UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS TESIS DOCTORAL Caracterización estructural y funcional de la anexina A2 humana. Disección molecular de los mecanismos de agregación de membranas MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Francisco José Martínez Carmona DIRECTOR Francisco Javier Turnay Abad © Francisco José Martínez Carmona, 2023 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina TESIS DOCTORAL Caracterización estructural y funcional de la anexina A2 humana. Disección molecular de los mecanismos de agregación de membranas MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Francisco José Martínez Carmona Director: Francisco Javier Turnay Abad Madrid, 2023 A mis padres, a mi famila Esta investigación se ha realizado en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Químicas, de la Universidad Complutense de Madrid, bajo la dirección del Dr. Javier Turnay Abad, a quien quiero agradecer su infinita paciencia, su inagotable e incondicional ayuda, todos los conocimientos transmitidos tanto a nivel pedagógico, como docente e investigador, así como su gran esfuerzo y dedicación, desde el primer hasta el último momento. Quiero recordar de manera muy especial a la Dra. María Antonia Lizarbe por la inestimable ayuda y apoyo que me ofreció en todo momento, asimismo quiero agradecer también a la Dra. Nieves Olmo todos los consejos, orientaciones y la atención que me ha prestado. Quisiera agradecer a mis compañeros con los que he compartido laboratorio (Juan Carlos, Michel, Jorge…) durante todo este tiempo, toda la ayuda que me han proporcionado y buenos momentos que hemos pasado. No puedo dejar de dar las gracias a todos cuantos me han apoyado y animado, mi hermana Juani, Norma, mis amigos. Y con todo mi cariño a María, quien me animó a iniciar esta aventura, y a mis hijos, Fernando, Irene, María y Francisco por toda la comprensión y tiempo que me han regalado. ABREVIATURAS ABC: ATP binding cassette; transportador dependiente de ATP ACE2: Receptor de la enzima convertidora de la angiotensina ALXR: Receptor de lipoxina A4 BS3: Bis(sulfosuccinimidil)suberato BTV: Blue Tongue Virus; virus de la lengua azul CCA: Convex Constrait Algorithm CD: Dicroísmo circular CD11b: Cadena α de la integrina β2 CD63: Glicoproteína 3 asociada a la membrana lisosómica CMV: Citomegalovirus CSFV: Classical swine fever virus; virus de la peste porcina clásica DTT: 1,4-ditiotreitol ECL: Enhanced ChemiLumniniscence; quimioluminiscencia mejorada EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico EGTA: Ácido etilenglicol-bis(β-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-tetraacético ELA: Esclerosis lateral amiotrófica EMT: transición epitelio-mesénquima ERK: Extracellular signal‐Regulated Kinase EGTA: Ácido etilenglicol-bis(β-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-tetraacético EV71: Enterovirus 71 FPR: Receptor de péptidos formilados GPS: Glicerofosfoserina HCV: Virus de la hepatitis C HIV‐1: Virus de la inmunodeficiencia humana 1 HK2: Células epiteliales renales humanas HRP: Peroxidasa de rábano IAV: Virus de la gripe A ILK: Integrin ligated kinase; quinasa ligada a integrinas IP3: Inositol-1,4,5-trisfosfato IP3R: Receptor de IP3 IPTG: Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido KSV: Constante de Stern-Volmer LB: Lysogenic Broth (medio de cultivo bacteriano) LDL: Lipoproteína de baja densidad lncRNA: RNA largo no codificante LUVs: Large Unilamellar Vesicles; vesículas unilamelares grandes MAP: Proteínas asociadas a microtúbulos MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase; proteína quinasa activada por mitógeno MDCK: Madin‐Darby Canine Kidney MEK: MAPK‐Extracellular signal‐Regulated Kinase Kinase; MAPK y ERK quinasa MOPS: Ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico MV: Measles virus; virus del sarampión NAC: N‐acetilcisteína NES: Secuencia de exportación nuclear NFκB: Factor nuclear κB NMDA: N-metil-D-aspartato NTA: Ácido nitrilotriacético PA: Ácido fosfatídico PAGE: Electroforesis en geles de poliacrilamida PC: Fosfatidilcolina PDB: Protein Data Bank PE: Fosfatidiletanolamina PI: Fosfatidilinositol PIP2: Fosfatidilinositol bisfosfato PKC: Proteína quinasa C PLA2: Fosfolipasa A2 PMCA: Plasma Membrane Calcium Pump PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PRP: Primer recognition protein PRRSV: Virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino PS: Fosfatidilserina RSV: Virus respiratorio sincitial rTEV: Proteasa recombinante del virus del mosaico del tabaco RT‐PCR: Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real SARS‐CoV‐2: Coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo SDS: Dodecilsulfato sódico SERCA: ATPasa de calcio del retículo sarcoendoplásmico SNARE: Receptor de proteínas de fijación de NSF soluble (implicadas en la fusión de membranas) SOC: Canales de calcio dependientes de depósito STAT3: Transductor de señal y activador de la transcripción 3 TAE: Tampón Tris-acetato-EDTA TBS: Tris buffered saline; Disolución salina con tampón Tris TfB: Tampón de transformación TLR4: Receptor tipo Toll 4 Tm: Temperaturade fusión (desnaturalización) tPA: Activador del plasminógeno tisular UV: Ultravioleta UTR: Región no traducida VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular VPH: Virus del papiloma humano ÍNDICE ÍNDICE Índice i ÍNDICE RESUMEN / SUMMARY......................................................................................................... 1 1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................. 7 1.1. LA SUPERFAMILIA MULTIGÉNICA DE LAS ANEXINAS........................................ 9 1.2. ESTRUCTURA GENERAL DE LAS ANEXINAS........................................................... 14 1.2.1. El núcleo proteico ....................................................................................................... 16 1.2.2. El dominio N-terminal .............................................................................................. 20 1.2.3. Interacciones de las anexinas ................................................................................ 27 1.3. FUNCIONES DE LAS ANEXINAS ..................................................................................... 29 1.3.1. Anexinas intracelulares ........................................................................................... 30 1.3.2. Anexinas extracelulares ........................................................................................... 41 1.4. LA ANEXINA A2 ...................................................................................................................... 43 1.4.1. Estructura de la anexina A2 humana ................................................................. 43 1.4.2. Funciones de la anexina A2 .................................................................................... 49 1.4.3. Funciones extracelulares de la anexina A2 ..................................................... 51 1.4.4. Funciones intracelulares de la anexina A2 ...................................................... 54 2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 59 3. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 63 NOMENCLATURA Y PROPIEDADES DE LAS VARIANTES DE ANEXINA A2 ..... 65 TAMPONES Y MEDIOS DE CULTIVO .................................................................................... 66 3.1. TÉCNICAS BÁSICAS DE MANIPULACIÓN DE DNA................................................ 67 3.1.1. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y purificación de fragmentos de DNA .................... 67 3.1.2. Cultivo y transformación de Escherichia coli ................................................ 67 3.1.3. Aislamiento y purificación de plásmidos a partir de cultivos en medio líquido ........................................................................................ 69 3.1.4. Reacciones de modificación enzimática del DNA ......................................... 69 ÍNDICE ii Índice 3.1.5. Secuenciación del DNA ............................................................................................. 70 3.2. TÉCNICAS ANALÍTICAS GENERALES.......................................................................... 70 3.2.1. Cuantificación de la concentración de proteína ............................................ 70 3.2.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS .............. 72 3.2.3. Transferencia e inmunodetección (Western blot) ........................................ 73 3.3. VECTORES DE EXPRESIÓN DE LAS ANEXINAS RECOMBINANTES............. 75 3.3.1. Construcción de los vectores de expresión ..................................................... 75 3.3.2. Mutagénesis dirigida por PCR ............................................................................... 76 3.4. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES .... 78 3.4.1. Cultivo de las bacterias e inducción de la expresión de las proteínas .............................................................................................................. 78 3.4.2. Digestión con la proteasa rTEV ............................................................................ 80 3.5. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL ........................................................................... 81 3.5.1. Espectros de dicroísmo circular ........................................................................... 81 3.5.2. Espectroscopía de emisión de fluorescencia .................................................. 82 3.6. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL .................................................................................. 83 3.6.1. Formación de vesículas fosfolipídicas ............................................................... 83 3.6.2. Determinación de la concentración de fosfolípidos .................................... 84 3.6.3. Ensayos de unión a las vesículas fosfolipídicas ............................................. 84 3.6.4. Ensayos de agregación de vesículas ................................................................... 85 3.6.5. Ensayos de entrecruzamiento de proteínas en presencia de vesículas .............................................................................................. 85 3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .................................................................................................... 86 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................................. 87 4.1. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA ANEXINA A2 HUMANA ........................ 89 4.1.1. Expresión y purificación de la anexina A2 humana ..................................... 89 4.1.2. Expresión y purificación de la anexina A2 WT-A2h .................................... 89 4.2. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA ANEXINA A2 HUMANA .......... 92 4.2.1. Análisis estructural mediante dicroísmo circular (CD) ............................. 93 ÍNDICE Índice iii 4.2.2. Curvas de desnaturalización térmica ................................................................. 96 4.2.3. Estudio del entorno del único residuo de triptófano de la anexina A2 ..........................................................................................................97 4.3. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA ANEXINA A2 HUMANA.............. 103 4.3.1. Unión a vesículas fosfolipídicas ......................................................................... 103 4.3.2. Ensayos de agregación de vesículas fosfolipídicas ................................... 106 4.4. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE MUTANTES DE LA ANEXINA A2 ............... 111 4.4.1. Clonación de las variantes mutadas de la anexina A2 humana ........... 111 4.4.2. Aislamiento y purificación de las proteínas recombinantes ................. 120 4.5. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LAS VARIANTES MUTADAS DE LA ANEXINA A2 HUMANA ...................................................................................... 121 4.5.1. Mutante de deleción de la hélice anfipática N-terminal (Δ14-A2h) .. 121 4.5.2. Mutantes con sustitución de lisina por alanina en la superficie convexa ................................................................................................... 124 4.5.3 Mutantes con la dimerización “antiparalela” impedida .......................... 126 4.6. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA VARIANTES MUTADAS DE LA ANEXINA A2 HUMANA ...................................................................................... 129 4.6.1. Unión a vesículas fosfolipídicas ......................................................................... 129 4.6.2. Agregación a vesículas fosfolipídicas .............................................................. 137 4.6.3. Análisis de entrecruzamiento en ausencia y presencia de vesículas ........................................................................................... 146 4.7. OBSERVACIONES FINALES ........................................................................................... 153 5. CONCLUSIONES..............................................................................................................155 6. BIBLIOGRAFÍA ...............................................................................................................159 ÍNDICE iv Índice RESUMEN / SUMMARY RESUMEN Resumen 3 RESUMEN Las anexinas son una familia multigénica de proteínas que intervienen en los procesos de agregación y fusión de las membranas biológicas. Uno de sus miembros más conocidos es la anexina A2 (o p36/calpactina-1), capaz de unirse a fosfolípidos ácidos de forma dependiente del calcio, como ocurre con otros miembros de la misma familia. Su localización es principalmente citosólica, donde está implicada en numerosos procesos como endocitosis, exocitosis, canal iónico o en la interacción de microfilamentos de actina con membranas. En su forma heterotetramérica, especialmente con la proteína S100A10 (p11), la anexina A2 se ha implicado como factor determinante en innumerables procesos biológicos extracelulares como la anticoagulación o como marcador de mal pronóstico tumoral por su participación en la activación del plasminógeno. Su actividad nuclear aún es poco conocida y parece implicar la regulación de numerosos genes incluyendo la propia S100A10. La coexistencia subcelular de diferentes estados de la proteína, en los que la forma monomérica de anexina A2 está creciendo en relevancia funcional, está hasta la fecha poco estudiada. Para profundizar en el conocimiento estructural y funcional de esta anexina en su forma monomérica, se ha llevado a cabo la clonación, expresión en Escherichia coli y purificación de la proteína recombinante. Una vez purificada se ha realizado un análisis estructural mediante dicroísmo circular y espectroscopía de emisión de fluorescencia, lo que ha permitido observar el efecto específico del calcio en la estructura global de la proteína, así como en el microentorno del único residuo de triptófano (Trp213). Además, se han obtenido una serie de variantes mutadas de la proteína para analizar a fondo los procesos de unión a membranas y agregación de vesículas fosfolipídicas. La caracterización funcional ha mostrado que, a diferencia de otras anexinas, la anexina A2 humana posee un sitio alternativo de unión a membranas independiente de calcio que podría estar localizado en la hélice α anfipática N-terminal, pero que solo se manifestaría en la denominada “conformación abierta” donde el extremo N-terminal se libera del núcleo proteico tras la interacción de la proteína con las membranas por su superficie convexa. Asimismo, se ha confirmado el papel esencial de tres residuos de lisina situados en la superficie convexa de la molécula en la unión a membranas RESUMEN 4 Resumen independiente de calcio y en los procesos de agregación de vesículas ricas en fosfolípidos ácidos tanto independiente como dependiente de calcio. También se ha estudiado la posible implicación de los dímeros "antiparalelos" laterales de la proteína en la agregación de membranas. En contraste con lo sugerido anteriormente, la formación de estos dímeros regula negativamente este proceso. Por último, se proponen modelos para los mecanismos de agregación de vesículas mediados por anexina A2 en presencia de calcio, en un proceso que depende de la formación de puentes diméricos de proteína entre las vesículas a través de las superficies cóncavas hidrofóbicas de las proteínas. SUMMARY Summary 5 SUMMARY Annexins are a multigene family of proteins involved in the aggregation and fusion processes of biological membranes. One of its best-known members is annexin A2 (or p36/calpactin-1), which is able to bind to acidic phospholipids in a calcium- dependent manner, as occurs with other members of the same family. Its localization is mainly cytosolic, where it is involved in numerous processes such as endocytosis, exocytosis, ion channel or in the interaction of actin microfilaments with membranes. In its heterotetrameric form, especially with the S100A10 (p11) protein, annexin A2 has been involved as a determinant factor in several extracellular biological processes such as anticoagulation or as a marker of poor tumor prognosis due to its participation in plasminogen activation. Its nuclear activity is still poorly understood and seems to involve the regulation of numerous genes including S100A10 itself. The subcellular coexistence of different states of the protein, in which the monomeric form of annexin A2 is growing in functional relevance, is to date poorly described. To gain further structural and functional knowledge on this annexin in its monomeric form, the cloning, expression in Escherichia coli and purification of the recombinant protein have been carried out. Once purified, a structural analysis was carried out by circular dichroism and fluorescence emission spectroscopy, which allowed the analysis of the specific effect of calcium on the global structure of the protein, as well as on the microenvironment of the single tryptophan residue (Trp213). In addition, a series of mutated variants of the protein have been obtained to analyze in depth the processes of membrane binding and aggregation of phospholipid vesicles. Functional characterization has shown that, unlike other annexins, human annexin A2 possesses an alternative calcium-independent membrane binding site that could be located in the N-terminal amphipathic α-helix but only in the so-called "open conformation" where the N-terminal domain is released from the protein core after interaction of the protein with membranes through its convex surface. Likewise, the essential role of three lysine residues located on the convex surface of the molecule has been confirmed in the calcium- independent binding to membranes as well as in the calcium-dependent and independent aggregation of vesicles rich in acidic phospholipids. SUMMARY 6 Summary The possible involvement of the lateral "antiparallel" dimers of the protein in membrane aggregation has also been studied. In contrast to what was previously suggested, the formation of these dimers negatively regulates this process. Finally, we propose models for calcium-dependent annexin A2-mediated vesicle aggregation mechanisms, in a process that depends on the formation of dimeric protein bridges between vesicles which involve the interaction between the hydrophobic concave surfaces of the proteins. 1. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 1.1. La supefamilia multigénica de las anexinas 9 1. INTRODUCCIÓN 1.1. LA SUPERFAMILIA MULTIGÉNICA DE LAS ANEXINAS Hace ya más de 40 años que las anexinas fueron descubiertas (Creutz y col., 1978), pero no fue hasta finales del siglo pasado (1990) que se aunaron bajo el nombre de “anexinas” y constituían un grupo de proteínas cuya principal función era la de unirse a membranas biológicas en presencia de calcio (Crumpton y Dedman, 1990). Inicialmente, estas proteínas recibieron nombres que tenían que ver con la función fundamental que realizaban, como lipocortina o calpactina (inhibe la producción del factor activador de las plaquetas), ancorina CII (potencial receptor de membrana de colágeno tipo II), proteína anticoagulante de placenta, etc. Éstas y otras proteínas homólogas se agruparon bajo el nombre de anexinas, ya que todas presentaban similitud de secuencia y estructura y, en presencia de calcio, eran capaces de unirse a las membranas celulares. Las anexinas forman una superfamilia de proteínas solubles, son ubicuas y poseen una gran capacidad para unirse a la superficie aniónica de los fosfolípidos que forman parte de las membranas biológicas. La unión está mediada por el establecimiento de enlaces de coordinación con un ion Ca2+ que ocupa la posición central en una bipirámide pentagonal, donde cinco de los enlaces pertenecen a la proteína y los dos restantes a las cabezas polares de los fosfolípidos de membrana (Crumpton y Dedman, 1990), aunque estudios más actuales sugieren otras posibilidades de interacción con las membranas. Se han identificado más de mil proteínas de la superfamilia de anexinas en los principales filos de los eucariotas, aunque las anexinas están ausentes en las levaduras y algunos seres procariotas (Moss y Morgan, 2004; Bandorowicz-Pikuła, 2007). Fue la anexina A7 humana, denominada anteriormente sinexina (Creutz y col., 1978), la primera anexina que se purificó y caracterizó; las primeras que se clonaron fueron las anexinas A1 y A2 humanas, conocidas anteriormente como lipocortina y calpactina, respectivamente (Kristensen y col., 1986). El sistema de nomenclatura oficial finalmente propuesto por el “Human Genome Nomenclature Organization” para estas proteínas se acordó sobre la base de la filogenia molecular y el análisis genómico comparativo (Morgan y col., 1999). Las INTRODUCCIÓN 10 1.1. La supefamilia multigénica de las anexinas anexinas se nombran con una letra en función del reino/grupo al que pertenecen, según se especifica más adelante, seguido de un número correlativo en función de cuándo se descubrieron. A los vertebrados y sus ortólogos en metazoos cordados se les asignó la letra A; en mamíferos hay 12 genes de anexinas (ANXA1‐ANXA13), dejándose de asignar la anexina A12 debido a que originalmente ésta se descubrió en Hydra y no se encontró un ortólogo en vertebrados. En la Tabla 1 y en la Figura 1 se muestran las distintas subfamilias de anexinas según su presencia en los distintos reinos. En principio se reservó la nomenclatura “anexina F” para las posibles anexinas de procariotas, pero hasta la fecha no se han descubierto proteínas de esta familia, aunque sí proteínas que contienen repeticiones de secuencia y estructuras similares (Morgan y col., 2006; Kodavali y col., 2014). Tabla 1. Subfamilias de las anexinas. La superfamilia génica de las anexinas se clasifica según su presencia en los reinos y grupos de los seres vivos, atendiendo a su origen evolutivo (Morgan y col., 1999). Subfamilia Organismos anexinas A Anexinas humanas y ortólogos en metazoos cordados anexinas B Metazoos no vertebrados (mayoritariamente insectos) anexinas C Mycetozoa y hongos anexinas D Plantas anexinas E Protistas anexinas F Procariotas Se estima que las anexinas se originaron hace aproximadamente 1000 millones de años en musgos, helechos y gimnospermas. Aunque el protista primitivo unicelular Giardia lamblia tiene al menos siete genes que pertenecen a la subfamilia de la anexina E (Giardia lamblia genome project) (Gerke y Moss, 2002). Las anexinas actuales surgieron a través de duplicaciones génicas de un antecesor común, probablemente en procariotas o en eucariotas inferiores, a partir de los cuales habrían surgido todas las subfamilias que se conocen actualmente (Smith y Moss, 1994). El análisis de las características generales de los genes de las anexinas de vertebrados caracterizados hasta el momento reflejan una conservación total del tamaño de los exones y de las fases de los intrones, excepto en el caso de los genes de las anexinas A7 (Morgan y Fernández, 1997) y las anexinas A13 (Iglesias y col., INTRODUCCIÓN 1.1. La supefamilia multigénica de las anexinas 11 2002). Sin embargo, los genes de las anexinas de invertebrados, plantas y protistas presentan un número y fase de intrones, así como de posición de splicing, bastante diferentes entre ellos (Fernández y Morgan, 2003). Figura 1. Distribución filogenética de las anexinas. En la figura se representa la distribución de las anexinas en sus cinco familias principales y su correlación con los principales grupos de organismos, así como el número de genes implicados en su expresión (Morgan y col., 1999; Moss y Morgan, 2004). Las anexinas de humanos y sus ortólogas se clasifican como anexinas A; a la familia de las anexinas B pertenecen las del resto de animales, principalmente insectos; la familia de las anexinas C, en hongos y algunos grupos de eucariotas unicelulares, D en plantas y E en protistas. Al menos 40 subfamilias adicionales esperan clasificación formal. La mayoría de las especies eucariotas tienen entre 1 y 20 genes de anexina (Gerke y Moss, 2002). INTRODUCCIÓN 12 1.1. La supefamilia multigénica de las anexinas Los genes de las anexinas se han duplicado de forma extensa e independiente en varios de los linajes eucariotas, tal y como se aprecia en su filogenia molecular (Figura 1), sus estructuras génicas y en sus posiciones cromosómicas. Las anexinas vegetales (pertenecientes a la familia denominada D) forman un grupo único donde las proteínas generalmente carecen de dominios amino terminales y de los sitios funcionales de unión a calcio en el segundo y tercer dominio (Clark y col., 2001). La familia C de las anexinas se encuentra presente en organismos unicelulares: hongos, algas pardas y diatomeas. La familia de la anexina B aparece en la mayoría de los invertebrados donde se han producido numerosas duplicidades. En insectos se aprecia que estas duplicidades siguen un complejo patrón; duplicaciones génicas que han generado más de 20 subfamilias, como sucede en Drosophila, algunos mosquitos y abejas, que las diferencian de las anexinas de los vertebrados. En erizos de mar, tunicados y lanceolados presentan formas proteicas ya cercanas a las anexinas A13, A7 y A11, considerados como los genes precursores de las anexinas de los vertebrados, siendo el gen de la anexina A13 el más primitivo de ellos (Morgan y Fernández, 1997; Iglesias y col., 2002). En vertebrados, la familia A incluye 12 anexinas, todas ellas expresadas en mamíferos; el análisis de los genes de mamíferos revela que las anexinas se dividen en tres grupos principales (Figura 2). Un primer grupo comprende las primeras anexinas de vertebrados, éstas son la A7, la A11 y la A13 (sombreado amarillo). Un segundo grupo incluye las anexinas A4, A5 y A8 (naranja), y el tercer grupo comprende las anexinas A1, A2, A3, A9 y A10 (verde) (Gerke y Moss, 2002; Morgan y col., 2004). La anexina A6 es las más difícil de categorizar por su peculiar estructura fruto de la duplicación génica y posterior fusión de genes de anexinas A5 (región 5’) y anexina A10 (región 3’). Aunque no existen datos funcionales para todos estos grupos, es posible identificar cierta cohesión dentro de los mismos: las anexinas A1 y A2 se unen a proteínas de la familia S100; las anexinas A4 y A5 están más estrechamente relacionadas con la regulación del flujo iónico; la anexina A6, que comparte características de ambos grupos, manifiesta funciones que pertenecen a ambos. INTRODUCCIÓN 1.1. La supefamilia multigénica de las anexinas 13 En la especie humana hay 12 genes que codifican para las anexinas; éstos se encuentran dispersos en el genoma en los cromosomas 1, 2, 4, 5, 8, 9, 10 y 15. Aunque los genes de las anexinas ortólogas de otros vertebrados varían de manera ligera en tamaño, son muy similares en la secuencia (Fernández y Morgan, 2003). Las anexinas son pues una superfamilia multigénica ampliamente distribuida en los seres vivos; se expresan en la mayoría de los organismos, y se encuentran en las diferentes especies de todos los reinos eucariotas, donde una de sus funciones más estudiada ha sido la de su capacidad de unión a membranas en una forma dependiente de calcio. La ubicuidad, la estabilidad y su conservación molecular le dan un papel fundamental en la fisiología celular, con distintas funcionalidades involucradas en mecanismos de adhesión, tráfico de membranas y transducción de señales, entre otros. Una lista más extensa de subfamilias y especies de anexinas, desde su origen evolutivo, así como los principales descubrimientos en la diversidad de sus funciones biológicas son publicados periódicamente en la página web “The Annexin Homepage” (http://www.structuralchemistry.org/annexins/). Figura 2. Árbol filogenético de la familia de las anexinas de vertebrados (ANXA). Los datos están obtenidos de (Morgan y col., 2004). El número de genes de anexinas ortólogas empleado en el análisis está indicado entre paréntesis. Los genes se agrupan en tres grandes grupos indicados por sombreados de distintos colores en función de su antigüedad y similitud de secuencias. El gen de la anexina A6 aparece en dos bloques: ANX5’A6 y ANX3’A6. INTRODUCCIÓN 14 1.2. Estructura general de las anexinas 1.2. ESTRUCTURA GENERAL DE LAS ANEXINAS Todas las proteínas que forman esta superfamilia comparten una característica estructural común: un núcleo (dominio C-terminal) altamente conservado, compuesto por cuatro (u ocho, en la anexina A6) dominios homólogos de aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, que presentan estructuras tridimensionales similares y altamente conservadas a lo largo del esquema evolutivo de las anexinas (Moss y Morgan, 2004). En el interior de cada dominio aparece una secuencia de 17 residuos en los que hay un grado de conservación incluso superior y que están directamente relacionadas con la unión de iones calcio y su unión a membranas biológicas. La anexina A5 fue la primera proteína de esta familia que se cristalizó y cuya estructura tridimensional se resolvió mediante difracción de rayos X (Figura 3) (Huber y col., 1990a; Huber y col., 1990b; Huber y col., 1992). Una disposición tridimensional prácticamente idéntica en el núcleo de la proteína se ha podido observar en la cristalización de otras anexinas. La apariencia general de estas proteínas es la de un disco helicoidal ligeramente curvado en el que los cuatro dominios se disponen en torno a un poro central de carácter hidrofílico. En la cara convexa se encuentran los sitios de unión de calcio, siendo este el lugar de interacción con los fosfolípidos que forman parte de las membranas biológicas. Las anexinas pueden interaccionar, además, con otros componentes que participan en la organización estructural de la célula, la señalización intracelular por modulación enzimática o mediante el flujo de iones (pueden actuar como canales iónicos atípicos), o incluso en el control del crecimiento celular. La región cóncava se situaría en el lado opuesto a la membrana interaccionando con el extremo N- terminal y con algunas estructuras citoplasmáticas (o proteínas extracelulares) (Gerke y Moss, 2002). INTRODUCCIÓN 1.2. Estructura general de las anexinas 15 Figura 3. Estructura tridimensional de la anexina A5. Se representa el característico modelo de plegamiento del núcleo proteico de las anexinas. En la figura puede apreciarse en negro el extremo N-terminal de la proteína. En el núcleo proteico quedan señalados los cuatro dominios (I, en color azul marino, II azul celeste, III naranja, IV rojo). En el dominio III se indican las distintas α-hélices asignándoles letras que van de la A a la E. Los sitios de unión de calcio de tipo II se indican en cada dominio (iones calcio representados por esferas amarillas), resaltándose los residuos implicados en dichos sitios de unión, así como el residuo de Trp 187 expuesto del dominio III tras la unión a calcio. En el panel B se aprecia el poro central hidrofílico. Las figuras se han preparado utilizando el programa MOLMOL (Koradi y col., 1996). Los ficheros con datos de la estructura tridimensional de la anexina A5 humana se han obtenido del Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) (Fichero PDB 1A8A) (Swairjo y col., 1995). INTRODUCCIÓN 16 1.2. Estructura general de las anexinas 1.2.1. El núcleo proteico El núcleo proteico de la mayoría de las anexinas de vertebrados ha sido analizado por cristalografía de rayos X, observándose una alta conservación en las estructuras secundarias y terciarias (Rosengarth y Luecke, 2003; Turnay y col., 2003b). Las diferencias evolutivamente significativas entre las subfamilias de las proteínas se localizan preferentemente en sitios accesibles en la superficie de la proteína que determinan la unión a la membrana (Moss y Morgan, 2004). Los niveles de conservación más elevados se observan, sobre todo, en el núcleo proteico y, de manera más acusada, en los dominios II y IV, siendo el lugar de unión de calcio del dominio II el más conservado de todos (solo ausente en anexina A10). Por el contrario, las mayores diferencias tanto en secuencia como en longitud se observan en los dominios N-terminales, que son responsables de las distintas localizaciones y funciones especializadas de estas proteínas y suelen ser susceptibles de modificaciones postraduccionales o permiten la interacción con otras proteínas (Figura 4) (Dehal y col., 2002; Turnay y col., 2003a). Figura 4. Comparativa esquemática de los dominios de las anexinas de vertebrados. En color negro se indican los cuatro dominios altamente conservados de los núcleos proteicos de las anexinas A humanas incluyendo el de la B12 de Hydra. En blanco aparecen las regiones de unión entre dominios, en azul, los extremos N-terminales, y en rojo las pequeñas extensiones C-terminales. A la derecha, entre paréntesis, se indica el número total de residuos, indicándose también el de los dominios N- y C- terminales. INTRODUCCIÓN 1.2. Estructura general de las anexinas 17 Como ya se ha comentado anteriormente, en el núcleo proteico de estas proteínas aparecen los sitios de unión al calcio. Otros cationes intracelulares, como el zinc, pueden unirse y originar efectos alostéricos que favorecen de forma sinérgica la unión de calcio (Lewit-Bentley y col., 1992). La afinidad que presentan estas proteínas por el calcio aumenta considerablemente (hasta 3 órdenes de magnitud) cuando se encuentran en presencia de fosfolípidos ácidos (Turnay y col., 2005; Fernández-Lizarbe y col., 2017). Además, medidas de unión a calcio han mostrado que las anexinas podrían unir entre dos y diez iones de calcio por cada molécula, existiendo sitios de unión en los cuatro dominios del núcleo proteico (Bazzi y Nelsestuen, 1991; Turnay y col., 2003b; Lizarbe y col., 2013). Las secuencias de residuos que están implicados en la unión de calcio han podido determinarse mediante estudios cristalográficos. La secuencia consenso sería: Leu/Met-Lys-Gly-X-Gly-Thr-(38 residuos)-Asp/Glu, donde X puede ser cualquier aminoácido, siendo la anexina A9 la única anexina de vertebrados en la que no aparecen estas secuencias (Morgan y Fernández, 1997). Estos sitios canónicos de unión de calcio se denominan de tipo II (o sitios AB, por situarse en el bucle entre las hélices A y B) para diferenciarlos de los sitios presentes en las proteínas con el motivo estructural EF‐hand (también denominados de tipo I), característico de proteínas como la parvalbúmina o la calmodulina, que tiene cuatro motivos de unión a calcio con una estructura de hélice-bucle-hélice (Oku y col., 2017). En las Figuras 3 y 5 se puede apreciar que en el sitio de unión de tipo II (sitio AB), el catión de calcio forma una bipirámide pentagonal coordinándose con siete ligandos. En esta estructura aparecen tres oxígenos carbonílicos de los enlaces peptídicos en residuos alternos que se encuentran en la secuencia del bucle que unen las hélices A y B, así como dos oxígenos del grupo carboxílico de un ácido glutámico o aspártico alejado en la secuencia (al final de la hélice D). Los sitios de unión de calcio están involucrados en la unión de las anexinas a las membranas formando complejos anexina-calcio-fosfolípidos. Desde hace tiempo, estudios realizados mediante mutagénesis dirigida corroboran que los sitios AB son básicos para la unión a membranas, pero existen sitios adicionales de unión, los sitios DE, que aumentan la afinidad por la unión a los fosfolípidos aunque no son suficientes para dicha unión, como se ha visto en la anexina A2 (Jost y col., 1997). INTRODUCCIÓN 18 1.2. Estructura general de las anexinas Los sitios DE de unión de calcio, denominados también de tipo III, están situados en el bucle entre las hélices D y E (sitio DE) (Figura 5) (Lizarbe y col., 2013). Estos sitios presentan menor afinidad por el calcio que los de tipo II, y los ligandos de coordinación son dos oxígenos del enlace DE, además un carboxilato de la hélice E. En la anexina A5 (en los dominios I, II y III), y en la repetición II de las A1 y A2, se ha caracterizado otro sitio adicional de unión a calcio que se conoce como sitio B, en el que el catión se coordina con el oxígeno de un enlace peptídico y un carboxilato bidentado, ambos de la hélice B. Este sitio también presenta 7 coordinaciones con el calcio, estando tres de las cuatro restantes coordinadas con moléculas de agua, y la Figure 5. Estructura tridimensional de la anexina A5 de rata. La estructura tridimensional de la anexina A5 de rata con los cuatro sitios de unión de calcio de tipo II saturados con calcio se obtuvo utilizando el programa MOLMOL y la estructura del Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) (Fichero PDB 1A8A) (Swairjo y col., 1995). Se muestra una vista lateral (A), una superior (B), un detalle de la interacción en el dominio III con calcio y la cabeza polar de fosfatidilserina (PS; GPS: glicerofosfoserina) (C), así como una representación de la superficie hidrofóbica (amarillo) y polar (azul) de la molécula (D). Los iones calcio se representan mediante esferas amarillas. En el panel (C) se muestran los tres posibles sitios de unión de calcio en el dominio III (AB, B y DE) indicándose las coordinaciones con los átomos de oxígeno (rojo) y fósforo (magenta). Los átomos de carbono del GPS se muestran en verde. INTRODUCCIÓN 1.2. Estructura general de las anexinas 19 séptima, con un oxígeno del carboxilo de la serina presente en la fosfatidilserina (PS) (Rosengarth y Luecke, 2003), lo que estabiliza la interacción con la cabeza polar de la PS justificando así que sea este fosfolípido ácido el que presenta una mayor afinidad por la anexina. Los sitios de unión a calcio de tipo II aparecen en casi todos los dominios, por lo que se supone que los cuatro dominios pueden colaborar en la interacción con las membranas. Sin embargo, se ha descrito que en mutantes de la anexina A5 en los cuales se suprime el sitio AB de distintos dominios, el dominio I parece ser imprescindible para el proceso de unión. Los residuos involucrados en este sitio constituyen una secuencia muy conservada en todas las anexinas. Esta secuencia consenso se encuentra exclusivamente en los dominios I o II, y en ocasiones en ambos, pero no en los dominios III y IV (Montaville y col., 2002). Los dominios fundamentales para la unión con membranas pueden variar en las distintas anexinas; así, en la anexina A4, es el dominio I como en la A5 (Nelson y Creutz, 1995), y en las anexinas A1 y A2 este papel lo desempeña el dominio II (Bharadwaj y col., 2013). La unión de las anexinas a las membranas biológicas en presencia de calcio responde genéricamente con un modelo que conlleva una alteración local de la membrana, donde la proteína no llega a insertarse en la bicapa. Esta unión genera un desorden a ambos lados de la membrana que hace que aumente la permeabilidad a los iones. La unión lleva aparejado un proceso de oligomerización de las proteínas, formándose trímeros y, posteriormente, dímeros o trímeros de trímeros, repitiendo una matriz ordenada de redes cristalinas que tapiza la capa lipídica como se ha descrito para la anexina A5 (Figura 6) (Oling y col., 2000; Reviakine, 2018). In vivo, el modelo que se propone para poder explicar el proceso de la oligomerización de las anexinas parte de células en reposo, donde la concentración de calcio en el interior de la célula es baja, y las moléculas de anexina están libres y no forman agregados. Según se estimula a las células, la concentración de calcio aumenta alrededor de la membrana, y es cuando las moléculas de anexina se unen a la superficie de la membrana y se produce agregación entre ellas (Seaton y Dedman, 1998). Esta agregación acaba alterando las propiedades de la membrana afectando a la fluidez de los fosfolípidos, y a otras propiedades de proteínas y enzimas que INTRODUCCIÓN 20 1.2. Estructura general de las anexinas están unidas a la membrana. En ausencia de calcio también es posible que las anexinas interaccionen con membranas biológicas, como se ha descrito para las anexinas A5 y la B12 en situaciones específicas. 1.2.2. El dominio N‐terminal El dominio N-terminal de las anexinas se caracteriza por presentar una alta variabilidad tanto en secuencia como en longitud, y está unido al dominio I del núcleo proteico a través de una secuencia linker de unos 10 residuos. A pesar de su pequeño tamaño en comparación con el núcleo proteico, es muy importante para la estabilidad estructural de las anexinas, y es el responsable de las distintas localizaciones y funciones específicas de las mismas a través de modificaciones postraduccionales y la unión a otras proteínas (Moss y Morgan, 2004; Lizarbe y col., 2013). Las anexinas encuadradas dentro del grupo A y B (Tabla 1, Figura 1), es posible dividirlas en tres grupos diferentes en función de la longitud que presenta el extremo N-terminal; esta clasificación es meramente estructural y no se suele reflejar en características funcionales comunes. Figura 6. Ensamblaje periférico de la anexina A5 en las membranas lipídicas. En color azul se representa la proteína monomérica en solución, la cual se une a la fosfatidilserina de la bicapa lipídica (color gris) de forma dependiente de calcio formando trímeros y constituyendo la unidad que se repite en el ensamblaje de estructuras cristalinas p6 y p3 (Pigault y col., 1994). La numeración de los dominios que aparece en uno de los trímeros es la de Huber y col. (Huber y col., 1992). Las formas básicas que se repiten en las redes cristalinas se indican con rombos rojos (Reviakine, 2018). INTRODUCCIÓN 1.2. Estructura general de las anexinas 21 En un primer grupo se encuentran aquellas anexinas cuyo extremo N-terminal es inferior a 20 residuos (Figura 4). En este grupo encontramos la anexina B12 de Hydra, con un extremo N-terminal formado por 4 residuos; esta proteína de 316 aminoácidos puede formar trímeros y hexámeros en presencia de calcio, los cuales se estabilizan tras interaccionar con las membranas celulares pudiendo llegar a insertarse a pH ligeramente ácidos (Luecke y col., 1995; Tao y col., 2020). En cuanto a las anexinas de vertebrados con el extremo N-terminal corto, de hasta 12 residuos, encontramos a las anexinas: A5, A4, A10, A3, A6 y la A8 (ordenadas de menor a mayor extensión del extremo N-terminal). La anexina A5 (319 aminoácidos y 35,8 kDa de masa molecular) es una proteína ubicua y que puede ser secretada, es inhibidora de PKC, presenta actividad anticoagulante y antiinflamatoria, interacciona con colágeno, es un canal de calcio y puede actuar como lugar de anclaje para los virus de la hepatitis B y de la gripe. La anexina A4 (320 aminoácidos y 36 kDa) se encuentra presente en células epiteliales de mamíferos, pero ausente en aves, no es secretada, y participa en los procesos de exocitosis. La anexina A10 (324 aminoácidos y 37,2 kDa) no es secretada y es posible encontrarla en células del estómago, hígado y páncreas; una característica importante de esta anexina es que carece de los sitios de unión de calcio de Tipo II en los dominios I, II y IV. La anexina A3 (322 residuos y 36,2 kDa) es otra proteína no secretada expresada mayoritariamente en neutrófilos y monocitos, y manifiesta un papel relevante en los procesos exocíticos. La A6 (324 aminoácidos y 75,7 kDa) es el miembro más grande de la familia debido a que posee dos núcleos proteicos que se encuentran unidos por una región bisagra, con un total de ocho repeticiones homólogas (Cornely y col., 2011). Esta estructura peculiar surgió de un proceso de duplicación génica y posterior fusión de los genes de anexinas con 4 dominios y se ha observado también en anexinas de la subfamilia E. Esta anexina se expresa en multitud de líneas celulares y está implicada en la regulación de las vías de exocitosis y endocitosis, en la proliferación de linfocitos T, inhibe a ciertas proteínas quinasas, y actúa como organizadora de los dominios de membranas modulando la homeostasis del colesterol intracelular y siendo esencial en procesos de reparación de membrana (Enrich y col., 2011; Cornely y col., 2016; Enrich y col., 2017; Bandorowicz-Pikuła y Seliga, 2018). Por último, dentro de este grupo encontramos a la anexina A8 (326 aminoácidos y 36,8 kDa); se trata de una proteína no secretada y está presente en INTRODUCCIÓN 22 1.2. Estructura general de las anexinas las células epiteliales y endoteliales de distintos órganos y está implicada en la progresión de varios tipos de carcinomas (Heitzig y col., 2017; Rossetti y Sacchi, 2020). Entre las anexinas que poseen un extremo N-terminal considerado intermedio (entre 24 y 36 residuos) estarían la A9, A2, A1 y la isoforma A13b, de la A13. Estas proteínas contienen estructuras α-helicoidales que están implicadas en interacciones con proteínas de la familia S100, siendo estas asociaciones fundamentales para su función (Lizarbe y col., 2013). La Anexina A1 (345 aminoácidos y 37 kDa) es considerada como una proteína periférica de las membranas plasmáticas, aunque también es posible encontrarla en la matriz extracelular, es secretada y se ubica en la luz de vesículas secretoras, así como en el núcleo celular (Araújo y col., 2021). Está presente en multitud de líneas celulares y participa en una gran variedad de vías inflamatorias. Dentro de estas funciones destaca su actividad antiinflamatoria ya que inhibe varias enzimas relacionadas con la respuesta inflamatoria, como la óxido nítrico sintasa inducible o la fosfolipasa A2 (Lim LH y Pervaiz S, 2007), actúa como un regulador de la proliferación y diferenciación de linfocitos T, o ejerce una actividad antiinflamatoria a través de la interacción del extremo N-terminal acetilado con los receptores de péptidos formilados (FPR) (Lim y Pervaiz, 2007; Caso y col., 2021; Qin y col., 2022). Existen también evidencias de su importante papel en la maquinaria de proliferación celular, en la regulación de la señalización de muerte celular, así como en la eliminación fagocítica de las células en apoptosis y en los procesos de carcinogénesis (Han y col., 2020). La estructura tridimensional de la anexina A1 ha sido determinada tanto en ausencia como en presencia de calcio (Figura 7) (Rosengarth y col., 2001; Rosengarth y Luecke, 2003). El extremo N-terminal de la anexina A1 estabiliza la estructura por interacción con el dominio IV a través de los residuos 28 a 41. Esta región está precedida por dos hélices-α anfipáticas. En ausencia de calcio (Figura 7A), la segunda hélice (aminoácidos 18 a 27) interacciona con el dominio IV, mientras que la primera hélice (aminoácidos 2 a 17) se inserta dentro del dominio III desplazando a la hélice IIID que se despliega formando un bucle. En presencia de calcio (Figura 7B) la extensión N-terminal se separa del núcleo proteico y, debido a su elevada INTRODUCCIÓN 1.2. Estructura general de las anexinas 23 movilidad, su estructura tridimensional no ha podido ser determinada con precisión. Sin embargo, este despliegue parece ser esencial para las funciones de esta proteína, al permitir su interacción con membranas biológicas y con otras proteínas a través de las hélices anfipáticas. Figura 7. Estructura tridimensional de la anexina A1 de cerdo. (A) La figura muestra la proteína con su longitud completa en ausencia de calcio (archivo PDB 1HM6); en color verde se muestran las dos α-hélices anfipáticas consecutivas en el extremo N-terminal (residuos 2-17 y 18-28). La primera se inserta en el Dominio III (color naranja) desplazando a la hélice del dominio III D (Rosengarth y col., 2001). (B) Estructura tridimensional de la anexina A1 saturada con calcio. No se puede apreciar la estructura del extremo N-terminal por su elevada movilidad; la hélice IIID aparece correctamente plegada (Rosengarth y Luecke, 2003). INTRODUCCIÓN 24 1.2. Estructura general de las anexinas La anexina A9 (338 aminoácidos y 37,6 kDa) se detectó en células de hígado y bazo fetal, pero su expresión es relativamente escasa en otros tipos celulares, aunque se ha observado su sobreexpresión en distintos tipos de células tumorales. Se trata de una anexina atípica debido a que ha sufrido la pérdida de los cuatro sitios canónicos de unión de calcio tipo II, aunque sigue presentado una elevada similitud de secuencia con el resto de las anexinas de vertebrados, siendo su parálogo más próximo la anexina A2 (Morgan y Fernández, 1998; Goebeler y col., 2003; Yu y col., 2018; Zhou y col., 2021). La anexina A13 presenta dos isoformas: A13a, con 315 residuos y 35,5 kDa de masa molecular, y la A13b formada por 356 aminoácidos y 39,5 kDa. El mRNA de la isoforma corta carece del exón 2, lo que se traduce en que el extremo N-terminal posee 41 residuos menos que la anexina A13b (desde Ser6 hasta Pro46, ambos incluidos). Se considera que es la más antigua de las anexinas de vertebrados y es la menos ubicua de ellas, expresándose únicamente en las células epiteliales intestinales y renales. Ambas isoformas aparecen implicadas en los procesos de transporte de vesículas de los enterocitos, siendo esencial para la realización de sus funciones la miristoilación en la Gly del extremo N-terminal (Fiedler y col., 1995; Turnay y col., 2005; Fernández-Lizarbe y col., 2017). La Anexina A2 (p36, 338 aminoácidos y 38,5 kDa), que constituye el principal objeto de estudio de esta tesis, será analizada en más detalle en el apartado 4 de esta introducción. En su región N-terminal posee una secuencia de 12 residuos en que forman una α-hélice anfipática que intermedia la interacción con dímeros proteicos de la familia S100 (S100A10 o p11), formando un heterotetrámero (anxA2)2(S100A10)2. Es una proteína ubicua y se expresa en numerosas líneas celulares, aunque la expresión varía en función del tipo celular; así, por ejemplo, se encuentran altos niveles de esta proteína en las células epiteliales del intestino y de pulmón. Está implicada en la agregación de vesículas, donde destaca un papel principal en el tráfico intracelular de vesículas (Chasserot-Golaz y col., 1996; Chasserot-Golaz y col., 2005; Morel y Gruenberg, 2007; Morel y Gruenberg, 2009). Entre otras funciones destacables de la A2, pueden mencionarse su participación en procesos de regulación de la coagulación sanguínea favoreciendo la activación del plasminógeno a plasmina (Kassam y col., 1998; Fitzpatrick y col., 2000). Esto INTRODUCCIÓN 1.2. Estructura general de las anexinas 25 permite la activación proteolítica de metaloproteinasas y la degradación de componentes de la matriz extracelular, lo cual es esencial para la progresión de procesos de metástasis (Lokman y col., 2011). De hecho, la sobreexpresión de la anexina A2 se considera un marcador de malignidad en diversos tipos de células tumorales. Dentro del grupo de las anexinas que poseen un extremo N-terminal con más de 100 residuos, se encuadran las anexinas A7 y A11 (Figura 4). La anexina A7 (465 aminoácidos) no se secreta y se localiza en diferentes compartimentos celulares. Tiene dos posibles isoformas, una de 47 y otra de 51 kDa de masa molecular. La isoforma más grande se expresa en el cerebro, el esqueleto y en el músculo cardíaco. En la región temporal del cerebro humano, la anexina A7 se encuentra de manera exclusiva en las células astrogliales (Clemen y col., 2003). También es posible encontrarla en células cromafines y musculares. El extremo N- terminal de la anexina A7, al igual que en el resto de las anexinas, determina su especificidad funcional. Esta anexina provoca la agregación de membranas de una forma dependiente de calcio, promueve la fusión de las membranas durante la exocitosis del surfactante pulmonar, las catecolaminas y la insulina, y se ha sugerido que se necesitan interacciones entre el núcleo proteico y el largo extremo N-terminal para la unión a las membranas biológicas y su capacidad para inducir la agregación de las mismas (Naidu y col., 2005). Al igual que alguna otra proteína de la familia, la anexina A7 aparece involucrada en procesos tumorales de manera que su localización subcelular se ha asociado con la aparición, invasión, metástasis y progresión de una amplia variedad de tumores, promoviendo, por ejemplo, el desarrollo y la malignidad de cáncer de hígado, gástrico, colorrectal y de mama (Guo y col., 2013). La anexina A11 (504 aminoácidos y 56,6 kDa) se expresa de forma ubicua en multitud de tipos celulares y, al igual que la A1 y la A2, interacciona con proteínas de la familia S100, en concreto con S100A6 (Lecona y col., 2003). La anexina A11 como muchos miembros de la familia, aparece involucrada en procesos exocíticos, en el tráfico de vesículas, en la citoquinesis y en la progresión del ciclo celular cuando aparece asociada a S100A6. Se la ha asociado con enfermedades de naturaleza autoinmune como el lupus eritematoso sistémico o la artritis INTRODUCCIÓN 26 1.2. Estructura general de las anexinas reumatoide. Como otras anexinas aparece relacionada con procesos tumorales teniendo una especial relevancia en tumores ginecológicos y en concreto en el de ovario (Wang y col., 2014). Se han observado algunas similitudes entre los extremos N-terminales largos de las anexinas A7 y A11, donde se aprecia una abundancia en residuos de Gly, Tyr, Pro y Gln, destacando la presencia de tres repeticiones GYPP. La región N-terminal de las anexinas sufre distintas modificaciones, tanto a nivel postranscripcional como postraduccional, que tienen consecuencias tanto en su estructura como en su función. Procesos de eliminación alternativa de intrones, a nivel postranscripcional, se han descrito por ejemplo en la anexina A13 generando las dos isoformas A13a y A13b anteriormente descritas y con estructuras y funciones diferenciadas. Algo similar ocurre en la anexina A11 bovina, donde se ha descrito que los residuos 20-56 en la isoforma A11a se reemplazan por 39 aminoácidos diferentes en la isoforma A11b (Towle y Treadwell, 1992). Asimismo, la anexina 7b contiene en la posición 146 de su extremo N-terminal 22 residuos adicionales (Magendzo y col., 1991). En cuanto a las modificaciones postraduccionales que puede experimentar el dominio N-terminal de las anexinas, son destacables los procesos de fosforilación. Así sucede en la Tyr 21 (fosforilado por el EGFR) o las Ser 27 y 43 (PKC) de la anexina A1 (D'Acunto y col., 2014) o en la anexina A2 en la Tyr 23 (c-Src) o las Ser 11 y 25 (PKC) (Grindheim y col., 2017). También se ha descrito la fosforilación de las anexinas A7 y A11 tanto por PKC en residuos de Thr/Ser como por tirosina quinasas, modificando radicalmente las propiedades funcionales de estas proteínas (Furge y col., 1999; Li y col., 2018). La fosforilación por PKC puede darse también en otras anexinas que contienen la secuencia consenso en la extensión N-terminal (Ser/Thr- Val/Leu-Arg/Lys), como ocurre en la anexina A3, A4, A8 y A10; esta secuencia no se ha visto en las anexinas A5 y A6 y, de hecho, no se fosforilan por PKC (Rothhut, 1997). Otra de las modificaciones postraduccionales relevantes que sufren las anexinas es la acilación del residuo N-terminal. Casi todas las anexinas presentan acetilación del grupo amino, lo que les confiere estabilidad estructural y les posibilita la interacción con otros proteínas, como es el caso de la anexina A2, que requiere la acetilación N- terminal para su interacción con la proteína S100A10 (Nazmi y col., 2012). Un caso INTRODUCCIÓN 1.2. Estructura general de las anexinas 27 particular es el de la anexina A13 donde ambas isoformas pueden presentar miristoilación del grupo amino terminal. Esta modificación permite que la proteína se pueda unir a membranas biológicas en ausencia de calcio por inserción de la cadena hidrofóbica en las bicapas. Además, en la isoforma A13b parece ser esencial para unirse a balsas lipídicas o rafts, resultando determinante para su funcionalidad in vivo (Lecat y col., 2000; Turnay y col., 2005). 1.2.3. Interacciones de las anexinas Además de las interacciones con membranas y vesículas de naturaleza lipídica, las anexinas también poseen la capacidad de interaccionar con otros ligandos tanto de naturaleza proteica como no proteica. El extremo N-terminal es determinante para establecer las interacciones con estos otros ligandos, ya que muchos de los sitios de unión se localizan en esta región. Cabe mencionar las interacciones con las proteínas de la familia S100, con proteínas del citoesqueleto (p.e., actina), con antígenos de superficie víricos (como en el caso de los virus de la hepatitis B, la gripe o el SARS- COV-2) y con ligandos no proteicos como los ácidos nucleicos, nucleótidos, y otros ligandos como la colina o la vitamina D (Miwa y col., 2008; Taylor y col., 2018a; Koerdt y col., 2019; Weisz y Uversky, 2020; Patil y col., 2021). Las anexinas, tienen la capacidad de interaccionar entre sí con otros tipos de anexinas. Por ejemplo, la anexina A2 puede interaccionar de manera dependiente de calcio con la A5 (Brooks y col., 2002) o con la A1 (Lee y col., 1999). Las proteínas S100 contienen el motivo estructural de unión de calcio tipo I, más conocido como EF‐hand, formando dímeros en presencia de calcio por interacción entre la primera α-hélice de una molécula con la última de la otra. La formación de estos dímeros es esencial para la interacción con las anexinas a través de las hélices α anfipáticas que estas poseen en el extremo N-terminal. El primer complejo que se estudió fue el que formaba la A2 con la S100A10, conocida anteriormente como p11 (Becker y col., 1990) (más adelante se describirá con más detalle este tipo de interacción) seguido por el de la anexina A1 con S100A11 (Naka y col., 1994). Algunas anexinas interaccionan solo con un tipo de proteína S100, como es el caso de los complejos AnxA5-S100A12 o AnxA11-S100A6, pero es más habitual que se puedan establecer interacciones de una anexina con varias proteínas S100 y, a la INTRODUCCIÓN 28 1.2. Estructura general de las anexinas inversa, una proteína S100 con varias anexinas. Por ejemplo, la anexina A2 puede interaccionar con S100A4, S100A6, S100A10 y S100A1, y la anexina A6 con S100A1, S100A6, S100A11 y S100B. Por otro lado, la proteína S100A6 interacciona con las anexinas A2, A6 y A11, o S100A11 con las anexinas A1, A2 y A6 (Miwa y col., 2008; Rintala-Dempsey y col., 2008; Weisz y Uversky, 2020). La acetilación del extremo N- terminal de las anexinas parece ser un factor determinante para las interacciones dado que estabiliza las hélices anfipáticas de este dominio responsables de la interacción con las proteínas S100 (Réty y col., 2000). Las anexinas interaccionan con proteínas del citoesqueleto, por lo que es posible pensar que podrían estar participando en la dinámica membrana-citoesqueleto con un efecto regulatorio. Estas interacciones, a diferencia de lo que ocurre con las proteínas S100, parecen tener lugar a través del núcleo proteico de las anexinas. Además, a través de estas interacciones pueden participar en procesos de reparación de daños en las membranas plasmáticas (Koerdt y col., 2019). A modo de ejemplo, se ha descrito que la anexina A2 desempeña un papel esencial en la formación de los macropinosomas gracias a su interacción con actina (Merrifield y col., 2001). En el mismo sentido, se ha evidenciado que la anexina A1 es un componente importante de la fagocitosis en macrófagos posibilitando a través de su interacción con actina la formación de los fagosomas (Patel y col., 2011), o que la anexina A6 tiene una papel muy relevante en la interacción entre las membranas y el citoesqueleto en células de la musculatura lisa (Filipenko y Waisman, 2001). Se han descrito también ligandos no proteicos que interaccionan con las anexinas, como son los ácidos nucleicos. La anexina A11 interviene en el transporte neuronal de RNA a través de su extremo N-terminal, actuando como anclaje entre los gránulos de RNA desprovistos de membranas y las membranas de los lisosomas, que son transportados activamente, realizando una función celular crítica que se ve interrumpida en los casos de desarrollo de ELA (Liao y col., 2019). Los nucleótidos también pueden ser ligandos de algunas anexinas. Se ha descrito que las interacciones entre la anexina A6 y los nucleótidos de guanina estaban condicionadas por los grupos fosfato. Los cambios estructurales inducidos por los fosfatos en la anexina A6 son pequeños y afectan a unos nueve residuos en cada uno de los dos núcleos proteicos de esta proteína con una secuencia consenso F-X-X-K- INTRODUCCIÓN 1.3. Funciones de las anexinas 29 Y-D/E-K-S-L (localizadas en los residuos 293-301 y en 641-649) (Bandorowicz- Pikula y col., 2003). La anexina A1, interacciona con ATP en células ganglionares de la retina en tratamientos de glaucoma en los que se utiliza como vector un adenovirus recombinante (Luo y col., 2021). También se ha sugerido que la anexina A7 puede servir como un sitio de acción común para el calcio, el GTP (con un sitio de unión próximo al extremo N-terminal), y la proteína quinasa C en el proceso de fusión de la membrana exocítica en células cromafines (Caohuy y Pollard, 2002). Por otra parte, se ha descrito que las anexinas tienen capacidad para asociarse a ligandos de otra naturaleza que no sea nucleotídica. Este es el caso, a modo de ejemplo, de la anexina A3, que interacciona con las benzodiacepinas provocando cambios de tipo estructural y funcional (Hofmann y col., 1998). 1.3. FUNCIONES DE LAS ANEXINAS Todas las anexinas comparten una función que es común a todas ellas, su capacidad de interaccionar con membranas biológicas en procesos generalmente dependientes de calcio. No obstante, destacan otras funciones genéricas para todas ellas, como pueden ser su implicación en la organización y tráfico de membranas, participando en procesos de exocitosis, endocitosis y fagocitosis. En ocasiones, y asociadas a las membranas, pueden funcionar como canales iónicos o bien como regulador de éstos y, más recientemente, se ha descrito que pueden participar en procesos de proliferación y diferenciación celular. A pesar de que se trata de proteínas muy conservadas, donde los núcleos proteicos presentan un elevado grado de similitud de secuencia y estructura, algunas anexinas tienen funciones más específicas, muchas de ellas debidas o reguladas por el extremo N-terminal particular de cada una de ellas. Las anexinas son proteínas mayoritariamente citosólicas y se pueden encontrar en forma soluble o asociadas a la membrana en función de la concentración intracelular de calcio. Además de interaccionar con los fosfolípidos, pueden también interaccionar de manera reversible o irreversible con estructuras del citoesqueleto. Ciertas anexinas pueden también expresarse en la superficie celular en determinadas condiciones: estableciendo contactos entre la célula y la matriz extracelular (anexinas A2 y A5) (Turnay y col., 1995; Wang y col., 2018); INTRODUCCIÓN 30 1.3. Funciones de las anexinas expresándose en la superficie de las plaquetas (anexina A5), actuando como anticoagulante (Park y col., 2016), o de las células endoteliales vasculares, activando la plasmina (anexina A2) (Brownstein y col., 2001), o translocándose del citosol a la superficie celular al exponer las células a glucocorticoides (anexina A1) (Solito y col., 1994). En algunas circunstancias se ha encontrado a las anexinas A11 y A2 en el núcleo celular (Eberhard y col., 2001; Lecona y col., 2003). 1.3.1. Anexinas intracelulares Las anexinas pueden tener distintas localizaciones intracelulares; aunque generalmente están solubles en el citosol, pueden establecer un equilibrio entre la forma soluble y la unida a distintas membranas en función de la concentración de calcio. Esta concentración puede estar regulada por las propias anexinas, ya que es posible que establezcan canales iónicos a través de las membranas, como más adelante se comentará. En la Figura 8 se muestra un esquema de las funciones intracelulares más relevantes que desempeñan las anexinas. Figura 8. Funciones intracelulares de las anexinas. Dentro de las funciones de las anexinas como proteínas intracelulares puede destacarse su papel regulador en las concentraciones intracelulares de calcio al establecer canales iónicos, su implicación en los procesos de tráfico de membranas, su interacción con proteínas del citoesqueleto o en su participación en la proliferación y diferenciación celular. INTRODUCCIÓN 1.3. Funciones de las anexinas 31 a) Anexinas como canales de calcio y reguladoras de otros canales iónicos Algunas anexinas, entre ellas la anexina A5 y la A2, pueden actuar como canales de calcio en determinadas circunstancias (acidificación local, oligomerización, etc.); en todos los casos se requiere que previamente haya una concentración de calcio mínima para que se produzca la interacción e inserción en la membrana. En cualquier caso, el mecanismo concreto que posibilita que estas proteínas actúen como canales iónicos sigue siendo debatido. Los principales mecanismos propuestos se recogen en la Figura 9. El primer modelo que se propuso se basa en la presencia de un poro hidrofílico en el centro de la estructura de la anexina. Cuando ésta se une a la membrana en presencia de calcio puede provocar una desestabilización de la bicapa fosfolipídica induciendo la electroporación de la membrana promoviendo de esta manera la permeabilidad iónica (Figura 9A) (Kourie y Shorthouse, 2000). Figura 9. Modelos propuestos para la formación de canales iónicos por ciertas anexinas. (A) Modelo basado en la distorsión de las bicapas lipídicas y electroporación de las membranas. (B) Modelo basado en la inserción del hexámero de la anexina B12 en la membrana, permitiendo el flujo de calcio a través de su canal central hidrofílico. (C) Modelo basado en la reestructuración conformacional detectada en las anexinas A5 y B12 a pH ligeramente ácido, sugiriéndose la aparición de 7 dominios transmembrana. INTRODUCCIÓN 32 1.3. Funciones de las anexinas Por otro lado, el análisis de la anexina B12 de Hydra ha sugerido dos mecanismos adicionales. Inicialmente, y basado en la estructura cristalina de un hexámero de esta proteína en presencia de calcio, se propuso la inserción del hexámero hidrofílico en la membrana generando un estructura transmembrana con un poro central hidrofílico que sería el responsable de la actividad de canal de calcio (Figura 9B) (Luecke y col., 1995). Posteriormente, se observó que esta anexina, y también la anexina A5, podrían sufrir un cambio conformacional considerable a valores de pH ligeramente ácidos próximos a la membrana. Estudios de resonancia de espín electrónico sugieren que las α-hélices se mantienen, pero se reagrupan de forma que la proteína pasa a tener 7 dominios transmembrana adoptando la topología de los canales iónicos convencionales (Figura 9C) (Isas y col., 2000; Kim y col., 2005). No solo el núcleo proteico tiene un papel relevante en esta función de las anexinas; el dominio N-terminal también tiene sus implicaciones en la regulación de esta actividad. Así en la anexina A2 y en la A5, la deleción de este dominio incapacita a la proteína para desempeñar el papel de canal iónico a través de la membranas (Gerke y Moss, 1997). Existen también bastantes evidencias experimentales demostrando que algunas anexinas, como la A2, A4 y A6, pueden actuar como moduladores de la actividad de otros canales iónicos, como los canales de cloruro en la membrana plasmática y canales de calcio en el retículo sarcoplásmico (Gerke y Moss, 2002; Gerke y col., 2005). b) Anexinas en el tráfico de vesículas Otra de las funciones generales que realizan las anexinas intracelulares es la de su implicación en el tráfico de membranas. En multitud de procesos celulares, como la endocitosis, la exocitosis, la fagocitosis, o las infecciones víricas, entre otros, algunas anexinas desempeñan un papel esencial debido a su capacidad para agregar y fusionar membranas (Figura 10). Dada la naturaleza electrostática negativa originada por los fosfolípidos que forman las membranas, el ion calcio surge como un mediador fundamental en estos procesos de fusión. Aunque la mayor parte de las anexinas descritas hasta la fecha se unen a las membranas a través del núcleo proteico por los sitios de unión de calcio de tipo II, existen otros posibles INTRODUCCIÓN 1.3. Funciones de las anexinas 33 mecanismos de unión que son independientes de calcio. Estos sitios pueden localizarse en el extremo N-terminal o en el propio núcleo proteico, habiéndose descrito regiones con secuencias K/RGD que podrían participar en estos procesos (Morgan y col., 2004). Las membranas de las vesículas que participan en las rutas de exocitosis, endocitosis o fagocitosis realizan los procesos de fusión y agregación de membranas con la participación de anexinas. A través de la exocitosis, la célula dirige el contenido de sus vesículas secretoras hacia el exterior mediante la fusión de su membrana con la Figura 10. Anexinas y tráfico de membranas. Algunas anexinas están implicadas con los procesos celulares de endocitosis, exocitosis o fagocitosis. La participación de las anexinas junto a las vesículas y proteínas del citoesqueleto parece relevante en el tráfico de membranas entre el dictiosoma y la membrana plasmática en ambos sentidos. En la imagen se representa la participación de las isoformas de la anexina A13, de vesículas del dictiosoma en células polarizadas. INTRODUCCIÓN 34 1.3. Funciones de las anexinas membrana citoplasmática y la expulsión del contenido vesicular al exterior pudiendo ser el contenido de estas vesículas, neurotransmisores, hormonas, proteínas de distinta naturaleza, lípidos y otras moléculas. Además, las vesículas se dirigen hacia la membrana plasmática guiadas por el citoesqueleto, estando las anexinas implicadas en la interacción vesícula-citoesqueleto (p.e., actina). Es conocido que en este proceso el aparato de Golgi juega un papel fundamental estableciendo un equilibrio entre los procesos de exocitosis y endocitosis (Marengo y Cardenas, 2018). El papel clave de las anexinas en el tráfico de vesículas es bien conocido desde que se descubrió y aisló la anexina A7 (sinexina) y se vio su papel en la exocitosis de los gránulos cromafines regulada por calcio (Pollard y col., 1980). Desde entonces han sido numerosas las anexinas que se han vinculado a los procesos de exocitosis, entre ellas las anexinas A1, A2, A3, A6, A7, A11, A13 y B7, y en concreto a procesos ligados con la liberación de vesículas de la red trans-Golgi (Gerke y Moss, 2002). Por ejemplo, se ha descrito que la anexina A2 promueve la formación de microdominios lipídicos esenciales para la exocitosis regulada por calcio (Chasserot-Golaz y col., 2005). En lo que respecta a los procesos de endocitosis, las anexinas implicadas que mejor se han caracterizado son las anexinas A1, A2 y A6 (Futter y White, 2007). La anexina A2 se ha identificado como un importante elemento en la formación de los endosomas tempranos (Morel y Gruenberg, 2009) y la anexina A1 parece participar en la internalización de endosomas multivesiculares y del EGFR (White y col., 2006). Además de la anexina A1, otras anexinas también participan en diferentes etapas que controlan el transporte endocítico y la señalización por el receptor del EGF, como las anexinas A2, A6 y A8 (Grewal y Enrich, 2009). La anexina A6 también participa en la regulación del transporte de colesterol e, indirectamente, en la exportación de caveolina desde el aparato de Golgi (Cubells y col., 2008; Grewal y col., 2010; Enrich y col., 2011; Enrich y col., 2017). Por último, las anexinas A1 y A2 se consideran importantes en los procesos de fagocitosis, como se ha observado en macrófagos que fagocitan células apoptóticas, aunque otras anexinas, como la A5, A6, la A7 y la A11, parecen estar también implicadas en este proceso (Pittis y col., 2003; Fan y col., 2004; Fang y col., 2012). Como en otros muchos procesos en los que están implicadas estas proteínas, las modificaciones que se producen en el extremo N-terminal originan cambios importantes en su funcionalidad. Así, la fosforilación INTRODUCCIÓN 1.3. Funciones de las anexinas 35 del residuo de Ser27 en la anexina A1, bloquea su unión a los fagosomas (Kusumawati y col., 2001). En el caso de células polarizadas (tal y como se muestra en la Figura 10), la anexina A13 participa en los procesos de exocitosis, siendo posible localizar ambas isoformas en la región apical, pero aparentemente solo la isoforma corta (AnxA13a) en la basolateral. En células MDCK (Madin Darby Canine Kidney), ambas isoformas se unen a los rafts que se forman en el aparato de Golgi de una manera independiente de calcio (Astanina y col., 2010). Aunque el papel exacto que desempeñan estas proteínas no es del todo conocido, parece confirmado que participan en la formación y liberación de las vesículas portadoras, en su transporte y en el anclaje y fusión final (Lecat y col., 2000). c) Agregación de vesículas dependiente de anexinas Además de su capacidad para interactuar con las membranas fosfolipídicas, varias anexinas de vertebrados son capaces de mediar en la agregación de vesículas, lo que está directamente relacionado con los procesos de endocitosis y exocitosis. Se ha descrito que las anexinas A1, A2, A4, A6 y A7 son capaces de inducir agregación de vesículas, mientras que otras, como las anexinas A3, A5, A6, A11 y la A13b no miristoilada, no la promueven (Blackwood y Ernst, 1990; Raynal y Pollard, 1994; Lecona y col., 2003; Turnay y col., 2005). Aunque la anexina A5 de mamíferos no induce agregación de vesículas, su ortólogo en aves sí que promueve la agregación (Turnay y col., 2009). La anexina A5 de pollo muestra una gran similitud de secuencia y estructura con las anexinas de mamíferos ausentes en aves, como las anexinas A3 y A4. Por lo tanto, algunas de las funciones fisiológicas ejercidas por estas proteínas pueden ser llevadas a cabo por la anexina A5, incluso aquellas que podrían requerir la agregación de la membrana dependiente del calcio. La agregación de las vesículas está regulada negativamente por la fosforilación del dominio N-terminal en residuos de serina/treonina y tirosina (Rothhut, 1997; Kaetzel y col., 2001; Turnay y col., 2003a; Dorovkov y col., 2011) o por la proteólisis de la extensión N-terminal (Bitto y Cho, 1999). Además, el proceso de agregación puede conducir finalmente a procesos de fusión, como se ha descrito para la anexina A7 en relación con su participación en la exocitosis de surfactante pulmonar, INTRODUCCIÓN 36 1.3. Funciones de las anexinas catecolaminas e insulina (Naidu y col., 2005). La composición de fosfolípidos y la sensibilidad al calcio para esta actividad de agregación varían significativamente entre las anexinas individuales (Raynal y Pollard, 1994; Gerke y col., 2005). Además, la composición y organización de los lípidos regula la sensibilidad al calcio de ciertas anexinas para la formación de puentes de membrana mediante la modulación de la fluidez de la membrana (Illien y col., 2012). ¿Cómo inducen las anexinas la agregación de membranas? Se han propuesto varios mecanismos que se representan en la Figura 11: (A) autoasociación-dimerización de anexinas unidas a membranas separadas; (B) establecimiento de heterotetrámeros formados por dos anexinas y dos proteínas S100; o (C), la aparición de un segundo sitio de unión a fosfolípidos tras la interacción de anexinas específicas con membranas a través de los sitios de tipo II dependientes de calcio situados en la superficie convexa de estas anexinas. Se ha observado mediante criomicroscopía electrónica que la anexina A4 agrega vesículas mediante el establecimiento de un dímero de la proteína (Kaetzel y col., 2001), del mismo modo que se ha demostrado para la anexina A5 de pollo. En este último caso, la agregación tiene lugar al unirse las moléculas de anexina a las vesículas por la región convexa (donde se encuentran los sitios de unión de calcio y fosfolípidos) y el establecimiento de dímeros de proteína por las regiones cóncavas de anexinas en vesículas opuestas, jugando el extremo N-terminal un papel esencial en la dimerización (Turnay y col., 2009). Las anexinas A1 y A2 parecen ser capaces de inducir la agregación de la membrana a través de diferentes mecanismos en los que el dominio N-terminal también desempeña un papel importante: A) la formación de dímeros mediante la interacción a través de los dominios N-terminales de las anexinas monoméricas, como se sugiere para la anexina A4 y la anexina A5 de pollo (Ayala-Sanmartin y col., 2008); B) la formación de puentes de membrana a través de heterotetrámeros con proteínas de la familia S100 (S100A11 y S100A10) (Dempsey y col., 2003; Illien y col., 2010); o C) la interacción de una molécula con dos membranas adyacentes de forma simultánea, por un lado a través de la región convexa y los sitios de unión de calcio y fosfolípidos y, por el otro, mediante las hélices anfipáticas que se liberan en presencia de calcio y que posibilitan la interacción con la membrana adyacente INTRODUCCIÓN 1.3. Funciones de las anexinas 37 (Rosengarth y Luecke, 2003; Zibouche y col., 2008). La anexina A2 es más propensa a formar heterotetrámeros debido a una conformación dimérica activa constitutiva de la S100A10 en condiciones fisiológicas, mientras que en la anexina A1, los mecanismos B y C son los más probables. En el caso de la anexina A6 se han sugerido otros mecanismos de agregación. Como se ha comentado anteriormente, esta proteína es única en la superfamilia de Figura 11. Mecanismos propuestos para la agregación de vesículas mediada por anexinas. El mecanismo de agregación depende de las características moleculares de la anexina implicada en el proceso. En todos los casos, el calcio es esencial para inducir el proceso. (A) Agregación inducida por las interacciones anexina-anexina a través del lado cóncavo de las moléculas (participación del extremo N-terminal). (B) Agregación inducida por la formación de puentes heterotetraméricos de anexina. La anexina A2 no requiere calcio para interactuar con la S100A10, ya que esta pequeña molécula S100 se encuentra permanentemente en la forma "activada" sin unir calcio. Otras anexinas requieren calcio para la formación del complejo con las proteínas S100, que se encuentran en una forma "inactivada" a bajas concentraciones de calcio (p.e., anexina A1 con S100A11). (C) Agregación de vesículas inducida por la aparición de un segundo sitio de unión a fosfolípidos en el extremo N-terminal tras la unión dependiente de calcio a una membrana y la consiguiente reordenación estructural de la anexina. INTRODUCCIÓN 38 1.3. Funciones de las anexinas anexinas, ya que consta de dos módulos centrales de anexina conectados por un bucle de 40 aminoácidos. La fosforilación de un residuo de treonina en el bucle de conexión parece aumentar la flexibilidad de la molécula, permitiendo que cada uno de los núcleos se una a membranas opuestas (Freye-Minks y col., 2003). También se ha observado que, a concentraciones de calcio elevadas (~2 mM), aumenta la flexibilidad del bucle conector permitiendo la agregación de las membranas (Buzhynskyy y col., 2009). d) Interacción con el citoesqueleto y reparación de membranas Otra de las funciones que desempeñan las anexinas intracelulares (Figura 10) es la de interaccionar con proteínas del citoesqueleto, mayoritariamente actina, regulando el equilibrio dinámico membrana-citoesqueleto. La anexina A2 fue la primera anexina en la que se observó su interacción con filamentos de actina de forma dependiente de calcio. Además, esta anexina posee la capacidad de agrupar filamentos de F-actina y desempeña un papel importante en su polimerización (Hayes y col., 2006; Morel y col., 2009). Otra anexina que se une a la F-actina es la anexina A1, que también interactúa con la profilina, una proteína de unión a la G-actina y reguladora de la polimerización de la actina (Álvarez-Martínez y col., 1997; McArthur y col., 2009). La interacción de la anexina A5 con la actina también se ha notificado en las plaquetas, donde actúa como un regulador clave del proceso de coagulación (Tzima y col., 2000). Por último, se ha descrito que la interacción de la anexina A6 con la actina es necesaria para la reorganización dinámica del sarcolema durante la contracción del músculo liso controlada por el calcio (Babiychuk y col., 1999; Gerke y col., 2005). En cuanto a los microtúbulos, se ha descrito una colocalización de la anexina A11 con la α-tubulina durante la mitosis en células COS-7 (Farnaes y Ditzel, 2003). La migración de la anexina A11 hacia el núcleo depende de calcio y, probablemente, requiere su interacción con la calciclina (S100A6). Una vez en el núcleo, la anexina A11 desempeña una función esencial para la formación del cuerpo medio y la finalización de la fase terminal de la citoquinesis (Tomas y col., 2004). La reparación de la membrana celular es un proceso activo que requiere calcio extracelular, vesículas intracelulares y exocitosis dependiente del calcio. Además del INTRODUCCIÓN 1.3. Funciones de las anexinas 39 calcio y las vesículas citoplasmáticas, se han identificado varias familias de proteínas (SNARES, sinaptotagminas, ferlinas y anexinas) como parte de la maquinaria de reparación (Draeger y col., 2011; Koerdt y col., 2019). Por ejemplo, se ha descrito que la disferlina, la MG53, la AHNAK, la calveolina-3 y la calpaína-3 participan en la reparación del músculo esquelético. Las primeras anexinas de las que se sabe que participan en este proceso fueron las anexinas A1 y A2, que interactúan con la disferlina (Lennon y col., 2003; McNeil y col., 2006). Posteriormente, se observó que el autoensamblaje de la anexina A5 en conjuntos bidimensionales en las membranas tras la activación por calcio promovía la reparación de la membrana celular (Bouter y col., 2011). De hecho, las actividades antiinflamatorias, profibrinolíticas y antitrombóticas de estas tres anexinas (A1, A2 y A5) se han relacionado con la maquinaria de reparación que protege a las células contra los daños derivados de la rotura de la membrana (Ling y col., 2004; D'Acquisto y col., 2008). La anexina A6 también participa en la reparación de la membrana formando parte de un andamio que une los microdominios de la membrana con el citoesqueleto (Cornely y col., 2011) y proporcionando una protección de la permeabilidad de la membrana contra las tensiones químicas y físicas (Creutz y col., 2012). En resumen, la reparación de la membrana plasmática requiere la formación de un complejo conjunto de interacciones proteína-proteína como el descrito para el complejo multiproteico tridimensional, que incluye S100A10, anexina A2 y AHNAK que, junto con la disferlina, funciona en la reparación del tejido muscular y cardíaco (Dempsey y col., 2012). e) Anexinas y señalización intracelular Las anexinas interactúan con las membranas en microdominios específicos que se caracterizan por su composición lipídica y su estructura. Como se ha comentado anteriormente, las anexinas interaccionan preferentemente con PS, pero también interactúan con otros fosfolípidos, como el PA, el PI, el PIP2, el PE, los ácidos grasos (por ejemplo, el ácido araquidónico), las ceramidas y los metabolitos derivados de los lípidos (Bandorowicz-Pikula y col., 2012). La mayoría de estas moléculas participan en vías de señalización mediadas por lípidos que regulan procesos celulares clave (Schug y col., 2012). Así, el PIP2 es uno de los principales fosfoinosítidos de la membrana plasmática que comprende aproximadamente el 1% INTRODUCCIÓN 40 1.3. Funciones de las anexinas de los fosfolípidos de la membrana plasmática. La anexina A2 se une con gran afinidad al PIP2, que suele encontrarse en dominios de membrana ricos en colesterol, proporcionando un enlace con el citoesqueleto de actina (Rescher y col., 2004; Futter y White, 2007; Hayes y col., 2009). Dado que el PIP2 es el precursor de los segundos mensajeros IP3 y diacilglicerol, la anexina A2 podría estar implicada no solo en la regulación de la dinámica del citoesqueleto de membrana sino también en otros eventos de señalización celular. La esfingomielinasa ácida convierte la esfingomielina en ceramida bajo ciertas condiciones en presencia de concentraciones elevadas de calcio. Tras su síntesis, la ceramida se autoasocia en plataformas, promoviendo una gran reorganización de la estructura de la membrana plasmática que implica la agrupación de moléculas de señalización y una amplificación de la formación, fusión y tráfico de vesículas. Así, la ceramida se considera un mediador lipídico clave en procesos celulares como la diferenciación, la proliferación, la detención del crecimiento y la apoptosis (Ho y col., 2022). Se ha descrito de que la anexina A1 participa en la producción de ceramida dependiente del calcio y promueve su agrupación en las plataformas de membrana. Estos efectos están restringidos a esta anexina ya que dependen de su dominio N- terminal específico (Babiychuk y col., 2008). La PKCα fosforila las anexinas A1, A2 y A4 modificando sus propiedades de unión a calcio y fosfolípidos. Aunque la anexina A6 interactúa directamente con la PKCα, no está fosforilada; esta anexina actúa como un nuevo andamio para reclutar a la PKCα a la membrana plasmática, lo que promueve la formación del complejo PKCα/EGFR con la consiguiente inhibición de la señalización por el EGFR inducida por el ligando (Enrich y col., 2011). La anexina A5 también se ha descrito como un regulador negativo de la actividad de la PKC; esta inhibición no se debe a una interacción directa, sino como consecuencia del secuestro de fosfolípidos (Dubois y col., 1998). Se ha descrito que varias anexinas modulan la vía de señalización EGFR/Ras a través de diferentes mecanismos. Por ejemplo, la anexina A6 inactiva a Ras mediante el reclutamiento de la p120GAP (proteína activadora de la GTPasa) en la membrana plasmática de las células del cáncer de mama (Vila de Muga y col., 2009). Otras anexinas implicadas en la regulación de la señalización y el tráfico de EGFR/Ras son las anexinas A1, A2 y A8. Las anexinas A1 y A2 son sustratos de fosforilación del INTRODUCCIÓN 1.3. Funciones de las anexinas 41 EGFR. Además, estas anexinas pueden interactuar con varias proteínas implicadas en esta y otras vías de señalización (Grewal y Enrich, 2009; Shetty y col., 2012). La anexina A5 regula la malignidad de las células de hepatocarcinoma regulando las vías de señalización mediadas por integrina, RAC1 y las MAP-quinasas (MEK y ERK) dado que la eliminación del gen de esta anexina provoca una disminución de la proliferación, migración, invasión y adhesión de estas células a los ganglios linfáticos (Sun y col., 2018). 1.3.2. Anexinas extracelulares Las anexinas que se encuentran localizadas en el exterior celular participan en diversos procesos biológicos. En el esquema de la Figura 12, se señalan los más destacados para esta localización de las anexinas. a) Anexinas e inflamación Uno de los procesos biológicos mejor caracterizados y regulados por las anexinas es la inflamación. La anexina A1 es capaz de inhibir diferentes enzimas implicadas en Figura 12. Funciones extracelulares generales de las anexinas. Las anexinas son proteínas eminentemente intracelulares, aunque también se han detectado anexinas secretadas o circulando en el plasma. Dentro de sus funciones como proteínas extracelulares destacan el control de la respuesta inflamatoria, actividad antitrombogénica, participación en la inhibición de la coagulación sanguínea o suponer un lugar para el anclaje y entrada de virus a la célula. INTRODUCCIÓN 42 1.3. Funciones de las anexinas el proceso inflamatorio, como la fosfolipasa A2 (PLA2), la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y la óxido-nítrico sintasa inducible (iNOS). Además, una vez secretada, la anexina A1 (o su dominio N-terminal escindido) se une al receptor de péptidos formilados (FPR o ALXR) promoviendo la separación de los leucocitos de la pared endotelial e inhibiendo su diapédesis a las zonas de inflamación o infección, con la consiguiente reducción de la respuesta inflamatoria (Kamal y col., 2005). Además de afectar a la migración de los leucocitos mediante la activación del FPR, la anexina A1 extracelular está implicada en apoptosis. Puede desencadenar respuestas proapoptóticas en los neutrófilos, y puede funcionar como un ligando en la superficie celular que promueva la fagocitosis cuando las células se vuelvan apoptóticas (Solito y col., 2003; Tabe y col., 2007). Sin embargo, una sobreexpresión de anexina A1 puede inhibir la fagocitosis de agregados proteicos y se ha asociado a la aparición de enfermedades como el Parkinson (Darvish y col., 2021). También se ha descrito que la anexina A5 inhibe a la PLA2 (Buckland y Wilton, 1998) y, teniendo en cuenta su capacidad de interactuar con la PS, también es capaz de inhibir la fagocitosis de los cuerpos apoptóticos por parte de los macrófagos (Kenis y col., 2006). La anexina A6 también inhibe la actividad de la PLA2. Esta actividad está implicada en los eventos de vesiculación del Golgi y su inhibición en células que sobreexpresan anexina A6 interfiere con la exportación de caveolina desde las membranas del Golgi (Cubells y col., 2008). b) Anexinas en coagulación y fibrinolisis Se ha propuesto un papel anticoagulante para la anexina A5 extracelular basado en su capacidad para formar escudos cristalinos 2D en la superficie de las plaquetas activadas que expresan PS en la hemicapa exterior de su membrana. Este escudo secuestra eficazmente la PS de los factores procoagulantes que utilizan este fosfolípido en la cascada de coagulación (Gerke y col., 2005). A este respecto, se ha propuesto que la inhibición mediada por anticuerpos de la propiedad anticoagulante de la anexina A5 puede ser una de las causas de las pérdidas recurrentes de embarazos observadas en pacientes con lupus eritematoso y síndrome antifosfolípido (Satoh y col., 1999). INTRODUCCIÓN 1.4. La anexina A2 43 La anexina A2 desempeña un papel importante en la fibrinólisis. Se ha descrito que la anexina A2 extracelular también forma heterotetrámeros con S100A10 en la superficie celular. Este complejo de la superficie celular actúa como correceptor para el plasminógeno y el activador tisular del plasminógeno (tPA), promoviendo la producción de plasmina con la consiguiente degradación de la fibrina (Bharadwaj y col., 2021b). 1.4. LA ANEXINA A2 La anexina A2 (denominada inicialmente calpactina-1 o p36) fue una de las primeras anexinas descubiertas junto a la anexina A1 (lipocortina) y la anexina A6 (sinexina) alrededor de 1980. Se caracterizó como una proteína que unía las membranas al citoesqueleto de actina y podía encontrarse tanto en forma monomérica como heterotetramérica (AnxA22-S100A102). Al igual que el resto de las anexinas, la anexina A2, es una proteína soluble capaz de unirse a los fosfolípidos ácidos que forman parte de las membranas biológicas mediante un proceso dependiente de calcio participando en diferentes y numerosos procesos biológicos. Se localiza preferentemente en el citoplasma, pero también asociada a las membranas, tanto en el interior celular como asociada a la membrana externa e interaccionando con la matriz extracelular, e incluso en núcleo celular (Eberhard y col., 2001). Puede destacarse como función principal de esta proteína la de participar en el mantenimiento de la unión de estructuras biológicas, sobre todo aquellas relacionadas con la interacción entre membranas biológicas y el citoesqueleto. En la anexina A2 se pueden encontrar algunas particularidades estructurales y funcionales que la diferencian de otras anexinas; estas diferencias tienen que ver no solo con su extremo N-terminal, sino también con peculiaridades de su núcleo proteico que le posibilitan la interacción con membranas de forma independiente de calcio (Hakobyan y col., 2017). 1.4.1. Estructura de la anexina A2 humana La anexina A2 humana monomérica posee 338 aminoácidos (excluyendo la Met N-terminal) con una masa molecular de 38,5 kDa. En 1996, el grupo de Robert Huber publicó por primera vez la estructura tridimensional del núcleo proteico de la INTRODUCCIÓN 44 1.4. La anexina A2 anexina A2 humana truncado en sus primeros 30 residuos. El núcleo de la proteína (residuos 34-339) forma una estructura compacta y muy resistente a la acción de proteasas, en la que se puede diferenciar una región convexa, donde se localizan los sitios de unión de calcio, y una región cóncava donde parte del extremo N-terminal cierra la estructura interaccionando con el dominio IV, como en todas las anexinas conocidas hasta la fecha. El extremo carboxilo terminal de la anexina A2, mantiene el patrón característico de la estructura del núcleo proteico de las anexinas (Figura 13), con cuatro dominios de alrededor de 70 aminoácidos, cada uno de ellos constituido por cuatro hélices α orientadas de manera antiparalela y formando una superhélice dextrógira, y una quinta hélice (hélice C) perpendicular a las anteriores (Bharadwaj y col., 2013; Lizarbe y col., 2013). A diferencia de otras anexinas de vertebrados, la anexina A2 solo presenta la secuencia canónica de unión de calcio tipo II (KGXGT-38-D/E) en los dominios II, III y IV, estando ausente en el dominio I (Morgan y col., 2004; Moss y Morgan, 2004). Este dominio, sin embargo, sí que presenta los otros posibles sitios de unión de calcio (B y DE), que están también presentes en los dominios II y III. Se ha postulado que la presencia de estos sitios adicionales de unión provoca el incremento de la afinidad de toda la molécula por el calcio y también por las cabezas polares de los fosfolípidos, aunque no parecen ser suficientes para establecer el mecanismo que permita a la proteína unirse a las membranas biológicas (Lizarbe y col., 2013). Al igual que en el resto de las anexinas, en la anexina A2 la extensión N-terminal está considerada como el principal elemento regulador tanto de la estructura como de la función ya que contribuye a la estabilidad de la estructura global y media en la interacción con otras proteínas o incluso en la autoasociación de monómeros. La extensión N-terminal de la A2 tiene 32 aminoácidos y contiene una secuencia de 11 aminoácidos que pueden formar una hélice anfipática (Figura 13). INTRODUCCIÓN 1.4. La anexina A2 45 Figura 13. Estructura tridimensional de la anexina A2 humana en presencia de calcio. La estructura de esta proteína tiene el modelo de plegamiento típico del núcleo proteico de las anexinas. Se pueden observar los cuatro dominios del núcleo, que se representan con diferentes colores: el dominio I de azul marino, el II de azul celeste, el III de color anaranjado y el IV de color rojo. Las α-hélices están marcadas con letras desde la A a la E en el dominio III. Los iones de calcio están representados por esferas de color amarillo y en su interior con letras se señalan los tipos de los sitios de unión; así AB representa un lugar de unión a calcio de tipo II o canónico, y DE o B son los sitios de unión de tipo III. El extremo N-terminal está representado de color marrón claro y aparece truncado. Los residuos 2 a 12 forman una hélice anfipática que se representa en forma de rueda helicoidal, con los residuos hidrofóbicos coloreados de azul y los polares o cargados, de blanco. En la segunda imagen que se corresponde con la vista superior, se puede apreciar de manera muy clara el poro central de carácter hidrofílico. El modelo se ha preparado utilizando el programa MOLMOL (PDB ID: 1XJL) (Rosengarth y Luecke, 2004). INTRODUCCIÓN 46 1.4. La anexina A2 Esta región es esencial para que sea posible la interacción con dímeros de la proteína S100A10 (p11) en el lado cóncavo de la anexina A2, ya que contiene cuatro residuos de naturaleza hidrofóbica (Val-4, Ile-7, Leu-8 y Leu-11) que posibilitan la asociación con los monómeros de S100A10, pudiendo formarse estructuras tetraméricas funcionales formadas por dos moléculas de anexina A2 y dos de S100A10, mediante un proceso independiente de calcio (Bharadwaj y col., 2013). Estos heterotetrámeros estarían estabilizados por el establecimiento de hasta 19 puntos de contacto entre la anexina A2 y los monómeros de S100A10, en los que participan los residuos hidrófobos del extremo N-terminal de la anexina y las hélices HI y HIV de cada uno de los monómeros de S100A10. En la Figura 14 se representa la estructura tridimensional del complejo entre un dímero de S100A10 y péptidos N-terminales acilados (residuos 2 a 14) de la anexina A2 humana (Réty y col., 1999). Figura 14. Modelo tridimensional de la interacción entre péptidos derivados del extremo N‐terminal de la anexina A2 y el dímero de S100A10 (p11). Los monómeros de S100A10 se representan con los colores rojo y naranja, y los péptidos de la anexina A2 en azul oscuro. Se indican los extremos N- y C-terminales de las proteínas, así como la secuencia de los péptidos empleados de la anexina A2, indicándose en azul los que forman la hélice α anfipática. El modelo se ha preparado utilizando el programa MOLMOL (PDB ID: 1BT6). INTRODUCCIÓN 1.4. La anexina A2 47 El extremo N-terminal de la mayoría de las anexinas y también de la anexina A2, sufre modificaciones postraduccionales. En la Figura 15 se destacan los residuos más relevantes que sufren este tipo de modificaciones en la anexina A2. Estas modificaciones regulan algunas funciones de la proteína ubicadas en el núcleo proteico, como la actividad de unión de fosfolípidos o a la F-actina (Hubaishy y col., 1995). La acetilación N-terminal es una de las modificaciones postraduccionales más frecuentes en las anexinas y está presente en la anexina A2. De hecho, la acetilación de la Ser-2 es esencial para poder unirse a S100A10 y formar un heterotetrámero estable (Nazmi y col., 2012). La fosforilación de algunos residuos de este segmento es otra de las modificaciones postraduccionales más importantes que sufre la proteína. Así, desde hace años se considera a la anexina A2 como uno de los sustratos principales para la familia Src de tirosinas quinasas, así como para oncogenes con actividad tirosina quinasa, ya que es fosforilada por la proteína tirosina quinasa pp60src, codificada a partir del oncogén del virus del Sarcoma de Rous en la Tyr24 (Erikson y col., 1984; Powell y Glenney, 1987). La fosforilación de este residuo provoca un cambio conformacional en la proteína que estabiliza su interacción con las membranas (Morel y Gruenberg, 2009). La fosforilación de la Tyr24, también juega un papel crucial en la malignidad de células de adenocarcinoma de colon (Xiao y col., 2020), además de aparecer involucrada en procesos endocíticos, particularmente en la internalización del Figura 15. Representación esquemática del extremo N‐terminal de la anexina A2. En el dominio N-terminal de la anexina A2 (Ser-2 a Phe-33) tienen lugar las modificaciones postraduccionales como la acetilación (Ser-2) y la fosforilación (Ser-12, Tyr-24 y Ser-26). También incluye un residuo de cisteína susceptible de reacciones redox (Cys-9) y una secuencia de exportación nuclear (NES) (Val-4 a Leu-13). El sitio de unión de S100A10 es una hélice anfipática con lo residuos hidrofóbicos Val-4, Ile-7, Leu-8 y Leu-10 estableciendo contactos con S100A10 (Bharadwaj y col., 2013). INTRODUCCIÓN 48 1.4. La anexina A2 receptor de insulina o en la transición de endosomas tempranos a tardíos (Biener y col., 1996; Grindheim y col., 2017). Otro residuo del extremo N-terminal de la anexina A2 que también es susceptible de sufrir fosforilación es la Ser26; en las células cromafines, la fosforilación de este residuo por la PKC se produce en respuesta a la estimulación de la nicotina y se ha relacionado con la exocitosis de los gránulos (Delouche y col., 1997). La fosforilación del residuo de Ser12 por PKC causa modificaciones en la estabilidad del complejo AnxA2-S100A10 de manera que lleva a producir una disociación del heterotetrámero (Jost y Gerke, 1996). La fosforilación del extremo N-terminal por v-Src parece promover la entrada de la anexina A2 monomérica en el núcleo celular. Su vuelta al citosol está condicionada por la presencia de una secuencia de exportación nuclear situada también en esta región (Figura 15), por lo que este proceso parece estar regulado por modificaciones fosfo-desfosfo (Eberhard y col., 2001). Los residuos de cisteína sufren procesos de oxidación/reducción en las proteínas. La anexina A2 tiene cuatro residuos de cisteína, la Cys-9, Cys-133, Cys-262 y Cys- 335. Las cisteínas 133 y 262 forman un puente disulfuro, mientras que la 9 (extremo N-terminal) y la 335 (núcleo proteico) están libres y orientadas hacia el lado convexo de la proteína opuesto al de interacción con las membranas. La Cys-335 participa en la reducción de un puente disulfuro en la plasmina necesario para su autoproteolisis y liberación del péptido antiangiogénico angiostatina (Kwon y col., 2002). Por otro lado, la Cys-9 es sensible a los procesos de oxidación y reducción, de manera que, en situaciones de estrés oxidativo celular, la cisteína oxidada estimula las vías de señalización que logran la activación de las respuestas antioxidantes de la célula. Es susceptible de S-glutationilación cuando se produce un estado de estrés oxidativo, por ejemplo, en células expuestas a la citoquina TNF-α. Aunque la cisteína modificada estaría dentro de la secuencia implicada en la formación del heterotetrámero con S100A10, no parece alter la interacción (Sullivan y col., 2000), aunque sí que parece que afecta a la capacidad de agregación de vesículas del complejo A2-S100A10 (Singh y Liu, 2000). También se ha descrito que la función reguladora redox que realizan estos residuos es muy importante en la tumorigénesis (Madureira y col., 2011a). INTRODUCCIÓN 1.4. La anexina A2 49 1.4.2. Funciones de la anexina A2 Se puede afirmar que la localización de la anexina A2 es ubicua, se puede encontrar en numerosos tipos de células monocitos, macrófagos, células endoteliales y epiteliales, y se sobreexpresa en numerosas células tumorales. En función del tipo celular y de su localización pueden variar tanto su expresión como su funcionalidad. Originalmente esta proteína fue identificada como una proteína intracelular y los niveles que puede alcanzar en el citoplasma son elevados, aunque también se puede expresar extracelularmente. Muchos estudios se centran en las funciones del heterotetrámero, pero se han descrito varias funciones que están ligadas a su conformación monomérica y que difieren de las que presentan cuando está en forma tetramérica (Bharadwaj y col., 2021a). De modo genérico puede afirmarse que la anexina A2, al igual que otras anexinas, posee como funciones más destacadas la de participar en los mecanismos de agregación de membranas, la regulación de la interacción entre la membrana y el citoesqueleto y la formación de microdominios. La anexina A2 presenta algunas particularidades que la diferencian del resto de anexinas; así, se ha sugerido que la anexina A2 monomérica podría interaccionar y agregar membranas de forma independiente de calcio, aunque con menor afinidad (Jost y col., 1997; Gokhale y col., 2005). Cuando la forma monomérica o heterotetramérica se une a una bicapa lipídica forma una monocapa de proteínas agrupadas junto con los fosfolípidos aniónicos que se acumulan por debajo de estos grupos de proteínas (Menke y col., 2005). La anexina A2 y el heterotetrámero participan en la formación de “balsas” de lípidos ricas en colesterol (rafts) y en la vinculación que se produce con las proteínas del citoesqueleto (Liu y col., 2015). Las funciones de la anexina A2, pueden diferenciarse en función de la ubicación de la proteína, que puede encontrarse en tres lugares de la célula separados por membranas: en el exterior celular, en el interior celular (citoplasma) y en el núcleo (Figura 16). INTRODUCCIÓN 50 1.4. La anexina A2 Cuando la anexina A2 forma el complejo con S100A10, los requerimientos de calcio se reducen en los procesos de interacción con las membranas. Además, la anexina A2 es esencial en la regulación de S100A10 ya que evita su degradación mediada por ubiquitina (He y col., 2008). La anexina A2 carece de péptido señal, pero se detecta en el exterior celular debido, posiblemente, a transportadores del tipo ATP binding cassette (ABC), como se ha descrito para la anexina A1 (Chapman y col., 2003; Wein Figura 16. Principales funciones intra y extracelulares de la anexina A2. La anexina A2 puede encontrarse en distintos compartimentos celulares, incluido el núcleo, en equilibrio entre la forma soluble monomérica y la unida al citoesqueleto (tráfico intracelular de vesículas) o a membranas (en forma monomérica o heterotetramérica), dependiendo de la concentración local de calcio, de la composición lipídica o del estado de fosforilación de la Tyr-24 (sustrato de EGFR). La formación del heterotetrámero está regulada negativamente por la fosforilación por PKC de la Ser-12. El residuo de Cys-9 es importante en la regulación del estado redox intracelular y nuclear. A pesar de carecer de péptido señal, la anexina A2 se puede localizar extracelularmente tanto en forma monomérica como heterotetramérica. El tetrámero participa en la activación de proteasas extracelulares, como la plasmina; la forma monomérica, mediante su Cys-335, reduce un puente disulfuro en la plasmina liberando el péptido antiangiogénico angiostatina. El monómero de anexina puede unirse a moléculas de ácidos nucleicos (DNA y RNA) y se ha descrito que puede estimular la actividad de la DNA polimerasa α formado parte del complejo proteico de reconocimiento de cebadores durante la replicación. INTRODUCCIÓN 1.4. La anexina A2 51 y col., 2004), siendo responsable de la exportación extracelular de S100A10 (Kwon y col., 2005) 1.4.3. Funciones extracelulares de la anexina A2 a) Activación de proteasas por la anexina A2 y cáncer Extracelularmente, la anexina A2 se ha descrito como un receptor de S100A10, y ésta actúa estimulando la activación del plasminógeno a plasmina por tPA (activador tisular del plasminógeno), estimulando la descomposición de los coágulos sanguíneos de fibrina (Madureira y col., 2011b). De hecho, una sobreexpresión de anexina A2 genera unos niveles altos de plasmina que se acumula en el plasma pudiendo detectarse problemas hemorrágicos en enfermedades que se encuadran dentro de las anexinopatías (Rand, 2000; Hayes y col., 2007). También mediante la regulación de la actividad proteolítica de la plasmina, el complejo (AnxA2-S100A10)2 juega un papel muy importante en la metástasis e invasión tumoral, ya que esta actividad de la plasmina en la superficie celular es utilizada por las células tumorales, macrófagos y neutrófilos asociados al tumor para digerir la matriz extracelular y otras barreras tisulares (Madureira y col., 2012), favoreciendo además el proceso de neoangiogénesis ayudando a las células tumorales a obtener nutrientes y oxígeno (Ling y col., 2004). Por el contrario, el monómero de anexina A2 actuaría como plasmina reductasa (a través de la Cys-335) liberando angiostatina con actividad antiangiogénica (Kwon y col., 2002). La A2 actúa también como un receptor o proteína de unión para otras proteasas, como la catepsina B. La procatepsina B interactúa con el heterotetrámero (AnxA2- S100A10)2 en la superficie de las células tumorales, activándose. Además, el heterotetrámero tiene capacidad para unirse a proteínas de la matriz extracelular, como el colágeno de tipo I o la tenascina C, lo que facilita la degradación de estas proteínas por las proteasas favoreciendo el proceso de invasión y la motilidad de las células tumorales (Mai y col., 2000). Hay muchas evidencias experimentales que confirman la relación que existe entre la desregulación en la expresión de la anexina A2 y la tumorigénesis en distintos tipos de cáncer (mama, páncreas, riñón, colon, hígado, pulmón, etc.), aunque no es tan conocido el papel que desempeña S100A10 INTRODUCCIÓN 52 1.4. La anexina A2 (Zhang y col., 2004; Esposito y col., 2006; Domoto y col., 2007; Sharma y col., 2010; Sun y col., 2013; Christensen y col., 2018). Como se ha comentado anteriormente, la anexina A2 juega un papel clave en los procesos de la progresión tumoral, como la invasión, metástasis o incluso resistencia a los medicamentos, por lo que se la ha propuesto como un marcador de diagnóstico y pronóstico para la predicción de malignidad tumoral, así como una potencial diana terapéutica (Bharadwaj y col., 2013; Sharma, 2019). En el cáncer de próstata la expresión de la anexina A2 presenta unos resultados que pudieran parecer contradictorios, ya que, a diferencia de lo que sucede en otros tipos de cáncer, en este hay una merma en la expresión de la anexina A2 (y de otras como las anexinas A1, A4, A7 y A11) y de S100A10, lo que parece estar relacionado con la dependencia de andrógenos en este tipo de cáncer (Xin y col., 2003; Yee y col., 2007). b) Anexina A2 e inflamación El papel del heterotetrámero extracelular en la inflamación es otra de las funciones principales que pudieran destacarse, ya que se ha descubierto el papel fundamental que desempeña al mediar en la producción de señales proinflamatorias en respuesta a diversos estímulos y al promover la migración e infiltración de macrófagos dependientes de la plasmina (Song y col., 2012). La plasmina que genera el heterotetrámero de anexina A2 induce la unión de la anexina A2 monomérica unida a la membrana al receptor TLR4 (Toll‐Like Receptor; proteínas que forman parte del sistema inmunitario innato). Esto provoca una fosforilación mediada por PKC de los residuos de Ser-12 y Ser-26, induciendo la disociación del heterotetrámero y posibilitando la ubiquitinación y degradación proteasómica de S100A10. A la vez, la unión del tPA al residuo de lisina del carboxilo terminal de la S100A10 induce la activación de ILK (quinasa ligada a integrinas) de manera dependiente del antígeno CD11b, induciéndose la producción de mediadores proinflamatorios, como el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y algunas interleuquinas (Bharadwaj y col., 2013). En el proceso fagocítico, la adhesión entre las células está mediada por el heterotetrámero de anexina A2. Su presencia en la superficie celular de los INTRODUCCIÓN 1.4. La anexina A2 53 macrófagos facilita la fagocitosis de los linfocitos apoptóticos que expresan fosfatidilserina. De hecho, el tratamiento de los macrófagos, o de los linfocitos, con un anticuerpo monoclonal frente a la anexina A2 inhibe la fagocitosis mediada por macrófagos de los linfocitos apoptóticos (Fan y col., 2004). La agrupación de los dominios de PS que origina el heterotetrámero en la superficie celular podría ser la señal para que los fagocitos reconocieran a los linfocitos apoptóticos, de manera que el heterotetrámero de anexina A2 pudiera mediar en la adhesión entre los macrófagos y los linfocitos apoptóticos (Myrvang y col., 2013). c) Anexina A2 y patogénesis viral La anexina A2 ha sido relacionada con episodios de patogénesis viral, estando relacionada con diferentes tipos virus y aparece involucrada en diferentes fases del ciclo viral. Uno de los virus que está vinculado con la anexina A2 es el virus del papiloma humano (VPH). El heterotetrámero participa en la entrada y en el tráfico intracelular del virus, en la disolución de la cápsida, y protege a los viriones de la degradación lisosomal. La anexina A2 parece desempeñar un papel más relevante, dado que anticuerpos frente a la anexina A2 alteran la cinética de entrada del virus, pero no ocurre lo mismo cuando se elimina S100A10, por lo que el monómero de anexina A2 también debe participar en el proceso. Además, se ha visto que la anexina A2 puede interaccionar con CD63, otro conocido mediador de la entrada del virus (Dziduszko y Ozbun, 2013; Taylor y col., 2018a). La anexina A2 está implicada en la infección por numerosos otros virus, tanto virus DNA como RNA, entre ellos el enterovirus 71 (EV71), el virus sincitial respiratorio (RSV), el citomegalovirus (CMV), el virus de la hepatitis C (HCV), el virus del SIDA (HIV-1) e incluso el SARS-COV-2 (Figura 17) (Taylor y col., 2018b; Patil y col., 2021). En general, el heterotetrámero parece estar implicado tanto en el anclaje del virus como en el proceso de endocitosis y exocitosis de los viriones, mientras que en la replicación del genoma viral y en el ensamblaje de los virus parece jugar un papel más relevante el monómero de anexina. INTRODUCCIÓN 54 1.4. La anexina A2 1.4.4. Funciones intracelulares de la anexina A2 a) Trafico de vesículas e interacción con el citoesqueleto Dentro de las funciones intracelulares la anexina A2 algunas son indispensables para la vida celular, como las que están relacionadas con los procesos de tráfico de vesículas y agregación y fusión de membranas. Desde hace tiempo se conoce la implicación del heterotetrámero de anexina A2 en la agregación y liberación del contenido de catecolaminas de los gránulos cromafines cuando las células adrenales se estimulan con acetilcolina o nicotina. Este proceso se da incluso a Figura 17. Esquema de la implicación de la anexina A2 monomérica y heterotetramérica en infecciones virales. (A) Virus con evidencias de la participación de la anexina A2 en la adhesión y entrada en la célula, que puede ocurrir por endocitosis o por fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática. (B) Virus que han demostrado utilizar anexina A2 durante la replicación y expresión del genoma, un proceso que puede ocurrir en el citoplasma o en el núcleo. (C) Virus que se ha demostrado que utilizan anexina A2 durante el ensamblaje, la maduración y la salida de la célula. El ensamblaje puede producirse en el núcleo o en el citoplasma, y la liberación se consigue a través de la lisis celular, apoptosis, exocitosis o fusión directa con la membrana plasmática. Esquema modificado de (Taylor y col., 2018b). (HPV: virus del papiloma humano; EV7: enterovirus 71; RaV: virus de la rabia; RSV: virus respiratorio sincitial; CMV: citomegalovirus; HIV-1: virus de la inmunodeficiencia humana 1; SARS-COV-2: coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo; IAV: virus de la gripe (influenza) tipo A; virus de la bronquitis infecciosa; HCV: virus de la hepatitis C; MV: virus del sarampión (measles); CSFV: virus de la peste porcina clásica; BTV: virus de la lengua azul. INTRODUCCIÓN 1.4. La anexina A2 55 concentraciones relativamente bajas de calcio porque la interacción de la anexina con S100A10 aumenta su afinidad por los fosfolípidos al igual que la fosforilación de la Ser-26 por PKC (Sarafian y col., 1991). En los procesos de endocitosis y de exocitosis, tanto el complejo heterotetramérico (AnxA2-S100A10)2 como la anexina A2 monomérica contribuye a la formación y estabilización de microdominios lipídicos ricos en colesterol (Harder y col., 1997; Chasserot-Golaz y col., 2005; Gokhale y col., 2005). Además, la anexina A2 es esencial para el proceso de transporte de las vesículas exocíticas desde el aparato de Golgi hacia los rafts lipídicos en la membrana plasmática, pero no para las vesículas que no se asocian a rafts (Jacob y col., 2004). La implicación de la anexina A2 en la endocitosis también puede deberse a su propiedad de unirse a la actina y regular el crecimiento de los filamentos (Hayes y col., 2007), mediante un proceso dependiente de calcio, a través de una interacción con clatrina (Creutz y Snyder, 2005), o bien mediante procesos independientes de clatrina (Valapala y Vishwanatha, 2011). La fosforilación de la Tyr-24 parece esencial para la estabilización de las balsas lipídicas y la posterior asociación con todo el sistema endosómico. Aunque S100A10 no parece ser imprescindible para el proceso de endocitosis mediado por la anexina A2, sí se ha observado que facilita la traslocación de la anexina A2 a la membrana y dirige a la anexina A2 hacia el citoesqueleto cortical y mejorando la interacción con la F-actina. La anexina A2 también parece estar implicada en el proceso de polarización de las células epiteliales y en la formación y estabilización de las uniones adherentes dependientes de E-cadherina. De hecho, en células MDCK knock out para la anexina A2, estas uniones adherentes no se llegan a formar, aunque sí las uniones estrechas dependientes de claudina (Lee y col., 2004; Yamada y col., 2006). b) Anexina A2 en complejos ribonucleoproteicos Existen numerosos trabajos que confirman que la anexina A2 está implicada en la localización y en la regulación de la traducción de ciertos mRNA en polisomas unidos al citoesqueleto y, por tanto, en la regulación de la biosíntesis de proteínas específicas, como la c-myc y la propia anexina A2, ambas vinculadas a la transformación maligna. Esta interacción es dependiente de calcio y, lo más INTRODUCCIÓN 56 1.4. La anexina A2 probable, es que la anexina A2 se active mediante vías de señalización adicionales, que dan lugar a modificaciones postraduccionales y modulan su unión a varios ligandos, incluidos mRNA específicos, como se ha visto en el caso de la fosforilación de la Ser-26 (Aukrust y col., 2017; Grindheim y col., 2017). Los residuos positivos y polares de las hélices C-D del dominio IV de anexina A2 se unen a secuencias cis en los 3'-UTR de su propio mRNA, así como los mRNA de c-myc, de la enzima colágeno prolil-4-hidroxilasa-α y del receptor R1 de N-metil-D-aspartato (NMDA), contribuyendo así a la regulación postranscripcional de la expresión de estos genes. Los elementos cis en los 3’-UTR contienen la secuencia consenso 5'-AA(C/G)(A/U)G aunque también podría haber sitios de unión no canónicos. En el caso del mRNA de c-myc, la asociación con la anexina A2 parece regular su localización perinuclear asociada al citoesqueleto gracias a la interacción anexina-actina (Vedeler y col., 2012). En el caso del mRNA de c-myc, se ha comprobado que la anexina A2 también puede unirse, de manera dependiente de calcio, al sitio interno de entrada al ribosoma en la región 5’-UTR. Esta interacción también se favorece cuando la Ser- 26 de la anexina A2 está fosforilada y se ha sugerido que la anexina regula negativamente la expresión de c-Myc durante su transporte hasta la región perinuclear (Strand y col., 2021). Recientemente se ha visto también la asociación de la anexina A2 con el RNA largo no codificante (lncRNA) LINC01133, que está sobreexpresado en hepatocarcinoma. Este lncRNA actúa como “esponja” del miR-159a-5p con el consiguiente aumento en la expresión de SNAI1 y la inducción de la transición epitelio-mesénquima (EMT). Por otro lado, al unirse a la anexina A2, favorece su activación por fosforilación en la Tyr-24 y ésta, a su vez, activa la señalización por STAT3 con el consiguiente incremento en la transcripción de la ciclina D1 (Yin y col., 2021). c) Anexina A2 nuclear Aunque la anexina A2 se localiza principalmente en el citoplasma y la membrana plasmática, también se puede encontrar en menor proporción en el núcleo, lo que sugiere una función nuclear de la proteína. La anexina A2 posee una secuencia de exportación nuclear (NES; ver Figura 15) y la inhibición de la NES por desfosforilación de la Ser-26 es suficiente para causar la acumulación nuclear. Se ha INTRODUCCIÓN 1.4. La anexina A2 57 demostrado que la anexina A2 se acumula en el núcleo en respuesta a agentes genotóxicos como la radiación gamma, la radiación UV, el etopósido y el cromo VI, y que este proceso está mediado por la secuencia de exportación nuclear de la anexina A2. La acumulación nuclear de anexina A2 se bloquea por el agente antioxidante N- acetilcisteína (NAC) y está estimulada por el peróxido de hidrógeno (H₂O₂), lo que sugiere que la acumulación es dependiente de las especies reactivas del oxígeno. En respuesta a los agentes genotóxicos, las células desprovistas de anexina A2 muestran un aumento de los niveles de fosfo-histona H2AX y p53, un mayor número de focos nucleares de la proteína de unión a p53 y un aumento de los niveles de 8- oxo-2'-desoxiguanina nuclear, lo que sugiere que la anexina A2 desempeña un papel en la protección del DNA contra los daños (Madureira y col., 2012). Se ha descrito también que la anexina A2 forma parte del complejo proteico de reconocimiento de cebadores (PRP; Primer Recognition Protein), colaborando en la actividad de la DNA polimerasa α durante la replicación del DNA (Jindal y col., 1991). También se ha descrito recientemente que la anexina A2 desempeña un papel en la respuesta inflamatoria de células epiteliales renales humanas (HK2) que puede estar mediado por la regulación de la transcripción y el splicing alternativo de genes relacionados con la inflamación, entre ellos genes implicados en la señalización por interferón, algunas citoquinas proinflamatorias, o el factor NFκB (Chen y col., 2022). Con respecto a este último factor, en células del músculo liso vascular se ha comprobado que un incremento en la expresión de anexina A2 promueve la fosforilación de la subunidad p65 de NFκB y que se cotransportan al núcleo induciendo una respuesta proinflamatoria (Cheng y col., 2022). INTRODUCCIÓN 58 1.4. La anexina A2 2. OBJETIVOS OBJETIVOS 2. Objetivos 61 2. OBJETIVOS Como ya hemos señalado, la anexina A2 es una proteína fundamentalmente citosólica que está implicada en procesos de unión a membranas biológicas, induciendo agregación de las mismas de una manera dependiente de calcio. Está presente en procesos de tráfico intracelular de vesículas, interactuando con actina, o bien extracelularmente participando en la activación del plasminógeno, además de numerosos procesos en los que está involucrada la interacción con membranas. En primer lugar, se plantea conseguir el aislamiento y la purificación de la anexina recombinante para poder realizar una caracterización estructural y funcional de la misma mediante técnicas espectroscópicas y analizando cómo afecta la unión de calcio. También se plantea la obtención de distintos mutantes para evaluar la importancia de la hélice anfipática N-terminal y de ciertos residuos específicos en la estructura y funcionalidad de la anexina A2 monomérica. Los objetivos específicos que se plantean son: 1. Clonación, expresión y purificación de la anexina A2 humana. 2. Caracterización estructural y funcional de la anexina A2 humana. 2.1. Caracterización espectroscópica mediante dicroísmo circular y espectroscopía de fluorescencia. Efecto de la unión de calcio. 2.2. Caracterización de la unión a vesículas fosfolipídicas y de la capacidad de agregación de las mismas. 3. Diseño y obtención de mutantes de anexina A2. Clonación, expresión y purificación de los mutantes. 3.1. Caracterización estructural de los mutantes 3.2. Determinación de la importancia que tiene la hélice anfipática N-terminal y ciertos residuos clave de la proteína en la unión y agregación de vesículas fosfolipídicas. 3.3. Propuesta de modelos que expliquen los posibles mecanismos de unión y agregación de vesículas. 4. Análisis de la capacidad de oligomerización de la anexina A2 (y sus distintas formas mutadas) en ausencia y presencia de vesículas fosfolipídicas mediante ensayos de entrecruzamiento. Relación con la funcionalidad de la proteína. OBJETIVOS 62 2. Objetivos 3. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS Nomenclatura y propiedades de las variantes de anexina A2 65 3. MATERIALES Y MÉTODOS NOMENCLATURA Y PROPIEDADES DE LAS VARIANTES DE ANEXINA A2 Proteína Mutaciones Nº de residuos Masa molecular (Da) E0,1% (ml·mg‐1·cm‐1) WT‐A2h ─ Tag‐6His 339 359 38.748,17 41.228,77 0,88 0,90 Δ14‐A2h Δ1-14 Tag‐6His 325 345 37.019,13 39.499,73 0,92 0,94 TM‐A2h E189A R196A E219A Tag‐6His 339 359 38.546,98 41.057,50 0,88 0,90 Δ14‐TM‐A2h Δ1-14 E189A R196A E219A Tag‐6His 325 345 36.817,94 39.298,54 0,92 0,94 TK‐A2h K49A K206A K281A Tag‐6His 339 359 38.576,90 41.027,50 0,88 0,90 Δ14‐TK‐A2h Δ1-14 K49A K206A K281A Tag‐6His 325 345 36.847,86 39.328,46 0,92 0,94 4K‐A2h K49A K206A K249A K281A Tag‐6His 339 359 38.519,81 41.000,41 0,88 0,90 La anexina A2 (WT-A2h), y todas las variantes no truncadas, tendrán un residuo de Gly N-terminal adicional tras la rotura proteolítica por rTEV entre un residuo de Gln y otro de Gly en la secuencia de reconocimiento. La extensión introducida en el extremo N-terminal (Tag‐6His) incorpora 20 aminoácidos adicionales en la secuencia. En las variantes identificadas como Δ14 se han eliminado los residuos 1 al 14 (hélice anfipática N-terminal) y pueden contener o no la extensión Tag‐6His. TM hace referencia a “Triple Mutante”, donde se modifican los residuos implicados en la formación de puentes salinos en los dímeros asimétricos de la anexina A2 (propuesto a partir de los datos cristalográficos). TK y 4K hacen referencia a la sustitución de tres o cuatro residuos de Lys por Ala en la región convexa de la molécula de anexina A2. MATERIALES Y MÉTODOS 66 Tampones y medios de cultivo TAMPONES Y MEDIOS DE CULTIVO Medios de cultivo bacterianos Medio Composición LB (Lysogenic Broth) Bactotriptona al 1% (p/v), extracto de levadura al 0,5% (p/v), NaCl al 1% (p/v). Ψ‐Broth Bactotriptona al 2% (p/v), extracto de levadura al 0,5% (p/v), MgSO4 al 0.4% (p/v), KCl 10 mM, pH 7,4. TfB1 RbCl2 100 mM, MnCl2 50 mM, acetato potásico 30 mM, CaCl2 10 mM, glicerol al 15% (v/v), pH 5,2 ajustado con ácido acético 0,2 M y esterilizado por filtración a través de membranas de 0,2 μm de poro. TfB2 Mops 10 mM, pH 7,0, RbCl2 10 mM, CaCl2 75 mM, glicerol al 15% (v/v) y esterilizado por filtración o autoclavado. Tampones de electroforesis Composición TAE Tris-acetato 40 mM, pH 7,9, EDTA 1 mM. Tampón de muestras SDS‐PAGE Tris 65 mM, pH 6,8, SDS al 3% (p/v), glicerol al 10% (v/v), azul de bromofenol al 0,02% (p/v). Tampón de desarrollo SDS‐PAGE Tris 25 mM, pH 8,4, glicocola al 0,14% (p/v), SDS al 0,1% (p/v). Disoluciones de tinción de geles PAGE‐SDS Composición Azul de Coomassie (teñido) Coomassie (Brilliant blue R-250) al 0,25% (p/v), metanol al 50% (v/v), ácido acético glacial al 10% (v/v). Azul de Coomassie (desteñido) Ácido acético glacial al 7,5% (v/v), metanol al 20% (v/v). Tampones de preparaciones de plásmidos Composición Tampón de resuspensión Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, RNasa A 100 μg/ml. Disolución de lisis NaOH 0,2 M, SDS al 1% (p/v). Tampón de neutralización Acetato potásico 1,32 M, pH 4,8. Tampón de lavado NaCl 200 mM, Tris 20 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM. Otros tampones y disoluciones Composición Tampón de aplicación análisis aminoácidos Citrato sódico 19.61 g/l, HCl conc. 16,50 ml/l, pH 2,2. Tampón de transferencia Tris 48 mM, pH 9,5, glicocola 39 mM, SDS 0,0375% (p/v), metanol al 20% (v/v). TBS Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5 TBS‐T TBS con Tween-20 al 0,05% (v/v) Tampón de reprobing Tris 62,5 mM, pH 6,7, SDS 2% (p/v), β-mercaptoetanol 100 mM. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Técnicas básicas de manipulación de DNA 67 3.1. TÉCNICAS BÁSICAS DE MANIPULACIÓN DE DNA 3.1.1. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y purificación de fragmentos de DNA El análisis de plásmidos y fragmentos de DNA se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa 0,7-2% (p/v) en TAE. La electroforesis se desarrolla a voltaje constante entre 80-100 V, siendo su duración variable en dependencia del tamaño del DNA que se desee separar. En todos los casos se emplean patrones de DNA lineal, de tamaño conocido, con el fin de identificar la longitud de los fragmentos analizados. Los geles se tiñen con una disolución de Gel Red (Biotium), y se observan bajo la luz ultravioleta. Para la electroforesis preparativa se utilizan geles de agarosa de bajo punto de fusión y el desarrollo de la misma se realiza a 4°C. Para purificar el fragmento de interés se emplea el kit QIAquick Gel Extraction de Qiagene. Inicialmente se recorta la porción de agarosa que contiene la banda deseada y se añaden 3 volúmenes de tampón, que contiene tiocianato de guanidinio, incubándose a 50°C durante unos 10 minutos hasta que se disuelva la agarosa. Tras la adición de 100 μl de isopropanol la mezcla se aplica en minicolumnas situadas en el interior de tubos eppendorf y se centrifuga a 15.000 rpm en una microfuga durante 1 minuto. El eluido se descarta y las columnas se lavan con 750 μl de tampón de lavado, que contiene etanol al 80% (v/v), seguido de centrifugación a 15.000 rpm durante 3 minutos. Tras desechar este nuevo eluido, se centrifuga una vez más y se mantienen los tubos abiertos 15 minutos para asegurar la eliminación total del etanol. Finalmente, la columna se transfiere a un nuevo tubo y se aplican 50 μl de agua ultrapura. Transcurridos 30 segundos, la elución del DNA se realiza por centrifugación a 15.000 rpm durante 1 minuto. 3.1.2. Cultivo y transformación de Escherichia coli El cultivo de las bacterias transformadas con los distintos plásmidos se realiza en condiciones de esterilidad, para lo cual los medios empleados se autoclavan a 120°C durante 20 minutos al igual que todo el material que se emplee en estos procedimientos. El medio de cultivo seleccionado es el LB. Para los cultivos sólidos se emplea este mismo medio con agar al 1,2% (p/v). En ambos tipos de cultivos se MATERIALES Y MÉTODOS 68 3.1. Técnicas básicas de manipulación de DNA emplea ampicilina 100 μg/ml como factor de selección, evitando además el crecimiento de otros microorganismos. Preparación de bacterias competentes El protocolo de transformación que se describe a continuación requiere la obtención previa de células “competentes”. Para ello, se siembran bacterias de la cepa de E. coli DH5α o BL21(DE3) en una placa de LB-agar y se cultivan durante 14-16 horas. A partir de una colonia de este cultivo se inoculan 5 ml de medio Ψ‐Broth y se incuban en un matraz erlenmeyer a 37°C con agitación continua hasta que la suspensión bacteriana alcanza una densidad óptica de aproximadamente 0,3 a 600 nm. Este precultivo se reinocula en 100 ml de Ψ‐Broth, manteniéndose bajo agitación continua a 37°C hasta alcanzar una densidad óptica cercana a 0,5, momento en el cual se detiene el cultivo. Éste se centrifuga en tubos estériles durante 15 minutos a 3.000 rpm y 4°C en una centrífuga Himac CR22N y empleando un rotor R20A2. Tras eliminar el sobrenadante, se resuspende el sedimento bacteriano en 30 ml de medio TfB1 a 4°C, manteniéndose así durante 90 minutos. Seguidamente se centrifuga de nuevo, resuspendiéndose las bacterias a 4°C en 4 ml de TfB2. Las bacterias obtenidas por este método se guardan congeladas a –80°C en alícuotas de 200 μl de suspensión en tubos eppendorf estériles de 2 ml. Transformación de E. coli El protocolo de transformación seguido se basa en el método de Hanahan (Hanahan, 1983) con algunas modificaciones. El proceso consiste en incubar 200 μl de las células competentes, obtenidas de la manera antes detallada, con aproximadamente 10 ng del plásmido correspondiente, durante 30 minutos en un baño de hielo. A continuación, las bacterias se someten a un choque térmico de 45 segundos a 42°C, enfriándolas después en hielo durante al menos 2 minutos. Seguidamente se añaden 800 μl de medio Ψ‐Broth y se incuba la suspensión durante 1 hora a 37°C. Por último, se plaquean 100-500 μl de la suspensión final en una placa de LB-agar con ampicilina 100 μg/ml y se incuba durante 14-16 h a 37°C para obtener colonias individuales. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Técnicas básicas de manipulación de DNA 69 3.1.3. Aislamiento y purificación de plásmidos a partir de cultivos en medio líquido El aislamiento de plásmidos clonados en E. coli se lleva a cabo utilizando el sistema de purificación Gen EluteTM Plasmid Miniprep kit (Sigma‐Aldrich). El proceso se inicia con 5 ml de un cultivo saturado de células trasformadas en medio LB- ampicilina. Las células se sedimentan por centrifugación a 10.000 g durante 1-2 minutos. El sedimento se resuspende en 0,2 ml de tampón de suspensión y tras añadir 0,2 ml de disolución de lisis se mezclan por inversión suave hasta que la disolución se aclara. A continuación, se añaden 0,35 ml de tampón de neutralización. La muestra se vuelve a mezclar por inversión y se mantiene a temperatura ambiente durante 10 minutos y, posteriormente, se centrifuga en una microfuga durante 10 minutos a 15.000 rpm. El sobrenadante así obtenido se trasvasa a otro tubo de microfuga, que contiene una columna previamente preparada, y se centrifuga durante 1 minuto (para preparar la columna basta con añadir 0,5 ml de una suspensión suministrada por el fabricante a las columnas previamente insertadas en tubos de microfuga y centrifugar durante 1 minuto a 15.000 rpm descartando el eluido). Posteriormente, la columna se lava con 0,75 ml de tampón de lavado diluido 5:7 en etanol al 95% (v/v). En este caso también se elimina el eluido. A continuación, la columna se transfiere a un tubo eppendorf y se centrifuga en una microfuga a 15.000 rpm durante 2 minutos para secar la resina. Finalmente, se coloca la minicolumna en un nuevo tubo y se aplican 50 μl de agua ultrapura, eluyéndose el DNA por centrifugación a 15.000 rpm en una microfuga durante 1 minuto. 3.1.4. Reacciones de modificación enzimática del DNA Análisis con endonucleasas de restricción La utilización de estas enzimas permite obtener fragmentos de DNA específicos, lo que hace posible la construcción de plásmidos para la clonación y expresión de las distintas proteínas recombinantes y, por otro lado, facilita la identificación de los plásmidos purificados. Las enzimas y sus correspondientes tampones son de New England BioLabs y de Roche. Cantidades adecuadas de DNA se digieren por adición de la endonucleasa (o endonucleasas) de restricción correspondiente sobre una mezcla de reacción que contiene, además del DNA, el MATERIALES Y MÉTODOS 70 3.2. Técnicas analíticas generales tampón óptimo para la digestión y agua hasta completar el volumen final deseado. Las digestiones se realizan por incubación de la mezcla de reacción durante 1 hora, en la mayoría de los casos, y a la temperatura requerida por las enzimas utilizadas. Una vez finalizada la digestión, las endonucleasas se inactivan por calentamiento. El resultado de las digestiones se visualiza mediante electroforesis en geles de agarosa. Ligación de fragmentos de DNA La utilización de la enzima DNA ligasa del bacteriófago T4 (T4 DNA Ligasa, Fermentas) permite clonar diferentes fragmentos de DNA (insertos) en los distintos plásmidos. La enzima establece enlaces fosfodiéster entre el fragmento y el plásmido cortado (siempre que tengan extremos compatibles), facilitando así la construcción de los plásmidos recombinantes. Las reacciones de ligación se realizan a 15°C durante 16 horas tras la adición de la enzima a la mezcla de reacción que contiene plásmido linealizado y el inserto (con extremos compatibles y a una relación molar adecuada, entre 1:2 y 1:10) en el tampón de ligación suministrado por la casa comercial. 3.1.5. Secuenciación del DNA La secuenciación del DNA de los plásmidos recombinantes se ha llevado a cabo en el Centro de Asistencia a la Investigación, Centro de Genómica y Proteómica de la Universidad Complutense de Madrid. 3.2. TÉCNICAS ANALÍTICAS GENERALES 3.2.1. Cuantificación de la concentración de proteína La determinación de la concentración de proteína de las preparaciones purificadas se realiza mediante análisis de aminoácidos, o a través de los espectros de absorción UV, una vez determinado el coeficiente de extinción molar. Valoración por análisis de aminoácidos Las muestras se secan a vacío y se hidrolizan en 100 μl de HCl azeótropo tridestilado 5,7 N que contiene fenol al 0,1% (p/v) y norleucina (17 pmol/ml) como estándar interno. Después de cerrar las hidrólisis en tubos Pyrex a vacío, éstos se mantienen MATERIALES Y MÉTODOS 3.2. Técnicas analíticas generales 71 a 110°C durante 24 horas. A continuación, se abren los tubos, se llevan las muestras a sequedad y se lavan dos veces con 100 μl de agua destilada. Los hidrolizados se disuelven en 50 μl de tampón de aplicación, compuesto por 19,61 g de citrato sódico, 16,50 ml de HCl concentrado y 1 ml de fenol en un volumen final de 1 litro, a pH 2,2. Por último, se trasvasan las muestras a tubos de teflón, se centrifugan durante 5 minutos en una microfuga Beckman y se aplican entre 5 y 30 μl de las mismas en un analizador automático modelo Beckman 6300 conectado a un módulo de interfase analógica System Gold. El integrador automático del sistema permite calcular la concentración de cada aminoácido en el hidrolizado. De esta forma, conocida la composición de aminoácidos de la proteína pura, se puede estimar la concentración de la misma en la disolución inicial teniendo en cuenta el estándar interno de norleucina. Valoración por medidas de absorción en el UV Los coeficientes de extinción molar se calculan a partir de espectros de absorción de la proteína pura en la región UV-visible y calculándose la concentración exacta de la muestra analizada mediante análisis de aminoácidos de una alícuota tomada directamente de la cubeta de cuarzo. Los espectros se registran a longitudes de onda comprendidas entre 250 y 350 nm, en cubetas de cuarzo de 1 cm de paso óptico y a una velocidad de barrido de 200 nm/min. Las medidas se llevan a cabo en un espectrofotómetro termostatizado Shimadzu-UV-1800 de doble haz. Los espectros obtenidos de esta forma se corrigen para eliminar el efecto de la absorción aparente debida a dispersión de luz, de manera que se determine la absorción real de la proteína a 280 nm. La absorción aparente producida por la dispersión es inversamente proporcional a la longitud de onda, de acuerdo con la siguiente expresión: Aap = k·λ-n donde k y n son constantes. Los cromóforos proteicos no presentan absorción significativa por encima de 310 nm, por lo que toda absorción a estas longitudes de onda es aparente. En consecuencia, la representación doble logarítmica de la absorción a longitudes de onda superiores a 310 nm frente a la longitud de onda MATERIALES Y MÉTODOS 72 3.2. Técnicas analíticas generales genera una recta, a partir de la cual se obtienen los valores de k y n. El espectro de absorción real se calculará, entonces, restando el valor correspondiente de dispersión a cada longitud de onda al espectro registrado inicialmente. Una vez conocida la absorción real de la proteína a 280 nm y el coeficiente de extinción molar, la concentración de proteína se calcula aplicando la ecuación de Lambert-Beer. Los coeficientes de extinción molar calculados mediante análisis de aminoácidos resultaron ser:  WT-A2h y mutantes no truncados (con His-Tag): E0.1% = 0.90 ml·mg-1·cm-1  Δ14-A2h y mutantes truncados (con His-Tag): E0.1% = 0.94 ml·mg-1·cm-1  WT-A2h y mutantes no truncados (rTEV): E0.1% = 0.88 ml·mg-1·cm-1  Δ14-A2h y mutantes truncados (rTEV): E0.1% = 0.92 ml·mg-1·cm-1 Cuando la concentración de proteína que se obtuvo fue menor de 0,5 mg/ml, se consideró necesario concentrar las preparaciones por encima de 1 mg/ml mediante ultrafiltración empleando concentradores Vivaspin 20 (Sartorius) que poseen membranas de poro promedio 10 kDa y centrifugando a 4.000 g en una centrífuga refrigerada Hettich Rotina 35R. 3.2.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS Polimerización de los geles La polimerización de los geles de poliacrilamida, así como el desarrollo de la electroforesis, se llevan a cabo en un equipo Mini‐Protean de Bio‐Rad con geles de 0,75 mm de espesor, 7 cm de alto y 8 cm de ancho. Se emplean tanto sistemas de 10 como de 15 pocillos. La electroforesis se desarrolla en un sistema discontinuo, de acuerdo al procedimiento descrito por Laemmli (Laemmli, 1970). Las muestras para electroforesis se preparan disolviéndolas en tampón de muestras SDS-PAGE, o bien, si las muestras están en disolución, añadiendo una tercera parte de tampón de aplicación tres veces concentrado. El azul de bromofenol se emplea como referencia del desarrollo de la electroforesis al migrar con el frente durante la misma. En caso necesario se puede añadir al tampón de aplicación β-mercaptoetanol al 5% (v/v) como agente reductor. Las muestras de electroforesis MATERIALES Y MÉTODOS 3.2. Técnicas analíticas generales 73 se desnaturalizan por calentamiento a 90°C durante 5 minutos antes de su aplicación. La electroforesis se lleva a cabo en el tampón de desarrollo SDS-PAGE. El desarrollo de la misma se realiza a una intensidad de corriente constante (25 mA/gel) suministrada por una fuente Bio‐Rad 1000/500, deteniéndose al alcanzar el azul de bromofenol el extremo inferior del gel. Detección de proteínas con azul de Coomassie La detección de proteínas se lleva a cabo tras el desarrollo de la electroforesis por inmersión del gel durante 15 minutos en la disolución de teñido con azul de Coomassie al 0,25 (p/v) que, además, fija las proteínas al contener metanol al 50% (v/v) y ácido acético al 10% (v/v). El exceso de colorante se elimina por sucesivos lavados en la disolución de desteñido. Determinación de la masa molecular en PAGE‐SDS El empleo de un patrón con proteínas de masas moleculares conocidas, preteñidas con azul de Coomassie (Bio‐Rad) o sin preteñir (Sigma‐Aldrich), permite la determinación de la masa molecular de las proteínas. La representación del logaritmo decimal de las masas moleculares de los patrones frente a su movilidad electroforética permite la estimación de la masa molecular de las proteínas analizadas mediante la interpolación de sus valores de movilidad electroforética en la recta patrón. 3.2.3. Transferencia e inmunodetección (Western blot) La transferencia electroforética se realiza básicamente según el procedimiento descrito por Towbin y colaboradores (Towbin y col., 1979). Tras el desarrollo de la electroforesis en las condiciones anteriormente descritas, los geles, así como las membranas de nitrocelulosa (Hybond ECL; Amersham) y las láminas de papel 3MM (Whatman), se equilibran durante 10 minutos en tampón de transferencia. La transferencia se lleva a cabo utilizando un equipo de transferencia (SV20-SDB, Sigma‐Aldrich), aplicándose una intensidad de corriente constante de 0,8 mA/cm2 MATERIALES Y MÉTODOS 74 3.2. Técnicas analíticas generales de gel durante 1 hora hasta conseguir la transferencia total de las proteínas del gel a la membrana de nitrocelulosa. Finalizada la transferencia, la membrana se satura por incubación a temperatura ambiente durante 1 hora con TBS-Tween-20 al 0,05% (v/v; TBS-T) que contiene leche deslipidizada al 5% (p/v). A continuación, se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, o bien 18 horas a 4°C, con el anticuerpo correspondiente diluido en TBS-T con leche deslipidizada al 1% (p/v). Posteriormente, la membrana se lava exhaustivamente con TBS-T. La incubación con el correspondiente segundo anticuerpo, marcado con peroxidasa, se lleva a cabo durante una hora a temperatura ambiente en TBS-T con leche deslipidizada al 0.1% (p/v) a la dilución adecuada. Tras un lavado en condiciones idénticas a las del primer anticuerpo, el revelado se realiza utilizando el kit comercial de ECL (Enhanced ChemiLuminiscence; Amersham) basado en la emisión de luz por la oxidación de luminol (una diacilhidrazida cíclica) en presencia de H2O2 catalizada por la peroxidasa conjugada al segundo anticuerpo. La luminiscencia de las bandas se detecta a distintos tiempos de exposición (evitando siempre la saturación de la luminiscencia) en un equipo ChemiDoc-It de UVP (o ChemiDoc XRS+ de Bio‐Rad), cuyo software permite el densitometrado de las bandas proporcionando un “volumen” de acuerdo con la intensidad de las mismas. Los anticuerpos primarios utilizados han sido: Anticuerpo Tipo Dilución Casa comercial Anti-poli-His mAb 1/1.000 Sigma‐Aldrich Conjugado con peroxidasa Anti-AnxA2 Ab 1/500 Santa Cruz Biotechnology Anti-AnxA2 mAb 1/5.000 Transduction Laboratories. BD Biosciences Anti-IgG de cabra-HRP Ab conejo 1/10.000 Jackson ImmunoResearch Anti-IgG de ratón-HRP Ab cabra 1/5.000 Fisher Scientific (Pierce) En algunos casos las membranas se pueden reutilizar para llevar a cabo la inmunodetección de otras proteínas. Para ello, la membrana de nitrocelulosa se sumerge en tampón de reprobing durante 30 minutos a 50°C. Tras la retirada del MATERIALES Y MÉTODOS 3.3. Vectores de expresión de las anexinas recombinantes 75 tampón y posterior lavado exhaustivo de la membrana con TBS-T, se procede nuevamente con el protocolo de detección con anticuerpos a partir de la saturación con leche deslipidizada. 3.3. VECTORES DE EXPRESIÓN DE LAS ANEXINAS RECOMBINANTES 3.3.1. Construcción de los vectores de expresión El plásmido pBH4, cedido por el Dr. Wendell Lim (Universidad de San Francisco, California, EE.UU.), se utilizó como vector para la expresión de la anexina A2 humana recombinante y para los distintos mutantes que se han empleado (Figura 18). Con estas construcciones se transformaron posteriormente células de Escherichia coli competentes de la cepa. El plásmido pBH4 contiene el origen de replicación de E. coli, el gen de la β-lactamasa (que proporciona resistencia a ampicilina), y el gen lacI, que induce una sobreexpresión del represor del operón lac. Asimismo, incluye Figura 18. Esquema del vector de expresión utilizado para la clonación del cDNA de la anexina A2 humana. Se muestra la región de clonación donde se ha insertado el cDNA. El vector es un plásmido que contiene un gen marcador de selección a ampicilina (AMPR), un origen de replicación procariota (pBR322 ori) y un gen represor (lacl) que controla la expresión del gen de la anexina A2 humana a nivel de promotor (PT7). En sombreado de color azul aparece la secuencia de 6 His, y en color rosa la secuencia de corte específica por rTEV. MATERIALES Y MÉTODOS 76 3.3. Vectores de expresión de las anexinas recombinantes las bases que codifican para una extensión de polihistidina (His‐Tag) y un sitio de corte para la proteasa del virus del mosaico del tabaco (rTEV). El cDNA de la anexina A2 humana se clonó mediante RT-PCR, empleando oligonucleótidos que incluían las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción BamHI (5’) y XhoI (3’) para permitir su inserción en el vector de expresión pBH4 en fase con una secuencia que codifica para 6 histidinas y el sitio de corte de la rTEV (construcción pBH4.A2h) (Figura 18). La anexina A2 resultante tras el corte con rTEV contiene un residuo de Gly adicional en el extremo N-terminal que surge de la secuencia de reconocimiento de la proteasa, que corta necesariamente entre un residuo de Gln y otro de Gly, como se aprecia en la figura. La totalidad de las variantes de la anexina A2h que se han analizado, han sido producidas utilizando este mismo vector como molde y empleando mutagénesis dirigida por PCR. 3.3.2. Mutagénesis dirigida por PCR Todas las variantes de la anexina A2 humana se han obtenido mediante la utilización de la técnica del QuickChange. Este método logra de una manera sencilla la introducción de mutaciones puntuales, por lo que se consigue reemplazar, eliminar o insertar la secuencia de uno o varios aminoácidos de la cadena polipeptídica de una proteína mediante una reacción de PCR. Esta reacción se lleva a cabo con unos oligonucleótidos complementarios que deben contener la mutación, la adición o la deleción que sea necesaria para cada caso, introduciendo o eliminando además algún sitio de restricción único para poder seleccionar los clones mutados teniendo en cuenta que no modificasen el resto de la secuencia de aminoácidos (Figura 19). Para las reacciones PCR se ha empleado una DNA polimerasa de alta fidelidad (Pfu o Phusion, Fisher Scientific) que utiliza como molde el vector completo generando copias no cerradas covalentemente de los plásmidos con las mutaciones. Los plásmidos originales que actúan como molde estarán metilados, por lo que se eliminarán tras la reacción de PCR mediante digestión con la enzima DpnI. Finalmente, se procede a la transformación de células competentes dma+ (DH5α) para que reparen la mella en los nuevos plásmidos. Tras el plaqueo en LB-ampicilina, se chequean las colonias haciendo minipreparaciones de plásmidos y digestiones MATERIALES Y MÉTODOS 3.3. Vectores de expresión de las anexinas recombinantes 77 con las enzimas de restricción cuyos sitios se han introducido (o eliminado) junto a la mutación. Finalmente, se selecciona una de las colonias positivas y se hace un cultivo a media o gran escala para purificar los plásmidos. Todas las reacciones de PCR se llevan a cabo en un termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystem). Las condiciones idóneas para cada tipo de reacción han sido muy similares ya que el tamaño de los plásmidos en todos los casos es muy parecido y siempre se ha tenido en cuenta las Tm de los cebadores. La etapa de la desnaturalización se realiza a 97°C, la de hibridación de los cebadores se lleva a cabo a una temperatura próxima a su Tm para todas las proteínas y recombinantes entre 52°C-58°C y, por último, la etapa de elongación se hace a 72°C. Los programas utilizados emplean entre 20 y 30 ciclos (en algunos casos se dan 5 ciclos a una temperatura superior para aumentar la fidelidad de las copias amplificadas) y la mezcla de reacción típica tiene un volumen final de 50 μl, con 25-50 ng de molde plasmídico, 2.5 ng/μl de cada uno de los cebadores, 0,2 mM de cada dNTP y 1 μl de Pfu o Phusion DNA polimerasa (2,5 U/μl). El programa de PCR estándar empleado habitualmente ha sido: Figura 19. Esquema del protocolo QuickChange para introducir mutaciones puntuales. MATERIALES Y MÉTODOS 78 3.4. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes  10 s a 97°C.  5 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 60°C, 8 min a 72°C.  25 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 52°C-58°C (según los cebadores), 8 min a 72°C.  10 min a 72°C. Finalmente, las muestras se quedan almacenadas a una temperatura de 4°C. Las secuencias de los cebadores, así como las mutaciones generadas y los sitios de restricción empleados con sus correspondientes enzimas, se muestran en el apartado de Resultados y Discusión. 3.4. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES Con el fin de expresar tanto la proteína intacta (WT‐A2h; Wild Type-anexina A2) como el resto de las variantes, se transforman células competentes BL21(DE3) de E. Coli con las construcciones anteriormente descritas para finalmente poder aislar y purificar las proteínas recombinantes. Esta cepa se emplea por ser deficiente en las proteasas lon (citoplasma) y OmpT (membrana externa). La purificación se llevará a cabo aprovechando la presencia del Tag de histidinas, eliminando posteriormente el péptido adicional por digestión con la proteasa del virus del mosaico del tabaco (rTEV). 3.4.1. Cultivo de las bacterias e inducción de la expresión de las proteínas En todos los casos, los cultivos destinados a la purificación de las proteínas recombinantes se inician el día anterior transformando las células con el plásmido que corresponda. Con el fin de poner a punto la expresión, se hacen cultivos a pequeña escala para optimizar la concentración de inductor y los tiempos de cultivo. Para ello se inoculan 10 ml de medio LB con 100 μg/ml de ampicilina y, cuando el cultivo alcanza una densidad óptica a 600 nm de 0,5, el cultivo se divide en cuatro. A tres de ellos se les añade IPTG (0,5, 1 y 2 mM, respectivamente) y el otro se mantiene sin inductor para comprobar la expresión basal. Los tubos se mantienen en incubación tomándose alícuotas de 50 μl a distintos tiempos (a partir de 2 h), analizándose directamente el sedimento bacteriano mediante PAGE-SDS. Se comprobó que la expresión basal era en todos los casos muy elevada y que la proteína no se degradaba a tiempos largos de cultivo, por lo que los cultivos a gran MATERIALES Y MÉTODOS 3.4. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes 79 escala se hicieron en ausencia de IPTG y a tiempos largos alcanzándose la fase estacionaria del cultivo. Para las purificación de las proteínas recombinantes, se parte de una colonia bacteriana y se inoculan 5 ml de medio LB con ampicilina 100 μg/ml con el fin de obtener un precultivo con células creciendo exponencialmente. De estos precultivos se añaden 100 µl a matraces Erlenmeyer de 1 litro de capacidad, que contienen 250 ml de LB y ampicilina 100 µg/ml y se incuban a 37°C con agitación a 300 rpm durante al menos 16 h. Tras ello, las bacterias recogen por centrifugación a 6000 rpm durante 10 minutos a 4°C, desechándose el sobrenadante, y se resuspenden con 50 ml de tampón Tris 50 mM, pH 7,8, 2,5 mM EGTA, NaCl 0,1 M y PMSF 2 mM. Después de resuspender adecuadamente el sedimento bacteriano, éste se homogeneiza empleando un sonicador de punta Branson durante un tiempo total de 4 minutos, en ciclos de 20 segundos de sonicación seguidos de 1 minuto en reposo en hielo. Tras ello, se mantiene en agitación durante 12 horas y se centrifuga a 15.000 rpm durante 30 minutos a 4°C, separándose un primer sobrenadante. El precipitado se resuspende en 25 ml del mismo tampón anterior y se somete de nuevo a sonicación en la condiciones anteriormente mencionadas. Finalmente, se vuelve a centrifugar a 15.000 rpm durante 30 minutos a 4°C, separándose un segundo sobrenadante y resuspendiendo el precipitado en 12,5 ml del tampón utilizado durante todo el protocolo para chequearlo por electroforesis (posteriormente, este precipitado final se descarta). En cada uno de los pasos se recoge una alícuota de 50 µl para su posterior análisis mediante PAGE-SDS en geles al 10% de acrilamida. Los dos sobrenadantes obtenidos se juntan y se dializan exhaustivamente frente a tampón Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,3 M, e imidazol 20 mM y se cargan en una columna de Ni-NTA-agarosa (Agarose Beads Technologies) equilibrada en el mismo tampón. Tras eliminar las proteínas no retenidas lavando la columna con el tampón de equilibrado, las proteínas recombinantes se eluyen inicialmente con tampón que contiene imidazol 50 mM seguido de imidazol 250 mM, realizando posteriormente un lavado con imidazol 500 mM y equilibrando finalmente la columna con el tampón inicial. Tras medir la absorción a 280 nm de todas las fracciones, se seleccionan algunas para su análisis electroforético. Las fracciones que contienen la proteína MATERIALES Y MÉTODOS 80 3.4. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes recombinante pura se juntan y se dializan exhaustivamente frente a tampón Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,1 M. El dializado resultante se filtra utilizando jeringuillas estériles a través de membranas de 0,22 µm de diámetro de poro, en tubos Falcon estériles de 15 ml. Todo el proceso se realiza en condiciones de esterilidad, y finalmente se almacenan alícuotas de 1 ml que contienen las proteínas almacenándose a una temperatura de 4°C, para su utilización en ensayos y estudios próximos, o bien a -80°C para su almacenamiento a largo plazo. 3.4.2. Digestión con la proteasa rTEV La purificación final de todas las proteínas recombinantes se realizó aprovechando una extensión de polihistidina (ver Figura 18), que está presente en todas ellas, por lo que las proteínas fueron digeridas con la proteasa rTEV del virus del mosaico del tabaco, suministrada por la casa comercial Sigma‐Aldrich. Esta enzima contiene también una secuencia de polihistidina y reconoce de manera específica una secuencia de 7 aminoácidos, cortando entre un residuo de Gln y otro de Gly, quedando esta última como extremo N-terminal. La relación molar empleada fue de 1:50 de enzima:proteína recombinante, para un volumen final de 50 μl. La mezcla de la digestión se incuba durante 24 horas a 4°C, en presencia de EDTA 0.5 mM y DTT 1mM, y el rendimiento se analizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS). Para poder recuperar la proteína finalmente digerida se aprovechó la interacción que se produce de manera específica entre la región de polihistidina con la resina del gel de la columna de Ni-NTA-agarosa. La proteína digerida saldría no retenida mientras que tanto la rTEV como las proteínas recombinantes no digeridas y los extremos N-terminales liberados quedarían retenidos. Posteriormente se comprobó que esta extensión de polihistidina no interfiere en las propiedades estructurales y funcionales (interacción con vesículas de fosfolípidos, mecanismos de agregación de vesículas, procesos de dimerización) de las proteínas recombinantes, ya que no existieron diferencias sustanciales en la caracterización funcional y estructural entre las proteínas digeridas y no digeridas con la proteasa, por lo que algunos de los ensayos posteriores y con algunas proteínas se realizaron con recombinantes sin digerir. MATERIALES Y MÉTODOS 3.5. Caracterización estructural 81 3.5. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL 3.5.1. Espectros de dicroísmo circular Las medidas de dicroísmo circular de las proteínas se llevan a cabo en un dicrógrafo Jasco modelo J-715 que incorpora un arco de xenon de 150 W. Se emplean cubetas termostatizadas de 0,05-0,1 cm de paso óptico para registrar el espectro en la región del ultravioleta lejano (longitudes de onda inferiores a 250 nm) y de 0,5 cm en el ultravioleta próximo (entre 250 y 320 nm). Las medidas se realizan a una velocidad de barrido constante de 50 nm/min, con un ancho de banda de 2 nm y una resolución de 0,2 nm. El tiempo de respuesta del equipo se ajusta a 1 segundo y se mide el espectro a 20°C. Los espectros obtenidos son la media de seis barridos independientes. A partir de estos espectros se realiza una predicción de estructura secundaria de acuerdo al método CCA (Convex Constraint Analysis) (Perczel y col., 1992). El dicrógrafo permite obtener medidas de elipticidad en miligrados, de manera que se requiere conocer la concentración de proteína y el número de residuos de la misma para poder expresar los datos como elipticidad molar por residuo de aminoácido [θ]MRW, en unidades de grado·cm2·dmol-1, corregida para la elipticidad de la disolución tampón. Para ello, se determina la concentración de proteína en las distintas disoluciones a través de los espectros de absorción en la región UV-visible, transformándose los resultados de acuerdo con la siguiente expresión: [θ]MRW: elipticidad molar por residuo θ: elipticidad en miligramos M: masa molecular de la proteína c: concentración en mg/ml de la proteína l: paso óptico de la cubeta en cm N: número de residuos de la proteína Las curvas de desnaturalización térmica se han determinado monitorizando las variaciones en la elipticidad a una longitud de onda de 208 nm (punto isodicroico; la contribución de la lámina β es igual a la correspondiente a la estructura exp 1[ ] 10MRW M c l N        MATERIALES Y MÉTODOS 82 3.5. Caracterización estructural aperiódica), y en un rango de temperatura de entre 20 y 80°C, empleando un incremento de temperatura de 60°C/h. Las temperaturas de desnaturalización de las proteínas (Tm) se determinaron a partir del máximo de la primera derivada de las curvas de desnaturalización suavizadas a través de transformadas de Fourier empleando la aplicación informática incluida con el dicrógrafo. El efecto que provoca la unión de calcio a las proteínas en los espectros de dicroísmo circular en el UV lejano, y sobre las temperaturas de fusión, se analiza empleando muestras de proteínas con concentraciones crecientes de CaCl2. Las muestras control contienen EGTA 1 mM para asegurar la ausencia total de Ca2+; además, se incluyen controles para verificar la especificidad de la interacción con los iones Ca2+, así como el posible efecto del aumento de la fuerza iónica, empleando concentraciones equivalentes de MgCl2. La predicción de la estructura secundaria de las proteínas a partir de los espectros de CD en el UV lejano se llevó a cabo utilizando el algoritmo de restricción conversa CCA, tal y como lo describe Perczel A, y col (Perczel A, y col, 1992). 3.5.2. Espectroscopía de emisión de fluorescencia Los espectros de emisión de fluorescencia (300-400 nm) se obtienen a una temperatura de 20°C en un espectrofluorímetro SLM Aminco 8000C equipado con un arco de Xenon de 450W. Las disoluciones de proteína se analizan en cubetas de 0,4 cm de paso óptico de excitación y 1,0 cm de emisión, empleando anchuras de rendija de 4 cm para ambos haces luminosos. El voltaje de los canales se ajusta en cada caso de modo que la señal recibida se encuentre siempre entre los límites aconsejados. En caso necesario se emplean polarizadores de calcita Glan-Thompson que permiten evitar los efectos de dispersión de luz; el polarizador de excitación se orienta horizontalmente (90°) y el de emisión verticalmente (0°). Todos los espectros fueron registrados en ausencia de calcio (EGTA 1mM) o bien después de la adición de volúmenes crecientes de una disolución tamponada de CaCl2 hasta alcanzar 75 mM. De la misma manera también se obtuvieron los espectros de emisión para las muestras de proteínas a una fuerza iónica equivalente (MgCl2 75 mM). La emisión de fluorescencia del residuo único de Trp-213 se midió utilizando una MATERIALES Y MÉTODOS 3.6. Caracterización funcional 83 longitud de onda de excitación de 295 nm y registrando los espectros de emisión entre 305 y 410 nm. En todos los ensayos es necesario determinar la absorción de las muestras a la longitud de onda de excitación, ya que si la absorción a la longitud de onda de excitación supera 0,04 unidades hay que corregir los espectros de acuerdo con el efecto de filtro interno. Apagamiento por acrilamida El apagamiento de la fluorescencia de triptófano por adición de acrilamida se determina a partir del espectro de emisión de fluorescencia excitando a 295 nm en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) o en presencia de CaCl2 75 mM. Teniendo en cuenta el efecto de dilución y evitando el efecto de filtro interno, se calcula la constante de apagamiento (KSV) de acuerdo con la ecuación de Stern-Volmer: F0/F=1+KSV[Q], donde F0 es la intensidad de fluorescencia en ausencia de apagador y F la intensidad de fluorescencia a una concentración de apagador [Q] (Lakowicz, 2006). 3.6. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL 3.6.1. Formación de vesículas fosfolipídicas Los fosfolípidos (fosfatidilserina, PS, o fosfatidilcolina, PC; ambos de Avanti Polar Lipids) se disuelven en una mezcla de cloroformo:metanol 2:1 y se secan inicialmente mediante una corriente suave de nitrógeno y, a continuación, a vacío durante un mínimo de 2 horas para eliminar completamente el disolvente. Se obtiene así una fina película lipídica que se hidrata en tampón Hepes 10 mM, pH 7,8, NaCl 0,1 M durante 60 minutos a una temperatura superior a la de transición de fase del fosfolípido correspondiente. Seguidamente, se agita la preparación violentamente para llegar a formar vesículas multilamelares que se sonican en baño durante 5 minutos. Las vesículas se someten a diez ciclos sucesivos de extrusión en un Extruder (Lipex Biomembranes) a través de dos filtros de policarbonato de 400 nm de diámetro de poro. Con ello se obtiene una población de vesículas unilamelares con un diámetro promedio centrado alrededor del diámetro de poro del filtro. Para obtener vesículas de 100 nm de diámetro, se parte de la preparación previa de vesículas de 400 nm, sometiéndolas a 5-10 ciclos adicionales de extrusión con membranas de 100 nm de diámetro de poro. MATERIALES Y MÉTODOS 84 3.6. Caracterización funcional 3.6.2. Determinación de la concentración de fosfolípidos La concentración de fosfolípidos se calcula determinando la cantidad de fósforo en cada muestra por el procedimiento colorimétrico de Rouser (Rouser y col., 1970). A las muestras se les añaden 0,4 ml de ácido perclórico al 70% y se mantienen durante 30 minutos a 250°C en baño de arena con los tubos tapados con ampollas de vidrio. Posteriormente, se dejan enfriar a temperatura ambiente y se añaden, bajo agitación, 3 ml de agua destilada. A continuación, se adicionan 0,45 ml de molibdato amónico al 2,5% (p/v) y, seguidamente, 0,45 ml de ácido ascórbico al 10% (p/v), agitándose los tubos tras la adición de los reactivos. Las muestras se mantienen 5 minutos a 100°C en baño de agua, tiempo suficiente para que desarrollen color. Tras enfriar las muestras a temperatura ambiente se mide la absorción de las mismas a 820 nm. la cantidad de fósforo se determina interpolando el valor de A280 en una recta patrón construida en un intervalo de 0 a 40 μg de fósforo a partir de una disolución estándar de Na3PO4 de 100 μg P/ml. 3.6.3. Ensayos de unión a las vesículas fosfolipídicas Los ensayos de unión de las proteínas recombinantes se realizan con vesículas fosfolípidas de 400 nm de diámetro, a una relación molar constante proteína:lípido de 1:800, tanto en ausencia (EGTA 1 mM) como en presencia de diferentes concentraciones de CaCl2. Con el objeto de analizar la influencia de la fuerza iónica en la unión de las proteínas con las vesículas de fosfolípidos, se realizaron los ensayos a unas concentraciones crecientes de NaCl (0,1 M, 0,3 M y 0,5 M). Todos los ensayos se llevan a cabo en tampón Hepes 10 mM, pH 7,8, a la concentración de NaCl requerida, incubando la mezcla proteína-lípido durante 15 minutos a temperatura ambiente en un volumen final de 100 μl. En todos los casos se incluyen controles en ausencia de lípidos a las tres fuerzas iónicas ensayadas. Posteriormente la mezcla se centrifuga a 150.000 g durante 1 h, a una temperatura de 4°C en una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima Max‐XP empleando un rotor TLA 120.1. Tras la separación de los sobrenadantes y precipitados obtenidos de la centrifugación, se añaden 25 μl de tampón de aplicación 5x para PAGE-SDS a los sobrenadantes y los precipitados se resuspenden en 125 μl de tampón de aplicación 1x, analizándose mediante PAGE-SDS en condiciones reductoras y tinción con azul MATERIALES Y MÉTODOS 3.6. Caracterización funcional 85 de Coomassie, o bien mediante Western Blot. Los geles o las membranas fueron digitalizados en un sistema ChemiDoc XRS+ de Bio‐Rad y se densitometraron utilizando el software ImageLab. El porcentaje de la proteína unida fue determinado a partir de, al menos, tres ensayos independientes en los que se analizaron todas las variables experimentales en el mismo gel. Los controles que se utilizaron sin vesículas fosfolipídicas mostraron poca o nula sedimentación de la proteína en las distintas condiciones experimentales. 3.6.4. Ensayos de agregación de vesículas Los estudios de la inducción agregación de las vesículas se llevan a cabo utilizando vesículas unilamelares de PS de 100 nm de diámetro. Los ensayos se llevan a cabo en una cubeta termostatizada a 25°C, en la cual se añaden las vesículas a una concentración final de 0,1 mg/ml, CaCl2 100 μM o EGTA 1 mM, y la concentración de NaCl correspondiente (0,1, 0,3 o 0,5 M). El proceso de agregación se inicia tras la adición de la proteína con agitación y registrándose la absorción a 320 nm durante al menos 10 minutos en un espectrofotómetros Shimadzu‐UV‐1800 equipado con un sistema Peltier. Se comprobó que, en ausencia de proteína, no se registraba variación en la absorción a 320 nm en ninguna de las condiciones experimentales ensayadas, restándose estos controles a las curvas de agregación obtenidas tras la adición de proteína. Las curvas de agregación se ajustan mediante regresión no lineal a hipérbolas, determinándose el valor de la ΔA320 a los 10 minutos. La velocidad inicial aparente (V0 ap.) se obtiene del análisis y ajuste de las curvas durante los primeros 30 segundos de agregación, calculando el valor de la derivada de la función de ajuste a tiempo cero. 3.6.5. Ensayos de entrecruzamiento de proteínas en presencia de vesículas El entrecruzamiento de proteínas en ausencia o presencia de vesículas PS de 400 nm (relación molar lípido:proteína 1000:1; 2 μM de proteína) se llevó a cabo tras 15 min de interacción en ausencia (EGTA 1 mM) o en presencia de CaCl2 100 μM. A esta relación molar lípido/proteína no se deberían observar asociaciones laterales de las moléculas de anexina unidas sobre una sola membrana, de forma que, si se observa MATERIALES Y MÉTODOS 86 3.7. Análisis estadístico dimerización de la proteína, esta es debida a interacciones entre moléculas de anexina en vesículas distintas. Se probaron, además, diferentes concentraciones de NaCl (0,1, 0,3 y 0,5 M). Todo el volumen se incubó además con el agente de entrecruzamiento Bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3 de Pierce; brazo espaciador es de 11.4 Å) a una concentración final 1 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esta reacción se detuvo mediante la adición de Tris, pH 7,4 (concentración final 100 mM) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las muestras sin vesículas se prepararon directamente para SDS-PAGE; las muestras con vesículas PS se ultracentrifugaron a 150.000 g a 4°C durante 1 h y los sedimentos se resuspendieron en el mismo volumen que los que no tenían vesículas directamente en tampón de carga. Todas las muestras se analizaron mediante PAGE- SDS en geles al 8% de acrilamida y Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la anexina A2 humana (BD Biosciences). 3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO La distribución normal de los datos se determinó mediante la prueba de Shapiro- Wilk, y la homogeneidad de la varianza mediante la prueba de Brown-Forsythe. Los análisis ANOVA de dos vías y las pruebas t de Student (de dos colas) se realizaron con el programa SigmaPlot v14.5 (Systat Software) y se tomó p<0,05 como nivel mínimo de relevancia estadística. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Expresión y purificación de la anexina A2 89 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA ANEXINA A2 HUMANA En un primer bloque de resultados se recogen los estudios de caracterización estructural y funcional de la anexina A2 humana recombinante (WT-A2h), para lo cual se hizo necesario su clonación, expresión en E. coli, y purificación. 4.1.1. Clonación de la anexina A2 humana La clonación de la anexina A2 humana se había logrado anteriormente en nuestro grupo de investigación a partir de RNA aislado de células HT-29 de adenocarcinoma de colon humano, seguido de RT-PCR empleando cebadores que contenían adicionalmente los sitios de restricción BamHI (forward primer) y XhoI (reverse primer). El fragmento obtenido de la PCR se clonó inicialmente en un plásmido de alto número de copias (pBluescript II SK+) y, finalmente, en el plásmido pBH4 (Figura 18), obteniéndose el vector de expresión pBH4.A2h. Este vector de expresión procariota se utilizó posteriormente no solo para la expresión y purificación de la anexina A2 humana (WT-A2h), sino también para la obtención del resto de variantes y proteínas mutadas derivadas de ésta. Las distintas construcciones se emplearon para transformar células competentes de las cepas de E. coli DH5α y BL21(DE3), las primeras con el fin de amplificar los plásmidos y conservar cultivos en glicerol a -80°C, y las segundas para la expresión de las proteínas recombinantes. 4.1.2. Expresión y purificación de la anexina A2 WT‐A2h La expresión de la proteína recombinante se ha logrado mediante la transformación de células de la cepa de E. coli BL21(DE3), deficiente en proteasas, y que es adecuada para la expresión abundante de proteínas recombinantes. La elección de una cepa deficiente en proteasas es necesaria, a pesar de la resistencia a la degradación proteolítica que muestran las anexinas, debido a que el extremo N-terminal puede encontrarse desplegado del núcleo proteico y, a diferencia de éste, sufrir la acción de proteasas que trunquen este extremo. En cualquier caso, al encontrarse la extensión de polihistidinas en el extremo N-terminal, solo se purificaría la proteína RESULTADOS Y DISCUSIÓN 90 4.1. Expresión y purificación de la anexina A2 intacta, pero la utilización de la cepa BL21(DE3) aumentará el rendimiento en proteína no truncada. De forma inicial, se hicieron varias pruebas de expresión para determinar la concentración idónea del inductor (IPTG), la temperatura de cultivo, y el tiempo de inducción. Se obtuvieron alícuotas de los cultivos en las distintas condiciones y se analizaron mediante PAGE-SDS y tinción con azul de Coomassie o mediante Western blot con anticuerpos policlonales frente a la anexina A2 (datos no mostrados). En estos ensayos se pudo comprobar que las bacterias transformadas con pBH4.A2h presentaban una muy elevada expresión basal y que se podían emplear largos tiempos de cultivo a 37°C en ausencia de IPTG para aumentar la expresión debido a la mínima degradación de la proteína. Por ello, se decidió llevar a cabo la expresión de la proteína WT-A2h en ausencia de IPTG y manteniendo los cultivos 18-24 horas con agitación constante a 250 rpm a 37°C. Tras el cultivo, las bacterias se recogieron por centrifugación y se llevaron a cabo dos extracciones por sonicación en presencia de EGTA 2,5 mM, como se describe en el apartado de Materiales y Métodos. En la Figura 20A se puede apreciar el análisis electroforético de las primeras etapas de la purificación de WT-A2h. Figura 20. Solubilización de WT‐A2h a partir del sedimento bacteriano y purificación cromatográfica en Ni‐NTA‐agarosa. (A) Análisis de las distintas etapas de la solubilización mediante PAGE-SDS (gel al 10% de acrilamida) en condiciones reductoras y teñido con azul de Coomassie: (H) homogeneizado total; (S1) y (S2) sobrenadantes de las extracciones con EGTA 2,5 mM tras sonicación; (P1) y (P2), sedimentos insolubles tras las solubilizaciones; (P) patrón de masas moleculares (kDa). (B) Análisis de fracciones de la cromatografía en Ni-NTA-agarosa: (C) material cargado en la columna; (L) proteínas eluidas en el lavado con imidazol 20 mM. La anexina A2 comienza a eluir pura con tampón conteniendo imidazol 50 mM, pero eluye mayoritariamente a 250 mM. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Expresión y purificación de la anexina A2 91 En el gel puede apreciarse que la proteína más abundante en el homogeneizado bacteriano (H) tiene una masa molecular en torno a los 37 kDa, que se corresponde con la masa de la anexina A2 (comprobado más adelante mediante Western blot). Se puede apreciar que, aunque no se indujese la expresión con IPTG, la producción basal fue muy abundante. Por el contrario, el rendimiento de la solubilización mediante sonicación en presencia de EGTA no permitió un rendimiento muy elevado en proteína soluble. Esto podría deberse a una interacción independiente de calcio con las membranas bacterianas, o bien a una producción excesiva y formación de cuerpos de inclusión. Sin embargo, la proteína solubilizada fue más que suficiente para continuar la purificación y obtener un rendimiento aceptable para la caracterización de la proteína. La purificación de la proteína WT-A2h continuó tras juntar los sobrenadantes S1 y S2 y dializar frente al tampón de cromatografía en Ni-NTA-agarosa conteniendo 20 mM imidazol para minimizar las interacciones no específicas con la resina y retirar completamente el EGTA, que eliminaría el Ni2+ de la resina (Figura 20B). Tras la carga y el lavado exhaustivo con tampón conteniendo 20 mM imidazol, se comprobó que la proteína WT-A2h había quedado completamente retenida a la columna. Con el fin de eliminar otros posibles contaminantes retenidos de forma inespecífica, se llevó a cabo otro lavado con imidazol 50 mM, comprobándose que no quedaban contaminantes y que la proteína recombinante comenzaba a eluir, por lo que se completó la elución con tampón que contenía imidazol 250 mM. Como se puede observar en la Figura 20B, la proteína eluida está pura sin presencia de contaminantes proteicos. Tras su diálisis frente a tampón Hepes 10 mM, pH 7,8, NaCl 0,1 M, se filtró a través de membranas de 0,22 μm. El rendimiento final de la proteína WT-A2h con la extensión de polihistidina fue de 12-15 mg/L de cultivo bacteriano. Con el fin de eliminar posibles artefactos durante la caracterización estructural y funcional de la anexina A2, se eliminó la mayor parte del péptido adicional que contenía la extensión de polihistidina por digestión con la proteasa rTEV. Como ya se ha descrito en Materiales y Métodos, se puede eliminar el fragmento digerido, la proteína no digerida y la propia proteasa por una recromatografía en Ni-NTA- agarosa. La proteína WT-A2h sin la extensión adicional saldrá no retenida mientras que el resto quedarán retenidas por tener extensiones de polihistidina. En la Figura RESULTADOS Y DISCUSIÓN 92 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana 21 se recoge tanto el análisis electroforético de distintas etapas de la purificación, como su análisis mediante Western blot con anticuerpos policlonales frente a la anexina A2 humana. Las preparaciones de anexina A2, tanto digerida con rTEV como la que contiene la cola de polihistidina, se concentraron por encima de 1 mg/ml mediante ultrafiltración con filtros de 10 kDa de diámetro de poro promedio y se conservaron a 4°C (utilización inmediata) o a -80°C (conservación a largo plazo). 4.2. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA ANEXINA A2 HUMANA La caracterización estructural de la anexina A2 humana (WT-A2h) se ha llevado a cabo mediante técnicas espectroscópicas, empleando dicroísmo circular tanto en el UV lejano como en el próximo, así como mediante espectroscopía de fluorescencia del único residuo de triptófano que contiene la proteína. Figura 21. Expresión y purificación de WT‐A2h.6H y WT‐A2h. El análisis se ha llevado a cabo mediante PAGE-SDS y tinción con azul de Coomassie o Western blorτ empleando un anticuerpo policlonal frente a la anexina A2 humana. (H) Homogeneizado bacteriano; (S) mezcla de los sobrenadantes S1 y S2 (Figura 20A) obtenidos tras centrifugación del homogeneizado en Tris 50 mM, pH 7,8, conteniendo NaCl 0,3 M, EGTA 2,5 mM, imidazol 20 mM y PMSF 2 mM (tampón de homogeneización). WT-A2h.6H es la proteína recombinante purificada antes de la digestión con rTEV, y WT-A2h la anexina A2 humana sin la extensión adicional. Las masas moleculares en kDa se indican a la izquierda. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana 93 4.2.1. Análisis estructural mediante dicroísmo circular (CD) Los espectros CD de WT-A2h se realizan en las condiciones que se han descrito en el epígrafe Materiales y Métodos. La forma de los espectros de WT-A2h a 20°C en el UV lejano (zonas de transiciones n-π* y π-π* de los enlaces amida), es característico de una proteína con un alto contenido en α-hélice, en concordancia con los dos mínimos de elevada elipticidad negativa a 222 y 208 nm (Figura 22). Este hecho, además, confirma el correcto plegamiento de la proteína recombinante producida en E. coli. A 80°C, la proteína se desnaturaliza completamente y de forma irreversible. En ausencia de iones divalentes, la proteína agrega y precipita, pero en presencia de éstos se obtienen espectros con una alta contribución de estructuras β. Figura 22. Espectros de CD de la anexina A2 en el UV‐lejano. Los espectros se registraron en tampón Hepes 10 mM, pH 7,8 conteniendo NaCl 0,1 M, y cada espectro es la media de seis barridos. Los espectros se muestran en ausencia de calcio (EGTA 1 mM; negro), en presencia de CaCl2 95 mM (rojo) y MgCl2 95 mM (azul), tanto a 20°C como a 80°C. Ya es sabido que la unión de las anexinas a las membranas biológicas es un proceso dependiente de calcio y ocasiona reajustes estructurales en la proteína, como se ha comentado en la Introducción. Estos reajustes pueden acabar afectando tanto al núcleo de la proteína como a al dominio N-terminal. Uno de los objetivos de esta memoria es la de analizar el efecto que la unión de calcio puede ocasionar en la estructura y en la estabilidad en la anexina A2. Cuando se quiere analizar el efecto de la unión de calcio en ausencia de membranas, se debe tener en cuenta que la afinidad de las anexinas para este catión es aproximadamente tres órdenes de RESULTADOS Y DISCUSIÓN 94 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana magnitud inferior a la que presentarían en presencia de fosfolípidos (Turnay y col., 2002). Por esta razón se han utilizado unas concentraciones de calcio muy superiores a las fisiológicas: 1.5 mM extracelular y 100 nM intracelular, aunque se pueden encontrar picos en las concentraciones de calcio intracelular de 1-10 μM o concentraciones de hasta 400 μm en el aparato de Golgi o en el retículo endoplásmico (ver Figura 23) (Leipziger y col., 1996; Pizzo y col., 2011; Fernández- Lizarbe y col., 2017). Figura 23. Concentraciones de calcio libre en compartimentos intracelulares y en el medio extracelular. La concentración basal de calcio citosólica y nuclear es de ~100 nM, mientras que la concentración extracelular es del orden de entre 1,2-1,5 mM en la región basolateral. Los almacenes intracelulares de calcio, principalmente el retículo endoplásmico (ER) y el aparato de Golgi, pueden liberar calcio al citoplasma cuando las células son estimuladas con diferentes agonistas. Los principales canales implicados son los canales de calcio dependientes de inositol (1,4,5)-trisfosfato (IP3R) y los receptores de rianodina (RyR). La liberación de calcio resultante en el citoplasma puede elevar transitoriamente la concentración de calcio intracelular hasta 100 veces. El aumento del calcio citosólico desencadena rápidamente mecanismos de exportación de calcio, como la ATPasa de calcio de la membrana plasmática (PMCA), que exporta calcio contra gradiente hacia el compartimento luminal. El agotamiento del calcio en los almacenes internos provoca la apertura de los canales dependientes de depósito (SOC) de la membrana basolateral. Finalmente, cuando cesa la estimulación, la ATPasa del retículo sarco-endoplásmico (SERCA) rellena los almacenamientos internos de calcio bloqueando la entrada de calcio por el SOC. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana 95 Como puede apreciarse, los espectros obtenidos en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) o en presencia de MgCl2 95 mM son prácticamente idénticos, mientras que el obtenido a saturación de calcio (CaCl2 95 mM) presenta una ligera mayor elipticidad negativa en sus dos mínimos a 208 y 222 nm. La predicción de estructura secundaria empleando el algoritmo CCA (Convex Constraint Algorithm) (Perczel y col., 1992) predice una proporción en α-hélice del 61,7%, 8,6% estructura β y 29,7% giros β y estructura aperiódica en ausencia de calcio, mientras que el porcentaje en α-hélice se incrementa ligeramente en presencia de calcio (hasta un 64,2%). Estos datos están de acuerdo con los datos cristalográficos obtenidos para la anexina A2 humana, donde el núcleo proteico de la proteína alcanza casi el 80% de estructura en α-hélice en presencia de calcio. La diferencia radica en el extremo N-terminal, cuya estructura no ha podido ser determinada por su elevada movilidad y los cristales se han obtenido con proteínas truncadas desde el residuo de Pro21 en la estructura más completa de la que se dispone en la base de datos del PDB (Figura 13) (Rosengarth y Luecke, 2004). Los cristales obtenidos en ausencia de calcio muestran un contenido en α-hélice ligeramente inferior, lo que coincide con los espectros de dicroísmo aquí mostrados. Se ha descrito que el extremo N-terminal puede formar una hélice α anfipática cuando se asocia con la proteína S100A10 para formar los heterotetrámeros, o incluso se ha postulado que puede formarse cuando interacciona con membranas (Réty y col., 1999; Bharadwaj y col., 2013). Sin embargo, es muy posible que en disolución, en las condiciones en las que se obtienen los espectros de dicroísmo circular, esta hélice no se forme y, por ello, el contenido en α-hélice global que se detecta sea inferior al obtenido de la estructura tridimensional de la proteína truncada. Otro aspecto que se debe considerar es la relación entre las elipticidades a 222 y 208 nm entre los espectros en presencia y ausencia de calcio. Esta relación es ligeramente superior en presencia de calcio (1,05 veces), lo que indica que la longitud de las hélices es algo mayor en estas condiciones que en ausencia de Ca2+, como se ha descrito también para otras anexinas de vertebrados (Turnay y col., 2005). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 96 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana 4.2.2. Curvas de desnaturalización térmica El estudio de la estabilidad térmica de la anexina A2 monomérica se ha realizado mediante el análisis de la variación de la elipticidad molar por residuo ([θ]MRW) a 208 nm entre 20 y 80° C, aumentando la temperatura a una velocidad constante de 60°C/h (Figura 24). A esta longitud de onda se detecta principalmente la desaparición de estructura secundaria en α-hélice dado que la elipticidad molar debida a la lámina β y a la ordenación aperiódica presentan el mismo valor (punto isodicroico). La elevada velocidad de barrido de la temperatura se escogió tras comprobar la irreversibilidad del proceso de desnaturalización en todas las condiciones ensayadas. En ausencia de calcio (EGTA 1 mM) los espectros de WT-A2h en el UV-lejano son relativamente parecidos a los obtenidos tras la saturación con calcio. Sin embargo, Figura 24. Curvas de desnaturalización térmica obtenidas mediante dicroísmo circular. La desnaturalización de WT-A2h se ha estudiado registrando la elipticidad molar por residuo a 208 nm en una cubeta termostatizada de 0,05 cm de paso óptico, elevando la temperatura a una velocidad de 60°C/h y en ausencia (EGTA 1 mM) o presencia de concentraciones crecientes de Ca2+, o una concentración de Mg2+ equivalente a la máxima empleada de Ca2+. Para simplificar, solo se muestran las curvas en ausencia de Ca2+ (negro) y a la máxima concentración de Ca2+ (rojo) o de Mg2+ (azul). El inserto muestra la dependencia de la temperatura de fusión (Tm) con la concentración de calcio y los datos representan valores medios de al menos dos determinaciones independientes a cada concentración. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana 97 como puede apreciarse en la Figura 24, sí que se observa un efecto importante del calcio en la estabilidad térmica de la proteína a medida que se incrementa la concentración de CaCl2, pasando la temperatura de fusión (melting temperature, Tm) de 55,1°C en ausencia de calcio a 67,5°C tras saturarse con este ion. Además, se trata de un efecto específico de la unión de calcio, y no del incremento en la fuerza iónica, puesto que una concentración de Mg2+ 95 mM prácticamente no varía la estabilidad térmica de la proteína, si bien la transición es ligeramente más cooperativa que en ausencia de los cationes divalentes. La estabilización de la estructura secundaria de la proteína recombinante en ausencia de fosfolípidos depende de manera hiperbólica de la concentración de calcio, de manera que se alcanza el punto medio del efecto a una concentración de 8,4 mM de CaCl2. 4.2.3. Estudio del entorno del único residuo de triptófano de la anexina A2 La anexina A2 humana posee un único residuo de triptófano (Trp213) que está situado en la hélice B del dominio III y se encuentra orientado hacia el interior hidrofóbico del núcleo proteico, de acuerdo con la estructura tridimensional de los cristales obtenidos de esta proteína (Figura 25). Figura 25. Representación tridimensional del dominio III de WT‐A2h. En la imagen se muestra la conformación que presenta el dominio III de la WT-A2h en presencia de calcio (esfera amarilla). La posición del Trp213 se muestra con la flecha de color negro. La Lys206 protuberante aparece también representada. El fichero con los datos de la estructura de la anexina A2 humana se han obtenido del Protein Data Bank (fichero PDB 1XJL). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 98 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana El dicroísmo circular en el UV próximo (longitud de onda entre 250-320nm) y la espectroscopía de emisión de fluorescencia se han utilizado para estudiar el entorno de este residuo y comprobar si se altera tras la interacción de la proteína con calcio, como ha reportado nuestro grupo de investigación para otras anexinas de vertebrados con un único residuo de triptófano, como las anexinas A5, A11, A13a y A13b (Turnay y col., 2002; Lecona y col., 2003; Turnay y col., 2005; Fernández- Lizarbe y col., 2017). Los espectros de dicroísmo circular en el UV próximo de WT-A2h muestran un mínimo muy marcado en torno a 280 nm con una elipticidad molar entre -10.000 y -11.500 grado·cm2·dmol-1 (Figura 26). La aparición de este mínimo es debida al residuo de Trp213 y confirma que dicho residuo se encuentra en un entorno con muy poca movilidad, sin apenas libertad conformacional, alejado del disolvente y dentro del núcleo hidrofóbico de la proteína. El espectro no presenta variaciones importantes cuando se realiza en ausencia o presencia de calcio, aunque cuando la proteína está saturada con calcio, el mínimo es algo mayor en valor absoluto y hay un ligero desplazamiento de 2 nm hacia el azul (de 279 nm con EGTA a 281 nm en presencia de Ca2+). Estos datos indican que la proteína sufre algún cambio conformacional en el entorno del Trp213 que ocasiona que este residuo pase a un entorno aún más protegido y rígido cuando la proteína se satura con calcio. Figura 26. Espectro de dicroísmo circular de WT‐A2h en el UV‐próximo. Los registros se realizaron en Hepes 10 mM, pH 7,8 y NaCl 0,1 M a 20°C utilizando una cubeta de 0,5 cm de paso óptico y una concentración 25 μM de proteína. Cada espectro es la media de seis barridos y se han suavizado con el software del programa de captura; en color negro, el espectro en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) y en color rojo, en presencia de CaCl2 75 mM. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana 99 A pesar de la gran similitud entre los núcleos proteicos de las anexinas de vertebrados, la ubicación de residuos concretos puede variar considerablemente. Así, aunque las anexinas A5 y A13a y A13b tienen el único residuo de triptófano en el bucle entre las hélices A y B del dominio III (Trp187 en A5, Trp186 en A13a y Trp227 en A13b), el Trp213 en la anexina A2 está situado próximo al bucle, pero sobre la hélice B, mientras que en la posición equivalente al triptófano de las otras anexinas aparece la Lys206 (Figura 25). En el caso de los residuos situados en el bucle AB, se ha observado que el residuo de triptófano pasa de estar enterrado en el interior hidrofóbico de la proteína, a estar completamente expuesto tras la unión de calcio (Turnay y col., 2002; Turnay y col., 2005; Fernández-Lizarbe y col., 2017). Sin embargo, en WT-A2h ocurre el fenómeno contrario, al pasar el residuo de triptófano a un entorno incluso más rígido y protegido del disolvente. Para analizar si la estructura terciaria que rodea al triptófano en la anexina A2 sufre algún tipo de modificación originada por la unión de calcio, se ha llevado a cabo también un estudio espectrofluorimétrico de este residuo registrando los espectros de emisión de fluorescencia excitando a 295 nm en presencia de concentraciones crecientes de CaCl2 (Figura 27). Figura 27. Espectros de emisión de fluorescencia de WT‐A2h. (a) Se muestran los espectros de emisión a una longitud de onda de excitación de 295 nm en ausencia de calcio (EGTA 1mM; color negro) y a distintas concentraciones de CaCl2 (rojo). En color azul se indica el espectro en presencia de MgCl2 75 mM. Todos los registros se hicieron a 20°C utilizando una concentración de proteína 5 μM. La intensidad de la fluorescencia se muestra en unidades arbitrarias. (b) Variación de la intensidad y de la posición del máximo de cada espectro de emisión a distintas concentraciones de calcio (negro) y magnesio (azul). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 100 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana La posición del máximo de emisión puede dar una idea muy aproximada del grado de exposición al disolvente que presenta el Trp213. Como se observa en la Figura 27, en ausencia de calcio la WT-A2h muestra un máximo a una longitud de onda de 329 nm. A medida que se aumenta la concentración de calcio, se observa una disminución del rendimiento cuántico con un ligero desplazamiento al azul hacia los 324 nm. La saturación del efecto se alcanza alrededor de una concentración 10 mM de CaCl2, estando el punto medio de la transición a una concentración 250 μM. El efecto que la unión del calcio produce en el entorno del Trp213 difiere con la concentración necesaria para provocar cambios en la estabilidad térmica, donde la concentración requerida es considerablemente superior. Esto puede ser debido a que el cambio conformacional que afecta al entorno del triptófano dependa solo de la unión de calcio a los sitios de unión de mayor afinidad, los situados en los bucles AB; por otro lado, la unión de calcio a los sitios adicionales tipo III (B y DE, descritos en la Introducción), que presentan menor afinidad por este ion, se ha demostrado que también contribuyen a la estabilidad estructural de la proteína (Lizarbe y col., 2013). Esto justificaría el mayor requerimiento de calcio para saturar su efecto sobre la estabilidad térmica de la anexina A2. Para confirmar la localización interna del residuo de triptófano de la anexina A2 en disolución, como sugieren los espectros de dicroísmo circular en el UV-próximo y los espectros de emisión de fluorescencia, se llevaron a cabo ensayos de apagamiento de emisión de fluorescencia utilizando acrilamida. Esta molécula puede inducir un apagamiento de la fluorescencia, siendo más efectiva cuanto más expuesto al disolvente se encuentre el fluoróforo. En la Figura 28, se representan los espectros de emisión de fluorescencia de WT-A2h (λex. = 295 nm) en ausencia y en presencia de calcio y a concentraciones crecientes de acrilamida (hasta 360 mM). Como se puede observar, la adición de acrilamida genera una disminución del rendimiento cuántico del Trp213 (sin desplazamiento del máximo), pero esta disminución no es muy acusada debido al bajo grado de exposición de este residuo. Para confirmarlo y cuantificar el efecto, los datos de emisión de fluorescencia en el máximo correspondiente (329 nm para EGTA 1 mM y 324 nm en CaCl2 75 mM) se ajustan a la ecuación de Stern-Volmer como función de la concentración de acrilamida, obteniéndose constantes (KSV) de 1,85 M-1 y 0,85 M-1 en ausencia o presencia de calcio, respectivamente. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana 101 ¿Por qué disminuye el rendimiento cuántico del W213 tras la unión de calcio por la anexina A2? Teniendo en cuenta que este residuo pasa a un entorno más protegido al interaccionar la anexina A2 con calcio, cabría esperar el efecto contrario, un aumento en el rendimiento cuántico. Sin embargo, se observa el efecto opuesto. Cuando se analiza la estructura tridimensional del dominio III, se puede ver que el nitrógeno del anillo indólico del Trp213 está relativamente cerca (≤ 3 Å) del oxígeno carbonílico del enlace peptídico de la Leu198 situada en la hélice IIIA. De este modo, podría formarse un puente de hidrógeno entre este átomo de oxígeno y el N-H del imidazol (Figura 29). Tras el cambio conformacional inducido por el calcio, este puente de hidrógeno posiblemente adquiera una disposición atómica más favorable y, por lo tanto, induciría un apagamiento estático mayor de la fluorescencia del Trp213. Figura 28. Apagamiento de la emisión de fluorescencia del Trp213 con acrilamida. Los espectros de emisión de fluorescencia a diferentes concentraciones de acrilamida (0 a 360 mM), en ausencia (EGTA 1 mM) o presencia de calcio (75 mM) se muestran en la parte superior. En la parte inferior se recoge la representación de Stern-Volmer indicando las constantes de apagamiento (KSV) obtenidas tanto en ausencia como en presencia de calcio. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 102 4.2. Caracterización estructural de la anexina A2 humana Para finalizar, y a modo de resumen, la caracterización espectroscópica de la anexina A2 humana recombinante (WT-hA2) pone de manifiesto que se ha conseguido purificar la proteína correctamente plegada, que es capaz de unir calcio de forma específica y que esta unión induce un significativo aumento en su estabilidad conformacional promoviendo un ligero cambio estructural que puede detectarse mediante cambios espectroscópicos en el único residuo de triptófano de la proteína. Con esta proteína en su estado nativo, y en ausencia de S100A10, se procede a su caracterización funcional centrándola en su capacidad para unirse a vesículas fosfolipídicas ácidas (en presencia o ausencia de calcio) y verificar si la proteína monomérica tiene capacidad de agregar vesículas estudiando el mecanismo mediante el cual tiene lugar. Figura 29. Detalle de la estructura del dominio III de WT‐A2h. El residuo de triptófano 213 (W213) en presencia de calcio se aproxima a la leucina 198 (L198) fortaleciéndose el enlace por puente de hidrógeno entre el nitrógeno indólico del triptófano (en color azul) y el oxígeno carbonílico del enlace peptídico de la leucina (en color rojo), provocando un mayor apagamiento estático de la fluorescencia que cuando la proteína está en ausencia de calcio. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.3. Caracterización funcional de la anexina A2 humana 103 4.3. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA ANEXINA A2 HUMANA 4.3.1. Unión a vesículas fosfolipídicas Como ya hemos señalado, la anexina A2 humana presenta capacidad de unión a vesículas fosfolipídicas ácidas cargadas negativamente. Se han realizado pruebas para analizar qué efecto tiene el calcio en la unión que establece la proteína con los fosfolípidos de las membranas y proponer un modelo de unión a membranas dependiente de calcio, así como analizar la posible unión a membranas independiente de este ion. Además, la unión a las membranas podría originar reordenamientos entre el núcleo de la proteína y la extensión del dominio N-terminal, apareciendo nuevos sitios de unión a membranas (Hakobyan y col., 2017). Para estudiar la interacción de la anexina A2 con las vesículas de fosfolípidos se llevaron a cabo ensayos mediante ultracentrifugación tras incubar la proteína WT-A2h con un exceso de vesículas unilamelares grandes (LUV) con un diámetro promedio de 400 nm. Tras la centrifugación, se procedió al análisis de la proteína que estuviera presente tanto en la fracción del sobrenadante como en los sedimentos de las vesículas mediante SDS-PAGE o Western blot en las distintas condiciones experimentales ensayadas. En primer lugar, se analizó la unión de WT-hA2 a vesículas de fosfatidilcolina (PC) y fosfatidilserina (PS), tanto en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) como a diferentes concentraciones de calcio y NaCl 0,1 M, manteniendo una relación molar lípido/proteína elevada (800/1) (Tabla 2). Tabla 2. Unión de WT‐A2h a vesículas unilamelares grandes (LUV) de PC y PS. Composición de los LUV [Ca2+] (μM) WT‐A2h unida (%) PC PS 0 (EGTA 1 mM) 100 0 (EGTA 1 mM) 0,5 30 100 7 ± 2 5 ± 4 51 ± 4 79 ± 9 91 ± 3 100 Los datos representan la media de 3-4 experimentos independientes ±SD. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 104 4.3. Caracterización funcional de la anexina A2 humana No se observó una unión significativa a las LUV de PC mientras que la unión a PS fue cercana al 50% en ausencia de calcio (Tabla 2) y significativamente mayor con calcio, alcanzando el 100% a 100 μM. A diferencia de la mayoría de las anexinas, la anexina A2 puede unirse a las vesículas ricas en fosfolípidos ácidos en ausencia de calcio, por lo que la molécula debe presentar regiones o residuos únicos que permitan esta unión independiente de calcio, siendo esta la primera vez que se describe esta interacción en la anexina A2 sin la participación de S100A10. Para analizar esta posibilidad, posteriormente se estudiará la unión de diferentes variantes mutadas de la anexina A2 a los LUV como sistema modelo. Una vez determinada la concentración de calcio a partir de la cual se conseguía un 100% de interacción con los LUV de PS, se procedió a estudiar la influencia de la fuerza iónica en la interacción. El objetivo era debilitar los posibles puentes salinos que existieran y aumentar el número de interacciones de tipo no electrostáticas. Para ello se incrementó la fuerza iónica desde la que proporciona el tampón con una concentración de NaCl 0,1 M hasta 0,3 y 0,5 M, y se analizó la interacción en las condiciones antes mencionadas tanto en ausencia de calcio como en presencia de CaCl2 100 μM (Figura 30). Figura 30. Ensayos de unión de WT‐A2h a vesículas unilamelares de PS. (a) La unión de la anexina A2 a vesículas de 400 nm de diámetro se realizó por ultracentrifugación en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) o en presencia de CaCl2 100 μM y a tres concentraciones de NaCl (0,1, 0,3 y 0,5 M). (S), sobrenadante, (P) precipitado. Se indica el porcentaje de proteína unida del análisis densitométrico para cada una de las condiciones experimentales. (b) Esquema de las posibles interacciones entre WT-A2h y las vesículas en ausencia y presencia de calcio. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.3. Caracterización funcional de la anexina A2 humana 105 Se observó, en primer lugar, que en ausencia de vesículas de PS la práctica totalidad de la anexina permanece en el sobrenadante. En la Figura 30a solo aparece este control a una concentración de NaCl 0,1 M, pero también se comprobó la ausencia de sedimentación a otras fuerzas iónicas y tanto en presencia de EGTA 1 mM como de CaCl2 100 μM (datos no mostrados). En todos los casos, al realizar el densitometrado de los geles, siempre se restó el valor del control correspondiente en ausencia de vesículas. El análisis densitométrico del gel que muestra la unión de WT-A2h a las vesículas de PS revela que el aumento de la fuerza iónica disminuye de forma muy acusada la interacción independiente de calcio, pasando de un 51% de interacción a fuerza iónica fisiológica a un 13% con NaCl 0,3 M y prácticamente desapareciendo la interacción a 0,5 M. En la figura se recogen dos posibles mecanismos de interacción independientes de calcio; uno de ellos se basaría en la interacción del monómero de anexina con las vesículas a través la α-hélice anfipática N-terminal. Sin embargo, si este fuera el mecanismo, se debería observar también interacción con vesículas de PC, y los resultados mostrados en la Tabla 2 no lo corroboran. Además, el aumento en la fuerza iónica debería reforzar la interacción hidrofóbica de esta hélice con las bicapas, pero tampoco es el caso. En este sentido, y de acuerdo con lo descrito para la anexina A1 (Rosengarth y col., 2001; Rosengarth y Luecke, 2003), es posible que la extensión N-terminal de la anexina A2 se mantenga también fuertemente unida al núcleo proteico en ausencia de calcio, por lo que no se desplegaría generando ese otro posible sitio de interacción con membranas. La práctica desaparición de la interacción independiente de calcio al aumentar la fuerza iónica pone de manifiesto la alta relevancia que tienen las interacciones de tipo electrostático entre la anexina A2 y los fosfolípidos cargados negativamente de las vesículas. Por ello, debe existir alguna región de la molécula con residuos cargados positivamente que posibiliten la interacción. El análisis de la estructura de la molécula reveló la existencia de unos residuos de lisina proyectados hacia el exterior en la cara convexa de la proteína (Lys49, Lys249, Lys281 y Lys206). Por ello se decidió analizar la implicación de estos residuos mediante mutagénesis dirigida, obteniéndose las variantes TK-A2h y 4K-A2h, que se analizarán más adelante. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 106 4.3. Caracterización funcional de la anexina A2 humana En lo que respecta a la unión de la anexina a las vesículas en presencia de CaCl2 100 μM, el análisis densitométrico revela que el porcentaje de unión de la proteína a las vesículas es del 100% a unas fuerzas iónicas correspondientes a concentraciones de NaCl 0,1 M y 0,3 M, y solo se aprecia una ligera disminución en la interacción (15%) a la mayor fuerza iónica empleada (Figura 30a). Como ya se había señalado, y al igual que en la mayor parte de las anexinas de vertebrados, esta unión a los fosfolípidos se establecerá a través de los sitios de unión de calcio de tipo II que se encuentran presentes en la cara convexa de la proteína (Figura 13) (Gerke y col., 2005). Estas interacciones mediante enlaces de coordinación e interacciones iónicas son muy fuertes y solo se debilitan ligeramente a elevada fuerza iónica. Por otro lado, en presencia de calcio y la vista de estos resultados, se puede sugerir la participación de la α-hélice anfipática N-terminal en la unión debido a que el calcio provoca un cambio conformacional en la proteína que la haría adoptar una conformación “abierta” (Lambert y col., 2004), en el que esta hélice dejaría de interaccionar con el núcleo proteico facilitando un sitio adicional para la interacción con las vesículas mediante interacciones mayoritariamente hidrofóbicas (que se favorecerían con el aumento de la fuerza iónica). Para conocer con más profundidad el papel que pudiera desempeñar esta región N-terminal sobre todo en procesos de agregación de vesículas, se decidió generar un mutante de deleción que careciese de esta hélice (Δ14-A2h), que también se analizará más adelante. 4.3.2. Ensayos de agregación de vesículas fosfolipídicas Una de las principales funciones que desempeña la anexina A2 es su participación en los procesos de transporte de vesículas intracelulares, así como en mecanismos de reparación de las membranas plasmáticas en procesos fisiológicos y patológicos (Lauritzen y col., 2015). Por otro lado, tal y como ocurre con otras anexinas y bajo condiciones específicas, la anexina A2 actúa como un puente posibilitando la interacción entre membranas en un proceso dependiente de calcio o en condiciones de pH ligeramente ácido (Lambert y col., 2004). Este proceso se ha descrito también, por ejemplo, para la anexina A5 y la anexina B12 (Isas y col., 2000). Existen numerosos estudios acerca de la implicación de la anexina A2 heterotetramérica en agregación de vesículas en procesos de endo y exocitosis. Sin RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.3. Caracterización funcional de la anexina A2 humana 107 embargo, se conoce muy poco acerca del papel que desempeña la forma monomérica, y del mecanismo por el cual induce estos procesos, por ejemplo durante la endocitosis y la agregación y fusión de estas vesículas con los lisosomas (Morel y Gruenberg, 2007). Los ensayos de agregación se llevaron a cabo como se especifica en el apartado de Materiales y Métodos, utilizando las mismas condiciones experimentales que en los de unión en cuanto a concentraciones de calcio, EGTA y NaCl. En este caso se han empleado vesículas unilamelares de PS con un diámetro promedio de 100 nm. La finalidad es que se pueda proponer un modelo a través del cual se puedan explicar los mecanismos mediante los cuales la proteína puede inducir la agregación de vesículas in vivo. En la Figura 31 (a, b y c) se recogen las curvas de agregación de un experimento típico donde en cada una de las condiciones indicadas se varía la concentración de proteína WT-A2h desde 0,5 hasta 8 μM, registrándose la variación en la absorción a 320 nm tras restar la correspondiente a los controles sin proteína. En ninguno de estos controles sin proteína se llegó a observar agregación de las vesículas. En la parte inferior (Figura 31d y e) se representan los valores de las velocidades iniciales aparentes (V0 ap.; ΔA320/s) y de ΔA320 a los 10 minutos en función de la concentración de proteína. Estos valores representan el promedio de un mínimo de dos ensayos independientes con una desviación estándar que resultó ser igual o inferior al 10% (no se muestran las barras de error para no complicar la figura). a) Agregación independiente de calcio En ausencia de calcio (Figura 31a), y a concentraciones muy bajas de proteína, ya es posible observar agregación, pero siempre algo menor que la que se detecta en presencia de CaCl2 100 μM (Figura 31b). El incremento en la fuerza iónica, como era de esperar, afecta en gran medida a la capacidad de agregación de vesículas dado que disminuye de forma muy significativa la unión a las mismas. Sin embargo, incluso a una concentración de NaCl 0,5 M, se ve una agregación inicial que disminuye con el tiempo. El proceso de agregación podría ser mediado por una sola capa de moléculas de anexina que podrían unir a una vesícula por el lado convexo de la molécula y a la otra por el extremo N-terminal (Figura 32a); la otra posibilidad RESULTADOS Y DISCUSIÓN 108 4.3. Caracterización funcional de la anexina A2 humana es que se requiera la formación de dímeros de anexina a través de las superficies cóncavas o de las hélices N-terminales (Figura 32b y c). Los datos cinéticos (V0ap.) y de ΔA320 final no permiten discernir entre las dos posibilidades porque no se llega a saturar la agregación a 8 μM de proteína (si disminuyera a elevada concentración de proteína, los procesos de agregación estarían originados por una molécula que une las dos membranas; si el efecto se satura y no decae, sería debido a la interacción entre moléculas unidas a membranas opuestas). Tampoco se puede descartar que a baja concentración de proteína se dé un mecanismo de agregación monomérico y que al elevar la concentración y “tapizarse” Figura 31. Curvas de agregación de vesículas unilamelares de PS inducidas por WT‐A2h. La agregación de vesículas se registró monitorizando la variación de la absorción a 320 nm tras la adición de las vesículas a mezclas de las proteínas recombinantes a distintas concentraciones y condiciones experimentales. (a) Agregación en ausencia de calcio (EGTA 5mM) y NaCl 0,1 M. En rojo se muestran las curvas a una concentración de 8 µM de proteína y NaCl 0,3 y 0,5 M. (b) Agregación en presencia de CaCl2 100 µM y NaCl 0,1 M. (c) Agregación en presencia de CaCl2 100 µM y NaCl 0,3 M. (d) Resumen de los datos obtenidos de velocidad inicial aparente en las distintas condiciones ensayadas. (e) Resumen de los datos obtenidos de incremento de absorción final a 320 nm. Los datos de las gráficas d y e se corresponden a la media de, al menos, dos experimentos independientes. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.3. Caracterización funcional de la anexina A2 humana 109 las vesículas de anexina, la agregación sea a través de dímeros por las regiones cóncavas o mediante los extremos N-terminales. Se ha propuesto que la anexina A2 puede formar dímeros “antiparalelos” por interacciones laterales por puentes salinos entre residuos situados en el dominio III de cada molécula, de forma que los lados convexos de cada anexina estarían orientados cada uno hacia un lado pudiendo estos dímeros, teóricamente, interaccionar con dos vesículas distintas induciendo la agregación (Rosengarth y Luecke, 2004). La interacción con las vesículas de PS se daría por los residuos cargados positivamente de la superficie convexa de las moléculas, sin descartar que las zonas cóncavas o los extremos N-terminales pudieran contribuir a la unión. Posteriormente se analizará la relevancia de estos residuos y la formación de dímeros antiparalelos en la funcionalidad de la anexina A2 obteniendo una variante mutada que no puede formar los puentes salinos. b) Agregación en presencia de calcio En presencia de calcio y con una fuerza iónica fisiológica, la anexina A2 induce la agregación de vesículas de forma más eficiente que en ausencia de calcio (Figura 31b). El proceso de agregación parece dispararse a concentraciones de proteína superiores a 1 μM (relación molar lípido/proteína 120/1), al igual que ocurría en ausencia de calcio. Este hecho parece sugerir que para que tenga lugar eficientemente la agregación, las vesículas deben estar “tapizadas” de anexina, por lo que es más probable que la agregación tenga lugar a través de la formación de Figura 32. Modelos para la agregación de vesículas por WT‐A2h en ausencia de calcio. (a) Agregación por monómeros a través de la superficie convexa con una vesícula y por la α-hélice anfipática con la otra. (b) Agregación por dimerización de las moléculas de anexina por interacción entre las superficies cóncavas o (c) por interacción entre los extremos N-terminales. (d) Agregación por dímeros “antiparalelos” estabilizados por cuatro puentes salinos. (Rectángulos azules: residuos Lys49, Lys249, Lys281 y Lys206) RESULTADOS Y DISCUSIÓN 110 4.3. Caracterización funcional de la anexina A2 humana dímeros entre las moléculas de anexina en vesículas opuestas. El análisis de los datos cinéticos y del ΔA320 a los 10 minutos parece sugerir también este tipo de mecanismo dado que, si la agregación tuviera lugar por una sola capa de moléculas, estos parámetros disminuirían a concentraciones altas de proteína porque las vesículas estarían recubiertas de moléculas de anexina que impedirían la agregación (Figura 31d y e). Sin embargo, no se puede descartar que a baja concentración de proteína pueda darse la agregación por una sola molécula (o por un dímero “antiparalelo”), como ocurría en ausencia de calcio. Cuando se aumenta de manera moderada la fuerza iónica (NaCl 0,3M), hay un aumento significativo en las cinéticas de agregación (Figura 31). Este hecho implica que en la agregación de vesículas van a participar interacciones de naturaleza no electrostática que se verán favorecidas al aumentar la polaridad del medio. Si se observa la molécula de anexina A2 (Figura 33) se puede observar que la superficie cóncava presenta amplias zonas de naturaleza hidrofóbica (en rojo), por lo que se puede sugerir que la agregación de vesículas podría estar promovida por la interacción entre estas superficies en moléculas de anexina unidas a vesículas opuestas. Sin embargo, no se pueden descartar otras posibilidades, como la posible interacción entre las hélices anfipáticas de los extremos N-terminales de estas moléculas, que también podría verse favorecida a elevada fuerza iónica. Figura 33. Representación de la superficie de la molécula de anexina A2. Se muestra una visión lateral de la molécula y otra inferior, donde se aprecia en rojo las regiones de naturaleza hidrofóbica en la superficie cóncava. En la vista lateral se indican las posiciones de los residuos de lisina (K) que se proyectan desde la superficie convexa. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 111 4.4. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE MUTANTES DE LA ANEXINA A2 Como ya se ha anticipado en el apartado anterior, hay una serie de residuos en la proteína que pueden desempeñar un papel clave en los mecanismos de interacción de la anexina A2 humana con las membranas biológicas y en el proceso de agregación y fusión de vesículas. Por este motivo, se procedió a la obtención de variantes mutadas de esta anexina: deleción de la hélice α anfipática N-terminal (Δ14-A2h); mutación de residuos de lisina (por alanina) que se proyectan desde la superficie convexa de la proteína (TK-A2h, Δ14TK-A2h y 4K-A2h); y mutación de tres residuos implicados en los cuatro puentes salinos responsables de la formación de los dímeros “antiparalelos” (TM-A2h y Δ14TM-A2h). En el apartado Materiales y Métodos se especifican los procedimientos y técnicas utilizadas para clonar, expresar y purificar las variantes mutadas de la anexina A2. 4.4.1. Clonación de las variantes mutadas de la anexina A2 humana a) Eliminación de la hélice anfipática N‐terminal El extremo N-terminal de la proteína desempeña un papel muy importante tanto en la estructura como en la estabilidad y funcionalidad de la proteína. En concreto, los primeros catorce residuos de este dominio pueden formar una hélice anfipática que es esencial para establecer interacciones con proteínas de la familia S100 (S100A10 y S100A4) (Réty y col., 2000; Ecsédi y col., 2017). Además, se ha descrito que, en entornos hidrofóbicos o que mimeticen las membranas, o a valores de pH ligeramente ácidos, esta región adopta estructura en α-hélice y se ha sugerido que esta hélice podría constituir un sitio de unión a membranas independiente de calcio (Hong y col., 2003; Zibouche y col., 2008) a diferencia de lo que ocurre con la anexina A1, que requiere calcio para la aparición de este sitio de interacción con membranas (Rosengarth y Luecke, 2003). Con el objetivo de estudiar en profundidad el papel funcional de esta hélice N-terminal, se planteó obtener un mutante con una deleción de los primeros 14 residuos (∆14‐A2h). Para ello se partió de la construcción previa pBH4.A2h, utilizándose como molde para obtener la construcción pBH4. ∆14-A2h mediante la técnica de QuickChange. En la Figura 34 se muestran los cebadores utilizados para RESULTADOS Y DISCUSIÓN 112 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 la deleción de los tripletes de los 14 aminoácidos que se corresponden a la hélice anfipática N-terminal. Tras la PCR, se transformaron bacterias de la cepa BL21(DE3) con 1 μl de la mezcla de reacción y se plaquearon en LB-agar-ampicilina. Tras seleccionar varias colonias, se hicieron cultivos de 5 ml de LB-ampicilina y se aislaron los plásmidos presentes en cada colonia por el método de lisis alcalina y se digirieron alícuotas de cada uno con las enzimas de restricción BamHI y XhoI. El plásmido molde (pBH4.A2h; 6733 bp) debería generar dos fragmentos de 5.707 y 1.026 bp, mientras que el plásmido con la deleción (pBH4.Δ14.A2h) debería generar solo una banda de 6.685 bp al haberse eliminado el sitio de restricción BamHI. En la Figura 35 se muestra un gel correspondiente al análisis de restricción de una colonia positiva (1) y otra negativa (2) para la deleción. Figura 35. Análisis de restricción de plásmidos obtenidos por el método QuickChange para la obtención de pBH4.Δ14.A2h. En la figura se muestra el análisis de restricción con las enzimas BamHI y XhoI de los plásmidos aislados de una colonia positiva (1) y otra negativa (2). A la derecha del gel se indican las longitudes teóricas de los fragmentos. (P) Patrón de longitudes de DNA lineal, indicándose el tamaño de algunas bandas. Figura 34. Cebadores diseñados para la clonación de ∆14‐A2h. Se muestran los cebadores utilizados para la eliminación de la α-hélice anfipática del extremo N-terminal. En la supresión de los catorce primeros residuos de la anexina A2 humana se mantuvo el sitio de corte para rTEV (se indica con la flecha negra), aunque se eliminó el lugar de restricción para la enzima BamHI, que se utilizó para la selección. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 113 b) Mutación de residuos de lisina en la superficie convexa por alaninas La superficie convexa de la anexina A2 presenta abundantes zonas con carga negativa, pero en cada uno de los bucles entre las hélices A y B de los dominios I, III y IV se encuentran unos residuos de lisina que se proyectan hacia el exterior de la proteína (Lys49, Lys206 y Lys281; en el dominio II se encuentra Leu121). Adicionalmente, habría otro residuo de lisina entre las hélices IIID y IIIE que también se proyecta parcialmente hacia el exterior, la Lys249 (Figura 36). Estos residuos de lisina es muy posible que estén implicados en el establecimiento de uniones de naturaleza electrostática con fosfolípidos ácidos de las membranas. Para estudiar el papel de estos residuos en la capacidad de unión a membranas biológicas y en la agregación de vesículas, se han obtenido los mutantes TK-A2h y 4K-A2h, donde tres o cuatro lisinas se han sustituido por alaninas. Figura 36. Representación tridimensional de la anexina A2 mostrando los residuos de lisina protuberantes en la superficie convexa. Se muestran las cadenas laterales de los residuos de lisina protuberantes cargadas positivamente. La sustitución de los residuos K49, K206 y K281 por alaninas originará la proteína mutada TK-A2h; la inclusión adicional de la mutación K249A generará el mutante 4K-A2h. Se indican también los residuos de Leu121 y la Pro21. En la parte inferior se recoge la representación de la superficie de la molécula indicándose en rojo las regiones con carga negativa y en azul las positivas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 114 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 Para la obtención del mutante que carece de las tres lisinas protuberantes de la cara convexa de la proteína (TK-A2h), se actúa nuevamente sobre la construcción pBH4.A2h que contiene el cDNA de la anexina A2 humana. Las mutaciones se fueron introduciendo de una en una. Inicialmente, se sustituyó la Lys281 por Ala281 (K281A- A2h). Una vez purificado el plásmido mutado, éste se volvió a mutar por el mismo procedimiento para obtener la mutación doble K281A/K49A y, finalmente, el triple mutante K281A/K49A/K206A (TK‐A2h). Para ello se utilizaron los cebadores que se describen en la Figura 37. El mutante adicional 4K‐A2h se obtuvo utilizando como molde para el QuickChange el plásmido mutado pBH4.TK.A2h y los cebadores que se indican también en la Figura 37. Figura 37. Cebadores empleados para la clonación de TK‐A2h y 4k‐ A2h. En color rojo se muestran las bases modificadas en cada caso para introducir las mutaciones y los sitios de restricción adicionales empleados para identificar la correcta introducción de las mutaciones. La selección de las colonias que contenían los plásmidos mutados correctos se llevó a cabo tras aislar los plásmidos mediante cultivos a pequeña escala y lisis alcalina, seguida de los análisis de restricción que se recogen en la Tabla 3. En todos los casos se utilizaba como control negativo el plásmido que se había utilizado de partida para la PCR QuickChange. Debido al gran número de geles, solo se muestran algunos de ellos, como el de la confirmación del primer mutante K281A y del último con las cuatro lisinas sustituidas por alanina (4K.A2h) (Figura 38). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 115 Tabla 3. Análisis de restricción para la selección de la introducción correcta de las mutaciones para la obtención del plásmido pBH4.TK.A2h. Mutación PstI BamHI/KpnI MluI XhoI WT-A2h 5.053 1.680 6.733 6.733 6.733 K281A 5.053 1.680 6.733 4.989 1.744 6.733 K281A K49A 4.778 1.680 275 6.733 4.989 1.744 6.733 K281A K49A K206A 4.778 1.680 275 6.105 628 4.989 1.744 6.733 K281A K49A K206A K249A 4.778 1.680 275 6.105 628 4.989 1.744 6.466 267 En rojo se indican los cortes y las bandas características que permiten la identificación correcta de las mutaciones introducidas. Figura 38. Análisis de restricción de plásmidos obtenidos por el método QuickChange para la obtención de pBH4.E281A.A2h y pBH4.4K.A2h. (A) En la figura se muestra el análisis de restricción con la enzima MluI de plásmidos aislados de una colonia negativa (1) y otra positiva (2) para pBH4.E281A.A2h. (B) Análisis de restricción con la enzima XhoI de plásmidos aislados de una colonia negativa (1) y otra positiva (2) para pBH4.4K.A2h. A la derecha de los geles se indican las longitudes teóricas de los fragmentos. (P) Patrón de longitudes de DNA lineal, indicándose el tamaño de algunas bandas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 116 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 Por último, se obtuvo un mutante de deleción a partir del vector de expresión de TK- A2h (pBH4.TK.A2h), eliminando los codones correspondientes a los 14 primeros residuos de la anexina A2, generando el plásmido pBH4.Δ14.TK.A2h. Para ello se empleó también el método QuickChange con los cebadores descritos en la Figura 34 y se comprobó la correcta deleción de los codones mediante digestión de los plásmidos aislados de varias colonias con las enzimas de restricción BamHI y XhoI. Los plásmidos positivos (pBH4.Δ14.TK.A2h) deben generar solo una banda de DNA linealizado de 6.685 bp, mientras que los negativos (pBH4.TK.A2h) deberían dar dos bandas, una de 5.707 bp y otra de 1.026 bp (Figura 39). Figura 39. Análisis de restricción de plásmidos obtenidos por el método QuickChange para la obtención de pBH4.Δ14.TK.A2h. En la figura se muestra el análisis de restricción con las enzimas BamHI y XhoI de los plásmidos aislados de una colonia positiva (1) y otra negativa (2). A la derecha del gel se indican las longitudes teóricas de los fragmentos. (P) Patrón de longitudes de DNA lineal, indicándose el tamaño de algunas bandas. c) Mutación de los residuos implicados en la formación de dímeros “antiparalelos” Los monómeros de anexina A2, en presencia de calcio, forman un dímero en disposición “antiparalela” estableciéndose la unión entre los monómeros proteicos a través de puentes salinos que se forman entre residuos del dominio III de la proteína. En esta disposición un monómero tiene su superficie convexa en el mismo lado que la superficie cóncava del otro monómero, por lo que los sitios de unión a calcio y membranas aparecen en ambos lados. La interacción que se produce entre los monómeros tiene lugar mediante el establecimiento de cuatro puentes salinos entre residuos que se sitúan en el dominio III de ambas proteínas (Arg196-Asp209, Lys206-Glu189, Lys212-Glu219 y Glu219-Arg178; Figura 40) (Rosengarth y Luecke, 2004). Al igual que sucede con la anexina A6 bovina, en la que se ha visto que la proteína RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 117 adopta esta conformación “antiparalela”, los monómeros que forman el dímero pueden unirse a dos membranas al mismo tiempo induciendo la agregación de vesículas de fosfatidilserina (Avila-Sakar y col., 2000). Figura 40. Detalle de la estructura tridimensional del dímero de anexina A2 mostrando la región de contacto. La representación es un detalle de la estructura cristalina del dímero de la anexina A2 en presencia de calcio, obtenida del fichero PDB 1XJL (Rosengarth y Luecke, 2004). Se muestran las hélices A y B de los dominios III de cada monómero y los puentes salinos que mantienen la estructura. Los residuos que se sustituyen por alanina se indican con flechas rojas (E189, E219, R196). En la imagen superior se representa la disposición contrapuesta de las caras convexas y cóncavas del dímero de anexina A2 humana; el extremo N- terminal aparece en línea discontinua porque en la estructura cristalina no se podía determinar su posición. El mecanismo a través del cual la anexina A2 induce la agregación de vesículas no está del todo esclarecido. Se ha propuesto que dicho proceso pudiera estar desencadenado por la asociación de monómeros formando dímeros “antiparalelos” que, al tener sus superficies convexas orientadas en sentidos opuestos, teóricamente podrían interaccionar cada uno con una vesícula o membrana diferente (Rosengarth y Luecke, 2004; Drücker y col., 2013). Con el fin de comprobar esta hipótesis, se realizaron mutaciones puntuales que afectaban a los residuos que estaban implicados en la estabilidad del dímero “antiparalelo” mediante los mencionados puentes salinos, de manera que Glu189, Arg196 y Glu219 (Figura 40), fueron sustituidos por alanina. De esta forma se impide la formación de los cuatro puentes salinos y la dimerización “antiparalela”, generándose el mutante TM‐A2h. Al igual que en los anteriores mutantes, las mutagénesis dirigidas se realizaron mediante QuickChange. En la Figura 41 se muestran los cebadores directos e RESULTADOS Y DISCUSIÓN 118 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 inversos utilizados, así como los nuevos sitios de restricción incluidos para facilitar la selección de los plásmidos mutados. Figura 41. Cebadores empleados para la clonación de TM‐A2h. En color rojo se muestran las bases modificadas en cada caso para introducir las mutaciones y los sitios de restricción adicionales empleados para identificar la correcta introducción de las mutaciones. La selección de las colonias que contenían los plásmidos mutados correctos se llevó a cabo de la misma forma que se ha descrito para los mutantes de lisina (datos no mostrados); las bandas correspondientes a los análisis de restricción se recogen en la Tabla 4. Tabla 4. Análisis de restricción para la selección de la introducción correcta de las mutaciones para la obtención de los plásmidos pBH4.TM.A2h y pBH4.Δ14TM.A2h. Mutación MluI PstI/XhoI BssHII BamHI/XhoI WT-A2h 6.733 5.053 1.081 599 6.733 5.707 1.026 E189A 5.273 1.460 5.053 1.081 599 6.733 5.707 1.026 E189A R196A 5.273 1.460 5.053 1.081 433 166 6.733 5.707 1.026 E189A R196A E219A 5.273 1.460 5.053 1.081 433 166 4.770 1.963 5.707 1.026 Δ14TM-A2h 5.273 1.460 5.053 1.081 433 166 4.770 1.963 6.685 En rojo se indican los cortes y las bandas características que permiten la identificación correcta de las mutaciones introducidas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 119 Además, al igual que en el caso de la anexina A2 recombinante y el mutante TK-A2h, se obtuvo el mutante truncado sin la hélice anfipática N-terminal (Δ14TM‐A2h). La construcción de partida fue pBH4.TM.A2h, y la deleción suprime el único sitio de restricción BamHI que posee el plásmido de partida gracias al empleo de los cebadores descritos en la Figura 34. Tras el aislamiento de los plásmidos de las colonias de células transformadas, se llevó a cabo un análisis de restricción con las enzimas BamHI y XhoI utilizando el mismo protocolo que en los mutantes Δ14 anteriores (Δ14-A2h y Δ14TK-A2h) (Tabla 4; Figura 42). Figura 42. Análisis de restricción de plásmidos obtenidos por el método QuickChange para la obtención de pBH4.Δ14TM.A2h. En la figura se muestra el análisis de restricción con las enzimas BamHI y XhoI de los plásmidos aislados de una colonia positiva (1) y otra negativa (2). A la derecha del gel se indican las longitudes teóricas de los fragmentos. (P) Patrón de longitudes de DNA lineal, indicándose el tamaño de algunas bandas. En todos los casos, cada vez que se conseguía un plásmido mutado, no solo se llevaba a cabo el análisis de restricción, sino que, con aquellos que podían resultar positivos, se procedió a analizar su secuencia en el Centro de Genómica de la UCM tanto en dirección 5’→3’ como 3’→5’ empleando oligonucleótidos con la secuencia del promotor T7 (secuencia directa; 5’-TAATACGACTCACTATAGGG , el terminador T7 (secuencia en sentido inverso; 5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’) o bien algún otro oligonucleótido diseñado ex profeso para detectar las mutaciones. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 120 4.4. Clonación y expresión de variantes mutadas de la anexina A2 4.4.2. Aislamiento y purificación de las proteínas recombinantes Una vez obtenidas las construcciones que portaban las mutaciones, se transformaron bacterias de E. coli de la cepa BL21(DE3); esta cepa es deficiente en proteasas y es considerada idónea para una buena expresión de proteínas recombinantes. Al igual que ocurría con la expresión de WT-A2h, con el resto de las proteínas mutadas tampoco fue necesaria la inducción de la expresión con IPTG debido a la elevada expresión basal de las construcciones en pBH4. En general, la producción se llevó a cabo en 500 ml de medio de cultivo LB con 100 μg/ml de ampicilina como agente de selección, y se mantuvieron los cultivos a 37°C con agitación permanente durante 18-24 horas a 250 rpm. La purificación final de las proteínas se hizo tal y como se describe en el apartado Materiales y Métodos. En la Figura 43A, se muestra la producción y solubilización de la proteína recombinante ∆14-A2h, y en la parte B, el resultado de la cromatografía en Ni-NTA-agarosa. Al igual que se hizo con la proteína WT-A2h, las preparaciones se dializaron frente a tampón Hepes 10 mM, pH 7,8, NaCl 0.1 M, se filtraron a través de membranas de 0,22 μm, y se almacenaron a 4°C o a -80°C. Figura 43. Solubilización de Δ14‐A2h a partir del sedimento bacteriano y purificación cromatográfica en Ni‐NTA‐agarosa. (A) Análisis de las distintas etapas de la solubilización mediante PAGE-SDS (10%) en condiciones reductoras y teñido con azul de Coomassie: (H) homogeneizado total; (S1) y (S2) sobrenadantes de las extracciones con EGTA 2,5 mM tras sonicación; (P1) y (P2), sedimentos insolubles tras las solubilizaciones; (P) patrón de masas moleculares (kDa). (B) Análisis de fracciones de la cromatografía en Ni-NTA-agarosa (PAGE-SDS 12%): (C) material cargado en la columna; (L) proteínas eluidas en el lavado con imidazol 20 mM. La anexina A2 truncada (Δ14-A2h) comienza a eluir pura con tampón conteniendo imidazol 50 mM, pero eluye mayoritariamente a 250 mM. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.5. Caracterización estructural de variantes mutadas de la anexina A2 humana 121 El rendimiento que se obtiene es del orden de siete veces superior en el caso del mutante en el que se elimina la hélice anfipática (∆14-A2h) con respecto a la proteína WT-A2h (80-100 mg/L frente a 12-15 mg/L). Este hecho se repitió en las purificaciones de los mutantes con y sin la extensión N-terminal, obteniéndose rendimientos similares a los descritos para WT-A2h en TK-A2h, 4K-A2h y TM-A2h, y parecidos al de Δ14-A2h en Δ14TK-A2h y Δ14TM-A2h. Estos resultados sugieren que la hélice anfipática del dominio N-terminal podría tener un importante papel en la interacción con las membranas en ausencia de calcio. Así, durante la homogeneización de las bacterias que expresan anexina A2 o los mutantes que mantienen la hélice N-terminal, gran parte de la proteína producida no se solubilizará debido a su interacción independiente de calcio con las membranas bacterianas. En cualquier caso, los rendimientos más bajos fueron de alrededor de 10 mg por litro de cultivo bacteriano. 4.5. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LAS VARIANTES MUTADAS DE LA ANEXINA A2 HUMANA La caracterización estructural de los mutantes se ha llevado a cabo esencialmente mediante dicroísmo circular en el UV lejano y en el UV próximo, así como mediante el análisis de la estabilidad térmica de las proteínas, y siempre comparándolo con los datos obtenidos para la anexina A2 (WT-A2h). Además, se determinó en todos los casos el coeficiente de extinción molar, no detectándose diferencias significativas entre las distintas proteínas (datos al principio de Materiales y Métodos). 4.5.1. Mutante de deleción de la hélice anfipática N‐terminal (Δ14‐A2h) El espectro CD del mutante truncado ∆14-A2h en ausencia de calcio (Figura 44a) se ha realizado en las mismas condiciones que para WT-A2h. Los espectros obtenidos en el UV lejano revelan que Δ14-A2h se encuentra correctamente plegada, con dos mínimos a 208 y 222 nm y un elevado contenido en α-hélice en presencia de EGTA 1 mM (74,1%; superior al de la proteína WT-A2h, 61,7%), según predice el algoritmo CCA (Perczel y col., 1992). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 122 4.5. Caracterización estructural de variantes mutadas de la anexina A2 humana La eliminación de los 14 residuos de la hélice anfipática del extremo N-terminal provoca un aumento en el contenido en α-hélice de la proteína en lugar de disminuir, aumentando incluso la relación [θ]222/[θ]208 y, por tanto, la longitud de las hélices. Por ello es posible que, en ausencia de membranas o de S100A10, esta hélice no se forme. En cualquier caso, se ha observado que en las moléculas de anexina que poseen un extremo N-terminal relativamente largo, esta extensión provoca una disminución en el contenido en α-hélice debido a su relativa movilidad conformacional, como se ha descrito para la anexina A11(Lecona y col., 2003) o la isoforma larga de la anexina A13 (Turnay y col., 2005; Fernández-Lizarbe y col., 2017). En el UV próximo ∆14-A2h, al igual que WT-A2h, presenta un mínimo a 280 nm debido a la actividad óptica del Trp213 (Figura 44b). El mínimo de elipticidad negativa alcanza valores mayores altos en la proteína truncada ∆14-A2h (cercanos a -15.000 deg·cm2·dmol-1) si se compara con los valores observados en la proteína intacta. Esto significa que al truncar la extensión N-terminal, la estructura del núcleo se hace más compacta, de acuerdo con el aumento en el contenido en α-hélice, Figura 44. Espectros de dicroísmo circular en el UV lejano y UV próximo de ∆14‐A2h. Los espectros se registraron en Hepes 10 mM, pH 7,8 y NaCl 0,1 M a 20° C, en presencia de EGTA 1 mM. Los espectros de Δ14-A2h (azul) aparecen comparados con los de WT-A2h (en negro). Cada espectro representado es la media de seis escaneos y se han suavizado mediante el software del equipo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.5. Caracterización estructural de variantes mutadas de la anexina A2 humana 123 disminuyendo la movilidad del residuo de triptófano y aumentando su actividad óptica. La estabilidad térmica se analizó registrando la elipticidad molar a 208 nm en función de la temperatura a una velocidad de 60°C/h (Figura 45). Al igual que en WT-A2h, la desnaturalización térmica de la proteína es irreversible. En ausencia de calcio, la estabilidad térmica de ∆14-A2h es 1,5°C superior a la de la proteína intacta, lo que vuelve a sugerir un cambio conformacional de la proteína que la hace más compacta, como ya se ha comentado con anterioridad. Al igual que en la proteína intacta, el calcio incrementa significativamente la estabilidad térmica de Δ14-A2h aumentando su temperatura de fusión. Es un efecto específico de la interacción con calcio y no del aumento en la fuerza iónica dado que una concentración de MgCl2 equivalente a la máxima empleada de CaCl2 no induce prácticamente ninguna modificación. En la Figura 46 se puede comparar el efecto Figura 45. Curvas de desnaturalización térmica de ∆14‐A2h. Se muestran las curvas de desnaturalización térmica de Δ14-A2h en ausencia (negro; EGTA) y presencia de CaCl2 95 mM (rojo), o MgCl2 95 mM (azul), en tampón Hepes10 mM, pH 7,8, NaCl 0,1 M. El inserto muestra las temperaturas de fusión (Tm) a concentraciones crecientes de calcio, las cuales se determinaron a partir del punto de inflexión de las curvas de desnaturalización suavizadas (a partir del máximo de la primera derivada). Los datos representan los valores medios de al menos dos determinaciones independientes. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 124 4.5. Caracterización estructural de variantes mutadas de la anexina A2 humana del calcio en la proteína intacta y en la truncada, observándose siempre una mayor estabilidad en la última, alcanzándose antes el 50% del efecto (5,0 mM frente a 8,4 mM en WT-A2h). Figura 46. Dependencia de la Tm de WT‐A2h y Δ14‐A2h con la concentración de calcio. Las gráficas muestran las temperaturas de fusión (Tm) a concentraciones crecientes de CaCl2 (negro) y a la máxima concentración de MgCl2 (azul). Los datos representan los valores medios de al menos dos determinaciones independientes para cada concentración de CaCl2. Todos los datos espectroscópicos y de estabilidad térmica confirman, no solo que la proteína truncada esta correctamente plegada, sino también que la eliminación de los 14 residuos de la extensión N-terminal conlleva que la proteína adquiera una estructura más compacta al disminuir el tamaño de la extensión N-terminal, que posiblemente en disolución se encuentre en ordenación aperiódica. 4.5.2. Mutantes con sustitución de lisina por alanina en la superficie convexa Los espectros de dicroísmo circular en el UV lejano de los mutantes TK-A2h, Δ14TK- A2h y 4K-A2h revelan un alto porcentaje de estructura en α-hélice, muy parecido al de la proteína no modificada, confirmando el correcto plegamiento en todos los casos (Figura 47a). La sustitución de tres o cuatro lisinas en la región convexa de la proteína no supone grandes cambios en la predicción de estructura secundaria de acuerdo con el algoritmo CCA, si bien TK-A2h presenta aparentemente casi un 5% más de estructura en α-hélice y 4K-A2h un 4% menos que WT-A2h. Sí resulta más significativo el aumento en el contenido en α-hélice al eliminar los 14 residuos primeros residuos de TK-A2h (Δ14TK-A2h 74,2% frente a 66,9% en TK-A2h), de forma prácticamente idéntica a lo que se observaba con la proteína WT-A2h. De forma parecida, cuando se analizan los espectros de dicroísmo circular en el UV próximo, la sustitución de las lisinas por alaninas no supone ningún cambio significativo con respecto a WT-A2h, apareciendo un mínimo muy claro a 280 nm RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.5. Caracterización estructural de variantes mutadas de la anexina A2 humana 125 (Figura 47b). También se reproduce el efecto que tenía la deleción de los 14 residuos N-terminales, aumentando la actividad óptica del Trp213 que pasa a un entorno más rígido y protegido del disolvente. Se analizó también la estabilidad térmica de los distintos mutantes de lisina. En ausencia de calcio (EGTA 1mM) las temperaturas de fusión de TK-A2h, ∆14TK-A2h y 4K-A2h son de 55,6°C, 56,7°C y 53,0°C, respectivamente (Figura 48). La sustitución de las tres lisinas en WT-A2h y Δ14-A2h por residuos de alanina no supone ningún cambio significativo en la estabilidad térmica de las proteínas, volviéndose a confirmar que la supresión de los 14 primeros residuos supone una estabilización de la proteína. En presencia de CaCl2 95mM se repite que las proteínas se compactan y aumentan su estabilidad, con unos valores de Tm de 68,5°C, 69,8°C y 69,0°C, también respectivamente. El mutante 4K-A2h presenta una ligera menor estabilidad térmica en ausencia de calcio, que concuerda con su menor compactación y contenido en α-hélice, pero la saturación con calcio hace que la Figura 47. Espectros de dicroísmo circular en el UV lejano y UV próximo de los mutantes de lisina. (a) Espectros de dicroísmo circular en el UV lejano y (b) en el UV próximo registrados en Hepes 10 mM, pH 7,8, EGTA 1 mM y NaCl 0.1 M a 20°C. Cada espectro representado es la media de seis barridos. En la leyenda de (a) se especifica el color de cada espectro y la predicción de contenido en α-hélice de las distintas proteínas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 126 4.5. Caracterización estructural de variantes mutadas de la anexina A2 humana estructura se compacte y que su comportamiento térmico sea igual que el de TK-A2h e incluso ligeramente superior a WT-A2h. La variación de la Tm con la concentración de calcio sigue en todos los casos un patrón hiperbólico, al igual que WT-A2h y Δ14-A2h, alcanzándose el 50% del efecto de forma muy rápida para TK-A2h (3,6 mM), mientras que 4K-A2h presenta el valor más elevado (9,4 mM; algo mayor que WT-A2h), y Δ14TK-A2h se comporta muy parecido a Δ14-A2h (5,3 mM). 4.5.3. Mutantes con la dimerización “antiparalela” impedida El mutante TM-A2h se obtuvo por sustitución de los residuos Glu189, Arg196 y Glu219 por residuos de alanina en esas mismas posiciones. Con ello se anulan las posibles interacciones mediante puentes salinos que se habían detectado en la estructura cristalina de la anexina A2 humana en presencia de calcio (Rosengarth y Luecke, 2004). Sin embargo, no se había comprobado hasta la fecha si estos dímeros Figura 48. Curvas de desnaturalización térmica de TK‐A2h, ∆14TK‐A2h y 4K‐A2h. Se muestran las curvas de desnaturalización térmica de las tres proteínas en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) y en presencia de CaCl2 95 mM. A la derecha se representa la variación de la Tm en función de la concentración de calcio y a la máxima concentración de MgCl2. Los datos son el promedio de, al menos, dos determinaciones para cada condición experimental. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.5. Caracterización estructural de variantes mutadas de la anexina A2 humana 127 “antiparalelos” se forman en disolución y si están o no implicados en la funcionalidad de la proteína. Los espectros de dicroísmo circular en el UV lejano que se obtienen para este mutante TM-A2h y su forma truncada Δ14TM-A2h son semejantes al de las correspondientes proteínas sin mutar estos tres residuos (WT-A2h y Δ14-A2h), lo que confirma que las proteínas están correctamente plegadas (Figura 49a). En este caso, TM-A2h presenta un 2,8% más de estructura en α-hélice (64,6%) que la proteína no mutada, lo que podría estar relacionado con la imposibilidad de formación de dímeros (incluso en ausencia de calcio) que podría aumentar ligeramente la longitud de algunas hélices. Sin embargo, en la forma truncada Δ14TM-A2h no se aprecia un aumento tan significativo en el porcentaje en α-hélice como ocurría en Δ14-A2h y Δ14TK-A2h, aunque sigue siendo superior al de la proteína intacta (63,2% frente a 61,7% en WT-A2h). Los espectros en el UV próximo ponen de manifiesto que el residuo de Trp213 no se ve afectado por las mutaciones de los tres residuos implicados en la formación de Figura 49. Espectros de dicroísmo circular en el UV lejano y UV próximo de los mutantes TM‐A2h y Δ14TM‐A2h. (a) Espectros de dicroísmo circular en el UV lejano y (b) en el UV próximo registrados en Hepes 10 mM, pH 7,8, EGTA 1 mM y NaCl 0.1 M a 20°C. Cada espectro representado es la media de seis barridos. En la leyenda de (a) se especifica el color de cada espectro y la predicción de contenido en α-hélice de las distintas proteínas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 128 4.5. Caracterización estructural de variantes mutadas de la anexina A2 humana los puentes salinos; el espectro de TM-A2h es prácticamente idéntico al de WT-A2h y el de Δ14TM-A2h al de Δ14-A2h aunque con un mínimo con mayor elipticidad molar (-17.000 deg·cm2·dmol-1) (Figura 49b). Las curvas de desnaturalización térmica de la proteína TM-A2h y de su mutante truncado Δ14TM-A2h muestran, en ausencia de calcio, unos valores de Tm significativamente menores que las proteínas WT-A2h y Δ14-A2h (Figura 50). Este hecho sugiere que la proteína WT-A2h forma dímeros en disolución, incluso en ausencia de calcio, y que la dimerización contribuye a la estabilización estructural de la proteína. La rotura de los puentes salinos que origina la triple mutación impide la dimerización entre los dominios III de las dos moléculas de anexina A2 induciendo una reducción significativa en la temperatura de fusión, tanto en presencia como ausencia de calcio. Así la temperatura de fusión de TM-A2h en ausencia de calcio es de 50,6°C, frente a los 55,1°C que presenta WT-A2h, y en presencia de calcio 64,4°C Figura 50. Curvas de desnaturalización térmica de TM‐A2h y ∆14TK‐A2h. Se muestran las curvas de desnaturalización térmica de las dos proteínas en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) y en presencia de CaCl2 95 mM. A la derecha se representa la variación de la Tm en función de la concentración de calcio y a la máxima concentración de MgCl2. Los datos son el promedio de, al menos, dos determinaciones para cada condición experimental. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 129 frente a 67,5°C. En la variante truncada pasa algo parecido; la eliminación de los 14 residuos estabiliza algo la proteína, pero sigue siendo menor que las variantes truncadas que sí pueden formar dímeros (Tm de 53°C en ausencia de calcio), pero tras la saturación con calcio, esta disminución ya no se aprecia (Tm de 69,0°C). Estos valores de Tm son los más bajos de entre todos los mutantes, lo cual está indicando que la formación de los dímeros laterales en disposición “antiparalela” puede originarse en todas las variantes que posean estos tres residuos, y que la dimerización puede tener lugar tanto en presencia como en ausencia de calcio, contribuyendo a estabilizar las formas solubles de anexina A2. De igual modo que en el resto de las proteínas, se analizó el efecto que la variación en la concentración de calcio ejerce en su estabilidad térmica, observándose claramente la dependencia hiperbólica con la que la saturación con calcio estabiliza a la proteína. Los valores de Tm son más elevados en el mutante ∆14TM-A2h mientras que TM-A2h muestra los valores más bajos de temperatura de desnaturalización, aunque el 50% del efecto se alcanza antes (2,5 mM frente a 7,5 mM en el mutante truncado). A modo de resumen general, se puede concluir que todas las proteínas presentan un correcto plegamiento, lo cual es esencial para llevar a cabo un adecuado análisis comparativo entre ellas y con la anexina A2 intacta. Además, parece confirmarse que la anexina A2 puede formar dímeros “antiparalelos” en disolución, tanto en ausencia como en presencia de calcio. Así, a continuación, se utilizará esta batería de proteínas para proponer modelos de interacción de la anexina A2 con membranas y los posibles mecanismos de inducción de agregación de vesículas. 4.6. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA VARIANTES MUTADAS DE LA ANEXINA A2 HUMANA 4.6.1. Unión a vesículas fosfolipídicas La interacción de todas las proteínas recombinantes con las vesículas de fosfolípidos se ha estudiado replicando las condiciones experimentales que se utilizaron para RESULTADOS Y DISCUSIÓN 130 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana WT-A2h. Se han utilizado distintas concentraciones de NaCl con el fin de poder determinar los efectos que la fuerza iónica ejerce en los procesos de unión a las bicapas fosfolipídicas y sobre la formación de dímeros proteicos por interacciones electrostáticas. Al igual que se describió para WT-A2h, el ensayo de unión a vesículas se lleva a cabo empleando liposomas unilamelares de PS o PC de 400 nm de diámetro promedio, ultracentrifugación y análisis de los sobrenadantes y sedimentos en cantidades equivalentes mediante PAGE-SDS en condiciones reductoras y tinción con azul de Coomassie o Western blot. Se incluyen siempre controles sin vesículas fosfolipídicas y las interacciones se analizan tanto en ausencia (EGTA 1 mM) como en presencia de CaCl2 100 μM. a) Efecto de la eliminación de la hélice anfipática N‐terminal en la unión a vesículas De la misma manera que con la proteína recombinante intacta, se llevó a cabo un estudio preliminar de interacción de Δ14-A2h con vesículas de PS y PC a diferentes concentraciones de CaCl2 y fuerza iónica fisiológica (NaCl 0,1 M), tal y como se muestra en la Tabla 5. Tabla 5. Unión de WT‐ y Δ14‐A2h a vesículas unilamelares grandes (LUV) de PC y PS. Composición de los LUV [Ca2+] (μM) WT‐A2h unida (%) Δ14‐A2h unida (%) PC PS 0 100 0 0,5 30 100 7 ± 2 5 ± 4 51 ± 4 79 ± 9 91 ± 3 100 N.D. 2 ± 1 27 ± 2 68 ± 3 90 ± 3 96 ± 4 Los experimentos en ausencia de calcio se llevan a cabo en presencia de EGTA 1 mM. Los datos representan la media de 3-4 experimentos independientes ±SD. N.D.: no detectado. Como se puede observar, el mutante truncado presenta una nula capacidad de unión a PC, por lo que la débil unión que la proteína intacta presenta con vesículas de PC podría deberse a una débil interacción a través de la hélice anfipática N-terminal. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 131 Por otro lado, la anexina A2 es una de las pocas anexinas descritas con capacidad de unión a bicapas fosfolipídicas ácidas de forma independiente de calcio. En nuestro modelo experimental, la proteína WT-A2h llega a unirse en un 50%, pero cuando se elimina la hélice anfipática N-terminal, esta interacción disminuye a la mitad a una fuerza iónica fisiológica (NaCl 0,1 M). Esto indica que la hélice del extremo N‐ terminal debe estar involucrada de alguna manera en el proceso de unión a fosfolípidos en ausencia de calcio. Sin embargo, debe existir un mecanismo adicional de interacción independiente de calcio dado que la supresión de la hélice no elimina la interacción. También podría deberse a que la compactación del núcleo proteico provocada por la eliminación de parte del extremo N-terminal altere la capacidad de unión por un mecanismo distinto al de la interacción directa de la hélice anfipática con las bicapas. En la Figura 51a se muestran unos geles representativos de la interacción de WT- A2h y Δ14-A2h en ausencia y presencia de CaCl2 100 μM a distintas fuerzas iónicas. Figura 51. Ensayos de unión de WT‐A2h y Δ14‐A2h a vesículas unilamelares PS. (a) La unión de las proteínas a vesículas de 400nm de diámetro se analizó por ultracentrifugación en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) o en presencia de CaCl2 100 μM, y a tres concentraciones de NaCl (0,1, 0,3 y 0,5 M). (S), sobrenadante, (P) precipitado. Se indica el porcentaje de proteína unida del análisis densitométrico para cada una de las condiciones experimentales. (b) Esquema de las posibles interacciones entre Δ14-A2h y las vesículas en ausencia y presencia de calcio. Δ14- A2h se representa en otro color por el ligero cambio conformacional que supone la eliminación de los 14 residuos del extremo N-terminal. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 132 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana La eliminación de la hélice N-terminal afecta sobre todo a la unión independiente de calcio, como ya se mencionó al comentar los datos de la Tabla 5. Además, queda claro que la interacción con las vesículas en presencia de EGTA tiene un elevado carácter electrostático dado que el aumento en la fuerza iónica prácticamente anula la interacción, y esta interacción es muy probable que tenga lugar por la superficie convexa donde se encuentran los residuos de lisina que se proyectan hacia el exterior de la molécula. Además, es posible que, si la proteína no interacciona por la superficie convexa con las vesículas, no se libere el dominio N-terminal para adquirir la denominada “conformación abierta” (que también se adquiere por fosforilación de la Ser26) (Morel y Gruenberg, 2009). Si el extremo N-terminal permanece fuertemente unido al núcleo proteico al elevar la fuerza iónica, no podría tener lugar la interacción entre WT-A2h y las vesículas a través de la hélice anfipática. Por el contrario, a fuerza iónica fisiológica se podría liberar el extremo N- terminal y contribuiría a la unión; por eso la eliminación de la hélice anfipática provoca la disminución de la unión a las vesículas ácidas. Sin embargo, en presencia de calcio solamente se observa una disminución en la unión, en comparación con WT-A2h, a elevada fuerza iónica (NaCl 0,5 M), donde el porcentaje de unión baja de un 85% a tan solo el 39%. Lo que parece claro es que, en presencia de calcio, la unión a las vesículas va a tener lugar en ambas proteínas por la superficie convexa, a través de las coordinaciones mediadas por el ion Ca2+ y las cabezas polares de la PS. Estas interacciones son muy fuertes y no se rompen fácilmente al aumentar la fuerza iónica. Además, la interacción con las vesículas liberaría la extensión N-terminal en la molécula WT-A2h, generando sitios adicionales de unión a bicapas de PS a través de la hélice anfipática. Por este motivo, cuando se elimina esta hélice (Δ14-A2h) la interacción baja, aunque solo sea a fuerza iónica elevada. En cualquier caso, como se comentó con anterioridad, la supresión de los 14 residuos N-terminales supone un ligero cambio conformacional que podría justificar las diferencias en la unión en presencia de calcio a elevada fuerza iónica. El estudio de los ensayos de unión a vesículas empleando los mutantes de lisina y los mutantes donde se impide la dimerización “antiparalela” de las moléculas ayudarán a elucidar los mecanismos de interacción con vesículas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 133 b) Efecto de la eliminación de los residuos de lisina protuberantes de la superficie convexa En el apartado anterior se ha sugerido que la interacción independiente de calcio podría tener lugar preferentemente a través de interacciones entre residuos cargados positivamente en la superficie convexa de la molécula de anexina A2 y las cabezas polares con carga negativa de las vesículas de PS. El análisis de la estructura tridimensional de la anexina reveló la existencia de tres residuos de lisina que se proyectaban claramente hacia el exterior (Lys49, Lys206 y Lys281) y de un cuarto residuo (Lys249) que también podría estarlo. Por eso se decidió obtener los mutantes TK-A2h y 4K-A2h, caracterizados anteriormente, así como una variante de TK-A2h donde se eliminaba la hélice anfipática N-terminal (Δ14TK-A2h). En la Figura 52a se recogen los estudios de unión a vesículas unilamelares de PS de las tres proteínas mencionadas, comparándolas con la de la anexina A2 recombinante no mutada y se proponen unos modelos de interacción (Figura 52b) basados en los resultados. Cuando se analiza la unión independiente de calcio en la proteína TK-A2h se observa una disminución muy acusada del porcentaje de unión a las vesículas de PS (del 51% al 18%) incluso a fuerza iónica fisiológica. La interacción prácticamente desaparece cuando se elimina la hélice anfipática en este mutante de lisinas, y es total en el mutante 4K-A2h. Al aumentar la fuerza iónica todavía se debilita más llegando a ser casi nula. Estos resultados ponen de manifiesto que la anexina A2 puede interaccionar con vesículas ácidas en ausencia de calcio a través de las lisinas que se proyectan desde la superficie convexa de la molécula estableciendo interacciones electrostáticas con las vesículas cargadas negativamente. Estas interacciones se debilitan al aumentar la fuerza iónica al incrementarse las capas de solvatación que rodean a los residuos cargados. No se puede descartar una pequeña contribución de la hélice anfipática N-terminal, pero parece que, si la proteína no interacciona inicialmente mediante la superficie convexa, no se libera la extensión N-terminal y, por lo tanto, la hélice anfipática no podría contribuir a la interacción (como ocurre en el mutante 4K-A2h). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 134 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana Si bien ya se había sugerido que la anexina A2 podía interaccionar con membranas en ausencia de calcio, y que posiblemente algunos residuos de lisina de la superficie cóncava podrían estar implicados en la interacción (Hakobyan y col., 2017), esta es la primera vez que se demuestra que estos residuos de lisina son esenciales dado que su sustitución por residuos de alanina elimina completamente la interacción con las vesículas fosfolipídicas en ausencia de calcio. En presencia de calcio, y a una fuerza iónica fisiológica, TK-A2h, Δ14TK-A2h y 4K-A2h se comportan igual que la WT-A2h, con un 100% de la proteína unida a las Figura 52. Ensayos de unión de WT‐A2h y los mutantes TK‐A2h, Δ14TK‐A2h y 4K‐A2h a vesículas unilamelares PS. (a) La unión de las proteínas a vesículas de 400nm de diámetro se analizó por ultracentrifugación en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) o en presencia de CaCl2 100 μM, y a tres concentraciones de NaCl (0,1, 0,3 y 0,5 M). (S), sobrenadante, (P) precipitado. Se indica el porcentaje de proteína unida del análisis densitométrico para cada una de las condiciones experimentales. (b) Esquema de las posibles interacciones entre la anexina A2 y las vesículas en ausencia y presencia de calcio. Δ14TK-A2h se representa en otro color por el ligero cambio conformacional que supone la eliminación de los 14 residuos del extremo N-terminal. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 135 vesículas. Según va aumentando la concentración de NaCl se observa una disminución en el porcentaje de la proteína unida en los mutantes; esta disminución comienza a apreciarse a una fuerza iónica 0,3M de NaCl, con unos valores de proteína unida del 82% para TK-A2h, 77% para ∆14TK-A2h y 83% para 4K-A2h. Al aumentar a 0,5M la concentración de NaCl, la proteína no mutada disminuye ligeramente el porcentaje de proteína unida, pero esta disminución es muy superior en la variante ∆14TK-A2h, con solo un 18% de proteína unida, al igual que ocurría con las otras variantes truncadas. A la luz de estos resultados, se puede concluir que los residuos de lisina mutados no son estrictamente necesarios para la interacción dependiente de calcio, aunque su sustitución por residuos de alanina hace que la interacción sea algo más sensible al incremento de la fuerza iónica. Además, se vuelve a comprobar que la extensión N- terminal también puede contribuir a estabilizar la interacción dado que la eliminación de la hélice anfipática disminuye la capacidad de interacción a fuerzas iónicas moderadas o elevadas. c) Mutación de los residuos implicados en la dimerización “antiparalela” de la anexina A2 humana Como ya se ha comentado anteriormente, la estructura cristalina de la anexina A2 en presencia de calcio mostraba un dímero unido mediante cuatro puentes salinos entre residuos de los dominios III de cada molécula adoptando una disposición “antiparalela” (ver Figura 40), sugiriendo los autores que, de esta manera, podría unirse a dos membranas de manera simultánea (Rosengarth y Luecke, 2004; Drücker y col., 2013). Sin embargo, no existe ningún estudio que demuestre que este dímero tenga lugar en disolución. Con el fin de comprobar si la dimerización puede influir en la unión a vesículas y, posteriormente, en la capacidad de agregación de las mismas, se obtuvieron los mutantes TM-A2h y Δ14TM-A2h donde mediante tres mutaciones de los residuos implicados en los puentes salinos se bloquearía la posible dimerización de la molécula de anexina A2. En la Figura 53 se muestra un ensayo representativo de unión a vesículas unilamelares de PS en ausencia y presencia de calcio y a distintas fuerzas iónicas en las mismas condiciones que se ha descrito para los ensayos con el resto de las RESULTADOS Y DISCUSIÓN 136 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana variantes de la anexina A2 (se vuelve a mostrar con fines comparativos el ensayo de unión de WT-A2h). El comportamiento que muestra la variante TM-A2h en los ensayos de unión en ausencia de calcio y fuerza iónica fisiológica (NaCl 0,1 M) al compararlo con WT-A2h es prácticamente idéntico. Sin embargo, cuando se aumenta la fuerza iónica, la unión de la proteína TM-A2h, que no puede formar dímeros, se afecta en mucha menor escala que la proteína WT-A2h (teóricamente dimérica). De hecho, incluso a una concentración de NaCl 0,5 M, donde WT-A2h prácticamente no se une a las vesículas, TM-A2h mantiene un 20% de interacción. Este resultado parece confirmar que, en disolución, la anexina A2 puede formar este tipo de dímeros, incluso en ausencia de calcio. El mutante truncado no dimérico (Δ14TM-A2h) muestra, por el contrario, un comportamiento casi idéntico a Δ14-A2h en ausencia de calcio. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en ausencia de calcio, es muy posible que, en la forma no dimérica de la anexina A2 (TM-A2h), la contribución de la hélice anfipática Figura 53. Ensayos de unión de WT‐A2h y los mutantes TM‐A2h y Δ14TM‐A2h a vesículas unilamelares PS. La unión de las proteínas a vesículas de 400nm de diámetro se analizó por ultracentrifugación en ausencia de calcio (EGTA 1 mM) o en presencia de CaCl2 100 μM, y a tres concentraciones de NaCl (0,1, 0,3 y 0,5 M). (S), sobrenadante, (P) precipitado. Se indica el porcentaje de proteína unida del análisis densitométrico para cada una de las condiciones experimentales. Δ14TM-A2h se representa en otro color por el ligero cambio conformacional que supone la eliminación de los 14 residuos del extremo N-terminal. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 137 N-terminal tenga mayor importancia en la unión independiente de calcio a las vesículas. Por ello, se mantiene el 20% de interacción incluso cuando las interacciones electrostáticas entre los residuos de lisina y las cabezas polares de la PS se debilitan, favoreciéndose la interacción de la hélice anfipática N-terminal con las bicapas. La forma dimérica podría tener una interacción más fuerte con la extensión N-terminal, impidiendo o dificultando su liberación de núcleo proteico y, por tanto, la aparición del segundo sitio de interacción con membranas. En presencia de CaCl2 100 µM la interacción es prácticamente total, al igual que sucede con WT-A2h (porcentajes de unión del 100% para una concentración 0,1 y 0,3 M de NaCl), y solo baja ligeramente, aproximadamente un 20%, al elevar la concentración de NaCl hasta 0,5 M. En estas condiciones, el mutante TM-A2h se comporta igual que la proteína no modificada, por lo que el estado de dimerización no parece influir en la unión dependiente de calcio. Cuando se elimina la hélice anfipática de TM-A2h generando Δ14TM-A2h, se observa un comportamiento también casi idéntico a WT-A2h y TM-A2h. A diferencia de los otros mutantes truncados (Δ14-A2h y Δ14Tk-A2h), a elevada fuerza iónica mantiene un porcentaje de unión muy elevado (del 85%). 4.6.2. Agregación a vesículas fosfolipídicas Se han llevado a cabo ensayos de agregación de vesículas con las distintas variantes mutadas de la anexina A2 en las mismas condiciones que se emplearon para la proteína no modificada. Esto permite analizar la influencia de las distintas regiones modificadas en una de las funciones esenciales de la anexina A2, la agregación de membranas. Al igual que con la proteína WT-A2h, los ensayos se han llevado a cabo empleando vesículas unilamelares de PS de 100 nm de diámetro promedio a una concentración 0,1 mg/ml (aprox. 120 μM), en ausencia y presencia de calcio y a fuerza iónica fisiológica o incrementada a una concentración de NaCl 0,3 M (a mayor fuerza iónica, la unión es muy baja y, por lo tanto, no se esperaba una agregación apreciable). En las condiciones en las que se realizan los ensayos de agregación, nunca se detectó autoagregación de las vesículas de PS en ausencia de proteína. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 138 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana a) Agregación inducida por la anexina A2 truncada Δ14‐A2h Las curvas de agregación inducidas por la proteína truncada y la representación de los valores de V0 aparente y ΔA320 a los 10 minutos están recogidos en la Figura 54. Lo primero que llama la atención es que, en ausencia de calcio, la proteína ∆14‐A2h no induce agregación de las vesículas, ni siquiera a la máxima concentración de proteína (8 μM). Este hecho es muy significativo, porque pone de relieve la importancia que tiene la hélice anfipática N-terminal en la inducción del proceso de agregación de vesículas. Se requiere que la proteína se una a través de Figura 54. Curvas de agregación de vesículas unilamelares de PS inducidas por Δ14‐A2h. La agregación de vesículas se registró monitorizando la variación de la absorción a 320 nm tras la adición de las vesículas a mezclas de las proteínas recombinantes a distintas concentraciones y condiciones experimentales. (a) Agregación en presencia de CaCl2 100 µM y NaCl 0,1 M. (b) Agregación en presencia de CaCl2 100 µM y NaCl 0,3 M. (c) Resumen de los datos obtenidos de velocidad inicial aparente en las distintas condiciones ensayadas. (d) Resumen de los datos obtenidos de incremento de absorción final a 320 nm. Los datos de las gráficas c y d se corresponden a la media de, al menos, dos experimentos independientes. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 139 los residuos de lisina de la superficie convexa, y esta unión debe liberar el extremo N-terminal, que se uniría a la otra vesícula (agregación a través de una sola capa de proteína; Figura 32a) o bien sería responsable de la dimerización de moléculas en vesículas distintas (Figura 32b). Si se tienen en cuenta los datos de unión a vesículas, parece más probable la primera hipótesis dado que la eliminación de la hélice N-terminal supone una disminución muy apreciable de la unión. En presencia de calcio, y a semejanza de WT-A2h, la anexina truncada induce agregación de vesículas de PS incluso a baja concentración de proteína. La eliminación de la hélice anfipática solo induce una disminución de la velocidad inicial aparente a bajas concentraciones de proteína, pero que son mucho menores al aumentar la concentración (Figuras 31d y 54b). Nuestros resultados podrían parecer opuestos a los descritos por Zibouche y colaboradores (Zibouche y col., 2008), que describen que la eliminación del extremo N-terminal prácticamente impedía la agregación de vesículas; pero se debe tener en cuenta que en esos experimentos no se eliminaba solamente la hélice anfipática sino todo el extremo N-terminal, lo que podría estar causando importantes alteraciones en la estructura global de la proteína, aspecto no analizado por esos autores. El aumento en la fuerza iónica por elevación de la concentración de NaCl hasta 0,3 M también supone un aumento en la capacidad de agregación, lo que refuerza la hipótesis de la importancia de las interacciones hidrofóbicas entre las superficies cóncavas de moléculas de anexina en vesículas distintas, como ya se propuso al analizar la agregación inducida por la proteína WT-A2h (Figura 32b). b) Agregación inducida por los mutantes de lisina Los estudios de agregación se continuaron con los mutantes que carecían de las tres lisinas protuberantes de la cara convexa de la proteína (TK-A2h) y su variante truncada (∆14TK-A2h). Los ensayos se realizaron en idénticas condiciones experimentales y los resultados se recogen en la Figura 55. En estos mutantes, y como cabía esperar, en ausencia de calcio no se induce agregación de vesículas dado que prácticamente no se unen a ellas en estas condiciones experimentales (Figura 52). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 140 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana Al analizar los parámetros de agregación en presencia de calcio a una concentración de NaCl 0,1M se puede observar que la sustitución de los tres residuos de lisina por alanina induce una disminución importante en la velocidad inicial aparente de agregación comparada con WT-A2h (Figura 31d). El incremento en la fuerza iónica induce una mejora en el proceso de agregación tanto en la velocidad inicial aparente como en el ΔA320 a los 10 minutos, pero sigue siendo muy inferior a los obtenidos Figura 55. Curvas de agregación de vesículas unilamelares de PS inducidas por TK‐A2h y Δ14TK‐A2h. La agregación de vesículas se registró monitorizando la variación de la absorción a 320 nm tras la adición de las vesículas a mezclas de las proteínas recombinantes a distintas concentraciones y condiciones experimentales. (a) Agregación inducida por TK-A2h en presencia de CaCl2 100 µM y NaCl 0,1 (negro) y 0,3 M (rojo). (b) Agregación inducida por Δ14TK-A2h en presencia de CaCl2 100 µM y NaCl 0,1 M. (c) Resumen de los datos obtenidos de V0 aparente en las distintas condiciones ensayadas. (d) Resumen de los datos obtenidos de ΔA320 final. Los datos de las gráficas c y d se corresponden a la media de, al menos, dos experimentos independientes. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 141 con WT-A2h. De acuerdo con estos datos, parece que los residuos de lisina aceleran la unión a las vesículas en presencia de calcio, y aunque no puedan ser considerados esenciales, sí que contribuyen cinéticamente en el proceso de agregación. Sorprendentemente, al eliminar la hélice anfipática N-terminal en esta proteína (∆14TK-A2h), la velocidad inicial aparente de agregación y el ΔA320 final se recuperan, obteniéndose valores parecidos incluso al de WT-A2h y superiores a Δ14-A2h. De alguna manera, la eliminación de los tres residuos de lisina debe inducir algún cambio conformacional que hace que la hélice N-terminal interfiera con la dimerización de las proteínas por las superficies cóncavas, de forma que, al eliminar esta región las interacciones pueden tener lugar de forma más favorable. c) Agregación inducida por los mutantes con la dimerización “antiparalela” impedida Los mutantes en los que se ha impedido la dimerización “antiparalela”, TM-A2h y Δ14TM-A2h, son las variantes de la anexina A2 que inducen de forma más rápida (mayores valores de V0 ap.) el proceso de agregación, tanto en ausencia como en presencia de calcio, como se puede deducir del análisis de las curvas de agregación, no existiendo tanta diferencia en el ΔA320 a los 10 minutos (Figura 56). En ausencia de calcio, esta variante de anexina no dimérica no solo presenta una capacidad de agregación de vesículas de PS mayor que la anexina A2 dimérica, sino que también es menos sensible al incremento en la fuerza iónica (curvas rojas en la Figura 56a). Estos resultados estarían de acuerdo con los datos de unión a las vesículas, donde se observaba también un mayor porcentaje de unión en la proteína TM-A2h frente a WT-A2h a concentraciones de NaCl 0,3 y 0,5 M. En cuanto al mutante Δ14TM-A2h, en ausencia de calcio no mostró capacidad de agregación de vesículas ácidas, resultado lógico teniendo en cuenta la baja capacidad de unión que presenta esta proteína a las vesículas, y la ausencia de la hélice anfipática, que parece ser la responsable de la aparición del segundo sitio de unión a membranas en la anexina A2 (ninguno de los mutantes truncados de la anexina A2 presenta capacidad de agregación de vesículas en ausencia de calcio). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 142 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana En los experimentos realizados en presencia de CaCl2 100 μM y NaCl 0,1 M y 0,3 M (Figura 56b), puede apreciarse que la variante no dimérica de la anexina A2 no solo induce agregación de las vesículas ácidas, sino que lo hace con una mayor velocidad inicial aparente que la proteína no modificada WT-A2h (que puede formar dímeros “antiparalelos”). Se repite que, al aumentar la fuerza iónica, el proceso de agregación se acelera y se alcanzan agregados de mayor tamaño o con mayor ΔA320 final. Estos Figura 56. Curvas de agregación de vesículas unilamelares de PS inducidas por TM‐A2h y Δ14TM‐A2h. La agregación de vesículas se registró monitorizando la variación de la absorción a 320 nm tras la adición de las vesículas a mezclas de las proteínas recombinantes a distintas concentraciones y condiciones experimentales. (a) Agregación en ausencia de calcio (EGTA 5mM) y NaCl 0,1 M inducida por TM-A2h. En rojo se muestran las curvas a una concentración de 8 µM de proteína y NaCl 0,3 y 0,5 M. (b) Agregación en presencia de CaCl2 100 µM y NaCl 0,1 M (negro) y 0,3 M (rojo) inducida por TM-A2h. (c) Agregación en presencia de CaCl2 100 µM y NaCl 0,1 M inducida por Δ14TM-A2h. (d) Resumen de los datos obtenidos de V0 aparente en las distintas condiciones ensayadas. (e) Resumen de los datos obtenidos de ΔA320 final nm. Los datos de las gráficas d y e se corresponden a la media de, al menos, dos experimentos independientes. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 143 resultados vuelven a confirmar que deben existir fuerzas de naturaleza hidrofóbica, posiblemente entre las superficies cóncavas de moléculas de anexina unidas a vesículas distintas, que inducen el proceso de agregación estableciendo puentes proteicos diméricos (distintos de los dímeros laterales “antiparalelos”). Por lo tanto, la existencia de dímeros “antiparalelos”, como ocurre en la anexina A2 no modificada, dificulta (pero no impide) el proceso de agregación tanto en ausencia como en presencia de calcio. En cierto sentido, la existencia de los dímeros laterales “antiparalelos” actuaría como un mecanismo regulatorio que atenuaría la agregación de vesículas mediada por la anexina A2. Cuando se elimina la hélice anfipática en la anexina monomérica TM-A2h generando Δ14TM-A2h se observa que, aunque no induce agregación en ausencia de calcio, en presencia de CaCl2 100 μM y fuerza iónica fisiológica, el proceso de agregación tiene lugar más rápidamente y alcanzándose valores de ΔA320 final mayores que con la proteína no truncada (Figura 56c). El resultado va en el mismo sentido que lo observado con el mutante truncado Δ14-A2h y Δ14TK-A2h, que agregan vesículas más eficientemente que sus correspondientes proteínas no truncadas. Esto sugiere que el establecimiento de puentes proteicos diméricos entre las vesículas, mediante interacciones de tipo hidrofóbico mayoritariamente, está desfavorecido por la presencia de la hélice anfipática en esta región o por la mayor movilidad conformacional que pueda tener el extremo N-terminal intacto. d) Resumen de los procesos de agregación anexina‐vesículas de PS La anexina A2 no modificada (WT-A2h) induce la agregación de vesículas PS en presencia de CaCl2 100 μM y NaCl 0,1 M incluso a baja concentración de proteína (Figura 57a, círculos negros). Tanto la velocidad inicial aparente (V0 ap.) como la ΔA320 final muestran un patrón sigmoideo con la concentración de proteína que podría corresponder a la inducción de este proceso a través de diferentes mecanismos a alta o baja concentración de proteína. No se detecta disminución de la V0 aparente a altas concentraciones de proteína, lo que sugiere fuertemente que, al menos en estas condiciones, la agregación de vesículas implica la formación de puentes diméricos de proteína entre vesículas. La agregación de vesículas inducida por TM-A2h (Figura 57a, cuadrados rojos) presenta mayores valores de V0 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 144 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana aparente y ΔA320 final que WT-hA2, principalmente a bajas concentraciones de proteína (p<0,01). También se consigue una mayor agregación (V0 ap. y ΔA320) cuando se suprime la α-hélice anfipática N-terminal (Δ14-A2h; Figura 57a, Figura 57. Resumen de los procesos de agregación de vesículas de PS por la anexina A2 humana y sus variantes mutadas. (a) Representación en escala semilogarítmica de los procesos de agregación de vesículas de PS de 100 nm de diámetro promedio; en los paneles superiores se muestran los valores de V0 aparente y en los inferiores, ΔA320 final. La agregación se siguió monitorizando continuamente la absorbancia a 320 nm en una cubeta termostatizada a 25°C. Los experimentos de agregación se realizaron con 2 preparaciones diferentes de cada proteína recombinante y se repitieron al menos dos veces. Los datos representan valores medios; la desviación estándar siempre estuvo en torno o por debajo del 10% (no se muestra). (b) Curvas de agregación inducidas por las proteínas WT- hA2 y TM-hA2 a una concentración 8 μM en presencia de EGTA y tres concentraciones diferentes de NaCl (se muestran curvas representativas). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 145 triángulos morados; p<0,01). Por el contrario, la sustitución de los tres residuos de Lys que sobresalen por Ala (TK-A2h; Figura 57a, rombos azules) induce una fuerte disminución en la cinética de agregación (p<0,01), aunque no en los valores finales de ΔA320, que son bastante similares a los obtenidos con WT-A2h. Esto indica que estos residuos de Lys aceleran la unión de la anexina A2 a vesículas en presencia de calcio, pero no son esenciales para la agregación dependiente de calcio. Un aumento moderado de la fuerza iónica (NaCl 0,3 M) induce un aumento altamente significativo de los valores finales de absorción (p<0,01), aunque solo un ligero aumento de la cinética de agregación (Figura 57a, paneles intermedios). El aumento de la capacidad de agregación a mayor concentración de NaCl sugiere que intervienen fuerzas de atracción no electrostáticas, probablemente a través de la formación de dímeros de proteínas (de acuerdo con los datos de la cinética a alta concentración de proteínas). Pero estos dímeros deben ser diferentes de los laterales "antiparalelos" descritos por Rosengarth y Luecke (Rosengarth y Luecke, 2004), ya que el mutante en el que estos puentes salinos están bloqueados (TM-A2h; cuadrados rojos) es el que presenta una mayor capacidad de agregación. Además, el aumento de la concentración de NaCl puede debilitar los puentes salinos laterales entre los residuos situados en los dominios III, favoreciendo la formación de dímeros entre las regiones cóncavas hidrofóbicas más propensos a la agregación, como también sugirieron Ecsédi y colaboradores (Ecsédi y col., 2017). La eliminación de la α-hélice N-terminal también favorece la agregación; en este caso, se podría especular que esta eliminación puede facilitar el establecimiento de dímeros a través de las regiones cóncavas de moléculas de anexina opuestas en vesículas diferentes. La agregación también puede tener lugar en ausencia de calcio, pero solo se detecta para las proteínas WT-A2h y TM-A2h, que mantienen los residuos de lisina que se proyectan desde la superficie convexa, y no se observa nunca en las proteínas con la hélice N-terminal truncada (Figura 57a, paneles derechos). Sin embargo, ambas proteínas presentan valores aparentes de V0 aparente y ΔA320 inferiores en comparación con la agregación dependiente de calcio (p<0,01). En estas condiciones, la unión a vesículas de PS fue inferior al 50%, lo que podría justificar la agregación alterada. Curiosamente, la proteína TM-A2h muestra valores de V0 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 146 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana aparente mucho más altos que WT-A2h (p<0,01), mientras que las diferencias no fueron tan grandes en la ΔA320 final (p<0,05). En ausencia de calcio, la unión a vesículas de PS depende principalmente de los residuos cargados positivamente en el lado convexo de la molécula de anexina y, en menor medida, de interacciones potenciales a través de la α-hélice N-terminal. De hecho, al aumentar la concentración de NaCl, la agregación se ve fuertemente perjudicada (Figura 57b) debido al debilitamiento de las interacciones electrostáticas anexina-PS a través de los residuos de lisina y la consiguiente disminución de la unión de la proteína a las vesículas. 4.6.3. Análisis de entrecruzamiento en ausencia y presencia de vesículas Se realizaron ensayos de entrecruzamiento para comprobar si la agregación de vesículas inducida por la anexina A2 pudiera estar mediada a través de un proceso de dimerización entre moléculas de proteína, que se unen a distintas vesículas o, por el contrario, conocer si la agregación se trata de un mecanismo que está inducido por una única molécula de anexina que se une a las membranas de las vesículas a través de dos lugares distintos. Los protocolos experimentales utilizados están detallados en el apartado Materiales y Métodos, el agente de entrecruzamiento de residuos de lisina utilizado fue el BS3 [bis(sulfosuccinimidil)suberato], y se utilizaron unas condiciones experimentales muy similares a las de los anteriores estudios; presencia y ausencia de calcio, y diferentes concentraciones de NaCl. Todos los ensayos fueron llevados a cabo tanto en presencia como en ausencia de vesículas de PS. La relación molar PS/proteína con la que se ha trabajado, fue elevada (1000/1) para evitar en la medida de lo posible asociaciones laterales que se pudieran producir entre moléculas de anexina unidas en una misma vesícula. Los ensayos de entrecruzamiento se realizaron con todas las variantes de la proteína recombinante que se han estado utilizando en este trabajo. Se analizan las proteínas que se han unido a las vesículas de PS en los sedimentos que aparecen tras la centrifugación de las distintas preparaciones. Por ello, cuando la unión es prácticamente inexistente no es posible observar ni siquiera las formas monoméricas de las proteínas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 147 Cuando se analiza el entrecruzamiento de la proteína WT-A2h en disolución en ausencia de PS (Figura 58; izquierda), se detecta la formación de dímeros y de algunos agregados de elevada masa molecular tanto en presencia como en ausencia de calcio, y la dimerización no parece aumentar con la fuerza iónica. Estos dímeros no son debidos a la oxidación de las cisteínas libres dado que los geles se corren en condiciones fuertemente reductoras y, además, en los controles sin BS3 no aparecen dímeros. Figura 58. Análisis de entrecruzamiento de las proteínas WT‐A2h y ∆14‐A2h en disolución y tras la interacción con vesículas unilamelares de PS. El entrecruzamiento de las proteínas recombinantes se llevó a cabo a una relación molar fosfolípido/proteína de 1000/1 en ausencia (EGTA 1 mM) o presencia de CaCl2 100 μM y a tres concentraciones diferentes de NaCl (0,1, 0,3 y 0,5 M; triángulo) utilizando BS3; tras detener la reacción de entrecruzamiento, las muestras se centrifugaron y las proteínas unidas a las vesículas se analizaron mediante Western blot (pocillos PS). Los controles en ausencia de vesículas de PS también se entrecruzaron (carriles "Sin PS"); en estos casos, el entrecruzamiento se evaluó directamente en alícuotas sin centrifugación. (C) Controles de proteína en disolución sin BS3. La movilidad de los patrones de masa molecular se muestra a la derecha en kDa. Los experimentos de entrecruzamiento se realizaron al menos dos veces con 2 preparaciones diferentes de proteínas recombinantes; los geles corresponden a experimentos representativos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 148 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana El análisis de la anexina A2 unida a las vesículas de PS en presencia de calcio muestra un incremento significativo de dímeros de la proteína, sobre todo a la concentración de NaCl 0,3 M, que eran las condiciones en las que se promovía de forma más acusada la agregación de vesículas de PS. No se detectan dímeros en ausencia de calcio en el material asociado a las vesículas a pesar de que a una concentración de NaCl 0,1 M sí que se detectaba agregación. Estos resultados parecen confirmar que la agregación en presencia de calcio es debida a la formación de dímeros entre las superficies cóncavas de las moléculas de anexina en vesículas opuestas, mientras que en ausencia de calcio la agregación podría deberse a la unión de vesículas por una sola molécula unida a una vesícula por la interacción electrostática entre las lisinas y las cabezas polares de la PS, y a la otra por la hélice anfipática N-terminal, como también han sugerido otros autores para la anexina A2 (Zibouche y col., 2008; Grill y col., 2018) e incluso para la anexina A1 (Donohue y col., 2014), y concordaría con estudios de criomicroscopía electrónica donde se observan uniones de membrana inducidas por una sola capa de anexina A2 monomérica a pH ligeramente ácido, como el que se observa en la proximidad de membranas ricas en PS (Lambert y col., 2004). A diferencia de la anexina A2 sin modificar, la variante Δ14-A2h que carece de la hélice anfipática no presenta dímeros en disolución en ninguna de las condiciones experimentales (Figura 58, derecha). Sin embargo, cuando interacciona con vesículas de PS en presencia de calcio, la presencia de dímeros es muy evidente, sobre todo a una concentración de NaCl 0,3 M, confirmando la relación entre dimerización y agregación de vesículas por este mecanismo en presencia de calcio. A la mayor concentración de NaCl, la unión a las vesículas comienza a decaer, por lo que es lógico que disminuya la cantidad de proteína detectada y los dímeros formados. La eliminación de la α-hélice anfipática N-terminal impide completamente el entrecruzamiento de las moléculas de anexina por BS3. Por lo tanto, los dímeros detectados en WT-A2h en disolución dependen probablemente de interacciones de esta hélice con su homóloga en otro monómero de anexina o con una región diferente de la molécula opuesta. Además, los dímeros laterales "antiparalelos" no se detectan en estas condiciones experimentales, ya que no están presentes en los RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 149 experimentos de entrecruzamiento en Δ14-hA2 en los que estas interacciones laterales son teóricamente posibles. Los ensayos de entrecruzamiento también se han llevado a cabo con la variante de la anexina A2 en la que no se pueden formar los dímeros “antiparalelos” (TM-A2h) así como con la proteína con las lisinas protuberantes sustituidas por alanina (TK-A2h) (Figura 59). En la proteína TM-A2h en disolución (sin vesículas de PS), que no puede dimerizar lateralmente, se observa la presencia de dímeros tanto en ausencia como en Figura 59. Análisis de entrecruzamiento de las proteínas TM‐A2h y TK‐A2h en disolución y tras la interacción con vesículas unilamelares de PS. El entrecruzamiento de las proteínas recombinantes se llevó a cabo a una relación molar fosfolípido/proteína de 1000/1 en ausencia (EGTA 1 mM) o presencia de CaCl2 100 μM y a tres concentraciones diferentes de NaCl (0,1, 0,3 y 0,5 M; triángulo) utilizando BS3; tras detener la reacción de entrecruzamiento, las muestras se centrifugaron y las proteínas unidas a las vesículas se analizaron mediante Western blot (pocillos PS). Los controles en ausencia de vesículas de PS también se entrecruzaron (carriles "Sin PS"); en estos casos, el entrecruzamiento se evaluó directamente en alícuotas sin centrifugación. (C) Controles de proteína en disolución sin BS3. La movilidad de los patrones de masa molecular se muestra a la derecha en kDa. Los experimentos de entrecruzamiento se realizaron al menos dos veces con 2 preparaciones diferentes de proteínas recombinantes; los geles corresponden a experimentos representativos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 150 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana presencia de calcio (Figura 59, izquierda). Además, el contenido en dímeros aumenta al pasar de una concentración de NaCl 0,1 M a 0,3 M en presencia de calcio. Al analizar la proteína unida a las vesículas en presencia de calcio se detecta un incremento todavía mucho mayor en la presencia de dímeros en concordancia con una mayor capacidad de agregación de vesículas. En ausencia de calcio, la proteína unida a las vesículas es bastante inferior, pero aun así se detecta la presencia de dímeros, por lo que esta proteína monomérica podría inducir la agregación independiente de calcio tanto vía monómeros como mediante la formación de dímeros por las superficies cóncavas (que ya estarían preformados antes de interaccionar con las vesículas). En lo que respecta al mutante de lisinas TK-A2h, su comportamiento en cuanto al entrecruzamiento en disolución, tanto en presencia como en ausencia de calcio, es muy similar al de la proteína no modificada WT-A2h, apareciendo dímeros en ambas condiciones, aunque en mayor proporción en ausencia de calcio (Figura 59, derecha). La sustitución de lisinas por alaninas en la superficie convexa solo afecta a la unión independiente de calcio, hecho que queda claramente reflejado en la desaparición de la proteína en el material sedimentado con las vesículas de PS en ausencia de calcio. En el análisis de las variantes truncadas ∆14TM-A2h y ∆14TK-A2h, es posible observar algunas diferencias al compararlas con el resto de las proteínas analizadas, aunque estas diferencias no son notables (Figura 60). Cuando se analiza el entrecruzamiento tras la interacción con las vesículas de PS, en ausencia de calcio, y como cabía esperar, prácticamente no se ve proteína debido a que no se une a las vesículas. Sin embargo, en presencia de calcio, y de forma análoga a lo observado en Δ14-A2h, se aprecia una formación de dímeros acusada tanto a una concentración de NaCl 0,1 como a 0,3 M, volviendo a confirmar la posibilidad de que la agregación sea debida a la formación de estos dímeros a través de las caras cóncavas de las proteínas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana 151 Por último, nuestros resultados señalan que la dimerización lateral "antiparalela" descrita para WT-A2h (y potencialmente presente en Δ14-A2h, TK-A2h y Δ14Tk- A2h) no facilita la agregación de membrana. Al contrario, parece actuar como un mecanismo regulador que amortigua este proceso, ya que los mutantes TM-A2h y Δ14TM-A2h, que carecen de estas interacciones, tienen una mayor capacidad para formar dímeros y agregar vesículas (Figuras 59 y 60). En cualquier caso, esta dimerización lateral puede tener un papel diferente en la inducción de estados multiméricos implicados en las complejas funciones de la anexina A2. Figura 60. Análisis de entrecruzamiento de las proteínas Δ14TM‐A2h y Δ14TK‐A2h en disolución y tras la interacción con vesículas unilamelares de PS. El entrecruzamiento de las proteínas recombinantes se llevó a cabo a una relación molar fosfolípido/proteína de 1000/1 en ausencia (EGTA 1 mM) o presencia de CaCl2 100 μM y a tres concentraciones diferentes de NaCl (0,1, 0,3 y 0,5 M; triángulo) utilizando BS3; tras detener la reacción de entrecruzamiento, las muestras se centrifugaron y las proteínas unidas a las vesículas se analizaron mediante Western blot (pocillos PS). Los controles en ausencia de vesículas de PS también se entrecruzaron (carriles "Sin PS"); en estos casos, el entrecruzamiento se evaluó directamente en alícuotas sin centrifugación. (C) Controles de proteína en disolución sin BS3. La movilidad de los patrones de masa molecular se muestra a la derecha en kDa. Los experimentos de entrecruzamiento se realizaron al menos dos veces con 2 preparaciones diferentes de proteínas recombinantes; los geles corresponden a experimentos representativos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 152 4.6. Caracterización funcional de variantes mutadas de la anexina A2 humana ¿Son los dímeros en ausencia de membranas fosfolipídicas idénticos a los detectados tras la interacción con membranas? Nuestros resultados sugieren que son diferentes, ya que la eliminación de la α-hélice anfipática en ausencia de vesículas conlleva la desaparición de los dímeros entrecruzados. Por otra parte, los dímeros vuelven a observarse en Δ14-A2h en presencia de vesículas y calcio, condiciones que inducen la agregación vesicular. Varios autores han propuesto que la anexina A2 adopta conformaciones diferentes en solución (conformación cerrada) y tras su unión a membranas (conformación abierta), en contraste con la anexina A1, en la que la unión a calcio es suficiente para inducir la conformación abierta (Ecsédi y col., 2017; Grill y col., 2018). Así, los dímeros formados en ausencia de membranas requieren un extremo N-terminal intacto en la conformación cerrada, donde esta región interactúa con la superficie cóncava del núcleo de la proteína, aunque se desconoce su estructura concreta (Figura 61a). La dimerización en estas condiciones requiere probablemente la interacción entre las α-hélices anfipáticas N- terminales de moléculas de anexina opuestas o, quizás más probable, entre las superficies cóncavas. Además, pueden tener lugar interacciones laterales "antiparalelas" (aunque no hemos podido observarlas tras el entrecruzamiento con BS3 posiblemente debido a la ausencia de residuos de lisina próximos en la interfase entre los dominios III de los dímeros “antiparalelos”), así como agregados de mayor tamaño (Figura 61a). Cuando la anexina A2 interactúa con membranas, se produce un cambio conformacional hacia una conformación "abierta". Como sugieren Ecsédi y colaboradores (Ecsédi y col., 2017), el dominio N-terminal bajo esta conformación tiene una mayor movilidad y permitiría la interacción entre las superficies cóncavas de dos moléculas de anexina en un patrón similar al que se produce tras la fosforilación del residuo de serina 26 (Figura 61b). La existencia de dímeros laterales probablemente retrasa o dificulta este cambio conformacional, ya que la agregación de vesículas desencadenada por el mutante que carece de las interacciones laterales muestra una velocidad inicial aparente mayor que la anexina A2 no modificada. Además, la eliminación de los primeros 14 residuos probablemente facilita la adquisición de la conformación abierta, teniendo en cuenta que el mutante Δ14-A2h induce la agregación vesicular a concentraciones de proteína muy inferiores a las de WT-A2h y con valores de V0 aparente superiores. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.7. Observaciones finales 153 4.7. OBSERVACIONES FINALES Aunque muchos estudios se centran en el papel fisiológico y patológico del heterotetrámero de anexina A2 con S100A10 (p11), la anexina A2 monomérica también desempeña papeles importantes en diferentes tipos de células, estando implicada principalmente en el tráfico de vesículas intracelulares como la exocitosis (Gabel y Chasserot-Golaz, 2016) o en el transporte, agregación y fusión endosomal (Morel y Gruenberg, 2007). En este trabajo hemos diseñado variantes mutantes de la anexina A2 humana para aumentar el conocimiento sobre los mecanismos moleculares implicados en la agregación de vesículas mediada por anexina A2 en condiciones experimentales que se asemejan a diferentes microambientes celulares. Figura 61. Modelos propuestos para la agregación de vesículas inducida por la anexina A2. (a) Posibles estados de oligomerización de la estructura “cerrada” de la anexina A2 en disolución en ausencia de membranas. (b) Esquema de los diferentes posibles mecanismos de agregación de vesículas inducida por la anexina A2 en su conformación “abierta” en ausencia de calcio (EGTA) y en presencia de calcio intra o extracelular. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 154 4.7. Observaciones finales En ausencia de vesículas de PS, la anexina A2 adopta una conformación cerrada en la que el extremo N-terminal parece interactuar fuertemente con la superficie cóncava de la molécula o con el propio núcleo proteico(Ecsédi y col., 2017). En estas condiciones, la anexina A2 debe presentar un equilibrio entre monómeros y dímeros (formados por la interacción entre las α-hélices N-terminales o mediante la formación de los llamados dímeros "antiparalelos"), probablemente junto con agregados moleculares superiores (Figura 61a). Tras la unión a membranas dependiente de calcio, se produce un cambio conformacional hacia una conformación abierta en la que el extremo N-terminal presenta mayor movilidad y puede permitir la interacción entre las superficies cóncavas de dos moléculas de anexina A2 dando lugar a la agregación de vesículas (Figura 61b, derecha). Proponemos que la existencia de dímeros "antiparalelos" podría actuar como mecanismo regulador para atenuar la agregación de membranas mediada por anexina A2. En cualquier caso, la agregación monomérica no puede descartarse por completo, principalmente a bajas concentraciones de proteína. En ausencia de calcio, la agregación de vesículas ácidas parece depender de que los monómeros de anexina A2 actúen como puente entre dos membranas opuestas en lugar de dímeros. La superficie convexa interactúa con una de las membranas cargadas negativamente a través de los residuos de Lys protuberantes, y la α-hélice anfipática N-terminal con la otra (Figura 61b, izquierda). Por otro lado, la agregación dependiente de calcio probablemente implica la formación de dímeros de anexina A2 a través de sus superficies cóncavas no cargadas sin aparente implicación significativa de la α-hélice N-terminal (Figura 61b, derecha), aunque no puede descartarse que la agregación también pueda ser desencadenada por monómeros de anexina (Figura 61b, centro). Estos resultados estarían de acuerdo con los experimentos de criomicroscopía electrónica llevados a cabo por Lambert y colaboradores (Lambert y col., 2004) a pH neutro en presencia de calcio utilizando gránulos cromafines así como liposomas artificiales, donde detectaron anexina A2 entre dos membranas principalmente formando una doble capa proteica, pero también aunque menos frecuentemente, como una única capa. 5. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 5. Conclusiones 157 5. CONCLUSIONES Como se ha comentado al final del apartado de Resultados y Discusión, son abundantes los estudios acerca de la funcionalidad del heterotetrámero de anexina A2 con la proteína S100A10, pero los estudios acerca de la funcionalidad de la proteína monomérica son todavía muy escasos a pesar de que la anexina A2, sobre todo en el entorno intracelular, puede encontrarse en esta forma. Por este motivo se planteó su clonación y la obtención de variantes mutadas para diseccionar los residuos o dominios que pudieran estar relacionados con una de sus principales funciones, la interacción con membranas biológicas y su capacidad para unirlas y, en su caso, fusionarlas. Las principales conclusiones que se pueden resaltar de los estudios realizados son: I. Anexina A2 sin modificar 1. Se ha conseguido la clonación, expresión en bacterias y purificación de la anexina A2 humana recombinante con un elevado rendimiento. 2. Se ha caracterizado de forma exhaustiva la estructura de la anexina A2 humana en disolución detectándose cambios conformacionales relevantes tras la unión de calcio por la proteína que van acompañados de una elevada estabilización estructural. 3. Empleando un sistema modelo de vesículas unilamelares de PS, se ha verificado por primera vez la capacidad de unión de la anexina A2 a membranas cargadas negativamente en ausencia de calcio y su capacidad de agregación de las mismas. En presencia de calcio la unión es más fuerte al igual que el proceso de agregación. II. Mutantes de la anexina A2 humana 4. Se ha conseguido clonar, expresar y purificar una batería de mutantes de la anexina A2 humana para analizar el papel funcional de la hélice anfipática N- terminal (mutantes Δ14), el de los residuos de lisina protuberantes de la superficie convexa de la molécula (mutantes TK y 4K) y el de los puentes salinos que estabilizan la formación de dímeros “antiparalelos”. Todas las CONCLUSIONES 158 5. Conclusiones proteínas se pliegan correctamente y han sido caracterizadas espectroscópicamente. 5. Se ha demostrado por primera vez que el monómero de anexina puede unirse a membranas de forma independiente de calcio, y que esta interacción depende esencialmente de unos residuos de lisina protuberantes en la superficie convexa de la proteína. 6. La hélice anfipática N-terminal parece desempeñar un papel esencial para la agregación de vesículas cargadas negativamente en ausencia de calcio, pero para ello depende de la unión de la anexina a las vesículas mediante interacciones electrostáticas entre los residuos de lisina de la superficie convexa. Esta interacción provoca el paso de una conformación “cerrada” de la molécula, donde el extremo N-terminal estaría fuertemente unido al núcleo proteico, a una conformación “abierta” que libera el extremo N- terminal y se genera otro sitio de unión a membranas por la hélice anfipática. La agregación de vesículas estaría dirigida por moléculas de anexina con dos sitios de unión a membranas (puentes monoméricos). 7. En presencia de calcio, la anexina A2 se une más eficientemente a las vesículas cargadas negativamente. El extremo N-terminal no influye mucho en esta unión, pero su presencia dificulta el proceso de agregación de vesículas dado que la eliminación de la hélice anfipática favorece en todos los casos el proceso de agregación. 8. La agregación de vesículas en presencia de calcio depende de la formación de dímeros de proteína a través de las superficies cóncavas por interacciones de tipo hidrofóbico (puentes diméricos). 9. La anexina A2 puede encontrarse en disolución en forma dimérica, como se había sugerido por cristalografía de la proteína. En contra de lo que se había propuesto inicialmente, estos dímeros laterales “antiparalelos” no solo no favorecen la agregación de vesículas, sino que actuarían a modo de regulación negativa de esta actividad de la proteína. 6. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 6. Bibliografía 161 BIBLIOGRAFÍA Álvarez-Martínez MT, Porte F, Liautard JP, Sri Widada J (1997). Effects of profilin-annexin I association on some properties of both profilin and annexin I: modification of the inhibitory activity of profilin on actin polymerization and inhibition of the self-association of annexin I and its interactions with liposomes. Biochim Biophys Acta 1339:331-340. Araújo TG, Mota STS, Ferreira HSV, Ribeiro MA, Goulart LR, Vecchi L (2021). Annexin A1 as a Regulator of Immune Response in Cancer. Cells 10. Astanina K, Delebinski CI, Delacour D, Jacob R (2010). Annexin XIIIb guides raft-dependent and -independent apical traffic in MDCK cells. Eur J Cell Biol 89:799-806. 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