UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL El papel de los microorganismos en el desarrollo del mieloma múltiple MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Alba Rodríguez García Directores María Linares Gómez Joaquín Martínez López Madrid © Alba Rodríguez García, 2023 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL El papel de los microorganismos en el desarrollo del mieloma múltiple MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Alba Rodríguez García DIRECTORES María Linares Gómez Joaquín Martínez López Madrid, 2022 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL El papel de los microorganismos en el desarrollo del mieloma múltiple MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Alba Rodríguez García DIRECTORES María Linares Gómez Joaquín Martínez López Madrid, 2022 “Asumid riesgos. Dad grandes pasos, aunque sean pequeños. Seguid adelante con vuestra vida en todas y cada una de las direcciones que os lleve. Os estoy pidiendo que no tengáis miedo.” Rebecca Pearson, This is us A mi familia. A Arturo. Agradecimientos Sin duda una de las partes más bonitas de todos los libros y mi parte favorita de las tesis que he tenido la oportunidad de leer. Este trabajo es el resultado del esfuerzo y el cariño de muchas personas que lo han hecho posible y a las que quiero dar gracias. A mis directores de tesis, el Dr. Joaquín Martínez y la Dra. María Linares, por brindarme la oportunidad de formar parte de este magnífico grupo de investigación y por la confianza depositada en mí desde el primer día. Quienes conozcan a Joaquín sabrán que no solo es un referente en el campo de la medicina y la investigación, sino también una persona con un gran corazón, dispuesto a ayudar siempre. Sus ganas y su ambición por mejorar la salud de sus pacientes nos impulsan cada día a superarnos como científicos. Admiro sinceramente a María, como directora y también como amiga, porque ha sido y es un placer dejarse enseñar y guiar por ella, preocupándose siempre por el bienestar de los que le rodean incluso por encima del suyo propio. Nos haces el camino tan fácil que es una suerte trabajar contigo, María. Gracias también a la Dra. Sylvie Hermouet, por su gran dedicación colaborando en este trabajo y por todos sus consejos, que sin duda han contribuido a mi formación y aprendizaje. A la Dra. Rosa Ayala por su ayuda siempre que la he necesitado y por mostrarse siempre ilusionada con este trabajo. A Alfredo Pérez Rivilla, por estar siempre dispuesto a enseñarme nuevas e interesantes ideas sobre la microbiología y facilitar la obtención de gran parte de las muestras necesarias para este estudio. Me gustaría agradecer también la ayuda de todos mis compañeros del grupo, especialmente del equipo capitaneado por María: Alejandra, Roberto, Raquel, Andrés, Irene, María Hernández y Mari Luz. Creo firmemente que todos formamos una pieza clave dentro de este equipo y espero que sigamos apoyándonos todos, como lo habéis hecho conmigo hasta ahora. Gracias, Grefusit@s. A la mejor hermana de tesis que podría imaginar, Mari Luz, quiero decirle que le echamos mucho de menos y que ha sido todo un honor seguir sus pasos. Gracias, amiga, por estos maravillosos años aprendiendo juntas, estando incondicionalmente en los momentos buenos y más aún en los difíciles. Gracias también a mi compañera y amiga Isa, por su buena energía y enseñarme su forma de ver las cosas, que me ha recargado las pilas en muchos momentos. A mi otro gran equipo, mis compañeros del CNIO: Pedro, Michel, Álvaro, María, Marta, Lucía, Adri…Gracias por adoptarme en vuestra pequeña familia, por el ambiente tan guay que creáis dentro y fuera del laboratorio y por estar siempre disponibles a ayudarme. Estoy segura de que mis días trabajando con ratones hubiesen sido mucho más aburridos y posiblemente más dramáticos (aún). Gracias también al Hematobeer y a su CEO Richard, por incentivar a este grupo de “predoques” a animar los días malos con una buena cerveza. Gracias a Natalia, Laura C, Jessi, Elena, Eva, Almu…y a todo el equipo de investigación. A las compañeras de asistencial, en especial a Paqui, por revolucionarnos la pecera y a Vane, por su cariño y ánimo. Gracias a Noemí, mi compañera desde hace más de 10 años, por su amistad leal y sincera desde que estábamos en la universidad y que afortunadamente se ha convertido también en un apoyo dentro del laboratorio. A los pilares de mi vida, mi familia. Papá, mamá, sin vosotros nada sería posible. Gracias por vuestro esfuerzo, por tirar de mí en los días en los días en los que tiraría la toalla, por impulsarme a crecer. No puedo sentirme más afortunada de teneros. A mi hermana Sara, por su optimismo y su valor, que tanto tengo que aprender de ella. Ojalá cuidarnos siempre como hasta ahora, te quiero. A mis abuelos y tíos, especialmente a mi tía Maritere y a mis primas Nazareth y María. Gracias por creer en mí como lo hacéis y por sentiros siempre orgullosas de cada paso que doy. A mi amor incondicional, Arturo. Podría hacer otra tesis escribiendo lo mucho que tengo que agradecerte, por cuidarme siempre como lo haces, pero especialmente en este proceso. Gracias por aguantar todos y cada uno de mis agobios (algunos incluso varias veces), por empujarme siempre a ser mejor, a no conformarme, a ver las cosas desde tu punto de vista, siempre tan racional, tan calmado y que tanto admiro. “Menos mal que existes y no tengo que imaginarte”… Gracias por ser mi luz, por hacerme inmensamente feliz y querer compartir tu vida conmigo. Gracias también a mis amigas más íntimas, Laura, Cris, Mel, Sandra, Jessica y a mi amiga Claudia. A mis amigos de la universidad y a todos los que me he ido cruzando en este camino, porque habéis sido también indispensables para afrontarlo con humor y diversión. También quiero agradecer a las instituciones que han hecho posible este trabajo, la fundación Cris contra el Cáncer, la Sociedad Española de Hematología, el Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre y el CNIO. Finalmente, a todos los pacientes que batallan contra el cáncer y depositan su confianza en la investigación. Su lucha y sus ganas de vencer definen el sentido de nuestro trabajo y nos alientan a seguir en este camino. Gracias. ÍNDICE 1. RESUMEN/ABSTRACT .................................................................................... 1 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 11 2.1. Situación actual del mieloma múltiple .......................................................... 13 2.1.1. Definición ............................................................................................. 13 2.1.2. Epidemiología ....................................................................................... 13 2.1.3. Evolución de la enfermedad.................................................................. 14 2.1.4. Manifestaciones clínicas y diagnóstico ................................................. 18 2.1.5. Factores pronósticos y estratificación de riesgo ................................... 23 2.1.6. Tratamiento ........................................................................................... 24 2.1.6.1. Fármacos ........................................................................................ 26 2.1.6.2. Resistencia farmacológica ............................................................. 30 2.2. El papel de los microorganismos en los tumores hematológicos .................. 30 2.2.1. La estimulación antigénica como origen de los trastornos linfoproliferativos ................................................................................................ 30 2.2.2. Los mecanismos involucrados en la interacción de los microorganismos con la célula B ..................................................................................................... 33 2.2.3. La infección por VHC ........................................................................... 36 2.2.3.1. Biología, epidemiología y clínica .................................................. 36 2.2.3.2. Tratamientos .................................................................................. 37 2.2.4. La infección por VHB ........................................................................... 39 2.2.4.1. Biología, epidemiología y clínica .................................................. 39 2.2.4.2. Tratamientos .................................................................................. 41 2.2.5. La importancia de la microbiota ........................................................... 41 2.2.5.1. Metabolitos de la microbiota: ácidos grasos de cadena corta y urolitina A ...................................................................................................... 43 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................... 51 3.1. Hipótesis ........................................................................................................ 51 3.2. Objetivos ........................................................................................................ 53 4. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 55 4.1. Selección de pacientes y muestras ................................................................. 57 4.1.1. Estudio de pacientes con infecciones previas por hepatitis .................. 57 4.1.1. Estudio de la microbiota intestinal ........................................................ 60 4.2. Estudio de la evolución del MM e infección previa por VHC ...................... 62 4.2.1. Determinación de la carga viral ............................................................ 62 4.2.2. Determinación de los niveles de Ig Mc para monitorizar la enfermedad 62 4.2.3. Análisis multiparamétrico de citometría de flujo.................................. 63 4.2.4. Secuenciación de inmunoglobulinas mediante secuenciación de nueva generación ........................................................................................................... 63 4.2.5. Purificación de las Ig Mc y evaluación de su pureza ............................ 64 4.2.6. Análisis de la especificidad del reconocimiento antigénico de las Ig Mc purificadas ........................................................................................................... 66 4.3. Análisis de los microorganismos y los metabolitos de la microbiota............ 71 4.3.1. Extracción y cuantificación de ADN .................................................... 71 4.3.2. Secuenciación de ARN de la subunidad ribosomal 16s ....................... 71 4.3.3. Análisis bioinformático ......................................................................... 73 4.3.4. Cuantificación del género Gordonibacter ............................................ 74 4.3.5. Análisis de metabolitos producidos por la microbiota .......................... 75 4.3.5.1. Cuantificación de los niveles de AGCC ........................................ 75 4.3.5.2. Cuantificación de los niveles de urolitinas .................................... 76 4.3.6. Cultivo de líneas celulares .................................................................... 77 4.3.7. Experimentos de dosis-respuesta con compuestos de la microbiota .... 77 4.3.1. Estudio de apoptosis y ciclo celular mediante citometría de flujo ....... 79 4.3.2. Estudio del estrés oxidativo mediante inmunohistoquímica ................. 80 4.3.1. Análisis de expresión de p21 mediante PCR cuantitativa .................... 81 4.3.2. Análisis de expresión proteica mediante electrotransferencia .............. 82 4.3.3. Estudio in vivo ...................................................................................... 86 4.4. Análisis estadístico ........................................................................................ 87 5. RESULTADOS .................................................................................................. 89 5.1. El impacto de la hepatitis y tratamiento antiviral en la supervivencia en pacientes con MM ..................................................................................................... 91 5.2. La Ig Mc reconoció antígenos del VHC y determinó la eficacia del tratamiento antiviral ..................................................................................................................... 92 5.2.1. Los pacientes cuya Ig Mc reconoció específicamente el VHC y recibieron tratamiento antiviral no tuvieron progresión de la enfermedad .......................... 93 5.2.2. La evolución de la enfermedad fue peor para los pacientes no tratados frente al patógeno reconocido por su Ig Mc ........................................................ 98 5.3. Estudio de la microbiota intestinal en MM ................................................. 101 5.3.1. Análisis de la diversidad de la microbiota intestinal .......................... 101 5.3.1.1. La diversidad alfa disminuyó en pacientes en recaída y/o refractarios y aumentó al alcanzar la remisión completa ................................................ 101 5.3.1.2. La diversidad beta reveló diferencias en los pacientes en recaída y/o refractarios y en los pacientes que alcanzaron la remisión completa de la enfermedad .................................................................................................. 104 5.3.1.3. El estudio de diversidad reflejó cambios en la composición taxonómica a nivel de filo y de familia ....................................................... 105 5.3.2. Estudio de la microbiota relacionada con la producción de AGCC ... 108 5.3.2.1. La microbiota relacionada con la producción de AGCC disminuyó con la progresión y peor respuesta de la enfermedad .................................. 108 5.3.2.2. Estudio de las vías metabólicas de los AGCC en el MM ............ 112 5.3.2.3. Los niveles de AGCC producidos por la microbiota disminuyeron en la progresión de la enfermedad .................................................................... 114 5.3.3. Estudio de la microbiota productora de urolitina ................................ 116 5.3.3.1. La urolitina correlacionó positivamente con la producción de AGCC y con la diversidad alfa de los pacientes...................................................... 116 5.3.3.2. Los niveles de urolitina disminuyeron en los pacientes con MM en el momento de diagnóstico y tuvieron un impacto en la supervivencia ...... 117 5.3.3.3. La abundancia de microbiota productora de urolitina está disminuida en los pacientes con MM en el momento de diagnóstico y en recaída y/o refractariedad ............................................................................................... 119 5.3.4. Evaluación de la UA como diana terapéutica en el mieloma múltiple 123 5.3.4.1. El tratamiento con UA tuvo un efecto antiproliferativo en líneas celulares MM ............................................................................................... 123 5.3.4.2. La UA tuvo un impacto en el ciclo celular y la apoptosis ........... 123 5.3.4.3. La expresión de proteínas implicadas en la actividad mitocondrial disminuyó en las células tratadas con UA ................................................... 126 5.3.4.4. El tratamiento con UA atenuó el estrés oxidativo en líneas celulares de mieloma múltiple .................................................................................... 127 5.3.4.5. El tratamiento con UA mejoró significativamente la supervivencia en un modelo in vivo de MM ....................................................................... 129 5.3.4.6. La combinación de la UA con bortezomib tuvo un efecto sinérgico y es eficiente en la resistencia farmacológica. ................................................ 131 5.3.4.7. La combinación de UA con bortezomib moduló distintas vías de señalización implicadas en el desarrollo del MM ....................................... 133 6. DISCUSIÓN ..................................................................................................... 139 6.1. Las infecciones crónicas por VHC y VHB y el tratamiento antiviral impactan en el desarrollo del MM .......................................................................................... 141 6.2. La adecuada composición de la microbiota intestinal puede mejorar la evolución del MM ................................................................................................... 146 6.2.1. La diversidad microbiana disminuye durante la evolución de la enfermedad ........................................................................................................ 147 6.2.2. La microbiota productora de AGCC se asoció a estadios premalignos y de remisión de la enfermedad............................................................................ 148 6.2.3. La producción de UA mejora la evolución del MM ........................... 152 7. CONCLUSIONES ........................................................................................... 161 8. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 165 9. ABREVIATURAS ........................................................................................... 191 10. ANEXOS .......................................................................................................... 197 10.1. ANEXO 1. Información sobre las fechas de diagnóstico y tratamientos de la infección por VHC y del MM ............................................................................. 199 10.2. ANEXO 2. Purificación de inmunoglobulinas monoclonales y evaluación de su pureza ............................................................................................................ 201 10.3. ANEXO 3. Serotipo de VHC y carga viral de los pacientes antes y después del tratamiento antiviral .......................................................................................... 203 10.4. ANEXO 4. Artículos científicos ............................................................ 205 LISTADO DE TABLAS Tabla 1. Criterios de sospecha de la enfermedad. .......................................................... 18 Tabla 2. Criterios de diagnóstico. ................................................................................... 19 Tabla 3. Sistema Internacional de Estadiaje Revisado. .................................................. 24 Tabla 4. Fármacos aprobados actualmente para el tratamiento del mieloma múltiple... 25 Tabla 5. Alteraciones de la célula B inducidas por patógenos. ...................................... 34 Tabla 6. Fármacos de acción directa para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C. ...................................................................................................................... 38 Tabla 7. Antígenos y marcadores serológicos de la infección por el VHB. ................... 40 Tabla 8. Producción de ácidos grasos de cadena corta por la microbiota intestinal....... 44 Tabla 9. Características clínicas al diagnóstico de los pacientes con MM después de la infección por VHC o VHB, dependiendo de si han recibido o no tratamiento antiviral. 57 Tabla 10. Características clínicas al diagnóstico de los pacientes con gammapatías e infección previa por VHC. ............................................................................................. 59 Tabla 11. Características clínicas de los pacientes del estudio de la microbiota intestinal en el momento de la recogida de las muestras................................................................ 61 Tabla 12. Descripción del programa empleado en la secuenciación de inmunoglobulinas. ........................................................................................................................................ 64 Tabla 13. Listado de antígenos y proteínas empleados en los ensayos de reconocimiento antigénico. ...................................................................................................................... 69 Tabla 14. Descripción del programa empleado en la secuenciación de gen ARNr 16S. 73 Tabla 15. Descripción del programa de PCR cuantitativa para la cuantificación del género Gordonibacter. ............................................................................................................... 75 Tabla 16. Descripción de las líneas y el rango de dosis farmacológicas de los metabolitos de la microbiota empleados en los estudios de dosis-respuesta. .................................... 78 Tabla 17. Composición de los reactivos utilizados para preparar el tampón de lisis proteica. .......................................................................................................................... 83 Tabla 18. Listado de anticuerpos primarios y secundarios empleados para los análisis de electrotransferencia. ........................................................................................................ 85 Tabla 19. Clasificación de los pacientes, respuesta al tratamiento anti-VHC y evolución de GMSI o MM. ............................................................................................................. 98 Tabla 20. Información sobre las fechas de diagnóstico y de tratamientos frente al VHC y el MM recibidos por los pacientes. ............................................................................... 200 Tabla 21. Serotipo de VHC y carga viral de los pacientes antes y después del tratamiento antiviral. ........................................................................................................................ 203 LISTADO DE FIGURAS Figura 1. Incidencia global de mieloma múltiple en 2020. ............................................ 14 Figura 2. Proceso de diferenciación y maduración de la célula B. ................................. 15 Figura 3. El desarrollo del mieloma múltiple. ................................................................ 17 Figura 4. Perfil electroforético y proteinograma en las gammapatías monoclonales. .... 21 Figura 5. Imagen representativa de una médula ósea normal y una médula ósea de un paciente con mieloma múltiple. ...................................................................................... 22 Figura 6. Señalización del receptor de células B impulsada por antígeno en enfermedades linfoproliferativas. .......................................................................................................... 32 Figura 7. Mecanismo de alteración de la célula B por parte del virus de la hepatitis C. 36 Figura 8. Asociación entre la microbiota intestinal y la progresión del tumor en pacientes con mieloma múltiple. .................................................................................................... 46 Figura 9. La producción urolitina A desde sus precursores gracias a la actividad de la microbiota intestinal. ...................................................................................................... 48 Figura 10. Diagrama de flujo de selección de pacientes. ............................................... 58 Figura 11. Esquema del proceso de purificación de inmunoglobulina monoclonal a partir de muestras de suero. ...................................................................................................... 65 Figura 12. Protocolo de análisis de la reactividad frente al virus de la hepatitis C. ....... 67 Figura 13. Descripción del ensayo MIAA. ..................................................................... 70 Figura 14 .Esquema del proceso de análisis taxonómico mediante la secuenciación del gen de ARNr 16s en muestras de microbiota. ................................................................ 72 Figura 15. Supervivencia de los pacientes con MM e infección previa por VHB. ........ 91 Figura 16. Supervivencia de los pacientes con MM e infección previa por VHC. ........ 92 Figura 17. Remisión completa estable y reconocimiento específico del VHC en el paciente P1 con MM tratado con antivirales. ................................................................. 94 Figura 18. Evolución de la enfermedad y evaluación de la especificidad de la Ig Mc de los pacientes tratados con antivirales. ............................................................................ 95 Figura 19. Ensayo MIAA para analizar la reactividad frente a microorganismos infecciosos. ..................................................................................................................... 97 Figura 20. Evolución de los pacientes y evaluación del reconocimiento del VHC por la Ig Mc en pacientes no tratados con antivirales. .................................................................. 99 Figura 21. Evolución de los pacientes y evaluación del reconocimiento del VHC por la Ig Mc en el paciente P9. .................................................................................................... 100 Figura 22. Diversidad alfa del análisis de la microbiota intestinal como biomarcador de progresión de la enfermedad......................................................................................... 102 Figura 23. Diversidad alfa del análisis de la microbiota intestinal en muestras pareadas de pacientes en el momento de diagnóstico y al alcanzar la remisión completa............... 103 Figura 24. Comparación de la diversidad alfa en la recaída de la enfermedad. ........... 103 Figura 25. Diversidad beta del análisis de la microbiota intestinal como biomarcador de progresión de la enfermedad......................................................................................... 105 Figura 26. Composición taxonómica a nivel de filo. .................................................... 106 Figura 27. Composición taxonómica de la microbiota intestinal a nivel de familia. ... 107 Figura 28. Caracterización taxonómica de la microbiota intestinal en la progresión y respuesta de la enfermedad. .......................................................................................... 108 Figura 29. Caracterización taxonómica de la microbiota intestinal en la progresión de la enfermedad. .................................................................................................................. 110 Figura 30. Caracterización taxonómica de la microbiota intestinal en la respuesta al tratamiento. ................................................................................................................... 111 Figura 31. Análisis del género Agathobacter en la respuesta de la enfermedad. ......... 112 Figura 32. Vías metabólicas del análisis metagenómico. ............................................. 113 Figura 33. Niveles de los ácidos grasos de cadena corta en la progresión y respuesta del MM. .............................................................................................................................. 115 Figura 34. Correlación de los niveles de urolitina con los de ácidos grasos de cadena corta y con la diversidad alfa. ................................................................................................ 116 Figura 35. Niveles de urolitina en la progresión de la enfermedad. ............................. 118 Figura 36. Caracterización taxonómica de la microbiota relacionada con la producción de urolitina en la progresión de la enfermedad. ................................................................ 120 Figura 37. Análisis del género productor de urolitina Gordonibacter. ........................ 121 Figura 38. Análisis del género Terrrisporobacter. ....................................................... 122 Figura 39. Estudio del efecto de los ácidos grasos de cadena corta y la urolitina en la supervivencia de líneas celulares de mieloma múltiple................................................ 123 Figura 40. Estudio del efecto de la urolitina A sobre el ciclo y la apoptosis en la línea celular de MM JJN3-GFP mediante citometría de flujo............................................... 125 Figura 41. Estudio de la actividad mitocondrial tras la exposición a urolitina A en la línea celular JJN3-GFP. ......................................................................................................... 126 Figura 42. Estudio del estrés oxidativo tras la exposición a urolitina A en la línea celular JJN3-GFP. .................................................................................................................... 128 Figura 43. Estudio in vivo del tratamiento con urolitina en ratones injertados con la línea JJN3-GFP. .................................................................................................................... 130 Figura 44. Estudio de la combinación de urolitina A con bortezomib en líneas celulares de MM. ......................................................................................................................... 131 Figura 45. Estudio del tratamiento con urolitina y bortezomib en la línea celular JJN3- GFP resistente. .............................................................................................................. 132 Figura 46. Análisis de los niveles de expresión de p53 tras el tratamiento con urolitina A, bortezomib y su combinación en la línea celular JJN3-GFP. ....................................... 133 Figura 47. Análisis de los niveles de expresión de p21 tras el tratamiento con urolitina A, bortezomib y su combinación en la línea celular JJN3-GFP. ....................................... 135 Figura 48. Análisis de los niveles de expresión de mTOR y fu forma fosforilada (p- mTOR). ......................................................................................................................... 136 Figura 49. Purificación de las Ig Mc y evaluación de su pureza mediante isoelectroenfoque e inmunotransferencia. .................................................................... 201 1 1. RESUMEN/ABSTRACT RESUMEN/ABSTRACT 3 El papel de los microorganismos en el desarrollo del mieloma múltiple Introducción El mieloma múltiple (MM) es un cáncer hematológico en el que se produce una expansión descontrolada de células plasmáticas clonales en la médula ósea, que producen grandes cantidades de una sola inmunoglobulina monoclonal (Ig Mc). El MM representa el 1,8% de los cánceres y el tercer tumor hematológico más frecuente, especialmente diagnosticado en población adulta con rango de edad comprendido entre aproximadamente 65 y 74 años. A pesar de los grandes avances que han tenido lugar en la última década sobre la biología y tratamiento de esta enfermedad, el MM continúa siendo incurable. Aunque todavía se desconoce el origen de esta neoplasia hematológica, algunos estudios sugieren que podría ser clave la estimulación crónica antigénica por parte de microorganismos, como el virus de la hepatitis B (VHB) y el de la hepatitis C (VHC). En su interacción con la célula plasmática como parte del proceso de reconocimiento antigénico, la estimulación sostenida por parte de estas infecciones podría ser uno de los factores que desencadenen la patología. En este contexto, los microorganismos de la microbiota intestinal también juegan un papel importante en el desarrollo de enfermedades, incluyendo cánceres como el MM. Estudios previos se han centrado en entender la función moduladora de la microbiota en el MM, tratando de dilucidar cómo afecta la composición e interacción de estos microorganismos en el desarrollo de esta patología. Asimismo, se ha reportado que algunos metabolitos de la microbiota, como los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) o la urolitina A (UA), tienen un efecto beneficioso en otras enfermedades. Profundizar en el conocimiento de la relación entre los microorganismos infecciosos o de la microbiota intestinal podría resultar muy útil para entender el papel que juegan en el origen y evolución del MM, así como aportar nuevas estrategias terapéuticas para el manejo de esta enfermedad. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 4 Objetivos El objetivo principal de esta tesis es analizar la implicación de los microorganismos en el desarrollo del MM y su posible impacto terapéutico: i) estudiando el papel del virus de la hepatitis en el origen del MM y sus estadios premalignos analizando el reconocimiento antigénico y la eficacia del tratamiento antiviral en pacientes con infección previa; ii) caracterizando la composición de los microorganismos de la microbiota intestinal en los pacientes con MM, así como su relación a través de los metabolitos que generan. Materiales y métodos Para el estudio de la evolución del MM en pacientes con infecciones previas por los virus de la hepatitis C (VHC) y B (VHB), se analizó la progresión de la enfermedad y se evaluó la eficacia del tratamiento antiviral en la supervivencia de dos grandes cohortes de pacientes con datos obtenidos de la red federada global TriNetX. A continuación, se estableció otra cohorte de pacientes con MM y estadios premalignos e infección previa por VHC, y se analizó el reconocimiento específico por parte de las Ig Mc mediante ensayos de detección de antígenos como el ensayo INNO-LIA™ HCV Score, ensayos dot- blot, y el ensayo MIAA (Multiplex infectious-antigen arraay). Además, se evaluó la evolución de la enfermedad teniendo en cuenta el tratamiento antiviral y la especificidad de la Ig Mc. Para el estudio de la microbiota intestinal en pacientes con MM y estadios premalignos como la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) y el mieloma quiescente (MMq), se llevó a cabo la caracterización taxonómica de las poblaciones microbianas mediante la secuenciación del ARN ribosómico 16S y PCR cuantitativa. Asimismo, se han cuantificado los niveles de los metabolitos AGCC y urolitina en muestras de pacientes mediante espectrometría de masas y se ha evaluado su potencial terapéutico mediante ensayos in vitro e in vivo. Resultados Por un lado, la eficacia del tratamiento antiviral se confirmó en las dos grandes cohortes de pacientes con MM e infección previa por VHC o VHB, encontrando que el tratamiento mejoró significativamente la supervivencia de los pacientes que lo recibieron, especialmente en el caso del VHC con una probabilidad del 80,46%. Cuando analizamos RESUMEN/ABSTRACT 5 el reconocimiento antigénico en pacientes con infección previa por VHC y MM o estadios premalignos, encontramos que aquellos cuya Ig Mc era específica para el VHC y recibían tratamiento antiviral tenían una mejor evolución de la enfermedad. Incluso, un paciente con MM en tercera recaída consiguió la remisión completa de la enfermedad después del tratamiento antiviral y en ausencia de otros tratamientos hematológicos. Confirmando este hallazgo, en los pacientes cuya Ig Mc no reconoció el VHC, el antiviral no frenó el desarrollo de la enfermedad. Por otro lado, la caracterización taxonómica de la microbiota intestinal en pacientes con MM y estadios premalignos, reveló las diferencias en la diversidad y composición a lo largo de la evolución de la enfermedad, encontrándose menor diversidad en los pacientes con MM en recaída y/o refractario. De forma importante, se observó que la abundancia de microorganismos relacionados con la producción de AGCC, así como los niveles de estos metabolitos disminuyen en la progresión de la enfermedad. Asimismo, la microbiota productora de urolitina se asoció con una mejor evolución y supervivencia del MM. Además, la evaluación de la UA como diana terapéutica reveló su efecto antiproliferativo sobre líneas celulares en monoterapia y en combinación con el tratamiento de primera línea y su impacto positivo en la supervivencia en modelo murino de la enfermedad. Conclusiones Los resultados presentados en este trabajo avalan la importancia de los microorganismos en el origen y desarrollo del MM. En este estudio, se evidencia la relación causal del papel de la infección por VHC en la patogénesis de la enfermedad, demostrando que cuando el objetivo de la Ig Mc es el virus, el tratamiento antiviral favorece la evolución de la enfermedad. Este hallazgo abre un nuevo enfoque terapéutico para los pacientes con MM y estadios previos como la GMSI o el MMq. Por otro lado, se han caracterizado las diferencias en la microbiota intestinal de los pacientes con MM, revelando el papel beneficioso de los microorganismos productores de AGCC y UA. El análisis de estos microorganismos y sus metabolitos pueden servir como biomarcadores pronósticos. Finalmente, estos resultados señalan el impacto importante de la UA en el control de la progresión del MM y su resistencia a la terapia, postulándose como una posible nueva opción terapéutica en esta enfermedad. RESUMEN/ABSTRACT 7 The role of microorganisms in the development of multiple myeloma Introduction Multiple myeloma (MM) is a hematological malignancy in which there is an uncontrolled expansion of clonal plasma cells in the bone marrow, producing large amounts of a single monoclonal immunoglobulin (Mc Ig). MM represents 1.8% of cancers and the third most frequent hematological tumor, especially diagnosed in the adult population with an age range between approximately 65 and 74 years. Despite the great advances occurred in the last decade in the understanding of MM, it remains an incurable disease. Despite the origin of this hematological neoplasm is still unknown, some studies suggest that chronic antigenic stimulation by microorganisms, such as the hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV), could be key factors on this process. In the interaction with the plasma cell as part of the antigenic recognition process, the chronic antigen could be one of the drivers that trigger the pathology. In this context, the microorganisms of the gut microbiota also play an important role in the development of diseases, including cancers such as MM. Previous studies have focused on understanding the modulatory function of the microbiota in MM, trying to elucidate how the composition and interaction of these microorganisms affect the development of this pathology. Likewise, some microbiota metabolites, such as short-chain fatty acids (SCFAs) or urolithin A (AU), have been reported to have a beneficial effect on other diseases. Deepen the knowledge of the relationship between infectious microorganisms or the gut microbiota could be very useful to understand the role they play in the origin and evolution of MM, as well as providing new therapeutic strategies for the management of this disease. Objectives The main purpose of this thesis is to analyze the involvement of microorganisms in the development of MM and its possible therapeutic impact: i) studying the role of the hepatitis virus in the origin of MM and its pre-malignant stages, analyzing the antigenic recognition and the efficacy of antiviral treatment in patients with previous infection; ii) EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 8 characterizing the composition of the microorganisms of the gut microbiota in patients with MM, as well as their relationship through its metabolites. Materials and methods To study the evolution of MM in patients with previous infections by the hepatitis C (HCV) and B (HBV) viruses, the progression of the disease was analyzed, and the efficacy of antiviral treatment was evaluated in the survival of two large patient cohorts with data obtained from the TriNetX global federated network. Next, another cohort of patients with MM and premalignant stages and previous HCV infection was established, and specific recognition by the Mc Ig was analyzed using antigen detection tests such as the INNO-LIA™ HCV Score assay, dot-blot assays, and the MIAA (Multiplex infectious- antigen array) assay. In addition, the evolution of the disease was evaluated according to the antiviral treatment and the specificity of the Ig Mc. For the study of the gut microbiota in patients with MM and premalignant stages such as monoclonal gammopathy of uncertain significance (MGUS) and smoldering myeloma (SMM), the taxonomic characterization of the microbial populations was carried out by sequencing the 16S ribosomal RNA and quantitative PCR. Likewise, the levels of SCFAs and urolithins have been quantified in patient samples by means of mass spectrometry and their therapeutic potential has been evaluated by means of in vitro and in vivo models. Results On the one hand, the efficacy of antiviral treatment was confirmed in the two large cohorts of patients with MM and previous HCV or HBV infection, finding that the treatment significantly improved the survival of patients who received it, especially in the case of HCV with a probability of 80.46%. When we analyzed antigenic recognition in patients with previous HCV infection and MM or pre-malignant stages, we found that those whose Mc Ig was specific for HCV and received antiviral treatment had a better course of the disease. One patient with MM in third relapse even achieved complete remission of the disease after antiviral treatment and in the absence of other haematological treatments. Confirming this finding, in patients whose Mc Ig did not recognize HCV, the antiviral did not stop the development of the disease. RESUMEN/ABSTRACT 9 On the other hand, the taxonomic characterization of the gut microbiota in patients with MM and premalignant stages revealed differences in diversity and composition throughout the course of the disease, with less diversity found in patients with MM in relapse and/or refractory. Importantly, it was observed that the abundance of microorganisms related to the production of SCFAs, as well as the levels of these metabolites, decrease with the progression of the disease. Likewise, the urolithin-producing microbiota was associated with better evolution and survival of MM. In addition, the evaluation of UA as a therapeutic target revealed its antiproliferative effect on cell lines in monotherapy and in combination with first-line treatment and its positive impact on survival in a murine model of the disease. Conclusions In summary, the results presented in this work support the importance of microorganisms in the origin and development of MM. In this study, the causal relationship of the role of HCV infection in the pathogenesis of the disease is evidenced, demonstrating that when the target of Mc Ig is the virus, antiviral treatment favors the evolution of the disease. This finding opens a new therapeutic approach for patients with MM and previous stages such as MGUS or SMM. On the other hand, the differences in the gut microbiota of patients with MM have been characterized, revealing the beneficial role of SCFAs and UA-producing microorganisms. Analysis of these microorganisms and their metabolites may serve as prognostic biomarkers. Finally, these results point to the important impact of UA in controlling the progression of MM and its resistance to therapy, postulating it as a possible new therapeutic option in this disease. 11 2. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 13 2.1. SITUACIÓN ACTUAL DEL MIELOMA MÚLTIPLE 2.1.1. Definición El mieloma múltiple (MM) es un trastorno neoplásico que se caracteriza por la proliferación clonal de células plasmáticas (CP) malignas en la médula ósea que producen una secreción y acumulación de proteína inmunoglobulina (Ig) monoclonal (Ig Mc), también llamada proteína M o proteína monoclonal (PM), en sangre u orina, asociada a una disfunción orgánica (1). El MM forma parte del conjunto de trastornos denominados gammapatías monoclonales. Dentro de estos trastornos, el más común es la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), que es asintomático y normalmente precede al desarrollo del MM, con o sin un estadio intermedio denominado MM asintomático smoldering (en inglés) quiescente o (MMq). Las CP malignas normalmente residen en la médula ósea, pero también pueden encontrarse en sangre periférica o en otras zonas extramedulares, especialmente con el transcurso de la enfermedad (2). 2.1.2. Epidemiología El MM representa aproximadamente el 1,8% de todos los cánceres y el 10% de los tumores hematológicos en Estados Unidos en 2021, siendo una de las neoplasias hematológicas más comunes después del linfoma y la leucemia (3). A nivel global, la incidencia varía, pero es mayor en los países desarrollados, como Estados Unidos, Europa Occidental y Australia (Figura 1). La mayor incidencia en estos países probablemente se debe a la disponibilidad de mejores técnicas de diagnóstico y un mejor conocimiento clínico de la enfermedad (2). La incidencia de la enfermedad en 2021 fue ligeramente superior en hombres con un 8,8 de nuevos casos frente a 5,9 en mujeres por cada 100.000 personas (3). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 14 Figura 1. Incidencia global de mieloma múltiple en 2020. Incidencia de mieloma múltiple estimada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) estandarizada por edad, en ambos sexos y en todo el mundo. El ratio estandarizado por edad (REE) por cada 100.000 individuos es más elevado en los países desarrollados, como Estados Unidos, Europa Occidental y Australia. Imagen adaptada de la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer de la OMS (4). La supervivencia a 5 años relativa es del 57,8%, basado en los datos de supervivencia y epidemiología del Instituto Nacional de Salud (5). El MM se diagnostica frecuentemente en personas de entre 65 y 74 años, con una mediana de edad al diagnóstico de 69 años. Cada año hay unos 100.000 fallecimientos a causa de esta enfermedad en todo el mundo con una tasa de mortalidad de 3,2 por cada 100.000 personas (3). 2.1.3. Evolución de la enfermedad Para entender el desarrollo del MM, es necesario conocer la biología de las células plasmáticas y su evolución. Las células plasmáticas se originan a partir de células madre hematopoyéticas, que se diferencian en la médula ósea y en los órganos linfoides secundarios primero a células B, y después a células plasmáticas. En este proceso, la célula hematopoyética se diferencia en progenitores multipotentes, normalmente linfoides y eventualmente madura a las células B tras pasar por los estadios de pre-proB, pro-B, pre-B, B inmadura y B transicional (6) (Figura 2). INTRODUCCIÓN 15 Figura 2. Proceso de diferenciación y maduración de la célula B. En la médula ósea, las células madre hematopoyéticas sufren un proceso de maduración pasando por diferentes estadios hasta convertirse en células B maduras. Tras la estimulación antigénica, la célula B dará lugar a células plasmáticas de vida corta, de vida larga o células B de memoria. Durante la respuesta inmune, las células B se activan directamente tras la detección específica de un antígeno por su receptor de células B (BCR, B-cell receptor en inglés) o detectando patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs, Pathogen-Associated Molecular Pattern en inglés) a través de los receptores de reconocimiento de patrones (PRRs, Pathogen Recognition Receptor en inglés) (7). En la médula ósea, las células B inmaduras experimentan un reordenamiento V(D)J, un proceso que genera su diverso repertorio de inmunoglobulinas primarias (2). Después, las células B maduras salen de la médula ósea y llegan al tejido linfático donde se convierten en células plasmáticas de vida corta, que generan anticuerpos de baja afinidad IgM o IgD o migran a los centros germinales. En los centros germinales, tiene lugar la hipermutación somática y la interacción con las células T y se produce una maduración a células B de memoria o a EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 16 plasmoblasto. Tras el fenómeno de recombinación de cambio de clase, el plasmoblasto se convertirá en célula plasmática de vida larga con alta afinidad de unión y capacidad de generar el resto de las inmunoglobulinas (8,9). La función primaria de estas células plasmáticas de vida larga es por tanto la secreción de anticuerpos que median la inmunidad humoral frente a las infecciones. Al contrario que en las células plasmáticas normales, las células de mieloma secretan de forma patogénica grandes cantidades de Ig Mc, desencadenando la enfermedad (10). El desarrollo del MM es un proceso clínica y biológicamente muy heterogéneo con numerosas alteraciones genéticas. Algunas de ellas, como las traslocaciones que involucran oncogenes específicos, pueden proporcionar una ventaja proliferativa a las células, conduciendo a estadios patológicos como la GMSI o el MMq, y ocasionalmente el MM (2). La transformación maligna de las células sanas en células malignas es un proceso de múltiples pasos y factores (2,10,11) (Figura 3). Como se ha mencionado, el MM suele venir precedido de estadios precursores como la GMSI o el MMq. Aunque el riego medio anual de progresión de la GMSI al MM es de entre un 0,5% y 1% según el estudio de Sigurdartottir y colaboradores, el diagnóstico temprano de la GMSI tiene un efecto positivo en la supervivencia global de los pacientes con MM, probablemente debido al seguimiento clínico de la enfermedad (12). El MMq es el estadio intermedio que suele detectarse en el análisis rutinario de los pacientes con GMSI y podría progresar posteriormente a MM. El riesgo anual de progresión a MM desde el MMq es del 10% los primeros 5 años, 5% durante los siguientes 5 años y 1% después de 10 años (13). En los estadios finales de la enfermedad, las células de MM adquieren la capacidad para migrar de la médula ósea a la sangre y pasa a denominarse leucemia de células plasmáticas o MM extramedular (10). Algunas de las alteraciones genéticas que tienen lugar durante el desarrollo del mieloma son defectos cromosómicos, como los que involucran a los genes codificantes de la cadena pesada de la Ig o genes recurrentes como NSD2, FGFR3 y CCDN1 (9). Los mecanismos por los que se producen estos defectos cromosómicos son debidos en gran parte a alteraciones durante los procesos de recombinación y de reordenamientos V(D)J aberrantes (2). INTRODUCCIÓN 17 Además, se producen otras mutaciones secundarias, como las que involucran a la vía del NF-κB (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas, en inglés) y alteraciones genéticas y epigenéticas que afectan a genes como MYC e IRF4 (2). Figura 3. El desarrollo del mieloma múltiple. El desarrollo del MM es un proceso de varias etapas, que empieza con estadios precursores de la enfermedad, como la GMSI y el MMq. Además, el MM puede progresar fuera de la médula ósea y producir una leucemia de células plasmáticas. En el avance de esta enfermedad tienen lugar inicialmente eventos genéticos como traslocaciones e hiperdiploidías y posteriormente van acumulándose mutaciones adquiridas y otros eventos genéticos secundarios. MM, mieloma múltiple; GMSI, gammapatía monoclonal de significado incierto; MMq, mieloma quiescente. Imagen adaptada de Kumar y colaboradores (2). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 18 2.1.4. Manifestaciones clínicas y diagnóstico Las manifestaciones clínicas de la enfermedad producidas por la acumulación de Ig Mc y de células plasmáticas malignas conducen a la sintomatología denominada CRAB (Calcium, Renal, Anemia, Bone, en inglés), por sus características de hipercalcemia, fallo renal, anemia y lesiones óseas, aunque también deben tenerse en cuenta otras manifestaciones clínicas menos específicas (Tabla 1). Clínica CRAB 1. Dolor óseo (hasta el 75% de los pacientes) • Lesiones osteolíticas en radiología simple o en TAC • Osteoporosis • Fracturas patológicas 2. Anemia (65% de los pacientes) Debilidad, astenia, palpitaciones… 3. Insuficiencia renal (25-30% de los pacientes) Sed, poliuria, edemas… 4. Hipercalcemia (25% de los pacientes) Poliuria, polidipsia, náuseas, vómitos, astenia, estreñimiento… Otras manifestaciones 5. Alteraciones neurológicas Compresión medular o de raíces nerviosas 6. Síndrome general Fiebre, astenia, anorexia, y pérdida de peso 7. Infecciones de repetición • Pulmonares o urinarias • Bacterianas: neumococo, Haemophilus u otros bacilos Gram-negativos 8. Hiperviscosidad Astenia, cefalea, vértigo, somnolencia, diploidía, insuficiencia cardiaca, sangrado 9. Hemorragias Trastornos con plaquetas y factores de coagulación 10. Alteraciones analíticas Hallazgo casual en ocasiones sin clínica CRAB asociada: • VSG elevada • Hiperuricemia • Hiperproteinemia y/o hipogammablobulinemia y/o hipoalbuminemia • Identificación de PM en suero y/o en orina Tabla 1. Criterios de sospecha de la enfermedad. Las características de la sintomatología conocida como CRAB (hipercalcemia, fallo renal, anemia y lesiones óseas) así como otras manifestaciones (alteraciones neurológicas, infecciones…) son indicios de mieloma múltiple. TAC, tomografía axial computarizada; PM, proteína monoclonal; VSG, velocidad de sedimentación globular; CRAB, hipercalcemia, insuficiencia renal, anemia y lesiones óseas. Tabla adaptada de la Guía de Mieloma del Grupo de Gammapatías Monoclonales de Castilla y León (14). INTRODUCCIÓN 19 En el caso de los pacientes con GMSI o MMq, generalmente asintomáticos, la detección de los signos clínicos suele producirse de manera accidental como parte del seguimiento diagnóstico de otras patologías (15). Sin embargo, los pacientes con MM típicamente presentan ya los síntomas relacionados con el daño orgánico en el momento del diagnóstico. Actualmente, el criterio diagnóstico más aceptado es la guía del Grupo Internacional de Mieloma (IMWG, International Myeloma Working Group en inglés) (15). Según este criterio, el diagnóstico de la GMSI, el MMq y el MM requiere la detección de niveles de PM en suero, la infiltración de células plasmáticas en la médula ósea y la evaluación de los biomarcadores y la sintomatología CRAB. Al conjunto de biomarcadores y sintomatología CRAB se le denomina “eventos definidores del mieloma” (EDM) y permiten, por tanto, distinguir el mieloma de los estadios anteriores como la GMSI o el MMq (Tabla 2). Manifestaciones CRAB • Hipercalcemia: niveles de calcio en suero >1mg/dl por encima del límite superior de los valores normales (11 mg/dl) • Insuficiencia renal: la presencia de aclaramiento de creatinina de < 40 ml/min o niveles de creatinina en suero de > 2 mg/dl • Anemia: niveles de hemoglobina > 2g/dl por debajo del límite inferior de los valores normales (< 10g/dl) • Lesiones líticas: presencia de una o más lesiones líticas EDMs* • Manifestaciones CRAB • Células plasmáticas clonales en MO ≥60% • Ratio de cadenas ligeras en suero ≥100 • Dos o más lesiones focales GMSI MMq MM Niveles de PM en suero < 3g/dl y ≥ 3g/dl y/o - Infiltración de CP en MO <10% 10-60% ≥ 10% o plasmocitoma Sintomatología Ausencia de CRAB Ausencia de EDM o amiloidosis Presencia de EDM Tabla 2. Criterios de diagnóstico. El diagnóstico de gammapatía monoclonal de significado indeterminado (GMSI), mieloma múltiple quiescente (MMq) y mieloma múltiple (MM) requiere la detección de niveles séricos de proteína monoclonal, evaluación de la infiltración de células plasmáticas (CP) médula ósea (MO) y la identificación de eventos definidores de mieloma (EDM), en los que se incluyen la evaluación de biomarcadores y la presencia o ausencia de la clínica CRAB. CRAB, hipercalcemia, EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 20 insuficiencia renal, anemia, lesiones líticas; MO, médula ósea; PM, proteína monoclonal; EDM, eventos definidores de mieloma. *En ausencia de daño orgánico, la presencia de uno o más biomarcadores es suficiente para el diagnóstico. Tabla adaptada de Kumar y colaboradores (2). El estudio inicial de un paciente con sospecha de MM comienza con la investigación de la historia médica y antecedentes familiares y la exploración física (2). Después se llevan a cabo pruebas de laboratorio como hemograma, frotis de sangre periférica, perfil bioquímico (incluyendo valores de creatinina, urea, calcio y fósforo, proteínas totales, albúmina, β2-microglobulina sérica y lactato deshidrogenasa). Además, es importante realizar un estudio de proteínas en suero para caracterizar y cuantificar la Ig Mc mediante electroforesis e inmunofijación. También puede requerirse el estudio de proteínas a 24 horas o electroforesis y cuantificación de las cadenas ligeras Bence-Jones (BJ) en orina (2,14). Por otro lado, se realizan pruebas de imagen como la tomografía computarizada (TC) o tomografía axial computarizada (TAC) de cuerpo entero con dosis bajas de radiación, la tomografía por emisión de positrones (PET, positron emission tomography) / TC o la resonancia magnética nuclear (RMN) de cuerpo entero o de columna y pelvis. Actualmente la radiología convencional está en desuso. Además, debe realizarse un estudio de médula ósea a través de muestra de aspirado y/o biopsia en la que se realiza un inmunofenotipo (IF) mediante citometría de flujo (CMF) e hibridación in situ fluorescente (FISH) en CP purificadas. Las células plasmáticas, tanto normales como neoplásicas se caracterizan fundamentalmente por la alta expresión conjunta de CD38 y CD138 (16), por lo que estos marcadores son clave para el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad. Además, se debe realizar el estudio de del (17/17p), t (4;14), t (11;14), t (14;16), +1q, 1p. Otras pruebas complementarias son el electrocardiograma, la radiografía de tórax, serologías y ecocardiograma (2). La detección de PM debe hacerse tanto en suero como en orina mediante la electroforesis e inmunofijación de proteínas. La electroforesis, normalmente en gel de agarosa, aunque también puede realizarse electroforesis capilar, permite separar las proteínas en base a sus propiedades físicas en 5 regiones principales: albúmina, α1, α2, β y γ. Generalmente, las inmunoglobulinas migran en la región gamma, de ahí que también se denominen gammaglobulinas. Debido a la secreción descontrolada de Ig Mc, en las gammapatías monoclonales se observa un aumento de proteína en esa región (Figura 4). INTRODUCCIÓN 21 Figura 4. Perfil electroforético y proteinograma en las gammapatías monoclonales. La electroforesis en muestra de suero es la técnica utilizada para la separación de las proteínas y la identificación de la proteína monoclonal. El proteinograma permite cuantificar la cantidad de proteína en cada una de las cinco regiones principales: albúmina, α1, α2, β y γ. Generalmente, en las gammapatías monoclonales se detecta un aumento o pico de proteínas en la región γ. Si en la electroforesis se observa una banda monoclonal en esa región, deberían realizarse los siguientes pasos: medición cuantitativa de la banda monoclonal y proteinograma, inmunofijación y ensayo de detección de cadenas ligeras en suero. La inmunofijación se realiza para confirmar la presencia de la PM y para distinguir el isotipo de la Ig Mc. La PM puede ser la inmunoglobulina intacta, solo de cadenas ligeras (en el caso de mieloma de cadenas ligeras o BJ) o raramente de cadenas pesadas. La PM más común en los pacientes con gammapatías es la IgG, seguida de la IgA y raramente la IgM o la IgD (17). En el 80-90% de los pacientes la PM se identifica mediante la electroforesis en suero, pero en la minoría restante los pacientes con MM BJ o MM no secretor u oligosecretor, precisan la detección de las cadenas libres mediante la electroforesis en orina. En estos pacientes, la banda monoclonal no aparece en el suero, por lo que el proteinograma suele ser normal y resulta fundamental el estudio de proteínas en orina (18). Para el estudio de la médula ósea, que se realiza tanto en el aspirado como en la biopsia de médula ósea se incluye el estudio de la morfología de las células plasmáticas, y la EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 22 cuantificación de las células plasmáticas CD138 positivas mediante inmunohistoquímica (IHC, de immunohistochemistry en inglés), CMF, FISH y citogenética convencional (19). Para la cuantificación del número de células plasmáticas, el aspirado de médula puede ser suficiente, pero se recomienda la realización de la biopsia si la infiltración en el aspirado es escasa y plantea dudas diagnósticas (14). Si se realizan ambos métodos, se tiene en cuenta el porcentaje más alto de células plasmáticas para el diagnóstico (2). Como puede verse (Figura 5), en el diagnóstico de la enfermedad se detecta un alto porcentaje de células plasmáticas infiltradas en la médula ósea. Figura 5. Imagen representativa de una médula ósea normal y una médula ósea de un paciente con mieloma múltiple. Como puede observarse, en el mieloma múltiple hay una gran cantidad de infiltración de células plasmáticas en la médula ósea. Figura adaptada (20). La clonalidad de las células plasmáticas puede evaluarse mediante la IHC de la biopsia de médula, la tinción de inmunoperoxidasa o inmunofluorescencia (15). Además, puede demostrarse la clonalidad mediante CMF o el estudio de los reordenamientos de las inmunoglobulinas. En cuanto a la evaluación de las lesiones líticas, se puede realizar mediante los métodos de imagen anteriormente mencionados según el criterio del IMWG y la disponibilidad de los recursos. Idealmente el objetivo es usar cada vez más las técnicas más sensibles como el TAC, el PET-TAC o la RMN para detectar las lesiones lo más pronto posible (15), especialmente en la evaluación de los pacientes con MMq susceptibles de progresar a mieloma sintomático (21). De hecho, la detección de lesión por medio de estas técnicas de un tamaño mayor de 5 mm ya es suficiente para diagnosticar MM. El TAC de cuerpo INTRODUCCIÓN 23 entero con dosis bajas de radiación debe considerarse la técnica de elección. Es útil si existe dolor óseo en zonas de difícil valoración (costillas, esternón y escápulas) y para explorar regiones sintomáticas en las que la radiología convencional no muestra hallazgos (14). En combinación con el PET, que evalúa la actividad metabólica de las lesiones, el PET-TAC es desde 2016 la técnica necesaria para la evaluación de la respuesta completa (22). La técnica PET-TAC es muy útil en la detección de la enfermedad extramedular y en los plasmocitomas solitarios, así como en la confirmación de la respuesta en pacientes con BJ o MM no secretor u oligosecretor (14,23). Otra técnica de imagen alternativa es la RMN, especialmente útil para evaluar la afectación de partes blandas y las lesiones focales. La guía actual recomienda el TAC para diferenciar el MMq del MM sintomático y si es negativo, debería hacerse RMN para buscar más de una lesión focal en la médula ósea (19). 2.1.5. Factores pronósticos y estratificación de riesgo Desde el año 2000, ha mejorado considerablemente la supervivencia de los pacientes con MM (24), debido especialmente a los nuevos tratamientos y la identificación de marcadores de riesgo de la enfermedad. A pesar de la variabilidad y heterogeneidad de la enfermedad, existen varios factores para evaluar la progresión de la enfermedad, los cuales se combinan en un algoritmo y se recogen en el Sistema Internacional de Estadiaje (ISS, International Staging System en inglés) Revisado (ISS-R) (Tabla 3). Una de las formas para identificar los factores genéticos y estratificar el riesgo de los pacientes con mieloma, es el análisis genético de las células plasmáticas malignas, normalmente mediante FISH. Las alteraciones genéticas deben evaluarse en todos los pacientes con mieloma (25) y las más relevantes asociadas a peor progresión en la supervivencia (también denominadas cambios cromosómicos de alto riesgo) son: 1q+, t(4;14), t(14;16), t(14;20), y del(17p) (mutación TP53) (26–29). La presencia de otros factores de alto riesgo en combinación con la del(17p) y 1q+, confiere un riesgo adicional en los pacientes. Otras alteraciones cromosómicas pueden incluir hiperdiploidía, definida por la trisomía de los cromosomas 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 y/o 21 o la traslocación t (4;14) vista en 15-20% de los pacientes, pero no están asociadas con peor pronóstico (30). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 24 Estratificación de riesgo para mieloma múltiple Estadio ISS-R 1 Estadio ISS-R 2 Estadio ISS-R 3 β2-microglobulina (mg/dl) <3,5 <5,5 >5,5 Albúmina (g/dl) ≥3,5 <3,5a - Lactato deshidrogenasa Menor del límite superior de lo normal - Mayor del límite superior de lo normalb Alteraciones cromosómicas de alto riesgo: del(17p), t(4;14), t(14;16) Ausentes Presente o ausente Presente Ratio de supervivencia a 5 años (%) 77 61 47 Tabla 3. Sistema Internacional de Estadiaje Revisado. En los pacientes con mieloma múltiple, los biomarcadores de la enfermedad y los factores genéticos se combinan en un algoritmo, el ISS-R, para estimar el pronóstico. a Tanto el nivel de albúmina inferior a 3,5 g/dl, o bien el nivel de β2- microglobulina de 5,5 mg/l o más bajo pero superior a 3,5 mg/l, cumple con los criterios del estadio 2 de ISS-R. b Tanto el nivel de lactato deshidrogenasa más alto que límite superior normal o la presencia de anomalías cromosómicas de alto riesgo, además de un nivel de β2-microglobulina superior a 5,5 mg/l, establecen el criterio de estadio 3 del ISS-R. ISS, International Staging System, en inglés; ISS-R, ISS revisado. Tabla adaptada de Cowan y colaboradores (19). 2.1.6. Tratamiento Durante los últimos años, el conocimiento más amplio sobre la biología de la enfermedad, la disponibilidad de fármacos muy efectivos y el enfoque en mejorar la calidad de vida, han supuesto grandes avances en el tratamiento del MM (2). El objetivo principal del tratamiento de los pacientes con MM es aumentar la supervivencia y la calidad de vida mitigando las complicaciones relacionadas con la enfermedad mediante la supresión de la malignidad a largo plazo. Las terapias suelen tener como objetivo reducir la abundancia de células plasmáticas malignas en la médula ósea, que se mide en parte por el nivel de la proteína monoclonal y las cadenas ligeras libres en suero. De hecho, la reducción de las células plasmáticas malignas se correlaciona con un control de la enfermedad más duradero (31). Durante muchos años, la terapia se basaba en fármacos citotóxicos, principalmente agentes alquilantes (p.ej. melfalán y ciclofosfamida) y glucocorticoides (p.ej. INTRODUCCIÓN 25 dexametasona, prednisona) (32). Además de la terapia de trasplante autólogo hematopoyético, actualmente se dispone de otros tratamientos más nuevos y efectivos entre los que se encuentran los inhibidores del proteasoma (IP) (p.ej. bortezombib, el ixazomib y el carfilzomib), agentes inmunomoduladores (IMiDs, immunomodulatory drugs, en inglés) (p.ej. talidomida, lenalidomida y pomalidomida), anticuerpos monoclonales dirigidos a las células de mieloma (p.ej. daratumumab, elotuzumab e isatuximab), e inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) (p.ej. panabinostat, vorinostat), entre otros fármacos. Además, en 2021, la FDA (Food Drug Administration, en inglés) aprobó la primera terapia de células T con receptores quiméricos de antígeno (CAR-T, chimeric antigen-receptor therapy en inglés) frente al antígeno de maduración de célula B (BCMA, B-cell maduration antigen, en inglés) en MM (Idecabtagene Vicleucel) (33) y aún más recientemente el uso de los anticuerpos biespecíficos (34), como opción en pacientes en recaída y/o refractarios (Tabla 4). Clase Nombre Elegibilidad Agentes alquilantes Melfalán MM de nuevo diagnóstico y refractario Ciclofosfamida Bendamustina Glucocorticoides Dexametasona MM de nuevo diagnóstico Prednisona Inhibidores del proteasoma Bortezomib MM de nuevo diagnóstico y en recaída Ixazomib MM en recaída Carfilzomib MM en recaída Inmunomoduladores Talidomida MM de nuevo diagnóstico y en recaída y/o refractarios Lenalidomida Pomalidomida Anticuerpos monoclonales Daratumumab MM de nuevo diagnóstico y en recaída Elozutumab MM en recaída Isatuximab MM en recaída Inhibidores HDAC Panabinostat MM en recaída Vorinostat Otros fármacos Selinexor MM en recaída Terapia CAR-T Idecabtagene vicleucel MM en recaída Tabla 4. Fármacos aprobados actualmente para el tratamiento del mieloma múltiple. MM, mieloma múltiple; CAR-T, terapia con receptores quiméricos de antígeno (chimeric antigen-receptor therapy en inglés). Tabla adaptada de Cowan y colaboradores (19). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 26 Una vez que se ha confirmado el diagnóstico de MM, se debe valorar globalmente si el paciente es apto para el trasplante autólogo hematopoyético, teniendo en cuenta la edad, el estado y riesgo de la enfermedad y las comorbilidades. Si el paciente es apto, se inicia la terapia de inducción, que es una combinación de al menos 3 fármacos (IP, IMiD y esteroides) (19) administrado en unos 4-6 ciclos del régimen seleccionado y tiene como objetivo alcanzar la mejor respuesta posible (35). Posteriormente, en los pacientes candidatos se realiza el trasplante, acondicionado con el agente alquilante melfalán y a continuación se realizan las terapias de consolidación y mantenimiento. En los pacientes no candidatos al trasplante, suele administrarse una combinación de 2 o 4 fármacos incluyendo 1 o 2 fármacos IP, IMiDs, anticuerpo monoclonal, y glucocorticoides. 2.1.6.1. Fármacos Agentes alquilantes Los agentes alquilantes han sido uno de los tratamientos más clásicos desde hace más de 30 años. El mecanismo de acción de estos fármacos se basa en la adición de grupos metilo en el ADN (proceso denominado alquilación) causando la unión entre ambas hebras, impidiendo la síntesis de ADN y de ARN y provocando por tanto la muerte celular, especialmente en las células altamente proliferativas (36). A pesar de su elevada toxicidad y de que recientemente se ha evidenciado que aumentan la carga mutacional en las células de mieloma (37), los agentes alquilantes continúan formando parte del régimen terapéutico de los pacientes con mieloma (36,38). Glucocorticoides Otro grupo de compuestos tradicionalmente empleados en el tratamiento del MM son los glucocorticoides, que forman parte de las hormonas denominadas corticosteroides. En las células de mieloma, los glucocorticoides se unen a los receptores citosólicos, que se traslocan al núcleo y modulan la expresión génica mediante la activación o represión de genes diana, cruciales en la patogénesis del mieloma (39). A pesar de su elevada eficacia tanto en monoterapia como en combinación con otros fármacos, las toxicidades de la terapia con esteroides limitan la administración de dosis altas y afectan la calidad de vida del paciente (40). Inhibidores del proteasoma INTRODUCCIÓN 27 En los últimos años, los IPs han supuesto uno de los mayores avances en el tratamiento del cáncer y concretamente del mieloma, constituyendo ahora uno de los pilares en el manejo de esta enfermedad. Hasta la fecha, han sido aprobados tres IPs: bortezomib (2003), carfilzomib (2012) e ixazomib (2015). La inhibición del proteasoma da como resultado la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis a través de la modulación de varias vías, incluida la estabilización de p53, la activación de la vía c-Jun quinasa NH2-terminal y NF-κB que conduce a la activación de cascadas de caspasas intrínsecas y extrínsecas. Además, la inhibición del proteasoma puede dar lugar a la acumulación de proteínas desplegadas en el retículo endoplásmico, lo que posteriormente activa la vía de respuesta de proteínas desplegadas que conduce a la apoptosis (41,42). El bortezomib, el primer IP aprobado por la FDA, ha mostrado una mejora significativa en la clínica, tanto como tratamiento de primera línea como en pacientes en recaída y/o refractarios. Sin embargo, a pesar de su potente actividad anti-MM, la toxicidad asociada a su uso y la resistencia a algunas células cancerosas han restringido su uso. Como resultado, se desarrolló un IP de segunda generación, carfilzomib, con perfiles de eficacia y seguridad diferenciales. A diferencia de bortezomib, que forma un complejo reversible con el proteasoma, carfilzomib se une irreversiblemente al proteasoma e inhibe su actividad similar a la de la quimotripsina. El carfilzomib también demuestra un perfil de seguridad mejorado debido a su especificidad hacia la actividad similar a la quimotripsina del proteasoma y la rápida eliminación extrahepática del fármaco libre (42). El ixazomib es IP más reciente y el único administrado de manera oral, para el tratamiento del MM en recaída y/o refractario. Actualmente continúa estudiándose en numerosos ensayos clínicos, pero ha mostrado resultados prometedores, siendo eficaz y aparentemente bien tolerado en combinación con otros fármacos (43). Inmunomoduladores Junto con los IP, el descubrimiento de los IMiDs, han supuesto un gran avance en el tratamiento mejorando significativamente la supervivencia de los pacientes con mieloma. Además de ejercer un efecto antiproliferativo y proapoptótico sobre las células malignas, los IMiDs ejercen una función inmunorreguladora e interfieren con las interacciones del microambiente tumoral (44,45). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 28 El IMiD de primera generación fue la talidomida, un compuesto muy controvertido ya que se asoció a efectos teratogénicos tras su empleo como tratamiento en mujeres embarazadas a mediados de los años 50, hecho que supuso su retirada temporal del mercado (46). En 1990, se administró en pacientes con MM como terapia de uso compasivo, probando su eficacia en ese estudio (47) y posteriormente en combinación con dexametasona en pacientes refractarios (48) y de nuevo diagnóstico (49). Después apareció la lenalidomida como IMiD de segunda generación, y la pomalidomida de tercera generación, ambos con una eficacia muy superior a la talidomida, especialmente en pacientes refractarios (50). Los IMiDs modulan el ambiente inflamatorio de la médula ósea inhibiendo la progresión del MM con mecanismos como la reducción de interleucina (IL)-6, del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), la angiogénesis y otras interacciones clave para las células de mieloma (50). Además, recientemente, se ha descubierto que los IMiDs se unen a una proteína principal denominada cereblon, que pertenece a un complejo de ubiquitina ligasa E3. Por lo tanto, la inhibición de la talidomida del proceso de ubiquitinación conduce a la acumulación tóxica de proteínas y a la muerte de las células MM (51). Actualmente, los IMiDs deben considerarse una opción de tratamiento beneficiosa para pacientes con MM en recaída y/o refractarios que recibieron terapias previas que incluyeron bortezomib o lenalidomida (50) y especialmente en combinación con otros tratamientos (52). Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se unen a antígenos específicos en la superficie de las células, lo que induce la muerte de las células tumorales por citotoxicidad y fagocitosis (50). El daratumumab, el isatuximab y el elotuzumab fueron los primeros anticuerpos monoclonales introducidos en la clínica para el tratamiento del mieloma. Los dos primeros anticuerpos se unen específicamente al receptor de superficie CD38, altamente expresado en las células de mieloma (53). Elotuzumab, que se dirige frente a la glicoproteína CS1, promueve la muerte celular y se ha mostrado eficaz en combinación con IMiDs (54). Inhibidores de histona deacetilasa INTRODUCCIÓN 29 Los inhibidores HDAC, como el panobinostat y el vorinostat actúan abriendo la estructura de la cromatina en las células plasmáticas malignas. Como consecuencia, se activa la expresión de los genes supresores que habían sido silenciados previamente por una acetilación aberrante de la histona en las células plasmáticas malignas (50). Estos fármacos de regulación epigenética resultan eficaces pero debido a su toxicidad, su uso se ha restringido y se administran principalmente en combinación con otros tratamientos (55). Fármacos dirigidos El selinexor, un inhibidor selectivo del compuesto de exportación nuclear que bloquea la exportina 1 y fuerza la acumulación nuclear y la activación de proteínas supresoras de tumores, inhibe NF‑κB y reduce la traducción del ARN mensajero de la oncoproteína (56). Combinado con otros tratamientos resulta eficaz y una buena opción terapéutica actual para el mieloma refractario (57). Cabe mencionar otro inhibidor llamado Venetoclax, en este caso de Bcl-2, aprobado para otras neoplasias hematológicas y que ha mostrado una alta eficacia en ensayos clínicos en pacientes con MM, particularmente en aquellos que tienen la traslocación t(11;14) (58). Inmunoterapia La terapia CAR-T ha mostrado una actividad prometedora en las neoplasias malignas hematológicas y también se está estudiando para el tratamiento del MM. El anti-BCMA, que se expresa amplia y casi exclusivamente en células plasmáticas y células B, es uno de los más prometedores (59). Otros objetivos que se están evaluando incluyen CD19, CD38, CD138, molécula de activación de linfocitos de señalización o CS1, cadena ligera, GPRC5D y NKG2D (60). Además, recientemente se ha probado la eficacia de un anticuerpo biespecífico que se dirige tanto al CD3 como a BCMA. Bajo el nombre de teclistamab, este anticuerpo mostró resultados muy prometedores para los pacientes con MM en recaída y/o refractario (34). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 30 2.1.6.2. Resistencia farmacológica Los avances en el tratamiento del MM han contribuido a mejorar la respuesta y a conseguir mayor tiempo de supervivencia; sin embargo, la recaída es inevitable en casi todos los pacientes. El MM suele ser más agresivo con cada recaída, lo que conduce al desarrollo de una enfermedad resistente al tratamiento, que se asocia con una peor prognosis (61). Debido a la naturaleza heterogénea de la enfermedad, se han identificado muchas causas involucradas en la resistencia del MM. Algunos de estos mecanismos son: alteraciones genéticas y epigenéticas, metabolismo anormal del fármaco, desregulación de la apoptosis, persistencia de células madre del cáncer insensibles a fármacos, microambiente tumoral no funcional y otros mecanismos específicos de la inmunoterapia con anticuerpos (50). Profundizar en la comprensión de las vías y las proteínas implicadas en la resistencia, así como desarrollar nuevas estrategias terapéuticas son objetivos clave para seguir avanzando en el tratamiento del MM. 2.2. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LOS TUMORES HEMATOLÓGICOS 2.2.1. La estimulación antigénica como origen de los trastornos linfoproliferativos A pesar de los grandes avances en su conocimiento, la etiología del MM aún no está del todo clara. Algunos estudios recientes han sugerido la asociación del MM con varios microorganismos, incluyendo algunos infecciosos como el virus de la hepatitis B (VHB) o el virus de la hepatitis C (VHC). La estimulación crónica causada por antígenos infecciosos o autoantígenos (como la glicoproteína asociada a mielina o la glucoesfingosina) es uno de los factores que inician eventos patogénicos como la inflamación continuada, la proliferación descontrolada y la adquisición de alteraciones genéticas, conduciendo en último término al desarrollo del cáncer. De hecho, este mecanismo se ha visto asociado a otras enfermedades hematológicas, como la leucemia INTRODUCCIÓN 31 linfocítica crónica (LLC) y varios tipos de linfoma (62,63), donde esta interacción desregulada entre las células del sistema inmune y los microbios conducen a linfoproliferación y por tanto llevan a la progresión del tumor (64). El concepto de la linfoproliferación estimulada por antígeno como mecanismo patofisiológico se remonta a la década de 1990 con la identificación de Helicobacter pylori como agente causal del linfoma gástrico MALT. La transformación maligna de las células puede ocurrir directamente por la infección y transformación de la célula B o indirectamente mediante la estimulación crónica del BCR por parte del antígeno (65). La transformación directa por un agente microbiano es el escenario más simple que explica los linfomas asociados a infecciones. Algunos virus linfotrópicos que tienen la capacidad de transformar células son el virus Epstein-Barr (VEB), el herpesvirus 8 y el virus T- linfotrópico humano, que directamente infectan las células linfoides en las que expresan oncogenes virales (66–68). Otros virus menos conocidos, son Borrelia burgdorferi, Coxiella burnetti y el VHC, que se han asociado con linfoma de la zona marginal y linfomas difusos de la célula B (64,69). En el mecanismo alternativo, el patógeno microbiano no es intrínsecamente transformador ni oncogénico, pero ejerce una estimulación crónica que aumenta la tasa proliferativa de los efectores linfoides y, por lo tanto, favorece el proceso de transformación (64). Además, los microorganismos pueden liberar metabolitos genotóxicos, alterar la apoptosis, inactivar genes supresores de tumores y generar estrés oxidativo, contribuyendo a la transformación maligna (70). En relación a la estimulación antigénica crónica como mecanismo patogénico en el MM, recientemente, Nair y colaboradores han identificado la inmunoglobulina clonal reactiva a lisolípidos en algunas gammapatías esporádicas como la de Gaucher (71), observando también que la estimulación antigénica conduce a un incremento de la Ig Mc y de células plasmáticas in vivo (72). En este modelo, la activación inmunitaria crónica a través de antígenos lipídicos podría conducir a la expansión y a la transformación de células plasmáticas reactivas a los lípidos, llevando a la respuesta monoclonal de las células. De forma independiente, Hermouet y colaboradores observaron que en el 23% de los casos de GMSI, MMq y MM, la Ig Mc de estos pacientes reconocía un patógeno infeccioso, incluyendo virus como el VEB, VHC, virus del herpes simple (VHS) y bacterias como H. pylori (65). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 32 El BCR y especialmente, la región CDR3, tienen un papel clave en la iniciación y la perdurabilidad de la linfoproliferación mediada por antígenos. Esta región de aminoácidos es una zona decisiva para la detección específica del antígeno por parte de las inmunoglobulinas. De hecho, en el caso de la LLC se ha visto que aproximadamente el 30% de los casos podrían agruparse en base a los BCR estereotípicos con secuencias de aminoácidos características en la región CDR3. Recientemente, se ha visto que algunos de estos BCR estereotípicos eran altamente específicos para el β-(1,6)-glucano, un antígeno de las levaduras y hongos. Y de forma más interesante, las células B clonales de los pacientes de ese estudio, proliferaron en respuesta al β-(1,6)-glucano (73). Sin embargo, las células B expresan muchos otros receptores (de superficie) implicados en el reconocimiento antigénico microbiano además del BCR, incluyendo CD5 y CD6 (CLL) y PRR como TLR1, TLR2, TLR6, TLR7, TLR9, NOD1 y NOD2. La señalización a través de estos receptores es explotada por las células malignas para su propia supervivencia, y desencadena vías de moleculares claves (Figura 6). Figura 6. Señalización del receptor de células B impulsada por antígeno en enfermedades linfoproliferativas. INTRODUCCIÓN 33 Estimulación crónica BCR por antígenos y autoantígenos microbianos da como resultado la activación de varias vías de señalización intracelular que dan como resultado linfoproliferación, apoptosis reducida, supervivencia celular prolongada y alteración de la migración de las células, que puede contribuir a la aparición de neoplasias linfoides. BCR, B-cell receptor en inglés; VHC; virus de la hepatitis C; H. pylori, Helicobacter pylori; S. pneumoniae, estreptococo pneumoniae ;mTOR. diana de la rapamicina en células de mamífero; BLNK, proteína conectora de células B; BTK, tirosina quinasa de Bruton; PLCγ2, fosfolipasa C Gamma 2; PI3K, fosfatidilinositol 3- quinasa; PIP3, fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato; IP3, inositol 1,4,5-trifosfato; DAG, diacilglicerol; PDK, proteína quinasa D; Ca, calcio; JNK, junio quinasas N-terminales; IKK, quinasa IκB; PKC, proteína quinasa C; NFAT, factor nuclear de células T activadas; NF-κB, factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas; ATF2: factor de transcripción activador 2. Figura adaptada de Stevens y colaboradores (70). 2.2.2. Los mecanismos involucrados en la interacción de los microorganismos con la célula B Teniendo en cuenta el importante papel que tienen las células B durante la infección, se han propuesto muchos mecanismos por los cuales los patógenos podrían manipular a esta población de linfocitos para conseguir una ventaja selectiva (Tabla 5). Aunque estos mecanismos aún no se conocen del todo, las bacterias y virus capaces de infectar, utilizan a las células B como reservorios y suprimen la respuesta protectora de las mismas. En el caso de los virus, el más conocido como reservorio es el VEB, que entra en la célula B y consigue generar numerosas partículas virales que le sirven para modificar el tropismo de la célula y facilitar la diseminación de la infección (74). Por otro lado, algunos patógenos impiden la diferenciación y maduración de las células B en células B de memoria y células plasmáticas. Esta alteración puede conllevar que, durante la infección, se produzcan anticuerpos de baja afinidad que reemplacen a los anticuerpos más específicos y de vida larga. Mientras que la respuesta inmunitaria temprana a algunos virus, como el virus de la influenza, media la protección, los anticuerpos generados en respuesta a la infección por el VHC no logran eliminar el virus en pacientes con infecciones persistentes y trastornos linfoproliferativos como los linfomas de células B (75). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 34 Patógeno Infección de las células B Desviación de la activación de la célula B Desviación de la producción de anticuerpos Parásitos NR T. cruzi T. cruzi P. falciparum P. falciparum Virus CMV Virus del sarampión Virus del sarampión Virus del sarampión VEB VEB VEB VTMM VHC VTMM VHC VIH-1 VJC VIH-1 Virus influenza VHC Virus influenza Norovirus Bacterias B. abortus M. catarrhalis E. muris M. catarrhalis S. aureus B. burgdorferi S. typhimurium N. gonorrhoeae M. catarrhalis L. monocytogenes Y. pseudotuberculosis B. anthracis S. flexneri S. aureus Inducción de las células B de regulación Inducción de la muerte de células B Inducción de la supervivencia de las células B Parásitos L. major T. cruzi NR T. brucei P. chabaudi Virus CMV Virus influenza VEB VHB VHC VIH-1 VIH-1 Poliomavirus Bacterias B. abortus L. monocytogenes H. pylori S. typhimurium F. tularensis S. typhimurium C. abortus S. flexneri H. pylori Tabla 5. Alteraciones de la célula B inducidas por patógenos. Además de utilizar las células B como reservorio, algunos patógenos han desarrollado mecanismos para interferir con la señalización inmunitaria y la diferenciación de las células B para impedir la maduración de las células B en células B de memoria y células plasmáticas. B. abortus, Brucella abortus; B. anthracis, Bacillus anthracis; B. burgdorferi, Borrelia burgdorferi; C. abortus, Chlamydia abortus; CMV, citomegalovirus; VEB, Virus Epstein-Barr; E. muris, Ehrlichia muris; F. tularensis, Francisella tularensis; VHB, virus de la hepatitis B; VHC, virus de la hepatitis C; H. pylori, Helicobacter pylori; VJC, virus John Cunningham ; L. major, Leishmania major; L. monocytogenes, Listeria monocytogenes; M. catarrhalis, Moraxella INTRODUCCIÓN 35 catarrhalis; VTMM, virus del tumor mamario murino; N. gonorrhoeae, Neisseria gonorrhoeae; NR, no reportado; P. chabaudi, Plasmodium chabaudi; P. falciparum, Plasmodium falciparum; S. aureus, Staphylococcus aureus; S. flexneri, Shigella flexneri; S. typhimurium, Salmonella typhimurium; T. brucei, Trypanosoma brucei; T. cruzi, Trypanosoma cruzi; Y. pseudotuberculosis, Yersinia pseudotuberculosis. Tabla adaptada de Nothelfer y colaboradores (7). La glicoproteína E2 del VHC se une al CD82 de la superficie de la célula B e induce la activación y proliferación de células B naive. Esto se demostró al incubar células B con proteína E2 del VHC in vitro, pero además se ha visto que las células B infectadas in vivo muestran una mayor expresión de marcadores de activación (76). La unión a E2 y la subsiguiente infección viral de las células B induce la regulación positiva de la deaminasa de citosina inducida por activación (AID, Activation Induced Cytosine Deaminase en inglés) y la hipermutación de la cadena pesada de inmunoglobulina. Esto da como resultado una menor afinidad, una menor actividad neutralizante y una menor toxicidad mediada por el complemento de los anticuerpos específicos de E2, lo que podría explicar por qué, en los pacientes, los anticuerpos séricos específicos contra el VHC no logran neutralizar el virus (77) (Figura 7). Otro de los mecanismos por los cuales los patógenos contribuyen a la alteración del sistema inmunológico es la inducción de células B reguladoras que liberan citoquinas que pueden suprimir la inflamación y la respuesta protectora de las células T. Este mecanismo lo utilizan virus como citomegalovirus (CMV), el VHB y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (78–80). Además de entrar y alterar la maduración de la célula B, los patógenos pueden modular las vías de proliferación y muerte de la célula B, que es uno de los mecanismos más comunes en el caso de las infecciones crónicas (7). El VHC induce la supervivencia de las células B a través de la proteína de la cubierta E2, que se acopla al CD81 expresado en la superficie de las células B. Esto conduce a la activación de la vía NF‑κB y al aumento de la expresión de Bcl‑2 en las células B humanas, protegiendo a las células B de la muerte celular (81). Mientras que el VEB persiste intracelularmente en las células B, donde se esconde de las respuestas de anticuerpos, el VHC puede inducir respuestas de anticuerpos que desencadenen trastornos linfoproliferativos como el MM. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 36 Profundizar en el conocimiento de los procesos de malignización de enfermedades como el MM con relación a los microorganismos podría proporcionar nuevos tratamientos en aquellas infecciones que disponen de fármacos eficaces como las hepatitis causadas por VHC y VHB. Figura 7. Mecanismo de alteración de la célula B por parte del virus de la hepatitis C. La glicoproteína E2 del VHC se une a CD81 en la superficie de las células B, lo que conduce a la sobreexpresión de la AID y la inducción de la hipermutación de la inmunoglobulina. Esto resulta en menor afinidad, menor actividad neutralizante y menor toxicidad mediada por el complemento de los anticuerpos específicos de E2. VHC, virus de la hepatitis C; AID, deaminasa de citosina inducida por activación; Ig, inmunoglobulina. Imagen adaptada de Nothelfer y colaboradores (7). 2.2.3. La infección por VHC 2.2.3.1. Biología, epidemiología y clínica El VHC es un pequeño virus envuelto con un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo que codifica una gran poliproteína de 3010 aminoácidos (82). Después de entrar INTRODUCCIÓN 37 en la célula del hospedador, la poliproteína es traducida y procesada para producir las proteínas virales, que pueden ser estructurales (Core, E1 y E2) o no estructurales (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS55A y NS5B), necesarias para la replicación del virus (83). Este virus se clasifica en siete genotipos y posee una región en el extremo 5’de su ARN con secuencias altamente conservada que hace posible su diagnóstico molecular (84). Originalmente, la infección por este virus se denominó hepatitis “non-A-non B” (NANBH, en inglés), ya que en la década de 1970 se reportaron casos de hepatitis similares a los ya conocidos, pero se descartó que los responsables fueran los virus de la hepatitis A y B. Posteriormente, el aislamiento y la identificación de los anticuerpos, publicado en la revista Science, resultó en el descubrimiento del VHC (85,86). El gran impacto en el descubrimiento y la investigación del VHC ha sido galardonado recientemente con el Premio Nobel en Medicina del año 2020 (87). Actualmente, la infección por el VHC afecta a 1,5 billones de personas al año (88) y es responsable de 290.000 muertes al año (89). Tras la infección, entre 4 y 12 semanas después, se desarrolla una hepatitis aguda, que en ocasiones de detecta por una ictericia levemente visible producida por el aumento de los niveles de bilirrubina. Sin embargo, los síntomas de esta fase aguda suelen ser inespecíficos (como fatiga, náuseas, fiebre…) e incluso en algunos casos transcurre de manera asintomática y los individuos no saben que están infectados. En hasta un 80% de los casos, la infección aguda deriva en la infección crónica por el VHC (90), que ocasiona daño hepático y cirrosis (en el 20% de los casos en un periodo de 10-30 años), y en el peor de los casos resulta en la aparición de un carcinoma hepatocelular. Los factores de riesgo para el desarrollo de cirrosis hepática incluyen la presencia de hepatitis crónica con niveles elevados de alanina aminotransferasa, ingesta elevada de alcohol y la coinfección por el VHB. Además, la infección crónica puede producir otras manifestaciones fuera del hígado, como son la diabetes mellitus tipo II y las enfermedades cardiovasculares (91). 2.2.3.2. Tratamientos Profundizar en el conocimiento de los mecanismos de infección del virus, así como el estudio de sus proteínas no estructurales ha sido clave en el desarrollo de los tratamientos antivirales. Tras el descubrimiento del virus, el tratamiento principal para la infección por VHC era la terapia con interferón alfa, cuyo mecanismo de acción se basa en la supresión de la replicación viral (92). Actualmente, debido a sus efectos secundarios y a que no EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 38 puede administrarse en algunos grupos de pacientes, como aquellos que padecen cirrosis de hígado descompensada o trastornos psiquiátricos, su uso está muy limitado y generalmente es en combinación con fármacos más específicos (90). La investigación de los mecanismos y propiedades de este virus resultó en el descubrimiento de los agentes virales de acción directa. El primer fármaco de acción directa fue aprobado por la FDA en 2011 suponiendo un hito en el tratamiento de la infección por VHC y desde entonces, los fármacos de acción directa constituyen la mejor opción terapéutica (88) (Tabla 6). Tipo Mecanismo de acción Fármaco Inhibidores proteasa NS3/4 Bloquean la traducción de la poliproteína del VHC glecaprevir, paritaprevir, voxilaprevir, grazoprevir Inhibidores de NS5A Interfieren en la acción de la ARN polimerasa viral daclatasvir, ledipasvir, pibrentasvir, elvasvir Inhibidores polimerasa NS5B Actúan en la interacción de las proteínas virales y del huésped (el mecanismo se desconoce con exactitud) sofosbuvir, dasabuvir Tabla 6. Fármacos de acción directa para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C. ARN, ácido ribonucleico; VHC, virus de la hepatitis C. Los inhibidores frente a NS4B todavía están siendo estudiados y testados en ensayos clínicos (93). Las recomendaciones de tratamiento están basadas en el genotipo del VHC y apuestan por la combinación de estos fármacos para conseguir una eficacia mayor (84). La alta variabilidad del VHC dificulta el desarrollo de una vacuna, por lo que la prevención y el acceso al tratamiento son hoy en día las mejores estrategias para controlar la infección (94). De forma interesante, algunos estudios han mostrado que la erradicación del VHC ya sea con interferón o con antivirales de acción directa conducen a una regresión o prevención de recaída en algunos tipos de linfoma (95–97). Además, un estudio japonés realizado desde el año 1969 hasta el 2006 concluye que los pacientes que recibieron un tratamiento de interferón y consiguieron una respuesta viral sostenida (lo cual quiere decir que eran indetectables) no desarrollaron ningún linfoma comparados con la muestra que INTRODUCCIÓN 39 representaba a aquellos que no alcanzaron esta respuesta, entre los cuales, se dieron casos de linfomas (98). 2.2.4. La infección por VHB 2.2.4.1. Biología, epidemiología y clínica El VHB es un virus pequeño envuelto con un genoma de ADN transcrito de forma inversa perteneciente a la familia viral Hepadnaviridae y se puede dividir en 10 genotipos (99). Presenta la característica inusual de que su ADN se replique a través de un intermediario de ARN y pueda integrarse en el genoma del huésped. Además, durante la replicación, se transforma en ADN circular cerrado covalentemente (ADNccc). El VHB se caracteriza por un genoma que consta de 4 marcos de lectura abiertos superpuestos: el gen S, que codifica las proteínas de la cubierta; el gen central, que codifica las proteínas central y “e”; el gen P, que codifica la ADN polimerasa; y el gen X, que codifica un transactivador transcripcional (100). La OMS estimó que aproximadamente 296 millones de personas estaban infectadas con VHB en 2019 y murieron unas 820.000 personas a causa de la infección por este virus (101). Debido a su capacidad de integrarse en el genoma del hospedador, se trata de un virus altamente oncogénico. Al igual que el VHC, es un virus hepatotrópico cuya infección tiene una fase aguda caracterizada por episodios inflamatorios en el hígado y cuando se cronifica conduce a fibrosis y cirrosis y en último término carcinoma hepatocelular. El marcador serológico clave de la hepatitis B aguda y crónica es la detección de HBsAg en suero. Sin embargo, varios otros marcadores serológicos de VHB son clínicamente útiles en la infección por VHB. Por ejemplo, en pacientes con recuperación clínica de la infección por VHB, los anticuerpos contra HBsAg (anti- HBs) y el antígeno central de la hepatitis B (HBcAg; anti-HBc) pueden ser detectables. Inicialmente, el HBsAg fue producido en levaduras y se diseñó como una vacuna recombinante eficaz para el VHB, por lo que se tiene en cuenta para evaluar la eficacia de la vacunación en pacientes infectados por el VHB (102). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 40 Los anticuerpos anti-HBc pueden permanecer detectables en pacientes con infección crónica por VHB, y junto a otros marcadores séricos, pueden evaluar el estado virológico de la enfermedad (Tabla 7). Marcador serológico Descripción Significado clínico HbeAg (antígeno e) Proteína contenida en la nucleocápside del núcleo del VHB Detectable en suero cuando el nivel de virus es muy elevado. Indica una alta infectividad (en fase aguda o crónica) HBcAg (antígeno del núcleo) Proteína de superficie de la nucleocápsida del núcleo que no se secreta y, como resultado, no se puede detectar en el suero de individuos infectados (sin embargo, su anticuerpo sí) Su presencia indica una replicación del VHB en curso durante la infección activa HBsAg (antígeno de superficie) Proteína de la superficie del VHB. Se utiliza para fabricar la vacuna. Es el primer marcador que aparece. Se detecta 3 semanas después de los síntomas y si permanece más de 24 semanas indica cronicidad de la infección Anti-HBe Anticuerpo frente al antígeno e Se correlaciona con disminución de la replicación viral y de infectividad Anti-HBs Anticuerpo frente al antígeno de superficie Aparece de 1 a 3 meses después de la vacunación o después de la recuperación de una infección aguda e indica inmunidad frente al VHB Anti-HBc Anticuerpos frente al antígeno del núcleo Aparece al inicio de los síntomas en la hepatitis B aguda y persiste de por vida, lo que indica una infección previa o en curso por el VHB en un período de tiempo indefinido IgM anti HBc Anticuerpo IgM frente al antígeno del núcleo Su presencia indica infección aguda reciente (< 6meses) IgG anti HBc Anticuerpo IgG frente al antígeno del núcleo Indica contacto con la infección, pero no es indicativo de inmunidad HbeAg HBsAg Anti- HBe Anti- HBs IgM anti HBc IgG anti HBc ADN VHB Infección aguda + + - - + + + Infección crónica (<6 meses) +/- + +/- - - + + Inmunidad al VHB (infección pasada) - - - + - + - Inmunidad al VHB (vacunación) - - - + - - - Tabla 7. Antígenos y marcadores serológicos de la infección por el VHB. INTRODUCCIÓN 41 2.2.4.2. Tratamientos A pesar de que sigue siendo elevada, la incidencia de las infecciones por VHB está disminuyendo, debido la disponibilidad la vacuna desde la década de 1980 (103) y a la eficacia de los tratamientos antivirales. Las indicaciones de tratamiento de la infección crónica se basan en los niveles del ADN viral en suero, las transaminasas y la afectación hepática de los pacientes. Los tratamientos incluyen tanto al interferón convencional (IFNα‑2b) como en su forma pegilada (PEG-IFNα) así inhibidores de la transcriptasa inversa, que son análogos de la nucleosida o nucleotida y por eso reciben el nombre de NUCs. Estos últimos son antivirales que impiden la replicación del VHB, pero requieren un mantenimiento de la terapia a largo plazo. Existen 6 NUCs aprobados por la FDA: lamividina, adefovir, entecavir, telvivudina, tenofovir disoproxil fumarato (TDF) y tenofovir alafenamida (TAF) (102). Actualmente, el tratamiento de primera línea es el PEG-IFNα, el entecavir, el TDF y el TAF (104). Los pacientes que padecen una coinfección con el VHC deben tratarse primero del VHB, ya que iniciar la terapia con los antivirales de acción directa del VHC podría reactivar el VHB (105). 2.2.5. La importancia de la microbiota Aproximadamente 100 billones de microorganismos (la mayoría de ellos bacterias, pero también virus, hongos y protozoos) habitan en el tracto intestinal humano, constituyendo una gran comunidad que llamamos microbiota (106). Estos microorganismos y sus genes, que reciben el nombre de microbioma, influyen en numerosos procesos fisiológicos, incluyendo digestión, metabolismo, función y desarrollo cognitivo y sistema inmune (107,108). Además, los cambios en la microbiota normal, proceso denominado disbiosis, pueden contribuir al desarrollo de enfermedades autoinmunes, metabólicas, diabetes y cáncer, entre otras. El desequilibrio de la microbiota interfiere en la relación entre los microorganismos colonizadores y las células, conduciendo a cambios en inflamación, el ciclo celular, la proliferación o el metabolismo de estas células. Estas alteraciones promueven la transformación de las células o el daño en el ADN, que son factores de riesgo para desarrollar cáncer (109). De hecho, el microbioma, es decir el conjunto de EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 42 los microorganismos y su genoma, ha sido incluido recientemente como uno de los “Hallmarks of cancer”, por su papel en el desarrollo, progresión y respuesta a esta enfermedad (110). La colonización del intestino por parte de los microorganismos juega un papel importante en la hematopoyesis y en la maduración del sistema inmune. De hecho, se ha descrito que la depleción de microbiota en ratones altera las poblaciones celulares de la médula ósea, alterando la función inmune (111). Sin embargo, los mecanismos de esta interacción siguen estudiándose (112). En el caso del MM, algunos estudios se han centrado en entender la microbiota como modulador de la progresión de la enfermedad (113,114). Concretamente, Calcinotto y colaboradores encontraron que microorganismos específicos de la microbiota promueven la diferenciación y migración de los linfocitos Th17 (linfocitos T helper 17, en inglés) desde el tracto intestinal hasta la médula ósea e incrementando los niveles de IL-17, favoreciendo la progresión del MM (113). Las células plasmáticas en el MM pueden sobrevivir en el tracto gastrointestinal durante largos períodos de tiempo. La naturaleza de la microbiota intestinal afecta el grado de estimulación antigénica de estas células y puede desempeñar un papel en el desarrollo de mutaciones y la evolución clonal (115). De hecho, se ha sugerido que las especies patogénicas de la microbiota podrían ser responsables de la estimulación antigénica en la GMSI y en el MM (112,116). Estos estudios respaldan la influencia de la microbiota intestinal en el microambiente del mieloma (113,114) y plantean preguntas sobre cómo la microbiota intestinal y sus metabolitos podrían afectar el desarrollo del mieloma. Por ejemplo, Jian y colaboradores han descrito un aumento en la abundancia relativa de bacterias intestinales que reciclan nitrógeno en pacientes con MM y son responsables de la acumulación de nitrógeno ureico durante la progresión de la enfermedad. Estas bacterias están involucradas en la producción de L-glutamina, que es un aminoácido esencial para las células MM. Las células del MM producen altas cantidades de NH4 +, que se transforma en el hígado en urea y alcanza altas concentraciones en la sangre y puede seleccionar bacterias recicladoras de nitrógeno como K. pneumoniae o S. pneumoniae (114). En el contexto de la terapia, la microbiota intestinal parece estar relacionada con el trasplante alogénico y el inconveniente que ocurre en algunos casos de enfermedad crónica de injerto contra huésped (117). De hecho, en un estudio de 111 pacientes con INTRODUCCIÓN 43 MM se asoció la baja diversidad de la microbiota con un mayor riesgo de muertes relacionadas con el trasplante y la enfermedad de injerto contra huésped (118). Además, la microbiota puede influir en la respuesta y toxicidad de los tratamientos (119). De hecho, actualmente se están realizando numerosos ensayos clínicos con el objetivo de modular la microbiota para mejorar la respuesta terapéutica en tumores hematológicos (120). En MM, la abundancia de algunos microorganismos de la microbiota como Eubacterium halli y Faecalibacterium prausnitzii se asoció a una mejor respuesta en pacientes tratados con PIs y/o IMiDs seguidos de trasplante autólogo (121). Por otro lado, se ha visto una prevalencia más alta de las bacterias antinflamatorias de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus en ratones expuestos a dexametasona que podrían potenciar el efecto inmunosupresor de la dexametasona (122). Similarmente, las alteraciones de la microbiota intestinal se ha relacionado con la respuesta o la toxicidad de otros tratamientos, como la ciclofosfamida (123), el melfalán (124) o incluso la terapia CAR- T (125). 2.2.5.1. Metabolitos de la microbiota: ácidos grasos de cadena corta y urolitina A La microbiota intestinal produce un reservorio extremadamente diverso de metabolitos a partir de componentes dietéticos exógenos y/o compuestos endógenos generados por los microorganismos y el huésped, siendo por tanto claves en la interacción entre la microbiota y el organismo. Existe cada vez más evidencia de que la microbiota intestinal podría influir positivamente en el sistema inmune y el microambiente de la médula ósea mediante la producción de pequeñas moléculas, como los metabolitos bacterianos (120). Uno de los grupos de metabolitos más importantes y estudiados, son los ácidos grasos de cadena corta (AGCC), entre los que se encuentran el acetato, el propionato y el butirato (126), constituyendo el 95% de los AGCC (127). Se denominan AGCC porque son ácidos grasos libres que contienen menos de 6 carbonos, constituyendo una cadena corta, de 2 carbonos en el caso del acetato, 3 en el del propionato y 4 en el del butirato. Debido a que tienen cadenas hidrofóbicas relativamente más cortas, así como el grupo carboxilo hidrofílico, los AGCC son solubles en agua y se absorben o transportan fácilmente al interior de las células. Los AGCC son producidos por la microbiota intestinal como EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 44 productos de fermentación, lo que significa que se oxidan parcialmente a partir de moléculas de azúcar en condiciones anaeróbicas en el colon. Las vías de producción del acetato varían entre los distintos grupos microbianos como son las bacterias entéricas y las acetogénicas como es el caso del género Blautia. En estos microoganismos se realiza vía acetil-CoA o mediante la vía Wood-Ljungdahl, respectivamente. Sin embargo, las vías del propionato y del butirato son más específicas y conservadas. La producción de propionato está dominada por relativamente pocos géneros bacterianos y es llevada a cabo utilizando dos vías: la vía del lactato por Firmicutes y la vía del succinato por Bacteroidetes. Por su parte, el butirato es producido también por Firmicutes, como Faecalibacterium prausnitzii, Eubacterium rectale, Eubacterium hallii y Ruminococcus bromio (128). Las vías principales de producción de butirato son a través de la degradación de carbohidratos (acetil-CoA) y de aminoácidos (4-aminobutirato, glutarato y lisina) (129). Algunos de los microorganismos y vías de producción de los AGCC se encuentran recogidos en la Tabla 8. AGCC Vías/Reacciones Productores Acetato desde piruvato vía acetil-CoA La mayoría de las bacterias entéricas, por ejemplo, Akkermansia muciniphila, Bacteroides spp., Bifidobacterium spp., Prevotella spp., Ruminococcus spp. vía Wood-Ljungdahl Blautia hidrogenotrófica, Clostridium spp., Streptococcus spp. Propionato vía del succinato Bacteroides spp., Phascolarctobacterium succinatutens, Dialister spp., Veillonella spp vía del acrilato Megasphaera elsdenii, Coprococcus catus vía del propanediol Salmonella spp., Roseburia inulinivorans, Ruminococcus obeum Butirato ruta de la fosfotransbutirilasa/ butirato quinasa Coprococcus comes, Coprococcus eutactus ruta butiril-CoA:acetato CoA transferasa Anaerostipes spp., Coprococcus catus, Eubacterium rectale, Eubacterium hallii, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia spp. Tabla 8. Producción de ácidos grasos de cadena corta por la microbiota intestinal. AGCC, ácidos grasos de cadena corta. Tabla adaptada de Koh y colaboradores (130). Su papel fisiológico es muy importante, ya que son responsables de la absorción de iones, la motilidad del intestino y la modulación del sistema inmune (131). Por lo general, los INTRODUCCIÓN 45 AGCC pueden reducir la proliferación y la migración de las células inmunitarias, reducir la cantidad de los niveles de citoquinas e inducir la apoptosis para inhibir la inflamación. Los AGCC no sólo juegan un papel en homeostasis intestinal, sino que también se transportan a través del intestino para entrar en la circulación sanguínea e influir en la función y el metabolismo de los tejidos periféricos (130,132). En los últimos años, se ha descrito el papel beneficioso de los AGCC en la evolución de varias enfermedades, como la enfermedad intestinal inflamatoria (133), la diabetes (134), la aterosclerosis (135) y especialmente en cáncer (136). En el caso del MM, algunos estudios han correlacionado algunos microorganismos productores de AGCC con el ISS de los pacientes (137). Además, Jian y colaboradores demostraron que las bacterias productoras de AGCC como Anaerostipes hadrus, Clostridium butyricum, y Clostridium saccharobutylicum tenían menor abundancia en los pacientes con MM, y que la presencia de Clostridium butyricum en un el modelo de ratón de MM redujo la progresión del tumor (114). Aunque aún no está del todo estudiado, Jasinski y colaboradores proponen que los AGCC pueden inhibir la función del NF-kB y de las citocinas proinflamatorias como IL- 6 y TNF-α (138), que desempeñan un papel en la activación de los osteoclastos para crear nichos para las células de mieloma y, además, promover diferenciación de los Th17 (139) (Figura 8). Por otro lado, se ha propuesto que los AGCC modulan directamente los procesos de regulación de la célula B y la diferenciación de la célula plasmática (140). En el contexto de la terapia, los AGCC también están involucrados en la respuesta al tratamiento. De hecho, en MM se ha visto que la abundancia de la microbiota productora del butirato estaba aumentada en pacientes de MM que alcanzaron una respuesta al tratamiento con enfermedad mínima residual negativa y tuvieron menor toxicidad (121). Las interacciones de los AGCC con el epitelio intestinal se basan en la modulación de la expresión génica a través de las HDAC y en la señalización a través de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR, G protein-coupled receptors en inglés) (128). Los AGCC, particularmente el propionato y el butirato, tienen una potente acción inhibitoria de las HDAC, que se ha visto demostrado en células de cáncer de colon (141) y recientemente en linfocitos T citotóxicos (142). En el estudio de Luu y colaboradores, se demostró además que la acción inhibitoria de HDAC del butirato refuerza la actividad antitumoral del sistema inmune y podrían ser de gran utilidad en el contexto de la inmunoterapia. El segundo mecanismo involucra a los receptores GPCRs como EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 46 GPCR109A, GPCR43 y GPR4, que pueden transmitir señales basadas en los diferentes tipos de células y ligandos (128). Las vías de señalización de los AGCC a través de los GPCR también se han visto que tienen un papel clave en la regulación de la respuesta inmune (143). Figura 8. Asociación entre la microbiota intestinal y la progresión del tumor en pacientes con mieloma múltiple. Las bacterias productoras de ácidos grasos de cadena corta se reducen significativamente, lo que da como resultado un aumento de los niveles de NF-κβ, IL-6 y TNF-α, que se sabe que contribuyen a la progresión tumoral en el MM. AGCC, ácidos grasos de cadena corta, MM, mieloma múltiple. Adaptada de Jasinski y colaboradores (138). Otro de los metabolitos producidos por la microbiota son las urolitinas, que son compuestos producidos a partir de los elagitaninos, que están presentes en las bayas del género Rubus (frambuesa, mora, mora, zarza ártica) y Fragaria (fresa), y en granadas, té, nueces y algunos otros frutos secos, vinos envejecidos en roble y uvas moscatel (144– 146). Tras la hidrólisis en el intestino, los elagitaninos se someten a lactonización para producir ácido elágico (EA, ellagic acid, en inglés) (146). A pesar de encontrarse en numerosos alimentos de la dieta, los elagitaninos y el EA tienen una baja INTRODUCCIÓN 47 biodisponibilidad y apenas se absorben en el intestino, por lo que llegan al colon donde son rápidamente metabolizados en urolitinas. Este proceso se realiza gracias a la microbiota, ya que se ha demostrado que la administración de EA en ratones asépticos no es suficiente para detectar urolitina (147), mientras que sí se consigue en presencia de microbiota (148). La urolitina A (UA) es la forma más activa biológicamente frente al resto de urolitinas (144,145) y la más conservada entre especies. El proceso de conversión de los precursores en UA no ocurre en todos los individuos y es dependiente de varios factores como la edad, la salud y la dieta además de tener una determinada microbiota intestinal (149). Aunque se han propuesto varias especies, la identificación de bacterias productoras de UA aún se investiga, siendo Gordonibacter el género más establecido (146). Los individuos que metabolizan elagitaninos y EA en urolitinas se clasifican en tres grupos o fenotipos llamados metabotipos. Mientras que aquellos que producen UA se clasifican como metabotipo A, los productores de UA, IsoUAy urolitina B se clasifican como metabotipo B. Las personas que no producen ninguna de las urolitinas o las producen en una cantidad no detectable se agrupan bajo el metabotipo 0 (144). Tras su absorción, la UA puede llegar a diferentes partes del organismo donde juegan un papel importante en la regulación de funciones y procesos biológicos de oxidación, inflamación, cáncer, obesidad, y envejecimiento (150). Su papel más estudiado es la mejora de la función mitocondrial, mediante la retirada y reciclaje de mitocondrias no funcionales a través del proceso de autofagia denominado mitofagia (145). En línea con esto, se ha visto que la UA tiene un papel en la fosforilación oxidativa de las proteínas mitocondriales (OXPHOS, mitocondrial oxidative phosphorylation, en inglés) (151,152), que está desregulado en algunos tumores hematológicos, entre ellos el MM (153). Sin embargo, no es el único mecanismo de acción, ya que también se han propuesto otros como la modulación del estrés oxidativo o la inhibición de la proliferación de las células cancerígenas (145) . En estudios in vitro, se ha visto que la UA ejerce acción anticancerígena (154) y su eficacia se ha probado en modelos celulares humanos de cáncer de próstata, de hígado, de mama, de colon, de páncreas y de endometrio (150). Se ha descrito que ejerce su acción EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 48 anticarcinogénica mediante la regulación de la expresión de varios oncogenes, genes que median en el ciclo celular, supresores de tumores y receptores de factores de crecimiento (155–158) (Figura 9). Figura 9. La producción urolitina A desde sus precursores gracias a la actividad de la microbiota intestinal. La ingesta en la dieta de alimentos ricos en elagitaninos y ácido elágico conduce a la conversión metabólica de estos precursores en urolitina A (UA) por parte de la microbiota. Esta conversión ocurre solo en presencia del microbioma apropiado. La UA también puede suplementarse directamente. Figura adaptada de D’Amico y colaboradores (145). Con respecto al ciclo celular, se ha visto que la exposición a UA resulta en la detención en la fase G2/M e inducción de la apoptosis en células cancerígenas (155). En la regulación del ciclo celular, la señalización de los supresores de tumores p53 y p21 son clave y estudiados en el proceso de carcinogénesis (159), incluido en el MM (160). Otra de las vías implicadas en el efecto antiproliferativo y antiapoptótico del tratamiento con UA es PI3K/AKT/mTOR, a través de la cual se ha demostrado su potente efecto inhibitorio en cáncer pancreático (157). La vía de PI3K/AKT/mTOR es una de las vías más estudiadas en cáncer, por lo que los inhibidores de esta vía se proponen como una opción terapéutica en algunas neoplasias hematológicas (161). Concretamente, en MM INTRODUCCIÓN 49 se ha visto que se activa de forma anómala en las células malignas, produciendo cambios en la expresión de mTOR (162). Desde su descubrimiento en 2005, numerosos trabajos se han centrado en profundizar en el estudio de la urolitina, desde entender su metabolismo y relación con la microbiota, hasta tratar de descubrir su interacción con la célula, mecanismos y vías en las que podría estar implicada (150). Hasta la fecha, este metabolito aún no se ha explorado en MM, pero la evidencia mencionada sobre su efecto en otros cánceres incentiva el interés para su estudio en este trabajo. 51 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 53 3.1. HIPÓTESIS Pese a los recientes avances, el MM continúa siendo una enfermedad de etiología desconocida. La estimulación crónica antigénica por parte de microorganismos tanto infecciosos como propios puede desencadenar el desarrollo de trastornos de proliferación de las células plasmáticas, entre los que se encuentra el MM. Las infecciones por VHB y VHC podrían ser una de las causas del origen del MM. Conocer si existe una relación causal ambas patologías, permitirá entender mejor el desarrollo de la enfermedad y proporcionará una mejora en la aproximación terapéutica en estos pacientes. Los microorganismos de la microbiota intestinal desempeñan un papel importante en el pronóstico y la respuesta a la terapia en el MM. Analizar las alteraciones en la composición de las poblaciones microbianas características de los pacientes con MM y estadios previos al MM podría tener utilidad como biomarcador pronóstico de la enfermedad. Asimismo, los metabolitos producidos por parte de la microbiota intestinal constituyen un factor clave en el metabolismo de los pacientes. El estudio de los compuestos derivados de la microbiota potencialmente terapéuticos como los AGCC o la urolitina supondrían un apoyo en el abordaje farmacológico de la enfermedad. 3.2. OBJETIVOS De esta forma, los objetivos específicos del trabajo son: 1. Evaluar la eficacia del tratamiento antiviral en la enfermedad de MM en pacientes con infecciones previas por VHC y VHB. 2. Analizar el reconocimiento antigénico por parte de la Ig Mc de pacientes con gammapatías monoclonales que hayan presentado infecciones previas por VHC. 3. Estudiar la composición y diversidad de la microbiota intestinal y su implicación en el MM. Identificar los microorganismos beneficiosos y perjudiciales, durante el desarrollo de la enfermedad y la respuesta a la terapia. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 54 4. Explorar el uso de los metabolitos liberados por la microbiota intestinal como los ácidos grasos y la urolitina con fines terapéuticos en la enfermedad de MM. 55 4. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 57 4.1. SELECCIÓN DE PACIENTES Y MUESTRAS 4.1.1. Estudio de pacientes con infecciones previas por hepatitis En primer lugar, para el estudio del desarrollo del MM en pacientes con infección previa por VHB y VHC se establecieron dos cohortes incluyendo datos de pacientes obtenidos de TriNetX, LLC (TriNetX, Massachusetts, EE.UU.), una red de investigación de salud federada que proporciona acceso a registros médicos electrónicos de centros de atención médica en todo el mundo. El estudio incluyó datos de sujetos de TriNetX Global Collaborative Network con un MM diagnosticado entre los últimos 3 a 20 años, después de un diagnóstico de infección por VHB o VHC, que habían recibido o no tratamientos antivirales. La información clínica de los pacientes de ambas cohortes se encuentra recogida en la Tabla 9. Cohorte VHB Cohorte VHC Tratamiento Antiviral Si No Si No Sexo n 175 1192 179 1041 H/M (H%) 73,7 60,1 65,9 64,8 Edad (años) n 175 1192 179 1041 Media ± SD 59,8 ± 10,4 61 ± 13,1 59,5 ± 8,9 60,2 ± 12,7 Hemoglobina (g/κµ) n 164 1125 175 946 Media ± SD 11,4 ± 3,08 11,1 ± 2,67 11,4 ± 2,57 10,9 ± 2,75 Plaquetas (109/l) n 166 1101 176 916 Media ± SD 158 ± 96,8 179 ± 102 161 ± 87,9 174 ± 100 Calcemia (mmol/l) n 159 1091 175 890 Media ± SD 2,25 ± 0,23 2,25 ± 0,21 2,27 ± 0,20 2,23 ± 0,23 Creatinina (μmol/l) n 164 1117 175 937 Media ± SD 173 ± 214 260 ± 906 250 ± 933 247 ± 715 Lesiones óseas n 175 1192 179 1041 n con lesiones 61 449 78 379 Tabla 9. Características clínicas al diagnóstico de los pacientes con MM después de la infección por VHC o VHB, dependiendo de si han recibido o no tratamiento antiviral. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 58 n, número de pacientes; SD, desviación estándar; VHB, virus de la hepatitis B; VHC, virus de la hepatitis C. Se consultaron las cohortes en TriNetX hasta el 22 de marzo de 2022 y se recopilaron dos grandes cohortes de pacientes con MM que habían sido infectados por el VHB (VHB positivos, n=1367) o el VHC (VHC positivos, n=1220). Los pacientes se clasificaron en cuatro grupos: pacientes infectados con MM que recibieron tratamiento antiviral (contra el VHB, n=175; o contra el VHC, n=179), y los que no (n=1192 para pacientes VHB positivos; n=1041 para pacientes VHC positivos) (Figura 10). Figura 10. Diagrama de flujo de selección de pacientes. Diseño de selección de cohortes de pacientes con MM e infección previa por VHB (en naranja) o por VHC (en azul). VHB, virus de la hepatitis B; VHC, virus de la hepatitis C; MM, mieloma múltiple. En segundo lugar, para el análisis del reconocimiento específico de los antígenos en pacientes con infección previa por VHC, se estableció una tercera cohorte con pacientes del Hospital 12 de Octubre que presentasen GMSI o MM y que hubieran sido infectados previamente con VHC. Las características clínicas de estos pacientes al diagnóstico están recogidas en la Tabla 10. MATERIALES Y MÉTODOS 59 Pacientes P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Sexo (H/M) M M M H H H M M M Edad (años) 66 67 53 78 56 53 76 80 79 Diagnóstico MM IgGλ GMSI IgGκ GMSI IgGκ GMSI IgAλ MM BJ κ GMSI IgAλ GMSI IgGκ MM IgAλ MM IgGκ Fecha de diagnóstico Ago 2011 Ene 2003 Nov 2017 Jun 2016 Oct 2014 Sep 2018 Nov 2015 Ene 2006 Sep 2016 Ig Mc (g/dl) 5,67 1,72 0,74 1,47 0,0914 1,23 1,17 4,37 1,57 ISS IIA NA NA NA III NA NA IIA III Hemoglobina (g/dl) 12,8 15 15,1 12,6 10,3 15,9 10,5 11,6 10 Creatinina (mg/dl) 0,72 0,73 0,63 1,03 7,99 0,92 1,07 0,96 1,99 Células plasmáticas en médula ósea (%) 16 - - 9 98 - - 36 45 Plaquetas (109/l) 163 170 309 173 190 104 206 152 231 Leucocitos (109/l) 3,4 7,1 5 4,5 4,8 5,6 6,3 3,4 6,8 Calcemia (mmol/l) 2,4 2,5 2,3 2,4 2,3 2,3 2,4 2,5 2,3 β2-Microgobulina (mg/l) 2,9 - 2,1 - 13,07 - - 6,44 5,9 Citogenética de alto riesgo No - - - No No Sia No No LDH alta No No Si No Si No No No Si Tabla 10. Características clínicas al diagnóstico de los pacientes con gammapatías e infección previa por VHC. VHC, virus de la hepatitis C; H, hombre; M, mujer, P, paciente; MM, mieloma múltiple; Ig, Inmunoglobulina; BJ, Bence-Jones; Mc, monoclonal; CP, células plasmáticas; MO, médula ósea; GMSI, gammapatía monoclonal de significado incierto; ISS, sistema internacional de estadiaje (en inglés); LDH, lactato deshidrogenasa; NA, no aplicable. a Citogenética de alto riesgo: del17p, t(4;14), t(14;16) o t(14;20). En los últimos 20 años, nueve pacientes desarrollaron GMSI (n=5) o MM (n=4) tras la infección por VHC y fueron clasificados en dos grupos: pacientes infectados con MM que recibieron tratamiento antiviral (n=6) y los que no (n=3). La información sobre los tratamientos antivirales y hematológicos recibidos por esta cohorte de pacientes se EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 60 encuentra recogida en el anexo 1 (Tabla 20). Se recogieron muestras de suero de los pacientes P1-P9 y en el caso del paciente P1, se seleccionaron muestras de células plasmáticas purificadas disponibles en el Biobanco de muestras del Hospital 12 de Octubre. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Instituto de Investigación Biomédica del Hospital 12 de Octubre, habiendo dado los pacientes su consentimiento informado por escrito, tras haber comprendido el mismo, de acuerdo con las directrices recogidas en la Declaración de Helsinki. 4.1.1. Estudio de la microbiota intestinal Para los estudios de microbiota intestinal se reclutaron 46 pacientes con GMSI (n=11), MMq (n=9), MM al diagnóstico (MMdx) (n=10), MM en recaída y/o refractario (MMrr) (n=7) y MM en remisión completa (MMrc) (n =9, 3 de ellos emparejados con el momento de diagnóstico). El grupo control consistió en individuos sanos (n = 8, mediana de edad 66 años; rango 49-94 años) sin signos de enfermedad en la médula ósea. Las características clínicas de estos pacientes al diagnóstico están recogidas en la Tabla 11. Para el estudio de la microbiota intestinal se recogieron muestras de heces y de suero, que fueron alicuotadas y almacenadas a -80°C. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Instituto de Investigación Biomédica del Hospital 12 de Octubre y todos los pacientes y donantes sanos dieron su consentimiento informado por escrito, tras haber comprendido el mismo, de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. MATERIALES Y MÉTODOS 61 GMSI MMq MMdx MMrr MMrc Pacientes 11 9 10 7 9 Sexo n 11 9 10 7 9 H/F (H%) 45 67 70 71 78 Edad (años) n 11 9 10 7 9 Mediana 72 58 68 72 58 Rango (Min-Max) 51-85 28-86 49-85 42-80 49-75 Ig Mc (g/dl) n 11 9 10 6 7 Mediana 0,48 1,2 2,61 0,875 0,07 Rango (Min-Max) 0-1,27 0,8-4,3 0,08-6,8 0,16-2,25 0-4,3 CP en MO (%) n 3 8 10 5 6 Mediana 7 21 29,5 26 1 Rango (Min-Max) 6-8 7-60 2-77 1-50 0-44 Leucocitos (109/l) n 11 8 10 7 9 Mediana 5,5 6,3 6,05 5 6,2 Rango (Min-Max) 4,1-8,6 4,9-7,3 2-12,7 1,8-13,8 0,78-13,4 Hemoglobina (g/dl) n 11 9 10 7 9 Mediana 13,8 13,6 11,4 11,4 12,1 Rango (Min-Max) 11,1-16,1 10,2-16,2 7,4-16,7 7,6-12,7 10,7-14,9 Plaquetas (109/l) n 11 8 10 7 9 Mediana 210 263,5 217,5 148 197 Rango (Min-Max) 99-364 237-327 101-344 80-423 109-350 Calcemia (mg/dl) n 9 8 9 7 8 Mediana 2,43 2,35 2,40 2,35 2,41 Rango (Min-Max) 2,35-2,52 1,6-2,47 2,25-2,8 2,07-2,45 2,07-3,52 Creatinina (mg/dl) n 11 9 10 7 8 Mediana 0,91 0,8 1,035 0,92 0,885 Rango (Min-Max) 0,59-1,74 0,54-5,36 0,69-2,01 0,77-4 0,73-1,87 Lesiones óseas n 9 5 10 6 4 n con lesiones (%) 11,11 0 60 83,33 25 ISS n 0 2 8 3 5 Estadio I 0 1 3 0 3 Estadio II 0 0 4 1 1 Estadio III 0 0 1 2 1 Tabla 11. Características clínicas de los pacientes del estudio de la microbiota intestinal en el momento de la recogida de las muestras. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 62 H, hombre; M, mujer; GMSI, gammapatía monoclonal de significado incierto; MMdx, mieloma múltiple (MM) a diagnóstico; MMq, mieloma quiescente; MMrr, MM en recaída y/o refractario; MMrc, MM en remisión completa Ig, Inmunoglobulina; Mc, monoclonal; ISS, sistema internacional de estadiaje (en inglés). 4.2. ESTUDIO DE LA EVOLUCIÓN DEL MM E INFECCIÓN PREVIA POR VHC 4.2.1. Determinación de la carga viral La determinación cuantitativa del ARN del VHC en las muestras de plasma de los pacientes del Hospital 12 de Octubre con infección previa por VHC se llevó a cabo usando el ensayo Veris HCV en el que se realiza una amplificación cuantitativa de del ARN del VHC, una vez realizada su transcripción inversa a ADN complementario (ADNc), usando el sistema DxN Veris Molecular Diagnostics System (Beckman Coulter, California, EE.UU.) calibrado según los estándares internacionales de la Organización Mundial de la Salud (163). Este sistema integra la extracción de ácidos nucleicos, la transcripción reversa, la amplificación mediante PCR cuantitativa (PCRq, PCR quantitative en inglés) y la detección mediante ensayo Taqman™ (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE.UU.). 4.2.2. Determinación de los niveles de Ig Mc para monitorizar la enfermedad Para el seguimiento de la enfermedad en los pacientes con gammapatía e infección previa por VHC se cuantificaron los niveles de Ig Mc, de Ig totales o de cadenas ligeras kappa/lambda en suero, dependiendo del paciente. Los niveles de proteína se visualizaron mediante los sistemas de electroforesis de proteínas y/o inmunofijación empleados en la práctica clínica (22). Esta determinación se llevó a cabo de manera rutinaria siguiendo las guías clínicas actuales en el Hospital 12 de Octubre. MATERIALES Y MÉTODOS 63 4.2.3. Análisis multiparamétrico de citometría de flujo Utilizando muestras de médula ósea, se determinó el IF mediante la técnica de CMF descrita anteriormente (164) y utilizada de forma rutinaria en la práctica clínica. Las aberraciones fenotípicas detectadas en el diagnóstico se usaron para la evaluación de la enfermedad residual molecular después de la terapia de inducción. Durante el seguimiento, la respuesta inmunofenotípica se definió como la ausencia de células plasmáticas patológicas detectables a un nivel de sensibilidad de 10-5, siguiendo los criterios del IMWG. 4.2.4. Secuenciación de inmunoglobulinas mediante secuenciación de nueva generación El número de clones de células plasmáticas presentes en las muestra del paciente P1 y la carga tumoral se analizaron mediante secuenciación de nueva generación (NGS, next- generation sequencing, en inglés). Partiendo de 650 ng de ADN, se llevó a cabo una amplificación por PCR con AmpliTaq Gold™ DNA Polymerase (ref. N8080240, Life Technologies, Madrid, España) y cebadores estandarizados cebadores estandarizados desarrollados por Biomed-2 para amplificar todas las inmunoglobulinas pesadas y ligeras lambda KVJ y FR2, siguiendo el protocolo descrito anteriormente (165) en un volumen final de 50 µl con las condiciones indicadas en la Tabla 12. Para comprobar la correcta amplificación, se realizó una electroforesis de agarosa durante 1 hora y media en el aparato QIAxcel Advanced (Qiagen, Hilden, Alemania) utilizando el marcador QX alignment marker 15 BP/3KB (ref. 929530, Qiagen). Después se procedió a la purificación del producto utilizando las esferas magnéticas Agencourt® AMPure® XP Reagent (ref. A63882, Beckman Coulter) en proporción 1X, siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la cuantificación de las muestras en el equipo Qubit® 4.0 Fluorometer, empleando los reactivos del kit Qubit® dsDNA BR Assay (ref. Q32853, Thermo Fisher Scientific), se llevó a cabo la preparación de librerías utilizando el kit NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep de Illumina® (ref. E7103, New England Biolabs, Massachusetts, EE.UU.). Tras la preparación de amplicones, se procedió al ligado y purificación de adaptadores con las esferas mencionadas anteriormente con las condiciones recogidas en la Tabla 12. A continuación, se realizó el enriquecimiento del ADN mediante PCR con NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (ref. E7600, New EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 64 England Biolabs) y posterior purificación con las esferas magnéticas utilizadas anteriormente. Después, se llevó a cabo la secuenciación en el aparato MiSeq™ (Illumina, California, EE.UU.). Los datos de secuenciación se analizaron para identificar y cuantificar la secuencia específica del clon (clonotipo) presente en cada muestra. La identificación de clonotipos se realizó utilizando el software MiXCR Immune Repertoire Analyzer (MiLaboratories, California, EE.UU.) se identificó un clonotipo cuando se obtuvieron al menos 400 lecturas de secuenciación idénticas o estaban presentes con una frecuencia >1 %. Reacción Ciclos Tiempo Temperatura(C°) Amplificación inicial 1 7 minutos 95 35 30 segundos 94 31 segundos 60 32 segundos 72 1 10 minutos 72 1 ∞ 4 Preparación de amplicones 1 30 minutos 20 1 30 minutos 65 1 ∞ 4 Ligado de adaptadores 1 15 minutos 20 Enriquecimiento del ADN 1 30 segundos 98 4-12 30 segundos 98 75 segundos 65 1 5 minutos 65 1 ∞ 4 Tabla 12. Descripción del programa empleado en la secuenciación de inmunoglobulinas. 4.2.5. Purificación de las Ig Mc y evaluación de su pureza La purificación de las inmunoglobulinas monoclonales IgG e IgA del resto de inmunoglobulinas presentes en el suero se llevó a cabo mediante la separación de proteínas en electroforesis en gel de agarosa utilizando el kit SAS-1 Hi-Res-12- High Resolution (ref. 200700, Helena Biosciences, Gateshead, Reino Unido) (Figura 11). Primero, se preparó la muestra de cada paciente diluyendo 2 µl del suero en 38 µl de PBS y a continuación se cargó el gel con 35 µl en cada pocillo utilizando la misma muestra en todos los pocillos del gel. Posteriormente se llevó a cabo la electroforesis durante 12 min, a 18ºC, con 250V y 10 aplicaciones en el aparato SAS-1 (Helena Biosciences). Al MATERIALES Y MÉTODOS 65 finalizar la electroforesis, se cortaron y tiñeron los pocillos de los extremos con el colorante violeta ácido de alta resolución (ref. HL17535A, Helena Biosciences) del mismo kit durante 15 min y se realizó un primer secado de 15 min a 70 ºC. Tras decolorar en solución de ácido acético 10% (ref. 45726, Sigma-Aldrich, Missouri, EE.UU.), agua 45%, y etanol (ref. 45726, PanReac AppliChem, Ottoweg, Alemania)) 45%, se realizó un segundo secado a 70ºC durante 10 min. Utilizando de guía los pocillos teñidos para identificar la banda de la proteína monoclonal, se recortó la banda que contenía la proteína monoclonal de los restantes pocillos del gel sin teñir y se extrajo la proteína en PBS durante toda la noche en agitación a 37 ºC. A continuación, se centrifugó a 8000 rpm durante 6 min para extraer el sobrenadante. Para determinar la concentración de proteína, se cuantificó a 280 nm en el espectrofotómetro ND-1000 Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). Figura 11. Esquema del proceso de purificación de inmunoglobulina monoclonal a partir de muestras de suero. Para cada paciente, la muestra de suero diluida se cargó en todos los pocillos del gel y se llevó a cabo la electroforesis. Después, se recortó el gel por los pocillos extremos y se tiñeron los bordes. Tras la reconstrucción del gel, se localizó la banda de interés y se recortó la región del gel no EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 66 teñido a la misma altura. Finalmente, se eluyó el contenido de los pocillos no teñidos para obtener la muestra de Ig Mc purificada del paciente. Ig Mc, inmunoglobulina monoclonal. La pureza de cada fracción de Ig Mc fue analizada mediante electroforesis e inmunotransferencia a partir de 50 ng de proteína. Para ello, se realizó un gel de isoelectroenfoque en un rango de pH 3-10, se transfirió en membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF) Immun-Blot® (ref. 162-0177, Bio-Rad Laboratories, California, EE.UU.) y se incubó con anticuerpos de conejo conjugados con peroxidasa de rábano anti- IgG humana (cadenas pesadas y ligeras) (descatalogado, Dako Santa Clara, California, EE.UU.) y anti- IgA humana (cadena alfa) (descatalogado, Dako Santa Clara, California, EE.UU.). Para ver el resultado de la purificación de las inmunoglobulinas monoclonales y la evaluación de la pureza en estos pacientes consultar el anexo 2. Como excepción, en un paciente diagnosticado con MM BJ de cadenas ligeras kappa, la purificación se llevó a cabo usando las bolas magnéticas PureProteome™ Protein G (ref. LSKMAGG10, Merck Millipore, Massachusetts, EE.UU.) y PureProteome™ Protein Kappa (ref. LSKMAGKP02, Merck Millipore) y la pureza se comprobó mediante electroforesis nativa en gel de poliacrilamida al 15% a 120V durante 6 horas y posterior tinción con Coomassie (ref. 1610436, Bio-Rad Laboratories) durante 1 hora en agitación. Después se lavó durante 2 horas (4 lavados de 30 min) con solución decolorante compuesta de ácido acético al 10%, metanol al 50% y agua destilada al 40%. 4.2.6. Análisis de la especificidad del reconocimiento antigénico de las Ig Mc purificadas Para analizar la reactividad de la IgG monoclonal frente a las proteínas del VHC, se utilizó el test INNO-LIA™ VHC Score (ref. 80538, Fujirebio, Tokio, Japón), que se basa en la realización de un inmunoensayo con antígenos bien definidos derivados de proteínas dominantes del VHC de la región del núcleo o core, la región hipervariable E2, la región helicasa NS3 y las regiones NS4A, NS4B y NS5A. Los antígenos utilizados son proteínas recombinantes o péptidos sintéticos, altamente purificados y fijados en una membrana de nailon. Si están presentes en la muestra, los anticuerpos contra el VHC se unen a las líneas de antígeno del VHC en la tira y la unión se detecta mediante la adición de un conjugado de cabra anti-IgG humana (H+L) marcado con fosfatasa alcalina. El procedimiento se MATERIALES Y MÉTODOS 67 llevó a cabo partiendo de 10 µl de muestra de la Ig Mc purificada y de suero de cada paciente, siguiendo las instrucciones y con los reactivos del kit (Figura 12). Figura 12. Protocolo de análisis de la reactividad frente al virus de la hepatitis C. Primero, se incubaron las tiras reactivas con la muestra de suero diluida en 1 ml de solución diluyente, se incubo en agitación a temperatura ambiente toda la noche y se lavó 3 veces durante 5 minutos con la solución de lavado. A continuación, se incubó durante 30 minutos primero con 1 ml de la solución de conjugado y tras repetir los lavados, con 1 ml de la solución con el sustrato. Finalmente, tras añadir la solución final para detener la reacción con otra incubación de 30 minutos, se procedió a secar las tiras para su posterior interpretación de antígenos del VHC: proteínas C1, C2, E2, NS3, NS4 y NS5. Para las inmunoglobulinas monoclonales IgA, se realizaron ensayos dot-blot en membranas de nitrocelulosa (ref. 10600124, Sigma-Aldrich) con 1µg de proteína recombinante de la región del core, NS3 y NS4 (ref. ab49015, ab138346, ab49027, EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 68 Abcam, Cambridge, Reino Unido). Una vez secadas, las membranas se saturaron en tampón fosfato salino (PBS, ref. BE17-516F, Lonza, Walkersville, EE. UU.) - Tween® 20 (Tw, ref. P9416, Sigma-Aldrich) y albúmina de suero bovino (BSA, bovine serum albumin en inglés, ref. A2153, Sigma-Aldrich) al 5% durante 2 horas y se incubaron con la muestra de suero y Ig Mc purificada de cada paciente durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, se incubaron durante 1 hora con anticuerpo de asno anti- humano IgG (H+L) AffinityPure (ref. 709-035-149, Jackson ImmunoResearch, Cambridge, Reino Unido) con dilución 1:1000 y se reveló con el kit ECL™ Start Western Blotting Detection Reagent (ref. GERPN3243, Thermo Fisher Scientific), para la detección de señal quimioluminiscente. En el caso del paciente diagnosticado con MM BJ de cadenas ligeras kappa, se utilizó el kit Alinity i Anti-VHC (ref. 08P0622, Abbott GmbH & Co. Weisbaden, Alemania), que se basa en un inmunoanálisis quimioluminiscente de micropartículas en la que se utilizan los antígenos de VHC de la región del núcleo o core, de la región NS3 y NS4. La presencia o ausencia de anticuerpos anti-VHC en la muestra se determinó comparando en el aparato Alinity i System (Abbott GmbH & Co.) las unidades relativas de luz (URL) quimioluminiscentes de la reacción con las URL del punto de corte determinadas a partir de una calibración activa. Este ensayo se realiza de manera rutinaria en la práctica clínica del Hospital 12 de Octubre y en este estudio se llevó a cabo a partir de las muestras de suero y de inmunoglobulinas monoclonales purificadas de los pacientes, siguiendo las instrucciones del kit. Para analizar reactividad de las inmunoglobulinas presentes en el suero y en las Ig Mc purificadas (G o A) a otros microorganismos, se utilizó el ensayo Multiplex infectious- antigen arraay (MIAA) desarrollado y descrito por Hermouet y colaboradores (65,166). El ensayo MIAA se realizó frente a 8 patógenos infecciosos utilizando antígenos y/o lisados comerciales de los mismos (Tabla 13): B. burgdorferi: proteína VisE y una mezcla de dos antígenos, CMV: una mezcla de cinco antígenos; virus Epstein-Barr (VEB): antígeno nuclear 1 (EBNA-1) y proteína viral de la cápside (VCA); H. pylori: FC509; VHS-1: proteína gG y un lisado; VHS-2: proteína gG; Toxoplasma gondii: proteínas 24 y 30; virus Varicela-zoster (VVZ): proteína gE y Orf26. MATERIALES Y MÉTODOS 69 Microorganismo Antígeno/ Proteína Referencia (Fabricante) VHC Core C1 ab49015 (Abcam) NS3 ab138346 (Abcam) NS4 ab49027 (Abcam) B. burgdorferi VisE ab138339 (Abcam) p41 - (Abcam) p66 - (Abcam) CMV pp28 ab43038 (Abcam) glicoproteína B ab43040 (Abcam) UL80a ab43042 (Abcam) ICP36 ab43044 (Abcam) pp65 ab54103 (Abcam) VEB EBNA-1 ab138345 (Abcam) VCA ab43145 (Abcam) H. pylori FC509 FC509 (EastCoast Bio) VHS-1 gG ab43048 (Abcam) lisado 10-145-000 (Advanced Biotech, Nueva Jersey, EE.UU.) VHS-2 gG ab67703 (Abcam) T. gondii p30 ab68110 (Abcam) p24 ab43137 (Abcam) VVZ Ge ab43050 (Abcam) Orf26 ab43052 (Abcam) Tabla 13. Listado de antígenos y proteínas empleados en los ensayos de reconocimiento antigénico. Se detalla la referencia y fabricante de los antígeno y proteína de cada uno de los microorganismos utilizados en los ensayos de reconocimiento antigénico. VHC, virus de la hepatitis C; VEB, virus Epstein-Barr; EBNA-1, antígeno nuclear 1; VCA, proteína viral de la cápside; CMV, citomegalovirus; H. pylori, Helicobacter pylori; B. burgdorferi, Borrelia burgdorferi; T. gondii, Toxoplasma gondii; VHS-1, virus herpes simple 1, VHS-2, virus herpes simple-2; T. Gondii, Toxoplasma gondii; VVZ, virus de la varicela Zoster. Para cada paciente, se analizaron en paralelo las muestras de suero (Ig policlonales e Ig Mc) y la Ig Mc purificada. Las concentraciones de inmunoglobulina se ajustaron a 400 µg/ml para el suero y entre 50 y 200 µg/ml para la Ig Mc purificada, en un volumen de 80µL. Los portaobjetos del MIAA fueron incubados durante 2 horas con las distintas muestras a temperatura ambiente. Después de varios lavados, se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-humano IgG (H+L) o IgA (0.2 µg/ml) marcado con Dylight 680™ (ref. IR2904, Immunoreagents, Carolina del Norte, EE.UU.). La señal EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 70 fluorescente se detectó con el sistema de escáner de imagen infrarroja Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, EE.UU.) y se cuantificó usando el programa GenePix© Microarray Acquisition & Analysis (Molecular Devices, California, EE.UU.). Se utilizaron 3 umbrales de detección positiva: 500, para H. pylori y Toxoplasma gondii (T. gondii); 1000 para CMV, VHS-1 y VHS-2 y 1400, para VEB, VVZ y B. burgdorferi. Las señales detectadas por debajo de esos umbrales se consideraron negativas (Figura 13). Figura 13. Descripción del ensayo MIAA. El ensayo MIAA (multiplex infectious-antigen array, en inglés) consiste en un portaobjetos que contiene 16 membranas; cada membrana se representa ampliada, con los antígenos o los lisados por triplicado. Para cada paciente, las Ig del suero o la Ig Mc purificada se ensayan en paralelo utilizando el ensayo MIAA; cada tipo de muestra se ensaya al menos en duplicado. La señal de fluorescencia indica el estado serológico de cada muestra y está representada como la intensidad de la muestra después corregida tras eliminar la señal de fondo (F-B). Como controles positivos o negativos se utilizan muestras que contengan o no Ig específicas cada uno de los antígenos o proteínas testadas. VEB, virus Epstein-Barr; EBNA-1, antígeno nuclear 1; VCA, proteína viral de la cápside; Ag, antígeno; CMV, citomegalovirus; H. pylori, Helicobacter pylori; VHS-1, virus MATERIALES Y MÉTODOS 71 herpes simple 1, VHS-2, virus herpes simple-2; T. gondii, Toxoplasma gondii; VVZ, virus varicela Zoster; PBS, tampón fosfato salino (phosphate saline buffer, en inglés); BSA, albúmina de suero bovino (bovine serum albumin, en inglés). 4.3. ANÁLISIS DE LOS MICROORGANISMOS Y LOS METABOLITOS DE LA MICROBIOTA 4.3.1. Extracción y cuantificación de ADN La extracción de ADN de muestras de heces se llevó a cabo utilizando el kit AllPrep® PowerFecal® DNA/RNA (ref. 80244, Qiagen) partiendo de entre 100-200 mg de muestra y siguiendo las instrucciones del fabricante. La cuantificación de la concentración de ADN obtenida se determinó con el kit Qubit® dsDNA HS Assay (ref. Q32854, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) utilizando el equipo Qubit® 4.0 Fluorometer (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). 4.3.2. Secuenciación de ARN de la subunidad ribosomal 16s La secuenciación del gen bacteriano del ARN ribosómico (ARNr) 16S fue llevada a cabo por la empresa Zymo Research utilizando el kit de preparación de librerías Quick-16S™ NGS (ref. D6400, Zymo Research, California, EE.UU.) (Figura 14). Primero, se realizó una amplificación dirigida mediante PCRq partiendo de 2 µl de ADN a una concentración de 5-20 ng/µl y utilizando los cebadores Quick-16S™ Primer Set V3-V4 (ref. D6405-2-400, Zymo Research) en el termociclador 7500 Real-Time PCR System® (Applied Biosystems, Massachusetts, Estados Unidos). Las condiciones de la PCR se detallan en la Tabla 14. Tras hacer una limpieza de enzimas mediante otra PCR, se añadieron los códigos identificativos y los productos finales de PCRq se cuantificaron con lecturas de fluorescencia. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 72 Figura 14 .Esquema del proceso de análisis taxonómico mediante la secuenciación del gen de ARNr 16s en muestras de microbiota. A partir de la muestra de heces, se llevó a cabo la extracción del ADN, después se amplificaron las regiones de interés V3-V4 del gen ARNr 16S, se secuenció y posteriormente se llevó a cabo la comparación y agrupación de secuencias similares OTUs (operational taxonomic unit, en inglés) y el análisis bioinformático con la ayuda de programas informáticos y bases de datos. La librería final se agrupó en base a la misma molaridad y finalmente se purificó con Select-a-Size DNA Clean & Concentrator™ (ref. D4080, Zymo Research), y se cuantificó con TapeStation® (Agilent Technologies, California, EE.UU.) y Qubit® 4.0 Fluorometer (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Como control positivo, para cada extracción de ADN se utilizó el estándar de comunidad microbiana ZymoBIOMICS® (ref. D6300, Zymo Research). Por último, la librería final se secuenció en el secuenciador Illumina® MiSeq™ con un kit de reactivos v3 (600 ciclos). MATERIALES Y MÉTODOS 73 Reacción Ciclos Tiempo Temperatura (C°) Amplificación inicial 1 10 minutos 95 20 30 segundos 95 30 segundos 55 3 minutos 72 1 ∞ 4 Limpieza de enzimas 1 15 minutos 37 1 10 minutos 95 1 ∞ 4 Adición de códigos identificativos 1 10 minutos 95 5 30 segundos 95 30 segundos 55 3 minutos 72 1 ∞ 4 Cuantificación de la librería 1 2 minutos 72 ∞ 4 Tabla 14. Descripción del programa empleado en la secuenciación de gen ARNr 16S. 4.3.3. Análisis bioinformático Para cada muestra, se llevó a cabo la asignación de bases, el filtrado para detectar muestras de baja calidad, la eliminación de lecturas policlonales y la asignación de las lecturas a cada muestra correspondiente. Después, se eliminaron las regiones del cebador y las secuencias se recortaron a fragmentos de 150 pares de bases. Los archivos en formato FASTQ se analizaron con el programa QIIME 2 (v2019.7) para quitar replicados de lecturas y eliminar singletes. Después, se realizó el agrupamiento de unidades taxonómicas operativas (OTU, operational taxonomic unit, en inglés) con una similitud del 99 % utilizando la base de datos SILVA 16S (v132). Las abundancias relativas de OTUs se calcularon como proporciones porcentuales con respecto al número total de lecturas por muestra. Los análisis de diversidad alfa y beta se llevaron a cabo utilizando una estrategia bioinformática en Python. Para evaluar la diversidad alfa, se calcularon las siguientes métricas: los índices Chao 1, Pielou, Simpson y Shannon. Para estudiar la diversidad beta, se calculó la disimilitud de Bray-Curtis. Luego, se aplicó el análisis de coordenadas principales a las matrices de disimilitud resultantes, y se usaron gráficos de análisis de coordenadas principales bidimensionales para visualizar la disimilitud composicional entre grupos y muestras. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 74 A continuación, se realizó la asignación de las OTUs identificadas utilizando las bases de datos QIIME2 y SILVA 16S. Para el análisis de predicción metagenómica, se utilizó el programa PICRUSt2 (v2.2.0-b), utilizando los perfiles de genes ortólogos de la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, en inglés). El análisis de PICRUSt2 se basa en las secuencias del gen del ARN ribosomal 16S y asocia las OTUs con el contenido del gen. Se utilizó el análisis del tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSE, Linear discriminant analysis Effect Size, en inglés) para identificar taxones diferencialmente abundantes y vías funcionales entre los grupos. Finalmente, se filtraron los taxones con una abundancia relativa menor del 0,01 %. 4.3.4. Cuantificación del género Gordonibacter Para llevar a cabo la cuantificación del género Gordonibacter, se contó con la colaboración del grupo liderado por la Dr. Victoria Selma (Laboratorio de Alimentación y Salud, Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura- Centro Superior de Investigaciones Científicas, CEBAS-CSIC), siguiendo el protocolo descrito anteriormente (167). Primero, se extrajo el ADN a partir de 200 mg de muestra fecal, utilizando el kit QIAamp DNA stool Mini (ref. 51504, Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, se determinó la concentración del ADN obtenido utilizando el aparato NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific). Después, se realizó la amplificación de Gordonibacter mediante PCRq utilizando los cebadores y sonda diseñados por el grupo colaborador a partir de las secuencias del gen ARNr 16S obtenidas de la base de datos GenBank (base de datos del European Molecular Biology Laboratory) alineados con el programa CLUSTAL W (168). La sonda TaqMan tenía marcaje con 6-carboxifluoresceína (FAM) en el extremo 5’ y el blackberry quencher (BBq). Las concentraciones finales de la sondas y cebadores fueron de 100 nM. La PCRq se llevó a cabo en el termociclador 7500 Real-Time PCR System® (Applied Biosystems) con las condiciones detalladas en la Tabla 15. Las muestras se analizaron en triplicado y comparando con una curva de estándares de ADN genómico con 6 diluciones seriadas de Gordonibacter pamelaeae (cuya secuencia de ADN está depositada en la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemania) con el número de depósito DSM 19378T). MATERIALES Y MÉTODOS 75 Reacción Ciclos Tiempo Temperatura (C°) Desnaturalización 1 5 minutos 95 Alineamiento 20 30 segundos 94 45 segundos 55-65 con autoincremento de 0.5 2 minutos 72 20 30 segundos 94 45 segundos 55 2 minutos 72 Extensión 1 5 minutos 72 Tabla 15. Descripción del programa de PCR cuantitativa para la cuantificación del género Gordonibacter. 4.3.5. Análisis de metabolitos producidos por la microbiota 4.3.5.1. Cuantificación de los niveles de AGCC La cuantificación de AGCC se llevó a cabo en muestras de suero mediante espectrometría de masas con la tecnología de triple cuadrupolo (LC-QQQ-MS, en inglés) con monitorización de múltiples reacciones (MRM, multiple reaction monitoring, en inglés), en el servicio del Centro de Asistencia a la Investigación (CAI) de Espectrometría de Masas de la Universidad Complutense de Madrid. Como estándares, se preparó una mezcla con 5000 mg/l de acetato, propionato, y butirato (ref. 71251, 18215, B103500, Sigma-Aldrich) en una solución de acetonitrilo con agua en proporciones 1:1. Para la preparación de las muestras, las proteínas se precipitaron con un volumen igual de acetonitrilo LiChrosolv® (ref. 1.00029.1000, Supelco®, Sigma-Aldrich) y H2O (1:1). Después de centrifugar durante 10 minutos a 4ºC, se procedió a la derivatización mezclando 40 µl de cada muestra o de la mezcla de estándares con 20 µl de clorhidrato de 3-3-nitrofenilhidrazina (ref. E6383, Sigma-Aldrich) y 20 µl de N-(3- dimetilaminopropil)-N' 120 mM. -clorhidrato de etilcarbodiimida en piridina al 6% (ref. P/7920/08, Thermo Fisher Scientific). Posteriormente, se incubaron durante 30 min a 40 ºC. Luego, los estándares y las muestras se diluyeron en 1920 µl y 920 µl de acetonitrilo al 10%, respectivamente. Finalmente, tanto los estándares como las muestras se filtraron con filtros de polímero de politetrafluoroetileno de 0,22 μm (ref. GVWP04700, Sigma- Aldrich) y se analizaron mediante un espectrómetro de masas LC-ESI-QQQ 8030 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón). Los análisis se realizaron inyectando 30 µl EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 76 utilizando agua con 0,01% de ácido fórmico (A) (CL00.1308.1000, ChemLab, Zedelgem, Bélgica) y acetonitrilo con 0,01% de ácido fórmico (B) como fases móviles y con un flujo de 0,6 ml/min. El gradiente utilizado fue el siguiente: 0-2 min, 20% A; 2-7 min 40% B; 7-7,5 min 40%-100% B, 8-11 min, vuelta a las condiciones iniciales. 4.3.5.2. Cuantificación de los niveles de uroli tina s Para cuantificar los niveles de urolitinas se contó con la ayuda del grupo dirigido por el Dr. Tomás Barberán (Laboratorio de Calidad, Seguridad y Bioactividad de Alimentos Vegetales, CEBAS-CSIC) siguiendo el protocolo descrito previamente (169). Se partió de 300 mg de muestras de heces, que se descongelaron y se homogeneizaron con 10 ml de metanol con dimetilsuldóxido (DMSO) y agua (en proporciones 40:40:20) y con cloruro de hidrógeno (HCl) al 0,1% utilizando un homogeneizador ultrasónico Vibra- Cell™ VC 50 durante 1 min. Después, esta mezcla se centrifugó a 5000×g durante 10 min a temperatura ambiente y se filtró el sobrenadante con un filtro de PVDF de 0,22 μm (ref. SLGVV255F, Merck Millipore). Una vez preparadas las muestras, se llevó a cabo la espectrometría de masas HPLC-DAD-ESI en un cromatógrafo HPLC (serie 1200, Agilent Technologies) acoplado con un detector de espectrómetro de masas de cuadrupolo único y un detector de matriz de diodos en serie (6120 cuadrupolo, Agilent Technologies). Se inyectaron 5 µl de muestra en una columna Poroshell 120 EC-C18 (3 x 100 mm, 2,7 µm) (ref. HEWL695970-302, Agilent Technologies) utilizando agua con 0,5% de ácido fórmico (A) y acetonitrilo (B) como fases móviles y un flujo de 0,5 ml/min. Se utilizó el siguiente gradiente: 0-7 min, 5-18 % B, 7-17 min, 18-28 % B, 17-22 min, 28-50 % B, 22- 27 min, 50-90 % B mantenido durante 1 min y luego volvió a las condiciones iniciales. Los cromatogramas se registraron a 305 nm. Como confirmación de la cuantificación, se realizó la espectrometría de masas en modo de monitoreo selectivo de iones. La ionización por electrospray se llevó a cabo utilizando nitrógeno como nebulizador y los siguientes parámetros: voltaje capilar 3500V, flujo de gas de secado 10 l/min; presión del nebulizador 45 psi, y temperatura de secado 300 ºC. Los metabolitos se identificaron utilizando sus propiedades espectrales UV y masa molecular, y por comparación con estándares auténticos disponibles en la colección de metabolitos del laboratorio. MATERIALES Y MÉTODOS 77 Para el análisis y posterior representación, se relativizó el número de pacientes con niveles detectables de urolitina con respecto al total de pacientes en cada grupo. 4.3.6. Cultivo de líneas celulares Las líneas celulares empleadas para este estudio fueron JJN3, procedente de la médula ósea de un paciente con leucemia de células plasmáticas y U266, procedente de la sangre periférica de un paciente con MM refractario. Ambas líneas se obtuvieron del repositorio DSMZ y fueron transducidas en el laboratorio previamente a este estudio con el lentivector pRLL-luc/GFP, con el fin de que las células expresasen la luciferasa de luciérnaga y la proteína fluorescente verde (GFP, green fluorescent protein en inglés) en una proteína de fusión dirigida por el promotor del CMV. Tras esta transducción, se denominaron JJN3-GFP y U266-GFP. El mantenimiento de ambas líneas se realizó en un incubador humidificado a 37 ⁰C, bajo una atmósfera de 5 % de CO2 y se pasaron cada 2- 3 días. El medio de cultivo utilizado para su cultivo fue RPMI-1640 (ref. BE12-167F Lonza) suplementado con 10% de BSA (ref. A2153, Sigma-Aldrich) y antibióticos (100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina, ref. DE17-602E, Lonza). Además, se generó la línea JJN3-GFP resistente a bortezomib (JJN3-GFP_R-Btz) tras la exposición mantenida a dosis crecientes de dicho fármaco (ref. S1013, Selleckchem, Houston, EE.UU.) hasta alcanzar una dosis de 11 nM. 4.3.7. Experimentos de dosis-respuesta con compuestos de la microbiota Los ensayos de dosis-respuesta frente a UA y a distintos AGCC se realizaron en las líneas JJN3-GFP y U266-GFP. En el caso de los ensayos con UA, se utilizó además la línea JJN3-GFP_R-Btz. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 x 105 células/ml y se trataron durante 48 horas con UA (ref. 4C28139, 1ClickChemistry Inc., Nueva Jersey, EE.UU.), acetato (ref. S-5636, Sigma-Aldrich), butirato (b-5887, Sigma-Aldrich) y propionato (ref. P-5435, Sigma-Aldrich), o DMSO como vehículo. Para los experimentos de combinación de urolitina se empleó además el fármaco bortezomib (ref. S1013, Selleckchem) en monoterapia o en la combinación de ambos. El rango de concentraciones en el que expusieron está recogido en la Tabla 16. El porcentaje de EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 78 DMSO utilizado como vehículo fue el mismo que para el ensayo de cada fármaco. El volumen final de cada pocillo fue de 100 µl (50 µl de células + 50 µl de fármaco). Línea Compuesto Rango de dosis Monoterapia Combinación JJN3-GFP Acetato 250 mM - 0,16 mM - JJN3-GFP Butirato 20 mM - 0,23 mM - JJN3-GFP Propionato 80 mM - 0,92 mM - U266-GFP Acetato 250 mM - 0,16 mM - U266-GFP Butirato 20 mM - 0,23 mM - U266-GFP Propionato 80 mM - 0,92 mM - JJN3-GFP Urolitina 100 µM - 1,15µM 100 µM - 0,78 µM U266-GFP Urolitina 100 µM - 1,15µM 100 µM - 0,78 µM JJN3-GFP Bortezomib - 10 nM - 1,25 nM U266-GFP Bortezomib - 10 nM - 1,25 nM JJN3-GFP R Urolitina 100 µM - 0,78 µM 100 µM - 0,78 µM JJN3-GFP R Bortezomib - 10 nM - 1,25 nM Tabla 16. Descripción de las líneas y el rango de dosis farmacológicas de los metabolitos de la microbiota empleados en los estudios de dosis-respuesta. Tras 48 horas de exposición, se realizó la lectura de la viabilidad celular usando 10 µl del reactivo sal de tetrazolio WST-8/CCK8, del kit Cell Counting Kit-8 (ref. 96992, Sigma- Aldrich), basado en una reacción colorimétrica para cuantificar el número de células vivas. Tras añadir el reactivo, siguiendo las instrucciones del fabricante, las células se incubaron a 37 ⁰C durante un mínimo de 30 minutos, y se midió la señal de absorbancia a una densidad de 450 nm y de 650 nm en el lector espectrofotométrico BioTek™ Epoch™ 2 Microplate Spectrophotometer (BioTek, Colmar, Francia) y el programa Gen5 (BioTek). Para analizar el efecto de cada fármaco, primero se eliminó el ruido de fondo, utilizando la señal a 650 nm y, posteriormente, se normalizaron los datos de los pocillos tratados con respecto a los pocillos vehículo o aquellos que tuvieron una viabilidad mayor, calculando así el porcentaje de supervivencia. A continuación, se calculó la concentración inhibitoria media máxima (IC50, half- maximal inhibitory concentration, en inglés) se calculó utilizando la media de tres experimentos independientes mediante un ajuste no lineal en el programa GraphPad Prism 8.0.1 (California, EE.UU.). Las gráficas de dosis-respuesta se representaron como la media de la supervivencia ± el error estándar de la media (SEM) para cada punto. MATERIALES Y MÉTODOS 79 Para el análisis del potencial sinérgico o antagónico de los experimentos de combinación de urolitina con bortezomib, se utilizó el programa Compusyn (Combosyn Inc., Paramus, EE. UU.) siguiendo el método descrito por Chou y Talai (170). De esta forma, se obtuvieron los valores de índice de combinación (CI, combination index, en inglés), que acorde con el teorema de dicho método, define los efectos de sinergia, adición y antagonismo como <1, 1 y >1, respectivamente. Los isobologramas representan a nivel gráfico el efecto en la supervivencia a las dosis estudiadas, siendo en el eje de ordenadas los datos correspondientes a un fármaco y en el de abscisas los datos del otro fármaco. Los puntos en cada eje que se corresponden con las dosis efectivas y se unen por una recta que representa la línea de adición o de no interacción. De esta forma, los puntos, resultantes de las combinaciones de los fármacos, que queden representados por debajo de la línea de aditividad tendrán un IC< 1, indicando la sinergia de la combinación. 4.3.1. Estudio de apoptosis y ciclo celular mediante citometría de flujo Para los estudios de muerte y ciclo celular, se utilizó la línea celular JJN3-GFP que fue expuesta al tratamiento con UA (ref. 4C28139, 1ClickChemistry Inc) a una concentración de 15 µM DMSO en el mismo porcentaje como control. Para el estudio de muerte celular, se llevó a cabo el ensayo de doble marcaje con anexina V, que permite detectar apoptosis celular y yoduro de propidio (PI, propidium iodide en inglés), que se usa para detectar células necróticas o en fase tardía de apoptosis. Para llevar a cabo este ensayo, las células fueron cultivadas a una densidad de 5 x 105 células/ml, expuestas a las condiciones descritas previamente, durante 24 horas. Pasado ese tiempo, se recogieron 1 x 106 células, se lavaron con PBS en frío y se incubaron con 2,5 µl de anexina V conjugada con aloficocianina (APC) (ref. 640941, BioLegend, California, EE.UU) diluido en 100 µl de tampón Binding Buffer 1X (ref. 422201, BioLegend) durante 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Después, se marcaron con 100 µl de yoduro de propidio (ref. P4864, Sigma-Aldrich) diluido en 200 µl de tampón Binding Buffer 1X. Como control interno, se utilizaron células sin el marcaje de anexina V y también sin el de yoduro de propidio. Tras centrifugar y resuspender en PBS, se analizaron con el citómetro de flujo FACS Canto II (BD Biosciences, California, EE.UU). La recogida de datos se hizo a través del programa FACS Diva (BD Biosciences) EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 80 en el que se registraron 3×104 de eventos por condición. Los resultados se analizaron con el programa FlowJo™ versión 10 (BD Biosciences). Para el estudio de ciclo celular, las células fueron cultivadas a una densidad de 5 x 105 células/ml expuestas a las diferentes condiciones del tratamiento ya mencionadas, durante 24 horas. Pasado ese tiempo, se recogieron 1 x 106 células, se lavaron con PBS y se llevó a cabo la fijación y permeabilización de las células con etanol frío al 70% durante toda la noche a -20 °C. Posteriormente, se lavaron 2 veces con PBS, y se incubaron durante 30 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente con 10 µl de yoduro de propidio y 2,5 µl de RNAasa A (ref 10109142001, Merck Millipore) en PBS hasta alcanzar un volumen final de 250 µl. Tras centrifugar y resuspender en PBS, se analizaron con el citómetro de flujo FACS Canto II (BD Biosciences). La recogida de datos se hizo a través del programa FACS Diva (BD Biosciences) en el que se registraron 3×104 de eventos por condición. Los resultados se analizaron con el programa FlowJo™ versión 10 (BD Biosciences). 4.3.2. Estudio del estrés oxidativo mediante inmunohistoquímica Para el estudio del estrés oxidativo, la línea celular JJN3-GFP se expuso al tratamiento con urolitina en cuatro condiciones, según la concentración: 15 µM, 30 µM, 60 µM y 100 µM. Además, se expusieron células en DMSO como control. Las células fueron cultivadas a una densidad de 5 x 105 células/ml en flasks y a 37 °C. Pasadas 48 horas, las células se lavaron 2 veces con PBS y se llevó a cabo su adhesión a un portaobjetos centrifugando en el aparato Shandon CytoSpin® (Thermo Fisher Scientific) durante 5 min a 700 xg. Posteriormente, se fijaron en metanol (ref. 67-56-1, Thermo Fisher Scientific) durante 5 minutos para su conservación. La IHC comenzó refrescando las muestras con PBS con 1% de BSA (ref. A2153, Sigma- Aldrich), e incubando con H2O2 (ref. 95321, Sigma-Aldrich) al 3% en metanol (ref. 67- 56-1, Thermo Fisher Scientific) durante 5 minutos, para inactivar la peroxidasa endógena de la muestra. Después, se procedió al desenmascaramiento y recuperación de antígenos, llevando las muestras a ebullición en tampón citrato (ácido cítrico 1,8 nM, ref. C1909; citrato de sodio 8,2 nM, ref. W302600, ambos de Sigma-Aldrich). Posteriormente, se procedió al bloqueo con PBS con 5% de BSA durante 1 hora a 4°C, para evitar las uniones no específicas, y a continuación, se incubaron con el anticuerpo de conejo anti-4 MATERIALES Y MÉTODOS 81 Hydroxinonenal (HNE) (ref. ab46545, Abcam) diluido en proporción 1:100 en PBS con 1% de BSA. Dicha incubación se realizó en cámara húmeda, durante toda la noche y 4°C. Al día siguiente, las muestras se lavaron 3 veces en PBS con 1% de BSA, se incubaron durante 30 minutos con 1-3 gotas del anticuerpo secundario de conejo conjugado con peroxidasa SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (ref. 8114, Cell Signaling Technology, Massachusetts, EE.UU.), y se lavaron 3 veces para eliminar el anticuerpo secundario no unido. A continuación, se usó el reactivo 3,3-diaminobencidina DAB Substrate kit (ref. ab94665, Abcam) para detectar la unión del anticuerpo secundario, añadiendo 1 gota de cromógeno en 1,5 ml de sustrato, tal y como indicaba el fabricante. Después, las muestras se sometieron a una tinción de contraste con la solución de hematoxilina de Carazzi (ref. 255298.1610, PanReac AppliChem) antes de deshidratarlas con concentraciones crecientes de etanol (96% y 100%, ref. 191086.1214, PanReac AppliChem) y xilol (ref. 251769.2711, PanReac AppliChem). Finalmente, se sellaron superponiendo un cubreobjetos con DPX Mountant (ref. 06522, Sigma-Aldrich). Para visualizar y fotografiar las muestras se utilizó el soporte AdaptaSpot (Spotlab, SL, Madrid, España) con el teléfono iPhone 12 (Apple Inc, California, EE.UU) acoplado al microscopio óptico Nikon Eclipse 80i. 4.3.1. Análisis de expresión de p21 mediante PCR cuantitativa Para la cuantificación de los niveles de expresión génica de p21 se utilizaron las líneas celulares JJN3-GFP y JJN3-GFP_R-Btz, que fueron expuestas al tratamiento con UA (ref. 4C28139, 1ClickChemistry Inc) a una concentración de 15 µM, bortezomib (ref. S1013, Selleckchem) a 4 nM, la combinación de ambos o DMSO en el mismo porcentaje como control. Las células fueron cultivadas a una densidad de 5 x 105 células/ml durante 48 horas en frascos de cultivo y a 37 °C. Pasado el tiempo de incubación, se recogieron las células y se lisaron con un tampón compuesto por el buffer de lisis RLT (ref. 1053393, Qiagen) y β-mercaptoetanol (ref. M6250, Sigma-Aldrich) al 1% y después se extrajo el ARN utilizando el kit AllPrep DNA/RNA MiniKit (ref. 80004, Qiagen). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 82 Posteriormente se llevó a cabo la síntesis de ADNc a partir del ARN extraído utilizando el kit High Capacity DNAc Reverse Transcription (ref. 4374967, Applied Biosystems), que contiene una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), cebadores aleatorios, transcriptasa reversa, inhibidores de ARNasa y tampón de reacción. En cada caso se emplearon 500 ng de ARN manteniendo así el ratio 1:1 de mezcla de reacción de la transcriptasa con el ARN de partida. El programa empleado en el termociclador Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (ref.4375786, Thermo Fisher Scientific) fue: 10 minutos a 25ºC, 120 minutos a 37ºC, 5 minutos a 85ºC y tiempo infinito a 4ºC. Posteriormente, se realizó la PCRq utilizando la mezcla TaqMan™ Gene Expression Master Mix (ref. 4369016, Thermo Fisher Scientific) y la sonda de expresión TaqMan™ (FAM) para el gen p21 (ref. Hs00355782_m1, ref. 4331182, Thermo Fisher Scientific) y del gen β-glucuronidasa (GUS) (Hs00939627_m1, ref. 4304970 Thermo Fisher Scientific) como control. El ensayo de amplificación de las muestras se realizó por triplicado en placas de 96 pocillos con 2 µl de ADNc y un volumen final de 10 µl en el aparato QuantStudio™ 5 Real-Time PCR Instrument (96-Well 0.1 ml Block) (ref. A28133, Applied Biosystems). Tras una incubación a 95ºC durante 10 minutos para que se produzca la activación de la polimerasa, se realizó la amplificación durante 40 ciclos en dos pasos: desnaturalización (95ºC, 15 segundos) e hibridación (60ºC, 1 minuto). La cuantificación de los niveles de expresión génica de p21 se realizó con los valores de umbral de ciclo (Ct, cycle threshold en inglés) empleando el método comparativo de ΔΔCt descrito por Livak y Schmittgen (171) , usando en todos los casos como control interno el gen de expresión constitutiva GUS. Además, los datos fueron normalizados frente al control procedente de las muestras sin tratamiento. 4.3.2. Análisis de expresión proteica mediante electrotransferencia Para el análisis de OXPHOS se utilizó la línea celular JJN3-GFP, que fue expuesta durante 48 horas al tratamiento con UA (ref. 4C28139, 1ClickChemistry Inc) a 15 µM. Para el estudio de mTOR y p53 se utilizaron las líneas JJN3-GFP y JJN3-GFP_R-Btz, que fueron expuestas durante 3 horas en el caso de mTOR y su forma fosforilada o 48 MATERIALES Y MÉTODOS 83 horas en el caso de p53, al tratamiento con urolitina (ref. 4C28139, 1ClickChemistry Inc) a una concentración de 15 µM, bortezomib (ref. S1013, Selleckchem) a 4 nM. En todos los casos, como control se incubaron células con exposición a DMSO en el mismo porcentaje que los fármacos. Las células fueron cultivadas a una densidad de 5 x 105 células/ml en frascos de cultivo a 37 °C. Pasado el tiempo de incubación, se llevó a cabo la extracción de proteínas de las células con un tampón de lisis (Tabla 17) utilizando 1 ml de tampón por cada 5 millones de células. La lisis celular se realizó en frío y se favoreció mediante vórtex periódicos cada 5 minutos durante 30 minutos y posteriormente las muestras se centrifugaron a 1400xg en el aparato durante 5 minutos para obtener el contenido proteico del sobrenadante. Después, se realizó la cuantificación de las proteínas midiendo la concentración con el reactivo (ref. 500-0205, Bio-Rad), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se midió la señal de absorbancia a 595 nm de cada muestra en triplicado, usando el aparato de lectura de placas BioTek™ Epoch™ 2 Microplate Spectrophotometer (BioTek) y el programa Gen5 (BioTek). Reactivo Concentración Referencia (fabricante) Tris-HCl pH 8 50 mM T6066 (Sigma-Aldrich) NaCl 150 mM S3014 (Sigma-Aldrich) Tritón 1% X100 (Sigma-Aldrich) Deoxicolato 0,50% D6750 (Sigma-Aldrich) SDS 0,10% L3771 (Sigma-Aldrich) Inhibidores de proteasas 1X 04693124001 (Roche, Sigma-Aldrich) Inhibidores de fosfatasas 1X 04906837001 (Roche, Sigma-Aldrich) DNAsa I 1000 U/ml EN0521 (Thermo Fisher Scientific) Agua destilada - B230531 (Fresenius Kabi, Hesse, Alemania) Tabla 17. Composición de los reactivos utilizados para preparar el tampón de lisis proteica. HCl, cloruro de hidrógeno; NaCl, cloruro sódico; SDS, dodecil sulfato de sodio; DNAsa, desoxirribonucleasa. Posteriormente los extractos de proteína de las muestras (30µg) se separaron mediante electroforesis unidimensional en geles de poliacrilamida (Solución 40% Acrilamida/Bis 29:1, ref. 1610146, Bio-Rad Laboratories) al 10% en condiciones desnaturalizantes con SDS (ref. L3771, Sigma-Aldrich), y el tampón de electroforesis TGS Buffer (ref. 161- 0732, Bio-Rad Laboratories). El extracto de proteínas se preparó previamente con tampón para muestras Laemmli 1X (ref. 1610747, Biorad) mezclado con β-Mercaptoetanol al 10% y se hirvieron durante 3 minutos a 100°C. Las condiciones de electroforesis fueron 120 EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 84 voltios constantes durante 60-90 minutos (aproximadamente y según el avance del frente de carga) y con referencia al marcador de peso molecular Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (ref. 161-0394, Bio-Rad Laboratories). Después, los geles se transfirieron a membranas de PVDF Immun-Blot® (ref. 162-0177, Bio-Rad Laboratories) previamente activadas en metanol (ref. 67-56-1, Thermo Fisher Scientific), agua destilada y tampón de transferencia (1 minuto, 5 minutos y 15 minutos, respectivamente) durante 1 hora y 15 min en el caso de p53 y OXPHOS y 1 hora y 45 minutos en el caso de mTOR y p-mTOR, a 400 mA y a 4°C. El tampón de transferencia utilizado fue TG Buffer (ref. 161-0734, Bio-Rad Laboratories). Para comprobar la eficacia de la transferencia de las proteínas a la membrana, éstas se tiñeron con solución Ponceau S (ref. P7170, Sigma-Aldrich) para su visualización. Tras lavar las membranas para eliminar el colorante con tampón Tris Salino (TBS, ref. 10776834, Thermo Fisher Scientific) – Tween® 20 al 0,1% (Tw, ref. P9416, Sigma- Aldrich) – BSA (ref. A2153, Sigma-Aldrich) (TBS-Tw-BSA) al 0,3% (peso/volumen), se llevó a cabo el bloqueo en TBS-Tw-BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se procedió a incubar las membranas con los anticuerpos primarios correspondientes preparados en TBS-Tw-BSA al 0,3% (Tabla 18) durante toda la noche a 4ºC. Pasado ese tiempo, se lavaron las membranas 5 veces durante 30 minutos en total con TBS-Tw-BSA al 0,3% y se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente diluido en TBS-Tw-BSA al 0,3% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se repitió el lavado de las membranas y se revelaron mediante señal quimioluminiscente con el kit ECL™ Start Western Blotting Detection Reagent (ref. GERPN3243) o con el kit ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent (ref. GERPN2232) Amersham™ (GE Healthcare, Sigma-Aldrich), utilizando el aparato ChemiDoc™ MP Imaging System (ref. 12003154; Bio-Rad Laboratories). La captura de imágenes y las densitometrías utilizadas para el análisis se hicieron utilizando el programa ImageLab 5.0 (Bio-Rad Laboratories). Para cada muestra, se normalizó la banda de la expresión de la proteína de interés con la banda del gen de expresión constitutiva gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Para representar el efecto del tratamiento, la intensidad de cada banda de las muestras con tratamiento se normalizó con respecto al control sin tratamiento. MATERIALES Y MÉTODOS 85 Anticuerpos primarios Proteína PM (kDa) Nombre Referencia (Casa comercial) Origen Dilución de uso complejo I (NDUFB8) 18 Total OXPHOS Human WB Antibody Cocktail Ab110411 (Abcam) Ratón 1/10000 complejo II (SDHB) 29 complejo III subunidad II(UQCRC2) 48 complejo IV subunidad II (COX II) 22 ATP sintasa subunidad alfa (ATPSA) 54 mTOR 289 mTOR (7C10) Rabbit mAb 2983 (Cell Signaling Technology) Conejo 1/1000 p-mTOR 289 Phospho-mTOR (Ser2481) 2974 (Cell Signaling Technology) Conejo 1/1000 p53 53 Anti-p53 antibody [PAb 240] ab26 (Abcam) Ratón 1/5000 GAPDH 37 GAPDH monoclonal antibody AM4300 (Invitrogen) Ratón 1/10000 Anticuerpos secundarios Nombre Referencia (Casa comercial) Origen Dilución de uso Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody 7074 (Cell Signaling Technology) Cabra 1/2000 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody 7076 (Cell Signaling Technology) Caballo 1/10000 Tabla 18. Listado de anticuerpos primarios y secundarios empleados para los análisis de electrotransferencia. Se detalla el nombre y la referencia de la casa comercial, el origen y la dilución de uso de los distintos anticuerpos empleados de expresión de proteínas mediante electrotransferencia. Para los anticuerpos primarios se menciona además la proteína a la que se dirigen y el PM de la misma. PM, peso molecular; mTOR, diana de rapamicina en células de mamífero; p-mTOR, mTOR fosforilado; NDUFB8, subunidad 8 del subcomplejo beta de NADH deshidrogenasa del Complejo I; SDHB, la subunidad B de la succinato deshidrogenasa del Complejo II; MTCO1, la subunidad 1 del complejo citocromo c oxidasa del Complejo IV; UQCRC2, la subunidad 2 del complejo citocromo b-c1 del Complejo III; ATP5A, ATP sintasa subunidad alfa del Complejo V; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 86 4.3.3. Estudio in vivo Con el fin de estudiar la eficacia y la seguridad de la UA, se emplearon ratones hembra inmunodeficientes Nod scid gamma (NSG) de Jackson Laboratory (NOD.Cg- PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/Szj) (Bar Harbor, EE. UU.) de entre 6 y 8 semanas de edad. Los ratones fueron adquiridos a través de la empresa Charles River Laboratories International, Inc (EEUU) y mantenidos en el Animalario del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas. El estudio fue supervisado y evaluado por el Comité de Ética de la Investigación y Bienestar Animal, así como por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Experimentación y se realizó acorde al protocolo aprobado PROEX 023/17. Se mantuvieron en cubetas con 5 animales, en racks ventilados bajo un ambiente controlado libre de patógenos, a una temperatura constante y con ciclos de 12h de luz 12h de oscuridad. Se les administró comida y bebida ad libitum. Para generar el modelo de enfermedad de MM, se empleó la técnica de xenoinjerto de la línea celular JJN3-GFP a través de la inyección intravenosa vía vena caudal. Para llevarlo a cabo, los animales fueron inmovilizados en un cepo y se inocularon 1 x 106 células resuspendidas en 100 µl de PBS empleando agujas hipodérmicas 25G (Braun SE). Tres días después de la inyección, los ratones comenzaron el tratamiento con vehículo (DMSO) en el grupo control (n=5), y UA dosis de 200 mg/kg en el grupo de tratamiento (n=5) en régimen de 5 días por semana (de lunes a jueves y los sábados) durante 4 semanas. Además, los animales fueron monitorizados una vez a la semana mediante control del peso y medición del tumor mediante bioluminiscencia utilizando el sistema de imagen in vivo IVIS® Lumina Series III (Perkin Elmer). Para obtener la imagen in vivo el equipo cuenta con una cámara oscura con un sistema integrado de anestesia utilizando gas isofluorano al 2-3% con oxígeno para mantener anestesiados a cinco animales en paralelo. Para la detección de la bioluminiscencia, se administraron 200 µl de D-luciferina (ref.88291, Thermo Fisher Scientific) disuelta en PBS a una dosis de 150 mg/kg por vía intraperitoneal, dejando actuar durante 10 minutos, para una captura óptima de la señal. El seguimiento de la enfermedad se realizó diariamente durante los 34 días que duró el experimento y cada ratón fue sacrificado cuando aparecieron signos de enfermedad MATERIALES Y MÉTODOS 87 avanzada como la parálisis trasera o puntos finales humanitarios (pérdida del 10% del peso, parámetros de dolor, pelo erizado, etc.). 4.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Todos los análisis estadísticos de las grandes cohortes de pacientes con MM e infecciones previas por VHB y VHC se realizaron con la plataforma de TriNetX. La supervivencia de los pacientes de cada cohorte se analizó con el método de Kaplan-Meier y se utilizó la prueba Log-Rank para evaluar las diferencias de las curvas. Para el análisis, no se tuvieron en cuenta los pacientes cuyo último registro quedase fuera de la ventana temporal del estudio (desde 1 mes a 1096 días después del diagnóstico de MM). Los análisis descriptivos de la composición de la microbiota y de la diversidad se representaron como media ± SEM. Además, se compararon estadísticamente mediante la prueba paramétrica de Student’s T-Test o la prueba no paramétrica de la U de Mann- Whitney, según correspondiera. Las diferencias entre los grupos en la estructura de la comunidad (diversidad beta) se probaron utilizando un ANOVA multivariante permutacional (PERMANOVA). Las correlaciones se calcularon con la prueba Pearson. Las curvas de supervivencia global se analizaron mediante la estimación de Kaplan- Meier, utilizando la prueba Maximally Selected Rank. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 8.01 (GraphPad Software Inc., California, EE.UU.) y Python. Para los experimentos in vitro con los AGCC y la UA, cada experimento se realizó al menos por triplicado. Las comparaciones entre dos grupos con distribución normal se realizaron usando el Student’s T-Test paramétrico pareado o no pareado según las condiciones del estudio. La curva de supervivencia del ensayo in vivo se analizó mediante la estimación de Mantel-Cox con el estadístico Log-Rank. Las comparaciones estadísticas se hicieron en GraphPad Prism 8.01. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas en P<0,05 (*), P<0,01 (**). 89 5. RESULTADOS RESULTADOS 91 5.1. EL IMPACTO DE LA HEPATITIS Y TRATAMIENTO ANTIVIRAL EN LA SUPERVIVENCIA EN PACIENTES CON MM Como primera aproximación al estudio del posible papel de las infecciones en el MM, analizamos el efecto del tratamiento antiviral en la evolución de los pacientes. Cuando estudiamos a los pacientes con MM que habían tenido previamente infección por VHB (n=1367) y recibieron el tratamiento antiviral, observamos que tuvieron una mayor probabilidad de supervivencia (77,91%), en comparación con los que no recibieron tratamiento antiviral (68,41%). El análisis de supervivencia Kaplan-Meier reveló que estas diferencias fueron estadísticamente significativas según el test Log-Rank (p=0,016) (Figura 15). Figura 15. Supervivencia de los pacientes con MM e infección previa por VHB. Análisis de supervivencia Kaplan-Meier de pacientes con MM tras infección por VHB tratados (morado) y no tratados con tratamiento antiviral (verde). MM, mieloma múltiple; VHB, virus de la hepatitis B; gl, grados de libertad. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 92 Similarmente, cuando analizamos la evolución de los pacientes con MM e infección previa por VHC (n=1220), aquellos que recibieron tratamiento antiviral tuvieron una mayor supervivencia (80,46%) comparados con los que no recibieron el tratamiento antiviral (70,78%). En este caso, las diferencias fueron aún más significativas que en la infección por VHB (p=0.005) (Figura 16). Figura 16. Supervivencia de los pacientes con MM e infección previa por VHC. Análisis de supervivencia Kaplan-Meier de pacientes con MM tras infección por VHC tratados (morado) y no tratados con tratamiento antiviral (verde). MM, mieloma múltiple; VHC, virus de la hepatitis C; gl, grados de libertad. 5.2. LA IG MC RECONOCIÓ ANTÍGENOS DEL VHC Y DETERMINÓ LA EFICACIA DEL TRATAMIENTO ANTIVIRAL Tras ver el efecto del antiviral en la supervivencia de los pacientes con infección por VHB y con un impacto mucho más significativo en el caso del VHC, nos centramos en analizar la evolución del MM y sus estadios previos (GMSI, MMq) según el tratamiento antiviral para la infección por VHC y la especificidad de la Ig Mc en estos pacientes. RESULTADOS 93 5.2.1. Los pacientes cuya Ig Mc reconoció específicamente el VHC y recibieron tratamiento antiviral no tuvieron progresión de la enfermedad De los nueve pacientes estudiados, en seis de ellos (67%) la Ig Mc reconoció específicamente el VHC: los pacientes P1-4, P7 y P8. Cuatro de estos pacientes (P1-4) recibieron tratamiento antiviral (detallado en anexo 1). Como cabía esperar, después del tratamiento antiviral, la carga viral del VHC disminuyó hasta niveles indetectables para los pacientes P1, P3 y P4 y niveles casi indetectables para el paciente P2. De forma interesante, estos pacientes presentaron una mejor evolución que aquellos pacientes que reconocieron VHC, pero no fueron tratados con antivirales (P7 y P8) (detallado en anexo 3). Para el paciente P1, que padecía MM en tercera recaída, el tratamiento antiviral, además de provocar una disminución del VHC hasta niveles indetectables (Figura 17 A), como se ha comentado anteriormente consiguió una remisión completa del MM. A pesar de que en ese momento el paciente no estaba recibiendo ningún tratamiento anti-MM, la Ig Mc disminuyó notablemente (Figura 17 B). Además, la citología y el análisis por CMF revelaron que la cantidad de células plasmáticas en médula ósea era inferior al 5% y que la enfermedad mínima residual era negativa. El número de clones de las células plasmáticas presentes en la muestra y la carga tumoral se analizó por NGS (Figura 17C). La desaparición de la Ig Mc también pudo verse en la electroforesis en gel de agarosa antes y después del tratamiento antiviral (Figura 17D). La remisión completa de la enfermedad en el paciente P1 se mantuvo hasta terminar este estudio durante más de 45 meses. Para comprobar que la Ig Mc era específica del VHC, se estudió el reconocimiento antigénico mediante el inmunoensayo INNO-LIA™ HCV Score. Como puede verse (Figura 17E), la muestra de suero detectó las proteínas del VHC Core C1, Core C2, E2 y NS3, mientras que la muestra purificada de la Ig Mc reconoció únicamente la proteína del core C1. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 94 Figura 17. Remisión completa estable y reconocimiento específico del VHC en el paciente P1 con MM tratado con antivirales. A) Carga viral del VHC cuantificada en el suero del paciente. La línea horizontal de puntos negra representa el umbral de detección del virus. B) Cantidad de Ig Mc determinada en la electroforesis de proteínas del suero. C) Porcentaje de células plasmáticas (CP) determinadas por citología de médula ósea, citometría de flujo (CMF) y CP patológicas por inmunofenotipo (IF). (A-D) La línea vertical de puntos azul representa el momento del tratamiento antiviral. D) Gel de agarosa que representa la migración de las proteínas del suero antes (2014) y después (2017) del tratamiento antiviral (la banda recuadrada corresponde a la Ig Mc del paciente). E) Ensayo INNO-LIA HCV™ Score e inmunotransferencia usado para detectar la reactividad del suero de la IgG del suero (S) del paciente y la IgG monoclonal purificada frente a diferentes proteínas del VHC. La señal obtenida con la proteína C1 del paciente P1 parece débil pero reproducible cuando se ensayaron varias muestras de la IgG Mc purificada. Ig Mc, Inmunoglobulina monoclonal; C, controles positivo. En el resto de los pacientes positivos para VHC (todos con GMSI, P2-4) y que recibieron tratamiento antiviral, la carga viral también disminuyó hasta niveles indetectables en todos los casos (Figura 18A). Tras el tratamiento antiviral y en ausencia de otros tratamientos hematológicos, el componente monoclonal de los pacientes P2 y P4 RESULTADOS 95 disminuyó de manera notable y se mantuvo estable. Para el paciente P3, la concentración de Ig Mc disminuyó ligeramente, pero se mantuvo estable más de 39 meses (Figura 18B). Figura 18. Evolución de la enfermedad y evaluación de la especificidad de la Ig Mc de los pacientes tratados con antivirales. A) Carga viral del VHC cuantificada en los sueros de los pacientes P2-P6. La línea horizontal de puntos negra representa el límite de detección del tratamiento antiviral. B) Cantidad de inmunoglobulina monoclonal (Ig Mc) determinada por electroforesis del suero. (A, B) La línea vertical azul indica el momento del tratamiento antiviral. C) Test INNO-LIA HCV™ Score para EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 96 detectar la reactividad de las IgGs del suero (S) e IgGs monoclonales purificadas (Mc), frente a distintas proteínas del VHC. D) Ensayo dot-blot para detectar la reactividad del suero de los pacientes frente a las diferentes proteínas del VHC (las IgAs no pueden estudiarse con el test INNO-LIA HCV™ Score). El monoclonal IgA del paciente P4 reconoció la proteína NS3 del VHC, mientras que el paciente P6 no reconoció ninguna de las proteínas del VHC del ensayo. C, control. Cuando estudiamos la Ig Mc de estos pacientes P2-4 con GMSI, en todos los casos reconoció específicamente antígenos del VHC: proteína Core C1 o proteínas NS3/NS4 (Figura 18C-D). Al tratarse de pacientes con GMSI, siguiendo las recomendaciones de las guías clínicas, estos pacientes no recibieron ningún tratamiento hematológico. Con el fin de verificar que la Ig Mc de los pacientes P1-4 sólo reconocía al VHC, se comprobó su reactividad frente a otros microorganismos usando el ensayo MIAA evaluando en paralelo las muestras de suero y de Ig Mc purificada. Como se esperaba, las muestras de suero fueron reactivas frente a varios microorganismos (VEB, CMV, VHS- 1, VHS-2, VVZ, H. pylori, B. burgdorferi, etc.), pero la muestra de Ig Mc no detectó ningún otro de los microorganismos testados, confirmando la pureza y la especificidad por el VHC (Figura 19). RESULTADOS 97 Figura 19. Ensayo MIAA para analizar la reactividad frente a microorganismos infecciosos. Se analizó la reactividad de las inmunoglobulinas (Ig) del suero (G o A) y de la las Ig purificadas (G y A) frente a 8 patógenos infecciosos: Borrelia burgdorferi: proteína VisE y una mezcla de dos antígenos); citomegalovirus (CMV): una mezcla de cinco antígenos; virus de Epstein-Barr (VEB): antígeno nuclear-1 (EBNA-1) y proteína de la cápside viral (VCA); Helicobacter pylori: FC509; virus Herpes simple-1 (VHS-1): proteína gG y un lisado; virus Herpes simple-2 (VHS- 2): proteína gG; Toxoplasma gondii: proteínas 24 y 30; virus Varicela-Zoster (VVZ): proteíns gE y Orf26. Las líneas discontinuas representan los umbrales de detección positiva (ver apartado Métodos para más detalle). Para cada paciente, se analizaron en paralelo las Ig del suero (Ig policlonal + Ig Mc) y la preparación de Ig Mc purificada. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 98 5.2.2. La evolución de la enfermedad fue peor para los pacientes no tratados frente al patógeno reconocido por su Ig Mc Dos pacientes con mieloma de cadenas ligeras BJ (P5) y GMSI (P6) recibieron con éxito el tratamiento con antivirales (Figura 18A). Sin embargo, su Ig Mc no reconoció el VHC y estos pacientes no mostraron una mejor evolución del MM (P5) y de la GMSI (P6). A pesar de haber recibido varios tratamientos anti-MM, el paciente P5 presentó dos recaídas después de la terapia antiviral. Para el paciente P6 con GMSI, la enfermedad persistió con un 7,5% de células plasmáticas en médula ósea y un componente monoclonal de 0,86 g/dl durante 9 meses después de la terapia (Figura 18B). En estos pacientes no fue posible determinar el objetivo de su Ig Mc (Figura 18C), debido a las limitaciones de muestra con el ensayo MIAA. Tres de los pacientes infectados con VHC (P7-9) no recibieron tratamiento antiviral y tuvieron peor evolución de la enfermedad. Como puede verse en la Tabla 19, el paciente P7 progresó en tan solo 5 meses desde la GMSI al mieloma quiescente con un 17% de células plasmáticas en médula ósea. P Dx Ig Mc Purif. Diana de la Ig Mc Antiviral Disminución en la Ig Mc Progresión SLP (meses) P1 MM IgGλ Sí VHC C1 Sí Sí No, RC estable 45 P2 GMSI IgGκ Sí VHC NS3 Sí Sí No 46 P3 GMSI IgGκ Sí VHC NS3 Sí Sí No 26 P4 GMSI IgAλ Sí VHC NS3 Sí Sí No 39 P5 MM BJ Cadena ligera κ Sí Desconocido Sí No Sí, 2 recaídas 7 P6 GMSI IgAλ Sí Desconocido Sí No No, GMSI estable 17 P7 GMSI IgGκ Sí VHC NS3 No No Sí, a MMq - P8 MM IgAλ Sí VHC NS3 No No Sí, fallecimiento - P9 MM IgGκ Sí HSV-1 No No Sí, fallecimiento - Tabla 19. Clasificación de los pacientes, respuesta al tratamiento anti-VHC y evolución de GMSI o MM. MM, Mieloma múltiple; P, paciente, Dx, diagnóstico; BJ, Bence-Jones; Ig Mc, Inmunoglobulina monoclonal; Purif. Purificada; SLP, Supervivencia libre de progresión; VHC, virus de la hepatitis RESULTADOS 99 C; RC, remisión completa; GMSI, gammapatía monoclonal de significado incierto; VHS-1, virus del herpes simple-1. A pesar de recibir tratamientos anti-MM, los pacientes P8 y P9 también sufrieron la progresión de la enfermedad y ambos fallecieron (Figura 20A). En el caso de los pacientes P7 y P8, su Ig Mc purificada sí que reconoció específicamente el VHC. Como puede verse, el paciente P7 reconoció la proteína NS3 y el paciente P8 las proteínas NS3 y NS4 del VHC (Figura 20B-C). Al estudiar de la Ig Mc por el VHC mediante el ensayo MIAA con otros microorganismos, comprobamos que el reconocimiento era específico del VHC y no se producía con ningún otro de los microorganismos estudiados. Figura 20. Evolución de los pacientes y evaluación del reconocimiento del VHC por la Ig Mc en pacientes no tratados con antivirales. A) Cantidad del monoclonal IgG determinada por la electroforesis de proteínas del suero. B) Ensayo INNO-LIA ™HCV Score para detectar la reactividad de las IgGs del suero y la de la IgG monoclonal purificada para el paciente P7, que reconoció la proteína NS3 del VHC. C) Ensayo dot-blot usado para detectar la reactividad de las IgAs del suero y de la IgA monoclonal purificada EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 100 en el paciente P8, que reaccionó frente a la proteína NS3 del VHC. Se observó además una señal débil para NS4, posiblemente debido a contaminación de IgAs policlonales. C, control; S, suero; Mc, Ig Mc. En cuanto al paciente P9, cuya progresión de la PM puede verse en la Figura 21, observamos que no había reconocimiento del VHC por parte de la Ig Mc (Figura 21B). Sin embargo, el INNO-LIA ™HCV Score y los ensayos dot-blot, mostraron el reconocimiento específico de proteínas del VHS-1 (Figura 21C). Figura 21. Evolución de los pacientes y evaluación del reconocimiento del VHC por la Ig Mc en el paciente P9. A) Cantidad del monoclonal IgG determinada por la electroforesis de proteínas del suero. B) Ensayo INNO-LIA ™HCV Score para detectar la reactividad de las IgGs del suero y la de la IgG monoclonal purificada para el paciente P9, que no reconoció ninguna proteína del VHC. C) Ensayo dot-blot usado para detectar la reactividad de las IgGs del suero y de la IgG monoclonal purificada en el paciente P9, que reaccionó frente al lisado de proteínas VHS-1 del virus Herpes simple-1. C, control; S, suero; Mc, Ig Mc. RESULTADOS 101 5.3. ESTUDIO DE LA MICROBIOTA INTESTINAL EN MM 5.3.1. Análisis de la diversidad de la microbiota intestinal 5.3.1.1. La diversidad alfa disminuyó en pacientes en recaída y/o refractarios y aumentó al alcanzar la remisión completa Con el objetivo de evaluar la composición de la microbiota intestinal, se llevaron a cabo estudios de alfa y diversidad beta mediante la secuenciación del gen de ARNr 16S. Para analizar las diferencias en la progresión, se comparó la composición de la microbiota en los controles, y en los pacientes con GMSI, MMq y MMdx. Además, se evaluó la respuesta o no al tratamiento en los pacientes MMrc y MMrr. En el análisis de diversidad alfa, que se refiere a la biodiversidad intrínseca de cada grupo, observamos que los pacientes con MMrr tuvieron una menor riqueza de microorganismos comparados con el grupo de controles, GMSI, MMq y MMdx. La diferencia que mostró este grupo en la diversidad alfa puede observarse según todos los índices comúnmente utilizados como medida de la riqueza intrínseca: Pielou, Shannon, OTUs observados, Chao y Simpson. Sin embargo, no observamos diferencias entre la diversidad alfa de los pacientes MMrc, que también recibieron tratamiento, con respecto a los pacientes antes del mismo, lo que sugiere una recuperación de la diversidad de la microbiota en la remisión completa (Figura 22). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 102 Figura 22. Diversidad alfa del análisis de la microbiota intestinal como biomarcador de progresión de la enfermedad. Se muestran los valores de media ± SEM de los principales índices de diversidad alfa: Pielou, Shannon, OTUs (del inglés Operational Taxonomic Unit) observados, Chao y Simpson en los grupos de controles (C) y pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), mieloma quiescente (MMq), mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx), MM en recaída y/o refractario (MMrr), y MM en remisión completa (MMrc). *P<0,05; **P<0,01. De hecho, cuando analizamos la diversidad alfa en las muestras pareadas de pacientes a diagnóstico y en remisión completa, observamos que la diversidad de los pacientes era mayor cuando alcanzan la remisión completa (Figura 23). Además, al analizar las muestras de todos los pacientes en el momento del diagnóstico (GMSI, MMq, MMdx) y clasificarlos según los que recayeron o no, encontramos que en los pacientes que recayeron, la diversidad alfa era mayor en los pacientes que no sufrieron recaída (Figura 24). RESULTADOS 103 Figura 23. Diversidad alfa del análisis de la microbiota intestinal en muestras pareadas de pacientes en el momento de diagnóstico y al alcanzar la remisión completa. Se muestran los valores de media ± SEM de los principales índices de diversidad alfa: Pielou, Shannon, OTUs (del inglés Operational Taxonomic Unit) observados, Chao y Simpson en los pacientes con MM en el momento de diagnóstico (MMdx) y al alcanzar la remisión completa (MMrc) **P<0,01; ***P<0,001. Figura 24. Comparación de la diversidad alfa en la recaída de la enfermedad. Se muestran los valores de media ± SEM del índice de diversidad alfa de Pielou en las muestras de los pacientes en el momento de diagnóstico de los pacientes que recayeron (R) y de los que no sufrieron recaídas (NR). **P<0,01. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 104 5.3.1.2. La diversidad beta reveló diferencias en los pacientes en recaída y/o refractarios y en los pacientes que alcanzaron la remisión completa de la enfermedad Siguiendo con el estudio de la diversidad, también estudiamos la diversidad beta, que indica el grado de cambio en la composición taxonómica entre diferentes comunidades de la microbiota de dos grupos, considerando las OTUs y sus abundancias relativas en común. Para detectar la diferencia en la diversidad de especies entre diferentes muestras, se realizó un análisis de coordenadas principales PCoA (Principal Coordinates Analysis en inglés). El PCoA es un método dimensional en el que cada muestra se muestra como un punto, y el cuadrado de la distancia ente los puntos, es igual a la diferencias originales entre datos, que después se convierten en datos cuantitativos. Por tanto, las muestras más cercanas, indican mayor similitud. El índice de Bray-Curtis se empleó para cuantificar la disimilitud entre muestras y después las diferencias se representaron en un análisis de coordinadas principales. Como esperábamos, el grupo de pacientes con MMrr mostró diferencias en la diversidad beta comparado con el resto de los grupos. Cuando comparamos la diversidad beta de los pacientes entre el momento de diagnóstico y de recaída, también vimos diferencias significativas. Como puede verse (Figura 25), las diferencias entre las muestras pareadas de diagnóstico y de recaída quedaron recogidas en dos grupos separados. RESULTADOS 105 Figura 25. Diversidad beta del análisis de la microbiota intestinal como biomarcador de progresión de la enfermedad. Representación gráfica del análisis de coordenadas principales de la disimilitud de Bray-Curtis. Los valores de las coordenadas principales 1 (PCo1), 2 (PCo2) y 3 (PCo3) para cada muestra en los grupos A) control (C) y pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI); mieloma quiescente (MMq), mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx); MM en recaída y/o refractario (MMrr); MM en remisión completa (MMrc) y B) MMdx y MMrc en muestras pareadas. 5.3.1.3. El estudio de diversidad reflejó cambios en la composición taxonómica a nivel de filo y de familia Tras observar estas diferencias en la diversidad, quisimos caracterizar la composición taxonómica de la microbiota en los distintos grupos de pacientes. Acorde con los resultados previos, los pacientes con MMrr mostraron una menor abundancia relativa a nivel de filo, con diferencias significativas en el filo Synergistota (Figura 26). A nivel de familia, se observó una mayor abundancia de Oscillospiraceae, Leuconostocaceae y Micrococcaceae en los estadios premalignos y menores niveles de Synergistaceae y Oscillospiraceae en los pacientes MMrr (Figura 27). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 106 Figura 26. Composición taxonómica a nivel de filo. A) Abundancia relativa (%) de los filos bacterianos en la microbiota intestinal de los grupos controles (C); gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), mieloma quiescente (MMq); mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx); MM en recaída y/o refractario (MMrr); RESULTADOS 107 MM en remisión completa (MMrc). B) Abundancia relativa (%) del filo Synergistota en los pacientes MMdx y MMrr representada por la media ± SEM. *P<0,05. Figura 27. Composición taxonómica de la microbiota intestinal a nivel de familia. Abundancia relativa (%) representada por la media ± SEM de A) la familia Oscillospiraceae en los grupos de control (C) y pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), mieloma quiescente (MMq); mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx); B) las familias Leuconostocaceae y Micrococcceae en los pacientes con GMSI y MMdx; y C) las familias Synergistaceae y Oscillospiraceae en los pacientes MMdx y con MM en recaída y/o refractario (MMrr). *P<0,05. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 108 5.3.2. Estudio de la microbiota relacionada con la producción de AGCC 5.3.2.1. La microbiota relacionada con la producción de AGCC disminuyó con la progresión y peor respuesta de la enfermedad En la caracterización a nivel de género, encontramos que la abundancia de la microbiota relacionada con la producción de AGCC estaba disminuida en los pacientes MMdx comparado con los controles. Estas diferencias en los niveles de abundancia entre los grupos de progresión de la enfermedad fueron significativas en Butyricimonas, Prevotella y Senegalimassilia (Figura 28A). Figura 28. Caracterización taxonómica de la microbiota intestinal en la progresión y respuesta de la enfermedad. A) Abundancia relativa (%) representados por la media ± SEM de los microorganismos beneficiosos de los géneros Butyricimonas, Prevotella y Senegalimassilia en los controles (C) y pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), mieloma quiescente (MMq) y mieloma múltiple (MM) en el momento del diagnóstico (MMdx). B) Comparación de RESULTADOS 109 la abundancia relativa (%) de los géneros Blautia y Weissella entre GMSI y MMdx. *P<0,05, **P<0,01. La abundancia relativa de estos géneros mostró una tendencia a disminuir en la progresión de la enfermedad desde estadios premalignos (GMSI, MMq) hasta el diagnóstico (MMdx). Cuando comparamos el grupo de pacientes GMSI con MMdx, observamos diferencias en los géneros Weissella y Blautia (Figura 28B). Por el contrario, el género Lachnoclostridium, que ha sido correlacionado negativamente con acetato en otros estudios (172) mostró mayores niveles de abundancia en MMdx comparado con los controles y el género Intestinibacter, que también se correlaciona negativamente con los AGCC (173), tuvo una mayor abundancia en MMdx comparado con los controles (Figura 29A). De forma interesante, encontramos una disminución de este género cuando comparamos la respuesta completa al tratamiento comparado con MMdx, acompañada de un aumento en el microorganismo patogénico Actinomyces en MMrr comparado con MMdx (Figura 29B). También descubrimos una disminución en MMrr con respecto a MMdx en la abundancia relativa de los géneros Haemophilus, Dorea y Fusicatenibacter (Figura 30A), que son productores de AGCC (174–176). Similarmente a los resultados obtenidos en el análisis de la progresión, se observaron menores niveles de abundancia de los géneros Blautia y Weissella en MMdx comparado con el momento de remisión completa (Figura 30B). Además, encontramos una correlación positiva de los niveles de ambos géneros con los niveles de los AGCC propionato y butirato presentes en el suero de los pacientes. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 110 Figura 29. Caracterización taxonómica de la microbiota intestinal en la progresión de la enfermedad. Abundancia relativa (%) representada por la media ± SEM de los microorganismos patogénicos de A) los géneros Lachnoclostridium, e Intestinibacter en controles (C), y pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), mieloma quiescente (MMq) y mieloma múltiple (MM) en el momento del diagnóstico (MMdx); B) los géneros Intestinibacter y Actinomyces en los pacientes MMdx y MM en remisión completa (MMrc) o en recaída y/o refractario (MMrr), respectivamente. *P<0,05; **P<0,01. RESULTADOS 111 Figura 30. Caracterización taxonómica de la microbiota intestinal en la respuesta al tratamiento. Abundancia relativa (%) representada por la media ± SEM de los microorganismos de los géneros A) Haemophilus, Dorea y Fusicatenibacter en pacientes con mieloma múltiple (MM) en el momento del diagnóstico (MMdx) y en recaída/refractario (MMrr); y B) Blautia, Weissella y Fibrobacter en los pacientes MMdx y MM en remisión completa (MMrc) (en muestras pareadas en el caso del género Fibrobacter). *P<0,05, **P<0,01. Cuando comparamos la evolución de los pacientes con MM desde el diagnóstico hasta la remisión completa usando muestras pareadas, encontramos un aumento en los microorganismos productores de fibra (177,178), relacionada con la producción de butirato, Fibrobacter (Figura 30B) y Agathobacter (Figura 31A). En el caso de Agathobacter además encontramos diferencias significativas entre pacientes con MMrc y MMrr, quienes mostraron niveles hasta seis veces menores (Figura 31B). Debido a que este género parecía mostrar una fuerte relación con la respuesta al tratamiento, lo siguiente que hicimos fue analizar la supervivencia de los pacientes con niveles altos y bajos de la Agathobacter. De forma interesante, observamos que la supervivencia de los EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 112 pacientes con más abundancia de Agathobacter fue significativamente mayor que aquellos con menor abundancia de este género (Figura 31C). Figura 31. Análisis del género Agathobacter en la respuesta de la enfermedad. Abundancia relativa (%) representada por la media ± SEM del genéro Agathobacter en pacientes A) con mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx) y MM en remisión completa (MMrc) en muestras pareadas; B) MMrc y MM en recaída y/o refractario (MMrr). C) Representación de curva de supervivencia global (SG) de Kaplan-Meier en pacientes MMrr o MMrc con niveles de abundancia alto (rojo) o bajo (azul) del género Agathobacter. El punto de corte se estableció utilizando el estadístico Maximally Selected Rank. 5.3.2.2. Estudio de las vías metabólicas de los AGCC en el MM Para profundizar en el estudio funcional de las comunidades de la microbiota intestinal, hicimos una predicción de las vías metabólicas basadas en los perfiles taxonómicos. Para ello, llevamos a cabo un análisis LEfSe para comparar las vías metabólicas de la base de datos KEGG entre los diferentes grupos. Como se muestra en la Figura 32A, observamos RESULTADOS 113 un aumento de la vía metabólica del butirato en los controles en comparación a los pacientes MMdx (Figura 32A). Figura 32. Vías metabólicas del análisis metagenómico. Análisis discriminante lineal (LEfSE, Linear Discriminant Analysis Side Effect, en inglés) que representa las vías metabólicas de la base de datos KEGG (del inglés Kyoto Encyclopedia of EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 114 Genes and Genomes) y MetaCyc entre los grupos A) control (C) y pacientes con mieloma múltiple (MM) en el momento del diagnóstico (MMdx); B) MMdx y pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI); C) MMdx y pacientes con MM en recaída/refractario; D) MMdx y pacientes con MM en remisión completa (MMrc). E) Representación de la probabilidad de supervivencia global (SG) Kaplan-Meier todos los pacientes estudiados con niveles de abundancia alto (rojo) o bajo (azul) de la vía metabólica del propionato en función del tiempo. El punto de corte se estableció utilizando el estadístico Maximally Selected Rank. Todas las vías de KEGG mostraron un cambio estadísticamente significativo (P<0,05), con un umbral de puntuación LDA establecido en 2,5. La abundancia relativa de vías metabólicas relacionadas con los AGCC está representada por la media ± SEM. *P<0,05, **P<0,01. Cuando comparamos los pacientes del estadio premaligno GMSI con los MMdx, vimos un incremento en la vía de la metanogénesis relacionada con el acetato (Figura 32B). Las diferencias en el metabolismo del butirato se observaron también en la respuesta, junto con las vías metabólicas de los ácidos grasos y del propionato. Como era de esperar, la abundancia de estas vías relacionadas con los AGCC fue menor en los pacientes MMrr comparado con los MMdx (Figura 32C). Similarmente, en el análisis de las vías implicadas en la respuesta, observamos una disminución de la vía del propionato en los pacientes MMrr comparados con los MMrc (Figura 32D). Para completar el estudio de su posible impacto en la respuesta de la enfermedad, quisimos analizar la supervivencia de los pacientes en relación al metabolismo del propionato y encontramos que la supervivencia global de los pacientes era mayor (p=0.02) en pacientes con niveles altos de esta vía, en comparación a aquellos con niveles bajos (Figura 32E). 5.3.2.3. Los niveles de AGCC producidos por la microbiota disminuyeron en la progresión de la enfermedad Para validar la asociación de los AGCC con la progresión del MM, quisimos cuantificar los niveles de estos acetato, butirato y propionato en las muestras de suero de los pacientes. Los resultados obtenidos en el análisis de estos metabolitos mediante espectrometría de masas revelaron las diferencias en los niveles de AGCC en los distintos grupos de progresión. Como puede verse, cuando comparamos los pacientes con estadios RESULTADOS 115 previos al MM, el nivel de acetato disminuyó en los pacientes con mieloma quiescente con respecto a los GMSI (Figura 33A). Por otro lado, cuando comparamos los pacientes con GMSI con los pacientes MMdx, observamos menores niveles de butirato y propionato en estos últimos (Figura 33B-C). Como era de esperar, se encontraron correlaciones significativas con los productores de ácidos grasos Blautia, Weisella y Agathobacter (Figura 3D). Además, los niveles butirato se encontraron disminuidos en los pacientes MMdx con respecto a los MMrc (Figura 33E). Figura 33. Niveles de los ácidos grasos de cadena corta en la progresión y respuesta del MM. A) Niveles de acetato en suero (mg/l) en pacientes con gammapatía monoclonal de significado indeterminado (GMSI) y mieloma quiescente (MMq). B) Niveles de butirato en suero (mg/l) en los pacientes con GMSI y mieloma múltiple (MM) al diagnóstico (MMdx). C) Niveles de propionato en suero (mg/l) en los pacientes con GMSI y MMdx. D) Correlación de Pearson entre los niveles de acetato, propionato, butirato y el total de todos (mg/l) en controles y pacientes con GMSI, MMq y MMdx. E) Niveles de butirato en suero en pacientes con MMdx y MM en remisión completa (MMrc). E). *P<0,05, **P<0,01. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 116 5.3.3. Estudio de la microbiota productora de urolitina 5.3.3.1. La urolitina correlacionó positivamente con la producción de AGCC y con la diversidad alfa de los pacientes La producción de AGCC se ha asociado a la transformación de polifenoles por parte de la microbiota intestinal (179). Así, el enriquecimiento de AGCC previamente mencionado podría asociarse con la producción de urolitinas (180,181). Tal y como esperábamos, observamos una correlación positiva entre la producción de los AGCC propionato y butirato con los niveles de urolitina total y, en especial, de UA, que determinamos en las heces de los pacientes (Figura 34A). Figura 34. Correlación de los niveles de urolitina con los de ácidos grasos de cadena corta y con la diversidad alfa. A) Correlación de los niveles de urolitina total y urolitina A y los niveles de acetato, propionato y butirato en las muestras de suero de todos los pacientes. B) Correlación de los niveles de urolitinas total y urolitina A y la diversidad alfa medida por los índices Chao, Pielou, Shannon y Simpson en las muestras de suero de todos los pacientes. *P<0,05. Debido a que también se ha asociado una mayor diversidad a una mayor producción de urolitina, específicamente de la UA (180), quisimos estudiar la diversidad intrínseca de los grupos de pacientes o diversidad alfa y su relación con la producción de estos metabolitos. Los resultados de correlación mostraron que los principales índices de diversidad alfa, Chao, Pielou, Shannon y Simpson, determinados en el análisis de secuenciación del gen del ARNr 16S procedente de las muestras fecales, se RESULTADOS 117 correlacionaron positivamente con los niveles de urolitina total y de UA presentes en las heces de los pacientes (Figura 34B). 5.3.3.2. Los niveles de urolit ina disminuyeron en los pacientes con MM en el momento de diagnóstico y tuvieron un impacto en la supervivencia Siguiendo con el análisis de la urolitina en los pacientes, evaluamos si los niveles de este metabolito se veían influidos por la progresión del MM y su respuesta al tratamiento, encontrando que el porcentaje de pacientes con niveles detectables de urolitina era menor en los grupos de pacientes con la enfermedad en su forma más activa, es decir, los grupos MMdx y MMrr (Figura 35A) frente a los que se encontraban en un estadio premalignos (GMSI y MMq), así como los pacientes en remisión completa. Cuando clasificamos a los pacientes según si tenían o no niveles detectables de urolitina, observamos que el grupo mayoritario con niveles no detectables fue el de MM activo (56%), mientras que solo el 15% de los pacientes con urolitina tenían la enfermedad activa (Figura 35B). Tras estos hallazgos, nos preguntamos si la presencia de urolitina estaba relacionada con la supervivencia de los pacientes y descubrimos que los pacientes con niveles detectables de urolitina en heces tuvieron una mayor supervivencia libre de progresión (Figura 35C). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 118 Figura 35. Niveles de urolitina en la progresión de la enfermedad. A) Proporción de individuos (%) de cada grupo de estudio con niveles detectables de urolitina total en muestras de heces. Los grupos estudiados fueron controles (C) y pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), mieloma quiescente (MMq), mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx), MM en recaída/refractario (MMrr) y en remisión completa (MMrc). B) Proporción (%) de los grupos de pacientes MM en recaída (MMrc), GMSI y MMq (pre-MM), y MMdx y MM en recaída/refractario (MM activo), con o sin niveles de urolitina detectables en suero. C) Representación de la probabilidad de supervivencia libre de progresión (SLP) Kaplan-Meier de los pacientes MMrr y MMrc con ausencia (rojo) o presencia (azul) de urolitina en suero. El punto de corte se estableció utilizando el estadístico Maximally Selected Rank. RESULTADOS 119 5.3.3.3. La abundancia de microbiota productora de urolitina está disminuida en los pacientes con MM en el momento de diagnóstico y en recaída y/o refractariedad En base a los resultados obtenidos, nos propusimos estudiar los microorganismos relacionados con la producción de urolitinas en las muestras de pacientes, tanto en la progresión como en la respuesta de la enfermedad. En el estudio mediante secuenciación del 16S de los niveles de dichos microorganismos en la progresión de la enfermedad, observamos una disminución significativa en la abundancia relativa de Ruminococcus, correlacionado positivamente con la producción de urolitina (181), en los pacientes con MM en el momento de diagnóstico comparado con los controles sanos. Similarmente, los niveles de abundancia del género Raoultibacter también disminuyeron en los pacientes con MM en el momento de diagnóstico e incluso en estadios premalignos como GMSI y quiescente con diferencias significativas (Figura 36A). Por su parte, Raoultibacter ha sido descubierta recientemente a partir de la productora de urolitina Gordonibacter urolithinfaciens, con la que comparte un alto porcentaje de similitud y es filogenéticamente muy cercana(182). Al contrario, los niveles de abundancia del género Erysipelatoclostridium, correlacionado negativamente con la producción de urolitinas (181), fue significativamente mayor en los pacientes de MM al diagnóstico con respecto a los controles. Además, se observaron diferencias significativas entre los grupos de progresión estudiados. Otro género cuya correlación con la producción de urolitina es negativa, Flavonifractor (181) también aumentó en MM al diagnóstico con respecto a los controles y a los pacientes con GMSI con diferencias significativas (Figura 36B). Cuando analizamos los niveles de los microorganismos relacionados con la producción de urolitina en la respuesta de la enfermedad, vimos una disminución en los niveles de Ruminococcus gauvreauii y un aumento de Phocea en los pacientes refractarios con respecto a los pacientes en el momento de diagnóstico (Figura 36C). Al contrario que Ruminococcus, el género Phocea se ha visto correlacionado negativamente con la producción de urolitina(181). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 120 Figura 36. Caracterización taxonómica de la microbiota relacionada con la producción de urolitina en la progresión de la enfermedad. Abundancia relativa (%) de los géneros A) Ruminococcus, Raoultibacter en controles (C) y pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), mieloma quiescente (MMq), mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx); B) Erysipelatoclostridium y Flavonifractor en C, GMSI, MMq y MMdx; C) Ruminococcus y Phocea en pacientes MMdx y con MM en recaída/refractarios (MMrr). RESULTADOS 121 En el estudio de uno de los microorganismos productores de urolitina más importantes, el género Gordonibacter, observamos una tendencia en la disminución de sus niveles en los pacientes MMrr con respecto a MMdx (Figura 37A) y también a los pacientes MMrc (Figura 37B). Como era de esperar, la correlación de este género con la producción de urolitina total y de UA mostró una tendencia positiva. Figura 37. Análisis del género productor de urolitina Gordonibacter. Abundancia relativa (%) del género Gordonibacter en A) pacientes con mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx), y MM en recaída/refractario; B) pacientes con MM en remisión completa (MMrc) y MMrr. C) Correlación de Pearson de la abundancia de Gordonibacter con los niveles de urolitina total y de urolitina en muestras de suero de todos los pacientes analizados. Los análisis para A-B y C se realizaron con los niveles de abundancia relativa resultantes de la secuenciación del 16S y de la PCRq, respectivamente. Similarmente, el género Terrisporobacter, se observó disminuido en los pacientes refractarios en comparación a los pacientes de diagnóstico (Figura 38A) y también a los de remisión completa (Figura 38B). Además, Terrisporobacter se correlacionó positivamente con los niveles de urolitinas y significativamente con la producción de UA (Figura 38C). Cuando evaluamos la supervivencia de los pacientes en relación a este EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 122 género, observamos que los pacientes con presencia de Terrisporobacter tuvieron una supervivencia mayor que aquellos que no (Figura 38D). Figura 38. Análisis del género Terrrisporobacter. Abundancia relativa (%) del género Terrisporobacter en A) pacientes con mieloma múltiple (MM) a diagnóstico (MMdx), y MM en recaída/refractario; B) pacientes con MM en remisión completa (MMrc) y MMrr. C) Correlación de Terrisporobacter con los niveles de urolitina total y de urolitina en muestras de suero de todos los pacientes analizados. D) Representación de la probabilidad de curva de supervivencia global (SG) Kaplan-Meier en pacientes de MMrr y MMrc con presencia (azul) o ausencia (rojo) de Terrisporobacter en suero en función del tiempo. RESULTADOS 123 5.3.4. Evaluación de la UA como diana terapéutica en el mieloma múltiple 5.3.4.1. El tratamiento con UA tuvo un efecto antiproliferativo en líneas celulares MM Para estudiar el efecto terapéutico de la UA, se evaluó la supervivencia de las células en las líneas celulares de MM JJN3-GFP y U266-GFP tras la exposición durante 48 horas a dicho compuesto, en comparación a los AGCC. Tal y como se muestra en la Figura 39, la urolitina presentó un gran poder citotóxico sobre ambas líneas celulares con valores de IC50 en el rango de micromolar (IC50 JJN3-GFP= 6 µM; IC50 U266-GFP = 16,51 µM) (Figura 39), comparado con el de los AGCC, con los valores de IC50 en el rango de milimolar, tanto en la (IC50 Acetato: 7,81 mM, IC50 Butirato: 1,50 mM, IC50 Propionato: 5,10 mM) como en U266-GFP (IC50 Acetato: 22,52 mM, IC50 Butirato: 1,28 mM, IC50 Propionato: 6,28 mM) (Figura 39). Figura 39. Estudio del efecto de los ácidos grasos de cadena corta y la urolitina en la supervivencia de líneas celulares de mieloma múltiple. Curvas de dosis-respuesta tras 48 horas de exposición a los metabolitos acetato, butirato, propionato y urolitina A en JJN3-GFP y U266-GFP. Se representa la media ± SEM de los datos normalizados respecto a la condición control. 5.3.4.2. La UA tuvo un impacto en el ciclo celular y la apoptosis Puesto que la línea celular JJN-GFP mostró un mayor efecto citotóxico, se decidió elegir esta línea para continuar el estudio. La inhibición de la proliferación fue acompañada EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 124 además de una detención del ciclo celular mediada por el tratamiento con UA. El estudio de citometría en las células tratadas con urolitina, en una concentración de 15 µM, reveló un aumento en el número de células en fase S (20%) y en fase G2/M (14,8%) con respecto al control sin tratamiento (5,56% y 7,93%, respectivamente). Por el contrario, la población celular en fase G0/G1 disminuyó en las células tratadas con urolitina (59,7%) comparadas con el control (80,6%) (Figura 40A). Con el objetivo de dilucidar si la inhibición de la proliferación celular se producía por la vía de la apoptosis, utilizamos el marcadores de citometría anexina V y yoduro de propidio. La anexina V tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina, que queda expuesta en la superficie celular de las fases tempranas de la muerte celular y el yoduro de propidio para detectar la apoptosis tardía (183). Como puede observarse, las células apoptóticas o anexina V positivas en la condición de tratamiento con urolitina a 15 µM es superior (11,3%) que la misma población en la condición control (8,8%) (Figura 40B). Estos resultados sugieren que la vía de la apoptosis podría estar implicada en el control del crecimiento y ciclo celular en células tratadas con urolitina. RESULTADOS 125 Figura 40. Estudio del efecto de la urolitina A sobre el ciclo y la apoptosis en la línea celular de MM JJN3-GFP mediante citometría de flujo. A) Representación del ciclo celular de JJN3-GFP tras 24 horas de exposición a urolitina A mediante el histograma que muestra el contenido de ADN y el contaje de células en los diferentes estadios del ciclo celular y diagrama de barras de su distribución por fases: fase G0/G1, fase S y fase G2/M. B) Representación de la apoptosis mediante diagrama de puntos y gráfico de barras representando las células (%) vivas (negativas tanto para anexina V como para PI, en apoptosis temprana (positivas en anexina V), en apoptosis tardía y muerte (positivas tanto para anexina V como para PI) y en necrosis (sólo positivas para PI). APC, aloficocianina; PI, yoduro de propidio. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 126 5.3.4.3. La expresión de proteínas implicadas en la actividad mitocondrial disminuyó en las células tratadas con UA Con el fin de evaluar el papel de la urolitina sobre la actividad mitocondrial de las células de mieloma, se estudió la expresión proteica de los complejos de la cadena respiratoria tras la exposición al tratamiento con urolitina a la concentración de 15µM. Los resultados obtenidos mostraron una disminución de los niveles de los complejos mitocondriales III, IV y V en las células tratadas con urolitina, con diferencias significativas en tres de ellos. Los complejos I y II, sin embargo, no mostraron diferencias con respecto al grupo de células sin el tratamiento (Figura 41). Figura 41. Estudio de la actividad mitocondrial tras la exposición a urolitina A en la línea celular JJN3-GFP. Niveles de expresión de los complejos del sistema de fosforilación oxidativa sobre la línea celular JJN3-GFP sin tratar (control) y tras la exposición a urolitina A (UA) durante 48 horas analizados RESULTADOS 127 por electrotransferencia. Los complejos estudiados fueron: subunidad 8 del subcomplejo beta de NADH deshidrogenasa del Complejo I (NDUFB8), la subunidad B de la succinato deshidrogenasa del Complejo II (SDHB), la subunidad 1 del complejo citocromo c oxidasa del Complejo IV (MTCO1), la subunidad 2 del complejo citocromo b-c1 del Complejo III (UQCRC2) y ATP sintasa subunidad alfa del Complejo V (ATP5A). La condición de control se expuso a DMSO en las mismas condiciones que el tratamiento con UA. Los gráficos de barras representan la media ± SEM de la expresión de los complejos normalizados frente al control de carga gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). *P<0,05. 5.3.4.4. El tratamiento con UA atenuó el estrés oxidativo en líneas celulares de mieloma múltiple Con el objetivo de estudiar el efecto de la urolitina en el estrés oxidativo, se estudió la vía de peroxidación lipídica mediante uno de los principales productos generados en este proceso, el HNE. El análisis de IHC de la línea celular JJN3-GFP, reveló una disminución en los niveles de HNE en las células tratadas con urolitina. Como puede verse, el marcaje con HNE se atenuó en todas las condiciones de tratamiento, en un rango de concentraciones de urolitina de 15 a 100 µM (Figura 42). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 128 Figura 42. Estudio del estrés oxidativo tras la exposición a urolitina A en la línea celular JJN3-GFP. Niveles de HNE en la línea celular JJN3-GFP tras la exposición a urolitina A (UA) durante 48 horas a distintas concentraciones: 15 µM, 30 µM, 60 µM y 100 µM analizados mediante IHC. La condición de control se expuso a DMSO en las mismas condiciones que el tratamiento con UA. RESULTADOS 129 5.3.4.5. El tratamiento con UA mejoró significativamente la supervivencia en un modelo in vivo de MM Para verificar la eficacia y seguridad del tratamiento con urolitina, se realizó un estudio in vivo en ratones inmunodeficientes NSG. Para ello, tal y como se describe en el apartado 4.3.3, se injertaron 1 x 106 células de la línea JJN3-GFP y 3 días después, se inició el tratamiento con urolitina o DMSO en el caso del grupo control durante 4 semanas. El análisis de imagen de bioluminiscencia reveló que el tratamiento con urolitina inhibió la proliferación de las células tumorales en comparación con el grupo de ratones control (Figura 43A-B). Además, se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la supervivencia global en el grupo de tratamiento con respecto al grupo control (P=0,0048) (Figura 43C). La media de supervivencia en días del grupo de tratamiento fue de 29 días frente a los 24,8 días del grupo control. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 130 Figura 43. Estudio in vivo del tratamiento con urolitina en ratones injertados con la línea JJN3-GFP. A) Imágenes de bioluminiscencia tomadas en posición dorsal y ventral del grupo tratado con urolitina A (UA) y del grupo control expuesto a DMSO, tras 7, 14, 21 y 28 días desde el inicio del experimento. B) Comparación de la señal luminiscente entre los grupos de control y tratados con UA en los días 7, 14 y 21. Se representa la media ± SEM la señal luminiscente obtenida en fotones por segundo (f/s). C) Análisis de supervivencia Kaplan-Meier del grupo control y tratado con UA. **P<0,05. RESULTADOS 131 5.3.4.6. La combinación de la UA con bortezomib tuvo un efecto sinérgico y es eficiente en la resistencia farmacológica. Dada la eficacia del tratamiento con urolitina A en las líneas celulares de MM, nos propusimos evaluar el posible efecto de la combinación con bortezomib. El estudio de sinergia reveló que la mayoría de las dosis en combinación tuvieron un efecto sinérgico entre ambos fármacos, con índices de combinación inferiores a 0,5 tanto en la línea JJN3-GFP (con 19 puntos con IC<0,5) como en la U266-GFP (con 11 puntos con IC<0,5) (Figura 44). Figura 44. Estudio de la combinación de urolitina A con bortezomib en líneas celulares de MM. Isobologramas normalizados que representando los IC tras el tratamiento combinado de urolitina A y bortezomib en las líneas JJN3-GFP y U266-GFP. IC, índice de combinación. Puesto que la línea JJN3-GFP había mostrado un mayor poder citotóxico en monoterapia y una mayor sinergia con el bortezomib, se decidió elegir esta línea para continuar este estudio. Para evaluar la eficiencia del tratamiento con urolitina en la resistencia a bortezomib, se llevó a cabo el estudio de dosis-respuesta en la línea resistente a 11 nM de bortezomib JJN3-GFP_R-Btz, que mostraba una IC50 3,2 veces superior (Figura 45A). Como muestra la Figura 45B, el efecto citotóxico del tratamiento con urolitina en la línea resistente a bortezomib fue similar a lo observado en la sensible. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 132 A continuación, quisimos conocer si el efecto sinérgico observado entre ambos fármacos en la línea sensible ocurría también la línea resistente a bortezomib. Tal y como puede observarse, la sinergia también se produjo en la línea JJN3-GFP R, con 15 puntos de combinación inferiores a 0,5 (Figura 45C). Figura 45. Estudio del tratamiento con urolitina y bortezomib en la línea celular JJN3-GFP resistente. A) Curvas de dosis-respuesta tras 48 horas de exposición a bortezomib en la línea sensible JJN3- GFP y resistente JJN3-GFP_R-Btz. B) Curvas de dosis-respuesta tras 48 horas de exposición a urolitina A en la línea sensible JJN3-GFP y resistente JJN3-GFP_R-Btz. (A-B) Se representa la media ± SEM de los datos normalizados respecto a la condición control. C) Isobolograma normalizado representando los IC tras el tratamiento combinado de urolitina A y bortezomib en la línea JJN3-GFP_R-Btz. IC, índice de combinación; Btz, bortezomib. RESULTADOS 133 5.3.4.7. La combinación de UA con bortezomib moduló distintas vías de señalización implicadas en el desarrollo de l MM Para la caracterización molecular de las vías de señalización implicadas en el tratamiento con urolitina y su combinación con el bortezomib, se analizó la expresión de proteínas mediante electrotransferencia y PCRq. Este estudio se llevó a cabo en las líneas JJN3- GFP y JJN3-GFP R tras su exposición a las distintas condiciones de tratamiento: control, urolitina a 15 µM, bortezomib a 4 nM y su combinación. Puesto que previamente habíamos observado un efecto en el ciclo celular, nos propusimos profundizar en una de las principales vías implicadas en estos procesos, la vía p53/p21. Como primer resultado, obtuvimos que el tratamiento con urolitina en monoterapia tuvo un efecto similar en la expresión de la proteína p53 que con el tratamiento con bortezomib. Ambos fármacos aumentaron ligeramente la expresión de p53 con respecto al control, pero el tratamiento con la combinación potenció dicho incremento significativamente. Además, este impacto sobre la expresión de p53 en la condición de tratamiento de combinación, también se observó en la línea resistente a bortezomib (Figura 46). Figura 46. Análisis de los niveles de expresión de p53 tras el tratamiento con urolitina A, bortezomib y su combinación en la línea celular JJN3-GFP. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 134 Niveles de p53 analizados por electrotransferencia en la línea celular JJN3-GFP sensible y resistente a bortezomib (Btz) tras la exposición a urolitina A (UA) a 15 µM, Btz a 4 nM y la combinación de ambos (UA+Btz) durante 48 horas. La condición de control se expuso a DMSO en las mismas condiciones que el tratamiento de combinación. Los gráficos de barras representan la media ± SEM de la expresión de p53 normalizada frente al control de carga gliceraldehído 3- fosfato deshidrogenasa (GAPDH). *P<0,05. Cuando estudiamos la diana de p53, p21, no observamos diferencias en los niveles de expresión en las células sensibles tratadas con urolitina con respecto al control, pero sí un aumento significativo en la línea resistente. Similarmente a lo observado en la expresión de p53, el tratamiento de combinación con bortezomib incrementó el nivel de expresión tanto en la línea sensible como en la resistente (Figura 47). Por tanto, estos resultados demostraron que el tratamiento de combinación de urolitina con bortezomib es efectivo es restituir la función de las proteínas p53 y p21. A continuación, estudiamos otra de las vías principales que contribuyen a la patogénesis del MM, la vía PI3K/Akt/mTOR. Cuando analizamos el nivel de la proteína p-mTOR fosforilada en la línea sensible, observamos una disminución en todas las condiciones de tratamiento, con respecto al control. De los tratamientos estudiados, la exposición a urolitina en monoterapia como en combinación disminuyó los niveles de p-mTOR en las células sensibles, hallándose diferencias significativas con respecto al control. En las células JJN3-GFP R, la combinación de la urolitina A con bortezomib también resultó en una disminución significativa de p-mTOR (Figura 48). RESULTADOS 135 Figura 47. Análisis de los niveles de expresión de p21 tras el tratamiento con urolitina A, bortezomib y su combinación en la línea celular JJN3-GFP. Expresión de p21 analizado mediante PCRq sobre la línea celular JJN3-GFP sensible y resistente a bortezomib (Btz) tras la exposición a urolitina A (UA) a 15 µM, Btz a 4 nM y la combinación de ambos (UA+Btz) durante 48 horas. La condición de control se expuso a DMSO en las mismas condiciones que el tratamiento de combinación. Los gráficos de barras representan la media ± SEM de la expresión de p21 normalizada frente al control de carga gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 136 Figura 48. Análisis de los niveles de expresión de mTOR y fu forma fosforilada (p-mTOR). Niveles de expresión de mTORy p-mTOR analizados por electrotransferencia sobre la línea celular JJN3-GFP sensible y resistente a bortezomib (Btz) tras la exposición a urolitina A (UA) a 15 µM, Btz a 4 nM y la combinación de ambos (UA+Btz) durante 3 horas. La condición de control se expuso a DMSO en las mismas condiciones que el tratamiento de combinación. Los gráficos RESULTADOS 137 de barras representan la media ± SEM de la expresión de p21 normalizada frente al control de carga gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). *P<0,05; **P<0,01. 139 6. DISCUSIÓN DISCUSIÓN 141 Distintos trabajos han sugerido la asociación del MM y de sus estadios premalignos con varios microorganismos, incluyendo algunos infecciosos como el VHC y el VHB (184– 188). Las infecciones causadas por estos y otros microorganismos podrían constituir el evento inicial que origine la patogénesis y conduzca en último término al desarrollo de la enfermedad. Por otro lado, se han propuesto varias posibles interacciones entre la microbiota intestinal y el MM. El complejo e interactivo equilibrio entre estos microorganismos no patógenos y el sistema inmunológico humano implica que su papel pueda ser tanto perjudicial, contribuyendo a promover la inflamación y el microambiente tumoral o beneficiosa con funciones como la como protección frente a patógenos, regulación del metabolismo y modulación inmunitaria (138,189). 6.1. LAS INFECCIONES CRÓNICAS POR VHC Y VHB Y EL TRATAMIENTO ANTIVIRAL IMPACTAN EN EL DESARROLLO DEL MM Algunos estudios previos han sugerido que existe una asociación entre las gammapatías monoclonales y la infección. En particular, se ha observado que al menos un tercio de los casos de GMSI y MM presentan una Ig Mc que reconoce algún patógeno infeccioso (65). Recientemente, Nair y colaboradores demostraron in vivo que la estimulación crónica antigénica puede conducir al aumento de células plasmáticas e Ig Mc, lo que respalda que las infecciones crónicas pueden ser el origen de las gammapatías monoclonales (72). Este nuevo modelo patogénico es importante ya que ofrece, la posibilidad de tratamiento para pacientes con GMSI, así como un enfoque terapéutico novedoso para MM: la reducción o supresión de la estimulación antigénica mediante el tratamiento de la infección que inició la gammapatía. En base a esta aproximación, en este trabajo se ha investigado el efecto del tratamiento antiviral en la evolución del MM en pacientes con infecciones previas por VHB o VHC. En ambas cohortes, la supervivencia de los individuos que recibieron terapia antiviral fue significativamente más alta que en los pacientes con MM cuya infección por VHB o VHC EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 142 no fue tratada. La efectividad de la terapia antiviral fue mayor en el caso de los pacientes con infecciones previas por VHC. Posiblemente esta diferencia pueda deberse a que los tratamientos anti-VHC son más eficaces contra los virus que los tratamientos anti-VHB, que normalmente no eliminan totalmente el VHB. De hecho, el ADNccc del VHB permanece estable en el núcleo de los hepatocitos, y la persistencia del ADNccc representa una barrera terapéutica para curar la infección crónica por el VHB (190–192). Cuando estudiamos el reconocimiento antigénico en una cohorte más pequeña de pacientes, observamos que un 66,7% de los pacientes reconocían específicamente al VHC. En este estudio, se seleccionaron pacientes que habían tenido infección por VHC antes del diagnóstico de la GMSI o el MM. De estos nueve pacientes, se pudo identificar el antígeno reconocido por la Ig Mc en siete de ellos, que resultó ser el VHC en seis casos y VHS-1 en un caso. Desafortunadamente, las técnicas actuales no permiten identificar el reconocimiento de las cadenas ligeras clonales, por lo que desconocemos cual es el antígeno que reconoce la Ig Mc en 2 de los pacientes. Estos resultados están en línea con los resultados anteriores obtenidos por Hermouet y colaboradores, que observaron que cuando los pacientes con GMSI o MM tienen antecedentes de infección por VHC, su Ig Mc se dirige al VHC en aproximadamente el 85 % de los casos (185). Para todos los casos estudiados de GMSI o MM positivos para el VHC, la especificidad clonal del VHC también se demostró a través del reconocimiento del VHC por la IgG monoclonal purificada y la falta de reconocimiento de otros patógenos infecciosos. El antígeno más reconocido fue el NS3. Esta proteína estructural contiene una helicasa de ARN que es fundamental para la replicación y el ensamblaje viral. Además, su otro dominio contiene una proteasa que divide a la propia poliproteína viral e inactiva proteínas del sistema inmune del hospedador (193). Por ello, los inhibidores de la proteasa de NS3 son uno de los fármacos más desarrollados para mejorar la terapia antiviral y una de las proteínas que es útil testar en pacientes que adquieren resistencia a la terapia (94). De forma interesante, observamos que aquellos pacientes que presentaban una Ig Mc que reconocía específicamente el VHC, el tratamiento antiviral mejoraba notablemente el resultado de su gammapatía. Es importante destacar que, en uno de los casos, por primera vez que se observado una remisión completa prolongada y estable en un paciente con MM refractario cuya IgG monoclonal reconocía el VHC, después de la administración única del tratamiento antiviral y mucho después de la administración de otros tratamientos DISCUSIÓN 143 hematológicos. Tras 48 meses de recibir los antivirales sofosbuvir y ledipasvir, el paciente permaneció en remisión completa sin síntomas de MM. Seguramente, la remisión completa del MM en este caso está relacionada con la desaparición del VHC, ya que nunca se ha demostrado que los medicamentos antivirales que recibió este paciente tengan ningún efecto anti-MM. Lógicamente, para los dos pacientes VHC positivos cuya Ig Mc no reconocía el VHC, el tratamiento antiviral no tuvo un efecto favorable sobre la GMSI o el MM del paciente (lo que confirma que los fármacos anti-VHC no tienen efectos anti-MM intrínsecos). Por lo tanto, este trabajo demuestra que se puede identificar el antígeno de la Ig Mc de los pacientes y relacionar la gammapatía a una infección crónica previa. Este enfoque debería ser útil para una fracción significativa de pacientes con GMSI y MM ya que un estudio reciente reveló que hasta el 7,4 % de los pacientes con MM fueron positivos para el ARN del VHC (194). Incluso, un estudio reveló que la prevalencia de las infecciones crónicas por VHB y VHC en pacientes con mieloma era del 11,0 % y el 9,0 %, respectivamente (195). La mayoría de los estudios sobre la prevalencia de la infección por el VHC se han realizado en áreas endémicas del VHC, como el sur de Europa y el este de Asia, y estos estudios han sugerido que la infección por el VHC tiene un papel patogénico en los trastornos linfoproliferativos, incluido el MM (194,195). Sin embargo, otros estudios han revelado incidencias similares de infección por VHC en pacientes con mieloma y en controles (196,197). Estas diferencias puedan deberse a la heterogeneidad en la manera de considerar el estatus del VHC, ya que algunos autores tienen en cuenta la presencia de anticuerpos y otros solo la del ARN viral. Según nuestros datos, la prevalencia del VHB y VHC en pacientes con MM globalmente es del 2,2% y del 1,98%, pero es importante destacar que sólo se incluyeron pacientes con la información de tratamientos recibidos disponible y teniendo en cuenta tanto los datos existentes sobre los anticuerpos presentes en suero como la carga viral, lo que podría explicar la diferencia con los estudios previos de otros autores. En el estudio de Kassem y colaboradores (194), los autores enfatizan que las pruebas serológicas al momento del diagnóstico de MM son necesarias para identificar a los pacientes infectados, y proponen que la confirmación de casos positivos por técnicas moleculares debería ser obligatoria. Si la gammapatía está relacionada con el microorganismo infeccioso, se puede determinar si la Ig Mc del paciente reacciona contra EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 144 el patógeno. Esta información permitiría proponer o incidir en administrar tratamientos antivirales o antibióticos a los pacientes con GMSI (actualmente no tratados), con el fin de frenar su evolución a MM y también a pacientes con MMq y MM, como tratamiento complementario, con el objetivo de mejorar la respuesta del paciente a la quimioterapia. Por tanto, la estrategia de tratar el antígeno reconocido por la Ig Mc, debería mejorar el pronóstico en pacientes con gammapatías, especialmente aquellos en las etapas GMSI o MMq. De hecho, estudios previos reportaron la necesidad de un seguimiento completo de los pacientes con infección crónica por la posibilidad de que desarrollen MM o linfoma no Hodgkin (198). Esta hipótesis ya ha sido evidenciada por Nair y colaboradores, quienes observaron que la terapia dirigida frente a un lípido antigénico en la enfermedad de Gaucher resultó en una reducción de la inmunoglobulina clonal in vivo (199). Similarmente, Panfilio y colaboradores (200) descubrieron un caso de regresión del MM después del tratamiento antiviral de un paciente con infección por VHC. Sin embargo, estos autores no estudiaron el antígeno al que se dirige la Ig Mc del paciente. Además, Ioannou y colaboradores también vieron un efecto beneficioso del tratamiento con interferón frente al MM en pacientes infectados por el VHC, pero no estudiaron la especificidad antigénica de la Ig Mc (201). Por el contrario, nuestro estudio establece que el tratamiento anti-VHC mejora e incluso suprime la GMSI o el MM cuando la gammapatía está impulsada por el VHC, es decir, cuando la Ig Mc del paciente se dirige al VHC. Inversamente, cuando la Ig Mc no reconoció al VHC, el tratamiento anti-VHC no tuvo efecto sobre la gammapatía, una confirmación indirecta de que el efecto beneficioso de la terapia antiviral sobre la GMSI y el MM actúa a través de la eliminación de la infección por el VHC. Se han hecho observaciones similares para pacientes infectados por el VIH diagnosticados con MM, en los que el tratamiento para el VIH dio como resultado una reducción significativa de la Ig Mc, una respuesta superior a la terapia contra el MM y mejoró la supervivencia general y libre de progresión (202). Aunque no se ha estudiado la especificidad de la Ig Mc de estos pacientes, los resultados obtenidos son consistentes con un papel beneficioso de la terapia antirretroviral en términos de controlar la proliferación de las células plasmáticas y la producción de Ig Mc. Similarmente a nuestros resultados en relación a la eficacia del tratamiento antiviral, Hermine y colaboradores, observaron la regresión del linfoma en pacientes cuyos linfocitos estaban infectados con VHC y recibieron tratamiento antiviral (96). Lamentablemente, a pesar de que la terapia antiviral es altamente eficaz frente a la DISCUSIÓN 145 infección por VHC, muchos pacientes no reciben tratamiento debido a barreras que van desde el diagnóstico tardío, la dificultad en el manejo con otras enfermedades o el rechazo por miedo a efectos secundarios o la falta de conciencia por parte del paciente (203). Nuestro estudio destaca la urgencia de tratar el VHC en pacientes infectados, especialmente en casos de GMSI, MMq o MM que presentan una Ig Mc que reacciona contra el virus, previo a los esquemas de quimioterapia. Además, recientemente se ha evidenciado que los actuales tratamientos de acción directa para el VHC pueden co- administrarse de manera segura y eficaz con la quimioterapia frente al MM (204). A pesar de que en estudios observacionales se ha demostrado que el VHC es un factor de riesgo para el desarrollo de ciertas enfermedades proliferativas, incluido el MM (188,205), los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Los mecanismos de entrada de las células del VHC implican la unión de la proteína E2 de la envoltura del virus y CD81, una molécula muy abundante en la superficie de los hepatocitos y también de los linfocitos B (100,206,207). Por lo tanto, el VHC puede infectar tanto a los hepatocitos como a las células B por lo que podría inducir directamente alteraciones genéticas en las células infectadas y el posterior desarrollo de malignidades hepáticas o de células B. De hecho, se ha visto que la unión del CD81 a las células B por la combinación de la proteína del VHC E2 y el anti-CD81 mAb, conduce a la proliferación de las células B nativas (76). Además, esta interacción E2-CD81 induce el proceso de hipermutación de los genes de las inmunoglobulinas en las células B (208), por lo que puede influir en el desarrollo de las patologías relacionadas con estas células (81). En el estudio llevado a cabo por Dai y colaboradores (209), se demostró que las proteínas del VHC se expresan en células B y sobrerregulan la señalización del BCR durante la infección. En base a estos resultados, los autores señalan la importancia de estas proteínas que podrían contribuir a la linfomagénesis. Ellos proponen un modelo en el que el VHC puede estimular inicialmente la proliferación de células B; posteriormente, las células B transformadas ya no requieren estimulación continua del VHC y sus BCR pueden tener una reactividad indetectable con el VHC. Esta hipótesis estaría en línea con el mecanismo que también se propone de “hit and run” por el cual el VHC tiene capacidad mutagénica que afecta a oncogenes y genes supresores (208). Los estudios que enfatizan la importancia de la estimulación crónica por los antígenos del VHC, sugieren un mecanismo de acción similar al que se desarrolla durante la infección EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 146 por H. pylori, que aumenta el riesgo de carcinogénesis indirecta y linfomagénesis en pacientes infectados con una cepa virulenta. La infección por H. pylori induce la inflamación gástrica y la estimulación antigénica crónica de las respuestas inmunitarias de las células B, lo que facilita la adquisición de alteraciones genéticas y la transformación de los tejidos gástricos infectados, así como de las células del linaje B. En los pacientes infectados, no es raro observar la presencia de Ig oligoclonales y después una Ig Mc (por lo tanto, de un clon plasmocitario), que por lo general desaparecen rápidamente. Es probable que el mismo proceso ocurra en la GMSI iniciada por la infección, excepto que el clon plasmocitario y la Ig Mc persisten durante más de 6 meses, a menudo durante varios años, y eventualmente progresan hacia el MM. Según nuestros resultados, en el contexto de la infección por VHC, dichos clones serían dependientes de antígenos, ya que el tratamiento antiviral resulta en la reducción o supresión de la célula plasmática clonal y la Ig Mc. Además, en el contexto de las gammapatías como la GMSI y el MM, es probable que el mecanismo más frecuente de transformación celular por el VHC sea indirecto, ya que los antígenos del VHC se detectan en células mononucleares periféricas en pacientes que padecen la infección crónica (210). Probablemente todos los mecanismos propuestos, la estimulación crónica del antígeno, la interacción de alta afinidad entre la proteína E2 del VHC y sus receptores celulares, la infección directa por el VHC de las células B y los eventos de transformación no se excluyen mutuamente, pero pueden combinarse en un modelo multifactorial provocando trastornos linfoproliferativos como el MM asociados al VHC (100,211). 6.2. LA ADECUADA COMPOSICIÓN DE LA MICROBIOTA INTESTINAL PUEDE MEJORAR LA EVOLUCIÓN DEL MM En esta parte del trabajo, utilizando una cohorte de 54 controles y pacientes en diferentes estadios de la enfermedad (GMSI, MMq, MMdx, MMrc y MMrr), se han identificado diferentes géneros y vías metabólicas como marcadores de evolución del MM, incluyendo la respuesta al tratamiento. Solo unos pocos estudios han evaluado previamente el estado de la microbiota en MM (113,114,121,137,212,213) y ninguno de ellos se ha enfocado DISCUSIÓN 147 analizar la progresión del MM usando muestras de pacientes en distintos estadios de la enfermedad. Además de descubrir diferencias en la diversidad de la microbiota intestinal, en este trabajo también se evidencia la función protectora de algunos metabolitos relacionados con la microbiota como los AGCC y la urolitina, con potencial aplicación en el MM. 6.2.1. La diversidad microbiana disminuye durante la evolución de la enfermedad Los resultados obtenidos en el análisis de la diversidad de la microbiota intestinal revelaron que la diversidad alfa está disminuida en los pacientes con MM en recaída o refractarios. Estas diferencias en la composición taxonómica de la diversidad alfa no parecen estar causadas por el tratamiento, como se vio en un estudio con pacientes de leucemia mieloide aguda tras la quimioterapia (214), ya que los pacientes en remisión completa, que también han recibido tratamiento, tuvieron niveles más altos de diversidad alfa. De hecho, el mayor nivel de diversidad alfa en los pacientes al alcanzar la remisión completa fue más evidente cuando lo comparamos con muestras pareadas con el momento del diagnóstico. En uno de los estudios que analizan la diversidad de la microbiota intestinal en pacientes de MM, encontraron que la diversidad alfa estaba disminuida en el grupo de los pacientes con MM comparado con el grupo control (137). Sin embargo, en nuestros resultados, no vimos diferencias significativas entre estos grupos, probablemente debido al menor tamaño de muestra, en comparación al estudio mencionado. La diversidad alfa también podría predecir la respuesta al tratamiento de los pacientes, ya que, al analizar las muestras de todos los pacientes en el momento de diagnóstico, encontramos menores niveles de diversidad alfa en aquellos que posteriormente recayeron. Similarmente, en un reciente estudio con 79 pacientes con MM en recaída o refractarios, se observó que la diversidad alfa de la microbiota oral fue más baja en los pacientes que tuvieron progresión de la enfermedad (215). En relación con el trasplante, se ha visto que hay pérdida de diversidad alfa después del trasplante (216) y que la menor diversidad en los pacientes antes del trasplante alogénico se asocia a una mortalidad más alta (118), confirmando el valor predictivo de la diversidad en los pacientes de MM. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 148 Aunque se ha sugerido que las diferencias en los cambios de la microbiota puedan deberse a la exposición a antibióticos de los pacientes que reciben trasplante, lo cierto es que no se han visto diferencias significativas que lo demuestren (217). En este trabajo el tamaño de la cohorte no nos permitió analizar las diferencias en la diversidad después de recibir diferentes tipos de antibióticos ni los tratamientos frente al MM. A pesar de que se ha evidenciado la relación entre los antibióticos y la microbiota, aún faltan estudios más amplios con muchos grupos de antibióticos en pacientes con MM (138). En línea con los resultados que obtuvimos en la diversidad alfa, también encontramos diferencias en la diversidad beta en pacientes en recaída y/o refractarios, que se agruparon por separado, y nuevamente, observamos diferencias cuando los pacientes alcanzaban la remisión completa. En el trabajo publicado por D’Angelo y colaboradores, el análisis de diversidad beta demostró que las comunidades microbianas eran distintas antes y después del trasplante en pacientes con MM. Además, los autores sugirieron que la pérdida de diversidad y las diferencias en la composición microbiana podría estar asociada con menor supervivencia libre de progresión (217). Las diferencias en la composición bacteriana tienen gran influencia sobre el microambiente de la médula ósea y la hematopoyesis. De hecho, se ha demostrado que ratones con una composición bacteriana distinta tenían una menor regulación de la producción de células madre y progenitores hematopoyéticos (218). Por todo ello, el estudio de la diversidad y composición microbiana tiene gran impacto en el contexto de los tumores hematológicos, como es el caso del MM. 6.2.2. La microbiota productora de AGCC se asoció a estadios premalignos y de remisión de la enfermedad En el estudio de la caracterización taxonómica, encontramos menor abundancia del filo Synergistota y de las familias Synergistaceae y Oscillospiraceae en los pacientes en recaída y/o refractarios, comparados con el grupo de diagnóstico. Estos microorganismos, se han visto correlacionados con niveles altos de AGCC (219,220). Además, también observamos una mayor abundancia de Oscillospiraceae, Leuconostocaceae y Micrococcaceae en los estadios premalignos, también relacionados con la producción de AGCC (221,222). DISCUSIÓN 149 A nivel de género, observamos que disminuyeron los géneros Butyricimonas, Prevotella y Senegalimassilia a lo largo de la progresión del MM. Nuevamente, todos estos géneros se han relacionado con la producción de AGCC (172,175,219,223). Como ya se ha mencionado, el estudio de Calcinotto y colaboradores (113) demostraron que la especie Prevotella heparinolytica acelera la progresión del MM. Sin embargo, los mismos autores reconocieron que Prevotella podría ejercer efectos pro o antitumorales según la cepa dominante. De hecho, la abundancia de Prevotella melaninogenica modelos preclínicos y humanos o su colonización en el intestino de ratón se asocia con una disminución de las células proinflamatorias Th17 en el intestino, en las articulaciones, en el sistema nervioso central y en la médula ósea, lo que conduce a la supresión de la artritis (224), mejora de la encefalomielitis autoinmune (225), ausencia de esclerosis múltiple (226) y disminución de la progresión del MM (113). Con respecto a Senegalimassilia y Butyricimonas, ambos microorganismos también se han visto previamente disminuidos en diferentes enfermedades (114,227), con lo que podrían presentar un papel protector. Adicionalmente, observamos que Blautia y Weissella tienen mayor abundancia en el estadio premaligno, GMSI, que en el MM activo. Estos dos géneros se han asociado previamente con la producción de AGCC, especialmente del propionato (175,228), lo que concuerda con lo observado en nuestro análisis de correlación. Por otro lado, su papel protector se ha evidenciado en diferentes enfermedades (212,229,230), luego su mayor abundancia en estadios premalignos podría ser beneficioso para los pacientes. Por el contrario, los géneros Lachnoclostridium e Intestinibacter presentaron niveles más abundantes en estadios más avanzados de la enfermedad. Ambos géneros han sido relacionados inversamente con la producción de AGCC (172,231) y asociados positivamente con enfermedades; Lachnoclostrodium se ha propuesto como marcador de adenoma en cáncer colorrectal (232) e Intestinibacter se ha relacionado con trastornos del neurodesarrollo (233) y nefropatía (173). Curiosamente, el género Intestinibacter, junto con Actinomyces, un patógeno oportunista, también se asoció inversamente con la respuesta al tratamiento. En un estudio reciente se observado que Intestinibacter está enriquecido en pacientes con peor respuesta en el melanoma (234). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 150 Cabe destacar que, al comparar las muestras pareadas encontramos que los pacientes tenían niveles más elevados de Fibrobacter en la remisión completa con respecto al momento de diagnóstico. Este género de microorganismos es especialmente importante en la producción de AGCC, ya que proporciona el sustrato para la producción de estos metabolitos a partir de la celulosa ingerida en la dieta (235,236). Similarmente, el género productor de butirato Agathobacter (178), aumentó en pacientes con respuesta completa en comparación con pacientes en el momento del diagnóstico y además con respecto a aquellos que no respondieron al tratamiento (en recaída y/o refractario). Además, observamos una correlación positiva de Agathobacter y AGCC, como se ha reportado previamente (178,237). Cabe destacar que la supervivencia en pacientes con mayor abundancia relativa de Agathobacter fue significativamente mayor que en aquellos con menor abundancia, lo que convierte a este microorganismo en un biomarcador de respuesta a tener en cuenta. De hecho, los niveles altos de este género de microorganismos se han visto asociados a pacientes con tasas favorables de respuesta global y con supervivencia libre de progresión en cáncer de pulmón no microcítico avanzado (238). De esta forma, mientras que otros trabajos se han centrado en microorganismos como Bacteroides, Clostridium o Rothia (137) o bacterias oportunistas recicladoras de nitrógeno como Klebsiella y Streptococcus (114), en este proyecto hemos identificado distintos géneros protectores de la microbiota que están relacionados con la producción de AGCC. Por ello, en este trabajo, también se exploraron las vías metabólicas asociadas a los diferentes estadios de la enfermedad. Como cabía esperar, las vías relacionadas con la producción de los metabolitos de AGCC se asociaron con estadios menos avanzados de la enfermedad, como la GMSI o el MM en el momento de diagnóstico, mientras que los niveles menos abundantes de estas vías se observaron en los pacientes en recaída y/o refractarios. En particular, los pacientes con niveles altos en la vía del metabolismo del propionato tuvieron una supervivencia significativamente mayor. Aproximadamente el 95% de los AGCC producidos gracias al metabolismo bacteriano, son absorbidos por los colonocitos, donde sirven como fuente de energía o son transportado al torrente sanguíneo, mientras que el 5% restante se elimina con las heces DISCUSIÓN 151 (239). Los metabolitos presentes en la circulación periférica son medibles en plasma y se encuentran en una concentración de entre 50 y 100 µM en el caso del acetato y entre 0,5 y 10 µM para el propionato y el butirato (240). Aunque los perfiles de AGCC se usan ampliamente como marcadores de salud o enfermedad intestinal, es importante tener en cuenta que una parte de los AGCC se absorben rápidamente, luego los niveles circulantes en suero representan solo una parte de los mismos (241). En este trabajo encontramos que el butirato y el propionato estaba disminuido en MM en comparación a los pacientes con GMSI. Además, en el caso del acetato, vimos una disminución también en los pacientes con MMq. Aunque el valor predictivo en los niveles de AGCC no está muy explorado en MM, nuestros resultados están en línea con la disminución que se ha visto en otros tipos de cáncer (136) y con lo observado recientemente con los niveles de butirato asociado a enfermedad mínima residual negativa en pacientes con MM (213). Por este motivo, quisimos estudiar si los niveles de AGCC en plasma se veían alterados a lo largo de la progresión del MM. Ciertamente, la concentración de los AGCC depende no solo de la composición bacteriana, sino también del tránsito intestinal, del flujo de interacción de metabolitos hospedador-microbiota y de forma muy importante, de la dieta (140). De hecho, los animales libres de microorganismos, que no tienen microbiota intestinal, muestran niveles muy bajos de AGCC tanto en el intestino como circulantes (242), del mismo modo que los ratones en un ambiente normal, pero alimentados con una dieta baja en fibra o sin fibra (243). El análisis de los AGCC en un número mayor de pacientes con MM teniendo en cuenta su dieta, especialmente el consumo de fibra podría ser de gran importancia como marcador pronostico del MM. Además, observamos que los niveles de butirato eran significativamente mayores en los pacientes al alcanzar la remisión completa, en comparación a los pacientes en el momento del diagnóstico. En un ensayo clínico con pacientes con enfermedad de injerto contra huésped en tratamiento, se compararon los niveles de AGCC en suero, encontrando que los pacientes respondedores a la terapia tuvieron niveles más elevados de propionato y butirato que aquellos que no respondieron (244). Además, recientemente se ha demostrado una asociación entre los niveles altos de butirato y la microbiota productora de este metabolito y en una respuesta estable de la enfermedad en MM (213). Así pues, los AGCC podrían tener también utilidad como marcadores de respuesta. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 152 En base a estos resultados, y dada la evidencia previa del efecto antiproliferativo y preventivo evidenciado en otros tipos de cáncer (136), quisimos validar el papel beneficioso de los AGCC en líneas celulares de MM, aún sin explorar. Nuestros hallazgos confirman, por primera vez, el poder citotóxico in vitro de estos metabolitos de la microbiota en líneas celulares de MM y sugieren un potencial uso terapéutico de los mismos. El efecto antitumoral de los AGCC ya se ha explorado en otros tipos de cáncer, demostrando su efecto citotóxico en células de carcinoma hepático (245) y en cáncer colorrectal (246). En este último estudio, los AGCC inhibieron el crecimiento de células de cáncer colorrectal humanas y, similarmente a nuestros resultados, el butirato mostró un poder inhibitorio mayor, en comparación al resto. De entre los AGCC, el butirato ha sido el más investigado en el contexto antiproliferativo, por su capacidad para inducir diferentes efectos según el tipo celular, ya que puede no tener efecto o incluso estimular el crecimiento de los colonocitos o actuar como un eficiente inhibidor HDAC en células cancerígenas (130). Cabe destacar que, en este trabajo, los valores de IC50 del butirato y el acetato, expuestos en las líneas celulares de MM, fueron menores que en las líneas celulares de cáncer colorrectal empleadas en el estudio de Ohara y colaboradores (246). Los valores de IC50 reportados en dicho estudio fueron de 2,89 mM en el caso del butirato y 16,6 mM para el acetato, frente a los valores de 1,50 mM y 7,81 mM que presentaron los mismos compuestos en este trabajo. Como se ha mencionado previamente, la función anticancerígena de los AGCC se debe en parte a su función inhibitoria de HDAC y de citoquinas proinflamatorias (132), involucradas en la patogénesis del MM. Por tanto, el uso de estos compuestos o su combinación con otros inhibidores HDAC ya empleados en la clínica, podría potenciar los efectos anti-MM y ampliar las estrategias terapéuticas. 6.2.3. La producción de UA mejora la evolución del MM Aunque aún no está muy estudiado, se han observado cambios en bacterias productoras de AGCC después de la producción de urolitina por parte de la microbiota intestinal (179). Además, el consumo de alimentos ricos en precursores importantes en el metabolismo de DISCUSIÓN 153 las urolitinas, como las nueces, se ha relacionado con una modulación de la microbiota dependiente de urolitina e incremento de la producción de AGCC (247). En el trabajo publicado por Cortes y colaboradores, se observó una correlación entre la microbiota productora de urolitina y la productora de AGCC (248). En base a estos resultados y dada la correlación la correlación positiva hallada en nuestro análisis entre los niveles de urolitina total y de UA con los AGCC, quisimos continuar explorando la microbiota en relación con la producción de UA en el contexto del MM, ya que no existe aún ningún trabajo al respecto. La mayoría de los estudios previos explorando la producción de urolitinas, se han enfocado en analizar la presencia de estos metabolitos tras el consumo de alimentos ricos en nueces, granadas y otros alimentos ricos en elagitaninos (247,249–251). Tras el proceso su conversión a partir de los elagitaninos y el EA, la urolitina puede estar disponible en el plasma en un rango de concentraciones de entre 0,003 y 5,2 µM (146) y de 0–316,7 μg g−1 en heces (252). Dado que no se ha fomentado el consumo previo de alimentos ricos en precursores en este trabajo, muchos pacientes tenían niveles indetectables de urolitinas. Por consiguiente, no ha sido posible realizar una comparación en base a la cuantificación de los niveles de urolitina. A pesar de esta limitación, la posible ingesta de estos alimentos que forman parte de la dieta mediterránea (181), han permitido la detección de niveles de urolitinas en algunos pacientes. En primer lugar, quisimos correlacionar los niveles de UA con la diversidad alfa ya que, en otros escenarios, los individuos con producción de UA tienen una mayor diversidad alfa en comparación con aquellos con producción nula (253). En efecto, en nuestros pacientes con MM, encontramos una correlación positiva entre los niveles de UA y la diversidad alfa. La mayor riqueza y diversidad de especies de la microbiota intestinal puede estar relacionada con un aumento en la capacidad de transformar los precursores procedentes de la dieta en UA, por lo que explicaría la mayor producción de UA asociada a más diversidad microbiana. Por otro lado y de forma interesante, nuestros resultados indicaron que la proporción de individuos con niveles detectables de urolitina era menor en el grupo de pacientes con diagnóstico de MM y con MMrr, en comparación con los pacientes con estadios previos e incluso, pacientes que alcanzaron la remisión completa. Adicionalmente, cuando EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 154 clasificamos a los pacientes según la presencia o no de UA, observamos que hay una asociación entre pertenecer a un grupo u a otro. En base a esta clasificación, los pacientes con la enfermedad activa, es decir, tanto los pacientes en el momento de diagnóstico como en el momento de la recaída, mayoritariamente no tenían niveles de urolitina detectables. Dado que la media de edad en los pacientes con MM es de 67 años (3) y que se ha propuesto que la edad es un factor importante que determina la microbiota involucrada en la producción de UA (254), podría indicar que la edad más avanzada en estos pacientes esté relacionada con menores niveles de UA. Sin embargo, otros trabajos indican que no hay evidencia de que los niveles de UA disminuyan con la edad (145). Además, con el fin de hacer objetiva la comparación, en nuestro estudio se han incluido controles con un rango de edad similar a los pacientes con MM. Por todo ello, podríamos atribuirlo probablemente a la condición de enfermedad. De hecho, posteriormente vimos que los pacientes que carecían de niveles detectables de urolitina en suero, tenían menor supervivencia libre de progresión de la enfermedad, lo que apoya los resultados previamente descritos. Aunque se sabe que la composición de la microbiota regula la capacidad para producir UA desde sus precursores, aún no se conocen todas las bacterias responsables de esa conversión (145). Estudios previos han identificado ciertos grupos y especies de microbiota intestinal asociados con la conversión y la producción de urolitina, destacando el género Gordonibacter (146,250). De hecho, hasta la fecha, solo dos especies del género Gordonibacter son los únicos que se han podido aislar y demostrar su producción y transformación en urolitinas (146). Puesto que este género está en una abundancia relativa muy baja, es difícil detectar sus niveles por NGS (247) y por ese motivo se caracterizó también por PCRq. Como cabía esperar, los niveles de Gordonibacter se observó una tendencia positiva, aunque no significativa en la correlación con urolitina. Por otra parte, la menor producción de urolitina observada previamente en los pacientes con diagnóstico y con recaída de MM, probablemente esté relacionada con la menor abundancia del género Gordonibacter. En línea con lo anterior, Gordonibacter y su función productora de urolitina, podría tener un papel en la mejor respuesta de la enfermedad, según lo observado en la abundancia relativa de este género y en los niveles detectables de urolitina en este grupo de pacientes. En un estudio previo con pacientes con la enfermedad de Parkinson, se demostró que los pacientes no productores de urolitina y con menor abundancia del género Gordonibacter, padecieron una enfermedad más agresiva (255). DISCUSIÓN 155 Sin embargo, otros microorganismos se han relacionado con la transformación de diferentes compuestos para producir elagitaninos y EA, por ejemplo, Phocea (181), cuya abundancia estaba aumentada en los pacientes con MM en recaída y/o refractario y Ruminococcus. Con respecto a Ruminococcus, cuya abundancia estaba disminuida en los pacientes con el diagnóstico de MM y en pacientes en recaída y/o refractarios, también se ha observado una disminución de su abundancia en muestras de pacientes con LLC. En base a sus resultados, Fiatová y colaboradores (256) sugirieron que Ruminococcus podía tener un papel en la disfunción del sistema inmune que tiene lugar en esta enfermedad , al igual que ocurre en el MM (257). De forma interesante, el nivel de abundancia de Raoultibacter, también se vio disminuido desde los estadios premalignos como la GMSI o el MMq, además de en el estadio de diagnóstico de MM. Este género de microorganismos se ha identificado y nombrado recientemente y comparte más de un 90% con el género Gordonibacter (182), luego podría tener una función similar en cuanto a la producción de UA. Otros microorganismos, cuya abundancia estaba incrementada en los pacientes con MM, como Erysipelatoclostridium y Flavonifractor o en los pacientes en recaída y/o refractarios se han correlacionado negativamente con la producción de UA (181). El patógeno oportunista Erysipelatoclostridium, se ha visto que podría alterar la respuesta inflamatoria (258) y constituye un biomarcador de detección temprana en cáncer colorrectal (259). Por su parte, Flavonifractor, también ha sido ampliamente asociado a una gran variedad de enfermedades (260), como los trastornos autoinmunes (261) o las enfermedades mentales (262). Otro de los microorganismos previamente correlacionados con urolitinas (181), Terrisporobacter, también mostró una correlación positiva con urolitina en nuestro análisis. Observamos diferencias significativas en la abundancia relativa de este género en los pacientes en recaída y/o refractariedad, que en este caso carecían de niveles detectables. Además, la ausencia de Terrisporobacter, se asoció a una menor supervivencia libre de progresión. Aunque una especie del género se ha descrito como patogénica (263) en otro estudio se ha demostrado un efecto probiótico y beneficioso del género Terrisporobacter en animales (264). EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 156 En base a estos resultados y dada la evidencia del papel beneficioso de la UA en numerosas enfermedades (145), nos propusimos estudiar su efecto en el MM. En 2009, un estudio in vitro pionero informó del efecto antiproliferativo de las urolitinas, principalmente UA, frente a diferentes células cancerosas de colon (158). Desde entonces, las propiedades anticancerígenas de las urolitinas, incluida la antiproliferación, la promoción de la apoptosis y la antiangiogénesis, han sido exploradas en modelos celulares de cáncer como el de colon, próstata, mama, riñón, hígado y cerebro (265). En este trabajo, se ha demostrado por primera vez el poder antiproliferativo de la UA líneas celulares de MM. En comparación al otro grupo de metabolitos testados en este estudio, los AGCC, la UA tiene un mayor efecto antiproliferativo en líneas celulares de MM. Según nuestros resultados, la UA fue capaz de inhibir el crecimiento celular tras 48 horas de exposición, obteniendo una IC50 de 6 y 16,51 µM en las líneas de MM JJN3-GFP y U266-GFP, respectivamente. Este efecto inhibitorio en células de MM parece mayor que lo explorado en otras líneas tumorigénicas, como es el caso del cáncer colorrectal, con valores de IC50 de 20-76 µM reportados en varios ensayos con líneas celulares (155,251,266) o de cáncer de próstata, con valores de IC50 de 32-70 µM (267). Luego, este ensayo demuestra un efecto antiproliferativo robusto en líneas celulares de MM. Por otro lado, la UA tuvo un impacto en el ciclo celular y la apoptosis en las células de la línea de MM JJN3-GFP. El ciclo celular tiene múltiples fases bien identificadas (G0/G1, S, y G2/M) a través de las cuales las células crecen y se replican principalmente controladas por proteínas clave. En el MM, al igual que ocurre con otros tipos de cáncer, se produce una desregulación de algunas de estas proteínas, resultando en ciclos aberrantes de división celular que contribuyen a la patogénesis por lo que la búsqueda de inhibidores que induzcan la detención del ciclo celular tiene un gran interés terapéutico (160). Muchos de los agentes anticancerígenos inducen la detención del ciclo celular en puntos de control clave, como son la bendamustina y el bortezomib. Ambos fármacos, empleados en MM, conducen a una detención del ciclo celular en la fase G2/M (268,269) En este ensayo, el tratamiento con UA resultó en una depleción de la fase G0/G1 con una acumulación de células en las fases S y G2/M, probando la detención del ciclo celular en esos puntos. Estudios previos ya han demostrado que la UA induce la detención del ciclo celular en la fase G2/M en las células de cáncer de vejiga (270), células de cáncer de próstata (271), y de las fases G2/M y S en células de cáncer de colon (251), entre otros. Sin embargo, el aumento de células en la fase S tras la exposición a UA contrasta con los DISCUSIÓN 157 estudios publicado por Vicinanza y colaboradores (271), quienes observaron un menor porcentaje de células en la fase S y por Sánchez-González, quienes reportaron la detención del ciclo en la fase G0/G1 en células de cáncer de próstata (272). Por consiguiente, todos estos trabajos parecen indicar que puede haber diferencias en el efecto de la UA sobre el ciclo celular dependiendo del tipo de cáncer y el contexto. Al igual que sucede en otros tipos de cáncer, las células de MM son capaces de evitar la apoptosis, contribuyendo no solo al inicio de la tumorigénesis, sino también a su desarrollo y mecanismos de resistencia a fármacos Algunos de los tratamientos más efectivos en MM, como el bortezomib modulan los procesos de regulación de la apoptosis (273). Dada la evidencia previa del efecto de la UA en otras líneas tumorales y lo observado en el análisis del ciclo celular, en este trabajo quisimos estudiar el efecto de la UA sobre la apoptosis en línea celular. Este análisis reveló que la UA indujo la apoptosis tardía y muerte sobre las células de MM. Aunque el efecto de la UA sobre la apoptosis no se ha explorado previamente en MM, nuestros resultados corroboraron lo observado en otras líneas tumorales. En uno de los estudios más recientes y completo sobre el efecto anticáncer de la UA (155), realizado en células de cáncer colorrectal, demostraron el efecto sobre la apoptosis temprana y tardía de la UA. Sin embargo, cabe mencionar que las concentraciones de la UA fueron mucho mayores (25 µM, 50 µM y 100 µM) que en el presente trabajo (15 µM), luego probablemente sea más efectiva en dosis más altas. De hecho, en el trabajo de El-Wetidy y colaboradores (155), concluyeron que se trataba de un efecto dependiente de dosis. Por tanto, este trabajo es el primero en demostrar que la UA tiene un efecto inhibitorio en la proliferación celular, en la distribución del ciclo celular y en la apoptosis. Una de las vías principales por las que se ejecuta la apoptosis es la vía mitocondrial (273). Las células plasmáticas malignas sufren procesos de alteración metabolismo mitocondrial, un mecanismo biológico bien caracterizado en el contexto de la apoptosis (274). De hecho, nuestro grupo de investigación ha demostrado que hay un aumento de la actividad mitocondrial en los pacientes con MM a medida que progresa la enfermedad (153). Uno de los mecanismos de acción más consistentes y estudiado de la UA es la ayuda en el reciclaje y mantenimiento de la salud mitocondrial (145). Por otra parte, el bloqueo del metabolismo de OXPHOS y la inhibición por tanto de la actividad EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 158 mitocondrial en las células de MM puede tener un gran impacto en frenar la progresión de la enfermedad (153). Como cabía esperar, nuestros resultados revelaron el efecto de la UA sobre los complejos de la cadena de fosforilación oxidativa de la mitocondria, con una disminución significativa en los complejos mitocondriales COXII, ATP sintasa de la subunidad alfa del complejo 5 (ATP5A) y UQCRC2. En línea con lo observado por Ortiz- Ruiz y colaboradores, quienes estudiaron el efecto de un inhibidor de la mitocondria en líneas de MM, la UA tuvo un efecto similar en el complejo COXII. Cuando analizamos el efecto de la urolitina sobre el estrés oxidativo, medido a través de del compuesto de peroxidación lipídica HNE, observamos menor estrés oxidativo en las células de líneas celulares de MM tras la exposición a UA. En el estudio de El-Wetidy y colaboradores (155), los autores consideraron que la UA promovía el estrés oxidativo debido al aumento de la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS, reactive oxygen species en inglés) induciendo un efecto tóxico en las células de cáncer de colon que conduce a la apoptosis y la muerte celulares. Sin embargo, el efecto observado en nuestro análisis está en línea con otros estudios previos que han demostrado que la UA podía considerarse un antioxidante al disminuir la producción de ROS en las células T24 de cáncer de vejiga humano (275) y las células de cáncer de hígado HepG2 (276). Puesto que se ha descrito que la transformación oncogénica de las células plasmáticas conduce a un aumento del estrés oxidativo, la atenuación de este fenómeno por la exposición de la UA podría frenar esta malignización que tiene lugar en el MM (277). Además, el estrés oxidativo se genera como un subproducto del aumento de la respiración mitocondrial, porque se necesitan altos niveles de ATP para sostener la maquinaria de plegamiento de proteínas, que es un proceso altamente dependiente de ATP (278). Por tanto, el menor estrés oxidativo podría también estar relacionado con el efecto de la UA sobre la función mitocondrial observada previamente. Durante mucho tiempo, los antioxidantes se han considerado como agentes supresores de tumores, pero cada vez hay más evidencia sobre su papel dual en el contexto del cáncer (277). Esta controversia, unido a que en este trabajo no se ha cuantificado la producción de ROS, no nos permite sacar conclusiones robustas sobre el beneficio de la UA en el contexto del estrés oxidativo. DISCUSIÓN 159 Como se ha mencionado, estudios previos han reportado la actividad antitumoral de las urolitinas en líneas celulares en varios tipos de cáncer (265). Además, en estudios in vivo se ha observado que la administración de UA aumentó la supervivencia en modelos de ratón de enfermedad aguda de riñón (279) y en cáncer de páncreas (157). Nuestros resultados han mostrado por primera vez que el tratamiento con UA aumenta significativamente la supervivencia en ratones con MM. De manera importante, tras 28 días de seguimiento 4 de 5 ratones del grupo de tratamiento se mantuvieron con vida, mientras que todos los ratones del grupo sin tratamiento fallecieron. En línea con el estudio llevado a cabo por Totiger y colaboradores (157), el seguimiento de la señal por bioluminiscencia permitió observar una reducción de la progresión del tumor. Uno de los fármacos de primera línea más empleados en la clínica es el bortezomib (42), cuyo mecanismo de inducción de la apoptosis en MM produce cambios en la función mitocondrial (280). Además, en el contexto de la resistencia, se ha demostrado que en el proceso de adaptación de las células de mieloma al bortezomib están involucradas proteínas de regulación metabólica y la homeostasis redox de la mitocondria (281). El análisis in vitro en líneas de MM tras el tratamiento de la UA en combinación con bortezomib reveló un efecto sinérgico de ambos compuestos, tanto en la línea sensible como en la resistente a bortezomib. Adicionalmente, se demostró que la UA tenía un efecto inhibitorio similar en ambas líneas, luego estos resultados sugieren que la UA en monoterapia o en combinación, podrían ser una buena opción terapéutica en pacientes resistentes al bortezomib. Cuando exploramos las vías de señalización que pueden estar involucradas tras la combinación de ambos compuestos, el tratamiento de UA con bortezomib aumentó los niveles de expresión de p53 y p21 tanto en la línea sensible como en la resistente. La desregulación de la vía p53/p21 es uno de los mecanismos frecuentemente estudiados en MM y el abordaje de su estudio con fin terapéutico ha sido ampliamente descrito (282). Además, p21 es un importante inhibidor que bloquea el ciclo celular (283), luego el aumento de su expresión estaría relacionado con la detención del ciclo celular observado previamente. El aumento de los niveles de expresión de p53 y p21 tras el tratamiento con UA ya se ha evidenciado en otras líneas celulares (265). En el presente trabajo, además de demostrar por primera vez que la UA aumentó los niveles de expresión de p53 y significativamente de p21 sobre la línea celular JJN3-GFP, se observó que la combinación con bortezomib potenció ese incremento. Cabe destacar además la eficacia de la EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 160 combinación en la línea resistente y no solo en la sensible. La sinergia de ambos fármacos podría deberse a su acción común en sobre el ciclo celular. Por otra parte, otras de las vías más importantes implicadas en la progresión del tumor en MM es la vía PI3K/Akt/mTOR (284). Numerosos estudios han reportado que mTOR fosforilado, es decir, en su forma activa, puede contribuir a la carcinogénesis (285–287). Por ese motivo muchos estudios se han enfocado en los inhibidores de mTOR por su posible papel en el tratamiento del MM (288). En este trabajo, el tratamiento con UA inhibió la expresión de la forma fosforilada, de mTOR y, además, usándose en combinación con bortezomib se redujeron los niveles de expresión tanto de mTOR como de p-mTOR. Nuestros resultados respaldan la hipótesis propuesta por Totiger y colaboradores de que la UA regula a la baja la señalización de la vía oncogénica PI3K/Akt/mTOR. Estos resultados señalan un papel importante de la UA en MM, que podrían ayudar a frenar la progresión del tumor y aumentar la supervivencia de los pacientes con la enfermedad. Además, su uso en combinación con el bortezomib podría suponer una estrategia prometedora en el contexto de la resistencia farmacológica. 161 7. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 163 Las conclusiones principales extraídas de este trabajo se enumeran a continuación. 1. El tratamiento antiviral tiene un impacto beneficioso en la supervivencia de los pacientes con MM e infecciones previas por VHC y VHB. La probabilidad de supervivencia es mayor en los pacientes tratados con antiviral, lo que potencialmente permitiría optimizar el tratamiento de los pacientes con MM y hepatitis viral. 2. El análisis del reconocimiento antigénico por parte de la Ig Mc permite demostrar que, si el VHC está implicado en el origen de la gammapatía, el tratamiento antiviral facilita la disminución o desaparición de la Ig Mc y de las células plasmáticas clonales. Esta observación aporta no solo una robusta evidencia del papel de la infección por VHC en la patogénesis del MM, sino que establece la importancia del tratamiento antiviral incluso en estadios previos como la GMSI o el MMq. 3. La composición y diversidad de la microbiota intestinal es distinta en los pacientes con MM, especialmente durante la progresión de la enfermedad. El nivel de abundancia de los microorganismos productores de metabolitos beneficiosos es menor en los pacientes con MM en el momento de diagnóstico y en la progresión de la enfermedad, en comparación a estadios previos o de remisión completa. La caracterización de la microbiota permite identificar microorganismos y vías metabólicas relacionados con una mayor supervivencia de los pacientes con MM. 5. La presencia de microorganismos productores de metabolitos como los AGCC y la urolitina disminuye en estadios más avanzados de la enfermedad. Las diferencias observadas en los niveles de estos metabolitos de la microbiota sugieren su valor pronóstico como biomarcadores de progresión y respuesta de la enfermedad. De forma importante, se ha demostrado el efecto antiproliferativo de estos metabolitos in vitro. Además, la UA logró frenar la tumorigénesis y aumentar la supervivencia en el modelo in vivo de MM. Finalmente, en este trabajo se han explorado algunas de las vías moleculares involucradas en el papel de la UA sobre la patogénesis de la enfermedad y se ha validado su potencial terapéutico en monoterapia o en combinación con bortezomib. 165 8. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 167 1. Kyle RA, Rajkumar SV. Multiple myeloma. N Engl J Med. 2004 Oct 28;351(18):1860–73. 2. Kumar SK, Rajkumar V, Kyle RA, van Duin M, Sonneveld P, Mateos MV, et al. Multiple myeloma. Nat Rev Dis Primers. 2017 Dec 21;3(1):17046. 3. Siegel RL, Miller KD, Fuchs HE, Jemal A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2022;72(1):7–33. 4. Cancer today [Internet]. [cited 2022 Oct 11]. Available from: http://gco.iarc.fr/today/home 5. Myeloma - Cancer Stat Facts [Internet]. SEER. [cited 2022 Oct 11]. Available from: https://seer.cancer.gov/statfacts/html/mulmy.html 6. Barwick BG, Gupta VA, Vertino PM, Boise LH. Cell of Origin and Genetic Alterations in the Pathogenesis of Multiple Myeloma. 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Clustering according to urolithin metabotype explains the interindividual variability in the improvement of cardiovascular risk biomarkers in overweight-obese individuals consuming pomegranate: A randomized clinical trial. Mol Nutr Food Res. 2017 May;61(5). 252. Li Z, Henning SM, Lee RP, Lu QY, Summanen PH, Thames G, et al. Pomegranate extract induces ellagitannin metabolite formation and changes stool microbiota in healthy volunteers. Food Funct. 2015;6(8):2487–95. BIBLIOGRAFÍA 187 253. Singh A, D’Amico D, Andreux PA, Fouassier AM, Blanco-Bose W, Evans M, et al. Urolithin A improves muscle strength, exercise performance, and biomarkers of mitochondrial health in a randomized trial in middle-aged adults. Cell Rep Med. 2022 May 17;3(5):100633. 254. Cortés-Martín A, García-Villalba R, González-Sarrías A, Romo-Vaquero M, Loria-Kohen V, Ramírez-de-Molina A, et al. The gut microbiota urolithin metabotypes revisited: the human metabolism of ellagic acid is mainly determined by aging. 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EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 190 288. Calimeri T, Ferreri AJM. m-TOR inhibitors and their potential role in haematological malignancies. British Journal of Haematology. 2017;177(5):684– 702. 191 9. ABREVIATURAS ABREVIATURAS 193 ADNc: ADN complementario ADNccc: ADN circular cerrado covalentemente Ag: antígeno AGCC: ácidos grasos de cadena corta ALT: alanina aminotransferasa APC: aloficocianina ARNr: ARN ribosómico ATP5A: ATP sintasa subunidad alfa del Complejo V B. burgdorferi: Borrelia burgdorferi BCMA: antígeno de maduración de la célula B (B-cell maduration antigen en inglés) BCR: receptor de célula B (B-cell receptor en inglés) BJ: Bence-Jones BSA: albúmina de suero bovino (bovine serum albumin En inglés) Btz: Bortezomib CAR-T: terapia con receptores quiméricos de antígeno (chimeric antigen-receptor therapy en inglés) CI: índice de combinación (combination index, en inglés) CMF: citometría de flujo CMV: citomegalovirus CNIO: Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas CP: célula plasmática CRAB: hipercalcemia, insuficiencia renal, anemia, lesiones óseas (Calcium, Renal, Anemia, Bone en inglés) CEBAS-CSIC: Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura- Centro Superior de Investigaciones Científicas Ct: umbral de ciclo (cycle threshold en inglés) DMSO: dimetil sulfóxido EA: ácido elágico (ellagic acid, en inglés) EDM: eventos definidores de mieloma FDA: Food Drug Administration FISH: hibridación in situ fluorescente GAPDH: Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 194 GFP: proteína fluorescente verde (green fluoresecent protein en inglés) GMSI: gammapatía monoclonal de significado incierto GPCR: receptores acoplados a proteínas G (G protein-coupled receptors en inglés) GUS: gen β-glucuronidasa H. pylori: Helicobacter pylori HCL: cloruro de hidrógeno HDAC: histona deacetilasa HNE: 4-hidroxinonenal IC50: concentración inhibitoria media máxima (half-maximal inhibitory concentration en inglés) IF: inmunofenotipo Ig Mc: inmunoglobulina (Ig) monoclonal IHC: inmunohistoquímica (Immunohistochemistry en inglés) IL: interleucina IMiDs: fármacos inmunomoduladores IMWG: Grupo internacional de trabajo en mieloma múltiple (International Myeloma Working Group en inglés) IP: Inhibidor del proteasoma ISS: Sistema Internacional de Estadiaje (International Staging System en inglés) IVIS: In vivo imagen system KEGG: Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes en inglés) LEfSE: Linear discriminant analysis Effect Size LLC: leucemia linfocítica crónica MIAA: multiplex infectious-antigen array MM: mieloma múltiple MMdx: mieloma múltiple al diagnóstico MMq: mieloma quiescente MMrc: mieloma múltiple en remisión completa MMrr: mieloma múltiple en recaída y/o refractario MO: médula ósea MTCO1: subunidad 1 del complejo citocromo c oxidasa del Complejo IV mTOR: diana de rapamicina en células de mamífero (mammalian Target of Rapamycin, en inglés) ABREVIATURAS 195 NDUFB8: subunidad 8 del subcomplejo beta de NADH deshidrogenasa del Complejo I NF-κB: factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (Nuclear factor kappa-light- chain-enhancer of activated B cells en inglés) NGS: secuenciación de nueva generación (Next-generation sequencing en inglés) NSG: nod scid gamma OMS: Organización Mundial de la Salud OTU: unidad taxonómica operativa (operational taxonomic unit en inglés) OXPHOS: fosforilación oxidativa de las proteínas mitocondriales (mitochondrial oxidative phosphorylation en inglés) PAMPs: patrones moleculares asociados a patógenos (Pathogen- associated molecular pattern en inglés) PCoA: análisis de coordenadas principales (Principal Coordinates Analysis en inglés) PCRq: PCR cuantitativa (quantitative PCR en inglés) PET: tomografía por emisión de positrones (Positron Emission Tomography en inglés) PI: yoduro de propidio (Propidium iodide en inglés) PM: proteína monoclonal PRR: receptor de reconocimiento de patógeno (Pathogen Recognition Receptor en inglés) PVDF: fluoruro de polivinilideno RMN: resonancia magnética nuclear ROS: especies reactivas de oxígeno (reactive oxygen species en inglés) SDHB: subunidad B de la succinato deshidrogenasa del Complejo II SEM: error estándar de la media SG: supervivencia global T. gondii: Toxoplasma gondii TAC: tomografía axial computarizada TBS: tampón TRIS salino (TRIS buffer saline en inglés) Th17: linfocitos T helper 17 Tw: Tween® 20 UA: urolitina A EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 196 UQCRC2: subunidad 2 del complejo citocromo b-c1 del Complejo III VEB: virus Epstein-Barr VHB: virus de la hepatitis B VHC: virus de la hepatitis C VHS: virus del herpes simple VIH: virus de la inmunodeficiencia humana VVS: virus de la varicela Zoster 197 10. ANEXOS ANEXOS 199 10.1. ANEXO 1. Información sobre las fechas de diagnóstico y tratamientos de la infección por VHC y del MM Fecha de detección de VHC Fecha de diagnóstico de GMSI o MM Fecha de tratamiento antiviral Antiviral Fecha de tratamiento hematológico Tratamiento hematológico recibido P1 Dic 1992 Ago 2011 Mar 2016 Sofosbuvir + Ledipasvir Sep 2013 Terapia NK + lenalidomida Jun 2014 Bortezomib + lenalidomida + dexametasona Feb 2015 Bendamustina - bortezomib - dexametasona P2 Desconocida (antes de 2003) Ene 2003 May 2016 Paritaprevir / Ritonavir- Ombitasvir + Dasabuvir NA No tratado (GMSI) P3 Ene 2000 Nov 2017 Ene 2018 Glecaprevir + Pibrentasvir NA No tratado (GMSI) P4 Ene 1996 Jun 2016 Ago 2016 Sofosbuvir + Ledipasvir NA No tratado (GMSI) P5 Desconocida (antes de 2014) Oct 2014 Jul 2016 Sofosbuvir + Ledipasvir Oct 2015 y Oct 2016 Lenalidomida + dexametasona Abr 2017 Ensayo clínico: m14- 031 VD+Venetoclax/Placebo P6 Feb 1995 Sep 2018 Oct 2018 Glecaprevir + Pibrentasvir NA No tratado (GMSI) P7 Desconocida (antes de abril de 2017) Nov 2015 NA No tratado NA No tratado (GMSI) P8 Desconocida (antes de septiembre de 1978) Ene 2016 NA No tratado Jul 2006 Ensayo clínico GEM05: melfalan, bortezomib y prednisona Abr 2009 Lenalidomida + dexametasona EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN EL DESARROLLO DEL MIELOMA MÚLTIPLE 200 P9 Desconocida Sep 2016 NA No tratado Jun 2016 EC TCD13983 Isatuximab, Velcade y Ciclofosfamida (NCT02513186) Nov 2016 Lenalidomida + Dexametasona Tabla 20. Información sobre las fechas de diagnóstico y de tratamientos frente al VHC y el MM recibidos por los pacientes. NA, No aplica; P, paciente; VHC, virus de la Hepatitis C; MM, mieloma múltiple; GMSI, gammapatía monoclonal de significado incierto. ANEXOS 201 10.2. ANEXO 2. Purificación de inmunoglobulinas monoclonales y evaluación de su pureza Figura 49. Purificación de las Ig Mc y evaluación de su pureza mediante isoelectroenfoque e inmunotransferencia. ANEXOS 203 10.3. ANEXO 3. SEROTIPO DE VHC Y CARGA VIRAL DE LOS PACIENTES ANTES Y DESPUÉS DEL TRATAMIENTO ANTIVIRAL Pacientes Serotipo VHC Carga virala (Log) antes del tratamiento Carga virala (Log) después del tratamiento P1 1b 6,69 1 P2 1b 6,46 1,27 P3 4 5,10 1 P4 1b 3,83 1 P5 1a 6,19 1,68 P6 3 6,07 1,23 Tabla 21. Serotipo de VHC y carga viral de los pacientes antes y después del tratamiento antiviral. VHC, virus de la hepatitis C. a: Nota: el límite de detección de la técnica de determinación de carga viral es 1. ANEXOS 205 10.4. ANEXO 4. ARTÍCULOS CIENTÍFICOS A continuación, se detallan los artículos científicos publicados como autora durante el periodo de realización de esta tesis doctoral. Ancos-Pintado R, Bragado-García I, Morales ML, García-Vicente R, Arroyo- Barea A, Rodríguez-García A, et al. High-Throughput CRISPR Screening in Hematological Neoplasms. Cancers. 2022 Jul 25;14(15):3612. Rodríguez-García A, Linares M, Morales ML, Allain-Maillet S, Mennesson N, Sanchez R, et al. Efficacy of Antiviral Treatment in Hepatitis C Virus (HCV)-Driven Monoclonal Gammopathies Including Myeloma. Front Immunol. 2022 Jan 11;12:797209. Linares M, López-Ejeda N, Álvarez P, Culebras E, Díaz E, García MT, Rodríguez-García A et al. Service-Learning, Movies, and Infectious Diseases: Implementation of an Active Educational Program in Microbiology as a Tool for Engagement in Social Justice. Front Microbiol. 2021 Jun 29;12:589401. Álvarez N, Rodríguez-García A, Morales ML, Gutiérrez M, Montero M, Poza M, et al. Clonal hematopoiesis-defining mutations have no impact on the development of thrombosis in a cohort of patients with myeloid pathology. Leukemia Research. 2021 Sep;108:106613. Rodríguez-García A, García-Vicente R, Morales ML, Ortiz-Ruiz A, Martínez- López J, Linares M. Protein Carbonylation and Lipid Peroxidation in Hematological Malignancies. Antioxidants. 2020 Dec 1;9(12):1212. Morales ML, Arenas A, Ortiz-Ruiz A, Leivas A, Rapado I, Rodríguez-García A, et al. MEK inhibition enhances the response to tyrosine kinase inhibitors in acute myeloid leukemia. Sci Rep. 2019 Dec;9(1):18630. Rodríguez-García A, Morales ML, Garrido-García V, García-Baquero I, Leivas A, Carreño-Tarragona G, et al. Protein Carbonylation in Patients with Myelodysplastic Syndrome: An Opportunity for Deferasirox Therapy. Antioxidants. 2019 Oct 24;8(11):508. Tesis Alba Rodríguez García PORTADA ÍNDICE LISTADO DE TABLAS LISTADO DE FIGURAS 1. RESUMEN/ABSTRACT 2. INTRODUCCIÓN 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 4. MATERIALES Y MÉTODOS 5. RESULTADOS 6. DISCUSIÓN 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFÍA 9. ABREVIATURAS 10. ANEXOS