UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Departamento de Biología Animal I (Zoología) TESIS DOCTORAL Evolución de Pelobatidos y Peloditidos (Amphibia, Anura): morfología y desarrollo del sistema esquelético MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María del Rosario Rodríguez Talavera Director Francisco de Borja Sanchiz y Gil de Avalle Madrid Ed. electrónica 2019 © María del Rosario Rodríguez Talavera, 1989 /L °'`^`^^ Departamento de Biología Animal I Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Complutense de Madrid ireeemema HVOLIICIOB DH PHLOBATIDOS Y PHLODITIDOS (A1^[PHIBIA, AHURA): XORFOLOGIA Y DHSARROLLO DHL SISTHxA HSQIIñLHTICO Memoria presentada para optar al grado de doctor en Ciencias Biológicas por l[aría del xosarío Rodríguez Talavera v^ B^ del director de la tesis ^^%^ ^a ^-...^r ^ Dr. D. Francisco de Borja Sanchíz y Gil de Avalle Invest:igador del CSIC en el Museo Nacional de Ciencias Iiaturales Madrid, octubre de 1989 AGRADfiCII[ IfiHTOS En primer lugar deseo expresar mi agradecimiento al Dr. Sanchíz, director de esta tesis, por sugerirme el tema de investigación y por su valiosa colaboración, tolerancia y acertadas críticas durante el desarrollo del trabajo. E1 Dr. Castanet CLaboratoire d'Anatomie Comparée, IJniversité Paris VII) revisó amablemente los resultados esqueletocronológicos. Aumerosas personas me acompañaron en los viajes de recolección de material. Especialmente agradezco la colaboración de Begoña Arano y Asunción Rodríguez Espeso en Portugal; Juan Carlos Arrechea y Jesús Dorda en 14arruecos, y Marisa Esteban en el sur de Espa4ia. Las siguientes personas colectaron material adicional para este estudio: Begoña E►rano, Ignacio Doadrio, Jesús Dorda, Carmen Díaz-Paniagua, Marisa Esteban, Mario García-Paris, Paloma Garzón, Rafael Márquez y Carolina Martín- Albaladejo. Rosa María Gómez-Prieto colaboró pacientemente en el trabajo de laboratorio, y mecanografió las tablas. Luis García-Hidalgo, Jose Enrique Gonzalez y Miguel Tejedo me ayudaron a abordar l.a estadística. Antonio Madrigal, Manolo Merino y Rafael Merino, pasaron a tinta las figuras. Angel Sanz, con su dominio de las técnicas fotagráficas, mejoró la resolució:n de las preparaciones histológicas. Pilar Herrero, Carmen Díaz-Paniagua, Rosa María Gómez, Mercedes Hervás y Teresa Aparicio me animaron constantemente en el curso de la investigación. Juan Carlos Arrechea me acompañó en innumerables y tediosos muestreos semanales por la provincia de Madrid todos estos años. Realizó los últimos retoques en las figuras y me ayudó a comprobar las referencias internas del texto. E1 personal del Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid facilitó mi estancia en el Centro y el desarrollo del trabajo. Esi;e trabajo ha sido parcialmente financiado con una beca predoctoral del CSIC en el Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid y una beca de intercambio entre el CSIC y el CNRS en el Laboratoire d'Anatomie Comparée de la Université de Paris VII. La investigación se incluye en el proyecto CSIC- CAICYT 2].1 (1985-1988). IHD ICE 1. IHTRODUCCIOH 1 2. li[ATERIALES, TECHICAS AHALITICAS Y I^[ETODOLOGIA 12 2 .1. l[ATERIALES 13 2 .2 . TECH ICAS DE ^[iJESTRBO 15 2.3. TBCHICAS HISTOLOGICAS 17 2.3.1. Tínciones de cartílago y hueso 1? 2.3.2. Preparación de esqueletos desarticulados 20 2.3.3. Técnicas de esqueletocronología 21 2.4 . PROTOCOLO DB L05 S%PER Il[fiHT05 DB CREC Il[ IBHTO Y DESARROLLO LARYARIO 25 2.4.1. Bsperinento para determinar la temperatura óptiaa de crecíaiento 25 2.4.2. Bsperimento para deter^inar la edad a que se alcan?-A cada estadio de desarrollo 25 2.5. DBFIHICIOB Dfi LA BIOXfiTRIA fi%TERBA 26 2.5.1. Hedidas esternas de renacuajos 26 2.5.2. l[edidas egternas de adultos 27 2.6. AHALISIS CIIAHTITATIVOS 30 3. RESULTADOS Y DISCUSIOH 31 3.1. TRABAJOS PRELIxIHARBS 32 3.1.1. Pelobates cultri^. TEIIPEBATURA OPTIli[A DB CREC Il[ IfiHTO LARVAB IO 32 3.12. Pelobates cultri,^,ç. BDAD A QIIE SE ALCAHZA CADA BSTADIO DE DBSARROLLO DBL PERIODO LARVARIO A TEPIPERATURA OPTU[A 36 3.1.3. TALLA fiH CADA BSTADIO DE DESARROLLO DE Pelobates cultri^ Y Pel^iy^^unctatus 40 3.1.4. BS"TRUCTURA POR SB%OS Y BDADES DE LAS POBLACIOHES POSTIi[fiTAI[ORFICAS DBL GBHERO Pelobates AHALIZADAS 46 .1. Pelobates cultri^ 46 .2. Pelobates varaldii 56 .3. Pelobates fuscus y P. s9riacus 60 3.1.5. TAl[AfFO DB LOS EJBI[PLARES !lDULTOS .1. Dimorfismo ^^^1 en Pelobates cultr^^ y P. varaldii .2. Diferencias morfométricas intraespecíficas en P_elobates cultri^ .3. Tamaño medio de los adultos de las especies estudiadas 62 62 66 70 3.1.6. RBLACIOH fiFTRfi fiDAD Y TAl[A4í0 BH Pelobates cultriTnes y P. varaldii 72 3.2. DESARROLLO DE LOS SISTExAS ESQ►ELETICOS DE Pelobates cult_^ Y Pel^ es punctatus 77 3.2.1. CRA^fEO .1. Descripción del cráneo adulto de Pelobates cultripes .2. Secuencia de asificación del cráneo de P. cultrip^, .3. Comparación con Pelgjytes nunctatus y otras especies de Anuros 3.2.2. COLUl^[IfA VERTEBRAL .1. Descripción de la columna adulta de Pelobates cultri^ .2. Desarrollo de la columna vertebral de Pelobates cultr1p^ç .3. Secuencia de asificación de la columna vertebral de P. cultri,^ .4. ^[alformaciones de la columna vertebral de P. cultri^ .5. Comparación con Pelody}es ^^nctatus y las restantes especies de Anuros 3.2.3. XIEXBRO AHTERIOR Y CIBTiiRA ESCAPIILAR .1. Descripción del miembro anterior y de la cintura escapular adulta de Pelo ^tes cultr ^ .2. Secuencia de osificación del miembro anterior y cintura escapular de P. cultrines .3. Comparación con Pel^^,punctatus y otras especies de Anuros 7? ?? 77 95 118 118 118 120 129 136 150 150 150 170 3.2.4. XIfiIIBRO POSTBRIOR Y CIHTURA PfiLVIAHA .1. Descripción del miembro posterior y de la cintura pelviana de Pelobates sstl^fg^ .2. Secuencia de osificación del aieabro posterior y cintura pelviana de P. cultrip^ .3. Comparación con PB_l^y.#^_^unctatus y otras especies de Anuros 4. COHCLUSIOHES GBHfiRALfiS 5. B IBL IOGRAF IA 195 195 195 214 246 254 6. APfiIfDICB 2^g 1. IBTRODIICCIOIf - 2 - 1. IHTRODIICCIOH Los caracteres osteológicos juegan un papel fundamental en la macrosistemáticá de los anuros. Lynch <1973) utilizó^ 38 caracteres en su análisis evolutivo del orden; vefntitrés de ellos, casi las dos terceras partes, eran osteológicos. A1 mismo tiempo, el esqueleto es casi el único sistema orgánico disponible para estudios paleontológicos y evolutivos del pasado. Por otra parte, podemos afíadir la utilidad del sistema esquelético para estudios de biología evolutiva; existen tendencias recientes en esta disciplina que hipotetizan alteraciones en la duración relativa de los acontecimientos del desarrollo Cheterocronías) como una de las causas fundamentales del cambio morfológico (Alberch et al., 1979). Este trabajo revisa y actualiza los conocimientos existentes sobre la osificación del esqueleto de los anuros. Paralelamente examina el proceso de condrificación de los miembros anteriores y posteriores, especialmente en lo referente al carpo y al tarso, y de sus respectivas cinturas. Su aportación más original reside en el estudio del proceso de osificación con una visión muy amplia del desarrollo, pues considera parte importante del mismo no sólo todos los estadios larvarios, sino también todas las clases de edad de las etapas juvenil y adulta. A1 mismo tiempo, determina la variabilidad de caracteres osteológicos de importancia sistemática, y establece homologías atendiendo al origen embriológico de los elementos. De hecho, el método de trabajo permite utilizar ejemplares preservados en alcohol o formol largo tiempo y, específicamente, integrar datos procedentes de series ontogénicas fósiles. Los estudios de este tipo son necesarios, pues los parámetros básicos para dilucidar la participación de procesos heterocrónicos en los cambios morfológicos todavía no se han cuantificado en el esqueleto completo de ningún anuro. Tales parámetros son: momentos de inicio y finalización de la osificación, tamaño de las piezas al comienzo de la misma, y tasa de crecimiento de los elementos esqueléticos. Por lo cual, es evidente la necesidad de conocer con detalle la cronología de la diferenciación de todos los elementos esqueléticos de algunas especies clave, medir en ellas el mayor ^número de parámetros del desarrollo y precisar su variabilidad - 3 - intraespecífica. Esto nos proporcionaría un marco de referencia para determina.r qué parámetros y procesos del desarrollo del esqueleto tienen utilidad taxonómica y filogenética, así como identificar caracteres que resulten convergentes en la etapa adulta. Hasta el momento se ha investigado el proceso de osificación del cráneo de dieciacho especies de anuros, de las 3.438 existentes sobre Rana ^piens. Estos autores además de realizar una descripción completa y detallada de la cronología de la osificación de todos los huesos de cráneo, describen dos alteraciones de la secuencia de osificación normal en renacuajos tratados con tiroxina en estadios tempranos del desarrollo. Entre los inconvenientes a la hora de utilizar sus datos en nuestros estudios camparativos, podemos segalar que utilizaron una tabla de desarrollo específica de Rana pipiens, la de Taylor & Kollros (1946>; además, la descripción del progreso de la osificación se interrumpe al fin de la metamorfosis, y por último, los animales fueron criados en cautividad. Gaudin C1978) sobre Bufo boreas. En este trabajo se comparan las secuencias de osificación de renacuajos de campo de dos localidades distintas con renacuajos de laboratorio. Se pone de manifiesto que la osificación en los animales de laboratorio se retrasa respecto a los del campo. Se reseñan todos los huesos y se describe el avance de la osif.icación en la. etapa postmetamórfica, dividiendo los ejemplares en clases de tamaño. Se utiliza la tabla de desarrollo de Limbaud 8^ Volpe (19:i7), muy parecida a la de Gosner C1960>. Los datos que aporta son sin duda los que mejor se ajustan a nuestros requerimientos comparativos. - 4 - Hanken & Hall <1984) sobre ^ombina orientalis. Los autores describen cuatro variaciones intraespecíficas de la secuencia normal de osi.ficación de la especie. Clasifican los renacuajos con la tabla de Gosner (1960), pero no describen la osificación de tres huesos que pre^sumiblemente mineralizan después de concluir la metamorfosis. E1 est.udio se realizó con ejemplares criados en cautividad. Sor^prendentemente sólo existen estudios de la asificación postcraneal de dos especies de anuros: Xenopus laevis , y resultó duramente criticado por primera vez por Williams (1959). Este autor revisó los trabajos existentes sobre la embriología de la columna vertebral de los tetrápodos y, aunque reconoce que el modelo explica muy bien las vértebras fósiles de los tetrápodos y que las vértebras de todas las especies actuales - 5 - son homólogas, concluye que los datos embriológicos no se ajustan a la hipótesis de Gadow y que, por tanto, es necesaria una nueva síntesis que sólo podrá realizarse cuando se disponga de descripciones libres de la influencia de la teoría de los arcualia. Wake (1970) examina el desarrollo vertebral en los anfibios y no encuentra pruebas de resegmentación en los esclerotomos, ya que no detecta esclerocele; pone en evidencia que, a falta de fósiles, la homologar.ión de los centros vertebrales de los anfibios actuales con pleurocentros o intercentros no es posible. E1 modelo básico de quiridio, justificado con todo detalle por Holgrem (1933), poseía en el carpo/tarso tres filas de huesos; una proximal con tres elementos, una central con cuatro elementos centrales más un elemento Y, y una distal con 5 carpales/tarsales. A este carpo/tarso seguían cinco metacarpianos/metatarsianos. Este patrón se reproduciría más o menos completamente en la ontogenia de todos los tetrápodos; la ausencia de algunos elementos se explicaba por "fusiones" en los estadios precondrogénicos. E1 modelo se ajustaba bastante bien al carpo fósil bien conservado más antiguo que se conoce, el de F^yops, y a la condrificación del carpo de Pelobates fuscus CEmery, 1894; Schmalhausen, 1907) y Bombina bombina (_ "Bombinator ^^") (Steiner, 1921>, trabajos precursores del modelo de Holgrem. Este modelo fue refutado por los experimentos de Hinchlife (1977) en embriones de pollo (Gallus damesticus). Según describen Hinchlife & Johnson (1980), el marcaje con sulfato radioactivo de las condensaciones precondrogénicas del carpo de pollo puso de manifiesto que eran cuatro, el mismo número que piezas podían observarse en el adulto; mientras que él número de condensaciones precartilaginosas aceptado previamente era de trece, creyéndose que luega unas se fusionaban y otras se perdían. Recientemente Shubin & Alberch (1986> proponen la homología del quiridio de los tetrápodos, apoyándose en que los mecanismos básicos para la generación de nuevas condensaciones cartilaginosas son los mismos en todos ellos: segmentación, bifurcación y condensaciones "de novo". La elección de Pelobátidos y Pelodítidos para este trabajo de tesis se debe a su controvertida posición en la evolución de los anuros. Lynch <1973>, - 6 - trabajand.o sólo con adultos, los situó en un nivel de transición entre los anuros con caracteres primitivos -Archaeobatrachia- y los que poseían caracteres fundamentalmente derivados -Neobatrachia-. En cambio Sokol (1975), en la :Eilogenia que estableció basándose exclusivamente en caracteres larvarios, consideró dos linajes principales, Discoglossoidei y Ranoidei, y situó a los Pelobatoidea en la base de la radiación adaptativa de estos últimos. Por otra parte, Rocek (1970) apoyándose en la peculiarísima ontogenia del frontoparietal de Pelobates fuscus, ubicó el género Pelobates, junto con Pípidos, Paleobatrácidos y Rinofrínidos en un orden nuevo -Archaeosalientia-, mientras el orden Neosalientia agrupaba a los restantes anuros. En vista de la controversia existente, es evidente que cualquier información relativa a la estructura y desarrollo de los Pelobatoidea será de extraordinario interés para los que trabajan en sistemática de anuros. La superfamilia Pelobatoidea agrupa tres familias: Pelobatidae, Pelodytidae y Megophryidae (Cannatella, 1985). La familia Pelobatidae está constituida por tres géneros y once especies. E1 género Pelobates se distribuye actualmente por Eurasia y norte de Africa (consultar la figura 1> y está constituido por cuatro especies: P.^ cultrin^, P. fuscus, p, syriacus y P. varaldii. Los géneros Scaphiopus y$^^ se localizan en Norteamérica, en las áreas señaladas en la figura 2. La familia Pelodytidae es monogenérica y sólo tiene actualmente dos especies: Pelodytes punctatus en la Península Ibérica y suroeste de Francia y P. caucasicus en el Caúcaso. Las áreas de distribución de ambos taxones se indican en la figura 3. La familia Megophryidae está poco estudiada. Frost (1985) reconoce 72 especies, distribuidas por el sudeste asiático e islas adyacentes, en el área rayada de la figura 3. Lógicamente, nos hemos centrado en el estudio detallado de las especies ibéricas en los estudios comparados. En el intervalo, se han utilizado tablas de desarrollo específicas, cuyas equivalencias con la de Gosner son tediosas de establecer caso por caso. 2. ^TEgL^LES, TBCHICAS AiALITICAS Y IIBTODOLOGIA - 13 - 2.1. XATERIéLES En total se han utilizado para este estudio 195 renacuajos de P1 cult_r ^ioes, 43 de F. varaldii, 9 de P. fuscus, 161 de Pe^tes punctatus y 227 eiemplares juveniles y adultos de distintas especies de Pelobátidos, Pelodítidos y Megófridos, cuyos números de colección y tipo de manipulación a que fueron sometidos se resegan en el apéndice I. La mayoría del material fue capturado personal y expresamente para esta tesis. Los renacuajos fueron clasificados atendiendo a su estado de desarrollo en 22 clases distintas correspondientes a los estadios 25 a 46 de la tabla de Gosner (1960), desde que el renacuajo comienza a alimentarse hasta que se completa la reabsorción de la cola. En la figura 4 se muestran las características que identifican cada estadio de desarrollo. En cada aspecto del desarrollo se ha utilizado un número variable de renacuajos, cuya cantidad se especifica en cada caso, bien porque la tinción no era óptima, bien porque la estructura en cuestión no se había desarrollado todavía o se había perdido durante el proceso de tinción, o ya sea porque se consideró que no había variabilidad que justificara estudiar con detalle todos los ejemplares disponibles de cada estadio de Gosner. Para algunos tratamientos posteriores, los ,^uveniles y adultos del género Pelobates se clasificaron en grupos de edad. E1 número de años se determinó por métodos esqueletocronológicos . La mayoría de los esqueletos adultos fueron desarticulados. Previamente se disecó un miembro anterior a nivel de la hemicintura escapular y uno posterior a nivel de la articulación de la tibiofíbula con el tibialfibular y se sometieron a doble tinción para cartílago y hueso; la otra mano disecada a nivel de la mugeca y el otro pie disecado a nivel de la articulación del tibialfibular con el resto del tarso, se sometieron sólo a tinción ósea. Esto se hizo así porque el estudio detallado del carpo, tarso y cintura escapular no es posible en esqueletos desarticulados. ►a ►y sa Eeta.dio final embrioaario. Iaioia alimsntacióa iadependiente. ^ x ^ xelaoióa d - 1 Ij ^ xd ea pata post. ii ^uu.^ tt^,^^^•t,u ^i^a _ 'd1 . koag ^pe.ricióa dedoe iadividualisados 32 3I ss Se euele dividir ea4}y43* i 9ó 37 ia ^l t n r1iUr^i1 tr1^r^1• Inolyye lo^ de 1 pats del. fuera Dei 37 al 39 se pueds ordaaar por tallae pstaa post. . i Coa iaioio• tubéroulos .; ' subartioula.ree. - ' puedea ao verae•^o, biea^ eatoaoes seguir oriterio ___ de ta11a - 0 D 3e ha iaioiado ^s la reabeor- oióa de la pie sa oloa^cal. Orisatar biea loagitudiaaleeate ^pa.ra svalvar temaHo booe.. q6: Fin metemorfoeie Figura 4.- Características de los estadios de desarrollo 25 a 46 de la tabla ^ de Gosner <1960>. - 15 - 2.2. TBCBICAS DB l[IIBSTRBO E1 trabajo de campo consistió en la captura de ejemplares juveniles y adultos y en muestreos periódicos de una charca para obtener renacuajos de todos los estadios de desarrollo, determinar la duración del periodo larvario y la estructura de la población. La captura de juveniles y adultos se realizó mediante recorridos nocturnos en coche a poca velocidad (10-15 Km/h) en noches de lluvia, a través de biotopos adecuados, resultando más fructíferas las primeras semanas de lluvia intensa de otoño y primavera así como los recorridos a pie por las orillas de las charcas de reproducción. En este último caso sólo se obtuvieron adultos, y con el primer método se consiguieron además individuos que no habían alcanzado todavía la madurez sexual. Los ejemplares en los últimos estadios de la metamorfosis, que ya habían abandonado el agua, y los recién metamorfoseados se localizaban fácilmente bajo piedras en las proximidades de las charcas. En sitios con pocas piedras se ocultaban en las grietas del barro cuarteado; en este caso, cuando se observaba en una grieta tierra removida, se escarbaba con un palito o con el dedo hasta que la humedad era la adecuada y empezaban a aparecer los sapitos. Por lo general había más de uno en cada escondrijo. • Estos ejemplares eran traslados vivos al laboratorio y, una vez pesados, se congelaron a -20^C. Para la obtención de renacuajos se utilizaron salabres de 34 a 45 cm de diámetro, con una red de pesca incorporada de 2,5 mm de abertura de malla. De pie dentro de la charca, o desde la orilla, se pasa la manga en un sentido y otro dos o tres veces, próxima al fondo y entre la vegetación de la orilla -cuando la hay-, antes de sacarla fuera. Después de separar los renacuajos de los restos de vegetación y barro arrastrados con ellos, la muestra se fija en formalina al 4x tamponada con 0,5 g de carbonato magnésico por litro, para evitar la ciescalcificación de los huesos. Las puestas se localizan a simple vista en las orillas de la charca, a - 16 - poca profundidad. La que se empleó en los experimentos fue trasladada al laboratorio'en agua de la propia charca. La charca de donde proceden la mayor parte de los renacuajos de p1 cultripes está situada en San Agustín de Guadalix Cl^adrid) a 40° 41' de latitud N y 3^ 37' de longitud W, y a 684 m sobre el nivel del mar. Es una excavación artificial sobre el cauce de un pequeYio arroyo estacional, efectuada para que el ganado vacuno disponga de agua hasta comienzos del verano. Cuando se encuentra al máximo de su capacidad, en diciembre y enero, mide 6.45 x 16.74 m y tiene una profundidad máxima de 0.90 m. Fue visitada desde el aflo 82 al 86, cada temporada con mayor asiduidad que la anterior. E1 último año se muestreó semanalmente durante los meses de febrero a julio, hasta que se secó. A los renacuajos obtenidos se les determinó el estadio de desarrollo, siguiendo la tabla de Gosner ^1960). Se seleccionaron al azar 10 individuos de cada estadio para los estudios de crecimiento en condiciones naturales. Posteriormente, estos mismos ejemplares se utilizaron para describir el desarrollo del esqueleto. - 17 - 2.3. TBCIf ICAS H ISTOLOG ICAS 2.3.1. Tinciones de cartílago y hueso Se han utilizado dos técnicas distintas de tinción de esqueletos articulados. En la primera se tiñó el hueso con alizarina roja S y el cartílago con azul de alcian 8GX . E1 azul de alcian se une específicamente a los mucopolisacáridos ácidos de la sustancia fundamental del cartílago por cada litro de solución, al menos durante dos días. También es posible utilizar material de colecciones conservado en metanol o etanol de 60-70^, pero hay que dejarlo en formalina algunos días antes de empezar y en este caso la transparencia de las masas musculares que se consigue no es tan buena como cuando el material ha sido fijado y conservado en formalina desde el primer momento. Bvisceración. Retirar la piel del especimen. Cuando se van a teñir ejemplares completos, es preciso extraer también la totalidad de las visceras y los ojos, así como los tejidos conjuntivos fuertemente pigmentados que luego ocultaran las estructuras sobre las que se encuentran. Lavado. Sumergir el ejemplar en abundante agua del grifo, cambiándola al - 18 - menos do^s veces, durante 12 horas. La utilización de agua templada acelera el proceso. Si^el ejemplar presenta abundante pigmentación oscura bajo la píel, es preciso sumergirlo en una solución de agua oxigenada al 3°ti durante 2 0 3 horas en estufa a 30°C para blanquear los pigmentos. Lavar con agua del grifo y depositarlo en baños sucesivos de agua desionizada cada 2 horas, tres o cuatro veces. A partir de aquí el proceso difiere según se vaya a realizar una tinción doble (caz^tílago-hueso) o sencilla (hueso>. Si se va a proceder a una tinción doble del sistema esquelético, se comienza por: Tinr.ión del cartílago. Se seca el exceso de agua del ejemplar con papel de filtro y se introduce, junto con su número grabado en cinta plástica, en una solución teYíidora constituida por 15 mg de azul de alcian BGX, 70 ml de etanol absoluto y 30 ml de ácido acético glacial. Si el proceso se realiza en estufa a 30^C requiere unas 12-14 horas; a temperatura ambiente puede necesitar más de 24 horas, depende del tamafío del ejemplar y del tiempo que haya permanecido en líquidos conservadores. Los mejores resultados se obtienen con especímenes fijados y conservados exprofeso para la utilización de esta técnica. Es muy importante no dejar el ejemplar en la solución teñidora más tiempo del necesario, pues en este caso también se tiñe de azul la musculatura, haciendo prácticamente imposible conseguir que transparente después. Fijación de la tinción. Se realiza por deshidratación completa en etanol absoluto, secando el ejemplar previamente con papel de filtro. Hay que cambiar el etanol por lo menos una vez o más, hasta que deje de virar a color azulado con el paso de las horas. Debe estar en etanol al menos dos días. Es importante que la deshidratación sea completa para evitar que el colorante destiña y se difunda por todas las estructuras. En caso de necesidad, el proceso de tinción puede interrumpirse en este momento durante varias semanas. Transparentación. Primero se procede a la rehidratación del ejemplar, - 19 - pasándolo por una serie de bafíos de etanol de concentración decreciente (?5^, 50^, 25°) hasta agua desionizada, donde debe permanecer unas dos horas. Los ejemplares más pequeños pueden transferirse a alcohol de 50^ y al agua directamente; los mayores pueden requerir hasta dos ^o tres horas en cada paso. Seguidamente, sumergir el especimen en una solución enzimática elaborada con 30 ml de agua saturada con borax (tetraborato sódico, NarB40^.1OH^0), 70 ml de agua desionizada y 1 g de tripsina, en estufa a 30°-C. Dejar el ejemplar en este baño hasta que los tejidos estén suficientemente macerados -el cuerpo parece goma al levantarlo con pinzas y los huesos son visibles a través de los tejidos-, cambiando la solución cada dos o tres días, o más frecuentemente si toma un color azulado o huele a podrido. Es importante sacar el material a tiempo, pues de lo contrario se descompondría en fragmentos. Tinción del hueso. Se introduce el ejemplar en una disolución de hidróxido potásico (KOH> al 1.5°,6, a la que se ha añadido 1 ml de solución teñidora por cada 100 ml. La solución tegidora se elabora con: 5 ml de ácido acético, 10 ml de glicerina, 60 ml de solución del hidrato de cloral al 1',G y se satura con alizarina roja S. Se mantiene el ejemplar sumergido hasta que los huesos se colorean de rojo. E1 pr•oceso dura menos de 24 horas y se debe interrumpir cuanto antes. Si antes de llegar a este paso el ejemplar ha macerado en exceso, se utilizan disoluciones menores de KOH -hasta del 0.5^-. Acabado del proce.so de transparentación. Pasar a la solución constituida por: 20 partes de glicerina, 3 partes de KOH al 4°^6 y?7 partes de agua desionizada. Si el ejemplar se encuentra perfectamente transparentado este paso no es necesario. Preparación para el almacenaje. Transferir a una mezcla de 40 partes de glicerina y 60 partes de etanol de 65^. Dejar el ejemplar allí hasta que suba a la superfice; requiere dos o tres días a temperatura ambiente y de 6 a 12 horas a 30^C, dependiendo del volumen. Seguidamente, pasar a 70 partes de glicerina y 30 partes de etanol de no 65^. Mantenerlo aquí hasta que ^ flote: dos-tres días. Se acelera con la -20- temperatura. ►^ o Finalmente, pasar a glicerina pura. Dejarlo hasta que ^ suba a la superfice: un día. Se acelera con la temperatura. Almacenaje. Cambiar la glicerina y añadir un cristal de timol para evitar el crecimiento de mohos y bacterias. Si únicamente va a procederse a la tinción del hueso, se continúa el proceso en la fase de transparentación sin pasar por los baños decrecientes de alcohol -porque el ejemplar se encontraría totalmente hidratado- y se ejecutan todos los pasos siguientes de la manera ya descrita hasta el almacenamiento final en glicerina. Con estos métodos de preparación. se evitan los problemas de interpretación derivados de la reconstrucción a partir de material seccionado serialmente. Los ejemplares se examinaron a la lupa binocular varias veces. De cada uno, se anotaron todas las piezas teñidas con alizarina del cráneo, la columna vertebral, los miembros anteriores y posteriores y sus respectivas cinturas. En los estadios de desarrollo más tempranos se apuntaron también todos los elementos diferenciados por el azul de alcián en los miembros. De cada estadio de desarrollo se efectuaron dibujos, con una cámara clara Wild Heerbrugg typ. 308700, y fotos, al menos en norma dorsal, del estado de osificación y/o condrificación de los cuatro segmentos en que hemos dividido el esqueleto. Y también, del carpo y del tarso de juveniles y adultos de distintos tamagos. 2.3.2. Preparación de esqueletos desarticulados Para la preparación de esqueletos desarticulados se siguieron dos procedimie^ntos,.según el material fuera fresco o hubiera estado conservado en - 21 - alcohol o formol. Los ejem plares frescos, después de retirarles la piel, las vísceras y los ojos y de ensartar un hilo de nylon de pescar a través de todas las vértebras, se introducen enteros en frascos de cristal llenos de agua en sus dos terceras partes y se cierran herméticamente. Se colocan en estufa a 40^C y se dejan macerar agitando enérgicamente cada doce horas. E1 tiempo que tardan en pudrirse varía entre dos y siete días. Una vez se observan en el fondo del frasco todos los huesos desarticulados y restos de tejidos, se vierte el contenido sobre un tamiz de 0.5 mm o 0.1 mm de luz, según el tamaño del ejemplar y se procede a un concienzudo lavado con agua del grifo. Se vuelven a introducir los huesos, ya separados de los restos, en el frasco y se añade una solución de agua oxigenada al 3°ti dejándola actuar desde unos minutos hasta media hora, dependiendo nuevamente del tamaño, con objeto de desengrasar, blanquear y desinfectar los huesos. Nuevamente se lava con abundante agua, y se dejan secar completamente sobre papel de filtro, desde donde se i.ntroducen en las cajitas de almacenaje hasta su posterior estudio. Los ejemplares procedentes de colecciones de museo que han permanecido largo tiempo en soluciones de alcohol o formol, después de retirarles la piel, las vísceras y los paquetes musculares más importantes de los miembros, se introducen en una disolución de KOH al 4'/. en estufa a 40°C. E1 proceso debe vigilarse muy de cerca, ya que necesita ser interrumpido antes de que los huesos estén completamente limpios, pues ello significa que el KOH ha comenzado a deteriorarlos. Se lavan con abundante agua corriente y se terminan de limpiar a la lupa con pinzas; en este supuesto no es imprescindible desinfectar con agua oxigenada. Posteriormente, se secan y almacenan como en el caso anterior. 2.3.3. Técnicas de esqueletacronología La determinación de la edad de los ejemplares postmetamórficos del género p^obates se realizó contando el número de líneas hematoxinófilas de detención del crecimiento -LAC, en francés- en cortes transversales de fémur, previamente descalcificados con ácido nítrico CDTO^H) al 5'/., siguiendo las -22- técnicas publicadas por Smirina (1972> y Castanet ( 1975; 1981).. Estas marcas histológicas representan paradas momentáneas de la osteogénesis. Son siempre de espesor muy débil (10-15 µm máximo), translúcid;^s, más refringentes y más cromófilas que el resto del tejido óseo (Castanet, 1987). Están constituidas por una yuxtaposición bastante desordenada y más o menos linear de fibras de colágeno. La menor organización estructura:L del hueso explica en gran parte que el mineral y la sustancia fundamental estén ligeramente más conce^itradas a su nivel: este aspecto físico así como ].as propiedades químicas particulares adquiridas por una superficie ósea en parada de crecimiento, originan las propiedades hematoxinófilas de las líneas cimentantes (Castanet, 1981). ^To se tiñen con colorantes específicos para el colágeno. Se consideran basófilas pues son fuertemente positivas al reactivo de Shiff, aunque no se ha realizado ningún estudio específico para probarlo ^ A1K. 12H^;0) hasta la saturación. Se deja madurar por lo menos un mes y se filtra antes de su utilización. Mientras más tiempo lleva preparada, menos minutos necesita para teñir. Lavar. Con agua desionizada, cambiando los cortes de un pocillo a otro por lo menos una vez. l[ontar. Los cortes ya hidratados entre porta y cubre con glicerol- gelatina de Merck. De cada individuo se montaron entre 15 y 20 cortes de la diáfisis del fémur izquierdo. Después de estudiar cada corte al microscopio, se seleccionó el mejor y se realizó una fotografía en blanco y negro del mismo. Todas las fotos fueron realizadas con el mismo objetivo y reveladas con la misma ampliación.. Las fotografías permitieron comparar unas poblaciones con otras, realizar medidas sobre ellas y comprobar si la primera línea de detención del crecimiento había sido completamente reabsorbida. En los cortes transversales de huesos largos de anfibios adultos se observan cios estructuras óseas: un anillo exterior de origen pericondral, que crece en grosor por aposición de capas desde el exterior y en el que se encuentran las líneas de detención del crecimiento, y un anillo interno, de origen endocondral, de crecimiento centrípeto hacia el interior de la médula, en el que también se aprecian líneas hematoxinófilas mucho más próximas entre sí y difíciles de contar. E1 límite entre ambos tipos de hueso lo señala la línea de reabsorción; se tiñe con hematoxilina más intensamente que todas las demás y presenta un perfil irregular (Castanet, 1975). Antes de que comience la formación de hueso endocondral, se produce reabsorción en la parte interna del anillo pericondral. Este proceso es de distinta intensidad según las especies y las poblaciones . Para averiguar si en un adulto ha desaparecido completamente la primera línea, hemos superpuesto la fotografía de su corte sobre una de un juvenil con una sola l.ínea y hemos comparado los perímetros de la primera línea de ambos a contraluz. Si en el adulto la primera línea que se aprecia -completa o parcialmente reabsorbida- es de diámetro semejante al de la única línea del juvenil, suponemos que dicha línea es la primera; en cambio, si su diámetro es mucho mayor, hemos considerado que la primera línea se ha reabsorbido completamente y que, en realidad, la primera que vemos es la se$unda. E1 error en la determinación de la edad lo hemos calculado realizando exámenes sucesivos de la misma preparación, separados por periodos de tiempo de más de una semana. Si al tercer repaso no se había detectado ninguna diferencia en la determinación del número de líneas, la edad se daba por buena; si había diferencias, se repetían las observaciones hasta conseguir tres resultados iguales seguidos; si en el décimo examen no se había ilegado a un compromiso, se aceptaba la edad modal y se establecía como error el rango de los tres últimos resultados. -25- 2.4. PROTOCOLO DE LOS E%PERIlIEHTOS Dfi CRECIXIEBTO Y DESARROLLO LARVARIO 2.4.1. Egperimento para determinar la temperatura óptiaa de crecimiento Se :prepararon tres acuarios de 9 litros de capacidad con 27 renacuajos cada uno Cdensidad = 3 renacuajos/litro>. Sustrato arenoso con rocas calcáreas; pH = 7,4. Todos los renacuajos procedían de la misma puesta y se encontraba.n en estadios de desarrollo alrededor del 30 de la tabla de Gosner. Fueron elegidos al azar de un acuario a temperatura ambiente donde se había depositado una puesta recogida en San Agustín de Guadalix CMadrid). Se les alimentó con lechuga fresca ad libitum. Mediante un calentador con termostato se mantuvo constante la temperatura del agua de cada acuario a 25, 28 y 31°-C, respectivamente. A intervalos regulares se midió el peso total de los renacuajos de cada acuario en balanza de precisión, con una aproximación de 0.001 g. A los 18 días se dio por terminado el experimento al aparecer los primeros individuos en metamorfosis. 2.4.2. Esperinento para determinar la edad a que se alcanza cada estadio de desarrollo a temperatura óptima Dos grupos de renacuajos, de cuatro ejemplares cada uno y procedentes de la misma puesta, fueron criados en laboratorio a temperatura óptima y a temperatura ambiente, respectivamente. Los acuarios tenían una capacidad de 28 litros (densidad = 1 renacuajo/ 7 litros) para que el agua no tuviera que ser cambiada a lo largo de todo el experimento. Los ejemplares fueron alimentados con hojas de lechuga cruda ^ libit^ y pienso compuesto para truchas. Se introdujo en el recipiente una piedra cali.za y se les sometió al ciclo natural de luminosidad. Cada renacuajo fue examinado diariamente a la misma hora, anotándose su estadio de desarrollo (Gosner, 1960>, su longitud cabeza + cuerpo, su longitud total y la ^temperatura máxima y mínima del agua desde el día anterior. -26- 2.5 . DEF Ig IC IOB DE LA B IOIIETE IA E%TERH^ 2.5.1. xedidas esternas de renacuajas En norma lateral (figura 5) y estableciendo como eje de orientación el que pasa entre el extremo más anterior del hocico y el extremo de la cola, se realizaron dos medidas paralelas a dicho eje: LCC: Longitud cabeza + cuerpo. Distancia entre el extremo más anterior del hocico y el punto más posterior de la pieza cloacal. LT: Longitud total. Distancia entre el extremo más anterior del hocico y el extrem o de la cola. Se midieron todos los renacuajos antes de ser teñidos. Las medidas se efectuaron con la ayuda de un micrómetro digital Aikon measurescope 10 con precisión 0.001 mm, redondeándose a la centésima de milímetro más próxima. Figura 5.- Medidas externas efectuadas sobre renacuajos. LCC, longitud cabeza + cuerpo, y LT, longitud total. -27- 2.5.2. Xedidas esternas de adultos Lo^^ ejemplares se midieron en fresco, recién sacrificados o recién descongelados. Sólo se midieron conservados en alcohol los procedentes de MUS►OS. Se definieron las medidas señaladas en la figura 6. La mayoría se tomaron c.on calibre Mitutoyo (precisión 0.05 mm), excepto LCC (con regla, precisión 0.5 mm), TMA y T1tL (con micrómetro digital, precisión 0.001 mm, redondeando a la centésima de mm más próxima) y PESO en el apéndice I; en las restantes especies sólo se consideró la variable LCC. -30- 2.6. AHALISIS BSTADISTICQS En primer lugar, se realizó una descripción básica de las caracterís^ticas de las variables, considerando su media ^), su desviación típica (s>, el número de casos examinados (n> y los valores máximos y mínimos detectados. A partir de estos datos, y sólo cuando se consideró necesario para las representaciones gráfícas, se calcularon también los límites de confianza de la media al 95°,6. E1 t:ipo de distribución de las variables --si eran normales o nó- se determinó con el programa Microstat, en un ordenador personal AT compatible con IBM^ Ataio Comet 11.5. La comparación de los valores medios de una variable con distribución normal Cp. e., LCC o cualquier otra variable métrica con distribución continua) entre dos poblaciones, se realizó con un test de la t de Student para varianzas separadas, siendo la hipótesis nula que las dos muestras proceden de la misma población y, por tanto, tienen la mi ►ma media. Cuando las variables a comparar no presentaban una distribución normal (p.e., la edad) se utilizó el test de la U de Iíann-Witney, siendo la hipótesis nula que las dos muestras provienen de poblaciones que siguen el mismo tipo de distribución. Para determinar la existencia de asociación entre dos variables cuando una de ellas no se distribuía normalemente Cp. e., la edad y el tamaño> utilizamos el coeficiente de correlación ordenada de Spearman, comprobando si la hipotesis nula r.<0 se podía rechazar con un nivel de significación del 95^ , del 99°,G . Los calculos se realizaron con la ayuda de los programas de Ia serie BMDP, en el Centro de Cálculo del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. 3. RESIILTADOS Y DISCUSI08 - 32 - 3.1. TRABAJOS PREL Il[ IBARfiS 3. 1. 1. Pelobates cultri^. TfiI[PfiRATIIRA OPTU[A Dfi CRfiCIl^[IfiHTO LARVARIO La temperatura óptima de crecimiento larvario de Pelobates cultripes es aproximadamente de 28°-C CTalavera & Sanchíz, 1985). En las figuras 7 y 8 y en la tabla 1. puede verse que el peso medio por renacuajo y el porcentaje de incremento de peso es mayor a 28°C que a las otras dos temperaturas estudiadas -25^C y 31^C-, y simétrico respecto a ellas. A los 18 días de iniciado el experimento (en el estadio 30 de desarrollo de la tabla de Gosner) los primeros renacuajos alcanzaron el climax metamórfico (estadio 42) en el acuario a 28°C. Los incrementos de peso a 25°C son aceptables y los renacuajos llegan a completar la metamorfosis a esa temperatura; mientras que en el acuario a 31^, después de 30 días, ningún individuo había superado el estadio 36. Por tanto, el rango de temperaturas que seleccionaría P. cultri^ incluiría los 25^C, pero no llegaría a los 31°C. Este resultado se encuentra en el ran$o de temperaturas seleccionadas por Pelobates fuscus: 25,1 - 28,6^C CRiihmekorf, 1958), situándose próximo a su extremo superior. Se incluye igualmente en los rangos de temperaturas preferidos por Bombina varie^, Bufo bufo y Rana esculenta , Alytes obstetricans, $,yla arborea, Rana temporaria y$.^ arvalis CRiihmekorf, 1958>, y por debajo de las temperaturas preferidas por Bufo calamita y B. viridis (Ri;hmekorf, 1958>. -33- Peso medio por renacuajo (m► .) 1500 r 1000 soo 28° C 25° C 31° C 0 S 10 Á 18 20 Días Figura 7.- Pelobates cultrip,^. Peso medio (mg) por renacuajo, en los acuarios a 25, 28 y 31^C. -34- 96 de incremento de peso, sobre el^. peso inicial, po^ renacuajo U00 28° C 25° C 31° C SO i 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Días Figura 8.- Pelobates cultripes. Porcentaje de incremento de peso sobre el peso medio inicial de cada renacuajo a 25, 28 y 31°C. -35- Tabla 1.- Peso medio (mg> por renacuajo y porcentaje de incremento sobre el peso inicial en renacuajos de Pelobates cultri^es criados en el laboratorio a tres temperaturas distintas. 259C 28flC 314C -------------------------------------------- --------------------------------------- Dia n Peso ^edio por renacuajo (®gl X Apesa n Peso ^edia por renacuajo (mgl X ^pesa n Peeo ®edio por renacuajo (®al X Apesa ----------------------••---------------------- ---------------------------------- --------------------------------------- 0 27 61.4,07 0.00 26 659.23 0.00 28 593.57 0.00 7 27 792.96 29.13 23 1154.35 75,11 28 713.21 20.16 11 27 851.41 39,b2 -- ----- --- •27 857,41 44.45 14 -- --- -- 23 1268.26 92,38 18 27 1100.37 7R,19 23 1350.00 104,78 26 958,85 61.54 -36- 3.1.2. Pelobates cultri^. EDAD A QIIfi Sñ ALCAHZA CADA BSTADIO DE ^ DESARROLLO DEL PERIODO LARVAFIO A TBlIPBRATIIRA OPTII[A En la tabla 2 se reseña la edad media en que Pelobates cultripes alcanza cada estadio de Gosner (1960) cuando la temperatura del agua se mantiene constante a 28^C. A dicha temperatura la duración media del periodo larvario --entendiendo como tal el comprendido entre los estadios 25 y 46- es de 33,33 días. Los valores extremos registrados en renacuajos procedentes de la misma puesta fueron de 30 y 36 días. La edad a que se alcanza cada estadio se utilizará posteriormente en la elaboración de los índices de osificación de la especie a lo largo del desarrollo. En la tabla 3 se muestran las duraciones medias de cada estadio de desarrollo (Gosner, 1960> a temperatura óptima. Es de destacar la enorme variación entre unos y otros. Algunos como el 25, 32, 33 y 39 transcurren en menos de un día; mientras el 36 y 3? duran tres o más de cuatro días, respectivamente. La figura 9 presenta el porcentaje de tiempo del desarrollo larvario que emplea cada estadio. A temperatura óptima, Pelobates cultriges permanece casi el 14'/e del tiempo en el estadio 37; cuando la temperatura del agua se mantiene constante, este estadio es, con diferencia, el más largo de todos. -37- Tabla 2.- Pe?obates cultrip^. A temperatura óptima de crecimiento, edad media a que se alcanza cada estadio de desarrollo del periodo larvario. Estadio Gosner Edad media Edad mínima Edad máxima (dias) (dias) (dias) -------------------------------------------------------------------------- L •► (^ ^ ^^ 26 1. t^0 1 1 27 2. t ^p ^ ^ 28 3. 5t? ? 4 29 4.75 4 6 ?^^ b. 5i^ 5 B ?1 B. QC^ 6 lt? ^^2 9.62 B 12 T^ •^ •J 10. ?7 9 1.; 34 11.25 1^ 14 35 12.25 il 15 •b 13.75 12 17 •►7 16.75 14 21 '8 21.25 18 24 .^9 2 ^. 87 2‚ 26 4C^ 24.75 21 27 41 25.75 22 28 42 27. 75 24 3c? 4^ 29. i ^tj 26 ? 1 44 ? 1. t?^ 27 .;4 45 _ . •^ _^ 29 ?5 46 33.^^ ^0 ^b -38- Tabla 3.- Pelobates• cultri^es. A 28°C, duración media de cada estadio de Gosner (1960) y porcentaje de tiempo del desarrollo larvario que emplea cada estadio. ^ Estadio Gosner Duración media. Duración mínima Duración mA>cima % de ±iemoo sobre (dias) (dias) (dias) la. duracibn total del desarrollo larvario --------------•------------------------------------------------------------------------- ^°•J ;1 ^b 1.OCl 1 1 '.09 27 1.5C^ 1 ^ 4. 64 ►8 1. ^5 1 ? ?.87 29 1.75 1 2 5.41 3C^ 1. 5^? 1 2 4. 64 31 1.6^ 0.5 ^ 5.U1 32 U.75 0.5 1 ?.3^ 33 0.88 4.5 1 ► .72 ?4 1.QU 1 1 3.U9 35 1.5• 1 ► 4.64 36 3.UC^ 2 4 9.28 37 4. 5^? ? 6 1^:,. 92 38 2.62 ► 3 8.1Q 39 0.88 ^^.5 1 "7^ 40 1. U^? 1 1 '. ^?9 41 ^. C^U ^ ? 6. 19 4^ 1.25 1 2 _,87 43 2.OU 1 ^ 6.19 44 1.33 1 2 4.11 45 1. OU 1 1 3, i^9 15 ^ ^° ^ 5 ae ^ 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 ^3 44 45 • Bstadios de desarrollo (Gosner, 1960) Figura 9.- Pelobates cultripes. A temperatura óptima, porcentaje de tfempo que emplea cada estadio de Gosner (1960) del total del desarrollo larvario. - 40 - 3. R. 3. TALLA BH CADA ESTADIO DB DESARROLLO Dfi Pelobates cultri^ ^ Y Pelad4 tes ^unctatus La tabla 4 muestra los estadísticos básicos, a cada estadio de Gosner C1960>, de la longitud cabeza + cuerpo (LCC) de Pelobates cultrin^s a lo largo de su desarrollo larvario. Todos los renacuajos fueron colectados en la misma charca (San Agustín de Guadalix, Madrid> entre los años 1984 y 1986. La LCC máxima se alcanza en el estadio 39 y es ligeramente superior a 30 mm. Se observa una disminución progresiva de esta variable durante los estadios 39 - 41 y la primera mitad de la metamorfosis Cestadios 42 y 43>. En nuestra muestra alcanza su valor mínimo en el estadio 44, en el cual el acortamiento medio de la longitud cabeza + cuerpo respecto al estadio 39 es del 23.88'^6. La f:uerte disminución de talla a lo largo de las últimas fases del desarrollo larvario de los Pelobates cultrip^. procedentes del campo nos obligó a efectuar comprobaciones en el laboratorio. Iiedimos diariamente ocho renacuajos hermanos, cuatro criados a 28°C y cuatro a temperatura ambiente. Desde su valor máximo, los primeros experimentaron una disminución de LCC del 22.03',6, por término medio, y los segundos del 22.3?'^G. Sus curvas de crecimiento se representan en la figura 10. Buena parte de la reducción de LCC se explica por la reabsorción de la pieza cloacal durante los estadios 40 y 41. Otra parte, no cuantificada, se debe a la aproximación de unas vértebras a otras y al acortamiento de la cabeza que hemos detectado en los ejemplares teñidos y transparentados entre los estadio;a 41 y 43. Es pr•obable que esta disminución de los espacios intervertebrales sea causada por el aumento de la concentración de hormonas tiroideas durante la metamorfosis. Según Houdry & Beaumont (1985), entre otras muchas acciones, estas hormonas provocan disminución de vol^imen por deshidratación y fragmentación en ciertas fibra^ musculares. Hasta nuestro conocimiento no ha llegado ningún trabajo que mencione la aproximación que experimentan las vértebras de anuros durante la metamorfosis, por lo que sugerimos que se debiera continuar en el futuro con este tipo de investigación. Tabla 4.- Pelobates cultripes. Renacuajos colectados en el campo. Estadísticos básicos de la longitud cabeza + cuerpo (mm) a cada estadio de Gosner (1960). _ valor valor Estadio Gosner n x s mínimo mdximo (mm) (mm) (mm) (mm) -------------------------------------------------------------------------- ^^ .:J 1 5.67 26 1 7.78 - - - 27 1 1'.76 - - - 28 1 12.b8 - - - ^9 1 14.56 - - - :1^^ 9 15. 5.^ 1. 31 1^. 67 17. 56 ? 1 10 16. 84 _. G9 11. 51 22. ^^^7 ..^^̂ 1 c) 24. 71 1. 95 16. 60 23 . G.3 33 1C^ 21.39 2.^2 16.58 24.49 .^4 1c) 2'.86 2.0' 19.56 2b.55 :^5 1^ 24.66 ^.99 19.78 28.68 36 1^) 27 . 8' .s . 57 21. 80 ^ 1. 95 ^7 9 29. 12 2, b4 25. 68 .T_•4, n 1 ^8 8 28.94 2.56 26.55 ^2.91 39 9 ^0. ?6 2. 36 27. 1.^ 35. ^)^^ 4^) 8 28.85 2.62 25.55 ►:^.56 41 1 t) 25. 19 1. ?.^ ^3. 19 27. 9C^ 42 10 23.94 1.49 21.89 2b.89 43 9 2.^.19 Q.B6 22.b7 25.58 44 1G 2^.11 0.57 22.24 24.01 45 10 25.78 2.22 21.5B 28.3i^ 46 lc? 24.07 1.97 21.46 28.75 la sem, postm. 9 25.15 1.?4 22.54 27.14 2a sem. postm. i 28.57 - - - 40 ^ TEMP, AMBIENTE ^ 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 16 80 84 88 EDAD (DIAS> Figura 10.- Pelobates cultri$es. Crecimiento en longitud cabeza + cuerpo . Nuevamente la talla máxima <17.06 mm> se alcanza en el estadio 39, y durante la metamorfosis el cuerpo subre una reducción progresiva de tamago del 15.13x, que alcanza su mínimo en el estadio 44. A partir de este estadio los metamiírficos comienzan a alimentarse de presas animales vivas Cgusanos de harina que les eran ofrecidos diariamente). E1 tamago medio al fin de la metamorfosis fue de 13.77 mm, con valor mínimo registrado de 11.94 mm y máximo de 15.57 mm. En la figura 11 se comparan los valores medios, intervalos de confianza al 95°ti, y rango de LCC de Pelobates cultrip^ y PelodYtes punctatus. Estos datos se utilizaran posteriormente en la elaboración de las trayectorias ontogenéticas de ambas especies, en el capítulo dedicado al desarrollo del sistema esquelético. Tabla 5.- Pelody.^.^_punctatus. Renacuajos criados en el laboratorio. Estadísticos básicos de la longitud cabeza + cuerpo a cada estadio de Gosner (1960 ) . _ valor valor Estadio Gosner n x (mm) s (mm) mínimo (mm) máximo (mm) --------^------------------------------------------------------------------ i5 26 5 5.52 ^i, 3^ 4.99 5.98 27 4 6.98 ^:1.51 6.31 7.56 2B 6 8.26 <_^.80 b.9:s 9.62 29 6 8.82 0.31 8.45 9.29 •►0 b 9. 13 0. 46 8. ?3 9. 91 31 b 10.11 c),76 9.00 11.50 32 6 10.4? c).92 8.62 11.49 33 8 11.94 0.57 10.81 12.68 •:;4 10 12 . 4' 1. ^^ 1 9. 95 14. 97 35 9 13.33 1.32 11.07 15.73 3b 9 14.47 1.01 13.01 16.03 37 lí 15.06 1.09 13.23 17.01 38 ii 16.14 2.14 12.80 2ra,77 39 4 17.06 1.59 14.53 18.Bb 4r^ 4 17.04 i.ib 15,11 18.18 41 9 15.44 1.56 13.16 1B.17 42 5 15.bb Cr,83 14.51 17.08 4:^ B 15.2^? 1.94 13.20 19.49 44 10 13.63 1.2r^ 11.66 15.13 45 7 14.16 1.98 11.38 17.61 46 5 13.77 1.23 11.94 15.57 2a sem. postm. 10 16.30 1.17 15.00 19.00 30 d 20 10 ^ ^ ^^ al y` B B E a ® ^ ^ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 25 2d 27 28 2^ 30 31 32 33 34 35 36 37 38 3^ 40 41 42 43 44 45 46 1°s 2°s Sstadios de desarrollo (^osner,1960) P. cultripes . punctatus Figura 11.- Pelobates cultripes y Pelody►tes ^unctatuG. Valores medios, intervalos de confianza y rango de la longitud cabeza + cuerpo (LCC) en mm, a cada estadio de Gosner (1960>. -46- 3. 1.. 4. BSTRIICTIIRA POR SE%OS Y EDADES DE LAS POBLACIOHES POSTXSTAI[6RFICAS DEL GESERO Pelobates AHALIZADAS 3.1.^.1. Pelobates cultri^ De E:sta especie hemos estudiado dos poblaciones: una procedente de las estribaciones de la sierra norte de Madrid, colectada a lo largo de todo el ago en la:s carreteras y charcas alrededor de las localidades de El Berrueco (925 m sobre el nivel del mar> y San Agustín de Guadalix <684 m s.n.m.), y otra, capturada únicamente en la época de reproducción, de Porto Covo (Portugal) « 100 m s.n.m.> en la región del Bajo Alentejo. La figura 12 muestra la situacií>n geográfica de ambas localidades. Figura 12.- Situación geográfica de las principales localidades de muestreo de Pelobates cultripes y p. varaldii. 1, E1 Berrueco y San Agustín de Guadalix (Madrid, España>. 2, Porto Covo (Bajo Alentejo, Portugal). 3, Bosque de la Mamora (Kenitra, Marruecos). - 47 - La población de Madrid estaba compuesta de 41 individuos. De ellos, 10 eran sapit.os recién metamorfoseados, 2 juveniles y el resto adultos: 15 machos y 14 hembras. La edad de los juveniles y adultos se determinó por métodos esqueletoc.ronológicos. En la figura 13 se aprecia la estructura por sexos y edades del material analizado. La ^sdad media de los machos fue 7.73 años y la de las hembras 6.79 afios. La diferencia entre las edades medias de ambos sexos no resultó significat:iva (test de la U de Mann-Witney: n, = 15; n2 = 14; U= 120; P= 0.5052> . La edad máxima detectada que alcanza esta especie en libertad es de 12 años (un macho). La hembra más vieja tenía 11 afíos. En su conjunto, la población capturada se reveló muy longeva: el 58'/o de los ejemplares capturados (18 individuos) tenía ocho o más años. De la población de Porto Covo se determinó la edad de 15 ejemplares, todos adultos (11 machos y 4 hembras>. E1 histograma de frecuencias se presenta e:n la figura 14. La edad media de los machos fue 4.64 años y la de las hembras 4.50. La probabilidad de que ambas muestras pertenecieran a la misma población resultó igual a 1(test de la U de Mann-Witney: n, = 11; n2 = 4; U= 22; P= 1.0000). Por tanto, en esta localidad tampoco hay diferencias entre las edades medias de ambos sexos. E1 individuo más viejo de la población portuguesa tenía 7 años, y la edad mejor representada fue la de cinco agos. Las diferencias de longevidad entre ambas poblaciones de P. cultrives son importantes. La desigualdad registrada entre las edades máximas de Madrid y Porto Covo fue de cinco años más a favor de la primera localidad. La edad media de la población adulta madrileña >► ^dad (años) Figura 13.- pelobates cultri^ . Histogramas de distribución por clases de edad de ambos sexos. medias de ambas poblaciones resultaron muy altamente significativas . En el 32.26x puede haber error en un año y en el 19.35'ti en dos afíos. Esto es debido fundamentalmente a tres factores: desaparicián completa de la 18 línea; proximidad entre las últimas líneas - debido a la gran longevidad-, y sobre todo, existencia de dobles ciclos de actividad sólo algunos años. Ver detalles en la tabla 6. 0.5 m m Lámina I.- Pelobates cultripes (Madrid). Cortes transversales de diáfisis de fémur teñidos con hematoxilina de Ehr•lich. A, juvenil de un año y tres meses. B, macho de seis ^3ños. C, hembra de once años. D, macho de ocho años. he, hueso endosteal; lr, línea de reabsorción, 1, la línea de detención del creci- miento, 2, 2a línea de detención del crecimiento. - 5^ - Tabla 6.- Pelobates cultri,pes. Porcentaje de individuos de dos poblaciones CMadrid y Porto Covo) presentando distintos tipos de dificultades a la hora de determinar el número exacto de líneas hematoxinófilas presentes. Localidad N X de indiv, de X de individuos con la X de individuos presentando detereinación edad 1@ linea coepletaoente lineas dohles difícil reabsorhida --------- ---- ----------------------- ------------------------ ------------------------------------------ ib 151,bIX1 error en error en 21 (87.1OX) ----------------------------------------- 100X lineas > SOX lineas ( 50X lineas Madrid 31 1 año 2 años 10 132.2bX1 dobles dohles dobles ----------- --------- ----------- ------------- ------------ 10 132.2bXi 6 l19.35X} b(19.25X1 b 119.25X1 15 148.39X1 ------------------------ ------------------------- 3 (20.OOX1 ------------------------------------------ 9 (60,OOX1 ----------------------------------------- error en error en 100X lineas >SOX lineas ( 50X lineas 1 año 2 años dobles dobles dobles Porto Covo 15 ------------- --------- 2 l13.33X1 ----------- ------------ ------------ 3 120.OOX1 0 10.00X1 4 t26.61X1 2 113.33X1 3(20.OOX1 -53- - La reabsorción endosteal es importante; tiene lugar entre el fin de la metamorfosis y la madurez sexual (2° año. Ver en lámina I el individuo A de un año y tres meses de edad). Normalmente acarrea la destrucción parcial de la la línea, que desaparece completamente en el 32.26°ti de los ejem plares estudiados. Ver lámina I B. - E1 porcentaje de individuos presentando líneas dobles es muy alto (87.10^): E1 19.25°,6 presentaba todas las líneas dobles (lámina I B); otro 19.22% presentaba más del 50'/° de las líneas dobles (lámina I C>, y el restante 48.39'/. presentaba menos de la mitad de las líneas desdobladas (lámina I D> . Consultar tabla 6. - Más de la tercera parte de la población (35.48%> mostraba un gran crecimiento entre el primer aPlo y el segundo. - E1 hueso endosteal alcanza un espesor importante (lámina I B y I D) y su reconstrucción comienza al alcanzar la madurez sexual. Las líneas de detención del crecimiento se marcan bien en él, pero su número es ligeramente inferior al que se cuenta en el hueso de origen pericondral. La lámina II presenta una selección de cortes de diáfisis de fémur pertenecientes a la población de Porto Covo: A) Individuo recién metamorfoseado, que sufrió un breve periodo de estivación en nuestro laboratorio; el hueso pericondral apenas ha sufrido reabsorción y la reconstrucción endosteal no ha comenzado. B) Macho de tres años. E1 borde interno del hueso ha sufrido una destrucción parcial, ya que la 18 línea se muestra incompleta; sin embargo, la reconstrucción endosteal que le sigue es todavía muy débil y no afecta a la totalidad del perímetro de la cavidad medular. C) Macho de 5 años -la edad mejor representada en esta población-. E1 hueso endosteal rodea completamente la cavidad medular. En el proceso de preparación se ha desprendido ligeramente de su posición origiñal: la línea de fractura se corresponde con la de reabsorción. La 48 línea es doble en su A 0.5 m m Lámina II.- Pelobates cultripes (Porto Covo). Cortes transversales de diáfisis de fémur teñidos con hematoxilina de Ehrlich. A, individuo recién metamorfoseado; breve estivación en labor•. Es posible que la ausencia de individuos de dos años se deba a la sequía de la temporada 81-82 que podría haber impedido la reproducción de la especie en el área. En la lámina III pueden observarse cortes de diáfisis de fémur de py varaldii: A) Hembra de un año. La primera línea está completa y rodea concéntricamente la cavidad medular. Esto indica que el hueso pericondral apenas ha sufrido reabsorción -la reabsorción normalmente es más intensa en un lado y esto desplaza ligeramente del centro a la cavidad medular. E1 hueso que se formó durante la fase de renacuajo se conserva; se distingue porque está más vascularizado, indicando con ello un crecimiento más rápido (Castanet, 1982). La reconstrucción endosteal es importante y aparentemente comienza antes del primer periodo de reposo. B) Hembra de tres años. Primera línea completa. Conserva parcialmente el hueso pericondral fuertemente vascularizado característico de la fase larvaria. Tercera línea muy próxima al borde externo. Crecimiento importante entre el primer ago y el segundo. A 0.5mm D Lámina III.- Pelobates varaldii. Cortes transversales de ^iiáfisis de fémur teñidos con hematoxilina de Ehrlich. A, hembra de un año. B, hembra de tres años. C, hembra de cinco zños. D, macho de sieie años. he, hueso endosteal; lr, líne^i de reabsorción; 1, la línea de detención del crecimiento. -59- C) Hembra de cinco años. Primera línea parcialmente reabsorbida. La quinta línea no se aprecia, pero la cantidad de corteza periférica después de la cuarta nos obliga a considerar que tiene un año más. Crecimiento importante entre el primer año y el segundo. D> Macho de siete años. Primera línea completa; tercera y cuarta parcialmente dobles; séptima línea muy próxima al borde externo. Crecimiento importante entre primer y segundo año. Las características histológicas de la población de P. varaldii son las siguientes: - La determinación de la edad resultó difícil en el 15.38'^ de los cortes estudiados. En el 10.26% puede haber un error de un aPio en la determinación y en el 5.13°ti de dos años. E1 factor de confusión fundamental es la poca intensidad con que se tiYíen algunas líneas. Esto hace que ciertas líneas se consideren en un conteo y se ignoren en el siguiente, provocando diferencias en los resultados. - La primera línea se encontraba presente -total o parcialmente- en los 39 individuos estudiados. - Muy pocos individuos presentaban algunas líneas dobles - siempre menos del 50'^6. Ver lámina III D-. Esta circunstancia no es motivo de dificultad a la hora de establecer el número de líneas en esta población. - La totalidad de los ejemplares mostraba un crecimiento importante entre el primer año y el segundo. - E1 hueso endosteal alcanza un espesor considerable, dejando un espacio muy pequeño para la cavidad medular en los individuos más viejos Clámina III D). Su reconstrucción comienza poco después del fin de la metamorfosis y antes del primer periodo de reposo; esto evita que la primera línea sea reabsorbida en su totalidad. La edad media de P. varaldii en libertad es de 4.18 años. Las -60- diferencias de longevidad media no son significativas si los comparamos con Ia población.de F. cultripes de Porto Covo capturada a nivel del mar (test de la U de Mann-Witney; n, = 39; n2 = 15; U= 252; P= 0.4196>, pero si lo son, y al máximo nivel de significación, con la población adulta de P. cultriges de Madrid (test de la U de Mann-Witney n, = 39; n2 = 29; U= 933; P= 0.0000). También hay diferencias en la edad a que se alcanza la madurez sexual; un a4ío en P. varaldii; dos a4íos en P. cultripg^ (Madrid) . 3.1.4.3. Pelobates fuscus y P. syriacus Hemos estudiado diez P. fuscus adultos procedentes de distintas localidades centroeuropeas, por tanto no podemos considerarlos una población. En uno de los ejemplares macho, no encontramos líneas, a pesar de que había alcanzado la madurez sexual. En los restantes se determinó la edad sin problemas. E1 histograma de frecuencias por clases de edad y sexo se muestra en la figura 16. q Y ^ n- 1 ® aa n= 8 ^ 1 2 3 4 Sdad ( Mos ) Figura 16.- Pelobates fuscus. Distribución por sexos y clases de edad de los ejemplares analizados. - 61 - La edad máxima registrada fue cinco años, tanto en machos como en hembras, y la mínima dos años. Histológicamente, la intensidad con que se tiñen las líneas varía muchísimo de unos individuos a otros. Esta óaracterística es coherente con la distinta procedencia geográfica de los ejemplares. lTo hemos encontrado líneas desdobladas. Existe hueso endosteal a los dos años de edad. A primera vista no parece que se haya reabsorbido la primera línea; por el contrario, el hueso pericondral más interno muestra la vascularización abundante característica del hueso que crece a gran velocidad en la etapa larvaria. A falta de cortes de individuos juveniles y recién metamorfoseados no se puede aseverar nada más. De Pelobates syriacus pudimos conseguir dos ejemplares en un intercambio con el Museo de Historia DTatural de Bulgaria. Uno de ellos era un juvenil que no había sufrido todavía ningún periodo de reposo y el otro una hembra de cuatro años con las líneas de detención del crecimiento muy marcadas y la primera línea completa. La edad de cada individuo nos servirá en el capítulo siguiente para establecer distintas clases en la población postmetamórfica. Con ello facilitaremos la descripción del proceso de osificación del esqueleto en la etapa adulta. -62- 3.1.5. TAl^A9'r0 DE LOS BJfi]^PL9RfiS ADIILTOS 3.1.5.1. Dimorfismo segual en Pelobates cultrines y p. varaldii En P. cultripes y P. varaldii no hay diferencias significativas de tamaño entre machos y hembras. En los P, cuLtri^s de Madrid la longitud media cabeza + cuerpo (LCC) de los machos fue 79.87 mm y la de las hembras 79.57 mm. La probabilidad de que las medias de ambas muestras procedieran de la misma población fue muy alta (test de la t de Student para varianzas separadas; t= 0.8; grados de libertad = 20.9; P = 0.9342 ) . En los P. varaldii la LCC media de los machos fue 56.48 mm y la de las hembras 58.21 mm. La diferencia entre ambas medias tampoco resultó significativa (test de la t de Student para varianzas separadas; t=-0.89; g.d.l. = 32.7; P= 0.3822). Se tomaron además otras doce medidas de caracteres morfológicos externos, descritas en el apartado 2.5.2. Los estadísticos básicos de machos y hembras de la población de pi cultripes madrileña se muestran en la tabla 7 y los de la población de p. varaldii en la tabla 8. Ninguna de las diferencias entre machos y hembras en los valores medios de las doce variables resultaron significativas, ni en P. cultrines ni en P. varaldii. Consultar la tabla 9. Podemos concluir que en ambas especies no hay ningún carácter morfométrico externo que permita distinguir con fiabilidad machos de hembras. -63- Tabla 7.- Pelobates cultrj^^ . Estadísticos básicos de trece variables morfométricas. A, machos; B, hembras. A).- MACHOS Variable n x s valor mínimo valor má;^imo (mm) (mm) (mm) (mm) ----------------------------------------------------------------- LCC 15 79. 87 6. 82 bC^. ^)^^ AC 15 28. 70 2. C^9 22. 5^^ MA 15 48.97 4.89 34.50 MF' 15 104. ^4 9. ^5 75. C^t) F 15 :?5. 4^.1 :^. 46 25. Qi.^ TIB 15 31.Q8 ?.lb 21.5^) FIE 15 51.95 4.?5 '7.5p IO 15 8. 88 1. r^7 b. 8^) DN 15 5. Q4 . 36 4. 5^ ) NO 15 6. 47 . 52 5. bl'^ DO 15 9. 86 . 96 7. C^c7 TML 15 6.7.^ .b5 4.86 TMA 15 3.25 .^9 2.26 B).- HEM9RAS 87. 0^) 31. 15 54.55 112. ^5 ?8. 3i.^ ^4.4^^ 56.2^) 1^). 9G 5. 65 7. 40 ! 0. 9 ►i 7.85 ^.Bc) Variable n x s valor mínimo valor máximo (mm) (mm) ( mm) (mm) ----------------------------------------------------------------- LCC 14 79. 57 11. 45 57 .^)^ ^ 1^^ 1. ^)^^ AC 14 28. 31 ^. 24 22, c)^) :^5. 1C^ MA 14 45.7? 6.41 ^Ú.Oc) 55.45 MF 14 100. 3^7 12. 51 77. ^7C^ 124. 8C^ F 14 v4. 9^ ^ 4. 7^) 27. 50 44. 35 TIB 14 29.41 4.21 22.Bi? 37.95 PIE 14 48.54 6.14 ^,6.D0 58.85 IO 12 9.22 1.4q 7.65 19.95 DN 14 4.9b .71 3.8C^ 6.2^? NO 14 6.63 .81 5.5^^ 8.5^ DO 14 9.41 1.^9 6.5^ 11.?5 TML 14 b.48 .96 4.15 7.66 TMA 14 2.96 .67 1.81^ 4.Q6 - 64 - Tabla 8.- Felobates varaldii. Estadísticos básicos de trece variables morfométricas. A, machos; B, hembras. A),- MACHOS Variable n x (mm) s (mm) valor mínimo (mm) valor má;:imo (mm) LCC 21 56.48 5.11 44.40 6:?.0^^ AC 21 2U.9G 1.78 16.45 2^.2^) MA 21 29. 58 3. r^q 2t^. 95 3?. C^r.^ MF 21 71.19 6.79 51.7Q 77.85 F 21 24. 09 2. 2b 18. c)c) 26. 75 TIP 21 21. ^)6 1.97 15.85 2^.35 F I E 21 ^4 . 96 3. 52 25 .^)5 ^9 . 3^) IO 21 6.19 .b9 4.45 7.2^^ DN 21 3.^5 . 52 ^.15 4.4C^ NO 21 4.7^ . 66 3.1G 5.65 DO 21 7.68 .53 6.?5 8.40 TML 2G 3.85 .?9 •^.QS 4.54 TMA 2^) 1.14 . 22 .51 1.50 R).- HEMBRAS Variable n x (mm) s (mm) valor mínimo (mm) valor má:. B^ Pelobates varaldii. Ninguna de las diferencias entre medias resultó significativa. A).- Pelobates cultripes (Madrid) Variable t Probabilidad Grados libertad --------------------------------------------------------• LCC Q. 8 c). 9342 2c), 9 AC p.'8 0.71r^9 21.9 MA 1. 52 0. 14^)8 24. ^ MP 4.98 0.3'b? 23.9 F ► . pb U. 95^)5 2•^. 8 TIB 1.2U Q.24Q4 24.1 FIE 1.72 c>. C^989 2:;.' IO -c).86 0.40c)2 24.3 DN U.37 U.713U 18.9 NO -0.62 0.54C^6 21.9 DO 1.Oi^ r^.3256 2^.8 TML ^^.81 r^.4275 22.7 TMA 1.44 p.1635 2c).7 B).- Felobates varaldii Variable t Probabilidad Grados libertad --------------------------------------------------------- LCC -U.89 0.3822 32,7 AC -1. 25 0. 2242 :;3, ^) MA -4. 16 0. 87 3C^ 32. 3 MP -0.8U 0.4^19 :^1.4 F -0.99 U.332r^ 31.7 TIP -0.78 4.4418 31.4 PIE -0.38 0.7061 33.4 IO -1.81 O.Q793 34.5 DN -U.38 0.7467 37.2 NO -1.01 U.32r^9 37.1 DO -1.05 U.3425 32.4 TML -0.3U 0.7631 31.7 TMA -1.73 ^).0919 33.7 -66- 3.1.5.2. Diferencias aorfométrica,s intraespecífícas en P. cultri,p^ç. La LCC media de los P. cultripes de Madrid fue 79.?2 mm y la de la población de Porto Covo 71.75 mm. Las diferencias de talla entre ambas poblaciones resultaron ser altamente significativas (test de la t de Student para varianzas separadas; t= 3.31; g.d.l. = 39.1; P= 0.0020>. En la figura 17 se representa el histograma de frecuencias por clases de tamaño de las poblaciones adultas de P. cultripes de Madrid y de Porto Covo. Las diferencias entre los valores medios de las doce medidas restantes resultaron altamente significativas o muy altamente significativas (MA, MP, F, I0, DN, A0, TML y TMA>, exceptuando el diámetro del ojo CDO>. La tabla 10 muestra los estadísticos básicos de las trece medidas en ambas poblaciones y la tabla 11 los resultados del test de la t de Student para varianzas separadas entre los valores medios de las variables. -67- MADRID 30 20 ^ q POR?O COVO 20 10 60 r0 70 100 LCC ( ^n ) ^ LCC (mw) Figura 17.- pelobates cultri^es. Distribución de frecuencias por clases de tamaño de los adultos de dos poblaciones ibéricas capturadas a distinta altitud. -68- Tabla 10.- Pelobates cultri^es. Estadísticos básicos de trece variables biométricas, en dos poblaciones capturadas a distinta altitud (?Sadrid y Porto Covo). A).- Población de Madrid Variable n x (mm) s (mm) valor mínimo ( mm) valor má;,imo (mm) LCC 29 79.72 9.18 57.0^) lO1.Or? AC 29 28.51 2.66 22.00 35.1^ MA 29 47.40 5.81 ^3.00 55.45 MP 29 102.39 10.94 75.Or^ 124.B0 F 29 34.95 4.0^ 25.00 44.15 TIB 29 3C^.27 3.73 21.50 37.95 PIE 29 50.?0 5.48 36.00 58.85 IO 27 9.r^3 1.0' 6.80 10.95 DN 29 5. Or.^ 0. 55 3. 80 6. 2i ^ NO 29 6.55 0.67 5.50 8.50 DO 29 9.64 1.19 6.50 11.35 TML 29 b.bl c).81 4.15 7.B5 TMA 29 3.11 0.56 1.80 4.06 B).- Población de F'orto Covo Variable n x s valor mínimo valor méximo (mm) (mm) ( mm) (mm) ----------------------------------------------------------------- LCC 16 71.75 6.81 59.00 84.00 AC 16 26.02 2.16 21.B5 29.45 MA ib 40.96 4.01 33.10 47.50 MF' ib 92.61 7.15 77.50 140.Ora F 16 31.10 2.30 26.85 34.15 TIB 16 27.2:, 2.^9 21.95 30.70 PIE ib 45.26 4.r^7 35.60 50.45 IO 16 7.13 0.71 5.90 8.05 DN 16 3.64 0.41 3.00 4.45 NO ib 5.60 0.53 4.65 6.25 DO 16 9.27 0.47 8.50 10.00 TML 15 5.36 0.74 4.05 6.48 TMA 14 1.87 0.39 1.29 2.51 -69- Tabla 11.- Resultados del test de la t de Student para varianzas separadas al comparar los valores medios de trece variables morfométricas en dos poblaciones de P. cultripes capturadas a distinta altitud. Variable t Probabilidad Grados libertad ------------------------------------------------------- LCC ► . •11 0. OU2c) *^ ?9. 1 AC ^.4c) ^^. ^7r^ib ^^ 36.8 MA 4. ?8 r^, ^)^)c) i**^ 44. b MP •• . 62 ^. D0^)B *^* 41. 6 F 4.^8 4.ODU2 *** 42.9 TIB ?.32 O.OC^19 ^* 41.9 RIE 3.51 4.OD12 ** 39.r^ IO 7.16 0.0^0^) *** 4^,p DN 9.4Q r^.O40p *^* '8.7 NO 5. 21 0. Qt7^C^ *^r^ 37. ^ DO 1. 48 Q. 1457 4^). p TML 5. 1:^ p. r^r^qi^ *** 30. 9 TMA 8. 42 ^. ^4^r.^ ^^^ ^5. 4 *** muy altamente significativa (al 99.9%) ** muy significativa (al 99%) * significativa (al 95%) -70- 3.1.5.3. Tamaño medio de los adultos de las especies estudiadas De la familia Pelobatidae hemos medido ejemplares de los tres géneros: Pelobates, Scaphio,pus y ,^pQ,^. Del género Pelobates tenemos datos de todas las especies. E1 tamaño medio, indicado por la longitud cabeza + cuerpo (LCC) de los adultos de las dos poblaciones de P, cultrip^ utilizados en la elaboración de esta tesis fue 79.72 mm Cn = 29) y 71.75 mm (n = 16); el de P. varaldii, 57.24 mm (n = 41>; el de P. fuscus, 50.56 mm (n = 18>, y por último, el de P. sayriacus, 68.50 mm (n = 10). De las especies americanas conocemos el tamaño medio de una de cada género: 53.60 mm ^gea multip a^ Cn = 10> y 62.44 mm Scagh^opus couchii . De la familia ^[egophryidae sólo tenemos la LCC media de 10 ^^^nhr; s montana <78.90 mm ) y un i^ptobrachium hassel ti t<58.00 mm> . De la familia Pelodytidae conocemos las tallas medias de los dos componentes de la misma: Pelodytes punctatus (30.59 mm; n= 29) y py caucasicus (45.00 mm; n = 3 ) . Los estadísticos básicos de la longitud cabeza + cuerpo de las especies mencionadas se presentan en la tabla 12. - 91 - Tabla 12.- Estadísticos básicos de la longitud cabeza + cuerpo en los adultos de las familias Pelobatidae, Pelodytidae y xegophryidae. Familia Pelobatidae n x s valor mínimo valor má;:imo (mm) (mm) (mm) (mm) ------------------------------------------------------------------ P, cultripes 29 (Madrid) P. cultripes 1b (Porto Covo) P. varal di i 41 F'. f uscus 18 F'. si ryacus 1Q S. couchi i 9 S. multiplictus it? Familia Megophryidae 79.72 9.18 57.0^? lO1.C^^^ 71.75 6.81 59.00 B4.c?^^ 57. ^4 b. O1 44. ^^Q 67. Ot? 5^^. 56 4. 38 44. p0 b^^. ^^? 6B. 5t7 5. 62 61. 0^ 79. ► t? 62. 44 :^. 95 57. t)^? 70. OC^ 53.60 1.8^^ 5C^.t?i^ 56.^0 x s valor mínimo valor má:.imo (mm) (mm) (mm) (mm) ------------------------------------------------------------------ M. moritana lt7 78. 9U 6. 7t? 69. t?h 9t?. t?^ L. hasseltii 1 58.4<.^ Familia Pelodytidae n x s valor mínimo valor m^; 0.05>, deja de existir una relación positiva entre la edad y el tamaño. Por consiguiente, podemos concluir que los sapos de espuelas de esta localidad finalizan su crecimiento en longitud a los cuatro años. E1 diagrama de dispersión de la edad y el tamaño de los P. cultri^es de Madrid de la figura 18, apoya gráficamente nuestros resultados. En la población de P. cultrig^ de Porto Covo, la correlación entre edad y tamaño es muy significativa utilizando toda la muestra (n = 15; edad mínima = 3 años); significativa para los mayores de tres años, y deja de existir relación entre la edad y el tamaño a partir de los cuatro años. La tabla 13 presenta los distintos coeficientes de correlación y el nivel de significación, y la figura 19, el diagrama de dispersión de ambas variables. - 73 - Tabla 13.- ►oeficientes de correlación de Spearman Cr.> entre la edad (n^ de agos> y el tama4io ^). C5 més de 4 años 2? i^,i^9^^9 184^^.C^2 >> • .1f^ B).- Forto Covo Edad n r= S P ------------------------------------------------------- més de 2 años 15 ^.b175 214.2 C C.O1** más de ^ años 12 b.536B 132.47 ^ 0.05* más de 4 años 9 4.^912 73.06 } 4.05 ^** muy altamente significativa (al 99.9%) ** muy significativa (al 99%) * significativa (al 95%) -74- ^ 0 ^^ 12 b c^ ^ 11 0 10 •o 0 9 or • 8 • ^i •w o 0 7 6 5 0 0 4 • o 0 3 o • 2 0 1 n n 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 • p^ (n= 15) ° ^^ (n= 14) o juv (n= 2) LCC ( ^nm ) Figura 18.- pelobates cultrig^.s (Madrid>. Diagrama de dispersión para la edad y el tamaYio . Incluyendo los sapos de un año, la correlación entre edad y LCC es positiva y significativa (rs = 0.3602; n= 39; P< 0.05>, pero la relación entre ambas variables desaparece a partir de los dos años y Lebedkina (1986> . 3.2.1.2. Secuencia de osificación del cráneo de Pelobates cultri^;, En P. cultri^ la secuencia de aparición de los quince huesos es la siguiente: paraesfenoides, frontoparietal, prooticooccipital, septomaxilar, premaxilar, nasal y maxilar; esr_amoso, vómer, anguloesplenial y dentario; pterigoideo, esfenetmoides, cuadradoyugal y proceso posteromedial del hioides. La mayoría de estos huesos surgen a partir de un solo centro de osificación, con las siguientes excepciones: el frontoparietal, prooticooccipital, escamoso y dentario se forman al fusionarse dos o más centros de osificación independientes, que en otras especies constituyen dos o más huesos distintos; y además, en el premaxilar, maxilar y vómer, cada diente comienza a osificar autónomamente. Por ello, vamos a proceder a una descripción de los acontecimientos más importantes en el desarrollo de cada hueso y del momento en que se producen. Paraesfenoides.- Hueso de membrana, medial, plano y en forma de T, que protege ventralmente la región ótíca y orbitotemporal del encéfalo y llega hasta el extremo posterior del esfenetmoides. Ver fig. 21. A B rroM. esf.net. naa^ p^resf. ^sptm^x. proe. ^lar (Phm^x) maa. prsmaz. mmk. 1^.!'1►R^ No Figura 21.- Cráneo de Pelobates cultri^es. e, norma dorsal; B, norma ventral; C, norma lateral; D, mandíbula inferior en norma dorsal; E, mandíbula inferior en norma ventral. -79- r ^ , ^ ^ ^ ^ Smm Figura 22.- Esqueleto de la laringe e hioides de Pelobates cultripes en norma ventral. En negro, el hueso; eñ blanco, el cartílago. 1, proceso posteromedial del hioides. - 80 - Es el primero en comenzar a osificar en el estadio 34 (fig. 23 A). Desde el,primer momento presenta su forma definitiva, ganando espesor a lo largo del desarrollo larvario. Frontoparíetal.- Hueso plano, de origen dérmico, que cierra la caja craneana dorsalmente, con ornamentación en su cara externa constituida por tubérculos individualizados Se forma al fusionarse cinco elementos distintos: dos corresponden a los frontoparietales y son los primeros en aparecer en el estadio 36 (fig. 23 B); dos a los extraescapulares laterales , que aparecen en el estadio 40, y uno al extraescapular medial . A, B y C, estadio 44 en normas dorsal, ventral y lateral, respectivamente; D, fi y F, estadio 45 en normas dorsal, ventral y lateral, respectivamente. 7, septomaxilar; 8,^ premaxilar; 10, maxilar; 11, preopercular; 12, vómer; 13, anguloesplenial; 14, dentario; 15, dientes de los premaxilares; 16, dientes de los maxilares; 17, pterigoideo; 18, esfenetmoides; 19, cuadradoyugal, y 20, dientes de los vómeres. 11 19 2, B 2Z 5mm , Figura 25.- Osificación del cráneo de pelobates cultri^^ en que se ha iniciado la mineralización. Se indica el número de ejemplares estudiados por estadio. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Estadios 6osner 25 26 21 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 36 39 40 41 42 43 44 45 4b la s. 2a no e^emol.exam. 0 1 1 1 1 10 10 10 14 10 10 10 9 8 10 10 7 8 10 :0 19 10 9 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Centros de osificación Porcentaje de individuos presentando osificación ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Paraes4enoides Frontoparietales Exoccipitales Proóticos Extraescapulares laterales Extraescapular medial Septomaxilares Premaxilares Nasal es Maxilares Preaperculares V6®eres Anguloespleniales Dentarios Dientes en Premaxilares Dientes en Maxilares Pterigoideos Esfenetmoides Dientes en Vdmeres Cuadradoyugales Escamosos Procesos posteromediales del Hioides Mentoaeckelianos 20 10 30 bC 90 90 t00 50 100 30 100 22 100 90 100 20 70 100 50 71 100 14 75 104 14 75 90 t00 70 100 70 100 30 80 100 20 70 100 20 50 100 20 50 100 50 100 50 100 10 30 100 40 90 100 BO 90 100 60 90 100 b0 100 20 50 100 2? 100 -85- Tabla 15.- peloba. s cul.rip^. Para cada estadio de desarrollo (Gosner, 1960), porcentaje de individuos en que la fusión de dos o más centros de osificación ha comenzado. Estadios 6osner 40 41 42 4^ 44 45 4b :@sem. ler aF^e no ejemol, exam. 10 7 B 10 10 10 10 9 Z Fusiones en el cráneo Porcentaje de individuos en oue la fusidn ha caaen:ado ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- Frontaoarietales + Estraescaoular aedial 29% 257. Frontoescao. aedial + Extraescaos.lats. IOX 14 157. 1007. Oientes + Maxiiares 40X 907, 100X Dientes + Premaxilares SO% 1007. !]ientes + Vóaeres 20X 100X Preoperculares + Escaaosos 20X 100X Proáticos + Exoccipitales 0 100X Frontales en su linea aedia 0 100ií 1mm 1mm Lámina IV.- Pelobates cultripes. A, corte sagital de un frontoparietal en su línea media. B, detalle del anter^ior^, mostrando la simetría de tr^es líneas de detención del crecimiento (señala- das con flechas). 'finción con hematoxilina de Ehrlich. -87- de tubérculos de la zona central del hueso no sufre remodelación, como puede deducirse de' la simetría de las líneas. Prooticooccipitales.- Huesos pares, de origen endocondral que protegen completamente la región ótica. Forma muy irregular (fig. 21). Están cubiertos parcialmente por el frontoparietal y articulan con el atlas mediante dos cóndilos, uno en cada elemento de la pareja. Cada uno proviene de la fusión de dos elementos: exoccipital y proótico. E1 primer centro de osificación que aparece corresponde al exoccipital, en el estadio 37. E1 segundo aparece en el estadio 38, correspondiendo al proótico de otras especies . Prenagilares.- Huesos de membrana, pares, limitan la parte anterior del endocráneo. Inician su osificación en el estadio 42, en la pars facialis . Poseen dientes de tipo pleurodonto en su parte ventral, que comienzan a osiicar en el estadio 44 a partir de centros individualizados . iasales.- Huesos pares de origen dérmico, cuyas partes medias cubren el tectum nasi, mientras que las laterales cubren la pared postnasal. Su cara dorsal es ligeramente convexa y posee ornamentación tubercular del mismo tipo que la del frontoparietal. Comienzan a osificar en el estadio 43 con su forma definitiva (fig. 23 E), tiñéndose ligeramente antes el área del proceso posterior. La ornamentación sigue las mismas pautas en su aparición que la del frantoparietal. ][asilares.- Huesos pares de origen dérmico, ornamentados. Comienzan a osificar a la vez que los nasales, en el estadio 43, en el área de la futura _ ^ ,:•. _^° ^- :ámina anterior (fig. 23 E^. No alr_.ar:zan su forma defir.itiva hasta la orim?ra semana. Í>o^;tm et,amórf ica . Fo.-^ta•dcres de úiente:. qur consti±uyen las zonas a.ntera-lateraie:_. y laterales dei arc:o dental. Esto_, coi^ier...^ r^ a osi*"icar er: el e^^tadio 44, ca^.a uno a partir de uu oentro de osificaciór, distinto (fig. 24 C), aparecien:,o primero los situados en la lámina anterier del mar.iiar; ya en el estadio 4^ se observa ur. di^nte anclado en el hueso y colocado siempre a un tercio de :_u er.tremo anterior (fig. 24 F). El proceso palatino comien^a a observarse en el estadio 44 come una. prolongación de la maxilla hacia el interior del cráneo ifig. 24 E), sin que se haya podido observar un centro de osificacióri independiente para él. Escamosos.- Huesos pares de ►rigen complejo que surgen a partir de do:^ ^^entro^• de osifioa^ión. Su cara externa =.e halla ornamentada con tubér^^ulos. E1 primer centro en aparecer lo hace en el estadio 44, alrededor de la pars ouadrata palatoquadrati cartilaginosa y originará el proceso posterolateral del hueso y la parte anterio.i- de la lámina ifig. 24 A- F), siguiendo a Lebedkina (1986> lo llamamos preopercular. E1 segundo centro de osificación surge en el estadio 46 sobre la crista parotica y constituirá el ramo parótico del hueso adulto y la parte posterior de la lámina ; en el estadio 45 comienza la osificación de 1^:!s - 89 - dientes, cada uno a partir ^le un centro inderendieiite (fig. 24 E), y en la primera semana postmetamórfi►a se fusionan cor. el hueso, iniciando el ;aroce:^e lo:_- diente^• situados más próximos al eje sagital tfig. 25 E). Angulo^pleniales.- Hueso^^ pares, dermales, alargados con iigera forma de S en norma dor^al y situados en la mandíbula inferior. Comienzan a osificar en el estadio 44 por su extremo posterior (fig. 24 C), y alcanzan su forma definitiva ai finali^ar la metamorfosis (fig. 25 C>. Dentarir^s.- Huesos pares, alargados y cousiderablemente delgados, de origen dérmico, situados en el arco mandibular inferior. Cada elemento del par contacta con su simétrico en la sínfisi^ medial y se juntan con lo:^ anguloespleniales a lo Iargo de su superficie exterior, cubriendo el cartílago de Meckel lateralmente. Siguen un desarrollo paralelo al de los anguloespleniales: comien^an a osificar en el estadio 44 por su extremo anterior (fig. 24 C> y al finalizar la metamorfosis tienen su forma definitiva (fig. 25 C>; una semana después el mentomeckeliano comienza a o,ificar (fig. 25 F>. Es éste un centro de osificación par de origen cartilaginoso que desde que aparece se halla fusionado sinostóticamente con el dentario, constituyendo ambos una sola pieza. Pterigoideos.- Huesos pares de origen dérmico, situados en la parte posterior del cráneo, contactan con el paraesfenoides, los cuadradoyugales y escamosos. Tienen forma triangular y cada uno de sus tres vártices se alarga en un ramo. Su zona central es la primera en aparecer en el estadio 45 (fig. 24 D- Fi; luago la osificación se va e:^tendiendo hacia los ramos interior y posterior, y la última área en osificar es la correspondiente al ramo maxilar, que presenta señales de mineraliza•^iór. en la primera semana postmetamórfica (fig. ^'S E>. Esfenetmoides.- Hueso único de origen endocondral, situado en el - 90 - interior de la ^aja craneana, cubierto dorsalmente por el frontoparietal v los nasales; ventralmente limita con el paraesfenoides, los vómeres y los pro^esú:^ palatinos de los ma:^ilares. Su forma es rectangular, con tres procesos en su parte anterior. Comienza a osificar en el estadio 45 a partir de dos centros de osifi^ación en la parte anterior del encéfalo, justo a los lados de los forámenes para la salida de los nervios olfativos (fig. 24 D- F). Ño alcanza su forma definitiva hasta la madurez sexual que es cuando los tres procesos anteriores se observan osificados. Cuadradoyugales.- Huesos pares. Tradicionalmente se les adjudica un or^igen doble, cartilaginoso y de membrana (Kemp ^ Hoyt, 1969; RoL^ek, 1950, y referencias en ambos>. Se situan en los extremos lateroposteriores del cráneo; limitan con los maxilares, escamosos y pterigoideos, y articulan con los angulares de la mandíbula inferior. En los individuos examinados de estadio 45 aparece un centro de osificación entre el extremo inferior del proceso posterolateral del escamo^^o y el maxilar . En la primera semana postmetamórfica la osificación ha invadido la parte distal cartilaginosa de la pars cuadrata palatoquadrati que constituye la superficie de articulación de este hueso con la mandíbula inferior, sin que se haya observado un centro de osificación independiente en esta invasión (fig. 25 A- F). Procesos posteromediales del hioides.- Huesos pares de origen endocondral; pertenecen a lo^: elementos viscerales libres del endocráneo (fig. 291 , Comien^an a o:^ificar en el estadio 46, presentando su forma definitiva en la primera semana postmetamórfica (fig. 2^ B y E>. E1 comienzo de su osificación señala el fin de la metamorfosis en ei cráneo. A1 terminar la metamorfosis, en el estadio 46 de la tabla de Gosner (1960>, la osificación ha comenzado en todos los huesos del crán^o, pero é^sto:^ no alcanzan una forma parecida a la adulta hasta una semana después. - 91 - Tabla 16.- Sécuencia en que inician su osificación los distintos elementos del cráneo de Pe1_obates cultrtpe^, cronología de las fusiones de dos o más centros, estadio de desarrollo en que se inicia cada suceso - considerando como tal el primero a partir del cual al menos el 50% de los ejemplares presenta el hecho- y, por último, edad media a que comienza y termina cada estadio en renacuajos criados a temperatura óptima. ' Elementos del cráneo Fusiones Est.6osner Edad Idías? a 2AoC --------------------------------------------------------------------------------------------------- Paraesfenoides 34 11.25-12.25 Frontoparietales 3b 13.75-1b.75 Exoccioitales 37 1b.75-21.25 Proóticos 38 16.75-23.67 Extraescaoulares iaterales Extraescapular medial 40 e 24.15-25.75 Septomaxilares Frontopar. + Extraescp. m. + 42 27.75-29.00 Premaxilares Eztraescaps. lats. ' Nasales Mazilares 43 e 29.00-31.00 Preooerculares Vómeres Angulaespieniales Dentarios Dientes de los premaxilares Dientes de los ®axilares 44 e e e 31.00-32.33 Pterigoideos 45 32.33-33.33 Esfenetmoides ^ Dientes de los vómeres ° Cuadradoyugales ° Escamasos Dientes + Maxilares 4b 33,33 Proc. posteromed, hiodes Dientes + Premaxilares ' Dientes + Vómeres la sem, oostm. Preooerculares + Escamosos Mentomeckelianos Mentoeeckelianos + Dentarios lnunca se observan separadosi . 2@ sem. oostm. Prodticos + Exoccipitales ler año Frontales en su línea sedia ' - 92 - La tabla 16 resume la cronología del comienzo de la osificación en los veintitrés centros distintos del cráneo de P. cultri^es y el momento del desarrollo en que algunos de ellos se fusionan constituyendo un cráneo adulto de quince elementos individualizados. Se considera "estadio de inicio" de la osificación de un elemento, o de la fusión de dos de ellos, el primero a partir del cual al menos el 50°^ de los ejemplares estudiados presenta el hecho. En las tablas 14 y 15 se relacionan los porcentajes detallados y el número de individuos estudiados de cada estadio. La secuencia en que comienza la osificación de los veintitrés elementos es la siguiente: paraesfenoides, frontoparietales, exoccipitales, proóticos, extraescapulares laterales, extraescapular medial; septomaxilares, premaxilares, nasales y maxilares, preoperculares, vómeres, anguloespleniales y dentarios, dientes de los premaxilares y dientes de los maxilares; más tarde, pterigoideos, esfenetmoides, cuadradoyugales, dientes de los vómeres, escamosos y procesos posteromediales del hioides, y finalmente, mentomeckelianos. La primera fusión que se produce es la de los frontoparietales con el extraescapular medial, seguida de la fusión de esta nueva pieza con los extraescapulares laterales; luego se fusionan las primeros dientes de los maxilares con el hueso que los soporta, los dientes de los premaxilares con los mism os y los dientes de los vómeres hacen lo propio; del mismo modo, poco después de aparecer el preopercular se fusiona con el escamoso; más adelante, el mentomeckeliano comienza a osificar sin que se aprecie nunca separado del dentario, y finalmente, los proóticos y exoccipitales por un lado y los frontales en su línea media por otro, se fusionan ya bien entrada la fase terrestre y antes de cumplir el primer ago. Ver tabla 16. Es sorprendente la escasa variabilidad observada en la secuencia de osificación. De los 176 ejemplares estudiados, sólo dos de ellos presentan una alteración de la secuencia modal descrita: en un ejemplar de estadio 43 los pterigoideos habían comenzado a osificar sin que la mineralización se hubiera iniciado en los dientes de los premaxilares y maxilares, y en otro de estadio 44 la osificación del esfenetmoides había comenzado sin que lo hubiera hecho la de los pterigoideos. Por tanto, podemos afirmar que la secuencia de -93- osificación craneana de P. cultripes está muy bien definida. Bo podemos decir lo mismo del estadio de desarrollo en que se inicia la osificación de cada hueso, lo normal es que tenga que transcurrir un lapso de dos estadios desde que un centro de osificación aparece en un pequeño porcentaje de individuos hasta que está presente en el 100 °^G de los individuos de estadios posteriores, como puede verse en la tabla 14 y en la figura 26. E1 paraesfenoides, proótico y premaxilar son los huesos con mayor rango de posibilidades en cuanto a su momento de aparición. Pertenecen a las primeras etapas de la secuencia. Los dos primeros osifican en la fase prometamórfica, mientras que el premaxilar lo hace al iniciarse la metamorfosis. En nuestra especie el proceso de inicio de la osificación en los veintitrés centros que totalizan quince huesos desarticulados distintos, a temperatura de crecimiento óptima, dura en total 29 días. E1 paraesfenoides comienza su osificación en el estadio 34, a los once días de edad; veintidós días después, al fin de la metamorfosis, han aparecido los quince huesos del complemento craneal, sólo falta por aparecer en el dentario su centro de osificación de origen endocondral, el mentomeckeliano, que iniciará su mineralización entre la primera y la segunda semana de vida terrestre. Los detalles de la edad a cada estadio se relacionan en la tabla 16. En casi ningún estadio es posible prever el número exacto de centros de osificación que . va a haber presentes. E1 rango de posibilidades es especialmente amplio durante la metamorfosis, donde hemos encontrado desde individuos de estadio 43 con siete centros de osificación hasta individuos con dieciseis, y ejemplares de estadio 44 que poseían entre once y dieciocho centros. E1 estadio mejor definido resultó ser el 38, pues la asificación había comenzado en los cuatro primeros huesos de la secuencia en los diez renacuajos estudiados. - 94 - I 32 . I 1 . ^ i ^ ^- PF FRP EX PRO EL EN SP PRE NA NA% POP VO AMG DEN OPRE ONAX PT ESF DVO LYU ESC PpNIO NN Centros de osificación del cráneo Figura 26.- Pelobates cultri^. Para cada centro de osificación del cráneo, estadios de desarrollo entre los que comienza su osificación. Las barras horizontales señalan el estadio a partir del cual más del 50^ de los renacuajos examinados presenta osificación. AbG, anguloesplenial; CYU, cuadradoyugal; DEDT, dentario; DMAX, dientes del maxilar; DPRE, dientes del premaxilar; DVO, dientes del vómer; EL, extraescapular lateral; EM, extraescapular medial; ESC, escamoso; ESF, esfenetmoides; fiX, exoccipital; FRP, frontoparietal; 14AX, maxilar; MM, mentomeckeliano; 1PA, nasal; PF, paraesfenoides; P.p. HIO, proceso posteromedial del hioides; PRE, premaxilar; PT, pterigoideo; PRO, proótico; SP, septomaxilar, y V0, vómer. - 95 - 3.2.1.3. Comparación con Pel punctatus y otras especies de Anuros Se puede realizar desde cuatro puntos de vista: - Número de huesos del esqueleto adulto. - Número de centros de osificación en el desarrollo de cada hueso. - Secuencia de osificación. - Duración del inicio de la osificación. ^ En cuanto al número de huesos del esqueleto adulto, contamos coñ datos de 18 especies, recopilados por Trueb (1985). Resumimos aquí el complemento óseo que esta autora encontró en las especies revisadas; los huesos se4falados con un asterisco faltan en algunas. Huesos prenetanórficos: Paraesfenoides Frontoparietal Exoccipital Huesos netamórficos: Septomaxilar Premaxilar liaxilar Anguloesplenial Dentario Nasal Froótico Huesos del fin de la metamorfosis: Cuadradoyugal^ Palatino^ Pterigoideo Vómer^ ?Sentomeckeliano Huesos postmetamórfic^s: Esfenetmoides Columella-^ Interfrontal# -96- De este coniunto básico de 28 huesos, en Pelobates cultri^es faltan tres: el palatino, la columella y el interfrontal; en P^lodytes punctatus sólo faltan el palatino y el interfrontal. En ambas especies el exoccipital y el proótico se hallan fusionados , es decir, se ha estudiado una especie de cada uno de los tres grandes grupos de Pelobátidos en sentido amplio, por tanto, su susencia puede considerarse una característica del grupo. De las restantes especies sin palatino libre, podemos señalar a todos los Archaeobatrachia -anuros considerados antiguos- en que se ha estudiado el tema: (í,^►t^^ hus truei, Eombina orientalis, Rhino^hrynu^ dorsalis, ^yy^ laevis, ^[, borealis y^(,, tropicalis (en Trueb, 1985). En p, cultripes no hemos encontrado un centro de osificación atribuible a la columella. Cannatella <1985) tampoco la encuentra, no obstante duda de su ausencia y considera que puede haberla perdido en el proceso de preparación del esqueleto desarticulado. En P, fuscus y P. syriacus no hem os encontrado columella en ninguno de los ejemplares estudiados. Rocek (1980) no la menciona en p, fuscus; sin embargo Cannatella (1985) dice que existe, aunque -97- reducida en sus proporciones típicas, tanto en P. fuscus como en P^^.yriacus. En la única especie del género en que hemos detectado una columella bien desarrollada es en P. varaldii, y podemos precisar que inicia su osificación una semana después del fin de la metamorfosis. De las especies que se consideran más próximas filogenéticamente al género Pelobates, la columella se halla presente en Pelo ytes punctatus (esta tesis> y en todas las especies de los géneros Sca^io^ y^g; en Mesra^ s aceras, M. montana y L^ntobrachium hasseltii (Cannatella, 1985>. De las especies de anuros consideradas primitivas, carecen de ella: Ascaahus truei, Bombina orientalis y Rhinophrynus dorsalis . Repasaremos lo que se sabe de cada hueso en las distintas especies, siempre que se hallan detectado diferencias respecto a lo descrito aquí para Pelobates cultripes. Frontoparietal.- E1 tipo de desarrollo descrito en esta tesis para ^ çultr ,pes que implica la fusión de cinco centros de osificación: dos pares y uno medial, hemos podido comprobarlo también en P. varaldii criados en nuestro laboratorio; era conocido ya en P. fuscus y P• s4 riacus (Rocek, 1980 y 1988), y según este autor en P. fuscus se conocía este hecho desde antiguo (Severtzoff, 1891). Por tanto, este tipo de desarrollo tan peculiar se da en todas las especies del género Pelobates, y como veremos a continuación, en ninguna otra de las estudiadas hasta la fecha. - 98 - Entre las especies que se suponen más estrechamente emparentadas con nuestro género, conocemos el desarrollo del frontoparietal en cuatro de ellas: s,aphiopus hammondi (Eaton, 1939>, ^^phrys boettgp„ri y Lentobrachium hHSSeltii (Griffiths, 1954>, y Pelody^es punctatus (Griffiths, 1954; esta tesis>, y en todas surge a partir de un sólo centro de osificación par. De las restantes familias consideradas primitivas, se han estudiado: Asca^hus truei ; Disco9losus gictus, Alytes obstetricans y Xenopus tropicalis, y R..^^ ens , y un solo centro en R. clamitans (Eaton, 1939), R. nicobarensis (Griffiths, 1954>; R. aurora, $,. cascadae y R. pretiosa (Altig, 1969b>. Del género B^a se han estudiado ocho especies, presentando B. calamita B. carens (Griffiths, 1954) dos centros de osificación en cada frontoparietal, y B. californicus (Eaton, 1939); B. bufo, B. marinus, ^ ;,^^g nP R^.^., $, regularis y B. boreas (Gaudin, 19?8> un sólo centro. Del género $,y^, se han estudiado dos especies y en las dos había un sólo centro de osificación: ^I. regilla y Sedra <1949); mientras que para Griffiths <1954), los parietales no se han perdido, sino que se han fusionado con los frontales en -99- las especies en que los fontoparietales presentan un solo centro de osificación.^ Sin embargo, el mismo Griffiths <1954>, después de estudiar este tema en veintinueve especies, señala que incluso en renacuajos criados en las uniformes condiciones del laboratorio, el tamaño resultó ser una guía muy poco fidedigna para determinar con antelación el estado de osificación craneal. Por tanto, podría ser que la cantidad y variedad de ejemplares utilizados en estos trabajos -que no se especifica en material y métodos, pues son publicaciones relativamente antiguas- fuera insuficiente para detectar procesos que, como éstos, transcurren muy deprisa durante el desarrollo. No obstante, una ontogenia del frontoparietal tan especial como la del género Pelobates, no se ha descrito para ningún otro anuro actual. Rocek (1980) le da una gran importancia filogenética, pero no nos pronunciamos sobre este aspecto pues los géneros $$^ y Ptdf.p. presentan gran variabilidad. Baoccipitales.- Hemos visto que en P• cultri^s comienzan a osificar a partir de un solo centro de osificación cada uno. Lo mismo sucede en Pelo ytes ^nctatus (datos propios) y en Bufo boreas describen tres centros en Rana pipiens y Altig (1969a> detecta también tres centros de osificación en Ascaphus truei. Los proóticos se fusionan con los exoccipitales en algunas especies. En Py cultripes nosotros hemos visto que la fusión ya se había producido en los individuos de un año de edad. En Pelodytes punctatus, dos semanas después del fin de la metamorfosis ambos huesos se encuentran separados, mientras que los encontramos fusionados en los veintinueve adultos que hemos estudiado. En ^,g►aDhus truei (Altig, 1969a) y Pseudacris nigri.a tris riatA (Stokely & List, 1954>, los autores dicen que la fusión tiene lugar en el adulto. No existen datos de otras especies. - 100 - P*PnAYilares.- Hemos visto que en P. cultri^ primero osifica la pars facialis y luego la pars dentalis. Rocek <1980) describe un desarrollo inverso en el premaxilar de P. fuscus; en cambio, la secuencia de acontecimientos en p^lodytes punctatus, y la descrita en Ascaphus truei (Altig, 1969a>, H^^ ^g,i1],^ (Gaudin, 1973> y Rana ^piens . Este autor en su revisión del tema encuentra que el doble origen de este hueso en P. fuscus fue descrito por Reinbach <1939>. También se había mencionado en algunos Ránidos y Bufónidos ; en Bufonidae y Atelopodidae . Ningún autor americano menciona este doble origen del escamoso. Kemp & Hoyt (1969) describen el desarrollo de este hueso en Rana pj,piens a partir de un solo centro de osificación situado en la pars cuadrata palatoquadrati; sin embargo, en la figura 21 c de dicho trabajo se aprecia un segundo centro de osificación sobre la crista parotica que los autores no mencionan en sus descripciones. Gaudin (1973> describe también un solo centro de osificación en Hyla regilla. E1 mismo Gaudin <1978) examinó el desarrollo de 725 $.^fQ ^^ y ni menciona ni discute el segundo centro de osificación del escamoso, que aparece en otros bufónidos sobre la crista parotica. Según Lebedkina <1986> solo los Discoglósidos de los géneros ^a y Algtes desarrollan sus escamosos apartir de un centro de osificación único situado sobre el palatocuadrado. Nosotros hemos observado este mismo tipo de - 101 - origen del escamoso en Pelodytes punctatus. Vóaeres.- Surgen a partir de un solo centro en P. cultripes y Pelodgtes nunctatus (datos propios), Rana pipiens (Kemp & Hoyt, 1969), e^ a regilla (Gaudin, 1973) y a partir de dos centros en Pseudacris n^g,rita triseriata (Stokely & List, 1954). Los dientes que porta este hueso osifican a partir de un centro cada uno. Los autores citados no indican este hecho. Pterigoideos.- Surgen a partir de un centro de osificación en p^ cultr4s y Pelodytes punctatus , y a partir de tres centros, uno en cada rama del hueso, en $yla re,gilla . Coluaella.- Este hueso no existe en Pelobates cultripes. Osifica a partir de un solo centro en la primera semana después del fin de la metamorfosis en Pelobates varaldii. En Pelod^ tes,^unctatus existe este hueso bien desarrollado en el adulto, pero no había comenzado su osificación en los sapitos de dos semanas de edad estudiados. DTo hay datos sobre el número de centros de osificación de este hueso en las restantes especies, debido a que su mineralización se produce después de que la metamorfosis ha concluido. Hay confusión en cuanto al número de centros en los huesos de origen endocondral: exoccipitales, proóticos y esfenetmoides, principalmente porque los autores no proporcionan dibujos o fotos que muestren los distintos centros; en cambio, la diferencia en el número de centros en los huesos de origen dermal: frontales, maxilares, escamosos, vómeres y pterigoideos, está mucho mejor documentada gráficamente en las distintas especies y no hay - 102 - ninguna duda de que es real. Su importancia filogenética está aún sir. determinar. ' Después de la revisión realizada, podemos concluir que el número de centros de osificación en el cráneo es superior al número de huesos, en las diez especies en las que su proceso de osificación se conace con más detalle: Asca^hus truei (Altig, 1969a); Bombina orientalis, (Hanken & Hall, 1984>; Bufo boreas ; Hryla regilla (Gaudin, 1973>; Pelobates cultripg= y Pelobates varaldii (esta tesis); Pelobates fuscus (Rocek, 1980); Pelodytes punctatus ; Pseudacris nigrita triseriata . En cuanto a la secuencia de osificación, la de Pelobates varaldii es casi igual a la de P. cultripes. La única diferencia detectada es la existencia de un centro de osificación adicional en P. varaldii. Este centro corresponde a la columella y es el último del cráneo en iniciar su osificación, después del mentomeckeliano, en la primera semana postmetamórfica. Le sigue en similitud la secuencia de osificación de Pelo tes vunctatus, especie con la que se le considera estrechamente emparentado. Ver tabla 17 y figura 27. Las únicas diferencias se deben a que en Pelodytes el escamoso y el vómer inician su osificación después que el anguloesplenial y el dentario, mientras que en Pelobates la inician inmediatamente antes, y que la secuencia en Pelodytes posee dos elementos más: la columella y el parahioides. A falta de conocimientos sobre la secuencia del anfibio ancestral que utilizaríamos como punto de partida para realizar comparaciones, nos serviremos de la síntesis elaborada por Trueb <1985>. Esta autora selecciona los patrones de osificación comunes a las 18 especies de las que se conoce su secuencia, aunque en la mayoría de manera incompleta. Su resumen, que se expone en el apartado anterior, separa los huesos del cráneo, sin incluir el hioides, en cuatro grupos. Hasta la fecha ningún autor, excepto en esta tesis, ha detallado la secuencia de aparición de todos los centros. Respecto a lo considerado común, Pelobates cultrip,^ presenta las siguientes diferencias: - 103 - Tabla 17.- Sécuencia de osificación, número de ejemplares estudiados y estadio de Gosner en que se inicia la osificación en cada hueso en el 50'/, de los ejemplares examinados de Pelodgfes punctatus y Pplobates cultrip.^ , Bombina orientalis (Hanken & Hall, 1984>, Bufo boreas (Gaudin, 1978>, ^rla re^j,lla (Gaudin, 1973 ) y Asc phus truei (Altig, 1969> . Pelodytes ounctatus (n = 154) Pelobates cultripes (n = 17b) Rana pioiens ( n = 2321 Bombina orientalis (n = 137) Paraesfenoides ( 341 Paraesfenoides ( 34) Paraesfenoides 1321 Frontoparietal (37) Frontooarietal ( 361 Frontoparietal ( 3b) Ezoccioital (34) Ezoccipital (37) Ezoccioital ( 37) Ezoccipital l37) Frontooarietal ( 361 Paraesfenoides 13@1 Prodtico ( 3@) Prodtica (3@) Prodtico (40) Seotomaxilar (41) SeptoAaxilar l43) Septomazilar (42) Premazilar (411 Premazilar 143) Prewazilar ( 43i Premaxilar l42) Mazilar (42) Vdoer (43) Maxilar 144) Nasal (431 Septomaxilar 1421 Nasal 1431 Nasal ( 44) Mazilar (43) Nasal f43) Mazilar (44) Anguloesplenial ( 4) Escaooso (44) Dentario l43) Anguloesplenial (45) Dentario ( 45) Vdmer (44) Anguloesplenial 143) Dentario (45) Escamoso 145) Anguloesplenial l44) Escamoso l43) Escaeoso 145) Vdmer ( 46) Dentario (44) Pterigoideo (44) Cuadradoyugal (46) Pteriogideo ( 46) Pterigoideo l45) Vdmer 145) Pterigoideo (46) Esfenetmaides (46) Esfenetaoides (45) Mento®eckeliano ( 45) Prodtico (46) Pr.pm,hiodes ( 2asem.) Cuadradoyugal (451 Cuadradoyugal (45) Interfrontal (46) Parahiodes ( 2asem.) Pr.p®.hiodes (4b) Palatino (45) Esfenetsoides (postm.) Cuadradoyugal ( 2asem.) Mentooeckeliano(2asem.) Coluoella (45) Mento^eckeliano Ipostm,3 Mento^eckeliano ( 2asea.) Pr.oo.hiodes (4b1 No figura el hioides Coluoella ( adultol Esfenetmoides (postm.) -104- Tabla 17,- (Continuación>. Bufo boreas (n = 156) Hyla regilla In = 190) Ascaohus truei In = 32) --------------------------------------------------------------------------------- Exoccioital (36) Paraesfenoides (31) Paraesfenoides 134) Paraesfenaides (371 Frontooararietal (35) Frontooararietal !31) Frontooarietal 138) Exoccipital (37) Exoccioital 137) Prodtico (41) Prodtico (37) Septomaxilar (42) Premaxilar (41) Vómer l41) Premaxilar (42) Escamoso (41) Premaxilar (42) Escamoso (42) Septomazilar (42) Seotomaxilar (42) Proótico 1421 Maxiiar (42) Maxilar (42) Anguloesolenial (42) Anguloesplenial (42) Nasal (42) Dentario 142) Nasal (421 Escamoso (42) Mazilar (46) Dentario (42) Pterigoideo 143) VC^oer 14b) Pterigoideo (43) Anguloesplenial 14! Pterigoideo (46) Vómer (postm. Lcc = 10-19 ^m) Dentario (431 Esfenetmoides 146) Mentameckeliano (Lcc = 10-19 ^ml Mentoseckeliano (Lcc=10-15®m)Mentomeckeliano (46) Palatino (Lcc = 1D-19 mm) Cuadradoyugal (Lcc=10-15mm1 Nasal l46) Cuadradoyuq_al Ilcc = 10-19 am) Palatino ILcc = 10-15 m®) Na figura el hioides Coluoella ILcc = 20-29 mm) Columella lLcc = 10-15 mm) Esfenetaoides (adulto) Esfenetmoides (Lcc = 10-15 mm) No figura el hioides No figura el hioides - 105 - P, punctatus 0 ^ ^ 0 40 ^ L 36 32 J PF fRP EX PRO SP PRE NA MAX ESC YO ANG DEN PT ESF CYU PplIIO N11 PIYHIO COL Huesos del cráneo Figura 27.- Secuencia de osificación y estadio de comienzo de la mineralización de cada hueso del cráneo en el 50^ de los ejemplares de Pelod^►te^ _punctAtus (trazo grueso>, comparada con la de Pelabates cultri^ (trazo fino>. COL, columella, y PARHIO, parahioides. Resto de las abreviaturas como en la figura 26. - 106 - - E1 proótico comienza a osificar en la fase premetamórfica. Lo común es que osifique'al principio de la metamorfosis (Ascaphus truei, Bufo boreas y Rana ,pipiens> o hacia el fin de la misma este hueso retrasa el comienzo de su mineralización hasta después de concluida la misma . La secuencia de osificación, en las especies en que se ha estudiado su variabilidad: Bombina orientalis, Bufo boreas y Rana pi in ens, está tan bien determinada como en P. cultripes. En B. orientalis, Hanken & Hall <1984> detectaron ligeras alteraciones de la secuencia en la aparición de un hueso en cuatro de los 137 renacuajos de laboratorio que estudiaron. En Bufo boreas, Gaudin (1978), después de estudiar 723 ejemplares, afirma encontrar en los criados en laboratorio un retraso importante en el comienzo de la osificación en todos los huesos, pero no describe alteraciones de la secuencia; y, finalmente, Kemp ^ Hoyt (1969) consiguieron alterar la secuencia de aparición de los primeros huesos en Rana^i^îens, administrando tiroxina a renacuajos en estadios de desarrollo premetamórficos, provocando el comienzo de la osificación en los premaxilares, septomaxilares y maxilares, sin que hubieran osificado previamente los proóticos, y en los dos individuos en que la administración de la hormona se realizó en los estadios de desarrollo más tempranos, tampoco había comenzado a osificar el paraesfenoides. La detección de dos alteraciones de la secuencia modal en P. cultri^es colectados en el campo se suma a las ya conocidas en Bombina orientalis y Rana piD^ criadas en laboratorio, y affade una evidencia más a la hipótesis emitida por Hanken & Hall (1984> de que la secuencia representa un conjunto de sucesos esencialmente independientes -formación de centros de osificación discretos-, que tienen lugar en un orden prescrito provocado por una variación - 107 - .-. ^ 44 ^, o, w L ► 42 N 67 0 40 H ^ ó ^ L L y^j 38 y d ' ^ I CJ C ,,, 36 0 •r ^ f0 ^ W 34 32 ^ P. :cul tri pes R. pipiens PF FRP EX PRO SP PRE NA MR) ESC YO ANG DEN ^Pi ESF CYU PpHIO NI PAL COL Huesos del cráneo Figura 28.- Secuencia de osificación y estadio de comienzo de la mineralización de cada hueso del cráneo en el 50^ de los ejemplares de $^na R,lpiens CKemp & Hoyt, 1969; trazo grueso>, comparada con la de Pelobates cultrines , comparada con la de Pelobates cultrives Ctrazo fino>. Abreviaturas como en las figuras 26, 27 y 28. Ao se representa el hioides. - 110 - adulto ^ posta. ^ 46 ^ ►̂4 ^ ^o o, ^ ^ L 42 ^ a c ^ ^ ^ v 40 . ^ W 32 ^ H, regilla P, cultripes T- PF FRP EX PRO SP PRE NA NAX ESC VO AN6 OEN PT ESF CYU MM PAL COL Huesos del cráneo Figura 31.- Secuencia de osificación y estadio de comienzo de la mineralización de cada hueso del cráneo de $yla re,gilla . Abreviaturas como en las figuras 26 y 27. No se representa el hioides. - 111 - i1 O ^D Ol ^ adulto P. cultripes post^..^ 46 .̂.. N O ^ ^ 0 N y _ 44 ^ , f A. truei `^ 40. 0 ^ ^ 32 ^ PF FRP EX PR.O 3P PRE MA MAX ESC YO ANG DEN ^ PT ESF C^U MM Huesos del cráneo Figura 32.- Secuencia de osificación y estadio de comienzo de la mineralización de cada hueso del cráneo de Ascanhu, s truei , comparada con la de pelobates cultrj,p^s Ctrazo fino). Abreviaturas como en las figuras 26 y 27. No se representa el hioides, - 112 - intracraneal de ciertos parámetros del desarrollo, como puede ser el umbral de respuesta dé los enclaves osteogénicos a los niveles de hormona tiroidea circulante; frente a la hipótesis alternativa de que la formación de un centro es dependiente de otra osificación previa y es una precondición para la aparición de los centros subsiguientes. En cuanto a la duración del proceso de inicio de la osificación -entendiendo como tal el lapso de tiempo que transcurre desde la aparición del primer centro de osificación hasta la aparición del último, a temperatura óptima de desarrollo-, no hay datos de duración real para ninguna especie, excepto los que se proporcionan en esta tesis para Pelobates cultrip^. Este parámetro es fundamental para dilucidar la intervención de procesos de heterocronía en las variaciones que se detectan de unas especies a otras. A falta de datos sobre los días que dura el proceso, tendremos que comparar unas especies con otras basándonos en el estado de su osificación en cada estadio de Gosner <1960). A1 igual que en P. cultripes, en Pelodytes punctatus el proceso se inicia en el estadio 34 en que comienza a osificar el paraesfenoides y termina en un momento no precisado de la fase postmetamórfica en que osifica la columella. La duración en días no la conocemos, pues no se ha determinado experimentalmente. Lo que si podemos deducir es que la edad a que alcanza el estadio 34 es inferior a la de P. cultrives, porque su longitud media en ese estadio es LCC = 11.94 mm, mientras que la de P. cultri,pes es LCC = 23.86 mm, y sabemos, por los datos de campo de Díaz Paniagua <1987>, que el ritmo de crecimiento en longitud de las larvas de ambas especies en el campo es similar. Por tanto, Pelodytes punctatus sufre una aceleración general de su desarrollo cuando lo comparamos con P. cultri^. Aunque la secuencia de aparición de los huesos en ambas especies es muy semejante, el estadio de inicio de la osificación está algo retrasado en la mayoría de los huesos de Pelodytes; achacamos el hecho a que los ejemplares de esta especie han sido criados en laboratorio. Ver figura 27. - 113 - En Rana ,pj iens criadas en laboratorio (Kempt ^ Hoyt, 1969), el proceso abarca desde el estadio 32 hasta después de la metamorfosis, sin precisar cuando osifica el esfenetmoides. E1 tamago de ambas especies al fin de la metamorfosis es el mismo: 25.40 mm de media para Rana pjpiens CTaylor & Kollros, 1946> y 25.49 mm para los Pelobates cultripes , y termina después de la metamorfosis. Figura 29. En Bufo boreas , la osificación dura desde el estadio 35 hasta después de la metamorfosis. Su tamaño al fin de la misma es de unos 10 mm (Gaudin, 1978), siendo el renacuajo menor y de desarrollo más rápido de todas las especies resefiadas. Ver figura 30. fin H,yla regilla CGaudin, 1973), la osificación se inicia en el estadio 31, y al fin de la metamorfosis quedan todavía sin mineralizar cinco huesos. Su tamaño al concluir la metamorfosis oscila entre 10 y 15 mm . Ver figura 31. Dado que el proceso de desarrollo es altamente dependiente de la temperatura, para comparar unas especies con otras tendríamos que determinar experimentalmente la temperatura óptima de desarrollo, para seguidamente calcular, a esa temperatura, la duración en días u horas de cada estadio de Gosner. Sólo en esas circunstancias serían comparables realmente los datos de duración. Como por otro lado, hemos comprobado que el proceso de osificación se retrasa de manera significativa en los renacuajos criados en el laboratorio, aún cuando la densidad de renacuajos por litro es baja y la comida abundante y variada esta dificultad en ^a boreas y Altig <1969b) en el géner.o 8^^>, estaríamos obligados a utilizar en nuestras comparaciones interespecíficas ejemplares colectados en el campo. - 114 - Este segundo problema no es pequego, pues indefectiblemente, al menos en renacuajos que como Pelobates alcanzan gran tamafio en su vida larvaria, las sales cálcicas disueltas en el agua urbana son insuficientes para que los ejemplares las acumulen en su sistema endolinfático en cantidad equiparable a la que consiguen los renacuajos colectados en el campo. Esto es así debido a que las larvas toman los iones necesarios principalmente a través de las branquias (74^>, y el resto a nivel tegumentario (25^) e intestinal (5%); a lo largo del climax metamórfico los aportes cálcicos del exterior disminuyen porque las branquias se reabsorben y, a partir del periodo juvenil, el intestino se convierte en el órgano principal de absorcióa de calcio . A falta de datos de la duración del proceso en días, y visto que en ninguna especie termina al fin de la metamorfosis, sino que en ese momento quedan uno o más huesos sin iniciar su osificación, hemos utilizado el tamaño medio en cada estadio como un índice de la duración del desarrollo de cada especie (hemos asumido que a mayor tamaño, el desarrollo es más largo a temperatura óptima de crecimiento). Con los datos de longitud cabeza + cuerpo y con el número de centros que han iniciado su osificación en cada estadio y Bombina or{entalis (Hanken & Hall, 1984>. La representación gráfica se muestra en la figura 33. Hemos prescindido de los centros de osificación correspondientes a los dientes y al hioides, pues carecíamos de estos datos en B. orientalis. Como puede verse en la figura, la trayectoria de PelobatP^ durante el desarrollo larvario es la más larga de las tres; al fin de la metamorfosis posee 18 centros de 19, mientras que ^ga posee 15 de 17 y Pelo tes 14 de 17. La mayor longitud de la trayectoria de Pelobates en la fase acuática de su vida, se debe a que son seis los centros que osifican en el periodo prometamórfico, frente a tres en ^$ y cuatro en Pelody^es, y a que el tama4io que alcanza la larva es mucho mayor que en las otras dos especies. Como contraste, su trayectoria postmetamórfica finaliza muy pronto, en la - 115 - segunda semana (LCC = 28.57 mm>, antes de alcanzar las dimensiones máximas de LCC del periodo larvario; no podemos decir lo mismo de Pelodytes, que a ese mismo tamago postmetamórfico ha conseguido iniciar la osificación en dos huesos más, pero la columella (centro número 17) sólo la hemos encontrado en individuos de más de un año, ya maduros sexualmente (tamago mínimo de LCC = 23.5 mm>. Ao tenemos datos de cuando y a que longitud cabeza + cuerpo osifican los dos últimos huesos de Bombina orientalis, aunque sabemos que ambos están presentes en todos los ejemplares adultos. Aparentemente, la evolucibn del cráneo en las especies estudiadas hasta el momento ha implicado cambios en la secuencia de aparición de los diferentes huesos, en la duración de los procesos de osificación y en el número de huesos y centros de osificación que llegan a aparecer. En cuanto a los huesos que están variablemente presentes según las especies: columella, palatino, cuadradoyugal, interfrontal, vómer y parahioides, todos ellos aparecen normalmente hacia el fin de la metamorfosis ó después de la misma, y su ausencia puede ser el resultado de cambios heterocrónicos en el programa ontogenético. Ao podemos decir lo mismo de la variación en el número de centros de osificación, ya que su número difiere sobre todo en los huesos dermales que comienzan a osificar durante la prometamorfosis, como los frontoparietales; la metamorfosis, como los escamosos, o hacia el fin de la metamorfosis, como los pterigoideos y vómeres. Todos estos huesos tienen en común que su forma es muy variable de unas especies a otras; además, excepto el vómer, los otros tres están presentes siempre en todas las especies. Sobre todo, la existencia de distinto número de centros de osificación en frontales y escamosos se explica difícilmente por la actuación de procesos heterocrónicos, ya que surgen en las primeras etapas del desarrollo o de la metamorfosis, y parece plausible atribuirles cierta importancfa filogenética. Nuestros resultados sugieren que cuanto más cerca está filogenéticamente una especie de otra, más parecidas son sus secuencias de osificación; según se desprende de la similitud entre las secuencias de los dos Pelobates estudiados y entre ambas y la de Pelo ytes. - 116 - Tabla 18.- Longitud media en cada estadio de Gosner (1960> y número de centros de osificación presentes en el cráneo de Pelodytes gunctatuç testa tesis>, Bombina orientalis CHanken & Hall, 1984) y Pelobates cultri^ ocho vértebras presacras. 2) Atlas no fusionado con la segunda vértebra. 3) Sacro no fusionado con el urostilo^. 4> Centra vertebrales procélicos; cóndilos libres en subadultos^. 5> Diapófisis sacras ampliamente dilatadas. 6) Ausencia de procesos transversos en el urostilo. 7) Procesos transversos de las vértebras presacras anteriores <28, 38 y 48> alargados. 8> Apófisis transversas de las vértebras pre►acras posteriores (58, 68, 7a y 88) cortas. 9) Articulación sacro-coccígea monocondilar. 10) Arcos neurales imbricados. Los dos caracteres señalados con asterisco son los que se han modificado. En la figura 34 se representa una columna con las vértebras desarticuladas en normas dorsal y ventral. 3.2.2.2. Desarrollo de la coluana vertebral de Pelobates cultri^ Después de un cuidadoso examen de 174 renacuajos de los estadios 26 a 46 de la tabla de Gosner, podemos afirmar que el desarrollo de los centra vertebrales es de tipo.epicordal. Este modelo implica la condrificación y osificación únicamente de la zona dorsal de la vaina fibrosa que rodea la notocorda (^Iookerjee, 1931 y 1936) . Desde el punto de vista ontogenétfco, el atlas y las vértebras 28, 38, 4a y sacra (98) de pelobates están constituidas por tres piezas que sur$en a partir de seis centros de osificación distintos: un par corresponde al arco neural, un par al centrum y un par al cóndilo. Los procesos transversos de las vértebras 2?, 38, 48 y sacra se diferencian a partir de su arco neural. Las vértebras 5a, 6a, 7a y ga están constituidas por cuatro partes que A ATLAS V2 V3 V4 V5 V6 V$ SACRO UROSTILO 5 mm ^L- '^ B Figura 34.- Columna vertebral de Pelobates cultri^es. A^ norma dorsal; B, norma ventral. - 12G - surgen a partir de ocho centros de osificación: dos del arco neural, dos del centrum, do► del cóndilo y dos de las apófisis transversas. • E1 urostilo surge a partir de nueve centros: seis de los arcos neurales 10^, 11^ y 12° ; dos del centrum de la vértebra 108, y uno medial -el hipocordio-, situado debajo de la notocorda, alargado contrapuesto a todos los anteriores. Y Cargados de sales cálcicas, los sacos paravertebrales del sistema endolinfático alcanzan su máximo desarrollo en el estadio 41, en el cual penetran hasta el urostilo a ambos lados del cordón nervioso central. En la figura 35 se señalan, en norma ventral, las partes de la 28 vértebra. En el estadio 43 (fig. 35 A) las zonas de distinta procedencia ontogenética todavía están separadas; al fin de la metamorfosis se fusiona el centrum con el arco neural. Durante el primer año (fig. 35 C) se une el cóndilo con el centrum, y finalmente, en el adulto (fig. 35 D), desaparece cualquier sutura que pudiera revelar el origen individualizado de las distintas partes. 3.2.2.3. Secuencia de asificación de la columna vertebral de Pelobates cultri^ En cada vértebra, primero aparece el par de centros de osificación que origina el arco neural. Varios días después -cinco a temperatura óptima- osifican los dos centros cuya fusión dará lugar al ceatrum vertebral. Dos semanas más tarde, hacia la mitad del periodo metamórfico mineraliza el par de centros que producirá el cóndilo (ver lámina V D). Finalmente, y sólo en las vértebras 58, 68, 78 y 88, se distinguen un par de centros, uno a cada lado de la vértebra, que rápidamente se fusionan con el arco neural y que pertenecen a las apófisis transversas (ver Iámina V B). ^ Tanto el comienzo de la osificación de los arcos neurales, como el de los centra e hipocordio sigue una secuencia de aparición cefalo-caudal. En cambio, los cóndilos aparecen primero en las vértebras centrales (58 y 68) y - 121 - Figura 35.- pelobates cultripes, En norma ventral, denominación de las partes de la 28 vértebra, y ontogenia de la fusión del centrum con el arco neural (A y B) y del cóndilo con el centrum (B. C y D). A, renacuajo de estadio 43; B, postmetamórfico de un a4ío; C^ postmetamórfico de un afío y tres meses; D^ adulto de cinco años. 1, centrum; 2, arco neural; 3, cóndilo; 4, apófisis transversa; 5, prezigapófisis; 6, postzigapófísis, y 7, neurapófisis. / - 122 - Lámina V.- Osificación de la columna vertebral. En azul, el cartílago; en • rojo, el hueso. A, Pelo ytes punctatus; estadio 36 CGosner, 1960) en norma dorsal. Se aprecian claramente los pares de centros de osificación que constituiran cada centrum, y los pares que darán lugar a los arcos neurales. B, Pelobates cultri^es; estadio 45 CGosner, 1960) en norma dorsal. La flecha señala el centro de osificación que originará la apófisis transversa derecha de la séptima vértebra. C, Pelo ^rtes punctatus; estadio 46 hasta la aparición del último porque el sacro se desplaza a la vértebra 108 , o decrece a siete <2.44% en renacua^os y 12.5°ti en juveniles y adultos> porque el atlas se fusiona con la 28 vértebra (en siete adultos) o porque la 88 vértebra desarrolla diapófisis sacras asimétricas Atlas fusionado con la segunda vértebra. Se presenta en el 10.94% de los adultos. Esta anomalía no puede detectarse en renacuajos porque la fusión de los cóndilos con su centrum tiene lugar durante el primer año de vida - 130 - Lámina VI.- ?talformaciones de la columna vertebral de renacuajos de • Pelobates cultripes. En azul, el cartílago; en rojo, el hueso. A, columna vertebral normal en norma dorsal (estadio 45); la flecha señala el arco neural de la diaodécima vértebra. En blanco, el carbonato cálcico almacenado en los sacos paravertebrales del sístema endolinfático. B, nueve vértebras presacras y procesos transversos anormales en Vs . Los adultos con cualquier tipo de malformación que afecte a la simetría del sacro presentan, además, el urostilo fusionado con él. 6) Presencia de procesos transversos en el urostilo. Afecta al 4.69°^G de la población postmetamórfica . fin un ejemplar el urastilo anormal estaba fusionado con el sacro y en dos adultos . En el otro renacuajo, la 5a vértebra había desarrollado procesos transversos alargados y simétrícos, semejantes a los de - 134 - la 48, asociado con el desplazamiento del sar_.ro a la 10a vértebra (lámina VI B). ' 8) Procesos transversas anormales en las vértebras presacras posteriores. Se han detectado diapófisis sacras asimétricas en la 88 vértebra en dos renacuajos (2.44°,6) y un adulto (1.56%); en todos los casos se consideró que esta vértebra formaba parte del sacro. Ver lámina VI C y fig. 36 H. 9) Articulación sacro-coccígea bicondilar. Ao se ha detectado en adultos, y en ningún caso podría detectarse en renacuajos. Ao puede descartarse su aparición pues el cóndilo de articulación se forma por la fusión de dos centros de osificación; si esta fusión no se produjera, tendríamos una articulación bicondilar. A pesar de que se detecta claramente un cónd^ilo libre entre sacro y urostilo en la primera semana postmetamórfica (ver tablas 19-22>, esta pieza no alcanza un tamaño semejante al de los cóndilos de las vértebras presacras; en los adultos la superficíe de articulación del centrum del sacro aparece ligeramente cóncava -en vez de convexa- y sólo en la zona dorsal presenta una minúscula protuberancia que corresponde al cóndilo sin desarrollar. 10) Arcos neurales abiertos dorsalmente. Se ha detectado un adulto (1.56°,G> con los arcos neurales del atlas y de la 28 vértebra sin cerrar dorsalmente (fig. 36 K). La anomalía no puede observarse en renacuajos, pues el cierre dorsal de los arcos neurales de las vértebras anteriores tiene lugar hacia el final de la metamorfosis, en el estadio 44 (ver tabla 21). De los individuos con malformaciones, tal como las hemos descrito, tres renacuajos (42.86x) y seis adultos (31.58°^6> presentaban una; dos renacuajos (28.57°ti) y nueve adultos <47.37°^G) presentaban dos; otros dos renacuajos (28.57°^G) y tres adultos <15.79%> presentaban tres, y finalmente, un adulto (5.26'/.) presentaba cinco. En resumen, el 30% de los juveniles y adultos presenta algún tipo de anomalía en su columna vertebral. Las más comunes son las .fusiones de elementos en los segmentos anteriores (atlas con 28 vértebra) y/o posteriores (sacro con urostilo) de la columna. - 135 - Tabla 23.- 'Tipos de anomalías de la columna vertebral y frecuencia de las mismas en los dos ciclos vitales de Pelobates cultri,pes. Renacuajos (n= 821 ^uveniles y adultos (n= 641 ------------------ --------------------------- 11 Variacidn en el n^ al 9 vért. presacras .................. 1 11.22X? ................ 0(OX1 de vértebras presacras ......... bf atlas + Vz....... no se detecta ............. 7(10.94X1 7 vért.presacras ^ cl sacro asi^. en Vg 2(2.44X1 ................ 1 11.56X) 21 Atlas + Vy .............................................................. no se detecta............. 7(10.44X) 31 Sacro fusionado con urostilo ........................................... no se detecta............. il (17.19X1 41 Ano^alías en las al 8a y 9a vért ....................... 2(2.44X1 ................ 1 11.56X1 diapdfisis sacras .............. bl 9a y 10@ vért...................... 4 14.88X1 ................ 4(b.25X1 51 Presencia de procesos transversos en urostilo .......................... no se detecta............. 3(4.69X1 b) Procesos transversos anor^ales en las vért. presacras anteriores ....... 2(2.44X1 ................ 2(3.12X1 71 Procesos transversos anonales en las vért. presacras posteriores ...... 2(2.44X! ................ 1(1.SbX1 B1 Articulacidn sacro-coccígea bicondilar ................................. no se detecta............. 0(OX1 91 Arcos neurales abiertos dorsal^ente (Atlas y 2a vért.l ................. no se detecta............. 1 11.56X1 - 136 - En la mue.stra estudiada sólo las vértebras 68 y?e no han registrado irregularidades. Las malformaciones de tipo la, lc, 5, 7 y 8 de la tabla 23 se detectan tanto en renacuajos como en adultos. Según se muestra en dicha tabla, los porcentajes en ambos ciclos vitales de P. cultripes son similares. Por tanto, podemos deducir que las anomalías de los procesos transversos de las vértebras, sean presacras o sean asimetrías de las diapófisis sacras, no parecen afectar a la viabilidad de los individuos. 3.2.2.5. Comparación con Pelc^d^tes ^unctatus y las restantes especies de Anuros Vamos a realizar el análisis deteniéndonos en los cinco puntos que nos parecen más importantes: bTúmero de elementos de la columna. - l^úmero de centros de osificación. - Secuencia de osificación. - Duración del proceso de inicio de la osificación. - Porcentaje de malformaciones en las poblaciones. En Pelobates cultriges la columna vertebral está constituida por diez elementos: nueve vértebras (ocho presacras y una sacra) y el urostilo. Este patrón es el más común en los anuros. Sobre este patrón adulto, las variaciones más importantes en cuanto al número de elementos son: - La posesión de diez vértebras (nueve de ellas presacras>, circunstancia que se da en 1as dos familias consideradas más primitivas: Ascaphidae y Leiopelmatidae CGriffiths, 1963; Cannatella, 1985). Ao podemas dejar de señalar que, como anomalía, se han detectado nueve vértebras presacras completas en dos de las familias más antiguas: Pelobatidae (1.22°ti de los renacuajos de P,. cultripes estudiados para la elaboración de esta tesis y un adulto de ;^^ intermontanus resegado por Kluge en 1966) y Discoglossidae C0.41x de los 813 ejemplares de Bombina variegata examinados por ISadej, ^1965). Las restantes - 137 - familias de anuros presentan ocho vértebras presacras o menos (Kluge & Farris, 1969; Lynch, 1973; Cannatella, 1985> y hasta la fecha no se ha detectado en ninguna especie ni un solo ejemplar con el número de vértebras presacras incrementado a nueve. - La posesión de menos de nueve vértebras implica casi siempre alguna anomalía, normalmente la fusión del atlas con la segunda vértebra C10.94% en la población postmetamórfica de P• cultri}^es) o de la octava con el sacro . Sólo se conoce una verdadera reducción a siete vértebras presacras por adelantamiento del sacro en cuatro géneros de Bufónidos: Laurentophryne, MertensQphr^, Aectophry.^ y Pelp.^yne (Tihen, 1960b y 1965) y en los extinguidos Paleobatrácidos CSpinar, 1972). - La fusión del sacro y el urostilo precisamente era un carácter diagnóstico de la familia Pelobatidae hasta la revisión realizada en esta tesis: en dicha familia todas las especies, excepto P• cultri^ y P. varaldii, presentan sinostosis sacro-urostilar. De las restantes familias, los,Pípidos y algunos Megófridos, Micr^hílidos y Bufónidas CLynch, 1973) presentan fusión; en las demás la articulación del sacro y el urostilo es de tipo sincondrótico (sin cavidad sinovial) en B,^ç^phi^^. y Leiopelma (Cannatella, 1985); monocondilar en Barbourula y Bombina, y bicondilar en las restantes especies de anuros (Lynch (1973) y Cannatella (1985), erróneamente, describen la articulación de Pelodvtes como monocondilar. Ver lámina V C. - La presencia de costillas libres en la 28, 38 y 4a vértebras es la condición considerada primitiva por todos los autores. En las familias actuales sólo las presentan los Ascáfidos, Leiopelmátidos y Discoglósidos. Los Pípidos desarrollan costillas independientes al final de la metamorfosis, pero se fusionan con los procesos transversos durante el desarrollo postmetamófico y no se detectan en los adultos. Las restantes familias, incluidas Pelobatidae, Pelodytidae y Megophryidae, no presentan costillas libres. - 138 - En cuanto al número de centros de osificación, en P, cultripes se han detectado 36: 35 pares y uno impar. Presentan centros de osificación bien diferenciados las siguientes partes de las vértebras: arcos neurales, centra, cóndilos y apófisis transversas (sólo vértebras 5a-88>; además, hemos de considerar los diversos centros de osificación del urostilo. Cada arco neural se farma al osificar el ^par de elementos cartilaginosos que lo origina. Estos elementos aparecen dorsolaterales a la notocorda, uno a cada lado del tubo neural, crecen rodeándolo y finalmente se encuentran por encima del mismo en su línea media. E1 desarrollo de los arcos neurales de Pelo tes punctatus es semejante al de ^, cultripes. Ro hay diferencias en cuanto al número de centros de osificación de cada arco neural entre Pelobates y las restantes especies en las que se ha estudiado el desarrollo de los mismos con detalle: Rana temporaria, "Bombinator j,gneus" (_ Bombina bombina) y Bufo melanostictus (I^ookerjee, 1931); Xenopus laevis (14ookerjee, 1931; Smit, 1953 y 1956); Racophorus maculatus, I2icrohyla rubra y Rana afsrana (Mookerjee & Das, 1939). En P. cultri^, cada centrum proviene de la fusión de dos centros de osificación situados entre la base de cada hemiarco neural y el dorso de la notocorda. Del mismo modo se originan los centra en peloçiaytes^unctatus (ver lámina V A> y en Xeno►us laevis . Tenemos datos suficientes para adelantar que la osificación de los centra en las especies con desarrollo vertebral de tipo epicordal se inicia a partir de dos centros de osificación simétricos. Estos centros se fusionan después de su aparición, más o menos rápidamente según las especies. Hemos observado que la fusión se produce más deprisa en pelabates cultripes que en Pelodytes gunctatus (ver centrum de la segunda vértebra en la lámina V A). En cambio, y a pesar de la detallada descripción del desarrollo de tipo - 139 - pericordal que Mookerjee (1931> realiza sobre Rana temporaria, este autor no relata con detalle el inicio de la osificación de los centra. Afortunadamente, Sedra & Moursi (1958) indican que en Eufo regularis la osificación de los centra es pericordal y se inicia en dos puntos dorsales a la notocorda, en la base de los arcos neurales; y posteriormente dicha osificación se extiende alrededor de la notocorda. En las especies que se suponen estrechamente relacionadas con Pelobates cultripes, el desarrollo de los centra es de tipo epicordal en P. varaldii (observaciones propias) y P. fuscus (Emelianoff, 1925); Sca}^hionus holbrookii (Kluge & Farris, 1969), S. couchii y S. hurterii (Cannatella, 1985>. Por el contrario, el desarrollo es de tipo pericordal en: Snea bombifrons y^ intermontanus (Kluge & Farris, 1969; Cannatella, 1985); ^pea hammondii y S multiplicatus ; ^,ptobrachium hasseltii y Megçzghry,,,ç montana (Kluge & Farris, 1969>, y M^,gorys m^,^jr . Los Pelobates de 1a misma edad e incluso los individuos de un aPio, poseen vértebras anficélicas y entre ellas cóndilos sueltos, condición que sólo se cono^ía en Megophryidae (Ramaswami, 1933; Lynch, 1973) y Myobatrachidae . A los grupos anteriores hemos de afíadir el género S^phiopus, pues al desarticular los esqueletos de los S. couchii adultos de menor tamaño se nos han desprendido los cóndilos de algunas vértebras espontáneamente. Las especies de las familias Pelobatidae, Megophryidae y Myobatrachidae son las únicas, entre todos los anuros, con cóndilos libres en algún momento - 140 - de su vida. En nuestra opinión las vértebras procélicas de Pelobates y Pelo ytes rlo pueden considerarse homólogas, puesto que difieren en su desarrollo. En P. cult. rT s los procesos transversos de las vértebras 28, 3a, 4a y sacra osifican como una prolongación del hemiarco neurai de cada lado. En este aspecto nuestras observaciones coinciden con las realizadas por Emelianoff (1925> sobre P. fuscus. En cambio, las apófisis de las vértebras 5a^ 6a^ 7a y ga osifican a partir de centros independientes situados en la mitad proximal de cada apófisis, los cuales se fusionan rápidamente con el arco neural Cver lámina V B>. Esta última observación es nueva en el desarrollo de los anuros. Hemos hallado una breve referencia al proceso de condrificación y osificación independiente que sufren las apófisis transversas de las vértebras presacras posteriores en el desarrollo de ^„nonus laevis (Smit, 1953, 1956>, sin ningún comentario sobre su posible importancia evolutiva; los autores que han trabajado posteriormente en el desarrollo de la columna vertebral de anuros no mencionan el tema. La importancia de la osificación independiente de las apófisis transversas radica en la posiblidad de relacionarlas con costillas; puesto que, por analogía con el fósil de esta línea evolutiva más .antíguo que se conoce . Se han descrito dos arcas neurales en el urostilo de Rana temToraria, Bufo melanostictus CMookerjee, 1931) , Bufo americanus e I^],^ c^.^soscelis CBranham & List, 1979); y tres arcos neurales en XenoDUS laevis (Smit, 1953, 1956; Branham & List, 1979>, Ascaphus truei . E1 caso de Meg.pph,^s maior merece una reseña especial. Su urostilo es proporcionalmente muy largo y presenta una cresta dorsal bien desarrollada que llega casi hasta el final de su extremo posterior. Según Griffiths C1956> posee diecisiete vértebras caudales osificadas en estadios larvarios - 141 - tempranos, que se reabsorben en la metamorfosis. En las fotos 2 y 5 de Griffiths. (1963) se cuentan sin dificultad 11 piezas osificadas detrás del sacro en un renacuajo de ^1. maiar inmediatamente antes del inicio de la metamorfosis, según deducimos del grado de osificación de su cráneo y falanges. No obstante, el autor indica en el texto que son cuatro las vértebras que se incorporan al urostilo. De confirmarse esto último nos encontraríamos ante un ejemplo de reabsorción de piezas osificadas. En cualquier caso, creemos que el estudio del desarrollo del esqueleto en los Aiegófridos puede añadir nuevos e interesantes datos a lo conocido hasta la fecha. Es posible que exista una relación positiva entre el número de arcos neurales que constituyen el urostilo y la longitud relativa de su cresta dorsal . En P. cultripes, además de los arcos neurales de las vértebras 10a, 118 y 128, osifica y forma parte del urostilo el centrum de la 108 vértebra. No se ha observado inicio de osificación en el área de los centra en el urostilo de Pelodv tes. En cuanto a la secuencia de osificación, la de pelodytes punctatus es prácticamente la misma que la de Pelobates cultripes, como puede verse en la figura 37 y en la tabla 24. Las diferencias más notables se deben a la ausencia en Pelo tes de los centros que en Pelobates aparecen al final del desarrollo. Las discrepancias en el momento de inicio de la osificación en los centros homólogos son pequeñas; en la mayoría Pelodytes resulta más precoz, con un estadio de Gosner de ventaja, y esto a pesar de que los ejemplares se criaron en el laboratorio. De la ser_uencia de osificación de la columna vertebral en otras especies de anuros no hemos encontrado más que datos parciales de $s^Il^ ^^. (Kemp & Hoyt, 1969 ) y Xenopus laevis (Smit, 1956 ). En la primera especie, las vértebras comienzan a osificar, en dirección cefalo-caudal, en el estadio IX de la tabla de Taylor & Kollras <1946> equivalente al estadio 34 de Gosner, y el urostilo en el estadio XII (37 de Gosner). En Xenopus laevis -142- t^^^^S t2 t ^^^ e h to i ♦^ Pelobates cultripes ^^ Pelodytes punctatus COt^iDILOS ^ APOF̂IS► YRM(SVSRSAS Figura 3?.- Representación gráfica de las secuencias de osificación de las columnas vertebrales de Pelobates cultri^ Y pelodytes ^unctatus, h, hipocordio. - 143 - Tabla 24.- Secuencias de osificación de la columna vertebral de pelobates ^^ultr pes y Pelod^tes nunctatus , $en ^us laevis CSmit, 1956) y Bana pipiens , y los procesos transversos de las vértebras 58-8a en el 64 C44 de Gosner). Consultar la tabla 24. A pesar de la escasez de datos, lo poco que se conoce de otras especies coincide plenamente con la secuencia de osificación de P. cultripes descrita en esta tesis. En P. cultripes el tiempo que transcurre desde que aparece el primer centro de osíficación en la columna hasta que surge el último es de 24,5 días a temperatura óptima, y en cuanto a etapas del desarrollo, abarca desde el estadio 36 al 46 de la tabla de Gosner. No tenemos datos de duración de Pelodytes punctatus, aunque en esta especie el lapso proporcional de tiempo es menor y la osificación se inicia antes: el proceso transcurre entre los estadios 35 y 42. Las trayectorias ontogenéticas del desarrollo de la columna vertebral de ambas especies, elaboradas con la misma metodología que las del cráneo (ver tabla 25), se muestran en la figura 38. Nuevamente la longitud de la trayectoria de Pelobates es sensiblemente mayor debido, fundamentalmente, a que su columna posee más elementos. En cuanto al porcentaje de individuos con malformaciones en la columna vertebral, en Pelobates cultripes llega al 30'^6 de los 64 ejemplares estudiados (Talavera, 1987); en Pelod^ty es punctatus es del 12.19'/. C41 individuos estudiados. Ver figura 39>; en p^lobates fuscus es del 10.77% sobre 65 individuos ; en Eombina variegata del 10.70',^ sobre 813 ejemplares (Madej, 1965); en Bombina bombina del 10.45'/. sobre 555 ejemplares CMadej, 1965> y porcentajes menores en los géneros S►a^^iopus y^^. Ver tabla 26. Destaca el alto porcentaje de anomalías en P. cultriDes, comparado con los porcentajes en las demás especies. Las anomalías se deben - 145 - Tabla 25.- Para cada estadio de Gosner, longitud media cabeza + cuerpo (LCC> y número de centros que han iniciado su osificación en la columna vertebral de Pelobates cultri,pes y Pelodytes punctatus, Pelodytes punctatus Pelobates cultripes Estadio Gosner Lcc (mm) No centros Lcc (mm) No centros 34 12. 43 35 13. 33 6 24.66 4 36 14.47 8 27.83 4 37 15.06 iB 29.12 14 38 16.14 19 28.94 19 39 17.06 20 30.3b 20 40 28.85 22 41 42 15. bb 21 43 23.19 26 44 23.11 29 45 25. 78 33 46 24.07 35 la sem. 25.49 36 - 146 - 15 20 25 30 LCC (mm) • Pelobates cultripes O Pelodytes punctatus Fi$ura 38.- Trayectorias ontogenéticas del proceso de osificación de las columnas vertebrales de p^lobates cultripes y Pelodytes ^unctatus. - 147 - Tabla 26.- Para las especies señaladas, autor que realizó el trabajo, número de individuos estudiados y porcentaje de ejemplares presentando anomalías en su columna vertebral. x de eje^pl. t de eje^pl. con X de eje^pl. N^ eje^pl. con ano^alías ano^alías en el sacro con asi^etrías estudiados en la calu^na y/o urostilo en el sacro ------------------------------------------------------------------------------------------------------ Pelabates cultripes 64 29.69 20.31 7.81 (juveniles y adultos? Talavera 119811 Pelobates cultripes 82 8.54 7.32 frenacuajosl Talavera 119871 Pelobates fuscus b5 10.77 Adolphi (iB951 Scaphiopus couchii B9 3.37 2.45 Kluge 419bb1 Spea ha^^ondii 20 5.00 5.00 Kluge (19661 Spea bo^bifrons 34 2.94 2.94 Kluge (19bb1 Pelodytes punctatus 41 12.19 7.32 4.88 Esta tesis 8o^óina variegata 613 10.70 10.58 6.76 Madej (19651 Bo^bina bo^óina 555 10.45 10.45 5.77 Madej (19651 lmm h--I lmm F-^ Figura 39.- Pelo tes Dunctatus. A, en norma dorsal, columna vertebral normal. Malformaciones detectadas en adultos: B, fusión del atlas y la 28 vértebra; C, fusión de las vértebras 28 y 38; D, fusión del atlas, 28 y 3H vértebras ; fi. sacro asimétrico constituido por la fusión de dos vértebras (9a y 108) y el urostilo; F, sacro asimétrico constituido por la fusión de tres vértebras (7a^ ga y ga) y el urostilo; G, sacro normal fusionado con una vértebra postsacra completamente desarrollada . Si sólo nos fijamos en las malformaciones que afectan al sacro y/o urostilo, el porcentaje es del 20.31^ en P, cultri^, del 10.77% en P. fuscus y del 7,32% en Pe1_odytes gunctatus; las cifras son menores en las restantes especíes. Y si atendemos al porcentaje de ejemplares con asimetrías en el sacro -que siempre implican la participación en el mismo de dos vértebras-, encontramos afectados al ?.81'^6 de los renacuajos y al 7.32% de los adultos de P. cultripes, al 6.76°^b de las Bombina variegata, al 5.77'/° de las B. bombina y al 4.88°^6 de los Pelodytes punctatus. Nuevamente la especie P. cultripes presenta los porcentajes más altos de malformaciones, y además, se da la circunstancia de que las asimetrías del sacro no parecen afectar a la viabilidad de los individuos, pues su porcentaje es semejante en renacuajos y en adultos. Resaltamos estos resultados porque ya Zweifel (1956> encontró que la frecuencia de anomalías en el sacro era mayor en los Pelobátidos fósiles del Terciario de Aorteamérica que en las formas actuales , y Tihen (1960) postuló que los primeros pelobátidos, y específicamente los progenitores del complejo Sc^^,^ un s-S}L, habrían exhibido una variación vertebral considerable. Si aceptamos que las especies ancestrales de anuros debían presentar gran variabilidad en los caracteres de su columna vertebral, y dado que la proporción de P, cultripes con alguna anomalía rebasa con mucho los porcentajes conocidos en cualquier otro taxon actual, esta peculiaridad parece una buena evidencia de la condición primitiva de Pelobates cultripa^, - 150 - 3.2.3. XIEl[BEO AgTExIOR Y CIBTURA fiSCAPIILAR 3.2.3.1. Descripción del aieabro anterior y de la cintura escapular. adulta de Pelobates cultri^ E1 miembro anterior de. Pelobates cultripes está constituido por dos huesos largos, diez elementos carpales, cuatro metacarpianos y diez falanges, cuya fórmula es: 2, 2, 3, 3. La cintura escapular se compone de un hueso ventral medial, el esternón, y cuatro piezas oseas pares: escápula y cleitro Cdorsales>, y clavícula y coracoides (ventrales>. Es de tipo arcífero, según definición de Griffiths t1963). Este tipo se caracteriza porque los cartílagos epicoracoideos son relativamente anchos; en su parte anterior se encuentran unidos por un discreto puente precoracoideo y en su parte posterior permanecen libres, solapándose uno sobre otro medialmente. A1 mismo tiempo, clavículas y coracoides forman entre sí ángulos divergentes. En la figura 40 se muestra la morfología adulta, posición anatómica y denominación de los huesos del miembro anterior y cintura de P. cultripes. En la cintura escapular utilizamos la nomenclatura de Griffiths C1963>; en el carpo adulto, la de Howes & Ridewood <1888) modificada, y en el desarrollo del carpo, la de Holgrem <1933). 3.2.3.2. Secuencia de asificación del aieabro anterior y cintura escapular de Pelobates cultri^ La secuencia de osificación de los 31 huesos C30 páres y uno medial) del miembro anterior y cintura escapular de P. cultripes la dividimos en tres etapas, para mayor claridad en la exposición: En la primera, de los siete elementos del brazo y la cintura escapular, seis comienzan su osificación entre los estadios 38 y 39 de la tabla de Gosner C1960), en el siguiente orden: húmero, escápula, ulna y radio, cleitro, ^ 5mm Figura 40.- ?^orfología, posición anatómica y denominación de los huesos del miembro anterior y cintura escapular de Pelobates cultripes. En negro, el hueso; en blanco, el cartílago. 1, húmero; 2, escápula; 3, radioulna; 4, cleitro; 5, clavícula; 6, coracoides; 7, esternón; 8, supraescápula; 9, omoesternón; 10, cartílago epicoracoideo; 11, postaxialcentral; 12, preaxialcentral; 13, radial; 14, carpal 3; 15, ulaar; 16, prepollex 1; 17, prepollex 2; 18, carpal 2; 19, subulnar; 20, carpal 1, y 21, metacarpiano del dedo I. - I52 - clavícula y coracoides; mientras que el último elemento, el esternón, osifica en la primera semana después de la metamorfosis. A continuación, describimos los detalles del desarrollo más interesantes: - E1 húmero es el primer elemento en condrificar en el estadio 31 (figura 41 A). Y el primero en osificar en el estadio 38. - La radioulna se constituye por la fusión de dos elementos que condrifican por separado durante el desarrollo (figura 41 A- E>. E1 radio y la ulna comienzan a osificar al mismo tiempo (estadio 38; figura 42 A), pero independientemente, y es a lo largo de este proceso cuando se produce la fusión de las zonas osificadas de las dos piezas, aumentando la longitud fusionada a la par que la osificación avanza. Ver lámina VII. - La escápula y el cleitro provienen de la misma pieza cartilaginosa que aparece en el estadio 32 Cfigura 41 A- D)y comienza a osificar en dos puntos distintos en el estadio 38. E1 primero dará lugar a la escápula y el segundo al cleitro; ambos centros de osificación no llegan a ponerse en contacto y el dique cartilaginoso que los separa no funciona como una articulación. - Los dos rudimentos cartilaginos que se prolongan desde la cavidad glenoidea ventralmente, se acaban uniendo medialmente en el estadio 38. La osificación alrededor del rudimento más anterior dará lugar a la clavícula, en el estadio 38, y la del elemento porterior al coracoides, en el estadio 39. E1 área cartilaginosa que une los dos huesos medialmente permanece sin osificar toda la vida y recibe el nombre de cartílago epicoracoideo. Ver figura 40. - fil elemento prezonal {omoesternón> y el postzonal ; 2, segundo centro de osificación del carpo l= preaxialcentral>. A , B \ c co ^ A , B ( ^ 1^// u ^I 4 J ,,. , ^ ^- 1 \ i^ o ^/ iv vo 2 3 I^ 2 •u cl s Y i G ,, 1 i t mm , Figura 41.- Secuencia de condrificación del miembro anterior y cintura escapular de Pelobates cultripes, entre los estadios 35 y 38. A y B, estadio 35; C y D, estadio 36; fi, F, G y H, estadio 37; g, estadio 38. ca, clavicula; cl, cleitro; co, coracoides; e, escápula; h, húmero; r, radio; u, ulna; iv, cuarto metacarpiano; iii, tercer metacarpiano. i, radial; 2, central 4; 3, ulnar; 4, carpal 3; 5, central 1; 6, pisiforme; 7, intermedio; 8, central 3; 9, carpal 2; 10, central 2; 11, elemento Y; 12, carpal 1; 13, prepollex 1, y 16, subulnar. iii u iv ir u u l 1 I 2mm l I I iv u iv u L 1 I I Figura 42.- Pelobates cultripes. Aparición y fusión de los elementos del carpo, y secuencia de osificación de metacarpianos y falanges, entre los estadios 38 y 42. En blanco, el cartílago; en negro, el hueso. A, estadio 38; B, estadio 39; C, estadio 40, y D, estadio 42. 14, carpal 5; 15, prepollex 2; 17, prepollex 3. Restantes abreviaturas como en la figura 41. - 157 - Tabla 27.-'Pelobates cultripes. Secuencia de condríficación y de osificación del brazo y cintura escapular, sePFalando el estadio de desarrollo (Gosner, 1960> en que se produce cada acontecimiento. SECUENCIA DE CONDRIFICACION SECUENCIA DE OSIFICACION N^ de orden Elemento Est. Gosne r Hueso Est. Gosner 1^ H^amero 31 HQmero ^B zo Escápula-Cleitro 32 Escápula 38 30 Ulna 33 Ulna 38 40 Radio 33 Radio 3B 5^ Coracoides 36 Cleitro 38 bo Clavícula 36 (final) Clavícula 38 70 Esternón 43 Coracoides 39 B^ Omoesternón 45 Esternbn la semana post. - 158 - Tabla 28.-^P_elobates cultrip^. Para cada estadio de desarrollo y para cada hueso, porcentaje de los individuos estudiadós que presentaba mineralización (determinada por tinción con alizarina roja S). ESTADIO GOSNER 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 4b las 2as laa Ad ----------------------------------------------------------------------------------- N^ EJMPL. EXAMINADOS 10 9 8 ip 9 6 8 9 10 10 10 9 1 2 45 ----------------------------------------------------------------------------------- HUMERO 10 100 ESCAPULA 75 100 ULNA 62 100 RADIO 62 100 CLEITRO 62 100 CLAVICULA 62 90 100 CORACOIDES 25 80 100 ESTERNON 30 89 100 METACARPIANO III 12 70 100 METACARPIANO IV 12 60 100 FALANGE III.1 12 40 100 METACARPIANO II 12 40 100 METACARPIANO I 40 100 FALANGE II.1 30 78 83 87 100 FALANGE IV.1 20 78 83 87 100 FALANGE III.2 24 67 67 87 100 FALANGE IV.2 10 33 67 87 100 FALANGE I.1 44 67 87 100 FALANGE III.3 33 67 87 89 100 FALANGE II.2 33 67 87 89 100 FALANGE IV.3 ^.ZJ3 67 87 89 100 FALANGE I.2 33 67 87 89 100 POSTAXIALCENTRAL 10 60 100 PREAXIALCENTRAL 10 20 78 100 RADIAL 20 0 56 100 CARPAL 3 44 100 ULNAR 0 100 PREPOLLEX 1 96 PREPOLLEX 2 91 CARPAL 2 87 SUBULNAR 87 CARPAL 1 80 - 159 - porcentaje de individuos que presentaba osificación, para cada estadio de desarrollo y para cada hueso. La segunda etapa de la osificación del miembro anterior está constituida por la mineralización de metacarpianos y falanges. E1 proceso se inicia en los catorce huesos entre los estadios 39 y 41. Durante ia metamorfosis no se produce ninguna novedad digna de ser reseñada; en los huesos aumenta el porcentaje de diáfisis osificada, a la vez que se produce crecimiento en longitud. La secuencia de condrificación de los huesos de los dedos es prácticamente la misma que la de osificación. E1 primer elemento en condrificar y posteriormente en osificar es el metacarpiano del tercer dedo (III), seguido del metacarpiano IV, inmediatamente después aparece el metacarpiano II y lá primera falange del tercer dedo . Ambos se unen entre los estadios 40 y 41 (figura 42 D>. - E1 preaxialcentral, es el segundo elemento en osificar en la primera semana después de la metamorfosis (figura 43 B>. Proviene de la fusión de dos piezas cartilaginosas, una dorsal y otra ventral: los elementos Y y CZ de Schmalhausen (1907) y Holgrem (1933>. Las dos condensaciones aparecen en el estadio 37 y se fusionan en el 38. Ver figura 41 F y G, y lámina VII B. - E1 radial es el tercer hueso en osificar (la semana postmetamórfica; figura 43 C>, procede de la fusión de tres elementos cartilaginosos. E1 radial, que aparece el primero (est. 35; figura 41 B), el central 1(est. 36; figura 41 D y lámina VII A), y el intermedio (est. 37; figura 41 E y lámina VII B)). Aormalmente, se fusiona el intermedio con el radial en el estadio 38 (figura 42 B y lámina VII C) y después a este complejo se incorpora el central en el estadio 39 (ffgura 42 C y lámina VII D); sin embargo, hemos encontrado ejemplares en el estadio 38 en que la fusión de los tres elementos ya se había producido . - E1 carpal 3 osifica en cuarto lugar (la semana postmetamórfica; figura 43 D). Condrifica a partir de dos esbozos cartilaginosos; el primero aparece en el estadio 36 (figura 41 D y lámina VII A) y el segundo en el estadio 37 , fusionándose ambos rápidamente en ese mismo estadio (figura 41 G>. Prueba de la rapidez con que se produce la fusión es que de nueve carpos en ese estadio examinados sólo en uno se encontraban ambos elementos separados. - E1 ulnar osifica en quinto lugar en la segunda semana postmetamórfica 1 I I ► fYYYI I I I w K t I I • ^ ^ ^ ^ ^ 5mm Figura 43.- Pelobates cultrip^. Secuencia de osificación de los huesos del carpo. fin blanco, el cartílago; en negro, el hueso. A, estadio 46; B, C y D, primera semana postmetamórfica; E, segunda semana postmetamórfica; F, G, H, J y g, adultos. U, ulna; IV, cuarto - metacarpiano; 1, postaxialcentrak 2, preaxialcentral; 3, radial; 4, carpal 3; 5, ulnar; 6, prepollex 1; 7, prepollex 2; 8, carpal 2; 9, subulnar, y 10, carpal 1. I I I - 163 - (figura 43 E) y proviene de la fusión de dos elementos cartilaginosos completamente superpuestos: uno que aparece en el estadio 36 en la cara dorsal, llamado ulnar (figura 41 D y lámina VII A), y otro que aparece en el estadio 37 en la cara ventral y que Emery (1894) llamó pisiforme (figura 41 E y lámina VII B). Ambos se fusionan en el estadio 39 (figura 42 B y lámina VII C). Estos cinco elementos forman el cuerpo principal del carpo. Inician su osificación entre el fin de la metamorfosis y los 10 días siguientes. Sólo se han detectado dos alteraciones de la secuencia descrita, después de examinar 10 P. cultri^ de estadio 45, 10 de estadio 46, 9 de una semana de edad, uno de dos semanas, dos de dos meses (estos criados en el laboratorio>, dos de un año y 45 adultos. En un renacuajo de estadio 45 estaba osificando el radial en una mano, sin que hubieran iniciado su osificación ni el postaxial central ni el preaxialcentral que lo precenden en la secuencia; mientras que en la otra mano no había comenzado la osificación en ningún hueso. En un recién metamorfoseado la osificación había comenzado en el postaxialcentral, el radial y el ulnar, habiéndose "saltado" el preaxialcentral y el carpal 3. En los cinco huesos restantes, la secuencia de osificación sufre también ligeras alteraciones respecto a la de condrificación. Condriffcan en el siguiente orden: carpal 2, carpal 1 y prepollex 1(estadio 3?; figura 41 F y K, y lámina VII B>); prepollex 2 y subulnar (estadio 38; figura 42 A y B, y lámina VII C) y prepollex 3(estadio 40; figura 42 C>. Este último se fusiona con el prepollex 2 en el estadio 41. Las cinco piezas inician su osificación después de la madurez sexual, en un orden ligeramente alterado: prepollex 1, prepollex 2, carpal 2, subulnar y carpal 1. Ver figura 43 F- K. Hemos encontrado un individuo en que esta secuencia estaba alterada; el subulnar había comenzado su osificación, sin que se hubiera iniciado la del carpal 2. En la tabla 30 se resume la secuencia y el estadio de desarrollo en que condrifican y osifican los elementos del carpo. Es importante resaltar que ambas secuencias no coinciden. Además, durante el proceso de condrificación, las piezas del carpo condrifican unas antes, otras a la vez y otras - 164 - Tabla 30.- ^Pelobates cultripes. Secuencia de condrificación y de osifica^^ión del carpo y estadio de desarrollo (Gosner, 1960) en que se produce cada acontecimiento. ^ SECUENCIA DE CONDRIFICACION Estadio de Gosner SECUENCIA DE OSIFICACION Edad ------------------------------------ Radi al 35 Postaxialcentral Estadio 46 Central 4 35 Prea; y cuatro años de edad, al que todavía faltaban por osificar los tres últimos huesos; otro macho de tres años, pero de mayor tamaño (LCC = 74 mm) tenía ya todos los huesos osificados. En machos no hay correlación significativa entre edad y número de elementos osificados 0.05); y tampoco la hay entre LCC y número de huesos 0.05). Ver figuras 45 y 46. ' En las hembras existe correlación muy altamente significativa en ambos supuestos, siendo mayor el coeficiente de correlación entre el número de elementos osificados del carpo y el tamaño (rs = 0.8137; n= 14; S= 84.77; P < 0.001> que entre éste número y la edad tenían todas las piezas del carpo osificadas, aún el más joven <3 afios) y de menor tamaño le faltaban dos elementos por osificar. En P. cultripes, el inicio de la osificación en la cintura escapular, húmero y radioulna emplea 19 días a temperatura óptima de crecimiento, entre los estadios 38 (21.25 días) y el fin de la la semana postmetamórfica (40.33 días). - 166 - x ^o-^ ® machos (n = 15) q hembras (n = 14) 0 10 70 ^ 50 -^ y Número de elementos osificados en el carpo Figura 44.- Histograma de frecuencias del número de elementos osificados en el carpo, en los Pelobates c^ltrip^ adultos de la población de }Iadrid. 0 0 O O ^ ^► o 0 ^ r r 0 5 10 Edad (n° de años) • - d'd' ( n = 15 ) o-^^ (n = 14) •-juv. (n = 12) Figura 45.- Pelobates cultripes. gúmero de elementos del carpo osificados en relación con la edad, en la población de Madrid. - 168 - 10 , 0 a L ^O u r V C QJ ^ O ^ io u .^ w •r ó b^ N O ^ CQ^ W ^ d ^ ^ 20 30 •-d'd' (n = 15) o-g^ (n = 14) ♦ - juv. (n = 12) • io•ó• •^ ^oi o 0 0 0 0 0 0 50 60 70 80 80 100 110 Longitud cabeza + cuerpo (mm) Figura 46.- PPlobates cultrj^pes. Número de elementos del carpo osificados en relación con el tamago (LCC), en la población de ^tadrid. - 169 - Tabla 31.- Pelobates cultripes. Aúmero de elementos osificados en el carpo en relación con el tamaño y con la edad en juveniles y adultos de la población de Madrid. No elementos i Juveniles i Adultos osificados i i Machos Hembras en el carpo i LCC Edad i LCC Edad LCC Edad ------------------------------------i-------------------------------------------- 5 i 41 i 1 i i 57 i 5 5 i 52 i 1 i i 64 i 3 --------------------------------------------------------------------------------- b i i i 72 i 4 6 i i i 75 i 2 --------------------------------------------------------------------------------- 7 i i 64 i 4 i 8 i i i 81 i 9 9 i i i 74 i 5 9 i i i 82 i 4 10 i i 74 i 3 i 77 i 10 i i 76 i 8 i 79 i 8 i i 76 i 10 i 85 i 10 i i 78 i 8 i 85 i il i i 79 i B i 86 i 8 i i 84 i 12 i 96 i 8 i i 82 i 9 i 101 i 8 i i 83 i b i i i i 83 i 7 i i i i 83 i 9 i i i i 85 i 7 i i i i 85 i 8 i i i i 87 i 8 i i i i 87 i 9 i i - 170 - La osificación se inicia en metacarpianos y falanges entre los estadios 39 (23.87 días de edad a 28° C> y fin del 41 (27.75 días>; empleando el proceso, por término medio, 3.88 días. Los cinco huesos principales del carpo: postaxialcentral, preaxialcentral, carpal 3, radial y ulnar osifican entre el fin de la metamorfosis (estadia 46) y los diez días siguientes. Y los cinco huesos periféricos (prepollex 1, prepollex 2, carpal 2, subulnar y carpal 1) comienzan a osificar después de la madurez sexual. En los machos, la osificación se ha inicfado en todos ellos a los tres años de edad, si se ha alcanzado el tamago crítico de 74 mm; mientras que en las hembras el proceso se alarga hasta los 8 0 10 aPíos de edad, como puede verse en la tabla 31. Tenemos que resaltar que en todos los ejemplares de P• cultri^s examinados los elementos del carpo fueron diez, sin que se haya registrado ni una sola fusión o alteración del patrón básico. Por tanto, la variabilidad en cuanto al número de elementos del carpo de P. cultrig,as, hasta el momento, es inexistente, concentrándose las diferencias en el estado de osificación de los mismos. 3.2.3.2. Comparación con Pelodv̂ tes ^yncta^.iis y otras especies de Anuros Vamos a comparar los tres segmentos en que hemos dividido la cintura escapular y, el miembro anterior por separado, atendiendo a las siguientes características: Aúmero de elementos en el adulto. Aúmero de centros de condrificación y/o osificación. Secuencia de osificación. Duración del proceso de inicio de la osificación. Frecuencia de malformaciones. - 171 - Cintura escapular y brazo En pelobates cultrives, la cintura escapular consta de nueve huesos: cuatro pares y uno medial. E1 mismo número de elementos se halla presente en las otras tres especies del género. Los otros dos géneros vivientes de la familia Pelobatidae, ^^hi^ s y S^e^, se caracterizan por la ausencia de osificación en el esternón, que permanecé cartilaginoso toda la vida. Tanto L^ptobrachium hASSeltii como Mesr^hrys montana poseen esternón óseo. Y lo mismo podemos decir de Pe^tes ^nctatus y P. caucasicus. En cuanto al número de centros de osificación de la cintura escapular, húmero, radio y ulna, no hemos observado ninguna diferencia en Peladytes punctatus respecto a Pelobates cultripes. En cambio, detectamos dos alteraciones en la secuencia en que se produce el inicio de la osificación. En Pe^rtes, la escápula se retrasa hasta después de que el radio y la ulna han comenzado su mineralización, y el coracoides inicia su osificación antes de que lo hagan el cleitro y la clavícula. En la literatura, sólo existen datos parciales de la secuencia de osificación de dos especies: %enopus laevis y ana pipiens. Van Pletzen (1956) segala que el coracoides, el húmero y la radioulna comienzan a osificar en el estadio 56 de la tabla normal de ^p,g^. <37 de la de Gosner), y la escápula, el cleitro y la clavícula en el 58 <41 de Gosner). Frente a la secuencia patrón de P. cultri^^, destaca el gran adelanto en la osificación del coracoides y el considerable retraso de la escápula. Kemp & Hoyt C1969> indican que en Rana ^inTens el húmero comienza a osificar ,en el estadio XI <36 de Gosner) de su tabla normal; la escápula inicia su osificación después del radio y la ulna, y el cleitro después del coracoides y la clavícula. Los detalles de la comparación de secuencias entre las cuatro especies se pueden consultar en la tabla 32. En cuanto a la duración del inicio de la osificación, en P, cultriDes los elementos pares de este segmento osifican entre los estadios 38 y 39, - 172 - Tabla 32.-•Secuencias de o►ificación y estadios de desarrollo y na ^piens (Taylor & Kollros, 1946 ) . Peloóates cultripes Pelodytes punctatus Kenopus laevis Rana pipiens n = 177 n = 159 n = lb2 Hd^ero 38 Hd^ero 31 Hd^ero 31 (= 56) Hd^ero 36 (= XI) EscApula 38 Radio 37 Caracoides 37 Radio 37 (= XII1 Ulna 38 Ulna 37 Radio 37 Ulna 37 ' Radio 38 Escápula 38 Ulna 37 ' Escápula 38 l= XIIII Cleitro 38 Coracoides 38 Escápula 41 l= 581 Coracoides 38 ' Clavícula 38 Cleitro 38 Cleitro 41 ' Clavícula 39 (= XIV1 Coracoides 39 Clavícula 38 Clavícula 41 ' Cleitro 39 ' Esterndn 1^ se^. Esterndn ler ^es Esterndn no osifica Esterndn 46 (= XXV? O^oesterndn no osif. O^oesterndn no osif. O^oesterndn ' O^oesterndn 46 ' - 173 - empleando en el proceso 3.5 días, que se incrementan a 19 si incluimos la osificación • del esternón. En Pelo te^• ^unctat^s la osificación de los elementos pares se inicia antes, entre los estadios 37 y 38, y termina más tarde, aproximadamente un mes de.spués de la metamorfosis , ya que en este género el esternón permanece cartilaginoso en el adulto (Cannatella, 1985). En Rana ^i,niens (Kemp ^ Hoyt, 1969>^ la mineralización de los nueve huesos de la cintura escapular y brazo se inicia entre los estadios 36 y 46 (XI y XXV de la tabla normal de $, ^iT oiens). ][etacarpianos y falanges En P. cultri es, la mano consta de cuatro dedos, con las siguientes falanges: 2, 2, 3, 3; por tanto, junto con los metacarpianos, suman 14 huesos. E1 mismo número de elementos se encuentra en todas las especies de las familias Pelobatidae, Pelodytidae y Megophryidae. Y ésta es la fórmula general en la mayoría de las especies de Anuros, salvando algunos Hílidos, Microhílidos y Racofóridos con falanges intercalares antes de la última de cada dedo (Lynch, 1973 ) . Tanto los metacarpianos como las falanges osifican a partír de un sólo centro situado en la parte media de la diáfisis, exceptuando las falanges terminales que comienzan a osificar por su extremo distal. Ho hay centros de osificación secundarios en las epífisis. Sin embargo, j^,antobrachium hasseltii mostraba los cartílagos epifisarios de todos sus huesos largos, incluidas las falanges, fuertemente calcificados en que se inicia la mineralización de los metacarpianos y las falanges de Pelobates cultrip.Q.^ y Pelodytes nunctat„s (esta tesis> y Rana pipiens (Kemp & Hoyt, 1969). E1 asterisco señala los huesos que alteran su orden de osificación respecto a la secuencia patrón de Pelobates cultripes. Entre paréntesis, estadios de desarrollo de la tabla normal de Rana pipiens CTaylkor & Kollros, 1946). Pelobates cultripes Pelodytes punctatus Rana pipiens ------------------------- ------------------------ n = 177 n = 159 Metacarpiano III 39 Metacarpiano III 39 Metacarpianos 38 (= XIII) Metacarpiano IV 39 Metacarpiano IV 39 Falanges 39 (= XIV) Falange III.1 40 Falange III.1 41 Metacarpiano II 40 *Falange IV.1 41 Metacarpiano I 40 Metacarpiano II 41 Falange II.1 40 *Falange II.1 41 Falange IV.1 40 Metacarpiano I 41 Falange III.2 40 Falange III.2 41 Falange IV.2 41 Falange IV.2 42 Falange I.1 41 Falange I.1 44 Falange III.3 41 Falange II1.2 44 Falange II.2 41 Falange II.2 44 Falange IV.3 41 Falange IV.3 44 Falange I.2 41 Falange I.2 45 C ^\ ^ D I I/ \ Ir^^^ ^^^^U E „ S F ^. ----- ..6 - ^ f l I I I I S mm Figura 47.- Composición del carpo adulto en la familia Pelobatidae. en norma dorsal: A, Pelobates cultri^s; B, P. varaldii; C, P. ^vriacus; D, ^ fy^çy^; B. Scanhin= us couchii; F, Snea multinlícatus. Línea contínua, hueso; línea discontinua, cartílago. fv, cuarto metacarpiano; 1, postaxialcentral; 2, preaxialcentral; 3, radial; 4, carpal 3; 5, ulnar; 6, prepollex 1; 7, prepollex 2; 8, carpal 2; 9, subulnar; 10, carpal 1, y 11, prepollex 3. - 177 - De la familia Pelodytidae hemos estudiado el carpo de las dos especies que la constituyen. Tanto Pelo tes punctatus como P. caucasicus muestran nueve huesos en su carpo, para cuya denominación conservamos parcialmente la de Howes & Ridewood C1898>. Los huesos son: hamatum, preaxialcentral, radial ulnar, prepollex 1, prepollex 2, carpal 2, carpal 1 y subulnar. No hemos encontrado la tercera falange del prepollex que muestran las ilustraciones de Howes & Ridewood (1898>. Nosotros consideramos la osificación que hemos llamado subulnar un verdadero hueso del carpo, homólogo al correspondiente de P. cultri^. La figura 48 presenta un dibujo de los carpos de ambos pelo tes. De la familia Megophryidae hemos estudiado el carpo de 1^egonT r^s montana y de I^,ptobrachium hasseltii. E1 de la primera especie está constituido por nueve huesos, a los que se añade un décimo elemento cartilaginoso en la base del metacarpiano IV. Carece de subulnar. Ver figura 49 A. E1 carpo de Leptobrachiu^ difiere de los de las restantes especies descritas hasta la fecha. Posee trece elementos. De ellos tres pertenecen al prepollex. Entre el postaxialcentral y el cuarto metacarpiano aparece un pequeño hueso que hemos denominado carpal 4. Entre el postaxialcentral, el preaxialcentral y el tercer metacarpiano hay dos huesos, en vez de uno como en pelobates; para el menor de ellos, incluido casi en la epífisis del metacarpiano del tercer dedo, hemos conservado el nombre de carpal 3, y al de mayor tama4fo lo hemos denominado central 3, como a la pieza cartilaginosa que en Pelobates aparece en la misma posición durante el desarrollo del carpo y que posteriormente se fusiona con el carpal 3. Por último, en la palma de la mano, incluido entre los tendones que la cruzan y sin articular con ningún hueso del carpo, se encuentra un elemento osificado que hemos considerado un hueso sesamoideo. No hemos podido dilucidar si el hueso subulnar existe, ya que la epífisis distal de la radioulna se halla fuertemente calcificada en esta especie, impidiendo la observacíón. En la figura 49 B y C se muestra el carpo de L. hasseltii en normas dorsal y ventral. Howes & Ridewood <1898>, que estudiaron 60 especies de anuros pertenecientes a 37 géneros, describieron diez tipos de carpo entre los anuros - 17b - A B 3 mm Figura 48.- Composición del carpo adulto en la familia Pelodqtidae. En norma ' dorsal: A, Pe_lod^vtes nunctatus; B, p,,, caucasicus. iv, cuarto metacarpiano; h, hamatum. A g C , , , , , ^ Smm Figura 49.- Composición del carpo adulto en la familia l^egop►ryidae. En norma dorsal: A, ^govhrvs montana; B, Lentobrachium hasseltii. En norma ventral: C, ^^obrachium hasseltii. Línea contínua, hueso; línea discontínua, cartílago; rayas, cartílago calcificado. IV, cuarto metacarpiano. - 180 - actuales, y hasta la fecha no se habían encontrado más variaciones.^2eproducimos las ilustraciones originales en la figura 50. Si prescindimols de las variaciones en el número de elementos provocadas por el distinto número de falanges en el prepollex (las cinco segaladas con un asterisco en la figura 50), nos quedamos con que estos autores describieron cínco modelos distintos de carpo. A ellos hay que añadir ahora los de Pelobates y Pelo tes, debido a la presencia en ellos del subulnar - osificación descrita por Howes & Ridewood en el siglo pasado, pero a la que no dieron importancia por considerarla perteneciente a la epífisis de la radioulna. Nosotros hemos puesto de manifiesto en nuestro estudio que este elemento tiene existencia independiente en una étapa del desarrollo (estadios 39 y 40. Ver lámina VII G) y que su osificación es de tipo endocondral, igual que la de los restantes elementos del carpo. Finalmente, hemos de incorporar el modelo de carpo de Lentobrachium, el único anuro actual descrito hasta el momento con todos los elementos carpales independientes de los centrales. Hemos de a^adir que entre las especies fósiles se han descrito cuatro cuyos carpos presentaban libre el carpal 4, a saber: Palaeobatrachus sr̂randig^ (Spinar, 1972; Jarosova, 1973), de la extinguida familia Palaeobatrachidae, y •ordi pha ^ gracilis, G. longicostatus y Thoraciliacus rostrice,p^ . Cada autor añade elementos nuevos en su descripción, que coinciden con los detectados por nosotros en P. cultripe^, faltando de sus descripciones sólo el prepollex 3 y el subulnar. Dado que el subulnar tiene existencia independiente en los adultos de p. fuscus . Nuestra suposición se basa en que todas las figuras que presentan son de estadios anteriores. No existen otras descripciones del desarrollo del carpo de miembros de las familias Pelobatidae, Pelodytidae y^[egophryidae. Sería deseable, muy especialmente, el estudio del desarrollo del carpo de Lentobrachium hasseltii. Lo más importante que se conoce del desarrollo del carpo de las restantes especies de anuros lo resume Holgrem (1933), detallando el desarrollo en }^,,,nopus laevis (Discoglossidae) y Bufo bufo y en Pe1_odytes punctatus transcurre entre los estadios 34 y 41 de.la tabla de Gosner. En Pelobates cultrip^, P, varaldii y Pelod,ytes nunctatus sólo hay un centro de osificación por cada hueso del carpo. DTo sabemos como transcurre el proceso en las demás especies, pero, hasta la fecha, no hay motivos para esperar más de un centro de osificación por hueso. En cuanto a la secuencia de osificación del carpo, hemos dividido la de Pelobates cultrip,^ en dos fases. La primera, afecta a los huesos que hemos llamado centrales y se desarrolla en los diez días posteriores a la metamorfosis, en el siguiente orden: postaxialcentral, preaxialcentral, radial, carpal 3 y ulnar. La segunda, que hemos denominado de los huesos periféricos, se inicia después de alcanzada la madurez sexual y comprende el prepollex 1, prepollex 2, carpal 2, subulnar y carpal 1. A primera vista, parece que los huesos osifican por orden de tamaño. De P. varaldii hemos estudiado los carpos de dos recién metamorfoseados, cinco adultos de un año (dos machos y tres hembras) y 30 adultos de más de un año <16 machos y 14 hembras). Aunque suponemos que la secuencia de osificación del bloque central es igual que la de P. cultripes, sólo podemos afirmar con seguridad que el postaxialcentral es el primer hueso en iniciar la osificación y que de los huesos periféricos el último en osificar es el carpal 1, el penúltimo el subulnar, el antepenúltimo el carpal 2 y los primeros ambas falanges del prepollex. A1 igual que en P. cultri^„^, en P. varaldii existe dimorfismo sexual en el estado de osificación de los elementos del carpo periférico. En los individuos de un ago cumplido (n = 5), tanto los machos como las hembras tenían los cinco elementos en estado cartilaginoso todavía. En todos los machos de más de dos años de edad (n = 16) los cinco elementos habían iniciado su osificación. Y de las 14 hembras - 185 - de más de dos años sólo en dos de ellas, una de 4 afíos CLCC = 65 mm> y otra de 5 CLCC = 53 mm> faltaban por osificar en la primera tres huesos y en la segunda uno; sin embargo, las correlaciones en las hembras de dos o más años entre el número de elementos osificados del carpo y la edad a partir de los dos años Crs = 0.0954 ; S= 411.59 ; n = 14 ; P >> 0.10 ) y entre el número de huesos y LCC no resultaron significativas. Aunque son altamente significativas en ambos supuestos y en ambos sexos si se incluyen los individuos de un año. Ver tabla 35. En la figura 51 se presenta el diagrama de dispersión del estado de osificación del carpo de 37 P. varaldii frente a la edad, y en la figura 52 frente al tamaño. En la figura 53 se compara el estado de osificación de los recién metamorfoseados, juveniles y hembras de p, cultripes y P. varaldii en relación con su tamaño. La representación gráfica muestra con claridad que, a igualdad de tamaño, la osificación del carpo de ^., varaldii está mucho más avanzada que la de P. cultripes. Lo mismo sucede entre ambas especies cuando se comparan hembras de la misma edad, como se refleja en la figura 54. Esto está ligado al alcance de la madurez sexual en p. varaldii a menor edad y menor tamago. Esta especie, respecto a P. cultripes, muestra mayor osificación del carpo y disminución en el grado de osificación del cráneo. De la secuencia de osificación del carpo de P. fuscus nada podemos decir, puesto que los 7 machos estudiados presentaban el proceso finalizado. De p, syriacus, la única hembra examinada tenía ya los diez huesos, y el juvenil de pocos meses -no había sufrido todavía su primer periodo de reposo- presentaba osificados los cinco huesos centrales y el prepollex 2. Dtada podemos avanzar tampoco de la secuencia de osificación en SCaThionus couchii tn = 9), ^jea multiplicatus (n = 10), 1^Ie nhrXs montana , ni en P. fuscus (n = 7>, ni en p,^ ^riacus (n = 2> . En Scaphio= us couchii (n = 9) y en ^nea multipjicatus (n = 10) no se ha detectado variabilidad alguna, y lo mismo podemos afirmar de ^,gophrys montana en cada estadio de desarrollo del miembro posterior y cintura pelviana de P. cultripes se forman a partir de 31 centros de osificación, todos pares. Para mayor claridad, los dividimos en tres segmentos y relatamos por separado sus secuencias de osificación. E1 primer segmento agrupa a los dos huesos largos de la pata posterior y a los dos huesos de la cintura pelviana. Osifican en el siguiente orden: fémur, ilion, tibia y fíbula (en el estadio 38> e isquion (en el estadio 44). La tibiofíbula osifica a partir de dos. centros adyacentes, correspondientes uno a la tibia y otro a la fíbula. Se fusionan inmediatamente después de su aparición. E1 proceso de osificación determina la asociación de ambos elementos; en estado cartilaginoso las dos piezas permanecen independizadas y antes de que se inicie su osificación adquieren epífisis comunes: primero la proximal (estadio 35) y 5 Smm Figura 56.- Morfología, posición anatómica y denominación de los huesos de la pata posterior y cintura pelviana de Pelobates cultri^e.s.. 1, fémur; 2, ilion; 3, tibiofíbula; 4, isquion; 5, sacro; 6, urostilo; ?, fibular; 8, tibial; 9, prehallux 2; 10, prehallux 1; 11, central; 12, tarsal 2; 13, tarsal 3, y 14, quinto metatarsiano. 4 A g /i ll 2 ll ^ 2mm C 6 00 00 a E 4 .^ ^ ^ ^^ e ^\ ^ D ,o 2 mm Figura 57.- Pelobates cultri es. Desarrollo de la pata posterior y de la cintura pelviana entre los estadios 31 y 36 CGosner, 1960). Secuencia de aparición de los distintos elementos. A, estadio 31; B, estadio 32; C, estadio 33; D, estadio 34; fi, estadio 35; F, estadio 36. 1, fémur; 2, fíbula; 3, tibia; 4, fibular; 5, ilion; 6, tibial; 7, metatarsiano IV; 8, metatarsiano V; 9, isquion, y 10, tarsal 3. - 198 - después la distal (estadio 36). Ver figura 58 A y B, y lámina VIII A y B. E1 isquion osifica también a partir de dos centros en el estadio 44. En el estadio 35 condrifican dos piezas independientes y ampliamente separadas (figura 57 E y F), cada una adosada al extremo posterior de su ilion. En ningún momento del desarrollo aparece alguna otra pieza independiente que se pueda asociar al pubis. Estos cuatro huesos derivan de cinco centros de condrificación y otros tantos de osificación, todos pares. La secuencia y estadio de Gosner en que aparecen durante el desarrollo larvario de P^ cultriges se detalla en la tabla 37. Las dos secuencias no coinciden. Por ejemplo: el ilion osifica en segundo lugar, pero es el cuarto elemento en condrificar; la tibia y la fíbula inician su osificación a la vez, a pesar de que la fíbula aparece ligeramente antes en estado cartilaginoso. En la tabla 38 se señala, para cada estadio de Gosner, el porcentaje de individuos examinados en que cada centro había iniciado su osificación. La duración del inicio de la osificación en este segmento es de 11,08 días por término medio; desde la edad de 21,25 días a que se alcanza el estadio 38, hasta los 32,33 días en que termina el estadio 44, a temperatura óptima. La segunda etapa de la osificación está constituida por la mineralización de los cinco metatarsianos y las catorce falanges. E1 primer elemento en condrificar es el metatarsiano del cuarto dedo en el estadio 34 Cfigura 57 D), que también es el primero en iniciar su osificación en el estadio 39. En ambos procesos le siguen los metatarsianos V y III. En una secuencia radial que tiene por eje principal el dedo IV continuan apareciendo los restantes metatarsianos y falanges en el orden y estadio de desarrollo que se indica en la tabla 39. Las figuras 57 y 58 muestran etapas sucesivas del proceso. Las últimas falanges en condrificar son las terminales de los dedos II y I, y las últimas en osificar ambas falanges del dedo I. A f , ófl^ °00 2,mm . 2mm Figura 58.- Pelobates cultrines. Condrificación del tarso y secuencias de condrificación y de osificación de los metatarsianos y falanges entre los estadios 37 y 40 (Gosner, 1960). En blanco, el cartílago; en negro, el hueso. A, B y C^ estadio 37; D. estadio 40. f, fibular; V, quinto metatarsiano; 10, tarsal 3; 11, central dorsal; 12, central ventral; 13, prehallux 1; 14, tarsal 2, y 15, prehallux 2. - 200 - Lámina VIII.- Desarrollo del tarso de Pelobates cultripe,^. En azul, el cartílago; en rojo, el hueso. A, estadio 36; obsérvese la independencia del tibial y el fibular. B^ estadio 37; las epífisis del tibial y el fibular se han fusionado. C, estadio 39; la osificación se ha iniciado en todos los huesos largos; tibia y fíbula a punto de finalizar su fusión. D^ estadio 46; la flecha segala el centro de osificación de origen endocondral del prehallux 1. F, fibular, y V, quinto metatarsiano. '_ V _F . -202- Tabla 37.- Pelobates cultri^s. Secuencias de condrificación y de osificación de la pata posterior y cintura pelviana. SECUENCIA DE CONDRIFICACION i SECUENCIA DE OSIFICACION ----------------------------------i----------------------------- Elemento Est. Gosner i Hueso Est. Gosner ----------------------------------i----------------------------- io Fémur 29 i Fémur 38 2o Fíbula 34 i Ilion 38 3o Tibia 34 i Fíbula 3B 4^ Ilion 32 i Tibia 38 5^ Isquion 35 i Isquion 44 -203- Tabla 38.- Peloba es cultriges. Porcentaje de los individuos examinados en que cada centro de osificación de la pata posterior y cintura pelviana había iniciado su mineralízación. Se estudian por separado los distintos estadios de desarrollo de Gosner (1960), las primeras semanas postmetamórficas, los juveniles, y los adultos de ambos sexos tde Madrid y de Porto Covo>. Madrid PortCovo ESTADIO GOSNER 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 ptm jv h. m. h. m. No EJMPL.EXAMINADOS 10 9 8 10 8 7 8 9 10 10 10 10 2 14 15 4 12 FEMUR 0 li 87 100 ILION 87 100 TIBIA 87 100 FIBULA 87 100 TIBIAL 50 80 FIBULAR 50 80 ISQUION 22 100 METATARSIANO IV 37 60 100 METATARSIANO V 37 60 100 METATARSIANO III 37 60 100 FALANGE IV.1 12 60 100 METATARSIANO II 12 60 100 FALANGE V.1 12 50 100 FALANGE III.1 12 50 100 FALANGE IV.2 12 40 100 METATARSIANO I 12 40 87 FALANGE IV.3 . 30 87 FALANGE II.1 40 87 100 FALANGE III.2 , 30 75 100 FALANGE V.2 20 75 85 87 100 FALANGE IV.4 75 85 87 89 100 FALANGE II.2 37 85 87 89 100 FALANGE III.3 37 BS 87 89 100 FALANGE V.3 37 85 B7 89 100 FALANGE I.1 37 85 87 89 100 FALANGE I.2 37 85 87 89 100 PREHALLUX 2 12 44 100 PREHALLUX 1 10 50 100 CENTRAL 28 87 0 92 TARSAL 2 0 27 0 58 TARSAL 3 0 7 0 17 TARSAL 1 0 8 -204- Tabla 39.- Pelobates cultripes, Secuencias de condrificación y de osificación de los metatarsianos y falanges de la pata posterior, y estadio de desarrollo en que se produce cada acontecimiento. SECUENCIA DE CONDRIFICACION SECUENCIA DE OSIFICACION Estadio Gosner Estadio Gosner Metatarsiano IV 34 Metatarsiano I 39 Metatarsiano V 35 Metatarsiano V 39 Metatarsiano III 35 Metatarsiano III 39 Falange IV.1 35 Falange IV.1 39 Metatarsiano II 35 Metatarsiano II 39 Falange V.1 36 Falange V.1 39 Falange III.1 36 Falange III.1 39 Falange IV.2 36 Falange IV.2 40 Metatarsiano I 3b Metatarsiano I 40 Falange II.1 37 Falange IV.3 44 Falange IV.3 37 Falange II.1 40 Falange III.2 37 Falange III.2 40 Falange V.2 37 Falange V.2 40 Falange I.1 37 Falange IV.4 44 Falange IV.4 37 Falange II.2 40 Falange III.3 37 Falange III.3 41 Falange V.3 37 Falange V.3 41 Falange II.2 37 Falange I.1 41 Falange 1.2 37 Falange I.2 41 -205- E1 inicio de la condrificación de los dedos de la pata posterior de P^ çl li tripes tzanscurre entre los estadios 34 y 37, mientras que en la mano el proceso se inicia ligeramente después (ver tabla 29>. Su osificación se produce entre los estadios 39 y 41 (figura 58 D), a la vez que la de los dedos de la mano, y dura lo mismo: 3,88 días por término medio, desde la edad de 23,87 días hasta los 27,75 días. E1 tercer segmento se refiere al tarso. Los siete elementos osifican en la siguiente secuencia: tibial y fibular, prehallux 2, prehallux 1, central, tarsal 2 y tarsal 3. E1 tibial y el fibular inician su osificación simultáneamente en el estadio 39 Clámina VIII C). E1 fibular comienza a condrificar antes, en el estadio 32; mientras el tibial se identifica por primera vez en el estadio 33. A1 finalizar el estadio 36, ambas piezas presentan una epífisis proximal común, y al cancluir el estadio 37, se fusionan también su epífisis distales. Ver figuras 5? F y 58 A- D, y lámina VIII A y B. Las dos piezas aparecen individualizadas en los esqueletos desarticulados de los adultos excepto en los ejemplares de mayor tamaño, en los cuales pueden separarse manualmente. E1 inicio de la osificación en estas dos piezas, al igual que en los restantes huesos largos de los miembros, es de tipo pericondral. Es decir, alrededor de la diáfisis cartilaginosa se deposita una matriz ósea (ver fémur, tibia y fíbula en la lámina VIII A>, constituida fundamentalmente por fibras de colágeno. Posteriormente se impregna de sales cálcicas y se hace susceptible a la tinción con alizarina roja (Hall, 1974>. Poco más tarde, el cartílago es destruido y en su lugar se reconstruye hueso de tipo endocondral (ver cortes transversales de fémur en las láminas I, II y III para diferenciar los dos tipos de hueso). E1 prehallux 2, o hueso de la espuela, también osifica de esta manera. fin cambio, los otros cuatro huesos del tarso, al igual que los del carpo, sufren osificación de tipo endocondral exclusivamente: el centro de osificación aparece en el interior de la pieza cartilaginosa. En las preparacionés se observa un núcleo te4iido de rojo -hueso- rodeado completamente por tejido de color azul -cartílago-. Comparar las láminas 7 A y B con la 7C. Ver centros de osificación 1 y 2 del carpo, en la lámina VII D, y centro de osificación del prehallux 1, segalado con una flecha en la lámina -206- VIII D. E1 tibial y el fibular, por su comportamiento en las secuencias de condrificación y de osificación, y por el tipo de osificación que sufren, -si no fuera porque tradicionalmente se incluyen en el tarso-, deberían incluirse en el primer segmento descrito; es decir, en el de los huesos largos del miembro posterior y cintura pelviana. E1 prehallux 2 es el tercer elemento del tarso en osificar, en el estadio 44 y se fusionan en el 39. En los machos osifica en cuanto éstos alcanzan el tamaño y la edad media de la población a que pertenecen. En las hembras sólo osifica en algunas de las más viejas y de mayor tamago. E1 tarsal 2 condrifica en el estadio 37 . Sólo osifica en los machos de tamaño y edad superior a la media en ambas poblaciones. Ver figura 59 F. E1 tarsal 1 condrifica sólo en algunos individuos. Si lo hace, su aparición se efectua en el estadio 44. Este elemento se encontraba presente en dos (18.20'/0) de los 11 P. cultripes entre el estadio 44 y la primera semana postmetamórfica examinados con este fin. En la población adulta de I4adrid, el tarsal 1 se identificaba en el 6.90% de los ejemplares, siempre en estado - 20? - 2mm D W 2 mm F Figura 59.- Pelobates cultripes. Secuencia de osificación del tarso. En blanco, el cartílago; en negro, el hueso. A, estadio 43; B, estadio 44; C, primera semana postmetamórfica; D, fi y F, adultos. F, fibular; T, tibial; V, quinto metatarsiano; 3, prehallux 2; 4, prehallux 1; 5, central; 6, tarsal 2, y 7, tarsal 3. -208- cartilaginoso. En la población de Porto Covo, esta pieza se reconocía en el 66.70% de lós sapos; en uno de ellos, incluso, había comenzado a osifir_ar (figura 64 B). Las diferencias en la presencia del tarsal 1 entre los p1 cultripes adultos de las dos poblaciones son muy altamente significativas (n, = 29; n2 = 9; U= 52.50; P= 0.0001>. DTo hay diferencias entre ambos sexos en cuanto a su presencia, en ninguna de las dos poblaciones (Madrid: n, = 14; n2 = 13; U= 90.50; P= 0.9574. Porta Covo: n, = 5; n2 = 2; U= 6.50; P= 0.4624>. La osificación de los tres elementos finales de la secuencia: central, tarsal 2 y tarsal 3 se produce después de la madurez sexual. En la tabla 40 se resume la secuencia y el estadio de desarrollo o la edad en que condrifican y osifican los elementos del tarso de P. cultri^„s. En el estado de osificación de los tres elementos finales de la secuencia se observa dimorfismo sexual. Este es aún más acusado que el existente en los huesos periféricos del carpo. E1 número de elementos osificados en el tarso de los machos de la población de Madrid es mayor que el número de tarsales osificados en las hembras, con un nivel de significación del 99,9',G Ctest de la U de Mann-Witney, n, = 15; nz = 14; U= 174.00; P= 0.001>. En la población de Porto Covo, la diferencia entre el número de huesos en el tarso de los machos y el número de huesos en el de las hembras es significativa al 997. T ^ r ^ i! 50 ^ 30 ^ io^ . 4 5 A ® a^achos (n = 15) ^ he^bras (n = 14) Número de ele^aentos osificados en el tarso B y ^O^ ® Nc1^oS ( n = 12 ) ^ henbras (n = 4) ^ ^ r > T v ^o ^ 301 10^ 4 S 6 7 Ní^ero de elsentos osificados en el tarso 8 Figura 60.- Pelobates cultri^es. Histogramas de frecuencia del número de elementos osificados en el tarso de machos y hembras. Las diferencias entre .ambos sexos son muy significativas. A^ población de Madrid; B^ población de Porto Covo. A ® SO ^ 30 ^ 1O^ 4 f0^ 70 ^ 0 ti K 10^ 4 S Ug de eleaentos osificados en el tarso Madrid (n = 15) ^ Porto Covo (n = 12) 8 ® Madrid (n = 14) ^ Porto Covo (n = 4) Fi$ura 61.- Distribución de frecuencias del número de elementos osificados en el tarso en dos poblacianes de Pelobates cultri^es. Las diferencias entre las dos poblaciones no son significativas. A^ machos; B^ hembras.. 6 7 llú^ero de eleaentos osificados en el tarso - 212 - En P. cultri^s, existe una relación positiva y muy altamente significatida entre el número de elementos osificados en el tarso y la longitud cabeza + cuerpo del ejemplar, en los machos de la población de Madrid ; significativa al 95% en los machos de Porto Covo (n = 12; rs = 0.5322; S= 133.79; P< 0.05), y también significativa al 95°^G en las hembras de Madrid (n = 14; rs = 0.5694; S= 195.92; P calcularse tarso" es elementos figura 62; < 0.05). En las hembras de Porto Covo la relación no puede porque cero. E1 diagrama de dispersión del tamaflo (LCC) y el número osificados en el tarso en Pelobates cultripes se representa en se utilizan símbolos diferentes para los machos y las hembras la desviación típica de la variable "número de huesos del de la de cada población. La relación entre el número de huesos del tarso y la edad es significativa al 95°^6 en los machos de P. cultri es de la poblacíón madrileña 0.10). Tampoco es significativa en los machos de esta especie de Porto Covo (n = 11; rs = 0.0898; S= 200.24; P» 0.10), ni en las hembras de Madrid Cn = 14; rs = 0.3184; S= 310.13; P>0.10>. E1 diagrama de dispersión del número de huesos del tarso y la edad en Pelobates cultrines puede consultarse en la figura 63. E1 proceso de inicio de la osificación en el tarso de p. cultrig^s transcurre en tres fases. La primera afecta a sus dos huesos largos, tibial y fibular, que osifican en el estadio 39; el proceso sucede a los 24 días de edad a 28^ C y dura menos de un día. La segunda, afecta a los huesos de la espuela, prehallux 2 y prehallux 1, que osifican en 2,33 días por término medio, entre los 31 y 33,33 días de edad a temperatura óptima. La tercera, afecta al hueso central y a los tarsales 2 y 3, que sólo osifican en los adultos; su mineralización se inicia después de la madurez sexual y finaliza uno o dos años más tarde, en cuanto el animal alcanza su tamaYio definitivo. La intensidad del proceso es mayor en los machos que en las hembras. E1 número de elementos afectados por la osificación depende del sexo y del .,0 ^ e 4 « _ ^ o O^ o • ^ Cñ • • 0 00 oi.^ .!: o 0 O® ® O ^ o op ®OD 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 • Madrid. Machos (n = 15) p Nadrid. Heebras (n = 14) Longitud cabeza + cuerpo (ae) e Nadrid. Recién set. y juv. (n = 12) O Porto Covo. Machoa (n = 12) ® Porto Covo. He^bras (n = 4) Figura 62.- Pelobates cultripes. Diagrama de dispersión de la longitud cabeza + cuerpo (LCC) y el número de elementos osificados en el tarso. Se distingue entre juveniles, machos y hembras, y entre los individuos de la población de Madrid y los de la población de Porto Covo. « Z - 214 - 8^ O 6 -^ O • O g p p^ • • 4 -i O Op • • ^ • ^ m O 0 0 ^ ^ ^ p o O 2^ -^ - 0 5 10 • Madrid. Machos (n = 15) g^ (^ nt ^^os) ^ Madrid. He^bras (n = 14) e Madrid. Recién ^et. y juv. (n = 12) ^ Porto Covo. Machos (n = 11) ® Porto Covo. Neabras (n = 4) Figura 63.- Pelobates cultri^.. Diagrama de dispersión de la edad y el número de elementos osificados en el tarso. Se distingue entre juveniles, machos y hembras, y entre Ia población de ^tadrid y la de Porto Covo. - 215 - tamaffo definitivo del animal; sólo está relacionado con la edad en los dos años posteriores a la adquisición de la madurez sexual, después de este tiempo el número de elementos osificados en el tarso no depende de ella, sino del tamaño máximo alcanzado. Las correlaciones entre el número de elementos osificados en el carpo y el número de elementos osificados en el tarso son positivas y significativas, tanto en los machos entre los estadios 55 y 60 de la tabla normal de X^.g1t^, equivalentes aproximadamente al 36 - 43 de la tabla de Gosner, y en Rana pj,piens (Kemp & Hoyt, 1969> entre los estadios X y XXV de la tabla normal de $^, equivalentes al 35 - 46 de la de Gosner. l[etatarsianos y falanges En Pelobates cultrines, el pie consta de cinco dedos, con 2, 2, 3, 4 y 3 falanges, respectivamente; al contabilizar los metatarsianos resultan 19 huesos. E1 mismo número de elementos se observa en Pelodytes punctatus y las - 219 - Tabla 41.- Secuencias de osificación del miembro posterior y cintura pelviana de Pelobates cultrip^ y Pel_odytes punctatus (esta tesis>, Xeno^u^ l^i^ . Los huesos señalados con un asterisco han modificado su posición respecto a la secuencia patrón de P. cultripes, o no existen en dicha especie. Pelobates cultripes Pelodytes punctatus Xenopus laevis Rana pipiens --------------------- --------------------- ------------------------- n = I71 n = 159 n = 162 Féar 38 Ilion 38 Tibia 3B Fíhula 38 Isquion 44 Fdwr Tibia Fíbula Ilion Isquion 37 37 37 31 44 Féwr Ilion Tibia Fíbula Isquion Epipubis 36 t= 551 37 t= 56) 37 ' 31 ' 41 1= 58i 43 l= 601 Féar 35 (= Xf Tibia 35 ' Fíbula 35 ' Ilion 36 t= XI) Isquíon 42 t= XXI) Pubis 46 l= XXV) Metatarsiano IV 39 Metasiano IV 38 Metatarsianos 39 t= 56) Metatarsianos 3b t= XI1 Metatarsiano V 39 Metatarsiano V 38 Falanges 41 t= 581 Falanges 37 t= XII) Metatarsiano III 39 Metatarsiana III 38 Falange IV.1 39 Falange IV.1 38 Metatarsiano II 39 Metatarsiano II 39 Falange V.1 39 tFalange III.1 41 Falange III.1 39 Falange V.1 41 Falange IV.2 40 Falange IV.2 41 Metatarsiano I 40 Metatarsiano I 41 Falange IV.3 40 }Falange II.1 42 Falange II.1 40 fFalange III.2 42 Falange III.2 40 Falange IV.3 42 Falange V.2 40 Falange V.2 42 Falange IV.4 40 fFalange I.1 42 Falange II.2 40 Falange IV.4 43 Falange III.3 41 fFalange III.3 43 Falange V.3 41 Falange II.2 43 Falange I.1 41 Falange V.3 43 Falange I.2 41 Falange I.2 44 Tibial 38 Tihial 38 Tibial 37 ( = 561 Tibial 36 1= XI) Fibular Prehallux 2 Prehalluz 1 Central Tarsal 2 Tarsal 3 Tarsal 1 38 44 46 adultos solo ^achos solo ^achos solo ^achos Porto Covo Fibular Central Tarsal 1 Tarsal 2 Prehallux 1 Prehallux 2 Prehalluz 3 Tarsal 3 38 adultos ^achos ^achos ^achos ^achos no osif. na osific. Fibular 37 t= 56) Fibular 36 t= XI1 - 218 - restantes especies de las familias Pelobatidae, Pelodytidae y Megophryidae. En las dos especies estudiadas de esta última familia, Leptobrachium hasseltii y ^Ie^,phr^s montana las epífisis de todos los huesos largos del pie estaban fuertemente calcificadas. En cuanto a la secuencia de osificación, Pel^tes ^unctatus presenta cinco alteraciones sobre el patrón descrito en P. cultripes: la primera falange del tercer dedo ; las falanges II.1 y III.2 osifican antes que la IV.3; la I.1 se adelanta a la IV.4, a la II.2, a la III.3 y a la V.3; a su vez, la falange III.3 precede en el inicio de su osificación a la II.2. Los detalles de las secuencias de ambas especies pueden consultarse en la tabla 41. Ho existen datos adicionales de ninguna otra especie de anuro. En P. cultripes, la duración media del proceso es de 3.88 días a temperatura óptima de crecimiento; el proceso se inicia en los 19 huesos entre los estadios 39 y 41. En pelo tes punctatus, el comienzo de la osificación se produce entre los estadios 38 y 44; en Xenopus laevis <1Pewth, 1956> entre el 56 y 58 de la tabla normal de X^.gu^, equivalentes al 39 - 41 de la tabla de Gosner, y en Rana p^iens (Kemp & Hoyt, 1969) entre el XI y el XII de su tabla normal, equivalentes al 36 - 37 de la de Gosner. Tarso Según las poblaciones, el tarso de P, cultrives está constituido por siete elementos o por ocho. La población de Madrid presenta tibial, fibular, prehallux 2, prehallux 1, central, tarsal 2 y tarsal 3(figura 64 A); mientras que la de Porto Covo posee un tarsal 1 adicional (figura 64 B). A1 igual que la población de ^, cultri^es de Porto Covo, el 92.86°^ de los P. varaldii examinados con este fin poseían tres tarsales (figura 64 E), dos <33.33°^G) poseían cuatro , y uno presentaba sólo dos (16.67°^). En la literatura sólo consta la existencia de tres tarsales en esta especie (Chomiakoff, 1894; Schmalhausen, 1908>. Ningún autor que haya estudiado la anatomía o el desarrollo del tarso en anuros Cp.e.: Howes & Ridewood, 1888; Chomiakoff, 1894; Schmalhausen, 1908; Holgrem 1933; Jarosova 19?4; Saint Aubain, 1981) indica que el número de tarsales pueda estar sujeto a variabilidad intraespecífica, circunstancia que nosotros hemos detectado en las especies del género Pelobates. Desafortunadamente, los ejemplares procedentes de colecciones científicas conservados largo tiempo en alcohol son incapades de absorber adecuadamente el colorante para el cartílago. Este ha sido el caso en los Scaphiopus couchii estudiados, y por tanto, no hemos podido determinar el número de tarsales cartilaginosos presentes. De este especie sólo podemos segalar los elementos osificados, en la figura 64 G. Son cinco: tibial, fibular, prehallux 1, central y un tarsal. Este último, osificado sólo en cinco (56.56'.G> de los nueve machos estudiados. Snea multinlicatus mostraba, en los diez machos examinados, seis huesos en el tarso: tibial, fibular, prehallux 1, prehallux 2, central y un tarsal. E1 tibial y el fibular se encontraban completamente fusionados en sus extremos proximal y distal en todos los casos. No ha sido posible determinar la existencia de más elementos tarsales en estado cartilaginoso, por el problema mencionado en el párrafo anterior. Los elementos óseos se han representado en la figura 64 H. De la familia Pelodytidae hemos estudiado el tarso de las dos especies existentes. En Pelo tes ^iunctatus, aunque la variabilidad en el número de elementos es grando, el tarso está constituido en 17 casos (60.71'L) por ocho elementos: tibial-fibular . A veces falta el prehallux 3(n = 6; 21.43',G; figura 65 B); mientras que en otros individuos se observa un elemento cartilaginoso adicional debajo del ,,. 3mm C ^t 3mm B , ^ Smm Figura 65.- Morfología del tarso en la familia Pelodytidae. fin blanco, el cartílago; en negro, el hueso. A, B y C, variabilidad en Pelodytes ^unctatus; D, Pe1_ody ç caucasi^^^^ (sólo elementos óseos). - 222 - prehallux 3(n = 5; 17.86x; figura 65 C>. De los ocho elementos, Pelo tes nunctatus presenta osificado siempre uno: el tibialfibular (figura 65 C). Como máximo hemos encontrado osificados seis, en uno de los machos de mayor tamaño: tibialfibular, central, tarsal 1, tarsal 2, prehallux 1 y prehallux 2(fi$ura 65 A). En el único tarso de Pelod,ytes caucasicus estudiado sólo se encontraba osificado el tibialfibular. A1 menos presentaba dos elementos cartilaginosos en el prehallux; pero no podemos descartar la existencia de más piezas en el mismo, ni pudimos establecer el número de tarsales, ya que la tinción resultó deficiente. E1 dibujo puede contemplarse en la figura 65 D. fin la familia Megophryidae, el tarso de $esr hr^s montana está compuesto por ocho elementos: tibial, fibular, prehallux 1, prehallux 2, prehallux 3, central y dos tarsales. fil tibial y el fibular sufren osificación; pero los restantes elementos del tarso, excepto las últimas falanges del prehallux, están constituidos por cartílago calcificado. En la figura 66 A se presenta un dibujo del mismo en norma dorsal. E1 tarso de I^^obrachium hasseltii presenta siete elementos, como puede verse en la figura 66 B. Las epifisis comunes al tibial y al fibular se hallan fuertemente calcificadas, al igual que los restantes elementos del tarso, exceptuando el prehallux 2 que se conserva cartilaginoso en su mayor parte. Hasta el momento, se han descrito nueve variaciones en el número de elementos del tarso CHowes ^ Ridewood, 1888), fin la figura 6? las reproducimos del trabajo original. Si prescindimos de las variaciones debidas a la existencia de uno, dos, tres o cuatro elementos en el prehallux (sePialadas con asterisco en la figura), nos quedamos con cuatro tipos de tarso. Tres de ellos tienen en común tres huesos: tibial, fibular y central; difieren en la posesión de uno . E1 cuarto modelo descrito por estos autores se caracteriza por la fusión del tibial y el fibular en toda su longitud, y la existencia de un central y tres tarsales (Pelo tes - 223 - 8 u Smm Figura 66.- Morfología del tarso en la familia Megophryidae. En negro, el cartílago calcificado; en blanco, el hueso. A^ ^gop^,vs mr antana; B. j^ntobrachium hasseltii. D K Figura 67.- Tipos de tarso en Anuros . Los señalados con un asterisco sólo difieren en el número de elementos del prehallux. A, A1Xtes obstetricans; B, "Bombinator igneus" C= Bombina bombina); C, Pelodytes punctatus; D, "Xenophrys monticola" <= 24ego^hr^s montana); fi, Limno ,ynastes tasmaniensis; F, X^1d^ . laevis; G, ^rla caerulea; $, Ceratop^s ornata, y%, Phryniscus laevis. E F ^ ^. _ ^^•A^^•^ - 225 - punctatus). Las descripciones de tarsos de anuros fósiles son escasas, debido a que la naturaleza cartilaginosa de los tarsales impide su fosilización. Sólo en Thoraciliacus rostrice,ps y t'ord . phal ^G gra .i . Correspondían al tibial, fibular, central; tarsales 1, 2 y 3, y prehallux 1 en la primera especie y al prehallux 2, además, en la segunda. En Maeronelobates osborni (Pelobatidae> fosilizaron seis huesos: tibial, fibular, prehallux 2, prehallux 1, central y un tarsal -probablemente el 2- sólo osificaba el tibíal, fibular, central y tres segmentos de prehallux . En cuanto al número de centros de condrificación, en Pelobates cultrip^ hemos encontrado uno por cada elemento del tarso menos el central, que posee dos. En total ocho centros. De este género sólo se ha. estudiado con anterioridad el desarrollo del tarso de la especie centroeuropea, Pelobates fl1^ç11^., (Chomiakoff, 1894; Schmalhausen, 1908; Holgrem, 1933) que, como podemos ver en la figura 64 E, generalmente presenta tres tarsales. Chomiakoff (1894) describió un sólo centro de condrificación para cada elemento, incluido el central. En cambio, Schmalhausen (1908) y Holgrem (1933), además de detectar dos centros de condrificación en la ontogenia del central homologan el tarsal 3 a un central 3+ tarsal 3, aunque Schmalhausen nunca identifica dos esbozos cartilaginosos independientes en su desarrollo. Holgrem <1933) afirma haber visto ambos elementos, central 3 y tarsal 3, independientes, pero no muestra ninguna fotografía. A pesar de la gran cantidad de P. cultrip^ que he examinado no he podido confirmar, en esta especie, el origen doble del tarsal 3. En Pelodytes p^nr.ta+ii^ se identifican 10 centros de condrificación de aparición constante, que surgen en la siguiente secuencia: fibular ; prehallux 2 y tarsal 1(estadio 38; figura 69 A y lámina IX B>; por último, el esbozo del prehallux 3 se independiza en la primera semana después de finalizar la metamorfosis. Los centrales dorsal y ventral se fusionan en el estadio 38. En algunos ejemplares del estadio 37 aparece un esbozo cartilaginoso muy pequeYfo sobre el tarsal 3, que aparentemente se fusiona con él en ese mismo estadio, pues no se detecta en el estadio 38 0 posteriores. Lo mismo sucede sobre los tarsales 2 y 1 entre los estadios 44 y 46, y de nuevo también sólo en algunos ejemplares. Esto nos hace dudar sobre si dichos esbozos serán de aparición constante, pero de individualidad fugaz durante el desarrollo; o bien, aparecen esporádicamente tan sólo en algunos individuos. Ao existen otras descripciones del desarroTlo del tarso en las familias Pelobatidae, Pelodytidae o Megophryidae. De las restantes familias de anuros, se conoce el desarrollo del tarso de siete especies, pertenecientes a las cinco familias siguientes: - Discoglossidae: - Pipidae: - Hylidae: - Bufonidae: - Ranidae: "Bombinator i ^^c" <= Bombina h.Qmbin^) (Schmalhausen, 1908 ) ; "Bombinator pa^- y^" (= Bombina varieg^ta> , y Discoglossus pictus (Jarosova, 1974>. Xenopus 7aevis . Hyla arborea (Schmalhausen, 1908> "Bufo variabilis" (= Bufo viridis) Rana arvalis (Tschernoff, 1907). La duración del proceso de condrificación del tarso de Pelobates cultripes a 28^C es de 11.63 días (del estadio 32 al final del estadio 37). En Pelodytes punctatus el proceso transcurre entre el estadio 32 y la le semana -227- 0 ^o,`` ^^ s 9 C „ 1mm n 4 e 4 Figura 68.- Desarrollo de la pata posterior y cintura pelviana de Pela tes ^unctatus. Secuencia de condrificación. A, estadio 32; B, estadio 35; C y D, estadio 37. 1, fémur; 2, fíbula; 3, tibial; 4, fibular; 5, ilion; 6, metatarsiano IV; 7, tibial; 8, metatarsiano V; 9, i ►quion; 10, tarsal 3; 11, central dorsal; 12, central ventral; 13, prehallux 1, y 14, tarsal 2. - 228 - Lámina IX.- Desarrollo del tarso de Pelo tes punctatus. En azul, el • cartílago; en rojo, el hueso. A^ estadio 37; tibial y fibular con sus epífisis fusionadas. B. estadio 38; se inicia la osificación del tibial y el fibular, a la vez que el proceso de fusión. C^ estadio 41; la osificación de tipo pericondral se ha iniciado en las falanges; la fusión del tibial y el fibular supera el 50'b de ^ su longitud. D^ estadio 46; fusión del tibial y el fibular prácticamente concluida. C e D _f _v C 1mm E D G 2mm Figura 69.- Proceso de osificación y de fusión del tibialfibular en Pelod^v a^ nunctatus. A. estadio 38; B^ estadio 39; C, estadio 40; D^ estadio • 42; fi. estadio 43; F^ estadio 45; G. estadio 46; H. primera semana postmetamórfica; H^ adulto. -231- postmetamórfica. En Pelobates cultri^s y P. varaldii solo hay un centro de osificación por cada hueso del tarso. En Pelo tes ^unctatus los huesos osifican a partir de un único centro, con la excepción del tibialfibular que osifica a partir de dos centros, uno en el tibial y otro en el fibular. La secuencia de osificación del tarso de Pelobates cultripes es la siguiente: tibial y fibular C18 etapa>; prehallux 2 y prehallux 1 C28 etapa>; central, tarsal 2 y tarsal 3 Cetapa adulta). La tercera etapa presentaba notables diferencias entre machos Cllegan a osificar los tres elementos> y hembras . En los machos de P. varaldii, al igual que en P. cult,-i^, existe una relación positiva y significativa entre el número de elementos osificados en el tarso y el tamaño del ejemplar y entre dicho número y la edad 0.10> y entre dicho estado y la edad (n = 16; rs = 0.1?14; S= 5??.45; P> 0.10). En las hembras no hay relación ^ 0 1 ® Ilachos ( n= 18 ) ^ !1enbras ( n = 16 ) 10^ 4 6 7 llísero de eleaentos osificados en el tareo 8 Figura 70.- Pelobates varaldii. Distribución de frecuencias del número de elementos osificados en el tarso de machos y hembras. Las diferencias entre ambos sexos son muy altamente significativas. - 233 - significativa ni entre el número de huesos del tarso y el tamaño (n = 16; rs = 0.1508; S ^= 577. 46; P> 0.10, ni entre dicho número y la edad (n = 16; rs = 0.1118; S= 603.98; P> 0.10>. Los diagramas de dispersión correspondientes se muestran en las figuras 71 y 72. La secuencia de osificación de los elementos del tarso de Pelodytes ^anctatus transcurre como sigue: tibialfibular (estadio 38); central, tarsal 1, tarsal 2, prehallux 1 y prehallux 2(adultos>. E1 tarsal 3 y el prehallux 3 nunca osifican en esta especie. Podemos dividir la osificación del tarso en dos etapas. La primera de ellas afecta al tibialfibular. Dada la peculiar anatomía de este hueso, en la figura 69 dibujamos aspectos sucesivos en la progresión de la fusión y la osificación de los dos elementos que lo constituyen. Las epifisis proximales del tibial y el fibular se fusionan hacia la mitad del estadio 37 (figura 68 C y lámina IX A); y las distales al finalizar el mismo y la fusión de sus diáfisis en el 39 (figura 69 B y lámina IX B>. La fusión afecta al 83°,G de la longitud del fibular al finalizar la metamorfosis . _ En el estadio 38 se encuentra osificado el 25°ti de la longitud del fibular y el 83x en el 46 (figura 69 G y lámina IX D>. En el adulto, entre el 88 y el 90°ti de la longitud del fibular -incluídas las epífisis- está constituida por tejido óseo. En la figura 73, se muestra el paralelismo de los procesos de osificación y fusión del tibial fibular de Pelo ytes punctatus. Los datos en que se basa la figura se detallan en la tabla 42. En cuanto al crecimiento relativo en longitud de los elementos largos del tarso, tenemos que decir que el fibular pasa de tener una longitud máxima equivalente al 1S6 de la longitud cabeza + cuerpo en el renacuajo de estadio 33, al 5°ti en el estadio 3?, el 10% en el 39, el 17% en el 42; el 21°G en el 43 - 23ç - 0 8^ m • • ^ ^ v ^ g^ O W O • • N•• • • b V ^ ^ ^ w 4,^ 0 0 o eo^ ^ m on ^ ^ 2 r ZO 30 40 50 60 70 Longitud cabeza ^ cuerpo (ao) • ^achos (n = 18) O He^bras (n = 16) o Recién ^etasorfoseados (n = 2) Figura 71.- Pelobates varaldii. Diagrama de dispersión de la longitud cabeza + cuerpo (LCC> y el número de elementos osificados en el tarso. ^^^, -G _^ - 8 • ^ ^ ^ • ^ ^ 6 ^ ^ • • • ^ A ^ ® s ^9 0 ^̂ ,, w 4 ^ ® ® o 0 ,^ ^ g 0 2 4 6 8 Sdad (en.n! de años) • Machos (n = 18) O Heabras (n = 16) e Recién aetaoorfoseadoe (n = 2) Figura 92.- Pelobates varaldii. Diagrama de dispersión de la edad y el número de elementos osificados en el tarso. ^---^ lLeión 20 ^ 20^ Eatadioa de desarrollo (Goaner. 1960) `^+ oaificación ^ creciaiento en longitud Figura 73.- Pelo ,ytes punctatus. Trazo medio, crecimiento en longitud del fibular (expresado como porcentaje de la longitud cabeza + cuerpo>. Trazo grueso, progreso de la osificación del fibular, y, trazo fino, progreso de su fusión con el tibial (expresados como porcentajes de la longitud del fibular en cada estadio, incluidas las epífisis). - 237 - Tabla 42.- lelody^es punctatus. Crecimiento en longitud relativa del fibular, progreso de su fusión con el tibial y avance de su osificación a lo largo del desarrollo. Estadio de Longitud del % de la long. % de la long. Gosner fibular del fibular del fibular (% de LCC) fusionada osificada ------------------------------------------------------------ 33 1 .13 0 0 35 3 .O1 0 0 36 3 .54 0 0 37 3 .63 0 0 37 4 .39 24 .67 0 37 5 .60 29 .53 0 38 6 .32 25 .37 0 3B 6 .67 28 .13 25 .18 39 10 .44 62 .18 47 .13 40 13 .12 56 .67 40 .52 42 17 .35 73 .80 60 .93 43 20 .84 60 .73 74 .86 45 23 .92 71 .41 84 .33 46 24 .53 83 .24 82 .92 2a sem. 24 .19 90 .58 80 .51 adulto 28 .58 100 87 .74 adulto 25 .03 100 B9 .83 - 238 - y el 24°,6 en el 46; su longitud en el adulto oscila entre el 25 y el 28°ti de su talla . E1 aumento de longitud relativa del tarso de Pelo tes nunctatus a lo largo de su desarrollo larvario y su crecimiento postmetamórfico se representa también en la figura 73. A1 fin de la metamorfosis, el tibialfibular de P. punctatus muestra unas proporciones semejantes a las del adulto. La segunda y última etapa de la osificación del tarso de P. nunctatus afecta al central, tarsal 1, tarsal 2, prehallux 1 y prehallux 2. Esta etapa presenta dimorfismo sexual: en las hembras sólo osifica el central. En la figura 74 se representan los histogramas de frecuencia por clases, según el número de elementos del tarso osificados, de los machos y las hembras estudiados. E1 escaso número de hembras invalida cualquier comparación estadística de la distribución de los datos. En los machos, la relación entre el número de elementos del tarso osificados y el tamago es positiva y altamente significativa (n = 26; rs = 0.5173; S= 1411.90; P< 0.01). E1 diagrama de dispersión de las dos variables se representa en la figura 75. En cuanto a la duración del proceso de inicio de la osificación en el tarso, en P. cultri}^es la primera y segunda etapas transcurren entre los estadios 39 y 46 de la tabla de Gosner y dura 9,33 días. La tercera etapa se inicia al ago siguiente de alcanzar la madurez sexual; tiene una duración imprecisa, y afecta a más elementos en los machos. En P. varaldii, la tercera etapa de la osificación del tarso también implica más elementos en los machos. En Pelodytes punctat^s sólo hay dos etapas. La primera se inicia en el estadio 38 y la segunda por lo menos un ago después de que las gónadas maduren; al igual que en las dos especies anteriores, esta etapa presenta dimorfismo sexual. Consultar la tabla 41. E1 tibial y el fibular de ^1s_ laevis (BTewth, 1956> inician su osificación en el estadio 56 de su tabla normal (equivalente al 37 - 39 de la de Gosner) y los restantes elementos en la etapa adulta (Bernasconi, 1951>. En Eana ^piens , el tibial y el fibular empiezan a osificar en el estadio XI de su tabla normal 90 ^ ® 70 ^ s o -^ 30 ^ 101 1 Machos (n = 26) ^ Hesbras (n = 3) 4 Número de elementos osificados en el tarso 2 3 Figura 74.- Pelodytes ^unctatus. Dimorfismo sexual en el número de elementos osificados en el tarso. « z 6 5^ 4^ ^ • M • S -1 2 -I O 1-, ^" • e^N^t ^ 10 20 30 40 50 Longitud cpbcza + cuerpo (rn) • Machos (n = 26) O Henbras (n = 3) DRecién ^eta^orfoseados (n = 11) Figura 75.- P^d_jLt^^s!nctatus. Diagrama de dispersión del tamaño y el número de elementos del tarso osificados. -241- (equivalente al 36 de la de Gosner>; los autores no indican cuando osifican los tarsales. No hay datos sobre la duración del proceso de osificación del tarso de cualquier otro anuro. La trayectoria ontogenética del proceso de condrificación y de osificación del miembro posterior y cintura pelviana de P. cultripes, en tiempo real a 28°C, se representa en la figura 76. Los datos con que hemos realizado dicha figura pueden consultarse en la tabla 43. La trayectoria del proceso de osificación del miembro posterior y cintura pelviana de Pelobates cultri a^, modificada para poder compararla con la de Pelodv._,tes _punctatus se muestra en la figura 77. En abcisas, en vez de representar tiempo real, representamos la longitud media cabeza + cuerpo a cada estadio de Gosner. Los datos a partir de las cuales construimos esta representación figuran en la tabla 44. Las anomalías más comunes en el miembro posterior y cintura pelviana, se reducen a: variabilidad en el número de tarsales, detectada en Pelobates cultri^., P, varaldii y P. fuscus. - variabilidad en el número de elementos del prehallux, muy común en pelod,vtes ^unctatus. - variabilidad en el estado de osificación del tarso en los adultos de las familias Pelobatidae y Pelodytidae, condicionada fundamentalmente por el sexo del animal, y secundariamente por su tamafio. - asimetrías en el número de elementos afectados de osificación entre una pata y otra. Dado que siempre y exclusivamente afectaban al último elemento de la secuencia, he interpretado estas asimetrías como temporales y he considerado que la osificación del elemento en cuestión ya se había iniciado, aunque esto sólo fuera estrictamente cierto para uno de los elementos del par. -242- Oaificación. NacAos Hes^Cras afos o• Bs►dioa de deearrollo (Goaner. 1960) Figura 96.- Pelobate=^ cultripg^. Trayectorias ontogenéticas de los procesos de inicio de la condrificación y de inicio de la osificación del miembro posterior y de la cintura pelviana. - 243 - Tabla 43.- ^Para cada estadio de Gosner (1960), edad característica a temperatura óptima de crecimiento (28°C) y número de centros de condrificación y de osificación presentes en el miembro posterior y cintura pelviana de Pelobates cultriDes. Estadio Edad a Edad N° de centros N° de centros de que se alcanza característica de condrificación de osificación Gosner cada estadio a 28° C presentes presentes a 2B° C(en días) (en días) ----------------------------------------------------------------------------- 28 3 .50 4 .12 0 29 4 .75 5 .62 1 30 6 .50 7 .25 3 31 8 .00 B .81 3 32 9 .62 9 .99 5 33 10 .37 10 .81 6 34 11 .25 11 .75 7 35 12 .25 13 .00 13 36 13 .75 15 .25 18 37 16 .75 19 .00 33 38 21 .25 22 .56 6 39 23 .87 24 .31 13 40 24 .75 25 .25 21 41 25 .75 26 .75 25 42 27 .75 2B .37 25 43 29 .00 30 .00 25 44 31 .00 31 .6b 27 45 32 .33 32 .83 27 46 33 .33 33 .33 28 hembras 29 machos 31 - 244 - ^achoe de P. purtctalau rc1►oa de P. cultripee 30 -i 2s^ $ 26 M ^ ^ 24 ^, M W O QQ ^ s 20 +ii ^ 1e ^ 16 ^, 14 ^ 12 • ° 10 ^ ^ e ^ 6- 4 ^___ 14 /6 18 20 22 24 28 Longitud cabeze + cuerpo (^) T 28 he^br^s hsbrae 30 // 79 80 Figura 77,- Trayectorias ontogenéticas del proceso de inicio de la osificación en el miembro posterior y cintura pelviana de Pelobates cultripes y Pelodytes punctatus. - 245 - Tabla 44.- Para cada estadio de Gosner, longitud media cabeza + cuerpo CLCC) y número de centros de osificación presentes en. Pelobates cultrip^s y Pelo^tes nunctatus. Pelobates cultripes Pelodytes punctatus ------------------- ------------------- Estadio Gosner LCC N? centros de osificación LCC No centros de osificación --------- ------------------------ ----------------------- 36 14.47 0 37 29.12 0 15. Ob 4 3B 28.94 6 16. 14 10 39 30.36 13 17.06 11 40 28.B5 21 41 25.19 25 15.44 15 42 15.66 20 43 15.20 24 23.11 27 13.63 26 45 46 24.03 28 Hembras 79.57 29 30.59 27 Machos 79.87 31 30.20 31 4. COHCLIISIOHES GBHBRALBS - 24? - 4. COHCLIISIOHES GEHERALES Esta tesis se ha realizado sobre el desarrollo del esqueleto de los anuros en sus etapas media y final, y tanto el tema como las familias objeto de estudio eran muy poco conocidas. Por ello, en este capítulo no resulta factible enumerar todas las observaciones y descripciones nuevas que se han realizado y sólo resegaremos las conclusiones que tienen implicaciones y repercusiones más generales. 1. Los estadios de Gosner de la etapa larvaria de Pelobates cultri^ presentan duraciones muy desiguales, incluso cuando la temperatura del agua se mantiene constante. 2. Se propone un método patrón para calcular la duración en días de cada estadio. Este método permite comparaciones interespecíficas. Consiste en medir la duración -en días u horas- de cada estadio a la temperatura óptima de crecimiento, en cada especie. 3. Durante la metamorfosis, los renacuajos, además de la disminución de longitud total debida a la reabsorción de la cola, experimentan paralelamente una reducción de su longitud cabeza + cuerpo. Esta se explica, a nivel morfológico, por reabsorción de la pieza cloacal, acortamiento de la parte anteríor del cráneo y contracción de los espacios intervertebrales. La reducción es proporcionalmente mayor en los renacuajos de mayor tamaño. 4. Las poblaciones del género Pelobates no presentan diferencias entre machos y hembras en la edad a la que maduran las gónadas. 5. Las poblaciones del género Pelobates no presentan diferencias de longevidad atribuibles al sexo. 6. Las poblaciones del género Pelobates no presentan dimorfismo sexual en talla. 7. Las diferencias de tamaño y de longevidad interpoblacionales de - 248 - Pelobates cultripes se consideran, en principio, asociadas a factores ambientales. En concreto, la población capturada a nivel del mar se mostró significativamente más pequeña y menos longeva. 8. E1 crecimiento en longitud de Pelobates cultripes y P. varaldii se considera terminado dos años después de lograr la madurez sexual. La primavera inmediatamente siguiente al invierno en que maduran las gónadas, los sapos siguen creciendo en longitud cabeza + cuerpo y probablemente no se reproducen; la segunda primavera después de la madurez se reproducen con toda seguridad y crecen un poco más, luego el crecimiento en longitud de los animales se interrumpe. De hecho, nuestros resultados cuestionan la validez general de la teoría del crecimiento indefinido de las especies poiquilotermas. 9. Las diferencías de tamago entre los adultos de Pelobates cultripes y P,_ varaldii se explican por un desfase en el momento de alcanzar la madurez sexual. Esto acarrea una morfología pedomórfica de tipo progenético en E^ varaldii, con menor longitud cabeza + cuerpo en esta especie que alcanza un aPlo antes la madurez sexual. 10. Se concluye que las secuencias de osificación de los cuatro segmentos en que hemos dividido el esqueleto caracterizan, inequívocamente, el desarrollo de una especie. S1 a esto aúadimos que la variabilidad intraespecífica detectada es bajísima, podemos recomendar vivamente la utilización de secuencias de osificación como caracteres taxonómicos en la inferencia de filogenias. Estos cara ►teres afectan a un segmento del proceso de desarrollo; no son sólo rasgos distintivos de la etapa larvaria o adulta, como el resto de los caracteres utilizados hasta la fecha en la taxonomía de anuros. 11. Nuestros resultados demuestran que, como cabía esperar, las especies del mismo género manifiestan diferencias de muy pocos pasos en sus secuencias de osificación. Estas diferencias son mayores entre las especies de las dos familias estudiadas -que tradicionalmente se han considerado muy próximas filogenéticamente-, y son mucho más acusadas con las especies de las restantes familias revisadas. Por tanto, los - 249 - resultados de las comparaciones interespecíficas son congruentes a grandes, rasgos con la macrotaxonomía actual. Consecuentemente, se recomienda la acumulación de más datos sobre este tipo de caracteres del desarrollo procedentes de más especies y de más familias, pues se requieren para inferir relaciones de parentesco entre ellas. 12. La utilización de estos datos exigirá la elaboración de índices de similaridad entre secuencias y entre estadios. La obtención de los mismos se hallará sujeta a la siguiente restricción: E1 número de ejemplares necesario para establecer secuencias detalladas oscilará entre cinco y diez por estadio, ya que el número mínimo ha de ser igual, al menos, al número de centros que inician su osificación. Esta imposición garantiza suficientes "instantáneas" de un proceso que, además de ser continuo, está dividido en estadios muy desiguales tanto en duración como en número de acontecimientos de diferenciación del esqueleto. A la vez, minimiza la subjetividad en la determinación de los estadios, tanto de un mismo autor en distintos momentos como, sobre todo, las diferencias de apreciación entre distintos investigadores cuando se quieren comparar los resultados de sus trabajos. 13. De nuestras indagaciones preliminares se desprende que el momento de inicio de la mineralización de los huesos se ve afectado en gran medida por factores ambientales, tales como la temperatura o la crianza en cautividad. Estos resultados obligan a que los trabajos relacionando la osificación del esqueleto con otros procesos del desarrollo morfológico - estadios de Gosner, por ejemplo- deban ser realizados exclusivamente con ejemplares colectados en el campo en sitúaciones "no límite", que son los que presentan rangos de variación más reducidos. Por encima de todo, esta recomendación ha de aplicarse estrictamente en las comparaciones ínterespecíficas del momento de inicio de la osificación de cada hueso. Dada la variabilidad de estos caracteres, no son aconsejables para estudios taxonómicos; aunque estos datos son claves en la identificación de heterocronías. 14. Para cada centro de osificación, se propone que se considere estadio - 250 - de inicio de su mineralización, el primero de la serie en el cual al menos el 50°ti de los ejemplares examinados presenta mineralización. Se censura el criterio empleado hasta ahora por otros autores^que consideran estadio de inicio el primero en que algún ejemplar, aunque sea uno solo, presenta mineralización, pues favorece que las escasas excepciones se consignen como patrón típico de la especie. 15. En Pelobates cultrines se han detectado pequefias alteraciones respecto a la secuencia patrón, en las secuencias de osificación del cráneo y del carpo. Estos datos contribuyen a confirmar la hipótesis de Hanken & Hall ^ (1984> de que la secuencia de osificación es un conjunto de sucesos esencialmente independientes. 16. Se confirma la colaboración de una osificación medial de tipo dérmico en la constitución del frontoparietal de Pelobates cultrip^ y P, varaldii. Rocek <1980> la describió con todo detalle en P. fuscus y P, svri^ aéus; sin embargo, dudamos de la importancia filogenética que dicho autor atribuye a este centro de osificación adicional, apoyándonos en la gran diversidad que existe, publicada en la bibliografía, en cuanto a número de centros de osificación en los huesos de membrana del cráneo de los anuros. 17. Se coincide con otros autores en que la reducción del número de vértebras presacras en los anuros es un carácter derivado de todo el orden. Se hipotetiza la desaparición de las últimas vértebras por un simple proceso de heterocronía. Después de la condrificación de las nueve o diez primeras vértebras, en las estadios 25 y 26, se produciría una ralentización del proceso de diferencíación vertebral, llegando finalmente a la interrupción del proceso de condrificación dos o tres arcos neurales más tarde, al final de la metamorfosis. Este fenómeno iría asociado con una aceleración del ritmo de crecimiento longitudinal de los huesos largos de los miembros y de las cinturas. 18. La presencia en Pelobates cultri^ de centros de osificación independientes en las apófisis transversas de las últimas vértebras presacras, 58, 68, 7a y 88, hace posible la homologación de dichas apófisis con costillas. Ao ha podido confirmarse la existencia de -251- costillas en Pelod^tes punctatus. 19. E1 estudio comparado del desarrollo de la columna vertebral de Pelobátidos y Pelodítidos nos permite afirmar q ►e la procelia de sus vértebras adultas se alcanza por un proceso de desarrollo convergente. Sólo se presentan cóndilos libres en los pelobátidos juveniles. Por tanto, dicho carácter debe codificarse de distinta manera en las dos familias. 20. Auestros resultados, en cuanto a porcentajes de malformaciones en la columna vertebral de renacuajos y adultos, nos permiten afirmar rotundamente que las asimetrías del sacro no tienen ninguna repercusión significativa en la probabilidad de supervivencia de los individuos que las padecen. 21. La variabilidad existente en la columna vertebral de las especies estudiadas en cuanto a: número de vértebras presacras, fusión de vértebras, tipo de articulación sacrococcígea y presencia de procesos transversos en el urostilo, aboga en contra de su utilización indiscriminada como caracteres taxonómicos a nivel familiar sin una valoracíón previa, taxón por taxón, de su variabilidad intraespecífica. 22. Del estudio cuidadoso de la condrificación de la cintura pelviana de Pelobates cultripes y Pelodytes punctatus se desprende que en ningún momento de su ontogenia existe una pieza cartilaginosa independiente que pueda asociarse al pubis. Tampoco se ha encontrado una descripción clara de la posible ontogenia del pubis en la revisión bibliográfica efectuada. Como consecuencia, se defiende la ausencia de pubis al menos en las dos familias estudiadas. 23. Las osificaciones que se inician después de la madurez sexual -carpo y tarso- mostraron diferencias significativas entre ambos sexos en su estado de mineralización, en las tres especies de las que se estudió gran número de ejemplares. Estos resultados nos parecen suficientes para enunciar una hipótesis sobre la osificación más intensa del carpo y del tarso en los anuros machos, respecto a las hembras de su misma especie. Además, esperamos que el dimorfismo sea más acusado en las especies con - 252 - mayor talla adulta de entre las varias de un mismo género. Esta conclusión tiene repercusión en paleontología:' en especies fósiles de anuros, será posible identificar el sexo de una fracción de individuos en las poblaciones de las cuales existan, al menos, veinte carpos y tarsos bien conservados. ^ 24. En las especies examinadas, la variabilidad en el número de elementos del carpo ha sido prácticamente inexistente a nivel intraespecífico e intragenérico. Pero, de los estudios del proceso de condrificación y de la revisión bibliográfica efectuada, se deducen multitud de convergencias en la morfología adulta. No obstante, la gran divergencia de los carpos adultos de Hegogh_r^vs y Leptobrachium a4iade un dato que nos parece importante para la posible ubicación de estas especies en familias distintas. 25. Se rechaza el modelo de desarrollo del carpo de los tetrápodos de Holgrem <1933). Los datos no apoyan la recapitulación durante el desarrollo del carpo de un modelo ancestral, equivalente en número de elementos al del anfibio Fri^ons_, el cual poseía el carpo conservado completo más antigiio que se conoce. 26. Se sugiere que el tibial y el fibular de los anuros podría proceder de la duplicación de la tibia y la fíbula, en vez de pertenecer al tarso. Para ello, nos basamos en el tipo de osificación que sufren -idéntica a la de los restantes huesos largos- y en su comportamiento en las secuencias de condrificación y de osificación del miembro posterior. Mientras no se descubran fósiles que prueben un alargamiento progresivo de estos dos huesos, me parece que también debe tenerse en cuenta la posibilidad de su aparición filogenéticamente brusca por un mecanismo de duplicación. 27. Se rectifican los siguientes caracteres diagnósticos de la familia Pelobatidae (Lynch, 1973; Cannatella, 1985>: - Presencia de columella: este hueso falta en Pelobates cultri^^,s, p^ ^çy^,,, y P. s,yriacus, aunque se encuentra osificado y bien desarrrollado ea P. varaldii y todas las especies de los géneros - 253 - SCaDhio^ y ^^g, - Fusión del sacro y el urostilo: sólo es cierta en Pelobates fuscus, pj svriacus y las especies de los géneros Scan^^ y,^g^a, fil 83'^ de los adultos de Pelobates cultripg^ y la casi totalidad de los P. varaldii conservan individualizadas ambas piezas, y articuladas por un sólo cóndilo de tamaño insignificante. 28. Se rechazan, por erróneos, los siguientes caracteres diagnósticos de la familia Pelodytidae (Lynch, 1973; Cannatella, 1985>: fusión del atlas y la segunda vértebra, anomocelia de la columna vertebral, y articulación sacrococcígea monocondilar. Esta última articulación es de tipo bicondilar, con tendencia a la fusión parcial de los dos cóndilos en los Pelocí4 tes nunctatus de mayor tamaño. 29. Se aPiade un nuevo carácter a las diagnosis de las familias Pelobatidae y Pelodytidae: la presencia en todas las especies de un hueso del carpo descrito e identificado como tal por primera vez en este trabajo, el subulnar. 30. Los estudios comparados de desarrollo se han revelado como el mejor método para filtrar los caracteres óseos utilizados en la macrosistemática del orden Anura, pues permiten identificar -y eliminar de los análisis- muchos caracteres convergentes y ponderar otros. La ponderación es necesaria en caracteres afectados de gran variabilidad intraespecífica, elevado porcentaje de malformaciones, o resultado múltiple de un sólo y simple proceso heterocrónico. Por otra parte, estos estudios sirven para caracterizar inequívocamente todos los estadios de desarrollo de una especie. Además, con ellos se podrán inferir filogenias entre varias especies estadio por estadio y, posteriormente, examinar la congruencia de los resultados. - 254 - 5. BIBLIOGRAFIA - 255 - ADOLPHI, H. (1895). Uber Variationen der Spinalnerven und der Wirbelsdule anurer Amphibien. II . l[orph. Jb.^ 22: 448-490. ALBERCH, P. <1985). Problems with the interpretations of developmental sequences. Syst. Zool., 34 <1): 46-58. ---------- & ALBERCH, J. <1981). Heterochronic mechanism of morphological diversification and evolutionary change in the neotropical salamander, Bolitoglossa occidentalis . Size and shape in ontogeny and phylogeny. Paleobiology, 5(3): 296-317. ALTIG, R. C1969a>. Notes on the ontogeny of the osseous cranium of ^ç.^^ ^LU^i. Herpetologica, 25 (1): 59-62. --------- (1969b). Developmental cranial osteology of three species of Rana (Anura). Ph. D. dissertation, Oregon State University, Corvallis, 81 pp. En Gaudin (1978). ALVAREZ, J. & SALVADOR, A. <1984). Cría de anuros en la laguna de Chozas de Arriba (León> en 1980. xediterránea Ser. Biol.. 7: 27-48. ANDERSEN, M. L. <197?>. Myological studies on the relationship between the anuran prepollex and prehallux. Herp. Rev., 8(3) supplement: 1. ANDREONE, F. & PAVIGNANO, I. <1988). Observations on the breeding migration of Pelobates fuscus insubricus Cornalia, 1873 at a ditch in North Western Italy : 241-250. ARNOLD, E. N. ^ BURTON, J. A. (1978>. Guía de campo de los reptiles y anfibios de Espa4(a y Europa. Ediciones Omega, S. A., Barcelona. 275 pp. - 256 - BAKER, J. R. (1933). Cytological Technique. The principles and practice of ^nethods used to determine the structure of the netazoan cell. Methuen & CO., London. 211 pp. BARBADILLO, L. J. (1987). La Guía de Incafo de los anfibios y reptiles de la Península Ibérica, Islas Baleares y Canarías. Incafo, Madrid. 693 PP^ BA^SO^LU, M. & ZALOuLU, S. (1964>. Morphological and osteological studies in Pelobates syriacus from Izmir Region, Western Anatolia (Amphibia, Pelobatidae). Senckenberg. biol., 45 (3/5): 233-242. BERNASCONI, A. F. <1951). vber den Ossifikationsmodus bei Xeno^us laevis Daud. Densk. schNeiz. naturf. Ges.. 79: 1-252 + 2 láms. BORN, G. C1880). Nachtrdge zu "Carpus und Tarsus". ]Iorph. Jb., 6: 49-78. BOSCA Y CASANOVES, E. <1919>. Una adición al género Pelobates Wagler. Boln. x. Soc. esp. Hist. nat., 19: 89-93 + Lám. I. BOULENGER, G. A. (1920). Sur le Pelobates Wilsoni, Boscá. Boln. B. Soc. esp. Hist. nat., 20: 293-294. BRANHAM, A. E. & LIST, J. C. (1979). Development of the urostyle during metamorphosis in five species of anurans. J. Xorph., 159: 311-330. BROWN, G. W. Jr. (1964 ). The metabolism of Amphibia. En J. A. Moore (ed.> : . Physiology of the Amphibia. Academic Press, New York. pp.: 1-98. BUFFRENIL, V. de (1982). Morphogenesis of bone ornamentation in extant and extint crocodilians. Zoonorphology, 99: 155-166. BURKE, A. C. & ALBERCH, P. <1985). The development and homology of the chelonian carpus and tarsus. J. I[orph., 186: 119-131. - 257 - BUSACK, S. D. (198b>. Biogeographic analysis of the herpetofauna separates by the formation of the strait of Gibraltar. aational Geographic Research, 2 <1): 17-36. ---------- --; MAXON, L. R. & WILSON, M. A. <1985>. Pelobates varaldii (Anura: Pelobatidae): a morphologically conservative sp=cies. Copeia, 1985 (i): 107-112. ---------- -- & ZUG, G. R. (1976). Observations on the tadpoles of Pelobates cult^e^ from Southern Spain. Herpetologica, 32: 130-137. CANNATELLA, D. C. (1985). A philogeny of primitfve frogs CArchaeobatrachians). Ph. D. Thesis. Univ. Kansas, Lawrence. 404 pp. ---------- ------ & TRUEB, L. (1988). Evolution of Pipoid frogs: Morphology and phylogenetic relationships of Pseudhymenochirus. J. Herpet., 22 (4 ) : 439-456. CASTANET, J. C1975). Quelques observations sur la présence et la structure des marques squelettiques de croissance chez les amphibiens. Bull. Sac. zool. Fr., 100: 603-620. ---------- -- (1981>. Nouvelles données sur les lignes cimentantes de 1'os. Arch. Biol. ^ruselles), 92: 1-24. ---------- -- (1982). Recherches sur la croissance du tíssu osseux des reptiles. Application: La méthode squelettochronologique. Thése Dr. és Sciences. Univ. Paris VII. 244 pp. ---------- -- (1987). La sq_uelettochronologie chez les Reptiles III- Application. Annls Sci. nat., Zoologie, 138 Série. 8: 157-172. CONANT, R. <1958). A field guide to reptiles and amphibians of fiastern and Central Horth America (28 edición 1975). Houghton Mifflin Co, Boston. 429 pp. - 258 - GHQMIAKGFF, M. von (1894). Die Entwickelung des Tarsus bei Pelobate_ fu^„=.. Bull. Soc. Hat. Xoscou, 8: 351-357 + lám. VIII. DIAZ-PANIAGUA, C. (1983). Influen^_ia de las carac_+.erísticas del medio a^_uátí^=o sobre Ias poblatiiones de larvas de anfibios en la Reserva Biológica de Doñana (Huelva, España). Doffana, Acta Vertebrata, l^? (1) : 41-53. ---------- ------ (1985). Larval diets related to morpholagical chara►ters of five anuran species in the Biological Reserve of Doílana . En Ro^ek, Z. (ed.>: Studies in Herpetology, Prague, pp: 429-432. ---------- ------ 3^ ARRIZABALAGA, B. (1987>. Development and growth rates of coexisting Pelobate.s cultri^s and Pelod,t,y es gunctatus. En Gelder, J. J. van; Strijbosch, H. & Bergers, P. J. M. . Nueva localidad para Pelo ytes nunctatus CDaudin> 1802. Doñana, Acta Vertebrata, 10 (1): 203. DUELLMAN, W. E. & TRUEB, L. (1986). Biology of Amphibians. McGraw-Hill Book Company, New York. 670 pp. D^UKI►, G. & PASULJEVI► , G. (1983). On chorological demarcation of the species Pelobates fuscus (Laurenti) 1768 and Pelobates ^yriacus, Boettger 1889 . Development of the frontoparietal bones in frogs. Copeia, 1939 (2 ) : 95-97 . ---------- ---- <1942>. Are the "fronto-parietal" bones in frog actually frontals. J. Vash. Acad. Sci., 32: 151-153. EISELT, J. von (1988>. Krótenfrósche (Pelobates gen., Amphibia salientia) in Ti;rkischThrakien und Griechenland. Annln. naturh. l[us. Vien, 90 (B): 51-59. EMELIANOFF, S. V. <1925). 2ur Frage vber die Entwickelung der Wirbflsául? bei den Amphibier_. Russk. zool. Zh., 5. (1-2): 53-72. En ruso, con resumen en alemán. - 260 - EMERY, C. (1894>. Sulla morfologia dei membri degli anfibi e sulla filogenia del chiropterigio. 8icerche Lab. Anat, xoma, 4: 5-35 + 2 láms. ---------- (1897). Die fossilen Reste von Archegosaurus und Eryops und ihre Bedeutung fiir die Morphologie des GliedmaBenskelets. Anat. Anz., 14: 201-208. ESTEBAN, M. & SANCHIZ, B. (1986). Paleoclimatic inferences based on fossil ranids. En Ro^ek, Z. (ed.): Studies in Herpetology, Prague, pp: 379- 382. ESTES, R. (1970). New fossil Pelobatid Frogs and a review of the genus Eopelobates. Bull. ^[us. t^mp. Zool. Harv., 139 <6 ): 293-339. -------- & REIG, 0. A. (1973>. The early fossil record of frogs a review of the evidence. En Vial, J. L. : Hvolutíonary biology of the anurans: Contesporary re.search on major problems, Univ. Missouri Press, Columbia, pp: 11-63. ETKIN, W. (1964>. Metamorfosis. En J. A. Moore (ed.): Physiology of the Anphibia. Academic Press, New York. pp: 427-468. FINK, W. L. (1982). The conceptual relationship between ontogeny and phylogeny. Paleobiology, 8 <3): 254-264. FOX, H. (1984). Amphibian morphogenesis. Humana Press, Clifton (New Jersey), 301 pp. FROST, D. R. (ed.) (1985). Amphibian species of the Norld: A tagononic and geographic reference. Allen Press, Inc. & The Association of Systematics Collections, Lawrence . 732 pp. GABE, M. (1969). Techniques histologiques. Masson et Ce, París. 1113 pp. GADOW, H. (1896>. On the evolution of the vertebral column of Amphibia and Amniota. Phil. Trans. $. Soc., Series B, 187: 1-57. -261- --------- & ABBOTT, E. C. (1895>. On the evolution of the vertebral column of fishes. Phil. Trans. R. Soc., Series B, 186: 193-221. GANS, C. & PARSONS, T. S. (1966>. On the origin of the j umping me►hanism in frogs. fivolution, 20: 92-99. GARCIA-PARIS, ^I. (1985). Los anfibias de fispaña. Publicaciones de Extensión Agraria, Madrid. 287pp. GARCIA-VALDECASAS, A. & SANCHfZ, B. <1989>. La inferencia filogenética. En Aguirre, A. (Coordinador): Paleontología. Huevas tendencias. CSIC, ^ Madrid. pp: 47-59. GARDINER, B. G. <1983). Gnathostome vertebrae and the classification of the Amphibia. Zool. J. Linn. Soc., 75: 1-59. GAUDIN, A. J. (1973). The development of the skull in the Pacific tree frog, Hyla regilla. Herpetologica, 29: 205-218. ---------- -- <1978>. The sequence of cranial ossification in the California toad, ^Q boreas (Amphibia, Anura, Bufonidae). J. Herpet., 12: 309- 318. GEGENBAUR, C. (1864>. IIntersuchungen zur Vergleichenden Anatosie der Virbelthiere. I. Carpus und Tarsus. Verl. W. Engelmann, Leipzig. 127 pp + 6 láms . GISLEN, T. <1936). On the history of the evolution and distribution of the european Pelobatids. Zoogeographica. 3: 119-131. GOSNER, K. L. <1960). A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification. Herpetologica. 16: 183-190. GREEN, T. L. (1931>. On the pelvis of the anura: a study in adaptation and recapitulation. Proc. zool. Soc. Lond., 1931 (4>: 1259-1290. - 262 - GREGORY, W. K.; MINER, R. W. 8^ NOBLE, G. K. (1923>. The carpus of Er^von_s and the structure of the primitive chiropterygium. Bull. Aa. Xus. nat. Hist., 48: 279-288. GRIFFITHS, I. (1954). On the nature of the fronto-parietal in Amphibia, Salientia. Proc. zool. Soc. Lond., 123: 781-792. ---------- -- (1956). Status of Protobatrachus massinoti. Hatus^e, Lond., 177: 342-343. ---------- -- (1959>. The phylogenetic status of the Sooglossinae. Ann. nat. Hist., 2: 626-640. ---------- -- (1963). The phylogeny of the Salientia. Biol. Rev., 38: 241-292 + 1 lám . GUARDABASSI, A. <1952). I sali di calcio del sacco endolinfatico ed i processi di calcificazione delle ossa durante la metamorfosi normale e sperimentale nelle larve di Bufo vul^is, Rana dalmatina e$^a esculenta. Boll. Soc. ital. Biol. sper., 28: 355-357. ---------- ---- <1960>. The utilization of the calcareous deposits of the endolymphatic sacs of Bufo bufo bufo in the mineralization of the skeleton. Investigations by means of Ca°S. Z. Zellforsch., 51: 278- 282. HAINES, R. W. (1938). The primitive form of epíphisis in the long bones of tetrapods. J. Anat., 72: 323-343. ---------- -- (1969). Epiphyses and sesamoids. En Gans, C.; Bellairs, S. d'A. & Parsons, T. S. (eds.): Biology of the Reptilia. Vol. 1. I^Iorphology A. Academic Press, London. pp: 81-116. HALL, B. K. (1984). Development processes underlying heterochrony as an evolutionary mechanism. Can. J. Zool., 62: 1-7. - 263 - HALLIDAY, T. R. & VERRELL, P. A. (1988>. Body size and age in amphibians and reptiles. J. Herpet., 22 (3): 253-265. HANKEN, J. (1982). Appendicular skeletal morphology in minute salamanders, genus Th^LiU^ : Growth regulation, adult size determination, and natural variation. J. Xorph., 174: 57-77. ---------- (1983>. High incidence of limb skeletal variants in a peripheral population of the red-backed salamander, Plethodon cinereus . Effects of temperature on growth, development and color polymorphism in the ornate chorus frog Pseudacris ornata. Copeia, 1988 (4>: 1001-1007. HEMELAAR, A. S. M. <1981>. Age determination of male Bufo bufo from the Aetherlands, based on year rings in phalanges. Anphibia-xeptilia, 1 <3/4): 223-233. ---------- -------- (1988>. Age, growth and other population characteristics of Bufo bufo from different latitudes and altidudes. J. Herpet., 22 (4 ) : 369-388. HERRERA, C. M. (1973). Régimen alimenticio de T^Yto alba en España sudoccidental. Ardeola, 19 (2): 359-394. HERRERO, P. & TALAVERA, R. R. (1988). Citotaxonomic studies on Iberian and - 264 - Maroccan Pelobates (Anura: Pelobatidae). Acta zool. cracov., 31 .(17 ) : 505-508 + lám. XVIII. HINCHLIFFE J. R. (1977). The chondrogenic pattern in chick limb morphogenesis: a problem of development and evolution. En Ede, B. A.; Hinchliffe, J. R. & Balls, M.: Yertebrate limb and somite aorphogenesis. Gambridge Univ. Press. En Hinchliffe 8^ Johnson (1980). ---------- ----- & JOHNSON, D. R. (1980). The development of the vertebrate limb. An approach through egperiment. genetics and evolution. Clarendon Press, Oxford, 268 pp + 13 láms. HOLMGREN, N. (1933). On the origin of the tetrapod limb. Acta zool.. Stockh.^ 14: 185-295 ---------- -- (1949>. On the tetrapod limb problem-again. Acta zool.^ Stockh.. 30: 485-508. HOTA, A. K. & DASH, M. C. (1986). Growth and metamorphosis of anuran larvae: effect of diet and temperature. Alytes^ 5<4>: 165-172. HOUDRY, J. & BEAUMONT, A. <1985>. I.es aétaaarphoses des aaphibiens. I4asson ed., París. 273 pp. HOWELL, A. B. <1935>. Morphogenesis of the shoulder architecture. Part III. Amphibia. Q. Rev. Biol.^ 10: 39?-431. HOWES, G. B. (1886). On some abnormalities of the Frog's vertebral column. & tem^oraria. Anat. Anz., 1: 277-281. ---------- & RIDEWOOD, W. (1888>. On the carpus and tarsus of the anura. Proc. zool. Soc. Lond.. (1888 ): 141-182 + 2 láms. INGER, R. F. C196?>. The development of a phylogeny of frogs. Svolution^ 21: 369-384. - 265 - JARO►OVA, J. <1973>. The components of the carpus in Paleobatrachus and their development in two related recent species. Cas. narod. l[us., 142 (1-4): 89-106 + 8 láms. ---------- -- (1974>. The components of the tarsus in Paleobatrachus and their development in related recent species. Acta IIniv. Carol.- Geologica, 1: 119-144 + 16 láms.. KADEL, H. & HEMMER, H. (1984). Temperature dependence of larval development in the Mallorcan midwife toad, Baleaphryne muletensis. En Hemmer, H. & Alcover, J. A. . Sequence of ossification in the skeleton of growing and metamorphosing tadpoles of Rana gip,ens. J. l[orph., 129: 415-444. KLUGE, A. G. <1966>. A new pelobatine frog from the lower Miocene of South Dakota with a discussion of the evolution of the S•aphiogus-Spea complex. Contr. Sci.. 113: 1-26. ---------- FARRIS, J. S. (1969). Quantitative phyletics and the evolution of anurans. Syst. Zool.. 18 <1>: 1-32. LEBEDKINA, N. S. (1986). The homologies of temporal bones in Amphibia and Reptilia. En Z. Ro•ek (ed.): Studies in Herpetology, Prague, pp: 303-306. LEE, J. C. (1982). Accuracy and precísion in anuran morphometrics: artifacts of preservation. Syst. Zool., 31 (3 ); 266-281. LIBBIN, R. M.; SINGH, I. J.; HIRSCHMAN, A. & MITCHELL, 0. G. <1988). A prolonged cartilaginous phase in newt forelimb skeletal regeneration. J. egp. Zool., 248: 238-242. -266- LIMBAUGH, B. A. & VOLPE, E. P. (1957). Early development of the gulf coast toad, Bufo vallice^s, Weigmann. Am. Xus. Hovit., 1842: 1-32. LOCQUIN, M. & LANGERON, M. (1985). I[anual de l[icroscopía. Labor, S. A., Barcelona. 373 pp. LYNCH, J. D. <1973>. The transition from Archaic to Advanced frogs. En Vial, J. L. (ed.): fivolutionarq Biology of the Anurans: Contenporary research on major problems, Univ. Missouri Press, Columbia, pp: 133-182. McNAMARA, K. J. (1988). Patterns of heterochrony in the fossil record. Tree, 3 (7>: 176-180. ^IADEJ, Z. C1965>. Variations in the sacral region of the spine in Bombina b^mb^Il^ and Bombina variegata (Linnaeus, 1758> (Salientia, Discoglossidae). Acta biol. cracov. Série Zoologie, 8: 185-197. MARTENS, H. (1984). Temperature selection in tadpoles of Balea^ryne m^^latan^i^. En Hemmer, H. & Alcover, J. A. : História Biológica del Ferreret. Ed. Moll, Ciutat de Mallorca, pp: 163-168. ---------- (1986). Sur la répartition altitudinale de Pelobates cultri,^ (Amphibia, Pelobatidae) en France. Bull. Soc. Herp. Fr., 39: 20-21. MATHUR, J. K. & GOEL, S. C. (1976). Patterns of chondrogenesis and calcification in the developing limb of the lizard, Calotes versicolor. J. 1[orph., 149: 401-419. MELENDEZ, B. (1979). Anfibios. En Paleontologia, II : 157?-1578. AEVO, E. (1968>. Pipid frogs from the early Cretaceous of Israel and Pipid evolution. Bull. Xus. conp. Zool. Harv., 136 <8): 255-318. NEWTH, D. R. (1949). A contribution to the study of the fore-limb eruption in metamorphosing anura. Proc. zool. Soc. Lond., 119: 643-659. ---------- (1956>. The development of skeleton and muscles of the pelvic girdle and hindlimbs. En DTieuwkoop, P. D. & Faber, J. , bTorth-Holand Publishing Company, Amsterdam, pp: 117-120. - 268 - NIEUWKOOP, P. D. & FABER, J. (eds.) (1956). 8ormal table of %enonus laevis flaudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of aetaaorphosis. (2a edición 1967), North-Holand Publishin8 Company, Amsterdam. 252 pp + 10 láms. NOBLE, G. K. (1931>. Biology of the Amphibia. (28 edición 1954>. Dover Publications, Inc., New York. 577 pp. NUSSBAUM, R. A. <1982). Heterotopic bones in the hindlimbs of frogs of the families Pipidae, Ranidae and Sooglossidae. Herpetologica, 38 (2>: 312-320. ORTON, G. L. (1953). The systematics of vertebrate larvae. Syst. Zool., 2(2>: 63-75. ---------- (1955>. The role of ontogeny in systematics and evolution. Bvolution, 9: 75-83. ---------- <1957). The bearing of larval evolution on some problems in frog classification. Syst. Zool., 6 (2>: ?9-86. OSTER, G. F.; SHUBIN, N.; MURRAY, J. D. & ALBERCH, P. <1988>. Evolution and morphogenetic rules: the shape of the vertebrate limb in ontogeny and phylogeny. Bvolution, 42 (5>: 862-884. PARKER, W. K. <1881>. On the structure. and development of the skull in Batrachia, part. III. Phil. Trans. R. Soc., 172 <1>: 1-266. En Ramaswami (1935). PARSONS, T. S. & WILLIAMS, E. E. <1962). The teeth of Amphibia and their relation to Amphibian phylogeny. J. xorph., 110: 375-389. ---------- --------------------- (1963). The relationships of the modern Amphibia: a re-examination. Q. Rev. Biol., 38: 26-53. - 269 - PASTEUR, G. (1958). Sur les tendances évolutives et la phylogénie des Pélobates (Batraciens Anoures) actuels. C. r. hebd. Séanc. Acad. Sci., Paris, 247: 1037-1039. --------- & BONS, J. <1959). Les batraciens du Maroc. Trav. Inst, scient.. chérif. ser. Zool., 17: XVI + 241 pp. PAWLOWSKA-INDYK, A. (1985>. The effect of temperature during the embrionic development on the structure of the vertebral column of X^Ilagu^. laevis , North-Holand Publishing Company, Amsterdam, pp: 112-116. PORTER, K. R. (1972). Herpetology. W. B. Saunders Company, Philadelphia. 524 PP ^ QUEIROZ, K. de C1985>. The ontogenetic method for determining character polarity and its relevance to phylogenetic systematics. Syst. Zool.^ 34 <3>: 280-289. RAGE, J.-C. & RO►EK, Z. <1989). Redescription of Triadobatrachus massinoti CPiveteau, 1936) an anuran amphibian from the early Triassic. Palaeontographica Abt. A, 206: 1-16. RAMASWAIII, L. S. (1935). The cranial morphology of some examples of Pelobatidae CAnura). Anat. Anz., 81: 65-96. REILLY, S. M. (1986). Ontogeny of cranial ossification in the Eastern newt Notophthalmus viridescens (Caudata: Salamandridae), and its relationship to metamorphosis and neoteny. J. llorph., 188: 315-326. REINBACH, W. (1939). vber das Os supratemporale von Pelobates fuscus. l[orph. Jb., 84: 169-186. En Rocek (1980). - 270 - RICQLES, A. de (1964>. La formation des os longs des membres de Pleurodeles ' rraltlii (Michahelles), premi^re partie. Bull. Soc. zool. Fr.^ 89: 797-808. ---------- -- (1965). La formatíon des os longs des membres de P1e^^rodeles ^1ii , Deuxiéme partie. Bull. Soc. zool. Fr., 90: 267-286. RIDEWOOD, W. G. (1897). On the structure and development of the hyobranquial skeleton of the Parsley-Frog (Pelodytes punctatus). Proc. zool. Soc. Lond.^ 39: 577-594 + lám. XXXV. RITLAND, R. M. <1955>. Studies on the post-cranial morphology of A^.ç^^ truei. J. ][orph.^ 97: 119-177. RO►EK, Z. C1984). Cranial anatomy of frogs of the family Pelobatidae Stánius, 1856, with outlines of their phylogeny and systematics. Acta IIniv. Carol.-Biologica, 1980-1981: 1-164. --------- (1982). Macropelobates osborni Noble, 1924 - redescription and reassignment. Acta Univ. Carol.-Geologica. 4: 421-438. --------- (1988). Origin and evolution of the frontoparietal complex in anurans. Amphibia-Eeptilia, 9: 385-403. ROSAS-GONZALEZ, A. (1989). Paleontología, ontogenia y heterocronía. En Aguirre, E. (Coordinador>: Paleontología. Yuevas tendencias. CSIC, Madrid. pp: 83-107. RvHMEKORF, E. <1958). Beitrdge zur ákologie mitteleurop^ischer Salientia. II. Temperatuwahl der Larven. Z. Xorph. Okol. Tiere^ 47; 20-36. RYSER, J. (1988). Determination of growth and maturation in the common frog, Rana temporaria, by skeletochronology. J. Zool.^ Lond. 216, 673-685. -2?1- SAGE, R. D.; PRAGER, E. M. & WAKE, D. B. (1982>. A Gretaceous divergence time between pelobatid frogs . Microvertébrés nouveaux des Trapps du Deccan : 175-194. SALVADOR, A. (1974>. Guía de las anfibios y reptiles espafioles. ICONA, Madrid, 282 pp. ---------- -- <1985). Guía de campo de los anfibios y reptiles de la Península Ibérica, Islas Baleares y Canarias. S. García . Nuevos restos fósiles de la familia Pelodytidae . fistudios geol., 34 : 9-27. ---------- (1984>. Análisis filogenético' de la tribu Alytini (Anura, Discoglossidae) mediante el estudio de su morfoestructura ósea. En Hemmer, H. ^ Alcover, J. A. : Studies in Herpetology, Prague, pp: 111-116. - 272 - ---------- (1986a). Tendencias actuales en sistemática evolutiva. Facultad de 'Geología, Univ. Zaragoza, Zaragoza. 4 pp. ---------- (1986b>. La evolución de los Discoglosidos: implicaciones metodológicas. Resúmenes del I Congreso Hacional de Herpetología & II Reunió General de la SCIH, Societat Catalana d'Ictiologia i Herpetología, BeniAssim. p. 94. ---------- & SANZ, J. L. (1980). Los anfibios del Pleistoceno medio de Aridos- 1(Arganda, Madrid). Ocupaciones achelenses en el valle del Jarama, Diputación de Madrid, Madrid, pp: 105-126. SCHAEFFER, B. (1941). The morphological and functional evolution of the tarsus in amphibians and reptiles. Bull. An. ^[us. nat. Hist., 78: 395-472. SCHMALHAUSEA, J. J. von <1907). Die Entwickelung des Skelettes der vorderen Extremitdt der anuren Amphibien. Ant. Anz., 31: 177-187. ---------- ------------ <1908). die Entwickelung des Skelettes der hinteren Extremitdt der anuren Amphibien. Anat. Anz, 33: 337-344. SEDRA, S. N. <1949>. On the homology of certain elements in the skull of Bufo r^,gularis Reuss : Yormal table of %enODUS laevis (D^audin) (28 edición 1967). DTorth-Holand Publishing Company, Amsterdam, pp: 93-101. ---------- ---------------- (1957). The development of the skull, visceral arches, larynx and visceral muscles of the south african clawed toad Xenopus laevis (Daudin) during the process of inetamorphosis (from stage 55 to stage 66>. Verhd. g. ned. Akad. Vet., 51: 1-80. - 273 - SEDRA, S. N. & MOURSI, A. A. (1958). The ontogenesis of the vertebral column of Bufo re,gularis Reuss. Cesk. Xorfol., 6: 7-32. SEVERTZOFF, A. N. (1891>. Ueber eininge Eigenthiimlichkeiten in der Entwickelungund im Bau des Sch^dels von Pelobates fuscus. Bull. Soc. Hat. xoscou, 5: 143-160. En Ro►ek C1980). SHUBIN, N. H. 8a ALBERCH, P. (1986>. A morphogenetic approach to the origin and basic organization of the tetrapod limb. fivolut. Biol., 20: 319-387. SIMOAS, E. V. & HORN, J. R. van C1971). A new procedure for whole-mount alcian blue staining of the cartilaginous skeleton of chicken embryos, adapted to the clearing procedure in potassium hydroxide. Acta 1[orphol. Heerl.-Scand., 8: 281-292. S^SIRINA, E. ^[. <1972). Annual layers in bones of Rana temporaria. Zool. Zh., 51 (10): 1529-1534. En ruso, con resumen en inglés. ---------- ---• KLEVEZAL, G. A. & BERGER, L. (1986). Experimental^ investigation of the annual layer formation in bones of amphibians. Zool. Zh., 65 <10): 1526-1534. En ruso, con resumen en inglés. S1IIT, A. L. (1953>. The ontogenesis of the vertebral column of enopus laevis CDaudin> with special reference to the segmentation of the metotic region of the skull. Annale IIniv. Stellenbasch, Sect. A, 29 (3 ): 79- 136. ---------- (1956). The further development of skeleton and musculature of the trunk. En Nieuwkoop, P. D. & Faber, J. (eds.): Yoraal table of %eno^us laevis (Daudin) (28 edición 1967), North-Holand Publishing Company, Amsterdam, pp: 102-109. - 274 - SOFIANIDU, T. S. (1977), fistudio de la biología y ecología de Pelobates syriuacus Boettger (A.mphibia: Pelobatidae). Tesis Doctoral. Univ. Salónica, 181 pp. En griego. SOKAL, R. R. & ROHLF, F. J. (1979). Biometría. Principios y métodos estadísticos en la investigación biológica. Blume Ed., Madrid. 832pp. SOKOL, 0. M. (1975>. The phylogeny of anuran larvae: a new look. Copeia, 1975 (1>: 1-23. ---------- (1977). A subordinal classification of frogs (Amphibia: Anura>. J. Zaol., Lond.. 182: 505-508. ---------- (1981a). The larval chondrocranium of Pelodytes punctatus, with a review of tadpole chondrocrania. J. ^[orph.. 169: 161-183. ---------- C1981b). The filter apparatus of larval Pe1_oci.^ytes punctatuç (Amphibia: Anura). Amphibia-xeptilia. 2: 195-208. ►PINAR, Z. V. (1972). Tertiary Frogs from Central Europe. Academia, Prague. 286 pp. ---------- --; BOUBELfK, M. & ROMANOVSK¢, A. (1971>. A contribution to thé phylogeny of the family Pelobatidae . Acta IIniv. Carol.- Geologica. 3: 279-285. ---------- -- & TATARINOV, L. P. (1986). A new genus and species of Discoglossid frog from the Upper Cretaceous of the Gobi desert. J. Vert. Paleont., 6 <2 ) : 113-122 . STEBBINS, R. C. <1966>. A field guide to Vestern Eeptiles and Amphibians. Houghton Mifflin Company, Boston. 279 pp. STEINER, H. <1921>. Hand und FuB der Amphibien, ein Beitrag zur Extremitdtenfrage. Anat. Anz., 53: 513-544. - 275 - STEPHENSON, E. M. (1960>. The skeletal characters of Leiopelma hamiltoni 'McCulloch, with particular reference of the effects of heterochrony on the genus. Trans. R. Soc. 8. Z., 88: 473-488. ----------, N. G. (1955). On the development of the frog Leiopelma hochstetteri. Proc. zool. Soc. Lond., 124: 785-795. STOKELY, P. S. & LIST, J. C. <1954). The progress of ossification in the skull of the cricketfrog Pseudacris nigrita triseriata. Copeia, 1954 (3> : 211-217. TALAVERA, R. R. (1985). Notas sobre la ontogenia de las especializaciones locomotoras del tarso de Pelodytes punctatus and Pelodytes ,punctatus (Anura, Pelodytidae>. Abstracts of the First Vorld Congress of Herpetology, Univ. Kent, Canterbury. ---------- ----- & SANCHIZ, B. <1987a>. Temperature dependence of larval development in Pelobates cultripes (preliminary experiments). En J. J. van Gelder, H. Strijbosch & P. J. M. Bergers . On ^eoscaDhiogus and other Pliocene pelobatid frogs. Copeia, 1960 <2 > : 89-94. ---------- (1960b). Two new genera of African bufonids, with remarks on the phylogeny of related genera. Copeia^ 1960 (3): 225-233. ---------- (1965). Evolutionary trends in frogs. Am. Zool.. 5: 309-318. TREWAVAS, E. (1933>. The hyoid and larynx of the Anura. Phil. Trans. R. Soc. Lond., Series B, 222: 401-52?. TRUEB, L.. <1966>. Morphology and development of the skull in the frog H3[1^ septentrionalis. Copeia, 1966: 562-573. --------- (1973). Bones, frogs and evolutian. En J. L. Vial (ed.>: Bvolutionary biology of the anurans: Conteaporary research on major probleas. Univ. Missouri Press, Columbia, pp: 62-132.. - 277 - --------- (1985). A summary of osteocranial development in anurans with ^notes on the sequence of cranial ossification in Rhinoohrynus dorsalis (Anura: Pipoidea: Rhinophrynidae). Suid-Afrikaanse Tydskrif vir Vetenskap, 81: 181-185. ---------- & ALBERCH, P. (1985>. Miniaturization and the anuran skull: a case study of heterochrony. Fortschr. Zool., 30: 113-121. TSCHERNOFF, N. D. von (1907). Zur Embryonalentwickelung der hinteren Extremit^ten des Froches. Anat. Anz., 30: 593-612. TSCHUGUNOVA, T. J. <1981>. Interfrontal en Bombina orientalis . xevta Biol. Lisb., 12: 643-654. WAKE, D. B. (1970>. Aspects of vertebral evolution in the modern Amphibia. Forma Functio, 3: 33-60. ---------- & LAWSON, R. <1973>. Development and adult morphology of the vertebral column in the Plethodontid Salamander ^ltriç_e^ hi^lineata^ with comments on vertebral evolution in the Amphibia. J. 1[orph., 139: 251-300. - 278 - WASSERSUG, R. J. (1975>. The adaptative significance of the tadpole stage with •comments on the maintenance of complex life cycles in Anurans. Am. Zool., 15: 405-417. ---------- ----- (1976). A procedure for differential staining of cartilage and bone in whole formalin-fixed vertebrates. Stain Tech., 51 <2): 131-134. ---------- ----- & HOFF, K. (1982). Developmental changes in the orientation of the anuran jaw suspension. A preliminary exploration into the evolution of Anuran metamorphosis. fivolut. Biol.^ 15: 223-246. WILEY, E. 0. <1981). Phylogenetics. The theory and practice of phylogenetic systematics. John Wiley & Sons, Inc., DTew York. 439 pp. WILLIAMS, E. E. (1959). Gadow's arcualia and the development of tetrapod vertebrae. Q. 8ev. Biol., 34: 1-32. ZWEIFEL, R. G. (1956>. Two pelobatid frogs from the tertiary of North America and their relationships to fossil and recent forms. Am. l[us. Yovit., 1762: 1-45. -279- 6. APfi1fDICfi - 280 - 6. APEHDICE Relación de los ejemplares examinados en esta Tesis. Las abreviaturas de las colecciones utilizadas son las siguientes: MNCN = Museo Nacional de Ciencias Naturales, Madrid MM, P P, PV, RFC, RPCPC, RPF, RPV y SM = siglas de trabajo del Museo Nacional de Ciencias Naturales, Madrid ZFMK = Zoologisches Forschungsinstitut und Museum Alexander Koening, Bonn Las abreviaturas entre paréntesis indican el tipo de manejo a que fue sometido cada especimen: CED> = Esqueleto desarticulado (ME) = Medidas externas (T1) = Tinción con alizarina (T2) = Tinción con alizarina y azul de alcian FAl[ IL IA l[ñGOPHEY IDAE j^ntobrachium hasseltii xs^t^ hrn ^s montana (n = 10 adultos> MNCN 86121622 - 86121630 ; 8401109 (ED); 8405231 ; 861211 - 8612119 ; 86121177 - 86121194 (ED, ME, T1, T2); Manzanares el Real (T1). -281- RPC 381 - 385 (T2 > ; 389 - 390 (T2 > ; 395 - 397 (T2 > . (n = 195 renacuajos> RPC 006 - 008; 010 - 019 (ME, T2); RPC 039; 041 - 047; 049 - 051; 058; 059; 064; 066; 081 - 089; 091; 093 - 097; 099; 101 - 104; 108; 113; 114; 120; 122; 123; 126; 131; 271; 272; 274 - 277; 279; 283; 284; 287; 292; 294; 296; 300; 307; 308; 313; 315 - 333; 339 - 341; 344; 346; 347; 349; 350; 352; 357 - 361; 363; 364; 386 - 388; 391 - 394; 398 - 402; 404; 408; 410 - 416; 421; 424 - 428; 430 - 432; 434 - 437; 439 - 449; 452 - 455; 457 - 461; 463; 466; 468 - 470; 477; 484; 485; 488 - 491; 496; 544; 585; 586; 588; 590; 595; 597; 599; 601; 602; 604; 605 (T2); RPC 298; 301; 304; 306; 309; 311; 333F; 333K (ME). pelobates fuscus (n = 46 adultos y juveniles) MNCN 662 - 664 (ME); 8301261 ; 8612161 (ED, ME, T1, T2>; 8612162 (ED); 8612163 - 8612167 (ED, ME, T1, T2). ZFMK 16006 (ME>; 20307 - 20312 : 23838 (ME); 23853 (ME); 23854 (ME); 23858 (ME); 27950 ; 105 - 110 (T2 ) . Pelobates svrTia►us (n = 12 adultos y juveniles) MNCN 821021121 CED, ME, T1, T2>; 821021122 (ME, T2>; 8210211123 . ZFMK 9947 ; 23837 . PV043 (ME, T2). (n = 43 renacuajos> PV 001 - 005; 008; O10 - 031; 033 - 042; 044 - 048 (T2). - 282 - ^^hio^l^s couchii (n = 10 adultos) MNGN 8206161 (ED); 86121641 - 86121649 (ED, T1, T2>. Snea multi^licatus (n = 10 adultos) IINCN 86121632 - 86121640 ; SM010 (T2>. FAl[ILIA PfiLODYTIDAfi Pel ^tes ^^nctatus (n = 41 adultos y juveniles) MNCN 86121157 - 86121176 (ED, T1, T2>; 87011314 - 87011321 IiNCN 84110111 - 84110121 (ME, T2); RPP 017 - 092; 112 -118; 121; 122; 125; 127 - 133; 135; 136; 141; 143 - 145; 149; 151; 156 - 159; 167 - 174; 181 - 185; 191; 196 - 201; 203 - 208; 211 - 214; 219; 221 - 224; 226 - 231; 236; 237; 246; 247 ; 14072 (ME). Tesis María del Rosario Rodríguez Talavera PRELIMIANES INDICE 1. INTRODUCCION 2. MATERIALES, TECNICAS ANALITICAS Y METODOLOGIA 2.1. MATERIALES 2.2. TECNICAS DE MUESTREO 2.3. TECNICAS HISTOLOGICAS 2.4. PROTOCOLO DE LOS EXPERIMENTOS DE CRECIMIENTOS Y DESARROLLO LARVARIO 2.5. DEFINICION DE LA BIOMETRIA EXTERNA 2.6. ANALISIS CUANTITATIVOS 3. RESULTADOS Y DISCUSION 3.1. TRABAJOS PRELIMINARES 3.2. DESARROLLO DE LOS SISTEMAS ESQUELETICOS DE PELOBATES CULTRIPES Y PELODYTES PUNCTATUS 4. CONCLUSIONES GENERALES 5. BIBLIOGRAFIA 6. APENDICE