UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Identificación de nuevos polimorfismos en genes del sistema inmune y del metabolismo de fármacos para anticipar complicaciones en pacientes sometidos a un trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Paula Muñiz Sevilla DIRECTORES Ismael Buño Borde Carolina Martínez Laperche Madrid © Paula Muñiz Sevilla, 2022 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Identificación de nuevos polimorfismos en genes del sistema inmune y del metabolismo de fármacos para anticipar complicaciones en pacientes sometidos a un trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA EN INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA PRESENTADA POR Paula Muñiz Sevilla DIRECTORES Ismael Buño Borde Carolina Martínez Laperche Madrid, 2022 © Paula Muñiz Sevilla, 2022 El presente trabajo titulado Identificación de nuevos polimorfismos en genes del sistema inmune y del metabolismo de fármacos para anticipar complicaciones en pacientes sometidos a un trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos ha sido realizado por Doña Paula Muñiz Sevilla en el Hospital General Universitario Gregorio Marañón y en el Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, bajo la dirección del Dr. Ismael Buño Borde responsable del Laboratorio de Genética Hematológica (Servicio de Hematología y Hemoterapia del Hospital General Universitario Gregorio Marañón (HGUGM), Madrid) y Director Científico del Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM) y la Dra. Carolina Martínez Laperche, responsable del Laboratorio de Genética Hematológica (Servicio de Hematología y Hemoterapia, HGUGM, Madrid). Opta al título de Doctor: Paula Muñiz Sevilla La recompensa de nuestro trabajo no es lo que obtenemos, sino en los que nos convertimos AGRADECIMIENTOS No soy de escribir este tipo de cosas, los que me conocen saben que soy más de demostrar. Sin embargo, la ocasión lo merece, así que lo voy a intentar hacer lo mejor posible. Sin duda nunca podré agradecer lo suficiente a todas las personas que me han acompañado en esta etapa, y es que ¡Por fin estamos aquí!. ¿Cómo empezar? No podría ser de otra manera que, agradeciendo a mis directores, Carol e Isma, quienes me dieron la oportunidad de vivir y disfrutar ese concepto de “medicina traslacional” que sin duda ha superado mis expectativas. Gracias por esa paciencia infinita y dedicación absoluta. Carolina gracias por acompañarme en este camino, me quedo con tu capacidad de llegar a todo en medio del caos. Sin ti no hubiese aprendido y crecido tanto. Ismael gracias por acogerme y por tu indudable dedicación. Mirando hacia atrás aún no me creo de lo que soy capaz de hacer con un poco de ADN. Gracias por la oportunidad que me disteis hace ya unos cuantos años, y es que entre rato y rato he hecho TFG, TFM y ahora toca lo mejor, tesis doctoral. Mis chicuelos del laboratorio de Genética Hematológica, ¡os toca!, los que me han sufrido en el día a día, pero sin duda con muchas risas y grandes momentos para recordar. Susi, por esas tardes de confidencias, eres un tesoro y qué suerte conocerte. Gracias por ser un apoyo incondicional en todo. Asun y Merche porque si está, está y así todo sale de puturrú (creo que con eso lo digo todo). Gracias por tener siempre un abrazo para mí. Alfonso, Loli y Jose, gracias por tener una palabra cariñosa en todo momento y ayudarme siempre. A María por hacerme ver las cosas con un poco de calma y a Diego por aceptar tal desafío conmigo. Gracias a todos por lo que me habéis enseñado, no solo de genética. No puedo olvidarme de mi Lauri, que fue corto, pero intenso, pronto me tienes en Australia. Fuiste un descubrimiento muy bonito. Isma y Sara gracias por esas charlas de linfocitos B, modelos, saltos de página, tagmentación, etc. No hay un día aburrido con vosotros. Miren, por nuestro mano a mano con los polimorfismos, sin esos momentos esta tesis no sería lo mismo. No puedo olvidar a las chicas de genómica. A Julia por ser un apoyo en todo y en todo momento. A Ainhoa por esas charlas mañaneras abriendo el hospital. Por supuesto a Cris, “polluela”, amiga eres de lo mejor que me llevo después de estos años. Gracias por tu apoyo incondicional y por esas miles de anécdotas juntas. Indudablemente no pueden faltar mis amigos, mi segunda familia. Qué bonito compartir esto con vosotros. Gracias por hacer fácil lo difícil. Aunque he sido muy intensa, fiel a mí misma, ya estamos aquí. Sois una mezcla de paciencia, comprensión y cariño. Ellos, Andrea y Alex, compañeros de carrera y mil batallas más. Andrea, qué suerte tenerte en mi vida. No hay mejor equipo que el nuestro. Eres uno de mis tesoros. Alex, gracias por esas risas que siempre vienen bien. De este trabajo la portada es toda tuya. Después de esto toca mil y una rutas pendientes. Alex ya puedes darte prisa, que Islandia nos espera. Javi y Cristian por ser la familia que se elige. Pocos me conocen como vosotros y lo mejor es que después de 10 años, posiblemente alguno más, aquí seguimos. Gracias por cuidarme siempre como si fuera una hermana. Virginia, quien me iba a decir que ser monitora me iba a dar una amiga incondicional. Gracias por siempre tener un ratito para mí. Y para terminar, sin duda no estaría aquí sin mi familia. Mi hermana, porque sin ella no sería quien soy y no habría logrado llegar hasta donde estoy. Gracias por ser mi ancla a tierra y no soltarme nunca. Papá y mamá por su apoyo incondicional. Gracias por haberme impulsado y ayudado a crecer sin dejar de creer en mí. Gracias por no dejar que me rinda. Chus, por empujarme a seguir superándome. Moli, Antonio y Toño, porque con un café se arregla todo. A mis abuelos, a los que estáis aquí y a los que están un poco más lejos, espero que estéis orgullosos. Siempre habéis creído en mí y en que conseguiría todo lo que me propusiera. Sin duda esta etapa ha sido una continua montaña rusa en todos los sentidos, pero llegar aquí ha merecido la pena y me quedo con todo lo que he aprendido, momentos vividos, y personas que seguiré teniendo a mi lado. Repito, no tengo palabras para agradeceros por haberme acompañado en esta etapa. Gracias a todos por creer siempre en mí y compartir conmigo esta aventura. Me habéis enseñado que si te lo propones todo es posible. Índice ÍNDICE RESUMEN ___________________________________________________________________ 3 SUMMARY __________________________________________________________________ 9 ABREVIATURAS _____________________________________________________________ 13 1. INTRODUCCIÓN _________________________________________________________ 17 1.1. Sistema hematopoyético ________________________________________________ 17 1.1.1. Hemopatías. Enfermedades de la sangre ________________________________ 17 1.2. Trasplante hematopoyético _____________________________________________ 19 1.2.1. Características del trasplante hematopoyético alogénico ___________________ 21 1.2.2. Sistema HLA ______________________________________________________ 22 1.2.3. Tipos de trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos ____________ 24 1.2.4. Complicaciones post-trasplante _______________________________________ 25 1.2.4.1. Enfermedad de injerto contra receptor (EICR) ____________________________ 27 1.2.4.1.1. Enfermedad de injerto contra receptor aguda (EICRa) ________________ 27 1.2.4.1.2. Enfermedad de injerto contra receptor crónica (EICRc) _______________ 29 1.2.4.2. Complicaciones post-trasplante asociadas a la toxicidad del régimen de acondicionamiento ____________________________________________________________ 31 1.2.4.3. Otras complicaciones post-trasplante: MRT y recaída ______________________ 32 1.3. Biomarcadores ________________________________________________________ 33 1.3.1. Biomarcadores genómicos (polimorfismos) _____________________________ 34 1.3.1.1. Biomarcadores genómicos no HLA. Genes de citocinas y del metabolismo de fármacos _____________________________________________________________________ 36 1.3.1.1.1. Genes de citocinas ____________________________________________ 36 1.3.1.1.2. Genes del metabolismo de fármacos: ciclofosfamida _________________ 38 1.4. Modelos predictivos del desarrollo de complicaciones ________________________ 41 2. HIPÓTESIS ______________________________________________________________ 45 3. OBJETIVOS _____________________________________________________________ 49 4. PACIENTES Y MÉTODOS ___________________________________________________ 53 4.1. Bloque 1. Polimorfismos en genes de citocinas asociados a complicaciones post- trasplante __________________________________________________________________ 53 4.1.1. Pacientes _________________________________________________________ 53 4.1.2. Métodos _________________________________________________________ 54 4.1.2.1. Diseño panel de secuenciación masiva ___________________________________ 54 4.1.2.2. Análisis de las variables genéticas. Anotación y filtrado de variantes _________ 56 4.1.2.3. Análisis estadístico ____________________________________________________ 57 4.1.2.4. Análisis funcional de los genes incluidos en los modelos seleccionados ______ 59 4.2. Bloque 2. Polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida asociados a complicaciones post-trasplante ________________________________________________ 60 4.2.1. Pacientes _________________________________________________________ 60 4.2.2. Métodos _________________________________________________________ 61 4.2.2.1. Diseño panel de secuenciación masiva ___________________________________ 61 4.2.2.2. Análisis de las variables genéticas. Anotación y filtrado de variantes _________ 62 4.2.2.3. Detección de polimorfismos de ALDH en donantes ________________________ 63 4.2.2.4. Análisis estadístico ____________________________________________________ 63 5. RESULTADOS ___________________________________________________________ 67 5.1. Bloque 1. Polimorfismos en genes de citocinas asociados a complicaciones post- trasplante __________________________________________________________________ 67 5.1.1. Estudio de variables genéticas mediante un panel de NGS __________________ 67 5.1.1.1. Características de calidad del panel de NGS ______________________________ 67 5.1.1.2. Resultados del panel de NGS ___________________________________________ 68 5.1.2. Asociación de polimorfismos en genes de citocinas y variables clínicas con complicaciones post-trasplante _______________________________________________ 69 5.1.3. Modelos predictivos genético/clínicos seleccionados para cada complicación post- trasplante _____________________________________________________________ 70 5.1.3.1. EICRa II-IV ____________________________________________________________ 70 5.1.3.2. EICRa III-IV ___________________________________________________________ 72 5.1.3.3. EICRc ________________________________________________________________ 73 5.1.3.4. EICRc moderada-severa ________________________________________________ 74 5.1.3.5. Mortalidad relacionada con el trasplante ________________________________ 75 5.1.3.6. Recaída ______________________________________________________________ 77 5.1.3.7. Supervivencia global __________________________________________________ 78 5.1.4. Relaciones funcionales de los genes incluidos en los modelos predictivos _____ 81 5.2. Bloque 2. Polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida asociados a complicaciones post-trasplante ________________________________________________ 82 5.2.1. Estudio de variables genéticas mediante panel de NGS ____________________ 83 5.2.1.1. Características de calidad del panel de genes _____________________________ 83 5.2.1.2. Resultados del panel de NGS ___________________________________________ 83 5.2.2. Asociación de polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida y variables clínicas con complicaciones post-trasplante _____________________________ 87 5.2.2.1. EICRa ________________________________________________________________ 89 5.2.2.2. EICRc ________________________________________________________________ 89 5.2.2.3. Síndrome de obstrucción sinusoidal _____________________________________ 90 5.2.2.4. Cistitis hemorrágica ___________________________________________________ 90 5.2.2.5. Mortalidad relacionada con el trasplante ________________________________ 90 6. DISCUSIÓN _____________________________________________________________ 95 6.1. Bloque 1. Polimorfismos en genes de citocinas asociados a complicaciones post- trasplante __________________________________________________________________ 96 6.2. Bloque 2. Polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida asociados a complicaciones post-trasplante _______________________________________________ 108 7. CONCLUSIONES ________________________________________________________ 117 7.1. Bloque 1. Polimorfismos en genes de citocinas asociados a complicaciones post- trasplante _________________________________________________________________ 117 7.2. Bloque 2: Polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida asociados a complicaciones post-trasplante _______________________________________________ 117 8. BIBILIOGRAFÍA _________________________________________________________ 121 9. ANEXOS ______________________________________________________________ 137 ANEXO I. Índice de figuras ____________________________________________________ 137 ANEXO II. Índice de tablas ____________________________________________________ 138 ANEXO III. Genes parálogos relacionados con los genes del metabolismo de la ciclofosfamida. _____________________________________________________________ 140 ANEXO IV. Variables genéticas obtenidas tras la aplicación de los filtros descritos en el apartado de Pacientes y Métodos para el análisis del panel de NGS allogenomics. ______ 141 ANEXO V. AUC de las 15 variables más relevantes incluidas en los modelos predictivos seleccionados para las complicaciones post-trasplante. ____________________________ 171 ANEXO VI. Relación de las características de los distintos puntos de corte para la estratificación de los pacientes para cada una de las complicaciones post-trasplante. ________________ 173 ANEXO VII. Resumen de las variables seleccionadas para cada uno de los modelos aplicados en las complicaciones post-trasplante. __________________________________________ 176 ANEXO VIII. Resultado del análisis univariante sin significación estadística entre polimorfismos de las enzimas del metabolismo de la Cy con complicaciones tras un Haplo-TPH con Cy post- TPH. ___________________________________________________________________ 177 Resumen RESUMEN 3 Identificación de nuevos polimorfismos en genes del sistema inmune y del metabolismo de fármacos para anticipar complicaciones en pacientes sometidos a un trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos El trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos (alo-TPH), procedimiento que consiste en la sustitución de un sistema hematopoyético, previamente alterado, por otro sano, es una estrategia potencialmente curativa frente a distintas neoplasias hematológicas. El éxito del alo-TPH depende del equilibrio entre el sistema inmune del donante y receptor. Su eficacia terapéutica se basa en la reacción inmunológica de las células del donante frente a las células tumorales del paciente, lo que se conoce como enfermedad de injerto contra leucemia, mediante la cual los linfocitos del donante destruyen a las células tumorales del paciente. Aunque el alo-TPH es una terapia curativa no está exenta de complicaciones post-trasplante, tales como rechazo del injerto, enfermedad de injerto contra receptor (EICR), infecciones, síndrome de obstrucción sinusoidal (SOS), cistitis hemorrágica (CH), recaída, etc. Alrededor del 35-50% de los pacientes que se someten a un alo-TPH desarrollan EICR. La EICR es la primera causa de morbilidad y mortalidad después de un alo-TPH. Los factores que se suelen usar para determinar el riesgo de EICR y otras complicaciones post-trasplante son variables: la compatibilidad HLA entre donante y receptor, la edad y género de donante y receptor, la fuente de progenitores hematopoyéticos, profilaxis de EICR, enfermedad de base, régimen de acondicionamiento, etc. Sin embargo, existen estudios que demuestran que los polimorfismos en genes del sistema inmune o del metabolismo de fármacos se pueden correlacionar con algunas complicaciones post-trasplante. En este contexto, este trabajo se ha centrado en primer lugar en identificar nuevos polimorfismos en genes de citocinas y elaborar modelos predictivos genético/clínicos que permitan anticipar el riesgo de desarrollar EICR, mortalidad relacionada con el trasplante (MRT), recaída y supervivencia global (SG) en pacientes sometidos a un alo-TPH HLA-idéntico. Como segundo objetivo, detectar nuevos polimorfismos en enzimas del metabolismo de fármacos, centrándonos en la ciclofosfamida (Cy) y su relación con el desarrollo de complicaciones post- trasplante como EICR, SOS, CH, y MRT. Para el estudio de nuevos polimorfismos se han diseñado dos paneles de secuenciación masiva (NGS). El primero con 132 genes de citocinas aplicado a 90 alo-TPH HLA-idénticos. Un segundo panel con 13 genes relacionados con las enzimas del metabolismo de la Cy incluyó 182 pacientes sometidos a un alo-TPH haploidéntico. RESUMEN 4 Mediante el panel de NGS de 132 genes de citocinas se identificaron 737 polimorfismos. Para la selección de las variables más relevantes para cada complicación post-trasplante se utilizaron modelos de regresión logística bayesiana. De esta forma se elaboraron modelos genético/clínicos para las distintas complicaciones post-trasplante en pacientes sometidos a un alo-TPH HLA-idéntico. Para cada modelo se seleccionaron variantes en determinados polimorfismos de genes de citocinas que se asociaron a una determinada complicación. El modelo seleccionado para EICRa II-IV incluyó la edad del donante y el receptor como variable clínica y cinco variables genéticas (CCL25, CXCR4, CXCL13, IL26 y IL2RA). Para EICRa III-IV se incluyeron 9 polimorfismos (IL12RB1, IL17A, IL17RA, IL21R, CCL25, CXCR2, CXCL16, IL17D y IL2RA). Para EICRc se seleccionaron 4 variables genéticas (IL2RA, IL7R, XCR1 y IL3RA) y para EICRc moderada-severa 9 polimorfismos (IL7R (dos variantes), IL17RC, CXCR6, IL10RA, IL25, IL12RB1, IL7 y IL11). En cuanto a la MRT se seleccionaron 6 variables genéticas (IL20RB (dos variantes), IL12RB1, CXCL11, IL15RA y CXCL2). En el caso de la recaída se incluyeron 7 variables genéticas (IL21R (dos variantes), CCL15 (tres variantes), CCL21, IL21R (dos variantes), CXCL11, CXCR4 y CCR10). Por último, se elaboró un modelo para la SG formado por 7 variables genéticas (CXCL11, CCL21, CCL16 (dos variantes), IL10RB, CCL25 y IL12RB1). Acorde a los puntos de corte seleccionados para cada modelo los pacientes se clasificaron en alto o bajo de riesgo de desarrollar cada complicación. Todos los modelos obtuvieron una significación estadística de p<0,0001. Mediante el panel de 13 genes relacionados con el metabolismo de la Cy se identificaron 40 polimorfismos. Para la selección de las variables más relevantes para cada complicación post- trasplante se realizó un estudio estadístico mediante riesgos competitivos. Las variables genéticas que reducen la actividad de las enzimas del metabolismo de la Cy, tanto las relacionadas con la activación como las de detoxificación, se relacionan con mayor incidencia de EICRa, EICRc, MRT y SOS. En este contexto, en el análisis multivariante, se detectó que la presencia del polimorfismo rs3211371 en CYP2B6 y el alelo nulo de GSTT1 se asociaron con riesgo de desarrollar EICRa II-IV y EICRa III-IV, respectivamente. En cuanto a la EICRc, únicamente el polimorfismo rs3745274 en CYP2A6 se relacionó con menor riesgo de EICRc. En el caso de la MRT se obtuvo correlación con mayor riesgo de desarrollar esta complicación en presencia de la variante genética en el polimorfismo rs143731390 en CYP2A6 y el haplotipo GSTA1*B. Únicamente el alelo nulo de GSTM1 se correlacionó con mayor riesgo de SOS. De manera global, el estudio de polimorfismos genómicos en donante y receptor, tanto en genes del sistema inmune como en genes relacionados con el metabolismo de fármacos, previo al alo- RESUMEN 5 TPH permite anticipar el desarrollo de distintas complicaciones y, en consecuencia, optimizar el manejo clínico de los pacientes, en el contexto de una medicina personalizada de precisión. Summary SUMMARY 9 Identification of new polymorphisms in immune system and drug metabolism genes to anticipate complications in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is a potentially curative procedure for hematological malignancies. The procedure is based on the replacement of an altered hematopoietic system by a healthy one. The success of allo-HSCT depends on the balance between the donor and recipient immune systems. The effectiveness of allo-HSCT lies in the donor immune system's capacity to remove leukemia cells via the graft-versus-leukemia effect, where donor T cells recognize and eliminate leukemic cells. Despite allo-HSCT is a curative therapy it is not exempt from developing post- transplant complications, associated with the aggressiveness of the process, such as graft rejection, graft-versus-host disease (GVHD), infections, sinusoidal obstruction syndrome (SOS), hemorrhagic cystitis (HC), disease relapse, etc. Overall 35-50% of patients who undergo allo-HSCT develop GVHD. GVHD is the major cause of morbidity and mortality after allo-HSCT. The factors that are often used to determine the risk of GVHD and other post-transplant complications are HLA compatibility between donor and recipient, age and gender of donor and recipient, source of hematopoietic progenitors, GVHD prophylaxis, diagnosis of the disease, conditioning regimen, etc. However, there are already studies showing that polymorphisms in immune system or drug metabolism genes are correlated with the development of post-transplant complications. Within this context, this work has focused on the identification of new polymorphisms in cytokine genes and the development of predictive genetic/clinical models to anticipate the risk of developing GVHD, transplant-related mortality (TRM), relapse and overall survival (OS) in patients undergoing HLA-identical allo-HSCT. Additionally, a second objective was to detect new polymorphisms in drug metabolism enzymes, mainly cyclophosphamide (Cy), and their relationship with the development of post-transplant complications such as GVHD, SOS, HC, and TRM. Two next-generation sequencing (NGS) gene panels have been designed to identify new polymorphisms with clinical relevance. The first one consisted of 132 cytokine genes and was performed in 90 HLA-identical allo-HSCT. A second panel with 13 genes related to Cy metabolism enzymes was used in 182 patients undergoing haploidentical allo-HSCT. SUMMARY 10 A total of 737 polymorphisms were identified through the 132 cytokine gene NGS panel. Bayesian logistic regression models were used to select the most relevant variables for each post-transplant complication. In this way, genetic/clinical models were developed for the different post-transplant complications in patients undergoing HLA-identical allo-HSCT. For the regression model of each post-transplant complication, variants in selected cytokine gene polymorphisms were selected. The model selected for II-IV aGVHD included donor and recipient age as clinical variable and five cytokines (CCL25, CXCR4, CXCL13, IL26 and IL2RA). For III-IV aGVHD, 9 polymorphisms were selected (IL12RB1, IL17A, IL17RA, IL21R, CCL25, CXCR2, CXCL16, IL17D and IL2RA). For cGVHD 4 genetic variables were selected (IL2RA, IL7R, XCR1 and IL3RA) and for moderate-severe cGVHD 9 polymorphisms (IL7R (two variants), IL17RC, CXCR6, IL10RA, IL25, IL12RB1, IL7 and IL11). For TRM, 6 genetic variables were selected (IL20RB (two variants), IL12RB1, CXCL11, IL15RA and CXCL2). For relapse, 7 genetic variables were included (IL21R (two variants), CCL15 (three variants), CCL21, IL21R (two variants), CXCL11, CXCR4 and CCR10). Finally, a model was developed for OS based on seven genetic variables (CXCL11, CCL21, CCL16 (two variants), IL10RB, CCL25 and IL12RB1). According to the cut-off points selected for each model, patients were classified at high or low risk of developing each complication. All models had a statistical significance of p<0.0001. The panel of 13 genes related to Cy metabolism identified 40 polymorphisms. For the identification of the most relevant variables for each post-transplantation complication, a statistical study was carried out using competitive risks. Genetic variables that decrease the activity of Cy metabolism enzymes, either those related to activation or detoxification, are related to a higher incidence of aGVHD, cGVHD, TRM and SOS. In this context, in the multivariate analysis, it was found that the presence of the rs3211371 polymorphism in CYP2B6 and the null allele of GSTT1 were associated with risk of developing II-IV aGVHD and III-IV aGVHD, respectively. For cGVHD, only the rs3745274 polymorphism in CYP2A6 was associated with lower risk of cGVHD. In the case of TRM, a correlation was obtained with a higher risk of developing this complication in the presence of the genetic variant in the rs14373731390 polymorphism in CYP2A6 and the GSTA1*B haplotype. Only the null allele of GSTM1 correlated with increased risk of SOS. Overall, genomic polymorphisms in donor and recipient, both in genes of the immune system and in drug metabolism genes, allow to anticipate the development of different complications after allo-HSCT and, consequently, to optimize the clinical management of patients, in the context of a personalized precision medicine. Abreviaturas ABREVIATURAS 13 ABREVIATURAS Ac Anticuerpo. ALDH Aldehído deshidrogenasa. Alo-TPH Trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos. AUC Área bajo la curva (del inglés area under the curve). BLR Regresión Logística Bayesiana (del inglés Bayesian Logistic Regression). CH Cistitis hemorrágica. CES Células endoteliales sinusoidales hepáticas. CPAs Células presentadoras de antígenos. Cr Cromosoma. Cy Ciclofosfamida. CYP450 Citocromo P450. DAMPs Patrones moleculares asociados al daño. DNE Donante no emparentado. EICL Enfermedad de injerto contra leucemia. EICR Enfermedad de injerto contra receptor. EICRa Enfermedad de injerto contra receptor aguda. EICRc Enfermedad de injerto contra receptor crónica. EICRc mod-sev Enfermedad de injerto contra receptor crónica moderada-severa. EVOH Enfermedad venooclusiva hepática. G-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos. GETH Grupo Español de Trasplante Hematopoyético. GP Proceso Gaussiano ( del inglés Gaussian Process). GST Glutation S-transferasa. Haplo-TPH Trasplante alogénico haploidéntico de progenitores hematopoyéticos. HLA Antígeno humano leucocitario (del inglés Human leucocyte antigen). HWE Equilibrio de Hardy-Weinberg. IA Incidencia acumulada. ICT Irradiación corporal total. IFN Interferón. IGV Visor de genómica integradora (del inglés Integrative Genomics Viewer). IL Interleucina. LASSO Regresor logístico con regularización L1 (del inglés Least Absolute Shrinkage and Selection Operator). ABREVIATURAS 14 LLA Leucemia linfoide aguda. LMA Leucemia mieloide aguda. LNH Linfoma no hodgkin. MAF Frecuencia del alelo minoritario (del inglés Minor allele frequency). MO Médula ósea. MRP2 Proteína de resistencia a múltiples fármacos (del inglés multi-drug resistance protein 2). MRT Mortalidad relacionada con el trasplante. NH Neoplasia hematológica. NGS Secuenciación masiva (del inglés Next-generation sequencing). ONT Organización Nacional de Trasplante. PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos. SCU Sangre de cordón umbilical. SG Supervivencia global. SHR Relación de riesgo (del inglés Subhazard ratio). SNP Polimorfismo de un único nucleótido (del inglés single nucleotide polymorphism). SP Sangre periférica. SOS Síndrome de obstrucción sinusoidal. STD Desviación estándar (del inglés Standard deviation). TCR Receptor de linfocito T. Tef Linfocito T efector (del inglés effector T lymphocytes). Th Linfocito T colaborador (del inglés helper T lymphocyte). TNF Factor de necrosis tumoral (del inglés tumor necrosis factor). TPH Trasplante de progenitores hematopoyéticos. Treg Linfocito T regulador (del inglés regulatory T cells). VAF Frecuencia alélica de la variante (del inglés Variant allele frequency). WT Salvaje (del inglés Wild type). Introducción INTRODUCCIÓN 17 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Sistema hematopoyético El sistema hematopoyético (del griego Hema= sangre, poyesis= producción) es el sistema encargado de la formación de los componentes sanguíneos. La hematopoyesis es el proceso de formación, desarrollo y maduración de los elementos de la sangre (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) a partir de un precursor celular común conocido como célula madre hematopoyética pluripotencial, localizada en la médula ósea (MO) (1). La MO proporciona un microambiente óptimo para la proliferación, la diferenciación, la adhesión y la quiescencia de las células madre hematopoyéticas (2). Todos los elementos que constituyen la MO tienen un mismo origen que es una célula madre pluripotencial, la cual se diferencia en dos grandes grupos: la célula madre mieloide que da origen a la serie granulocítica, eritroide, megacariocítica y monocítica, y la célula madre linfoide, que da origen a la serie linfoide que incluye linfocitos B, T y células NK (Figura 1). Esta diferenciación se lleva a cabo por la acción de distintos factores de crecimiento específicos para cada célula. 1.1.1. Hemopatías. Enfermedades de la sangre Las enfermedades de la sangre (hemopatías) pueden tener un carácter neoplásico (tumoral) o no neoplásico. Dado que las primeras tienen, por lo general, peor pronóstico habitualmente se las suele denominar neoplasias hematológicas (NH). La MO es la encargada de la producción de las células de la sangre que el organismo necesita. Algunas veces, la MO “enferma” y se altera el número, la maduración o la función (en especial la muerte celular programada o apoptosis) de las células que produce. Este hecho, que puede afectar al linaje eritroide (anemias, policitemias, etc.) o a los que producen los glóbulos blancos (leucemias, linfomas, mielomas, etc.), constituye el fundamento del desarrollo de las NH (3). INTRODUCCIÓN 18 Figura 1. Esquema de la hematopoyesis. Imagen modificada de McConnell TH (4). Las NH son un grupo heterogéneo de enfermedades malignas que se producen en los componentes sanguíneos, que afectan a la sangre, MO o tejido linfoide. Estas neoplasias provienen de la expansión clonal de progenitores hematopoyéticos, determinando el estado de diferenciación de la transformación celular el fenotipo de la enfermedad (5). Las NHs son la expresión fenotípica de la trasformación neoplásica de los precursores hematopoyéticos, mediante un proceso acumulación de alteraciones genómicas en los genes que regulan funciones celulares como proliferación, diferenciación, supervivencia y muerte celular. Estas mutaciones ocasionan una proliferación excesiva, una parada en la maduración y/o una inhibición de la apoptosis, dando lugar a un acúmulo de células indiferenciadas e hiperlongevas que impide llevar a cabo una hematopoyesis normal (6). Las enfermedades hematológicas no neoplásicas se definen como aquellas que afectan a la sangre y sus componentes sin provocar una producción descontrolada de células, pero afectan INTRODUCCIÓN 19 a su función, y producen cambios en el sistema de coagulación o proteínas del sistema inmunológico. En este grupo se encuentra por ejemplo la aplasia medular (anomalía adquirida o congénita que provoca la eliminación o lesión de las células madres hematopoyéticas de donde se originan todos los componentes celulares de la sangre), las inmunodeficiencias, etc. Este tipo de enfermedades suelen tratarse con quimioterapia, con o sin radioterapia, o con inmunoterapia. Sin embargo, tanto las enfermedades hematológicas neoplásicas como no neoplásicas pueden llegar a necesitar un trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH). 1.2. Trasplante hematopoyético El TPH es un procedimiento terapéutico cuyo desarrollo se inició a principio del siglo XX. Se llevaron a cabo trasplantes experimentales en animales, descubriendo que las células del receptor reconocían como extraño al inóculo de células trasplantadas y se producía un rechazo del injerto (7). En 1957 el Dr.Thomas (galardonado en 1990 con el Premio Nobel de Medicina) y colaboradores publicaron por primera vez el resultado de un tratamiento de radioterapia y quimioterapia seguido de la infusión intravenosa de MO en humanos (8). La mayoría de los pacientes fallecieron por fallo del injerto o por progresión, pero uno de los pacientes presentó un prendimiento transitorio. A finales de los años 50 se publicaron diversos estudios de compatibilidad en la selección del donante, lo que supuso un gran avance en el TPH (9,10). En la década de los 80 se llevaron a cabo distintos avances para determinar las características que perfilan el trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos (alo-TPH). Entre ellos destacan: el desarrollo de separadores celulares capaces de recolectar células de sangre periférica (SP) (11), el conocimiento biológico del efecto injerto contra leucemia (EICL) (12) y la enfermedad de injerto contra receptor (EICR) (13). Gracias a estos avances, en 1977 Thomas y su grupo publicaron una serie de 100 pacientes con leucemia aguda avanzada, tratados con irradiación corporal total y ciclofosfamida (Cy), que recibieron un alo-TPH de un hermano idéntico para los antígenos leucocitarios humanos (HLA), algunos de los cuales se curaron de su enfermedad (14). Desde entonces han aparecido nuevas formas de trasplante, con distintos tipos de acondicionamiento, fuentes de progenitores hematopoyéticos alternativas, inmunodepresores y estrategias que permiten superar las barreras del HLA. INTRODUCCIÓN 20 Todos estos progresos han permitido que el TPH sea la principal terapia curativa para un amplio grupo de pacientes con enfermedades hematológicas. El TPH es un tratamiento donde la MO del enfermo, productora de células malignas, es destruida mediante la administración de un tratamiento de acondicionamiento constituido por altas dosis de quimioterapia y/o radioterapia, y posteriormente reemplazada por una MO sana (15). De manera general, en el TPH, los progenitores hematopoyéticos, obtenidos de MO, SP o sangre de cordón umbilical (SCU), pueden proceder (Figura 2): - Del mismo paciente, lo que se denomina un trasplante autólogo. Estos serán utilizadas posteriormente para recuperar la MO del mismo después del tratamiento intensivo con quimioterapia. Es un procedimiento más sencillo que el alo-TPH y con menos complicaciones; pero en determinadas enfermedades, la probabilidad de curación es inferior como sucede en leucemias agudas ya que no existe el EICL. - De un donante histocompatible (familiar o no emparentado), lo que sería por tanto un alo-TPH. Las células precursoras hematopoyéticas provienen de un donante distinto al receptor. El alo- TPH se fundamenta en el EICL, donde las células inmunitarias del donante reconocen y destruyen a las células malignas del receptor. Sin embargo, no está exento de complicaciones post-trasplante como la EICR. Este tipo de trasplante incrementa las posibilidades de remisión a largo plazo una vez que las complicaciones relacionadas con el trasplante se hayan resuelto. Figura 2. Tipos de trasplante hematopoyético. MO: Médula ósea; SCU: Sangre de cordón umbilical; SP: Sangre periférica; TPH: Trasplante hematopoyético. Imagen modificada de Carreras et al. (16). INTRODUCCIÓN 21 1.2.1. Características del trasplante hematopoyético alogénico El alo-TPH consiste en la administración de un tratamiento quimioterápico, denominado acondicionamiento, con efecto inmunosupresor, seguido de la infusión de progenitores hematopoyéticos de un donante sano, los cuales reconstituirán la hematopoyesis en el receptor. El éxito del alo-TPH depende del equilibrio entre el sistema inmune del donante y receptor. Su eficacia se basa en la reacción inmunológica (alorreactividad) de las células del donante frente a las células tumorales del paciente, lo que se conoce como EICL, mediante la cual los linfocitos del donante atacan y destruyen a las células tumorales del receptor (15). Debido a la activación de estas células inmunocompetentes este procedimiento suele acompañarse de distintas complicaciones post-trasplante, como por ejemplo el ataque de estas células del donante contra las células sanas del receptor al reconocerlas como extrañas, lo que se denomina EICR, que es la principal complicación después del alo-TPH y la causa más importante de morbilidad y mortalidad post-trasplante (17). También destaca un elevado de riesgo de desarrollar diferentes infecciones debido a la inmunosupresión a la que se somete a los pacientes para evitar el riesgo de EICR y a la inmunosupresión que provoca el propio desarrollo de EICR. El receptor también puede provocar una respuesta inmune contra las células del donante en el contexto de un rechazo del injerto (18). Existen diversos factores que influyen en este equilibrio como el régimen de acondicionamiento, la fuente de progenitores, los fármacos inmunosupresores, etc. Las modalidades del alo-TPH se han diversificado según el tipo de donante, la fuente de progenitores hematopoyéticos y la intensidad del acondicionamiento. Según el tipo de donante, el alo-TPH puede ser de un donante familiar o de un donante no emparentado (DNE). Ambos casos pueden ser HLA idéntico o HLA no idéntico, siendo en este último caso entre los que se encuentran los donantes haploidénticos (haplo-TPH) La fuente de progenitores hematopoyéticos puede ser la MO, la SP, o la SCU. Las tres fuentes de células progenitoras tienen distintas características biológicas que condicionan el desarrollo del procedimiento. En cuanto a la intensidad del tratamiento de acondicionamiento se define según sea mieloablativo, en el cual el régimen de preparación utilizado busca una eliminación completa del tejido hematopoyético del receptor; o de intensidad reducida, donde el tratamiento de acondicionamiento utilizado es menos intenso, menos mielosupresor, pero más inmunosupresor, aunque no elimina completamente el tejido hematopoyético del receptor (15,19). INTRODUCCIÓN 22 Los grandes avances logrados como la optimización en la selección del donante, modulación de la intensidad del acondicionamiento e individualización de la profilaxis frente a la EICR y las infecciones oportunistas se reflejan en los datos de registro de la Organización Nacional de Trasplante (ONT), que muestran un continuo incremento en su utilización (Figura 3) ya que cada vez es más eficaz y tiene una menor morbi-mortalidad. Figura 3. Actividad de trasplante de progenitores hematopoyéticos en España (2002-2020). Fuente: Registro de la ONT. 1.2.2. Sistema HLA Una de las principales funciones del sistema inmune para la defensa del organismo es el reconocimiento de antígenos extraños presentados por las moléculas de HLA, las cuales juegan un papel muy importante en el desarrollo del sistema inmunitario, ya que presentan esos antígenos a los linfocitos T, que desencadenan una respuesta inmune (20). El alo-TPH fue posible gracias a la identificación y descripción del sistema HLA. La selección de los donantes adecuados para el alo-TPH se basa fundamentalmente en la compatibilidad de HLA entre donante y receptor. Este sistema es conocido como el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC o HLA en el ser humano) y se trata del sistema genético más polimórfico del ser humano. El sistema HLA está formado por proteínas de superficie localizadas en determinados tipos de células. Están codificadas por genes localizados en el cromosoma 6 y se agrupan en 3 regiones diferentes: HLA de clase I, II y III (Figura 4). Dentro de la clase I se encuentran HLA-A, HLA-B y HLA-C, que son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos y se expresan en todas las células, excepto en los hematíes. Al grupo II pertenecen HLA-DP, HLA-DQ, y HLA-DR, que interaccionan principalmente con las células T helper (Th) y se expresan en células dendríticas, macrófagos, linfocitos B y otras INTRODUCCIÓN 23 células presentadoras de antígenos (CPAs). Las funciones del grupo I y II se basan en llevar a cabo la presentación de distintos péptidos (procedentes de patógenos o de la propia célula) al sistema inmune, pudiendo así distinguir entre “lo propio” y “lo ajeno” y determinar las sustancias extrañas. Por otro lado, los genes pertenecientes al grupo III están implicados en procesos de inflamación (21). Los antígenos de clase I y II son esenciales para controlar el reconocimiento de la histocompatibilidad en el TPH. De manera que el resultado de un alo-TPH depende en gran parte del grado de compatibilidad entre el donante y el receptor. Figura 4. Región del HLA del cromosoma 6. Imagen modificada de Xie et al. (22). El sistema HLA se hereda con carácter mendeliano, es decir, se recibe un haplotipo de cada progenitor, por lo que la probabilidad de tener un hermano compatible idéntico es del 25% y la probabilidad de que dos personas no emparentadas compartan el mismo HLA es de 1/50.000- 100.000. La disparidad de estos antígenos entre donante y receptor se relaciona con el grado y la severidad de la EICR, así como con el rechazo del injerto (15). Además gracias a la alorreactividad de las células T del donante contra el HLA del receptor que difiere entre receptor y donante estas células producen el EICL y eliminan a las células tumorales (23). A pesar de que el tipo de HLA es el factor determinante a la hora de elegir a un donante adecuado, también se tienen en cuenta otros factores, como edad y sexo del donante (se prefiere que sea un varón joven), la serología para citomegalovirus, el grupo sanguíneo y los antecedentes médicos. INTRODUCCIÓN 24 1.2.3. Tipos de trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos Según el tipo de donante el alo-TPH puede ser de: - Donante HLA-idéntico Es el donante que comparte con el receptor cada uno de los 2 alelos en los 5 principales locus (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 y HLA-DQB1), lo que sería una compatibilidad 10/10. Según la relación del donante y el receptor puede ser donante emparentado o DNE. El donante emparentado HLA idéntico tiene total identidad en los HLA de clase I y II. Se considera la mejor situación, pero sólo un 25% de los pacientes dispone un hermano totalmente idéntico, ya que cada persona hereda un haplotipo de cada uno de sus progenitores. Los DNE son aquellos que se encuentran en registros internacionales formados por donantes voluntarios. En el caso de España, la entidad que lleva a cabo este registro se denomina Registro Español de Donantes de Médula Ósea (REDMO). Además, REDMO está interconectado con la red internacional de registros y, por tanto, puede acceder a los donantes voluntarios en cualquier parte del mundo. Inicialmente se lleva a cabo la búsqueda de un donante idéntico, de no localizarse se acepta un donante con una o dos diferencias HLA. A pesar de que la posibilidad de encontrar un donante no emparentado HLA idéntico es del 50% se requiere un plazo de tiempo en ocasiones mayor del que se dispone por la situación de la patología del paciente. - Donante haploidéntico El donante y receptor comparten únicamente uno de los haplotipos del HLA. Es una opción interesante ya que, teóricamente, el 100% de los pacientes tendrían un donante haploidéntico familiar (hijos, padres, hermanos, etc.). Se está consolidando paulatinamente como una opción terapéutica en aquellos pacientes con enfermedades hematológicas con indicación de trasplante y ausencia de donante HLA idéntico. Incluso puede ser valorado como una opción alternativa al trasplante HLA idéntico de DNE en casos con ausencia de donante idéntico familiar e indicación urgente. Además, este tipo de trasplante proporciona un efecto alorreactivo más potente, generando un mejor control de la enfermedad con menores tasas de recaída, pero con el inconveniente de un mayor riesgo de EICR aguda (EICRa). Sin embargo, en los últimos años las nuevas estrategias como el uso de células haploidénticas sin manipular junto con la infusión de Cy post-trasplante están consiguiendo resultados muy satisfactorios en la prevención de EICR, sin aumentar el riesgo de recaída. INTRODUCCIÓN 25 1.2.4. Complicaciones post-trasplante El alo-TPH puede presentar múltiples complicaciones debido a las diferencias en el HLA, la toxicidad del acondicionamiento y la inmunosupresión a la que se somete al paciente. También hay que tener en cuenta otra serie de factores como la situación de la enfermedad al trasplante, edad y estado del paciente, etc. (Figura 5). § Complicaciones a corto plazo Muchos de los problemas que surgen inmediatamente después del trasplante se deben a los tratamientos de acondicionamiento. Entre ellos se encuentran: - Mucositis (inflamación o úlceras en las mucosas). - Náuseas y vómitos. - Alopecia. - Infecciones. Hasta que se lleva a cabo el prendimiento leucocitario aumenta el riesgo del desarrollo de distintas infecciones. La reconstitución inmune es diferente para las poblaciones leucocitarias, y de ello depende las infecciones por distintos patógenos en diferentes momentos tras el trasplante. - Hemorragias. La trombopenia severa producida por la aplasia medular secundaria a la quimioterapia de acondicionamiento aumenta el riesgo de hemorragias severas. - Parotiditis. Consiste en la inflamación de las parótidas que pueden desarrollar los pacientes que reciben irradiación corporal total. - Cistitis hemorrágica (CH). Inflamación de la vejiga urinaria debido a una etiología infecciosa o no infecciosa que resulta en sangrado de la mucosa de la vejiga. - Enfermedad venooclusiva hepática/síndrome de obstrucción sinusoidal (EVOH/SOS). En este síndrome, los metabolitos tóxicos generados durante el régimen de acondicionamiento dañan las células endoteliales sinusoidales (CES) y los hepatocitos, lo que conlleva a una disfunción hepática. - EICRa. - Fallo del injerto primario. Se caracteriza por la ausencia de la recuperación de prendimiento de neutrófilos >0,5x109/L en el día +28, plaquetas <20x109/L y hemoglobina 80 g/L. - Fallo del injerto secundario (rechazo del injerto). Se caracteriza por la pérdida de al menos dos líneas celulares en pacientes que habían presentado previamente injerto hematopoyético sin otras causas (EICR, infecciones, toxicidad farmacológica, etc.). INTRODUCCIÓN 26 - Progresión temprana de la enfermedad. Figura 5. Factores relacionados con el trasplante que afectan a la recuperación inmunitaria, y tipo y cronología de las infecciones que se presentan después de un alo-TPH. EVO: Enfermedad venooclusiva hepática; EICR: Enfermedad de injerto contra receptor; VHS: Virus herpes simple; CMV: Citomegalovirus; VVZ: Virus de la varicela-zóster. Imagen modificada de Burik and Freifeld. § Complicaciones a largo plazo Los problemas que pueden surgir después del trasplante a largo plazo dependen de muchos factores, como el tipo de trasplante, el tratamiento de acondicionamiento, el estado general del paciente, la edad del paciente, la duración y el grado en que el sistema inmunitario queda inhibido, la EICR, etc. Entre los posibles riesgos a largo plazo de un trasplante se incluyen: - Enfermedad de injerto contra receptor crónica (EICRc). - Recaída. - Neoplasias secundarias. - Alteraciones hormonales, como hipotiroidismo o esterilidad. - Alteraciones pulmonares, como enfermedad pulmonar obstructiva o neumonitis intersticial tardía. - Alteraciones músculo-esqueléticas. - Cataratas. INTRODUCCIÓN 27 1.2.4.1. Enfermedad de injerto contra receptor (EICR) La EICR se considera la principal cauda de morbi-mortalidad post-trasplante (24). Como consecuencia de la respuesta inmune de las células del donante contra las células del receptor se produce una reacción inflamatoria importante mediada por los linfocitos del donante y estimulada por aquellos tejidos que han sido lesionados por la enfermedad de base, por las infecciones previas o por el tratamiento de acondicionamiento. El factor de riesgo más importante en el desarrollo de EICR es la disparidad HLA entre donante y receptor. La EICR se clasifica en EICRa y EICRc. Esta clasificación depende de los síntomas del paciente y el tiempo de aparición antes o después de los 100 días post-trasplante. Los dos tipos afectan a órganos y tejidos diferentes, produciendo así distintos síntomas. Es posible presentar un solo tipo, los dos, un tipo después del otro, o incluso ambos a la vez a lo largo del desarrollo post- trasplante (17). 1.2.4.1.1. Enfermedad de injerto contra receptor aguda (EICRa) La EICRa se presenta en el 35-50% de los pacientes sometidos a un alo-TPH (25). A pesar de los avances en su diagnóstico y tratamiento, es aún la mayor causa de mortalidad en los primeros 100 días post-trasplante. Los principales factores de riesgo (26) que producen su desarrollo son: - Incompatibilidad HLA. - Uso de DNE. - Paciente de edad avanzada. - Donante mujer multípara. - Uso de un donante femenino para un receptor masculino. - Intensidad del régimen de acondicionamiento (altas dosis de quimioterapia y/o irradiación corporal total). - La SP como fuente de progenitores hematopoyéticos. - Acondicionamiento mieloablativo. - Presencia de enfermedad previa al trasplante. De manera general esta forma aguda afecta a la piel, el hígado y el tracto gastrointestinal (estómago, intestino y colon). Algunos de los síntomas de esta complicación son erupción cutánea, náuseas, vómitos, diarrea, y hepatitis colestásica. INTRODUCCIÓN 28 Se definen cuatro grados clínicos según la gravedad de la afectación cutánea, hepática y digestiva: grado I (leve), grado II (moderada), grado III (severa) y grado IV (muy severa). Los pacientes con enfermedad de grado III y IV presentan peores desenlaces clínicos y una menor supervivencia (25% a los 5 años para el grado III y una supervivencia del 5% para el grado IV) (27). La fisiopatología de la EICRa fue descrita por Ferrara et al. (17) y se produce en tres fases (Figura 6): I. Fase aferente. Daño tisular y estimulación de las CPAs. El régimen de acondicionamiento, la propia enfermedad de base y el desarrollo de infecciones previas producen daños en los órganos del receptor dando lugar a la liberación de citocinas proinflamatorias (serían las “señales de peligro”), que estimulan la expresión de moléculas de adhesión y activan a las CPAs. II. Fase de expansión. Activación, diferenciación y migración de linfocitos T alorreactivos del donante a los órganos diana. Las CPAs del receptor liberan citocinas proinflamatorias que actúan como señal para la activación, proliferación y maduración de las células T del donante. Las “señales de peligro” generadas en la primera fase aumentan esta activación por la expresión de moléculas coestimuladoras. La activación de los linfocitos T del donante induce la transcripción de genes de citocinas y sus receptores, promoviendo un mayor reclutamiento de células inmunes innatas que contribuyen aún más al medio inflamatorio de las citocinas. Las células T activadas producen IL2 e interferón γ (IFN-γ) (o respuesta TH1). Tras su estimulación y activación, las células T, se dividen y se diferencian fundamentalmente hacia células citotóxicas capaces de dirigir la respuesta inmune efectora. III. Fase efectora. Efectos inflamatorios y celulares: lesión tisular y daño en órganos diana. Finalmente, los linfocitos T citotóxicos, las células NK, y los macrófagos producen daños en los órganos terminales. Las citocinas proinflamatorias estimulan, a su vez, la producción de nuevas citocinas por parte de los tejidos dañados. De esta forma, el daño tisular produce una amplificación constante de las señales inflamatorias, perpetuando e incrementando una respuesta inflamatoria fisiológica exagerada y fuera de control. INTRODUCCIÓN 29 Figura 6. Fisiopatología EICRa. EICRa: Enfermedad de injerto contra receptor aguda; CPAs: Células presentadoras de antígenos; CTL: Linfocitos T citotóxicos; NK: Células natural killer. Imagen modificada de Blazar et al. (28). 1.2.4.1.2. Enfermedad de injerto contra receptor crónica (EICRc) La EICRc aparece en aproximadamente un 40% de los trasplantes de hermano HLA-idéntico, y hasta un 70% de los alo-TPH no emparentados. De hecho la supervivencia a los 10 años de los pacientes que desarrollan EICRc leve es del 80%; mientras que es inferior al 5% cuando se trata de una EICRc severa (29). Se considera un síndrome de origen alorreactivo con unas manifestaciones clínicas similares a una enfermedad autoinmune como la esclerodermia, síndrome de Sjögen o la cirrosis biliar primaria (30). La EICRc puede ocurrir de novo, de forma progresiva tras presentar EICRa, o de forma quiescente, cuando la EICRa se ha resuelto y posteriormente se desarrolla EICRc. Clásicamente la EICRc se clasificaba en limitada y extensa, en cambio en 2005 el Instituto Nacional de la Salud de Estados Unidos (NIH) estableció tres grados de severidad (leve, moderado y severo), según los órganos afectados y la intensidad de la afectación. Los síntomas de la forma crónica pueden estar limitados a un solo órgano o pueden estar diseminados. Entre las partes del cuerpo más afectadas se encuentran la piel, las mucosas, los ojos, el hígado, el tracto gastrointestinal, los pulmones y las articulaciones. INTRODUCCIÓN 30 Los principales factores de riesgo que se asocian a la EICRc (26) son: - Haber presentado EICRa. - Incompatibilidad HLA o DNE. - Paciente y/o donante de edad avanzada. - Donante femenino para un receptor masculino, y donante multípara. - Origen de las células madre - Las células madre obtenidas a partir de SP presentan un mayor riesgo de presentar EICRc. - Las células madre obtenidas a partir de SCU presentan el menor riesgo de producir EICRc. - Infección por citomegalovirus. A diferencia de la EICRa, la afectación orgánica de EICRc es mucho más amplia y heterogénea, y predomina fibrosis más que apoptosis. En este caso se produce la pérdida de tolerancia a antígenos propios, de ahí su similitud con las enfermedades autoinmunes, lo que da lugar a la producción de linfocitos autorreactivos. La fisiopatología de la EICRc se produce en tres fases (28) (Figura 7): I. Lesión tisular con inflamación. El régimen de acondicionamiento produce daño tisular en el organismo del receptor, dando lugar a la liberación de citocinas proinflamatorias, que dan lugar a la activación de las células T del donante por la presentación de antígenos gracias a las CPAs del receptor. II. Inflamación crónica, lesión del timo y desregulación de la inmunidad mediada por linfocitos T y B. Se produce la activación de los linfocitos T y B por su contacto con las CPAs. Estos linfocitos T polarizan hacia las células T CD4+ TH2 y TH17, que son linfocitos implicados en los fenómenos autoinmunes. Estas células escapan al control del timo, el cual con el régimen de acondicionamiento también ha sido dañado, lo que da lugar a la pérdida de formación de linfocitos reguladores, y también hace que se produzca una selección negativa disminuida de células T CD4+ alorreactivas. INTRODUCCIÓN 31 III. Fibrosis. Los linfocitos TH2 activan a los macrófagos, que a su vez producen la activación y proliferación de los fibroblastos, los cuales producen TGF-β y PDGF-a, dando lugar al depósito de matriz extracelular, generando así la fibrosis del tejido. Por otro lado, la presencia del factor activador de células B de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), presente en enfermedades autoinmunes, proporciona señales de supervivencia e inhibición de la apoptosis a los linfocitos B, haciendo que sean autorreactivos, los cuales producen anticuerpos que se depositan en los tejidos, generando así más fibrosis, y por tanto más daño tisular. Figura 7. Fisiopatología EICRc. Ac: Anticuerpo; TH: Linfocito T colaborador; Treg: Linfocito T regulador; BAFF: Factor activador de células B; TGFb: Factor de crecimiento transformante b; PDGF: Factor de crecimiento derivado de plaquetas. Imagen modificada de Blazar et al. (28). 1.2.4.2. Complicaciones post-trasplante asociadas a la toxicidad del régimen de acondicionamiento Como consecuencia de la toxicidad hepática del acondicionamiento y del propio TPH se produce el SOS, también conocido como EVOH. Los criterios clínicos definitorios son hepatomegalia, ictericia cutáneo-mucosa y retención hídrica. Los síntomas y signos del SOS suelen aparecer durante los primeros 21 días post-trasplante. La incidencia de SOS varía según el tipo de acondicionamiento empleado. Para los pacientes que se someten a un alo-TPH con acondicionamiento mieloablativo de hermano HLA idéntico es del 7%; mientras que si se trata de un alo-TPH de DNE es del 11%. En cambio, en el acondicionamiento de intensidad reducida esta incidencia baja al 0% en alo-TPH de hermano HLA-idéntico y al 8% en DNE (31). Aunque la gravedad de la enfermedad es muy variable, se asocia con una mortalidad de hasta el 85% (32). INTRODUCCIÓN 32 La patogenia de este síndrome se asocia a la acumulación metabolitos tóxicos relacionada con la metabolización de fármacos de la quimioterapia, en especial la Cy, mediante el sistema enzimático del citocromo P450 (CYP450), y además por la insuficiente metabolización de esos metabolitos tóxicos por el sistema enzimático del glutatión. Estos metabolitos tóxicos lesionan las CES. Cuando ocurre el SOS, las CES se dañan y se desprenden. Esto promueve el escape de eritrocitos, leucocitos y plaquetas entre los hepatocitos y las CES, contribuyendo al inicio de procesos inflamatorios y formación de trombos. Además existen distintos factores asociados a mayor riesgo de SOS, tales como: hepatopatía previa, ferritina >1,000 ng/mL, acondicionamiento con busulfán, alelo nulo para el gen GSTM1, edad avanzada, etc. (33). Otra complicación importante es la CH, es una de las causas más importantes de morbilidad después de un alo-TPH. Se caracteriza por la presencia de hematuria mantenida durante más de 7 días. La incidencia es variable, en torno al 15%. El uso de altas dosis de Cy y busulfán como régimen de acondicionamiento se asocia con CH de aparición temprana. Sin embargo, la CH de inicio tardío con frecuencia se observa debido a infecciones virales, principalmente por citomegalovirus y virus BK. Hasta el momento los principales factores de riesgo son: toxicidad directa del acondicionamiento sobre el urotelio, edad avanzada, EICR, Cy post-trasplante, coagulopatía, trombocitopenia e infecciones virales (34,35). 1.2.4.3. Otras complicaciones post-trasplante: MRT y recaída A pesar de que el alo-TPH es una de las estrategias de tratamiento de elección para muchas enfermedades hematológicas tiene la desventaja de producir mortalidad asociada al trasplante (MRT), debida principalmente a la EICR, complicaciones infecciosas y toxicidad relacionada con el acondicionamiento. Por ello la MRT sigue siendo la principal barrera para el éxito del alo-TPH, donde aproximadamente el 10% de los pacientes sometidos a este tipo de trasplante sufren MRT al año post-trasplante (36). Sin embargo, en la práctica clínica se han realizado cambios con el objetivo de disminuir la toxicidad, así como mejoras en la estrategia de prevención y tratamiento han disminuido la gravedad de la EICR. En este sentido se han incorporado tratamientos preventivos, nuevos antifúngicos, prevención de enfermedades nosocomiales, etc. con la idea de disminuir la MRT. Esto ha permitido que se reduzca la incidencia de MRT al año post-TPH del 24% en 1990 al 9,5% en 2016 (36). También hay que tener en cuenta que la recaída después del alo-TPH, derivada de la reducción de la MRT en los últimos años, es la causa más frecuente de fracaso del trasplante y de mortalidad. Aproximadamente la muerte asociada a la recaída se da en el 30-50% de los INTRODUCCIÓN 33 pacientes que se han sometido a un alo-TPH. El riesgo de recaída es más alto en los primeros 12 meses tras el TPH, y las recaídas tempranas se asocian a peor pronóstico. El riesgo de recaída varía en función del diagnóstico, el estado de la enfermedad pre-TPH y la intensidad del acondicionamiento (37). Estas complicaciones, como consecuencia última, repercuten en la supervivencia global (SG). Hay que tener en cuenta la existencia de ciertos factores que influyen en la SG, como son la enfermedad de base, el riesgo genético, los tipos de acondicionamiento, el estado de la enfermedad pre-TPH, la profilaxis y los tratamientos de las infecciones, etc. (38). En los últimos años gracias a las mejoras incluidas en los factores relacionados con el alo-TPH la SG se ha ido incrementando, pasando del 57,6% en 1999 al 72,1% en 2016 (39). Por lo tanto, después de la descripción previa de las diferentes complicaciones post-trasplante un objetivo importante es la búsqueda de biomarcadores que nos ayuden a anticipar las probabilidades de cada paciente a desarrollar complicaciones post-trasplante. 1.3. Biomarcadores Gracias al avance en diferentes tecnologías relacionadas con la genómica en la última década se han realizado esfuerzos para la búsqueda y validación de biomarcadores específicos previos al trasplante para las distintas complicaciones post-trasplante que faciliten el diagnóstico precoz, así como la anticipación de la respuesta al tratamiento, incluso la mortalidad asociada. El uso de biomarcadores puede ayudar a identificar distintas vías biológicas que puedan favorecer la identificación de nuevas dianas terapéuticas. Estos avances permitirían conseguir un mayor éxito al llevar a cabo un alo-TPH al minimizar las complicaciones asociadas al mismo, así como la mortalidad. Un biomarcador se define como una característica biológica, bioquímica, antropométrica, fisiológica, etc., objetivamente medible, capaz de identificar procesos fisiológicos o patológicos, o bien una respuesta farmacológica a una intervención terapéutica (40). La identificación de nuevos biomarcadores es compleja y cuenta con diferentes etapas hasta su aplicación clínica. El biomarcador ideal debe caracterizarse por tener alta sensibilidad y especificidad, ser reproducible, rápido y económico, no invasivo, y tener suficiente relevancia preclínica y clínica como para modificar las decisiones relativas al proceso patológico en que se aplica. En la Tabla 1 se muestran los diversos tipos de biomarcadores en el contexto del TPH. Los biomarcadores estáticos se caracterizan por ser biomarcadores predictivos obtenidos en un INTRODUCCIÓN 34 momento determinado; mientras que los dinámicos son aquellos que se pueden determinar en diferentes momentos a lo largo del tiempo (pudiendo observar una dinámica) (41). Haciendo referencia a los biomarcadores dinámicos, los marcadores proteicos son los más prometedores ya que son fácilmente evaluables y permiten valorar el estado de la enfermedad en cada momento. Ya existen estudios, como los publicados por nuestro grupo entre otros, que demuestran que el aumento de determinadas proteínas, por ejemplo ST2, REG3a, elafina, IL6, IL2Ra, etc. (42–44) en el plasma se correlacionan con el diagnóstico de EICR, peor pronóstico y peor respuesta al tratamiento. En este contexto se han identificado biomarcadores proteicos para el manejo de la EICRa mediante los cuales se ha validado un algoritmo conocido como MAP “MAGIC algorithm probability”, que combinando dos proteínas gastrointestinales (ST2 y REG3a) permite estimar la probabilidad de MRT (45,46). Mediante este algoritmo se predice la gravedad de EICRa y su respuesta al tratamiento. Tabla 1. Tipos de biomarcadores. Treg: Linfocitos T reguladores; TNF: Factor de necrosis tumoral; Treg: Linfocitos T reguladores. Tipos Biomarcador Ejemplos Estáticos (biomarcadores genómicos) Disparidad HLA Genes HLA Polimorfismos en genes no HLA Citocinas (interleucinas y quimiocinas): IL2, IL6, IL17, CCR5 Antígenos menores de histocompatibilidad: HY, HA-1 Genes de la inmunidad innata: TLR, MBL Genes implicados en el metabolismo de fármacos: Ciclofosfamida, fludarabina Dinámicos Micro-RNA miR-100 Marcadores celulares Treg, células dendríticas Proteómica TNF-α , albúmina, angipoyetina-2, elafina En particular el presente trabajo se centra en el estudio de biomarcadores estáticos en genes no-HLA, concretamente en biomarcadores genómicos en genes de citocinas y del metabolismo de fármacos. 1.3.1. Biomarcadores genómicos (polimorfismos) Los biomarcadores genómicos consisten en la presencia de polimorfismos en regiones que suelen afectar a la expresión del gen. Un polimorfismo es un cambio en la secuencia de ADN entre individuos de la misma especie que se mantiene a lo largo del tiempo y que se encuentra en una frecuencia superior al 1% de la población. La forma más común de esta variación genética es el cambio de un solo nucleótido (del inglés single nucleotide polymorphism, SNP) (47). Los INTRODUCCIÓN 35 polimorfismos son los responsables de la gran variabilidad existente entre los individuos de una misma especie. Se distribuyen de manera heterogénea por todo el genoma y se encuentran tanto en las regiones codificantes (exones) como no codificantes (intrones y región promotora). El cambio de un único nucleótido, si ocurre en una región codificante puede provocar un cambio de aminoácido en la proteína resultante, y ello puede resultar en una modificación de su actividad o función. Los cambios también pueden ocurrir en regiones del promotor de un gen y modificar su expresión. Lo mismo puede ocurrir si el cambio se produce en un intrón. Aunque los intrones no se traducen a proteína, cambios en su estructura pueden modular la expresión del gen. Otras veces, probablemente la mayoría, los cambios son silentes y no tienen repercusiones funcionales. En este contexto la genómica permite la búsqueda de biomarcadores en el periodo pretrasplante que puedan identificar pacientes de riesgo de desarrollar distintas complicaciones post-trasplante. Uno de los biomarcadores más relevantes en el TPH es la discordancia HLA entre donante y receptor. Sin embargo, se han descrito otros biomarcadores genómicos que pueden favorecer el desarrollo de complicaciones post-trasplante tales como los antígenos menores de histocompatibilidad, los polimorfismos en genes no HLA como los relacionados con el sistema inmune o con genes relacionados con el metabolismo de fármacos (Tabla 2) (48). Tabla 2. Ejemplos de polimorfismos en genes no HLA y su asociación con distintas complicaciones post-TPH. AgmH: Antígeno menor de histocompatibilidad; EICR: Enfermedad de injerto contra receptor; EICRa: EICR aguda; EICRc: EICR crónica; MRT: Mortalidad relacionada con el trasplante; SOS: Síndrome de obstrucción sinusoidal; TNF: Factor de necrosis tumoral; R: Receptor; Ref: Referencia; D: Donante; ↑:Aumento; ↓:Disminución. Biomarcador Tipo de biomarcador Polimorfismo Complicación post- trasplante Ref TNFa Citocinas −308 GA (D) ↑ EICRa III-IV ↑ EICRc extenso (49) IL1A −889T (R y D) ↑ Supervivencia, ↑MRT (50) IL1B −511T (R y D) CCR5 CCR5∆32 (R) ↓ EICRa (51) MIF -173C ↓ Recaída (52) GSTM1 Metabolismo de fármacos Alelo nulo ↑ SOS (53) AgmH HY Antígeno menor de histocompatibilidad AgmH HY R hombre/ D mujer ↓ Recaída ↑ EICRa (54) INTRODUCCIÓN 36 1.3.1.1. Biomarcadores genómicos no HLA. Genes de citocinas y del metabolismo de fármacos 1.3.1.1.1. Genes de citocinas Las citocinas son pequeñas proteínas secretadas por distintas células durante la respuesta inmune para llevar a cabo procesos de interacción y comunicación intercelular. Son producidas por muchos tipos celulares, pero mayoritariamente por los macrófagos y linfocitos Th. Hay tanto citocinas proinflamatorias como antiinflamatorias (55). Existen distintas clasificaciones dentro de las citocinas, algunas de ellas son: linfocinas (citocinas producidas por linfocitos), quimiocinas (citocinas con actividades quimiotácticas), interleucinas (citocinas producidas por un leucocito y que actúan sobre otros leucocitos). De manera más específica en el contexto del presente trabajo: - Interleucinas (IL): regulan la activación de las células del sistema inmune y controlan la diferenciación y proliferación de poblaciones celulares. Pueden tener funciones pro- inflamatorias y anti-inflamatorias. Además, activan el endotelio y mejoran la permeabilidad vascular. - Quimiocinas: estimulan la motilidad de las células del sistema inmune, como los neutrófilos, y las dirigen hacia el lugar de la inflamación. Las citocinas pueden actuar sobre las propias células que las secretan (acción autocrina), sobre las células cercanas (acción paracrina) o, en algunos casos, sobre las células distantes (acción endocrina). Las citocinas proinflamatorias son producidas principalmente por macrófagos activados y están involucradas en la regulación positiva de reacciones inflamatorias. Como ya se ha comentado la EICR es una complicación post-alo-TPH debida a la alorreactividad que se produce entre donante y receptor, en donde las células T del donante reconocen como extrañas a las células sanas del receptor. En este contexto se sabe que el fenotipo de las células T (TH1 y TH2) es el responsable de la gravedad de la EICR, dando lugar a sus formas EICRa y EICRc respectivamente (17,26). Además, las citocinas proinflamatorias (IL1, IL2, TNF-α o INFγ) ejercen efectos directos sobre los tejidos diana de la EICR. De manera que se puede asegurar que las citocinas tienen un papel clave en la fisiopatología de la EICR (Figura 8). INTRODUCCIÓN 37 Figura 8. Citocinas implicadas en la fisiopatología de la EICR. DAMPs: Patrones moleculares asociados a daño; PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos; EICRa: Enfermedad de injerto contra receptor aguda; EICRc: Enfermedad de injerto contra receptor crónica. Imagen modificada de Henden AS et al. (56). Existe abundante información sobre estos tipos de citocinas y las funciones que llevan a cabo, algunos ejemplos son: - IL1. Actividad proinflamatoria. Induce la síntesis de proteínas de fase aguda, regula la hematopoyesis. - IL2. Actividad citotóxica e inflamatoria. Induce la proliferación de linfocitos T, B y células NK - IL4. Inhibe la activación de macrófagos y promueve la activación y proliferación de linfocitos B, y la diferenciación a células TH2. - IL6. Actividad proinflamatoria. Induce la síntesis de proteínas de fase aguda. - CCL7. Atrae a macrófagos en la inflamación. - CCL16. Atrae a linfocitos y monocitos. - CX3CL1. Participa en la migración y adhesión leucocitaria. - CXCL5. Activa y atrae a neutrófilos. En los últimos años se han publicado distintos artículos que relacionan la presencia de polimorfismos en genes de citocinas, responsables de la “tormenta de citocinas”, con la EICR. Algunos de ellos se muestran en la Tabla 3 (54,57). INTRODUCCIÓN 38 Tabla 3. Polimorfismos en genes del sistema inmune y su asociación con la EICR. EICR: Enfermedad de injerto contra receptor; EICRa: EICR aguda; EICRc: EICR crónica; D: Donante; R: Receptor; Ref: Referencia; MRT: Mortalidad relacionada con el trasplante; TGFb: Factor de crecimiento transformante b; TNF: Factor de necrosis tumoral; VEB: virus de Epstein-Barr; ↑:Aumento; ↓:Disminución. Gen Polimorfismo Complicación post- trasplante Ref TNFa TNF−308 GA (D) ↑ EICRa III-IV ↑ EICRc extensa (49) TNFR II 196R (R) ↑ EICRa, (D) ↑ EICRc (58) TGFb 29T ↓ EICRa (R) (59) INFγ +874(T/A) AA (R) ↑ EICRa y EICRc y reactivación de VEB (51) IL10RB e IL10 IL10 −592A (R) e IL10RB 238G (D) ↓ EICRa III-IV (60) IL1RA IL1RN*2 (D) ↓ EICRa III-IV (61) IL2 −330G(R) ↑ EICRa II-IV (62) IL6 −174G/C G (D) ↑EICRa IL1A −889T (R y D) ↑ Supervivencia, ↑MRT IL1B −511T (R y D) CCR5 CCR5∆32 CCR5∆32 (R) ↓ EICRa, CCR5∆32 (D) ↑ EICRa III-IV (51) CCR6 rs2301436 GG(R) ↓ EICRc (63) 1.3.1.1.2. Genes del metabolismo de fármacos: ciclofosfamida La variabilidad interindividual en la respuesta a un fármaco, la expresión de la variabilidad biológica interindividual, puede ser debida a causas farmacocinéticas (absorción, distribución, metabolización y excreción) o por causas farmacodinámicas (interacción fármaco-receptor). En este contexto aparece el concepto de la famacogenética, una disciplina que se encarga del estudio de los aspectos genéticos relacionados con la variabilidad de respuesta a medicamentos entre distintos individuos. Es decir, determina cómo un polimorfismo genético afecta al metabolismo y acción de los medicamentos. Por tanto, la acción farmacológica de un medicamento estará condicionada por polimorfismos genéticos, que influirán tanto en el proceso de farmacocinética como en el de farmacodinámica (64). En el contexto del alo-TPH, el metabolismo de distintos fármacos administrados como parte del régimen de acondicionamiento y en la profilaxis de EICR puede ser relevante en relación a las complicaciones post-trasplante (65). Como se ha comentado previamente, existen varias estrategias para prevenir la EICR, una de ellas es la administración de Cy post-trasplante a dosis altas, inicialmente usada en el haplo-TPH y que se está ampliando a otro tipo de TPH. La Cy post- trasplante elimina la expansión de las células T alorreactivas, sin afectar a las células madre hematopoyéticas infundidas (Figura 9). Esto se debe a que las células madre hematopoyéticas INTRODUCCIÓN 39 expresan niveles elevados de aldehído deshidrogenasa (ALDH), que es el principal mecanismo de detoxificación de la Cy, lo que les confiere resistencia a este fármaco (66). Figura 9. Mecanismo para la inducción de la tolerancia mediante ciclofosfamida post-trasplante. CD: Células dendríticas, CMH: Células madre hematopoyéticas, Cy: Ciclofosfamida, DN: Doble negativo, DP: Doble positivo, MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad, Teff: Linfocito T efector, Treg: Linfocito T regulador, TCR: Receptor de linfocito T. Imagen modificada de Luznik L, et al. (67). Con el uso de Cy post-trasplante en altas dosis en los días +3 y +4 se reduce el riesgo de desarrollar EICR (EICRa II-IV 35-45% o EICRc 20-30%), manteniendo una adecuada reconstitución inmune y una baja tasa de muerte relacionada con el trasplante (68). Esta aproximación permite un injerto adecuado y la conservación del potencial efecto terapéutico del EICL, aunque la recaída sigue siendo el principal problema (67). La Cy es una mostaza nitrogenada que actúa como agente alquilante, de manera que se une al ADN durante la fase S del ciclo celular formando enlaces covalentes que bloquean la replicación celular y la transcripción celular (69). Este profármaco requiere su bioactivación, convertirse en fosforamida, para ser citotóxico y poder llevar a cabo su acción. En este caso, la activación es llevada a cabo por enzimas de la superfamilia del CYP450. Está descrito que esta bioactivación, y como consecuencia su efecto final, depende de la actividad de dichas enzimas que participan en su metabolismo (66). La Cy se activa en el hígado pasando a los metabolitos 4-hidroxiciclofosfamida y aldofosfamida. Posteriormente, en la célula diana, la aldofosfamida se hidroliza en mostaza de fosforamida (el principio activo) y en acroleína (compuesto urotóxico, pues al ser eliminado a través de la vejiga pueden causar irritación de las paredes de la vejiga. Esta irritación puede ser grave y provocar la formación de úlceras que causen hemorragias significativas en forma de CH). En cambio INTRODUCCIÓN 40 existen tipos de células, como las células madre hematopoyéticas, que como se ha comentado previamente, al tener una elevada concentración de ALDH no se ven afectadas por la Cy. Distintas isoformas contribuyen a la bioactivación de Cy, incluyendo los CYP450: CYP2A6, 2B6, 2C9, 2C19 y 3A4; siendo CYP2B6 donde exhibe la mayor actividad de 4-hidroxilasa. La detoxificación se realiza principalmente a través de glutatión S-transferasas (GSTA1, GSTP1) y aldehído deshidrogenasa (ALDH1A1, ALDH3A1) (Figura 10) (66). Figura 10. Metabolismo de la ciclofosfamida. La Cy (profármaco) es activado por los CYP450 hepáticos a 4- hidroxiciclofosfamida, que permanece en equilibrio con la aldofosfamida. Estos dos metabolitos se difunden en las células. Dependiendo del tipo de célula, en células con baja concentración de ALDH (células sensibles como los linfocitos), la aldofosfamida se convierte espontáneamente en mostaza fosforamida (metabolito activo) y acroleína. Sin embargo, en células con alta concentración de ALDH (como las células madre hematopoyéticas), la aldofosfamida se convierte en carboxifosfamida (inactiva). ALDH: Aldehído deshidrogenasa; Cy: Ciclofosfamida; GST: Glutation-S- Transferasa. Esta figura ha sido creada en Biorender.com. El nivel de la mostaza de fosforamida activa está determinado por la tasa de activación y detoxificación de la Cy y sus metabolitos. Se sabe que las enzimas involucradas en el metabolismo de la Cy son altamente polimórficas y tienen alelos con actividad disminuida o ausente (Tabla 4) (70,71). Por lo tanto, las variaciones genéticas en estas enzimas pueden ser responsables de las grandes diferencias interindividuales tanto en la eficacia como en la toxicidad del tratamiento con Cy en el contexto del alo-TPH. INTRODUCCIÓN 41 Tabla 4. Polimorfismos en enzimas implicadas en el metabolismo de la ciclofosfamida y su asociación con complicaciones post-TPH. EVOH: Enfermedad venooclusiva hepática; Ref: Referencia; ↑:Aumento; ↓:Disminución. 1.4. Modelos predictivos del desarrollo de complicaciones Sin embargo, a pesar de que hay diversos estudios que relacionan la presencia de polimorfismos en genes de citocinas o en genes del metabolismo de la Cy, hoy en día no se utilizan estos biomarcadores como predictores de complicaciones post-trasplante. El motivo fundamental es que aunque muchos de estos polimorfismos se han asociado con la EICR o con otras complicaciones post-alo-TPH, la identificación de un único polimorfismo de un único gen, de forma aislada, no tiene la sensibilidad y especificidad necesarias para una buena predicción de estas complicaciones post-trasplante. Por ello la estrategia a seguir sería el uso combinado de varios de ellos, junto con variables clínicas, intentando elaborar un modelo predictivo. De hecho, los modelos predictivos se diseñan para anticipar una variable respuesta y surgen como herramientas útiles para mejorar el uso diagnóstico y pronóstico de los biomarcadores. En este contexto en los últimos años diversos grupos han elaborado distintos modelos predictivos en el campo del alo-TPH, usando tanto variables clínicas como genéticas. Kim et al. (75,76) diseñaron un modelo con variables clínicas y genéticas, lo que les permitió una mejor estratificación del riesgo para la EICRa, MRT, SG y la supervivencia libre de recaída. El grupo de Paczesny (42) desarrolló un panel proteómico de 4 citocinas medidas en plasma para el diagnóstico de EICRa, y otro panel para la estratificación de los pacientes según el riesgo de desarrollar EICRc. Por otro lado, nuestro grupo elaboró distintos modelos predictivos clínico- genéticos para EICR mediante un regresor logístico con regularización L1 (LASSO) (77). Si bien ha habido avances significativos en los últimos años, los hallazgos no han llegado a incorporarse al manejo clínico de los pacientes en el contexto asistencial. Se deben optimizar los modelos predictivos para complicaciones post-trasplante para favorecer su uso universal en Gen Polimorfismo Complicación post-trasplante Ref CYP2B6 CYP2B6*2 (rs8192709) ↑ Cistitis hemorrágica (71) CYP2B6*4 (rs2279343) ↑ Mucositis oral CYP2B6*5 ↑ Recaída (72) GSTM1 Alelo nulo ↑ EVOH (73) GSTP1 rs1695 ↑ Supervivencia, ↓ Recaída (65) ALDH1A1 ALDH1A1*2 ↑ Toxicidad hepática (74) ALDH3A1 ALDH3A1*2 ↑ Cistitis hemorrágica INTRODUCCIÓN 42 la rutina asistencial. Por lo tanto, en este contexto se plantean los siguientes hipótesis y objetivos. Hipótesis HIPÓTESIS 45 2. HIPÓTESIS El alo-TPH ofrece una posible curación para los pacientes con NH gracias especialmente al EICL. No obstante, el alo-TPH no está exento de riesgos y representa un procedimiento complejo asociado, en muchas ocasiones, al desarrollo de complicaciones. La presencia de polimorfismos en genes del sistema inmune y en enzimas implicadas en el metabolismo de distintos fármacos afectan a la expresión de estos genes y por tanto influyen en el desarrollo de complicaciones post-trasplante. De forma específica, los polimorfismos en genes de citocinas están implicados en el desarrollo de distintas complicaciones post-trasplante (EICRa, EICRc, MRT, recaída y SG). Por otro lado, los polimorfismos en genes del metabolismo de la Cy están implicados en el desarrollo de complicaciones tales como EICR, SOS, MRT y CH. La tipificación de estos polimorfismos permite estratificar a los pacientes en función del riesgo de desarrollar distintas complicaciones post-trasplante. Estos hallazgos permitirán establecer la importancia de determinados polimorfismos en genes de citocinas y en enzimas del metabolismo de la Cy que favorezcan un manejo optimizado de los pacientes sometidos a un alo-TPH. Objetivos OBJETIVOS 49 3. OBJETIVOS El objetivo global del trabajo fue identificar nuevos polimorfismos en genes de citocinas y enzimas del metabolismo de fármacos (concretamente la Cy) y correlacionarlos con el desarrollo de complicaciones post-trasplante. Para alcanzar el objetivo global se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Para la determinación de los polimorfismos en genes de citocinas y su relación con complicaciones post-trasplante se plantearon los siguientes objetivos: 1.1. Realizar una búsqueda bibliográfica de las citocinas implicadas en las reacciones inmunológicas que se producen en el alo-TPH. 1.2. Diseñar y desarrollar un panel de secuenciación masiva (NGS) para el estudio de las citocinas implicadas en la fisiopatología de complicaciones post-trasplante. 1.3. Aplicar el panel de NGS al estudio de 90 alo-TPH HLA idéntico de donante familiar realizados en el Hospital General Universitario Gregorio Marañón. 1.4. Realizar un análisis bioinformático profundo de los genes secuenciados. 1.5. Seleccionar las variables clínicas y genéticas que se asocien con las diferentes complicaciones post-trasplante mediante modelos de regresión logística bayesiana. 1.6. Elaborar un modelo predictivo genético-clínico para la estratificación de los pacientes según el riesgo de desarrollar distintas complicaciones post-trasplante. 2. Para el estudio de los polimorfismos implicados en el metabolismo de la Cy y su relación con complicaciones post-trasplante se plantearon los siguientes objetivos: 2.1. Realizar una búsqueda bibliográfica de los genes implicados en el metabolismo de la Cy. 2.2. Diseñar y desarrollar un panel de NGS con los genes previamente seleccionados. 2.3. Aplicar el panel de NGS al estudio 182 pacientes sometidos a un haplo-TPH con Cy post- trasplante en el Hospital General Universitario Gregorio Marañón. 2.4. Realizar un análisis bioinformático profundo de los genes secuenciados. 2.5. Seleccionar las variables clínicas y genéticas que se asocien con las diferentes complicaciones post-trasplante mediante métodos estadísticos de riesgos competitivos. Pacientes y Métodos PACIENTES Y MÉTODOS 53 4. PACIENTES Y MÉTODOS La descripción de la metodología se ha estructurado en dos bloques. El bloque 1 describe los métodos relacionados con el estudio de polimorfismos en genes de citocinas y el bloque 2 los relacionados con polimorfismos en genes del metabolismo de la Cy. Del total de polimorfismos (variable genética) analizados en el presente estudio se han seleccionado aquellos en los que la presencia de la variante (alelo) minoritaria se asocia con el desarrollo de una complicación. 4.1. Bloque 1. Polimorfismos en genes de citocinas asociados a complicaciones post-trasplante 4.1.1. Pacientes Se planteó un estudio retrospectivo en el que se incluyeron 90 pacientes, y sus respectivos donantes, sometidos a un alo-TPH de donante familiar HLA-idéntico realizado en el Hospital General Universitario Gregorio Marañón desde 2000 hasta 2015. En todos ellos la profilaxis de EICR fue ciclosporina A y metotrexate. Del total de trasplantes disponibles (n=90) se censuraron aquellos pacientes que murieron o recayeron sin haber desarrollado la complicación antes del día 100 para el análisis de EICRa (n=2) o del día 200 para el análisis de EICRc (n=28). De manera que el estudio finalmente incluyó un total de 88 pacientes para EICRa y 62 pacientes para EICRc. En el caso del estudio de la MRT se censuraron aquellos pacientes que murieron debido a causas no relacionadas con la toxicidad del trasplante (n=20), por tanto en este caso se incluyeron 70 pacientes. Por último, respecto al análisis de la recaída se excluyeron del estudio aquellos casos que, sin haber recaído, fallecieron por otros motivos durante el primer año después del trasplante (n=13), siendo finalmente 77 pacientes lo que se incluyeron en este análisis. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital General Universitario Gregorio Marañón y todos los pacientes y donantes incluidos en el estudio firmaron un consentimiento informado de acuerdo con la declaración de Helsinki. La información de pacientes y donantes se recogió de la historia clínica electrónica. Las variables clínicas que se incluyeron en el estudio fueron diagnóstico hematológico, edad en el momento del trasplante, sexo del donante y del receptor, régimen de acondicionamiento, fuente de progenitores hematopoyéticos, radioterapia y si el paciente había recibido un PACIENTES Y MÉTODOS 54 trasplante previo. Las principales características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Características clínicas de la cohorte de pacientes sometidos a un TPH HLA-idéntico incluidos en el estudio. ICT: Irradiación corporal total. Otros*: anemia aplásica, leucemia linfática crónica, leucemia mieloide crónica. Variable Cohorte (n=90) Edad Receptor. Mediana (rango), años 44 (13-65) Edad Donante. Mediana (rango), años 44 (11-73) Sexo receptor (Hombre/Mujer) 60/30 Sexo donante (Hombre/Mujer) 48/42 Patología, n (%) Leucemia Mieloide Aguda Linfoma No Hodgkin Leucemia Linfoide Aguda Síndrome Mielodisplásico Mieloma Múltiple Linfoma de Hodgkin Otros* 29 (32,2) 24 (26,7) 18 (20) 8 (8,9) 4 (4,4) 3 (3,3) 4 (4,4) Fuente Progenitores Hematopoyéticos, n (%) Sangre Periférica Médula Ósea 85 (94,4) 5 (5,6) Régimen de Acondicionamiento, n (%) Mieloablativo Intensidad reducida 53 (58,9) 37 (41,1) Radioterapia (ICT), n (%) 16 (17,8) Trasplante autólogo previo, n (%) 1 (1,1) 4.1.2. Métodos 4.1.2.1. Diseño panel de secuenciación masiva Se diseñó un panel de 132 genes de citocinas (Tabla 6), donde se incluyeron 73 genes correspondientes a interleucinas y 59 al grupo de quimiocinas, denominado panel Allogenomics v1.13 (panel diseñado por nuestro grupo). Las sondas se diseñaron para detectar regiones codificantes y no codificantes, en concreto, regiones UTR, splicing (±1,2 pares de bases) y regiones upstream y downstream (±200 pares de bases). PACIENTES Y MÉTODOS 55 Tabla 6. Genes incluidos en el panel de allogenomics, correspondientes a interleucinas y quimiocinas. El término “ENST” de la columna de isoforma canónica hace referencia al identificador del transcrito de cada gen. Esta información ha sido obtenida de la base de datos online para genomas de eucariotas denominada “Ensembl”. Gen Isoforma canónica Gen Isoforma canónica ACKR3 ENST00000272928.3 IL13RA1 ENST00000371666.3 CCL1 ENST00000225842.3 IL13RA2 ENST00000371936.1 CCL11 ENST00000305869.3 IL15 ENST00000296545.7 CCL13 ENST00000225844.2 IL15RA ENST00000397248.6 CCL14 ENST00000622526.1 IL16 ENST00000302987.4 CCL15 ENST00000617897.4 IL17A ENST00000340057.1 CCL16 ENST00000611905.3 IL17B ENST00000261796.3 CCL17 ENST00000219244.4 IL17C ENST00000244241.4 CCL18 ENST00006160541.1 IL17D ENST00000304920.3 CCL19 ENST00000311925.2 IL17F ENST00000336123.4 CCL2 ENST00000225831.4 IL17RA ENST00000319363.6 CCL20 ENST00000358813.4 IL17RB ENST00000288167.3 CCL21 ENST00000259607.2 IL17RC ENST00000295981.3 CCL22 ENST00000219235.4 IL17RD ENST00000296318.7 CCL23 ENST00000615050.1 IL17RE ENST00000383814.8 CCL24 ENST00000416943.1 IL18 ENST00000280357.7 CCL25 ENST00000390669.3 IL18R1 ENST00000409599.1 CCL26 ENST00000394905.2 IL18RAP ENST00000264260.2 CCL27 ENST00000259631.4 IL19 ENST00000340758.2 CCL28 ENST00000361115.4 IL1A ENST00000263339.3 CCL3 ENST00000613922.1 IL1B ENST00000263341.2 CCL4 ENST00000615863.1 IL1R1 ENST00000410023.1 CCL5 ENST00000065122.1 IL1R2 ENST00000332549.3 CCL7 ENST00000378569.2 IL1RAP ENST00000317757.3 CCL8 ENST00000394620.1 IL1RL1 ENST00000233954.1 CCR1 ENST00000296140.3 IL1RL2 ENST00000264257.2 CCR10 ENST00000332438.4 IL1RN ENST00000259206.5 CCR2 ENST00000292301.4 IL2 ENST00000226730.4 CCR3 ENST00000545097.1 IL20 ENST00000367098.1 CCR4 ENST00000330953.5 IL20RA ENST00000316649.5 CCR5 ENST00000292303.4 IL20RB ENST00000329582.4 CCR6 ENST00000341935.5 IL21 ENST00000264497.3 CCR7 ENST00000246657.2 IL21R ENST00000337929.3 CCR8 ENST00000326306.4 IL22 ENST00000538666.1 CCR9 ENST00000357632.2 IL22RA1 ENST00000270800.1 CX3CL1 ENST00000006053.6 IL22RA2 ENST00000296980.2 CX3CR1 ENST00000358309.3 IL23A ENST00000228534.4 CXCL1 ENST00000395761.3 IL23R ENST00000347310.5 CXCL10 ENST00000306602.1 IL24 ENST00000391929.3 CXCL11 ENST00000306621.3 IL25 ENST00000329715.2 CXCL12 ENST00000395794.2 IL26 ENST00000229134.4 CXCL13 ENST00000286758.4 IL27 ENST00000356897.1 PACIENTES Y MÉTODOS 56 CXCL14 ENST00000337225.5 IL27RA ENST00000263379.2 CXCL16 ENST00000293778.6 IL2RA ENST00000379959.3 CXCL17 ENST00000601181.1 IL2RB ENST00000216223.5 CXCL2 ENST00000508487.2 IL2RG ENST00000374202.2 CXCL3 ENST00000296026.4 IL3 ENST00000296870.2 CXCL5 ENST00000296027.4 IL31 ENST00000377035.1 CXCL6 ENST00000226317.5 IL32 ENST00000525643.2 CXCL9 ENST00000264888.5 IL33 ENST00000381434.3 CXCR1 ENST00000295683.2 IL34 ENST00000429149.2 CXCR2 ENST00000318507.2 IL3RA ENST00000331035.10 CXCR3 ENST00000373691.4 IL4 ENST00000231449.2 CXCR4 ENST00000409817.1 IL4R ENST00000395762.2 CXCR5 ENST00000292174.4 IL5 ENST00000231454.1 CXCR6 ENST00000458629.1 IL5RA ENST00000446632.2 IL10 ENST00000423557.1 IL6 ENST00000404625.1 IL10RA ENST00000227752.3 IL6R ENST00000368485.3 IL10RB ENST00000290200.2 IL7 ENST00000263851.4 IL11 ENST00000264563.2 IL7R ENST00000303115.8 IL11RA ENST00000555003.1 IL8 ENST00000307407.3 IL12A ENST00000305579.2 IL9 ENST00000274520.1 IL12B ENST00000231228.2 IL9R ENST00000244174.5 IL12RB1 ENST00000600835.2 XCL1 ENST00000367818.4 IL12RB2 ENSG00000674203.1 XCL2 ENST00000367819.3 IL13 ENST00000304506.3 XCR1 ENST00000309285.3 Se purificó ADN genómico de SP o MO del receptor antes del trasplante y del donante mediante el kit Maxwell® RSC Blood DNA (Promega, Madison, WI, EE.UU.). El genotipado de las muestras pretrasplante de los 90 alo-TPH se realizó a partir de muestras de SP o MO. La preparación de librerías e indexado se realizó siguiendo el protocolo del fabricante (Agilent, California, EEUU) mediante un panel custom de NGS de enriquecimiento por captura. El producto de enriquecimiento por captura se secuenció en la plataforma HiSeq (2x101-paired-end; Illumina, San Diego, CA, EE. UU). 4.1.2.2. Análisis de las variables genéticas. Anotación y filtrado de variantes Los archivos FASTQ se alinearon con la secuencia de referencia del genoma humano (GRCh38/hg38) usando la herramienta de alineamiento Burrows Wheeler Alignment v0.7.15- r1140. Posteriormente, para la identificación de variantes se empleó una combinación de dos algoritmos diferentes, VarScan y GATK. Las variantes identificadas se anotaron utilizando la base de datos Ensembl, bases de datos poblacionales (Exome Aggregation Consotium (ExAC) y 1000 Genomes) y bases de datos específicas (ClinVar, Catalog of Somatic Mutations in Cancer PACIENTES Y MÉTODOS 57 (COSMIC), Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) y Human Gene Mutation Database (HGMD)). Para determinar la frecuencia poblacional (Minor Allele Frequency, MAF) de las distintas variantes se utilizaron las bases poblaciones GenomAD y 1000 Genomes. Después de la anotación, todos los polimorfismos localizados en secuencias codificantes, regiones de splicing (±1, 2 pares de bases), regiones UTR y regiones upstream y downstream (±200 pares de bases) fueron analizados. Se seleccionaron variantes no sinónimas con un número de lecturas superior a 30X en la isoforma principal del gen, con una frecuencia alélica de la variante (VAF) mayor a un 40%, una MAF ≥1%, y representadas en al menos un 5% de la cohorte de pacientes. 4.1.2.3. Análisis estadístico Para el análisis de los datos se definió una versión bayesiana de un regresor logístico con regularización L1 (LASSO), denominado Regresión Logística Bayesiana (del inglés BLR). A modo de resumen en una primera fase se aplicó este modelo para identificar qué variables resultan más relevantes para la predicción de cada una de las complicaciones post-trasplante. Una vez hecha la selección de características, en una segunda fase, se aplicó un clasificador basado en Procesos Gaussianos (GP) para clasificar a los pacientes a partir de la estimación de la probabilidad de alto riesgo. A partir de este análisis se diseñaron distintos modelos de riesgo para cada una de las complicaciones post-trasplante incluidas en este estudio. La base fue desarrollar un modelo que permitiera realizar una selección de variables (con reducción de la dimensionalidad) en función de su importancia para la clasificación sin perder interpretabilidad. Es decir, obtener la probabilidad de riesgo alto teniendo en cuenta todas las variables de entrada. A continuación, se presenta de manera detallada la metodología para seleccionar las variables genético/clínicas incluidas en los modelos de cada complicación post-trasplante que permitieran clasificar a los pacientes de alto riesgo de desarrollar estas complicaciones post-trasplante. Paso I. Selección de variables mediante BLR (versión probabilística de un regresor logístico) La principal ventaja de los modelos probabilísticos es que se aprenden distribuciones de probabilidad y, por tanto, se tiene una estimación de la incertidumbre en torno a los valores estimados (la desviación estándar (std)). El objetivo fue desarrollar un modelo que permitiera realizar una selección de variables, en función de su importancia para la clasificación y sin perder interpretabilidad. PACIENTES Y MÉTODOS 58 Para construir cada modelo se tuvieron en cuenta tres componentes principales: los datos de entrada X (datos genéticos y clínicos), los pesos asociados a las variables de entrada W (pesos asociados a cada variable de entrada; uno para cada variable + bias (sesgo: proporciona información sobre la tendencia del modelo a sobreestimar o subestimar una variable, cuantifica el error sistemático del modelo)) y la complicación que se intenta predecir Y (predecir el alto riesgo o bajo riesgo para una complicación determinada). Con este método se establece que los pesos asociados a las variables que no sean relevantes para la predicción tomen valor cero y que, de esta forma, solo las variables relevantes tengan pesos no nulos. Para forzar esto se asume que cada peso sigue una distribución Laplaciana con media en cero, es decir, se fuerza que el valor más probable a priori (antes de ver los datos) para los pesos sea cero. El siguiente paso fue definir cómo se relacionan las tres componentes: X, Y y W. La probabilidad de que Y tome un determinado valor viene dada por una combinación lineal de las distintas variables de entrada (X) (esto significa que el alto o bajo riesgo de desarrollar una complicación viene dada por la combinación de las distintas variables de entrada). La contribución de cada variable en esa combinación lineal viene dada por el vector de pesos W, por lo que las variables más relevantes o informativas de cara a la predicción tendrán un peso mayor que las no informativas. Por ello se definen los pesos (valores W) de cada variable de entrada que explican el desarrollo de cada complicación (es decir, definir la probabilidad (valor dentro del intervalo [0,1]) de los distintos pesos dados los datos observados). Para ello el sistema “aprende” de la distribución de los datos. El proceso de aprendizaje se hace maximizando la ELBO (Evidence Lower Bound), lo cual permite inferir qué valores de w son más probables dadas las observaciones sin grandes desviaciones de la distribución a priori (regularización). Como resultado final se obtiene una media (valor más probable) y una varianza (confianza sobre estos valores) para cada uno de los pesos. El modelo aprende esta distribución mediante las muestras de entrenamiento y, así, se obtiene una media (valor más probable) y una incertidumbre (varianza) para cada peso, teniendo un peso para cada variable. Una varianza pequeña informa que el modelo está muy seguro del valor estimado, mientras que una varianza grande indica que el modelo muestra incertidumbre sobre el valor estimado. La obtención de los pesos y selección de las variables finales se hizo mediante LOO (Leave One Out) dado el relativamente reducido número de observaciones (casos). Consiste en hacer N entrenamientos (N = número de muestras) dejando una muestra en test y N-1 muestras en train, rotando la muestra que se queda en test. De esta forma se obtiene una distribución de pesos PACIENTES Y MÉTODOS 59 para cada entrenamiento, y para los resultados finales se promedian las medias y las varianzas. De esta forma se asegura que los resultados no están sobreajustados a una partición concreta de los datos. El valor final se obtiene promediando las N predicciones correspondientes a las N muestras de los pesos. De esta forma se obtiene una predicción más robusta, porque se tiene en cuenta la varianza presente en los pesos. A partir de este procedimiento se seleccionaron las 15 variables más relevantes para cada complicación. Paso II. Clasificación GP Una vez seleccionadas las 15 variables más relevantes, se entrenó un GP con esas 15 variables para determinar la capacidad de predicción de esas variables. La idea principal de un GP es modelar la distribución subyacente de las variables de entrada X junto con la etiqueta Y como una distribución Gaussiana multivariante (de más de una dimensión). Un GP está definido por una función de media y una función de covarianza. La media es una función de las variables de entrada (X) y la covarianza es una función que expresa la dependencia entre los distintos puntos, la cual se conoce como kernel. En este caso también se realizaron distintas particiones. Se hicieron 200 particiones aleatorias de train/test. Para cada partición entrenamos un GP con los datos de train y obtenemos área bajo la curva (AUC) para los datos de test. Finalmente, se obtuvo el promedio de las 200 AUCs correspondientes a las 200 particiones y la std. Una vez seleccionadas las 15 variables para cada modelo teniendo en cuenta el AUC y el número de variables (Anexo V) se seleccionaron aquellas de mayor riesgo que tenían más relevancia para cada modelo predictivo. Posteriormente teniendo en cuenta la sensibilidad, especificidad, falsos positivos y falsos negativos (en ambos casos poniendo el límite en un 15%) se seleccionó el mejor punto de corte para la posterior estratificación de los pacientes en alto o bajo riesgo de acuerdo con el modelo seleccionado para cada complicación post-trasplante. 4.1.2.4. Análisis funcional de los genes incluidos en los modelos seleccionados Para buscar una relación funcional entre los genes incluidos en los modelos finalmente seleccionados y poder establecer funciones comunes se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento de estos genes con un software online denominado “Enrichr”, mediante el cual se realizó un análisis de significación biológica. PACIENTES Y MÉTODOS 60 Enrichr es una herramienta de análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Contiene bibliotecas de genes para la regulación de la transcripción, vías e interacciones de proteínas, ontología genética (del inglés Gene Ontology (GO), permite describir un gen/producto génico en detalle, considerando tres aspectos principales: su función molecular, el proceso biológico en el que participa y su ubicación celular), firmas de células tratadas con fármacos y expresión de genes en diferentes células y tejidos. Las bibliotecas de genes provienen de más de 70 recursos y contienen más de 200.000 conjuntos de genes anotados. El análisis de enriquecimiento es un método computacional para determinar relaciones funcionales de un conjunto de genes al compararlo con conjuntos de genes anotados que representan el conocimiento biológico previo. El análisis de enriquecimiento comprueba si un conjunto de genes se superpone significativamente con conjuntos de genes anotados. 4.2. Bloque 2. Polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida asociados a complicaciones post-trasplante 4.2.1. Pacientes Se seleccionaron de manera retrospectiva 182 pacientes con una NH sometidos a un haplo-TPH con Cy post-trasplante realizado de manera consecutiva en el Hospital General Universitario Gregorio Marañón entre diciembre de 2007 y junio de 2019. Las características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 7. La profilaxis de EICR consistió en altas dosis de Cy (50 mg/kg) administrada los días +3 y +4 después del trasplante, seguido por un inhibidor de la calcineurina (como tacrolimus) y micofenolato 10 mg/kg/8h desde el día +5. En ausencia de EICR, el micofenolato se discontinuó al día +35. El inhibidor de la calcineurina se retiró entre los días +60 y +90 en ausencia de EICR y se interrumpió el día +120. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital General Universitario Gregorio Marañón y todos los pacientes incluidos en el estudio firmaron un consentimiento informado de acuerdo con la declaración de Helsinki. La información relativa a pacientes y donantes se recogió de la historia clínica electrónica. PACIENTES Y MÉTODOS 61 Tabla 7. Características clínicas de la cohorte de pacientes sometidos a un Haplo-TPH incluidos en el estudio. Otros*: anemia aplásica, leucemia linfática crónica, leucemia mieloide crónica. Variable Cohorte (n=182) Edad receptor. Mediana (rango), años 48 (16-67) Edad donante. Mediana (rango), años 40 (14-74) Sexo receptor (Hombre/Mujer) 122/60 Sexo donante (Hombre/Mujer) 100/82 Diagnóstico, n (%) Leucemia Mieloide Aguda 65 (35,7) Linfoma no Hodgkin 25 (13,7) Leucemia Linfoide Aguda 19 (10,4) Síndrome Mielodisplásico 18 (9,9) Mieloma Múltiple 5 (2,7) Linfoma de Hodgkin 21 (11,5) Otros* 29 (15,9) Enfermedad pre-trasplante, n (%) Enfermedad activa o respuesta parcial 79 (43,4) Respuesta completa 103 (56,6) Régimen de acondicionamiento, n (%) Mieloablativo 82 (45,1) Intensidad reducida 100 (54,9) Trasplante previo, n (%) Trasplante autólogo 46 (25,3) Trasplante alogénico 18 (9,9) 4.2.2. Métodos 4.2.2.1. Diseño panel de secuenciación masiva Se realizó una búsqueda bibliográfica de los genes que codifican para las enzimas implicadas en el metabolismo de la Cy, dado que se administra como un profármaco y para llevar a cabo su función necesita ser activada previamente. Se seleccionaron un total de 13 genes implicados en la activación y detoxificación de la Cy (CYP3A4, CYP3A5, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, GSTA1, GSTM1, GSTP1, GSTT1, ALDH1A1 y ALDH3A1) (Tabla 8). En este panel de NGS se diseñaron sondas para detectar regiones codificantes. PACIENTES Y MÉTODOS 62 Tabla 8. Genes relacionados con el metabolismo de la ciclofosfamida incluidos en el panel custom de NGS. El término “ENST” de la columna de isoforma canónica hace referencia al identificador del transcrito de cada gen. Esta información ha sido obtenida de la base de datos online para genomas de eucariotas denominada “Ensembl”. Gen Isoforma Canónica ALDH1A1 ENST00000297785.3 ALDH3A1 ENST00000457500.2 CYP2A6 ENST00000301141.5 CYP2B6 ENST00000324071.4 CYP2C19 ENST00000371321.3 CYP2C8 ENST00000371270.3 CYP2C9 ENST00000260682.6 CYP3A4 ENST00000336411.2 CYP3A5 ENST00000222982.4 GSTA1 ENST00000334575.5 GSTM1 ENST00000309851.5 GSTP1 ENST00000398606.3 GSTT1 ENST00000248935.5 Se purificó ADN genómico de SP o MO del receptor antes del trasplante mediante el kit Maxwell® RSC Blood DNA (Promega, Madison, WI, EE.UU.). El genotipado se llevó a cabo mediante un panel custom de NGS de enriquecimiento por captura según el protocolo del fabricante (Kit xGen® Lockdown® Probes and Panels_IDT; IDT, EE.UU.) utilizando 50 ng de ADN. Las librerías se secuenciaron en la plataforma MiSeq (2x101-paired-end; Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). El panel se aplicó a todos los receptores ya que el metabolismo de la Cy en su mayor parte se produce en las células hepáticas. Solamente hay una parte del metabolismo de este fármaco que ocurre en las células hematopoyéticas que es mediante la ALDH. Por lo tanto, primero se aplicó el panel en todos los receptores y posteriormente solamente se estudió en las muestras del donante las variantes encontradas en la ALDH. 4.2.2.2. Análisis de las variables genéticas. Anotación y filtrado de variantes Los archivos FASTQ se alinearon con el genoma humano de referencia (versión GRCh37/hg19) utilizando la herramienta Burrows Wheeler Alignment v0.7.9a-isis.1.01. La identificación o llamada de variantes se realizó utilizando el algoritmo GATK. Se utilizó Integrative Genomics Viewer (IGV) para visualizar las variantes alineadas con el genoma de referencia y comprobar los posibles errores de secuenciación. Se utilizó el software BaseSpace (Illumina, EE.UU.) que proporcionaba la infraestructura y la interfaz para el análisis bioinformático. Se analizaron los polimorfismos localizados en regiones codificantes. Se seleccionaron aquellos con una profundidad superior a 30x en la isoforma canónica del gen, una VAF≥ 0,4 y que estuvieran representados en al menos el 5% en nuestra cohorte. Además, se utilizaron bases de datos PACIENTES Y MÉTODOS 63 poblacionales (GenomAD y 1000 Genomes) para consultar la MAF de cada uno de ellos, con el fin de identificar variantes con MAF ≥1%. Además, se utilizó la base de datos Ensembl para analizar los genes parálogos de las enzimas incluidas en el panel de NGS (Anexo III) y así garantizar la veracidad de las variantes encontradas. El polimorfismo rs3957357 en GSTA1, incluido en el haplotipo GSTA1*B, y el polimorfismo rs9332242 en CYP2C9 no deberían seleccionarse de acuerdo con los filtros descritos anteriormente, ya que no son variantes localizadas en región codificante. Sin embargo, estos polimorfismos cumplieron con los criterios de profundidad, VAF y estar en al menos un 5% de la cohorte. Además, a través del programa IGV, pudimos verificar la existencia de estas variantes. Por estas razones, ambos polimorfismos fueron incluidos en nuestro estudio. 4.2.2.3. Detección de polimorfismos de ALDH en donantes Del total de polimorfismos obtenidos en el panel de NGS utilizando los filtros establecidos previamente en el análisis de las muestras de los receptores, se seleccionaron los 2 SNPs en la región codificante de ALDH (rs2228100 y rs887241) (Tabla 20). El estudio de los SNPs de ALDH se realizó en las muestras de los donantes mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el genotipado rhAmpSNP (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) con un sistema LightCycler 480 (Roche, Suiza) según el protocolo del fabricante. 4.2.2.4. Análisis estadístico Las variables cuantitativas se expresaron como mediana y rango. Las variables categóricas se expresaron como frecuencia y porcentaje. Se utilizó el test exacto de Fisher para comparar la distribución de las variables categóricas. La incidencia acumulada (IA) se calculó mediante el test de fine-grey desde el momento en que se alcanzó la remisión completa hasta la fecha del evento o del último seguimiento (para aquellos pacientes que no sufrieron ningún evento) o la fecha de aparición del riesgo competitivo (para aquellos pacientes que fallecieron o fueron trasplantados sin aparición de eventos). El riesgo de enfermedad se evaluó mediante el cálculo de los cocientes de subhazard ratio (SHR) y sus intervalos de confianza (IC) del 95%. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Para el análisis multivariante se utilizó el método de regresión de riesgos competitivos, incluyendo como variables independientes todas las variables con un valor p<0,05 en el análisis univariante para los posibles predictores de complicaciones post-trasplante. PACIENTES Y MÉTODOS 64 Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS v.26 (IBM Corporation, EE.UU.) y la versión 3.5.1 de R, paquete "cmprsk". Resultados RESULTADOS 67 5. RESULTADOS Los resultados de esta tesis se presentan en dos apartados diferentes. El primero de ellos está orientado al estudio de polimorfismos en genes de citocinas y su correlación con complicaciones post-trasplante después de un alo-TPH HLA-idéntico. En el segundo apartado se muestran los resultados correspondientes al estudio de polimorfismos en genes del metabolismo de la Cy, en pacientes que hayan recibido un haplo-TPH, y su correlación con complicaciones post- trasplante. En la presentación de estos resultados el término polimorfismo/variable genética hace referencia a la variante minoritaria de esa posición que se asocia al desarrollo de complicaciones post-trasplante. 5.1. Bloque 1. Polimorfismos en genes de citocinas asociados a complicaciones post-trasplante Para este estudio se seleccionaron 132 genes correspondientes a citocinas, donde se incluyeron 73 genes correspondientes a interleucinas y 59 al grupo de quimiocinas, a estudiar en una cohorte de 90 pacientes sometidos a un TPH HLA-idéntico. En este estudio se analizaron regiones codificantes y no codificantes, incluyendo regiones UTR, de splicing y regiones upstream y downstream. En base a los datos clínicos obtenidos para el estudio de lo 90 pacientes sometidos a un alo-TPH de donante HLA-idéntico (Tabla 5). La mediana de edad de los receptores y donantes fue de 44 años. La patología más frecuente fue la leucemia mieloide aguda (LMA) (32,2%), seguida del linfoma no Hodgkin o leucemia linfoide aguda. Estas tres neoplasias abarcan el 71% de los casos estudiados. En el 94,4% de los casos la fuente de progenitores hematopoyéticos fue SP. El régimen de acondicionamiento empleado en la mayoría de los casos fue mieloablativo (58,9%). 5.1.1. Estudio de variables genéticas mediante un panel de NGS 5.1.1.1. Características de calidad del panel de NGS En la Tabla 9 se muestran los resultados de calidad del análisis del panel de NGS utilizado en el bloque 1. RESULTADOS 68 Tabla 9. Resultados del análisis del panel de NGS allogenomics. *Cobertura media sin duplicados de PCR. Panel Allogenomics Cobertura media* 279x Porcentaje de duplicados 8,7% Porcentaje de lecturas on-target 92,5% Porcentaje de mapeado 99,9% 5.1.1.2. Resultados del panel de NGS Tras la aplicación de los filtros previamente descritos en el apartado de Pacientes y Métodos se obtuvieron un total de 737 polimorfismos en 119 genes (Anexo IV). De estos polimorfismos, 93 (12,6%) se localizaron en regiones codificantes, concretamente 91 eran variantes missense y otras dos variantes codificaban a un codón de stop. Del total de variables genéticas en regiones codificantes, 25 (26,9%) pertenecieron al grupo de quimiocinas, y las otras 68 (73,1%) al grupo de interleucinas (Figura 11). Por otra parte, de los 737 polimorfismos seleccionados, 644 se localizaron en regiones no codificantes (87,4%): regiones 3’ y 5’ UTR, regiones de splicing, upstream y downstream. Del total de polimorfismos en regiones no codificantes, 205 se incluyeron en el grupo de quimiocinas (31,8%) y 439 en el de interleucinas (68,1%) (Figura 11). Figura 11. Selección de variables en el panel de NGS de allogenomics usando la metodología descrita en Pacientes y Métodos. RESULTADOS 69 5.1.2. Asociación de polimorfismos en genes de citocinas y variables clínicas con complicaciones post-trasplante Para este estudio se incluyeron los 737 polimorfismos seleccionados en base a los filtros previamente descritos, así como las variables clínicas incluidas en la Tabla 5. Teniendo en cuenta el número de variables tan elevado se realizaron modelos de BLR para poder seleccionar las variables genético/clínicas más importantes implicadas en cada una de las complicaciones post- trasplante. Inicialmente se seleccionaron las 15 variables genético/clínicas más relevantes para cada complicación post-trasplante con la idea de reducir la dimensionalidad de los datos, pero sin perder interpretabilidad. De estas 15 variables, se seleccionaron un número concreto teniendo en cuenta el AUC y el número de variables (Tablas 11-17, Anexo V) para posteriormente volver a entrenar los modelos con las variables finalmente seleccionadas, con el fin de dar robustez al modelo elegido. En función de la presencia de las variables seleccionadas para cada modelo se calculó un valor para cada paciente. Posteriormente, acorde a los datos de sensibilidad y especificidad, así como a la ratio de falsos positivos y falsos negativos (se estableció un máximo del 15%), se seleccionaron los puntos de corte adecuados para realizar la estratificación de los pacientes en alto o bajo riesgo de desarrollar cada una de las complicaciones post-trasplante (Tabla 10 y Figura 12). En el Anexo VI se detallan los distintos puntos de corte seleccionables para cada una de las complicaciones post-trasplante. A continuación, se muestran los resultados obtenidos para cada una de las complicaciones post- trasplante desde la selección inicial de las 15 variables genético/clínicas más relevantes hasta el modelo finalmente seleccionado que permitió la estratificación de los pacientes en alto o bajo riesgo de desarrollar la complicación post-trasplante en estudio. En el Anexo VII se muestra un resumen del tipo de variable incluida en cada uno de los modelos genético/clínicos finalmente seleccionados. RESULTADOS 70 Tabla 10. Puntos de corte seleccionados para realizar la estratificación de los pacientes en alto/bajo riesgo para cada una de las complicaciones post-TPH. EICRa: Enfermedad de injerto contra receptor aguda; EICRc: Enfermedad de injerto contra receptor crónica; EICRc mod-sev: EICRc moderada-severa; MRT: Mortalidad relacionada con el trasplante; Neg: Negativos; Pos: Positivos; Pto: Punto; Rec: Recaída; SG: Supervivencia global; STD: Desviación estándar; S: Sensibilidad; E: Especificidad. Todos los datos referentes a las características del punto de corte se muestran en %. Pto de corte S STD (S) E STD (E) Neg. (media/STD) Falsos Neg. (media/STD) Pos. (media/STD) Falsos Pos. (media/STD) EICRa II-IV 0,6 74,77 14,21 73,5 15,91 31,78/9,50 15,53/9,27 41,55/10,57 11,14/7,30 EICRa III- IV 0,4 65,29 22,94 91,09 7,87 68,44/9,37 8,42/7,05 15,22/7,80 7,92/6,72 EICRc 0,5 83,28 14,56 58,99 23,26 22,88/9,89 10,20/9,51 52,92/12,37 14/11,06 EICRc mod-sev 0,4 87,88 14,24 84,34 14,06 50,04/12,71 5,23/5,95 36,08/11,29 8,65/7,41 Rec. 0,5 79,06 15,09 90,61 10,04 55,31/11,35 9,56/7,44 29,91/9,80 5,22/5,79 MRT 0,5 54,79 25,77 88,93 11,56 60,96/10,71 14,86/8,82 16,04/8,94 8,14/8,21 SG 0,6 57,39 17,55 86,81 12,41 43,5/9,83 22,36/9,08 27,64/9,2 6,5/6,94 5.1.3. Modelos predictivos genético/clínicos seleccionados para cada complicación post-trasplante Las complicaciones post-trasplante analizadas fueron EICRa II-IV, EICRa III-IV, EICRc, EICRc mod- sev, MRT, recaída y SG. La IA de EICRa fue del 56,7% para el grado II-IV y del 23,3% para el grado III-IV a los 100 días post-trasplante. En el caso de EICRc y EICRc mod-sev la IA a los 3 años post- trasplante fue del 43,3% y 27,8%, respectivamente. A su vez la IA de MRT a los 3 años fue del 24,4%. En cuanto a la recaída, la IA a los 2 años fue del 29%. La SG a los 2 años fue del 60%. En las Tablas 11-17 se nombran términos matemáticos que se definen a continuación: - Peso medio: peso medio obtenido para las particiones aleatorias de los datos. - Std peso medio: desviación típica del peso para las particiones aleatorias de los datos. - Var media: varianza media obtenida para las particiones aleatorias de los datos. - Std var media: desviación típica de la varianza obtenida para las particiones aleatorias de los datos. 5.1.3.1. EICRa II-IV El modelo clínico-genético inicial (AUC: 0,85) estaba formado por dos variables clínicas, la edad del donante y del receptor; y 13 variables genéticas (Tabla 11). De los polimorfismos seleccionados (13/15), en el grupo de interleucinas se incluyeron 9 variables genéticas (69,2%), y las otras 4 (30,8%) en el grupo de quimiocinas. En regiones no codificantes se localizaron 11 RESULTADOS 71 polimorfismos (84,6%) y los otros dos se localizaron en secuencias codificantes. Todas las variables genéticas asociadas al riesgo de EICRa II-IV se localizaron en el receptor, excepto los polimorfismos en CXCR4, IL24 e IL2RA. El modelo predictivo finalmente seleccionado (AUC:0,81; sensibilidad: 74,77% y especificidad: 73,53%) constaba de 7 variables (identificadas en azul en la Tabla 11) en donde las únicas variables clínicas que se seleccionaron fueron la edad del donante y receptor. Respecto a los polimorfismos incluidos, 3 de ellos pertenecieron al grupo de quimiocinas (60%) y los otros dos al grupo de interleucinas. Todos los polimorfismos se localizaron en regiones no codificantes. Sólo los polimorfismos en IL2RA y CXCR4 asociados a EICRa II-IV se detectaron en el donante. En cuanto a la capacidad de estratificación del riesgo de los pacientes acorde al modelo seleccionado se pudo observar que de los pacientes clasificados de alto riesgo de desarrollar EICRa II-IV el 80,8% de los pacientes desarrollaron esta patología a los 180 días post-trasplante. Mientras que sólo el 31,7% de los pacientes clasificados como de bajo riesgo desarrollaron EICRa II-IV (Figura 12). Tabla 11. Asociación de las 15 variables más relevantes para EICRa II-IV. D: Donante, R: Receptor; STD: Desviación estándar; Var: Varianza. En azul se identifican las variables finalmente incluidas en el modelo pre-TPH seleccionado. Variable Polimorfismo Localización D/R Peso Medio Std Peso Medio Var Media Std Var Media Edad - - D 0,71 0,05 0,24 0,13 CCL25 rs11671930 Upstream R 0,46 0,03 0,19 0,08 Edad - - R 0,36 0,03 0,24 0,07 IL26 rs2068016 Upstream R 0,35 0,03 0,17 0,06 CXCL13 rs1052563 3'UTR R 0,34 0,03 0,16 0,05 IL2RA rs12722485 Upstream D 0,33 0,02 0,16 0,06 CXCR4 rs2680880 5'UTR D 0,31 0,03 0,12 0,05 IL17RA rs11702918 3'UTR R 0,31 0,02 0,15 0,05 IL17RA rs887796 3'UTR R 0,28 0,03 0,12 0,05 IL12RB1 rs3746190 3'UTR R 0,27 0,02 0,11 0,06 IL10RA rs3135932 Missense R 0,26 0,02 0,12 0,05 CXCR5 rs45627033 3'UTR R 0,25 0,01 0,14 0,04 IL1RL1 rs10206753 Missense R 0,25 0,02 0,10 0,05 IL1RL1 rs10192157 Downstream R 0,25 0,01 0,10 0,06 IL24 rs142666392 Upstream D 0,24 0,02 0,13 0,04 RESULTADOS 72 5.1.3.2. EICRa III-IV En el modelo inicial de 15 variables (AUC: 0,89) como variable clínica únicamente se incluyó la edad del donante y 14 polimorfismos (Tabla 12). El 78,6% (11 variables) de los polimorfismos pertenecieron al grupo de interleucinas, y los otros 3 a quimiocinas (21,4%). En su mayoría (85,7%) los polimorfismos se localizaron en regiones no codificantes. Solo se encontraron dos variables genéticas de riesgo asociadas a EICRa III-IV localizadas en regiones codificantes, una en CCL25 y otra en IL4R. De las 3 quimiocinas seleccionadas dos de ellas se detectaron en el receptor. En el grupo de interleucinas, el 45,5% (5/11) de esas variables asociadas a riesgo de EICRa III-IV se localizaron en el receptor. Finalmente se seleccionó un modelo formado por 9 variables genéticas (AUC: 0,81; sensibilidad: 65,29% y especificidad: 91,09%) (identificadas en azul en la Tabla 12). En concreto 3 polimorfismos pertenecieron a quimiocinas (33,3%) y las otras 6 variables genéticas al grupo de interleucinas (66,7%). A excepción del polimorfismo en CCL25, todas las variables genéticas incluidas en este modelo se localizaron en secuencias no codificantes (88,9%). En las interleucinas el 50% de los polimorfismos se localizaron en el receptor, y el otro 50% en el donante. En cambio en las quimiocinas, 2/3 (66,6%) de los polimorfismos asociados a EICRa III- IV se detectaron en el receptor. Aplicando este modelo se observó que a los 180 días post-trasplante el 70% de los pacientes clasificados de alto riesgo desarrollaron esta complicación. Mientras que sólo el 10,3% de los pacientes clasificados de bajo riesgo mostraron EICRa III-IV (Figura 12). RESULTADOS 73 Tabla 12. Asociación de las 15 variables más relevantes para EICRa III-IV. D: Donante, R: Receptor; STD: Desviación estándar; Var: Varianza. En azul se identifican las variables finalmente incluidas en el modelo pre-TPH seleccionado. Variable Polimorfismo Localización D/R Peso Medio Std Peso Medio Var Media Std Var Media IL12RB1 rs3746190 3'UTR R 0,43 0,04 0,17 0,08 IL17A rs3819024 Upstream R 0,35 0,03 0,13 0,06 IL17RA rs4819962 3'UTR R 0,32 0,03 0,14 0,05 IL21R rs961914 5'UTR D 0,31 0,02 0,15 0,05 CCL25 rs1129763 Missense R 0,28 0,02 0,14 0,04 CXCR2 rs1126580 3'UTR R 0,27 0,02 0,13 0,07 CXCL16 rs76152703 3'UTR D 0,26 0,02 0,14 0,04 IL17D rs9579928 Upstream D 0,26 0,02 0,12 0,04 IL2RA rs12722602 3'UTR D 0,26 0,02 0,13 0,04 IL5RA rs17659353 3'UTR R 0,26 0,02 0,13 0,03 IL17A rs3819024 Upstream D 0,25 0,02 0,11 0,05 Edad - D 0,24 0,02 0,12 0,04 IL15RA rs2387089 Upstream D 0,24 0,02 0,11 0,04 IL6 rs62449495 Upstream R 0,24 0,02 0,12 0,04 IL4R rs1805010 Missense D 0,23 0,02 0,10 0,05 5.1.3.3. EICRc Aplicando modelos probabilísticos para la selección de las 15 variables más relevantes con la asociación de riesgo de EICRc sólo se seleccionaron variables genéticas (AUC: 0,90) (Tabla 13). Del total de polimorfismos, 11/15 (73,3%) pertenecieron al grupo de interleucinas y 4/15 (26,7%) al grupo de quimiocinas. Del total de las variables genéticas incluidas en el grupo de interleucinas, 4/11 (36,4%) se localizaron en regiones codificantes. Excepto esas 4 variables genéticas localizadas en región codificante, el resto de los polimorfismos (11/15; 73,3%) pertenecientes a interleucinas y quimiocinas se localizaron en secuencias no codificantes. En el grupo de quimiocinas se incluyeron 4 variables genéticas, todas ellas, excepto una, se detectaron en el donante. Por otro lado, del grupo de interleucinas asociadas al riesgo de EICRc, en su mayoría, 7/11 (63%) estaban localizadas en el receptor. Para esta complicación post-trasplante finalmente se desarrolló un modelo donde se incluyeron 4 variables genéticas (AUC: 0,73; sensibilidad: 83,28% y especificidad: 58,99%) (identificadas en azul en la Tabla 13). Todos los polimorfismos, excepto XCR1, se incluyeron en el grupo de interleucinas (3/4, 75%). En cuanto a la localización de estas variables genéticas, solo el polimorfismo en IL3R se encontró en región codificante, siendo los polimorfismos en regiones RESULTADOS 74 no codificantes los predominantes (3/4; 75%) en este modelo. Todos los polimorfismos de riesgo pertenecientes al grupo de interleucinas se localizaron en el receptor. La única quimiocina seleccionada, XCR1, se encontró en el donante. En base al modelo seleccionado se vio que a los 2 años post-trasplante el 76,7% de los pacientes clasificados de alto riesgo desarrollaron EICRc. Sin embargo, en ese período de tiempo el 30% de los pacientes clasificados de bajo riesgo desarrollaron EICRc (Figura 12). Tabla 13. Asociación de las 15 variables más relevantes para EICRc. D: Donante, R: Receptor; STD: Desviación estándar; Var: Varianza. En azul se identifican las variables finalmente incluidas en el modelo pre-TPH seleccionado. Variable Polimorfismo Localización D/R Peso Medio Std Peso Medio Var Media Std Var Media IL2RA rs12722485 Upstream R 0,44 0,04 0,21 0,08 IL7R rs10063294 3'UTR R 0,41 0,03 0,16 0,07 XCR1 rs2371 Upstream D 0,30 0,03 0,12 0,05 IL3RA rs17883366 Missense R 0,29 0,03 0,13 0,05 IL27RA rs35026308 Missense R 0,27 0,03 0,12 0,05 IL7R rs756271586 5'UTR R 0,26 0,02 0,14 0,04 IL17F rs2397084 Missense D 0,25 0,02 0,14 0,03 CXCL16 rs11658971 3'UTR D 0,24 0,02 0,14 0,05 IL17A rs7747909 3'UTR D 0,23 0,02 0,12 0,05 IL3RA rs11480 3'UTR R 0,23 0,02 0,12 0,05 IL7 rs6997891 Upstream D 0,23 0,02 0,13 0,03 CXCL12 rs2839683 Upstream R 0,22 0,02 0,12 0,04 XCR1 rs201114927 Upstream D 0,22 0,02 0,11 0,06 IL17RA rs887796 3'UTR R 0,22 0,02 0,11 0,04 IL27RA rs35026308 Missense D 0,22 0,02 0,12 0,04 5.1.3.4. EICRc moderada-severa En el modelo genético inicial de las 15 variables (AUC: 0,91) más relevantes para esta complicación post-trasplante se seleccionaron 4 polimorfismos en el grupo de quimiocinas (26,7%) y 11 polimorfismos en interleucinas (73,3%) (Tabla 14). Solo se seleccionaron 3 variables genéticas en regiones codificantes (20%), todas ellas incluidas en el grupo de las interleucinas. El resto de polimorfismos en interleucinas y quimiocinas se localizaron en regiones no codificantes (80%). En el grupo de quimiocinas el 50% de los polimorfismos se localizaron en el donante y el otro 50% en el receptor. En cambio, en el grupo de interleucinas, de las 11 variables genéticas, 6 de ellas (54,5%) se localizaron en el donante. RESULTADOS 75 Acorde al número de variables y su peso asociado finalmente se seleccionó un modelo genético formado por 9 polimorfismos (AUC: 0,88; sensibilidad: 87,88% y especificidad: 84,34%) (identificados en azul en la Tabla 14). Del total de las variables genéticas incluidas, el 88% (8/9 variables) pertenecieron a interleucinas. A excepción de IL17RC e IL12RB1, todas las variables se encontraron en secuencias no codificantes (77,7%). En el grupo de interleucinas, 5/8 polimorfismos (62,5%) se asociaron con riesgo de EICRc mod-sev por su presencia en el receptor. En cambio la única quimiocina incluida en el modelo se localizó en el donante en región no codificante. Aplicando el modelo en la cohorte de estudio, el 81,4% de los pacientes de alto riesgo desarrollaron EICRc mod-sev a los 2 años post-trasplante. Frente a los clasificados de bajo riesgo en donde el 8,8% acabaron desarrollando esta patología (Figura 12). Tabla 14. Asociación de las 15 variables más relevantes para EICRc moderada-severa. D: Donante, R: Receptor; STD: Desviación estándar; Var: Varianza. En azul se identifican las variables finalmente incluidas en el modelo pre-TPH seleccionado. Variable Polimorfismo Localización D/R Peso Medio Std Peso Medio Var Media Std Var Media IL7R rs10063294 3'UTR R 0,46 0,04 0,20 0,10 IL7R rs72742450 3'UTR R 0,44 0,03 0,17 0,06 IL17RC rs279549 Missense R 0,38 0,03 0,17 0,06 CXCR6 rs3774639 Upstream D 0,36 0,03 0,14 0,08 IL10RA rs4252243 Upstream R 0,34 0,03 0,16 0,04 IL25 rs7145551 Upstream D 0,31 0,03 0,13 0,05 IL12RB1 rs11575934 Missense R 0,30 0,03 0,13 0,04 IL7 rs6997891 Upstream D 0,27 0,02 0,14 0,04 IL11 rs2298885 3'UTR D 0,26 0,03 0,12 0,04 ACKR3 rs34135799 Upstream R 0,24 0,02 0,14 0,04 CXCR4 rs17848385 Upstream D 0,24 0,02 0,13 0,03 IL25 rs7145531 Upstream D 0,24 0,02 0,12 0,04 IL5RA rs2290610 Missense D 0,24 0,03 0,11 0,04 CCL16 rs2063979 3'UTR R 0,23 0,02 0,13 0,03 IL11 rs1042505 3'UTR D 0,23 0,02 0,12 0,04 5.1.3.5. Mortalidad relacionada con el trasplante En el caso de la mortalidad tóxica en el modelo inicial de las 15 variables más relevantes solo se incluyeron variables genéticas (AUC: 0,89) (Tabla 15). De los polimorfismos seleccionados, 5 RESULTADOS 76 pertenecieron al grupo de quimiocinas (33,3%) y los otros 10 al grupo de interleucinas (66,6%). Todos los polimorfismos se localizaron en regiones no codificantes. En el grupo de quimiocinas 3/5 variables genéticas seleccionadas se localizaron en el receptor. En cambio, en el grupo de interleucinas, el 50% se detectaron en el receptor y el 50% en el donante. El modelo finalmente seleccionado para la MRT se compuso de 6 variables genéticas (AUC: 0,74; sensibilidad: 54,79% y especificidad: 88,93%) (identificadas en azul en la Tabla 15). Todas las variables incluidas se localizaron en secuencias no codificantes. Al grupo de interleucinas pertenecieron 4/6 polimorfismos (66,7%). Los polimorfismos pertenecientes a quimiocinas (2/6; 33,3%) se detectaron en el receptor. En cambio, en el caso de las interleucinas asociadas a mayor riesgo de MRT, el 50% se localizaron en el donante y el otro 50% en el receptor. Tras la estratificación de los pacientes en alto o bajo riesgo en base al punto de corte seleccionado se observó que a los 2 años post-trasplante la IA de MRT en los pacientes clasificados de alto riesgo fue del 47,1%. En cambio, la IA de MRT en pacientes de bajo riesgo fue de 13,2% a los 2 años (Figura 12). Tabla 15. Asociación de las 15 variables más relevantes para la MRT. D: Donante, R: Receptor; STD: Desviación estándar; Var: Varianza. En azul se identifican las variables finalmente incluidas en el modelo pre-TPH seleccionado. Variable Polimorfismo Localización D/R Peso Medio Std Peso Medio Var Media Std Var Media IL20RB rs835634 Upstream R 0,36 0,03 0,14 0,06 IL20RB rs835632 Upstream R 0,35 0,03 0,14 0,06 IL12RB1 rs404733 3'UTR D 0,31 0,02 0,13 0,06 CXCL11 rs9994667 3'UTR R 0,30 0,03 0,14 0,05 IL15RA rs2387089 Upstream D 0,29 0,02 0,15 0,06 CXCL2 rs9131 3'UTR R 0,28 0,02 0,14 0,05 CCL28 rs11741797 3'UTR R 0,27 0,02 0,11 0,06 IL12RB1 rs3746190 3'UTR D 0,26 0,02 0,11 0,04 CXCL12 rs1801157 Downstream D 0,25 0,02 0,11 0,04 IL12B rs34324765 3'UTR R 0,25 0,02 0,12 0,04 IL20RB rs55871480 Upstream R 0,25 0,02 0,13 0,07 IL10 rs1800893 Upstream D 0,24 0,02 0,11 0,05 IL10 rs3024496 3'UTR D 0,24 0,02 0,12 0,06 CCL16 rs2063979 3'UTR D 0,23 0,02 0,13 0,04 IL6 rs62449495 Upstream R 0,23 0,02 0,13 0,04 RESULTADOS 77 5.1.3.6. Recaída Para este complicación, inicialmente se seleccionó un modelo genético de 15 variables genéticas (AUC: 0,94) donde el 66,6% (10/15) de los polimorfismos correspondieron al grupo de quimiocinas, y 5 (33,3%) al grupo de interleucinas (Tabla 16). En su mayoría, 14/15 variables genéticas (93,3%), se localizaron en secuencias no codificantes. En el grupo de las interleucinas, salvo un polimorfismo en IL7R, se localizaron en el receptor (80%); en cambio en las quimiocinas 7/10 polimorfismos se detectaron en el receptor. En el caso de las interleucinas, 3/5 variables genéticas se localizaron en el gen IL21R (Tabla 16). En el modelo final seleccionado se incluyeron 10 polimorfismos (AUC: 0,93; sensibilidad: 79,06% y especificidad: 90,61%) (identificados en azul en la Tabla 16). Del total de variables incluidas en el modelo, 3 variables (30%) se localizaron en una única interleucina (IL21R), y 7 (70%) en varias quimiocinas. Todas las variables genéticas se localizaron en regiones no codificantes. En el grupo de interleucinas, todos los polimorfismos se localizaron en el receptor. En el grupo de quimiocinas, 5/7 (71,4%) variables se detectaron en el receptor, y del total de las variables seleccionadas, 3/7 (42,8%) pertenecieron a CCL15. En base al modelo seleccionado el 81,5% de los pacientes de alto riesgo recayeron a los 2 años post-trasplante. En cambio, de los pacientes clasificados de bajo riesgo, solamente recayeron el 12% (Figura 12). RESULTADOS 78 Tabla 16. Asociación de las 15 variables más relevantes para la recaída. D: Donante, R: Receptor; STD: Desviación estándar; Var: Varianza. En azul se identifican las variables finalmente incluidas en el modelo pre-TPH seleccionado. Variable Polimorfismo Localización D/R Peso Medio Std Peso Medio Var Media Std Var Media IL21R rs8060368 Upstream R 0,50 0,04 0,20 0,09 CCL15 rs2293788 5'UTR D 0,45 0,03 0,20 0,07 CCL21 rs11574915 5'UTR R 0,37 0,03 0,17 0,05 IL21R rs961914 5'UTR R 0,35 0,02 0,17 0,05 CXCL11 rs9994667 3'UTR R 0,34 0,03 0,14 0,06 IL21R rs2189521 5'UTR R 0,34 0,02 0,12 0,06 CXCR4 rs2680880 5'UTR D 0,30 0,03 0,13 0,05 CCL15 rs2293788 5'UTR R 0,28 0,01 0,15 0,04 CCL15 rs41508645 5'UTR R 0,28 0,02 0,15 0,03 CCR10 rs3760384 Upstream R 0,28 0,02 0,11 0,07 CXCL2 rs9131 3'UTR R 0,28 0,02 0,12 0,05 IL7R rs10063294 3'UTR D 0,28 0,02 0,12 0,05 CCL25 rs2032887 Missense D 0,27 0,03 0,13 0,05 CCR10 rs2271029 5'UTR R 0,27 0,02 0,11 0,05 IL33 rs1048274 3'UTR R 0,27 0,03 0,14 0,06 5.1.3.7. Supervivencia global El modelo inicial con las 15 variables más relevantes (AUC: 0,86) incluyó únicamente variables genéticas (Tabla 17). En el grupo de quimiocinas se localizaron 8 polimorfismos (53,3%), de los cuales 3 de ellos pertenecieron al gen CCL16 y otros dos a CCL25, y las otras 7 variables genéticas (46,6%) se incluyeron en el grupo de interleucinas. Del total de polimorfismos, 11 se localizaron (73,3%) en secuencias no codificantes, de los cuales 5 (45,5%) eran quimiocinas y 6 (54,5%) interleucinas. En este modelo, 6/15 (40%) variables se localizaron en el receptor, en donde 3 pertenecieron al grupo de interleucinas y las otras 3 al grupo de quimiocinas. Finalmente, para este modelo únicamente se seleccionaron 7 variables genéticas (AUC: 0,78; sensibilidad: 57,39% y especificidad: 86,81%) (identificadas en azul en la Tabla 17). Únicamente se seleccionaron dos genes en interleucinas. El resto de las variables genéticas 5/7 (71,4%) se incluyeron en el grupo de quimiocinas. Todos los polimorfismos localizados en quimiocinas, excepto CCL25, e interleucinas (85,71%) se localizaron en regiones no codificantes, en concreto regiones UTR. En este caso 2/7 (28,6%) se localizaron en regiones UTR del gen CCL16. Todas las quimiocinas, excepto CCL12 y CXCL11, y las interleucinas incluidas se detectaron en el donante. RESULTADOS 79 Aplicando el modelo seleccionado se observó que a los 5 años post-trasplante solo 17,3% de los pacientes clasificados de alto riesgo siguen vivos versus el 68,6% de los pacientes de bajo riesgo (Figura 12). Tabla 17. Asociación de las 15 variables más relevantes para la supervivencia global. D: Donante, R: Receptor; STD: Desviación estándar; Var: Varianza. En azul se identifican las variables finalmente incluidas en el modelo pre-TPH seleccionado. Variable Polimorfismo Localización D/R Peso Medio Std Peso Medio Var Media Std Var Media CXCL11 rs9994667 3'UTR R 0,55 0,05 0,19 0,10 CCL21 rs11574915 5'UTR R 0,45 0,04 0,20 0,06 CCL16 rs2063979 3'UTR D 0,34 0,02 0,16 0,05 CCL16 rs146038760 3'UTR D 0,34 0,02 0,17 0,05 IL10RB rs1058867 3'UTR R 0,33 0,025 0,13 0,056 CCL25 rs2032887 Missense D 0,32 0,03 0,15 0,06 IL12RB1 rs3746190 3'UTR D 0,32 0,02 0,14 0,06 CCL16 rs33995560 3'UTR D 0,30 0,02 0,15 0,04 IL1A rs17561 Missense D 0,30 0,03 0,12 0,05 CCL15 rs854625 Missense D 0,29 0,02 0,15 0,04 CCL25 rs2032887 Missense R 0,29 0,02 0,14 0,05 IL10 rs1800893 Upstream D 0,29 0,02 0,10 0,04 IL12B rs34324765 3'UTR R 0,29 0,03 0,13 0,05 IL20RB rs55871480 Upstream R 0,29 0,02 0,11 0,06 IL10 rs3024496 3'UTR D 0,28 0,02 0,09 0,05 RESULTADOS 80 Figura 12. Estratificación de los pacientes en alto/bajo riesgo de desarrollar las complicaciones post-TPH acorde al modelo predictivo y el punto de corte seleccionados. RESULTADOS 81 5.1.4. Relaciones funcionales de los genes incluidos en los modelos predictivos Teniendo en cuenta los genes incluidos en los modelos para las distintas complicaciones post- trasplante finalmente se seleccionaron 30 genes de citocinas (17 interleucinas y 13 quimiocinas). Mediante el análisis de enriquecimiento con el software online denominado “Enrichr” se obtuvieron las cuatro vías de señalización más relevantes que relacionaban funcionalmente los genes incluidos en los modelos (Tabla 18). Las vías de señalización obtenidas fueron: señalización de las citocinas, quimiocinas, JAK/STAT e IL17/TH17 obteniendo una elevada significación estadística para cada una con un p-valor de 2,5*10-56, 1,48*10-27, 4,04*10-18 y 4,97*10-9, respectivamente. En la primera vía de señalización correspondiente a citocinas se incluyeron el 100% de los genes seleccionados en los modelos predictivos. La segunda vía relacionada con las quimiocinas, estaba representada por 13/30 citocinas (43,3%), concretamente se incluyeron todas las quimiocinas. Otra vía seleccionada fue la vía de señalización JAK/STAT donde se incluyeron 13/30 citocinas (43,3%), todas ellas correspondientes a interleucinas. Por último, la vía de señalización IL17/TH17 estuvo formada por 5/30 citocinas (16,6%), donde se incluyeron cuatro interleucinas y una quimiocina. Respecto a los modelos seleccionados, todos los genes se relacionaron con la vía de las citocinas. Además, concretamente en el modelo seleccionado para EICRa II-IV se seleccionaron cinco genes, donde dos fueron interleucinas (40%) incluidas en la vía de JAK/STAT; y las otras tres quimiocinas (60%) correspondían a la vía de quimiocinas. Para el modelo de EICRa III-IV se incluyeron nueve genes, donde seis fueron interleucinas (66,7%) de las cuales 4 estaban relacionadas con la vía de JAK/STAT y otras dos interleucinas se incluyeron en la vía IL17/TH17; además se incluyeron 3 quimiocinas (33,3%) relacionadas con la propia señalización de quimiocinas. En el caso de EICRc de los cuatro genes incluidos, tres fueron interleucinas (75%) relacionadas con la vía JAK/STAT y la única quimiocina (25%) se incluyó en la vía de señalización propia de estas citocinas. Para el modelo de EICRc mod-sev se seleccionaron 8 genes, en donde 7 (87,5%) fueron interleucinas y 5 de ellas se incluyeron en la vía de señalización JAK/STAT; las otras dos restantes se relacionaron con la vía IL17/TH17; y una única quimiocina (12,5%). En el modelo de MRT se incluyeron 5 genes, donde 3 fueron interleucinas (60%) relacionadas con la vía de señalización JAK/STAT; y las dos quimiocinas (40%) se incluyeron en la vía de señalización propia de ellas y una de estas quimiocinas también se relacionó con la vía IL17/TH17. Para la recaída el modelo constaba de 6 genes, una única interleucina (16,7%) relacionada con la señalización de JAK/STAT y los otros 5 genes fueron quimiocinas (83,3%) implicadas en la vía de RESULTADOS 82 señalización de estas moléculas. Por último, en el modelo de SG se seleccionaron 6 genes, en su mayoría formado por quimiocinas 4/6 (66,7%), todas incluidas en las vías de señalización de quimiocinas, y dos interleucinas (33,3%) relacionadas con la vía de señalización en JAK/STAT. Tabla 18. Relación funcional entre los genes seleccionados para cada complicación post-trasplante y la vía de señalización en la que participan, así como modelos predictivos de las complicaciones en las que se ha seleccionado cada gen. En azul se muestran los procesos de señalización en los que están involucrados los genes seleccionados en los modelos. Y en verde se muestra el modelo al que pertenece cada uno de los genes incluidos en los modelos. Vía de señalización Modelos predictivos Citocinas Quimiocinas JAK/STAT IL17/ TH17 EICRa II-IV EICRa III-IV EICRc EICRc mod- sev MRT Recaída SG IL7 IL11 IL17A IL17D IL25 IL26 IL2RA IL3RA IL7R IL10RA IL10RB IL12RB1 IL15RA IL17RA IL17RC IL20RB IL21R CCL15 CCL16 CCL21 CCL25 CXCL2 CXCL11 CXCL13 CXCL16 CCR10 CXCR2 CXCR4 CXCR6 XCR1 5.2. Bloque 2. Polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida asociados a complicaciones post-trasplante Se secuenciaron 182 pacientes seleccionados inicialmente para evaluar si existía alguna correlación entre polimorfismos en genes del metabolismo de la Cy y distintas complicaciones post-trasplante. El panel utilizado en este bloque fue un panel de NGS custom de 13 genes implicados en el metabolismo de la Cy incluyendo enzimas de activación y detoxificación, tal y RESULTADOS 83 como se ha detallado previamente en el apartado de Pacientes y Métodos. En este panel se analizaron las regiones codificantes para las que estaban diseñadas las sondas del panel de NGS. La mediana de edad de los pacientes y donantes fue de 48 y 40 años, respectivamente. En su mayoría los pacientes (35,7%) fueron diagnosticados de LMA. El régimen de acondicionamiento empleado en la mayoría de los casos fue de intensidad reducida (54,9%) (Tabla 7). 5.2.1. Estudio de variables genéticas mediante panel de NGS 5.2.1.1. Características de calidad del panel de genes En la Tabla 19 se muestran los resultados de calidad del análisis del panel utilizado en este bloque. Tabla 19. Resultados del análisis del panel de NGS de ciclofosfamida. *Cobertura media sin duplicados de PCR. Panel NGS Cobertura media* 104,9x Porcentaje de duplicados 6,7% Porcentaje de lecturas on-target 95,6% Porcentaje de mapeado 99,9% 5.2.1.2. Resultados del panel de NGS Utilizando los filtros definidos previamente descritos en el apartado de Pacientes y Métodos, se detectaron 40 polimorfismos en 11 genes del metabolismo de la Cy (Tabla 20, Figura 13). Figura 13. Selección de variables genéticas para el panel de NGS de enzimas del metabolismo de la Cy usando la metodología descrita en Pacientes y Métodos. MAF: Frecuencia del alelo minoritario; VAF: Frecuencia alélica de la variante. Se observaron 26 polimorfismos en 5 genes de activación de Cy (CYP450): 10 SNPs en CYP2A6, 5 SNPs en CYP2B6, 3 SNPs en CYP2C8 y 4 SNPs en CYP2C9 y otros 4 en CYP2C19. En los genes de detoxificación (GSTs y ALDH), se encontraron 14 polimorfismos: 2 SNPs en GSTA1, 2 SNPs y el alelo nulo de GSTM1, 3 SNPs en GSTP1 y el alelo nulo de GSTT1; además, se detectó 1 SNP en ALDH1A1 y 4 SNPs en ALDH3A1. RESULTADOS 84 Las frecuencias de los genotipos fueron similares a las observadas en el Proyecto 1000 Genomes para la población española y se ajustaron al equilibrio de Hardy-Weinberg, excepto las frecuencias de los polimorfismos rs1065411 y rs1056806, que estuvieron en desequilibrio de ligamiento (Tabla 20). Teniendo en cuenta el tipo de variable, las variantes sinónimas (19/40) fueron las mayoritarias (47,5%) tras el análisis con los filtros previamente descritos. De este tipo de variantes, 13 SNPs se localizaron en CYP450 y 6 en genes de detoxificación (3 en GSTs y 3 en ALDH). El segundo tipo de variante predominante fue variantes missense (17/40; 42,50%), localizadas en su mayoría en genes de activación CYP450 (12/17); y los otros 5 SNPs pertenecieron a GSTs (3/17) y a ALDH (2/17). Además se encontraron dos variables en regiones no codificantes, comprobadas mediante IGV, una en 3’UTR en el gen CYP2C9 y otra en la región upstream de GSTA1. De los 40 polimorfismos seleccionados, dos de ellos eran alelos nulos, ambos en genes de detoxificación, uno en GSTM1 y otro en GSTT1. RESULTADOS 85 Ta bl a 20 . V ar ia bl es o bt en id as t ra s la a pl ica ci ón d e lo s fil tr os d es cr ito s en e l a pa rt ad o de P ac ie nt es y M ét od os p ar a el p an el d e N GS d e ge ne s re la ci on ad os c on e l m et ab ol ism o de la ci cl of os fa m id a. D : D on an te ; R : R ec ep to r; EU R M AF : F re cu en ci a de l a le lo m in or ita rio e n eu ro pe os ; C r: Cr om os om a; R ef : a le lo m ás fr ec ue nt e; V ar : a le lo m in or ita rio ; p -H W E: p -v al or d el e qu ili br io de H ar dy -W ei nb er g; M AF : M ín im a fr ec ue nc ia a lé lic a; b b: A le lo m in or ita rio e n ho m oc ig os is; A B: A le lo h et er oc ig ot o; A A: A le lo m ás fr ec ue nt e en h om oc ig os is. * S i p <0 ,0 5- N o en c on co rd an ci a co n el e qu ili br io d e Ha rd y- W ei nb er g. N om en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Is of or m a ca nó ni ca (v ar ia nt e) Ef ec to va ria nt e db SN P EU R M AF bb , n (% ) Ab , n (% ) AA , n (% ) p- HW E CY P2 A6 (c yt oc hr om e P4 50 fa m ily 2 su bf am ily A m em be r 6 ) Cr 19 41 35 06 15 C T EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 12 24 C> T p. (P ro 40 8= ) Si nó ni m a rs 28 39 94 62 0, 02 0 (0 ) 12 (6 ,6 ) 17 0 (9 3, 4) 0, 64 41 35 05 94 C T EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 12 45 C> T. p .(H is4 15 =) Si nó ni m a rs 20 02 97 7 0, 08 11 (6 ) 1 (0 ,5 ) 17 0 (9 3, 4) 0, 09 41 34 98 74 A T EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 13 12 A> T. p .(A sn 43 8T yr ) M iss en se rs 14 37 31 39 0 0, 07 0 (0 ) 13 (7 ,1 ) 16 9 (9 2, 9) 0, 61 41 35 61 88 G A EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 14 4G >A . p .(G ln 48 =) Si nó ni m a rs 81 92 72 1 0, 09 0 (0 ) 12 (6 ,6 ) 17 0 (9 3, 4) 0, 64 41 35 58 49 T C EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 21 7T >C . p .(L eu 73 =) ) Si nó ni m a rs 23 02 99 0 0, 02 0 (0 ) 30 (1 6, 5) 15 2 (8 3, 5) 0, 22 41 35 46 06 C A EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 40 6C >A . p .(A rg 13 6= ) Si nó ni m a rs 49 86 89 2 0, 19 0 (0 ) 29 (1 5, 9) 15 3 (8 4, 1) 0, 24 41 35 45 33 T A EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 47 9T >A . p .(L eu 16 0H is) M iss en se rs 18 01 27 2 0, 03 0 (0 ) 15 (8 ,2 ) 16 7 (9 1, 8) 0, 56 41 35 62 81 A G EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 51 A> G. p .(V al 17 =) Si nó ni m a rs 11 37 11 5 0, 24 15 (8 ,2 ) 66 (3 6, 3) 10 1 (5 5, 5) 0, 37 41 35 28 40 C T EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 77 1C >T . p .(A rg 25 7= ) Si nó ni m a rs 18 09 81 1 0, 08 1 (0 ,5 ) 13 (7 ,1 ) 16 8 (9 2, 3) 0, 19 41 35 29 36 G A EN ST 00 00 03 01 14 1. 5: c. 67 5G >A . p .(S er 22 5= ) Si nó ni m a rs 28 39 94 48 0, 02 0 (0 ) 10 (5 ,5 ) 17 2 (9 4, 5) 0, 7 CY P2 B6 (c yt oc hr om e P4 50 fa m ily 2 su bf am ily B m em be r 6 ) Cr 19 41 52 27 15 C T EN ST 00 00 03 24 07 1. 4: c. 14 59 C> T. p .(A rg 48 7C ys ) M iss en se rs 32 11 37 1 0, 11 5 (2 ,7 ) 33 (1 8, 1) 14 4 (7 9, 1) 0, 08 41 50 99 50 G C EN ST 00 00 03 24 07 1. 4: c. 21 6G >C . p .(P ro 72 =) ) Si nó ni m a rs 22 79 34 1 0, 06 0 (0 ) 19 (1 0, 4) 16 3 (8 9, 6) 0, 45 41 51 28 41 G T EN ST 00 00 03 24 07 1. 4: c. 51 6G >T . p .(G ln 17 2H is) M iss en se rs 37 45 27 4 0, 24 12 (6 ,6 ) 67 (3 6, 8) 10 3 (5 6, 6) 0, 8 41 49 72 74 C T EN ST 00 00 03 24 07 1. 4: c. 64 C> T. p .(A rg 22 Cy s) M iss en se rs 81 92 70 9 0, 06 0 (0 ) 21 (1 1, 5) 16 1 (8 8, 5) 0, 41 41 51 52 63 A G EN ST 00 00 03 24 07 1. 4: c. 78 5A >G . p .(L ys 26 2A rg ) M iss en se rs 22 79 34 3 0, 09 1 (0 ,5 ) 14 (7 ,7 ) 16 7 (9 1, 8) 0, 25 CY P2 C8 (c yt oc hr om e P4 50 fa m ily 2 su bf am ily C m em be r 8 ) Cr 10 96 79 87 49 A G EN ST 00 00 03 71 27 0. 3: c. 11 96 A> G. p .(L ys 39 9A rg ) M iss en se rs 10 50 96 81 0, 12 9 (4 ,9 ) 54 (2 9, 7) 11 9 (6 5, 4) 0, 38 96 82 70 30 G A EN ST 00 00 03 71 27 0. 3: c. 41 6G >A . p .(A rg 13 9L ys ) M iss en se rs 11 57 20 80 0, 12 10 (5 ,5 ) 54 (2 9, 7) 11 8 (6 4, 8) 0, 25 96 81 81 19 C G EN ST 00 00 03 71 27 0. 3: c. 79 2C >G . p .(I le 26 4M et ) M iss en se rs 10 58 93 0 0, 06 0 (0 ) 16 (8 ,8 ) 16 6 (9 1, 2) 0, 53 CY P2 C9 (c yt oc hr om e P4 50 fa m ily 2 su bf am ily C m em be r 9 ) Cr 10 96 74 88 93 C G EN ST 00 00 02 60 68 2. 6. c. *1 08 C> G 3’ -U TR rs 93 32 24 2 0, 12 10 (5 ,5 ) 55 (3 0, 2) 11 7 (6 4, 3) 0, 3 96 74 10 53 A C EN ST 00 00 02 60 68 2. 6: c. 10 75 A> C. p .(I le 35 9L eu ) M iss en se rs 10 57 91 0 0, 07 0 (0 ) 24 (1 3, 2) 15 8 (8 6, 8) 0, 34 96 74 87 37 A T EN ST 00 00 02 60 68 2. 6: c. 14 25 A> T. p .(G ly 47 5= ) Si nó ni m a rs 10 57 91 1 0, 07 0 (0 ) 23 (1 2, 6) 15 9 (8 7, 4) 0, 36 96 70 20 47 C T EN ST 00 00 02 60 68 2. 6: c. 43 0C >T . p .(A rg 14 4C ys ) M iss en se rs 17 99 85 3 0, 12 10 (5 ,5 ) 55 (3 0, 2) 11 7 (6 4, 3) 0, 3 RESULTADOS 86 N om en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Is of or m a ca nó ni ca (v ar ia nt e) Ef ec to va ria nt e db SN P EU R M AF bb , n (% ) Ab , n (% ) AA , n (% ) p- HW E CY P2 C1 9 (c yt oc hr om e P4 50 fa m ily 2 su bf am ily C m em be r 1 9) Cr 10 96 54 16 16 G A EN ST 00 00 03 71 32 1. 3: c. 68 1G >A . p .(P ro 22 7= ) Si nó ni m a rs 42 44 28 5 0, 15 1 (0 .5 ) 33 (1 8, 1) 14 8 (8 1, 3) 0, 56 96 60 26 22 C T EN ST 00 00 03 71 32 1. 3: c. 99 0C >T . p .(V al 33 0= ) Si nó ni m a rs 37 58 58 0 0, 14 3 (1 .6 ) 41 (2 2, 5) 13 8 (7 5, 8) 0, 98 96 60 26 23 G A EN ST 00 00 03 71 32 1. 3: c. 99 1G >A . p .(V al 33 1I le ) M iss en se rs 37 58 58 1 0, 07 0 (0 ) 23 (1 2, 6) 15 9 (8 7, 4) 0, 36 96 52 25 61 T C EN ST 00 00 03 71 32 1. 3: c. 99 T> C. p .(P ro 33 =) Si nó ni m a rs 17 88 50 98 0, 07 0 (0 ) 24 (1 3, 2) 15 8 (8 6, 8) 0, 34 GS TA 1 (g lu ta th io ne S - tr an sf er as e al ph a 1) Cr 6 52 65 89 62 A G EN ST 00 00 03 34 57 5. 5: c. 37 5A >G . p .(L ys 12 5= ) Si nó ni m a rs 10 51 77 5 0, 42 30 (1 6, 5) 86 (4 7, 3) 66 (3 6, 3) 0, 82 52 66 86 87 C T EN ST 00 00 03 34 57 5. 5: c. -1 35 C> T Up st re am rs 39 57 35 7 0, 43 37 (2 0, 3) 76 (4 1, 8) 69 (3 7, 9) 0, 06 GS TM 1 (g lu ta th io ne S - tr an sf er as e m u 1) Cr 1 11 02 33 13 8 G C EN ST 00 00 03 09 85 1. 5: c. 51 9G >C . p .(L ys 17 3A sn ) M iss en se rs 10 65 41 1 0, 46 23 (1 2, 6) 12 (6 ,6 ) 14 7 (8 0, 8) 0* 11 02 33 14 7 C T EN ST 00 00 03 09 85 1. 5: c. 52 8C >T . p .(A sp 17 6= )) Si nó ni m a rs 10 56 80 6 0, 16 4 (2 .2 ) 15 (8 ,2 ) 16 3 (8 9, 6) 0* Al el o nu lo GS TM 1* 0 87 (4 7, 8) 95 (5 2, 2) GS TP 1 (g lu ta th io ne S - tr an sf er as e pi 1 ) Cr 11 67 35 26 89 A G EN ST 00 00 03 98 60 6. 3: c. 31 3A >G . p .(I le 10 5V al ) M iss en se rs 16 95 0, 33 17 (9 ,3 ) 81 (4 4, 5) 84 (4 6, 2) 0, 69 67 35 35 79 C T EN ST 00 00 03 98 60 6. 3: c. 34 1C >T . p .(A la 11 4V al ) M iss en se rs 11 38 27 2 0, 07 0 (0 ) 13 (7 ,1 ) 16 9 (9 2, 9) 0, 61 67 35 39 70 T C EN ST 00 00 03 98 60 6. 3: c. 55 5T >C . p .(S er 18 5= ) Si nó ni m a rs 48 91 0, 34 19 (1 0, 4) 89 (4 8, 9) 74 (4 0, 7) 0, 3 GS TT 1 (g lu ta th io ne S- tr an sf er as e th et a 1) Cr 22 Al el o nu lo GS TT 1* 0 41 (2 2, 5) 14 1 (7 7, 5) AL DH 1A 1 (a ld eh yd e de hy dr og en as e 1 fa m ily m em be r A 1) Cr 9 75 54 58 82 C T EN ST 00 00 02 97 78 5. 3: c. 22 5C >T . p .(S er 75 =) ) Si nó ni m a rs 13 95 9 0, 49 38 (2 0, 9) 10 2 (5 6) 42 (2 3, 1) 0, 1 AL DH 3A 1 (a ld eh yd e de hy dr og en as e 3 fa m ily m em be r A 1) Cr 17 19 64 67 50 G A EN ST 00 00 04 57 50 0. 2: c. 18 9G >A . p .(G lu 63 =) ) Si nó ni m a rs 59 10 27 60 0, 03 0 (0 ) 10 (5 ,5 ) 17 2 (9 4, 5) 0, 7 19 64 59 38 T G EN ST 00 00 04 57 50 0. 2: c. 40 0T >G . p .(S er 13 4A la ) M iss en se rs 88 72 41 0, 35 20 (1 1) 80 (4 4) 82 (4 5, 1) 0, 94 19 64 44 72 T A EN ST 00 00 04 57 50 0. 2: c. 74 1T >A . p .(P ro 24 7= )) Si nó ni m a rs 20 72 33 0 0, 39 26 (1 4, 3) 78 (4 2, 9) 78 (4 2, 9) 0, 37 19 64 29 52 C G EN ST 00 00 04 57 50 0. 2: c. 98 5C >G . p .(P ro 32 9A la ) M iss en se rs 22 28 10 0 0, 24 19 (1 0, 4) 68 (3 7, 4) 95 (5 2, 2) 0. 20 RESULTADOS 87 5.2.2. Asociación de polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida y variables clínicas con complicaciones post-trasplante Las complicaciones post-trasplante analizadas fueron EICRa II-IV, EICRa III-IV, EICRc, EICRc mod- sev, MRT, SOS y CH. La IA de EICRa fue del 39% para el grado II-IV y del 12,1% para el grado III- IV a los 100 días post-trasplante. En el caso de EICRc y EICRc mod-sev la IA a los 3 años post- trasplante fue del 37,4% y 19,2%, respectivamente. A su vez la IA de MRT a los 3 años fue del 29,1%. De los casos analizados, el 9% desarrolló SOS y el 25% CH. Y la SG a los 5 años después del trasplante fue del 66%. A continuación, en la Tabla 21 se muestra la asociación entre las variables clínicas y las diferentes complicaciones post-trasplante. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en ninguno de los supuestos. Tabla 21. Análisis univariante entre complicaciones post-TPH y variables clínicas de la cohorte incluida en el estudio de enzimas del metabolismo de la ciclofosfamida con complicaciones tras un Haplo-TPH con Cy post-TPH. Acond: Acondicionamiento; EICR: Enfermedad de injerto contra receptor; EICRa: EICR aguda; EICRc: EICR crónica; EICRc mod- sev: EICRc moderada severa; R: Receptor; D: Donante; Dx: Diagnóstico; EA: Enfermedad activa; LMA: Leucemia mieloide aguda; RP: Respuesta parcial; MRT: Mortalidad relacionada con el trasplante; SOS: Síndrome de obstrucción sinusoidal; IC: Intervalo de confianza; CH: Cistitis hemorrágica; SHR: Relación de riesgo: >1 riesgo; <1 protector. En cuanto a las variables genéticas, los 40 polimorfismos seleccionados inicialmente se correlacionaron con cada una de las complicaciones post-trasplante. Las variables con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) se muestran en la Tabla 22 (análisis Variable EICRa II-IV EICRa III-IV EICRc EICRc mod-sev MRT SOS CH p-valor; SHR (95%IC) Edad (R) (≥ 48 años) 0,66;1,88 (0,14-3,51) 0,36;1,28 (0,54-3,07) 0,72;0,85 (0,43-1,68) 0,11;0,50 (0,22-1,12) 0,11;0,87 (0,49-1,79) 0,87;0,92 (0,56-2,45) 0,11;0,13 (0,17-1,37) Edad (D) (≥ 40 años) 0,63;1,03 (0,12-1,37) 0,40;0,63 (0,33-1,59) 0,14;1,3 (0,67-2,43) 0,09;1,26 (0,41-2,97) 0,76;0,77 (0,25-1,89) 0,82;1,14 (0,72-2,34) 0,60;1,84 (0,58-2,65) Género (R) (varón) 0,41;1,13 (0,69-2,55) 0,21;1,66 (0,62-4,47) 0,27;0,65 (0,31-1,34) 0,56;1,03 (0,44-2,36) 0,55;1,01 (0,51-2,01) 0,73;0,89 (0,31-2,57) 0,06;0,51 (0,25-1,03) Género (D) (varón) 0,56;1,00 (0,53-1,86) 0,15;0,58 (0,24-1,38) 0,59;0,78 (0,39-1,56) 0,31;0,63 (0,29-1,39) 0,14;0,60 (0,31-1,16) 0,80;1,19 (0,43-3,27) 0,86;0,91 (0,46-1,80) Dx (no LMA) 0,22;0,75 (0,40-1,40) 0,20;0,62 (0,26-1,49) 0,47;0,74 (0,36-1,49) 0,17;0,88 (0,71-1,09) 0,40;0,75 (0,39-1,44) 0,61;0,76 (0,28-2,09) 0,29;0,66 (0,33-1,30) Status pre-TPH (EA o RP) 0,63;1,2 (0,64-2,25) 0,17;1,9 (0,81-4,64) 0,35;0,82 (0,41-1,64) 0,53;1,05 (0,47-2,31) 0,06;1,92 (0,86-3,69) 0,56;0,95 (0,34-2,61) 0,86;1,12 (0,56-2,21) Acond. (mieloablativo) 0,16;1,4 (0,26-1,91) 0,28;0,6 (0,24-1,46) 0,21;1,39 (0,70-2,75) 0,59;0,42 (0,39-1,86) 0,47;0,31 (0,191-2,76) 0,30;1,18 (0,67-5,08) 0,73;0,85 (0,43-1,69) TPH previo 0,09;1,8 (0,93-3,48) 0,35;1,55 (0,64-3,78) 0,51;0,43 (0,41-1,83) 0,67;0,80 (0,60-2,30) 0,12;1,7 (0,88-3,33) 0,59;1,00 (0,35-2,86) 0,27;1,91 (0,96-3,8) RESULTADOS 88 univariante), y en la Tabla 23 (análisis multivariante). En el Anexo VIII se muestran los resultados de las variables que tras el análisis estadístico no se correlacionaron con ninguna complicación post-trasplante. Tabla 22. Análisis univariante entre variables de las enzimas del metabolismo de la ciclofosfamida con complicaciones tras un Haplo-TPH con Cy post-TPH. D: Actividad enzimática desconocida; SHR: Relación de riesgo:>1 riesgo; <1 protector; IC: Intervalo de confianza; ↓ o ↑: Disminución o aumento de la actividad enzimática descrita previamente en la bibliografía; Ref: Referencia; wt: alelo salvaje; EICR: Enfermedad de injerto contra receptor; EICRa: EICR aguda; EICRc: EICR crónica; EICRc mod-sev: EICRc moderada severa; SOS: Síndrome de obstrucción sinusoidal; CH: Cistitis hemorrágica; MRT: Mortalidad relacionada con el trasplante. Se estudiaron los genes CYP3A4, CYP3A5, ALDH1A1 y ALDH3A1 aunque no encontramos diferencias estadísticamente significativas. Gen SNP Actividad enzimática (Ref) Efecto de la variante Complicación post-Haplo-TPH p-valor SHR (95%IC) CYP2A6 rs4986892 D Sinónima EICRc 0,02 0,38 (0,12-0,98) SOS 0,03 5,17 (1,31-6,49) rs1801272 ↓ (No funcional) (78) Missense EICRa II-IV 0,03 2,74 (1,20-6,25) EICRc 0,04 3,86 (1,07-4,06) EICRc mod-sev 0,0002 7,28 (2,01-9,90) rs143731390 ↓ (79) Missense MRT 0,01 3,1 (1,13-9,48) CYP2B6 rs3745274 ↑ (71) Missense EICRc mod-sev 0,01 0,37 (0,17-0,83) rs3211371 ↓ (80) Missense EICRa II-IV 0,01 2,46 (1,16-4,44) rs2279341 D Sinónima EICRc 0,03 2,11 (1,73-8,74) rs2279343 ↑/↓ (81) Missense CH 0,03 3,16 (2,8-7,2) rs3745274 (wt) Normal (71) - SOS 0,002 1,6 (1,1-2,1) CYP2C8 rs10509681 ↓ (82) Missense EICRa II-IV 0,01 1,59 (1,01-2,50) EICRa III-IV 0,02 4,07 (2,34-11,64) rs11572080 ↓ (82) Missense EICRa II-IV 0,04 2,41 (1,01-4,68) EICRa III-IV 0,03 4,12 (1,04-15,91) CYP2C9 rs1799853 ↓ (83) Missense EICRa II-IV 0,03 1,67 (1,17-3,47) EICRa III-IV 0,02 4,35 (1,53-10,33) CYP2C19 rs4244285 ↓ (No funcional) (84) Sinónima MRT 0,01 2,45 (1,33-8,37) rs3758580 D Sinónima MRT 0,04 2,02 (1,14-10,87) GSTA1 rs1051775 D Sinónima EICRa III-IV 0,003 0,46 (0,01-0,69) MRT 0,04 1,86 (1,5-5,1) GSTA1*B (rs3957357) ↓ (85) Missense EICRa III-IV 0,01 2,53 (1,74-10,02) MRT 0,03 1,43 (1,3-2,8) GSTM1 GSTM1*0 ↓ (No funcional) (73) Alelo nulo SOS 0,04 2,3 (1,10-6,97) GSTP1 rs1695 ↓(86) Missense EICRa III-IV 0,04 2,77 (1,28-11,19) GSTT1 GSTT1*0 ↓ (No funcional) (87) Alelo nulo EICRa III-IV 0,01 2,62 (1,179-5,86) RESULTADOS 89 Tabla 23. Análisis multivariante de las complicaciones después de un trasplante haploidéntico con ciclofosfamida post-trasplante. IC: Intervalo de confianza; SHR: Relación de riesgo:>1 riesgo; <1 protector; EICR: Enfermedad de injerto contra receptor; EICRa: EICR aguda; EICRc: EICR crónica; EICRc mod-sev: EICRc moderada severa; SOS: Síndrome de obstrucción sinusoidal; MRT: Mortalidad relacionada con el trasplante. Gen Polimorfismo Efecto de la variante Complicación post-Haplo-TPH p-valor SHR (95%IC) CYP2A6 rs143731390 Missense MRT 0,003 3,44 (1,15-9,64) CYP2B6 rs3745274 Missense EICRc mod-sev 0,02 0,38 (0,28–0,72) rs3211371 Missense EICRa II-IV 0,008 2,02 (1,93–8,12) GSTA1 rs1051775 Sinónima EICRa III-IV 0,042 0,42 (0,24-0,81) MRT 0,004 2,56 (1,37-8,47) GSTA1*B (rs3957357) Missense MRT 0,036 2,32 (1,06-10,67) GSTM1 GSTM1*0 Alelo nulo SOS 0,032 1,36 (1,11-6,32) GSTT1 GSTT1*0 Alelo nulo EICRa III-IV 0,005 3,29 (1,28-12,23) 5.2.2.1. EICRa Las tasas de IA para la EICRa grado II-IV y III-IV a los 100 días post-trasplante fueron del 39% y del 12% respectivamente. Las variables genéticas en los genes de activación CYP2A6 (rs1801272, denominado haplotipo CYP2A6*2), CYP2B6 (rs3211371), CYP2C8 (rs10509681 y rs11572080, denominados haplotipo CYP2C8*3) y CYP2C9 (rs1799853) se asociaron con una mayor incidencia de EICRa II-IV y/o EICRa III-IV (Tabla 22). Los polimorfismos en los genes de detoxificación: GSTA1*B, GSTP1 (rs1695) y GSTT1*0 (alelo nulo) se correlacionaron con una mayor incidencia de EICRa III-IV y la variable genética rs1051775 en GSTA1 se correlacionó con una menor incidencia de EICRa III-IV (Tabla 22). En el análisis multivariante, una mayor incidencia de EICRa II-IV se asoció al polimorfismo rs3211371 en CYP2B6. En GSTA1 (rs1051775) y GSTT1*0 se mantuvieron las mismas correlaciones de riesgo con EICRa III-IV que en el análisis univariante (Tabla 23). 5.2.2.2. EICRc Las tasas de IA de la EICRc y de la EICRc mod-sev a los 1000 días post-trasplante fueron del 37% y del 19%, respectivamente. El polimorfismo rs1801272 en el gen de activación CYP2A6 se correlacionó con una mayor incidencia de EICRc y EICRc mod-sev y la variable genética rs2279341 en CYP2B6 con mayor incidencia de EICRc. Por otro lado, los polimorfismos en CYP2A6 (rs4986892) y CYP2B6 (rs3745274) se correlacionaron con una menor incidencia de EICRc y EICRc mod-sev, RESULTADOS 90 respectivamente (Tabla 22). En el análisis multivariante, sólo el haplotipo CYP2B6*6 (rs3745274) se asoció con una menor incidencia de EICRc mod-sev (Tabla 23). 5.2.2.3. Síndrome de obstrucción sinusoidal El SOS se diagnosticó en 17 pacientes (9%). Dos variables genéticas en los genes de activación, CYP2A6 (rs4986892), CYP2B6 (rs3745274 alelo salvaje) y una en un gen de detoxificación, GSTM1*0 (alelo nulo) se asociaron con una mayor incidencia de SOS (Tabla 22). En el análisis multivariante sólo el alelo nulo de GSTM1 mantuvo diferencias estadísticamente significativas con SOS (Tabla 23). 5.2.2.4. Cistitis hemorrágica Cuarenta y cinco pacientes presentaron CH (25%). Los portadores del polimorfismo CYP2B6*4 (rs2279343) tuvieron una incidencia estadísticamente significativa mayor de CH (Tabla 22). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en el análisis multivariante con ningún polimorfismo (Tabla 23). 5.2.2.5. Mortalidad relacionada con el trasplante La IA de MRT a los 1000 días post-trasplante fue del 29%. Los polimorfismos en CYP2A6*35 (rs143731390) y en CYP2C19 (rs4244285, rs3758580) se asociaron con mayor riesgo de desarrollar MRT. Respecto a las enzimas implicadas en la detoxificación de la Cy, encontramos que el haplotipo GSTA1*B aumentó el riesgo de desarrollar MRT (Tabla 22). En el análisis multivariante, nuestros resultados mostraron que CYP2A6*35 (rs143731390), GSTA1 rs1051775 y GSTA1*B se correlacionaron con mayor riesgo de MRT (Tabla 23). No se encontró significación estadística entre las variables en ALDH (en receptor y donante) y las complicaciones post-trasplante. A raíz de estos resultados en la Figura 14 se muestra una representación del efecto de la disminución de la actividad que producen ciertos polimorfismos en las enzimas de activación y detoxificación de la Cy y su posible correlación con las complicaciones post-trasplante. RESULTADOS 91 Figura 14. Polimorfismos con disminución de la actividad en enzimas del metabolismo de la Cy y complicaciones post-TPH. Se muestra el efecto de los SNPs en las enzimas del metabolismo Cy: los SNPs en las enzimas CYP450 y GST conducen a una disminución de la actividad enzimática y producen un nivel bajo de mostaza fosforamida y un nivel alto de metabolitos tóxicos, respectivamente. Estos SNPs conducen a una mayor incidencia de EICR, SOS y MRT. Esta figura ha sido creada en Biorender.com. Discusión DISCUSIÓN 95 6. DISCUSIÓN Hoy en día el alo-TPH es el tratamiento de elección en muchas NH gracias al EICL que producen los linfocitos del donante frente a las células tumorales del paciente. El alo-TPH ofrece la posibilidad de obtener una mayor supervivencia a largo plazo en aquellos pacientes que tienen una enfermedad de riesgo intermedio o alto y como tratamiento de rescate en pacientes con enfermedad recidivante (88). A pesar del conocimiento de la fisiopatología del alo-TPH sigue siendo un procedimiento complejo y gran parte de los pacientes presentan complicaciones relacionadas con el mismo, como la recaída de la enfermedad, que representa la causa principal del fracaso del tratamiento, y la EICR (17). Aproximadamente el 40% de los pacientes desarrollan EICR. En consecuencia, la EICR y las complicaciones infecciosas asociadas a ella contribuyen a la morbilidad y a la mortalidad relacionada con el trasplante (89). Existen distintos factores de riesgo conocidos que afectan a la eficacia del alo-TPH, tales como la histocompatibilidad HLA, la edad del paciente, la fuente de progenitores hematopoyéticos, la disparidad de sexo entre donante y receptor, el tipo de enfermedad, el estado de la enfermedad antes del TPH, etc. Pero estas variables clínicas no son capaces de identificar de una forma precisa a aquellos pacientes que tienen más probabilidades de desarrollar las distintas complicaciones post-trasplante. En los últimos tiempos se ha demostrado que la variabilidad genética (polimorfismos) en genes no-HLA de donante y receptor también afecta al resultado del alo-TPH (90). Por un lado, como se ha comentado previamente, una de las moléculas más estudiadas en este contexto son las citocinas. Estas moléculas actúan sobre diferentes tipos de células, produciendo un equilibrio entre una respuesta inflamatoria o antiinflamatoria, modulando por tanto la EICR, así como infecciones, etc. que finalmente influirán en la evolución del alo-TPH (91). En este contexto ya existen evidencias de que los polimorfismos en genes de citocinas que suelen alterar la expresión o la función de estas proteínas, influyen en la respuesta inmune que se produce en la EICR, por lo que podrían utilizarse como biomarcadores para anticipar el riesgo de desarrollar estas complicaciones (92–94). Además de polimorfismos en genes de la inmunidad relacionados con distintas complicaciones post-trasplante también se ha demostrado la importancia de la farmacogenética en la eficacia de un fármaco administrado en el contexto de acondicionamiento del alo-TPH, tales como la Cy y el busulfán; lo que repercute en las complicaciones post-trasplante que puedan darse. Existen publicaciones que correlacionan la presencia de polimorfismos en genes relacionados con el DISCUSIÓN 96 metabolismo de agentes citotóxicos utilizados en el alo-TPH con el desarrollo de diferentes complicaciones post-trasplante (64,71). En este contexto, por tanto, es imprescindible profundizar e identificar nuevos biomarcadores que, paralelamente a los ya conocidos, permitan estimar el riesgo de desarrollar EICR, así como de otras complicaciones post-trasplante. La capacidad de anticipar el desarrollo de EICR, y por tanto el riesgo de morbilidad y mortalidad, permite una actuación preventiva dando lugar a tratamientos personalizados. A continuación, se va a exponer la discusión estructurada en los dos bloques que se han planteado en el apartado de Resultados. 6.1. Bloque 1. Polimorfismos en genes de citocinas asociados a complicaciones post-trasplante En las últimas décadas, numerosos grupos (94–96) incluido el nuestro (77), han demostrado que los polimorfismos en genes no HLA, sobre todo en genes de citocinas, podrían utilizarse como biomarcadores para determinar el riesgo de desarrollar complicaciones post-trasplante, principalmente la EICR. Aunque se han descrito biomarcadores genómicos potencialmente útiles, por el momento no hay un único biomarcador que en términos de sensibilidad o especificidad sea lo suficientemente eficaz para el diagnóstico o predicción de esta patología. Por tanto, es importante construir modelos de riesgo donde se puedan incluir varios polimorfismos y variables clínicas que permitan anticipar estas complicaciones de forma más precisa. En uno de los estudios realizado por nuestro grupo (77) se desarrollaron modelos genético- clínicos para predecir EICR grave. En este estudio solamente se seleccionaron 25 polimorfismos previamente descritos por su implicación en el alo-TPH y se utilizó un método de estimación por regresión lineal denominado LASSO. Con el fin de mejorar estos modelos y ampliar el conocimiento a nuevas variantes genéticas no descritas previamente, decidimos diseñar un panel de NGS de 132 genes (incluyendo secuencias codificantes y no codificantes) para identificar nuevos polimorfismos en genes relacionados con la respuesta inmune, concretamente citocinas, que pudieran estar relacionados con el desarrollo de complicaciones post-trasplante. La mayor parte de los estudios publicados que han asociado la presencia de polimorfismos con complicaciones post-trasplante suelen incluir variables ya conocidas (62,95,97–100). En cambio, DISCUSIÓN 97 en este trabajo, el abordaje es diferente ya que al secuenciar el gen completo nuestro objetivo fue identificar nuevas variables genéticas que se asocien con el desarrollo de complicaciones post-trasplante. Dado que el número de variables genéticas obtenidas fue muy elevado, se utilizaron métodos matemáticos de mayor complejidad, como el BLR (descrito previamente en Pacientes y Métodos), para identificar los polimorfismos más relevantes para la clasificación de los pacientes en alto o bajo riesgo de desarrollar distintas complicaciones, pero sin perder interpretabilidad. Finalmente se seleccionaron los 41 polimorfismos más relevantes en 30 genes de citocinas. El número de variables incluidas en los distintos modelos predictivos fueron: cinco polimorfismos para EICRa II-IV y dos variables clínicas, nueve polimorfismos en EICRa III-IV, cuatro polimorfismos en EICRc, nueve polimorfismos en EICRc mod-sev, seis polimorfismos en MRT, nueve polimorfismos para la recaída y siete polimorfismos en SG. Teniendo en cuenta los 41 polimorfismos, el 87,8% se localizaron en regiones no codificantes (UTR, upstream y downstream). Por lo tanto, las regiones no codificantes parecen tener una gran importancia en el contexto del trasplante ya que habitualmente están relacionadas con la mayor o menor expresión de la proteína (101,102). Es interesante destacar que la mayor parte de las variables genéticas seleccionadas no han sido descritas previamente. En la Tabla 24 se muestra un breve resumen de la función biológica de cada uno de los genes seleccionados, según lo descrito en la literatura. A pesar de no poder concretar exactamente, por el momento, el efecto de los polimorfismos en la función de cada gen, sí es importante contextualizar la función de cada uno de estos genes en el sistema inmune. DISCUSIÓN 98 Tabla 24. Función y polimorfismos asociados a cada complicación post-trasplante de los genes seleccionados en el presente estudio. EICR: Enfermedad de injerto contra receptor; EICRa: EICR aguda; EICRc: EICR crónica; EICRc mod- sev: EICRc moderada severa; MRT: Mortalidad relacionada con el trasplante; SG: Supervivencia global; Ref: Referencia; IL: Interleucina; TH: Linfocito T colaborador. En amarillo se identifican las interleucinas proinflamatorias y en naranja las quimiocinas incluidas en los modelos de EICR. Función biológica (Ref) Polimorfismo Modelo predictivo In te rle uc in as IL7 Activación células T (103) rs6997891 EICRc mod-sev IL11 Actividad antiinflamatoria. Inhibición EICR (104) rs2298885 EICRc mod-sev IL17A Secreción de citocinas proinflamatorias (105) rs3819024 EICRa III-IV IL17D Situaciones de estrés -> IL6, IL8 (106) rs9579928 EICRa III-IV IL25 Citocina proinflamatoria/antiinflamatoria (107) rs7145551 EICRc mod-sev IL26 Secreción citocinas proinflamatorias (108) rs2068016 EICRa II-IV IL2RA IL2RA soluble aumenta en EICR (109) rs12722485 EICRa II-IV/EICRc rs12722602 EICRa III-IV IL3RA Presentación antigénica células T del donante (110) rs17883366 EICRc IL7R Desarrollo de linfocitos ->citocinas proinflamatorias (111) rs72742450 EICRc mod-sev rs10063294 EICRc/EICRc mod-sev IL10RA Propiedades inmunosupresoras/antiinflamatorias (112) rs4252243 EICRc mod-sev IL10RB Inhibe la inducción de citocinas proinflamatorias (113) rs1058867 SG IL12RB1 Diferenciación TH1/TH17 y señalización JAK/STAT -> citocinas proinflamatorias (114,115) rs3746190 EICRa III-IV/SG rs11575934 EICRc mod-sev rs404733 MRT IL15RA Proliferación células T y NK -> citocinas proinflamatorias (116,117) rs2387089 MRT IL17RA Secreción citocinas proinflamatorias -> reclutamiento neutrófilos e inflamación tisular (105, 118) rs4819962 EICRa III-IV IL17RC rs279549 EICRc mod-sev IL20RB Señalización de citocinas-> inflamación (119) rs835634/rs835632 MRT IL21R Proliferación/diferenciación células linfoides (120) rs961914 EICRa III-IV/Recaída rs8060368/rs2189521 Recaída Q ui m io ci na s CCL15 Quimioatrayente para las células inmunes (121) rs2293788/ rs41508645 Recaída CCL16 Actividad quimiotáctica para linfocitos y monocitos (122) rs2063979/rs146038760 SG CCL21 Activación, migración y diferenciación células T (123) rs11574915 Recaída/SG CCL25 Funciones protectoras para EICR/ migración en cáncer/ enfermedades inflamatorias (124,125) rs11671930 EICRa II-IV rs1129763 EICRa III-IV rs2032887 SG CXCL2 Migración de neutrófilos (126) rs9131 MRT CXCL11 Reclutamiento de células efectoras en alo-TPH (127,128) rs9994667 MRT/Recaída/SG CXCL13 Inflamación y migración (129,130) rs1052563 EICRa II-IV CXCL16 Reclutamiento linfocitos T citotóxicos (131) rs76152703 EICRa III-IV CCR10 Migración de células T a la piel (132) rs3760384 Recaída CXCR2 Reclutamiento de neutrófilos (133) rs1126580 EICRa III-IV CXCR4 Movilización celular (134,135) rs2680880 EICRa II-IV/Recaída CXCR6 Migración de linfocitos T CD8+ al hígado (136) rs3774639 EICRc mod-sev XCR1 Reclutamiento células T y NK (137) rs2371 EICRc DISCUSIÓN 99 Hay una presencia significativa de genes (citocinas) incluidos en los modelos predictivos de EICRa y EICRc que se corresponden con interleucinas proinflamatorias (10/21; 47,6%, marcadas en amarillo en la Tabla 24). Este tipo de citocinas activan vías de señalización relacionadas con el contexto proinflamatorio característico de la EICR (56). También se seleccionaron 7/21 (33,3%) quimiocinas para los modelos de EICR (marcadas en naranja en la Tabla 24), donde todas ellas potencian ese efecto inflamatorio que se da en la EICR ya que se encargan del reclutamiento de neutrófilos y linfocitos a los sitios donde existe un proceso inflamatorio (138). Además, se seleccionaron dos interleucinas con actividades antiinflamatorias, IL10RA y IL11 (Tabla 24). Los mediadores antiinflamatorios actúan inhibiendo el reclutamiento de leucocitos y reduciendo la permeabilidad vascular. Estas acciones producen la activación de cascadas de señalización para finalizar la respuesta inflamatoria y promover la reparación del tejido (139). La función de estas dos interleucinas se detalla en el apartado de modelos predictivos para EICRc mod-sev. Aunque aún no disponemos de estudios funcionales, las variables seleccionadas podrían estar relacionadas con el aumento de la expresión de la proteína proinflamatoria, como ocurre con muchos polimorfismos descritos (140), o disminución de una proteína antinflamatoria a la que codifiquen y por lo tanto influir en el riesgo de desarrollar EICR. En el análisis de estos resultados se han utilizado herramientas para el análisis de enriquecimiento en grupos de genes como “Enrichr” (141) para buscar relaciones funcionales entre los 30 genes seleccionados en los modelos predictivos. Mediante este análisis computacional se observó que además de la vía de señalización de las citocinas y quimiocinas, como era de esperar, se seleccionaron dos vías de señalización representadas en el contexto inflamatorio: la vía de señalización IL17/TH17 y la señalización JAK/STAT (Tabla 18). Vía de señalización de citocinas: interleucinas y quimiocinas En la EICR se produce un fenómeno de inflamación debido al reconocimiento de antígenos del receptor por parte de los linfocitos T del donante, produciendo así la activación de mediadores de la inflamación que causan el daño tisular. Esto sumado al daño tisular producido por el acondicionamiento puede propagar la respuesta inflamatoria. De manera que debido a la activación del sistema inmune se produce una respuesta inflamatoria descontrolada que tendrá consecuencias en la morbilidad y mortalidad del paciente. Las manifestaciones y la gravedad de la EICR están influenciadas por las proporciones de células T naïve que maduran a lo largo de los fenotipos de células T reguladoras, TH1, TH2 o TH17. Esta maduración está influenciada en gran medida por las citocinas que, a su vez, activan los factores de transcripción e impulsan el DISCUSIÓN 100 desarrollo hacia un fenotipo dominante. Además, las citocinas proinflamatorias ejercen efectos directos sobre los tejidos diana de la EICR (56). Vía de señalización IL17/TH17 Las citocinas de la familia de la IL17 son fuertes inductores de la inflamación y ayudan en la defensa frente a patógenos. Sin embargo, también contribuyen a la destrucción de tejidos que se produce en enfermedades inflamatorias crónicas y autoinmunes como la psoriasis, la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple (142). Las células TH17 son células T CD4+ que producen citocinas proinflamatorias como IL17A, IL17F, IL21, IL22, TNF-α, G-CSF y algunas quimiocinas. La IL17 juega un papel central en la inmunidad innata, la inflamación y relaciona la activación de las células T con la movilización y activación de los neutrófilos (143). La IL17 promueve la expresión genes proinflamatorios a través de la activación de la cascada NF-κB, MAPK y C/EBP (144). Aunque es una citocina característica de las células TH17, se sabe que la IL17 también se expresa en otros tipos de células inmunes como las células T CD8+, las células NK y las células linfoides innatas. En este contexto existen varios estudios (145,146) que ponen de manifiesto el papel de la IL17 en la EICR, en donde se expone que los linfocitos TH1 y TH17 activados secretan citocinas proinflamatorias que conducen a la apoptosis de las células en los tejidos diana en la EICR, principalmente en el intestino, el hígado y la piel (147,148) (Figura 15). Figura 15. Función de los linfocitos TH17 en la EICR. CPA: Células presentadoras de antígenos. Imagen modificada de Zhu S et al. (142). DISCUSIÓN 101 Vía de señalización JAK/STAT Esta vía está implicada en la patogénesis de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, como la artritis reumatoide, la psoriasis y la enfermedad inflamatoria intestinal. Muchas citocinas involucradas en la patogénesis de enfermedades autoinmunes e inflamatorias usan esta vía para transducir señales intracelulares. Las mutaciones en los genes JAK y STAT causan varios síndromes de inmunodeficiencia y los polimorfismos en estos genes están asociados con enfermedades autoinmunes. Esta vía regula la activación de las células inmunitarias que subyacen a la EICR, incluidas las CPAs, las células T, los neutrófilos y las células B (149,150). Por tanto se encarga de regular la activación celular, la proliferación, la migración y la producción de citocinas, lo que potencia la gravedad de la EICR (151) (Figura 16). En este contexto ya existen fármacos que inhiben esta vía de señalización y se usan para el tratamiento de la EICR, como por ejemplo Ruxolitinib (150). Figura 16. Mecanismo de la vía de señalización JAK/STAT en la EICR. P: Indica la fosforilación de STAT. Esta figura ha sido creada en Biorender.com. Modelos predictivos y genes incluidos en las complicaciones post-trasplante estudiadas Para el modelo genético-clínico predictivo de EICRa II-IV se seleccionaron la IL26 y la IL2RA, como se puede ver en la Tabla 18, citocinas que ejercen su función inflamatoria mediante la señalización JAK/STAT. En el caso de la IL26, producida por células TH1, mediante la señalización de STAT3 produce la secreción de citocinas proinflamatorias como IL1B y TNF-α (108), pudiendo DISCUSIÓN 102 de esta manera estar implicada en la EICR. La IL2, a través de la señalización de su receptor IL2RA, incluido en este modelo, es un potente inductor de la proliferación de células T y la diferenciación de células T efectoras TH1 y TH2; los cuales participan en la EICR. Además está descrito que IL2RA en su forma soluble aumenta en estados de activación inmunitaria, incluida la EICR (109), lo que pone de manifiesto su papel en la EICR. Concretamente IL2RA es uno de los biomarcadores incluidos en el panel de Paczesny (42) para el diagnóstico de EICR. Por su parte, las tres quimiocinas incluidas en este modelo se relacionan con migración celular. A pesar de que la CCL25 está descrita en enfermedades relacionadas con la inflamación (152) en el contexto de la EICR está asociado a la proliferación de células T reguladoras que inhiben la EICR (124). Sin embargo, existen estudios que demuestran que CCL25 se expresa en el epitelio del intestino delgado, lo que puede regular el tráfico de células T efectoras al intestino (152). Por lo que si el polimorfismo encontrado en este estudio potencia la acción de CCL25, podría aumentar el reclutamiento de linfocitos T y con ello potenciar la EICR. El polimorfismo seleccionado en CXCR4 (rs2680880), según lo descrito en la bibliografía (153), el alelo TT de este polimorfismo se relaciona con menor movilización de células progenitoras, por lo tanto no es fácil establecer una posible asociación con EICR. En ambos casos serán necesarios estudios funcionales para determinar la función de estos polimorfismos. Por otro lado, la quimiocina CXCL13 participa en procesos de migración y está descrito que su expresión aumenta en la EICRa gastrointestinal, lo que concuerda con que haya sido seleccionada para este modelo (130). En cuanto a la única variable clínica incluida, la edad del donante y receptor, sí que está descrito que la edad en ambos casos es un factor de riesgo para EICRa (26), sobre todo considerar pacientes de edad avanzada. Tal como se refleja en la Tabla 18, 4/6 interleucinas seleccionadas en el modelo genético de EICRa III-IV se relacionaron con la señalización JAK/STAT, dando lugar a la producción de citocinas proinflamatorias, responsables del proceso inflamatorio que se da en la EICR. Concretamente IL12RB1, mediante su ligando IL12, e IL21R mediante IL21 activan la vía de señalización del JAK/STAT, dando lugar a la proliferación de células linfoides (154), que por tanto podrían intervenir en el proceso inflamatorio de la EICR. En concreto, hay estudios que demuestran que bloqueando la cascada de señalización IL21/IL21R se podría prevenir la EICR (155). El papel de IL2RA, como se ha comentado previamente, está muy descrito en el contexto de la EICR. En el caso de IL17D, está descrito que en respuesta al estrés induce a las células endoteliales a la síntesis de IL6, IL8 y G-CSF (106), las cuales al tratarse de citocinas proinflamatorias podrían estar relacionadas con la EICR. En cuanto a los otras dos interleucinas, IL17A e IL17RA, se incluyeron en la señalización TH17. Esto se debe a que las células TH17 DISCUSIÓN 103 producen IL17A, la cual posteriormente interacciona con IL17RA, produciendo citocinas proinflamatorias (105), lo que pone de manifiesto su papel en la EICR. Respecto a las quimiocinas incluidas, se correlacionan con el reclutamiento de células del sistema inmune a sitios inflamados. Tanto CXCR2 como CXCL16 participan en el reclutamiento de neutrófilos y linfocitos T a los tejidos inflamados (133,136), pudiendo probablemente potenciar el ambiente inflamatorio de la EICR. Concretamente, está descrito que el bloqueo de la interacción de CXCL2/CXCR2 reduce la letalidad de la EICR, posiblemente debido a que se inhibe la migración de las células T a los órganos (133). De hecho, CXCR6 y CXCL16 son quimiocinas cuya expresión está aumentada en el hígado y en el intestino en la EICRa (136). En el caso de CCL25, como se ha comentado previamente, es necesario más estudios que determinen el efecto de este polimorfismo en la función del gen. Teniendo en cuenta los modelos elaborados para EICRa grados II-IV y III-IV, en base a nuestros resultados observamos que se seleccionaron polimorfismos, aunque distintos, en ambos modelos para los genes CCL25 (rs11671930 grado II-IV y rs1129763 grado III-IV) y IL2RA (rs12722485 grado II-IV y rs12722602 grado III-IV) (Tabla 24). Hasta el momento en el contexto de la EICR hay estudios que muestran que CCL25 tiene efectos protectores para EICR, ya que al interaccionar con su receptor, conduce a la producción de células T reguladoras y suprime las respuestas inmunitarias específicas de antígeno asociadas con EICR. En base a ello deberíamos determinar en estudios futuros qué implicación tiene la presencia de estos polimorfismos en regiones no codificantes en la función final de CCL25 y su implicación con EICRa. En cuanto a IL2RA se sabe que tras el reconocimiento de antígeno las células T secretan IL2, produciendo así la activación y expansión de células T alorreactivas (109) las cuales podrían interferir en el desarrollo de la EICR. Por otro lado, se elaboró un modelo genético predictivo para la EICRc, una complicación que afecta al 60% de los pacientes que reciben un alo-TPH de hermano HLA-idéntico. Todas las interleucinas seleccionadas en este modelo se relacionaron con la vía de señalización JAK/STAT (Tabla 18), lo que refuerza su papel en el proceso inflamatorio característico de esta patología. IL7R aparte de su papel en el desarrollo de linfocitos T, lo que podría contextualizar su papel en la EICR, está descrito que la presencia de variantes genéticas en este gen se asocian con el riesgo de EICRa grave (111). En el caso de IL3RA (CD123), es un receptor expresado en las células dendríticas plasmocitoides que producen elevados niveles de IFN, una citocina proinflamatoria muy importante en la EICR (156). Además es un receptor relacionado con la EICR al participar directamente en la presentación antigénica a las células T del donante (91); y más concretamente hay estudios donde reflejan que la expresión de CD123 aumenta en EICRa DISCUSIÓN 104 gastrointestinal (110). La única quimiocina incluida, XCR1, se relaciona con procesos de migración de linfocitos T, lo que podría estar relacionado con que esos linfocitos se desplacen y produzcan daño en distintos tejidos (157). De hecho en el contexto de la EICR, Bouazzaoui y col. (137) demuestran que se producen niveles elevados de la interacción XCL1/XCR1 en el intestino, hígado, pulmón y piel durante el curso de la EICR. De manera que a pesar de que estas citocinas están implicadas en procesos relacionados con la EICR es necesario determinar en estudios futuros cuál es el efecto de los polimorfismos en cada uno de los genes seleccionados. También se elaboró un modelo genético para la EICRc moderada-severa. Todas las interleucinas seleccionadas en este modelo, salvo IL17RC e IL25, se incluyeron en la vía de señalización JAK/STAT (Tabla 18). En el caso de IL7 e IL7R llevan cabo su acción mediante esta vía para promover la supervivencia, la proliferación y la actividad de los linfocitos T y B (158), los cuales están implicados en el desarrollo de EICRc (159). Esto justificaría que estos genes hayan sido seleccionados en este modelo. En cambio, en el caso de IL10RA su acción, mediada por IL10, activa la expresión de genes antiinflamatorios, por lo que debemos determinar qué efecto tiene el polimorfismo seleccionado en el contexto inflamatorio. Quizás este polimorfismo disminuya la expresión de IL10RA pudiendo aumentar el riesgo de EICR. En este contexto sí que existen polimorfismos en la región promotora de IL10 que producen una disminución de su expresión y se correlacionan con el riesgo de desarrollar EICR (140). Además está descrito que IL10 inhibe las funciones de los macrófagos y la expresión de las citocinas TH1, lo que se asoció a pacientes con EICRa (99). También hay que mencionar que aunque IL11 se relacione con la vía de señalización JAK/STAT, en el contexto de la EICR y otras enfermedades inflamatorias está descrito que inhibe este proceso (104,160,161). Por lo que habrá que determinar si el polimorfismo en este gen potencia o inhibe su acción antiinflamatoria. IL17RC e IL25 se relacionaron con la vía de señalización IL17/TH17 (Tabla 18). IL17RC tiene correlación con esta vía de IL17/TH17 ya que junto con IL17RA es el receptor, localizado en células epiteliales, que media la función de IL17A/F, produciendo citocinas proinflamatorias que pueden estar implicadas en la patogenicidad de la EICR. En el caso de IL25 (IL17E) activa a los linfocitos TH2, los cuales participan activamente en la EICRc, pero inhibe a los TH17. Además está descrito que IL25 en el contexto de psoriasis se encarga de la producción de citocinas proinflamatorias y del reclutamiento de células inmunitarias (107), lo que justifica su papel en la EICR. En cuanto a IL12RB1, como ya se ha comentado previamente, ya hay publicaciones que ponen de manifiesto su papel en la EICR. Respecto a la quimiocina seleccionada, CXCR6 se relaciona con procesos de migración de linfocitos T, células del sistema inmune que participan en el proceso inflamatorio de la EICR, y por tanto polimorfismos en este gen podrían afectar a su expresión. Está descrito DISCUSIÓN 105 un aumento de expresión de CXCR6 en el intestino y en el hígado en la EICR, concretamente la expresión de CXCR6 se vio aumentada en las células T CD8+ dando lugar a un rápido reclutamiento de estas células en el hígado (162). Teniendo en cuenta los cuatro modelos predictivos seleccionados para EICR (EICRa II-IV y III-IV; así como EICRc y EICRc mod-sev) a continuación destacamos los polimorfismos coincidentes entre estos dos modelos (Tabla 24). En el caso de EICRc y EICRc mod-sev se seleccionó el polimorfismo rs10063294 en IL7R. Este receptor está implicado en la proliferación de linfocitos, lo que no es de extrañar que esté relacionado con la EICR, dado su importancia en la alorreactividad en el TPH (163). Por otro lado, en el caso de EICRa II-IV y EICRc se incluyó el polimorfismo rs12722485 en IL2RA, un gen cuya expresión se encuentra aumentada en la EICRa. Por lo que a pesar de que por su función podrían estar implicados en el desarrollo de EICR, sí que queda por determinar cuál es exactamente el efecto que producen los polimorfismos seleccionados en estos genes. Cabe resaltar, que en los modelos de EICR más graves se seleccionó un mayor número de genes. Esto puede explicarse dado que se debe producir un mayor contexto inflamatorio que afecte a diversos órganos y que por tanto produzca una mayor gravedad de EICR. Esto es consistente con los modelos seleccionados para EICR grave obtenidos por este grupo en un estudio previo (77). En el modelo genético para la MRT todas las interleucinas seleccionadas fueron relacionadas con la vía JAK/STAT (Tabla 18), cuya señalización conduce a la síntesis de citocinas proinflamatorias. Esto podría explicarse dado que el ambiente inflamatorio que producen pueda afectar a la MRT a largo plazo, por todo el daño que se produce en los tejidos. Lo que además se refuerza con las quimiocinas seleccionadas para este modelo, relacionadas con la migración de células del sistema inmune a sitios de inflamación. De hecho existen publicaciones donde se refleja que la disminución de EICR impacta favorablemente en la MRT (164,165). Es decir, evitando ese daño producido en los órganos, en el contexto de la EICR, se disminuye la MRT. Teniendo en cuenta los modelos predictivos previamente seleccionados para EICR, en este caso se volvió a seleccionar un polimorfismo en IL12RB1 (rs404733), aunque distinto al incluido en los modelos de EICRa III-IV y EICRc mod-sev. Estos resultados refuerzan la importancia de IL12RB1 en el contexto de EICR grave. De hecho está descrito que IL12 e IL23, las cuales llevan a cabo su función mediante este receptor, son mediadores proinflamatorios de la EICR, responsables de la diferenciación TH1 y TH17, respectivamente (114). Para el modelo genético de recaída solo se seleccionaron 3 variables genéticas en una única interleucina, IL21R, relacionada con la señalización JAK/STAT (Tabla 18), mediante la cual lleva DISCUSIÓN 106 a cabo sus funciones de proliferación y diferenciación de linfocitos T, NK y B. Sí que podemos suponer que IL21R, a través de su ligando IL21, se relacione con la recaída, ya que está descrito que IL21 es producida principalmente por las células T CD4+, y actúa sobre las células donde se expresa su receptor, IL21R, el cual se expresa en la mayoría de las células linfoides, incluidas las células B, las células TH, las células T citotóxicas, las células NK, las células dendríticas y los macrófagos. En este contexto la IL21 actúa sobre distintas poblaciones pudiendo regular positiva o negativamente las respuestas inmunitarias (166). Destaca que en este modelo se seleccionaron sobre todo quimiocinas (7/10). Esto podría explicarse tal y como se plantea en un estudio en pacientes pediátricos diagnosticados de leucemia linfoblástica aguda en donde la expresión de ciertos receptores de quimiocinas se ve incrementada en pacientes en recaída. En este estudio plantean que las células dentro de un órgano secretan quimiocinas que reclutan aquellos leucocitos que expresan el receptor específico en sus membranas. De manera que las células tumorales migran siempre que expresen receptores de quimiocinas específicos. Las células tumorales serían indistinguibles de las células normales en su capacidad para utilizar estas vías celulares. Las células tumorales que secretan y/o responden a las quimiocinas tendrían una ventaja selectiva y podrían mostrar resistencia a la terapia (167). Finalmente se elaboró un modelo genético predictivo de supervivencia global. Las dos interleucinas seleccionadas en este modelo (Tabla 18) se correlacionaron con la vía JAK/STAT. En donde la producción de IFN-γ mediante la vía de JAK/STAT, como se da en la señalización por IL12RB1, se asocia con la supervivencia en varios tipos de cáncer (168). Respecto a IL10RB, mediante esta vía ejerce sus efectos antiinflamatorios que podrían relacionarse con la supervivencia. En cuanto a las quimiocinas seleccionadas se relacionan con procesos de migración y diferenciación de diferentes células del sistema inmune. Probablemente estas quimiocinas sean capaces de reclutar distintos tipos de células inmunitarias en el tumor que, a su vez, pueden modular el crecimiento tumoral y la metástasis. De hecho hay estudios donde se demuestra que las quimiocinas juegan un papel importante en el reclutamiento de distintas células del sistema inmune en el tumor (169). En los modelos de recaída y SG se seleccionó el mismo polimorfismo para CCL21 y CXCL11. En base a los descrito en la literatura ambas quimiocinas se correlacionan con activación, migración y diferenciación de las células T, lo que puede estar relacionado con el desarrollo de ciertas neoplasias, asociándose por tanto a recaída y supervivencia. DISCUSIÓN 107 Utilidad clínica de los modelos seleccionados para las complicaciones post-trasplante Como se ha comentado previamente clásicamente en la práctica clínica para estimar el riesgo de desarrollar EICR, así como otras complicaciones post-trasplante, se han utilizado variables clínicas como la edad del paciente, el sexo de donante y receptor, la fuente de progenitores hematopoyéticos, el régimen de acondicionamiento, toxicidad del tratamiento, tipo de trasplante, las líneas de tratamiento previo, etc. Sin embargo, con estas variables no se identifica con elevada exactitud a los pacientes con riesgo de desarrollar distintas complicaciones. Además la mayor parte de los estudios de polimorfismos genéticos no parecen tener, de forma individual, el peso suficiente como único predictor para determinar el riesgo de desarrollar complicaciones post-trasplante. Por esa razón en este trabajo se elaboraron modelos de predicción que incluyeran los polimorfismos en genes de citocinas de mayor relevancia. En nuestros resultados los modelos seleccionados se caracterizaron por tener una elevada sensibilidad (Tabla 10), destacando sobre todo los modelos de EICRc y EICRc mod-sev donde la sensibilidad fue del 83,28% y 87,88%; respectivamente. En donde concretamente para el modelo de EICRc mod-sev se observó que a los 2 años el 81% de los pacientes clasificados de alto riesgo desarrollaron esta complicación, y tan sólo el 8,8% de los de bajo riesgo acabaron teniendo EICRc mod-sev (Figura 12). Sin embargo, la sensibilidad para los modelos de EICRa tampoco fue desdeñable siendo de un 74,77% para el grado II-IV y 65,29% para el grado III-IV, dado que permite clasificar adecuadamente a los pacientes ya que el 80% para EICRa II-IV y el 70% para EICRa III-IV de los pacientes clasificados de alto riesgo desarrollaron esta complicación a los 180 días post-trasplante. Para los modelos de recaída, MRT y SG la sensibilidad fue un poco menor, siendo del 79%, 54% y 57% respectivamente, sin embargo los falsos positivos fueron inferiores al 10%. De manera que estos modelos han demostrado utilidad clínica para anticipar y estratificar a los pacientes de desarrollar complicaciones post-trasplante, lo que además es complementario a las variables clínicas ya conocidas. La implantación de estos modelos en las unidades de trasplante puede ayudar a dirigir mejor el tratamiento de estos pacientes y acercarnos a una medicina personalizada. En base a los resultados obtenidos, hay que tener en cuenta que la mayoría de las variables genéticas seleccionadas para los modelos predictivos de cada una de las complicaciones post- trasplante se localizaron en regiones no codificantes, y que la mayor parte de estos polimorfismos identificados por su relevancia clínica (asociación con complicaciones post- trasplante) no están descritos en la literatura. Por tanto un aspecto importante a llevar a cabo DISCUSIÓN 108 es la realización de estudios funcionales para determinar si estas variables genéticas producen cambios de expresión en las proteínas. Adicionalmente se deben validar estos modelos con un tamaño muestral mayor y en otras modalidades de TPH. En estos momentos estamos desarrollando un panel de NGS donde se incluyen los 41 polimorfismos seleccionados para cada una de las complicaciones post-trasplante que nos permita validar estos resultados en otra cohorte similar a la estudiada, y en cohortes donde esté incluida la Cy como profilaxis de la EICR. 6.2. Bloque 2. Polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida asociados a complicaciones post-trasplante La farmacogenética estudia la influencia de los genes sobre la actuación (eficacia, complicaciones, etc.) de los fármacos. Específicamente se centra en los genes que codifican para las enzimas que metabolizan los fármacos. La presencia de polimorfismos se ha asociado a cambios en el metabolismo o efecto de los fármacos (64). Estos estudios genéticos han permitido explicar la variabilidad interindividual en la respuesta o la toxicidad de los fármacos. En el alo-TPH, se han descrito distintos polimorfismos en genes implicados en el metabolismo de los fármacos utilizados en los regímenes de acondicionamiento y en la profilaxis de la EICR, tales como el metrotexate, ciclosporina A, busulfán y la Cy, implicados en el desarrollo de complicaciones post-trasplante (71), ya que conducen a la disminución o pérdida de actividad de las enzimas CYP450 (65,71). Además las variantes genéticas en los genes de detoxificación (GSTs) conducen a una detoxificación deficiente para eliminar los metabolitos intermedios debido a una menor actividad enzimática, lo que produce mayores cantidades de metabolitos tóxicos (86). El presente estudio se centra en el análisis de polimorfismos en enzimas del metabolismo de la Cy. La Cy es un agente alquilante que actúa a través de su metabolito activo, la mostaza fosforamida, para inducir la rotura de la cadena de ADN. Las células T citotóxicas se caracterizan por ser células de rápida proliferación por lo que de manera general son más susceptibles a la Cy debido a su capacidad reducida para replicar el ADN dañado. En cambio, las células madre hematopoyéticas, debido a la elevada expresión de ALDH, son resistentes a la acción de la Cy. La Cy administrada post-trasplante, por tanto, elimina las células T alorreactivas tanto del donante como del receptor sin alterar el injerto (67). La Cy es un profármaco que necesita ser metabolizada por el hígado para llevar a cabo su efecto. El sistema CYP450 se encarga de la transformación de la Cy en el metabolito antitumoral activo, la mostaza fosforamida (66). La detoxificación de los metabolitos de la Cy está mediada por ALDH y GSTs (65) (Figura 10). DISCUSIÓN 109 Existen pocos estudios (71) que describan el efecto de la presencia de polimorfismos en genes de activación y detoxificación del metabolismo de la Cy en el contexto del trasplante alogénico, y hasta la fecha no hay estudios en el contexto del haplo-TPH. El objetivo de este estudio ha sido identificar nuevos polimorfismos en genes del metabolismo de la Cy y correlacionarlos con distintas complicaciones (EICR, MRT, SOS o CH), tras un haplo- TPH. En este bloque, a diferencia del anterior, se aplicaron métodos estadísticos diferentes dado que el primer estudio tenía un número de variables elevado, lo que llevó a la necesidad de recurrir a estudios matemáticos más complejos para poder seleccionar las variables con mayor relevancia para cada una de las complicaciones post-trasplante. En cambio, en este bloque, dado que el número de variables era menor, no se hizo necesario aplicar esos métodos matemáticos de mayor complejidad, y por el contrario se aplicaron análisis de incidencia acumulada. Enfermedad de injerto contra receptor (EICR) En el contexto del alo-TPH si durante el metabolismo de la Cy se produce una menor cantidad de su metabolito activo (mostaza fosforamida), no se producirá la eliminación de las células T alorreactivas que podrían producir la EICR (67). Según nuestro conocimiento, hasta el momento no existen publicaciones que correlacionen polimorfismos en estas enzimas con el desarrollo de EICR. En el análisis univariante de este estudio se detectaron 8 polimorfismos en los genes CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8 y CYP2C9 correlacionados con EICR. Del total de variables genéticas, excepto CYP2A6 (rs4986892) para EICRc y CYP2B6 (rs3745274) para EICRc mod-sev, todas se correlacionaron con mayor riesgo de desarrollar EICR (aguda o crónica) (Tabla 22). CYP2B6 es la principal enzima implicada en la activación de Cy en el hígado (69). Los polimorfismos genéticos en el gen que codifica para esta enzima contribuyen a la variación interindividual de la actividad y expresión de CYP2B6 (170,171). Está descrito que el haplotipo CYP2B6*5 (rs3211371) produce una menor expresión de la proteína CYP2B6 y un 50% menos de 4-hidroxiciclofosfamida en comparación con el alelo salvaje (alelo mayoritario) (80,172). En nuestro estudio los pacientes con este polimorfismo presentaron una alta incidencia de EICRa II-IV, lo que se mantuvo en el análisis multivariante. Esto podría deberse a que al producir menos 4-hidroxiciclofosfamida, se produce por tanto menos fosforamida (metabolito activo de la Cy), y por ello una menor eliminación de los linfocitos T alorreactivos que dan lugar a la EICR. También se encontró que la presencia del alelo menos frecuente en el polimorfismo rs2279341 DISCUSIÓN 110 en el gen CYP2B6 estaba asociado con mayor riesgo de EICRc, sin embargo, no hay información sobre esta variante sinónima y su efecto en la función de la proteína. Además, la variante en el polimorfismo CYP2B6*6 (rs3745274) se asoció con una menor incidencia de EICRc mod-sev en los análisis univariante y multivariante. Estos resultados podrían explicarse dado que el alelo variante conduce a una expresión disminuida, aunque la proteína tiene mejor capacidad catalítica (173), lo que a pesar de tener una expresión disminuida es capaz de realizar adecuadamente, incluso mejor, el metabolismo de la Cy. CYP2A6 es una enzima con un papel menor en el metabolismo de la Cy. En este estudio los pacientes con la variante CYP2A6 (rs1801272), que produce una enzima no funcional (78), presentaron un riesgo incrementado de desarrollar EICRa grado II-IV, EICRc y EICRc mod-sev. Tiene sentido que esta variante no funcional se correlacione con EICRa y EICRc, ya que al no tener ningún tipo de actividad enzimática la Cy no puede transformarse en su metabolito activo y eliminar los linfocitos responsables de la EICR. En cuanto a la variante rs4986892 se encontró asociación con EICRc, pero como variable protectora de EICRc. Todavía no se sabe si, a pesar de ser una variante sinónima, implica cambios en la función de la proteína. En este estudio se vio que la presencia de dos variantes en los polimorfismos rs11572080 y rs10509681 en el gen CYP2C8 que constituyen el haplotipo CYP2C8*3, se correlacionaron con mayor riesgo de EICRa II-IV y III-IV. Estos dos polimorfismos se han correlacionado con la disminución de la actividad del CYP2C8 respecto al fármaco antitumoral paclitaxel (82). Sin embargo, hasta el momento no había estudios que correlacionasen estas variables con la EICR. Además, hay que tener en cuenta que el CYP2C8 tiene un papel menor en el metabolismo de la Cy. Otra enzima muy implicada en el metabolismo de la Cy es la enzima CYP2C9. En nuestro estudio observamos una asociación estadísticamente significativa entre la presencia de la variante en el polimorfismo CYP2C9*2 (rs1799853) y la EICRa II-IV y III-IV. Esta variante ya había sido descrita previamente con una menor actividad de la 4-hidroxilasa (83). Teniendo en cuenta esta menor actividad, tanto en los polimorfismos de CYP2C8 como de CYP2C9, la Cy no sería metabolizada en su totalidad a su forma activa y por tanto los linfocitos responsables de la EICR no serían eficazmente eliminados, lo que podría estar relacionado con el mayor riesgo de EICR. Por otro lado, la detoxificación de los metabolitos de Cy se produce principalmente a través de varias enzimas denominadas aldehído deshidrogenasas (ALDH1A1 y ALDH3A1). Adicionalmente otra vía de detoxificación incluye las enzimas denominadas glutatión S-transferasas (GSTA1, GSTM1, GSTP1 y GSTT1). Se sabe que la familia de las GSTs está compuesta por isoformas altamente polimórficas (86). Además, el busulfán, un agente antineoplásico alquilante y fármaco DISCUSIÓN 111 ampliamente utilizado en los regímenes de acondicionamiento previos al TPH, también es metabolizado por estas enzimas. Existen polimorfismos en los genes de detoxificación que conducen a una disminución de la capacidad de detoxificación de los metabolitos de Cy debido a una menor actividad enzimática, lo que conduce a un aumento de las cantidades de metabolitos tóxicos (65). GSTA1 es la principal GST en el hígado y es importante para la detoxificación de la Cy y el busulfán (65). GSTA1 tiene 3 polimorfismos asociados en la región promotora, y se han definido 2 haplotipos, GSTA1*A y GSTA1*B, basados en los polimorfismos de esta región (-631 T>G, -567 T>G, -69 C>T (rs3957357), y -52 G>A) (174). El haplotipo GSTA1*B se ha asociado a niveles reducidos de la proteína y, por tanto, a una menor detoxificación y a una mayor exposición al fármaco, lo que da lugar a una mayor exposición a los metabolitos activos de la Cy, y por tanto a una mayor toxicidad (85,175). Además, GSTA1 es la principal enzima implicada en el metabolismo del busulfán. En estudios anteriores se ha descrito que GSTA1*B reduce significativamente el aclaramiento del busulfán (176,177). En este estudio se obtuvo una correlación estadísticamente significativa entre GSTA1*B y una mayor incidencia de EICRa III-IV. Por lo tanto, la disminución de la actividad de esta enzima podría conducir a una acumulación de metabolitos tóxicos. La Cy no es directamente tóxica para las CES, sin embargo cuando es metabolizada, su metabolito activo, la mostaza fosforamida, que es un sustrato para GSTA1, es la responsable de la toxicidad que se puede producir en las células (74). De hecho, la EICR es una complicación relacionada con el daño tisular que se produce en el régimen de acondicionamiento y las citocinas inflamatorias que se producen. Hay estudios que demuestran que los pacientes con GSTA1*A (variante con mayor actividad enzimática que GSTA1*B) tienen una menor incidencia de EICR, ya que se produciría un menor daño tisular, lo cual coincide con lo descrito en nuestro estudio (178). Otra variante relacionada con la EICRa III-IV fue la rs1051775 en el gen GSTA1, sin embargo, es una variante sinónima y no hay estudios sobre su posible efecto en la proteína. GSTP1, codifica para una enzima con importante afinidad por los metabolitos de la Cy. La sustitución de un solo nucleótido A313G (rs1695) da lugar a un cambio de aminoácido que se asocia a una menor actividad catalítica específica del sustrato. Hay estudios que muestran que los pacientes con esta variante en el polimorfismo rs1695 tienen una mayor toxicidad cuando son tratados con Cy (65). En este estudio, los pacientes portadores de la variante A313G en rs1695 mostraron un mayor riesgo de desarrollar EICRa III-IV, lo cual es consistente con estudios previos que relacionan el polimorfismo rs1695 con una mayor incidencia de EICR (71). DISCUSIÓN 112 Las deleciones polimórficas en GSTT1 son comunes en la población (179). En nuestro estudio encontramos una correlación entre GSTT1*0 (alelo nulo) con una mayor incidencia de EICRa III- IV, lo que se mantiene en el análisis multivariante. La falta de este alelo podría dar lugar a que las enzimas implicadas en la activación de la Cy (CYP450) se saturen, al no ir eliminando los metabolitos intermedios, y por tanto no metabolicen la Cy a su forma activa, que es la que elimina los linfocitos alorreactivos de la EICR. Síndrome de obstrucción sinusoidal (SOS) En nuestro estudio se observó que la presencia del alelo menos frecuente (variante) en tres polimorfismos en los genes CYP2A6, CYP2B6 y GSTM1, respectivamente, se correlacionó con una mayor incidencia de SOS. El alelo variante para CYP2B6*6 conduce a una expresión disminuida de la proteína, aunque la proteína tiene una capacidad catalítica mejorada (173). En nuestros resultados se muestra que la incidencia de SOS fue mayor en pacientes portadores del genotipo GG CYP2B6*6 rs3745274 (alelo salvaje) posiblemente debido a la formación de metabolitos tóxicos. En el estudio de Rocha et al. (71) se describen los mismos resultados. En el caso de CYP2A6, a pesar de que tiene un papel menor en el metabolismo de la ciclofosfamida, puede que su efecto en el SOS también esté relacionado con la formación de mayor número de metabolitos tóxicos. Nuestros resultados mostraron una correlación entre GSTM1*0 (alelo nulo) con SOS, lo que se mantuvo en el análisis multivariante. En este contexto está descrito una mayor incidencia de SOS en pacientes con b-talasemia sometidos a TPH, portadores de GSTM1 nulo (73). Además, el busulfán provoca una toxicidad hepática que puede verse agravada por la exposición a la Cy, dando lugar al SOS (180). Esta correlación de GSTM1*0 con la Cy y busulfán puede explicarse dado que ambos fármacos necesitan de la acción de esta GST, la cual si no funciona adecuadamente podría producir la acumulación de metabolitos tóxicos. Hay que tener en cuenta que el uso de busulfán como parte del régimen de acondicionamiento y la presencia de GSMT1*0 están reconocidos como factores de riesgo de esta complicación post-trasplante (53). Estos resultados muestran que el estudio del alelo nulo de GSTM1 debería implementarse en el manejo clínico de los pacientes trasplantados de donantes haploidénticos con el fin de diseñar estrategias eficaces para prevenir el SOS. Cistitis Hemorrágica (CH) En el presente trabajo también se estudió la correlación entre los polimorfismos genéticos en el metabolismo de Cy y el desarrollo de CH. Encontramos que la presencia de la variante en el polimorfismo CYP2B6*4 (rs2279343) se asoció con la CH. Hay estudios que correlacionan la presencia de estos polimorfismos con una mayor incidencia de mucositis oral (71). Existen DISCUSIÓN 113 diferentes estudios sobre el aumento o la reducción de la actividad del CYP2B6*4 (81,173), si bien este polimorfismo no está bien estudiado y se necesita un mayor número de estudios. Sin embargo sí que existen polimorfismos en CYP2B6 relacionados con CH (65). La CH está directamente relacionada con la presencia de acroleína, un metabolito activo de la Cy (181), por lo que polimorfismos que afecten a la expresión de CYP2B6 pueden dar lugar a la producción de mayor o menor cantidad de acroleína, y en consecuencia influir en la incidencia de CH. Mortalidad relacionada con el trasplante (MRT) Aunque las complicaciones y la MRT han disminuido en los últimos años, la MRT sigue siendo el principal obstáculo para el TPH. Hay estudios que demuestran que el aumento de la exposición a los metabolitos tóxicos de la Cy conduce a un aumento de la toxicidad hepática, de la mortalidad y a una disminución de la supervivencia (182). Se seleccionaron tres variables genéticas en dos enzimas de activación (CYP2A6 y CYP2C19) y se correlacionaron con la probabilidad de sufrir MRT. La variante en el polimorfismo rs143731390 del gen CYP2A6 (CYP2A6*35) conduce a una disminución de la actividad de la enzima, lo que conlleva a una disminución de la activación de la Cy, lo que podría conducir a una acumulación de Cy y por lo tanto una mayor toxicidad (79). Este polimorfismo se mantuvo estadísticamente significativo en el análisis multivariante. Respecto a la enzima CYP2C19, se observó que la presencia de variantes (ambas sinónimas) en los polimorfismos rs4244285 y rs3758580 se correlacionaron de forma estadísticamente significativa con la MRT. Sin embargo, CYP2C19*2 (rs4244285), a pesar de ser una variante sinónima, es una variante que produce una alteración del marco de lectura y conduce a un codón de “stop” prematuro y a una proteína no funcional (84). Este polimorfismo había sido previamente descrito en un estudio que muestra que los portadores con el genotipo CYP2C19*2 tienen mayor probabilidad de MRT (183). Los pacientes con este genotipo clasificados como “malos metabolizadores” tenían una hepatotoxicidad y nefrotoxicidad significativamente mayores, por lo que todo ello puede influir en la MRT (183). Además encontramos dos polimorfismos estadísticamente significativos en el análisis univariante y multivariante en GSTA1 asociados a la MRT, el haplotipo GSTA1*B que se ha asociado a niveles reducidos de proteína, y una variante sinónima (rs1051775). El haplotipo GSTA1*B produce un menor metabolismo del fármaco (174), por lo que podría dar lugar a una mayor toxicidad en las células. Como conclusión general al estudio presentado en este bloque 2 encontramos una correlación entre los polimorfismos en los genes relacionados con el metabolismo de Cy y el desarrollo de EICR y otras complicaciones tras el haplo-TPH. En general, los polimorfismos relacionados con la DISCUSIÓN 114 disminución de la actividad de las enzimas que activan la Cy (nivel bajo del metabolito activo) se correlacionaron con una mayor EICRa, EICRc, MRT y SOS. Por otro lado, los polimorfismos asociados con una baja actividad en las enzimas de desintoxicación (alto nivel de metabolitos tóxicos) se correlacionaron con una mayor incidencia de EICR severa, MRT y SOS (Figura 14). Sin embargo, estos polimorfismos deberán validarse en otros tipos de alo-TPH con Cy post- trasplante. Esto demostraría la utilidad clínica que tiene el análisis de estas variables genéticas antes del trasplante, ya que podría facilitar la personalización del riesgo y el manejo clínico de los pacientes sometidos a haplo-TPH. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en ambos bloques de este trabajo se demuestra que la incorporación de estudios genéticos pre-trasplante donde se analicen la presencia de polimorfismos genéticos en genes del sistema inmune y en genes relacionados con el metabolismo de fármacos permiten anticipar el desarrollo de distintas complicaciones post- trasplante, así como mejorar el manejo terapéutico de los pacientes que vayan a recibir un trasplante. Conclusiones CONCLUSIONES 117 7. CONCLUSIONES 7.1. Bloque 1. Polimorfismos en genes de citocinas asociados a complicaciones post-trasplante 1. La mayor parte de los polimorfismos con relevancia clínica identificados se encuentran en secuencias no codificantes (habitualmente relacionadas con la expresión de los genes), en su mayoría no descritas en la bibliografía, lo que pone de manifiesto la importancia del estudio de estas regiones del genoma y su implicación en complicaciones post-trasplante. 2. La aplicación de algoritmos matemáticos permite la selección de las variables más relevantes para construir modelos predictivos de las distintas complicaciones post- trasplante en la práctica clínica. 3. Todos los modelos predictivos obtenidos están formados únicamente por variables genéticas, excepto el modelo de EICRa II-IV, el cual, además de variables genéticas, incluye una única variable clínica, la edad del donante y el receptor. 4. Los genes seleccionados en los modelos predictivos pertenecen a vías de señalización implicadas en procesos inflamatorios, como son la vía de señalización JAK/STAT y la vía de señalización IL17/TH17. 5. Los modelos predictivos con variables genéticas en genes de citocinas permiten la clasificación de los pacientes en alto o bajo riesgo de desarrollar complicaciones (EICRa, EICRc, MRT, recaída y SG) post-trasplante, lo que permitirá optimizar el manejo clínico de los pacientes trasplantados. 7.2. Bloque 2: Polimorfismos en genes del metabolismo de la ciclofosfamida asociados a complicaciones post-trasplante 1. Los polimorfismos con relevancia clínica localizados en secuencias codificantes se relacionan con la mayor o menor actividad de las proteínas, tal como se describe en la literatura, lo que pone de manifiesto la importancia del estudio de este tipo de polimorfismos y su implicación en complicaciones post-trasplante. 2. Las variables genéticas que conducen a una disminución de la actividad de las enzimas de activación de la Cy producen una menor cantidad de su metabolito activo. En cambio, los polimorfismos que disminuyen la actividad de las enzimas de detoxificación dan lugar a una mayor acumulación de metabolitos tóxicos. CONCLUSIONES 118 3. Los polimorfismos que reducen la actividad de las enzimas del metabolismo de la Cy tanto las relacionadas con el procesamiento como las de detoxificación, se relacionan con mayor incidencia de EICRa, EICRc, MRT y SOS. a) La presencia del polimorfismo rs3211371 en la enzima de activación CYP2B6 que conduce a una disminución de su actividad (menor metabolito activo) se asocia con el desarrollo de EICRa II-IV. Además, el alelo nulo de GSTT1, que produce una enzima no funcional, se correlaciona con EICRa III-IV. b) El polimorfismo rs3745274 en CYP2A6 se asocia con menor riesgo de EICRc mod-sev, dado que la mayor capacidad catalítica que le confiere esta variante, a pesar de tener una expresión disminuida, conduce a una mayor actividad de la enzima, y por tanto a un mayor metabolismo de la Cy. c) La MRT se asocia con la presencia de una variante genética en CYP2A6 y con el haplotipo GSTA1*B, polimorfismos que conducen a una disminución de la actividad de las enzimas de detoxificación, y por tanto a la acumulación de metabolitos tóxicos. d) La presencia del alelo nulo de GSTM1 es un factor de riesgo relacionado con el SOS. 4. La detección de polimorfismos en las enzimas implicadas en el metabolismo de la Cy permite caracterizar a los pacientes que metabolizan este fármaco de manera deficiente facilitando así la toma de decisiones terapéuticas que disminuyan el riesgo de desarrollo de complicaciones post-trasplante. CONCLUSIÓN GLOBAL El estudio de polimorfismos en donante y receptor previo al alo-TPH permite anticipar el desarrollo de distintas complicaciones, optimizando el manejo terapéutico de los pacientes, en el contexto de una medicina genómica personalizada. Bibliografía BIBLIOGRAFÍA 121 8. BIBILIOGRAFÍA 1. Doulatov S, Notta F, Laurenti E, Dick JE. Hematopoiesis: a human perspective. Cell Stem Cell. 2012;10(2):120-136. 2. Shafat MS, Gnaneswaran B, Bowles KM, Rushworth SA. The bone marrow microenvironment - Home of the leukemic blasts. Blood Rev. 2017;31(5):277-286. 3. Hu D, Shilatifard A. Epigenetics of hematopoiesis and hematological malignancies. Genes Dev. 2016;30(18):2021-2041. 4. McConnell TH. 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Selección de variables en el panel de NGS de allogenomics usando la metodología descrita en Pacientes y Métodos. Figura 12. Estratificación de los pacientes en alto/bajo riesgo de desarrollar las distintas complicaciones post-TPH acorde al modelo predictivo seleccionado y el punto de corte seleccionado. Figura 13. Selección de variables genéticas para el panel de NGS de enzimas del metabolismo de la Cy usando la metodología descrita en Pacientes y Métodos. Figura 14. Polimorfismos con disminución de la actividad en enzimas del metabolismo de la Cy y complicaciones post-TPH. Figura 15. Función de los linfocitos TH17 en la EICR. Figura 16. Mecanismo de la vía de señalización JAK/STAT en la EICR. ANEXOS 138 ANEXO II. Índice de tablas Tabla 1. Tipos de biomarcadores. Tabla 2. Ejemplos de polimorfismos en genes no HLA y su asociación con distintas complicaciones post-TPH. Tabla 3. Polimorfismos en genes del sistema inmune y su asociación con la EICR. Tabla 4. Polimorfismos en enzimas implicadas en el metabolismo de la ciclofosfamida y su asociación con complicaciones post-TPH. Tabla 5. Características clínicas de la cohorte de pacientes sometidos a un TPH HLA-idéntico incluidos en el estudio. Tabla 6. Genes incluidos en el panel de allogenomics, correspondientes a interleucinas y quimiocinas. Tabla 7. Características clínicas de la cohorte de pacientes sometidos a un Haplo-TPH incluidos en el estudio. Tabla 8. Genes relacionados con el metabolismo de la ciclofosfamida incluidos en el panel custom de NGS. Tabla 9. Resultados del análisis del panel de NGS allogenomics. Tabla 10. Puntos de corte seleccionados para realizar la estratificación de los pacientes en alto/bajo riesgo para cada una de las complicaciones post-TPH. Tabla 11. Asociación de las 15 variables más relevantes para EICRa II-IV Tabla 12. Asociación de las 15 variables más relevantes para EICRa III-IV. Tabla 13. Asociación de las 15 variables más relevantes para EICRc. Tabla 14. Asociación de las 15 variables más relevantes para EICRc moderada-severa. Tabla 15. Asociación de las 15 variables más relevantes para la MRT. Tabla 16. Asociación de las 15 variables más relevantes para la recaída. Tabla 17. Asociación de las 15 variables más relevantes para la supervivencia global. ANEXOS 139 Tabla 18. Relación funcional entre los genes seleccionados para cada complicación post- trasplante y la vía de señalización en la que participan, así como modelos predictivos de las complicaciones en las que se ha seleccionado cada gen. Tabla 19. Resultados del análisis del panel de NGS de ciclofosfamida. Tabla 20. Variables obtenidas tras la aplicación de los filtros descritos en el apartado de Pacientes y Métodos para el panel de NGS de genes relacionados con el metabolismo de la ciclofosfamida. Tabla 21. Análisis univariante entre complicaciones post-TPH y variables clínicas de la cohorte incluida en el estudio de enzimas del metabolismo de la ciclofosfamida con complicaciones tras un Haplo-TPH con Cy post-TPH. Tabla 22. Análisis univariante entre variables de las enzimas del metabolismo de la ciclofosfamida con complicaciones tras un Haplo-TPH con Cy post-TPH. Tabla 23. Análisis multivariante de las complicaciones después de un trasplante haploidéntico con ciclofosfamida post-trasplante. Tabla 24. Función y polimorfismos asociados a cada complicación post-trasplante de los genes seleccionados en el presente estudio. ANEXOS 140 AN EX O II I. G en es p ar ál og os re la ci on ad os c on lo s g en es d el m et ab ol is m o de la c ic lo fo sf am id a. La b ús qu ed a de g en es p ar ál og os se re al izó e n la b as e de d at os En se m bl . Ge n AL DH 1A 1 AL DH 3A 1 CY P2 A6 CY P2 B6 CY P2 C1 9 CY P2 C8 CY P2 C9 CY P3 A4 CY P3 A5 GS TA 1 GS TM 1 GS TT 1 GS TP 1 Pa rá lo go s AL DH 1A 2 AL DH 3A 2 CY P2 A1 3 CY P2 A1 3 CY P2 C9 CY P2 C1 9 CY P2 C1 9 CY P3 A7 CY P3 A7 GS TA 2 GS TA 2 N o ha y da to s GS TA 2 AL DH 1A 3 AL DH 3B 1 CY P2 A7 CY P2 A7 CY P2 C1 8 CY P2 C1 8 CY P2 C1 8 CY P3 A7 -C YP 3A 51 P CY P3 A7 -C YP 3A 51 P GS TA 5 GS TM 4 GS TA 1 AL DH 1A 2 AL DH 3B 2 CY P2 F1 CY P2 A6 CY P2 C8 CY P2 C9 CY P2 C8 CY P3 A5 CY P3 A4 GS TA 3 GS TM 2 GS TA 3 AL DH 1B 1 AL DH 1A 3 CY P2 B6 CY P2 C8 CY P2 E1 CY P2 E1 CY P2 E1 CY P3 A4 3 CY P3 A4 3 GS TA 4 GS TA 4 GS TA 4 AL DH 1L 1 AL DH 1A 1 CY P2 C1 9 CY P2 C9 CY P2 A1 3 CY P2 A1 3 CY P2 A1 3 GS TP 1 GS TM 3 GS TA 5 AL DH 1L 2 AL DH 1A 2 CY P2 S1 CY P2 S1 CY P2 F1 CY P2 F1 CY P2 F1 GS TM 2 GS TA 1 GS TM 3 AL DH 9A 1 AL DH 2 CY P2 C1 8 CY P2 F1 CY P2 A6 CY P2 A6 CY P2 A6 GS TM 1 GS TA 5 GS TM 4 AL DH 8A 1 AL DH 1B 1 CY P2 C9 CY P2 C1 9 CY P2 B6 CY P2 B6 CY P2 B6 GS TM 4 GS TA 3 GS TM 2 AL DH 5A 1 AL DH 8A 1 CY P2 C8 CY P2 C1 8 CY P2 A7 CY P2 A7 CY P2 A7 GS TM 3 GS TP 1 GS TM 1 AL DH 7A 1 AL DH 1L 1 CY P2 E1 CY P2 E1 CY P2 S1 CY P2 S1 CY P2 S1 GS TM 5 GS TM 5 GS TM 5 AL DH 6A 1 AL DH 9A 1 CY P2 D6 CY P2 D6 CY P2 D6 CY P2 D6 CY P2 D6 HP GD S HP GD S HP GD S AL DH 4A 1 AL DH 1L 2 CY P2 U1 CY P2 U1 CY P2 U1 CY P2 U1 CY P2 U1 AL DH 16 A1 AL DH 5A 1 CY P2 J2 CY P2 J2 CY P2 J2 CY P2 J2 CY P2 J2 AL DH 3A 1 AL DH 4A 1 CY P2 D7 CY P2 D7 CY P2 D7 CY P2 D7 CY P2 D7 AL DH 3A 2 AL DH 6A 1 CY P2 W 1 CY P2 W 1 CY P2 W 1 CY P2 W 1 CY P2 W 1 AL DH 3B 1 AL DH 7A 1 CY P2 R1 CY P2 R1 CY P2 R1 CY P2 R1 CY P2 R1 AL DH 3B 2 AL DH 16 A1 CY P2 A7 ANEXOS 141 AN EX O IV . V ar ia bl es g en ét ic as o bt en id as tr as la a pl ic ac ió n de lo s f ilt ro s d es cr ito s e n el a pa rt ad o de P ac ie nt es y M ét od os p ar a el a ná lis is d el p an el d e N G S al lo ge no m ic s. Cr : C ro m os om a; R ef : A le lo m ás fr ec ue nt e; V ar : A le lo d e la v ar ia nt e m in or ita ria ; E U R M AF : F re cu en ci a de l a le lo m in or ita rio e n eu ro pe os . Ge n N om en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Is of or m a ca nó ni ca (V ar ia nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF AC KR 3 at yp ic al ch em ok in e re ce pt or 3 Cr 2 23 65 68 87 1 C T up st re am rs 34 13 57 99 0, 1 23 65 69 29 5 A G up st re am rs 60 12 39 59 0, 05 23 65 69 68 6 G T EN ST 00 00 02 72 92 8. 3: c. -2 65 G> T 5’ U TR rs 61 04 80 17 0, 08 CC L1 1 ch em ok in e C- C m ot if lig an d 11 Cr 17 34 28 81 01 A G EN ST 00 00 03 05 86 9. 3: c. *4 11 A> G 3’ U TR rs 10 19 10 9 0, 19 34 28 58 75 G A EN ST 00 00 03 05 86 9. 3: c. 67 G> A m iss en se rs 11 29 84 4 0, 17 34 28 78 18 T A EN ST 00 00 03 05 86 9. 3: c. *1 28 T> A 3’ U TR rs 50 27 58 1 0, 73 34 28 78 28 A T EN ST 00 00 03 05 86 9. 3: c. *1 38 A> T 3’ U TR rs 76 02 80 40 0, 73 CC L1 4 ch em ok in e C- C m ot if lig an d 14 Cr 17 35 98 43 51 T C EN ST 00 00 06 22 52 6. 1: c. 22 9A >G m iss en se rs 16 97 18 02 0, 05 35 98 36 66 A G EN ST 00 00 06 22 52 6. 1: c. *1 35 T> C 3’ U TR rs 41 34 17 49 0, 07 35 98 37 24 C G EN ST 00 00 06 22 52 6. 1: c. *7 7G >C 3’ U TR rs 41 49 51 50 0, 04 35 98 34 54 T C do w ns tr ea m rs 71 38 14 88 0, 12 35 98 65 76 G A EN ST 00 00 06 22 52 6. 1: c. 74 C> T m iss en se rs 75 23 88 86 0, 04 35 98 69 71 G C up st re am rs 85 46 83 0, 23 35 98 68 79 A G up st re am rs 98 92 58 6 0, 07 CC L1 5 ch em ok in e C- C m ot if lig an d 15 Cr 17 36 00 15 03 G A EN ST 00 00 06 17 89 7. 1: c. -1 1C >T 5’ U TR rs 22 93 78 8 0, 06 35 99 75 81 C T do w ns tr ea m rs 41 38 98 47 0, 03 36 00 20 35 G A EN ST 00 00 06 17 89 7. 1: c. -5 43 C> T 5’ U TR rs 75 93 05 60 0, 03 36 00 14 22 G A EN ST 00 00 06 17 89 7. 1: c. 71 C> T m iss en se rs 85 46 25 0, 04 36 00 27 76 A C up st re am rs 85 46 28 0, 07 35 99 66 18 T G do w ns tr ea m rs 85 46 90 0, 22 35 99 68 16 T G do w ns tr ea m rs 85 46 91 0, 06 35 99 69 08 C T do w ns tr ea m rs 85 46 92 0, 22 ANEXOS 142 ANEXOS 143 ANEXOS 144 ANEXOS 145 ANEXOS 146 ANEXOS 147 ANEXOS 148 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF CX CL 13 ch em o ki n e C -X -C m o ti f lig an d 1 3 C r4 7 7 6 1 1 0 7 8 T C EN ST 0 0 0 0 0 2 8 6 7 5 8 .4 :c .* 3 9 T> C 3 ’U TR rs 1 0 5 2 5 6 3 0 ,1 CX CL 14 ch em o ki n e C -X -C m o ti f lig an d 1 4 C r5 1 3 5 5 7 1 3 4 1 T C EN ST 0 0 0 0 0 3 3 7 2 2 5 .5 :c .* 5 1 2 A >G 3 ’U TR rs 1 0 4 6 0 9 2 0 ,0 7 4 7 3 5 4 4 2 A G EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .4 2 5 T> C m is se ns e rs 1 0 5 0 9 9 8 0 ,4 4 4 7 3 3 5 1 8 A G do w ns tr ea m rs 1 0 5 1 0 0 7 0 ,1 4 4 7 3 4 5 9 1 G A EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .* 1 5 C >T 3 ’U TR rs 1 0 5 1 0 0 9 0 ,3 4 4 7 3 4 2 9 1 TA T EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .* 2 1 1 d el T 3 ’U TR rs 1 1 2 8 9 1 0 1 0 ,2 2 4 7 3 4 4 0 3 G A EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .* 1 0 0 C >T 3 ’U TR rs 1 1 6 5 8 9 7 1 0 ,1 4 4 7 3 5 2 6 8 G A EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .5 9 9 C >T m is se ns e rs 2 2 7 7 6 8 0 0 ,4 4 4 7 3 9 4 9 2 C A EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .- 9 6 G >T 5 ’U TR rs 2 3 0 4 9 7 0 0 ,5 7 4 7 3 3 7 2 1 C T EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .* 7 8 2 G >A 3 ’U TR rs 4 7 9 0 6 9 6 0 ,9 8 4 7 3 3 3 6 9 T C do w ns tr ea m rs 6 5 0 2 8 1 9 0 ,9 8 4 7 3 9 5 1 9 G T EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .- 1 2 3 C >A 5 ’U TR rs 7 5 2 3 7 0 0 ,2 2 4 7 3 9 5 2 0 C T EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .- 1 2 4 G >A 5 ’U TR rs 7 5 2 3 7 1 0 ,2 2 4 7 3 4 2 2 7 A G EN ST 0 0 0 0 0 2 9 3 7 7 8 .1 0 :c .* 2 7 6 T> C 3 ’U TR rs 7 6 1 5 2 7 0 3 0 ,0 9 CX CL 17 ch em o ki n e_ C -X - C _m o ti f_ lig an d _1 7 C r1 9 4 2 4 4 2 9 6 1 C T EN ST 0 0 0 0 0 6 0 1 1 8 1 .5 :c .- 1 2 9 G >A 5 ’U TR rs 1 1 6 7 3 6 4 5 0 ,0 9 7 4 0 9 7 5 8 6 C C A A A T EN ST 0 0 0 0 0 5 0 8 4 8 7 .2 :c .* 1 6 6 _* 1 6 9 d u p A TT T 3 ’U TR rs 3 3 9 5 0 4 8 6 0 ,4 7 7 4 0 9 9 5 5 7 T C up st re am rs 3 8 0 6 7 9 2 0 ,6 4 7 4 0 9 7 3 3 2 C T EN ST 0 0 0 0 0 5 0 8 4 8 7 .2 :c .* 4 2 4 G >A 3 ’U TR rs 9 1 3 1 0 ,6 2 7 3 9 9 6 3 7 3 C G EN ST 0 0 0 0 0 2 9 6 0 2 7 .4 :c .* 1 2 6 4 G >C 3 ’U TR rs 3 5 2 0 4 7 0 ,8 8 7 3 9 9 7 1 3 5 T C EN ST 0 0 0 0 0 2 9 6 0 2 7 .4 :c .* 5 0 2 A >G 3 ’U TR rs 3 7 7 5 4 8 8 0 ,3 3 7 3 8 4 3 5 2 3 C A do w ns tr ea m rs 1 0 0 0 4 8 1 9 0 ,9 7 7 3 8 4 3 6 4 9 A G do w ns tr ea m rs 1 0 0 1 6 5 5 4 0 ,9 7 7 3 8 3 8 2 8 2 C T EN ST 0 0 0 0 0 2 2 6 3 1 7 .9 :c .* 6 4 1 C >T 3 ’U TR rs 1 6 8 5 0 0 7 3 0 ,3 5 7 3 8 3 8 5 7 4 T C EN ST 0 0 0 0 0 2 2 6 3 1 7 .9 :c .* 9 3 3 T> C 3 ’U TR rs 1 9 5 7 0 7 7 0 ,9 8 ch em o ki n e C -X -C m o ti f lig an d 5 C r4 CX CL 6 ch em o ki n e C -X -C m o ti f lig an d 6 C r4 CX CL 16 ch em o ki n e C -X -C m o ti f lig an d 1 6 C r1 7 CX CL 2 ch em o ki n e_ C -X - C _m o ti f_ lig an d _2 C r4 CX CL 5 ANEXOS 149 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 7 6 0 0 1 8 3 5 A G E N S T 0 0 0 0 0 2 6 4 8 8 8 .5 :c .* 1 7 6 3 T > C 3 ’U T R r s 1 0 3 3 6 0 ,5 1 7 6 0 0 1 6 0 6 G A E N S T 0 0 0 0 0 2 6 4 8 8 8 .5 :c .* 1 9 9 2 C > T 3 ’U T R r s 1 0 3 3 7 0 ,1 8 7 6 0 0 1 5 9 6 G A E N S T 0 0 0 0 0 2 6 4 8 8 8 .5 :c .* 2 0 0 2 C > T 3 ’U T R r s 1 0 5 0 1 7 6 0 ,0 9 7 6 0 0 2 8 4 5 G A E N S T 0 0 0 0 0 2 6 4 8 8 8 .5 :c .* 7 5 3 C > T 3 ’U T R r s 3 7 3 3 2 3 6 0 ,0 8 2 1 8 1 6 5 1 2 0 A C E N S T 0 0 0 0 0 2 9 5 6 8 3 .2 :c .9 2 T > G m is se ns e r s 1 6 8 5 8 8 1 1 0 ,0 4 2 1 8 1 6 4 3 8 5 C G E N S T 0 0 0 0 0 2 9 5 6 8 3 .2 :c .8 2 7 G > C m is se ns e r s 2 2 3 4 6 7 1 0 ,0 3 2 1 8 1 3 6 2 4 3 G A E N S T 0 0 0 0 0 3 1 8 5 0 7 .6 :c .* 3 5 9 G > A 3 ’U T R r s 1 1 2 6 5 8 0 0 ,4 3 2 1 8 1 3 6 2 2 2 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 1 8 5 0 7 .6 :c .* 3 3 8 A > G 3 ’U T R r s 1 3 3 0 6 4 4 1 0 ,0 4 2 1 8 1 2 6 2 8 2 G A E N S T 0 0 0 0 0 3 1 8 5 0 7 .6 :c .- 1 4 9 G > A 5 ’U T R r s 4 6 7 4 2 5 9 0 ,5 1 1 3 6 1 1 7 3 5 6 G T G up st re am r s 1 1 3 2 3 0 0 0 1 1 3 6 1 1 7 3 3 6 G A up st re am r s 1 1 6 8 2 9 2 8 0 ,1 9 1 3 6 1 1 6 5 6 5 G A up st re am r s 1 3 9 8 7 7 4 3 0 0 ,0 4 1 3 6 1 1 7 1 2 2 T G up st re am r s 1 7 8 4 8 3 8 5 0 ,0 9 1 3 6 1 1 6 4 3 4 A G up st re am r s 2 4 7 1 8 5 9 0 ,1 9 1 3 6 1 1 5 9 7 9 A T E N S T 0 0 0 0 0 4 0 9 8 1 7 .1 :c .- 4 0 T > A 5 ’U T R r s 2 6 8 0 8 8 0 0 ,4 2 1 1 8 8 8 3 9 4 0 C G E N S T 0 0 0 0 0 2 9 2 1 7 4 .4 :c .- 2 C > G 5 ’U T R r s 1 0 8 9 2 3 0 7 0 ,1 7 1 1 8 8 9 4 8 9 1 A G E N S T 0 0 0 0 0 2 9 2 1 7 4 .4 :c .* 2 2 8 A > G 3 ’U T R r s 3 9 2 2 0 ,4 2 1 1 8 8 9 5 6 4 7 C C A E N S T 0 0 0 0 0 2 9 2 1 7 4 .4 :c .* 9 8 5 d u p A 3 ’U T R r s 4 5 5 4 3 9 3 3 0 ,2 5 1 1 8 8 9 5 3 0 9 C T E N S T 0 0 0 0 0 2 9 2 1 7 4 .4 :c .* 6 4 6 C > T 3 ’U T R r s 4 5 6 2 7 0 3 3 0 ,0 4 1 1 8 8 9 7 7 5 7 C C T E N S T 0 0 0 0 0 2 9 2 1 7 4 .4 :c .* 3 1 0 4 d u p T 3 ’U T R r s 5 2 9 9 7 6 7 2 4 0 ,2 5 1 1 8 8 9 6 3 6 8 T C E N S T 0 0 0 0 0 2 9 2 1 7 4 .4 :c .* 1 7 0 5 T > C 3 ’U T R r s 5 8 1 0 6 3 0 ,4 6 1 1 8 8 9 4 9 7 9 C G E N S T 0 0 0 0 0 2 9 2 1 7 4 .4 :c .* 3 1 6 C > G 3 ’U T R r s 6 7 6 9 2 5 0 ,2 5 1 1 8 8 9 6 8 5 5 G A E N S T 0 0 0 0 0 2 9 2 1 7 4 .4 :c .* 2 1 9 2 G > A 3 ’U T R r s 7 5 4 3 8 0 4 6 0 ,0 2 C r 2 CX CR 4 c h e m o k in e C - X - C m o t if r e c e p t o r 4 C r 2 CX CR 5 c h e m o k in e C - X - C m o t if r e c e p t o r 5 C r 1 1 CX CL 9 c h e m o k in e C - X - C m o t if L ig a n d 9 C r 4 CX CR 1 c h e m o k in e C - X - C m o t if r e c e p t o r 1 c h e m o k in e C - X - C m o t if r e c e p t o r 2 C r 2 CX CR 2 ANEXOS 150 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 4 5 9 4 7 5 5 2 T G E N S T 0 0 0 0 0 4 5 8 6 2 9 .1 :c .* 4 2 T > G 3 ’U T R r s 2 2 3 4 3 5 8 0 ,5 3 4 5 9 4 2 3 9 5 C T up st re am r s 3 7 7 4 6 3 8 0 ,2 1 4 5 9 4 2 1 6 2 G A up st re am r s 3 7 7 4 6 3 9 0 ,4 4 5 9 4 5 1 3 1 C A E N S T 0 0 0 0 0 4 5 8 6 2 9 .1 :c .- 1 3 5 1 C > A 5 ’U T R r s 9 3 6 9 3 9 0 ,2 1 2 0 6 7 7 3 0 6 2 T G up st re am r s 1 8 0 0 8 7 2 0 ,7 6 2 0 6 7 7 3 8 2 2 C T up st re am r s 1 8 0 0 8 9 3 0 ,4 5 2 0 6 7 7 3 3 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6 6 8 C T EN ST 0 0 0 0 0 6 7 4 2 0 3 .2 :c .- 3 3 6 C >T 5 ’U TR rs 1 2 1 4 2 8 2 3 0 ,1 6 6 7 3 0 7 6 4 8 G A EN ST 0 0 0 0 0 6 7 4 2 0 3 .2 :c .- 3 5 6 G >A 5 ’U TR rs 1 7 1 2 9 7 2 8 0 ,0 1 6 7 3 9 6 7 8 3 G T EN ST 0 0 0 0 0 6 7 4 2 0 3 .2 :c .* 6 9 4 G >T 3 ’U TR rs 1 8 7 4 3 9 6 0 ,9 8 6 7 3 6 7 8 4 4 G C EN ST 0 0 0 0 0 6 7 4 2 0 3 .2 :c .1 2 7 8 G >C m is se ns e rs 2 3 0 7 1 4 5 0 ,0 5 C r1 IL1 2B in te rl eu ki n 1 2 B C r5 IL1 2R B1 in te rl eu ki n 1 2 r ec ep to r su b u n it b et a 1 C r1 9 IL1 2R B2 in te rle uk in 1 2 re ce pt or su bu ni t b et a 2 IL1 2A in te rl eu ki n 1 2 A C r3 ANEXOS 153 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 1 3 2 6 5 6 1 8 9 C T up st re am r s 1 1 5 0 0 8 0 9 9 0 ,1 8 1 3 2 6 6 0 7 5 3 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 0 4 5 0 6 .7 :c .* 4 7 1 A > G 3 ’U T R r s 1 2 9 5 6 8 5 0 ,7 9 1 3 2 6 5 7 1 1 7 C T up st re am r s 1 8 0 0 9 2 5 0 ,1 8 1 3 2 6 6 0 2 7 2 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 0 4 5 0 6 .7 :c .4 3 1 A > G m is se ns e r s 2 0 5 4 1 0 ,7 9 1 3 2 6 5 5 9 6 4 C T up st re am r s 6 7 0 0 6 5 6 0 0 ,1 8 1 3 2 6 6 0 9 7 7 T C E N S T 0 0 0 0 0 3 0 4 5 0 6 .7 :c .* 6 9 5 T > C 3 ’U T R r s 8 4 7 0 ,7 9 1 3 2 6 6 0 8 0 8 A C E N S T 0 0 0 0 0 3 0 4 5 0 6 .7 :c .* 5 2 6 A > C 3 ’U T R r s 8 4 8 0 ,7 9 1 1 8 7 9 2 7 5 7 C C A T G E N S T 0 0 0 0 0 3 7 1 6 6 6 .7 :c .* 9 0 8 _ * 9 1 0 d u p T G A 3 ’U T R r s 1 1 1 6 5 3 6 1 4 0 ,2 9 1 1 8 7 2 6 1 6 4 G A up st re am r s 1 9 3 7 2 7 1 0 ,6 6 1 1 8 7 9 2 8 1 8 T G E N S T 0 0 0 0 0 3 7 1 6 6 6 .7 :c .* 9 6 4 T > G 3 ’U T R r s 2 2 5 4 6 7 2 0 ,1 3 1 1 8 7 9 2 4 1 6 C T E N S T 0 0 0 0 0 3 7 1 6 6 6 .7 :c .* 5 6 2 C > T 3 ’U T R r s 2 2 5 4 7 5 8 0 ,1 3 1 1 8 7 9 1 9 3 5 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 7 1 6 6 6 .7 :c .* 8 1 A > G 3 ’U T R r s 2 4 9 5 6 3 6 0 ,1 3 1 1 8 7 2 6 1 1 6 G A up st re am r s 2 4 9 5 6 3 7 0 ,1 3 1 1 8 7 2 7 3 5 8 G T up st re am r s 6 6 0 3 4 4 1 0 ,5 2 1 4 1 7 3 2 9 3 1 C A E N S T 0 0 0 0 0 2 9 6 5 4 5 .1 1 :c .* 8 3 C > A 3 ’U T R r s 1 0 5 1 9 6 1 3 0 ,1 1 1 4 1 7 3 3 2 7 9 A T E N S T 0 0 0 0 0 2 9 6 5 4 5 .1 1 :c .* 4 3 1 A > T 3 ’U T R r s 1 0 5 7 9 7 2 0 ,4 6 1 4 1 7 3 3 3 9 4 T C E N S T 0 0 0 0 0 2 9 6 5 4 5 .1 1 :c .* 5 4 6 T > C 3 ’U T R r s 1 0 8 3 3 0 ,6 5 1 4 1 7 1 9 3 8 5 T C E N S T 0 0 0 0 0 2 9 6 5 4 5 .1 1 :c .- 8 0 T > C 5 ’U T R r s 2 2 5 4 5 1 4 0 ,7 1 4 1 7 3 3 6 4 8 C T E N S T 0 0 0 0 0 2 9 6 5 4 5 .1 1 :c .* 8 0 0 C > T 3 ’U T R r s 2 2 9 1 5 9 6 0 ,4 6 1 4 1 6 3 6 1 2 6 T A up st re am r s 3 8 0 6 7 9 8 0 ,1 3 1 4 1 6 3 6 3 4 0 G A up st re am r s 4 1 2 5 7 9 1 5 0 ,0 3 1 4 1 7 3 3 3 6 5 G T E N S T 0 0 0 0 0 2 9 6 5 4 5 .1 1 :c .* 5 1 7 G > T 3 ’U T R r s 9 2 8 2 7 4 3 0 ,0 8 IL1 3 in t e r le u k in 1 3 C r 5 IL1 3R A1 in t e r le u k in 1 3 r e c e p t o r s u b u n it a lp h a 1 C r X IL1 5 in t e r le u k in 1 5 C r 4 ANEXOS 154 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 5 9 4 9 0 4 9 C T do w ns tr ea m rs 1 1 2 5 6 0 8 4 0 ,0 7 5 9 4 9 0 7 2 T C do w ns tr ea m rs 1 1 2 5 6 0 8 5 0 ,0 3 5 9 5 0 6 7 8 C T do w ns tr ea m rs 1 1 2 5 6 0 9 4 0 ,0 3 5 9 4 9 5 2 5 G C do w ns tr ea m rs 1 2 2 4 2 0 1 5 0 ,0 3 5 9 4 9 4 3 3 A G do w ns tr ea m rs 1 2 2 5 0 6 8 8 0 ,0 3 5 9 5 0 5 8 1 G A do w ns tr ea m rs 1 7 1 4 6 9 8 0 0 ,1 3 5 9 6 0 4 0 5 T G EN ST 0 0 0 0 0 3 9 7 2 4 8 .6 :c .8 0 3 A >C m is se ns e rs 2 2 2 8 0 5 9 0 ,4 6 5 9 5 3 0 8 9 C T EN ST 0 0 0 0 0 3 9 7 2 4 8 .6 :c .* 6 G >A 3 ’U TR rs 2 2 2 9 1 3 5 0 ,0 8 5 9 5 2 7 3 1 A C EN ST 0 0 0 0 0 3 9 7 2 4 8 .6 :c .* 3 6 4 T> G 3 ’U TR rs 2 2 9 6 1 3 5 0 ,4 9 5 9 7 8 1 3 8 C G up st re am rs 2 3 8 7 0 8 9 0 ,4 2 5 9 4 9 3 8 1 T C do w ns tr ea m rs 4 1 2 9 4 0 1 3 0 ,0 3 5 9 4 9 6 0 6 G A do w ns tr ea m rs 4 1 2 9 4 0 1 5 0 ,0 8 5 9 5 0 6 7 2 G A do w ns tr ea m rs 4 1 2 9 4 0 2 3 0 ,0 3 5 9 5 1 4 9 8 C T do w ns tr ea m rs 4 1 2 9 4 0 2 9 0 ,1 5 9 5 1 5 3 3 A T do w ns tr ea m rs 4 1 2 9 4 0 3 1 0 ,0 3 5 9 4 8 9 3 6 C T do w ns tr ea m rs 4 3 6 7 8 4 5 0 ,7 2 5 9 7 7 9 9 2 C G up st re am rs 4 7 4 9 8 5 8 0 ,9 8 5 9 7 8 0 5 7 G A up st re am rs 4 7 4 9 8 5 9 0 ,1 2 5 9 5 1 3 7 7 A G do w ns tr ea m rs 7 9 2 3 9 8 4 0 ,0 3 5 9 4 9 4 7 9 G C do w ns tr ea m rs 9 9 7 1 0 4 7 0 ,0 3 8 1 3 0 9 4 4 1 T C do w ns tr ea m rs 1 1 3 1 4 4 5 0 ,3 7 8 1 3 0 8 9 9 9 G T do w ns tr ea m rs 1 1 3 2 5 0 ,1 3 8 1 3 0 5 9 2 8 T G EN ST 0 0 0 0 0 3 0 2 9 8 7 .8 :c .3 4 4 1 T> G m is se ns e rs 1 1 5 5 6 2 1 8 0 ,0 7 8 1 3 0 9 6 6 7 C T do w ns tr ea m rs 1 7 8 7 5 5 5 6 0 ,1 IL1 6 in te rl eu ki n 1 6 C r1 5 IL1 5R A in te rl eu ki n 1 5 r ec ep to r su b u n it a lp h a C r1 0 ANEXOS 155 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 81 30 98 06 G A do w ns tr ea m rs 17 87 55 57 0, 1 81 31 10 58 C T do w ns tr ea m rs 17 87 55 58 0, 1 81 31 19 52 A T do w ns tr ea m rs 17 87 55 63 0, 27 81 30 94 04 G T do w ns tr ea m rs 17 87 55 85 0, 01 81 31 25 30 T C do w ns tr ea m rs 37 26 0, 41 81 28 57 98 C T EN ST 00 00 03 02 98 7. 8: c.1 30 0C >T m is se ns e rs 40 72 11 1 0, 1 81 31 17 90 A G do w ns tr ea m rs 47 78 64 0 0, 04 81 31 20 47 T C do w ns tr ea m rs 47 78 64 1 0, 41 81 31 20 48 T C do w ns tr ea m rs 47 78 89 2 0, 41 81 31 17 63 T C do w ns tr ea m rs 80 41 55 7 0, 47 81 30 89 81 A G do w ns tr ea m rs 85 9 0, 31 52 18 53 86 TC T up st re am rs 17 88 68 08 0, 94 52 19 05 37 C T EN ST 00 00 03 40 05 7. 1: c.* 12 45 C> T 3’ UT R rs 19 74 22 6 0, 18 52 19 05 41 C T EN ST 00 00 03 40 05 7. 1: c.* 12 49 C> T 3’ UT R rs 37 48 06 7 0, 09 52 18 59 88 A G up st re am rs 38 19 02 4 0, 38 52 18 55 55 A G up st re am rs 47 11 99 8 0, 74 52 18 94 51 G A EN ST 00 00 03 40 05 7. 1: c.* 15 9G >A 3’ UT R rs 77 47 90 9 0, 25 52 18 56 95 C T up st re am rs 81 93 03 6 0, 74 14 93 82 66 9 A G up st re am rs 11 09 46 6 0, 24 14 93 84 08 2 T C up st re am rs 16 84 83 0, 19 14 93 71 62 2 G A do w ns tr ea m rs 35 32 51 0, 5 14 93 79 45 1 A G up st re am rs 35 32 72 0, 17 14 93 80 62 6 A G up st re am rs 35 32 73 0, 19 14 93 83 78 0 A G up st re am rs 35 32 74 0, 19 14 93 72 45 7 C T do w ns tr ea m rs 37 24 02 0, 53 in te rle uk in 1 6 Cr 15 IL1 7A in te rle uk in 1 7A Cr 6 IL1 7B in te rle uk in 1 7B Cr 5 IL1 6 ANEXOS 156 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 17 11 01 99 G A EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 37 9G >A 3’ U TR rs 28 95 33 2 0, 65 17 11 02 54 C T EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 43 4C >T 3’ U TR rs 31 79 92 1 0, 59 17 11 30 82 AG A EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 32 65 de lG 3’ U TR rs 34 74 11 58 0, 07 17 11 50 25 C A EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 52 05 C> A 3’ U TR rs 38 27 27 8 0, 18 17 11 50 39 G C EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 52 19 G >C 3’ U TR rs 38 27 27 9 0, 19 17 10 92 90 G A EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .2 07 1G >A m is se ns e rs 41 32 36 45 0, 11 17 08 40 17 G A up st re am rs 48 19 55 3 0, 79 17 08 41 45 G A up st re am rs 48 19 55 4 0, 79 17 08 41 23 A G up st re am rs 48 19 95 8 0, 79 17 11 52 88 T C EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 54 68 T> C 3’ U TR rs 48 19 96 2 0, 72 17 11 29 90 TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT T EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 : c .* 31 70 _* 31 79 = 3’ U TR rs 54 79 06 48 0 0, 12 17 11 25 41 A G EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 27 21 A> G 3’ U TR rs 56 00 49 60 0, 05 17 11 21 57 CA T C EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 23 38 _* 23 39 de lA T 3’ U TR rs 57 38 05 32 0, 1 17 11 30 39 A G EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 32 19 A> G 3’ U TR rs 57 46 99 5 0, 07 17 11 55 87 G G A EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 57 79 du pA 3’ U TR rs 58 44 28 8 0, 45 17 11 41 80 T G EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 43 60 T> G 3’ U TR rs 59 92 62 8 0, 55 17 11 42 85 C T EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 44 65 C> T 3’ U TR rs 62 62 34 03 0, 06 17 11 39 96 T C EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 41 76 T> C 3’ U TR rs 73 80 35 0, 55 17 10 83 19 C T EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .1 10 0C >T m is se ns e rs 87 95 77 0, 26 17 11 09 33 C G EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 11 13 C> G 3’ U TR rs 88 26 43 0, 17 17 11 08 07 G A EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 98 7G >A 3’ U TR rs 88 26 44 0, 59 17 11 27 95 G A EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 29 75 G >A 3’ U TR rs 88 77 96 0, 8 17 08 50 42 T C EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .-5 0T >C 5’ U TR rs 91 78 64 0, 79 17 08 50 84 G C EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .-8 G >C 5’ U TR rs 91 78 65 0, 79 17 11 35 82 G A EN ST 00 00 03 19 36 3. 10 :c .* 37 62 G >A 3’ U TR rs 96 06 61 7 0, 7 Cr 22 IL1 7R A in te rle uk in 1 7 re ce pt or A ANEXOS 157 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 53 86 52 49 C T EN ST 00 00 02 88 16 7. 7: c. 14 50 C> T st op _g ai ne d rs 10 43 26 1 0, 07 53 85 88 03 T C EN ST 00 00 02 88 16 7. 7: c. 83 2T >C m is se ns e rs 22 32 34 6 0, 02 53 84 51 91 C G up st re am rs 28 38 56 69 0, 02 53 86 55 53 A G EN ST 00 00 02 88 16 7. 7: c. *2 45 A> G 3’ U TR rs 30 17 0, 35 53 84 53 45 T C up st re am rs 37 55 81 7 0, 31 53 86 55 74 C T EN ST 00 00 02 88 16 7. 7: c. *2 66 C> T 3’ U TR rs 37 74 62 6 0, 03 53 84 51 59 C T up st re am rs 45 56 08 31 0, 29 53 84 51 64 A G up st re am rs 45 61 62 36 0, 29 53 86 54 80 C T EN ST 00 00 02 88 16 7. 7: c. *1 72 C> T 3’ U TR rs 66 72 07 24 0, 04 53 86 55 38 T C EN ST 00 00 02 88 16 7. 7: c. *2 30 T> C 3’ U TR rs 70 93 24 0, 35 99 15 77 1 C T up st re am rs 10 56 28 6 0, 49 99 28 39 7 G A EN ST 00 00 02 95 98 1. 7: c. 11 83 G >A m is se ns e rs 11 54 61 44 8 0, 01 99 32 85 9 G C EN ST 00 00 02 95 98 1. 7: c. 17 35 +1 G >C sp lic e_ va ria nt rs 14 85 75 24 6 0, 01 99 13 55 9 G A up st re am rs 17 21 54 0, 54 99 17 19 0 C G EN ST 00 00 02 95 98 1. 7: c. -1 26 C> G 5’ U TR rs 76 78 13 54 0, 02 99 33 70 2 C G do w ns tr ea m rs 22 70 89 4 0, 22 99 28 34 7 A G EN ST 00 00 02 95 98 1. 7: c. 11 33 A> G m is se ns e rs 27 95 49 0, 99 99 33 66 9 A G do w ns tr ea m rs 27 95 51 0, 99 99 13 49 9 A G up st re am rs 27 95 66 0, 55 99 14 59 5 G A up st re am rs 45 58 63 0, 54 99 17 08 3 A T up st re am rs 45 65 20 0, 54 99 15 21 0 C T up st re am rs 69 38 02 0, 54 99 18 38 6 C T EN ST 00 00 02 95 98 1. 7: c. 54 5C >T m is se ns e rs 70 85 67 0, 54 IL1 7R B in te rle uk in 1 7 re ce pt or B Cr 3 IL1 7R C in te rle uk in 1 7 re ce pt or C Cr 3 ANEXOS 158 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 57 16 86 64 A AT TC T up st re am rs 10 64 35 09 0, 62 57 16 98 42 A AC up st re am rs 11 38 71 51 0, 62 57 09 48 13 T C EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *1 58 0A >G 3’ UT R rs 11 44 10 19 7 0, 02 57 09 41 83 G A EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *2 21 0C >T 3’ UT R rs 11 92 05 51 0, 22 57 09 16 99 T A EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *4 69 4A >T 3’ UT R rs 11 92 79 68 0, 22 57 09 18 36 A G EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *4 55 7T >C 3’ UT R rs 12 48 68 55 0, 15 57 16 95 00 G A up st re am rs 12 49 48 52 0, 11 57 10 25 57 C T EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. 90 1G >A m is se ns e rs 17 05 77 18 0, 15 57 09 13 96 G A EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *4 99 7C >T 3’ UT R rs 17 28 90 35 0, 19 57 09 39 63 G A EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *2 43 0C >T 3’ UT R rs 20 35 65 3 0, 9 57 09 11 74 T G EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *5 21 9A >C 3’ UT R rs 20 35 65 5 0, 19 57 09 10 73 A C EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *5 32 0T >G 3’ UT R rs 20 35 65 6 0, 15 57 16 65 49 C A up st re am rs 28 65 78 65 0, 21 57 16 65 52 C A up st re am rs 42 82 03 0 0, 66 57 16 67 30 C A up st re am rs 42 83 54 5 0, 62 57 16 67 92 C T up st re am rs 42 83 54 6 0, 04 57 16 93 70 C A up st re am rs 42 99 45 5 0, 4 57 16 94 73 C T up st re am rs 43 03 84 1 0, 62 57 09 04 90 C T EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *5 90 3G >A 3’ UT R rs 46 81 94 9 0, 56 57 16 59 16 T A up st re am rs 61 27 60 53 0, 62 57 09 80 07 G A EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. 16 96 C> T m is se ns e rs 61 74 22 67 0, 03 57 10 43 91 G A EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. 76 4C >T m is se ns e rs 67 80 99 5 0, 71 57 16 58 70 C T up st re am rs 73 07 52 82 0, 4 57 16 85 65 C G up st re am rs 76 30 09 3 1 57 16 89 81 A G up st re am rs 76 41 77 1 0, 66 57 09 13 52 C T EN ST 00 00 02 96 31 8. 11 :c. *5 04 1G >A 3’ UT R rs 93 11 64 1 0, 9 IL1 7R D in te rle uk in 1 7 re ce pt or D Cr 3 ANEXOS 159 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 9 9 2 0 4 4 0 C G do w ns tr ea m rs 1 1 5 7 9 4 7 1 2 0 ,0 6 9 9 1 7 0 0 2 C G C do w ns tr ea m rs 2 0 1 6 9 0 8 3 0 0 ,0 3 9 9 0 2 4 8 3 G A up st re am rs 2 7 9 5 8 9 0 ,3 6 9 9 0 1 3 8 8 A G up st re am rs 2 7 9 5 9 0 0 ,5 6 9 9 2 0 2 6 8 G C G do w ns tr ea m rs 3 4 9 8 4 4 1 9 0 ,5 7 9 9 0 1 6 7 1 G A up st re am rs 4 6 8 6 3 8 1 0 ,1 9 9 9 0 1 7 0 6 G A up st re am rs 4 6 8 6 3 8 2 0 ,0 5 9 9 1 8 0 2 9 C T do w ns tr ea m rs 4 6 8 6 3 8 3 0 ,1 9 9 9 0 2 4 4 9 C T up st re am rs 7 4 4 4 2 6 5 6 0 ,0 3 9 9 0 1 8 6 9 A G up st re am R s4 5 4 6 0 7 0 ,5 5 9 9 2 0 4 7 3 T C do w ns tr ea m rs 7 8 3 4 9 4 0 ,5 7 9 9 1 6 2 1 4 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 8 3 8 1 4 .7 :c .* 4 0 7 G >A 3 ’U TR rs 8 8 8 3 0 ,5 4 1 1 2 1 6 4 0 0 2 G A EN ST 0 0 0 0 0 2 8 0 3 5 7 .1 1 :c .- 1 0 5 C >T 5 ’U TR rs 3 6 0 7 1 7 0 ,9 8 1 1 2 1 6 4 0 1 6 A C EN ST 0 0 0 0 0 2 8 0 3 5 7 .1 1 :c .- 1 1 9 T> G 5 ’U TR rs 3 6 0 7 1 8 0 ,0 7 1 0 2 3 5 1 8 9 6 C T up st re am rs 1 0 1 9 2 1 5 7 0 ,4 1 0 2 3 5 1 3 8 4 C A up st re am rs 1 1 1 2 3 9 2 3 0 ,3 8 1 0 2 3 9 7 8 4 2 T G EN ST 0 0 0 0 0 4 0 9 5 9 9 .5 :c .* 9 5 6 T> G 3 ’U TR rs 1 1 3 5 3 5 4 0 ,2 5 1 0 2 3 9 6 9 2 8 TG T EN ST 0 0 0 0 0 4 0 9 5 9 9 .5 :c .* 4 6 d el G 3 ’U TR rs 1 1 4 6 5 6 5 6 0 ,0 3 1 0 2 3 9 8 2 3 6 C T EN ST 0 0 0 0 0 4 0 9 5 9 9 .5 :c .* 1 3 5 0 C >T 3 ’U TR rs 1 5 6 8 6 8 1 0 ,7 8 1 0 2 3 9 7 5 0 3 G C EN ST 0 0 0 0 0 4 0 9 5 9 9 .5 :c .* 6 1 7 G >C 3 ’U TR rs 3 7 3 2 1 2 5 0 ,2 5 1 0 2 3 9 7 5 0 2 A C EN ST 0 0 0 0 0 4 0 9 5 9 9 .5 :c .* 6 1 6 A >C 3 ’U TR rs 3 7 3 2 1 2 6 0 ,2 5 1 0 2 3 9 7 2 9 0 G C EN ST 0 0 0 0 0 4 0 9 5 9 9 .5 :c .* 4 0 4 G >C 3 ’U TR rs 3 7 3 2 1 2 7 0 ,1 8 1 0 2 3 5 1 4 6 8 A G up st re am rs 4 9 8 8 9 5 5 0 ,4 1 0 2 3 5 1 6 1 5 T C up st re am rs 4 9 8 8 9 5 7 0 ,4 1 0 2 3 5 1 8 2 5 T C up st re am rs 4 9 8 8 9 5 8 0 ,4 IL1 8R 1 in te rl eu ki n 1 8 re ce p to r 1 C r2 IL1 7R E in te rl eu ki n 1 7 re ce p to r E C r3 IL1 8 in te rl eu ki n 1 8 C r1 1 ANEXOS 160 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 1 0 2 3 5 0 9 7 1 G A up st re am r s 6 7 0 4 5 6 5 0 ,4 1 0 2 3 5 1 3 9 7 C T up st re am r s 6 7 3 4 7 4 2 0 ,4 1 0 2 3 5 1 1 2 7 A C up st re am r s 6 7 4 9 1 1 4 0 ,4 1 0 2 3 5 0 9 5 3 T C up st re am r s 6 7 5 1 9 6 7 0 ,4 1 0 2 3 5 0 9 7 0 T C up st re am r s 6 7 5 1 9 7 7 0 ,4 1 0 2 3 5 1 3 9 8 T C up st re am r s 6 7 5 2 4 8 2 0 ,4 1 0 2 3 9 6 9 4 8 C T E N S T 0 0 0 0 0 4 0 9 5 9 9 .5 :c .* 6 2 C > T 3 ’U T R r s 7 5 7 0 8 2 1 0 ,0 7 1 0 2 4 2 3 2 2 6 C A E N S T 0 0 0 0 0 2 6 4 2 6 0 .6 :c .- 5 2 C > A 5 ’U T R r s 1 1 4 0 1 0 1 0 0 ,1 2 1 0 2 4 1 8 5 8 4 A G up st re am r s 1 4 2 0 1 0 6 0 ,7 8 1 0 2 4 1 8 3 8 3 T A up st re am r s 1 8 3 3 1 7 4 0 ,5 3 1 0 2 4 1 8 2 8 9 A G up st re am r s 4 8 5 1 5 8 1 0 ,1 2 1 0 2 4 1 9 6 4 1 G T E N S T 0 0 0 0 0 2 6 4 2 6 0 .6 :c .- 2 5 7 G > T 5 ’U T R r s 6 7 5 6 4 0 7 0 ,1 1 0 2 4 5 2 3 2 7 G A E N S T 0 0 0 0 0 2 6 4 2 6 0 .6 :c .* 1 4 6 G > A 3 ’U T R r s 7 5 5 9 4 7 9 0 ,7 8 1 0 2 4 5 2 3 7 4 T A E N S T 0 0 0 0 0 2 6 4 2 6 0 .6 :c .* 1 9 3 T > A 3 ’U T R r s 7 6 0 3 2 5 0 0 ,7 8 2 0 6 8 4 2 7 8 0 C G E N S T 0 0 0 0 0 3 4 0 7 5 8 .6 :c .* 1 5 8 C > G 3 ’U T R r s 1 7 9 8 0 ,1 5 2 0 6 8 4 2 6 1 2 T C E N S T 0 0 0 0 0 3 4 0 7 5 8 .6 :c .6 3 8 T > C m is se ns e r s 2 2 4 3 1 9 1 0 ,7 7 2 0 6 8 4 2 8 8 0 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 4 0 7 5 8 .6 :c .* 2 5 8 A > G 3 ’U T R r s 2 2 4 3 1 9 3 0 ,7 6 2 0 6 7 9 8 3 9 5 A C up st re am r s 7 8 6 1 8 9 7 5 0 ,0 9 1 1 2 7 7 4 6 5 9 T C E N S T 0 0 0 0 0 2 6 3 3 3 9 .3 :c .* 4 0 8 A > G 3 ’U T R r s 1 3 0 4 0 3 7 0 ,2 9 1 1 2 7 7 9 6 4 6 C A E N S T 0 0 0 0 0 2 6 3 3 3 9 .3 :c .3 4 0 G > T m is se ns e r s 1 7 5 6 1 0 ,2 9 1 1 2 7 8 5 6 9 6 G A up st re am r s 1 8 0 0 7 9 4 0 ,2 9 1 1 2 7 7 4 5 0 6 A G E N S T 0 0 0 0 0 2 6 3 3 3 9 .3 :c .* 5 6 1 T > C 3 ’U T R r s 2 8 5 6 8 3 6 0 ,2 9 1 1 2 7 8 6 0 0 0 G A up st re am r s 3 7 8 3 5 2 1 0 ,3 2 1 1 2 7 7 4 1 3 8 T T T G A A E N S T 0 0 0 0 0 2 6 3 3 3 9 .3 :c .* 9 2 5 _ * 9 2 8 d u p T T C A 3 ’U T R r s 3 7 8 3 5 5 3 0 ,6 8 1 1 2 7 7 4 3 7 0 G C E N S T 0 0 0 0 0 2 6 3 3 3 9 .3 :c .* 6 9 7 C > G 3 ’U T R r s 4 1 2 9 4 7 3 6 0 ,0 2 IL1 9 in t e r le u k in 1 9 C r 1 IL1 A in t e r le u k in 1 a lp h a C r 2 IL1 8R 1 in t e r le u k in 1 8 r e c e p t o r 1 C r 2 IL1 8R AP in t e r le u k in 1 8 r e c e p t o r a c c e s s o r y p r o t e in C r 2 ANEXOS 161 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 1 1 2 8 2 9 8 5 6 C G EN ST 0 0 0 0 0 2 6 3 3 4 1 .6 :c .* 5 0 5 G >C 3 ’U TR rs 1 0 7 1 6 7 6 0 ,2 5 1 1 2 8 3 8 2 5 2 C G up st re am rs 1 1 4 3 6 2 3 0 ,2 9 1 1 2 8 3 7 7 8 2 T C up st re am rs 1 1 4 3 6 2 5 0 ,2 9 1 1 2 8 3 6 8 1 0 G A EN ST 0 0 0 0 0 2 6 3 3 4 1 .6 :c .- 1 1 8 C >T 5 ’U TR rs 1 1 4 3 6 2 7 0 ,6 5 1 1 2 8 3 7 5 7 6 TA C C A T up st re am rs 3 9 1 7 3 4 5 1 IL1 R2 in te rl eu ki n 1 re ce p to r, t yp e II C r2 1 0 1 9 9 1 8 8 8 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 3 2 5 4 9 .7 :c .- 1 8 5 G >A 5 ’U TR rs 7 8 4 2 3 0 6 7 0 ,0 1 1 9 0 6 5 7 4 5 9 C T EN ST 0 0 0 0 0 3 1 7 7 5 7 .7 :c .* 8 5 2 C >T 3 ’U TR rs 6 2 2 8 6 2 6 4 0 ,1 1 9 0 5 1 3 8 0 5 T G up st re am rs 7 3 0 5 8 1 4 1 0 ,0 4 1 9 0 5 1 3 8 2 4 C G up st re am rs 7 4 8 1 1 6 7 8 0 ,0 4 1 9 0 5 1 3 3 3 3 C G up st re am rs 7 7 4 7 9 4 2 7 0 ,3 4 1 0 2 3 5 1 7 5 1 C A EN ST 0 0 0 0 0 2 3 3 9 5 4 .5 :c .1 5 0 1 C >A m is se ns e rs 1 0 1 9 2 0 3 6 0 ,4 1 0 2 3 5 1 7 5 2 A G EN ST 0 0 0 0 0 2 3 3 9 5 4 .5 :c .1 5 0 2 A >G m is se ns e rs 1 0 2 0 4 1 3 7 0 ,4 1 0 2 3 5 1 9 0 2 T C EN ST 0 0 0 0 0 2 3 3 9 5 4 .5 :c .1 6 5 2 T> C m is se ns e rs 1 0 2 0 6 7 5 3 0 ,4 1 0 2 3 3 9 0 0 8 C A EN ST 0 0 0 0 0 2 3 3 9 5 4 .5 :c .2 3 3 C >A m is se ns e rs 1 0 4 1 9 7 3 0 ,2 4 1 0 2 3 5 6 0 7 4 C T do w ns tr ea m rs 1 1 9 0 2 0 4 4 0 ,1 3 1 0 2 3 3 8 1 9 3 C T EN ST 0 0 0 0 0 2 3 3 9 5 4 .5 :c .- 7 2 C >T 5 ’U TR rs 1 3 4 3 1 8 2 8 0 ,1 5 1 0 2 3 5 6 0 3 9 G G A G C G C C C C A G A C TG A G do w ns tr ea m rs 1 3 7 9 5 3 6 9 3 0 ,1 3 1 0 2 3 5 6 3 3 9 G C do w ns tr ea m rs 4 8 5 1 5 6 6 0 ,4 1 0 2 3 5 6 3 4 7 G A do w ns tr ea m rs 4 8 5 1 5 6 7 0 ,1 2 1 0 2 3 5 1 5 4 7 G A EN ST 0 0 0 0 0 2 3 3 9 5 4 .5 :c .1 2 9 7 G >A m is se ns e rs 4 9 8 8 9 5 6 0 ,4 1 0 2 2 3 9 3 7 1 G T EN ST 0 0 0 0 0 2 6 4 2 5 7 .6 :c .* 1 3 0 G >T 3 ’U TR rs 1 2 9 9 3 9 3 7 0 ,0 3 1 0 2 2 3 9 7 2 3 C T EN ST 0 0 0 0 0 2 6 4 2 5 7 .6 :c .* 4 8 2 C >T 3 ’U TR rs 1 3 0 0 1 0 7 5 0 ,0 5 1 0 2 1 8 6 9 8 4 T C EN ST 0 0 0 0 0 2 6 4 2 5 7 .6 :c .- 1 1 5 T> C 5 ’U TR rs 1 3 0 1 7 5 8 4 0 ,0 5 1 0 2 2 3 5 2 4 8 T C EN ST 0 0 0 0 0 2 6 4 2 5 7 .6 :c .1 6 4 9 T> C m is se ns e rs 2 3 0 2 6 1 2 0 ,1 9 in te rl eu ki n 1 re ce p to r ac ce ss o ry p ro te in C r3 IL1 RL 1 in te rl eu ki n 1 re ce p to r- lik e 1 C r2 IL1 B in te rl eu ki n 1 b et a C r2 IL1 RA P IL1 RL 2 in te rl eu ki n 1 re ce p to r- lik e 2 C r2 ANEXOS 162 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 1 1 3 1 1 3 0 8 6 G A up st re am rs 1 7 0 4 2 9 1 7 0 ,1 1 1 1 3 1 1 7 9 3 2 G A EN ST 0 0 0 0 0 2 5 9 2 0 6 .9 :c .- 8 7 G >A 5 ’U TR rs 2 2 3 4 6 7 7 0 ,2 9 1 1 3 1 1 7 9 8 8 A G EN ST 0 0 0 0 0 2 5 9 2 0 6 .9 :c .- 3 1 A >G 5 ’U TR rs 2 2 3 4 6 7 8 0 ,2 9 1 1 3 1 1 8 0 0 7 G C EN ST 0 0 0 0 0 2 5 9 2 0 6 .9 :c .- 1 2 G >C 5 ’U TR rs 2 2 3 4 6 7 9 0 ,2 9 1 1 3 1 3 3 0 0 9 C G EN ST 0 0 0 0 0 2 5 9 2 0 6 .9 :c .* 1 3 8 C >G 3 ’U TR rs 3 1 5 9 5 1 0 ,2 8 1 1 3 1 1 7 6 4 0 A C up st re am rs 4 2 5 1 9 6 8 0 ,2 9 1 1 3 1 3 3 0 3 3 C T EN ST 0 0 0 0 0 2 5 9 2 0 6 .9 :c .* 1 6 2 C >T 3 ’U TR rs 4 2 5 2 0 4 1 0 ,0 4 1 1 3 1 3 3 8 3 5 G A EN ST 0 0 0 0 0 2 5 9 2 0 6 .9 :c .* 9 6 4 G >A 3 ’U TR rs 9 0 0 5 0 ,3 1 1 3 7 0 0 0 2 6 5 G C EN ST 0 0 0 0 0 3 1 6 6 4 9 .9 :c .* 1 2 9 3 C >G 3 ’U TR rs 1 0 5 9 2 3 2 0 ,2 9 1 3 7 0 0 2 0 7 6 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 1 6 6 4 9 .9 :c .1 1 4 4 C >T m is se ns e rs 1 3 4 2 6 4 2 0 ,2 6 1 3 7 0 0 0 7 7 3 T G EN ST 0 0 0 0 0 3 1 6 6 4 9 .9 :c .* 7 8 5 A >C 3 ’U TR rs 1 4 7 5 1 1 9 0 ,4 3 1 3 7 0 0 4 7 1 0 C T EN ST 0 0 0 0 0 3 1 6 6 4 9 .9 :c .7 7 5 G >A m is se ns e rs 1 5 5 5 4 9 8 0 ,9 9 1 3 7 0 0 0 2 3 5 T C EN ST 0 0 0 0 0 3 1 6 6 4 9 .9 :c .* 1 3 2 3 A >G 3 ’U TR rs 3 5 4 7 9 4 0 4 0 ,0 3 1 3 7 0 0 0 1 9 9 C A EN ST 0 0 0 0 0 3 1 6 6 4 9 .9 :c .* 1 3 5 9 G >T 3 ’U TR rs 4 1 2 8 8 9 6 9 0 ,0 2 1 3 7 0 0 1 0 5 8 C T EN ST 0 0 0 0 0 3 1 6 6 4 9 .9 :c .* 5 0 0 G >A 3 ’U TR rs 7 7 1 9 5 6 0 ,9 9 1 3 6 9 5 5 6 2 6 A G up st re am rs 1 0 5 1 3 0 1 8 0 ,0 8 1 3 7 0 1 1 0 4 3 C T EN ST 0 0 0 0 0 3 2 9 5 8 2 .8 :c .* 8 2 0 C >T 3 ’U TR rs 1 0 8 8 5 8 0 ,6 1 1 3 6 9 5 7 5 4 9 C TT C T C up st re am rs 1 4 8 9 6 7 7 8 8 0 ,4 3 1 3 7 0 1 0 9 6 9 C T EN ST 0 0 0 0 0 3 2 9 5 8 2 .8 :c .* 7 4 6 C >T 3 ’U TR rs 3 6 1 2 3 6 0 ,0 7 1 3 6 9 5 7 8 6 0 T C up st re am rs 5 5 8 7 1 4 8 0 0 ,1 3 1 3 6 9 5 7 6 8 3 A T up st re am rs 8 3 5 6 3 2 0 ,4 3 1 3 6 9 5 7 6 5 4 T C up st re am rs 8 3 5 6 3 3 0 ,4 3 1 3 6 9 5 7 4 6 1 C T up st re am rs 8 3 5 6 3 4 0 ,4 3 1 3 6 9 5 5 6 5 8 A C up st re am rs 8 3 5 6 3 6 0 ,5 1 3 6 9 5 4 3 1 5 A T up st re am rs 8 3 5 6 3 7 0 ,4 7 IL1 RN in te rl eu ki n 1 re ce p to r an ta go n is t C r2 IL2 0R A in te rl eu ki n 2 0 re ce p to r su b u n it al p h a C r6 IL2 0R B in te rl eu ki n 2 0 re ce p to r su b u n it b et a C r3 ANEXOS 163 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 12 26 12 67 9 G A EN ST 00 00 02 64 49 7. 7: c. *3 1C >T 3’ U TR rs 17 87 92 98 0, 08 12 26 12 66 5 C T EN ST 00 00 02 64 49 7. 7: c. *4 5G >A 3’ U TR rs 17 88 63 48 0, 08 27 45 03 70 C G EN ST 00 00 03 37 92 9. 7: c. *1 08 7C >G 3’ U TR rs 20 96 0, 23 27 40 22 45 C T EN ST 00 00 03 37 92 9. 7: c. -3 90 C> T 5’ U TR rs 21 89 52 1 0, 62 27 40 20 09 G A up st re am rs 21 89 52 2 0, 05 27 40 18 30 G C up st re am rs 22 14 53 7 0, 35 27 44 98 80 C A EN ST 00 00 03 37 92 9. 7: c. *5 97 C> A 3’ U TR rs 22 39 92 8 0, 23 27 44 95 76 G A EN ST 00 00 03 37 92 9. 7: c. *2 93 G >A 3’ U TR rs 22 85 45 2 0, 23 27 44 97 47 G A EN ST 00 00 03 37 92 9. 7: c. *4 64 G >A 3’ U TR rs 30 93 38 7 0, 22 27 45 02 00 C T EN ST 00 00 03 37 92 9. 7: c. *9 17 C> T 3’ U TR rs 30 93 41 2 0, 1 27 44 94 60 G A EN ST 00 00 03 37 92 9. 7: c. *1 77 G >A 3’ U TR rs 56 80 31 23 3 0, 02 27 40 13 09 G G G TG G TG G TG G CA up st re am rs 56 86 77 94 4 0, 04 27 40 10 93 C T up st re am rs 80 60 36 8 0, 34 27 40 25 29 C T EN ST 00 00 03 37 92 9. 7: c. -1 06 C> T 5’ U TR rs 96 19 14 0, 12 68 25 43 96 A T up st re am rs 22 27 48 3 0, 55 68 25 41 49 G A up st re am rs 22 27 48 4 0, 2 68 24 81 48 T A do w ns tr ea m rs 22 27 50 8 0, 2 24 14 44 12 G C up st re am rs 10 79 46 44 0, 67 24 12 03 95 T C EN ST 00 00 02 70 80 0. 1: c. *4 10 A> G 3’ U TR rs 11 47 74 88 7 0, 04 24 14 44 34 C G up st re am rs 12 74 68 76 0, 05 24 12 81 98 C T EN ST 00 00 02 70 80 0. 1: c. 61 3G >A m is se ns e rs 16 82 92 04 0, 17 24 12 09 78 G C EN ST 00 00 02 70 80 0. 1: c. 15 52 C> G m is se ns e rs 37 95 29 9 0, 4 24 12 07 24 G A EN ST 00 00 02 70 80 0. 1: c. *8 1C >T 3’ U TR rs 37 95 30 0 0, 62 24 12 06 26 C T EN ST 00 00 02 70 80 0. 1: c. *1 79 G >A 3’ U TR rs 37 95 30 2 0, 41 24 14 45 05 T C up st re am rs 45 92 21 2 0, 95 IL2 2 in te rle uk in 2 2 Cr 12 IL2 2R A1 in te rle uk in 2 2 re ce pt or s ub un it al ph a 1 Cr 1 IL2 1R in te rle uk in 2 1 re ce pt or Cr 16 IL2 1 in te rle uk in 2 1 Cr 4 ANEXOS 164 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 24 14 45 04 T C up st re am rs 46 39 69 9 0, 95 24 14 41 88 A AT TG T up st re am rs 71 57 57 91 0, 95 24 11 97 81 C T EN ST 00 00 02 70 80 0. 1: c. *1 02 4G >A 3’ U TR rs 72 64 85 64 0, 08 13 71 44 51 9 A G EN ST 00 00 02 96 98 0. 6: c. *1 10 5T >C 3’ U TR rs 15 43 50 9 0, 13 13 71 43 93 7 A C EN ST 00 00 02 96 98 0. 6: c. *1 68 7T >G 3’ U TR rs 20 25 66 0, 83 13 71 45 47 7 A G EN ST 00 00 02 96 98 0. 6: c. *1 47 T> C 3’ U TR rs 27 64 66 0, 23 13 71 44 95 0 C T EN ST 00 00 02 96 98 0. 6: c. *6 74 G >A 3’ U TR rs 28 36 6 0, 82 13 71 61 70 3 A G EN ST 00 00 02 96 98 0. 6: c. 47 T> C m is se ns e rs 28 38 56 92 0, 03 13 71 73 48 5 G A EN ST 00 00 02 96 98 0. 6: c. -1 38 C> T 5’ U TR rs 65 70 13 6 0, 41 67 25 94 37 C A EN ST 00 00 03 47 31 0. 9: c. *3 09 C> A 3’ U TR rs 10 88 96 77 0, 3 67 24 02 75 G A EN ST 00 00 03 47 31 0. 9: c. 11 42 G >A m is se ns e rs 11 20 90 26 0, 06 67 16 81 29 G T EN ST 00 00 03 47 31 0. 9: c. 9G >T m is se ns e rs 18 84 44 4 0, 52 20 69 04 30 0 T C do w ns tr ea m rs 11 29 99 9 0, 43 20 69 01 56 0 T C EN ST 00 00 03 91 92 9. 7: c. 37 3T >C m is se ns e rs 11 50 25 8 0, 45 20 68 97 16 5 TT A T up st re am rs 14 26 66 39 2 0, 14 20 68 96 18 1 T C up st re am rs 29 11 11 0, 02 20 69 03 85 8 T A do w ns tr ea m rs 30 93 43 7 0, 01 20 69 03 86 5 A T do w ns tr ea m rs 30 93 43 8 0, 02 23 37 61 45 G T EN ST 00 00 03 29 71 5. 2: c. *2 65 G >T 3’ U TR rs 11 46 55 21 0, 02 23 37 60 35 G A EN ST 00 00 03 29 71 5. 2: c. *1 55 G >A 3’ U TR rs 38 11 17 8 0, 31 23 37 28 08 C T up st re am rs 71 45 53 1 0, 26 23 37 28 31 C T up st re am rs 71 45 55 1 0, 27 68 22 58 24 G A up st re am rs 11 57 09 15 0, 13 68 22 64 61 C T up st re am rs 20 68 01 6 0, 11 68 20 13 64 T C EN ST 00 00 02 29 13 4. 4: c. *4 81 A> G 3’ U TR rs 37 41 80 9 0, 1 in te rle uk in 2 5 Cr 14 IL2 6 in te rle uk in 2 6 Cr 12 IL2 2R A2 in te rle uk in 2 2 re ce pt or s ub un it al ph a 2 Cr 6 IL2 3R in te rle uk in 2 3 re ce pt or Cr 1 IL2 4 in te rle uk in 2 4 Cr 1 IL2 5 IL2 2R A1 in te rle uk in 2 2 re ce pt or s ub un it al ph a 1 Cr 1 ANEXOS 165 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 28 49 98 85 C G EN ST 00 00 03 56 89 7. 1: c. 49 8G >C m is se ns e rs 14 74 13 29 2 0, 05 28 50 77 75 T C up st re am rs 15 31 09 0, 4 28 50 39 07 A C EN ST 00 00 03 56 89 7. 1: c. 17 5T >G m is se ns e rs 17 85 57 50 0, 04 28 50 20 82 A G EN ST 00 00 03 56 89 7. 1: c. 35 6T >C m is se ns e rs 18 12 06 0, 29 28 49 95 24 A G EN ST 00 00 03 56 89 7. 1: c. *1 27 T> C 3’ U TR rs 40 83 7 0, 4 28 51 18 23 T C up st re am rs 56 35 49 01 0, 29 28 50 83 72 G A up st re am rs 78 22 57 63 0, 04 14 04 24 81 T C EN ST 00 00 02 63 37 9. 3: c. 56 3T >C m is se ns e rs 35 02 63 08 0, 2 14 03 18 04 C G EN ST 00 00 02 63 37 9. 3: c. -6 9C >G 5’ U TR rs 65 11 90 5 0, 22 14 03 08 54 G T up st re am rs 78 16 13 95 0, 15 60 11 41 1 A G EN ST 00 00 03 79 95 9. 7: c. *1 46 1T >C 3’ U TR rs 12 24 43 80 0, 42 60 12 19 5 C T EN ST 00 00 03 79 95 9. 7: c. *6 77 G >A 3’ U TR rs 12 71 99 19 0, 05 60 63 17 3 AA C A up st re am rs 12 72 24 85 0, 34 60 12 80 2 C T EN ST 00 00 03 79 95 9. 7: c. *7 0G >A 3’ U TR rs 12 72 26 00 0, 02 60 11 90 3 C T EN ST 00 00 03 79 95 9. 7: c. *9 69 G >A 3’ U TR rs 12 72 26 02 0, 11 60 11 20 0 T A EN ST 00 00 03 79 95 9. 7: c. *1 67 2A >T 3’ U TR rs 12 72 26 05 0, 2 60 11 17 0 G A EN ST 00 00 03 79 95 9. 7: c. *1 70 2C >T 3’ U TR rs 12 72 26 06 0, 28 60 10 68 1 A C do w ns tr ea m rs 12 72 26 09 0, 03 60 63 58 1 G A up st re am rs 14 21 01 28 2 0, 03 60 11 60 5 C T EN ST 00 00 03 79 95 9. 7: c. *1 26 7G >A 3’ U TR rs 15 70 53 8 0, 51 37 12 62 86 C T EN ST 00 00 02 16 22 3. 9: c. *1 81 0G >A 3’ U TR rs 14 64 13 24 0 0, 04 37 12 76 81 C G EN ST 00 00 02 16 22 3. 9: c. *4 15 G >C 3’ U TR rs 22 89 41 0, 29 37 12 85 79 G T EN ST 00 00 02 16 22 3. 9: c. 11 73 C> A m is se ns e rs 22 89 42 0, 18 13 20 60 63 9 C T EN ST 00 00 02 96 87 0. 2: c. -6 8C >T 5’ U TR rs 31 48 0, CR 01 10 65 0, 25 13 20 60 78 5 C T EN ST 00 00 02 96 87 0. 2: c. 79 C> T m is se ns e rs 40 40 1 0, 25 Cr 22 IL3 in te rle uk in 3 Cr 5 IL2 7R A in te rle uk in 2 7 re ce pt or s ub un it al ph a Cr 19 IL2 RB in te rle uk in 2 re ce pt or s ub un it be ta IL2 RA in te rle uk in 2 re ce pt or s ub un it al ph a Cr 10 IL2 7 in te rle uk in 2 7 Cr 16 ANEXOS 166 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 3 0 7 1 1 5 5 C T do w ns tr ea m rs 3 5 5 9 4 1 5 5 0 ,0 8 3 0 6 5 3 2 4 G C EN ST 0 0 0 0 0 5 2 5 6 4 3 .7 :c .- 1 9 9 G >C 5 ’U TR rs 7 6 5 8 0 9 4 7 0 ,1 6 2 5 6 2 9 2 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 8 1 4 3 4 .7 :c .* 1 2 4 G >A 3 ’U TR rs 1 0 4 8 2 7 4 0 ,3 2 6 2 5 6 5 2 9 A C EN ST 0 0 0 0 0 3 8 1 4 3 4 .7 :c .* 3 6 1 A >C 3 ’U TR rs 1 0 4 8 2 7 9 0 ,9 6 6 2 3 6 9 7 7 A T up st re am rs 1 0 9 7 5 5 0 7 0 ,2 3 6 2 3 7 2 6 3 G A up st re am rs 1 0 9 7 5 5 0 9 0 ,7 2 6 2 3 6 8 3 0 C T up st re am rs 1 1 2 9 3 5 6 1 6 0 ,2 3 6 2 5 7 9 1 9 TT A A A T EN ST 0 0 0 0 0 3 8 1 4 3 4 .7 :c .* 1 7 5 5 _* 1 7 5 8 d el A TA A 3 ’U TR rs 2 0 1 0 7 6 4 2 9 0 ,0 2 6 2 5 7 9 3 6 TC TA T EN ST 0 0 0 0 0 3 8 1 4 3 4 .7 :c .* 1 7 7 3 _* 1 7 7 5 d el TA C 3 ’U TR rs 3 0 6 9 9 0 4 0 ,9 3 6 2 5 7 8 9 8 A G EN ST 0 0 0 0 0 3 8 1 4 3 4 .7 :c .* 1 7 3 0 A >G 3 ’U TR rs 8 1 7 2 0 ,9 3 7 0 6 4 6 8 4 1 G C EN ST 0 0 0 0 0 4 2 9 1 4 9 .6 :c .- 1 0 7 G >C 5 ’U TR rs 3 8 1 3 9 0 4 0 ,4 6 7 0 6 4 6 9 4 7 C G EN ST 0 0 0 0 0 4 2 9 1 4 9 .6 :c .- 1 C >G 5 ’U TR rs 3 8 1 3 9 0 5 0 ,3 4 7 0 6 6 0 0 9 7 C A EN ST 0 0 0 0 0 4 2 9 1 4 9 .6 :c .6 3 9 C >A st o p _g ai n ed rs 4 9 8 5 5 5 6 0 ,1 7 0 6 5 7 0 8 6 G C EN ST 0 0 0 0 0 4 2 9 1 4 9 .6 :c .3 6 7 G >C m is se ns e rs 8 0 4 6 4 2 4 0 ,4 7 1 3 8 2 5 7 8 C T EN ST 0 0 0 0 0 3 3 1 0 3 5 .9 :c .* 1 1 3 C >T 3 ’U TR rs 1 1 4 8 0 0 ,1 4 1 3 7 8 7 5 1 G C EN ST 0 0 0 0 0 3 3 1 0 3 5 .9 :c .9 6 7 G >C m is se ns e rs 1 7 8 8 3 3 6 6 0 ,1 8 1 3 3 6 9 0 7 T C EN ST 0 0 0 0 0 3 3 1 0 3 5 .9 :c .- 5 8 T> C 5 ’U TR rs 7 4 7 1 0 5 2 0 ,6 2 1 3 2 6 7 4 0 1 8 C T EN ST 0 0 0 0 0 2 3 1 4 4 9 .6 :c .- 3 3 C >T 5 ’U TR rs 2 0 7 0 8 7 4 0 ,1 7 1 3 2 6 7 2 9 5 2 T G up st re am rs 2 2 4 3 2 4 8 0 ,0 7 1 3 2 6 7 3 4 6 2 C T up st re am rs 2 2 4 3 2 5 0 0 ,1 7 2 7 3 6 4 8 9 6 A G do w ns tr ea m rs 1 0 2 9 4 8 9 0 ,6 2 7 3 6 4 2 2 1 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 9 5 7 6 2 .6 :c .* 3 9 1 G >A 3 ’U TR rs 1 0 4 9 6 3 1 0 ,5 6 2 7 3 1 3 7 0 0 A G up st re am rs 1 2 9 2 7 1 7 2 0 ,6 3 2 7 3 1 3 7 0 2 G A up st re am rs 1 2 9 2 7 5 4 3 0 ,9 1 2 7 3 6 3 0 7 9 A G EN ST 0 0 0 0 0 3 9 5 7 6 2 .6 :c .1 7 2 7 A >G m is se ns e rs 1 8 0 1 2 7 5 0 ,2 1 IL4 in te rl eu ki n 4 C r5 IL4 R in te rl eu ki n 4 re ce p to r C r1 6 IL3 3 in te rl eu ki n 3 3 C r9 IL3 4 in te rl eu ki n 3 4 C r1 6 IL3 RA in te rl eu ki n 3 re ce p to r su b u n it al p h a C rX IL3 2 in te rl eu ki n 3 2 C r1 6 ANEXOS 167 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 27 34 48 82 A G EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. 22 3A >G m is se ns e rs 18 05 01 0 0, 43 27 36 25 51 A C EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. 11 99 A> C m is se ns e rs 18 05 01 1 0, 11 27 36 26 43 T C EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. 12 91 T> C m is se ns e rs 18 05 01 2 0, 1 27 36 26 59 C T EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. 13 07 C> T m is se ns e rs 18 05 01 3 0, 04 27 36 28 59 T C EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. 15 07 T> C m is se ns e rs 18 05 01 5 0, 15 27 36 36 06 T G EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. 22 54 T> G m is se ns e rs 18 05 01 6 0, 05 27 36 38 36 T C EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. *6 T> C 3’ U TR rs 20 74 57 0 0, 05 27 36 39 18 C G EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. *8 8C >G 3’ U TR rs 22 34 92 4 0, 04 27 31 35 59 A C up st re am rs 80 60 79 8 0, 49 27 31 35 60 C A up st re am rs 80 60 93 8 0, 49 27 36 45 68 C T EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. *7 38 C> T 3’ U TR rs 86 74 0, 04 27 36 44 66 A G EN ST 00 00 03 95 76 2. 6: c. *6 36 A> G 3’ U TR rs 88 32 0, 56 13 25 44 49 5 C T up st re am rs 20 69 81 0 0, 99 13 25 44 22 4 A G up st re am rs 20 69 81 2 0, 69 31 08 58 3 A G EN ST 00 00 04 46 63 2. 6: c. -3 7T >C 5’ U TR rs 11 71 34 19 0, 13 30 69 75 2 C T EN ST 00 00 04 46 63 2. 6: c. *4 73 G >A 3’ U TR rs 17 65 93 53 0, 24 31 10 07 5 C T EN ST 00 00 04 46 63 2. 6: c. -2 76 G >A 5’ U TR rs 22 90 60 8 0, 3 30 98 27 3 T C EN ST 00 00 04 46 63 2. 6: c. 38 5A >G m is se ns e rs 22 90 61 0 0, 35 30 69 77 4 G A EN ST 00 00 04 46 63 2. 6: c. *4 51 C> T 3’ U TR rs 34 08 33 0, 51 31 09 98 4 G A EN ST 00 00 04 46 63 2. 6: c. -1 85 C> T 5’ U TR rs 40 54 76 0 0, 28 22 72 56 13 T C up st re am rs 20 69 82 4 0, 1 22 72 58 37 G T up st re am rs 20 69 82 7 0, 12 22 72 57 17 G G TC up st re am rs 35 08 17 82 0, 61 22 72 47 19 G A up st re am rs 62 44 94 95 0, 2 IL5 RA in te rle uk in 5 re ce pt or s ub un it al ph a Cr 3 IL4 R in te rle uk in 4 re ce pt or Cr 16 IL5 in te rle uk in 5 Cr 5 IL6 in te rle uk in 6 Cr 7 ANEXOS 168 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 1 5 4 4 6 9 3 8 0 G T G EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .* 4 0 0 9 d el T 3 ’U TR rs 1 1 2 9 2 0 9 6 0 ,5 9 1 5 4 4 6 7 4 0 8 C TT C EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .* 2 0 3 1 _* 2 0 3 2 d el TT 3 ’U TR rs 1 4 3 9 1 5 1 4 1 0 ,0 1 1 5 4 4 0 3 8 7 7 C T up st re am rs 1 5 5 2 4 8 1 0 ,9 4 1 5 4 4 5 4 4 9 4 A C EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .1 0 7 3 A >C m is se ns e rs 2 2 2 8 1 4 5 0 ,3 6 1 5 4 4 6 5 4 2 0 T C EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .* 4 0 T> C 3 ’U TR rs 2 2 2 9 2 3 8 0 ,7 8 1 5 4 4 0 4 1 9 5 C T up st re am rs 3 8 8 7 1 0 4 0 ,1 6 1 5 4 4 6 6 4 0 4 T C EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .* 1 0 2 4 T> C 3 ’U TR rs 4 0 7 2 3 9 1 0 ,7 8 1 5 4 4 6 8 1 2 8 T C EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .* 2 7 4 8 T> C 3 ’U TR rs 4 1 3 0 8 4 1 5 0 ,0 1 1 5 4 4 6 7 3 8 9 T A EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .* 2 0 0 9 T> A 3 ’U TR rs 4 3 7 9 6 7 0 0 ,7 9 1 5 4 4 0 5 0 9 3 C T up st re am rs 4 8 4 5 6 1 6 0 ,9 7 1 5 4 4 0 5 4 2 2 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .- 2 0 8 G >A 5 ’U TR rs 4 8 4 5 6 1 7 0 ,4 1 5 4 4 6 7 5 8 6 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .* 2 2 0 6 G >A 3 ’U TR rs 7 3 0 1 6 2 1 0 0 ,0 1 1 5 4 4 6 5 6 0 8 C T EN ST 0 0 0 0 0 3 6 8 4 8 5 .7 :c .* 2 2 8 C >T 3 ’U TR rs 7 5 1 4 4 5 2 0 ,7 8 7 8 7 3 2 9 6 0 C A C EN ST 0 0 0 0 0 2 6 3 8 5 1 .8 :c .* 7 5 2 d el T 3 ’U TR rs 3 5 8 5 2 5 7 7 0 ,2 1 7 8 8 0 5 7 7 0 G T up st re am rs 6 9 9 7 8 9 1 0 ,1 1 3 5 8 7 8 0 3 8 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 0 3 1 1 5 .7 :c .* 1 5 5 2 G >A 3 ’U TR rs 1 0 0 5 3 8 4 7 0 ,1 4 3 5 8 7 7 4 0 3 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 0 3 1 1 5 .7 :c .* 9 1 7 G >A 3 ’U TR rs 1 0 0 6 3 2 9 4 0 ,5 6 3 5 8 7 7 8 1 2 A G EN ST 0 0 0 0 0 3 0 3 1 1 5 .7 :c .* 1 3 2 6 A >G 3 ’U TR rs 1 0 4 9 1 4 3 4 0 ,2 9 3 5 8 7 7 7 3 9 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 0 3 1 1 5 .7 :c .* 1 2 5 3 G >A 3 ’U TR rs 1 0 4 9 1 4 3 5 0 ,2 4 3 5 8 7 9 3 2 7 T C EN ST 0 0 0 0 0 3 0 3 1 1 5 .7 :c .* 2 8 4 1 T> C 3 ’U TR rs 1 0 5 3 4 9 6 0 ,2 9 3 5 8 5 2 8 1 2 G T G up st re am rs 1 0 7 1 2 5 3 0 0 ,6 7 3 5 8 5 6 4 7 3 T C up st re am rs 1 1 5 6 7 6 8 5 0 ,2 8 3 5 8 5 6 5 2 8 G A up st re am rs 1 1 5 6 7 6 8 6 0 ,7 3 5 8 7 9 0 3 3 G A EN ST 0 0 0 0 0 3 0 3 1 1 5 .7 :c .* 2 5 4 7 G >A 3 ’U TR rs 1 3 1 6 7 1 3 6 0 ,1 4 3 5 8 5 2 7 8 5 TT TT G T up st re am rs 1 4 2 3 7 6 7 8 8 0 ,6 7 IL6 R in te rl eu ki n 6 re ce p to r C r1 IL7 R in te rl eu ki n 7 re ce p to r C r5 IL7 in te rl eu ki n 7 C r8 ANEXOS 169 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 35 87 68 18 G G G AA A EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *3 42 _* 34 5d up AA AG 3’ U TR rs 14 54 16 68 9 0, 14 35 87 10 88 G A EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. 41 2G >A m is se ns e rs 14 94 55 5 0, 7 35 86 09 66 T C EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. 19 7T >C m is se ns e rs 14 94 55 8 0, 7 35 85 28 67 CT C up st re am rs 15 12 86 24 6 0, 28 35 87 95 01 A G EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *3 01 5A >G 3’ U TR rs 18 62 63 2 0, 14 35 87 61 72 A G EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. 10 66 A> G m is se ns e rs 31 94 05 1 0, 28 35 87 83 86 G C G EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *1 90 2d el C 3’ U TR rs 33 99 42 44 0, 14 35 85 28 21 T G up st re am rs 35 64 85 52 0, 7 35 87 88 25 T C EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *2 33 9T >C 3’ U TR rs 64 51 23 1 0, 7 35 87 89 93 C T EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *2 50 7C >T 3’ U TR rs 68 81 27 0 0, 27 35 87 90 54 G T EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *2 56 8G >T 3’ U TR rs 68 81 70 6 0, 27 35 87 44 73 C T EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. 73 1C >T m is se ns e rs 68 97 93 2 0, 27 35 87 94 93 A G EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *3 00 7A >G 3’ U TR rs 70 01 79 0, 29 35 87 94 81 G A EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *2 99 5G >A 3’ U TR rs 72 74 24 50 0, 06 35 85 28 45 CC T C up st re am rs 74 99 19 55 0, 28 35 85 28 12 TT G TT T TT EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. -2 66 _- 26 3d el 5’ U TR rs 75 62 71 58 6 0, 21 35 87 81 47 G A EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *1 66 1G >A 3’ U TR rs 77 16 06 4 0, 7 35 85 28 12 G TT T G TT TG TT T EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c .-2 66 _- 26 3d up 5’ U TR rs 75 62 71 58 6 0, 54 35 87 77 24 A T EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *1 23 8A >T 3’ U TR rs 92 92 61 7 0, 7 35 87 84 10 G A EN ST 00 00 03 03 11 5. 7: c. *1 92 4G >A 3’ U TR rs 92 92 61 8 0, 14 IL9 in te rle uk in 9 Cr 5 13 58 92 47 6 G A EN ST 00 00 02 74 52 0. 1: c. 35 0C >T m is se ns e rs 20 69 88 5 0, 13 15 60 10 16 2 A G EN ST 00 00 02 44 17 4. 10 :c .1 31 9A >G m is se ns e rs 15 01 78 90 3 0, 16 15 60 10 15 9 A G EN ST 00 00 02 44 17 4. 10 :c .1 31 6A >G m is se ns e rs 20 04 13 39 8 0, 14 in te rle uk in 9 re ce pt or Cr X IL9 R IL7 R in te rle uk in 7 re ce pt or Cr 5 ANEXOS 170 Ge n No m en cl at ur a Cr Po sic ió n Re f Va r Iso fo rm a c an ón ic a ( Va ria nt e) Lo ca liz ac ió n db SN P EU R M AF 1 6 8 5 8 1 2 9 7 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 6 7 8 1 8 .3 :c .* 7 7 A > G 3 ’U T R r s 1 0 4 2 8 8 2 0 ,3 1 1 6 8 5 7 6 6 2 6 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 6 7 8 1 8 .3 :c .- 1 2 A > G 5 ’U T R r s 1 1 6 4 5 3 1 8 4 0 ,1 6 1 6 8 5 8 1 2 7 4 G C E N S T 0 0 0 0 0 3 6 7 8 1 8 .3 :c .* 5 4 G > C 3 ’U T R r s 1 5 7 8 5 0 ,1 1 6 8 5 7 6 5 2 0 C T E N S T 0 0 0 0 0 3 6 7 8 1 8 .3 :c .- 1 1 8 C > T 5 ’U T R r s 2 8 4 3 3 3 3 7 0 ,5 7 1 6 8 5 8 1 9 9 8 C T E N S T 0 0 0 0 0 3 6 7 8 1 8 .3 :c .* 7 7 8 C > T 3 ’U T R r s 9 8 2 1 4 3 0 ,1 1 6 8 5 4 4 0 0 5 G A up st re am r s 1 9 3 3 1 1 4 0 ,2 3 1 6 8 5 4 0 8 8 4 T A E N S T 0 0 0 0 0 3 6 7 8 1 9 .2 :c .* 6 8 A > T 3 ’U T R r s 4 7 0 7 3 3 0 ,5 4 4 6 0 2 0 3 4 8 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .* 5 9 8 T > C 3 ’U T R r s 1 3 0 7 4 3 8 2 0 ,1 2 4 6 0 2 8 0 8 1 A C up st re am r s 1 3 0 9 0 1 9 4 0 ,1 2 4 6 0 2 0 5 0 5 T C E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .* 4 4 1 A > G 3 ’U T R r s 1 3 0 9 7 5 5 6 0 ,1 2 4 6 0 2 7 7 1 8 G A E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .- 3 3 3 C > T 5 ’U T R r s 1 3 9 2 2 9 0 0 ,3 4 4 6 0 2 8 1 7 8 C C T up st re am r s 1 4 2 5 9 9 9 7 3 0 ,0 8 4 6 0 2 7 5 7 7 G T G G up st re am r s 2 0 1 1 1 4 9 2 7 0 ,1 6 4 6 0 2 7 7 2 7 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .- 3 4 2 T > C up st re am r s 2 3 7 1 0 ,7 7 4 6 0 2 7 5 7 8 T G A T E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .- 1 9 5 _ - 1 9 4 d e lT C 5 ’U T R r s 3 4 8 3 5 2 4 5 0 ,4 2 4 6 0 1 9 7 2 6 T C E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .* 1 2 2 0 A > G 3 ’U T R r s 3 5 3 3 4 6 6 5 0 ,1 2 4 6 0 1 7 9 9 2 T C E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .* 2 9 5 4 A > G 3 ’U T R r s 3 5 4 5 4 8 7 7 0 ,1 2 4 6 0 1 9 8 1 2 A G E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .* 1 1 3 4 T > C 3 ’U T R r s 3 6 0 4 0 1 3 5 0 ,1 2 4 6 0 2 7 9 6 8 A G up st re am r s 4 4 4 7 8 0 7 0 ,1 8 4 6 0 1 7 6 4 7 T G E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .* 3 2 9 9 A > C 3 ’U T R r s 6 7 6 4 0 4 2 0 ,3 4 4 6 0 1 7 4 1 6 G A E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .* 3 5 3 0 C > T 3 ’U T R r s 7 1 3 2 7 0 0 6 0 ,1 2 4 6 0 1 7 7 5 7 C T E N S T 0 0 0 0 0 3 0 9 2 8 5 .3 :c .* 3 1 8 9 G > A 3 ’U T R r s 7 1 3 2 7 0 0 7 0 ,1 2 XC L2 c h e m o k in e C m o t if li g a n d 2 C r 1 XC R1 c h e m o k in e C m o t if r e c e p t o r 1 C r 3 XC L1 c h e m o k in e C m o t if li g a n d 1 C r 1 ANEXOS 171 AN EX O V . A U C de la s 15 v ar ia bl es m ás r el ev an te s in cl ui da s en lo s m od el os p re di ct iv os s el ec ci on ad os p ar a la s co m pl ic ac io ne s po st -t ra sp la nt e. A U C: á re a ba jo la cu rv a; S TD : D es vi ac ió n es tá nd ar ; E IC Ra : E nf er m ed ad d e in je rt o co nt ra re ce pt or a gu da ; E IC Rc : E nf er m ed ad d e in je rt o co nt ra re ce pt or c ró ni ca ; E IC Rc m od -s ev : E IC Rc m od er ad a- se ve ra ; M RT : M or ta lid ad re la ci on ad a co n el tr as pl an te ; S G : S up er vi ve nc ia g lo ba l; D: D on an te ; R : R ec ep to r. EI CR a II- IV EI CR a III -IV M RT SG Va ria bl e Po lim or fis m o AU C M ed ia ST D AU C Va ria bl e Po lim or fis m o AU C M ed ia ST D AU C Va ria bl e Po lim or fis m o AU C M ed ia ST D AU C Va ria bl e Po lim or fis m o AU C M ed ia ST D AU C Ed ad D - 0, 69 0, 10 IL 12 RB 1 rs 37 46 19 0 0, 64 0, 12 IL 20 RB rs 83 56 34 0, 68 0, 15 CX CL 11 rs 99 94 66 7 0, 65 0, 11 CC L2 5 rs 11 67 19 30 0, 68 0, 12 IL 17 A rs 38 19 02 4 0, 69 0, 14 IL 20 RB rs 83 56 32 0, 70 0, 14 CC L2 1 rs 11 57 49 15 0, 67 0, 11 Ed ad R - 0, 73 0, 11 IL 17 RA rs 48 19 96 2 0, 75 0, 15 IL 12 RB 1 rs 40 47 33 0, 72 0, 14 CC L1 6 rs 20 63 97 9 0, 70 0, 12 IL 26 rs 20 68 01 6 0, 76 0, 11 IL 21 R rs 96 19 14 0, 78 0, 16 CX CL 11 rs 99 94 66 7 0, 71 0, 13 CC L1 6 rs 14 60 38 76 0 0, 75 0, 11 CX CL 13 rs 10 52 56 3 0, 79 0, 10 CC L2 5 rs 11 29 76 3 0, 81 0, 12 IL 15 RA rs 23 87 08 9 0, 73 0, 12 IL 10 RB rs 10 58 86 7 0, 75 0, 11 IL 2R A rs 12 72 24 85 0, 81 0, 10 CX CR 2 rs 11 26 58 0 0, 78 0, 13 CX CL 2 rs 91 31 0, 74 0, 13 CC L2 5 rs 20 32 88 7 0, 77 0, 11 CX CR 4 rs 26 80 88 0 0, 81 0, 10 CX CL 16 rs 76 15 27 03 0, 79 0, 13 CC L2 8 rs 11 74 17 97 0, 74 0, 14 IL 12 RB 1 rs 37 46 19 0 0, 79 0, 11 IL 17 RA rs 11 70 29 18 0, 83 0, 10 IL 17 D rs 95 79 92 8 0, 80 0, 11 IL 12 RB 1 rs 37 46 19 0 0, 77 0, 13 CC L1 6 rs 33 99 55 60 0, 79 0, 09 IL 17 RA rs 88 77 96 0, 83 0, 10 IL 2R A rs 12 72 26 02 0, 82 0, 10 CX CL 12 rs 18 01 15 7 0, 78 0, 13 IL 1A rs 17 56 1 0, 86 0, 09 IL 12 RB 1 rs 37 46 19 0 0, 84 0, 10 IL 5R A rs 17 65 93 53 0, 84 0, 10 IL 12 B rs 34 32 47 65 0, 77 0, 14 CC L1 5 rs 85 46 25 0, 84 0, 09 IL 10 RA rs 31 35 93 2 0, 85 0, 09 IL 17 A rs 38 19 02 4 0, 86 0, 09 IL 20 RB rs 55 87 14 80 0, 83 0, 13 CC L2 5 rs 20 32 88 7 0, 84 0, 08 CX CR 5 rs 45 62 70 33 0, 87 0, 08 Ed ad D - 0, 85 0, 11 IL 10 rs 18 00 89 3 0, 82 0, 12 IL 10 rs 18 00 89 3 0, 85 0, 08 IL 1R L1 rs 10 20 67 53 0, 86 0, 08 IL 15 RA rs 23 87 08 9 0, 85 0, 11 IL 10 rs 30 24 49 6 0, 85 0, 12 IL 12 B rs 34 32 47 65 0, 88 0, 08 IL 1R L1 rs 10 19 21 57 0, 86 0, 08 IL 6 rs 62 44 94 95 0, 87 0, 10 CC L1 6 rs 20 63 97 9 0, 86 0, 13 IL 20 RB rs 55 87 14 80 0, 87 0, 08 IL 24 rs 14 26 66 39 2 0, 85 0, 09 IL 4R rs 18 05 01 0 0, 89 0, 09 IL 6 rs 62 44 94 95 0, 89 0, 10 IL 10 rs 30 24 49 6 0, 87 0, 08 ANEXOS 172 EI CR c EI CR c m od -s ev Re ca íd a Va ria bl e Po lim or fis m o AU C M ed ia ST D AU C Va ria bl e Po lim or fis m o AU C M ed ia ST D AU C Va ria bl e Po lim or fis m o AU C M ed ia ST D AU C IL 2R A rs 12 72 24 85 0, 65 0, 14 IL 7R rs 10 06 32 94 0, 72 0, 13 IL 21 R rs 80 60 36 8 0, 69 0, 11 IL 7R rs 10 06 32 94 0, 62 0, 14 IL 7R rs 72 74 24 50 0, 73 0, 12 CC L1 5 rs 22 93 78 8 0, 78 0, 1 XC R1 rs 23 71 0, 73 0, 14 IL 17 RC rs 27 95 49 0, 8 0, 11 CC L2 1 rs 11 57 49 15 0, 85 0, 1 IL 3R A rs 17 88 33 66 0, 74 0, 13 CX CR 6 rs 37 74 63 9 0, 82 0, 12 IL 21 R rs 96 19 14 0, 85 0, 1 IL 27 RA rs 35 02 63 08 0, 76 0, 14 IL 10 RA rs 42 52 24 3 0, 83 0, 11 CX CL 11 rs 99 94 66 7 0, 84 0, 1 IL 7R rs 75 62 71 58 6 0, 81 0, 12 IL 25 rs 71 45 55 1 0, 84 0, 1 IL 21 R rs 21 89 52 1 0, 84 0, 1 IL 17 F rs 23 97 08 4 0, 82 0, 12 IL 12 RB 1 rs 11 57 59 34 0, 87 0, 1 CX CR 4 rs 26 80 88 0 0, 91 0, 07 CX CL 16 rs 11 65 89 71 0, 84 0, 11 IL 7 rs 69 97 89 1 0, 84 0, 11 CC L1 5 rs 22 93 78 8 0, 91 0, 08 IL 17 A rs 77 47 90 9 0, 84 0, 11 IL 11 rs 22 98 88 5 0, 88 0, 1 CC L1 5 rs 41 50 86 45 0, 91 0, 07 IL 3R A rs 11 48 0 0, 87 0, 1 AC KR 3 rs 34 13 57 99 0, 88 0, 08 CC R1 0 rs 37 60 38 4 0, 93 0, 07 IL 7 rs 69 97 89 1 0, 87 0, 09 CX CR 4 rs 17 84 83 85 0, 93 0, 07 CX CL 2 rs 91 31 0, 94 0, 06 CX CL 12 rs 28 39 68 3 0, 9 0, 09 IL 25 rs 71 45 53 1 0, 91 0, 08 IL 7R rs 10 06 32 94 0, 93 0, 07 XC R1 rs 20 11 14 92 7 0, 89 0, 1 IL 5R A rs 22 90 61 0 0, 92 0, 08 CC L2 5 rs 20 32 88 7 0, 93 0, 07 IL 17 RA rs 88 77 96 0, 91 0, 08 CC L1 6 rs 20 63 97 9 0, 91 0, 08 CC R1 0 rs 22 71 02 9 0, 94 0, 06 IL 27 RA rs 35 02 63 08 0, 91 0, 08 IL 11 rs 10 42 50 5 0, 91 0, 07 IL 33 rs 10 48 27 4 0, 95 0, 05 ANEXOS 173 AN EX O V I. Re la ci ón d e la s ca ra ct er íst ic as d e lo s di st in to s p un to s de c or te p ar a la e st ra tif ic ac ió n de lo s pa ci en te s pa ra c ad a un a de la s c om pl ic ac io ne s po st - tr as pl an te . E IC Ra : E nf er m ed ad d e in je rt o co nt ra re ce pt or a gu da ; E IC Rc : E nf er m ed ad d e in je rt o co nt ra re ce pt or cr ón ic a; E IC Rc m od -s ev : E IC Rc m od er ad a se ve ra ; M RT : M or ta lid ad re la ci on ad a co n el tr as pl an te ; S G : S up er vi ve nc ia g lo ba l; ST D: D es vi ac ió n es tá nd ar ; S : S en sib ili da d; E : E sp ec ifi ci da d. E n ne gr ita se id en tif ic an lo s pu nt os d e co rt e se le cc io na do s pa ra la e st ra tif ic ac ió n de lo s pa ci en te s de a lto /b aj o rie sg o de d es ar ro lla r ca da u na d e la s co m pl ic ac io ne s po st -T PH a co rd e al m od el o se le cc io na do . S en sib ili da d =[ Po sit iv o/ (P os iti vo +F al so n eg at iv o) ]* 10 0. E sp ec ifi ci da d= [N eg at iv o/ (N eg at iv o+ Fa lso p os iti vo )]* 10 0. Pu nt o de co rt e S ST D (S ) E ST D (E ) N eg at iv os Fa lso s P os iti vo s Fa lso s N eg at iv os Po sit iv os EI CR a_ II- IV 0, 3 94 ,5 9% 7, 01 % 41 ,0 8% 17 ,9 2% m ed ia = 1 7, 80 % ST D = 8, 24 % m ed ia = 2 5, 11 % ST D = 9, 65 % m ed ia = 3 ,7 5% ST D = 4, 44 % m ed ia = 5 3, 33 % ST D = 9, 83 % 0, 4 90 ,4 2% 8, 69 % 57 ,9 6% 19 ,7 3% m ed ia = 2 4, 19 % ST D = 9, 34 % m ed ia = 1 8, 72 % ST D = 9, 83 % m ed ia = 6 ,1 1% ST D = 5, 66 % m ed ia = 5 0, 97 % ST D = 10 ,2 1% 0, 5 85 ,5 6% 11 ,4 4% 66 ,0 0% 16 ,4 6% m ed ia = 2 8, 44 % ST D = 9, 17 % m ed ia = 1 4, 47 % ST D = 8, 09 % m ed ia = 8 ,9 7% ST D = 6, 52 % m ed ia = 4 8, 11 % ST D = 10 ,0 5% 0, 6 74 ,7 7% 14 ,2 1% 73 ,5 0% 15 ,9 1% m ed ia = 3 1, 78 % ST D = 9, 50 % m ed ia = 1 1, 14 % ST D = 7, 30 % m ed ia = 1 5, 53 % ST D = 9, 27 % m ed ia = 4 1, 55 % ST D = 10 ,5 7% 0, 7 57 ,5 2% 15 ,1 4% 85 ,1 9% 13 ,7 7% m ed ia = 3 6, 36 % ST D = 9, 36 % m ed ia = 6 ,5 5% ST D = 6, 11 % m ed ia = 2 5, 92 % ST D = 10 ,7 5% m ed ia = 3 1, 17 % ST D = 10 ,1 0% EI CR a_ III -IV 0, 3 78 ,0 4% 19 ,6 6% 83 ,0 3% 11 ,3 5% m ed ia = 6 1, 58 % ST D = 10 ,1 9% m ed ia = 1 4, 78 % ST D = 10 ,2 5% m ed ia = 6 ,1 1% ST D = 6, 11 % m ed ia = 1 7, 53 % ST D = 8, 55 % 0, 4 65 ,2 9% 22 ,9 4% 91 ,0 9% 7, 87 % m ed ia = 6 8, 44 % ST D = 9, 37 % m ed ia = 7 ,9 2% ST D = 6, 72 % m ed ia = 8 ,4 2% ST D = 7, 05 % m ed ia = 1 5, 22 % ST D = 7, 80 % 0, 5 53 ,7 7% 23 ,6 4% 96 ,1 4% 5, 31 % m ed ia = 7 2, 64 % ST D = 9, 51 % m ed ia = 3 ,7 2% ST D = 4, 45 % m ed ia = 1 0, 55 % ST D = 7, 68 % m ed ia = 1 3, 08 % ST D = 6, 76 % 0, 6 45 ,2 7% 24 ,0 7% 97 ,9 6% 3, 71 % m ed ia = 7 4, 47 % ST D = 9, 72 % m ed ia = 1 ,8 9% ST D = 2, 97 % m ed ia = 1 3, 53 % ST D = 8, 48 % m ed ia = 1 0, 11 % ST D = 6, 15 % 0, 7 31 ,4 3% 22 ,2 1% 98 ,7 4% 2, 80 % m ed ia = 7 5, 33 % ST D = 9, 99 % m ed ia = 1 ,0 3% ST D = 2, 16 % m ed ia = 1 6, 80 % ST D = 9, 66 % m ed ia = 6 ,8 3% ST D = 5, 17 % EI CR c 0, 3 91 ,4 8% 10 ,1 5% 18 ,4 9% 19 ,4 8% m ed ia = 6 ,7 3% ST D = 7, 05 % m ed ia = 3 0, 15 % ST D = 14 ,7 0% m ed ia = 4 ,7 3% ST D = 5, 84 % m ed ia = 5 8, 38 % ST D = 12 ,7 8% 0, 4 89 ,1 9% 12 ,5 4% 43 ,9 2% 24 ,2 2% m ed ia = 1 6, 69 % ST D = 9, 20 % m ed ia = 2 0, 19 % ST D = 15 ,5 1% m ed ia = 6 ,4 6% ST D = 7, 63 % m ed ia = 5 6, 65 % ST D = 12 ,5 0% ANEXOS 174 ANEXOS 175 ANEXOS 176 AN EX O V II. R es um en d e la s va ria bl es s el ec ci on ad as p ar a ca da u no d e lo s m od el os a pl ic ad os e n la s co m pl ic ac io ne s po st -t ra sp la nt e. IL : I nt er le uc in as ; Q : Q ui m io ci na s; D : D on an te ; R : R ec ep to r; RC : R eg io ne s co di fic an te s; R N C: R eg io ne s no c od ifi ca nt es .; EI CR a: E nf er m ed ad d e in je rt o co nt ra r ec ep to r ag ud a; EI CR c: E nf er m ed ad d e in je rt o co nt ra r ec ep to r cr ón ic a; E IC Rc m od -s ev : EI CR c m od er ad a- se ve ra ; M RT : M or ta lid ad r el ac io na da c on e l tr as pl an te ; SG : su pe rv iv en ci a gl ob al . ANEXOS 177 AN EX O V III . R es ul ta do d el a ná lis is u ni va ria nt e si n si gn ifi ca ci ón e st ad íst ic a en tr e po lim or fis m os d e la s en zi m as d el m et ab ol is m o de la C y co n co m pl ic ac io ne s t ra s un H ap lo -T PH c on C y po st -T PH . E IC Ra : E nf er m ed ad d e in je rt o co nt ra re ce pt or a gu da ; E IC Rc : E nf er m ed ad d e in je rt o co nt ra re ce pt or c ró ni ca ; E IC Rc m od -s ev : E IC Rc m od er ad a- se ve ra ; M RT : M or ta lid ad re la ci on ad a co n el tr as pl an te ; S O S: S ín dr om e de o bs tr uc ci ón si nu so id al ; C H: C ist iti s h em or rá gi ca ; R ef : A le lo m ás fr ec ue nt e; V ar : Al el o de la v ar ia nt e m in or ita ria ; I C: In te rv al o de c on fia nz a; S HR : r el ac ió n de ri es go : > 1 rie sg o; < 1 pr ot ec to r. Ge n Re f Va r Is of or m a ca nó ni ca (v ar ia nt e) Ef ec to d e la va ria nt e Po lim or fis m o EI CR a II- IV EI CR a III -IV EI CR c EI CR c m od - se v M RT SO S CH p- va lo r; SH R (9 5% IC ) CY P2 A6 C T EN ST 00 00 03 01 14 1. 5. c. 12 24 C> T p. (P ro 40 8= ) Si nó ni m a rs 28 39 94 62 0, 95 ; 1 ,0 2 (0 ,4 1- 2, 54 ) 0, 74 ; 1 ,2 6 (0 ,3 1- 5, 13 ) 0, 43 ; 0 ,6 3 (0 ,2 0- 1, 98 ) 0, 33 ; 0 ,3 8 (0 ,0 5- 2, 66 ) 0, 16 ; 0 ,2 4 (0 ,0 3- 1, 73 ) 0, 88 ; 0 ,8 5 (0 ,1 1- 6, 49 ) 0, 49 ; 1 ,5 7 (0 ,4 5- 5, 49 ) C T EN ST 00 00 03 01 14 1. 5. c. 12 45 C> T p. (H is 41 5= ) Si nó ni m a rs 20 02 97 7 0, 52 ; 1 ,3 0 (0 ,5 8- 2, 95 ) 0, 65 ; 0 ,6 2 (0 ,0 7- 4, 93 ) 0, 96 ; 0 ,9 7 (0 ,3 6- 2, 65 ) 0, 39 ; 0 ,4 1 (0 ,0 5- 3, 12 ) 0, 29 ; 0 ,5 1 (0 ,1 4- 1, 82 ) 0, 38 ; 1 ,9 2 (0 ,4 4- 8, 29 ) 1; 1 ,0 1 (0 ,2 6- 3, 92 ) G A EN ST 00 00 03 01 14 1. 5. c. 14 4G >A p .(G ln 48 =) Si nó ni m a rs 81 92 72 1 0, 55 ; 1 ,2 4 (0 ,5 7- 2, 70 ) 0, 21 ; 1 ,3 7 (0 ,4 1- 3, 21 ) 0, 61 ; 1 ,2 4 (0 ,5 3- 2, 90 ) 0, 38 ; 0 ,4 1 (0 ,0 5- 3, 10 ) 0, 14 ; 0 ,2 4 (0 ,0 3- 1, 59 ) 0, 38 ; 1 ,9 2 (0 ,4 4- 8, 29 ) 0, 73 ; 0 ,5 9 (0 ,1 2- 2, 80 ) T C EN ST 00 00 03 01 14 1. 5. c. 21 7T >C p .(L eu 73 =) ) Si nó ni m a rs 23 02 99 0 0, 12 ; 0 ,5 5 (0 ,2 6- 1, 16 ) 0, 27 ; 0 ,4 4 (0 ,1 0- 1, 89 ) 0, 53 ; 0 ,7 9 (0 ,3 9- 1, 63 ) 0, 05 ; 0 ,1 3 (0 ,0 1- 1, 01 ) 0, 99 ; 1 (0 ,4 9- 2, 02 ) 0, 25 ; 0 ,3 1 (0 ,0 4- 2, 30 ) 1; 0 ,9 1 (0 ,3 6- 2, 29 ) A G EN ST 00 00 03 01 14 1. 5. c. 51 A> G p .(V al 17 =) Si nó ni m a rs 11 37 11 5 0, 94 ; 0 ,9 6 (0 ,4 3- 2, 16 ) 0, 82 ; 0 ,8 5 (0 ,1 9- 3, 71 ) 0, 79 ; 0 ,8 9 (0 ,3 8- 2, 05 ) 0, 71 ; 1 ,2 0 (0 ,4 4- 3, 34 ) 0, 65 ; 0 ,7 9 (0 ,2 8- 2, 21 ) 0, 84 ; 1 ,1 5 (0 ,2 7- 4, 81 ) 0, 56 ; 0 ,5 8 (0 ,1 6- 2, 10 ) C T EN ST 00 00 03 01 14 1. 5. c. 77 1C >T p .(A rg 25 7= ) Si nó ni m a rs 18 09 81 1 0, 22 ; 1 ,5 2 (0 ,7 7- 3, 00 ) 0, 53 ; 0 ,5 2 (0 ,0 6- 4, 09 ) 0, 47 ; 1 ,3 5 (0 ,5 9- 3, 08 ) 0, 73 ; 0 ,7 7 (0 ,1 7- 3, 46 ) 0, 18 ; 0 ,4 2 (0 ,1 1- 1, 53 ) 0, 52 ; 1 ,6 0 (0 ,3 7- 6, 94 ) 0, 75 ; 1 ,2 3 (0 ,3 6- 4, 16 ) G A EN ST 00 00 03 01 14 1. 5. c. 67 5G >A p .(S er 22 5= ) Si nó ni m a rs 28 39 94 48 0, 54 ; 1 ,3 2 (0 ,5 3- 3, 26 ) 0, 53 ; 1 ,5 5 (0 ,3 9- 6, 23 ) 0, 27 ; 0 ,4 7 (0 ,1 2- 1, 77 ) 0, 45 ; 0 ,4 7 (0 ,6 9- 3, 27 ) 0, 22 ; 0 ,2 9 (0 ,0 4- 2, 12 ) 0, 96 ; 1 ,0 4 (0 ,1 4- 7, 97 ) 0, 26 ; 2 ,1 3 (0 ,5 7- 7, 91 ) CY P2 C8 C T EN ST 00 00 03 24 07 1. 4. c. 64 C> T p. (A rg 22 Cy s) M iss en se rs 81 92 70 9 0, 78 ; 0 ,9 0 (0 ,4 3- 1, 87 ) 0, 62 ; 0 ,6 9 (0 ,1 6- 2, 96 ) 0, 42 ; 1 ,3 2 (0 ,6 6- 2, 66 ) 0, 17 ; 1 ,8 4 (0 ,7 6- 4, 42 ) 0, 56 ; 0 ,7 7 (0 ,3 2- 1, 86 ) 0, 45 ; 0 ,4 5 (0 ,0 6- 3, 53 ) 0, 78 ; 1 ,2 5 (0 ,4 5- 3, 44 ) C G EN ST 00 00 03 71 27 0. 3. c. 79 2C >G p .(I le 26 4M et ) M iss en se rs 10 58 93 0 0, 76 ; 0 ,8 8 (0 ,3 8- 2, 03 ) 0, 72 ; 0 ,6 8 (0 ,1 8- 1, 49 ) 0, 98 ; 0 ,9 8 (0 ,4 4- 2, 22 ) 0, 22 ; 1 ,7 7 (0 ,7 0- 4, 45 ) 0, 92 ; 1 ,0 4 (0 ,4 3- 2, 52 ) 0, 64 ; 0 ,6 1 (0 ,0 8- 4, 64 ) 0, 36 ; 0 ,4 1 (0 ,0 8- 1, 87 ) CY P2 C9 C G EN ST 00 00 02 60 68 2. 6. c. *1 08 C> G 3’ UT R rs 93 32 24 2 0, 06 ; 1 ,5 7 (0 ,9 9- 2, 47 ) 0, 19 ; 1 ,7 0 (0 ,7 6- 3, 78 ) 0, 29 ; 1 ,3 0 (0 ,7 9- 2, 13 ) 0, 80 ; 1 ,0 9 (0 ,5 4- 2, 21 ) 0, 31 ; 1 ,3 3 (0 ,7 6- 2, 33 ) 0, 55 ; 1 ,3 3 (0 ,5 1- 3, 48 ) 0, 15 ; 1 ,7 5 (0 ,8 7- 3, 48 ) A C EN ST 00 00 02 60 68 2. 6. c. 10 75 A> C. p .(I le 35 9L eu ) M iss en se rs 10 57 91 0 0, 33 ; 1 ,5 4 (0 ,6 7- 1, 83 ) 0, 57 ; 1 ,3 6 (0 ,4 6- 4, 00 ) 0, 80 ; 1 ,0 9 (0 ,5 1- 2, 36 ) 0, 56 ; 0 ,6 9 (0 ,2 0- 2, 37 ) 0, 91 ; 1 ,0 4 (0 ,4 9- 2, 19 ) 0, 85 ; 0 ,8 6 (0 ,1 9- 3, 89 ) 0, 20 ; 0 ,3 9 (0 ,1 1- 1, 39 ) A T EN ST 00 00 02 60 68 2. 6. c. 14 25 A> T p. (G ly 47 5= ) Si nó ni m a rs 10 57 91 1 0, 44 ; 1 ,2 9 (0 ,6 7- 2, 47 ) 0, 51 ; 1 ,4 3 (0 ,4 9- 4, 23 ) 0, 91 ; 0 ,9 5 (0 ,4 2- 2, 12 ) 0, 62 ; 0 ,7 3 (0 ,2 2- 2, 52 ) 0, 81 ; 1 ,,0 9 (0 ,5 2- 2, 28 ) 0, 90 ; 0 ,9 1 (0 ,2 0- 4, 10 ) 0, 21 ; 0 ,4 2 (0 ,1 2- 1, 48 ) ANEXOS 178 Tesis Paula Muñiz Sevilla ÍNDICE RESUMEN SUMMARY ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS PACIENTES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS