UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I TESIS DOCTORAL Fisiología y fisiopatología del DLK1 en el endotelio vascular MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Mª Ángeles Higueras López Directores Santiago Lamas Peláez Patricia Rodríguez Pérez Madrid, 2014 © Mª Ángeles Higueras López, 2014   D                                                     UNIV Departa FI VERSID FA amento SIOLO EL E DAD CO ACULTA de Bioq                   OGÍA DE NDOT TE Mª Ánge M   OMPLUT AD DE B química                       A Y FIS E DLK TELIO ESIS DO eles Higu Madrid, 2 TENSE BIOLOG a y Biolo                        SIOPA K1 EN O VAS OCTORA ueras Ló 2014 DE MAD GÍA ogía Mo              ATOLO SCULA AL ópez DRID olecular OGÍA AR r I                                                           Re bajo Vº Sa U Depa F DE D ealizada en o la direcció ºBº de los antiago Lam Peláe NIVERS F rtamento FISIOL DLK1 E M Para o n el Centro ón de los D directores mas z IDAD CO FACULTA o de Bioq OGÍA Y EN EL E Memor ª ÁNGELE ptar al gra de Biolog Drs. Santia s de la tes Patric   OMPLUT AD DE B química Y FISIO ENDOT ria present ES HIGUE do de Doc ía Molecul ago Lamas sis cia Rodrígu Pérez ENSE DE BIOLOGÍA y Biolog OPATO TELIO V ada por RAS LÓPE ctor de Bioq lar Severo s Peláez y uez E MADRI A gía Molec OLOGÍA VASCU EZ quimica Ochoa (C Patricia Ro VºBº de Mª Áng ID cular I A ULAR BMSO-CS odríguez P el interesa geles Higu López   SIC) Perez ado ueras     D. SANTIAGO LAMAS PELÁEZ, Profesor de Investigación del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid (España), y DÑA. PATRICIA RODRIGUEZ PEREZ, investigadora del Hospital Mount Sinai, Nueva York (Estados Unidos) CERTIFICAN Que Dña. Mª Ángeles Higueras López, Licenciada en Bioquimica por la Universidad Autónoma de Madrid, ha realizado bajo mi dirección el proyecto correspondiente a su Tesis Doctoral titulado: “Fisiología y fisiopatología de DLK1 en el endotelio vascular” y que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para su presentación como Tesis Doctoral en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I de la Universidad Complutense de Madrid. LOS DIRECTORES, Fdo. Santiago Lamas Peláez Fdo. Patricia Rodríguez Pérez     A mis padres, a Ismael y a mi hija. Gracias por estar a mi lado y por todo lo que me dais día a día. Os quiero.     AGRADECIMIENTOS Ha llegado el momento de escribir una parte también muy difícil de la tesis, la de dar las gracias a todos los que han contribuido en el desarrollo de este trabajo de alguna u otra forma. Seguramente me dejaré a alguien en el tintero, pido disculpas por ello. En primer lugar quiero dar las gracias a la persona que me dio la oportunidad, hace ya mucho tiempo, de entrar en el mundo de la investigación en el laboratorio, el Prof. Santiago Lamas, mi director de tesis, muchas gracias por haberme dado un voto de confianza y haberme ayudado a desarrollarme profesionalmente. Comencé en esto rellenando cajas de puntas y preparando diluciones como técnico y finalmente, casi sin saber cómo me encuentro defendiendo una tesis doctoral. Gracias por ser más que un jefe, por tu lado humano con las personas siempre dispuesto a ayudar en lo profesional y también si está en tu mano en lo personal. A la Dra. Patricia Rodríguez, mi co- directora de tesis, contigo he aprendido lo que es trabajar de forma rigurosa en un laboratorio de investigación. Gracias por querer transmitirme el amor y la ilusión en este trabajo, eres un ejemplo a seguir. Gracias a mis compañeros de laboratorio, después de tanto tiempo en el laboratorio han pasado muchos compañeros, unos han dejado más huella que otros, pero con todos ellos he compartido muchos momentos inolvidables que quedarán para siempre en mi recuerdo. Nunca podré olvidar a mis compañeros del CNIC y la ilusión con la que comenzábamos nuestra andadura profesional. Sara, Ceci, Tania, Yoli, Conchi, Susana, Inma, Laura, Esther, Cristina Castañares, Cristina de Álvaro, Tarín, fue fantástico conoceros y trabajar con vosotros. Tambián gracias a Antonio Martínez y María Monsalve, por guiarme en mis primeros experimentos en el laboratorio. A todos mis compañeros del CIB y CBMSO. Gracias Mariano, mi compañero de laboratorio y de inglés, por compartir esas risas y por tu bondad. A Fernando, por ese café y charla por la mañana para despejarnos un poco y coger fuerzas para comenzar, y como no a tu equipo: los chicos del fibroteam: David, José y Oscar, grandes profesionales con una carrera exponencial. A Estrella, compañera de batallas desde mis comienzos, todavía recuerdo el primer día que nos conocimos a poco tiempo de nacer tu peque. Gracias por coger las riendas y ser la mamá del laboratorio. A Rosa, con su tesón y trabajo, allá por donde vayas dejarás el listón muy alto. Siempre recordaré nuestro viaje a los “Estates” con nuestras aventuras, gracias por tu compañerismo y tu amistad. Cris, gracias por ese toque divertido que le das a todos los días, haces que todo sea más fácil. Macarena, gracias por estar dispuesta siempre a enseñarme y ayudarme con los animales del laboratorio. A las nuevas generaciones que vienen pisando fuerte, Patricia, Verónica y María, con un futuro muy prometedor. Y al resto de compañeros y amigos que han pasado y están en el laboratorio: Clara, Noemi, Fran, Eva, y Marta. Gracias a todos. Por supuesto tengo que agradecer a personas de otros laboratorios, sin su colaboración este trabajo no habría sido posible: Arántzazu Alfranca y Juan Miguel Redondo, Álvaro González-Rajal, Jose Luis de la Pompa, Jorge Laborda. Gracias a todos. Por último quiero dar las gracias a mi familia. A mis padres, Manuel y Mª Ángeles, gracias por darme todo lo que una hija puede desear. Os quiero. A mis hermanos Manuel y Eduardo, y mis cuñadas Rufi y Arancha. A mis sobrinos Manu, Jaime y Edu, sois unos chavales ejemplares. Gracias por esos fines de semana en familia que ayudan a desconectar del trabajo y sentirte entre los tuyos. Gracias a mi suegra Ana María y mi cuñada Ana por todo vuestro cariño. Gracias a mi marido Ismael, por compartir tu vida conmigo, por estar a mi lado, por ayudarme, por quererme. Te quiero. Gracias a mi hija, Mª Ángeles, aunque seas muy pequeña y no lo sepas ni entiendas eres el motor de mi vida, haces que todo se vea de forma diferente y mejor. Te quiero.       INDICCE     Indice 13    INDICE RESUMEN EN INGLÉS……………………………………………………………..19 ABREVIATURAS ............................................................................................. 27  LISTA DE FIGURAS ........................................................................................ 31  LISTA DE TABLAS ......................................................................................... 37  1.RESUMEN .................................................................................................... 41  2. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 45  2.1. El proceso de angiogénesis ................................................................... 45  2.2. Rutas implicadas en Angiogénesis: VEGF, Notch y TGFβ. ................... 50  2.2.1. La ruta de señalización del VEGF................................................... 51  2.2.2. La ruta de señalización de Notch. .................................................... 53  2.2.3. La ruta de señalización de TGF-β. ................................................... 57  2.3. Componentes de la ruta de Notch: receptores, ligandos canónicos y dianas. .......................................................................................................... 59  2.3.1. Receptores de la ruta de Notch. ...................................................... 59  2.3.2. Ligandos canónicos de la ruta de Notch. ......................................... 61  2.3.3. Dianas de la ruta de Notch. ............................................................. 62  2.4. DLK1: Ligando no canónico de la ruta de Notch. ................................... 64  2.4.1. Estructura de Dlk1. .......................................................................... 65  2.5. Papel fisiológico de DLK1. ..................................................................... 69  2.6. Papel fisiopatológico de DLK1. .............................................................. 72  3. OBJETIVOS ................................................................................................. 79  4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 83  4.1. Materiales .............................................................................................. 83  LINEAS CELULARES ................................................................................ 83  RATONES ................................................................................................. 84  REACTIVOS USADOS PARA LOS CULTIVOS CELULARES .................. 84  ADENOVIRUS ........................................................................................... 85  ANTICUERPOS ......................................................................................... 86  Indice 14    VECTORES PLASMÍDICOS ...................................................................... 87  4.2 MÉTODOS .............................................................................................. 88  ELECTROFORESIS, TRANSFERENCIA DE LAS MUESTRAS E INMUNODETECCIÓN (WESTERN BLOT) ................................................ 88  EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL Y ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA POR PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL ........................................... 88  ENSAYO DE REENDOTELIZACIÓN EN PLACA (“Scratch Assay”) ......... 90  FORMACIÓN DE ANGIOTUBOS EN MATRIGEL ..................................... 90  EXPLANTES DE ANILLOS DE AORTA .................................................... 91  ENSAYO DE MATRICES TRIDIMENSIONALES (“PLUGS”) DE MATRIGEL ................................................................................................................... 91  TRANSFECCIÓN CELULAR Y ENSAYO DE LUCIFERASA .................... 92  ENSAYO DE VIABILIDAD Y PROLIFERACIÓN CELULAR ...................... 93  APOPTOSIS .............................................................................................. 93  AISLAMIENTO Y TINCIÓN DE RETINAS ................................................. 94  ENSAYO DE GANANCIA Y PÉRDIDA DE FUNCIÓN EN PEZ ZEBRA .... 95  ENSAYO ANGIOGENESIS EN TUMOR XENOINJERTADO .................... 96  ENSAYO CON REPORTERO DE NOTCH EN PEZ ZEBRA ..................... 97  ANÁLISIS ESTADÍSTICO .......................................................................... 97  5. RESULTADOS ........................................................................................... 101  5.1 Expresión de Dlk1 en endotelio vascular adulto. ................................... 101  5.2 Regulación de la angiogénesis por Dlk1. .............................................. 103  5.2.1. Efecto de la ganancia y pérdida de función de la ruta de Notch sobre la formación de angiotubos. ..................................................................... 103  5.2.2. La sobreexpresión de Dlk1 en células endoteliales inhibe la formación de angiotubos in vitro. ............................................................. 104  5.2.3. La ausencia de DLK1 se correlaciona con un aumento de la angiogénesis. ........................................................................................... 106  Indice 15    5.2.4. La ausencia de Dlk1 se correlaciona con mayor angiogénesis ex vivo. ......................................................................................................... 108  5.2.5. La ganancia de función de Dlk1 también promueve la angiogénesis in vivo. ...................................................................................................... 110  5.2.6. El proceso de re-endotelización en placa se retrasa significativamente por la sobreexpresión de Dlk1. ................................... 112  5.2.7. El proceso de re-endotelización en placa se acelera en ausencia de Dlk1. ........................................................................................................ 113  5.2.8. Estudio de la proliferación, viabilidad y apoptosis en células carentes de Dlk1 respecto a células control. .......................................................... 114  5.2.9. La ausencia de Dlk1 promueve cambios en la arquitectura vascular de la retina. .............................................................................................. 116  5.2.10. La ausencia de Dlk1 se asocia con dilatación de los vasos y con hemorragias. ............................................................................................ 119  5.2.11. Regulación de la angiogénesis por Dlk1 en el modelo de pez zebra. ................................................................................................................. 121  5.2.12. Regulación de la angiogénesis tumoral en el pez zebra. ............. 124  5.3 Interacción de DLK1 con la ruta de Notch. ............................................ 125  5.3.1. DLK1 disminuye la expresión del gen reportador de luciferasa de Hes-1. ...................................................................................................... 125  5.3.2. Dlk1 disminuye la expresión del reportador RbpJK in vivo. ........... 126  5.3.5. La ruta de Notch está activada en células endoteliales carentes de Dlk1. ........................................................................................................ 128  5.3.3. El efecto de DLK1 tiene lugar antes de la proteólisis del receptor de Notch. ...................................................................................................... 129  5.3.4. La sobreexpresión de NICD bloquea el efecto de Dlk1 sobre la angiogénesis en matrigel. ........................................................................ 130  5.4 Interacción de Dlk1 con la ruta de TGF-β. ............................................ 131  5.4.1 Activación por TGF-β en células endoteliales MLEC WT y KO para Dlk1. ........................................................................................................ 131  Indice 16    5.4.2. Papel de TGF-β en la regulación de la angiogénesis retiniana de ratones WT y KO para Dlk1. .................................................................... 132  6. DISCUSIÓN ............................................................................................... 137  6.1. DLK1 se expresa en células endoteliales de organismos adultos. ....... 138  6.2. La ausencia de DLK1 está asociada con un aumento en la angiogénesis. .................................................................................................................... 139  6.3. DLK1 regula el desarrollo vascular en angiogénesis tumoral en pez zebra. .......................................................................................................... 141  6.4. DLK1 inhibe la angiogénesis por antagonismo con la ruta de Notch. .. 143  6.5. DLK1 inhibe la ruta de Notch en un paso inicial de la señalización. ... 148  6.6. Dlk1 interfiere con la activación de la ruta de TGF-β ........................... 150  7. CONCLUSIONES. ..................................................................................... 155  8. BIBLIOGRAFIA ......................................................................................... 159 9. ANEXO I …………………………………………………………………………177 10. ANEXO II ……………………………………………………………………….206       RESUMMEN EEN INGLLÉS     Resumen en inglés 19    INTRODUCTION Blood vessels are essential for the development and viability of vertebrate embryos. Mesoderm cells give rise to endothelial precursor cells through several pathways. Some endothelial cells may derive from hemangioblast, which are able to evolve into both hematopoietic and endothelial cells. During the initiation phase, named vasculogenesis, angioblast aggregate forming-cords and differentiate into endothelial cells. These primitive vessels must branch and establish new connections. This process is called angiogenesis and is defined as the formation of new blood vessels from pre-existing ones. This angiogenic expansion phase requires phenotypic heterogeneity among endothelial cells in their response to stimulatory cues. Sprouting angiogenesis entails the selection of individual endothelial cells for outward migration from a parent vessel. This leading tip cells respond to a VEGF gradient by migrating according to it. Endothelial cells behind the tip cell in the emerging sprout, termed stalk cells, do not migrate independently, but instead proliferate and eventually lumenize. Vessel remodeling also contributes to network patterning. Each phase of vascular development requires the integration of multiple signaling pathways to precisely coordinate cells behavior such that multicellular vessel networks form and expand. In this thesis we focus on the Notch and TGF-β pathways. The Notch signaling pathway is essential for vascular development and recent evidence implicates Notch signaling as a critical integration node for the establishment and/or maintenance of endothelial heterogeneity within developing vessels. TGF-β signaling has a crucial role at the vascular plexus-remodeling stage. DLK1 (Delta like-1 homologue), also known as Pref-1 and FA1, is an EGF-like membrane bound protein that contains six tandem EGF-like repeats, a juxtamembrane region with a TACE-mediated cleavage site, a transmembrane domain, and a short intracellular tail. TACE-mediated cleavage yields a soluble form of DLK1 with a molecular weight of 50 KDa. Alternative DLK1 splicing products have been described in several mammalian species resulting in membrane bound and soluble forms. The structure of DLK1, defined as non canonical ligand, is very related to the canonical Notch ligands Delta like-1, 3, 4 Resumen en inglés 20    (Dll1, Dll3 and Dll4) and Jagged 1 and 2 (Jagg1 and Jagg2). However DLK1 misses the DSL domain (Delta-Serrate-LAG2) which is present at the N- terminus of all canonical Notch ligands and is necessary for the interaction between Notch receptor and the ligands. Despite the absence of a DSL domain, interaction between DLK1 and the Notch receptor was shown in the yeast GAL4 two-hybrid system. DLK1 was described in neuroendocrine tumours and preadipocytes. DLK1 affects several differentiation processes, including adipogenesis, muscular and neuronal differentiation, bone differentiation, and haematopoiesis. Since the Notch signaling pathway is essential for vascular development and physiology by controlling angiogenesis in pre- and post-natal life, we reasoned that DLK1 could contribute to regulate this process in adult endothelial cells through the interaction with Notch receptors. OBJECTIVES –To study the expression of DLK1 in adult endothelial cells of different species (human, mouse, porcine and bovine) using a series of in vitro and in vivo approaches: tube-like structure formation in vitro, aortic ring ex vivo assays, matrigel plug assay in vivo, retinal isolation and studies of vascular development in the zebrafish model. - To investigate whether the suppression of Dlk1 promotes vessel migration in a model of zebrafish xenograft tumour formation. – To elucidate the potential interaction of DLK1 with the Notch signaling pathway in the context of angiogenesis, using several approaches: Notch- dependent luciferase reporter Hes-1, protein and mRNA levels of different Notch signaling pathway targets (Hey-1, Slug, Snail). – To identify the step at which DLK1 is interfering with the Notch signaling pathway. – To explore whether the TGF-β pathway, involved in angiogenesis, is also interacting with DLK1. RESULTS Resumen en inglés 21    We found that DLK1 was expressed in murine, human, porcine and bovine adult endothelial cells. As DLK1 is a non canonical ligand of the Notch pathway which is essential for angiogenesis we explored the potential role of DLK1. First we observed an increased formation of angiotubes in mouse lung endothelial cells (MLEC) derived from Dlk1-null mice both in the absence and presence of VEGF (Fig 21). This phenotype was reversed by the introduction of adenoviral expression constructs bearing DLK1 (Fig 22). In addition, BAEC overexpressing DLK1 showed delayed re-endothelization after 18 h of in-plate endothelial wound-healing (scratch assay) (Fig 27). Consistently, wound closure was significantly accelerated in MLEC from Dlk1-null mice (Fig 28). To address the contribution of proliferation and/or apoptosis to the final effect observed, we evaluated the consequences of DLK1 suppression in MLEC. The absence of DLK1 significantly correlated with increased cell proliferation (Fig 29), in the absence of apoptosis or necrosis (Fig 30). Using an ex-vivo model of aortic segments from DLK1 null mice, these exhibited a significantly higher pro- angiogenic profile (Fig 23) that was abrogated by re-expression of DLK1 in a dose-dependent fashion (Fig 24). We then investigated the effect of DLK1 expression in an in vivo model of ectopic angiogenesis of Matrigel plugs implanted subcutaneously in the abdominal region of healthy mice. Whereas VEGF-treated plugs showed macroscopic neovessel formation and increased haemoglobin content, functional vascular structures were drastically reduced in plugs exposed to DLK1 expression compared to controls (Fig 25). To confirm the antiangiogenic role of DLK1 in vivo, we studied the retinal vessel formation in Dlk1-null mice compared with their wild-type counterparts. Retinas from null mice showed focal hypervascularization at p5 and p14 (Fig 31). A detailed study of the affected regions in the retinas of Dlk1-null mice demonstrated an increased number of filopodia and tip cells (Fig 32) consistent with a dysregulation of angiogenesis. The retinal vascular network from Dlk1 KO mice exhibited enlarged and tortuous veins. It also presented arterioles with larger diameter, disappearance of micro-vascular capillary beds and loss of their characteristic straight morphology. Also hyaluronic vessels from P6 KO retinas appeared to be more tortuous and of larger caliber compared to P6 WT vessels (Fig 33). When observed at a macroscopical level, Dlk1-null mice showed more hemorrhages compared with their wild-type counterparts (Fig 34). Frontal Resumen en inglés 22    cryostat sections of isolectin B4 stained embryos at E12.5 of development showed dilated vessels in the Dlk1 KO embryo compared to wild-type (Fig 35). To investigate the role of DLK1 in angiogenesis in other vertebrate models, we performed experiments in embryos from zebrafish. The human version of DLK1 was microinjected and overexpressed in one-cell stage embryo. Three days after the injection, embryos expressing DLK1 showed an abnormal pattern of dorsal vascularization that was dose-dependent and consisted of aberrant intersegmental vessel branching and a lack of an established dorsal longitudinal anastomotic vessel (Fig 36). To study whether DLK1 played a role by itself in the development of zebrafish vasculature, the endogenous orthologous mRNA was targeted with a morpholine (MO). Six day-old larvae showed ectopic subintestinal angiogenesis. This phenotype was dose-dependent on the concentration of the MO and was rescued by the expression of human DLK1 (Fig 37). In a model of zebrafish xenograft tumour formation, suppression of DLK1 resulted in visible migration of vessels towards the tumour cell mass, an effect reversed by co-injection with human DLK1 mRNA (Fig 38). To study the potential interaction of DLK1 with the Notch signaling pathway in the context of angiogenesis we investigated the expression of the Notch- dependent luciferase reporter Hes-1. We observed that the expression of DLK1 reduced Hes-1 activity in a dose-dependent manner (Fig 39). To confirm that DLK1 was also inhibiting Notch signaling in another model, we perfomed studies in zebrafish embryos expressing the Notch-dependent fluorescent effector RbpJk. DAPT drastically reduced fluorescence associated with Notch signaling, while antagonism of Dlk1 with a MO moderately enhanced it. In contrast, injection of embryos with the human Dlk1 mRNA promoted a marked abrogation of Notch-dependent fluorescence (Fig 40). We then studied the abundance of Notch signaling pathway-related proteins in MLEC from Dlk1-null mice compared to WT. In Dlk1-null mice the levels of Notch 1 intracellular domain (NICD-Notch active) were higher than in WT. We also found increased levels of target proteins of the Notch pathway (Slug, Snail and Hey-1) in MLEC from Dlk1-null mice compared to WT. When we performed studies of angiotube formation in porcine aortic endothelial cells (PAEC) overexpressing NICD, we Resumen en inglés 23    observed that the angiotube formation was not reduced by DLK1 overexpression (Fig 44). To explore if DLK1 interacted with the TGF-β pathway we studied the expression of the luciferase reporter PAI-1, a target of the TGF-β pathway. The luciferase activity was higher in MLEC from Dlk1-null mice compared to WT in response to TGF-β (Fig 45). To investigate if these results had a reflection in vivo, we studied retinas from DLK1 KO mice exposed to TGF-β. We confirmed that the levels of another TGF-β target, Id_1, were higher compared to WT (Fig 46). CONCLUSIONS This work shows for the first time to our knowledge that: 1. DLK1 is expressed in murine, human, porcine and bovine adult endothelial cells showing a dual inhibitory effect on migration and proliferation. 2. It acts as a powerful antiangiogenic factor in several models and organisms. The absence of DLK1 correlates with focal retinal hyperangiogenesis and an increased number of filopodia and tip cells. 3. DLK1 regulates vascular development and tumour angiogenesis in zebrafish. 4. It negatively regulates Notch signaling, likely by interfering with canonical ligand-receptor interaction. 5. DLK1 may also affect other pathways such as TGF-β. The response to TGF-β is higher when the levels of DLK1 are downregulated. Antagonism of the Notch pathway by the use of decoys has proven to be effective in animal models of tumour progression and the use of endogenous inhibitor of the Notch pathway has been claimed to represent a potential therapeutic avenue. As an inhibitor of the Notch pathway. DLK1 may represent a candidate on which to focus for the development of new therapies with antiangiogenic effects. Resumen en inglés 24        ABRREVIATTURAS       Abreviaturas 27    ABREVIATURAS AML: Leucemia mieloide aguda. ANG-1: Angiopoietina-1 ANK: Repeticiones de anquirina. BAEC: Células endoteliales de aorta bovina. BMPs: Proteínas morfogenéticas óseas. C/EBP: Proteínas de unión al activador CCAAT. CE: Célula endotelial. Dlk1: Homólogo Delta like 1 Dll1, 3 y 4: Delta-like 1, 3 y 4. Dfp: Dias post-fecundación. DSL: Delta/Serrate/Lag-2. EE: Endosomas tempranos. ER: Retículo endoplasmático. FA1: Antígeno fetal 1. GDFs: Factores de diferenciación y crecimiento. GH: Hormona de crecimiento. HCC: Carcinoma hepatocelular. Hpf: Horas post-fecundación. hMSC: Células mesenquimales humanas. HUVEC: Células endoteliales de vena de cordón umbilical humano. iPS: Células madre pluripotentes inducidas. Abreviaturas 28    MEC: Matriz extracelular. MIF: Factor inhibitorio Mulleriano. MLEC: Células endoteliales de pulmón murino. MVBs: Cuerpos multivesiculares. MO: Morfolino. NECD: Dominio extracelular de Notch. NICD: Dominio intracelular de Notch. NP 1 y 2: Neurofilina 1 y 2. O-Fut 1: o-Fucosiltransferasa. PAEC: Células endoteliales de aorta porcina. PDGF-B: Factor de crecimiento derivado de plaquetas. PEST: Motivo rico en prolina/ácido glutámico/serina/treonina) PIGF ó PGF: Factor de crecimiento de placenta. PPARγ: Receptor de peroxisoma-proliferador activado gamma. Pref-1: Factor preadipocitario. RAM: Módulo de asociación de RBP Jκ. SHH: Sonic hedgehog. TAD: Dominio de activación transcripcional. TGF-β: Factor de crecimiento transformante β. TβR I, II y III: Receptores de TGF-β tipo I, II y III. VEGF: Factor de crecimiento del endotelio vascular. VRAP: Proteína asociada a VEGF. ZOG: Factor específico zona del glomérulo de la glándula adrenal.       LISTATA DE FFIGURAAS       Lista de Figuras 31    LISTA DE FIGURAS Figura 1. Desarrollo de vasculogénesis y angiogénesis. ................................. 45 Figura 2. Brote angiogénico. ............................................................................ 47 Figura 3. Crecimiento de vasos sanguíneos por invaginación.. ....................... 48 Figura 4. Reclutamiento e incorporación de células de la circulación sanguínea......................................................................................................... 48 Figura 5. Desarrollo de los vasos sanguíneos. ................................................ 50 Figura 6. Ruta de señalización de VEGF en células endoteliales en angiogénesis.. .................................................................................................. 52 Figura 7. Ruta de señalización de Notch.. ....................................................... 54 Figura 8. Especialización célula tip/stalk durante el brote angiogénico. .......... 56 Figura 9. Ruta de señalización TGF-B/BMP en células endoteliales en angiogénesis.. .................................................................................................. 58 Figura 10. Receptores Notch.. ......................................................................... 60 Figura 11. Ligandos canónicos de receptores Notch.. ..................................... 61 Figura 12. Diversidad de dianas de Notch.. ..................................................... 64 Figura 13. Estructura de Dlk1. ......................................................................... 66 Figura 14. Representación esquemática del cluster Dlk1-Dio3.. ..................... 67 Figura 15. Diferenciación de células madre mesenquimales (MCS) en varios tipos celulares. ................................................................................................. 69 Figura 16. Expresión de Dlk1 en células endoteliales de organismos adultos provenientes de diferentes especies.. ............................................................ 101 Figura 17. Expresión de mRNA en células endoteliales de diferentes organismos adultos.. ...................................................................................... 102 Lista de Figuras 32    Figura 18. Formación de angiotubos en matrigel de células endoteliales porcinas. ......................................................................................................... 103 Figura 19. Formación de angiotubos de células endoteliales de aorta porcina (PAEC) sembradas sobre matrigel.. ............................................................... 104 Figura 20. Niveles de P-VEGFR2 por western blot en células endoteliales de aorta bovina. ................................................................................................... 105 Figura 21. Formación de angiotubos en células endoteliales de pulmón de ratón (MLEC) a partir de animales control (WT) y knockout (KO) para Dlk1 sembradas sobre matrigel.. ............................................................................ 106 Figura 22. Formación de angiotubos inhibida por Dlk1 en células endoteliales de pulmón de ratón (MLEC) knockout para Dlk1 sembradas sobre matrigel. 107 Figura 23. Explantes de anillos de aorta de ratones control (WT) y knockout (KO) para Dlk1 embebidos en matrigel.. ........................................................ 108 Figura 24. Explantes de aorta de animales knockout (KO) para Dlk1. .......... 109 Figura 25. Ensayo de angiogénesis in vivo mediante plugs de matrigel.. ..... 110 Figura 26. Estudio histológico de la secciones de los plugs de matrigel implantados subcutáneamente (Hematoxilina-Eosina). ................................. 111 Figura 27. Efecto de la sobreexpresión de Dlk1 en ensayo de migración sobre células endoteliales.. ...................................................................................... 113 Figura 28. Efecto de la ausencia de Dlk1 en ensayo de migración sobre células endoteliales. ................................................................................................... 114 Figura 29. Viabilidad y proliferación en células WT respecto a células KO para Dlk1. ............................................................................................................... 115 Figura 30. Apoptosis en células WT y KO para Dlk1. .................................... 116 Figura 31. Angiogénesis retiniana en animales control (WT) y knockout (KO) para Dlk1 a 5 y 14 días del periodo postnatal.. .............................................. 117 Figura 32.Células tip y filopodios en el frente angiogénico de la retina.. ....... 118 Lista de Figuras 33    Figura 33. Red vascular de la retina en ratones WT y KO para Dlk1. ........... 119 Figura 34. Hemorragias en retinas de animales KO para Dlk1 comparadas con animales control (WT). ................................................................................... 120 Figura 35. Secciones frontales de embriones a estadio 12.5 (E 12.5) teñidas con isolectina B4. ........................................................................................... 121 Figura 36. Fenotipo de ganancia de función en pez zebra dosis dependiente de Dlk1.. .............................................................................................................. 122 Figura 37. Embriones WT de pez zebra. ....................................................... 123 Figura 40. Imágenes de microscopia de fluorescencia de larvas.. ................ 124 Figura 41. Efecto de Dlk1 sobre la actividad del promotor de Hes-1.. ........... 125 Figura 42. Pez zebra que expresa el elemento de respuesta a Notch (Tg(ptf1a:eGFP)jh1) a los 2 días postfecundación. ........................................ 127 Figura 43. Niveles de proteínas implicadas en la ruta de Notch en células MLEC WT y KO para Dlk1.............................................................................. 128 Figura 44. Regulación de Snail y Slug en células MLEC WT y KO para Dlk1.. ....................................................................................................................... 129 Figura 45. Efecto de Dlk1 sobre la actividad del promotor de Hes-1 en células endoteliales que sobreexpresan NICD.. ......................................................... 130 Figura 46. Formación de angiotubos de células endoteliales de aorta porcina (PAEC) que sobreexpresan NICD sembradas sobre matrigel. ....................... 131 Figura 47. Activación de la ruta de TGF-B en células WT y KO para Dlk1. ... 132 Figura 48. Imágenes representativas de retinas de ratones WT y KO para Dlk1. ....................................................................................................................... 133 Figura 49. Fenotipo de las retinas de ratones KO para Dlk1. ........................ 146 Figura 50. Co-cultivo de células OP estromales y células BAEC.. ................ 147 Figura 51. Modelo de inhibición de la ruta de Notch por DLK1...................... 149 Lista de Figuras 34    Figura 52. Actividad de la ruta de Notch por Hes-1 con modificación post- traduccional por Fringe. .................................................................................. 150        LISTAA DE TATABLASS     Lista de Tablas 37    LISTA DE TABLAS Tabla 1. Anticuerpos ........................................................................................ 86 Tabla 2. Vectores plasmídicos ......................................................................... 87 Tabla 3. Secuencias de primers ....................................................................... 89 Lista de Tablas 38          RESSUMENN       Resumen 41    1.RESUMEN   El objetivo de esta tesis es el estudio del papel de la proteína DLK1 (el homólogo de Delta Like 1) en el desarrollo de la vasculatura, en concreto de la angiogénesis, que es la formación de nuevos vasos a partir de otros preexistentes. Este proceso ocurre en situaciones fisiológicas, tales como el desarrollo embrionario, formación de la placenta, en la vascularización del endometrio durante el ciclo menstrual, crecimiento óseo y cicatrización de heridas y en procesos patológicos, donde se da un crecimiento anormal de los vasos sanguíneos, tales como la psoriasis, la degeneración macular asociada a la edad, el desarrollo de tumores, las úlceras diabéticas y la artritis reumatoide inmunogénica. La proteína DLK1 está implicada en la diferenciación de distintos tipos celulares: adipocitos, osteoblastos, hepatocitos, células musculares y hematopoyéticas. Tiene una estructura muy similar a los ligandos canónicos de la ruta de Notch y se le clasifica como un ligando no canónico de dicha ruta, la cual está implicada en diferentes procesos, siendo uno de los más importantes el de angiogénesis. En este trabajo se describe la expresión de DLK1 en células endoteliales procedentes de organismos adultos de diferentes especies (bovina, murina, porcina y humana). Hasta el momento únicamente se había descrito su expresión en varios tejidos a nivel embrionario como son la glándula pituitaria, páncreas, pulmón, glándula adrenal, placenta y tejidos derivados del mesodermo, mientras que en adultos su expresión era conocida en glándula pituitaria, renal y determinados tipos de tumores. Debido a su expresión en el endotelio y a su implicación en la ruta de Notch se estudió si podría desempeñar algún papel en el proceso de angiogénesis. Para ello hicimos varias aproximaciones utilizando modelos in vitro (scracth-assay y formación de angiotubos en matrigel), ex vivo (ensayos de anillos de aorta), e in vivo (ensayo de implantación de estructuras de matrigel “plugs” subcutáneamente, estudio de la formación de la vasculatura en Resumen 42    la retina de ratones y estudio de la formación de la vasculatura en el modelo de pez zebra). La sobreexpresión de DLK1 fue capaz de inhibir de forma notable la formación de angiotubos, mientras que la carencia de DLK1 produjo un aumento de la formación de angiotubos en células endoteliales procedentes de animales knockout (KO) para Dlk1. En los experimentos in vivo se observó como DLK1 es capaz de inhibir la formación de nuevos vasos, mientras que una carencia de DLK1 da lugar a alteraciones en la estructura de los vasos. En el modelo del pez zebra la sobreexpresión de DLK1 dió lugar a una formación aberrante de los vasos, mientras que una disminución de la expresión se asoció con un aumento de angiogénesis ectópica así como un aumento en la angiogénesis tumoral. El mecanismo a través cual DLK1 podría ejercer su acción en el proceso de angiogénesis podría estar mediado por varias rutas. Una de ellas es la ruta de Notch, ya que alteraciones en la expresión de DLK1 conlleva a inhibición o activación de dicha ruta. Así en las células endoteliales procedentes de animales carentes para Dlk1 hay una activación medida por las dianas finales de dicha ruta. Además DLK1 también podría estar ejerciendo su efecto a través de otros mecanismos, como por ejemplo la ruta de TGF-β, ya que se observó como en las células KO para Dlk1 hay una mayor respuesta a TGF-β. Por los resultados obtenidos en este trabajo puede concluirse que la proteína DLK1 está implicada en la regulación del proceso de angiogénesis, no solamente a nivel fisiológico, sino también a nivel patológico. Estos resultados ponen de manifiesto una ruta de regulación del proceso de angiogénesis.       INNTRODDUCCIÓÓN         2. I 2.1.   unos saco hem vaso de n vaso vaso un p NTROD El proce La form s agregado o vitelino matopoyétic os sanguín novo. Suel os sanguín os primitivo proceso de Figura 1. D hemangiobla con importa la diferencia aorta dorsal del endotelio de Notch. En Después de se estabilice de plaqueta angiopoietin UCCIÓN so de ang ación de la os de célu . Los h cas o a cé neos se de le distingu neos a part os da lugar remodelac Desarrollo de asto puede da nte participac ación en arteria o en la vena o vascular (VE n el saco vitel el remodelado en y maduren as B (PDGF na-1 (ANG-1) ( N giogénes a vasculatu ulas proge hemangiob élulas endo nomina va uirse de la tir de otros r a la forma ción (Fig. e vasculogén ar lugar a las ión de la ruta a o vena (B). a cardinal; est EGF), por la f ino, los angiob vascular, se . Este proceso -B), el facto (D). 45  sis ura en el e nitoras de blastos p oteliales. L asculogéne a angiogén s ya preex ación de u 1). nesis y angio células de la de Notch (A) Los angiobla te proceso est familia de pro blastos se fus reclutan célu o está mediad r de crecimi embrión se enominada ueden d La primera esis e impli nesis, que xistentes. L n plexo va ogénesis. En línea hemato . La ruta de N astos intraemb tá mediado po oteínas Sonic sionan para fo las murales p do por el facto ento transfor inicia por s hemang iferenciars fase de la ca la form implica la La intercon ascular prim n el embrión opoyética y a Notch también brionarios se a or el factor de hedgehog (SH rmar el plexo ara que los n or de crecimie rmante β (TG Introduc la aparició ioblastos e se a cé a formació ación de v a formació nexión de e mario que el precursor angioblastos contribuye a agregan en la e crecimiento HH) y la ruta vascular (C). nuevos vasos ento derivado GF β), y la cción ón de en el élulas ón de vasos ón de estos sufre Introducción 46    Durante el proceso de angiogénesis las células endoteliales migran y proliferan en respuesta a varios estímulos, ensamblándose en túbulos que contienen uniones célula-célula características del endotelio. Este proceso puede ocurrir mediante cuatro mecanismos diferentes [1, 2]: a) Formación de nuevos "brotes" angiogénicos (mecanismo conocido como “sprouting”), que se divide en varios pasos: a) la activación de la célula endotelial, b) degradación local de la membrana basal vascular y la matriz extracelular, c) proliferación de las células endoteliales y d) migración para formar el nuevo brote. Después se produce la formación del lumen y finalmente la estabilización del vaso nuevamente formado mediante el reclutamiento de los pericitos y células del músculo liso (Fig. 2). Se ha visto que el conjunto de células endoteliales implicadas en este proceso es bastante heterogéneo y responden de forma diferente frente a estímulos angiogénicos. La célula que se encuentra en el frente (denominada “tip”) no prolifera en respuesta a factores de crecimiento [3], sino que responde a la señalización por gradientes de VEGF emitiendo filopodios. Contiguas a estas células se encuentran las células denominadas ”stalk”, que quedan extendidas, con pocos filopodios pero estableciendo un lumen y proliferando para dar soporte a la célula que migra al frente [4] [5].   b Figura 2. B angiogénica de MEC o in células end responden inducción de degradación está guiado reclutamient formación d repulsión cu células que interfaz CE- oxígeno y a perfusión ta uniones celu crecimiento Figura adap b) Genera Este me rata y t entre p endotel remode indepen Brote angiogé as (VEGF) y fa nhibidores de oteliales pue (células en g e movilidad y a n de la matriz por gradiente to de pericitos del lumen par uando se enc forman el “tal -CE establece así reduce las ambién promu ulares, deposi puede desenc tada de Ralf H ción de inv ecanismo s tiene cuatr paredes en iales, form elado de ndientes (F énico El brote actores pro-qu VEGF). En c den emerger gris). El brote actividad invas extracelular es de VEGF. L s al nuevo br ra evitar fuga cuentren dos lo” implica la en un lumen c s señales pro ueve el proce ición de matri cadenar la ret H. Adams y Ka vaginacion se demost ro fases p ndoteliales mación de los nue Fig. 3). 47  e está contro uiescentes (co condiciones fa r (célula en v e requiere el siva, la modul (A). El crecim La liberación rote. Las unio as (B). Puede células migra fusión de vac continuo. El f o-angiogénica eso de madu iz y unión de tracción del br ari Alitalo, 200 nes que se tró inicialm principales: s opuestas un centro evos vaso lado por el b ontacto con p avorables para verde), mient cambio de lación de los c miento de la c de PDGFB po ones CE-CE s en surgir inte atorias. La for cuolas (C). Los flujo sanguíne s que son in uración, como pericitos. La r rote (D). 07 (Ref. 2.) e producen mente en la creación s, reorgan o intersticia os dividid alance entre pericitos, cierta a la angiogén ras que otras polaridad api contactos célu célula endoteli or esta célula se deben man eracciones de rmación del lu s procesos de eo mejora la l ducidas por h o la estabiliza retirada de los n en vasos a circulació de un áre nización d al de pare dos en Introduc señales pro- as moléculas nesis algunas s células no ical-basal, la ula-célula y la ial migratoria promueve el ntener tras la e adhesión o umen en las e fusión en la liberación de hipoxia. Esta ación de las s factores de s preexiste ón pulmona ea de con de las uni ed endote dos capi cción entes. ar de tacto ones lial y lares Intro   c oducción Figura 3. C proliferación moléculas d Figura adap c) Incorpo del vas contribu mecanis Figura 4. R Requiere se las células precursoras precursoras permitir la e angiogénico necesariame de células e Figura adap Crecimiento d n, movimiento e matriz extra tada de Ralf H ración de o sanguín uir a la a smos [5] (F Reclutamient eñales quimiot endoteliales. en el endote circulantes expansión de os. Las célul ente un fenoti ndoteliales loc tada de Ralf H de vasos sa celular, degra acelular. H. Adams y Ka células pre neo: este r ngiogénes Fig. 4). to e incorpo tácticas positiv La migració elio requiere l (angioblastos l diámetro de las que prov po endotelial, cales perivasc H. Adams y Ka 48  anguíneos po adación de m ari Alitalo, 200 ecursoras reclutamie sis que tie oración de c vas y factores ón transendo la modulación s) pueden dif el vaso o pue vienen de la sino que pue culares. ari Alitalo, 200 or invaginaci matriz extracel 07 (Ref. 2) endotelial nto de cé ene lugar células de la s locales que telial y/o la n de los conta ferenciarse e eden ser reclu a circulación eden promove 07 (Ref. 2) ón. Este pro ular y depósit es circulan lulas endo a través circulación promueven la incorporación actos CE-CE. en células en uidos para nu no tienen q r la proliferaci oceso implica to de nuevas ntes a la p oteliales p de los sanguínea. a adhesión a n de células . Las células ndoteliales y uevos brotes que adquirir ión y el brote pared uede otros Introducción 49    d) Proceso de elongación y ensanchamiento: ocurre como reestructuración de vasos preexistentes en respuesta a la demanda metabólica de células adyacentes. Este proceso también se ha descrito como remodelado y da lugar finalmente a la estructura ramificada en los vasos sanguíneos. Para que esta red vascular sea funcional requiere la separación de una red venosa y otra arterial que están interconectadas mediante un lecho de capilares que se establece entre los órganos distales. Mientras los tubos endoteliales que forman el plexo vascular primitivo son indistinguibles morfológicamente [6], las venas y arterias maduras son diferentes en la composición de la matriz extracelular, espesor y abundancia de músculo liso y de otras células de soporte que aportan propiedades mecánicas y fisiológicas especializadas. Varios estudios in vivo han demostrado una expresión diferencial en células endoteliales de arteria o vena de EphrinB2 y EphB4 respectivamente, en embriones de ratón antes de establecerse la circulación, lo que indica que la diferenciación en arteria o vena puede estar predeterminada genéticamente [7- 9]. La inactivación genética de EphrinB2 o EphB4 interrumpe el remodelado angiogénico de arterias y venas y, como consecuencia de ello el animal muere a mitad de la gestación por anomalías vasculares [7]. Se ha descrito como la activación selectiva de la ruta de Notch por DLL4 induce la expresión de EphrinB2 en células endoteliales [10]. Además existe una red vascular linfática que está formada también por células endoteliales y se encuentra interconectada a la red arteria-vena mediante el conducto torácico. Ambas redes endoteliales son esenciales para la homeostasis en el organismo y su malformación o disfunción contribuye al desarrollo de enfermedades [11, 12].   El proceso de angiogénesis es también un fenómeno fisiológico en el organismo adulto, que se da en los órganos reproductivos femeninos durante la foliculogénesis en el ovario y formación del cuerpo lúteo, así como en el endometrio durante el ciclo menstrual y en el desarrollo embrionario. También Intro   está emb da u dond prom com artrit VEG EphB 2.2. esta oducción implicada bargo tamb un crecimie de el tumo mover la m o la psoria tis reumato Varias r GFRc; Not B4; TGFβ   Figura 5. D no diferencia o hematop sanguíneas) lugar una fa Finalmente s Rutas im Por razo memoria a en el c bién es un ento anorm or necesita metástasis. asis, enferm oide inmun rutas han s tch-DSL ( y PDGF [ Desarrollo de adas reciben oyéticas part ). Estos grupo se de remode se obtiene un mplicadas ones de re se detallan crecimiento proceso fu mal de esto a la forma . Además medades n nogénica y sido implic Delta-Serr 5] (Fig 5). los vasos s señales de VE tiendo de p os de células s elado, con fusi plexo vascula s en Angi elevancia e n a continu 50  o óseo y undamenta os vasos sa ación de n está impl neovascula y enfermed cadas en e rate-LAG2) sanguíneos. I EGF para lleg pequeños gru se unen para f ión, regresión ar maduro. ogénesis en relación uación las la cicatr al en estad anguíneos nuevos vas icada en e ares intrao dad cardiov el proceso ); Angiopo nicialmente la gar a convertir upos de cél formar un plex y expansión p s: VEGF, con los re rutas de V ización de dos patológ , como la t sos para p enfermeda culares, úl vascular. de angiog oietina- Ti as células me rse en células ulas (isletas xo primario. D para formar nu Notch y T esultados p EGF, Notc e heridas. gicos dond tumorogén poder crec ades de la lcera diabé génesis: VE ie2; Ephri esenquimales s endoteliales de células Después tiene uevos vasos. TGFβ. presentado ch y TGFβ . Sin de se nesis, cer y a piel ética, EGF- inB2- os en . Introducción 51    2.2.1. La ruta de señalización del VEGF. El VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), fue identificado inicialmente por su capacidad para mediar permeabilidad vascular y después se describió como agente mitogénico para células endoteliales [13, 14]. Hoy en día se sabe que es una citoquina esencial para el desarrollo y la homeostasis del sistema vascular. La haploinsuficiencia de VEGF da lugar a muerte embrionaria a mitad de la gestación debido a defectos cardiovasculares [15, 16]. Asimismo, la sobreexpresión de VEGF da lugar a alteraciones en el desarrollo vascular cardiaco y produce la muerte en el embrión [17], de modo que los niveles de VEGF deben estar estrechamente controlados. El VEGF-A es un miembro prototípico de una familia génica que incluye: VEGF- B, VEGF-C, VEGF-D y el factor de crecimiento de placenta (PIGF o PGF). Estas moléculas interaccionan con tres receptores tirosina quinasa, VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) y VEGFR3 (Flt4), y otros dos receptores no tirosina quinasa, neuropilina 1 y 2 (NP1 y NP2), que se unen además a otros ligandos. Por splicing alternativo pueden generarse cuatro isoformas diferentes de VEGF-A: VEGF121, VEGF165, VEGF189 y VEGF206. El VEGF165 es una proteína homodimérica que se une a heparina con afinidad media [18]. Los VEGF189 y VEGF206 son capaces de unirse con mayor afinidad a la heparina, y casi siempre se encuentran unidos a proteoglicano heparansulfato en la superficie celular o en la matriz extracelular. El VEGF121 no puede unirse a heparina y es una proteína que difunde libremente. Los estudios en modelos genéticos deficientes empleando modelos de ratón deficitarios en la isoforma VEGF-A, han confirmado la importancia del gradiente de VEGF-A en el desarrollo del sistema vascular, regulado por el balance entre el VEGF que difunde libremente y el VEGF unido a proteoglicano heparansulfato. El VEGFR2 media la mitogénesis y permeabilidad vascular en las células endoteliales en respuesta a VEGF-A. En cambio el VEGFR1, dependiendo de su localización [19], puede regular negativamente la señalización del receptor 2 secuestrando VEGF [20, 21], y promoviendo además la migración de monocitos [22] y la secreción de proteasas y de otros Intro   facto tamb sobr oducción ores de c bién el cr reexpresió Figura 6. R VEGFR1 (F en las célul mientras que 1 (NP1). El células endo Figura adap crecimiento recimiento n de este r uta de señali lt1) y VEGFR as endoteliale e VEGF165 y VEGF promu oteliales. tada de Matth o por célu de deter receptor [2 ización de VE 2 (Flk1/KDR) es en angiogé VEGF188 tam ueve migración hew T. Holderf 52  ulas endo rminadas 25, 26]. EGF en célul representan l énesis. El VE mbién pueden n, proliferació field and Chris oteliales [2 células tu as endotelial los dos recept EGF121 se un n unirse al co- ón, morfogéne stopher C.W. 23, 24]. S umorales les en angiog tores de VEG ne a VEGFR1 receptor de la esis y expresió Hughes, 2008 Se ha des asociado génesis. Los GF principales 1 y VEGFR2, a neuropilina- ón génica en 8 (Ref. 31) scrito a la Introducción 53    Los factores PIGF y VEGF-B se unen selectivamente a VEGFR1 [21, 27], mientras que VEGF-C y D se unen principalmente a VEGFR3, mediando la linfangiogénesis [28]. Las isoformas de VEGF-A que se unen a heparina también pueden interaccionar con los correceptores NP1 y NP2, que potencian la señalización a través de VEGFR2 de forma independiente [29, 30]. En la vía de señalización VEGF-A se une al receptor VEGFR2, y la presencia de NP1 o NP2 aumenta la señal en respuesta a VEGF165, pero no a VEGF121. Esta unión implica la fosforilación en los residuos de Tyr1175 del receptor, la unión de PLCγ, y la activación de la cascada MAPK/ERK con el subsiguiente aumento de la proliferación celular [31](Fig. 6). En contraste, la migración está mediada por dos cascadas de señalización a partir del receptor. La primera incluye el adaptador Shb y su unión a la Tyr1175 fosforilada para activar la cascada PI3K. La segunda se relaciona con una proteína asociada a VEGF (VRAP), que se une a la Tyr 951 fosforilada, activándose la cascada Src. Finalmente el VEGFR2 también interacciona con FAK, lo cual es esencial para la renovación de las adhesiones focales (Fig. 6) 2.2.2. La ruta de señalización de Notch. La ruta de señalización de Notch es un sistema de comunicación entre células. Dicha ruta es esencial en los mecanismos de regulación de genes que están implicados en múltiples procesos de diferenciación, tanto durante el desarrollo embrionario como durante la vida adulta [32-34]. En mamíferos, la ruta de Notch está compuesta por 4 receptores (Notch 1-4) y 5 ligandos: Jagged1, Jagged2, Delta-like (Dll)1, Dll3 y Dll4, a los que en conjunto se les denomina familia DSL (Delta/Serrate/Lag-2) [35]. Normalmente el receptor de Notch se procesa en Golgi mediante una furina y se expresa en la superficie celular como heterodímero unido de forma no covalente [36]. La interacción del ligando con el receptor da lugar a una serie de cortes proteolíticos secuenciales del receptor. El primer corte en la membrana está mediado por unas enzimas que pertenecen a la familia ADAM Intro   (A D ADA oducción Disintegrin AM17 (TAC Figura 7. R retículo end una O-gluco proteasa en (1). En la ac da lugar a u también pue sufrir una r tempranos ( Figura adapt And Meta CE) en mam Ruta de seña oplasmático ( osiltransferasa el sitio S1 y ctivación med una serie de c ede procesar regulación po EE), cuerpos tada de An-Ch alloproteina míferos. alización de ER), donde e a (Rumi). Notc además se m iada por ligan cortes proteolí dentro del c or endocitosis multivesicular hi Tien et al, 2 54  ase): ADA Notch. La t es glicosilado ch se traslada modifica por la ndo; Notch int íticos (S2-ADA compartimento s, dándose e res (MVBs), e 2009 (Ref. 42)    AM10 (kuz raducción de por una O-fuc a Golgi donde a N-acetilgluco eracciona con AM y S3/4-γ-s o endocítico ( l transporte d ndosomas tar ) zbanian) e Notch se pr cosiltransferas e se procesa p osaminiltransf n los ligandos secretasa). Es (2). Notch ad de Notch en rdíos y lisosom en drosoph roduce en el sa (O-Fut1) y por una Furin ferasa Fringe s DSL, lo que sta secretasa demás puede endosomas mas. hila y Introducción 55    Después se producen 2 cortes por el complejo γ-secretasa (presenilina1, presenilina2, Aph-1 y Nicastrina) generando el dominio intracelular de Notch (NICD), que es la forma activa del receptor [37-39], el cual se trasloca al núcleo para iniciar la transcripción génica. Una vez en él, NICD interacciona con el represor transcripcional CSL (CBF-1, Supresor of Hairless, Lag-1), también conocido como RBP-Jk (Recombination Signal-Binding Protein 1 for Jk) y CBF1 (C promoter-Binding Factor 1) y el coactivador Mastermind [40] lo que da lugar a la desrepresión/activación de los genes diana Notch-CSL. Además hay otros factores de transcripción (ej. CBP/P300 y PCAF) que se reclutan hacia este complejo para promover el aumento en la expresión de los genes diana de Notch [41, 42] (Fig. 7). La γ-secretasa también procesa el ligando (Dll1) que libera su dominio intercelular y es capaz de interaccionar con Smad-2, Smad-3 y Smad-4 aumentando la transcripción de la ruta TGF-β dependiente de Smad [43]. Además Notch también está implicado en una ruta de señalización independiente de CSL [44]. La ruta de Notch es crucial para la formación del brote angiogénico. La activación de esta ruta se ve modificada por la respuesta heterogénea a VEGF de las células endoteliales implicadas en el proceso de angiogénesis, de manera que en aquellas células que responden activamente a VEGF, denominada célula emergente o “tip” se produce un aumento en la expresión del ligando Dll4 [45], en esta célula “tip” los niveles de la ruta de Notch no son muy altos ya que hay un antagonismo por Jagged1 de Dll4. Esto hace que se produzca un incremento en la expresión de VEGFR2 y una disminución en VEGFR1, lo que aumenta la sensibilidad de esta célula emergente a VEGF [46]. En general eso promueve que esta población celular adquiera un fenotipo migratorio y “emerja” para migrar desde el vaso parental. Los receptores de Notch en las células vecinas (“stalk”) se unen a los ligandos Dll4 y activan la ruta de Notch e inhiben la expresión de VEGFR2 y el proceso de gemación en estas células. Las células stalk sobreexpresan Jagged1, que antagoniza la actividad Dll4. Ello limita la señalización de Notch en las células emergentes que mantienen su respuesta a la estimulación por VEGF y migran para establecer el nuevo vaso. La actividad de Jagged1 depende de Fringe. En mamíferos existen 3 proteínas Fringe: lunatic fringe, manic fringe y radical Intro   fring rece regio un r inme final tetra a un con       oducción ge. Estas p eptor de N ones espe residuo de ediatament mente se asacárido l na activació el ligando Figura 8. E señalización tip o stalk en Figura adap proteínas Notch med ecíficas de e fucosa. te un resid e incorpor a interacci ón de la ru Jagged da Especializació n de VEGF y n el endotelio tada de Rui B son N-Ace iante la a las repetic Tras la u duo de gala ran 4 res ión del rec uta, mientr a lugar a u ón célula tip/ Notch están i vascular. Benedito et al, 56  etilglucosa adición de ciones EG unión de l actosa y ot siduos de ceptor de N ras que la na inhibici /stalk durant implicadas en 2009 (Ref. 17 miniltransf N-acetilgl GF donde p a N-acetil tro de ácid azúcar. Notch con interacción ón (Fig. 8) te el brote an n la especializ 73) ferasas qu lucosamina previamen glucosami do siálico, d En prese el ligando n del recep ). ngiogénico. L ación de las c ue modifica a (GlcNAc nte se ha u ina se añ de manera encia de o Delta da ptor modifi Las rutas de células hacia an el c) en unido aden a que este lugar cado Introducción 57    2.2.3. La ruta de señalización de TGF-β. El factor de crecimiento transformante β (TGF-β) es una citoquina multifuncional que regula varias funciones celulares como proliferación, diferenciación, migración, adhesión, apoptosis y supervivencia de diferentes tipos celulares [47]. Experimentos de ganancia y pérdida de función en ratones han demostrado que el factor TGF-β es importante durante el proceso de embriogénesis y en el mantenimiento de la homeostasis durante la vida adulta [48]. En el sistema cardiovascular la ruta de TGF-β está implicada en procesos de arteriogénesis, angiogénesis, en el desarrollo cardiaco y patologías cardiovasculares [49, 50], en el remodelado de la matriz extracelular y en el desarrollo de la fibrosis [51]. Además las acciones del TGF-β son altamente dependientes del contexto celular. La familia de TGF-β incluye más de 40 miembros, que tienen en común una estructura dimérica y la presencia de un motivo estructural de cisteínas. Esta familia está dividida en varias subfamilias: TGF-βs, proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), factores de diferenciación y crecimiento (GDFs), factor inhibitorio Mulleriano (MIF) y activinas o inhibinas. En mamíferos están presentes tres isoformas de TGF-β, TGF-β1, TGF- β2 y TGF-β3. Se secretan en forma latente por lo que necesitan ser activadas por proteasas o trombospondina antes de unirse a su receptor específico. Estos receptores son proteínas serina/treonina quinasa unidas a superficie de tipo I y II (TβR-I y TβR-II), que forman complejos heteroméricos en presencia de los ligandos dimerizados. Además los ligandos también pueden unirse a co- receptores de endoglina y betaglicano, conocidos como receptores tipo III (TβR-III) [52-54]. El ligando soluble se une al receptor tipo II que está constitutivamente activo, después se produce la interacción y fosforilación del receptor tipo I, lo que da lugar a un complejo ligando-receptor activado. Posteriormente el receptor I fosforila las proteínas efectoras que se encuentran por debajo en la cascada de señalización: las Smads. La familia de las Smads se encuentra muy conservada y se divide en tres grupos: a) R-Smads: Son Smads asociadas a receptor. Intro   b c sust rece Sma com trans de e regu oducción b) Co-Smad c) I-Smads: Se han rato para eptores act ad8 median Una vez plejo se d scripción, s estos gene ulación neg Figura 9. R TGF-β seña TGF-β norm dependiendo BMP4) son cambio otras Figura adap ds: Son Sm : Son Sma descrito ci los diferen tivados po n rutas de z fosforilad dirige al n se une y re es diana s gativa de la Ruta de señal aliza a través malmente supr o de la prese proangiogén s (BMP9 y BM tada de Matth mads coop ads inhibito inco Smad ntes recep or TGF-β y señalizació da esta R-S núcleo don egula prom son Smad6 a ruta de s lización TGF- de TGFβR-II rime la prolife encia de otros nicas, increm MP10) suprime hew T. Holderf 58  peradoras. orias. ds asociada ptores. S y activinas ón activad Smad se u nde en co motores de 6 y Smad eñalizació -B/BMP en c y Alk1 en cél eración y pod s factores, co entando la m en la proliferac field and Chris as a recep mad2 y S s; mientras as por BM une a la C olaboración e diferentes 7, cuya ex n del TGF- células endot lulas endotelia ría suprimir o omo el VEGF. migración de ción y migraci stopher C.W. ptor en hum mad3 son s que Sm MPs, GDFs Co-Smad (S n con otro s genes di xpresión d -β [57] [4] ( eliales en an ales activando o incrementar . Algunas BM células end ón. Hughes, 2008 manos, que n sustrato mad1, Sma y MIFs. Smad4), y os factore iana [54]. da lugar a (Fig. 9). ngiogénesis. o las Smads. la migración MPs (BMP2 y doteliales, en 8 (Ref.31) e son para ad5 y este es de Dos a una Introducción 59    Se ha descrito que la ruta de TGF-β coopera con la ruta de Notch en el proceso de angiogénesis. El bloqueo de ALK1 durante el desarrollo postnatal en ratón da lugar a una hipervascularización en la retina. El bloqueo conjunto de ALK1 y la ruta de Notch genera una hipervascularización exacerbada, mientras que la activación de ALK1 es capaz de rescatar el fenotipo de hipervascularización producido por la inhibición de la ruta de Notch [55]. Además se ha descrito que la señalización por BMP mediada por Smad1/Smad5 coopera con la ruta de Notch en la selección de las células tip y stalk. La inactivación específica de endotelio de las proteínas Smad1/Smad5 en embriones de ratón da lugar a una señalización de Notch alterada, lo que produce un aumento del número de células tip [56].También se ha descrito la cooperación de las rutas de Notch y TGF-β en modelos in vitro, donde NICD y Smad3 cooperan en la activación de promotores sintéticos específicos de Notch y Smad, como el promotor fusionado a luciferasa CAGA Luc [57]. 2.3. Componentes de la ruta de Notch: receptores, ligandos canónicos y dianas. 2.3.1. Receptores de la ruta de Notch. Existen cuatro receptores de la familia Notch en mamíferos (Notch 1-4). Son proteínas transmembrana tipo I que se sintetizan como precursores de cadena única y que son sometidos a glicosilación por la o-fucosiltransferasa (POFUT1) en el retículo endoplasmático y posteriormente procesados por una furina en el trans-Golgi dando lugar a las dos subunidades extracelular (NECD) e intracelular (NICD) que se encuentran unidas de forma no covalente [32, 38, 58, 59] (Fig. 10). Intro   El do a b c Adem al nú oducción Figura10. R transmembr EGF y repet asociación (ANK), y un Notch 1 y activación tr ominio extr a) Un dom en con secunda repeticio ligando. b) Un dom c) Tres re indepen más prese úcleo. Receptores N rana heterodim ticiones LIN/N RBPJκ), secu na secuencia Notch2, de f ranscripcional racelular (N minio de 29 ncreto), qu arias de g ones son . minio de he epeticiones ndiente de entan un do otch. Se han méricas que e Notch. El domi uencias de lo a PEST (moti forma similar (TAD). NECD) con 9-36 repetic ue pueden glicosilació esenciale terodimeriz s Notch/LI ligando. ominio tran 60  n identificado c en el dominio nio intracelula ocalización nu ivo rico en p a Notch en ntiene: ciones EG n unir ca ón y fuco es para q zación [62 IN-12 (LN nsmembra cuatro recepto extracelular c ar contiene un uclear, siete prolina/ácido Drosophila, F (depend alcio [60] osilación [6 ue se pro 2]. R), que l ana, implica ores Notch. S contienen repe dominio RAM repeticiones d glutámico/seri contienen un diendo del y sufrir 61] . Algu oduzca la imitan una ado en tran Son proteínas eticiones tipo M (módulo de de anquirina ina/treonina). n dominio de receptor N modificaci unas de e unión co a señaliza nsmitir la s Notch ones estas on el ación señal   El do a b c mien peric 2.3.2 prote una (Delt en D Esto trans ominio intr a) Seis rep transmis b) Un dom c) Una sec de la pr Los rec ntras que citos. El re 2. Ligando Los liga eínas trans familia de ta, Serrate Delta-like (D os ligandos smembran racelular (N peticiones sión de las minio rico e cuencia C- roteína. ceptores N Notch 3 s ceptor Not os canónic andos can smembran ligandos, e y Lag2) Dll1, Dll3 y s están c na y una re NICD) con de anquir s señales. n glutamin -terminal P Notch 1 y se expresa tch 2 se ex cos de la ónicos qu na de tipo I que se car [63, 64]. L y Dll4) o Se compuesto egión intrac 61  ntiene: rina en tán na. PEST, que y 4 se ex a en las xpresa en c ruta de No e unen y I. La mayo racteriza p Los ligando errate Jagg s por un celular (Fig Figura Notch Jagge tres m transm extrac 2), d repetic Difiere compo ndem, que e facilita la xpresan en células m cardiomioc otch. activan lo oría de esto por la prese os DSL en ged-like (J dominio e g. 11). a 11. Ligand h. En mamí d y Delta-like, miembros re membrana q elular con un ominios DO ciones tipo EG en en el núme osición de los e son nece a degradac n el endo usculares citos. os recepto os ligandos encia de u n mamífero Jagged1 y extracelula dos canónic íferos tienen , donde se ha espectivament que contien dominio DSL S (Delta y GF y una regi ero de repetic dominios. Introduc esarias pa ción proteo otelio vasc lisas y en ores Notch s pertenec un dominio os se clasi y Jagged2) ar, un dom cos de recep n dos subfa an identificado te. Son pro nen una (Delta/Serrate y como OS ión rica en cis ciones EGF y cción ara la olítica cular, n los h son cen a DSL ifican ). minio ptores amilias, o dos y oteínas región e/LAG- SM-11), steína. y en la Introducción 62    El dominio extracelular (ECD) contiene: a) Un dominio N-terminal, que puede subdividirse en dos regiones diferentes según el contenido en cisteínas: la región N1 rica en cisteínas y la región N2 libre de cisteínas. b) Un dominio DSL. c) Unos dominios de tipo EGF (factor de crecimiento epidérmico) en tandem (6-16), que están compuestos por unos 40 aminoácidos, entre ellos 6 cisteínas que son capaces de formar puentes disulfuro. El dominio DSL junto con el extremo N-terminal y las dos primeras repeticiones EGF son necesarios para que estos ligandos se unan a los receptores Notch. Además presenta un dominio transmembrana, que une las dos regiones extracelular e intracelular. La región intracelular (ICD) de estos ligandos presenta un dominio C-terminal citoplasmático muy corto detrás del dominio transmembrana. Estas secuencias no están muy conservadas pero contienen múltiples lisinas en las que se podría añadir un residuo de ubiquitina para regular el tráfico intracelular de proteínas. Además muchos ligandos presentan en su dominio C-terminal dominios putativos PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1) [65] que son necesarios para que se den interacciones con el citoesqueleto. 2.3.3. Dianas de la ruta de Notch. Tras la activación de Notch, la formación del complejo ternario que contiene CSL, NICD y Mam es esencial para regular la transcripción de los genes diana de esta vía [32, 66]. Los genes diana de Notch-CSL mejor definidos son la familia de factores de transcripción bHLH (basic Helix Loop Helix), HES (Hairy Enhancer of Split) y Hey (Hairy/Enhancer of Split-related with YRPW motif). Estos fueron los primeros en los que se observó un cambio en la transcripción después de la activación de la ruta de Notch [67]. Todas las proteínas HES/HEY parecen funcionar como represores transcripcionales. Presentan un motivo común WRPW/Y en el extremo C-terminal, que es suficiente para reclutar corepresores transcripcionales de la familia Groucho [68, 69]. Introducción 63    Además se han encontrado genes implicados en proliferación y apoptosis que están también regulados directamente por Notch. Myc es un gen diana en varios tipos de células cancerosas y en células de Drosophila [70-73]. Otros genes diana directamente implicados en promover la proliferación son ciclina D [74-76], string/CDC25 [71, 72] y CDK5 [72]. En otros contextos Notch puede activar inhibidores del ciclo celular como p21[77]. Reaper y Wrinkled/hid en Drosophila son genes efectores de apoptosis directamente controlados por Notch [71], al igual que ocurre con bcl2 en mamíferos [78]. También existen componentes de la ruta de Notch que son dianas en sí mismos de esta vía; Deltex1 es una ubiquitin ligasa que regula el tráfico de Notch y es además una diana transcripcional [79], NRARP es un inhibidor de Notch que parece ser diana de la ruta en un amplio rango de tipos celulares en vertebrados [80, 81] y otros descritos como dianas en invertebrados son neuralized, numb y kuzbanian/Adam10 [82]. Además se ha descrito que Notch1 autoregula su transcripción durante el desarrollo de los timocitos [73, 83]. También se han identificado como dianas componentes de otras rutas de señalización. Entre ellos se encuentran múltiples reguladores de la ruta de Ras identificados mediante bioinformática y screening genético en C.Elegans, donde una fosfatasa MAP quinasa, LIP-1 es una diana directa con otros cinco reguladores negativos de la ruta RAS-MAPK [84, 85] [86](Fig. 12). También se ha descrito que las proteínas Notch regulan la expresión de genes que están implicados en funciones celulares. Entre ellos destaca la familia de proteínas SNAIL constituida por los factores de transcripción Snail y Slug, reguladores clave implicados en la transición epitelio mesénquima [12] que se produce durante la formación de las válvulas cardiacas [87] . Slug es un represor transcripcional cuya expresión está inducida cuando la ruta de Notch se activa por unión del receptor de Notch con el ligando Jagged1. La expresión de Slug es necesaria para la represión del promotor de la VE-Cadherina y de la E-Cadherina, implicados en promover la migración de las células endoteliales transformadas, fenómeno clave en el desarrollo del corazón [88, 89]. Además otros autores han descrito una implicación directa de la ruta de Notch vía Snail en el desarrollo de la transición epitelio mesénquima que sufren Intro   las c fibro   2.4. en c actú más hum nom feoc glán codif oducción células ep osis intersti Figura 12. D interacción e complejo de une a CSL salidas, con El tamaño in Figura adap DLK1: Li DLK1 (e carcinomas a como re tarde en mano duran mbres: pG2 cromocitom dula adre fican para piteliales d cial en la e Diversidad de entre el ligand e la gamma s y recluta Ma algunos de lo ndica la frecue tada de Sarah igando no el homólog s de pulmó egulador n 1994 se a nte el seg 2 (a partir d ma) [94] y Z nal) que e la misma del túbulo enfermeda e dianas de N do y el recept ecretasa para am para activ os genes dian encia con la qu h Bray y Fred o canónic go de delta ón [91], y c egativo de isló el ant gundo trim de un clon ZOG (Fact es el hom proteína. 64  proximal ad renal pro Notch. Diagra tor permite el a liberar el No var los genes na. Se indica l ue una base o Bernard, 2010 co de la r a like 1) fu como el fa e la difere tígeno feta mestre. Ad n de cDNA tor específ mólogo de   para contr ogresiva [8 ama simplifica corte por la m otch activo [90 s diana. Las la secuencia c ocupa una pos 0 (Ref. 86) ruta de N e inicialme ctor pread nciación a al 1 (FA 1) demás se A que se en fico de la z Dlk1 en r ribuir al de 89]. do de la ruta metaloproteasa 0]. En el núcl flechas indica consenso de u sición determin otch. ente identif ipocitario 1 adipocitaria ) [93] del fl le denom ncontraba zona del g rata. Todo esarrollo d de Notch. La a ADAM y el leo, NICD se an diferentes unión a CSL. nada. ficado en 1 (Pref-1), a [92]. Un fluido amni minó con aumentad glomérulo os estos g de la 1993 que n año iótico otros do en de la enes Introducción 65    La expresión de DLK1 se detecta a día 11 del periodo embrionario en ratón con un incremento progresivo de sus niveles hasta el final de la gestación [92, 95]. A los 12.5 días del estado embrionario la expresión de Dlk1 es elevada en glándula pituitaria, páncreas, pulmón, glándula adrenal, placenta y muchos tejidos derivados del mesodermo (músculo esquelético y cartílago) [96, 97]. A los 16.5 días del estado embrionario los niveles de Dlk1 disminuyen en la mayoría de estos tejidos aunque permanecen en la glándula pituitaria, adrenal y músculo esquelético. En embriones humanos la expresión es similar al ratón, y la expresión en adulto se restringe a determinados tipos celulares, como células β del páncreas, células somatotropas de la glándula pituitaria, médula ósea, glándula adrenal y músculo esquelético [93, 95, 98-100] . 2.4.1. Estructura de Dlk1. El gen que codifica para DLK1 contiene 5 exones y 4 intrones. El inicio de la transcripción se encuentra a 169 pb por encima del codón de iniciación. En el gen de Dlk1 se produce splicing alternativo que puede alterar la estructura y función de la proteína resultante. En cada forma alternativa de este gen, la región yuxtamembrana extracelular es delecionada total o parcialmente, lo que da lugar a reorganizaciones en las repeticiones tipo EGF localizándolas más próximas a la membrana [101] DLK1 se sintetiza como una proteína de 385 aminoácidos con una secuencia señal en el extremo N-terminal y un único dominio membrana de 300-322 aminoácidos. Pertenece a la familia de proteínas de tipo EGF y presenta en su dominio extracelular 6 repeticiones en tándem de tipo EGF, que contienen 6 cisteínas conservadas para la formación de 3 enlaces disulfuro, así como otros aminoácidos característicos de las proteínas que presentan estos dominios de repetición tipo EGF. Esta proteína se procesa proteolíticamente en un sitio yuxtamembrana y próximo al extremo N-terminal para generar las formas solubles, una mayor de 50 kDa y una más pequeña de 25 kDa respectivamente. Este procesamiento de la proteína se da por una proteasa de la familia ADAM, la enzima convertidora de TNF-α (TACE, ADAM17). Intro   Deb reorg mem Las EGF form oducción ido al spl ganización mbrana [10 formas A y Las form F. En las fo mas C, C2, Figura 13. E V) y 4 intron La proteína señal; EGF citoplasmáti licing alter n de las re 02]. Por ell y B dan lug mas C, C2 ormas D y D y D2 se Estructura de nes. Hay varia se organiza e REPEATS, re co. rnativo qu epeticiones o es posib gar a la iso , D y D2 a D2 la 6º re suprime u e Dlk1. La est as isoformas d en las siguien epeticiones d 66  ue se da s tipo EGF ble encontr oforma may afectan tod epetición d un sitio pot tructura del ge de la proteína ntes regiones: e tipo EGF; J a nivel d F localizánd rar varias yor soluble das al 6º do e EGF-like encial de N en está comp que se origin : UT, región n JM, región yu de gen se dolas más isoformas e de 50 kD ominio de e se pierde N-glicosilac uesta por cinc an por splicing no traducida; S xtamembrana e produce s próximas de la prot Da. la repetici e entera. E ción (Fig. co exones (I- g alternativo. S, secuencia a; C, dominio una s a la eína. ones En las 13).   pate ratón encu (Rtl1 pate capa con emb deio degr es m term adip Dlk1 se e erna que s n (12F1), uentra Dlk 1) y Dio3 q erna (Fig. 1 Figura 14. Re genes que heredado p desde el cr elemento int los genes c activos. Peg11 acidad par la familia brionarios, nidasa tipo rada hormo muy impor mogénesis ocito marr encuentra e se encuent y en el cr k1 contiene que se exp 14) epresentació codifican par or vía patern romosoma he tergénico DM codificantes s (Rtl1) es ra retrotra a de retr principalm o 3 (D3), ona tiroide rtante para [103, 104 rón [105]. en un clust tra localiza romosoma e 3 genes presan des ón esquemáti a proteína; D na y múltiples eredado por R (IR-DMR), q sean reprimido un gen nsponerse rotransposo mente en p una enzim ea (T3) en a la funcio ], ya que 67  ter de gene ado en la a 14 huma s que codi sde la copia ca del cluste Dlk1, Rtl1 y D s genes no c vía materna. que se encue os en el crom tipo retr e de forma ones Ty3 placenta. D ma conserv metabolito onalidad d es capaz es regulad zona dista ano (14q32 fican para a del crom er Dlk1-Dio3.E Dio3, expresad codificantes R . Esta impron entra entre Dlk mosoma mat otransposo a autónom 3/gypsy. S Dio3 codif vada que c os inactivo del tejido a de estimu o por impr al del crom 2). El dom a proteínas mosoma he Este dominio c dos desde el RNA (ncRNA) nta está regu k1 y Gtl2, lo q erno y los nc on que h ma y mues Se expres ica para la contiene se os. Esta ho adiposo m ular la dife Introduc ronta genó mosoma 1 minio dond s: Dlk1, P eredado po contiene tres l cromosoma ) expresados ulada por el que hace que cRNAs sean ha perdido stra homo sa en est a yodo-tiro elenociste ormona tiro marrón (BA erenciación cción ómica 2 de de se eg11 or vía o su ología tados onina ina y oidea AT) y n del Introducción 68    Además 7 genes ARNs no codificantes se expresan desde la copia del cromosoma heredada materna: Meg3/Gtl2, Anti-Peg11, Meg8, Irm/"Rian", AK050713, AK053394 y Meg9/Mirg [106]. La mayoría de estos genes no codificantes contienen microRNAs (miRNAs) y/o RNAs nucleares pequeños (snoRNAs) dentro de sus intrones. Se ha demostrado que la organización y la impronta de este dominio está altamente conservado en humano, ratón y cordero [107, 108]. Este dominio además es muy importante en la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS), ya que la generación de estas células normalmente da lugar al silenciamiento epigenético del cluster. Se encuentra activado en células totalmente pluripotentes y reprimido en células parcialmente pluripotentes. Así, el grado de activación de esta región está directamente relacionado con el nivel de pluripotencia de las células madre [109, 110]. Por ello, la modulación de la impronta genómica en las células madre aporta un nuevo nivel de regulación epigenética para establecer y mantener estas células. La proteína DLK1 fue una de las primeras proteínas descritas como ligando no canónico de la ruta de Notch, debido a la homología estructural que tiene con la familia de proteínas Notch/Delta/Serrate. Sin embargo no contiene el dominio DSL (Delta-Serrate-LAG2) que si presentan los ligandos canónicos de Notch en la región extracelular, y que es necesario para que se dé el reconocimiento y la interacción entre el ligando y el receptor [64, 111]. En su lugar presenta un dominio DOS (Delta y OSM-11) en su extremo N-terminal. Este motivo está presente en algunos ligandos canónicos de los receptores Notch, y en proteínas solubles o ancladas a membrana, que van a colaborar en la activación de la ruta de Notch con los ligandos que contienen el dominio DSL [66, 112]. DLK1 también es un marcador de células madre. Recientemente se ha demostrado la implicación de DLK1 en neurogénesis. La forma soluble de la proteína secretada por los astrocitos se une a la forma de DLK1 anclada en la membrana de las células madre neuronales, manteniendo así la capacidad de autorrenovación de las mismas [113]. También es un marcador de células   mad cond 2.5. de p dre en híga drogénesis Papel fis DLK1 es progenitore Figura 15. celulares. L tipos celular hueso, cartí diferenciarse nervioso. Figura adap ado fetal hu s temprano siológico stá implica es mesenq Diferenciació Las células ma res y tejidos m ílago, músculo e en tejidos tada de Capla umano [11 o a partir de de DLK1 ado en la d uimales de ón de célula adre mesenqu mesenquimale o, estroma, te de origen no an y Bruder, 2 69  4], y adem e células p . diferenciaci erivados de as madre me uimales prolife es. Estas célu endones y tej o-mesenquima 001 (Ref. 116 más está im progenitora ión de vari e médula ó esenquimales eran antes de d ulas pueden d jido adiposo. al como hígad 6) mplicado en as [115]. os tipos ce ósea [116] s (MCS) en v diferenciarse e iferenciarse e Además son do, corazón, Introduc n el proces elulares a (Fig. 15). varios tipos en diferentes en células de capaces de piel y tejido cción so de partir Introducción 70    Estos procesos de diferenciación son: a) Hematopoyesis [117-120]. Dlk1 es un regulador muy importante en la proliferación de progenitores hematopoyéticos. El uso de una fracción soluble de DLK1 humano permite inhibir la diferenciación de células madre hematopoyéticas. b) Adipogénesis [121-125]. El adipocito es la célula especializada en acumular grasa y que puede ser utilizada en periodos de deprivación para obtener energía, por lo que el tejido adiposo es muy importante en el metabolismo energético. Además el adipocito puede liberar citoquinas implicadas en regular la homeostasis energética como la leptina y la adiponectina [126, 127] o citoquinas inflamatorias, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la interleukina-6 (IL-6) [128]. El proceso de diferenciación de los adipocitos se encuentra gobernado por el receptor γ activado por proliferadores del peroxisoma (PPARγ) y la familia de factores de transcripción que son proteínas de unión al activador CCAAT (C/EBP), que se encuentran bajo el control de hormonas e interacciones célula-célula y célula-matriz [122]. Durante la diferenciación adipocitaria temprana C/EBPβ y D/EBPδ se inducen por dexametasona e isobutilmetilxantina respectivamente. Estos a su vez inducen PPARγ y C/EBPα activando marcadores adipocitarios esenciales para la función del adipocito. El proceso de diferenciación puede observarse in vitro en la línea celular preadipocitaria 3T3-L1, la cual se diferencia hacia adipocito maduro tras el tratamiento con el cóctel de diferenciación: insulina + dexametasona + metilisobutilxantina [129]. PREF-1 se expresa en elevados niveles en los preadipocitos, pero disminuye durante la diferenciación, debido a la dexametasona. Hay una correlación directa entre la disminución de PREF- 1 y la eficiencia en el proceso de diferenciación en las células 3T3L1 [130, 131]. Finalmente está ausente en los adipocitos maduros, por lo que se utiliza como marcador de adipogénesis [92, 132]. PREF-1 se describió como inhibidor de la diferenciación adipocitaria [92, 122, 133, 134] impidiendo la acumulación de lípidos y la expresión de factores de transcripción implicados en el proceso de adipogénesis. Este Introducción 71    efecto inhibitorio es mediado por la forma soluble de mayor tamaño (50 KDa) [135], que es capaz de inducir el factor de transcripción Sox 9 a través de la activación de ERK. Este factor de transcripción se une a regiones del promotor de C/EBP β y δ suprimiendo su transcripción [136]. Dlk1 no interacciona con Notch para realizar esta función sino que es capaz de interaccionar directamente con fibronectina mediante el dominio yuxtamembrana de Dlk1 y el dominio C-terminal de la fibronectina [137]. DLK1 activa las moléculas de señalización a partir de integrina, FAK y Rac, para activar MEK/ERK e inhibir finalmente la diferenciación adipocitaria [138]. Además los niveles de Dlk1 en los preadipocitos se pueden modular por miR-15a [139] c) Osteogénesis [140]. Se ha identificado Dlk1 como un regulador en la diferenciación del adipocito y osteoblasto de células madre mesenquimales humanas (hMSC). Se ha determinado la importancia de DLK1 en este proceso en modelos de ratón y enfermedades humanas caracterizados por la deficiencia o sobreexpresión de Dlk1, asociado con varios defectos en el desarrollo que afectan a cambios en el crecimiento y en la cantidad de grasa así como con malformaciones esqueléticas [141, 142]. d) Diferenciación celular neuroendocrina [143]. En ratones deficientes en Dlk1 no se produce correctamente la neurogénesis postnatal en la zona subventricular [113]. En estados embrionarios tempranos Dlk1 se expresa en las células primordiales adrenogonadales [144]. Las células β del páncreas y las células somatotropas de la pituitaria producen hormonas circulantes bajo el control de señales que provienen del sistema nervioso. Las células β producen insulina en respuesta a niveles bajos de glucosa en suero, y las células somatotropas secretan la hormona de crecimiento (GH). Existe una correlación inversa entre los niveles de DLK1 en suero y GH. Así cuando hay niveles elevados de GH circulantes disminuye la cantidad de DLK1 soluble en suero. En cambio en preadipocitos de rata, la GH exógena impide la diferenciación adipocitaria inducida por la disminución de la expresión de DLK1. La hormona de crecimiento ejerce muchos de sus efectos estimulando la producción de IGF-I, y la sobreexpresión de DLK1 disminuye la Introducción 72    señalización de IGF-I, lo que refleja la capacidad de DLK1 para disminuir GH [145, 146]. La placenta es otro órgano endocrino, implicado en el control del crecimiento fetal mediante la producción de factores de crecimiento y a través de la regulación de la transferencia de nutrientes al feto. DLK1 se expresa en las células endoteliales fetales. e) Diferenciación de hepatocitos [147]. DLK1 se expresa en hígado fetal. Es un marcador para hepatoblastos, que es el tipo celular progenitor común de hepatocitos y células epiteliales biliares. f) Diferenciación del sistema nervioso central y periférico. Se ha detectado la presencia de las isoformas FA1/dlk en el sistema nervioso central humano y de rata. g) Diferenciación de condrocitos. Se ha descrito DLK1 como un marcador de superficie para células madre progenitoras de los condrocitos, y se ha visto que esta proteína es fundamental para inducir la condrogénesis [115]. Además se ha encontrado la implicación de DLK1 en procesos de cierre de heridas donde se ha relacionado con el proceso de reparación de las mismas in vivo, ya que se ha detectado expresión de DLK1 en un tejido mesenquimal no diferenciado de la zona de reparación de tejido de la oreja de ratones MRL (Murphy Roth Large), que cura con mucha facilidad las lesiones infligidas regenerando sus células y C57BL/6 siendo en los ratones MRL donde más se expresa DLK1 y los que mayor capacidad de reparación tisular presentan [148, 149]. 2.6. Papel fisiopatológico de DLK1. Además DLK1 se ha implicado en varios procesos fisiopatológicos: a) Está implicada en riesgo y progresión en determinados cánceres en niños: Introducción 73    Neuroblastoma: es una forma de cáncer infantil que se origina a partir de progenitores de la cresta neural. Suele comenzar con mayor frecuencia en las glándulas suprarrenales, localizadas en la parte superior de los riñones. Más en concreto muchos de estos tumores se generan en la medula adrenal que está constituida principalmente por las células cromafines, responsables de la producción de noradrenalina mediante la dopamina β hidroxilasa (DBH) a partir de dopamina. Se ha descrito que la expresión de DBH se correlaciona con la expresión de DLK1 en líneas celulares de neuroblastoma, donde además un aumento de DLK1 da lugar a una población de precursores de células cromafines en la que no se ha completado el proceso de diferenciación [150]. Glioma: es una tipo de tumor que se origina en el cerebro o en la médula espinal y donde se ha encontrado una mayor expresión de DLK1 comparada con cerebros normales [151]. Tumor de Wilms o nefroblastoma: es una neoplasia maligna del riñón y el segundo tipo de cáncer abdominal más frecuente en niños. En esta patología se han encontrado sobreexpresados varios genes sujetos a impronta genómica, entre ellos Dlk1 [149, 152]. b) Está implicada en determinados tumores en adultos. Se expresa en una subpoblación de células ovales hepáticas, que son consideradas como células madre/progenitoras en hígado de rata adulta [153]. En carcinoma hepatocelular (HCC) un 20,5% de los casos examinados fueron positivos para Dlk1, también en adenocarcinoma de colon (58%), en carcinoma de isletas pancreáticas (50%) y en carcinoma de pulmón (50%). De forma que Dlk1 es una proteína de superficie que se expresa en muchos carcinomas, incluidos HCC y puede ser una diana potencial para terapia de anticuerpos monoclonales para carcinomas [154]. Leucemia mieloide aguda (AML): es un tipo de cáncer producido en las células que normalmente madurarían hacia los diferentes tipos de células sanguíneas. En la mayoría de los casos se origina de células que se convertirían con glóbulos blancos, de forma que las células madre mieloides se convierten en un tipo de glóbulos blancos inmaduros. En muchos casos de esta enfermedad se ha encontrado Introducción 74    una sobreexpresión de DLK1 debido a una pérdida de la impronta genómica [155]. c) DLK1 está asociada con hipertrofia muscular en un modelo de ratón en el que hay sobreexpresión [156]. Existe una mutación denominada Callipyge en ovino, en la que se detecta un aumento de los niveles de DLK1. Estos animales presentan una mayor masa muscular esquelética en los cuartos traseros donde se ha detectado un aumento en las fibras de tipo IIB de miosina [157]. En los ratones en los que hay sobreexpresión de DLK1 específica en músculo también hay un incremento en la masa total muscular y en el diámetro de las fibras a las 6 semanas de nacer. d) También podría haber una relación entre los niveles de DLK1 y los sujetos obesos. En concreto, se han detectado mayores niveles de la isoforma soluble (FA1) en suero de pacientes obesos [158]. e) Al estar la expresión del gen de Dlk1 sujeta a impronta genómica, de forma que se expresa únicamente desde la copia heredada paterna, si se heredan las dos copias desde un único parental se desarrollan las disomias uniparentales del cromosoma 14 (UPD14). Dependiendo del origen de la copia parental se dan dos fenotipos diferentes: - UPD14 materna: que cursa con retraso en el crecimiento pre- y post- natal, pubertad precoz, hipotonía, retraso leve en el desarrollo, obesidad, articulaciones hiperextensibles, macrocefalia y escoliosis. - UPD14 paterna: tiene un fenotipo más severo que la materna y cursa con polihidramnios, anormalidades esqueléticas con desarrollo de brazos y piernas más cortos, torax estrecho y dificultad respiratoria, retraso mental de moderado a severo, escoliosis y rasgos faciales diferentes como por ejemplo orejas y ojos más pequeños. La implicación de DLK1 en el contexto de la angiogénesis hasta el momento es que se ha detectado su expresión en las células endoteliales de los vasos sanguíneos y mayores niveles de DLK1 en zonas de ramificación de la vasculatura durante el desarrollo en órganos vascularizados como páncreas, pulmón y glándula submandibular [97]. No se conoce si la modulación de los Introducción 75    niveles de la proteína puede afectar al proceso de formación de vasos, ni en condiciones fisiológicas ni en condiciones patológicas. Esta ausencia ha fundamentado el planteamiento de los siguientes objetivos: Introducción 76          OBJEETIVOSS       Objetivos 79    3. OBJETIVOS   1. Estudiar la expresión de DLK1 en el contexto de la fisiología y fisiopatología del endotelio vascular. 2. Una vez determinada la expresión de DLK1 en células endoteliales de organismos de diferentes especies adultas (humana, bovina, porcina y murina), nos propusimos estudiar cuál es su papel en estas células. Decidimos centrarnos principalmente en el proceso de la angiogénesis por dos causas; primero por su hallazgo en el endotelio y segundo porque estaba descrito en la bibliografía como un ligando no canónico de la ruta de Notch, que es muy importante en la formación de la vasculatura. Para estudiar la implicación de DLK1 en el proceso de la angiogénesis utilizamos varias aproximaciones: a) Experimentos desarrollados in vitro mediante la formación de angiotubos por células endoteliales sobre una matriz de matrigel. b) Experimentos desarrollados ex vivo mediante explantes de anillos de aorta. c) Experimentos desarrollados in vivo mediante implantación de estructuras de matrigel “plugs”, estudio de la formación de vasos en el pez zebra y el estudio de la formación de la vasculatura en la retina del ratón. 3. Estudiar si los niveles de la proteína DLK1 afectan además al desarrollo de una vasculatura patológica, utilizando para ello un modelo de células tumorales en el pez zebra. 4. Una vez determinada la implicación de DLK1 en el proceso de angiogénesis, estudiar si los primeros procesos que se dan en la formación de los vasos, como son la migración, proliferación y apoptosis están también alterados. Objetivos 80    5. Elucidar cuál es el mecanismo molecular por el cuál DLK1 interfiere en el desarrollo de los vasos, y en particular su interacción con la ruta de Notch. Determinar el nivel de interacción con dicha ruta. 6. Estudiar si la ruta de TGF-β puede verse también afectada por variaciones en los niveles de DK1.       MAATERIAALES YY MÉTOODOS       Materiales y Métodos 83    4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Materiales LINEAS CELULARES   3T3-L1: Son fibroblastos de embrión de ratón, que pasan de tener un fenotipo preadipocitario a diferenciarse a adipocitos. Esta diferenciación se induce por la confluencia, concentración de suero y presencia en el medio de cultivo de otros componentes, como son la insulina, isobutilmetilxantina y dexametasona. Se cultivan en Medio Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM) + 10% suero de ternera recién nacida [159] + 1% penicilina/estreptomicina (P/S). HEK293A: Se trata de una línea renal embrionaria humana utilizada para la producción, amplificación y titulación de adenovirus defectivos. Esta línea contiene una copia del gen E1 integrada de forma estable, que aporta las proteínas E1a y E1b necesarias para generar los adenovirus recombinantes. Se cultiva en D-MEM + 10% Suero Bovino Fetal FBS + 1% P/S. MLEC: Son células endoteliales de pulmón de ratón. Estas células se aislaron a partir de los ratones de cepa 129 SvJ/XI control (WT) y de ratones carentes de Dlk1 (KO). Tras dislocación cervical se extrajeron los pulmones, se trocearon y digirieron con colagenasa al 0,1% en Hank´s Balanced Salt Solution (HBSS), hasta que se obtuvo una suspensión homogénea de células. Esta población celular mixta se sometió primero a una selección negativa con el anticuerpo FCsRII/III (CD16/CD32) para eliminar los macrófagos y a otra selección positiva posterior con el anticuerpo ICAM-2 (CD102) específico para células endoteliales. Como anticuerpo secundario se utilizó un anti-IgG unido a bolas magnéticas, para poder capturar las células mediante un imán. Estas células se sembraron sobre una matriz de gelatina al 0,1%, fibronectina (10 µg/ml) y colágeno tipo I (20 µ/ml) preparada en PBS 1x y se cultivaron en D- MEM:Ham F-12 (1:1) + 20% FBS + Glutamina (2 mM) + Heparina + ECGF + P/S 1%. Materiales y Métodos 84    HUVEC: Son células endoteliales de vena de cordón umbilical humano: tras canular la vena del cordón umbilical se realizó primero un lavado con buffer fosfato salino (PBS 1x), y después se digirió con colagenasa al 0,1% en HBBS durante 20 minutos a 37º. Posteriormente se recogieron las células endoteliales y se sembraron sobre una matriz de gelatina al 0,2% en PBS 1x. BAEC: Son células endoteliales de aorta bovina: Tras lavar la aorta con PBS 1x, se perfundió con colagenasa al 0,1% en HBSS manteniendo clampados ambos extremos durante 20 minutos a 37º. Posteriormente se recogieron las células y se sembraron sobre una matriz de gelatina al 0,2% en PBS 1x. Se cultivaron en RPMI 1640 + 10% FBS + 1% P/S. PAEC: Son células endoteliales de aorta porcina (PAEC): Esta línea fue generosamente cedida por el Dr. de la Pompa (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares – CNIC). Se cultivaron en D-MEM + 10% FBS + 1% P/S. RATONES   Los ratones controles y modificados genéticamente para la supresión de la proteína Dlk1 [160] fueron de la cepa 129 SvJ/XI y fueron cedidos mediante acuerdo de transferencia de material por el Prof. J. Laborda (Universidad de Castilla La Mancha). REACTIVOS USADOS PARA LOS CULTIVOS CELULARES   L-Glutamina: Aminoácido que complementa el medio de cultivo (GIBCO). PBS: Tampón fosfato salino (Phosphate Buffer Saline). Contiene NaCl 140 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2mM y KCl 3 mM. FBS: Suero fetal bovino (Fetal Bovine Serum) (Sigma) Tripsina: Contiene EDTA. Se utiliza para despegar las células con el fin de procesarlas posteriormente (Sigma). Penicilina/Estreptomicina: Antibióticos de amplio espectro contra bacterias gram-negativas y gram-positivas. 1000 unidades/ml de penicilina y 1000 unidades/ml de estreptomicina (PAN Biotech GmbH). Materiales y Métodos 85    Dulbecco´s Modified Eagle Medium: Medio de cultivo DMEM para las células 293A, los preadipocitos 3T3-L1 de ratón y las células endoteliales de aorta porcina (PAEC) (Gibco). RPMI1640: Medio de cultivo para células endoteliales bovinas (BAEC) (Gibco). MCDB131: Medio de cultivo para los anillos de aorta (Sigma). EBM-2: Medio de cultivo para células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC) (Sigma). DMEM/ F12: Medio para preparar el medio de cultivo de células endoteliales de pulmón murinas (MLEC) (Gibco). HBSS: Tampón utilizado para diluir la colagenasa (Merck). Fibronectina: Proteína de matriz extracelular utilizada en el cultivo de MLEC (Sigma). Colágeno Tipo I: Proteína de matriz extracelular utilizada en el cultivo de MLEC (Vitrogen 100). Gelatina Bovina (Sigma): Proteína que contiene mezcla de diferentes tipos de colágeno utilizada para sembrar los cultivos primarios de BAEC, HUVEC y MLEC. Suero de ratón: Utilizado en el medio de cultivo de los anillos de aorta. ADENOVIRUS   Los adenovirus que codifican GFP, DLK1-GFP (bicistrónico) o DLK1-HA se obtuvieron de Vector Biolabs. La línea célular HEK293A se utilizó para la amplificación de los adenovirus. Posteriormente, los adenovirus fueron purificados y titulados siguiendo las indicaciones de los correspondientes kits de Clontech (Adeno-X Maxi y Adeno-X Rapid Titer respectivamente).     Materiales y Métodos 86    ANTICUERPOS   NOMBRE TIPO ORIGEN REFERENCIA DILUCIÓN Anti-Dlk1 Policlonal Abcam ab21682 1:1000 Anti-NICD Policlonal Abcam ab8925 1:1000 Anti-Hey Policlonal Santa Cruz sc-28746 1:1000 Anti-Slug Polyclonal Santa Cruz sc-10436 1:500 Anti-β Actin Monoclonal Sigma A1978 1:10000 FCsRII/III CD16/CD32 Monoclonal BD Pharmingen 553142 1:300 ICAM-2 CD102 Monoclonal BD Pharmingen 553325 1:300 Ig-G Coated Beads Invitrogen 110.35 1:100 Anti-GFP Monoclonal Roche 11814460001 Anti-BrdU Monoclonal Abcam ab6326 1:100 Anti-Rat Alexa 488 1:200 Anti-Rabbit IR Dye 926-32211 1:15000 Anti-Mouse IR Dye 926-32220 1:15000 Anti-Goat IR Dye 51003 1:15000 Anti-HA Monoclonal Roche 11867423001 1:1000 Tabla 1. Anticuerpos Materiales y Métodos 87    VECTORES PLASMÍDICOS     PROTEÍNA VECTOR CLON Dlk1         cDNA Humano SC127962 Hes-1 350 pb del fragmento del promotor de ratón de Hes-1 NICD Renila Tabla 2. Vectores plasmídicos.     Materiales y Métodos 88    4.2 MÉTODOS   ELECTROFORESIS, TRANSFERENCIA DE LAS MUESTRAS E INMUNODETECCIÓN (WESTERN BLOT) Las células fueron lisadas con el buffer RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, NP-40 1%, Na-deoxicolato 0.5%, NaCl 150mM, EDTA 2mM, NaF 50mM) al que se añadió 1% dodecilsulfato sódico (SDS) y el cocktail inhibidor de proteasas (Mini-EDTA Complete- ROCHE). Se incubaron los lisados a 4º durante 30 minutos y posteriormente se homogenizaron mediante ultrasonidos. La concentración total de proteínas se determinó utilizando el ácido bicinconínico (BCA – BicinChoninic Acid). Las muestras se cargaron en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato (SDS-PAGE) al 10%. Tras la electroforesis, las proteínas se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa (Millipore), mediante transferencia en húmedo a 200 mA durante 2 horas. Posteriormente las membranas se bloquearon según el caso con albúmina de suero bovino (BSA, Sigma) al 5% diluida en tampón salino tris (TBS), con detergente Tween 20 (Sigma) al 0,1% (TBS-T) o con leche al 5% diluida también en TBS con Tween 20 (TBS-T), durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se incubaron con los anticuerpos primarios a 4ºC en BSA al 3% o leche al 3% diluidos en TBS-T durante toda la noche. Finalmente se realizó una incubación con el anticuerpo secundario en TBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente. La detección de las bandas se realizó mediante el sistema de imagen de infrarrojo LI-COR Odyssey. EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL Y ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA POR PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL Las células sembradas en monocapa se lavaron una vez con tampón fosfato salino (PBS 1x), y después se extrajo el ácido ribonucleico (ARN) total mediante fenol-cloroformo. Una vez purificado se determinó su concentración mediante absorción espectofotométrica a 260 nm, así como la presencia de contaminantes estableciendo la relación A260 nm/A280 nm.   La r com (Bior prim La re reali term pare reco Tab Las desn desn 60ºC retrotransc plementar rad) utiliza mero a 42º d eacción en zó median mociclador ejas de olig ogen en la bla 3. Prim condicione naturalizac naturalizac C durante cripción (R rio se realiz ando 1 µg durante 1 n cadena nte el kit co C1000 The gonucleótid Tabla 3. mers para P es de la P ción inicial ción a 95º 1 minuto. T, Revers zó median g del ARN hora y a co de la polim omercial S ermal Cyc dos según PCR PCR para a 98ºC du C durante Al finaliza 89  se Transcr nte el kit co N. La rea ontinuació merasa (P Sso Fast E cler CFS96 el gen dia la mayoría urante 30 e 30 segun ar los ciclo ription) par omercial iS cción se n a 70º du CR) cuant Eva Green 6 de Biorad na de inte a de los g segundos ndos y an os de PCR Materia ra la obten Script cDNA llevó a ca rante 15 m titativa en Supermix d. Se utiliza rés, cuyas enes fuero seguido d nillamiento R se realiza ales y Méto nción del A Synthes abo incub minutos. tiempo re (Biorad) e aron difere s secuencia on: un cic de 40 ciclo y extensi aron curva odos ADN is Kit ando al se en un entes as se lo de os de ón a as de Materiales y Métodos 90    desnaturalización (melting) para comprobar la amplificación de un único producto además de analizar por gel de agarosa para comprobar su tamaño. Los datos se han analizado por el método de la cuantificación relativa por comparación de los Ct (umbral en el que comenzamos a detectar señal por amplificación), utilizando la siguiente fórmula: Cantidad relativa de ARN= 2exp –(∆∆Ct) Donde ∆Ct = Ct del gen de interés – Ct del gen control interno. ∆∆Ct = ∆Ct de la muestra calibradora - ∆Ct de la muestra desconocida. En los experimentos que se realizan en este trabajo la muestra calibradora es la muestra control (o procedente de animales WT), mientras que la muestra desconocida procede de células sometidas a tratamiento o de células procedentes de los animales genéticamente deficitarios para Dlk1. Como control interno se utilizó la GAPDH. ENSAYO DE REENDOTELIZACIÓN EN PLACA (“Scratch Assay”) Se sembraron células endoteliales en placa de 24 pocillos. Una vez establecida la monocapa celular se realizó una incisión con una punta de pipeta. El cierre de la herida se monitorizó mediante microfotografía, tomando imágenes cada 30 minutos durante 24 horas. Se utilizó un microscopio Leica AF6000 LX con una cámara monocromática Hamamatsu CCD C9100-02 acoplada. FORMACIÓN DE ANGIOTUBOS EN MATRIGEL Este ensayo está basado en la diferenciación de células endoteliales y la formación de estructuras de tipo tubular sobre una matriz extracelular de Matrigel (BD Bioscience) [161]. Es un ensayo muy rápido y reproducible, utilizado sobre todo para estudiar el papel de determinados componentes o moléculas en el proceso de angiogénesis [162]. Se realizó en placa de 96 pocillos añadiendo 40 µl por pocillo de una matriz de Matrigel diluido 1:1 en medio 199. Después de 30 minutos a 37º se sembraron células endoteliales porcinas a una concentración de 3x104 células por pocillo, en 0,1 ml de D-MEM con 10% de suero bovino fetal (FBS) ó células endoteliales de pulmón de ratón Materiales y Métodos 91    a la misma concentración en medio D-MEM:F-12 (1:1) con 8% de FBS y 2 mM de glutamina con o sin VEGF (5ng/ml) (R&D System). Tras 5-6 horas de incubación a 37º los angiotubos se tiñeron con MTT (bromuro de 3-(4,5- Dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio) (Sigma) durante 30 minutos. Se tomaron imágenes con objetivo 2x en un microscopio invertido Nikon eclipse TE2000-U con una cámara digital acoplada. La cuantificación de angiotubos se hizo con el programa Angioquant y se confirmó el resultado mediante contaje manual. EXPLANTES DE ANILLOS DE AORTA Para estudiar la angiogénesis en un modelo ex-vivo se cultivaron anillos de aorta en geles en tres dimensiones [163]. Para ello se sacrificaron ratones por dislocación cervical y se extrajeron las aortas torácicas que se mantuvieron en tampón fosfato salino (PBS 1x) a 4º. Se limpiaron las aortas del tejido adiposo que las rodea sin dañar las paredes del vaso, e inmediatamente se incubaron algunas con los adenovirus recombinantes a una concentración de 1x109 ó 5x109 upf/ml (unidades formadoras de placas/ml). Tras la incubación durante 4 horas a 37º, se embebieron anillos de 1 mm de longitud entre dos capas de matriz (Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, BD Biosciences), en placa de 96 pocillos. En cada pocillo se añadieron 100 µl de medio MCDB131 suplementado con 2,5% de suero de ratón, 1% de glutamina y 1% de mezcla de antibióticos penicilina/estreptomicina. Tras seis días de cultivo los explantes fueron examinados por el microscopio. La cuantificación se hizo midiendo la longitud de los vasos por anillo usando el programa ImageJ. ENSAYO DE MATRICES TRIDIMENSIONALES (“PLUGS”) DE MATRIGEL Para el estudio de la angiogénesis in vivo se implantaron subcutáneamente estructuras de matrigel en la región abdominal de ratones C57/BL6. Dichas estructuras contenían una mezcla de 500 µl de matrigel bajo en factores de crecimiento sin rojo fenol (BD Bioscience) y heparina a 0,3 mg/ml (Sigma). Los correspondientes adenovirus (Ad. GFP, Ad. Dlk1 ó Ad. Dlk1-GFP), VEGF (250 ng/ml), un inhibidor de la ruta de Notch, DAPT 10 mg/kg peso del animal y DMSO (0,01%) fueron añadidos a la matriz según el caso. Para la implantación del correspondiente “plug”, los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso) y xilazina (10 Materiales y Métodos 92    mg/kg de peso). Tras 10 días de la implantación del matrigel los animales fueron sometidos a eutanasia en cámara de CO2. Los “plugs” fueron extraídos y diseccionados y se midió el contenido de hemoglobina utilizando tetrametil bencidina (TMB, Sigma), donde este cromógeno se oxida mediante el peróxido de hidrógeno liberado por la actividad peroxidasa que posee el grupo hemo de la molécula de la hemoglobina. En otro grupo de experimentos se extrajeron los “plugs” para los correspondientes análisis histológicos e inmunohistoquímico. Se fijaron mediante formaldehido y se embebieron en parafina. Se hicieron cortes para hacer tinciones con hematoxilina-eoxina, y después se examinaron las muestras en microscopio en campo claro (Olympus DX50). TRANSFECCIÓN CELULAR Y ENSAYO DE LUCIFERASA El plásmido de sobreexpresión de Dlk1, que contiene una copia de cDNA del clon humano de Dlk1 (SC127962), se obtuvo de la casa comercial Origen (pCMV6 XL4). Con el fin de detectar la expresión de la proteína exógena se insertó una región señal (tag) de hemaglutinina. Para valorar el efecto de Dlk1 sobre la función transcripcional de Notch se utilizó un plásmido que contiene 350 pb del promotor de Hes-1 de ratón seguido del gen reportero de la luciferasa en pGL2 basic [164]. Las células endoteliales (BAEC y PAEC) se cultivaron en placas de 24 pocillos. Una vez alcanzada la confluencia del 60-70% se co-transfectaron con el plásmido del promotor de Hes-1 fusionado a la luciferasa, un vector de pGL2 que expresa la proteína Renilla como control de la transfección y el plásmido de expresión de Dlk1. Para ello se utilizó Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y medio Optimem I. A las 4-6 horas se cambió el medio Optimem I por medio completo y se esperó 24 horas para leer el ensayo. La actividad luciferasa se determinó mediante el kit “Dual Luciferase Reporter Assay System” (Promega). El resultado se expresó como nº de veces de inducción respecto a la transfección con los plásmidos control. Materiales y Métodos 93    ENSAYO DE VIABILIDAD Y PROLIFERACIÓN CELULAR El ensayo de viabilidad se realizó utilizando la sal de tetrazolio: sodio 2, 3,- bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)-carbonil]-2H-tetrazol (XTT, Cell Proliferation Kit II, Roche), que detecta las células metabólicamente activas, reduciéndose el XTT por las deshidrogenasas mitocondriales para generar como producto final una sal de formazán soluble en agua. La cantidad de formazán detectado por absorbancia se correlaciona directamente con el número de células activas metabólicamente en el cultivo. Se sembraron células endoteliales con una densidad de 3000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se tomaron medidas a tiempos 0, 24, 48, 72 y 96 horas tras la incubación durante 4 horas con XTT a 37º. Para estudiar la proliferación celular se utilizó 5-bromo-2´- deoxiuridina (BrdU) que indica la proporción de células que están proliferando activamente, medida por la incorporación de BrdU al ADN de nueva síntesis. Se cultivan las células en medio que contiene BrdU y esta se incorpora en lugar de la timidina en la cadena de ADN de nueva síntesis. Se detectó mediante un anticuerpo anti- BrdU (1:100), seguido de un anticuerpo secundario anti-rata Alexa 488 (1:200). A las 4, 8 y 24 horas se contaron las células positivas para BrdU por campo con un aumento de 40 veces, contando una media de 6 campos por muestra en tres experimentos por duplicado. Se tomaron imágenes con una cámara digital DS-2Mv acoplada a un microscopio invertido Nikon TE2000-U. APOPTOSIS Para determinar el grado de apoptosis se utilizó la anexina-V, que es capaz de marcar las células en un estadio temprano de aquella, ya que es una proteína de unión específica al fosfolípido fosfatidilserina, el cual se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática y es expuesto en la cara externa de dicha membrana cuando comienza el proceso de apoptosis. Para distinguir células vivas de células muertas, se combina con la tinción de núcleo AAD-7. Ello permite identificar células en apoptosis temprana (7-AAD negativas y PE- Anexina V positivas), células en apoptosis tardía o ya muertas (PE-Anexina y 7-AAD positivas), y células viables (PE-Anexina y 7-AAD negativas). Materiales y Métodos 94    Para ello se trataron células MLEC obtenidas de ratones control (WT) y ratones carentes de Dlk1 (KO) con 2,5 µM de estaurosporina, que induce apoptosis mediante la inhibición de proteínas kinasa C, durante 2, 4, 8 y 19 horas. Se resuspendieron las células en 100 µl de buffer de unión a anexina (0,1 M Hepes/NaOH (pH:7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2), 2.5 µl de anexina V y 5 µl de 7-amino-actinomicina (7-AAD). Se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y después de añadieron 200 µl de buffer de unión a anexina. El análisis de la apoptosis y necrosis se realizó mediante citometria de flujo (FACSCanto II High Throughput Sampler Option, Becton Dickinson). AISLAMIENTO Y TINCIÓN DE RETINAS La angiogénesis en la retina del ratón es un modelo de desarrollo de una estructura vascular altamente organizada después del nacimiento. Debido a la posibilidad de monitorizar y manipular el proceso de angiogénesis retiniana durante el periodo postnatal, este modelo resulta adecuado para estudiar fenómenos como el de gemación (sprouting) y la organización morfogenética de las redes vasculares [165]. El ratón al nacer carece de vasculatura retiniana, desarrollándose esta en los siguientes 14 días. Al mismo tiempo que tiene lugar esta angiogénesis postnatal, los vasos hialoideos, formados durante la etapa embrionaria, involucionan y desaparecen. Todo este proceso presenta una regulación espacio-temporal muy estrecha que permite la manipulación experimental [166]. Por el contrario en el humano la vasculatura retiniana se desarrolla completamente durante el periodo de la gestación, de manera que a la semana intrauterina 40 ya está totalmente desarrollada. Se sacrificaron ratones control (WT) y carentes de Dlk1 (KO) de estadios P0- P14 mediante cámara de CO2 y se extrajeron los ojos que fueron fijados con paraformaldehído al 1% en PBS durante toda la noche a 4º. Las retinas fueron extraídas y tras ser lavadas con tampón fosfato salino (PBS 1x) se permeabilizaron con PBT (PBS + 0,1% Igepal, Sigma). Después se bloquearon con avidina/biotina (Vector) y con suero de cabra al 2% en PBT. Se marcaron con Isolectina B4 (Griffonia simplicifolia) conjugada con biotina para detectarla mediante Estreptavidina-647 Alexa Fluor (Invitrogen) [167]. Se tomaron imágenes de 8-10 retinas por grupo experimental mediante un microscopio confocal Nikon A1R. La cuantificación de células punta [168] Materiales y Métodos 95    [168], filopodios y áreas vasculares se realizó mediante el programa ImageJ. ENSAYO DE GANANCIA Y PÉRDIDA DE FUNCIÓN EN PEZ ZEBRA El Danio Rerio (pez zebra) es un pez pequeño de aguas tropicales que vive en las riberas del norte de la India, norte de Pakistan, Nepal y Bhutan en el sur de Asia. Debido a su pequeño tamaño y fácil cultivo, el pez zebra se ha convertido en un organismo modelo para el estudio del desarrollo del embrión. Su desarrollo es muy similar a la embriogénesis en vertebrados superiores, incluido el humano. A diferencia de los mamíferos, el desarrollo adulto transcurre fuera de la madre en huevos transparentes. Esto hace posible estudiar el desarrollo del embrión en su medio natural y permite observar la formación de los órganos internos dentro del organismo vivo. El desarrollo del embrión es muy rápido: en las primeras 24 horas después de la fertilización todos los órganos principales están formados y en 2-3 días sale y comienza a buscar comida. Después de 3-4 meses son sexualmente maduros y pueden generar nueva descendencia. Una hembra puede poner 200 huevos/semana. El tiempo de generación tan corto, el gran número de descendientes, la transparencia visual de los embriones y la similitud con los mamíferos en bastantes genes, son ventajas que hacen del pez zebra un modelo ideal para el estudio del desarrollo en vertebrados. Se han identificado en pez cebra un gran número de mutaciones que bloquean el desarrollo embrionario y muchas de ellas son útiles para el estudio de enfermedades humanas. Los organismos mutantes posibilitan una mejor comprensión de las redes genéticas que controlan el desarrollo de las especies vertebradas, incluyendo la humana. Los ejemplares del pez zebra se mantuvieron y criaron en condiciones estándar a 28º. Se utilizaron embriones transgénicos Tg(fli:EGFP) y Tg(gata1:dsRed) para monitorizar el desarrollo de la vasculatura y el flujo sanguíneo respectivamente. El doble transgénico Tg(fli1:ECGF) y Tg(gata1:dsRed) se generó mediante cruces de las líneas individuales. El plásmido que contiene el cDNA de Dlk1 humano se inyectó a diferentes concentraciones en embriones en el estadio monocelular. Se utilizó el mismo plásmido vacío como control. Se tomaron imágenes de los embriones a las 72 Materiales y Métodos 96    horas post-fecundación (72 hpf) utilizando un microscopio de disección equipado con epifluorescencia (MZF16FA, Leica) y una cámara digital (DFC310FX, Leica). Se diseñaron morfolinos antisentido (MO) (Gene-Tools, OR, USA), que son oligonucleótidos antisentido con anillos de morfolino que inhiben el comienzo de la traducción. En este caso está dirigido al codón de iniciación del gen Dlk1 en el pez zebra (NCBI Reference Sequence: XM_001921677.1): 5´- CCAAAACCTCACAGAAGCTCGTCAT – 3´. Como control se utilizó un morfolino con una secuencia al azar. Se inyectaron a 62.5, 125 y 250 μM en embriones en el estadio mono o bicelular. Las fotografías fueron tomadas a 6 días postfecundación (6 dpf). Se analizaron 100 embriones por condición y experimento. ENSAYO ANGIOGENESIS EN TUMOR XENOINJERTADO Se inyectaron mbriones Tg(fli:eGFP)[169] en el estadio monocelular con MO contra zfDlk1, cap mRNA hDlk1 ó ambos, y se mantuvieron a 28º. Tras 24 horas a partir de la fertilización los embriones se incubaron con 0.2 mM de 1- fenil-2-tio-urea (Sigma) en agua, para impedir la pigmentación. A las 48 hpf se retiró el corion a los embriones y se anestesiaron con tricaina metanosulfonato (MS-222, Sigma). Se transfirieron los embriones a un gel de agarosa modificado para la microinyección. Antes de la inyección se marcaron células tumorales in vitro durante 24 horas con 2 μg/ml de 1,1-Dioctadecil-3,3,3´-tetrametillindocarbocianina perclorato (DiI, Fluka). Se resuspendieron las células en DMEM (Sigma) y se inyectaron 2-5 nL de la solución de células tumorales (25 células/nL) en la cavidad perivitelina de cada embrión utilizando un microinyector Eppendorf (FemtoJet 5247, Eppendorf). Los embriones inyectados se mantuvieron a 28º y se examinaron 2 días después para monitorizar la angiogénesis inducida por las células tumorales desde los vasos sub-intestinales utilizando un microscopio de fluorescencia (MZF16FA, Leica) equipado con una cámara digital (MZF16FA, Leica). Cada experimento, que incluye de 25-50 embriones, se repitió al menos 2 veces. Materiales y Métodos 97    ENSAYO CON REPORTERO DE NOTCH EN PEZ ZEBRA El modelo Tg(ptf1a:eGFP)jh1 es un pez zebra transgénico con un reportero que contiene 12 sitios de unión de la proteína de la ruta de Notch Rbp-Jκ, delante del promotor mínimo de la β-globina y el gen reportero de la proteína verde fluorescente [170]. Los embriones Tg(ptf1a:eGFP)jh1 se inyectaron en el estadio monocelular con MO contra zfDlk1, cap mRNA hDk1 ó fueron tratados durante 36 hpf con DAPT durante 12 horas, y se permitió su desarrollo a 28º. 24 horas después de la fertilización se incubaron los embriones con 0.2 mM de 1-fenil-2-tio-urea (Sigma) para impedir la pigmentación. A las 48 hpf se tomaron imágenes de 5 embriones y se midió la luminosidad en el canal RBG de al menos 5 imágenes por experimento con AdobePhotoShop CS3 Extended (Adobe Systems Incorporated). ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizó mediante test no-paramétrico (test Mann-Whitney) en la mayoría de los experimentos. Cuando fue posible se aplicó un análisis paramétrico de t- Student o Análisis de varianza One-way según el caso. Materiales y Métodos 98          RRESULLTADOSS         5. R 5.1 dura célu marc dato posi El a célu hum Com está A). A lisad RESULTA Expresió Este ge ante la rege las en un cada expre os sobre D ble función análisis me las endote mana, porci Figura 16. proveniente pulmón (ML células endo carril contie (izquierda) y mo control bien carac Además o dos de célu ADOS ón de Dlk1 en se ha eneración estado ind esión en lo Dlk1 y func n en el end ediante in eliales de na y bovin Expresión es de diferen LEC), células oteliales de a ne cinco vec y del monóme positivo se cterizada l bservamos ulas endot 1 en endo detectado y podría te diferenciad os vasos de ción vascu dotelio vasc munoblot organism a. de Dlk1 en ntes especies endoteliales aorta porcina es menos ca ro (derecha) e e han utiliz a abundan s también teliales bo 101  otelio vas o en célul ener un pa do. En el e e la placen lar, nos p cular adult permitió d os adultos n células en s. Western b s de vena de (PAEC) y fib antidad de pro en células end zado célul nte expres mediante vinas adu scular adu as progen pel genera endotelio e nta [97]. Da lanteamos to. detectar la s en difer ndoteliales d blot de células e cordón um roblastos de oteína total) ( doteliales de a las preadip ión basal d western-b ltas de mu ulto. nitoras en al en el ma l único pre ado el esc s estudiar s a expresió rentes esp de organism s endoteliales bilical human ratón 3T3-L1 (A). Expresión aorta bovina (B pocitarias de esta pro blot la form uestras no Resulta varios te antenimien ecedente e caso núme su expres ón de Dlk pecies: mu mos adultos s murinas de no (HUVEC), (este último n del dímero B). 3T3-L1, d oteína (Fig ma diméric o hervidas ados ejidos to de es su ro de ión y 1 en urina, onde g. 16; ca en (Fig. Res   16; dere Tam Tran ultados B, izquier echa). mbién se co nscripción - Figura 17. adultos. Ge pulmón (ML células endo diferentes lín rda) y la f omprobó - Reacción Expresión d el de agarosa LEC), células oteliales de ao neas de célula forma mon la expres n en Caden de mRNA en a de RT-PCR endoteliales orta porcina (P as endoteliales 102  nomérica e ión del me na de la Po n células end R en tiempo re s de vena de PAEC) y fibro s. SEM±SD d en muestr ensajero m olimerasa) doteliales de eal de células e cordón um oblastos de rat e organismo; as hervida mediante R en tiempo e diferentes s endoteliales bilical human tón 3T3-L1 (A ***p<0.001 vs as (Fig. 16 RT-PCR (R o real (Fig. organismos s murinas de no (HUVEC), A). Cts de las 3T3-L1 (B). 6; B, Retro 17).   5.2   5.2.1 la fo de fo sobr trans (dom de a com Butil Regulaci 1. Efecto d ormación d Para es ormación d re matrige sfectadas minio de N angiotubos ún de la ru l Ester (DA     Figura 18. Control (A), tratamiento ón de la a de la gana de angiotu studiar el e de tubos a l células e con dosis otch intrac s que es uta de Not APT), se in Formación d transfeccion con DAPT (B) angiogén ancia y pé ubos. fecto de la a partir de endoteliale creciente celular-NIC dependien ch; N-[N-( hibió la for de angiotubo con dosis cr ). 103  nesis por rdida de f a activación células e es de aorta es de la fo CD). Se ob nte de dos (3,5-Difluo rmación de os en matrig recientes (0.5 Dlk1. función de n de la ruta ndoteliales a porcina orma activ bservó un a sis. Cuand rofenacetil e estas est gel de células 5, 1.5, 3.0 y e la ruta d a de Notch s aisladas, controles a del rece aumento e do utilizam -L-alanil)]- tructuras (F s endoteliale 6.0 μg) de N Resulta e Notch s h en un en , se sembr (PAEC W eptor de N en la forma mos el inhi -S-fenilglic Fig. 18.). es porcinas. NICD (C-F) y ados sobre nsayo raron WT) y Notch ación bidor ina t- Res   5.2.2 form orga no c pape angi prim form ultados 2. La so mación de Debido anismos ad canónico d el en una ogénesis. Figura 19. F sembradas de sobreexp número de independien *,# p<0.05 ( Con el mer lugar u mación de a obreexpre angiotubo a la detec dultos y ba e la ruta d a de las Formación de sobre matrig presión de cD angiotubos ntes por grupo (B). fin de estu una aproxi angiotubos esión de os in vitro ción de la asándonos de Notch, funciones e angiotubos gel. Basal, tra DNA de Dlk1 en presenci o realizado po udiar el pa mación in s de las cé 104  Dlk1 en o. expresión s en su de decidimos principale s de células e nsfectadas co (A). Las grá ia y ausenc or duplicado. apel de DL vitro. Par élulas endo células de Dlk1 e escripción estudiar s es de dic endoteliales on plásmido co áficas represe cia de VEGF Las barras re LK1 en es ra ello se oteliales se endotelia en células e estructura si podría d ha ruta, e de aorta porc ontrol (pCMV6 entan la cuan F de tres p presentan la te modelo estudió la embradas ales inhib endoteliale al como lig desempeña el proceso rcina (PAEC) 6) y plásmido ntificación del reparaciones media±SEM; o, se realiz a capacida sobre mat be la es de ando ar un o de zó en ad de trigel.   En p de a plás porc se s prim form trans endo célu angi form del angi rece pued sign 20). primer luga angiogénes mido vací cinas (Fig. sembraron meros angio mación de sfectadas c oteliales. P las fueron otubos se mación de e Para ve receptor d ogénesis, eptor de VE de observ ificativame Figura 20. bovina. La sobreexpres SEM de n=3 ar, para es sis, se tra o control, 19). Las sobre ma otubos. La angiotubo con el plás Para aver tratadas c e reveló in estas estru er si DLK1 de VEGF, se analizó EGF 2 cua var no hay ente mayo Niveles de P fosforilación sión de DLK1 3. studiar el e ansfectó un en líneas células tra atrigel y a a sobreexp s compar smido cont riguar si e con el mism ndependien ucturas per puede ten que es la ó mediante ando hay u y un nive r al sobree P-VEGFR2 po del receptor (A). Cuantific 105  efecto del a n plásmido s celulares ansfectada las 4 hora presión de rada con trol vacío ( este proce mo. El efe nte del V rsistió en p ner algún e a ruta prin e western- una sobree l de fosfo expresar D or western b 2 de VEGF cación de la aumento d o de sobr s endotelia as y células as se obse e DLK1 ind las condic (pCMV6) e eso está a ecto de DL EGF, ya q presencia d efecto sobr ncipal imp blot los niv expresión orilación d DLK1 con blot en célula (VEGFR2) n fosforilación d e DLK1 so eexpresión ales tanto s en condi ervó la for dujo una in ciones bas en ambos t afectado p K1 sobre l que la in de dicho fa re el nivel d licada en veles de fo de la prot el recepto respecto a as endotelial no se ve alte del VEGFR2 Resulta obre el pro n de Dlk1 bovinas c ciones bas rmación d nhibición d sales y co tipos de cé por VEGF a formació nhibición d actor. de fosforila el proces osforilació teína. Com or de VEG al control les de aorta erada con la (B). Media ± ados oceso y el como sales e los de la ntrol, élulas F, las ón de de la ación o de n del mo se GF 2 (Fig. Res   5.2.3 angi angi proc sobr incu sign del form tanto form Dlk1 care ultados 3. La au iogénesis Con el ogénesis cedentes d re matrige bación. Co ificativame WT. Para mación de a o en prese mación de , pero se entes de Dl Figura 21. (MLEC) a pa matrigel. Ex (MLEC) con Imágenes r sembradas s de angiotub triplicado; * p usencia d . fin de estu se aislaro e ratones el y se ob omo mues ente mayo a comprob angiotubos encia com angiotubo e mantiene lk1. Formación d artir de anim xpresión de D ntroles (WT) y representativa sobre matrige bos en las cél p<0.05) (C). de DLK1 udiar cómo on células control (W bservó la stra la figu r en célula bar si el s en ausen mo en ause s tanto en e el efecto de angiotubo ales control Dlk1 por west y knockout (K as de células el ±VEGF tras ulas control f 106  se corre o la ausen endotelia WT) y knoc formación ra 21, la f as procede VEGF pu ncia de DL encia de d n células c o promoto os en célula (WT) y knock tern-blot en cé KO). La β act s MLEC cont 6 h (B). El an frente a las K laciona c ncia de DL ales de pu kout (KO) n de angio formación entes del ede tener LK1, se rea dicho facto control com or de angi as endotelial kout (KO) par élulas endote tina se usó co trol (WT) y k nálisis cuantita KO para Dlk1 con un au LK1 afecta ulmón de para Dlk1, otubos tra de estas e KO compa r algún ef alizaron los or. El VEG mo en cé ogénesis es de pulmó ra Dlk1 semb liales de pulm omo control d knockout (KO ativo represen (media ±SEM umento d a al proces ratón (M , se sembr as 6 hora estructuras aradas co fecto sobr s experime GF favorec élulas KO en las cé ón de ratón bradas sobre món de ratón de carga (A). O) para Dlk1 nta el número M de n=3 por de la so de LEC) raron s de s fue n las re la entos ce la para élulas   sem aden aden DLK célu com MLE única Con el f bradas s novirus de Tras 24 novirus co K1 y GFP, s las que so o se redu EC KO t amente la Figura 22. pulmón de representativ sobreexpres GFP en célu fin de reve obre mat Dlk1 que c 4 horas ontrol que se sembra obreexpres uce la form ransfectad GFP (Fig Formación d ratón (MLEC vas de célul san GFP o Dlk ulas endotelial ertir el feno trigel, se coexpresa de incuba sobreexp aron dichas san DLK1 mación de das con 22). de angiotubo C) knockout as endotelial k1-GFP (A). W les MLEC infe 107  otipo de las sobreexp a la proteín ación de presa GFP s células e se consi los angio el adeno os inhibida p para Dlk1 s es KO para Western blot m ectadas con ad s células e presó la a verde flu las célul P, y el ad endoteliales guió rever otubos com ovirus con por Dlk1 en sembradas s Dlk1 infecta mostrando la denovirus (B). ndoteliales proteína uorescente as endote enovirus q s sobre m rtir el feno mparada c ntrol que células end obre matrige das con ade expresión de Resulta s KO para mediante e (GFP). eliales co que coexp matrigel. E otipo, vién con las cé sobreexp doteliales de el. Imágenes enovirus que GFP y Dlk1- ados Dlk1 e un on el presa En las dose élulas presa Res   5.2.4 vivo célu ensa se h angi colág facto unas rode los a secc incu ultados 4. La aus o. Para co las endote ayos de ex ha propue ogénesis. geno dan ores pro- o s ramificac eadas de c En prim anillos de cionar, lava baron las a Figura 23. E Dlk1 embeb de aorta ma partir de ani 6 horas de como media encia de omprobar l eliales en xplantes de esto como En este e lugar a un o antiangio ciones de m élulas mur mer lugar y aorta y q ar y embe aortas con Explantes de bidos en mat arcadas con D llos de aorta d cultivo. Cuan a±SEM de n=3 Dlk1 se c la mayor c los exper e anillos de uno de l ensayo los na respues ogénicos. microvasos rales (célul con el fin que forman eber en la DiI-Ac-LD anillos de ao trigel. Célula DiI LDL (A). Fo de animales c tificación de l 35 anillos de 6 108  correlacio capacidad rimentos d e aorta. El los más ú s anillos de sta angiogé El crecim s formadas las de mús de demos n los angi matriz de DL. orta de ratone as endoteliales otografías repr control o caren la longitud de 6 ratones; p*˂0 ona con m angiogén de matrige modelo e útiles para e aorta em énica que iento angi s por célula sculo liso/p strar que la otubos so e colágeno es control (W s de angiotub resentativas d ntes de Dlk1 e e los vasos, lo 0.05 (B). mayor ang ica que pr el in vitro, x vivo de a a evaluar mbebidos e puede ser ogénico se as endotel pericitos) [1 as células e n endoteli o los anillo WT) y knockou bos procedent de la formación embebidos en os valores se giogénesi resentaba , se realiz anillos de a el proces en los gele r modulada e compon iales en ca 171] . emergente iales, ante os de aorta ut (KO) para tes de anillos n de vasos a matrigel tras e representan s ex n las zaron aorta o de es de a por ne de apa y es de es de a, se   Este afec célu degr acum proc knoc de a Dlk1 fue s para dosis aden 24). e reactivo ctar a su r las endot radada po mula en la Una vez cedió a em ckout (KO) angiotubos compara significativ a Dlk1 (Fig La resp s depend novirales q Figura 24. representativ sobreexpres o es incor ratio de cr teliales se or las enz membrana z demostr mbeber an ) para Dlk1 a partir de do con los amente m . 23B). uesta pro- diente, tra que permit Explantes d vas de aorta sión de DLK1 rporado se recimiento e marcan zimas liso a intracelu rada la nat illos de ao en matric e explantes s animales ayor en lo angiogénic as la pre ten la sob de aorta de as preincubad con dos conce 109  electivame [172] ni a con este osomales y lar (Fig. 23 turaleza d orta proce ces de mat s de anillos s WT. Asim s explante ca de esto eincubación breexpresió animales kn das con partíc entraciones d nte a las a la viabili e compue y la sond 3, A.). e dichas e edentes de rigel. Se o s de aorta mismo la es procede s animales n de las ón de DLK nockout (KO culas adenov iferentes. células e dad celula esto, la li da fluoresc estructuras e ratones bservó un de los ani longitud de entes de lo s KO se re aortas c K1 durante ) para Dlk1. virales control Resulta endoteliales ar. Cuando ipoproteína cente (DiI s tubulares control (W mayor nú males KO e dichos t os animales evirtió, de fo con partíc e 4 horas . Fotografías l GFP, y de ados s sin o las a es I) se s, se WT) y mero para tubos s KO orma culas (Fig. Res   5.2.5 in vi angi angi cons de m prev célu func bajo mg/m esta aden (inhi cont nega ultados 5. La gana ivo. Para de ogénesis ogénico o siste en im modo que viamente s las endote cionales. En esto en factore ml por “p bleciéndos nos de so bidor de tenían com ativo para Figura 25. una imagen implantación representan ancia de f eterminar i se utilizó o anti-ang mplantar Ma e éste sol e introduce eliales del os experim es de creci plug”). En se de est breexpres la ruta d mo factor verificar la Ensayo de a representativ n (A). Cuantif media±SEM función de n vivo el e un métod iogénico d atrigel ® e idifica y f en junto al propio ra mentos se imiento y s cada “plu ta forma l ión de Dlk e Notch) pro-angio a efectivida angiogénesis va de la angiog ficación del co de 6 ratones * 110  e Dlk1 tam efecto de l do que pe de una d n la zona v forma un l matrigel c atón migra implantó sin rojo fen ug” se in los siguien k1 (Dlk1 G y su veh génico el ad del ensa s in vivo med génesis en p ontenido de h * p<0.05 frent mbién pro a sobreex rmite dete determinad ventral del “plug” o componen an hacia e en animal nol, y en pr ncluyeron ntes grupo GFP y Dlk hículo, DM VEGF, e ayo. diante plugs lugs de matrig hemoglobina e Ad GFP en mueve la presión de erminar el da molécu ratón sub estructura tes pro-an l “plug” fo es control resencia de diferentes os: adeno 1 HA), el MSO. Tod excepto el de matrigel. gel después d de los plugs. presencia de angiogén e Dlk1 sob potencial ula. El mé bcutáneam a gelificada giogénicos ormando v l C57, ma e heparina compone o control G reactivo D os los “p grupo co . Se muestra de 10 días de Los valores VEGF (B). nesis bre la pro- étodo ente, a. Si s, las vasos atrigel a (0,3 entes GFP, DAPT lugs” ontrol   Com cuan hem VEG efec ruta mo se mu ntificación moglobina y Por el c GF, se red cto fue com de Notch, Figura 26. E subcutánea trataron con adenovirus d de Notch, D matrigel de (B). uestra en de la ang y estudio h contrario, dujo drástic mparable a DAPT (Fi Estudio histo amente (Hem n adeno GFP de sobreexpre DAPT. Barra d control positiv la figura giogénesis istológico, la formac camente e l observad ig. 25). ológico de la matoxilina-Eos sin VEGF (co esión de Dlk1 de escala: 50 vo (Ad. GFP + 111  a 25, en s mediante fue algo m ión de va en los plu do en los p a secciones d sina). Se im ontrol negativo (Ad. GFP-DL μm. (A). Deta + VEGF) y en el grupo e determin menor que sos en los gs que so plugs tratad de los plugs mplantaron rato o), con VEGF LK1) así como alle de vasos los plugs trat o control nación del en presen s animales obreexpres dos con el de matrigel i ones C57 con (control posit o con el inhibid formados en ados con el A Resulta sin VEGF l contenid ncia de VE s tratados san Dlk1. l inhibidor implantados n plugs y se tivo) y con el dor de la ruta los plugs de Ad. GFP-Dlk1 ados F, la o de GF. s con Este de la Resultados 112    Con el fin de analizar los angiotubos verosímilmente formados en los plugs, en otro grupo de experimentos se realizaron tinciones de cortes histológicos de los mismos con hematoxilina-eosina. En aquellos plugs en los que se había incluido el adeno-Dlk1, se observó una disminución en el número de vasos así como una desorganización estructural del plug. Se obtuvieron resultados similares con el inhibidor de la ruta de Notch, DAPT (Fig. 26). Estos resultados apoyan la idea de que Dlk1 es capaz de inhibir el proceso de angiogénesis tanto in vitro (formación de angiotubos en matrigel), como ex vivo (explantes de anillos de aorta) e in vivo (implantación de plugs de matrigel). Por ello decidimos estudiar como Dlk1 puede afectar a procesos implicados en las primeras fases de la angiogénesis que incluyen la proliferación y la migración celular. 5.2.6. El proceso de re-endotelización en placa se retrasa significativamente por la sobreexpresión de Dlk1. Como se ha descrito en trabajos anteriores [173] una disminución o una inhibición de la activación de Notch se asocia con una inhibición del crecimiento, migración celular y retraso de cierre de incisiones realizadas en monocapas celulares (scratch assay). Asimismo también existe un retraso en la re-endotelización de heridas realizadas en la piel de ratones transgénicos que expresan ADN antisentido para Notch o en animales tratados con inhibidores de la γ-secretasa responsable del corte proteolítico y la activación de Notch [174]. Para comprobar si el ligando no canónico de la ruta de Notch, Dlk1, pudiera afectar la migración de las células endoteliales, se realizaron ensayos de re-endotelización o “wound healing” in vitro. Para ello se transfectaron células endoteliales bovinas con el cDNA de Dlk1 y se analizó el tiempo de cierre de las heridas tomando un video con una cámara monocromática Hamamatsu acoplada al microscopio durante 24 horas. El análisis demostró un retraso significativo en el cierre de la herida en aquellas células que sobreexpresaban Dlk1 comparado con las células en condiciones basales o con las transfectadas con un plásmido control. Este retraso se observó también tras el tratamiento con el inhibidor estándar de la γ-secretasa DAPT.   Se c está sobr (Fig 5.2.7 Dlk1 herid reali re-en cierr Dlk1 tiem comprobó complet reexpresió . 27). Figura 27. E endoteliales condiciones tratadas con heridas en células endo tiempo de ci 7. El proce 1. Para co das, se s zaron incis ndotelizac re de la he compara po en las como a la tamente n con Dlk1 Efecto de la s s. Se mues basales, ex n el inhibidor d las condicion oteliales en la ierre de la her eso de re omprobar s sembraron siones sob ión de la erida se p do con la células co as 18h, en cerrada, y tratamie sobreexpresi stran imágen xpresando el de la γ-secreta nes control. L a herida. El a rida (media ±S -endoteliz si la carenc células e bre las mo herida, to produjo m s células ontrol la he 113  las condi mientras ento con D ón de Dlk1 e nes represen vector cont asa DAPT, a Las líneas roj análisis cuant SEM de n=3 p zación en cia de Dlk1 ndoteliales onocapas. omándose más rápidam control, si erida aún p ciones bas que en DAPT está en ensayo de ntativas de rol pCMV6, tiempo cero y as marcan e titativo repres or triplicado; * placa se 1 tenía un s KO par Durante 2 fotografía mente en iendo com ermanecía sal y contr n las co aún en pro migración so células end sobreexpresa y a tiempo de l frente migra senta el % de * p<0.05). acelera en efecto sob a Dlk1 y c 24 horas se as cada 30 n las célula mpleto a la a sin cerrar Resulta rol la herid ondiciones oceso de c obre células oteliales en ando Dlk1 y cierre de las atorio de las e área en el n ausenci bre el cierr controles, e monitori 0 minutos as carente as 20h. A r (Fig. 28). ados da ya de cierre ia de re de y se zó la . El es de este . Res   5.2.8 care podí mod mue cont hora con inco ultados Figura 28. endoteliales endoteliales endoteliales tiempo indic 8. Estud entes de D Para de ían debers dificar los erte celular Para el trol y knoc as del cult el número La dete rporación d Efecto de la s. Se muest carentes de en el cierre d cado del cierre dio de la Dlk1 respe eterminar s se a camb niveles de res en el co lo se sem ckout para ivo. La me de células erminación de bromod a ausencia d ran imágenes Dlk1 y células de la herida. E e de la herida ( prolifera ecto a célu si las difer bios en la e DLK1, ontexto de mbraron cé Dlk1 y se edida de l s metabólic n de la deoxiuridin 114  de Dlk1 en s representat s control. Las El análisis cua (media ±SEM ación, via ulas contro rencias en proliferaci se estud pérdida d élulas endo e tomaron a absorba camente a proliferació a (BrdU) ( ensayo de m tivas de cierr líneas rojas in antitativo repre de n=3 por tr bilidad y ol. n la velocid ón y/o ap iaron la v e función d oteliales p medidas ancia se c activas en e ón celular Fig. 29). migración so re de heridas ndican el fren esenta el % d iplicado; * p<0 apoptos dad de re- optosis de viabilidad, de DLK1. roveniente a las 0, 2 orrelaciona el cultivo. r se hizo obre células s en células nte de células del área en el 0.05). is en cé -endoteliza e las célula proliferaci es de anim 24, 48, 72 a directam o mediant lulas ación as al ón y males y 96 mente te la   proli de B debí con célu resp   Figura 29. V Estudio de l de células B las 24 horas Se obse feración y BrdU y activ Para co ía a una m anexina V las con el Se com pecto a las Viabilidad y a viabilidad ce BrdU positivas s, BrdU [175] y ervó como viabilidad vidad meta omprobar mayor apo V y el tint compuesto mprobó que células co proliferación elular mediant . Imágenes re y DAPI (azul)- en las cé celulares abólica mit si esta m ptosis de te vital 7-A o pro-apop e la ause ontrol (Fig. 115  n en células W te XTT a las 2 epresentativas - núcleos. Esc élulas que que se re tocondrial ayor prolif las células AAD (7-am ptótico esta encia de D 30). WT respecto 24, 48, 72 y 96 s de células co cala barra: 50 carecían d eflejaron e (ensayo XT feración e s control s mino-actin aurosporin Dlk1 no af a células KO 6 horas (A). C ontrol y carent µm. (B) de Dlk1 ha n mayores TT). n las célu se hicieron omicina), a. fecta a la Resulta O para Dlk1. Cuantificación tes de Dlk1 a abía una m s incorpora ulas KO n n experime tratando a apoptosis ados mayor ación no se entos a las s con Res   5.2.9 de la ruta el pa de v de e ultados Figura 30. A pulmón mur y 19 horas. células apo representan 9. La ause a retina. Este mo de Notch apel antian vasos retin edad, cuan Apoptosis en rinas controles Después de optóticas y ne Media±SEM. encia de D odelo ha s en el desa ngiogénico ianos de a do se está n células WT s y carentes d la incubación ecróticas (%) Dlk1 prom sido amplia arrollo de de Dlk1 in animales co á desarrolla 116  y KO para D de Dlk1 con 2, con Anexina se analizaro mueve cam amente uti la vascula n vivo se e ontroles y ando y ya Dlk1. Se tratar ,5 µM de esta V y 7-Amino- on por citome mbios en l ilizado par tura [45, 1 estudió la d knockout se ha des ron células en aurosporina du -Actinomicina etria de flujo. a arquitec ra estudiar 76, 177]. diferencia e para Dlk1 arrollado p ndoteliales de urante 2, 4, 8 (7-ADD), las . Las barras ctura vasc r el papel d Para conf en la forma de 5 y 14 por comple cular de la irmar ación días eto la   vasc con culatura re isolectina Figura 31. Dlk1 a 5 y 1 de retinas m Cuantificació 10 animales a días 5 y 1 en animales spectivam B4. Angiogénesi 14 días del pe marcadas con ón del área de s (*p<0.05) (B) 4 (C). Cuantif s KO para Dlk1 ente. Para is retiniana e eriodo postna isolectina B4 e las retinas c ). Detalle de z ficación de zo 1 a días 5 y 14 117  a identifica en animales atal. Se mues de animales cubiertas por zonas hiperva onas hipervasc 4. Media ±SEM r el endote control (WT stran imágene WT y KO pa vasos a días scularizadas e cularizadas fre M de 10 anim elio se real T) y knockou es de microsco ara Dlk1 a día s 5 y 14. Med en animales K ente a zonas ales (*p<0.05) Resulta lizó un ma ut (KO) para opia confocal as 5 y 14 (A). dia ± SEM de KO para Dlk1 no afectadas ) (D). ados rcaje Res   hipe de 5 angi se e angi filopo de l célu proc ultados Las re rvasculariz 5 días esta ogénico, m ncuentra e En el d ogénesis odios [178 os ratone las “tip” y ceso de an Figura 32.C células tip y (A). Análisis tinas de zación en as zonas d mientras qu en zonas lo desarrollo se correla 8] . Un estu s knockou de filopod giogénesis Células tip y filopodios de cuantitativo d animales los estadio e mayor d ue en los a ocalizadas de la retin aciona con udio detall ut para Dl ios, lo que s (Fig 32). filopodios e retinas marca de células tip y 118  s que ca os P5 y P densidad d animales c s dispersas na del rat la formac lado de las lk1 muest e sugiere u en el frente adas con isole y filopodios (*p arecían de P14. En las e vasos se con 14 día s por toda l tón el proc ción de cé s regiones tra un aum una altera angiogénico ectina B4 de ra p<0.05) (B). e Dlk1 m s retinas d e encuentr as la hiperv a retina. (F ceso de s élulas “tip” afectadas mento en ción en la de la retina atones WT y K mostraron de los anim ran en el f vasculariza Fig 31). sprouting e endotelia s de las re el númer regulació a. Detalle de KO para Dlk1 una males rente ación en la les y etinas o de n del   5.2.1 hem cond vaso   10. La aus morragias. Los vas diciones no os tortuoso Figura 33. R venosa en r de los vaso comparada de vasos hia sencia de sos sanguí ormales, p os [179]. Red vascular ratones WT (A s hialoideos e con los anima aloideos en las Dlk1 se neos de la ero en alg r de la retina A) y ratones K es más tortuo ales control, W s retinas de ra 119  asocia co a retina son unas enfer en ratones W KO para Dlk1 osa en las ret WT (C) en rato atones WT (E) on dilataci n rectos o rmedades WT y KO para (B) en ratone inas de los an ones de estadi ) comparada c ión de los ligeramen pueden ob a Dlk1.Dispos es adultos. La nimales KO (D o postnatal 6 con los KO pa Resulta s vasos y nte curvado bservarse sición arterio- a arquitectura D) para Dlk1 días. Detalle ara Dlk1 (F). ados y con os en unos Res   anim clara Esta los a perio vaso morf Para y KO esta tejido deriv En a evide loca en re ultados Además males KO amente vis as hemorra animales K Figura 34. animales c Dlk1 a día hemorragias La impl odo embrio os sanguín fogénesis d a analizar O para Dlk dio 12.5 d os (glánd vados del m animales c ente corre lizaron en elación con s cuando s para Dlk1 sibles dura agias apare KO analizad Hemorragia ontrol (WT). 6 postnatal s en % (n=16 licación de onario, don neos, cereb de determ posibles d k1, se hici días, cuan ula pituita mesoderm carentes d elato en la región o n el desarr se analiza se obse nte la extra ecieron co dos y del 3 s en retinas Imágenes re tomadas a retinas analiza e DLK1 e nde se ha bro, placen inados órg iferencias eron corte ndo los niv aria, pánc mo) en el em de Dlk1 se los anima ocular, don rollo del ne 120  ron a nive rvaron un acción de d on una frec 33.3% en l s de animal epresentativas través de lu adas por grup en angiogé relacionad nta y en lo ganos [97]. en la form es histológ veles de D creas, pul mbrión [97 e observa ales contr nde se han ervio óptico el macrosc a serie de dichas reti cuencia de as retinas es KO para de retinas d upa (A). Cuan po) (B). énesis se do su expre s puntos d mación de v icos de la DLK1 son món, glán 7]. ron vasos rol. Algun n descrito n o (Fig 35). cópico las e hemorra nas. l 81.3% en de los anim Dlk1 comp e ratones WT ntificación de ha descr esión con l de ramifica vasos en l cabeza e más altos ndula adre s de mayo os de es niveles ele s retinas d agias que n las retina males con paradas con T y KO para retinas con rito duran la formació ación duran los ratones en embrion s en difere enal y te or diámetro stos vasos evados de e los eran as de trol. te el ón de nte la s WT nes a entes ejidos o sin s se Dlk1,   5.2.1 mod zebr en e emb dors entre Figura 35. isolectina B eritrocitos co 11. Regula Para co delos de v ra. Para ell estado de briones que sal de Dlk1 e vasos int Secciones f B4. Embriones on el microsco ación de la onocer si la vertebrados o se inyec embrión d e expresan dependie tersegmen frontales de s control (A,B opio confocal s a angiogé a función d s, se real ctó ADN hu de una cé n DLK1 mu ente de la d ntales y au 121  embriones a B) y KO para D se muestra en énesis por de Dlk1 en lizaron ex umano de lula. Tres uestran un dosis, con usencia de a estadio 12 Dlk1 (C,D). La n color rojo. r Dlk1 en e angiogéne perimentos Dlk1 con días desp patrón an nsistente e vaso dors 2.5 (E 12.5) t a autofluoresc el modelo esis es ext s en emb el fin de s pués de la ormal de v en conexio sal longitud Resulta teñidas con cencia de los de pez ze tensible a briones de sobreexpre a inyección vasculariza nes aberra dinal (Fig. ados ebra. otros pez esarlo n, los ación antes 36). Res   Para ortól la in subi morf ultados Figura 36. F Tg(fli:eGFP) claro compa de hDlk1 (A con 500 pg arteria inter efecto dosis horas postfe se repitió 2 escala: A: 2m a comprob logo del D nyección ntestinal e folino y se Fenotipo de g ); Tg (gata1:ds arando mofolo A). Imagen en de hDlk1 (B) rsegmental y -dependiente ecundación (D 2 veces. Las mm; B,C: 200 ar la espec lk1 endóge del morfo ectópica. E rescató po ganancia de sRED) embrio gía general en campo claro . Imagen de m eritrocitos m en vasos inte D). Cada cond barras repre μm. cificidad de eno del pe olino, las Este fenoti or la co-ex 122  función en p ones a 72h po n un embrión mostrando d microscopia d marcados con ersegmentales ición incluye sentan media e Dlk1 en ez zebra fu larvas de ipo fue de presión de pez zebra dos ost-fertilización WT y un emb etalle de la c de fluorescenc GATA-dsRE s en embrione 100-300 embr a±SEM (*p<0 los resulta ue suprimid e 6 días ependiente e Dlk1 hum sis dependie n (A-C). Image brión inyectado ola del embrió cia que muest D (C). Cuant s inyectados c riones y cada .05 vs contro ados anteri do con un mostraron de la con mano (Fig. ente de Dlk1. en de campo o con 500 pg ón inyectado tra yemas de tificación del con hDlk1 72 experimento ol). Barra de iores, el m morfolino. n angiogén ncentració 37) mRNA Tras nesis ón de   Figura 37. 72h de post Imágenes e Morfología g marcados co plásmido co las flechas oligonucleót un embrión y cDNA de fecundación humano (hD vasos subin menos dos control; #p<0 Embriones W t-fertilización ( n campo claro general de em on GATA-dsR ontrol. Embrion indican arte tido MO contro Dlk1 morfolino Dlk1 (I). Cu n inyectadas c Dlk1) (J). Las ntestinales. Ca veces. Las b 0.025 vs MO 2 WT de pez ze (A-F). Embrion o (A, B, D y E mbriones WT RED (B y C) d nes inyectado erias intersegm ol (MO control o (H). Fenotip uantificación d con MO contro flechas identi ada experime arras represe 250uM). Barra 123  ebra. Tg (Fli: nes Tg (fli:eG ). Imágenes d (A) y brotes d e embriones W os con 500 pg mentales. Em l) (G). Brotes e po después de de angiogéne ol, Dlk1 MO s ifican vasos in nto, que inclu entan media±S a de escala: A eGFP); embr GFP) a los 6 d de microscopia de arterias int WT inyectado g de cDNA de mbriones inye ectópicos de v e la co-inyecci sis ectópica olo, o co-inye ntersegmenta uye 100-300 e SEM (*´p<0.0 A y D: 2mm; B iones Tg (gat días post-fertili a de fluoresce tersegmentale s con 500 pg e Dlk1 (D-F). ectados con vasos interseg ón de Dlk1 M en larvas de ectados con pl les y las punt embriones, fu 05 vs control; , C y E-I: 200 Resulta ta1:dsRed) a ización (G-I). encia (C y F). es, eritrocitos de cDNA de En (C) y (F), 250 uM de gmentales en MO (MO Dlk1) e día 6 post- lásmido Dlk1 tas de flecha e repetido al *p<0.025 vs μm. ados Res   5.2.1 angi vasc célu con inyec post una subi ultados 12. Regula Debido ogénesis q culatura en Para es las tumora 1,1-diocta ctaron en t-fertilizació respuest ntestinales   Figura 38. post-fecunda dpf (B). Las células tumo tumor cuand coinyectado embriones, #p<0.025 vs ación de la a la imp quisimos e n un proces studiar la ales de ma adecil 3,3 el espacio ón. Tras 24 ta proang s. Imágenes de ación) (A) y la s flechas ind orales. Cuant do se inyecta con mRNA y se repitió 2 morfolino 250 a angiogé licación qu estudiar si so patológ angiogén amífero pro ,3´,3´-tetra o previtelin 4-48 horas iogénica e microscopi arvas inyectad ican vasos in tificación de e a el morfolino de Dlk1 hum veces. Las b 0 μM). Barra d 124  énesis tum ue se ha también p ico como l esis tumo oangiogéni ametilindoc o de embr s, esta pob que da ia de fluores das con morfo ntersegmenta embriones qu o comparado mano capead barras represe de escala: 200 moral en el visto de puede afec a formació oral en es cas, previa carbocianin riones de p blación de a lugar a scencia de la olino de Dlk1 les y las pun e muestran a a Dlk1 a dife do (C). Cada entan media±S 0 μm. l pez zebra Dlk1 en ctar a la fo ón de tumo ste modelo amente ma na perclor pez zebra células tum al desarro arvas. Contro en modelo xe ntas de flech angiogénesis erentes conce condición in SEM (*p<0.02 ra. el proces ormación d ores. o se utiliz arcadas in rato, que a las 48 h morales in ollo de v ol 4 dpf (días enograft a 2 ha identifican inducida por entraciones o ncluye 25-50 25 vs control; o de de la zaron vitro e se horas duce vasos   La incre la c espe 5.3 5.3.1 Hes- desc Se h un in de u pote supresión ementada co-inyecció ecificidad d Interacció 1. DLK1 d -1. Dlk1 fue critos [92, ha descrito nhibidor de una forma encia inhibi Figura 39. E Dlk1 en célu endoteliales de Notch, DA de Dlk1 y llamativa ón con e del Dlk1 (F ón de DL disminuye e uno de lo 180, 181], o que Dlk1 e la señaliz a anclada toria [183] Efecto de Dlk ulas endotelia transfectadas APT (C). Las 1 mediant a de vasos l mRNA Fig. 38). LK1 con la e la expre os primero muy simila interaccio zación [182 a membr . k1 sobre la ac ales (A). Activi s con Dlk1 a d barras repres 125  te morfol s hacia la m humano a ruta de esión del os ligandos ar estructu ona con el 2-184], ya rana resist ctividad del p idad luciferasa diferentes dos sentan la med ino dió l masa tumo de Dlk1, Notch. gen repor s no canón uralmente a receptor d sea a trav tente a A promotor de a del promoto sis y tratadas dia±SEM; * p< ugar a u oral, que fu demostrá rtador de nicos de la a los ligand de Notch, a vés de la f ADAM que Hes-1. Sobree or de Hes 1 (B con el inhibid 0.05. Resulta una migra ue revertida ándose as luciferas a ruta de N dos canón actuando c forma solu e posee m expresión de B) en células dor de la ruta ados ación a por sí la a de Notch nicos. como ble o mayor Resultados 126    Para estudiar el nivel de activación de la ruta de Notch utilizamos una de las proteínas finales implicadas en la activación de la ruta de Notch, Hes1. Para ello se utilizó una construcción que contiene una secuencia de 350 pb del promotor murino de Hes-1 fusionada al gen reportador de la luciferasa, de forma que es posible monitorizar la actividad transcripcional del gen diana (Fig 41 B). Para ahondar en la posible interacción entre DLK1 y la ruta de Notch, se sobreexpresó DLK1 en células endoteliales de aorta bovina o porcina, mediante plásmidos de expresión de Dlk1 anclado al epítopo de hemaglutinina (HA) (Fig 41 A). Al sobreexpresar DLK1 en ambos modelos de células endoteliales se observó una inhibición dependiente de la concentración sobre la diana final de la ruta de Notch, Hes-1 que fue similar al nivel de inhibición observado con el tratamiento del inhibidor DAPT (Fig 41C). 5.3.2. Dlk1 disminuye la expresión del reportador RbpJK in vivo. Para comprobar si Dlk1 inhibía la ruta de señalización de Notch en otro modelo se utilizaron embriones del pez zebra que expresaban el efector fluorescente RbpJk, y que también es diana de la ruta de Notch. Como se observa en la figura 41B el inhibidor de Notch, DAPT, redujo drásticamente la fluorescencia comparada con el control. En consistencia con esta observación, al antagonizar Dlk1 mediante un morfolino (MO) se consiguió aumentar ligeramente la fluorescencia asociada a RbpJk (Fig 41 C). Por el contrario al inyectar embriones de pez zebra con el mRNA de hDlk1 se detectó una disminución de la señal asociada a la ruta de Notch (Fig 41 D).   Figura 40 (Tg(ptf1a:eG µM durante Cuantificació condiciones (*´p<0.01 vs . Pez zebr GFP)jh1) a lo 12 horas (B) ón de la lum (E). Las ba s control; *p<0 ra que exp os 2 días pos ), inyectados minosidad de rras represen .01 vs control 127  presa el e stfecundación con MO Dlk1 las figuras e ntan la Media ; #p<0.05 vs M elemento de n. Control (A) (D), inyectad en el canal a±SEM de 3 MO 250 µM). e respuesta , tratados con dos con mRN RBG para la preparacione Resulta a a Notch n DAPT a 50 NA Dlk1 (D). as diferentes es diferentes. ados Res   5.3.3 Dlk1 parti may nive célu activ ultados 3. La ruta 1. La activ ir de raton yores nivele l de prote las endote vidad de la                     Figura 41. N KO para Dl proteína de densitometr WT y KO, do niveles de m de Notch vidad de la es KO par es de las p eína como eliales care a ruta de No Niveles de pr k1. Niveles d NICD en cé ía de la prote onde el gráfico mRNA determi h está act a ruta de N ra Dlk1. Co proteínas N de mRNA entes de D otch. (Fig. roteínas impl e proteína de élulas MLEC eína de NICD o muestra la c nados por PC 128  tivada en Notch fue omo se m NICD (B) y A (C). Es Dlk1 en co 43). icadas en la e Dlk1 en MLE WT y KO. E (B). Niveles d cuantificación CR en tiempo r células en estudiada uestra en y Hey-1, en to indica ondiciones ruta de Notc EC WT y KO El gráfico mue de proteína d por densitome real (C). ndoteliale en las ML la figura 4 n los anima que en es basales h h en células para Dlk1 (A estra la cuant e Hey 1 en cé etría de la pro es carente LEC aislad 42, observa ales KO ta ste model hay una m MLEC WT y A). Niveles de tificación por células MLEC oteína Hey1 y es de das a amos nto a o de mayor   ruta prote tanto 5.3.4 Notc med desc rece Para es de Notch eína y mR Las célu o en mens   Figura 42. determinaro cuantificació mRNA de cuantificació 4. El efect ch. El efect diante com crito la inte Para ve eptor de No studiar los y en la T NA de las ulas KO pa ajero como Regulación n los niveles d ón por densito Slug y Snail ón por PCR en to de DLK to antagón petencia c eracción dir er averigua otch se uti niveles de TEM en cé mismas a ara Dlk1 p o en prote de Snail y S de proteína S ometría de la l en células n tiempo real ( K1 tiene lu ico de DL con los liga recta con e r si Dlk1 a lizó la líne 129  e las proteí élulas endo partir de c resentaron ína (Fig 44 Slug en célu Slug en célula a proteína Slu s MLEC WT (B). gar antes K1 sobre andos canó el sistema actúa antes ea celular e ínas Slug y oteliales K cultivos cel n mayores 4). ulas MLEC W as MLEC WT y ug (A). Se de y KO, dond de la pro la ruta de ónicos. Sin del doble s o despué endotelial y Snail1, im KO para D ulares. niveles de WT y KO pa y KO. El gráfic terminaron lo de el gráfico oteólisis d Notch pod embargo, híbrido [11 és de la inte de aorta p Resulta mplicadas lk1 se ais e Slug y S ara Dlk1. Se co muestra la os niveles de o muestra la del recepto dría tener , también s 12, 184]. eracción c porcina (PA ados en la laron Snail1 or de lugar se ha con el AEC) Res   que y est NICD may célu activ 5.3.5 angi NICD a es no. matr form 46). ultados expresa la table. Como s D se detec yor que en las donde vidad del p Figura 43. endoteliales endoteliales 2)(A). Activid NICD (B), y DAPT (C). 5. La so iogénesis Una vez D, la activi studiar si la La sobr rigel. De n mación de lo a forma ac se muestra ctó una ac las célula NICD está promotor de Efecto de D s que sobre de aorta porc dad luciferasa en células tra obreexpres en matrig z demostra idad de la a capacida reexpresió uevo las p os angiotu tiva del rec a en la fig ctividad ba as control ( á expresad e Hes-1 (C Dlk1 sobre l eexpresan NI cina (PAEC W a del promotor ansfectadas co sión de N gel. ado que e ruta de No ad de form n de Dlk1 presencia d bos en las 130  ceptor de N gura 45, e sal del pro (panel B). do de mane C). la actividad ICD. Niveles WT) controles r de Hes1 célu on Dlk1 y trata NICD bloq en células otch no se mar angiotu no afectó de VEGF n s células do Notch NIC en las cél omotor de La sobree era estable del promoto de NICD en y que sobree ulas PAEC co adas con el in quea el ef que expre e ve afecta ubos en es ó a la form no tuvo efe onde se so D de mane ulas que Hes-1 sig expresión e, no tuvo or de Hes-1 línea estable expresan NICD ontrol y que so hibidor de la r fecto de esan de fo ada por Dlk stas células mación de ecto signifi obreexpres era constit sobreexpr nificativam de Dlk1 e efecto sob en células e de células D (PAEC 1 y obreexpresan ruta de Notch Dlk1 sobr orma estab k1, se proc s se altera angiotubo icativo sob saba Dlk1 tutiva resan mente n las bre la re la ble el cedió aba o os en bre la (Fig.   5.4 5.4.1 Dlk1 plan algú neur Figura 44. F que sobree horas de cu angiotubos t Interacció 1 Activaci 1. Dada la teó la hipó n precede rogénesis r Formación de expresan NIC ultivo de PAE tanto en prese ón de Dlk ión por T a conocida ótesis de q ente ya q regulando e angiotubos CD sembradas EC sembradas encia como en k1 con la GF-β en c a interacci ue Dlk1 pu ue se ha la vía de N 131  s de células e s sobre matr s sobre matr n ausencia de ruta de T células en ión entre udiera mod descrito Notch y la endoteliales rigel. Formac igel (A). Cua VEGF (B). TGF-β. ndoteliales las ruta d dular esta i que Dlk1 vía BMP [1 de aorta porc ión de angiot ntificación de s MLEC W de Notch interacción es capaz 185]. Resulta rcina (PAEC) tubos a las 4 el número de WT y KO y TGF β n, existiend z de prom ados para β, se do ya mover Res   parti med PAI- resp KO este 5.4.2 rato tamb TGF Id-1 ultados   Figura 45. luciferasa de KO para Dlk promotor CA (NICD) y sob Para co icular sobr diante un re -1 (CAGA- puesta fue para Dlk1. efecto, sie 2. Papel d nes WT y Para co bién in viv F-β en retin que es út Activación d el promotor CA k1 en condicio AGA-Luc en re breexpresand omprobar s re el proce eportador Luc), una significativ . La sobre endo la res de TGF-β KO para D omprobar s vo, se proc nas de rato il para mo de la ruta de AGA-Luc en r ones basales espuesta a TG o Dlk1 (B). si DLK1 tie eso de ang de lucifera de las dian vamente m expresión spuesta me en la reg Dlk1. si el efecto cedió a es ones KO pa nitorizar la 132  TGF-B en c respuesta a TG y sobreexpre GF-β en célul ene algún e giogénesis asa que co nas mejor mayor en la o re-expre enor (Fig 4 gulación o de Dlk1 studiar el e ara Dlk1 y a respuesta células WT y GF-β en célul sando Dlk1 (A as BAEC con efecto sob s se estud ontiene un conocidas as células esión de D 46). de la ang sobre la ru estado de WT. Para a a TGF-β KO para Dlk as MLEC de r A). Actividad l n la ruta de No re la ruta d ió la respu a región d s de la ruta provenien Dlk1 revirti giogénesis uta de TG activación ello se uti . Como se k1. Actividad ratones WT y uciferasa del otch activada de TGF β, uesta a TG del promoto a de TGF ntes de rat ó parcialm s retinian F-β tiene n de la rut ilizó la pro e observa y en GF β or de β. La tones mente a de lugar ta de teína en la   figur com obse selec ra 44, los paradas c erva tanto ctivamente Figura 46. I de retinas d durante 3 ho tratados con TGF-β (F) e niveles de con los W en las zo e se detect mágenes rep de ratones a oras (B). Deta n TGF-β (D) e n zonas hiper e Id-1 son WT. Este a onas de va ta hipervas presentativas día 8 postnat alle de retinas en zonas no h rvascularizada 133  mayores aumento b asculatura scularizaci s de retinas d tal WT contro s de ratones hipervasculari as. en las reti basal del e a normal c ón. de ratones WT ol (A) y tratad KO a día 8 p izadas y no tr inas de los estado de como en re T y KO para D dos con TGF- ostnatal no tr ratados (E) y Resulta s animales e activació egiones d Dlk1. Detalle -β (50 ng/ml) ratados (C) y tratados con ados s KO ón se onde Resultados 134          DISSCUSIÓÓN       Discusión 137    6. DISCUSIÓN La proteína DLK1 se ha descrito como un ligando no canónico de la ruta de Notch que aunque carece del dominio DSL necesario para el reconocimiento y posterior unión al receptor de Notch es capaz de unirse y producir una inhibición de la ruta. Ya que la ruta de Notch se encuentra muy implicada en el proceso de la angiogénesis se quiso ver si DLK1 puede tener algún efecto sobre este proceso, tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas. Primero se comprobó si DLK1 se expresa en las células endoteliales adultas. Hasta el momento no se había descrito nada al respecto, únicamente se había detectado a nivel embrionario, donde se había observado que los niveles de esta proteína son muy altos y su expresión disminuye en el organismo adulto quedando restringida únicamente a determinados órganos y células, como son: glándula pituitaria, glándula adrenal y células β del páncreas. Una vez comprobado que DLK1 se expresa en células endoteliales de organismos adultos de diferentes especies, estudiamos si las variaciones en los niveles de esta proteína podrían influenciar al proceso de la angiogénesis. Para ello hicimos varias aproximaciones tanto in vitro, como la formación de angiotubos en matrigel; ex vivo, como los ensayos de anillos de aorta y estudios de la formación de la vasculatura in vivo, como la implantación de plugs de matrigel y estudios de la formación de vasos en la retina de ratones y en el modelo del pez zebra. Comprobamos como variaciones en los niveles de DLK1 alteran el desarrollo de la vasculatura, no solamente en condiciones fisiológicas sino también en condiciones fisiopatológicas, como es la formación de vasos asociada a tumores en el modelo de pez zebra. También se estudió a través de que ruta DLK1 podría estar alterando el proceso de angiogénesis. La primera ruta que decidimos estudiar es la ruta de Notch, y encontramos como variaciones en los niveles de DLK1 producen variaciones en la activación de la ruta de Notch. Las variaciones que encontramos en la formación de vasos mediadas por alteraciones en los niveles de DLK1 no se explican totalmente por variaciones de la ruta de Notch. Esto nos llevó a estudiar otras posibles rutas implicadas en el proceso de Discusión 138    angiogénesis, como son principalmente las rutas de señalización del VEGF y del TGF-β. En la ruta del VEGF no se observó que la alteración en los niveles de DLK1 tuviesen un efecto en la activación de esta ruta. Respecto a la ruta del TGF-β, si parece haber algún efecto sobre la activación de esta ruta cuando variamos los niveles de DLK1. El proceso de angiogénesis es un proceso complejo regulado por varias rutas, que a su vez son también rutas complejas, por lo que replanteó un estudio en mayor profundidad, tanto en la ruta Notch, estudiando posibles interacciones de los ligandos canónicos de dicha ruta con el ligando no canónico DLK1 como en la ruta de TGF-β. 6.1. DLK1 se expresa en células endoteliales de organismos adultos. Uno de los tipos celulares donde se describió originalmente la proteína DLK1 es el preadipocito [92, 130, 141, 186], donde está implicada en su diferenciación hacia el adipocito. También se describió inicialmente en carcinoma de pulmón y en una línea celular tumoral neuroendocrina [180]. Posteriormente se describió en otros tipos celulares como células β del páncreas, en células somatotropas de la glándula pituitaria y en células madre mesenquimales de médula ósea (hMCS). Las hMCS tienen la capacidad de diferenciarse hacia varios tipos celulares, como adipocitos, osteocitos, condrocitos, cardiomiocitos, mioblastos, neuronas y astrocitos. En todos estos tipos celulares DLK1 tiene una función muy importante ya que participa en su proceso de diferenciación. Es necesario que haya una regulación de los niveles de esta proteína. Así, la sobreexpresión de Dlk1 inhibe la diferenciación de los adipocitos, osteoblastos y condrocitos. Esto apunta a que la expresión de esta proteína podría estar implicada en mantener un estado no diferenciado en varios tipos celulares. En general los niveles de DLK1 son elevados durante el período embrionario, mientras que en el adulto su expresión llega prácticamente a desaparecer de forma que queda restringida únicamente a determinados tejidos como páncreas, médula ósea, glándula pituitaria y glándula adrenal [10- 12]. También se ha detectado su expresión en los vasos de la placenta [97, Discusión 139    187], y en tejido tumoral como carcinoma de células renales, carcinoma de pulmón, neuroblastoma y tumores endocrinos [151]. Uno de los primeros hallazgos de este trabajo ha sido la detección de Dlk1 en células endoteliales de organismos adultos en diferentes especies: humana, bovina, porcina y murina. Se ha detectado tanto el mRNA de Dlk1 como la expresión de la proteína. Esta nueva localización en células endoteliales adultas sugiere que podría desempeñar una nueva función en otro contexto diferente a los previamente descritos. 6.2. La ausencia de DLK1 está asociada con un aumento en la angiogénesis. Una vez comprobada la expresión de DLK1 en las células endoteliales de organismos adultos y que esta proteína tiene una estructura muy similar a los ligandos canónicos de la ruta de Notch, se estudió si esta proteína puede desempeñar algún papel en el contexto de la angiogénesis. Al estudiar la posible implicación de la proteína DLK1 en el proceso de formación de vasos utilizando varios modelos experimentales se observó cómo esta proteína tiene efectos considerables sobre la formación de la vasculatura. Hasta ahora la implicación de Dlk1 en el proceso de angiogénesis se ha descrito únicamente a nivel embrionario, donde se ha detectado su expresión en sitios de “branching” en morfogénesis y en los vasos sanguíneos de la placenta [97]. Por ello la implicación de Dlk1 en el proceso de angiogénesis en organismos adultos era un proceso desconocido hasta la realización de este trabajo. En el estudio de la angiogénesis utilizando modelos in vivo, se observó como en las retinas de los ratones deficitarios en Dlk1, existe un engrosamiento en zonas de la vasculatura y un aumento en el número de células “tip” y filopodios en regiones aisladas de la retina, siguiendo una distribución al azar. Se utilizó además otro modelo in vivo para confirmar los resultados, el pez zebra, en el cual al eliminar la copia de Dlk1 mediante un antagonista génico (morfolino), se produce un aumento en la formación de los vasos subintestinales. Discusión 140    Estos resultados obtenidos en modelos animales están apoyados por otros modelos experimentales. Así, en un modelo ex vivo en el que se extraen aortas de los animales KO para Dlk1 y los animales control y se hacen anillos que se embeben en matrices, las células endoteliales provenientes de los anillos de los ratones KO para Dlk1 tienen mayor capacidad de migración y formación de angiotubos comparada con los animales control que expresan la proteína. Además cuando se realizan otros experimentos para ver la capacidad angiogénica de estas células endoteliales carentes de Dlk1 obtenidas a partir de pulmones de los animales KO, se observa como estas células tienen una mayor capacidad de formación de angiotubos sembradas sobre una matriz de matrigel comparada con las células controles. El proceso de proliferación y el de migración están implicados en la angiogénesis, donde se encuentran ambos aumentados tanto en procesos fisiológicos como en procesos fisiopatológicos. Esta hiperangiogénesis que observamos en ausencia de DLK1 se vio también acompañada de un aumento en la proliferación y migración de las células endoteliales carentes de DLK1 comparadas con las células endoteliales controles, reflejado en mediciones de XTT y ensayo de cierre de heridas en placa. Para descartar un efecto por muerte celular se estudió el proceso de apoptosis, no encontrándose ninguna diferencia entre las células endoteliales carentes de DLK1 y las células control. Estos datos apoyan que la proteína DLK1 en las células endoteliales está implicada en el proceso de proliferación celular. Este efecto de DLK1 sobre la proliferación se ha descrito también en otros tipos celulares, como preadipocitos y células hematopoyéticas, donde la expresión de Dlk1 inhibe no solamente el proceso de diferenciación sino también la proliferación mediante regulación de la entrada de la célula en fase G1/S [188, 189]. Sin embargo, en experimentos de reparación de herida realizados in vivo en tejido de la oreja sobre ratones de las cepas MRL y C57BL/6 se observa una reparación completa del tejido en el ratón de la cepa MRL, que expresa mayores niveles de DLK1, localizados principalmente en el blastema, donde se encuentran las células no diferenciadas que están proliferando activamente [148]. Estas diferencias entre los resultados descritos en la bibliografía in vivo y nuestros datos in vitro de cierre de herida en placa con células endoteliales podrían Discusión 141    deberse fundamentalmente al modelo utilizado para realizar el ensayo, donde al partir de un modelo in vivo existen muchos más factores que afectan al proceso de cierre de la herida y que no podemos controlar, mientras que en nuestro ensayo in vitro el número de variables que pueden influir en el proceso disminuye considerablemente. Además, en el modelo descrito in vivo los niveles mayores de DLK1 se localizan en el blastema y no se menciona nada acerca de los niveles de la proteína en el endotelio, objeto específico de nuestro modelo in vitro. En consistencia con los resultados anteriores, al aumentar los niveles de la proteína DLK1, en el modelo in vivo de embriones pez zebra inyectados con el cDNA de Dlk1, se observa un patrón anormal de vascularización con una formación aberrante de los vasos intersegmentales y ausencia de anastomosis de la arteria dorsal intersegmental. Utilizando otro modelo in vivo de ratón, se constató que la proteína DLK1 inhibe la formación de vasos en una matriz de matrigel implantada subcutáneamente con factor de crecimiento VEGF. Además en el modelo ex vivo de anillos de aorta, el aumento de angiogénesis que se observa en los animales KO para Dlk1 se revierte al re-expresar la proteína mediante un vector adenoviral de forma dependiente de la concentración. En conjunto todos estos resultados apoyan que los cambios en la expresión de la proteína DLK1, dan lugar a alteraciones en la formación de vasos en el contexto fisiológico, ya sea hiperangiogénesis por ausencia de la proteína o inhibición del proceso por sobreexpresión de la proteína. 6.3. DLK1 regula el desarrollo vascular en angiogénesis tumoral en pez zebra. Tras comprobar el efecto de DLK1 en el proceso de angiogénesis en condiciones fisiológicas se estudió si además tiene una función en la angiogénesis tumoral. La angiogénesis fisiológica se asocia a los procesos de iniciación, formación, maduración, remodelado y regresión de células endoteliales, todos altamente regulados. Sin embargo se admite que durante la formación de un tumor, esta regulación está alterada, con supresión de Discusión 142    remodelado y regresión vasculares. Para estudiar este fenómeno en el modelo in vivo del pez zebra se inyectaron células tumorales de mamífero proangiogénicas en el espacio perivitelino [190]. En las condiciones normales control hay un crecimiento de vasos hacia la masa de células tumorales. Cuando se bloquea la expresión de DLK1 mediante un morfolino se observa un mayor crecimiento de vasos hacia la masa de células tumorales. Se consiguió revertir el efecto de bloquear la expresión de DLK1 sobre la formación de vasos, y se recuperó el fenotipo de los controles al coinyectar el mRNA de Dlk1. Nuestros datos sugieren por tanto que el papel de Dlk1 en la formación de los vasos también se refleja en procesos patológicos, como es la angiogénesis tumoral, donde actúa como inhibidor. La implicación de Dlk1 en angiogénesis tumoral se ha descrito posteriormente en la literatura en un modelo de ratón que es transplantado subcutáneamente con células tumorales RENCA, donde el tratamiento con vacunas basadas en péptidos o sobreexpresión de Dlk1 mediante lentivirus son ambos inmunogénicos y capaces de activar la respuesta inmune por parte de los linfocitos citotóxicos. Esta respuesta inmune va dirigida contra las células que expresan mayoritariamente DLK1 en esa zona tumoral y estas células son los pericitos que recubren los vasos nuevos que se forman en la masa tumoral. De esta forma tanto los péptidos de Dlk1 como la sobreexpresión mediante lentivirus son terapéuticos contra el tumor [191], de forma que se produce una normalización de los vasos sanguíneos asociados al tumor. Esta normalización de los vasos asociados al tumor tiene su reflejo en varios parámetros como son: disminución del número de vasos sanguíneos, cambios en la distribución de la vasculatura, disminución de la hipoxia que se produce principalmente en el centro de la masa tumoral y disminución de la permeabilidad vascular. Discusión 143    6.4. DLK1 inhibe la angiogénesis por antagonismo con la ruta de Notch.   Para estudiar el mecanismo por el cual DLK1 modula el proceso de angiogénesis se evaluó el estado de activación de la ruta de señalización de Notch en las células endoteliales provenientes de pulmón de los animales carentes de DLK1 y de los animales control. En las células endoteliales carentes de DLK1 hay mayores niveles del receptor de Notch activado, NICD. Estos mayores niveles de NICD se han visto anteriormente en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) derivados de ratones KO para Dlk1 [192]. Además hay mayores niveles de algunas dianas finales de la ruta como HES-1, HEY, SLUG y SNAIL, lo que sugiere que la ruta de Notch está basalmente activada cuando no existe DLK1 (Fig. 42). Además, en nuestro modelo in vitro, la proteína DLK1 es capaz de antagonizar la ruta de Notch, utilizando como ensayo la actividad luciferasa del promotor de Hes-1 (Fig. 40). En el modelo del pez zebra se observa el mismo efecto sobre la ruta de Notch. La reducción de los niveles de DLK1 mediante un morfolino promueve la activación de la ruta de Notch, reflejada en un ensayo reportador (Fig. 41). Por el contrario, la sobre- expresión de DLK1 mediante el mRNA, produce el efecto opuesto. En trabajos anteriores se ha descrito como DLK1 es capaz de interaccionar con el receptor de NOTCH1 [184, 192, 193]; es posible que DLK1 se una a las repeticiones EGF10-11 o EGF12-13 del receptor de NOTCH, lo que bloquearía la unión y activación de la ruta de Notch por el ligando canónico. Este se une habitualmente al receptor en trans a través de las repeticiones EGF11-12, por lo que DLK1 actuaría potencialmente como un antagonista. Sin embargo, aún no se ha demostrado la unión directa de DLK1 y el receptor ya sean endógenos o expresados ectópicamente. Se ha descrito que los niveles altos de DLK1 se asocian con la disminución en algunos genes diana de la ruta de Notch, como Hes-1 y E(spl) [184]mβ en mamíferos y mosca respectivamente [182-184]. También se ha descrito el efecto opuesto, de manera que el dímero de DLK1 aumenta la expresión de Hes-1 en timocitos [117]. Otros autores han propuesto modos alternativos de acción de DLK1, mediante una interacción directa con fibronectina [138] y otras moléculas, como IGFBP1 [194], aunque estas interacciones no implican la región de EGF de DLK1. Discusión 144    A la vista de los resultados, el efecto de DLK1 sobre el proceso de angiogénesis, ya sea fisiológico o patológico, parece estar mediado a través de la ruta de Notch. De acuerdo con esta propuesta Dlk1 podría actuar como competidor por el receptor de Notch en el endotelio con los ligandos canónicos que hay ya descritos, y que tienen diferente efecto sobre el proceso de angiogénesis. Mecanismos potenciales del efecto de DLK1 sobre angiogénesis La ruta de señalización de Notch es fundamental en el proceso de angiogénesis. La regulación de la ruta de Notch se produce a diferentes niveles. Una primera forma de regulación es por la interacción del receptor con los ligandos canónicos. Esta interacción es también dependiente de contexto, de forma que según al ligando que se una y el entorno puede dar lugar a diferencias en la activación o inhibición de la ruta de señalización. Una segunda regulación se produce por las modificaciones post-traduccionales del receptor, ya sean glicosilaciones o acetilaciones, que hacen que el receptor tenga mayor afinidad por unos ligandos u otros, dando lugar también como consecuencia a inhibición o activación de la ruta. Así los ligandos canónicos de la ruta de Notch, Dll4 y Jagged1 tienen efectos opuestos en el proceso de angiogénesis mediado por VEGF, de forma que controlan el equilibrio entre célula “tip” y célula “stalk”. Esto se hace por la modificación post-traduccional por Fringe, la glicosiltransferasa que modifica el receptor favoreciendo así la interacción con un ligando frente a otro [176]. Además puede darse una regulación de la ruta de Notch por internalización del receptor, lo que puede dar lugar tanto a una activación como a una inhibición. Esta internalización se produce mediante invaginaciones que dan lugar a endosomas primeramente tempranos y después tardíos, en los que se puede producir la proteólisis del receptor, dando lugar a la isoforma activa NICD; o pasar a degradación vía proteosoma por modificación con ubiquitina. Se ha descrito como el bloqueo de esta ruta de señalización da lugar a defectos en el remodelado vascular en el saco embrionario y a una formación aberrante del circuito arteria-vena en los embriones de ratón [195] . De los componentes de la ruta, dos de los cinco receptores de Notch, que son los receptores Notch1 y Notch4 y tres de los cinco ligandos canónicos de Notch, que son Jagged1, Dll1 y Dll4 se expresan Discusión 145    en las células endoteliales y participan en la formación de la vasculatura. Hay muchos estudios previos en los que se demuestra como alteraciones de la ruta de Notch dan lugar a una formación anormal de los vasos sanguíneos [195, 196] asociándose tanto a mutaciones en los receptores Notch1 y Notch4, como en los ligandos canónicos Jagged1, Dll1 y Dll4. En particular el ligando Dll4 está muy implicado en la regulación de la diferenciación hacia célula emergente o “tip” y célula soporte o “stalk”. Se ha descrito como deleciones en heterocigosis de Dll4 en ratón o la inhibición farmacológica de la ruta de Notch están asociadas con un incremento en el número de células tip endoteliales que emiten filopodios y un aumento en la expresión de genes marcadores de estas células “tip” comparado con los controles, lo que sugiere que Dll4 es un regulador negativo del “sprouting” vascular [197]. Se acepta en el momento actual que la proteína DLK1 se comporta como un ligando no canónico de la ruta de Notch, por su homología estructural con los ligandos canónicos [35]. DLK1 puede interaccionar con el receptor de NOTCH1 a través de la repeticiones EGF [184] con lo que podría actuar como antagonista de la ruta de Notch. Por los resultados obtenidos en el modelo de ratón carente de Dlk1, no habría un bloqueo de la ruta de Notch, sino una sobreactivación. Según el modelo descrito esto llevaría a una disminución en el número de células “tip” o emergentes y un aumento del número de células “stalk” o soporte. Este mayor número de células stalk podría explicar las zonas de mayor engrosamiento que se encuentran en zonas localizadas de la retina, pero en nuestro modelo también vemos un aumento del número de células “tip” que emiten filopodios en el frente angiogénico. El fenotipo que encontramos en las retinas de los animales KO para Dlk1 es similar al fenotipo descrito para los animales que no expresan el ligando canónico de la ruta de Notch Jagged1, que es un regulador pro-angiogénico que actúa inhibiendo la activación de la ruta de Notch por Dll4 [176]. Es posible que DLK1 puede desempeñar una función similar al ligando canónico Jagged1 inhibiendo la activación de la ruta de Notch por Dll4. Disc   es a esta qued de N ligan apro los sobr obse capa endo fluor ante BAE que del p co-c JAG cusión   Figura 47. zonas localiz Aun así algo comp blecer el dan potenc Para estu Notch expre ndo no c oximación u ligandos reexpresan ervación se az de repr oteliales co rescente eriormente EC. Cuand sobreexpr promotor d cultivar las GGED1, ob Fenotipo de zadas de la va í la interacc pleja [198 papel con cialmente a udiar si exi esados pri canónico d utilizando canónico n o no e observó oducir la i on las célu (GFP). E mediante o co-cultiv resan DLL de Hes-1, l células en servamos las retinas d asculatura. ción entre 8] y se n ncreto de afectados iste compe ncipalmen de la ruta un co-culti os Dll4 diferentes que DLK1 nhibición d ulas estrom ste result actividad vamos las L4-GFP, ve o que nos ndoteliales también u 146  de ratones K ligandos c necesitaría Dlk1 y q en el proce etición entr nte en célu a de No ivo de célu o Jagged s isoforma tanto solu de la ruta males cont tado es luciferasa células e emos un a s indica una s con célu un aumento O para Dlk1. canónicos n hacer que ligand eso de vas re los ligan las endote tch DLK1 ulas estrom d1 y cé as de D uble como de Notch trol que ex similar a del promo ndoteliales aumento d a activació las estrom o de la rut Mayor engro y no canó mayores e os canón scularizació ndos canón eliales Dll4 , hicimos males que lulas end LK1. En anclado a co-cultivan xpresan la al que ha otor de He s con célu de la activ ón de la rut males que a de Notch osamiento en nicos de N estudios, icos de N ón. nicos de la y Jagged1 s una pri sobreexpr doteliales esta pri a membran ndo las cé proteína v abíamos es-1 en cé ulas estrom vidad lucife ta de Notc sobreexpr h, pero en Notch para Notch a ruta 1 y el mera resan que mera na es élulas verde visto élulas males erasa ch. Al resan este   caso célu ruta por l célu Notc célu un p o el aume las endote de Notch, la isoforma Figura 48. actividad de Tanto la isof condiciones sobreexpres de las difere membrana, en las célula Esta inh la Balb/c1 ch1 y no e las donde plásmido ó ento es m eliales las aunque e a soluble (F Co-cultivo d e la ruta de No forma de DLK basales y sados en las c entes isoform S:DLK1 solub as estromales hibición de 4, que so expresan D se ha act inmoviliza enor. En isoformas n nuestro Fig. 49.) de células O otch medida m K1 anclada a activada p células estrom as de DLK1 ( ble) (B). Sobre OP (C). e la ruta d on un sub Dlk1. Al añ ivado la ru ación en pla 147  ambos co de DLK1 modelo ve OP estromale mediante activ membrana co por los ligan males OP (A). (B:basal, C:co eexpresión de de Notch s bclon de ñadir DLK1 uta median aca de Dll4 o-cultivos , ambas s emos una m es y células vidad luciferas omo soluble in ndos canónic Sobreexpresi ontrol, T:DLK1 e los ligandos se ha des las célula 1 se inhibe nte sobreex 4 [192]. al sobreex son capace mayor inhib s BAEC. Inhi sa del promot nhiben la ruta cos DLL4 y ón en células 1 total, M:DLK canónicos Dl scrito en o s 3T3-L1 e la ruta de xpresión d Discu xpresar en es de inhib bición med ibición de la tor de Hes-1. de Notch en y JAGGED1 s endoteliales K1 anclado a l4 y Jagged1 otro model que expr e Notch e de Jagged1 usión n las bir la diada lo de resan n las 1 por Discusión 148    Según nuestros resultados, DLK1, tanto la forma soluble como anclada a membrana, son capaces de inhibir la ruta de Notch activada por DLL4 o JAGGED1 en nuestro modelo de células endoteliales, de forma que actúan como antagonistas de la ruta de Notch. La posible competición entre los ligandos canónicos y el ligando no canónico DLK1 podría producirse por impedimento de la unión de los ligandos canónicos al receptor a través de las repeticiones EGF 11-12, de forma que quedarían bloqueadas estas posiciones, ya que DLK1 se ha descrito que se une al receptor a través de las repeticiones 10-11 y 12-13. 6.5. DLK1 inhibe la ruta de Notch en un paso inicial de la señalización. Hemos intentado abordar el estudio sobre el nivel de la ruta de Notch interferido por DLK1. Comprobamos como la proteína DLK1 está ejerciendo su efecto de inhibición a nivel de membrana, cuando el receptor no se ha unido al ligando y no se encuentra proteolizado en su forma activa, ya que células endoteliales que sobreexpresan la forma activa del receptor NICD siguen formando angiotubos sembradas sobre una matriz de matrigel en presencia de DLK1. Se observó como DLK1 es incapaz de inhibir la ruta de señalización de Notch una vez que el receptor se encuentra en su forma activa, como pudimos comprobar utilizando un modelo celular que sobreexpresa la forma activa del receptor de NOTCH (NICD). En este modelo donde tenemos la ruta de Notch sobreactivada, DLK1 es incapaz de disminuir la actividad del promotor de Hes- 1. Se comprobó además mediante ensayos funcionales in vitro, donde la sobreexpresión de Dlk1 en células endoteliales que sobreexpresan la isoforma activa del receptor de Notch (NICD), no produce la inhibición de formación de angiotubos que se da en condiciones normales. Por ello podemos concluir que el efecto de DLK1 sobre la inhibición de la angiogénesis mediante la inhibición de la ruta de Notch se produce a nivel del receptor, donde podría haber una competencia directa con los ligandos canónicos de la ruta de Notch; de forma que una vez que la ruta está activada DLK1 no tiene efecto sobre la misma.       Una post desc princ la ru inhib por reali med plás lucife rece Notc Figura 49. M en la isoform Notch a niv forma activa de las for t-traduccion crito en cipalmente uta, mientr biéndose la glicosilació zamos una diante la mido, y m erasa del eptor se en ch (Fig. 52 Modelo de in ma soluble co vel membrana a del receptor rmas de re nal del re retina c e con el lig ras que c a ruta [17 ón del rec a primera sobreexpre iramos el promotor ncuentra m ) nhibición de l omo en la anc a, antes de pr NICD. gulación d eceptor po uando el gando canó cuando no 6]. Para e ceptor de aproximac esión de nivel de ac de Hes-1 más glicosi 149  la ruta de No clada a memb roducirse la p de la ruta d or glicosil l recepto ónico Dll44 está mod estudiar si Notch pu ción favore la glicos ctivación d 1. Lo que ilado DLK1 otch por DLK brana inhibe l proteólisis del de Notch e ación. Se r está m 4, dando l dificado in esta mod uede afect eciendo la iltransferas de la ruta d e observam 1 no es ca 1. 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Esta proteína interactúa directamente con el dominio HLH de Hes_1 suprimiendo la unión de Hes_1 en su propio promotor, de forma que se interrumpe su autorepresión, por lo que los niveles de HES-1 son mayores. Ello había sido observado anteriormente en las células endoteliales que provienen de los animales KO para Dlk1 comparadas con los controles. Esto no interfiere con la actividad supresora de Hes_1 sobre otros genes diana que tienen sitios de unión a Hes_1 [200], como por ejemplo Dll1 y Dll4 en cuyas regiones promotoras se une Hes-1 y regula negativamente su expresión en “stem cells” [201, 202]. Estos datos sugieren que la ausencia de DLK1 favorece una mayor respuesta a TGF-β. Según los resultados obtenidos en este trabajo la proteína DLK1 está implicada en la formación de la vasculatura tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas. Esta nueva función para DLK1 en el contexto de la angiogénesis amplía las opciones para el tratamiento de patologías asociadas a anormalidades en la formación de vasos, como por ejemplo para el tratamiento del cáncer, donde el proceso de angiogénesis se ha reconocido como diana terapéutica. El primer agente antiangiogénico que comenzó utilizándose y sigue utilizándose en la actualidad es el anticuerpo dirigido contra el VEGF (Bevacizumab), que se ha utilizado tanto en cáncer como en neovascularización ocular. Pero estos tratamientos no son totalmente eficaces y en algunos casos se acaba desarrollando resistencia. Por ello es importante encontrar nuevos mecanismos dirigidos principalmente al bloqueo de la formación de la red vascular que alimenta la masa tumoral. Todas aquellas rutas de señalización implicadas en el desarrollo de la angiogénesis serían potencialmente dianas, por lo que la ruta de Notch y TGF-β pueden ser candidatas para el desarrollo de nuevas terapias antiangiogénicas. Así DLK1 puede representar nueva herramienta para la regulación del proceso de la angiogénesis mediante efectos sobre la ruta de Notch y de TGF-β. Discusión 152        COONCLUS SIONESS       Conclusiones 155    7. CONCLUSIONES. 1. DLK1 se expresa en células endoteliales, donde su presencia se correlaciona inversamente con la formación de angiotubos y el retraso en el cierre de las heridas. 2. La ausencia de DLK1 está asociada con un incremento del sprouting en la angiogénesis mientras que la sobreexpresión de Dlk1 inhibe la formación de nuevos vasos in vivo. 3. La regulación de la expresión de DLK1 está implicada en la regulación de la formación de la vasculatura en condiciones fisiológicas. La ausencia de Dlk1 se correlaciona con hiperangiogénesis focal en la retina, que se manifiesta mediante zonas localizadas de mayor engrosamiento en la vasculatura, así como un aumento también localizado en el “sprouting” y el número de las células “tip” y número de filopodios por célula. 4. La regulación de la expresión de DLK1 está además implicada en procesos patológicos, como la formación de la vasculatura en tumores. DLK1 regula el desarrollo vascular en angiogénesis tumoral en pez zebra, de forma que un aumento en los niveles de la proteína inhibe la formación de los vasos. 5. El mecanismo mediante el cual DLK1 inhibe el proceso de angiogénesis es a través del antagonismo de la ruta de Notch, de forma que cuando hay una sobreexpresión de la proteína hay una disminución de proteínas finales de esta ruta de señalización. 6. Este antagonismo se produce por competencia con los ligandos canónicos de la ruta de Notch. Conclusiones 156    7. El nivel al que DLK1 es capaz de inhibir de la ruta de Notch es anterior a NICD, posiblemente en la interacción con el receptor. Así una vez que está activada la ruta y está presente la forma activa del receptor, DLK1 es incapaz de ejercer su efecto sobre la misma. 8. Además DLK1 puede estar ejerciendo su efecto a través de otras rutas implicadas en el proceso de angiogénesis, como la ruta del TGF-β. En el modelo de células endoteliales procedentes de animales carentes de Dlk1, la respuesta al TGF-β es mayor. 9. Por los resultados obtenidos en este trabajo puede decirse que DLK1 podría estar implicada en la regulación del proceso de angiogénesis, no solamente de manera fisiológica, sino también en patología, como en tumores. DLK1 es un candidato a considerar en el tratamiento de tumores, donde los inhibidores que se utilizan de forma rutinaria no son totalmente efectivos o se llega a desarrollar resistencia a los mismos después del tratamiento.       BIBLIOOGRAFFÍA       Bibliografía 159    8. BIBLIOGRAFIA   1. Chung, A.S. and N. Ferrara, Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology, 2011. 27: p. 563-84. 2. Adams, R.H. and K. Alitalo, Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature reviews. Molecular cell biology, 2007. 8(6): p. 464-78. 3. Gerhardt, H., et al., VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. The Journal of cell biology, 2003. 161(6): p. 1163-77. 4. Potente, M., H. Gerhardt, and P. Carmeliet, Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell, 2011. 146(6): p. 873-87. 5. Kim, Y., The effects of nutrient depleted microenvironments and delta- like 1 homologue (DLK1) on apoptosis in neuroblastoma. 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The non-canonical NOTCH ligand DLK1 exhibits a novel vascular role as a strong inhibitor of angiogenesis Patricia Rodrı́guez1†, Marı́a Angeles Higueras1†, Alvaro González-Rajal2, Arántzazu Alfranca3, Marta Fierro-Fernández1, Rosa Ana Garcı́a-Fernández4, Maria José Ruiz-Hidalgo5, Marı́a Monsalve6, Fernando Rodrı́guez-Pascual1,7, Juan Miguel Redondo3, Jose Luis de la Pompa2, Jorge Laborda5, and Santiago Lamas1* 1Laboratorio Mixto Consejo Superior de Investigaciones Cientı́ficas (CSIC)-Fundación Renal ‘Iñigo Alvarez de Toledo’, Centro de Biologı́a Molecular ‘Severo Ochoa’, Nicolás Cabrera 1, 28029 Madrid, Spain; 2Departamento de Biologı́a del Desarrollo y Reparación Cardiovascular, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain; 3Departamento de Biologı́a Vascular e Inflamación, CNIC, Madrid, Spain; 4Departamento de Anatomı́a Patológica, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense, Madrid, Spain; 5Departamento de Quı́mica Inórgánica, Orgánica y Bioquı́mica, Universidad de Castilla-La Mancha, Albacete, Spain; 6Departamento de Cardiologı́a Regenerativa, CNIC, and Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC, Madrid, Spain; and 7Centro de Investigación Cardiovascular, CSIC and Institut Catalá de Ciencies Cardiovasculars, Barcelona, Spain Received 1 August 2011; revised 20 October 2011; accepted 3 November 2011; online publish-ahead-of-print 8 November 2011 Time for primary review: 23 days Aims The epidermal growth factor-like protein Delta-like 1 (DLK1) regulates multiple differentiation processes. It resem- bles NOTCH ligands structurally and is considered a non-canonical ligand. Given the crucial role of the NOTCH pathway in angiogenesis, we hypothesized that DLK1 could regulate angiogenesis by interfering with NOTCH. We therefore investigated the expression and function of DLK1 in the vascular endothelium and its role in the regu- lation of angiogenesis. Methods and results We report DLK1 expression in the endothelium of different species, including human, cow, pig, and mouse. Angio- genesis was studied by using in vitro and in vivo models of angiotube formation in endothelial cells, retinal phenotypes in Dlk1-null mice, and vessel development in zebrafish. DLK1 overexpression strongly inhibited angiotube formation, whereas lung endothelial cells from Dlk1-null mice were highly angiogenic. In vivo studies demonstrated DLK1- mediated inhibition of neovessel formation and revealed an altered pattern of angiogenesis in the retinas of Dlk1- null mice. The expression of human DLK1 in zebrafish embryos severely altered the formation of intersegmental vessels, while knockdown of the orthologous gene was associated with ectopic and increased tumour-induced angio- genesis. NOTCH-dependent signalling as determined by gene expression reporters was inhibited by the presence of DLK1 in vascular endothelial cells. In contrast, Dlk1-null mice showed increased levels of NOTCH downstream targets, such as Snail and Slug. Conclusion Our results unveil a novel inhibitory role for DLK1 in the regulation of angiogenesis, mediated by antagonism of the NOTCH pathway, and establish the basis for investigating its action in pathological settings. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Keywords Angiogenesis † Delta-like 1 † Pref-1 † Endothelium † NOTCH 1. Introduction Delta-like 1 (DLK1), also known as Pref-1 and FA1, is a transmem- brane protein pertaining to the epidermal growth factor superfamily and initially described in neuroendocrine tumours and preadipocytes.1,2 It has been described that DLK1 affects several dif- ferentiation processes, including adipogenesis, muscular and neuronal differentiation, bone differentiation, and haematopoiesis.3 Several reports from our groups and others support that DLK1 may operate as a non-canonical ligand of the NOTCH pathway, as it † These authors contributed equally to this work. * Corresponding author. Tel: +34 911964455; fax: +34 911964420, Email: slamas@cbm.uam.es Published on behalf of the European Society of Cardiology. All rights reserved. & The Author 2011. For permissions please email: journals.permissions@oup.com. Cardiovascular Research (2012) 93, 232–241 doi:10.1093/cvr/cvr296 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ lacks the DSL domain conserved in classic NOTCH ligands that med- iates ligand–receptor interaction.4 –6 This structural feature has been related to its capacity to inhibit NOTCH signalling in different cellular systems and organisms, by the interactions with specific EGF-like repeats of NOTCH.7 The potentially diverse effects of DLK1 would then depend on the cell context and state of NOTCH activation.8 To date, information on the presence of DLK1 in adult endothelia is restricted to adipose tissue vascular cells and placental blood vessels,9,10 and to our knowledge, there are no functional data in the vasculature. Angiogenesis, defined as the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a central process in embryonic and post-natal life and the object of intense study due to its relevance for tumour pro- gression and therapy.11 Since the NOTCH signalling pathway is essen- tial for vascular development and physiology by controlling angiogenesis in pre- and post-natal life,12,13 we reasoned that DLK1 could contribute to regulate this process in adult endothelial cells through the interaction with NOTCH receptors. In this study, we ana- lysed the role of DLK1 in angiogenesis by using a series of in vitro and in vivo approaches. We find that overexpression of DLK1 inhibits mi- gration and angiotube formation in mammalian vascular endothelial cells and disrupts normal embryonic vascularization in zebrafish. Genetic ablation of DLK1 in mice is associated with increased angio- genesis in vitro and with focal areas of retinal hypervascularization. Specific knockdown of the orthologous Dlk1 of zebrafish results in ectopic angiogenesis. Moreover, in a tumour angiogenesis model in zebrafish, suppression of Dlk1 promotes vessel migration towards the tumour cell mass. We also find that the NOTCH signalling pathway is targeted by DLK1 in the context of angiogenesis and that DLK1 antagonizes NOTCH-dependent signalling in endothelial cells, while, in contrast, this signalling is enhanced in Dlk1-null mice. Collectively, these results reveal a previously unknown role for DLK1 in the vasculature as a regulator of NOTCH-mediated angiogenesis. 2. Methods 2.1 Adenoviruses Adenoviruses encoding GFP, DLK1-GFP, or DLK1-HA were obtained from Vector Biolabs. Adenoviruses were purified using the Adeno-X Maxi Purification Kit and titered using the Adeno-X Rapid Titer Kit (Clontech). 2.2 Cell culture and animal handling Bovine aortic endothelial cells (BAEC) and porcine aortic endothelial cells (PAEC) were obtained from cow and pig aortas at a local slaughterhouse and cultured as described.14 For isolation of mouse lung endothelial cells (MLEC), mice were sacrificed by cervical dislocation and lungs were excised and collagenase-digested. The mixed population obtained was first subjected to negative selection with anti-FCsRII/III and then to posi- tive selection with anti-ICAM-2 and anti-IgG-coated magnetic beads. MLEC were grown on a mixture of fibronectin, type I collagen, and 0.1% gelatine-coated plates. Isolation of human umbilical vein endothelial cells is described in Supplementary material online. They were obtained from umbilical cords of normal deliveries (after approval by the Ethics Committee of the Hospital ‘Ruber Internacional’) and in agreement with principles outlined in the Declaration of Helsinki. Animals were handled in agreement with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals contained in Directive 2010/63/EU of the European Parliament. Approval was granted by the local ethics review board of Centro de Bio- logı́a Molecular ‘Severo Ochoa’. 2.3 Western blot analysis Details are provided in Supplementary material online. 2.4 Cell proliferation assays Endothelial cells were at a density of 3000 cells/well. XTT turnover was measured at 0, 24, 48, 72, and 96 h after 4 h incubation at 378C to allow colour development (Cell Proliferation Kit II). BrdU incorporation at 4, 8, and 24 h was detected by anti-BrdU (1:100), followed by anti-rat (1:200; Alexa 488). Images were taken with a Nikon eclipse TE2000-U inverted-microscope coupled to a digital-sight DS-2Mv. 2.5 Cell transfection and luciferase assay DLK1 plasmid was obtained from Origene (pCMV6 XL4, human cDNA clone, SC127962). A haemagglutinin tag was added (Vector Biolabs). The Hes-1 luciferase reporter construction, containing a 350 bp mouse promoter fragment of the Hes-1 gene inserted upstream of the luciferase gene in pGL2 Basic, has been reported elsewhere.15 Endothelial cell trans- fection and determination of luciferase activity are detailed in Supplemen- tary material online. 2.6 Scratch assay Endothelial cell monolayers were mechanically wounded and the rate of coverage of the denuded area was monitored by time-lapse microscopy for 24 h as described,16 using a Leica AF6000 LX microscopy coupled to a monochromatic Hamamatsu CCD C9100-02. 2.7 Tube-like structure formation in vitro The microcapillary-like formation assay was performed by using 96-well culture plates coated with 40 mL of Matrigel (BD Bioscience) as described.17 Endothelial cells with or without vascular endothelial growth factor (VEGF; 5 ng/mL) were seeded on the polymerized Matrigel and incubated at 378C for 5–6 h. Angiotubes were stained with MTT. Images were taken with a Nikon eclipse TE2000-U inverted microscope coupled to a digital-sight DS-2Mv. Tube formation was quantified by using the Angioquant software. 2.8 Aortic ring assay Rings of mouse aorta were cultures in three-dimensional gels as described.18 Thoracic aortas were removed from mice sacrificed by cer- vical dislocation. Pieces of aortas were immediately exposed or not to re- combinant adenoviruses at 1 × 109 or 5 × 109 plaque-forming units/mL. Four hours after infection, 1 mm long rings were embedded in Growth Factor Reduced Matrigel in 96-well plates. Each well contained 100 mL of MCDB131 supplemented with 2.5% mouse serum, 1% glutamine, and 1% P/S. After 6 days of culture, explants were examined by microscopy. The length of vessels was quantified by ImageJ. 2.9 Matrigel plug assay in vivo Growth Factor Reduced Matrigel Phenol Red-free (500 mL), heparin (0.3 mg/mL), and VEGF (250 ng/mL), adenovirus, DAPT (10 mg/kg of body weight) or DMSO (0.01%), as appropriate, were injected subcutane- ously in the mice abdominal region. Mice were anaesthetized by injecting (ip) ketamine (100 mg/kg) plus xylazine (10 mg/kg) and constantly moni- tored by veterinarian surveillance of reflex absence. Animals were eutha- nized in a CO2 chamber after day 10 of implantation, plugs were dissected, and haemoglobin was measured using the TMB method (Sigma). Haemoglobin content was normalized to plug weight. In another set of experiments, plugs were removed for histological examin- ation. Formaldehyde-fixed plugs were embedded in paraffin-wax and Role of DLK1 in angiogenesis 233 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ sectioned followed by staining with haematoxylin and eosin and examin- ation under a light microscope (Olympus DX50). 2.10 Retinal isolation and staining P0-P14 pups were sacrificed in a CO2 chamber and eyes enucleated and fixed overnight in 1% PFA at 48C. Then, retinas were dissected out and whole-mount stained with biotinylated isolectin B4 (Sigma-Aldrich) fol- lowed by streptavidin, Alexa Fluor 647 conjugate (Invitrogen) as described.19 Images from 8 to 10 retinas per experimental group were acquired in a Nikon A1R confocal microscope, and quantification of tip cells, filopodia, and vascular areas was carried out with ImageJ software. 2.11 Zebrafish DLK1 gain- and loss-of-function assays Zebrafish (Danio rerio) were maintained and raised under standard condi- tions at 288C. Transgenic Tg(fli1:EGFP) and Tg(gata1:dsRed) embryos were used to track endothelial cell populations and blood flow. Tg(fli1:EGFP); Tg(gata1:dsRed) were generated by standard crossing of individual lines. A plasmid encoding the human DLK1 cDNA was injected at different con- centrations in one-cell stage embryos. The same plasmid without the human DLK1 cDNA was used as a control. Embryos were allowed to develop and pictures were taken at 72 hpf using a dissection microscope equipped with epifluorescence (MZF16FA, Leica) and a digital camera (DFC310FX, Leica). Sequences and experiments regarding anti-sense morpholinos (MO) are described in Supplementary material online. 2.12 Zebrafish tumour xenograft angiogenesis assay Tg(fli:eGFP)20 embryos were injected at one-cell stage with MO against zfDLK1 or capped hDLK1 mRNA or both, and allowed to develop at 288C. Twenty-four hours post-fertilization fish embryos were incubated with water containing 0.2 mM 1-phenyl-2-thio-urea (Sigma) to prevent pigmentation. At 48 h post-fertilization, zebrafish embryos were dechor- ionated with the help of a sharp tip forceps and anaesthetized with tricaine (MS-222, Sigma). Anaesthetized embryos were transferred onto a modified agarose gel for microinjection. Before injection, tumour cells were labelled in vitro with 2 mg/mL of 1,1-dioctadecyl-3,3,3′,3′- tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI, Fluka) and were further incubated for 24 h. Cells were resuspended in DMEM and 2–5 nL of tumour cell solution (25 cells/nL) was injected into the perivitelline cavity of each embryo using an Eppendorf microinjector (FemtoJet 5247). After injection, the fish embryos were immediately transferred into housing-keeping water. Injected embryos were kept at 288C and were examined 2 days after to monitor tumour-induced angiogenesis from subintestinal vessels (SIV) using a fluorescent microscope (MZF16FA, Leica) equipped with a digital camera (MZF16FA, Leica). 2.13 Zebrafish NOTCH-reporter assay Tg(ptf1a:eGFP)jh1 is a transgenic NOTCH-responsive zebrafish line har- bouring 12 Rbp-Jk-binding sites up-stream of the b-globin minimal pro- moter and the enhanced Green fluorescent protein reporter gene.21 Tg(ptf1a:eGFP)jh1 embryos were injected at one-cell stage with MO against zfDLK1 or capped hDLK1 mRNA or were treated at 36 hpf with DAPT for 12 h and allowed to develop at 288C. Details of the proto- col are described in Supplementary material online. 2.14 RNA extraction and real-time PCR Detailed methods and primers used are described in Supplementary ma- terial online, Table S1. 2.15 Statistical analysis Comparisons were evaluated by Student’s t-test for unpaired data or one-way analysis of variance when parametric tests were possible or by non-parametric tests, as appropriate. 3. Results 3.1 DLK1 is expressed in endothelial cells where its presence correlates inversely with angiotube formation and delays wound healing Given the scarce information on DLK1 in the vasculature, we first studied its expression in several endothelial cell types and species. We found that DLK1 was expressed in murine, human, porcine, and bovine adult endothelial cells (Figure 1A). In the description of the phenotype corresponding to the Dlk1-null mice, obesity and serious osteo-skeletal malformations were reported22 but no explicit allusion was made to any changes in the vasculature. For this reason, we undertook studies in MLEC derived from Dlk1-null mice23 and observed increased formation of angiotubes both in the absence and presence of VEGF (Figure 1B). This phenotype was reversed by the introduction of adenoviral expression constructs bearing DLK1 (Figure 1C). In addition, BAEC overexpressing DLK1 showed delayed re-endothelization after 18 h of in-plate endothelial wound- ing (scratch assay) (see Supplementary material online, Figure S1A). Consistently, wound closure was significantly accelerated in MLEC from DLK1-null mice (see Supplementary material online, Figure S1B and C; see Supplementary material online, Videos S1 and S2). To address the contribution of proliferation and/or apoptosis to the final effect observed, we evaluated the consequences of DLK1 suppression in MLEC. We found that the absence of DLK1 signifi- cantly correlated with increased cell proliferation (see Supplemen- tary material online, Figure S1D and E). However, DLK1 did not interfere with apoptosis or necrosis (see Supplementary material online, Figure S2). These results suggest a dual inhibitory effect of DLK1 on the migration and proliferation of these endothelial cell types. 3.2 The absence of DLK1 is associated with increased sprouting angiogenesis while DLK1 overexpression inhibits neovessel formation in vivo To examine the effect of DLK1 on angiogenesis in an ex vivo model, we studied the outgrowth of endothelial cells from aortic explants obtained from WT or Dlk1-null mice. Aortic segments from null mice exhibited a significantly higher pro-angiogenic profile (Figure 2A) that was abrogated in a dose-dependent fashion when DLK1 was expressed in aorta explants of the null mutant background (Figure 2B). We then investigated the effect of DLK1 expression con- structs in an in vivo model of ectopic angiogenesis based on the forma- tion of vessels in Matrigelw plugs implanted subcutaneously in the abdominal region of healthy mice. Whereas VEGF-treated plugs showed macroscopic neovessel formation and increased haemoglobin content, functional vascular structures were drastically reduced in plugs exposed to DLK1 expression constructs compared with con- trols, an effect comparable in magnitude to that observed in plugs P. Rodrı́guez et al.234 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ Figure 1 Expression of DLK1 in adult endothelia and reciprocal relationship between DLK1 and angiogenesis. (A) Left blot showing DLK1 dimer in non-boiled lysates (30 mg) of endothelial cells from mouse (MLEC), human (HUVEC), pig (PAEC), and cow (BAEC) as well as 3T3 cells (1 mg) by a specific antibody. b-Actin was used as a loading control. Right blot showing non-boiled lysates from MLEC WT and KO. Samples were assayed from two independent preparations. (B) Representative images from wild-type and DLK1-null isolated MLEC in the presence or absence of VEGF. Quan- titative analysis represents the number of tube-like structures from three independent preparations per group. Values are presented as mean+ SEM assayed per duplicate (*P , 0.05). (C ) Cells from DLK1 null were infected with adenoviruses GFP or DLK1-GFP. (D) Lysates (45 mg) from cells infected with adenoviruses GFP or DLK1-GFP were incubated with DLK1, GFP, and actin antibodies. Representative image of endothelial cells 24 h after infection at a multiplicity of infection of 500 showing an infection efficiency of �90% Scale bars: B: 500; C: 100 and D: 50 mm. Role of DLK1 in angiogenesis 235 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ Figure 2 DLK1 regulates angiogenesis in vivo. (A) Representative images from wild-type and DLK1-null aorta segments. The quantification of vessel- like structures length (lower panel) shows an increase in neovessel outgrowth from explants of null mice. Values are presented as mean+ SEM of n ¼ 35 rings from six mice; *P , 0.05. (B) The pro-angiogenic response of the null mice is abolished in explants pre-incubated with a DLK1 adenovirus in a concentration-dependent manner, 1 × 109 (middle panel) and 5 × 109 (lower panel) plaque-forming units/mL compared with GFP adenovirus (upper panel). (C ) Ectopic angiogenesis was analysed in Matrigel plugs containing adenovirus (1 × 109 plaque-forming units/mL) control, or plugs con- taining VEGF plus adenovirus control, Ad.DLK1, Ad.DLK1-GFP, DAPT, or vehicle (DMSO). Photograph of plugs after 10 days of implantation. The quantification of haemoglobin content (right panel) shows that the VEGF pro-angiogenic effect is reduced in plugs containing DLK1 or DAPT. Values represent mean+ SEM from six mice (*P , 0.05 vs. Ad.GFP plus VEGF). (D) Haematoxylin- and eosin-stained sections of the plugs show decreased vascularization in Ad.DLK1, Ad.DLK1-GFP, and DAPT-treated plugs. Scale bars: A: 1 mm; B: 100 mm; D: 50 mm. P. Rodrı́guez et al.236 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ treated with the g-secretase inhibitor DAPT which is a established in- hibitor of the NOTCH pathway24 (Figure 2C and D). 3.3 The absence of DLK1 correlates with focal retinal hyperangiogenesis To confirm the antiangiogenic role of DLK1 in vivo, we studied the po- tential differences in retinal vessel formation in Dlk1-null mice com- pared with their wild-type counterparts. Retinas from null mice showed focal hypervascularization at p5 and p14 (Figure 3A; see Sup- plementary material online, Figure S3). This hypervascularization was enhanced at p5, indicating a more prominent role of DLK1 in the regulation of vascular leading edge progression (p5) than in remodel- ling (p14). In the developing murine retina, sprouting angiogenesis correlates well with the formation of endothelial tip cells and filo- podia.12 A detailed study of the affected regions in the retinas of Dlk1-null mice demonstrated an increased number of filopodia and tip cells (Figure 3B), consistent with a dysregulation of angiogenesis. Collectively, our results indicate that DLK1 acts as a brake for proliferation, migration, and angiogenesis in the vascular endothelium of post-natal mammals. 3.4 DLK1 regulates vascular development and tumour angiogenesis in zebrafish To investigate whether the role of DLK1 in angiogenesis could be extended to other vertebrate models, we performed experiments in embryos from Danio Rerio (zebrafish), in which the human version of DLK1 was microinjected and overexpressed in one-cell stage embryo. Three days after the injection, embryos expressing DLK1 showed an abnormal pattern of dorsal vascularization that was DLK1 dose-dependent, manifested in aberrant intersegmental vessel branching and a lack of an established dorsal longitudinal anas- tomotic vessel (Figure 4A–F; see Supplementary material online, Figure S4). To decipher whether DLK1 played a role by itself in the develop- ment of zebrafish vasculature, the endogenous orthologous mRNA was targeted with an MO. Upon MO injection, 6 days old larvae showed ectopic subintestinal angiogenesis (Figure 4G–J). This pheno- type was MO dose-dependent and was rescued by the concomitant Figure 3 Altered retinal angiogenesis in DLK1-null mice. (A) Confocal images of retinas from wild-type or DLK1-null p5 and p14 pups stained for isolectin B4. Retinas of null mice p5 show a hyperfused plexus compared with wild-type. Right panel depicts the quantification of retinal areas covered by vessels. Bars represent mean+ SEM from 10 mice (*P , 0.05). (B) Isolectin B4 immunofluorescence showing increased tip cell and filopodia in the DLK1-null p5 pups angiogenic front. Squared areas are blown-up in the right panels. Bar graph depicts the quantitative analysis of tip cells and filopodia (*P , 0.05). Scale bars: A: 200; B: 50 (left side) and 20 (right side) mm. Role of DLK1 in angiogenesis 237 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ expression of human DLK1 (Figure 4J). In a model of zebrafish xeno- graft tumour formation,25 suppression of DLK1 resulted in a clearly visible migration of vessels towards the tumour cell mass, an effect reversed by co-injection with human DLK1 mRNA (Figure 5A–C ). Our results suggest that DLK1 plays a role in the developing vascula- ture of zebrafish, hence supporting that this protein contributes to setting the general angiogenic programme. 3.5 DLK1 inhibits angiogenesis by antagonizing the NOTCH pathway To study the potential interaction of DLK1 with the NOTCH signalling pathway in the context of angiogenesis, we used several approaches. First, we found that expression of the NOTCH-dependent luciferase re- porter Hes-1 was reduced in a dose-dependent manner, in endothelial cells expressing DLK1 (Figure 6A). This occurred at levels similar to the effect observed after treatment with the g-secretase inhibitor DAPT (Figure 6B). We then studied the abundance of NOTCH signalling pathway-related proteins in MLEC from Dlk1-null mice and observed that the levels of the Notch1 intracellular domain (NICD) indicative of Notch1 activation and the downstream transcriptional effector Hey1 were markedly augmented (Figure 6C), thus suggesting that the absence of Dlk1 might contribute to derepress the Notch pathway. As Notch receptors have been shown to regulate Snail family of proteins in specific types of endothelial cells,26,27 we examined whether their ex- pression was altered in endothelial cells from Dlk1-null mice. We found increased levels of Snail mRNA and Slug protein in MLEC of Dlk1-null mice, compared with MLEC from wild-type mice (Figure 6D), suggesting that Dlk1 is inhibiting the expression of Snail and Slug. Figure 4 DLK1 affects angiogenesis in WT zebrafish embryos. (A–F ) Tg(Fli:eGFP); Tg(gata1:dsRed) embryos at 72 h post-fertilization. (G– I ) Tg(fli:eGFP) at day 6 post-fertilization. (A, B, D, and E) Bright-field images. (C and F) Fluorescent microscope images. General morphology of wild-type embryos (A) and intersegmental artery sprouts and GATA-dsRED-labelled erythrocytes (B and C) from a wild-type embryo injected with 500 pg of control cDNA plasmid. (D–F) Embryos injected with 500 pg of DLK1 cDNA. In (C) and (F), arrows highlight intersegmental arteries. (G) Embryo injected with 250 mM control MO oligonucleotide (MO control). (H ) Ectopic sprouts of the SIV in a DLK1-morphant embryo. (I ) Phenotype after co-injection of DLK1 MO (MO Dlk1) and DLK1 cDNA. (J ) Quantification of ectopic angiogenesis in day 6 pf larvae injected with control MO, DLK1 MO alone, or co-injected with human DLK1 plasmid (hDLK1). Arrows identify SIV. Each experiment, which included 100–300 embryos, was repeated at least twice. Bars represent mean+ SEM (*′P , 0.05 vs. control; *P , 0.025 vs. control; #P , 0.025 vs. MO 250 mM). Scale bars: A and D: 2 mm; B, C and E– I: 200 mm. P. Rodrı́guez et al.238 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ 3.6 DLK1 inhibits angiogenesis upstream of NOTCH intracellular signalling To evaluate the step at which DLK1 was interfering with the NOTCH signalling pathway, we performed studies of angiotube formation in PAEC in resting conditions and in PAEC overexpressing NICD, which are engineered to express active NOTCH-dependent signals in a ligand–receptor independent manner. In keeping with previous reports,27 PAEC stably expressing NICD showed high levels of Hes-1- dependent luciferase expression (data not shown). Expression of DLK1 resulted in the expected inhibition of angiotube formation, both in the presence and absence of VEGF (see Supplementary ma- terial online, Figure S5, upper panels). In contrast, angiotube formation in cells with constitutive NICD expression was not reduced by DLK1 (see Supplementary material online, Figure S5, lower panels), thus sug- gesting that DLK1 acts at the level of NOTCH receptors to regulate angiogenesis. To confirm that DLK1 was also inhibiting NOTCH sig- nalling in another model, we performed a series of studies in zebrafish embryos expressing the NOTCH-dependent fluorescent effector RbpJk. As shown in Supplementary material online, Figure S6A and B, DAPT drastically reduced fluorescence associated with NOTCH signalling, while antagonism of DLK1 with an MO moderately enhanced it (see Supplementary material online, Figure S6C). In con- trast, injection of embryos with the human Dlk1 mRNA promoted a marked abrogation of NOTCH-dependent fluorescence (see Sup- plementary material online, Figure S6D). Taken together, these results support the notion that DLK1 is negatively regulating NOTCH signalling, likely by interfering with canonical ligand–recep- tor interaction. 4. Discussion Since the initial description of DLK1 as an inhibitor of adipocyte and neuroendocrine differentiation, a growing body of evidence suggests that it may act as a general inhibitor of differentiation, including cell types of non-neuroendocrine lineage such as osteoblasts,28 myo- cytes,29 haematopoietic cells,30 and chondrocytes.31 Work by one of our groups has established that DLK1 may antagonize the NOTCH pathway in several settings and that this antagonism relies on its capacity to act as a non-canonical ligand.4 Precisely, because an essential role of the NOTCH pathway is to regulate angiogenesis, we asked what role, if any, could be played by DLK1 in the context of this fundamental biological process. This work shows for the first time to our knowledge that DLK1 is: (i) expressed in adult endothelial cells and (ii) it acts as a powerful antiangiogenic factor in several models and organisms. Furthermore, we have been able to provide evidence supporting that this inhibition of angiogenesis is mediated by interfer- ence with the NOTCH pathway and plausibly with canonical ligand– receptor interaction. Several reports lend a basis for the interaction between DLK1 and the NOTCH 1 receptor, suggesting that the former exerts an antag- onistic role due to its capacity to bind to those NOTCH EGF-like repeats also involved in the interaction with NOTCH ligands.4,7,8 Figure 5 Knockdown of DLK1 promotes, and DLK1 inhibits, tumour-induced angiogenesis in zebrafish xenograft assay. Fluorescent microscopic images of (A) 4 dpf control and (B) MO-injected larvae xenografted with MDA-MB-435 tumour cells at 2 dpf. Arrows highlight SIV and arrowheads identify tumour cells. (C ) Quantification of embryos showing tumour-induced angiogenesis when injected with MO against DLK1 at different concen- trations or co-injected with human Dlk1 capped mRNA. Each condition, which included 25–50 embryos, was repeated at least twice. Bars represent mean+ SEM (*P , 0.025 vs. control; #P , 0.025 vs. MO 250 mM). Scale bars: 200 mm. Role of DLK1 in angiogenesis 239 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ However, other authors have proposed alternative modes of action for DLK1 invoking direct interaction with fibronectin32 and other molecules, such as IGFBP1,6 although these interactions do not involve the DLK1 EGF-like region. It has been established that three of the five canonical NOTCH ligands (Jagged 1, Dll1, and Dll4) are expressed in endothelial cells and play critical roles in vascular angio- genesis.12 For example, maintenance of arterial identity relies on the Notch1–Dll interaction.33,34 Heterozygous deletion of Dll4 in mice or pharmacological inhibition of NOTCH signalling was associated with increased numbers of filopodia-extending endothelial tip cells and increased expression of tip cell marker genes compared with con- trols,35 thus suggesting that Dll4 is a negative regulator of vascular sprouting. Dll4 and Jagged1 have opposing effects on sprouting angio- genesis mediated by VEGF signalling, by controlling the equilibrium between tip and stalk cells through a mechanism regulated by the gly- cosyltransferase Fringe, which post-translationally modifies the NOTCH receptors.33 In zebrafish, the absence of NOTCH promotes a shift towards the tip cell phenotype, favouring vessel sprouting, and loss of Dll4 was associated with an increased endothelial cell number.36 In addition, several studies have found that the NOTCH pathway is generally related to angiogenesis inhibition, at least when the canonical ligand Dll4 is involved (see Phng and Gerhardt37 for review). The interaction between canonical and non-canonical NOTCH ligands is a complex one38 and further studies are needed to establish the precise interplay of DLK1 with the canonical NOTCH ligands in the vasculature. The phenotype found in the retinas of Dlk1-null mice (increased number of vessels, tip cells, and filopodia in selective areas) is consistent with the antiangiogenic action of DLK1 observed in cultured cells and in the zebrafish model. Our data clearly show that Dlk1 interferes with Notch signal- ling but do not define the precise level of interaction or the Notch canonical ligand potentially affected. Thus, a straightforward interpret- ation of discrepancies between the vascular phenotype observed in this study in mice and zebrafish and those previously reported in models bearing genetic modifications of NOTCH canonical ligands is still premature. Figure 6 DLK1 inhibits angiogenesis by antagonizing the NOTCH signalling pathway. (A) Quantification of NOTCH signalling in bovine endothelial cells measured by Hes-1 activity. (B) cDNA DLK1 (0.25 mg) decreases Hes-1 activity to a similar extent than 0.5 mM of the g-secretase inhibitor, DAPT. Bars represent mean+ SEM of three independent experiments assayed per triplicate (*P , 0.05). Lysates from control cells or cells trans- fected with a control vector or with DLK1-HA (50 mg) were incubated with DLK1, HA, and actin antibodies. Densitometric analysis yielded a 2.5-fold increased DLK1 protein with respect to controls. (C ) Representative western blots (n ¼ 3) from Notch intracellular domain (NICD, upper panel) and Hey1 (lower panel) showing protein up-regulation in lung endothelial cells from KO mice. Quantification of four different mouse preparations per group by densitometry and qRT-PCR (mean+ SEM; *P , 0.05). (D) Representative western blot of Slug protein (n ¼ 3). Quantitative qRT-PCR and densitometric analysis showing Slug and Snail are enhanced in DLK1 KO mice (n ¼ 4, mean+ SEM; *P , 0.05). P. Rodrı́guez et al.240 at U niversidad A utonom a de M adrid. B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ Antagonism of the NOTCH pathway by the use of decoys has proven to be effective in animal models of tumour progression39 and the use of endogenous inhibitors of the NOTCH pathway has been claimed to represent a potential therapeutic avenue.40 The regu- lation of angiogenesis in tumours is the object of intense study in the context of providing effective means of deferring or suppressing human tumoral growth. However, tumours seem to find mechanisms of escape from anti-VEGF-directed therapies,41 and hence, it is essen- tial to search for new candidates and targets mediating an antiangio- genic effect. In this pathological setting, and supported by our observations in zebrafish tumour-induced angiogenesis, it will be worth determining the potential of DLK1 to abrogate tumour- dependent angiogenesis in mammals. Supplementary material Supplementary material is available at Cardiovascular Research online. Acknowledgments We thank José Félix de Celis for critical review of the manuscript and all members of the Lamas lab for helpful discussion. Conflict of interest: A provisional patent based on this work was filed in October 2010 (ES1641.793) by Consejo Superior de Investi- gaciones Cientı́ficas (CSIC). Funding This work was supported by the conjoint grant Cardiovrep S2006/ BIO-0194 from the Comunidad Autónoma de Madrid (to S.L., J.L.P., and J.M.R.), CSD 2007-00020 (to S.L. and M.M.), SAF2009-07520 (to S.L.), and BFU2007-61094 (to J.L.) all from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN). References 1. 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B iblioteca de E conom icas on M arch 10, 2014 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ D ow nloaded from http://cardiovascres.oxfordjournals.org/lookup/suppl/doi:10.1093/cvr/cvr296/-/DC1 http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ http://cardiovascres.oxfordjournals.org/ CVR‐2011‐823R1    Supplementary Data Detailed Methods Adenoviruses Adenoviruses encoding GFP, DLK1-GFP (bicistronic) or DLK1-HA were obtained from Vector Biolabs. Adenoviruses were purified using the Adeno-X Maxi Purification Kit (Clontech) and titered using the Adeno-X Rapid Titer Kit (Clontech) Cell lines, endothelial cells isolation and culture Mouse 3T3-L1 cell line was routinely maintained in DMEM with 10% bovine calf serum and 1% penicillin-streptomycin (P/S). The 293A cell line, used to amplify the adenoviruses, was maintained in DMEM with 10% fetal bovine serum (FBS). Bovine aortic endothelial cells (BAEC) and porcine aortic endothelial cells (PAEC) were obtained from cow and pig aortas at a local slaughterhouse and cultured as described 1. For isolation of mouse lung endothelial cells (MLEC), lungs from 129 SVJ wild-type and DLK1 null mice were excised, collagenase-digested, and further disaggregated to produce a single cell suspension. The mixed population obtained was first subjected to negative selection with anti FCsRII/III antibody (CD16/CD32) (BDTM) and then to positive selection with anti ICAM-2 antibody (CD102) (BDTM) and anti-IgG-coated magnetic beads (Invitrogen). MLECs were grown on a mixture of fibronectin (Sigma), type I collagen (Vitrogen 100) and 0.1% gelatine (Sigma) coated plates with DMEM + Ham´s F-12, 20% FBS, 1% P/S, 2 mM Glutamine and brain cow extract growth factor for endothelial cells (ECGF). In the case of HUVEC, these were obtained from umbilical cords of normal deliveries (after approval by the ethics committee of the Hospital “Ruber Internacional”) and in agreement with principles outlined in the declaration of Helsinki. Animals were handled in agreement with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals contained in Directive 2010/63/EU of the European Parliament. Approval was granted by the local ethics review board of Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”. CVR‐2011‐823R1    For human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) isolation, umbilical cords were digested with 0.1% collagenase at 37ºC for 20 minutes. Endothelial cells were collected and grown on 0.2% gelatin with Medium 199 + 20% FBS, 1% P/S and ECGF. Western Blot Analysis Cells were lysed in RIPA buffer with a Protease Inhibitor cocktail (Roche) and 1% SDS, then these lysates were sonicated and incubated at 4ºC for 30 minutes. Total protein concentration was determined using BCA reagent (Pierce). Lysates were subjected to 10% SDS-PAGE electrophoresis and transferred to nitrocellulose membranes (Millipore). Membranes were blocked with TBS containing 5% BSA or milk for 1 h and probed with DLK1 antibody (1:2500; Santa Cruz), anti-NICD (1:1000; Abcam), anti-Hey (1:1000; Santa Cruz), anti-Slug (1:500; Santa Cruz) and anti- Actin (1:10000; Sigma). Following incubation at 4ºC overnight, membranes were incubated with anti-rabbit or anti-mouse (Odyssey, 926-32211 and 926-32220, respectively) at room temperature for 1h. Detection was performed using the LI-COR Odyssey Infrared Imaging System. The optical density of the protein bands was analyzed by Multi-Gauge V3.0. Apoptosis MLEC from wild-type and DLK1 null mice were treated with staurosporine at 2.5 M for 2, 4, 8 and 19 hours. Cells were resuspended in 100 l of annexin-binding buffer (0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2) plus 2.5 l annexin V and 5 μl 7-Amino-Actinomycin (7-AAD). After 15 min of incubation at room temperature, 200 l of annexin-binding buffer was added and apoptosis and necrosis were analysed by flow cytometry (FACSCanto II High Throughput Sampler Option; Becton Dickinson) Cell transfection and luciferase assay CVR‐2011‐823R1    DLK1 plasmid was obtained from Origene (pCMV6 XL4, human cDNA clone, SC127962). A hemaglutinin tag was added in order to detect the exogenous protein (Vector Biolabs). The Hes-1 luciferase reporter construction, containing a 350 bp mouse promoter fragment of the Hes-1 gene inserted upstream of the luciferase gene in pGL2 Basic, has been reported elsewhere 2. Endothelial cell cultures at 60-70% confluence were co-transfected with Hes-1 luciferase reporter plus Renilla vector (pGL2, Promega) with lipofectamine (Invitrogen). Twenty four hours after transfection, luciferase activity was determined using the Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) and expressed as fold induction relative to levels obtained with transfection of control plasmids. Scratch assay Endothelial cell monolayers were mechanically wounded and the rate of coverage of the denuded area was monitored by time-lapse microscopy for 24 hours using a Leica AF6000 LX microscopy coupled to a monochromatic Hamamatsu CCD C9100-02 camera. Tube-like structure formation in vitro The microcapillary-like formation assay was performed by using 96-well culture plates coated with 40 µl of Matrigel (BD Bioscience) 3 diluted 1:1 in Medium 199 per well. After 30 min at 37ºC, porcine endothelial cells (3x104) in 0.1 ml of 10% FBS-DMEM or mouse lung endothelial cells (3x104) in D-MEM:F-12 (1:1) + 8% FBS + 2 mM Gln with or without VEGF (5 ng/ml) (R&D System) were seeded on the polymerized Matrigel and incubated at 37ºC for 5-6 hours. Angiotubes were stained with MTT (Sigma) for 30 minutes. Images of the capillary-like structures were taken at 2x magnification with a Nikon eclipse TE2000-U inverted-microscope coupled to a digital- sight DS-2Mv. Tube formation was quantified by using the Angioquant software and double-checked by eye-counted. Aortic ring assay CVR‐2011‐823R1    Angiogenesis was studied by culturing rings of mouse aorta in three-dimensional gels as described 4. Thoracic aortas were removed from mice sacrificed by cervical dislocation and immediately transferred to a culture dish containing ice-cold phosphate buffered saline. The periaortic fibro-adipose tissue was carefully removed without damaging the aortic wall. Pieces of aortas were immediately exposed or not to recombinant adenoviruses at 1x109 or 5x109 plaque-forming units/ml. Four hours after infection, one-millimeter long rings were embedded in Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced (BD Biosciences) in 96-well plates. Each well contained 100 µl of MCDB131 supplemented with 2.5% mouse serum, 1% glutamine and 1% P/S. After 6 days of culture, explants were examined by microscopy. The vessel length per ring was quantified by ImageJ software. Matrigel plug assay in vivo Growth Factor Reduced Matrigel Matrix Phenol Red-free (500 µl) (BD, Bioscience), heparin (0.3 mg/ml) (Sigma), and VEGF (250 ng/ml), adenovirus, DAPT (10 mg/kg of body weight) or DMSO (0.01%), as appropriate (see fig. 2) were injected subcutaneously in the abdominal region of wild-type mice. Mice were anesthetized by injecting (i.p) ketamine (100 mg/kg) plus xylazine (10 mg/kg) and constantly monitored by veterinarian surveillance of reflex absence. Animals were euthanized in a CO2 chamber after day 10 of implantation, plugs were removed for histological and immunohistochemical examination. Formaldehyde-fixed plugs were embedded in paraffin-wax and sectioned followed by staining with hematoxylin and eosin and examination under a light microscope (Olympus DX50, Olympus America Inc., Center Valley, PA) Retinal isolation and staining P0-P14 pups were sacrificed in a CO2 chamber and eyes enucleated and fixed overnight in 1% PFA at 4ºC. Then, retinas were dissected out and whole-mount stained with CVR‐2011‐823R1    biotinylated Griffonia simplicifolia isolectin B4 (Sigma-Aldrich) followed by streptavidin, Alexa Fluor 647 conjugate (Invitrogen) as described 5. Images from 8-10 retinas per experimental group were acquired in a Nikon A1R confocal microscope, and quantification of tip cells, filopodia and vascular area was carried out with ImageJ software. Zebrafish DLK1 gain- and loss-of-function assays Zebrafish (Danio rerio) were maintained and raised under standard conditions at 28°C. Transgenic Tg(fli1:EGFP) and Tg(gata1:dsRed) embryos were used to track endothelial cell populations and blood flow. Tg(fli1:EGFP); (gata1:dsRed) were generated by standard crossing of individual lines. A plasmid encoding the human DLK1 cDNA was injected at different concentrations in one cell stage embryos. The same plasmid without the human DLK1 cDNA was used as a control. Embryos were allowed to develop and pictures were taken at 72 hpf using a dissection microscope equipped with epifluorescence (MZF16FA, Leica) and a digital camera (DFC310FX, Leica). Anti- sense morpholinos (MO) (Gene-Tools, OR, USA) (5´- CCAAAACCTCACAGAAGCTCGTCAT-3´) were designed to target the initiation codon (ATG) of the zebrafish Dlk1 gene (NCBI Reference Sequence: XM_001921677.1). A random sequence MO was used as a control. Each was injected at 62.5, 125 and 250 M in one or two cell stage embryos that were allowed to develop until 6 dpf when pictures were taken. For the rescue experiment DLK1 morpholino at 250 M and 500 pg of plasmid encoding the human DLK1 were co-injected in one cell embryos and pictures were taken at 6 dpf. At least 100 embryos per condition were analyzed per experiment. Zebrafish tumor xenograft angiogenesis assay. Tg(fli:eGFP) 6 embryos were injected at 1 cell stage with MO against zfDLK1 or capped hDLK1 mRNA or both, and allowed to develop at 28 °C. Twenty-four hours postfertilization fish embryos were incubated with water containing 0.2 mM 1-phenyl- 2-thio-urea (Sigma) to prevent pigmentation. At 48 h post-fertilization, zebrafish embryos were dechorionated with help of a sharp tip forceps and anesthetized with CVR‐2011‐823R1    tricaine (MS-222, Sigma). Anesthetized embryos were transferred onto a modified agarose gel for microinjection. Before injection, tumor cells were labeled in vitro with 2 g/mL of 1,1-Dioctadecyl-3,3,3´-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI, Fluka, Germany) and were further incubated for 24 h. Cells were resuspended in DMEM (Sigma) and 2-5 nL of tumor cell solution (25 cells/nL) were injected into the perivitelline cavity of each embryo using an Eppendorf microinjector (FemtoJet 5247, Eppendorf). After injection, the fish embryos were immediately transferred into housing-keeping water. Injected embryos were kept at 28 °C and were examined 2 days after to monitor tumor-induced angiogenesis from sub-intestinal vessels (SIV) using a fluorescent microscope (MZF16FA, Leica) equipped with a digital camera (MZF16FA, Leica). Each experiment, which included 25-50 embryos, was repeated at least twice. Zebrafish NOTCH-reporter assay Tg(ptf1a:eGFP)jh1 is a transgenic NOTCH-responsive zebrafish line harboring 12 Rbp- J binding sites up-stream of the -globin minimal promoter and the enhanced Green fluorescent protein reporter gene 7. Tg(ptf1a:eGFP)jh1 embryos were injected at 1 cell stage with MO against zfDLK1 or capped hDLK1 mRNA or were treated at 36 hpf with DAPT for 12 hours and allowed to develop at 28°C. Twenty-four hours postfertilization fish embryos were incubated with water containing 0.2 mM 1-phenyl-2-thio-urea (Sigma) to prevent pigmentation. At 48 hpf pictures containing around 15 embryos (petri-dish with at least 50 embryos) were taken (MZF16FA, Leica and MZF16FA, Leica) and luminosity in the RBG channel of at least 5 pictures per experiment was measured with Adobe PhotoShop CS3 Extended (Adobe Systems Incorporated). RNA extraction and real-time PCR Cell monolayers were washed with phosphate-buffered saline, total RNA was prepared with phenol-cloroform extraction. cDNA synthesis was undertaken using iScript cDNA Synthesis Kit (Biorad, cat# 170-8891). Quantitative real-time PCR was performed using C1000 Thermal Cycler CFX96 Biorad. The endogenous Dlk1 cDNA was amplified by Sso Fast Eva Green Supermix (Biorad, cat# 172-5201) using the appropriate primers (Table I). CVR‐2011‐823R1    Statistical analysis All data are expressed as mean ± standard error of the mean (SEM) for at least n=3 experiments. Comparisons were evaluated by Student´s t-test for unpaired data or one- way analysis of variance when parametric tests were possible or by non-parametric tests, as appropriate. p values <0.05 were considered as statistically significant. Supplementary References 1. Lamas S, Marsden PA, Li GK, Tempst P, Michel T. Endothelial nitric oxide synthase: molecular cloning and characterization of a distinct constitutive enzyme isoform. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89:6348-6352. 2. Jarriault S, Brou C, Logeat F, Schroeter EH, Kopan R, Israel A. Signalling downstream of activated mammalian Notch. Nature 1995;377:355-358. 3. Isaji M, Miyata H, Ajisawa Y, Takehana Y, Yoshimura N. Tranilast inhibits the proliferation, chemotaxis and tube formation of human microvascular endothelial cells in vitro and angiogenesis in vivo. Br J Pharmacol 1997;122:1061-1066. 4. Mikirova NA, Casciari JJ, Riordan NH. Ascorbate inhibition of angiogenesis in aortic rings ex vivo and subcutaneous Matrigel plugs in vivo. J Angiogenes Res 2010;2:2. 5. Pitulescu ME, Schmidt I, Benedito R, Adams RH. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc 2010;5:1518-1534. 6. Lawson ND, Weinstein BM. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol 2002;248:307-318. 7. Parsons MJ, Pisharath H, Yusuff S, Moore JC, Siekmann AF, Lawson N et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev 2009;126:898-912. CVR‐2011‐823R1    Supplementary Table 1 Primer Sequence Dlk For Bovine 5´AGTGCCCATGGAGCTGAATG3´ Dlk For Mouse, Human, Porcine 5´AGCACCTATGGGGCTGAATG3´ Dlk Rev Bovine 5´CCGGATGTCTAGGTCACAGAG3´ Dlk Rev Mouse 5´CCGAACGTCTATTTCGCAGAA3´ Dlk Rev Human, Porcine 5´CCGAACATCTCTATCACAGAG3´ GAPDH For 5´GCCTGGTCACCAGGGCTGC3´ GAPDH Rev 5´CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGG3´ m Hey For 5´CACGCCACTATGCTCAATGT3´ m Hey Rev 5´TCTCCCTTCACCTCACTGCT3´ m Snail For 5´TCTGAAGATGCACATCCGAAGCCA3´ m Snail Rev 5´AGGAGAATGGCTTCTCACCAGTGT3´ Slug For 5´AGATGCACATTCGAACCCAC3´ Slug Rev 5´GTCTGCAGATGAGCCCTCAG3´ CVR‐2011‐823R1    Supplementary Figure Legends Figure S1. DLK1 regulates motility and proliferation of vascular endothelial cells. A. Representative images from porcine aortic endothelial cells under basal conditions, expressing a control vector, pCMV6, overexpressing DLK1 or treated with the - secretase inhibitor, DAPT, at time zero and at the time of the control closure. Red lines mark the migratory edge of the “wound”. B. Representative pictures of lung endothelial cells from wild-type and DLK1-null mice. C. Quantitative analyses represent percentage of the wound area at closure time, respectively (mean + SEM of n=3 independent preparations assayed per triplicate; *p<0.05). D. Quantitative analysis showing a higher viability in lung endothelial cells from null mice compared to wild- type. Error bars represent SEM from at least three independent preparations (*p<0.05). E. Quantification of BrdU-positive cells showing increased cell proliferation in DLK1 null mice. Representative images from BrdU (green) and DAPI (blue)-stained cells from wild-type and null mice at 24 hours. Scale bars: 50 m Figure S2. DLK1 absence does not modify endothelial cell apoptosis. MLEC from WT and KO mice were treated with 2.5 M staurosporine for 2, 4, 8 and 19 hours. After incubation with Annexin V and 7-Amino-Actinomycin (7-ADD), apoptotic and necrotic cells (%) were analyzed by flow cytometry. Bars represent mean + SEM (n=2 independent experiments, each performed in triplicate). Figure S3. Retinal hypervascularization in the DLK1 null developing vasculature. Whole-mount immunofluorescence for isolectin B4 in the p5 and p14 KO pups showing areas of a dense, hyperfused plexus in the retinal endothelium. Quantification of retina coverage by vessels at the affected areas vs non-affected in the same retina from null mice. Values represent mean + SEM from 10 mice per group (*p<0.05). Scale bars: 200 m Figure S4. hDLK1 gain-of-function phenotype in zebrafish is dose-dependent. A-C: Tg(Fli:eGFP); Tg(gata1:dsRed) embryos at 72 h post fertilization. A. Bright-field image CVR‐2011‐823R1    comparing general morphology in a WT embryo (upper) and hDLK1 500pg injected embryo (lower). B. Bright-field image showing detail of hDLK1 500 pg injected embryo. C. Fluorescent microscope image showing intersegmental artery sprouts and GATA-dsRED-labeled erythrocytes. Note the aberrant sprouting of the intersegmental vessel (ISV) and the lack of normal blood flow. This phenotype is more dramatic than the one shown in Figure 4D-F. D. Quantification of ISV defects in 72 hpf embryos injected with hDLK1 plasmid at different concentrations. Each experiment, which included 100-300 embryos, was repeated at least twice. Bars represent mean + SEM (*p<0.05 vs control). Where error bars are not visible, they are smaller than data point. Scale bars: A: 2 mm; B,C: 200 m. Figure S5. DLK1 antagonizes the NOTCH pathway upstream of NICD signaling. Microvessel-like structures formed by PAEC transfected with a control vector pCMV6 (basal) or a DLK1 expression plasmid, in the absence or presence of VEGF. The lower panel depicts that PAEC stably expressing NICD transfected with a DLK1 plasmid produce a similar endothelial network than cells under basal conditions. Graphs represent quantification of the number of tube-like structures from three independent preparations per group assayed per duplicate. Bars represent mean + SEM; *, # p<0.05. Scale bars: 1 mm Figure S6. DLK1 affects NOTCH signaling pathway in zebrafish. NOTCH- responsive transgenic zebrafish (Tg(ptf1a:eGFP)jh1 ) at 2 dpf. A: control B: Treated with DAPT 50 M for 12 hours C: injected with MO DLK1 D: injected with capped hDLK1 mRNA. E. Quantification of picture´s luminosity on the RBG channel for the different conditions assayed. Bars represent mean + SEM from 3 different preparations. (*´p<0.01 vs control; *p<0.01 vs control; # p<0.05 vs MO 250 M)     CVR‐2011‐823R1    Legend for video files Supplementary Videos (SV) 1 and 2: MLEC from Dlk1 WT (SV1) or null (SV2) mice were subjected to scratch assay and wound was monitored along time until re- endothelization was complete. A B D E Figure S1 Figure S2. Figure S3 Figure S4 * * PAEC control (-) VEGF (+) VEGF B as al B as al cD N A D lk 1 cD N A D lk 1 PAEC NICD Figure S5. Figure S6.                                                       ANNEXO II   177    PATENTE Inventores (p. o. de firma): Santiago Lamas, Patricia Rodríguez, Mª Angeles Higueras, Jorge Laborda Título: Uso de Dlk1 como inhibidor de angiogénesis N.º de solicitud: P201031547 País de prioridad: ES Fecha de prioridad: 21 octubre 2010 OTRAS PUBLICACIONES Martinez-Ruiz, A., et al., S-nitrosylation of Hsp90 promotes the inhibition of its ATPase and endothelial nitric oxide synthase regulatory activities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005. 102(24): p. 8525-30.                     178                    Tesis Mª Ángeles Higueras López PORTADA AGRADECIMIENTOS INDICE RESUMEN EN INGLÉS ABREVIATURAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABLAS 1. RESUMEN 2. INTRODUCCIÓN 3. OBJETIVOS 4. MATERIALES Y MÉTODOS 5. RESULTADOS 6. DISCUSIÓN 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA ANEXO I ANEXO II