UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA TESIS DOCTORAL Detección y epidemiología de Salmonella spp. en aves silvestres en la Península Ibérica MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Bárbara Martín-Maldonado Jiménez DIRECTORES Dra. Clara Marín Orenga Dr. Luis Revuelta Rueda © Bárbara Martín-Maldonado Jiménez, 2021 2 4 6 7 Esta tesis ha sido realizada dentro del marco de colaboración del Grupo de Estudio de la Medicina y Conservación de los Animales Silvestres (GEMAS), en el hospital de Fauna Salvaje del Grupo de Rehabilitación de la Fauna Salvaje y su Hábitat (GREFA), y dirigida por profesores titulares de las facultades de Veterinaria de las Universidades CEU-Cardenal Herrera y Complutense de Madrid. Asimismo, los estudios que en ella se recogen se encuentran financiados por diferentes proyectos de las tres entidades. 8 9 “Solo el amor a la naturaleza, la pasión por la vida y la certeza de que formamos parte de una comunidad total, que va desde la más pequeña bacteria hasta el hombre, nos darán fuerza para defender el único hogar que tenemos, un pequeño planeta perdido en una remota galaxia al que hemos dado en llamar Tierra.” Félix Rodríguez de la Fuente 10 11 Agradecimientos 12 Agradecimientos 13 Nunca pensé en lo fácil y a la vez difícil que sería redactar los agradecimientos. Fácil porque sólo debía transcribir lo que he sentido a lo largo de todos estos años por las personas que me han apoyado en los buenos y los malos momentos. Difícil porque es muy complicado sintetizarlo y no escribir una tesis entera sobre esos sentimientos sin dejar a nadie fuera… En primer lugar, debo agradecer todo a mis directores de tesis, Clara Marín y Luis Revuelta, a sus ideas y sus consejos, que me han acompañado durante estos casi 5 años de montaña rusa. Cuando empecé no imaginaba cómo iban a ser estos años, creo que nadie puede imaginárselo. Al principio todo es emocionante, te apasiona lo que haces y lees, el trabajo del laboratorio, tus primeros resultados… hasta que llega la primera piedra y caes al suelo. Aprendes que investigar significa ser capaz de superar todas esas piedras, y que casi nunca salen las cosas como tú quieres. Ellos han conseguido enseñarme no sólo todos los conocimientos adquiridos a lo largo de esta tesis, sino a ser investigadora, a pensar en ese “¿y si…?”, y plantearme nuevos retos y estudios. Porque todos sus comentarios e insistencias me han empujado a ser mejor estudiante e investigadora. Especialmente gracias a Clara, por haberme acogido desde el minuto uno como una más de sus estudiantes, por haber estado para darme la mano en cada bache, pero sobre todo por haberme vuelto del revés cada texto que redactaba (resumen, artículo o tesis) dejando todo en rojo, porque de esta manera me ha enseñado a redactar en leguaje científico correctamente y sin irme por las ramas como hago ahora. Gracias por ayudarme a tener paciencia con los experimentos, a no desistir cuando un resultado no cuadra y a buscarle la explicación a todo. En este punto también debo mencionar a Santiago Vega que, aunque no figura como director mío, ha estado a mi lado también apoyándome, dándome ideas y consejos, como un director más. Gracias por todo tu esfuerzo y por ser la persona que eres. Gracias a todos los estudiantes internos y doctorandos de la Facultad de Veterinaria de la UCH-CEU con los que he tenido el placer de aprender, y en especial a Sandra Sevilla, Laura Montoro y Laura Lorenzo por haberme ayudado tantas y tantas veces, todas y cada una de ellas con una sonrisa en la cara. Trabajar con vosotros ha sido una experiencia que nunca olvidaré y que espero poder repetir en el futuro. Gracias a mi familia, de la que me siento especialmente orgullosa. A mi abuelo Mariano, que, aunque ya no está entre nosotros desde hace muchos años, sé que estaría orgulloso. Él respetaba a los “estudiosos”, como él decía, más que a nada. Ayudaba a todo el que podía con sus estudios porque, para él, el conocimiento y la investigación eran lo más importante en la sociedad. Es gracias a esa filosofía que he podido tener una educación maravillosa y llegar a donde he llegado. Él le inculcó a mi padre que la mejor herencia que se podía dejar a un hijo era una buena educación. Trabajó duro durante toda su vida para poder dar la mejor educación y Agradecimientos 14 todas las oportunidades posibles a sus hijos y nietos, aunque no pudo ver cómo sus nietos cumplían sus sueños al conseguir los trabajos por los que tanto habían luchado. Gracias a ti, abuelo, estés donde estés, por todas tus lecciones. Gracias a mis padres, porque han estado a mi lado día y noche a lo largo de toda mi vida. Desde pequeñita me enseñaron a cuidar y respetar a todas las criaturas del planeta, a ser buena persona, solidaria y altruista. A mi padre por obligarme a ver los documentales de Félix cuando era pequeña y no quería dormir la siesta. A mi madre por ponerme desde bien pequeñita “La vida es así”, y por despertar en mí ese interés hacia la medicina. Ambos me han apoyado en todas mis locuras: cuando les dije que quería ser veterinaria, cuando les dije que quería dedicarme a fauna silvestre y cuando les dije que quería hacer un doctorado. Ninguna de las tres cosas ha sido fácil, y ha habido muchos momentos en lo que desearía haberlo dejado todo, pero ellos siempre han estado ahí, a mi lado, apoyando cada decisión, celebrando cada éxito y animándome en los peores momentos de la manera en que podían, aunque ni siquiera fueran conscientes de lo que hacían. Hace poco encontré, haciendo limpieza, un diploma de la Cumbre para la Tierra de 1992, de cuando apenas tenía 4 añitos. En él firmaba una promesa por la tierra: “Prometo hacer todo cuanto esté a mi alcance para conseguir de la Tierra un lugar seguro y acogedor para la generaciones presentes y futuras de nuestra especie y de todas las especies que conviven en ella”. Creo que, casi 30 años después, he conseguido mantenerme fiel a esa promesa y aportar mi pequeño granito de arena. Gracias a mis compañeros de GREFA, mi segunda familia, mi Ohana, mi ika’hale. Fernando, Irene, Laura, Virginia, Aida, Natalia, Omar e Iris. Sin vosotros no sólo no habría sido logísticamente posible, sino que no habría conseguido las fuerzas necesarias para terminar esta maratón. Habéis conseguido intercalar los días de interminables revisiones veterinarias, los cabezazos contra la pared del laboratorio, y la locura provocada por tantas horas sentada al ordenador con litros de lágrimas y arrugas provocadas por carcajadas, momentos de compañerismo y unidad que en pocos sitios he podido observar, haciéndome sentir una privilegiada dentro de nuestro tan machacado sector. Gracias por esas escapadas frikis al campo para desconectar y por esas sesiones gratuitas de “consulta psicológica”. Gracias por enseñarme un universo de posibilidades y un mundo entero que descubrir. Y, sobre todo, gracias por demostrar al mundo que un equipo tullido puede llegar a ser el mejor equipo de trabajo. Debo hacer especial mención a Fernando González por darme tantas oportunidades: la de realizar un voluntariado en GREFA, formarme con ellos en medicina de la conservación, unirme al grupo GEMAS y realizar una tesis en GREFA, y finalmente pasar a formar parte del equipo veterinario, entre otras muchas que han ido surgiendo a lo largo de los más de 10 años que han pasado desde que le conocí. A lo largo de todos estos años se ha convertido, no sólo en mi jefe, sino en Agradecimientos 15 un compañero y un modelo a seguir. Sé que no lo digo a menudo, pero me siento enormemente agradecida de haberos encontrado a todos, pero especialmente a ti, Fernando. Gracias a todos los voluntarios que han pasado por GREFA a lo largo de todos estos años: Nerea, Rocío, Gema, Alba, Alicia, Cristina, Elisa, Inês, Andrea, Jennifer, Pablo, y muchos otros, me habéis ayudado de formas que ni siquiera os podéis imaginar, consiguiéndome sacar siempre la mejor de las sonrisas y obligándome a centrarme en la tesis al incluirme en vuestro increíble grupo de estudio. Siempre tendréis un huequito en mi corazón. Y por supuesto gracias a todos mis amigos, los de toda la vida, los que han aguantado mis interminables horas de estudio, mis enclaustramientos, mis “llego tarde” por enésima vez. ¡Gracias por demostrar que se puede tener vida social fuera de la veterinaria! Gracias por estar al pie del cañón a pesar de todo, por aguantar mis enfados con el universo, por compartir mis alegrías y mis locuras, y por empujarme a seguir hacia adelante y ser mejor persona. En especial, gracias a Clara por enseñarme que una sola persona no puede con todo, sólo somos humanos, y a veces necesitamos ayuda. Gracias por estar ahí siempre que he necesitado esa ayuda, hermanita. Kuaka’a karibu, rafiki! Siempre contigo, amigo. Agradecimientos 16 17 Contenidos 18 Contenidos 19 Índice de figuras y tablas 23 Abreviaturas y acrónimos 29 Resumen / Abstract 35 1. Introducción 45 1.1. Género Salmonella 47 1.1.1. Características del género Salmonella 47 1.1.2. Taxonomía y nomenclatura 48 1.1.3. Caracterización de Salmonella spp. 49 1.1.4. Factores de virulencia 51 1.1.5. Salmonelosis 53 1.1.5.1. Importancia de la salmonelosis en salud pública 55 1.1.5.2. Importancia de la salmonelosis en sanidad animal 57 1.1.5.3. Salmonella spp. como agente zoonótico 59 1.1.6. Métodos de detección de Salmonella spp. 60 1.1.6.1. Aislamiento mediante cultivo bacteriano 61 1.1.6.2. Perfil bioquímico 65 1.1.6.3. Serotipificación 68 1.1.6.4. Fagotipificación 68 1.1.6.5. Métodos de tipificación genotípica 69 1.1.7. Programas de control y prevención de salmonelosis 69 1.2. Resistencias a antimicrobianos 71 1.2.1. Definición y desarrollo de resistencias a antimicrobianos 71 1.2.2. Problemática en salud pública 74 1.2.3. Salmonella resistente a antimicrobianos 77 1.2.4. Métodos de detección de resistencias a antimicrobianos 79 1.2.5. Planes de actuación contra el desarrollo de resistencias 84 1.3. Fauna silvestre 86 1.3.1. La fauna ibérica: biodiversidad y conservación 86 1.3.1.1. Aves rapaces ibéricas: el águila de Bonelli 88 1.3.1.2. Aves silvestres urbanas 93 Contenidos 20 1.3.2. Las aves silvestres como reservorio de patógenos 96 1.3.3. Salmonella en aves silvestres 99 1.4. Justificación de la tesis 101 2. Objetivos 103 3. Metodología 107 3.1. Estudio de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en una población de águila de Bonelli (Aquila fasciata) de la Comunidad Valenciana 109 3.1.1. Especie y área de estudio 109 3.1.2. Recogida de muestras cloacales y heces 109 3.1.3. Aislamiento y detección de Salmonella 111 3.1.4. Test de susceptibilidad a antimicrobianos 112 3.1.5. Análisis estadístico 113 3.2. Estudio comparativo de muestras cloacales conservadas de águila de Bonelli (Aquila fasciata) recogidas en lugares de difícil acceso para la detección de Salmonella spp.: congelación vs refrigeración 114 3.2.1. Especie y área de estudio 114 3.2.2. Recogida y conservación de muestras cloacales 115 3.2.3. Aislamiento e identificación de Salmonella 116 3.3. Estudios de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en cinco especies diferentes de aves silvestres ligadas a ambientes urbanos 117 3.3.1. Población de estudio y recogida de muestras 117 3.3.2. Aislamiento e identificación de Salmonella 118 3.3.3. Test de susceptibilidad a antimicrobianos 118 3.3.4. Análisis estadístico 119 4. Resultados 121 4.1. Estudio de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en una población de águila de Bonelli (Aquila fasciata) de la Comunidad Valenciana 123 4.1.1. Resumen 123 4.1.2. Referencias 123 4.1.3. Manuscrito original 125 Contenidos 21 4.2. Estudio comparativo de muestras cloacales conservadas de águila de Bonelli (Aquila fasciata) recogidas en lugares de difícil acceso para la detección de Salmonella spp.: congelación vs refrigeración 131 4.2.1. Resumen 131 4.2.2. Referencias 131 4.2.3. Manuscrito original (en revisión) 133 4.3. Estudios de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en cinco especies diferentes de aves silvestres ligadas a ambientes urbanos 147 4.3.1. Resumen 147 4.3.2. Referencias 147 4.3.3. Manuscrito original 149 5. Discusión general 155 6. Conclusiones / Conclusions 163 7. Referencias bibliográficas 167 Contenidos 22 23 Indice de figuras y tablas 24 Indice de figuras y tablas 25 Figura 1. Taxonomía del género Salmonella según Lignieres 1900. Fuente: elaboración propia. 48 Figura 2. Fuentes de infección de Salmonella más frecuentes en la Unión Europea en 2018. Fuente: gráfico modificado a partir de datos de EFSA, 2019. 56 Figura 3. Diagrama Sankey de la distribución de serovares de Salmonella más prevalentes en humanos y las fuentes de infección animal o alimentaria. Fuente: EFSA, 2018. 57 Figura 4. Prevalencias de Salmonella observadas en los diferentes tipos de producción aviar en la Unión Europea, desde 2007 hasta 2018. Fuente: EFSA, 2019. 58 Figura 5. Colonias compatibles con Salmonella en diferentes medios selectivos y diferenciales. De izquierda a derecha y de arriba a abajo: MacConkey, Desoxicolato, EMB, Hektoen, XLD, SS, Verde Brillante, XLT4® y ASAP®. Fuente: collage de elaboración propia montado con varias imágenes extraídas de diferentes proveedores. 63 Figura 6. Transformación genética. Fuente: adaptado de Tortora et al. (2007). 73 Figura 7. Transducción. Fuente: adaptado de Tortora et al. (2007). 73 Figura 8. Conjugación bacteriana. Fuente: adaptado de Tortora et al. (2007). 74 Figura 9. Cronograma que muestra el tiempo transcurrido entre el descubrimiento de diversos antimicrobianos y la detección de resistencias frente a ellos. Fuente: Plan Nacional de Resistencia frente a Antimicrobianos (PRAN). 75 Figura 10. Principales causas de muerte y estimaciones de número de bajas que causarán en 2050. Fuente: O’Neil, 2014. 76 Figura 11. Test de sensibilidad a antimicrobianos con el método de difusión disco-placa (izquierda) y con el método de difusión E-test (derecha). Fuentes: imagen propia y Biomérieux® España, respectivamente. 81 Figura 12. Test de susceptibilidad a antimicrobianos con el método de microtitulación en caldo Mueller-Hinton. Fuente: imagen propia. 82 Figura 13. Fotografía de cernícalo patirrojo (izquierda) y buitre orejudo (derecha). Fuente: imágenes de Tomás Belka y Yathin Sk, respectivamente. 89 Figura 14. Fotografía de águila imperial joven (izquierda) y alimoche (derecha). Fuente: Juan José Iglesias Lebrija (GREFA) y Sergio de la Fuente García (GREFA), respectivamente. 89 Indice de figuras y tablas 26 Figura 15. Fotografía de águila de Bonelli en vuelo (izquierda) y posada (derecha). Fuente: Sergio de la Fuente (GREFA). 90 Figura 16. Jaula de aclimatación o hacking con seis águilas de Bonelli ya liberadas. Fuente: proyecto Life Bonelli (GREFA). 93 Figura 17. Selección de aves urbanas incluidas en el desarrollo de esta tesis. De izquierda a derecha: cigüeña blanca, gaviota sombría, paloma torcaz, estornino negro y gorrión común. Fuente: dibujos extraídos de la Enciclopedia de Aves de España SEO/Birdlife, 2008. 94 Figura 18. Diagrama de flujo de microorganismos entre los diferentes sectores. Fuente: elaboración propia. 97 Figura 19. Mapa del área de estudio en el que se indican los nidos de águila de Bonelli de las provincias de Castellón, Valencia y Alicante incluidos en el estudio. En las imágenes que acompañan se puede ver todo el proceso desde el avistamiento del nido (Imagen A) hasta que el individuo es examinado por los veterinarios (Imagen E). El asterisco indica donde se encuentra el nido en cada imagen. Fuente: Martín- Maldonado et al., 2019. 110 Figura 20. Recogida de hisopo cloacal en un pollo de águila de Bonelli. Fuente: Martín- Maldonado et al., 2019. 111 Figura 21. Crecimiento compatible con Salmonella en MSRV, XLD y ASAP (de izquierda a derecha). Fuente: collage de elaboración propia con imágenes cedidas por la Dra. Clara Marín Orenga. 112 Figura 22. Test de susceptibilidad a antimicrobianos por difusión disco-placa de dos cepas bacterianas diferentes. Fuente: imagen propia. 113 Figura 23. Revisión veterinaria de las águilas criadas en cautividad. Fuente: imágenes de GREFA. 114 Figura 24. Diferencias entre un pollo/cría alimentado por un parental (izquierda) y un volantón (derecha) de águila de Bonelli. Fuente: proyecto Life Bonelli (GREFA). 115 Figura 25. Recogida de hisopos cloacales en cigüeña blanca y paloma torcaz. Fuente: imágenes de GREFA. 118 Indice de figuras y tablas 27 Tabla 1. Perfil bioquímico general del género Salmonella (Terragno et al., 2003). 67 Tabla 2. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp. (Le Minor et al., 1982:1986). 67 Tabla 3. Fórmula empleada para 500 mL de medio de transporte FBP con carbón activado. 116 Indice de figuras y tablas 28 29 Abreviaturas y acrónimos 30 Abreviaturas y acrónimos 31 ºC: grados Celsius ADN: ácido desoxirribonucleico AMP: ampicilina AMR: antimicrobial resistance API: Analitical Profile Index aw: actividad de agua AZM: azitromicina BPW: buffered peptone water C: cloranfenicol CAZ: ceftazidime CDC: centre for disease control and prevention CECAV: centro de calidad avícola de la Comunidad Valenciana CHL: cloranfenicol CIA: critically important antimicrobials CIP: ciprofloxacino CLSI: clinical laboratory standards institute CMI: concentración mínima inhibitoria COL: colistina CS: citrato de Simmons CTX: cefotaxime ECDC: European Centre for Disease Control and Prevention EFSA: European Food Safety Agency ELISA: Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay EMB: Eosin Methylene Blue etc: etcétera EUCAST: European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing FBP: Fructose-1,6-bisphosphatase supplement FDA: Food and Drus Administration FOX: cefoxitina GLM: General Linear Model GM: gentamicina GN: gentamicina GPS: Global Positioning System GREFA: Grupo de Rehabilitación de la Fauna Autóctona y su Hábitat GSM: Global System for Mobile communications H: antígeno flagelar H1: flagelinas de fase 1 H2: flagelinas de fase 2 ISO: International Organization for Standarization LCV: Laboratorio Central de Veterinaria LPS: Lipopolisacárido McK: MacConkey agar Abreviaturas y acrónimos 32 MDR: Multi-drug resistant MEM: meropenem MENSURA: Mesa Española para la Normalización de la Susceptibilidad y Resistencia a Antimicrobianos mL: mililitro MLVA: Multiple Loci VNTR Analysis MSRV: Modified Semisolid Rappaport Vasiliadis mST: monofasic Salmonella Typhimurium µL: microlitros n: número de individuos, tamaño de muestra NA: ácido nalidíxico NCCLS: National Commitee for Clinical Laboratory Standards Suggest O: antígeno somático OIE: Oficina Internacional de Epizootías OMS: Organización Mundial de la Salud p: valor de probabiblidad PCR: Polymerase Chain Reaction PDR: Pan-Drug Resistant PFGE: Pulsed-Field Gel Electrophoresis pH: power of hydrogen PRAN: Plan Nacional frente a las Resistencias a Antimicrobianos pSLT: virulence plasmid of Salmonella enterica serovar Typhimurium RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA RCM: Medio Reforzado para Clostridios ReLAVRA: Red Latinoamericana de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RL: sulfametoxazol SIGRE: Sistema Integrado de Gestión y Recogida de Envases SIM: Sulfito Indol Motilidad spp: especie SS: Salmonella-Shigella agar STX: trimetoprim-sulfametoxazol TCY: tetraciclina TGC: tigeciclina TM: trimetoprim TSI: Triple Sugar Iron UFC: Unidad Formadora de Colonias UFCS: Union Française des Centres de Sauvegarde de la faune sauvage UICN: Unión International para la Conservación de la Naturaleza Vi: antígeno de superficie o de virulencia Abreviaturas y acrónimos 33 vol/vol: volume to volume VP: Voger-Proskauer vs: versus W: trimetoprim XDR: Extreme-drug Resistant XLD: Xilosa-lisina-deoxicolato XLT4: Xilosa-lisina-tergitol Abreviaturas y acrónimos 34 35 Resumen / Abstract 36 Resumen / Abstract 37 RESUMEN Salmonella es el segundo patógeno de importancia en salud pública en número de casos, y el número uno en número de brotes, en la Unión Europea, solo por detrás de Campylobacter. A pesar de ser una bacteria comensal del intestino de numerosas especies homeotermas, puede llegar a causar cuadros clínicos de tipo gastrointestinal o, incluso, extraintestinal, como por ejemplo artritis reactivas o meningitis. Además, Salmonella es una enterobacteria de la que se han aislado cepas resistentes a diferentes antimicrobianos tanto en humanos como en animales, agravando los cuadros clínicos observados al no ser eficaz el tratamiento. En la actualidad, la resistencia a antimicrobianos representa el mayor reto al que se enfrenta la medicina occidental del siglo XXI, pues ocasiona fallo terapéutico en miles de casos y un gran número de muertes al año. En los últimos años, se ha publicado la detección de cepas de Salmonella resistente a diferentes antimicrobianos a partir de muestras obtenidas de fauna salvaje. Se ha demostrado la capacidad de la fauna silvestre como portadora asintomática de dicha bacteria, lo cual cobra especial importancia en el caso de las aves. A través del vuelo, son capaces de cubrir más territorio que los mamíferos, aún más en el caso de aves migratorias, teniendo una capacidad de diseminación de bacterias mucho mayor. Sin embargo, el mayor riesgo no es la diseminación de Salmonella por diferentes regiones, sino la de cepas portadoras de resistencias a antimicrobianos. Por tanto, resulta de vital importancia el estudio de Salmonella en las aves silvestres, incluyendo el perfil de resistencias a antimicrobianos presente en las cepas detectadas. En este contexto, entre los años 2015 y 2019, se llevaron a cabo tres estudios experimentales en diferentes poblaciones de aves silvestres. El objetivo del primer estudio experimental fue determinar la presencia de Salmonella y de las resistencias a antimicrobianos asociadas a ella en individuos jóvenes de águila de Bonelli nacidos en libertad en la Comunidad Valenciana. Como objetivo secundario se estableció la definición del tipo de muestra más adecuado para la detección de Salmonella en estas circunstancias. Para ello se recogieron hisopos cloacales de cada individuo, los cuales se conservaron en medio CaryBlair, al mismo tiempo que heces frescas de cada nido. La detección de Salmonella se realizó siguiendo la norma ISO 6579:2002 (Anexo D), y las cepas obtenidas fueron serotipadas en el Laboratorio Nacional de Referencia para Salmonelosis Animal (LCV, Algete), mediante aglutinación antigénica con antisueros específicos siguiendo el esquema Le Minor-White- Kauffman. Finalmente, se realizó un test de susceptibilidad a antimicrobianos a todas las cepas aisladas, mediante el test de difusión disco-placa o test de Kirby-Bauer, siguiendo las recomendaciones del Comité Europeo de Análisis de Susceptibilidad a Antimicrobianos (EUCAST). Los resultados mostraron una prevalencia de Salmonella de 35,5% de los individuos Resumen / Abstract 38 de águila de Bonelli incluidos en el estudio, mientras que la positividad en nidos fue del 60,7%, lo que indica que la mejor muestra para la detección de Salmonella son las heces frescas. La prevalencia obtenida fue muy superior a la observada en otras regiones de España en la misma especie, si bien dichos estudios se basaron en muestras de individuos adultos y no en pollos. Este puede ser un factor a tener en cuenta, pues la microbiota intestinal sufre diversas modificaciones a lo largo del desarrollo del individuo hasta estabilizarse. Por otro lado, el ambiente en el que se crían los pollos puede favorecer la infección y reinfección a partir de alimento contaminado o heces de hermanos o padres infectados que se van acumulando en el nido. Los serotipos más aislados fueron Enteritidis, Typhimurium y Houston (14,3% cada uno), siendo los dos primeros serotipos zoonóticos de gran relevancia en avicultura y salud pública. Este hecho, recalca la importancia que pueden llegar a tener las aves silvestres como diseminadoras de Salmonella por el medio ambiente, pudiendo contaminar cultivos, granjas e incluso zonas urbanas. También se detectaron en menor medida S. Cerro, S. Manhattan, S. Carnac y S. Tomegbe. Finalmente, el análisis de susceptibilidad a antimicrobianos determinó un 36,8% de las cepas resistentes a ampicilina y una única cepa resistente además a tigeciclina, ambos antimicrobianos ampliamente utilizados en producción porcina en los últimos años. Estos hallazgos sugieren una posible relación entre la producción animal y el medio ambiente, de manera que bacterias que hayan adquirido resistencias a antimicrobianos en granjas, puedan ser diseminadas por el medio natural hasta llegar a la fauna silvestre. El segundo estudio experimental tuvo como objetivo estudiar la viabilidad de Salmonella en muestras cloacales recogidas en individuos silvestres de difícil acceso, usando de nuevo como modelo el águila de Bonelli, y comparando el empleo de medio FBP enriquecido con carbón activo en congelación frente al uso de medio Cary Blair en refrigeración. En esta ocasión, se recogieron muestras de individuos volantones nacidos en libertad en Andalucía y de individuos volantones nacidos en cautividad en centros de recuperación de fauna silvestre. Se recogieron dos hisopos cloacales de cada individuo (n=63), uno se conservó en medio CaryBlair en refrigeración, mientras que el segundo en medio nutritivo FBP enriquecido con carbón activado en congelación. Las muestras fueron analizadas a las 72 horas de su recogida, en el caso de los hisopos conservados en Cary Blair, y a los tres meses en el caso del medio FBP. De nuevo, la detección de Salmonella se realizó en ambos casos siguiendo la norma ISO 6579:2002 (Anexo D). No se detectó Salmonella en ninguna de las muestras de águila de Bonelli procesadas, independientemente del método de preservación. Por tanto, tanto el medio FBP en congelación como el medio Cary Blair en refrigeración durante más de 72 horas resultaron ineficaces en la detección de Salmonella en águila de Bonelli. Resumen / Abstract 39 Por último, el objetivo del tercer estudio experimental fue investigar la presencia de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas a ella en individuos de cinco especies diferentes de aves urbanas. A fin de poder abarcar diferentes nichos ecológicos y comportamientos se seleccionaron las siguientes especies: cigüeña blanca, gaviota sombría, paloma torcaz, estornino negro y gorrión común. Todas las aves incluidas en este estudio fueron animales ingresados en el hospital de fauna salvaje de GREFA por diferentes motivos. En todos ellos, se recogieron hisopos cloacales durante su primera revisión en el hospital (n=300) y siempre previo a la administración de cualquier tratamiento, que fueron conservados en medio CaryBlair en refrigeración hasta su procesado en el laboratorio de GREFA en las primeras 24 horas. La detección de Salmonella se realizó siguiendo la norma ISO 6579-1:2017 (Anexo D), y el serotipado de las cepas obtenidas se realizó en el Laboratorio Nacional de Referencia para Salmonelosis Animal (LCV, Algete), mediante aglutinación antigénica con antisueros específicos siguiendo el esquema Le Minor-White-Kauffman. En este estudio, el test de susceptibilidad a antimicrobianos de las cepas aisladas de aves urbanas se realizó mediante microdilución en caldo Mueller-Hinton, siguiendo las recomendaciones de la Decisión Europea 2013/652/EU. Los resultados mostraron una prevalencia global de Salmonella de 12,3%, siendo la especie con mayor tasa de infección la cigüeña blanca (59,5%), y el gorrión común y el estornino negro las especies con menor prevalencia (5,4% y 2,7%, respectivamente). Los resultados obtenidos se corresponden con los publicados por otros autores. Además, se observó una relación estadísticamente significativa entre la detección de Salmonella y el ambiente en el que se recogieron las aves, habiendo una diferencia significativa en el grupo que provenía de vertederos (p=0,031). Los serotipos más detectados fueron de nuevo Enteritidis (43,2%) y Typhimurium (16,2%), seguidos de su variante monofásica o mST (13,5%) y otros seis serotipos previamente descrito en fauna silvestre por diferentes autores. El test de susceptibilidad a antimicrobianos reveló un 40,5% de cepas resistentes a algún antimicrobiano, de las cuales el 86,7% fueron consideradas multirresistentes. Los antimicrobianos con mayor tasa de resistencia fueron con diferencia ciprofloxacino (36,4%) y el ácido nalidíxico (36,4%), seguido de la colistina (27,3%) entre otros. De nuevo, se observó una estrecha relación entre el ambiente del que provenían las aves y la presencia de AMR, existiendo una mayor tasa de AMR en el grupo que provenía de vertederos (p<0,05). De esta manera se pone de manifiesto la diseminación de las resistencias a antimicrobianos en la fauna urbana frente a un amplio número de antimicrobianos de diferentes familias, mostrando además su potencial como agentes diseminadores en el medio ambiente. Resumen / Abstract 40 En conclusión, los resultados obtenidos en los diferentes estudios que forman esta tesis doctoral muestran el importante papel como portadores asintomáticos, y por tanto diseminadores, de Salmonella spp. que juegan tanto el águila de Bonelli como las aves urbanas. La presencia de resistencias a antimicrobianos en las cepas aisladas a lo largo de estos trabajos es ligeramente mayor en aves urbanas que en el águila de Bonelli, siendo en ambos casos un porcentaje moderado-alto. Esta proporción de bacterias resistentes en fauna silvestre destaca la importancia del control del uso de antimicrobianos y la gestión de sus residuos a fin de ralentizar el desarrollo de resistencias. Resumen / Abstract 41 ABSTRACT Salmonella is one of the most important foodborne pathogens in the European Union. It causes the highest number of outbreaks, and is the second pathogen with the greatest number of cases, only behind Campylobacter. Despite being a commensal bacterium of the intestine of numerous homoeothermic species, it can cause gastrointestinal or even extra-intestinal clinical signs, like reactive arthritis or meningitis. Furthermore, Salmonella resistant strains have already been isolated in both humans and animals to many different antimicrobials. This condition can affect the effectiveness of treatment, aggravating clinical presentations. Currently, antimicrobial resistance represents the greatest challenge for 21st-century medicine, as it causes treatment failure in thousands of cases and a large number of deaths per year. During last years, numerous resistant Salmonella strains to different antimicrobials has been detected from samples obtained from wildlife and environment. The ability of wildlife as an asymptomatic carrier of this bacterium has been demonstrated, which is especially important in the case of birds. Through flight, they are capable of covering more territory than mammals, even more in the case of migratory birds. In this context, birds could have a higher capacity for spread bacteria and antimicrobial resistance, as Salmonella resistant strains. Therefore, the study of Salmonella epidemiology in wild birds is of vital importance, including the antimicrobial resistance pattern present in detected strains. In this context, three different studies were carried in different wild bird populations between 2015 and 2019. The aim of the first study was to study the presence of Salmonella and antimicrobial resistances in free-borne nestlings of Bonelli’s eagle from the Valencia Region (n=45). As secondary objective, the determination of the most effective type of sample for the detection of Salmonella (feces or cloacal swab) was established. From each animal a cloacal swab preserved in CaryBlair medium, and fresh feces from each nest were collected and analyzed. The detection of Salmonella was carried out following the ISO 6579: 2002 recommendations (Annex D), and the obtained strains were serotyped at the National Reference Laboratory for Animal Salmonellosis (LCV, Algete), by antigenic agglutination with specific antisera following the Le Minor-White- Kauffman scheme the serotyping. Finaly, antimicrobial susceptibility tests were performed for all the isolated strains by disk diffusion or Kirby-Bauer method, and according to European Committee for Antimicrobial Susceptibility Test (EUCAST) guidelines. Prevalence of Salmonella in Bonelli's eagle nestlings was 35.5%, while the positivity in nests was 60.7%, which is much higher than that observed in other regions of Spain in the same species, although these studies were based on samples from adults and not on nestlings. This may be a factor to take into account since the intestinal microbiota undergoes some modifications throughout the Resumen / Abstract 42 development of the individual until it stabilizes. Moreover, the environment in which the chickens are raised may favor infection and reinfection from contaminated food or feces from infected siblings or parents accumulated in the nest. The most isolated serotypes were Enteritidis, Typhimurium and Houston (14.3%, each one). The two first serotypes are considered important zoonotic pathogens in poultry and public health. This fact underscores the importance that wild birds can have as disseminators of Salmonella in the environment, contaminating crops, farms and even urban areas. In a lower proportion, S. Cerro, S. Manhattan, S. Carnac and S. Tomegbe were also isolated. Finally, the antimicrobial susceptibility analysis determined 36.8% of the strains resistant to ampicillin, and a single strain also resistant to tigecycline. Both antimicrobials were widely employed in swine production. This fact suggests a relation between livestock and environment: bacteria with resistance acquired in farms can be disseminated through the environment and wildlife. For the second experimental study, the aim was to study the viability of Salmonella in cloacal samples collected from wild Bonelli’s eagles from remote areas, comparing two different preservation methods: freezing charcoal FBP medium vs. refrigerated Cary Blair medium. Free- borne nestling from Andalousia and captive-borne nestlings from wildlife rescue centers were sampled. Two cloacal swabs were obtained from each nestling (n=63): one was preserved in CaryBlair medium at 4ºC during 72 hours, and the other in FBP medium enriched with activated carbon at -20ºC during three months. Salmonella detection was performed according to the ISO 6579: 2002 recommendations (Annex D). Salmonella was not detected in any of the processed Bonelli's eagle samples, regardless of the preservation method employed. Thus, charcoal FBP at freezing temperatures and refrigerated Cary Blair for 72 hours resulted ineffective in Salmonella survival in swabs from Bonelli’s eagle. Finally, in the third experimental design the aim was to study the epidemiology of Salmonella and the antimicrobial resistance pattern of the isolated strains from individuals of five different species of urban birds were included. In order to be able to cover different ecological niches and behaviors, the species selected were: white stork, lesser black-backed gull, common wood pigeon, common starling and house sparrow. All the birds included in this study were animals admitted to the GREFA wildlife hospital for different reasons as natural diseases, traumas or orphan nestlings. From all of them, a cloacal swab was collected during their first examination in the hospital and prior to the administration of any treatment (n=300). Swabs were stored refrigerated in CaryBlair medium until processed at GREFA’s laboratory within 24 hours from the collection. The detection of Salmonella was carried out following the ISO 6579-1: 2017 standards (Annex D), isolated strains were serotyped at the National Reference Laboratory for Animal Resumen / Abstract 43 Salmonellosis (LCV, Algete), by antigenic agglutination with specific antisera following the Le Minor-White-Kauffman scheme the serotyping. The antimicrobial susceptibility test was performed by microdilution in Mueller-Hinton broth, according to the 2013/652/EU Decision. Results showed a global prevalence of Salmonella of 12.3% in urban birds. The species with the highest infection rate was the white stork (59.5%, 22/37), in contrast to house sparrows and common starling, which had the lower rates (5.4% and 2.7%, respectively). The results obtained agree to those published by other authors. In addition, a statistically significant relationship was observed between the detection of Salmonella and the environment in which the birds were collected, with a significant difference in the group that came from landfills (p=0.031). The serotypes most detected were again Enteritidis (43.2%) and Typhimurium (16.2%), followed by monophasic variant or mST (13.5%) and six more serotypes previously reported in wildlife by other authors. The antimicrobial susceptibility test revealed 40.5% of strains resistant to some antimicrobial, of which 86.7% were considered multi-resistant. The antimicrobials with the highest rate of resistance were by far ciprofloxacin (36.4%) and nalidixic acid (36.4%), followed by colistin (27.3%) among others. Again, a close relationship was observed between the environment from which the birds came and the presence of AMR, with a higher rate of AMR in the group that came from landfills (p < 0.05). These results highlight the spread of antimicrobial resistance in urban birds to a large number of antimicrobials from different families, and the potential role of these birds as carriers and disseminators on the environment. In conclusion, Bonelli's eagle and urban birds play an important role as asymptomatic carriers, and therefore disseminators, of Salmonella spp. The presence of antimicrobial resistance in the strains isolated throughout these studies is slightly higher in urban birds than in the Bonelli's eagle, with a moderate-high percentage in both cases. This proportion of resistant bacteria in wildlife stands out the importance of antimicrobial control and residues management in order to slow down the antimicrobial resistance development. Resumen / Abstract 44 45 1.Introducción 46 Introducción 47 1.1. Género Salmonella 1.1.1. Características del género Salmonella Se trata de una enterobacteria de distribución mundial que forma parte de la microbiota intestinal de la mayoría de animales homeotermos y algunos poiquilotermos, sean domésticos o silvestres, debido a la gran capacidad de adaptación que presentan. La mayoría de los animales son, por tanto, portadores asintomáticos, excretando la bacteria a través de las heces y siendo la transmisión vía fecal-oral (CDC, 2017). Las bacterias pertenecientes a este género son bacilos pleomórficos gram-negativos, catalasa positivos, oxidasa negativos, no fermentadores de lactosa y no formadores de esporas. Además, la mayoría poseen flagelos perítricos que les confieren cierta movilidad, con excepción de algunas variantes inmóviles. Poseen un metabolismo fermentativo y oxidativo, fermentando de esta manera la glucosa, el manitol y el sorbitol con producción de ácido y gas, a excepción de Salmonella Typhi y otras serovariedades que sólo producen ácido y sulfuro de hidrógeno (Terragno et al., 2003; Stanchi et al., 2007). Son anaerobios facultativos, de forma que en condiciones de anaerobiosis utilizan los carbohidratos del medio como fuente de carbono, mientras que en presencia de oxígeno pueden nutrirse de ácidos orgánicos y aminoácidos además de los carbohidratos (Biberstein y Chung Zee, 1994). La media de supervivencia de Salmonella es alta en ambientes asociados a sustratos orgánicos, sobreviviendo incluso a la refrigeración y la congelación. Su capacidad de multiplicación no se ve alterada en rangos de temperatura entre los 7ºC y los 49ºC, sin embargo, se inactiva a temperaturas fuera de ese rango y/o pH (power of hydrogen) inferior a 5.0. También son capaces de tolerar altas concentraciones de sal, aunque no son capaces de multiplicarse en concentraciones superiores a 3-4% de cloruro sódico (Jawetz et al., 2014). Se ha descrito una alta supervivencia de estas bacterias en agua, llegando a sobrevivir durante varios meses. El valor óptimo de actividad de agua (aw) para su multiplicación es 0.995, aunque también presenta una gran resistencia a la baja aw por lo que puede sobrevivir en ambientes secos hasta varias semanas. Incluso se ha descrito la supervivencia de Salmonella en agua congelada durante periodos prolongados (Jawetz et al., 2014). Asimismo, puede permanecer viable durante meses en productos ricos en proteínas y grasas, como por ejemplo el chocolate. También toleran elevadas concentraciones de ácidos biliares y su crecimiento in vitro no se ve inhibido por la presencia de colorantes como el azul de metileno, el cristal violeta o el verde brillante, lo que confiere cierta ventaja a la hora de preparar medios de cultivo selectivos y Introducción 48 diferenciales. Sin embargo, se trata de un microorganismo sensible a los típicos tratamientos térmicos utilizados a la hora de cocinar, lo que ayuda en el control y prevención de la salmonelosis. Además, los desinfectantes comunes como fenoles, iodados y clorados resultan eficaces frente a las bacterias de este género (Jawetz et al., 2014). 1.1.2. Taxonomía y nomenclatura Salmonella spp. se incluye dentro de la familia Enterobacteriaceae, colonizando de forma natural el tracto intestinal de los animales homeotermos, la cual a su vez pertenece al orden Enterobacteriales (Figura 1). Dominio Bacteria Filo Proyteobacteria Clase Gammaproteobacteria Orden Enterobacteriales Familia Enterobacteriaceae Género Salmonella Figura 1. Taxonomía del género Salmonella según Lignieres 1900. Fuente: elaboración propia. Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae son comensales que habitan de manera regular el intestino de numerosas especies de mamíferos, aves, reptiles, e incluso anfibios. Por lo general, suelen comportarse como bacterias apatógenas, como por ejemplo Hafnia. Sin embargo, pueden llegar a ser patógenas oportunistas e incluso patógenos de gran importancia en salud pública, como son algunas especies de Salmonella y Campylobacter. Como patógenos oportunistas son capaces de provocar gran variedad de signos clínicos en animales y humanos, la mayoría de carácter gastrointestinal, interfiriendo en el desarrollo de la patología numerosos factores (especie bacteriana, estado inmunitario y edad del huésped, vía de transmisión, etc.). Los patógenos más importantes de esta familia poseen una estructura antigénica compleja y son capaces de producir diferentes factores de virulencia y toxinas, por lo que pueden causar tanto lesiones entéricas como sistémicas (Muñoz et al., 2000). Introducción 49 En la actualidad, el género Salmonella comprende dos especies, Salmonella bongori y Salmonella enterica, agrupando esta última la mayoría de las bacterias del género que colonizan el intestino de los animales homeotermos. A su vez, S. enterica se divide en seis subespecies (o subgrupos fenotípicamente diferentes), los cuales se designan bien por su nombre bien por un número romano: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) e indica (VI) (Grimont y Weill, 2007). En 1989, la hasta entonces denominada subespecie bongori o subgrupo V pasó a ser una especie en sí misma (Reeves et al., 1989). A lo largo de las últimas décadas, las diferentes subsespecies de Salmonella han sido aisladas de multitud de especies animales, así como de diferentes ambientes (Terragno et al., 2003; Grimont y Weill, 2007): 9 Salmonella enterica: o Aislada principalmente de humanos y animales homeotermos: S. enterica subsp. enterica. o Aislada principalmente de animales poiquilotermos y del ambiente: S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae y S. enterica subsp. indica. 9 Salmonella bongori: aunque no constituye un patógeno para los humanos, se ha aislado en animales homeotermos, observando relación con ciertas patologías. Dentro de cada subespecie encontramos diferentes serotipos o serovares de Salmonella que pueden clasificarse desde un punto de vista epidemiológico en función de su rango de adaptación a una o más especies hospedadoras (Kingsley y Bäumler, 2000). Según esto, existen serotipos adaptados a un único hospedador, como por ejemplo Salmonella Gallinarum en aves, serotipos adaptadas que en ocasiones puedes aislarse en otros hospedadores, como Salmonella Cholerasuis que se asocia a suidos, y serotipos no adaptados a hospedadores específicos, como por ejemplo Salmonella Typhimurium (Uzzau et al., 2000). Por tanto, ciertos serotipos de Salmonella pueden considerarse zoonóticos al ser capaces de saltar de una especie hospedadora a otra. 1.1.3. Caracterización de Salmonella spp. La clasificación de Salmonella en serotipos se realiza a partir de la combinación de antígenos superficiales somáticos (O) o flagelares (H), los cuales se identifican mediante técnicas de Introducción 50 microaglutinación con sueros específicos. Eventualmente también se puede determinar un antígeno de superficie conocido como antígeno de virulencia (Vi), presente en algunos serotipos de Salmonella (Typhi, Paratyphi C, etc.), y relacionado con la capacidad de invasión de la bacteria (Popoff y Le Minor, 1997; Jawetz et al., 2014). La clasificación de los serotipos de Salmonella según la estructura antigénica se basa en el esquema Kauffmann-White, ya que fue White quien realizó la primera clasificación en 1926, la cual modificó Kauffmann en 1941. Recientemente Grimont y Weill (2007) propusieron nombrar el esquema como Le Minor-Kauffmann-White, pues de todos los serotipos descritos de Salmonella, más de 1300 fueron descritos por Le Minor. Los antígenos somáticos (O) son polisacáridos termoestables, tipo-específicos, que se localizan en la pared celular de la bacteria, incluidos en el lipopolisacárido (LPS). Se dividen en antígenos mayores, que definen el serogrupo y son compartidos por todas las bacterias del mismo, y antígenos menores, cuyo valor discriminativo es menor ya que son compartidos por salmonelas de diferentes serogrupos (Stanchi et al., 2007). El esquema Le Minor-Kauffmann-White divide al género Salmonella en 67 serogrupos, a los cuales se les asignó inicialmente una letra de la A a la Z. Sin embargo, actualmente se designa cada grupo antígenos según las características del antígeno somático mayor, manteniendo las letras de forma provisional y entre paréntesis, por ejemplo, O:4 (B) (Grimont y Weill, 2007). Cabe destacar la existencia de algunas cepas, comúnmente denominadas “rugosas”, que carecen del polisacárido O por un defecto en su síntesis, por lo que no se pueden serotipar. Al contrario que los anteriores, los antígenos flagelares (H) son proteicos y termolábiles, y forman parte de las flagelinas de los flagelos. La gran mayoría de las serovariedades tienen dos fases en su antígeno flagelar (H1 y H2), diferenciables por medio de aglutinación en tubo de ensayo, aunque algunas llamadas monofásicas, poseen una única fase flagelar. Las flagelinas de fase 1 o H1 son específicas y características del serotipo, y se denominan con letras minúsculas que van de la a a la z. Las flagelinas de fase 2 o H2 no son específicas, por lo que son comunes a diferentes serotipos, y se denominan con la letra z seguida de subíndices. Por último, los aislados monofásicos pueden pertenecer a serovariedades que de manera natural carece de ambas fases flagelares, o bien a consecuencia de una inactivación o falta de expresión del gen que codifica la fase ausente (Andino y Hanning, 2015). Por último, el antígeno de superficie o de virulencia (Vi) es también termolábil, y protege a la bacteria proporcionándole una resistencia antifagocítica. Se trata de un polisacárido compuesto de ácido N-acetilglucosaminurónico que ayuda a prevenir la fagocitosis y protege a la bacteria Introducción 51 de las reacciones oxidativas que producen los fagocitos. Así, las serovariedades que presentan este antígeno son más infecciosas y virulentas que las que no (Pachón, 2009). Aplicando todo lo anterior, la fórmula antigénica de una Salmonella se expresa como: Antígeno somático O: Antígeno flagelar H1: Antígeno flagelar H2 Por ejemplo, la fórmula de S. Typhimurium es 1,4,5,12:i:1,2. No obstante, todas las serovariedades de S. enterica subsp. enterica conservan su denominación original, la cual suele hacer referencia a la región geográfica en la que aislaron por primera vez (S. Dublin o S. Ohio). Las serovariedades de las demás subespecies y de S. bongori aisladas después de 1966 deben designarse con su fórmula antigénica correspondiente. Por otro lado, la escritura de los serotipos en los textos debe ir precedida de la palabra “serotipo” o “ser.” siempre que se mencione por primera vez, y debe realizarse con la inicial en mayúscula y sin cursiva. Por ejemplo: Salmonella serotipo Typhimurium o Salmonella ser. Typhimurium (Grimont y Weill, 2007). En la actualidad se han descrito más de 2500 serotipos de Salmonella mediante dicho esquema (Dekker y Frank, 2015). Más del 50% de los serotipos descritos pertenecen a S. enterica subsp. enterica. 1.1.4. Factores de virulencia La virulencia de Salmonella se relaciona con la capacidad que presenta para invadir las células hospedadoras, replicarse en su interior y resistir a los mecanismos de defensa típicos (digestión por fagocitos y destrucción por la acción del complemento). Además del antígeno de superficie (Vi) ya explicado anteriormente, se han descrito diferentes factores de virulencia en el género Salmonella (Pachón, 2009). El primero es la capacidad de adherencia a las células epiteliales del intestino o a su matriz extracelular (Wilson et al., 2019). La adherencia se realiza a través de adhesinas, cuya estructura les permite reconocer los receptores de los enterocitos, así como activar los linfocitos B y neutrófilos favoreciendo la proliferación celular y secreción de citocinas. Dentro de la amplia variedad de adhesinas que existen, las enterobacterias suelen presentar: fimbria, fibrilla, flagelo, lipopolisacárido y cápsula. 9 Las fimbrias y los pelos o pili presentan una estructura similar a los flagelos, pero no confieren motilidad. Introducción 52 9 La presencia de flagelo y/o cápsula viene definido por la serovariedad de Salmonella, de manera que únicamente presentan cápsula los serovares Typhi, Paratyphi y Dublin. En cuanto al flagelo, todas las serovariedades son mótiles a excepción de S. Gallinarum y S. Pullorum. La producción de adhesinas codificadas por el plásmido de virulencia (pSLT: virulence plasmid Salmonella Typhimurium) permiten la unión de la bacteria a las microvellosidades del enterocito mediante la presencia de fimbrias agregativas conocidas como curli, así como la unión de la bacteria a las placas de Peyer a través de fimbrias polares largas (Wilson et al., 2019). Además, en algunas serovariedades de Salmonella (por ejemplo, Typhimurium) se ha descrito la formación de pseudópodos en el enterocito hospedador, lo que favorece la entrada de la bacteria en vesículas endocíticas. La producción de toxinas constituye otro factor de virulencia a tener en cuenta. Salmonella es capaz de producir diferentes tipos de toxinas (Ochoa y Rodríguez, 2005): 9 Enterotoxinas: moléculas liberadas al intestino que dan lugar a síntomas gastrointestinales como diarrea y cólico. Se expresan pocas horas después de la adherencia de la bacteria con el enterocito, y está presente en numerosos serovares. 9 Endotoxinas: forman parte de la membrana externa de la bacteria, estando su actividad muy ligada al LPS. Favorecen la respuesta inflamatoria local que daña el epitelio intestinal y ofrecen una resistencia a la bacteria frente a la acción del complemento al impedir que éste se una a la membrana externa de la bacteria. 9 Citotoxinas: se asocian con la superficie celular, inhibiendo la síntesis proteica de la célula hospedadora, y facilitando de esta manera la adherencia de la bacteria a los enterocitos. Su acción provoca la muerte celular y su desprendimiento de la mucosa intestinal, lo que se traduce en un flujo de iones y líquido hacia la luz intestinal que origina la diarrea. Se considera que la producción de estas toxinas es dependiente de la fase de crecimiento bacteriano, observando una mayor producción en la fase logarítmica que en la estacionaria. Por otro lado, Salmonella es capaz de liberar diversas citocinas pro-inflamatorias que inducen la migración de neutrófilos y macrófagos produciendo inflamación a nivel intestinal. Dicha inflamación reduce la permeabilidad vascular, que junto con la pérdida de la integridad del epitelio intestinal incrementa la salida de líquidos y electrolitos al lumen intestinal potenciando Introducción 53 la diarrea. Además, la acción de las enzimas catalasa y superóxido dismutasa de Salmonella neutralizan los radicales libres producidos por los fagocitos (Wilson et al., 2019). Finalmente, la capacidad de supervivencia en ambientes ácidos es otro factor de virulencia, pues permite a la bacteria atravesar los jugos estomacales para llegar al intestino, donde se realiza la infección (Wilson et al., 2019). 1.1.5. Salmonelosis Los reservorios de Salmonella incluyen tanto animales domésticos, como de producción y silvestres. Se han descrito casos de salmonelosis relacionados con el contacto con ganado porcino, vacuno, aves silvestres y de corral, roedores, reptiles, perros y gatos. La mayoría de los animales son portadores asintomáticos que excretan Salmonella de forma intermitente a través de las heces (Barrow y Methner, 2013). La transmisión se produce vía fecal-oral, y puede ser directa o indirecta al ingerir alimentos o agua contaminada. En humanos, la salmonelosis está principalmente asociada al consumo de alimentos contaminados de origen animal (ovoproductos, carne de ave y leche), crudos o mal cocinados, aunque también se ha descrito asociada al consumo de hortalizas y frutas contaminadas por estiércol y al contacto con mascotas u otros animales (Cruz, 2016). También se ha descrito la transmisión vertical transovárica, considerándose la principal vía de contaminación de Salmonella en producción de huevos al ser la más difícil de combatir. Tras la ingestión de la bacteria, se produce la invasión del tejido linfoide intestinal (placas de Peyer y tonsilas cecales en aves), proliferando en la capa mucosa de las células epiteliales del intestino. Posteriormente, Salmonella invade los enterocitos adhiriéndose a la superficie de los mismos mediante fimbrias y produciendo una alteración en su superficie conocida como ruffling como respuesta al contacto, lo que permite la entrada de la bacteria en el interior del enterocito. Se considera que Salmonella puede invadir diferentes líneas celulares, para lo cual es capaz de estimular diferentes vías de transducción de señales para invadir las células hospedadoras (Ochoa y Rodríguez, 2005). Se trata de una infección intracelular facultativa, que puede llevarse a cabo dentro de células no fagocíticas y, en ocasiones, en las vacuolas con bajo pH de los macrófagos. Una vez la infección llega a la lámina propia del intestino, se produce una reacción inflamatoria, seguida de una trombosis y finalmente ulceración de la misma (Barrow y Methner, 2013). Todo ello origina una secreción de fluido intestinal y, por tanto, un cuadro de diarrea. Introducción 54 Las serovariedades no tifoideas afectan al íleon y, en menor medida, al colon, causando leves ulceraciones en la mucosa y ocasionado un cuadro clínico gastrointestinal con sintomatología leve y autolimitante, de 4-7 días de duración. La lesión más observada es una enterocolitis con contenido intestinal sanguinolento, acompañado de un aumento en el tamaño de los ganglios mesentéricos. Los síntomas más comunes son: fiebre alta, dolor abdominal, diarrea muy acuosa que puede ser sanguinolenta, náuseas e incluso vómitos (Dekker y Frank, 2015). Sin embargo, en algunos casos, ocurre una fase extraintestinal con diseminación de la bacteria a ganglios linfáticos mesentéricos y sangre, pudiendo alcanzar el resto de órganos (bazo, hígado, ovario, etc.). En estos casos, el cuadro clínico puede agravarse con un proceso septicémico agudo que dará lugar a la presencia de abscesos intrabdominales, colecistitis, infecciones de tracto urinario, abortos, artritis, necrosis de extremidades, enfermedad respiratoria, etc. En cualquiera de los casos, los síntomas no son patognomónicos (Dekker y Frank, 2015). Finalmente, en los casos de mayor gravedad se puede observar síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante, osteomielitis y meningitis, principalmente en individuos inmunocomprimidos, ancianos y niños. Se estima que el 5% de los casos de salmonelosis tiene complicaciones graves como la artritis reactiva, o daños neurológicos y neuromusculares, mientras que en 1% de los casos la infección provoca la muerte (Ajene et al., 2013). Tanto durante el proceso, como tras desaparecer los síntomas, los individuos con salmonelosis excretan la bacteria en las heces hasta 5 semanas después de la remisión de signos clínicos. Sin embargo, en algunos casos la excreción de Salmonella puede prolongarse hasta varios meses, pasando a ser portadores asintomáticos. El estado de portador crónico es más frecuente en animales que en humanos (Dekker y Frank, 2015). Los serovares de mayor repercusión clínica son los que pertenecen a la subespecie S. enterica enterica, los cuales pueden afectar a multitud de animales de sangre caliente, incluyendo aves, reptiles y mamíferos. A este grupo perteneces los dos serovares zoonóticos más importantes en salud pública y responsables de la mayoría de brotes de salmonelosis a nivel mundial: Salmonella Enteritidis, principalmente asociado a ovoproductos y carne de aves de corral, y Salmonella Typhimurium, relacionado con el ganado porcino, bovino, ovino y aves de corral (WHO, 2002; EFSA, 2019). Introducción 55 1.1.5.1. Importancia de la salmonelosis en salud pública La salmonelosis presenta una distribución mundial, aunque de manera muy general las serovariedades tifoideas (Typhi y Paratyphi) afectan más a países en vías de desarrollo que las no tifoideas, siendo además específico de los humanos. La región más afectada por la fiebre tifoidea es el sureste asiático, siendo la India el país con mayor porcentaje de casos declarados (cerca de 500 casos cada 100.000 habitantes al año) (Marchello et al., 2019). Se estima que a nivel mundial se producen al año unos 26 millones de casos provocados por S. Typhi y cerca de 5 millones por S. Patatyphi, causando un total de 215.000 muertes anuales. Su transmisión está ligada al consumo de alimentos contaminados con materia fecal de personas infectadas, y por tanto, a unas prácticas higiénico-sanitarias pobres (CDC, 2017). Por el contrario, las serovariedades no tifoideas de Salmonella son menos específicas, teniendo un amplio rango de hospedadores, por lo que la fuente de infección pueden ser alimentos o agua contaminados con materia fecal procedente de personas, animales de abasto, mascotas, etc. Se ha observado una tendencia estacional, declarando un mayor número de caso durante los meses de verano. Se estima que a nivel global se producen cerca de 153 millones de casos anuales, con una media de 57.000 muertes al año (CDC, 2017). Desde 2008 se ha observado una importante disminución en el número de casos en la Unión Europea, la cual se estancó en 2013. Esta disminución se debe a los sistemas de vigilancia, control y prevención de los estados miembros. Sin embargo, a día de hoy, sigue siendo la segunda zoonosis más notificada en la Unión Europea, superada únicamente por la campylobacteriosis. El número de casos declarados de salmonelosis en humanos varía entre los diferentes países miembros de la Unión Europea, debido, entre otros factores, a las diferencias en los sistemas de monitorización, la recogida sistemática de muestras y el procesado de las mismas, la carga ganadera y el estado sanitario de la misma (EFSA, 2019). En 2018, en la Unión Europea se confirmaron 91.857 casos de salmonelosis en humanos, lo que supone una incidencia de 20,1 casos por cada 100.000 habitantes, un 2% superior al año anterior, manteniendo la tendencia al alza de los últimos años. De todos los casos declarados, el 43,2% fueron hospitalizados, registrando una tasa de mortalidad del 0,19%. En cuanto al origen de estas infecciones, el 65,1% de estos casos fueron considerados domésticos, al no estar relacionados con viajes fuera de la Unión Europea. Dentro de las infecciones de origen alimentario, la salmonelosis supuso el 30,7% de los casos, siendo la principal fuente de infección los huevos y derivados de los mismos (Figura 2) (EFSA, 2019). Introducción 56 48% 10% 10% 4% 6% 7% 3% 3% 1%1%1%2% 1%1% 2% 1% Huevos y ovoproductos Repostería Comida preparada Otras comidas Carne de cerdo y derivados Carne de pollo y derivados Queso Dulces y chocolate Lácteos (no queso) Pescado y derivados Vegetales y derivados Menús de restaurante Crustáceos, moluscos y derivados Desconocidos Leche Carnes rojas y derivados Carne de cordero y derivados En España se declararon más de 8.700 casos, un 7,3% menos que los declarados en 2017. Sin embargo, si revisamos con detalle los informes de años anteriores, en España se observa una importante tendencia al alza desde 2014 hasta 2017, la cual se ha relacionado con una mejora en las medidas de vigilancia de Salmonella (EFSA, 2019). Al igual que en años anteriores, el mayor número de casos de salmonelosis se han registrado en niños menores de 14 años (51%). Además, se ha observado una tendencia marcadamente estacional en los brotes de salmonelosis, con picos en los meses de verano, relacionado con los cambios en los hábitos de alimentación en el periodo de vacaciones (EFSA, 2019; ECDC, 2019). Figura 2. Fuentes de infección de Salmonella más frecuentes en la Unión Europea en 2018. Fuente: gráfico modificado a partir de datos de EFSA, 2019. Introducción 57 Los serotipos más aislados en los últimos años han sido Enteritidis (60,9%), Typhimurium (13,8%), Typhimurium monofásica o mST (4,7%), Infantis (2,3%) y Derby (0,8%). La frecuencia de aislamiento de los diferentes serovares depende en gran medida de la fuente de infección, observando grandes diferencias entre el origen de los alimentos (Figura 3) (EFSA, 2019). Figura 3. Diagrama Sankey de la distribución de serovares de Salmonella más prevalentes en humanos y las fuentes de infección animal o alimentaria. Fuente: EFSA, 2018. 1.1.5.2. Importancia de la salmonelosis en sanidad animal Siguiendo las recomendaciones de vigilancia de patógenos zoonóticos de la Agencia de Seguridad Alimentaria Europea (European Food Safety Authority, EFSA), en 2018 se recogieron muestras de más de 920.000 animales en 27 países miembros de la UE. La mayor prevalencia de Salmonella se observó en producción de porcino y de aves. De los 92.089 suidos testados, el 41,26% resultaron positivos a Salmonella spp., siendo el serotipo más aislado S. Derby, seguido de S. Typhimurium. En avicultura, en cambio, se observaron importantes diferencias en la prevalencia de Salmonella, y de los diferentes serotipos, según el tipo de producción, observando la mayor prevalencia en granjas de engorde de pavo (EFSA, 2019). Debido a la alta prevalencia del patógeno, se trata de una enfermedad que anualmente tiene un elevado coste socio-económico, aumentando drásticamente cuando tenemos en cuenta los costes derivados de la producción animal. Aunque es una infección que generalmente causa Introducción 58 cuadros clínicos leves a moderados, y con poca relevancia epidemiológica, sí provoca graves consecuencias para la producción, principalmente porcina y aviar. La EFSA estima que los gastos derivados de la implementación de programas de control y vacunación, así como los gastos y pérdidas generados por los brotes de salmonelosis en producción animal pueden llegar a suponer en conjunto hasta 3.000 millones de euros anuales en la Unión Europea (USDA, 2014; EFSA, 2019). A pesar de que en el año 2016 se observó un incremento en los casos reportados, la tendencia en los últimos diez años ha sido a la baja, observando una disminución muy acusada entre 2008 y 2014, probablemente debida a la implantación de programas de control de la salmonelosis, coordinados entre todos los estados miembros, y dirigidos principalmente a la producción avícola (Figura 4). De esta manera, en avicultura se observó un descenso de la prevalencia de salmonelosis de 0,96% en 2007 a 0,29% en 2015. Sin embargo, al comparar los resultados obtenidos en 2018 con los de 2017, se observa un ligero incremento en la prevalencia en gallinas reproductoras y broiler, así como en cría y engorde de pavo, donde el porcentaje de positivos ha aumentado considerablemente (EFSA, 2019). Figura 4. Prevalencias de Salmonella observadas en los diferentes tipos de producción aviar en la Unión Europea, desde 2007 hasta 2018. Fuente: EFSA, 2019. Introducción 59 Por otro lado, en avicultura se fijaron los objetivos de prevalencias para los cinco serovares de mayor importancia en gallinas reproductoras, y con mayor repercusión en salud pública, a través del Reglamento CE 1003/2005 (BOE, 2005). Según los datos recogidos en el último informe de la EFSA, los serovares de Salmonella de mayor importancia en producción aviar son: Enteritidis, Typhimurium (incluyendo mST), Virchow, Infantis y Hadar. En 2018, el serotipo más reportado en gallinas ponedoras fue Enteritidis, mientras que en broiler fue Infantis. En cambio, en producción de pavos el serotipo más aislado fue un serotipo muy similar a Typhimurium, y a mST, que aún no ha sido definido (EFSA, 2019). 1.1.5.3. Salmonella spp. como agente zoonótico Como ya se ha comentado, las bacterias del género Salmonella tienen un amplio rango de hospedadores, afectando a numerosas especies animales, así como al ser humano. Además de las especies de abasto ya mencionadas anteriormente (aves, suidos y bóvidos), Salmonella puede colonizar de igual manera el intestino de nuestras mascotas, convirtiéndolas en portadoras. Se trata por tanto de una bacteria con un importante carácter zoonótico, generalmente observado en serovariedades no tifoideas (WHO, 2018). Aunque la transmisión de la bacteria sigue siempre una vía feco-oral, la fuente de infección puede ser muy variable, pudiendo ser una infección directa o indirecta a través de alimentos, agua u objetos contaminados. La salmonelosis, al igual que en el resto de animales, puede ser clínica, cursando con síntomas clásicos gastrointestinales, o subclínica. En la forma subclínica, las bacterias se encuentran de forma latente en el organismo y pueden ser excretadas con las heces de manera intermitente o persistente (Acha y Szyfres, 2003). A lo largo de los años se han descrito numerosos brotes de salmonelosis, en personas, asociados al contacto con mascotas y otros animales (Corrente et al., 2017; Robertson et al., 2018; Rukambile et al., 2019). Este hecho es de gran importancia principalmente por dos razones. La primera de ellas es el contacto frecuente que tienen las personas con sus mascotas a través de las caricias y juegos, además del hecho de compartir el hogar con ellos, lo que aumenta las probabilidades de transmisión de la bacteria. La segunda razón es el riesgo de adquirir una bacteria resistente a antibióticos, y es que la administración de antibióticos a nuestras mascotas favorece el desarrollo de cepas resistentes, las cuales pueden ser transmitidas a sus dueños (Simpson et al., 2018). Por suerte, los estudios realizados sobre Salmonella en perros y gatos muestran una baja prevalencia de la bacteria en estas mascotas, lo que sugiere una baja tasa de transmisión hacia sus dueños y otros animales (Lowden et al., 2015; Reimschuessel et al., 2017). Introducción 60 No obstante, en los últimos años ha aumentado la tenencia de especies exóticas como mascotas. Especies como los conejos, hurones, erizos, cobayas y petauros pueden también ser portadores de Salmonella y transmitir la bacteria a sus dueños (Woodward et al., 1997; Pignon y Mayer, 2011; Robertson et al., 2018). Uno de los grupos de mascotas más asociados a brotes de salmonelosis es el de los reptiles. Salmonella también forma parte de la microbiota intestinal de estos animales, y puede excretarse de manera continuada o intermitente, dependiendo de varios factores como por ejemplo el estrés de la cautividad o el manejo. Ya en 1963, Hersey y Mason describieron un caso de salmonelosis asociado al contacto con tortugas (Hersey y Mason, 1963). Sin embargo, el aumento en la tenencia de reptiles como mascotas en los últimos años ha provocado un incremento exponencial en los casos de salmonelosis asociada a estas especies, principalmente en niños (Gambino-Shirley et al., 2018). De la misma manera, las aves como mascotas representan también un riesgo en la transmisión de Salmonella, tanto a través del contacto, como a través de productos como egagrópilas, heces, y cualquier objeto susceptible de contaminarse (Grimes, 1987; Boseret et al., 2013). 1.1.6. Métodos de detección de Salmonella spp. Ante la sospecha de salmonelosis, las muestras recogidas para la detección del microorganismo pueden ser varias en función del cuadro clínico que presente el individuo. Generalmente, el diagnóstico se realiza a partir de una muestra de heces, aunque también se puede realizar a partir de tejidos, hisopados, sangre, alimentos contaminados, agua contaminada, etc. El aislamiento de Salmonella spp. a partir de otros órganos y sangre se considera una confirmación de septicemia (Quinn et al., 2002). Es importante tener en cuenta que la excreción de Salmonella en las heces no es constante, sino que se realiza de manera intermitente, sobre todo en fases subclínicas de la enfermedad. Por tanto, un resultado negativo no significa que el individuo no porte la bacteria. A fin de aumentar las posibilidades de un diagnóstico positivo, se recomienda en la medida de lo posible la recogida seriada de muestras fecales de, al menos, 3 días consecutivos (Ishola, 2009). Con el avance de las tecnologías, en la actualidad existen múltiples opciones para el diagnóstico de salmonelosis. El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, siendo al mismo tiempo sencillo, repetible, rápido y económico. Desafortunadamente, ningún método cumple con todos los criterios. De manera tradicional, se recurre al aislamiento mediante cultivo bacteriano seguido de la confirmación mediante pruebas bioquímicas, sin embargo, pueden observarse alteraciones en los medios de cultivo, así como en algunas pruebas bioquímicas, ya Introducción 61 sean provocados por la cepa bacteriana, o por el estado de los reactivos. Por esta razón es aconsejable apoyarse también en métodos serológicos (ELISA: Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay) y moleculares (PCR: Polymerase Chain Reaction), que ofrecen la capacidad de detectar pequeñas cantidades de Salmonella, aunque económicamente son más costosos (Ward et al., 2005). 1.1.6.1. Aislamiento mediante cultivo bacteriano Existe una gran variedad de medios de cultivo en los que se puede aislar Salmonella: medios de enriquecimiento con sustancias inhibidoras para microorganismos competitivos, medios de enriquecimiento y de cultivo generales, y medios de cultivo selectivos. El aislamiento mediante cultivo bacteriano se divide, generalmente, en tres etapas sucesivas: enriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo y siembra en placa con medios sólidos selectivos y diferenciales (Merk, 1994). 1. Pre-enriquecimiento no selectivo. El objetivo es la recuperación de las bacterias con daño subletal por las diferentes condiciones de tratamientos industriales y/o de almacenamiento, aumentando la calidad de la muestra. Para ello se emplean diferentes medios: agua de peptona, caldo lactosado, caldo nutritivo, etc. El más utilizado es el agua de peptona tamponada o BPW (Buffered Peptone Water) (Stanchi et al., 2007). 2. Enriquecimiento selectivo. Este segundo enriquecimiento tiene como finalidad inhibir el crecimiento de la microbiota acompañante, aumentando así la concentración de Salmonella. Existen diferentes opciones: 9 Caldo selenito: se trata de un caldo compuesto por agua de peptona como aporte nutritivo para el desarrollo bacteriano, lactosa como hidrato de carbono fermentable y selenito, cuya acción inhibe el crecimiento de bacterias intestinales a excepción de Salmonella, Proteus y Pseudomonas (Merk, 1994). 9 Caldo tetrationato: inhibe el desarrollo de coliformes y otras bacterias acompañantes, favoreciendo el de bacterias reductoras de tetrationato, como son Salmonella y Proteus. Además, contiene sales biliares que inhiben gran cantidad de microorganismos presentes en la microbiota intestinal (Palumbo y Alford, 1970). 9 Caldo Rappaport-Vassiliadis: presenta una baja concentración de verde malaquita, cloruro magnésico y harina de soja, lo que favorece la recuperación de Salmonella. Introducción 62 Además, la reducción del pH a 5,2 incrementa la selectividad, siendo un caldo con un rendimiento cercano al 100%, especialmente cuando se incuba a 41-43ºC (Van Schothorst et al., 1987). Existe además una modificación semi-sólida en placa (MSRV: Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis) que permite visualizar la expansión mediante desplazamiento de Salmonella por la placa tras su incubación. 3. Medios de cultivo selectivos y diferenciales (Figura 5). 9 Medios de cultivo selectivos. Presentan en su fórmula sustancias inhibidoras como antibióticos, colorantes, sales biliares, etc., que permiten seleccionar el crecimiento de ciertos microorganismos. Los más empleados permiten la rápida detección de bacterias no fermentadoras de lactosa, y contienen sales biliares como agentes inhibidores. o Agar MacConkey (McK): las sales biliares y el cristal violeta inhiben la proliferación de bacterias gram-positivas. Presenta además un indicador rojo que permite observar la degradación de la lactosa al ser fermentada. Así, las colonias latosa-positivas son rosadas con un halo turbio, mientras que las lactosa- negativas, como Salmonella, son incoloras (Stanchi et al., 2007). o Agar desoxicolato: el desoxicolato sódico inhibe el crecimiento de coliformes y gram-positivos. Las colonias de Salmonella son pequeñas, incoloras, elevadas y opacas, presentando en algunos casos un precipitado negro en el centro (Stanchi et al., 2007). o Agar eosina azul de metileno (EMB: eosin methylene blue): permite el crecimiento de enterobacterias patógenas. En su fórmula presenta lactosa y sacarosa, lo que permite diferenciar las bacterias en base a su capacidad para fermentarlos, y por el aspecto y color de sus colonias. Los colorantes empleados inhiben a su vez el crecimiento de gram-positivos. Las colonias de Salmonella se observan incoloras o de color ámbar (Bonnie, 2001). Introducción 63 Figura 5. Colonias compatibles con Salmonella en diferentes medios selectivos y diferenciales. De izquierda a derecha y de arriba a abajo: MacConkey, Desoxicolato, EMB, Hektoen, XLD, SS, Verde Brillante, XLT4® y ASAP®. Fuente: collage de elaboración propia montado con varias imágenes extraídas de diferentes proveedores. 9 Medios de cultivo diferenciales: permiten clasificar bioquímicamente las bacterias por su actividad metabólica. El crecimiento de la bacteria en el medio produce una variación del pH del medio o alguna actividad enzimática, modificando el aspecto del medio y/o de la colonia (Figura 5). Los más empleados son: o Agar Hektoen entérico: tiene sales biliares que producen un efecto supresor de la microbiota acompañante, aunque ejercen poca inhibición en Salmonella y Shigella. Presenta dos indicadores, el azul de bromotimol y la fucsina ácida, de manera que las colonias se distinguen macroscópicamente en base a la capacidad de fermentar lactosa. Las colonias de Salmonella producen ácido sulfhídrico que da un color negro con un halo transparente alrededor dando la imagen de “ojo de pescado” (Murray y Shea, 2004). o Agar xilosa-lisina-deoxicolato (XLD): el desoxicolato inhibe las bacterias coliformes, permitiendo el crecimiento de Proteus, que puede llegar a confundirse con las colonias de Salmonella. Al contrario que Shigella, Salmonella fermenta la xilosa y descarboxila la lisina, generando ácido sulfhídrico (Hurtado, 2001). Este proceso provoca un cambio de color del medio que pasa a ser amarillo. Además, las colonias de Salmonella presentan una precipitación de sulfuro de hierro que le da un color negro (Murray y Shea, 2004). o Agar Salmonella-Shigella® (SS): contiene sales biliares y verde brillante que inhiben el desarrollo de bacterias gram-positivas, coliformes y Proteus. Además, Introducción 64 presenta tiosulfato de sodio, de manera que Salmonella produce ácido sulfhídrico formando colonias translúcidas con el centro negro (Murray and Shea, 2004). o Verde brillante: se trata de un medio altamente selectivo para enterobacterias patógenas, a excepción de S. Typhi y S. Paratyphi. Presenta rojo de fenol como indicador de pH, de manera que al haber producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares el medio vira a amarillo. Las colonias de Salmonella se observan de color rosa, blanco o transparente sobre un fondo rojo (Murray y Shea, 2004). o Agar xilosa-lisina-tergitol (XLT4): se trata de un medio altamente selectivo que permite la diferenciación de Salmonella en base a la fermentación de la xilosa, lactosa y sucrosa, además de la descarboxilación de lisina y producción de sulfuro de hidrógeno. Las colonias de Salmonella productoras de H2S son amarillas con el centro negro, sin embargo, a medida que pasa el tiempo, las colonias se recubren por completo de pigmento negro y pueden tomas una tonalidad rosada hacia la periferia. Las colonias de Salmonella que no producen H2S son de color rosado amarillento (Pachón, 2009). o Agar ASAP® o BD CHROMagar Salmonella®: se trata de un medio cromogénico altamente selectivo que permite la diferenciación de las colonias de Salmonella en base a la actividad de la enzima C8-esterasa en el metabolismo de los azúcares. Las colonias de Salmonella se observan de color rosa-púrpura, mientras que las colonias de otros géneros son de color verde-azulado o incluso transparentes (Gaillot et al., 1999). A fin de estandarizar los estudios realizados en Salmonella, en 2003 la Organización Internacional de Normalización (ISO: International Organization for Standardization) publicó una norma ISO en la que se recomiendan los pasos a seguir para el aislamiento de la bacteria en el laboratorio. Posteriormente, se han ido haciendo revisiones del documento, así como pequeñas modificaciones. Actualmente la norma vigente para la detección de Salmonella es la ISO 6579-1:2017 en la que se detallan los pasos a seguir, que de manera resumida son los siguientes: 1. Pre-enriquecimiento de la muestra en agua de peptona tamponada durante 18±2 horas a una temperatura entre 34 y 38ºC. Introducción 65 2. Enriquecimiento en agar MSRV, en el que se inoculan 100 µL en tres gotas equidistantes. Las placas son incubadas durante 24-48 horas a 41,5±1ºC. 3. Aislamiento en dos medios selectivos de cultivo en placa: las colonias sospechosas de ser Salmonella serán sembradas en aislamiento en dos medios selectivos en simultáneo. Uno de los medios será el agar XLD, mientras que el segundo medio puede variar (ASAP, CHROMagar, XLT4…). 4. Siembra en masa de una única colonia compatible con Salmonella en un medio de cultivo nutritivo general. 5. Confirmación de Salmonella mediante pruebas bioquímicas. 6. Serotipificación de las cepas de Salmonella obtenidas. 1.1.6.2. Perfil bioquímico Para obtener una confirmación final del diagnóstico de Salmonella, las colonias sospechosas observadas en los cultivos diferenciales deben someterse a diferentes pruebas bioquímicas, seleccionadas en base a su capacidad discriminativa. Generalmente, dichas pruebas se realizan en una serie de medios específicos que permiten una clara visualización de los resultados (Pachón, 2009). Existe una gran variedad de pruebas bioquímicas disponibles: producción de indol, rojo de metilo, triple azúcar hierro o TSI (Triple Sugar Iron), el citrato de Simons (CS), sulfito indol motilidad (SIM), hidrólisis de urea, desaminación de fenilalanina, descarboxilación de lisina, arginina y ornitina, hidrólisis de gelatina, utilización de malonato, Voges-Proskauer (VP), fermentación de glucosa con producción de ácido y gas, fermentación de lactosa, sacarosa, manitos, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa, maltosa, xilosa, trehalosa, celobiosa, eritritol, hidrólisis de esculina, fermentación de melibiosa, de arabitol, de glicerol, utilización de acetato, lipasa, ADNasa, transformación nitrato-nitrito, oxidasa y fermentación de manosa (Pachón, 2009). A continuación, se explican las pruebas más empleadas en la confirmación de Salmonella: 9 Triple azúcar hierro (TSI): esta prueba se basa en la fermentación de azúcares y producción de ácido sulfhídrico y gas. Se trata de un agar que contiene altas concentraciones de sacarosa y lactosa y una baja concentración de glucosa, además de rojo de fenol como indicador de pH. La confirmación de Salmonella se produce cuando Introducción 66 la reacción es alcalina/acido con producción de H2S, el cual precipita en el fondo del tubo con las sales de hierro dando un color negro (K/A H2S++) (Instituto Nacional de Salud, 2003). 9 Citrato de Simons (CS): el medio utilizado para esta prueba contiene fosfato sódico de amonio, fosfato monopotasio, sulfato magnésico, citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador de pH. La prueba se basa en la capacidad de los microorganismos para usar el citrato de sodio como fuente de carbono. De ser así, al extraer el nitrógeno del fosfato de amonio que contiene el medio, éste se alcaliniza virando de verde a azul, como ocurre en el caso de Salmonella (Farmer, 2003). 9 Producción de indol: el indol es uno de los componentes de la degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano producen indol, ácido pirúvico y amoniaco, dando lugar a la formación de un complejo rojo. Salmonella no tiene la capacidad de formar indol, por lo que no se produce ninguna reacción en el medio (MacFaddin, 2003). 9 Sulfito indol motilidad (SIM): esta prueba se realiza en un medio semisólido en el que se evalúan en simultáneo la capacidad de producción de indol, de H2S y la motilidad de los microorganismos. Las bacterias móviles provocan una turbidez homogénea del medio. La mayoría de las serovariedades de Salmonella son mótiles a excepción de S. Gallinarum (MacFaddin, 2003). 9 Hidrólisis de urea: mediante la enzima ureasa, los microorganismos transforman la urea liberando moléculas de amoniaco al medio, el cual se alcaliniza cambiado el color gracias al indicador de pH. Salmonella no tiene capacidad de hidrolizar la urea, por lo que no se observa reacción ninguna. Esta prueba es vital en la diferenciación de Salmonella y Proteus (MacFaddin, 2003). Existen técnicas automatizadas y kits comerciales de identificación de microorganismos que se basan en la realización de determinadas pruebas bioquímicas en simultáneo, como por ejemplo las tiras API 20E (Analitical Profile Index), las cuales en 24 horas dan el resultado. Otros sistemas más avanzados pueden dar el resultado en apenas 18 horas o menos, como el Vitek (BioMerieux®). El perfil bioquímico de Salmonella es estable para la mayoría de las serovariedades, observando los siguientes resultados en las pruebas bioquímicas (Tabla1) (Terragno et al., 2003). Introducción 67 Tabla 1. Perfil bioquímico general del género Salmonella (Terragno et al., 2003). Prueba Resultado Prueba Resultado Prueba Resultado Oxidasa - Ureasa - SIM + Catalasa + VP - LOD + Sacarosa - Rojo de metilo + Producción H2S + Indol - CS + TSI K/A H2S++ VP: Voges-Proskauer; CS: Citrato de Simmons; SIM: sulfito indol motilidad; LOD: lisina-ornitina- descarboxilasa; TSI: triple azúcar hierro (triple sugar iron); +: 90% o más de resultados positivos, -: 90% o más de resultados negativos Sin embargo, existen ciertas diferencias bioquímicas entre diferentes subespecies que se muestran en la Tabla 2 (Le Minor et al., 1982:1986). Tabla 2. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp. (Le Minor et al., 1982:1986). PRUEBAS BIOQUÍMICAS Salmonella enterica Salmonella bongori (V) subsp. enterica (I) subsp. salamae (II) subsp. arizonae (IIIa) subsp. diarizonae (IIIb) subsp. houtenae (IV) subsp. indica (VI) Dulcitol + + - - - D + ONPG - - + + - D + Malonato - + + + - - - Gelatinasa - + + + + + - Sorbitol + + + + + - + KCN - - - - + - + L(+)-tartrato + - - - - - - Mucato + + + - (70%) - + + Salicina - - - - + - - Lactosa - - - (75%) + (75%) - D - +: 90% o más de resultados positivos, -: 90% o más de resultados negativos, D: diferentes reacciones Introducción 68 1.1.6.3. Serotipificación El género Salmonella contiene más de 2500 serotipos diferentes, entre los cuales encontramos serotipos específicos de hospedador y serotipos no específicos, serotipos zoonóticos y serotipos comensales, oportunistas y patógenos. Es por esta razón, por la que es de vital importancia la serotipificación de las cepas obtenidas de Salmonella. A través de ella se obtiene información crucial para la realización de estudios epidemiológicos sobre los brotes de salmonelosis, sobre todo de cara a establecer las vías de transmisión y posibles fuentes de infección (Terragno et al., 2003). Los serotipos de Salmonella se clasifican en base a las diferencias en sus antígenos somáticos (O), flagelares (H) y de virulencia (Vi). Estos antígenos generalmente se identifican mediante el uso de anticuerpos monovalentes y polivalentes, disponibles comercialmente, en pruebas de aglutinación en lámina. Primero se identifican los antígenos O, usando antisueros contra los grupos del O1 al O67, para después probar el antisuero Vi y por último usar los antisueros contra los antígenos H (Jawetz et al., 2014). La identificación de los serotipos sobre la combinación antigénica está dada en el “Esquema Le Minor-Kauffmann-White”, el cual está publicado por el Centro Colaborador de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de Referencia e Investigación de Salmonella del Instituto Pasteur en París (Grimont y Weill, 2007). 1.1.6.4. Fagotipificación Esta técnica se basa en la capacidad de los virus (fagos) para infectar a las bacterias y destruirlas, produciendo zonas de lisis visibles a simple vista sobre placas de agar en las que ha habido un crecimiento previo de dicha bacteria. Se trata de un virus con una alta especificidad, de manera que cada fago es capaz de infectar únicamente a una determinada cepa de una determinada bacteria o a cepas muy similares incluidas en un mismo grupo o fagogrupo (Pedraza et al., 2014). En el caso de Salmonella, esta técnica se ha utilizado para tipificar las cepas, siendo el fagotipo o lisotipo de gran valor en el estudio epidemiológico de este género bacteriano, pues se ha descrito un alto grado de correlación entre el fagotipo y el origen epidémico (Rabsch et al., 2002). Por ello, se utiliza en los laboratorios de referencia como marcador epidemiológico secundario. Además, determinados fagotipos se han asociado a determinadas características, como por ejemplo, la multirresistencia a antimicrobianos o la capacidad invasiva de la cepa. Introducción 69 Hasta el momento, se han descrito esquemas de fagotipificación para algunas serovariedades de Salmonella: Typhi, Paratyphi A y B, Typhimurium y Enteritidis. Además, se han desarrollado esquemas para otros serotipos de importancia clínica y epidemiológica como Newport o Virchow, entre otros (Petrow et al., 1974; Chambers et al., 1987). Pese a facilitar una información de gran interés epidemiológico, se trata de una técnica muy laboriosa que requiere una amplia fagoteca cuyo acceso se encuentra muy limitado. Además, multitud de mecanismos pueden producir cambios en el fagotipo y no todas las cepas pueden ser caracterizadas. 1.1.6.5. Métodos de tipificación genotípica La serotipificación y fagotipificación son métodos fenotípicos que proporcionan una información epidemiológica de gran relevancia, sin embargo, en ocasiones se necesitan métodos que permitan diferencias cepas fenotípicamente idénticas o muy similares. En estos casos, se usan métodos de tipificación genotípica, los cuales tienen un poder de discriminación mayor y son relativamente reproducibles. Dentro de los métodos descritos, los más utilizados son: perfil plasmídico, patrones de restricción cromosómica mediante electroforesis de campo constante (RFLP: Restiction Fragment Length Polymorphism) o en campo pulsado (PFGE: Pulsed-Field Gel Electrophoresis), revelado de fragmentos específicos mediante hibridación con sondas genéricas (por ejemplo: ribotipado) y métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como son la amplificación aleatoria de ácido desoxirribonucleico (ADN) polimórfico (RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA) o la detección de polimorfismos en secuencias repetidas en tándem (MLVA: Multiple Loci VNTR analysis). Un estudio realizado en 2009 por la EFSA muestra que la PFGE es la técnica más utilizada para la tipificación molecular de Salmonella en los laboratorios de referencia (EFSA, 2009). 1.1.7. Programas de control y prevención de salmonelosis Existen numerosos programas de control nacionales e internacionales de Salmonella con vistas a proteger al consumidor. En la Unión Europea está vigente la Directiva de Zoonosis 2003/99/EC sobre la vigilancia de las zoonosis y los agentes zoonóticos, así como el Reglamento CE 2160/2003 sobre el control de Salmonella y otros agentes zoonóticos específicos transmitidos por los alimentos (European Community, 2003; BOE, 2003). Ambos establecen la adopción de medidas eficaces para la detección y control de la presencia de Salmonella en todas las etapas Introducción 70 de la producción de alimentos, a fin de disminuir su prevalencia y, por tanto, el riesgo que supone para la salud pública. En consecuencia, en 2007 arrancó en España el primer Programa Nacional de Control de la Salmonella en gallinas reproductoras tanto en explotaciones avícolas de puesta como de carne regido por el Reglamento CE 1168/2006. En la actualidad, la vigilancia de Salmonella se establece a través de varios sistemas: el sistema de brotes, el sistema de información microbiológica y el laboratorio nacional de referencia de Salmonella y Shigella. Los dos primeros son sistemas básicos de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica, gestionada por el Centro Nacional de Epidemiología (BOE, 2006). En casos leves o moderados de salmonelosis, el tratamiento antimicrobiano está desaconsejado para evitar el desarrollo de resistencias a antimicrobianos y multiplicación de las cepas resistentes. En casos graves, el tratamiento de elección es sintomático, centrado en la reposición de fluidos y electrolitos para paliar el estado de deshidratación. En caso de riesgo de septicemia o en grupos de riesgo (lactantes, ancianos y pacientes inmunodeprimidos) es necesaria la antibioterapia, la cual debe basarse en un antibiograma previo. Los antibióticos de elección son las penicilinas y las fluoroquinolonas, mientras que en casos de cepas resistentes se han utilizado tetraciclinas y sulfamidas con éxito (EFSA, 2019). La prevención en la transmisión e infección por esta bacteria se basa en múltiples medidas de control a lo largo de toda la cadena alimentaria, desde la producción agrícola hasta la manipulación y elaboración final de alimentos en establecimientos comerciales y hogares. Las principales medidas de control son (WHO, 2018): x La educación en higiene alimentaria para manipuladores de alimentos, haciendo especial hincapié en el correcto lavado de manos antes, durante y después de la manipulación, así como en la refrigeración adecuada de los alimentos. x La exclusión de personas enfermas en la manipulación de alimentos y del cuidado de pacientes hospitalizados. x El establecimiento de programas de control de Salmonella: control de alimentos, limpieza y desinfección de útiles y superficies, control de vectores y otras medidas sanitarias e higiénicas. Por otro lado, para evitar la transmisión de Salmonella a partir de mascotas infectadas o portadoras, se recomienda respetar las medidas básicas de higiene y supervisar el contacto entre niños y mascotas (Simón-Viván et al., 2012). Introducción 71 1.2. Resistencias a antimicrobianos 1.2.1. Definición y desarrollo de resistencias La resistencia a antimicrobianos (AMR: antimicrobial resistance) se define como la capacidad de una determinada cepa bacteriana para sobrevivir o incluso multiplicarse en presencia de una concentración dada de un antimicrobiano. Se trata por tanto de un proceso evolutivo en las bacterias a fin de sobrevivir ante un medio ambiente hostil (Oteo-Iglesias, 2016). Los mecanismos de resistencia frente a antimicrobianos de las bacterias son fundamentalmente tres (Oteo-Iglesias, 2016): 9 Inactivación del antimicrobiano mediante la producción de enzimas, como por ejemplo las betalactamasas. 9 Modificaciones bacterianas que impiden la acción del antimicrobiano sobre la estructura diana, como por ejemplo mutaciones en la pared celular que impiden el acceso del antimicrobiano a la bacteria o en el sistema de transporte. Incluso pueden producirse modificaciones que provoquen la expulsión activa de la molécula. 9 Alteración por parte de la bacteria de su estructura diana, impidiendo la acción de la molécula antimicrobiana. Una misma bacteria puede desarrollar varios mecanismos de resistencia frente a uno o varios antimicrobianos, del mismo modo que un antimicrobiano puede ser inactivado por diferentes mecanismos de diferentes especies bacterianas (Daza, 1998). Por otro lado, existen dos tipos de resistencias: la natural o intrínseca y la adquirida. La resistencia intrínseca es una propiedad específica de esa especie bacteriana que le ofrece ventajas competitivas respecto a las demás especies bacterianas. Generalmente se debe a la ausencia de la estructura diana sobre la que actúan los antimicrobianos, como por ejemplo la falta de pared en el Mycoplasma en relación a los betalactámicos. Se trata de una propiedad anterior a la exposición al antimicrobiano. Así lo demuestran algunas bacterias encontradas en fósiles glaciares de las regiones árticas de Canadá de más de 2000 años de edad (Hart, 1998). Hay que tener en cuenta, además, que existen microorganismos productores de moléculas antimicrobianas, por ejemplo, Bacillius polymyxa que produce la polimixina B. Dichas especies son por definición resistentes a las moléculas antimicrobianas que producen. Introducción 72 La resistencia adquirida, en cambio, surge a partir de mutaciones en el material genético de las bacterias a nivel individual, lo que constituye un serio problema para la medicina occidental. Este tipo de resistencia puede adquirirse a través de diferentes vías (Oteo-Iglesias, 2016): 9 Mutación cromosómica: generalmente se origina a partir del contacto de la bacteria con el antimicrobiano en cuestión. 9 Transmisión vertical: el material genético que codifica la resistencia es transmitido de generación en generación mediante la división celular mitótica. 9 Transmisión horizontal: el material genético que codifica la resistencia se transfiere a otras bacterias cercanas, que pueden ser de la misma especie o no, a través de plásmidos, transposones o integrones. o Plásmidos: son moléculas genéticas extracromosomales de pequeño tamaño, que tienen replicación independiente del cromosoma, por lo que también se les llama replicones. Existen diferentes tipos de plásmidos, como los integrativos, que pueden integrarse en el cromosoma bacteriano, o los conjugativos, que codifican pili cuya función es la transferencia de los plásmidos de unas bacterias a otras. o Transposones: son grupos de genes capaces de moverse de manera autosuficiente dentro del genoma de una célula. Existen transposones simples o de inserción, que únicamente contienen los genes necesarios para la propia transposición, y compuestos, que además de dichos genes contienen genes específicos como los de resistencia a antimicrobianos. Estos transposones además pueden provocar mutaciones al moverse de un lugar a otro en el cromosoma o entre dos cromosomas diferentes, por lo que también reciben el nombre de “genes saltarines” (Sánchez et al., 2012). o Integrones: son una familia de elementos genéticos potencialmente móviles, capaces de integrar y expresar genes de resistencia a los antibióticos. No son capaces de realizar autotransposición, pero suelen asociarse a secuencias de inserción, transposones o plásmidos conjugativos que sirven de vehículos (González et al., 2004). Mediante recombinación genética, un fragmento de ADN exógeno puede integrarse en el genoma de una célula receptora. Así es como las bacterias pueden incorporar en su genoma genes de resistencia a antimicrobianos sin siquiera haber estado en contacto Introducción 73 con éstos. Existen tres mecanismos a través de los cuales puede producirse (Tran y Jacoby, 2002; Tortora et al., 2007): a. Transformación genética: el ADN libre se incorpora a la célula receptora y si ésta es “competente” se producirá un cambio genético. Sin embargo, muy pocas cepas bacterianas son competentes por lo que es el mecanismo menos común de transferencia de resistencias (Figura 6). Figura 6. Transformación genética. Fuente: adaptado de Tortora et al. (2007). b. Transducción: el ADN es transferido de una célula a otra utilizando un virus bacteriófago como vehículo. El bacteriófago tiene la capacidad de incorporar su ácido nucleico al de la bacteria, replicándose conjuntamente bajo el nombre de profago. Cuando el fago provoca la lisis de la bacteria, las partículas de ADN bacteriano incorporado al genoma viral pueden pasar a la siguiente bacteria que sea infectada por ese fago (Figura 7). Figura 7. Transducción. Fuente: adaptado de Tortora et al. (2007). c. Conjugación: es una transferencia de material genético de célula a célula por contacto directo, mediante puentes de unión. El material transferido puede ser un plásmido, un transposón o un integrón. Se trata del mecanismo más efectivo en la transmisión de resistencias (Figura 8). Introducción 74 Figura 8. Conjugación bacteriana. Fuente: adaptado de Tortora et al. (2007). 1.2.2. Problemática y salud pública La resistencia a antimicrobianos es un proceso inevitable de la evolución bacteriana causado por el consumo de antibióticos. Desde el descubrimiento de la penicilina en 1928 por el doctor Alexander Fleming, el uso de los antibióticos se ha extendido por todo el mundo siendo uno de los pilares fundamentes de la medicina occidental (Bennet y Chung, 2001). A lo largo del siglo XIX se han aislado diferentes moléculas antimicrobianas con multitud de mecanismos de acción, que se han ido clasificado en diferentes familias en base a su origen, el cual podía ser natural (a partir de un hongo o una bacteria) o sintético. Así, los antimicrobianos se han utilizado en el tratamiento tanto de personas como de animales desde su descubrimiento. Aunque hoy en día ya está totalmente prohibido en Europa la administración de antibióticos de forma profiláctica, durante muchos años los antibióticos se utilizaron en dosis subterapéutica en explotaciones de producción animal como promotores del crecimiento. La administración de estos antibióticos de forma profiláctica, dificultaba la infección de los animales por microorganismos patógenos y elevaba los parámetros productivos de los mismos. Sin embargo, esta práctica se prohibió en el año 2006, ya que de la misma manera que se aumentaban los parámetros productivos de los animales, también se provocaba un aumento paulatino de las resistencias a los antimicrobianos utilizados (Ovejero, 2017) (Figura 9). El desarrollo de nuevas moléculas antimicrobianas se ha ralentizado drásticamente en los últimos años, mientras que las resistencias han aumentado exponencialmente en cuanto a (Muñoz, 2017): 9 La velocidad a la que diseminan las resistencias por multiplicación bacteriana y por mecanismos de transferencia a otras bacterias. Por ejemplo, el porcentaje de cepas de E. coli resistente a cefalosporinas de tercera generación pasó de estar en 10-25% en 2011 a estar en 25-50% en tan sólo cinco años. Introducción 75 9 El número de antibióticos a los que es resistente una cepa bacteriana, o lo que es lo mismo el desarrollo de multirresistencias. Cuando una bacteria es resistente a un antibiótico tiene mayor probabilidad de adquirir otras resistencias, convirtiéndose en multirresistente. En 2016, el porcentaje de cepas multirresistentes de Klebsiella pneumoniae se encontraba en 25-50%. 9 La velocidad de desarrollo de nuevos mecanismos de resistencia a antimicrobianos, como por ejemplo el gen NDM-1 que codifica resistencia a beta-lactámicos, incluyendo el carbapenem. 9 Aparición de resistencias a antibióticos de última generación y de último recurso. Por ejemplo, el porcentaje de cepas de Acinetobacter spp. resistente a cabapenemes en 2016 era superior al 50%. Figura 9. Cronograma que muestra el tiempo transcurrido entre el descubrimiento de diversos antimicrobianos y la detección de resistencias frente a ellos. Fuente: Plan Nacional de Resistencia frente a Antimicrobianos (PRAN). Introducción 76 A día de hoy, se trata de un fenómeno creciente con graves implicaciones socio-económicas, lo que lo convierte en un problema de salud pública prioritario en todo el mundo. Se calcula que las resistencias a antimicrobianos son causa directa o indirecta de cerca de 700.000 muertes al año en todo el mundo, de las cuales cerca de 37.000 se producen en Europa según las últimas publicaciones del Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades (ECDC: European Centre of Disease Prevention and Control). En cuanto al coste económico que implica, teniendo en cuenta tanto los gastos directos (aislamiento de patógenos, detección de resistencias, fallos terapéuticos, etc.) como los indirectos (pérdidas en producción animal, investigación y desarrollo, etc.) superan anualmente los 7.000 millones de dólares gasto anual (Armbruster y Roberts, 2018). En 2014 Jim O’Neill, economista británico, realizó una estimación sobre la magnitud del problema de las resistencias y sus repercusiones socio-económicas en el futuro. Sus resultados muestran que en el año 2050 cerca de 10 millones de muertes anuales serán a causa de las resistencias, superando con creces las muertes producidas por el cáncer (O’Neill, 2014) (Figura 10). Figura 10. Principales causas de muerte y estimaciones de número de bajas que causarán en 2050. Fuente: O’Neil, 2014. Introducción 77 Por otro lado, el problema de la resistencia, y en particular la multirresistencia entre los bacilos gram-negativos, es especialmente preocupante, ya que se ha descrito la detección de resistencias a la práctica totalidad de los antibióticos, limitando de esta manera las opciones terapéuticas de las infecciones que producen. Ante esta situación, ha sido necesaria la recuperación de antiguos antibióticos que aún mantienen cierta actividad frente a estos microorganismos como es la colistina (Ruiz-Garbajosa y Cantón, 2016). La colistina es una polimixina aislada a partir del organismo Paenibacillus polymyxa, la cual ha sido ampliamente utilizada en veterinaria como profilaxis/metafilaxis y promotor de crecimiento, mientras que su uso en humanos ha estado muy restringido debido a la neuro- y nefrotoxicidad que produce (Rebelo et al., 2018). Por ello se considera un antibiótico de último recurso frente a enterobacterias multirresistentes, y en la actualidad su uso en veterinaria está restringido a fin de evitar el desarrollo de resistencias frente a colistina. Sin embargo, diversos estudios muestran la existencia de cepas resistentes a colistina a través del gen mcr-1, el cual además es transferible aumentando drásticamente el riesgo para la diseminación de dicha resistencia y limitando aún más las opciones terapéuticas (Ruiz-Garbajosa y Cantón, 2016). 1.2.3. Salmonella resistente a antimicrobianos A mitad de los años 60 empezaron a detectarse con cierta frecuencia cepas de S. Typhimurium resistentes a antimicrobianos, y particularmente multirresistentes a cuatro o más antimicrobianos. Desde la década de los 90 se ha descrito en numerosos países una alta tasa de cepas de Salmonella multirresistentes a diferentes antimicrobianos (Jurado-Tarifa, 2016). Por esta razón se ha establecido una categoría de antimicrobianos conocida como “Antimicrobianos Críticamente Importantes” (CIA: Critically Important Antimicrobials), constituida por ciprofloxacina y cefotaxime, aquellos de elección frente a salmonelosis graves en adultos y niños, respectivamente. También incluye la tigeciclina, antimicrobiano de segunda línea para el tratamiento de esta patología, y la colistina, la cual representa el último recurso en medicina humana para los casos más graves de salmonelosis (EFSA y ECDC, 2019). En 2017, el 21,3% de las cepas de Salmonella aisladas de muestras de humanos resultaron ser resistentes al menos a un antimicrobiano, de las cuales el 28,6% fueron multirresistentes. El serovar mST resultó tener la mayor tasa de multirresistencia (81,4%). Los antimicrobianos más afectados fueron las sulfonamidas (32,8%), tetraciclinas (30,2%) y ampicilina (27,5%), seguidos de las fluoroquinolonas (13%). Por otro lado, la resistencia frente a cefalosporinas de tercera generación apenas llega al 2%. En un 0,9% de las cepas se observó una combinación de Introducción 78 resistencia frente a ciprofloxacina y cefotaxime. Finalmente, se detectó también un 4,7% de resistencia frente a colistina, dentro de la cual el 88,9% de las cepas pertenecían a los serotipos Enteritidis y Dublin, los cuales han resultado ser los que presentan mayor tolerancia intrínseca a la colistina (EFSA y ECDC, 2019). Ambos serotipos presentan la misma fórmula de antígeno O, por lo que se cree que dicha tolerancia a la colistina se debe al LPS (Agerso et al., 2012). Por tanto, existe una clara influencia del serovar en el desarrollo o adquisición de resistencias en el caso de Salmonella. También se han aislado cepas resistentes de Salmonella en producción animal, observando hasta un 51,3% de multirresistencia en porcino y un 29,5% en vacuno de la Unión Europea en 2017. En producción porcina se ha descrito una alta resistencia frente a tetraciclina, sulfametoxazol y ampicilina en las cepas de Salmonella, hasta un 76% en algunos estados miembro, seguidos de trimetoprim (20,7%), cloranfenicol (14,6%), ácido nalidíxico (10,3%) y ciprofloxacino (6,3%). Apenas se observó resistencia frente a gentamicina, azitromicina, meropenem, tigeciclina, observando resistencia frente a este último antibiótico únicamente en cuatro de los estados miembros. La resistencia observada frente a tigeciclina en producción porcina se ha asociado al serovar Typhimurium principalmente, y casi siempre en combinación con resistencia frente a otros antimicrobianos (ampicilina, sulfametoxazol, trimetoprim y tetraciclina). El porcentaje de resistencia frente a colistina obtenido fue inferior al 2%, no estando asociado a un serotipo concreto. En cuanto a las cefalosporinas de tercera generación, únicamente se observó resistencia en España e Italia en una proporción muy baja, detectando, además, cepas con resistencia combinada frente a cefotaxime y ciprofloxacino. Al igual que en humanos, los serotipos con mayor tasa de multirresistencia fueron mST (78%) y Typhimurium (62,2%). En España, cerca del 90% de las cepas de Salmonella aisladas en producción porcina en 2017 presentaron resistencia frente al menos a un antimicrobiano. Sin embargo, en comparación con años anteriores, la tendencia es a la baja (EFSA y ECDC, 2019). Aunque en menor proporción, las resistencias encontradas en las cepas aisladas de ganado vacuno siguen la misma tendencia frente a ampicilina, sulfametoxazol, tetraciclina, trimetoprim, cloranfenicol, ácido nalidíxico y ciprofloxacino. La resistencia obtenida frente a colistina fue de cerca del 14% en ganado vacuno, estando asociada en todos los casos al serotipo Dublin. En este caso, no se detectaron resistencias frente a cefalosporinas de tercera generación, meropenem o tigeciclina, y el único país que detectó resistencia frente a colistina en ganado vacuno fue Dinamarca (EFSA y ECDC, 2019). Introducción 79 En cuanto a la producción avícola, los últimos datos publicados en la Unión Europea pertenecen a muestras recogidas y procesadas durante el año 2016. Ese año se detectó un alto porcentaje de resistencia frente a fluoroquinolonas (63,1%), sulfametoxazol (55,6%) y tetraciclina (46,1%) en carne de broiler, seguidos de ampicilina (19,7%) y trimetoprim (14,8%). Tanto en gallinas ponedoras como en pavo se observó la misma tendencia, sin embargo, los porcentajes resultaron moderadamente más bajos. Apenas se detectaron resistencias frente a cefalosporinas de tercera generación, excepto en Portugal, país en el que se obtuvo un 39,4% de resistencia frente a este grupo de antimicrobianos. El porcentaje de resistencia combinada frente a ciprofloxacino y cefotaxime en dicho país fue del 33,3%, mientas que en el resto de la Unión Europea fue de únicamente el 2,2%. La tasa de resistencia frente a tigeciclina fue de 1,9% en broiler y 0,2% en gallina ponedora, existiendo una fuerte asociación al serotipo Infantis, el más aislado en avicultura ese año. La resistencia a colistina observada fue similar a la de tigeciclina, existiendo una fuerte asociación en este caso a los serovares Dublin y Enteritidis, los cuales ya se ha mencionado presentan una cierta tolerancia intrínseca frente a este antimicrobiano. En general, la tasa de multirresistencia fue del 50,3% de las cepas resistentes aisladas. Concretamente, más del 70% de las cepas de S. Infantis mostraron multirresistencia, cuando casi la totalidad de las cepas aisladas de ese serovar presentaban resistencia al menos a un antimicrobiano (94,4%). En cambio, S. Enteritidis apenas mostró un 10,6% de multirresistencia en broiler, y un 33,1% en gallina ponedora. A pesar de ello, S. Enteritidis fue el serovar con mayor tasa de resistencia frente a colistina (EFSA y ECDC, 2018). 1.2.4. Métodos de detección de resistencias a antimicrobianos Existen diferentes test de susceptibilidad a antimicrobianos. Los más utilizados hasta ahora han sido aquellos de tipo fenotípico, basados en el cultivo bacteriológico. Para ello, siempre se debe tener un cultivo monoclonal previamente aislado en medio sólido de la bacteria a estudiar, a partir del cual se realiza una suspensión bacteriana estandarizada (inóculo). A fin de que la técnica sea válida, el inóculo debe contener una concentración determinada de unidades formadoras de colonias o UFC (104 UFC). Sin embargo, una suspensión con 104 UFC apenas produce turbidez, por lo que se prepara una suspensión de 108 UFC, que produce una turbidez de 0.5 MacFarland, y finalmente se diluye 1:10 para obtener el inóculo final (Cantón et al., 2000). Para la correcta realización del test se ha estandarizado el protocolo a nivel internacional, de manera que se puedan comparar los resultados entre diferentes laboratorios. El resultado depende del medio de cultivo elegido, su pH y composición, la concentración de antimicrobiano Introducción 80 utilizada, la temperatura y atmósfera de incubación, la velocidad de crecimiento bacteriano, el tamaño del inóculo, etc. (Pasteran et al., 2003). A fin de minimizar todas las posibles variaciones, se utiliza por norma general el medio de cultivo Mueller-Hinton, ya que se encuentra estandarizado para la gran mayoría de bacterias y tiene una serie de cualidades que lo convierte en el medio de elección (Malbrán, 2012): 9 La reproductibilidad de los resultados de sensibilidad a antimicrobianos entre distintos lotes es muy alta. 9 Apenas presenta inhibidores para la acción de ciertos antimicrobianos, como las sulfonamidas o las tetraciclinas. 9 Permite un buen crecimiento de la mayoría de bacterias. 9 Existe gran cantidad de información y datos sobre este medio en test de sensibilidad. En general podemos hablar de dos grandes grupos de test de susceptibilidad a antimicrobianos: los métodos por difusión y los métodos por dilución. Cada uno de ellos tiene su protocolo estandarizado. A continuación, se describen de manera resumida: 9 Difusión disco-placa: sobre una placa de agar Mueller-Hinton, con ayuda de un hisopo estéril, se extiende el inóculo de la bacteria a estudiar por toda la superficie. A continuación, se depositan una serie de discos de papel secante, cada uno de ellos impregnado en un antimicrobiano concreto. Al entrar en contacto el disco con el agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar, actuando sobre la bacteria. Tras 24 horas de incubación a 37ºC se observa el efecto de los antimicrobianos sobre la bacteria inoculada. Gracias a las guías desarrolladas por el CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), se puede determinar si la bacteria es resistente o sensible a cada antimicrobiano en función del diámetro del halo de inhibición obtenido (Figura 11). Se trata de un método rápido, sencillo y barato, de gran utilidad en la clínica diaria, estandarizado por Kirby-Bauer. Sin embargo, al no ser cuantitativo, no es muy útil para estudios epidemiológicos (Hudzicki, 2009; Bayot y Bragg, 2019). Introducción 81 Figura 11. Test de sensibilidad a antimicrobianos con el método de difusión disco-placa (izquierda) y con el método de difusión E-test (derecha). Fuentes: imagen propia y Biomérieux® España, respectivamente. o Epsilon-test o E-test: se trata de una variante del método anterior que permite la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI), siendo por tanto un método cuantitativo. El protocolo es similar, pero en lugar de utilizar discos de papel secante impregnados en antimicrobiano, se utilizan unas tiras de plástico no poroso que presentan un gradiente predefinido de antimicrobiano, el cual equivale a unas 15 diluciones. Tras 24 horas de incubación a 37ºC, la CMI será el valor obtenido en el punto de intersección entre el halo de inhibición y la tira (Figura 11) (García, 2011). 9 Macrodilución en placas/tubos: cada tubo se añade una cantidad estándar de caldo Mueller-Hinton con una concentración específica de antimicrobiano, el cual se ha añadido previamente, y sobre el agar ya solidificado se inocula el agente. Tras 24 horas de incubación a 37ºC se observa el crecimiento o la ausencia del mismo de la bacteria en cada uno de los tubos. De esta manera se obtiene la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cada antimicrobiano para esa cepa bacteriana. A fin de comprobar si la cepa es resistente o sensible al antibiótico, existe una serie de guías desarrolladas por el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST: European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing) en las que se indican los puntos de corte para cada especie bacteriana y antimicrobiano (Cantón et al., 2000; Bayot y Bragg, 2019). o Macrodilución en caldo: la técnica es muy similar, pero como medio de cultivo se utiliza caldo Mueller-Hinton en lugar de agar. o Microtitulación en pocillos: se trata de una variante del método anterior. La técnica es similar, sin embargo, se realiza en placas de microtitulación de 96 Introducción 82 pocillos. En cada uno debe quedar un volumen final de 100 µL de caldo Mueller- Hinton e inóculo (Figura 12). Éste es uno de los métodos más empleados en la actualidad, y las placas pueden prepararse en el laboratorio o comprarse paneles comerciales que ya contienen las diluciones de antimicrobiano en cada pocillo (Cantón et al., 2000; Bayot y Bragg, 2019). Figura 12. Test de susceptibilidad a antimicrobianos con el método de microtitulación en caldo Mueller-Hinton. Fuente: imagen propia. La elección de los antimicrobianos que incluiremos en el test de sensibilidad depende del objetivo, así como de la situación en cuanto a desarrollo de resistencias en el espacio y tiempo. Existen una serie de recomendaciones de múltiples organismos nacionales, como el grupo MENSURA (Mesa Española para la Normalización de la Susceptibilidad y Resistencia a Antimicrobianos) y el PRAN (Plan Nacional frente a la Resistencia a los Antibióticos) e internacionales, como el NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards Suggest), la FDA (Food and Drug Administration), o la EFSA. De manera general se incluye al menos un antimicrobiano de cada familia, además de los antimicrobianos clave en el control de la especie o género bacteriano de estudio. Los antimicrobianos incluidos deben resultar de utilidad para el estudio tanto clínico como epidemiológico de la bacteria. Por tanto, hay que tener en cuenta la eficacia clínica, prevalencia de resistencia, coste, indicaciones de los organismos internacionales, y las recomendaciones de consenso para antimicrobianos de primera elección y alternativos (Pasteran et al., 2003). Los resultados obtenidos nos indicarán la categoría de la cepa bacteriana para cada antibiótico, existiendo tres opciones: sensible, resistente y de sensibilidad intermedia. La categoría de sensibilidad intermedia se aplica cuando una cepa tiene una sensibilidad disminuida frente a un antimicrobiano, pero un tratamiento a dosis altas puede resultar exitoso. Sin embargo, debe Introducción 83 valorarse la toxicidad del antimicrobiano en el organismo antes de pautar una dosis más alta. Por otro lado, dentro de la categoría de resistente, las cepas bacterianas pueden ser (Jiménez et al., 2019): 9 Resistente: simplemente muestra resistencia a un antimicrobiano, o a varios antimicrobianos de una única familia. 9 Multirresistente (MDR): cuando es resistente a varios antimicrobianos. Aunque no se ha estandarizado esta definición, por lo general se aplica a dos situaciones, según el criterio elegido. Numerosos autores definen una cepa multirresistente como una cepa resistente al menos a un antimicrobiano de dos familias diferentes (López-Pueyo et al., 2011; Alvarado y Xavier, 2016). Sin embargo, el ECDC, el Centro de Control y Prevención de Enfermedades Estadounidense (CDC: Center for Disease Control and Prevention) y la Red Latinoamericana de Vigilancia de la Resistencia a Antimicrobianos (ReLAVRA) son más restrictivos considerando una cepa multirresistente como aquella resistente al menos a un antimicrobiano de tres familias diferentes (Magiorakos et al., 2012; Jiménez Pearson et al., 2019). Además, algunos autores consideran que una cepa resistente al menos a un antimicrobiano clave debe considerarse multirresistente a fin de tener en cuenta su importancia epidemiológica en salud pública (Siegel et al., 2007). 9 Extremadamente resistente (XDR): el aislamiento bacteriano es resistente a todas las familias de antimicrobianos excepto a una o dos de ellas. Se clasifican en una categoría diferente a las multirresistentes debido a la alta probabilidad que tienen de ser resistentes a todos los antimicrobianos (Magiorakos et al., 2012). 9 Panresistente (PDR): se trata de una cepa bacteriana que es resistente a todos los antimicrobianos aprobados y comercializados para el tratamiento frente a esa bacteria. Por otro lado, en la actualidad se han desarrollado técnicas moleculares, como la PCR, mediante las cuales se puede analizar directamente la presencia de los diferentes genes que codifican resistencias a antimicrobianos en una determinada muestra sin necesidad de aislar previamente el patógeno. Por ello, es posible obtener resultados en menos tiempo que con los métodos fenotípicos, y por tanto establecer lo antes posible un tratamiento eficaz lo que puede derivar en una mayor probabilidad de éxito, acortando los plazos de recuperación del paciente (Felsenstein et al., 2016). Sin embargo, un resultado negativo en la detección de genes de resistencia no implica que dicha bacteria no sea resistente mediante otros mecanismos, por lo que se pueden dar falsos negativos. Además, pese a la rapidez con la que se obtienen resultados, los métodos fenotípicos siguen siendo los más empleados debido a su bajo coste y sencillez en Introducción 84 la metodología. Aun así, la información que proporcionan y la rapidez del método molecular es de gran interés, por lo que puede considerarse el perfecto complemento a los métodos fenotípicos tradicionales (Bard y Lee, 2018). 1.2.5. Planes de actuación contra el desarrollo de resistencias Prohibir el uso de un antimicrobiano no garantiza la disminución de las resistencias frente a él, debido a la alta permanencia de los genes de resistencia en el ambiente. Por tanto, es necesaria una intervención más amplia. En vista del aumento exponencial de la resistencia a antimicrobianos, así como del escaso número de nuevos antimicrobianos en desarrollo, la detección temprana y la monitorización de bacterias multirresistentes se convierte en una herramienta fundamental (Fernandes y Martens, 2017). Por otro lado, una vez aparecida una población bacteriana resistente a un antibiótico, ésta permanecerá en el ambiente diseminando la resistencia a mayor velocidad cuantos más antibióticos haya en el ambiente. Por tanto, resulta de vital importancia la vigilancia en el medio ambiente de genes de resistencia, así como de residuos de antibióticos. Para combatir el problema de la diseminación de resistencias ya existentes y frenar el desarrollo de nuevas, es necesario un abordaje multidisciplinar, así como medidas institucionales dirigidas a reducir dicha diseminación. Una de las principales medidas a tomar es la mejora en la detección de microorganismos multirresistentes, junto con el uso clínico racional de los antimicrobianos basado en el programa PRAN y similares. Dichas medidas deben realizarse conjuntamente en salud pública y sanidad animal para obtener el mejor resultado posible (Ruiz- Garbajosa y Cantón, 2016). En 2017, la Comisión Europea adoptó un nuevo plan de acción contra las resistencias a antimicrobianos basado en la premisa de One Health (EFSA y ECDC, 2019). Por ello, se ha organizado un enfoque multidisciplinar en el que colaboran diferentes instituciones nacionales e internacionales dedicadas a la salud pública, sanidad animal e higiene y control de los alimentos. Dicho plan pretende mejorar los métodos de detección y monitorización coordinando los diferentes planes de cada estado miembro, y ampliar los conocimientos sobre el desarrollo y la diseminación de las resistencias, promoviendo para ello la investigación, a fin de mejorar el diagnóstico clínico. Uno de los objetivos principales es reducir el consumo de antimicrobianos, tanto en humanos, como en animales, fomentando la estrategia vacunal en detrimento de la antibioterapia, y la mejora en los programas de higiene y bioseguridad. Además, este plan incluye una serie de acciones dirigidas a la sensibilización de la población, Introducción 85 como promover el uso prudente de los antimicrobianos, disminuyendo paulatinamente su consumo en la comunidad, y la correcta gestión de residuos de los antimicrobianos, por ejemplo, a través del punto SIGRE (Sistema Integrado de Gestión y Recogida de Envases) (EFSA y ECDC, 2019). A fin de garantizar un uso prudente de los antimicrobianos y maximizar de esa manera su eficacia, evitando el desarrollo de nuevas resistencias, se recomienda realizar un diagnóstico preciso y un test de sensibilidad de los microorganismos implicados antes de pautar un tratamiento. Además, en la elección del antimicrobiano se deberá tener en cuenta la categorización de los antimicrobianos (European Medicines Agency, 2020): 9 Categoría A: antibióticos no aprobados para su uso en medicina veterinaria en la Unión Europea. Incluyen: carbapenemes, cefalosporinas de última generación, glicopépticos y glicilciclinas. 9 Categoría B: son aquellos que deben ser utilizados como segunda elección en veterinaria y/o último recurso por ser críticamente importantes para la salud humana, ya que son la única terapia para tratar patologías graves. No deben utilizarse como primera elección a menos que su uso esté justificado. Incluye: cefalosporinas de tercera y cuarta generación, fluoroquinolonas, etc. 9 Categoría C: incluye antimicrobianos para los cuales hay una alternativa en medicina humana en la Unión Europea, pero sólo existen unas pocas alternativas aprobadas para determinadas patologías en medicina veterinaria. Estos antimicrobianos sólo deben usarse cuando los de la categoría D no son efectivos. 9 Categoría D: son aquellos que se usan de manera regular en veterinaria, siendo los de primera elección, pero que son críticamente importantes para la salud humana, lo que significa que el desarrollo y diseminación de resistencias frente a estos antimicrobianos representa un riesgo para la salud pública. No deben usarse como profilaxis/metafilaxis, ni para mejorar el rendimiento de la producción animal. Finalmente, se están investigando nuevas estrategias terapéuticas frente a las bacterias como el uso de enzibióticos, péptidos antimicrobianos, nanopartículas, bacteriófagos o inhibidores de la formación de biofilms. Introducción 86 1.3. Fauna silvestre 1.3.1. La fauna ibérica: biodiversidad y conservación La península Ibérica es una de las regiones con mayor biodiversidad de Europa, en gran parte debido a la posición geográfica que ocupa, así como a su orografía, que facilita la presencia de multitud de biotopos diferentes en las que albergar cientos de especies animales distintas. Sin tener en cuenta los invertebrados, la fauna ibérica cuenta cerca de 900 especies de animales, dentro de las cuales la clase más grande y representativa es la de las aves (Linaza y Viejo, 2007). La avifauna ibérica es una de las más ricas en Europa, contando con más de 500 especies descritas. Además, las condiciones climáticas, así como la diversidad en ecosistemas hacen de la península Ibérica una región ideal como corredor de migraciones. Así, anualmente se observa el paso de miles de aves que utilizan el territorio como lugar de paso y abastecimiento entre su región de cría, al norte de Europa, y su zona de invernada, en África (Liminana et al., 2012). También se han descrito especies del norte de Europa que eligen la península Ibérica como zona de invernada, como por ejemplo el milano real (Milvus milvus) o la grulla común (Grus grus) (Larsson, 2016; Maciorowski et al., 2019). Además, el aumento de las temperaturas relacionado con el cambio climático ha favorecido que poblaciones de varias especies que tradicionalmente realizaban migraciones dejen de hacerlas, o en algunos casos realicen migraciones más cortas, como en el caso de la cigüeña blanca (Ciconia ciconia). En los últimos años se han descrito poblaciones residentes durante todo el invierno en la zona central de la península Ibérica, donde además consiguen fácilmente alimento en ciudades y vertederos (Arizaga et al., 2018). Por otro lado, el incremento de la población urbana y el abandono rural han impulsado el desarrollo urbano y la producción ganadera y agrícola intensiva, provocando una fragmentación, destrucción o pérdida de hábitats naturales, así como un aumento de la contaminación ambiental, que afectan sin duda alguna a la biodiversidad animal (Smith et al., 2009). Además, el equilibrio de los ecosistemas puede verse alterado por la competencia interespecífica, ya sea por causas naturales, como por ejemplo en la relación depredador-presa, o por la introducción de especies por el hombre, por ejemplo, con las translocaciones de individuos para alcanzar densidades deseadas o la liberación de especies alóctonas con potencial invasor. Por otro lado, los agentes patógenos han regulado de manera tradicional las poblaciones silvestres mediante presión selectiva (Sommer, 2005). Sin embargo, la desaparición de ciertos microorganismos puede ser perjudicial para el mantenimiento del ecosistema (OIE y IUCN, 2014). Todo ello mantenido a lo largo del último siglo, ha favorecido una disminución en las poblaciones de determinadas especies que ahora se encuentran amenazadas, como por ejemplo la lechuza Introducción 87 común (Tyto alba) o el lince ibérico (Lynx pardinus) (Martínez y Zuberogoitia, 2004; Cabezas- Díaz et al., 2009). Este declive en la biodiversidad ibérica se ha visto potenciado además por el desarrollo de poblaciones estables de especies invasoras. La mayoría de estas especies han sido introducidas por el ser humano por diversas razones: comercio de especies exóticas como mascotas, producción de especies para alimentación o producción de animales con fines peleteros. El aumento de temperaturas durante el invierno, hacen que la península Ibérica resulte ser un buen refugio para muchas de estas especies, las cuales establecen poblaciones residentes en nuestros ecosistemas, desplazando la fauna ibérica (Gallardo et al., 2017). Uno de los ejemplos más llamativos en este aspecto es el del visón europeo (Mustela lutreola), mustélido en peligro crítico de extinción según la Unión International para la Conservación de la Naturaleza (UICN), cuyo nicho ecológico lo está ocupando desde hace algunos años el visón americano (Neovison vison). Esta especie resulta tener una mayor tasa de reproducción, además de un comportamiento más oportunista, adaptándose bien a diferentes ecosistemas y desplazando a la especie autóctona hasta casi llevarla a su extinción (Pödra y Gómez, 2018). Pero no se trata de un caso aislado; el galápago de Florida (Trachemys scripta), el cangrejo americano (Procambarus clarkii), la cotorra argentina (Myiopsitta monachus), la rana toro (Lithobates catesbeianus) o el mapache (Procyon lotor) son algunos de los casos más destacados de nuestra geografía en los últimos años (BOE, 2019a). Afortunadamente, en la actualidad, son muchos los programas de conservación que se están llevando a cabo en la península Ibérica con diferentes objetivos: reducir el impacto ecológico de la actividad humana, restaurar los ecosistemas, reforzar las poblaciones de algunas especies en peligro, cría en cautividad de otras en estado crítico, etc. Todos estos programas han propiciado además la investigación en todas estas especies, nichos y biotopos, publicando en los últimos años gran cantidad de información recopilada en el transcurso de estos proyectos (Life Bonelli, 2013; Aquila a-Life, 2018). Sin embargo, pese a todos los esfuerzos, la conservación de la biodiversidad se presenta como un reto multifactorial que sólo puede lograrse mediante el estudio de todos los factores implicados y el uso de todas las herramientas posibles, como confirma la corriente actual de investigación “One Health” o lo que en castellano se traduciría como “Una Única Salud”. La forma más eficaz y rápida de obtener resultados en una investigación es abordarla desde todos los puntos de vista posibles, para lo que hace falta un equipo de trabajo multidisciplinar y en la mayoría de los casos la colaboración entre diferentes instituciones de todo el mundo. Muchas de las publicaciones editadas recientemente tienen estos enfoques multidisciplinares, relacionando la biología de la especie con la ecología, Introducción 88 medicina veterinaria, epidemiología de agentes infecciosos, salud pública o incluso con factores socio-económicos (Zinsstag et al., 2011; Zaragoza et al., 2019). Probablemente la acción más importante en la defensa de la biodiversidad es la concienciación de la población. Durante décadas, numerosas instituciones han apostado por la educación ambiental como arma principal en la lucha por el medio ambiente, a través de programas educativos en colegios y universidades, documentales televisados o publicaciones en periódicos y revistas. Sin embargo, hasta hace pocos años, el acceso a esta información era muy variable en función de la región o la educación de la población. El desarrollo de nuevas tecnologías, como los simuladores y la realidad virtual, y la aparición de las redes sociales han causado un gran impacto en las nuevas generaciones, llegando a más público en muy poco tiempo. El resultado de todo ello se traduce en una creciente preocupación por el medio ambiente y el cambio climático (Carmichael y Brulle, 2017). 1.3.1.1. Aves rapaces ibéricas: el águila de Bonelli Las aves rapaces son uno de los principales grupos de la avifauna ibérica, siendo esta región la que posee la mayor biodiversidad de rapaces de Europa (González, 2010). De manera general las rapaces son aves carnívoras, la mayoría predadoras y altamente especializadas para la caza. Su tamaño varía según la especie, pero todas ellas se caracterizan por tener unas fuertes garras con las que sujetar la presa y un pico ganchudo adaptado al tipo de alimentación, del que también existe una gran variedad, en función del género y la especie de la que se trate. La mayoría de las especies tienen un fuerte carácter territorial, mientras que algunas forman comunidades. Su época de celo se extiende desde principios de enero hasta marzo, siendo la época de reproducción y cría desde marzo hasta julio, según las condiciones climáticas. Sin embargo, en los últimos años, el aumento de las temperaturas ha provocado que poco a poco se vayan adelantando las épocas de celo y cría, así como el retraso en la migración de las especies que la realizan. Por otro lado, esta misma situación ha provocado la llegada de nuevas especies de aves rapaces desde África, como son el cernícalo patirrojo (Falco vespertinus) y el buitre orejudo (Torgos tracheliotos), que se han empezado a asentar en el sur de la península (González, 2010) (Figura13). Introducción 89 Figura 13. Fotografía de cernícalo patirrojo (izquierda) y buitre orejudo (derecha). Fuente: imágenes de Tomás Belka y Yathin Sk, respectivamente. En la actualidad, se encuentran catalogadas 35 especies de aves rapaces diferentes en el Listado de Especies Silvestres en Régimen de Protección Especial y el Catálogo Español de Especies Amenazadas (BOE, 2019b). Se dividen en tres grandes órdenes: Strigiformes, donde se incluyen las rapaces nocturnas, Accipitriformes y Falconiformes, donde se incluyen las rapaces diurnas. Dentro de las especies más amenazadas encontramos el águila imperial (Aquila adalberti), el quebrantahuesos (Gypaetus barbatus), el milano real (Milvus milvus), y el alimoche canario o guirre (Neophron percnopterus majorensis) (Figura 14). Además, en las últimas décadas se ha observado un grave declive de las poblaciones de varias especies como por ejemplo la lechuza común (Tyto alba) o el águila de Bonelli (Aquila fasciata) (SEO BirdLife, 2008). Figura 14. Fotografía de águila imperial joven (izquierda) y alimoche (derecha). Fuente: Juan José Iglesias Lebrija (GREFA) y Sergio de la Fuente García (GREFA), respectivamente. Introducción 90 El águila de Bonelli, tradicionalmente llamada águila perdicera, es una rapaz accipitriforme que se extiende por la cuenca mediterránea y el sudeste asiático. Se considera un águila de tamaño medio, midiendo unos 70 cm de longitud y 150-170 cm de envergadura de media, y con un peso entre 1,6 y 2,2 kg. Su plumaje es marrón, con las zonas ventrales blancas con moteado marrón (Figura 15) (SEO BirdLife, 2008). Figura 15. Fotografía de águila de Bonelli en vuelo (izquierda) y posada (derecha). Fuente: Sergio de la Fuente (GREFA). Habita en zonas muy variables, aunque tiene preferencia por zonas rocosas y cortados, donde realizan sus nidos a gran altura. La puesta generalmente consta de dos huevos, y los pollos son cuidados por ambos progenitores, alimentándose solos a partir de los 45-50 días con las presas que les proporcionan los padres. A partir de los 60 días el plumón ha desaparecido y el plumaje definitivo ya se ha desarrollado por completo, pasando a ser volantones. Pocos días después comienzan a realizar sus primeros vuelos cortos (SEO BirdLife, 2008). Aunque los individuos jóvenes realizan dispersiones que van desde decenas hasta miles de kilómetros, una vez establecido su territorio, los adultos se mantienen en el mismo mientras haya abundancia de alimento (Cadahía et al., 2005). Esta etapa de dispersión se realiza durante los tres o cuatro primeros años de vida, hasta llegar a la madurez sexual, momento en el cual se asientan en un territorio para construir su nido, el cual suele localizarse en roquedos y acantilados (Pavón et al., 2009). Si la disponibilidad de alimento y las condiciones ambientales para la reproducción son favorables, ocupan este territorio durante toda su vida, evitando el contacto con otras parejas Introducción 91 reproductoras de su misma especie, por lo que se consideran animales residentes y territoriales. A pesar de poder realizar pequeños movimientos de pocos kilómetros de distancia, el territorio del águila de Bonelli puede llegar a medir cerca de 80 km2 de territorio de media (Conde de Dios, 2018). Además, se trata de un ave cuya relación con la actividad humana es casi nula, ocupando regiones poco habitadas y/o alejadas de los núcleos urbanos (Ontiveros, 2016). Su alimentación se basa tradicionalmente en conejo europeo (Oryctolagus cuniculus) y perdiz roja (Alectoris rufa), sin embargo, la disminución paulatina de las poblaciones de estas presas por diferentes motivos ha provocado su adaptación complementando la dieta con diferentes especies de columbiformes (Moleón et al., 2012). Por este y otros factores, las poblaciones mediterráneas de águila de Bonelli han sufrido un fuerte descenso en los últimos años, por lo que se considera una especie amenazada en esta región. En la península Ibérica, el águila de Bonelli apenas se observa en la meseta norte, encontrando las poblaciones más estables en Andalucía y Comunidad Valenciana. Entre los factores causantes de esta regresión se encuentran la escasez de alimento, la fragmentación y desaparición del hábitat y el efecto de ciertas actividades humanas, como la escalada, el furtivismo, etc. Una de sus principales causas de mortalidad es la electrocución en torres las torres de electricidad. Como la mayoría de las aves, el águila de Bonelli tiene tendencia a posarse en los puntos altos de estas torres, y además también en los puntos inferiores de las crucetas, lo que las hace especialmente vulnerables a la electrocución (Hernández-Matías et al., 2015). Por otro lado, también se ha observado la alta prevalencia del parásito Trichomonas en pollos de águila de Bonelli de campo (Gómez et al., 2018). La transmisión de este parásito se ha relacionado con la ingesta de palomas portadoras, dando lugar a unas lesiones necróticas en cavidad oral y esófago que progresan afectado musculatura y hueso adyacentes. Con un diagnóstico temprano y el tratamiento adecuado, la patología tiene buen pronóstico, sin embargo, en aves de vida libre el pronóstico depende completamente de la capacidad del sistema inmune del individuo, siendo generalmente mortal (Gómez et al., 2018; Santos et al., 2019). En la actualidad, son varios los programas de conservación y reintroducción de esta especie, destacando dos de ellos, destacando el Life Bonelli (2013-2017), el Life ConRaSi (2015-2018) y el Aquila a-Life (2018-2022). La mayoría son proyectos internacionales, en los que intervienen España, Francia e Italia, y sus principales acciones consisten en la corrección de tendidos, la cría en cautividad de individuos para reintroducirlos en zonas despobladas y el seguimiento de las parejas reproductoras de vida libre junto con el chequeo veterinario y marcaje de los pollos que anualmente nacen (Lebrija et al., 2012). La cría en cautividad se realiza en diferentes centros de Introducción 92 España, como GREFA (Grupo de Rehabilitación de la Fauna Autóctona y su Hábitat), y Francia (UFCS: Union Française des Centres de Sauvegarde de la faune sauvage), con ejemplares irrecuperables que se mantienen en cautividad para su reproducción, siendo un método muy delicado y complejo con el que anualmente se obtienen unos 5 o 6 individuos en total. La ventaja que presenta frente a la cría en libertad es el control que se tiene en el momento de la incubación del huevo, de la eclosión y durante los primeros días del pollo, el cual es el periodo más crítico. Una vez superados los primeros días de vida, si todo va bien, el animal es introducido en el nido con sus padres, los cuales terminan de criarlo, alimentarlo y educarlo, hasta el momento de trasladarle (Aquila a-Life, 2018). Otra acción de suma importancia que se realiza en estos proyectos es la extracción de un número variable de pollos de águila de Bonelli de poblaciones más estables, como por ejemplo la de Andalucía, en función de las tendencias poblacionales observadas en la última temporada entre otros factores. Dichos pollos son traslocados en regiones menos pobladas, como por ejemplo Navarra, La Rioja o las Islas Baleares. El número de ejemplares traslocados varía en función de la tasa de reproducción de cada año y de las tendencias poblacionales. Finalmente, cada año se liberan tanto los individuos criado en cautividad como los traslocados mediante la técnica de hacking, es decir, introduciéndolos en una jaula grande ubicada en la región en la que se van a liberar, en la que permanecen hasta desarrollar por completo el plumaje con el fin de aclimatarse a las nuevas condiciones ambientales (Figura 16). Una vez desarrollado el plumaje por completo, la jaula se abre, para liberar las águilas, mientras se sigue aportando comida dentro de la jaula abierta para facilitar que los individuos se establezcan en el área (Aquila a-Life, 2018). Gracias a estas acciones, entre 2013 y 2017 se liberaron más de 80 águilas de Bonelli jóvenes, algunas criadas en cautividad y otras traslocadas de poblaciones estables, principalmente en la zona centro-norte de la península e Islas Baleares, reforzando de esta manera las poblaciones de estas regiones (Iglesias et al., 2017). Además, desde 2013, se está realizando el seguimiento de cerca de 150 ejemplares de vida libre a los que se suman cada año más de 30 pollos marcados en el campo y los nacidos en cautividad dentro del programa Aquila a-Life a fin de estudiar la tasa de mortalidad juvenil y adulta, y sus causas (Aquila a-Life, 2018). Introducción 93 Figura 16. Jaula de aclimatación o hacking con seis águilas de Bonelli ya liberadas. Fuente: proyecto Life Bonelli (GREFA). 1.3.1.2. Aves silvestres urbanas El aumento de la actividad humana con el paso de los años ha repercutido en la fauna silvestre. Mientras que muchas especies de animales han sido desplazadas, algunas se han adaptado a esta actividad, coexistiendo hoy en día en ciudades y núcleos urbanos donde encuentran recursos ilimitados para realizar sus actividades (Miranda, 2017). El incremento exponencial de la producción de residuos en los últimos años supone para estos animales una gran ventaja en la búsqueda de alimento y materiales para la construcción de sus nidos. Hoy en día, es sencillo encontrar carnes, pescados, frutas, vegetales y otros alimentos en cualquier vertedero o planta de residuos, así como en los contenedores que se encuentran distribuidos por las ciudades, atrayendo el interés de multitud de animales (Gilbert et al., 2016). Sin embargo, la alimentación a base de residuos puede ocasionar patologías nutricionales (déficits de vitaminas), intoxicaciones (botulismo, salmonelosis, colibacilosis) y la bioacumulación de metales pesados y otras sustancias como plaguicidas o residuos farmacológicos (Plaza y Lambertucci, 2018). Al almacenamiento de los residuos durante largos periodos de tiempo en zonas descubiertas y de fácil acceso para la fauna silvestre hay que sumarle la incorrecta gestión de residuos medicamentosos por parte de la población, favoreciendo el desarrollo de resistencias a Introducción 94 antimicrobianos en las bacterias presentes en el suelo y residuos, y convirtiéndose así en una fuente importante de cepas bacterianas multirresistentes para la fauna urbana (Camacho et al., 2016). Esta fauna urbana está compuesta por animales de todas las clases, desde murciélagos, roedores y lagartijas, hasta jabalíes y mapaches. Pero la clase más abundante en nuestro país es, sin duda, la de las aves. Cigüeñas, gaviotas, ánades, palomas, tórtolas, urracas, estorninos, mirlos y gorriones, son algunas de las especies más frecuentes en zonas urbanas, todas ellas con diferentes nichos y tipos de alimentación (Imagen 17). Sin embargo, en los últimos años se ha observado una regresión y/o desplazamiento en las poblaciones de algunas de estas especies, como por ejemplo en el gorrión (Passer domesticus). A pesar de ser un ave ampliamente distribuida y muy relacionada con ambientes urbanos, en los que encuentran gran cantidad de recursos y alimento, en los últimos las poblaciones en las grandes ciudades han disminuido drásticamente en parte debido a la introducción de especies invasoras como la cotorra argentina. Aunque se han estudiado otros factores que influyen en la dinámica de esta especie, como por ejemplo el efecto de la radiación electromagnética asociada a las antenas de telefonía, la contaminación ambiental, o el almacenamiento subterráneo de las basuras (Balmori y Hallberg, 2007; Bernat-Ponce et al., 2018:2019). Estos elementos afectan de igual manera a otras especies como son las palomas torcaces y las tórtolas turcas, además de multitud de especies paseriformes. Además, las enfermedades infecciosas también actúan como factor negativo en las poblaciones de estas especies, como por ejemplo el aumento de la prevalencia de Trichomonas gallinae en palomas torcaces (Columba palumbus) y tórtolas turcas (Streptopelia decaocto), que causa gran mortalidad en las poblaciones de estas y otras aves, o la alta prevalencia descrita de manera general en paseriformes de Salmonella (Mather et al., 2016; Marx et al., 2017). Figura 17. Selección de aves urbanas incluidas en el desarrollo de esta tesis. De izquierda a derecha: cigüeña blanca, gaviota sombría, paloma torcaz, estornino negro y gorrión común. Fuente: dibujos extraídos de la Enciclopedia de Aves de España SEO/Birdlife, 2008. Introducción 95 En el lado opuesto encontramos especies como las cigüeñas, gaviotas y estorninos, cuyas poblaciones urbanas han ido en aumento en los últimos años, expandiéndose a regiones en las que antes apenas se avistaban. Pese al gran declive que tuvieron en la década de los 70, las poblaciones de cigüeña blanca (Ciconia ciconia) en la península Ibérica se han ido recuperando poco a poco, siendo una de las aves más emblemáticas de muchos pueblos. Una de las principales causas de esta recuperación ha sido la adaptación de esta especie a la alimentación presente en vertederos (Gilbert et al., 2016). Tal ha sido el impacto que, aun siendo un ave tradicionalmente migratoria, se ha observado como cada vez son más los individuos que realizan migraciones cortas de norte a sur de la península o incluso deciden no migrar, estableciéndose poblaciones residentes cerca de núcleos urbanos, como sucede en la meseta central (Wilcove y Wilkeski, 2008). De manera similar, se han establecido poblaciones residentes en la Comunidad de Madrid de gaviotas, principalmente gaviota sombría (Larus fuscus) y reidora (Chroichocephalus ridibundus). Mayoritariamente, las gaviotas son aves que ocupan las zonas costeras, aprovechando el excedente de la pesca y lonjas como recurso alimentario y migrando en invierno a zonas más cálidas como el sur de la península Ibérica. Durante décadas han utilizado determinados puntos del centro peninsular como zonas de parada y reabastecimiento. Sin embargo, el aumento de la población humana en estas zonas y el consiguiente incremento de residuos, han favorecido el establecimiento de grupos residentes de gaviotas que se mueven entre los principales embalses de la comunidad y los vertederos y mercados de abasto, donde disponen de recursos alimentarios ilimitados durante todo el año (Galván et al., 2003). Por tanto, en la actualidad existen individuos tanto de cigüeña blanca, como de gaviota sombría y reidora, que pueden ser residentes o migratorios. En cualquier caso, es importante destacar que tanto el requerimiento energético de la migración como una alimentación basada en residuos urbanos afecta negativamente al sistema inmune, aumentando la susceptibilidad de los individuos a la infección por diversos patógenos (Arriero et al., 2015; Plaza y Lambertucci, 2018). En resumen, el empleo de residuos como recurso alimentario por parte de las aves urbanas, pueden favorecer la transmisión de patógenos como por ejemplo Salmonella. Además, es importante destacar que, dentro de su territorio, estas especies realizan ciertos desplazamientos en busca de alimento o mejores zonas donde anidar, lo que las convierte en un puente entre la ciudad y el mundo rural y, por ello, en potenciales agentes diseminadores. Introducción 96 1.3.2. Las aves silvestres como reservorio de patógenos Al igual que los animales de abasto, o las mascotas, la fauna silvestre se encuentra expuesta a millones de microorganismos, los cuales pueden causar enfermedad en función de diferentes factores. No obstante, en base a la ley de selección natural expuesta por Charles Darwin en su obra “El origen de las especies”, la fauna silvestre tiende a desarrollar cierta resistencia a las enfermedades endémicas de la región en la que habitan, lo que les transforma en portadores asintomáticos e incluso en reservorios de determinadas enfermedades (Darwin, 1859; Bengis et al., 2002). El concepto de reservorio se refiere a una especie capaz de mantener un agente infeccioso en un área determinada, en ausencia de contaminación cruzada de otros animales domésticos o silvestres. Por otro lado, un portador asintomático es una especie capaz de infectarse y excretar el patógeno sin desarrollar signos clínicos evidentes. Así, los individuos de una especie que sea reservorio pueden ser o no portadores asintomáticos al infectarse (Prieto, 2014). En este sentido, la fauna silvestre puede actuar como portadores asintomáticos de numerosos patógenos, los cuales pueden diseminar por el medio ambiente y transmitir a animales domésticos y humanos por diferentes vías. Por lo general, el contacto entre fauna silvestre y ganado se reduce mediante el empleo de barreras físicas como el vallado en las explotaciones intensivas. Sin embargo, no es necesario un contacto directo para la transmisión de agentes infecciosos, ya que muchos de ellos tienen una alta persistencia en el medio, lo que hace posible la transmisión indirecta a través de fómites contaminados, y, muchos de ellos, pueden diseminarse a través de aguas contaminadas, punto en el que las aguas de escorrentía juegan un papel importante. Además, no hay que olvidar que muchas enfermedades infecciosas se transmiten a través de vectores, los cuales pueden ser especies muy diversas de mosquitos, garrapatas o incluso otras aves. Otros factores que influyen en la transmisión de enfermedades son las deficiencias nutricionales, el estrés, alteraciones en el comportamiento o las fluctuaciones en el clima, así como la densidad de población de especies animales y de los vectores. Por ejemplo, los períodos con alta tasa de lluvias favorecen el desarrollo de los vectores, aumentando la incidencia de enfermedades mediadas por vector (Bengis et al., 2002; Jones et al., 2008). Un estudio publicado en 2008 sugiere que el 75% de los patógenos zoonósicos emergentes tienen su principal origen en la fauna silvestre (Jones et al., 2008). En este sentido, la fauna silvestre sirve como indicador precoz en la vigilancia de enfermedades infecciosas emergentes. Un ejemplo de ello fue la detección de West Nile en brotes de mortalidad masiva en córvidos previos a los brotes acontecidos en caballos o humanos en nuestro país (Sánchez-Vizcaíno et al., Introducción 97 2014). Sin embargo, diversos estudios demuestran que la diseminación de patógenos entre animales silvestres y domésticos es multidireccional, encontrando multitud de ejemplos de transmisión de agentes infecciosos de ganado a fauna silvestre, como es el caso de la tuberculosis o la brucelosis (Bengis et al., 2002; Palmer et al., 2012). Por ello, resulta de gran interés el estudio de las enfermedades infecciosas en la fauna silvestre, más aún, teniendo en cuenta la estrecha relación que existe entre el medio ambiente, las zonas rurales y las grandes ciudades. De los patógenos emergentes que pueden afectar al hombre, cerca del 60% son zoonósicos, afectando también a los animales, ya sean domésticos o silvestres (Jones et al., 2008). El concepto “One Health” o “Una Única Salud” hace referencia a esta relación, poniendo de manifiesto su importancia a la hora de considerar una única medicina que afecta tanto a personas como a animales y a ecosistemas (Figura 18). Entre estos componentes existe una red de conexiones dinámicas que permite el intercambio de patógenos en todas las direcciones, aumentando además la probabilidad de emergencia de nuevos patógenos (Rhyan y Spraker, 2007). A raíz de ello, se han creado grupos de investigación multidisciplinares que incluyan médicos, veterinarios, biólogos, epidemiólogos, ingenieros forestales y ecólogos, entre otros profesionales de la rama sanitaria, para poder obtener una visión global de los posibles problemas sanitarios, y poder dar una alerta temprana de las enfermedades más prioritarias, tanto por su impacto en la fauna silvestre como en la salud pública y sanidad animal. Figura 18. Diagrama de flujo de microorganismos entre los diferentes sectores. Fuente: elaboración propia. Introducción 98 En 2013, la Oficina Internacional de Epizootías (OIE) lanzó una plataforma online (WAHIS-Wild) en la que poder consultar la información relativa a diferentes enfermedades infecciosas presentes o no en diferentes países del mundo. Por desgracia, a día de hoy aún son pocos los países que tienen establecido un buen sistema de vigilancia de estas enfermedades en la fauna silvestre, por lo que los datos mostrados en la plataforma están incompletos. Por tanto, surge la necesidad de impulsar la vigilancia y control de enfermedades en la fauna silvestre, tanto a nivel nacional como internacional, así como la colaboración y el intercambio de información entre profesionales de los diferentes grupos de trabajo e instituciones (Prieto, 2014). Sin embargo, el estudio de las enfermedades que puedan afectar a la fauna silvestre tiene numerosas limitaciones tanto científicas como políticas (Becker et al., 2019). Por lo general, estos estudios requieren una serie de permisos legales y procedimientos burocráticos, así como la colaboración de varias instituciones y autoridades. Además, la bibliografía de base en medicina de fauna silvestre es relativamente escasa si comparamos con la que existe en animales domésticos y humanos. Incluso la obtención de un censo de una determinada especie o de una estimación de la densidad de poblaciones puede llegar a ser realmente complicado. Esta falta de datos a la hora de diseñar un estudio de investigación obliga a los científicos a extrapolar dichos datos de unas especies a otras, lo que puede traducirse en un sesgo de los resultados y conclusiones que se obtengan. Por último, la mayoría de especies son difíciles de capturar y manejar, lo que dificulta una correcta recogida de muestras y el establecimiento de un protocolo completo, sistemático y rutinario. Además, son animales fácilmente estresables, y el estrés provocado por el manejo puede causar ciertas alteraciones en los parámetros hematológicos y bioquímicos dificultando aún más los estudios y falseando los resultados obtenidos (Jones et al., 2008). En este aspecto, el mantenimiento de especies amenazadas en núcleos zoológicos, como por ejemplo centros de cría en cautividad de especies amenazadas o de educación ambiental, así como zoológicos, parece ser una gran ventaja, ofreciendo un acceso mucho más sencillo a toda esa información. No obstante, a la hora de realizar estudios sobre ciertas patologías, es importante recordar que el mantenimiento en cautividad de un animal va a influir en numerosos factores, como, por ejemplo, la dieta, el comportamiento o el nivel de estrés (Giambelluca et al., 2017). A pesar de ello, en la actualidad la mayoría de sistemas de vigilancia de fauna silvestre en España se encuentran ligados a la detección de patógenos en animales ingresados o criados en centros de recuperación y otros núcleos zoológicos, animales marcados en el campo, presas de caza y/o cadáveres localizados en el medio natural. Introducción 99 1.3.3. Salmonella en aves silvestres Como ya se ha comentado, las aves pueden portar de manera natural Salmonella en el intestino, siendo portadores de la misma y, por tanto, origen de numerosos brotes de salmonelosis. De igual manera se ha confirmado la presencia de Salmonella en el tracto intestinal de las aves silvestres, las cuales, por lo general, portan la bacteria de forma asintomática. En los últimos años, se han realizado estudios en diferentes regiones del mundo y diferentes especies de aves, observando diferentes prevalencias de la bacteria. En la península Ibérica se han publicado algunos artículos en los que se muestra la prevalencia de Salmonella en diferentes aves silvestres, principalmente aves rapaces. En la mayoría de ellos, Salmonella se ha detectado en bajas proporciones en los individuos de águila de Bonelli examinados, aunque la mayoría de estos estudios eran multi-especie y contaban con un número bajo de individuos de cada una de ellas (Reche et al., 2003; Millán et al., 2004; Molina-López et al., 2015; Jurado-Tarifa et al., 2016). No obstante, los estudios dirigidos a especies diana muestran prevalencias mayores, como la observada en buitre leonado (Gyps fulvus) que supera el 52% (Marin et al., 2014). En las aves urbanas, la prevalencia también varía en función de la especie, la época del año, las condiciones climáticas, etc. Los estudios publicados muestran una tasa de Salmonella entre 0% y 50%, siendo las aves más afectadas los paseriformes, las gaviotas y las cigüeñas (Ramos et al., 2010; Mather et al., 2016). Es importante tener en cuenta que la excreción de Salmonella generalmente es intermitente, por lo que lo ideal para realizar estudios de prevalencia es la recogida seriada de heces lo más frescas posible (Ivanek et al., 2012). No obstante, el acceso y manejo de estos individuos es realmente complicado, por lo que la mayoría de estudios se pueden clasificar en dos tipos: estudios de campo, en los que se recogen heces del nido o hisopo cloacal del individuo, y estudios en centros de recuperación (Millán et al., 2004; Marin et al., 2014; Krawiec et al., 2015). Dentro de este segundo grupo, en función del funcionamiento del centro y de los objetivos, podemos encontrar estudios en los que se recogen heces durante tres días, heces del primer día o hisopo cloacal en el momento del ingreso. Por tanto, según la metodología empleada se puede considerar que la prevalencia de Salmonella pudiera estar subestimada. A fin de obtener la mayor información posible y encontrar las relaciones existentes entre los diferentes factores, es imprescindible el estudio de las serovariedades implicadas, teniendo en cuenta que no todas ellas tienen carácter zoonótico demostrado. En general los serotipos más aislados en los estudios realizados en fauna silvestre en la península Ibérica son Typhimurium y Enteritidis, ambos con fuerte carácter zoonótico, aunque también se han aislado en menor Introducción 100 proporción serotipos como Infantis, Indiana, Houston o Cerro, entre otros (Molina-Lopez et al., 2011:2015; Marin et al., 2014:2018). Por tanto, es importante tener en cuenta la gran la capacidad de diseminación de Salmonella de estas aves de vida libre por todo el territorio que ocupan, así como a través de las rutas de migración en caso de ser aves migratorias. De esta manera pueden contaminar granjas de producción animal, tierras de cultivo, parques, etc. En un estudio realizado en 2018, en Australia, se detectó que el 81% de las cepas de Salmonella aisladas en gatos compartían serotipo con las aisladas en aves silvestres, infectándose éstos a través de la caza (Simpson et al., 2018). Por otro lado, aunque poco se sabe del rol de la fauna silvestre en la epidemiología de las resistencias a antimicrobianos, las aves silvestres deben ser consideradas y estudiadas en profundidad en este aspecto, dada la capacidad de diseminación de microorganismos que presentan (Palmgren, 2002). Numerosas publicaciones recientes ponen en evidencia el aumento en la detección de resistencias a antimicrobianos en enterobacterias aisladas en fauna silvestre en todo el mundo, hallándose cepas multirresistentes de Salmonella en milano real, buitre leonado, águila real (Aquila chrysaetos), ratonero (Buteo buteo), cernícalo vulgar (Falco tinnunculus), lechuza (Tyto alba), autillo (Asio otus) y mochuelo (Athene noctua). Fuera del grupo de las rapaces, también se han detectado cepas multirresistentes en abubilla (Upupa epops), gaviota plateada (Chroicocephalus novaeholandiae), gaviota reidora, paloma bravía (Columba livia f. domestica), cuervo (Corvus corax), y cornejas (Corvus frugilegus). En cambio, un estudio realizado en 2015 por Mather et al. (2016), en Reino Unido, no detectó ninguna resistencia a antimicrobianos en las cepas de Salmonella aisladas de paseriformes, lo que coincide con los resultados publicados posteriormente por Troxler et al. (2017). En líneas generales, los antimicrobianos con mayor tasa de resistencia son la ampicilina, amoxicilina, tetraciclinas y sulfonamidas, observando una sensibilidad mayor frente a quinolonas y cefalosporinas de tercera y cuarta generación, aunque también se han detectado resistencias frente a estos antibióticos (Molina-López et al., 2011:2015; Botti et al., 2013; Janecko et al., 2015; Blanco, 2015; Dolejska et al., 2016; Troxler et al., 2017). Finalmente, también se han notificado cepas de Salmonella resistente a colistina y aisladas de fauna silvestre, entre otros, en buitre leonado y abubilla (Molina-López et al., 2015). Introducción 101 1.4. Justificación de la tesis El género Salmonella comprende más de 2.500 serotipos diferentes los cuales pueden llegar a causar enfermedad en el ser humano, siendo además muchos de ellos zoonóticos. Se trata de la segunda zoonosis de origen alimentario más diagnosticada en la Unión Europea, teniendo además un alto impacto socio-económico (EFSA, 2019). Es capaz de colonizar el intestino de numerosas especies de animales homeotermos, suponiendo por tanto un riesgo también para los animales, especialmente las aves y los cerdos de producción, donde de manera rutinaria se realizan controles sanitarios en busca de Salmonella y otras bacterias. La puesta en marcha de medidas como ésta ha conseguido que año tras año se observe una tendencia a la baja en el número de casos declarados en la Unión Europea (EFSA, 2019). Por otro lado, las resistencias a antimicrobianos se han convertido en una grave amenaza para la salud pública en los últimos años, y se estima que se convertirán en la primera causa de muerte a nivel mundial en apenas 30 años (O’Neil, 2014). La rápida expansión de estas resistencias a través de múltiples vías se ha visto facilitada por el uso indiscriminado de los antibióticos y la globalización del siglo XXI, entre otros factores (Muñoz, 2017). En la actualidad, numerosos estudios confirman la detección de cepas bacterianas multirresistentes, e incluso panresistentes, que ponen en grave peligro la salud humana, llegando en muchos casos a la muerte de las personas afectadas (Rossolini et al., 2007; Lim et al., 2016). Por tanto, su estudio se ha convertido en una de las principales prioridades en investigación sanitaria, siendo de gran relevancia los estudios de vigilancia realizados en personas y animales, incluyendo los animales de producción (EFSA and ECDC, 2019). Numerosos estudios confirman el papel de la fauna silvestre como portador asintomático y agente diseminador de diferentes especies bacterianas, entre las cuales se encuentra Salmonella, así como de cepas resistentes a antimicrobianos (Palmgren, 2002; Jurado-Tarifa, 2016; Troxler et al., 2017). La urbanización de los ecosistemas y el aumento del ecoturismo han propiciado en las últimas décadas una mayor interacción entre el ser humano, el medio ambiente y la fauna silvestre, siendo posible un intercambio eficaz de microorganismos y resistencias a antimicrobianos entre ambos sectores. Sin embargo, apenas existen publicaciones sobre estos temas en fauna silvestre, estando la mayoría de ellos asociados a casos clínicos o centros de recuperación (Millán et al., 2004; Molina-López et al., 2011:2015). Los ecosistemas pueden definirse como un fuerte indicador del estatus sanitario de una región, por lo que, en consecuencia, debe ser estudiado en profundidad a fin de obtener un sistema de alerta temprana en multitud de campos, como puede ser la epidemiología de Salmonella o la Introducción 102 diseminación de resistencias a antimicrobianos (Zhao et al., 2019). No obstante, es importante tener en cuenta todas las limitaciones que pueden aparecer durante el diseño y la ejecución de un estudio en fauna silvestre, incluyendo el manejo de los animales y la demora en el procesado de las muestras (Becker et al., 2019). Por tanto, es necesario un sistema que permita un mayor margen de tiempo desde la recogida de las muestras hasta su análisis en el laboratorio. En este sentido, esta tesis pretende arrojar un poco de luz sobre la presencia de Salmonella y resistencias a antimicrobianos en aves rapaces, no vinculadas a la actividad humana, tomando como modelo al águila de Bonelli, y aves urbanas, cuya interacción con las personas es prácticamente constante. 103 2.Objetivos 104 Objetivos 105 El objetivo general de esta tesis es conocer la epidemiología de Salmonella en diferentes especies de aves de la fauna silvestre ibérica, así como la detección de resistencias a antimicrobianos que ésta pueda portar. Para ello, se han desarrollado los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar la presencia de Salmonella y de las AMR asociadas a ella en individuos jóvenes de águila de Bonelli nacidos en libertad en la Comunidad Valenciana, y definir el tipo de muestra más adecuado para la detección de Salmonella. 2. Estudiar la viabilidad de Salmonella en muestras cloacales recogidas en individuos silvestres de difícil acceso, usando como modelo el águila de Bonelli, y comparando el empleo de medio FBP enriquecido con carbón activo en congelación frente al uso de medio Cary Blair en refrigeración. 3. Investigar la presencia de Salmonella y las AMR asociadas a ella individuos de cinco especies diferentes de aves urbanas. A fin de completar todos los objetivos establecidos, se han desarrollado tres estudios experimentales diferentes: 1. Estudio de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en una población de águila de Bonelli (Aquila fasciata) de la Comunidad Valenciana. 2. Estudio comparativo de muestras cloacales conservadas de águila de Bonelli recogidas en lugares de difícil acceso: congelación vs refrigeración. 3. Estudio de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en cinco especies diferentes de aves silvestres ligadas a ambientes urbanos. Objetivos 106 107 3.Metodología 108 Metodología 109 3.1. Estudio de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en aves rapaces autóctonas de la península Ibérica, utilizando como modelo el águila de Bonelli o águila perdicera (Aquila fasciata) A fin de mejorar los programas de conservación de la especie, la Consejería de Medio Ambiente de la Generalitat Valenciana otorgó los permisos necesarios para la recogida de muestras. Todos los animales fueron manejados siguiendo las directrices de la directiva europea 2010/63/EU sobre bienestar animal (European Union, 2010). 3.1.1. Especie y área de estudio Durante las temporadas de cría de 2015 y 2016 se recogieron muestras de águila de Bonelli nacidas y criadas en diferentes nidos, todos ellos localizados en la Comunidad Valenciana, aprovechando el anillamiento de los pollos que realiza el ministerio anualmente. El periodo de recogida de muestras fue de marzo a mayo, ambos meses inclusive, de ambos años. Todos los animales incluidos en el estudio fueron pollos criados en libertas de águila de Bonelli y revisados en su correspondiente nido (durante el estudio, cada nido fue revisado únicamente una vez). De cada uno de ellos se anotó la información referente a la edad, sexo, número de pollos por nido y localización del nido. La edad se determinó en base al desarrollo de las plumas, así como al cálculo aproximado de edad en días basado en el seguimiento observacional que realizan los Agentes Forestales sobre los nidos. El sexo se determinó mediante análisis genético enviando una muestra de sangre al Laboratorio Central de Veterinaria (LCV) (Ministerio de Agricultura y Medio Ambiente, Algete, Madrid) (Griffiths et al., 1998). 3.1.2. Recogida de muestras cloacales y heces Para recoger las muestras fue necesaria la colaboración de un equipo coordinado de Agentes Forestales escaladores dada la altura a la que se encontraban. Al llegar al nido introducían las crías en las mochilas correspondientes para bajarlos a tierra firme, donde el equipo veterinario realizó un examen completo del estado del animal antes de recoger las muestras y colocar las anillas pertinentes (Figura 19). Metodología 110 Figura 19. Mapa del área de estudio en el que se indican los nidos de águila de Bonelli de las provincias de Castellón, Valencia y Alicante incluidos en el estudio. En las imágenes que acompañan se puede ver todo el proceso desde el avistamiento del nido (Imagen A) hasta que el individuo es examinado por los veterinarios (Imagen E). El asterisco indica donde se encuentra el nido en cada imagen. Fuente: Martín- Maldonado et al., 2019. De cada uno de los individuos incluidos en este estudio se recogió un hisopo cloacal, introducido aproximadamente 1 cm en la cloaca, el cual fue conservado en medio de transporte Cary-Blair (DELTALAB, Barcelona) (Figura 20). Además, se recogió una muestra de heces del nido, lo más frescas posible, siempre que fue posible. Todas las muestras fueron transportadas en refrigeración en cajas isotermas al laboratorio, donde se procesaron en las siguientes 24 horas. Metodología 111 Figura 20. Recogida de hisopo cloacal en un pollo de águila de Bonelli. Fuente: Martín-Maldonado et al., 2019. 3.1.3. Aislamiento e identificación de Salmonella En el laboratorio, el aislamiento de Salmonella se realizó siguiendo las recomendaciones de la norma ISO 6579:2002 (Anexo D). Primero se pre-enriqueció la muestra introduciendo el hisopo o una muestra de las heces en un tubo con agua de peptona tamponada al 2,5% (Scharlau, Barcelona), en una proporción 1:10 vol/vol. Dicho tubo se incubó a 37±1ºC durante 18±2 horas. Pasado ese tiempo, de cada muestra pre-enriquecida, se inocularon 100 µL en tres gotas equidistantes en una placa de MSRV (Difco, Valencia), el cual se incubó a 41,5±1ºC durante 24- 48 horas. De las placas que presentaron crecimiento compatible con Salmonella, se recogió una muestra que se inoculó en dos medios de agar específicos para la detección de Salmonella: XLD (Liofilchem, Valencia) y ASAP (bioMerieux, Marcy l’Étoile, France). Ambas placas fueron incubadas de nuevo a 37±1ºC durante 24-48 horas, y de las placas positivas se recogió una única colonia compatible con Salmonella al azar que fue sembrada en un medio nutritivo general e incubada a 37±1ºC durante 24 horas (Figura 21). A partir del crecimiento obtenido se realizó un test bioquímico para confirmar el género Salmonella mediante el uso de tiras API-20E (bioMerieux, Marcy l’Étoile, France), y se recogió un criovial que fue conservado a -80ºC con el que poder trabajar posteriormente. En la figura 21 se pueden observar los crecimientos compatibles con Salmonella en los diferentes medios empleados. Metodología 112 Figura 21. Crecimiento compatible con Salmonella en MSRV, XLD y ASAP (de izquierda a derecha). Fuente: collage de elaboración propia con imágenes cedidas por la Dra. Clara Marín Orenga. El serotipado de cada una de las cepas aisladas fue realizado en el Centro de Calidad Avícola de la Comunidad Valenciana (CECAV) mediante el uso de antisueros específicos y siguiendo el esquema de Le Minor-Kauffmann-White (Grimont y Weill, 2007). 3.1.4. Test de susceptibilidad a antimicrobianos También se realizó un test de susceptibilidad a antimicrobianos de cada una de las cepas aisladas, siguiendo las recomendaciones del Comité Europeo de Test de Susceptibilidad a Antimicrobianos (EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) (Matuschek et al., 2014). Se procesó una cepa de Salmonella de cada nido o pollo positivo a Salmonella, empleando la técnica de difusión disco-placa basado en el método Kirby-Bauer (Matuschek et al., 2014) y siguiendo las recomendaciones en cuanto concentraciones de antimicrobianos dadas por EUCAST. Cada cepa de Salmonella fue sembrada por toda la superficie de una placa de Mueller-Hinton sobre la que se colocaron los discos impregnados con los diferentes antimicrobianos, la cual fue incubada a 37ºC durante 24 horas (Figura 22). La elección de antimicrobianos se basó en la decisión europea 2013/653 (European Union, 2013), incluyendo dos quinolonas: ciprofloxacino (CIP, 5µg) y ácido nalidíxico (NA, 30µg); tres beta- lactámicos: ampicilina (AMP, 10µg), cefotaxime (CTX, 30µg) y ceftazidime (CAZ, 30µg); un fenicol: cloranfenicol (C, 5µg); una sulfonamida: trimetoprim-sulfametoxazol (SXT, 1,25/23,75µg); una polimixina: colistina (COL, 10µg); un macrólido: azitromicina (AZM, 15µg); una glicilglicina: tigeciclina (TGC, 15µg); un aminoglucósido: gentamicina (GN, 10µg); y una pirimidina: trimetoprim (TM, 5µg). Se consideró una cepa multirresistente (MDR) cuando Metodología 113 presentaba resistencia frente a dos o más familias diferentes de antimicrobianos. La fuente utilizada para la interpretación de los resultados fue: http://www.eucast.org/clinincal_breakpoint/. Figura 22. Test de susceptibilidad a antimicrobianos por difusión disco-placa de dos cepas bacterianas diferentes. Fuente: imagen propia. 3.1.5. Análisis estadístico Se analizó la relación entre la presencia de la bacteria y la diana de muestreo (pollo o nido), para lo cual se realizó un modelo linear generalizado (GLM: General Linear Model). También se estudió la relación entre la presencia de bacteria y el tipo de muestra analizada (hisopo cloacal o heces), sexo (hembra o macho), edad (35-40, 41-45 o >45 días) y la provincia (Castellón, Valencia o Alicante). Para estos análisis se definió una distribución binomial y se utilizó una función de enlace probit. Se asignaron datos binomiales a cada muestra de manera que 1 representaba una muestra positiva a Salmonella, mientras que 0 representaba una negativa. Además, se estudió la posible relación entre la presencia de la bacteria en la muestra y el número de pollos en cada nido, usando de nuevo un GLM. Para ello se consideró la presencia de Salmonella como la variable respuesta y el número de pollos (1 o más de 1) como la variable fija. Para todos los análisis, un valor de p inferior a 0,05 fue considerado como indicador de diferencias estadísticamente significativas en la variable estudiada. Los análisis fueron realizados con una aplicación de software comercial (paquete software SPSS 21.0, SPSS Inc, Chicago, IL, 2002). http://www.eucast.org/clinincal_breakpoint/ Metodología 114 3.2. Estudio comparativo de muestras cloacales conservadas de águila de Bonelli (Aquila fasciata) recogidas en lugares de difícil acceso para la detección de Salmonella spp.: congelación vs refrigeración 3.2.1. Especie y área de estudio Durante las temporadas de cría de 2017 y 2018, se recogieron muestras de águila de Bonelli nacidas y criadas en diferentes nidos localizados en Andalucía, así como de las criadas en cautividad dentro de los proyectos Life Bonelli y Aquila a-Life. En el caso de las nacidas en libertad, el acceso a los nidos fue coordinado entre los veterinarios del Grupo de Rehabilitación de la Fauna Autóctona y su Hábitat (GREFA) y varios equipos de agentes forestales escaladores de la región, dentro de las acciones incluidas en los proyectos Life Bonelli (2017) y Aquila a-Life (2018). Una vez llegados al nido, los escaladores descendieron los pollos introduciéndolos en mochilas para poder realizar un examen veterinario completo a cada uno de ellos, recoger las muestras necesarias y marcar cada pollo con las anillas pertinentes y un emisor GPS o GSM. Entre las muestras recogidas, se incluyeron muestras de sangre para análisis completos, a fin de confirmar el estatus sanitario de cada individuo, además de las muestras necesarias para la realización de este estudio. El estudio fue llevado a cabo en colaboración con la Junta de Andalucía y siguiendo siempre las recomendaciones sobre bienestar animal de la directiva europea 2010/63/EU (Unión Europea 2010). En el caso de las águilas nacidas en cautividad, se esperó a que tuvieran una edad aproximada a los 45 días, momento en el que alcanzan el tamaño adulto, para aprovechar el manejo y realizar una revisión veterinaria completa, recoger la muestra necesaria para nuestro estudio y colocar el emisor GPS o GSM junto con las anillas (Figura 23). Figura 23. Revisión veterinaria de las águilas criadas en cautividad. Fuente: imágenes de GREFA. Metodología 115 Además de las muestras indicadas anteriormente, de cada individuo se anotó la edad, sexo, número de pollos por nido y localización del nido. La edad se determinó en base al desarrollo de las plumas, así como al cálculo aproximado de edad en días basado en el seguimiento observacional que realizan los agentes forestales sobre los nidos, y se definieron dos categorías diferentes (Figura 24): 9 Pollo/Cría (0-55 días): el cuerpo está completamente cubierto por plumón que poco a poco se desprende, a la vez que se desarrollan las plumas de vuelo. En esta etapa el individuo es alimentado por los padres. 9 Volantón (55-65 días): apenas queda plumón en la cabeza, y las plumas de vuelo están prácticamente desarrolladas en su totalidad. El individuo se alimenta por su cuenta de las presas que son facilitadas por los padres. Al final de esta etapa comienzan a realizar vuelos cortos cerca del nido. Figura 24. Diferencias entre un pollo/cría alimentado por un parental (izquierda) y un volantón (derecha) de águila de Bonelli. Fuente: proyecto Life Bonelli (GREFA). 3.2.2. Recogida y conservación de muestras cloacales Para la detección de Salmonella se recogieron dos hisopos cloacales de cada uno de los individuos incluidos en este estudio (libertad y cautividad), que se introdujeron en la cloaca aproximadamente 1 cm. Una vez recogidas las muestras se conservaron siguiendo dos protocolos de conservación. Por un lado, se conservaron en un medio FBP enriquecido con carbón activo, desde su recogida hasta su análisis tres meses después (Gorman y Adley, 2004) (Tabla 3). Metodología 116 Por otro, las muestras recogidas se conservaron en un medio de transporte Cary Blair (DELTALAB, Barcelona) en refrigeración desde su recogida hasta su procesado en el laboratorio. En este caso, las muestras se procesaron a su llegada al laboratorio, en un máximo de 72 horas desde su recogida. Tabla 3. Fórmula empleada para 500 ml de medio de transporte FBP con carbón activado Referencia comercial Cantidad Caldo nutriente nº2 Oxoid® CM67 12,50 g Agar bacteriológico Difco® 214010 0,60 g Glicerol Panreac 75 mL Extracto de levadura Difco® 212750 0,5 g Carbón activado Oxoid® 2,5 g Suplemento crecimiento para Campylobacter Oxoid® SR 0084 2 mL Agua destilada - 425 mL g: gramos; mL: mililitros 3.2.3. Aislamiento e identificación de Salmonella En el caso de las muestras congeladas, estas se descongelaron previamente a su siembra dejándolas en refrigeración 5 horas antes de su análisis. Posteriormente, se homogenizaron y el aislamiento de la bacteria se realizó siguiendo las indicaciones de la norma ISO 6579:2002 (Anexo D), descrita anteriormente. La misma norma se utilizó para el análisis de las muestras conservadas en refrigeración. Metodología 117 3.3. Estudio de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en aves urbanas de la Comunidad de Madrid 3.3.1. Población de estudio y recogida de muestras Para lograr el objetivo de este estudio se recogieron muestras de cinco especies diferentes de aves urbanas de la Comunidad de Madrid durante su primer examen trans su ingreso en el hospital de fauna silvestre de GREFA, siguiendo siempre las normas sobre bienestar animal descritas en el Real Decreto 53/2013 (BOE, 2013). Las especies incluidas en el estudio fueron: cigüeña blanca (Ciconia ciconia), gaviota sombría (Larus fuscus), paloma torcaz (Columba palumbus), estornino negro (Sturnus unicolor) y gorrión común (Passer domesticus). La recogida de muestras se realizó entre junio de 2018 y enero de 2019. El ingreso de los individuos en el hospital fue debido a diferentes causas: caída del nido, traumatismos y otras causas como botulismo, en el caso de las gaviotas, impactación de molleja por ingesta de cuerpos extraños, en el caso de las cigüeñas, o quedar atrapados en edificios. Todos los animales fueron identificados y clasificados por edad en jóvenes (incluyendo pollos y volantones) o adultos. Además, se recogió información sobre el ambiente en el que se encontraban antes de llegar al hospital, existiendo dos principales ambientes: rural y urbano. En el caso de las gaviotas, el ambiente urbano estaba siempre asociado a la alimentación en vertederos. En las cigüeñas se consideraron los vertederos como un tercer tipo de ambiente. Tras el registro de toda la información, se realizó un examen veterinario completo de cada animal, anotando todos los signos clínicos observados en caso de haberlos. Cuando fue necesario necesario se realizaron pruebas de diagnóstico complementarias como hematologías, bioquímicas, radiografía y ecografía. Por último, antes de administrar ningún fármaco, se recogió un hisopo cloacal, el cual se conservó en medio Cary Blair a 4ºC hasta su procesado en el laboratorio de GREFA (Figura 25). Metodología 118 Figura 25. Recogida de hisopos cloacales en cigüeña blanca y paloma torcaz. Fuente: imágenes de GREFA. 3.3.2. Aislamiento e identificación de Salmonella Todas las muestras fueron analizadas de acuerdo con la norma ISO 6579-1:2017 (Anexo D), la cual se detalla en el apartado de “Metodología”. Las cepas de Salmonella fueron enviadas al Laboratorio Nacional de Referencia para Salmonelosis Animal (LCV, Algete), donde se determinó el serotipo de cada una de ellas mediante aglutinación antigénica con antisueros específicos siguiendo el esquema Le Minor-White-Kauffman (Grimont y Weill, 2007). 3.3.3. Test de susceptibilidad a antimicrobianos Por último, se realizó un test de susceptibilidad a antimicrobianos a todas las cepas aisladas en el Laboratorio Nacional de Referencia para Salmonelosis Animal (Laboratorio Central de Veterinaria, Algete), utilizando el método de microdilución en caldo Mueller-Hinton y siguiendo las recomendaciones de la norma ISO 20776-1:2006 para determinar la CMI. De acuerdo con la decisión europea 2013/652/EU (European Union, 2013), se analizó la susceptibilidad a un total de 14 antimicrobianos de diferentes familias, incluyendo dos quinolonas: ciprofloxacino (CIP) y ácido nalidíxico (NA); cuatro beta-lactámicos: ampicilina (AMP), cefoxitina (FOX), ceftazidime (CAZ) y meropenem (MEM); un fenicol: cloranfenicol (CHL); una sulfonamida: sulfametoxazol (RL); una polimixina: colistina (COL); un macrólido: azitromicina (AZM); una glicilciclina: tigeciclina (TGC); un aminoglucósido: gentamicina (GN); una pirimidina: trimetoprim (W); y una Metodología 119 tetraciclina; tetraciclina (TCY). Los resultados obtenidos clasificaron cada una de las cepas en sensible, intermedia y resistente a cada uno de los antimicrobianos incluidos en el test, en base a los puntos de corte epidemiológicos recomendados por EUCAST (Leclerq et al., 2013). Al no tener punto de corte definido, los resultados de azitromicina y sulfametoxazol no pudieron ser interpretados. Se consideró una cepa multirresistente en caso de mostrar resistencia al menos a un antimicrobiano de dos o más familias diferentes. 3.3.4. Análisis estadístico Todos los resultados fueron analizados estadísticamente con una aplicación de software comercial (SPSS 21.0 software package; SPSS Inc., Chicago, IL, 2002). Se realizó un modelo lineal generalizado (GLM) para estudiar la relación entre la presencia de Salmonella y las características de los individuos incluidos en el estudio (especie animal, edad, patología primaria y ambiente). También se realizó un test de chi-cuadrado para estudiar la relación entre Salmonella y las resistencias halladas. Finalmente se realizó un último test de chi-cuadrado para estudiar la relación entre los serovares aislados y el origen de las aves urbanas. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa cuando el valor p fue igual o inferior a 0.05 (p ≤ 0.05). Metodología 120 121 4.Resultados 122 Resultados 123 4.1. Estudio de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en aves rapaces autóctonas de la península Ibérica, utilizando como modelo el águila de Bonelli o águila perdicera (Aquila fasciata) 4.1.1. Resumen Numerosos estudios confirman la implicación de las aves silvestres en la diseminación de enterobacterias patógenas en el medio ambiente. El objetivo de este estudio fue estudiar la presencia de Salmonella en volantones de águila de Bonelli nacidos en libertad en la Comunidad Valenciana, y detectar las resistencias a antimicrobianos que las cepas aisladas pudieran portar. Además, se comparó la eficacia de dos muestras diferentes para la detección de Salmonella mediante cultivo bacteriano: heces frescas recogidas del nido frente a hisopos cloacales recogidos de cada volantón. En total se analizaron 28 nidos y 45 volantones. En los nidos, la prevalencia de Salmonella fue de 61±9,2%, mientras que en los volantones la prevalencia de la bacteria fue de 36±7,1%. Entre todas las cepas aisladas se identificaron ocho serovares diferentes, siendo los más frecuentes S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Houston y S. Cerro. En cuanto a las resistencias a antimicrobianos, el 36,8% de las cepas mostraron un fenotipo resistente a ampicilina, y un 5,3% frente a tigeciclina. En conclusión, este estudio demuestra el papel de los volantones de águila de Bonelli como portadores asintomáticos de Salmonella resistente. Además, confirma que la detección de Salmonella mediante cultivo es más eficaz a partir de muestras de heces frescas. 4.1.2. Referencias Artículo científico: Referencia bibliográfica: Martín-Maldonado, B., Montoro-Dasi, L., Pérez-Gracia, M. T., Jordá, J., Vega, S., Marco-Jiménez, F., & Marin, C. (2019). Wild Bonelli’s eagles (Aquila fasciata) as carrier of antimicrobial resistant Salmonella and Campylobacter in Eastern Spain. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 67, 101372. Índice de Impacto de la revista: 1.573 en JCR en 2019 en Veterinary Science Posición de la revista: Q2 en JCR en 2019 en Veterinary Science Resultados 124 Proceedings: x Martín-Maldonado B.; Montoro-Dasí, L.; Jordá, J.; Vega, S.; Revuelta, L; Marin, C. "Detección de resistencias a antimicrobianos en Salmonella en una población de águila de Bonelli". XIII Congreso de Investigación para Estudiantes Pregraduados de Ciencias de la Salud y XVII Congreso de Ciencias Veterinarias y Biomédicas (Abril, 2018), Madrid. Comunicación oral. x Montoro-Dasí L.; Martín-Maldonado, B.; Pérez-Gracia, M.T.; Marin, C. "¿Es posible que las águilas perdiceras sean fuente de diseminación de Salmonella en el medio ambiente?". 15th Congreso Internacional de Estudiantes (Abril, 2018), Valencia. Comunicación oral. Resultados 125 Resultados 126 Resultados 127 Resultados 128 Resultados 129 Resultados 130 Resultados 131 4.2. Estudio comparativo de muestras cloacales conservadas de águila de Bonelli (Aquila fasciata) recogidas en lugares de difícil acceso para la detección de Salmonella spp.: congelación vs refrigeración 4.2.1. Resumen Salmonella es una de las enterobacterias más importantes en salud pública y sanidad animal de los últimos años al ser la causante de numerosos brotes con diferente sintomatología clínica. Dentro del amplio rango de especies hospedadoras que presenta Salmonella se incluye la fauna silvestre, y más concretamente las aves silvestres, que pueden portar de manera asintomática la bacteria y diseminarla a largas distancias. Dada la cantidad de conexiones directas o indirectas, que existen entre la salud pública, la sanidad animal y el medio ambiente, el concepto One Health destaca la importancia de integrar las tres disciplinas para un completo abordaje. En este contexto, es esencial estudiar la epidemiología de Salmonella en estas especies silvestres a fin de obtener la información más óptima posible. Para la detección de Salmonella, las muestras deben ser procesadas lo antes posible. Sin embargo, el acceso a las poblaciones de aves silvestres puede resultar laborioso al habitar regiones distantes e inaccesibles, retrasándose el análisis de las muestras. Este estudio compara dos métodos diferentes de conservación de muestras. Para ello, se recogieron dos hisopos cloacales de 63 volantones de águila de Bonelli localizados en diferentes nidos de Andalucía. Uno de los hisopos fue conservado en medio nutritivo suplementado con FBP y carbón activado en congelación a -20ºC. El otro hisopo fue conservado en refrigeración en medio Cary Blair. La detección de Salmonella se realizó siguiendo las recomendaciones de la norma ISO 6579-1:2017 (Anexo D). Independientemente del método de conservación utilizado, el aislamiento de Salmonella por cultivo bacteriológico no fue posible en ninguna muestra. 4.2.2. Referencias Artículo científico: Referencia: Martín-Maldonado, B., Moraleda Fernández, V., Mencía-Gutiérrez, A., Pastor Tiburón, N., López Márquez, I., Suárez Regalado, L., González, F., Revuelta, L., & Marin, C. Comparative study of preserved cloacal simples from Bonelli’s Eagle (Aquila fasciata) collected in places with difficult Access for Salmonella detection: freezing vs. refrigeration. Under review in Current Microbiology. Resultados 132 Índice de Impacto de la revista: 1.746 en JCR en 2019 en Microbiology (enviado, en fase de revisión) Posición de la revista: Q4 en JCR en 2019 en Microbiology Resultados 133 Resultados 134 Resultados 135 Title Page Comparative study of preserved cloacal samples from Bonelli’s eagle (Aquila fasciata) collected in places with difficult access for Salmonella detection: freezing vs. refrigeration Martín-Maldonado, B.1,2*, Moraleda Fernández, V.1,2, Mencía-Gutiérrez, A.2, Pastor Tiburón, N.1,2, López Márquez, I.1,2, Suárez Regalado, L.1,2 González, F.1,2, Revuelta, L.2,3, Marin, C.2,4 1Grupo de Rehabilitación de la Fauna Autóctona y su Hábitat (GREFA). Hospital de Fauna Salvaje. Madrid, Spain. 2Grupo de Estudio de la Medicina y Conservación de la Fauna Silvestre (GEMAS), Spain. 3Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid. Departamento de Fisiología Animal. Madrid, Spain. 4Facultad de Veterinaria, Universidad CEU-Cardenal Herrera. Instituto de Ciencias Biomédicas. Departamento de Producción Animal, Sanidad Animal y Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Valencia, Spain. *Corresponding author: Bárbara Martín-Maldonado. Postal address: GREFA C/ Monte del Pilar, s/n. CP 28220, Majadahonda (Madrid), SPAIN. E-mail address: bmmjimenezvet@gmail.com Acknowledgements The authors would like to thank the GEMAS Research Group (Grupo de Estudio de Medicina y Conservación de Animales Salvajes), CAMPYSALMO Research Group, Sandra Sevilla Navarro among them, and GREFA volunteers for their technical support, especially Francisco J. García-Peña, Omar El Moulate and Alicia Carrero. Funding information This study was funded by the CEU-Cardenal Herrera University (INDI 16/32) and University Complutense of Madrid, in collaboration with LIFE Bonelli (LIFE12 NAT/ES/000701) and AQUILA a-LIFE (LIFE16 NAT/ES/000235) projects. Author contributions All authors contributed to the study conception, design and development. Funding was obtained by Fernando González, Clara Marín and Luis Revuelta. Material preparation and samples collection were performed by Virginia Moraleda, Laura Suárez Regalado, Natalia Pastor Tiburón and Irene López Márquez. Microbiology analysis were performed by Clara Marin, Bárbara Martín-Maldonado and Aida Mencía- Gutiérrez. The study was supervised by Fernando González and Clara Marin. The first draft of the manuscript was written by Bárbara Martín-Maldonado and Clara Marín and all authors commented on previous versions of the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. mailto:bmmjimenezvet@gmail.com Resultados 136 Compliance with ethical standards Conflict of interest. The authors declare that they have no conflict of interest. Ethical approval. All procedures performed with animals are in accordance with the ethical standards of the European Union (Directive 2010/63/EU). Resultados 137 Blinded Paper Comparative study of preserved cloacal samples from Bonelli’s eagle (Aquila fasciata) collected in places with difficult access for Salmonella detection: freezing vs. refrigeration Abstract Salmonella is one of the most relevant enterobacteria in both public and animal health, as it causes a large number of outbreaks with different clinical signs. The wide range of species that Salmonella can host include wildlife, and more specifically wild birds, which can spread the bacteria over large distances. The One Health approach stands for the integration of public health, animal health and environmental health as one, due to the numerous interconnections between all of them. In this context, it becomes essential to study the epidemiology of Salmonella in these species in order to achieve the most optimal information possible. For Salmonella detection, samples should be analysed as soon as possible. However, the access to wild bird populations can be arduous when they live in distant or inaccessible regions. In this experimental study, two different methods of sample preservation are compared. Two cloacal swabs were collected from 63 Bonelli’s eagle nestlings from different nests in Andalusia and stored in different transport media. The first one was preserved on FBP medium with activated charcoal and frozen. The second was refrigerated in Cary Blair medium. Salmonella detection was performed following ISO 6579-1:2017 (Annex D) recommendations. Salmonella isolation was not possible from all the samples, independently of the preservation method used. Keywords: Bonelli eagle, Salmonella, sample preservation, wildlife, conservation Introduction Salmonella is an enterobacterium with relevant impact upon public health due to the large number of salmonellosis cases reported every year. Clinical signs can vary from gastrointestinal symptomatology to septicaemia, arthritis or meningitis (EFSA 2019). The distribution of Salmonella is wide, as a multitude of animal species can host the bacteria in their intestine. Wild birds have been described as an important reservoir of Salmonella and potential disseminators in the environment (de Lucía et al. 2018; Rula et al. 2019). The prevention of Salmonella dissemination is essential for the control of salmonellosis in both humans and animals. Regarding One Health premises, a multifactorial approach is essential to obtain the best results, including public health, animal health and environmental health, involving wildlife. Nevertheless, the access to many wildlife species represents a major challenge, as they commonly inhabit remote regions and the handling of these animals requires a high level of specialisation. Thus, results obtained in different studies are difficult to compare (Reche et al. 2003; Millán et al. 2004; Marin et al. 2014). Resultados 146 Resultados 147 4.3. Estudio de Salmonella y las resistencias a antimicrobianos asociadas en aves urbanas de la Comunidad de Madrid 4.3.1. Resumen Las resistencias a antimicrobianos (AMR) es uno de los principales retos del siglo XXI. Las aves silvestres han sido descritas como reservorios de resistencias a antimicrobianos en diferentes especies bacterianas como Salmonella spp. Por otro lado, la escasez de alimento, el cambio climático y el crecimiento demográfico de los últimos años han forzado a numerosas especies de fauna silvestre a modificar sus hábitos alimentarios acercándose a zonas urbanas. En este contexto, el objetivo de este estudio fue detectar la presencia de Salmonella, junto con la de AMR, en aves silvestres que habitan en las ciudades y alrededores. Para ello, un total de 300 aves urbanas fueron incluidas, de las cuales se recogió un hisopo cloacal para la detección de Salmonella. Las muestras se procesaron siguiendo las recomendaciones de la norma ISO 6579- 1:2017 (Anexo D), y el serotipado de las cepas aisladas se realizó de acuerdo con el esquema de White-Kauffman-Le Minor. El análisis de susceptibilidad a antimicrobianos se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Decisión Europea 2013/652/EU. Del total de muestras recogidas, se aisló Salmonella en el 12,3%, siendo las cigüeñas blancas provenientes de vertederos las aves con mayor porcentaje de positividad (p<0,05). Los serotipos más frecuentemente hallados fueron zoonóticos (S. Enteritidis, S. Typhimurium y mST). Además, el 40,5% de las cepas aisladas mostraron resistencias, principalmente frente a ciprofloxacino (36,4%), ácido nalidíxico (36,4%) y colistina (27,3%). Estos resultados muestran la importancia del control del consumo de antimicrobianos, así como de la gestión de los residuos que generan a fin de disminuir el desarrollo de AMR en núcleos urbanos que puedan diseminarse por el medio ambiente. Para ello es vital la cooperación entre la comunidad científica, la administración pública y la población en general. 4.3.2. Referencias Artículo científico: Referencia bibliográfica: Martín-Maldonado, B., Vega, S., Mencía-Gutiérrez, A., Lorenzo- Rebenaque, L., de Frutos, C., González, F., Revuelta, L. & Marin, C. (2020). Urban birds: An important source of antimicrobial resistant Salmonella strains in Central Spain. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 101519. Resultados 148 Índice de Impacto de la revista: 1.573 en JCR en 2019 en Veterinary Science Posición de la revista: Q2 en JCR en 2019 en Veterinary Science Proceedings: x Martín-Maldonado, B.; González, F.; Mencía-Gutiérrez, A.; López, I.; Suárez, L.; Moraleda, V.; Revuelta, L.; Marín, C.; Vega, S. "Salmonella spp detection in white storks and ring doves admitted at a wildlife rescue center in central Spain". 4th International Conference on Avian, Herpetological and Exotic Mammal Medicine – ICARE (Abril, 2019), London (UK). Póster. x Martín-Maldonado, B.; Revuelta, L.; Vega, S.; Marín, C. "Importancia de los residuos urbanos en la diseminación de resistencias a antimicrobianos en Salmonella spp". V Jornadas de Investigación en Doctorado - PhDay Complutense – VETINDOC (Junio, 2019), Madrid. Comunicación oral. Resultados 149 Resultados 150 Resultados 151 Resultados 152 Resultados 153 Resultados 154 155 5.Discusión general 156 Discusión general 157 A lo largo de este trabajo se pone de manifiesto la importancia del estudio de la fauna silvestre en su papel como agente diseminador de microorganismos de importancia en salud pública como Salmonella. Además, resalta la importancia del método de conservación de muestras en especies que habitan zonas remotas a fin de llevar un control más exhaustivo y comparable sobre el estado sanitario de los ecosistemas. Numerosos estudios muestran la estrecha relación que existe en la actualidad entre el ser humano, los animales y el ecosistema a través de múltiples vías de conexión (One Health), de manera que cualquier efecto en uno de los tres sectores repercute de una manera u otra en los otros dos (Rhyan y Spraker, 2007). El concepto One Health o Única Salud se refiere a la necesidad de abordar las enfermedades desde un punto de vista más amplio, que incluya la salud pública, la sanidad animal y la salud de los ecosistemas (Zaragoza et al., 2019). En las últimas décadas se ha producido un aumento exponencial en la diseminación de numerosos patógenos, en parte debido a la globalización, por lo que cada vez es más necesario un sistema de alerta temprana de posibles patógenos. En este sentido, el ecosistema se puede definir como un buen indicador del estado sanitario de una región, siendo de vital importancia el estudio de la fauna silvestre para este fin (Zaragoza et al., 2019). Salmonella sigue siendo hoy por hoy una de las zoonosis más importantes tanto en Europa, como en el mundo (WHO, 2018; EFSA, 2019). A lo largo de los últimos años se ha detectado un alto porcentaje de aves silvestres portadoras de Salmonella (Reche et al., 2003; Millán et al., 2004; Molina-López et al., 2011:2015; Marin et al., 2014:2018; Krawiec et al., 2015; Jurado- Tarifa et al., 2016; Mather et al., 2016; Troxler et al., 2017). Sin embargo, no todos los serotipos de Salmonella tienen la misma capacidad patógena, por lo que en el estudio de epidemiológico de dicha bacteria resulta imperativo la determinación de los serotipos de las cepas aisladas (WHO, 2018). Los serotipos detectados en fauna silvestre son variados. Un estudio realizado por Marin et al. (2014) en buitre leonado (Gyps fulvus) detectó hasta seis serotipos diferentes, entre los cuales se encontraba S. Typhiumurium, uno de los serotipos más detectados en los casos de salmonelosis humana y animal. Otros serotipos como Enteritidis, mST, Infantis o Newport han sido también detectados en muestras procedentes de diferentes especies de aves silvestres (Andrés et al., 2013; Molina-López et al., 2015; Gruszynski et al., 2014; Marin et al., 2014:2018). Por otro lado, en los últimos años las AMR han adquirido gran protagonismo en todo el mundo, presentándose a día de hoy como el mayor reto al que se enfrenta la medicina occidental moderna (O’Neil, 2014; EFSA, 2019). Se consideran responsables de cerca de 700.000 muertes al año en todo el mundo, no sólo por el fallo terapéutico directo que producen en enfermedades Discusión general 158 infecciosas contraídas de manera primaria, sino por infecciones nosocomiales derivadas de la estancia en un hospital, donde el desarrollo de AMR por parte de las bacterias circulantes en ese entorno se eleva exponencialmente (Jasovsky et al., 2016). Por esta razón, se considera de gran interés incluir el estudio de las AMR en las investigaciones bacteriológicas llevadas a cabo no sólo en humanos, sino también en animales, incluyendo la fauna silvestre. De esta manera, se pretende obtener una visión más global del problema a fin de establecer y mejorar protocolos que ayuden a frenar su expansión (Zaragoza et al., 2019). Diversos estudios demuestran que la presión ambiental de antibióticos a las que se exponen las bacterias influye directamente en el desarrollo o adquisición de resistencias frente a estos antibióticos (Oteo-Iglesias, 2016). En base a esta teoría, cabría esperar un porcentaje bajo o nulo de bacterias resistentes aisladas de fauna silvestre. Numerosos estudios muestran porcentajes moderados de detección de AMR en estas especies, los cuales van en aumento con el tiempo (Allen et al., 2010; Ramos et al., 2010; Antilles et al., 2015; Faruq et al., 2016; Troxler et al., 2017; Marin et al., 2018; Sevilla et al., 2020). En este sentido, nuestro primer trabajo experimental se centró en el estudio epidemiológico de Salmonella, así como de las resistencias a antimicrobianos asociadas, en individuos jóvenes de águila de Bonelli presentes en nidos de la Comunidad Valenciana. Los resultados obtenidos fueron muy superiores a lo esperado (35,5%), confirma el potencial reservorio y diseminador que supone la fauna silvestre para la transmisión de esta bacteria (Martín-Maldonado et al., 2019). Es importante señalar que, al no haber observado signos compatibles con salmonelosis en ninguno de los animales, podemos considerar a esta especie como reservorio asintomático. A pesar de que estudios previos demuestran la presencia de Salmonella en aves rapaces silvestres, la tasa de animales positivos por lo general es notablemente inferior a los obtenidos en nuestro trabajo, variando entre 4,2% y 8,5% en la Península Ibérica (Millan et al., 2004; Molina-López et al., 2015; Jurado-Tarifa et al., 2016). Concretamente en el águila de Bonelli, Reche et al. (2003) no obtuvo ningún individuo positivo. Sin embargo, ese estudio incluyó únicamente individuos adultos, mientras que el nuestro se centra en pollos. Numerosas publicaciones confirman una mayor presencia de Salmonella en individuos jóvenes, debido probablemente a las variaciones que sufre la microbiota intestinal durante el desarrollo de las crías hasta constituir una microbiota estable (Teyssier et al., 2018; Kohl et al., 2019). Además, las crías de águila de Bonelli son alimentadas por los padres, durante sus fases de pollo y volantón, hasta que desarrollan por completo el plumaje y son capaces de volar y obtener por sí mismos alimento (Battisti et al., 1998). De esta manera, los restos de alimento se juntan con las heces de las crías y parentales en el nido, en el que se encuentran las crías hasta su emancipación, favoreciendo la transmisión de bacterias entre parentales, crías y restos de Discusión general 159 alimento. En cuanto a los serotipos más detectados en los individuos de águila de Bonelli analizados, S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Houston destacan claramente. Los tres serovares han sido previamente hallados en diferentes especies de aves silvestres y animales domésticos, y con una evidente capacidad zoonótica, poniendo de manifiesto la importancia de las aves silvestres portadoras en la circulación de la bacteria en el medio rural y en la transmisión de la misma entre fauna silvestre, animales domésticos, de granja y el ser humano (Marin et al., 2014:2018; Blanco, 2018; EFSA, 2019). Por otro lado, el porcentaje obtenido de cepas resistentes a antimicrobianos fue relativamente alto (36,8%), observando resistencia principalmente frente a ampicilina, aunque también se obtuvo una cepa resistente a tigeciclina. Ambos antibióticos han sido empleados de manera habitual en veterinaria, principalmente en producción porcina. En la Comunidad Valenciana la cabaña ganadera porcina destaca notablemente entre las demás, siendo una región con un alto número de explotaciones porcinas, a diferencia de otras comunidades como País Vasco o Madrid. A pesar de todas las medidas de seguridad implementadas, son muchas las especies de fauna silvestre que se alimentan en las proximidades de estas granjas, como las palomas, exponiéndose a la adquisición de multitud de bacterias muchas veces resistentes (Andrés et al., 2013). A falta de perdiz roja y conejo, el águila de Bonelli se alimenta de otras aves de pequeño tamaño, entre las que destacan las columbiformes (Moleón et al., 2012), bien porque la hayan adquirido en granjas de producción, abundantes en la región, o bien en ciudades. Las palomas podrían ser el agente transmisor de esta bacteria, ligando la actividad humana con el medio ambiente y confirmando la existencia de esa red de conexiones entre los diferentes sectores a la que hace alusión el concepto One Health. Finalmente, este estudio, nos permitió reafirmar que el mejor tipo de muestra para la detección de Salmonella en águila de Bonelli mediante cultivo bacteriológico son las heces frescas recogidas en el nido. Al igual que el tipo de muestra recogido, la conservación de la misma hasta su análisis en el laboratorio tiene gran importancia en la obtención de resultados comparables entre países. En bacteriología, y más concretamente en la detección de Salmonella, los expertos recomiendan siempre el análisis de la muestra lo más temprano posible, a fin de mantener la viabilidad de las bacterias que puedan estar presentes en la muestra recogida. Sin embargo, en ocasiones los trabajos realizados con fauna silvestre, requieren de un mayor margen de tiempo desde que se recoge la muestra, hasta que se procesa en el laboratorio, pues se trata de animales huidizos de muy difícil captura, y que en muchas ocasiones se encuentran en zonas remotas o de difícil acceso para los investigadores (Cross et al., 2012). Para estas situaciones, se ha descrito la utilidad de determinados medios de transporte para la conservación de ciertas bacterias Discusión general 160 durante un mayor periodo de tiempo, dando más margen al investigador (Palmgren et al., 2000; Gorman y Adley, 2004; Ivenson et al., 2009; Berenger et al., 2019). Es importante tener en cuenta la logística que hay detrás de todos estos estudios, así como los objetivos propuestos, para poder elegir el método de conservación de muestras que más se ajuste a cada uno de ellos. El objetivo de nuestro segundo trabajo experimental fue comparar la eficacia de dos métodos previamente descritos en la detección de Salmonella a partir de hisopos cloacales de pollos de águila de Bonelli. Los métodos escogidos ya habían sido utilizados con éxito para la conservación, y posterior cultivo, de enterobacterias: el medio FBP enriquecido con carbón activado mantenido a -20ºC por un lado, y el medio Cary Blair mantenido a 4ºC por otro. Independientemente del medio de conservación empleado, no se consiguió aislar Salmonella de ninguna de las muestras recogidas. Mientras que García-Peña et al. (2017) utilizaron el medio FBP enriquecido con carbón activado en congelación para la detección de Campylobacter pero no de Salmonella, el medio de transporte Cary Blair mantenido en refrigeración sí que se ha utilizado previamente para la preservación de Salmonella, aumentando su viabilidad de la bacteria durante un margen mayor de tiempo (Berenger et al., 2019). Por otro lado, las rápidas fluctuaciones de temperatura sufridas por las muestras desde su recogida hasta la llegada al laboratorio, pueden dar lugar a daños irreversibles en la membrana celular que impidan el posterior cultivo de las bacterias o incluso a la muerte prematura de las mismas, explicando los resultados obtenidos en este estudio (Mindock et al., 2001; Semenov et al., 2007; Ramamurthy et al., 2014). Teniendo en cuenta esto, los estudios realizados en regiones remotas con fauna silvestre podrían dar lugar a resultados subestimados, según el método de conservación de muestras y el tiempo de demora entre la extracción de muestras y su análisis. En cambio, estudios realizados en centros de recuperación o poblaciones de más fácil acceso obtendrían resultados más veraces al llegar las muestras antes al laboratorio. En este sentido, nuestro tercer estudio se centró en el estudio epidemiológico de Salmonella en 300 aves urbanas ingresadas en un centro de recuperación de fauna silvestre de Madrid, incluyendo diferentes especies autóctonas con diferentes comportamientos y hábitos. La estrecha relación entre ser humano y fauna silvestre, que se observa en las ciudades, puede potenciar enormemente la diseminación en ambas direcciones de microorganismos como Salmonella, así como la de resistencias a antimicrobianos (Ramos et al., 2010; Hilbert et al., 2012; Andrés et al., 2013:2014; Antilles et al., 2015; Krawiec et al., 2015; Gomez et al., 2016; Bárbara et al., 2017; Migura-García et al., 2017). En esta ocasión, las muestras recogidas para nuestro estudio fueron hisopos cloacales, debido a la facilidad de muestreo durante la primera exploración veterinaria del animal, en el momento de su ingreso. Para asegurar unos buenos Discusión general 161 resultados, las muestras fueron procesadas en menos de 12 horas en el laboratorio del mismo centro. Pese a haber obtenido en total un 12,3% de individuos positivos a Salmonella, nuestros resultados muestran diferencias significativas entre las diferentes especies, siendo la cigüeña blanca la que mayor positividad de Salmonella obtuvo (59,5%), y mancando una enorme diferencia con especies como el gorrión común o el estornino negro (Gómez et al., 2016, Dolejska et al., 2016; Haesendonk et al., 2016). En el caso de los gorriones, en cambio, obtuvimos una positividad del 5,4%, pese a que la familia de las paseriformes siempre ha mostrado prevalencias superiores de Salmonella, siendo incluso una importante causa de mortandad en estas especies (Refsum et al., 2003; Hernández et al., 2012; Giovannini et al., 2013; Brobey et al., 2017). No obstante, la mayoría de estos estudios se centran el diagnóstico de animales con sintomatología y que presentaban altas mortalidades, mientras que nuestro estudio recogió muestras de individuos sanos. En este sentido, Rouffaer et al. (2016) concluyeron que los gorriones comunes no constituyen un reservorio significativo de Salmonella, pues no se aisló la bacteria de ninguno de los individuos incluidos en el estudio. De nuevo, los serotipos más frecuentes aislados entre las cepas aisladas de las aves urbanas, se corresponden con los tres serotipos zoonóticos más prevalentes en producción animal y los cuales han sido aislados también en brotes de salmonelosis humana: S. Enteritidis, S. Typhimurium y mST (Hernandez et al., 2016; Troxler et al., 2017; Blanco et al., 2018; EFSA, 2019). En este contexto, Hernández et al. (2016) relacionaron la presencia de S. Typhimurium en ibis blanco de Florida, en diferentes casos de salmonelosis en personas, poniendo de manifiesto el fuerte carácter zoonótico de este serotipo, así como el papel que juega la fauna urbana como reservorio y diseminador del mismo. Por otro lado, se detectó una relación estadísticamente significativa entre las cigüeñas positivas Salmonella y el lugar de procedencia de las mismas, siendo mayor la positividad en aquellas que venían de vertedero (77,3%). Además, en el caso de la gaviota sombría, todos los individuos positivos se alimentaban también en vertederos (Martín-Maldonado et al., 2020). La mala gestión de residuos y la acumulación de los mismos en los vertederos, favorecen la proliferación y supervivencia de numerosos microorganismos, así como el desarrollo de resistencias a antimicrobianos por parte de las bacterias ambientales. El análisis de la resistencia a antimicrobianos mostró un alto porcentaje de cepas resistentes al menos a un antimicrobiano (40,5%), siendo los antimicrobianos más afectados la ciprofloxacina (36,4%), el ácido nalidíxico (36,4%) y la colistina (27,3%). Estos datos se asemejan a los obtenidos por Troxler et al. (2017), y adquieren gran relevancia en el caso de las enterobacterias, y concretamente de Salmonella, debido a los antimicrobianos afectados, debido a la importancia de las quinolonas y la colistina en el tratamiento de la salmonelosis (Ruiz-Garbajosa et al., 2016; Rebelo et al., 2018). Discusión general 162 Finalmente cabe destacar que, de todas las cepas resistentes de Salmonella aisladas de aves urbanas, el 86,7% fueron consideradas multirresistentes, lo que pone de manifiesto la presión ambiental de antimicrobianos a la que se ven sometidas estas especies urbanas, y por tanto las personas. En conclusión, las aves autóctonas, tanto de vida silvestre como urbana, constituyen un importante reservorio de Salmonella, así como de resistencias a antimicrobianos, y juegan un papel crucial en la diseminación de ambos en ciudades y medio ambiente. Además, la falta de estandarización de los protocolos de recogida de muestras, así como la conservación de las mismas hasta su análisis, puede dar lugar a resultados muy dispares entre comunidades e incluso países. Por tanto, es necesario realizar controles sanitarios estandarizados de la fauna autóctona, a fin de estudiar la evolución en microorganismos patógenos como Salmonella, así como de sus resistencias. 163 6.Conclusiones 164 Conclusiones / Conclusions 165 1. El águila de Bonelli juega un importante papel como portadores asintomáticos y diseminadores de Salmonella spp. así como de resistencias a antimicrobianos. 2. En la comparación de recogida de hisopo cloacal frente a recogida de heces frescas para la detección de Salmonella por cultivo, resulta ser más eficaz el análisis a partir de muestras de heces frescas. 3. En cuanto a la conservación de muestras, el uso de medio nutritivo con suplemento FBP mantenido en congelación no es efectivo para la detección de Salmonella mediante cultivo bacteriológico a partir de hisopos cloacales de individuos jóvenes de águila de Bonelli, al igual que el medio Cary Blair conservado en refrigeración durante 72 horas. 4. Las aves urbanas son también reservorio de Salmonella, variando notablemente la prevalencia entre las especies estudiada, siendo mayor en cigüeña blanca (59,5%), seguida de paloma torcaz (18,9%), gaviota sombría (13,3%), gorrión común (5,4%) y estornino negro (2,7%). 5. Además, en el caso de las cigüeñas, se observa una relación estadísticamente significativa entre la presencia de Salmonella y el origen de los individuos, siendo más frecuente en aquellos que provienen de vertederos y alrededores. 6. Finalmente, se ha detectado un moderado-alto porcentaje de AMR en las cepas de Salmonella aisladas, siendo ligeramente mayor en aves urbanas (40,5%) que en águila de Bonelli (36,8%). Entre todas las resistencias halladas, cabe destacar la resistencia frente a colistina en aves urbanas (27,3%). Conclusiones / Conclusions 166 1. Bonelli’s eagle plays an important role as asymptomatic carriers and disseminators of different serovars of Salmonella spp. and antimicrobial resistances. 2. Comparing cloacal swab collection versus fresh feces collection for Salmonella detection, the analysis from fresh feces samples is more efficient. 3. On the sample preservation, nutritive medium with FBP supplement maintained in freezing temperatures is not effective for Salmonella detection by bacteriological culture from cloacal swabs from young Bonelli’s eagles. Cary Blair medium maintained in refrigeration temperatures during 72 hours is neither effective. 4. Urban birds are also reservoirs of different zoonotic serotypes of Salmonella. However, Salmonella detection varies among bird species, being higher in white stork (59.5%), followed by common wood pigeons (18.9%), black-backed gulls (13.3%), house sparrows (5.4%) and common starlings (2.7%). 5. In addition, in white storks, a statistically important relation has been obtained between Salmonella detection and the origin of animals, being more frequent in storks from landfills. 6. Finally, a moderate-high percentage of antimicrobial resistances was observed in both studies, being higher in urban birds (40.5%) than in Bonelli’s eagle (36.8%). Among AMR detected, colistin resistance stands out in urban birds (27.3%). 167 7.Referencias bibliográficas 168 Referencias Bibliográficas 169 Acha, P. N., & Szyfres, B. (2003). Zoonoses and communicable diseases common to man and animals. Vol. I. Bacterioses and mycoses. Scientific and Technical Publication No. 580. Pan American Health Organization, Regional Office of the WHO, Washington, USA, 384, pp. 392. Agersø, Y., Torpdahl, M., Zachariasen, C., Seyfarth, A., Hammerum, A. M., & Nielsen, E. M. (2012). Tentative colistin epidemiological cut-off value for Salmonella spp. Foodborne pathogens and disease, 9(4), 367-369. Ajene, A. N., Walker, C. L. F., & Black, R. E. (2013). Enteric pathogens and reactive arthritis: a systematic review of Campylobacter, Salmonella and Shigella-associated reactive arthritis. Journal of health, population, and nutrition, 31(3), 299. Alvarado, A., & Xavier, D. (2016). 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