UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA III 

© María Encarnación Fernández Contreras, 1992 

 

 

 

 

 

  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  

TESIS DOCTORAL 

Detección de ADN de Papilomavirus humanos (PVH) en 
epitelios de tracto genital femenino  

 

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR 

PRESENTADA POR 

María Encarnación Fernández Contreras 
   
 DIRECTORA 

 
María Isabel Cour Bóveda 

Madrid, 2005 



T72.32V-14BIBLIOTECA UCM

~~O5324goz

Mm Isabel cour Bóveda, Profesor Titular del Departamento de

Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad

Complutense de Madrid

INFORMA:

Que el trabajo titulado “DETECCION DE ADN DE PAPILOMAVIRUS

HUMM4OS (PV!!> EN EPITELIOS DE TRACTO GENITAL FEMENINO”, realizado

bajo su dirección por M~ Encarnación Fernández Contreras,

Licenciada en CC. Biológicas, cumple todos los requisitos para

ser presentado como Tésis Doctoral.

Madrid, 27 de Septiembre de 1992

M. I.Cour

tA~ ~o’7»&A

R.5-IJ 2t-1



AGRADECIMIENTOS

— A mis padres, por sus afios de sacrificio y por su apoyo,

sin los que jamás hubiera podido llegar hasta donde estoy.

— A la Prof. Dra. D~ Isabel Cour Bóveda, por brindarse

amablemente a dirigir este trabajo.

— Al Prof. Dr. D. Eduardo López de la Osa, por el entusiasmo

con que ha apoyado siempre esta investigación.

- A los Dres. M. Rejas, J.A. Martinez, M. Prados, J.A. Pérez—

Moro, R. Abildua, M. Herraiz, 1. Cristóbal y al Prof. J.A

Vidart por su amabilidad al aportar las muestras objeto de

este estudio.

— Al Dr. J.A. Martinez, por su inestimable ayuda en el

análisis estadístico de los resultados.

— A mis compañeros de laboratorio, especialmente a Inés

Antón, Luisa Palau y Belén Martínez, que compartieron

conmigo los primeros pasos en esta investigación, y a Valle

Yagtie y Diana Nigro, por su colaboración en el

procesamiento de parte de las muestras incluidas en la

misma.

— A D. Jesús M~ Rodríguez Losas, por la realización

<desinteresada y “contra—reloj”) de los gráficos incluidos

en este trabajo.



— A los Dres E.—M. de Villiers y T. Kahn del Instituto Alemán

de Investigaci6n del Cáncer (DKFZ> de Heidelberg, Alemania,

por su asesoramiento científico y técnico.

— Y, muy especialmente, a Julio, mi marido, por sus palabras

de aliento en los momentos difíciles y, además, por su

colaboración en parte de la transcripción del texto.

En resumen, y como, inevitablemente, me olvidaré de alguien,

a todos aquellos que, de una forma u otra, han hecho posible la

realización de este trabajo.



Esta tésis está dedicada a todos los que me apoyaron

en mis peores momentos y creyeron en mi, incluso cuando yo

dejaba de hacerlo.

* A mi familia:

• A Julio, mi marido

• A mis padres y a mi hermana, que inicia este año sus

estudios universitarios

• A Man Tere, mi madre política

* A mis compañeros de laboratorio y, muy especialmente, a

Inés Antón.

* A quienes me brindaron su apoyo “desde más lejos” y no

pudieron ver terminado este trabajo:

• a mis abuelos

• a D. Germán Burriel Rodríguez

y, muy especialmente, a mi tío Dionisio



INDICE

A. nITRODUCCION GENERAL

INTRODUCCION

HISTORIA

SISTEMATICA Y CLASIFICACION

1.

II.

Sistemática

Clasificación de los Papilomavirus

Humanos <PVH)

1. PVH cutáneos

2. PVH mucosos

3. PVH mucosos y cutáneos

ESTRUCTURA

ORGANIZACION GENETICA

MULTIPLICACION VIRAL

1. Replicación

1. Replicación plasmídica

2. Replicación vegetativa

II. Transcripción

TRANSFORMACION

1. Ensayos de transformación in vitro

II. Genes transformantes

1. Gen ES

2. Genes E6 y E7

Faq.

1

2

5

5

a

11

13

16

16

21

27

27

29

III. Secuencias con influencia indirecta 31



EPIDEMIOLOGíA Y PATOGENIA 32

1. Infecciones cutáneas 34

1. Verrugas epidérmicas

2. Epidermodisplasia verruciforme (EV)

II. Infecciones respiratorias 35

1. Papilomas laríngeos

2. Papilomas nasales

III. Infecciones orales 36

1. Hiperpíasia epitelial focal

IV. Papilomas conjuntivos 38

V. Infecciones genitales 38

1. Verrugas anogenitales (condilomas)

2. Neoplasia intraepitelial <CIN)

3. Cáncer cervical

DIAGNOSTICO 45

1. Técnicas inmunohistoquimicas 45

II. Detección de ácidos nucleicos 45

1. Southern-blot.

2. Dot-blot.

3. Hibridación in situ

4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR>

TRATAMIENTO Y PROFILAXIS 49

1. Agentes citotóxicos

2. Métodos destructivos

3. Interferón.



B. APORTACION PERSONAL

MATERIAL Y METODOS 50

1. Pacientes y muestras 50

1. Pacientes

2. Muestras

II. Técnicas 51

1. Extracción de ADN

2. POR

3. Identificación de genotipos de PVH

III. Análisis estadístico 56

RESULTADOS 60

1. Método 60

II. Datos obtenidos 60

1. Grupo Normal

2. Grupo Patológico

DISCUSION

1. Técnica 79

II. Datos obtenidos 79

1. Grupo Normal (GN) 79

2. Grupo Patológico <GP) 81

CONCLUSIONES 89

BIBLIOGRAFíA 93



1INTRODUCCION

Los datos obtenidos en numerosas investigaciones ponen de

manifiesto la existencia de una clara asociación entre la

aparición en el tracto genital femenino de alteraciones de

diverso grado de malignidad y la presencia de virus del género

Papillomavirus. Además, se ha correlacionado la severidad de las

lesiónes producidas con el genotipo infectante, identificable

únicamente mediante métodos de detección de ácidos nucleicos,

entre los que destaca por su sensibilidad la reacción en cadena

de la polimerasa (PCR), desarrollada recientemente.

La práctica inexistencia en nuestro pais de estudios sobre

prevalencia y distribución de genotipos de Papilomavirus Humanos

(PVH) nos ha llevado a realizar el presente trabajo, con el fin

de conocer la frecuencia de aparición de estos virus en mujeres

de nuestro medio con y sin alteraciones en el epitelio genital

y su influencia en la aparición de las mismas.



HISTORIA 2

El caracter infeccioso de las verrugas humanas se sospechaba

desde hace siglos, pero fue Ciuf fo, en 1907, quien establecio por

primera vez la naturaleza viral de estos tumores al demostrar su

transmisión a traves de filtrados acelulares. En 1933 Richard

Shope describio el primer papilomavirus, reconociéndolo como

agente etiológico de la papilomatosis cutánea del conejo de cola

de algodón, el CRPV <del inglés Cottontail Rabbit

Papillomavirus) . Este virus, que aparece habitualmente en los

papilomas cutáneos de esta raza de conejos, producía lesiones

análogas en el conejo doméstico que progresaban hacia la

malignidad en la mayoria de los casos. Este fué el primer ejemplo

experimental de la producción de cáncer en mamíferos por parte

de un virus ADN oncógeno. Además, a partir del estudio de Shope

se dedujeron las propiedades más importantes de la acción de los

virus ADN oncógenos <1>:

1. El virus “desaparece” (se hace latente) con la

progresión de las lesiones, hacia la malignidad.

2. La exposición a ciertos agentes tísicos y químicos

(cofactores> aumenta el porcentaje de malignización.

3. El ADN aislado de partículas virales purificadas es

infeccioso.

Las descripciones morfológicas del virión llegaron con el

uso generalizado del microscopio electrónico (2). Sin embargo,



3

si éste se observaba fácilmente en algunos tipos de verrugas como

las plantares, su demostración era difícil en otras

localizaciones <tracto genital, laringe). La imposibilidad de

cultivar estos virus in vitro (la replicación sólo tiene lugar

en queratinocitos diferenciados) enlenteció considerablemente su

estudio. El análisis bioquímico e inmunológico de las proteínas

virales llevó a pensar durante los años 60 que existía un único

tipo de Papilomavirus Humano (PVH) y que la morfología y el

comportamiento del mismo dependían de la localización y del tipo

de epitelio infectado.

Gracias al desarrollo de las técnicas de Genética Molecular

el estudio de los Papilomavirus experimentó un considerable

avance a finales de la década de los 70 (3, 4>. Los métodos de

hibridación y clonaje de ácidos nucleicos permitieron la

identificación de más de 60 tipos diferentes de PVH (5),

dependiendo el tipo de lesión del genotipo infectante. También

fue posible la definición de sus genes y el estudio de las

funciones desempeñadas por cada uno de ellos. Con la puesta a

punto, durante la década de los 80, de los ensayos de

transformación in vitro se inició el estudio de las funciones

virales implicadas en la inducción de la proliferación celular

<6)

En los últimos años el interés despertado por los

Papilomavirus Humanos ha sido creciente. La asociación de ciertos

PVH con diversos tipos de cáncer parece cada vez más evidente

(3,7).

Algunos PVH de localización cutánea podrían desempeñar un

papel decisivo en la aparición de los carcinomas de células



4

escamosas típicos de la epidermodisplasia verruciforme (EV) . Por

otra parte, la infección del tracto genital por estos virus

constituye actualmente una de las la enfermedades de transmisión

sexual (ETS) más frecuente <8—10), lo que tiene una importancia

fundamental si se considera la asociación, cada vez más clara,

que existe entre algunos PVH y la aparición de carcinomas en el

tracto genital femenino y masculino. Además, algunos PVH

genitales pueden infectar a los recién nacidos durante el parto,

provocando durante la infancia alteraciones respiratorias que en

muchos casos tienen mal pronóstico (11, 12).



5

SISTEMATICA Y CLASIFICACION

1. SISTEXATICA

Tanto papilomavirus como poliomavirus se agrupan en una sola

familia, PAPOVAVIRIDAE, cuyo nombre proviene de las dos letras

iniciales de los primeros virus que se agruparon en ella

(papilomavirus del conejo, poliomavirus del ratón y virus

vacuolizante de los simios —SV4O—). Todos ellos se caracterizaban

por ser pequeños, desnudos e icosaédricos, por poseer una

molécula de ADN circular de cadena doble y por multiplicarse en

el núcleo de la célula infectada (6)

La familia .PAPOVAVIRIDAE se dividió inicialmente en dos

géneros atendiendo al tamaño de los viriones:

— Papillomavirus (55 nm>

— Polyomavirus (45 nm>

Sin embargo, estudios posteriores pusieron de manifiesto la

existencia de diferencias tan evidentes en su organización

genómica y en sus propiedades biológicas, que desaconsejaban su

inclusión como miembros de la misma familia. Esto llevó a la

diferenciación de dos subfaxnilias:

- PDLYOMAVIRXNAE

- PAPXLLOMAVIRINAE

En efecto, existen antígenos específicos de cada subfamilia



6

que permiten su identificación por técnicas serológicas. En

cuanto a la homología de su material genético, se ha observado

que, en condiciones de baja astringencia, los miembros de cada

subfamilia hibridan entre si, pero nunca con los de la otra

subfamilia.

Por tanto, la sistemática de los papovavirus quedaría de la

siguiente forma:

FAM. PAPOVAVIRXDAE

- SF. POLYOMAVIRINAE: Gen. Polyomavirus

* Humanos (BK, JC)

* Diversas especies de animales (ej. SV4O)

- SF. PAPILLOMAVIRINAE: Gen. Papillomavirus

* Humanos (PVH)

* Diversas especies de animales

Las características de ambas subfamilias se resumen en la

Tabla 1.



7

PAPILWMAVIRINAE

55nm

FOLYOMAVIRINAS

4 Snm

Simetría

Mat. genético

Icosaédrica

ADN doble circular
(5x106 d —8 kb—)

Icosaédrica

ADN doble circular
(3,6x106 d —Skb—)

TABLA 1: Características generales de la familia
PAPOVAVIRIDAR

Tamaño



8

II. CLASIFICACION DE LOS PAPILOMAVIRUS HUMANOS <PVII>

Hasta el momento se han aislado cerca de 70 tipos distintos

de PVH, diferenciables únicamente mediante técnicas de

hibridación de ácidos nucleicos (5, 13). Hasta ahace poco, se

consideraba que un determinado aislado era un nuevo genotipo

cuando éste presentaba un grado de homología del 50% o menos con

el resto de los conocidos.

Inicialmente la “homología” se determinaba según el grado

de hibridación, en fase liquida (14) del nuevo genotipo con otros

establecidos. Sin embargo, este método hace difícil el

reconocimiento de aquellos PVH que tengan escasa relación con los

conocidos, como es el caso de PVH—41, aislado directamente de

partículas virales y cuya homología con el resto del grupo es

casi nula. Ello ha hecho que se esté recurriendo a la

secuenciación para identificar nuevos PVH de forma más precisa.

Actualmente se considera que nos encontramos ante un nuevo

genotipo de PVH cuando éste presenta una homología inferior al

90% en los genes E6, E7 y Li (2)

La clasificación se ha hecho considerando el lugar

preferente de aparición de dichos genotipos distinguiéndose los

siguientes grupos:

1. Pfl CUTMlEOS:

La mayoría de los papilomavirus humanos pertenecientes a

este grupo han sido aislados de pacientes de epidermodisplasia

verruciforme (EV); de ellos, PVH-5, PVH-8 y, en menor grado, PVH-

14, 17 y 20 se han relacionado con carcinomas de células

escamosas que aparecen en algunos de estos enfermos tras la



9

exposición al sol <15).

Otros PVH cutáneos no asociados a EV son PVH-l y PVH-4,

aislados de verrugas plantares y vulgares, PVH—7 observado en

“verrugas de los carniceros”, frecuentes en manipuladores de

carne y PVH—41, detectado en ciertos carcinomas (16, 17).

2. PV]! MUCOSOS:

La diferenciación dentro de este grupo no es estricta y

muchos PVH pueden aparecer en distintas mucosas; sin embargo, se

pueden distinguir los siguientes subgrupos:

2.1. Genitales: Genotipos relacionados con lesiones benignas y

malignas del tracto genital. Aunque cada uno de ellos aparece

típicamente en uno u otro tipo de lesiones (ej: PVH—6 y 11 se

consideran benignos, mientras que PVH—16 y 18 suelen relacionarse

con alteraciones malignas>, a veces es posible encontrar

genotipos “malignos” en lesiones benignas y viceversa.

2.2. Respiratorios y del tracto digestivo: Numerosos

papilomavirus genitales han sido aislados también en tumores de

los tractos respiratorio y digestivo, aunque la mayoría de ellos

no aparecen en lesiones malignas. En cualquier caso, hasta el

momento sólo se tiene noticia de dos genotipos exclusivamente

orales: PVH—13 <18) y PVH—32 (19> ,detectados ambos en pacientes

con hiperpíasia epitelial focal; PVH—32 se ha encontrado, además,

en papilomas orales.



‘o

3. MUCOSOS Y CUTM<EOS:

Algunos genotipos de PVH han sido aislados, tanto de

lesiones mucosas como cutáneas, constituyendo, por lo tanto,

excepciones a la anterior clasificación. Algunos ejemplos de ello

son PVH—57 (20>; PVH-2 que, aunque presente típicamente en

lesiones cutáneas, se ha detectado en papilomas orales (21>; PVH—

7, productor, como ya se ha reseñado, de las “verrugas de los

carniceros” y que es frecuentemente observado en papilomas orales

de pacientes de SIDA (22> o PVH—l6, que, además de en lesiones

genitales, se ha detectado en algunas afecciones cutáneas como

la enfermedad de Bowen (5, 23).



11

ESTRUCTURA

Los virus del género Papillomavirus son pequeños <52—55 nm>,

desnudos y con simetría icosaédrica. El virión está formado por

una molécula de ADN circular rodeado de una cápside protéica y

que tiene una densidad de 1,34 g/ml en gradiente de CsCl (6).

La cápside está compuesta por 72 capsómeros y en ella se

distinguen al menos dos proteínas estructurales, denominadas

majar y minar según su proporción en el contenido protéico total

de la partícula. La proteína majar constituye el 80% de las

totales y tiene un peso molecular aproximado de 50.000 d, frente

a los 70.000 d de la minar, que se encuentra en mucho menor

proporción. Además, el análisis de las proteínas del virión ha

puesto de manifiesto la presencia de histonas de origen celular

que se asocian al ADN viral formando un complejo parecido a la

cromatina (3, 24, 25).

Como se indicaba al principio de este apartado, el genoma

de Papillomavirus consiste en una molécula de ADN circular de

cadena doble. Dicho ADN tiene una longitud aproximada de 8.000

pb, un peso molecular de unos 5,2 x 106 d y un contenido medio de

pares G:C del 42%. El material genético constituye

aproximadamente el 12% del peso del virión (6).



FIGURA 1: Micrografía electrónica de partículas de

papilomavirus <Tomado de Zuckerman AJ. et

al. John Wiley & Sons. 1987>





13

ORGANI ZACION GENETICA

La disposición genética de los papilomavirus es muy similar

en todos los miembros del género. Gracias al análisis de ARNs

codificados por Papilomavirus bovino tipo 1 (PVB 1), se ha

determinado que sólo una de las hebras sirve como molde para la

transcripción, característica que parece ser común para todos

estos virus (26—28). Dentro de la hebra codificadora pueden

distinguirse las siguientes regiones atendiendo a su

localización:

1. REGION REGULADORA

También llamada “no codificadora” (NCR —nan coding reglan—)

o “de control largo” (LCR —long control region—). Su tamaño

aproximado es de 1 kb y en ella se encuentran el origen de la

replicación y numerosos elementos de control de replicación y

transcripción

2. REGION E

Contiene al menos seis genes tempranos (early>, que

constituyen el 69% del genoma y tienen un tmaño total aproximado

de unas 4,5 kb.

Se ha comprobado que esta región es suficiente para inducir

transformación <29) y, por tanto, es la que confiere a los

papilomavirus esta propiedad biológica. Se expresa en células

infectadas no productivas y en células transformadas (28).



14

3. REGION L

Esta región está constituida por dos genes tardíos (late>,

L1 y I.~ que codifican respectivamente las proteínas major y minar

de la cápside y que sólo se expresan en células infectadas

productivamente <26, 30>.



E6 E7LCR

pL
‘o

El

I~
o

FIGURA 2: Mapa genético de PVH-16. (Tomado de Fields

et al Rayen Preas Ltd. New York, 1990>.

Li

EB



16
HULTIPLICACION VIRAL

Aunque el ADN de los papilomavirus puede detectarse en

células basales y parabasales del epitelio infectado <31), la

expresión de los genes estructurales <L) y el ensamblaje sólo son

posibles en queratinocitos altamente diferenciados. Además, y

como veremos más adelante, es en este tipo de células en las

únicas en las que es posible la replicación vegetativa. Esto

indica un tropismo especifico por células escamosas que impide

la propagación de estos virus en cultivos celulares, lo que

dificulta su estudio in vitro. No obstante, la capacidad de

algunos de ellos y, en especial del PVB 1, de tranformar células

de roedores, ha permitido investigar a cerca de las funciones

implicadas tanto en la multiplicación viral como en la

transformación de las células infectadas. Aunque la mayoría de

los datos se han obtenido de PVB 1, parece que pueden hacerse

extensivos al resto de los papilomavirus.

1. REPLICACION

El ADN de los papilomavirus puede aparecer en forma

episómica o integrado en el genoma de la célula infectada,

existiendo, por tanto, dos tipos de replicación viral (6)

— Plasmidica: Tiene lugar en células de la porción

epidérmica inferior, en las que el Ami viral episómico se

encuentra en un alto número de copias.

— Vegetativa: Sólo se produce en células diferenciadas, en

las que normalmente no hay síntesis de ADN.



17

1. REPLICACION PLASMIDICA

Como se verá más adelante, el modelo más extendido divide

este proceso en das fases:

— Aniplificación o “establecimiento”: El ADN viral se

amplifica, pasando de bajo a moderado número de copias.

— Mantenimiento: El número de copias obtenido permanece

relativamente constante durante varias generaciones

celulares.

i.i. secuencias implicadas

El origen de la replicación se encuentra dentro de la LCR

(33>, interviniendo, además otros elementos:

— Secuencias de mantenimiento del plásmido o PMS (plasmid

maintenance sequences) (33—35). Se han detectado dos:

• PMS 1, cerca del origen de replicación (del nucleótido

7116 al 7234).

• PMS 2, dentro del gen El (del nucleátido 1515 al 1615).

— Elementos estimuladores. Parece que las PMSs necesitan este

tipo de elementos para que haya replicación. Se ha

detectado una secuencia que podría desempeñar esta función,

del nucleótido 6.706 al 6793.



18

— Gen El. Este gen es responsable de al menos dos funciones

implicadas en la replicación, realizadas por los siguientes

elementos:

El-li: Es una proteina de unos 23.000 d, codificada por el

extremo 5’; fue identificada con un antisuero dirigido

contra el posible extremo N-terminal del El (36). Existen

numerosos datos que indican que E1—M o factor mod es en

realidad un modulador, ya que las alteraciones del mismo no

impiden las primeras fases de la replicación, pero los

mutantes pierden la capacidad reguladora de este proceso

(17). Además, El—M suprime la replicación de plásmidos

quiméricos SV—40/PVB-l (40, 41).

E1—R: No se ha identificado ninguna proteina

correspondiente a los dos tercios del extremo 3’ (C—

terminal) del El; sin embargo, se han detectado homologías

entre ciertas secuencias de este segTnento y antígenos T

largos de poliomavirus, directamente implicados en la

replicación de éstos (37); además, los virus con mutaciones

en esta zona no pueden replicarse como plásmidos. Todo ello

indica que existe un elemento, El—R o factor rep,

responsable de la replicación propiamente dicha ~ 36).



19

— secuencias con influencia indirecta. Otras secuencias

posiblemente implicadas en la replicación son:

Genes 86 y 87. Algunas mutaciones en estos genes dan

lugar a virus que se replican en bajo número de copias

de (mutantes cap) <38, 39), lo que sugiere que E6 y E7

codificarían elementos controladores del número de

copias.de ADN viral.

Gen 82. Se ha observado que las mutaciones en este

gen producen virus defectivos en replicación (41—44>.

Como se verá mas adelante, las proteinas del gen E2 se

unen a secuencias especificas del ADN viral, por lo

que se le atribuye, al menos, un papel regulador.

1.2. Mecanismo

Se desconoce cual es el mecanismo exacto de replicación

plasmidica. Sin embargo, las funciones asignadas al gen El han

llevado a algunos autores a proponer el modelo de dos etapas

mencionado al principio de esta sección (38):

— Pase de amplificación: El segmento correspondiente del gen

El codifica el factor rep (E1—R) y, durante un corto

espacio de tiempo, el genoma viral, que se encuentra en

bajo número de copias, se amplifica, consiguiéndose entre

50 y 400 copias de ADN plasmidico por genoma diploide.



20

— Fase de mantenimiento: Durante esta etapa el ADN viral

continua replicándose, pero de forma que se obtiene sólo

una copia de plásmido por cada ciclo de división celular.

Se piensa que el factor mad (E1—M> podría actuar en esta

fase “marcando” los genomas virales hijos para que no se

repliquen hasta el siguiente ciclo celular; de esta forma,

y como ya se ha mencionado, el número de copias de plásmido

permanece constante. Se ha propuesto un modelo alternativo,

según el cual, los plásmidos se replicarían obteniéndose

una copia por genoma celular sin necesidad de ningún

“marcaje” <45)

2. REPLICACION VEGETATIVA

Se produce en células epiteliales diferenciadas. Cuando se

alcanza este grado de diferenciación, estas células pierden la

capacidad de síntesis de Ami. Sin embargo y pese a no haber

proliferación celular, la producción de genomas virales aumenta

considerablemente sin que exista ningún tipo de regulación <6,

46). Es posible que el factor E1—R esté implicado en este

proceso.

II. TRABSCRIPCION

La transcripción en los papilomavirus es un proceso

complejo, caracterizado por:

— Numerosos promotores.

— Numerosos y complejos modelos de maduración del ARN.

— Producción diferencial de ARNm según el tipo de célula.



22.

1. TIPOS DE ARNm VIRAL

Existen dos sitios de poliadenilación de los ARNm de

papilomavirus:

1.1. A~

Es el más común. Está situado en el nucleótido 4.180

<inmediatamente después de la región E). Utilizan el A0 ARNm de

factores implicados en replicación plasmidica, regulación de la

transcripción y transformación celular y es el único que se

emplea en células transformadas (28).

1.2. A1

Situado en el nucleótido 7.156 (después de la región L), los

ARNs que lo utilizan aparecen en células productivas

(queratinocitos diferenciados), pero no en células transformadas

o infectadas no productivas.

2. PROMOTORES

Se ha detectado un total de siete promotores activos, que

se designan mediante la letra P y un subíndice que indica la

posición 5’ de la especie más abundante expresada a partir del

mismo. Estos promotores son:

— PS9, P890, P~3, P3080, P71~ y P»0, activos en células

transformadas (30, 46—49).



22

— P~0 o ~L (promotor tardío), activo en queratinocitos

productivos, da lugar a los ARNm tardíos <región L y

gen E4) (30)

3. ELEMENTOS cís

La LCR de los papilomavirus contiene elementos estimuladores

o de respuesta (RE, del inglés responsive elements) capaces de

responder, tanto a factores reguladores de la transcripción de

origen viral, como a factores celulares. Se ha demostrado que

dichos elementos tienen cierta especificidad por tejidos o

células y fueron observados por primera vez en PVH—16 y 18 (50,

51>; dos de los más importantes son E2RE, y E2RE2 que, como

veremos, son necesarios para la acción del transactivador

codificado por el gen E2. Se ha descrito otro elemento de este

tipo más allá de la región E, al que se ha llamado “estimulador

distal” (51>, cuya función se desconoce por el momento.

4. FROTEINAS E2

4.1. Transactivador E2TA

El E2TA (E2 trans—activator> es una proteína de 48 Kd (410

aminoácidos), correspondiente a la secuencia completa del gen E2.

Se expresa a partir del promotor P~3, aunque podría utilizar

algún otro, como el P~ y actúa estimulando la transcripción de

genes virales mediante la interacción con los elementos de

respuesta E2RE, y E2RE2. Parece que el propio P~3 está también

regulado por elementos de respuesta localizados en la LCR <53>.

El transactivador E2TA presenta dos dominios muy conservados



23

y una región interna no conservada (6, 54) . Las regiones

conservadas son:

— Extremo 1<—terminal: Es una secuencia de 220 aminoácidos

<aa) que podría presentar zonas con estructura de alfa—

hélice. Es responsable de la transactivación.

— Extremo C—terminal: Consta de 100 aa y no parece presentar

estructuras especiales. Podría estar implicada en la

formación de dimeros. Se ha observado cierta homología

entre esta región y el producto del oncogen c—mos ~

4.2. Represores

Como su nombre indica, reprimen la acción del E2TA. Su

función también está regulada por elementos de respuesta de la

LCR. El gen E2 codifica dos proteinas represoras:

- E2TR (E2 transcriptional represor), de 31 Kd, que se

expresa a partir del promotor P3080

- ES/E2TR (EB/E2 transcriptional represor), de 28 ¡Cd, debe su

denominación a que está formada por una secuencia de 11

aminoácidos codificada por el gen ES unida a la porción C—

terminal (del aminoácido 206 al 410) del E2. El E8/E2TR se

traduce a partir de un ARNm que incluye la secuencia

correspondiente al gen ES unida a la posición 3’ del E2.



24

Los elementos E2TR y E8/E2TR sólo se han descrito en PVB 1,

pero se piensa que podrían existir productos con estructura y

funciones equivalentes en los PV’H genitales <~~>

4.3. Mecanismo de acción de las proteínas E2

Las proteinas E2 son capaces de unirse al ADN a través de

secuencias especificas. Se ha establecido la existencia de dos

tipos de secuencias consenso con esta función: ACCN6GGT y

ACCN6GTT, donde N6 es cualquier combinación de seis nucleótidos.

Dentro del genoma de PVB 1 existe un total de 17 sitios de unión

específicos con afinidad variable por los productos E2,

determinada por las N6 (111) . Por otra parte, se han observado

fenómenos de cooperatividad entre los sitios de unión (56).

E2TA. Aunque se desconoce el mecanismo exacto de

activación de la transcripción, se sabe que es necesaria la

unión en forma de dimeros del E2TA a sitios específicos

dentro de los elementos estimuladores. Como ya se ha

mencionado, la dimerización tiene lugar a través del

extremo C—terminal.

Se ha observado que el E2TA puede actuar sobre

promotores no homólogos, lo que implica que podría activar

también promotores celulares <57, 58>.

• Represores. Podrían ejercer su función de varias formas:

1. Formación de homodímeros que competirlan con el E2TA

por los sitios de unión.



25

2. Formación de heterodimeros inactivos con moléculas de

E2TA <recuérdese que el O—terminal es común>

Parece existir otro mecanismo de represión, basado en la

unión del E2TA a sitios de baja afinidad situados justo antes de

los promotores: esto impedirla la transcripción a partir de los

mismos. Dicho mecanismo se apoya en estudios realizadas en PVH

18 (59).

5. OTROS REGULADORES

Se piensa que los genes E6 y E7 de PVH 16 y 18 tienen

también funciones reguladoras de la transcripción, aunque no se

ha determinado su significado fisiológico. Se ha observado que

el producto E7 de PVH 16 es capaz de activar el promotor E2 de

adenovirus y también se han asignado propiedades activadoras al

producto E6 de PVH 18 (6, 60>.

6. TRANSCRZPCION DE LOS GENES L

Como ya se ha mencionado, la expresión de los promotores

tardíos P~0 y ~L sólo se produce en queratinocitos diferenciados.

En las células transformadas (no diferenciadas), la transcripción

de estos promotores es inhibida por la influencia de secuencias

situadas dentro de la región L, que evitan el reconocimiento de

la señal de poliadenilación por el complejo ARN polimerasa II y,

por tanto, la expresión de los genes tardíos. También existen

secuencias que inducen la degradación rápida de los ARNm

correspondientes. Tras la diferenciación, la replicación pasa a



26

ser vegetativa, descendiendo considerablemente la síntesis de ADN

y, con ella, los factores celulares implicados en estos procesos.

Esto explicaría la capacidad de los queratinocitos de expresar

los genes L. Se han propuesto otros modelos de regulación

transcripcional de estos genes durante la diferenciación celular,

pero se desconoce aún el mecanismo exacto (61).



27
TRANSFORMACION

Los virus del género Papillomavirus se caracterizan por

inducir tumores en el epitelio infectado. Aparecen en el mismo

cambios morfológicos como acantosis (aumento del espesor de la

epidermis> e hiperqueratosis debidos, muy probablemente a la

acción de los productos virales.

Aunque, como ya se ha comentado, no pueden propagarse en

cultivos in vitra, son capaces de provocar transformaciones

morfológicas en ciertas lineas celulares. Esta propiedad se

describió por primera vez a principios de los años 60 en PVB 1

<6), por lo que este virus ha servido de modelo para el estudio

de los fenómenos asociados a la transformación.

1. ENSAYOS DE TRANSPORMACION IN VITRO

En este tipo de ensayos se han empleado preferentemente

células de roedores como C127, NIH, 3T3 y otras lineas de hamster

y rata. Además de la aparición de cambios morfológicos <las

células C127 toman forma afilada, pierden la inhibición por

contacto y adquieren carácter tumorigénico en ratones desnudos),

se han comprobado los siguientes aspectos:

1. El ADN viral, en estado episómico, no necesita integrarse

en el genoma celular para mantener el fenotipo

transformado. No obstante, si dicha integración no se

produce debe conservarse un alto número de copias ya que,

en caso contrario, se perderá dicho fenotipo, tal y como

ocurre en los mutantes cap <39, 62)



28

2. Los virus con replicación defectiva también tienen

capacidad transformante, lo que indica que el estado

episómico no es necesario aunque, como velamos en la

sección dedicada a la replicación, es el más frecuente ~

44, 63, 64>.

3. Se ha observado que los ratones curados del genoma viral

por tratamiento con interferón pierden el fenotipo

transformado, por lo que la transformación dependería de la

expresión continua del ADN viral (65)

4. Para la transformación sólo se requiere un fragmento

subgenómico que constituye el 69% del ADN viral, en el que

se encuentran los genes tempranos (29)

Existen estudios más recientes, realizados en papilomavirus

humanos genitales en los que se ha conseguido la transformación

de células in vitro mediante diversos métodos, como la

cotransfección con marcadores selectivos dominantes <66) o el

empleo de células primarias o de queratinocitos (67—70). Así, ha

podido comprobarse que los PVH asociados con lesiones malignas

<PVH 16 o 18> son capaces de transformar, lo que no ocurre con

los considerados como “benignos”; sin embargo, se ha conseguido

producir in vitro partículas de PVH 11 completas mediante la

exposición de células de prepucio o cérvix uterino a extractos

de condiloma y su posterior implantación en ratones atimicos

<71)



29

II. GENES TRANSFORMANTES

1. GEN ES

Codifica una proteina de 44 aa que es suficiente para

transformar ciertas células en cultivo (6, 70> y que es la mas

pequeña que se conoce con esta prpopiedad. Presenta un dominio

fuertemente hidrofóbico, correspondiente al extremo N—terminal

y otro fuertemente hidrófilico, correspondiente al e—terminal,

capaz de inducir síntesis de ADN. Además, cuenta en su cadena con

dos restos de cisteina necesarios para la transformación,

posiblemente responsables de la formación de dimeros <70, 72).

El gen ES está muy conservado dentro del género, existiendo

también similitudes estructurales entre las distintas proteinas

ES, pero se desconoce su función exacta, sobre todo en los PVH

(73). Se piensa, no obstante, que la proteina E5 podría actuar

alterando la actividad de las proteinas de membrana implicadas

en la proliferación celular <6>.

2.2. GENES E6 Y E7

Ambos genes son imprescindibles para la aparición del

fenotipo transformado y podrían codificar dos proteinas

correspondientes respectivamente a los genes completos E6 y E7

y un producto mixto EG-E7 (~~>• Además, los genotipos humanos PVH

16 y 18 podrían dar lugar a un proteina E6 truncada <EC) (75).

Los productos completos E6 y E7 presentan una gran similitud

estructural. Ambas presentan varias zonas con cisteinas en la

forma Cys—X—X—Cys, propia de numerosas proteinas que se unen al

ADN (76>.

Las proteinas E6 y E7 de PVII 16 y 18 pueden transformar



30

células de roedores por separado, pero para la transformación de

fibroblastos o queratinocitos es necesaria la presencia de la

proteina E6 (77, 88).

-Proteína E6: Su longitud se ha estimado en 158 aa, a partir

de la secuencia del gen E6. Posee gran cantidad de restos

de cisteina ~ Se piensa que podría asociarse con

proteinas celulares implicadas en la regulación de la

proliferación o diferenciación.

— Proteina E7: Consta de unos 98 aa y presenta una curiosa

similitud entre los 37 aa de su extremo N—terminal y

ciertos segmentos del producto del gen ElA de adenovirus

(Ad ElA) que permiten la asociación de éste con el producto

del gen p105—RB, supresor del retinoblastoma <80>. Se ha

comprobado que la proteina E7 de los PVH genitales también

puede formar complejos in vitra con el píOS-liB (81>. Algo

similar podría suceder in vivo, interfiriéndose el

funcionamiento normal de este gen y dando lugar, de este

modo, a la aparición del fenotipo transformado. Este tipo

de secuencias del producto E7 está muy conservado en todos

los PVH genitales, lo que indica que la asociación con el

píOS—liB no basta para la transformación, ya que los

considerados no oncógenos <PVH 6 y PVH 11) carecen de esta

propiedad.

Como ya se mencionó en la sección dedicada a la replicación,

las proteinas E6 y El podrían tener, además, un papel modulador



31

en la replicación, controlando el número de copias de ADN

episómíco.

III. SECUENCIAS CON INFLUENCIA INDIRECTA: GENES El y E2

Se ha observado que las mutaciones en los genes El y E2

influyen aumentando o suprimiendo respectivamente la capacidad

transformante de PVB 1 <82, 83). Sin embargo, su papel parece ser

indirecto y se debe más bien a las funciones que desempeñan tanto

en la replicación plasmidica como en la transcripción.



32
EPIDEMIOLOGíA Y PATOGENIA

Los papilomavirus se transmiten por contacto directo con la

partícula viral, generalmente asociado con pequeños traumatismos

del epitelio como abrasiones (PVH cutáneos> o contacto sexual

(PVH genitales). También es posible la transmisión perinatal <PVH

respiratorios>, quedando algunos casos en los que se desconoce

el modo de infección.

Las lesiones más típicas de los papilomavirus son las

verrugas, la mayoría de las cuales son benignas y autolimitantes

y tienen origen monoclonal (1, 84). El virus infecta las células

basales del epitelio, induciendo su proliferación. Muchas de las

células infectadas presentan una gran cavidad perinuclear,

rodeada por un citoplasma denso. Este tipo de morfología se

conoce como coilocitosis y sirve, muchas veces, como diagnóstico

de la infección (1) (Figura 3>.

La multiplicación viral tiene lugar exclusivamente en el

núcleo, de modo que los productos virales sólo se detectan en el

citoplasma cuando se rompe la membrana nuclear. Como ya se ha

mencionado en otras secciones, la expresión de unos genes u otros

depende del grado de diferenciación de las células.

La progresión hacia la malignidad de este tipo de lesiones

depende del genotipo de PVH infectante (sólo unos cuantos tienen

poder oncogénico) y de la acción de cofactores (1, 5, 7>. La

gravedad de las mismas depende, además de su localización.





34

1. INFECCIONES CUTANEAS

1. VERRUGAS EPIDERMICAS

Suelen ser de tres tipos:

— Comunes o vulgares: Tienen forma de domo y numerosas

proyecciones cónicas, que dan a la superficie aspecto

rugoso <papilomatosis). Suelen aparecer en las manos.

— Plantares: Se caracterizan por un considerable aumento del

espesor de la capa córnea (hiperqueratosis). Aparecen en la

planta del pie.

— Planas: No presentan papilomatosis. Aparecen sobre todo en

brazos, cara y alrededor de las rodillas.

La transmisión puede ser directa, por contacto con el tejido

infectado de otra persona o por autoinoculación, o indirecta, por

exposición a partículas virales presentes en objetos

contaminados.

Aunque la correlación entre el genotipo de PVH infectante

y el tipo de verruga no es absoluta, PVH—1 suele aparecer en

verrugas plantares, mientras que PVH—2 lo hace en las vulgares

y PVH—3 y 10 en las planas; PVH—7 se asocia, sin embargo, con las

lesiones que aparecen en las manos de los manipuladores de carne

(“verrugas de los carniceros”) (5).

Las verrugas suelen ser pequeñas y escasas, excepto en casos

de inmunodepresión. En general, regresan espontáneamente a los

dos tal vez debido a mecanismos de inmunidad celular <1).



35

2. EPIDERMODISPLASIA VERRUCIFORME <EV>

Se trata de una enfermedad larga que se caracteriza por la

no regresión de las lesiones papilomatosas, algunas de las cuales

progresan hacia la malignidad <85>.

El modo de transmisión de la EV es desconocido. Se ha

observado que afecta a miembros de la misma familia, existiendo

en los enfermos antecedentes frecuentes de consanguinidad

parental, lo que sugiere algun tipo de asociación con factores

genéticos; de hecho, esta enfermedad se consideró hereditaria

hasta principios de los años 60 (1>. Se piensa que la EV podría

estar favorecida por algún defecto genético del sistema

inmunitario <muchos de los pacientes tienen afectada la imunidad

celular>. Además, la enfermedad se comporta en ocasiones como un

carácter recesivo ligado al cromosoma X (86)

Se han aislado numerosos genotipos de PVII de lesiones de EV,

pero los más frecuentes son PVH—5, 8, 14, 17 y 20, asociados

también con carcinomas cutáneos de células escamosas, de donde

también se ha aislado PVH—41 <~, 17>. Este último virus aún no

ha sido detectado en pacientes de EV.

La enfermedad se inicia en la infancia con lesiones

generalizadas en forma de verrugas planas y de placas rojizas que

recuerdan a la pityriasis versicolor. En un tercio de los casos

se produce malignización de las placas, especialmente de las

expuestas a la radiación solar.



36

II. INFECCIONES RESPIRATORIAS

La mayoría de estas infecciones están producidas en realidad

por papilomavirus genitales, especialmente PVH—6 y PVH-1l,

presentes en casi todos los papilomas respiratorios (5, 87—90>.

1. PAPILOMAS LARíNGEOS

Se trata de lesiones poco frecuentes, que pueden producir

obstrucciones más o menos graves de las vias respiratorias.

Afectan principalmente a laringe y cuerdas vocales, aunque

también pueden aparecer en las cavidades oral y nasal, tráquea

o pulmones.

Se piensa que la transmisión es perinatal, especialmente en

niños y jóvenes. Se ha observado que el 60% de las madres de

niños con papilomas laríngeos tienen antecedentes de verrugas

genitales (11, 12). Además, el parto rara vez ha sido por

cesarea. La aparición en pacientes adultos podría deberse a un

periodo de latencia más largo del normal o a la adquisición de

la infección mediante prácticas de sexo oral.

Estas lesiones suelen tratarse mediante cirugía, existiendo

a menudo fenómenos de recurrencia o diseminación de la infección

después de las intervenciones. Ello indica que el virus se

encuentra también en las células del epitelio normal adyacente

(91)

2. PAPILOMAS NASALES

Se clasifican como escamosos o fungiformes, invertidos y de

células cilíndricas.

Su modo de transmisión se desconoce y, aunque también suelen



37

atribuirse a PVH—6 y 11 (1, ~>, se ha aislado PVH—16 en algunos

de ellos.

3. CAECER DEL TRACTO RESPIRATORIO

Los papilomas respiratorios rara vez progresan hacia cáncer.

No obstante, existen datos que describen un aumento de las

malignizaciones tras la irradiación con rayos X (92)

Tampoco parece existir una asociación clara con ningún

genotipo concreto, aunque PVH—30 fué aislado de un carcinoma

laríngeo (93> y se han observado secuencias relacionadas con PVH—

16 (94>.

III. INFECCIONES ORALES

1. HIPERELASIA EPITELIAL FOCAL CREP>

Aunque es cosmopolita, la prevalencia de esta enfermedad es

mayor en ciertas poblaciónes indias y esquimales <1).

Los papilomavirus más frecuentes son PVH—13 y PVH—32, que

son los únicos que parecen exclusivos de la mucosa oral (1,5>.

La HEF se caracteriza por la aparición de nódulos elevados

en la mucosa infectada que persisten durante varios años y no

sufren transformación maligna. Aparece preferentemente en niños

y suele afectar a miembros de la misma familia.

2. OTRAS LESIONES ORALES

Las más benignas son los papilomas escamosos, que no han

podido relacionarse con ningún genotipo concreto (1>. La

morfología y el genotipo causal del resto de las lesiones indica

que se producen por contacto con otros epitelios infectados. Así,



38

es posible observar condilomas acuminados y otras lesiones

mucosas, producidos por PVH genitales, y verrugas vulgares

labiales, asociadas con PVH—2. También se ha detectado PVH-7 en

lesiones orales de pacientes infectados por el virus de la

inmunodeficiencia humana <VIH> <22>.

IV. PAPILOMAS CONJUNTIVOS

Son raros y aparecen a cualquier edad, estando en su mayoría

producidos por PVH-6 y 11 (95, 96).

V. INFECCIONES GENITALES

La transmisión sexual de las verrugas genitales se

estableció ya a finales de los años 60. Otros autores (97, 98)

observaron la frecuencia de las infecciones cervicales por PVH

y su semejanza con distintos grados de neoplasia. Por otra parte,

este tipo de lesiones se transmite en un alto porcentaje a las

parejas de los pacientes afectados, donde suele encontrarse el

mismo genotipo causal <1).

1. VERRUGAS ANOGENITALES (CONDILOMAS>

Son las lesiones más típicas de PVH. Suelen aparecer en

adultos jóvenes y promiscuos (99), parejas de pacientes afectados

e individuos inmunodeprimidos <100, 101).

Los condilomas suelen tener más de una localización

anogenital (102), pudiendo ser de dos tipos:

— Acuminados: Tienen proyecciones superficiales y son

exofiticos. En la mujer es raro encontrarlos en cérvix.



39

— Planos: Carecen de proyecciones. Son más comunes en cérvix

que los anteriores, donde, a veces sólo son visibles por

colposcopia, confundiéndose fácilmente con lesiones de tipo

CIN—l <ver apartado siguiente).

Los condilomas acuminados están asociados en su mayoría con

la infección por PVH—6 y 11 (5, 103), aunque PVH—l6 puede

aislarse en un 10% de ellos, mientras que los planos presentan

una etiología más heterogénea.

2 • NEOPLASIAS INTRAEPITELIALES • CIN

Los estados cancerosos en el tracto genital van precedidos

de lesiones precursoras llamadas neoplasias intraepiteliales.

Aunque la significación es equivalente en otras localizaciones

como vulva y pene, el mayor número de datos se refiere a la

neoplasia intraepitelial cervical o CIN ( del inglés cervical

intraepitbelial neoplasia). Según su gravedad, se distinguen tres

tipos (1).

— CIN—l: displasia leve (se han agrupado aquí los condilomas

planos>.

— CIN—2: displasia moderada.

— CIN—3: displasia severa.

El carácter precursor de estas lesiones se apoya en diversos

datos. Los tejidos con lesiones graves tienen áreas contiguas con

lesiones moderadas y el genotipo infectante suele ser el mismo

(104, 105>.



40

Casi todos las PVH están presentes en lesiones moderadas y

subclinicas (5>, mientras que los genotipos 18 y 18 suelen

hacerlos en CIN—3 y carcinomas <~, 106, 107>. Además se ha

observado que las neoplasias en que aparecen PVH—16 y 18

progresan en mayor número hacia la malignidad que las causadas

por PVH—6 y 11 <108)

3 • CAECER CERVICAL

Se estima que PVH—16 aparece en el 50—60% de los carcinomas

invasivos de cérvix, mientras que PVH—18 lo hace en un 10—20% y.

en menor proporción, otros genotipos como PVH—31, 33, 35, 39, 45,

52 y 56 <~>~

Por otra parte, se ha aislado ADN de PVH de líneas celulares

obtenidas a partir de carcinomas: PVH—16 aparece en células CaSki

o SiHa (106, 109) y PVH—18 lo hace en varias líneas, como HeLa,

C4—l o 5W756 (7>. Recientemente se han detectado células

portadoras de otros genotipos, como 31 o 39 <7). Otro dato

indicativo de la relación entre presencia de PVH y cáncer

cervical es el hecho de que las metástasis asociadas con estos

carcinomas tengan el mismo genotipo que el tumor de origen <110,

111>

3.1. Estado del genoma viral

En las lesiones benignas y premalignas el ADN de PVH aparece

en estado episómico, mientras que en las malignas suele

integrarse en el genoma celular (7, 112).

Para la integración es necesaria la rotura y linearización

del genoma viral, que tiene lugar por la región E1/E2, impidiendo



41

la síntesis de los factores reguladores codificados por estos

genes (75, 113). De este modo se pierde el control sobre la

expresión de los genes transformantes E6 y E7, que aumenta

considerablemente en lesiones malignas (7) y pasa, posiblemente,

a estar regulada por factores celulares adyacentes.

3.2. Influencia de factores celulares

Las infecciones por PVH no siempre progresan hacia cáncer

y, cuando esto ocurre, el periodo de latencia entre dichas

infecciones y la malignización oscila entre 20 y 50 años (114>.

Ésta y otras observaciones sugieren que la presencia de PVH

podría no ser suficiente para la aparición de transformaciones

malignas.

Stanbridge <115) demostró que las células HeLa, portadoras

de PVH—18 perdían su carácter tumoral al fusionarlas con

fibroblastos o queratinocitos normales. Posteriormente Saxon

(116) observó que estas células perdían la capacidad de inducir

tumores en ratones desnudos tras la adición de cromosoma 11. Por

otra parte, se ha observado que PVH—16 no puede malignizar in

vitro fibroblastos normales, pero si aquellos que presentan

delecciones en dicho cromosoma (117). La introducción de

cromosoma 11 normal también suprime el carácter tumoral en las

células SiHa <118); probablemente, las delecciones en el mismo

implican la pérdida de genes supresores de tumores. Según zur

Hausen, el cromosoma 11 expresa un factor llamado CIF <cellular

interfering factor), que regula negativamente la expresión de los

PVH oncógenos en estas lineas celulares <119, 120>.

Parece que el lugar donde se produce la integración también



42

es un aspecto a tener en cuenta. Las etapas tardías de los

carcinomas cervicales están asociadas con um aumento de la

expresión del oncogén c-myc <102). Las células HeLa y C4-1

contienen secuencias integradas en el cromosoma 8, cerca de este

locus (7>. Existen otros estudios que indican que los PVH se

integran preferentemente cerca de los genes myc en carcinomas

invasivos, lo que apoya la teoría de que dicha integración

favorece la activación de ciertos oncogenes celulares (121).

Como ya se mencionó en el capitulo dedicado a la

multiplicación viral, también es posible que los factores

codificados por algunos genes de PVH alteren el funcionamiento

de ciertos genes supresores de tumores (7, 81>.

3.3. Factores exógenos

Existen otros factores que podrían tener cierta influencia

sobre la carcinogénesis anogenital.

Se piensa, por ejemplo, que la infección por el virus Herpes

simplex podría favorecer la replicación plasmidica de los

papilomavirus (7>.

El tabaco también ha sido considerado como un factor de

riesgo importante para la aparición de cáncer cervical y se ha

observado que sustancias como la nicotina aparecen concentradas

en el fluido vaginal de las fumadoras (122). También podrían

acumularse otros productos mutagénicos en el tracto genital como

consecuencia del metabolismo de ciertas bacterias (7).

Por último, el riesgo de cáncer cervical parece ser

levemente superior en mujeres que utilizan anticonceptivos

orales. Algunos autores han descrito en la LCR un elemento



43

sensible a la progesterona que estimula la expresión genética de

PVH y, posiblemente, la proliferación de células portadoras de

ADN viral <123, 124).



LESION PV]! <GENOTIPO)

Epidérmicas

Verrugas 1, 2, 3, 4, 10, 26, 29, 38, 41,
49, 57, 63, 65

Quiste epidermoide

Verrugas de carniceros

EV

Alt. bowenoides

Carc. c. escamosas

60

2,7

2, 3, 10 (exclusivos>
5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 37, 47, 50.

16, 34, 35

5, 8, 14, 17, 20, 47, 41

Genitales

Condiloma acuminado

N. intraepitelial

Carcinoma

6, 11, 42, 44, 51, 55, 53, 58, 67

6, 11, 16, 18, 26, 30, 31,
34, 35, 39, 40, 42, 43, 45,
52, 52, 56, 57, 58, 59, 61,
64

6, 11, 16, 18, 31, 33, 35,
45, 51, 52, 54, 56, 58, 66

33,
51,
62,

39,

Tumores de cabeza y cuello

Papilomatosis

HEF

Carcinoma

6, 11, 32, 7, 57, 2.

13, 32

2, 6, 11, 16, 18, 30

TABLA II: Genotipos de papiloma presentes en diversas
lesiones (tomado de Muñoz et al. IARC Scientific
Publications 1992>



45

DIAGNOSTICO DE LAS INFECCIONES GENITALES POR PV]

!

1. TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS

Parte de ellas se basan en la detección del antígeno

especifico de grupo. La prueba sólo es positiva en aquellas

lesiones en las que existe producción de partículas virales y,

además, no es posible la identificación de los genotipos

implicados (2, 125).

Existen también pruebas basadas en la producción de

antisueros contra proteínas especificas virales, obtenidas por

clonaje en bacterias de fragmentos específicos del genoma <2,

126). Aún hay que comprobar, sin embargo, si los anticuerpos

conseguidos son realmente específicos para cada uno de los

genotipos estudiados.

II. DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS

Basadas en la hibridación del ADN de la célula infectada

con el ADN (o ARN) viral marcado, que recibe el nombre de sonda.

Para evitar reacciones inespecificas se recomienda la separación

de dichas sondas de los vectores bacterianos en los que se donan

para permitir su amplificación, ya que las muestras clínicas

suelen estar contaminadas con ADN bacteriano.

El marcaje de las sondas puede ser isotópico o pueden

utilizarse moléculas detectables por reacciones enzimáticas

(biotina, digoxigenina, etc).

1. SOUTHERN-BLor

El ADN celular se digiere con una enzima de restricción,

separándose los fragmentso obtenidos por electroforesis en gel



46

de agarosa. Tras un paso de desnaturalización, dichos fragmentos

se transfieren a un filtro de nylon o nitrocelulosa y se procede

a la hibridación (127>

Esta técnica tiene una alta sensibilidad (pueden detectarse

entre 0,1 y 0,001 copias por célula) y permite conocer el estado

del genoma viral, aunque tiene la desventaja de ser larga y

laboriosa (2). Existe una variante <blot inverso>, consistente

en la fijación al filtro del ADN viral no marcado, que se hibrida

con ADN genómico marcado. La ventaja de este método consiste en

que en un solo experimento puede determinarse la positividad de

una muestra a numerosos genotipos de PVH. Su sensibilidad máxima

es de unas 5 copias por célula (128>.

2 • DOT-BLOT

El ADN se fija sin fragmentar al filtro, por lo que es mucho

más simple que el método anterior, aunque no permite conocer el

estado del genoma viral. Este método también tiene una variante

en la cual, las células infectadas se fijan sobre el filtro y se

desnaturalizan, sin extraer el ADN, pasando a la hibridación

<129). Sin embargo, su sensibilidad no excede de las 50 copias

por célula y tiene las desventajas de favorecer hibridaciones

inespecificas y de tener un alto ruido de fondo.

3. HIBRIDACION 11< SIl’!)

Realizada directamente sobre secciones tisulares, esta

técnica permite localizar exactamente el genoma viral,

preservando la morfología celular. Su sensibilidad es, sin

embargo, inferior a las anteriores (entre 20 y 50 copias por



47

célula dependiendo del tipo de marcaje> (2). Recientemente Nuovo

y cols. han desarrollado un método mediante el cual se

amplifican secuencias de HPV dentro de la misma sección <130) y

que permite detectar hasta una copia de genoma viral por célula.

4. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR>

Desarrollada recientemente (131, 132>, consiste en la

amplificación de secuencias especificas de ADN mediante ciclos

sucesivos de desnaturalización—apareamiento de iniciadores—

amplificación, gracias a la acción de una polimerasa termoestable

dependiente de iones ~ Esta enzima, denominada polimerasa

Taq, debe su nombre a la bacteria Therrnus aguaticus, de la que

fue aislada. Su temperatura óptima de reacción oscila entre los

70 y los SOQC, por lo que no se destruye durante las fases de

desnaturalización y, además, se impide la actuación inespecifica

de polimerasas celulares. De esta forma, el número de secuencias

de ADN aumenta de forma exponencial con cada ciclo de

amplificación, pudiendo llegar a detectarse una secuencia por

cada 100.000 células (2).

Para la amplificación de secuencias de PVH pueden utilizarse

iniciadores consenso <2, 133) o iniciadores específicos para cada

genotipo (134>. Los primeros tienen la ventaja de que permiten

la detección de un gran número de genotipos de PVI-I e incluso de

algunos nuevos o no secuenciados por ser complementarios a

secuencias situadas dentro de genes muy conservados, como El o

Lí. También se han diseñado iniciadores de este tipo

complementarios a zonas de la región E6/E7 (135, 136>, pero su

eficacia disminuye al existir diferencias de secuencia entre



48

distintos PVH. Los iniciadores específicos se utilizan para

detectar la presencia de genotipos concretos de PV}I y como método

de confirmación de los resultados obtenidos con los iniciadores

consenso.

Tras la amplificación, el producto obtenido <amplic6n> se

visualiza fácilmente en geles de agarosa o poliacrilamida. Si se

han utilizado iniciadores consenso, es necesaria su

identificación mediante hibridación con sondas oligonucleotidicas

especificas (133), digestión con enzimas de restricción (137) o

nueva amplificación con iniciadores tipoespecificos (138>.

En cualquier caso, la extraordinaria sensibilidad de esta

técnica hace que deban exptremarse las precauciones a la hora de

procesar las muestras y preparar la mezcla de reacción, ya que

cualquier contaminación con secuencias problema dará lugar

facilmente a falsos positivos.



49
TRATAMIENTO Y PROFILAXIS

La únicas medidas eficaces de prevención de las infecciones

por papilomavirus son las tendentes a reducir el riesgo de

contagio sexual. Al no haberse identificado los determinantes

inmunogénicos capaces de generar anticuerpos protectores no se

han desarrollado, por el momento, vacunas efectivas.

En cuanto al tratamiento de estas infecciones, los métodos

empleados más utilizados son los siguientes:

1. AGENTES CITOTOXICOS

- Podofilina: Resma de Podophyllum peltatum o P. emeál. Se

trata de un poderoso antimitótico, pero debe administrarse

con precaución por sus efectos irritantes (139>.

— 5—Fluorouraailo (5—FU>: Inhibe la síntesis de ADN (139>.

2. NETODOS DESTRUCTIVOS

— Electrocoagulación

- Crioterapia (con N2 liquido o hielo seco)

— Vaporización con lasser

— cirugía (139)

3. INTERFERON

El tratamiento con interferon se ha aplicado con éxito en

lesiones genitales (1), aunque su eficacia parece disminuir en

portadores sanos de VIH . Sin embargo, los buenos resultados

obtenidos en estas infecciones no pueden hacerse extensivos a los

papilomas respiratorios (1).



50
MATERIAL Y MÉTODOS

1. PACIENTES Y MUESTRAS

1. PACIENTES

Se ha estudiado la presencia de Ami de PVH en un total de

345 mujeres distribuidas en dos grupos:

1.1. Grupo Patológico (GP>

Constituido por 96 pacientes con signos clínicos y/o

citológicos sugestivos de infección por PVH, procedentes del

Servicio de Ginecología y Obstetricia y del Centro de

Enfermedades de Transmisión Sexual (C.E.T.S.) del Hospital

Universitario de San Carlos.

1.2. Grupo Normal (SN)

Formado por 249 mujeres que acudían a revisión ginecológica,

sin alteraciones citológicas o clínicas relacionadas con

presencia de PVH. Dichas mujeres procedían de un centro de

planificación familiar de Guadalajara, de la Asociación Española

contra el Cáncer y del Hospital de Madrid.

Todas las pacientes contestaron cuestionario donde se

recogían diversos datos epidemiológicos y demográficos como edad

de la primera relación sexual, consumo de tabaco, antecedentes

de E.T.S., utilización de anticonceptivos orales, etc.



51

2. MUESTRAS

Los tipos de muestra tomados para este estudio y su

distribución en los grupos estudiados fue la siguiente:

2.1. Grupo Patológico:

— Exudado endocervical (en 80 mujeres)

— Lavado cervicovaginal (en 73 mujeres)

— Biopsia cervical (en 63 mujeres)

— Biopsia vulvar (en 68 mujeres)

2.2. Grupo Normal:

— Exudado endocervical (249 mujeres>

Todas las muestras se tomaron bajo control colposcópico. Las

biopsias se congelaron inmediatamente en N2 liquido,

conservándose a —7OQC hasta el momento de la extracción del ADN.

Los exudados se incluyeron en un medio de transporte especial

<Vira Pap Specimen Collection ¡<it -IZASA; BRL-), congelándose,

junto con los lavados, a —20~C hasta su procesamiento.

II. TÉCNICAS

1. EXTRACCION DEL ADN

Los exudados endocervicales y los lavados se repartieron en

alícuotas de 500 ul, añadiéndose 33 ul de SDS al 22% y 20 ul de

una sol de 6 mg/ml de proteinasa K. La mezcla se incubó durante

una hora a 37~C y se purificó mediante una extracción con fenol

y otra con cloroformo—alcohol isoamilico 24:1. Para precipitar

el ADN se añadieron al sobrenadante final 50 ul de acetato sódico



52

3M <pH= 5,5) y dos volúmenes de etanol absoluto, manteniéndose

a —20~C al menos dos horas.

Las biopsias fueron troceadas y resuspendidas en 2 ml de

tampón de lisis <EDTA lOmM, NaCí lOOmM, SDS al 1% y Tris HOl 10

mM, pH= 7,5), al que se añadieron unos 15 ul de una solución de

20 mg/ml de proteinasa K. La mezcla se incubó a 650C 2—3 horas

o a 37~C toda la noche. Las proteinas se eliminaron añadiendo 600

ul de una solución de NaCí 6M y centrifugando a unas 3000—3500

rpm durante 15 minutos para favorecer su sedimentación. El

sobrenadante se decantó en otro tubo y se sometió a dos

centrifugaciones más. El ADN se precipitó en unos 20 minutos

añadiendo 2 volúmenes de etanol absoluto a temperatura ambiente.

Tras una nueva centrifugación, las muestras se aspiraron

mediante vacio y se dejaron secar al aire para eliminar los

restos de etanol, resuspendiéndose en agua destilada estéril.

2. PCR

2.1. Preparación de la mezcla de reacción

Los reactivos y concentraciones utilizados fueron los

siguientes:

REACTIVO CONCENTRACION VOLUMEN CONCENTRACION

INICIAL POR TUBO FINAL

HYO9 5OuM Sul 2,5uM
MYll 5OuM Sul 2,5uM
Tampón de reacción 10X1 10 ul lx
4ATP 10 mM 2 ul 200 uM
dGTP lOmM 2u1 200uM
dCTP lOmM 2u1 200uM
dTTP lOmM 2u1 200uM
Polimerasa Taq 5 U/ul 0,5 ul 2,5 U
H~O destilada estéril —— hasta 100 uF ——

ADN -- -- 1 ug (aprox.

1 Composición: ¡<Cl 500 mM, MgCl
2 40 mM, Tris 100 mM; pH= 8,5.

2 Hay que tener en cuenta el volúmen de ADN.



53

Para reducir el riesgo de contaminaciones y errores debidos al

pipeteo de los reactivos, se calculó la mezcla de reacción

necesaria para todos los tubos incluidos en la reacción, teniendo

en cuenta las concentraciones finales y excluyendo muestras y

controles. La mezcla se repartió en los tubos añadiéndose,

posteriormente, las muestras y los controles. La preparación se

cubrió con 50—100 ul de aceite mineral, para evitar

condensaciones que pudieran alterar la amplificación (este paso

puede realizarse en primer lugar, antes de la adición de la

mezcla, precipitándose los reactivos por centrifugación breve>.

Los controles utilizados fueron los siguientes:

— Control negativo: La ausencia de contaminaciones se

comprobó incluyendo un tubo con todos los componentes de la

mezcla de reacción y agua en lugar de ADN.

— Control interno: Para verificar la ausencia de inhibidores

de la reacción y la presencia de suficiente ADN, también se

añadieron a la mezcla los iniciadores PCO4 y 0H20 <Perkin-

Elmer), específicos del gen de la beta—globina, que dan

lugar a un amplicón de 268 pb.

- Control positivo de PV]!: Plásmidos portadores de los

genomas de PVH-18 y PVH-33. Dichos plásmidos se utilizaron

para transformar la cepa DH5—alfa de E. cali, extrayéndose

mediante métodos convencionales (140)



54

2.2. Amplificación

Se realizaron 40 ciclos de amplificación, cada uno de los

cuales constaba de los siguientes pasos:

— Desnaturalización: 95~C, 1 minuto

- Apareamiento de los iniciadores: 37~C, 2 minutos

— Polimerización: 72~C, 1,5 minutos

La reacción se completó con un ciclo adicional en el que la

fase de polimerización se prolongó durante 5 minutos. Los

productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis

en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Se consideraron

positivas aquellas muestras que presentaron una banda de 400—500

pb. (Fig 4).

3. IDENTIFICACION DE GENOTIPOS DE PV]!

3.1. Marcaje de sondas específicas.

Las sondas MYl2, MY13, MYl4, WD74 y MY16, especificas para

PVH—6, 11, 16, 18 y 33 respectivamente (133) se marcaron mediante

una técnica no isotópica para oligonucleótidos desarrollada por

Schmitz et al (141). Este método consiste en la adición de uno

o varios nucleótidos marcados con digoxigenina al extremo 3’—OH

de la secuencia, gracias a la acción de una transferasa terminal,

en presencia de iones Co. Cuando se añade un solo nucleótido, la

molécula utilizada es la digoxigenin—di—desoxiuridina—trifosfato

<DIG-dd-UTP), mientras que en las reacciones de adición múltiple

(tailing) seutilizadigoxigenin—desoxiuridina—trifosfato <DIG—d—

UTP). El ADN marcado se detecta mediante una reacción enzimática



55

(ver apartado 3.3.>.

La reacción se llevó a cabo utilizando un kit de Boehringer—

Manheim, según los siguientes pasos:

1. Preparación de la siguiente mezcla de reacción:

- 4 ul de tampón de reacción

— 4 ul de solución de CoCí2

— 1 ug de oligonucleótido

- 1 ul de mezcla de dNTPs, con DIG-d-UTP.

— 50 U de transferasa terminal.

2. Incubación a 37~C durante una hora

3. Frenado de la reacción con 2 ul de una mezcla de glucógeno

y EDTA 0,2M, pH= 8.

4. Precipitación del oligonucleótido marcado con etanol

absoluto y LiCí 4M.

3.2. Hibridación

La hibridación se llevó a cabo mediante la técnica de Dat—

blot. Se tomaron 10 ul de las muestras y se diluyeron en 500 ul

de agua estéril, transfiriéndose 75 ul de esta dilución a filtros

de nylon (Boehringer—Manheim> mediante vacio.

Para comprobar la sensibilidad de la deección se prepararon

dilucioes seriadas (de 1/50 a 1/3200) del amplicón obtenido de

PVH—1. Dichas diluciones se incluyeron; junto con el amplicón

de PVH—33 en todos los filtros con objeto de verificar, además,



56

la especificidad de las sondas empleadas.

Tras la transferencia mediante vacio se procedió según los

siguientes pasos:

1. Fijación del ADN a la membrana mediante calor (l2O~C, 30

minutos>.

2. Prehibridación a 68~C durante una hora con una solución

compuesta de SSC 5X, N—Lauroylsarcosina al 0,1%, SDS al

0,02% y reactivo bloqueante (Boehringer—Manheim) al 1%.

3. Hibridación a 542C durante al menos 6 horas con 50 ng de

sonda por ml de la solución anterior.

4. Lavado de los filtros, dos veces con SSC 2X y SDS al 0,1%

y dos veces con SSC O,lX y SDS al 0,1%, a la temperatura de

hibridación.

3.3. Detección

Para el revelado de la reacción se utilizó un kit de

detección de Boehringer—Manheim, siguiéndose las instrucciones

del fabricante: el filtro se bloqueó durante 30 minutos y se

incubó en una solución 1/5000 de fragmento Fab—anti—DIG conjugado

con fosfatasa alcalina. Posteriormente se adicionaron los dos

sustratos de esta enzima: 5—bromo—4—cloro—3—indolil fosfato

(BCIP) y sal de nitro—azul de tetrazolio <NBT, del inglés

nitroblue tetrazolium). Si la reacción es positiva, ambos

compuestos dan lugar a un precipitado azulado <Figura ~>



57

III. ABALISIS ESTADíSTICO

Las pruebas estadísticas utilizadas para el tratamiento de

los resultados han sido el test de la >0 y el test de

homogeneidad de muestras <comparación de medias y de

porcentajes), para datos no apareados. En todos los casos se fijó

un nivel de significación de p< 0,05.

Por otra parte, con el fin de comprobar si las mujeres

infectadas por PVH tenían mayor riesgo de presentar ciertas

alteraciones clínicas y/o citológicas en tracto genital que las

no infectadas, hemos realizado un estudio retrospectivo (casos—

control). En él hemos determinado la >0, la Odd Ratio (O.R.> y el

intervalo de confianza (95%) para la O.R. poblacional.

También se ha estudiado de forma análoga la relación entre

la presencia de dichas alteraciones y otros factores como consumo

de tabaco, utilización de anticonceptivos orales, antecedentes

de E.T.S., aparición de otras infecciones, etc, con objeto de

comparar su influencia con la de la infección por PVH (142>.







60

RESULTADOS

1. METODO

Se detectó ADN hasta la dilución 1/800 del amplicón de PVH—

18, correspondiente a 4,02 ng de ADN.

Ninguno de los controles utilizados en la hibridación (PVI{-

18 y 33> fue positivo al reaccionar con las sondas especificas

de los PVH estudiados (Figura 4>

II. DATOS OBTENIDOS.

En la Tabla III se recogen los porcentajes de positividad

en las muestras de exudado de las mujeres del grupo normal y

patológico <1,20% y 11,25% respectivamente).

1. GRUPO NORMAL (GN>

Sólo tres de las mujeres de este grupo fueran positivas para

PVH. En una de ellas el genotipo encontrado fue PVH—18, mientras

que en las otras dos fue indeterminado.

2. GRUPO PATOLOGICO (GP>

Hubo 41 mujeres que presentaron alguna muestra positiva en

este grupo <42,7%). Las frecuencias obtenidas en cada uno de los

tipos recogidos se muestra en la Tabla IV y en la Figura 6. Los

más frecuentes fueron PVH—6 (en lavados), PVH—16, PVH—18 (en

biopsias) y, en mucha mayor proporción, los PVH indeterminados

(en todos los tipos de muestra).

Se diagnosticaron alteraciones citológicas en 29 de las

mujeres positivas (23 tenían papiloma, 7 CIN—l, 11 CIN—2 y 6 CIN—



61

3>. Al comprobar la distribución de los distintos genotipos de

PVH en cada tipo de alteración (Figuras 7 a 12) se observó que

los designados como indeterminados fueron siempre los más

frecuentes, aunque PVH—18 destaca en las mujeres con CIN—l y 2.

Los porcentajes de positividad observados en los distintos

tipos de muestra de las mujeres positivas se recogen en la Tabla

V. Las cifras más altas se obtuvieron en biopsias, siendo

similares en cérvix y vulva. La prevalencia obtenida en lavados

fue levemente superior a la observada en exudados.

Hubo 13 mujeres positivas simultaneamente en cérvix y vulva.

En once de ellas <84,6%) coincidió alguno de los genotipos

encontrados <en 7 totalmente y en 4 parcialmente) (Figura 13)

Cinco de las mujeres positivas presentaron ADN de PVH en

exudado y lavado, coincidiendo en todas ellas los genotipos

encontrados <Figura 14).

En 44 de las mujeres estudiadas pudieron obtenerse todos los

tipos de muestra. Quince (34,1%) presentaron alguna muestra

positiva, coincidiendo en 11 de ellas (73,3%> los genotipos de

PV!! en al menos dos muestras (Figura 15)

En la Tabla VI y en las Figuras 16, 17 y 18 se recogen los

datos sobre distintos factores de riesgo para la aparición de

alteraciones clínicas y/o citológicas.

Además de la infección por PV!!, se encontraron diferencias

significativas entre el GP (con alteraciones) y el GN (sin

alteraciones> con respecto a consumo y dosis de tabaco,

antecedentes de ETS, presencia de otros microorganismos

(hallazgos microbiológicos) y edad de la primera relación sexual.



62

No se encontraron diferencias significativas entre los

porcentajes de mujeres que utilizaban anticonceptivos orales en

uno y otro grupo.



G.P. G.N.

PVH %

1

11

16

18

33

IND

LM.

1/80 1,3 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

1/80 1,3 1/249 0,4

1/80 1,3 0 0

6/80 7,5 2/249 0,8

0 0 0 0

TOTAL 9/80 11,3 3/249 1,2

LM.= Infeccionesmixtas
IND. = Indeterminado

Tabla III: Porcentajes de positividad frente a PVH
en exudadosde mujeres normales y
patológicas



EXUDADO LAVADO B. CÉRVIX B. VULVA

11

16

18

33

IND

I.M.

1/80 3,2 2/68 ¡ 2,9

0 0 0 0 0 0 1/68 1,4

0 0_¡

1,3

1/72 1,4 3/63 4,8 3/68 4,4

1/80 0 0 2/63 3,2 2/68 2,9

1/80 1,3 1/72 1,4 0 0 0 0

6/80 7,5 6/72 8,3 7/63 9,6 9/68 13,2 ¡

o O o 0 8/63 12,7 7/68 10,3

TOTAL 9/80 11,3 10/72 13,9 22/63 34,9 24/68 35,2

LM. = Infeccionesmixtas
fINID. = Indeterminado

Tabla IV: Distribución de PVH en las distintas
muestras del G.R

6 1,3 2/72 2,7 2/63



MUESTRA NUMERO POSITIVAS

Exudado

Lavado

B. cérvix

B. vulva

32 9(28,1%)

30 10(33,3%)

30 22 (73,3%)

31 23 (74,2%)

Tabla V: Porcentajes de positividad en la muestras
de las mujeres positivas del G.P.



‘+1,5

45

40

35

30

25

20

15

10

5

o »

INa =INDETERMINADQ

PVH-6 PVI-I-11 PVH-16 PVH-1BPVH-33 IND
ir

Rgura6 Ustnbuck5n de genotipos de PVYI en las nvjeres postkmdelGR



%50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

o

¡NO. = INDETERMINADO

Figurá y Distuibucián de genotipos de PVH en mujeres positivas con
alteraciones citolágicas.

PVH-6 PVH-i 1 PVH.1 6 PVH-1 8 PVH-33 ¡NO



50

45
40

35

30

25

20

15

10

5

o

IND = INDETERMINADO

Figura 8 DÉtribución de genotipos de PVI-1 en mujeres positivas con diagnóstico
citológico de papiloma

PVH-6 PVH-11PVH-16 PVH-18PVH-433 IND



80
71.4

28.6

14,3 14,3 ¡

0,0
— -

1 1
PVH-6 PVH-11 PVI-l-16 PVH-18PVH-33 ¡NO

IND.=INDETERMINADO

70 —

60

50-

40

30—

20 —

lo—

O

Figura 9 Distribución de genotipos de PVH en mujeres positivas con CIN-1.



70

60

50

40

30

20

lo

O

PV1-l-6 PVH-1 1 PVH-1 6 PVH.1 8 PVH-33 IND

IND.=INDETERMINADO

Figuralo Distribución de genotipos de PVH en mujeres positivas con CIN>-2.



60

50

40

30

20

10

o

¡NO.=INDEJERMIALADO

PVI-1-6 PVH-11 PVH.16 PVH-18 PVH-33 ¡NO

Figura 11: Distribución de genotipos de PVH en mujeres positivas con CIN-3.



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CQ
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CV

o-Ua)E1
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a,E-nEIId2



—4

• ~, , uit ti

Rgura13 Coincidencia de genotipos de PVH en mujeres
positivas en ceMx y vulva



Figura 14 Coincidencia de genotipos de PVH en mujeres
posft¡vas en exudados y lavados,



• COINCIDENTES

El POSITIVAS

Figural5 Grupo de mujeres con Indas las muesfras: coincidencia de
genotipos de PVH.

34Q90/



E. RIESGO GN GP P OR R(OE>
a

Ic x

PVH 11,3% 1,20% <0.001 10,39 90% 3,004-31,22 17,38

TABACO 41,22% 69.79% <0,001 3.29 70% 1,82-5,96 15,47

ANTEC. ETS 35,52% 77,08% <0.001 6,10 84% 1,44-25,76 46.61

H. MICROR. 14.03% 26,04% <0,05 2,15 53% 1,20-3,84 6,69

AC 46,2% 57,3% N.S. 1,56 36% 2,5.0,97 342

OR = ODD RATIO
R(DEI — Riesgo atribuible
IC = Intervalo de confianza

Tabla VI: Incidencia de distintos factores de riesgo en
las mujeres estudiadas.
<asociación =x½3,84)



—
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12

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4

2

o
CONSUMO TABACO

E GN. (sin aheraciones)

E (con aíterac¡ones>

Figura 17 Relaci&-i entre consumo de tabaco (dosis) y aparición de aheraciones clínicas

y/o citológicas en tracto gen¡tai femenino.

..ti

12

ji
u
~1•



25
años

20

15 —

10 —

5

o

EDAD DE LA PRIMERA RELACION SEXUAL

E GN. <sin alteraciones>

E GR (con alteraciones)

Figura 18: Relación entre edad de la primera relación sexual y aparición de alteraciones

Y-

clínicas y/o citológicas en tracto genital femenino.



79

DISCUSION

1. TECNICA

Mediante el empleo de las sondas oligonucleotídicas marcadas

con DIG-d-UTP fuimos capaces de detectar 4,02 ng de ADN en la

hibridación posterior a la PCR. Schmitz et al (141> consiguen con

este mismo método sensibilidades de hasta 50 pg.

A la gran sensibilidad descrita para este método en la

bibliografía hay que añadir su rapidez: la reacción colorimétrica

que se lleva a cabo al final del proceso (ver “Material y

Métodos”) tiene lugar en unas horas (a veces en unos minutos),

mientras que para las autorradiografias el filtro debe estar

expuesto a las películas fotográficas durante varios días.

También hay que considerar la mayor vida media de las sondas

no isotópicas (varios años) frente a las radiactivas (las sondas

marcadas con P32 duran menos de dos semanas) . Si, además, tenemos

en cuenta los inconvenientes de las sondas isotópicas, con las

que se requieren numerosas precauciones de manejo, es lógico

pensar en el marcaje no radiactivo como una alternativa cada vez

más importante para la detección de secuencias especificas de ADN

y, en particular, para la identificación de productos de PCR de

peso molecular equivalente.

II. DATOS OBTENIDOS

1. GRUPO NORMAL <QN>

Se detectó ADN de PV!! en el exudado de 3 de las 249 mujeres

del GN <1,2%>. Esta cifra es inferior a la mayoría de las

encontradas en los estudios revisados. No obstante, Claas et al,



80

en Holanda <143), encuentran un 1,4% de positividad en muestras

de raspado cervical de mujeres normales. Otros autores hallan

cifras algo más altas. Así, Evander et al (144), en Suecia,

encuentran un 5,6% utilizando los iniciadores MYO9 y MY11

diseñados por Manos et al <133> y empleados en nuestro estudio,

porcentaje próximo al encontrado por Melchers en Holanda (5%)

<145>, con iniciadores tipoespecificos.

Existen otros trabajos en la bibliografla que estudian

grupos de mujeres sin anomalías citológicas ni clínicas

utilizando iniciadores tipoespecificos. La mayoría de ellos

arrojan cifras de positividad sensiblemente superiores a las

encontradas por nosotros, que oscilan entre 8,7% <146) y 53,2%

<147>. Van den Brule et al detectan porcentajes de positividad

situados entre 3,5% y 13,9%, utilizando iniciadores consenso no

degenerados (135). El propio Evander (144) observa como la

prevalencia obtenida en su estudio con los iniciadores >1709 y

MY1l se incrementa de un 5,6% a un 19,2% al realizar una segunda

amplificación con los iniciadores no degenerados 0P5 y GP6,

utilizados por van den Brule. Parece que el mayor grado de

homología de éstos y de los iniciadores tipoespecificos con las

secuencias diana y la menor longitud del amplicón aumentarían

considerablemente la eficiencia de la amplificación (144).

Sólo hemos encontrado un trabajo de este tipo en población

española (148>, donde las prevalencias oscilan alrededor del 4%

<148). Dicho estudio está realizado, al igual que el nuestro,

mediante amplificación con los iniciadores M709 y MYll y

posterior hibridación con sondas especificas. Las diferencias con

nuestros datos <1,2%) podrían deberse, tal vez, a que esta



81

investigación se llevó a cabo en una población cuya procedencia

geográfica (diversas comunidades españolas) es mucho más

heterogénea que la de nuestro estudio, limitado a la Zona Centro.

En una de las tres mujeres positivas encontradas en el grupo

normal objeto de nuestro estudio se detectó ADN de PVH—18,

mientras que las otras dos fueron indeterminadas. Claas <143>

encuentra dos mujeres positivas en un grupo de 143 normales; en

una de ellas se detectó ADN de PVH—16, siendo la otra

indeterminada. Es significativo el alto porcentaje de PV!!

indeterminados hallados en otros trabajos. (137, 138, 144>, que

deteotan, asimismo, una frecuencia elevada de PVH—16. También se

observa un porcentaje significativo de PV!! indeterminados en los

estudios realizados en nuestro país (148) (no se diferencian las

frecuencias de PVH—16 y 18).

También nos parece significativa la aparición en nuestro

grupo de PVH—18, poco frecuente en población normal.

2. GRUPO PATOLOGICO

2.1. Positividad en las muestras estudiadas.

El porcentaje de muestras positivas fue mas elevado en las

biopsias (alrededor del ~ que en exudados y lavados (tabla

IV). La positividad en este último tipo de muestra fue levemente

superior a la encontrada en exudados <13,9% y 11,3%

respectivamente). Las cifras más altas se observan en las

biopsias, siendo similares en vulva y cérvix. Ello es debido a

que la biopsia corresponde directamente a la lesión, mientras que

el contenido de exudados y lavados consiste en células

exfoliadas, que se encuentran en mayor número en los lavados, lo



92

que justificaría el mayor porcentaje de positividad de estas

muestras, aunque no es significativo.

2.2. Prevalenoia

Al igual que sucedía en el GN, nuestra prevalencia en el GP

ha sido, en general, inferior a la mayoría de las observadas en

los estudios revisados, que oscilan entre 26,3% en raspados

cervicales (144) y 90% (146) en exudados y biopsias. La mayoría

de estos estudios se ha realizado con iniciadores tipoespecificos

o consenso no degenerados. Evander encuentra un 26,3% de

positivos en muestras de raspado cervical de mujeres con atipias

analizadas con los iniciadores MYO9 y MY11; al hacer una segunda

amplificación con los iniciadores GPS y GP6 (135, 149) el número

de pacientes positivas aumenta hasta un 84,2%. Van Doornum (150>,

utilizando iniciadores tipoespecificos encuentra un 25% de

positividad en exudados de mujeres con alto riesgo de ETS,

algunas de las cuales presentaban clínica o antecedentes de

condilomas, aunque sólo un 3% tenían anomalías citológicas.

Los genotipos más frecuentes en nuestro estudio fueron PVH—6

(en lavados), PVH—16 y, en mayor proporción, los PVH

indeterminados. En otros estudios también se encuentra una

prevalencia algo superior de PVH—16 (138, 143, 144, 145, 146,

151) aunque las cifras de PVH indeterminados son bastante altas

<137, 138, 144>.

2.3. Distribución en alteraciones citológicas

Se diagnosticaron alteraciones citológicas en 29 de las 41

mujeres positivas de nuestro estudio. Los PVH indeterminados



83

fueron siempre los más frecuentes en cada tipo de alteración <p

<0,001), seguidos de PVH—18 y 16 en menor proporción <Figuras 7

a 12>. Se detectó ADN de PV!! en 23/35 mujeres con diagnóstico

citológico de papiloma <41,8%>, 7/14 de CIN—1 (50%>, 11/15 de

CIN—2 (42,3%) y 6/16 de CIN—3 (37,5%). Estos datos no se

corresponden con los estudios revisados (138, 143, 151), en los

que el porcentaje de pacientes positivos para PV!! aumenta con la

severidad de la lesión. Hubo 12 mujeres con clínica sugestiva de

infección por PVH y citología normal, de las que 7 (58,3%) fueron

positivas. El genotipo más frecuente fue PVH—6 en tres de ellas,

seguido de dos indeterminados. La mayor prevalencia dentro de

este grupo se justifica por el hecho de que dichas mujeres

tenían, sin embargo, lesiones clínicas evidentes. Ello explicaría

también el mayor porcentaje de pacientes con PVH—6, genotipo

frecuente en lesiones benignas.

A la vista de los datos de frecuencia global y parcial de

cada genotipo de PVH, incluyendo los indeterminados, comenzamos

a sospechar que tal vez su distribución varíe en nuestro país,

donde genotipos como los estudiados aquí (PVH—6, 11, 16, 18 y ~

podrían no ser tan frecuentes, haciendo necesario el empleo de

iniciadores que permitan la detección de otros PVH menos usuales.

Este punto es compartido por otros autores (T. Kahn —DKFZ,

Heidelberg—, comunicación personal), que han mostrado su interés

en la realización de estudios de colaboración empleando

iniciadores no degenerados y/o tipoespecificos.



84

2.4. Coincidencia de genotipos en distintas muestras

Los genotipos encontrados coincidieron en un alto porcentaje

de las muestras estudiadas. Hubo 13 mujeres positivas

simultáneamente en cérvix y vulva; en 11 de ellas (84,6%)

coincidía alguno de los genotipos de PV!! detectados. La

correlación fue total en las 5 mujeres positivas simultáneamente

en exudado y lavado <Figuras 13 y 14>.

El hecho de encontrar genotipos semejantes en cérvix y vulva

no es raro, ya que la infección por PV!! se transmite por contacto

sexual y éste afecta a ambas localizaciones. La coincidencia

total en las 5 mujeres con exudado y lavado positivos se debería

a que, en realidad, lo que varia en estos dos tipos de muestras

es la cantidad de las células existentes en ellas, pero no su

tipo ni su localización.

Fue posible tomar todos los tipos de muestra en 44 mujeres,

15 de las cuales (34,1%) tuvieron alguna nuestra positiva; en 11

de ellas (73,3%> coincidieron los genotipos encontrados en al

menos dos muestras <Figura 15).

2.5. Influencia de otros factores de riesgo

Se ha sugerido la posibilidad de que, además de la infección

por PVH , intervengan otros factores en el desarrollo de

alteraciones del tracto genital femenino (2), aunque los datos

aportados dan a éstos una importancia variable <2, 143, 152,

153)

En nuestro estudio hemos determinado la asociación entre

consumo y dosis de tabaco, antecedentes de ETS, presencia de

otros microorganismos (hallazgos microbiolgógicos>, utilización



35

de anticonceptivos orales, edad de la primera relación sexual y,

por supuesto, detección de PV!! <Tabla VI; Figuras 16, 17 y 18>.

Encontramos diferencias estadisticamente significativas

entre el Grupo Normal (sin alteraciones citológicas y/o clínicas)

y el Grupo Patológico (con alteraciones citológicas y/o clínicas)

con respecto a todos los factores estudiados, a excepción del uso

de anticonceptivos orales. Esto significa que para las 345

mujeres incluidas en nuestro estudio existía relación entre

dichos factores y aparición de alteraciones clínicas y/o

citológicas en el tracto genital.

— Consumo de tabaco: Hemos encontrado asociación entre

consumir tabaco y tener alteraciones en el tracto genital.

El valor de la OR indica que la probabilidad de que

aparezcan dichos signos es 3,29 veces mayor en las mujeres

fumadoras que en las no fumadoras. El valor del riesgo

atribuible ¡«DE> <0,7> indica que el 70% de las mujeres que

tienen ciertos signos citológicos o clínicos en el tracto

genital los tienen por ser fumadoras , el resto (30%)

presentarán estos signos a pesar de no serlo. El intervalo

de confianza IC indica los valores entre los que se

encontraría la OR de la población general con una confianza

del 95% (1,82—5,96).

La asociación entre consumo de tabaco y aparición de

alteraciones ha sido observada por otros autores (122,

152>. Se ha sugerido que la aparición de estas atipias

podría deberse a la influencia de ciertos constituyentes

del tabaco presentes en fluido vaginal.



96

También hemos encontrado diferencias significativas entre

las dosis medias consumidas por los fumadores del grupo

patológico (GP) (17,5 cigarrillos/dia) y por las del grupo normal

(GN> (12,3 cigarrillos/día) (Figura 17)

— Antecedentes de ETS: La probabilidad de que aparezcan

alteraciones clínicas y/o citológicas en el tracto genital

es 6,1 veces mayor en aquellas mujeres con antecedentes de

ETS, con un riesgo atribuible del 84% <IC= 1,44—25,76).

El 77,1% de las mujeres con alteraciones citológicas

habían tenido algún episodio de ETS. El antecedente mas

frecuente se refería a historia previa de condilomas,

seguido, en mucho menor grado, por micosis y tricomoniasis.

La asociación entre historia previa de condilomas y

aparición de neoplasias ha sido observada por otros autores

(154, 155).

— Presencia de otros microorganismos: También se ha

encontrado asociación, aunque algo inferior, con la

presencia de otros agentes microbiológicos. En nuestro

estudio el riesgo de aparición de alteraciones es 2,15

mayor entre las mujeres que presentan otras infecciones,

siendo el riesgo atribuible de 53% (IC= 1,20—3,84). según

zur Hausen (2) la presencia de otros microorganismos podría

contribuir a la producción de sustancias carcinogénicas,

procedentes, en parte, del metabolismo de los mismos. En

nuestro estudio, el microorganismo más frecuente fue

Candida, seguida de Chlamydia. Existen datos que indican



37

asociación entre este último agente y aparición de alteraciones

del tracto genital <140, 143, 156>. Sin embargo, en un estudio

más reciente (143> no parece existir una asociación significativa

entre Chlamydia y atipias cervicales. La prevalencia de otros

agentes como HSV, relacionado frecuentemente con displasias

genitales (2>, o VIH ha sido muy escasa.

Los datos existentes son, sin embargo, contradictorios

y no parece existir una asociación clara entre presencia de

otras infecciones y alteraciones del tracto genital <153).

— Utilización de anticonceptivos orales: Las diferencias con

respecto a este factor están cercanas a la significación

(X= 3,42; X~= 3,84>; sin embargo, no podemos afirmar que

exista asociación entre estos dos factores, aunque otros

autores si hablan de una posible relación entre ambos, ésta

es muy leve y no es posible establecer si las diferencias

se deben al anticonceptivo o a aspectos comportamentales de

las mujeres que los utilizan (152). Se ha sugerido la

existencia de regiones en el genoma de PVH sensibles a la

acción de la progesterona, lo que podría sugerir una acción

sinérgica con PV!! <123, 124).

— Edad de la primera relación sexual: Se han encontrado

diferencias entre el Grupo Normal (21,5 años) y el Grupo

Patológico <19,5 años) <p <0,001) <Figura 18).

No hemos podido valorar otros datos como número de parejas

sexuales, ya que esta pregunta no fue contestada uniformemente



88

por las mujeres incluidas en este estudio.

— Infección por PVH: Se determinó que las mujeres infectadas

por PVH tienen 10,4 veces mas probabilidad de presentar

alteraciones clínicas y/o citológicas en tracto genital que

las no infectadas, con un valor R(DE>= 0,9. Ésto indica que

el 90% de las mujeres con clínica y/o citología en tracto

genital presentan dichos signos por estar infectadas por

PV!! y sólo un 10% tendrá estas alteraciones sin que se

detecte este virus (IC= 3—31,2>. Por lo tanto, para las

mujeres incluidas en nuestro estudio, el factor de riesgo

más importante para la aparición de alteraciones en

epitelio genital ha sido la infección por PVH, lo que

coincide con los datos existentes en la bibliografía, que

confieren a este virus un carácter oncogénico.



89
CONCLUS IONES

A la vista de los datos obtenidos en nuestro estudio podemos

extraer las siguientes conclusiones:

1. El método de detección no radioactivo utilizado (marcaje

terminal con DIG-d-UTP) constituye una útil alternativa

a las sondas radioactivas

2. Los genotipos encontrados en el grupo normal fueron PV!!—

18 en una paciente e indeterminados en dos.

3. El 42,7% de las mujeres del grupo patológico presentó al

menos una muestra positiva para PVH.

4. El porcentaje de positividad fue más elevado en las

biopsias, siendo equivalentes las cifras obtenidas en vulva

y cérvix.

5. El porcentaje de muestras positivas fue mayor en lavados

que en exudados, aunque sin diferencia significativa.

6. El tipo de PVH más frecuentemente encontrado en todos los

tipos de muestras fue el indetermindado, seguido de PVH-16

en biopsias y PVH—6 en lavados.

7. Trece de las mujeres estudiadas fueron positivas

simultáneamente en vulva y cérvix. En 11 de ellas (84,6%)

coincidía al menos uno de los genotipos encontrados.



90

8. Hubo cinco mujeres positivas simultánemente en exudado y

lavado. En todas ellas coincidieron los genotipos

encontrados.

9. Fue posible obtener exudado, lavado, biopsia de cérvix y

biopsia de vulva en 44 mujeres, presentando 15 de ellas

alguna muestra positiva. Los genotipos detectados

coincideron en al menos dos muestras de 11 de estas

pacientes <73,3%>.

10. En las mujeres con alteraciones citológicas los PVH más

frecuentes fueron los indeterminados, tanto en el total de

ellas, como en cada uno de los tipos diagnosticados

(papiloma, CIN—l, CIN—2, CIN—3>

11. Se detectó ADN de PV!! en 7/12 (58,3%) mujeres con clínica

sugestiva de infección por PVH, pero con citología normal,

siendo PVH-6 el genotipo más frecuente.

12. La probabilidad de padecer alteraciones clínicas y/o

citológicas de tracto genital es 3,29 veces superior en las

mujeres fumadoras que en las no fumadoras de nuestro

estudio, existiendo diferencia estadisticamente

significativa entre la dosis de cigarrillos consumida por

las mujeres del GN y de GP.



91

13. La probabilidad de padecer alteraciones clínicas y/o

citológicas en el tracto genital es 6,1 veces mayor en las

mujeres con antecedentes de ETS que entre las que no los

tenían, siendo la historia previa de condilomas el episodio

más frecuente.

14. La posibilidad de padecer alteraciones del tracto genital

es 2,15 veces mayor en las mujeres en las que existían

otras infecciones que en las que no las presentaban, siendo

Candida y Chlamydia los agentes más frecuentes.

15 La edad de la primera relación sexual de las mujeres con

alteraciones del tracto genital <GP) era inferior con

diferencia significativa a la de las mujeres sin

alteraciones (GP>.

16. No se encontró asociación entre la aparición de

alteraciones del tracto genital y la utilización de

anticonceptivos orales.

17. La probabilidad de padecer alteraciones en el tracto

genital fue 10,3 veces mayor en las mujeres infectadas por

PVH que en las no infectadas. La infección por este virus

es, por tanto, el factor de riesgo más importante entre los

estudiados.



92

28. La frecuencia de aparición de los genotipos de PV!!

estudiados (PVH—6, 11, 16, 18 y 33> no se corresponde con

la encontrada en otros paises. Esto, junto con el alto

porcentaje de PV!! indeterminados sugiere que la

distribución de estos virus podría variar en nuestro país.



93

BIBLIOGRAFíA

1. SHAH K.V., HOWLEY P.M.: Papillomaviruses En: Fields B.N.,

Knipe D.M. et al Eds. Virology Rayen Press, Ltd. New York

1990, pp. 1651—1676.

2. DE VILLIERS E.—M.: Laboratory techniques in the

investigation of human papillomavirus intection. Genitourin

Med 1992; 68: 50—54.

3. GISSMANN L., PFISTER H., ZUR HAUSEN H.: Human

papillomaviruses characterization of four ditterent

isolates. Virology 1977; 76: 569—580.

4. ORTH G., FAVRE M., CROISSANT O.: Characterization of a new

type of human papillomavirus that causes skin warts. J

Virol, 1977; 24: 108—120.

5. DE VILLIERS E. ->1.: Heterogeneity of the human

papillomavirus group. J Virol, 1989; 63: 4898—4902.

6. HOWLEY P.M.: Papilomavirinae aná their replication. En:

Fields B.N., Knipe D.M. et al. Virology. Rayen Press, Ltd.

New York, 1990; Pp 1625—1650.

7. ZUR HAUSEN H.: Molecular mechanisms in the malignant

transtormation by DNA viruses. Prog Obstet Gynecol, 1992;

35: 239—249.



94

8. U.S. Department of Health and Human Services: Sexually

transmitted disease statistics, 1985. Issue No.135. Public

Health Service. Atlanta, Georgia: Centers for Disease

Control, 1987.

9. SULIGOI B., GIULIANI >1., BINRIN N.: Tbe National

surveillance Systems Lcr sexually transmitted diseases in

Italy. CDC Surveillance summaries. MMWR, 1992; 41: 35—41.

10. VILATA J.J., NOGUEIRA J.M.: Condiloma acuminado ( Vengas

genitales. Verrugas venéreas >. En : Enfermedades de

transmisión sexual producidas por virus. Ed. EMISA

Editorial Médica Internacional ) Madrid, 1990; pp.105-114.

11. COOK T.A., BRUNSCHWIG J.P., BUTEL J.S. et al: Laryngeal

papilloma: etiologic and therapeutic considerations. Ann

Otol Rhinol Laryngol, 1973; 82: 649—655.

12. QUICK C.A., WATTS S.L., KRZYZEK R.A. et al: Relationship

between condylomata and laryngeal papillomata. Clinical and

molecular virological evidence. Ann Otol Rhinol Laryngol,

1980; 89: 467—471.

13. DE VILLIERS E.-M: Hy~bridization methods other than PCR: An

update. En : Muñoz N., Bosch F.X., Shah K.V. and Meheus

eds.The Epidemiology of Human Papillomavirus and cervical

cancer. IARC, 1992; Pp. 111—119.



95

14. COCCIN J.R., ZUR HAUSEN H.: Workshop on papillomaviruses

and cancer. Cancer Res, 1979 ; 39: 545—546.

15. ORTH G.: Epidermiodisplasia verruciformis: a mnodel for

understanding the oncogenicity of human papillornavirus in

human cancer. En: Papillomaviruses—Symposium No. 120. CIBA

Foundation-Symposium J. Wiley and Sons, Inc. New York 1986;

PP. 156—174.

16. ORTH O., JABLONSKA S., FAVRE M. et al: Identification of

papillornavirus ti butchers’ warts. J Invest Dermatol,1981;

76:97—102.

17. GRINMEL M.,DE VILLIERS E.-M., NEUMANN C. et al:

Characterization of a new papillomavirus ( HPV-41 ) from

disaeminated warts and detection of its DNA in some skin

carcinomas. Int J Cancer, 1988; 41: 5—9.

18. PFISTER H., HETTICH 1., RUNNE U. et al: Characterization of

human papillomavirus type 13 from focal epithelial

hyperplasia Heck lesions. 3 Virol, 1983; 47: 363—366.

19. BEAUDENON Si.., PRAETORIUS F., KREMSDORF D. et al: A new type

of human papillomavirus associated with oral focal

epithelial hyperplasia. 3 Invest Dermatol, 1987; 88: 130—

135.



96

20. DE VILLIERS E.-M., HIRSCH-BEHNAN A., VON KNEBEL-DOEBERITZ

C., NEUMANN Ci. AND ZTJR HAUSEN H: Twa newly identified human

papillomavirus types ( HPV-40 and 57 ) isol atad from

mucosal lesions. Virology,1989; 171: 248—253.

21. DE VILLIERS E.-M., WEIDAVER H., OTTO H. AND ZUR HAUSEN H:

Papillomavi rus DNA in human ion gua carcinomas. Int J

Cancer,1985; 36: 575—578.

22. GREENSPAN Di., DE VILLIERS E.-M., GREENSPAN 3.5. et al:

Unusual ¡¡PV types in oral warts in association with ¡¡IV

infectian. 3 Oral Pathol, 1988; 17: 482—487.

23. OSTROW LS., MARISAS D., MITOHEL A.J. et al

Epidermodysplasia verruciformis.A case associ atad with

primary lympha tic dysplasia, depressed cali-media ted

immunity and .Bowen diseasa containing HPV-l6 DNA. Arch

Dermatol, 1987; 123: 1511—1516.

24. FAVRE Mi., BREITBURD F., CROISSANT O. et al: Structural

pal ype pti des fo rahhit, ba vine and human papilloma

vireuses. 3 Virol, 1975; 15: 1239—1247.

25. PFISTER H., GISSMAN L., ZUR HAUSEN H.: Partial

characterizatian of protains of human papilloma vi rusas

(¡¡PV) 1—3. Virology, 1977 ; 83: 131—137.



97

26. AMTMANN E., SAUER G.: Bovina papilloma virus transcription:

polyadenylated RNA spacias and assessmnant of the direction

of transcription. J Virol, 1982; 43: 59—66.

27. ENGEL L.W., HEILMAN C.A., HOWLEY P.M.: Transcriptional

organization of the bovine papillomavirus type 1. 3 Virol,

1983; 47: 516—528.

28. HEILMAN C.A., ENGEL L., LOWY D.R. et al : Viru—specific

transcription in bovine papillomavirus—transformed mouse

celis. Virology, 1982; 119: 22—34.

29. LOWY D.R., DVORETZKY 1., SHOBER R. et al : In vitro

tumoriganic transformation by a de! ined sub—ganomic

fragment of bovina papilloma virus DNA. Nature, 1980; 287:

72—74.

30. BAXER C.Ci., HOWLEY P.M.: Diterential promoter utilization

by the papillomavirus in transtormed celís ami productively

infectad wart tissues. EMBO 3, 1987; 6: 1027—1035.

31. SCHNEIDER A., OLTERSDORF T., SCHNEIDER V.: Distribution of

human papillomavirus 16 genome in cervical neoplasia lay

molecular in situ bybridization of tissue sections. Int 3

Cancer, 1987; 39: 717—721.



98

32. STOLER M.H., BROKER T.R..: In situ hybridization detaction

o! human papillomavirus DNA aná messengar RNA in genital

condylomas and a cervical carcinoma. Hum Pathol, 1986; 17:

1250—1258.

33. WALDECK Si., ROSL F., ZENTORA? H.: Origin of replication in

episomal bovina papilloma virus typa 1 DNA isolatad from

transformará celis. EMBO,1984; 3: 2173—2178.

34. LUSKY M., BOTCHAN M.R.: Charactarization of the bovina

papilloma virus plasmid ¡naintenance saquances. Cell,1984;

36: 391—401.

35. LAMBERT P.F.: Papillomavirus DNA replication. 3 Virol,

1991; 65: 3417—3420.

36. THORNER L., BUCAY N., CHOE J. at al : Tha product of tha

bovina papillomavirus type 1 modulator gene (M) is a

phosphoprotein. 3 Virol, 1988; 62: 2474—2482.

37. SEIF 1.: Sequence homnology between the larga tumor antigan

of pol yomavi rusas aná tha putativa El protain of

papillomavirusas. Virology, 1984; 138: 347—352.

38. BERG L., LUSKY M.,STENLUND A. at al : Rapression of bovina

papilloma virus replication is niedi atad lay a virally

ancoded trans- acting factor. Celí, 1986; 46: 753—762.



99

39. BERG L.J., SINGH It, BOTOHAN M.: Complamentation of a

bovina papilloma virus low—copy—number mutant: evidence for

a temporal requiremant of tbe complemanting gana. >101 Celí

Biol, 1986; 6: 859—869.

40. ROBERTS J.M., WEINTRAUB H.: Negativa control of DNA

raplication in composite SV4O-bovina papilloma virus

plasmids. Celí, 1986; 46: 741—752.

41. DIMAIO D., SETTLEMAN 3.: Bovina papillomavirus mutant

temperatura defectiva for transformation,replication aná

transactivation. EMBO 3, 1988; 7: 1197—1204.

42. GROFF D.E., LANCASTER W.D.: Ganatic analysis of tha 3’

aarly ragion transtormation aná replica tion functions of

bovina papillomavirus type 1. Virology, 1986; 150: 221—230.

43. RABSON M.S., YEE C., YANG Y.C. et al : Bovina

papillomavirus type 1 3’aarly region transtormation and

plasraid maintanance functions. J Virol, 1986; 60: 626—634.

44. SARVER N., RABSON M.Si., YANG Y.C. et al : Localization aná

anal ysis of bovina papillomavirus typa 1 transforming

functions. J Virol, 1984; 52: 377—388.

45. GILBERT D.M., COHEN S.N.: Bovina papilloma virus plasmiás

replicate randomly in mouse fibroblasts throughout 3 phasa

of tha cali cycla. Celí, 1987; 50: 59—68.



100

46. BURNETT S., KIESSLING U., PETTERSSON U.: Loss o! bovina

papillomavirus DNA replica tion control in growth-arrestad

transformad calis. J Virol, 1989; 63: 2215—2225.

47. CHOE Ji.., VAILLANCOURT Pi., STENLUND A. et al : Bovina

papillomavirus typa 1 encodas two forms of a

transcriptional repressor: structural ami functional

analysis of new viral cDNAs. 3 Virol, 1989; pp. 1743—1755.

48. STENLUND A., BREAI4 G.L., BOTCHAN M.R.: A promotar with an

intarnal ragulatory dornain is part of tha origin of

raplication in .BPV—l. Science,1987; 236: 1666—1671.

49. STENLUND A., ZABIELSKI J., AHOLA H. at al: Massanger RNAs

from tha transforming ragion of bovina papilloma virus type

1. 3 Mol Biol, 1985 ; 182: 541—554.

50. CRIPE T.P., HAUGEN T.H., TURK J.P., at al : Transcriptional

regulation of the human papillomavirus-16 E6-E7 promoter lay

a keratinocyte—dependent enhancar, ami lay viral E2 trans—

activa tor aná raprassor gana produ cts: implications for

cervical carcinogenasis. EMBO J , 1987 ; 6: 3745—3753.

51. THIERRY F., GARCíA—CARRANCA A., YANIV Mi. : Elements that

control tbe transcription of genital papillomavirus type

18. Cancer calla , 1987 ; 5: 23—32.



101

52. LUSKY Mi.., BERG L., WEIHER H. et al Bovina papilloma virus

containa an activator of gana axpression at the distal and

o! the aarly transcription unit. >101 Celí Biol , 1983 ; 3:

1108—1122.

53. HERMONAT P.L., SPALHOLZ B.A., HOWLEY P.M. Tha bpvina

papillomavi rus P2~ promoter is E2 trana—rasponsiva:

evidanca Lar E2 autora gulation. EMBO 3 , 1988 ; 7: 2815—

2822.

54. GIRI 1., DANOS O., YANIV M. : Genomic structura of tha

cottontail rabbit ( Shope ) papillornavirus. Proc Natí Acad

Sci USA , 1985 ; 82 : 1580—1584

55. HIROCHIKA H., HIROCHIKA E., BROKER T.R., et al Functional

rnapping oL tha human papillomavirus typa 11 transcriptional

anhancar and ita intaraction with tha trans—acting E2

protein. Genes Dey , 1988 ¡ 2: 54—67.

56. SPALHOLZ B.A., BYRNE J.C., HOWLEY P.M. : Evidanca for

cooparativity betwaan E2 binding sites in E2 trana-

ragulation of bovina papillomavirus type 1. 3 Virol , 1988

62 : 3143—3150.

57. HAUCEN T.H., CRIPE T.P., GINDER C.D. , et al : Trana—

actication of an upstream early gana proznotar of bovina

papilloma virus—l lay a product of tha viral E2 gene.EMBO 3,

1987 ; 6: 145—152.



102

58. HEIKE T., MIYATAKE 5., YOSHIDA M. , at al : Bovina

papillamavi rus encadad E2 protein activatas lymphokina

ganas through DNA alamants, distinct from tha consansus

motif, in tha long control ragion of its own genome. EMBO

3, 1989 ; 8: 1411—1417.

59. THIERRY Fi., YANIV Mi. : Tha .BPV-E2 trans-acting protein can

be aitbar an activator or a repressor of tha ¡¡PV 18

regulatory region . EMBO J , 1987 , 6: 3391—3397.

60. GUIS D., GROSSMAN 5., BEDELL M.A., at al Inducibla aná

constitutiva anhancar domaina in the noncoding region of

human papillomavirus typa 18 . 3 Virol, 1988 ; 62: 665—672.

61. BAYER C.C., NOE 3.5. Transcriptional termination batwaan

bovina papillomavirus typa 1 ( BPV-1 ) aarly aná late

pal yadanyl ation sitas blocks late transaription in BPV-1

transformad celís. 3 Virol , 1989 ; 63: 3529—3534.

62. LAW M.F., LOWY D.R., DVORETZKY 1., at al

transformad lay bovina papillomavirus

extrachrornosomal viral DNA saquancas. Proc

USA , 1981 ; 78 : 2727—2731.

63. LUSKY M., BOTCHAN M.R.

papilloma virus typa

requirements. Proc Natí

3613.

Mouse celís

contain only

Natí Acad Sci

Transiant replica tion of bovina

1 plasmiás : Gis and trans

Acad Sci USA , 1986 ; 83 ¡ 3609—



103

64. PATEL K.R., SMITH ItT., CAMPO Mi.S. Bovina papillomavirus

typa 4 ( BPV—4 ) - ganoma saquanca. J Gen Biol , 1987 ; 63

2117—2128.

65. TUREK L.P., BYRNE J.C., LOWY D.R., et al :Intarfaron

induces morpholag’ic ravarsion with elimination of

extrechrornosomal viral ganomes in bovina papillomavirus—

transformad mouse celis. Parc Natí Acad Sci USA , 1982 ; 79

7914—7918.

66. VASUMOTO Si., BUPRHARDT A.L., DONINGER Ji., at al : Human

papillornavirus type 16-induced malignant transtormation of

NIR STS calís. J Virol , 1986 ; 57 : 572—577.

67. KANDA T., WATANABE Si., YOSHIIKO K. Immortalization of

primar>’ rat calís lay human papillomavi rus type 16

sulagenomie fragments controllad lay tha SV4O promotar.

Virology , 1988 ; 165 : 321—325.

68. MATLASHEWSKI G., SCHNEIDER Ji., BANKS L. et al : Human

papillomavirus typa 16 DNA cooparatas with activatad ras in

transforming primary calís. EMBO 3 , 1987 ; 6 : 1741—1746.

69. PIRISI L., YASUMOTO 5., FELLER M.,at al: Transformation o!

human fibroblasts ami karatinocytas witb human

papillamavirus type 16 DNA. J Virol, 1987 ; 61:1061—1066.



104

70. SCHLEGEL R., PHELPS W. C., ZHANG Y. L.,at al: Quantitativa

Karatinacyte asa>’ datacts twa biological activitias of

human papillomavirus DNA aná iden tiLias viral typas

associatas with carvical carcinoma. EMBO 3,1988 ; 7:3181—

3187.

71. KREIDER Ji. W., HOWETT M. K., WOLFER 5. A.,et al:

Morpbologi cal transtormation in vivo of human uterina

carvix with papillomavirus from condylomata acuminata.

Natura, 1985 ; 317:639—641.

72. GREEN >1., LOEWENSTEIN Pi. M.: Damonstration that a

chamicall>’ synthesizad BPVl oncoprotain and its C-terminal

domain function to induce cellular DNA synthasas. Celí,

1987 ; 51:795—802.

73. BUBB Vi., McCANCE Di. Ji., SCHLEGEL R.: DNA sacuanca of the

HPV-16 ES Ofl and tha structural consarvation of its

encadar protein. Virology, 1988 ; 163:243—246.

74. YANG Y. Ci., OKAYAMA H., HOWLEY P. Mi.: Bovina papillomavirus

cantains multiple transforming ganas. Proc Natí Acad Sci

USA, 1985 ; 82:1030—1034.

75. SCHEWARZ E., FREESE U. It, GISSMAN Li., et al: Structura aná

transcription of human papillomavírus secuences in cervical

carcinoma celís. Natura, 1985 ; 314:111—114.



105

76. COLE Si. T., DANOS O.: Nucleotide sacuance and comparativa

analysis of tha human papillomavirus typa 18 genome. 3 Mol

Biol, 1987 ; 159:599—608.

77. MUNGER K., PHELPS W. Ci., BUBB Vi., et al: Tha E6 and El

genes of human papillomavirus togathar are necassary and

suffi ci ant far transformation of primar>’ human

karatinocytas. 3 Virol, 1989 ; 63:4417—4421.

78. WATANABE 5., KANDA Ti., YOSHIIKE It: Human Papillomavirus

type 16 tranaformation of primar>’ human ambryonic

Libroblasts requires axpression of apen reading trames E6

ariel El. 3 Virol, 1989 ; 63:965—969.

79. BARBOSA Mi. Si., LOWY Di. E., SCHILLER Ji. T.:Papillomavirus

polypeptidas E6 aná El are zinc binding proteinsi. J Virol,

1989 ; 63:1404—1407.

80. WHYTE P., BUCHKOVICH K. Ji.., HOROWITZ Ji. M.,at al:

Association betwaan an onca gene and anti—oncogana: tba

adanovi rus Ela proteins lainel to tha ratinoblastoma gana

product. Nature, 1988 ; 334:124—129.

81. MUNGER Xi., WERNESS B., DYSON N.,at al: Camplax formation of

human papillomavirus El pratairis witb tha ratinoblastoma

gana product. EMBO J, 1989 ; 8:4099—4105.



106

82. LAMBERT Pi. Fi., HOWLEY Pi. Mi.: Bovina papillomavirus typa 1

El raplication — defectiva mutants ara alterad in their

transcriptional regulatian. 3 Virol, 1988 ; 62:4009—4015.

83. SCHILLER 3. Ti., KLEINER E., ANDROPHY E. Ji., et al:

Identification of bovina papillomavirus El mutants with

increased transforming and transcriptional activity. 3

Virol, 1989 ; 63:1775—1782.

84. MURRAY Ri., HOBBS Ji., PAYNE B.: Possibla clonal origin of

cammon warts (verruca vulgaris). Natura, 1971 ; 232:51—52.

85. JABLONSKA 5., DABROWSKI Ji., JAKUBOWICZ Xi.:

Epidarmodysplasia verruciformis as a modal in studies on

tha role of papovaviruses in oncoganasis. Cancer Res, 1972

32:583—589.

86i. ANDROPHY E. 3., DVORETZKY 1., LOWY Di. Ri.: X—linkad

inheritanca of epidarmodysplasia varruciformis: gene tic ami

viralogic atudies of a kindrad. Arch Dermatol, 1985 ;

121:864—868.

87. GISSMANN La.., DIEHL Vi., SCHULTZ-LOULON H. Ji.., at al:

Molecular cloning anel charactarization of human

papillomavirus DNA derivad from a laryngaal papilloma. 3

Virol, 1982 ; 44:393—400.



107

83. MOUNTS Pi.., SHAH Xi.: Raspirator>’ papillomatosis: etiological

reí ation to genital tract papillomaviruses. Prog Med Virol,

1984 ; 29:90—114.

99. MOUNTS Pi., SKAH Xi. Vi., KASHIMA H.: Viral atiology of

juvanila and adult onsat squamaus papilloma of the larynx.

Proc Enatí Acad Sci USA, 1982 ; 79:5425—5429.

90. TERRY R. Mi., LEWIS Fi. A., GRIFFITHS Si.., at al:

Damonstration of human papillomavirus typas 6 aná 11 in

juvanila laryngeal papillomatosis lay in situ DNA

hybridization. 3 Pathol, 1987 ; 153:245—248.

91. STEINBERG Ha.., TOPP W., SOHENEIDER Pi. Si.,at al: Laryngeal

papillomavirus infaction during clinical ramission. N Engí

3 Med, 1983 ; 309:1261—1264.

92. GALLOWAY Ti. Ci., SOPER G.R., ELSEN G.: Carcinoma of tha

Larynx aLtar irradiation for papillomai. Arch Otolaryngol,

1960 ; 72:289—294.

93. KAHN Ti., SCHWARZ E., ZUR HAUSEN II.: Molecular cloning anel

charactarization of the DNA of a new human papillomavirus

(HPV30) from a laryngeal carcinoma. mt J Cancer, 1986 ;

37:61—65.



108

94. BRANDSMA Ji. Li., STEINBERG B. Mi., ABRAMSON A. Mi., et al:

Prasence of human papillomavirus typa 16 relatad sequences

in verrucous carcinarna of the larynx. Cancer Res, 1986 ;

46:2185—2188.

95. LASS Ji. H., JENSON A. B., PAPALE Ji. Ji., at al:

Papillomaví rus in human conjunctival papillomas. Mi 3

Ophthalmol, 1983 ; 95:364—368.

96. McDONELL Pi. Ji.., McDONELL Ji. Mi., KESSIS Ti., at al: Detection

o! human papillomavirus type 6/11 DNA in conjunctival

papillomas by in situ hybridization with radiactiva probas.

Hum Pathol, 1987 ; 18:1115—1119.

97. MEISELS A., FORTIN R., ROY Mi.: Condylomatous lasions of tha

carvix. IT. Cytologic colpostopic and histopathologic stud>’

Acta Cytol, 1977 ; 21:379—390.

93. MEISELS A., MORIN Ci., CASAS—CORDERO Mi..: Human

papillomavirus infection of tba uterina carvix. mt 3

Gynecol Pathol, 1982 ; 1:75—94.

99. ORIEL 3.: Natural histor>’ of tha ganital warts. Br 3 Vener

Dis, 1971 ; 47:1—13.



109

100. ALLUB Mi. 1., BARR Bi. Bi. B., McLAREN Xi. B., at al: Human

papillomaví rus infection and cervical intraepithalial

neoplasia in woman with renal allogra!ts. Br Med 3, 1989 ¡

298:153—156.

101. HALPERT Ri., FRUCHTER Ri. Gi., SEDLIS A.., et al: Human

papillomavirus aná lowar genital neoplasia in renal

transplant patients. Obstet Gynecol, 1986 ; 68:251—258.

102. REíD R., GREENBERG Mi.., JENSON A. B., et al: Sexualí>’

transraittad papillomavirus infections. 1. Tha anatomic

distribution aná pathologic grade of neoplas tic lassions

asuaciated with diffarant viral typas. Am 3 Obstet Gynecol,

1984 ¡ 156:212—222.

103. GISSMANN Li., WOLNICK Li., IKENBERG H., at al: Human

papillomavirusas types E aná 11 DNA sequences in genital

anel laryngaal papillamas anel in soma cervical cancars. Proc

Natí Acad Sci USA, 1983 ; 80:560—563.

104. REíD R., CRTJN O. Pi., HERSCHMAN B. R., at al: Genital warts

aná cervical cancar. III. Subclini cal papillomaviral

infectian and cervical neoclasia are linkad lay a spectrum

of continuous morphologic aná biologic change. Cancer, 1984

; 53:943—953.



110

105. SAlTO Xi., SAlTO A., FU Y. 5., et al: Topagraplaical study of

cervical condyloma anel intraepitbalial neoplasia. Cancer

1987 ; 59:2064—2070.

106. BOSHART Mi., GISSMANN Li., IKENBERG Hi., at al: A new type of

papilloma virus DNA aná ita presenca in genital cancer

biopsias anel in cal línea derví ved fram cervical cancar.

EMBO J, 1984 ¡ 3:1151—1157.

107. LORINCZ Ai., TEMPLE Ti., KURMANN O. F.,at al: Oncogenic

association of spacific human papillamavirus types with

cervical neoclasia. 3 Natl Cancer Inst, 1987 ; ppi.671—67?.

108. CAMPION Mi. Ji., McCANCE Di. Ji., CUZICI< Ji., et al: .Progressive

potential of milel cervical atypia: prospactive cytological,

colposcopic, ami virological studyi. Lancet, 1986 ; 2:237-

240.

109. VEE Ci., KRISHNAN-HEWLETT 1., BAYER Ci. Ci.., et al: Presence

aná axpressian of papilloma virus saqu ancas in human
N

cervical calcinama celí unas. Am 3 Pathol, 1985 ¡ 119:361—

366.

LíO. FUCHS 2. G., GIRARDI Fi., PFISTER Hi..: Human papillomavirus

16 DNA in cervical cancera aná in lymph nodas of cervical

cancer patients: a diagnostic markar for aarly metastases?.

Int 3 Cancer, 1989 ; 43:41—44.



111

111. LANCASTER W. E., CASTELLANO Ci., SANTOS Ci., at al: Human

papillomavirus deoxyribonucleic acid in cervical carcinoma

from primar>’ aná matastatic sites. Mi 3 Obstet Gynecol,

1986 ¡ 154:115—119.

112. McCANCE Di. Ji.: Human papillomavirus and cervical cancar.

Lancet, 1987 ¡ ¡:986.

113i. BAYER Ci. Ci., PHELPS W. Ci., LINDGREN Vi., et al: Structural

anel transcriptional analysis of human papillomavirus type

16 sequancas in cervical carcinoma calI lines. 3 Virol,

1987 ; 61:962—971.

114. ZUR HAUSEN Hi., SCHNEIDER A.: Tha role of papillomaviruses

in human anoganital cancer. Salzman Ni. Pi., Howley Pi. Mi.,

eds. In: The papovaviridaa, vol 2: tha papillomavirusasi.

New York Plenum Press, 1987 ¡ ppi.245—263.

115. STANBRIDGE E. Ji.: Suppression of mnalignancy in human celís.

Nature, 1976 ; 260:17—20.

116. SAXON Pi. Ji., SRIVATASEN E. 5., STANBRIDGE E. Ji.:

Introduction of human chromosoma 11 vía micraceil transfer

controls tumorigenic expression of ¡¡aLa celís. EMBO 3, 1986

; 5:3461—3466.



112

117. SMITS H. Li., HAADSHEER E., ROOD Si., at al: Induction of

anchoraga—indapndence growtb an human embryonic fibroblasts

with a deletion in the short arm of chromasoroe 11 lay human

papillomavirus type 16 DNA. 3 Virol, 1988 ¡ 62:4538—4543.

113. ATKIN Ni. B., BAYER Mi. Ci.: Deficiancy of alí or part of

chromosome 11 in several tpes of cancer: Significanca of a

reduction in tha number of normal chromosomes 11. Cytogenet

Celí Genet, 1988 ; 47:106—107.

119. ROSL Ri., DURST Mi., ZUR HAUSEN H.: Selectiva suppression of

human papillomavirus tranacriptian in non—tumorigenic calla

lay .5 — azacytidine. EMBO 3, 1988 ; 7:1321—1328.

120i. ZUR HAUSEN H.: Intracellular surveillance of persisting

viral infectiona. Human genital cancer rasults from

deficiant contra of papillomarivus infection. Lancet, 1986

¡ 2:489—491.

121. COUTOURIER Ji., SASTRE-GARAU Xi., SCHNEIDER-MAUNOURY Si., et

al: Integration of papillomavirus DNA near myc ganes in

genital carcinamas ami its consaquancas for proto—ancagene

axpression. 3 Virol, 1991 ¡ 8:4534—4538.

122. HOFFMANN Di., HECHT Si. Si.., HALEY Ni. Ji., et al: Tumoriganic

agants in tobacco producta aná their uptake lay chewers,

smokars aná non-smokers. 3 Celí Biochem (Suppl>, 1985

90:33.



113

123. GLOSS B., BERNAXUJ Hi.Ui., SEEDORF K., at al : The upstream

regulator>’ region of tha human papillomavirus—16 contains

an E2 protein—independent anhancar wich is apací Lic Lar

cervical carcinoma celis aná regulatad lay glucocorticoid

hormones. EMBO 3 , 1987 ¡ 6: 3735—3743.

124. PATER 14.M. , HUGHES G.A., HYSLOP D.Ei. , et al

Glucocorticoid—dapandent oncogenic transformation lay typs

16 anel not type 11 human papillomavirus DNA. Natura, 1988

¡ 335: 832—834.

125. FIRZLAFF J.M., KIVIAT N.B., BECKMANN Ai.M., et al

Dataction of human papillomavirus capsid antigens in

various squamous apitbalial lesions using antibodies

directed against the LI ami L2. Open Reading Pramesi. Virol,

1988 ; 164 : 467—477.

126. MATLASHEWSKI G.., BANKS Li., WU-LIAO Ji., at al : The

exprassion of human papillamavirus type 18 ES protain in

bacteria and the production of anti-E6 antibadies. 3 Virol

1986 ; 67: 1909—1916.

127. SOTHERN E.M. Detaction of specific saquences amang DNA

fragmants separatad lay gel electrophoresis. 3 Mal Biol,

1975 ; 98: 503—517.



114

128. dE VILLIERS E.—M., SCHNEIDER A., GROSS O., at al : Analysis

of benign and malignant uro genital tumours Lar human

papillomaví rus infection lay laballing cellu lar DNA. Med

Microbiol Immunol, 1986 ¡ 174 : 281—286.

129. WAGNER Di., IKENBERG Hi., BOHM Ni., et al : Idantification of

human papillomavirus in cervical swabs lay deoxyrilaanucleic

acid in situ bylaridization. Obstet Gynecol, 1984 ¡ 64

767—772.

130. NUOVO 0.3., McCONELL P.,FORDE A., at al: DEtecttion of

human papilamavirus DNA in formaling - fixed tissuas by in

situ hylaridization aLtar amplification by polymerase chain

reaction. Am 3 Pathol, 1991 ; 139:847—854.

131. SAIKI R. Xi., SCHARF 5., FALOONA Fi., et al: Enzymatic

amplification of B—globin genomic saquances andt

rastriction site anal ysis br diagnosis of sickla celí

anemia. Science, 1985 ; 230:1350—1354.

132. SAIXI R. Xi., GELFAND Di. Ha.., STOFFELS Si., at al: Primer -

directed enzymatic amplificatian o! DNA with a tarmostabla

DNA polymerasei. Science, 1988 ; 239:487—491.

133. MANOS Mi. Mi., TINO Y., WRIGHT Di. K., et al: Use of

pal ymerase chain reaction amplification for detaction of

genital human papillomavirusas. Cancer Celís, ; 7:209—

214.



115

134. SHIBATA Di. Xi.., ARNHEIM Ni., MARTIN W. Ji.: Dataction of human

papillomavirus in parafin - embedelad - tissue uning the

polymerasa chain reaction. 3 Exp Med, 1988 ; 167:225—230.

135. RESNICK R. Mi., CORNELISSEN Mi. Ti. E., WRIGHT Di. liC., at al:

Dataction aná typing of human papillomaví rus in archí val

cervical can cer specimens lay DNA amplification with

consansus primers. 3 Natí Cancer Inst, 1990 ¡ 82:1477—1484.

136. FUJINAGA Y., SHIMADA Mi., OKAZAWA Xi., et al: Simultaneous

dataction aná typing of genital human papillomavirus DNA

using the polymarasa chain raaction. 3 Gen Virol, 1991 ;

72:1039—1044.

137. YOSHIKAWA H., KAWANA Ti., KITAGAWA Xi.., at al: Detection aná

typing of multiple genital human papillomaviruses lay DNA

amplification with consansus primers. Jpn Cancer Res, 1991

; 82:524—531.

138. VAN DEN BRIlLE A. Ji. Ci., MEIJER Ci. Ji. Li. Mi., BAYELS Vi., et

al: Rapid dataction of human papillomavirus in carvi cal

scrapes lay combined general primer — media ted aná type —

spacific polymerase — chain reaction. 3 Clin Microbiol,

1990 ; 23:2739—2743.



116

139. McCANCE Di. Ji., GARDNER 5. Di.: Papovavi rusas:

papillomavirusas aná polyomaviruses. En: Principles and

practice of Clinical Virology. Zuckerman A. Ji., Banatvala

Ji. E., Pattison Ji. Ri. ads., 1987

140. SAI4BROOK Ji., FRITSCH E. Fi., MANIATIS Ti.: Molecular claning:

a laborator>’ manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1989 ; PP. 1.74 — 1.84.

141. SCHMITZ G.G., WALTER Ti., SEIBL R., et al : Non-radioactive

labeling of oligonucleotides in vitro with the hapten

digoxigenin lay tailing with terminal transfarase. Anal

Biochem , 1991 ¡ 192: 222—231.

142. XAHL-MARTIN—COLIMON : Fundamentos da Epidarniologia. Eol

Diaz de Santos. 1990

143i. CLAAS E. Ci.J., MELCHERS W.Ji.G., NIESTERS Hi.G.Mi., et al

Infection of the carvix uterí with human papillamavirus aná

Chlamydia trachomatis. 3 Med Virol, 1992 ; 37: 54—57

144. EVANDER Mi.., EDLUND Xi.., BODEN E., et al : Comparison of a

one—step and a two—stap polymerase chain reaction with

degenerate general primers in a population-based study of

human papillomavirus infaction in young swedish women. 3

Clin Microbiol, 1992 ; 30: 987—992.



117

145. MELCHERS W.J.G., BRULE A.Ci.J., WALBOOMERS J.M.M., et al

Increased detection rata of human papillomavirus in

cervical scrapes lay tha polymerase chain reaction as

comparad with modified fish and southarn lalot analysis. 3

Med Virol, 1989 ; 27 : 329—335

146. GJOEN Xi., SIEBXE J.C., FLIXXE Mi., et al Genital human

papilloma virus infaction in Oslo studied lay dat blot DNA

hybridization and tha polymarasa chain reaction. 3 Med

Microbiol , 1991 ; 34: 159—164

147. HALLAM Ni., CREEN Ji., GIBSON Pi., at al Prevalance aL ¡¡PV

carvi cal infaction in a famil>’ planning clinic determinad

lay polymerase chain reaction and dat blot hybridizatian. 3

Med Virol, 1991 ; 34: 154—158

143. SMI JOSE Si., SANTAMARíA Mi., ALONSO DE RUIZ Pi., at al : ¡¡PV

types in women witb normal citology. En Epidemiology of

cervical cancer. Muñoz Ni., Bosch F.Xi., Shah K.V., Meheus

A., edsi. IARO, 1992 ; pp. 75—84

149. SNIDJERS P.J.F., VAN DEN BRULE Ai.J.Ci.., SCHRIJNEMAKERS

H.F.J., at al The use of general primers in tha

polymarasa chain reaction permits tha detection of a broad

spactrum of human papilloma genotypas. 3 Gen virol, 1990 ¡

71: 173—181



118

150. VAN DOORNUM G.J.J., HOOYKAAS Ci., JUFFERMANS L.H.J., at al

Pravalence of human papillomaví rus infections among

hatarosaxual man aná women wi th muítiple sexual partnars.

3 Med Virol, 1992 ; 37: 13—21

151. VANDENVELDE Ci., SOHEEN R., VAN PACHTERBEKE O., et al

Prevalenca of high risk genital papillomaviruses in the

Belgian famala population determines lay Last multiplax

polymarasa chain reaction. 3 Med Virol, 1992 ; 36: 279—282

152. SCHNEIDER A., XOUSTSKY Li. Natural histor>’ and

epidemiologí cal featuras ob genital ¡¡PV infection. En

Epidemiology of cervical cancer. Muñoz Ni., Bosch F.X., Shah

X.V., Meheus A. eds. IARO, 1992 ¡ PP. 23—52

153. LACEY C.J.N. Assassmant of axposura to saxualí>’

transmittad diseases other than human papillomavirus. En

Epidemiology of cervical cancer. Muñoz Ni., Bosch F.Xi.., Shah

K.V., Meheus A. eds. IARC , 1992 ; PP. 93—105

154. PETERS R.K., THOMAS Di., HAGAN D.G., et al : Risk bactars

for invasiva cervical cancar among Latinas ariel non—Latinas

in Los Angeles County. 3 Natí Cancer Inst, 1986 ; 77: 1063—

1077

155. CUZICK Ji., SINGER Ai.,DE STAVOLA B.L., et al: Casa-control

study of risk fact ors bar cervical intraepithelial

neoplasia in young women. Eur 3 Cancer, 1990 ¡ 26: 684—690.



119

156. ALLERDING Ti.Ji., JORDAN Si.Wi.., BOARDI4AN ¡tE. Association of

human papillomavi rus anel Chlamydia infactions with

incidance cervical neoplasia. Acta Cytologica, 1985 ¡ 29:

653—660


	DETECCIÓN DE ADN DE PAPILOMAVIRUS HUMANOS (PVH) EN EPITELIOS DE TRACTO GENITAL FEMENINO
	AGRADECIMIENTOS
	ÍNDICE
	A. INTRODUCCIÓN GENERAL
	INTRODUCCIÓN
	HISTORIA
	SISTEMÁTICA Y CLASIFICACIÓN
	ESTRUCTURA
	ORGANIZACIÓN GENÉTICA
	MULTIPLICACIÓN VIRAL
	TRANSFORMACIÓN
	EPIDEMIOLOGÍA Y PATOGENIA
	DIAGNÓSTICO
	TRATAMIENTO Y PROFILAXIS

	B. APORTACIÓN PERSONAL
	MATERIAL Y MÉTODOS 
	RESULTADOS
	DISCUSIÓN
	CONCLUSIONES
	BIBLIOGRAFÍA