UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA TESIS DOCTORAL Obtención y caracterización de anticuerpos recombinantes (scF y dAb) para la detección de nuez (Juglans regia) y pistacho (Pistacia vera) en alimentos mediante técnicas inmunoenzimáticas Elisa Production and characterization of recombinant antibodies (scFv and dAb) for the detection of walnut (Juglans regia) and pistachio (Pistacia vera) in foods using enzyme-linked inmunosorbent assay (Elisa) techinques MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Raquel Madrid García Directoras Teresa García Lacarra Rosario Martín de Santos Aina García García Madrid © Raquel Madrid García, 2023 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA TESIS DOCTORAL OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES (scFv y dAb) PARA LA DETECCIÓN DE NUEZ (Juglans regia) Y PISTACHO (Pistacia vera) EN ALIMENTOS MEDIANTE TÉCNICAS INMUNOENZIMÁTICAS ELISA PRODUCTION AND CHARACTERISATION OF RECOMBINANT ANTIBODIES (scFv and dAb) FOR THE DETECTION OF WALNUT (Juglans regia) AND PISTACHIO (Pistacia vera) IN FOODS USING ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) TECHNIQUES MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Raquel Madrid García DIRECTORAS Teresa García Lacarra Rosario Martín de Santos Aina García García UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Nutrición y Ciencia de los Alimentos PROGRAMA DE DOCTORADO EN VETERINARIA TESIS DOCTORAL OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES (scFv y dAb) PARA LA DETECCIÓN DE NUEZ (Juglans regia) Y PISTACHO (Pistacia vera) EN ALIMENTOS MEDIANTE TÉCNICAS INMUNOENZIMÁTICAS ELISA PRODUCTION AND CHARACTERISATION OF RECOMBINANT ANTIBODIES (scFv and dAb) FOR THE DETECTION OF WALNUT (Juglans regia) AND PISTACHIO (Pistacia vera) IN FOODS USING ENZYME- LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) TECHNIQUES Memoria para optar al título de Doctor con mención honorífica de “Doctorado Internacional” que presenta la licenciada Raquel Madrid García Madrid © Raquel Madrid García, 2023 A mis padres "De todas las virtudes que podemos adquirir, ninguna es más útil y esencial que la habilidad de transformar la adversidad en un reto con el que disfrutar". Mihaly Csikszentmyhaly (Psicólogo e investigador) AGRADECIMIENTOS Después de una larga caminata y unas cuantas zanjas que saltar por el camino, por fin ha llegado el momento de cerrar esta etapa. Y estas primeras páginas van dedicadas a todas las personas que me han acompañado durante este camino. En primer lugar, quería agradecer a mis directoras de la Tesis Doctoral por acogerme dentro de su grupo de investigación. Teresa, gracias porque siempre has estado motivándome en los buenos y en los malos momentos, resolviéndome dudas, enseñándome a redactar y organizar artículos científicos y esta misma Tesis Doctoral. Admiro tu paciencia detrás de cada una de las correcciones y la delicadeza que muestras en cada detalle. En todos estos años, espero haber aprendido muchas cosas, y la mayoría son gracias a ti. Charo, te agradezco tus conversaciones motivacionales, que siempre estés ahí para dar el visto bueno final, y que me hayas enseñado las buenas formas para con los demás, éstas son muy importantes. Y Aina, ahora como mi directora, siempre serás mi gran compañera de andanzas por el laboratorio y una amiga con la que he podido tener grandes conversaciones, que me ha soportado en mis peores momentos, pero que siempre ha estado ahí, escuchando, apoyando, ayudando y sacándome una sonrisa. Nunca olvidaré los momentos que hemos pasado en nuestras escapadas a congresos. Y tú nunca olvidarás mi desorganización selectiva de objetos en momentos especiales. A las diferentes entidades públicas que han permitido la financiación de este trabajo mediante los proyectos: AGL2013-48018-R, S2013/ABI-2747, AGL2017-84316-R y P2018/BAA-474, al Ministerio de Economía y Competitividad por la concesión de un contrato predoctoral dentro del Programa de Formación de Personal Investigador (BES-2014- 068553) y una ayuda para la realización de una estancia en el extranjero (EEBB-I-17- 12714). Agradecer a Isabel su completa disposición para ayudarme en todo cuanto he necesitado. Contigo tuve el primer contacto en este laboratorio con los MLPA. Tu cercanía me ayudó a abrirme, y mis escapadas a tu despacho siempre me han ayudado a despejarme y desahogarme. En cuanto a mis predecesoras, Inés, Nicolette y Silvia, gracias por inculcarme la base de mi Tesis, en especial a Silvia, que prácticamente mi Tesis es una continuación de la tuya, y me enseñaste todos los “tips” necesarios para una buena selección. Y a las nuevas incorporaciones al grupo, Edu y Santi, hemos coincidido poco, pero hemos pasado buenos momentos. Al resto de las personas que prácticamente habitan en este departamento mi más sincero agradecimiento por la cálida acogida recibida. Pablo y Luis, agradeceros los interminables ánimos a continuar con más fuerza cada vez que os veía por el pasillo y coincidía que algún experimento no había salido. Juan Miguel, mira al final dónde estoy, y tú pensabas que este momento nunca llegaría, irónicamente. Siempre me levantabas una sonrisa a pesar de que tu humor se basaba en mis penurias. Nunca dejes de meterte conmigo. A Ana, Paloma, María y Juan gracias por ser tan atentos. A Santiago, Andrés, Aurora y Alberto por ayudarme cuando lo necesitaba. Y al resto de los profesores, con los que se han compartido historias y momentos inolvidables a la hora de la comida. A todos los compañeros que estuvieron en este departamento y coincidieron conmigo, Carlos, Sara, Javi, Cristina, Alicia, y a los que continúan compartiendo momentos actualmente, Estefanía, Rebeca, Claudio y Nuria, daros las gracias por haber formado parte de este largo camino que no olvidaré jamás. Y no me olvido de Marina e Irma, el dúo dinámico festivalero, gracias por los consejos y vuestra alegría, hacíais que mis problemas desaparecieran, no habría sido lo mismo sin vosotras. Al resto de los nuevos integrantes de todos los grupos de investigación, agradeceros los buenos momentos fuera de estos muros. También quiero dar las gracias a Marcos Alcocer por acogerme en su grupo de investigación en la Universidad de Nottingham, supervisar mi trabajo y hacerme la estancia mucho más agradable, mostrándome la buena comida y los rinconcitos inexplorados de Sutton Bonington. De esa estancia obtuve un regalo, la amistad de Gabriela, juntas hicimos de nuestra estancia un periodo de muchas aventuras, risas y experiencias inolvidables. A mi familia. Gracias a mis padrinos, mi tía, y mi abuelo que siempre se han preocupado por mi bienestar y felicidad. A mis padres agradecerles todo lo que me han dado, por su apoyo incondicional, por mi educación y la famosa frase “estudia lo que te guste que ya trabajarás en lo que puedas, y si es de lo que has estudiado, mucho mejor” que me ha hecho llegar donde estoy. Ellos siempre me dicen que están orgullosos de mí y eso me da fuerzas para llegar aún más lejos. Sin ellos no sería lo que soy hoy en día. Y a Tarita también, que ella siempre me ha hecho desconectar y mirar todo desde otra perspectiva. Os quiero mucho. HEIYMA. A mi nueva familia, Mario, Neko y Tsuki, por un futuro lleno de ilusión, diversión y trastadas. En especial agradecer a Mario su incesante transmisión de positivismo para llevar a cabo esta etapa. Has sido un gran apoyo. Y te agradezco enormemente los detalles y las distracciones cuando más lo necesitaba. Sabiendo que nuestra relación comenzó en periodo Tesis, espero que la nueva “Raquel sin Tesis” te siga gustando y continuemos juntos muchos años más. Junto a él, agradecer la cálida acogida recibida de la nueva familia vallecana, Esther y Emilio, junto sus hijos y numerosos nietos, que, por ellos, tengo cumpleaños casi todos los meses del año. No puedo terminar sin agradecer a Mercedes su paciencia y serenidad a la hora de escuchar mis problemas. Siempre has estado ahí, desde que comenzamos juntas la carrera, apoyándome, como gran amiga que eres. Y por último, agradecer a mis amigos de Radio Patio, Alex, Vero y Xandra, por las innumerables cenas de parloteo para resetear el cerebro, las inolvidables escapadas rurales para tomar aire fresco y las grandiosas noches de Eurovisión para disfrutar. Que todo esto no se pierda nunca. PRESENTACIÓN DE LA TESIS DOCTORAL PRESENTACIÓN DE LA TESIS DOCTORAL La presente Tesis Doctoral titulada “Obtención y caracterización de anticuerpos recombinantes (scFv y dAb) para la detección de nuez (Juglans regia) y pistacho (Pistacia vera) en alimentos mediante técnicas inmunoenzimáticas ELISA” ha sido realizada en el Departamento de Nutrición y Ciencia de los Alimentos (Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid), y se presenta en formato de compendio de artículos científicos. La detección de alérgenos alimentarios es importante con el fin de verificar el etiquetado de los alimentos y evitar las reacciones adversas para la salud derivadas de la exposición involuntaria de consumidores alérgicos. Actualmente, aunque las técnicas inmunológicas desarrolladas para el control de alérgenos presentes en los alimentos son muy utilizadas por las industrias y autoridades sanitarias, tienen algunas limitaciones, entre las que se encuentra el hecho de que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales, que requieren la utilización de animales de experimentación. Durante las últimas décadas, el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética ha permitido ofrecer alternativas innovadoras para la obtención de anticuerpos monoclonales que no requieran de la inmunización previa de animales. En esta Tesis Doctoral se propone el desarrollo y la utilización de anticuerpos recombinantes que no requieren la inmunización de animales de experimentación para la detección de nuez y pistacho en los alimentos, mediante técnicas inmunoenzimáticas de ELISA. Los tres artículos que forman parte de esta Tesis han sido publicados en revistas recogidas dentro del campo Food Science and Technology del Journal Citation Reports y abordan los siguientes aspectos: 1. Selección y modificación funcional de anticuerpos recombinantes específicos frente a nuez a partir de un repertorio de fragmentos de anticuerpos de tipo scFv. Utilización de los anticuerpos recombinantes obtenidos para la detección de alérgenos de nuez en alimentos mediante técnicas inmunoenzimáticas ELISA. La primera parte de esta Tesis Doctoral consistió en aislar los primeros fago-anticuerpos recombinantes específicos frente a nuez (Juglans regia) recogidos en la bibliografía. Se obtuvieron mediante phage display a partir de un repertorio sintético de fago-anticuerpos de tipo scFv (genoteca Tomlinson I). A continuación, se empleó la levadura Pichia pastoris como sistema de expresión para la modificación funcional y la producción in vivo de un scFv biotinilado específico frente a nuez (JrBSF). El scFv biotinilado y multimerizado en un núcleo de ExtAvidina-peroxidasa (HRP), se utilizó para desarrollar un ensayo inmunoenzimático de PRESENTACIÓN DE LA TESIS DOCTORAL ELISA directo que permite la detección de nuez en matrices alimentarias. Finalmente, se analizaron 100 muestras de alimentos comerciales usando 3 métodos de detección de nuez diferentes: el ELISA directo desarrollado con el scFv multimérico recombinante, un ELISA sándwich basado en anticuerpos policlonales, y una técnica de PCR en tiempo real. El trabajo realizado ha dado lugar a la publicación de 2 artículos en los que la doctoranda aparece como primera autora: 1.1. Raquel Madrid, Silvia de la Cruz, Aina García-García, Marcos J.C. Alcocer, Isabel González, Teresa García, Rosario Martín (2018). Multimeric recombinant antibody (scFv) for ELISA detection of allergenic walnut. An alternative to animal antibodies. Journal of Food Composition and Analysis, 67, 201–210. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.01.017 En este artículo se describe la selección y caracterización de un fago-anticuerpo tipo scFv específico de nuez a partir de la genoteca Tomlinson I, la producción in vivo del anticuerpo recombinante biotinilado en Pichia pastoris y la utilización del scFv multimerizado para la detección de nuez mediante un ELISA directo. 1.2. Raquel Madrid, Aina García-García, Pablo Cabrera, Isabel González, Rosario Martín, Teresa García (2021). Survey of commercial food products for detection of walnut (Juglans regia) by two ELISA methods and Real Time PCR. Foods, 10, 440. https://doi.org/10.3390/foods10020440 En este trabajo se recoge el estudio comparativo de tres métodos de detección de nuez en alimentos: (1) ELISA directo con el anticuerpo recombinante JrBSF multimerizado, (2) ELISA tipo sándwich con anticuerpos policlonales y (3) PCR en tiempo real. El estudio se completa con el análisis de 100 muestras de alimentos comerciales con diversas menciones sobre el contenido de nuez en su etiquetado. 2. Selección mediante phage display de fago-anticuerpos específicos frente a pistacho a partir de una genoteca de fago-anticuerpos de dominio único (dAbs) para la detección de proteínas alergénicas de pistacho en alimentos. En esta parte de la Tesis Doctoral se trataba de conseguir los primeros anticuerpos recombinantes frente a pistacho (Pistacia vera), producidos sin inmunización animal, para ser utilizados en inmunoensayos para la detección del pistacho en productos alimentarios. Con este fin, se evaluaron varias estrategias de biopanning para la selección de sondas https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.01.017 https://doi.org/10.3390/foods10020440 PRESENTACIÓN DE LA TESIS DOCTORAL específicas frente al pistacho a partir de un repertorio de anticuerpos de dominio único (dAb) de origen humano. Finalmente, se seleccionó el clon PVF4, que produce un fago- anticuerpo dAb que no presenta reacción cruzada con el anacardo pese a su proximidad filogenética y que reconoce una banda única de ∼22 kDa relacionada con la subunidad básica de la globulina 11S del pistacho (alérgeno Pis v 2). Además, el método ELISA desarrollado en esta parte de la Tesis Doctoral, que consistía en un ELISA indirecto ligado a fagos, se utilizó para evaluar la aplicabilidad del anticuerpo para el análisis de 77 productos comerciales. En la última parte de la Tesis Doctoral se presenta la producción de dAbs biotinilados in vivo específicos frente a las proteínas de pistacho en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. Debido a la presencia de un codón Ámbar en la secuencia del dAb que truncaba su producción, se llevó a cabo mutagénesis dirigida para modificarlo. Se consiguió la producción del dAb biotinilado pero no el reconocimiento del antígeno. El trabajo realizado ha dado lugar a la publicación de un artículo en el que la doctoranda aparece como primera autora, aunque los resultados de la última parte todavía no se han publicado: 2.1. Raquel Madrid, Aina García-García, Isabel González, Rosario Martín, Teresa García (2020). Phage displayed domain Antibodies (dAb) for detection of allergenic pistachio proteins in foods. Foods, 9, 1230. https://doi.org/10.3390/foods9091230 Este artículo describe la selección de un fago-anticuerpo específico frente a pistacho a partir de una genoteca de dAb, y el desarrollo de un ELISA indirecto ligado a fagos para la detección de pistacho en alimentos. 2.2. Producción de un dAb específico frente a proteínas de pistacho, biotinilado in vivo en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. (Artículo en preparación). En esta parte de la Tesis Doctoral se describe el proceso de producción in vivo en la levadura Pichia pastoris de un anticuerpo recombinante biotinilado tipo dAb para la detección de pistacho en alimentos mediante un ELISA directo. https://doi.org/10.3390/foods9091230 ÍNDICE ÍNDICE Índice de Figuras .................................................................................................................... VII Índice de Tablas ................................................................................................................... XIII ABREVIATURAS .......................................................................................................................... XV RESUMEN ................................................................................................................................. 1 SUMMARY ................................................................................................................................. 7 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 13 I.1. REACCIONES ADVERSAS A LOS ALIMENTOS ...........................................................................15 I.1.1. Alergia alimentaria ...........................................................................................16 I.1.1.1. Alergia alimentaria mediada por IgE .............................................................19 I.1.1.2. Prevalencia .................................................................................................21 I.1.1.3. Dosis Umbral ..............................................................................................22 I.1.2. Alergia a los frutos de cáscara ..........................................................................24 I.1.3. Marco legislativo: Información alimentaria facilitada al consumidor .....................27 I.1.3.1. Planes de control de alérgenos .....................................................................29 I.2. MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE ALÉRGENOS ......................................................................31 I.2.1. Técnicas basadas en la detección de proteínas ..................................................32 I.2.1.1. Inmunoensayos ...........................................................................................32 I.2.1.1.1. ELISA ....................................................................................................32 I.2.1.1.2. Dispositivos de flujo lateral (DFL) ............................................................36 I.2.1.2. Cromatografía y espectrometría de masas ....................................................37 I.2.1.3. Biosensores ................................................................................................39 I.2.2. Técnicas basadas en la detección de ADN..........................................................41 I.2.2.1. PCR y PCR en tiempo real ............................................................................41 I.2.2.2. MLPA ..........................................................................................................45 I.2.2.3. Biosensores de ADN ....................................................................................46 I.3. PRODUCCIÓN DE FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS IN VITRO ....................................................47 I.3.1. Anticuerpos recombinantes ...............................................................................50 I.4. PRESENTACIÓN DE ANTICUERPOS EN FAGOS (PHAGE DISPLAY)...................................................55 I.4.1. Fago Filamentoso M13 .....................................................................................56 I.4.2. Selección por afinidad (Biopanning) ..................................................................59 I.4.3. Genotecas de scFv y dAb ..................................................................................61 I.5. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES .................................................63 CAPÍTULO II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .................................................................................. 71 CAPÍTULO III. PLAN DE TRABAJO Y METODOLOGÍA RESUMIDA ................................................... 77 III.1. PLAN DE TRABAJO ...................................................................................................... 79 III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA ........................................................................................... 80 III.2.1. Muestras y preparación de los extractos de proteínas y ADN .............................. 80 III.2.2. Selección de scFv y dAb específicos frente a nuez y pistacho mediante presentación en fagos (phage display) .............................................................. 80 III.2.3. Selección de clones de fago-scFv individuales mediante ELISA monoclonal .......... 81 III.2.4. Secuenciación y caracterización de los clones seleccionados ............................... 82 III.2.5. Producción de scFv biotinilados mediante transformación en Pichia pastoris ........ 82 III.2.6. Producción y caracterización del scFv multimerizado .......................................... 83 III.2.7. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las proteínas de nuez y pistacho reconocidas por los anticuerpos recombinantes seleccionados .................................................................................................. 83 III.2.8. Desarrollo de una técnica de ELISA directo para la detección de nuez utilizando un scFv específico frente a nuez multimerizado con ExtrAvidina- HRP ................................................................................................................ 84 III.2.9. Aplicación de diversos formatos de técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) utilizando anticuerpos recombinantes para detectar la presencia de alérgenos vegetales en alimentos ..................................................................... 85 III.2.10. Comparación del JrBSF-scFv multimerizado en ELISA directo con un kit comercial de ELISA tipo sándwich y una técnica de PCR en tiempo real .............. 85 CAPÍTULO IV. RESULTADOS .................................................................................................. 87 IV.1. MULTIMERIC RECOMBINANT ANTIBODY (SCFV) FOR ELISA DETECTION OF ALLERGENIC WALNUT. AN ALTERNATIVE TO ANIMAL ANTIBODIES ........................................................... 89 IV.2. SURVEY OF COMMERCIAL FOOD PRODUCTS FOR DETECTION OF WALNUT (JUGLANS REGIA) BY TWO ELISA METHODS AND REAL TIME PCR ................................................................. 101 IV.3. PHAGE DISPLAYED DOMAIN ANTIBODIES (DAB) FOR DETECTION OF ALLERGENIC PISTACHIO PROTEINS IN FOODS ................................................................................ 119 IV.4. PRODUCCIÓN DE UN DAB ESPECÍFICO FRENTE A PROTEÍNAS DE PISTACHO, BIOTINILADO IN VIVO EN LA LEVADURA METILOTRÓFICA PICHIA PASTORIS .................................................. 141 CAPÍTULO V. DISCUSIÓN INTEGRADORA ............................................................................... 155 V.1. Obtención de anticuerpos recombinantes específicos frente a nuez (Juglans regia) mediante la técnica de presentación en fagos (phage display) a partir de genotecas de fago-anticuerpos recombinantes tipo scFv. ........................................................... 157 V.1.1. Enriquecimiento de la genoteca Tomlinson I en clones de fago-scFv específicos de nuez ........................................................................................ 158 V.1.2. Selección de clones de fago-scFv individuales mediante ELISA monoclonal ........ 159 V.1.3. Secuenciación y caracterización de los clones seleccionados ............................. 160 V.1.4. Producción de scFv biotinilados mediante transformación en Pichia pastoris ...... 161 V.1.5. Producción y caracterización del scFv multimerizado ........................................ 164 V.1.6. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las proteínas de nuez reconocidas por el scFv seleccionado ....................................................... 166 V.1.7. Desarrollo de una técnica de ELISA directo para la detección de nuez utilizando un scFv específico frente a nuez multimerizado con ExtrAvidina- HRP .............................................................................................................. 168 V.1.8. Aplicación de la técnica de ELISA directo con scFv multimerizado para verificar la presencia de nuez en alimentos comerciales, y comparación con un kit comercial de ELISA y una técnica de PCR en tiempo real ........................ 170 V.2. Obtención de anticuerpos recombinantes específicos frente a pistacho (Pistacia vera) mediante la técnica de phage display a partir de genotecas de fago- anticuerpos recombinantes tipo dAb ......................................................................... 177 V.2.1. Enriquecimiento de la genoteca de dAbs en clones de fago-dAb específicos de pistacho mediante diferentes estrategias de biopanning .............................. 177 V.2.2. Selección de clones de fago-dAb individuales mediante ELISA monoclonal ......... 181 V.2.3. Secuenciación y caracterización de los clones seleccionados ............................. 183 V.2.4. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las dianas moleculares reconocidas por los anticuerpos recombinantes frente a pistacho ........................................................................................................ 184 V.2.5. Desarrollo de una técnica inmunoenzimática de ELISA indirecto, utilizando un fago-anticuerpo específico para la detección de pistacho en alimentos ......... 186 V.2.6. Producción de dAb biotinilados in vivo, específicos frente a las proteínas de pistacho en la levadura metilotrófica Pichia pastoris ......................................... 191 CAPÍTULO VI. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS ....................................................................... 195 CAPÍTULO VII. TRABAJO FUTURO ........................................................................................ 201 CAPÍTULO VIII. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 205 Anexo I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL .................................. 229 VII ÍNDICE DE FIGURAS Capítulo I. Introducción Figura I.1. Categorías de las reacciones adversas a los alimentos (versión de Sampson et al., 2014). ..........................................................................................................15 Figura I.2. Clasificación de alérgenos alimentarios (Adaptación de Smith, 2017). ....................17 Figura I.3. Inducción de Inmunoglobulinas E por alérgenos alimentarios y cascada de señalización celular (imagen adaptada de Renz et al., 2018 y Xu et al., 2022) ........20 Figura I.4. Prevalencia de la alergia alimentaria en el mundo (Imagen de Renz et al., 2018). .........................................................................................22 Figura I.5. Representación de los 14 grupos de ingredientes de declaración obligatoria recogidos en el Reglamento (UE) 1169/2011 (Anexo II) por causar alergias o intolerancias alimentarias. ...................................................................................29 Figura I.6. Representaciones gráficas de los diferentes tipos de ELISAs. ................................33 Figura I.7. Diagrama del dispositivo de flujo lateral (DFL). El dispositivo de flujo lateral consiste en una membrana de nitrocelulosa sobre un material de soporte con un anticuerpo de captura específico del antígeno en una línea de prueba (T) y un anticuerpo anti-conjugado en una línea de control (C). S: muestra. ...............37 Figura 1.8. Representación esquemática de PCR-ELISA. La PCR-ELISA comienza con la PCR seguida de un ensayo inmunológico y la detección de la producción de color. El gen diana se amplifica en presencia de DIG-dUTP. Empleando la afinidad de la biotina con la avidina, el gen amplificado se inmoviliza en la placa y, finalmente, utilizando el anticuerpo secundario y el sustrato, se visualiza la producción de color. ..........................................................................44 Figura I.9. Esquema de la técnica de MLPA mediante hemi-sondas empleadas para la detección de secuencias específicas de ADN. .......................................................46 Figura I.10. Estructura básica de una inmunoglobulina (Ig), y de diversos tipos de fragmentos de anticuerpos: un fragmento de unión al antígeno (Fab), un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), fragmento variable estabilizado por enlace disulfuro (dsFv), fragmento variable de cadena pesada (dAbs), scFv unido a fragmento constante (scFv-Fc) y diabody o anticuerpos biespecíficos (bsAB). VH, región variable de la cadena pesada; VL, región variable de la cadena ligera; CH1-3, regiones constantes de la cadena pesada; CL, región variable de la cadena pesada. Las cadenas ligera y pesada, y las regiones Fab y Fc se encuentran unidas mediante puentes disulfuro, mientras que las cadenas ligera y pesada de los scFv lo están mediante un conector de serina y glicina. ............................................................................................................48 Figura I.12. Representación esquemática del fago M13 con la localización de las cinco proteínas de superficie (pIII, pVI, pVII, pVIII, pIX). .............................................57 ÍNDICE DE FIGURAS VIII Figura I.13. Representación esquemática del proceso de infección de E. coli por el fago M13 durante la tecnología de phage display. Elaboración propia adaptada de Ledsgaard et al., 2018. ....................................................................................... 58 Figura I.14. Representación del proceso de obtención de la genoteca de anticuerpos expresados en fagos (phage display) y de los ciclos de selección por afinidad (biopanning), consistente en un paso de incubación de la genoteca de fago- anticuerpo con la proteína diana, eliminación de los fagos no unidos, elución de los fagos unidos y amplificación de los fagos en E. coli, antes de realizar otro ciclo. Después de 3-5 ciclos se lleva a cabo la etapa de postselección. ........... 60 Figura I.15. Pasos de la purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad (figura adaptada de Ayyar et al., 2012). i: preparación de la matriz por activación química generando grupos funcionales reactivos en la superficie (la química puede seleccionarse en función de la elección del ligando a inmovilizar); ii: procedimiento de purificación. ..................................................... 68 Capítulo IV. Resultados* IV.1. Multimeric recombinant antibody (scFv) for ELISA detection of allergenic walnut. An Alternative to animal antibodies Figura IV.1.1. pMJA186 vector containing scFv JR35, c-myc epitope and BAP nucleotide sequences constructed in pPICZαB plasmid (Zeor, integrative plasmid carrying the secretion signal sequence from the S. cerevisiae α factor prepro-peptide and functional sites for the integration at the 5’ AOX1 locus of P. pastoris X-33)........................................................................................ 97 Figura IV.1.2. Electrophoretic analysis of the polymerase chain reaction (PCR) products obtained from different P. pastoris clones using primers: MJA254/MJA259 (A), and MJA255/ MJA256 (B). Lane 1: non-transformed P. pastoris; lane 2: pMJA186-G2 clone; lane 3: JrBSF clone. NC=PCR negative control, M=molecular weight marker BioMarker™ Low 50–1000 bp. ............................. 97 Figura IV.1.3. Dot-blotting analysis of culture supernatants from the different P. pastoris clones revealed with mouse monoclonal anti-c-myc-antibody (A) or ExtrAvidin-peroxidase (B), induced or non-induced with methanol. NC: negative control, P. pastoris X-33 non-transformed clone; PC: positive control, biotinylated scFv targeting almond protein; pMJA186: P.pastoris clone transformed with pMJA186 plasmid; JrBSF: P. pastoris clone co- transformed with pMJA186 and pMJA180 plasmids; Broth: only culture media. .......................................................................................................... 97 Figura IV.1.4. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in nonreducing conditions of monomeric and multimeric scFv. Lane 1: ExtrAvidin-peroxidase (Mw≈112 kDa); lane 2: scFv (Mw≈30 kDa); lane 3: multimeric scFv (Mw≈220 kDa). Highlighted band was excised and * Las Figuras pertenecientes a los artículos científicos van descritas con el número del capítulo, seguido del número del artículo al que corresponde, y del número de orden de la figura. https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002158 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002158 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002158 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002158 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002158 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002159 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002159 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002159 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002159 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002159 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002160 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002160 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002160 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002160 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002160 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002160 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002160 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002160 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002161 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002161 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002161 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002161 ÍNDICE DE FIGURAS IX analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF). ....................................................................97 Figura IV.1.5. Amino acid sequence of the JrBSF scFv deduced from the nucleotide sequence by Expasy Web site. Positions of the complementary determining regions for the variable domains of heavy (H-CDR 1–3) and light (L-CDR 1–3) chains are indicated. The mino acid sequences found in matrix- assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry (MALDI- TOF/TOF) analysis are underlined. ..................................................................98 Figura IV.1.6. Ultracentrifugation analysis of the multimeric-scFv, monomeric scFv and ExtrAvidin-Peroxidase with sedimentation coefficients in PBS at 20 °C. An amplified portion of the figure is shown indicating a peak of ExtrAvidin- peroxidase (A), a first peak of multimeric scFv (B), and second peak of multimeric scFv (C). .......................................................................................98 Figura IV.1.7. Standard curves of the multimeric-scFv (■,●) and the phage-scFv (▲) enzymelinked immunosorbent assays (ELISAs) performed with protein extracts obtained from raw (■,▲) and heat treated (●) ground walnut samples in wheat flour binary mixtures. The curves show the average values and the standard deviations corresponding to triplicate experiments performed in six different days. ......................................................................99 IV.2. Survey of commercial food products for detection of walnut (Juglans regia) by two ELISA methods and real time PCR Figura IV.2.1. ELISA results obtained from experimental walnut/corn flour binary mixtures prepared with raw peeled walnut (RPW, ■), toasted peeled walnut (TPW, ●), raw unpeeled walnut (RUPW, ▲), and toasted unpeeled walnut (TUPW, ▼) using the Alertox® walnut ELISA kit. The protein extracts from binary mixtures were used undiluted (A) or diluted 1:5 (B) or 1:25 (C) in protein extraction buffer, and results were compared with the standard curve obtained with the ready to use standards provided with the kit (STD, ◄). Points represent the mean value ± SD (n = 2; 3 independent experiments).Determination of cross-reactivity with heterologous species using the sandwich ELISA kit for walnut. ....................... 109 Figura IV.2.2. Standard curves obtained from experimental binary mixtures (raw peeled walnut samplesin corn flour), analyzed with the Alertox® walnut ELISA kit (■) and the multimeric scFv ELISA (●). Protein extracts were prepared according to directions of each method and diluted 1:25 (ELISA kit) or 1:100 (scFv ELISA) in PBS for comparison. Points represent the mean value ± SD (n = 2; 3 independent experiments). ................................................... 110 Figura IV.2.3. SDS-PAGE electrophoresis (A) and JrBSF scFv immunoblots (B, C) of 10 μg walnut extract (W), 10 μg pecan extract (Pe), and 2 μg purified JrBSF (scFv). Mw of the protein marker bands (ColorBurstTM Electrophoresis Protein Marker, Sigma) is indicated. JrBSF scFv in the immunoblots was detected either with Anti-c-Myc monoclonal antibody (9E10) and alkaline phosphatase (AP) conjugated anti-mouse IgG (B) or with horseradish peroxidase (HRP) conjugated Anti-6X His tag® antibody (ab1187) (C). .......... 111 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002161 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002161 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002162 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002162 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Alignment of peptides identified by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry and the MASCOT Database Search engine in the 11S globulin seed storage protein 2-like (Juglans regia) (Accession Number: XP_018818401.1). ....................................................................................... 112 IV.3. Phage displayed domain antibodies (dAb) for detection of allergenic pistachio proteins in foods Figura IV.3.1. Phage titers obtained after each round of affinity selection against pistachio extract, following different biopanning strategies (S1–S4). ............................. 127 Figura IV.3.2. Indirect phage-dAb ELISA results obtained with polyclonal phages rescued at each round of selection from strategies S1–S4 against pistachio. Precipitated phages from each round of selection were analysed against pistachio, cashew and peanut extracts and negative controls (betagalactosidase and BSA). Absorbance values are the mean of three independent experiments with duplicates. Error bars show the standard deviation for each set of data. ...................................................................... 128 Figura IV.3.3. Indirect phage-dAb ELISA results obtained with monoclonal phages selected from the second round of biopanning against a set of tree nuts. Absorbance values are the mean of four independent experiments with duplicates. Error bars show the standard deviation for each set of data. ......... 129 Figura IV.3.4. Amino acid sequences of the pistachio binding dAbs deduced from the nucleotide sequences by SnapGene tool. Positions of the complementarity determining regions of the variable domains (CDR 1–3) and the c-Myc and VSV tags are indicated as determined by IMGT/V-QUEST tool. ....................... 130 Figura IV.3.5. Elution profile of pistachio proteins obtained from preparative FPLC size exclusion column(A) showing absorbance values at 280 nm. (B) Indirect phage-dAb ELISA with some fractions obtained from FPLC (indicated by an orange bar). Absorbance values are the mean of duplicates. Error bars show the standard deviation for each set of data. ......................................... 131 Figura IV.3.6. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in reducing conditions of different fractions obtained in size exclusion chromatography (A) and immunoblot with PVF4 phage-dAb (B) of 10 μg of pistachio extract (T) and 10 μL of each fraction sample. Mw of the protein marker bands (ColorBurstTM Electrophoresis Protein Marker, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) is indicated. Highlighted bands were excised and analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF). Phage-dAb in the immunoblot was detected with anti-M13 monoclonal mouse antibody conjugated with Horseradish peroxidase (HRP). ..................................................................... 131 Figura IV.3.7. Amino acid sequence of the 11S globulin (Pistacia vera) (accession number: ABU42022). Positions of peptides identified by matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) from lane ‘T’ in the Western blot are in red bold font. Positions of the peptides identified from the lane ‘4’ are underlined with green solid lines. Positions of the peptides identified from lanes ‘6’ and ‘8’ are discontinuous underlined. ................................................................................................. 132 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002168 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002168 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002168 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002168 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002169 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The 11S globulins are hexameric proteins with subunits comprising an acidic polypeptide 30–40 kDa in size that is disulphide-linked to a 20 kDa basic polypeptide. (A) SWISS-MODEL of a homo-trimer of pistachio 11S globulin seed storage protein (ABU42022), (B) SWISS-MODEL of the basic subunit homo-trimer recognised by PVF4-dAb, the rectangles show the possible epitope recognition zones. ............................................................... 132 Figura IV.3.9. Standard curve of the phage-dAb enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) performed with protein extracts obtained from ground defatted pistachio (■) in corn flour binary mixtures. The plot shows the average values and the standard deviations corresponding to duplicate experiments performed in three different days. ................................................................ 133 Figura IV.3.S1. Secuencias nucleotídicas clones dAb ............................................................. 140 IV.4. Producción de un dAb específico frente a proteínas de pistacho, biotinilado in vivo en la levadura metilotrófica Pichia pastoris Figura IV.4.1. Análisis electroforético de los productos de las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) obtenidos de los clones pRAS002 y pRAS002.BirA de Pichia pastoris usando los primers MJA254/259 que amplifican la secuencia del dAB (A) y MJA255/MJA256 que amplifican la secuencia de la BirA (B). NC=PCR negative control, Mw=molecular weight marker Hyperladder IV. ....... 146 Figura IV.4.2. Secuencia nucleotídica y aminoacídica del clon dAb PVF4. Recuadro rojo marca la posición del codón Ámbar sin mutar (secuencia naranja) y mutado por cambio de TAG a CAG (secuencia verde). ................................................ 147 Figura IV.4.3. Análisis electroforético del producto de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) obtenido del clon pRAS002 mutado (PVF4m5) usando los primers MJA254 y MJA253. PC=control positive de PCR (scFv), NC=control negativo, Mw=molecular weight Biomarker Low Bioventures. ......................... 148 Figura IV.4.4. Análisis electroforético de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) obtenidos de las colonias (de 1 a 10) de Pichia pastoris con el vector pRAS002 mutado (PVF4m5) usando los primers MJA254 y MJA253. PC=control positive de PCR (dAb), Mw=molecular weight Biomarker Low Bioventures. ......................................................................... 148 Figura IV.4.5. Análisis por dot blot de los sobrenadantes de cultivo de diferentes clones de Pichia pastoris antes y después de la inducción con metanol, revelados con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-c-Myc-AP o con un anticuerpo anti-His-HRP. NC: control negativo, Pichia pastoris X-33 sin transformar; Control positivo: pMJA302 (García-García, 2019) dAb frente a gluten y pMJA181 (de la Cruz et al., 2016) scFv frente a almendra. ............................. 149 Figura IV.4.6. Análisis electroforético en SDS (sodium dodecyl sulphate) 4-20 % bajo condiciones reductoras, de los sobrenadantes de cultivo de diferentes clones de Pichia pastoris inducidos con metanol. Mw: ColorBurstTM Electrophoresis Protein Marker; SN: control negativo, sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris X-33 sin transformar; Control positivo: pMJA302 (García-García, 2019) dAb frente a gluten y pMJA186 (Madrid et al., 2018) scFv frente a nuez. Las bandas resaltadas se cortaron y analizaron https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002176 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002176 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002176 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002176 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002176 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002176 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002177 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002177 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002177 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002177 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc115002177 ÍNDICE DE FIGURAS XII mediante desorción láser asistida por matriz/espectrometría de masas en tándem de ionización (MALDI-TOF/TOF). ...................................................... 150 Figura IV.4.7. Resultados de ELISA indirecto obtenidos con el sobrenadante inducido de los clones transformados con PVF4m5 o pRAS002 en Pichia pastoris. Los valores de absorbancia son la media de duplicados obtenidos en un mismo experimento. Las barras de error muestran la desviación estándar para cada grupo de datos. ................................................................................... 150 Figura IV.4.8. Análisis electroforético de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) obtenidos de las colonias (de 1 a 10) de Pichia pastoris pRAS002m cotransformado con el vector pMJA180, usando los primers MJA254-MJA253 (A) y MJA256-MJA255 (B). NC=PCR negative control, PVF4m5=clon no transformado con BirA; Mw=molecular weight Biomarker Low Bioventures (A) y 1Kb Ladder (B). ......................................................... 151 Figura IV.4.9. Análisis dot blot de los sobrenadantes de cultivo de diferentes clones de Pichia pastoris cotransformados con pMJA180 y revelados con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-c-Myc AP (A), con un anticuerpo anti- His-HRP (B) y con ExtrAvidina-HRP (C), mostrándose las diferencias entre los inducidos y sin inducir con metanol. Control positivo: pMJA181 (de la Cruz et al., 2016) scFv frente a almendra. .................................................... 152 Figura IV.4.10. Perfil de elucción del sobrenadante de PVF4m5.BirA obtenido en el FPLC a partir de columna Ni-NTA, mostrando los valores de absorbancia a 280 nm de las fracciones 1 y 2 ................................................................................. 153 Figura IV.4.11. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en condiciones reductoras de diferentes fracciones obtenidas de la cromatografía de afinidad Ni-NTA (A) e immunoblot con anti-c-Myc-AP (B) de 20 µg de cada fracción o 10 µL de cada muestra. Mw: ColorBurstTM Electrophoresis Protein Marker; 1, 2 y 3, son las fracciones obtenidas de la cromatografía; BMMY: medio de cultivo; Waste: desecho, muestra que no se ha unido a la columna de afinidad. dAb PVF4m5.BirA en el immunoblot fue detectado por el anticuerpo anti- c-Myc conjugado con AP. ............................................................................. 153 Capítulo V. Discusión V.1.6. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las proteínas de nuez reconocidas por el scFv seleccionado. Figura V.1.1. Modelo simulado de una globulina 11S de nuez. A) Homotrímero de 11S de nuez, B) SWISS-MODEL de la subunidad básica reconocida por el scFv JrBSF. ......................................................................................................... 168 XIII ÍNDICE DE TABLAS Capítulo I. Introducción Tabla I.1. Proteínas alergénicas de los frutos de cáscara (Fuente: Weinberger y Sicherer, 2018). .............................................................................................25 Tabla I. 2. Listado de Kits comerciales en diferentes formatos para la detección de nuez y pistacho (elaboración propia). ..............................................................34 Tabla I.3. Ejemplos de inmunosensores para la detección de alérgenos en alimentos ........39 Tabla I.4. Principales aplicaciones de técnicas de PCR para la detección de alérgenos alimentarios. .................................................................................................42 Tabla I.5. Ejemplos de aplicaciones de biosensores de ADN para el análisis de alimentos. .....................................................................................................47 Capítulo IV. Resultados† IV.1. Multimeric recombinant antibody (scFv) for ELISA detection of allergenic walnut. An Alternative to animal antibodies Tabla IV.1.1. List of primers employed in this work. .............................................................93 Tabla IV.1.2. List of heterologous species analysed in the Indirect phage enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). .......................................................................95 Tabla IV.1.3. Peptides identified by matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF). ...........................................................98 Tabla IV.1.4. Determination of the presence of walnut in various commercial processed food products using walnut multimeric-scFv enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and real-time polymerase chain reaction (PCR). .........................99 IV.2. Survey of commercial food products for detection of walnut (Juglans regia) by two ELISA methods and real time PCR Tabla IV.2.1. DNA sequences and description of the pecan (AF303825) and walnut (HE574850) primers and probes to develop a real time PCR. .......................... 106 Tabla IV.2.2. Determination of cross-reactivity with heterologous species using the sandwich ELISA kit for walnut. ..................................................................... 108 Tabla IV.2.3. Peptides identified by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry and the MASCOT Database Search engine. Protein scores greater than 83 were significant (p < 0.05). .................................................................................. 112 † Las Tablas pertenecientes a los artículos científicos van descritas con el número del capítulo, seguido del número del artículo al que corresponde, y del número de orden de la figura. https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966177 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966178 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966178 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966179 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966179 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966180 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966180 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966180 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966181 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966181 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966182 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966182 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966183 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966183 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966183 ÍNDICE DE TABLAS XIV Tabla IV.2.4. Determination of the presence of walnut in commercially processed food products using multimeric scFv ELISA, Alertox® Walnut ELISA kit, and real time PCR. ................................................................................................... 113 IV.3. Phage displayed domain antibodies (dAb) for detection of allergenic pistachio proteins in foods Tabla IV.3.1. List of heterologous species analysed in the indirect phage enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). .................................................................... 123 Tabla IV.3.2. Different biopanning strategies used, and number of specific pistachio- binding clones obtained from each strategy. ................................................. 125 Tabla IV.3.3. Determination of the presence of pistachio in commercial processed food products using PVF4 phage-dAb ELISA and pistachio-specific real-time polymerase chain reaction (PCR). ................................................................. 134 Tabla IV.3.S1. Peptides identified by MALDI‐TOF/TOF from electrophoretic bands recognised by the PVF4 phage‐dAb in the pistachio extract (T) and in the chromatographic fractions 4, 6 and 8. .......................................................... 139 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966184 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966184 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966184 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966185 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https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966188 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966188 https://ucomplutense-my.sharepoint.com/personal/raqmad01_ucm_es/Documents/DOCTORADO%20EN%20VETERINARIA/TESIS/Versiones/TESIS%20RMG%2018.docx#_Toc114966188 ABREVIATURAS XV ABREVIATURAS Abs Absorbancia ADN Ácido desoxirribonucleico AECOSAN Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición AESAN Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición AOX Alcohol oxidasa (del inglés alcohol oxidase) AP Fosfatasa alcalina (del inglés alkaline phosphatase) APPCC Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico ARN Ácido ribonucleico BAD Dominio aceptor de biotina (del inglés biotin acceptor domain) BDB Banco de datos de biopanning BHK Células de riñón de hámster bebé (del inglés baby hamster kidney) BirA Ligasa de biotina (del inglés biotin ligase) BLAST Herramienta informática de alineamiento de secuencias de tipo local (del inglés Basic Local Alignment Search Tool) BLI Interferometría de biocapa (del inglés bio-layer interferometry) BMGY Medio complejo tamponado con glicerol y extracto de levadura (del inglés Buffered minimal glycerol-complex yeast extract medium) BMMY Medio complejo tamponado con metanol y extracto de levadura (del inglés Buffered minimal methanol-complex yeast extract medium) BRC British Retail Consortium BSA Albúmina sérica bovina (del inglés bovine serum albumin) bsAB Anticuerpos biespecíficos CAI Centro de asistencia a la investigación CDR Regiones determinantes de la complementariedad (del inglés complementary determining regions) CEBAS- CSIC Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura-Consejo Superior de Investigaciones Científicas CH Cadena constante pesada (del inglés constant heavy) CHO Células derivadas de ovario de hámster chino (Cricetus griseus) (del inglés Chinese hamster ovary) CL Cadena constante ligera (del inglés constant light) CSIC Consejo Superior de Investigaciones Científicas dAb Anticuerpo de dominio único (del inglés single domain-antibody) DBPCFC Prueba de provocación oral doble ciego controlada por placebo (del inglés double- blind placebo-controlled food challenge) ddPCR duplex dropletdigital PCR DFL Dispositivo de flujo lateral ABREVIATURAS XVI DNAsas Desoxirribonucleasa dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates DO Densidad óptica DPV Voltimetría de pulso diferencial (del inglés differential pulse voltammetry) dsFV Fragmento variable estabilizado por enlace disulfuro dUTP Desoxiuridina trifosfato (del inglés deoxyuridine triphosphate) DVT Codón degenerado de aminoácidos hidrofílicos ((A/G/T) (A/G/C) T) EAACI Academia Europea de Alergia e Inmunología Clínica (del inglés European Academy of Allergy and Clinical Immunology) ECL Quimioluminiscencia mejorada (del inglés enhanced chemiluminescence) EFSA Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (del inglés European Food Safety Authority) EIS Espectrometría de impedancia electroquímica ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (del inglés enzymed-linked immunosorbent assay) ELOSA Ensayo por inmunoabsorción ligado a oligonucleótidos (del inglés enzymed-linked oligoosorbent assay) EMBOSS European Molecular Biology Open Software Suite ESAC Comité científico asesor de la EURLE CVAM ESI Ionización por electroespray (del inglés electrospray ionization) EU Unión Europea (del inglés European Union) EURL ECVAM Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para alternativas a la experimentación animal. ExlA Endoxilanasa A Fab Fragmento de unión al antígeno (del inglés fragment-antigen-binding) FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación FARRP Food Allergy Research and Resource Program Fc Región del fragmento cristalizable (del inglés fragment crystallizable region) FCεRI Receptor de alta afinidad de la IgE FDA Administración de Alimentos y Medicamentos (del inglés Food and Drug Administration) FDE Agencia Europea de Alimentos y Bebidas (del inglés FoodDrink Europe) FIAB Federación Española de Industrias de la Alimentación y Bebidas FPLC Cromatografía líquida rápida de proteínas (del inglés fast protein liquid chromatography) Fv Fragmento monocatenario de anticuerpos formados por VH y VL GlaA Promotor de la glucoamilasa Gln Glutamina GRAS Generalmente reconocido como seguro ABREVIATURAS XVII HAMA Anticuerpos humanos anti-ratón (del inglés human anti-mouse antibody) HCAbs Anticuerpos solo de cadena pesada (del inglés heavy chain-only antibody) HCG Gonadotropina coriónica humana (del inglés human chorionic gonadotropin) HEK293 Células embrionarias de riñón humano 293 (del inglés human embryonic kidney 293 cells) His Histidina HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia (del inglés high-performance liquid chromatography) HRP Peroxidasa de rábano (del inglés horseradish peroxidase) Hlya α-hemolisina Ig Inmunoglobulina IgNAR Inmunoglobulinas con nuevo receptor de antígenos IL Interleuquina IMAC Cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados IMGT/V- QUEST Herramienta de InMunoGeneTics/ funciona con los genes V-J y V-D-J reordenados y la línea germinal V-GENE INIA Instituto Nacional de Investigación Agraria y Alimentaria IRTA Institut de Recerca I Tecnologia Agroalimentaries IT Trampa de iones (del inglés ion trap) IUIS Unión Internacional de las Sociedades Inmunológicas (del inglés International Union of Immunological Societies) IUPAC Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (del inglés International Union of Pure and Applied Chemistry) Kb Kilobase KDa Kilodalton LAMP Amplificación de ADN isotérmica mediada por bucle (del inglés loop-mediated isothermal amplification) LC-MS Liquid Chromatography and Mass Spectrometry LOAEL Nivel más bajo con efecto adverso observado (del inglés lowest observed adverse effect level) LOD Límite de detección (del inglés limit of detection) LOQ Límite de cuantificación (del inglés limit of quantification) LTP Proteínas transportadoras de lípidos (del inglés lipid transfer proteins) MAGYP Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca de Argentina MALDI- TOF/TOF Desorción/ionización láser asistida por matriz (del inglés matrix-assisted laser desorption/ionization) y tiempo de vuelo (del inglés time of flight) MAPA Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación de España mAu Mil unidades de Absorbancia MLPA Amplificación dependiente de ligasa de múltiples sondas (del inglés multiplex ligation probe amplification) MPBS Tampón fosfato salino con leche desnatada (del inglés skimmed milk phosphate- buffered saline) ABREVIATURAS XVIII MRC Medical Research Council MS Espectrometría de masas (del inglés mass spectrometry) MTD Dosis máxima tolerada (del inglés máximum tolerated dose) MYC Etiqueta del oncogén humano c-myc (EQKLISEEDL) NGS Secuenciación de nueva generación Ni-NTA Columna de níquel con ligando quelante de ácido nitriloacético NOAEL Nivel sin efecto adverso observado (del inglés no observed adverse effect level) nsLTP Proteína de transferencia de lípidos no específica NS0 Células de mieloma de ratón no secretoras OMS Organización Mundial de la Salud PAL Etiquetado precautorio de alérgenos (del inglés precautionary allergen labelling) pb Pares de bases PBS Tampón fosfato salino (del inglés phosphate-buffered saline) PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés polymerase chain reaction) PEG Polietilenglicol (del inglés polyethylene glycol) PTM Modificaciones postraduccionales (del inglés postranslational modifications) PVDF Polifluoruro de vinilideno (del inglés polyvinylidene difluoride) qPCR PCR cuantitativa Real-time PCR PCR en tiempo real SAO Síndrome de alergia oral scFv Fragmento variable de cadena sencilla (del inglés single chain variable fragment) scFv-Fc ScFv unido a fragmento constante SD Desviación estándar (del inglés standard deviation) SDS-PAGE Dodecilsulfato sódico (del inglés sodium dodecyl sulfate) SEI Sociedad Española de Inmunología SPCE Screen-printed carbon electrode SPE Screen-printed electrodes SPR Resonancia de plasmones superficiales (del inglés surface plasmon resonance) SWV Voltametría de onda cuadrada (del inglés squarewave voltammetry) Taq pFU Taq polymerase Proofreading high-fidelity TBS Tampón Tris salino (del inglés Tris buffered saline) TBST Tampón Tris salino con Tween TMB Tetrametilbenzidina (del inglés tetramethylbenzidine) TNF-α Interferón α ABREVIATURAS XIX TY Medio de cultivo líquido con triptona y extracto de levadura TYE Medio de cultivo con triptona, extracto de levadura y agar UE Unión Europea UPR Respuesta a proteínas desplegadas (del inglés unfolded protein response) VH Cadena variable pesada (del inglés variable heavy chain) VHH Cadena variable pesada de anticuerpos de camélidos (del inglés variable heavy chain of a camelid antibody) VITAL Etiquetado voluntario de alérgenos traza accidentales (del inglés voluntary incidental trace allergen labelling) Vk Cadena variable ligera (kappa) (del inglés variable light chain) VL Cadena variable ligera (del inglés variable light chain) VNAR Receptor variable de antígeno derivado de tiburón (del inglés shark variable new antigen receptor) VSV Vesicular Stomatitis virus epitope WHO Organización Mundial de Alergia (del inglés World Allergy Organization) YPD Medio de cultivo con dextrosa, peptona y extracto de levadura RESUMEN RESUMEN 3 Obtención y caracterización de anticuerpos recombinantes (scFv y dAb) para la detección de nuez (Juglans regia) y pistacho (Pistacia vera) en alimentos mediante técnicas inmunoenzimáticas ELISA La alergia alimentaria es un problema de salud pública en auge. La exposición accidental de individuos sensibles a ingredientes alergénicos, incluso en pequeñas cantidades, puede desencadenar reacciones alérgicas severas. Para garantizar un alto nivel de protección de la salud de los consumidores, la Unión Europea obliga a mencionar en el etiquetado de los alimentos los ingredientes que figuran en el Anexo II del Reglamento (UE) 1169/2011, entre los que se encuentran la nuez y el pistacho. Con el fin de cumplir con las normas establecidas, las industrias y agencias encargadas de la seguridad alimentaria han de tener a su disposición métodos analíticos fiables, que permitan la detección en los productos alimenticios de los ingredientes causantes de las reacciones alérgicas, presentes de forma voluntaria o accidental. Existen multitud de métodos genéticos e inmunológicos para la detección de alérgenos en alimentos, siendo las técnicas de ELISA y PCR las más extendidas. La técnica de PCR permite la detección de una secuencia específica de ADN de la especie diana en el alimento, mientras que la técnica de ELISA consiste en la identificación de una proteína alergénica o un marcador proteico mediante el uso de anticuerpos. Los inmunoensayos son los métodos más utilizados para la detección de alérgenos, debido a su rapidez, sencillez, sensibilidad y capacidad de automatización. Sin embargo, todos los inmunoensayos disponibles se basan en el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales desarrollados en animales. La normativa internacional sobre el bienestar animal (Directiva Europea 2010/63/EU) fomenta el desarrollo de alternativas basadas en el principio de las “tres erres”: reemplazar, reducir y refinar el uso de animales en los procesos de investigación y experimentación. En este contexto, el desarrollo de anticuerpos recombinantes y técnicas inmunoenzimáticas basadas en ellos, que no dependen de la inmunización animal, es una alternativa novedosa y prometedora para la detección de alérgenos. La tecnología del phage display permite la selección de sondas de afinidad a partir de genotecas (repertorios) de fagos recombinantes que expresan en su superficie fragmentos de anticuerpos (tipo Fab, scFv o dAb). El proceso de selección por afinidad, conocido como biopanning, implica la exposición de la genoteca de fagos al antígeno de interés, seguida de la recuperación de los fagos unidos a la molécula diana y su posterior amplificación en RESUMEN 4 Escherichia coli. Para mejorar la sensibilidad y la avidez de los anticuerpos seleccionados, la fusión con un dominio aceptor de biotina permite, en presencia de la enzima biotín ligasa, unirse a una molécula de biotina. La adición de una molécula de ExtrAvidina-peroxidasa (HRP) a los anticuerpos biotinilados, induce la formación de anticuerpos multiméricos. Teniendo en cuenta los aspectos anteriores, en esta Tesis Doctoral se han empleado diferentes metodologías para la detección de nuez y pistacho en alimentos. En primer lugar, se ha abordado la obtención de anticuerpos recombinantes frente a las proteínas de nuez (Juglans regia) y pistacho (Pistacia vera) mediante la técnica de phage display a partir de genotecas comerciales, y su empleo en el desarrollo de técnicas de ELISA para la detección de nuez y pistacho en alimentos. Asimismo, se ha llevado a cabo la identificación y caracterización de las proteínas reconocidas por los fago-anticuerpos, empleando técnicas electroforéticas, cromatográficas y espectrométricas. Además, se ha llevado a cabo una modificación funcional de los anticuerpos recombinantes mediante su biotinilación y multimerización, empleando el organismo eucariota Pichia pastoris, para mejorar la sensibilidad y la aplicabilidad de la técnica de ELISA desarrollada. Por último, se ha elaborado un estudio comparativo sobre la sensibilidad y especificidad entre el ELISA directo con los anticuerpos multimerizados, un ELISA tipo sándwich con anticuerpos policlonales y una PCR en tiempo real. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: 1) A partir de la genoteca Tomlinson I se seleccionaron, en la segunda y tercera rondas de selección, 11 clones de fago-anticuerpos de tipo scFv que reconocían nuez y no cacahuete. De ellos, el clon denominado JR35 presentó el tamaño de banda esperado tras el análisis por PCR. 2) Se insertó el dominio aceptor de biotina (BAD) en el extremo C-terminal del scFv con el vector de expresión pPICZαB con el que se transformó Pichia pastoris. Posteriormente, la levadura se cotransformó con un vector que contenía la secuencia de la enzima biotín ligasa, dando lugar al clon JrBSF. Tras la inducción con metanol de Pichia pastoris, la producción del scFv biotinilado JrBSF fue de 6 mL a una concentración de 2 mg/mL. 3) Dado que la avidina es una proteína tetramérica que puede unir hasta 4 moléculas de biotina, se demostró la unión del anticuerpo scFv biotinilado específico de nuez a ExtrAvidina-HRP mediante pruebas de dot blot, espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF) RESUMEN 5 y experimentos de velocidad de sedimentación. Se comprobó que un núcleo de ExtrAvidina- HRP podía incorporar al menos 2 moléculas de scFv biotiniladas. 4) El scFv multimérico específico de nuez se utilizó para el desarrollo de un ELISA directo cuyo límite de detección (LOD) de nuez cruda en mezclas binarias con harina de trigo se estableció en 1616 mg Kg−1, siendo de 2466 mg Kg−1 en las mezclas binarias con nuez horneada, y mejorando el LOD del ELISA indirecto empleando el fago-scFv JR35 que fue de 6378 mg Kg−1. Además, este scFv mostró solo un 2,25 % de reacción cruzada frente a la pacana, muy cercana filogenéticamente a la nuez. 5) La aplicabilidad del ELISA directo desarrollado se demostró mediante el análisis de 30 productos comerciales. 6) El scFv JrBSF reconoció una banda de 15 kDa en el extracto de nuez utilizando técnicas electroforéticas e immunoblots. Mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF se identificó esa banda como globulina 11S (alérgeno Jug r 4) de Juglans regia con un 31 % de cobertura de la secuencia. 7) En un estudio comparativo en el que se analizaron 100 muestras de alimentos comerciales con el ELISA directo basado en el scFv-JrBSF multimerizado, un kit comercial de ELISA tipo sándwich y una técnica de PCR en tiempo real, la técnica más sensible resultó ser la de PCR en tiempo real, seguida del kit ELISA y del ELISA multimérico. El kit ELISA se vio menos afectado por el procesado de los alimentos, pero mostró más reacción cruzada con la pacana, produciendo falsos positivos. De todas las muestras analizadas, entre un 7- 12,6 % de las muestras contenían nuez, pero no la declaraban. Hubo una muestra que declaraba nuez, pero no se detectó por ninguna metodología. Por lo tanto, para una verificación fiable del etiquetado de alimentos que contengan nuez es conveniente emplear una combinación de técnicas genéticas e inmunoenzimáticas. 8) Para la obtención de anticuerpos específicos de pistacho a partir de un repertorio (genoteca) comercial de dAbs se llevaron a cabo varias estrategias de selección hasta obtener candidatos que no mostraron reacción cruzada con el anacardo y el cacahuete. El proceso de biopanning incluyó 2 rondas de selección con extractos de proteína sin desengrasar (S1 y S2) o extractos desengrasados (S3 y S4) de pistacho, anacardo y cacahuete. Las estrategias S3 y S4 presentaron un mayor enriquecimiento en fago-dAbs que reconocen al pistacho. De los 8 clones seleccionados y tras el análisis de su secuencia, se observó que todos eran diferentes menos el clon PVF4-dAb procedente de la S4 y el clon PVC12-dAb obtenido de la S3. La presencia de un codón Ámbar en la CDR1 de 6 clones RESUMEN 6 impedía la expresión del dAb en Pichia pastoris, pero en cepas supresoras de E. coli este codón de stop se interpreta como glutamina (Gln). 9) La identificación de las proteínas de pistacho reconocidas por el fago-dAb PVF4 se realizó mediante la separación cromatográfica del extracto desengrasado del pistacho, seguida del análisis de las fracciones obtenidas del FPLC mediante Western blot y ELISA indirecto con el fago-dAb PVF4. Las fracciones reconocidas por el fago-dAb tenían un tamaño entre 20-35 kDa, confirmándose mediante MALDI-TOF/TOF que se correspondían con la secuencia aminoacídica de la proteína 11S (alérgeno Pis v 2) de Pistacia vera, con una cobertura del 45 %. El análisis de las secuencias peptídicas obtenidas indicó que principalmente pertenecían a la subunidad básica de la proteína. 10) La técnica de ELISA indirecto desarrollada con el fago-dAb precipitado del clon PVF4, permitió reconocer al pistacho en matrices alimentarias con un límite de detección de 3983 mg Kg−1 y sólo presentó reacción cruzada con la yema de huevo en un 4,30 %. 11) En el análisis de 77 productos comerciales para valorar la aplicabilidad de la técnica de ELISA indirecto, el límite de detección y el procesado a altas temperaturas de algunas muestras provocaron que no se detectara pistacho en 14 muestras que lo declaraban en su etiquetado. Por otro lado, las muestras que declaraban contener frutos de cáscara diferentes al pistacho o trazas de frutos de cáscara, y contenían anacardo (filogenéticamente cercano al pistacho) fueron negativas tanto para el ELISA indirecto como para la técnica de PCR en tiempo real, demostrando la especificidad del fago-anticuerpo. SUMMARY SUMMARY 9 Production and characterisation of recombinant antibodies (scFv and dAb) for the detection of walnut (Juglans regia) and pistachio (Pistacia vera) in foods using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniques Food allergy is a growing public health problem. Accidental exposure of sensitive individuals to allergenic ingredients, even in small amounts, can trigger severe allergic reactions. To ensure a high level of consumer health protection, the European Union requires food labelling to mention ingredients listed in Annex II of Regulation 1169/2011, including walnuts and pistachio nuts. To comply with the established rules, food safety industries and agencies must have reliable analytical methods at their disposal, to allow the detection of ingredients causing allergic reactions, which may be present, either intentionally or accidentally, in foodstuffs. There are a multitude of genetic and immunological methods for the detection of allergens in food, with ELISA and PCR methods being the most widespread. PCR allows the detection of a specific DNA sequence of the target species in the food, while the ELISA method involves the identification of an allergenic protein or protein marker using antibodies. Immunoassays are the most widely used methods due to their speed, simplicity, sensitivity, and automation capability. However, all available immunoassays are based on the use of polyclonal or monoclonal antibodies developed in animals. International animal welfare regulations (European Directive 2010/63/EU) encourage the development of alternatives based on the "3Rs" principle: replace, reduce, and refine the use of animals in research and experimental processes. To this end, the development of recombinant antibodies and enzyme-linked immunosorbent techniques without animal immunisation is a novel and promising alternative for allergen detection. Phage display technology allows the selection of affinity probes from recombinant libraries expressing antibody fragments on their surface (Fab, scFv or dAb type). The selection process (biopanning) involves exposure of the phage library to the antigen of interest, followed by recovery of the phage bound to the target molecule and subsequent amplification in Escherichia coli. To improve the sensitivity and avidity of the selected antibodies, attachment of a biotin acceptor domain allows binding to a biotin molecule, in the presence of the enzyme biotin ligase. The formation of multimeric antibodies is induced with the addition of an avidin-peroxidase (HRP) molecule. SUMMARY 10 Taking into account the above mentioned aspects, in this PhD Thesis different methodologies have been used for the detection of walnut and pistachio in food. Firstly, recombinant antibodies against walnut (Juglans regia) and pistachio (Pistacia vera) proteins have been obtained from commercial phage-antibody libraries by means of the phage display, and they have been used in the development of ELISA methods for the detection of walnut and pistachio in food. Likewise, the identification and characterisation of the proteins recognised by the phage-antibodies have been carried out using electrophoretic, chromatographic and spectrometric techniques. In addition, to improve the sensitivity and applicability of the ELISA method developed, a functional modification consisting of biotinylation and multimerization of the recombinant antibodies has been carried out in Pichia pastoris, a eukaryotic organism. Finally, a comparative study on the sensitivity and specificity between a direct ELISA with the multimerised antibodies, a sandwich ELISA with polyclonal antibodies and a real-time PCR has been carried out. The results obtained were as follows: 1) Eleven clones were selected from the Tomlinson I library, which recognised walnut but not peanut, after the second and third rounds of selection. However, only the clone JR35 produced a band of the expected size after PCR analysis. 2) The biotin acceptor domain (BAD) was inserted at the C-terminus of the scFv in the expression vector pPICZαB, which was transformed in Pichia pastoris and then, a cotransformation with a vector codifying for the biotin ligase enzyme was developed to obtain the JrBSF clone. After methanol induction of Pichia pastoris, 6 mL of biotinylated JrBSF scFv were produced at a concentration of 2 mg mL−1. 3) Since avidin is a tetrameric protein that can bind up to four biotin molecules, the binding of the walnut-specific biotinylated scFv antibody to ExtrAvidin-HRP was demonstrated by dot blot assays, mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) and sedimentation rate experiments. Thus, it was demonstrated that, a ExtrAvidin-HRP core molecule could incorporate at least 2 biotinylated scFv molecules. 4) The walnut-specific multimeric scFv was used for the development of a direct ELISA with a limit of detection of 1616 mg Kg−1 for raw walnut in binary mixtures of wheat flour, being 2466 mg Kg−1 in binary mixtures with baked walnut, and improving the LOD of the indirect ELISA with the phage-scFv JR35 (6378 mg Kg−1). Furthermore, it showed only 2.25 % cross-reactivity with pecan, which is phylogenetically very close to walnut. SUMMARY 11 5) The applicability of the developed direct ELISA was demonstrated with the analysis of 30 commercial products. 6) Electrophoretic and immunoblot analysis demonstrated that the JrBSF scFv bound to a 15 kDa band in walnut extracts. This band was identified as 11S globulin (allergen Jug r 4) from Juglans regia, with 31 % sequence coverage using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. 7) In a comparative study where 100 commercial food samples were tested by a direct ELISA using scFv-JrBSF, a commercial sandwich ELISA kit and a real-time PCR, the most sensitive method was the real-time PCR, followed by the ELISA kit and the multimeric ELISA. The ELISA kit was less affected by food processing, but showed a higher cross- reactivity to pecans, giving false positives. Of all samples tested, 7-12.6 % contained walnuts, but did not declare it. There was one sample that claimed to contain walnut but it was not detected by any methodology. Therefore, the use of genetic and enzyme-linked immunosorbent techniques is necessary for a reliable labelling verification of walnut containing foods. 8) Several screening strategies were carried out to obtain pistachio specific antibodies from a commercial library of dAbs, which did not show cross-reactivity with cashew and peanut. The biopanning process included two rounds of screening with whole protein extracts (S1 and S2) or defatted extracts (S3 and S4) from pistachio, cashew and peanut. Strategies S3 and S4 showed a higher enrichment of pistachio-binding phage-dAbs. After sequence analysis, all the 8 clones selected were different, except PVF4-dAb from S4 and PVC12-dAb from S3. The presence of an Amber codon in CDR1 of six clones prevented the expression of dAb in Pichia pastoris, but this stop codon is translated as glutamine (Gln) in E. coli suppressor strains. 9) Identification of pistachio proteins recognised by the phage-dAb PVF4 was performed by chromatographic separation of defatted pistachio extract, followed by Western blot analysis and indirect ELISA of the fractions obtained from FPLC with the phage-dAb PVF4. The phage-dAb bound fractions with a size between 20-35 kDa and MALDI-TOF/TOF analysis identified the amino acid sequence of the bands as the 11S protein (allergen Pis v 2) from Pistacia vera, with a sequence coverage of 45 %. Following analysis of the peptide sequences obtained, it was determined that the basic subunit of the protein was preferentially recognised. SUMMARY 12 10) The indirect ELISA technique developed using precipitated phage-dAb from the clone PVF4, recognised pistachio with a detection limit of 3983 mg Kg−1, and cross-reacted only 4.30 % with egg yolk. 11) In the analysis of 77 commercial products to assess the applicability of the indirect ELISA method, the limit of detection and the high processing temperature resulted in the lack of detection of pistachio in 14 samples that declared it in their labelling. On the other hand, the samples that declared to contain nuts other than pistachio or traces and thereof contained cashew nuts (phylogenetically close to pistachio), tested negative in the indirect ELISA and real-time PCR, demonstrating the specificity of the method. Capítulo I INTRODUCCIÓN I. INTRODUCCIÓN 15 I.1. REACCIONES ADVERSAS A LOS ALIMENTOS Las personas están constantemente expuestas a un gran número de proteínas alimentarias, ya que una alimentación saludable consta de una dieta variada, completa y equilibrada. Sin embargo, algunos componentes de la dieta pueden actuar como factores desencadenantes de reacciones adversas. Las reacciones adversas a los alimentos incluyen a las alergias y a las intolerancias alimentarias, lo que ha dado lugar a la aparición de multitud de términos en este campo. La Academia Europea de Alergia e Inmunología Clínica (EAACI, European Academy of Allergy and Clinical Immunology) clasifica las reacciones adversas a los alimentos como tóxicas y no tóxicas (Figura I.1). Las reacciones tóxicas son las provocadas por alimentos que contienen compuestos tóxicos, como toxinas microbianas, metales pesados, plaguicidas o sustancias con actividad farmacológica. En este caso, a todos aquellos que consuman ese alimento les afectará en mayor o menor medida, dependiendo del individuo y de la cantidad ingerida. Las reacciones no tóxicas se describen como hipersensibilidad alimentaria y dependen de la susceptibilidad de cada individuo. A su vez, las reacciones no tóxicas pueden dividirse en dos tipos: si no están mediadas por mecanismos inmunitarios se clasifican como intolerancias alimentarias, y cuando hay una base inmunitaria se clasifican como alergias alimentarias. Las intolerancias alimentarias se dividen a su vez en metabólicas, farmacológicas o producidas por mecanismos desconocidos. En el grupo de alergias alimentarias podemos distinguir las mediadas por IgE y las no mediadas por IgE (Muraro et al., 2014; Sicherer y Sampson, 2018). Figura I.1. Categorías de las reacciones adversas a los alimentos (versión de Sampson et al., 2014). I. INTRODUCCIÓN 16 I.1.1. Alergia alimentaria La alergia alimentaria es la reacción adversa a los alimentos que hace referencia a cualquier respuesta anormal desde el punto de vista clínico, mediada por el sistema inmunitario, producida tras las ingestión, contacto o inhalación de un alimento o de un aditivo alimentario contenido en el mismo, que en la mayoría de las personas no provoca ningún efecto perjudicial. La única forma posible de prevenir una reacción alérgica en individuos sensibles consiste en evitar por completo los alimentos que la desencadenan, lo que implica una restricción de la dieta. Históricamente, para prevenir que la alergia alimentaria apareciera en los niños con mayor riesgo de padecerlas se las recomendaba evitar esos alérgenos. Actualmente, se está estudiando la posibilidad de evitar la aparición de alergias alimentarias aplicando estrategias para facilitar el aumento de la tolerancia inmunológica y la reducción de los síntomas mediante la incorporación precoz de los posibles alérgenos en la alimentación de los niños (de Silva et al., 2020; Muraro et al., 2014), pero su efectividad es muy limitada. Se han llevado a cabo numerosas investigaciones sobre diversas formas de inmunoterapia alimentaria, como las vías de administración oral, sublingual y epicutánea. La inmunoterapia oral es la más prometedora en cuanto a la cantidad de proteína que puede ingerirse, pero también ha demostrado ser menos tolerable y tener un perfil de seguridad menos favorable (con más efectos secundarios) en comparación con la inmunoterapia sublingual y la inmunoterapia epicutánea, que ofrece una menor protección, pero es muy tolerable y tiene el mejor perfil de seguridad. Sin embargo, ninguna de las opciones ofrece tolerancia permanente (Burks et al., 2018). Los alérgenos alimentarios son cualquier proteína presente en el alimento que es susceptible de sensibilizar el sistema inmune. Se distinguen dos clases de alérgenos alimentarios según sus diferentes mecanismos inmunológicos. Los alérgenos alimentarios de clase I son los más comunes y los principales sensibilizadores de las enfermedades alérgicas, pudiendo provocar reacciones en individuos sensibles. Mayoritariamente, las proteínas implicadas son las glicoproteínas solubles en agua con pesos moleculares entre 10-70 kDa. Los alérgenos alimentarios de clase I son estables al calor, al ácido y a las proteasas, lo que los hace especialmente resistentes a la digestión gástrica. Los alérgenos alimentarios de clase II se refieren a los aeroalérgenos que pueden causar una variedad de síntomas diferentes en individuos previamente sensibilizados, por reactividad cruzada de las IgE (Figura I.2). En la actualidad, el diagnóstico de alergias alimentarias solo es satisfactorio para los alérgenos alimentarios de clase I, ya que los extractos estandarizados I. INTRODUCCIÓN 17 de los alérgenos alimentarios de clase II son difíciles de aislar y muy lábiles (Aas, 1978; Breiteneder y Ebner, 2000; Jones y Burks, 2008; Sampson et al., 2014). Figura I.2. Clasificación de alérgenos alimentarios (Adaptación de Smith, 2017). Atendiendo a secuencias de aminoácidos compartidas, propiedades moleculares y estructuras tridimensionales conservadas, los alérgenos se agrupan en un número limitado de familias proteicas. En el caso de proteínas alergénicas de alimentos vegetales, el 65 % pertenece a cuatro familias dominantes: las prolaminas, las cupinas, las profilinas y la familia Bet v 1. La superfamilia de las prolaminas comprende tres grandes grupos de alérgenos alimentarios vegetales, las albúminas 2S, las proteínas de transferencia de lípidos no específicas (nsLTP) y los inhibidores de la alfa-amilasa/tripsina de los cereales. La superfamilia de las cupinas comprende las globulinas, principalmente de las legumbres y los frutos de cáscara, dividiéndose en la vicilina 7S y en la legumina 11S. Las profilinas son proteínas citosólicas muy conservadas en plantas, que se encargan de la reorganización de microfilamentos en diversos procesos. Tanto las profilinas como los homólogos de Bet v 1 presentan reacción cruzada con los alimentos, ya que personas con alergia al polen suelen padecer síntomas alérgicos después de ingerir ciertos alimentos vegetales. Por ejemplo, los alérgenos de las frutas de la familia Rosaceae o tejidos somáticos de la familia Apiaceae presentan reacción cruzada con los alérgenos presentes en el polen de abedul, en particular Bet v 1. Finalmente, las principales familias de alérgenos de origen animal son las tropomiosinas, las caseínas y las parvalbúminas (Breiteneder y Mills, 2005, 2009; Breiteneder y Radauer, 2004; Mills et al., 2002). I. INTRODUCCIÓN 18 Las manifestaciones clínicas de las alergias alimentarias son extremadamente variables, desde pequeños trastornos digestivos e irritaciones de la piel hasta síntomas más graves como la anafilaxia que, en algunos casos, puede poner en peligro la vida del consumidor. En la actualidad, la alergia alimentaria es una de las principales causas de anafilaxia tratada en los servicios de urgencias de los países desarrollados, especialmente en los niños (Sicherer y Sampson, 2018). Las manifestaciones clínicas de la alergia alimentaria pueden afectar a la piel, las vías respiratorias, el tracto gastrointestinal y el sistema cardiovascular y nervioso. En los pacientes alérgicos, la piel es uno de los órganos diana más comunes en las reacciones de hipersensibilidad alimentaria mediadas por IgE. En el 80 % de las reacciones alérgicas a los alimentos se producen manifestaciones clínicas que incluyen prurito y urticaria. Pero también, la piel es un lugar importante de sensibilización primaria a los alérgenos alimentarios, por lo que la dermatitis atópica se considera un factor de riesgo para el desarrollo de una alergia alimentaria, especialmente durante la infancia y la niñez temprana. Los alimentos más comunes asociados a la dermatitis atópica son la leche de vaca, el huevo, el cacahuete, la soja, el trigo, el pescado y los frutos secos. (De Martinis et al., 2020; Jones y Burks, 2008; Perry et al., 2004). Las alergias alimentarias se han convertido en un importante problema de salud en todo el mundo. Por ese motivo, varios países han introducido en su legislación la obligación de indicar la presencia de determinados ingredientes alergénicos en las etiquetas de los alimentos. Sin embargo, un importante factor de riesgo para las personas sensibilizadas es la presencia de alérgenos por contaminaciones cruzadas que ocurren durante el procesamiento de las materias primas o durante el almacenamiento del producto finalizado. Se ha corroborado cómo en la manipulación de alimentos alergénicos, las partículas se desplazan en mayor o menor medida en función de su forma, siendo el desplazamiento mayor de las partículas esféricas, favoreciendo la contaminación cruzada (Meima et al., 2021). Entre otros problemas asociados al procesado de alimentos se encuentran la pérdida de trazabilidad o la sustitución fraudulenta de ingredientes. Por ello, en el etiquetado se debe distinguir claramente entre la información de alérgenos presentes en la lista de ingredientes y un etiquetado de alérgenos preventivo para aquellos alérgenos que puedan estar presentes o de los que se puedan encontrar trazas. Además, para garantizar el cumplimiento de la normativa sobre el etiquetado de los alimentos hay que incluir la evaluación del riesgo de alérgenos no declarados en las materias primas que se compran a los proveedores (FIAB, 2016; Sicherer y Sampson, 2014). Por otra parte, para evitar un uso excesivo del etiquetado precautorio de alérgenos (PAL) y aumentar el número de productos seguros a disposición de las personas alérgicas, es importante el establecimiento de dosis I. INTRODUCCIÓN 19 umbrales en esta población (Allen y Taylor, 2018; DunnGalvin et al., 2015). Según la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), aunque se están empleando pruebas sensibles para la detección de alérgenos, siguen existiendo problemas importantes, como límites de detección fuera del rango de sensibilidad clínica, y especificidad y reproducibilidad insuficientes (EFSA, 2014). I.1.1.1. Alergia alimentaria mediada por IgE Los 8 alimentos responsables de la mayoría de las reacciones alérgicas más importantes en Europa y EE. UU., son el cacahuete, los frutos de cáscara, la leche, el huevo, el pescado, el marisco, la soja y el trigo. En los primeros años de vida, las alergias mediadas por IgE más frecuentes son las causadas por la leche de vaca, el huevo, el cacahuete, el trigo, la soja, el pescado y los frutos de cáscara. Sin embargo, en la edad adulta, la mayoría de las alergias están causadas por la ingestión de cacahuetes, frutos de cascara, marisco y pescado. Estas diferencias se deben principalmente a la inmadurez del sistema inmune en edades tempranas, así como a una exposición distinta a determinados grupos de alimentos en los diferentes grupos de edad (Burks et al., 2001). La hipersensibilidad de tipo I mediada por IgE se considera el tipo más común de alergia alimentaria (Figura I.3). La alergia alimentaria mediada por IgE puede dividirse en dos fases. En la fase inicial, llamada fase de sensibilización, se produce una exposición al alérgeno a través del sistema gastrointestinal, la mucosa o la piel. En estas zonas, las células dendríticas son las encargadas de capturar a los alérgenos, procesarlos y presentarlos a las células de linfocitos T, para la diferenciación de estas células en diferentes subtipos de células T helper (Th), como las células CD4+ Th2, para iniciar una respuesta inmunitaria adaptativa (Walsh y Mills, 2013). La alergia es impulsada por las células CD4+ Th2 específicas del alérgeno, que producen las citoquinas IL-4, IL-5 e IL-13. En el caso de los individuos susceptibles, las citoquinas tienen una función importante en la diferenciación de las células Th2, que conduce a la secreción de IgE específicas del alérgeno por parte de las células de linfocitos B específicas del alérgeno. Las IgE desempeñan un papel fundamental en la alergia alimentaria. Una vez producidas, las IgE se unen a la forma tetramérica del receptor de alta afinidad de la IgE (FcεRI) en los mastocitos y los basófilos. En la fase de inducción, tras una nueva exposición al alérgeno alimentario, se produce el reconocimiento del alérgeno por parte de las IgE unidas al receptor FcεRI, lo que promueve la cascada de señalización que desencadena la liberación de histamina, prostaglandinas y leucotrienos y otros factores I. INTRODUCCIÓN 20 que provocan los síntomas relacionados con la alergia (Kim y Burks, 2015; Monaci et al., 2020; Renz et al., 2018; Stone et al., 2010; Wambre et al., 2017). Figura I.3. Inducción de Inmunoglobulinas E por alérgenos alimentarios y cascada de señalización celular (imagen adaptada de Renz et al., 2018 y Xu et al., 2022). Existen diversas rutas de sensibilización, pero una misma familia de alérgenos suele compartir la misma ruta. La sensibilización a los alérgenos alimentarios ocurre principalmente a través del tracto gastrointestinal, pero aquellos que poseen reactividad cruzada con el polen de algunas plantas producen sensibilización por vía pulmonar (Uzzaman y Komarow, 2014). Cuando la sensibilización ocurre a nivel gastrointestinal, los alérgenos alimentarios presentan unas propiedades moleculares que incrementan su estabilidad térmica y su resistencia a la acción desnaturalizante de las proteasas. Sorprendentemente, en este sentido solo existen 2 familias de alérgenos: las caseínas y las cupinas, que mantienen su alergenicidad después de haber sido digeridas (Breiteneder y Mills, 2005). Así, la primera barrera defensiva frente a los alérgenos y los microorganismos es la mucosa intestinal. Ésta posee ácido gástrico, mucus, un epitelio intestinal íntegro, enzimas digestivas, peristaltismo intestinal, así como otros factores inespecíficos que constituyen la barrera no inmunológica. Si los alérgenos y microorganismos consiguen I. INTRODUCCIÓN 21 atravesar esa primera barrera, a continuación, se enfrentan a la barrera inmunológica que engloba a los mecanismos de respuesta innatos (péptidos antimicrobianos, células inmunes que expresan receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos, etc.) y a los mecanismos adaptativos (linfocitos, IgA). En algunas ocasiones, los antígenos no digeridos o parcialmente digeridos y los microorganismos pueden detectarse finalmente en la mucosa y en los nódulos linfáticos, y los antígenos solubles también pueden encontrarse en la sangre y llegar hasta otros tejidos. La captación de antígenos está regulada por el paso a través de células epiteliales y células M, o mediante la captación directa de las células dendríticas transepiteliales. Este fenómeno puede resultar beneficioso, permitiendo la inducción de tolerancia inmunitaria frente a los antígenos ambientales. Pero las personas con alergias alimentarias presentan debilitada la barrera no inmunológica e incrementada la permeabilidad intestinal. Esto es debido a que la neutralización del ácido gástrico aumenta el paso de proteínas a través de la mucosa, produciendo una respuesta adaptativa intensa que conlleva la aparición de células T productoras de citoquinas Th2, IgE específicas del alérgeno, y en casos de reiteradas exposiciones, desgranulación de basófilos y mastocitos (Bischoff y Sellge, 2014; Salvo-Romero et al., 2015; Sellge et al., 2010; Untersmayr y Jensen-Jarolim, 2006). I.1.1.2. Prevalencia La verdadera prevalencia de la alergia alimentaria es difícil de establecer, debido a la heterogeneidad en la metodología y diseño de los estudios epidemiológicos disponibles. A pesar de estas limitaciones, se ha llegado a la conclusión de que la prevalencia de las alergias alimentarias varía según edad y región, reflejando las diferencias de las dietas en las diferentes culturas. En los países desarrollados se ha observado un incremento en la prevalencia de las alergias alimentarias, aunque está comenzando a aumentar también en los países en vías de desarrollo (Figura I.4) (McWilliam et al., 2020; Sicherer y Sampson, 2018). La alta prevalencia en el mundo desarrollado es especialmente alarmante en el caso de la población infantil ya que mientras en adultos es de aproximadamente un 2-4 %, se estima que alrededor del 6-8 % de los niños padecen alergias alimentarias y hasta un 3 % ha experimentado complicaciones sanitarias (Gupta et al., 2011; Rona et al., 2007; Taylor- Black y Wang, 2012; Zuidmeer et al., 2008). En España, la mayor prevalencia de alergia alimentaria se localiza en Extremadura y en el centro de la península (de la Hoz, 2015). La alergia a los frutos de cáscara es infrecuente en el primer año de vida, probablemente debido al limitado consumo de frutos secos. A los I. INTRODUCCIÓN 22 6 años, la prevalencia de la alergia a los frutos de cáscara es similar a la de la alergia a los cacahuetes. Más de un tercio de los niños con alergia al cacahuete y al huevo en la infancia tienen alergia a los frutos secos a los 6 años (McWilliam et al., 2019). Figura I.4. Prevalencia de la alergia alimentaria en el mundo (Imagen de Renz et al., 2018). Aún con estos datos, la EFSA concluyó que las alergias alimentarias afectan a una proporción relativamente pequeña de la población. Pero considerando que las reacciones alérgicas pueden ser graves, incluso potencialmente mortales, y que las personas con intolerancias alimentarias también pueden ver afectada su calidad de vida, la EFSA propone el fomento de las buenas prácticas en la manipulación de alimentos, así como controles de calidad exhaustivos en las industrias alimentarias. No se conocen exactamente los factores desencadenantes de las alergias alimentarias, pero sí se ha corroborado que los factores genéticos, ambientales (como la luz solar e insuficiencia de vitamina D o dietas ricas en ácidos grasos) o el exceso de higiene pueden influir en la aparición y aumento de las alergias alimentarias (EFSA, 2014). I.1.1.3. Dosis Umbral Los umbrales pueden definirse como la cantidad máxima de un alimento alergénico que puede tolerarse sin producir ninguna reacción adversa. Un umbral individual es la cantidad I. INTRODUCCIÓN 23 máxima de un alimento alergénico que puede ser tolerada por un individuo específico alérgico a los alimentos, mientras que un umbral poblacional es la cantidad máxima de un alimento alergénico que puede tolerar toda la población (o una subpoblación representativa) de individuos con un tipo específico de alergia alimentaria. Los umbrales también pueden denominarse NOAEL (niveles sin efecto adverso observado) o MTD (dosis máxima tolerada). La dosis más baja que provoca una reacción se denomina LOAEL (nivel más bajo observado con efecto adverso). Existen datos clínicos sobre las dosis umbrales de varios alimentos alergénicos obtenidos a partir de pruebas orales para el diagnóstico o para inmunoterapia. Los datos umbrales individuales obtenidos pueden utilizarse para modelar estadísticamente los umbrales de distribución de la población para los alérgenos (FARRP, 2021). Sin embargo, la mayoría de las personas alérgicas a los alimentos no conoce su dosis umbral individual porque nunca se les ha realizado la provocación oral a doble ciego controlada con placebo (DBPCFC), prueba diagnóstica “gold standard” en alergia de alimentos como parte de su diagnóstico. El conocimiento del NOAEL y LOAEL es bastante beneficioso para el individuo, porque dictará el grado de cuidado necesario en la aplicación de una dieta de evitación segura y eficaz. A su vez, se amplía la dieta y se mejora la nutrición y la calidad de vida del paciente tras la confirmación de la alergia alimentaria por la DBPCFC (Cerecedo et al., 2014). En España se estima que solo el 13 % de los pacientes con alergias alimentarias son diagnosticados de forma rutinaria mediante DBPCFC debido a que al ser una técnica laboriosa no se realiza en la práctica clínica habitual (de la Hoz, 2015). Por ello, normalmente se aconseja a los alérgicos a los alimentos que eviten por completo el alimento o los alimentos agresivos, asumiendo esencialmente que la dosis umbral es cero. Pero este hecho no mejora la calidad de vida del paciente alérgico y actualmente existen datos suficientes para establecer las dosis umbrales que puedan usarse como referencia en la industria alimentaria. Por ejemplo, Japón y Suiza son los únicos países que han adoptado un umbral/nivel de acción reglamentario para los alérgenos alimentarios. Japón establece el límite de 10 µg/g de proteína para el etiquetado y Suiza de 1000 µg/g de alimento (Ballmer-Weber et al., 2015). A pesar de la dificultad de determinar dicho valor, existe cierto consenso científico en establecer los límites de detección para diferentes ingredientes alergénicos entre 1 y 100 mg Kg-1, dependiendo del alimento (Johnson et al., 2011; Remington et al., 2020; Taylor et al., 2014). En este sentido, la EAACI y el programa VITAL (Voluntary Incidental Trace Allergen Labeling) de la industria australiana establecieron las dosis de referencia mínima o dosis umbrales de algunos alérgenos principales para provocar una reacción alérgica que no causarían efectos adversos en el 95 % de los consumidores sensibles, con el fin de animar a la industria alimentaria a utilizar I. INTRODUCCIÓN 24 una aplicación de un etiquetado precautorio creíble, proporcionando una mayor confianza al consumidor y una mejora de su seguridad. (Allen et al., 2014; Allen y Taylor, 2018). I.1.2. Alergia a los frutos de cáscara Los frutos de cáscara han demostrado ser beneficiosos para la salud debido a su alto contenido de ácidos grasos insaturados y a la presencia de otros compuestos biológicamente activos, como tocoferoles, esteroles vegetales y compuestos fenólicos. Con el fin de mejorar las características nutricionales de los alimentos comerciales, es frecuente la incorporación de frutos de cáscara a ciertos productos, lo que supone un riesgo para el consumidor alérgico. Entre los frutos de cáscara de mayor consumo se encuentran las almendras, nueces, anacardos, pacanas, pistachos, avellanas, nuez de Brasil, macadamia, piñones y castañas. Y de ellos, el 90 % son responsables de alergias alimentarias (Geiselhart et al., 2018; Ros, 2010). Los frutos de cáscara se encuentran entre los alimentos que con mayor frecuencia causan reacciones alérgicas agudas y casi todos ellos se han asociado a reacciones alérgicas mortales. A pesar de su importancia clínica, la epidemiología de la alergia a los frutos de cáscara sigue siendo poco conocida y la prevalencia en diferentes regiones del mundo aún no está bien caracterizada. En un estudio de McWilliam et al (2015) la prevalencia de la alergia a los frutos secos confirmada por IgE fue inferior al 2 %, mientras que la prevalencia de la alergia probable a los frutos secos osciló entre el 0,05 % y el 4,9 %. Las estimaciones de prevalencia de reacciones de síndrome de alergia oral (SAO) a los frutos de cáscara fueron más altas (8-11,4 %) y procedían predominantemente de Europa. La prevalencia varió significativamente según la región, siendo la avellana el fruto de cáscara que más reacciones alérgicas produce en Europa, la nuez y el anacardo en los EE.UU y la nuez de Brasil, la almendra y la nuez en el Reino Unido (McWilliam et al., 2015). Los frutos de cascara tienen dos tipos principales de proteínas, las metabólicas y las de almacenamiento. Las proteínas de almacenamiento de las semillas (Tabla I.1) son los alérgenos asociados a muchos casos de reacción anafiláctica grave a los frutos de cáscara. Estas incluyen la superfamilia de las prolaminas (incluidas las albúminas 2S) y la superfamilia de las cupinas, formada por las proteínas del grupo de las leguminas (las globulinas 11S) y las vicilinas (las globulinas 7S). Otras proteínas de los frutos de cascara son las conocidas como panalérgenos, donde se incluyen las proteínas de transferencia de lípidos (LTP), las profilinas (proteínas estructurales), las proteínas relacionadas con la patogénesis y las heveínas. Estas proteínas son similares a las del polen, las semillas, las I. INTRODUCCIÓN 25 frutas y las verduras, y están asociadas a la reactividad cruzada mediada por la IgE. La sensibilización a estas proteínas puede dar lugar al Síndrome de Alergia alimentaria Oral (SAO), aunque también es posible que se produzcan reacciones sistémicas, especialmente en el caso de las LTP y albúminas 2S (Weinberger y Sicherer, 2018). Tabla I.1. Proteínas alergénicas de los frutos de cáscara (Fuente: Weinberger y Sicherer, 2018). FC Familia Nombre Tipo Relevancia Clínica Avellana Panalérgenos Cor a 1 PR-10 Homólogo de Bet v 1; SAO Cor a 2 Profilina Homólogo de Bet v 2; SAO Cor a 8 LTP Reacciones sistémicas en niños de áreas Mediterráneas PA Cor a 9 Globulina 11S Reacciones sistémicas Cor a 11 Globulina 7S Cor a 14 Albúmina 2S Reacciones sistémicas Anacardo PA Ana o 1 Globulina 7S Ana o 2 Globulina 11S Ana o 3 Albúmina 2S Reacciones sistémicas Pistacho PA Pis v 1 Albúmina 2S Homólogo de Ana o 3; Reacciones sistémicas Pis v 2 Globulina 11S Homólogo de Ana o 2; Reacciones sistémicas Pis v 3 Globulina 7S Pis v 5 Globulina 11S Homólogo de Ana o 1 Nuez PA Jug r 1 Albúmina 2S Reacciones sistémicas Jug r 2 Globulina 7S Reacciones sistémicas Jug r 4 Globulina 11S Reacciones sistémicas Jug r 6 Vicilin-like cupin 7S Panalérgenos Jug r 3 nsLTP1 Reacciones sistémicas en individuos del Mediterráneo Jug r 5 Profilina Jug r 7 Profilina Jug r 8 nsLTP2 Pacana PA Car i 1 Albúmina 2S Homólogo de Jug r 1 Car i 2 Globulina 7S Reacciones sistémicas Car i 4 Globulina 11S Homólogo de Jug r 4 Almendra PA Pru du 6 Globulina 11S Panalérgenos Pru du 3 LTP Pru du 4 Profilina Piñón PA Pin p 1 Albúmina 2S Reacciones sistémicas Nuez de Brasil PA Ber e 1 Albúmina 2S Reacciones sistémicas Ber e 2 Globulina 11S PA, proteína de almacenamiento; SAO, síndrome de alergia oral; nsLTP, proteína de tranferencia de lípidos no específica. Esta Tesis se centra en el estudio de las proteínas alergénicas de nuez y pistacho, así como su detección en alimentos. I. INTRODUCCIÓN 26 El primer alérgeno identificado en la nuez fue Jug r 1, una proteína perteneciente a la familia de las albúminas 2S y que es similar a los alérgenos presentes en la nuez de Brasil (Ber e 1, 82 %), el ricino (89 %), la semilla de algodón (59 %) y la semilla de mostaza (45 %). El segundo alérgeno identificado fue Jug r 2, una globulina 7S que a pesar de tener un 70 % de secuencia de aminoácidos idéntica a Ara h 1, no presenta reactividad cruzada con las proteínas homólogas del cacahuete. En 2004 se identificó el alérgeno Jug r 3, una proteína de transferencia de lípidos (LTP) del extracto de nuez que se une mediante inmunotransferencia a la IgE del 91,3 % de los pacientes alérgicos a las nueces. Otra proteína alergénica de la nuez perteneciente a la familia de las leguminas, una globulina 11S, fue identificada por Teuber et al (1999) y denominada Jug r 4, que ha demostrado tener reacción cruzada con pacana, anacardo y avellana. Además, el 75 %, 78 % y 65 % de los sueros con IgE de pacientes alérgicos se unen a los alérgenos de la nuez, Jug r 1, Jug r 3 y Jug r 4, respectivamente, siendo Jug r 3 y Jug r 1 los alérgenos más potentes de la nuez (Pastorello et al., 2004; Rangsithienchai et al., 2013; Robotham et al., 2009; Roux et al., 2003; Teuber et al., 1999; Wallowitz et al., 2006). En el caso del pistacho, los alérgenos principales son Pis v 1 (albúmina 2S) y Pis v 2 (globulina 11S). Pis v 1, que pertenece a la familia de las albúminas 2S, muestra una similitud estructural con los alérgenos del anacardo con un 64 % de identidad de secuencia con Ana o 3 y un 48 % con Ana o 2 (Robotham et al., 2005; Wang et al., 2003). Pis v 2 tiene homología con Jug r 4 de la nuez (50 %), Cor a 9 de la avellana (47 %) y Ber e 2 de la nuez de Brasil (46 %). El 68 y el 50 % de los pacientes con alergia al pistacho muestran reacción cruzada de Ig frente a Pis v 1 y Pis v 2, respectivamente. Por otra parte, Pis v 3 (similar a una vicilina 7S) y Pis v 5 (subunidad ácida de la globulina 11S) están reconocidas como alérgenos menores del pistacho, ya que su unión a IgE no supera el 40 % en pacientes alérgicos (Ahn et al., 2009; Beyer et al., 2002; Geiselhart et al., 2018; Noorbakhsh et al., 2011; Wallowitz et al., 2006; Willison et al., 2008). Como se ha comentado, la sensibilización alimentaria es un paso previo al desarrollo de la alergia alimentaria. La sensibilización suele comenzar en la infancia y da lugar a la producción de anticuerpos específicos de tipo inmunoglobulina E contra determinados alimentos. Los patrones de sensibilización y cosensibilizacion a los componentes de la nuez o el pistacho muestran claras diferencias geográficas en la población alérgica europea. La sensibilización a la nuez relacionada con el polen de abedul (Jug r 5) predomina en el norte y centro de Europa, mientras que la sensibilización a la proteína de transferencia de lípidos (Jug r 3) predomina en el sur de Europa. La sensibilización a la profilina (Jug r 7) es I. INTRODUCCIÓN 27 frecuente en toda Europa. Finalmente, la sensibilización a las proteínas de almacenamiento (Jug r 1, 2, 4 y 6) se ha detectado hasta en el 10 % de los sujetos analizados (Lyons et al., 2021). Con respecto al pistacho, los estudios disponibles se realizaron en grupos muy pequeños, en pacientes con alergia al anacardo y al pistacho, en los que se investigó la reactividad cruzada entre el principal alérgeno del anacardo (Ana o 1) y Pis v 3. Estos estudios sugieren que el anacardo es el principal sensibilizador, pero al encontrar un paciente alérgico al pistacho y no al anacardo, se planteó la posibilidad de que el pistacho pueda ser ocasionalmente el principal sensibilizador (Andorf et al., 2017; Van der Valk et al., 2017). Los fenómenos de cosensibilización y/o reactividad cruzada entre los alérgenos del pistacho y del anacardo son bastante frecuentes, ya que los pacientes sensibilizados presentan IgE específicas frente a ambos frutos de cáscara, que reconocen proteínas homólogas en el pistacho y el anacardo (Uotila et al., 2016). I.1.3. Marco legislativo: Información alimentaria facilitada al consumidor Todo consumidor tiene derecho a que los alimentos que compre cumplan con la normativa de seguridad alimentaria en cuanto al etiquetado de los alimentos, indicando la presencia de alérgenos en ellos. El Codex Alimentarius, creado en 1962 por la Organización de las Naciones Unidas para la agricultura y la alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), establece las normas y directrices que deben aplicarse en todos los países a fin de garantizar la seguridad alimentaria. Sin embargo, la aplicación concreta de dicha normativa difiere en los distintos países/continentes. Los principales alérgenos o grupos de alérgenos (leche, huevo, pescado, cacahuetes, frutos secos, soja, crustáceos, mariscos y cereales con gluten) contenidos en los productos comerciales en cualquier cantidad deben declararse en las etiquetas en Europa, Estados Unidos, Canadá, Australia, Nueva Zelanda, China, Sudamérica y Sudáfrica. Debido a que los frutos secos son uno de los 8 grupos responsables de un gran número de reacciones alérgicas, están incluidos en la lista de alimentos alergénicos con etiquetado obligatorio en la mayoría de los países/regiones (por ejemplo, EE.UU., Canadá, UE), a excepción de Japón y Corea. Sin embargo, algunos alimentos como el altramuz, los cereales, el apio, la mostaza, el sésamo, el melocotón o el tomate solo deben declararse en determinados países o continentes (Fierro et al., 2017; Gendel, 2012; López, 2018; Taylor y Baumert, 2015; Taylor y Hefle, 2006). Debido a la falta de consenso existente para determinar cuál es la dosis umbral de los alérgenos, se ha producido cierto abuso por parte de la industria alimentaria en el uso del etiquetado precautorio como las advertencias del tipo “puede contener”. Esto, junto con el I. INTRODUCCIÓN 28 hecho de que no existen directrices homologadas para determinar el nivel de riesgo del alérgeno en la industria, provoca que cada fabricante tenga diferentes métodos para identificar e interpretar el riesgo de la presencia de alérgenos. Además, dependiendo del país de donde proceda el alimento, el etiquetado de alérgenos varía considerablemente. Globalmente, los países y zonas pueden caracterizarse por tener un etiquetado obligatorio de alérgenos alimentarios, un etiquetado voluntario de alérgenos alimentarios o ninguna regulación. En los países que tienen requisitos de etiquetado de alérgenos alimentarios estrictos, identifican diferentes alérgenos prioritarios basándose, en su mayoría, en investigaciones científicas sobre la prevalencia de alérgenos realizadas en esos países. Otros países utilizan un "proceso de adopción" adoptando total o parcialmente una o varias regulaciones bien reconocidas, como las regulaciones establecidas por la autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) en la Unión Europea, el Codex Alimentarius o la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA)(Diao, 2017). En septiembre de 2020, la Comisión del Codex Alimentarius (CXC 80-2020) publicó la versión revisada de su Norma mundial sobre principios generales de higiene de los alimentos (CXC 1-1969). Como principio general se introdujo el concepto de cultura de seguridad alimentaria, que promueve la seguridad alimentaria mejorando la toma de conciencia y el comportamiento de los empleados en las empresas alimentarias. Además, se ha añadido al Codex Alimentarius que los alimentos no preenvasados en los comercios minoristas de alimentación también deben incorporar el etiquetado de alérgenos, y que se deben conocer y declarar los alérgenos importantes de otros países donde se exportan los productos (FAO et al., 2020). Finalmente, el concepto de cultura de seguridad alimentaria para la reducción de los alérgenos alimentarios se introdujo en el Reglamento (UE) 2021/382 (Comisión Europea, 2021). En Europa, la alergia alimentaria es un problema creciente de salud pública que afecta a más de 17 millones de personas, sobre todo niños y jóvenes, con consecuencias que pueden variar desde benignas hasta potencialmente mortales. Por ello, la EFSA considera la investigación en métodos para la detección y cuantificación de alérgenos en alimentos una línea prioritaria de actuación, con el fin de facilitar el análisis del riesgo y poder establecer en el futuro umbrales de concentraciones de alérgenos en los alimentos que protejan a la población sensible (EFSA, 2017). Teniendo en cuenta que la única medida eficaz para evitar las reacciones alérgicas a los alimentos en personas predispuestas es la exclusión estricta de los alérgenos de la dieta, el Reglamento Europeo (UE) 1169/2011 y el Real Decreto 126/2015 sobre información alimentaria facilitada al consumidor, establecen I. INTRODUCCIÓN 29 los 14 alérgenos que obligatoriamente deben declararse en el etiquetado de los alimentos, estén o no envasados (Figura I.5). Éstos deben destacarse del resto de los ingredientes listados en los alimentos procesados, independientemente de su cantidad. Sin embargo, esta lista puede incorporar en un futuro próximo nuevas dianas que las evidencias científicas relacionen con un aumento de la prevalencia de procesos alérgicos (European Union, 2011; Ministerio de la Presidencia, 2015). Figura I.5. Representación de los 14 grupos de ingredientes de declaración obligatoria recogidos en el Reglamento (UE) 1169/2011 (Anexo II) por causar alergias o intolerancias alimentarias. I.1.3.1. Planes de control de alérgenos Teniendo en cuenta el alto número de personas alérgicas, la confección de un plan para controlar los alérgenos en cualquier industria alimentaria, incluidas las de hostelería, es una labor imprescindible. Este plan debe inculcar tanto a la industria alimentaria como al personal de cocina y de sala, la importancia de formar y concienciar sobre el tema de los alérgenos y sus implicaciones a nivel sanitario y económico, así como el peligro que supone la contaminación cruzada por una incorrecta manipulación de los alimentos. Los objetivos principales del plan de control de alérgenos son garantizar: (1) que los productos que contienen alérgenos están correctamente etiquetados, y (2) que ningún producto contiene I. INTRODUCCIÓN 30 alérgenos no declarados. A su vez, es imprescindible conocer cuáles son los alérgenos en cada materia prima que se va a emplear para preparar los alimentos o productos comerciales. Igualmente importante y necesario es implementar una gestión específica de proveedores relacionada con alérgenos, contar con listas de compra de alimentos alérgenos y requerir toda la información relacionada con la presencia de alérgenos en todos los productos que se suministran. Es decir, se debe exigir a los proveedores que certifiquen la ausencia de alérgenos en las materias primas, ya que la correcta gestión de los alérgenos depende de su autenticidad. Para facilitar la gestión de alérgenos en las industrias alimentarias y el cumplimiento de la normativa sobre declaración de alérgenos en el etiquetado, diversas instituciones, como la Agencia Europea de Alimentos y Bebidas (FDE, FoodDrink Europe), el British Retail Consortium (BRC), la Agencia Española de Seguridad alimentaria y Nutrición (AESAN) y la FDA (Food and Drug Administration), ofrecen guías para el control de alérgenos. Las industrias registradas ante la FDA deben realizar controles preventivos adecuados y evitar la inclusión de alérgenos no declarados en los alimentos. Además, deben monitorizar la correcta implementación de las medidas preventivas y formular acciones correctivas si esto no sucede. El BRC publicó una guía de buenas prácticas para el manejo de alérgenos en 2014, cuyo objetivo es ayudar a desarrollar un sólido sistema de manejo de alérgenos. La Agencia Española de Consumo, Seguridad alimentaria y Nutrición (AECOSAN) publicó en 2015 una guía cuyo objetivo es ayudar a los operadores alimentarios y autoridades responsables a comprender y aplicar el Real Decreto 126/2015 por el que se aprueba la norma general relativa a la información alimentaria de los alimentos que se presenten sin envasar para la venta al consumidor final y a las colectividades, de los envasados en los lugares de venta a petición del comprador, y de los envasados por los titulares del comercio al por menor (Ministerio de la Presidencia, 2015). Por último, el Diario Oficial de la Unión Europea ha publicado recientemente la comunicación de la Comisión Europea (2022/C355/01) sobre la aplicación de sistemas de gestión de la seguridad alimentaria que contemplan buenas prácticas de higiene (BPH) y procedimientos basados en los principios del APPCC. Su finalidad es facilitar y armonizar la aplicación de los requisitos de la UE sobre las BPH y los principios del APPCC como parte de los sistemas de gestión de la seguridad alimentaria y hace especial énfasis en la gestión de alérgenos. Además, establece las medidas de control para prevenir la contaminación cruzada por alérgenos tanto en la producción primaria como en las fases posteriores de la cadena alimentaria y da pautas acerca de la utilización del etiquetado precautorio de alérgenos, que solo debe utilizarse en el caso de que no pueda aplicarse de manera eficiente una estrategia preventiva y el I. INTRODUCCIÓN 31 producto pueda presentar un riesgo para los consumidores alérgicos (Comisión Europea, 2022). Por otro lado, la aparición de métodos de detección cada vez más sensibles está aumentando el número de alimentos en los que se detectan alérgenos y a niveles muy bajos. Esto ha resultado en una reducción en el número de alimentos etiquetados como "libres de alérgenos", lo que significa que la variedad de alimentos disponibles para los consumidores alérgicos se ve reducida. I.2. MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE ALÉRGENOS Para las personas alérgicas, la presencia de alérgenos no declarados en los alimentos, incluso la presencia de trazas de alérgenos debida a la contaminación durante el procesamiento de los alimentos supone una gran amenaza para su salud. Por lo tanto, a falta de tratamientos eficaces para evitar el desencadenamiento de una reacción adversa potencialmente grave, los pacientes alérgicos y los proveedores de alimentos deben disponer de métodos de detección rápidos y sencillos para asegurar el cumplimiento de la legislación sobre el etiquetado de alérgenos en los alimentos. Un método eficaz debe tener una especificidad y una sensibilidad excelentes, ya que una gran variedad de componentes alimentarios puede interferir con el ensayo, y para algunas personas una dosis baja es suficiente para provocar reacciones graves (Monaci et al., 2020). Los métodos analíticos rápidos son necesarios para facilitar la detección fiable de alérgenos por parte de los laboratorios de control de las industrias alimentarias y determinar si un alimento ha sufrido contaminación cruzada y, además, para identificar cómo y cuándo se ha producido esta contaminación (Prado et al., 2016). La detección de ingredientes alergénicos puede basarse en una detección directa de las proteínas alergénicas, principalmente mediante métodos inmunoquímicos como las técnicas inmunoenzimáticas ELISA y dispositivos de flujo lateral (DFL). Otros métodos que también se pueden emplear son los biosensores de proteína, la espectrometría de masas y la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). También se puede realizar detección indirecta de alérgenos mediante la detección de fragmentos de ADN/ARN específicos de la especie de interés, por técnicas como PCR convencional o en tiempo real, biosensores de ácidos nucleicos o técnicas de MLPA (amplificación múltiple dependiente de ligación). Los métodos de detección más empleados en la industria incluyen los ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) I. INTRODUCCIÓN 32 y la espectrometría de masas, métodos que están actualmente disponibles comercialmente para la detección alérgenos (Flanagan, 2015). No obstante, hay que tener en cuenta que, dependiendo de la diana elegida, la capacidad de la técnica para detectar proteínas puede verse afectada por el procesado al que se somete el alimento. I.2.1. Técnicas basadas en la detección de proteínas I.2.1.1. Inmunoensayos Los inmunoensayos están basados en la alta afinidad y las interacciones específicas de los anticuerpos con sus correspondientes dianas proteicas (antígenos, en este caso alérgenos). Los ensayos inmunoenzimáticos como la técnica de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) han sido los métodos analíticos más utilizados por la industria alimentaria y las agencias reguladoras para controlar los residuos de alérgenos de forma rutinaria, debido a su sensibilidad y especificidad y a tener un manejo sencillo (Jayasena et al., 2015). El dispositivo de flujo lateral (DFL) es un formato ideal como prueba de campo, muy utilizado por la industria alimentaria, ya que permite determinar rápidamente la presencia de alérgenos. I.2.1.1.1. ELISA Debido a su simplicidad y alta sensibilidad, ELISA es la técnica más comúnmente empleada en la gestión de riesgos de seguridad alimentaria para la detección de alérgenos alimentarios. La técnica ELISA se basa en el reconocimiento y la unión de regiones específicas de los antígenos (epítopos) a anticuerpos específicos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, obtenidos a partir de animales inmunizados, o recombinantes (obtenidos in vitro). La unión del antígeno y el anticuerpo se detecta utilizando una enzima unida al antígeno, al anticuerpo específico o a un anticuerpo secundario, que convierte el complejo antígeno-anticuerpo en un producto coloreado cuando se añade el sustrato enzimático. Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa de rábano (HRP) o la fosfatasa alcalina, que pueden actuar sobre sustratos específicos para producir cambios de color dependientes de la concentración (Sena-Torralba et al., 2020). Los analitos pueden ser cualquier alérgeno alimentario o una mezcla de varios alérgenos y pueden detectarse y cuantificarse en matrices alimentarias complejas. Sin embargo, los métodos ELISA, que se basan en la interacción específica entre los anticuerpos y los antígenos, pueden dar en ocasiones resultados inexactos debido a la reacción cruzada del I. INTRODUCCIÓN 33 anticuerpo con las proteínas de otros alimentos. Por lo tanto, la elección del anticuerpo y de la proteína objetivo son los factores determinantes para la eficacia de la detección (Holzhauser et al., 2020; Xu et al., 2022). Existen diversos formatos de ELISA, que se pueden clasificar en competitivo y no competitivo (Figura I.6). Estos dos tipos de ensayos se utilizan dependiendo del propósito de los experimentos y también de los tipos de anticuerpos y antígenos (Konstantinou, 2017). Figura I.6. Representaciones gráficas de los diferentes tipos de ELISAs. Se han desarrollado numerosos ELISAs para la detección y cuantificación de proteínas alergénicas en varios productos alimentarios, como un ELISA tipo sándwich que detecta el alérgeno 2S de soja mediante un anticuerpo monoclonal altamente específico y sin reacciones cruzadas, cuyo límite de detección (LOD) se encuentra entre 1-10 ppm (o mg Kg−1) (Ueberham et al., 2019). Otro ELISA tipo sándwich fue desarrollado para detectar residuos de pistacho tanto crudos como tostados en alimentos, utilizando antisueros de oveja como reactivo de captura y antisueros de conejo como reactivo detector marcado con fosfatasa alcalina. El ELISA optimizado tenía un límite de cuantificación (LOQ) de <1 ppm, con una reactividad cruzada con el anacardo equivalente a 4 ppm de pistacho tostado (Lim, 2010). I. INTRODUCCIÓN 34 También se han desarrollado multitud de kits comerciales para la detección de alérgenos de frutos de cáscara (Sena-Torralba et al., 2020). Un ejemplo de ello, es el kit de ELISA directo Monotrace mediante anticuerpo monoclonal específico de pacana, que no presenta reacciones cruzadas y un LOD de 0,5 ppm (Liu et al., 2017). Conviene señalar que el método de extracción y la solución estándar de alérgenos son aspectos cruciales en la aplicación de cualquier ELISA, y estos carecen de estandarización, lo que dificulta la comparación de los resultados entre diferentes kits. A su vez, la solubilidad de la proteína difiere significativamente si se trata de ingredientes crudos o después del procesamiento de los alimentos, debido a la formación de agregados de proteína, la desnaturalización o la modificación química que sufren las proteínas (Monaci et al., 2020; Verhoeckx et al., 2015). En la Tabla I.2. se recogen los kits comerciales disponibles para la detección de nuez y pistacho, y sus principales características. Tabla I. 2. Listado de Kits comerciales en diferentes formatos para la detección de nuez y pistacho (elaboración propia). Kit Comercial Formato Código Reactividad Cruzada LOD ppm Analito Romer Labs AgraQuant Sandwich ELISA COKAL0948 0,35 Nuez Romer Labs AgraStrip Lateral flow device COKAL0910AS 10 Nuez RIDASCREEN R- Biopharm Lateral flow device BL607-10/-25 Pacana 100, Anacardo 1, Pistacho 0,1 10 Nuez Biofront technologies monoclonal antibody-based ELISA assay Pacana (0,0023 %), judía adzuki (0,002 %), colza (0,0014 %), y nuez moscada (0,0018 %) 0,22 Nuez Cortez Diagnostics, INC. Sandwich ELISA Soja 0,003 %, Piñón 0,003 %, Pistacho 0,003 %, Sésamo 0,003 %, Nuez de Brasil 0,003 %, Avellana 0,022 %, Castaña 0,11 %, Pecan 0,80 % 0,35 Nuez Arigo Biolaboratories ELISA Kit ARG80818 0,35 Nuez I. INTRODUCCIÓN 35 Tabla I.2. Continuación. Antibodies online ELISA Kit ABIN997097 0,35 Nuez Elution technologies- Equilabo ELISA Kit LOQ 2 Nuez Astorilab ELISA Kit AST601396 Nuez BioKits Neogen Assay Kit 902085J 0,25 Nuez Biosystems ELISA kit 0,35 Nuez Aler-tox Biomedal KT-5909 0,6 Nuez RIDASCREEN Biopharm Lateral flow device BL611-10/-25 Nuez de brasil 0,1, anacardo 4, avellana 0,1, calabaza 0,1, nuez 0,8 1 Pistacho Romerlab AgraQuant Plus Sandwich ELISA COKAL2748F anacardo (12 %), avellana (0,17 %), nuez (0,0008 %), pacana (0,0005 %), girasol (0,0002 %) 1 Pistacho Romerlab AgraQuant Sandwich ELISA COKAL2748 anacardo (12 %), avellana (0,17 %), nuez (0,0008 %), pacana (0,0005 %), girasol (0,0002 %) 0,13 Pistacho Romerlab Agrastrip Lateral flow device COKAL1310AS 2 Anacardo/ Pistacho Cortez Diagnostics ELISA Kit Rapidtest 12 % 0.13 Pistacho Arigo Bio ELISA Kit ARG80811 0,13 Pistacho Antibodies online ELISA Kit ABIN2683231 12 % 1-40 Pistacho Elution techonologies ELISA Kit < 1 % 1 Pistacho Astorilab ELISA kit AST601996 12 % -- Pistacho Biosystems ELISA kit cod14127 12 % 0,13 Pistacho Biomedal Alertox Sandwich ELISA 12 % 0,13 Pistacho Biofront technologies ELISA Kit 96 wells 0,001 % pacana 0,12 Pistacho Immunolab PIS-E01 Anacardo 4 % 0,13 Pistacho Equilabo Generon well strips 12x8 ETE-75PST < 1 % 3,249 Pistacho I. INTRODUCCIÓN 36 I.2.1.1.2. Dispositivos de flujo lateral (DFL) Se trata de una herramienta semicuantitativa para la detección de alérgenos alimentarios, que utiliza señales visuales para indicar los resultados de las pruebas de forma rápida y sencilla. Es la forma de inmunoensayo más utilizada dentro de la industria alimentaria. Al igual que el ELISA, el DFL funciona según el principio de la interacción específica entre los alérgenos y los anticuerpos, pero la señal visual se basa en las partículas coloreadas recubiertas de anticuerpos (Figura I.7). El DFL consiste en una membrana con un depósito donde se aplica la muestra líquida que contiene los anticuerpos o antígenos que queremos detectar, y una ventana de reacción que generalmente consta de una línea de prueba (línea T) y una línea de control (línea C). Tras dejar caer una solución en el depósito sobre la membrana, el líquido se difunde por la membrana hacia las zonas T y C. Para garantizar la validez del dispositivo, el anticuerpo de detección se conjuga con oro y se seca en una almohadilla de fibra (almohadilla de oro). La almohadilla donde va la muestra proporciona los tampones optimizados necesarios para la realización de la prueba. La tira también contiene una almohadilla de mecha que proporciona la difusión necesaria para que los fluidos se muevan a través de la membrana. Cuando se aplica una muestra positiva a la tira, el antígeno objetivo de la muestra se une primero al anticuerpo marcado con oro y fluye a través de la membrana, formando un sándwich con el anticuerpo de captura presente en la línea de prueba. Esto da lugar a la formación de una línea visible, y el resultado se interpreta como positivo. El exceso de anticuerpo marcado con oro se desplaza y se une al anticuerpo anti-conjugado en la línea de control y se desarrolla la segunda línea. Esta segunda línea, a menudo denominada línea de control, sirve como control interno. El resultado es negativo si sólo está presente la línea de control (Baumert y Tran, 2015; Grothaus et al., 2006; Xu et al., 2022). La primera aplicación, y una de las más populares, de este formato fue el uso de la gonadotropina coriónica humana (HCG) para la detección del embarazo. Actualmente, la principal aplicación de los DFL es en la gestión de alérgenos, para la detección de residuos de éstos en superficies y poder evaluar el riesgo de contaminación cruzada en líneas de producción compartidas en las industrias alimentarias. La primera versión aplicada al campo de los alérgenos alimentarios fue ideada por Mills, Potts, Plumb, Lambert y Morgan (1997) para detectar proteínas de cacahuete. Desde entonces, se han desarrollado y comercializado numerosos DFL para la detección de alérgenos alimentarios en productos crudos y también en productos procesados. Actualmente se dispone de algunos kits comerciales para la detección de almendras, avellanas, mariscos, gluten, cacahuetes, leche, I. INTRODUCCIÓN 37 soja y huevo, con LODs que van de 1 a 25 ppm. Sin embargo, al igual que en el ELISA, el rendimiento de los DFL se puede ver afectado por los efectos del procesamiento y de la matriz (Mills et al., 1997; Monaci et al., 2020; Prado et al., 2016; Schubert-Ullrich et al., 2009). Figura I.7. Diagrama del dispositivo de flujo lateral (DFL). El dispositivo de flujo lateral consiste en una membrana de nitrocelulosa sobre un material de soporte con un anticuerpo de captura específico del antígeno en una línea de prueba (T) y un anticuerpo anti-conjugado en una línea de control (C). S: muestra. Los DFL pueden ser tan sensibles como los ELISA. Son pruebas de naturaleza cualitativa, baratas, rápidas y fáciles de usar por lo que no requieren personal especializado. Una ventaja adicional de los DFL es que su uso no requiere una instrumentación compleja, lo que los hace adecuados para su uso sobre el terreno, como en instalaciones de equipos industriales y de restauración. Sin embargo, no están diseñados para la automatización en el laboratorio de análisis e identificación de un gran número de muestras (Popping et al., 2010). I.2.1.2. Cromatografía y espectrometría de masas La cromatografía y la espectroscopia de masas (MS) representan esencialmente la combinación de métodos de separación y detección, basados en las diferencias de las propiedades físicas y químicas de los componentes de los alimentos. Es un sistema potencialmente adecuado para la detección múltiple de alérgenos alimentarios, por su alta precisión, reproducibilidad, eficiencia y especificidad (Costa et al., 2016; Holzhauser et al., I. INTRODUCCIÓN 38 2020). La MS es capaz de detectar con precisión rastros de frutos de cáscara horneados a temperaturas que alcanzan 150 °C, evitando los problemas de desnaturalización parcial, disminución de solubilidad y reactividad cruzada de las muestras que aparecen en ocasiones en los inmunoensayos (Perner et al., 2019). Los métodos basados en la espectrometría de masas representan la alternativa más reciente a los enfoques convencionales basados en anticuerpos. En particular, el acoplamiento entre la espectrometría de masas y la cromatografía líquida ha demostrado ser un éxito en la detección y cuantificación de alérgenos alimentarios. Sin embargo, su aplicación requiere el uso de equipos costosos, altos costes de mantenimiento y requiere personal cualificado. Por lo tanto, la tecnología MS no es adecuada para el análisis de rutina de alérgenos en los alimentos. Sin embargo, se puede utilizar como método auxiliar para confirmar los resultados obtenidos por otros métodos. El procedimiento experimental incluye la extracción/purificación de proteínas de alimentos potencialmente contaminados, su digestión con tripsina y la detección por LC-MS de los péptidos prototípicos en condiciones instrumentales adecuadas. Cada paso necesita una optimización adecuada durante el desarrollo del método para garantizar el mejor rendimiento en términos de sensibilidad, especificidad y robustez (Monaci et al., 2020; Monaci y Visconti, 2009). Las técnicas más empleadas en espectrometría de masas para generar iones son las de MALDI (desorción/ionización láser asistida por matriz, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) y ESI (ionización por electroespray, Electrospray Ionization). A continuación, los iones generados se separan en función de su relación masa/carga (m/z). El analizador puede ser de tiempo de vuelo (TOF, Time of Flight), cuadrupolo (Q, quadrupole) o de trampa iónica (IT, Ion Trap)(Johnson et al., 2011; Monaci y Visconti, 2009). Finalmente, el detector registra el número de iones para cada valor m/z. La técnica de espectrometría de masas requiere una etapa de separación previa, que puede ser electroforesis en gel o cromatografía líquida, para simplificar la mezcla compleja de péptidos y proteínas que constituyen la muestra, y que se van a analizar en el espectrómetro. En función del procesado de la muestra se distinguen dos estrategias diferentes conocidas como bottom up y top down, dependiendo del nivel de información que se necesite obtener. Mientras que el primer enfoque requiere una etapa de digestión con una o más enzimas proteolíticas para aumentar la cobertura de péptidos, el segundo analiza las proteínas intactas y sus productos de fragmentación (Monaci y Visconti, 2009; Prado et al., 2016). Utilizando péptidos digeridos con tripsina con una secuencia y tamaño específicos de múltiples alérgenos alimentarios como péptidos distintivos de cada alérgeno, New et al I. INTRODUCCIÓN 39 (2018) desarrollaron una técnica de LC-MS/MS que puede analizar simultáneamente la clara de huevo, la leche desnatada, el cacahuete, la soja y los frutos secos. La técnica mostró una alta recuperación (60-119 %), repetibilidad (CV <20 %) y sensibilidad, con un LOD de 10 ppm para cada alérgeno en galletas y pan procesados, cumpliendo así los requisitos mínimos de rendimiento establecidos por la Association of Official Analytical Chemists International (New et al., 2018). I.2.1.3. Biosensores Un biosensor es un dispositivo que emplea propiedades de reconocimiento biológico para un bioanálisis selectivo (Kumar, 2008). El principal objetivo de la investigación en este campo es el desarrollo de sistemas lab-on-a-chip que permitan el análisis rápido, sensible y económico de las muestras. Este hecho convierte a los biosensores en una alternativa interesante para ser utilizada por pequeños laboratorios de control o para realizar análisis rápidos in situ por la industria. En la Tabla I.3 se presentan algunos ejemplos de biosensores desarrollados para la detección de alérgenos en alimentos. Tabla I.3. Ejemplos de inmunosensores para la detección de alérgenos en alimentos. Sensor Diana LOD Referencia SPCE-nAu (electrodos cabono) Ara h 1 (cacahuete) 3,8 ng mL−1 Alves, Pimentel, Nouws, Marques, et al., 2015 SPCE-nAu Ara h 6 (cacahuete) 0,27 ng mL−1 Alves, Pimentel, Nouws, Correr, et al., 2015 SPCE Ara h 1 (cacahuete) 3,5 ng mL−1 Freitas, Nouws y Delerue-Matos, 2021 SPCE-nanodiamantes Ara h 1 (cacahuete) 0,78 ng mL−1 Freitas et al., 2022 Electroquímico COOH- MBs-HRP Sin a 1 (mostaza) 0,82 ng mL−1 Gamella et al., 2020 Au-SPR + prisma cristal y Au-SPE Cor a 14 (avellana) 1 mg Kg−1 Costa et al., 2021 Au-SPEs (individual y array de 8×SPEs) Gliadina, Ara h 1, Cor a 1, Caseína, Ovoalbúmina/Gluten, cacahuete, avellana, leche y huevos Gliadina: 0,075 mg Kg−1 Ara h 1: 0,007 mg Kg−1 Cor a 1: 0,089 mg Kg−1 Caseína: 0,170 mg Kg−1 Ovoalbúmina: 0,003 mg Kg−1 Lin et al., 2017 Los biosensores constan de tres componentes: un receptor biológico específico para el analito que se va a detectar, un transductor para convertir el elemento de reconocimiento I. INTRODUCCIÓN 40 en una señal adecuada y un dispositivo lector con la electrónica asociada o los procesadores de señales que son responsables de la visualización de los resultados. Las moléculas diana, como las proteínas o el ADN, pueden inmovilizarse en la superficie de un chip sensor y la actividad de unión entre las moléculas reconocidas puede monitorizarse cuantitativamente, es decir, permite medir una interacción molecular específica en tiempo real (Schubert- Ullrich et al., 2009). La detección y la cuantificación se logran mediante diversas técnicas fisicoquímicas, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial (SPR), la absorción mejorada por resonancia (REA) o los sensores de fluorescencia de onda evanescente, por nombrar algunas. En función de la naturaleza del transductor empleado, los biosensores se pueden clasificar en: ópticos, electroquímicos, piezoeléctricos y termométricos. Los biosensores ópticos se basan en la medición del cambio que se produce en la superficie del sensor cuando el analito se une al elemento de reconocimiento del dispositivo. Dentro de este grupo destacan los biosensores basados en la resonancia de plasmones superficiales (SPR, surface plasmon resonance). Esta técnica mide el ángulo SPR producido por una reducción abrupta en la intensidad de luz reflejada cuando un haz de luz incide con un ángulo específico sobre la lámina delgada de oro donde se encuentra el analito y a través de un prisma, interactúa con los electrones libres del metal (plasmones de superficie). El ángulo SPR varía en función del índice de refracción del medio dieléctrico. Este tipo de biosensores son especialmente atractivos en el ámbito de la seguridad alimentaria, puesto que permiten la detección del analito en matrices alimentarias complejas con un mínimo procesado de la muestra (Narsaiah et al., 2012; Tang et al., 2010). Los sensores electroquímicos presentan una alta sensibilidad, especificidad y sencillez de funcionamiento, y su tiempo de detección es en la mayoría de los casos tan corto como el de los DFL, lo que demuestra su potencial para el control de alérgenos en los alimentos. Los sensores electroquímicos pueden clasificarse en función del modo de transducción de la señal electroquímica en amperométricos, voltamétricos y de impedancia. Los sensores amperométricos para la detección de alérgenos suelen basarse en partículas magnéticas y electrodos de carbono serigrafiados desechables (Ruiz-Valdepeñas Montiel et al., 2016). En los sensores impedimétricos, un procedimiento clave es la espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) que consiste en la aplicación de un leve estímulo de voltaje de corriente alterna, pudiendo reflejar las propiedades eléctricas de la superficie del electrodo del sensor, permitiendo la monitorización directa de la interacción entre el biorreceptor y su diana (Trashin et al., 2015). Al igual que los sensores de impedancia, los sensores voltamétricos pueden monitorear la unión de biomoléculas en la superficie del electrodo I. INTRODUCCIÓN 41 utilizando técnicas voltamétricas, como la voltametría de onda cuadrada (SWV) y la voltametría de pulso diferencial (DPV) (Eissa et al., 2013; Kilic et al., 2020). En los últimos años, los biosensores han encontrado una atención creciente en el análisis de alimentos y la detección de alérgenos alimentarios, debido a la disponibilidad comercial de plataformas y kits SPR especiales (por ejemplo, Biacore Q, GE Healthcare y Spreeta, Texas Instruments). Los LODs conseguidos con estos biosensores son comparables a los de los ELISA tradicionales y están en el rango de 1 a 10 mg Kg−1 (Xu et al., 2022). I.2.2. Técnicas basadas en la detección de ADN Las técnicas basadas en el ADN presentan la ventaja de que el ADN se ve menos afectado que las proteínas por las operaciones de procesado, encontrándose normalmente intacto tras someterse a temperaturas de cocinado. Además, para el ADN se pueden emplear tampones de extracción más agresivos que los usados para la extracción de proteínas evitando afectar a su integridad. Por otra parte, el contenido de ADN suele ser más estable que los niveles de proteínas de la muestra, que pueden variar entre distintas especies o variedades. Un inconveniente citado con frecuencia en esta metodología es que algunos componentes de la matriz alimentaria pueden afectar al análisis y a la amplificación del ADN (López-Calleja, de la Cruz, González, et al., 2015b; Poms et al., 2004). I.2.2.1. PCR y PCR en tiempo real La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es capaz de amplificar y detectar específicamente secuencias de ácidos nucleicos de plantas o animales que se utilizan en la fabricación de alimentos. Aunque las proteínas son las que provocan las reacciones alérgicas de tipo inmediato a los alimentos, la detección basada en ácidos nucleicos permite al analista identificar y cuantificar de forma indirecta la presencia del alimento alergénico en el que se encuentran, para cumplir con los requisitos de etiquetado de los alimentos o para identificar los llamados alérgenos ocultos. Las dianas de ADN para estos casos pueden ser los genes que codifican una proteína alergénica o cualquier otro marcador de ADN específico (Prado et al., 2016). I. INTRODUCCIÓN 42 Tabla I.4. Principales aplicaciones de técnicas de PCR para la detección de alérgenos alimentarios. Método Gen diana LOD Matriz Ref Alérgeno Nuez RT PCR, SybrGreen Jug r 3 100 ppm Productos comerciales Linacero et al., 2016 Pistacho RT PCR, SybrGreen Pis v 1 100 ppm Productos comerciales Sanchiz et al., 2017 LAMP (loop mediated isothermal amplification) Pis v 1 10 ppm Productos comerciales Mao et al., 2020 Anacardo LNA y TaqMan Ana o 1 10 ppm Productos comerciales Sanchiz, Ballesteros, et al., 2018 Piñón RT PCR, TaqMan Chloroplast tRNA-Leu 0,1 ppm Productos comerciales Garino et al., 2016 RT PCR, TaqMan ITS-1 de trigo, trigo sarraceno y cacahuetes 10 ppm Comida procesada Miyazaki et al., 2019 Cacahuete RT PCR, TaqMan Ara h 6 10 mg/Kg Cacahuetes tratados Sanchiz et al., 2021 Nuez y Almendra RT PCR, SybrGreen Jug r 1, Jug r 3 y Jug r 4 (matK) y almendra (Pru av 1) 1 pg (1,6 copias) Productos comerciales Houhoula et al., 2019 Anacardo y Macadamia RT PCR, TaqMan ITS de anacardo y macadamia 0,1 mg/Kg Productos comerciales López-Calleja, de la Cruz, González, et al., 2015a Nuez y Pacana RT PCR, TaqMan ITS de nuez y pacana 0,1 mg/Kg Productos comerciales López-Calleja, de la Cruz, González, et al., 2015b Pistacho RT PCR, TaqMan ITS de pistacho 0,1 mg/Kg Productos comerciales López-Calleja et al., 2014 Avellana RT PCR, TaqMan ITS de avellana 0,1 ppm Matrices alimentarias Lopez-Calleja et al., 2013 Gluten RT PCR, TaqMan ITS de trigo, cebada y centeno 10-50 mg/Kg Mezclas binarias García-García et al., 2019 Sésamo y Lino RT PCR, TaqMan ITS de sésamo y lino 1,3-1,4 mg/Kg Productos comerciales López-Calleja, de la Cruz, Martín, et al., 2015 Colza y Soja GMO duplex dropletdigital PCR (ddPCR) Fat A y Lectina 0,10 % Semillas Demeke, Lee y Eng, 2022 Tetraplex RT-PCR ITS1 o ITS2 de almendra, nuez de Brasil, anacardo, avellana, macadamia, pacana, pistacho y nuez 1 pg Frutos de cáscara no procesados Ito et al., 2018 Multiplex End point PCR Cor a 1, 2S albumin, Avenin, Ara h 2, Ana o3, B1 hordein, Gliadin, Gly, m Bd28K, 11S-1 50.000 μg/L 50ppm Avellana, pistacho, avena, sésamo, cacahuete, anacardo, cebada, trigo, soja y pacana Cheng et al., 2016 I. INTRODUCCIÓN 43 Se han utilizado varios enfoques basados en la técnica de PCR para la detección de ingredientes alergénicos, como la PCR a punto final, la PCR en tiempo real o cuantitativa y la PCR-ELISA. La PCR a punto final es el método más sencillo y probablemente el menos costoso para la amplificación del ADN. Sus principales inconvenientes son que este método de PCR requiere un paso adicional para la detección del producto de amplificación, que tradicionalmente se ha realizado mediante electroforesis en gel, y que este método es una técnica meramente cualitativa. La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR o real-time PCR) permite controlar la amplificación del ADN mientras se produce, ya que las señales (generalmente fluorescentes) pueden controlarse a medida que se generan durante la amplificación del ADN objetivo. Sin embargo, al tratarse de un método de detección indirecta, los resultados de la cuantificación se expresan como número de copias de ADN o concentración de ADN, por lo que deben diseñarse factores de conversión al contenido de proteínas para proporcionar información útil sobre el nivel real de contaminación de los ingredientes alergénicos. Además, aunque en menor medida que las proteínas, su precisión en el rastreo de ingredientes alergénicos en los alimentos también se ve afectada por el procesamiento de los alimentos que perjudica la estabilidad del ADN. Por último, también la composición de la matriz alimentaria plantea retos a la detección basada en el ADN, ya que los componentes, como la grasa, el azúcar, las proteínas y los metabolitos vegetales secundarios, pueden inhibir la reacción de la PCR (Higuchi et al., 1992; Linacero et al., 2019; Sharma et al., 2016). Estas técnicas se ven limitadas por la necesidad de equipos de laboratorio, por ejemplo, un termociclador, la complejidad de la operación y el grado de experiencia requerido (Xu et al., 2022). Aun así, es una de las técnicas más empleadas para la detección de ADN de alérgenos, virus, bacterias, etc., (Tabla I.4). La PCR-ELISA o ELOSA (enzyme-linked oligosorbent assay) es un ensayo híbrido que combina la PCR como primer paso y utiliza el ELISA como sistema de detección de los amplicones marcados (Figura I.8). Para ello, el gen de interés se amplifica mediante PCR en presencia de desoxiuridina trifosfato (dUTP) marcada con digoxigenina. Posteriormente, los productos de PCR se unen a sondas oligonucleotídicas específicas que están marcadas con biotina en su extremo 5’. Después, los amplicones biotinilados se unen a una placa de microtitulación recubierta de estreptavidina, donde se formarán complejos y solo los productos de PCR que contengan la secuencia de interés es la que se unirá, mientras que el resto se eliminará tras los lavados. Por último, se utiliza un anticuerpo anti-digoxigenina I. INTRODUCCIÓN 44 marcado con enzimas para producir una señal colorimétrica que puede medirse con un lector de ELISA. Este método se ha aplicado con éxito a la detección de <10 ppm de avellana en alimentos procesados e ingredientes alimentarios, lo que eliminó el potencial de reactividad cruzada observado en ELISA (Holzhauser et al., 2002; Popping et al., 2010; Sue et al., 2014). Figura 1.8. Representación esquemática de PCR-ELISA. La PCR-ELISA comienza con la PCR seguida de un ensayo inmunológico y la detección de la producción de color. El gen diana se amplifica en presencia de DIG-dUTP. Empleando la afinidad de la biotina con la avidina, el gen amplificado se inmoviliza en la placa y, finalmente, utilizando el anticuerpo secundario y el sustrato, se visualiza la producción de color. Debido al número de alérgenos alimentarios que pueden encontrarse en un alimento, la detección simultánea de diferentes ingredientes alergénicos es de gran interés para los laboratorios de control. Con este objetivo, se ha desarrollado una PCR múltiple donde se puede observar un tamaño de amplicón distinto para cada alérgeno. Como algunos termocicladores para PCR en tiempo real tienen la capacidad de detectar varias sondas fluorescentes, pueden adaptarse fácilmente para detectar varios alérgenos alimentarios simultáneamente. Los métodos de PCR múltiple tienen varias ventajas, como el ahorro de tiempo, la reducción del coste del análisis y la disminución de la probabilidad de contaminación cruzada (Schöringhumer et al., 2009). La técnica de PCR-ELISA también puede ser útil para detectar y diferenciar entre múltiples secuencias/objetivos que podrían ser amplificados por un conjunto común de cebadores, lo que es una ventaja para la detección de múltiples ingredientes alergénicos. La concentración del ADN puede cuantificarse por la reacción de color enzima-sustrato. Sin embargo, este enfoque sólo puede considerarse semicuantitativo porque dicha I. INTRODUCCIÓN 45 cuantificación se realiza al final de la reacción de PCR y no durante la fase de crecimiento exponencial, como en la qPCR (Poms et al., 2004). I.2.2.2. MLPA La amplificación dependiente de ligasa de múltiples sondas (MLPA, Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) fue descrita por Schouten et al (2002), y está condicionada por un paso previo de ligación, que solo tiene lugar si la secuencia de ADN diana está presente en la muestra. Es una técnica capaz de detectar hasta 50 secuencias genómicas de ADN en una única reacción. Para ello, se diseñan dos hemi-sondas adyacentes de modo que una contenga el cebador directo y la otra el inverso. Uno de los cebadores estará marcado con un fluoróforo que permite su detección mediante electroforesis capilar. Además, las sondas poseen otro oligonucleótido que será responsable de hibridar con la secuencia diana. Asimismo, una de las dos hemi-sondas posee un fragmento de relleno que permite modificar la longitud de la sonda en función de las necesidades del experimento. Únicamente cuando las dos hemi-sondas han hibridado puede producirse la ligación en una etapa posterior, y solo las sondas ligadas se amplificarán durante la reacción de PCR, por lo que el número de productos de ligación de sonda es una medida del número de secuencias diana presentes en la muestra. Por tanto, la cantidad de producto de PCR es proporcional a la cantidad de ADN diana presente en la muestra. La reacción de MLPA se divide en 5 etapas: 1) Desnaturalización del ADN e hibridación con las hemi-sondas MLPA; 2) reacción de ligación; 3) PCR; 4) separación de los productos amplificados mediante electroforesis capilar; 5) análisis de los datos (Figura I.9). En las publicaciones de Ehlert et al (2009) y Mustorp, Drømtorp y Holck (2011), aplicaron la técnica de MLPA para detectar múltiples alérgenos al mismo tiempo. El primero aplica la tecnología MLPA a la detección de cacahuetes, anacardos, nueces, pistachos, avellanas, semillas de sésamo, nueces de macadamia, nueces, almendras y nueces de Brasil, alcanzando un LOD de 5 mg Kg−1, mientras que los segundos emplean la técnica para la detección de sésamo, soja, avellana, cacahuete, altramuz, gluten, mostaza y apio, y su LOD fue de 10 mg Kg−1, dependiendo del componente analizado. En nuestro grupo investigador, también se empleó la técnica MLPA para la detección de cereales en un modelo de pastel al que se añadieron experimentalmente diferentes niveles de cada una de las semillas de trigo, cebada, centeno y avena. En este caso, la técnica mostró una especificidad óptima frente a un número representativo de especies vegetales y animales y se logró un LOD de 50 mg Kg−1 (García-García et al., 2018). Asimismo, se empleó la MLPA para la detección I. INTRODUCCIÓN 46 simultánea de ADN de girasol, amapola, lino, sésamo y soja en productos comerciales obteniendo un LOD de 10 mg Kg−1 y específico frente a 50 especies animales y vegetales (López-Calleja et al., 2017). Figura I.9. Esquema de la técnica de MLPA mediante hemi-sondas empleadas para la detección de secuencias específicas de ADN. I.2.2.3. Biosensores de ADN La detección de material alergénico en los alimentos mediante la tecnología de biosensores ha tenido poca repercusión en las aplicaciones basadas en anticuerpos. Sin embargo, tiene el potencial de desarrollarse para la detección de ADN o productos de PCR. En este sentido, se ha desarrollado un genosensor basado en principios electroquímicos para la detección de productos de PCR resultantes de la amplificación de los genes correspondientes a las principales isoformas de alérgenos de la avellana, Cor a 1.03 y Cor a 1.04 (Bettazzi et al., 2008). Este dispositivo tiene varias ventajas, como la portabilidad, la rentabilidad y la disponibilidad. Por ejemplo, en el trabajo desarrollado por Sun et al (2012) se utilizó un sensor electroquímico de ADN basado en una sonda marcada con 5’- SH y 3’-biotina, utilizada para la detección de un fragmento del gen Ara h 1 del cacahuete. En este caso, el biosensor se evaluó previamente con diferentes concentraciones del ADN diana y proporcionó un LOD de 0,35 fM. Finalmente, el biosensor de ADN se probó con un I. INTRODUCCIÓN 47 extracto de ADN de una bebida láctea de cacahuete sin necesidad de una amplificación previa por PCR y dio una respuesta cuantitativa. Tabla I.5. Ejemplos de aplicaciones de biosensores de ADN para el análisis de alimentos. Electrodo Inmobilización Diana LOD Ref. Oro Uniones Au-S Ara h 2 10 pM López et al., 2014 SPCE Strep-MBs Cor a 9 20 pg Montiel et al., 2017 Oro Au-thiol Ara h 1 0,35 fM Sun et al., 2012 Microbeads de poliestireno Uniones NH2 Cacahuete, avellana y nuez 1,4 pM Christopoulou, Karaiskou y Kalogianni, 2018 Carbón/Carbón/ Ag SPCEs Esferas magnéticas Sola l 7 0,2 pM Pereira-Barros et al., 2019 AuPd NWs/D-GQDs Aerogel de grafeno Ara h 1 4.7 × 10−23 M Li et al., 2018 Óxido de grafeno Hairpin probes Cacahuete y soja 1 nM Yuan et al., 2019 Los biosensores de ADN y los chips de genes son de gran interés debido a su potencial para obtener información específica de la secuencia de una manera más rápida, sencilla y barata en comparación con la hibridación tradicional. Además, cabe esperar que el interés por los sensores basados en el ADN aumente en un futuro próximo junto con la producción comercial de estos dispositivos y su uso generalizado (Tabla I.5). Sin embargo, la investigación básica sigue siendo necesaria para mejorar las tecnologías de los sensores, las estrategias de detección y los instrumentos y procedimientos analíticos (Kavita, 2017). I.3. PRODUCCIÓN DE FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS IN VITRO Las técnicas inmunológicas desarrolladas hasta ahora para el control de alérgenos presentes en los alimentos son muy utilizadas por las industrias y autoridades sanitarias, tienen algunas limitaciones, como la utilización de anticuerpos policlonales o monoclonales que requieren de animales de experimentación para su producción. El avance de técnicas de ingeniería genética ha permitido ofrecer alternativas innovadoras para la obtención de anticuerpos monoclonales que no requieran de la inmunización previa de animales. I. INTRODUCCIÓN 48 La estructura básica de una inmunoglobulina (Figura I.10) tiene la forma característica de una “Y”. Está constituida por dos cadenas peptídicas largas e iguales (H, pesadas) y dos cadenas peptídicas cortas e iguales (L, ligeras) interconectadas por varios puentes disulfuro. Figura I.10. Estructura básica de una inmunoglobulina (Ig), y de diversos tipos de fragmentos de anticuerpos: un fragmento de unión al antígeno (Fab), un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), fragmento variable estabilizado por enlace disulfuro (dsFv), fragmento variable de cadena pesada (dAbs), scFv unido a fragmento constante (scFv-Fc) y diabody o anticuerpos biespecíficos (bsAB). VH, región variable de la cadena pesada; VL, región variable de la cadena ligera; CH1-3, regiones constantes de la cadena pesada; CL, región variable de la cadena pesada. Las cadenas ligera y pesada, y las regiones Fab y Fc se encuentran unidas mediante puentes disulfuro, mientras que las cadenas ligera y pesada de los scFv lo están mediante un conector de serina y glicina. Los vertebrados expresan cinco clases o isotipos de anticuerpos en función del tipo de cadena pesada que contengan: alfa (IgA), delta (IgD), épsilon (IgE), gamma (IgG) y mu (IgM) que presentan diferencias en el peso molecular, función y ubicación. Por otro lado, hay dos tipos de cadenas ligeras (k y λ) y cada cadena ligera contiene un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Las cadenas pesadas de la IgG contienen un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). Si la estructura de la inmunoglobulina se somete a la acción de la enzima papaína, se divide por la zona de bisagra y separa el fragmento Fab (Fragment antigen binding o fragmento de unión al antígeno) del fragmento Fc o Fragmento de región cristalizable. El fragmento Fab determina la especificidad, la diversidad y la afinidad de la unión al antígeno (paratopo) y está formado por las regiones variables de las cadenas H y L (VH y VL), situadas en el extremo N terminal, I. INTRODUCCIÓN 49 y la primera región constante (CH1 y CL). Dentro de cada dominio VH y VL hay tres regiones hipervariables que reciben el nombre de regiones determinantes de la complementariedad (CDR, Complementary Determining Regions). Estas regiones hipervariables son las responsables del reconocimiento del antígeno y confieren a las inmunoglobulinas una gran especificidad y diversidad. Los dominios constantes de la región Fc (Fragmento de región cristalizable) son responsables de la formación de la estructura del anticuerpo y de sus funciones efectoras, así como de la determinación de la vida media in vivo de la inmunoglobulina (García-Merino, 2011; Weisser y Hall, 2009). El uso de los primeros anticuerpos con fines terapéuticos se remonta a 1890 cuando Emil von Behring describió que la administración de suero de animales inoculados con pequeñas dosis de toxinas era capaz de neutralizar a éstas. Pero no fue hasta 1986 cuando se aprobó por la FDA el primer anticuerpo monoclonal murino, denominado muromonab, para el tratamiento del rechazo en pacientes transplantados, dirigido frente al antígeno CD3 que se expresa en la superficie de los linfocitos T (Langjahr y Sotelo, 2016). En la primera mitad de la década de 1970, Milstein y Köhler investigaban en el laboratorio de biología molecular de Cambridge (Reino Unido) los mecanismos moleculares de la generación de la diversidad de los anticuerpos. Para ello, necesitaban producir una célula B inmortal con especificidad conocida para así poder analizar las mutaciones presentes en los genes de las inmunoglobulinas. Cuando fusionaron células de mieloma murino con células obtenidas del bazo de un animal inmunizado, consiguieron seleccionar solamente células híbridas (hibridomas) que pueden propagarse de manera indefinida en cultivo. Posteriormente, de entre todos los hibridomas, se seleccionaban los mejores clones para producir los anticuerpos monoclonales específicos de la diana. Su trabajo fue publicado en Nature y después recibieron el premio Nobel por este descubrimiento (García-Merino, 2011; Köhler y Milstein, 1975). La llegada de la tecnología del hibridoma ha sido fundamental para el desarrollo de la investigación y la comercialización de anticuerpos monoclonales, ya que proporcionó un potente método para producir anticuerpos definidos a nivel molecular, con calidad constante y en grandes cantidades contra cualquier tipo de antígeno (Ahmad et al., 2012; Shim, 2017). Pero los anticuerpos monoclonales se enfrentan a varias dificultades para su aplicación clínica en personas, ya que su origen es exclusivamente murino y podrían generar anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA, human anti-mouse antibody) cuando se introducen en personas, provocando una rápida eliminación del anticuerpo monoclonal de la circulación sanguínea, lo que limita sus aplicaciones clínicas. Además, la tecnología de producción de anticuerpos monoclonales es lenta y laboriosa, y los ratones no siempre I. INTRODUCCIÓN 50 proporcionan la respuesta de anticuerpos de alta afinidad frente a un antígeno concreto necesaria para el desarrollo de ensayos sensibles. Para solventar estos problemas y teniendo en cuenta las características de las inmunoglobulinas, se recurrió a la ingeniería genética con el fin de obtener anticuerpos monoclonales recombinantes, es decir, de origen murino pero con porciones del anticuerpo reemplazadas por proteínas de origen humano. Así es como surgieron los anticuerpos monoclonales quiméricos (65-90 % de cadena humana) que permitieron disminuir la respuesta HAMA y aportaron nuevas funciones a los anticuerpos. Con el objetivo de producir anticuerpos con un alto porcentaje de secuencia humana, surgieron los anticuerpos monoclonales humanizados (90-95 % de cadena humana) donde las CDR de un anticuerpo murino se incorporan a un anticuerpo humano (Ahmad et al., 2012; García-Merino, 2011; Langjahr y Sotelo, 2016; Shim, 2017). Más recientemente, se han desarrollado tecnologías que son capaces de generar anticuerpos completamente humanos, como el uso de ratones transgénicos en los que se introducen los genes de las inmunoglobulinas humanas (Lonberg, 2008), o mediante la tecnología de Phage Display (presentación de proteínas en la superficie de fagos filamentosos) que permite obtener anticuerpos monoclonales sin utilizar ratones (Hoogenboom y Chames, 2000). I.3.1. Anticuerpos recombinantes Los anticuerpos derivados de animales no han mejorado significativamente en los últimos 40 años. Tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales son producidos a partir de inmunización animal, y tienen limitaciones tanto en la especificidad como en la reproducibilidad (Figura I.11). Los anticuerpos policlonales reconocen varios epítopos de un solo antígeno y los anticuerpos monoclonales producen una única especie de anticuerpo. Sin embargo, los anticuerpos recombinantes son producidos por células transfectadas con ADN que codifica para un determinado anticuerpo. Por consiguiente, al tener una secuencia conocida, su afinidad y especificidad pueden ser definidas, es decir, aportan repetibilidad y reproducibilidad a los experimentos. Los anticuerpos recombinantes pueden ser de origen animal (por clonación del ADN de hibridomas o de repertorios genéticos de anticuerpos de células B de animales inmunizados), de origen humano (generados a partir de repertorios genéticos de anticuerpos de donantes humanos) o de origen sintético (a partir de genes sintéticos), que se transforman y expresan a gran escala en sistemas procariotas o I. INTRODUCCIÓN 51 eucariotas, por ejemplo, en bacterias, líneas celulares de mamíferos o levaduras (Frenzel et al., 2013). Figura I.11. Ventajas y limitaciones de los anticuerpos policlonales y monoclonales. A partir de la generación de los anticuerpos recombinantes, se desarrollaron los anticuerpos no derivados de animales. Son anticuerpos derivados de repertorios de fragmentos de anticuerpos recombinantes generados in vitro sin utilizar en ningún momento la inmunización animal y pueden utilizarse en las técnicas habituales de análisis inmunológico, como Western blot, inmunohistoquímica, citometría de flujo, ensayos de inmunoadsorción, inmunoprecipitación, etc. Estos anticuerpos pueden ser idénticos en estructura a la inmunoglobulina G (IgG) completa, o pueden consistir en partes de un anticuerpo (Figura I.10), como el fragmento de unión al antígeno (Fab), fragmento variable de cadena única (scFv), fragmento variable de cadena única dimerizado por el dominio constante del fragmento (Fc)(scFv-Fc), fragmento variable estabilizado por enlace disulfuro (dsFv), diabody o anticuerpos biespecíficos (bsAB), fragmento variable de cadena pesada (VH) derivado de camélidos (VHH), receptor variable de antígeno derivado de tiburón (VNAR), entre otros (Kumar et al., 2019; Ma y O’Kennedy, 2017). Un scFv está compuesto por las regiones VH y VL unidas por un conector flexible (de entre 15-20 residuos de aminoácidos). Los scFv suelen producirse bien en sistemas bacterianos y son el formato preferido para los repertorios de presentación de anticuerpos I. INTRODUCCIÓN 52 sobre fagos (phage display). El scFv es uno de los formatos de anticuerpos recombinantes más populares, debido a su pequeño tamaño (25-27 kDa), facilidad de penetración en los tejidos, corto tiempo de generación, capacidad de ser expresado en E. coli, alta afinidad por el antígeno y relativa estabilidad estructural (Ahmad et al., 2012; Crivianu-Gaita y Thompson, 2016; Davies et al., 2000; Li et al., 2015; Shim, 2017). A principios de la década de 1990, el grupo de Hamers-Casterman descubrió que en el suero de especies de la familia Camelidae, había tres tipos de anticuerpos completamente funcionales (IgG1, IgG2 e IgG3). De ellos, las IgG2 e IgG3 carecían de la cadena ligera y suponían el 25-40 % del total de inmunoglobulinas séricas, dependiendo de la especie, lo cual denota su importancia en la respuesta inmune de estos animales (Arbabi-Ghahroudi, 2017; Blanc et al., 2009; Hamers-Casterman et al., 1993). En este tipo de anticuerpos, únicamente el dominio variable de la cadena pesada es el responsable del reconocimiento del antígeno, y esa afinidad no se ve disminuida con respecto a un anticuerpo convencional. Finalmente, se desarrollaron los denominados anticuerpos de dominio único dAbs (single domain antibody), que se caracterizan por presentar únicamente la región variable de la cadena pesada de los anticuerpos, y tener alta afinidad por los antígenos a pesar de ser muy pequeños (~12-15 kDa), con pesos moleculares de aproximadamente una décima parte de los anticuerpos monoclonales de tamaño completo (Davies et al., 2000; Muyldermans, 2013; Shim, 2017). Las dos formas mejor estudiadas de dAbs son el VHH (fragmentos de VHH) y el VNAR (fragmentos de VNAR). Son versiones manipuladas de anticuerpos de solo cadena pesada, en las que el VHH deriva de los HCAbs de los camélidos y el VNAR de las inmunoglobulinas con nuevo receptor de antígenos (IgNAR) de los tiburones. Los VHH y VNAR parecen tener una evolución convergente y contienen regiones CDR largas, a menudo más grandes que los anticuerpos humanos y murinos convencionales, lo que les permite penetrar más fácilmente en los sitios activos del antígeno diana (Flajnik et al., 2011; Henry y MacKenzie, 2018). Entre los anticuerpos de nueva generación que han demostrado un gran potencial como fármacos biológicos se encuentran los biespecíficos. Un anticuerpo biespecífico (BsAb) puede dirigirse y unirse simultáneamente a dos antígenos diferentes (o a diferentes epítopos del mismo antígeno) y, por tanto, proporcionar una mayor especificidad de unión. Los BsAbs han tenido un gran éxito en el campo de la inmunoterapia contra el cáncer (Kumar et al., 2019; Nelson, 2010; Sedykh et al., 2018). Los anticuerpos recombinantes ofrecen numerosas ventajas con respecto a los anticuerpos convencionales (Kumar et al., 2019; Ma y O’Kennedy, 2017; Manoutcharian I. INTRODUCCIÓN 53 et al., 2016; Nelson, 2010; Wesolowski et al., 2009). Entre las ventajas más destacables se encuentra una mayor reproducibilidad, debido a que las secuencias que los codifican están bien definidas, y la posibilidad de mejorar su afinidad y especificidad mediante la modificación de las condiciones experimentales para favorecer el aislamiento de los anticuerpos contra un determinado antígeno. Esto garantiza un suministro ilimitado de anticuerpos de la misma calidad, con idénticos perfiles de unión, aumentando la reproducibilidad de los experimentos científicos, a lo largo del tiempo y entre laboratorios, sin variación entre lotes. Además, la secuencia genética de un anticuerpo no derivado de animales puede modificarse para añadir multitud de características, incluyendo una variedad de formatos de anticuerpos y sistemas de detección (por ejemplo, fusión con moléculas marcadoras, enzimas, etc.). La posibilidad de añadir un sistema de detección tiene la ventaja de disminuir la necesidad de anticuerpos secundarios marcados. También cabe destacar la disminución del tiempo y la facilidad para una conversión del isotipo del anticuerpo a un formato más conveniente. Pero la ventaja principal y más novedosa es que se pueden producir anticuerpos recombinantes sin utilizar ningún animal, como se ha mencionado anteriormente. La aplicación de los anticuerpos recombinantes en biomedicina se está volviendo cada vez más común debido a la alta especificidad, sensibilidad y estabilidad de este tipo de sondas de afinidad y su fácil optimización mediante modificaciones genéticas y químicas (Ma y O’Kennedy, 2017). En la actualidad se estudia cómo los scFv, dAbs y BsAbs pueden emplearse en modelos preclínicos de cáncer, así como en enfermedades infecciosas y autoinmunes, y muchos de ellos comienzan a emplearse como terapéuticos en enfermedades neurodegerativas (Manoutcharian et al., 2016). Desde la aparición de la pandemia de COVID-19, la aplicación de la tecnología de anticuerpos recombinantes ha tenido un auge extraordinario. Se han desarrollado rápidamente multitud de anticuerpos recombinantes anti-SARS-CoV-2 a partir de genotecas de fragmentos de anticuerpos, que son capaces de neutralizar al virus o reconocer la proteína spike del virus, y se han utilizado en procedimientos de diagnóstico y de tratamiento para frenar la pandemia actual (Bertoglio et al., 2021; Lei et al., 2020; Ren et al., 2020; Sridharan et al., 2020). En el campo del análisis de alimentos, los anticuerpos empleados para la detección de alérgenos proceden mayoritariamente de la inmunización de animales con extractos proteicos de la especie de interés o con los alérgenos purificados y conjugados con una proteína portadora. A partir de los animales inmunizados se puede obtener el suero con anticuerpos policlonales o bien linfocitos B del bazo para la generación de hibridomas que I. INTRODUCCIÓN 54 produzcan anticuerpos monoclonales. Se calcula que solo en la Unión Europea se utilizan cada año cerca de un millón de animales para el desarrollo y la producción de anticuerpos (Barroso et al., 2020). Russell y Burch en 1959, propusieron una nueva ciencia aplicada que mejorara el trato a los animales de laboratorio y, al mismo tiempo, mejorara la calidad de la ciencia en los estudios que utilizan animales. Introdujeron y definieron los términos de reducción, refinamiento y reemplazo, formulado como “el principio de las tres erres” para minimizar el potencial de dolor y angustia de los animales en la investigación biomédica (Russell y Burch, 1960). La necesidad de una evolución bioética en la investigación se ve reflejada en la Directiva 2010/63/UE, de la UE, traspuesta a la legislación española a través del Real Decreto 53/2013 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos, no permitiendo el uso de métodos basados en animales cuando existen otros métodos alternativos que permitan obtener los resultados buscados (Barroso et al., 2020; Ministerio de la Presidencia, 2013; Parlamento Europeo, 2010; Tannenbaum y Bennett, 2015). En 2018, el Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para alternativas a la experimentación animal (EURL ECVAM) pidió a su comité científico asesor (ESAC, EURL ECVAM Scientific Advisory Committee) que revisara la validez científica de los anticuerpos no derivados de animales generados por phage display utilizados para la investigación y su aplicación en ámbitos reglamentarios y de diagnóstico (European Commission y Joint Research Centre, 2018). En su revisión, el ESAC concluye que los anticuerpos no derivados de animales son unos reactivos bien caracterizados, generados por una tecnología probada, que no solo son equivalentes a los producidos en animales, sino que además ofrecen importantes ventajas tanto desde el punto de vista científico como económico. Por lo tanto, los anticuerpos recombinantes pueden reemplazar a los anticuerpos derivados de animales en la gran mayoría de aplicaciones, además de mejorar la reproducibilidad científica y tener un impacto social positivo. El EURL ECVAM recomienda que no se utilicen más animales para el desarrollo y la producción de anticuerpos para la investigación, la regulación, el diagnóstico y las aplicaciones terapéuticas y que los países de la UE bajo la directiva 2010/63/EU no deberían autorizar el desarrollo y producción de anticuerpos mediante inmunización animal (Barroso et al., 2020). A partir de este momento, aparecieron dos posturas en la comunidad científica. Por una parte, aquellos que apoyan la recomendación del ESAC, afirmando que es una nueva era donde queda demostrada la valía de los anticuerpos generados sin inmunización animal como los desarrollados en tiempo récord contra el SARS-CoV-2 para contrarrestar la propagación del virus (Gray et al., 2020). Por otra parte, aquellos que alegan que los documentos presentados contienen percepciones distorsionadas de las posibilidades actuales de los anticuerpos no derivados de animales, y I. INTRODUCCIÓN 55 que se necesita una mayor validación científica (González-Fernández et al., 2020). A esta postura se suma la Sociedad Española de Inmunología (SEI, 2020) que considera que la tecnología de hibridomas es todavía necesaria para el desarrollo de las ciencias biomédicas y que se necesita potenciar el desarrollo de métodos alternativos en paralelo, sin bloquear la tecnología actual. Entre sus argumentos mencionan que aún es necesario un repertorio universal de fago-anticuerpos, que estos repertorios presentan limitaciones para generar anticuerpos frente a virus, que presentan menor afinidad y especificidad, así como que esta tecnología es más cara y requiere de experiencia y laboratorios diseñados para este fin. Además, señala que para la obtención de los hibridomas, el único paso que requiere el uso de animales es la fase de inmunización. I.4. PRESENTACIÓN DE ANTICUERPOS EN FAGOS (PHAGE DISPLAY) La presentación de anticuerpos en fagos o phage display es una técnica que permite la selección de anticuerpos de alta afinidad y especificidad. La producción de anticuerpos monoclonales para investigación y uso clínico está estrechamente relacionada con el desarrollo de esta tecnología, descrita inicialmente por Smith en 1985 y desarrollada posteriormente por otros grupos, como los de Winter, McCafferty, Lerner y Barbas. Desde entonces, esta tecnología se ha utilizado ampliamente para la investigación y el desarrollo de anticuerpos en todo el mundo, dando lugar a numerosos anticuerpos que han llegado a ser usados con fines terapéuticos y diagnósticos. Por el desarrollo de la tecnología de presentación en fagos, George P. Smith y Sir Gregory P. Winter fueron galardonados con el Premio Nobel de Química en 2018 (Kumar et al., 2019). Esta tecnología se basa en la ingeniería genética de los bacteriófagos y en la presentación al antígeno de interés, en repetidas rondas de selección, de un repertorio policlonal de fragmentos de anticuerpos (con hasta 1011 clones diferentes) que se expresan en la superficie de un fago filamentoso que lleva integrada la secuencia genética del fragmento exhibido. Esta técnica facilita en gran medida la producción recombinante de reactivos para su uso en investigación y diagnóstico clínico, así como para productos farmacéuticos de uso terapéutico en humanos. El primer anticuerpo monoclonal totalmente humano obtenido mediante phage display fue Adalimumab (Humira), un monoclonal anti-TNF usado como tratamiento de la artritis reumatoide (Lee et al., 2007; Lorenz, 2002; Shim, 2017). La tecnología de presentación en fagos permite un mayor control sobre el proceso de selección. Por ejemplo, en las primeras etapas del proceso se permite la predefinición de muchas propiedades bioquímicas y biofísicas finales de los anticuerpos a través de la I. INTRODUCCIÓN 56 elección de determinados antígenos. Se puede empezar directamente con los repertorios naïve, sintéticos y semisintéticos existentes. La mayor ventaja de esta tecnología es que se pueden identificar sondas que reconocen al antígeno diana independientemente de sus propiedades inmunogénicas. Esto no es posible en otras técnicas de aislamiento de anticuerpos (Kumar et al., 2019). Además, a diferencia de la tecnología de hibridomas, la presentación en fagos permite la selección de multitud de anticuerpos frente a un gran número de dianas moleculares tanto biológicas y como no biológicas (incluidos autoantígenos y toxinas), evitando por completo el uso de animales vivos. Por otra parte, como esta tecnología se lleva a cabo in vitro, las condiciones de selección y cribado pueden controlarse mejor. Por ejemplo, pueden incluirse moléculas competidoras para dirigir la selección a dianas específicas, y debido a que utiliza cultivos microbianos, los protocolos son más sencillos. Otra ventaja añadida de la expresión en fagos es la posibilidad de incluir nuevos dominios o epítopos que confieran a los fragmentos de anticuerpos propiedades específicas, por ejemplo, la unión a moléculas que permitan su purificación o incrementen su sensibilidad en diversas técnicas analíticas (Bitencourt et al., 2020; Skerra y Plückthun, 1988). Estas características hacen de la presentación en fagos o phage display una herramienta poderosa para comprender mejor los procesos inmunológicos y las enfermedades humanas que implican la formación de anticuerpos contra antígenos definidos (Hammers y Stanley, 2014). Esta tecnología requiere de la expresión de un amplio repertorio de péptidos o fragmentos de anticuerpos en la superficie de partículas víricas que conforman la genoteca creada. El vector más comúnmente utilizado para la generación de repertorios de fragmentos de anticuerpos recombinantes con gran variabilidad ha sido el fago filamentoso M13 (Ståhl et al., 2013). I.4.1. Fago Filamentoso M13 El bacteriófago o fago filamentoso M13 es el vector de expresión más utilizado en la construcción de genotecas de fragmentos de anticuerpos recombinantes. Pertenece a la familia de los colifagos Ff. Infecta específicamente a células gram-negativas como E. coli, mediante ciclos de replicación no líticos, debido a que son portadoras del plásmido conjugativo denominado factor F-pilus o factor de fertilidad. El fago M13 (Figura I.12) está compuesto por una molécula de ADN monocatenario y circular de 6-7 Kb de longitud y una cápside de estructura cilíndrica de aproximadamente 7 nm de ancho y 900 nm de longitud, donde intervienen 5 proteínas diferentes (pIII, pVI, pVII, pVIII y pIX). La cubierta cilíndrica I. INTRODUCCIÓN 57 donde se aloja el ADN está constituida en gran medida por 2700 copias de la proteína pVIII. El resto de las proteínas se localizan en los extremos del fago, donde aparecen 3-5 copias de cada una, agrupándose en un extremo las proteínas pIII y pVI, y en el otro extremo las proteínas pVII y pIX (Berkowitz y Day, 1976; O’Callaghan et al., 1973; Rasched y Oberer, 1986). Figura I.12. Representación esquemática del fago M13 con la localización de las cinco proteínas de superficie (pIII, pVI, pVII, pVIII, pIX). La infección de E. coli por el bacteriófago M13 comienza con la adhesión del fago a la bacteria mediante la interacción entre la proteína minoritaria de cubierta pIII y el pilus F de la bacteria (Figura I.13). Más concretamente, el dominio N2 de pIII en un extremo del bacteriófago interactúa con el pilus. Esto desencadena la retracción del pilus, lo que hace que pIII entre en contacto con TolA y actúe de correceptor en la membrana interna de la bacteria. Tres proteínas Tol están presentes en E. coli; TolA, TolR y TolQ, y todas son esenciales para la infección al mediar la despolimerización de la cubierta del fago y la translocación del ADN en la bacteria. Posteriormente, la pIII se inserta en la membrana interna y el ADN del fago se libera en el citoplasma del hospedador al tiempo que se desprende de la proteína de cubierta principal, pVIII (Karlsson et al., 2003; Ledsgaard et al., 2018; Rakonjac et al., 1999; Shim, 2017). El ADN del fago permanece latente hasta que se replica dentro de la bacteria donde se expresan sus proteínas, que o bien forman la cápside proteica del fago M13 o bien desempeñan un papel en la replicación, el ensamblaje o la secreción del bacteriófago. Este tipo de bacteriófago nunca va a integrar su genoma en el cromosoma del hospedador, sino que mantiene su ADN estable en forma de plásmido y se convierte directamente en forma replicativa, produciendo cientos de partículas víricas en una sola célula sin necesidad de replicación celular. El bacteriófago M13 no es lítico, es decir, cuando se alcanzan entre las I. INTRODUCCIÓN 58 100-200 copias de ADN, la replicación se detiene y se continúa con el ensamblaje de las nuevas partículas de fago replicadas en la membrana bacteriana. El genoma se recubre de la cápside proteica y escapa de la bacteria huésped sin lisarla, por lo que continúa el crecimiento celular, aunque las bacterias infectadas muestran una tasa de crecimiento más lenta que las no infectadas (Loh et al., 2019; Pande et al., 2010). Figura I.13. Representación esquemática del proceso de infección de E. coli por el fago M13 durante la tecnología de phage display. Elaboración propia adaptada de Ledsgaard et al., 2018. Por lo tanto, una de las ventajas es que las genotecas de fagos basadas en M13 pueden almacenarse como reservas de E. coli congeladas antes, durante o después del proceso de selección por afinidad (biopanning), lo que ofrece opciones de manipulación y almacenamiento más sencillo que otros sistemas basados en fagos líticos. Otra ventaja del bacteriófago M13 como plataforma para el desarrollo de genotecas de anticuerpos es que es muy estable y puede soportar altas temperaturas, almacenamiento prolongado, desecación, condiciones ácidas o tratamientos desinfectantes (Branston et al., 2013). Por otra parte, existe una limitación en el tamaño de la proteína recombinante a expresar en la superficie de este fago, debido a que pueden interferir en el ensamblaje de los viriones o en la infección de la bacteria. Por ello, cuando se trata de expresar un fragmento de anticuerpo mediante phage display se recurre al uso de fagémidos (Adda et al., 2002; Sidhu, 2001; Smith y Petrenko, 1997). El fagémido contiene el origen de replicación tanto de la bacteria como del fago, la señal de empaquetamiento del fago, y la secuencia de la proteína recombinante que se quiere I. INTRODUCCIÓN 59 expresar fusionada a la secuencia de la proteína pIII, así como un gen de resistencia a antibióticos. Su uso permite una fácil preparación y mantenimiento del vector, un alto rendimiento de ADN de doble cadena y mejores tasas de transformación (Georgieva y Konthur, 2011). Pero carece de los genes que codifican para las proteínas estructurales del fago y que le permiten empaquetar el ADN dentro de él. Por esta razón, tras la producción de grandes cantidades de la proteína recombinante expresada, se utiliza el fago auxiliar M13K07 o fago helper, el cual posee una señal de empaquetamiento defectiva y un gen de resistencia a antibióticos diferente al del fagémido. Cuando las células que contienen el fagémido se infectan con M13K07, la proteína pII (de replicación) producida por los genes del M13K07 reconoce como secuencia de origen de fago a la que se encuentra presente en el fagémido, por lo que en consecuencia es capaz de replicarse y de empaquetarse junto con las nuevas proteínas estructurales codificadas por el fago auxiliar. La señal de empaquetamiento defectiva que presenta el fago auxiliar permite el vínculo físico entre el genotipo codificado por el fagémido y el fenotipo mostrado por el M13K07. Por lo tanto, el fago resultante es un virión híbrido que lleva una mezcla de proteínas de cubierta procedentes del fago auxiliar y de pocas copias de proteínas de fusión unidas a la proteína recombinante (Bratkovič, 2010; Vieira y Messing, 1987). Dado que el fago auxiliar posee un gen de resistencia a antibióticos diferente al fagémido, esto permitirá la selección exclusiva de aquellas bacterias que hayan adquirido la información genética proporcionada por ambos. I.4.2. Selección por afinidad (Biopanning) A partir de una genoteca de miles de millones de anticuerpos recombinantes expresados en la superficie de fagos filamentosos se pueden seleccionar aquellos que tengan afinidad por una molécula diana específica mediante un procedimiento de selección llamado biopanning o selección por afinidad (Figura I.14). La principal ventaja de la tecnología de presentación en fagos es que a partir de un gran número de clones diferentes se pueden seleccionar fragmentos de anticuerpos específicos de forma sencilla y rápida. Además, dado que los fagos seleccionados pueden amplificarse mediante propagación en E. coli, se pueden realizar múltiples rondas de biopanning para reducir la selección a aquellas secuencias que tienen una unión más fuerte y específica a la molécula diana. La posible falta de detección de fago-anticuerpos específicos después de varias rondas de selección puede ocurrir si la estrategia empleada no es la correcta o si la genoteca de los anticuerpos utilizada no está bien generada o no tiene suficiente diversidad. I. INTRODUCCIÓN 60 Figura I.14. Representación del proceso de obtención de la genoteca de anticuerpos expresados en fagos (phage display) y de los ciclos de selección por afinidad (biopanning), consistente en un paso de incubación de la genoteca de fago-anticuerpo con la proteína diana, eliminación de los fagos no unidos, elución de los fagos unidos y amplificación de los fagos en E. coli, antes de realizar otro ciclo. Después de 3-5 ciclos se lleva a cabo la etapa de postselección. Es un proceso que requiere de gran paciencia, y en ocasiones se necesitan varios intentos antes de tener éxito. Inicialmente es muy importante elegir adecuadamente la estrategia de biopanning que se llevará a cabo, así como una buena calidad de genoteca. Finalmente, entre todos los elementos a considerar para una exitosa selección de fagos se incluyen, cómo inmovilizar el antígeno, en qué cantidad, cuántas rondas de selección y cómo eliminar los fago-anticuerpos no específicos. Por ello se establecen las siguientes etapas en el proceso de selección por afinidad (Adda et al., 2002; Menendez y Scott, 2005; Pande et al., 2010; Smith y Petrenko, 1997): I. INTRODUCCIÓN 61 1) Inmovilización de la diana. 2) Unión de fagos: la genoteca de fagos se añade al sitio donde se encuentra la diana en una solución que permite la estabilidad de la diana y una mínima unión no específica del fago. Es importante comenzar la primera ronda con un repertorio (genoteca) grande y muy diverso para tener más posibilidades de aislar fagos de interés. 3) Eliminación de los fagos no unidos: para evitar las uniones inespecíficas y aislar fagos con mayor afinidad, los lavados son estrictos. 4) Elución de los fagos: la elución específica del fago unido a la diana puede llevarse a cabo en una solución con pH extremos, desnaturalizantes, fuerza iónica, proteólisis limitada o sonicación. 5) Identificación mediante secuenciación de ADN de los clones infectados con los fagos eluidos y análisis de los resultados. 6) Amplificación de los fagos seleccionados y repetición del proceso de biopanning entre 3 y 6 veces para enriquecer la genoteca con los clones de mayor afinidad por el antígeno. Tras finalizar el proceso de selección, los clones de fagos elegidos son analizados mediante ELISA para comprobar la capacidad de unión del fago frente al antígeno diana y los clones seleccionados son nuevamente secuenciados para corroborar la secuencia nucleotídica que codifica para los fragmentos de anticuerpos de interés. I.4.3. Genotecas de scFv y dAb Los repertorios (genotecas) de anticuerpos pueden obtenerse principalmente por dos métodos, ya sea a partir de secuencias de anticuerpos codificados en el ARNm de las células B de donantes animales o humanos inmunizados o no inmunes, o generadas sintéticamente utilizando secuencias de nucleótidos aleatorios dentro de las CDR (regiones determinantes de la complementariedad) seleccionadas, en combinación con una o múltiples regiones marco para replicar la diversidad de un repertorio natural de anticuerpos (Conrad y Scheller, 2005). La generación de genotecas es un proceso largo y delicado, en el que todos los reactivos de PCR y muestras deben manipularse y almacenarse con precaución, evitando contaminaciones con otras fuentes de ADN y favoreciendo la eliminación de DNAsas (Ma y O’Kennedy, 2017). Las genotecas sintéticas y semisintéticas consisten en secuencias sintéticas o en una mezcla de secuencias sintéticas y naturales, respectivamente. La especificidad de los anticuerpos para reconocer al antígeno se basa principalmente en las regiones CDR del gen de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos. La CDRH3 es más diversa en composición (1023 posibles secuencias) y longitud (6-24 aminoácidos) y juega I. INTRODUCCIÓN 62 un papel importante en el sitio de unión al antígeno y en su reconocimiento (Kumar et al., 2019). En las genotecas sintéticas las CDR se insertan directamente, mientras que en las semisintéticas se realizan mutaciones aleatorias o dirigidas en la CDR3, mediante métodos basados en PCR o por mutación de las 6 CDRs y clonando en una cadena molde de anticuerpo. Un repertorio típico de anticuerpos comprende una enorme diversidad de especificidades de unión a antígenos, que se generan por los procesos genéticos de recombinación y mutación. Desde 1990, se han empleado diferentes formatos de anticuerpos para la construcción de genotecas de fago-anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos humanos como los mostrados en la Figura I.10. Por lo general, estos fragmentos de anticuerpos se fusionan con la G3P del fago M13 y mediante la clonación de un gran número de genes que codifican un fragmento de anticuerpo, se pueden generar grandes genotecas de anticuerpos de las que se pueden seleccionar muchos anticuerpos diversos (Kanyavuz et al., 2019; Ledsgaard et al., 2018). Como ejemplo, Schofield et al seleccionaron con éxito más de 7200 anticuerpos recombinantes contra 292 antígenos a partir de un repertorio de scFv humanos que contenía 1,1 × 1010 clones (Schofield et al., 2007). En la genoteca Tomlinson I, desarrollada por el laboratorio del Dr. Greg Winter en el MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, Reino Unido), los fagos expresan anticuerpos recombinantes humanos de tipo scFv, constituidos por un único polipéptido que contiene los dominios VH (V3-23/DP-47) y Vκ (O12/O2/DPK9) unidos mediante un conector flexible de glicina y serina. La región CDR3 está diseñada para tener la mínima longitud (7 residuos de aminoácidos) pero manteniendo la capacidad de unión al antígeno. La variabilidad se introduce con las regiones CDR2 y CDR3, mientras que la secuencia de la región CDR1 se mantiene constante. De este modo, las genotecas de fragmentos de anticuerpos de tipo scFv consisten en combinaciones aleatorias de regiones variables de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos, que presentan una gran diversidad, y que se expresan como proteínas de fusión a una de las proteínas estructurales del fago M13, normalmente la proteína pIII (Hoogenboom, 2005). Estas genotecas naïve están constituidas por unos 108 clones diferentes de fagémidos, obtenidos a partir de linfocitos B de donantes humanos no inmunizados, a partir de los que, mediante transcripción inversa y amplificación por PCR, se obtuvieron los genes de la región variable de las cadenas ligera y pesada de las inmunoglobulinas, que posteriormente se subclonaron en el fagémido pIT2 que posee el gen de resistencia a ampicilina. Los fagémidos se encuentran transformando células de E. coli de la cepa TG1 (K12Δ (lac-proAB) supE thi hsdD5/F' traD36 proA+B lacIq I. INTRODUCCIÓN 63 lacZ M15). El fago ayudante que emplea es el KM13, que posee resistencia a kanamicina (Goletz et al., 2002; Lee et al., 2007; Tomlinson et al., 1992). El repertorio de anticuerpos de dominio único dAb creado por MRC Laboratory of Molecular Biology (Christ et al., 2006) se basa en la secuencia un dominio VH (DP47) humano aislado, denominado HEL4, con propiedades similares a las de los dominios V(HH) (Jespers, Schon, James, et al., 2004). HEL4 es altamente soluble a concentraciones de ≥ 3 mM, esencialmente monomérico y resistente a la agregación inducida por el calor a concentraciones de hasta 56 µM. La genoteca procede de la cadena pesada VH V3-23 y presenta diversidad sintética introducida por mutagénesis de PCR en CDR1, CDR2 y CDR3 y está clonada en formato de fago. El repertorio ha sido diseñado y expresado en el vector fagémido pR2 con los marcadores MYC y VSV y resistencia a ampicilina, para resistir la agregación inducida por el calor en los fagos y se ha demostrado que contiene sondas de unión a antígenos que se repliegan sin pérdida importante de la afinidad tras el enfriamiento (Christ et al., 2006, 2007; Famm et al., 2008; Jespers, Schon, Famm, et al., 2004). Por tanto, las genotecas de tipo dAb contienen una gran diversidad de las tres CDRs y se expresan como proteínas de fusión a la proteína pIII del fago (Hoogenboom, 2005). Estas genotecas naïve están constituidas por unos 109 clones diferentes de fagémidos (Lee et al., 2007). Al igual que las genotecas de scFv, la genoteca de dAb se encuentra transformanda en células de E. coli de la cepa TG1 (K12Δ (lac-proAB) supE thi hsdD5/F' traD36 proA+B lacIq lacZ M15) y el fago ayudante para la fase de infección de phage display es el KM13, que posee resistencia a kanamicina. Ambas genotecas tienen la peculiaridad de que tras el proceso de biopanning y la realización de los lavados, los fagos se eluyen mediante la digestión con tripsina. La tripsina escinde el péptido de la región de la etiqueta de c-Myc que existe entre el anticuerpo y la proteína pIII del fago, eliminando además, el ruido de fondo provocado por la presencia del fago ayudante M13, ya que éste sí es sensible a la tripsina, y al digerirse pierde la capacidad infectiva (Kristensen y Winter, 1998). I.5. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES Hay muchas opciones de sistemas para la expresión de anticuerpos recombinantes, entre las que se incluyen, bacterias, líneas celulares de mamíferos, células de insectos, plantas, levaduras y hongos filamentosos. Generalmente, las proteínas de más de 100 kDa se expresan en sistemas eucariotas y las proteínas de menos de 30 kDa se expresan en I. INTRODUCCIÓN 64 sistemas procariotas. A veces se requieren modificaciones postraduccionales para la expresión de anticuerpos recombinantes (por ejemplo, anticuerpos terapéuticos) para minimizar la inmunogenicidad del anticuerpo. En ese caso, se pueden seleccionar líneas celulares de mamíferos, células de insectos, levaduras y plantas transgénicas como sistemas de expresión de anticuerpos recombinantes. El sistema más ampliamente utilizado es el de levaduras metilotróficas como Pichia pastoris, ya que alcanza rendimientos muy altos en la producción extracelular, del orden de gramos por litro (de la Cruz et al., 2015). Cuando se producen proteínas recombinantes, el primer paso consiste en clonar la secuencia de ADN e introducirla en el sistema de expresión elegido para su traducción. En el proceso de elección de un sistema de expresión, se deben considerar una serie de factores, como el tamaño, la calidad, función, velocidad de producción y rendimiento de la proteína, así como de la pureza y cantidad requeridas del producto final. El sistema bacteriano de expresión es el elegido mayoritariamente para la expresión de anticuerpos recombinantes pequeños no glicosilados, como scFvs y dAbs. En comparación con otros sistemas, los bacterianos como E. coli tienen un sistema de producción más rápido y sencillo, llegando a alcanzar concentraciones de producción considerables, pero no es capaz de glicosilar las proteínas, por lo que, si se requiere la glicosilación para la fusión de proteínas a los anticuerpos recombinantes, este sistema no es una buena elección. En el año 1988, se realizó la primera producción de anticuerpos recombinantes funcionales al espacio periplásmico de E. coli, donde se produjo la secreción del Fv y la correcta formación de los enlaces disulfuro y correcto ensamblaje por el entorno oxidante (Frenzel et al., 2013; Skerra y Plückthun, 1988). Los fragmentos de anticuerpos solubles pueden expresarse en el sobrenadante del cultivo, en el periplasma bacteriano y/o en el interior del citoplasma bacteriano. Aunque la secreción de los anticuerpos recombinantes en el medio de cultivo o la extracción de éstos del periplasma por choque osmótico proporciona un menor rendimiento global, el entorno oxidativo fuera del citoplasma celular confiere la formación adecuada de los enlaces disulfuro necesarios para el plegado natural de los dominios de los anticuerpos, además de obtenerse una alta concentración de anticuerpo prácticamente puro (Rajput et al., 2014; Weisser y Hall, 2009). Los anticuerpos expresados en grandes cantidades en el citoplasma celular suelen dar lugar a la formación de cuerpos de inclusión y a la agregación de anticuerpos (Guo et al., 2003). Alternativamente, la expresión puede dirigirse al entorno oxidante del espacio periplásmico, bajo la regulación de la secuencia líder pelB (Padiolleau-Lefèvre et al., 2006), o al sobrenadante del cultivo utilizando el sistema de α-hemolisina (HlyA) de E. coli. El sistema HlyA es un aparato secretor de tipo I que forma un canal proteico entre las membranas interna y externa de E. coli a través del I. INTRODUCCIÓN 65 cual se secreta la toxina hemolisina. Este sistema ha demostrado ser competente en la secreción de híbridos proteicos heterólogos, incluyendo scFv (Fernández et al., 2000). También existen otras bacterias gram-negativas como Proteus mirabilis o Pseudomonas putida donde los rendimientos de producción de scFv fueron de 12 y 3,6 mg mL-1 respectivamente (Dammeyer et al., 2011; Rippmann et al., 1998). Las bacterias gram-positivas secretan directamente la producción de los anticuerpos recombinantes debido a que les falta la membrana externa y ya se han utilizado con éxito Bacillus brevis, Bacillus subtilis y Bacillus megaterium. Además, esta última no produce proteasas alcalinas y confiere una alta estabilidad a los vectores plasmídicos durante el crecimiento, lo que permite la expresión estable de transgenes durante el cultivo a largo plazo en biorreactores. También se han utilizado como organismos de producción los lactobacilos, considerados como generalmente seguros (GRAS). Este estatus GRAS de los lactobacilos permite su uso directo para la aplicación oral, por ejemplo, para la producción de fragmentos de anticuerpos anti-Streptococcus mutans para prevenir la caries dental (Frenzel et al., 2013; Krüger et al., 2002; Vary, 1994). La producción de anticuerpos en levaduras y hongos ofrece la rentabilidad y efectividad de E. coli combinadas con las ventajas de la expresión eucariótica, incluyendo el procesamiento, el plegado y las modificaciones postraduccionales de la proteína, con una glicosilación similar a la humana. Además, la proteína se expresa en el sobrenadante del cultivo, lo que permite una purificación más rápida y sencilla. Asimismo, la proteína purificada contiene menos endotoxinas contaminantes en comparación con las bacterias, ya que suelen expresarse en forma soluble en las levaduras. Entre las levaduras más empleadas se encuentran Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Kluyveromyces lactis, y los hongos filamentosos Aspergillus awamori, Aspergillus niger. La inducción de la expresión de proteínas, por ejemplo, en la levadura metilotrófica Pichia pastoris, emplea un promotor obtenido del gen de alcohol oxidasa I (AOXI) regulado por metanol. Este promotor está estrechamente regulado y permite altos niveles de expresión extracelular que se producen por métodos de cultivo alimentados por metanol. Para la expresión de anticuerpos en los hongos se suelen utilizar dos promotores: el promotor de la glucoamilasa (glaA) y el promotor de la endoxilanasa A (exlA). En comparación con las levaduras, en los hongos filamentosos son más difíciles de generar clones transformados, pero tienen una larga tradición de uso en biotecnología y se han utilizado para la expresión de fragmentos de IgG (Frenzel et al., 2013; Gasser y Mattanovich, 2007; Weisser y Hall, 2009). I. INTRODUCCIÓN 66 Se ha explorado la alternativa del uso del parásito eucariota Leishmania tarentolae como sistema de expresión de diferentes proteínas recombinantes. Una de las principales ventajas de este sistema de expresión es el patrón de glicosilación similar al de los mamíferos: este protozoo es capaz de realizar la glicosilación O y la glicosilación N, que está muy conservada en los mamíferos. En consecuencia, este protozoo y otros parásitos se han empezado a utilizar para la producción de anticuerpos recombinantes con un rendimiento proteico de 2- 6 mg L−1 de scFv purificado (Fernández-Robledo y Vasta, 2010; Klatt y Konthur, 2012). Las células de los insectos representan un sistema de expresión muy versátil ya que pueden ser fácilmente transfectadas con virus específicos de los insectos como los de la familia Baculoviridae. Estos virus son altamente específicos y seguros para los mamíferos y plantas. Además, contienen un sistema de plegado y secreción de proteínas de mamífero eficiente, siendo capaces de realizar modificaciones posttraduccionales más complejas que las realizadas por los sistemas eucarióticos celulares. Su gran robustez, combinada con unos requisitos menos sofisticados para la fermentación, proporciona algunas ventajas en comparación con las células procariotas. Entre las ventajas que presenta este tipo de sistema de expresión se encuentran la capacidad de realizar fosforilaciones y N y O glicosilaciones, la correcta hidrólisis del péptido señal, la acrilación, palmitilación y miristilación. Estas características podrían marcar la diferencia al permitir la producción de anticuerpos con costes muy bajos. Entre las desventajas encontramos la expresión de inmunoglublinas en agregados y bajos niveles de expresión, probablemente causado por la sobrecarga del procesamiento posttraduccional cuando se encuentran bajo el control del fuerte promotor Polyhedron (Cérutti y Golay, 2012; Frenzel et al., 2013) Para una reducción eficaz de los costes de producción, pueden utilizarse plantas transgénicas, ya que representan un sistema de expresión altamente escalable; el cultivo puede ampliarse fácilmente sin un gran aumento de los costes. Para su producción solo se requieren nutrientes sencillos, agua y luz solar, siendo la más usada es Arabidopsis thaliana. En cambio, la generación de plantas transgénicas sigue siendo muy compleja y difícil. El obstáculo más importante de las plantas transgénicas es el procesamiento posterior, ya que puede ser necesario procesar toneladas de material vegetal. Además, las plantas son incapaces de realizar una auténtica N-glicosilación para producir N-glicanos que son esenciales para la estabilidad, el plegado y la actividad biológica de la mayoría de las proteínas terapéuticas. A pesar de estos problemas, se ha demostrado que los scFv y los anticuerpos monoclonales expresados en plantas tienen una afinidad y una actividad de I. INTRODUCCIÓN 67 unión similares a las de las bacterias (Ahmad et al., 2012; Demain y Vaishnav, 2009; Ma et al., 2003; Malabadi et al., 2012; Weisser y Hall, 2009). Finalmente, las líneas celulares de mamíferos son las más utilizadas para la producción de anticuerpos, ya que proporcionan un sofisticado sistema de plegado y secreción, así como una glicosilación similar a la humana. Los sistemas celulares de mamíferos más comunes utilizados para generar proteínas recombinantes son las células de ovario de hámster chino (CHO) y las no secretoras (NS0). La línea celular CHO aislada en los años 50 dio lugar a una serie de progenie genéticamente diferente, como las líneas celulares K1-, DukX B11-, DG44- y otras que difieren en la calidad del producto proteico y el rendimiento alcanzable. El rendimiento máximo de expresión de IgG funcional fue de 5 g L−1, pero el aumento de la producción no conduce a una gran reducción de los costes de producción. Cada vez son más las líneas celulares que han recibido la aprobación para la producción de proteínas recombinantes, entre las que se encuentran las células Per.C6, las células de mieloma de ratón NS0, las células de riñón de hámster bebé (BHK) y la línea celular de riñón embrionario humano HEK293. Por otra parte, para la producción de altos niveles de anticuerpos recombinantes se necesitan grandes esfuerzos técnicos que conllevan costes relativamente altos, puesto que se requiere de biorreactores de precio elevado para realizar la producción de proteínas a escala comercial. (Bandaranayake y Almo, 2014; Dalton y Barton, 2014; Frenzel et al., 2013; Wurm, 2004) Una vez producidos los anticuerpos recombinantes en el sistema elegido, es necesario proceder a su purificación para su uso como reactivo inmunológico. La cromatografía de afinidad es uno de los métodos más utilizados para la purificación de anticuerpos, debido a su alta selectividad y rapidez. Su eficacia se basa en gran medida en las características de unión del anticuerpo requerido y del ligando utilizado para la captura del anticuerpo (Ayyar et al., 2012). A lo largo de los años, la purificación de anticuerpos basada en la proteína A ha sido la tecnología más importante para la purificación industrial de anticuerpos, ya que la mayoría de los anticuerpos comerciales han sido monoclonales o policlonales, pero con la entrada de los anticuerpos recombinantes en el mercado, esto ha cambiado. La cromatografía de afinidad (Figura I.15) emplea diferentes tipos de agentes de unión (ligandos) y soportes de fase sólida (matrices). I. INTRODUCCIÓN 68 Figura I.15. Pasos de la purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad (figura adaptada de Ayyar et al., 2012). i: preparación de la matriz por activación química generando grupos funcionales reactivos en la superficie (la química puede seleccionarse en función de la elección del ligando a inmovilizar); ii: procedimiento de purificación. Mediante la optimización de diversas propiedades, como la especificidad, la selectividad, la reproducibilidad, las químicas de conjugación y la rentabilidad de estos componentes, este método puede aplicarse para la purificación a gran escala de anticuerpos con el fin de lograr el rendimiento y la pureza deseados del producto (Arora et al., 2017). Los anticuerpos recombinantes pueden purificarse utilizando técnicas de cromatografía de afinidad, que separa los anticuerpos en función de su interacción específica y reversible con antígenos objetivo inmovilizados o moléculas marcadoras. Una de las estrategias más comunes de purificación de anticuerpos recombinantes es la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC), que separa el anticuerpo que contiene grupos específicos (por ejemplo, histidina; normalmente localizada en el extremo C-terminal para evitar la purificación de proteínas incompletas) mediante la unión covalente coordinada con marcadores de iones metálicos (por ejemplo, iones de níquel, cobre, zinc y cobalto) inmovilizadas en la resina. El número de átomos donantes de pares de electrones (por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre) en el compuesto quelante determina la fuerza y la I. INTRODUCCIÓN 69 estabilidad de unión del complejo metal-quelato. Así, se ha demostrado que los iones metálicos (Ni2+, Cu2+, Co2+ y Zn2+) muestran una alta afinidad hacia la región Fc de la IgG, más que las regiones Fab (Ayyar et al., 2012; Todorova-Balvay et al., 2004). Los cuatro pasos principales de la purificación basada en IMAC son el equilibrio de la muestra, unión, lavado y elución. Inicialmente, los anticuerpos recombinantes con marcadores específicos (por ejemplo, colas de histidinas) se unirán a la resina. El paso de lavado permite eliminar los anticuerpos no específicos y la mayoría de las impurezas. Por último, la proteína de interés suele eluirse cambiando el pH (generalmente se utiliza un tampón de pH bajo, como el acetato de sodio de pH 4,4, y se recoge inmediatamente en un tampón de neutralización, por ejemplo, 100 mM de NaOH, para preservar la actividad del anticuerpo purificado), o añadiendo una molécula competitiva (por ejemplo, 250 mM de imidazol) (Ma y O’Kennedy, 2015, 2017; McMahon y O’Kennedy, 2000). Hay muchas resinas, columnas y beads de IMAC disponibles en el mercado (por ejemplo, de Bio-Rad Laboratories, Pall Life Sciences, Thermo Scientific Pierce, GE Healthcare, QIAGEN, Merck Millipore y Sigma-Aldrich). Capítulo II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 73 Las nueces y los pistachos son los frutos de cáscara más extendidos y comercializados en el mundo debido a sus propiedades nutritivas y organolépticas (Dreher, 2012; Hayes et al., 2015). Según la base de datos de consumo del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA), el consumo per cápita en 2021 de frutos de cáscara está en 3,55 Kg ingeridos por persona y año, un 6,8 % inferior a 2020. A pesar de perder relevancia con respecto a 2020 (momento en que el consumo creció de forma muy destacada gracias a la permanencia en los hogares durante más tiempo), consiguen ganar participación en la cesta de los hogares españoles con respecto a 2019 ya que ese año los españoles consumieron 147 millones de Kg de frutos de cáscara, siendo el consumo medio por persona y año de 3,19 Kg. Los frutos de cáscara más consumidos fueron nueces (0,67 Kg/persona/año), cacahuetes (0,35 Kg), almendras (0,25 Kg) y pistachos (0,18 Kg). Las nueces son el primer fruto de cáscara por orden de consumo en los hogares españoles, representando el 20,6 % sobre el volumen total de frutos de cáscara, con un gasto de 5,63 € por persona y año. Además, el perfil de hogar con mayor consumo de nueces se corresponde con personas mayores de 50 años (MAPA, 2019, 2021). Un consumo regular de frutos de cáscara se asocia a una disminución del riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares debido a la presencia de compuestos fenólicos en las pieles, que inhiben la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (Goli et al., 2005; Labuckas et al., 2008). Asimismo, la frecuencia de consumo de frutos secos está inversamente relacionada con un aumento del riesgo de desarrollar diabetes mellitus tipo 2 y de los síntomas relacionados con el envejecimiento, efectos atribuidos principalmente a la fibra, las grasas saludables, los antioxidantes y los compuestos antiinflamatorios de las nueces (Bulló et al., 2015; Rock et al., 2017). Debido a sus propiedades beneficiosas, la nuez y el pistacho también se emplean mucho en la industria alimentaria, por lo que, de forma directa (compra de frutos de cáscara) o indirecta (productos comerciales con contenido de frutos de cáscara), una gran parte de la población está consumiendo tanto nuez como pistacho, lo que justifica su crecimiento sostenido a nivel mundial. Los mayores productores de nuez a nivel mundial son China, Estados Unidos e Irán. En cuanto al consumo de nuez, en primer lugar se encuentra Israel con 0,6 kg/persona/año, seguido de Irán (0,52 kg/persona/año) y Estados Unidos (0,5 kg/persona/año) (MAGYP, 2019). Los mayores productores de pistacho en el año 2018 fueron Irán, Estados Unidos y Turquía, siendo a su vez los mayores consumidores de pistachos. Turquía es el mayor consumidor de pistacho con un consumo anual de 130.202 Tm al año. Estados Unidos es el segundo consumidor más importante, con un total II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 74 de 93.432 Tm al año, e Irán ha aumentado constantemente el consumo de pistachos hasta 49.504 Tm, lo que lo convierte en el tercer mayor consumidor (FAO, 2018; Misachi, 2018). A pesar de sus efectos beneficiosos para la salud, los frutos de cáscara son considerados como importantes alérgenos que con frecuencia causan reacciones adversas en consumidores alérgicos (Costa et al., 2014; Geiselhart et al., 2018). Las alergias alimentarias son un problema creciente en la salud pública y el desarrollo de métodos rápidos y eficaces de detección de alérgenos es esencial para que los fabricantes de alimentos garanticen un etiquetado preciso y aseguren una información fiable al consumidor alérgico. Entre las técnicas disponibles actualmente para identificar alérgenos alimentarios, destacan las que se basan en la detección de proteínas mediante técnicas inmunoenzimáticas ELISA. Las técnicas ELISA se emplean para la detección cualitativa o cuantitativa de proteínas alergénicas tanto en la investigación y diagnóstico de las alergias, como en el control de calidad de los alimentos en diversas industrias y en el control oficial del etiquetado de los alimentos. Actualmente existen en el mercado inmunoensayos y kits comerciales de ELISA dirigidos a detectar nuez y pistacho mediante el empleo de anticuerpos monoclonales y policlonales obtenidos por inmunización de animales de experimentación. Sin embargo, pueden mostrar reacciones cruzadas con otras especies filogenéticamente relacionadas (Tabla I.2). En el caso de la nuez (Juglans regia) es frecuente la aparición de reacciones cruzadas con la pacana (Carya illinoinensis), mientras que en el caso del pistacho (Pistacia vera) pueden presentar reactividad cruzada con el anacardo (Anacardium occidentale) y el mango (Mangifera indica) (Noorbakhsh et al., 2011). En consecuencia, es necesario desarrollar métodos alternativos más específicos que eviten las reacciones cruzadas con especies no diana y que respeten las recomendaciones de bienestar animal. El desarrollo de métodos basados en la obtención de anticuerpos recombinantes puede representar una alternativa eficaz para satisfacer estas necesidades. En este contexto, esta Tesis Doctoral tiene por objetivo principal la obtención de anticuerpos recombinantes frente a las proteínas alergénicas de nuez (Juglans regia) y pistacho (Pistacia vera) mediante la técnica de presentación en fagos (phage display) a partir de genotecas comerciales sintéticas que contienen fago-anticuerpos recombinantes, que no requieren el empleo de animales de experimentación. Con este procedimiento se tiene fácil acceso a la secuencia nucleotídica codificante de los anticuerpos, lo que permite su modificación mediante ingeniería genética con el fin de mejorar sus propiedades de unión al antígeno o II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 75 incorporar modificaciones funcionales en los anticuerpos generados, a la vez que se desarrollan técnicas de ELISA para la detección de estas especies en alimentos. En este contexto, los objetivos específicos de esta Tesis Doctoral son: 1. Obtención, caracterización y modificación funcional de anticuerpos recombinantes específicos frente a nuez (Juglans regia) y pistacho (Pistacia vera) mediante la técnica de presentación en fagos (phage display) a partir de genotecas de fagos recombinantes. 2. Producción de los anticuerpos recombinantes biotinilados mediante transformación en Pichia pastoris. 3. Identificación, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las dianas moleculares reconocidas por los anticuerpos recombinantes frente a nuez y pistacho, y caracterización de la interacción molecular entre dichos epítopos y los anticuerpos recombinantes obtenidos. 4. Puesta a punto de diversos formatos de técnicas inmunoenzimáticas (ELISA), utilizando los anticuerpos recombinantes obtenidos, con y sin modificación funcional, para detectar la presencia de nuez y pistacho en alimentos. Capítulo III PLAN DE TRABAJO Y METODOLOGÍA RESUMIDA III.1. PLAN DE TRABAJO 79 III.1. PLAN DE TRABAJO Para conseguir los objetivos de esta Tesis Doctoral ha sido necesario desarrollar el siguiente plan de trabajo: 1. Obtención de anticuerpos recombinantes específicos frente a nuez (Juglans regia) mediante la técnica de presentación en fagos (phage display) a partir de genotecas de fago-anticuerpos recombinantes tipo scFv y su utilización para la detección de nuez en alimentos mediante técnicas inmunoenzimáticas (ELISA). 1.1. Enriquecimiento de la genoteca Tomlinson I en clones de fago-scFv específicos de nuez. 1.2. Selección de clones de fago-scFv individuales mediante ELISA monoclonal. 1.3. Secuenciación y caracterización de los clones seleccionados. 1.4. Producción de scFv biotinilados mediante transformación en Pichia pastoris. 1.5. Producción y caracterización del scFv multimerizado. 1.6. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las proteínas de nuez reconocidas por el scFv seleccionado. 1.7. Desarrollo de una técnica de ELISA directo para la detección de nuez utilizando un scFv específico frente a nuez multimerizado con ExtrAvidina-HRP. 1.8. Aplicación de la técnica de ELISA directo con scFv multimerizado para verificar la presencia de nuez en alimentos comerciales, y comparación con un kit comercial de ELISA y una técnica de PCR en tiempo real. 2. Obtención de anticuerpos recombinantes específicos frente a pistacho (Pistacia vera) mediante la técnica de phage display a partir de genotecas de fago-anticuerpos recombinantes tipo dAb y su utilización para la detección de pistacho en alimentos mediante técnicas inmunoenzimáticas (ELISA). 2.1. Enriquecimiento de la genoteca de dAbs en clones de fago-dAb específicos de pistacho mediante diferentes estrategias de biopanning. 2.2. Selección de clones de fago-dAb individuales mediante ELISA monoclonal. 2.3. Secuenciación y caracterización de los clones seleccionados. 2.4. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las dianas moleculares reconocidas por los anticuerpos recombinantes frente a pistacho. 2.5. Desarrollo de una técnica inmunoenzimática de ELISA indirecto, utilizando un fago- anticuerpo específico para la detección de pistacho en alimentos. 2.6. Producción de dAb biotinilados in vivo, específicos frente a las proteínas de pistacho en la levadura metilotrófica Pichia Pastoris. III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA 80 III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA La metodología resumida para el desarrollo del plan de trabajo indicado para cada uno de los apartados de la Tesis Doctoral se recoge a continuación. III.2.1. Muestras y preparación de los extractos de proteínas y ADN Las muestras se obtuvieron de establecimientos comerciales especializados y, cuando no fue posible, se solicitaron las especies botánicas de interés a organismos de investigación como el Instituto Nacional de Investigación Agraria y Alimentaria (INIA), Instituto de Investigación y Tecnología Agroalimentarias de Cataluña (IRTA) y el Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura (CEBAS-CSIC). Asimismo, se analizaron muestras comerciales de alimentos adquiridos en diversos establecimientos minoristas de alimentación para comprobar la validez de los métodos desarrollados a lo largo de este trabajo para la detección de vegetales alergénicos y la verificación del etiquetado. Tras la identificación de las muestras biológicas, se prepararon muestras de referencia y mezclas experimentales que contengan concentraciones conocidas entre 0,1 mg Kg−1 y 5 % en peso de cada especie diana en la matriz de elección. Las muestras fueron homogeneizadas mediante un molino IKA A11 (5 g). Partiendo de 200 mg del homogeneizado, se prepararon los extractos proteicos mediante la incorporación de 1200 μL de tampón de extracción, incubación con agitación, posterior centrifugación, filtrado y cuantificación de proteínas mediante BCA. Los extractos se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para llevar a cabo análisis de PCR en tiempo real, se extrajo ADN de las muestras comerciales y mezclas experimentales mediante Wizard DNA Clean-Up System Kit y se cuantificó la concentración de ADN mediante NanoDrop ND-1000. III.2.2. Selección de scFv y dAb específicos frente a nuez y pistacho mediante presentación en fagos (phage display) Se emplearon las genotecas comerciales Tomlinson I (scFv, con región VH V3-23/d47 y JH4b, y región VK O12/O2/DPK9 y JK1) y de anticuerpos de dominio único (dAb, solo con región VH V3-23/d47). Estas genotecas comprenden más de 100 millones de fragmentos de anticuerpos diferentes, clonados en un vector fagémido resistente a la ampicilina y transformado en células TG1 de E. coli (K12Δ (lac-proAB) supE thi hsdD5/F’ traD36 proA+B laclq lacZΔM15). III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA 81 Se realizaron varias rondas de selección, alternando como soportes de la reacción paletas de poliestireno y partículas paramagnéticas recubiertas con un extracto proteico de la especie diana (pistacho o nuez), con el fin de evitar la selección de fago-anticuerpos que reconozcan al soporte. Para evitar reacciones cruzadas con otros alérgenos vegetales, se incluyó una etapa de hibridación sustractiva utilizando extractos de proteínas heterólogas (pacana, anacardo y cacahuete). Los fagos que reconocían a la especie diana se eluyeron con tripsina, se amplificaron en E. coli y se sometieron a varias rondas de selección para enriquecer la genoteca en fago-anticuerpos específicos frente a la especie diana. Para la amplificación de los fagos, se inoculó 1 mL de bacterias recuperadas del biopanning (o hasta una DO600 de 0,1) en 500 mL de 2×TY (16 g L−1 triptona, 10 g L−1 extracto de levadura y 5 g L−1 NaCl) que contenía 100 µg mL-1 de ampicilina y 4 % (p/v) de glucosa y se incubó a 37 °C hasta alcanzar una DO600 de 0,5. Por otra parte, 10 mL del cultivo se infectó con 5x1010 partículas de fago ayudante y se resuspendió en 100 mL de 2xTY con ampicilina, kanamicina y glucosa para incubar toda la noche. Después, para conocer el título del biopanning, se realizó la precipitación de los fagos con polietilenglicol (PEG)/NaCl y se realizaron diferentes diluciones en PBS para extender en placas de agar TYE (15 g L−1 bacto-agar, 10 g L−1 triptona, 5 g L−1 extracto de levadura y 8 g L−1 NaCl). A su vez, los fagos precipitados se usaron en un ELISA indirecto para confirmar especificidad y analizar productos comerciales. III.2.3. Selección de clones de fago-scFv individuales mediante ELISA monoclonal Para seleccionar los clones que se unen a la nuez y el pistacho, se recogieron al azar 95 colonias individuales de las placas TYE de la segunda ronda de selección frente a la especie diana y se inocularon en pocillos separados de microplacas de cultivo celular Nunc que contenían 200 µL de 2 × TY con 100 µg mL-1 de ampicilina y 4 % de glucosa. Tras la infección con el fago ayudante, se examinaron los fagos monoclonales para comprobar la unión a la especie diana (nuez o pistacho) mediante un ELISA monoclonal, tapizando placa Maxisorp Nunc con 25 µL del sobrenadante del cultivo, bloqueando con MPBS (1 % de leche en polvo en PBS) y detectando con anticuerpo monoclonal de ratón HRP/anti-M13. Aquellos clones que presentaron una ratio de absorbancia (Abs nuez o pistacho/ Abs cacahuete) mayor a 5 fueron seleccionados. III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA 82 III.2.4. Secuenciación y caracterización de los clones seleccionados Los clones seleccionados se amplificaron por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los primers LMB3 y pHEN para nuez y CDR1-2 Fw (5’-ACGTCAGAAGACATCA GGTGCAGCTGTTGGAGTC-3’) y CDR3 Rev (5’-TCAGTTGAAGACCTCGAATTCAGATCCTCTTC TGAGATG-3’) para pistacho. Los productos de PCR de nuez (VH y VL, 935 pb) y pistacho (VH, 360-390 pb) se examinaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %. A continuación, se secuenciaron para confirmar con la secuencia completa de los clones. Este análisis se llevó a cabo en la Unidad de Genómica de la universidad Complutense de Madrid con el secuenciador multicapilar ABI Prism 3730 y los primers pR2seq (5’- CCCTCATAGTTAGCGTAACGA-3’) y M13 rev (5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’). Las secuencias de nucleótidos se compararon con el software European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS), y luego se analizaron con IMGT/V-QUEST (software de alineación de secuencias para inmunoglobulinas y receptores de células T) para determinar las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la VH y VL. III.2.5. Producción de scFv biotinilados mediante transformación en Pichia pastoris Una vez conocida la secuencia de los clones, se introdujeron modificaciones funcionales (conjugación con biotina, EQKLISEEDL) con el fin de multimerizar los anticuerpos mediante su unión a una molécula de ExtrAvidina-HRP y optimizar la sensibilidad de la detección. Para ello, se llevó a cabo una cotransformación con dos vectores en Pichia pastoris, el primero con la secuencia del anticuerpo y el dominio aceptor de biotina (BAD), denominados pMJA186-G2 para nuez y pRAS002m para pistacho, y el segundo con la enzima biotín ligasa (pMJA180 para ambos). La producción de los fragmentos scFv o dAb específicos solubles por parte de 95 clones transformados en Pichia pastoris se confirmó mediante dot blot de los sobrenadantes tras la inducción con metanol. Este paso de cribado por dot blot es muy útil para asegurar la selección de clones transformados con éxito que expresan la proteína de interés. El vector pMJA180 con la secuencia de la enzima biotín ligasa tiene de base el vector pPIC6α con resistencia a blasticidina, cuya concentración en los medios de expresión (BMGY, buffered glycerol-complex médium, y BMMY, buffered methanol-complex medium) se incrementó hasta 500 μg mL-1, para asegurar la selección de los clones cotransformados. III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA 83 La inserción de ambos plásmidos en el ADN genómico del clon seleccionado de Pichia pastoris se evaluó mediante PCR con los pares de cebadores MJA254/MJA259 (para scFv/dAb-BAD) y MJA255/MJA256 (para BirA). III.2.6. Producción y caracterización del scFv multimerizado Los clones seleccionados se cultivaron en primer lugar en el medio Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (YPD) con zeocina y blasticidina y de ahí se pasaron a 600 mL de medio de cultivo BMGY durante 18 h en agitación. Después, la inducción con metanol durante 72 h en medio BMMY (600 mL) produjo la secreción del anticuerpo biotinilado al medio de cultivo. El cultivo se centrifugó para eliminar las levaduras y se filtró por membrana de 0,4 μm. La purificación del sobrenadante se llevó a cabo mediante cromatografía en ÄKTA purifier FPLC system a través de una columna Hi-Trap de proteína L (eluido con 0,1 M glicina-HCl) o de una columna Ni-NTA (eluido con gradiente de imidazol). Las fracciones recuperadas fueron dializadas en PBS a través de AMICON Ultra-15 Centrifugal Filter Units ajustando la concentración a 2 mg mL-1. Para la multimerización de scFv biotinilados se utilizó ExtrAvidina-HRP siguiendo las directrices del NIH Tetramer Core Facility. El procedimiento consistió en añadir a una alícuota de 100 μL (200 μg) de scFv biotinilado, 0,5 μL de solución de ExtrAvidina-HRP (2,5 mg mL-1) cada 10 min hasta un total de 10 veces. La reacción se llevó a cabo en un mezclador de muestras (HulaMixer Sample Mixer). Los tubos de anticuerpos multimerizados se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C hasta su uso. III.2.7. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las proteínas de nuez y pistacho reconocidas por los anticuerpos recombinantes seleccionados La caracterización de la estabilidad del epítopo se realizó mediante ELISA directo de los extractos proteicos sometidos a tratamiento térmico (horneado y autoclavado) con los anticuerpos multimerizados de nuez o fago-anticuerpos de pistacho. El fraccionamiento de extractos proteicos mediante la separación cromatográfica de exclusión de tamaño molecular se llevó a cabo en un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas (sistema ÄKTA purifier FPLC). Se inyectaron 100 μL de extracto proteico de nuez/pistacho desgrasado y filtrado en una columna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR, III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA 84 previamente equilibrada con PBS. La velocidad de flujo se mantuvo en 0,5 mL min−1. Las fracciones eluidas se recogieron en viales de vidrio de 1,5 mL y se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior en el ELISA frente a los anticuerpos recombinantes. También se llevaron a cabo electroforesis en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes, así como Western blot de los extractos proteicos y de las fracciones obtenidas mediante cromatografía líquida para corroborar a qué familia proteica estaba reconociendo cada uno de los anticuerpos recombinantes. La identificación mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF) de las fracciones cromatográficas y/o bandas electroforéticas reconocidas por los anticuerpos recombinantes se realizó en la Unidad de Proteómica del CAI que dispone de un sistema de cromatografía liquida capilar (LC-MS-MS), modelo Q-TOFII de Micromass y de un espectrómetro de masas 4800 Plus MALDI-TOF/TOF Analyzer, con fuente de ionización tipo MALDI y dos analizadores tipo tiempo de vuelo en tandem y cámara de colisión (CID) para fragmentación de iones de Applied Biosystems. Para el análisis del índice de multimerización de los anticuerpos recombinantes biotinilados se contó con el apoyo del Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC, para llevar a cabo los experimentos de coeficiente de sedimentación mediante ultracentrifugación. III.2.8. Desarrollo de una técnica de ELISA directo para la detección de nuez utilizando un scFv específico frente a nuez multimerizado con ExtrAvidina-HRP El ELISA directo utilizando JrBSF-scFv multimerizado específico de la nuez (Juglans regia Biotinylated Soluble Fragment-single chain antibody, multimerizado con ExtrAvidina-HRP) se desarrolló para detectar la proteína de la nuez en productos comerciales y para determinar la sensibilidad del método con los extractos de las mezclas binarias. Los pocillos de las placas de microtitulación se recubrieron con los extractos de proteínas a analizar diluidos 1:100 en PBS. La placa se bloqueó con albúmina de suero bovino (BSA) al 3 % en TBS (tampón tris-fosfato). Después, se añadieron 100 μL de scFv multimerizado (2 mg mL−1) diluido 1:500 (v/v) en TBST con 1 % de BSA. Por último, se añadieron 100 µl de solución de sustrato TMB a cada pocillo, se paró la reacción con 50 µl de ácido sulfúrico 1M y se midió la absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro FLUOSTAR Optima. Los III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA 85 lavados después de cada paso se realizaron con TBS. Todos los experimentos se realizaron por duplicado en tres días diferentes. III.2.9. Aplicación de diversos formatos de técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) utilizando anticuerpos recombinantes para detectar la presencia de alérgenos vegetales en alimentos Los fago-anticuerpos dAb específicos frente a pistacho y los fragmentos scFv biotinilados específicos de nuez y purificados, se emplearon en el desarrollo de técnicas de ELISA indirecto y directo, para la detección de pistacho y nuez, respectivamente, en alimentos. Para evaluar el nivel de detección y la capacidad de cuantificación de las técnicas desarrolladas, se analizaron mezclas experimentales que contenían concentraciones conocidas de nuez o pistacho en una matriz alimentaria (harina de trigo o maíz). Se elaboraron rectas de calibración para evaluar la idoneidad (afinidad, nivel de detección, especificidad) de los anticuerpos recombinantes para detectar y cuantificar la presencia de nuez y pistacho en alimentos. Estas curvas se ajustaron a la ecuación logística de 4 parámetros utilizando el software Origin 8.0. Asimismo, se estudió la influencia del tratamiento térmico en el reconocimiento de estos alérgenos. El límite de detección (LOD) se calculó como la concentración de la proteína objetivo que presenta un valor de absorbencia superior a la media de los 8 frutos de cáscara más tres veces su desviación estándar (SD). Una vez elegidas las sondas de afinidad con mejores características, y puestas a punto las técnicas de ELISA, se analizaron muestras comerciales de alimentos procesados con el fin de determinar la presencia y concentración de nuez y pistacho en estas matrices. Se consideró que un producto comercial era positivo cuando su valor de absorbancia era mayor que el del estándar de 103 mg Kg−1. III.2.10. Comparación del JrBSF-scFv multimerizado en ELISA directo con un kit comercial de ELISA tipo sándwich y una técnica de PCR en tiempo real La prueba se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante del kit comercial, añadiendo 100 μL de extractos de muestras no diluidas y diluidas (1:5, 1:10, 1:25 en tampón de extracción de proteínas) a las placas tapizadas con el anticuerpo específico de nuez del kit Alertox (Biomedal Diagnostics). Un control de extracción negativo (sin muestra) III.2. METODOLOGÍA RESUMIDA 86 y el estándar de 0 mg Kg−1 se incluyeron en todos los ensayos, y cada muestra se analizó por duplicado. El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) se calcularon como la concentración de la proteína objetivo que presenta un valor de absorbancia superior al blanco (harina de maíz) más 3 o 10 veces, respectivamente, su desviación estándar. Se generó una curva de concentración-respuesta utilizando los estándares proporcionados por el kit, trazando los valores de absorbancia frente a la concentración de nuez. La curva estándar obtenida se ajustó a la ecuación logística de 4 parámetros utilizando el software Origin 8.0. La reactividad cruzada del ensayo se calculó para 8 frutos secos y la soja, como la cantidad de nuez estimada interpolando los valores de absorbancia de los extractos no diluidos en la ecuación logística obtenida del kit. El análisis de la PCR en tiempo real de las muestras comerciales se realizó utilizando cebadores específicos para la nuez (WalITSdir/WalITSinv) y una sonda (WalITSP) o cebadores específicos de la nuez (PecITSdir/PecITSinv) y una sonda (PecITSP) (Tabla IV.2.1). Todos los análisis de PCR en tiempo real se realizaron por duplicado para cada extracto de ADN, junto con su correspondiente control endógeno 18S. Capítulo IV RESULTADOS IV.1. RESULTADOS 89 IV.1. MULTIMERIC RECOMBINANT ANTIBODY (SCFV) FOR ELISA DETECTION OF ALLERGENIC WALNUT. AN ALTERNATIVE TO ANIMAL ANTIBODIES Las nueces están clasificadas como un importante ingrediente alergénico que puede provocar reacciones graves en personas sensibles. Por ello, las industrias alimentarias tienen la responsabilidad de declarar en los alimentos envasados la presencia de nueces para evitar una exposición involuntaria. Los inmunoensayos se utilizan ampliamente para detectar proteínas alergénicas pero los únicos disponibles dependen del uso de inmunización animal. En este trabajo, a partir de la genoteca Tomlinson I se ha conseguido aislar un anticuerpo recombinante de tipo scFv que es capaz de reconocer a la nuez, y que mediante la introducción de modificaciones de la secuencia se ha transformado en Pichia pastoris para producir in vivo el anticuerpo Juglans regia Biotinylated Soluble Fragment- single chain (JrBSF-scFv) y multimerizarlo con ExtrAvidina-HRP. Este scFv multimerizado se ha utilizado para el desarrollo de un ELISA directo que permite detectar la nuez con un límite de detección de 1616 mg Kg−1. El ensayo solo presenta reacción cruzada con la pacana en un 2,25 % por lo que es una buena herramienta para la detección de nuez en matrices alimentarias crudas y horneadas. Raquel Madrid, Silvia de la Cruz, Aina García-García, Marcos J.C. Alcocer, Isabel González, Teresa García, Rosario Martín (2018). Multimeric recombinant antibody (scFv) for ELISA detection of allergenic walnut. An alternative to animal antibodies. Journal of Food Composition and Analysis, 67, 201–210. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.01.017 Publicado en Journal of Food Composition and Analysis Índice de impacto (2018): 2,994 Posición en JCR (2018): 37/135 https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.01.017 IV.1. RESULTADOS 91 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0889157518300176 IV.2. RESULTADOS 101 IV.2. SURVEY OF COMMERCIAL FOOD PRODUCTS FOR DETECTION OF WALNUT (JUGLANS REGIA) BY TWO ELISA METHODS AND REAL TIME PCR La detección de alérgenos en los alimentos es muy importante y requiere una especificidad y sensibilidad determinada para detectar cantidades muy pequeñas de alérgenos en alimentos procesados. En el presente estudio se analizaron 100 muestras de alimentos comerciales con tres técnicas diferentes para la detección de nuez: un kit de ELISA tipo sándwich basado en anticuerpos policlonales, un ELISA directo utilizando un scFv multimérico y una PCR en tiempo real. El método más sensible fue la PCR en tiempo real, seguido del kit ELISA en sándwich y el ELISA con scFv multimérico. A su vez, el kit ELISA se vio menos afectado por el tratamiento térmico de las muestras que el ELISA directo con scFv multimérico, pero presentó mayor reacción cruzada con la pacana, y esos falsos positivos tuvieron que confirmarse mediante PCR en tiempo real. En cuanto al análisis de los 100 productos comerciales, entre el 7 y el 12,6 % de las muestras contenían nuez, pero no la declaraban, lo que indica un riesgo para los consumidores alérgicos a la nuez. Solo hubo una muestra que declaraba nuez en el etiquetado pero no se detectó con ninguna técnica. Los resultados confirman que el uso complementario de las diferentes técnicas permite una verificación fiable del etiquetado de alérgenos. Raquel Madrid, Aina García-García, Pablo Cabrera, Isabel González, Rosario Martín, Teresa García (2021). Survey of commercial food products for detection of walnut (Juglans regia) by two ELISA methods and Real Time PCR. Foods, 10, 440. https://doi.org/10.3390/foods10020440 Publicado en FOODs Índice de impacto (2021): 5,561 Posición en JCR (2021): 35/143 https://doi.org/10.3390/foods10020440 IV.2. RESULTADOS 103 IV.2. RESULTADOS 104 IV.2. RESULTADOS 105 IV.2. RESULTADOS 106 Tabla IV.2.1. DNA sequences and description of the pecan (AF303825) and walnut (HE574850) primers and probes to develop a real time PCR. IV.2. RESULTADOS 107 IV.2. RESULTADOS 108 Tabla IV.2.2. Determination of cross-reactivity with heterologous species using the sandwich ELISA kit for walnut. IV.2. RESULTADOS 109 Figura IV.2.1. ELISA results obtained from experimental walnut/corn flour binary mixtures prepared with raw peeled walnut (RPW, ■), toasted peeled walnut (TPW, ●), raw unpeeled walnut (RUPW, ▲), and toasted unpeeled walnut (TUPW, ▼) using the Alertox® walnut ELISA kit. The protein extracts from binary mixtures were used undiluted (A) or diluted 1:5 (B) or 1:25 (C) in protein extraction buffer, and results were compared with the standard curve obtained with the ready to use standards provided with the kit (STD, ◄). Points represent the mean value ± SD (n = 2; 3 independent experiments).Determination of cross-reactivity with heterologous species using the sandwich ELISA kit for walnut. IV.2. RESULTADOS 110 Figura IV.2.2. Standard curves obtained from experimental binary mixtures (raw peeled walnut samplesin corn flour), analyzed with the Alertox® walnut ELISA kit (■) and the multimeric scFv ELISA (●). Protein extracts were prepared according to directions of each method and diluted 1:25 (ELISA kit) or 1:100 (scFv ELISA) in PBS for comparison. Points represent the mean value ± SD (n = 2; 3 independent experiments). IV.2. RESULTADOS 111 Figura IV.2.3. SDS-PAGE electrophoresis (A) and JrBSF scFv immunoblots (B, C) of 10 μg walnut extract (W), 10 μg pecan extract (Pe), and 2 μg purified JrBSF (scFv). Mw of the protein marker bands (ColorBurstTM Electrophoresis Protein Marker, Sigma) is indicated. JrBSF scFv in the immunoblots was detected either with Anti-c-Myc monoclonal antibody (9E10) and alkaline phosphatase (AP) conjugated anti-mouse IgG (B) or with horseradish peroxidase (HRP) conjugated Anti-6X His tag® antibody (ab1187) (C). IV.2. RESULTADOS 112 Tabla IV.2.3. Peptides identified by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry and the MASCOT Database Search engine. Protein scores greater than 83 were significant (p < 0.05). Figura IV.2.4. Alignment of peptides identified by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry and the MASCOT Database Search engine in the 11S globulin seed storage protein 2-like (Juglans regia) (Accession Number: XP_018818401.1). IV.2. RESULTADOS 113 Tabla IV.2.4. Determination of the presence of walnut in commercially processed food products using multimeric scFv ELISA, Alertox® Walnut ELISA kit, and real time PCR. IV.2. RESULTADOS 114 IV.2. RESULTADOS 115 IV.2. RESULTADOS 116 IV.2. RESULTADOS 117 IV.3. RESULTADOS 119 IV.3 PHAGE DISPLAYED DOMAIN ANTIBODIES (DAB) FOR DETECTION OF ALLERGENIC PISTACHIO PROTEINS IN FOODS Al igual que las nueces, los pistachos también pueden provocar reacciones alérgicas graves en individuos alérgicos. En este trabajo, exponemos el aislamiento de los primeros anticuerpos recombinantes producidos sin inmunización animal para la detección de pistacho en productos alimentarios. Se evaluaron varias estrategias de biopanning por presentación en fagos del repertorio de anticuerpos de dominio único (dAb) de origen humano en busca de sondas específicas frente al pistacho. El clon que produce el fago-dAb PVF4 fue seleccionado porque además no presentó reacción cruzada con el anacardo, a pesar de su proximidad filogenética con el pistacho. Los análisis de Western blot y de espectrometría de masas en tándem por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF/TOF) demostraron que este clon reconocía una banda única de ∼22 kDa relacionada con la subunidad básica de la globulina 11S del pistacho (alérgeno Pis v 2). Por último, ensayos de sensibilidad del ELISA indirecto con el fago-dAb PVF4 desarrollado determinaron un límite de detección (LOD) de 3983 mg Kg−1. Para evaluar la aplicabilidad del ELISA indirecto se analizaron 77 productos alimentarios comerciales. Raquel Madrid, Aina García-García, Isabel González, Rosario Martín, Teresa García (2020). Phage displayed domain Antibodies (dAb) for detection of allergenic pistachio proteins in foods. Foods, 9, 1230. https:/10.3390/foods9091230 Publicado en FOODs Índice de impacto (2020): 4,350 Posición en JCR (2020): 37/143 IV.3. RESULTADOS 121 IV.3. RESULTADOS 122 IV.3. RESULTADOS 123 Tabla IV.3.1. List of heterologous species analysed in the indirect phage enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). IV.3. RESULTADOS 124 IV.3. RESULTADOS 125 Tabla IV.3.2. Different biopanning strategies used, and number of specific pistachio-binding clones obtained from each strategy. IV.3. RESULTADOS 126 IV.3. RESULTADOS 127 Figura IV.3.1. Phage titers obtained after each round of affinity selection against pistachio extract, following different biopanning strategies (S1–S4). IV.3. RESULTADOS 128 Figura IV.3.2. Indirect phage-dAb ELISA results obtained with polyclonal phages rescued at each round of selection from strategies S1–S4 against pistachio. Precipitated phages from each round of selection were analysed against pistachio, cashew and peanut extracts and negative controls (betagalactosidase and BSA). Absorbance values are the mean of three independent experiments with duplicates. Error bars show the standard deviation for each set of data. IV.3. RESULTADOS 129 Figura IV.3.3. Indirect phage-dAb ELISA results obtained with monoclonal phages selected from the second round of biopanning against a set of tree nuts. Absorbance values are the mean of four independent experiments with duplicates. Error bars show the standard deviation for each set of data. IV.3. RESULTADOS 130 Figura IV.3.4. Amino acid sequences of the pistachio binding dAbs deduced from the nucleotide sequences by SnapGene tool. Positions of the complementarity determining regions of the variable domains (CDR 1–3) and the c-Myc and VSV tags are indicated as determined by IMGT/V-QUEST tool. IV.3. RESULTADOS 131 Figura IV.3.5. Elution profile of pistachio proteins obtained from preparative FPLC size exclusion column(A) showing absorbance values at 280 nm. (B) Indirect phage-dAb ELISA with some fractions obtained from FPLC (indicated by an orange bar). Absorbance values are the mean of duplicates. Error bars show the standard deviation for each set of data. Figura IV.3.6. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in reducing conditions of different fractions obtained in size exclusion chromatography (A) and immunoblot with PVF4 phage-dAb (B) of 10 μg of pistachio extract (T) and 10 μL of each fraction sample. Mw of the protein marker bands (ColorBurstTM Electrophoresis Protein Marker, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) is indicated. Highlighted bands were excised and analysed by matrix- assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry (MALDI- TOF/TOF). Phage-dAb in the immunoblot was detected with anti-M13 monoclonal mouse antibody conjugated with Horseradish peroxidase (HRP). IV.3. RESULTADOS 132 Figura IV.3.7. Amino acid sequence of the 11S globulin (Pistacia vera) (accession number: ABU42022). Positions of peptides identified by matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) from lane ‘T’ in the Western blot are in red bold font. Positions of the peptides identified from the lane ‘4’ are underlined with green solid lines. Positions of the peptides identified from lanes ‘6’ and ‘8’ are discontinuous underlined. Figura IV.3.8. The 11S globulins are hexameric proteins with subunits comprising an acidic polypeptide 30–40 kDa in size that is disulphide- linked to a 20 kDa basic polypeptide. (A) SWISS-MODEL of a homo- trimer of pistachio 11S globulin seed storage protein (ABU42022), (B) SWISS-MODEL of the basic subunit homo-trimer recognised by PVF4- dAb, the rectangles show the possible epitope recognition zones. IV.3. RESULTADOS 133 Figura IV.3.9. Standard curve of the phage-dAb enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) performed with protein extracts obtained from ground defatted pistachio (■) in corn flour binary mixtures. The plot shows the average values and the standard deviations corresponding to duplicate experiments performed in three different days. IV.3. RESULTADOS 134 Tabla IV.3.3. Determination of the presence of pistachio in commercial processed food products using PVF4 phage-dAb ELISA and pistachio- specific real-time polymerase chain reaction (PCR). IV.3. RESULTADOS 135 IV.3. RESULTADOS 136 IV.3. RESULTADOS 137 IV.3. RESULTADOS 138 IV.3. RESULTADOS 139 Tabla IV.3.S1. Peptides identified by MALDI‐TOF/TOF from electrophoretic bands recognised by the PVF4 phage‐dAb in the pistachio extract (T) and in the chromatographic fractions 4, 6 and 8. IV.3. RESULTADOS 140 Figura IV.3.S1. Secuencias nucleotídicas clones dAb. IV.4. RESULTADOS 141 IV.4 PRODUCCIÓN DE UN DAB ESPECÍFICO FRENTE A PROTEÍNAS DE PISTACHO, BIOTINILADO IN VIVO EN LA LEVADURA METILOTRÓFICA PICHIA PASTORIS En el trabajo anterior se consiguió aislar a partir de un repertorio de dAbs (anticuerpos de dominio único), un fago-anticuerpo que reconoce específicamente al pistacho, denominado PVF4. Este anticuerpo presentaba un codón de stop Ámbar (TAG) en la secuencia del CDR1, pero su producción como fago-anticuerpo no entraña dificultad porque se emplea la cepa supresora de E. coli TG1, que traduce el codón TAG por glutamina. El problema surge cuando se dispone de un sistema de expresión a gran escala del anticuerpo soluble que no es supresor de ese codón de stop, como es la levadura metilotrófica Pichia pastoris X33. Con el fin de mejorar la producción de anticuerpos recombinantes en Pichia pastoris, se llevó a cabo mutagénesis dirigida mediante cebadores específicos que permitió el cambio del primer nucleótido del codón de stop TAG por un codón CAG que codifica para una glutamina. Este cambio no afectaba ni a la estructura del anticuerpo ni a su reconocimiento debido a que la glutamina en esa posición es un aminoácido conservado en secuencias de inmunoglobulinas. Mediante secuenciación se comprobó el cambio introducido en el vector de expresión, y este vector se utilizó para la transformación en Pichia pastoris. Se realizó a continuación la cotransformación de ese clon mediante la incorporación de la secuencia de la enzima biotín ligasa (BirA) para conseguir la biotinilación in vivo de los dAbs. Para confirmar la especificidad y seleccionar el clon con mayor producción del anticuerpo recombinante PVF4 se realizaron ensayos de inducción de Pichia pastoris, electroforesis en SDS, ELISA y dot blot. El clon denominado PVF4-m5.BirA fue el seleccionado para la producción a gran escala de anticuerpos recombinantes de tipo dAb específicos de pistacho. Raquel Madrid, Aina García-García, Isabel González, Rosario Martín, Teresa García (2022). In vivo production of biotinylated dAb specific to pistachio protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Manuscrito en preparación. Resultados pendientes de publicación. IV.4. RESULTADOS 143 1. Introducción En la actualidad, para la producción de proteínas recombinantes se dispone de una gran variedad de sistemas de expresión. Uno de los sistemas más utilizados es Pichia pastoris, levadura metilotrófica que utiliza el metanol como fuente de carbono y de energía y que permite el procesamiento y plegamiento de proteínas con modificaciones postraduccionales. El fago-anticuerpo PVF4 específico de pistacho se obtuvo a partir de una genoteca comercial de dAbs en un modelo bacteriano (E. coli TG1). Una vez analizada su sensibilidad, especificidad y empleabilidad para el análisis de productos comerciales mediante el desarrollo de un ELISA indirecto (Madrid et al., 2020), se planteó la producción de los anticuerpos recombinantes solubles y biotinilados para su posterior multimerización. Para ello, se escogió a Pichia pastoris X-33 como organismo productor. Esta levadura metilotrófica es un sistema de producción que se caracteriza por su crecimiento hasta alcanzar densidades celulares muy altas, por los fuertes promotores regulados, y por la capacidad de producir gramos de proteína recombinante por litro de cultivo, tanto intracelular como extracelularmente (Ahmad et al., 2014). Tiene, entre otras ventajas, la facilidad de inicio de la transcripción por adición de metanol. Pero esta producción se puede ver truncada por los problemas de proteolisis (reducción del rendimiento del producto, pérdida de actividad biológica y contaminación de la muestra con productos de la degradación) (Jahic, 2003), por la presencia de algún codón de parada en la secuencia de la proteína recombinante o por la presencia de aminoácidos antinaturales que se incorporan en la secuencia traducida en respuesta a la presencia de un codón Ámbar (TAG) (Wiltschi, 2016; Young et al., 2009; Young y Schultz, 2010) . 2. Material y Métodos 2.1. Transformación de Pichia pastoris para la producción del dAb PVF4 biotinilado Para conseguir la producción in vivo de los dAbs PVF4 biotinilados en Pichia pastoris se partió del vector pPICZα (pRAS002) que contenía el dominio aceptor de biotina (BAP). Posteriormente, el clon obtenido se cotransformó con el vector pPIC6α que contenía la secuencia de la enzima biotín ligasa, BirA (pRAS002.BirA). Los clones obtenidos de esta cotransformación se analizaron mediante técnicas de secuenciación, PCR, Western blot y ELISA. IV.4. RESULTADOS 144 2.2. Mutagénesis dirigida Para llevar a cabo la mutagénesis, a partir del plásmido pRAS002 obtenido anteriormente, que se encontraba en E. coli DH5α (es importante que se encuentre en esta cepa para que el ADN parental sin la mutación se encuentre metilado), se realizó una amplificación por PCR con 50 ng de plásmido, los dos primers (PV4_T100_c_For_1 y PV4_T100_c_Rev_1) diseñados específicamente con este fin, dNTPs y la enzima Taq pFU (Proofreading high-fidelity). La amplificación consistió en 15 ciclos, con la fase de anillamiento a 56 °C durante un minuto, y una fase de elongación a 68 °C en la que se emplearon 2 min por cada Kb, es decir, unos 8 min. Tras la amplificación por PCR, el ADN metilado/parental, que no contiene la mutación introducida, se digirió con la enzima de restricción Dpn I durante 1 h y 30 min a 37 °C. Posteriormente, 3 µL del producto de la digestión se añadieron a 50 µL de células supercompetentes XL1-Blue, y se transformaron mediante shock térmico. Se seleccionaron 10 colonias al azar para amplificar, extraer el plásmido y secuenciar, para confirmar que la mutación se había introducido. Para la amplificación de la secuencia de dAb a partir de colonias individuales se usaron los cebadores MJA254 y MJA253, y para la amplificación de la secuencia de los cebadores MJA255 y MJA256 (Tabla IV.1.1). La PCR se llevó a cabo utilizando My Taq Mix 2x (Bioline Reagents Limited, Londres, Reino Unido) y el siguiente programa de PCR: primero 95 °C durante 9 min, después 30 ciclos consistentes en 95 °C durante 30 s, 62 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, seguidos de una extensión final a 72 °C durante 7 min. Los productos de la PCR se examinaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 %. La transformación en Pichia pastoris se detalla en la sección 2.8 del capítulo IV.1, así como, la metodología de la electroporación y la inducción de Pichia pastoris. Las transformaciones tanto en XL1 Blue como en HB2151 se llevaron a cabo según las recomendaciones del fabricante. La producción del dAb, biotinilado y sin biotinilar se llevó a cabo según el proceso descrito en la sección 2.9 del capítulo IV.1, pero mediante columna de Ni-NTA con gradiente de imidazol según recomendaciones del fabricante. Los sobrenadantes se analizaron mediante dot blot para comprobar la presencia de dAb biotinilado utilizando ExtrAvidina-HRP (Sigma-Aldrich, SKU E2886) (1:5000 v/v) en BSA al 1 % para su detección, y la membrana se reveló con el sustrato quimioluminiscente Clarity Western ECL (Bio-Rad). IV.4. RESULTADOS 145 Para realizar un ELISA indirecto, se tapizó la placa con extractos de pistacho, nuez, almendra y cacahuete, se bloqueó con BSA al 3 %, se añadió el sobrenadante de Pichia pastoris en BSA con TBS en una relación de 1:7,5. Por último, se añadió el anticuerpo secundario anti-His-HRP (1:10.000) y se reveló con sustrato TMB. Los ensayos electroforéticos para la confirmación de la presencia de los dAb biotinilados se realizaron en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12 % en condiciones no reductoras. El gel se tiñó con Coomassie Brilliant Blue R- 250, y las bandas de interés se recortaron con un bisturí y se sumergieron en una solución de ácido acético al 5 % (v/v). El análisis de los péptidos se realizó en un espectrómetro de masas MALDI- TOF/TOF Analyzer 4800 Plus (AB SCIEX, MA, USA), en la Unidad de Proteómica de la Universidad Complutense de Madrid (España). Otros geles de SDS-PAGE se usaron para llevar a cabo ensayos de Western blot que se describen en la sección 2.8 del capítulo IV.2. 3. Resultados El análisis por PCR con los primers MJA254 y MJA259 de los clones obtenidos tras la cotransformación de Pichia pastoris con los vectores pPICZα (que contiene la secuencia del BAD) y pMJA180 (que codifica para la enzima BirA) puso de manifiesto que contenían en su interior la secuencia del dAb específico de pistacho (423 pb) tanto en el clon pRAS002 y pRAS002.BirA (Figura IV.4.1A). Además, para corroborar la presencia de la enzima biotín ligasa en el clon pRAS002.BirA, se llevó a cabo otra PCR con los primers MJA255 y MJA256 que amplifican la secuencia de BirA, obteniéndose una banda del tamaño correspondiente (~ 900 pb) (Figura IV.4.1B). El clon pRAS002.BirA fue inducido para la producción del dAb biotinilado, pero ni análisis de dot blot, Western blot ni ELISA determinaron la presencia de la producción de un anticuerpo válido, porque no reconocía su diana, y tampoco era reconocido por otros anticuerpos comerciales. El sobrenadante inducido fue purificado a través de una columna de afinidad por la proteína A, y no se obtuvo ningún pico de purificación. IV.4. RESULTADOS 146 Figura IV.4.1. Análisis electroforético de los productos de las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) obtenidos de los clones pRAS002 y pRAS002.BirA de Pichia pastoris usando los primers MJA254/259 que amplifican la secuencia del dAB (A) y MJA255/MJA256 que amplifican la secuencia de la BirA (B). NC=PCR negative control, Mw=molecular weight marker Hyperladder IV. La secuenciación del clon PVF4 puso de manifiesto la presencia de un codón Ámbar. Por este motivo, se planteó realizar mutagénesis dirigida en el codón TAG, cambiándolo a CAG (Gln), como sería traducido en el sistema supresor de Ámbar de E. coli TG1 (Figura IV.4.2). El primer paso consistió en el diseño de cebadores o primers que incluyeran el cambio: • PV4 T100 c for 1 (5'-ctccggagttagccttaacaatCaggttatgagctgg-3') • PV4 T100 c rev 1 (5'-ccagctcataacctGattgttaaggctaactccggag-3') En la mayoría de las genotecas empleadas para la selección de anticuerpos frente a proteínas es frecuente la aparición del codón Ámbar. Esta mutación es generada al azar dentro de la secuencia de codificación del anticuerpo, y no interfiere durante el proceso de biopanning y selección de los fagos en la cepa bacteriana E. coli TG1, donde el codón TAG se traduce como glutamina, pero impide la expresión del scFv soluble en cepas no supresoras (Marcus et al., 2006; Ossysek et al., 2015). IV.4. RESULTADOS 147 Figura IV.4.2. Secuencia nucleotídica y aminoacídica del clon dAb PVF4. Recuadro rojo marca la posición del codón Ámbar sin mutar (secuencia naranja) y mutado por cambio de TAG a CAG (secuencia verde). En E. coli HB2151 o Pichia pastoris, utilizadas para la selección y secreción de anticuerpos solubles, el codón Ámbar se traduce como señal de parada, por lo que no se produce el anticuerpo de longitud completa y no se detecta ninguna unión antígeno-anticuerpo, a no ser que un supresor inhiba la acción de este codón Ámbar (Tolner et al., 2013; Young et al., 2009). En esta Tesis Doctoral también se encontró este problema, ya que las secuencias de numerosos dAbs seleccionados contenían un codón Ámbar en CDR1 del VH como en el caso del dAb PVF4. Al confirmarse que las 10 colonias seleccionadas tras la mutagénesis incluían el cambio, se extrajo el fragmento que codifica la secuencia del dAb mutado mediante digestión con enzimas de restricción Pst I y Not I, y se introdujo en el plásmido pPICZα con el BAD, y ese vector se introdujo en células electrocompetentes HB2151. Se obtuvieron en total 16 colonias, se seleccionó una de ellas y se realizó una PCR con los primers MJA253 y MJA254. En la Figura IV.4.3, se demuestra la presencia de la secuencia del dAb de pistacho en el clon mutado. IV.4. RESULTADOS 148 Figura IV.4.3. Análisis electroforético del producto de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) obtenido del clon pRAS002 mutado (PVF4m5) usando los primers MJA254 y MJA253. PC=control positivo de PCR (scFv), NC=control negativo, Mw=molecular weight Biomarker Low Bioventures. El siguiente paso consistió en la transformación de Pichia pastoris con el nuevo vector pRAS002m (PVF4m5) que previamente se había linearizado con la enzima de restricción Sac I. Se obtuvieron aproximadamente 100 colonias de las que seleccionaron 10 al azar para crecer en medio de cultivo YPD y hacer una PCR con los cebadores MJA253 y MJA254. De las 10 colonias, sólo 6 presentaron el tamaño adecuado para la secuencia del dAb, por lo que la eficiencia de la transformación fue del 60 % (Figura IV.4.4). Figura IV.4.4. Análisis electroforético de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) obtenidos de las colonias (de 1 a 10) de Pichia pastoris con el vector pRAS002 mutado (PVF4m5) usando los primers MJA254 y MJA253. PC=control positive de PCR (dAb), Mw=molecular weight Biomarker Low Bioventures. Antes de cotransformar uno de los clones que contienen el dAb PVF4 con el BAD, con el vector que contiene la enzima biotín ligasa, se quiso confirmar la posibilidad de producción del anticuerpo una vez ha sido mutado. Para ello, los clones 1, 3, 4, 7, 8 y 10 fueron IV.4. RESULTADOS 149 sometidos a inducción con metanol a diferentes temperaturas (27 °C, 25 °C y 20 °C), y la producción de dAbs en el sobrenadante de Pichia pastoris se evaluó por dot blot (Figura IV.4.5). Figura IV.4.5. Análisis por dot blot de los sobrenadantes de cultivo de diferentes clones de Pichia pastoris antes y después de la inducción con metanol, revelados con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-c-Myc-AP o con un anticuerpo anti-His-HRP. NC: control negativo, Pichia pastoris X-33 sin transformar; Control positivo: pMJA302 (García-García et al., 2020) dAb frente a gluten y pMJA181 (de la Cruz et al., 2016) scFv frente a almendra. El análisis electroforético de los sobrenadantes de los cultivos de Pichia pastoris (Figura IV.4.6), puso de manifiesto la aparición de un mayor número de bandas a la temperatura de incubación de 25 °C y que a 20 °C. A la temperatura de incubación de 27 °C, se observaron las mismas bandas que a 25 °C pero en el clon 8 se puede observar una banda extra de un tamaño aproximado de 20 kDa. Esa banda, junto con las tres bandas diferentes del clon 3, fueron sometidas a un análisis de MALDI-TOF/TOF, en el que las bandas del clon 3 presentaron péptidos de inmunoglobulinas. Una vez corroborada la presencia de inmunoglobulinas (dAb) producidas en el sobrenadante, se realizó un ELISA indirecto para confirmar que el anticuerpo recombinante permanecía estable para el reconocimiento de pistacho a las temperaturas de 20 y 25 °C. Las absorbancias obtenidas a 450 nm se detallan en la Figura IV.4.7, donde se observa una mayor inespecificidad a temperaturas bajas que a 25 °C, donde las reacciones cruzadas son casi inexistentes. IV.4. RESULTADOS 150 Figura IV.4.6. Análisis electroforético en SDS (sodium dodecyl sulphate) 4-20 % bajo condiciones reductoras, de los sobrenadantes de cultivo de diferentes clones de Pichia pastoris inducidos con metanol. Mw: ColorBurstTM Electrophoresis Protein Marker; SN: control negativo, sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris X-33 sin transformar; Control positivo: pMJA302 (García-García et al., 2020) dAb frente a gluten y pMJA186 (Madrid et al., 2018) scFv frente a nuez. Las bandas resaltadas se cortaron y analizaron mediante desorción láser asistida por matriz/espectrometría de masas en tándem de ionización (MALDI-TOF/TOF). También, en el análisis de dot blot (Figura IV.4.5) se determinó que el clon 1 que presentaba mayor reconocimiento por el pistacho y mostraba buena producción. En consecuencia, el clon 1 fue seleccionado para su posterior cotransformación con el plásmido pMJA180, que contiene la secuencia de la enzima biotín ligasa, con el fin de poder biotinilar y multimerizar los dAbs. Figura IV.4.7. Resultados de ELISA indirecto obtenidos con el sobrenadante inducido de los clones transformados con PVF4m5 o pRAS002 en Pichia pastoris. Los valores de absorbancia son la media de duplicados obtenidos en un mismo experimento. Las barras de error muestran la desviación estándar para cada grupo de datos. De la cotransformación del clon 1 (pRAS002m o PVF4m5) con el plásmido pMJA180 se obtuvieron multitud de clones, de los cuales se seleccionaron solo 10, pero todos, además IV.4. RESULTADOS 151 de conservar la secuencia del dAb, incluían la secuencia de la BirA, según se demostró mediante PCR de los clones con los pares de cebadores MJA254-MJA253 (que amplifica el dAb) y MJA255-MJA256 (que amplifica la BirA) (Figura IV.4.8). En la electroforesis se comprobó como el clon pRAS002m o PVF4m5, no cotransformado, presentaba una banda del tamaño correspondiente a la secuencia del dAb (486 pb), pero no las bandas de ~900 pb correspondientes a BirA. Figura IV.4.8. Análisis electroforético de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) obtenidos de las colonias (de 1 a 10) de Pichia pastoris pRAS002m cotransformado con el vector pMJA180, usando los primers MJA254-MJA253 (A) y MJA256-MJA255 (B). NC=PCR negative control, PVF4m5=clon no transformado con BirA; Mw=molecular weight Biomarker Low Bioventures (A) y 1Kb Ladder (B). Para poder elegir al mejor clon productor del anticuerpo recombinante biotinilado a una temperatura de 25 °C, se realizó un dot blot con los sobrenadantes de los clones cotransformados inducidos por metanol, y se compararon con los clones sin inducir y con diferentes anticuerpos de reconocimiento: anti-c-Myc-AP, anti-His-HRP y ExtrAvidina-HRP (que confirma sin el anticuerpo se encuentra biotinilado o no). En la Figura IV.4.9 se muestran las grandes diferencias observadas entre los clones inducidos y sin inducir en los casos A y B, siendo poco apreciables las diferencias en el caso C. De todos ellos, se seleccionó el clon 5 y pasó a denominarse PVF4m5.BirA. IV.4. RESULTADOS 152 Figura IV.4.9. Análisis dot blot de los sobrenadantes de cultivo de diferentes clones de Pichia pastoris cotransformados con pMJA180 y revelados con un anticuerpo monoclonal de ratón anti- c-Myc AP (A), con un anticuerpo anti-His-HRP (B) y con ExtrAvidina-HRP (C), mostrándose las diferencias entre los inducidos y sin inducir con metanol. Control positivo: pMJA181 (de la Cruz et al., 2016) scFv frente a almendra. Por último, el clon PVF4m5.BirA fue inducido en un volumen de 500 mL de cultivo BMMY para producir el dAb biotinilado, que se purificó del sobrenadante a través de una columna Ni-NTA con gradiente de imidazol (Figura IV.4.10). Se purificó el dAb biotinilado a partir de 125 mL de sobrenadante y el pico obtenido a la concentración de 78 % de imidazol, alcanzó una absorbancia de 2500 mAu. El pico se recogió en dos fracciones (1 y 2) cuantificándose en el Nanodrop 7 mg mL-1 en 3 mL, por lo que se obtuvieron 21 mg de proteína en solo 125 mL. Con el fin de identificar las proteínas presentes en las fracciones 1 y 2 del único pico obtenido en la Figura IV.4.10, se realizó una electroforesis SDS-PAGE con 10 µL (20 µg de proteína) de cada fracción bajo condiciones reductoras (Figura IV.4.11A). Las bandas más prominentes que se observaron presentaban un tamaño de ~20 kDa a ~35 kDa. El patrón fue similar al descrito en (Madrid et al., 2020). IV.4. RESULTADOS 153 Figura IV.4.10. Perfil de elucción del sobrenadante de PVF4m5.BirA obtenido en el FPLC a partir de columna Ni-NTA, mostrando los valores de absorbancia a 280 nm de las fracciones 1 y 2. Figura IV.4.11. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en condiciones reductoras de diferentes fracciones obtenidas de la cromatografía de afinidad Ni-NTA (A) e immunoblot con anti-c-Myc-AP (B) de 20 µg de cada fracción o 10 µL de cada muestra. Mw: ColorBurstTM Electrophoresis Protein Marker; 1, 2 y 3, son las fracciones obtenidas de la cromatografía; BMMY: medio de cultivo; Waste: desecho, muestra que no se ha unido a la columna de afinidad. dAb PVF4m5.BirA en el immunoblot fue detectado por el anticuerpo anti-c-Myc conjugado con AP. IV.4. RESULTADOS 154 Una vez verificada la presencia del dAb específico del pistacho (Figura IV.4.11B), se procedió a multimerizar con ExtrAvidina-HRP para usar el anticuerpo recombinante en un análisis de ELISA directo. Sin embargo, el dAb multimerizado no reconoció al pistacho. Se probaron varias opciones de ELISA, pero no se consiguió visualizar una reacción antígeno- anticuerpo. Capítulo V DISCUSIÓN INTEGRADORA V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 157 V.1. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES ESPECÍFICOS FRENTE A NUEZ (JUGLANS REGIA) MEDIANTE LA TÉCNICA DE PRESENTACIÓN EN FAGOS (PHAGE DISPLAY) A PARTIR DE GENOTECAS DE FAGO-ANTICUERPOS RECOMBINANTES TIPO SCFV Las técnicas inmunológicas disponibles para la detección de alérgenos en alimentos emplean anticuerpos policlonales o monoclonales, obtenidos mediante la inmunización de animales con extractos de proteínas solubles totales o proteínas purificadas, alergénicas o no, de la especie de interés. Actualmente existen en el mercado una amplia variedad de genotecas de fagos recombinantes que expresan desde una secuencia aleatoria de oligopéptidos hasta fragmentos de anticuerpos de diferente naturaleza. En este último grupo se encuentran los fragmentos Fab (fragment antigen-binding) que incluyen las regiones variables y la primera región constante de las inmunoglobulinas, los fragmentos variables de las cadenas ligera y pesada unidos por un péptido conector (scFv, single-chain variable fragment), o solo regiones variables de las cadenas pesadas de los anticuerpos (dAb, single-domain antibody). La tecnología de presentación en fagos (phage display) es una herramienta poderosa y eficaz para producir anticuerpos recombinantes sin inmunización animal (Lee et al., 2007; Qi et al., 2012). Mediante esta tecnología y partiendo de la genoteca de scFv Tomlinson I+J, los clones específicos frente a nuez se seleccionaron por afinidad a través de un proceso denominado “biopanning”. Debido a que los fagos seleccionados se pueden amplificar por propagación en E. coli, es posible realizar múltiples rondas de biopanning con el objetivo de reducir la selección a sólo aquellos clones que tengan una unión más específica con la molécula diana (Parmley y Smith, 1988). Esta genoteca está basada en un único patrón humano para VH (V3-23 / DP-47 y JH4b) y Vκ (O12 / O2 / DPK9 y Jκ1), con cambios incorporados en las posiciones correspondientes a las regiones hipervariables determinantes del reconocimiento del antígeno (CDRs). La CDR3 de la cadena pesada se diseñó para que fuera lo más corta posible y aun así pudiera formar una superficie de unión a antígeno. La genoteca Tomlinson I tiene una diversidad de 1,47×108 variantes y está construida en el plásmido pIT2 (HIS myc tag). Este fagémido contiene el origen de replicación y la señal de empaquetamiento del fago, pero requiere del fago ayudante M13KO7 (helper phage) para que le proporcione las proteínas de empaquetamiento y le confiera resistencia a Kanamicina, de forma que la coinfección le otorgue la posibilidad de convertirse en fago filamentoso, con una longitud de las partículas fágicas variable según V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 158 la longitud de su ADN. La coinfección fagémido-fago da lugar a viriones híbridos que exhiben pocas copias de la proteína de fusión y que contienen el genoma del fagémido. Fagos y fagémidos son los vectores más frecuentemente usados en la tecnología de phage display. Los fagémidos se utilizan en mayor medida que los fagos, debido a que los genomas de fagémidos son más pequeños y pueden incorporar fragmentos largos de ADN exógeno, y en segundo lugar, son más eficientes en la transformación y permiten obtener una genoteca de fagos con una alta diversidad y muchos sitios de restricción de endonucleasas, necesarios para la recombinación de ADN y la manipulación genética (Qi et al., 2012). El fagémido posee la ventaja de expresar en la superficie del fago la proteína exógena mediante fusión a la proteína pIII (Figura I.12). Esta proteína se dirige a la membrana interna antes del ensamblaje de los fagos, debido a que posee una secuencia señal (PelB) localizada en el extremo N-terminal. Es la proteína de la cápside de virus más empleada, debido a que tolera inserciones de mayor tamaño, que deben insertarse entre el péptido señal y el extremo N-terminal de la proteína pIII (Georgieva y Konthur, 2011; Lee et al., 2007). En este trabajo, en la superficie de un fago se expresa un scFv unido a dos epítopos diferentes, c-Myc y 6xHis. V.1.1. Enriquecimiento de la genoteca Tomlinson I en clones de fago- scFv específicos de nuez En el proceso de biopanning se aislaron clones específicos de nuez a través de tres rondas de selección, utilizando como ligando un extracto de proteína total de nuez cruda y pelada, inmovilizado en un soporte sólido. La eliminación de la piel se debe a su alto contenido en taninos y polifenoles, que se unen y precipitan proteínas y que pueden dificultar el proceso de unión del ligando con el repertorio de fago-scFvs (Sze-Tao y Sathe, 2000). Para asegurar el éxito del biopanning, es muy importante que en la primera ronda de selección se disponga de la mayor variedad de clones posibles, partiendo de 1,47 x 108 variantes y disponiendo de, al menos, un clon de cada variante. Se debe amplificar la genoteca hasta 1012-1013 viriones por mL para empezar el proceso. Los fagos en solución se presentan al antígeno para que se produzca la unión antígeno-fago- anticuerpo. Aquellos viriones que tras la exposición no han tenido afinidad con el antígeno se retiran mediante lavado y los que permanecen unidos se eluyen mediante una digestión con tripsina. Esos fagos eluidos se amplifican de nuevo para obtener nuevos viriones que se emplearán en la siguiente ronda de selección. Hay que tener en cuenta que entre los fagos eluidos pueden encontrarse algunos con uniones inespecíficas o que reconozcan a otras proteínas no diana pero estrechamente relacionadas. Para evitar la inespecificidad, se V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 159 realiza un biopanning negativo o hibridación sustractiva al comienzo de la estrategia, empleando como ligando las proteínas no diana que pueden interferir en la selección. En este caso, se trata de un extracto de pacana inmovilizado en el soporte. Con el fin de minimizar la selección de variantes de fagos inespecíficas que reconozcan otros componentes presentes en el sistema del soporte, las rondas de selección se llevaron a cabo en diferentes soportes sólidos, alternando las paletas de poliestireno con esferas magnéticas (Dynabeads) que poseen grupos p-toluenosulfonilo, permitiendo la unión covalente de los grupos amino de las proteínas mediante una reacción de sustitución nucleófila (Bakhshinejad et al., 2016). Finalizado el proceso de biopanning, se comparó el número de fagos eluidos en cada ronda con el obtenido en la etapa anterior de biopanning. El número de partículas de fago recuperadas después del primer biopanning fue de 7x105 pfu mL−1, siendo de 1,75x106 pfu mL−1 después de la segunda ronda y de 106 pfu mL−1 después de la tercera ronda de selección. En comparación con los resultados descritos por Lee et al (2007), el aumento en cada ronda debe ser de 100 veces. Sin embargo, entre la primera y la segunda ronda de selección los fagos eluidos aumentaron solo 2,5 veces, y entre la segunda y tercera ronda de selección el título no aumentó más. Estos resultados pueden indicar que la metodología de hibridación sustractiva descarta gran parte de los fagos reactivos de la nuez, seleccionando los más específicos. Para confirmar esta hipótesis, se realizó un ELISA policlonal enfrentando el conjunto de los fagos eluidos de cada ronda de selección a los antígenos de nuez, pacana y cacahuete. Los resultados mostraron que los valores más altos de absorbancia para las proteínas de nuez correspondían a la segunda y tercera rondas de biopanning, y se encontró una reactividad cruzada muy baja frente a seroalbúmina bovina (BSA), pacana y cacahuete (Figura 3 del Anexo I). En definitiva, de acuerdo con estos resultados, la segunda ronda de biopanning permitió la selección de la población de fagos que reconocía específicamente a la nuez y no fueron necesarias rondas adicionales. V.1.2. Selección de clones de fago-scFv individuales mediante ELISA monoclonal Los fagos que se aislaron de las rondas de selección segunda y la tercera se emplearon para el aislamiento de 95 colonias de E. coli TG1 para llevar a cabo un ELISA de fagos monoclonales. Como criterios de selección, se consideraron positivos aquellos clones en los que los valores de absorbancia frente nuez fueran al menos 5 veces superiores a los valores la absorbancia frente al extracto de cacahuete (utilizado como control negativo). V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 160 Un total de 8 de las 95 colonias aisladas de la segunda ronda (8,4 %) y 3 de los 95 (3 %) de la tercera ronda, se consideraron como clones positivos para nuez. Tras la selección inicial, los fagos-scFv producidos por los 11 clones seleccionados se precipitaron con PEG/NaCl y se sometieron de nuevo a un ELISA monoclonal para observar la estabilidad de los resultados. Finalmente, se seleccionaron 6 clones que permanecían constantes en la producción de anticuerpos frente a nuez para un análisis posterior mediante PCR y secuenciación. V.1.3. Secuenciación y caracterización de los clones seleccionados Los cebadores LMB3 y pHEN se utilizaron para comprobar mediante la amplificación por PCR, el tamaño del inserto que codifica el scFv de los 6 clones seleccionados. En los clones que contienen el inserto VH-VL completo se amplifica un producto de un tamaño aproximado de 935 pb. Sin embargo, únicamente un clon de los 6 analizados, denominado JR35, mostró una banda con el tamaño esperado. Su posterior análisis por secuenciación determinó el marco de lectura de la inmunoglobulina, el péptido de unión (GGGS x4) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las cadenas VH y VL del scFv, permitiendo deducir la secuencia aminoácidica final. Los 5 clones restantes fueron descartados, debido a que sus secuencias nucleotídicas no eran completas, conteniendo sólo la cadena VH o VL, o presentando doble lectura en la secuenciación. Es frecuente la aparición de clones incompletos de este tipo, porque aunque las cadenas pesadas y ligeras suelen ir emparejadas en el sistema inmunológico humano, las VH y VL pueden existir en algunas circunstancias de forma aislada, manteniendo su capacidad de reconocer a los antígenos (de la Cruz et al., 2013; Lee et al., 2007). En las genotecas de fragmentos de anticuerpos, esto puede ser debido a los eventos de recombinación in vivo que se han utilizado para mejorar su diversidad partiendo de dos vectores separados que codifican los dominios VH y VL, respectivamente (Miersch y Sidhu, 2012). A su vez, en una genoteca pueden observarse clones no funcionales, secuencias incompletas y la generación de fragmentos de anticuerpos mal plegados que pueden dar lugar a aglutinantes no específicos. Con el objetivo de minimizar estos inconvenientes que afectan negativamente a las genotecas, se han desarrollado técnicas de síntesis para generar diversidad aleatoria controlada en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), incorporando nucleótidos en diferentes posiciones y utilizando varios enfoques (Acevedo-Rocha et al., 2015; Geyer et al., 2012). En el caso de la genoteca Tomlinson I, se utilizó la degeneración DVT para introducir diversidad en la CDR (normalmente en la CDR3), que se rige por una fórmula específica para la incorporación de las bases (D es 33 % de G, A o T, y V es 33 % de G, A o C). Esta V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 161 fórmula produce múltiples combinaciones de codones degenerados que aumentan la diversidad del gen, y los anticuerpos generados presentan mayor afinidad y especificidad en estas genotecas (Ch’ng et al., 2016; Geyer et al., 2012). Este método mejora la calidad de la genoteca limitando la presencia de polipéptidos incompletos, pero no los elimina. V.1.4. Producción de scFv biotinilados mediante transformación en Pichia pastoris La producción de scFvs solubles en las condiciones reductoras del citoplasma de E. coli es ineficiente debido a la dificultad de formarse los enlaces disulfuro y permitir el plegamiento correcto de las proteínas eucariotas. Por lo tanto, los scFvs se segregan en el periplasma como proteínas solubles o se expresan en el citoplasma como cuerpos de inclusión insolubles, lo que dificulta la obtención de los anticuerpos (Vakz y Benhar, 2014). Tras la obtención del fago-anticuerpo, se quiso emplear la forma soluble del scFv para poder utilizarlo en diferentes técnicas inmunoquímicas. Gracias a la sencillez de las técnicas necesarias para la manipulación genética de Pichia pastoris y su capacidad de realizar modificaciones postraduccionales eucarióticas, este organismo es ampliamente utilizado como un sistema de expresión que mejora la producción de proteínas recombinantes y heterólogas, ya sea intra o extracelularmente, con respecto a otros sistemas de producción (Damasceno et al., 2012). Para que se produzca la secreción de proteínas es necesario emplear una secuencia señal que la dirija hacia la ruta secretora. Una de las secuencias señal que ha sido empleada con mayor frecuencia es el péptido señal del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae. La expresión de cualquier gen heterólogo en Pichia pastoris requiere la inserción del gen en un vector de transformación que permita la integración por recombinación homóloga de ese gen en el genoma de Pichia pastoris (Cregg et al., 2000). Debido a que Pichia pastoris no posee plásmidos nativos, se han desarrollado varios vectores de expresión diseñados para transformar tanto a E. coli como a Pichia pastoris, disponibles en http://www.invitrogen.com. Para la expresión de los genes heterólogos, los vectores contienen un cassette de expresión compuesto por una región de DNA de aproximadamente 0,9 Kb que contiene la secuencia 5' (promotor) del gen AOX1 (AOX1p) y un fragmento de aproximadamente 0,3 Kb que contiene la secuencia 3' del gen (terminador de la transcripción) (Koutz et al., 1989). Los fragmentos del promotor y terminador están separados por uno o más sitios únicos de clonación. Además, se ha desarrollado toda una familia de vectores para Pichia pastoris que contienen el gen Sh ble, el cual confiere resistencia a la zeocina (Higgins et al., 1998) además de pertenecer al tipo de mutantes Mut+ que conserva el gen AOX1 genómico intacto y, por lo tanto, emplean el metanol como V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 162 fuente de carbono y como medio de inducción de las proteínas. La expresión de genes dentro de la ruta del metanol (AOX1) está reprimida por la glucosa, el glicerol y el etanol, pero se induce fuertemente por el metanol, aumentando la concentración de la proteína soluble en el medio de cultivo con alta densidad celular (Cregg et al., 2000; Demain y Vaishnav, 2009). Una de las ventajas del uso de Pichia pastoris para la producción de proteínas exógenas es que la proteína heteróloga secretada constituye la gran mayoría de la proteína total en el medio y, a su vez, la secreción sirve como una primera etapa para la purificación, ya que evita tener que separar a posteriori la proteína heteróloga del conjunto de proteínas celulares. (Cregg et al., 2000). En esta Tesis Doctoral, la metodología propuesta consistió en fusionar un dominio aceptor de biotina (biotin acceptor domain, BAD) al scFv, para añadir una molécula de biotina en un proceso de biotinilación in vivo y, posteriormente, formar multímeros empleando un núcleo de avidina conjugada con peroxidasa (ExtrAvidina-HRP). Este hecho permitiría unir al núcleo de avidina 4 moléculas de anticuerpo biotinilado que reconocerían a su vez 4 epítopos del antígeno, incrementando proporcionalmente la señal, mejorando la sensibilidad y avidez (Barat y Wu, 2007; Cloutier et al., 2000). Aunque existen técnicas que permiten la biotinilación aleatoria de la proteína, estas presentan el inconveniente de que la biotina se puede incorporar en un lugar donde inactive residuos aminoacídicos críticos para el reconocimiento del epítopo (Kumada, 2014). Para permitir la biotinilación de los fragmentos scFv solubles, se insertó la secuencia del BAD en el extremo C-terminal del scFv en el vector de expresión pPICZαB, entre la secuencia nucleotídica correspondiente al scFv JR35 y la secuencia del epítopo c-myc, originando el plásmido de expresión pMJA186 (Figura IV.1.1), que se propagó en la cepa de E. coli Dh5α. Tras comprobar la correcta orientación del inserto y el mantenimiento del marco de lectura, el plásmido se linearizó y se insertó en el genoma de la cepa de Pichia pastoris X-33, para proceder a la expresión de los fragmentos solubles. Además de la secuencia BAD, el scFv expresado por los clones de Pichia pastoris contenía un epítopo c-myc (EQKLISEEDL) y una cola de poli-histidina que permiten su purificación y detección. La producción de los fragmentos scFv específicos solubles por 95 clones transformados de Pichia pastoris, se confirmó por dot blot de los sobrenadantes tras la inducción con metanol. Esta técnica de selección de dot blot para la selección de clones es muy útil para asegurar que los clones han sido transformados con éxito y que expresan la proteína de interés (Neophytou y Alcocer, 2017). Uno de los clones con mayor expresión de la proteína de interés (denominado pMJA186-G2) se seleccionó con el fin de biotinilar in vivo los fragmentos solubles de anticuerpo. Para ello, se construyó un segundo plásmido (pMJA180) que contenía la secuencia nucleotídica codificante de la V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 163 enzima biotín ligasa (BirA) en el vector comercial pPIC6α y se cotransformó en el clon pMJA186-G2. Esta enzima cataliza la unión covalente de una molécula de biotina al aminoácido lisina (K) del BAD, en una reacción de dos etapas. Para mejorar la transformación y selección, se utilizaron plásmidos con resistencia a los antibióticos disponibles para Pichia pastoris: el gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus (resistencia a zeocina) (Drocourt et al., 1990) y el gen de la blasticidina S-desaminasa de Aspergillus terreus (resistencia a la blasticidina) (Kimura et al., 1994). La concentración de blasticidina se incrementó hasta 500 µg mL-1 para asegurar la selección de clones cotransformados. El ADN del clon cotransformado llamado JrBSF se analizó para demostrar la presencia o ausencia de las secuencias scFv y BirA. Mediante PCR con los cebadores MJA254 y MJA259, se confirmó que el clon JrBSF contenía un fragmento de 780 Kb que consiste en el scFv unido a la secuencia de nucleótidos BAD (Figura IV.1.2) codificado por el plásmido pMJA186. Además, mediante PCR con los cebadores MJA255 y MJA256 se demostró la presencia de una banda de aproximadamente 975 Kb, correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la BirA codificada por el plásmido pMJA180, confirmando la cotransformación con los dos vectores en el clon JrBSF. Por el contrario, el clon pMJA186-G2 solo produjo la banda de 780 Kb, correspondiente al vector pMJA186, que contiene el scFv y el BAD (Figura IV.1.2). Con la finalidad de seleccionar entre los clones de Pichia pastoris cotransformados el mejor productor de scFv biotinilado, se realizó la inducción de los clones a pequeña escala (en un volumen de 1 mL). Para optimizar la producción de scFv biotinilado, el clon JrBSF se cultivó en medios tamponados (BMGY y BMMY), ya que los valores de pH de los medios de inducción más apropiados para la producción de scFv son de 6,5-8,0 (Shi et al., 2003). La enzima BirA, también producida por el clon JrBSF, catalizaría la unión de una molécula de biotina al péptido aceptor (BAD) unido al scFv, dando como resultado una producción directa de scFv biotinilado in vivo. Tras la inducción con metanol de los clones cotransformados con el plásmido JrBSF, los sobrenadantes obtenidos se analizaron mediante dot blot (Figura IV.1.3) para comprobar la correcta expresión de los fragmentos solubles. La membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) se recubrió con sobrenadantes de cultivo de clones pMJA186-G2 y JrBSF antes y después de la inducción con metanol. Como el plásmido de expresión añade al scFv el epítopo c-Myc, fue sencillo determinar aquellos clones de mayor producción, incubando la membrana con un anticuerpo anti-c-Myc conjugado con fosfatasa alcalina. Así, al revelarse la membrana con sustrato cromogénico AP (Figura IV.1.3A), se detectó V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 164 scFv en el sobrenadante de ambos cultivos (pMJA186G2 y JrBSF) inducidos por metanol. Sin embargo, en la membrana que contiene los mismos sobrenadantes, pero que se reveló con ExtrAvidina-HRP (Figura IV.1.3B), se demostró que solo el clon cotransformado de Pichia pastoris (JrBSF) era capaz de producir scFv biotinilado. Estos resultados confirman que este clon (JrBSF) fue efectivo en la coexpresión de genes exógenos y en la producción de la enzima BirA funcional. A diferencia de los métodos de biotinilación in vitro (Li y Sousa, 2012), que requieren la producción y purificación previa de enzimas, en este trabajo la biotinilación se realizó in vivo. Esta tecnología de biotinilación in vivo se puede aplicar para la purificación de proteínas, el análisis de la localización de proteínas y la interacción proteína-proteína principalmente en levaduras (de la Cruz et al., 2016; Neophytou y Alcocer, 2017). La expresión de proteínas heterólogas en Pichia pastoris está muy condicionada por su estabilidad. Cuando los scFv no son estables, no se expresan adecuadamente, acumulándose en el interior de la célula y desencadenando una serie de efectos que dificultan su secreción al medio. Entre estos efectos se observa un incremento en los niveles de transcripción de genes responsables de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR, unfolded protein response), que se asocian a un aumento de plegamiento del retículo endoplásmico en condiciones de estrés y a la degradación de proteínas incompletas o con plegamiento defectuoso (Whyteside et al., 2011). Por lo tanto, los resultados obtenidos anteriormente mediante dot blot confirman que el scFv JrBSF seleccionado es lo bastante estable como para ser expresado y secretado por Pichia pastoris. V.1.5. Producción y caracterización del scFv multimerizado Una vez seleccionado el clon JrBSF, se utilizó para producir fragmentos de scFv biotinilados a mayor escala (600 mL de medio de cultivo). El sobrenadante obtenido tras la inducción del clon durante 72 h con metanol se purificó mediante una columna de cromatografía de afinidad (proteína L HiTrap). Esta columna contiene una matriz de agarosa unida a la proteína L, que presenta afinidad hacia la región variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulinas y fragmentos de inmunoglobulina (Lee et al., 2007; Ma y O’Kennedy, 2015). El proceso de purificación produjo 6 mL de scFv biotinilado (2 mg mL−1), proporcionando 12 mg de proteína, que se distribuyeron en alícuotas de 100 μL y se mantuvieron congeladas a -80 °C. Esta gran capacidad de Pichia pastoris para producir cantidades considerables de proteína por litro de cultivo, llegando en algunas ocasiones al orden de gramos, puede variar en función de las características estructurales de la proteína y de las condiciones de cultivo (Shi et al., 2003). V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 165 Con el objetivo de aumentar la valencia de los scFv biotinilados para unirse al antígeno y así aumentar la sensibilidad de los ensayos para la detección de nuez, se procedió a la formación de multímeros mediante la adición de un núcleo de avidina conjugada con peroxidasa de rábano (ExtrAvidina-HRP, Horseradish peroxidase) siguiendo el procedimiento descrito por el del NIH Tetramer Core Facility. La avidina es una proteína tetramérica que se une con gran afinidad y de forma no covalente a una molécula de biotina (Kd = 4 x 10-14 M). Debido a esta propiedad, la avidina y la estreptavidina se han utilizado ampliamente como sondas y matrices de afinidad para una amplia variedad de aplicaciones en ensayos bioquímicos, diagnósticos, purificación mediante afinidad y administración de medicamentos. En los últimos años ha habido un interés creciente en explorar esta interacción no covalente en sistemas de administración a nanoescala de agentes terapéuticos, incluyendo pequeñas moléculas, proteínas, vacunas, anticuerpos monoclonales y ácidos nucleicos (Jain y Cheng, 2017; Kipriyanov et al., 1995). La multimerización de scFvs biotinilados se ha utilizado para aumentar la afinidad por el antígeno, mejorando así la avidez y la señalización en ensayos inmunoenzimáticos (Barat y Wu, 2007; Cloutier et al., 2000; de la Cruz et al., 2016). El empleo de la avidina/estreptavidina marcada con diferentes moléculas, como por ejemplo fluoróforos o enzimas, permite acortar el tiempo de los ensayos al no requerir de anticuerpos secundarios, y permitiría emplear los scFv biotinilados en cualquier técnica inmunoquímica para la detección de alérgenos en alimentos. Para demostrar la multimerización del scFv, se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras de scFv monomérico y multimérico (Figura IV.1.4). El análisis electroforético del scFv multimérico mostró una banda con un peso molecular de aproximadamente 220 kDa que no estaba presente en el scFv monomérico, y podría corresponder con el tamaño esperado de los tetrameros (≈ 230 kDa). Para confirmar esta hipótesis, se escindió la banda y se tripsinizó para identificarla mediante espectrometría de masas en tándem de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF/TOF). La comparación con la base de datos de proteínas mostró que la banda contenía una mezcla de péptidos identificados como peroxidasa de Armoracia rusticana, cadena pesada de inmunoglobulina de Homo sapiens y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina humana que compartía la misma CDR2 que el scFv JrBSF (Tabla IV.1.3). Este resultado es consistente con la presencia del scFv JrBSF multimerizado. Además, cuando los resultados de la espectrometría de masas se compararon con la secuencia de aminoácidos del JrBSF, la cobertura fue del 34 %. V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 166 Se realizaron experimentos de velocidad de sedimentación para estudiar el grado de multimerización alcanzado. Los análisis de ultracentrifugación mostraron diferencias entre el coeficiente de sedimentación (S) del scFv biotinilado monomérico y el scFv multimerizado con ExtrAvidina-HRP (Figura IV.1.6). Aunque se podrían unir hasta 4 moléculas de biotina a un núcleo de ExtrAvidina, los resultados obtenidos solo respaldaron que la mayoría de las moléculas de ExtrAvidina unían 2 scFv biotinilados. Una hipótesis que explica esta multimerización menor de lo esperable es que la conjugación de la ExtrAvidina con peroxidasa ocultaría los sitios de unión de biotina en la molécula de avidina, lo que dificultaría la producción de tetrámeros completos. Este hecho también fue observado por de la Cruz et al., 2016. V.1.6. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las proteínas de nuez reconocidas por el scFv seleccionado Debido a que el fago-scFv JR35 se seleccionó frente a un extracto proteico de nuez, era conveniente identificar las dianas proteicas reconocidas específicamente por el fago- anticuerpo y su versión soluble y biotinilada JrBSF. Para caracterizar las proteínas específicas reconocidas por el scFv JrBSF, se realizó una electroforesis en gel de acrilamida SDS-PAGE y Western blot del extracto de nuez. La electroforesis reveló la presencia de múltiples bandas de diferentes tamaños (aproximadamente 45 kDa, 30-35 kDa, 17 kDa y 15 kDa y 8 kDa). El análisis mediante Western blot demostró que la banda de proteína de nuez de aproximadamente 15 kDa fue detectada con mayor intensidad por el scFv (Figura IV.2.3A), cuando la membrana se reveló con los anticuerpos anti-c-Myc y anti-His tag (Figura IV.2.3B-C). También se observó una débil reactividad con otras bandas de mayor tamaño presentes en los extractos de nuez y pacana que corresponderían aproximadamente con 30-35 kDa y 45 kDa. Para identificar las proteínas de la banda de aproximadamente 15 kDa reconocida por el anticuerpo, se cortó y se analizó en el servicio de proteómica de la Universidad Complutense de Madrid. Mediante MALDI-TOF/TOF se identificaron 19 péptidos de la globulina 11S de tipo 2 (Jug r 4) de Juglans regia (Número de acceso: XP_018818401.1) (Tabla IV.2.2) en la banda electroforética, con una cobertura del 31 % de la secuencia, especialmente en su segunda mitad, coincidiendo con la subunidad básica (Figura IV.2.4). V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 167 Las proteínas de almacenamiento de las semillas pueden representar hasta el 50 % de la totalidad de contenido de proteínas en la nuez. Las globulinas 11S y 7S y la albúmina 2S son las proteínas de almacenamiento capaces de provocar respuestas alérgicas en individuos sensibles. En particular, la glubulina 11S o Jug r 4 está reconocida por la OMS/UISI (Organización Mundial de la Salud/Unión Internacional de las Sociedades Inmunológicas) como uno de los alérgenos menores pero relevantes de la nuez, capaz de producir reacción alérgica en el 65 % de los pacientes sensibles (Teuber et al., 2003). Esta proteína se encuentra dentro del grupo de las leguminas, funcionando como donante de nitrógeno para el crecimiento de las plántulas durante la germinación. Está codificada por varios genes, cuyos productos de expresión se procesan proteolíticamente durante la traducción, mediante la eliminación del péptido señal hidrofóbico, dando lugar a 2 polipéptidos denominados subunidad ácida (35-40 kDa en SDS-PAGE) y subunidad básica (20-30 kDa) (Shewry et al., 2003; Wallowitz et al., 2006). El alérgeno Jug r 4 o cupina es una proteína de alto peso molecular (aprox. 350 kDa) que consta de tres monómeros (cada uno con una subunidad ácida y otra básica) que forman un homotrímero, y que a su vez se une a otro homotrímero formando una estructura hexamérica (dímeros de trímeros ensamblados cara a cara) que presenta una estabilidad térmica intermedia (Robotham et al., 2009; Shewry et al., 2003). Los resultados obtenidos por Western blot y MALDI-TOF/TOF apoyan la idea de que el clon JrBSF expresa un scFv capaz de reconocer epítopos conformacionales en la subunidad básica de la globulina 11S (Jug r 4). Se determina que es la subunidad básica porque el sitio de separación primario entre las subunidades básicas y ácidas es bastante conservado entre una amplia variedad de plantas (Car i 4, Cor a 9. Ana o 2, Ara h 3) y contiene un enlace péptidico Asn-Gly. Este enlace peptídico es parte de la secuencia aminoácidica NGLEET en Jug r 4, presente en la secuencia la Figura IV.1.4 y que determina la separación de ambas subunidades, ácida y básica (Wallowitz et al., 2006). El reconocimiento de estos epítopos, mayoritariamente de la subunidad básica, se puede observar en el modelo tridimensional del trímero 11S obtenido a partir de la secuencia de los péptidos proporcionada en el análisis del servidor Mascot (Figura V.1.1) con la aplicación web SWISS- MODEL de expasy.org. Este mayor reconocimiento depende de la conservación de la estructura terciaria de la proteína en esa región, que se destruye durante la SDS-PAGE, pero también es posible que el scFv esté reconociendo epítopos concretos de esa proteína (zonas conservadas) o de otras proteínas. En este sentido, Robotham et al (2009), observaron que la mayoría de los epítopos que más reconocimiento tenían por parte de las IgE de pacientes alérgicos se encuentran en el interior de la estructura coincidente con la V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 168 subunidad básica. Por consiguiente, se necesitaría de una desnaturalización de las subunidades para exponer al epítopo y se produzca el reconocimiento por parte de la IgE. Figura V.1.1. Modelo simulado de una globulina 11S de nuez. A) Homotrímero de 11S de nuez, B) SWISS-MODEL de la subunidad básica reconocida por el scFv JrBSF. V.1.7. Desarrollo de una técnica de ELISA directo para la detección de nuez utilizando un scFv específico frente a nuez multimerizado con ExtrAvidina-HRP Una vez obtenido el scFv JrBSF y su multimerización con ExtrAvidina-HRP, los scFv multimerizados se emplearon como sondas de afinidad en un ELISA directo para comprobar si el fragmento de anticuerpo expresado por Pichia pastoris continuaba reconociendo a la proteína de nuez, y si se conseguía mejorar la sensibilidad con relación a la técnica de ELISA indirecto con fago-anticuerpos. El anticuerpo multimerizado se empleó en los ensayos a una concentración final de 2 µL mL- 1. El análisis de muestras de nuez de diferentes orígenes geográficos (España y California) no influyó en los valores de absorbancia en el ELISA directo. El análisis de mezclas binarias de nuez en harina de trigo mediante ELISA directo empleando los scFv multimerizados con una molécula de ExtrAvidina-HRP permitió obtener las curvas estándar correspondientes tanto con la nuez cruda como horneada y compararlas con los resultados del ELISA indirecto con el fago-anticuerpo (Figura IV.1.7). El límite de detección (LOD) de nuez cruda en la mezcla binaria se calculó a partir de seis experimentos realizados por triplicado y en diferentes días. Siguiendo las directrices de la IUPAC, el límite de detección (LOD) se definió como la mínima concentración de proteína diana que mostrara un valor de absorbancia mayor que el valor medio de absorbancia del blanco más tres veces su desviación estándar, y se calculó interpolando dicho valor de absorbancia en V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 169 la curva estándar correspondiente. El LOD alcanzado por el ELISA directo usando los scFv multimerizados del clon JrBSF fue de 1616 mg Kg−1. En comparación, el LOD del ELISA indirecto para la misma mezcla binaria utilizando el fago-scFv JR35, el LOD fue de 6378 mg Kg−1, un 25,33 % menos sensible. El tratamiento térmico de horneado (160 °C durante 13 min) influyó ligeramente sobre la capacidad del ELISA directo para detectar las proteínas de nuez, elevando el LOD hasta 2466 mg Kg−1. Por lo tanto, la tetramerización del scFv mejoró sustancialmente la sensibilidad del ensayo con relación al fago-anticuerpo. Además, el ELISA directo realizado con scFv multimérico es más rápido y requiere menos manipulación que el ELISA indirecto con fago-scFv. Hay que añadir que el horneado puede desnaturalizar parcialmente el epítopo reconocido por el scFv multimérico en la proteína de la nuez, elevando el LOD de 1616 a 2466 mg Kg−1 (1,5 veces) en una matriz alimentaria. En general, las cupinas presentan una alta estabilidad térmica manteniendo su conformación a temperaturas inferiores a 94 °C, y una gran resistencia a la proteolisis, lo que permite mantener sus propiedades alergénicas durante el tránsito gastrointestinal (Mills et al., 2002). Varios investigadores han evaluado los cambios inducidos por el tostado, el hervido, el calentamiento por microondas y la cocción a presión en la alergenicidad de las legumbres y los frutos de cáscara, mostrando que el procesamiento basado en la presión y ciertos tratamientos térmicos parecen tener un impacto importante en la capacidad de unión in vitro de las IgE (Álvarez-Álvarez et al., 2005; Cabanillas et al., 2012, 2014; Cuadrado et al., 2009, 2011; Maleki et al., 2000; Schmitt et al., 2010). En este trabajo, se ha podido comprobar que, a temperaturas superiores de 160 °C durante 13 min, como la usada en el tratamiento del horneado, la integridad de la globulina 11S se ve afectada y por lo tanto el epítopo reconocido por el scFv JrBSF. Debido a las relaciones filogenéticas cercanas entre las especies de nuez, pacana y otros frutos de cáscara, así como a la gran variedad de plantas y componentes animales que pueden estar presentes en diferentes productos alimenticios comerciales, es necesario verificar la especificidad del ELISA desarrollado frente a una amplia gama de especies. Con este fin, se analizaron extractos de proteínas de 63 especies no diana, entre las que se incluyen 9 frutos de cáscara, 48 especies vegetales y 6 especies animales (Tabla IV.1.2). Sólo el extracto de pacana mostró una absorbancia diferente a la del blanco, provocando un 2,25 % de reacción cruzada con la nuez. Interpolando la absorbancia obtenida en el ELISA directo por el extracto de pacana en la fórmula logarítmica obtenida de la curva estándar de nuez cruda, sería el equivalente a detectar 22,5 g Kg-1 de nuez. Conviene señalar que la reactividad cruzada entre nuez y pacana está presente con frecuencia en los kits ELISA y en los métodos publicados para la detección de la nuez, debido a que V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 170 pertenecen a la misma familia botánica (Juglandaceae) y presentan proteínas alergénicas, como las albúminas, con un 92 % de similitud. La reactividad cruzada con otros frutos de cáscara (pistacho, avellana, nuez de Brasil, castaña, piñón) y otras especies de plantas (quinoa, sésamo, trigo sarraceno y soja) también es relativamente frecuente (Costa et al., 2014; Niemann et al., 2009; Wang et al., 2014), pero no fue observada con el scFv JrBSF. La reactividad cruzada de 2,25 % frente a la pacana observada con el JrBSF scFv multimérico hace que este ELISA no sea lo suficientemente específico para la detección de nuez en productos que contienen pacana, aunque la reacción cruzada es menor que la de otros kits ELISA. Varias compañías han desarrollado kits comerciales basados en técnicas de ELISA tipo sándwich para la detección de nuez en alimentos (Tabla I.2). Algunos ELISAs que usan anticuerpos policlonales frente al alérgeno Jug r 1, alcanzan un LOD inferior a 1 mg Kg−1, en numerosas matrices alimentarias como galletas, helados o chocolates (Wang et al., 2014). Sin embargo, con frecuencia la sensibilidad varía en función de la matriz utilizada, debido a la dificultad de extracción de las proteínas de interés o de detección del alérgeno. V.1.8. Aplicación de la técnica de ELISA directo con scFv multimerizado para verificar la presencia de nuez en alimentos comerciales, y comparación con un kit comercial de ELISA y una técnica de PCR en tiempo real Una vez puesta a punto la técnica de ELISA con el scFv JrBSF multimerizado para la detección de nuez, se llevó a cabo el análisis de muestras de alimentos con el fin de demostrar la presencia de nuez y verificar el correcto etiquetado de los productos comerciales. Además, los resultados obtenidos de ese análisis se compararon frente a un kit comercial de ELISA para la detección de nuez. Asimismo, se empleó un método de PCR en tiempo real específico de nuez previamente desarrollado por nuestro grupo de investigación (López-Calleja, de la Cruz, González, et al., 2015b), para descartar los posibles falsos negativos o falsos positivos presentes en las técnicas inmunológicas. El método de PCR en tiempo real permite diferenciar la nuez de la pacana y tiene una sensibilidad equivalente a 0,1 mg Kg−1. Con el fin de evaluar la aplicabilidad del ELISA directo desarrollado en esta Tesis Doctoral con relación a otras técnicas disponibles, se utilizó un kit comercial ELISA no competitivo tipo sándwich, que emplea anticuerpos policlonales específicos de nuez (Alertox Walnut, Biomedal Diagnostics, Sevilla). Según la información proporcionada por el fabricante, este kit presenta un LOD y LOQ de 0,6 mg Kg−1 y 2 mg Kg−1, y está diseñado para detectar y cuantificar la nuez en el intervalo de 2- V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 171 50 mg Kg−1. La evaluación del kit comercial comenzó por la verificación de los datos de sensibilidad y especificidad aportados por el fabricante. Con relación a la especificidad, el manual del kit ELISA indicaba que durante su validación no se encontraron reacciones cruzadas significativas frente a 30 matrices alimentarias. Sin embargo, al extrapolar en la ecuación logística obtenida a partir de los estándares proporcionados por el kit los resultados de absorbancia obtenidos en nuestro laboratorio a partir de 8 matrices alimentarias, varias matrices presentaron reacciones cruzadas. Cabe destacar que la almendra, no incluida en la lista del kit, presentó una reactividad cruzada del 8,97 % [0,274 (Abs almendra) / 3,055 (Abs nuez) x100] con respecto a la absorbancia de nuez a una concentración de 100 mg Kg−1 e interpolando la absorbancia de la almendra en la ecuación logística obtenida de los estándares del kit se obtuvo una concentración de 2,38 mg Kg−1 de nuez presente en la almendra. No incluir una advertencia sobre esta reacción cruzada puede dar lugar a un falso positivo, y que se etiquetara el alimento como con presencia de nuez. Las personas alérgicas a la almendra pueden llegar a comprar ese producto confiando en que no les afectará, pudiendo desencadenarles una reacción alérgica. A su vez, personas alérgicas a la nuez no comprarán ese producto por evitar una posible reacción alérgica, a pesar de estar libre de este alérgeno. Y por último, no sería posible especificar la cantidad de alérgeno real que puede haber de nuez si se encuentra junto con almendra en el mismo producto, puesto que se vería enmascarado por la almendra. Por otra parte, la absorbancia de la pacana detectada como nuez obtuvo una reactividad cruzada de 3,04 mg Kg−1 (11,72 % con respecto al valor de 100 mg Kg−1 de nuez), superior al 0,82 % indicado en el manual del kit. Los valores de LOD y LOQ calculados en este trabajo utilizando la curva estándar fueron de 2,2 mg Kg−1 y 3,3 mg Kg−1 respectivamente, siendo ligeramente superiores a los indicados en el manual del kit (0,6 mg Kg−1 y 2 mg Kg−1, respectivamente), por lo que no se podría establecer la concentración real de nuez en un producto comercial. Considerando los resultados obtenidos en este trabajo, sería conveniente que aquellas matrices que según el manual del kit no presentaban reactividad cruzada fueran reevaluadas. Además, estos resultados corroboran que al igual que en otras técnicas y kits comerciales de ELISA para la detección de nuez (Costa et al., 2014), la pacana es la especie que más reacciones cruzadas produce y sería necesario emplear un método de confirmación que pueda diferenciar la nuez de las especies que producen reacciones cruzadas, como la técnica de PCR en tiempo real (López- Calleja, de la Cruz, González, et al., 2015b). V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 172 En segundo lugar, se evaluó la sensibilidad del Kit comercial ELISA mediante el análisis de mezclas binarias de nuez en harina de maíz que contenían 50, 20, 10, 5, 2 mg Kg−1 de nuez, siendo el valor más alto el de 50 mg Kg−1. Para evaluar la influencia de los polifenoles presentes en la testa (capa fina por encima de la semilla) sobre el reconocimiento de las proteínas alergénicas de la nuez por los anticuerpos, se prepararon mezclas con nuez pelada y sin pelar. Además, con el fin de evaluar la influencia del tostado en el reconocimiento del epítopo, como se demostró en el caso del JrBSF (Figura IV.1.7), se prepararon las mismas mezclas binarias con nuez cruda y con nuez tostada. Los valores de absorbancia obtenidos de cada mezcla experimental en las diferentes condiciones se representaron frente a la concentración de nuez (100-1 mg Kg−1) y se compararon con la curva de calibración obtenida usando los estándares del kit (50, 15, 5, 2 y 0 mg Kg−1). Se comprobó que las 4 curvas en las diferentes condiciones de nuez fueron similares (Figura IV.2.1), indicando que la presencia de polifenoles en la testa y el tostado a 160 °C no afectan a la detección de nuez por parte del kit. Pero cabe destacar que el valor de absorbancia de la nuez (100 mg Kg−1), y también las mezclas binarias de 50, 20, 10, 5, 2 mg Kg−1 en todas las condiciones de la nuez (cruda, y horneada, con testa y sin ella), sin diluir y siguiendo las instrucciones del fabricante, están por encima del valor de absorbancia más alto (50 mg Kg−1) de los estándares del kit. Por ello, se prepararon diluciones de los extractos a 1:5 y 1:25 en tampón de extracción de proteínas. Las muestras diluidas 25 veces dieron valores de absorbancia por debajo del estándar, por lo que tampoco permitían una correcta cuantificación. Sin embargo, las absorbancias de las muestras diluidas 5 veces fueron las más cercanas a las absorbancias obtenidas con los estándares del kit. De nuevo, a pesar de tener mayor sensibilidad y estabilidad en cuanto al tratamiento de las muestras, el kit ELISA debería ser reevaluado, debido a que la cuantificación no sería fiable. También es posible que la matriz alimentaria empleada para hacer las mezclas binarias o los estándares del kit pueda influir en la eficiencia de la extracción. Atendiendo al tipo de tampón que se emplea en la extracción de proteínas de muestras comerciales procesadas, se ha determinado que el tampón influye de forma considerable en la detección de nuez mediante técnicas inmunoenzimaticas, siendo más efectivo el reconocimiento de las proteínas en PBS y pH alto que con reactivos comerciales (Jayasena et al., 2019). Por lo que el método de extracción elaborado en nuestro laboratorio sería más eficiente e influiría menos en el reconocimiento de la proteína que las extracciones llevadas a cabo con los reactivos comerciales proporcionados en el kit. No obstante, siguiendo las instrucciones del fabricante, se analizaron todos los extractos sin diluir, y la concentración aparente de nuez de los extractos heterólogos se expresó como reactividad cruzada. V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 173 De la comparación realizada se puede concluir que el ELISA directo con el scFv JrBSF multimérico desarrollado en esta Tesis Doctoral, y el kit ELISA tienen distintas características. El ELISA directo presenta menos reacciones cruzadas que el kit, pero también menor sensibilidad. Sería adecuado establecer un sistema de análisis complementario mediante PCR en tiempo real, para excluir los falsos negativos o positivos, para tener un resultado más fiable. La principal ventaja y novedad del método de ELISA con scFv multimérico es la selección in vitro de anticuerpos, que permite su producción ilimitada sin utilizar animales de experimentación, con la ventaja de incrementar la producción y disminuir el coste. Además, cabe destacar que los anticuerpos recombinantes pueden modificarse in vitro, tanto en su secuencia de aminoácidos como por conjugación genética con otras moléculas que mejoren su sensibilidad. La posterior modificación funcional añadiendo una molécula fluorescente o una biotina al anticuerpo podrían emplearse en diferentes plataformas analíticas como los dispositivos de flujo lateral o arrays. Una ventaja adicional de las técnicas de ELISA sobre los métodos basados en el ADN es que se detecta la molécula alergénica, es decir, la proteína, en lugar del ADN que no es un componente alergénico en sí mismo. Después del análisis de muestras de referencia y mezclas experimentales para evaluar las ventajas y limitaciones del kit comercial y del ELISA con scFv multimerizado para la detección de nuez en alimentos, se procedió a evaluar su aplicabilidad para el análisis de alimentos comerciales. En total se analizaron 101 muestras comerciales obtenidas de diferentes establecimientos e incluyendo una gran variedad de tipos de alimentos, para que el muestreo fuera lo suficientemente diverso para observar las limitaciones de todas las técnicas. Con relación a su contenido en nuez, 28 muestras la declaraban como ingrediente en el etiquetado. De las 28 muestras que declaraban contenido de nuez en su etiquetado, 11 produjeron resultados negativos por alguna de las técnicas empleadas, principalmente, la técnica del ELISA directo con scFv, aunque 2 fueron negativas en la técnica de PCR en tiempo real y una para el kit ELISA. Entre las muestras negativas se encontraron un chocolate, una salsa, una bebida, 2 helados, 5 yogures y un sándwich. Las 2 muestras negativas por PCR en tiempo real fueron el chocolate, que no declaraba un porcentaje específico de nuez, y el helado, que declaraba un 10 % de nuez. Para descartar que se tratara de una sustitución fraudulenta de la nuez por otro fruto de cáscara, como la pacana, se realizó una PCR en tiempo real específica para la detección de pacana, resultando igualmente negativo. Sin embargo, con el kit de ELISA se obtuvieron valores de absorbancia a 450 nm de 1,9 en el chocolate y 2,6 en el helado, quedando estos valores por encima de la curva estándar del kit, lo que corroboraría de forma cualitativa que se encuentra por V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 174 encima de 50 mg Kg−1, como marca el etiquetado del producto. Dos hipótesis probables que puedan explicar estos datos contradictorios son: la posibilidad de un etiquetado erróneo del producto, en cuyo caso el resultado del kit ELISA estaría mostrando un falso positivo, o bien que la matriz alimentaria que contiene el alérgeno interfiera en el análisis mediante las técnicas de ELISA multimérico y PCR en tiempo real, por lo que se trataría de falsos negativos. Hay que tener en cuenta que el 15,67 % de la proteína total de la nuez corresponde a la fracción de globulinas 11S (Mao y Hua, 2012), es un porcentaje pequeño que por acción mecánica o química durante el procesado, o simplemente por interferencia de la matriz donde se encuentra, tanto en el helado como en el chocolate, puede hacer que esas proteínas se degraden o se oculte su epítopo obteniéndose falsos negativos. En el caso de las 9 muestras que solo resultaron negativas al ser analizadas por ELISA multimérico, se puede concluir que en algunas muestras puede deberse a su mayor LOD y que el procesado de los alimentos afecta a la eficiencia esta la técnica de detección ya que todas las muestras afectadas han recibido al menos un tratamiento de pasteurización. Por lo tanto, los resultados negativos de las 11 muestras (39 %) podrían indicar que se debería llevar a cabo un estudio y análisis más minucioso de las matrices alimentarias particulares a fin de corroborar los resultados negativos y poder determinar la limitación de los métodos analíticos desarrollados. Además, la baja cantidad de proteínas en el chocolate, la presencia de polifenoles y el procesamiento de los alimentos podrían estar interfiriendo con los métodos analíticos (Ozdal et al., 2013; Tomaino et al., 2010). En el caso de las 2 muestras (chocolate y yogurt) con etiquetado precautorio de alérgenos (PAL) de la posible presencia de trazas de nuez, con ninguno de los tres métodos resultaron ser positivas en la detección de nuez. Hay que tener en cuenta que estos productos PAL surgen para evitar problemas por la presencia inadvertida de alérgenos, pero restringen su elección por parte de los consumidores alérgicos. En este caso puede tratarse de un etiquetado abusivo, ya que se está colocando de forma preventiva en alimentos que no tienen riesgo alguno de contener trazas de dicho alérgeno, lo que puede inducir a que muestren rechazo o desconfianza hacia esos productos. Una buena regulación de la reglamentación del uso de los productos con PAL podría mejorar la seguridad y la calidad de vida de los consumidores sensibles, pero el etiquetado precautorio de los alérgenos sólo debería utilizarse tras una evaluación exhaustiva de los riesgos de contaminaciones cruzadas de alérgenos presentes en la elaboración del producto y de que éstas no se pueden eliminar (DunnGalvin et al., 2015). Una dificultad adicional que afecta al PAL es la falta de dosis de referencia mínimas definidas que pueden causar reacción alérgica. Los umbrales o dosis desencadenantes son la cantidad más baja de un alérgeno alimentario V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 175 que puede provocar una reacción alérgica. Cuando se conozcan para los distintos alérgenos, se podrá trabajar para reducir la contaminación cruzada por debajo de estos niveles y que los consumidores estén protegidos ante unos etiquetados precautorios más fiables y puedan ver incrementada su posibilidad de elección del alimento. Pero es muy difícil establecer esos umbrales, porque cada paciente presenta una sensibilidad muy diferente. Si existe el riesgo de que un producto alimenticio se vea afectado por una contaminación cruzada de alérgenos, la etiqueta debe incluir una de las siguientes declaraciones: puede contener “X” o no es adecuado para personas con alergia a “X” (Remington et al., 2020; Taylor et al., 2014). De los 30 productos analizados que indicaban en su etiquetado que contenían otros frutos de cáscara distintos de nuez, todos los tipos de muestras resultaron negativos excepto algunos de los cereales. Los resultados positivos obtenidos mediante todas las técnicas podrían indicar contaminaciones cruzadas en estos productos. Las 7 muestras positivas (23 %) contenían pacana o una mezcla de pacana con otros frutos de cáscara, como se verificó mediante la técnica PCR en tiempo real específica para la pacana. La reactividad cruzada de la pacana con la nuez suele encontrarse en todos los métodos ELISA disponibles para la detección de nuez (Costa et al., 2014; Niemann et al., 2009), por lo que los métodos ELISA estarían produciendo falsos positivos, detectando una reacción cruzada con la nuez. Por otra parte, 6 de esas muestras resultaron positivas para nuez por PCR en tiempo real, con alrededor de 300 mg Kg−1 de nuez. Según los resultados de la técnica de PCR, 6 de las 7 muestras contenían tanto nueces como pacanas. Solo una muestra resultó negativa para nuez por el método de PCR y por ELISA directo, pero fue positiva para el kit ELISA, conteniendo solo pacanas. Esta muestra debería considerarse como falso positivo y supondría un problema para los consumidores alérgicos. Mediante el método de ELISA directo con el JrBSF, 5 muestras sin nuez declarada, pero que declaraban contenido en pacana, resultaron positivas para nuez (16,67 %). Por lo tanto, no es posible determinar en estas muestras si los resultados de la prueba ELISA detectan la nuez y/o la pacana. De las 26 muestras analizadas en cuyo etiquetado se indicaba que contenían trazas de otros frutos de cáscara distintos de la nuez, 3 de las muestras de chocolates resultaron positivas mediante la técnica de PCR en tiempo real (11,5 %) y solo 2 de ellas mediante el kit ELISA (7,7 %). En una de las muestras de chocolate, la nuez se detectó solo por PCR a una concentración de 230 mg Kg−1 que, aunque fue negativa en los métodos ELISA, es una concentración suficiente para que un consumidor sensible pueda tener una reacción alérgica. Entre las causas de este positivo pueden encontrarse una contaminación cruzada V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 176 del alimento en la industria o en el procesado de la muestra, ya que no se detectó mediante ningún ensayo inmunoenzimático. Los bajos niveles de nuez presentes en la muestra pueden indicar una contaminación involuntaria, ya sea en las materias primas o en el equipo o el entorno de la industria alimentaria. Otra razón por la que puede no detectarse la nuez en las muestras de chocolate puede deberse a la presencia de polifenoles del chocolate, que se unen a las proteínas de la nuez formando complejos que inhiben su reconocimiento (Labuckas et al., 2008; Ozdal et al., 2013), y al tratamiento al que los chocolates son sometidos durante su producción. Dado que las muestras que dieron positivo mediante el kit ELISA de la nuez (absorbancias de 1,87 y 0,121) y la técnica de PCR en tiempo real, no fueron declarados en su etiquetado, estos productos fueron etiquetados incorrectamente y supondrían un peligro para el consumidor sensible. De acuerdo con estos resultados, hubo entre un 4,95 y 8,91 % de muestras (dependiendo del método analítico) que contenían nuez, pero no la declaraban en su etiquetado, lo que confirma que existe un riesgo para los consumidores alérgicos. De manera similar, Ford et al (2010) informaron de casi un 3,5 % de productos positivos para alérgenos de nuez que no estaban declarados en esos productos, y de un 5,3 % de positivos entre los productos que “pueden contener nuez". Ante estos resultados, se puede entender que los consumidores alérgicos muestren al final cierto rechazo a los productos que declaran "puede contener" en su etiquetado, ya sea por desconfianza al observar el producto, por su conocimiento de la empresa fabricante o por sus experiencias pasadas. Hasta el 8 % de los consumidores alérgicos declaran haber tenido reacciones alérgicas ante la ingestión de productos PAL (Allen y Taylor, 2018). También es importante tener en cuenta que el uso abusivo de etiquetados precautorios crea frustración en el consumidor alérgico, porque limita sus opciones de alimentos a consumir, y finalmente asume riesgos que pueden llegar a perjudicar su salud (DunnGalvin et al., 2015). Por último, ninguna de las 15 muestras analizadas que no declaraban contener frutos de cáscara o trazas de frutos de cáscara fueron positivas para la nuez en ninguna de las técnicas descritas en este estudio (Tabla IV.2.4). Del análisis de 101 muestras comerciales realizado para comprobar la veracidad del etiquetado con relación a la presencia de nuez, se deduce la importancia de que los métodos analíticos para detectar ingredientes alergénicos en los alimentos tengan una especificidad y sensibilidad adecuadas para rastrear cantidades muy pequeñas de los alérgenos en matrices complejas de alimentos procesados. Las tres técnicas utilizadas en este estudio tienen ventajas e inconvenientes. La técnica de PCR en tiempo real es la más sensible de V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 177 las empleadas, pero es la más costosa y hay que tener en cuenta que no detecta proteínas alergénicas, sino el ADN de la nuez. No obstante, se ha utilizado para confirmar tanto los resultados de falsos negativos como los falsos positivos, porque es capaz de discernir claramente entre el ADN de la nuez y el de la pacana, y además presenta un LOD muy bajo (0,1 mg Kg−1). A pesar de que el límite de detección del ELISA con scFv multimerizado era el más alto, había una buena concordancia entre los resultados inmunoenzimáticos y los de la PCR en tiempo real, excepto para algunas muestras líquidas o semisólidas tratadas con calor (lácteos, bebidas, sándwich) o las que contenían pacana. En comparación con la prueba de ELISA directo con scFv multimerizado, el kit de ELISA sándwich de nuez demostró mayor sensibilidad y resultó menos afectado por el procesamiento de las muestras, pero tenía una mayor reactividad cruzada con la pacana y otros frutos de cáscara declarados por el fabricante, lo que producía algunos falsos positivos para la nuez. Dado que cada método tiene ventajas y limitaciones para la detección de alérgenos, la técnica de PCR en tiempo real y los inmunoensayos ofrecen enfoques complementarios (Holzhauser, 2018). Además, sería conveniente que las industrias alimentarias apliquen buenas prácticas para elaborar un etiquetado fiable de los alérgenos, así como el uso combinado de ambas técnicas para el control interno de contaminaciones cruzadas, incluyendo el análisis del riesgo de los alérgenos en sus planes de APPCC. V.2. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES ESPECÍFICOS FRENTE A PISTACHO (PISTACIA VERA) MEDIANTE LA TÉCNICA DE PHAGE DISPLAY A PARTIR DE GENOTECAS DE FAGO-ANTICUERPOS RECOMBINANTES TIPO DAB El segundo objetivo de esta Tesis Doctoral consistió en la obtención de fago-anticuerpos recombinantes frente a pistacho, seleccionados por afinidad mediante phage display a partir de una genoteca comercial semisintética de tipo dAb (single domain antibody), y su empleo en el desarrollo de una técnica inmunoenzimática (ELISA indirecto) para la detección de pistacho en alimentos. V.2.1. Enriquecimiento de la genoteca de dAbs en clones de fago-dAb específicos de pistacho mediante diferentes estrategias de biopanning Debido a la creciente demanda de anticuerpos recombinantes en medicina e investigación, se está produciendo un auge de la tecnología de phage display o presentación en fagos filamentosos como medio de obtener anticuerpos recombinantes de manera rápida V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 178 y económica, permitiendo su producción a gran escala en organismos tanto procariotas como eucariotas. Mediante técnicas de ingeniería genética, o utilización de plásmidos comerciales y cepas bacterianas se puede obtener una producción de hasta 4 g L−1 de anticuerpos recombinantes (Gupta y Shukla, 2017; Ledsgaard et al., 2018). Para conseguir el aislamiento de anticuerpos recombinantes específicos frente a una determinada diana, los principales aspectos a considerar son la calidad de las genotecas que se emplean, es decir, el número de anticuerpos funcionales correctamente plegados que contiene la genoteca, así como una buena estrategia de biopanning (Mandrup et al., 2013). Para desarrollar este segundo objetivo de la Tesis Doctoral, se empleó una genoteca comercial de fago-anticuerpos recombinantes de dominio único (dAb). La visión de los anticuerpos solo como moléculas compuestas de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, cambió cuando se llevó a cabo un análisis de moléculas de inmunoglobulina G (IgG) total y fraccionada en el suero de un dromedario en el laboratorio del profesor Raymond Hamers de la Vrije Universiteit Brussel de Bélgica (VUB). Un proyecto en el que los estudiantes debían realizar pruebas diagnósticas serológicas de la infección por tripanosoma en camellos dio como resultado un descubrimiento fortuito, demostrando la presencia de anticuerpos que carecían de una cadena ligera y que mantenían la capacidad de unir antígenos (Arbabi-Ghahroudi, 2017). La genoteca de anticuerpos de domino único, single domain antibody (dAb), está compuesta de fragmentos de anticuerpos humanos que carecen de cadena de cadena ligera y solo contienen el dominio variable de la cadena pesada o VH. Para su enriquecimiento se necesita del fago ayudante M13 K07, que infecta E. coli TG1 a través del pili bacteriano usado como receptor y genera títulos de hasta 1013 fagos por mililitro de cultivo bacteriano. El empleo de genotecas de dAbs, tiene un gran interés para la selección de sondas específicas debido a que presentan mayor grado de diversidad de fragmentos de anticuerpos y un menor tamaño que las plataformas de anticuerpos convencionales. Entre las ventajas de los dAb también destacan: a) una elevada estabilidad térmica por su mayor contenido en residuos hidrofílicos; b) alta solubilidad al no presentar linker artificial como en los scFv que una la VH con VL; c) la facilidad para su subclonación y expresión; d) su coste de producción relativamente bajo; e) la facilidad con que se pueden modificar mediante ingeniería genética; y f) su facilidad de penetración en tejidos (Arbabi-Ghahroudi, 2017). V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 179 Por todo ello, se eligió esta genoteca para facilitar la selección de anticuerpos específicos frente a pistacho. Esta es una genoteca semisintética no inmune de anticuerpos de dominio único, con un tamaño (Rz) de 3x109 y basada en un marco de VH de línea germinal humana (V3-23/D47), que fue desarrollada por Daniel Christ en el Laboratorio de Biología Molecular del Consejo de Investigación Médica de Cambridge (Reino Unido) (Lee et al., 2007). La diversidad en estos anticuerpos (en las posiciones H27-33, H35, H50, H52-H54, H94, H95- H100(a-k), H101, H102) se introdujo en los dominios de unión a antígenos mediante mutagénesis dirigida por PCR en las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3). Su tamaño ofrece un extenso repertorio de fago-anticuerpos, aumentando la probabilidad de encontrar clones de alta afinidad por una determinada diana molecular. La genoteca está construida en el vector fagémido pR2, resistente a la ampicilina, que contiene los epítopos MYC y VSV, para facilitar su identificación y purificación. Además, esta genoteca se ha diseñado para minimizar la tendencia a la agregación de los anticuerpos, reduciendo la longitud de la CDR3, pero manteniendo la capacidad de reconocimiento del antígeno. Uno de los procesos más importantes a la hora de seleccionar los clones específicos es el proceso de biopanning (Parmley y Smith, 1988). En esta Tesis Doctoral se plantearon diferentes estrategias de selección para obtener fago-dAbs específicos de pistacho. Se emplearon diferentes superficies para la inmovilización de los antígenos y diferentes dianas proteicas para evitar la selección de los fagos con afinidad por las superficies de inmovilización o por otras proteínas no diana que podrían dar lugar a falsos positivos. Con relación a la diana molecular, la selección se suele llevar a cabo empleando moléculas purificadas (Hoogenboom et al., 1998). Sin embargo, no todos los antígenos están disponibles comercialmente y la purificación de proteínas vegetales, al tener una expresión multigénica, es incompleta y laboriosa. En trabajos anteriores del grupo de investigación, se consiguieron aislar con éxito fago-anticuerpos específicos frente a la nuez del Brasil y frente a la almendra utilizando extractos completos de proteína de las especies diana (de la Cruz et al., 2013, 2015), demostrándose que estos extractos permiten aislar clones más específicos ya que se unen a una variedad más amplia de moléculas (Menendez y Scott, 2005). De forma similar, también se empleó un extracto de nuez en el primer objetivo de esta Tesis Doctoral. Por lo tanto, para seleccionar fago-dAbs frente a pistacho se consideró partir de extractos totales de estos frutos de cáscara, en diferentes condiciones, para evaluar la especificidad y la afinidad de cada estrategia de selección. Como en el caso de la genoteca de scFv, el proceso comienza con la inmovilización del ligando o diana de interés en un soporte sólido sobre el que se añaden los fago-dAbs de la genoteca en solución, para V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 180 que se produzca la unión al antígeno (diana) de los fago-dAbs específicos. Aquellas partículas de fago-dAbs inespecíficas que no se han unido a la fase sólida se eliminan durante los pasos de lavado, y las que permanecen unidas al antígeno inmovilizado se eluyen mediante la adición de tripsina. Este hecho favorece la recuperación cuantitativa de todos los fagos con independencia de la afinidad de la interacción, a diferencia de la elución convencional mediante cambios de pH que preferentemente rompen las interacciones más débiles, produciendo un sesgo con aquellos anticuerpos que tienen baja afinidad (Thomas y Smith, 2010). Los fagos específicos del antígeno pueden amplificarse en una cepa apropiada de E. coli para sus aplicaciones posteriores o para el siguiente ciclo de selección, facilitando un mayor enriquecimiento. La ronda final de selección puede determinarse mediante la evaluación de que no se produzca un aumento adicional en el rendimiento de los fagos eluidos. Aun así, debido a la existencia de uniones inespecíficas que limitan el enriquecimiento en cada ronda de selección, al menos hay que llevar a cabo dos rondas de selección, alternando el tipo de soporte, y escoger aquellos clones que presenten una afinidad real y específica por el antígeno. Se llevaron a cabo diferentes estrategias de biopanning (S1-S4) para obtener clones específicos de pistacho (Tabla IV.3.2). En todas las estrategias se utilizaron paletas de poliestireno como fase sólida para la primera ronda de biopanning y esferas magnéticas para la segunda ronda, a fin de evitar el aislamiento de fago-dAbs que reconozcan a la fase sólida y que producirían falsos positivos. Otro aspecto que se debe controlar es la posibilidad de seleccionar clones que produzcan reacciones cruzadas con especies no diana. Para minimizarlo, se incluyó previamente en cada ronda de selección una etapa de hibridación sustractiva o biopanning negativo, que consiste en la incubación de la genoteca con el soporte unido al extracto frente al cual no debe haber reconocimiento, como ocurre entre el pistacho y el anacardo. Ambos pertenecen a la familia de las Anacardiáceas y, debido a su proximidad filogenética, es difícil obtener anticuerpos específicos del pistacho que no tengan una reacción cruzada con el anacardo (Tawde, 2004). Las dos rondas de selección se llevaron a cabo utilizando extractos de proteínas de pistacho, anacardo y cacahuete enteros (S1 y S2) o desengrasados (S3 y S4). El proceso de desengrasado se incorporó en las estrategias debido a que este tipo de frutos de cáscara tienen prácticamente la mitad de contenido en grasa, que interfiere en la reacción de reconocimiento de la diana por parte del fago-dAb. Este proceso se realizó con acetona, que a su vez permite la eliminación de polifenoles presentes en los frutos, que también interfieren en el reconocimiento (Moo- Huchin et al., 2019; Ozdal et al., 2013; Tomaino et al., 2010). En S1 y S3 la estrategia de biopanning consistió en una hibridación sustractiva con cacahuete en la primera y segunda V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 181 rondas de selección y una selección positiva con pistacho en ambas rondas. Se observó que en la estrategia con el extracto desengrasado (S3) se recuperaron muchos más clones que en S1. En las estrategias S2 y S4 se realizó una selección negativa frente a cacahuete en la primera ronda y frente a anacardo en la segunda. Esta doble selección negativa favoreció la aparición de clones más específicos, pero en menor número (Figura IV.3.2 y Tabla IV.3.2). El aumento en el número de fagos eluidos conforme se realizan las rondas de selección está relacionado con el enriquecimiento de la genoteca en variantes de fagos que presentan afinidad por el pistacho, lo que indicaría que el proceso de biopanning transcurrió de forma acorde a lo descrito en la bibliografía. Para confirmar esta hipótesis, se realizó un ELISA de fago-dAbs policlonales con el conjunto de fago-dAbs recuperados al final de cada ronda de selección, enfrentándolos a los extractos de pistacho, anacardo y cacahuete, y utilizando BSA y β-galactosidasa como controles negativos (Figura IV.3.2). Los resultados mostraron un aumento en los valores de absorbancia frente a las proteínas de pistacho después de la segunda ronda, con importantes diferencias entre las estrategias. Cuando se utilizaron extractos proteicos no desengrasados como diana, la unión al pistacho aumentó sólo ligeramente en la estrategia S1, y no aumentó con relación a la primera ronda en S2. Por el contrario, la utilización de extractos desengrasados como diana permitió un claro enriquecimiento de la genoteca en fago-dAbs frente a pistacho, con valores más altos registrados en la S3 que en la S4. Este resultado podría significar que la selección negativa contra el anacardo produjo la recuperación de un número menor de fagos con afinidad por el pistacho, pero más específicos. Se encontró una reactividad cruzada muy baja en los pocillos tapizados con BSA, β-galactosidasa, anacardo y cacahuete. Por tanto, según estos resultados, el uso de extractos desengrasados aumentó la eficiencia del proceso de biopanning, de manera que la población de fagos que reconoció específicamente al pistacho se enriqueció considerablemente en la segunda ronda, evitando la necesidad de rondas adicionales de selección. En consecuencia, se procedió al aislamiento de 95 clones individuales a partir de los fago-dAbs recuperados de la segunda ronda de selección. V.2.2. Selección de clones de fago-dAb individuales mediante ELISA monoclonal Dado que el propósito final de los anticuerpos seleccionados es desarrollar un inmunoensayo para la detección de pistacho en alimentos, se requiere que los clones seleccionados presenten afinidad hacia pistacho. Por ello, se realizó un ELISA de fago-dAbs monoclonales para aislar e identificar los clones que producían dAbs que reconocen proteínas de pistacho. Se aislaron 95 colonias de E. coli TG1 de las placas de titulación de V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 182 las segundas rondas de selección de las diferentes estrategias, y se analizaron los fago- dAbs producidos en el sobrenadante del cultivo. Los clones se consideraron positivos cuando la unión al extracto de pistacho fue al menos 5 veces mayor que la unión a los extractos de cacahuete o anacardo utilizados como controles negativos (A450 frente al pistacho > 5 × A450 frente al control negativo). Cuando se realizó la selección negativa con el cacahuete entero (S1), se obtuvieron solo 2 clones que reconocieron el pistacho (PVD5 y PVF10), pero también mostraron reacción cruzada con el anacardo (Tabla IV.3.2). Es posible que la sustracción con el cacahuete eliminara los clones que reconocen a otros frutos de cáscara, disminuyendo la posibilidad de obtener fagos libres que se pudieran unir a pistacho. En la estrategia S2, la selección negativa se realizó con el cacahuete en la ronda 1 y con el anacardo en la ronda 2. Esta estrategia dio como resultado un solo clon positivo que reconoció exclusivamente el pistacho (PVG3). Finalmente, este clon fue descartado porque su secuencia de nucleótidos reveló que no codificaba para un dAb completo, generando un anticuerpo truncado que carecía del péptido señal y la región FR1, y parte de la CDR1. Los pistachos se caracterizan por su alto contenido en grasa (entre 40,6 y 53,5 %), con un perfil de ácidos grasos cardiosaludables (Dreher, 2012; Tomaino et al., 2010). También son ricos en polifenoles (alrededor de 600 mg por 100 g), que forman complejos con las proteínas provocando cambios en las propiedades estructurales, funcionales y nutricionales de ambos compuestos (Ozdal et al., 2013). Teniendo en cuenta que el alto contenido de grasa del pistacho y otros frutos secos podría estar obstaculizando la obtención de dAb específicos del pistacho, se realizaron las mismas estrategias de biopanning utilizadas con los extractos enteros (S1 y S2), pero utilizando extractos desengrasados de pistacho, cacahuete y anacardo. En la estrategia S3, de los 95 clones analizados de la segunda ronda se obtuvieron un total de 13 clones (13,7 %) que reconocían al pistacho (Tabla IV.3.2). Tres de ellos mostraron reacción cruzada con el extracto de anacardo (PVA7, PVA8 y PVD8), y los clones restantes solo reconocían al pistacho (PVB4, PVB9, PVC11, PVC12, PVD6, PVE12, PVF6, PVF9, PVG8 y PVH7). En la estrategia S4, se obtuvieron 4 clones que se unieron a pistacho de los 95 clones analizados de la segunda ronda (4,2 %). Tres de ellos se consideraron específicos del pistacho (PVA1, PVA12 y PVF4), y sólo 1 reaccionó también con el anacardo (PVB12). Tras el examen inicial, se seleccionaron 8 clones de las segundas rondas de S3 y S4 para evaluar mediante un ELISA monoclonal con fago-dAb su especificidad frente a 10 especies de frutos de cáscara alergénicos (Figura IV.3.3). Solo hubo un clon, PVA8 (S3), que presentó reacción cruzada con el extracto de anacardo y fue desechado. El resto de los clones fueron completamente específicos frente a pistacho. Estos V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 183 resultados demostraron que el proceso de hibridación sustractiva con una proteína estrechamente relacionada con el pistacho, como el extracto de anacardo, excluía una parte de los fagos reactivos de pistacho, pero aun así permitía la selección de los fago-dAbs más específicos. Además, el uso de extractos desengrasados era necesario para obtener clones específicos de pistacho, eliminando los ácidos grasos y polifenoles. Por lo tanto, los extractos utilizados en las estrategias S3 y S4 se caracterizan por un alto contenido de proteínas sin elementos como los ácidos grasos y los fenoles que interactúan o impiden el reconocimiento de los epítopos de las proteínas por parte de los dAb, mejorando así la eficiencia de la selección de los anticuerpos. En definitiva, para llevar a cabo una buena estrategia de biopanning hay que tener en cuenta: a) el tipo de extractos que se emplean, conociendo su contenido en proteína, polifenoles y ácidos grasos, así como las relaciones filogenéticas entre ellos; b) el soporte o combinación de soportes que se emplean para eliminar inespecificidades con el material empleado; c) llevar a cabo hibridaciones sustractivas, considerando las relaciones filogenéticas, para eliminar aquellos clones que puedan producir falsos positivos; y d) realizar al menos dos rondas de selección que permitan ver el incremento en el número de fagos obtenidos. V.2.3. Secuenciación y caracterización de los clones seleccionados El ADN de los 8 clones específicos de pistacho seleccionados, y 1 de los clones con reacción cruzada con el anacardo, se amplificó mediante PCR con los cebadores CDR1-2 y CDR3 para estimar la proporción de clones que contenían el inserto completo de VH (aproximadamente 360-390 pb) y todos ellos produjeron fragmentos de amplificación del tamaño esperado. Se secuenciaron los insertos de los plásmidos purificados para corroborar el correcto marco de lectura de la secuencia y que integraran los epítopos c-Myc y VSV. Las secuencias se publicaron en GenBank con los siguientes números de acceso: PVA8-dAb (MN862009), PVB9-dAb (MN631054), PVD6-dAb (MN862010), PVE12-dAb (MN862011), PVF4-dAb (MN612110), PVF6-dAb (MN631055), PVF9-dAb (MN862012), y PVH7-dAb (MN862013). Al compararlos con la base de datos del NCBI y IMGT/V-quest, se confirmó que la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de los clones positivos seleccionados correspondía al gen de la línea germinal IGHV3-23 de Homo sapiens. Por último, el análisis de las secuencias de aminoácidos deducidas para los 9 clones (Figura IV.3.4) demostró que todos eran diferentes, excepto el dAb PVF4, obtenido con la estrategia S4, y el PVC12, obtenido con la estrategia S3, que tenían la misma secuencia de nucleótidos. Por este motivo, al aparecer un mismo clon específico en dos estrategias diferentes se V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 184 decidió seleccionar el clon PVF4 por su mayor estabilidad de cultivo y producción de fago- dAb. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los dAbs específicos de pistacho no contenían inserciones o deleciones en CDR1 y CDR2 en ninguno de los clones. Como era de esperar, la mayor variabilidad entre los clones seleccionados se encontraba en CDR3, tanto en secuencia como en longitud, con longitudes de 12 a 20 residuos. Además, cabe destacar la presencia de un codón de parada que estaba presente en la CDR1 de 6 clones, y en CDR3 de un clon (PVH7), debido a una mutación de tipo Ámbar. Estas mutaciones son frecuentes en este tipo de genotecas debido a la aleatorización de las secuencias de las CDRs y a que se emplea la cepa supresora Ámbar de E. coli TG1. Esta cepa K12Δ (lac- proAB) supE thi hsdD5/F’ traD36 proA+B laclq lacZΔM15 es una cepa supresora Ámbar (supE) que se utiliza para la propagación de los fagos y la expresión de las proteínas heterólogas fusionadas con la proteína pIII de la cubierta. El codón Ámbar (UAG) es un codón de terminación de la traducción que no codifica para ningún aminoácido. Las cepas supresoras de Ámbar portan mutaciones en la secuencia del anticodón de un gen que codifica para un ARNt. Este ARNt portador de la mutación en el anticodón (ARNtGLN) permite reconocer y traducir un triplete UAG como glutamina (Gln). El supresor Ámbar supE se encuentra en muchas cepas de E. coli K-12 de uso común (Niccheri et al., 2014; Singaravelan et al., 2010). Los clones de dAb afectados por mutaciones Ámbar pueden utilizarse para la selección de fagos, pero para producir los dAb en forma soluble en una cepa no supresora es necesario realizar una mutagénesis dirigida para suprimir la mutación. Cuando se producen como fragmentos de anticuerpos solubles, los dAb de esta genoteca se secretan unidos a los péptidos marcadores de c-Myc y VSV para facilitar su purificación del cultivo donde son excretados. V.2.4. Identificación y caracterización, mediante técnicas cromatográficas, electroforéticas, espectroscópicas e inmunoquímicas, de las dianas moleculares reconocidas por los anticuerpos recombinantes frente a pistacho Para identificar las fracciones de proteína reconocidas por el fago-dAb PVF4, se realizó una separación cromatográfica del extracto de pistacho desengrasado mediante cromatografía líquida rápida de proteínas o Fast protein liquid chromatography (FPLC), seguida de un ELISA indirecto y un Western blot con las fracciones obtenidas. La separación cromatográfica se realizó mediante una columna de exclusión molecular con extracto de pistacho desengrasado, obteniéndose hasta 56 fracciones diferentes de un volumen aproximado de 1 mL. El perfil de proteínas (Figura IV.3.5A) presentó 2 picos principales y V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 185 3 picos menores a una longitud de onda de 280 nm. De las fracciones más representativas de cada uno de los picos obtenidos, se analizaron 100 µL en un ELISA indirecto frente a los fago-anticuerpos producidos por el clon PVF4. Las fracciones 4-17, pertenecientes a los dos picos mayores y los primeros menores, fueron detectadas por el fago-dAb PVF4 (Figura IV.3.5B). Con el fin de identificar las proteínas específicas reconocidas por este clon, se realizó una electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras del extracto total de pistacho y de las fracciones seleccionadas. Las principales bandas electroforéticas obtenidas tenían pesos moleculares que iban de ∼20 kDa a ∼35 kDa (Figura IV.3.6A). Los patrones electroforéticos y del Western blot obtenidos con el extracto total de pistacho y con las fracciones 4-17, fueron similares a los descritos por Liu, Chhabra, y Sathe, (2015) en condiciones reductoras empleando un anticuerpo monoclonal murino frente a pistacho. En el Western blot con el fago-dAb PVF4 solo se produjo una banda de ∼22 kDa (Figura IV.3.6B). Comparando el resultado con el de Liu et al., 2015, es probable que el antígeno reconocido por el dAb-PVF4 sea la subunidad básica de la globulina 11S del pistacho (alérgeno Pis v 2) que pertenece a la superfamilia de proteínas de las cupinas, y que se ha identificado como uno de los principales alérgenos del pistacho (Ahn et al., 2009). Para verificar esta hipótesis, las bandas reconocidas por el fago-dAb se escindieron del gel de SDS-PAGE y se analizaron por espectrometría de masas en tándem de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF/TOF). Como se muestra en la Tabla IV.3.S1, los péptidos obtenidos de todas las bandas se identificaron en la secuencia de aminoácidos de la globulina 11S (Pistacia vera) (número de acceso: ABU42022). La cobertura de la secuencia 11S obtenida fue del 45 % en el caso de la banda correspondiente al extracto total de pistacho, del 22 % en la fracción 4 obtenida de la cromatografía, del 30 % en la fracción 6 y del 25 % en la fracción 8. Las globulinas 11S se definen como bicupinas debido a la presencia de dos dominios de cupina, cada uno presentando un motivo en forma de barril beta. Son estructuras multiméricas no glicosiladas (hexámeros o mezcla de trímeros) sintetizadas como un polipéptido único, que se divide después de la traducción en un polipéptido ácido (30 - 40 kDa) y un polipéptido básico (22 – 27 kDa) unidos por un enlace de disulfuro (Ahn et al., 2009; Costa et al., 2019). Cabe señalar que la mayoría de los péptidos obtenidos de las bandas 4, 6 y 8, se alinean con la región C-terminal de la secuencia de la proteína, mientras que los péptidos de la banda del extracto total se alinean a lo largo de toda la secuencia (Figura IV.3.7). V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 186 Con el fin de conocer mejor la interacción entre el fago-dAb PVF4 y la globulina 11S del pistacho (ABU42022) identificada por MALDI-TOF/TOF, se elaboró un modelo tridimensional (Figura IV.3.8) utilizando el servidor SWISS-MODEL https://swissmodel.expasy.org/. El modelo se construyó mediante la comparación con la secuencia y estructura de la proteína más estrechamente relacionada disponible en la base de datos, que es la proteína de almacenamiento de la semilla (globulina 11S) de Amaranthus hypochondriacus L., 3qac.1.A, y que sirvió de plantilla al servidor para generar la estructura terciaria más cercana a la del pistacho. La mayoría de los péptidos identificados por MALDI-TOF/TOF, pertenecen a la subunidad de proteína básica (Cupina-1) de la globulina 11S, como se observa en los recuadros que se señalan en la Figura IV.3.8. Este resultado concuerda con el de Liu et al (2015), indicando que la subunidad básica de la globulina 11S del pistacho es un buen antígeno para producir anticuerpos dirigidos a los epítopos relevantes para la alergia humana. V.2.5. Desarrollo de una técnica inmunoenzimática de ELISA indirecto, utilizando un fago-anticuerpo específico para la detección de pistacho en alimentos Una vez seleccionado el clon PVF4 por su capacidad de producir fago-dAbs frente a pistacho sin producir reacciones cruzadas frente a otros frutos de cáscara, se procedió a desarrollar una técnica de ELISA indirecto para la detección de pistacho en alimentos empleando dicho fago-dAb. Previamente a la realización de los ensayos de ELISA indirecto, se titularon los fagos precipitados y se optimizó el número de partículas a utilizar en los inmunoensayos, fijándose finalmente en 1011 fago-dAb por pocillo. Para determinar la especificidad del fago-dAb PVF4 se analizaron mediante ELISA indirecto 67 especies heterólogas (frutos de cáscara, vegetales y animales) y no se observaron reacciones cruzadas, como se indica en la tabla IV.3.1. A continuación, se procedió a evaluar la sensibilidad de la técnica de ELISA indirecto con mezclas binarias de harina de maíz y pistacho tostado molido, que contenían desde 105 hasta 100 mg Kg−1 de pistacho en la mezcla. Debido a que la mayoría de los alimentos que contienen pistacho como ingrediente, suelen incluirlo tostado, el proceso de biopanning se llevó a cabo con pistachos tostados. Además, se comprobó que el fago-anticuerpo dAb-PVF4 permite la detección del pistacho tanto crudo como tostado un ELISA indirecto. Otros investigadores también han analizado mediante inmunoensayos pistacho crudo, tostado en seco y cocido al vapor, comprobando que la inmunorreactividad sólo disminuye cuando el tratamiento térmico se realiza con vapor o con calor y presión en las condiciones más duras (Noorbakhsh et al., 2011; Sanchiz, V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 187 Cuadrado, et al., 2018). En este trabajo se prepararon las mezclas binarias con el pistacho tostado, para asemejarlo lo más posible a la realidad de los productos comerciales. Sin embargo la realidad de los productos comerciales es muy heterogénea y, si se quisiera emplear la técnica con fines cuantitativos para determinar la sensibilidad del fago- anticuerpo, las mezclas binarias deberían tener una composición y tratamiento tecnológico lo más parecida posible a los productos comerciales que se van a analizar, ya que estos también son sometidos a diferentes tratamientos térmicos, de altas presiones o enzimáticos que pueden disminuir la alergenicidad del pistacho y por tanto su reconocimiento. Recientemente, se ha puesto de manifiesto que cuando anacardo y pistacho se someten a un tratamiento térmico junto con incremento de presión, disminuye su capacidad de unión a las IgE, siendo aún más marcada esta inhibición en el anacardo (Blanco et al., 2018). También se observó que el tratamiento combinado temperatura/presión reducía el contenido total de proteína del extracto, debido a la disminución de su solubilidad por la formación de agregados (Vicente et al., 2020). Para evaluar la sensibilidad de la técnica, los pocillos de las placas ELISA se tapizaron con los extractos proteicos obtenidos de las mezclas binarias con diferentes concentraciones de pistacho (100 %, 10 %, 7,5 %, 5 %, 2,5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % y 0 %) en una matriz de harina de maíz. El pistacho de las muestras se detectó con el fago- dAb PVF4 (Figura IV.3.9). La curva dosis-respuesta obtenida dibuja una sigmoidal que se ajusta mediante una ecuación logística de 4 parámetros a un R2 de 0,99869. El límite de detección se calculó como la concentración aparente de pistacho que presentaba una absorbancia superior a la media de las absorbancias de los frutos de cáscara no diana, más tres veces su desviación estándar. El valor que se obtuvo fue de 3983 mg Kg−1. Los coeficientes de variación de cada uno de los puntos se encontraron entre el 2 % y el 15 %, dispersión aceptable para una buena reproducibilidad del método, puesto que los valores deben estar por debajo del 10 % para una buena reproducibilidad y son aceptables hasta el 20 %. Este LOD obtenido es más alto que los límites de detección publicados para otros inmunoensayos y kits comerciales disponibles para detectar pistacho usando anticuerpos policlonales o monoclonales. Por ejemplo, los kits de ELISA de pistacho MonoTrace de BioFront Technologies y AgraQuant ELISA de Romer Labs presentan un LOD de 0,12- 0,13 mg Kg−1 en varias matrices alimentarias, mientras que los dispositivos de flujo lateral tienen un LOD 10 veces superior (Costa et al., 2019; Liu et al., 2015). La matriz alimentaria puede tener un efecto considerable en la detección del alérgeno mediante ELISA, ya que numerosos factores pueden afectar a los resultados. Entre ellos se encuentra la dificultad de extraer y recuperar las proteínas alergénicas de forma cuantitativa de esas matrices V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 188 alimentarias. Las condiciones de pH, fuerza iónica, etc., pueden disminuir la solubilidad de las proteínas, causar modificaciones químicas y agregados de proteínas (Lim, 2010; Taylor et al., 2009). Por tanto, es necesario validar el método analítico para distintas matrices alimentarias porque, en definitiva, la capacidad de un método ELISA para detectar proteínas de alérgenos alimentarios en una muestra se ve afectada por la eficiencia con la que estas proteínas se extraen de la muestra, así como por la eficiencia con la que el anticuerpo detecta estas proteínas en el extracto de la muestra. El rendimiento global de un método basado en ELISA para la detección de alérgenos alimentarios es una función de estos dos parámetros (Abbott et al., 2010). Una vez calculado el LOD, se calculó la reactividad cruzada del ensayo como la cantidad estimada de pistacho que se obtiene al interpolar los valores de absorbancia de las especies heterólogas en la ecuación logística obtenida. De las 67 especies vegetales y animales analizadas, solo el huevo desarrolló una absorbancia mayor que el LOD de las proteínas de pistacho. Un estudio más exhaustivo de esta reacción cruzada demostró que solo aparecía en la yema de huevo (4,30 %) mientras que la clara de huevo presentaba niveles de absorbancia muy similares al blanco. Aunque este hecho podría suponer la aparición de falsos positivos en el análisis de muestras comerciales que contengan yema de huevo, es muy frecuente que los productos que declaran huevo en su etiquetado normalmente contengan solo clara de huevo, que además es la fracción del huevo dónde se concentran la mayoría de sus alérgenos (Benedé et al., 2015). Por otra parte, la técnica de ELISA indirecto con el fago-anticuerpo PVF4 es específico de pistacho y no reconoce al anacardo como sí lo hacen otros inmunoensayos publicados, que presentan una reacción cruzada entre el 12 % e incluso hasta el 90 % (Cho et al., 2015; Costa et al., 2019). A pesar de la mayor especificidad del ELISA con PVF4-dAb, su sensibilidad es inferior a la de otros métodos de ELISA publicados que usan tanto anticuerpos monoclonales como policlonales para la detección de pistacho con una sensibilidad en torno a 1 mg Kg−1 (Costa et al., 2019; de la Cruz et al., 2017; Lim, 2010; Liu et al., 2015). Las técnicas disponibles para la detección de ADN de pistacho también tienen mayor sensibilidad. La técnica de PCR en tiempo real con sondas de ADN bloqueado (LNA probe-real time PCR) alcanza una sensibilidad de 10 mg Kg−1 (Sanchiz et al., 2017), la de FAST real time PCR alcanza una sensibilidad de 40 mg Kg−1 (Torricelli et al., 2020), un ensayo combinado de PCR decaplex junto con electroforesis capilar tiene un LOD de 50 mg Kg−1 (Cheng et al., 2016) y la sensibilidad de la técnica de PCR en tiempo real desarrollada en nuestro laboratorio para V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 189 pistacho es de 0,1 mg Kg−1 (López-Calleja et al., 2014). A diferencia de las técnicas inmunológicas, la PCR no detecta proteínas alergénicas en los alimentos, sino el ADN, por lo que se considera una técnica indirecta de detección de alérgenos. Esto puede suponer un inconveniente para utilizar la técnica de PCR con el fin de controlar la eliminación de las proteínas alergénicas en las instalaciones de elaboración de alimentos. La aplicabilidad del ELISA indirecto desarrollado para determinar la presencia o ausencia de pistacho con el fago-dAb PVF4, se evaluó mediante el análisis de 77 productos comerciales adquiridos en tiendas de Madrid, incluyendo productos de panadería y pastelería, barritas energéticas, chocolates, helados, yogures, bebidas, salsas y platos preparados. Las muestras se clasificaron atendiendo al etiquetado en 4 grupos según su contenido en pistacho y otros frutos secos (Tabla IV.3.3). Entre las muestras analizadas, 34 se incluyeron en el grupo de “pistacho declarado como ingrediente”, 5 tenían etiquetado precautorio indicando “trazas de pistacho", 29 declaraban otros frutos de cáscara como ingredientes o como trazas, y las 9 restantes no declaraban contener frutos de cáscara ni trazas de ellos. A fin de confirmar los resultados obtenidos en el ELISA indirecto, las muestras también fueron analizadas mediante la técnica de PCR en tiempo real específica para pistacho que se había desarrollado previamente en nuestro laboratorio (López-Calleja et al., 2014). De las 34 muestras que declaraban contener pistacho como ingrediente, sólo un chocolate resultó negativo por la técnica de PCR en tiempo real (97 %). Por el contrario, sólo 20 muestras resultaron positivas mediante el ELISA indirecto con PVF4-dAb (58,8 %). Los resultados negativos del ELISA podrían deberse a que el contenido de pistacho se encuentre por debajo del LOD de la técnica, como en el caso de las galletas, chocolate y pastel, cuyo contenido en pistacho no está especificado en el etiquetado. También los resultados negativos pueden deberse a la influencia del tratamiento térmico de estos alimentos, puesto que la temperatura de procesado puede haber producido el despliegue de la estructura terciaria de las proteínas y la agregación de las cadenas proteicas, o que una matriz alimentaria compleja afecte al reconocimiento del epítopo por parte del anticuerpo, lo que a menudo conduce a resultados de falsos negativos o falsos positivos. En este caso pueden encontrarse las muestras de embutido, paté, helado y snack, que a pesar de presentar en el etiquetado el porcentaje de pistacho y ser detectado por PCR en tiempo real, resultaron negativas por ELISA. Otra posibilidad para dar respuesta a un falso negativo sería la sustitución fraudulenta del pistacho por otro producto menos costoso. El alto precio del pistacho ha suscitado preocupaciones sobre la autenticidad de algunos V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 190 productos relacionados con el pistacho en la industria de la confitería. Comúnmente se adultera añadiendo un guisante verde, debido a la similitud del color de su núcleo, que va del amarillo claro al verde intenso (Eksi-Kocak et al., 2016). Pero este hecho no es muy frecuente, ya que normalmente su presencia en productos elaborados se debe a una contaminación accidental en la industria alimentaria, lo que representa un importante riesgo para la salud de las personas alérgicas (Sanchiz et al., 2017). Entre los 5 productos que incluían un etiquetado de advertencia sobre posibles trazas de pistacho, 1 dio positivo solo por PCR (un embutido) (20 %), y 2 muestras dieron positivo por ambos métodos (una pasta rellena y una salchicha) (40 %). Hay que tener en cuenta que sólo 2 muestras resultaron negativas (40 %) por lo que no presentaban trazas y podrían ser consumidas por pacientes alérgicos. Es esencial un etiquetado adecuado de aquellos productos comerciales que puedan contener alérgenos para ayudar a las personas alérgicas a identificar fácilmente los alimentos que deben evitar, ya que pueden suponer un grave riesgo para su salud. Un uso exhaustivo de estas técnicas de detección puede conducir a un menor uso del etiquetado precautorio, evitando así restricciones dietéticas innecesarias para las personas alérgicas al pistacho que pueden afectar negativamente a su nutrición, salud y calidad de vida. Asimismo, el uso de técnicas de detección en las industrias alimentarias ayudará a cumplir de forma más eficiente con las directrices de etiquetado establecidas en el Reglamento (UE) 1169/2011 (Allen y Taylor, 2018; DunnGalvin et al., 2015; European Union, 2011; Lim, 2010). En el grupo de 29 muestras etiquetadas con contenido de otros frutos de cáscara distintos del pistacho o sus trazas, todas las muestras fueron negativas por los métodos ELISA con fago-dAb y PCR en tiempo real, verificando la ausencia de pistacho en estos productos. Cabe señalar que las 10 muestras que declaraban anacardos en la lista de ingredientes, todas resultaron negativas tanto por el método ELISA como con el método PCR para la detección de pistachos, por lo que se vuelve a demostrar la ausencia de reacción cruzada con el anacardo en las técnicas desarrolladas en este trabajo. Además, esas muestras dieron positivo en el método de PCR en tiempo real específico para el anacardo, también desarrollado en nuestro grupo (López-Calleja, de la Cruz, González, et al., 2015a). En el último grupo de 9 productos sin frutos de cáscara declarados, todas las muestras dieron negativo para el pistacho. La aplicación de estos anticuerpos puede resultar útil para la detección de alérgenos de una forma rápida y específica, protegiendo la salud de los consumidores alérgicos al pistacho. Además, si se implementara la técnica ELISA en todas las industrias alimentarias, V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 191 facilitaría el cumplimiento de las normas de etiquetado de alérgenos, evitando alimentos con reacciones cruzadas, etiquetados incorrectos o un etiquetado precautorio abusivo. Para finalizar, se debe mejorar la sensibilidad y la facilidad de producción de estos anticuerpos para su empleo en matrices complejas como chocolates, galletas o yogures. Es necesario conocer las características de la interacción entre los alérgenos y los anticuerpos recombinantes obtenidos. Mediante la modificación de las CDRs de los anticuerpos seleccionados por mutagénesis sería posible mejorar la afinidad de los anticuerpos con el antígeno. Se trata de llegar a niveles de detección similares a otras técnicas inmunológicas (1 mg Kg−1) para garantizar la trazabilidad y etiquetado correcto de alérgenos. Además, cabe destacar, que es posible añadir in vitro a los anticuerpos otras moléculas que mejoren su sensibilidad. La posterior modificación funcional añadiendo una molécula fluorescente o una biotina al anticuerpo podrían emplearse en diferentes plataformas analíticas como los dispositivos de flujo lateral o arrays. Estos puntos se llevaron a cabo en el siguiente apartado. V.2.6. Producción de dAb biotinilados in vivo, específicos frente a las proteínas de pistacho en la levadura metilotrófica Pichia pastoris Como se describe en el capítulo IV.4, antes de conocer el problema de la presencia del codón Ámbar en la secuencia del clon PVF4, se llevó a cabo la producción de dAb biotinilados mediante la transformación en Pichia pastoris. En la Figura IV.4.1 se muestran los resultados de las amplificaciones de PCR con diferentes parejas de cebadores que amplifican el dAb o la secuencia de BirA de los clones obtenidos tras las transformaciones (pRAS002 y pRAS002.BirA). En ambos casos, se obtuvieron bandas del tamaño adecuado. Sin embargo, después de realizar varios ensayos de dot blot, Western blot, ELISA y purificación por columna de afinidad de proteína A y no obtener ningún resultado, se determinó que, en la transformación, el ADN del dAb se insertó en el genoma de Pichia pastoris, pero al estar presente el codón Ámbar TAG y este organismo ser incapaz de suprimirlo, éste se tradujo como señal de parada. En consecuencia, era necesario eliminar ese codón Ámbar antes de inducir la producción soluble del dAb en Pichia pastoris. Así, se llegó a la conclusión que era necesaria la realización de mutagénesis dirigida cambiando el codón TAG a CAG (Gln) (Figura IV.4.2) mediante unos cebadores específicos en el plásmido pRAS002. Después de la transformación en células XL1 Blue, se obtuvieron 10 clones y todos ellos presentaban el nucleótido cambiado. Se obtuvo una eficiencia de esos cebadores del 100 %. La secuencia mutada se introdujo en pPICZα y en células HB2151 electrocompetentes donde se obtuvieron 16 colonias. En la figura IV.4.3 se confirmó la V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 192 presencia de la secuencia mutada de PVF4 para continuar con el proceso de transformación en Pichia pastoris con el vector pRAS002m (PVF4m5) que contiene el dominio aceptor de biotina (BAD). De las 10 colonias que se obtuvieron de la transformación, solo 6 presentaron el tamaño adecuado para la secuencia del dAb, por lo que la eficiencia de la transformación fue del 60 % (Figura IV.4.4). Tras el análisis por dot blot de los sobrenadantes de cultivo de diferentes clones mutados (PVF4m5) y antes de la cotransformación en Pichia pastoris con el vector que contiene la enzima BirA (Figura IV.4.5), se observó que la temperatura puede influir en el rendimiento de la proteína recombinante, mejorando la producción a través de la inducción con metanol en las temperaturas de 20 y 25 °C. Este hecho también se observa en la Figura IV.4.6 donde se observa un mayor número de bandas a la temperatura de 20 y 25 °C. A 27 °C las bandas eran más claras en el clon 3, y en el clon 8 aparecía un patrón diferente. Tanto las tres bandas del clon 3 como la banda anómala del clon 8 fueron analizados por MALDI- TOF/TOF, lo que nos aseguró la presencia de péptidos de inmunoglobulinas, a pesar de tratarse de péptidos inducidos a la temperatura de 27 °C. La influencia de la temperatura en la inducción también se observó en la Figura IV.4.7, donde el ELISA indirecto con los sobrenadantes del PVF4m5 presenta mayor inespecificidad a temperaturas bajas. Sin embargo, a 25 °C, las reacciones cruzadas son casi inexistentes. Esta influencia de la temperatura en la inducción de Pichia pastoris en todas las metodologías realizadas puede ser debida a la escasa estabilidad de la proteína recombinante producida a temperaturas más altas, a la liberación de más proteasas de las células muertas y a los problemas de plegamiento a temperaturas más altas (Hong et al., 2002). Li et al (2001) han demostrado que la reducción de la temperatura del proceso de inducción de 30 a 23 °C aumentó el rendimiento de las proteínas con un incremento del 29 % en la producción de proteínas recombinantes. Es posible que la adición de inhibidores de la proteasa específicos al medio de cultivo pueda mejorar la producción. Se identificaron 3 tipos de proteasas presentes en el medio de cultivo de Pichia pastoris que expresan scFv: aspárticas, cisteínas y serinas. Cuando se añadió un inhibidor de la serina al medio de cultivo se redujo la actividad de la proteasa un 53 %, y un 30 % con un inhibidor de la proteasa aspártica (Shi et al., 2003). Dado que el clon 1 presentó mayor reconocimiento por el pistacho en el ELISA indirecto (Figura IV.4.7) y mayor producción en el análisis de dot blot (Figura IV.4.5), éste fue el utilizado para la cotransformación con el plásmido pMJA180 que contiene la secuencia de la enzima biotín ligasa para biotilinar y multimerizar los dAbs. De esa cotransformación, se obtuvieron multitud de clones pero sólo 10 fueron seleccionados. Todos se analizaron por V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 193 PCR y posterior electroforesis (Figura IV.4.8) y mostraron amplificaciones del tamaño deseado. Por lo tanto, la eficiencia de la cotransformación resultó en un 100 %. Para la selección de los mejores clones, se realizó un dot blot de los sobrenadantes de todos los clones obtenidos tras la cotransformación, inducidos y sin inducir. En la Figura IV.4.9 se muestran las grandes diferencias observadas entre los clones inducidos y sin inducir, así como las diferencias entre clones, ya que los clones 9 y 10 parece que han perdido el epítopo de la cola de histidinas al no observarse luminiscencia, pero sí han producido anticuerpo, porque son reconocidos por el anti-c-Myc. De todos ellos, se seleccionó el clon 5 y pasó a denominarse PVF4m5.BirA. A partir de ese momento se procedió a la inducción en un mayor volumen (500 mL) de medio de cultivo donde los dAb biotinilados se excretaban. El medio de cultivo (125 mL) se purificó a través de columna Ni- NTA con gradiente de imidazol, donde el pico se obtuvo a una concentración de 78 % de imidazol. A su vez, se determinó que la producción de Pichia pastoris fue realmente buena, obteniendo 21 mg de proteína (dAb) de los 125 mL, por lo que la mutagénesis podría también influir en la producción al no tener el impedimento del codón de parada. En el Western blot (Figura IV.4.11) el anticuerpo anti-c-Myc-AP fue capaz de reconocer a las bandas más prominentes, al igual que el sobrenadante sin purificar. Ni en el desecho de la purificación (aquello que no se une a la columna) ni en el sobrenadante del clon PVF4m5.BirA sin inducir, se encontró ninguna banda reconocida por el anti-c-Myc-AP. En consecuencia, el sistema empleado para la producción de proteína exógena en Pichia pastoris es eficiente y limpio. El reconocimiento del dAb a lo largo de todo el carril de electroforesis podría estar indicando diferentes formas de este mismo anticuerpo presentes en el medio. Es posible que esté formando dímeros y por eso aparezca de un mayor tamaño, o que se esté degradando por la presencia de proteasas en el medio de cultivo. También, la presencia de glicosilaciones en el dAb puede cambiar su estructura conformacional y por lo tanto su tamaño. En el immunoblot (Figura IV.4.11B) se comprobó la producción de una gran cantidad de anticuerpo con distintos tamaños. Es posible que, a pesar de emplear el medio BMMY y conseguir mejorar la producción a 25 °C, no se esté eliminando la presencia de proteasas, aunque este medio es específico para disminuir su presencia. La adición de inhibidores de la proteasa específicos al medio de cultivo podría mejorar la producción y la integridad del anticuerpo (Shi et al., 2003). V. DISCUSIÓN INTEGRADORA 194 La mayor ventaja de Pichia pastoris para expresar proteínas heterólogas como proteínas secretadas, es que secreta niveles muy bajos de proteínas nativas. Dado que en el medio mínimo de Pichia pastoris hay una cantidad muy baja de proteínas, la secreción de la proteína de interés comprende la gran mayoría de la proteína total del medio y sirve como un primer paso en la purificación de la proteína (Sreekrishna et al., 1997). Sin embargo, las modificaciones postraduccionales (PTM) se producen en la gran mayoría de las proteínas y son esenciales para la función. La glicosilación es un tipo de PTM, y está implicada en el plegamiento, transporte y función de las proteínas (Hamby y Hirst, 2008). Es frecuente que Pichia pastoris introduzca esas modificaciones postraduccionales y si hay sitios de glicosilación reconocidos (Asn-X-Ser/Thr) en la secuencia de la proteína de interés, la glicosilación puede ocurrir en estos sitios. Diversos estudios han puesto de manifiesto efectos positivos y negativos de la glicosilación en la afinidad de los anticuerpos por los antígenos. Suelen estar presentes en alrededor del 15 % de los dominios variables. Por este motivo, se emplearon 2 programas informáticos, N- GlyDE (Pitti et al., 2019) y NetNGlyc 1.0 Server, para evaluar la presencia de posibles sitios de glicosilación en el dAb PVF4. Mediante el análisis informático, se predijeron 2 sitios de glicosilación posibles, uno en el aminoácido 146 situado en CDR2 y otro en el 190 en CDR3. Ambos se encuentran en regiones importantes de reconocimiento y plegamiento de la proteína. La estructura del carbohidrato adherido a esa región puede afectar a la actividad de los anticuerpos (Wright y Morrison, 1997) impidiendo su reconocimiento o unión al antígeno. Además, la introducción de glicanos en CDR3 de la cadena pesada podría ser más perjudicial para la unión de antígenos en comparación con los otros bucles, debido a las limitaciones estéricas (Van De Bovenkamp et al., 2018). Por tanto, es necesario seguir trabajando en esta línea de investigación para mejorar los anticuerpos ya obtenidos, o modificarlos para que presenten mayor afinidad por el antígeno en la técnica de ELISA directo. Capítulo VI CONCLUSIONES/CONCLUSIONS VI. CONCLUSIONES 197 Primera. Se han aislado por primera vez sondas de afinidad de tipo scFv específicas frente a la nuez (Juglans regia), a partir de genotecas no inmunes de fago-anticuerpos recombinantes. El fago-anticuerpo JR35 se ha empleado con éxito para la detección específica de nuez en alimentos mediante una técnica inmunoenzimática de ELISA indirecto, con un LOD de 6378 mg Kg−1. Segunda. Se ha conseguido producir el scFv específico frente a nuez en forma soluble y biotinilado in vivo (JrBSF) en el organismo eucariota metilotrófico Pichia pastoris, mediante cotransformación con dos vectores de expresión. La multimerización del scFv JrBSF sobre un núcleo de ExtrAvidina-HRP, permitió desarrollar un ELISA directo que mejoró la capacidad de reconocer a la nuez, disminuyendo el LOD a 1616 mg Kg−1. La aplicabilidad de este anticuerpo se ha demostrado mediante el análisis de numerosos alimentos comerciales. Tercera. Se han aislado por primera vez sondas de afinidad específicas frente al pistacho (Pistacia vera) a partir de genotecas no inmunes de fago-anticuerpos recombinantes de tipo dAb. El fago-anticuerpo PVF4 se ha empleado con éxito para desarrollar una técnica de ELISA indirecto para la detección de pistacho con un LOD de 3983 mg Kg−1, que no presentó reacción cruzada con el anacardo, pese a su proximidad filogenética con el pistacho. La aplicabilidad del fago-anticuerpo PVF4 en la técnica de ELISA indirecto se evaluó mediante el análisis de productos comerciales. Cuarta. Mediante técnicas electroforéticas, cromatográficas, espectroscópicas y de ultracentrifugación, se ha determinado que los anticuerpos recombinantes scFv JrBSF y dAb PVF4 reconocen epítopos en la globulina 11S de la nuez y el pistacho, alérgenos Jug r 4 y Pis v 2 respectivamente, reconociendo en ambos casos la subunidad básica del alérgeno. VI. CONCLUSIONS 199 First. Walnut-specific (Juglans regia) scFv affinity probes have been isolated for the first time from non-immune recombinant phage display antibody libraries. The phage-antibody JR35 has been successfully used for the specific detection of walnut in food by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique with a LOD of 6378 mg Kg−1. Second. The production of Juglans regia Biotinylated Soluble scFv Fragments specific (JrBSF) for walnut, has been achieved in vivo in the methylotrophic eukaryotic organism Pichia pastoris after cotransformation with two expression vectors. The multimerisation of the JrBSF scFv on an ExtrAvidin-HRP core allowed the development of a direct ELISA that improved the ability to recognise walnut, decreasing the LOD to 1616 mg Kg−1. The applicability of this antibody has been demonstrated by analysis of numerous commercial foods. Third. Pistachio-specific (Pistacia vera) dAb affinity probes have been isolated for the first time from non-immune recombinant phage display antibody libraries. The phage- antibody PVF4 has been successfully used to develop an indirect ELISA method for the detection of pistachio with a LOD of 3983 mg Kg−1, which did not cross-react with cashew, despite its phylogenetic proximity to pistachio. The applicability of the phage-antibody PVF4 in the indirect ELISA technique was evaluated by analysis of commercial products. Fourth. Using electrophoretic, chromatographic, spectroscopic and ultracentrifugation techniques, it has been determined that the recombinant antibodies scFv JrBSF and dAb PVF4 recognise epitopes in the 11S globulin of walnut and pistachio, allergens Jug r 4 and Pis v 2 respectively, recognising in both cases the basic subunit of the allergen. Capítulo VII TRABAJO FUTURO VII. TRABAJO FUTURO 203 Como resultado del desarrollo de esta Tesis Doctoral es importante ampliar el número de alérgenos detectados, así como mejorar la sensibilidad y facilidad de uso de los anticuerpos recombinantes para su empleo en el análisis de matrices complejas. Para conseguir estos objetivos es muy importante la disponibilidad de repertorios de anticuerpos recombinantes de alta calidad a partir de los cuales buscar sondas específicas frente las dianas de interés mediante la tecnología de presentación en fagos. Los repertorios de que disponemos ya han sido amplificados para obtener anticuerpos recombinantes contra diferentes alérgenos, y nuevas reamplificaciones darían lugar a la degeneración del repertorio y a la pérdida de su diversidad, por lo que la probabilidad de éxito en el proceso de cribado sería remota. Por estas razones, se plantea abordar la generación de anticuerpos recombinantes mediante la construcción de repertorios de fagos recombinantes que puedan ser aplicados para el aislamiento de sondas específicas frente a otros alérgenos de interés. Los anticuerpos policlonales de conejos han sido ampliamente utilizados para el desarrollo de técnicas inmunológicas, puesto que el conejo representa una fuente excepcional de anticuerpos de alta afinidad y especificidad. Los conejos, además de utilizar la hipermutación somática para diversificar sus genes IgH, como ocurre en humanos y ratones, utilizan un mecanismo similar a la conversión somática de genes, que implica la recombinación homóloga entre los segmentos del gen VH y los genes VDJ reordenados (Peng et al., 2017; Winstead et al., 1999). Teniendo en cuenta estos factores, se propone la generación de un repertorio de scFvs no inmune a partir de material genético de conejo, utilizando como fuente los órganos linfoides de conejos no inmunizados. Para ello, se obtendrá médula ósea y bazo de animales sacrificados para consumo humano en un matadero de conejos. De este modo, a partir de un número reducido de animales, se obtendrá el material genético necesario para generar un repertorio de anticuerpos recombinantes que permita la selección de anticuerpos recombinantes frente a multitud de dianas diferentes. En la actualidad, la tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS) se aplica cada vez más en diferentes campos, como la inmunología básica y aplicada. Esto incluye la secuenciación de los repertorios emparejados de cadenas pesadas y ligeras humanas, tanto de células B naïve como específicas de antígeno, así como de repertorios de anticuerpos o de receptores de células T. En este sentido, se utilizará la tecnología NGS para estudiar los nuevos repertorios obtenidos y evaluar su enriquecimiento en anticuerpos recombinantes específicos. VII. TRABAJO FUTURO 204 Las plataformas NGS que requieren la amplificación por PCR están inevitablemente influidas por la tasa de error innata de las polimerasas. En consecuencia, se propone el uso del dispositivo de secuenciación MinION (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, Reino Unido) que hace uso de la tecnología de secuenciación Nanopore (nanoporos embebidos en membrana) para secuenciar los repertorios generados, ya que no requiere amplificación por PCR y proporciona las mayores longitudes de lectura logradas hasta la fecha (Rouet et al., 2018). Para la preparación del repertorio de secuenciación se utilizará el kit rápido de código de barras. Este kit incluye identificadores moleculares únicos (IMU), que son un tipo de código de barras molecular que permite corregir errores y aumentar la precisión durante la secuenciación. Las subpoblaciones de fagos recuperadas tras las rondas de selección se analizarán en un único experimento de secuenciación etiquetando cada muestra con un IMU que permite su estudio individualizado. Esta aproximación se empleará para validar los repertorios de fagos construidos, determinar con precisión el tamaño de los repertorios generados y evaluar su diversidad clonal. Además, se utilizarán diferentes herramientas bioinformáticas para llevar a cabo la modelización de los anticuerpos recombinantes obtenidos y evaluar los posibles residuos de aminoácidos implicados en la unión antígeno-anticuerpo. Para ello, se emplearán herramientas que realizan la predicción de parátopos (Antibody i-Patch), la predicción de epítopos (EpiPred) o la orientación VH-VL (ABangle), entre otras. Para identificar el sitio más probable de unión del antígeno, se han diseñado programas como AutoDock4 y PepSite2, siendo este último ampliamente utilizado para predecir la unión de péptidos a la superficie de las proteínas. La herramienta más novedosa y actual que podemos emplear para la predicción de la estructura de los anticuerpos es AlphaFold, que es un sistema de inteligencia artificial desarrollado por DeepMind que predice la estructura 3D de una proteína a partir de su secuencia de aminoácidos. También existe la posibilidad del uso de métodos de biopanning informáticos como el banco de datos de biopanning (BDB), sin necesidad de llevar a cabo el proceso de selección por afinidad. El BDB almacena datos de fago-anticuerpos secuenciados por tecnologías convencionales (Sanger) y de NGS (He et al., 2018). Estas tecnologías informáticas pueden suponer recursos importantes para obtener resultados acerca de posibles interacciones entre antígenos y anticuerpos sin necesidad de realizar el biopanning en el laboratorio. Capítulo VIII BIBLIOGRAFÍA VIII. BIBLIOGRAFÍA 207 A Aas, K. (1978). What makes an allergen an allergen. 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OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 232 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 233 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 234 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 235 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 236 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 237 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 238 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 239 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 240 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 241 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 242 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 243 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 244 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 245 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 246 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 247 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 248 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 249 ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL 250 Tesis Raquel Madrid García PORTADA PRESENTACIÓN DE LA TESIS DOCTORAL ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS ABREVIATURAS RESUMEN SUMMARY CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN CAPÍTULO II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS CAPÍTULO III. PLAN DE TRABAJO Y METODOLOGÍA RESUMIDA CAPÍTULO IV. RESULTADOS CAPÍTULO V. DISCUSIÓN INTEGRADORA CAPÍTULO VI. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS CAPÍTULO VII. TRABAJO FUTURO CAPÍTULO VIII. BIBLIOGRAFÍA ANEXO I. OTRAS PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL