obtained as described below in Parameterization of EAMA Compound and Modified CYS Residue section. Secondly, Glide docking was carried out for EAMA. Then, the side chains were refined and optimized within 5.0 Å of EAMA poses using Schrödinger Prime. Finally, the Glide SP redocking was performed using the default parameters. The 14 top-ranked EAMA poses were output and sorted by IFD score in the range of -17.559 kcal mol−1 to -14.630 kcal mol−1. Over 75% of the EAMA poses interact with either D4 and/or C5 of the DYKDC peptide. The 5 top-ranked EAMA poses were docked at D4 and/or C5 selecting EAMA pose 3 that interacts with D4 and C5 (IFD score of -16.869 kcal mol−1) as the initial structure to conduct MD simulation. Parameterization of EAMA compound and modified CYS residue The force field parameter for EAMA to be used for MD simulation, which has positive charge (1+), was obtained using the following protocol: 1) the geometry of the molecule, drawn using VIDA7 program, was optimized using Quantum Mechanics Semi- empirical (QMS) minimization; 2) all EAMA atomic partial charges were computed with the AM1-BCC semi-empirical method as implemented in the Amber 14.0 Antechamber programs;5,8, and 3) the parameterization of the ligand atoms were done using the GAFF force field.5 Visual Molecular Dynamics (VMD),9 PyMOL10 and VIDA7 programs were Publicaciones científicas 198 used for further structure visualization and drawing. The Amber force field for the modified C-terminus cysteine residue on the thiol group (i.e., the hydrogen atom of the thiol group was replaced by a methyl group) was obtained by 1) keeping the same parameters for all backbone atoms and beta carbon atom of the standard C-terminus cysteine residue; and 2) adjusting the charges for the modified thiol group based on AM1- BCC semi-empirical method calculations. The charges and parameters are available upon request. Molecular dynamics simulations setups We performed extensive, 1 µs MD simulation for each system using the FF14SB all– atom Amber force field5,11 and the TIP3P water12 or the DMSO models in all calculations. The DMSO solvent box, created by John Dalmaris13 and reported on Richard Bryce's group website,13 based on atomic parameters for the Amber force field developed by Fox and Kollman14 was used as well. During the MD simulations, all present titratable groups in the peptides were treated charged. The three systems were initially minimized using the Steepest Descent and Conjugate Gradient methods to remove all the possible unfavorable interactions from the built peptides models. Weak restraints on the peptides (force constants 2 to 1 kcal mol−1 Å−2) were imposed. Then, the apo-peptide systems DYKD and DYKDDDDK (FLAG) were heated from 0 K until 1500 K or until 2000 K, respectively, and then cooled slowly until 300 K using Langevin dynamics15 at constant volume. They were heated to 1500 K for 1 ns (or 2000 K for 800 ps) with a Langevin collision frequency of γ = 5.0 ps−1, and cooled down slowly for other 1.7 ns (or 1.9 ns) with a Langevin collision frequency of γ = 5.0 ps−1. Three (or one) sodium ions were added to each system, respectively, to neutralize the simulation cell. Then, the volume was allowed to change freely and the temperature was kept constant with a Langevin collision frequency of γ = 5.0 ps−1, and isotropic Berendsen regulation16 (1 atm) with a Berendsen coupling constant of taup = 5.0 ps. The weak positional restrains on the peptides was gradually reduced from 0.5 kcal mol−1 Å−2 to 0.1 kcal mol−1 Å−2 respectively, until the system was allowed to move freely. Non–bonded cutoffs of 9 Å was used for the Lennard–Jones potentials and electrostatic interactions calculated using particle– mesh Ewald (PME). The production MD simulation was carried out using the NPT ensemble and using Particle Mesh Ewald Molecular Dynamics (pmemd.MPI). In the production stage the temperature was maintained at 300 K using Langevin dynamics with a collision frequency of γ = 5.0 ps-1. The isotropic Berendsen regulation16 (1 atm) with a Berendsen coupling constant of taup = 5.0 ps was also used. The length of all bonds involving hydrogen atoms was kept fixed with the SHAKE algorithm.17 The pressure was kept fixed at 1 atm. The equations of motion were integrated with a time– Publicaciones científicas 199 step of 2 fs. The coordinates were recorded at every 5 ps. The MD simulation of DYKDC peptide/EAMA complex system was set up as for the previous apo-peptides except for the heating protocol where the temperature was directly increased from 0 K to 300 K using Langevin dynamics with collision frequency of γ = 5.0 ps−1. The initial structure of the DYKDC/EAMA complex was obtained as described above in Molecular Induced Fit Docking (IFD) with Standard Precision (SP) section. In addition, there was a strong positional restraint on Cys5 of DYKDC peptide (force constant 100 kcal mol−1 Å−2) during the MD simulation to mimic the immobilization of the peptide C-terminus thiol group covalently bond to the silica. All MD simulations and analysis were performed using Amber,5,18, Simulaid,19 and VIDA7 programs. Results and discussion section S7. Equations The amount of immobilized ligand (expressed as degree of functionalization in mmol g-1, Df) on the silica surface was estimated by elemental microanalysis data, more precisely from the change in carbon content (∆%C) compared to the preceding step (Equation S1): 𝐷𝑓 = ∆𝐶% · 𝐹 𝑚𝐶· 𝑁𝐶 (Eq. S1) Where Df is the degree of functionalization (mmol g-1), %C is the difference in the carbon content versus the preceding step, F is the conversion factor (10) required to express the result in mmol g-1, mC is the atomic weight of carbon (12 g mol-1) and NC the number of carbon atoms presented in the coupled ligand. The coupling yield expressed in % was calculated applying Equation S2: 𝑌𝑖𝑒𝑙𝑑 = 𝑋𝐶 𝑋𝐴 ∙ 100 (Eq. S2) Where XC is the amount of ligand attached to the surface (mmol) and XA is the total amount of available ligand of the preceding step (mmol). Publicaciones científicas 200 S8. Characterization of derivatized silica beads Silane derivatization Figure S2. Functionalization scheme of silanization step using (A) 3-(2- aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane (AEAPMS) with (1) one or (2) two methoxy groups grafted to the silica surface and (B) N-(2-aminoethyl)-2,2,4-trimethyl-1-aza-2- silacyclopentane (AETAZS). Derivatization using 3-(2-aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane (AEAPMS) Table S3. Elemental microanalysis results and degree of functionalization (Df, expressed as mmol g-1 calculated according to Eq. S1) corresponding to silica beads derivatized using 3-(2- aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane (AEAPMS) under different experimental conditions. Material %C %H %N Df (mmol g-1) SiOH 0.05 0.27 0.09 - Si-DMPTSA1 2.03 0.66 0.68 0.24 Si-DMPTSA2 2.25 0.68 0.71 0.27 Si-DMPTSA3 2.32 0.7 0.73 0.28 Si-DMPTSA4 3.48 0.86 1.04 0.41 Si-DMRT* 1.78 0.60 0.68 0.25 *According to the experimental ratio between carbon and nitrogen content, all the samples were calculated assuming only one methoxy group grafted to the silica surface, whereas Df of Si-DMRT was calculated assuming two methoxy groups grafted to the silica surface. As described in Table S3, when comparing the optimum 2 h (Si-DMPTSA1) versus 16 h (Si-DMPTSA4) reaction times, under the same experimental conditions, it can be noticed that longer times yielded a higher functionalization degree (Si-DMPTSA4, 0.41 mmol g-1). Interestingly, when performing silane coupling reaction at room AEAPMS AETAZS A B Publicaciones científicas 201 temperature and in the absence of catalyst during 24 h (Si-DMRT), a decrease in the grafting content was observed (0.25 mmol g-1) compared with Si-DMPTSA4. Figure S3. 29Si CP/MAS NMR spectra of silica particles functionalized with silane AEAPMS using different conditions: Si-DMPTSA1 (3.75 mmol g-1, 110 ºC, PTSA, 2 h), Si-DMPTSA4 (3.75 mmol g-1, 110 ºC, PTSA, 16h) and Si-DMRT (3.75 mmol g-1, 25 ºC, 24 h). Table S4. Elemental microanalysis results and degree of functionalization (Df, expressed as mmol g-1 calculated according to Eq. S1) of three different batches of Si-DMPTSA1. Batch %C %H %N Df (mmol g-1) Si-DMPTSA 1A 2.03 0.66 0.68 0.24 Si-DMPTSA 1B 2.09 0.66 0.63 0.25 Si-DMPTSA 1C 2.51 0.73 0.75 0.30 Figure S4. Nitrogen adsorption isotherms corresponding to Si-DMPTSA1 and rehydroxilated silica (SiOH) samples. D Q3 Q4 Publicaciones científicas 202 Derivatization using N-(2-aminoethyl)-2,2,4-trimethyl-1-aza-2-silacyclopentane (AETAZS) Figure S5. 29Si CP/MAS NMR spectra of silica particles functionalized with silane AETAZS using different con-centration levels 3.75 mmol (Si-AZA1), 7.5 mmol (Si-AZA2) and 11.25 mmol g–1 (Si- AZA3). The same intensity in Q3 signal indicates a similar extent of surface silanol condensation reaction (note that this signal is higher than for the sample Si-DMPTSA4, functionalized with AEAPMS). On its turn, silane coupling gives rise to a signal at about 13 ppm, called M signal, associated to the monofunctional silane grafting, that exhibits similar intensity in the three samples being unable to distinguish the changes in silane content.20 Table S5. Elemental microanalysis results and degree of functionalization (Df, expressed as mmol g-1 calculated according to Eq. S1) corresponding to silica beads derivatized using N-(2- aminoethyl)-2,2,4-trimethyl-1-aza-2-silacyclopentane (AETAZS). Material %C %H %N Df (mmol g-1) SiOH 0.05 0.27 0.09 - Si-AZA1 1.15 0.46 0.35 0.12 Si-AZA2 1.21 0.51 0.36 0.13 Si-AZA3 1.27 0.53 0.37 0.13 M Q3 Q4 Publicaciones científicas 203 Table S6. Elemental microanalysis results and degree of functionalization (Df, expressed as mmol g-1 calculated according to Eq. S1) of different batches of Si-AZA1. Batch %C %H %N Df (mmol g-1) Si-AZA 1A 1.36 0.58 0.48 0.142 Si-AZA 1B 1.36 0.57 0.48 0.142 Si-AZA 1C 1.35 0.58 0.49 0.141 Si-AZA 1D 1.15 0.46 0.35 0.12 Figure S6. Nitrogen adsorption isotherms corresponding to Si-AZA1 and rehydroxylated silica (SiOH) samples. Figure S7. Pore size distribution curves obtained from the adsorption (A) and desorption (B) branches of the isotherms for (black) SiOH, (blue) SiDMPTSA1 and (red) SiAZA1 samples. D (nm) 0 20 40 60 80 100 120 140 d V p / D ( c m 3 g -1 n m -1 ) 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,0120.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 D (nm) 0 20 40 60 80 100 120 140 d V p / D ( c m 3 g -1 n m -1 ) 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0 20 40 60 80 100 120 140 D (nm) d V p /∆ D ( c m 3 g -1 n m -1 ) 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 d V p /∆ D ( c m 3 g -1 n m -1 ) 0 20 40 60 80 100 120 140 D (nm) A B SiOH SiDMPTSA1 SiAZA1    SiOH SiDMPTSA1 SiAZA1    Publicaciones científicas 204 Figure S8. Scanning electron micrographs of amino-functionalized particles at optimum conditions. (A) Si-DMPTSA1 (3.75 mmol AEAPMS g-1, 110 ºC, PTSA, 2 h), (B) Si-AZA1 (3.75 mmol AETAZS g-1, 25 ºC, 24 h). Iodoacetylation of amino-modified particles Figure S9. Functionalization scheme of iodoacetylation of amino-modified silica beads. Functionalization degree of iodoacetamide groups immobilized on silica beads was estimated by applying the Equation S1 based on the change in the carbon content versus the previous step (Si-DMPTSA1 and Si-AZA1, respectively) to the final product (designed as Si-DM-IAc-X or Si-AZA-IAc-X). Table S7. Elemental microanalysis results and degree of functionalization (Df) obtained after iodoacetylation reaction of Si-DMPTSA1 samples of different batches. Batch %C %H %N ∆%C Df (mmol g-1) Si-DM-IAc-0 2.41 0.64 0.69 0.32 0.13 Si-DM-IAc-1 2.44 0.66 0.74 0.41 0.17 Si-DM-IAc-2 2.84 0.75 0.74 0.33 0.14 Si-DM-IAc-3 2.82 0.72 0.75 0.31 0.13 Si-DM-IAc-4 2.88 0.74 0.77 0.37 0.15 Si-DM-IAc-5 2.98 0.75 0.80 0.47 0.20 A B Si-AZA1Si-DMPTSA1 Publicaciones científicas 205 Table S8. Elemental microanalysis results and degree of functionalization (Df) obtained after iodoacetylation reaction of Si-AZA1 samples of different batches. Batch %C %H %N ∆%C Df (mmol g-1) Si-AZA-IAc-1 1.54 0.53 0.45 0.18 0.08 Si-AZA-IAc-2 1.60 0.56 0.45 0.25 0.10 Si-AZA-IAc-3 1.61 0.54 0.45 0.26 0.11 Peptide DYKDC coupling Figure S10. Functionalization scheme of peptide DYKDC coupling to iodoacetylated silica beads. Table S9. Elemental microanalysis results and degree of functionalization (Df) obtained after peptide DYKDC immobilization on iodoacetylated Si-DM-IAc particles. Batch %C %H %N %S ∆%C Df (mmol g-1) Si-DM-Pept-0 4.03 0.85 1.34 0.17 1.62 0.052 Si-DM-Pept-1 3.93 0.85 1.28 0.20 1.49 0.048 Si-DM-Pept-2 4.55 0.91 1.25 0.23 1.71 0.055 Si-DM-Pept-3 4.50 0.98 1.23 0.21 1.68 0.054 Si-DM-Pept-4 4.39 0.95 1.22 0.21 1.51 0.048 Si-DM-Pept-5 4.38 0.95 1.25 0.23 1.4 0.045 Table S10. Elemental microanalysis results and degree of functionalization (Df) obtained after peptide DYKDC immobilization on iodoacetylated Si-AZA-IAc particles. Batch %C %H %N %S ∆%C Df (mmol g-1) Si-AZA-Pept-1 2.57 0.61 0.72 0.09 1.03 0.033 Si-AZA-Pept-2 2.82 0.72 0.69 0.12 1.22 0.039 Si-AZA-Pept-3 2.67 0.66 0.68 0.11 1.06 0.034 Publicaciones científicas 206 S9. Hierarchically imprinted MIP-AZA polymers Figure S11. (A) Scanning electron micrographs of MIP-AZA particles and (B) particle size distribution adjusted to a Gaussian model (OriginPro 2017). Table S11. Imprinting factors (calculated as RMIP/RNIP) obtained for the DYKD and FLAG peptides in the MIPs prepared in this work using the optimized MISPE protocol. Polymer Analyte IF MIP-DM DYKD 2.0 MIP-AZA 2.0 MSP8* 12.8 MIP-DM FLAG 3.2 MIP-AZA 21.3 MSP8* 3.3 *Non-hierarchically imprinted polymer (MSP8) was synthesized using DYKD as template molecule as reported previously.21 S10. Computational study of DYKDC peptide/EAMA complex, and DYKD and DYKDDDDK peptides Figure S12. Cluster analysis of (A) DYKDC peptide/EAMA complex in DMSO: the two main conformations are depicted: cluster 1 (~40%) and cluster 2 (~60%); (B) DYKD peptide in water: the three main conformations are depicted: cluster 1 (~50%), cluster 2 (~37%), and cluster 3 (~13%); (c) DYKDDDDK (FLAG) peptide in water: the three main conformations are depicted: cluster 1 (~52%), cluster 2 (~28%) and cluster 3 (~20%). BA 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nanoseconds A 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nanoseconds B 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nanoseconds C Publicaciones científicas 207 Table S12. Hydrogen bonds analysis for the DYKDC peptide/EAMA complex (Last 1 µs MD simulation). Acceptor DonorH Donor % Occupied Distance (Å) Angle (°) CYS@O* EAMA@H1 EAMA@N1 62.80 3.13 145.32 CYS@OXT* EAMA@H1 EAMA@N1& 74.50 2.97 151.06 CYS@O EAMA@H4 EAMA@N2& 38.80 2.77 155.48 EAMA@H5 EAMA@N2 34.20 2.80 152.40 EAMA@H6 EAMA@N2 23.90 2.75 158.74 CYS@OXT EAMA@H4 EAMA@N2 30.80 3.02 139.49 EAMA@H5 EAMA@N2 30.90 2.95 142.76 EAMA@H6 EAMA@N2 15.60 3.04 137.45 ASP4@OD1* EAMA@H4 EAMA@N2 17.20 2.74 163.43 EAMA@H5 EAMA@N2 9.20 2.73 162.12 EAMA@H6 EAMA@N2 22.90 2.72 164.08 ASP4@OD2* EAMA@H4 EAMA@N2 8.30 2.74 163.59 EAMA@H5 EAMA@N2 20.80 2.72 163.04 EAMA@H6 EAMA@N2 22.00 2.72 163.19 *O and OXT represent the carboxyl oxygen of the –COO- groups of D4 and C5. &N1 and N2 represent the nitrogen of the –NH and –NH3 groups of EAMA, respectively. Hydrogen bonds were determined via the distance between the heavy atoms using a cutoff of 3.5 Å and the angle between the acceptor and donor atoms using a cutoff of 120. Figure S13. Computational study of DYKDC peptide/EAMA complex in DMSO. Root-mean- square deviation (RMSD) with respect to minimized initial structure backbone atoms. Time (ns) R M S D ( Ȧ ) 0 200 400 600 800 1000 12 10 8 6 4 2 0 1200 14 DYKDC EAMA Publicaciones científicas 208 Table S13. Hydrogen bonds analysis for the DYKDC peptide/EAMA complex (Cluster 1, first 400 ns of last 1 µs MD simulation). Acceptor DonorH Donor % Occupied Distance (Å) Angle (°) CYS@O* EAMA@H1 EAMA@N1& 75.44 3.06 148.08 CYS@OXT* EAMA@H1 EAMA@N1 62.66 2.99 149.03 CYS@O EAMA@H4 EAMA@N2& 45.86 2.79 152.22 EAMA@H5 EAMA@N2 34.34 2.84 146.87 EAMA@H6 EAMA@N2 14.04 2.78 158.30 CYS@OXT EAMA@H4 EAMA@N2 36.34 2.95 142.93 EAMA@H5 EAMA@N2 35.84 2.87 146.41 EAMA@H6 EAMA@N2 9.77 3.01 136.24 ASP4@OD1* EAMA@H4 EAMA@N2 7.02 2.71 164.58 EAMA@H5 EAMA@N2 9.77 2.72 162.06 EAMA@H6 EAMA@N2 22.81 2.72 163.88 ASP4@OD2* EAMA@H4 EAMA@N2 5.26 2.75 161.12 EAMA@H5 EAMA@N2 18.80 2.72 163.99 EAMA@H6 EAMA@N2 37.09 2.72 162.77 *O and OXT represent the carboxyl oxygen of the –COO- groups of D4 and C5. &N1 and N2 represent the nitrogen of the –NH and –NH3 groups of EAMA, respectively. Hydrogen bonds were determined via the distance between the heavy atoms using a cutoff of 3.5 Å and the angle between the acceptor and donor atoms using a cutoff of 120. Figure S14. Computational study of DYKDDDDK (FLAG) peptide in water. Root-mean-square deviation (RMSD) of the FLAG peptide with respect to minimized initial structure backbone atoms: (A) aligned with respect to all residues; and (B) aligned with respect to residues 5 to 8 (DDDK). Time (ns) R M S D ( Ȧ ) 0 200 400 600 800 1000 2 1.5 1 0.5 0 2.5 FLAG Peptide I 5-8 aa Time (ns) R M S D ( Ȧ ) 0 200 400 600 800 1000 FLAG Peptide 6 4 1 0 7 5 3 2 A B Publicaciones científicas 209 Table S14. Hydrogen bonds analysis for the DYKDC peptide/EAMA complex (Cluster 2, last 600 ns of last 1 s MD simulation). Acceptor DonorH Donor % Occupied Distance (Å) Angle (°) CYS@O* EAMA@H1 EAMA@N1& 54.41 3.19 142.79 CYS@OXT* EAMA@H1 EAMA@N1 82.36 2.96 152.09 CYS@O EAMA@H4 EAMA@N2& 34.11 2.76 158.40 EAMA@H5 EAMA@N2 34.11 2.76 156.10 EAMA@H6 EAMA@N2 30.45 2.75 158.87 CYS@OXT EAMA@H4 EAMA@N2 27.12 3.08 136.44 EAMA@H5 EAMA@N2 27.62 3.02 139.61 EAMA@H6 EAMA@N2 19.47 3.06 137.85 ASP4@OD1* EAMA@H4 EAMA@N2 23.96 2.75 163.20 EAMA@H5 EAMA@N2 8.82 2.74 162.16 EAMA@H6 EAMA@N2 22.96 2.73 164.21 ASP4@OD2* EAMA@H4 EAMA@N2 10.32 2.73 164.43 EAMA@H5 EAMA@N2 22.13 2.72 162.51 EAMA@H6 EAMA@N2 11.98 2.72 164.04 *O and OXT represent the carboxyl oxygen of the –COO- groups of D4 and C5. &N1 and N2 represent the nitrogen of the –NH and –NH3 groups of EAMA, respectively. Hydrogen bonds were determined via the distance between the heavy atoms using a cutoff of 3.5 Å and the angle between the acceptor and donor atoms using a cutoff of 120. References [1] A. Poma, A. Guerreiro, M.J. Whitcombe, E. V. Piletska, A.P.F. Turner, S.A. Piletsky, Solid-phase synthesis of molecularly imprinted polymer nanoparticles with a reusable template-"plastic antibodies", Adv. Funct. Mater. 23 (2013) 2821–2827. [2] ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Catalog Number A2220 Sigma Aldrich (accesed August 8th, 2020). [3] R. I. Boysen, Advances in the development of molecularly imprinted polymers for the separation and analysis of proteins with liquid chromatography, J Sep Sci. 42 (2019) 51– 71. Publicaciones científicas 210 [4] A. C. Moser, D. S. Hage, Immunoaffinity chromatography: an introduction to applications and recent developments, Bioanalysis 2 (2010) 769–790. [5] D. A. Case, T. E. Cheatham 3rd, T. Darden, H. Gohlke, R. Luo, K. M. Merz Jr, A. Onufriev, C. Simmerling, B. Wang, R. J. Woods, The Amber biomolecular simulation programs, J. Comput. Chem. 26 (2005) 1668–1688. [6] Schrödinger Release 2018-3: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2018; Induced Fit Docking protocol; Glide, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2018; Prime, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2018. [7] VIDA 4.3.0.4: OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM. http://www.eyesopen.com. [8] J. M. Wang, W. Wang, P. A. Kollman, Antechamber: an accessory software package for molecular mechanical calculations, Abstr. Pap. Am. Chem. S. 222 (2001) U403. [9] W. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten, VMD: Visual Molecular Dynamics, J. Mol. Graph. 14 (1996) 33–38. [10] The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8.2.3 Schrödinger, LLC. [11] J. A. Maier, C. Martinez, K. Kasavajhala, L. Wickstrom, K. E. Hauser, C. Simmerling, ff14SB: improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB, J. Chem. Theory Comput. 11 (2015) 3696–3713. [12] W. L. Jorgensen, J. Chandrasekhar, J. D. Madura, R. W. Impey, M. L. Klein, Comparison of simple potential functions for simulating liquid water, J. Chem. Phys. 79 (1983) 926–935. [13] Amber parameter database. Maintained by Richard Bryce. http://research.bmh.manchester.ac.uk/bryce/amber. Accessed July 2, 2019. [14] T. Fox, P. A. Kollman. Application of the RESP methodology in the parametrization of organic solvents, J. Phys. Chem. B 102 (1998) 8070–8079. [15] R. Pastor, B. Brooks, A. Szabo, An analysis of the accuracy of Langevin and molecular dynamics algorithms, Mol. Phys. 65 (1988) 1409−1419. [16] H. J. C. Berendsen, J. P. M. Postma, W. F.van Gunsteren, A. DiNola, J. R. Haak, Molecular dynamics with coupling to an external bath, J. Chem. Phys. 81 (1984) 3684−3690. [17] J. P. Ryckaert, G. Ciccotti, H. J. C. Berendsen, Numerical-integration of cartesian equations of motion of a system with constraints - molecular-dynamics of n-alkanes, J. Comput. Phys. 23 (1977) 327–341. Publicaciones científicas 211 [18] D. Case, V. Babin, J. Berryman, R. Betz, Q. Cai, D. Cerutti, T. Cheatham III; T. Darden, R. Duke, H. Gohlke, et al. Amber 14; University of California: San Francisco, (2014). [19] M. Mezei, Simulaid: a simulation facilitator and analysis program, J. Comput. Chem. 31 (2010) 2658–2668. [20] N. García, E. Benito, J. Guzmán, P. Tiemblo, Use of p-toluenesulfonic acid for the controlled grafting of alkoxysilanes onto silanol containing surfaces: preparation of tunable hydrophilic, hydrophobic, and super-hydrophobic silica, J. Am. Chem. Soc. 129 (2007) 5052–5060. [21] L. N. Gómez-Arribas, J. L. Urraca, E. Benito-Peña, M.C. Moreno-Bondi, Tag-specific affinity purification of recombinant proteins by using molecularly imprinted polymers, Anal. Chem. 91 (2019) 4100–4106 https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.8b05731 https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.8b05731 . Publicaciones científicas 213 3.2. Polímeros de impronta molecular para el análisis de micotoxinas en alimentos Las micotoxinas son compuestos tóxicos originados en el metabolismo secundario de algunos géneros de hongos y su presencia en alimentos y piensos puede ocasionar graves problemas de salud, tanto en humanos como en animales. De entre todas las micotoxinas conocidas, el alternariol (AOH), producido por el género Alternaria alternata, se incluye dentro del grupo de las micotoxinas emergentes y ha suscitado mucho interés desde hace varios años debido a sus efectos adversos en humanos y animales, como se ha comentado anteriormente en la sección 1.2.2. La Publicación III describe la síntesis de un MIP selectivo a AOH y su empleo como sorbente selectivo para la extracción de la micotoxina empleando MISPE. Para ello, se llevó a cabo la síntesis de una biblioteca de polímeros utilizando una aproximación combinatoria y análogos sintéticos del AOH como moléculas plantilla. Se optimizaron todos los parámetros del método MISPE para la extracción selectiva del AOH, y, finalmente, se llevó a cabo la determinación de la micotoxina en muestras de tomate utilizando ultrasonidos en la etapa previa de extracción. Las etapas de las que consta este trabajo se pueden resumir en: 1. Síntesis de una biblioteca de mini-MIPs en formato bloque empleando una aproximación combinatoria utilizando diferentes análogos sintéticos como moléculas plantilla (S1-S4), monómeros funcionales y entrecruzantes. 2. Síntesis y caracterización de MIPs sintetizados en forma de partículas esféricas empleando gel de sílice como molde sacrificable para la polimerización y el análogo S2 (3,8,9-trihidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona) como molécula plantilla. 3. Optimización de un método MISPE para la extracción selectiva del AOH. 4. Optimización de un método de análisis para la determinación de AOH en muestras de tomate empleando ultrasonidos en la etapa de extracción (UAE-MISPE-HPLC- FLD). Publicaciones científicas 215 3.2.1. Publicación III: Tailoring molecularly imprinted polymer beads for alternariol recognition and analysis by a screening with mycotoxin surrogates Reproduced from: Journal of Chromatography A 1425 (2015) 231–239 Copyright © 2015, with permission from Elsevier Abstract Molecularly imprinted porous polymer microspheres have been prepared for selective binding of alternariol (AOH), a phenolic mycotoxin produced by Alternaria fungi. In order to lead the synthesis of recognition materials, four original AOH surrogates have been designed, prepared and characterized. They bear different number of phenol groups in various positions and different degree of O-methylation on the dibenzo[b,d]pyran-6-one skeleton. A comprehensive library of mixtures of basic, acidic or neutral monomers, with divinylbenzene or ethyleneglycol dimethacrylate as cross- linkers, were polymerized at a small scale in the presence of the four molecular mimics of the toxin molecule. This polymer screening has allowed selection of the optimal composition of the microbeads (N-(2-aminoethyl) methacrylamide, EAMA, and ethylene glycol dimethacrylate). The latter are able to bind AOH in water-acetonitrile (80:20, v/v) with an affinity constant of (109 ± 10) mM-1 and a total number of binding sites of 35 ± 2 µmol g-1, being alternariol monomethylether the only competitor species. Moreover, 1H- NMR titrations have unveiled a 1:2 surrogate-to-EAMA stoichiometry, the exact interaction sites and a binding constant of 1.5 x 104 M-2. A molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) method has been optimized for selective isolation of the mycotoxin from aqueous samples upon a discriminating wash with 3 mL of acetonitrile/water (20:80, v/v) followed by determination by HPLC with fluorescence detection. The method has been applied, in combination to ultrasound-assisted extraction, to the analysis of AOH in tomato samples fortified with the mycotoxin at five Publicaciones científicas 216 concentration levels (33–110 µg kg-1), with recoveries in the range of 81–103% (RSD < 4%, n = 6). To the best of our knowledge, this is the first imprinted material capable of molecularly recognizing this widespread food contaminant. Introduction Alternariol (AOH) and alternariol monomethyl ether (AME) (Figure 1) are two mycotoxins produced by a number of species of the Alternaria fungal genus. These molds can be found in soil, plants, food, feed and indoor air and are among the main microorganisms responsible for pre- and post-harvest damage to agricultural products such as cereal grains, sunflower seeds, oilseed rape, pecans and various fruits such as tomatoes, apples, mandarins, olives, peppers, melons or raspberries.1-3 The main mycotoxin-producing fungal species is Alternaria alternate.1 These fungi may grow naturally under cold-storage4 or shelf-life conditions, and are responsible for significant financial losses in the food industry. Moreover, the mold Alternaria is a recognized allergy-causing fungus.5 Information on the natural occurrence of AOH or AME in food is still scarce; however, both mycotoxins have been detected in marketed products at concentrations in the 1–1000 μg kg-1 range.1,4 High values have also been reported in sunflower seeds and food products such as fruit juices, tomato derivatives, beer and wine.6 The toxicological impact of Alternaria toxins on humans and livestock is still under study. Alternariol and AME are not acutely toxic; however some in vitro studies have demonstrated that both compounds are mutagenic and clastogenic,6,7 with AOH showing higher genotoxicity that AME.4 At present, no formal regulations or limits for any of the Alternaria toxins have been set in any country. However, sensitive and selective analytical methods are required to investigate their toxicity and detect their presence in different food matrices, preventing mycotoxin contamination of derived commercial products. Methods reported in the literature for AOH analysis include gas chromatography, thin layer chromatography and high performance liquid chromatography with UV, fluorescence or mass spectrometry detection.4,8-12 A couple of immunochemical methods (ELISA-type) have been set for determination of this mycotoxin in apple and tomato,13 corn and feed.14 Moreover, determination of AOH in complex food matrices usually requires clean-up and pre-concentration steps prior to analysis to improve the method sensitivity and selectivity. Solid phase extraction (SPE), with C18, aminopropyl or Oasis® HLB sorbents,4,15,16 is usually the preferred method for extraction of these toxins from food samples. Publicaciones científicas 217 In recent years, the use of molecularly imprinted polymers as stationary phases for SPE (also called “molecularly imprinted solid phase extraction” or MISPE) has proven to be a convenient alternative to traditional SPE cartridges, including immunoaffinity solid phases, for selective extraction of mycotoxins in food analysis.17-20 Advantages of these materials compared to natural receptors comprise their ease of preparation, physicochemical stability, storage convenience, competitive cost, feasibility of manufacturing receptors against toxic substances, and the possibility of performing molecular recognition in organic media.21-24 This work describes the development of the first MIP selective to AOH. The polymers have been prepared using the “template mimic” approach,25 especially useful if the target is toxic, dangerous, expensive or difficult to synthesize.26 AOH is a toxic expensive chemical, the total synthesis of which is a time-consuming procedure that involves seven synthetic steps.27 The use of surrogate molecules instead of the analyte itself has an additional advantage: gradual leaching of the remaining template traces will not contaminate the sample, preventing false positives because the surrogate has different physicochemical properties than those of the analyte (chromatographic retention time, optical absorption/emission spectra, or different molecular weight for mass spectral analysis). In the present work, we have employed easy-to-obtain molecular surrogates of AOH and AME (S1–S4, Figure 1)28 in the MIP preparation. A combinatorial screening approach has allowed us selection of the optimal template mimic, functional monomer and cross-linker formulation for the polymer synthesis. Selective rebinding of AOH to the MIP library elements vs the non-imprinted (NIP) controls has been evaluated by HPLC, and the best composition was singled out for preparation of microspherical particles using porous silica beads as sacrificial scaffolds in the polymerization.29 Then, a MISPE method has been optimized for selective extraction of AOH from aqueous solutions of standards and its application to the analysis of the mycotoxin in fortified tomato extracts by HPLC with FLD detection has been demonstrated. Materials and methods Reagents and chemicals Acetonitrile (ACN), methanol (MeOH, HPLC grade) and chlorobenzene (>99.8%) were from Sigma-Aldrich. Extra dry dimethyl sulfoxide (DMSO) was from Acros. Water was purified to type I with a Millipore Direct-Q system. Solvents were dried over 3 Å molecular sieves. Alternariol (3,7,9-trihydroxy-1-methyl-6H-dibenzo[b,d]pyran-6-one, 96%) from Alternaria sp., ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), 2-[4-(2-hydroxyethyl)- Publicaciones científicas 218 1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES), divinylbenzene (DVB), 2- (diethylamino)ethylmethacrylate (DAEM), 4-vinylpyridine (VPY), 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), methacrylic acid (MAA) and 4-vinylbenzoic acid (VBA) were from Sigma-Aldrich. Methacrylamide (MAM, Fluka), 1-ALPP (1-allylpiperazine, Lancaster), N- (2- aminoethyl)methacrylamide (EAMA, Polysciences; as hydrochloride), 2,2’- azobis(2,4-dimethylvaleronitrile) (ABDV, Wako), tetrabutylammonium hydroxide (TBAOH, Apollo), trifluoroacetic acid (TFA, 99%, Alfa Aesar), AlCl3 (98%, Fluka), dodecanethiol (98%,Aldrich), 2-bromo-4,5-dimethoxybenzoic acid (98%, Aldrich), 2- bromo-5-methoxybenzoic acid (98%, Aldrich) and resorcinol (99%, Aldrich), were employed as received unless otherwise stated. Optical spectroscopy UV-VIS absorption spectra were recorded with a Varian Cary 3-Bio spectrophotometer. Steady-state and time-resolved emission measurements were carried out on a Horiba Fluoromax-4TCSPC spectrofluorometer equipped with a 150-W xenon lamp for the spectral recordings, and a Horiba NanoLED-340 (343-nm, 1-ns pulses filtered through a 340-nm band-pass filter) for lifetime determinations. Fluorescence decays were measured with a 200-ns window after accumulating at least 10,000 counts in the peak channel. Emission lifetimes were extracted from the exponential curve fittings using the proprietary Horiba algorithm with deconvolution of the instrumental response function. The goodness-of-the-fit of the exponential decays was judged by visual inspection and the reduced chi-squared parameter (R 2 < 1.2) of the residuals. All emission measurements were carried out using optically diluted samples (Aexc < 0.1). 1H-NMR titrations Titrations were performed in a Bruker Avance DPX500 spectrometer at 500 MHz. To that end, 4.2 mg (0.0172 mmol) of alternariol surrogate S2 were dissolved in 0.7 mL of anhydrous DMSO-d6 (24.5 mM final concentration) in a glass vial. A stock solution of EAMA (0.287 M in DMSO-d6) was prepared by dissolving 51.88 mg of EAMA hydrochloride in 1.1 mL of anhydrous DMSO-d6 and adding this solution to a stoichiometric amount of solid TBAOH (from a 1 M solution in MeOH, evaporated at reduced pressure). Increasing amounts of EAMA stock were added to the S2 solution to final S2/EAMA mole ratios of 10, 5.0, 3.3, 2.0, 1.43, 1.25, 1.00, 0.67, 0.50, 0.40, 0.33, 0.25, 0.20, 0.13, and 0.10, and their 1H-NMR spectra were recorded and analyzed. Publicaciones científicas 219 Figure 1. Chemical structures of (A) alternariol (AOH) and alternariol monomethyl ether (AME) toxins, (B) S1-S4 surrogates and (C) functional monomers and cross-linkers employed for the synthesis of MIPs. Combinatorial MIP library preparation The functional monomers indicated in Table S1 (Supplementary data) were used to create the MIP/NIP libraries. The composition of each MIP was, in all cases, template (T)/functional monomer (FM)/cross-linker (CL) in a 1:32:160 mole ratio. The volume of porogen (DMSO) for each polymer synthesis was calculated in such a way that the VDMSO/(VDMSO + Vtotal monomers) ratio is kept at ~ 0.57. Non-imprinted polymers (NIPs) were prepared in the same way, but without adding the template to the monomer mixture. The polymers were synthesized in 2 mL 96- well polypropylene plates (Radleys) following the pattern shown in Table S1. Stock solutions of the components (monomers, initiator, template) were transferred into the wells. Monomers that were supplied as the hydrochloride salt were firstly neutralized by adding a stoichiometric amount of TBAOH. To this end, the solvent in the required amount of commercial 1 M solution of TBAOH in methanol was removed by rotavaporation, and the solid residue was dissolved in anhydrous DMSO purged with argon beforehand. Then, either neat DMSO or the DMSO- TBAOH mixture was added to the wells containing the functional monomers, in such a way that the total volume was either 300 µL for the polymer series based on DVB as cross-linker, or 475 µL if the cross-linker was EDMA (in order to keep the ratio Publicaciones científicas 220 VDMSO/(VDMSO + Vtotal monomers) ~ 0.57). Then, the selected template was added to each DMSO solution of monomers, and left equilibrating for 15 min at room temperature to allow for the monomer-template interaction to occur. Finally, the ABDV radical initiator and the chosen cross-linker (EDMA or DVB) were added to each well. The 96-well plates were purged with nitrogen for 5 min and sealed with PTFE-coated lids (Radleys, UK). Then, they were placed into an oven for one day at 50 °C and a second day at 70 °C. The bulk polymers obtained in this way were ground with an agate mortar and the grains were transferred to another 2 mL/well 96-well plate containing a 10 µm polypropylene porous membrane per well. For extracting the template from the imprinted polymers, the latter were washed 3 times with 2 L of a solution of HCl 5% in MeOH (v/v) and 500 mL of water. After each washing step, HPLC analysis of the supernatant was performed in order to determine whether the template was still present. Non-imprinted polymers (NIPs) were treated in the same way. The washed polymers were employed to carry out binding experiments with our target analyte, AOH. Prior to incubation with the mycotoxin, the library was washed with water and conditioned with the buffer used for the tests. Then, 1000 µL of a solution of AOH (7.5 mg L-1) in either HEPES buffer (0.1 M, pH 7.5) or acetonitrile (separate experiments, see Table S2 and Table S3) was added to 20 mg of each polymer placed in each well and the microplate was left to equilibrate for 24 h. The 7.5 µg load of the toxin corresponds roughly to 10% of the maximum concentration of binding sites, taking into account the amount of template that was used during the MIP synthesis and assuming quantitative template removal. After filtration, the concentration of free AOH in the solution was determined by reverse-phase HPLC analysis. The amount of mycotoxin adsorbed by the polymer particles was determined from Equation 1: 𝐵 = (𝐶0−𝐹) 𝐶0 ∙ 100 (1) where B is the percentage of AOH bound to the polymer, C0 (mM) is the initial AOH concentration and F (mM) is the final mycotoxin concentration in the supernatant. After the first binding experiment, the plate was washed with MeOH-TFA (99:1 v/v) until the template could no longer be detected by reverse-phase HPLC in the washing solution. The plates were subsequently reused in the next binding experiment. Alternariol re-binding in the polymer library The synthesized NIPs and MIPs library was incubated for 24 h with a solution of AOH in HEPES (100 mM, pH 7.5) and, in a different experiment, with a solution of AOH in neat acetonitrile. Then, the concentration of free analyte was determined in the supernatants by HPLC, and this concentration was converted to the total amount of Publicaciones científicas 221 bound analyte per polymer. The rebinding values for AOH are represented in Tables S2 and Table S3 (Supplementary data). These results show that the combination of EAMA as functional monomer and EDMA as cross-linker renders the strongest binding for AOH when surrogate S2 is used as the template molecule. Therefore, such combination (S2 = T; EAMA = FM; EDMA = CL) was selected for the subsequent synthesis of the polymer beads. Polymerization into silica beads Silica microspheres (SiliaSphere™ PC, 40–75 μm diameter, 500 Å pore size, SiliCycle, www.silicycle.com) were employed as a mold for the polymer synthesis: 1 mmol of template (S2), 2 mmol of the functional monomer (EAMA, neutralized with TBAOH as described above), and 2 mmol of the co-monomer (MAM) were dissolved in a DMSO-acetonitrile mixture (180/415 µL), and mixed with 20 mmol of the cross-linker (EDMA) and the radical initiator (2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile), ABDV) (2% by total weight of monomers). Then, 4.6 g of the silica microbeads were placed in a 100 mL glass vial and were mixed by stirring with the cocktail solution until the silica beads were freely flowing. The vial was sealed with a rubber septum, the system was purged with argon for 5 min and the mixture was left in the oven for polymerization (60 °C, 24 h). Then, the silica was dissolved by adding 3 x 150 mL of 3 M aqueous solution of ammonium hydrogen difluoride (Alfa Aesar) and shaking the mixture for 24 h after each addition. The final polymer obtained in this way was thoroughly washed with water (until pH ~ 7), 1 L of MeOH/TFA (99:1, v/v) and, finally, 0.5 L of MeOH. The polymer beads were dried in a vacuum oven at 50 ºC for 24 h prior to characterization and use. Then the powder was settled in MeOH/water (80:20, v/v) to remove fine particles. A non- imprinted polymer was prepared in the same way, but in the absence of the template molecule. Chromatographic evaluation of the polymers Imprinted and non-imprinted polymer beads were slurry-packed in methanol into stainless steel HPLC columns (150 x 2.1 mm I.D.) using MeOH/water (80:20, v/v) as the driving solvent. For their chromatographic evaluation, the following conditions were used: 1.0 mL min−1 flow rate, 10 μL sample volume, 0.5 mM analyte concentration, excitation/emission at 258/440 nm for fluorescence detection. Results shown are the average of three separate analyte injections. Methanol was used as void volume marker. The retention factor (k) for each analyte was calculated as k = (tR − t0)/t0, where tR and t0 are the retention times of the analyte and the void marker, respectively. The imprinting factor (IF) was calculated as IF = kMIP/kNIP, i.e., the ratio of the retention factor of each analyte in the MIP column to that in the NIP column. The selectivity of the polymer Publicaciones científicas 222 towards analogues of the template molecule was evaluated using water/acetonitrile (80:20, v/v), as it allows elution of all the analytes within 30 min. Equilibrium re-binding experiments Polymer beads (20 mg) were mixed with 2 mL of a water/acetonitrile (80:20, v/v) mixture containing different amounts of AOH (0.005–0.750 mM), and the mixtures were incubated for 24 h at room temperature. After incubation, the supernatant was collected and injected into the HPLC as described above. The amount of guest species bound to the polymer (B) was calculated by subtracting the free amount of the former (F) from the initial mycotoxin concentration in the mixture. Binding experiments were carried out in duplicate. Optimized extraction procedure of AOH in the MIP cartridge Solid-phase extraction cartridges (2.5 mL, Varian, Palo Alto, CA, USA) were packed with 100 mg of the S2-imprinted or the corresponding non-imprinted polymers. After equilibration with 10 mL of phosphate buffer (100 mM, pH 8.5), the mycotoxin sample, dissolved in 15 mL of phosphate buffer (100 mM, pH 8.5), was percolated at a constant flow rate of 0.93 mL min-1 with the aid of a 4-channel Gilson Minipuls 3 peristaltic pump (Villiers Le Bel, France). The cartridges were rinsed with 3 mL of ACN/water (20:80, v/v) in order to remove the non-specifically retained compounds. Finally, the mycotoxins were eluted from the cartridge with 1 mL of methanol/trifluoroacetic acid (TFA) 99:1 (v/v). The eluates from the MISPE column were analyzed by HPLC-FLD. Before a new application, the cartridges were re-equilibrated with 5 mL of methanol and 10 mL of phosphate buffer (100 mM, pH 8.5). All the experiments were run in triplicate. Tomato sample analysis Fresh tomatoes, obtained from a local supermarket, were chopped in portions and stored at 4 ºC in the dark. Samples were fortified (n = 6) with AOH at five concentration levels (0, 33, 50, 75 and 110 µg kg-1) and let stand for 30 min in the dark before analysis. Aliquots of the fortified samples (2 g) were extracted with 20 mL of phosphate buffer (100 mM, pH 8.5) by sonication for 10 min (Ultrasons, Selecta). Then, the extracts were filtered through a double cellulose filter (10 µm) and 15 mL of the filtrate were loaded in the cartridges and analyzed as described previously. For quantification purposes, non-fortified tomato extracts were pre-concentrated in the MIP cartridges, checked for the absence of analyte at the method detection limits, and spiked with the mycotoxins stock solutions. Linear calibration graphs were obtained in the 0–500 µg L-1 range for AOH (r2 ˃ 0.990). All the experiments were run in triplicate. Publicaciones científicas 223 Results and discussion Template selection and preparation The laborious preparation of the natural products AOH and AME reported in the literature3 led us to design surrogate templates of the target analytes (Figure 1) to carry out the molecularly imprinted polymerization in multi-gram scale. The structure of AOH and AME points at their phenol groups, biphenyl ring system and the lactone moieties as the key features to provide interactions with the functional monomers.30 Selective recognition by the surrogate-imprinted polymers might be based on hydrogen bonding (1-ALPP, HEMA, MAA, VPA, DAEM, VPY, EAMA monomers) or hydrophobic interactions (DVB). The acidity of the phenol group(s) can also lead to important electrostatic interactions in organic media if they are deprotonated by strongly basic functional monomers (1-ALPP, DAEM, EAMA), as it has been demonstrated for other phenolic toxins such as zearalenone.31,32 The commercial availability of 2-bromo- (di)methoxybenzoic acids and resorcinol were the basis for the design and synthesis of surrogates S1 and S3 (Figure 2); subsequent demethylation should allow preparation of surrogates S2 and S4 in multi-gram amounts. Templates S1-S4 have been obtained by a modification of a published procedure33 to increase the product yields. Ito et al. carry out (inefficient) demethylation with anhydrous AlCl3 in chlorobenzene. Moreover, they obtain a mixture of fully and partially demethylated products, so that a final chromatographic purification is needed. In our hands, co-addition of a powerful nucleophile such as thiol has provided an alternative method of demethylation by a SN2 mechanism,34 leading to an enhancement of the product yield and furnishing the pure fully demethylated S2 surrogate. Moreover, instead of the usual volatile stinky ethanethiol, we employed dodecanethiol, an odorless solid reagent that still provides good AlCl3-catalyzed demethylation yields on methyl aryl ethers.35 Figure 2. Synthesis of the S1-S4 surrogates of AOH and AME. Publicaciones científicas 224 Optical properties of the surrogates The structural resemblance between AOH, AME and the novel surrogates S1-S4 is supported by the similarity of their spectroscopic features. Figure 3 and Table 1 show that surrogates S1 and S2 display almost identical band shape and maxima (absorption and emission at ca. 330 and 398 nm, respectively). The same observation holds for surrogates S3 and S4 (lowest energy absorption band at ca. 350 nm and emission at 421 nm for both compounds). All surrogates are significantly fluorescent, with emission quantum yields (f) between 0.18 and 0.26, and fast decay from the excited state (emission lifetimes, f, ranging between 1.7 and 2.5 ns). While demethylation of the molecules (from S1 to S2 and S3 to S4) does not affect the position or shape of the absorption and emission spectra, it slightly affects the excited state decay: for example, conversion of S1 to S2 decreases f from 0.25 to 0.18 and f from 1.84 to 1.74 ns; similarly, demethylation of S3 to S4, changes f from 0.26 to 0.22 and f from 2.54 to 2.40 ns). A similar trend is also observed for AOH and AME: their absorption and emission spectra are superimposable. Remarkably, the fluorescence spectra of AOH and AME are different from those of S1-S4, the toxins showing an additional broad, red- shifted emission at ca. 470 nm in addition to the 390 nm band. We attribute this supplementary fluorescence to an excited state intramolecular proton transfer (ESIPT) species that occurs in the AOH and AME molecules and not in their surrogates due to the relative position of the –OH group on C-7 of the aromatic skeleton and the C-6 carbonyl (Figure 1). Such dual emission has been described in the literature for related chemical structures (e.g. salicylic acid) and also attributed to ESIPT.36−38 Figure 3. Normalized (A) absorption and (B) fluorescence (λexc = 300 nm) spectra of surrogates S1 (black), S2 (red), S3 (green), S4 (blue), AOH (cyan) and AME (pink) in aerated acetonitrile. (C) Fluorescence decays at 420 nm for AOH surrogates S2 and S4 (λexc = 343 nm). Choice of the polymer A combinatorial MIP/NIP library was prepared (see Supplementary data and Table S1 for details) by employing the four different templates, S1-S4, in combination Publicaciones científicas 225 with different functional monomers and cross-linkers to find out the surrogate leading to the polymer with the best recognition of the target analyte (AOH). The phenol groups of AOH and its surrogates (Figure 1) suggest that all of them should effectively interact with functional monomers bearing sufficiently basic groups to undergo hydrogen bonding or an acid-base reaction with them. If the latter occurs, it will be followed immediately by ion pairing in organic solvents, yet this type of interaction in MIP technology is deemed to furnish less selectivity than hydrogen bonding without deprotonation.30 Taking into account this fact, a set of functional monomers (MAM, EAMA, 2-DAEM, 4-VIPY, TBMA) containing a basic nitrogen atom (Figure 1) was selected to manufacture the MIP/NIP library. Other common neutral monomer such as HEMA, or even carboxylic monomers (MAA, VBA), were also tested to explore other possible interaction modes with the surrogate templates. To allow full solubilization of the monomer, cross-linker, surrogate and initiator, all the polymers were prepared in dimethyl sulfoxide, a hydrogen bondpreserving, moderately porogenic solvent.39 Two cross-linkers, namely the fairly polar EDMA and the hydrophobic DVB (Figure 1), were chosen for the imprinting process to investigate the influence of the polymer matrix polarity on its affinity for AOH. The final composition of the library is described in Table S1; each MIP was prepared using the same T/FM/CL mole ratio (1:32:160). In the absence of template, the same FM-to-CL ratio was employed for the NIP syntheses. Table 1. Absorption and fluorescence data for surrogates S1-S4, AOH and AME in acetonitrile at 298 K under air. abs a (nm) (, 103 M-1 cm-1) em a (nm)  f b f (ns)c S1 258 (42.6 ± 1.2), 308 (15.5 ± 0.4), 330 (9.0 ± 0.3, sh) 398 0.25 1.84 S2 255 (24. ± 4), 308 (9.2 ± 1.3), 330 (4.5 ± 0.5, sh) 398 0.18 1.74 S3 280 (17.3  0.5), 308 (11.1  0.3), 346 (5.5 ± 0.2) 421 0.26 2.54 S4 279 (16.3 ± 1.2), 308 (10.2 ± 0.8), 350 (5.1 ± 0.3) 421 0.22 2.40 AOH 331, 341d 390, 461 0.062 < 1e AME 331, 341d 390, 471 0.062 < 1e a Uncertainties of the absorption and emission maxima are ± 1 nm. b λex = 340 nm; 9,10-diphenyl-anthracene in cyclohexane was used as standard (f = 0.90 ± 0.04);38 the uncertainty of the f value is 5%. c λex = 343 nm, λem = 420 nm. d Molar absorption coefficients not determined due to the scarcity and cost of the natural toxin. e Regardless the emission wavelength, the measured fluorescence lifetime is below the instrument lowest limit (1 ns). Publicaciones científicas 226 Once the templates were thoroughly extracted after polymerization, the MIP/NIP library was incubated for 24 h with solutions of AOH in either 100 mM pH 7.5 HEPES buffer or ACN. The concentration of free analyte in the supernatants was used to calculate the amount of bound analyte per polymer (Qbound, %, Tables S2 and S3). These results show that the combination of EAMA as functional monomer and EDMA as cross- linker renders the strongest binding of AOH in both solvents when surrogate S2 is used as the template molecule. Moreover, such combination provides the maximum difference between the corresponding MIP/NIP binding. The moderate polarity of EDMA probably avoids the unspecific binding of the highly hydrophobic toxin. Therefore, the EAMA- EDMA mixture was chosen for a larger-scale synthesis of the MIP beads. 1H-NMR experiments After having found the molecular surrogate and functional monomer that generate a MIP with the best AOH recognition properties within the investigated polymer library, NMR titrations were carried out in order to determine the surrogate-monomer binding stoichiometry. This will provide the optimal template-to-functional monomer molar ratio before proceeding with the synthesis of the polymer beads. Using a too low functional monomer-to-template ratio would decrease binding constants. On the other hand, too high ratios could lead to an unwanted increase of unspecific adsorption in the final MIP. Monitoring changes of chemical shift of key surrogate molecule protons vs. the mole fraction of EAMA will yield the desired information. The imprinted polymers prepared with EAMA functional monomer, template S2 and EDMA as cross-linker, showed the highest affinity for alternariol. Therefore, the interaction of the EAMA with S2 was investigated by 1H-NMR in DMSO-d6. The template concentration was kept constant, while increasing amounts of EAMA were added to the mixture. Figure S1 (Supplementary data) displays the 1H-NMR spectra for the different titration steps. Protons H7 and H10 (Figure 1) were those undergoing the largest chemical shift changes, with a value of -0.48 (H7) and -0.32 (H10) ppm. Therefore, their chemical shifts were monitored for obtaining the obs values represented in the Job plot of Figure S2. The other aromatic H1, H2 and H4 protons also display visible changes. The shielding of the aromatic protons of surrogate S2 in the presence of EAMA is compatible with a hydrogen donor-acceptor interaction between the template and the monomer molecules. The Job plot shown in Figure S2 allows determination of the stoichiometry of the monomer-template interaction. The maximum in the Job plot is 0.67, which means that a 2:1 EAMA-to-S2 complex is formed. Then, a series of titration Publicaciones científicas 227 experiments was performed to determine the association constants for a 2:1 complex as defined in Equations S2 and S3 in the Supplementary data.40 A non-linear least squares fitting renders binding constants of 2.6 and 2.4 x 103 M−1 for K11 (depending on the proton that is beingmonitored, H7 or H10) and 5.7 and 6.3 M−1 in the case of K21. The strongest acidity of the phenol group on C9 (pKa = 7.5 ± 0.2, as predicted by ACD/Labs v12.02 software, compared to 8.9 ± 0.2 and 12.3 ± 0.2 for the OH groups on C3 and C8, respectively) suggests that it may be the preferred interaction site with the EAMA monomer. The larger chemical shift variation experimented by H10 is in agreement with such allocation. These binding constants are ca. one tenth of those determined by 1H NMR for the interaction between cyclododecyl 2,4-dihydroxybenzoate (a surrogate of the zearalenone toxin) and 1-allylpyperazine.32 The stronger basicity of the latter compared to EAMA, together with the fact that the determination was carried out in acetonitrile-d3 rather than DMSO-d6, might account for these differences in spite of the common diphenol moiety present in both analytes. Synthesis of MIP and NIP porous microbeads The functional (EAMA) and cross-linker (EDMA) monomers that yielded MIPs with the best recognition of AOH (see above) were then used for preparing porous MIP beads. Two polymers were synthetized, one of them including MAM as diluent monomer. The final MIP compositions were as follows, S2/EAMA/EDMA (molar ratio 1:4:20) and S2/EAMA/MAM/EDMA (molar ratio 1:2:2:20). Microspheres (Figure 4) are obtained by polymerizing the monomer and template mixture in acetonitrile-DMSO (3:7 v/v) into the pores of commercial 40–75 µm diameter silica beads. The latter are dissolved with NH4HF2 after polymerization, leaving behind void channels in the resulting MIP bead structure.29 These channels accelerate mass transfer kinetics of the target analyte to the recognition sites into the beads with respect to bulk MIPs. The highly porous MIP/NIP spheres obtained are roughly the same size than the initial silica beads (see SEM picture on Figure 4B). To evaluate the performance of the EAMA-based polymers as MISPE sorbents, the beads (20 mg) were packed in SPE cartridges, equilibrated with 5 mL of methanol and 10 mL of phosphate buffer (100 mM, pH 8.5) and loaded with 1 mL solution of alternariol (1 mg L-1) in phosphate buffer (100 mM, pH 8.5). The cartridges were rinsed with 0 or 1 mL of ACN/water (20:80, v/v) and eluted with 1 mL 1% TFA in MeOH. Publicaciones científicas 228 Figure 4. Scheme of the preparation of the MIP and NIP microspheres with a silica mold and SEM images of the intermediate composite material (A) and the same beads after treatment with 3 M aqueous NH4HF2 (B). As shown in Figure S3 (Supplementary data), no significant differences in the AOH recoveries were obtained with both MIPs in the absence of a washing step (n = 3; RMIP1 = 97%, RSD 7%; and RMIP2 = 102%, RSDMIP2 1%; RNIP2 103%, RSD 0.4%), in agreement with the results obtained in the library evaluation. However, the use of an equimolar mixture of EAMA and MAM as functional monomers resulted in NIPs with much lower non-specific binding (RNIP1 = 5 %; RSD 1%) than those prepared with EAMA (RNIP2 = 66%, RSD 6%) after a washing step with 1 mL water-ACN (80:20, v/v). Therefore, this composition was selected for further experiments. Chromatographic evaluation of the polymer selectivity In order to find out the selectivity of the imprinted material for alternariol, this toxin and other compounds with a similar structure were analyzed by HPLC using a home- packed MIP column. Because phenols are far less acidic in organic media,41 the retention capacity of the imprinted and non-imprinted polymers in pure acetonitrile is moderate because there is no ionic interaction between the non-ionized AOH and the (protonated) amine-containing polymer. However, a significant imprinting effect for the template (S2) was observed when the mobile phase was an 80:20 (v/v) mixture of water and acetonitrile. Under these conditions, the retention time of AOH in the MIP rose aprox. 10- fold with respect to that measured in the NIP thanks to deprotonation of the phenolic toxin. This remarkable increase of the AOH retention time in the MIP vs. the NIP is actually larger than in the case of the S2 template itself (IF = 9.6, see Table 2); therefore, such solvent composition was deemed optimal for the AOH recognition. Other solvent compositions provided less imprinting effect. The ability of the imprinted polymer to retain A B Publicaciones científicas 229 other related analytes with the optimal water-ACN mobile phase, are collected in Table 2.42–44 The imprinting factors (IFs) measured for AOH, AME and surrogate S4 were 10.8, 10.4 and 10.6, respectively, indicating a very high degree of molecular recognition of the MIP for these three species although it was prepared using surrogate S2 as template. However, binding of AME and surrogate S4 to the MIP contains a significant contribution from their hydrophobicity. We must bear in mind that not only the shape and structure of the molecule influences the retention capacity of the polymer, but the polarity of the guest also plays a significant role if rebinding is carried out in aqueous or predominantly aqueous media. The hydrophobicity of a compound is usually measured by its log P parameter (P is the n-octanol/water partition coefficient). AOH, AME and S4 exhibit a lower polarity than S2 (higher log P values, Table 2) and, therefore, their retention times both in the MIP and in the NIP (Table 2) are longer than those measured for S2 due to their stronger hydrophobic interactions with the polymer material. Other structurally related compounds such as catechol and resorcinol were practically not retained on either the MIP or the NIP (kMIP/NIP <1.2). Low retentions in the MIP, compared to S2 (kMIP = 7.2), were also observed for phenol (kMIP = 2.2) despite of the similarities in their log P values (S2: 1.6; phenol: 1.5). The smaller size of these diphenol compounds than S2 can explain such behavior after the notion that only those analytes with the right spatial fit for the binding cavities and group location matching will be properly recognized by the imprinted material. Table 2. Parameters of the binding of different phenolic compounds to the best imprinted polymer (MIP, see above) and to the corresponding non-imprinted polymer (NIP) in the selected solvent mixture; tR, retention time; k, retention factor; IF, imprinting factor.a tR (min) (MIP) tR (min) (NIP) kMIP kNIP IF log P AOH 16.6 1.9 40.5 3.8 10.8 2.7 ± 0.842 S2 3.3 0.7 7.2 0.8 9.6 1.6 ± 1.142 AME 28.6 3.1 70.5 6.8 10.4 3.9 ± 0.442 S4 19.4 2.2 47.5 4.5 10.6 2.3 ± 0.842 Catechol 0.9 0.5 1.2 0.3 4.8 0.7 ± 0.643 Phenol 1.3 0.6 2.2 0.5 4.4 1.544 Resorcinol 0.8 0.5 1.0 0.3 4.0 0.844 a In water/acetonitrile (80:20, v/v); concentration of each phenol: 200 mg L-1. The void volume marker was methanol (t0 NIP = 0.4 min, t0 MIP = 0.4 min). Results are the average of three separate analyte injections. Publicaciones científicas 230 Binding capacity Efficient MIP materials should display, in addition to high affinity and selectivity, a substantial binding capacity for the analyte of interest. The latter requirement is particularly relevant in solid phase extraction (SPE) applications of MIPs, so that SPE can be performed with small amounts of the polymer, allowing reduction or suppression of non-selective adsorption of unrelated species that accompany the target in real samples. The most widely applied binding model is the continuous distribution represented by the Freundlich isotherm (Equation 2).45 𝐵 = 𝑎𝐹𝑚 (2) The latter assumes that the number of guest molecules bound to the polymer (B) is a power function of the amount of free ones (F). The equation fitting parameters carry a physical meaning: a is proportional to the number of binding sites of the polymer (NT) and their average affinity for the guest (K0), while m provides a measure of the binding sites heterogeneity (“heterogeneity index”). The value of m varies from one to zero, decreasing with increasing heterogeneity of the binding sites. The apparent number of sites, NK1−K2, and the apparent weighted average affinity, KK1−K2, derived from Rampey’s equations (Equations S3 and S4, Supplementary data)46 are summarized in Table S4. The differences in the adsorption isotherms (Figure S4, Supplementary data) show that the binding capacity of the MIP (NMIP = 35 μmol g-1) is higher than that of the corresponding NIP (NNIP = 22 μmol g-1). The same is true for the weighted average affinity in the measured 0.005 ± 0.75 mM concentration range (KMIP= 109 mM-1; KNIP= 50 mM-1). No significant differences were observed in the heterogeneity index of the imprinted polymer (0.41 ± 0.07, Table S4) and the corresponding NIP (0.49 ± 0.02). Optimization of the MISPE procedure for AOH extraction Several factors were evaluated to establish the optimum conditions for the SPE procedure including the study of the composition and volume of the eluting solvent, the flow rate of the loading solution, the composition of the washing solvent and the breakthrough volume (maximum sample volume that can be pre-concentrated with quantitative recovery of analyte). To select the composition of the elution solvent, 10 mL samples of AOH (200 µg L-1) dissolved in phosphate buffer (100 mM, pH 8.5) were percolated through the cartridges (containing 20 mg of polymer) and eluted with 1% TFA in MeOH. Quantitative mycotoxin recoveries (R = 102%, RSD 5%, n = 3) were achieved using 1 mL of 1% TFA in MeOH (v/v), a solvent that was selected for further experiments. Figure S5 (Supplementary data) shows the effect of the loading solution flow rate on the recovery Publicaciones científicas 231 of AOH when 10 mL samples of AOH (200 µg L-1) dissolved in phosphate buffer (100 mM, pH 8.5) were loaded into the MIP cartridge. Recoveries close to 100% were obtained at flow rates ≤ 0.93 mL min-1. The use of higher rates led to a continuous decrease in the recovery values as the interaction time between the analytes and the sorbent was decreased. Thus, a loading flow rate of 0.93 mL min-1 was selected as optimal for further experiments. Several water-ACN mixtures (100–50%, v/v) were evaluated as washing solvents for the MISPE procedure to minimize the non-specific interactions between the mycotoxin and the imprinted polymer. As shown in Figure 5, the retention of AOH in the MIP and in the NIPs was higher at lower ACN concentrations in the washing solvent. The highest differences between the MIP and NIP were obtained using a 80:20 (v/v) water-ACN mixture. Under these conditions, AOH recoveries were 96% (RSD 2%, n = 3) for the MIP and lower than 1% in the NIP. Therefore, this solvent composition was selected for the washing step. Figure 5. Extraction recoveries (%) of AOH from the MIP and the NIP after percolation of 1 mL of phosphate buffer (100 mM, pH 8.5) spiked with 0.2 µg of the mycotoxin, using a washing step with 1 mL of water-ACN (0–50% ACN, v/v) followed by elution with 1 mL of 1% TFA in MeOH (RSDMIP < 9%; RSDNIP < 5%; n = 3). As shown in Figure S6 (Supplementary data), an increase in the washing volume from 1 to 3 mL of the 80:20 (v/v) water-ACN mixture did not significantly affect the retention of AOH in the MIP, with recoveries in the range of 96–102% (RSD < 5%, n = 3), while retention in the NIP was negligible. Finally, a volume of 3 mL of ACN/water (20:80, v/v) was selected for the washing step. Larger volumes were not tested to avoid an increase in the analysis time. In order to evaluate the breakthrough volume, the cartridges were loaded with increasing volumes (1–50 mL) of AOH (200 µg L-1) in phosphate buffer (100 mM pH 8.5) NIP MIP0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 50 R e c o v e ry ( % ) AcN (%) Publicaciones científicas 232 and rinsed with 3 mL of water/ACN (80:20, v/v); then, the analyte was eluted with 1 mL of 1% TFA in methanol and the eluates were analysed by HPLC-FLD. As shown in Table S5, an increase from 20 to 100 mg in the amount of polymer per cartridge led to larger breakthrough volumes, and recoveries higher than 91% were obtained for sample volumes up to 50 mL. Recoveries in the NIP (data not shown) were below 10% in all cases. MISPE application to the determination of AOH in tomato samples Finally, a preliminary evaluation of the performance of the MIP cartridges for AOH extraction in food samples was carried out by applying the optimized method to the determination of the mycotoxin in five fortified ground tomato samples (0-110 μg kg-1, n = 6). After sonication in phosphate buffer (100 mM, pH 8.5), 15 mL of the extract were loaded into the cartridges and the samples were pre-concentrated using the optimized MISPE method followed by HPLC-FLD analysis. The results are summarized in Table 3. Mean recoveries ranged from 81% to 103% with RSDs <4%. Figure S6 shows the chromatogram of an AOH-spiked (33 μg kg−1) tomato extract before and after MISPE. The chromatogram from a blank extract after MISPE is also included in the plot showing the lack of interferences co-eluting with the analyte. These results demonstrate the usefulness of the synthetized MIP for the selective extraction of AOH from food samples. We are currently working in the optimization of a mycotoxin extraction method, prior to MISPE, to improve performance as well as on the determination of other mycotoxins produced by Alternaria fungi. Table 3. Average recoveries (%) and relative standard deviations (RSDs, %, n = 6) obtained after ultrasound extraction followed by MISPE-HPLC-FLD of tomato samples fortified with AOH at five different concentration levels. Spiking level (µg kg-1) Found (µg kg-1) Recovery (%) RSD (%) 33 26.9 81 4 50 51.7 103 4 66 65.2 99 2 75 74.3 99 1 110 111.9 102 2 Conclusions Molecular engineering and efficient synthesis of alternariol toxin surrogates, together with a combinatorial approach, have allowed preparation of molecularly Publicaciones científicas 233 imprinted polymer materials showing good affinity and selectivity for the target species in aqueous medium. When obtained as highly porous microparticles, the MIPs feature rapid binding kinetics and ease of handling for solid phase extraction applications. Moreover, the use of surrogates will avoid false positives in the chromatographic analysis of the toxin, allows cheap access to unlimited amounts of the recognition materials, and removes the toxicity of the natural metabolite during the synthesis of the MIPs. NMR studies have enabled a detailed characterization of the interaction between the mimic template and the functional monomer that will lead in the future to the design of efficient novel MIPs for phenolic analytes (preservatives, Fusarium toxins, flavonoids, bisphenol- A, neurotransmitters, antiseptics, flavorings and non-ionic detergents, among other relevant species). In this regard, N-(2-aminoethyl)methacrylamide has shown to be particularly efficient as functional monomer to provide recognition materials for alternariol that have been successfully applied to the development of a MISPE method for the determination of AOH in food samples. Acknowledgments Financial support from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO, CTQ2012-37573-C02) is gratefully acknowledged. R.A.G. Abou-Hany and A.B. Descalzo thank MINECO for a F.P.I. doctoral grant and a Ramón y Cajal contract, respectively. J.L. Urraca thanks CEI-Moncloa for a postdoctoral contract. References [1] N. Paster (Ed.) (2008), Mycotoxins in fruits and vegetables, Academic Press-Elsevier, San Diego. [2] N. Magan, M. Olsen (Eds.) (2004), Mycotoxins in food, Woodhead, Cambridge, UK. [3] S. Bräse, A. Encinas, J. Keck, C.F. Nising, Chemistry and biology of mycotoxinsand related fungal metabolites, Chem. Rev. 109 (2009) 3903–3990. [4] V. Ostry, Alternaria mycotoxins: an overview of chemical characterization, pro-ducers, toxicity, analysis and occurrence in foodstuffs, World Mycotoxin J. 1 (2008) 175–188. [5] I. Kustrzeba-Wojcicka, E. Siwak, G. Terlecki, A. Wolanczyk-Medrala, W. Medrala, Alternaria alternata and its allergens: a comprehensive review, Clin. Rev. Allergy Immunol. 47 (2014) 354–365. [6] S. Marin, A.J. Ramos, G. Cano-Sancho, V. Sanchis, Mycotoxins: occurrence, tox- icology, and exposure assessment, Food Chem. Toxicol. 60 (2013) 218–237. Publicaciones científicas 234 [7] E.M. Brugger, J. Wagner, D.M. Schumacher, K. Koch, J. Podlech, M. Metzler, L. Lehmann, Mutagenicity of the mycotoxin alternariol in cultured mammaliancells, Toxicol. Lett. 164 (2006) 221–230. [8] P.M. Scott, D. Weber, S.R. Kanhere, Gas chromatography–mass spectrometry of Alternaria mycotoxins, J. Chromatogr. A 765 (1997) 255–263. [9] P.M. Scott, S.R. Kanhere, Chromatographic method for Alternaria toxins in apple juice, Methods Mol. Biol. 157 (2001) 225–234. [10] P. Yogendrarajah, L. Jacxsens, S. De Saeger, B. De Meulenaer, Co-occurrence of multiple mycotoxins in dry chilli (Capsicum annum L.) samples from themarkets of Sri Lanka and Belgium, Food Control 46 (2014) 26–34. [11] B.P. Lau, P.M. Scott, D.A. Lewis, S.R. Kanhere, C. Cléroux, V.A. Roscoe, Liq-uid chromatography–tandem mass spectrometry of the Alternaria mycotoxins alternariol and alternariol monomethyl ether in fruit juices and beverages, J. Chromatogr. A 998 (2003) 119–131. [12] A. Prelle, D. Spadaro, A. Garibaldi, M.L. Gullino, A new method for detection of five Alternaria toxins in food matrices based on LC–APCI-MS, Food Chem. 140(2013) 161– 167. [13] Y. Ackermann, V. Curtui, R. Dietrich, M. Gross, H. Latif, E. Märtlbauer, E. Usleber, Widespread occurrence of low levels of alternariol in apple and tomato products, as determined by comparative immunochemical assessment using monoclonal and polyclonal antibodies, J. Agric. Food Chem. 59 (2011) 6360–6368. [14] A. Burkin, G.P. Kononenko, Enzyme immunassay of alternariol for the assessment of risk of agricultural products contamination, Appl. Biochem. Microbiol.47 (2011) 72–76. [15] N.J.K. Simpson (Ed.) (2000), Solid-phase extraction: principles, techniques, and applications, CRC Press, Boca Raton, FL. [16] R.I. Olariu, C. Arsene, D. Vione, N. Grinberg (2013), Solid phase extraction: principles and applications, CRC Press, Boca Raton, FL. [17] J.L. Urraca, C.S.A. Aureliano, E. Schillinger, H. Esselmann, J. Wiltfang, B. Seller- gren, Polymeric complements to the alzheimer's disease biomarker β-amyloid isoforms Aβ1-40 and Aβ1-42 for blood serum analysis under denaturing conditions, J. Am. Chem. Soc. 133 (2011) 9220–9223. Publicaciones científicas 235 [18] P. Lucci, D. Derrien, F. Alix, C. Pérollier, S. Bayoudh, Molecularly imprinted polymer solid-phase extraction for detection of zearalenone in cereal sample extracts, Anal. Chim. Acta 672 (2010) 15–19. [19] C. Giovannoli, C. Passini, F. Di Nardo, L. Anfossi, C. Baggiani, Determination of ochratoxin A in Italian red wines by molecularly imprinted solid phase extraction and HPLC analysis, J. Agric. Food Chem. 62 (2014) 5220–5525. [20] S. Wei, Y. Liu, Z. Yan, L. Liu, Molecularly imprinted solid phase extraction coupled to high performance liquid chromatography for determination of aflatoxin M1 and B1 in foods and feeds, RSC Adv. 5 (2015) 20951–20960. [21] S. W. Lee, T. Kunitake (Eds.) (2013), Handbook of molecular imprinting, Pan Stanford Publishing, Singapore. [22] K. Haupt (Ed.) (2012), Molecular imprinting, Springer, Heidelberg. [23] L. Chen, S. Xuab, J. Lia, Recent advances in molecular imprinting technology: current status, challenges and highlighted applications, Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 2922–2942. [24] L. Ye, K. Mosbach, Molecular imprinting: synthetic materials as substitutesfor biological antibodies and receptors, Chem. Mater. 20 (2008) 859–868. [25] L.I. Andersson, A. Paprica, T. Arvidsson, A highly selective solid phase extractionsorbent for the preconcentracion of sameridina made by molecular imprinting, Chromatography 46 (1997) 57–62. [26] S.A. Piletsky, M.J. Whitcombe (Eds.) (2013), Designing receptors for the next generation of biosensors, Springer, Berlin, Heidelberg. [27] K. Koch, J. Podlech, E. Pfeiffer, M. Metzler, Total synthesis of alternariol, J. Org. Chem. 70 (2005) 3275–3276. [28] G. Orellana, M.C. Moreno Bondi, A.B. Descalzo, J.L. Urraca, R.A.G. Abou-Hany, PCT Patent Appl. ES2013000082. [29] M.M. Titirici, A.J. Hall, B. Sellergren, Hierarchically imprinted stationary phases: mesoporous polymer beads containing surface-confined binding sites for adenine, Chem. Mater. 14 (2002) 21–23. [30] C. Alvarez-Lorenzo, A. Concheiro (Eds) (2013), Handbook of molecularly imprinted polymers, Smithers-Rapra, Shropshire, UK, pp. 23–86. Publicaciones científicas 236 [31] J.L. Urraca, M.D. Marazuela, E.R. Merino, G. Orellana, M.C. Moreno-Bondi, Molec- ularly imprinted polymers with a streamlined mimic for zearalenone analysis, J. Chromatogr. A 1116 (2006) 127–134. [32] J.L. Urraca, M.C. Carbajo, M.J. Torralvo, J. González-Vázquez, G. Orellana, M.C. Moreno-Bondi, Effect of the template and functional monomer on the textural properties of molecularly imprinted polymers, Biosens. Bioelectron. 24 (2008)155–161. [33] H. Ito, A. Iguchi, T. Hatano, Identification of urinary and intestinal bacterialmetabolites of ellagitannin geraniin in rats, J. Agric. Food Chem. 56 (2008) 393– 400. [34] M. Node, K. Nishide, K. Fuji, E. Fujita, Hard acid and soft nucleophile system.2. Demethylation of methyl ethers of alcohol and phenol with an aluminumhalide-thiol system, J. Org. Chem. 45 (1980) 4275–4277. [35] M. Node, K. Kumar, K. Nishide, S. Ohsugi, T. Miyamoto, Odorless substitutes forfoul-smelling thiols: syntheses and applications, Tetrahedron Lett. 42 (2001) 9207– 9210. [36] A. Weller, Über die fluoreszenz der salizylsäure und verwandter verbindungen, Naturwissenschaften 42 (1955) 175–176. [37] A.U. Acuña, F. Toribio, F. Amat-Guerri, J. Catalán, Excited state proton transfer: a new feature in the fluorescence of methyl 5-chlorosalicylate and methyl 5- methoxysalicylate, J. Photochem. 30 (1985) 339–352. [38] K. Rurack (2008), Fluorescence quantum yields: methods of determination and stan- dards, in: U. Resch-Genger (Ed.), Standardization and quality assurance in fluorescence measurements, I, Springer, Berlin, Heidelberg. [39] B. Sellergren (Ed.) (2000), Molecularly imprinted polymers, man-made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, vol. 23, Elsevier, Amsterdam. [40] L. Fielding, Determination of association constants (Ka) from solution NMR data, Tetrahedron 56 (2000) 6151–6170. [41] A. Kütt, I. Leito, I. Kaljurand, L. Sooväli, V.M. Vlasov, L.M. Yagupolskii, I.A. Koppel, A comprehensive self-consistent spectrophotometric acidity scale of neutral Bronsted acids in acetonitrile, J. Org. Chem. 71 (2006) 2829–2838. [42] Calculated Using Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) SoftwareV12.02, 2014. Publicaciones científicas 237 [43] B. Bukowska, J. Michałowicz, A. Krokosz, P. Sicińska, Comparison of the effect of phenol and its derivatives on protein and free radical formation in humanerythrocytes (in vitro), Blood Cell. Mol. Dis. 39 (2007) 238–244. [44] J. Li, Prediction of internal standards in reversed-phase liquid chromatography, Chromatographia 60 (2004) 63–72. [45] H. Kim, D.A. Spivak, New insight into modeling non-covalently imprinted poly-mers, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 11269–11275. [46] A.M. Rampey, R.J. Umpleby, G.T. Rushton, J.C. Iseman, R.N. Shah, K.D. Shimizu, Characterization of the imprint effect and the influence of imprinting conditions on affinity, capacity, and heterogeneity in molecularly imprinted polymers using the Freundlich isotherm-affinity distribution analysis, Anal.Chem. 76 (2004) 1123–1133. Supporting information Synthesis procedures Synthesis of 3-hydroxy-8,9-dimethoxy-6H-dibenzo[b,d]pyran-6-one (S1 surrogate) 2-Bromo-4,5-dimethoxybenzoic acid (0.95 g, 3.6 mmol) and resorcinol (0.93 g, 8.4 mmol) were dissolved in 4.25 mL of an aqueous solution containing sodium hydroxide (0.339 g, 8.4 mmol), and heated at 80 ºC for 30 min. Then, 5% (w/v) copper sulfate aqueous solution (1.45 mL) was added to the mixture and a precipitate was formed after 10 min. The reaction mixture was neutralized by adding 0.9 mL of concentrated hydrochloric acid and filtered. After washing with 5 mL water and 3 mL of methanol, the solid was suspended in 10 mL of MeOH and heated at 50 ºC for 10 min. Once at room temperature, the solid was filtered out and washed with diethyl ether. Yield: 71%. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 3.92 (s, 3H, -OCH3), 4.05 (s, 3H, -OCH3), 6.77 (d, J = 2.81 Hz, 1H, Ar-H), 6.88 (dd, J1 = 8.69 Hz , J2 = 2.33 Hz, 1H, Ar-H), 7.57 (s, 1H, Ar- H), 7.72 (s, 1H, Ar-H), 8.24 (d, J = 8.24 Hz, 1H, Ar-H), 10.58 (s, 1H, -OH) ppm; FT-IR: 3265, 2979, 2835, 1691, 1606, 1520, 1464, 1372, 1330, 1290, 1225, 1174, 1124, 1085 cm-1; MS-ESI (negative), m/z; calculated for C15H11O5, [M-H]–: 271.1; found: 270.7. Synthesis of 3,8,9-trihydroxy-6H-dibenzo[b,d]pyran-6-one (S2 surrogate) AlCl3 (0.786 g, 5.8 mmol) was suspended in a mixture of dodecanethiol (0.5 mL) and chlorobenzene (8.5 mL) in an ice bath under argon. Then, S1 (0.337 g, 1.2 mmol) was added to the suspension and, after 30 min, the ice bath was removed and the mixture was kept at room temperature for an additional 30 min period. Finally, it was heated at 100 ºC. The reaction was monitored by TLC (silica, CH2Cl2-MeOH 20:1 v/v). After 5 h, the mixture was poured onto 15 mL of 3% aqueous HCl in an ice bath, and the Publicaciones científicas 238 precipitate was filtered off and washed with water and methanol. Yield: 72%. 1H-NMR: (300 MHz, DMSO-d6) : 6.72 (d, J = 2.34 Hz, 1H, Ar-H), 6.82 (dd, J1 = 8.64 Hz, J2 = 2.37 Hz, 1H, Ar-H), 7.47 (s, 1H, Ar-H), 7.53 (s, 1H, Ar-H), 7.88 (d, J = 8.82 Hz, 1H, Ar-H), 10.13 (s, 3H, -OH) ppm; FT-IR: 3363, 2924, 1762, 1619, 1460, 1383, 1326, 1283, 1212, 1127, 1065, 990, 883, 846, 805 cm-1; MS-ESI (negative), m/z; calculated for C13H7O5, [M-H]–: 243.0; found: 242.7. Synthesis of 3-hydroxy-9-methoxy-6H-dibenzo[b,d]pyran-6-one (S3 surrogate) 2-Bromo-5-methoxy benzoic acid (2.0 g, 8.6 mmol) and resorcinol (2.0 g, 18 mmol) were dissolved in 9.1 mL of an aqueous solution of sodium hydroxide (0.727 g, 18.1 mmol), and heated at 80 ºC for 30 min. Then, a 5% (w/v) CuSO4 aqueous solution (3.6 mL) was added and a precipitate separated after 10 min. The mixture was neutralized with 0.9 mL of concentrated aqueous HCl. After filtering and washing with 5 mL of water and 3 mL of methanol, the precipitate was further washed with 10 mL of hot methanol and finally diethyl ether. Yield: 59%. 1H NMR: (300 MHz, DMSO-d6) : 3.93 (s, 3H,-OCH3), 6.79 (d, J = 2.25 Hz,1H, Ar-H), 6.87 (dd, J1 = 8.66 Hz, J2 = 2.33 Hz ,1H, Ar- H), 7.54 (dd, J1 = 8.87 Hz, J2 = 2.78 Hz, 1H, Ar-H), 7.64 (d, J = 2.73 Hz, 1H, Ar-H), 8.14 (d, J = 8.73 Hz, 1H, Ar-H), 8.26 (d, J = 8.91 Hz, 1H, Ar-H), 10.27 (s, 1H, -OH) ppm; FT- IR: 3343, 2988, 2839, 1768, 1693, 1497, 1460, 1324, 1289, 1173, 1126, 1069, 1032, 836, 811, 774, 730 cm-1; MS-ESI (neg.), m/z; calculated for C14H9O4, [M-H]–: 241.1; found: 240.7. Synthesis of 3,8-dihydroxy-6H-dibenzo[b,d]pyran-6-one (S4 surrogate) AlCl3 (0.700 g, 5.2 mmol) was suspended in a mixture of dodecanethiol (0.5 mL) and chlorobenzene (8.5 mL) and placed into an ice bath under argon. Then S3 (0.300 g, 1.2 mmol) was added, and after 30 min, the ice bath was removed and the mixture was kept at room temperature for an additional 30 min. Finally, it was heated at 100 ºC. The reaction was monitored by TLC (silica, CH2Cl2–MeOH 20:1 v/v). After 5 h, the mixture was poured onto 15 mL of 3% aqueous HCl in an ice bath, and the resulting precipitate was filtered and washed with water and a few milliliters of methanol. Yield: 70%. 1H NMR: (300 MHz, DMSO-d6) : 6.75 (d, J = 2.37 Hz, 1H, Ar-H), 6.83 (dd, J1 = 8.67 Hz, J2 = 2.37 Hz, 1H, Ar-H), 7.34 (dd, J1 = 8.7 Hz, J2 = 2.69 Hz, 1H, Ar-H), 7.53 (d, J = 2.64, 1H, Ar-H), 8.05 (d, J = 8.76 Hz, 1H, Ar-H), 8.14 (d, J = 8.85 Hz, 1H, Ar-H), 10.21 (s, 2H, -OH) ppm; FT-IR: 3321, 3196, 2924, 2854, 1773, 1700, 1615, 1462, 1317, 1272, 1126, 1080, 729 cm-1; MS-ESI (negative), m/z; calculated for C13H7O4, [M-H]–: 227.0; found: 226.7. Publicaciones científicas 239 NMR experiments The 1H-NMR study of the interaction of the EAMA monomer with the S2 surrogate is shown on Figure S1. In this titration, the template S2 concentration has been kept constant, while increasing amounts of EAMA were added to the mixture. H7 and H10, i.e., those undergoing the largest chemical shift changes, were the protons selected for representing the Job plots shown in Figure S2. Figure S1. 1H-NMR titration of surrogate S2 with EAMA in acetonitrile-d3/DMSO-d6 (70:30 v/v). Figure S2. Chemical shift change of the H7 and H10 as a function of the mole fraction of EAMA in acetonitrile-d3/DMSO-d6 (70:30) ([S2] = 0.025 mol L-1). The blue circles correspond to the experimental data for H10, and the red squares for H7. Monomer 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1   o b s x  S u rr o g a te 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 Publicaciones científicas 240 The difference between the chemical shift of the monitored surrogate S2 proton (H7 or H10) in the absence and in the presence of EAMA (obs), can be calculated from equation S1:           0 0 11 11 11 21 21 11 11 21 2 [ ] 1 2 [ ] [ ] obs K K K A K K K A T (S1) where 0 11 and 0 21 are the differences between the proton chemical shifts of the free, 1:1 or 2:1 complexed species, K11 and K21 are the corresponding association constants, while [A] and [T] are the concentration of the free EAMA and surrogate S2, respectively. The approximate free EAMA concentration is a function of the total concentrations of template and amine ([T]T and [A]T), K11 and K21 for all the points in the experimental curves showed where according to Eq. S2:1 2 11 21 11 11 21 [ ] 2 [ ] [ ] [ ] 1 [ ] 4 [ ] [ ] T T T T T T A K K T A A K T K K T A     (S2) The variables obs and [A]T are measured experimentally, while 0 11, 0 21, K11 and K21 need to be estimated from the curve to fit the Equation S2. The value of the intermediate variable [A] must be iteratively calculated using Equation S3 for all the points of the experimental curve. Polymer library and alternariol re-binding experiments Table S1. Polymer and templates distribution in the 96-well plate. Functional monomer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A (ALPP) NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 B (MAM) NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 C (HEMA) NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 D (MAA) NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 E (VBA) NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 F (DAEM) NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 G (VPY) NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 H (EAMA) NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 EDMA DVB Publicaciones científicas 241 Table S2. Rebinding (%) of AOH after 24 h incubation of 20 mg of polymer with 7.5 mg L-1 mycotoxin in 100 mM pH 7.5 HEPES buffer (n = 2). Functional monomer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A (ALPP) 82 75 96 92 91 88 93 98 97 92 B (MAM) 69 92 94 90 95 78 94 98 99 97 C (HEMA) 77 93 93 93 93 75 94 98 98 98 D (MAA) 93 96 100 100 98 55 96 99 97 96 E (VBA) 78 96 92 98 97 65 95 93 93 87 F (DAEM) 98 100 100 99 98 81 96 98 98 88 G (VPY) 97 97 98 97 94 49 95 97 93 96 H (EAMA) 100 100 100 100 100 100 99 100 100 100 EDMA DVB Table S3. Rebinding (%) of AOH after 24 h incubation of 20 mg of polymer with 7.5 mg L-1 mycotoxin in acetonitrile (n = 2). ACN NIP S2 S1 S3 S4 NIP S2 S1 S3 S4 A (ALPP) 55 52 54 54 63 61 58 54 57 56 B (MAM) 50 54 56 54 56 56 56 57 61 57 C (HEMA) 45 54 54 54 53 57 57 58 55 55 D (MAA) 57 59 59 56 55 53 53 38 57 56 E (VBA) 47 56 53 52 53 55 53 60 56 62 F (DAEM) 26 59 62 61 64 67 89 52 65 62 G (VPY) 22 65 62 60 62 64 76 78 74 80 H (EAMA) 71 90 66 71 78 72 76 75 66 64 EDMA DVB Publicaciones científicas 242 Alternariol re-binding to the MIP beads Figure S3. Alternariol extraction recoveries (%) obtained with the MIP/NIP bead cartridges as a function of the polymer composition, with and without a washing step. MIP1: S2/EAMA/MAM/EDMA (molar ratio 1:2:2:20); MIP2: S2/EAMA/EDMA (molar ratio 1:4:20). Loading: 1 mL of AOH (1 mg L-1) in phosphate buffer (100 mM pH 8.5); washing: 1 mL of 80:20 water/ACN (v/v); elution: 1 mL of 1% TFA in MeOH (RSDMIP < 7%; RSDNIP < 6%; n = 3). The curves displayed on Figure S4 shows the higher affinity of the S2-imprinted polymer for alternariol than that of the non-imprinted material. Figure S4. Equilibrium binding isotherms for the uptake of AOH by the selected MIP (blue) and its corresponding NIP (red) in water/acetonitrile (80:20, v/v). F and B represent the amount of free and bound AOH in the solution, respectively. The symbols represent experimental data (8 data per plot; n = 2), while the solid lines are their fits calculated by the Freundlich equation (B = aFm). 0 20 40 60 80 100 MIP 1 NIP 1 MIP 2 NIP 2 R e c o v e ry ( % ) No wash 1 mL (AcN/water) Free (mM) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 B o u n d (  m o l g -1 ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Publicaciones científicas 243 The binding parameters NK1−K2 and KK1−K2 can be measured for any set of K1 and K2 values that are within the boundaries Kmin and Kmax defined by Rampey et al.2 The subscripts on NK1−K2 and KK1−K2 mean that these equations yield values that represent only a subset of the entire distribution from K1 to K2. These limits are set by the concentration range over which the experimental binding isotherm was measured (Fmin to Fmax). For comparison purposes it is important to calculate NK1−K2 and KK1−K2 over the same range of binding affinities (K1 to K2). 𝑁𝐾1−𝐾2 = 𝑎(1 − 𝑚2)(𝐾1 −𝑚 − 𝐾2 −𝑚) (S3) 𝐾𝐾1−𝐾2 = ( 𝑚 𝑚−1 ) ( 𝐾1 1−𝑚 − 𝐾2 1−𝑚 𝐾1 −𝑚 − 𝐾2 −𝑚 ) (S4) Table S4. Equilibrium binding isotherm parameters for the uptake of AOH by the MIP and NIP in 80:20 water/acetonitrile (v/v). The polymer binding capacity (a) and the binding site heterogeneity index (m) were obtained from the fit of the experimental data (Figure S4) to the corresponding Freundlich isotherm (Eq. 2). The association constants (K) and specific binding capacities (N) were calculated from Eqs. S3 and S4. a (µmol g-1(mM-1)m) m NK1−K2 (µmol g -1 ) KK1−K2 (mM -1 ) Krange (mM -1 ) r 2 MIP 75 ± 9 0.41 ± 0.07 35 ± 2 109 ± 10 31 - 2014 0.98 NIP 46 ± 2 0.49 ± 0.02 22 ± 2 50 ± 4 23 - 1007 0.997 Figure S5. Recoveries obtained for different flow rates using a 10 mL solution of AOH (200 µg L-1) in phosphate buffer (100 mM, pH 8.5) as percolation medium. The mycotoxin was eluted from the MIP cartridge with 1 mL solution of 1% TFA in MeOH (RSD < 7%, n = 3). 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 1,5 2 R e c o v e ry ( % ) Flow rate (mL min-1) Publicaciones científicas 244 Figure S6. Extraction recoveries (%) obtained on the MIP and the NIP for AOH after percolation of 10 mL of phosphate buffer (100 mM, pH 8.5) spiked with 2 µg AOH using a washing step with 1, 2 or 3 mL of 80:20 water/ACN (v/v). The mycotoxin was eluted from the MIP cartridge with 1 mL solution of 1% TFA in MeOH (RSDMIP < 5%; RSDNIP < 1%; n = 3). Table S5. Extraction recoveries (%) obtained with the MIP cartridges (20 mg and 100 mg polymer) for AOH after loading increasing volumes of a 200 µg L-1 solution of AOH in phosphate buffer (100 mM pH 8.5), using a washing step with 3 mL of 80:20 (v/v) water/ACN. Samples were eluted with 1 mL of 1% TFA in methanol and analyzed by HPLC-FLD. Volume (mL) 20 mg polymer 100 mg polymer Recovery (%) RSD (%) Recovery (%) RSD (%) 1 100 7 100 0.6 5 99 2 94 1 10 93 3 98 8 25 87 2 96 3 50 84 1 91 5 Figure S7. HPLC–FLD chromatograms of a non-fortified tomato extract after MISPE (), a tomato extract spiked with 33 µg kg-1 AOH without MISPE (); and a tomato extract spiked with 33 µg kg-1 AOH after MISPE (). NIP MIP 0 20 40 60 80 100 1 2 3 R e c o v e ry ( % ) Water/AcN (mL) Time (min) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S ig n a l (m A U ) 0 4 8 12 16 20 24 28 Publicaciones científicas 245 References [1] K. Eliadou, K. Yannakopoulou, A. Rontoyianni, I.M. Mavridis, NMR Detection of simultaneous formation of [2]- and [3]pseudorotaxanes in aqueous solution between α- cyclodextrin and linear aliphatic α,ω-amino acids, an α,ω-diamine and an α,ω-diacid of similar length, and comparison with the solid-state structures, J. Org. Chem. 64 (1999) 6217–6226. [2] A.M. Rampey, R.J. Umpleby, G.T. Rushton, J.C. Iseman, R.N. Shah, K.D. Shimizu, Characterization of the imprint effect and the influence of imprinting conditions on affinity, capacity, and heterogeneity in molecularly imprinted polymers using the Freundlich isotherm-affinity distribution analysis, Anal. Chem. 76 (2004) 1123–1133. Publicaciones científicas 247 3.3. Descubrimiento de fragmentos de anticuerpo VH mediante tecnología phage display selectivos a la fitohemaglutinina y su clasificación acorde a una estrategia multiparamétrica Los anticuerpos recombinantes son elementos de reconocimiento producidos mediante ingeniería genética y su empleo en aplicaciones bioanalíticas ha experimentado un crecimiento sin precedentes en los últimos años. La tecnología de presentación de anticuerpos sobre la superficie de fagos (phage display) constituye una de las principales técnicas de producción de estos elementos de reconocimiento. No obstante, una de las etapas determinantes de esta tecnología es el cribado de los anticuerpos recombinantes obtenidos, resultando imprescindible el uso de técnicas que aporten información sobre las interacciones que se producen entre el fragmento de anticuerpo recombinante desplegado y el analito. Una de ellas es la microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de disipación. La Publicación IV de esta Tesis Doctoral describe la selección, aplicando la tecnología phage display, de fragmentos de anticuerpo, VH, desplegados en fagos selectivos a la PHA. Esta lectina, presente en distintas variedades de judía o alubia, es muy tóxica y se ha seleccionado como antígeno modelo debido a su complejidad estructural e interés analítico. La evaluación de los clones se llevó a cabo mediante medidas de QCM-D y su clasificación se realizó empleando una estrategia multiparámetrica basada en PCA. Las etapas de las que consta este trabajo se pueden resumir en: 1. Producción y selección de anticuerpos recombinantes monovalentes, VH, en formato fago selectivos a la fitohemaglutinina PHA (E2L2), aplicando la tecnología phage display. 2. Determinación, mediante QCM-D, de los parámetros cinéticos y termodinámicos característicos de la interacción entre los clones seleccionados y la PHA. 3. Clasificación de los clones aplicando PCA. 4. Evaluación de clones de alta afinidad mediante ensayos ELISA. . Discusión integradora 281 Los elementos de reconocimiento biomiméticos pueden considerarse receptores alternativos a los elementos biológicos tales como anticuerpos, enzimas o células, y son ampliamente utilizados en diferentes aplicaciones analíticas. En general, a pesar de la gran selectividad que suelen presentar los receptores de origen natural, su limitada estabilidad y elevado coste de preparación ha favorecido el desarrollo, en las últimas décadas, de alternativas sintéticas y semisintéticas que permiten evitar estas limitaciones. De entre todos ellos, según se ha comentado ampliamente en la Sección 1 (Introducción), los MIPs y los anticuerpos recombinantes han demostrado ser opciones viables a sus análogos biológicos. La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el desarrollo de receptores biomiméticos, para el reconocimiento de diferentes analitos y su empleo tanto en aplicaciones biotecnológicas como para el control de la seguridad alimentaria. 4.1. Polímeros de impronta molecular como elementos de reconocimiento biomiméticos Como se ha indicado en la sección 1.1.4., los MIPs son materiales sintéticos que permiten el reconocimiento selectivo de un analito gracias a la presencia en el material de cavidades específicas al mismo que se generan durante la etapa de síntesis. Actualmente es posible encontrar MIPs para una gran cantidad de analitos, especialmente si se trata de compuestos de bajo peso molecular. No obstante, para lograr un reconocimiento efectivo y selectivo, es necesario tener en cuenta los distintos factores que influyen en el proceso de preparación del polímero: selección de la molécula plantilla, composición de la mezcla de polimerización, condiciones de polimerización, formato de síntesis, etc. En la presente Tesis Doctoral se demuestra la importancia de seleccionar adecuadamente cada uno de estos parámetros para lograr el reconocimiento selectivo de los analitos seleccionados. Concretamente, se centra en el desarrollo de MIPs selectivos a péptidos de interés en el ámbito biotecnológico, así como para la extracción de micotoxinas, cuya principal aplicación es el campo agroalimentario. 4.1.1. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de péptidos y proteínas recombinantes sintetizados mediante la aproximación del epítopo Debido a los continuos avances en investigación en el campo de la biología molecular, el uso y la producción de proteínas recombinantes ha aumentado de forma notable en los últimos años. Para facilitar el proceso de purificación de las mismas, frecuentemente se emplean marcadores (p. ej. péptidos, proteínas de bajo peso Discusión integradora 282 molecular) que se fusionan a la proteína de interés mediante ingeniería genética. En la actualidad están disponibles en el mercado una gran variedad de marcadores de fusión cuyas características varían de forma sustancial entre ellos, dependiendo de la aplicación. Esta gran oferta permite diseñar protocolos de purificación de proteínas “a la carta”, empleando en la mayoría de los casos columnas de inmunoafinidad basadas en anticuerpos específicos que reconocen al marcador anclado a la proteína. Uno de los marcadores de fusión más versátiles que existen actualmente es el octapéptido DYKDDDDK (ácido aspártico-tirosina-lisina-ácido aspártico-ácido aspártico-ácido aspártico-ácido aspártico-lisina), conocido como FLAG (o FLAG-tag). Como ya se ha comentado en las Publicaciones I y II, el empleo de este péptido permite mejorar el proceso de purificación con respecto al uso de otros marcadores.483 La purificación de proteínas marcadas con el péptido FLAG se lleva a cabo empleando anticuerpos monoclonales anti-FLAG inmovilizados en resinas de agarosa o nanopartículas magnéticas. Aunque esta inmunopurificación es muy selectiva, las resinas presentan una vida útil limitada, escasa estabilidad en medios no fisiológicos, baja capacidad de carga y alto coste. Por ello, el desarrollo de materiales alternativos que ofrezcan la misma selectividad que estos elementos de reconocimiento biológico, mejorando sus propiedades físico-químicas, es de gran interés biotecnológico. En este sentido, y como se ha comentado previamente, los MIPs se presentan como materiales de reconocimiento biomiméticos que permiten una reducción considerable de los costes asociados al empleo de sus análogos naturales, así como simplificar de forma notable el proceso de purificación de proteínas recombinantes. La fabricación de MIPs para la extracción selectiva de macromoléculas presenta serias limitaciones. Una de las aproximaciones más utilizadas en la bibliografía para su síntesis consiste en reemplazar a la biomolécula, como molécula plantilla, por un pequeño fragmento peptídico característico de la proteína o de los polipéptidos que se quieren aislar, conocidos como epítopos. En la presente Tesis Doctoral, se han desarrollado MIPs basados en la aproximación de epítopo para el reconocimiento selectivo del marcador FLAG (DYKDDDDK), tanto en su forma libre como fusionado a una proteína fluorescente recombinante (mCherry). Los MIPs se sintetizaron mediante impronta no jerarquizada (Publicación I) y jerarquizada (Publicación II). En ambos casos se improntó un epítopo del FLAG formado por los cuatro aminoácidos (DYKD) del extremo N-terminal del péptido, en el caso de la impronta no jerarquizada (Publicación I) o bien, un péptido de cinco aminoácidos (DYKDC) en cuyo extremo C-terminal se incluye una cisteína para Discusión integradora 283 llevar a cabo su inmovilización orientada en un soporte de gel sílice, en el caso de la impronta jerarquizada (Publicación II). Síntesis de MIPs mediante impronta no jerarquizada A) Optimización del formato de síntesis El formato de síntesis de los MIPs es uno de los factores que afectan directamente a las características finales de los mismos. Como se ha descrito previamente en la sección 1.1.4.3., uno de los más simples es el denominado formato en bloque o monolito, cuya síntesis se ilustra en la Figura 42. Figura 42. Proceso de preparación de un MIP en formato bloque. Adaptado de la referencia [484]. Como punto de partida, para optimizar la composición del MIP se sintetizaron los polímeros, en formato bloque, a pequeña escala. Como monómeros funcionales se seleccionaron MAA y TFMAA, con el fin de establecer interacciones no covalentes entre los grupos carboxilato de estos y los grupos amino terminal, así como el grupo amino de la cadena lateral de la lisina de la molécula plantilla (péptido DYKD). Como entrecruzantes se emplearon TRIM, EDMA o DVB. La polimerización se llevó a cabo usando como porógeno DMF o mezclas de DMSO/ACN (25:75, v/v). En todos los casos se empleó una relación molar molécula plantilla (T)/monómero funcional (FM)/entrecruzante (CL) de 0.5:4:20 (polímeros MBP1–6, Tabla 12). Con esta aproximación tan solo se obtuvieron polímeros para las composiciones designadas como MBP1 y MBP2, el resto de las mezclas no polimerizó. Se decidió entonces sintetizar un nuevo lote de polímeros empleando una relación molar T:FM:CL diferente (0.5:4:30), usando DVB como entrecruzante (MBP7 y MBP8). Mezcla de prepolimerización Purga de la mezcla (N2 o Ar) Polimerización Extracción de la molécula plantilla Se retira el polímero del vial TrituradoTamizado Estufa Discusión integradora 284 Tabla 12. Composición de los polímeros sintetizados en formato bloque (MBP1-MBP8) empleando una mezcla equimolar de ácido metacrílico (MAA) y ácido trifluorometacrílico (TFMAA) como monómeros funcionales. Polímero Molécula plantilla (T) Monómeros funcionales (FM) Entrecruzante (CL) Porógeno T:FM:CL MBP1 DYKD MAA/TFMAA TRIM DMF 0.5:4:20 MBP2 DMSO/ACN MBP3 EDMA DMF MBP4 DMSO/ACN MBP5 DVB DMF MBP6 DMSO/ACN MBP7 DMF 0.5:4:30 MBP8 DMSO/ACN Para evaluar el reconocimiento selectivo de la molécula plantilla DYKD y el FLAG (DYKDDDDK) en los polímeros sintetizados, los MIP/NIPs (10 mg) se incubaron con una disolución acuosa de los péptidos (10 mg L-1) durante 24 h. En la Figura 43 se muestran las recuperaciones obtenidas (%), para los dos péptidos estudiados, con los polímeros sintetizados empleando TRIM (MBP1 y MBP2) o DVB (MBP7 y MBP8) como entrecruzantes. Se han añadido las letras M y N al código del polímero para designar al MIP y al NIP, respectivamente. Como se puede observar, los péptidos no se retienen en ninguno de ellos, independientemente de que estuvieran preparados en presencia (MIP) o ausencia del péptido DYKD (NIP). Figura 43. Recuperaciones (%) obtenidas tras la incubación (24 h) de una disolución acuosa de los péptidos DYKD y DYKDDDDK (10 mg L-1) con 10 mg de MIP/NIP (n = 3, CV ≤ 5%). Estos ensayos demuestran que en ningún caso se generan cavidades específicas para el reconocimiento de los péptidos o, alternativamente, que la porosidad del material no era la adecuada para facilitar el acceso de los analitos a los sitios de unión selectivos del material (Figura 44). DYKD DYKDDDDK0 20 40 60 80 100 MBP1 NBP1 MBP2 NBP2 R e c u p e ra c ió n ( % ) DYKD DYKDDDDK0 20 40 60 80 100 MBP7 NBP7 MBP8 NBP8 R e c u p e ra c ió n ( % ) A B Discusión integradora 285 Figura 44. Micrografías SEM de los MIPs sintetizados en forma de bloque. Por ello, se decidió explorar un formato alternativo para la síntesis de los MIPs empleando micropartículas esféricas de gel de sílice como moldes sacrificables. Esta aproximación permite la obtención de partículas de porosidad controlada, muy superior a la de los polímeros en bloque. Si se comparan ambos métodos de síntesis, la polimerización en bloque es mucho más sencilla de realizar que la basada en el empleo de moldes sacrificables de gel de sílice, sin embargo, las micropartículas obtenidas en el segundo caso presentan mayor área superficial y mayor porosidad, lo que a priori se debería traducir en una mayor retención selectiva del analito. Además, en el proceso de triturado de los polímeros en bloque pueden destruirse muchas cavidades específicas, disminuyendo así la capacidad de reconocimiento selectivo. Otra de las ventajas que presenta la síntesis de MIPs en forma de esferas es su tamaño y forma. Las partículas obtenidas tras el triturado y tamizado de los monolitos presentan una distribución de tamaño heterogénea y forma irregular, dependiente además de las condiciones de tamizado. Sin embargo, la forma de las partículas esféricas de MIP, su tamaño y su porosidad, viene condicionado por las características del molde de gel de sílice (40–75 μm, 500 Å) empleado en la síntesis. Esto permite una mayor reproducibilidad en los resultados obtenidos cuando se emplean diferentes lotes de MIPs. B) Optimización de la composición polimérica Una vez descartada la síntesis de los MIPs en formato bloque, se decidió llevar a cabo la preparación de los polímeros en forma de partículas esféricas, empleando gel de sílice como molde sacrificable para la polimerización, como se ha comentado previamente. Como se ilustra en la Figura 45, en esta aproximación la mezcla de prepolimerización se impregna en el soporte poroso y, tras la disolución del mismo, se obtienen partículas esféricas porosas de MIP complementarias al molde de partida. Como se describe en la Publicación I, se diseñó una biblioteca de polímeros, siguiendo Discusión integradora 286 una aproximación combinatoria, empleando monómeros funcionales ácidos (MAA, TFMAA, EAMA•HCl), neutros (HEMA) y básicos (1-ALLP, 2-DAEM) en combinación con entrecruzantes de diferente polaridad (TRIM, EDMA, DVB, MBA, PEGDMA), con objeto de seleccionar la composición mas adecuada para la retención selectiva del péptido. La polimerización se observó solo para aquellos polímeros preparados con MAA+TFMAA como monómeros funcionales y TRIM (designado como MSP1) o PEGDMA (MSP3) como entrecruzantes, así como para el polímero sintetizado con EAMA como monómero funcional y EDMA como entrecruzante (MSP8). Figura 45. Proceso de preparación de un MIP en formato esferas porosas utilizando partículas “sacrificables” de gel de sílice como molde. La retención de los péptidos DYKD y FLAG en los diferentes polímeros improntados sintetizados en forma de microesferas se evaluó mediante extracción en fase sólida, tambien conocido como MISPE cuando se emplean los MIPs como sorbentes. Las recuperaciones obtenidas para el DYKD y el marcador FLAG con los polímeros MSP1 y MSP3 fueron bajas (< 20%), aunque superiores a las conseguidas empleando la misma composición de los polímeros sintetizados en formato bloque. En el caso de los polímeros obtenidos con EAMA (MSP8), la recuperación obtenida para ambos péptidos fue considerablemente superior (RMSP8-DYKD = 66 %, RMSP8-FLAG = 92%, n = 3, CV < 2%), aunque mostraron cierta unión no específica, especialmente en el caso del FLAG. No obstante, en el MIP improntado con el péptido DYKD se retuvieron tanto el péptido de 4 como el de 8 aminoácidos, mostrando además un efecto de impronta selectiva frente al NIP, lo que confirmaría la utilidad de la “aproximación del epítopo” para esta aplicación. Es decir, improntando un péptido de 4 aminoácidos, es posible reconocer otro péptido más largo que contiene esta secuencia (DYKDDDDK, FLAG). C) Optimización de la molécula plantilla y del proceso MISPE Para evaluar el efecto de la molécula plantilla sobre la recuperación en el proceso MISPE se sintetizaron MIPs en el mismo formato de microesferas y relación molar 0.5:3:20 (T:FM:CL), con la composición del polímero MSP8, pero empleando el Gel de sílice Sílice-MIP composite MIP Discusión integradora 287 octapéptido DYKDDDDK (MSP9), o el ácido aspártico (MSP10), como moléculas plantilla. Los polímeros obtenidos se evaluaron mediante MISPE, estudiándose además el efecto de una etapa de lavado (0, 1 ó 3 mL de agua) sobre la retención selectiva de los péptidos en el MIP vs. NIP. Los resultados obtenidos (Figura 3, Publicación I) demuestran el buen reconocimiento selectivo del péptido DYKD especialmente en el MSP8 (RMSP8-DYKD = 64– 69%, n = 3, CV < 7%; RNSP8-DYKD = 5–16.5 %, n = 3, CV < 5%). Este dato demostraría la existencia de un efecto de impronta, puesto que el tetrapéptido se empleó como plantilla. Por otra parte, a medida que aumenta el volumen de lavado, las recuperaciones obtenidas en el MSP8 prácticamente no varían y, sin embargo, disminuyen considerablemente en el polímero sin impronta (NSP8), en el que no se observa prácticamente retención al aumentar el volumen de lavado (3 mL agua). La retención selectiva en el polímero puede justificarse considerando las interacciones electrostáticas que se producen durante la etapa de carga y de lavado entre los grupos amino protonados de la matriz polimérica y los grupos carboxilato de los péptidos a un pH fisiológico (pH 7.0). Sorprendentemente, la recuperación obtenida para el tetrapéptido en el caso del MSP9, improntado con el FLAG, fue menor en todos los casos (RMSP9-DYKD = 25–37%, n = 3, CV < 2 %), lo cual podría explicarse considerando que la molécula de menor tamaño no penetra adecuadamente en las cavidades generadas al improntar un péptido más largo. Por otra parte, el polímero sintetizado con ácido aspártico como plantilla (MSP10) no retuvo prácticamente al péptido DYKD, demostrando la importancia de la selección de la plantilla en el proceso de síntesis del MIP (RMSP10-DYKD =3–18.3 %, n = 3, CV < 2%). En el caso del FLAG, se observó una mayor retención de este octapéptido frente al tetrapéptido en todos los polímeros sintetizados, incluyendo el NIP. Este hecho puede justificarse considerando que la naturaleza apolar de este péptido (logP = 6.47) favorece su retención no específica en la matriz polimérica, cuya composición química posee también carácter hidrofóbico. Se observa que, al igual que sucede para el analito DYKD, a medida que aumenta el volumen de lavado (0–3 mL de agua), las uniones inespecíficas también disminuyen para el FLAG. Respecto al MSP10, se observó que las recuperaciones obtenidas para el péptido DYKDDDDK son mayores que para DYKD (RMSP10-DYKD/3-mL = 3%, RMSP10-FLAG/3-mL = 30%, n = 3, CV < 2%), y muy parecidas a las obtenidas en el polímero no improntado NSP8, lo que puede atribuirse a las interacciones no específicas de dicho péptido con los materiales poliméricos que pueden eliminarse incrementando el volumen de lavado. Discusión integradora 288 A partir de estos estudios se concluye que el MIP MSP8 es el más adecuado para la realización de los experimentos subsiguientes, además de establecer como óptimas la carga de los péptidos en tampón HEPES (100 mM. pH 7.5), el empleo de 3 mL de agua como volumen de lavado y el uso de 1 mL de agua/TBA (1%, p/v) como disolvente de elución. D) Estudios de reactividad cruzada frente a otros aminoácidos La reactividad cruzada del MSP8 se ha evaluado frente a aminoácidos ácidos, como el ácido glutámico y el ácido aspártico, al formar este último parte mayoritaria de la composición del FLAG. Para su detección y cuantificación se optimizó un método de HPLC-DAD mediante derivatización precolumna basado en la reacción de los aminoácidos con o-ftaldehído (OPA), en presencia de ácido 3-mercaptopropiónico como reductor en medio básico. El cromatograma obtenido para la separación de los aminoácidos se ilustra en la Figura 46A. Estos estudios se llevaron a cabo empleando las condiciones del proceso MISPE optimizadas anteriormente. Según se observa en Figura 46B, el reconocimiento del ácido aspártico en el MIP (< 25%, n = 3, CV < 5%) es superior al obtenido para el ácido glutámico (< 14%, n = 3, CV < 6%). Aunque la recuperación obtenida es muy baja (< 25%), sí existen ligeras diferencias con el NIP (< 11%, n = 3, CV < 6%), lo que podría justificarse considerando que la molécula plantilla contiene dos residuos de ácido aspártico. Figura 46. (A) Cromatograma correspondiente a la separación de los aminoácidos ácido aspártico y ácido glutámico. (B) Recuperaciones obtenidas en el estudio de reactividad cruzada con los polímeros MSP8 y NSP8: (1) carga: ácido aspártico y ácido glutámico (1 mL, 5 mg L-1) en tampón HEPES 100 mM, pH 7.5, (2) lavado: 3 mL de agua, (3) elución: 1 mL agua/TBA (1%, p/v). E) Purificación de proteínas recombinantes mediante procedimiento MISPE Una vez seleccionado el formato y la composición óptima del polímero (MSP8), se evaluó la utilidad de este material para la purificación de proteínas recombinantes marcadas no solo con FLAG, sino también con el propio epítopo DYKD, que no se Ácido aspártico Ácido glutámico S e ñ a l (U .A .) Tiempo (min) Ácido aspártico Ácido glutámico 0 20 40 60 80 100 MSP8 NSP8 R e c u p e ra c ió n ( % ) A B Discusión integradora 289 emplea a nivel comercial en la actualidad. Para ello, se diseñaron y expresaron dos proteínas recombinantes fluorescentes (mCherry-DYKD y mCherry-FLAG) a fin de facilitar su detección y cuantificación empleando los polímeros sintetizados. Los extractos celulares de lisis obtenidos a partir de dichas proteínas fluorescentes sobreexpresadas se purificaron empleando el MSP8 y su correspondiente polímero sin impronta NSP8. Como punto de partida se llevó a cabo la purificación de la proteína mCherry- FLAG empleando el proceso MISPE optimizado. Para ello se empaquetaron en el cartucho 25 mg de polímero (MSP8 o NPS8, respectivamente) y se empleó tampón Tris (20 mM pH 7.5) en lugar de HEPES como disolvente de acondicionamiento y carga, debido a que el tampón de lisis celular empleado contiene mayoritariamente Tris en su composición. Tras cargar 500 µL del extracto de lisis de la proteína mCherry-FLAG directamente en los cartuchos, se observó la saturación de los polímeros, eluyéndose en esta primera etapa alrededor del 70% de la proteína en el MIP y más del 80% en el NIP (Figura 47). Figura 47. Cuantificación de la pérdida de la proteína mCherry-FLAG en el MSP8 en la etapa de carga (Rcarga, %). Para evitar este problema, se decidió diluir el extracto de lisis (50 µL) con tampón Tris en proporción 1:10 (v/v) cargando en el cartucho un volumen final de 500 µL. Seguidamente, se llevó a cabo una etapa de lavado con 3 mL de agua y la elución de la proteína con 1 mL de agua/TBA (1%, p/v). Con estas condiciones MISPE no se detectó fluorescencia en ninguna de las alícuotas eluídas. Tras comprobar que la proteína mCherry-FLAG se retenía en los polímeros improntados en la etapa de carga, se decidió sustituir el disolvente de elución para evitar una posible precipitación de las proteínas dentro de los cartuchos. Así, en lugar de agua/TBA (1%, p/v) como disolvente de elución, se utilizaron 3 alícuotas (0.5 mL) de disolución tampón glicina (0.1 M, pH 3) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R c a rg a ( % ) MSP8 NSP8 Discusión integradora 290 neutralizándose inmediatamente con tampón Tris (1 M, pH 9). Este protocolo de elución se utiliza habitualmente en la purificación de proteínas marcadas con FLAG empleando columnas de inmunoafinidad. Además, a fin de controlar el pH del medio, se empleó tampón Tris (pH 7, 10 mM) como disolvente de lavado (3 mL) y la purificación se llevó a cabo dentro de una cámara fría (4 ºC) para minimizar la degradación de las proteínas recombinantes. Aunque solo se evaluó para el MIP, los resultados mejoraron significativamente respecto a los experimentos anteriores. No obstante, y tal como se aprecia en la Figura 48, la recuperación de la proteína recombinante mCherry-FLAG no es cuantitativa, obteniendo una recuperación media total de 47% (CV ≤ 24%) para tres réplicas. Figura 48. Recuperaciones obtenidas en la preconcentración de la proteína mCherry-FLAG tras analizar las 3 eluciones sucesivas (3 x 500 µL de disolución reguladora de glicina 0.1 M pH 3, n = 3) en los polímeros improntados (MSP8). Según se puede observar, a pesar de que se aprecia una mejoría en los resultados con respecto a los experimentos anteriores, solo se consiguió la elución parcial de la proteína recombinante. Por ello, se decidió evaluar la purificación de las proteínas mCherry marcadas (50 µL de extracto de lisis diluido 1:10, v/v) empleando Tris (20 mM pH 7.5) como disolvente de carga, agua como disolvente de lavado (3 mL), tampón glicina (0.1 M pH 3, 3 x 500 µL) como disolvente de elución y operando a temperatura ambiente. En estas condiciones, las recuperaciones obtenidas para ambas proteínas mCherry-DYKD y mCherry-FLAG fueron muy satisfactorias (RMSP8 ≥ 95%, CV ≤ 15%), confirmándose en ambos casos el reconocimiento selectivo en el MIP (Figura 4, Publicación I). El proceso de purificación se evaluó mediante SDS-PAGE para verificar la pureza de las proteínas purificadas. Este análisis confirmó que el método MISPE 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e c u p e ra c ió n ( % ) Elución 1 Elución 2 Elución 3 Discusión integradora 291 permitía la extracción selectiva de las proteínas mCherry marcadas con ambos péptidos a partir de un extracto de lisis celular. Como se observa en la Figura 49, en los carriles correspondientes a la evaluación de las disoluciones de elución obtenidas empleando el MSP8, se confirmó la presencia tanto de la proteína mCherry-DYKD (Figura 49A) como la proteína mCherry-FLAG (Figura 49B). Sin embargo, no se obtuvieron bandas proteicas en el caso de los eluatos correspondientes a los polímeros no improntados (NSP8), confirmándose los resultados obtenidos mediante medidas de fluorescencia. Estos datos demuestran que tras el proceso MISPE se consigue una limpieza sustancial de la muestra si se compara el extracto de lisis (carril 1) con la elución del MIP (carril 3), reteniéndose la proteína de interés a pesar de la complejidad del extracto y de la presencia de otras proteínas diferentes. Aunque los valores de recuperación fueron muy satisfactorios, se observó la presencia de una banda correspondiente a una proteína de menor peso molecular (aproximadamente 22 kDa) en el gel correspondiente al extracto de elución del MIP. Con el objeto de comprobar si se trataba de una degradación de la proteína recombinante, se realizó un análisis de las bandas por espectrometría de masas MALDI- TOF/TOF. Estos análisis revelaron la identidad de la proteína desconocida que coeluye con las proteínas mCherry marcadas, indicada con un asterisco (*) en la Figura 49 (carril 3), resultando ser una proteína propia de E. coli conocida como superóxido dismutasa [Fe] (SODF_ECO57). Con la confirmación de su secuencia, quedó descartada una posible degradación de las proteínas mCherry marcadas. Estos resultados están en consonancia con los hallazgos de Britton y colaboradores485 que describen la purificación de la proteína mCherry junto con la coelución de una proteína de E. coli, que por similitud en peso molecular podría corresponder a la proteína superóxido dismutasa, aunque ellos no realizaron ninguna confirmación ni identificación en su estudio. Con objeto de comparar los resultados obtenidos con el MIP sintetizado con los conseguidos empleando una separación con columnas de inmunoafinidad, la proteína mCherry-FLAG procedente del extracto de lisis se purificó empleando la resina comercial ANTI-FLAG M2 Affinity Gel. Esta resina contiene anticuerpos monoclonales ANTI-FLAG M2 inmovilizados en partículas de agarosa y supone el mejor control para evaluar si el empleo del MIP proporciona resultados comparables a los obtenidos empleando anticuerpos como elementos de reconocimiento selectivo. Discusión integradora 292 Figura 49. Geles SDS-PAGE correspondientes a las purificaciones de las proteínas mCherry- DYKD (A) y mCherry-FLAG (B) mediante MISPE (correspondiente a Figura 5, Publicación I) y (C) comparación con la purificación de la proteína mCherry-FLAG empleando la resina comercial ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (correspondiente a Figura S5, Publicación I). Las proteínas mCherry marcadas purificadas se indican con una flecha (►) y las proteínas coeluídas con un asterisco (*). Las recuperaciones obtenidas con los cartuchos de inmunoafinidad se cuantificaron mediante espectroscopia de fluorescencia. Se confirmó así una pérdida parcial de la proteína mCherry-FLAG en la etapa de carga, y la recuperación final en la etapa de elución fue inferior (RANTI-FLAG M2 = 58%, CV ≤ 12%) a la obtenida con el MSP8. Las alícuotas procedentes de las etapas de carga y elución se analizaron en paralelo mediante SDS-PAGE y, como se muestra en la Figura 49C, se confirma la presencia de la proteína mCherry-FLAG en la alícuota de carga (carril 2), lo cual está de acuerdo con los resultados obtenidos en las medidas de fluorescencia. El eluato (carril 3) demuestra la presencia de la proteína mCherry-FLAG (indicada con una flecha, ►) junto a una proteína de peso molecular inferior, la cual según su tamaño podría corresponder a la superóxido dismutasa [Fe] (indicada con un asterisco, *) como se ha descrito anteriormente. La copurificación de esta proteína junto con la mCherry-FLAG empleando anticuerpos específicos ANTI-FLAG M2 confirma, sin ninguna duda, la utilidad del MIP sintetizado para la purificación de proteínas recombinantes, y su 1 2 3 4 5 18.5 26 32 44 48 66 96 M (kDa) * 1 2 3 4 5 18.5 26 32 44 48 66 96 M (kDa) * A 1 2 3 M (kDa) 25 20 15 37 50 75 100 150 250 * B C Discusión integradora 293 comportamiento como material de reconocimiento biomimético, con unas características semejantes a las de las resinas de inmunoafinidad. Como se ha comentado previamente, hasta la fecha de publicación de este trabajo solo existían MIPs improntados con marcadores de afinidad comerciales para el caso del His-tag. En el caso del FLAG, no existe en el mercado ningún material que pueda competir actualmente con las resinas de inmunopurificación ANTI-FLAG. No obstante, según ha quedado demostrado a lo largo de este apartado, los resultados obtenidos con el MSP8 confirman que puede ser un excelente material de reconocimiento biomimético en sustitución de las resinas de inmunoafinidad que emplean anticuerpos específicos ANTI-FLAG M2. El polímero de impronta molecular sintetizado empleando el epítopo DYKD como molécula plantilla es el primer MIP que se describe para la purificación de proteínas recombinantes marcadas con el péptido FLAG. Además, los resultados obtenidos en la purificación de la proteína mCherry- DYKD también demuestran, por primera vez, la utilidad del tetrapéptido DYKD como marcador para la purificación de proteínas recombinantes empleando MIPs. Síntesis de MIPs mediante impronta jerarquizada A pesar de los buenos resultados conseguidos con el MSP8 para la separación de proteínas recombinantes marcadas con el marcador FLAG, las recuperaciones obtenidas en los estudios de reconocimiento con el octapéptido libre no mostraron grandes diferencias entre MIP y NIP. De hecho, el factor de impronta calculado (cociente entre las recuperaciones obtenidas en el MSP8 y NSP8) resultó relativamente bajo (IF 3.3) para este péptido (Publicación I). Es por ello que se planteó la necesidad de sintetizar una resina universal para su uso en la purificación de cualquier tipo de proteína recombinante marcada con el péptido FLAG, en la que la retención no específica del citado péptido fuese inferior a la conseguida hasta ese momento. Como se ha discutido previamente, el empleo de polímeros sintetizados en forma de partículas esféricas proporcionó mejores resultados que los obtenidos en forma de bloque, ya que es posible controlar el tamaño de partícula, forma y porosidad del polímero resultante. Como se ha indicado anteriormente, para la síntesis de dichas partículas la mezcla de prepolimerización, en la que se incluye la molécula plantilla, se absorbe en el interior de la partícula de sílice porosa, por lo que tras la polimerización parte de las cavidades de unión selectivas podrían estar ocluídas en el interior del material. Esto dificultaría tanto la etapa inicial de lavado del péptido como el posterior reconocimiento selectivo del mismo. Una de las estrategias sintéticas que se emplean para evitar esta limitación es la denominada impronta jerarquizada. A Discusión integradora 294 diferencia de la polimerización anterior, en este caso, la molécula plantilla se inmoviliza previamente y de forma covalente en el soporte poroso. Así, tras la polimerización y la posterior disolución del molde de gel de sílice funcionalizado, los sitios improntados se sitúan orientados hacia la superficie del polímero (Figura 50). Mediante esta estrategia, y, según queda ampliamente recogido en la bibliografía, los sitios de unión se encontrarán más accesibles mejorando de forma notable el reconocimiento de los analitos y proporcionando cinéticas de unión más rápidas.279 Figura 50. Proceso de preparación de un polímero mediante impronta jerarquizada. Adaptada de la referencia [282]. La molécula plantilla seleccionada en este caso para sintetizar el MIP corresponde, igual que en el caso de la impronta no jerarquizada, al epítopo del extremo N-terminal del péptido FLAG pero incluyendo una cisteína en el extremo C-terminal (DYKDC) para permitir su anclaje a la partícula de sílice (Publicación II). La optimización de la ruta de inmovilización es un proceso complejo, ya que es necesario encontrar las condiciones óptimas que permitan anclar una cantidad suficiente de péptido al soporte, sin modificar en exceso la porosidad de las partículas con los agentes funcionalizantes. A) Optimización de la ruta de anclaje del péptido DYKDC a gel de sílice El primer paso para llevar a cabo cualquier derivatización de partículas de gel sílice es su rehidroxilación. Las partículas presentan enlaces siloxano (Si-O-Si) no reactivos, que deben activarse para introducir grupos silanoles libres que faciliten la inmovilización posterior del péptido (Figura 51A). Este proceso se lleva a cabo tratando el soporte en medio ácido, normalmente HCl (20%, v/v), a temperatura elevada (˃ 120 ºC) durante 12 h. La química de los silanoles de las partículas de sílice es bastante compleja, ya que no todos estos grupos son exactamente idénticos. Así, en la superficie Mezcla de prepolimerización Molécula plantilla inmovilizada en los poros Complejo monómero-molécula plantilla Sílice porosa Polimerización ∆ Disolución del molde NH4HF2 Sitios de unión orientados MIP + Discusión integradora 295 de las partículas se pueden encontrar (Figura 51B): grupos silanoles vecinales (Q1), geminales (Q2), libres (Q3) y grupos siloxano sin activar (Q4).486 Figura 51. (A) Activación de grupos siloxano de las partículas de sílice en grupos silanoles. (B) Tipos de grupos silanoles y siloxanos presentes en la superficie de partículas de sílice. En primer lugar, para la derivatización de la sílice se decidió emplear el agente silanizante trifuncional N'-[2-(3-trimetoxisililpropilamino)etil]etano-1,2-diamina, abreviado como APTMS. Este silano posee una cadena alquílica de mayor longitud que otros empleados habitualmente en reacciones de silanización. Este hecho repercute directamente en la estabilidad del fragmento anclado, ya que según se ha descrito en la literatura, la amina primaria del silano puede coordinarse al átomo de silicio y producirse una catálisis intramolecular al formarse un ciclo estable de cinco miembros.487 El silano APTMS, al ser trifuncional, presenta tres grupos metoxi capaces de condensarse a los silanoles de la partícula de sílice. La Figura 52 muestra el esquema de reacción y las posibles situaciones de anclaje del organosilano a la sílice mediante uno (A), dos (B) o (C) tres grupos metoxi. Figura 52. Silanización de partículas de gel sílice rehidroxiladas empleando N'-[2-(3- trimetoxisililpropilamino)etil]etano-1,2-diamina (APTMS) como agente silanizante a través de la condensación de (A) uno, (B) dos o (C) tres grupos metoxi. La silanización se evaluó a tres tiempos de reacción diferentes (2 h, 4 h y 16 h) en tolueno anhidro, con objeto de obtener la máxima funcionalización posible (Tabla 13).488 El residuo seco se caracterizó mediante análisis elemental y, a partir del Silanoles libres (Q3) Silanoles geminales (Q2) Siloxanos (Q4) Silanoles vecinales (Q1) A B APTMS A B C Discusión integradora 296 contenido en carbono, se calculó el grado de funcionalización (Df, del inglés degree of functionalization) expresado en mmol de fragmento anclado por gramo de sílice. A partir de estos datos, se observó que la mayor funcionalización se obtenía tras 16 h de reacción, empleándose este material aminado (Si-APTMSON) para la siguiente etapa de derivatización. Tabla 13. Resultados obtenidos a partir del análisis elemental y grado de funcionalización (Df) correspondiente a la etapa de silanización empleando el silano APTMS. Muestra %C %H %N Df (mmol g-1) Si-APTMS2h 1.73 0.61 0.88 0.21 Si-APTMS4h 2.10 0.73 0.88 0.22 Si-APTMSON 2.43 0.6 (DM)* 1.14 0.29 *DM: desviación de método, pésima combustión. Para anclar el péptido a la sílice aminada es necesaria una etapa intermedia a fin de introducir un grupo funcional que reaccione de forma específica con el grupo tiol del péptido. Las dos rutas de inmovilización estudiadas se ilustran en la Figura 53. La primera se llevó a cabo empleando el reactivo GMBS (éster de N-γ- maleimidobutiriloxisuccinimida) y la segunda, con anhídrido yodoacético. Figura 53. Rutas de inmovilización del péptido DYKDC. (A) Ruta GMBS. (B) Ruta anhídrido yodoacético. Ruta del GMBS El GMBS es un agente entrecruzante heterobifuncional que se emplea con frecuencia para el anclaje de proteínas a soportes sólidos. En uno de sus extremos contiene un grupo N-hidroxisuccinimida (NHS) que reacciona con aminas primarias (medio pH 7–9) formando enlaces amida y, en el otro extremo, un grupo maleimida que permite la conjugación covalente a grupos sulfhidrilo mediante la formación de enlaces GMBS Péptido DYKDC Anhídrido yodoacético 1 2 A B 1 Péptido DYKDC 2 Discusión integradora 297 tioéteres (medio pH 6.5–7.5).489 Así, la sílice aminada (Si-APTMSON) se hizo reaccionar con el GMBS (PBS 1X, pH 7.2) y, posteriormente, se incubó con la disolución del péptido DYKDC (PBS 1X, EDTA 5mM, pH 7.2).490 Tras la purificación y secado, el sólido obtenido se designó como Si-GMBS-Pept. La Tabla 14 recoge los resultados del análisis elemental tanto para el sólido derivatizado como para la sílice de partida como comparativa. Tabla 14. Resultados obtenidos a partir del análisis elemental y grado de funcionalización (Df) correspondiente a la etapa de silanización empleando el silano APTMS y posterior anclaje del péptido DYKDC empleando GMBS. Muestra %C %H %N %S ∆%C Df (mmol g-1) Si-APTMSON 2.43 0.6 1.14 - - 0.29 Si-GMBS-Pept 3.50 0.86 1.00 0.05 1.07 - Como se puede observar, aunque se aprecia un incremento en el contenido en carbono, el azufre apenas es detectable y el contenido en nitrógeno disminuye en vez de aumentar. Por tanto, no se consideró satisfactoria la funcionalización de la sílice aminada con el péptido DYKDC empleando este reactivo. Ruta del anhídrido yodoacético La segunda ruta de inmovilización consistió en utilizar anhídrido yodoacético para introducir un grupo yodoacetamida en la sílice aminada, para su posterior reacción selectiva con el grupo tiol del extremo C-terminal del péptido DYKDC (Figura 53B). Así, tras la reacción del anhídrido yodoacético con 4-dimetilaminopiridina (DMAP), en DMF anhidra, se añadieron las partículas de sílice aminada (Si-APTMSON) al matraz de reacción y la suspensión se mantuvo con agitación orbital durante 72 h, a temperatura ambiente y aislada de la luz, designándose al residuo sólido obtenido como Si-APTMS- IAc. Posteriormente, para el anclaje del péptido DYKDC al soporte Si-APTMS-IAc se evaluaron dos rutas de derivatización, una en medio acuoso y otra en medio orgánico. En el primer caso, el péptido DYKDC disuelto en tampón borato (50 mM, pH 8.5, EDTA 5 mM) se hizo reaccionar con la sílice Si-APTMS-IAc (72 h, 25 ºC), designándose al residuo sólido resultante como Si-Pept-BF.491 En el caso de la derivatización en medio orgánico, el péptido DYKDC se hizo reaccionar con trietilamina en DMF anhidra, añadiéndose posteriomente las partículas de sílice yodoacetiladas (Si-APTMS-IAc). La suspensión se mantuvo con agitación orbital durante 72 h a temperatura ambiente, y aislada de la luz, designándose al residuo sólido obtenido como Si-Pept-DMF. La Tabla Discusión integradora 298 15 muestra los resultados obtenidos a partir del análisis elemental para los sólidos aislados en las distintas etapas de síntesis. Tabla 15. Resultados obtenidos a partir del análisis elemental y grado de funcionalización (Df) correspondiente a la etapa de silanización empleando el silano APTMS, posterior yodoacetilación y derivatización con el péptido DYKDC en medio acuoso y en medio orgánico. Muestra %C %H %N %S ∆%C Df (mmol g-1) Si-APTMSON 2.43 0.6 1.14 - - 0.29 Si-APTMS-IAc 3.28 0.6 1.14 0.85 0.35 Si-Pept-BF 2.26 0.56 0.58 -0.04 -1.02 - Si-Pept-DMF 6.00 1.33 1.33 0.30 2.72 0.09 Como se puede observar, cuando la derivatización se lleva a cabo en medio acuoso (Si-Pept-BF), se observa una disminución en el contenido de carbono, nitrógeno e hidrógeno, indicativo de que la sílice puede haberse degradado en las condiciones de pH utilizadas. Sin embargo, en medio orgánico (Si-Pept-DMF) sí se produce el anclaje del péptido DYKDC al soporte obteniéndose una funcionalización de 0.09 mmol g-1. Se observa un ligero aumento de la cantidad inmovilizada desde la aminación (0.29 mmol g-1) a la yodoacetilación (0.35 mmol g-1), atribuído al error experimental. Una vez evaluadas las diferentes rutas de síntesis, se establecieron como óptimas las siguientes condiciones: silanización con el agente APTMS (16 h, 25 ºC), seguido de una etapa de yodoacetilación con anhídrido yodoacético en presencia de DMAP en DMF (72 h, 25 ºC) y finalmente el anclaje del péptido, también en DMF, en presencia de trietilamina (72 h, 25 ºC). Para establecer la reproducibilidad de esta ruta de derivatización, se llevó a cabo la funcionalización completa de dos lotes más de partículas de sílice rehidroxiladas. La Tabla 16 recoge los resultados obtenidos a partir del análisis elemental de los materiales funcionalizados, así como el correspondiente grado de funcionalización. Como se observa, el grado de derivatización obtenido entre lotes en las tres etapas de síntesis es reproducible, obteniéndose una funcionalización media de 0.27 mmol g-1 en la etapa de silanización (CV < 6 %), 0.39 mmol g-1 en la etapa de yodoacetilación (CV < 9 %) y 0.10 mmol g-1 en la etapa de derivatización con el péptido DYKDC (CV < 11 %). B) Síntesis de MIPs mediate impronta jerarquizada empleando partículas derivatizadas con APTMS Las partículas derivatizadas con el péptido DYKDC (designadas como Si-Pept- DMF) se utilizaron como molde y plantilla para la síntesis de los polímeros de impronta Discusión integradora 299 Tabla 16. Resultados obtenidos a partir del análisis elemental elemental y grado de funcionalización (Df) para tres lotes de partículas diferentes, sintetizados empleando el procedimiento optimizado, partiendo de gel de sílice derivatizada con el silano trifuncional APTMS. Lote Muestra %C %H %N %S ∆%C Df (mmol g-1) 1 Si-APTMSON-1 2.43 0.6 1.14 - - 0.29 Si-APTMS-IAc-1 3.28 0.6 1.14 - 0.85 0.35 Si-Pept-DMF-1 6.00 1.33 1.33 0.30 2.72 0.09 2 Si-APTMSON-2 2.20 0.7 1.12 - - 0.26 Si-APTMS-IAc-2 3.15 0.87 1.13 - 0.95 0.40 Si-Pept-DMF-2 6.59 1.31 2.08 0.33 3.44 0.11 3 Si-APTMSON-3 2.27 0.84 1.11 - - 0.27 Si-APTMS-IAc-3 3.27 0.89 1.12 - 1 0.42 Si-Pept-DMF-3 6.67 1.36 2.12 0.38 3.4 0.11 molecular. La selección de la composición polimérica está basada en los resultados previos (Publicación I) según los cuales el polímero que presentaba mayor selectividad por el FLAG fue aquel sintetizado con EAMA•HCl como monómero funcional y EDMA como entrecruzante, empleando ABDV como iniciador radicálico (designado como MSP8). El procedimiento seguido en la síntesis es el descrito anteriormente para la preparación de MIPs empleando partículas de sílice como molde sacrificable. En este caso, para la preparación del polímero de impronta molecular mediante impronta jerarquizada (denominado MIP-TM), el monómero funcional, EAMA•HCl, y el entrecruzante, EDMA, se disolvieron en una mezcla de DMSO/DMF (1:1, v/v). La relación molar entre molécula plantilla (T), monómero funcional (FM) y entrecruzante (CL) obtenida al utilizar la sílice Si-Pept-DMF como plantilla fue de 1.6:4:20 (T:FM:CL). La polimerización se llevó a cabo a 70 ºC durante 24 h y, antes de disolver el molde, se tomó una muestra del material compuesto (MIP-TM@sílice) para su observación por microscopia electrónica. Sin embargo, al añadir NH4HF2 para disolver la sílice, no se obtuvo ningún residuo sólido. Las imágenes SEM tomadas del material compuesto MIP- TM@sílice confirmaron que la mezcla de prepolimerización no había penetrado en su totalidad dentro de la partícula, recubriéndose con el polímero tan solo la superficie de las mismas, según se ilustra en la Figura 54. Esto explicaría por qué no se obtienen partículas de MIP-TM, ya que el fino espesor de la capa polimérica favorece su colapso tras la disolución de la sílice. Discusión integradora 300 Figura 54. Micrografías SEM de la muestra correspondiente al material compuesto MIP-TM@ silica, obtenido a partir de las partículas Si-Pept-DMF, tras la polimerización (70 ºC, 24 h) previa disolución del molde de sílice. Dado que los resultados obtenidos empleando las partículas derivatizadas con el silano trifuncional no fueron satisfactorios, se decidió investigar más a fondo los motivos por los que la mezcla de prepolimerización no penetraba en el interior de los poros de las particulas de sílice. Para ello, se analizaron las partículas funcionalizadas en cada una de las tres etapas (Si-APTMSON, Si-APTMS-IAc y Si-Pept-DMF) mediante resonancia magnética nuclear en estado sólido con polarización cruzada/giro al ángulo mágico (29Si CP/MAS RMN, del inglés cross polarization (CP)/magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance spectroscopy). Estos estudios se llevaron a cabo en colaboración con la Prof. Nuria García del Instituto de Ciencia y Tecnología de Polímeros (ICTP-CSIC) de Madrid. La Figura 55A muestra los espectros superpuestos de las tres etapas de derivatización, distinguiéndose dos regiones correspondientes a las señales Q y las señales T, respectivamente. Las señales correspondientes al silicio inorgánico, esto es, las señales que corresponden al silicio de la superficie de la partícula se asignan a la región Q. Como se ha detallado anteriormente en la Figura 51, pueden presentarse diferentes escenarios en función de si existen enlaces siloxanos (Q4, δ ~ - 111 ppm), silanoles libres (Q3, δ ~ - 100 ppm) o silanoles geminales (Q2, δ ~ - 90 ppm) en la superficie de la partícula de sílice. De acuerdo a la distribución de señales en esta región Q, se confirma que quedarían muchos silanoles libres en la superficie de la partícula sin reaccionar. En cuanto a la región de las señales T, comprenden un intervalo desde -80 a -45 ppm y se asignan a las señales del silicio orgánico, es decir, el silano trifuncional. Según se observa en la ampliación (Figura 55B) se distinguen tres señales, a saber, T1 (δ ~ - 48 ppm), T2 (δ ~ - 57 ppm) y T3 (δ ~ - 67 ppm) que corresponden al diferente grado de condensación del organosilano (T3 ˃T2 ˃T1).492 Así, al ser la señal T3 la mayoritaria, Discusión integradora 301 los silanos se encontrarían en su mayoría completamente condensados. Combinando la interpretación de estas dos regiones, se podría concluir que existen grandes acumulaciones de silanos en pequeñas superficies, y el resto de silanoles de la superficie no se modifican (Figura 55C). Figura 55. (A) Espectros de 29Si CP/MAS RMN correspondientes a las partículas de sílice funcionalizadas con APTMS (Si-APTMSON), yodoacetiladas (Si-APTMS-IAc) y derivatizadas con el péptido DYKDC (Si-Pept-DMF). (B) Ampliación de la región correspondiente a las señales T. (C) Representación de la distribución de los silanos APTMS anclados a la micropartícula de SiO2. A pesar de que la distribución de los silanos está lejos de ser la ideal para la aplicación final, los espectros de la muestra de sílice yodoacetilada (Si-APTMS-IAc), así como de la sílice derivatizada con el péptido DYKDC (Si-Pept-DMF) son prácticamente idénticos. Esto significa que no existe alteración del silano anclado a medida que las partículas se someten a las reacciones anteriormente descritas y, por tanto, estas dos últimas etapas de derivatización han transcurrido de la forma esperada. C) Selección del soporte de gel de sílice De los estudios descritos anteriormente se deduce que la mejor ruta de síntesis para la inmovilización del péptido DYKDC es la que emplea anhídrido yodoacético para la funcionalización de la sílice y su posterior reacción selectiva con el grupo tiol del extremo C-terminal del péptido DYKDC. Para conseguir el máximo rendimiento en esta reacción la sílice debe estar funcionalizada con grupos amino homogéneamente distribuidos sobre la superficie. De este modo, se decidió emplear una sílice comercial aminada que se caracteriza por presentar una alta densidad de grupos amino (~ 1 mmol g-1), evitando así la etapa de derivatización con el silano aminado. Esta sílice, designada Si-APTMSON Si-APTMS-IAc Si-Pept-DMF δ (ppm) Región T Q4Q3 T3T2T1 δ (ppm) A B C Región Q Discusión integradora 302 como Si-NH, está constituida por partículas esféricas, condición necesaria para el posterior empaquetamiento del polímero en el cartucho de SPE y presenta un tamaño de partícula de 40–75 µm y un tamaño de poro de 110 Ȧ (Sigma-Aldrich). Los espectros de RMN en estado sólido descritos anteriormente (Figura 55) revelaron la existencia de grupos silanoles libres en la superficie de las partículas de sílice funcionalizadas con el silano trifuncional APTMS. Con objeto de minimizar la presencia de estos grupos, que podrían originar posteriormente interacciones no específicas con los componentes de la mezcla de polimerización, se introdujo una etapa de bloqueo antes de proceder a la derivatización. Este proceso de protección de los grupos silanoles libres se conoce por el término inglés “end-capping” y se emplea extensamente en la preparación de sorbentes para columnas para cromatografía. En esta etapa se emplean agentes metilantes y desactivantes, como el reactivo 1,1,1,3,3,3- hexametildisilazano (HMDS), que convierte los silanoles en los correspondientes éteres de trimetilsililo (Figura 56). Figura 56. Reacción de protección de los grupos SiOH superficiales de la sílica aminada con HMDS. Para llevar a cabo la protección de los grupos silanoles libres, las partículas de sílice aminadas (Si-NH) se hicieron reaccionar con HMDS en atmósfera inerte (24 h, 25 ºC) y posteriormente la mezcla se mantuvo a reflujo durante 4 h a 40 ºC. El residuo purificado y seco, designado como Si-NH-HMDS, se caracterizó mediante análisis elemental. Para las reacciones de yodoacetilación y posterior derivatización con el péptido DYKDC se emplearon las mismas condiciones optimizadas previamente. Los materiales funcionalizados se han denominado como Si-HMDS-IAc, en el caso de la sílice yodoacetilada, y Si-HMDS-Pept para la silice funcionalizada con el péptido DYKDC. Aunque las micrografías SEM permiten observar ciertas irregularidades en las partículas aminadas de partida (Figura 57), los tratamientos posteriores no parecen afectar a la morfología de estas. Todos los materiales funcionalizados se caracterizaron mediante análisis elemental con el fin de determinar el grado de derivatización conseguido. La Tabla 17 HMDS Discusión integradora 303 recoge los resultados obtenidos, incluyendo la muestra inicial de sílice aminada comercial (Si-NH). Figura 57. Micrografías SEM correspondientes a: (A) sílice aminada comercial (Si-NH), (B) sílice yodoacetilada (Si-HMDS-IAc) y (C) sílice derivatizada con el péptido DYKDC (Si-HMDS-Pept). Tabla 17. Resultados obtenidos a partir del análisis elemental y grado de funcionalización (Df) correspondiente a la derivatización de las partículas de sílice aminada comercial (Si-NH, 110 Å). Muestra %C %H %N %S ∆%C Df (mmol g-1) Si-NH 3.34 1.33 1.41 - - 1.00 Si-NH-HMDS 4.08 1.38 1.45 - 0.74 0.21 Si-HMDS-IAc 6.3 1.4 1.57 - 2.22 0.93 Si-HMDS-Pept 10.17 2.04 2.7 0.46 3.87 0.12 Como se puede observar, en la etapa de protección de los grupos silanoles se obtiene una funcionalización de 0.21 mmol g-1, lo que indica que, a pesar de la elevada funcionalización con grupos amino, en la superficie de la partícula comercial quedan grupos silanoles libres. La etapa de yodoacetilación puede considerarse un proceso prácticamente cuantitativo, ya que se produce una derivatización del 93% de los grupos amino. No obstante, a pesar de que la partícula de sílice comercial empleada en la síntesis presenta un grado de funcionalización con grupos amino superior a la obtenida para las partículas derivatizadas con APTMS, el rendimiento de la derivatización con el A B C Discusión integradora 304 péptido DYKDC no mejoró de forma significativa, con un valor de 0.12 mmol g-1 frente a los 0.10 mmol g-1 obtenidos con el silano APTMS. Las partículas funcionalizadas con el péptido DYKDC (Si-HMDS-Pept) se utilizaron para la síntesis del polímero de impronta molecular jerarquizado (designado como MIP-110) empleando la misma composicion polimérica que en el caso anterior. En este caso la relación molar T:FM:CL obtenida al utilizar la sílice Si-HMDS-Pept como plantilla fue de 1.3:4:20. Tras la polimerización (70 ºC, 24 h), se añadió NH4HF2 para disolver el molde. Aunque en esta ocasión sí que se obtuvo un residuo sólido, las imágenes tomadas con el microscopio electrónico de barrido permitieron comprobar que la mezcla de prepolimerización no se había infiltrado adecuadamente dentro de las partículas y al eliminar la sílice se obtenían aglomerados de polímero (Figura 58). Figura 58. Micrografías SEM correspondientes al MIP-110 sintetizado a partir de la sílice aminada comercial derivatizada con el péptido DYKDC (Si-HMDS-Pept). Aunque este tipo de sílice posee un área superficial más elevada (500 m2 g-1) que la derivatizada con el silano APTMS (60 m2 g-1, apartado 4.1.1.2.A.), su tamaño de poro es considerablemente inferior (110 Ȧ frente a 500 Ȧ), lo que dificultaría la distribución homogénea de la mezcla de prepolimerización en el interior de la partícula. Además, a diferencia del caso anterior, la sílice se derivatizó con el agente HMDS, lo que también podría contribuir a un bloqueo de los poros. Por todo ello se descartó el empleo de este soporte para estudios posteriores. Discusión integradora 305 D) Optimización de la etapa de silanización Para optimizar la etapa de silanización, se decidió emplear la sílice rehidroxilada con un tamaño de poro de 500 Ȧ (40–75 µm), a fin de obtener una distribución homogénea de los grupos aminosilano sobre la superficie de la partícula y facilitar así la posterior derivatización con el péptido DYKDC. A la vista de los resultados preliminares, se descartó el empleo de silanos trifuncionales, tanto etoxi como metoxi derivados, con el fin de evitar la formación de multicapas o agregados493 y la consiguiente oclusión de los poros de la sílice. Así, se evaluaron dos agentes silanizantes bajo diferentes condiciones (Publicación II): el silano difuncional 3-(2- aminoetilamino)propildimetoximetilsilano (AEAPMS) y el silano monofuncional N-(2- aminoetil)-2,2,4-trimetil-1-aza-2-silaciclopentano (AETAZS), según se ilustra en la Figura 59. Figura 59. (A) Esquema de derivatización de las micropartículas de sílice rehidroxiladas empleando dos tipos de silanos (1): AEAPMS y AETAZS. (B) Derivatización de las partículas silanizadas empleando: (2) anhídrido yodoacético y (3) el péptido DYKDC. Silanización con AEAPMS Con objeto de seleccionar la cantidad de AEAPMS óptima para la funcionalización de la sílice, se evaluaron tres concentraciones de silano distintas 3.75 (Si-DMPTSA1), 7.5 (Si-DMPTSA2) y 11.25 (Si-DMPTSA3) mmol AEAPMS g-1 de sílice. En todos los casos se utilizó el ácido p-toluensulfónico (PTSA) como catalizador, para así acelerar la reacción de hidrólisis del silano previa a la etapa de condensación entre AEAPMS AETAZS 1 2 3 Péptido DYKDC A B Discusión integradora 306 los hidroxilos libres de la sílice y dicho compuesto.494 La aceleración de esta etapa tiene como objetivo evitar la autocondensación de las moléculas de silano y reducir la formación de agregados, o de largas cadenas de silano sobre la superficie de la sílice. El análisis elemental de las partículas derivatizadas (Tabla S3, Publicación II) reveló que el incremento de la concentración del silano difuncional no mejoraba significativamente el grado de funcionalización de las mismas. Los análisis posteriores por RMN de sólidos mostraron prácticamente el mismo patrón en las tres muestras, aunque la menor intensidad en la señal Q3 (correspondiente a los silanoles libres) de la muestra Si-DMPTSA1, indica una disminución de los grupos Si-OH superficiales en estas partículas. Las muestras Si-DMPTSA2 y Si-DMPTSA3 presentaron además mayor intensidad en la señal del silicio orgánico en el espectro de RMN (correspondiente a la señal D), que podría explicarse considerando la autocondensación del aminosilano en el medio, previa a la reacción con los grupos silanoles superficiales.495 Por otra parte, manteniendo la concentración de silano fija (3.75 mmol AEAPMS g-1), se evaluó el efecto del tiempo de reacción y de la temperatura sobre la funcionalización de las partículas. Si se comparan los resultados obtenidos tras 2 h (Si- DMPTSA1) y 16 h (Si-DMPTSA4) de reacción, empleando las mismas condiciones experimentales, se observa que, al aumentar el tiempo se incrementa el grado de funcionalización de la sílice. Alternativamente, se procedió a la silanización del gel de sílice en ausencia del catalizador PTSA y a temperatura ambiente durante 24 h (Si- DMRT), observándose una funcionalización menor que para la Si-DMPTSA4, lo que confirma la eficacia del catalizador PTSA en el proceso de condensación de los silanos. Si se comparan los espectros de RMN de sólidos de estas tres muestras (Figura S3, Publicación II), se deduce que la muestra Si-DMPTSA1, denominada en adelante Si- DMPTSA, era la más adecuada para su posterior funcionalización con el péptido. Silanización con AETAZS El silano AETAZS es un agente monofuncional que no puede dar lugar a procesos de autocondensación, por lo que el recubrimiento superficial derivado de esta funcionalización se asemejará más a una estructura de monocapa que la proporcionada por otros silanos. La optimización de las condiciones de reacción para la silanización con el agente AETAZS se limitó al estudio de la concentración empleando 3.75 (Si- AZA1), 7.5 (Si-AZA2) y 11.25 (Si-AZA3) mmol AEATAZS g-1 de sílice, dado que el empleo de este silano requiere utilizar condiciones de atmósfera inerte y temperatura ambiente.496 En este caso se observó que el aumento en la concentración del silano monofuncional empleado en la derivatización no daba lugar a un aumento significativo Discusión integradora 307 de la cantidad de silano injertado. Los análisis de RMN en estado sólido de las tres muestras (Si-AZA1, Si-AZA2 y Si-AZA3, Figura S5, Publicación II) mostraron un perfil similar tanto en la región del silicio inorgánico (Q) como orgánico (M). Consecuentemente, un aumento de la concentración de silano en el medio de reacción no afectaba al grado de funcionalización final, por lo que se seleccionó como óptima la menor de las concentraciones evaluadas (3.75 mmol g-1), denominándose Si-AZA a las partículas derivatizadas empleando estas condiciones. La porosidad de las partículas silanizadas empleando las condiciones optimizadas se evaluó a partir de las isotermas de adsorción-desorción de nitrógeno mediante comparación con la sílice comercial rehidroxilada. En todos los casos se obtuvieron isotermas de tipo IV características, según la IUPAC, de materiales macro- mesoporosos.497 Los resultados obtenidos demostraron que los poros de las particulas no se habían obstruído tras la derivatización de las partículas con los silanos mono y difuncionales. Las siguientes etapas del proceso de funcionalización, es decir, la yodoacetilación y el posterior anclaje del péptido DYKDC se llevaron a cabo empleando las condiciones optimizadas anteriormente (apartado 4.1.1.2.A.). La Tabla 18 recoge un resumen de la funcionalización media obtenida en cada una de las etapas. Tabla 18. Resumen de las derivatizaciones medias obtenidas tras la funcionalización de las micropartículas de sílice con el silano difuncional (AEAPMS) y monofuncional (AETAZS), expresadas como grado de funcionalización (Df). Silano Muestra Df (mmol g-1) CV (%) Difuncional Si-DMPTSA 0.26 12%, n = 3 Si-DM-IAc 0.15 17%, n = 6 Si-DM-Pept 0.05 8%, n = 6 Monofuncional Si-AZA 0.14 8%, n = 4 Si-AZA-IAc 0.10 19%, n = 3 Si-AZA-Pept 0.035 9%, n = 3 E) Síntesis de MIPs mediate impronta jerarquizada empleando partículas derivatizadas con los silanos difuncional y monofuncional Síntesis de MIPs empleando metanol como porógeno El procedimiento de síntesis de los polímeros de impronta jerarquizada difiere ligeramente del protocolo descrito anteriormente (apartado 4.1.1.2.B.). En este caso las partículas funcionalizadas se introducen dentro de una jeringa, para forzar a la mezcla de prepolimerización a penetrar en su totalidad en su interior, aplicando una corriente Discusión integradora 308 de nitrógeno. La composición polimérica no se modificó respecto a la síntesis previa, empleando EAMA•HCl como monómero funcional y EDMA como entrecruzante en una relación molar 4:20 en presencia de ABDV como iniciador radicálico (Tabla 19). En este caso se evaluó el uso de metanol como porógeno a fin de reducir la viscosidad de la mezcla y facilitar la infiltración de la misma dentro de las partículas. Como soporte para la polimerización se emplearon las micropartículas derivatizadas con el péptido DYKDC (Si-DM-Pept y Si-AZA-Pept, respectivamente), mientras que para la síntesis de los polímeros sin impronta se emplearon las partículas funcionalizadas con los aminosilanos correspondientes (Si-DMPTSA y Si-AZA). Tabla 19. Composición de los MIPs sintetizados mediante impronta jerarquizada empleando metanol como disolvente. Polímero Soporte EAMA (mmol) EDMA (mmol) T:FM:CL MIP-DM-M Si-DM-Pept 0.06 0.30 0.8:4:20 NIP- DM-M Si-DMPTSA MIP-AZA-M Si-AZA-Pept 0.07 0.35 0.5:4:20 NIP-AZA-M Si-AZA La Figura 60 muestra las imágenes SEM de los polímeros sintetizados tras la disolución del molde de gel de sílice. Aunque tras la etapa de polimerización se aprecia la presencia de irregularidades en la superficie, la esfericidad de las partículas se ha mantenido constante, lo que facilita su empaquetamiento en los cartuchos de extracción en fase sólida. Para evaluar la retención selectiva de los péptidos en los MIPs, se empaquetaron 25 mg de polímero en cartuchos de SPE (1 mL) y se aplicó un proceso MISPE, similar al descrito para los polímeros sintetizados de forma no jerarquizada. Así, tras acondicionar los cartuchos, se cargó 1 mL de una disolución de los péptidos libres DYKD y DYKDDDDK (5 mg L-1) en tampón Tris (10 mM, pH 7.5), se lavó con 3 mL de agua y posteriormente se eluyeron con 1 mL de una disolución de agua/TBA (1%, p/v). Los resultados obtenidos tras el análisis por HPLC mostraron que el efecto de impronta obtenido es nulo, puesto que el epítopo DYKD se retiene más en los polímeros sin impronta que en los improntados, especialmente en el caso del MIP-DM-M (RMIP-DM- M/DYKD = 0%, RNIP-DM-M/DYKD = 48 %, CV < 8%). De hecho, el análisis de las fracciones de carga del MIP-DM-M reveló que, aproximadamente, el 70% del péptido DYKD se eluía en esta primera etapa. En cuanto a las recuperaciones obtenidas para el octapéptido FLAG, la retención se sitúa en torno al 90% en todos los polímeros sintetizados, independientemente de si se trataba de los MIPs o de los NIPs. La Figura 61 muestra Discusión integradora 309 las recuperaciones obtenidas para los péptidos libres DYKD y FLAG en los polímeros sintetizados tras aplicar el proceso MISPE. Figura 60. Micrografías SEM correspondientes a los MIPs sintetizados de forma jerarquizada, empleando metanol como disolvente, empleando las rutas de derivatización con un silano difuncional (DM) o monofuncional (AZA). Figura 61. Recuperaciones (%) obtenidas tras el proceso MISPE en los MIPs sintetizados en metanol mediante impronta jerarquizada. Condiciones MISPE: (1) carga: 1 mL péptidos DYKD y FLAG (5 mg L-1) en en tampón Tris (100 mM, pH 7.5), (2) lavado 3 mL de agua y (3) elución: 1 mL agua/TBA (1%, p/v) (CV < 8%, n = 3). MIP-DM-M NIP-AZA-MMIP-AZA-M NIP- DM-MA B C D DYKD FLAG0 20 40 60 80 100 MIP-DM-M NIP- DM-M MIP-AZA-M NIP-AZA-M R e c u p e ra c ió n ( % ) Discusión integradora 310 Síntesis de MIPs empleando dimetilsulfóxido como porógeno Las recuperaciones obtenidas con los MIPs jerarquizados sintetizados en metanol demostraron un reconocimiento selectivo nulo hacia ambos péptidos. La mezcla de prepolimerización utilizada, por tanto, no favorece la creación de sitios de unión selectivos. Una de las posibles causas de este comportamiento puede ser que el disolvente porógeno utilizado no favorezca las interacciones entre el péptido y el EAMA. Por ello, se decidió sustituir el metanol por DMSO como disolvente para la síntesis de los nuevos polímeros. El procedimiento de síntesis de los MIPs y NIPs jerarquizados fue idéntico al descrito anteriormente para la síntesis de los polímeros en metanol. No obstante, para obtener un material lo más parecido al empleado en la preparación del MIP y valorar las interacciones no específicas, se decidió utilizar la sílice yodoacetilada como soporte para la preparación de los NIPs (Si-DM-IAc y Si-AZA-IAc, respectivamente), dado que se trata del derivado obtenido inmediatamente antes del anclaje del péptido. Para la preparación de los MIPs se emplearon los soportes de sílice derivatizadas con el péptido DYKDC, descritas anteriormente (Si-DM-Pept y Si-AZA-Pept, respectivamente). El volumen de la mezcla de prepolimerización se calculó a partir de las isotermas de adsorción de nitrógeno como el 95% de la capacidad máxima admisible por cada material, de este modo se evita la polimerización del MIP fuera de las partículas. Las relaciones molares (T:FM:CL) para la preparación de los polímeros obtenidos a partir de la silice funcionalizada con el silano difuncional fue de 0.6:4:20 (MIP-DM), mientras que para aquellos preparados a partir del soporte derivatizado con el silano monofuncional fue de 0.4:4:24 (MIP-AZA). Tras la síntesis de los nuevos polímeros empleando DMSO como disolvente porógeno, se evaluó la retención de los péptidos libres DYKD y FLAG en los mismos mediante el método MISPE optimizado anteriormente para el polímero de impronta no jerarquizada (MSP8). Para comparar los resultados en las mismas condiciones, se incluyó también un estudio del volumen de lavado con agua (0, 1 y 3 mL). Los resultados obtenidos para el péptido DYKD muestran que las recuperaciones obtenidas para este compuesto disminuyen de forma similar, tanto en los MIPs como en los NIPs, a medida que aumenta el volumen de lavado. Aunque las diferencias entre los polímeros improntados (MIP-DM y MIP-AZA) y sin impronta (NIP-DM y NIP-AZA) son mejores que para los polímeros sintetizados en metanol, no se consideran suficientes para demostrar el efecto de impronta. En cuanto a los resultados obtenidos con el FLAG, las diferencias entre MIP y NIP son muy superiores en todos los casos. Las recuperaciones obtenidas en el MIP-DM disminuyen del 97% al 73% (CV < 7%, n = 3), mientras que en el NIP-DM Discusión integradora 311 lo hacen del 37% a 23% (CV < 5%, n = 3) al aumentar el volumen de lavado de 0 a 3 mL de agua. No obstante, las diferencias entre el MIP-AZA y el NIP-AZA son mucho más evidentes, especialmente al emplear un volumen de lavado de 3 mL, obteniéndose recuperaciones del orden del 87% (CV < 4%, n = 3) para el MIP frente a 4% (CV < 4%, n = 3) del NIP. El factor de impronta (IF, calculado como el cociente entre las recuperaciones del MIP y del NIP, tras una etapa de lavado con 3 mL de agua) obtenido para el MIP-AZA es de 21.3, mientras que el IF obtenido con el polímero sintetizado de forma no jerarquizada fue de tan solo 3.3. La Figura 62 muestra una gráfica comparativa de las recuperaciones obtenidas en las condiciones optimizadas en el proceso MISPE para los polímeros sintetizados. Figura 62. Recuperaciones (%) obtenidas tras el proceso MISPE en los polímeros de impronta molecular sintetizados mediante impronta jerarquizada empleando sílice derivatizada con los silanos difuncional (MIP-DM y NIP-DM) o monofuncional (MIP-AZA y NIP-AZA) y mediante impronta no jerarquizada (MSP8 y NSP8). Condiciones MISPE: (1) carga: 1 mL péptidos DYKD y FLAG (5 mg L-1) en tampón HEPES (100 mM, pH 7.5), (2) lavado 3 mL de agua y (3) elución: 1 mL agua/TBA (1%, p/v), (CV < 2-8%, n = 3). Las diferencias observadas entre el MIP-DM y el MIP-AZA pueden atribuirse a la derivatización de las partículas de sílice. Así, el azasilano AETAZS al ser un reactivo monofuncional, únicamente puede reaccionar de forma unilateral dando lugar a una estructura de monocapa real, mientras que el silano difuncional AEAMPS puede originar procesos de autocondensación. Este hecho, ligado a la inmovilización de la molécula plantilla, conduce a que la selectividad que presenta el MIP-AZA frente al péptido FLAG sea extraordinaria. No obstante, a pesar de que las recuperaciones obtenidas para el péptido DYKD son menores que para el octapéptido, este comportamiento no es del todo inusual en el campo de los MIPs. Varios estudios describen fenómenos similares a lo observado para el MIP-AZA. Uno de ellos es el estudio publicado por Rachkov y Minoura270 que sintetizaron un MIP empleando la aproximación del epítopo que DYKD FLAG 0 20 40 60 80 100 R e c u p e ra c ió n ( % ) Discusión integradora 312 reconocía mejor al péptido CYIQNCPLG que a la propia molécula empleada como plantilla (YPLG). La selectividad del MIP-AZA se evaluó además mediante estudios de reactividad cruzada frente a dos péptidos con diferente punto isoeléctrico. El péptido GRGDNP presenta un ácido aspártico en la misma cuarta posición que el FLAG, mientras que el péptido YPYDVPDYA incluye varias tirosinas y ácidos aspárticos en su estructura. Este péptido se emplea, al igual que el FLAG, como marcador de fusión para la purificación de proteínas recombinantes. Estos estudios confirmaron que para ambos péptidos las recuperaciones obtenidas eran despreciables (< 9%). F) Estudios de modelización molecular Para de comprender más a fondo los resultados de recuperación obtenidos para los péptidos libres (DYKD y FLAG) empleando los MIPs sintetizados mediante impronta jerarquizada y no jerarquizada, se llevó a cabo un estudio de modelización molecular de los mismos. También se realizó un estudio del péptido DYKDC simulando su inmovilización en un soporte sólido a través de su C-terminal, con objeto de poder establecer su conformación e interacción con el EAMA en el proceso de impronta. Este estudio se llevó a cabo en colaboración con el Prof. Yoel Rodríguez del Department of Natural Sciences, Hostos Community College of CUNY (Nueva York). La modelización del péptido DYKDC con el EAMA como monómero funcional reveló dos posibles conformaciones para este pentapéptido al aplicar restricciones sobre su extremo C-terminal, siendo una de ellas mayoritaria (~60%) en forma semiextendida lineal (tipo S). Además, las interacciones principales entre el péptido y el monómero funcional son de tipo enlace de hidrógeno entre los oxígenos de los grupos carboxilato del péptido y los hidrógenos del EAMA presentes en el extremo –NH3 + y el grupo –NH, favorecidas en este tipo de disolventes orgánicos al contrario que sucedería con otros disolventes más polares y de tipo prótico.113,118 En cuanto a los péptidos libres, los resultados obtenidos muestran que tanto el DYKD como el FLAG presentan 3 posibles conformaciones, siendo la mayoritaria en ambos casos la forma semiextendida lineal (tipo S) con una contribución similar para el péptido DYKD (~50%) y para el FLAG (~52%). Esta conformación mayoritaria coincide, a su vez, con la principal obtenida para el péptido plantilla DYKDC (Figura 63). No obstante, las conformaciones del FLAG se interconvierten unas en otras mucho más rápidamente que en el caso del péptido DYKD, que sucede más como en bloques. Este hecho está directamente relacionado con la mayor longitud y flexibilidad que presenta el octapéptido, justificando de este modo un mayor reconocimiento del MIP hacia este analito debido al rápido cambio conformacional que presenta. Discusión integradora 313 Figura 63. Modelización molecular y conformaciones principales. (A) Péptido DYKDC y EAMA; conformaciones 1 (naranja) y 2 (azul). (B) Péptido DYKD y (C) péptido DYKDDDDK (FLAG); conformaciones 1 (naranja), 2 (azul) y 3 (rojo). Con todo lo discutido en este apartado, ha quedado demostrada la importancia que tiene tanto la orientación de la molécula plantilla en el proceso de síntesis, como la correcta selección del resto de componentes de la mezcla de prepolimerización. A diferencia de lo que sucede en otros formatos, la impronta jerarquizada permite dirigir la inmovilización de la plantilla forzando a que los sitios de unión se dispongan con la geometría adecuada en la superficie del MIP. En el caso del FLAG, esta aproximación mejora significativamente la retención del analito en las cavidades improntadas, a diferencia de otros materiales en los que la plantilla no se encontraba inmovilizada durante la etapa de síntesis. En este último caso (MSP8), los cambios conformacionales producidos en la molécula plantilla durante la etapa de polimerización, darían lugar a la generación de cavidades de unión con diferentes geometrías distribuídas por todo el material, afectando negativamente a la selectividad del polímero final. Dada la excelente selectividad obtenida con el MIP-AZA, este material podría convertirse en un sorbente universal para la purificación de proteínas marcadas con FLAG. Actualmente, se está trabajando en la expresión de proteínas con interés biotecnológico marcadas con FLAG para su purificación empleando este polímero. 4.1.2. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaria En las últimas décadas el riesgo asociado a la presencia de contaminantes en el medio ambiente ha ido creciendo con la industrialización y el desarrollo de nuevas tecnologías. No obstante, los contaminantes también pueden aparecen de forma natural como resultado de procesos físicos, químicos o biológicos durante el almacenaje o la 45 A 45 45 B C Péptido DYKDC-EAMA Péptido DYKD Péptido DYKDDDDK Discusión integradora 314 fabricación del producto, como en el caso de las micotoxinas, que son compuestos tóxicos producidos en el metabolismo secundario de algunos géneros de hongos. Las micotoxinas producidas por el género Alternaria alternata, especialmente el alternariol (AOH) y el alternariol monometiléter (AME), están consideradas como micotoxinas emergentes y han suscitado interés en temas de salud pública desde hace varios años por los efectos adversos que producen.498 Es por ello que se necesita disponer de métodos analíticos robustos y fiables que permitan detectar estos compuestos en diversas matrices, con el propósito de garantizar la inocuidad de los productos en el marco global de la seguridad alimentaria. En la presente Tesis Doctoral, se han desarrollado MIPs para el reconocimiento selectivo de AOH y AME y los polímeros obtenidos se han empleado como sorbentes selectivos en extracción en fase sólida (MISPE). El primer polímero optimizado (MIP- EAMA-1, Publicación III) se empleó en el análisis de estas dos micotoxinas en muestras de tomate troceado, tras la extracción de las mismas con ultrasonidos (UAE), mientras que el segundo polímero (MIP-VIPY, Anexo II) se empleó en el análisis de AOH y AME en muestras de tomate triturado tras la optimización de un método basado en extracción con disolventes presurizados (PLE). Los MIPs sintetizados facilitaron tanto una buena limpieza de las muestras, como la preconcentración selectiva de las micotoxinas evaluadas. 4.1.3. Optimización de la composición polimérica Como se ha discutido anteriormente en la memoria, la correcta selección de la molécula plantilla tiene una incidencia directa sobre las características del polímero final. No obstante, no siempre es posible ni aconsejable emplear como plantilla el analito que se desea determinar, dado que pueden producirse falsos positivos en el proceso MISPE, debido a la extracción incompleta de la molécula plantilla tras la síntesis del MIP, o a la estabilidad, toxicidad, coste o disponibilidad de la misma.499 De hecho, una práctica bastante común es el empleo de moléculas que guardan una relación estructural estrecha con el analito, denominadas análogos, como plantillas para la detección del mismo. Por todo ello, para preparación de los MIPs selectivos a AOH y AME la Dra. R. A. G. Abou-Hany (Dpto. Química Orgánica I, Grupo GSOLFA) sintetizó y caracterizó extensamente cuatro análogos relacionados estructuralmente con las micotoxinas estudiadas (designados como S1-S4, Figura 64). Para la selección de la composición óptima del MIP se preparó una biblioteca de polímeros, empleando diferentes combinaciones de monómeros funcionales (MAM, EAMA, 2-DAEM, 4-VIPY, TBMA, Discusión integradora 315 MAA, VBA, HEMA) y entrecruzantes (EDMA, DVB) con objeto de determinar aquella composición que ofrecía mejores resultados en el reconocimiento selectivo del AOH. Los MIPs que mostraron mejores prestaciones fueron los preparados con EAMA y 4- VIPY como monómeros funcionales, EDMA como entrecruzante y el análogo S2 (3,8,9- trihidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona) como molécula plantilla. Las recuperaciones obtenidas en medio acuoso fueron cuantitativas para ambas composiciones (RMIP/NIP- EAMA= 100%; RMIP/NIP-VIPY= 97%), observándose únicamente diferencias significativas entre MIP y NIP en medio orgánico (RMIP-EAMA= 90%, RNIP-EAMA= 71%; RMIP-VIPY= 65%, RNIP-VIPY= 22%). Por este motivo, estas dos mezclas de prepolimerización se seleccionaron para la síntesis de MIPs en formato microesferas, ya que la aplicación final de la resina es su uso como sorbente en el proceso MISPE. Figura 64. Estructuras químicas de los análogos sintetizados (S1-S4). Los MIPs en formato microesferas se sintetizaron empleando gel de sílice como molde sacrificable para la polimerización (40–75 µm, 500 Å). Este formato de síntesis, como ha quedado demostrado a lo largo de la presente Tesis Doctoral, constituye una estrategia muy útil para la preparación de estos materiales, dado que, a diferencia de otros formatos, permite la obtención de MIPs de tamaño y porosidad controlada.277 En primer lugar, se llevó a cabo la síntesis de los polímeros compuestos por EAMA como monómero funcional y EDMA como entrecruzante. Paralelamente y con objeto de disminuir la hidrofobicidad del polímero resultante, se probó a añadir metacrilamida (MAM) como monómero diluyente. Según la bibliografía, la presencia de este monómero mejora el reconocimiento selectivo del analito en medio acuoso al incrementar la polaridad del polímero sintetizado.500 Se evaluaron así dos composiciones diferentes, denominadas MIP-EAMA-1 (S2/EAMA/MAM/EDMA, relación molar 1:2:2:20, designado como MIP1 en la Publicación III) y MIP-EAMA-2 (S2/EAMA/EDMA, relación molar S1 S2 S3 S4 Discusión integradora 316 1:4:20, designado como MIP2 en la Publicación III). Los MIPs sintetizados con 4- vinilpiridina como monómero funcional en combinación con MAM como monómero diluyente (S2/VIPY/MAM/EDMA, relación molar 1:2:2:20), no se caracterizaron en la presente Tesis Doctoral, formando parte del proyecto de Tesis realizado por otro miembro del grupo, denominándose a lo largo de esta sección como polímero MIP- VIPY.501 La retención del alternariol en los polímeros MIP-EAMA-1 y MIP-EAMA-2 se evaluó empleando MISPE. De este modo se cargó 1 mL de una disolución de AOH (1 mg L-1) en tampón fosfato (100 mM, pH 8.5), seguido de una etapa de lavado con 1 mL agua/ACN (80:20, v/v) y posterior elución con 1 mL de MeOH/TFA (99:1, v/v). Las recuperaciones obtenidas en el MIP-EAMA-1 para el AOH fueron de RMIP-EAMA-1 = 97 % (CV < 7%, n = 3) para el MIP y RNIP-EAMA-1 = 5 % (CV < 1%, n = 3) para el NIP, confirmándose la utilidad de introducir MAM como monómero diluyente para disminuir las interacciones no específicas. Evaluación de la selectividad y afinidad de los MIPs Para evaluar la selectividad del MIP-EAMA-1, en términos de factor de impronta (IF = kMIP/kNIP), los polímeros (MIP o NIP) se empaquetaron en una columna cromatográfica calculándose el factor de retención (k = (tR− t0)/t0, siendo tR y t0 los tiempos de retención del analito y del metanol) para las micotoxinas. Los IF para el AOH, AME, S2 y S4 fueron 10.8, 10.4, 9.6 y 10.6 respectivamente. Sin embargo, en el caso del AME y del análogo S4 la elevada retención se atribuyó en parte a su alta hidrofobicidad (log PAME = 3.9 ± 0.4; log PS4 = 2.3 ± 0.8). Otros compuestos estructuralmente relacionados con el alternariol, como el catecol, fenol y resorcinol, prácticamente no se retuvieron en el MIP, ni el el NIP (IF < 1.5), lo que demostraría la selectividad del material por las micotoxinas seleccionadas. La caracterización de los sitios de unión de los polímeros sintetizados (MIP- EAMA-1) se llevó a cabo evaluando las isotermas de adsorción. Los datos experimentales se ajustaron al modelo de Freundlich (Ecuación 1) que describe una distribución continua de sitios de unión. En este modelo se asume que el número de moléculas unidas al polímero (B) es función de la cantidad de moléculas que quedan libres (F). El factor preexponencial (a) representa la capacidad general de unión del polímero y es proporcional al número de sitios de unión y su afinidad, mientras que el exponente (m) representa el grado de heterogeneidad del polímero. 𝐵(𝐹) = 𝑎𝐹𝑚 Ecuación 1 Discusión integradora 317 A partir de este modelo y, acorde a las ecuaciones de Rampey502 (Ecuaciones S3 y S4, Publicación III), la capacidad general de unión del MIP-EAMA-1 (35 µmol g-1), en términos de número de sitios de unión (NK1−K2), resultó superior a la del NIP-EAMA- 1 correspondiente (22 µmol g-1). Lo mismo sucede con las constantes de afinidad (KMIP- EAMA-1= 109 mM−1; KNIP-EAMA-1= 50 mM−1), demostrando de nuevo el efecto de impronta conseguido. Según los resultados obtenidos por otros miembros del grupo,501 el número de sitios de unión (NK1−K2) para el polímero MIP-VIPY es 30 µmol g-1 y 24 µmol g-1 para el NIP-VIPY, siendo las constantes de afinidad 120 mM−1 y 68 mM−1, respectivamente. Estos datos demuestran la mayor selectividad del MIP-EAMA-1 por el alternariol, frente al polímero sin impronta, que el polímero sintetizado con vinilpiridina (MIP-VIPY). No obstante, el valor del parámetro a (µmol g-1(mM-1)m) del modelo de Freundlich, que está relacionado con la capacidad de unión del polímero, es menor en el caso de los polímeros sintetizados con EAMA (aMIP-EAMA-1 = 75, aNIP-EAMA-1 = 46) que para los preparados con 4-VIPY (aMIP-VIPY = 166 , aNIP-VIPY = 97). Este hecho, como se comentará más adelante, repercute directa y negativamente sobre la capacidad de carga de este polímero cuando se emplea como sorbente en MISPE. Optimización del método MISPE En la presente Tesis Doctoral se optimizaron todos los parámetros que afectan al proceso MISPE, concretamente el disolvente de elución, el caudal en la etapa de carga de la muestra, la composición del disolvente de lavado y el volumen de ruptura, para la preconcentración selectiva de las micotoxinas de Alternaria en el polímero MIP- EAMA-1 (Publicación III). La carga de la micotoxina se realizó en tampón fosfato (PB, pH 8.5), dado que en este medio el grupo amino de la resina polimérica de EAMA se encuentra protonado. En cuanto al disolvente de elución, se seleccionó 1 mL de MeOH/TFA (99:1, v/v), obteniéndose una elución cuantitativa del AOH (R = 102%, CV < 5%, n = 3) en este medio. Este tipo de disolventes favorecen la ruptura de interacciones iónicas, especialmente cuando llevan modificadores orgánicos ácidos o básicos, necesarios para eluir los analitos de la resina polimérica.503 A pesar de que el proceso de extracción en fase sólida puede realizarse simplemente mediante gravedad, el uso de bombas peristálticas es una práctica habitual que permite controlar de una forma más precisa el caudal de disolvente utilizado en las diferentes etapas. Se ensayaron caudales de carga en el intervalo de 0.5 a 1.8 mL min-1. Las recuperaciones obtenidas para caudales inferiores a 0.93 mL min-1 fueron próximas al 100% (RMIP-EAMA-1 = 98 %, CV < 1%), disminuyendo para flujos superiores debido a que se reduce el tiempo de interacción Discusión integradora 318 entre el analito y el soporte. Finalmente se seleccionó este valor como situación de compromiso entre el tiempo de análisis y la recuperación obtenida. Como se ha discutido anteriormente, la selección del disolvente de lavado resulta crítica en el proceso MISPE dado que en esta etapa es posible eliminar las interacciones no específicas del analito con el sorbente. Así, se ensayaron cinco posibles composiciones del disolvente de lavado empleando mezclas de agua/acetonitrilo en diferentes proporciones (1 mL, 100–50%, v/v) (Figura 5, Publicación III). Los resultados obtenidos mostraron que, a medida que aumenta el porcentaje de acetonitrilo en el disolvente de lavado, disminuye la recuperación del AOH. Las diferencias más pronunciadas entre MIP y NIP se obtuvieron empleando una relación agua/acetonitrilo 80:20 (v/v), con recuperaciones del 96% para AOH en el MIP-EAMA-1 (CV < 2%, n = 3). Un incremento del volumen de lavado de 1 a 3 mL no afectó a la retención del AOH en el MIP, con recuperaciones en el intervalo de 96–102% (CV < 5%, n = 3) y una retención despreciable en el NIP. Finalmente, se seleccionaron 3 mL de agua/acetonitrilo (80:20, v/v) como disolvente de lavado. Para determinar el volumen de ruptura, es decir, el volumen máximo que es posible percolar a través de los cartuchos para una concentración determinada de analito, se evaluaron diferentes volúmenes de carga (1, 5, 10, 25 y 50 mL) así como diferentes cantidades de polímero empaquetado (20 y 100 mg, respectivamente). Los resultados obtenidos demuestran que, a medida que aumenta el volumen de carga, la recuperación disminuye en todos los casos. Además, también se observa que una masa mayor de MIP permite obtener valores de recuperación superiores al disponer de un número mayor de sitios de unión. En el caso de emplear 20 mg de polímero, el descenso más acusado se observó al pasar de un volumen de carga de 10 mL (RMIP-EAMA-1 = 93%, CV < 3%) a 25 mL (RMIP-EAMA-1 = 87%, CV < 2%), mientras que para 100 mg de polímero esta diferencia se observa al pasar de los 25 mL (RMIP-EAMA-1 = 96%, CV < 3%) a 50 mL (RMIP-EAMA-1 = 91%, CV < 5%). Complementariamente, y debido a que tanto el alternariol como el alternariol monometiléter pueden encontrarse simultáneamente en las muestras reales, se llevó a cabo un estudio del volumen de carga en las condiciones optimizadas (mMIP-EAMA-1 = 100 mg, lavado = 3 mL agua/ACN 80:20 (v/v), elución = 1 mL MeOH/TFA 1% (v/v)) evaluando la retención de esta última micotoxina. Como se observa en la Figura 65, las recuperaciones obtenidas en el caso del AME fueron algo más bajas que las obtenidas para el AOH, disminuyendo ligeramente al aumentar el volumen de carga (V = 10 mL, RMIP-EAMA-1/AME = 94%, CV < 8%; V = 25 mL, RMIP-EAMA-1/AME = 87%, CV < 6%). Finalmente, aunque en el MIP-EAMA-1 se obtuvieron recuperaciones en el intervalo del 87–96%, Discusión integradora 319 para ambos analitos AOH y AME, cargando 25 mL de muestra, se decidió seleccionar un volumen de 15 mL para estudios posteriores como situación de compromiso entre el volumen percolado a través de los cartuchos y el tiempo de requerido para el análisis. Figura 65. Recuperaciónes obtenidas en función del volumen de una disolución de AME (200 µg L-1) en tampón fosfato (100 mM, pH 8.5) cargado en el cartucho de MIP (CV < 8%, n = 3). Si comparamos los resultados obtenidos con el MIP-EAMA-1 con los publicados posteriormente por el grupo de investigación para el MIP-VIPY,501 se confirma que el segundo MIP permite preconcentrar mayores volúmenes de muestra (25 mL) empleando menor masa de polímero (25 mg). Este dato está de acuerdo con el valor del parámetro “a” calculado para ambos MIPs a partir del ajuste de las isotermas de adsorción al modelo de Freundlich (aMIP-EAMA-1 = 75 vs. aMIP-VIPY = 166). No obstante, la retención no específica en el NIP-VIPY tambien es superior a la del MIP-EMA-1 (aNIP- EAMA-1 = 46 vs. aNIP-VIPY = 97). Este comportamiento se puede justificar considerando que, en el caso del MIP-EAMA-1, la interacción principal se establece a través de enlace de hidrógeno entre el grupo amino del monómero y el grupo fenol del analito, mientras que en el caso del MIP-VIPY también pueden producirse interacciones tipo π- π entre los anillos aromáticos. Esto da lugar a un incremento de las interacciones no específicas con el polímero, por lo que es necesario utilizar mayores volúmenes de lavado en el proceso MISPE para eliminar las interacciones no específicas.504 Las condiciones óptimas de los métodos MISPE para el reconocimiento selectivo del AOH y AME empleando los polímeros MIP-EAMA-1 y MIP-VIPY se recogen en la Tabla 20. Optimización del método de extracción de micotoxinas de Alternaria en muestras de tomate La determinación de las micotoxinas de Alternaria (AOH y AME) se realizó en muestras de tomate, dado que esta matriz y sus derivados se encuentran entre los alimentos que presentan mayor contaminación por los hongos de A. alternata.505 Se optimizaron dos procedimientos diferentes para la extracción de AOH y AME en muestras de tomate: la primera mediante extracción asistida por ultrasonidos 0 20 40 60 80 100 1 10 25 50 R e c u p e rr a c ió n ( % ) Volumen de carga (mL) Discusión integradora 320 (Publicación III) y la segunda empleando extracción con disolventes presurizados (PLE). En el primer caso la preconcentración se llevó a cabo empleando el MIP-EAMA- 1 optimizado en la presente Tesis Doctoral, mientras que en el segundo se utilizó el MIP- VIPY (Anexo II) sintetizado y optimizado por otro miembro del grupo de investigación.501 Tabla 20. Condiciones MISPE optimizadas para los polímeros sintetizados con EAMA (MIP- EAMA-1) y 4-vinilpiridina (MIP-VIPY) como monómeros funcionales. MIP-EAMA-1 MIP-VIPY Etapa Condiciones MISPE Acondicionamiento 5 mL MeOH 10 mL PB (100 mM, pH 8.5) 10 mL MeOH 10 mL PB (50 mM, pH 8.2) Carga 15 mL de muestra 25 mL de muestra Lavado 3 mL H2O/ACN (80:20, v/v) 2 mL ACN /H2O (5:95, v/v) 3 mL ACN/H2O (15:85, v/v) Elución 1 mL MeOH/TFA 1% (v/v) 1 mL MeOH/TFA 1% (v/v) Masa de polímero 100 mg 25 mg A) Extracción asistida por ultrasonidos Uno de los procedimientos de extracción de muestra más sencillos que existen es la extracción asistida por ultrasonidos, dado que el equipamiento que se requiere es mínimo en comparación con otras técnicas. El proceso de análisis completo (UAE- MISPE-HPLC-FLD) se ilustra en la Figura 66 y consta de varias etapas: 1) homogeneización y pesada de la muestra; 2) adición de 20 mL de tampón fosfato (100 mM, pH 8.5); 3) extracción de las micotoxinas asistida por ultrasonidos durante 10 min; 4) filtración del extracto con doble filtro de celulosa; 5) carga de 15 mL del extracto clarificado en el cartucho del MIP/NIP; 6) extracción selectiva de las micotoxinas mediante el método MISPE optimizado y, 7) análisis de las fracciones eluídas mediante HPLC-FLD. Para determinar la cantidad óptima de muestra para llevar a cabo la preconcentración en el cartucho de MIP, se contaminaron 1, 2, 3, 6 y 10 g del troceado de tomate con una concentración fija de AOH y AME (200 µg L-1). Tras aplicar el procedimiento de extracción descrito anteriormente, los extractos obtenidos se analizaron por HPLC-FLD. Como se observa en la Figura 67, a medida que aumenta la cantidad total de masa de tomate, la recuperación obtenida para ambos analitos disminuye, lo cual indica que se ha superado la capacidad de carga del cartucho. A partir de estos resultados se decidió realizar la preconcentración empleando 2 g como masa Discusión integradora 321 óptima de muestra para posteriores experimentos (RMIP-EAMA-1/AOH = 88%, CV < 5%; RMIP- EAMA-1/AME = 95%, CV < 0.4%, n = 3). Figura 66. Esquema del proceso UAE-MISPE-HPLC-FLD para la determinación de AOH y AME. Figura 67. Recuperaciones obtenidas para AOH y AME, empleando el procedimiento MISPE optimizado, en función de la masa de tomate evaluada (CVAOH < 8%, CVAME < 5%, n = 3). Las muestras de tomate (2 g) se enriquecieron con distintas concentraciones de ambas micotoxinas (AOH y AME) obteniéndose recuperaciones en el intervalo del 81– 103% (CV < 4%, n = 3) para AOH, como se detalla en la Tabla 3 (Publicación III), y del 89–101% (CV < 10%, n= 3) para AME según se detalla en la Tabla 21. Muestra de tomate + 20 mL tampón fosfato (100 mM, pH 8.5) Ultrasonidos (10 min) Filtración 15 mL muestra Proceso MISPE Análisis HPLC-FLD AOH AME 0 20 40 60 80 100 1 2 3 6 10 R e c u p e ra c ió n ( % ) Masa de tomate (g) Discusión integradora 322 Tabla 21. Recuperaciones medias (%) y coeficientes de variación (CV, %) obtenidos en el análisis de muestras de tomate fortificadas con AME empleando el método UAE-MISPE-HPLC- FLD optimizado (n = 6). Nivel fortificado (µg kg-1) Nivel encontrado (µg kg-1) Recuperación (%) CV (%) 22 19.6 88.9 9.6 33 32.7 99 1.9 44 44.5 101 2.5 50 50.2 100.5 1.3 75 75.3 100.4 0.9 A la vista de los resultados obtenidos, es posible afirmar que el polímero sintetizado con EAMA permite preconcentrar selectivamente tanto al AOH como al AME en muestras reales. La Figura 68 muestra el cromatograma obtenido tras aplicar el proceso MISPE en el análisis de ambas micotoxinas en una muestra de tomate, demostrándose la capacidad del MIP para llevar a cabo una limpieza eficiente de la misma y la preconcentración selectiva de los analitos. El MIP-EAMA-1 (Publicación III) fue el primer polímero de impronta molecular descrito en bibliografía para el reconocimiento selectivo de estas micotoxinas de Alternaria. Figura 68. Cromatograma obtenido en el análisis de AOH y AME en tomate troceado: (A) muestra sin fortificar (), (B) muestra antes del proceso MISPE (), (C) muestra después del proceso MISPE (). B) Extracción con disolventes presurizados La extracción con disolventes presurizados permite mejorar la eficiencia del proceso de extracción en muestras alimentarias, en comparación con otras técnicas, debido al empleo de elevadas presiones y temperaturas moderadas.506 Además, se AOH AME Discusión integradora 323 requieren tanto menores tiempos de extracción como volúmenes de disolvente, lo cual resulta especialmente interesante cuando se utilizan disolventes orgánicos. Por otra parte, su aplicación evita el uso de disolventes orgánicos halogenados, reduciéndose la contaminación medioambiental, y por ello se considera una técnica “verde”. No obstante, a diferencia de la extracción asistida por ultrasonidos, la PLE requiere el empleo de una instrumentación más compleja y la optimización de las variables experimentales correspondientes que van a tener una incidencia directa sobre la recuperación del analito. Según se detalla en el Anexo II de la presente Tesis Doctoral, se optimizaron la composición del disolvente de extracción, la temperatura, la presión y el número de ciclos de extracción. En primer lugar, y según describen varios estudios, las micotoxinas de Alternaria se extraen de forma muy eficiente en medios hidroorgánicos, especialmente aquellos que incluyen metanol en su composición, dada la elevada solubilidad que presentan en este medio.507 Por ello, se evaluaron mezclas de MeOH/H2O, en diferentes proporciones (100, 75, 50, 25 y 0%, v/v), como disolvente de extracción. El estudio se llevó a cabo a dos temperaturas (50 ºC y 70 ºC), y a una presión constante de 1000 psi, tras confirmar la estabilidad de las micotoxinas en estas condiciones. Los resultados obtenidos (Tabla S1, Anexo II), demuestran que a medida que disminuye el porcentaje de metanol en la mezcla extractante, disminuye la recuperación de los analitos. La situación de compromiso se alcanza empleando una mezcla de MeOH/H2O (25:75, v/v) permitiendo obtener unos valores de recuperación cuantitativos (RAOH= 97 %, RAME= 90%, CV < 4%, n = 3). El efecto de la presión se evaluó realizando la extracción a 1000, 2000 y 3000 psi, manteniendo un ciclo de extracción y empleando la mezcla de MeOH/H2O (25:75, v/v) como extractante. Un aumento en la presión no mejoró la recuperación de los analitos (RAOH/3000 psi= 92 %, RAME/3000 psi= 89%, CV < 8%, n = 3), favoreciéndose además la coextracción de componentes de la matriz que afectaban negativamente a la separación cromatográfica. Con relación a los ciclos de extracción (1, 2 ó 3), el aumento de estos incide negativamente sobre las recuperaciones obtenidas para ambas micotoxinas, por lo que se decidió seleccionar 1 ciclo de extracción y 1000 psi como condiciones óptimas de trabajo. Los extractos de PLE se evaporaron para eliminar completamente el metanol, dado que en presencia de este disolvente disminuye la retención selectiva en el MIP. Seguidamente se adicionaron 100 µL de metanol a los extractos evaporados para resolubilizar las micotoxinas y la disolución resultante se llevó a un volumen final de 25 mL con tampón fosfato (50 mM, pH 8.2). El proceso global (PLE-MISPE-HPLC-FLD) se ilustra en la Figura 69. Al igual que en el caso del UAE-MISPE-HPLC-FLD, las muestras Discusión integradora 324 de tomate se fortificaron con ambas micotoxinas obteniendo unas recuperaciones de 84–97% (CV < 8%) para el AOH y de 67–91% (CV < 13%) para el AME, tal y como se detalla en el Anexo II. Además, se llevó a cabo una validación completa del método obteniendo un LOD de 7 y 12 μg kg-1 para el AOH y el AME, y un LOQ de 20 y 36 μg kg-1 para el AOH y el AME, respectivamente. Figura 69. Procedimiento completo de extracción de AOH y AME mediante PLE-MISPE-HPLC- FLD. Los métodos analíticos descritos a lo largo de esta sección (UAE-MISPE-HPLC- FLD y PLE-MISPE-HPLC-FLD) han demostrado su utilidad para extraer, detectar y reconocer selectivamente a dos de las principales micotoxinas de Alternaria (AOH y AME) en muestras de tomate. No obstante, la elección de un método u otro dependerá de diversos factores, tales como el tipo de muestra, el tiempo de análisis, la cualificación operacional del personal, el consumo de disolventes o la posibilidad de automatización de la técnica. Mientras que el primer método (UAE-MISPE-HPLC-FLD) se sirve de instrumentación sencilla y de bajo coste al emplear ultrasonidos como técnica de extracción, el segundo método (PLE-MISPE-HPLC-FLD) requiere de instrumentación más compleja al realizarse la extracción de forma totalmente automatizada. No obstante, la PLE permite un mayor control sobre las condiciones del proceso, pudiéndose aplicar de forma rápida y eficaz a la extracción de micotoxinas en otras matrices más complejas. La piedra angular de ambos métodos es, indudablemente, la resina polimérica empleada para la preconcentración selectiva de las micotoxinas de Alternaria. Aunque tanto el polímero MIP-EAMA-1 como el MIP-VIPY permiten una limpieza muy eficaz de la Muestra de tomate Agente dispersante + Celda PLE PLE Evaporación TurboVap (22 mL) Enrase 25 mL tampón fosfato (50 mM, pH 8.2) Proceso MISPE Análisis HPLC-FLD 33 mL + 100 μL MeOH Filtración Discusión integradora 325 muestra, la diferencia entre ambos radica principalmente en su capacidad. El MIP-VIPY permite la carga de un mayor volumen de muestra utilizando una masa más pequeña de polímero en comparación con el MIP-EAMA-1. No obstante, el MIP-EAMA-1 presenta una mayor selectividad, por lo que su aplicación puede resultar especialmente interesante en el caso de muestras que presenten un mayor número de sustancias interferentes. 4.2. Selección de fragmentos de anticuerpo VH selectivos a la fitohemaglutinina mediante la tecnología de presentación de proteínas en la superficie de fagos (phage display) y posterior caracterización empleando la microbalanza de cristal de cuarzo Debido a los avances biotecnológicos alcanzados en los últimos años, la generación de anticuerpos recombinantes mediante ingeniería genética ha experimentado un crecimiento sin precedentes. En general, estos elementos de reconocimiento presentan mejores propiedades bioanalíticas que los anticuerpos tradicionales y son físico-químicamente más estables. Además, mediante el uso de técnicas de presentación en superficie como el phage display, es posible producir estos anticuerpos recombinantes in vitro sin la necesidad de emplear animales vivos. Una de las limitaciones de esta tecnología es la evaluación de los clones obtenidos una vez realizado el proceso de selección de los mismos (biopanning). Normalmente, los métodos que se utilizan para seleccionar a los mejores candidatos no ofrecen suficiente información acerca de las interacciones entre el fragmento desplegado y el antígeno. Además, debido a la estructura filamentosa del fago, es frecuente obtener señales no específicas, especialmente cuando se emplean métodos ELISA para su caracterización. Para establecer de una forma veraz la afinidad de los diferentes clones, es necesario emplear técnicas más específicas como la QCM y complementar la información obtenida con otros análisis estructurales. A pesar de que existen en la bibliografía algunos estudios que emplean la QCM para determinar las afinidades de los clones seleccionados por el analito, hasta la fecha no se han descrito estudios que combinen los datos cinéticos, termodinámicos y estructurales relativos a dicha interacción para extraer una información más completa sobre el reconocimiento fago-proteína.508,509 Según se describe en la Publicación IV, para llevar a cabo el descubrimiento de fragmentos de anticuerpo VH desplegados en fagos mediante la tecnología phage display, se ha seleccionado como antígeno modelo la PHA, debido a su complejidad estructural e interés analítico. Según se comentó en la sección 1.2.3., uno de los grupos Discusión integradora 326 de sustancias que ocasionan trastornos en la salud de los consumidores son los denominados factores antinutricionales, especialmente las lectinas presentes en las legumbres. De todas ellas, una de las mayoritarias es la PHA, pudiendo interaccionar con los receptores glicosilados de los enterocitos, derivando en problemas gástricos como la malabsorción de nutrientes y la destrucción irreversible del epitelio.472 Este trabajo se ha realizado en colaboración con el grupo del Prof. Ángel Maquieira de la Universidad Politécnica de Valencia que se ha encargado tanto de las medidas con la QCM como de su interpretación. 4.2.1. Selección de la biblioteca de fagos De todos los formatos de fragmentos de anticuerpos recombinantes conocidos, los de dominio único de origen humano, denominados fragmentos VH, presentan características particulares que les confieren un gran potencial para su empleo como elementos de reconocimiento en biosensores, según se comentó en la sección 1.1.3. Por ejemplo, dado su pequeño tamaño es posible que accedan más fácilmente a un mayor número de epítopos de la PHA que si se trabajara con otros formatos más voluminosos, como los fragmentos scFv o Fab. Una de las bibliotecas de fagos que presentan el formato VH es la diseñada por Christ y col. en el año 2007.84 Desde su creación ha sido aplicada con éxito al descubrimiento de anticuerpos VH frente a diferentes analitos como el péptido antigénico de la esclerosis múltiple CSF114(Glc),510 o para la proteína de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis.511 Como se comentó en la sección 1.1.3.3., la tecnología de presentación en superficie de fagos puede basarse en dos enfoques dependiendo del vector empleado. De este modo, si se emplea un sistema de fago, los anticuerpos se expresarán como proteínas de fusión en todas las proteínas de la cubierta de la partícula viral dando lugar a un sistema multivalente (Figura 70A). En cambio, si se emplean fagémidos como vectores, el fago resultante solo poseerá un número limitado de copias del anticuerpo, dando lugar a un sistema prácticamente monovalente (Figura 70B). No obstante, requiere la presencia de un fago auxiliar que proporcione los componentes necesarios para un correcto ensamblaje. La biblioteca diseñada por Christ y col. está basada en esta última aproximación y ha sido empleada en el descubrimiento de anticuerpos VH frente a PHA en la presente Tesis Doctoral. El concepto de polivalencia o monovalencia en relación al despliegue de los anticuerpos en la superficie de los fagos es de suma importancia en la determinación de la afinidad entre dicho fragmento y el antígeno. En un sistema polivalente la cantidad de fragmentos desplegados varía si se tiene en cuenta que además pueden sufrir Discusión integradora 327 procesos de proteolisis. De este modo, existirá una población heterogénea de fagos en la que no todos presentarán el mismo número de copias por partícula y, por tanto, presentarán diferentes grados de avidez. La avidez es una medida de la estabilidad global del complejo formado entre los anticuerpos y los antígenos y, por tanto, el uso de un sistema polivalente puede conducir a la selección de clones de baja afinidad enmascarados por una alta avidez.512 Figura 70. Estrategias empleadas en la tecnología phage display para la generación de anticuerpos recombinantes. (A) Sistema fago. (B) Sistema fagémido. Adaptado de la referencia [513]. Con el empleo de sistemas monovalentes este problema se minimiza, ya que al existir solo un anticuerpo desplegado por partícula viral se elimina el componente de la avidez para considerar solo la afinidad.514 Este sistema, como se ha comentado anteriormente, se basa en el uso de fagémidos para llevar a cabo el proceso de phage display. La Figura 71 muestra el vector utilizado en la presente Tesis Doctoral, que permite la expresión del fragmento VH fusionado al extremo N-terminal de la proteína pIII. Péptido señal Anticuerpo Proteína pIII Vector fago Origen de replicación del fago Péptido señal Anticuerpo Proteína pIII Vector fagémido Origen de replicación del fago Tag Gen resistencia antibiótico Origen de replicación del plásmido A B 2. Superinfección con el fago auxiliar Origen de replicación defectivo Infección E. coli 1. Transformación E. coli Anticuerpos recombinantes Discusión integradora 328 Figura 71. Mapa del vector pR2-VH utilizado en la selección de fragmentos VH frente a PHA. 4.2.2. Enriquecimiento de fagos e identificación de clones selectivos La tecnología de presentación en superficie de fagos se basa en una incubación iterativa de la biblioteca de fagos frente al antígeno, con el propósito de enriquecerse en aquellos más afines. En este caso se emplearon 4 rondas de selección y el enriquecimiento se realizó evaluando las titulaciones de los fagos seleccionados tras cada ronda mediante ensayos ELISA. Como se observa en la Figura S1 (Publicación IV), a pesar de que se aprecia un aumento en la relación entre los fagos eluídos y los iniciales, las diferencias obtenidas (expresadas como relación PHA/fondo) son relativamente pequeñas en comparación con otros trabajos en los que se emplean otras bibliotecas, como la scFv.515 Este comportamiento ha sido descrito por otros autores que tambien observaron señales procedentes del fondo significativamente altas en los ensayos ELISA.516 Todo ello podría atribuirse a la respuesta múltiple de un grupo heterogéneo de fagos, en el que la señal de los clones específicos no se aprecia adecuadamente debido a la presencia de fagos inespecíficos. En consecuencia, la selección de clones individuales resulta crucial para aislar aquellos fagos que presenten realmente unión selectiva. Para la identificación de fagos monoclonales se llevó a cabo el aislamiento de colonias individuales procedentes de la 2ª, 3ª y 4ª ronda. Empleando ensayos ELISA se seleccionaron los candidatos para estudios posteriores, fijándose un valor de corte de 2.8 (señal PHA/fondo) como valor de compromiso entre los monoclones totales y la variedad de secuencias potencialmente diferentes. Los resultados obtenidos mediante este ensayo demostraron que, de los 76 monoclones seleccionados, 25 cumplían el Fragmento VH Péptido señal pelB c-Myc tag VSV-G tag Gen III lacZα Origen de replicación M13 Gen resistencia Ampicilina Origen de replicación ColE1 Promotor lac Operador lac pR2-VH 4881 pb Discusión integradora 329 criterio de selección establecido (33%). Tras la secuenciación se obtuvieron 8 secuencias diferentes correspondientes a los clones 1, 11, 12, 41, 42, 61, 70 y 86. 4.2.3. Evaluación de los clones seleccionados El primer factor diferenciador entre los clones seleccionados es su secuencia de aminoácidos. Dado que las regiones CDR son las que establecen las principales interacciones con el antígeno, una forma de clasificar los clones es considerar la hidropaticidad de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3. Empleando este criterio se pueden distinguir tres grupos de fagos: el primero compuesto por los clones 61 y 86 que presentan una región CDR1 hidrofóbica; el segundo grupo que incluye al clon 12, con una región CDR2 hidrofóbica y el tercer grupo, formado por los clones 1, 11, 41, 42, 70 caracterizado por regiones CDR hidrofílicas. No obstante, esta clasificación no proporciona información sobre las interacciones entre los fragmentos VH y la PHA. Es necesario, por tanto, evaluar los parámetros cinéticos y termodinámicos característicos de la interacción entre la proteína y cada uno de los clones de fagos selecionados. Estas medidas se realizaron empleando QCM-D dado que, a diferencia de otras técnicas, proporciona información sobre la naturaleza y el mecanismo de interacción. La QCM emplea discos muy finos de cuarzo recubiertos a cada lado con un electrodo de oro. Dado que el cuarzo presenta carácter piezoeléctrico, al aplicar una corriente alterna, oscila a una determinada frecuencia de resonancia.517 Los parámetros que se miden en tiempo real en un experimento de QCM-D son la frecuencia (f), que proporciona información sobre la cantidad de masa adsorbida y del espesor de la capa que se formada en la superficie, y la disipación (D), relacionada con la rigidez de la capa formada y, por tanto, con su viscoelasticidad.518 En este trabajo, mientras que el incremento de frecuencia es del mismo orden para todos los clones, la variación de la disipación no es la misma en todos los casos. Este hecho está directamente relacionado con la orientación de los fagos sobre la superficie del sensor, de forma que aquellos fagos con altos valores de ∆D se dispondrían de forma más vertical. Este comportamiento se observa especialmente en el caso del clon 70. Empleando la QCM-D se han calculado las constantes de velocidad de asociación (kon) y disociación (koff) de los complejos entre los clones de fagos y la PHA y las constantes de afinidad (Ka), como la relación (kon/koff). Las constantes de afinidad de los anticuerpos suelen ser del orden de 106 M-1 a 1010 M-1, considerándose valores de afinidad aceptables los superiores a 109 M-1. 519,520 Los valores calculados para los clones evaluados se encuentran en el intervalo de 108 a 1010 M-1, por lo que la mayoría de ellos presenta una afinidad comparable a la de los anticuerpos. Discusión integradora 330 Según se comentó en la Publicación IV (Figura 3), las gráficas (∆D vs. ∆f) permiten agrupar los clones considerando su mecanismo de interacción, es decir, según se produzcan cambios más o menos significativos en el proceso de unión. El clon 70 pertenece al grupo que más cambios experimenta, seguido de los clones 11 y 41 que experimentan cambios moderados, y por último el grupo de los clones 1, 12, 42, 61 y 86 que experimentan cambios menores. Una vez se dispone de toda la información, es necesario el uso de herramientas que permitan identificar los parámetros más representativos para agrupar los clones seleccionados, como es el caso del análisis por PCA. En un primer momento se elaboró una matriz con los nueve parámetros considerados: koff, kon, Ka, factor de disipación (D), frecuencia (f), relación ∆f/∆D y el carácter hidropático de cada CDR. Tras analizarse las correlaciones, los factores que tenían más peso en el análisis fueron: kon, D y el carácter hidropático del CDR3. De acuerdo con los resultados obtenidos por PCA, es posible distinguir tres grupos de clones de fagos en función del parámetro que les agrupa. Así, se tienen dos grupos de clones clasificados estructuralmente según el factor de disipación (grupo A, clones 11, 41 y 70) e hidropaticidad del CDR3 (grupo B, clones 12 y 61), y otro grupo clasificado termodinámicamente por el valor de kon (grupo C, clones 1, 42 y 86). Además, se llevó a cabo una modelización molecular de los complejos formados entre la PHA y los fragmentos VH, encontrándose que los clones del grupo A se unen al epítopo de la subunidad L de la PHA, los del grupo B a la subunidad E y los clones del grupo C a ambos epítopos. 4.2.4. Análisis de los clones empleando inmunoensayos ELISA Alternativamente, la interacción entre los fragmentos VH desplegados en fagos para los ocho clones seleccionados y la PHA se evaluó mediante inmunoensayos ELISA, empleando dos tampones de bloqueo comerciales de distinta naturaleza, CSBF (casein blocking buffer, Figura 72) y PFBF (protein free blocking buffer, Figura 73), con el fin de disminuir las interacciones no específicas. Como se puede observar con ambos tampones de bloqueo, solo se obtuvieron respuestas específicas para el clon 70, que fueron más sensibles en presencia de CSBF, con una relación PHA/fondo de 79, que de PFBF (PHA/fondo = 22). Diferentes autores han descrito que cuando se realizan inmunoensayos con fagos se obtiene una elevada señal del fondo debido a que, por su forma filamentosa y su voluminosidad, pueden interaccionar de forma no específica con los pocillos de la placa ELISA.516 Discusión integradora 331 Figura 72. Resultados obtenidos en los inmunoensayos ELISA empleando CSBF (casein blocking buffer) como agente de bloqueo para los ocho clones seleccionados y agrupados según la clasificación obtenida por PCA. (A) Grupo A: clones 11, 41 y 70. (B) Grupo B: clones 12 y 61. (C) Grupo C: clones 1, 42 y 86. En color azul se muestra la señal corresponediente a PHA y en color rojo las correspondientes al fondo. 0 1 2 3 4 5 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 11] (ufp mL-1) Clon 11 PHA Fondo 5 4 3 2 1 0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 41] (ufp mL-1) Clon 41 5 4 3 2 1 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 70] (ufp mL-1) Clon 70 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 1 2 3 4 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 12] (ufp mL-1) Clon 12 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 61] (ufp mL-1) Clon 61 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 1] (ufp mL-1) Clon 1 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 42] (ufp mL-1) Clon 42 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 86] (ufp mL-1) Clon 86 4 3 2 1 0 A B C Discusión integradora 332 Figura 73. Resultados obtenidos en los inmunoensayos ELISA empleando PFBF (protein free blocking buffer) como agente de bloqueo para los ocho clones seleccionados y agrupados según la clasificación obtenida por PCA. (A) Grupo A: clones 11, 41 y 70. (B) Grupo B: clones 12 y 61. (C) Grupo C: clones 1, 42 y 86. En color azul se muestra la señal corresponediente a PHA y en color rojo los correspondientes al fondo. 4.2.5. Estrategias para el diseño de un ensayo de detección de PHA Actualmente en el grupo de investigación se están evaluando varias estrategias para la detección y cuantificación de PHA en muestras reales, a partir de los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral. La primera se basa en el empleo de los clones de fagos seleccionados para la construcción de un biosensor tipo sándwich (QCM-D) utilizando la información obtenida a partir del PCA (grupos A, B y C). En esta aproximación, se pretende emplear un clon 0,0 0,1 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 11] (ufp mL-1) Clon 11 0,0 0,1 0,2 0,3 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 41] (ufp mL-1) Clon 41 0,0 0,1 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 1] (ufp mL-1) Clon 1 A B C PHA Fondo 0,0 0,5 1,0 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 12] (ufp mL-1) Clon 12 1.0 0.5 0.0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 61] (ufp mL-1) Clon 61 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.1 0.0 0.3 0.2 0.1 0.0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 70] (ufp mL-1) Clon 70 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 S e ñ a l 0.1 0.0 S e ñ a l 0,0 0,1 0,2 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 42] (ufp mL-1) Clon 42 0.1 0.1 0.0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 1E+11 S e ñ a l [Clon 86] (ufp mL-1) Clon 86 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Discusión integradora 333 que no presente grandes cambios estructurales en su unión a PHA para emplearlo como anticuerpo primario (o anticuerpo de captura) y, dadas las extraordinarias propiedades que presenta el clon 70, utilizar este como anticuerpo secundario o anticuerpo de detección. Para ello, el clon primario, cuyo epítopo debe ser diferente al reconocido por el clon 70, se inmovilizará en el sensor QCM. De este modo, se obtendrá una capa orientada con el fragmento VH dirigida hacia la parte superior y libre para interaccionar con la PHA. El anticuerpo secundario (clon 70) se empleará no solo como elemento de detección sino también para amplificar la señal, dadas las excelentes respuestas obtenidas en medidas de disipación (Figura 74A). La segunda aproximación consiste en el uso del fragmento VH en su forma libre sin el fago. No obstante, como el propio fragmento por sí solo no es detectable, es necesario expresarlo junto con algún elemento que sí lo permita. Así, se está trabajando en la expresión del fragmento VH fusionado a una proteína fluorescente, para permitir su detección sin necesidad de emplear anticuerpos secundarios, y al marcador His-tag para permitir su purificación. Estos fragmentos se emplearán tanto en inmunoensayos competitivos como para el desarrollo de biosensores para la detección de PHA libre en muestras reales (Figura 74B). Figura 74. Estrategias en estudio para el diseño de biosensores para la detección de PHA. (A) Aproximación basada en el uso de dos clones de fagos con afinidad por diferentes epítopos de la proteína y un ensayo de tipo sándwich. (B) Aproximación basada en el uso del fragmento VH fusionado a una proteína fluorescente para la detección de PHA empleando un ensayo competitivo. A PHA Clon de captura Clon de detección VH VH sfGFP His-tag PHA PHA B Sustrato QCM Conclusiones 337 Los resultados descritos en esta memoria permiten concluir que se han alcanzado con éxito los principales objetivos propuestos en la Tesis Doctoral: la síntesis de elementos de reconocimiento biomimético, concretamente polímeros de impronta molecular y anticuerpos recombinantes, como alternativas a los anticuerpos de origen biológico, para su aplicación en la purificación de biomoléculas y para el control de la seguridad alimentaria. Las conclusiones particulares de los distintos capítulos de este trabajo de Tesis se resumen a continuación: 5.1. Síntesis de polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de péptidos y proteínas recombinantes mediante la aproximación del epítopo 5.1.1. Síntesis de MIPs mediante impronta no jerarquizada (Publicación I) 1. La aplicación de una aproximación combinatoria basada en la síntesis de una biblioteca de mini-MIPs, variando la composicion del monómero funcional (MAA, TFMAA, EAMA•HCl, HEMA, 1-ALLP o 2-DAEM) y del entrecruzante (EDMA, TRIM y DVB) y usando el péptido DYKD como plantilla, ha permitido seleccionar, con un menor número de experimentos, la composición óptima del MIP selectivo al FLAG. 2. La sustitución del péptido DYKD por ácido aspártico o el propio FLAG como moléculas plantilla no mejora la selectividad de los MIPs sintetizados para la preconcentración del marcador. Estos datos están de acuerdo con los resultados descritos por otros autores según los cuales, los polímeros sintetizados con un péptido de menor tamaño reconocen de forma más eficaz tanto a la plantilla como a péptidos con un tamaño superior que contengan los dichos aminoácidos. 3. El MIP que ha permitido obtener los mejores resultados en los ensayos de preconcentración de proteínas recombinantes marcadas con FLAG se prepara empleando el péptido DYKD como molécula plantilla (T), EAMA•HCl como monómero funcional (FM) y EDMA como entrecruzante (CL), en una relación molar 0.5:3:20 (T:FM:CL). La síntesis de micropartículas esféricas se realiza utilizando gel de sílice como molde sacrificable. 4. Las condiciones optimizadas para llevar a cabo la extracción en fase sólida (MISPE) simultánea de los péptidos libres DYKD y FLAG se resumen a continuación: a) 25 mg de MIP empaquetado en cartuchos de SPE; b) acondicionamiento del cartucho empleando 15 mL de una disolución amortiguadora de HEPES 100 mM, pH 7.5; c) carga de la muestra en HEPES 100 mM, pH 7.5 (1 mL); d) lavado con 3 mL de agua, para eliminar las interacciones no específicas con el soporte y; 4) elución con 1 mL de agua/TBA (1%, p/v), para eliminar las interacciones electrostáticas con el soporte y Conclusiones 338 favorecer la formación de pares iónicos. En estas condiciones las recuperaciones obtenidas para el FLAG fueron del orden del 89% (CV < 6%) en el MIP y muy inferiores (R = 27%, CV < 4%) en el NIP. 5. Se ha llevado a cabo la expresión de dos proteínas fluorescentes recombinantes marcadas con ambos péptidos, mCherry-DYKD y mCherry-FLAG y se ha demostrado, por primera vez, que el péptido DYKD puede ser un buen marcador de afinidad para la purificación de proteínas recombinantes empleando MIPs. 6. El MIP seleccionado (MSP8) se ha aplicado con éxito para la purificacion de los extractos celulares de lisis de las proteínas, mCherry-DYKD y mCherry-FLAG, sobreexpresadas. Se ha encontrado que las mejores condiciones de elución de las proteínas recombinantes del cartucho MIP son equivalentes a las empleadas con las columnas de inmunoafinidad: 3 x 0.5 mL de tampón glicina (0.1 M, pH 3) y posterior neutralización con una disolución reguladora de Tris (1 M, pH 9.0). 7. El método MISPE optimizado se ha empleado con éxito para la extracción selectiva de ambas proteínas recombinantes con excelentes recuperaciones (RMSP8-mCherry-DYKD = 95%, RMSP8-mCherry-FLAG = 103%, CV: 9–15%), que resultaron ser despreciables en el NIP (R < 1.5%), lo que confirma la utilidad de la aproximación del epítopo para esta aplicación. En el caso de la mCherry-FLAG los resultados obtenidos permitieron mejorar significativamente los conseguidos con una resina de inmunoafinidad comercial (ANTI- FLAG M2 Affinity Gel; RANTI-FLAG M2 = 58%, CV < 12%). 5.1.2. Síntesis de MIPs mediante impronta jerarquizada (Publicación II) 1. La silanización de las micropartículas de sílice es una de las etapas más críticas en la preparación de MIPs mediante impronta jerarquizada. Se ha demostrado que el empleo de un silano monofuncional (AETAZS) permite obtener, posteriormente, MIPs jerarquizados más selectivos que los obtenidos empleando un silano difuncional (AEAPMS). Este comportamiento se atribuye a la formación de monocapas de silano injertado. Además, se ha conseguido una excelente reproducibilidad entre lotes (CV ≤ 8%). 2. La ruta de derivatización optimizada ha permitido anclar covalentemente el péptido DYKDC a las partículas silanizadas. El grado de funcionalización alcanzado empleando el silano difuncional AEAMPS (Si-DM-Pept, 0.05 mmol g-1) fue superior al obtenido con el silano monofuncional AETAZS (Si-AZA-Pept, 0.035 mmol g-1). Sin embargo, en el segundo caso al obtenerse una distribución mas homogénea del péptido sobre la superficie de la sílice se forman cavidades selectivas mejor definidas, reduciéndose las uniones inespecíficas en el NIP. Conclusiones 339 3. Los MIPs jerarquizados se sintetizaron empleando las sílices derivatizadas con el péptido DYKDC (T), EAMA•HCl como monómero funcional y EDMA como entrecruzante. Los mejores resultados de recuperación para el péptido FLAG se han obtenido empleando el MIP sintetizado a partir de sílice derivatizada con el silano monofuncional (T:FM:CL, 0.4:4:24; RMIP-AZA =87 %; CV < 4%) en lugar del silano difuncional (0.6:4:20, RMIP-DM = 73%; CV < 4 %). 4. Los valores de recuperación obtenidos para el FLAG en los MIPs empleando ambos tipos de impronta, jerarquizada (RMIP-AZA = 87%; CV < 4%) y no jerarquizada (RMSP8-FLAG =89%, CV < 6%), son comparables. Sin embargo, la inmovilización orientada de la molécula plantilla en la sílice permite obtener MIPs con una mayor accesibilidad del analito a las cavidades formadas en el polímero, aunque el proceso de derivatización es más complejo que en el formato tradicional. Se consigue así una reducción sustancial de las interacciones no específicas del FLAG en el polímero jerarquizado respecto al no jerarquizado (factor de impronta 21.3 vs. 3.3), convirtiendo a este material en un excelente candidato para su uso como resina universal para la purificación de proteínas recombinantes marcadas con FLAG. 5. La modelización molecular ha demostrado ser una herramienta muy útil para justificar el reconocimiento molecular del péptido FLAG en el polímero de impronta molecular en comparación con el péptido DYKD. 5.2. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaria (Publicación III) 1. La síntesis de una biblioteca de mini-MIPs empleando una aproximación combinatoria utilizando diferentes moléculas plantilla (S1-S4), monómeros funcionales (1-ALLP, MAM, EAMA, MAA, VBA, DAEM y VIPY) y entrecruzantes (DVB y EDMA) ha permitido seleccionar las mejores composiciones para la síntesis de MIPs selectivos a alternariol. 2. La incorporación de metacrilamida como monómero diluyente en la síntesis de MIPs en formato esferas, empleando gel de sílice como molde sacrificable, (S2/EAMA/MAM/EDMA, relación molar 1:2:2:20), permite incrementar las recuperaciones obtenidas para el AOH (RMIP-S2/EAMA/MAM/EDMA = 97%, RMIP-S2/EAMA/EDMA = 92%, CV< 7%) y disminuir notablemente las interacciones no específicas (RNIP- S2/EAMA/MAM/EDMA = 5%, RNIP-S2/EAMA/EDMA = 66%, CV < 7%) en el polímero. 3. Las condiciones del método MISPE optimizado son las siguientes: a) 100 mg de polímero empaquetado en cartuchos de SPE, b) acondicionamiento del cartucho empleando 5 mL MeOH y 10 mL tampón fosfato PB (100 mM, pH 8.5), c) carga de 15 Conclusiones 340 mL de muestra en PB empleando un caudal de 0.93 mL min-1, d) lavado con 3 mL de H2O/ACN (80:20, v/v) para eliminar las interacciones no específicas y e) elución del AOH empleando 1 mL MeOH/TFA 1% (v/v). 4. El método de análisis completo para la determinación de alternariol en muestras de tomate utilizando ultrasonidos en la etapa de extracción (UAE-MISPE-HPLC-FLD) ha permitido obtener recuperaciones cuantitativas en un amplio intervalo de concentraciones (RAOH = 81–103%; CV < 4%) empleando 2 g de tomate como muestra, 20 mL tampón fosfato PB (100 mM, pH 8.5) como disolvente de extracción y 10 min como tiempo de extracción en UAE. 5. El MIP optimizado fue el primero descrito en bibliografía para el reconocimiento selectivo de AOH y su selectividad frente a la micotoxina es superior a la obtenida con otros polímeros sintetizados posteriormente en el grupo de investigación empleando VIPY como FM. 5.3. Descubrimiento de fragmentos de anticuerpo VH mediante tecnología phage display selectivos a la fitohemaglutinina y su clasificación acorde a una estrategia multiparamétrica (Publicación IV) 1. La tecnología phage display ha permitido seleccionar anticuerpos recombinantes monovalentes VH en formato fago selectivos a la fitohemaglutinina PHA (E2L2) empleando una biblioteca sintética. 2. La QCM-D ha demostrado ser una herramienta muy valiosa para evaluar cinética y termodinámicamente la interacción VH-PHA para los 8 clones seleccionados (1, 11, 12, 41, 42, 61, 70, 86) y determinar las constantes de velocidad de asociación (kon), disociación (koff) y afinidad (Ka). 3. El análisis por PCA ha permitido identificar mediante una combinación de datos estructurales, cinéticos y termodinámicos tres clústeres de clones cuyas características de unión y mecanismos de interacción son similares. Basándose en este análisis los clones se han clasificado en tres grupos: grupo A (clones 11, 41 y 70) y grupo B (12 y 61) agrupados estructuralmente en funcion del factor de disipación (D) y la hidropaticidad del CDR3, respectivamente, y el grupo C (1, 42 y 86) agrupados termodinámicamente según el valor de kon. 4. La estrategia desarrollada ha permitido la identificación de clones de alta afinidad, siendo el clon 70 el que permitió obtener mayores sensibilidades tanto en en las medidas realizadas con la QCM-D como en un ensayo ELISA (relación PHA/fondo = 79) al emplear caseína como agente de bloqueo. Conclusiones 341 5. La información obtenida en este estudio sienta las bases para el futuro desarrollo de sensores para la determinación de PHA al permitir la identificación de clones con diferentes afinidades, orientaciones de interacción y selectivos a distintos epítopos de la proteína. Bibliografía 345 [1] H. J. Cleaves (2011), Molecular recognition, en M. Gargaud, R. Amils, J. C. Quintanilla, H. J. Cleaves II, W. M. Irvine, D. L. Pinti, M. Viso (Eds), Encyclopedia of Astrobiology, Springer, Berlin, Heidelberg, pp. 937–1103. [2] O. H. Schmitt, Some interesting useful biomimetic transforms en Proceedings of the Third International Biophysics Congress, Boston, MA, EE. UU. (1969). [3] B. Bhushan, Biomimetics: lessons from nature - an overview, Philos. Trans. R. Soc. A Math. Phys. Eng. Sci. 367 (2009) 1445–1486. [4] M.A. Morales, J.M. Halpern, Guide to selecting a biorecognition element for biosensors, Bioconjug. Chem. 29 (2018) 3231–3239. [5] M.C. Moreno-Bondi, E. Benito-Peña, Analytical applications of biomimetic recognition elements, Anal. Bioanal. Chem. 408 (2016) 1725–1726. [6] L.C. Bock, L.C. Griffin, J.A. Latham, E.H. Vermaas, J.J. Toole, Selection of single- stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin, Nature 355 (1992) 564– 566. [7] J. Zhou, J. Rossi, Aptamers as targeted therapeutics: current potential and challenges, Nat. Rev. Drug Discov. 16 (2017) 181–202. [8] A.D. Ellington, J.W. Szostak, In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature 346 (1990) 818–822. [9] C. Tuerk, L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science 249 (1990) 505–510. [10] S. Balamurugan, A. Obubuafo, S.A. Soper, D.A. Spivak, Surface immobilization methods for aptamer diagnostic applications., Anal. Bioanal. Chem. 390 (2008) 1009– 1021. [11] M.N. Stojanovic, P. de Prada, D.W. Landry, Aptamer-based folding fluorescent sensor for cocaine, J. Am. Chem. Soc. 123 (2001) 4928–4931. [12] R. Nutiu, Y. Li, Structure-switching signaling aptamers, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 4771–4778. [13] K. M. Song, S. Lee, C. Ban, Aptamers and their biological applications, Sensors 12 (2012) 612–631. [14] W. Zhou, P.J. Jimmy Huang, J. Ding, J. Liu, Aptamer-based biosensors for biomedical diagnostics, Analyst 139 (2014) 2627–2640. Bibliografía 346 [15] Y. Zhang, B. S. Lai, M. Juhas, Recent advances in aptamer discovery and applications, Molecules 24 (2019) 941. [16] A. Safavi, A. Kefayat, F. Sotoodehnejadnematalahi, M. Salehi, M.H. Modarressi, Production, purification, and in vivo evaluation of a novel multiepitope peptide vaccine consisted of immunodominant epitopes of SYCP1 and ACRBP antigens as a prophylactic melanoma vaccine, Int. Immunopharmacol. 76 (2019) 105872. [17] M. Kalmouni, S. Al-Hosani, M. Magzoub, Cancer targeting peptides, Cell. Mol. Life Sci. 76 (2019) 2171–2183. [18] S. Pavan, F. Berti, Short peptides as biosensor transducers, Anal. Bioanal. Chem. 402 (2012) 3055–3070. [19] C. Wang, J. Wang, D. Liu, Z. Wang, Gold nanoparticle-based colorimetric sensor for studying the interactions of β-amyloid peptide with metallic ions, Talanta 80 (2010) 1626– 1631. [20] S. Clarke, F. Pinaud, O. Beutel, C. You, J. Piehler, M. Dahan, Covalent monofunctionalization of peptide-coated quantum dots for single-molecule assays, Nano Lett. 10 (2010) 2147–2154. [21] D. Feng, Y. Zhang, T. Feng, W. Shi, X. Li, H. Ma, A graphene oxide-peptide fluorescence sensor tailor-made for simple and sensitive detection of matrix metalloproteinase 2, Chem. Commun. 47 (2011) 10680–10682. [22] J.M. Palomo, Solid-phase peptide synthesis: an overview focused on the preparation of biologically relevant peptides, RSC Adv. 4 (2014) 32658–32672. [23] Y. Huang, F. Hu, R. Zhao, G. Zhang, H. Yang, D. Zhang, Tetraphenylethylene conjugated with a specific peptide as a fluorescence turn-on bioprobe for the highly specific detection and tracing of tumor markers in live cancer cells, Chem. Eur. J. 20 (2014) 158–164. [24] P. Guo, Y. Wang, Q. Zhuang, Highly sensitive and selective biosensor for heparin detection with rhodamine B-labelled peptides as fluorescent bioreceptors, Sens. Actuators B Chem. 299 (2019) 126873. [25] B.P. Joshi, J.Y. Park, K.H. Lee, Recyclable sensitive fluorimetric detection of specific metal ions using a functionalized PEG-PS resin with a fluorescent peptide sensor, Sens. Actuators B Chem. 191 (2014) 122–129. [26] P. Thirupathi, J.Y. Park, L.N. Neupane, M.Y.L.N. Kishore, K.H. Lee, Pyrene excimer- based peptidyl chemosensors for the sensitive detection of low levels of heparin in 100% Bibliografía 347 aqueous solutions and serum samples, ACS Appl. Mater. Interfaces 7 (2015) 14243– 14253. [27] K. J. Oh, K. J. Cash, K.W. Plaxco, Excimer-based peptide beacons: a convenient experimental approach for monitoring polypeptide−protein and polypeptide−oligonucleotide interactions, J. Am. Chem. Soc. 128 (2006) 14018–14019. [28] J. Wu, Y. Zou, C. Li, W. Sicking, I. Piantanida, T. Yi, C. Schmuck, A molecular peptide beacon for the ratiometric sensing of nucleic acids, J. Am. Chem. Soc. 134 (2012) 1958-1961. [29] J. Strauss, J. Daub, Optically active cyclic hexapeptides with covalently attached pyrene probes:  selective alkaline earth metal ion recognition using excimer emission, Org. Lett. 4 (2002) 683–686. [30] R. Fudala, A. P. Ranjan, A. Mukerjee, J. K. Vishwanatha, Z. Gryczynski, J. Borejdo, P. Sarkar, I. Gryczynski, Fluorescence detection of MMP-9. I. MMP-9 selectively cleaves Lys-Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-Ser-Gly-Lys peptide, Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2011) 834– 838. [31] B.R. White, H.M. Liljestrand, J.A. Holcombe, A “turn-on” FRET peptide sensor based on the mercury binding protein MerP, Analyst 133 (2008) 65–70. [32] D. Wild (Ed.) (2013), The immunoassay handbook: theory and applications of ligand binding, ELISA, and related techniques, Elsevier, Ámsterdam. [33] R. Peltomaa, E. Benito-Peña, M.C. Moreno-Bondi, Bioinspired recognition elements for mycotoxin sensors, Anal. Bioanal. Chem. 410 (2018) 747–771. [34] R. Peltomaa, E. Benito-Peña, R. Barderas, U. Sauer, M. González Andrade, M.C. Moreno-Bondi, Microarray-based immunoassay with synthetic mimotopes for the detection of fumonisin B1, Anal. Chem. 89 (2017) 6216–6223. [35] R. Peltomaa, F. Amaro-Torres, S. Carrasco, G. Orellana, E. Benito-Pena, M.C. Moreno-Bondi, Homogeneous quenching immunoassay for fumonisin B1 based on gold nanoparticles and an epitope-mimicking yellow fluorescent protein, ACS Nano 12 (2018) 11333–11342. [36] H.W. Schroeder, L. Cavacini, Structure and function of immunoglobulins, J. Allergy Clin. Immunol. 125 (2010) S41–S52. [37] S.C.B. Gopinath, T.H. Tang, M. Citartan, Y. Chen, T. Lakshmipriya, Current aspects in immunosensors, Biosens. Bioelectron. 57 (2014) 292–302. Bibliografía 348 [38] M. Baker, Reproducibility crisis: blame it on the antibodies, Nature 521 (2015) 274– 276. [39] N.S. Lipman, L.R. Jackson, L.J. Trudel, F. Weis-Garcia, Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources, ILAR J. 46 (2005) 258–268. [40] T.H. Scott-Taylor, S.C. Axinia, S. Amin, R. Pettengell, Immunoglobulin G; Structure and functional implications of different subclass modifications in initiation and resolution of allergy, Immun. Inflamm. Dis. 6 (2018) 13–33. [41] M.L. Chiu, D.R. Goulet, A. Teplyakov, G.L. Gilliland, Antibody structure and function: the basis for engineering therapeutics, Antibodies 8 (2019) 55. [42] I. Sela-Culang, V. Kunik, Y. Ofran, The structural basis of antibody-antigen recognition, Front. Immunol. 4 (2013) 302. [43] G. Hussack, T. Hirama, W. Ding, R. MacKenzie, J. Tanha, Engineered single- domain antibodies with high protease resistance and thermal stability, PLoS One 6 (2011) e28218. [44] H.R. Hoogenboom, Selecting and screening recombinant antibody libraries, Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1105–1116. [45] A. Frenzel, M. Hust, T. Schirrmann, Expression of recombinant antibodies, Front. Immunol. 4 (2013) 217. [46] U. Brinkmann, Y. Reiter, S.H. Jung, B. Lee, I. Pastan, A recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fv fragment, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993) 7538–7542. [47] B.T. McGuinness, G. Walter, K. Fitzgerald, P. Schuler, W. Mahoney, A.R. Duncan, H.R. Hoogenboom, Phage diabody repertoires for selection of large numbers of bispecific antibody fragments, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 1149–1154. [48] P. Holliger, T. Prospero, G. Winter, “Diabodies”: Small bivalent and bispecific antibody fragments, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993) 6444–6448. [49] A.F. Labrijn, M.L. Janmaat, J.M. Reichert, P.W.H.I. Parren, Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline, Nat. Rev. Drug Discov. 18 (2019) 585–608. [50] U. Brinkmann, R.E. Kontermann, The making of bispecific antibodies, MAbs 9 (2017) 182–212. Bibliografía 349 [51] C. Hamers-Casterman, T. Atarhouch, S. Muyldermans, G. Robinson, C. Hammers, E.B. Songa, N. Bendahman, R. Hammers, Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature 363 (1993) 446–448. [52] A.S. Greenberg, D. Avila, M. Hughes, A. Hughes, E.C. McKinney, M.F. Flajnik, A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature 374 (1995) 168–173. [53] T. He, J. Zhu, Y. Nie, R. Hu, T. Wang, P. Li, Q. Zhang, Y. Yang, Nanobody technology for mycotoxin detection in the field of food safety: Current status and prospects, Toxins 10 (2018) 180. [54] L.J. Holt, C. Herring, L.S. Jespers, B.P. Woolven, I.M. Tomlinson, Domain antibodies: Proteins for therapy, Trends Biotechnol. 21 (2003) 484–490. [55] J. Wesolowski, V. Alzogaray, J. Reyelt, M. Unger, K. Juarez, M. Urrutia, A. Cauerhff, W. Danquah, B. Rissiek, F. Scheuplein, N. Schwarz, S. Adriouch, O. Boyer, M. Seman, A. Licea, D. V. Serreze, F.A. Goldbaum, F. Haag, F. Koch-Nolte, Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity, Med. Microbiol. Immunol. 198 (2009) 157–174. [56] K. Bélanger, U. Iqbal, J. Tanha, R. MacKenzie, M. Moreno, D. Stanimirovic, Single- domain antibodies as therapeutic and imaging agents for the treatment of CNS diseases, Antibodies 8 (2019) 27. [57] R. Rouet, K. Dudgeon, M. Christie, D. Langley, D. Christ, Fully human VH single domains that rival the stability and cleft recognition of camelid antibodies, J. Biol. Chem. 290 (2015) 11905–11917. [58] G.P. Smith, Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface, Science 228 (1985) 1315–1317. [59] W.J. Chung, D.Y. Lee, S.Y. Yoo, Chemical modulation of M13 bacteriophage and its functional opportunities for nanomedicine, Int. J. Nanomedicine 9 (2014) 5825–5836. [60] R. Barderas, E. Benito-Peña, The 2018 Nobel Prize in Chemistry: phage display of peptides and antibodies, Anal. Bioanal. Chem. 411 (2019) 2475–2479. [61] J. Bazan, I. Całkosiñski, A. Gamian, Phage display a powerful technique for immunotherapy, Hum. Vaccines Immunother. 8 (2012) 1817–1828. [62] L.W. Deng, P. Malik, R.N. Perham, Interaction of the globular domains of pill protein of filamentous bacteriophage fd with the F-pilus of Escherichia coli, Virology 253 (1999) 271–277. Bibliografía 350 [63] D.A. Marvin, M.F. Symmons, S.K. Straus, Structure and assembly of filamentous bacteriophages, Prog. Biophys. Mol. Biol. 114 (2014) 80–122. [64] S.W. Smeal, M.A. Schmitt, R.R. Pereira, A. Prasad, J.D. Fisk, Simulation of the M13 life cycle I: assembly of a genetically-structured deterministic chemical kinetic simulation, Virology 500 (2017) 259–274. [65] D. O’connell, B. Becerril, A. Roy-Burman, M. Daws, J.D. Marks, Phage versus phagemid libraries for generation of human monoclonal antibodies, J. Mol. Biol. 321 (2002) 49–56. [66] J. W. Kehoe, B. K. Kay, Filamentous phage display in the new millennium, Chem. Rev. 105 (2005) 4056–4072. [67] L. Chasteen, J. Ayriss, P. Pavlik, A.R.M. Bradbury, Eliminating helper phage from phage display, Nucleic Acids Res. 34 (2006) 145. [68] H. Dooley, M.F. Flajnik, A.J. Porter, Selection and characterization of naturally occurring single-domain (IgNAR) antibody fragments from immunized sharks by phage display, Mol. Immunol. 40 (2003) 25–33. [69] N.H. Hamidon, S. Suraiya, M.E. Sarmiento, A. Acosta, M.N. Norazmi, T.S. Lim, Immune TB antibody phage display library as a tool to study B cell immunity in TB infections, Appl. Biochem. Biotechnol. 184 (2018) 852–868. [70] J.C. Almagro, M. Pedraza-Escalona, H.I. Arrieta, S.M. Pérez-Tapia, Phage display libraries for antibody therapeutic discovery and development, Antibodies 8 (2019) 44. [71] T.J. Vaughan, A.J. Williams, K. Pritchard, J.K. Osbourn, A.R. Pope, J.C. Earnshaw, J. McCafferty, R.A. Hodits, J. Wilton, K.S. Johnson, Human antibodies with sub- nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 309–314. [72] H.R. Hoogenboom, G. Winter, By-passing immunisation. Human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro, J. Mol. Biol. 227 (1992) 381–388. [73] A. Zhao, M.R. Tohidkia, D.L. Siegel, G. Coukos, Y. Omidi, Phage antibody display libraries: A powerful antibody discovery platform for immunotherapy, Crit. Rev. Biotechnol. 36 (2016) 276–289. [74] R.M. Hoet, E.H. Cohen, R.B. Kent, K. Rookey, S. Schoonbroodt, S. Hogan, L. Rem, N. Frans, M. Daukandt, H. Pieters, R. Van Hegelsom, N. Coolen-Van Neer, H.G. Nastri, I.J. Rondon, J.A. Leeds, S.E. Hufton, L. Huang, I. Kashin, M. Devlin, G. Kuang, M. Bibliografía 351 Steukers, M. Viswanathan, A.E. Nixon, D.J. Sexton, H.R. Hoogenboom, R.C. Ladner, Generation of high-affinity human antibodies by combining donor-derived and synthetic complementarity-determining-region diversity, Nat. Biotechnol. 23 (2005) 344–348. [75] E. Söderlind, L. Strandberg, P. Jirholt, N. Kobayashi, V. Alexeiva, A.M. Åberg, A. Nilsson, B. Jansson, M. Ohlin, C. Wingren, L. Danielsson, R. Carlsson, C.A.K. Borrebaeck, Recombining germline-derived CDR sequences for creating diverse single- framework antibody libraries, Nat. Biotechnol. 18 (2000) 852–856. [76] S. Chassagne, E. Laffly, E. Drouet, F. Hérodin, M.P. Lefranc, P. Thullier, A high- affinity macaque antibody Fab with human-like framework regions obtained from a small phage display immune library, Mol. Immunol. 41 (2004) 539–546. [77] J. Andris-Widhopf, C. Rader, P. Steinberger, R. Fuller, C.F. Barbas, Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display, J. Immunol. Methods 242 (2000) 159–181. [78] M.D. Sheets, P. Amersdorfer, R. Finnern, P. Sargent, E. Lindqvist, R. Schier, G. Hemingsen, C. Wong, J.C. Gerhart, J.D. Marks, Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (1998) 6157–6162. [79] L.J. Schwimmer, B. Huang, H. Giang, R.L. Cotter, D.S. Chemla-Vogel, F. V. Dy, E.M. Tam, F. Zhang, P. Toy, D.J. Bohmann, S.R. Watson, J.W. Beaber, N. Reddy, H.F. Kuan, D.H. Bedinger, I.J. Rondon, Discovery of diverse and functional antibodies from large human repertoire antibody libraries, J. Immunol. Methods 391 (2013) 60–71. [80] S. Kim, I. Park, S.G. Park, S. Cho, J.H. Kim, N. S.Ipper, S.S. Choi, E.S. Lee, H.J. Hong, Generation, diversity determination, and application to antibody selection of a human naïve Fab library, Mol. Cells 40 (2017) 655–666. [81] M. Silacci, S. Brack, G. Schirru, J. Mårlind, A. Ettorre, A. Merlo, F. Viti, D. Neri, Design, construction, and characterization of a large synthetic human antibody phage display library, Proteomics 5 (2005) 2340–2350. [82] O.A. Mandrup, N.A. Friis, S. Lykkemark, J. Just, P. Kristensen, A novel heavy domain antibody library with functionally optimized complementarity determining regions, PLoS One 8 (2013) e76834. [83] M. Weber, E. Bujak, A. Putelli, A. Villa, M. Matasci, L. Gualandi, T. Hemmerle, S. Wulhfard, D. Neri, A highly functional synthetic phage display library containing over 40 billion human antibody clones, PLoS One 9 (2014) e100000. Bibliografía 352 [84] D. Christ, K. Famm, G. Winter, Repertoires of aggregation-resistant human antibody domains, Protein Eng. Des. Sel. 20 (2007) 413–416. [85] R.M. de Wildt, C.R. Mundy, B.D. Gorick, I.M. Tomlinson, Antibody arrays for high- throughput screening of antibody-antigen interactions., Nat. Biotechnol 18 (2000) 989– 994. [86] R. Carlsson, E. Söderlind, n-CoDeR concept: Unique types of antibodies for diagnostic use and therapy, Expert Rev. Mol. Diagn. 1 (2001) 102–108. [87] P. Valadon, S.M. Pérez-Tapia, R.S. Nelson, O.U. Guzmán-Bringas, H.I. Arrieta- Oliva, K.M. Gómez-Castellano, M.A. Pohl, J.C. Almagro, ALTHEA Gold LibrariesTM: antibody libraries for therapeutic antibody discovery, MAbs 11 (2019) 516–531. [88] C.C. Lim, P.C.Y. Woo, T.S. Lim, Development of a phage display panning strategy utilizing crude antigens: isolation of MERS-CoV nucleoprotein human antibodies, Sci. Rep. 9 (2019) 6088. [89] R. Kumar, H.A. Parray, T. Shrivastava, S. Sinha, K. Luthra, Phage display antibody libraries: a robust approach for generation of recombinant human monoclonal antibodies, Int. J. Biol. Macromol. 135 (2019) 907–918. [90] N. Labrou (Ed.) (2014), Protein downstream processing en Methods in molecular biology, 1129, Humana Press, Totowa, NJ. [91] R. Peltomaa (2019), New optical biosensing strategies for the analysis of mycotoxins and toxigenic fungi in food, Tesis Doctoral, Universidad Complutense de Madrid. [92] A. Solemani Zadeh, A. Grässer, H. Dinter, M. Hermes, K. Schindowski, Efficient construction and effective screening of synthetic domain antibody libraries, Methods Protoc. 2 (2019) 17. [93] L. Pauling, A theory of the structure and process of formation of antibodies , J. Am. Chem. Soc. 62 (1940) 2643–2657. [94] N.M. Bergmann, N.A. Peppas, Molecularly imprinted polymers with specific recognition for macromolecules and proteins, Prog. Polym. Sci. 33 (2008) 271–288. [95] A. Nematollahzadeh, P. Lindemann, W. Sun, J. Stute, D. Lütkemeyer, B. Sellergren, Robust and selective nano cavities for protein separation: an interpenetrating polymer network modified hierarchically protein imprinted hydrogel, J. Chromatogr. A 1345 (2014) 154–163. Bibliografía 353 [96] G. Anantha-Iyengar, K. Shanmugasundaram, M. Nallal, K.P. Lee, M.J. Whitcombe, D. Lakshmi, G. Sai-Anand, Functionalized conjugated polymers for sensing and molecular imprinting applications, Prog. Polym. Sci. 88 (2019) 1–129. [97] S.A. Zaidi, Latest trends in molecular imprinted polymer based drug delivery systems, RSC Adv. 6 (2016) 88807–88819. [98] A. Poma, A. Guerreiro, M.J. Whitcombe, E. V. Piletska, A.P.F. Turner, S.A. Piletsky, Solid-phase synthesis of molecularly imprinted polymer nanoparticles with a reusable template-"plastic antibodies", Adv. Funct. Mater. 23 (2013) 2821–2827. [99] R.I. Boysen, L.J. Schwarz, D. V. Nicolau, M.T.W. Hearn, Molecularly imprinted polymer membranes and thin films for the separation and sensing of biomacromolecules, J. Sep. Sci. 40 (2017) 314–335. [100] M. E. Benito Peña (2006), Desarrollo y validación de métodos analíticos basados en nuevos elementos de reconocimiento molecular para la determinación de antibióticos β-lactámicos en muestras de interés agroalimentario y medioambiental, Tesis Doctoral, Universidad Complutense de Madrid. [101] M.J. Whitcombe, I. Chianella, L. Larcombe, S.A. Piletsky, J. Noble, R. Porter, A. Horgan, The rational development of molecularly imprinted polymer-based sensors for protein detection, Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 1547–1571. [102] J. Wang, R. Guo, J. Chen, Q. Zhang, X. Liang, Phenylurea herbicides-selective polymer prepared by molecular imprinting using N-(4-isopropylphenyl)-N′-butyleneurea as dummy template, Anal. Chim. Acta 540 (2005) 307–315. [103] J. Yang, Y. Li, C. Huang, Y. Jiao, J. Chen, A phenolphthalein-dummy template molecularly imprinted polymer for highly selective extraction and clean-up of bisphenol A in complex biological, environmental and food samples, Polymers 10 (2018) 1150. [104] S.H. Lee, R.A. Doong, Adsorption and selective recognition of 17β-estradiol by molecularly imprinted polymers, J. Polym. Res. 19 (2012) 9939. [105] D.R. Kryscio, N.A. Peppas, Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers, Acta Biomater. 8 (2012) 461–473. [106] C. Álvarez-Lorenzo, Á. Concheiro (Eds.) (2013), Molecularly imprinted polymers: a handbook for academia and industry, Smithers Rapra, Shropshire, UK. [107] K. Haupt (Ed.) (2012), Molecular imprinting, Springer, Heidelberg. [108] L. Chen, S. Xu, J. Li, Recent advances in molecular imprinting technology: current status, challenges and highlighted applications, Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 2922–2942. Bibliografía 354 [109] P.A.G. Cormack, A.Z. Elorza, Molecularly imprinted polymers: synthesis and characterisation, J. Chromatogr. B 804 (2004) 173–182. [110] K. Matyjaszewski, J. Spanswick, Controlled/living radical polymerization, Mater. Today 8 (2005) 26–33. [111] S. Beyazit, B. Tse Sum Bui, K. Haupt, C. Gonzato, Molecularly imprinted polymer nanomaterials and nanocomposites by controlled/living radical polymerization, Prog. Polym. Sci. 62 (2016) 1–21. [112] S. W. Lee, T. Kunitake (Eds.) (2013), Handbook of molecular imprinting: advanced sensors applications, Pan Stanford Publishing, Singapore. [113] B. Sellergren (Ed.) (2000), Molecularly imprinted polymers: man-made mimics of antibodies and their applications in analytical chemistry, Elsevier, Amsterdam. [114] A. Wulff, G.; Sarhan, The use of polymers with enzyme-analogous structures for the resolution of racemates, Angew. Chem. Int. Ed. 11 (1972) 341–344. [115] T. Ikegami, T. Mukawa, H. Nariai, T. Takeuchi, Bisphenol A-recognition polymers prepared by covalent molecular imprinting, Anal. Chim. Acta 504 (2004) 131–135. [116] B. Sellergren, B. Ekberg, K. Mosbach, Molecular imprinting of amino acid derivatives in macroporous polymers: Demonstration of substrate- and enantio- selectivity by chromatographic resolution of racemic mixtures of amino acid derivatives, J. Chrom. A 347 (1985) 1–10. [117] E. Rodríguez, F. Navarro-Villoslada, E. Benito-Peña, M.D. Marazuela, M.C. Moreno-Bondi. Multiresidue determination of ultratrace levels of fluoroquinolone antimicrobials in drinking and aquaculture water samples by automated online molecularly imprinted olid phase extraction and liquid chromatography, Anal. Chem. 83 (2011) 2046–2055. [118] R.J. Umpleby, G.T. Rushton, R.N. Shah, A.M. Rampey, J.C. Bradshaw, J.K. Berch, K.D. Shimizu, Recognition directed site-selective chemical modification of molecularly imprinted polymers, Macromolecules 34 (2001) 8446–8452. [119] S.A. Piletsky, A.R. Guerreiro, E.V. Piletska, I. Chianella, K. Karim, A.P.F. Turner. Polymer cookery 2. influence of polymerization pressure and polymer swelling on the performance of molecularly imprinted polymers, Macromolecules 37 (2004) 5018–5022. [120] S.A. Piletsky, H.S. Andersson, I.A. Nicholls. Combined hydrophobic and electrostatic interaction-based recognition in molecularly imprinted polymers, Macromolecules 32 (1999) 633–636. Bibliografía 355 [121] G. Tiwari, R. Tiwari, A. Rai. Cyclodextrins in delivery systems: applications, J. Pharm. Bioallied Sci. 2 (2010) 72–79. [122] W. Zhang, L. Qin, R.R. Chen, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Protein imprinted polymer using acryloyl-β-cyclodextrin and acrylamide as monomers, Appl. Surf. Sci. 256 (2010) 3000–3005. [123] S. Wang, B. Wang, H. Si, J. Shan, X. Yang, Preparation of magnetic molecularly imprinted polymer beads and their recognition for baicalein, RSC Advances 5 (2015) 8028–8036. [124] A.J. Mayes, J.M. Whitcombe, Synthetic strategies for the generation of molecularly imprinted organic polymers, Adv. Drug Deliv. Rev. 57 (2005) 1742–1778. [125] L. Wang, H. Yan, C. Yang, Z. Li, F. Qiao, Synthesis of mimic molecularly imprinted ordered mesoporous silica adsorbent by thermally reversible semicovalent approach for pipette-tip solid-phase extraction-liquid chromatography fluorescence determination of estradiol in milk, J. Chromatogr. A 1456 (2016) 58–67. [126] J. Zhan, G. Fang, Z. Yan, M. Pan, C. Liu, S. Wang, Preparation of a semicovalent, molecularly surface imprinted polymer for the rapid determination of trace acid orange II in food and environmental samples, Anal. Bioanal. Chem. 405 (2013) 6353–6363. [127] F.Q. An, H.F. Li, X.D. Guo, B.J. Gao, T.P. Hu, J.F. Gao, Novel ionic surface imprinting technology: Design and application for selectively recognizing heavy metal ions, RSC Adv. 9 (2019) 2431–2440. [128] N.F. Yusof, F.S. Mehamod, F.B. Mohd Suah, Fabrication and binding characterization of ion imprinted polymers for highly selective Co2+ ions in an aqueous medium, J. Environ. Chem. Eng. 7 (2019) 103007. [129] J. Chen, H. Bai, J. Xia, Z. Li, P. Liu, Q. Cao, Electrochemical sensor for detection of europium based on poly-catechol and ion-imprinted sol-gel film modified screen- printed electrode, J. Electroanal. Chem. 824 (2018) 32–38. [130] H. Kim, Y. Kim, J.Y. Chang, Preparation of a molecularly imprinted polymer containing Europium(III) ions for luminescent sensing, J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 50 (2012) 4990–4994. [131] N. Khoddami, F. Shemirani, A new magnetic ion-imprinted polymer as a highly selective sorbent for determination of cobalt in biological and environmental samples, Talanta 146 (2016) 244–252. Bibliografía 356 [132] Z. Li, L. Chen, Q. Su, L. Wu, X. Wei, L. Zeng, M. Li, Synthesis and characterization of a surface-grafted Pb(II)-imprinted polymer based on activated carbon for selective separation and pre-concentration of Pb(II) ions from environmental water samples, RSC Adv. 9 (2019) 5110–5120. [133] S. C. Lopes Pinheiro, A. B. Descalzo, I. M. Raimundo Jr., G. Orellana, M.C. Moreno-Bondi, Fluorescent ion-imprinted polymers for selective Cu(II) optosensing, Anal. Bional. Chem. 402 (2012) 3253–3260. [134] G.E. Southard, K.A. Van Houten, E.W. Ott, G.M. Murray, Luminescent sensing of organophosphates using europium(III) containing imprinted polymers prepared by RAFT polymerization, Anal. Chim. Acta 581 (2007) 202–207. [135] J. Wackerlig, P.A. Lieberzeit, Molecularly imprinted polymer nanoparticles in chemical sensing - Synthesis, characterisation and application, Sens. Actuators B Chem. 207 (2015) 144–157. [136] C. Baggiani, P. Baravalle, C. Giovannoli, L. Anfossi, C. Passini, G. Giraudi, Binding behaviour of molecularly imprinted polymers prepared by a hierarchical approach in mesoporous silica beads of varying porosity, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 1828–1834. [137] M. Menger, A. Yarman, J. Erdőssy, H. Yildiz, R. Gyurcsányi, F. Scheller, MIPs and aptamers for recognition of proteins in biomimetic sensing, Biosensors 6 (2016) 1–19. [138] J. Zuo, X. Zhang, X. Li, Z. Li, Z. Li, H. Li, W. Zhang, Preparation of monoethyl fumarate-based molecularly imprinted polymers and their application as a solid-phase extraction sorbent for the separation of scopolamine from tropane alkaloids, RSC Adv. 9 (2019) 19712–19719. [139] E. Benito-Peña, F. Navarro-Villoslada, S. Carrasco, S. Jockusch, M. F. Ottaviani, M. C. Moreno-Bondi, Experimental mixture design as a tool for the synthesis of antimicrobial selective molecularly imprinted monodisperse microbeads, ACS Appl. Mater. Interfaces 7 (2015) 10966–10976. [140] X. Wang, Y. Zhou, Y. Niu, S. Zhao, B. Gong, Preparation of monodisperse enrofloxacin molecularly imprinted polymer microspheres and their recognition characteristics, Int. J. Anal. Chem. 2019 (2019) 1–10. [141] N. Pérez-Moral, A.G. Mayes, Comparative study of imprinted polymer particles prepared by different polymerisation methods, Anal. Chim. Acta 504 (2004) 15–21. [142] A.G. Mayes, K. Mosbach, Molecularly imprinted polymer beads: suspension polymerization using a liquid perfluorocarbon as the dispersing phase, Anal. Chem. 68 (1996) 3769–3774. Bibliografía 357 [143] A. Motaharian, M.R.M. Hosseini, K. Naseri, Determination of psychotropic drug chlorpromazine using screen printed carbon electrodes modified with novel MIP- MWCNTs nano-composite prepared by suspension polymerization method, Sens. Actuators B Chem. 288 (2019) 356–362. [144] S. Chen, J. Fu, Z. Li, Y. Zeng, Y. Li, X. Su, X. Jiang, H. Yang, L. Huang, L. Zou, L. He, S. Liu, X. Ao, Y. Yang, Preparation and application of magnetic molecular imprinted polymers for extraction of cephalexin from pork and milk samples, J. Chromatogr. A 1602 (2019) 124–134. [145] X. Zhao, Y. Cui, J. Wang, J. Wang, Preparation of fluorescent molecularly imprinted polymers via pickering emulsion interfaces and the application for visual sensing analysis of Listeria monocytogenes, Polymers 11 (2019) 984. [146] M.A. Markowitz, P.R. Kust, G. Deng, P.E. Schoen, J.S. Dordick, D.S. Clark, B.P. Gaber, Catalytic silica particles via template-directed molecular imprinting, Langmuir 16 (2000) 1759–1765. [147] M. Gan, J. Pan, Y. Zhang, X. Dai, Y. Yin, Q. Qu, Y. Yan, Molecularly imprinted polymers derived from lignin-based Pickering emulsions and their selectively adsorption of lambda-cyhalothrin, Chem. Eng. J. 257 (2014) 317–327. [148] J. Haginaka, H. Sanbe, Uniformly sized molecularly imprinted polymer for (S)- naproxen, J. Chromatogr. A 913 (2001) 141–146. [149] Y. Nakamura, S. Masumoto, A. Kubo, H. Matsunaga, J. Haginaka, Preparation of molecularly imprinted polymers for warfarin and coumachlor by multi-step swelling and polymerization method and their imprinting effects, J. Chromatogr. A 1516 (2017) 71– 78. [150] S.A. Piletsky, I.Y. Dubey, D.M. Fedoryak, V.P. Kukhar, Substrate-selective polymeric membranes. Selective transfer of nucleic acids components, Biopolym. Cell 6 (1990) 55–58. [151] C. Algieri, E. Drioli, L. Guzzo, L. Donato, Bio-mimetic sensors based on molecularly imprinted membranes, Sensors 14 (2014) 13863–13912. [152] Y. Fuchs, O. Soppera, K. Haupt, Photopolymerization and photostructuring of molecularly imprinted polymers for sensor applications-A review, Anal. Chim. Acta 717 (2012) 7–20. [153] S. Carrasco, V. Canalejas-Tejero, F. Navarro-Villoslada, C. A. Barrios, M. C. Moreno-Bondi, Cross-linkable linear copolymer with double functionality: resist for Bibliografía 358 electron beam nanolithography and molecular imprinting, J. Mat. Chem. C 2 (2014) 1400-1403. [154] W. Xie, H. Wang, Y.W. Tong, N. Sankarakumar, M. Yin, D. Wu, X. Duan, Specific purification of a single protein from a cell broth mixture using molecularly imprinted membranes for the biopharmaceutical industry, RSC Adv. 9 (2019) 23425–23434. [155] M. Berghaus, R. Mohammadi, B. Sellergren, Productive encounter: molecularly imprinted nanoparticles prepared using magnetic templates, Chem. Commun. 50 (2014) 8993–8996. [156] H. Zhang, Recent advances in macromolecularly imprinted polymers by controlled radical polymerization techniques, Mol. Imprinting 3 (2016) 35–46. [157] M.C. Prete, D.M. Dos Santos, L. Effting, C.R.T. Tarley, Preparation of molecularly imprinted poly(methacrylic acid) grafted on iniferter-modified multiwalled carbon nanotubes by living-radical polymerization for 17β-estradiol extraction, J. Chem. Eng. Data 64 (2019) 1978–1990. [158] G. Ertürk, H. Özen, M.A. Tümer, B. Mattiasson, A. Denizli, Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples, Sens. Actuators B Chem. 224 (2016) 823–832. [159] T. Wangchareansak, A. Thitithanyanont, D. Chuakheaw, M.P. Gleeson, P.A. Lieberzeit, C. Sangma, Influenza A virus molecularly imprinted polymers and their application in virus sub-type classification, J. Mater. Chem. B 1 (2013) 2190–2197. [160] F.L. Dickert, O. Hayden, Bioimprinting of polymers and sol-gel phases. Selective detection of yeasts with imprinted polymers, Anal. Chem. 74 (2002) 1302–1306. [161] J.L. Urraca, R. Chamorro-Mendiluce, G. Orellana, M.C. Moreno-Bondi, Molecularly imprinted polymer beads for clean-up and preconcentration of β-lactamase-resistant penicillins in milk., Anal. Bioanal. Chem. 408 (2016) 1843–1854. [162] E. Yilmaz, O. Ramström, P. Möller, D. Sanchez, K. Mosbach, A facile method for preparing molecularly imprinted polymer spheres using spherical silica templates, J. Mater. Chem. 12 (2002) 1577–1581. [163] A. V. Linares, A. Falcimaigne-Cordin, L.A. Gheber, K. Haupt, Patterning nanostructured, synthetic, polymeric receptors by simultaneous projection photolithography, nanomolding, and molecular imprinting, Small 7 (2011) 2318–2325. Bibliografía 359 [164] J. Zdunek, E. Benito-Peña, A. Linares, A. Falcimaigne-Cordin, G. Orellana, K. Haupt, M.C. Moreno-Bondi, Surface-imprinted nanofilaments for europium-amplified luminescent detection of fluoroquinolone antibiotics, Chem. Eur. J. 19 (2013) 10209– 10216. [165] A.V. Linares, F. Vandevelde, J. Pantigny, A. Falcimaigne-Cordin, K. Haupt, Polymer films composed of surface-bound nanofilaments with a high aspect ratio, molecularly imprinted with small molecules and proteins, Adv. Funct. Mater. 19 (2009) 1299–1303. [166] G. Von Freymann, V. Kitaev, B. V. Lotsch, G.A. Ozin, Bottom-up assembly of photonic crystals, Chem. Soc. Rev. 42 (2013) 2528–2554. [167] C. Avci, I. Imaz, A. Carné-Sánchez, J.A. Pariente, N. Tasios, J. Pérez-Carvajal, M.I. Alonso, A. Blanco, M. Dijkstra, C. López, D. Maspoch, Self-assembly of polyhedral metal-organic framework particles into three-dimensional ordered superstructures, Nat. Chem. 10 (2018) 78–84. [168] X. Hu, Q. An, G. Li, S. Tao, J. Liu, Imprinted photonic polymers for chiral recognition, Angew. Chem. Int. Ed. 45 (2006) 8145–8148. [169] X. Hu, G. Li, M. Li, J. Huang, Y. Li, Y. Gao, Y. Zhang, Ultrasensitive specific stimulant assay based on molecularly imprinted photonic hydrogels, Adv. Funct. Mater. 18 (2008) 575–583. [170] X. Wang, Y. Pei, Y. Hou, Z. Pei, Fabrication of core-shell magnetic molecularly imprinted nanospheres towards hypericin via click polymerization, Polymers 11 (2019) 313. [171] S. Carrasco, E. Benito-Peña, F. Navarro-Villoslada, J. Langer, M.N. Sanz-Ortiz, J. Reguera, L.M. Liz-Marzán, M.C. Moreno-Bondi, Multibranched gold-mesoporous silica nanoparticles coated with a molecularly imprinted polymer for label-free antibiotic surface-enhanced raman scattering analysis, Chem. Mater. 28 (2016) 7947–7954. [172] M. Panagiotopoulou, Y. Salinas, S. Beyazit, S. Kunath, L. Duma, E. Prost, A.G. Mayes, M. Resmini, B. Tse Sum Bui, K. Haupt, Molecularly imprinted polymer coated quantum dots for multiplexed cell targeting and imaging, Angew. Chem. Int. Ed. 55 (2016) 8244–8248. [173] J. Xu, K. Haupt, B. Tse Sum Bui, Core-shell molecularly imprinted polymer nanoparticles as synthetic antibodies in a sandwich fluoroimmunoassay for trypsin determination in human serum, ACS Appl. Mater. Interfaces 9 (2017) 24476–24483. Bibliografía 360 [174] J. Fu, C. Ding, A. Zhu, Y. Tian, An efficient core-shell fluorescent silica nanoprobe for ratiometric fluorescence detection of pH in living cells, Analyst 141 (2016) 4766–4771. [175] M. Niu, C. Pham-Huy, H. He, Core-shell nanoparticles coated with molecularly imprinted polymers: a review, Microchim. Acta 183 (2016) 2677–2695. [176] C. Gonzato, M. Courty, P. Pasetto, K. Haupt, Magnetic molecularly imprinted polymer nanocomposites via surface‐initiated RAFT polymerization, Adv. Funct. Mater. 21 (2011) 3947–3953. [177] M.E. Byrne, V. Salian, Molecular imprinting within hydrogels II: progress and analysis of the field, Int. J. Pharm. 364 (2008) 188–212. [178] L. Scrivano, O.I. Parisi, D. Iacopetta, M. Ruffo, J. Ceramella, M.S. Sinicropi, F. Puoci, Molecularly imprinted hydrogels for sustained release of sunitinib in breast cancer therapy, Polym. Adv. Technol. 30 (2019) 743–748. [179] E. Benito-Peña, V. González-Vallejo, A. Rico-Yuste, L. Barbosa-Pereira, J.M. Cruz, A. Bilbao, C. Alvarez-Lorenzo, M.C. Moreno-Bondi, Molecularly imprinted hydrogels as functional active packaging materials, Food Chem. 190 (2016) 487–494. [180] Y. Xia, T. Guo, M. Song, B. Zhang, B. Zhang, Hemoglobin recognition by imprinting in semi-interpenetrating polymer network hydrogel based on polyacrylamide and chitosan, Biomacromolecules 6 (2005) 2601–2606. [181] D. Ran, Y. Wang, X. Jia, C. Nie, Bovine serum albumin recognition via thermosensitive molecular imprinted macroporous hydrogels prepared at two different temperatures, Anal. Chim. Acta 723 (2012) 45–53. [182] I. Chianella, A. Guerreiro, E. Moczko, J.S. Caygill, E. V. Piletska, I.M.P. De Vargas Sansalvador, M.J. Whitcombe, S.A. Piletsky, Direct replacement of antibodies with molecularly imprinted polymer nanoparticles in ELISA - Development of a novel assay for vancomycin, Anal. Chem. 85 (2013) 8462–8468. [183] A. Biffi, N. B. Graham, G. Siedlaczek, S. Stalberg, G. Wulff, The synthesis, characterization and molecular recognition properties of imprinted microgels, Macromol. Chem. Phys. 202 (2001) 163–171. [184] P. Çakir, A. Cutivet, M. Resmini, B.T.S. Bui, K. Haupt, Protein-size molecularly imprinted polymer nanogels as synthetic antibodies, by localized polymerization with multi-initiators, Adv. Mater. 25 (2013) 1048–1051. [185] F. Canfarotta, A. Poma, A. Guerreiro, S. Piletsky, Solid-phase synthesis of molecularly imprinted nanoparticles, Nat. Protoc. 11 (2016) 443–455. Bibliografía 361 [186] F. Canfarotta, L. Lezina, A. Guerreiro, J. Czulak, A. Petukhov, A. Daks, K. Smolinska-Kempisty, A. Poma, S. Piletsky, N. A. Barlev, Specific drug delivery to cancer cells with double-imprinted nanoparticles against epidermal growth factor receptor, Nano Lett. 18 (2018) 4641–4646. [187] H. Munawar, A.H.M. Safaryan, A. De Girolamo, A. Garcia-Cruz, P. Marote, K. Karim, V. Lippolis, M. Pascale, S.A. Piletsky, Determination of fumonisin B1 in maize using molecularly imprinted polymer nanoparticles-based assay, Food Chem. 298 (2019) 125044. [188] Y. Garcia, K. Smolinska-Kempisty, E. Pereira, E. Piletska, S. Piletsky, Development of competitive ’pseudo’-ELISA assay for measurement of cocaine and its metabolites using molecularly imprinted polymer nanoparticles, Anal. Methods 9 (2017) 4592–4598. [189] M.J. Abdin, Z. Altintas, I.E. Tothill, In silico designed nanoMIP based optical sensor for endotoxins monitoring, Biosens. Bioelectron. 67 (2015) 177–183. [190] C. Esen, J. Czulak, T. Cowen, E. Piletska, S.A. Piletsky, Highly efficient abiotic assay formats for methyl parathion: molecularly imprinted polymer nanoparticle assay as an alternative to enzyme-linked immunosorbent assay, Anal. Chem. 91 (2019) 958–964. [191] L. Chen, X. Wang, W. Lu, X. Wu, J. Li, Molecular imprinting: perspectives and applications, Chem. Soc. Rev. 45 (2016) 2137–2211. [192] G. Pan, S. Shinde, S. Y. Yeung, M. Jakštaitė, Q. Li, A.G. Wingren, B. Sellergren, An epitope‐imprinted biointerface with dynamic bioactivity for modulating cell-biomaterial interactions, Angew. Chem. Int. Ed. 56 (2017) 15959–15963. [193] M. Mahmoudi, S. Bonakdar, M.A. Shokrgozar, H. Aghaverdi, R. Hartmann, A. Pick, G. Witte, W.J. Parak, Cell-imprinted substrates direct the fate of stem cells, ACS Nano 7 (2013) 8379–8384. [194] D. Yin, X. Li, Y. Ma, Z. Liu, Targeted cancer imaging and photothermal therapy via monosaccharide-imprinted gold nanorods, Chem. Commun. 53 (2017) 6716–6719. [195] J. Pan, W. Chen, Y. Ma, G. Pan, Molecularly imprinted polymers as receptor mimics for selective cell recognition, Chem. Soc. Rev. 47 (2018) 5574–5587. [196] K. Ren, R.N. Zare, Chemical recognition in cell-imprinted polymers, ACS Nano 6 (2012) 4314–4318. https://pubs.rsc.org/en/results?searchtext=Author%3ADanyang%20Yin https://pubs.rsc.org/en/results?searchtext=Author%3AXinglin%20Li https://pubs.rsc.org/en/results?searchtext=Author%3AYanyan%20Ma https://pubs.rsc.org/en/results?searchtext=Author%3AZhen%20Liu Bibliografía 362 [197] T. Cohen, J. Starosvetsky, U. Cheruti, R. Armon, Whole cell imprinting in sol-gel thin films for bacterial recognition in liquids: Macromolecular fingerprinting, Int. J. Mol. Sci. 11 (2010) 1236–1252. [198] J. Borovička, W.J. Metheringham, L.A. Madden, C.D. Walton, S.D. Stoyanov, V.N. Paunov, Photothermal colloid antibodies for shape-selective recognition and killing of microorganisms, J. Am. Chem. Soc. 135 (2013) 5282–5285. [199] S.D. Harvey, G.M. Mong, R.M. Ozanich, J.S. McLean, S.M. Goodwin, N.B. Valentine, J.K. Fredrickson, Preparation and evaluation of spore-specific affinity- augmented bio-imprinted beads, Anal. Bioanal. Chem. 386 (2006) 211–219. [200] X. Shen, J. Svensson Bonde, T. Kamra, L. Bülow, J.C. Leo, D. Linke, L. Ye, Bacterial imprinting at pickering emulsion interfaces, Angew. Chem. Int. Ed. 126 (2014) 10863–10866. [201] O. Hayden, K.J. Mann, S. Krassnig, F.L. Dickert, Biomimetic ABO blood-group typing, Angew. Chem. Int. Ed. 45 (2006) 2626–2629. [202] K. Ren, R.N. Zare, Chemical recognition in cell-imprinted polymers, ACS Nano 6 (2012) 4314–4318. [203] S.M. Deporter, I. Lui, B.R. McNaughton, Programmed cell adhesion and growth on cell-imprinted polyacrylamide hydrogels, Soft Matter 8 (2012) 10403–10408. [204] S. W. Lv, Y. Liu, M. Xie, J. Wang, X.-W. Yan, Z. Li, W.-G. Dong, W.-H. Huang, Near-infrared light-responsive hydrogel for specific recognition and photothermal site- release of circulating tumor cells, ACS Nano 10 (2016) 6201–6210. [205] X. Lin, Y. Wang, L. Wang, Y. Lu, J. Li, D. Lu, T. Zhou, Z. Huang, J. Huang, H. Huang, S. Qiu, R. Chen, D. Lin, S. Feng, Interference-free and high precision biosensor based on surface enhanced Raman spectroscopy integrated with surface molecularly imprinted polymer technology for tumor biomarker detection in human blood, Biosens. Bioelectron. 143 (2019) 111599. [206] P.X. Medina Rangel, S. Laclef, J. Xu, M. Panagiotopoulou, J. Kovensky, B. Tse Sum Bui, K. Haupt, Solid-phase synthesis of molecularly imprinted polymer nanolabels: Affinity tools for cellular bioimaging of glycans, Sci. Rep. 9 (2019) 3923. [207] S. Shinde, Z. El-Schich, A. Malakpour, W. Wan, N. Dizeyi, R. Mohammadi, K. Rurack, A. Gjörloff Wingren, B. Sellergren, Sialic acid-imprinted fluorescent core–shell particles for selective labeling of cell surface glycans, J. Am. Chem. Soc. 137 (2015) 13908–13912. Bibliografía 363 [208] M. Panagiotopoulou, Y. Salinas, S. Beyazit, S. Kunath, L. Duma, E. Prost, A.G. Mayes, M. Resmini, B. Tse Sum Bui, K. Haupt, Molecularly imprinted polymer coated quantum dots for multiplexed cell targeting and imaging, Angew. Chem. Int. Ed. 55 (2016) 8244–8248. [209] A. Kushwaha, J. Srivastava, A.K. Singh, R. Anand, R. Raghuwanshi, T. Rai, M. Singh, Epitope imprinting of Mycobacterium leprae bacteria via molecularly imprinted nanoparticles using multiple monomers approach, Biosens. Bioelectron. 145 (2019) 111698. [210] C.S. Herrington, P.J. Coates, W.P. Duprex, Viruses and disease: Emerging concepts for prevention, diagnosis and treatment, J. Pathol. 235 (2015) 149–152. [211] M. Gast, H. Sobek, B. Mizaikoff, Selective virus capture via hexon imprinting, Mater. Sci. Eng. C 99 (2019) 1099–1104. [212] B.E. Pickett, E.L. Sadat, Y. Zhang, J.M. Noronha, R.B. Squires, V. Hunt, M. Liu, S. Kumar, S. Zaremba, Z. Gu, L. Zhou, C.N. Larson, J. Dietrich, E.B. Klem, R.H. Scheuermann, ViPR: An open bioinformatics database and analysis resource for virology research, Nucleic Acids Res. 40 (2012) 593–598. [213] G. Ertürk, B. Mattiasson, Molecular imprinting techniques used for the preparation of biosensors, Sensors 17 (2017) 288. [214] Z. Altintas, J. Pocock, K.A. Thompson, I.E. Tothill, Comparative investigations for adenovirus recognition and quantification: Plastic or natural antibodies?, Biosens. Bioelectron. 74 (2015) 996–1004. [215] S. Sykora, A. Cumbo, G. Belliot, P. Pothier, C. Arnal, Y. Dudal, P.F.X. Corvini, P. Shahgaldian, Virus-like particles as virus substitutes to design artificial virus-recognition nanomaterials, Chem. Commun. 51 (2015) 2256–2258. [216] F.L. Dickert, O. Hayden, R. Bindeus, K.J. Mann, D. Blaas, E. Waigmann, Bioimprinted QCM sensors for virus detection-screening of plant sap, Anal. Bioanal. Chem. 378 (2004) 1929–1934. [217] L.D. Bolisay, J.N. Culver, P. Kofinas, Molecularly imprinted polymers for tobacco mosaic virus recognition, Biomaterials 27 (2006) 4165–4168. [218] L.D. Bolisay, J.N. Culver, P. Kofinas, Optimization of virus imprinting methods to improve selectivity and reduce nonspecific binding, Biomacromolecules 8 (2007) 3893– 3899. Bibliografía 364 [219] Z. Altintas, M. Gittens, A. Guerreiro, K.A. Thompson, J. Walker, S. Piletsky, I.E. Tothill, Detection of Waterborne Viruses Using High Affinity Molecularly Imprinted Polymers, Anal. Chem. 87 (2015) 6801–6807. [220] M. Gast, S. Kühner, H. Sobek, P. Walther, B. Mizaikoff, Enhanced Selectivity by Passivation: Molecular Imprints for Viruses with Exceptional Binding Properties, Anal. Chem. 90 (2018) 5576–5585. [221] A. Cumbo, B. Lorber, P.F.X. Corvini, W. Meier, P. Shahgaldian, A synthetic nanomaterial for virus recognition produced by surface imprinting, Nat. Commun. 4 (2013) 1503. [222] C. Liang, H. Wang, K. He, C. Chen, X. Chen, H. Gong, C. Cai, A virus-MIPs fluorescent sensor based on FRET for highly sensitive detection of JEV, Talanta 160 (2016) 360–366. [223] B. Yang, H. Gong, C. Chen, X. Chen, C. Cai, A virus resonance light scattering sensor based on mussel-inspired molecularly imprinted polymers for high sensitive and high selective detection of Hepatitis A virus, Biosens. Bioelectron. 87 (2017) 679–685. [224] Y. Liu, T. Shen, L. Hu, H. Gong, C. Chen, X. Chen, C. Cai, Development of a thermosensitive molecularly imprinted polymer resonance light scattering sensor for rapid and highly selective detection of hepatitis A virus in vitro, Sens. Actuators B Chem. 253 (2017) 1188–1193. [225] N. Li, Y. jie Liu, F. Liu, M. fang Luo, Y. chun Wan, Z. Huang, Q. Liao, F. sheng Mei, Z. cheng Wang, A. yin Jin, Y. Shi, B. Lu, Bio-inspired virus imprinted polymer for prevention of viral infections, Acta Biomater. 51 (2017) 175–183. [226] W. Feng, C. Liang, H. Gong, C. Cai, Sensitive detection of Japanese encephalitis virus by surface molecularly imprinted technique based on fluorescent method, New J. Chem. 42 (2018) 3503–3508. [227] K. He, C. Chen, C. Liang, C. Liu, B. Yang, X. Chen, C. Cai, Highly selective recognition and fluorescent detection of JEV via virus-imprinted magnetic silicon microspheres, Sens. Actuators B Chem. 233 (2016) 607–614. [228] L. Luo, J. Yang, K. Liang, C. Chen, X. Chen, C. Cai, Fast and sensitive detection of Japanese encephalitis virus based on a magnetic molecular imprinted polymer– resonance light scattering sensor, Talanta 202 (2019) 21–26. [229] M. Jenik, R. Schirhagl, C. Schirk, O. Hayden, P. Lieberzeit, D. Blaas, G. Paul, F.L. Dickert, sensing picornaviruses using molecular imprinting techniques on a quartz crystal microbalance, Anal. Chem. 81 (2009) 5320–5326. Bibliografía 365 [230] T. Wangchareansak, A. Thitithanyanont, D. Chuakheaw, M.P. Gleeson, P.A. Lieberzeit, C. Sangma, Influenza A virus molecularly imprinted polymers and their application in virus sub-type classification, J. Mater. Chem. B 1 (2013) 2190–2197. [231] P.A. Lieberzeit, S. Chunta, K. Navakul, C. Sangma, C. Jungmann, Molecularly imprinted polymers for diagnostics: sensing high density lipoprotein and dengue virus, Procedia Eng. 168 (2016) 101–104. [232] H.A. Hussein, R.Y.A. Hassan, R.M. El Nashar, S.A. Khalil, S.A. Salem, I.M. El- Sherbiny, Designing and fabrication of new VIP biosensor for the rapid and selective detection of foot-and-mouth disease virus (FMDV), Biosens. Bioelectron. 141 (2019) 111467. [233] C. Tancharoen, W. Sukjee, C. Thepparit, T. Jaimipuk, P. Auewarakul, A. Thitithanyanont, C. Sangma, Electrochemical biosensor based on surface imprinting for Zika virus detection in serum, ACS Sensors 4 (2019) 69–75. [234] G.M. Birnbaumer, P.A. Lieberzeit, L. Richter, R. Schirhagl, M. Milnera, F.L. Dickert, A. Bailey, P. Ertl, Detection of viruses with molecularly imprinted polymers integrated on a microfluidic biochip using contact-less dielectric microsensors, Lab Chip 9 (2009) 3549–3556. [235] A. Karthik, K. Margulis, K. Ren, R.N. Zare, L.W. Leung, Rapid and selective detection of viruses using virus-imprinted polymer films, Nanoscale 7 (2015) 18998– 19003. [236] M. Glad, O. Norrlöw, B. Sellergren, N. Siegbahn, K. Mosbach, Use of silane monomers for molecular imprinting and enzyme entrapment in polysiloxane-coated porous silica, J. Chromatogr. A 347 (1985) 11–23. [237] N.W. Turner, C.W. Jeans, K.R. Brain, C.J. Allender, V. Hlady, D.W. Britt, From 3D to 2D: a review of the molecular imprinting of proteins, Biotechnol. Prog. 22 (2006) 1474– 1489. [238] C. Zheng, Z. Liu, R. Gao, L. Zhang, Y. Zhang, Recognition of oxytocin by capillary electrochromatography with monolithic tetrapeptide-imprinted polymer used as the stationary phase, Anal. Bioanal. Chem. 388 (2007) 1137–1145. [239] M. Andac, I.Y. Galaev, A. Denizli, Molecularly imprinted poly(hydroxyethyl methacrylate) based cryogel for albumin depletion from human serum, Colloids Surf. B 109 (2013) 259–265. [240] B. Pluhar, B. Mizaikoff, Advanced evaluation strategies for protein-imprinted polymer nanobeads, Macromol. Biosci. 15 (2015) 1507–1511. Bibliografía 366 [241] Lv, T. Tan, F. Svec, Molecular imprinting of proteins in polymers attached to the surface of nanomaterials for selective recognition of biomacromolecules, Biotechnol. Adv. 31 (2013) 1172–1186. [242] M. Stamm (Ed.) (2008), Polymer surfaces and interfaces, Springer, Berlin, Heidelberg. [243] C. Boitard, A. Lamouri, C. Ménager, N. Griffete, Whole protein imprinting over magnetic nanoparticles using photopolymerization, ACS Appl. Polym. Mater. 1 (2019) 928–932. [244] J. Ashley, X. Feng, A. Halder, T. Zhou, Y. Sun, Dispersive solid-phase imprinting of proteins for the production of plastic antibodies, Chem. Commun. 54 (2018) 3355– 3358. [245] R. Mahajan, M. Rouhi, S. Shinde, T. Bedwell, A. Incel, L. Mavliutova, S. Piletsky, I.A. Nicholls, B. Sellergren, Highly efficient synthesis and assay of protein-imprinted nanogels by using magnetic templates, Angew. Chem. Int. Ed. 58 (2019) 727–730. [246] P.C. Chou, J. Rick, T.C. Chou, C-reactive protein thin-film molecularly imprinted polymers formed using a micro-contact approach, Anal. Chim. Acta, 542 (2005) 20–25. [247] Y. Sun, S. Zhong, Molecularly imprinted polymers fabricated via Pickering emulsions stabilized solely by food-grade casein colloidal nanoparticles for selective protein recognition, Anal. Bioanal. Chem. 410 (2018) 3133–3143. [248] T. Zhou, J. Ashley, X. Feng, Y. Sun, Detection of hemoglobin using hybrid molecularly imprinted polymers/carbon quantum dots-based nanobiosensor prepared from surfactant-free Pickering emulsion, Talanta 190 (2018) 443–449. [249] Z.D. Hua, Z.Y. Chen, Y.Z. Li, M.P. Zhao, Thermosensitive and salt-sensitive molecularly imprinted hydrogel for bovine serum albumin, Langmuir 24 (2008) 5773– 5780. [250] N. Adrus, M. Ulbricht, Molecularly imprinted stimuli-responsive hydrogels for protein recognition, Polymer 53 (2012) 4359–4366. [251] H. Chen, D. Yuan, Y. Li, M. Dong, Z. Chai, J. Kong, G. Fu, Silica nanoparticle supported molecularly imprinted polymer layers with varied degrees of crosslinking for lysozyme recognition, Anal. Chim. Acta 779 (2013) 82–89. [252] S. Madhumanchi, R. Jadda, R. Suedee, Efficient adsorptive extraction materials by surface protein-imprinted polymer over silica gel for selective recognition/separation of human serum albumin from urine, J. Appl. Polym. Sci. 136 (2019) 46894. Bibliografía 367 [253] Q. Li, K. Yang, S. Li, L. Liu, L. Zhang, Z. Liang, Y. Zhang, Preparation of surface imprinted core-shell particles via a metal chelating strategy: specific recognition of porcine serum albumin, Microchim. Acta 183 (2016) 345–352. [254] D.Y. Li, X.W. He, Y. Chen, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Novel hybrid structure silica/CdTe/molecularly imprinted polymer: synthesis, specific recognition, and quantitative fluorescence detection of bovine hemoglobin, ACS Appl. Mater. Interfaces 5 (2013) 12609–12616. [255] Y. Li, H.-H. Yang, Q.-H. You, Z.-X. Zhuang, X.-R. Wang, Protein recognition via surface molecularly imprinted polymer nanowires, Anal. Chem. 78 (2006) 317–320. [256] F.T.C. Moreira, S. Sharma, R.A.F. Dutra, J.P.C. Noronha, A.E.G. Cass, M.G.F. Sales, Detection of cardiac biomarker proteins using a disposable based on a molecularly imprinted polymer grafted onto graphite, Microchim. Acta 182 (2015) 975– 983. [257] F.T.C. Moreira, R.A.F. Dutra, J.P.C. Noronha, A.L. Cunha, M.G.F. Sales, Artificial antibodies for troponin T by its imprinting on the surface of multiwalled carbon nanotubes: Its use as sensory surfaces, Biosens. Bioelectron. 28 (2011) 243–250. [258] J. Zhou, Y. Wang, J. Bu, B. Zhang, Q. Zhang, Ni2+-BSA directional coordination- assisted magnetic molecularly imprinted microspheres with enhanced specific rebinding to target proteins, ACS Appl. Mater. Interfaces 11 (2019) 25682–25690. [259] R. Gao, X. Cui, Y. Hao, G. He, M. Zhang, Y. Tang, Preparation of Cu2+-mediated magnetic imprinted polymers for the selective sorption of bovine hemoglobin, Talanta 150 (2016) 46–53. [260] Y. Yin, L. Yan, Z. Zhang, J. Wang, Magnetic molecularly imprinted polydopamine nanolayer on multiwalled carbon nanotubes surface for protein capture, Talanta 144 (2015) 671–679. [261] T. Zhou, J. Ashley, X. Feng, Y. Sun, Detection of hemoglobin using hybrid molecularly imprinted polymers/carbon quantum dots-based nanobiosensor prepared from surfactant-free Pickering emulsion, Talanta 190 (2018) 443–449. [262] R. Mahajan, M. Rouhi, S. Shinde, T. Bedwell, A. Incel, L. Mavliutova, S. Piletsky, I.A. Nicholls, B. Sellergren, Highly efficient synthesis and assay of protein-imprinted nanogels by using magnetic templates, Angew. Chem. Int. Ed. 58 (2019) 727–730. [263] Y. Saylan, A. Denizli, Molecular fingerprints of hemoglobin on a nanofilm chip, Sensors 18 (2018) 3016. Bibliografía 368 [264] X. Li, B. Zhang, W. Li, X. Lei, X. Fan, L. Tian, H. Zhang, Q. Zhang, Preparation and characterization of bovine serum albumin surface-imprinted thermosensitive magnetic polymer microsphere and its application for protein recognition, Biosens. Bioelectron. 51 (2014) 261–267 [265] W. Wan, Q. Han, X. Zhang, Y. Xie, J. Sun, M. Ding, Selective enrichment of proteins for MALDI-TOF MS analysis based on molecular imprinting, Chem. Commun. 51 (2015) 3541–3544. [266] J. Ashley, Y. Shukor, R. D’Aurelio, L. Trinh, T.L. Rodgers, J. Temblay, M. Pleasants, I.E. Tothill, Synthesis of molecularly imprinted polymer nanoparticles for α- casein detection using surface plasmon resonance as a milk allergen sensor, ACS Sensors 3 (2018) 418–424. [267] N.A. Karaseva, B. Pluhar, E.A. Beliaeva, T.N. Ermolaeva, B. Mizaikoff, Synthesis and application of molecularly imprinted polymers for trypsin piezoelectric sensors, Sens. Actuators B Chem. 280 (2019) 272–279. [268] N. S. Greenspan, Dimensions of antigen recognition and levels of immunological specificity, Adv. Cancer Res. 80 (2001) 147-187. [269] N. Minoura, A. Rachkov, M. Higuchi, T. Shimizu, Study of the factors influencing peak asymmetry on chromatography using a molecularly imprinted polymer prepared by the epitope approach, Bioseparation 10 (2001) 399–407. [270] A. Rachkov, N. Minoura, Recognition of oxytocin and oxytocin-related peptides in aqueous media using a molecularly imprinted polymer synthesized by the epitope approach., J. Chromatogr. A 889 (2000) 111–118. [271] L. Liu, J. Zheng, G. Fang, W. Xie, Improvement of the homogeneity of protein- imprinted polymer films by orientated immobilization of the template, Anal. Chim. Acta 726 (2012) 85–92. [272] http://www.rcsb.org/3d-view/2WHT/1 (último acceso 1/09/2020). [273] K. Yang, S. Li, L. Liu, Y. Chen, W. Zhou, J. Pei, Z. Liang, L. Zhang, Y. Zhang, Epitope imprinting technology: progress, applications, and perspectives toward artificial antibodies, Adv. Mater. 31 (2019) 1902048. [274] D. Dechtrirat, K.J. Jetzschmann, W.F.M. Stöcklein, F.W. Scheller, N. Gajovic- Eichelmann, Protein rebinding to a surface-confined imprint, Adv. Funct. Mater. 22 (2012) 5231–5237. http://www.rcsb.org/3d-view/2WHT/1 Bibliografía 369 [275] R. Xing, S. Wang, Z. Bie, H. He, Z. Liu, Preparation of molecularly imprinted polymers specific to glycoproteins, glycans and monosaccharides via boronate affinity controllable-oriented surface imprinting, Nat. Protoc. 12 (2017) 964–987. [276] R. Xing, Y. Ma, Y. Wang, Y. Wen, Z. Liu, Specific recognition of proteins and peptides via controllable oriented surface imprinting of boronate affinity-anchored epitopes, Chem. Sci. 10 (2019) 1831–1835. [277] E. Yilmaz, K. Haupt, K. Mosbach, The use of immobilized templates-a new approach in molecular imprinting, Angew. Chem. Int. Ed. 39 (2000) 2115–2118. [278] M. M. Titirici, A. J. Hall, B. Sellergren, Hierarchically imprinted stationary phases:  mesoporous polymer beads containing surface-confined binding sites for adenine, Chem. Mater. 14 (2001) 21–23. [279] M.M. Titirici, A.J. Hall, B. Sellergren, Hierarchical imprinting using crude solid phase peptide synthesis products as templates, Chem. Mater. 15 (2003) 822–824. [280] A. Nematollahzadeh, W. Sun, C.S.A. Aureliano, D. Lütkemeyer, J. Stute, M.J. Abdekhodaie, A. Shojaei, B. Sellergren, High-capacity hierarchically imprinted polymer beads for protein recognition and capture, Angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 495–498. [281] M.M. Titirici, B. Sellergren, Peptide recognition via hierarchical imprinting, Anal. Bioanal. Chem. 378 (2004) 1913–1921. [282] M.M. Titiricci (2005), Synthesis and evaluation of novel formats in molecular imprinting, Tesis Doctoral, Universidad de Dortmund. [283] N. Bereli, Y. Saylan, L. Uzun, R. Say, A. Denizli, L-Histidine imprinted supermacroporous cryogels for protein recognition, Sep. Purif. Technol. 82 (2011) 28– 35. [284] E. Moczko, A. Guerreiro, C. Cáceres, E. Piletska, B. Sellergren, S.A. Piletsky, Epitope approach in molecular imprinting of antibodies, J. Chromatogr. B 1124 (2019) 1–6. [285] H. Li, D. Li, Preparation of a pipette tip-based molecularly imprinted solid-phase microextraction monolith by epitope approach and its application for determination of enkephalins in human cerebrospinal fluid, J. Pharm. Biomed. Anal. 115 (2015) 330–338. [286] M.R. Milani Hosseini, N. Saeedzadeh Amiri, Fabrication of an eco-friendly ratiometric fluorescence sensor modified mesoporous structured epitope imprinted polymer for highly selective and sensitive determination of cytochrome c in biological samples, Anal. Methods 11 (2019) 5919–5928. Bibliografía 370 [287] Z. Altintas, A. Takiden, T. Utesch, M.A. Mroginski, B. Schmid, F.W. Scheller, R.D. Süssmuth, Integrated approaches toward high affinity artificial protein binders obtained via computationally simulated epitopes for protein recognition, Adv. Funct. Mater. 29 (2019) 1807332. [288] Y.P. Qin, H.Y. Wang, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Metal chelation dual-template epitope imprinting polymer via distillation-precipitation polymerization for recognition of porcine serum albumin, Talanta 185 (2018) 620–627. [289] M.X. Li, X.H. Wang, L.M. Zhang, X.P. Wei, A high sensitive epitope imprinted electrochemical sensor for bovine serum albumin based on enzyme amplifying, Anal. Biochem. 530 (2017) 68–74. [290] F. Yang, D. Deng, X. Dong, S. Lin, Preparation of an epitope-imprinted polymer with antibody-like selectivity for beta2-microglobulin and application in serum sample analysis with a facile method of on-line solid-phase extraction coupling with high performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A 1494 (2017) 18–26. [291] Y.P. Qin, C. Jia, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Thermosensitive metal chelation dual-template epitope imprinting polymer using distillation-precipitation polymerization for simultaneous recognition of human serum albumin and transferrin, ACS Appl. Mater. Interfaces 10 (2018) 9060–9068. [292] M.H. Lee, J.L. Thomas, C.L. Liao, S. Jurcevic, T. Crnogorac-Jurcevic, H.Y. Lin, Polymers imprinted with three REG1B peptides for electrochemical determination of Regenerating Protein 1B, a urinary biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma, Microchim. Acta 184 (2017) 1773–1780. [293] Y. Zhang, C. Deng, S. Liu, J. Wu, Z. Chen, C. Li, W. Lu, Active targeting of tumors through conformational epitope imprinting, Angew. Chem. Int. Ed. 54 (2015) 5157–5160. [294] X.T. Ma, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Epitope molecularly imprinted polymer coated quartz crystal microbalance sensor for the determination of human serum albumin, Sens. Actuators B Chem. 246 (2017) 879–886. [295] Y.J. Yan, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Nitrogen-doped graphene quantum dots- labeled epitope imprinted polymer with double templates via the metal chelation for specific recognition of cytochrome c, Biosens. Bioelectron. 91 (2017) 253–261. [296] S. Li, K. Yang, N. Deng, Y. Min, L. Liu, L. Zhang, Y. Zhang, Thermoresponsive epitope surface-imprinted nanoparticles for specific capture and release of target protein from human plasma, ACS Appl. Mater. Interfaces 8 (2016) 5747–5751. Bibliografía 371 [297] N. Gupta, K. Shah, M. Singh, An epitope-imprinted piezoelectric diagnostic tool for Neisseria meningitidis detection, J. Mol. Recognit. 29 (2016) 572–579. [298] X.L. Zhao, D.Y. Li, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, An epitope imprinting method on the surface of magnetic nanoparticles for specific recognition of bovine serum album, J. Mater. Chem. B 2 (2014) 7575–7582. [299] S. Schwark, W. Sun, J. Stute, D. Lütkemeyer, M. Ulbricht, B. Sellergren, Monoclonal antibody capture from cell culture supernatants using epitope imprinted macroporous membranes, RSC Adv. 6 (2016) 53162–53169. [300] X.M. Zhang, Y.P. Qin, H.L. Ye, X.T. Ma, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Silicon nanoparticles coated with an epitope-imprinted polymer for fluorometric determination of cytochrome c, Microchim. Acta 185 (2018) 1–9. [301] Y.Q. Yang, X.W. He, Y.Z. Wang, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Epitope imprinted polymer coating CdTe quantum dots for specific recognition and direct fluorescent quantification of the target protein bovine serum albumin, Biosens. Bioelectron. 54 (2014) 266–272. [302] X. Ji, D. Li, H. Li, Preparation and application of a novel molecularly imprinted solid- phase microextraction monolith for selective enrichment of cholecystokinin neuropeptides in human cerebrospinal fluid, Biomed. Chromatogr. 29 (2015) 1280– 1289. [303] J. Xu, F. Merlier, B. Avalle, V. Vieillard, P. Debré, K. Haupt, B. Tse Sum Bui, Molecularly imprinted polymer nanoparticles as potential synthetic antibodies for immunoprotection against HIV, ACS Appl. Mater. Interfaces 11 (2019) 9824–9831. [304] Y.P. Qin, D.Y. Li, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Preparation of high-efficiency cytochrome c-imprinted polymer on the surface of magnetic carbon nanotubes by epitope approach via metal chelation and six-membered ring, ACS Appl. Mater. Interfaces 8 (2016) 10155–10163. [305] X.L. Zhao, D.Y. Li, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, An epitope imprinting method on the surface of magnetic nanoparticles for specific recognition of bovine serum album, J. Mater. Chem. B 2 (2014) 7575–7582. [306] C.H. Lu, Y. Zhang, S.F. Tang, Z. Bin Fang, H.H. Yang, X. Chen, G.N. Chen, Sensing HIV related protein using epitope imprinted hydrophilic polymer coated quartz crystal microbalance, Biosens. Bioelectron. 31 (2012) 439–444. [307] J. Xu, F. Merlier, B. Avalle, V. Vieillard, P. Debré, K. Haupt, B. Tse Sum Bui, Molecularly imprinted polymer nanoparticles as potential synthetic antibodies for immunoprotection against HIV, ACS Appl. Mater. Interfaces 11 (2019) 9824–9831. Bibliografía 372 [308] D.Y. Li, X.M. Zhang, Y.J. Yan, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, Thermo-sensitive imprinted polymer embedded carbon dots using epitope approach, Biosens. Bioelectron. 79 (2016) 187–192. [309] H. Bagán, T. Zhou, N.L. Eriksson, L. Bülow, L. Ye, Synthesis and characterization of epitope-imprinted polymers for purification of human hemoglobin, RSC Adv. 7 (2017) 41705–41712. [310] K. Yang, S. Li, J. Liu, L. Liu, L. Zhang, Y. Zhang, Multiepitope templates imprinted particles for the simultaneous capture of various target proteins, Anal. Chem. 88 (2016) 5621–5625. [311] M. Babu, O. Kagan, H. Guo, J. Greenblatt, A. Emili, Identification of protein complexes in Escherichia coli using sequential peptide affinity purification in combination with tandem mass spectrometry, J. Vis. Exp. 69 (2012) 4057. [312] C.L. Young, Z.T. Britton, A.S. Robinson, Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications, Biotechnol. J. 7 (2012) 620–634. [313] V.M. Bolanos-Garcia, O.R. Davies, Structural analysis and classification of native proteins from E. coli commonly co-purified by immobilised metal affinity chromatography, Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 1760 (2006) 1304–1313. [314] E. Hochuli, W. Bannwarth, H. Dobeli, R. Gentzi, D. Stuber, Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent, Bio/Technology 6 (1988) 1321–1325. [315] https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/protein/expression- purification-detection/ni-nta-agarose/#orderinginformation (último aceso 1/09/2020). [316] J.C. Ayala, E. Pimienta, C. Rodríguez, J. Anné, C. Vallín, M.T. Milanés, E. King- Batsios, K. Huygen, L. Van Mellaert, Use of Strep-tag II for rapid detection and purification of Mycobacterium tuberculosis recombinant antigens secreted by Streptomyces lividans, J. Microbiol. Methods. 94 (2013) 192–198. [317] P. Surdej, M. Jacobs-Lorena, Strategy for epitope tagging the protein-coding region of any gene, Biotechniques 17 (1994) 560–565. [318] https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26181 (último aceso 1/09/2020). [319] M.C. Hillman, L.S. Yang, S. Sun, J.L. Duke, K.T. O’Neil, J.E. Kochie, A. Karjoo, P. Nath, L.A. Breth, K. Murphy, O.H. Ross, T.C. Burn, G.F. Hollis, R. Wynn, A https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/protein/expression-purification-detection/ni-nta-agarose/#orderinginformation https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/protein/expression-purification-detection/ni-nta-agarose/#orderinginformation https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26181 Bibliografía 373 comprehensive system for protein purification and biochemical analysis based on antibodies to c-myc peptide, Protein Expr. Purif. 23 (2001) 359–368. [320] T.P. Hopp, K.S. Prickett, V.L. Price, R.T. Libby, C.J. March, D.P. Cerretti, D.L. Urdal, P.J. Conlon, A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification, Nat. Biotechnol. 6 (1988) 1204–1210. [321] D. Cazalla, J.R. Sanford, J.F. Cáceres, A rapid and efficient protocol to purify biologically active recombinant proteins from mammalian cells, Protein Expr. Purif. 42 (2005) 54–58. [322] R.T. Raines, M. Mccormick, T.R. Van Oosbree, R.C. Mierendorf, The S · Tag fusion system for protein purification, Methods Enzymol. 326 (2000) 362–376. [323] S. Li, K. Yang, B. Zhao, X. Li, L. Liu, Y. Chen, L. Zhang, Y. Zhang, Epitope imprinting enhanced IMAC (EI-IMAC) for highly selective purification of His-tagged protein, J. Mater. Chem. B 4 (2016) 1960–1967. [324] P. T. Vallano, V. T. Remcho, Highly selective separations by capillary electrochromatography: molecular imprint polymer sorbents, J. Chromatogr. A 887 (2000) 125−135. [325] S. Pardeshi, S. K. Singh, Precipitation polymerization: a versatile tool forpreparing molecularly imprinted polymer beads forchromatography applications, RSC Adv. 6 (2016) 23525. [326] G. Zhu, G. Cheng, P. Wang, W. Li, Y. Wang, J. Fan, Water compatible imprinted polymer prepared in water for selective solid phase extraction and determination of ciprofloxacin in real samples, Talanta 200 (2019) 307–315. [327] X. Yu, H. Zeng, J. Wan, X. Cao, Computational design of a molecularly imprinted polymer compatible with an aqueous environment for solid phase extraction of chenodeoxycholic acid, J. Chromatogr. A (2019) 11–23. [328] H. Munawar, K. Smolinska-Kempisty, A.G. Cruz, F. Canfarotta, E. Piletska, K. Karim, S.A. Piletsky, Molecularly imprinted polymer nanoparticle-based assay (MINA): application for fumonisin B1 determination, Analyst 143 (2018) 3481–3488. [329] C. G. Li, B. Yuan, M. M. Dong, P. Y. Zhou, Y. X. Hao, Y. Y. Sun, M. K. Xu, D. Li, G. Y. Kai, J. H. Jiang, Purification and identification of an actinomycin D analogue from actinomycetes associated with Ganoderma applanatum via magnetic molecularly imprinted polymers and tandem mass spectrometry, Food Chem. Toxicol. 119 (2018) 150–160. Bibliografía 374 [330] A. Herrera-Chacón, Ş. Dinç-Zor, M. del Valle, Integrating molecularly imprinted polymer beads in graphite-epoxy electrodes for the voltammetric biosensing of histamine in wines, Talanta 208 (2020) 120348. [331] M. Chantada-Vázquez, J. Sánchez-González, E. Peña-Vázquez, M. J. Tabernero, A. M. Bermejo, P. Bermejo-Barrera, A. Moreda-Piñeiro, Simple and sensitive molecularly imprinted polymer – Mn-doped ZnS quantum dots based fluorescence probe for cocaine and metabolites determination in urine, Anal. Chem. 88 (2016) 2734−2741. [332] Y. Zhang, Z. Zhou, J. Zheng, H. Li, J. Cui, S. Liu, Y. Yan, C. Li, SiO2-MIP core-shell nanoparticles containing gold nanoclusters for sensitive fluorescence detection of the antibiotic erythromycin, Microchim. Acta 184 (2017) 2241–2248. [333] Y. Hao, R. Gao, D. Liu, G. He, Y. Tang, Z. Guo, Selective extraction and determination of chlorogenic acid in fruit juices using hydrophilic magnetic imprinted nanoparticles, Food Chem. 200 (2016) 215–222. [334] Z.E. Mbhele, S. Ncube, L.M. Madikizela, Synthesis of a molecularly imprinted polymer and its application in selective extraction of fenoprofen from wastewater, Environ. Sci. Pollut. Res. 25 (2018) 36724–36735. [335] H. G. Zuo, H. Yang, J.X. Zhu, P. Guo, L. Shi, C.R. Zhan, Y. Ding, Synthesis of molecularly imprinted polymer on surface of TiO2 nanowires and assessment of malathion and its metabolite in environmental water, J. Anal. Chem. 74 (2019) 1039– 1055. [336] P. Lucci, D. Pacetti, O. Núñez, N. G. Frega (2012), Current trends in sample treatment techniques for environmental and food analysis en L. Calderón (Ed.), Chromatography- The most versatile method of chemical analysis, InTechOpen, pp. 127–164. [337] E. H. M. Koster, C. Crescenzi, W. den Hoedt, K. Ensing, G. J. de Jong, Fibers coated with molecularly imprinted polymers for solid-phase microextraction, Anal. Chem. 73 (2001) 3140–3145. [338] N.S. Simões, H.L. de Oliveira, R.C.S. da Silva, L.S. Teixeira, T.L.S. Sales, W.V. de Castro, M.J.N. de Paiva, C. Sanches, K.B. Borges, Hollow mesoporous structured molecularly imprinted polymer as adsorbent in pipette-tip solid-phase extraction for the determination of antiretrovirals from plasma of HIV-infected patients, Electrophoresis 39 (2018) 2581–2589. [339] E. Rodríguez, F. Navarro-Villoslada, E. Benito-Peña, M. D. Marazuela, M. C. Moreno-Bondi, Multiresidue determination of ultratrace levels of fluoroquinolone Bibliografía 375 antimicrobials in drinking and aquaculture water samples by automated online molecularly imprinted solid phase extraction and liquid chromatography, Anal. Chem. 83 (2011) 2046–2055. [340] F.G. Tamayo, E. Turiel, A. Martín-Esteban, Molecularly imprinted polymers for solid-phase extraction and solid-phase microextraction: recent developments and future trends, J. Chromatogr. A 1152 (2007) 32–40. [341] S.S. Miao, M.S. Wu, H.G. Zuo, C. Jiang, S.F. Jin, Y.C. Lu, H. Yang, Core–shell magnetic molecularly imprinted polymers as sorbent for sulfonylurea herbicide residues, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 3634–3645. [342] T. Murakami, Y. Iwamuro, R. Ishimaru, S. Chinaka, H. Hasegawa, Molecularly imprinted polymer solid-phase extraction of synthetic cathinones from urine and whole blood samples, J. Sep. Sci. 41 (2018) 4506–4514. [343] C. Rui, J. He, Y. Li, Y. Liang, L. You, L. He, K. Li, S. Zhang, Selective extraction and enrichment of aflatoxins from food samples by mesoporous silica FDU-12 supported aflatoxins imprinted polymers based on surface molecularly imprinting technique, Talanta 201 (2019) 342–349. [344] T. Fodey, P. Leonard, J. O’Mahony, R. O’Kennedy, M. Danaher, Developments in the production of biological and synthetic binders for immunoassay and sensor-based detection of small molecules, TrAC - Trends Anal. Chem. 30 (2011) 254–269. [345] A. Rico-Yuste, S. Carrasco, Molecularly imprinted polymer-based hybrid materials for the development of optical sensors, Polymers 11 (2019) 1173. [346] L. Liu, X. Zhou, J.S. Wilkinson, P. Hua, B. Song, H. Shi, Integrated optical waveguide-based fluorescent immunosensor for fast and sensitive detection of microcystin-LR in lakes: optimization and analysis, Sci. Rep. 7 (2017) 3655. [347] Y. Saylan, A. Denizli, Molecular fingerprints of hemoglobin on a nanofilm chip, Sensors 18 (2018) 3016. [348] S. Carrasco, E. Benito-Peña, D.R. Walt, M.C. Moreno-Bondi, Fiber-optic array using molecularly imprinted microspheres for antibiotic analysis, Chem. Sci. 6 (2015) 3139–3147. [349] S. Xu, H. Lu, J. Li, X. Song, A. Wang, L. Chen, S. Han, Dummy molecularly imprinted polymers-capped CdTe quantum dots for the fluorescent sensing of 2,4,6- trinitrotoluene, ACS Appl. Mater. Interfaces 5 (2013) 8146–8154. Bibliografía 376 [350] P. S. Sharma, A. Wojnarowicz, W. Kutner, F. D’Souza (2016), Molecularly imprinted polymers as synthetic catalysts, en S. Li, S. Cao, S. Piletsky, A. P. F. Turner (Eds.) Molecularly imprinted catalysts: principle, synthesis, and applications, Elsevier, Ámsterdam, pp. 183–210. [351] G. Wulff, J. Liu, Design of biomimetic catalysts by molecular imprinting in synthetic polymers: the role of transition state stabilization, Acc. Chem. Res. 45 (2012) 239–247. [352] N.A. Peppas, Historical perspective on advanced drug delivery: how engineering design and mathematical modeling helped the field mature, Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (2013) 5–9. [353] S. Dhanashree, M. Priyanka, K. Manisha, K. Vilasrao, Molecularly Imprinted polymers: novel discovery for drug delivery, Curr. Drug Deliv. 13 (2016) 632–645. [354] F. Tashakori-Sabzevar, S.A. Mohajeri, Development of ocular drug delivery systems using molecularly imprinted soft contact lenses, Drug Dev. Ind. Pharm. 41 (2015) 703–713. [355] S.A. Zaidi, Latest trends in molecular imprinted polymer based drug delivery systems, RSC Adv. 6 (2016) 88807–88819. [356] P. Otero-Pazos, A. Rodríguez-Bernaldo de Quirós, R. Sendón, E. Benito-Peña, V. González-Vallejo, M. C. Moreno-Bondi, I. Angulo, P. Paseiro-Losada, Active food packaging based on molecularly imprinted polymers: study of the release kinetics of ferulic acid, J. Agric. Food Chem. 62 (2014) 11215–11221. [357] www.aecosan.msssi.gob.es (último acceso 01/09/2020). [358] R. Watson, V.R. Preedy (Eds.) (2019), Dietary interventions in gastrointestinal diseases: foods, nutrients and dietary supplements, Academic Press, Elsevier, Londres. [359] C. Ortolani, E.A. Pastorello, Food allergies and food intolerances, Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 20 (2006) 467–483. [360] S.G. Johansson, T. Bieber, R. Dahl, P. S. Friedmann, B.Q. Lanier, R. F. Lockey, C. Motala, J. A. Ortega Martell, T. A. Platts-Mills, J. Ring, F. Thien, P. Van Cauwenberge, H. C. Williams, Revised nomenclature for allergy for global use: report of the Nomenclature Review Committee of the World Allergy Organization, October 2003, J. Allergy Clin. Immunol. 113 (2004) 113, 832–836. [361] A. Rodríguez-Lara, M. Dolores Mesa, J. Aragón-Vela, R.A. Casuso, C.C. Vázquez, J.M. Zúñiga, J.R. Huertas, Acute/Subacute and sub-chronic oral toxicity of a hidroxytyrosol-rich virgin olive oil extract, Nutrients 11 (2019) 2133. http://www.aecosan.msssi.gob.es/ Bibliografía 377 [362] I.M. Vasconcelos, J.T.A. Oliveira, Antinutritional properties of plant lectins, Toxicon 44 (2004) 385–403. [363] N. Koppel, V.M. Rekdal, E.P. Balskus, Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota, Science 356 (2017) 1246–1257. [364] T. Martinović, U. Andjelković, M.Š. Gajdošik, D. Rešetar, D. Josić, Foodborne pathogens and their toxins, J. Proteomics 147 (2016) 226–235. [365] J.W. Bennett, M. Klich, Mycotoxins, Clin. Microbiol. Rev. 16 (2003) 497–516. [366] http://www.fao.org/food/food-safety-quality/a-z-index/mycotoxins/en/ (último acceso 01/09/2020). [367] W. P. Blount, Turkey “X” disease, Turkeys, 9 (1961) 52–54. [368] M. Sofie, C. Van Poucke, C.T.L. Detavernier, F. Dumoultn, M.D.E. Van Velde, E. Schoeters, S. Van Dyck, O. Averkieva, C. Van Peteghem, S. De Saeger, Occurrence of mycotoxins in feed as analyzed by a multi-mycotoxin LC-MS/MS method, J. Agric. Food Chem. 58 (2010) 66–71. [369] J.W. Bennett, M. Klich, Mycotoxins, Clin. Microbiol. Rev. 16 (2003) 497–516. [370] M.C. Smith, S. Madec, E. Coton, N. Hymery, Natural co-occurrence of mycotoxins in foods and feeds and their in vitro combined toxicological effects, Toxins 8 (2016) 94. [371] N. Magan, J. Lacey, Interactions between field, and storage fungi on wheat grain, Trans. Br. Mycol. Soc. 85 (1985) 29–37. [372] M. A. Klich, Aspergillus flavus: the major producer of aflatoxin, Mol. Plant Pathol. 8 (2007) 713–722. [373] M. Abrar, F.M. Anjum, M.S. Butt, I. Pasha, M.A. Randhawa, F. Saeed, K. Waqas, Aflatoxins: biosynthesis, occurrence, toxicity, and remedies, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 53 (2013) 862–874. [374] B. Caballero, P. Finglas, F. Toldra (Eds.) (2003), Encyclopedia of food sciences and nutrition, Academic Press, Londres. [375] S. Marchese, A. Polo, A. Ariano, S. Velotto, S. Costantini, L. Severino, Aflatoxin B1 and M1: Biological properties and their involvement in cancer development, Toxins 10 (2018) 214. [376] L. Reddy, K. Bhoola, Ochratoxins-food contaminants: Impact on human health, Toxins 2 (2010) 771–779. http://www.fao.org/food/food-safety-quality/a-z-index/mycotoxins/en/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20507532 Bibliografía 378 [377] M. Castegnaro, D. Canadas, T. Vrabcheva, T. Petkova-Bocharova, I.N. Chernozemsky, A. Pfohl-Leszkowicz, Balkan endemic nephropathy: Role of ochratoxins A through biomarkers, 50 Mol. Nutr. Food Res. (2006) 519–529. [378] S. Abid, W. Hassen, A. Achour, H. Skhiri, K. Maaroufi, F. Ellouz, E. Creppy, H. Bacha, Ochratoxin A and human chronic nephropathy in Tunisia: Is the situation endemic?, Hum. Exp. Toxicol. 22 (2003) 77–84 [379] W.C.A. Gelderblom, K. Jaskiewicz, W.F.O. Marasas, P.G. Thiel, R.M. Horak, R. Vleggaar, N.P.J. Kriek, Fumonisins - novel mycotoxins with cancer-promoting activity produced by Fusarium moniliforme, Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 1806–1811. [380] P.M. Scott, G.A. Lawrence, G.A. Lombaert, Studies on extraction of fumonisins from rice, corn-based foods and beans, Mycotoxin Res. 15 (1999) 50–60. [381] A.H. Merrill, M.C. Sullards, E. Wang, K.A. Voss, R.T. Riley, Sphingolipid metabolism: roles in signal transduction and disruption by fumonisins., Environ. Health Perspect. 109 (2001) 283–289. [382] M. Kamle, D.K. Mahato, S. Devi, K.E. Lee, S.G. Kang, P. Kumar, Fumonisins: impact on agriculture, food, and human health and their management strategies, Toxins 11 (2019) 328. [383] V. Maschietto, C. Colombi, R. Pirona, G. Pea, F. Strozzi, A. Marocco, L. Rossini, A. Lanubile, QTL mapping and candidate genes for resistance to Fusarium ear rot and fumonisin contamination in maize, BMC Plant Biol. 17 (2017) 20. [384] S.P. McCormick, A.M. Stanley, N.A. Stover, N.J. Alexander, Trichothecenes: From simple to complex mycotoxins, Toxins 3 (2011) 802–814. [385] M. Adhikari, B. Negi, N. Kaushik, A. Adhikari, A.A. Al-Khedhairy, N.K. Kaushik, E.H. Choi, T-2 mycotoxin: toxicological effects and decontamination strategies, Oncotarget 8 (2017) 33933–33952. [386] P. Sobrova, V. Adam, A. Vasatkova, M. Beklova, L. Zeman, R. Kizek, Deoxynivalenol and its toxicity, Interdiscip. Toxicol. 3 (2010) 94–99. [387] L. González-Osnaya, C. Cortés, J. M. Soriano, J. C. Moltó, J. Mañes, Occurrence of deoxynivalenol and T-2 toxin in bread and pasta commercialised in Spain, Food Chem. 124 (2011) 156–161. [388] L. Yang, Z. Yu, J. Hou, Y. Deng, Z. Zhou, Z. Zhao, J. Cui, Toxicity and oxidative stress induced by T-2 toxin and HT-2 toxin in broilers and broiler hepatocytes, Food Chem. Toxicol. 87 (2016) 128–137. Bibliografía 379 [389] F. Berthiller, C. Brera, C. Crews, M.H. Iha, R. Krska, V.M.T. Lattanzio, S. MacDonald, R.J. Malone, C. Maragos, M. Solfrizzo, J. Stroka, T.B. Whitaker, Developments in mycotoxin analysis: an update for 2014–2015, World Mycotoxin J. 9 (2016) 5–29. [390] T. Kuiper-Goodman, P.M. Scott, H. Watanabe, Risk assessment of the mycotoxin zearalenone, Regul. Toxicol. Pharmacol. 7 (1987) 253–306. [391] M. Poór, S. Kunsági-Máté, N. Sali, T. Koszegi, L. Szente, B. Peles-Lemli, Interactions of zearalenone with native and chemically modified cyclodextrins and their potential utilization, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 151 (2015) 63–68. [392] J.D. Ioi, T. Zhou, R. Tsao, M.F. Marcone, Mitigation of patulin in fresh and processed foods and beverages, Toxins 9 (2017) 157. [393] O. Puel, P. Galtier, I.P. Oswald, Biosynthesis and toxicological effects of patulin, Toxins 2 (2010) 613–631. [394] S.A.I. Wright, Patulin in food, Curr. Opin. Food Sci. 5 (2015) 105–109. [395] M. Magro, D.E. Moritz, E. Bonaiuto, D. Baratella, M. Terzo, P. Jakubec, O. Malina, K. Čépe, G.M.F. De Aragao, R. Zboril, F. Vianello, Citrinin mycotoxin recognition and removal by naked magnetic nanoparticles, Food Chem. 203 (2016) 505–512. [396] European Food Safety Authority, Scientific opinion on the risks for public and animal health related to the presence of citrinin in food and feed, EFSA Journal, 10 (2012) 2605. [397] E. Vanacloig-Pedros, M. Proft, A. Pascual-Ahuir, Different toxicity mechanisms for citrinin and ochratoxin a revealed by transcriptomic analysis in yeast, Toxins 8 (2016) 273. [398] V. E. F. Pinto, A. Patriarca, Alternaria species and their associated mycotoxins, Methods Mol. Biol. 1542 (2017) 13–32. [399] D.L. Hamilos, Allergic fungal rhinitis and rhinosinusitis, Proc. Am. Thorac. Soc. 7 (2010) 245–252. [400] S. Roussel, G. Reboux, A.P. Bellanger, S. Sornin, F. Grenouillet, J.C. Dalphin, R. Piarroux, L. Millon, Characteristics of dwellings contaminated by moulds, J. Environ. Monit. 10 (2008) 724–729. [401] T. Takigawa, B.L. Wang, N. Sakano, D.H. Wang, K. Ogino, R. Kishi, A longitudinal study of environmental risk factors for subjective symptoms associated with sick building syndrome in new dwellings, Sci. Total Environ. 407 (2009) 5223–5228. Bibliografía 380 [402] F. Massart, F. Micillo, G. Rivezzi, L. Perrone, A. Baggiani, M. Miccoli, V. Meucci, Zearalenone screening of human breast milk from the Naples area, Toxicol. Environ. Chem. 98 (2016) 128–136. [403] G.T. Liu, Y.Z. Qian, P. Zhang, Z.M. Dong, Z.Y. Shi, Y.Z. Zhen, J. Miao, Y.M. Xu, Relationships between Alternaria alternata and oesophageal cancer, IARC Sci. Publ. (1991) 258–262. [404] G.T. Liu, Y.Z. Qian, P. Zhang, W.H. Dong, Y.M. Qi, H.T. Guo, Etiological role of Alternaria alternata in human esophageal cancer., Chin. Med. J. 105 (1992) 394–400. [405] EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM), Scientific opinion on the risks for animal and public health related to the presence of Alternaria toxins in feed and food, EFSA J. 9 (2011) 2407. [406] D. Arcella, M. Eskola, J.A. Gómez Ruiz, Dietary exposure assessment to Alternaria toxins in the European population, EFSA J. 14 (2016) 4654. [407] M. Wenderoth, F. Garganese, M. Schmidt-Heydt, S.T. Soukup, A. Ippolito, S.M. Sanzani, R. Fischer, Alternariol as virulence and colonization factor of Alternaria alternata during plant infection, Mol. Microbiol. 112 (2019) 131–146. [408] A. Logrieco, A. Moretti, M. Solfrizzo, Alternaria toxins and plant diseases: an overview of origin, occurrence and risks, World Mycotoxin J. 2 (2009) 129–140. [409] M.Á. Pavón Moreno, I. González Alonso, R. Martín de Santos, T. García Lacarra, Importancia del género Alternaria como productor de micotoxinas y agente causal de enfermedades humanas, Nutr. Hosp. 27 (2012) 1772–1781. [410] C. Schmutz, E. Cenk, D. Marko, The Alternaria mycotoxin alternariol triggers the immune response of IL-1β-stimulated, differentiated Caco-2 cells, Mol. Nutr. Food Res. 63 (2019) 1900341. [411] E.J. Schoevers, R.R. Santos, B.A.J. Roelen, Alternariol disturbs oocyte maturation and preimplantation development, Mycotoxin Res. 36 (2020) 93–101. [412] M. Bansal, N. Singh, S. Alam, S. Pal, G.N.V. Satyanarayana, D. Singh, K.M. Ansari, Alternariol induced proliferation in primary mouse keratinocytes and inflammation in mouse skin is regulated via PGE2/EP2/cAMP/p-CREB signaling pathway, Toxicology 412 (2019) 79–88. [413] A. Patriarca, V. Fernández Pinto (2018), Alternaria en Reference module in food science, Elsevier, pp. 1–8. Bibliografía 381 [414] V.L. Pereira, J.O. Fernandes, S.C. Cunha, Mycotoxins in cereals and related foodstuffs: a review on occurrence and recent methods of analysis, Trends Food Sci. Technol. 36 (2014) 96–136. [415] G. D’Arco, M. Fernández-Franzón, G. Font, P. Damiani, J. Mañes, Analysis of fumonisins B1, B2 and B3 in corn-based baby food by pressurized liquid extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1209 (2008) 188– 194. [416] E. Pérez-Torrado, J. Blesa, J.C. Moltó, G. Font, Pressurized liquid extraction followed by liquid chromatography-mass spectrometry for determination of zearalenone in cereal flours, Food Control 21 (2010) 399–402. [417] J. L. Urraca, E. Benito-Peña, C. Pérez-Conde, M. C. Moreno-Bondi, J. J. Pestka, Analysis of zearalenone in cereal and swine feed samples using an automated flow- through immunosensor, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 3338–3344. [418] A. Desmarchelier, J.M. Oberson, P. Tella, E. Gremaud, W. Seefelder, P. Mottier, Development and comparison of two multiresidue methods for the analysis of 17 mycotoxins in cereals by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry, J. Agric. Food Chem. 58 (2010) 7510–7519. [419] R. Perestrelo, P. Silva, P. Porto-Figueira, J.A.M. Pereira, C. Silva, S. Medina, J.S. Câmara, QuEChERS - Fundamentals, relevant improvements, applications and future trends, Anal. Chim. Acta 1070 (2019) 1–28. [420] J. Tolosa, F.J. Barba, G. Font, E. Ferrer, Mycotoxin incidence in some fish products: QuEChERS methodology and liquid chromatography linear ion trap tandem mass spectrometry approach, Molecules 24 (2019) 527. [421] S. Ma, M. Wang, T. You, K. Wang, Using magnetic multiwalled carbon nanotubes as modified QuEChERS adsorbent for simultaneous determination of multiple mycotoxins in grains by UPLC-MS/MS, J. Agric. Food Chem. 67 (2019) 8035–8044. [422] Á. Tölgyesi, Z. Kunsági, Quantification of T-2 and HT-2 mycotoxins in cereals by liquid chromatography-multimode ionization-tandem mass spectrometry, Microchem. J. 106 (2013) 300–306. [423] J.D. di Mavungu, S. Monbaliu, M.L. Scippo, G. Maghuin-Rogister, Y.J. Schneider, Y. Larondelle, A. Callebaut, J. Robbens, C. van Peteghem, S. de Saeger, LC-MS/MS multi-analyte method for mycotoxin determination in food supplements, Food Addit. Contam. Part A 26 (2009) 885–895. Bibliografía 382 [424] M. Klötzel, U. Lauber, H.U. Humpf, A new solid phase extraction clean-up method for the determination of 12 type A and B trichothecenes in cereals and cereal-based food by LC-MS/MS, Mol. Nutr. Food Res. 50 (2006) 261–269. [425] N. W. Turner, S. Subrahmanyam, S. Piletsky, Analytical methods for determination of mycotoxins: a review, Anal. Chim. Acta 632, (2009) 168–180. [426] M. Castegnaro, M. Tozlovanu, C. Wild, A. Molinié, A. Sylla, A. Pfohl-Leszkowicz, Advantages and drawbacks of immunoaffinity columns in analysis of mycotoxins in food, Mol. Nutr. Food Res. 50 (2006) 480–487. [427] G.D.T.M. Jayasinghe, R. Domínguez-González, P. Bermejo-Barrera, A. Moreda- Piñeiro, Ultrasound assisted combined molecularly imprinted polymer for the selective micro-solid phase extraction and determination of aflatoxins in fish feed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1609 (2019) 460431. [428] M.E. Flores-Flores, E. González-Peñas, An LC–MS/MS method for multi- mycotoxin quantification in cow milk, Food Chem. 218 (2017) 378–385. [429] E. Moez, D. Noel, S. Brice, G. Benjamin, A. Pascaline, M. Didier, Aptamer assisted ultrafiltration cleanup with high performance liquid chromatography-fluorescence detector for the determination of OTA in green coffee, Food Chem. 310 (2019) 125851. [430] N. Ndube, L. van der Westhuizen, I.R. Green, G.S. Shephard, HPLC determination of fumonisin mycotoxins in maize: A comparative study of naphthalene-2,3- dicarboxaldehyde and o-phthaldialdehyde derivatization reagents for fluorescence and diode array detection, J. Chromatogr. B 879 (2011) 2239–2243. [431] P. Pokrzywa, E. Cieślik, M. Surma, Effect of storage conditions on the formation of type a and b trichothecenes in cereal products, Ann. Agric. Environ. Med. 26 (2019) 260– 265. [432] R. Montes, R. Segarra, M.Á. Castillo, Trichothecenes in breakfast cereals from the Spanish retail market, J. Food Compost. Anal. 27 (2012) 38–44. [433] E.K. Tangni, J.C. Motte, A. Callebaut, L. Pussemier, Cross-reactivity of antibodies in some commercial deoxynivalenol test kits against some fusariotoxins, J. Agric. Food Chem. 58 (2010) 12625–12633. [434] L. Anfossi, F. Di Nardo, S. Cavalera, C. Giovannoli, G. Spano, E.S. Speranskaya, I.Y. Goryacheva, C. Baggiani, A lateral flow immunoassay for straightforward determination of fumonisin mycotoxins based on the quenching of the fluorescence of CdSe/ZnS quantum dots by gold and silver nanoparticles, Microchim. Acta 185 (2018) 94. Bibliografía 383 [435] https://www.romerlabs.com/en/products/test-kits/mycotoxin-test-kits/ (último acceso 01/09/2020). [436] E.J. Llorent-Martínez, M.P. Fernández-Poyatos, A. Ruiz-Medina, Automated fluorimetric sensor for the determination of zearalenone mycotoxin in maize and cereals feedstuff, Talanta 191 (2019) 89–93. [437] L. Lu, R. Seenivasan, Y.C. Wang, J.H. Yu, S. Gunasekaran, An electrochemical immunosensor for rapid and sensitive detection of mycotoxins fumonisin B1 and deoxynivalenol, Electrochim. Acta 213 (2016) 89–97. [438] S. Di Giovanni, V. Zambrini, A. Varriale, S. D’Auria, Sweet sensor for the detection of aflatoxin M1 in whole milk, ACS Omega 4 (2019) 12803–12807. [439] I.J. Goldstein, R.C. Hughes, M. Monsigny, T. Osawa, N. Sharon, What should be called a lectin?, Nature 285 (1980) 66. [440] N. Sharon, History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules, Glycobiology 14 (2004) 53–62. [441] S. Olsnes, The history of ricin, abrin and related toxins, Toxicon 44 (2004) 361–70. [442] H. Puntscher, I. Cobankovic, D. Marko, B. Warth, Quantitation of free and modified Alternaria mycotoxins in European food products by LC-MS/MS, Food Control 102 (2019) 157–165. [443] D.B. Kim, N.E. Song, T.G. Nam, S. Lee, D. Seo, M. Yoo, Occurrence of emerging mycotoxins in cereals and cereal-based products from the Korean market using LC- MS/MS, Food Addit. Contam. Part A 36 (2019) 289–295. [444] C.Y. Yao, Z.L. Xu, H. Wang, F. Zhu, L. Luo, J.Y. Yang, Y.M. Sun, H.T. Lei, Y.X. Tian, Y.D. Shen, High affinity antibody based on a rationally designed hapten and development of a chemiluminescence enzyme immunoassay for quantification of Alternariol in fruit Juice, maize and flour, Food Chem. 283 (2019) 359–366. [445] W. Jia, L. Shi, F. Zhang, C. Fan, J. Chang, X. Chu, Multiplexing data independent untargeted workflows for mycotoxins screening on a quadrupole-Orbitrap high resolution mass spectrometry platform, Food Chem. 278 (2019) 67–76. [446] X. Qiao, J. Yin, Y. Yang, J. Zhang, B. Shao, H. Li, H. Chen, Determination of Alternaria mycotoxins in fresh sweet cherries and cherry-based products: method validation and occurrence, J. Agric. Food Chem. 66 (2018) 11846–11853. https://www.romerlabs.com/en/products/test-kits/mycotoxin-test-kits/ Bibliografía 384 [447] C. Wang, Y. Fan, W. He, D. Hu, A. Wu, W. Wu, Development and application of a QuEChERS-based liquid chromatography tandem mass spectrometry method to quantitate multi-component alternaria toxins in jujube, Toxins 10 (2018) 382. [448] H. Dong, Y. Xian, K. Xiao, Y. Wu, L. Zhu, J. He, Development and comparison of single-step solid phase extraction and QuEChERS clean-up for the analysis of 7 mycotoxins in fruits and vegetables during storage by UHPLC-MS/MS, Food Chem. 274 (2019) 471–479. [449] J. Wang, T. Peng, X. Zhang, K. Yao, Y. Ke, B. Shao, Z. Wang, J. Shen, H. Jiang, A novel hapten and monoclonal antibody-based indirect competitive ELISA for simultaneous analysis of alternariol and alternariol monomethyl ether in wheat, Food Control 94 (2018) 65–70. [450] H. Puntscher, M.L. Kütt, P. Skrinjar, H. Mikula, J. Podlech, J. Fröhlich, D. Marko, B. Warth, Tracking emerging mycotoxins in food: development of an LC-MS/MS method for free and modified Alternaria toxins, Anal. Bioanal. Chem. 410 (2018) 4481–4494. [451] D. Sun, N. Qiu, S. Zhou, B. Lyu, S. Zhang, J. Li, Y. Zhao, Y. Wu, Development of sensitive and reliable UPLC-MS/MS methods for food analysis of emerging mycotoxins in China total diet study, Toxins 11 (2019) 166. [452] W. Guo, K. Fan, D. Nie, J. Meng, Q. Huang, J. Yang, Y. Shen, E.K. Tangni, Z. Zhao, Y. Wu, Z. Han, Development of a QuEChERS-based UHPLC-MS/MS method for simultaneous determination of six Alternaria toxins in grapes, Toxins 11 (2019) 87. [453] Y. Zhang, H. Li, J. Zhang, B. Shao, Determination of Alternaria toxins in drinking water by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, Environ. Sci. Pollut. Res. 26 (2019) 22485–22493. [454] W.M. Watkins, W.T.J. Morgan, Neutralization of the anti-H agglutinin in eel serum by simple sugars, Nature 169 (1952) 825–826. [455] W.C. Boyd, E. Shapleigh, Diagnosis by subgroups of blood groups A and AB by use of plant agglutinins (lectins), J. Lab. Clin. Med. 44 (1954) 235–237. [456] A.B. Boraston, D.N. Bolam, H.J. Gilbert, G.J. Davies, Carbohydrate-binding modules: Fine-tuning polysaccharide recognition, Biochem. J. 382 (2004) 769–781. [457] W.J. Peumans, E.J. Van Damme, Lectins as plant defense proteins, Plant Physiol. 109 (1995) 347–352. [458] M.E. Etzler, G. Kalsi, N.N. Ewing, N.J. Roberts, R.B. Day, A nod factor binding lectin with apvrase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (1999) 5856–5861. Bibliografía 385 [459] S. Ménard, N. Cerf-Bensussan, M. Heyman, Multiple facets of intestinal permeability and epithelial handling of dietary antigens, Mucosal Immunol. 3 (2010) 247– 259. [460] H. Fekadu Gemede, Antinutritional factors in plant foods: potential health benefits and adverse effects, Int. J. Nutr. Food Sci. 3 (2014) 284. [461] E. J. M. Van Damme, N. Lannoo, W.J. Peumans (2008), Plant lectins, en: J.C. Kader, M. Delseny (Eds.), Advances in botanical research, Elsevier, pp. 107–209. [462] I. Lagarda-Diaz, A.M. Guzman-Partida, L. Vazquez-Moreno, Legume lectins: proteins with diverse applications, Int. J. Mol. Sci. 18 (2017) 1242. [463] N.R. Chandra, M.M. Prabu, K. Suguna, M. Vijayan, Structural similarity and functional diversity in proteins containing the legume lectin fold, Protein Eng. Des. Sel. 14 (2001) 857–866. [464] R.D. Leavitt, R.L. Felsted, N.R. Bachur, Biological and biochemical properties of Phaseolus vulgaris isolectins, J. Biol. Chem. 252 (1977) 2961–2966. [465] L.M. Hoffman, D.D. Donaldson, Characterization of two Phaseolus vulgaris phytohemagglutinin genes closely linked on the chromosome., EMBO J. 4 (1985) 883– 889. [466] Y. Kaneda, R.F. Whittier, H. Yamanaka, E. Carredano, M. Gotoh, H. Sota, Y. Hasegawa, Y. Shinohara, The high specificities of Phaseolus vulgaris erythro- and leukoagglutinating lectins for bisecting GlcNAc or β1-6-linked branch structures, respectively, are attributable to loop B, J. Biol. Chem. 277 (2002) 16928–16935. [467] http://www.rcsb.org/structure/3WCR (último acceso 01/09/2020). [468] http://www.rcsb.org/structure/1FAT (último acceso 01/09/2020). [469] H. Rüdiger, H.J. Gabius, Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications., Glycoconj. J. 18 (2001) 589–613. [470] K. Miyake, T. Tanaka, P.L. McNeil, Lectin-based food poisoning: A new mechanism of protein toxicity, PLoS One 2 (2007) e687. [471] S. Kumar, A.K. Verma, M. Das, S.K. Jain, P.D. Dwivedi, Clinical complications of kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) consumption, Nutrition 29 (2013) 821–827. [472] D. Kruszewska, P. Kiela, Å. Ljungh, K.H. Erlwanger, B.R. Weström, A. Linderoth, S.G. Pierzynowski, Enteral crude red kidney bean (Phaseolus vulgaris) lectin - Phytohemagglutinin - Induces maturational changes in the enterocyte membrane proteins of suckling rats, Biol. Neonate. 84 (2003) 152–158. http://www.rcsb.org/structure/3WCR http://www.rcsb.org/structure/1FAT Bibliografía 386 [473] J.G. Banwell, R. Howard, I. Kabir, J.W. Costerton, Bacterial overgrowth in indigenous microflora in the phytohemagglutinin-fed rat, Can. J. Microbiol. 34 (1988) 1009–1013. [474] K. Kunzelmann, J. Sun, R. Schreiber, J. König, Effects of dietary lectins on ion transport in epithelia, Br. J. Pharmacol. 142 (2004) 1219–1226. [475] J.G. Banwell, C.R. Abramowsky, F. Weber, R. Howard, D.H. Boldt, Phytohemagglutinin-induced diarrheal disease, Dig. Dis. Sci. 29 (1984) 921–929. [476] K. A. Lampel, S. Al-Khadi, S. M. Cahill (Eds.) (2004), Bad Bug Book FDA. Foodborne pathogenic microorganisms and natural toxins handbook. [477] https://www.euskadi.eus/contenidos/informacion/boletin_epidemiologico/es_def/ adjuntos/18bolepidemiol_c.pdf (último acceso 01/09/2020). [478] L. Celleno, M.V. Tolaini, A. D’Amore, N. V. Perricone, H.G. Preuss, A dietary supplement containing standardized Phaseolus vulgaris extract influences body composition of overweight men and women, Int. J. Med. Sci. 4 (2007) 45–52. [479] Y. Sun, J. Liu, Y. Huang, M. Li, J. Lu, N. Jin, Y. He, B. Fan, Phytohemagglutinin content in fresh kidney bean in China, Int. J. Food Prop. 22 (2019) 405–413. [480] A. Nasi, G. Picariello, P. Ferranti, Proteomic approaches to study structure, functions and toxicity of legume seeds lectins. Perspectives for the assessment of food quality and safety, J. Proteomics 72 (2009) 527–538. [481] S. He, B.K. Simpson, H. Sun, M.O. Ngadi, Y. Ma, T. Huang, Phaseolus vulgaris lectins: a systematic review of characteristics and health implications, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 58 (2018) 70–83. [482] M. Muzquiz, C. Burbano, G. Ayet, M. M. Pedrosa, C. Cuadrado, The investigation of antinutritional factors in Phaseolus vulgaris. Environmental and varietal differences, Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 3 (1999) 210–216. [483] A. Einhauer, A. Jungbauer, The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J. Biochem. Biophys. Methods 49 (2001) 455–465. [484] http://karstenolaf.free.fr/Imprinting.html (último acceso 07/09/2020). [485] J. Britton, R.P. Dyer, S. Majumdar, C.L. Raston, G.A. Weiss, Ten-minute protein purification and surface tethering for continuous-flow biocatalysis, Angew. Chem. Int. Ed. 56 (2017) 2296–2301. [486] L.T. Zhuravlev, V. V. Potapov, Density of silanol groups on the surface of silica precipitated from a hydrothermal solution, Russ. J. Phys. Chem. A 80 (2006) 1119–1128. http://karstenolaf.free.fr/Imprinting.html Bibliografía 387 [487] B.M. Grommersch, J. Pant, S.P. Hopkins, M.J. Goudie, H. Handa, Biotemplated synthesis and characterization of mesoporous nitric oxide-releasing diatomaceous earth silica particles, ACS Appl. Mater. Interfaces 10 (2018) 2291–2301. [488] E.F. Vansant, P. Van Der Voort, K.C. Vrancken (Eds.) (1995), Characterization and chemical modification of the silica surface, Elsevier, Ámsterdam. [489] G. T. Hermanson (Ed.) (2013), Bioconjugate Techniques, Elsevier, Ámsterdam. [490] P.T. Wingfield, Use of protein folding reagents, Curr. Protoc. Protein Sci. 84 (2016) A.3A.1–A.3A.8. [491] R. Mallik, C. Wa, D.S. Hage, Development of sulfhydryl-reactive silica for protein immobilization in high-performance affinity chromatography, Anal. Chem. 79 (2007) 1411–1424. [492] A. Ciogli, P. Simone, C. Villani, F. Gasparrini, A. Laganà, D. Capitani, N. Marchetti, L. Pasti, A. Massi, A. Cavazzini, Revealing the fine details of functionalized silica surfaces by solid-state NMR and adsorption isotherm measurements: the case of fluorinated stationary phases for liquid chromatography, Chem. Eur. J. 20 (2014) 8138– 8148. [493] M. Zhu, M.Z. Lerum, W. Chen, How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica, Langmuir 28 (2012) 416–423. [494] N. García, E. Benito, J. Guzmán, P. Tiemblo, Use of p-toluenesulfonic acid for the controlled grafting of alkoxysilanes onto silanol containing surfaces: Preparation of tunable hydrophilic, hydrophobic, and super-hydrophobic silica, J. Am. Chem. Soc. 129 (2007) 5052–5060. [495] N. García, E. Benito, P. Tiemblo, M.M.B. Hasan, A. Synytska, M. Stamm, Chemically guided topography in alkylsilane- and oligosiloxane-modified silica nanoparticle coatings: From very hydrophobic surfaces to “pearl” bouncing droplets, Soft Matter 6 (2010) 4768–4776. [496] B. Arkles, Y. Pan, G. Larson, D. Berry (2004), Cyclic azasilanes: volatile coupling agents for nanotechnology, en K. L. Mittal (Ed.), Silanes and other coupling agents, CRC Press, Boca Raton. [497] M. Thommes, K. Kaneko, A. V. Neimark, J.P. Olivier, F. Rodriguez-Reinoso, J. Rouquerol, K.S.W. Sing, Physisorption of gases, with special reference to the evaluation of surface area and pore size distribution (IUPAC Technical Report), Pure Appl. Chem. 87 (2015) 1051–1069. Bibliografía 388 [498] V. Ostry, Alternaria mycotoxins: an overview of chemical characterization, producers, toxicity, analysis and occurrence in foodstuffs , World Mycotoxin J. 1 (2008) 175–188. [499] E. Benito-Peña, V. González-Vallejo, A. Rico-Yuste, L. Barbosa-Pereira, J. M. Cruz, A. Bilbao, C. Álvarez-Lorenzo, M. C. Moreno-Bondi, Molecularly imprinted hydrogels as functional active packaging materials, Food Chem. 190 (2016) 487–494. [500] J. L. Urraca, M. C. Moreno-Bondi, A. J. Hall, B. Sellergren, Direct extraction of penicillin G and derivatives from aqueous samples using a stoichiometrically imprinted polymer, Anal Chem. 79 (2007) 695–701. [501] A. Rico-Yuste, J. Walravens, J.L. Urraca, R.A.G. Abou-Hany, A.B. Descalzo, G. Orellana, M. Rychlik, S. De Saeger, M.C. Moreno-Bondi, Analysis of alternariol and alternariol monomethyl ether in foodstuffs by molecularly imprinted solid-phase extraction and ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, Food Chem. 243 (2018) 357–364. [502] A.M. Rampey, R.J. Umpleby, G.T. Rushton, J.C. Iseman, R.N. Shah, K.D. Shimizu, Characterization of the imprint effect and the influence of imprinting conditions on affinity, capacity, and heterogeneity in molecularly imprinted polymers using the Freundlich isotherm-affinity distribution analysis, Anal. Chem. 76 (2004) 1123–1133. [503] J.L. Urraca, M.D. Marazuela, E.R. Merino, G. Orellana, M.C. Moreno-Bondi, Molecularly imprinted polymers with a streamlined mimic for zearalenone analysis, J. Chromatogr. A 1116 (2006) 127–134. [504] A. G. Mayes, M. J. Whitcombe, Synthetic strategies for the generation of molecularly imprinted organic polymers, Adv. Drug Deliv. Rev. 57 (2005) 1742–1778. [505] D. Arcella, M. Eskola, J.A. Gómez Ruiz, Dietary exposure assessment to Alternaria toxins in the European population, EFSA J. 14 (2016) 4654. [506] A. Mustafa, C. Turner, Pressurized liquid extraction as a green approach in food and herbal plants extraction: A review, Anal. Chim. Acta 703 (2011) 8–18. [507] P.M. Scott, W. Zhao, S. Feng, B.P.Y. Lau, Alternaria toxins alternariol and alternariol monomethyl ether in grain foods in Canada, Mycotoxin Res. 28 (2012) 261– 266. [508] A. Hengerer, C. Kösslinger, J. Decker, S. Hauck, I. Queitsch, H. Wolf, S. Dübel, Determination of phage antibody affinities to antigen by a microbalance sensor system, BioTechniques 26 (1999) 956–964. Bibliografía 389 [509] A. Hengerer, J. Decker, E. Prohaska, S. Hauck, C. Kößlinger, H. Wolf, Quartz crystal microbalance (QCM) as a device for the screening of phage libraries, Biosens. Bioelectron. 14 (1999) 139–144. [510] F. Niccheri, F. Real‐ Fernández, M. Ramazzotti, F. Lolli, G. Rossi, P. Rovero, D. Degl'Innocenti, Human recombinant domain antibodies against multiple sclerosis antigenic peptideCSF114(Glc), J. Mol. Recognit. 27 (2014) 618–626. [511] S. A. Dass, M. N. Norazmi, A. Acosta Dominguez, M. E. S. García San Miguel, G. J. Tye, Generation of a T cell receptor (TCR)-like single domain antibody (sDAb) against a Mycobacterium Tuberculosis (Mtb) heat shock protein (HSP) 16kDa antigen presented by Human Leukocyte Antigen (HLA)-A*02, Molecular Immunology 101 (2018) 189–196. [512] M. Zourob (Ed.) (2010), Recognition receptors in biosensors; Springer, Berlin, Heidelberg. [513] T. Clackson, H.B. Lowman (Eds.) (2004), Phage display: a practical approach, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido. [514] G. Winter, Harnessing Evolution to Make Medicines (Nobel Lecture), Angew. Chem. Int. Ed. 58 (2019) 14438–14445. [515] S. de la Cruz, C. Cubillos-Zapata, I. M. López-Calleja, S. Ghosh, M. Alcocer, I. González, R. Martín, T. García, Isolation of recombinant antibody fragments (scFv) by phage display technology for detection of almond allergens in food products, Food Control 54 (2015) 322–330. [516] R. Kontermann, S. Dübel (Eds.) (2001), Antibody engineering, Springer, Berlin, Heidelberg. [517] G. García-Martinez, E. A. Bustabad, H. Perrot, C. Gabrielli, B. Bucur, M. Lazerges, D. Rose, L. Rodriguez-Pardo, J. Fariña, C. Compère, A. Arnau Vives, Development of a mass sensitive quartz crystal microbalance (QCM)-based DNA biosensor using a 50 MHz electronic oscillator circuit, Sensors 11 (2011) 7656–7664. [518] M. Andersson, J. Andersson, A. Sellborn, M. Berglin, B. Nilsson, H. Elwing, Quartz crystal microbalance-with dissipation monitoring (QCM-D) for real time measurements of blood coagulation density and immune complement activation on artificial surfaces, Biosens. Bioelectron. 21 (2005) 79–86. [519] Q. Ashton Acton (Ed.) (2013), Immunoglobulins-advances in research and application, ScholarlyEditions, Atlanta, GA. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10101836 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10101836 Bibliografía 390 [520] M. H. V. van Regenmortel, A. Azimzadeh, Determination of antibody affinity, J. Immunoassay 21 (2000), 211–234. Anexos 393 7.1. Anexo I A continuación, se recoge el listado de publicaciones científicas relacionadas con la presente Tesis Doctoral: 1. R. A.G. Abou-Hany, J. L. Urraca, A. B. Descalzo, L. N. Gómez-Arribas, M. C. Moreno-Bondi, G. Orellana, Tailoring molecularly imprinted polymer beads for alternariol recognition and analysis by a screening with mycotoxin surrogates, J. Chromatogr. A 1425 (2015) 231−239. 2. L. N. Gómez-Arribas, E. Benito-Peña, M. C. Hurtado-Sánchez, M. C. Moreno- Bondi, Biosensing based on nanoparticles for food allergens detection, Sensors 18 (2018) 1087. 3. A. Rico-Yuste, L. N. Gómez-Arribas, M.C. Pérez-Conde, J. L. Urraca, M.C. Moreno-Bondi, Rapid determination of Alternaria mycotoxins in tomato samples by pressurised liquid extraction coupled to liquid chromatography with fluorescence detection, Food Addit. Contam. Part A 35 (2018) 2175−2182. 4. L. N. Gómez-Arribas, J. L. Urraca, E. Benito-Peña, M.C. Moreno-Bondi, Tag- specific affinity purification of recombinant proteins by using molecularly imprinted polymers, Anal. Chem. 91 (2019) 4100−4106. 5. L. N. Gómez-Arribas, M. Darder, N. García, Y. Rodriguez, J. L. Urraca, M. C. Moreno-Bondi, Hierarchically imprinted polymer for peptide tag recognition based on an oriented surface epitope approach, ACS Appl. Mater. Interfaces 12 (2020) 49111−49121. 6. L. N. Gómez-Arribas, A. Juste-Dolz, R. Peltomaa, D. Giménez-Romero, S. Morais, R. Barderas, C. Cuadrado, Á. Maquieira, E. Benito-Peña, M. C. Moreno-Bondi, Multi-parameter evaluation strategy of phage-displayed VH fragments based on quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, (artículo en preparación). Portada AGRADECIMIENTOS Índice Abreviaturas y símbolos Resumen Summary 1. Introduccion 2. Objetivos 3. Publicaciones científicas 3.1. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo depéptidos y proteínas mediante la aproximación del epítopo 3.1.1. Publicación I: Tag-specific affinity purification of recombinant proteins byusing molecularly imprinted polymers 3.1.2. Publicación II: Hierarchically imprinted polymer for peptide tag recognitionbased on an oriented surface epitope approach 3.2. Polímeros de impronta molecular para el análisis de micotoxinas enalimentos 3.2.1. Publicación III: Tailoring molecularly imprinted polymer beads foralternariol recognition and analysis by a screening with mycotoxin surrogates 3.3. Descubrimiento de fragmentos de anticuerpo VH mediante tecnologíaphage display selectivos a la fitohemaglutinina y su clasificación acorde auna estrategia multiparamétrica 4. Discusión integradora 5. Conclusiones 6. Bibliografía 7. Anexos